CN114829404A - 对糖基化的lag3特异的抗体及其使用方法 - Google Patents

对糖基化的lag3特异的抗体及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本申请提供了相对于未糖基化的LAG3选择性结合糖基化的LAG3的抗体。在一些方面，本申请还提供了包含糖基化的氨基酸位置的LAG3多肽。本申请还提供了制备和使用此类抗体和多肽的方法(例如，用于治疗癌症)。

Description

对糖基化的LAG3特异的抗体及其使用方法
序列表
本申请包含序列表，所述序列表已经以ASCII格式电子地提交并特此通过引用整体并入本文。所述ASCII副本创建于2020年9月22日，名称为24258_0014P1_Sequence_Listing.txt，并且大小为12,288字节。
技术领域
本发明整体上涉及医学、分子生物学和肿瘤学领域。更具体地说，它涉及用于治疗癌症的抗体。
发明背景
T细胞活化的持续性已经极大地重塑了广谱恶性癌症的治疗。例如，伊匹单抗(一种CTLA-4特异性抗体和首个FDA批准的靶向T细胞应答的检查点阻断剂)的开发，使得治疗转移性黑色素瘤成为可能(Hodi等人,The New England Journal of Medicine 363,711-723(2010))。
尽管CTLA-4和PD1-PDL1靶向癌症免疫疗法产生了令人印象深刻的影响，但大部分患有多种肿瘤类型的患者都没有应答。因此，焦点已转移到肿瘤微环境中的靶向替代抑制受体(IR)和抑制性机制。
IR的上调表达对于平衡共刺激受体活性和限制T细胞活化从而防止自身免疫、自身炎症和组织损伤至关重要。然而，肿瘤可以劫持这些所谓的免疫检查点机制，作为针对由CD4+和CD8+T细胞引发的抗肿瘤免疫应答的保护。首先在慢性病毒环境中描述，耐受的抗原特异性T细胞在肿瘤微环境中显示出IR的升高表达，对应于通过减少增殖和细胞因子释放来测量的功能性无应答。随着调节性T细胞的募集，产生的免疫耐受为有效消除肿瘤创造了多重障碍。因此，最近的癌症免疫治疗方法旨在通过靶向IR“以释放刹车”，使细胞毒性T细胞重新活跃起来以攻击肿瘤，从而逆转这种枯竭状态。
淋巴细胞活化基因-3(LAG3；CD223)可能是很有前途的co-IR，抑制T细胞活化和细胞因子分泌，从而确保免疫稳态状态。LAG-3对各种类型的淋巴细胞发挥不同的抑制作用。同时，LAG-3可以有效预防自身免疫性疾病的发生。LAG-3信号传导和与其他免疫检查点相互作用的确切分子机制大多尚不清楚。然而，LAG-3在多种环境中显示出与PD-1的显著协同作用以抑制免疫应答。LAG3也可以被广泛糖基化。Long等人，“The promising immunecheckpoint LAG-3:from tumor microenvironment to cancer immunotherapy,”Genes&Cancer,Vol.9(5-6),May 2018。
基于此，糖基化的LAG3特异性抗体可能在癌症疗法中有价值。
发明内容
本文提供了选择性结合糖基化的LAG3的分离的单克隆抗体(本文中的抗glycLAG3抗体)。在一些方面，抗体相对于未糖基化的LAG3选择性地结合在位置N188、N250、N256和/或N343处糖基化的LAG3。在某些方面，抗体增加IFN-γ和/或IL-2的分泌。在一些方面，抗体增加T细胞增殖。在一些方面，抗体阻断LAG3与Gal-3、MHCII、LSECtin和CD3中一种或多种的结合。
在一些实施方案中，分离的抗体选择性地结合具有N188糖基化的人LAG3。在一些实施方案中，分离的抗体选择性地结合具有N250糖基化的人LAG3。在一些实施方案中，分离的抗体选择性地结合具有N256糖基化的人LAG3。在一些实施方案中，分离的抗体选择性地结合具有N343糖基化的人LAG3。在一些实施方案中，分离的抗体选择性地结合具有N188和N250糖基化的人LAG3。在一些实施方案中，分离的抗体选择性地结合具有N188和N256糖基化的人LAG3。在一些实施方案中，分离的抗体选择性地结合具有N188和N343糖基化的人LAG3。在一些实施方案中，分离的抗体选择性地结合具有N250和N256糖基化的人LAG3。在一些实施方案中，分离的抗体选择性地结合具有N250和N343糖基化的人LAG3。在一些实施方案中，分离的抗体选择性地结合具有N256和N343糖基化的人LAG3。在一些实施方案中，分离的抗体选择性地结合具有N188、N250和N256糖基化的人LAG3。在一些实施方案中，分离的抗体选择性地结合具有N188、N250和N343糖基化的人LAG3。在一些实施方案中，分离的抗体选择性地结合具有N188、N256和N343糖基化的人LAG3。在一些实施方案中，分离的抗体选择性地结合具有N250、N256和N343糖基化的人LAG3。在一些实施方案中，分离的抗体选择性地结合具有N188、N250、N256和N343糖基化的人LAG3。
在某些方面，抗glycLAG3抗体结合LAG3并掩蔽或筛选一个或多个糖基化基序以阻断分子与该基序的结合或其他相互作用，并可阻断LAG3在该糖基化位点处的糖基化。在具体实施方案中，抗glycLAG3抗体掩蔽在N188、N250、N256和N343中的一个或多个处的糖基化位点。
在一些方面，抗体选择性地结合一个或多个糖基化基序。在一些方面，抗体结合包含糖基化基序和相邻肽的糖肽。在一些方面，抗体结合在三维上位于一个或多个糖基化基序附近的肽序列。
在某些方面，抗glycLAG3抗体对糖基化的LAG3的结合亲和力为0.1-13nM或0.1至10nM或0.1nM至5nM，包括下限值和上限值。在某些方面，抗体结合糖基化的LAG3的Kd小于相对于未糖基化的LAG3所表现出的Kd的一半。在进一步的方面，抗体结合糖基化的LAG3的Kd是相对于未糖基化的LAG3所表现出的Kd的至多十分之一。
在一个特定方面提供了抗glycLAG3单克隆抗体STC1317，及其抗原结合部分，以及其人源化和嵌合形式，所述单克隆抗体具有重链和轻链可变结构域，分别具有SEQ ID NO：3和5的氨基酸序列(没有任何信号序列的成熟的VH和VL区氨基酸序列)。本文提供了抗glycLAG3抗体，其与STC1317 MAb竞争结合糖基化的LAG3和/或结合与STC1317相同的表位。
下文表3显示了STC1317 MAb的重链和轻链可变(V)结构域的核酸(DNA)和相应氨基酸序列。SEQ ID NO：2和3是STC1317 VH结构域的核苷酸和氨基酸序列，SEQ ID NO：4和5是STC1317κ轻链可变结构域的成熟形式的核苷酸和氨基酸序列。表4提供了STC1317的Chothia、AbM、Kabat和Contact重链和轻链V结构域CDR。
在一个实施方案中，特异性和优先结合糖基化的LAG3的抗glycLAG3抗体包含具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的VH结构域和/或具有SEQ ID NO:5氨基酸序列的VL结构域。在一个实施方案中，抗glycLAG3抗体与包含SEQ ID NO：3的VH结构域和SEQ ID NO：5的VL结构域的抗体竞争特异性结合糖基化的LAG3。在其他实施方案中，抗glycLAG3抗体包含与SEQ IDNO:3的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VH结构域和/或与SEQ ID NO:5的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VL结构域。这些抗glycLAG3抗体可以是嵌合抗体并且包含人恒定结构域，例如来自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的恒定结构域。
在一个实施方案中，特异性和优先结合糖基化的LAG3的抗glycLAG3抗体包含VH结构域，所述VH结构域包含分别具有SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的氨基酸序列的Chothia CDR 1-3；包含分别具有SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:8的氨基酸序列的AbM CDR 1-3；包含分别具有SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:8的氨基酸序列的Kabat CDR 1-3；或包含分别具有SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15的氨基酸序列的Contact CDR 1-3，或其组合。在一个实施方案中，抗glycLAG3抗体与包含VH结构域的抗体竞争特异性结合糖基化的LAG3，所述VH结构域包含分别具有SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：7和SEQ ID NO：8的氨基酸序列的Chothia CDR 1-3；包含分别具有SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:10和SEQ ID NO:8的氨基酸序列的AbM CDR 1-3；包含分别具有SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:12和SEQ ID NO:8的氨基酸序列的Kabat CDR 1-3；或包含分别具有SEQ ID NO:13、SEQID NO:14和SEQ ID NO:15的氨基酸序列的Contact CDR 1-3，或其组合。优选地，VH和VL结构域具有相同类别的CDR，即两者都具有Chothia、AbM、Kabat或Contact CDR。
在其他实施方案中，抗glycLAG3抗体具有包含CDR H1、CDR H2和CDR H3的VH结构域，所述CDR H1、CDR H2和CDR H3具有在以下的1、2或3个CDR中具有1、2、3、4或5个氨基酸置换的氨基酸序列：分别具有SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的氨基酸序列的Chothia CDR，或分别具有SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:8的氨基酸序列的AbMCDR，或分别具有SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:8的氨基酸序列的Cabat CDR，或分别具有SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15的氨基酸序列的Contact CDR。抗glycLAG3抗体可以具有在VH和VL结构域二者的CDR中的氨基酸置换。在一些实施方案中，氨基酸置换是保守置换。
优选地，前述抗体具有人框架区，即是STC1317的人源化形式，并且任选地包含人恒定结构域，例如来自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的恒定结构域。
本领域技术人员将理解，可以在人源化抗体的CDR和/或框架区中进行一个或多个氨基酸置换以改善结合亲和力或其他参数。在实施方案中，抗glycLAG3抗体与包含上述VH和VL结构域以及其中的CDR的抗体竞争与糖基化的LAG3的特异性结合。在一个实施方案中，抗glycLAG3抗体结合糖基化的LAG3，其Kd为0.1-10nM或1-20nM，包括下限值和上限值。在实施方案中，抗glycLAG3抗体结合糖基化的LAG3的Kd小于抗体与未糖基化的LAG3结合所表现出的Kd的一半。在一个实施方案中，抗glycLAG3抗体结合糖基化的LAG3蛋白的Kd是相对于未糖基化的LAG3结合所表现出的Kd的至多五分之一。在一个实施方案中，抗glycLAG3抗体结合糖基化的LAG3蛋白的Kd是抗体与未糖基化的LAG3蛋白结合所表现出的Kd的至多十分之一。
在一个实施方案中，抗体是通过荧光标记或标志物直接或间接可检测的。在一个实施方案中，抗体用荧光标记或标志物例如FITC进行直接标记，或通过荧光标记的二抗进行检测。在一个实施方案中，STC1317 MAb或者其嵌合或人源化形式对糖基化的LAG3的结合亲和力为0.1-13nM或0.1-5nM，包括下限值和上限值。
在实施方案中，抗glycLAG3抗体与包含上述VH和VL结构域以及其中的CDR的抗体竞争与糖基化的LAG3的特异性结合。优选地，这些抗体具有人框架区，即是STC1317的人源化形式，并且任选地包含人恒定结构域，例如来自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的恒定结构域。本领域技术人员将理解，可以在人源化抗体的CDR或框架区中进行一个或多个氨基酸置换以改善结合亲和力或其他参数。在实施方案中，抗glycLAG3抗体结合糖基化的LAG3的Kd小于相对于未糖基化的LAG3所表现出的Kd的一半。在实施方案中，抗glycLAG3抗体结合糖基化的LAG3的Kd小于相对于未糖基化的LAG3所表现出的Kd的一半。在一个实施方案中，抗glycLAG3抗体结合糖基化的LAG3蛋白非Kd是抗体与未糖基化的LAG3结合所表现出的Kd的至多五分之一。在一个实施方案中，抗glycLAG3抗体结合糖基化LAG3蛋白的Kd是抗体与未糖基化的LAG3蛋白结合所表现出的Kd的至多十分之一。在一个实施方案中，在细胞流式细胞术结合测定法中，抗体表现出与表达WT LAG3的细胞的结合，以绿色计数对象/mm2表示，是表示与表达未糖基化的LAG3的细胞的结合的绿色计数对象/mm2的3倍、5倍、10倍、20倍、30倍或50倍。在一个实施方案中，抗体是通过荧光标记或标志物直接或间接可检测的。在一个实施方案中，抗体用荧光标记或标志物如FITC进行直接标记。在一个实施方案中，STC1317MAb或者其结合结构域或人源化或嵌合形式对糖基化的STC1317的结合亲和力是0.1-13nM或0.1至10nM或0.1至5nM，包括下限值和上限值。
在一些方面，抗体是重组的。在某些方面，抗体是IgG、IgM、IgA或其抗原结合片段。在其他方面，抗体是Fab'、F(ab')2、F(ab')3、单价scFv、二价scFv、双特异性抗体、双特异性scFv或单域抗体。在一些方面，抗体是人抗体或人源化抗体。在进一步的方面，抗体与显像剂、化疗剂、毒素或放射性核素缀合。
在另一个实施方案中，本文提供了一种组合物，其包含在药学上可接受的承载体中的实施方案的抗体(例如，抗体相对于未糖基化的LAG3选择性地结合糖基化的LAG3)。
在又一个实施方案中，提供了分离的多肽，其包含人LAG3的至少7个(例如，至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个)连续氨基酸的片段，所述片段包含对应于人LAG3的位置N188、N250、N256或N343的至少一个氨基酸。在进一步的方面，实施方案的分离的多肽包含人LAG3的至少7个(例如，至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个)连续氨基酸的片段，所述片段包含对应于人LAG3的位置N188、N250、N256或N343的至少一个氨基酸，并且其中所述对应于人LAG3的位置N188、N250、N256或N343的氨基酸中至少一个是糖基化的。在一些方面，实施方案的多肽融合或缀合至免疫原性多肽(例如匙孔
Figure BDA0003668004810000061
血蓝蛋白，KLH)。在某些方面，多肽进一步在C-或N-末端包含Cys残基。例如，在一些方面，多肽通过在Cys残基处的二硫键缀合至免疫原性多肽。
在又一个实施方案中，提供了包含多肽的组合物，所述多肽包含人LAG3的至少7个(例如，至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个)连续氨基酸的片段，所述片段包含对应于人LAG3的位置N188、N250、N256或N343的至少一个氨基酸，其中所述对应于人LAG3的位置N188、N250、N256或N343的氨基酸中至少一个是糖基化的，其中多肽配制在药学上可接受的承载体中。在一些方面，组合物是免疫原性组合物。在一些方面，免疫原性组合物还包含佐剂，例如明矾或弗氏佐剂。
在又一个实施方案中，本文提供了一种用于治疗患有癌症的受试者的方法，包括向受试者施用有效量的实施方案的抗体或分离的多肽。在某些方面，治疗癌症的方法包括向受试者施用有效量的多肽(例如，糖基化的LAG3多肽)。在进一步的方面，治疗癌症的方法包括向受试者施用有效量的实施方案的抗体(例如，相对于未糖基化的LAG3选择性结合糖基化的LAG3的抗体)，例如但不限于人源化或嵌合形式的STC1317，或与STC1317竞争结合糖基化的LAG3的抗体。在一些方面，癌症是乳腺癌、肺癌、头颈癌、前列腺癌、食管癌、气管癌、皮肤癌、脑癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、睾丸癌、结肠癌、直肠癌或皮肤癌。在某些方面，癌症是肾上腺癌、肛门癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、成人的脑/CNS肿瘤、儿童的脑/CNS肿瘤、乳腺癌、男性乳腺癌、青少年癌症、儿童癌症、年轻成年人癌症、不明原发灶的癌症、卡斯尔曼病、宫颈癌、结肠/直肠癌、子宫内膜癌、食管癌、尤因家族肿瘤、眼癌、胆囊癌、胃肠道类癌瘤、胃肠道间质瘤(GIST)、妊娠滋养细胞疾病、霍奇金病、卡波西肉瘤、肾癌、喉癌或下咽癌、白血病(例如，成人急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓样白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性髓样白血病(CML)、慢性粒单核细胞白血病(CMML)、儿童期白血病)、肝癌、肺癌(例如,非小细胞肺癌、小细胞肺癌)、肺类癌瘤、淋巴瘤、皮肤淋巴瘤、恶性间皮瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、鼻腔癌、鼻旁窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、儿童非霍奇金淋巴瘤、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、阴茎癌、垂体瘤、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤(如成人软组织癌)、皮肤癌(如基底细胞癌和鳞状细胞癌、黑色素瘤、梅克尔细胞癌)、小肠癌、胃癌、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、华氏巨球蛋白血症或肾母细胞瘤。在某些方面，抗体在药学上可接受的组合物中。在进一步的方面，抗体是全身施用的。在特定方面，抗体通过静脉内、真皮内、瘤内、肌内、腹膜内、皮下或局部施用。
在一些方面，方法还包括向受试者施用至少第二抗癌疗法。在某些方面，其中第二抗癌疗法是手术疗法、化学疗法、放射疗法、冷冻疗法、激素疗法、免疫疗法或细胞因子疗法。
在又一个实施方案中，本文提供了用于评估LAG3糖基化、N-连接的糖基化或N-糖基化的方法，包括使含有LAG3的样品与实施方案的抗体(例如，抗体相对于未糖基化的LAG3选择性结合糖基化的LAG3)。在一些方面，方法是体外方法。在某些方面，样品是细胞样品。
在又一个实施方案中，提供了制备抗体的方法，包括向动物施用根据实施方案的多肽(例如，具有人LAG3的至少7个连续氨基酸的片段的多肽，所述片段包含对应于人LAG3的位置N188、N250、N256或N343的至少一个氨基酸，其中对应于人LAG3的位置N188、N250、N256或N343的所述氨基酸中至少一个被糖基化)并从动物中分离抗体。例如，动物可以是小鼠、大鼠、兔或人。在某些方面，方法进一步包括鉴定抗体的CDR和对CDR周围的序列进行人源化以产生人源化的抗体。在更进一步的方面，方法包括重组表达人源化的抗体。因此，在另一个实施方案中，本文提供了通过上述方法产生的分离的抗体。因此，在一些实施方案中，本文提供了一种分离的抗体，其相对于未糖基化的LAG3选择性结合实施方案的多肽(例如，包含人LAG3的至少7个连续氨基酸的片段的多肽，所述片段包含对应于人LAG3的位置N188、N250、N256或N343的至少一个氨基酸，其中对应于人LAG3的位置N188、N250、N256或N343的所述氨基酸中至少一个是糖基化的)。
附图说明
图1.LAG3是高度糖基化的。加组氨酸标签的LAG3蛋白的SDS-PAGE分析。蛋白质样品(0.5μg)用或不用PNGase F预处理1h。在4-12％NuPAGE凝胶上分离蛋白质并用考马斯亮蓝染色。
图2A和2B.开发对糖基化的LAG3特异的单克隆抗体。使用LAG3-Fc或PNGase F处理的LAG3-Fc(每孔0.5μg)对抗LAG3单克隆抗体进行斑点印迹分析。(A)斑点印迹膜描绘了几种抗体(包括STC1317)的糖特异性结合活性。将LAG3-Fc和PNGase F处理的LAG3-Fc印迹到硝酸纤维素膜上。使用抗LAG3 mAb(0.5μg纯化的)和抗小鼠IgG二抗检测Ag-Ab相互作用。对于对照，分别使用从来自LAG3B(来自Balb/c)和LAG3N(来自NZW)的融合杂交瘤培养上清液中纯化的抗LAG3抗体。(B)相应96孔斑点印迹测定板的样品布局。
图3A和3B.通过Octet分析的抗LAG3抗体的传感图。来自高通量KD筛选的数据总结。数据拟合至1:1结合模型以提取缔合率和解离率。KD使用比率kd:ka计算。图显示了针对时间的应答，显示了相互作用的进度。抗LAG3抗体STC1301-1316(A)和STC1317-STC1322(B)的传感图。
图4.经由Biocore的STC1317的KD测定。使用Biacore结合测定法测定STC1317的结合亲和力(降低的平衡解离常数[KD]值)。六种浓度的LAG3，每一种稀释2倍，通过芯片。图描绘了针对时间的应答，显示了STC1317的相互作用的进展。
图5A和B.在STC1317存在下IFN-γ和IL-2的增加分泌。STC1317对响应刺激细胞(DC，树突细胞)的T细胞增殖(T)的影响。图显示了在STC1317和对照鼠IgG存在下的IL-2(A)和IFN-γ(B)细胞因子水平。在第5天通过ELISA对上清液中的细胞因子进行定量。
具体实施方式
N-糖基化是一种翻译后修饰，在内质网(ER)中开始，随后在高尔基体中进行加工(Schwarz&Aebi,Current Opinion in Structural Biology 21,576-582(2011))。这种类型的修饰首先由膜相关的寡糖基转移酶(OST)复合物催化，该复合物将由寡糖组成的预形成聚糖转移到位于NXT基序(-Asn-X-Ser/Thr)内的天冬酰胺(Asn)侧链受体(Cheung和Reithmeier，Methods 41(4):451-59(2007)；Helenius和Aebi，Science 291(5512):2364-69(2001))。从预形成聚糖中添加或去除糖类分别由一组糖转移酶和糖苷酶介导，它们以细胞和位置依赖性方式严格调节N-糖基化级联。
Galectin-3(Gal-3)作为抗原特异性T细胞活化的调节剂。LAG3表达与Gal-3相关，并且功能性LAG3对于Gal-3介导的细胞毒性T淋巴细胞免疫应答的抑制是必不可少的。LAG3可以被广泛糖基化。糖基化被认为是Gal-3结合的靶标。见Long等人(2018)的第182页。因此，相对于更一般的LAG3抗体，抗glycLAG3抗体可以表现出增强的Gal-3抑制作用。
如本文所用，除非另有说明，否则术语“淋巴细胞活化基因-3”或“LAG3”是指来自任何脊椎动物来源的LAG3，所述脊椎动物包括哺乳动物如灵长类动物(例如人、食蟹猴(cyno))，狗和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。除非另有说明，否则LAG3还包括各种LAG3同种型、相关LAG3多肽，包括其SNP变体，以及LAG3的不同修饰形式，包括但不限于磷酸化的LAG3、糖基化的LAG3和泛素化的LAG3。
下面提供了人LAG3的示例性氨基酸序列，其中N-连接的糖基化位点用粗体和下划线标出(N188、N250、N256和N343)：
Figure BDA0003668004810000101
如下表1所示，两个N-糖基化位点均位于LAG3的细胞外结构域。
特定LAG3同种型或变体的特定糖基化位点可以与特定LAG3同种型或变体的位置188、250、256或343处的氨基酸不同，这些位点位于LAG3的细胞外结构域中。基于序列比对和本领域的其他常识，本领域普通技术人员将能够确定任何特定LAG3同种型或变体对应于上文示例的人LAG3的N188、N250、N256和N343的糖基化位点。因此，本文还提供了相对于未糖基化的LAG3同种型或变体选择性结合糖基化形式的LAG3同种型或变体的抗体。LAG3同种型或变体的糖基化位点可以是上文提供的人LAG3序列的N188、N250、N256和N343的对应位点。本文还提供了包含LAG3同种型或变体的至少7个(例如，至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个)连续氨基酸的片段的多肽，所述片段包含对应于如上提供的示例性人LAG3序列的位置N188、N250、N256或N343的至少一个氨基酸。
如本文所用，并且除非另有说明，冠词“一个”、“一种”和“该”是指冠词的一个或多个语法对象。举例来说，一种抗体是指一种抗体或多于一种抗体。
如本文所用，并且除非另有说明，否则术语“或”与“和/或”可互换使用，除非明确指出仅指替代方案或替代方案是互斥的。如本文所用，除非另有说明，否则“另一个”是指至少第二个或更多。
如本文所用，并且除非另有说明，否则术语“约”表示值包括用于测定所述值的装置、方法的误差的固有变差，或在研究对象之间存在的变化。
如本文所用，并且除非另有说明，否则术语“抗体”是指在免疫球蛋白(或“Ig”)多肽类中的B细胞的多肽产物，其能够结合特定的分子抗原，例如IgG、IgM、IgA、IgD、IgE，以及具有其抗原结合片段的其他分子。抗体可由两对相同的多肽链构成，其中每对具有一条重链(约50-70kDa)和一条轻链(约25kDa)，并且每条链的每个氨基末端部分包括约100至约130或更多个氨基酸，并且每条链的每个羧基末端部分包括恒定区(参见Borrebaeck(编)(1995)Antibody Engineering,第二版,Oxford University Press.；Kuby(1997)Immunology,第二版，W.H.Freeman and Company，New York)。本文中，特定分子抗原包括糖基化的人LAG3。本文提供的抗体包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、合成抗体、重组产生的抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体、骆驼化抗体、嵌合抗体、胞内抗体、抗独特型(抗Id)抗体。
如本文所用，并且除非另有说明，术语“分离的”当用于提及抗体、抗原结合片段或多核苷酸时，是指所提及的分子不含至少一种在自然界中发现的组分。该术语包括从在其自然环境中发现的一些或所有其他组分中去除的抗体、抗原结合片段或多核苷酸。抗体自然环境的组分包括，例如，红细胞、白细胞、血小板、血浆、蛋白质、核酸、盐和营养物质。抗原结合片段或多核苷酸的自然环境的组分包括，例如，脂质膜、细胞器、蛋白质、核酸、盐和营养物质。本发明的抗体、抗原结合片段或多核苷酸也可以不含或一直基本上不含所有这些组分或从中分离或重组产生它的细胞的任何其他组分。
