CN114174317A - 鹅膏毒素抗体-药物缀合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本申请提供鹅膏毒素以及包含鹅膏毒素的抗体‑药物缀合物(ADC)，以及使用它们的组合物和方法。本文提供的组合物和方法可用于癌症治疗。它们还可用于使患者做好造血干细胞移植治疗的准备，并通过在移植操作前选择性消耗内源性造血干细胞来改善造血干细胞移植物的植入。本申请提供用于治疗各种造血疾病、代谢紊乱、癌症和自身免疫疾病以及预防移植物抗宿主病(GVHD)的方法和组合物。

Description

鹅膏毒素抗体-药物缀合物及其用途
发明领域
本发明涉及鹅膏毒素、包含鹅膏毒素的抗体-药物缀合物(ADC)、包含这样的ADC的组合物及其使用方法。
发明背景
单克隆抗体(mAb)可与治疗剂缀合以形成抗体药物缀合物(ADC)。与未缀合的抗体相比，ADC可以表现出增加的功效。抗体与药物的连接可以是直接的，或者可以是经由连接基间接的。成功的治疗性ADC的一个重要方面是ADC不仅有效而且耐受性良好。细胞毒素通常会影响功效和耐受性。
已提议ADC作为用于治疗癌症的治疗剂。使用ADC局部递送细胞毒性剂或细胞生长抑制剂(即在癌症治疗中杀死或抑制肿瘤细胞的药物)理论上允许将药物部分靶向递送至肿瘤，并在其中进行细胞内蓄积，其中这些未偶联药物的全身施用可能导致不可接受的毒性水平，对正常细胞也是如此。
ADC也被提议作为用于为患者进行移植和干细胞治疗做好准备的治疗方案。通过用细胞特异性ADC对患者进行调理，可以选择性地消耗干细胞或免疫细胞，同时使患者剩余的免疫系统大体完整。例如，Palchaudhuri等人(2016)Nat.Biotechnol.34，738-745描述了单剂量抗CD45 ADC(其中抗CD45抗体与皂草素缀合)的用途，以及它能够被植入供体细胞并在镰状细胞贫血模型中进行治疗的能力。与辐射不同，据报道CD45-SAPADC避免了中性粒细胞减少症和贫血，并以最小的总体毒性快速恢复T和B细胞。仍然需要可用于非遗传毒性靶向ADC调理的毒素，其中毒素对靶细胞有效，同时使对患者的副作用最小化。
发明概述
本发明提供可用于抗体药物缀合物(ADC)的鹅膏毒素，例如，用于将鹅膏毒素递送至靶细胞。本发明还提供抗体的特定修饰，其可用于抗体药物缀合物以将鹅膏毒素递送至靶细胞。本发明还涉及所述鹅膏毒素和抗体的组合，其具有增加的功效、增强的体内耐受性，并因此具有有利的治疗窗。
附图简要说明
图1描绘了式IV(图1A)、VI(图1B)和IIa(图1C)的结构。图1A至1C中的“Ab”代表抗体。图1A、1B和1C分别代表实施例中提及的缀合物A、B和C。缀合物A、B和C也称为ADC A、ADCB和ADCC。
图2图示描绘了在培养基(A)或50％人血清(B)中预孵育ADC下，在ADC存在下使用Kasumi-1细胞评估缀合物的血清稳定性的体外细胞毒性测定的结果。
图3图示描绘了为了评估可裂解和不可裂解的缀合物之间的细胞毒性的动力学差异，在ADC存在下使用Kasumi-1细胞(在与滴定的ADC样品一起孵育时迭代)进行的体外细胞毒性测定的结果。
图4图示描绘了使用Kasumi-1细胞(4A)和CD34+细胞(4B)进行的两种体外细胞杀伤测定的结果。所测试的ADC是抗CD117 ADCC。
图5图示描绘了抗CD117 ADCC有效消耗人源化NSG小鼠的骨髓中的人CD34+的能力。
图6是反映了用所示剂量的缀合物或对照处理的植入Kasumi-1细胞的人源化NSG小鼠的存活的Kaplan Meier图。
图7图示描绘了如雄性食蟹猴中所评估的缀合物C的功效。2.0mg/kg剂量(LALA)30.2867批次问题可能导致HSC敏感性降低。
图8图示描绘了含有缀合物A或缀合物C的ADC在雄性食蟹猴中的耐受性。
图9图示描绘了向雄性食蟹猴给药缀合物A和缀合物C的药物代谢动力学分析。
图10图示描绘了抗CD2和CD5ADCC能够消耗T细胞。
图11图示描绘了当抗CD2ADCA和C在第5天饱和时，一些细胞仍表达CD5。
