CN111479828A - 抗糖-muc1抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本公开内容涉及特异性结合MUC1的癌症特异性糖基化变体的抗糖‑MUC1抗体及其抗原结合片段，相关融合蛋白和抗体‑药物缀合物，以及编码此类生物分子的核酸。本公开内容进一步涉及抗体、抗原结合片段、融合蛋白、抗体‑药物缀合物和核酸的用途，用于癌症疗法。

Description

抗糖-MUC1抗体及其用途
1.序列表
本申请包含序列表，该序列表已经以ASCII格式电子提交，并且在此通过引用整体并入。于2017年10月24日创建的所述ASCII副本名为GOT-001WO_Sequence_Listing.txt，并且大小为33,265字节。
2.背景
人粘蛋白MUC1是在简单和腺上皮的顶表面上表达的多态性跨膜糖蛋白(Taylor-Papadimitriou等人,1999)。MUC1在腺癌中高度过表达并且是异常O-糖基化的。粘蛋白的胞外域含有可变数目的具有五个潜在的O-糖基化位点的20个氨基酸残基的串联重复(TR)(25-125)。O-聚糖在癌细胞中被不完全加工，导致泛癌碳水化合物抗原Tn(GalNAcα1-O-Ser/Thr)的表达(Springer,1984)。简单的粘蛋白型O聚糖Tn在腺癌(包括乳腺癌和卵巢癌)中广泛表达，并且在正常成人组织中显示有限的分布(Springer,1984)。癌症中这些O-聚糖的表达与不良预后关联，并且针对这些碳水化合物半抗原的天然抗体在癌症患者中增加(Miles等人,1995；Soares等人,1996；Werther等人,1996)。在本领域中需要利用在癌细胞中过表达的糖-MUC1表位的治疗方式。
3.发明概述
本公开内容通过提供基于对糖-MUC1的癌症特异性表位具有选择性的抗体和抗原结合片段的治疗剂和诊断剂，来捕获糖肽变体的肿瘤特异性。
本公开内容提供了抗糖-MUC1抗体及其抗原结合片段，其结合MUC1的癌症特异性糖基化变体。本公开内容进一步提供了包含抗糖-MUC1抗体和抗原结合片段的融合蛋白和抗体-药物缀合物，以及编码抗糖-MUC1抗体、抗原结合片段和融合蛋白的核酸。
本公开内容进一步提供了使用抗糖-MUC1抗体、抗原结合片段、融合蛋白、抗体-药物缀合物和核酸进行癌症疗法的方法。
在某些方面，本公开内容提供了结合MUC1的癌症特异性糖基化变体和第二表位的双特异性和其他多特异性抗糖-MUC1抗体和抗原结合片段。第二表位可以在MUC1自身上，在癌细胞上与MUC1共表达的另一种蛋白质上，或者在不同细胞，如活化的T细胞上呈现的另一种蛋白质上。此外，还公开了编码此类抗体的核酸，包括含有经密码子优化的编码区的核酸和包含未被密码子优化以在特定宿主细胞中表达的编码区的核酸。
抗糖-MUC1抗体和结合片段可以为含有融合配偶体的融合蛋白的形式。融合配偶体可用于提供第二功能，如T细胞信号传导蛋白的信号传导域的信号传导功能、T细胞活化的肽调控剂或标记系统的酶组分。示例性的T细胞信号传导蛋白包括4-1BB、CO3C和融合肽，例如CD28-CD3-zeta和4-lBB-CD3-zeta。4-1BB或CD137是T细胞的共刺激受体；CD3-zeta是T细胞抗原受体的信号转导组分。提供第二功能的部分可以是T细胞活化的调控剂，例如IL-15、IL-15Ra或IL-15/IL-15Ra融合物，或者它可以编码标记物或标记系统的酶组分，可用于在体内或体外监测结合的程度和/或位置。在本公开内容的一些实施方案中，编码位于T细胞，如自体T细胞背景中的这些预防和治疗活性的生物分子的构建体提供了用于募集过继转移的T细胞以预防或治疗多种癌症的强大平台。
在某些方面，本公开内容的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段包含表1所列的重链和/或轻链可变序列(或由核苷酸序列编码)。为了清楚，当在本文中使用术语“抗糖-MUC1抗体”时，意在包括单特异性和多特异性(包括双特异性)抗糖-MUC1抗体、单特异性和多特异性抗体的抗原结合片段、和含有抗体及其抗原结合片段的融合蛋白和缀合物，除非背景另外指出。同样，当使用术语“抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段”时，也意图包括单特异性和多特异性(包括双特异性)抗糖-MUC1抗体及其抗原结合，以及含有此类抗体和抗原结合片段的融合蛋白和缀合物，除非背景另外指出。
在其他方面，本公开内容的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段包含表1-3中列出的重链和/或轻链CDR序列(或由核苷酸序列编码)。表1中列出的CDR序列包括根据定义CDR边界的IMGT(Lefranc等人,2003,Dev Comparat Immunol 27:55-77、Kabat(Kabat等人,1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.)和Chothia(Al-Lazikani等人,1997,J.Mol.Biol 273:927-948)方案定义的CDR序列。表2中列出的CDR序列是表1中显示的CDR序列的重叠的组合区，其中IMGT、Kabat和Chothia序列以带下划线的粗体文本显示；表3中列出的CDR序列是表1中显示的CDR序列的重叠的共同区域。此类抗糖-MUC1抗体和抗原结合片段的框架序列可以是表1中的天然鼠框架序列或者可以是非天然的(例如，人源化的或人的)框架序列。
Figure BDA0002543006580000031
Figure BDA0002543006580000041
Figure BDA0002543006580000051
Figure BDA0002543006580000061
Figure BDA0002543006580000062
在某些方面，本公开内容提供了本公开内容的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其包含编号实施方案3至17中列出的任何CDR组合的氨基酸序列。在某些实施方案中，本公开内容的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段包括含有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR-H2、包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR-H3、包含SEQ ID NO:8氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ IDNO:31的氨基酸序列的CDR-L3。在一些实施方案中，CDR-H1包含SEQ ID NO:5、23、28或32的氨基酸序列。在一些实施方案中，CDR-H2包含SEQ ID NO:6或24的氨基酸序列。在一些实施方案中，CDR-H3包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。在一些实施方案中，CDR-L1包含SEQ IDNO:30或26的氨基酸序列。在一些实施方案中，CDR-L2包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列。在一些实施方案中，CDR-L3包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。在其他方面，本公开内容的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:5-7的重链CDR和SEQ ID NO:8-10的轻链CDR。在其他方面，本公开内容的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:23-25的重链CDR和SEQ ID NO:26、27和10的轻链CDR。在其他方面，本公开内容的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:28、29和25的重链CDR和SEQ ID NO:30、9和31的轻链CDR。在其他方面，本公开内容的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:32、24和7的重链CDR和SEQ ID NO:26、27和10的轻链CDR。在其他方面，本公开内容的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:33、29和25的重链CDR和SEQ ID NO:8、9和31的轻链CDR。抗原结合片段可以是鼠、嵌合、人源化或人的。
在另一方面，本公开内容的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段与分别包含SEQ IDNO:3和4的重链和轻链可变区的抗体或抗原结合片段竞争。在其他方面，本公开内容提供了具有重链和轻链可变区的抗MUC1抗体或抗原结合片段，所述重链和轻链可变区分别具有与SEQ ID NO:3和4的至少95％、98％、99％或99.5％的序列同一性。
在其他方面，本公开内容的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段是单链可变片段(scFv)。示例性的scFv包含轻链可变片段N端的重链可变片段。在一些实施方案中，scFv重链可变片段和轻链可变片段与4-15个氨基酸的接头序列共价结合。scFv可以为双特异性T细胞衔接子(bispecific T-cell engager)的形式或者在嵌合抗原受体(CAR)内。
抗糖-MUC1抗体和抗原结合片段可以为单链可变片段的多聚体、双特异性单链可变片段和双特异性单链可变片段的多聚体的形式。在一些实施方案中，单链可变片段的多聚体选自二价单链可变片段、三体(tribody)或四体(tetrabody)。在这些实施方案的一些中，双特异性单链可变片段的多聚体是双特异性T细胞衔接子。
本公开内容的其他方面涉及编码本公开内容的抗糖-MUC1抗体和抗体结合片段的核酸。在一些实施方案中，将编码抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段的核酸的部分进行密码子优化以在人细胞中表达。在某些方面，本公开内容提供了具有由重链核苷酸序列和轻链核苷酸序列编码的重链和轻链可变区的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，所述重链核苷酸序列与SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:13具有至少95％、98％、99％或99.5％的序列同一性，所述轻链核苷酸序列与SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14具有至少95％、98％、99％或99.5％序列同一性。包含核酸的载体(例如病毒载体，例如慢病毒载体)和宿主细胞也在本公开内容的范围内。重链和轻链编码序列可以存在于单个载体或分开的载体上。
本公开内容的另一方面是药物组合物，其包含根据公开内容的抗糖-MUC1抗体、抗原结合片段、核酸(或核酸对)、载体(或核酸对)或宿主细胞以及生理上合适的缓冲剂、佐剂或稀释剂。
本公开内容的另一个方面是制备嵌合抗原受体的方法，该方法包括在适合于编码区表达的条件下温育包含根据本公开内容的核酸或载体的细胞，并收集嵌合抗原受体。
本公开内容的另一方面是检测癌症的方法，其包括使细胞或组织样品与本公开内容的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段接触，并检测抗体是否与细胞或组织样品结合。
本公开内容的另一个方面是治疗癌症的方法，其包括对有此需要的受试者施用预防或治疗有效量的根据本公开内容的抗糖-MUC1抗体、抗原结合片段、核酸、载体、宿主细胞或药物组合物。
4.附图说明
图1：ELISA测定法的结果，显示了相对于MUC1，GO2与糖-MUC1的结合的特异性。
图2：GO2与结肠癌组织的结合。使用mAb GO2对侵入性结肠癌组织和邻近健康组织进行免疫组织化学标记。mAb GO2显示在与癌细胞上的细胞内和表面结构都具有高反应性的情况下与结肠癌细胞的独特结合。相反，没有看到对健康结肠细胞上的表面结构的反应性。
图3：GO2与胰腺癌组织的结合。使用mAb GO2对胰腺癌组织进行免疫组织化学标记。mAb GO2显示与胰腺癌细胞的独特结合。相反，对周围的健康组织未看到反应性或看到有限的反应性。
图4：GO2与乳腺癌组织的结合。使用mAb GO2对乳腺癌组织进行免疫组织化学标记。mAb GO2显示与侵入性乳腺癌细胞的独特结合。
图5：用抗体GO2和与抗微管蛋白剂单甲基澳瑞他汀F(MMAF)缀合的二抗的抗体依赖性细胞毒性测定法的结果。
图6：使用GO2定量循环肿瘤细胞的ELISA测定法结果。X轴显示细胞数，并且Y轴显示OD450值。
图7A-E：MUC1阳性TMA肿瘤核心的代表性图像。图7A：乳腺癌；图7B：非小细胞肺癌；图7C：卵巢癌；图7D：结肠直肠癌；图7E：前列腺癌。
图8：示例性抗糖-MUC1和抗CD3 T细胞双特异性抗体(TCB)的示意图。
图9A-B：用来源于患者的未经消化的肿瘤样品(支气管和肺的恶性新生物：中叶、支气管或肺、鳞状细胞癌)和50nM(图9A)或5nM(图9B)的不同TCB的Jurkat-NFAT活化测定法。
图10：用来源于患者的未经消化的肿瘤样品(支气管和肺的恶性新生物：下叶、支气管或肺、非角化鳞状细胞癌)和50nM的不同TCB的Jurkat-NFAT活化测定法。
图11：用来源于患者的未经消化的肿瘤样品(支气管和肺的恶性新生物：上叶、支气管或肺、腺泡型腺癌)和50nM的不同TCB的Jurkat-NFAT活化测定法。
图12A-12B：通过流式细胞术测量的GO2 TCB与MCF7 cs(图12A)和T3M4 pzfv(图12B)细胞上表达的MUC1的结合。
图13A-X：在存在来自两个健康供体(供体1，图13A-13L；供体2，图13M-13X)的PBMC的情况下在T3M4 pzfv上用GO2 TCB的肿瘤细胞杀伤和T细胞活化诱导，其通过CD4 T细胞和CD8 T细胞上的CD25和CD69上调以及IL6、IL8、IL10、IFNγ、TNFα和粒酶B的释放测量。图13A-13X中每个的相同图例。
图14A-14F：在存在PBMC的情况下在MCF7 cs上用GO2 TCB的肿瘤细胞杀伤的诱导(图14A-14B)和T细胞活化(分别为图14C-14F)，其通过CD8 T细胞和CD4 T细胞上的CD25和CD69的上调测量。图14A-14F中每个的相同图例。
图15A-B：GO2 TCB和HMFG1 TCB与MCF10A(人非致瘤性乳腺上皮细胞系)(图15A)和HBEpiC(人支气管上皮细胞)(图15B)结合。
图16A-C：在存在PBMC的情况下在MCF10A细胞上用GO2 TCB和HMFG1 TCB的肿瘤细胞杀伤诱导(图16A)和通过CD4 T细胞(图16B)和CD8 T细胞(图16C)上的CD25上调测量的T细胞活化。
图17：流过具有偶联的糖肽的流动池的GO2和GO2 TCB的图示。
图18A-B：传感图显示GO2(图18A)和GO2 TCB(图18B)与人和猕猴糖肽的结合。
图19A-D：GO2抗体(图19A-19B)和GO2TCB(图19C-19D)与人和猕猴糖肽的结合(亲和力)，以及“表观”KD的估计。
5.发明详述
5.1抗体
本发明人开发了针对存在于肿瘤细胞上的MUC1的糖型的新型抗体。这些抗体以抗体5F7(在本文中称为“GO2”)示例。在抗体筛选中鉴定GO2，所述抗体结合糖基化的60聚体，其代表3个拷贝的在MUC1中存在的串联重复之一，VTSAPDTRPAPGSTAPPAHG(SEQ ID NO:50)，该60聚体用纯化的重组人糖基转移酶多肽GalNAc-T2、GalNAc-T4和GalNAc-T1糖基化，以便模拟肿瘤细胞上存在的MUC1的糖基化模式。
以抗体GO2示例的本公开内容的抗糖-MUC1抗体可用作癌症诊断和治疗中的工具。
因此，在某些方面，本公开内容提供了抗体和抗原结合片段，其结合肿瘤细胞上存在的MUC1的糖型(本文称为“糖-MUC1”)，并且优选结合用GalNAc-T2、GalNAc-T4和GalNAc-T1糖基化的60聚体肽(VTSAPDTRPAPGSTAPPAHG)3(SEQ ID NO:47)，如美国专利号6,465,220中所述。
本公开内容的抗糖-MUC1抗体可以是多克隆的、单克隆的、遗传工程化的和/或本质上以其他方式修饰的，包括但不限于嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、灵长类抗体、单链抗体、双特异性抗体、双重可变域抗体等。在各个实施方案中，抗体包含抗体恒定区的全部或部分。在一些实施方案中，恒定区是选自以下的同种型：IgA(例如，IgA1或IgA2)、IgD、IgE、IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)和IgM。在具体的实施方案中，本公开内容的抗糖-MUC1抗体包含IgG1恒定区同种型。
如本文所用，术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。单克隆抗体通过本领域可用或已知的任何方式衍生自单个克隆，包括任何真核、原核或噬菌体克隆。可以使用本领域中已知的极其多种技术来制备可用于本公开内容的单克隆抗体，包括使用杂交瘤、重组和噬菌体展示技术或其组合。在本公开内容的许多用途中，包括在人中体内使用抗糖-MUC1抗体，可以适当地使用嵌合、灵长类化、人源化或人的抗体。
如本文所用，术语“嵌合”抗体是指具有衍生自非人免疫球蛋白(例如大鼠或小鼠抗体)的可变序列和通常选自人免疫球蛋白模板的人免疫球蛋白恒定区的抗体。产生嵌合抗体的方法是本领域已知的。参见例如Morrison,1985,Science 229(4719):1202-7；Oietal.,1986,BioTechniques 4:214-221；Gillieset al.,1985,J.Immunol.Methods 125:191-202；美国专利号5,807,715；4,816,567；和4,816397，其通过引用整体并入本文。
非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式是嵌合免疫球蛋白，其含有衍生自非人免疫球蛋白的最小序列。通常，人源化抗体将包含至少一个，且通常两个基本上整个可变域，其中所有或基本上所有的CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些，并且所有或基本上所有的FR区是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体还可包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少部分，通常是人免疫球蛋白共有序列的。抗体人源化的方法是本领域已知的。参见例如Riechmann等人,1988,Nature 332:323-7；Queen等人的美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,761；5,693,762；和6,180,370；EP239400；PCT公开文本WO 91/09967；美国专利号5,225,539；EP592106；EP519596；Padlan,1991,Mol.Immunol.,28:489-498；Studnicka等人,1994,Prot.Eng.7:805-814；Roguska等人,1994,Proc.Natl.Acad.Sci.91:969-973；和美国专利号5,565,332，其全部通过引用完整并入本文。
“人抗体”包括具有人免疫球蛋白氨基酸序列的抗体，并且包括从人免疫球蛋白文库或从针对一种或多种人免疫球蛋白转基因且不表达内源性免疫球蛋白的动物分离的抗体。人抗体可以通过本领域已知的多种方法来制备，所述方法包括使用自人免疫球蛋白序列衍生的抗体文库的噬菌体展示方法。参见美国专利号4,444,887和4,716,111；以及PCT公开文本WO 98/46645；WO 98/50433；WO 98/24893；WO 98/16654；WO 96/34096；WO 96/33735；和WO 91/10741，每篇通过引用完整并入本文。人抗体也可以使用不能表达功能性内源性免疫球蛋白但可以表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠产生。参见例如PCT公开文本WO 98/24893；WO 92/01047；WO 96/34096；WO 96/33735；美国专利号5,413,923；5,625,126；5,633,425；5,569,825；5,661,016；5,545,806；5,814,318；5,885,793；5,916,771；和5,939,598，它们通过引用完整并入本文。可以使用称为“指导选择”的技术来生成识别选定表位的完全人抗体。在此种方法中，使用选定的非人单克隆抗体，例如小鼠抗体，来指导识别相同表位的完全人抗体的选择(参见，Jespers等人，1988,Biotechnology 12:899-903)。
“灵长类化抗体”包含猴可变区和人恒定区。产生灵长类化抗体的方法是本领域已知的。参见例如美国专利号5,658,570；5,681,722；和5,693,780，其通过引用完整并入本文。
本公开内容的抗糖-MUC1抗体包括全长(完整)抗体分子以及能够结合糖-MUC1的抗原结合片段两者。举例而言，抗原结合片段的例子包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、单链Fv片段和单域片段。
Fab片段含有轻链恒定域(CL)和重链的第一恒定域(CH1)。Fab’片段与Fab片段的区别在于在重链CH1域的羧基端的几个残基的添加，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。F(ab')片段是通过切割F(ab')2胃蛋白酶消化产物的铰链半胱氨酸处的二硫键而产生的。抗体片段的其他化学偶联是本领域普通技术人员已知的。Fab和F(ab')1片段缺少完整抗体的Fc片段，从动物循环中更快清除，并且可以比完整抗体具有更少的非特异性组织结合(参见，例如Wahl等人,1983,J.Nucl.Med.24:316)。
“Fv”片段是含有完整靶标识别和结合位点的抗体的最小片段。该区域由紧密非共价缔合的一个重链和一个轻链可变域的二聚体(VH-VL二聚体)组成。正是在此构造中，每个可变域的三个CDR相互作用以在VH-VL二聚体的表面上定义靶结合位点。通常，6个CDR赋予靶标与抗体的结合特异性。然而，在某些情况下，即使单个可变域(或Fv的一半，其仅包含三个对靶标特异性的CDR)可以具有识别和结合靶标的能力，但亲和力比整个结合位点低。
“单链Fv”或“scFv”抗原结合片段包含抗体的VH和VL域，其中这些域存在于单个多肽链中。通常，Fv多肽在VH和VL域之间进一步包含多肽接头，其使得scFv能够形成靶标结合的期望的结构。
“单域抗体”由对糖-MUC1表现出足够亲和力的单一VH或VL域组成。在具体的实施方案中，单域抗体是骆驼化抗体(参见例如Riechmann,1999,Journal of ImmunologicalMethods 231:25-38)。
本公开内容的抗糖-MUC1抗体也可以是双特异性抗体和其他多种特异性抗体。双特异性抗体是对同一或不同抗原上的两个不同表位具有结合特异性的单克隆抗体，通常是人或人源化抗体。在本公开内容中，结合特异性之一可以针对糖-MUC1，并且另一种可以针对任何其他抗原，例如针对细胞表面蛋白、受体、受体亚基、组织特异性抗原、病毒衍生蛋白、病毒编码的包膜蛋白、细菌衍生的蛋白或细菌表面蛋白等。在某些优选的实施方案中，双特异性和其他多特异性抗糖-MUC1抗体以及抗原结合片段特异性结合第二MUC1表位，与MUC1共表达于癌细胞上的另一种蛋白质上的表位，或不同细胞(例如活化的T细胞)上呈现的另一种蛋白质上的表位。本公开内容的双特异性抗体包括IgG形式双特异性抗体和基于单链的双特异性抗体。
本公开内容的IgG形式双特异性抗体可以是本领域已知的各种类型的IgG形式双特异性抗体中的任一种，例如四源杂交瘤双特异性抗体，“突出-入-孔”双特异性抗体、CrossMab双特异性抗体、电荷配对双特异性抗体、共同轻链双特异性抗体、单臂单链Fab-免疫球蛋白γ双特异性抗体、二硫化物稳定的Fv双特异性抗体、DuetMab、受控Fab臂交换双特异性抗体、链交换工程化域体双特异性抗体、两臂亮氨酸拉链异二聚体单克隆双特异性抗体、κλ体双特异性抗体、双重可变域双特异性抗体和交叉双重可变域双特异性抗体。参见例如
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和Milstein,1975,Nature 256:495-497；Milstein和Cuello,1983,Nature 305:537-40；Ridgway等人,1996,Protein Eng.9:617-621；Schaefer等人,2011,Proc NatlAcad Sci USA 108:11187-92；Gunasekaran等人,2010,J Biol Chem 285:19637-46；Fischer等人,2015Nature Commun 6:6113；Schanzer等人,2014,J Biol Chem 289:18693–706；Metz等人,2012Protein Eng Des Sel 25:571–80；Mazor等人,2015MAbs 7:377–89；Labrijn等人,2013Proc Natl Acad Sci USA 110:5145–50；Davis等人,2010Protein EngDes Sel 23:195–202；Wranik等人,2012,J Biol Chem 287:43331–9；Gu等人,2015,PLoSOne 10(5):e0124135；Steinmetz等人,2016,MAbs 8(5):867-78；Klein等人,2016,mAbs,8(6):1010-1020；Liu等人,2017,Front.Immunol.8:38；和Yang等人,2017,Int.J.Mol.Sci.18:48，其通过引用完整并入本文。
在一些实施方案中，本公开内容的双特异性抗体是CrossMab。CrossMab技术详细记载于WO 2009/080251,WO 2009/080252,WO 2009/080253,WO 2009/080254,WO 2013/026833,WO 2016/020309,和Schaefer等人,2011,Proc Natl Acad Sci USA 108:11187-92，它们通过引用完整并入本文。简而言之，CrossMab技术基于双特异性IgG的一个Fab臂内重链和轻链之间的域交叉，其促进正确的链缔合。本公开内容的CrossMab双特异性抗体可以是“CrossMabFAB”抗体，其中双特异性IgG抗体的一个臂的Fab部分的重链和轻链被交换。在其他实施方案中，本公开内容的CrossMab双特异性抗体可以是“CrossMabVH-VL”抗体，其中双特异性IgG抗体的一个臂的Fab部分的重链和轻链的仅可变域是交换的。在其他实施方案中，本公开内容的CrossMab双特异性抗体可以是“CrossMabCH1-CL”抗体，其中双特异性IgG抗体的一个臂的Fab部分的重链和轻链的仅恒定域是交换的。与CrossMabFAB和CrossMabVH-VL相比，CrossMabCH1-CL抗体没有预测的副产物，因此，在某些实施方案中，CrossMabCH1-CL双特异性抗体是优选的。参见Klein等人,2016,mAbs,8(6):1010-1020。在以下第5.2节中描述本公开内容的CrossMab的其他实施方案。
在一些实施方案中，本公开内容的双特异性抗体是受控的Fab臂交换双特异性抗体。制备Fab-臂交换双特异性抗体的方法记载于PCT公开文本号WO2011/131746和Labrijn等人，2014Nat Protoc.9(10):2450-63，其通过引用完整并入本文。简而言之，可以通过如下制备受控的Fab-臂交换双特异性抗体：在CH3域中分别表达两个含有单一匹配点突变的亲本IgG1，在体外氧化还原条件下混合亲本IgG1以使半分子重组，并除去还原剂以允许链间二硫键的再氧化，从而形成双特异性抗体。
本公开内容的双特异性抗体可包含由第一和第二亚基组成的Fc域。在一个实施方案中，Fc域是IgG Fc域。在具体的实施方案中，Fc域是IgG1 Fc域。在另一个实施方案中，Fc域是IgG4 Fc域。在更具体的实施方案中，Fc域是IgG4 Fc域，其在位置S228(Kabat EU索引编号)处包含氨基酸取代，特别是氨基酸取代S228P。此氨基酸取代减少IgG4抗体的体内Fab臂交换(参见Stubenrauch等人，2010,Drug Metabolism and Disposition 38:84-91)。在另一个具体的实施方案中，Fc域是人Fc域。在甚至更具体的实施方案中，Fc域是人IgG1 Fc域。在SEQ ID NO:42中给出人IgG1 Fc区的示例性序列。
在具体的实施方案中，Fc域包含促进Fc域的第一和第二亚基缔合的修饰。人IgGFc域的两个亚基之间最广泛的蛋白质-蛋白质相互作用的位点在CH3域中。因此，在一个实施方案中，修饰是在Fc域的CH3域中。
在具体的实施方案中，所述促进Fc域的第一和第二亚基缔合的修饰是所谓的“突出-入-孔”修饰，其包括在Fc域的两个亚基之一中的“突出”修饰和Fc域的两个亚基的另一个中的“全”修饰。突出-入-孔技术记载于例如US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway等人,1996,Prot Eng 9:617-621,和Carter,J,2001,Immunol Meth 248:7-15。通常，该方法涉及在第一多肽的界面处引入突起(“突出”)，并在第二多肽的界面中引入相应的腔(“孔”)，使得可以将突起定位在腔中，以便促进异二聚体形成并阻碍同二聚体形成。通过用较大的侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换来自第一多肽界面的小氨基酸侧链来构建突起。通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换大的氨基酸侧链，在第二多肽的界面中创建与突起相同或相似大小的补偿腔。
因此，在一些实施方案中，将Fc域的第一亚基的CH3域中的氨基酸残基替换为具有较大侧链体积的氨基酸残基，从而在第一亚基的CH3域内产生可定位在第二亚基的CH3域内的腔中的突起，并且将Fc域的第二亚基的CH3域中的氨基酸残基替换为具有较小侧链体积的氨基酸残基，从而产生第二亚基的CH3域内的腔，该腔内可定位第一亚基的CH3域内的突起。优选地，所述具有较大侧链体积的氨基酸残基选自下组：精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)。优选地，所述具有较小侧链体积的氨基酸残基选自下组：丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和缬氨酸(V)。突起和腔可以通过改变编码多肽的核酸，例如通过位点特异性诱变，或通过肽合成来制备。示例性的取代是Y470T。
在具体的此类实施方案中，在Fc域的第一亚基中，将366位的苏氨酸残基替换为色氨酸残基(T366W)，并且在Fc域的第二亚基中，将407位的酪氨酸残基替换为缬氨酸残基(Y407V)和任选地将366位的苏氨酸残基替换为丝氨酸残基(T366S)，并且将368位的亮氨酸残基替换为丙氨酸残基(L368A)(根据Kabat EU索引编号)。在另一个实施方案中，在Fc域的第一亚基中，另外将354位的丝氨酸残基替换为半胱氨酸残基(S354C)或将356位的谷氨酸残基替换为半胱氨酸残基(E356C)(特别地将354位的丝氨酸残基替换为半胱氨酸残基)，并且在Fc域的第二亚基中，另外将349位的酪氨酸残基替换为半胱氨酸残基(Y349C)(根据Kabat EU索引编号)。在具体的实施方案中，Fc域的第一亚基包含氨基酸取代S354C和T366W，并且Fc域的第二亚基包含氨基酸取代Y349C、T366S、L368A和Y407V(根据Kabat EU索引编号)。
在一些实施方案中，静电操纵(例如如记载于Gunasekaran等人,2010,J BiolChem 285(25):19637-46)可用于促进Fc域的第一亚基和第二亚基的缔合。
在一些实施方案中，Fc域包含减少与Fc受体的结合和/或效应器功能的一个或多个氨基酸取代。
在具体的实施方案中，Fc受体是Fcγ受体。在一个实施方案中，Fc受体是人Fc受体。在一个实施方案中，Fc受体是活化性Fc受体。在一个具体的实施方案中，Fc受体是活化性人Fcγ受体，更具体地是人FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最具体地是人FcγRIIIa。在一个实施方案中，效应器功能是选自下组的一种或多种：补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)和细胞因子分泌。在一个具体的实施方案中，效应器功能是ADCC。
典型地，在Fc域的两个亚基的每个中存在相同的一个或多个氨基酸取代。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸取代降低Fc域与Fc受体的结合亲和力。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸取代使Fc域与Fc受体的结合亲和力降低至少2倍、至少5倍或至少10倍。
在一个实施方案中，Fc域在选自E233、L234、L235、N297、P331和P329(根据KabatEU索引编号)的位置处包含氨基酸取代。在更具体的实施方案中，Fc域在选自L234、L235和P329(根据Kabat EU索引编号)的位置处包含氨基酸取代。在一些实施方案中，Fc域包含氨基酸取代L234A和L235A(根据Kabat EU索引编号)。在一个此类实施方案中，Fc域是IgG1 Fc域，特别是人IgG1 Fc域。在一个实施方案中，Fc域在P329位处包含氨基酸取代。在更具体的实施方案中，氨基酸取代是P329A或P329G，特别是P329G(根据Kabat EU索引编号)。在实施方案中，Fc域包含在P329位处的氨基酸取代和选自E233、L234、L235、N297和P331(根据Kabat EU索引编号)的位置处的进一步的氨基酸取代。在更具体的实施方案中，进一步的氨基酸取代是E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D或P331S。在具体的实施方案中，Fc域在P329、L234和L235(根据Kabat EU索引编号)处包含氨基酸取代。在更具体的实施方案中，Fc域包含氨基酸突变L234A、L235A和P329G(“P329G LALA”、“PGLALA”或“LALAPG”)。具体地，在具体的实施方案中，Fc域的每个亚基包含氨基酸取代L234A、L235A和P329G(Kabat EU索引编号)，即在Fc域的第一和第二亚基的每个中，234位的亮氨酸残基替换为丙氨酸残基(L234A)，235位的亮氨酸残基替换为丙氨酸残基(L235A)，并且329位的脯氨酸残基替换为甘氨酸残基(P329G)(根据Kabat EU索引编号)。在一个此类实施方案中，Fc域是IgG1Fc域，特别是人IgG1 Fc域。
本公开内容的基于单链的双特异性抗体可以是本领域已知的各种类型的基于单链的双特异性抗体中的任一种，例如双特异性T细胞衔接子(BiTE)、双抗体、串联双抗体(tandabs)、双重亲和力再靶向分子(dual-affinity retargeting molecule)(DART)和双特异性杀伤细胞衔接子。参见例如
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等人,2000,Blood 95:2098–103；Holliger等人,1993,Proc Natl Acad Sci USA,90:6444–8；Kipriyanov等人,1999,Mol Biol 293:41–56；Johnson等人,2010,Mol Biol 399:436–49；Wiernik等人,2013,Clin Cancer Res 19:3844–55；Liu等人,2017,Front.Immunol.8:38；和Yang等人,2017,Int.J.Mol.Sci.18:48，其通过引用完整并入本文。
在一些实施方案中，本公开内容的双特异性抗体是双特异性T细胞衔接子(BiTE)。BiTE是具有两个抗原结合域的单多肽链分子，所述抗原结合域之一结合T细胞抗原，所述抗原结合域的第二个结合存在于靶标表面上的抗原(参见PCT公开文本WO 05/061547；Baeuerle等人,2008,Drugs of the Future 33:137-147；Bargou等人,2008,Science 321:974-977，通过引用完整并入本文。因此，本公开内容的BiTE具有与T细胞抗原结合的抗原结合域和针对糖-MUC1的第二抗原结合域。