如本文所用，并且除非另有说明，否则术语“单克隆抗体”是指作为单细胞克隆或杂交瘤或源自单细胞的细胞群体的产物的抗体。单克隆抗体也意指通过重组方法从编码重链和轻链的免疫球蛋白基因产生的抗体，以产生单分子免疫球蛋白种类。单克隆抗体制备物中抗体的氨基酸序列基本上是同质的，并且这种制备物中抗体的结合活性表现出基本上相同的抗原结合活性。相比之下，多克隆抗体是从群体中的不同B细胞中获得的，这些B细胞是结合特定抗原的免疫球蛋白分子的组合。多克隆抗体的每个免疫球蛋白可以结合相同抗原的不同表位。生产单克隆抗体和多克隆抗体的方法是本领域众所周知的(Harlow和Lane.,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)和Borrebaeck(编),Antibody Engineering:A Practical Guide,W.H.Freeman andCo.,Publishers,New York,pp.103-120(1991))。
如本文所用，并且除非另有说明，否则术语“人抗体”是指具有对应于人种系免疫球蛋白序列的人可变区和/或人恒定区或其部分的抗体。Kabat等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版,U.S.Department of Health and HumanServices,NIH Publication No.91-3242描述了这些人种系免疫球蛋白序列。本文中，人抗体可包括结合糖基化的人LAG3并由作为人种系免疫球蛋白核酸序列的天然存在的体细胞变体的核酸序列编码的抗体。
如本文所用，并且除非另有说明，否则术语“嵌合抗体”是指这样的抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或者属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而一条或多肽链的其余部分与衍生自另一物种或者属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要因为它们表现出所需的生物活性(参见美国专利号4,816,567；和Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))。
如本文所用，并且除非另有说明，否则术语“人源化抗体”是指包括人免疫球蛋白(例如受体抗体)的嵌合抗体，其中天然互补决定区(“CDR”)残基被替换为来自具有所需特异性、亲和力和能力的非人类物种(例如供体抗体，所述非人物种如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物)的相应CDR的残基。在一些情况下，人免疫球蛋白的一个或多个FR区残基被替换为相应的非人残基。此外，人源化抗体可具有在受体抗体或供体抗体中未发现的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体性能。人源化抗体重链或轻链可以具有基本上所有的至少一个或多个可变区，其中所有或基本上所有的CDR对应于非人免疫球蛋白的CDR，并且所有或基本上所有的FR是人免疫球蛋白序列的那些FR。人源化抗体可以具有免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。更多细节参见Jones等人,Nature,321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature,332:323-329(1988)；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593-596(1992)；Carter等人,Proc.Natl.Acd.Sci.USA 89:4285-4289(1992)；以及美国专利号：6,800,738，6,719,971，6,639,055，6,407,213和6,054,297。
如本文所用，并且除非另有说明，否则术语“重组抗体”是指通过重组方式制备、表达、产生或分离的抗体。重组抗体可以是使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体、从重组组合抗体文库中分离的抗体、从人免疫球蛋白基因的转基因和/或转染色体的动物(例如小鼠或牛)中分离的抗体(参见，例如，Taylor,L.D.等人，Nucl.Acids Res.20:6287-6295(1992))或通过任何其他涉及将免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的方式制备、表达、产生或分离的抗体。此类重组抗体可具有可变区和恒定区，包括源自人种系免疫球蛋白序列的那些(参见Kabat,E.A.等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版,U.S.Department of Health and Human Services,NIHPublication No..91-3242)。重组抗体也可以进行体外诱变(或者，当使用人Ig序列的转基因动物时，体内体细胞诱变)，因此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列可以是虽然来源于人种系VH和VL序列并与之相关，但并不天然存在于体内人抗体种系库中。
如本文所用，并且除非另有说明，否则术语“抗原结合片段”和类似术语是指抗体的一部分，其包括免疫特异性结合抗原并为抗体赋予抗原的特异性和亲和力的氨基酸残基。抗原结合片段可称为抗体的功能片段。抗原结合片段可以是单价的、二价的或多价的。
具有抗原结合片段的分子包括，例如，Fd、Fv、Fab、F(ab')、F(ab)2、F(ab')2、F(ab)3、F(ab')3、单链Fv(scFv)、双抗体、三抗体、四抗体、微型抗体或单域抗体。scFv可以是单价scFv或二价scFv。具有抗原结合片段的其他分子可以包括例如重链或轻链多肽、可变区多肽或CDR多肽或其部分，只要此类抗原结合片段保留结合活性即可。此类抗原结合片段可见于例如Harlow和Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,New York(1989)；Myers(编),Molec.Biology and Biotechnology:A Comprehensive Desk Reference,New York:VCH Publisher,Inc.；Huston等人,CellBiophysics,22:189-224(1993)；Plückthun和Skerra,Meth.Enzymol.,178:497-515(1989)以及Day,E.D.,Advanced Immunochemistry,第二版,Wiley-Liss,Inc.,New York,NY(1990)。抗原结合片段可以是具有至少5个连续氨基酸残基、至少10个连续氨基酸残基、至少15个连续氨基酸残基、至少20个连续氨基酸残基、至少25个连续氨基酸残基、至少40个连续氨基酸残基、至少50个连续氨基酸残基、至少60个连续氨基酸残基、至少70个连续氨基酸残基、至少80个连续氨基酸残基、至少90个连续氨基酸残基、至少100个连续氨基酸残基、至少125个连续氨基酸残基、至少150个连续氨基酸残基、至少175个连续氨基酸残基、至少200个连续氨基酸残基或至少250个连续氨基酸残基的氨基酸序列的多肽。
抗体的重链是指约50-70kDa的多肽链，其中氨基末端部分包括约120至130个或更多个氨基酸的可变区，且羧基末端部分包括恒定区。基于重链恒定区的氨基酸序列，恒定区可以是称为alpha(α)、delta(δ)、epsilon(ε)、gamma(γ)和mu(μ)的五种不同类型中的一种。不同的重链大小不同：α、δ和γ含有大约450个氨基酸，而μ和ε含有大约550个氨基酸。当与轻链结合时，这些不同类型的重链分别产生五类众所周知的抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，包括IgG的四个亚类，即IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。重链可以是人重链。
抗体的轻链是指约25kDa的多肽链，其中氨基末端部分包括约100至约110个或更多个氨基酸的可变区，且羧基末端部分包括恒定区。轻链的大致长度为211至217个氨基酸。基于恒定结构域的氨基酸序列，有两种不同的类型，称为lambda(λ)的kappa(κ)。轻链氨基酸序列是本领域众所周知的。轻链可以是人轻链。
抗体的可变结构域或可变区是指抗体的轻链或重链的一部分，其通常位于轻链或重链的氨基末端并且在重链中具有约120至130个氨基酸的长度和在轻链中具有约100至110个氨基酸长度，并且用于每个特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。不同抗体之间的可变结构域的序列差异很大。序列的可变性集中在CDR中，而可变结构域中较少可变的部分称为框架区(FR)。轻链和重链的CDR主要负责抗体与抗原的相互作用。本文使用的氨基酸位置编号是根据EU索引，如Kabat等人(1991)Sequences of proteins of immunological interest.(U.S.Department of Health and Human Services,Washington,D.C.)第5版。可变区可以是人可变区。
CDR是指在免疫球蛋白(Ig或抗体)VHβ-折叠框架的非框架区内的三个高变区(H1、H2或H3)之一，或抗体VLβ-折叠框架的非框架区内的三个高变区(L1、L2或L3)之一。因此，CDR是散布在框架区序列中的可变区序列。CDR区为本领域技术人员所熟知，并已由例如Kabat定义为在抗体可变结构域内具有最高变异性的区域(Kabat等人，J.Biol.Chem.252:6609-6616(1977)；Kabat,Adv.Prot.Chem.32:1-75(1978))。Chothia在结构上也将CDR区序列定义为不是保守β-折叠框架的部分的那些残基，并因此能够适应不同的构象(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。这两个术语在本领域中都是公认的。CDR在典型抗体可变结构域内的位置已通过比较多种结构得到确定(Al-Lazikani等人，J.Mol.Biol.273:927-948(1997)；Morea等人，Methods 20:267-279(2000)))。由于不同抗体中高变区内的残基数量不同，因此与典型位置相关的额外残基通常在典型可变结构域编号方案中的残基编号旁边用a、b、c等编号(Al-Lazikani等人，同上(1997))。这样的命名法对于本领域技术人员来说同样是众所周知的。
已经开发并被广泛采用一种通用编号系统，ImMunoGeneTics(IMGT)Information
Figure BDA0003668004810000161
(Lafranc等人,2003,Dev.Comp.Immunol.,27(1):55-77)。IMGT是一个综合信息系统，专门用于人类和其他脊椎动物的免疫球蛋白(Ig)、T细胞受体(TR)和主要组织相容性复合体(MHC)。在本文中，根据氨基酸序列和在轻链或重链中的位置来指示CDR。由于CDR在免疫球蛋白V结构域结构内的“位置”在物种之间是保守的，并存在于称为环的结构中，通过使用根据结构特征、CDR和框架残基比对可变结构域序列的编号系统，并易于识别。该信息可用于将来自一个物种的免疫球蛋白的CDR残基移植和替换到通常来自人抗体的受体框架中。Honegger等人,2001,J.Mol.Biol.,309:657-670已经开发了另一种编号系统(AHon)。编号系统之间的对应关系，包括例如Kabat编号和IMGT唯一编号系统，为本领域技术人员所熟知(参见例如Kabat，同上；Chothia等人，同上；Martin，2010,Antibody Engineering,Vol.2,Chapter 3,Springer Verlag；和Lefranc等人,1999,Nuc.Acids Res.,27:209-212)。
AbM和Contact方法也定义了CDR区序列。AbM高变区代表Kabat CDR和Chothia结构环之间的折衷，并被Oxford Molecular的AbM抗体建模软件使用(参见例如Martin，2010，Antibody Engineering，第2卷，第3章，Springer Verlag)。“contact”高变区基于对可用复杂晶体结构的分析。来自这些高变区或CDR中的每一个的残基如下所述。
CDR区序列的示例性描述在下表2中说明。典型抗体可变区内的CDR的位置已通过比较多种结构而确定(Al-Lazikani等人，1997，J.Mol.Biol.，273：927-948)；Morea等人，2000，Methods，20：267-279)。由于不同抗体中高变区内的残基数量不同，因此相对于典型位置的额外残基通常在典型可变区编号方案中的残基编号旁边用a、b、c等编号(Al-Lazikani等人，同上)。这样的命名法对于本领域技术人员来说同样是众所周知的。
表2.CDR区序列的示例性描述
Figure BDA0003668004810000162
Figure BDA0003668004810000171
一个或多个CDR也可以共价地或非共价地掺入分子中以使其成为免疫粘附素。免疫粘附素可以掺入一个或多个CDR作为较大多肽链的一部分，可以将入一个或多个CDR与另一条多肽链共价连接，或者可以非共价掺入入一个或多个CDR。CDR允许免疫粘附素与特定的目标抗原结合。
如本文所用并且除非另有说明，术语“结合”或“与…结合”是指分子之间的相互作用。相互作用可以是例如非共价相互作用，包括氢键、离子键、疏水相互作用和/或范德华相互作用。抗体与靶分子(例如糖基化的人LAG3)的单个表位之间的总非共价相互作用的强度是抗体对该表位的亲和力。“结合亲和力”通常是指分子(例如，抗体等结合蛋白)的单个结合位点与其结合伴侣(例如，抗原)之间的非共价相互作用总和的强度。
结合分子X(例如抗体)与其结合伴侣Y(例如抗体的同源抗原)的亲和力通常可以用解离常数(Kd)或平衡解离常数(KD)表示。低亲和力抗体通常结合抗原慢且易于解离，而高亲和力抗体通常结合抗原更快且保持结合更长时间。测量结合亲和力的多种方法在本领域中是已知的，其中任何一种都可以用于本公开内容的目的。“KD”或“KD值”可以通过本领域已知的测定法来测量，例如通过结合测定法测量。KD可以在放射性标记的抗原结合测定法(RIA)中测量，例如，用目标抗体的Fab形式及其抗原进行(Chen等人,(1999)J.Mol.Biol.293:865-881)。KD或KD值也可以通过使用Biacore的表面等离子共振测定法，使用例如BIAcoreTM-2000或BIAcoreTM-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)，或通过生物层干涉法,使用例如OctetQK384系统(ForteBio,Menlo Park,CA)进行测量。如本文所用，并且除非另有说明，如果抗体以比第二分子抗原更高的亲和力结合第一分子抗原，则认为所述抗体相对于第二分子抗原能够“选择性结合”第一分子抗原。抗体通常不结合完全不相关的抗原。
如本文所用，并且除非另有说明，否则本文所用的术语“多肽”包括具有2至30个氨基酸(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、25或30个氨基酸)以及更长的氨基酸链的寡肽，例如超过30个氨基酸，超过50个氨基酸，超过100个氨基酸，超过150个氨基酸，超过200多个氨基酸，超过300多个氨基酸，超过400多个氨基酸，超过500多个氨基酸，或者超过600多个氨基酸。可以例如通过重组表达或通过化学合成来产生多肽。本公开内容的多肽可以被翻译后修饰或化学修饰(例如，糖基化、氨基甲酰化、磷酸化、生物素化、荧光染料的附着等)。多肽可以在特定位点被糖基化。多肽可以包括不由天然遗传密码编码的非天然氨基酸。例如，多肽可以包括甲基化的骨架结构、拟肽骨架结构(聚-N-取代的甘氨酸)、L-氨基酸、R-氨基酸等。多肽可以具有野生型序列、天然存在的变体序列、突变体序列(例如，点突变体、缺失突变体)等。
抗glycLAG3抗体
本文提供了相对于未糖基化的LAG3选择性结合糖基化的LAG3的分离抗体。LAG3可以是人LAG3。糖基化的LAG3可以是LAG3的特定N-聚糖结构或LAG3的糖肽。在一些实施方案中，本文提供的抗体是相对于未糖基化的LAG3选择性结合糖基化的LAG3的抗原结合片段。
在一些实施方案中，本文提供的分离的抗体相对于未糖基化的LAG3选择性地结合在N188、N250、N256、N343或其任何组合处糖基化的人LAG3。在一些实施方案中，分离的抗体选择性地结合仅具有N188糖基化的人LAG3。在一些实施方案中，分离的抗体选择性地结合仅具有N250糖基化的人LAG3。在一些实施方案中，分离的抗体选择性地结合仅具有N256糖基化的人LAG3。在一些实施方案中，分离的抗体选择性地结合仅具有N343糖基化的人LAG3。在一些实施方案中，分离的抗体选择性地结合仅具有N188和N250糖基化的人LAG3。在一些实施方案中，分离的抗体选择性地结合仅具有N188和N256糖基化的人LAG3。在一些实施方案中，分离的抗体选择性地结合仅具有N188和N343糖基化的人LAG3。在一些实施方案中，分离的抗体选择性地结合仅具有N250和N256糖基化的人LAG3。在一些实施方案中，分离的抗体选择性地结合仅具有N250和N343糖基化的人LAG3。在一些实施方案中，分离的抗体选择性地结合仅具有N256和N343糖基化的人LAG3。在一些实施方案中，分离的抗体选择性地结合仅具有N188、N250和N256糖基化的人LAG3。在一些实施方案中，分离的抗体选择性地结合仅具有N188、N250和N343糖基化的人LAG3。在一些实施方案中，分离的抗体选择性地结合仅具有N188、N256和N343糖基化的人LAG3。在一些实施方案中，分离的抗体选择性地结合仅具有N250、N256和N343糖基化的人LAG3。在一些实施方案中，分离的抗体选择性地结合具有N188、N250、N256和N343糖基化的人LAG3。
在某些方面，抗glycLAG3抗体结合LAG3并掩蔽或筛选一个或多个糖基化基序以阻断分子与该基序的结合或其他相互作用，并可阻断LAG3在该糖基化位点处的糖基化。在具体实施方案中，抗glycLAG3抗体掩蔽在N188、N250、N256和N343中的一个或多个处的糖基化位点。
在一些实施方案中，本文提供的抗体选择性地结合LAG3的一个或多个糖基化基序。在一些实施方案中，抗体选择性地结合具有糖基化基序和相邻肽的糖肽。在一些实施方案中，抗体选择性地结合糖基化的LAG3，其Kd小于相对于未糖基化的LAG3所表现出的Kd的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在某些实施方案中，抗原结合片段结合糖基化的LAG3，其Kd小于相对于未糖基化的LAG3所表现出的Kd的50％。在一些实施方案中，抗体结合糖基化的LAG3，其Kd小于相对于未糖基化的LAG3所表现出的Kd的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、30％、40％、50％。在进一步的方面，抗体结合糖基化的LAG3，其Kd是相对于未糖基化的LAG3所表现出的Kd的至多十分之一。
提供了优先结合糖基化的LAG3的单克隆抗体，特别是本文所述的STC1317。还提供了STC1317的人源化和嵌合形式以及竞争结合STC1317的抗体。STC1317的重链和轻链可变结构域在下表3中提供。
在一个特定方面提供了抗glycLAG3单克隆抗体STC1317，其具有分别具有SEQ IDNO：3和5的氨基酸序列(没有任何信号序列的成熟的VH和VL区氨基酸序列)的重链和轻链可变域，及其抗原结合部分、以及其人源化和嵌合形式。本文提供了抗glycLAG3抗体，其与STC1317 MAb竞争结合LAG3和/或结合与STC1317相同的表位。
提供了STC1317 mAb的重链和轻链可变区(V)结构域的单克隆核酸(DNA)和相应氨基酸序列，如下表3所示。SEQ ID NO：2和3是STC1807 VH结构域的核苷酸和氨基酸序列，而SEQ ID NO：4和5是STC1317κVL结构域的成熟形式的核苷酸和氨基酸序列。表4提供了STC1317的Chothia、AbM、Kabat和Contact重链和轻链V结构域CDR。
在一个实施方案中，特异性和优先结合糖基化的LAG3的抗glycLAG3抗体包含具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的VH结构域和/或具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的VL结构域。在一个实施方案中，抗glycLAG3抗体与包含SEQ ID NO：3的VH结构域和SEQ ID NO：5的VL结构域的抗体竞争特异性结合糖基化的LAG3。在其他实施方案中，抗glycLAG3抗体包含与SEQID NO:3的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VH结构域和/或与SEQ ID NO:5的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的VL结构域。这些抗glycLAG3抗体可以是嵌合抗体并且包含人恒定结构域，例如来自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的恒定结构域。
在一个实施方案中，特异性和优先结合糖基化的LAG3的抗glycLAG3抗体包含VH结构域，所述VH结构域包含分别具有SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的氨基酸序列的Chothia CDR 1-3；包含分别具有SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:8的氨基酸序列的AbM CDR 1-3；包含分别具有SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:8的氨基酸序列的Kabat CDR 1-3；或包含分别具有SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15的氨基酸序列的Contact CDR 1-3，或其组合。在一个实施方案中，抗glycLAG3抗体与包含VH结构域的抗体竞争特异性结合糖基化的LAG3，所述VH结构域包含分别具有SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：7和SEQ ID NO：8的氨基酸序列的Chothia CDR 1-3；包含分别具有SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:10和SEQ ID NO:8的氨基酸序列的AbM CDR 1-3；包含分别具有SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:12和SEQ ID NO:8的氨基酸序列的Kabat CDR 1-3；或包含分别具有SEQ ID NO:13、SEQID NO:14和SEQ ID NO:15的氨基酸序列的Contact CDR 1-3，或其组合。在一个实施方案中，特异性和优先结合糖基化的LAG3的抗glycLAG3抗体包含VL结构域，所述VL结构域包含分别具有SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18的氨基酸序列的Chothia、AbM或KabatCDR 1-3；或包含分别具有SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21的氨基酸序列的Contact CDR 1-3，或其组合。在一个实施方案中，抗glycLAG3抗体与包含VL结构域的抗体竞争特异性结合糖基化的LAG3，所述VL结构域包含分别具有SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18的氨基酸序列的Chothia、AbM或Kabat CDR 1-3；或包含分别具有SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21的氨基酸序列的Contact CDR 1-3，或其组合。在一个实施方案中，抗glycLAG3抗体包含特定抗体或竞争对特定抗体的结合，所述特定抗体包含VH结构域并且包含VL结构域，所述VH结构域包含分别具有SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQID NO：8的氨基酸序列的Chothia CDR 1-3；包含分别具有SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:8的氨基酸序列的AbM CDR 1-3；包含分别具有SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:8的氨基酸序列的Kabat CDR 1-3；或包含分别具有SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15的氨基酸序列的Contact CDR 1-3；所述VL结构域包含分别具有SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18的氨基酸序列的Chothia、AbM或Kabat CDR 1-3；或包含分别具有SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21的氨基酸序列的Contact CDR 1-3。优选地，VH和VL结构域具有相同类别的CDR，即两者都具有Chothia、AbM、Kabat或ContactCDR。
在其他实施方案中，抗glycLAG3抗体具有包含CDR H1、CDR H2和CDR H3的VH结构域，所述CDR H1、CDR H2和CDR H3具有在以下CDR中的1、2或3个中具有1、2、3、4或5个氨基酸置换的氨基酸序列：分别具有SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR，或分别具有SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR，或分别具有SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR，或分别具有SEQ IDNO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR。抗glycLAG3抗体可以具有VL结构域，所述VL结构域包含CDR L1、CDR L2和CDR L3，它们具有在1、2或3个CDR中具有1、2、3、4或5个氨基酸置换的氨基酸序列：分别具有SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR，或分别具有SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR。抗glycLAG3抗体可以具有在VH和VL结构域二者的CDR中的氨基酸置换。在一些实施方案中，氨基酸置换是保守置换。
优选地，前述抗体具有人框架区，即，是STC1317的人源化形式，并且任选地包含人恒定结构域，例如来自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的恒定结构域。