图12A和12B图示描绘了显示体外细胞杀伤测定中的抗CD45 ADCA或C(图14A)或抗CD45 ADC A或B(图14B)的结果。
图13图示描绘了显示在体外细胞杀伤测定中的抗CD45 ADC A或C的结果。
图14图示描绘了抗CD45 ADC A或C在体内细胞消耗实验中的结果。
图15图示描绘了以许多剂量的量向小鼠给药抗CD45 ADC A或C的结果。示出了外周淋巴细胞、HSC和淋巴细胞的水平。所有ADC均以1mg/kg施用。
图16图示描绘了表明在T细胞杀伤测定中的抗CD137 ADC A或C的结果。
图17图示描绘了抗CD137 ADC A或C在48小时内的细胞系血清稳定性。
图18分别描绘了鹅膏蕈碱-连接基构建体HDP30.2867、30.0880、30.2371和30.1699的结构。
图19分别描绘了鹅膏蕈碱-连接基构建体HDP30.2115、30.2060和30.2347的结构。
图20图示描绘了在96h-BrdU测定中ADC化合物T-D265C-30.2867和T-D265C-30.0880分别对(A)SKBR-3、(B)NCI-N87、(C)BT474和(D)JIMT-1细胞系的体外细胞毒活性。
图21图示描绘了ADC化合物T-D265C-30.2867和T-D265C-30.0880分别在(A)人血浆、(B)小鼠血浆、(C)食蟹猴血浆和(D)PBS(对照)中分别孵育0、4和10天后的稳定性的SDS-PAGE/蛋白质印迹分析的结果。
图22图示描绘了ADC化合物T-D265C-30.2867分别在(A)人血浆、(B)小鼠血浆、(C)食蟹猴血浆和(D)PBS(对照)中分别孵育0、4和10天后对SBR-3细胞的体外细胞毒活性。
图23图示描绘了ADC化合物T-D265C-30.2867分别在(A)人血浆、(B)小鼠血浆、(C)食蟹猴血浆和(D)PBS(对照)中分别孵育0、4和10天后对NCI-N87细胞的体外细胞毒活性。
图24图示描绘了ADC化合物T-D265C-30.2867分别在(A)人血浆、(B)小鼠血浆、(C)食蟹猴血浆和(D)PBS(对照)中分别孵育0、4和10天后对JIMT-1细胞的体外细胞毒活性。
图25图示描绘了使用ADC化合物T-D265C-30.2867、T-D265C-30.0880和T-D265C-30.1699进行体内JIMT-1细胞异种移植肿瘤小鼠模型中抗Her2-ADC的细胞毒性功效分析的结果。
图26图示描绘了使用ADC化合物T-D265C-30.2867、T-D265C-30.0880和T-D265C-30.1699进行体内NCI-N87细胞异种移植肿瘤小鼠模型中抗Her2-ADC的细胞毒性功效分析的结果。
图27图示描绘了在96h-BrdU测定中ADC化合物h3/F11-D265C-Var16-30.2867和h3/F11-D265C-Var16-30.0880分别对(A)LNCap、(B)22RV1和(C)PC3细胞系的体外细胞毒活性。
图28图示描绘了使用ADC化合物h3/F11-D265C-Var16-30.2867、h3/F11-D265C-Var16-30.0880和h3/F11-D265C-Var16-30.2060进行体内LNCap细胞异种移植肿瘤小鼠模型中抗PSMA-ADC的细胞毒性功效分析的结果。
图29图示描绘了使用1mg/kg和20mg/kg之间的不同剂量的抗地高辛ADC化合物DIG-D265C-30.2867在猴中的耐受性研究的结果。示出了LDH、AST、ALT参数的评估结果。
图30图示描绘了使用DIG-D265C-30.2867在猴中的耐受性研究的结果。示出了血清中ADC的药物代谢动力学数据。
图31图示描绘了使用DIG-D265C-30.2867在猴中的耐受性研究的结果。示出了血清中鹅膏毒素的药物代谢动力学数据。
图32图示描绘了包含缀合至结构不同的鹅膏蕈碱衍生物的具有D265C突变(T-D265C)的抗Her2抗体的ADC化合物对JIMT-1细胞的体外细胞毒活性(A、B)。