在一些实施方案中，本公开内容的双特异性抗体是双重亲和力再靶向分子(DART)。DART包含至少两条多肽链，它们缔合(特别是通过共价相互作用)形成至少两个表位结合位点，其可以识别相同或不同的表位。DART的每条多肽链均包含免疫球蛋白轻链可变区和免疫球蛋白重链可变区，但这些区域不相互作用形成表位结合位点。而是，DART多肽链之一(例如，第一条)的免疫球蛋白重链可变区与不同(例如，第二条)DARTTM多肽链的免疫球蛋白轻链可变区相互作用以形成表位结合位点。类似地，DART多肽链之一(例如，第一条)的免疫球蛋白轻链可变区与不同(例如第二条)的DART多肽链的免疫球蛋白重链可变区相互作用以形成表位结合位点。DART可以是单特异性、双特异性、三特异性，等等，因此能够同时结合1、2、3或更多个不同的表位(它们可以具有相同或不同的抗原)。另外，DART可以是一价、二价、三价、四价、五价、六价等，因此能够同时结合1、2、3、4、5、6或更多个分子。DART的这两个属性(即特异性和效价程度可以组合在一起，例如产生四价(即能够结合四组表位)的双特异性抗体(即能够结合两个表位))等。PCT公开文本WO 2006/113665、WO 2008/157379和WO 2010/080538(它们通过引用完整并入本文)中公开了DART分子。
在本公开内容的双特异性抗体的一些实施方案中，结合特异性之一针对糖-MUC1，而另一特异性针对免疫效应细胞上表达的抗原。如本文所用，术语“免疫效应细胞”或“效应细胞”是指哺乳动物免疫系统中细胞的天然全集中的细胞，其可以被激活以影响靶细胞的存活力。免疫效应细胞包括淋巴样谱系的细胞，例如自然杀伤(NK)细胞，T细胞，包括细胞毒性T细胞，或B细胞，而且髓样谱系的细胞也可以视为免疫效应细胞，例如单核细胞或巨噬细胞，树突细胞和嗜中性粒细胞。因此，所述效应细胞优选是NK细胞、T细胞、B细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞或嗜中性粒细胞。将效应细胞募集到异常细胞意味着免疫效应细胞被带到异常靶细胞附近，从而效应细胞可以直接杀死它们被募集到的异常细胞或间接引发该异常细胞的杀死。为了避免非特异性相互作用，优选地，本公开内容的双特异性抗体特异性识别免疫效应细胞上的抗原，与体内其他细胞相比，所述抗原至少被这些免疫效应细胞过表达。存在于免疫效应细胞上的靶抗原可包括CD3、CD8、CD16、CD25、CD28、CD64、CD89、NKG2D和NKp46。优选地，免疫效应细胞上的抗原是在T细胞上表达的CD3。
如本文所用，“CD3”是指来自任何脊椎动物来源的任何天然CD3，包括哺乳动物，例如灵长类(例如人)，非人灵长类(例如猕猴)和啮齿类(例如小鼠和大鼠)，除非另有指示。该术语涵盖“全长”未处理的CD3以及源自在细胞中处理的任何形式的CD3。该术语还涵盖CD3的天然存在的变体，例如剪接变体或等位变体。免疫效应细胞上最优选的抗原是CD3epsilon链。已显示该抗原在将T细胞募集到异常细胞中非常有效。因此，本公开内容的双特异性抗体优选地特异性识别CD3ε。人CD3 epsilon的氨基酸序列显示在UniProt(www.uniprot.org)登录号No.P07766(版本144)或NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/)RefSeqNP_000724.1中。猕猴[Macaca fascicularis]CD3 epsilon的氨基酸序列显示在NCBIGenBank No.BAB71849.1中。为了人的治疗用途，使用其中CD3结合域特异性结合人CD3(例如人CD3 epsilon链)的双特异性抗体。为了在非人动物和细胞系中进行临床前测试，可以使用双特异性抗体，其中CD3结合域与临床前测试所用物种中的CD3(例如，用于灵长类测试的猕猴CD3)特异性结合。
如本文所用，“特异性结合”或“特异性识别”来自特定物种的靶抗原的结合域不排除与来自其他物种的抗原的结合或识别，因此涵盖一个或多个结合域具有种间交叉反应性的抗体。例如，“特异性结合”或“特异性识别”人CD3的CD3结合域也可以结合或识别猕猴CD3，反之亦然。
在一些实施方案中，本公开内容的双特异性抗体可以与单克隆抗体H2C(在PCT公开文本号WO2008/119567中描述)竞争对CD3表位的结合。在其他实施方案中，本公开内容的双特异性抗体可与单克隆抗体V9(在Rodrigues等人,1992,Int J Cancer Suppl 7:45-50和美国专利号6,054,297中描述)竞争对CD3表位的结合。在其他实施方案中，本公开内容的双特异性抗体可以与单克隆抗体FN18(在Nooij等人,1986,Eur J Immunol 19:981-984中描述)竞争对CD3表位的结合。在其他实施方案中，本公开内容的双特异性抗体可以与单克隆抗体SP34(在Pessano等人,1985,EMBO J 4:337-340中描述)竞争对CD3表位的结合。
本公开内容的抗糖-MUC1抗体包括衍生化的抗体。例如但不作为限制，衍生化的抗体通常通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白水解切割、与细胞配体或其他蛋白质的连接来修饰。多种化学修饰中的任一种可通过已知技术进行，包括但不限于特异性化学切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。此外，该衍生物可包含一种或多种非天然氨基酸，例如，使用ambrx技术(参见例如Wolfson,2006,Chem.Biol.13(10):1011-2)。
抗糖-MUC1抗体或结合片段可以是其序列已经被修饰以改变至少一种恒定区介导的生物学效应器功能的抗体或片段。例如，在一些实施方案中，抗-糖-MUC1抗体可以被修饰以相对于未修饰的抗体降低至少一种恒定区介导的生物学效应器功能，例如，降低的与Fc受体(FcγR)的结合。可以通过在FcγR相互作用所必需的特定区域处突变抗体的免疫球蛋白恒定区片段来减少FcγR结合(参见例如Canfield and Morrison,1991,J.Exp.Med.173:1483-1491；和Lundet al.,1991,J.Immunol.147:2657-2662)。抗体的FcγR结合能力的降低还可降低依赖于FcγR相互作用的其他效应器功能，例如调理作用、吞噬作用和抗原依赖性细胞毒性(“ADCC”)。
本文所述的抗糖-MUC1抗体或结合片段包括已被修饰以相对于未修饰的抗体获得或改善至少一种恒定区介导的生物学效应器功能，例如以增强FcγR相互作用(参见例如US2006/0134709)的抗体和/或结合片段。例如，本公开内容的抗糖-MUC1抗体可以具有以比相应的野生型恒定区更大的亲和力结合FcγRIIA、FcγRIIB和/或FcγRIIIA的恒定区。
因此，本公开内容的抗体抗原具有生物学活性的改变，其导致增加或降低的调理作用、吞噬作用或ADCC。此类改变是本领域已知的。例如，在美国专利号5,834,597中描述了降低ADCC活性的抗体修饰。示例性的ADCC降低变体对应于“突变体3”(在美国专利号5,834,597的图4中示出)，其中残基236被删除并且残基234、235和237(使用EU编号)被丙氨酸取代。
在一些实施方案中，本公开内容的抗糖-MUC1抗体具有低水平的岩藻糖或缺乏岩藻糖。缺乏岩藻糖的抗体与ADCC活性增强相关，尤其是在低剂量抗体下。参见Shields等人,2002,J.Biol.Chem.277:26733-26740；Shinkawa等人,2003,J.Biol.Chem.278:3466-73。制备少岩藻糖的(fucose-less)抗体的方法包括在大鼠骨髓瘤YB2/0细胞中生长(ATCC CRL1662)。YB2/0细胞表达低水平的FUT8 mRNA，它编码α-1,6-岩藻糖基转移酶，多肽岩藻糖基化所必需的酶。
在另一个方面，抗糖-MUC1抗体或结合片段包括增加或减少其与胎儿Fc受体FcRn的结合亲和力的修饰，例如，通过使参与FcRn相互作用的特定区域处的免疫球蛋白恒定区区段突变来进行(参见例如WO 2005/123780)。在具体的实施方案中，使IgG类的抗糖-MUC1抗体突变，使得重链恒定区的氨基酸残基250、314和428中的至少一个被单独取代，或以其任何组合取代，例如在250和428位处，或在250和314位处，或在314和428位处，或在250、314和428位处，其中250和428位是特定组合。对于250位，取代的氨基酸残基可以是除苏氨酸以外的任何氨基酸残基，包括但不限于丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、缬氨酸、色氨酸或酪氨酸。对于314位，取代的氨基酸残基可以是除亮氨酸以外的任何氨基酸残基，包括但不限于丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸或酪氨酸。对于428位，取代的氨基酸残基可以是甲硫氨酸以外的任何氨基酸残基，包括但不限于丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸或酪氨酸。合适的氨基酸取代的特定组合在美国专利号7,217,797(其通过引用并入本文)中的表1中鉴定。此类突变增加与FcRn的结合，这保护抗体免于降解并延长其半衰期。
在其他方面，本公开内容的抗原结合片段的抗糖-MUC1抗体具有插入一个或多个其高变区中的一个或多个氨基酸，例如，如Jung和Pluckthun,1997,Protein Engineering10:9,959-966；Yazaki等人,2004,Protein Eng.Des Sel.17(5):481-9.Epub 2004Aug.17；和美国专利申请号2007/0280931中描述。
在其他方面，特别是对于诊断应用有用，本公开内容的抗原结合片段的抗糖-MUC1抗体附接至可检测的部分。可检测的部分包括放射性部分、比色分子、荧光部分、化学发光部分、抗原、酶、可检测的珠(例如磁性或电极(例如，金)珠)或与另一种分子结合的分子(例如生物素或链霉亲合素)。
放射性同位素或放射性核素可包括3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I。
荧光标记物可以包括若丹明、镧系元素磷光体(phosphors)、荧光素及其衍生物、荧光染料、GFP(GFP表示“绿色荧光蛋白”)、丹磺酰、伞形酮(umbelliferone)、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二甲醛和荧光胺。
酶促标记物可包括辣根过氧化物酶、β半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶、葡萄糖6-磷酸脱氢酶(“G6PDH”)、α-D-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖淀粉酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶、溶菌酶、苹果酸脱氢酶和过氧化物酶。
化学发光标记物或化学发光剂，例如异鲁米诺(isoluminol)、鲁米诺和二氧杂环丁烷(dioxetanes)。
其他可检测的部分包括诸如生物素、洋地黄毒苷(digoxygenin)或5-溴脱氧尿苷的分子。
在某些方面，本公开内容的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段与GO2或包含GO2的重链和轻链可变区(分别为SEQ ID NO:3和4)的抗体或抗原结合片段竞争。
可以在表达由GO2结合的糖-MUC1表位的细胞上或在含有由GO2结合的表位的糖基化MUC1肽，例如如美国专利号6,465,220中所述用GalNAc-T2、GalNAc-T4和GalNAc-T1糖基化的60聚体肽(VTSAPDTRPAPGSTAPPAHG)3上测定竞争。不表达表位或未糖基化肽的细胞可用作对照。
可进行竞争测定法的细胞包括但不限于乳腺癌细胞系MCF7或T47D以及经工程化改造以表达糖-MUC1表位的重组细胞。在一个非限制性实例中，将缺乏UDP-Gal/GalNAc差向异构酶并且在缺乏GalNAc和Gal的外源添加的情况下分别缺少GalNAc O-糖基化和半乳糖基化的CHO IdID细胞经工程化改造以表达MUC1并在缺乏或存在GalNAc的情况下培养，后者产生表达GO2结合的MUC1的Tn糖型的细胞。表达MUC1的未糖基化形式的细胞可用作阴性对照。
用于竞争的测定法包括但不限于放射性物质标记的免疫测定法(RIA)、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、夹心ELISA荧光激活细胞分选(FACS)测定法和Biacore测定法。
在进行参考抗体和测试抗体(不论种类或同种型)之间的抗体竞争测定法时，可以首先用可检测的标记物，例如荧光团、生物素或酶(或甚至放射性)标记物标记参考物以实现后续鉴定。在此种情况下，将表达糖-MUC1的细胞与未标记的测试抗体温育，添加经标记的参考抗体，并测量结合标记物的强度。若测试抗体通过结合重叠表位与经标记的参考抗体竞争，则相对于没有测试抗体的情况下进行的对照反应，强度会降低。
在该测定法的具体实施方案中，首先测定在测定条件下(例如，规定的细胞密度)下产生最大结合的80％(“浓度80％”)的标记参考抗体的浓度，并用10倍浓度80％的未标记的测试抗体和浓度80％的标记的参考抗体进行竞争测定法。
抑制可以表示为抑制常数或Ki，其根据下式计算：
Ki＝IC50/(1+[参考抗体浓度]/Kd)，
其中IC50是产生参考抗体结合的50％降低的测试抗体的浓度，并且Kd是参考抗体的解离常数，其对糖-MUC1的亲和力的量度。在本文所述的测定条件下，与本文公开的抗糖-MUC1抗体竞争的抗体可以具有10pM至10nM的Ki。
在各个实施方案中，若在作为使用的特定测定条件下最大结合的80％的参考抗体浓度和比参考抗体浓度高10倍的测试抗体浓度时，测试抗体使参考抗体的结合降低至少约20％或更多，例如降低至少约20％,30％,40％,50％,60％,70％,80％,90％,95％或甚至更多，或者范围为任何前述数值之间的百分比，则认为测试抗体与参考抗体竞争。
在竞争测定法的一个实例中，通过使板与肽的溶液(例如，于4℃在PBS中浓度1μg/mL过夜)接触将糖基化的MUC1 60聚体肽粘附到固体表面，例如微孔板上。洗涤板(例如，PBS中的0.1％Tween 20)并封闭(例如，在Superblock,Thermo Scientific,Rockford,IL中)。将ELISA缓冲液(例如PBS中的1％BSA和0.1％Tween 20)中连续稀释(例如2.8μg/mL、8.3μg/mL或25μg/mL的浓度)的亚饱和量的生物素化GO2(例如，浓度80ng/mL)和未标记的GO2(“参考”抗体)或竞争性抗糖-MUC1抗体(“测试”抗体)抗体的混合物添加到孔，并在轻轻摇动的情况下将板温育1小时。洗涤板，将ELISA缓冲液中稀释的1μg/mL缀合有HRP的链霉亲合素添加至每个孔，并将板温育1小时。洗涤板并通过添加底物(例如，TMB,Biofx LaboratoriesInc.,Owings Mills,MD)检测结合的抗体。通过添加终止缓冲液(例如，Bio FX StopReagents,Biofx Laboratories Inc.,Owings Mills,MD)终止反应，并使用微板阅读器(例如，VERSAmax,Molecular Devices,Sunnyvale,CA)在650nm处测量吸光度。
此竞争测定法的变化也可以用于测试GO2与另一种抗糖-MUC1抗体之间的竞争。例如，在某些方面，抗糖-MUC1抗体用作参考抗体，并且GO2用作测试抗体。另外，代替糖基化的MUC1 60聚体肽，可以使用培养的细胞表面上(例如在上述细胞类型之一的表面上)表达的膜结合糖-MUC1。通常，使用约104至106个转染子，例如约105个转染子。用于竞争测定法的其他形式是本领域已知的并且可以得到采用。
在各个实施方案中，当以浓度0.08μg/mL,0.4μg/mL,2μg/mL,10μg/mL,50μg/mL,100μg/mL或范围为任何前述数值之间的浓度(例如范围为2μg/mL至10μg/mL的浓度)使用抗糖-MUC1抗体时，本公开内容的抗糖-MUC1抗体将经标记的GO2的结合降低至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％或范围为任何前述数值之间的百分比(例如本公开内容的抗糖-MUC1抗体将经标记的GO2的结合降低50％至70％)。
在其他实施方案中，当以浓度0.4μg/mL,2μg/mL,10μg/mL,50μg/mL,250μg/mL或范围为任何前述数值之间的浓度(例如范围为2μg/mL至10μg/mL的浓度)使用GO2时，GO2将经标记的本公开内容的抗糖-MUC1抗体的结合降低至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％或范围为任何前述数值之间的百分比(例如GO2将经标记的本公开内容的抗糖-MUC1抗体的结合降低50％至70％)。
在前述测定法中，可以将GO2抗体替换为包含GO2的CDR或重链和轻链可变区的任何抗体或抗原结合片段，例如GO2的人源化或嵌合对应物。
在某些方面，本公开内容的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段包含表1中列出的重链和/或轻链可变序列(或由核苷酸序列编码)。在其它方面，本公开内容的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段包含表1中列出的重链和/或轻链CDR序列(或由核苷酸序列编码)。此类抗糖-MUC1抗体和抗原结合片段的框架序列可以是表1中的天然鼠框架序列，或者可以是非天然(例如人源化或人)框架序列。
在其他方面，本公开内容提供了具有分别具有与SEQ ID NO:3和4的至少95％，98％，99％或99.5％序列同一性的重链和轻链可变区的抗MUC1抗体或抗原结合片段。
在其他方面，本公开内容的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段是单链可变片段(scFv)。示例性的scFv包含轻链可变片段N末的重链可变片段。在一些实施方案中，scFv重链可变片段和轻链可变片段与4-15个氨基酸的接头序列共价结合。scFv可以为双特异性T细胞衔接子的形式或者在嵌合抗原受体(CAR)内。
5.2抗糖-MUC1和抗CD3双特异性抗体
在一些方面，本公开内容的双特异性抗体可以包含特异性结合CD3的第一抗原结合域(例如，其包含表4中列出的CDR或VH和VL)和特异性结合糖MUC1的第二抗原结合域。第二抗原结合域可单独地或组合地包含上文对糖-MUC1抗体描述的特征(例如，包含表1-3中鉴定的CDR的组合，例如包含下文编号实施方案3至17中列出的任何CDR组合的氨基酸序列，或表1中鉴定的VH和VL序列的CDR)。
Figure BDA0002543006580000251
Figure BDA0002543006580000261
在一些实施方案中，第一抗原结合域包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:34的重链CDR-H1、SEQ ID NO:35的CDR-H2和SEQ ID NO:36的CDR-H3；该轻链可变区包含SEQ ID NO:37的轻链CDR-L1、SEQ ID NO:38的CDR-L2和SEQ ID NO:39的CDR-L3。
在一些实施方案中，第二抗原结合域包含例如CDR，其包含编号实施方案3至17中列出的任何CDR组合的氨基酸序列，例如(i)包含SEQ ID NO:5的重链CDR-H1，SEQ ID NO:6的CDR-H2和SEQ ID NO:7的CDR-H3的重链可变区；和包含SEQ ID NO:8的轻链CDR(CDR-L)1，SEQ ID NO:9的CDR-L2和SEQ ID NO:10的CDR-L3的轻链可变区。
在具体的实施方案中，双特异性抗体包含
(i)第一抗原结合域，其特异性结合CD3并包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括含有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的CDR-H1，包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的CDR-H3；所述轻链可变区包括含有SEQ IDNO:37的氨基酸序列的CDR-L1，包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ IDNO:39的氨基酸序列的CDR-L3；和
(ii)第二抗原结合域，其特异性结合糖-MUC1并包含(i)重链可变区，该重链可变区包括含有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的CDR-H1，更优选地，包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR-H1，包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR-H2，更优选包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR-H1，以及包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR-H3，更优选地，包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变区，其包括含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR-L1，包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR-L3，更优选地，包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR-L3。
在一些实施方案中，第一抗原结合域包含与SEQ ID NO.40的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的重链可变区序列和与SEQ ID NO:41的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的轻链可变区序列。
在一些实施方案中，第一抗原结合域包含SEQ ID NO:40的重链可变区序列和SEQID NO:41的轻链可变区序列。
在一些实施方案中，第二抗原结合域包含与SEQ ID NO.3的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的重链可变区序列和与SEQ ID NO:4的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的轻链可变区序列。
在一些实施方案中，第二抗原结合域包含SEQ ID NO:3的重链可变区序列和SEQID NO:4的轻链可变区序列。
在一些实施方案中，第一和/或第二抗原结合域是Fab分子。在一些实施方案中，第一抗原结合域是交换Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变区或恒定区被交换。在此类实施方案中，第二抗原结合域优选是常规的Fab分子。
在一些实施方案中，其中双特异性抗体的第一和第二抗原结合域都是Fab分子，并且在抗原结合域之一(特别是第一抗原结合域)中，Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH链是相互交换的，
i)在第一抗原结合域的恒定域CL中，124位的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代(根据Kabat编号)，并且其中在第一抗原结合域的恒定域CH1中，147位的氨基酸或213位的氨基酸被带负电荷的氨基酸取代(根据Kabat EU索引编号)；或
ii)在第二抗原结合域的恒定域CL中，124位的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代(根据Kabat编号)，并且其中在第二抗原结合域的恒定域CH1中，147位的氨基酸或213位的氨基酸被带负电荷的氨基酸取代(根据Kabat EU索引编号)。
双特异性抗体不包含在i)和ii)下提及的这两种修饰。具有VH/VL交换的抗原结合域的恒定域CL和CH1未彼此替换(即，它们保持未交换)。
在更具体的实施方案中，
i)在第一抗原结合域的恒定域CL中，124位的氨基酸独立被赖氨酸(K)，精氨酸(R)或组氨酸(H)取代(根据Kabat编号)，并在第一抗原结合域的恒定域CH1中，147位的氨基酸或213位的氨基酸独立被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代(根据Kabat EU索引编号)；或
ii)在第二抗原结合域的恒定域CL中，位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)，精氨酸(R)或组氨酸(H)独立取代(根据Kabat编号)，并且在恒定域CH1中在第二抗原结合域中，第147位的氨基酸或第213位的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立取代(根据Kabat EU索引编号)。
在一个此类实施方案中，在第二抗原结合域的恒定域CL中，124位的氨基酸独立被赖氨酸(K)，精氨酸(R)或组氨酸(H)取代(根据Kabat编号)，并且在第二抗原结合域的恒定域CH1中，147位的氨基酸或213位的氨基酸独立被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代(根据Kabat EU索引编号)。
在另一个实施方案中，在第二抗原结合域的恒定域CL中，124位的氨基酸独立被赖氨酸(K)，精氨酸(R)或组氨酸(H)取代(根据Kabat编号)，并且在第二抗原结合域的恒定域CH1中，147位的氨基酸独立被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代(根据Kabat EU索引编号)。
在具体的实施方案中，在第二抗原结合域的恒定域CL中，124位的氨基酸独立被赖氨酸(K)，精氨酸(R)或组氨酸(H)取代(根据Kabat编号)并且123位的氨基酸独立被赖氨酸(K)，精氨酸(R)或组氨酸(H)取代(根据Kabat编号)，并且在第二抗原结合域的恒定域CH1中，147位的氨基酸独立被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代(根据Kabat EU索引编号)，并且213位的氨基酸独立被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代(根据Kabat EU索引)。
在更具体的实施方案中，在第二抗原结合域的恒定域CL中，124位的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)，并且123位的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)，并且在第二抗原结合域的恒定域CH1中，147位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat EU索引编号)并且213位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat EU索引编号)。
在甚至更具体的实施方案中，在第二抗原结合域的恒定域CL中，124位的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)，并且123位的氨基酸被精氨酸(R)取代(根据Kabat编号)，并且在第二抗原结合域的恒定域CH1中，147位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat EU索引编号)，并且213位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat EU索引编号)。
在具体的实施方案中，若在第二抗原结合域的恒定域CL和恒定域CH1中进行根据上述实施方案的氨基酸取代，则第二抗原结合域的恒定域CL是kappa同种型的。
在一些实施方案中，第一和第二抗原结合域彼此融合，任选地通过肽接头。
在一些实施方案中，第一和第二抗原结合域各自是Fab分子，并且(i)第二抗原结合域在Fab重链的C端与第一抗原结合域的Fab重链的N端融合，或(ii)第一抗原结合域在Fab重链的C端与第二抗原结合域的Fab重链的N端融合。
在一些实施方案中，双特异性抗体提供与CD3的单价结合。
在具体的实施方案中，双特异性抗体包含特异性结合CD3的单一抗原结合域和两个特异性结合糖-MUC1的抗原结合域。因此，在一些实施方案中，双特异性抗体包含特异性结合糖-MUC1的第三抗原结合域。在一些实施方案中，第三抗原部分与第一抗原结合域相同(例如也是Fab分子并且包含相同的氨基酸序列)。
在具体的实施方案中，双特异性抗体进一步包含由第一和第二亚基构成的Fc域。在一个实施方案中，Fc域是IgG Fc域。在具体的实施方案中，Fc域是IgG1 Fc域。在另一个实施方案中，Fc域是IgG4 Fc域。在一个更具体的实施方案中，Fc域是IgG4 Fc域，其在S228位(Kabat EU索引编号)处包含氨基酸取代，特别是氨基酸取代S228P。在另一个具体的实施方案中，Fc域是人Fc域。在甚至更具体的实施方案中，Fc域是人IgG1 Fc域。在SEQ ID NO:42中给出人IgG1 Fc区的示例性序列。
在一些实施方案中，其中第一、第二和第三抗原结合域各自是Fab分子，(a)(i)第二抗原结合域在Fab重链的C端与第一抗原结合域的Fab重链的N端融合，并且第一抗原结合域在Fab重链的C端与Fc域的第一亚基的N端融合，或(ii)第一抗原结合域在Fab重链的C端与第二抗原结合域的Fab重链的N端融合，并且第二抗原结合域在Fab重链的C端与Fc域的第一亚基的N端融合；并且(b)在存在的情况下，第三抗原结合域在Fab重链的C端与Fc域的第二亚基的N端融合。
在具体的实施方案中，Fc域包含促进Fc域的第一和第二亚基缔合的修饰，例如，如5.1节所述。
在一些实施方案中，Fc域包含一个或多个减少与Fc受体的结合和/或效应器功能的氨基酸取代，例如如5.1节所述。
在具体的实施方案中，双特异性抗体包括
(i)特异性结合CD3的第一抗原结合域，其中第一抗原结合域是交换Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变区或恒定区，特别是可变区是交换的；
(ii)特异性结合糖-MUC1的第二和第三抗原结合域，其包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:5的重链CDR-H1，SEQ ID NO:6的CDR-H2和SEQ ID NO:7的CDR-H3；该轻链可变区包含SEQ ID NO:8的轻链CDR-L1，SEQ ID NO:9的CDR-L2和SEQ IDNO:10的CDR-L3，其中第二和第三抗原结合域各自是Fab分子，特别是常规Fab分子；
(iii)由能够稳定缔合的第一和第二亚基构成的Fc域，
其中第二抗原结合域在Fab重链的C端与第一抗原结合域的Fab重链的N端融合，并且第一抗原结合域在Fab重链的C端与Fc域的第一亚基的N端融合，且其中第三抗原结合域在Fab重链的C端与Fc域的第二亚基的N端融合。
在一个实施方案中，第一抗原结合域包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:34的重链CDR-H1，SEQ ID NO:35的CDR-H2和SEQ ID NO:36的CDR-H3；该轻链可变区包含SEQ ID NO:37的轻链CDR-L1，SEQ ID NO:38的CDR-L2和SEQ ID NO:39的CDR-L3。
在一个实施方案中，第一抗原结合域包含与SEQ ID NO:40的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的重链可变区序列和与SEQ ID NO:41的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的轻链可变区序列。
在一个实施方案中，第一抗原结合域包含SEQ ID NO:40的重链可变区序列和SEQID NO:41的轻链可变区序列。
在一个实施方案中，第二和第三抗原结合域包含与SEQ ID NO:3的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的重链可变区序列和与SEQ ID NO:4的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的轻链可变区序列。优选地，抗原结合域包含CDR，其包含编号实施方案3至17中列出的任何CDR组合的氨基酸序列。在一个实施方案中，第二和第三抗原结合域包含SEQ ID NO:3的重链可变区和SEQ ID NO:4的轻链可变区。
根据以上实施方案的Fc域可以单一或组合掺入上文关于Fc域描述的所有特征。
在一些实施方案中，抗原结合域和Fc区通过肽接头，例如通过如SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46中的肽接头彼此融合。
在一个实施方案中，在(ii)下的第二和第三Fab分子的恒定域CL中，124位的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)并且123位的氨基酸取代被赖氨酸(K)或精氨酸(R)取代，特别是被精氨酸(R)取代(根据Kabat编号)，并且在(ii)下第二和第三Fab分子的恒定域CH1中，147位的氨基酸氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat EU索引编号)，并且213位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat EU索引编号)。
在一个实施方案中，双特异性抗体包括含有与SEQ ID NO:43的序列至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同(并且优选包括含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR-L1，包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR-L3)的序列的多肽，包含与SEQ ID NO:44的序列至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同(并且优选包含表4中所列的CD3重链和轻链CDR序列)的序列的多肽，包含与SEQ ID NO:45的序列至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同(并且优选包括含有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的CDR-H1，包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR-H3)的序列的多肽，包含与SEQ ID NO:46的序列至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同(并且优选包括含有SEQ IDNO:33的氨基酸序列的CDR-H1，包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR-H2，包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR-H3，包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的CDR-L1，包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的CDR-L3)的序列的多肽。
在一个实施方案中，双特异性抗体包括含有SEQ ID NO:43的序列的多肽(特别是两个多肽)，包含SEQ ID NO:44的序列的多肽，包含SEQ ID NO:45的序列的多肽，和包含SEQID NO:46的序列的多肽。
5.3抗体-药物缀合物
本公开内容的另一方面涉及抗体药物缀合物(ADC)，其包括本公开内容的抗糖-MUC1抗体和抗原结合片段。ADC通常包含如本文所述的抗糖-MUC1抗体和/或结合片段，依靠一个或多个接头与其连接一种或多种细胞毒剂和/或细胞抑制剂。在具体的实施方案中，ADC是根据结构式(I)的化合物：
[D-L-XY]n-Ab
或其盐，其中每个“D”彼此独立代表细胞毒剂和/或细胞抑制剂(“药物”)；每个“L”彼此独立代表接头；“Ab”代表抗糖-MUC1抗原结合域，例如本文所述的抗糖-MUC1抗体或结合片段；每个“XY”代表在接头上的官能团Rx与抗体上的“互补”官能团Ry之间形成的连接，并且n代表与ADC连接的药物数目或ADC的药物与抗体比率(DAR)。
可以包含ADC的各种抗体(Ab)的具体实施方案包括上述抗糖-MUC1抗体和/或结合片段的各种实施方案。