本领域技术人员将理解，可以在人源化抗体的CDR和/或框架区中进行一个或多个氨基酸置换以改善结合亲和力或其他参数。在实施方案中，抗glycLAG3抗体与包含上述VH和VL结构域以及其中CDR的抗体竞争特异性结合糖基化的LAG3。在实施方案中，抗glycLAG3抗体结合糖基化的LAG3，其Kd小于相对于未糖基化的LAG3所表现出的Kd的一半。在实施方案中，抗glycLAG3抗体结合糖基化的LAG3，其Kd小于相对于未糖基化的LAG3所表现出的Kd的一半。在一个实施方案中，抗glycLAG3抗体结合糖基化的LAG3蛋白，其Kd是抗体与未糖基化的LAG3结合所表现出的Kd的至多五分之一。在一个实施方案中，抗glycLAG3抗体结合糖基化的LAG3蛋白，其Kd是抗体与未糖基化的LAG3蛋白结合所表现出的Kd的至多十分之一。在一个实施方案中，在细胞流式细胞术结合测定法中，抗体表现出与表达WT LAG3的细胞的结合，以绿色计数对象/mm2表示，是表示与表达未糖基化的LAG3的细胞的结合的绿色计数对象/mm2的3倍、5倍、10倍、20倍、30倍或50倍。在一个实施方案中，抗体可通过荧光标记或标志物直接或间接检测。在一个实施方案中，抗体直接用荧光标记或标志物如FITC进行标记。在一个实施方案中，STC1317 MAb或其结合结构域或者人源化或嵌合形式对糖基化的LAG3的结合亲和力为0.1-13nM或0.1-5nM，包括下限值和上限值。
又一个实施方案提供的分离的核酸分子，其分别编码抗glycLAG3 VH结构域和/或抗glycLAG3抗体VL结构域，编码VH结构域的核酸包含与SEQ ID NO:2至少90-98％相同的核苷酸序列，编码VL结构域的核酸包含与SEQ ID NO：4至少90-98％相同的核苷酸序列。在实施方案中，编码VH和/或VL结构域的核苷酸序列分别与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4是90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同。
下表3提供了STC1317的重链和轻链可变结构域的核苷酸和氨基酸序列。
表3.STC1317的重链和轻链可变结构域核苷酸和氨基酸序列
Figure BDA0003668004810000231
下表4中提供了根据Chothia、AbM、Kabat和Contact CDR的STC1317抗体的CDR序列。因此，提供了STC1317的人源化形式，与包含移植到人框架区中下表4的CDR的未糖基化的LAG3相比，其优先结合糖基化的LAG3。
表4.STC1317的CDR序列
Figure BDA0003668004810000232
Figure BDA0003668004810000241
在一些实施方案中，本文提供的抗glycLAG3抗体可以是IgG、IgM、IgA、IgD或IgE。抗glycLAG3抗体也可以是嵌合抗体、亲和力成熟抗体、人源化抗体或人抗体。抗glycLAG3抗体也可以是骆驼化抗体、胞内抗体、抗独特型(抗-Id)抗体。在一些实施方案中，抗glycLAG3抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。
在一些实施方案中，本文提供的抗体是相对于未糖基化的LAG3选择性结合糖基化的LAG3的抗原结合片段。抗原结合片段可以是Fd、Fv、Fab、F(ab')、F(ab)2、F(ab')2、F(ab)3、F(ab')3、单链Fv(scFv)、双抗体、三抗体、四抗体、微型抗体或单域抗体。scFv可以是单价scFv或二价scFv。
通过已知的方式和如本文所述，可以产生对糖基化的LAG3、一种或多种其相应的表位或任何前述的缀合物特异的多克隆或单克隆抗体、抗原结合片段和结合结构域和CDR(包括上述任何一种的工程改造形式)，无论此类抗原或表位是从天然来源分离的还是天然化合物的合成衍生物或变体。
抗体可以从任何动物来源(包括禽类和哺乳动物)产生。在一些实施方案中，抗体是绵羊、鼠(例如小鼠和大鼠)、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马或鸡抗体。此外，较新的技术允许从人组合抗体库中开发和筛选人抗体。例如，噬菌体抗体表达技术允许在没有动物免疫的情况下产生特异性抗体，如美国专利号6,946,546中所述，该专利通过引用全部并入本文。这些技术在Marks等人,Bio/Technol.,10:779-783(1992)；Stemmer,Nature,370:389-391(1994)；Gram等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:3576-3580(1992)；Barbas等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:3809-3813(1994)和Schier等人,Gene,169(2):147-155(1996)中有进一步的描述；其全部内容通过引用并入本文。
在各种动物物种中产生多克隆抗体以及产生各种类型的单克隆抗体(包括人源化、嵌合和完全人单克隆抗体)的方法在本领域中是众所周知的。例如，以下美国专利提供了对此类方法的有效描述，并以引用的方式并入本文：美国专利号3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,196,265；4,275,149；4,277,437；4,366,241；4,469,797；4,472,509；4,606,855；4,703,003；4,742,159；4,767,720；4,816,567；4,867,973；4,938,948；4,946,778；5,021,236；5,164,296；5,196,066；5,223,409；5,403,484；5,420,253；5,565,332；5,571,698；5,627,052；5,656,434；5,770,376；5,789,208；5,821,337；5,844,091；5,858,657；5,861,155；5,871,907；5,969,108；6,054,297；6,165,464；6,365,157；6,406,867；6,709,659；6,709,873；6,753,407；6,814,965；6,849,259；6,861,572；6,875,434；6,891,024；7,407,659；和8,178,098；其全部内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，抗glycLAG3抗体可以是单克隆抗体。在一些实施方案中，抗glycLAG3可以是多克隆抗体。可以给动物接种抗原，例如糖基化的LAG3多肽，以产生对糖基化的LAG3多肽特异的抗体。抗原经常与另一种分子结合或缀合以增强免疫应答。缀合物可以是与用于在动物中引发免疫应答的抗原结合的任何肽、多肽、蛋白质或非蛋白质物质。动物响应抗原接种而产生的抗体具有多种不同的分子(多克隆抗体)，这些分子由多种单独的产生抗体的B淋巴细胞产生。在动物体内产生多克隆抗体的正确条件下，动物血清中的大多数抗体识别已免疫动物的抗原化合物上的集体表位。
这种特异性可以通过亲和纯化进一步增强，以仅选择那些识别目标抗原或表位的抗体。生成单克隆抗体(MAb)的方法可以与制备多克隆抗体的方法相同。在一些实施方案中，诸如小鼠和大鼠的啮齿动物用于产生单克隆抗体。在一些实施方案中，兔、绵羊或蛙细胞用于产生单克隆抗体。大鼠的应用是众所周知的并且可以提供某些优势。小鼠(例如，BALB/c小鼠)是常规使用的，并且通常提供高百分比的稳定融合物。
杂交瘤技术涉及将来自先前用糖基化的LAG3多肽免疫的小鼠的单个B淋巴细胞与永生骨髓瘤细胞(通常是小鼠骨髓瘤)融合。该技术提供了一种将单个产生抗体的细胞繁殖无限代的方法，从而可以产生无限量的具有相同抗原或表位特异性的结构相同的抗体(单克隆抗体)。
可以通过本领域已知的可用于生产多肽的任何方法来生产抗glycLAG3抗体，所述方法例如体外合成、重组DNA生产等。人源化抗体可以通过重组DNA技术产生。本文所述的抗体也可以使用重组免疫球蛋白表达技术产生。包括人源化抗体在内的免疫球蛋白分子的重组生产描述于美国专利号4,816,397(Boss等人)、美国专利号6,331,415和4,816,567(均属于Cabilly等人)、英国专利GB 2,188,638(Winter等人)和英国专利GB 2,209,757；它们的全部内容通过引用并入本文。用于重组表达免疫球蛋白(包括人源化免疫球蛋白)的技术也可以在Goeddel等人，Gene Expression Technology Methods in EnzymologyVol.185Academic Press(1991)和Borreback,Antibody Engineering,W.H.Freeman(1992)中找到；它们的全部内容通过引用并入本文。关于重组抗体的产生、设计和表达的其他信息可以在Mayforth,Designing Antibodies,Academic Press,San Diego(1993)中找到。
已经开发了用人来源的类似结构域替换单克隆抗体的轻链和重链恒定结构域而使外源抗体的可变区保持完整的方法。备选地，在人免疫球蛋白基因的转基因小鼠或大鼠中产生完全人单克隆抗体。还开发了通过重组构建具有啮齿动物和人氨基酸序列两者的抗体可变结构域来将单克隆抗体的可变结构域转化为更加人形式的方法。在人源化单克隆抗体中，只有高变CDR来源于非人(例如小鼠、大鼠、鸡、美洲驼)单克隆抗体，框架区来源于人氨基酸序列。人们认为，将抗体中啮齿类动物特有的氨基酸序列替换为在人抗体相应位置发现的氨基酸序列将降低治疗使用期间发生不良免疫反应的可能性。产生抗体的杂交瘤或其他细胞也可能发生基因突变或其他变化，这可能会或可能不会改变由杂交瘤产生的抗体的结合特异性。
工程改造的抗体可以通过如下产生：使用单克隆抗体和其他抗体以及重组DNA技术来产生保留原始抗体的抗原或表位特异性的其他抗体或嵌合分子，即该分子具有结合结构域。此类技术可涉及将编码抗体的免疫球蛋白可变区或CDR的DNA引入不同抗体的框架区、恒定区或恒定区加框架区的遗传物质。参见，例如，美国专利号5,091,513和6,881,557，它们通过引用并入本文。
在某些实施方案中，抗glycLAG3抗体是人抗体。人抗体可通过本领域已知的多种方法制备，包括上述噬菌体展示方法，使用源自人免疫球蛋白序列的抗体文库(参见美国专利号4,444,887和4,716,111；和国际公开号WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735和WO 91/10741)。可以使用不能表达功能性内源性免疫球蛋白但可以表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠来生产人抗体。例如，可以将人重链和轻链免疫球蛋白基因复合物随机或通过同源重组引入小鼠胚胎干细胞。备选地，除了人重链和轻链基因之外，人可变区、恒定区和多样性区可以被引入小鼠胚胎干细胞中。小鼠重链和轻链免疫球蛋白基因可以单独地失去功能或随着通过同源重组引入人免疫球蛋白基因座同时失去功能。特别是，JH区的纯合缺失会阻止内源性抗体产生。将修饰的胚胎干细胞扩增并显微注射到胚泡中以产生嵌合小鼠。然后培育嵌合小鼠以产生表达人类抗体的纯合子代。使用选择的抗原，例如糖基化的LAG3多肽的全部或部分，使用常规方法免疫转基因小鼠。可以使用常规杂交瘤技术从免疫的转基因小鼠获得针对抗原的单克隆抗体(参见，例如，美国专利号5,916,771)。转基因小鼠携带的人类免疫球蛋白转基因在B细胞分化期间重新排列，随后发生类别转换和体细胞突变。因此，使用这种技术，可以产生治疗上有用的IgG、IgA、IgM和IgE抗体。对于用于产生人抗体的这种技术的概述，参见Lonberg和Huszar(1995,Int.Rev.Immunol.13:65-93，其通过引用全部并入本文)。对于用于产生人抗体和人单克隆抗体的该技术和产生这种抗体的方案的详细讨论，参见例如国际公开号WO 98/24893、WO 96/34096和WO 96/33735；和美国专利号5,413,923、5,625,126、5,633,425、5,569,825、5,661,016、5,545,806、5,814,318和5,939,598，其全部内容通过引用并入本文。此外，Abgenix,Inc.(Freemont,Calif.)和Medarex(Princeton,N.J.)等公司可以致力于使用与上述类似的技术提供针对所选抗原的人抗体。
在一个实施方案中，抗体是嵌合抗体，例如，包含来自非人供体的抗原结合序列移植到异源非人、人或人源化序列(例如，框架和/或恒定结构域序列)的抗体。在一个实施方案中，非人类供体是大鼠。在一个实施方案中，抗原结合序列是合成的，例如，通过诱变(例如，人噬菌体文库的噬菌体展示筛选等)获得。在一个实施方案中，本文提供的嵌合抗体具有鼠V区和人C区。在一个实施方案中，鼠轻链V区与人κ轻链融合。在一个实施方案中，鼠重链V区与人IgG1 C区融合。
产生嵌合抗体的方法是本领域已知的。参见例如，Morrison,Science 229:1202(1985)；Oi等人，BioTechniques 4:214(1986)；Gillies等人，J.Immunol.Methods 125：191-202(1989)；和美国专利号6,311,415、5,807,715、4,816,567和4,816,397；所有这些都通过引用全部并入本文。包含来自非人类物种的一个或多个CDR和来自人类免疫球蛋白分子的框架区的嵌合抗体可以使用本领域已知的多种技术产生，包括例如CDR移植(EP 239,400；国际公布号WO 91/09967；和美国专利号5,225,539、5,530,101和5,585,089)，饰面或表面重建(EP 592,106；EP 519,596；Padlan，Molecular Immunology 28(4/5):489-498(1991)；Studnicka等人,Protein Engineering 7:805(1994)；和Roguska等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:969(1994))，和链改组(美国专利号5,565,332)；所有这些都通过引用全部并入本文。
用于产生重组嵌合抗glycLAG3抗体的一种示例性方法可以包括以下：a)通过常规分子生物学方法构建表达载体，该表达载体编码和表达抗体重链，其中鼠抗glycLAG3单克隆抗体的CDR和可变区融合至来源于人免疫球蛋白的Fc区，从而产生用于表达嵌合抗体重链的载体；b)通过常规分子生物学方法构建表达载体，该表达载体编码并表达鼠抗glycLAG3单克隆抗体的抗体轻链，从而产生用于表达嵌合抗体轻链的载体；c)通过常规分子生物学方法将表达载体转移到宿主细胞中，以产生用于表达嵌合抗体的转染宿主细胞；和d)用常规细胞培养技术培养转染的细胞，从而产生嵌合抗体。
用于产生重组人源化抗glycLAG3抗体的一种示例性方法可以包括以下：a)通过常规分子生物学方法构建表达载体，该表达载体编码和表达抗体重链，其中保持供体抗体结合特异性所需的CDR和可变区框架的最小部分来源于非人免疫球蛋白，例如鼠抗glycLAG3单克隆抗体，而抗体的其余部分来源于人免疫球蛋白，从而产生用于表达人源化抗体重链的载体；b)通过常规分子生物学方法构建表达载体，该表达载体编码和表达抗体轻链，其中保持供体抗体结合特异性所需的CDR和可变区框架的最小部分来源于非人免疫球蛋白，如鼠抗glycLAG3单克隆抗体，而其余抗体来源于人免疫球蛋白，从而产生用于表达人源化抗体轻链的载体；c)通过常规分子生物学方法将表达载体转移到宿主细胞中，以产生用于表达人源化抗体的转染宿主细胞；和d)用常规细胞培养技术培养转染细胞，从而产生人源化抗体。
对于任一示例性方法，可以用这样的表达载体共转染宿主细胞，所述表达载体可以包含不同的选择标志物，但除了重链和轻链编码序列之外，优选是相同的。该程序提供重链和轻链多肽的相等表达。备选地，可以使用编码重链和轻链多肽两者的单一载体。重链和轻链的编码序列可以包含cDNA或基因组DNA或两者。用于表达重组抗体的宿主细胞可以是细菌细胞如大肠杆菌(Escherichia coli)，或更优选真核细胞(如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或HEK-293细胞)。表达载体的选择取决于宿主细胞的选择，并且可以进行选择以在所选宿主细胞中具有所需的表达和调节特性。可以使用的其他细胞系包括但不限于CHO-K1、NSO和PER.C6(Crucell,Leiden,荷兰)。此外，当选择宿主细胞以考虑物种特异性密码子使用偏好和增强蛋白质表达时，可以优化密码子使用。例如，对于CHO细胞表达，编码抗体的DNA可以掺入灰仓鼠(Cricetulus griseus，中国仓鼠卵巢细胞来源于此)优先使用的密码子。密码子优化方法可用于促进所需宿主细胞的表达改善(参见例如，Wohlgemuth等人，Philos.Trans.R.Soc.Lond.B Biol.Sci.366(1580):2979-2986(2011)；Jestin等人，J.Mol.Evol.69(5):452-457(2009)；Bollenbach等人，Genome Res.17(4):401-404(2007)；Kurland等人，Prog.Nucleic Acid Res.Mol.Biol.31:191-219(1984)；Grosjean等人，Gene18(3)：199-209(1982))。
在一个实施方案中，抗体是来源于骆驼抗体、优选来源于重链骆驼抗体的免疫球蛋白单可变结构域，没有轻链，其被称为VHH结构域序列或NanobodiesTM。NanobodyTM(Nb)是天然存在的单链抗体的最小功能片段或单个可变结构域(VHH)，并且是本领域技术人员已知的。它们衍生自在骆驼科动物中看到的仅重链抗体(Hamers-Casterman等人，Nature363：446-448(1993)；Desmyter等人，Nat.Struct.Biol.，803-811(1996))。在“骆驼科动物”家族中，发现了缺乏多肽轻链的免疫球蛋白。“骆驼科动物”包括旧世界骆驼科动物(双峰驼(Camelus bactrianus)和单峰驼(Camelus dromedarius))和新世界骆驼科动物(例如，小羊驼(Lama paccos)、大羊驼(Lama glama)、原驼(Lama guanicoe)和瘦驼(Lamavicugna))。单可变结构域重链抗体在本文中命名为NanobodyTM或VHH抗体。Nb的小尺寸和独特的生物物理特性在识别不常见或隐藏表位以及结合到蛋白质靶标的腔体或活性位点方面优于常规抗体片段。此外，Nb可以设计为多特异性和多价抗体，附着至报告分子，或人源化的。Nb是稳定的，可以在胃肠道系统中存活，并且可以很容易地制造。
通过将不同特异性的两个抗原结合位点统一到单个构建体中，双特异性抗体具有以极高特异性使两种离散抗原在一起的能力，并因此具有作为治疗剂的巨大潜力。双特异性抗体最初可以通过融合两种杂交瘤来制备，每种杂交瘤都能产生不同的免疫球蛋白。双特异性抗体也可以通过连接两个scFv抗体片段同时省略存在于完整免疫球蛋白中的Fc部分来产生。此类构建体中的每个scFv单元可由抗体重链(VH)和轻链(VL)中的每一条的一个可变结构域组成，通过合成的多肽接头彼此连接，后者通常经过基因工程改造，以便具有最低限度的免疫原性，同时保持对蛋白水解的最大抵抗力。可以通过多种技术连接各个scFv单元，包括掺入桥接两个scFv单元的短(通常少于10个氨基酸)多肽间隔物，从而产生双特异性单链抗体。因此，得到的双特异性单链抗体是在单个多肽链上包含两个具有不同特异性的VH/VL对的物质，其中各个scFv单元中的VH和VL结构域由多肽接头分开足够长以允许这两个结构域之间的分子内缔合，并且其中由此形成的scFv单元通过多肽间隔物彼此连续串联，该多肽间隔物保持足够短以防止例如一个scFv单元的VH结构域和另一个scFv单元的VL之间的不希望的缔合。
抗原结合片段的实例包括但不限于：(i)由VL、VH、CL和CH1结构域组成的Fab片段；(ii)由VH和CH1结构域组成的“Fd”片段；(iii)由单一抗体的VL和VH结构域组成的“Fv”片段；(iv)“dAb”片段，其由VH结构域组成；(v)分离的CDR区；(vi)F(ab')2片段，包含两个连接的Fab片段的二价片段；(vii)单链Fv分子(“scFv”)，其中VH结构域和VL结构域通过允许两个结构域缔合形成结合结构域的肽接头连接；(viii)双特异性单链Fv二聚体(美国专利号5,091,513)；和(ix)通过基因融合构建的双抗体、多价或多特异性片段(美国专利申请公开号20050214860)。Fv、scFv或双抗体分子可以通过掺入连接VH和VL结构域的二硫键来稳定。还可以制备具有与CH3结构域连接的scFv的微型抗体(Hu等人，Cancer Res.，56:3055-3061(1996))。
在实施方案中也考虑了抗体样结合肽模拟物。Liu等人,Cell Mol.Biol.,49:209-216(2003)描述了“抗体样结合肽模拟物”(ABiP)，它们是充当缩减(pared-down)抗体的肽并且具有更长的血清半衰期以及繁琐性较小的合成方法的某些优点。
糖基化的LAG3多肽
在又一个实施方案中，提供了包含多肽的组合物，该多肽包含人LAG3的至少7个(例如，至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个)连续氨基酸的片段，所述片段包含至少一个对应于人LAG3的位置N188、N250、N256或N343的氨基酸，其中对应于人LAG3的位置N188、N250、N256或N343的所述氨基酸中的至少一个是糖基化的，其中多肽配制在药学上可接受的承载体中。
在一些实施方案中，本文还提供了人LAG3的至少7个连续氨基酸的多肽，其具有至少一个对应于人LAG3的位置N188、N250、N256或N343的氨基酸，其中对应于人LAG3的位置N188、N250、N256或N343的所述氨基酸中的至少一个是糖基化的。在一些实施方案中，多肽具有人LAG3的至少7个连续氨基酸，具有被糖基化的对应于位置N188的氨基酸。在一些实施方案中，多肽具有人LAG3的至少7个连续氨基酸，具有被糖基化的对应于位置N250的氨基酸。在一些实施方案中，多肽具有人LAG3的至少7个连续氨基酸，具有被糖基化的对应于位置N256的氨基酸。在一些实施方案中，多肽具有人LAG3的至少7个连续氨基酸，具有被糖基化的对应于位置N343的氨基酸。
例如，多肽可以是人LAG3的氨基酸182-190或187-194的片段，其中N188是糖基化的。又例如，多肽可以是人LAG3的氨基酸247-254或248-256的片段，其中N250是糖基化的，或者是人LAG3的氨基酸252-259或255-265的片段，其中N256是糖基化的。又例如，多肽可以是人LAG3的氨基酸250-260或249-257的片段，其中N250和N256是糖基化的。又例如，多肽可以是人LAG3的氨基酸340-347或342-349的片段，其中343是糖基化的。本领域普通技术人员将理解本文所考虑的多肽包括具有人LAG3的至少7个连续氨基酸的任何和所有多肽，其包括对应于人LAG3的位置N188、N250、N256或N343的至少一个氨基酸，其中对应于人LAG3的位置N188、N250、N256或N343的所述氨基酸中的至少一个是糖基化的。
在一些实施方案中，多肽具有人LAG3的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续氨基酸。在一些实施方案中，多肽具有人LAG3的至少25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260或270、280个连续氨基酸。在一些实施方案中，本文提供的是具有至少两种本文提供的多肽的组合物。所述至少两种多肽可以是单独的分子或连接为一个分子。在一些实施方案中，组合物具有至少三种多肽、至少四种多肽或至少五种多肽。在一些实施方案中，组合物具有两种多肽、三种多肽、四种多肽或五种多肽。
在一些实施方案中，本文提供的多肽包括非天然氨基酸。在一些实施方案中，非天然氨基酸在α-氨基处甲基化以产生具有甲基化主链的肽。在一些实施方案中，非天然氨基酸是R-氨基酸。在一些实施方案中，非天然氨基酸可以包括染料(例如，荧光染料)或亲和标签。在一些实施方案中，本文提供的多肽包括化学修饰。化学修饰包括例如用生物素、荧光染料进行的化学修饰。本领域技术人员将认识到将非天然氨基酸引入多肽中和化学修饰多肽的方法是本领域熟知的。
在一些实施方案中，实施方案的多肽融合或缀合至免疫原性多肽(例如匙孔
Figure BDA0003668004810000321
血蓝蛋白，KLH)。在某些方面，多肽进一步包含在C-或N-末端处的Cys残基。例如，在一些方面，多肽通过Cys残基处的二硫键缀合至免疫原性多肽。
在又一个实施方案中，本文提供了具有多肽的免疫原性组合物，所述多肽包含人LAG3的至少7个连续氨基酸的片段，所述片段包含对应于人LAG3的位置N188、N250、N256或N343的至少一个氨基酸，其中对应于人LAG3的位置N188、N250、N256或N343的所述氨基酸中的至少一个是糖基化的，其中所述多肽被配制在药学上可接受的承载体中。在一些方面，免疫原性组合物还包含佐剂，例如明矾或弗氏佐剂。
在一些实施方案中，提供了制备抗体的方法，其包括将多肽施用于动物并从动物中分离抗体，其中多肽具有人LAG3的至少7个连续氨基酸的片段，所述片段具有对应于人LAG3的位置N188、N250、N256或N343的至少一个氨基酸，并且其中对应于人LAG3的位置N188、N250、N256或N343的所述氨基酸中的至少一个是糖基化的。动物可以是小鼠、大鼠、兔或人。在某些方面，方法进一步包括鉴定抗体的CDR和将CDR周围的序列人源化以产生人源化抗体。在更进一步的方面，方法包括重组表达人源化抗体。因此，在另一个实施方案中，提供了通过上述方法产生的分离的抗体。因此，在一些实施方案中，本文提供了分离的抗体，其选择性结合实施方案的多肽(例如，包含人LAG3的至少7个连续氨基酸的片段的多肽，所述片段包含对应于人LAG3的位置N188、N250、N256或N343的至少一个氨基酸，其中相对于未糖基化的LAG3，对应于人LAG3的位置N188、N250、N256或N343的所述氨基酸中的至少一个是糖基化的)。
本文提供的多肽可以通过本领域已知的任何方法制备。例如，可以通过化学合成或重组生产来制备多肽。用于表达和纯化重组多肽的示例性方法可参见例如Scopes R.K.,Protein Purification–Principles and Practice,Springer Advanced Texts inChemistry,第3版(1994)；Simpson R.J.等人,Basic Methods in Protein Purificationand Analysis:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,第1版(2008)；Green M.R.和Sambrook J.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory Press,第4版(2012)；Jensen K.J.等人,Peptide Synthesisand Applications(Methods in Molecular Biology),Humana Press,第2版(2013)。多肽的化学合成可以通过使用本领域熟知的方法来完成(参见Kelley和Winkler，1990，见:Genetic Engineering Principles and Methods,Setlow J.K,编,Plenum Press,N.Y.,Vol.12,pp 1-19；Stewart等人,1984,J.M.Young,J.D.,Solid Phase Peptide Synthesis,Pierce Chemical Co.,Rockford,Ill；Marglin和Merrifield,Ann.Rev.Biochem,39:841-866,at 862(1970).Merrifield,R.B.,1963,J.Am.Chern.Soc.85:2149-2154；Chemical Approaches to theSynthesis of Peptides and Proteins,Williams等人,编,1997,CRCPress,Boca Raton Fla.；Solid Phase Peptide Synthesis:A Practical Approach,Atherton&Sheppard,编,1989,IRL Press,Oxford,England；另见USPNs.4,105,603；3,972,859；3,842,067；和3,862,925)。