图33图示描绘了包含缀合至结构不同的鹅膏蕈碱衍生物的具有D265C突变(T-D265C)的抗Her2抗体的ADC化合物对NCI-N87细胞的体外细胞毒活性(A、B)。
图34图示描绘了包含缀合至结构不同的鹅膏蕈碱衍生物的具有D265C突变(T-D265C)的抗Her2抗体的ADC化合物对SKBR-3细胞的体外细胞毒活性(A、B)。
图35图示描绘了包含缀合至结构不同的鹅膏蕈碱衍生物的具有D265C突变(h3/F11-D265C-Var16)的抗PSMA抗体的ADC化合物对LNCap细胞的体外细胞毒活性(A、B)。
图36图示描绘了包含缀合至结构不同的鹅膏蕈碱衍生物的具有D265C突变(h3/F11-D265C-Var16)的抗PSMA抗体的ADC化合物对22RV1细胞的体外细胞毒活性(A、B)。
图37图示描绘了体内LNCap细胞异种移植肿瘤小鼠模型中包含结构不同的鹅膏蕈碱衍生物的多种抗PSMA-ADC的细胞毒性功效分析的结果。示出了最大耐受剂量(MTD)1/2和1/4下所有组的平均值+/-SEM。
图38图示描绘了体内LNCap细胞异种移植肿瘤小鼠模型中包含结构不同的鹅膏蕈碱衍生物的多种抗PSMA-ADC的细胞毒性功效分析的结果。示出了最大耐受剂量(MTD)1/2下所有组的平均值+/-SEM。
图39图示描绘了体内LNCap细胞异种移植肿瘤小鼠模型中包含结构不同的鹅膏蕈碱衍生物的多种抗PSMA-ADC的细胞毒性功效分析的结果。示出了最大耐受剂量(MTD)1/4下所有组的平均值+/-SEM。
图40图示描绘了体内LNCap细胞异种移植肿瘤小鼠模型中包含结构不同的鹅膏蕈碱衍生物的多种抗PSMA-ADC的细胞毒性功效分析的结果。示出了最大耐受剂量(MTD)1/2和1/4下在鹅膏毒素的氨基酸1处具有连接基连接的ADC的平均值+/-SEM。
图41图示描绘了体内LNCap细胞异种移植肿瘤小鼠模型中包含结构不同的鹅膏蕈碱衍生物的多种抗PSMA-ADC的细胞毒性功效分析的结果。示出了最大耐受剂量(MTD)1/2和1/4下在鹅膏毒素的氨基酸4处具有连接基连接的ADC的平均值+/-SEM。
图42图示描绘了体内LNCap细胞异种移植肿瘤小鼠模型中包含结构不同的鹅膏蕈碱衍生物的多种抗PSMA-ADC的细胞毒性功效分析的结果。示出了最大耐受剂量(MTD)1/4下具有可裂解连接基的ADC的平均值+/-SEM。
图43图示描绘了在CDX小鼠模型中，分别包含三重L234A/L235A/D265C突变和鹅膏毒素-连接基构建体HDP30.2060和HDP30.2867(分别为T-LALA-D265C-30.2060、T-LALA-D265C-30.2867)的抗Her2ADC对Her2-阳性NCI-N87细胞的细胞毒性功效分析的结果。
图44图示描绘了在CDX小鼠模型中，分别包含三重L234A/L235A/D265C突变和鹅膏毒素-连接基构建体HDP30.2060和HDP30.2867(分别为h3/F11-LALA-D265C-Var-30.2060、h3/F11-LALA-D265C-Var-30.2867)的抗PSMA ADC对PSMA阳性LNCap细胞的细胞毒性功效分析的结果。
图45图示描绘了用于包含携带L234A/L235A突变和/或D265C突变或者对照突变的抗体的Her2特异性ADC对Her2阳性SKBR-3细胞的体外细胞毒性潜力的评估的96小时BrdU测定的结果(A、B、C、D)。
图46图示描绘了用于包含携带L234A/L235A突变和/或D265C突变或者对照突变的抗体的Her2特异性ADC对Her2阴性THP-1细胞的体外细胞毒性潜力的评估的96小时CTG测定的结果(A、B、C、D)。
图47图示描绘了用于包含携带L234A/L235A突变和/或D265C突变或者对照突变的抗体的Her2特异性ADC对Her2阴性THP-1细胞的体外细胞毒性潜力的评估的120小时CTG测定的结果(A、B、C、D)。
发明详述