在结构式(I)的ADC和/或盐的一些具体实施方案中，每个D是相同的和/或每个L是相同的。
以下将更详细地描述可以构成本公开内容的抗糖-MUC1 ADC的细胞毒剂和/或细胞抑制剂(D)和接头(L)的具体实施方案，以及与ADC连接的细胞毒剂和/或细胞抑制剂的数目。
5.3.1.细胞毒剂和/或细胞抑制剂
细胞毒剂和/或细胞生长抑制剂可以是已知抑制细胞，且特别是癌细胞和/或肿瘤细胞的生长和/或复制和/或杀死细胞，且特别是癌细胞和/或肿瘤细胞的任何试剂。具有细胞毒性和/或细胞抑制性特性的许多试剂在文献中是已知的。各类细胞毒剂和/或细胞抑制剂的非限制性实例包括例如但不限于，放射性核素、烷基化剂、拓扑异构酶I抑制剂、拓扑异构酶II抑制剂、DNA嵌入剂(例如，沟结合剂，例如小沟结合剂)、RNA/DNA抗代谢物、细胞周期调节剂、激酶抑制剂、蛋白质合成抑制剂、组蛋白脱乙酰基酶抑制剂、线粒体抑制剂和抗有丝分裂剂。
以下提供了这些各种类别的某些类别内的试剂的具体非限制性实例。
烷化剂：asaley((L-亮氨酸，N-[N-乙酰基-4-[二-(2-氯乙基)氨基]-DL-苯丙氨酰基]-，乙酯；NSC 167780；CAS登记号3577897))；AZQ((1,4-环己二烯-1,4-二氨基甲酸，2,5-二(1-氮丙啶基)-3,6-二氧-，二乙酯；NSC 182986；CAS登记号57998682))；BCNU((N,N'-二(2-氯乙基)-N-亚硝基脲；NSC 409962；CAS登记号154938))；白消安(1,4-丁二醇二甲烷磺酸盐；NSC 750；CAS登记号55981)；(羧基邻苯二甲酸(carboxyphthalato))铂(NSC 27164；CAS登记号65296813)；CBDCA((顺-(1,1-环丁烷二羧酸)二氨铂(II))；NSC 241240；CAS登记号41575944))；CCNU((N-(2-氯乙基)-N'-环己基-N-亚硝基脲；NSC 79037；CAS登记号13010474))；CHIP(异丙铂；NSC 256927)；苯丁酸氮芥(NSC 3088；CAS登记号305033)；氯脲菌素((2-[[[(2-氯乙基)亚硝基氨基]羰基]氨基]-2-脱氧-D-吡喃葡萄糖；NSC 178248；CAS登记号54749905))；顺铂(顺铂；NSC 119875；CAS登记号15663271)；氯乙矾(NSC 338947；CAS登记号88343720)；氰基吗啉代多柔比星(NCS 357704；CAS登记号88254073)；cyclodisone(NSC 348948；CAS登记号99591738)；去水卫矛醇(dianhydrogalactitol)(5,6-双环氧卫茅醇；NSC 132313；CAS登记号23261203)；氟多潘(fluorodopan)((5-[(2-氯乙基)-(2-氟乙基)氨基]-6-甲基-尿嘧啶；NSC 73754；CAS登记号834913)；赫舒反(hepsulfam)(NSC 329680；CAS登记号96892578)；海恩酮(NSC 142982；CAS登记号23255938)；美法仑(NSC 8806；CAS登记号3223072)；甲基CCNU((1-(2-氯乙基)-3-(反-4-甲基环己烷)-1-亚硝基脲；NSC 95441；13909096)；丝裂霉素C(NSC 26980；CAS登记号50077)；米托唑酰胺(mitozolamide)(NSC 353451；CAS登记号85622953)；氮芥(盐酸(二(2-氯乙基)甲胺；NSC 762；CAS登记号55867)；PCNU((1-(2-氯乙基)-3-(2,6-二氧-3-哌啶基)-1-亚硝基脲；NSC 95466；CAS登记号13909029))；哌嗪烷化剂(二盐酸(1-(2-氯乙基)-4-(3-氯丙基)-哌嗪；NSC 344007))；哌嗪双酮(NSC 135758；CAS登记号41109802)；哌泊溴烷((N,N-二(3-溴丙酰基)哌嗪；NSC 25154；CAS登记号54911))；泊非霉素(N-甲基丝裂霉素C；NSC56410；CAS登记号801525)；螺乙内酰脲芥(spirohydantoin mustard)(NSC 172112；CAS登记号56605164)；替罗昔隆(三缩水甘油基异氰尿酸盐(triglycidylisocyanurate)；NSC296934；CAS登记号2451629)；四铂(NSC 363812；CAS登记号62816982)；塞替派(N,N',N”-三-1,2-联二甲基硫代磷酰胺；NSC 6396；CAS登记号52244)；曲他胺(triethylenemelamine)(NSC 9706；CAS登记号51183)；尿嘧啶氮芥(尿嘧啶芥(desmethyldopan)；NSC 34462；CAS登记号66751)；Yoshi-864(盐酸(二(3-甲磺酰氧基丙基)胺；NSC 102627；CAS登记号3458228)。
拓扑异构酶I抑制剂：喜树碱(NSC 94600；CAS登记号7689-03-4)；各种喜树碱衍生物和类似物(例如NSC 100880,NSC 603071,NSC 107124,NSC 643833,NSC 629971,NSC295500,NSC 249910,NSC 606985,NSC 74028,NSC 176323,NSC 295501,NSC 606172,NSC606173,NSC 610458,NSC 618939,NSC 610457,NSC 610459,NSC 606499,NSC 610456,NSC364830,和NSC 606497)；吗啉异氧柔比星(morpholinisoxorubicin)(NSC 354646；CAS登记号89196043)；SN-38(NSC 673596；CAS登记号86639-52-3)。
拓扑异构酶II抑制剂：多柔比星(NSC 123127；CAS登记号25316409)；氨萘非特(苯异喹啉二酮(benzisoquinolinedione)；NSC 308847；CAS登记号69408817)；m-AMSA((4'-(9-吖啶基氨基)-3'-甲氧基甲磺酸苯胺；NSC 249992；CAS登记号51264143))；蒽吡唑衍生物((NSC 355644)；依托泊苷(VP-16；NSC 141540；CAS登记号33419420)；吡唑啉吖啶((吡唑[3,4,5-kl]吖啶-2(6H)-丙胺,9-甲氧基-N,N-二甲基-5-硝基-，单甲磺酸盐；NSC 366140；CAS登记号99009219)；盐酸比生群(NSC 337766；CAS登记号71439684)；柔红霉素(NSC821151；CAS登记号23541506)；脱氧多柔比星(NSC 267469；CAS登记号63950061)；米托蒽醌(NSC 301739；CAS登记号70476823)；美诺立尔(NSC 269148；CAS登记号71628961)；N,N-二苯基道诺霉素(NSC 268242；CAS登记号70878512)；恶烷噻唑(oxanthrazole)(NSC 349174；CAS登记号105118125)；柔红霉素苯腙(rubidazone)(NSC 164011；CAS登记号36508711)；替尼泊苷(VM-26；NSC 122819；CAS登记号29767202)。
DNA插入剂：氨茴霉素(CAS登记号4803274)；契卡霉素(chicamycin)A(CAS登记号89675376)；托马霉素(tomaymycin)(CAS登记号35050556)；DC-81(CAS登记号81307246)；矛霉素(sibiromycin)(CAS登记号12684332)；吡咯苯二氮杂卓(pyrrolobenzodiazepine)衍生物(CAS登记号945490095)；SGD-1882((S)-2-(4-氨基苯基)-7-甲氧基-8-(3-4(S)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)--5-氧-5,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯[1,2-a][1,4]二氮杂卓-8-基)氧基)丙氧基)-1H-苯并[e]吡咯[1,2-a][1,4]二氮杂卓-5(11aH)-酮)；SG2000(SJG-136；(11aS,11a'S)-8,8'-(丙烷-1,3-二基二(氧基))二(7-甲氧基-2-亚甲基-2,3--二氢-1H-苯并[e]吡咯[1,2-a][1,4]二氮杂卓-5(11aH)-酮)；NSC 694501；CAS登记号232931576)。
RNA/DNA抗代谢物：L-阿拉诺新(NSC 153353；CAS登记号59163416)；5-氮胞苷(NSC102816；CAS登记号320672)；5-氟尿嘧啶(NSC 19893；CAS登记号51218)；阿西维辛(NSC163501；CAS登记号42228922)；氨基蝶呤衍生物N-[2-氯-5-[[(2,4-二氨基-5-甲基-6-喹唑啉基)甲基]氨基]苯甲酰基-]L-门冬氨酸(NSC 132483)；氨基蝶呤衍生物N-[4-[[(2,4-二氨基-5-乙基-6-喹唑啉基)甲基]氨基]苯甲酰基]L-门冬氨酸(NSC 184692)；氨基蝶呤衍生物一水合N-[2-氯-4-[[(2,4-二氨基-6-蝶啶基)甲基]氨基]苯甲酰基]L-天冬氨酸(NSC134033)；抗叶酸剂((Nα-(4-氨基-4-脱氧蝶酰基)-N7-半邻苯二甲酰-L-鸟氨酸；NSC623017))；Baker可溶性抗叶酸剂(NSC 139105；CAS登记号41191042)；二氯烯丙基指甲花醌(lawsone)((2-(3,3-二氯烯丙基)-3-羟基-1,4-萘醌；NSC 126771；CAS登记号36417160)；布喹那(NSC 368390；CAS登记号96201886)；替加氟((前药；5-氟-1-(四氢-2-呋喃基)-尿嘧啶；NSC 148958；CAS登记号37076689)；5,6-二氢-5-氮胞苷(NSC 264880；CAS登记号62402317)；甲氨蝶呤(NSC 740；CAS登记号59052)；甲氨蝶呤衍生物(N-[[4-[[(2,4-二氨基-6-蝶啶基)甲基]甲基氨基]-1-萘基]羰基]L-谷氨酸；NSC 174121)；PALA ((N-(膦酰基乙酰基)-L-天冬氨酸；NSC 224131；CAS登记号603425565)；吡唑霉素(NSC 143095；CAS登记号30868305)；三甲曲沙(NSC 352122；CAS登记号82952645)。
DNA抗代谢物：3-HP(NSC 95678；CAS登记号3814797)；2'-脱氧-5-氟尿苷(NSC27640；CAS登记号50919)；5-HP(NSC 107392；CAS登记号19494894)；α-TGDR(α-2'-脱氧-6-硫鸟苷；NSC 71851CAS登记号2133815)；阿非科林甘氨酸盐(aphidicolin glycinate)(NSC303812；CAS登记号92802822)；ara C(胞嘧啶阿糖胞苷；NSC 63878；CAS登记号69749)；5-氮杂-2'-脱氧胞苷(NSC 127716；CAS登记号2353335)；β-TGDR(β-2'-脱氧-6-硫鸟苷；NSC71261；CAS登记号789617)；环胞苷(NSC 145668；CAS登记号10212256)；胍那唑(NSC 1895；CAS登记号1455772)；羟基脲(NSC 32065；CAS登记号127071)；肌苷二醛(inosineglycodialdehyde)(NSC 118994；CAS登记号23590990)；麦克菌素(macbecin)II(NSC330500；CAS登记号73341738)；吡唑咪唑(pyrazoloimidazole)(NSC 51143；CAS登记号6714290)；硫鸟嘌呤(thioguanine)(NSC 752；CAS登记号154427)；巯嘌呤(NSC 755；CAS登记号50442)。
细胞周期调控剂：水飞蓟宾(silibinin)(CAS登记号22888-70-6)；表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate)(EGCG；CAS登记号989515)；原花青素(procyanidin)衍生物(例如原花青素A1[CAS登记号103883030],原花青素B1[CAS登记号20315257],原花青素B4[CAS登记号29106512],arecatannin B1[CAS登记号79763283])；异黄酮(例如染料木黄酮[4％5,7-三羟基异黄酮；CAS登记号446720]，黄豆苷元[4',7-二羟基异黄酮,CAS登记号486668]；吲哚-3-甲醇(CAS登记号700061)；槲皮素(NSC 9219；CAS登记号117395)；雌莫司汀(NSC 89201；CAS登记号2998574)；诺考达唑(CAS登记号31430189)；鬼臼毒素(CAS登记号518285)；酒石酸长春瑞滨(NSC 608210；CAS登记号125317397)；念珠藻素(cryptophycin)(NSC 667642；CAS登记号124689652)。
激酶抑制剂：阿法替尼(afatinib)(CAS登记号850140726)；阿西替尼(axitinib)(CAS登记号319460850)；ARRY-438162(binimetinib)(CAS登记号606143899)；博苏替尼(bosutinib)(CAS登记号380843754)；卡博替尼(cabozantinib)(CAS登记号1140909483)；色瑞替尼(ceritinib)(CAS登记号1032900256)；克唑替尼(crizotinib)(CAS登记号877399525)；达帕菲尼(dabrafenib)(CAS登记号1195765457)；达沙替尼(dasatinib)(NSC732517；CAS登记号302962498)；厄洛替尼(erlotinib)(NSC 718781；CAS登记号183319699)；依维莫司(everolimus)(NSC 733504；CAS登记号159351696)；福坦替尼(fostamatinib)(NSC 745942；CAS登记号901119355)；吉非替尼(NSC 715055；CAS登记号184475352)；依鲁替尼(ibrutinib)(CAS登记号936563961)；伊马替尼(NSC 716051；CAS登记号220127571)；拉帕替尼(lapatinib)(CAS登记号388082788)；仑伐替尼(lenvatinib)(CAS登记号857890392)；木利替尼(mubritinib)(CAS 366017096)；尼洛替尼(nilotinib)(CAS登记号923288953)；尼达尼布(nintedanib)(CAS登记号656247175)；帕博西尼(palbociclib)(CAS登记号571190302)；帕唑帕尼(pazopanib)(NSC 737754；CAS登记号635702646)；培加尼布(pegaptanib)(CAS登记号222716861)；普纳替尼(Ponatinib)(CAS登记号1114544318)；雷帕霉素(NSC 226080；CAS登记号53123889)；瑞格菲尼(regorafenib)(CAS登记号755037037)；AP 23573(地磷莫司(ridaforolimus))(CAS登记号572924540)；INCB018424(芦可替尼(ruxolitinib))(CAS登记号1092939177)；ARRY-142886(司美替尼(selumetinib))(NSC 741078；CAS登记号606143-52-6)；西罗莫司(NSC 226080；CAS登记号53123889)；索拉非尼(NSC 724772；CAS登记号475207591)；舒尼替尼(sunitinib)(NSC736511；CAS登记号341031547)；托法替尼(tofacitinib)(CAS登记号477600752)；西罗莫司(temsirolimus)(NSC 683864；CAS登记号163635043)；曲美替尼(trametinib)(CAS登记号871700173)；凡德他尼(vandetanib)(CAS登记号443913733)；威罗菲尼(vemurafenib)(CAS登记号918504651)；SU6656(CAS登记号330161870)；CEP-701(来他替尼(lesaurtinib))(CAS登记号111358884)；XL019(CAS登记号945755566)；PD-325901(CAS登记号391210109)；PD-98059(CAS登记号167869218)；ATP-竞争性TORC1/TORC2抑制剂，包括PI-103(CAS登记号371935749),PP242(CAS登记号1092351671),PP30(CAS登记号1092788094),Torin 1(CAS登记号1222998368),LY294002(CAS登记号154447366),XL-147(CAS登记号934526893),CAL-120(CAS登记号870281348),ETP-45658(CAS登记号1198357797),PX 866(CAS登记号502632668),GDC-0941(CAS登记号957054307),BGT226(CAS登记号1245537681),BEZ235(CAS登记号915019657),XL-765(CAS登记号934493762)。
蛋白质合成抑制剂：吖啶黄素(acriflavine)(CAS登记号65589700)；阿米卡星(amikacin)(NSC 177001；CAS登记号39831555)；阿贝卡星(arbekacin)(CAS登记号51025855)；阿司米星(astromicin)(CAS登记号55779061)；阿奇霉素(azithromycin)(NSC643732；CAS登记号83905015)；卡那霉素B(bekanamycin)(CAS登记号4696768)；金霉素(NSC13252；CAS登记号64722)；克拉霉素(NSC 643733；CAS登记号81103119)；克林霉素(CAS登记号18323449)；氯莫环素(CAS登记号1181540)；放线菌酮(cycloheximide)(CAS登记号66819)；放线菌素D(dactinomycin)(NSC 3053；CAS登记号50760)；达福普汀(CAS登记号112362502)；地美环素(CAS登记号127333)；地贝卡星(CAS登记号34493986)；双氢链霉素(CAS登记号128461)；地红霉素(CAS登记号62013041)；多西环素(CAS登记号17086281)；依米丁(NSC 33669；CAS登记号483181)；红霉素(NSC 55929；CAS登记号114078)；氟红霉素(CAS登记号83664208)；弗氏菌丝素(framycetin)(新霉素B；CAS登记号119040)；庆大霉素(NSC 82261；CAS登记号1403663)；甘氨酰环素(glycylcyclines)，诸如替吉环素(tigecycline)(CAS登记号220620097)；潮霉素B(CAS登记号31282049)；异帕米星(CAS登记号67814760)；交沙霉素(NSC 122223；CAS登记号16846245)；卡那霉素(CAS登记号8063078)；酮内酯诸如泰利霉素(CAS登记号191114484)、喹红霉素(cethromycin)(CAS登记号205110481)和索利霉素(solithromycin)(CAS登记号760981837)；林可霉素(lincomycin)(CAS登记号154212)；赖甲环素(CAS登记号992212)；甲氯环素(NSC 78502；CAS登记号2013583)；美他环素(美他环素；NSC 356463；CAS登记号914001)；麦迪霉素(CAS登记号35457808)；米诺环素(NSC 141993；CAS登记号10118908)；米卡霉素(CAS登记号55881077)；新霉素(CAS登记号119040)；奈替米星(CAS登记号56391561)；竹桃霉素(CAS登记号3922905)；恶唑烷酮类，诸如依哌唑胺(eperezolid)(CAS登记号165800044)、利奈唑胺(linezolid)(CAS登记号165800033)、泼斯唑来(posizolid)(CAS登记号252260029)、雷得唑来(radezolid)(CAS登记号869884786)、ranbezolid(CAS登记号392659380)、sutezolid(CAS登记号168828588)、特地唑胺(tedizolid)(CAS登记号856867555)；土霉素(NSC 9169；CAS登记号2058460)；巴龙霉素(CAS登记号7542372)；青哌环素(CAS登记号4599604)；肽基转移酶抑制剂，例如氯霉素(NSC 3069；CAS登记号56757)和衍生物诸如叠氮氯霉素(CAS登记号13838089)、氟苯尼考(CAS登记号73231342)和甲砜霉素(CAS登记号15318453)和截短侧耳素(pleuromutilins)诸如瑞他帕林(retapamulin)(CAS登记号224452668)、硫姆林(tiamulin)(CAS登记号55297955)、伐奈莫林(CAS登记号101312929)；吡利霉素(CAS登记号79548735)；嘌呤霉素(NSC 3055；CAS登记号53792)；奎奴普丁(CAS登记号120138503)；核糖霉素(CAS登记号53797356)；罗他霉素(CAS登记号74014510)；罗利环素(CAS登记号751973)；罗红霉素(CAS登记号80214831)；西索米星(CAS登记号32385118)；大观霉素(CAS登记号1695778)；螺旋霉素(CAS登记号8025818)；链阳菌素类诸如普那霉素(CAS登记号270076603)、奎奴普丁/达福普汀(CAS登记号126602899)和维吉霉素(CAS登记号11006761)；链霉素(CAS登记号57921)；四环素(NSC 108579；CAS登记号60548)；妥布霉素(CAS登记号32986564)；醋竹桃霉素(CAS登记号2751099)；泰洛星(CAS登记号1401690)；甲基姿苏霉素(verdamicin)(CAS登记号49863481)。
组蛋白脱乙酰酶抑制剂：艾贝司他(abexinostat)(CAS登记号783355602)；贝利司他(belinostat)(NSC 726630；CAS登记号414864009)；西达本胺(chidamide)(CAS登记号743420022)；恩替诺特(entinostat)(CAS登记号209783802)；吉维司他(givinostat)(CAS登记号732302997)；莫塞替诺特(mocetinostat)(CAS登记号726169739)；帕比司他(panobinostat)(CAS登记号404950807)；quisinostat(CAS登记号875320299)；resminostat(CAS登记号864814880)；罗米地辛(romidepsin)(CAS登记号128517077)；莱菔硫烷(sulforaphane)(CAS登记号4478937)；硫尿基丁腈(thioureidobutyronitrile)(KevetrinTM；CAS登记号6659890)；丙戊酸(NSC 93819；CAS登记号99661)；伏立诺他(vorinostat)(NSC 701852；CAS登记号149647789)；ACY-1215(rocilinostat；CAS登记号1316214524)；CUDC-101(CAS登记号1012054599)；CHR-2845(tefinostat；CAS登记号914382608)；CHR-3996(CAS登记号1235859138)；4SC-202(CAS登记号910462430)；CG200745(CAS登记号936221339)；SB939(pracinostat；CAS登记号929016966)。
线粒体抑制剂：水鬼蕉碱(pancratistatin)(NSC 349156；CAS登记号96281311)；罗丹明-123(CAS登记号63669709)；依地福新(NSC 324368；CAS登记号70641519)；d-alpha-生育酚丁二酸酯(NSC 173849；CAS登记号4345033)；化合物11β(CAS登记号865070377)；阿司匹林(NSC 406186；CAS登记号50782)；艾力替新(ellipticine)(CAS登记号519233)；小檗碱(CAS登记号633658)；变蓝菌素(CAS登记号17397896)；GX015-070(
Figure BDA0002543006580000391
1H-吲哚,2-(2-((3,5-二甲基-1H-吡咯-2-基)亚甲基)-3-甲氧基-2H-吡咯-5-基)-；NSC 729280；CAS登记号803712676)；南蛇藤醇(celastrol)(雷公藤红素(tripterine)；CAS登记号34157830)；二甲双胍(NSC 91485；CAS登记号1115704)；亮绿(NSC 5011；CAS登记号633034)；ME-344(CAS登记号1374524556)。
抗有丝分裂剂：别秋水仙碱(allocolchicine)(NSC 406042)；澳瑞他汀(auristatin)，诸如MMAE(单甲基澳瑞他汀E；CAS登记号474645-27-7)和MMAF(单甲基澳瑞他汀F；CAS登记号745017-94-1；软海绵素(halichondrin)B(NSC 609395)；秋水仙素(NSC757；CAS登记号64868)；秋水仙素衍生物(N-苯甲酰基-脱乙酰基苯甲酰胺；NSC 33410；CAS登记号63989753)；多拉司他汀(dolastatin)10(NSC 376128；CAS登记号110417-88-4)；美坦辛(NSC 153858；CAS登记号35846-53-8)；rhozoxin(NSC 332598；CAS登记号90996546)；泰素(taxol)(NSC 125973；CAS登记号33069624)；泰素衍生物((2'-N-[3-(二甲基氨基)丙基]谷氨酸(glutaramate)泰素；NSC 608832)；硫代秋水仙碱(3-脱甲基硫代秋水仙碱；NSC361792)；三苯甲基半胱氨酸(NSC 49842；CAS登记号2799077)；硫酸长春碱(NSC 49842；CAS登记号143679)；硫酸长春新碱(NSC 67574；CAS登记号2068782)。
可以在本文公开的ADC中包含这些试剂中的任何一种，其包含对抗体的附着位点或可以被修饰为包含对抗体的附着位点。
在一个具体的实施方案中，细胞毒剂和/或细胞抑制剂是抗有丝分裂剂。
在另一个具体的实施方案中，细胞毒剂和/或细胞抑制剂是澳瑞他汀，例如单甲基澳瑞他汀E(“MMAE”)或单甲基澳瑞他汀F(“MMAF”)。
5.3.2.接头
在本公开内容的抗糖-MUC1 ADC中，细胞毒剂和/或细胞抑制剂通过接头与抗体连接。将细胞毒剂和/或细胞抑制剂与ADC的抗体连接的接头可以是短的、长的、疏水的、亲水的、柔性的或刚性的，或者可以由区段组成，该区段各自独立地具有一种或多种上述特性，使得接头可以包含具有不同特性的区段。接头可以是多价的，使得它们将超过一种试剂与抗体上的单个位点共价连接，或者是单价的，使得它们将单一试剂与抗体上的单个位点共价连接。
如熟练技术人员将理解，接头通过形成一个位置处与细胞毒剂和/或细胞抑制剂的共价连接和另一处与抗体的共价连接将细胞毒剂和/或细胞抑制剂与抗体连接。共价连接通过接头上的官能团与试剂和抗体上的官能团之间的反应形成。如本文所用，表述“接头”意图包括(i)接头的非缀合形式，其包含能够共价连接接头与细胞毒剂和/或细胞抑制剂的官能团和能够共价连接接头与抗体的官能团；(ii)接头的部分缀合形式，该接头包含能够共价连接接头与抗体并且与细胞毒剂和/或细胞抑制剂共价连接的官能团或反之亦然；(iii)与细胞毒剂和/或细胞抑制剂和抗体两者共价连接的接头的完全缀合形式。在本公开内容的接头和抗糖-MUC1 ADC的一些具体的实施方案，以及用于使接头-试剂与抗体缀合的合成子中，包含接头上的官能团的部分以及在接头和抗体之间形成的共价连接具体显示为Rx和XY。
接头优选但不需要对细胞外部的条件是化学稳定的，并且可以设计成在细胞内部切割、毁灭和/或以其它方式特异性降解。或者，可以使用未设计成在细胞内部特异性切割或降解的接头。稳定接头对不稳定接头的选择可以取决于细胞毒剂和/或细胞抑制剂的毒性。对于对正常细胞有毒性的试剂，优选稳定的接头。可以利用选择性或靶向性并对正常细胞具有较低毒性的试剂，接头与胞外环境的化学稳定性不太重要。在ADC的背景下可用于将药物与抗体连接的极其多种接头是本领域已知的。这些接头以及其他接头中的任一种可用于将细胞毒剂和/或细胞抑制剂与本公开内容的抗糖-MUC1 ADC的抗体连接。
例如，在WO 2009/073445；WO 2010/068795；WO 2010/138719；WO 2011/120053；WO2011/171020；WO 2013/096901；WO 2014/008375；WO 2014/093379；WO 2014/093394；WO2014/093640(其内容通过引用整体并入本文)中描述了可以用于将许多细胞毒剂和/或细胞抑制剂与单一抗体分子连接的示例性多价接头。例如，Mersana等人开发的Fleximer接头技术具有实现具有高物理化学特性的高DAR ADC的潜力。如下所示，Mersana技术基于通过一系列酯键将药物分子掺入可溶的聚缩醛骨架中。该方法在维持良好的物理化学特性的情况下提供高负载的ADC(DAR多达20)。
树枝状类型接头的其他实例可以参见US 2006/116422；US 2005/271615；deGroot等人(2003)Angew.Chem.Int.Ed.42:4490-4494；Amir等人(2003)Angew.Chem.Int.Ed.42:4494-4499；Shamis等人(2004)J.Am.Chem.Soc.126:1726-1731；Sun等人(2002)Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215；Sun等人(2003)Bioorganic&Medicinal Chemistry 11:1761-1768；King等人(2002)TetrahedronLetters 43:1987-1990，每篇通过引用并入本文。
可以使用的示例性单价接头记载于例如Nolting,2013,Antibody-DrugConjugates,Methods in Molecular Biology 1045:71-100；Kitson等人,2013,CROs/CMOs--Chemica Oggi--Chemistry Today 31(4):30-38；Ducry等人,2010,BioconjugateChem.21:5-13；Zhao等人,2011,J.Med.Chem.54:3606-3623；美国专利号7,223,837；美国专利号8,568,728；美国专利号8,535,678；和WO2004010957，每篇通过引用并入本文。
作为示例而非限制，以下描述了可包含在本公开内容的抗糖-MUC1 ADC中的一些可切割和不可切割的接头。
5.3.3.可切割的接头
在某些实施方案中，接头在体内是可切割的。可切割的接头可以包含化学地或酶促地不稳定或可降解的键。可切割的接头通常依赖于细胞内的过程(例如细胞质的减少、溶酶体中的酸性条件的暴露、或被细胞内特定蛋白酶或其他酶切割)来释放药物。可切割的接头通常包含一个或多个可化学切割或可酶促切割的化学键，而接头的其余部分是不可切割的。在某些实施方案中，接头包含化学不稳定基团，例如腙和/或二硫化物基团。包含化学不稳定基团的接头利用血浆和一些细胞质区室之间的差异性质。促进含腙接头的药物释放的细胞内条件是内体和溶酶体的酸性环境，而含有二硫化物的接头在含有高硫醇浓度(例如谷胱甘肽)的细胞溶质中被还原。在某些实施方案中，可以通过使用化学不稳定基团附近的取代基引入位阻来增加包含化学不稳定基团的接头的血浆稳定性。
酸性不稳定基团(如腙)在血液中性pH环境(pH 7.3-7.5)中在体循环期间保持完整，并在一旦ADC内化进细胞的轻度酸性内体(pH 5.0-6.5)区室和溶酶体(pH 4.5-5.0)区室之后进行水解并释放药物。这种pH依赖性释放机制与药物的非特异性释放有关。为了增加接头的腙基团的稳定性，可以通过化学修饰(例如取代)改变接头，所述化学修饰允许调节以在溶酶体中实现更有效的释放，同时使循环中的损失最小化。
含腙接头可含有其他切割位点，例如另外的酸不稳定切割位点和/或酶促不稳定切割位点。包含示例性含腙接头的ADC包含以下结构：
Figure BDA0002543006580000431
其中D和Ab分别表示细胞毒性剂和/或细胞生长抑制剂(药物)和抗体，并且n表示与抗体连接的药物-接头的数量。在某些接头如接头(Ig)中，接头包含两个可切割的基团-二硫键和腙部分。对于这类接头，未修饰的游离药物的有效释放需要酸性pH或二硫化物还原和酸性pH。接头如(Ih)和(Ii)已经显示出对单个腙切割位点有效。
在ADC内化到酸性细胞区室中时，在全身循环过程中保持完整并进行水解并释放药物的其他接头包括碳酸酯基。当细胞毒性剂和/或细胞生长抑制剂可以通过氧共价连接时，这样的接头可能是有用的。
可以包含在接头中的其他酸不稳定基团包括含有顺式-乌头酰基(aconityl)的接头。顺式-乌头酰基化学使用与酰胺键并置的羧酸以加速酰胺在酸性条件下的水解。
可切割的接头还可包含二硫化物基团。二硫化物在生理pH下是热力学稳定的，并且被设计成在细胞内部内化时释放药物，其中细胞溶质与细胞外环境相比提供明显更具还原性的环境。二硫键的断裂通常需要存在细胞质硫醇辅因子，例如(还原的)谷胱甘肽(GSH)，使得含二硫化物的接头在循环中相当稳定，选择性地释放细胞溶质中的药物。胞内酶蛋白质二硫化物异构酶或能够切割二硫键的类似酶也可能有助于优先切割细胞内的二硫键。据报道，GSH以0.5-10mM的浓度范围存在于细胞中，而循环中的GSH或半胱氨酸(最丰富的低分子量硫醇)的浓度显著低于大约5μM。肿瘤细胞(其中不规则的血流导致缺氧状态)导致还原酶的活性增强，因此导致甚至更高的谷胱甘肽浓度。在某些实施方案中，含二硫化物的接头的体内稳定性可以通过对接头进行化学修饰(例如使用与二硫键相邻的位阻)来增强。
包含示例性含二硫化物接头的ADC包含以下结构：
Figure BDA0002543006580000441
其中D和Ab分别表示药物和抗体，n表示与抗体连接的药物-接头的数量，并且R在每次出现时例如独立地选自氢或烷基。在某些实施方案中，增加与二硫键相邻的位阻增加了接头的稳定性。当一个或多个R基团选自低级烷基如甲基时，结构如(Ij)和(Il)显示出增加的体内稳定性。
可以使用的另一种类型的可切割的接头是被酶特异性切割的接头。此类接头通常是基于肽的或包含充当酶的底物的肽区。基于肽的接头在血浆和细胞外环境中比化学不稳定接头倾向于更稳定。肽键通常具有良好的血清稳定性，因为溶酶体蛋白水解酶由于内源性抑制剂而具有非常低的血液活性，并且具有与溶酶体相比不利地较高血液pH值。具体地由于溶酶体蛋白酶(例如组织蛋白酶和纤溶酶)的作用而发生从抗体释放药物。这些蛋白酶能以升高的水平存在于某些肿瘤细胞中。
在示例性实施方案中，可切割的肽选自四肽如Gly-Phe-Leu-Gly(SEQ ID NO:128)、Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO:129)或二肽如Val-Cit、Val-Ala、Met-(D)Lys、Asn-(D)Lys、Val-(D)Asp、Phe-Lys、Ile-Val、Asp-Val、His-Val、NorVal-(D)Asp、Ala-(D)Asp 5、Met-Lys、Asn-Lys、Ile-Pro、Me3Lys-Pro、PhenylGly-(D)Lys、Met-(D)Lys、Asn-(D)Lys、Pro-(D)Lys、Met-(D)Lys、Asn-(D)Lys、AM Met-(D)Lys、Asn-(D)Lys、AW Met-(D)Lys和Asn-(D)Lys。在某些实施方案中，由于较长肽的疏水性，二肽比较长的多肽是优选的。
已经描述了多种基于二肽的可切割的接头，所述接头用于将药物(如多柔比星、丝裂霉素、喜树碱、吡咯并苯并二氮杂卓、他利霉素和澳瑞他汀/澳瑞他汀家族成员)与抗体连接(参见，Dubowchik等人,1998,J.Org.Chem.67:1866-1872；Dubowchik等人,1998,Bioorg.Med.Chem.Lett.8(21):3341-3346；Walker等人,2002,Bioorg.Med.Chem.Lett.12:217-219；Walker等人,2004,Bioorg.Med.Chem.Lett.14:4323-4327；Sutherland等人,2013,Blood 122:1455-1463；and Francisco等人,2003,Blood 102:1458-1465；将这些文献中的每一个通过引用并入本文)。所有这些二肽接头或这些二肽接头的修饰形式可用于本公开的抗-糖-MUC1 ADC中。可使用的其他二肽接头包括在ADC(例如Seattle Genetics的本妥昔单抗(Brentuximab Vendotin)SGN-35(AdcetrisTM)、Seattle Genetics的SGN-75(抗CD-70，Val-Cit-单甲基澳瑞他汀F(MMAF))、Seattle Genetics SGN-CD33A(抗CD-33,Val-Ala-(SGD-1882))、Celldex Therapeutics的格雷巴土木单抗(glembatumumab)(CDX-011)(抗NMB，Val-Cit-单甲基澳瑞他汀E(MMAE))和Cytogen的PSMA-ADC(PSMA-ADC-1301)(抗PSMA，Val-Cit-MMAE))中发现的那些。