修饰和衍生物
针对糖基化的LAG3的抗体可以具有中和或抵消糖基化的LAG3的作用的能力，而与动物物种、单克隆细胞系或抗体的其他来源无关。某些动物物种可能不太优选用于产生治疗性抗体，因为它们可能更可能由于通过抗体的Fc部分激活补体系统而引起变应性应答。然而，完整的抗体可以被酶消化成Fc(补体结合)片段，以及具有结合结构域或CDR的抗体片段。Fc部分的去除降低了抗体片段引发不希望的免疫应答的可能性，因此，不含Fc的抗体可用于预防性或治疗性处治疗。如上所述，抗体也可以被构建为嵌合的、部分或完全人的，以减少或消除由于向动物施用已经在其他物种中产生或具有来自其他物种的序列的抗体而导致的不良免疫学后果。
可以通过筛选表现出所需特性的变体来进一步改善抗glycLAG3抗体的结合特性。例如，这种改善可以使用本领域已知的各种噬菌体展示方法来完成。在噬菌体展示方法中，功能性抗体结构域展示在噬菌体颗粒的表面上，所述噬菌体颗粒携带编码它们的多核苷酸序列。在一个具体实施方案中，此类噬菌体可用于展示从库或组合抗体文库(例如人或鼠)表达的抗原结合片段，例如Fab和Fv或二硫键稳定的Fv。可以用抗原选择或鉴定表达结合目标抗原的抗原结合片段的噬菌体，例如，使用标记的抗原或者结合或捕获到固体表面或珠子的抗原进行。这些方法中使用的噬菌体通常是丝状噬菌体，包括fd和M13。抗原结合片段表达为与噬菌体基因III或基因VIII蛋白重组融合的蛋白。可用于制备如本文所述的抗体或多肽的噬菌体展示方法的实例包括在以下文献中公开的那些：Brinkman等人,J ImmunolMethods,182:41-50(1995)；Ames等人,J.Immunol.Methods,184:177-186(1995)；Kettleborough等人,Eur.J.Immunol.,24:952-958(1994)；Persic等人,Gene,187:9-18(1997)；Burton等人,Adv.Immunol.57:191-280(1994)；PCT公开WO 92/001047；WO 90/02809；WO 91/10737；WO 92/01047；WO 92/18619；WO 93/11236；WO 95/15982；WO 95/20401；和美国专利号5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743和5,969,108；所有这些都通过引用全部并入本文。
如上述参考文献中所述，在噬菌体选择之后，可以从噬菌体中分离抗体编码区并用于产生完整抗体，包括人源化抗体，或任何其他所需片段，并在任何所需宿主中表达，所述宿主包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌，例如，如下文详细描述的。例如，使用本领域已知的方法，诸如在以下文献中公开的那些，也可以使用重组产生Fab、Fab'和F(ab')2片段的技术：PCT公开WO 92/22324；Mullinax,R.L.等人,BioTechniques,12(6):864-869(1992)；和Sawai等人，Am.J.Reprod.Immunol,34:26-34(1995)；和Better,M.等人Science 240:1041-1043(1988)；所有这些都通过引用全部并入本文。可用于产生单链Fv和抗体的技术的示例包括在以下文献中描述的那些技术：美国专利号4,946,778和5,258,498；Huston,J.S.等人,Methods in Enzymology 203:46-88(1991)；Shu,L等人,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)90:7995-7999；和Skerra.A.等人,Science 240:1038-1040(1988)；所有这些都通过引用全部并入本文。
噬菌体展示技术可用于增加本文所述的抗glycLAG3抗体的亲和力。该技术可用于获得可用于本文所述的组合方法的高亲和力抗体。该技术称为亲和力成熟，采用诱变或CDR行走(CDR walking)和重新选择，使用此类受体或配体(或其细胞外结构域)或其抗原片段来鉴定与初始或亲本抗体相比以更高亲和力结合抗原的抗体(参见，例如，Glaser,S.M.等人,J.Immunol.149:3903-3913(1992))。诱变整个密码子而不是单个核苷酸会产生氨基酸突变的半随机库。文库可以从一组变体克隆构建，每个变体克隆的不同之处在于单个CDR中的单个氨基酸改变并且包含代表每个CDR残基的每个可能的氨基酸置换的变体。可以通过将固定化的突变体与标记的抗原接触来筛选对抗原具有增加的结合亲和力的突变体。本领域已知的任何筛选方法可用于鉴定对抗原具有增加的亲合力(avidity)的突变抗体(例如，ELISA)(参见例如，Wu，H.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)95(11):6037-6042(1998)；Yelton,D.E.等人,J.Immunol.155:1994-2004(1995)。也可以使用使轻链随机化的CDR行走。(参见Schier等人,J.Mol.Biol.263:551-567(1996))。
随机诱变可以与噬菌体展示方法一起使用，以鉴定改进的CDR和/或可变区。噬菌体展示技术可备选地用于通过定向诱变(例如，亲和力成熟或“CDR-行走”)增加(或降低)CDR亲和力。该技术使用靶抗原或其抗原片段来鉴定具有与初始或亲本抗体相比以更高(或更低)亲和力结合抗原的CDR的抗体(参见，例如，Glaser,S.M.等人，J.Immunol.149:3903-3913(1992))。
用于实现这种亲和力成熟的方法描述于例如：Krause,J.C.等人,MBio.2(1)pii:e00345-10.doi:10.1128/mBio.00345-10(2011)；Kuan,C.T.等人,Int.J.Cancer 10.1002/ijc.25645；Hackel,B.J.等人,J.Mol.Biol.401(1):84-96(2010)；Montgomery,D.L.等人,MAbs 1(5):462-474(2009)；Gustchina,E.等人,Virology 393(1):112-119(2009)；Finlay,W.J.等人,J.Mol.Biol.388(3):541-558(2009)；Bostrom,J.等人,MethodsMol.Biol.525:353-376(2009)；Steidl,S.等人,Mol.Immunol.46(1):135-144(2008)；和Barderas,R.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)105(26):9029-9034(2008)；所有这些都通过引用全部并入本文。
本文还提供了相对于“亲本”(或野生型)分子具有一个、两个、三个、四个、五个或更多个氨基酸置换、添加、缺失或修饰的抗glycLAG3抗体或糖基化的LAG3多肽的衍生物。这种氨基酸置换或添加可以引入天然存在的(即，DNA编码的)或非天然存在的氨基酸残基。此类氨基酸可以是糖基化的(例如，具有改变的甘露糖、2-N-乙酰基葡糖胺、半乳糖、岩藻糖、葡萄糖、唾液酸、5-N-乙酰神经氨酸、5-羟乙酰神经氨酸等含量)、乙酰化的、聚乙二醇化的、磷酸化的、酰胺化的、通过已知的保护/封闭基团衍生的、蛋白水解切割的、连接到细胞配体或其他蛋白质等。在一些实施方案中，改变的碳水化合物修饰调节以下一项或多项：抗体的溶解、抗体的亚细胞转运和分泌的促进、抗体组装的促进、构象完整性和抗体介导的效应子功能。在一些实施方案中，相对于缺乏碳水化合物修饰的抗体，改变的碳水化合物修饰增强了抗体介导的效应子功能。导致抗体介导的效应子功能改变的碳水化合物修饰是本领域熟知的(例如，参见Shields,R.L.等人,J.Biol.Chem.277(30):26733-26740(2002)；DaviesJ.等人Biotechnology&Bioengineering 74(4):288-294(2001)；所有这些都通过引用全部并入本文)。改变碳水化合物含量的方法是本领域技术人员已知的，参见例如Wallick,S.C.等人,J.Exp.Med.168(3):1099-1109(1988)；Tao,M.H.等人,J.Immunol.143(8):2595-2601(1989)；Routledge,E.G.等人,Transplantation 60(8):847-53(1995)；Elliott,S.等人,Nature Biotechnol.21:414-21(2003)；Shields,R.L.等人,J.Biol.Chem.277(30):26733-26740(2002)；所有这些都通过引用全部并入本文。
置换变体可以在本文提供的抗体或多肽内的一个或多个位点处包含一种氨基酸与另一种氨基酸的交换，并且可以设计为调节抗体或多肽的一种或多种性质，具有或不具有其他功能或性能的丧失。置换可以是保守的，即一个氨基酸被一个具有相似形状和电荷的氨基酸置换。保守置换在本领域中是众所周知的并且包括，例如，如下改变：丙氨酸至丝氨酸；精氨酸至赖氨酸；天冬酰胺至谷氨酰胺或组氨酸；天冬氨酸至谷氨酸；半胱氨酸至丝氨酸；谷氨酰胺至天冬酰胺；谷氨酸至天冬氨酸；甘氨酸至脯氨酸；组氨酸至天冬酰胺或谷氨酰胺；异亮氨酸至亮氨酸或缬氨酸；亮氨酸至缬氨酸或异亮氨酸；赖氨酸至精氨酸；甲硫氨酸至亮氨酸或异亮氨酸；苯丙氨酸至酪氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸；丝氨酸至苏氨酸；苏氨酸至丝氨酸；色氨酸至酪氨酸；酪氨酸至色氨酸或苯丙氨酸；和缬氨酸至异亮氨酸或亮氨酸。备选地，置换可以是非保守的，从而影响多肽的功能或活性。非保守变化通常涉及用化学上不同的残基置换一个残基，例如用极性或带电荷的氨基酸置换非极性或不带电荷的氨基酸，反之亦然。
在一些实施方案中，抗体可包含如表4中所列的第一组CDR，但在另一组或所有其他CDR组中不保守的残基处具有置换(例如，保守置换)。例如，抗体可包含Chothia、Abm或Contact型CDR组，但在重链CDR1序列(SEQ ID No：6、9或13)内不对应Kabat型CDR1序列(SEQID NO：11)中那些的残基处具有一个或多个置换。类似地，SEQ ID NO：20上的残基1-4可以被置换，例如具有保守置换。类似地，SEQ ID NO：18和/或SEQ ID NO：8上的尾随残基可以被置换，例如用保守置换。这些只是几个示例，但普通技术人员可以理解可以基于表4中所示的内容进行哪些置换。
在一些实施方案中，具有第一组CDR(例如，Chothia、AbM、Kabat和Contact)的抗体可以包含具有一个或多个氨基酸置换的框架区，使得一个或多个置换的残基在对应位置(通过序列比对和/或根据Kabat编号来评估)与第二组CDR一致，第二组CDR具有在第一组中CDR不存在的前导(即，N末端)或尾随(即，C末端)残基。例如，与轻链Contact型CDR2的C末端相邻的构架区具有对应于SEQ ID NO：17的氨基酸序列(Kabat型CDR2)的尾随残基的置换残基。在一些实施方案中，与轻链的AbM、Kabat或Chothia型CDR2的N末端相邻的构架区具有对应于SEQ ID NO：20(Contact型CDR1)的氨基酸序列的前导残基1-4中一个或多个的置换残基。类似地，在一些实施方案中，与轻链的Contact型CDR1的C末端相邻的框架区具有对应于SEQ ID NO:16(Kabat型CDR1)的氨基酸序列的前导残基1-6中一个或多个的置换残基。在一些实施方案中，与重链的Chothia型CDR2的C末端相邻的构架区具有对应于SEQ ID NO:12(Kabat型CDR2)的氨基酸序列的尾随残基9-17中一个或多个的置换残基。在一些实施方案中，与重链的Chothia、AbM或Kabat型CDR3的N末端相邻的框架区具有对应于SEQ ID NO:15(Contact型CDR3)的氨基酸序列的前导残基1-2中一个或多个的置换残基。在一些实施方案中，与重链的Kabat型CDR1的N末端相邻的框架区具有对应于SEQ ID NO:9(AbM型CDR1)的氨基酸序列的前导残基1-5中一个或多个的置换残基。这些只是几个示例，但是普通技术人员可以理解可以基于表4中所示的内容进行哪些框架置换。
在一些实施方案中，人源化抗体是衍生抗体。这种人源化抗体包括一个或多个非人CDR中的氨基酸残基置换、缺失或添加。与非衍生人源化抗体相比，人源化抗体衍生物可以具有基本上相同的结合、更好的结合或更差的结合。在一些实施方案中，CDR的一个、两个、三个、四个或五个氨基酸残基已经突变，例如置换、缺失或添加。
在一些实施方案中，多肽是衍生多肽。与野生型人LAG3相比，这样的多肽包括氨基酸残基置换、缺失或添加。与非衍生多肽相比，衍生多肽可以具有与抗glycLAG3抗体基本相同的结合、更好的结合或更差的结合。在一些实施方案中，人LAG3的一个、两个、三个、四个或五个氨基酸残基已被突变，例如置换、缺失或添加。
可以使用本领域技术人员已知的技术通过化学修饰来修饰本文所述的抗体或多肽，所述技术包括但不限于特异性化学切割、乙酰化、配制、衣霉素的代谢合成等。在一个实施方案中，衍生多肽或衍生抗体具有与亲本多肽或抗体相似或相同的功能。在另一个实施方案中，衍生多肽或衍生抗体相对于亲本多肽或亲本抗体表现出改变的活性。例如，衍生抗体(或其片段)可以比亲本抗体更紧密地结合其表位或对蛋白水解具有更强的耐受性。
衍生化抗体中的置换、添加或缺失可以在抗体的Fc区中，并因此可以用来改变抗体对一种或多种FcγR的结合亲和力。修饰与一种或多种FcγR具有改变的结合的抗体的方法是本领域已知的，参见例如PCT公开号WO 04/029207、WO 04/029092、WO 04/028564、WO99/58572、WO 99/51642、WO 98/23289、WO 89/07142、WO 88/07089和美国专利号5,843,597和5,642,821；所有这些都通过引用全部并入本文。在一些实施方案中，抗体或其他分子可以具有改变的对活化FcγR(例如FcγRIIIA)的亲和力。优选地，此类修饰还具有改变的Fc介导的效应子功能。影响Fc介导的效应子功能的修饰是本领域众所周知的(参见美国专利号6,194,551和WO 00/42072)。在一些实施方案中，Fc区的修饰导致抗体具有改变的抗体介导的效应子功能、改变的与其他Fc受体(例如，Fc活化受体)的结合、改变的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性、改变的C1q结合活性、改变的补体依赖性细胞毒活性(CDC)、吞噬活性或其任何组合。
衍生抗体或多肽也可以在哺乳动物，优选人中具有亲本分子或抗体的改变的半衰期(例如，血清半衰期)。在一些实施方案中，这种改变导致半衰期大于15天，优选地大于20天，大于25天，大于30天，大于35天，大于40天，大于45天，大于2个月、大于3个月、大于4个月或大于5个月。人源化抗体或多肽在哺乳动物、优选人中增加的半衰期导致在哺乳动物中所述抗体或多肽的更高血清滴度，并因此降低所述抗体或多肽的施用频率和/或降低待施用的所述抗体或多肽的浓度。可以通过本领域技术人员已知的技术产生具有增加的体内半衰期的抗体或多肽。例如，具有增加的体内半衰期的抗体或多肽可以通过修饰(例如，置换、缺失或添加)被鉴定为参与Fc结构域和FcRn受体之间的相互作用的氨基酸残基来产生。可以对本文所述的人源化抗体进行工程改造以增加生物学半衰期(参见例如美国专利号6,277,375)。例如，如本文所述的人源化抗体可以在Fc-铰链结构域中进行工程改造以具有增加的体内半衰期或血清半衰期。
如本文所述的具有增加的体内半衰期的抗体或多肽可以通过将聚合物分子如高分子量聚乙二醇(PEG)附接至所述抗体或多肽来产生。PEG可以用或不用多功能接头连接至抗体或多肽，通过PEG与所述分子或抗体的N或C末端的位点特异性缀合或通过赖氨酸残基上存在的ε-氨基进行连接。可以使用导致生物活性损失最小的直链或支链聚合物衍生化。缀合程度可以通过SDS-PAGE和质谱法密切监测，以确保PEG分子与抗体的正确缀合。未反应的PEG可以通过例如尺寸排阻或离子交换色谱法与抗体-PEG缀合物分离。
本文所述的抗体或多肽也可以通过Davis等人描述的方法和偶联剂(参见美国专利号4,179,337)进行修饰，以提供可以注射到哺乳动物循环系统中而基本上没有免疫原性应答的组合物。Fc部分的去除可以降低抗体片段引发不希望的免疫应答的可能性，因此，不含Fc的抗体可以用于预防性或治疗性治疗。如上所述，抗体也可以被构建成嵌合的、部分或完全人的，以减少或消除由于向动物施用已经在其他物种中产生或具有来自其他物种的序列的抗体而导致的不良免疫学后果。
融合体和缀合物
本文提供的抗glycLAG3抗体或糖基化的LAG3多肽也可以表达为与其他蛋白质的融合蛋白或化学缀合至另一部分。
在一些实施方案中，本文提供了具有Fc部分的抗体或多肽，其中Fc部分可以因同种型或亚类而不同，可以是嵌合的或杂合的，和/或可以经修饰，例如以改善效应子功能、半衰期控制、组织可及性、增强生物物理特性(如稳定性)和提高生产效率(并且成本更低)。可用于构建公开的融合蛋白的许多修饰和制备它们的方法是本领域已知的，参见例如Mueller,J.P.等人,Mol.Immun.34(6):441-452(1997)，Swann,P.G.,Curr.Opin.Immun.20:493-499(2008)，和Presta,L.G.,Curr.Opin.Immun.20:460-470(2008)。在一些实施方案中，Fc区是天然IgG1、IgG2或IgG4 Fc区。在一些实施方案中，Fc区是杂合体，例如具有IgG2/IgG4 Fc恒定区的嵌合体。对Fc区的修饰包括但不限于，修饰IgG4以防止与Fcγ受体和补体结合，修饰IgG1以改善与一种或多种Fcγ受体的结合，修饰IgG1以最小化效应子功能(氨基酸变化)，具有改变的/无聚糖的IgG1(通常通过改变表达宿主)，以及具有改变的pH依赖性的与FcRn结合的IgG1。Fc区可以包括整个铰链区，或小于整个铰链区。
另一个实施方案包括IgG2-4杂合体和IgG4突变体，它们与FcR的结合减少，这增加了它们的半衰期。代表性的IG2-4杂合体和IgG4突变体描述于Angal等人，Molec.Immunol.30(1):105-108(1993)；Mueller等人,Mol.Immun.34(6):441-452(1997)；和美国专利号6,982,323；所有这些都通过引用全部并入本文。在一些实施方案中，缺失IgG1和/或IgG2结构域，例如，Angal等人描述了丝氨酸241被脯氨酸替换的IgG1和IgG2。
在一些实施方案中，本文提供了具有至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90，或至少100个氨基酸的融合蛋白或多肽。
在一些实施方案中，本文提供了抗glycLAG3抗体或糖基化的LAG3多肽，其与至少一个部分连接或共价结合或形成复合物。这样的部分可以是但不限于增加分子作为诊断剂或治疗剂的功效的部分。在一些实施方案中，部分可以是显像剂、毒素、治疗酶、抗生素、放射性标记的核苷酸等。
在一些实施方案中，部分可以是酶、激素、细胞表面受体、毒素(例如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素(即PE-40)、白喉毒素、蓖麻毒蛋白、白树毒蛋白或美洲商陆抗病毒蛋白)、蛋白质(如肿瘤坏死因子、干扰素(如α-干扰素、β-干扰素)、神经生长因子、血小板衍生生长因子、组织纤溶酶原激活剂或凋亡剂(如肿瘤坏死因子-α、肿瘤坏死因子-β))、生物应答调节剂(例如淋巴因子(例如，白介素-1(“IL-1”)、白介素-2(“IL-2”)、白介素-6(“IL-6”))、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)或巨噬细胞集落刺激因子(“M-CSF”))或生长因子(例如，生长激素(“GH”)))、细胞毒素(例如，细胞生长抑制剂或杀细胞剂，例如紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米汀、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷(tenoposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙素、多柔比星、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌、普卡霉素、放线菌素D、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、单甲基澳瑞他汀E(MMAE；例如，维汀(vedotin))和嘌呤霉素及其类似物或同系物)、抗代谢物(例如甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶达卡巴嗪)、烷化剂(例如，二氯甲基二乙胺、噻替哌苯丁酸氮芥、美法仑、
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(卡莫司汀；BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、cyclothosphamide、白消安、二溴甘露醇、链脲佐菌素、丝裂霉素C和顺二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环类(例如，柔红霉素(以前的道诺霉素)和多柔比星)、抗生素(例如，更生菌素(以前的放线菌素)、博来霉素、普卡霉素和安曲霉素(AMC))或抗有丝分裂剂(例如，长春新碱和长春碱)。
将这些治疗部分与抗体缀合的技术是众所周知的；参见，例如，Amon等人,“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”,见MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY，Reisfeld等人(编),1985,pp.243-56,AlanR.Liss,Inc.)；Hellstrom等人,“Antibodies For Drug Delivery”,见CONTROLLED DRUGDELIVERY(2nd Ed.)，Robinson等人(编),1987,pp.623-53,Marcel Dekker,Inc.)；Thorpe,“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review”,见MONOCLONAL ANTIBODIES'84:BIOLOGICAL AND CLINICAL APPLICATIONS，Pinchera等人(编),1985,pp.475-506)；“Analysis,Results,And Future Prospective Of TheTherapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”,见MONOCLONALANTIBODIES FOR CANCER DETECTION AND THERAPY，Baldwin等人(编),1985,pp.303-16,Academic Press；Thorpe等人,Immunol.Rev.62:119-158(1982)；Carter等人,Cancer J.14(3):154-169(2008)；Alley等人,Curr.Opin.Chem.Biol.14(4):529-537(2010)；Carter等人,Amer.Assoc.Cancer Res.Educ.Book.2005(1):147-154(2005)；Carter等人,CancerJ.14(3):154-169(2008)；Chari,Acc.Chem Res.41(1):98-107(2008)；Doronina等人,Nat.Biotechnol.21(7):778-784(2003)；Ducry等人,Bioconjug Chem.21(1):5-13(2010)；Senter,Curr.Opin.Chem.Biol.13(3):235-244(2009)；和Teicher,Curr Cancer DrugTargets.9(8):982-1004(2009)。澳瑞他汀E)(MMAE)，例如维汀(vedotin)；或其组合。
在优选的实施方案中，抗体与美登素缀合，美登素是首先从埃塞俄比亚灌木Maytenus ovatus的树皮中分离的苯并桥环大环内酯。这种细胞毒性剂及其衍生物(例如美登木素)与长春花生物碱结合位点附近的微管蛋白结合。它们被认为对位于微管末端的微管蛋白具有高亲和力，而对分布在整个微管中的位点具有较低的亲和力。微管动力学的抑制导致细胞停滞在细胞周期的G2/M期，最终导致细胞因凋亡而死亡。(Oroudjev等人，Mol.Cancer Ther.，10L2700-2713(2010))。两种美登素衍生物(含硫醇类美登素)包括DM1和DM4(ImmunoGen，Inc.，Waltham，MA)已广泛与不可逆和可逆接头组合使用。特别是，用硫醚接头附接到抗体的DM1称为“emtansine”；用SPP接头附接到抗体的DM1称为“美坦辛(mertansine)”。用SPDB接头连接的DM4称为“ravtansine”；用sSPDB接头连接的DM4称为“soravtansine”。(ImmunoGen,Inc.,Waltham,MA)。在一个实施方案中，抗glycLAG3抗体-ADC包含作用于微管蛋白的美登木素类有效负载DM1。在一个实施方案中，抗glycLAG3抗体-ADC包含作用于微管蛋白的美登木素类有效负载DM4。在一个实施方案中，抗glycLAG3抗体-ADC包含作用于DNA的有效负载，例如DGN462(ImmunoGen,Inc.,Waltham,MA)。在一个实施方案中，抗glycLAG3抗体-ADC的抗glycLAG3抗体组分是STC1807的嵌合或人源化形式，或其结合部分。在一个实施方案中，抗glycLAG3抗体-ADC的抗glycLAG3抗体组分是STC1317的嵌合或人源化形式，或其结合部分。
在一个具体的实施方案中，与抗glycLAG3抗体缀合的细胞毒性剂是MMAE(单甲基澳瑞他汀E(或去甲基澳瑞他汀E))，一种剧毒的抗肿瘤剂，其抗有丝分裂活性涉及通过阻断微管蛋白的聚合来抑制细胞分裂。维汀(Vedotin)是一个国际非专有名称，是指在MMAE-抗体缀合物中的MMAE加上其与抗体的连接结构。在更具体的实施方案中，ADC是STC1317(嵌合或人源化形式)-MMAE或STC1317(嵌合或人源化形式)-MMAE。
许多化学接头是已知的并且用于将细胞毒性或作用于DNA的药物有效负载与抗体缀合以产生ADC。某些单独或联合使用以产生包含抗glycLAG3抗体的ADC的接头，特别是如本文所述在结合其靶标后内化的那些接头，包括SMCC(4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷甲酸N-羟基琥珀酰亚胺酯)；SPDB(N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯)；SPP(N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)戊酸酯)；磺基-SPDB或sSPDB(N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)-2-磺基丁酸酯)；硫醚接头琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(MCC)；和vc(缬氨酸-瓜氨酸二肽接头)。例如，经工程改造的接头(例如，SMCC、SPDB、S-SPDB)(Immunogen,Inc.)已被设计为在ADC与肿瘤结合之前是稳定的，然后在ACD被内化在癌细胞内后优化有效负载功效。其他接头，例如二肽vc接头，它是一种组织蛋白酶可切割的接头，可用于将抗体与细胞毒性剂偶联，细胞毒性剂例如澳瑞他汀，它是一种衍生自多拉司他汀10的有丝分裂抑制剂，例如单甲基澳瑞他汀E(MMAE)，例如，维汀。细胞毒素可以与抗体缀合，使得多于一个的毒素分子连接到每个抗体分子上，例如，每个抗体平均可以有2、3、4、5、6、7或8个毒素分子。