为了公开内容的清楚而不是以限制的方式，将本发明的具体描述分为随后的小节。
本发明涉及鹅膏毒素或其衍生物或类似物，其包含式(An)或式(Bn)的结构
Figure BDA0003429348370000031
Figure BDA0003429348370000041
其中n是2、3、4、5、6、7、8或9。
在一个实施方案中，本发明涉及鹅膏毒素或其衍生物或类似物，其包含式(A)的结构
Figure BDA0003429348370000042
或其对映异构体或非对映异构体。
在另一个实施方案中，本发明涉及鹅膏毒素或其衍生物或类似物，其包含式(B)的结构
Figure BDA0003429348370000043
或其对映异构体或非对映异构体。
所述鹅膏毒素或其衍生物或类似物可用于制备抗体-药物缀合物(ADC)。
发明人已表明根据本发明的ADC具有特别高的血浆稳定性和耐受性，并且因此具有改善的治疗窗。
本发明还涉及抗体-药物缀合物(ADC)，其包含经由连接基缀合至鹅膏毒素的抗体或其抗原结合片段，所述ADC具有式(I)的结构：
Figure BDA0003429348370000051
或其立体异构体；
其中：
Q是S或亚砜基团；
L是不可裂解连接基；
Z是通过L上存在的反应性取代基与抗体或其抗原结合片段中存在的反应性取代基之间的偶联反应形成的化学部分；并且
Ab是抗体或其抗原结合片段。
所述ADC可具有式(Ia)的结构：
Figure BDA0003429348370000052
所述ADC也可具有式(Ib)的结构：
Figure BDA0003429348370000053
在所述ADC中，L可包含以下中的一种或多种：键、-(C＝O)-、-C(O)NH-基团、-OC(O)NH-基团、C1-C6亚烷基、C1-C6亚杂烷基、C2-C6亚烯基、C2-C6亚杂烯基、C2-C6亚炔基、C2-C6亚杂炔基、C3-C6亚环烷基、亚杂环烷基、亚芳基、亚杂芳基、-(CH2CH2O)p-基团(其中p为1-6的整数)，或增溶基团；
其中每个C1-C6亚烷基、C1-C6亚杂烷基、C2-C6亚烯基、C2-C6亚杂烯基、C2-C6亚炔基、C2-C6亚杂炔基、C3-C6亚环烷基、亚杂环烷基、亚芳基或亚杂芳基可任选地被1至5个针对每种情况独立地选自以下的取代基所取代：烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、烷芳基、烷基杂芳基、氨基、铵、酰基、酰氧基、酰氨基、氨基羰基、烷氧羰基、脲基、氨基甲酸酯、芳基、杂芳基、亚磺酰基、磺酰基、羟基、烷氧基、硫烷基(sulfanyl)、卤素、羧基、三卤代甲基、氰基、羟基、巯基和硝基；
或者每个C1-C6亚烷基、C1-C6亚杂烷基、C2-C6亚烯基、C2-C6亚杂烯基、C2-C6亚炔基、C2-C6亚杂炔基、C3-C6亚环烷基、亚杂环烷基、亚芳基或亚杂芳基可任选地被一个或多个选自O、S和N的杂原子间断。
所述增溶基团可具有式-Oa-C(O)NH-SO2-NR1-，其中：
a是0或1；并且
R1选自氢、C1-C24烷基、C3-C24环烷基、C2-C24(杂)芳基、C3-C24烷基(杂)芳基和C3-C24(杂)芳基烷基，其中每一个可任选地被一个或多个选自O、S和NR3的杂原子取代或任选地被其间断，其中R3独立地选自氢和C1-C4烷基。
在所述ADC中，L可以包含-(CH2)n-单元，其中n是2-6的整数。优选地，L是-(CH2)n-，其中n是6。
在上述ADC中，Ab、Z和L共同构成的Ab-Z-L可由下式表示：
Figure BDA0003429348370000061
其中S是所述抗体或其抗原结合片段中存在的半胱氨酸残基的硫原子。
在一个实施方案中，本发明涉及抗体-药物缀合物(ADC)，其包含经由连接基缀合至鹅膏毒素的抗体或其抗原结合片段，所述ADC具有式(I)的结构：
Figure BDA0003429348370000062
或其立体异构体；
其中：
Q是S或亚砜基团；
L是可裂解连接基；