酶促可切割的接头可以包括自消(self-immolative)间隔物(spacer)，以在空间上将药物与酶促切割位点分开。药物与肽接头的直接附接可导致药物的氨基酸加合物的蛋白水解释放，从而损害其活性。使用自消间隔物允许在酰胺键水解时消除完全活性的化学未修饰的药物。
一种自消间隔物是双功能的对氨基苯甲醇基团(PABC)，其通过氨基基团与肽连接，形成酰胺键，而含胺的药物可通过氨基甲酸酯官能团附接至接头的苄基羟基基团。所得前药在蛋白酶介导的切割后被激活，导致释放未修饰的药物、二氧化碳和连接基团的残余物的1,6-消除反应。以下方案描绘了对氨基苄基醚的片段化和药物的释放：
Figure BDA0002543006580000461
其中X-D表示未修饰的药物。
还描述了这种自消基团的杂环变体。参见例如US专利号7,989,434，将其通过引用并入本文。
在一些实施方案中，酶促可切割的接头是基于β-葡糖醛酸的接头。通过溶酶体酶β-葡糖醛酸糖苷酶切割β-葡糖苷酸糖苷键可以实现药物的轻松释放。此酶大量存在于溶酶体内，并且在一些肿瘤类型中过表达，而细胞外的该酶活性较低。基于β-葡糖醛酸的接头可用于避免由于β-葡糖苷酸的亲水性而导致的ADC发生聚集的趋势。在一些实施方案中，基于β-葡糖醛酸的接头优选作为ADC的与疏水性药物连接的接头。以下方案描绘了药物从含有基于β-葡糖醛酸的接头的ADC的释放：
Figure BDA0002543006580000471
已经描述了多种可切割的基于β-葡糖醛酸的接头，所述接头用于将药物(如澳瑞他汀、喜树碱和多柔比星类似物、CBI小沟结合剂、以及皮司姆贝林(psymberin))与抗体连接(参见，Nolting,Chapter 5"Linker Technology in Antibody-Drug Conjugates,"In:Antibody-Drug Conjugates:Methods in Molecular Biology,vol.1045,pp.71-100,Laurent Ducry(Ed.),Springer Science&Business Medica,LLC,2013；Jeffrey等人,2006,Bioconjug.Chem.17:831-840；Jeffrey等人,2007,Bioorg.Med.Chem.Lett.17:2278-2280；and Jiang等人,2005,J.Am.Chem.Soc.127:11254-11255，将这些文献中的每一个通过引用并入本文)。所有这些基于β-葡糖醛酸的接头可用于本文所述的抗糖-MUC1 ADC中。
另外，含有苯酚基团的细胞毒性剂和/或细胞生长抑制剂可以通过酚氧与接头共价键合。在WO 2007/089149中描述的一种这样的接头依赖于以下方法，其中将二氨基-乙烷“SpaceLink”与传统的基于“PABO”的自消基团结合使用以递送苯酚。下面示意性地描绘了接头的切割，其中D表示具有酚羟基基团的细胞毒性剂和/或细胞生长抑制剂。
Figure BDA0002543006580000481
可切割的接头可以包含不可切割的部分或区段，和/或可切割的区段或部分可以包含在其他不可切割的接头中以使其可切割。仅举例来说，聚乙二醇(PEG)及相关聚合物在聚合物主链中可包含可切割的基团。例如，聚乙二醇或聚合物接头可包含一个或多个可切割的基团，如二硫化物、腙或二肽。
可包含在接头中的其他可降解的键包括通过PEG羧酸或活化的PEG羧酸与生物活性剂上的醇基反应形成的酯键，其中此类酯基通常在生理条件下水解以释放生物活性剂。可水解降解的键包括但不限于碳酸酯键；由胺和醛反应得到的亚胺键；通过醇与磷酸基团反应形成的磷酸酯键；为醛和醇的反应产物的缩醛键；为甲酸酯和醇的反应产物的原酸酯键；以及由亚磷酰胺基团与寡核苷酸的5'羟基基团在包括但不限于聚合物的末端处形成的寡核苷酸键。
在某些实施方案中，接头包含酶促可切割的肽部分，例如包含结构式(IVa)或(IVb)的接头：
Figure BDA0002543006580000491
或其盐，其中：肽表示可被溶酶体酶切割的肽(以C→N图示且未显示羧基和氨基“末端”)；T表示包含一个或多个乙二醇单元或亚烷基链或其组合的聚合物；Ra选自氢、烷基、磺酸酯和磺酸甲酯；p是范围为0至5的整数；q是0或1；x是0或1；y是0或1；
Figure BDA0002543006580000492
表示接头与细胞毒性剂和/或细胞生长抑制剂的附接点；并且*表示与接头的其余部分的附接点。
在某些实施方案中，肽选自三肽或二肽。在特定实施方案中，二肽选自：Val-Cit；Cit-Val；Ala-Ala；Ala-Cit；Cit-Ala；Asn-Cit；Cit-Asn；Cit-Cit；Val-Glu；Glu-Val；Ser-Cit；Cit-Ser；Lys-Cit；Cit-Lys；Asp-Cit；Cit-Asp；Ala-Val；Val-Ala；Phe-Lys；Val-Lys；Ala-Lys；Phe-Cit；Leu-Cit；Ile-Cit；Phe-Arg；和Trp-Cit。在某些实施方案中，二肽选自：Cit-Val和Ala-Val。
可包含在本文所述的抗糖-MUC1 ADC中的根据结构式(IVa)的接头的具体示例性实施方案包括下文所示的接头(如图所示，接头包含适用于将接头与抗体共价连接的基团)：
Figure BDA0002543006580000501
Figure BDA0002543006580000511
可包含在本文所述的抗糖-MUC1 ADC中的根据结构式(IVb)的接头的具体示例性实施方案包括下文所示的接头(如图所示，接头包含适用于将接头与抗体共价连接的基团)：
Figure BDA0002543006580000512
Figure BDA0002543006580000521
Figure BDA0002543006580000531
Figure BDA0002543006580000541
Figure BDA0002543006580000551
在某些实施方案中，接头包含酶可切割的肽部分，例如，包含结构式(IVc)或(IVd)的接头：
Figure BDA0002543006580000552
或其盐，其中：肽表示可被溶酶体酶切割的肽(以C→N图示且未显示羧基和氨基“末端”)；T表示包含一个或多个乙二醇单元或亚烷基链或其组合的聚合物；Ra选自氢、烷基、磺酸酯和磺酸甲酯；p是范围为0至5的整数；q是0或1；x是0或1；y是0或1；
Figure BDA0002543006580000561
表示接头与细胞毒性剂和/或细胞生长抑制剂的附接点；并且*表示与接头的其余部分的附接点。
可包含在本文所述的抗糖-MUC1 ADC中的根据结构式(IVc)的接头的具体示例性实施方案包括下文所示的接头(如图所示，接头包含适用于将接头与抗体共价连接的基团)：
Figure BDA0002543006580000562
可包含在本文所述的抗糖-MUC1 ADC中的根据结构式(IVd)的接头的具体示例性实施方案包括下文所示的接头(如图所示，接头包含适用于将接头与抗体共价连接的基团)：
Figure BDA0002543006580000571
Figure BDA0002543006580000581
在某些实施方案中，包含结构式(IVa)、(IVb)、(IVc)、或(IVd)的接头进一步包含通过暴露于酸性介质可切割的碳酸酯部分。在特定实施方案中，接头通过氧附接至细胞毒性剂和/或细胞生长抑制剂。
5.3.4.不可切割的接头
尽管可切割的接头可以提供某些优点，但包含本公开的抗糖-MUC1 ADC的接头不必是可切割的。对于不可切割的接头，药物的释放不依赖于血浆与一些细胞质区室之间的差异性质。假定药物的释放在ADC经由抗原介导的内吞作用内化并递送至溶酶体区室之后发生，在其中抗体通过细胞内蛋白水解降解而被降解至氨基酸水平。此过程释放药物衍生物，所述药物衍生物由药物、接头以及接头共价附接的氨基酸残基形成。来自具有不可切割的接头的偶联物的氨基酸药物代谢物更亲水并且通常膜可渗透性更低，与具有可切割的接头的偶联物相比，这导致更少的旁观者效应和更少的非特异性毒性。通常，具有不可切割的接头的ADC比具有可切割的接头的ADC在循环中具有更高的稳定性。不可切割的接头可以是亚烷基链，或者可以本质上是聚合的，例如基于聚亚烷基乙二醇聚合物、酰胺聚合物，或者可以包含亚烷基链、聚亚烷基乙二醇聚合物和/或酰胺聚合物的区段。
已经描述了用于将药物与抗体连接的多种不可切割的接头。参见，Jeffrey等人,2006,Bioconjug.Chem.17；831-840；Jeffrey等人,2007,Bioorg.Med.Chem.Lett.17:2278-2280；and Jiang等人,2005,J.Am.Chem.Soc.127:11254-11255；将这些文献中的每一个通过引用并入本文。所有这些接头都可以包含在本公开的抗糖-MUC1 ADC中。
在某些实施方案中，接头在体内是不可切割的，例如根据结构式(VIa)、(VIb)、(VIc)或(VId)的接头(如图所示，接头包含适用于将接头与抗体共价连接的基团)：
Figure BDA0002543006580000591
或其盐，其中：Ra选自氢、烷基、磺酸酯和磺酸甲酯；Rx是包含能够将接头与抗体共价连接的官能团的部分；并且
Figure BDA0002543006580000592
表示接头与细胞毒性剂和/或细胞生长抑制剂的附接点。
可包含在本文所述的抗糖-MUC1 ADC中的根据结构式(VIa)-(VId)的接头的具体示例性实施方案包括下文所示的接头(如图所示，接头包含适用于将接头与抗体共价连接的基团，并且
Figure BDA0002543006580000601
表示与细胞毒性剂和/或细胞生长抑制剂的附接点)：
Figure BDA0002543006580000602
5.3.5.用于将接头与抗体附接的基团
可以使用多种基团将接头-药物合成子与抗体附接以产生ADC。附接基团本质上可以是亲电子的并且包括：马来酰亚胺基团、活化的二硫化物、活性酯(如NHS酯和HOBt酯)、卤代甲酸酯、酸性卤化物、烷基和苄基卤化物(如卤代乙酰胺)。如下所讨论的，还存在与可以根据本披露使用的“自稳定性”马来酰亚胺和“桥接二硫化物”相关的新兴技术。使用的具体基团将部分取决于与抗体附接的位点。
在下面的示意图中描绘了在抗体偶联条件下自发水解以给出具有改善的稳定性的ADC物质的“自稳定性”马来酰亚胺基团的一个实例。参见US 20130309256 A1；以及Lyon等人，在线公开的Nature Biotech，doi：10.1038/nbt.2968。
通常系统：
Figure BDA0002543006580000611
Figure BDA0002543006580000621
Polytherics公开了一种桥接一对源自天然铰链二硫键还原的巯基的方法。参见，Badescu等人，2014，Bioconjugate Chem.25:1124-1136。该反应如以下方案所示。该方法的一个优势是能够通过完全还原IgG(产生4对巯基)，然后与4当量的烷基化剂反应来合成富集的DAR4 ADC的能力。还声称含有“桥联二硫键”的ADC具有增加的稳定性。
Figure BDA0002543006580000631
类似地，如下所述，已经开发了能够桥联一对巯基的马来酰亚胺衍生物(以下，1)。参见WO2013/085925。
Figure BDA0002543006580000641
5.3.6.接头选择考虑
如熟练技术人员已知的，为特定ADC选择的接头可受多种因素影响，包括但不限于与抗体的附着位点(例如，lys、cys或其他氨基酸残基)、药物药效团的结构约束和药物的亲脂性。为ADC选择的特定接头应设法平衡特定抗体/药物组合的这些不同因素。有关受ADC中接头选择影响的因素的综述，参见Nolting第5章“Linker Technology in Antibody-DrugConjugates”，于：Antibody-Drug Conjugates:Methods in Molecular Biology,第1045卷,第71-100页,Laurent Ducry(编),Springer Science&Business Medica,LLC,2013。
例如，已经观察到ADC实现存在于抗原阳性肿瘤细胞附近的旁观者抗原阴性细胞的杀伤。ADC对旁观者细胞杀死的机制指示了ADC的胞内加工过程中形成的代谢产物可以起作用。由抗原阳性细胞中ADC代谢产生的中性细胞毒性代谢物似乎在旁观者细胞杀伤中起作用，而可防止带电荷的代谢物跨膜扩散到培养基中，因此不能影响旁观者杀伤。在某些实施方案中，选择接头以减弱由ADC的细胞代谢物引起的旁观者杀伤效应。在某些实施方案中，选择接头以增加旁观者的杀伤效应。
在使用和/或存储的条件下，接头的性质也可影响ADC的聚集。通常，文献中报道的ADC含有每个抗体分子的不超过3-4个药物分子(参见例如Chari,2008,Acc Chem Res 41:98-107)。尝试获得更高的药物与抗体的比率(“DAR”)由于ADC的聚集而经常失败，特别若药物和接头都是疏水的话(King等人,2002,J Med Chem 45:4336-4343；Hollander等人,2008,Bioconjugate Chem 19:358-361；Burke等人,2009Bioconjugate Chem 20:1242-1250)。在许多情况下，高于3-4的DAR作为提高效力的手段可以是有益的。在细胞毒性和/或细胞抑制剂本质上是疏水性的情况下，可能希望选择相对亲水的接头作为减少ADC聚集的手段，尤其是在期望大于3-4的DARS的情况下。因此，在某些实施方案中，接头掺入在存储和/或使用过程中减少ADC聚集的化学部分。接头可掺入极性或亲水基团，例如带电荷的基团或在生理pH下变为带电荷以减少ADC聚集的基团。例如，接头可掺入带电荷的基团，例如盐或在生理pH下使例如羧酸盐脱质子化或使例如胺质子化的基团。
在WO 2009/073445；WO 2010/068795；WO 2010/138719；WO 2011/120053；WO2011/171020；WO 2013/096901；WO 2014/008375；WO 2014/093379；WO 2014/093394；WO2014/093640(其内容通过引用完整并入本文)中描述了已报道产生高达20的DAR的示例性多价接头，其可用于将多种细胞毒剂和/或细胞抑制剂与抗体连接。
在具体的实施方案中，在存储或使用期间ADC的聚集小于约10％，如通过大小排阻层析(SEC)所确定的。在具体的实施方案中，在存储或使用期间ADC的聚集小于10％，例如小于约5％，小于约4％，小于约3％，小于约2％，小于约1％，小于约0.5％，小于约0.1％或甚至更低，如通过大小排阻层析(SEC)所确定的。
5.3.7.制备抗糖-MUC1 ADC的方法
本公开内容的抗糖-MUC1 ADC可以使用公知的化学合成。所选择的化学将尤其取决于细胞毒剂和/或细胞抑制剂的身份、接头以及用于将接头与抗体连接的基团。通常，可以根据以下方案制备根据式(I)的ADC：
D-L-Rx+Ab-Ry→[D-L-XY]n-Ab (I)
其中D、L、Ab、XY和n如先前所定义，并且Rx和Ry代表能够彼此形成共价连接的互补基团，如上所讨论。
基团Rx和Ry的身份将取决于用于将合成子D-L-Rx与抗体连接的化学。通常，所用化学不应改变抗体的完整性，例如其结合靶标的能力。优选地，缀合抗体的结合特性将与未缀合的抗体的结合特性非常相似。用于使分子与生物分子，例如抗体缀合的多种化学和技术是本领域已知的，并且特别是对于抗体而言是公知的。参见例如Amon等人,“MonoclonalAntibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy,”in:MonoclonalAntibodies And Cancer Therapy,Reisfeld等人编,Alan R.Liss,Inc.,1985；Hellstrom等人,“Antibodies For Drug Delivery,”于:Controlled Drug Delivery,Robinson等人编,Marcel Dekker,Inc.,第2版1987；Thorpe,“Antibody Carriers Of Cytotoxic AgentsIn Cancer Therapy:A Review,”于:Monoclonal Antibodies'84:Biological AndClinical Applications,Pinchera等人编,1985；“Analysis,Results,and FutureProspective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody In CancerTherapy,”于:Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy,Baldwin等人编,Academic Press,1985；Thorpe等人,1982,Immunol.Rev.62:119-58；PCT公开文本WO89/12624。这些化学中的任一种均可用于将合成子与抗体连接。
可用于将合成子与可接近的赖氨酸残基连接的许多官能团Rx和化学是已知的，并且包括但不限于NHS-酯和异硫氰酸酯。
可用于将合成子与半胱氨酸残基连接的可接近的游离巯基基团的许多官能团Rx和化学是已知的，并且例如但不限于卤代乙酰基和马来酰亚胺。
然而，缀合化学不限于可用的侧链基团。通过将适当的小分子与胺连接，侧链(例如胺)可以转化为其他有用的基团(例如羟基)。通过将多功能小分子与抗体的可接近氨基酸残基的侧链缀合，可使用该策略来增加抗体上可用连接位点的数量。然后，适合于将合成子共价连接到这些“转化的”官能团的官能团Rx包括在合成子中。
抗体也可以被工程化以包括用于缀合的氨基酸残基。Axup等人,2012,Proc NatlAcad Sci USA.109(40):16101-16106描述了一种用于工程化改造抗体以包括在ADC的背景下可用于缀合药物的非遗传编码氨基酸残基的方法，可用于将合成子与未编码氨基酸连接的化学和官能团也是如此。
通常，将合成子与抗体的氨基酸残基的侧链连接，所述侧链包括例如可接近的赖氨酸残基的伯氨基团或可接近的半胱氨酸残基的巯基基团。游离巯基基团可通过还原链间二硫键获得。
对于其中Ry是巯基基团的连接(例如，当Rx是马来酰亚胺时)，通常首先将抗体完全或部分还原以破坏半胱氨酸残基之间的链间二硫化物桥。
不参与二硫化物桥的半胱氨酸残基可通过一个或多个密码子的突变而工程化改造到抗体中。还原这些未成对的半胱氨酸产生适于缀合的巯基基团。用于掺入工程化半胱氨酸的优选位置包括例如但不限于在人IgG1重链上的位置S112C,S113C,A114C,S115C,A176C,5180C,S252C,V286C,V292C,S357C,A359C,S398C,S428C(Kabat编号)和在人Igkappa轻链上的位置V110C,S114C,S121C,S127C,S168C,V205C(Kabat编号)(例如，参见美国专利No.7,521,541,美国专利No.7,855,275和美国专利No.8,455,622)。
如熟练技术人员将理解的，与抗体分子连接的细胞毒剂和/或细胞抑制剂的数量可以变化，以使得ADC的集合在性质上可以是异质的，其中一些抗体含有一种连接的试剂，一些则含有两种，一些则含有三个，等等(以及一些则没有)。异质性的程度将尤其取决于用于连接细胞毒剂和/或细胞抑制剂的化学。例如，在还原抗体以产生用于附着的巯基基团的情况下，通常产生每个分子具有0、2、4、6或8个连接的试剂的异质抗体混合物。此外，通过限制附着化合物的摩尔比，通常产生每个分子具有0、1、2、3、4、5、6、7或8个连接的试剂的抗体。因此，将理解的是，取决于背景，陈述的DAR可以是抗体集合的平均值。例如，“DAR4”可以指尚未经过纯化以分离特定DAR峰的ADC制剂，并且可以包含ADC分子的异质混合物，每种抗体具有不同数量的细胞抑制剂和/或细胞毒剂(例如，每个抗体的0、2、4、6、8个试剂)，但是具有4的平均药物与抗体比率。类似地，在某些实施方案中，“DAR2”是指异质ADC制剂，其中平均药物与抗体比率是2。
当期望富集的制剂时，可以通过异质混合物的纯化，例如，通过柱层析，例如疏水相互作用层析，获得具有限定数目的连接的细胞毒剂和/或细胞抑制剂的抗体。
如本领域中已知的，可以通过多种方法评估纯度。作为一个具体实例，可以通过HPLC或其他层析分析ADC制剂，并通过分析所得峰的曲线下的面积来评估纯度。
5.4嵌合抗原受体
本公开内容提供了包含本文描述的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段的嵌合抗原受体(CAR)。
本公开内容的CAR通常包含与跨膜域可操作地连接的胞外域，该跨膜域继而与用于信号传导的胞内域可操作连接。
本公开内容的CAR的胞外域包含抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段的序列(例如，如第5.1节或实施方案1至90中所述)。
分别在5.4.1和5.4.2节中描述示例性的跨膜域序列和胞内域序列。
本文所述的几种融合蛋白(例如，实施方案92和94-96)是CAR，并且CAR相关的公开内容适用于此类融合蛋白。
5.4.1.跨膜域
关于跨膜域，可以将CAR设计为包含与CAR的胞外域可操作地连接(例如融合)的跨膜域。
跨膜域可以源自天然或合成来源。在来源是天然的情况下，则该域可以源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。在本公开内容中特别使用的跨膜域可以源自T细胞受体的alpha,beta或zeta链,CD28,CD3 epsilon,CD45,CD4,CD5,CD8,CD9,CD16,CD22,CD33,CD37,CD64,CD80,CD86,CD134,CD137,CD154(即，至少包括它们的跨膜区)。在某些情况下，也可以使用多种人铰链，包括人Ig(免疫球蛋白)铰链。
在一个实施方案中，跨膜域是合成的(即，非天然存在的)。合成跨膜域的实例是主要包含疏水残基如亮氨酸和缬氨酸的肽。优选地，在合成跨膜域的每个末端发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。任选地，短的寡肽或多肽接头(优选长度在2至10个氨基酸之间)可以形成CAR的跨膜域和胞质信号传导域之间的连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供了特别合适的接头。
在一个实施方案中，本公开内容的CAR中的跨膜域是CD8跨膜域。在一个实施方案中，CD8跨膜域包含氨基酸序列YLHLGALGRDLWGPSPVTGYHPLL。
在一个实施方案中，本公开内容的CAR中的跨膜域是CD28跨膜域。在一个实施方案中，CD28跨膜域包含氨基酸序列FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV。
在一些情况下，本公开内容的CAR的跨膜域包含CD8a铰链域。在一个实施方案中，CD8a铰链域包含氨基酸序列TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFAC。
5.4.2.胞内域
本公开内容的CAR的胞内信号传导域负责激活表达CAR的免疫细胞的至少一种正常效应器功能。术语“效应器功能”是指细胞的专门功能。T细胞的效应器功能例如可以是细胞溶解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。因此，术语“胞内信号传导域”是指蛋白质的一部分，其转导效应器功能信号并指导细胞执行专门的功能。尽管通常可以使用整个胞内信号传导域，但在许多情况下，不必使用整个链。就使用胞内信号传导域的截短部分而言，可以使用此类截短部分代替完整链，只要其转导效应器功能信号。因此，术语胞内信号传导域意在包括足以转导效应器功能信号的胞内信号传导域的任何截短部分。
用于本公开内容的CAR的胞内信号传导域的优选实例包括T细胞受体(TCR)的胞质序列和协同起作用以在抗原受体衔接之后启动信号转导的共受体，以及具有相同功能能力的任何这些序列的衍生物或变体以及任何合成序列。
通过单独的TCR产生的信号可能不足以完全激活T细胞，并且还需要次级或共刺激信号。因此，可以说T细胞活化是由两类独特类别的胞质信号传导序列介导的：通过TCR启动抗原依赖性初级活化的(初级胞质信号传导序列)和以抗原非依赖性方式起作用以提供次级或共刺激信号的(次要胞质信号传导序列)。
初级胞质信号传导序列以刺激方式或抑制方式调节TCR复合物的初级活化。以刺激方式起作用的主要胞质信号转导序列可以含有信号转导基序，所述基序被称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM。
在本公开内容的CAR中特别有用的包含ITAM的包含初级细胞质信号转导序列的例子包括那些源自TCR zeta,FcR gamma,FcR beta,CD3 gamma,CD3 delta,CD3 epsilon,CD5,CD22,CD79a,CD79b,和CD66d的。特别优选地，本公开内容的CAR中的胞质信号传导分子包含来自CD3-zeta的胞质信号传导序列。
在一个优选的实施方案中，CAR的胞质域设计成包括单独或与可用于本公开内容的CAR的背景中的任何其它期望的胞质域组合的含有ITAM的初级胞质信号传导序列域(例如，CD3-zeta的)。例如，CAR的胞质域可以包括CD3zeta链部分和共刺激信号传导区。
共刺激信号传导区是指CAR的一部分，其包含共刺激分子的胞内域。共刺激分子是淋巴细胞对抗原的有效应答所需要的除抗原受体或其配体以外的细胞表面分子。此类分子的实例包括CD27,CD28,4-1BB(CD137),OX40,CD30,CD40,PD-1,ICOS，淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1),CD2,CD7,LIGHT,NKG2C,B7-H3，与CD83特异性结合的配体等。
本公开内容的CAR的胞质信号传导部分内的胞质信号传导序列可以以随机或规定顺序彼此连接。任选地，短的寡肽或多肽接头(优选长度在2至10个氨基酸之间)可以形成连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供了特别合适的接头。
在一个实施方案中，胞质域包含CD3-zeta的信号传导域和CD28的信号传导域。在另一个实施方案中，胞质域包含CD3-zeta的信号传导域和4-1BB的信号传导域。
5.5核酸、重组载体和宿主细胞
本公开内容涵盖编码用于抗-糖-MUC1抗体的免疫球蛋白轻链和重链基因的核酸分子、包含此类核酸的载体和能够产生本公开内容的抗-糖-MUC1抗体的宿主细胞。在某些方面，核酸分子也编码且宿主细胞能够表达本公开内容的抗糖-MUC1抗体和抗体结合片段(例如，如第5.1节和实施方案1至90中所述)以及包含它们的融合蛋白(例如，如实施方案91-96中所述)和嵌合抗原受体(如第5.4节和实施方案97-98中所述)。在实施方案111-113中描述了本公开内容的示例性载体，并且在实施方案114-117中描述了示例性宿主细胞。
本公开内容的抗糖-MUC1抗体可以通过在宿主细胞中重组表达免疫球蛋白轻链和重链基因来制备。为了重组表达抗体，用一种或多种携带编码抗体的免疫球蛋白轻链和重链的DNA片段的重组表达载体转染宿主细胞，使得轻链和重链在宿主细胞中表达，并任选地分泌到培养宿主细胞的培养基，可以从所述培养基中回收抗体。使用标准重组DNA方法来获得抗体重链和轻链基因，将这些基因整合到重组表达载体中，并将载体引入宿主细胞，例如Molecular Cloning；A Laboratory Manual,第二版(Sambrook,Fritsch and Maniatis(编),Cold Spring Harbor,N.Y.,1989),Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel,F.M.等人编,Greene Publishing Associates,1989)和美国专利No.4,816,397中描述的那些。
为了产生编码此类抗糖-MUC1抗体的核酸，首先获得编码轻链和重链可变区的DNA片段。这些DNA可以通过扩增和修饰编码轻链和重链可变序列的种系DNA或cDNA而获得，例如使用聚合酶链式反应(PCR)。人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列是本领域已知的(参见例如"VBASE"人种系序列数据库；还见Kabat等人,1991,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第五版,U.S.Department of Health and Human Services,NIHPublication No.91-3242；Tomlinson等人,1992,J.Mol.Biol.22T:116-198；和Cox等人,1994,Eur.J.Immunol.24:827-836；每篇的内容通过引用并入本文。
一旦获得编码抗糖-MUC1抗体相关的VH和VL区段的DNA片段，就可以通过标准重组DNA技术进一步操纵这些DNA片段，例如将可变区基因转化为全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中，将编码VH或VL的DNA片段可操作地连接至编码另一种蛋白质的另一种DNA片段，例如抗体恒定区或柔性接头。如在本背景中使用，术语“可操作地连接”是指将两个DNA片段连接在一起，使得由两个DNA片段编码的氨基酸序列保持在读框内。
可以通过将编码VH的DNA与编码重链恒定区(CH1,CH2,CH3和任选地CH4)的另一种DNA分子可操作地连接，将编码VH区的分离的DNA转化为全长重链基因。人重链恒定区基因的序列在本领域中是已知的(参见例如，Kabat等人，1991,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第五版,U.S.Department of Health and Human Services,NIHPublication No.91-3242)并且包含这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增获得。重链恒定区可以是IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA,IgE,IgM或IgD恒定区，但是在某些实施方案中是IgG1或IgG4恒定区。对于Fab片段重链基因，可以将编码VH的DNA与仅编码重链CH1恒定区的另一个DNA分子可操作地连接。
可以通过将编码VL的DNA与编码轻链恒定区CL的另一个DNA分子可操作地连接，将编码VL区的分离的DNA转换为全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列在本领域中是已知的(参见例如Kabat等人,1991,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and HumanServices,NIH Publication No.91-3242)并且包含这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增获得。轻链恒定区可以是kappa或lambda恒定区，但是在某些实施方案中是kappa恒定区。
为了产生scFv基因，可以将编码VH和VL的DNA片段可操作地连接至另一个编码柔性接头，例如编码氨基酸序列(Gly4～Ser)3的片段，使得VH和VL序列可以表达为连续的单链蛋白，其中VH和VL区通过柔性接头连接(参见，例如Bird等人,1988,Science 242:423-426；Huston等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；McCafferty等人,1990,Nature 348:552-554)。
为了表达本公开内容的抗糖-MUC1抗体，将如上所述获得的编码部分或全长轻链和重链的DNA插入表达载体中，使得该基因可操作地连接至转录和翻译控制序列。在本背景中，术语“可操作地连接”是指将抗体基因连接到载体中，使得载体中的转录和翻译控制序列发挥其预期的调节抗体基因的转录和翻译的功能。选择表达载体和表达控制序列以与所使用的表达宿主细胞相容。可以将抗体轻链基因和抗体重链基因插入分开的载体中，或更典型地，将这两个基因插入相同的表达载体中。
通过标准方法(例如，抗体基因片段和载体上互补限制性位点的连接，或者若不存在限制性位点，则平末端连接)将抗体基因插入表达载体。在插入抗糖-MUC1抗体相关的轻链或重链序列之前，表达载体已经可以携带抗体恒定区序列。例如，将抗糖-MUC1单克隆抗体相关的VH和VL序列转换为全长抗体基因的一种方法是将它们分别插入已经编码重链恒定区和轻链恒定区的表达载体中，使得VH区段可操作地连接到载体内的一个或多个CH区段，并且将VL区段可操作地连接到该载体内的CL区段。另外/或者，重组表达载体可编码促进抗体链从宿主细胞分泌的信号肽。可以将抗体链基因克隆到载体中，使得信号肽符合读框地连接至抗体链基因的氨基末端。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即，来自非免疫球蛋白蛋白质的信号肽)。
除抗体链基因外，本公开内容的重组表达载体还带有调节序列，其控制抗体链基因在宿主细胞中的表达。术语“调节序列”旨在包括控制抗体链基因的转录或翻译的启动子、增强子和其他表达控制元件(例如，聚腺苷酸化信号)。在例如Goeddel,GeneExpression Technology:Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,Calif.,1990中描述了此类调节序列。本领域技术人员应理解，表达载体的设计，包括调节序列的选择可以取决于诸如待转化的宿主细胞的选择、所需蛋白质表达水平等因素。用于哺乳动物宿主细胞表达的合适调节序列包括在哺乳动物细胞中指导高水平蛋白质表达的病毒元件，例如源自巨细胞病毒(CMV)(例如CMV启动子/增强子)、猿病毒40(SV40)(例如SV40启动子/增强子)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤的启动子和/或增强子。对于病毒调节元件及其序列的进一步描述，参见例如Stinski的美国专利No.5,168,062，Bell等人的美国专利No.4,510,245和Schaffner等人的美国专利No.4,968,615。
除抗体链基因和调节序列外，本公开内容的重组表达载体还可携带其他序列，例如调节载体在宿主细胞中复制的序列(例如复制起点)和选择标志物基因。选择标志物基因促进选择已引入载体的宿主细胞(参见例如Axel等人的美国专利No.4,399,216,4,634,665和5,179,017)。例如，通常，选择标志物基因在已引入载体的宿主细胞上赋予对药物如G418、潮霉素或氨甲蝶呤的抗性。合适的选择标志物基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于带有甲氨蝶呤选择/扩增的DHFR宿主细胞)和neo基因(用于G418选择)。为了表达轻链和重链，通过标准技术将编码重链和轻链的表达载体转染到宿主细胞中。术语“转染”的各种形式旨在涵盖通常用于将外源DNA引入原核或真核宿主细胞中的极其多种技术，例如电穿孔、脂转染、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等等。
有可能在原核或真核宿主细胞中表达本公开内容的抗体。在某些实施方案中，在正确折叠且具有免疫活性的抗体的最佳分泌的真核细胞例如哺乳动物宿主细胞中进行抗体的表达。用于表达本公开内容的重组抗体的示例性哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括DHFR-CHO细胞，描述于Urlaub和Chasin，1980,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216-4220，与DHFR选择标志物一起使用，例如，如Kaufman和Sharp，1982,Mol.Biol.159:601-621中所述)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。当将编码抗体基因的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞时，通过培养宿主细胞足以允许抗体在宿主细胞中表达或抗体分泌到培养宿主细胞的培养基中的时间段来生产抗体。可以使用标准蛋白质纯化方法从培养基中回收抗体。宿主细胞还可以用于产生完整抗体的一部分，例如Fab片段或scFv分子。应理解的是，以上过程的变型在本公开内容的范围内。例如，可以期望用编码本公开内容的抗糖-MUC1抗体的轻链或重链(但不是两者)的DNA转染宿主细胞。
为了表达本公开内容的CAR，例如如第5.4节以及实施方案97和98中所述，优选宿主细胞是T细胞，优选人T细胞。在一些实施方案中，当细胞与肿瘤细胞上的MUC1交联时，宿主细胞表现出抗肿瘤免疫性。在5.5.1节中描述了产生本公开内容的T细胞的详细方法。