在一个具体实施方案中，MMAE通过马来酰亚胺己酰基(MC)连接基团间接连接至抗体半胱氨酸，该连接基团与缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苯甲氧基羰基-MMAE(MC-vc-PAB-MMAE)偶联。在“MC-vc-PAB-MMAE”线性结构中，“MC”由马来酰亚胺和己酸组成，是连接抗体的部分，通常通过H链上的半胱氨酸基团连接。进而，“MC”附接到由缬氨酸(Val)和瓜氨酸(Cit)组成的“vc”接头，并且该接头是组织蛋白酶可切割的接头，可在肿瘤或癌细胞内被组织蛋白酶切割。“vc”附接到间隔物“PAB”，即对氨基苯甲酸，MMAE细胞毒素连接到该间隔物。MC-vc-PAB-MMAE ADC在被蛋白酶如组织蛋白酶B切割时释放游离的、膜可渗透的MMAE。在一个实施方案中，抗体的接头在细胞外液中是稳定的，但一旦ADC进入肿瘤或癌细胞就被组织蛋白酶切割，从而激活MMAE或其他毒素药物的抗有丝分裂机制。在另一个实施方案中，单甲基澳瑞他汀F(MMAF)通过马来酰亚胺己酰基(MC-MMAF)连接至抗体半胱氨酸。与MC-vc-PAB-MMAE ADC相比，MC-MMAF ADC与MCC-DM1ADC一样是不可切割的，并且必须内化和在细胞内降解，在细胞内释放半胱氨酸-MC-MMAF作为活性药物。
在一个实施方案中，细胞毒性有效负载在ADC内化到细胞中后在溶酶体中释放。在溶酶体中，溶酶体酶消化ADC的抗体组分。在溶酶体降解后，药物(和药物接头)有效负载被释放到细胞质中，在那里药物结合细胞内靶标，最终导致细胞死亡。理想的情况是，在接头仍然连接着的情况下，释放的有效负载是完全有活性的。在与ADC结合的靶标导致向溶酶体的运输不良的其他实施方案中，在靶细胞外稳定但是一旦进入细胞后就将有效负载从抗体组分上切割下来的接头提供了在细胞内、但在溶酶体之外释放有效负载的替代模式。在其他实施方案中，接头在细胞外液中是稳定的，但是一旦ADC进入肿瘤或癌细胞后就被组织蛋白酶切割，从而活化毒素药物的抗有丝分裂或其他细胞毒性机制。在其他实施方案中，通过可切割接头的作用释放的有效负载能够进入相邻的癌细胞并通过旁观者效应(bystandereffect)杀死它们，从而增强ADC的靶向和肿瘤杀死活性。
在一些实施方案中，如本文所述的抗体和多肽可以与标志物(例如肽)缀合以促进纯化。在一些实施方案中，标志物是：六组氨酸肽，血凝素“HA”标签(SEQ ID NO:22：YPYDVPDYA)，其对应于衍生自流感血凝素蛋白的表位(Wilson,I.A.等人,Cell,37:767-778(1984))，或“标志”标签(Knappik,A.等人,Biotechniques 17(4):754-761(1994))。
在一些实施方案中，部分可以是可以在测定法中检测到的显像剂。这样的显像剂可以是酶、辅基、放射性标记、非放射性顺磁性金属离子、半抗原、荧光标记、磷光分子、化学发光分子、生色团、发光分子、生物发光分子、光亲和性分子、有色颗粒或配体，例如生物素。
在一些实施方案中，酶包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；辅基复合物包括但不限于链霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素；荧光材料包括但不限于伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料，例如但不限于鲁米诺；生物发光材料包括但不限于萤光素酶、萤光素和水母发光蛋白；放射性物质包括但不限于铋(213Bi)、碳(14C)、铬(51Cr)、钴(57Co)、氟(18F)、钆(153Gd、159Gd)、镓(68Ga、67Ga)、锗(68Ge)、钬(166Ho)、铟(115In、113In、112In、111In)、碘(131I、125I、123I、121I)、镧(140La)、镥(177Lu)、锰(54Mn)、钼(99Mo)、钯(103Pd)、磷(32P)、镨(142Pr)、钷(149Pm)、铼(186Re、188Re)、铑(105Rh)、钌(97Ru)、钐(153Sm)、钪(47Sc)、硒(75Se)、锶(85Sr)、硫(35S)、锝(99Tc)、铊(201Ti)、锡(113Sn、117Sn)、氚(3H)、氙(133Xe)、镱(169Yb、175Yb)、钇(90Y)、锌(65Zn)；使用各种正电子发射断层扫描的正电子发射金属，和非放射性顺磁性金属离子。
可以使用本领域已知的技术将显像剂直接或通过中间体(例如本领域已知的接头)缀合至本文提供的抗体或多肽。关于可以缀合至抗体的金属离子和用于用作诊断剂的本文所述的其它分子，参见，例如，美国专利号4,741,900。一些缀合方法涉及使用金属螯合络合物，例如，有机螯合剂如二亚乙基三胺五乙酸酐(DTPA)；乙三胺四乙酸；N-氯-对甲苯磺酰胺；和/或与抗体连接的四氯-3-6α-二苯基甘脲-3。单克隆抗体也可以在偶联剂如戊二醛或高碘酸盐的存在下与酶反应。可以在这些偶联剂存在下或通过与异硫氰酸酯反应而制备具有荧光素标志物的缀合物。
在一些实施方案中，如本文所述的抗体或多肽可与第二抗体缀合以形成抗体异源缀合物，如Segal在美国专利号4,676,980中所述的。此类异源缀合物抗体还可以结合半抗原(例如荧光素)或细胞标志物(例如4-1-BB、B7-H4、CD4、CD8、CD14、CD25、CD27、CD40、CD68、CD163、CTLA4、GITR、LAG-3、OX40、TIM3、TIM4、TLR2、LIGHT、ICOS、B7-H3、B7-H7、B7-H7CR、CD70、CD47)或细胞因子(例如，IL-7、IL-15、IL-12,IL-4TGF-β,IL-10,IL-17,IFNγ,Flt3,BLys)或趋化因子(例如,CCL21)。
在一些实施方案中，本文所述的抗glycLAG3抗体或糖基化的LAG3多肽也可以附接至固体支持物，其可用于靶抗原或能够结合靶抗原的其他分子的免疫测定或纯化，所述靶抗原已经通过与本文所述的抗体或抗原结合片段的结合而固定在支持物上。此类固体支持物包括但不限于玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。
蛋白质纯化
蛋白质纯化技术为本领域技术人员所熟知。这些技术在一个层面上涉及将细胞、组织或器官均质化和粗分级成多肽和非多肽级分。除非另有说明，可以使用色谱和电泳技术进一步纯化目标蛋白质或多肽，以实现部分或完全纯化(或纯化至均质)。特别适合制备纯肽的分析方法是离子交换色谱、尺寸排阻色谱、反相色谱、羟磷灰石色谱、聚丙烯酰胺凝胶电泳、亲和色谱、免疫亲和色谱和等电聚焦。纯化肽的一种特别有效的方法是快速液相色谱(FPLC)或甚至高效液相色谱(HPLC)。如本领域公知的，据信可以改变进行各种纯化步骤的顺序，或者可以省略某些步骤，并且仍然产生制备基本上纯化的多肽的合适方法。
纯化的多肽意指可与其他组分分离的组合物，其中所述多肽相对于其天然可得状态被纯化至任何程度。因此，分离的或纯化的多肽也指脱离其可能天然存在的环境的多肽。一般而言，“纯化的”是指已进行分级以除去各种其他组分并且该组合物基本上保留其表达的生物活性的多肽组合物。当使用术语“基本上纯化的”时，该名称将指其中多肽形成组合物的主要成分的组合物，例如构成组合物中约50％、约60％、约70％、约80％、约90％％、约95％或更多的蛋白质。
根据本公开内容，用于定量多肽的纯化程度的各种方法是本领域技术人员已知的。这些包括，例如，确定活性级分的比活性，或通过SDS/PAGE分析评估级分内多肽的量。评估级分纯度的优选方法是计算级分的比活性，将其与初始提取物的比活性进行比较，从而计算其中的纯度，通过“纯化倍数”评估。当然，用于表示活性量的实际单位将取决于所选择的在纯化之后进行的特定测定技术，以及所表达的多肽是否表现出可检测的活性。
通常不要求多肽总是以其最纯化的状态提供。实际上，考虑到在某些实施方案中，基本纯化程度较低的产品可能具有实用性。部分纯化可以通过组合使用更少的纯化步骤，或通过使用相同一般纯化方案的不同形式来完成。例如，可以理解的是，使用HPLC设备进行的阳离子交换柱色谱通常会比使用低压色谱系统的相同技术产生更大的“倍数”纯化。相对纯化程度较低的方法可能在蛋白质产物的总回收率或保持表达蛋白质的活性方面具有优势。
亲和色谱是一种依赖于待分离的物质与其可特异性结合的分子之间的特定亲和力的色谱程序。这是一种受体-配体类型的相互作用。通过将结合配偶体之一共价偶联到不溶性基质上来合成柱材料。然后柱材料能够从溶液中特异性地吸附物质。通过将条件更改为不会发生结合的条件(例如，改变pH、离子强度、温度等)来发生洗脱。基质应该是一种不会以任何显著程度吸附分子并且具有宽范围的化学、物理和热稳定性的物质。配体应以不影响其结合特性的方式偶联。配体还应该提供相对紧密的结合。应该可以在不破坏样品或配体的情况下洗脱物质。
尺寸排阻色谱法(SEC)是一种色谱方法，其中将溶液中的分子基于它们的尺寸或更专业的术语是基于它们的流体动力学体积进行分离。它通常应用于大分子或大分子复合物，例如蛋白质和工业聚合物。通常，当使用水溶液将样品输送通过柱时，该技术称为凝胶过滤色谱，而当使用有机溶剂作为流动相时称为凝胶渗透色谱。SEC的基本原理是不同尺寸的颗粒将以不同的速率通过固定相进行洗脱(过滤)。这导致基于尺寸的颗粒溶液的分离。如果所有颗粒同时或几乎同时加载，相同尺寸的颗粒应该一起洗脱。
高效液相色谱法(或高压液相色谱法，HPLC)是柱色谱法的一种形式，常用于生物化学和分析化学中，用于分离、鉴定和量化化合物。HPLC使用装有色谱填料(固定相)的柱、使一个或多个流动相移动通过柱的泵和显示分子保留时间的检测器。保留时间因固定相、被分析分子和所用的一种或多种溶剂之间的相互作用而异。
本文还提供了一种用于评估LAG3糖基化、N-连接糖基化或N-糖基化的方法，包括使含有LAG3的样品与实施方案的抗体(例如，相对于未糖基化的LAG3选择性结合糖基化的LAG3抗体)接触。在一些方面，该方法是体外方法。在某些方面，样品是细胞样品。
核酸
本公开内容还考虑了编码本文所述的任何抗glycLAG3抗体或糖基化的LAG3多肽的核酸分子(DNA或RNA)。本文还提供了被构造为传输或复制此类核酸分子的载体分子(例如质粒)。核酸可以是单链的、双链的，并且可以包含单链和双链部分。
药物制剂
当进行含有抗体的药物组合物的临床应用时，制备适合预期应用的药物或治疗组合物通常是有益的。通常，药物组合物可以具有有效量的如本文所述的抗glycLAG3抗体或糖基化的LAG3多肽，或者具有溶解或分散在药学上可接受的承载体中的另外药剂。
本文还提供了具有如本文所述的抗glycLAG3抗体或糖基化的LAG3多肽的组合物。在一些实施方案中，组合物可以具有按重量计至少0.1％的抗体或多肽。在一些实施方案中，组合物可具有按重量计至少0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或更多的抗glycLAG3抗体或糖基化的LAG3多肽。在其他实施方案中，例如，抗glycLAG3或糖基化的LAG3多肽可构成组合物重量的约2％至约75％、约25％至约60％、约30％至约50％，或其中的任何范围。每种治疗有用的组合物中活性化合物的量可以这样制备，使得在任何给定单位剂量的化合物中都将获得合适的剂量。制备此类药物制剂领域的技术人员将考虑诸如溶解度、生物利用度、生物半衰期、施用途径、产品保质期以及其他药理学考虑的多种因素，因此，可能有各种剂量和治疗方案是合乎需要的。
组合物可以是具有作为活性成分的抗glycLAG3抗体或糖基化的LAG3多肽以及药学上可接受的承载体的药物组合物。药物组合物可以进一步包括一种或多种额外的活性成分。药学上可接受的承载体可以是由美国联邦或州政府的管理机构批准的承载体，或在美国药典、欧洲药典或其他公认的药典中列出的用于动物、更特别是用于人类的载体。
如本文所用，并且除非另有说明，否则术语“承载体”是指与治疗剂一起施用的稀释剂、佐剂(例如，弗氏佐剂(完全或不完全))、赋形剂、稳定剂或媒介物。“药学上可接受的承载体”是在所采用的剂量和浓度下对暴露于其中的细胞或哺乳动物无毒的承载体，其可以是无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些油，如花生油、豆油、矿物油、芝麻油等。药学上可接受的分子实体或组合物在适当地施用于动物例如人时不会产生不利的、变应性的或其他不良反应。鉴于本公开内容，具有抗体或额外活性成分的药物组合物的制备是本领域技术人员已知的，如Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，1990所示例，通过引用并入本文。此外，对于动物(例如人)施用，应理解制剂应符合FDA生物标准办公室要求的无菌性、热原性、一般安全性和纯度标准。
考虑组合物包括每毫升(ml)约0.001mg和约10mg的总抗体或多肽。因此，组合物中抗体或多肽的浓度可为约、至少约或至多约0.001、0.010、0.050、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0mg/ml或更多(或其中可导出的任何范围)。其中，约、至少约或至多约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％可以是抗glycLAG3抗体或糖基化的LAG3多肽。
根据本公开内容，具有如本文所述的抗体或其他多肽作为活性成分的药物组合物的制备是本领域技术人员已知的，如Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，1990所示例，通过引用并入本文。此外，对于动物(例如人)施用，应理解制剂应符合FDA生物标准办公室要求的无菌性、热原性、一般安全性和纯度标准。
药学上可接受的承载体包括液体、半固体(即，糊剂)或固体承载体。承载体或稀释剂的实例包括脂肪、油、水、盐溶液、脂质、脂质体、树脂、粘合剂、填充剂等，或它们的组合。药学上可接受的承载体可以包括水性溶剂(例如水、醇/水溶液、乙醇、盐溶液、胃肠外媒介物例如氯化钠、林格氏右旋糖等)、非水性溶剂(例如丙二醇、聚乙二醇、植物油和可注射的有机酯，如油酸乙酯)、分散介质、包衣剂(如卵磷脂)、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(如抗细菌剂或抗真菌剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体、对羟基苯甲酸酯(如，对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯)、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞)、等渗剂(例如，糖、氯化钠)、吸收延迟剂(例如，单硬脂酸铝、明胶)、盐、药物、药物稳定剂(例如，缓冲剂、氨基酸例如甘氨酸和赖氨酸、碳水化合物例如葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、山梨醇、甘露醇等)、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、矫味剂、染料、流体和营养补充剂，如本领域普通技术人员已知的类似材料及其组合。除非任何常规介质、试剂、稀释剂或承载体对接受者或其中所含组合物的治疗效果有害，其在用于实施这些方法的可施用组合物中的用途是适当的。根据众所周知的参数调整药物组合物中各种组分的pH和准确浓度。根据本公开的某些方面，组合物可以以任何方便和实用的方式与承载体组合，即通过溶液、悬浮、乳化、混合、包封、吸收、碾磨等。这样的程序对于本领域技术人员来说是常规的。
在一些实施方案中，药学上可接受的承载体可以是水性pH缓冲溶液。示例包括缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量((例如，少于约10个氨基酸残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖醇，例如甘露醇或山梨醇；成盐的抗衡离子，例如钠；和/或非离子表面活性剂，例如TWEENTM、聚乙二醇(PEG)和PLURONICSTM。
在一些实施方案中，药学上可接受的承载体可以是无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。水可以是承载体，特别是当静脉内施用药物组合物时。盐水溶液和水性右旋糖和甘油溶液也可以用作液体承载体，特别是用于可注射溶液。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇、聚山梨醇酯-80等。组合物还可以含有少量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。这些组合物可以采取溶液、混悬剂、乳剂、片剂、丸剂、胶囊、粉剂、缓释制剂等的形式。
本公开内容的某些实施方案可以具有不同类型的承载体，这取决于它是以固体、液体还是气溶胶形式施用，以及对于施用途径(例如注射)而言，它是否需要是无菌的。组合物可以配制用于静脉内、真皮内、透皮、鞘内、动脉内、腹膜内、鼻内、阴道内、直肠内、肌内、皮下、经粘膜、经口、表面、局部、通过吸入(例如，气溶胶吸入)、通过注射、通过输注，通过连续输注，通过局部灌注直接浸浴靶细胞、经导管、经灌洗、在脂质组合物(例如，脂质体)中、或通过本领域普通技术人员已知的其他方法或前述的任何组合(参见，例如，Remington'sPharmaceutical Sciences，第18版，1990，通过引用并入本文)。通常，此类组合物可以制备成液体溶液或悬浮液；也可以制备适用于在注射前加入液体后制备溶液或悬浮液的固体形式；并且，也可以乳化制剂。
可以将抗glycLAG3抗体或糖基化的LAG3多肽配制成游离碱、中性或盐形式的组合物。药学上可接受的盐包括酸加成盐，例如与蛋白质组合物的游离氨基形成的那些，或者与无机酸(如盐酸或磷酸)或有机酸(如乙酸、草酸、酒石酸或扁桃酸)形成的那些。与游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁；或有机碱如异丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸或普鲁卡因。
在进一步的实施方案中，本文提供了具有脂质的药物组合物。脂质可以广泛地包括一类特征性地不溶于水并且可以用有机溶剂萃取的物质。示例包括含有长链脂肪烃及其衍生物的化合物。脂质可以是天然存在的或合成的(即，由人设计或生产)。脂质可以是生物物质。生物脂质是本领域熟知的，并且包括例如中性脂肪、磷脂、磷酸甘油酯、类固醇、萜烯、溶血脂、鞘糖脂、糖脂、硫脂、具有醚-和酯-连接的脂肪酸的脂质、可聚合脂质及其组合。也可以使用除本文具体描述的那些被本领域技术人员理解为脂质的化合物。
本领域普通技术人员将熟悉可用于将组合物分散在脂质媒介物中的系列技术。例如，抗体或多肽可以分散在含有脂质的溶液中，溶解在脂质中，用脂质乳化，与脂质混合，与脂质组合，与脂质共价结合，作为悬浮液包含在脂质中，包含在胶束或脂质体中或与胶束或脂质体复合，或另外通过本领域普通技术人员已知的任何方式与脂质或脂质结构缔合。分散体可能会或可能不会导致脂质体的形成。
通常，组合物的成分单独提供或混合在一起以单位剂型提供，例如，作为在气密密封的容器中的干燥的冻干粉末或无水浓缩物，所述容器例如指示活性剂的量的安瓿或药囊。当组合物通过输注施用时，它可以用含有无菌药用级水或盐水的输液瓶分配。在通过注射施用组合物的情况下，可以提供以安瓿的无菌注射用水或盐水，以便可以在施用前混合各成分。
每种治疗有用的组合物中的活性成分的量可以这样制备，使得在任何给定的化合物单位剂量中都将获得合适的剂量。制备此类药物制剂的本领域的技术人员可以考虑诸如溶解度、生物利用度、生物半衰期、施用途径、产品保质期以及其他药理学考虑的多种因素，因此，可能有各种剂量和治疗方案是合乎需要的。
单位剂量或剂型是指适用于受试者的物理上离散的单位，每个单位包含预定量的药物组合物，所述量经计算可产生上文讨论的与其施用(即适当的途径和治疗方案)相关的所需应答。根据治疗次数和单位剂量，待施用的量取决于所期望的效果。施用给患者或受试者的本实施方案的组合物的实际剂量可以通过身体和生理因素确定，例如受试者的体重、年龄、健康和性别，所治疗的疾病类型，疾病渗透的程度，先前或同时的治疗干预，患者的特发性疾病，施用途径以及特定治疗物质的效力、稳定性和毒性。在其他非限制性实例中，剂量可具有每次施用从约1微克/kg/体重、约5微克/kg/体重、约10微克/kg/体重、约50微克/kg/体重、约100微克/kg/体重、约200微克/kg/体重、约350微克/kg/体重、约500微克/kg/体重、约1毫克/kg/体重、约5毫克/kg/体重、约10毫克/kg/体重、约50毫克/kg/体重、约100毫克/kg/体重、约200毫克/kg/体重、约350毫克/kg/体重、约500毫克/kg/体重、至约1000毫克/kg/体重或更高，以及可在其中导出的任何范围。在可从本文所列数字导出的范围的非限制性示例中，可以根据上述数字施用约5毫克/kg/体重至约100毫克/kg/体重、约5微克/kg/体重至约500毫克/kg/体重等的范围。无论如何，负责施用的从业者将确定组合物中一种或多种活性成分的浓度和用于个体受试者的一个或多个合适剂量。
如本领域普通技术人员将理解的，本文所述的组合物不受治疗性制剂的特定性质的限制。例如，此类组合物可以与生理上可耐受的液体、凝胶或固体承载体、稀释剂和赋形剂一起提供在制剂中。这些治疗性制剂可以以类似于其他治疗剂的方式施用于哺乳动物用于兽医用途，例如用于家养动物，以及用于人类的临床用途。一般来说，治疗效果所需的剂量会根据用途类型和施用方式以及个体受试者的具体要求而有所不同。施用给动物患者(包括人患者)的组合物的实际剂量可以通过物理和生理因素确定，例如体重、病症的严重性、所治疗的疾病类型、先前或同时的治疗干预、患者的特发性疾病，以及施用途径。取决于剂量和给药途径，优选剂量和/或有效量的给药次数可以根据受试者的反应而变化。无论如何，负责施用的从业者将确定组合物中一种或多种活性成分的浓度和用于个体受试者的一个或多个合适剂量。
疾病的治疗
如本文所用，除非另有说明，否则术语“受试者”是指作为治疗、观察和/或实验对象的动物。“动物”包括脊椎动物和无脊椎动物，例如鱼、贝类、爬行动物、禽类，尤其是哺乳动物。“哺乳动物”包括但不限于小鼠、大鼠、兔、豚鼠、狗、猫、绵羊、山羊、牛、马、灵长类动物，例如猴子、黑猩猩、猿和人。在一些实施方案中，受试者是人。
如本文所用，并且除非另有说明，否则术语“癌症”或“癌性的”是指哺乳动物中通常以不受调节的细胞生长为特征的生理状况。癌症的示例包括但不限于血液学癌症和实体瘤。
如本文所用，并且除非另有说明，否则术语“治疗”是指为了获得疾病或健康相关状况的治疗益处的目的向受试者施用或应用治疗剂或对受试者实施操作的过程和模式。例如，治疗可以包括向受试者施用治疗有效量的抗glycLAG3抗体。当用于提及癌症患者使用时，术语“治疗”是指可能降低癌症严重程度或者延缓或减缓癌症进展的作为，包括(a)抑制癌症生长、降低癌症生长速率、阻止发展、降低癌症侵袭性或防止癌症转移，和(b)导致癌症消退、延迟或最小化与癌症存在相关的一种或多种症状，或延长癌症患者的生存期。
如本文所用，并且除非另有说明，否则术语“治疗有效量”是指足以降低和/或改善给定疾病、病症或病况和/或与其相关的症状的严重性和/或持续时间的试剂(例如本文描述的抗体或多肽或者本文描述的其他试剂)的量。试剂(包括治疗剂)的治疗有效量可以是实现以下目的所必需的量：(i)减少或缓解给定疾病、病症或病况的发展或进展，(ii)减少或缓解给定疾病、病症或病况的复发、发展或发作，和/或(iii)改善或增强另一种疗法(例如，除了施用本文提供的抗体之外的疗法)的预防或治疗效果。本公开内容的物质/分子/药剂(例如，抗glycLAG3抗体或糖基化的LAG3多肽)的治疗有效量可以根据诸如以下因素而变化：个体的疾病状态、年龄、性别和体重，以及物质/分子/药剂在个体中引发所需应答的能力。治疗有效量包括其中物质/分子/药剂的任何毒性或有害作用被治疗有益作用所超过的量。
如本文所用，并且除非另有说明，否则术语“施用”是指将存在于体外的物质注射或以其他方式物理递送到患者内的行为，例如通过粘膜、真皮内、静脉内、肌内递送和/或本文所述或本领域已知的任何其他物理递送方法。当治疗疾病、病症或病况或其症状时，物质的施用通常发生在疾病、病症或病况或其症状发作之后。当预防疾病、病症或病况或其症状时，物质的施用通常发生在疾病、病症或病况或其症状发作之前。
本文还提供了抗glycLAG3抗体和糖基化的LAG3多肽的治疗用途。这些抗体或多肽可用于调节LAG3/MHCII信号传导的活性。这些抗体或多肽也可用于通过抑制LAG3在T细胞活化或增殖和细胞因子分泌中的抑制活性来治疗疾病。因此，本文提供了此类抗体或多肽在通过抑制或阻断LAG3信号传导而上调受试者的免疫系统中的用途。在一些实施方案中，本文提供了抗体或多肽阻断LAG3结合Gal-3、MHCII、肝窦内皮细胞凝集素(LSECtin)和/或CD3的用途。
在一些实施方案中，本文还提供了抗glycLAG3抗体和糖基化的LAG3多肽在治疗癌症中的治疗用途。免疫系统的上调在癌症的治疗中是特别需要的，因此本文还提供了癌症治疗的方法。癌症是指由细胞异常不受控制的生长引起的赘生物或肿瘤。癌症可以是原发性癌症或转移性癌症。在具体实施方案中，癌细胞对MCHII是阳性的。
在某些方面，可以施用实施方案的多肽或抗体(例如，糖基化的LAG3多肽或结合糖基化的LAG3的抗体)来治疗癌症。在具体实施方案中，抗glycLAG3抗体是STC1317的嵌合或人源化形式。本治疗方法适用的癌症包括任何恶性细胞类型，例如在实体瘤或血液学肿瘤中发现的那些。示例性的实体瘤可包括但不限于选自以下的器官的肿瘤：胰腺、结肠、盲肠、胃、脑、头、颈、卵巢、肾、喉、肉瘤、肺、膀胱、黑素瘤、前列腺和乳房。示例性的血液学肿瘤包括骨髓肿瘤、T或B细胞恶性肿瘤、白血病、淋巴瘤、母细胞瘤、骨髓瘤等。可以使用本文提供的方法治疗的癌症的其他实例包括但不限于：癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤、白血病、鳞状细胞癌、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌、肺的鳞状癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃部癌或胃癌(包括胃肠道癌和胃肠道间质癌)、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌或肾部癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、各种头颈癌、黑色素瘤、浅表扩散性黑素瘤、雀斑恶性黑素瘤、肢端雀斑样黑素瘤、结节性黑素瘤以及B细胞淋巴瘤(包括低级别/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞性(SL)NHL；中级/滤泡性NHL；中级弥漫性NHL；高级免疫母细胞NHL；高级淋巴母细胞性NHL；高级小无核裂细胞NHL(high grade small non-cleaved cell NHL)；巨大肿块(bulky disease)NHL；套细胞淋巴瘤；艾滋病(AIDS)相关淋巴瘤；和华氏巨球蛋白血症)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴母细胞白血病(ALL)、毛细胞白血病、多发性骨髓瘤、急性髓样白血病(AML)和慢性成髓细胞白血病。