Z是通过L上存在的反应性取代基与抗体或其抗原结合片段中存在的反应性取代基之间的偶联反应形成的化学部分；并且
Ab是抗体或其抗原结合片段。
所述ADC可具有式(Ia)的结构：
Figure BDA0003429348370000071
所述ADC可具有式(Ib)的结构：
Figure BDA0003429348370000072
在所述ADC中，L包含以下中的一种或多种：肼、二硫化物、硫醚、氨基酸、由至多10个氨基酸组成的肽、对氨基苄基(PAB)基团、杂环自降解(self-immolative)基团、C1-C6烷基、C1-C6杂烷基、C2-C6烯基、C2-C6杂烯基、C2-C6炔基、C2-C6杂炔基、C3-C6环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、-(C＝O)-基团、-C(O)NH-基团、-OC(O)NH-基团、-(CH2CH2O)p-基团(其中p是1-6的整数)，或增溶基团；
其中每个C1-C6烷基、C1-C6杂烷基、C2-C6烯基、C2-C6杂烯基、C2-C6炔基、C2-C6杂炔基、C3-C6环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基可任选地被1至5个针对每种情况独立地选自以下的取代基所取代：烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、烷芳基、烷基杂芳基、氨基、铵、酰基、酰氧基、酰氨基、氨基羰基、烷氧羰基、脲基、氨基甲酸酯、芳基、杂芳基、亚磺酰基、磺酰基、羟基、烷氧基、硫烷基、卤素、羧基、三卤代甲基、氰基、羟基、巯基和硝基；
或者每个C1-C6烷基、C1-C6杂烷基、C2-C6烯基、C2-C6杂烯基、C2-C6炔基、C2-C6杂炔基、C3-C6环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基可任选地被一个或多个选自O、S和N的杂原子间断。
所述增溶基团可具有式-Oa-C(O)NH-SO2-NR1-，其中：
a是0或1；并且
R1选自氢、C1-C24烷基、C3-C24环烷基、C2-C24(杂)芳基、C3-C24烷基(杂)芳基和C3-C24(杂)芳基烷基，其中每一个可任选地被一个或多个选自O、S和NR3的杂原子取代或任选地被其间断，其中R3独立地选自氢和C1-C4烷基。
根据本发明的一个实施方案，L包含选自Phe-Lys、Val-Lys、Phe-Ala、Phe-Cit、Val-Ala、Val-Cit和Val-Arg的肽。L可进一步包含PAB基团。
在一个实施方案中，L由下式表示：
Figure BDA0003429348370000081
根据优选的实施方案中，本发明涉及ADC，其包含缀合至鹅膏毒素的抗体，所述ADC具有式(II)的结构：
Figure BDA0003429348370000082
或其立体异构体。
所述ADC可具有式(IIa)的结构：
Figure BDA0003429348370000083
所述ADC可具有式(IIb)的结构：
Figure BDA0003429348370000091
根据本发明的优选实施方案，所述抗体或其抗原结合片段与在癌细胞或人类干细胞，特别是造血干细胞(HSC)，或T细胞的细胞表面上表达的抗原特异性结合。
根据本发明的另一个优选的实施方案，所述抗体或其抗原结合片段与人Her2、PSMA、CD37或CD123特异性结合。
根据本发明的另一个优选的实施方案，所述抗体或其抗原结合片段包含Fc区，该Fc区包含至少一个选自D265C、D265A、A118C、H435A、L234A或L235A (根据EU索引)的突变。
根据本发明的另一个优选的实施方案，所述抗体或其抗原结合片段与PSMA特异性结合并且包含根据SEQ ID NO.378的CDRH1、根据SEQ ID NO.379的CDRH2、根据SEQ IDNO.380的CDRH3、根据SEQ ID NO.381的CDRL1、根据SEQ ID NO.382的CDRL2，和根据SEQ IDNO.383的CDRL3。