重组DNA技术也可以用于去除编码对于与糖-MUC1的结合不必要的轻链和重链中的任一个或两个的部分或整个DNA。本公开内容的抗体也涵盖从此类截短的DNA分子表达的分子。
为了重组表达本公开内容的抗糖-MUC1抗体，可以用本公开内容的两个表达载体共转染宿主细胞，第一载体编码重链衍生的多肽，第二载体编码轻链衍生的多肽。两个载体可以包含相同的选择标志物，或者它们各自可以包含分开的选择标志物。或者，可以使用编码重链和轻链多肽两者的单个载体。
一旦编码抗糖-MUC1抗体的一个或多个部分的核酸，可以将进一步的改变或突变引入编码序列，例如以产生编码具有不同CDR序列的抗体，对Fc受体具有降低的亲和力的抗体或不同亚类的抗体的核酸。
本公开内容的抗糖-MUC1抗体也可以通过化学合成(例如，通过Solid PhasePeptide Synthesis,第2版,1984The Pierce Chemical Co.,Rockford,Ill.中描述的方法)产生。还可以使用无细胞平台产生变体抗体(参见例如Chu等人,Biochemia No.2,2001(Roche Molecular Biologicals)和Murray等人,2013,Current Opinion in ChemicalBiology,17:420-426)。
一旦已经通过重组表达产生了本公开内容的抗糖-MUC1抗体，就可以通过本领域已知的用于纯化免疫球蛋白分子的任何方法将其纯化，例如通过层析(例如，离子交换层析、亲和层析、分筛柱层析)、离心、差异溶解度或通过用于纯化蛋白质的任何其他标准技术进行。此外，本公开内容的抗糖-MUC1抗体和/或结合片段可以与本文所述或本领域中以其它方式已知促进纯化的异源多肽序列融合。
分离后，若想要的话，可以例如通过高效液相层析(参见例如Fisher,LaboratoryTechniques In Biochemistry And Molecular Biology,Work and Burdon编,Elsevier,1980)，或通过在SuperdexTM 75柱上的凝胶过滤层析(Pharmacia Biotech AB,Uppsala,Sweden)进一步纯化抗糖-MUC1抗体。
5.5.1. T细胞中CAR的重组生成
在一些实施方案中，使用逆转录病毒或慢病毒载体将编码本公开内容的抗糖-MUC1 CAR的核酸递送到细胞中。可以使用经转导的细胞作为载体或包囊的、结合的或裸露的载体的无细胞局部或全身递送将表达CAR的逆转录病毒和慢病毒载体递送到不同类型的真核细胞以及组织和整个生物体内。所使用的方法可以用于需要或足以稳定表达的任何目的。
在其他实施方案中，使用体外转录的mRNA将CAR序列递送到细胞中。可以使用经转染的细胞作为载体或包囊的、结合的或裸露的mRNA的无细胞局部或全身递送将体外转录的mRNA CAR递送到不同类型的真核细胞以及组织和整个生物体内。所使用的方法可以用于需要或足以瞬时表达的任何目的。
在另一个实施方案中，可以通过转座子在细胞中表达期望的CAR。
本公开内容的RNA转染方法的一个优点是RNA转染基本上是瞬时的并且是无载体的：可以在短暂的体外细胞活化后作为最小表达盒在无需任何其他病毒序列的情况下将RNA转基因递送至淋巴细胞并在其中表达。在这些条件下，转基因整合到宿主细胞基因组中是不可能的。由于RNA的转染效率及其均匀修饰整个淋巴细胞群体的能力，细胞的克隆不是必要的。
用体外转录的RNA(IVT-RNA)对T细胞的遗传修饰利用了两种不同的策略，这两种策略已在各种动物模型中进行了连续测试。通过脂质转染或电穿孔用体外转录的RNA转染细胞。优选地，期望使用各种修饰来稳定IVT-RNA，以实现转移的IVT-RNA的延长表达。
一些IVT载体在文献中是已知的，其以标准化方式用作体外转录的模板，并且已经以产生稳定的RNA转录物的方式进行了遗传修饰。当前，本领域中使用的方案基于具有以下结构的质粒载体：实现RNA转录的5'RNA聚合酶启动子，随后是在3'和/或5'侧翼有非翻译区(UTR)的感兴趣的基因，以及含有50-70A核苷酸的3'聚腺苷酸盒。在体外转录之前，通过II型限制酶将环状质粒在聚腺苷酸盒的下游(识别序列对应于切割位点)线性化。因此，聚腺苷酸盒对应于转录物中的后面的聚(A)序列。由于此程序，线性化后，一些核苷酸保留为酶切割位点的一部分，并在3'端延伸或掩盖聚(A)序列。尚不清楚这种非生理性的突出是否影响从此类构建体在胞内产生的蛋白质的量。
与更传统的质粒或病毒方法相比，RNA具有多个优势。从RNA来源的基因表达不需要转录，并且在转染后迅速产生蛋白质产物。此外，由于RNA仅必须进入细胞质而不是细胞核，因此典型的转染方法导致极高的转染率。此外，基于质粒的方法要求驱动感兴趣基因表达的启动子在所研究的细胞中具有活性。
在另一方面，可以通过电穿孔将RNA构建体递送到细胞中。参见例如，将核酸构建体电穿孔到哺乳动物细胞中的制剂和方法，如US 2004/0014645,US 2005/0052630A1,US2005/0070841A1,US 2004/0059285A1,US 2004/0092907A1中教导。在相关研究文献以及本领域中的许多专利和申请中，通常已知各种参数，包括任何已知细胞类型的电穿孔所需的电场强度。参见例如美国专利6,678,556,美国专利No.7,171,264,和美国专利7,173,116。用于电穿孔的治疗应用的装置是商品化的，例如，MedPulserTM DNA电穿孔治疗系统(Inovio/Genetronics,San Diego,Calif.)，并且在例如美国专利No.6,567,694；美国专利No.6,516,223,美国专利No.5,993,434,美国专利No.6,181,964,美国专利No.6,241,701,和美国专利No.6,233,482的专利中描述；电穿孔也可用于体外转染细胞，如描述于US20070128708A1中。电穿孔也可以用于将核酸体外递送到细胞中。因此，利用本领域技术人员已知的许多可用装置和电穿孔系统之任一种的核酸(包括表达构建体)对细胞的电穿孔介导的施用呈现了令人兴奋的将感兴趣RNA递送至靶细胞的新方法。
5.5.1.1 T细胞来源
在扩增和遗传修饰之前，从受试者获得T细胞来源。术语“受试者”旨在包括可以引发免疫应答的活生物体(例如，哺乳动物)。受试者的实例包括人、狗、猫、小鼠、大鼠及其转基因物种。优选地，受试者是人。
T细胞可获自多种来源，包括外周血单个核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。在本公开内容的某些实施方案中，可以使用本领域中可用的任何数量的T细胞系。在本公开内容的某些实施方案中，可以使用熟练技术人员已知的许多技术，例如FicollTM分离，从自受试者收集的血液单位中获得T细胞。在一个优选的实施方案中，通过单采血成分术(apheresis)从个体的循环血液中获得细胞。单采血成分术产品通常包含淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白细胞、红细胞和血小板。在一实施方案中，可以洗涤通过单采血成分术收集的细胞以除去血浆级份并将细胞置于适当的缓冲液或培养基中以用于随后的加工步骤。在本公开内容的一个实施方案中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在另一个实施方案中，洗涤溶液缺少钙，并且可以缺少镁，或者可以缺少许多(若不是全部的话)二价阳离子。再次，令人惊讶地，在不存在钙的情况下的初始活化步骤导致放大的活化。如本领域普通技术人员将容易理解的，洗涤步骤可以通过本领域技术人员已知的方法来完成，例如通过使用半自动“流过”离心机(例如Cobe 2991细胞处理器，Baxter CytoMate或Haemonetics Cell Saver 5)按照制造商的说明进行。洗涤后，可将细胞重悬于多种生物相容的缓冲液中，例如无钙无镁的PBS，PlasmaLyte A或其他含或不含缓冲液的盐水溶液。或者，可以去除单采血成分术样品的不期望的成分，并将细胞直接重悬浮在培养基中。
在另一个实施方案中，通过裂解红细胞并消减单核细胞(例如通过经由PERCOLLTM梯度离心或通过逆流离心淘析)从外周血淋巴细胞分离T细胞。可以通过阳性或阴性选择技术进一步分离T细胞的特定亚群，例如CD3+,CD28',CD4+,CD8+,CD45RA+和CD45RO+T细胞。例如，在一个实施方案中，通过与抗-CD3/抗-CD28(即3x 28)缀合的珠，例如
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M-450 CD3/CD28 T温育足以阳性选择期望的T细胞的时间段分离T细胞。在一个实施例中，时间段是约30分钟。在另一个实施方案中，时间段范围为30分钟至36小时或更长和其间的所有整数值。在另一个实施方案中，时间段是至少1、2、3、4、5或6小时。在另一个优选的实施方案中，时间段是10至24小时。在一个优选的实施方案中，温育时间段是24小时。为了从白血病患者中分离T细胞，使用更长的温育时间(例如24小时)可以提高细胞产率。在与其他细胞类型相比具有很少的T细胞的任何情况下，，例如在从肿瘤组织或免疫受损的个体中分离肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)中，可以使用更长的温育时间来分离T细胞。此外，使用更长的温育时间可以提高捕获CD8+T细胞的效率。因此，通过简单地缩短或延长允许T细胞与CD3/CD28珠结合的时间和/或通过增加或降低珠与T细胞的比率(如本文进一步所述)，可以在培养启动时或过程期间的其他时间点优先选择T细胞的亚群。另外，通过增加或减少珠或其他表面上抗CD3和/或抗CD28抗体的比率，可以在培养启动时或在其他期望的时间点时优先选择T细胞的亚群。熟练技术人员将认识到，在本公开内容的背景中也可以使用多轮选择。在某些实施方案中，可以期望进行选择过程并在活化和扩增过程中使用“未选择的”细胞。“未选择”的细胞也可以进行进一步的选择轮次。
可以通过针对负选择的细胞特有的表面标志物的抗体的组合实现通过负选择富集T细胞群体。一种方法是通过负磁免疫粘附或流式细胞术进行细胞分选和/或选择，该流式细胞术使用针对存在于阴性选择的细胞上的细胞表面标志物的单克隆抗体混合物。例如，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物通常包括针对CD14,CD20,CD11b,CD16,HLA-DR和CD8的抗体。在某些实施方案中，可以期望富集或阳性选择通常表达CD4+,CD25+,CD62Lhi,GITR+和FoxP3+的调节性T细胞。或者，在某些实施方案中，通过抗C25缀合的珠或其他类似的选择方法来消减T调节细胞。
为了通过阳性或阴性选择分离期望的细胞群体，可以改变细胞和表面(例如，颗粒诸如珠)的浓度。在某些实施方案中，可以期望显著减小珠和细胞混合在一起的体积(即，增加细胞的浓度)，以确保细胞和珠的最大接触。例如，在一个实施方案中，使用20亿个细胞/ml的浓度。在一个实施方案中，使用10亿个细胞/ml的浓度。在另一个实施方案中，使用大于1亿个细胞/ml。在另一个实施方案中，使用1000万、1500万、2000万、2500万、3000万、3500万、4000万、4500万或5000万个细胞/ml的细胞浓度。在另一个实施方案中，使用7500万、8000万、8500万、9000万、9500万或1亿个细胞/ml的细胞浓度。在进一步的实施方案中，可以使用1.25或1.5亿个细胞/ml的浓度。使用高浓度可导致增加的细胞产率，细胞活化和细胞扩增。此外，使用高细胞浓度允许更有效捕获可以弱表达感兴趣的靶抗原的细胞，例如CD28阴性T细胞，或从存在许多肿瘤细胞的样品(即白血病血液，肿瘤组织等)中。此类细胞群体可以具有治疗价值，并且期望获得。例如，使用高浓度的细胞可以更有效选择通常具有较弱CD28表达的CD8+T细胞。
在相关的实施方案中，可以期望使用较低浓度的细胞。通过显著稀释T细胞和表面(例如颗粒，例如珠)的混合物，将颗粒和细胞之间的相互作用最小化。这选择表达大量期望抗原的细胞以与颗粒结合。例如，在稀释浓度下，CD4+T细胞比CD8+T细胞表达更高水平的CD28，并且更有效地被捕获。在一个实施方案中，所用的细胞的浓度为5x 106/ml。在其他实施方案中，所用的浓度可以为约1x 105/ml至1x 106/ml以及其间的任何整数值。
在其他实施方案中，可以在旋转器上于2-10℃或在室温下以不同的速度将细胞温育不同的时间长度。
也可以在洗涤步骤之后冷冻用于刺激的T细胞。不希望受理论的束缚，冷冻和随后的解冻步骤通过去除细胞群体中的粒细胞和一定程度的单核细胞而提供了更均匀的产物。在去除血浆和血小板的洗涤步骤之后，可以将细胞悬浮在冷冻溶液中。尽管许多冷冻溶液和参数是本领域已知的，并且在此情况下将是有用的，但一种方法涉及使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白的PBS，或含有10％葡聚糖40和5％右旋糖，20％人血清白蛋白和7.5％DMSO或31.25％Plasmalyte-A，31.25％右旋糖5％，0.45％NaCl，10％葡聚糖40和5％右旋糖，20％人血清白蛋白和7.5％DMSO的培养基或含有例如Hespan和PlasmaLyte A的其他合适的细胞冷冻培养基，然后将细胞以每分钟1°的速率冷冻至-80℃，并储存在液氮储存罐的气相中。可以使用其他控制冷冻的方法以及在-20℃或在液氮中立即进行非控制冷冻。
在某些实施方案中，如本文所述将冷冻保存的细胞解冻并洗涤，并在使用本公开内容的方法活化之前在室温下静置1小时。
在本公开内容的背景中还涵盖在可能需要如本文所述的扩增细胞时之前的时间段时从受试者收集血液样品或单采血成分术产品。因此，可以在任何必要的时间点收集待扩增细胞的来源，并分离和冷冻期望的细胞(例如T细胞)，以后来用于针对许多疾病或状况的T细胞疗法中，所述疾病或状况将受益于T细胞疗法，例如本文所述的那些。在一个实施方案中，血液样品或单采血液成分术是从总体上健康的受试者采集的。在某些实施方案中，从具有发展疾病的风险但尚未发展疾病的一般健康的受试者中采集血液样品或单采血液成分术，并且分离并冷冻感兴趣的细胞以供以后使用。在某些实施方案中，可以将T细胞扩增，冷冻并在以后的时间使用。在某些实施方案中，在如本文所述的特定疾病诊断之后不久但在任何治疗之前从患者收集样品。在另一个实施方案中，在任何数量的相关治疗方式，包括但不限于用药剂治疗之前，从受试者的血液样品或单采血液成分术中分离细胞，所述药剂诸如那他珠单抗(natalizumab)，依法珠单抗(efalizumab)，抗病毒剂，化学疗法，放射，免疫抑制剂，如环孢菌素，硫唑嘌呤，甲氨蝶呤，霉酚酸酯和FK506，抗体或其他免疫消融剂，如CAMPATH，抗CD3抗体，环磷酰胺(cytoxan)，氟达拉滨，环孢菌素，FK506，雷帕霉素，霉酚酸，类固醇，FR901228和放射。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶钙神经素(环孢菌素和FK506)或抑制对生长因子诱导的信号传导重要的p70S6激酶(雷帕霉素)。(Liu等人,Cell 66:807-815,1991；Henderson等人,Immun.73:316-321,1991；Bierer等人,Curr.Opin.Immun.5:763-773,1993)。在另一个实施方案中，为患者分离细胞并冷冻以供以后与骨髓或干细胞移植或使用化学治疗剂，诸如氟达拉滨，外部束放射疗法(XRT)，环磷酰胺的T细胞消融疗法(例如，在之前，同时或之后)联合使用。
在本公开内容的另一个实施方案中，在治疗后直接从患者获得T细胞。在这方面，已经观察到，在某些癌症治疗之后，特别是在用损害免疫系统的药物治疗之后，在患者通常会从治疗中恢复的时段期间的治疗后不久，获得的T细胞的质量可以是最佳的或在其离体扩增的能力方面得到改善。同样，在使用本文所述方法进行离体操作后，这些细胞可以处于优选状态以实现增强的植入和体内扩增。因此，涵盖的是在本公开内容的背景中在该恢复阶段期间收集血细胞，包括T细胞，树突细胞或造血谱系的其他细胞。此外，在某些实施方案中，动员(例如，用GM-CSF动员)和调理方案可用于在受试者中创建条件，其中特定细胞类型的再增殖，再循环，再生和/或扩增是有利的，尤其在治疗后限定的时间窗期间。示例性的细胞类型包括T细胞，B细胞，树突细胞和免疫系统的其他细胞。
5.5.1.2 T细胞的活化和扩增
通常使用例如在美国专利No.6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；和美国专利申请公开文本No.20060121005中描述的方法活化和扩增T细胞。
通常，通过接触表面来扩增本公开内容的T细胞，所述表面具有对其附着的刺激CD3/TCR复合物相关信号的试剂和刺激T细胞表面上的共刺激分子的配体。特别地，可以如本文所述刺激T细胞群体，例如通过与抗CD3抗体或其抗原结合片段或固定在表面上的抗CD2抗体接触，或通过与钙离子载体结合与蛋白激酶C活化剂(例如，苔藓抑素)接触进行。为了共同刺激T细胞表面上的辅助分子，使用结合辅助分子的配体。例如，可以在适合于刺激T细胞增殖的条件下，使T细胞群体与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触。为了刺激CD4+T细胞或CD8+T细胞的增殖，则为抗CD3抗体和抗CD28抗体。可以使用抗CD28抗体的实例，包括9.3,B-T3,XR-CD28(Diaclone,Besancon,France)，也可以使用本领域通常已知的其他方法(Berg等人,Transplant Proc.30(8):3975-3977,1998；Haanen等人,J.Exp.Med.190(9):13191328,1999；Garland等人,J.Immunol Meth.227(1-2):53-63,1999)。
在某些实施方案中，可以通过不同的方案提供T细胞的主要刺激信号和共刺激信号。例如，提供每个信号的试剂可以在溶液中或与表面偶联。当与表面偶联时，试剂可以与同一表面(即，以“顺式”形式)偶联或与分开的表面(即，以“反式”形式)偶联。或者，可以将一种试剂与表面偶联，而另一种试剂在溶液中。在一个实施方案中，提供共刺激信号的试剂与细胞表面结合，并且提供初级激活信号的试剂在溶液中或与表面偶联。在某些实施方案中，这两种试剂都可以在溶液中。在另一个实施方案中，试剂可以为可溶形式，然后与表面，例如表达Fc受体的细胞或将结合试剂的抗体或其他结合剂交联。在这方面，参见例如用于人工抗原呈递细胞(aAPC)的美国专利申请公开号20040101519和20060034810，所述人工抗原呈递细胞(aAPC)被考虑用于活化和扩增本公开内容中的T细胞。
在一个实施方案中，将两种试剂固定在珠上，即固定在同一珠上，即“顺式”，或分开的珠子上，即“反式”。举例来说，提供初级激活信号的试剂是抗CD3抗体或其抗原结合片段，并且提供共刺激信号的试剂是抗CD28抗体或其抗原结合片段；并将这两种试剂以等同的分子量共固定在同一珠上。在一个实施方案中，使用与用于CD4+T细胞扩增和T细胞生长的珠结合的每种抗体的1:1比率。在本公开内容的某些方面，使用与珠结合的抗CD3:CD28抗体的比率，使得与使用1:1的比率观察到的扩增相比，观察到T细胞扩增的增加。在一个具体的实施方案中，与使用1:1的比率观察到的扩增相比，观察到约1至约3倍的增加。在一个实施方案中，与珠结合的CD3:CD28抗体的比率范围为100:1至1:100和其间的所有整数值。在本公开内容的一方面，与抗CD3抗体相比，更多的抗CD28抗体结合到颗粒，即，CD3:CD28的比率小于1。在本公开内容的某些实施方案中，与珠结合的抗CD28抗体与抗CD3抗体的比率大于2:1。在一个具体的实施方案中，使用与珠结合的抗体的1:100CD28:CD28比率。在另一个实施方案中，使用与珠结合的抗体的1:75CD28:CD28比率。在另一个实施方案中，使用与珠结合的抗体的1:50CD28:CD28比率。在另一个实施方案中，使用与珠结合的抗体的1:30CD28:CD28比率。在一个优选的实施方案中，使用与珠结合的抗体的1:10CD28:CD28比率。在另一个实施方案中，使用与珠结合的抗体的1:3CD28:CD28比率。在另一个实施方案中，使用与珠结合的抗体的3:1CD28:CD28比率。
1:500至500:1及其之间的任何整数值的颗粒与细胞的比率可用于刺激T细胞或其他靶细胞。如本领域普通技术人员容易理解的，颗粒与细胞的比率可取决于相对于靶细胞的颗粒尺寸。例如，小尺寸的珠仅可以结合几个细胞，而较大的珠可以结合多个。在某些实施方案中，细胞与颗粒的比率范围为1:100至100:1和其间的任何整数值，并且在其他实施方案中，比率包含1:9至9:1和其间的任何整数值，也可以用于刺激T细胞。如上所述，导致T细胞刺激的抗CD3和抗CD28偶联颗粒与T细胞的比率可以变化，但是某些优选的值包括1:100,1:50,1:40,1:30,1:20,1:10,1:9,1:8,1:7,1:6,1:5,1:4,1:3,1:2,1:1,2:1,3:1,4:1,5:1,6:1,7:1,8:1,9:1,10:1和15:1，一个优选的比率是每个T细胞的至少1:1颗粒。在一个实施方案中，使用1:1或更小的颗粒与细胞的比率。在一个具体的实施方案中，优选的颗粒:细胞比率为1:5。在进一步的实施方案中，颗粒与细胞的比率可以根据刺激日而变化。例如，在一个实施方案中，第一天的颗粒与细胞的比率为1:1至10:1，并且此后每天或每隔一天将额外的颗粒以最终比率1:1至1:10(基于添加日的细胞计数)添加到细胞达10天。在一个具体的实施方案中，在刺激的第一天的颗粒与细胞的比率为1:1，并且在刺激的第三和第五天调整为1:5。在另一个实施方案中，每天或每隔一天将颗粒添加到刺激的第一天的最终比率1:1，以及第三天和第五天的最终比率1:5。在另一个实施方案中，在刺激的第一天的颗粒与细胞的比率为2:1，并且在刺激的第三和第五天调整为1:10。在另一个实施方案中，每天或每隔一天将颗粒添加至刺激的第一天的最终比率1:1，以及第三天和第五天的1:10。本领域技术人员将意识到，多种其他比率可以适用于本公开内容。特别地，比率将取决于颗粒大小以及细胞大小和类型而变化。
在本公开内容的其他实施方案中，将细胞如T细胞与包被有试剂的珠组合，随后分离珠和细胞，然后培养细胞。在备选的实施方案中，在培养之前，不分离试剂包被的珠和细胞，而是一起培养。在另一个实施方案中，首先通过施加力如磁力来浓缩珠和细胞，从而导致细胞表面标志物的连接增加，从而诱导细胞刺激。
举例来说，可以通过使附着有抗CD3和抗CD28的顺磁性珠(3x 28个珠)接触T细胞来连接细胞表面蛋白。在一个实施方案中，将细胞(例如104至109个T细胞)和珠(例如
Figure BDA0002543006580000821
M-450CD3/CD28 T顺磁性珠以1:1的比率)在缓冲液，优选PBS(无二价阳离子，例如钙和镁)中组合。同样，本领域普通技术人员可以容易地理解可以使用任何细胞浓度。例如，靶细胞在样品中可能非常稀少，并且仅占样品的0.01％，或者整个样品(即100％)可以包含感兴趣的靶细胞。因此，任何细胞数目都在本公开内容的背景内。在某些实施方案中，可以希望显著降低颗粒和细胞混合在一起的体积(即，增加细胞的浓度)，以确保细胞和颗粒的最大接触。例如，在一个实施方案中，使用约20亿个细胞/ml的浓度。在另一个实施方案中，使用大于1亿个细胞/ml。在另一个实施方案中，使用1000万、1500万、2000万、2500万、3000万、3500万、4000万、4500万或5000万个细胞/ml的细胞浓度。在另一个实施方案中，使用7500万、8000万、8500万、9000万、9500万或1亿个细胞/ml的细胞浓度。在进一步的实施方案中，可以使用1.25或1.5亿个细胞/ml的浓度。使用高浓度可导致增加的细胞产率，细胞活化和细胞扩增。此外，使用高细胞浓度可以允许更有效地捕获可弱表达感兴趣的靶抗原的细胞，例如CD28阴性T细胞。此类细胞群体可以具有治疗价值，并且在某些实施方案中会是期望的。例如，使用高浓度的细胞允许更有效地选择通常具有较弱CD28表达的CD8+T细胞。
在本公开内容的一个实施方案中，可以将混合物培养数小时(约3小时)至约14天或其间的任何小时整数值。在另一个实施方案中，可以将混合物培养21天。在本公开内容的一个实施方案中，将珠和T细胞一起培养约八天。在另一个实施方案中，将珠和T细胞一起培养2-3天。还可以期望几个刺激周期，以便T细胞的培养时间可以是60天或更长。适用于T细胞培养的条件包括适当的培养基(例如，基本必需培养基或RPMI培养基1640或X-vivo 15，(Lonza))，其可以含有增殖和存活力所必需的因子，包括血清(例如胎牛或人血清)，白介素2(IL-2)，胰岛素，IFN-γ,IL-4,IL-7,GM-CSF,IL-10,IL-12,IL-15,TGFβ,和TNF-α或熟练技术人员已知的用于细胞生长的其他添加剂。用于细胞生长的其他添加剂包括但不限于表面活性剂，plasmanate和还原剂，例如N-乙酰基-半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可以包括RPMI 1640,AIM-V,DMEM,MEM,α-MEM,F-12,X-Vivo 15,和X-Vivo 20，优化剂(Optimizer)，添加氨基酸、丙酮酸钠和维生素，无血清或补充有合适量的血清(或血浆)或限定的一组激素，和/或足以使T细胞生长和扩增的细胞因子。抗生素如青霉素和链霉素仅包括在实验培养物中，而不包括在要注射到受试者中的细胞培养物中。将靶细胞维持在支持生长所必需的条件下，例如合适的温度(例如37℃)和气氛(例如空气加5％CO2)。
已经暴露于变化的刺激时间的T细胞可以表现出不同的特性。例如，典型的血液或经过单采血成分术的外周血单个核细胞产物具有大于细胞毒性或抑制性T细胞群体(TC,CD8+)的辅助性T细胞群体(TH,CD4+)。通过刺激CD3和CD28受体进行T细胞的离体扩增产生T细胞群体，其在约8-9天前主要由TH细胞组成，而在约8-9天之后，T细胞群体包含越来越大的TC细胞群体。因此，取决于治疗的目的，对受试者输注主要包含TH细胞的T细胞群体可以是有利的。类似地，若已经分离了TC细胞的抗原特异性亚组，则将此亚组以更大程度扩增可以是有益的。
此外，在CD4和CD8标志物外，其他表型标志物在细胞扩增过程中显著但是在很大程度上可再现地变化。因此，此类再现性实现针对特定目的定制活化的T细胞产物的能力。
5.6组合物
本公开内容的抗糖-MUC1抗体和/或抗糖-MUC1 ADC可以为包含抗糖-MUC1抗体和/或ADC以及一种或多种载体、赋形剂和/或稀释剂的组合物形式。可以将组合物配制用于特定用途，例如用于人类的兽医用途或药物用途。组合物的形式(例如干粉，液体制剂等)以及所用的赋形剂，稀释剂和/或载体将取决于抗体和/或ADC的预期用途，以及对于治疗用途，取决于给药模式。
对于治疗用途，组合物可以作为包含药物学上可接受的载体的无菌药物组合物的一部分提供。此组合物可以为任何合适的形式(取决于将其施用于患者的期望方法)。可以通过多种途径，例如口服，透皮，皮下，鼻内，静脉内，肌内，肿瘤内，鞘内，表面或局部地将药物组合物施用于患者。在任何给定情况下，最合适的施用途径将取决于特定的抗体和/或ADC，受试者，和疾病的性质和严重程度以及受试者的身体状况。通常，将静脉内或皮下施用药物组合物。
药物组合物可以方便地以单位剂量形式存在，所述单位剂量形式每剂含有预定量的本公开内容的抗糖-MUC1抗体和/或抗糖-MUC1 ADC。单位剂量中包含的抗体和/或ADC的量将取决于所治疗的疾病以及本领域公知的其他因素。此类单位剂量可以为适合于单次施用的含有一定量的抗体和/或ADC的冻干粉末的形式，或为液体的形式。干粉末单位剂量形式可以在试剂盒中包装，所述试剂盒具有注射器，适当量的稀释剂和/或其他可用于施用的组分。液体形式的单位剂量可以方便地以适用于单次施用的预填充有一定量抗体和/或ADC的注射器的形式提供。
药物组合物也可以以适合于多次施用的含有一定量的ADC的散装形式供应。
可通过将具有期望纯度的抗体和/或ADC与本领域通常使用的任选的药学上可接受的载体，赋形剂或稳定剂(它们在本文中都称为“载体”)，即缓冲剂，稳定剂，防腐剂，等渗剂(isotonifier)，非离子型去污剂，抗氧化剂和其他杂项添加剂混合来制备药物组合物，从而以冻干制剂或水溶液的形式进行存储。参见Remington's Pharmaceutical Sciences,第16版(Osol编1980)。此类添加剂在所采用的剂量和浓度下应对接受者无毒。
缓冲剂有助于将pH维持在接近生理条件的范围内。它们可以以极其多种浓度存在，但是通常以范围为约2mM至约50mM的浓度存在。适用于本公开内容使用的缓冲剂包括有机酸和无机酸及其盐两者，例如柠檬酸盐缓冲剂(例如，柠檬酸单钠-柠檬酸二钠混合物，柠檬酸-柠檬酸三钠混合物，柠檬酸-柠檬酸单钠混合物等)，琥珀酸盐缓冲液(例如，琥珀酸-琥珀酸单钠混合物，琥珀酸-氢氧化钠混合物，琥珀酸-琥珀酸二钠混合物等)，酒石酸盐缓冲液(例如酒石酸-酒石酸钠混合物，酒石酸-酒石酸钾混合物，酒石酸酸-氢氧化钠混合物等)，富马酸缓冲剂(例如富马酸-富马酸单钠混合物，富马酸-富马酸二钠混合物，富马酸单钠-富马酸二钠混合物等)，葡糖酸缓冲剂(例如葡糖酸-葡糖酸钠混合物，葡糖酸-氢氧化钠混合物，葡糖酸-戊二酸钾混合物等)，草酸盐缓冲液(例如草酸-草酸钠混合物，草酸-氢氧化钠混合物，草酸-草酸钾混合物等)，乳酸盐缓冲液(例如乳酸-乳酸钠混合物，乳酸-氢氧化钠混合物，乳酸-乳酸钾混合物等)和醋酸盐缓冲液(例如乙酸-乙酸钠混合物，乙酸-氢氧化钠混合物等)。另外，可以使用磷酸盐缓冲液，组氨酸缓冲液和三甲胺盐，例如Tris。
可以添加防腐剂以阻止微生物生长，并且可以以范围为约0.2％-1％(w/v)的量添加。用于本公开内容使用的合适的防腐剂包括酚，苯甲醇，间甲酚，对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸丙酯，十八烷基二甲基苄基氯化铵，卤化苯甲烃铵(benzalconium halides)(例如氯化物，溴化物和碘化物)，氯化六烃季铵和对羟基苯甲酸烷基酯如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯，儿茶酚，间苯二酚，环己醇和3-戊醇。可以添加有时被称为“稳定剂”的等渗剂(isotonicifier)以确保本公开内容的液体组合物的等张性，并且包括多元糖醇，例如三元或更高级的糖醇，例如甘油，赤藓糖醇，阿拉伯糖醇，木糖醇，山梨糖醇和甘露糖醇。稳定剂指广泛类别的赋形剂，其功能范围可以从填充剂到溶解治疗剂或有助于防止变性或粘附于容器壁的添加剂。典型的稳定剂可以是多元糖醇(上面列举)。氨基酸如精氨酸，赖氨酸，甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，组氨酸，丙氨酸，鸟氨酸，L-亮氨酸，2-苯丙氨酸，谷氨酸，苏氨酸等；有机糖或糖醇，例如乳糖，海藻糖，水苏糖，甘露醇，山梨糖醇，木糖醇，核糖醇，肌肉肌醇，半乳糖醇，甘油等，包括环多醇如肌醇；聚乙二醇；氨基酸聚合物；含硫的还原剂，例如尿素，谷胱甘肽，硫辛酸，巯基乙酸钠，硫代甘油，α-单硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量多肽(例如10个残基或更少的肽)；蛋白质，例如人血清白蛋白，牛血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮单糖，例如木糖，甘露糖，果糖，葡萄糖；二糖，例如乳糖，麦芽糖，蔗糖和海藻糖；和三糖(trisaccacharides)，例如棉子糖；和多糖如葡聚糖。稳定剂可以以范围为每wt ADC 0.5至10wt％的量存在。
可以添加非离子表面活性剂或去污剂(也称为“润湿剂”)以帮助增溶糖蛋白并保护糖蛋白免于搅动诱导的聚集，这也允许制剂暴露于剪切表面应激而不引起蛋白质变性。合适的非离子型表面活性剂包括Polysorbates(20、80等)，Polyoxamers(184、188等)和Pluronic多元醇。非离子表面活性剂可以以约0.05mg/mL至约1.0mg/mL，例如约0.07mg/mL至约0.2mg/mL的范围存在。
其他杂项赋形剂包括填充剂(例如淀粉)，螯合剂(例如EDTA)，抗氧化剂(例如抗坏血酸，甲硫氨酸，维生素E)和助溶剂。
5.7使用方法
本文所述的抗糖-MUC1抗体或结合片段可以用于各种诊断测定法中。例如，抗体和结合片段可用于免疫测定法，例如竞争性结合测定法，直接和间接夹心测定法以及免疫沉淀测定法，包括免疫组织化学，酶联免疫吸附测定法(ELISA)，荧光激活细胞分选(FACS)和Western印迹。
本文所述的抗糖-MUC1抗体或结合片段也可用于放射照像体内成像，其中将用可检测部分如不透射线的试剂或放射性同位素标记的抗体施用于受试者，优选施用于血流中，并测定标记抗体在宿主中的存在和位置。此种成像技术可用于恶性的分期和治疗。
本文所述的抗糖-MUC1抗体或结合片段、ADC和CAR可用于治疗表达糖-MUC1的癌症，特别是上皮癌，例如乳腺癌，卵巢癌，胰腺癌和肺癌。
当使用本公开内容的CAR进行治疗时，本公开内容的治疗方法包括对具有表达糖MUC1的肿瘤的受试者施用有效量的经工程化改造以表达本公开内容的CAR的遗传修饰细胞，例如如第5.4节或实施方案97或实施方案98中所述。在第5.5.1节中描述了修饰细胞，特别是T细胞以表达CAR的方法。
6.实施例
6.1实施例1：抗糖-MUC1抗体的鉴定
6.1.1.概述
使用重组糖基转移酶开发了具有不同O-聚糖密度和Tn(GalNAcα1-O-Ser/Thr)糖型的多重复MUC1糖肽的化学酶法合成。使用不同的多肽GalNAc-转移酶同等型来指导O-聚糖占据位点(Bennett等人，1998)。发现最佳的疫苗设计是具有高O-聚糖密度的Tn糖型，并且发现与KLH缀合的糖肽克服耐受性。在野生型Balb/c小鼠中，具有完全O-聚糖占据的糖肽引发与乳腺癌细胞系中表达的MUC1反应的最强的抗体应答，因此代表了最有效的疫苗设计。引发的体液免疫应答显示出对癌细胞的明显特异性。
6.1.2.材料和方法
6.1.2.1化学酶法合成多聚体Tn MUC1糖肽
如Fontenot等人，1993最初报道，合成了MUC1 60聚体(VTSAPDTRPAPGSTAPPAHG)n＝3(SEQ ID NO:47)肽。使用的对照肽衍生自MUC2(PTTTPISTTTMVTPTPTPTC)(SEQ ID NO:51)和MUC4(CPLPVTDTSSASTGHATPLPV)(SEQ ID NO:52)的串联重复。如美国专利号6,465,220中所述，使用纯化的重组人糖基转移酶多肽GalNAc-T2,GalNAc-T4,和GalNAc-T1(Bennett等人,1998；Schwientek等人,2002)在体外将肽糖基化。在反应混合物(1mg肽/mL)中进行肽的GalNAc糖基化，所述反应混合物含有25mM甲次砷酸盐(cacodylate)缓冲液(pH7.4)、10mM MnCl2、0.25％Triton X-100和2mM UDP-GalNAc。使用GalNAc-T1获得每个TR具有两个GalNAc的1mg 60聚体肽的糖基化(MUC160Tn6)。使用GalNAc-T2获得每个TR掺入三个GalNAc(MUC160Tn9)。在与GalNAc-T4反应中使用MUC160Tn9作为底物进行MUC1 TR(MUC160Tn15)中所有五个假定的O-糖基化位点取代。使用纳米级反相柱(Poros R3,PerSeptive Biosystems,Framingham,MA)和MALDI-TOF质谱法监测糖基化。通过在1100Hewlett Packard系统(Avondale，PA)中使用0.1％三氟乙酸(TFA)和0–80％乙腈的梯度在Zorbax 300SB-C3柱(9.4mm x 25cm)(Agilent Technologies,Palo Alto,CA)上进行高效液相层析(HPLC)纯化糖肽。。通过使用10μg称重的肽作为标准品，通过UV 210吸光度比较HPLC峰来进行糖基化反应的定量和估计。肽的GalNAc糖基化通常产生80-90％回收。通过配备有延迟提取的Voyager DE或Voyager DE Pro MALDI-TOF质谱仪(PerSeptiveBiosystems)上的MALDI-TOF质谱法对纯化的糖肽进行表征。MALDI基质为溶于30％水性乙腈中0.1％TFA的2:1混合物中的10g/L的2,5-二羟基苯甲酸(Aldrich,Milwaukee,WI)。通过将1μL样品溶液放在探针尖端上，接着是1uL基质制备在0.1％TFA中溶解到约1pmol/uL浓度的样品以进行分析。所有质谱均以线性模式获得。使用GRAMS/386软件(GalacticIndustries，Salem，NH)进行数据处理。
6.1.2.2免疫方案
使用戊二醛将糖肽偶联至KLH(Pierce，Rockford，IL)。通过使用级分的抗MUC1ELISA在PD-10柱上通过大小排阻层析分析反应，来评估缀合的效率。发现与排除级分的基本上所有反应和预期含有肽的纳入级分中的不明显反应性。进一步的评估包括在ELISA中对具有相应的糖肽的KLH缀合物进行的比较滴定分析。这两种分析均指示缀合物几乎是完全的，这应导致KLH与糖肽的比例1:300。向雌性Balb/c野生型小鼠皮下注射总体积200uL(与Freunds佐剂Sigma的1:1混合物)中的10或15μg(糖)肽。小鼠间隔14天接受四次免疫，并且在第三和第四次免疫后1周通过尾或眼出血获得血液样品。
6.1.2.3鼠MAb抗Tn-MUC1的产生