癌症具体可以是以下组织学类型，但不限于这些：恶性赘生物；癌；未分化的癌；巨细胞和梭形细胞癌；小细胞癌；乳头状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；毛母质癌；移行细胞癌；乳头状移行细胞癌；腺癌；恶性胃泌素瘤；胆管癌；肝细胞癌；结合性肝细胞癌和胆管癌；小梁腺癌；腺样囊性癌；腺瘤性息肉中的腺癌；腺癌，家族性结肠息肉症；实体癌；恶性类癌瘤；细支气管-肺泡腺癌；乳头状腺癌；嫌色细胞癌；嗜酸细胞癌；嗜酸性腺癌；嗜碱性细胞癌；透明细胞腺癌；颗粒细胞癌；滤泡状腺癌；乳头状和滤泡性腺癌；非包囊性硬化癌；肾上腺皮质癌；子宫内膜样癌(endometroid carcinoma)；皮肤附器癌；大汗腺腺癌；皮脂腺癌；盯聍腺癌；粘液表皮样癌；囊腺癌；乳头状囊腺癌；乳头状浆液性囊腺癌；粘液性囊腺癌；粘液性腺癌；印戒细胞癌；浸润性腺管癌；髓样癌；小叶癌；炎症性癌；乳房佩吉特病；腺泡细胞癌；腺鳞状癌；具有鳞状组织转化的腺癌；恶性胸腺瘤；恶性卵巢间质瘤；恶性泡膜细胞瘤；恶性粒层细胞肿瘤；恶性睾丸母细胞瘤(androblastoma,malignant)；塞尔托利细胞癌；恶性莱迪希细胞肿瘤；恶性脂质细胞肿瘤；恶性副神经节瘤；恶性乳房外副神经节瘤；嗜铬细胞瘤；血管球肉瘤；恶性黑素瘤；无黑色素性黑素瘤；浅表扩散性黑素瘤；巨大色素痣内恶性黑素瘤；上皮样细胞黑素瘤；恶性蓝痣；肉瘤；纤维肉瘤；恶性纤维组织细胞瘤；粘液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎型横纹肌肉瘤；小泡型横纹肌肉瘤；间质肉瘤；恶性混合瘤；苗勒混合瘤；肾母细胞瘤；肝胚细胞瘤；癌肉瘤；恶性间叶瘤；恶性勃勒纳瘤；恶性叶状瘤；滑膜肉瘤；恶性间皮瘤；无性细胞瘤；胚胎癌；恶性畸胎瘤；恶性卵巢甲状腺肿；绒毛膜癌；恶性中肾瘤；血管肉瘤；恶性血管内皮瘤；卡波西氏肉瘤；恶性血管外皮细胞瘤；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；皮质旁骨肉瘤；软骨肉瘤；恶性软骨母细胞瘤；间叶性软骨肉瘤；骨的巨细胞瘤；尤因肉瘤；恶性牙原性瘤；成釉细胞牙肉瘤；恶性成釉细胞瘤；成釉细胞纤维肉瘤；恶性松果体瘤；脊索瘤；恶性神经胶质瘤；室管膜瘤；星形细胞瘤；原浆性星形细胞瘤；纤维性星形细胞瘤；星形母细胞瘤；胶质母细胞瘤；少突神经胶质瘤；成少突神经胶质细胞瘤；原始神经外胚层瘤；小脑肉瘤；成神经节细胞瘤；神经母细胞瘤；视网膜母细胞瘤；嗅神经源性肿瘤；恶性脑膜瘤；神经纤维肉瘤；恶性神经鞘瘤；恶性颗粒细胞瘤；恶性淋巴瘤；霍奇金病；霍奇金；副肉芽肿；小淋巴细胞性恶性淋巴瘤；弥漫性大细胞恶性淋巴瘤；滤泡性恶性淋巴瘤；蕈样肉芽肿病；其他特定的非霍奇金淋巴瘤；恶性组织细胞增多症；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增生性小肠疾病；白血病；淋巴样白血病；浆细胞白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞白血病；髓样白血病；嗜碱性粒细胞性白血病；嗜酸性粒细胞性白血病；单核细胞性白血病；肥大细胞白血病；巨核母细胞性白血病；髓样肉瘤；和毛细胞白血病。
在一些实施方案中，本文提供的抗体或多肽可用于治疗癌症，其为乳腺癌、肺癌、头颈癌、前列腺癌、食管癌、气管癌、脑癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、睾丸癌、结肠癌、直肠癌或皮肤癌。
多肽或抗体可以在本文中以多种方式用作抗肿瘤剂。本文提供了使用多肽或抗体作为抗肿瘤剂的方法，因此包括使肿瘤细胞群体与治疗有效量的多肽或抗体接触足以抑制肿瘤细胞生长的时间段。
各种递送系统也是已知的并且可用于施用抗glycLAG3抗体或糖基化的LAG3多肽的相关分子，或相关药物组合物，例如包封在脂质体、微粒、微胶囊、能够表达抗体或融合蛋白、受体介导的胞吞作用的重组细胞中(参见，例如，Wu和Wu,1987,J.Biol.Chem.262:4429-4432)，构建作为逆转录病毒或其他载体的一部分的核酸等。
本文提供的施用方法包括但不限于注射，如通过肠胃外施用(例如，真皮内、肌内、腹膜内、静脉内和皮下)、硬膜外和粘膜(例如，鼻内和经口途径)。在一些实施方案中，本文提供的抗体、其他分子或药物组合物经肌内、静脉内、皮下、静脉内、腹膜内、经口、肌内、皮下、腔内、透皮或经皮施用。组合物可以通过任何方便的途径施用，例如通过输注或快速推注、通过上皮或粘膜皮肤内衬(例如口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)的吸收，并且可以与其他生物活性剂一起施用。施用可以是全身的或局部的。此外，还可以采用肺部施用，例如，通过使用吸入器或喷雾器，并与雾化剂一起配制。参见，例如，美国专利号6,019,968；5,985,20；5,985,309；5,934,272；5,874,064；5,855,913；5,290,540；4,880,078；和PCT公开号WO 92/19244；WO 97/32572；WO 97/44013；WO 98/31346和WO 99/66903；所有这些都通过引用全部并入本文。在一些实施方案中，本文提供的抗体、其他分子或药物组合物被局部施用至需要治疗的区域，这可以通过例如局部输注、通过注射或通过植入物来实现，所述植入物其为多孔、无孔或凝胶状材料，包括膜，例如sialastic膜，或纤维。在一些实施方案中，当施用本文所述的抗体或其他分子时，注意使用抗体或其他分子不吸收的材料。
在一些实施方案中，本文提供的抗体或多肽被配制在脂质体中用于靶向递送。脂质体是由包裹水相的同心有序的磷脂双层组成的囊泡。脂质体通常具有各种类型的脂质、磷脂和/或表面活性剂。脂质体的组分以双层构型排列，类似于生物膜的脂质排列。脂质体可以成为有用的递送媒介物，部分原因在于它们的生物相容性、低免疫原性和低毒性。制备脂质体的方法是本领域已知的并且在本文中提供，参见，例如，Epstein等人,1985,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:3688；Hwang等人,1980Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4030-4；美国专利号4,485,045和4,544,545；所有这些都通过引用全部并入本文。
本文还提供了制备具有延长的血清半衰期(即增强的循环时间)的脂质体的方法，例如在美国专利号5,013,556中公开的那些。在一些实施方案中，本文提供的方法中使用的脂质体不会从循环中快速清除，即不会被吸收到单核吞噬细胞系统(MPS)中。本文还提供了空间稳定化的脂质体，其使用本领域技术人员已知的常用方法制备。空间稳定化的脂质体可以包含具有庞大且高度柔性的亲水部分的脂质组分，这减少了脂质体与血清蛋白的不良反应，减少了通过血清组分的调理作用(oposonization)，并减少了通过MPS的识别。可以使用聚乙二醇制备空间稳定化的脂质体。对于脂质体和空间稳定化的脂质体的制备，参见，例如，Bendas等人,2001BioDrugs,15(4):215-224；Allen等人,1987FEBS Lett.223:42-6；Klibanov等人,1990FEBS Lett.,268:235-7；Blum等人,1990,Biochim.Biophys.Acta.,1029:91-7；Torchilin等人,1996,J.Liposome Res.6:99-116；Litzinger等人,1994,Biochim.Biophys.Acta,1190:99-107；Maruyama等人,1991,Chem.Pharm.Bull.,39:1620-2；Klibanov等人,1991,Biochim Biophys Acta,1062；142-8；Allen等人,1994,Adv.DrugDeliv.Rev,13:285-309，其全部内容通过引用并入本文。
本文还提供了适用于特定器官靶向的脂质体，参见例如，美国专利号4,544,545，或适用于特定细胞靶向的脂质体，参见例如，美国专利申请公开号2005/0074403，其全部内容通过引用并入本文。用于本文提供的组合物和方法的特别有用的脂质体可以通过反相蒸发法用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物产生。脂质体可以通过限定孔径的过滤器挤出，以产生具有所需直径的脂质体。在一些实施方案中，具有抗原结合片段的分子，例如，F(ab')，可以使用先前描述的方法缀合至脂质体，参见例如，Martin等人，1982,J.Biol.Chem.257:286-288，其通过引用全部并入本文。
如本文所述的人源化或嵌合抗体也可以配制成免疫脂质体。免疫脂质体是指脂质体组合物，其中抗体或其片段共价地或非共价地连接至脂质体表面。将抗体连接至脂质体表面的化学方法在本领域中是已知的，参见例如美国专利号6,787,153；Allen等人，1995,Stealth Liposomes,Boca Rotan:CRC Press,233-44；Hansen等人,1995,Biochim.Biophys.Acta,1239:133-144，通过引用将它们全部并入本文。在一些实施方案中，用于本文提供的方法和组合物的免疫脂质体进一步空间稳定化。在一些实施方案中，如本文所述的人源化抗体共价地或非共价地连接至疏水锚，该疏水锚稳定地植根于脂质体的脂质双层中。疏水锚的示例包括但不限于磷脂，例如磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PI)。为了实现抗体和疏水锚之间的共价连接，可以使用本领域中任何已知的生化策略，参见，例如，J.Thomas August编，1997，Gene Therapy:Advances in Pharmacology，Volume 40，Academic Press,San Diego,Calif.,p.399-435，通过引用将其全部并入本文。例如，抗体分子上的官能团可以与脂质体相关的疏水锚上的活性基团反应，例如抗体上赖氨酸侧链的氨基可以偶联至用水溶性碳二亚胺活化的脂质体缔合的N-戊二酰基-磷脂酰乙醇胺；或还原抗体的硫醇基团可以通过硫醇反应性锚(例如吡啶基硫代丙酰基磷脂酰乙醇胺)偶联至脂质体。参见例如，Dietrich等人,1996,Biochemistry,35:1100-1105；Loughrey等人,1987,Biochim.Biophys.Acta,901:157-160；Martin等人,1982,J.Biol.Chem.257:286-288；Martin等人,1981,Biochemistry,20:4429-38，通过引用将它们全部并入本文。具有抗糖基化的LAG3抗体的免疫脂质体制剂可特别有效地用作治疗剂，因为它们将活性成分递送至靶细胞(即包含抗体要结合的受体的细胞)的细胞质。在一些实施方案中，免疫脂质体可以在血液中具有增加的半衰期，特别是在靶细胞中，并且可以内化到靶细胞的细胞质中，从而避免治疗剂的损失或通过内溶酶体途径的降解。
本文提供的免疫脂质体组合物可以具有一种或多种囊泡形成脂质、本发明的抗体或其他分子或其片段或衍生物，以及任选的亲水性聚合物。囊泡形成脂质可以是具有两条烃链(例如酰基链和极性头基)的脂质。囊泡形成脂质的示例包括磷脂，例如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、磷脂酰肌醇、鞘磷脂和糖脂，例如脑苷脂、神经节苷脂。可用于本文提供的制剂的其他脂质是本领域技术人员已知的并且包含在本说明书中。在一些实施方案中，免疫脂质体组合物进一步包括亲水性聚合物，例如聚乙二醇和神经节苷脂GM1，其增加脂质体的血清半衰期。将亲水性聚合物缀合至脂质体的方法在本领域中是众所周知的并且包含在本说明书中。其他示例性免疫脂质体及其制备方法可参见例如美国专利申请公开号2003/0044407；PCT国际公开号WO 97/38731，Vingerhoeads等人,1994,Immunomethods,4:259-72；Maruyama,2000,Biol.Pharm.Bull.23(7):791-799；Abra等人,2002,Journal ofLiposome Research,12(1&2):1-3；Park,2002,Bioscience Reports,22(2):267-281；Bendas等人,2001BioDrugs,14(4):215-224,J.Thomas August ed.,1997,Gene Therapy: Advances in Pharmacology,Volume 40,Academic Press,San Diego,Calif.,p.399-435；所有这些都通过引用全部并入本文。
本文还提供了通过向患者施用单位剂量的抗glycLAG3抗体来治疗癌症患者的方法。本文还提供了通过向患者施用单位剂量的糖基化的LAG3多肽来治疗癌症患者的方法。单位剂量是指适合作为受试者的单位剂型的物理离散单位，每个单位含有预定量的活性物质，其经计算与所需的稀释剂(即承载体或媒介物)联合产生所需的治疗效果。
抗体、多肽或组合物以与剂量制剂相容的方式并且以治疗有效量施用。待施用的量取决于待治疗的受试者、受试者系统利用活性成分的能力以及所需的治疗效果程度。需要施用的活性成分的精确量取决于从业者的判断，并且对于每个个体受试者都是特有的。然而，本文公开了全身应用的合适剂量范围并且取决于施用途径。还考虑了用于初始施用和加强施用的合适方案，并且通常包括初始施用，然后通过随后注射或其他施用以一个或多个小时间隔重复给药。示例性多次施用在本文中描述并且可用于维持多肽或抗体的持续高血清和组织水平。备选地，考虑了足以将血液中的浓度维持在为体内疗法指定的范围内的连续静脉内输注。
治疗有效量是为达到所述效果而计算的预定量。通常，剂量将随患者的年龄、病况、性别和疾病程度而变化，并且可以由本领域技术人员确定。如果出现任何并发症，个体医生可以调整剂量。
在一些实施方案中，本文提供的抗体、多肽或药物组合物包装在气密密封的容器中，例如安瓿或药囊中。在一个实施方案中，本文提供的抗体、多肽或药物组合物以干燥的灭菌冻干粉末或无水浓缩物的形式提供在气密密封的容器中，并且可以例如用水或盐水重构至适当浓度用于施用至受试者。在一些实施方案中，本文提供的抗体、多肽或药物组合物以至少5mg、更优选至少10mg、至少15mg、至少25mg、至少35mg、至少45mg、至少50mg或至少75mg的单位剂量以干燥无菌冻干粉末提供在气密密封的容器中。本文提供的冻干抗体、多肽或药物组合物应在2至8℃在其原始容器中储存，并应在重构后12小时内、优选地在6小时内、5小时内、3小时内或1小时内施用。在一个替代实施方案中，本文提供的抗体、多肽或药物组合物以液体形式提供在指示抗体、多肽或药物组合物的数量和浓度的气密密封的容器中。在一些实施方案中，本文提供的抗体、多肽或药物组合物的液体形式以至少1mg/ml、更优选至少2.5mg/ml、至少5mg/ml、至少8mg/ml、至少10mg/ml、至少15mg/ml、至少25mg/ml、至少50mg/ml、至少100mg/ml、至少150mg/ml、至少200mg/ml提供在气密密封的容器中。
制剂中使用的精确剂量还将取决于施用途径和病况的严重程度，并应根据从业者的判断和每位患者的情况来决定。可以从来自体外或动物模型测试系统的剂量-应答曲线外推出有效剂量。对于抗glycLAG3抗体或糖基化的LAG3多肽，施用给患者的剂量通常为0.01mg/kg至100mg/kg患者体重。在一些实施方案中，施用给患者的剂量为0.01mg/kg至20mg/kg、0.01mg/kg至10mg/kg、0.01mg/kg至5mg/kg、0.01至2mg/kg、0.01至1mg/kg、0.01mg/kg至0.75mg/kg、0.01mg/kg至0.5mg/kg、0.01mg/kg至0.25mg/kg、0.01至0.15mg/kg、0.01至0.10mg/kg、0.01至0.05mg/kg或0.01至0.025mg/kg患者体重。施用给患者的剂量可以是0.2mg/kg、0.3mg/kg、1mg/kg、3mg/kg、6mg/kg或10mg/kg。预计低至0.01mg/kg的剂量显示出明显的药效学作用。预计0.10-1mg/kg的剂量水平是最合适的。也预期更高的剂量(例如，1-30mg/kg)是有活性的。通常，由于对外源多肽的免疫应答，人抗体在人体内的半衰期比来自其他物种的抗体更长。因此，可以实施更低剂量的人抗体和更低频率的施用。此外，通过修饰(例如脂化)，通过增强抗体的摄取和组织渗透，可以降低本文提供的抗体或多肽的施用剂量和频率。
在又一个实施方案中，组合物可以在控释或缓释系统中递送。本领域技术人员已知的任何技术可用于生产具有本文提供的一种或多种抗体、分子或药物组合物的缓释制剂。参见，例如，美国专利号4,526,938；PCT公开WO 91/05548；PCT公布WO 96/20698；Ning等人,Radiotherapy&Oncology 39:179-189(1996)，Song等人,PDA Journal ofPharmaceutical Science&Technology 50:372-397(1995)；Cleek等人,Pro.Int'l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24:853-854(1997)；和Lam等人,Proc.Int'l.Symp.ControlRel.Bioact.Mater.24:759-760(1997)；所有这些都通过引用全部并入本文。在一个实施方案中，泵可以用在控释系统中(参见Langer，同上；Sefton，1987,CRC Crit.RefBiomed.Eng.14:20；Buchwald等人,1980,Surgery 88:507；和Saudek等人,1989,N.Engl.J.Med.321:574)。在另一个实施方案中，聚合材料可用于实现抗体或多肽的控释(参见例如，Medical Applications of Controlled Release,Langer and Wise(编),CRCPres.,Boca Raton,Fla.(1974)；Controlled Drug Bioavailability,Drug ProductDesign and Performance,Smolen and Ball(编),Wiley,New York(1984)；Ranger和Peppas,1983,J.,Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61；也参见Levy等人,1985,Science 228:190；During等人,1989,Ann.Neurol.25:351；Howard等人,1989,J.Neurosurg.7 1:105)；美国专利号5,679,377号；美国专利号5,916,597；美国专利号5,912,015；美国专利号5,989,463；美国专利号5,128,326；PCT公开号WO 99/15154；和PCT公开号WO 99/20253)；所有这些都通过引用全部并入本文。
可用于缓释制剂的聚合物的示例包括但不限于聚(甲基丙烯酸羟乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯-共-乙酸乙烯酯))、聚(甲基丙烯酸)、聚乙交酯(PLG)、聚酸酐、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯酰胺、聚(乙二醇)、聚丙交酯(PLA)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)和聚原酸酯。在又一个实施方案中，控释系统可以放置在治疗靶标(例如肺)的附近，因此仅需要全身剂量的一部分(参见例如Goodson，在MedicalApplications of Controlled Release中，同上，vol.2,pp.115-138(1984))。在另一个实施方案中，根据Dunn等人(参见美国专利号5,945,155，其通过引用全部并入本文)，使用可用作控释植入物的聚合物组合物。基于从聚合物系统中原位控释生物活性材料的治疗效果，植入通常可以发生在患者体内需要治疗的任何地方。
在另一个实施方案中，使用非聚合物持续递送系统，由此将受试者体内的非聚合物植入物用作药物递送系统。在植入体内后，植入物的有机溶剂将从组合物中消散、分散或浸出到周围的组织液中，并且非聚合物材料将逐渐凝结或沉淀以形成固体多微孔基质(参见美国专利号5,888,533)。Langer(1990,Science 249:1527-1533)的评论中也讨论了控释系统。本领域技术人员已知的任何技术可用于生产包含本文提供的一种或多种治疗剂的缓释制剂。参见，例如，美国专利号4,526,938；国际公开号WO 91/05548和WO 96/20698；Ning等人,1996,Radiotherapy&Oncology 39:179-189；Song等人,1995,PDA Journal ofPharmaceutical Science&Technology 50:372-397；Cleek等人,1997,Pro.Int'l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24:853-854；和Lam等人,1997,Proc.Int'l.Symp.ControlRel.Bioact.Mater.24:759-760；所有这些都通过引用全部并入本文。
本文还提供了其中组合物具有编码如本文提供的抗体或多肽的核酸的实施方案，其中可以如下在体内施用所述核酸以促进其编码的抗体或多肽的表达：将它构建为适当的核酸表达载体的一部分并施用它使其变成细胞内的，例如，通过使用逆转录病毒载体(参见美国专利号4,980,286)，或通过直接注射，或通过使用微粒轰击(例如，基因枪；生物弹道，Dupont)，或用脂质或细胞表面受体或转染剂包被，或通过将其与已知进入细胞核的同源盒样肽连接施用(参见例如，Joliot等人,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:1864-1868)。备选地，可以将核酸引入细胞内并通过同源重组掺入宿主细胞DNA中以用于表达。
用治疗有效量的本文提供的抗体、多肽或药物组合物治疗受试者可以包括单次治疗或一系列治疗。考虑本文提供的抗体、多肽或药物组合物可全身或局部施用以治疗疾病，例如在患有局部晚期或转移性癌症的癌症患者中抑制肿瘤细胞生长或杀死癌细胞。它们可以静脉内、鞘内和/或腹膜内施用。它们可以单独或与抗增殖药物组合施用。在一个实施方案中，在手术或其他程序之前施用它们以减少患者的癌症负荷。备选地，它们可以在手术后施用，以确保任何剩余的癌症(例如，手术未能消除的癌症)不会存活。在一些实施方案中，它们可以在原发性癌症消退后施用以防止转移。
联合治疗
在某些实施方案中，实施方案的组合物和方法涉及施用糖基化的LAG3多肽或选择性结合至糖基化的LAG3的抗体，与第二或额外疗法组合施用。此类疗法可用于治疗与LAG3或糖基化的LAG3相关的任何疾病。例如，疾病可以是癌症，第二疗法是抗癌或抗过度增殖疗法。
方法和组合物，包括联合疗法，增强治疗或保护效果，和/或增加另一种抗癌或抗过度增殖疗法的治疗效果。治疗和预防方法和组合物可以以有效达到所需效果的组合量提供，所需效果例如杀死癌细胞和/或抑制细胞过度增殖。该方法可以涉及施用多肽或抗体和第二疗法。第二疗法可以有或可以没有直接的细胞毒性作用。例如，第二疗法可以是上调免疫系统而不具有直接细胞毒性作用的药剂。可以将组织、肿瘤或细胞暴露于包含一种或多种药剂(例如抗体或抗癌剂)的一种或多种组合物或药理学制剂，或通过将组织、肿瘤和/或细胞暴露于两种或更多种不同组合物或制剂，其中一种组合物提供1)多肽或抗体，2)抗癌剂，或3)多肽或抗体和抗癌剂两者。此外，考虑这样的联合疗法可以与化学疗法、放射疗法、手术疗法或免疫疗法结合使用。
当应用于细胞时，术语“接触”和“暴露”在本文中用于描述将治疗性多肽或抗体和化疗剂或放射治疗剂递送至靶细胞或与靶细胞直接并列放置的过程。例如，为了实现细胞杀死，将两种试剂以有效杀死细胞或防止其分裂的组合量递送至细胞。
抗glycLAG3抗体或糖基化的LAG3多肽可以在第二或额外的抗癌治疗之前、期间、之后或以各种组合施用。施用的间隔可以从同时到几分钟到几天到几周不等。在将抗体或多肽与抗癌剂分开提供给患者的实施方案中，通常会确保在每次递送时间之间不会度过较长一段时间，以使两种化合物仍然能够对患者发挥有利的组合作用。在这种情况下，预期可以在彼此之间约12至24或72小时内，和更具体地在彼此之间约6-12小时内向患者提供抗glycLAG3抗体或糖基化的LAG3多肽和第二疗法。在某些情况下，治疗时间段可以显著延长，其中各个施用之间度过几天(2、3、4、5、6或7天)至几周(1、2、3、4、5、6、7或8周)。
在具体实施方案中，抗glycLAG3抗体与一种或多种其他抗LAG3抗体组合施用，包括与瑞拉利单抗(relatlimab，BMS-986016)、LAG525、REGN3767、MGD013、FS118、TSR-033或IMP321组合施用于患者用于癌症的治疗。在其他实施方案中，抗glycLAG3抗体与一种或多种抗PD-1抗体组合施用，并且在一个具体实施方案中，抗PD-1抗体是德瓦鲁单抗(durvalumab)、纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗(pebrolizumab)、阿维单抗(avelumab)、阿特珠单抗(atezolizumab)或西米普利单抗(cemiplimab)，施用于患者以用于治疗癌症。在其他实施方案中，抗glycLAG3抗体与抑制LAG3、CTLA-4、PD-L1或PD-1活性的药剂一起施用，所述药剂例如是免疫粘附素，其具有与Fc结构域融合的PD-1、PD-L1、LAG3或CTLA-4蛋白的细胞外受体或配体结合部分。在一些实施方案中，抗glycLAG3抗体与阿特珠单抗或阿维单抗组合施用。
在具体实施方案中，抗glycLAG3抗体与相比于未糖基化的PD-1优先结合糖基化的PD-1的抗体组合施用。特别地，抗glycLAG3抗体可以与抗PD-1抗体STM418或STM432的嵌合或人源化形式组合施用，抗PD-1抗体STM418或STM432的嵌合或人源化形式相比于未糖基化的PD-1优先结合糖基化的PD-1，并且重链和轻链可变结构域的氨基酸序列(和编码核苷酸序列)公开于2017年6月8日公布的标题为“Antibodies Specific To Glycosylated PD-1And Methods Of Use Itsof”的PCT公开WO2017/096026中，其通过引用并入本文。
在具体实施方案中，抗glycLAG3抗体与相比于未糖基化的PD-L1优先结合糖基化的PD-L1的抗体组合施用。特别地，抗glycLAG3抗体可以与抗PD-L1抗体STM004或STM115的嵌合或人源化形式组合施用，抗PD-L1抗体STM004或STM115的嵌合或人源化形式相比于未糖基化的PD-L1优先结合糖基化的PD-L1，并且重链和轻链可变结构域的氨基酸序列(和编码核苷酸序列)公开于2016年10月6日公布的标题为“Antibodies Specific ToGlycosylated PD-L1 And Methods Of Use Itsof”的PCT公开WO2016/160792中，其通过引用并入本文。抗glyc-LAG3抗体还与抗PD-L1抗体STM073和SMT108的嵌合或人源化形式组合施用，抗PD-L1抗体STM073和SMT108的嵌合或人源化形式相比于未糖基化的PD-L1优先结合糖基化的PD-L1，并且重链和轻链可变结构域的氨基酸序列(和编码核苷酸序列)公开于2016年3月29日提交的标题为“Dual Function Antibodies Specific To GlycosylatedPD-L1 And Methods Of Use Itsof”的美国临时申请号62/314,652中，其通过引用并入本文。
在某些实施方案中，一个疗程可以持续1-90天或更长时间(这个范围包括中间的天数)。考虑可以在第1天到第90天(这个范围包括中间的天数)的任何一天或其任何组合施用一种药剂，并且在第1天到第90天(这个范围包括中间的天数)的任何一天或其任何组合施用另一种药剂。在一天(24小时)内，可以给患者施用一次或多次药剂。此外，在疗程之后，考虑有一段时间不施用抗癌治疗。该时间段可能持续1-7天，和/或1-5周，和/或1-12个月或更长(这个范围包括中间的天数)，这取决于患者的状况，例如他们的预后、强壮度，健康等。治疗周期可以根据需要重复。
可以采用各种组合。下面列出了一些用抗glycLAG3抗体或糖基化的LAG3多肽作为“A”和第二抗癌疗法作为“B”的治疗的示例：A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/BA/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A。
将本文提供的任何抗体、多肽或药物组合物与第二疗法组合施用给患者将遵循用于施用这样的第二疗法的一般方案，其中考虑第二治疗的毒性(如果有的话)。因此，在一些实施方案中，存在监测可归因于组合疗法的毒性的步骤。
化学疗法
根据本发明的实施方案，可以使用多种化疗剂作为第二疗法。化疗剂可以是在治疗癌症中施用的化合物或组合物。这些药剂或药物可以根据它们在细胞内的活性模式进行分类，例如，它们是否以及在什么阶段影响细胞周期。备选地，可以基于其直接交联DNA、嵌入DNA中或通过影响核酸合成诱导染色体和有丝分裂畸变的能力来表征药剂。
化疗剂的示例包括：烷化剂，诸如塞替派和环磷酰胺；磺酸烷基酯，诸如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮杂环丙烷，诸如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌、美妥替派(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)；乙烯亚胺和甲基蜜胺，包括六甲蜜胺、三亚乙基蜜胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基蜜胺；番荔枝内酯(尤其是布拉他辛和布拉他辛酮)；喜树碱(包括合成的类似物托泊替康)；苔藓抑素；卡利他汀(callystatin)；CC-1065(包括它的合成类似物阿多来新、卡泽来新和比泽来新)；念珠藻环肽(尤其是念珠藻环肽1和念珠藻环肽8)；多拉司他汀；多卡米星(包括合成的类似物、KW-2189和CB1-TM1)；软珊瑚醇；水鬼蕉碱；sarcodictyin；海绵抑素；氮芥类，诸如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、盐酸氧化氮芥、美法仑、新氮芥、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺和尿嘧啶氮芥；亚硝基脲(nitrosurea)，诸如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀；抗生素，诸如烯二炔抗生素(例如，卡奇霉素，特别是卡奇霉素γlI和卡奇霉素ωI1)；达内霉素，包括达内霉素A；二膦酸盐，诸如氯膦酸盐；埃斯波霉素；以及新制癌菌素生色团和有关的色蛋白烯二炔抗生素生色团、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素、氨茴霉素(authrarnycin)、偶氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素、嗜癌霉素、色霉素(chromomycinis)、更生霉素、柔红霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(包括吗啉代-多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯啉代-多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素类诸如丝裂霉素C、麦考酚酸、诺拉霉素(nogalarnycin)、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁和佐柔比星；抗代谢药，诸如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸、蝶罗呤和三甲曲沙；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤和硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，诸如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨和氟尿苷；雄激素类，诸如卡普睾酮、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇、美雄烷和睾内酯；抗-肾上腺药，诸如米托坦和曲洛司坦；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基酮戊酸；恩尿嘧啶；安吖啶；bestrabucil；比生群；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；秋水仙胺；地吖醌；依氟鸟氨酸(elformithine)；依利醋铵；埃博霉素；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明(lonidainine)；拟美坦辛，诸如美坦辛和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇(mopidanmol)；尼曲吖啶(nitraerine)；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；PSK多糖复合物；雷佐生；根霉素；西佐喃；锗螺胺；替奴佐酸；三亚胺醌；2,2',2”-三氯三乙胺；单端孢霉烯类(特别是T-2毒素、疣孢菌素(verracurin)A、杆孢菌素A和蛇形菌素)；乌拉坦(urethan)；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；加西托星(gacytosine)；阿糖胞苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；紫杉烷类，例如，紫杉醇和多西他赛吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；铂配位络合物，诸如顺铂、奥沙利铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺肖林；替尼泊苷；依达曲沙；道诺霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；伊立替康(例如，CPT-11)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；维A酸类，诸如视黄酸；卡培他滨；卡铂、丙卡巴肼、普卡霉素、吉西他滨、诺维本、法呢基-蛋白转移酶抑制剂、反式铂和上述任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
放射疗法
可以与本文所述的方法和组合物组合使用的另一种常规抗癌疗法是放射疗法或辐射疗法。放射疗法包括使用γ射线、X射线和/或将放射性同位素定向递送至肿瘤细胞。还考虑了其他形式的DNA损伤因子，例如微波、质子束辐照(美国专利号5,760,395和4,870,287；所有这些都通过引用全部并入本文)和紫外(UV)辐照。最可能的是，所有这些因素都会对DNA、DNA前体、DNA的复制和修复以及染色体的组装和维持产生广泛的损害。
肿瘤微环境本质上是抑制性的，因为存在骨髓来源的抑制性细胞和调节性T细胞，这些细胞浸润肿瘤并发挥抑制免疫应答的作用。此外，某些抑制性分子在T细胞和抗原呈递细胞(APC)上的表达会限制有效的免疫应答。辐射通过诱导肿瘤细胞凋亡、衰老、自噬来介导抗肿瘤作用，并且在某些情况下，可以刺激更有效的免疫应答。
远位效应(abscopal effect)是一种生理过程，由此原发性肿瘤的靶向辐射在不在辐射场的远处部位诱导抗肿瘤应答。负责远位效应的机制被认为是免疫介导的，涉及增强的肿瘤抗原向T细胞的呈递以及细胞因子和其他促炎因子的释放，这些因子刺激局部和全身免疫应答。由于远位效应影响位于远离接受放射治疗的原发肿瘤的肿瘤，因此可以触发远位效应的药剂在治疗转移性肿瘤方面特别有利，转移性肿瘤一旦扩散到体内的继发部位，通常就更难治疗。
本文所述的抗-glycLAG3抗体或糖基化的LAG3多肽可以刺激局部和全身免疫应答。在一些实施方案中，治疗有效量的如本文所述的抗体、多肽或药物组合物在放射疗法之前、同时或之后施用以实现协同远位效应。
在一些实施方案中，施用治疗有效量的本文所述的抗体、多肽或药物组合物，其有效地使宿主中的肿瘤对辐射敏感。辐射可以是电离辐射，尤其是γ辐射。在一些实施例中，γ辐射由线性加速器或放射性核素发射。放射性核素对肿瘤的辐射可以是外部的或内部的。
在一些实施方案中，本文所述的抗体、多肽或药物组合物的施用开始于肿瘤的辐射前长达一个月，特别是长达10天或一周。此外，肿瘤的辐射是分段的，在第一个和最后一个辐射期之间的区间内维持本文所述的抗体、多肽或药物组合物的施用。
辐射也可以是X射线辐射。X射线的剂量范围从50到200伦琴的每天剂量持续长时间段(3到4周)到2000至6000伦琴的单次剂量。放射性同位素的剂量范围变化很大，取决于同位素的半衰期、所发射辐射的强度和类型以及被赘生物细胞的吸收。
免疫疗法
本领域技术人员将理解免疫疗法可以与实施方案的方法组合或结合使用。在癌症治疗的背景下，免疫疗法通常依赖于使用免疫效应细胞和分子来靶向和破坏癌细胞。利妥昔单抗
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就是这样一个示例。检查点抑制剂，例如伊匹木单抗、派姆单抗、纳武单抗和阿特珠单抗是其他示例。免疫效应物可以是例如对肿瘤细胞表面上的一些标志物特异的抗体。单独的抗体可以作为疗法的效应物，或者其可以招募其他细胞来实际影响细胞杀伤。抗体也可以与药剂或毒素(例如化疗剂、放射性核素、蓖麻毒蛋白A链、霍乱毒素、百日咳毒素)缀合并仅用作靶向剂。备选地，效应物可以是携带直接或间接地与肿瘤细胞靶标相互作用的表面分子的淋巴细胞。各种效应细胞包括细胞毒性T细胞和NK细胞。
在免疫疗法的一个方面，肿瘤细胞带有一些易于靶向的标志物，即不存在于大多数其他细胞上。存在许多肿瘤标志物并且这些中的任何一个都可以适合于在本实施方案的情形中进行靶向。常见的肿瘤标志物包括CD20、癌胚抗原、酪氨酸酶(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、唾液酸路易斯抗原、MucA、MucB、PLAP、层粘连蛋白受体、erb B和p155。免疫疗法的一个替代方面是将抗癌作用与免疫刺激作用相结合。还存在免疫刺激分子，包括：细胞因子，如IL-2、IL-4、IL-12、GM-CSF、γ-IFN，趋化因子，如MIP-1、MCP-1、IL-8和生长因子，如FLT3配体。
目前正在研究或使用的免疫疗法的示例是免疫佐剂，例如牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、二硝基氯苯和芳香族化合物(美国专利号5,801,005和5,739,169；Hui和Hashimoto，Infect Immun.,66(11):5329-36(1998)；Christodoulides等人,Microbiology,66(11):5329-36(1998))；细胞因子疗法，例如干扰素α、β和γ，IL-1，GM-CSF和TNF(Bukowski等人,Clin Cancer Res.,4(10):2337-47(1998)；Davidson等人,J Immunother.,21(5):389-98(1998)；Hellstrand等人,ActaOncol.37(4):347-53(1998))；基因疗法，例如TNF、IL-1、IL-2和p53(Qin等人,Proc NatlAcad Sci U S A,95(24):14411-6(1998)；Austin-Ward和Villaseca,Rev Med Chil,126(7):838-45(1998)；美国专利号5,830,880和5,846,945)；和单克隆抗体，例如抗PD1、抗PDL1、抗CD20、抗神经节苷脂GM2和抗p185(Topalian等人,The New England journal ofmedicine,366:2443-2454(2012)；Brahmer等人,The New England journal of medicine366:2455-2465(2012)；Hollander,Front Immunol(2012):3:3.doi:10.3389/fimmu.2012.00003；Hanibuchi等人,Int J Cancer,78(4):480-5(1998)；美国专利号5,824,311)；所有这些都通过引用全部并入本文。考虑一种或多种抗癌疗法可以与本文所述的包括使用抗glycLAG3抗体或糖基化的LAG3多肽的疗法一起使用。
手术
大约60％的癌症患者将接受某种类型的手术，包括预防性、诊断性或分期、治愈性和姑息性手术。治愈性手术包括切除术，其中全部或部分癌组织被物理去除、切除和/破坏，并且可以与其他疗法结合使用，其他疗法例如本实施方案的治疗、化学疗法、放射疗法、激素疗法、基因疗法、免疫疗法和/或替代疗法。肿瘤切除是指对至少部分肿瘤进行物理去除。除肿瘤切除外，手术治疗还包括激光手术、冷冻手术、电手术和显微镜控制手术(莫氏手术)。
在切除部分或全部癌细胞、组织或肿瘤后，体内可能会形成空腔。可以通过给该区域灌注、直接注射或局部应用额外的抗癌疗法来完成治疗。这种治疗可以例如每1、2、3、4、5、6或7天，或每1、2、3、4和5周或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月进行重复。这些治疗也可以有不同的剂量。
其他药剂
考虑其他实际可以与本实施方案的某些方面组合使用以提高治疗的疗效。这些另外的药剂包括影响细胞表面受体的上调和GAP连接的药剂、细胞生长抑制剂和分化剂、细胞粘附的抑制剂、增加过度增殖细胞对凋亡诱导剂的敏感性的药剂或其他生物药剂。通过增加GAP连接的数量来增加细胞间信号传导可以增加对邻近过度增殖细胞群的抗过度增殖作用。在其他实施方案中，细胞生长抑制剂或分化剂可与本实施方案的某些方面组合使用以提高治疗的抗过度增殖功效。考虑使用细胞粘附抑制剂来提高本实施方案的功效。细胞粘附抑制剂的示例是粘着斑激酶(FAK)抑制剂和洛伐他汀。进一步考虑增加过度增殖细胞对细胞凋亡的敏感性的其他药剂，例如抗体c225，可以与本发明实施方案的某些方面组合使用以提高治疗功效。
试剂盒和诊断剂
在各个方面，本文提供的是包含治疗剂和/或其他治疗剂和递送剂的试剂盒。在一些实施方案中，考虑了用于制备和/或施用本文提供的疗法的试剂盒。试剂盒可以包括一个或多个密封的小瓶，小瓶含有本文提供的任何药物组合物。试剂盒可以包括例如至少一种抗glycLAG3抗体或糖基化的LAG3多肽，以及用于制备、配制和/或施用本文提供的组分或进行本文提供的方法的一个或多个步骤的试剂。
在一些实施方案中，试剂盒可以包括抗glycLAG3抗体和至少一种辅助试剂。在一些实施方案中，试剂盒可以包括糖基化的LAG3多肽和至少一种辅助试剂。
在一些实施方案中，该试剂盒还包括第二抗癌剂。第二抗癌剂可以是化疗剂、免疫治疗剂、激素治疗剂或细胞因子。
在一些实施方案中，试剂盒还可以包括合适的容器装置，其是不与试剂盒的组分反应的容器，例如eppendorf管、测定板、注射器、瓶子或试管。容器可以由可灭菌的材料(例如塑料或玻璃)制成。
试剂盒还可以包括指令图表，其概述了本文所述方法的程序步骤，并且将遵循与本文所述或普通技术人员已知的基本相同的程序。指令信息可以在包含机器可读指令的计算机可读介质中，当使用计算机执行时，其导致显示递送药学有效量的本文提供的抗体或多肽的真实或虚拟程序。试剂盒还可以包括呈管理药品或生物制品的制造、使用或销售的政府机构规定的形式的公示，该公示反映了所述机构关于人施用而制造、使用或销售的批准。
实施例
应当理解，也可以考虑不显著改变本文所述的各种实施方案的性质和精神的修改。因此，以下实施例旨在说明而非以任何方式限制。
材料和方法
通过Octet的KD确定和分箱。对于高通量KD筛选，抗体配体通过20nM溶液加载到传感器上。在含有1mg/ml牛血清白蛋白的PBS(测定缓冲液)中建立基线，通过将传感器浸没在测定缓冲液中的单一浓度分析物中来执行缔合步骤。在新鲜的测定缓冲液中进行并监测解离。所有实验均在1,000rpm的传感器振摇下执行。使用ForteBio的数据分析软件将数据拟合到1:1结合模型以提取缔合速率和解离速率。使用比率kd/ka计算KD。在典型的表位分箱测定法中，抗原LAG3-His(10nM)与第二抗体(10nM)在室温预孵育1小时。将对照抗体(20nM)加载到AMC传感器(ForteBio)上，并用完整的小鼠IgG抗体(Jackson ImmunoResearch)封闭传感器上剩余的Fc结合位点。传感器暴露于预温育的抗原-第二抗体混合物。使用ForteBio的数据分析软件7.0处理原始数据，并评估抗体对的竞争性结合。第二抗体的额外结合表示未被占用的表位(非竞争物)，而没有结合表示表位封闭(竞争物)。
LAG3的糖基化分析。为了确认LAG3蛋白的糖基化，如制造商所述，用酶PNGase F、Endo H、0-糖苷酶(New England BioLabs，Ipswich，MA，USA)处理细胞裂解物。
实施例1：LAG3是高度糖基化的。
基于UniProt数据库(http://www.uniprot.org)，人LAG3在N188、N250、N256和N343处被糖基化。为了确认LAG3蛋白的糖基化，我们按照制造商的描述用PNGase F(NewEngland BioLabs)处理LAG3蛋白。当LAG3蛋白在哺乳动物细胞中表达时，蛋白质的大小(57.5kDa)大于计算的分子量(46.41kDa)。用PNGase F的处理从蛋白质中去除寡糖部分，导致蛋白质的大小减少到预期的46.41kDa，如图1所示。该结果证实了LAG3蛋白的糖基化(图1)。
实施例2：抗LAG3抗体的生产。
我们获得了从来自Novoprotein的过表达重度糖基化的LAG3的293F细胞中纯化的LAG3-His蛋白。产生针对糖基化的人LAG3的单克隆抗体的杂交瘤是根据标准方案，通过将SP2/0鼠骨髓瘤细胞与从人LAG3免疫的Balb/C(n＝4)和NZW小鼠(n＝4；AntibodySolutions,Inc.,Sunnyvale,CA,USA)分离的脾细胞的融合获得的。在融合之前，使用FACS分析验证来自免疫小鼠的血清与LAG3免疫原的结合。产生了超过3000个产生单克隆抗体(mAb)的杂交瘤。再次测试产生抗体的杂交瘤的特异性。其中，22个生产mAb的候选杂交瘤通过FACS进行选择，其中使用表达LAG3 WT或4NQ(去糖基化形式)的293T细胞，在DCGF培养基(Antibody Solutions)中生长，并浓缩和纯化含有单克隆抗体的上清液。使用斑点印迹分析对纯化的mAb测试它们与糖基化的LAG3结合但不与去糖基化的LAG3结合的能力。该测定法的结果表明，在测试的22个mAb中，3个mAb特异性结合糖基化的LAG3(图2)。
为了促进从杂交瘤上清液中纯化每种抗体，通过ELISA确定每种抗体的同种型。根据制造商的说明使用针对每种抗体同种型的抗体(Sigma-Aldrich,Cat.#ISO2)。LAG3抗体的同种型结果列于表5。该同种型信息用于选择用于亲和层析纯化的柱树脂。对于快速蛋白质液相色谱(FPLC)，蛋白质G用于IgG1型，蛋白质A用于IgG2a和IgG2b(表5)。
表5.抗LAG3抗体的同种型。
mAb 同种型 mAb 同种型
STC1301 G1 STC1312 G2b
STC1302 G2a/G3 STC1313 G3/G2a
STC1303 G2a/G2b STC1314 G2b
STC1304 G2a STC1315 G1
STC1305 G1/A STC1316 G2a
STC1306 G2a STC1317 G1/G2a
STC1307 G2a/A STC1318 G2a
STC1308 A STC1319 G1
STC1309 M STC1320 G2b/G1
STC1310 G2b STC1321 G2b
STC1311 G2a STC1322 M
对于高通量KD筛选，通过20nM溶液将抗体配体加载到Octet传感器(Anti-MouseIgG Fc Capture(AMC)Biosensors)上。在含有1mg/mL牛血清白蛋白的PBS(测定缓冲液)中建立基线，并通过将传感器浸没在测定缓冲液中单一浓度的分析物中来执行缔合步骤。在新鲜的测定缓冲液中执行和监测解离。所有实验都是用传感器以每分钟1,000转的振动的情况下执行的。ForteBio(Menlo Park,CA,USA)数据分析软件用于将数据拟合到1:1结合模型以提取缔合速率和解离速率。使用比率kd:ka计算KD。数据总结在图3和表6中。其中，STC1317表现出最强的结合亲和力，其KD为2.85x109M。
表6.Octet测定的抗LAG3抗体的动力学参数。
样品ID 应答 KD(M) kon(1/Ms) kdis(1/s)
STC1301 -0.0048 3.42E+13 1.86E-03 6.37E+10
STC1302 -0.0024 1.82E+04 6.10E+01 1.11E+06
STC1303 -0.0001 2.73E+13 7.45E-03 2.04E+11
STC1304 -0.0043 <1.0E-12 9.31E-04 <1.0E-07
STC1305 -0.0094 <1.0E-12 9.31E-04 <1.0E-07
STC1306 0.0025 <1.0E-12 4.59E+04 <1.0E-07
STC1307 -0.0032 <1.0E-12 4.66E-04 <1.0E-07
STC1308 0.0226 <1.0E-12 9.35E+05 <1.0E-07
STC1309 0.0012 8.99E-06 6.43E+03 5.78E-02
STC1310 -0.0025 1.31E+09 6.90E+04 9.01E+13
STC1311 -0.0025 2.63E+11 1.22E+02 3.21E+13
STC1312 -0.0046 1.58E+20 1.04E+03 1.64E+23
STC1314 -0.004 5.16E+07 4.48E+03 2.31E+11
STC1315 0.0051 <1.0E-12 1.72E+100 1.67E-02
STC1316 0.0149 2.36E-11 6.15E+08 1.45E-02
STC1317 0.3111 2.85E-09 2.61E+05 7.42E-04
STC1318 0.0012 2.16E-07 1.60E+08 3.44E+01
STC1319 0.0129 1.74E-09 5.59E+05 9.72E-04
STC1320 0.0017 1.44E-06 4.02E+04 5.77E-02
STC1321 -0.0033 1.83E-12 7.45E-03 <1.0E-07
STC1322 -0.0036 <1.0E-12 1.86E-03 <1.0E-07
实施例3.抗体测序
杂交瘤细胞颗粒在-80℃冷冻，并使用RNeasy Plus Mini Kit(Qiagen，Hilden，DE)分离总RNA，并使用NanoDrop 2000分光光度计(Thermo Fisher Scientific)进行定量。按照制造商(Clontech，Mountain View，CA，USA)的说明，使用SMARTer RACE 5′/3′试剂盒执行cDNA合成和cDNA末端的快速扩增(RACE)。PCR引物购自Novagen Mouse Ig-Primer set(Merck KGaA,Darmstadt,DE,Germany)，用于Ig特异性PCR扩增。使用了每25μL反应体积0.5μg的重链引物组(A-F)、轻(kappa)链引物组(A-G)和模板RNA。凝胶分离后，将PCR产物连接到pCR 2.1载体中，转化感受态细胞，并在100μg/mL氨苄青霉素和50μL X-gal/IPTG琼脂板上进行选择。24小时后挑出白色菌落。培养后，分离质粒DNA并使用M13正向和反向引物进行测序。STC1317重链和κ轻链可变区的序列和CDR分别列于表3和表4中。
实施例4.通过Biocore分析确定KD
KD测定是使用Biacore X100仪器(GE Healthcare，Uppsala，Sweden)通过表面等离子共振执行的。使用标准程序将小鼠IgG1固定化在研究级CM5芯片上，抗体在HBS-EP+缓冲液中以2μg/mL流过芯片。接下来，六种浓度的LAG3，每一种稀释2倍，通过芯片。传感数据通过Biacore X100评估软件2.0.1版进行分析，其中结合动力学为1:1。发现STC1317对Fc标记和His标记的LAG3蛋白的KD分别为0.021nM和0.406nM。这表明STC1317对LAG3的结合亲和力非常强(图4和表7)。
表7.抗glyc-LAG3抗体STC1317与LAG3-His结合的BIACORE测定。
抗原 应答 KD(M) kon(1/Ms) kdis(1/s) 由以下测量
LAG3-Fc融合 0.3796 2.10E-11 3.45E+05 7.25E-06 Octet
LGG3-His标记 0.3111 2.85E-09 2.61E+05 7.42E-04 Octet
LAG3-His标记 - 4.06E-10 9.43E+05 3.83E-04 Biacore
实施例5.抗GlycLAG3抗体对T细胞增殖的影响。
为了在体外评估STC1317的功效，使用在IL-4(500U/mL)和GM-CSF(250U/mL)存在下培养7天的树突细胞(DC，由同种异体供体(Immunospot#CTL-CP1)的PBMC诱导)进行混合淋巴细胞反应(MLR)。根据制造商的建议，通过人类泛DC富集试剂盒(Miltenyi Biotech#130-100-777)分离DC，并用于刺激同种异体记忆或幼稚CD4+T细胞。还通过CD4微珠(Miltenyi Biotech#130-045-101)从另一个同种异体供体(Immunospot#CTL-CP1)的PBMC中富集CD4+T细胞。将DC(1×104个DC/孔)与1×105个T细胞/孔在存在STC1317的培养基中在96孔平底板(Nunc)中共培养。培养5天后，根据制造商的说明，通过细胞因子ELISA试剂盒(BioLegend)测定培养上清液中IFN-γ和IL-2的浓度。如图5所示，在STC1317存在下，T细胞增殖标志物IFN-γ和IL-2的分泌显著增加。
实施例6：抗体人源化——框架区
如上所述，为了某些目的，包括例如用于人类疾病的体内治疗，优选使用小鼠单克隆抗体的人源化衍生物。为了形成这种人源化抗体，首先将小鼠单克隆抗体的框架序列(“亲本”序列)与一组“受体”人抗体的框架序列进行比对，以鉴别框架序列中的差异。人源化是通过置换亲本和受体之间不匹配的框架残基来实现的。可以对潜在重要位置处的置换，例如在Vernier区、VH/VL链间界面或CDR规范类别决定位置处的置换分析预期的回复突变(参见Foote，J.等人，J.Molec.Biol.224:487-499(1992))。
保守域数据库(COD)(Marchler-Bauer等人(2011)Nucleic Acids Res.39:D225-D229)可用于确定每个氨基酸链的结构域内容和每个结构域的近似边界。根据几个常用定义可以准确确定可变结构域边界以及CDR的边界(Kabat,E.A.等人(1991)“Sequences ofProteins of Immunological Interest,”Fifth Edition.NIH Publication No.91-3242；Chothia,C.等人,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)；Honegger,A.等人,J.Molec.Biol.309(3):657-670(2001))。