从用与KLH偶联的完全GalNAc-糖基化的60聚体MUC1糖肽免疫的野生型Balb/c小鼠产生MAb。筛选基于糖肽ELISA，然后是用乳腺癌细胞系(MCF7和T47D)进行的免疫细胞学和用癌组织进行的免疫组织学。选择基于与相同小鼠的总血清相似的反应性模式。
6.1.2.4 ELISA
使用96孔MaxiSorp板(Nunc，Denmark)进行ELISA。将板在4℃用碳酸氢盐-碳酸盐缓冲液(pH 9.6)中的1μg/mL糖肽包被过夜，用磷酸盐缓冲液(PBS)中的5％牛血清白蛋白(BSA)封闭，接着于室温与血清(在PBS中稀释)或MAb温育2小时。用过氧化物酶缀合的兔抗小鼠免疫球蛋白(DakoCytomation,Glostrup,Denmark)或同种型特异性抗体过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠IgM,IgG1,IgG2a,IgG2b,或IgG3(Southern Biotechnology Associates,Birmingham,AL)检测结合的抗体。用O-苯二胺片(DakoCytomation)显色板并在492nm下读出。对照抗体包括抗MUC1抗体HMFG2和SM3(Burchell等人，1987)和抗碳水化合物抗体5F4(Tn)和3F1(STn)(Mandel等人，1991)。对照血清包括用与KLH连接的MUC4粘蛋白肽免疫的小鼠。
6.1.3.结果
使用与KLH缀合的GalNAc-MUC1 60聚体糖肽作为免疫原，产生针对GalNAc-MUC1的糖肽特异性mAb。使用ELISA测定法，生成的mAb GO2(5F7)与MUC1串联重复(VTSAPDTRPAPGSTAPPAHG)3(SEQ ID NO:47)特异性地起反应，已在体外使用纯化的重组人糖基转移酶GalNAc-T1,GalNAc-T2和GalNAc-T4使所述串联重复糖基化，其中与没有GalNAc残基的相应MUC1肽或具有相同类型的Tn糖型的无关糖肽不发生反应。图1中显示了ELISA测定法的结果。
6.2实施例2：抗糖-MUC1抗体的表征
6.2.1.概述
表征单克隆抗体GO2(5F7)结合与癌细胞相关的MUC1的Tn糖型的特异性。
6.2.2.材料和方法
6.2.2.1免疫细胞化学
将细胞系在冰冷的丙酮或甲醇:丙酮中固定10分钟。将固定的细胞与小鼠血清(1:200/1:400/1:800)或MAb于5℃温育过夜，然后在室温与异硫氰酸荧光素(FITC)缀合的兔抗小鼠免疫球蛋白(DakoCytomation)温育45分钟。将载玻片在含有对苯二胺的甘油中封固，并在Zeiss荧光显微镜(FluoresScience，Hallbergmoos，Germany)中进行检查。
6.2.2.2免疫组织化学
获得经福尔马林固定的、经石蜡包埋的乳腺癌组织。所有病例均按组织学类型常规分类。使用抗生物素蛋白-生物素过氧化物酶复合物方法进行免疫染色。将石蜡切片脱蜡，再水化，并用甲醇中的0.5％H2O2处理30分钟。将切片在TBS中漂洗，并与兔非免疫血清一起温育20分钟。漂洗切片，并与一抗在5℃温育过夜。漂洗切片并与TBS中以1:200稀释的生物素标记的兔抗小鼠血清(DakoCytomation)温育30分钟，然后用TBS漂洗，并且与抗生物素蛋白-生物素过氧化物酶复合物(DakoCytomation)一起温育1小时。将切片用TBS漂洗并用含有0.1％H2O2的0.05M TBS中新鲜制备的0.05％3,3′-二氨基联苯胺四盐酸盐显现。将切片用苏木精染色，脱水并封固。
6.2.3.结果
用GO2进行结肠直肠癌、胰腺癌和侵入性乳腺癌的免疫组织化学。结肠直肠癌组织的染色(图2)表明大部分癌细胞的细胞内和表面结构的强标记。相反，对健康的柱状上皮细胞观察到无反应性或显著较低的反应性。健康细胞中的标记仅限于细胞内结构，这预期由具有高分泌能力的细胞(如结肠柱状上皮)中存在大量生物合成中间体(经GalNAc修饰的糖蛋白)所致。用胰腺癌细胞(图3)和乳腺癌组织(图4)观察到相似的模式，与癌细胞具有强反应性，而具有与周围健康上皮或结缔组织细胞中的细胞内结构无反应性或有限的反应性。
6.3实施例3：抗糖-MUC1抗体的序列分析
制备来自产生单克隆抗体GO2的杂交瘤(5F7)的mRNA，进行逆转录和测序。
编码重链和轻链可变区及其信号序列的核苷酸序列分别在SEQ ID NO:11和SEQID NO:12中列出。由SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12编码的重链和轻链可变区分别在SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2中列出。预测的成熟可变区序列(在信号肽截短之后)分别在SEQ IDNO:3和SEQ ID NO:4中列出，并且分别由SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14编码。预测的重链CDR序列(IMGT定义)分别在SEQ ID NO:5-7中列出，并且预测的轻链CDR序列(IMGT定义)分别在SEQ ID NO:8-10中列出。
6.4实施例4：用抗糖-MUC1抗体将药物递送到癌细胞
6.4.1.概述
测试单克隆抗体GO2(5F7)将细胞毒剂递送至靶细胞的能力。
6.4.2.材料和方法
将OVCar人类卵巢癌细胞以1,000个细胞/孔添加至24孔细胞培养板。将单克隆抗体GO2和与抗微管蛋白试剂单甲基澳瑞他汀F(MMAF)(抗mFc-NC-MMAF)(Moradec目录号AM-101-AF)缀合的二抗添加至板，以给出以下浓度(以μg/ml计)的GO2和ADC：
Figure BDA0002543006580000911
将板于37℃温育48小时。温育48小时后，将
Figure BDA0002543006580000912
(Invitrogen)添加到每个孔，并测量600nm处的荧光。
6.4.3.结果
图5中显示了结果。结果显示了细胞毒性取决于一抗(GO2)浓度和所述抗体的存在，以及经ADC缀合的二抗的浓度和存在。换言之，当与携带细胞毒剂MMAF的二抗偶联时，GO2诱导此癌细胞系的细胞毒性。
6.5实施例5：用抗Muc1抗体进行循环肿瘤细胞定量
6.5.1.概述
测试单克隆抗体GO2(5F7)用于定量循环肿瘤细胞的能力。
6.5.2.材料和方法
将GO2缀合至磁分离珠并允许与不同浓度的肿瘤细胞的样品相互作用。用磁体将细胞和珠从溶液中拉出，并洗涤几次以除去未结合的物质。然后，将缀合至辣根过氧化物酶的GO2应用至含有结合的癌细胞的磁分离珠，温育，然后将未结合的缀合的GO2洗去。使用TNB作为底物进行比色反应。用硫酸终止反应，然后在样品上获得OD 450读数。
6.5.3.结果
在图6中显示结果。测定法的结果证明肿瘤细胞对GO2的结合。
6.6实施例6：使用抗糖-MUC1抗体对肿瘤组织进行免疫组织化学染色
6.6.1.材料和方法
将来自六个经福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)的组织微阵列(TMA)的切片切成2.5μm的厚度。本研究中使用来自乳腺癌(BC)、结肠直肠癌(CRC)、卵巢癌(OVC)、非小细胞肺癌(NSCLC)和前列腺癌(PrC)肿瘤的TMA。每个TMA可使用25-47个肿瘤组织核心进行评估。根据TMA，核心尺寸为1mm、2mm或3mm。每个组织核心代表一名患者。
在Discovery XT自动染色机(Ventana Medical Systems)上进行染色。用细胞条件1(CC1)溶液(Ventana Medical Systems)进行抗原恢复后，在Dako绿色培养基抗体稀释剂中以1g/mL的浓度应用GO2，并在37℃温育60分钟。使用在DAB(棕色沉淀物)中可视化的Optiview DAB IHC检测试剂盒(Ventana Medical Systems)检测GO2与肿瘤细胞的结合。
6.6.2.结果
图7中显示了MUC1阳性TMA肿瘤核心的代表性图像。在BC和OVC TMA中，大多数点(>90％)显示出GO2与肿瘤细胞的中等或强结合。70％和51％的NSCLC和CRC病例分别显示抗体与肿瘤细胞的中等和强结合。在前列腺癌中，抗原似乎是较少表达的。当应用GO-2时，TMA1中仅28％的点揭示中等或强的染色强度。染色模式总是胞质的，并且在许多情况下是膜结合的。在少数核心中观察到顶膜染色模式。
6.7实施例7：T细胞双特异性(TCB)形式的抗MUC1抗体的生产和纯化
6.7.1.材料和方法
6.7.1.1表达载体的产生
将GO2抗体转化为TCB形式，包括Fc区中的突出-入-孔和P329G/L234A/L235A(“PGLALA”)突变以及MUC1 CH1(147E/213E；“EE”)和CL(123R/124K；“RK”)区域中的带电荷的残基(参见SEQ ID NO:43-46)。图8中显示了TCB抗体。简言之，合成了GO2 mAb的可变重链和可变轻链(Geneart,Regensburg,Germany)，并插入到合适的表达载体中，在其中将它们融合到合适的人恒定重链或人恒定轻链。这些载体中的表达盒由CMV启动子、具有5'UTR的内含子A和BGH聚腺苷酸化位点组成。此外，质粒含有来自埃巴病毒的oriP区，用于在含有EBV核抗原(EBNA)的HEK293细胞中稳定维持。
6.7.1.2瞬时转染和产生
如下使用PEI介导的转染程序在HEK293 EBNA细胞中瞬时产生抗体。将HEK293EBNA细胞在含有6mM L-谷氨酰胺的Excell培养基中不含血清的悬浮液中培养。为了在500ml摇瓶中产生抗体，在转染前24小时接种3亿个HEK293 EBNA细胞(对于备用标度，相应调整所有量)。为了进行转染，将细胞以210x g离心10分钟，并用预热的20ml CD CHO培养基替换上清液。将表达载体在20ml CD CHO培养基中混合至最终量200μg DNA。添加540μl PEI后，将溶液涡旋振荡15秒，然后在室温温育10分钟。之后，将细胞与DNA/PEI溶液混合，转移至500ml摇瓶，并37℃在具有5％CO2气氛的培养箱中温育3小时。温育后，添加160ml含6mM谷氨酰胺、1.25mM丙戊酸和12.5％Pepsoy的
Figure BDA0002543006580000932
培养基(Sigma-Aldrich)，并将细胞培养24小时。转染后一天，添加12％进料7(48mL)+3g/L葡萄糖。7天后，收集培养上清液，以通过以3000xg离心45分钟来纯化。将溶液无菌过滤(0.22μm滤器)，并添加终浓度0.01％w/v的叠氮化钠。然后于4℃储存溶液。
6.7.1.3抗体纯化
通过使用蛋白A的亲和层析，然后通过大小排阻层析纯化分泌性蛋白质。对于亲和层析，在用20mM磷酸钠，20mM柠檬酸钠pH 7.5平衡的蛋白A MabSelect SuRe柱(GEHealthcare)上加载上清液。通过用平衡缓冲液洗涤除去未结合的蛋白质。使用用20mM柠檬酸钠、100mM氯化钠、100mM甘氨酸，pH 3.0创建的步骤(标准IgG)或梯度(双特异性抗体)洗脱来洗脱结合的蛋白质。通过添加1/10(v/v)的0.5M磷酸钠pH8.0调节收集的级分的pH。将蛋白质浓缩并过滤，然后在用20mM组氨酸、140mM氯化钠，pH 6.0平衡的HiLoad Superdex200柱(GE Healthcare)上加载。
通过分析大小排阻层析分析洗脱级分的聚集物含量。因此，将30μl每种级份应用到用200mM精氨酸、25mM K2PO4、125mM氯化钠、0.02％NaN3，pH 6.7平衡的TSK G3000 SWXL柱(TOSOH，7.8mm x 30cm)上。合并含有小于2％寡聚体的级份，并使用离心浓缩器(Millipore,
Figure BDA0002543006580000931
ULTRA–15,30k MWCO)浓缩至终浓度1-1.5mg/ml。于-80℃储存纯化的蛋白质。
6.7.2.结果
表5中显示了GO2 TCB抗体的生产产率和质量。
Figure BDA0002543006580000941
6.8实施例8：使用Jurkat-NFAT报告物测定法离体监测未经消化的来源于患者的肿瘤样品中的靶物表达
6.8.1.概述
使用GO2 TCB，使用Jurkat NFAT报告物测定法离体监测未经消化的原代人肿瘤样品中的靶物表达(糖-MUC1)。
6.8.2.材料和方法
6.8.2.1材料
·GO2 TCB(参见实施例7)
·DP47 TCB(非靶向，阴性对照)
·基质胶(货号734-1101,Corning/VWR,Switzerland)
·
Figure BDA0002543006580000942
超低附着多孔板(货号CLS7007-24EA,Sigma)
·细胞培养微板，96孔(货号655098,Greiner Bio-one,Switzerland)
·RPMI1640培养基(货号42401-018,FisherScientific,Schweiz)
·Jurkat培养基：RPMI1640培养基，具有2g/l D-葡萄糖、2g/l NaHCO3、10％FCS、25mM HEPES、2mM L-谷氨酰胺、1x NEAA、1x丙酮酸钠、200μg/ml潮霉素B
·Jurkat NFAT萤光素酶报告细胞(Promega)
·从德国Indivumed GmbH接受的肿瘤样品。样品在运输培养基中运输过夜。手术后约24小时，将样品切成小块。
6.8.2.2方法
通过添加17μl冷的基质胶制备96孔细胞培养微板。将板在37℃温育2分钟，然后添加肿瘤块(一式三份)。每孔添加33μl冷的基质胶，并将板在37℃再温育2分钟。每孔添加100μl(50nM或5nM)TCB抗体稀释(在没有潮霉素但有2X青霉素/链霉素的Jurkat培养基中稀释)。收获Jurkat-NFAT报告细胞，并使用ViCell评估存活力。将细胞以350x g离心7分钟，然后将它们重悬于不含潮霉素的Jurkat培养基中。每孔添加50μl细胞悬浮液(50,000个细胞/孔)。将板在加湿的培养箱中于37℃温育4至5小时，然后将它取出进行发光读数。对每孔添加50μl ONE-Glo溶液，并在黑暗中于室温温育10分钟。以5秒/孔检测时间使用WALLACVictor3 ELISA阅读器(PerkinElmer2030)检测发光。
6.8.3.结果
在图9-11中显示了来自三名患者的肿瘤样品的结果。图9中所示的结果来自肿瘤样品，其获自患有支气管和肺部的恶性新生物：中叶、支气管或鳞状细胞癌的患者。图10中显示的结果来自肿瘤样品，其获自具有支气管和肺部恶性新生物：下叶、支气管或肺部，非角化鳞状细胞癌的患者。图11中显示的结果来自肿瘤样品，其获自具有支气管和肺部恶性新生物：上叶、支气管或肺部，腺泡型腺癌的患者。图9-11中的每个棒表示一式三份的平均值。标准差由错误棒指示。虚线指示与没有任何TCB的肿瘤样品一起温育的Jurkat NFAT细胞的发光。使用两尾无配对t检验进行统计分析。认为低于0.05的P值是显著的，并用星号指示(*P≤0.05；**P≤0.001；***P≤0.001)。在图9-11的每个中，与用DP47阴性对照TCB温育的样品相比，与GO2 TCB温育的肿瘤样品显示显著更多的发光。
6.9实施例9：GO2 TCB的体外表征
6.9.1.概述
在表达MUC1的肿瘤细胞上对识别肿瘤特异性异常糖基化的MUC1的GO2 TCB(实施例7)进行了功能性表征。
6.9.2.材料和方法
6.9.2.1细胞系和PBMC
将T3M4 pfzv和MCF7 cs工程化肿瘤细胞系在具有10％FCS和2mM谷氨酰胺的DMEM中培养。MCF10A是人非致瘤性乳腺上皮细胞系(
Figure BDA0002543006580000951
CRL-10317)。HBEpiC是人支气管上皮细胞(Sciencell#3210)。通过使用来自健康志愿者的全血通过梯度离心分离PBMC。
6.9.2.2通过流式细胞术得到的靶物结合
如所指示的靶细胞用细胞解离缓冲液收获，用PBS洗涤并重悬在FACS缓冲液中。在96孔圆形底板中进行抗体染色。每孔接种200,000个细胞。将板以400g离心4分钟，并除去上清液。将测试抗体在FACS缓冲液中稀释，并将30μl抗体溶液在4℃添加到细胞30分钟。为了除去未结合的抗体，将细胞用FACS缓冲液洗涤两次，然后添加稀释的二抗(PE缀合的AffiniPure F(ab')2片段山羊抗人IgGFcγ片段特异性，Jackson ImmunoResearch#109-116-170)。在4℃温育30分钟后，洗去未结合的二抗。测量前，将细胞重悬于200μl FACS缓冲液中，并使用BD Fortessa通过流式细胞仪进行分析。一式三份进行测定法。
6.9.2.3 T细胞介导的肿瘤细胞杀伤和T细胞活化
用胰蛋白酶/EDTA收获靶细胞，计数并检查存活力。以每ml 300,000个细胞的终浓度将细胞重悬于其各自的培养基中。然后将100μl的靶细胞悬浮液转移到96平底板的每个孔中。将板在培养箱中于37℃温育过夜，以使细胞粘附于平板。次日，从全血中分离出PBMC。将血液用PBS以2:1稀释并覆盖在Leucosep管中的15ml Histopaque-1077(#10771,Sigma-Aldrich)上，并在不制动的情况下以450g离心30分钟。离心后，用10ml移液管收集含有细胞的条带，并转移到50ml管中。将管充满PBS直至50ml，然后离心(400g，10分钟，室温)。除去上清液，并将沉淀物重悬于PBS中。离心(300g，10分钟，室温)后，弃去上清液，合并2个管，并且重复洗涤步骤(这次离心350g，10分钟，室温)。然后，将细胞重悬，并将沉淀物合并在50mlPBS中用于细胞计数。计数后，将细胞离心(350g，10分钟，室温)，以每ml 600万个细胞重悬于含2％FCS和2nM谷氨酰胺的RPMI中。从分配的靶细胞中除去培养基，并添加在具有2％FCS和2nM谷氨酰胺的RPMI中稀释的测试抗体。将效应细胞溶液的300,000个细胞转移到每个孔，产生10:1的E:T比率。为了确定最大释放，将靶细胞用Triton X-100裂解。使用细胞毒性检测试剂盒(1644793，Roche Applied Science)在24小时和48小时后确定LDH释放。通过流式细胞术测量肿瘤细胞杀伤后T细胞上的活化标志物上调。简言之，收获PBMC，转移到96孔圆底板中，并用FACS缓冲液中稀释的CD4 APC(300514,BioLegend),CD8 FITC(344704,BioLegend),CD25 BV421(302630,BioLegend),CD69 PE(310906,BioLegend)抗体染色。在4℃温育30分钟后，将细胞用FACS缓冲液洗涤两次。在使用BD Fortessa II测量荧光之前，将细胞重悬于200μl FACS缓冲液中。一式三份进行测定法。
6.9.2.4通过细胞计数珠阵列得到的细胞因子/趋化因子释放
根据制造商的指南，使用细胞计数珠阵列(CBA)通过流式细胞术测量上清液中的细胞因子/趋化因子分泌。收集来自T细胞介导的杀伤测定法的上清液，并在-20℃储存。随后对上清液进行解冻，并且根据制造商的用法说明测试。使用以下CBA试剂盒(BDBiosciences)：CBA人干扰素gamma(IFNγ)Flex Set(E7)、CBA人粒酶B Flex Set(D7)、CBA人IL6 Flex Set(A7)、CBA人IL8 Flex Set(A9)、CBA人IL10 Flex Set(B7)和CBA人肿瘤坏死因子(TNF)Flex Set(D9)。使用BD FACS Canto II测量样品，并使用Diva软件(BDBiosciences)进行分析。一式三份进行测定法。
6.9.3.结果
证实了GO2 TCB与乳腺癌细胞系MCF7和胰腺癌细胞系T3M4(两者都被工程化改造以表达异常糖基化的MUC1)的结合(图12)。随后，使用新鲜分离的PBMC，在两种肿瘤细胞系MCF7和T3M4上测试GO2 TCB的活性(图13和图14)。在24小时后检测到对这两种细胞系的肿瘤细胞杀伤，并且在48小时后甚至更强。这伴随着CD4 T细胞和CD8 T细胞的强烈活化，其通过两种活化标志物CD25和CD69的上调和IL6,IL8,IL10,IFNγ,TNFα和粒酶B对上清液的释放测定。阴性对照包括相应的未靶向的TCB。
为了证明GO2 TCB不结合上皮细胞上正常糖基化的MUC1，测试了与作为人非致瘤性乳腺上皮细胞系的MCF10A和作为原代人支气管上皮细胞的HBEpiC的结合。阳性对照包括HMFG1 TCB，其不区分正常细胞和肿瘤细胞上表达的MUC1。发现HFMG1 TCB结合这两种测试的细胞，这证实了MUC1的表达，但GO2 TCB无法结合这些细胞(图15)。此外，还对GO2 TCB进行了测试，以查看在表达MUC1的正常上皮细胞存在下，它是否会诱导杀伤或T细胞活化。这在MCF10A细胞上进行了测试，并且用GO2 TCB无法检测到杀伤或T细胞活化，而HMFG1 TCB诱导杀伤和T细胞活化(图16)。
6.10实施例10：通过表面等离振子共振进行GO2和GO2 TCB抗体的功能表征
6.10.1.概述
通过表面等离振子共振表征GO2和GO2 TCB(实施例7)。
6.10.2.材料和方法
6.10.2.1 GO2和GO2 TCB与固定化的糖肽的结合
通过表面等离振子共振(SPR)评估GO2抗体和GO2 TCB与人和猕猴糖肽的结合(表6)。所有SPR实验均在25℃在Biacore T200上以HBS-EP作为运行缓冲液(0.01M HEPES pH7.4,0.15M NaCl,3mM EDTA,0.005％表面活性剂P20,Biacore,Freiburg/Germany)进行。
Figure BDA0002543006580000981
将生物素化的糖肽溶解在PBS中，并且终浓度在0.9至1.8mg/ml之间(表6)。将生物素化的糖肽直接偶联到链霉亲合素(SA)传感器芯片的流动池。使用了高达880个共振单位(RU)的固定化水平。在240秒内且以1000nM的浓度以30μL/分钟的流速注射GO2抗体或GO2TCB通过流动池(图17)。监测解离500秒。通过扣除在未固定化蛋白质的参照流动池中获得的响应来校正本体折射率差。
6.10.2.2 GO2和GO2 TCB对固定化糖肽的亲合力
通过表面等离子体共振(SPR)评估GO2和GO2TCB的亲合力。所有SPR实验均在25℃在Biacore T200上以HBS-EP作为运行缓冲液(0.01M HEPES pH 7.4,0.15M NaCl,3mMEDTA,0.005％表面活性剂P20,Biacore,Freiburg/Germany)进行。将物素化的糖肽(表6)直接偶联到链霉亲合素(SA)传感器芯片的流动池。使用高达200个共振单位(RU)的固定化水平。
在120秒内且以3.9至1000nM(1:2稀释)的浓度范围以30μL/分钟的流速注射GO2抗体或GO2 TCB通过流动池。监测解离400秒。通过扣除在未固定化蛋白质的参照流动池中获得的响应来校正本体折射率差。尽管存在相互作用二价，但通过使用Biaeval软件(GEHealthcare)将曲线拟合到1:1Langmuir结合得出KD。因此，“表观”KD只能用于比较目的。
6.10.3.结果
从图18的传感图中可以看出，GO2抗体(图18A)和GO2 TCB(图18B)结合人和猕猴糖肽两者。相比于人糖肽，GO2抗体和GO2 TCB以更高的亲和力结合猕猴糖肽。
如可以在图19中看出，二价GO2结合剂(IgG，TCB)对人糖肽的结合以三位数的纳摩尔计(图19A和19C)，而对猕猴糖肽的结合以两位数纳摩尔计(图19B和19D)。
6.11实施例11：猕猴中的GO2 TCB探索性单剂药动学和可耐受性研究
6.11.1.概述
本研究的目的是测定当通过对猕猴的单次静脉内注射给予时，实施例7中所述的GO2 TCB的药动学和可耐受性。
6.11.2.材料和方法
6.11.2.1 GO2 TCB的制备
GO2 TCB(2.12mg/mL)和制剂缓冲液(20mM组氨酸，140mM NaCl，0.01％Tween 20；pH 6.0)的冷冻原液的解冻在设置为维持4℃的冰箱中过夜完成。通过，在无菌条件下以适合于满足通过用制剂缓冲液稀释的剂量水平要求的浓度制备测试品给药制剂。
给药制剂在注射前2小时内制备，并在室温下储存直至使用。聚丙烯容器用于制备和储存给药制剂以防止吸附。给药制剂不应过滤，也不搅拌或摇动。通过温和移液或温和摆动容器完成任何混合。
6.11.2.2动物
在研究中使用2-4岁龄的猕猴(Macaca fascicularis)。开始给药前，使动物适应测试房灵长类毒理学适应至少6周。
在给药开始之前的一周期间，基于令人满意的兽医检查(到达后不久进行)、临床观察记录、体重概况和临床病理学检查，批准动物进入实验。
根据提供的组相容性信息，将为研究选择的动物随机分配到笼中，然后分配个别的研究编号。以多达5只的组将动物分配到笼中。
6.11.2.3畜牧业
在可能的情况下，按性别在多达5只的组中在两个层分群围栏中对动物进行群居饲养，该围栏的测量为下层上1.61x 1.66x 2.5m和上层上1.61x 1.66x 2.03m。草垫材料是木屑。草垫中没有干扰研究目标的已知污染物。
动物室环境的目标条件如下：
温度：18-24℃
湿度：40-70％
通风：每小时至少换气10次
光照周期：光照12小时和黑暗12小时(除非被研究程序/活动打断时)。
具有对温度和湿度的自动控制，其被连续监测和记录。有光周期的自动控制。
在整个研究中，特殊饮食服务(SDS)MP(E)短SQC饮食作为每日定量日粮提供。每只动物每天提供约200克饲料日粮一次。饲料中没有会干扰研究目标的已知污染物。这些动物可从公共供应处自由获取水。水中没有会干扰研究目标的已知污染物。
强化动物的栖息地环境，以促进群居互动，游戏和探索。这些动物具有栖木和材料，例如塑料玩具、球、攀爬架和不锈钢镜。这些经常交换以减少熟悉度。更换之前，所有玩具和攀爬架都要彻底清洁以避免交叉污染。通常每天也为动物提供一系列其他食物，例如混合饲料，蔬菜，坚果，饼干和水果。
在整个研究过程中兽医护理是可用的，并且由兽医人员检查动物，如根据临床体征或其他变化保证。
6.11.2.4实验设计
对一只雄性和一只雌性动物施用GO2 TCB。
Figure BDA0002543006580001001
通过在隐静脉或尾静脉中单次静脉内缓慢推注(1-2分钟)，将GO2TCB施用于适当的动物，相隔至少8天交错，使得在任何一天中只有一名雄性和一名雌性接受新的剂量水平。基于来自先前剂量水平的观察(包括临床病理数据)，对下一剂量组增加或减少剂量。每个剂量水平均使用未处理的动物。使用附有Vygon输注针的注射器给予剂量。
在给药后约72小时(在采集了最后的安排样品后)对动物进行尸检。对于由于严重的临床症状而必须在安排的日期之前终止的所有动物，分析临床病理(若可行的话，终止前额外的取样)和组织病理学的完整组。
由于此途径是临床应用的可能途径，因此已经选择了静脉内注射施用途径用于该研究。选择低剂量和高剂量水平以覆盖临床上相关的剂量范围并最小化对动物的潜在伤害。基于具有相似效力的相似T细胞双特异性抗体的猕猴中的经历来选择低剂量，并且高剂量代表其3倍增量。
6.11.3.结果
GO2 TCB在测试剂量时是耐受的。
7.具体实施方案，参考文献的引用
尽管已经示出和描述了各种具体实施方案，但是应当理解，可以在不脱离本公开内容的精神和范围的情况下进行各种改变。本公开内容通过以下阐述的编号的实施方案示例。
1.抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其：
a.优先结合与正常细胞相比在癌细胞上过表达的糖-MUC1表位；和
b.与抗体或抗原结合片段竞争对乳腺癌细胞系MCF7或T47D的结合，所述抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:3的重链可变(VH)序列和SEQ ID NO:4的轻链可变(VL)序列。
2.抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其
a.结合MUC1串联重复(VTSAPDTRPAPGSTAPPAHG)3，其已经使用纯化的重组人糖基转移酶GalNAc-T1、GalNAc-T2和GalNAc-T4在体外糖基化，并且(下文称为“第一表位”)；和
b.与抗体或抗原结合片段竞争对乳腺癌细胞系MCF7或T47D的结合，所述抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:3的重链可变(VH)序列和SEQ ID NO:4的轻链可变(VL)序列。
3.实施方案1或实施方案2的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其包含互补决定区(CDR)H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，所述互补决定区(CDR)H1包含SEQ IDNO:33的氨基酸序列、所述CDR-H2包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列、所述CDR-H3包含SEQ IDNO:25的氨基酸序列、所述CDR-L1包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列、所述CDR-L2包含SEQ IDNO:9的氨基酸序列，所述CDR-L3包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列。
4.实施方案3的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
5.实施方案3的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列。
6.实施方案3的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列。
7.实施方案3的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列。
8.实施方案3-7中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中CDR-H2包含SEQID NO:6的氨基酸序列。
9.实施方案3-7中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中CDR-H2包含SEQID NO:24的氨基酸序列。
10.实施方案3-9中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中CDR-H3包含SEQID NO:7的氨基酸序列。
11.实施方案3-10中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列。
12.实施方案3-10中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列。
13.实施方案3-12中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中CDR-L2包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列。
14.实施方案3-13中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中CDR-L3包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。
15.实施方案1或实施方案2的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中所述VH包含SEQ ID NO:5-7的互补决定区(CDR)，并且所述VL包含SEQ ID NO:8-10的CDR。
16.实施方案1或实施方案2的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中所述VH包含SEQ ID NO:23-25的互补决定区(CDR)，并且所述VL包含SEQ ID NO:26、27和10的CDR。
17.实施方案1或实施方案2的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中所述VH包含SEQ ID NO:28、29和25的互补决定区(CDR)，并且所述VL包含SEQ ID NO:30、9和31的CDR。
18.实施方案1-17中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其是嵌合抗体或人源化抗体。
19.实施方案1-18中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQ ID NO:3具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:4具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
20.实施方案1-18中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQ ID NO:3具有至少97％序列同一性的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:4具有至少97％序列同一性的氨基酸序列。
21.实施方案1-18中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQ ID NO:3具有至少99％序列同一性的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:4具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
22.实施方案1或实施方案2的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中所述VH包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，并且所述VL包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
23.实施方案1-22中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其是多价的。
24.实施方案1-22中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其为单链可变片段(scFv)的形式。
25.实施方案24的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中所述scFv包含在所述轻链可变片段N端的所述重链可变片段。
26.实施方案24的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中所述scFv重链可变片段和轻链可变片段与4-15个氨基酸的接头序列共价结合。
27.实施方案1-22中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其为多特异性抗体的形式。
28.实施方案27的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中所述多特异性抗体是结合第二表位的双特异性抗体，所述第二表位与所述第一表位不相同。
29.实施方案28的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中所述双特异性抗体是CrossMab、Fab臂交换抗体、双特异性T细胞衔接子(BiTE)或双重亲和力再靶向分子(DART)。
30.实施方案29的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中所述双特异性抗体是CrossMab。
31.实施方案30的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中所述双特异性抗体是CrossMabFAB。
32.实施方案30的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中所述双特异性抗体是CrossMabVH-VL。
33.实施方案30的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中所述双特异性抗体是CrossMabCH1-CL。
34.实施方案29的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中所述双特异性抗体是Fab臂交换抗体。
35.实施方案29的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中所述双特异性抗体是双重亲和力再靶向分子(DART)。
36.实施方案29的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中所述双特异性抗体是双特异性T细胞衔接子(BiTE)。
37.实施方案28-35中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中所述第二表位是MUC1表位。
38.实施方案28-35中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中所述第二表位是与正常细胞相比在癌细胞上过表达的MUC1表位。