使用MAFFT(Katoh,K.等人，Nucleic Acids Res.30:3059-3066(2002))生成亲本序列与小鼠和人种系序列的多重比对，并且每个比对中的条目根据与亲本序列的序列同一性进行排序。通过以100％的序列同一性聚类并排除冗余条目，将参考集简化为一组唯一的序列。
最佳受体框架选择是基于在两条链的框架中与受体的整个亲本抗体序列同一性；然而，构成VH/VL链间界面的位置特别令人感兴趣。此外，负责对5个CDR定义的规范结构的离散集合的CDR环长度和CDR位置(Chothia,C.等人,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)；Martin,A.C.等人,J.Molec.Biol 263:800-815(1996)；Al-Laziniki,B.等人,J.Molec.Biol.273:927-948(1997))与种系进行比较，以确定哪些种系框架具有相同的界面残基，并且已知支持相似的CDR环构象。
根据亲本抗体与人种系的序列比对，确定最接近的匹配条目。优选的人类种系的选择基于排序标准：(1)整个框架的序列同一性；(2)相同或相容的链间界面残基；(3)支持具有亲本CDR规范构象的环；(4)在表达的抗体中发现重和轻种系的组合；和(5)存在必须去除的N-糖基化位点。
产生了人源化的抗体的Fv区的结构模型。FR和CDR以及完整Fv的候选结构模板片段根据其与靶标的序列同一性以及模板结构的定性晶体学测量(例如分辨率，以埃
Figure BDA0003668004810000771
表示)评分、排序和从抗体数据库中选择。
为了在结构上比对CDR与FR模板，将CDR任一侧上的5个残基包含在CDR模板中。基于重叠区段和生成的结构序列比对生成片段的比对。通过MODELLER(SalI,A.等人；J.Molec.Biol.234:779-815(1993))处理模板片段连同比对。该方案创建来源于一组比对的结构模板的构象约束。通过缀合物梯度和模拟的退火优化程序，创建满足约束的结构集合。模型结构是根据能量评分从这个集合中选择的，能量评分来源于蛋白质结构的评分和构象约束的满足。检查模型并使用侧链优化算法优化靶标和模板之间不同位置的侧链并最小化能量。一套可视化和计算工具用于评估CDR构象变异性、局部堆积和表面分析，以选择一个或多个优选的模型。
构建亲本抗体的结构模型并检查缺陷，例如原子堆积不良、键长中的应力、键角或二面角。这些缺陷可能指示抗体结构稳定性的潜在问题。建模方案旨在最小化此类缺陷。人源化Fv的初始结构模型包含所有安全置换(即不应影响结合亲和力或稳定性的置换)和谨慎置换(即进行位置置换，但所述位置可能对结合亲和力很重要)。不改变在被认为与结合亲和力降低或稳定性降低的风险相关的位置处的置换。模板搜索和选择与亲本模板搜索分开执行，以便创建良好的独立模型，而不是亲本的紧密匹配的变体模型。随着进行潜在置换的评估，模型会更新以反映优选的置换和回复突变的影响。
实施例7：抗体人源化——恒定区：
可以通过分别在pFUSEss-CHIg-hG1和pFUSEss-CLIg-hK载体(Invivogen)中用人IgG1恒定区(CH1-CH3)替换小鼠恒定区来修饰STC1317重链的可变区(VH)和其κ轻链的可变区(VL)。重链和轻链嵌合体构建体可以以1:1的比例转染到293F悬浮细胞中5天。嵌合抗体(hSTC1317)可以通过蛋白质A亲和柱在HPLC上进行纯化。
贯穿本申请，引用了各种出版物。这些出版物的公开内容在此通过引用的方式全部并入本申请中，以便更全面地描述本公开内容所涉及的现有技术。尽管在此提供了某些特定实施方案的示例，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是可以进行各种改变和修改。这种修改也旨在落入所附权利要求的范围内。
序列表
<110> 斯特库比公司（STCUBE & CO.）
Yoo, Stephen S.
<120> 对糖基化的LAG3特异的抗体及其使用方法
<130> 24258.0014P1
<150> 62/912,867
<151> 2019-10-09
<160> 21
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 525
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 1
Met Trp Glu Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Phe Leu Gln Pro Leu Trp
1 5 10 15
Val Ala Pro Val Lys Pro Leu Gln Pro Gly Ala Glu Val Pro Val Val
20 25 30
Trp Ala Gln Glu Gly Ala Pro Ala Gln Leu Pro Cys Ser Pro Thr Ile
35 40 45
Pro Leu Gln Asp Leu Ser Leu Leu Arg Arg Ala Gly Val Thr Trp Gln
50 55 60
His Gln Pro Asp Ser Gly Pro Pro Ala Ala Ala Pro Gly His Pro Leu
65 70 75 80
Ala Pro Gly Pro His Pro Ala Ala Pro Ser Ser Trp Gly Pro Arg Pro
85 90 95
Arg Arg Tyr Thr Val Leu Ser Val Gly Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly
100 105 110
Arg Leu Pro Leu Gln Pro Arg Val Gln Leu Asp Glu Arg Gly Arg Gln
115 120 125
Arg Gly Asp Phe Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Arg Arg Ala Asp Ala
130 135 140
Gly Glu Tyr Arg Ala Ala Val His Leu Arg Asp Arg Ala Leu Ser Cys
145 150 155 160
Arg Leu Arg Leu Arg Leu Gly Gln Ala Ser Met Thr Ala Ser Pro Pro
165 170 175
Gly Ser Leu Arg Ala Ser Asp Trp Val Ile Leu Asn Cys Ser Phe Ser
180 185 190
Arg Pro Asp Arg Pro Ala Ser Val His Trp Phe Arg Asn Arg Gly Gln
195 200 205
Gly Arg Val Pro Val Arg Glu Ser Pro His His His Leu Ala Glu Ser
210 215 220
Phe Leu Phe Leu Pro Gln Val Ser Pro Met Asp Ser Gly Pro Trp Gly
225 230 235 240
Cys Ile Leu Thr Tyr Arg Asp Gly Phe Asn Val Ser Ile Met Tyr Asn
245 250 255
Leu Thr Val Leu Gly Leu Glu Pro Pro Thr Pro Leu Thr Val Tyr Ala
260 265 270
Gly Ala Gly Ser Arg Val Gly Leu Pro Cys Arg Leu Pro Ala Gly Val
275 280 285
Gly Thr Arg Ser Phe Leu Thr Ala Lys Trp Thr Pro Pro Gly Gly Gly
290 295 300
Pro Asp Leu Leu Val Thr Gly Asp Asn Gly Asp Phe Thr Leu Arg Leu
305 310 315 320
Glu Asp Val Ser Gln Ala Gln Ala Gly Thr Tyr Thr Cys His Ile His
325 330 335
Leu Gln Glu Gln Gln Leu Asn Ala Thr Val Thr Leu Ala Ile Ile Thr
340 345 350
Val Thr Pro Lys Ser Phe Gly Ser Pro Gly Ser Leu Gly Lys Leu Leu
355 360 365
Cys Glu Val Thr Pro Val Ser Gly Gln Glu Arg Phe Val Trp Ser Ser
370 375 380
Leu Asp Thr Pro Ser Gln Arg Ser Phe Ser Gly Pro Trp Leu Glu Ala
385 390 395 400
Gln Glu Ala Gln Leu Leu Ser Gln Pro Trp Gln Cys Gln Leu Tyr Gln
405 410 415
Gly Glu Arg Leu Leu Gly Ala Ala Val Tyr Phe Thr Glu Leu Ser Ser
420 425 430
Pro Gly Ala Gln Arg Ser Gly Arg Ala Pro Gly Ala Leu Pro Ala Gly
435 440 445
His Leu Leu Leu Phe Leu Ile Leu Gly Val Leu Ser Leu Leu Leu Leu
450 455 460
Val Thr Gly Ala Phe Gly Phe His Leu Trp Arg Arg Gln Trp Arg Pro
465 470 475 480
Arg Arg Phe Ser Ala Leu Glu Gln Gly Ile His Pro Pro Gln Ala Gln
485 490 495
Ser Lys Ile Glu Glu Leu Glu Gln Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro
500 505 510
Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Gln Leu
515 520 525
<210> 2
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体; MAb STC1317成熟的重链V结构域
<400> 2
gaagtgcagg tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctatgcca tgtcttgggt tcgccagact 120
ccggcgaaga ggctggagtg ggtcgcaact attagtggtg gtggtagtta cacctactat 180
ccagacagtg taaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtac 240
ctgcaaatga gcagtctgag gtctgaggac acagccatgt attactgtgc aagggggaag 300
tatggtaact acgactatga tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 360
tca 363
<210> 3
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体; MAb STC1317成熟的重链V结构域
<400> 3
Glu Val Gln Val Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Ala Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Lys Tyr Gly Asn Tyr Asp Tyr Asp Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 4
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体; MAb STC1317轻链V结构域
<400> 4
gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacc 60
atctcataca gggccagcaa aagtgtcagt acatctggct atagttatat gcactggaac 120
caacagaaac cagtacagcc acccagactc ctcatctatc ttgtatccaa cctagaatct 180
ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240
cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc acattaggga gctttacacg 300
ttcggagggg ggaccaagct ggaaataaaa 330
<210> 5
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体; MAb STC1317轻链V结构域
<400> 5
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Val Gln Pro Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg
85 90 95
Glu Leu Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 6
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体; STC1807重链CDR1
<400> 6
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
1 5
<210> 7
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体; STC1807重链CDR2
<400> 7
Ser Gly Gly Gly Ser Tyr
1 5
<210> 8
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体; STC1807重链CDR3
<400> 8
Gly Lys Tyr Gly Asn Tyr Asp Tyr Asp Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 9
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体; STC1807重链CDR1
<400> 9
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser
1 5 10
<210> 10
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体; STC1807重链CDR2
<400> 10
Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr
1 5 10
<210> 11
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体; STC1807重链CDR1
<400> 11
Ser Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 12
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体; STC1807重链CDR2
<400> 12
Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 13
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体; STC1807重链CDR1
<400> 13
Ser Ser Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 14
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体; STC1807重链CDR2
<400> 14
Trp Val Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr
1 5 10
<210> 15
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体; STC1807重链CDR3
<400> 15
Ala Arg Gly Lys Tyr Gly Asn Tyr Asp Tyr Asp Met Asp
1 5 10
<210> 16
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体; STC1807轻链CDR1
<400> 16
Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His
1 5 10 15
<210> 17
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体; STC1807轻链CDR2
<400> 17
Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser
1 5
<210> 18
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体; STC1807轻链CDR3
<400> 18
Gln His Ile Arg Glu Leu Tyr Thr
1 5
<210> 19
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体; STC1807轻链CDR1
<400> 19
Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn
1 5 10
<210> 20
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体; STC1807轻链CDR2
<400> 20
Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu
1 5 10
<210> 21
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体; STC1807轻链CDR3
<400> 21
Gln His Ile Arg Glu Leu Tyr
1 5

Claims (38)

1.一种分离的单克隆抗体，其相对于未糖基化形式的LAG3，选择性结合糖基化的LAG3。
2.权利要求1所述的分离的抗体，其中抗体增加IFN-γ和/或IL-2的分泌或其中抗体增加T细胞增殖。
3.权利要求1所述的分离的抗体，其中抗体阻断LAG3与Gal-3、MHCII、LSECtin和CD3中的一种或多种的结合。
4.权利要求1或3所述的分离的抗体，其中抗体相对于未糖基化的LAG3选择性地结合在位置N188、N250、N256、N343或其任何组合处糖基化的LAG3。
5.权利要求1至4中任一项所述的分离的抗体，其中抗glycLAG3抗体对糖基化的LAG3的结合亲和力为0.1-10nM，包括下限值和上限值。
6.权利要求1至5中任一项所述的分离的抗体，其中抗体掩蔽LAG3在N188、N250、N256或N145中的一个或多个处的糖基化。
7.权利要求1至6中任一项所述的分离的抗体，其与MAb STC1317竞争或交叉竞争与糖基化的LAG3的特异性结合。
8.权利要求1至6中任一项所述的分离的抗体，其中VH结构域具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列并且VL具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
9.权利要求1至6中任一项所述的分离的抗体，其中VH结构域具有与SEQ ID NO:3的氨基酸序列至少90％、95％或98％相同的氨基酸序列。
10.权利要求1至6或9中任一项所述的分离的抗体，其中VL结构域具有与SEQ ID NO：5的氨基酸序列至少90％、95％或98％相同的氨基酸序列。
11.权利要求1至6中任一项所述的分离的抗体，其具有VH结构域，所述VH结构域包含具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的Chothia CDR H1、具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的CDR H2以及具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的CDR H3。
12.权利要求1至6中任一项所述的分离的抗体，其具有VH结构域，所述VH结构域包含具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的AbM CDR H1、具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列的CDR H2以及具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的CDR H3。
13.权利要求1至6中任一项所述的分离的抗体，其具有VH结构域，所述VH结构域包含具有SEQ ID NO：11的氨基酸序列的Kabat CDR H1、具有SEQ ID NO：12的氨基酸序列的CDR H2以及具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的CDR H3。
14.权利要求1至6中任一项所述的分离的抗体，其具有VH结构域，所述VH结构域包含具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的Contact CDR H1、具有SEQ ID NO：14的氨基酸序列的CDRH2以及具有SEQ ID NO：15的氨基酸序列的CDR H3。
15.权利要求1至6或11至14中任一项所述的分离的抗体，其具有VL结构域，所述VL结构包含具有SEQ ID NO：16的氨基酸序列的CDR L1、具有SEQ ID NO：17的氨基酸序列的CDR L2以及具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR L3。
16.权利要求1至6或11至14中任一项所述的分离的抗体，其具有VL结构域，所述VL结构包含具有SEQ ID NO：19的氨基酸序列的Contact CDR L1、具有SEQ ID NO：20的氨基酸序列的CDR L2以及具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR L3。
17.权利要求1至6中任一项所述的分离的抗体，其具有包含CDR H1、CDR H2和CDR H3的VH结构域，所述CDR H1、CDR H2和CDR H3具有在以下的1个、2个或3个CDR中具有1、2、3、4或5个氨基酸置换的氨基酸序列：分别具有SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR，或分别具有SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR，或分别具有SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR，或分别具有SEQID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO：15的氨基酸序列的CDR。
18.权利要求1至6或17中任一项所述的分离的抗体，其具有包含CDR L1、CDR L2和CDRL3的VL结构域，所述CDR L1、CDR L2和CDR L3具有在以下CDR中的1个、2个或3个中具有1、2、3、4或5个氨基酸置换的氨基酸序列：分别具有SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR，或分别具有SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO：21的氨基酸序列的CDR。
19.权利要求1至6或11至18中任一项所述的分离的抗体，其具有人框架区。
20.权利要求1至6或11至18中任一项所述的分离的抗体，其具有重链或轻链人框架区，所述重链或轻链人框架区具有1、2、3、4、5或6个氨基酸置换。
21.权利要求1至6或11至20中任一项所述的分离的抗体，其包含人恒定结构域。
22.权利要求1至6或11至21中任一项所述的分离的抗体，其中抗体是IgG、IgM、IgA或其抗原结合片段。
23.权利要求1至6或11至22中任一项所述的分离的抗体，其中抗体是Fab'、F(ab')2、F(ab')3、单价scFv、二价scFv或单域抗体。
24.权利要求1至6或11至23中任一项所述的分离的抗体，其中抗体是人抗体或人源化抗体。
25.权利要求1至24中任一项所述的分离的抗体，其中抗体与显像剂、化疗剂、毒素或放射性核素缀合。
26.一种组合物，其包含在药学上可接受的承载体中的权利要求1至25中任一项所述的分离的抗体。
27.一种治疗患有癌症的受试者的方法，包括向受试者施用在药学上可接受的组合物中的有效量的权利要求1至26中任一项所述的分离的抗体。
28.权利要求27所述的方法，其中癌症是乳腺癌、肺癌、头颈癌、前列腺癌、食管癌、气管癌、皮肤癌、脑癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、睾丸癌、结肠癌、直肠癌或皮肤癌。
29.权利要求27或28所述的方法，其中分离的抗体通过静脉内、真皮内、瘤内、肌内、腹膜内、皮下或局部施用。
30.权利要求27或29中任一项所述的方法，还包括向受试者施用至少第二抗癌疗法。
31.权利要求30所述的方法，其中第二抗癌疗法是手术疗法、化学疗法、放射疗法、冷冻疗法、激素疗法、免疫疗法或细胞因子疗法。
32.权利要求30所述的方法，其中所述第二抗癌疗法是抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体或抗LAG3抗体。
33.权利要求30所述的方法，其中第二抗癌疗法是德瓦鲁单抗、纳武单抗、帕姆单抗、阿维鲁单抗、阿特珠单抗、西米普利单抗或伊匹单抗。
34.权利要求30所述的方法，其中第二抗癌疗法是与未糖基化的LAG3相比，优先结合糖基化的LAG3的抗LAG3抗体。
35.权利要求34所述的方法，其中第二抗癌疗法是抗糖基化的LAG3单克隆抗体的人源化或嵌合形式，其中VH结构域具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列并且VL具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列。
36.一种评估LAG3糖基化的方法，包括使含有LAG3的样品与权利要求1至25中任一项所述的抗体接触。
37.权利要求36所述的方法，进一步定义为体外方法。
38.权利要求36所述的方法，其中样品是细胞样品。
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