39.实施方案28-36中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中所述第二表位是T细胞表位。
40.实施方案39的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中所述T细胞表位包括CD3表位、CD8表位、CD16表位、CD25表位、CD28表位或NKG2D表位。
41.实施方案40的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中所述T细胞表位包含CD3表位，所述CD3表位任选地是人CD3中存在的表位。
42.实施方案41的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中所述CD3表位包括CD3gamma表位、CD3 delta表位、CD3 epsilon表位或CD3 zeta表位。
43.实施方案1-42中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其与可检测部分缀合。
44.实施方案43的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中可检测标志物是酶、放射性同位素或荧光标记物。
45.双特异性抗体，其包含结合CD3(任选地人CD3)的第一抗原结合域和结合糖-MUC1的第二抗原结合域，其中所述双特异性抗体与包含SEQ ID NO:3的重链可变(VH)序列和SEQ ID NO:4的轻链可变(VL)序列的抗体或抗原结合片段竞争对乳腺癌细胞系MCF7或T47D的结合，并且其中所述第一抗原结合域含有包含SEQ ID NO:34的重链CDR-H1，SEQ IDNO:35的CDR-H2和SEQ ID NO:36的CDR-H3的重链可变区；和包含SEQ ID NO:37的轻链CDR-L1，SEQ ID NO:38的CDR-L2和SEQ ID NO:39的CDR-L3的轻链可变区。
46.实施方案45的双特异性抗体，其中所述第二抗原结合域包含(i)包含SEQ IDNO:5的CDR-H1，SEQ ID NO:6的CDR-H2和SEQ ID NO:7的CDR-H3的重链可变区；和包含SEQID NO:8的轻链CDR-L1，SEQ ID NO:9的CDR-L2和SEQ ID NO:10的CDR-L3的轻链可变区。
47.实施方案45或实施方案46的双特异性抗体，其中所述第一抗原结合域包含与SEQ ID NO:40的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的重链可变区序列和与SEQ ID NO:41的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的轻链可变区序列。
48.实施方案47的双特异性抗体，所述第一抗原结合域包含SEQ ID NO:40的重链可变区序列和SEQ ID NO:41的轻链可变区序列。
49.实施方案45至48中任一项的双特异性抗体，其中所述第二抗原结合域包含与SEQ ID NO:3的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的重链可变区序列和与SEQ ID NO:4的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的轻链可变区序列。
50.实施方案49的双特异性抗体，其中所述第二抗原结合域包含SEQ ID NO:3的重链可变区序列和SEQ ID NO:4的轻链可变区序列。
51.实施方案45至50中任一项的双特异性抗体，其中所述第一和/或第二抗原结合域是Fab分子。
52.实施方案51的双特异性抗体，其中所述第一抗原结合域是交换Fab分子，其中所述Fab轻链和所述Fab重链的可变区或恒定区是交换的。
53.实施方案52的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体的第一和第二抗原结合域均为Fab分子，并且在所述抗原结合域之一(特别是所述第一抗原结合域)中，所述Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH彼此替换，其中
a.在所述第一抗原结合域的恒定域CL中，124位的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代(根据Kabat编号)，并且其中在所述第一抗原结合域的恒定域CH1中，147位的氨基酸或213位的氨基酸被带负电荷的氨基酸取代(根据Kabat EU索引编号)；或
b.在所述第二抗原结合域的恒定域CL中，124位的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代(根据Kabat编号)，并且其中在所述第二抗原结合域的恒定域CH1中，147位的氨基酸或213位的氨基酸被带负电荷的氨基酸取代(根据Kabat EU索引编号)。
其中具有VH/VL交换的抗原结合域的恒定域CL和CH1不彼此取代。
54.实施方案53的双特异性抗体，其中
a.在所述第一抗原结合域的恒定域CL中，124位的氨基酸独立被赖氨酸(K)，精氨酸(R)或组氨酸(H)取代(根据Kabat编号)，并在所述第一抗原结合域的恒定域CH1中，147位的氨基酸或213位的氨基酸独立被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代(根据Kabat EU索引编号)；或
b.在所述第二抗原结合域的恒定域CL中，位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)，精氨酸(R)或组氨酸(H)独立取代(根据Kabat编号)，并且在所述第二抗原结合域的恒定域CH1中，第147位的氨基酸或第213位的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立取代(根据KabatEU索引编号)。
55.实施方案54的双特异性抗体，其中在所述第二抗原结合域的恒定域CL中，124位的氨基酸独立被赖氨酸(K)，精氨酸(R)或组氨酸(H)取代(根据Kabat编号)，并且在所述第二抗原结合域的恒定域CH1中，147位的氨基酸或213位的氨基酸独立被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代(根据Kabat EU索引编号)。
56.实施方案55的双特异性抗体，其中在所述第二抗原结合域的恒定域CL中，124位的氨基酸独立被赖氨酸(K)，精氨酸(R)或组氨酸(H)取代(根据Kabat编号)，并且在所述第二抗原结合域的恒定域CH1中，147位的氨基酸独立被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代(根据Kabat EU索引编号)。
57.实施方案55的双特异性抗体，在所述第二抗原结合域的恒定域CL中，124位的氨基酸独立被赖氨酸(K)，精氨酸(R)或组氨酸(H)取代(根据Kabat编号)，并且123位的氨基酸独立被赖氨酸(K)，精氨酸(R)或组氨酸(H)取代(根据Kabat编号)，并且在所述第二抗原结合域的恒定域CH1中，147位的氨基酸独立被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代(根据KabatEU索引编号)，并且213位的氨基酸独立被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代(根据Kabat EU索引)。
58.实施方案57的双特异性抗体，其中在所述第二抗原结合域的恒定域CL中，124位的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)，并且123位的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)，并且在所述第二抗原结合域的恒定域CH1中，147位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat EU索引编号)，并且213位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat EU索引编号)。
59.实施方案57的双特异性抗体，其中在所述第二抗原结合域的恒定域CL中，124位的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)，并且123位的氨基酸被精氨酸(R)取代(根据Kabat编号)，并且在所述第二抗原结合域的恒定域CH1中，147位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat EU索引编号)，并且213位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat EU索引编号)。
60.实施方案53至59中任一项的双特异性抗体，其中所述第二抗原结合域的恒定域CL是kappa同种型的。
61.实施方案45至60中任一项的双特异性抗体，其中所述第一和第二抗原结合域彼此融合，任选地通过肽接头彼此融合。
62.实施方案61的双特异性抗体，其中所述第一和第二抗原结合域各自是Fab分子，并且(i)所述第二抗原结合域在Fab重链的C端与第一抗原结合域的Fab重链的N端融合，或(ii)所述第一抗原结合域在Fab重链的C端与第二抗原结合域的Fab重链的N端融合。
63.实施方案45至62中任一项的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体提供与CD3的单价结合。
64.实施方案63的双特异性抗体，其包含特异性结合糖-MUC1的两个抗原结合域。
65.实施方案64的双特异性抗体，其中特异性结合糖-MUC1的两个抗原结合域包含相同的氨基酸序列。
66.实施方案45至65中任一项的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体进一步包含由第一亚基和第二亚基组成的Fc域。
67.实施方案66的双特异性抗体，其中所述Fc域是IgG Fc域。
68.实施方案67的双特异性抗体，其中所述Fc域是IgG1 Fc域。
69.实施方案67的双特异性抗体，其中所述Fc域是IgG4 Fc域。
70.实施方案69的双特异性抗体，其中所述IgG4 Fc域在S228位(Kabat EU索引编号)处包含氨基酸取代，优选为氨基酸取代S228P。
71.实施方案66的双特异性抗体，其中所述Fc域是人Fc域。
72.实施方案71的双特异性抗体，其中所述Fc域是人IgG1 Fc域，其任选地包含SEQID NO:42。
73.实施方案66至72中任一项的双特异性抗体，其中所述第一、第二和(在存在的情况下)第三抗原结合域各自是Fab分子，(a)(i)所述第二抗原结合域在Fab重链的C端与所述第一抗原结合域的Fab重链的N端融合，并且所述第一抗原结合域在所述Fab重链的C端与所述Fc域的第一亚基的N端融合，或(ii)所述第一抗原结合域在所述Fab重链的C端与所述第二抗原结合域的Fab重链的N端融合，并且所述第二抗原结合域在所述Fab重链的C端与所述Fc域的第一亚基的N端融合；并且(b)在存在第三抗原结合域的情况下，所述第三抗原结合域在所述Fab重链的C端与所述Fc域的第二亚基的N端融合。
74.实施方案66至73中任一项的双特异性抗体，其中所述Fc域包含促进Fc域的第一和第二亚基缔合的修饰。
75.实施方案66至74中任一项的双特异性抗体，其中所述Fc域包含一个或多个降低与Fc受体的结合和/或效应器功能的氨基酸取代。
76.实施方案45的双特异性抗体，其包含
a.特异性结合CD3的第一抗原结合域，其中所述第一抗原结合域是交换Fab分子，其中所述Fab轻链和Fab重链的可变区或恒定区，特别是可变区是交换的；
b.特异性结合糖-MUC1的第二和第三抗原结合域，其包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:5的重链CDR-H1，SEQ ID NO:6的CDR-H2和SEQ ID NO:7的CDR-H3；该轻链可变区包含SEQ ID NO:8的轻链CDR-L1，SEQ ID NO:9的CDR-L2和SEQ IDNO:10的CDR-L3，其中所述第二和第三抗原结合域各自是Fab分子；
c.由能够稳定缔合的第一和第二亚基构成的Fc域，
其中所述第二抗原结合域在所述Fab重链的C端与所述第一抗原结合域的Fab重链的N端融合，并且所述第一抗原结合域在所述Fab重链的C端与所述Fc域的第一亚基的N端融合，且其中所述第三抗原结合域在所述Fab重链的C端与所述Fc域的第二亚基的N端融合。
77.实施方案77的双特异性抗体，其中所述第一抗原结合域包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:34的重链CDR-H1，SEQ ID NO:35的CDR-H2和SEQID NO:36的CDR-H3；该轻链可变区包含SEQ ID NO:37的轻链CDR-L1，SEQ ID NO:38的CDR-L2和SEQ ID NO:39的CDR-L3。
78.实施方案77的双特异性抗体，其中所述第一抗原结合域包含与SEQ ID NO:40的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的重链可变区序列和与SEQID NO:41的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的轻链可变区序列。
79.实施方案78的双特异性抗体，其中所述第一抗原结合域包含SEQ ID NO:40的重链可变区序列和SEQ ID NO:41的轻链可变区序列。
80.实施方案76至79中任一项的双特异性抗体，其中所述第二和第三抗原结合域包含与SEQ ID NO:3的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的重链可变区序列和与SEQ ID NO:4的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的轻链可变区序列。
81.实施方案80的双特异性抗体，其中所述第二和第三抗原结合域包含SEQ IDNO:3的重链可变区和SEQ ID NO:4的轻链可变区。
82.实施方案76至81中任一项的双特异性抗体，其中所述Fc域单独地或组合地掺入在第5.1和5.2节中关于Fc域描述的所有特征。
83.实施方案76至82中任一项的双特异性抗体，其中所述抗原结合域和所述Fc区通过肽接头彼此融合。
84.实施方案83的双特异性抗体，其中所述肽接头包含如SEQ ID NO:45和/或SEQID NO:46中的肽接头。
85.实施方案76至84中任一项的双特异性抗体，其中在所述第二和第三Fab分子的恒定域CL中，124位的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat编号)并且123位的氨基酸取代被赖氨酸(K)或精氨酸(R)取代，优选地被精氨酸(R)取代(根据Kabat编号)，并且在(ii)下的所述第二和第三Fab分子的恒定域CH1中，147位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat EU索引编号)，并且213位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat EU索引编号)。
86.实施方案76至85中任一项的双特异性抗体，其包括含有与SEQ ID NO:43的序列至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同的序列的多肽，包含与SEQ IDNO:44的序列至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同的序列的多肽，包含与SEQ ID NO:45的序列至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同的序列的多肽，和包含与SEQ ID NO:46的序列至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同的序列的多肽。
87.实施方案86的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体包括含有SEQ ID NO:43的序列的多肽，包含SEQ ID NO:44的序列的多肽，包含SEQ ID NO:45的序列的多肽和包含SEQ ID NO:46的序列的多肽。
88.实施方案87的双特异性抗体，其包含两个含有SEQ ID NO:43的序列的多肽。
89.实施方案45至88中任一项的双特异性抗体，其与可检测的部分缀合。
90.实施方案89的双特异性抗体，其中所述可检测的标志物是酶、放射性同位素或荧光标记物。
91.融合蛋白，其包含至少与第二氨基酸序列可操作连接的实施方案1至44中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段或实施方案45-90中任一项的双特异性抗体的氨基酸序列。
92.实施方案91的融合蛋白，其中所述第二氨基酸序列是4-1BB，CD3-zeta或其片段的氨基酸序列。
93.实施方案91的融合蛋白，其中所述第二氨基酸序列是融合肽的氨基酸序列。
94.实施方案93的融合蛋白，其中所述融合肽是CD28-CD3-zeta或4-lBB(CD137)-CD3-zeta融合肽。
95.实施方案91的融合蛋白，其中所述第二氨基酸序列是T细胞活化的调控剂或其片段的氨基酸序列。
96.实施方案95的融合蛋白，其中所述T细胞活化的调控剂是IL-15或IL-15Ra。
97.嵌合抗原受体(CAR)，其包含实施方案24-26中任一项的scFv。
98.实施方案97的CAR，其以氨基端至羧基端的顺序包含：人CD8前导肽、所述scFv、人CD8铰链域、人CD8跨膜域和CD3-zeta信号传导域。
99.抗体-药物缀合物，其包含与细胞毒剂缀合的实施方案1-44中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段或实施方案45-90中任一项的双特异性抗体或权利要求91-96中任一项的融合蛋白。
100.实施方案99的抗体-药物缀合物，其中所述细胞毒剂是澳瑞他汀(auristatin)、DNA小沟结合剂、烷化剂、烯二炔(enediyne)、lexitropsin、多卡米星(duocarmycin)、紫杉烷、多拉司他汀(dolastatin)、美登素生物碱(maytansinoid)或长春花生物碱(vinca alkaloid)。
101.实施方案100的抗体-药物缀合物，其中所述抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段或双特异性抗体通过接头与所述细胞毒剂缀合。
102.实施方案101的抗体-药物缀合物，其中所述接头在细胞内条件下是可切割的。
103.实施方案102的抗体-药物缀合物，其中所述可切割的接头能被细胞内蛋白酶切割。
104.实施方案103的抗体-药物缀合物，其中所述接头包含二肽。
105.实施方案104的抗体-药物缀合物，其中所述二肽是val-cit或phe-lys。
106.实施方案102的抗体-药物缀合物，其中所述可切割的接头能在小于5.5的pH水解。
107.实施方案106的抗体-药物缀合物，其中所述可水解的接头是腙接头。
108.实施方案102的抗体-药物缀合物，其中所述可切割的接头是二硫化物接头。
109.核酸，其包含实施方案1-44中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段或实施方案45-90中任一项的双特异性抗体或权利要求91-96中任一项的融合蛋白或实施方案97或实施方案98的CAR。
110.实施方案109的核酸，其中所述编码区经密码子优化以在人细胞中表达。
111.载体，其包含实施方案109或实施方案110的核酸。
112.实施方案111的载体，其是病毒载体。
113.实施方案112的载体，其中所述病毒载体是慢病毒载体。
114.宿主细胞，其经过工程化改造以表达实施方案109或实施方案110的核酸。
115.实施方案114的宿主细胞，其是经过工程化改造以表达实施方案97或实施方案98的CAR的人T细胞。
116.宿主细胞，其包含实施方案111至113中任一项的载体。
117.实施方案116的宿主细胞，其是T细胞且其中所述载体编码实施方案97或实施方案98的CAR。
118.药物组合物，其包含(a)实施方案1-44中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，实施方案45-90中任一项的双特异性抗体，权利要求91-96中任一项的融合蛋白，实施方案97或实施方案98的CAR，实施方案99至108中任一项的抗体-药物缀合物，实施方案109或实施方案110的核酸，实施方案111-113中任一项的载体，或实施方案114至117中任一项实施方案的宿主细胞，以及(b)生理上合适的缓冲液、佐剂或稀释剂。
119.治疗癌症的方法，其包括对有此需要的受试者施用有效量的实施方案1-44中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，实施方案45-90中任一项的双特异性抗体，权利要求91-96中任一项的融合蛋白，实施方案97或实施方案98的CAR，实施方案99至108中任一项的抗体-药物缀合物，实施方案109或实施方案110的核酸，实施方案111-113中任一项的载体，或实施方案114至117中任一项实施方案的宿主细胞，或实施方案118的药物组合物。
120.实施方案119的方法，其中所述受试者患有乳腺癌、非小细胞肺癌(non-smallcell lung cancer)、前列腺癌(prostate cancer)、胰腺癌(pancreatic cancer)、食道癌(esophageal cancer)或结肠直肠癌(colorectal cancer)。
121.检测生物样品中的癌症的方法，其包括使样品与实施方案1-44中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段接触，并检测所述抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段的结合。
122.实施方案121的方法，其进一步包括定量所述抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段的结合。
123.实施方案121或实施方案122的方法，其中将所述结合与作为阴性/基线对照的正常组织对照和/或与作为阳性对照的癌性组织对照进行比较。
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序列表
<110> GO医疗股份有限公司(GO Therapeutics, Inc.)
<120> 抗糖-MUC1抗体及其用途
<130> GOT-001WO
<160> 52
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 136
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 1
Met Gly Trp Ser Gly Ile Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Asp Ala Glu Leu Val Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Asp His Ala Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Tyr Phe Ser Pro Gly Asn Asp Asp Ile His Tyr Asn
65 70 75 80
Glu Lys Phe Glu Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
100 105 110
Tyr Phe Cys Lys Arg Ser Tyr Asp Lys Asp Phe Asp Cys Trp Gly Gln
115 120 125
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
130 135
<210> 2
<211> 140
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 2
Met Val Leu Ile Leu Leu Leu Leu Trp Val Ser Gly Thr Cys Gly Asp
1 5 10 15
Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Gly Val Ser Val Gly Glu
20 25 30
Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Thr
35 40 45
Asn Gln Lys Asn Tyr Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Thr Asn Gln Lys Asn
50 55 60
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu
65 70 75 80
Ile Tyr Trp Val Ser Asn Arg Lys Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr
85 90 95
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Lys
100 105 110
Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Arg Tyr Pro
115 120 125
Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
130 135 140
<210> 3
<211> 117
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 3
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Asp Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His
20 25 30
Ala Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Phe Ser Pro Gly Asn Asp Asp Ile His Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Glu Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Lys Arg Ser Tyr Asp Lys Asp Phe Asp Cys Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 4
<211> 125
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 4
Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Gly Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Thr Asn Gln Lys Asn Tyr Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Thr Asn Gln Lys
35 40 45
Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu
50 55 60
Leu Ile Tyr Trp Val Ser Asn Arg Lys Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
65 70 75 80
Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val
85 90 95
Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Arg Tyr
100 105 110
Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
115 120 125
<210> 5
<211> 8
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 5
Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His Ala
1 5
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 6
Phe Ser Pro Gly Asn Asp Asp Ile
1 5
<210> 7
<211> 10
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 7
Lys Arg Ser Tyr Asp Lys Asp Phe Asp Cys
1 5 10
<210> 8
<211> 12
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 8
Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Thr Asn Gln Lys Asn Tyr
1 5 10
<210> 9
<211> 3
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 9
Trp Val Ser
1
<210> 10
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 10
Gln Gln Tyr Tyr Arg Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 11
<211> 408
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 11
atgggatgga gcgggatctt tctcttcttc ctgtcagtaa ctacaggtgt ccactcccag 60
gttcagctgc agcagtctga cgcggagttg gtgaaacctg gggcttcagt gaagatatcc 120
tgcaaggctt ctggctacac tttcactgac catgctattc actgggtgaa gcagaggcct 180
gaacagggcc tggaatggat tggatatttt tctcccggaa atgatgacat tcactacaat 240
gagaagttcg agggcaaggc cacactgact gcagacaaat cctccagcac tgcctacatg 300
cagctcaaca gcctgacatc tgaagattct gcagtgtatt tctgtaaaag atcttacgac 360
aaggactttg actgctgggg ccaaggcacc actctcacag tctcctca 408
<210> 12
<211> 384
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 12
atggttctta tcttactgct gctatgggta tctggtacct gtggggacat tgtgatgtca 60
cagtctccat cctccctagg tgtgtcagtt ggagagaagg ttactatgag ctgcaagtcc 120
agtcagagcc ttttatacag taccaatcaa aagaactacc tggcctggta ccagcagaaa 180
ccagggcagt ctcctaagtt gctgatttac tgggtatcta ataggaaatc tggggtccct 240
gatcgcttca caggcagtgg atctgggaca gatttcactc tcaccatcag tagtgtgaag 300
gctgaagacc tggcagttta ttactgtcag caatattata ggtatccgct cacgttcggt 360
gctgggacca agctggagct gaaa 384
<210> 13
<211> 351
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 13
caggttcagc tgcagcagtc tgacgcggag ttggtgaaac ctggggcttc agtgaagata 60
tcctgcaagg cttctggcta cactttcact gaccatgcta ttcactgggt gaagcagagg 120
cctgaacagg gcctggaatg gattggatat ttttctcccg gaaatgatga cattcactac 180
aatgagaagt tcgagggcaa ggccacactg actgcagaca aatcctccag cactgcctac 240
atgcagctca acagcctgac atctgaagat tctgcagtgt atttctgtaa aagatcttac 300
gacaaggact ttgactgctg gggccaaggc accactctca cagtctcctc a 351
<210> 14
<211> 339
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 14
gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctaggtgtgt cagttggaga gaaggttact 60
atgagctgca agtccagtca gagcctttta tacagtacca atcaaaagaa ctacctggcc 120
tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aagttgctga tttactgggt atctaatagg 180
aaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240
atcagtagtg tgaaggctga agacctggca gtttattact gtcagcaata ttataggtat 300
ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagctg gagctgaaa 339
<210> 15
<211> 25
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 15
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Asp Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser
20 25
<210> 16
<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 16
Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly
1 5 10 15
Tyr
<210> 17
<211> 38
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 17
His Tyr Asn Glu Lys Phe Glu Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys
1 5 10 15
Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp
20 25 30
Ser Ala Val Tyr Phe Cys
35
<210> 18
<211> 11
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 18
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 19
<211> 26
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 19
Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Gly Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser
20 25
<210> 20
<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 20
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 21
<211> 36
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 21
Asn Arg Lys Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala
20 25 30
Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 22
<211> 10
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 22
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
1 5 10
<210> 23
<211> 5
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 23
Asp His Ala Ile His
1 5
<210> 24
<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 24
Tyr Phe Ser Pro Gly Asn Asp Asp Ile His Tyr Asn Glu Lys Phe Glu
1 5 10 15
Gly
<210> 25
<211> 8
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 25
Ser Tyr Asp Lys Asp Phe Asp Cys
1 5
<210> 26
<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 26
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Thr Asn Gln Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 27
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 27
Trp Val Ser Asn Arg Lys Ser
1 5
<210> 28
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 28
Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His
1 5
<210> 29
<211> 6
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 29
Ser Pro Gly Asn Asp Asp
1 5
<210> 30
<211> 13
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 30
Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Thr Asn Gln Lys Asn Tyr
1 5 10
<210> 31
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 31
Tyr Tyr Arg Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 32
<211> 10
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 32
Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His Ala Ile His
1 5 10
<210> 33
<211> 2
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 33
Asp His
1
<210> 34
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成CD3 CDR-H1肽
<400> 34
Thr Tyr Ala Met Asn
1 5
<210> 35
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成CD3 CDR-H2肽
<400> 35
Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 36
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成CD3 CDR-H3肽
<400> 36
His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 37
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成CD3 CDR-L1肽
<400> 37
Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn
1 5 10
<210> 38
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成CD3 CDR-L2 肽
<400> 38
Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro
1 5
<210> 39
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成CD3 CDR-L2肽
<400> 39
Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val
1 5
<210> 40
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成CD3 VH
<400> 40
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 41
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成CD3 VL
<400> 41
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 42
<211> 225
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成hIgG1 Fc 区
<400> 42
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro
225
<210> 43
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成MUC1 VL-CL(RK)
<400> 43
Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Gly Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Thr Asn Gln Lys Asn Tyr Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Thr Asn Gln Lys
35 40 45
Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu
50 55 60
Leu Ile Tyr Trp Val Ser Asn Arg Lys Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
65 70 75 80
Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val
85 90 95
Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Arg Tyr
100 105 110
Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val
115 120 125
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg Lys Leu Lys
130 135 140
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
145 150 155 160
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
165 170 175
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
180 185 190
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
195 200 205
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
210 215 220
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 44
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成CD3 VH-CL
<400> 44
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val
115 120 125
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
130 135 140
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
145 150 155 160
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
165 170 175
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
180 185 190
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
195 200 205
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
210 215 220
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 45
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MUC1 VH-CH1(EE)-Fc (孔, P329G LALA)
<400> 45
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Asp Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His
20 25 30
Ala Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Phe Ser Pro Gly Asn Asp Asp Ile His Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Glu Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Lys Arg Ser Tyr Asp Lys Asp Phe Asp Cys Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 46
<211> 672
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成MUC1 VH-CH1(EE)-CD3 VL-CH1-Fc (突出, P329G LALA)
<400> 46
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Asp Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His
20 25 30
Ala Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Phe Ser Pro Gly Asn Asp Asp Ile His Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Glu Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Lys Arg Ser Tyr Asp Lys Asp Phe Asp Cys Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly Gly Gly
210 215 220
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser
225 230 235 240
Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser
245 250 255
Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys
260 265 270
Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala
275 280 285
Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala
290 295 300
Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr
305 310 315 320
Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys
325 330 335
Leu Thr Val Leu Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
340 345 350
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
355 360 365
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
370 375 380
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
385 390 395 400
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
405 410 415
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
420 425 430
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
435 440 445
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser
450 455 460
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
465 470 475 480
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
485 490 495
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
500 505 510
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
515 520 525
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
530 535 540
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr
545 550 555 560
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
565 570 575
Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys
580 585 590
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
595 600 605
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
610 615 620
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
625 630 635 640
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
645 650 655
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
660 665 670
<210> 47
<211> 60
<212> PRT
<213> 智人
<400> 47
Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro
1 5 10 15
Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly
20 25 30
Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg
35 40 45
Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly
50 55 60
<210> 48
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人
<400> 48
Pro Asp Thr Ser Ala Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Val
1 5 10 15
Val Thr Ser Ala Pro
20
<210> 49
<211> 21
<212> PRT
<213> 成束猴(Macaca fascicularis)
<400> 49
Pro Asp Thr Ser Ala Ala Pro Gly Ser Thr Gly Pro Pro Ala His Val
1 5 10 15
Val Thr Ser Ala Pro
20
<210> 50
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人
<400> 50
Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro
1 5 10 15
Pro Ala His Gly
20
<210> 51
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人
<400> 51
Pro Thr Thr Thr Pro Ile Ser Thr Thr Thr Met Val Thr Pro Thr Pro
1 5 10 15
Thr Pro Thr Cys
20
<210> 52
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人
<400> 52
Cys Pro Leu Pro Val Thr Asp Thr Ser Ser Ala Ser Thr Gly His Ala
1 5 10 15
Thr Pro Leu Pro Val
20

Claims (77)

1.抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其：
a.优先结合与正常细胞相比在癌细胞上过表达的糖-MUC1表位；和
b.与抗体或抗原结合片段竞争对乳腺癌细胞系MCF7或T47D的结合，所述抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:3的重链可变(VH)序列和SEQ ID NO:4的轻链可变(VL)序列。
2.抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其
a.结合MUC1串联重复(VTSAPDTRPAPGSTAPPAHG)3，其已经使用纯化的重组人糖基转移酶GalNAc-T1、GalNAc-T2和GalNAc-T4在体外糖基化，并且(下文称为“第一表位”)；和
b.与抗体或抗原结合片段竞争对乳腺癌细胞系MCF7或T47D的结合，所述抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:3的重链可变(VH)序列和SEQ ID NO:4的轻链可变(VL)序列。
3.权利要求1或权利要求2的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其包含互补决定区(CDR)H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，所述互补决定区(CDR)H1包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列、所述CDR-H2包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列、所述CDR-H3包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列、所述CDR-L1包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列、所述CDR-L2包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列，所述CDR-L3包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列。
4.权利要求3的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
5.权利要求3的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列。
6.权利要求3的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列。
7.权利要求3的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中CDR-H1包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列。
8.权利要求3的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中CDR-H2包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
9.权利要求3的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中CDR-H2包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列。
10.权利要求3的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中CDR-H3包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
11.权利要求3的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列。
12.权利要求3的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中CDR-L1包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列。
13.权利要求3的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中CDR-L2包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列。
14.权利要求3的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中CDR-L3包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。
15.权利要求1或权利要求2的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中所述VH包含SEQ IDNO:5-7的互补决定区(CDR)，并且所述VL包含SEQ ID NO:8-10的CDR。
16.权利要求1或权利要求2的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中所述VH包含SEQ IDNO:23-25的互补决定区(CDR)，并且所述VL包含SEQ ID NO:26、27和10的CDR。
17.权利要求1或权利要求2的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中所述VH包含SEQ IDNO:28、29和25的互补决定区(CDR)，并且所述VL包含SEQ ID NO:30、9和31的CDR。
18.权利要求1或权利要求2的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其是嵌合抗体或人源化抗体。
19.权利要求1或权利要求2的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQID NO:3具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:4具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
20.权利要求1或权利要求2的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQID NO:3具有至少97％序列同一性的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:4具有至少97％序列同一性的氨基酸序列。
21.权利要求1或权利要求2的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQID NO:3具有至少99％序列同一性的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:4具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
22.权利要求1或权利要求2的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中所述VH包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列，并且所述VL包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
23.权利要求1或权利要求2的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其是多价的。
24.权利要求1或权利要求2的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其为单链可变片段(scFv)的形式。
25.权利要求24的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中所述scFv包含在所述轻链可变片段N端的所述重链可变片段。
26.权利要求24的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中所述scFv重链可变片段和轻链可变片段与4-15个氨基酸的接头序列共价结合。
27.权利要求1或权利要求2的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其为多特异性抗体的形式。
28.权利要求27的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中所述多特异性抗体是结合第二表位的双特异性抗体，所述第二表位与所述第一表位不相同。
29.权利要求28的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中所述双特异性抗体是CrossMab、Fab臂交换抗体、双特异性T细胞衔接子(BiTE)或双重亲和力再靶向分子(DART)。
30.权利要求29的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中所述双特异性抗体是CrossMab。
31.权利要求30的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中所述双特异性抗体是CrossMabFAB。
32.权利要求30的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中所述双特异性抗体是CrossMabVH-VL。
33.权利要求30的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中所述双特异性抗体是CrossMabCH1-CL。
34.权利要求29的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中所述双特异性抗体是Fab臂交换抗体。
35.权利要求29的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中所述双特异性抗体是双重亲和力再靶向分子(DART)。
36.权利要求29的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中所述双特异性抗体是双特异性T细胞衔接子(BiTE)。
37.权利要求28的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中所述第二表位是MUC1表位。
38.权利要求28的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中所述第二表位是与正常细胞相比在癌细胞上过表达的MUC1表位。
39.权利要求28的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中所述第二表位是T细胞表位。
40.权利要求39的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中所述T细胞表位包含CD3表位、CD8表位、CD16表位、CD25表位、CD28表位或NKG2D表位。
41.权利要求40的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中所述T细胞表位包含CD3表位，所述CD3表位任选地是人CD3中存在的表位。
42.权利要求41的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中所述CD3表位包含CD3 gamma表位、CD3 delta表位、CD3 epsilon表位或CD3 zeta表位。
43.权利要求1或权利要求2的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其与可检测部分缀合。
44.权利要求43的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中可检测标志物是酶、放射性同位素或荧光标记物。
45.融合蛋白，其包含至少与第二氨基酸序列可操作连接的权利要求1或权利要求2的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段的氨基酸序列。
46.权利要求45的融合蛋白，其中所述第二氨基酸序列是4-1BB、CD3-zeta，或其片段的氨基酸序列。
47.权利要求45的融合蛋白，其中所述第二氨基酸序列是融合肽的氨基酸序列。
48.权利要求47的融合蛋白，其中所述融合肽是CD28-CD3-zeta或4-lBB(CD137)-CD3-zeta融合肽。
49.权利要求45的融合蛋白，其中所述第二氨基酸序列是T细胞活化的调控剂或其片段的氨基酸序列。
50.权利要求49的融合蛋白，其中所述T细胞活化的调控剂是IL-15或IL-15Ra。
51.嵌合抗原受体(CAR)，其包含权利要求24的scFv。
52.权利要求51的CAR，其以氨基端至羧基端的顺序包含：人CD8前导肽、所述scFv、人CD8铰链域、人CD8跨膜域和CD3-zeta信号传导域。
53.抗体-药物缀合物，其包含与细胞毒剂缀合的权利要求1或权利要求2的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段。
54.权利要求53的抗体-药物缀合物，其中所述细胞毒剂是澳瑞他汀、DNA小沟结合剂、烷化剂、烯二炔、lexitropsin、多卡米星、紫杉烷、多拉司他汀、美登素生物碱或长春花生物碱。
55.权利要求54的抗体-药物缀合物，其中所述抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段通过接头与所述细胞毒剂缀合。
56.权利要求55的抗体-药物缀合物，其中所述接头在细胞内条件下是可切割的。
57.权利要求56的抗体-药物缀合物，其中所述可切割的接头能被细胞内蛋白酶切割。
58.权利要求57的抗体-药物缀合物，其中所述接头包含二肽。
59.权利要求58的抗体-药物缀合物，其中所述二肽是val-cit或phe-lys。
60.权利要求56的抗体-药物缀合物，其中所述可切割的接头能在小于5.5的pH水解。
61.权利要求60的抗体-药物缀合物，其中所述可水解的接头是腙接头。
62.权利要求56的抗体-药物缀合物，其中所述可切割的接头是二硫化物接头。
63.核酸，其包含权利要求1或权利要求2的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段的编码区。
64.权利要求63的核酸，其中所述编码区经密码子优化以在人细胞中表达。
65.载体，其包含权利要求63的核酸。
66.权利要求65的载体，其是病毒载体。
67.权利要求66的载体，其中所述病毒载体是慢病毒载体。
68.宿主细胞，其经过工程化改造以表达权利要求63的核酸。
69.宿主细胞，其是经过工程化改造以表达权利要求51的CAR的人T细胞。
70.宿主细胞，其包含权利要求65的载体。
71.宿主细胞，其是包含编码权利要求51的CAR的载体的T细胞。
72.药物组合物，其包含(a)权利要求1或权利要求2的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，和(b)生理上合适的缓冲液、佐剂或稀释剂。
73.治疗癌症的方法，其包括对有此需要的受试者施用有效量的权利要求1或权利要求2的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段。
74.权利要求73的方法，其中所述受试者患有乳腺癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、胰腺癌、食道癌或结肠直肠癌。
75.检测生物样品中的癌症的方法，其包括使样品与根据权利要求1或权利要求2的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段接触，并检测所述抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段的结合。
76.权利要求75的方法，其进一步包括定量所述抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段的结合。
77.权利要求75的方法，其中将所述结合与作为阴性/基线对照的正常组织对照，和/或与作为阳性对照的癌性组织对照进行比较。
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