根据本发明的另一个优选的实施方案，所述抗体或其抗原结合片段包含根据SEQID NO.375的重链可变区和根据SEQ ID NO.377的轻链可变区。
根据本发明的另一个优选的实施方案，所述抗体包含根据SEQ ID NO.371、SEQ IDNO.372、SEQ ID NO.373或SEQ ID NO.374的重链，和根据SEQ ID NO.376的轻链，或其抗原结合片段。
本发明还涉及抗体-药物缀合物(ADC)，其包含经由连接基缀合至鹅膏毒素或其衍生物或类似物的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含Fc区，该Fc区包含至少两个由L234A和L235A(根据EU索引)组成的突变。
根据特别优选的实施方案，所述Fc区进一步包含由D265C(根据EU索引)组成的突变。
根据本发明的优选实施方案，所述抗体或其抗原结合片段与在癌细胞，优选人癌细胞的细胞表面上表达的抗原特异性结合。
根据本发明的另一优选实施方案，所述抗体或其抗原结合片段与前列腺特异性膜抗原(PSMA)，优选人PSMA，或者Her2抗原、CD37，或CD123特异性结合。
优选的实施方案涉及抗体-药物缀合物(ADC)，其中所述抗体或其抗原结合片段与PSMA特异性结合并且包含根据SEQ ID NO.378的CDRH1、根据SEQ ID NO.379的CDRH2、根据SEQ ID NO.380的CDRH3、根据SEQ ID NO.381的CDRL1、根据SEQ ID NO.382的CDRL2，和根据SEQ ID NO.383的CDRL3。
根据本发明的优选的实施方案，与PSMA特异性结合的所述抗体或其抗原结合片段包含根据SEQ ID NO.375的重链可变区和根据SEQ ID NO.377的轻链可变区。
根据本发明的另一个优选的实施方案，所述抗体包含根据SEQ ID NO.372、SEQ IDNO.373或SEQ ID NO.374的重链，和根据SEQ ID NO.376的轻链，或其抗原结合片段。
在进一步优选的实施方案中，所述抗体-药物缀合物(ADC)包含缀合至选自HDP30.2060、HDP30.2115、HDP30.2347、HDP30.1699、HDP30.2371、HDP30.0880和HDP30.2867的任意化合物的抗体或其抗原结合片段。
本发明还涉及抗体-药物缀合物(ADC)，其包含抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段与人PSMA特异性结合，并且包含具有根据SEQ ID NO.374的氨基酸序列的重链和具有根据SEQ ID NO.376的氨基酸序列的轻链，并且其缀合至化合物HDP30.2060。最优选地，在所述ADC中，化合物HDP30.2060直接连接到所述抗体的半胱氨酸D265C的硫原子(EU编号)。
本发明还涉及抗体-药物缀合物(ADC)，其包含抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段与人PSMA特异性结合，并且包含具有根据SEQ ID NO.374的氨基酸序列的重链和具有根据SEQ ID NO.376的氨基酸序列的轻链，并且其缀合至化合物HDP30.2115。最优选地，在所述ADC中，化合物HDP30.2115直接连接到所述抗体的半胱氨酸D265C的硫原子。
本发明还涉及抗体-药物缀合物(ADC)，其包含抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段与人PSMA特异性结合，并且包含具有根据SEQ ID NO.374的氨基酸序列的重链和具有根据SEQ ID NO.376的氨基酸序列的轻链，并且其缀合至化合物HDP30.2347。最优选地，在所述ADC中，化合物HDP30.2347直接连接到所述抗体的半胱氨酸D265C的硫原子。
本发明还涉及抗体-药物缀合物(ADC)，其包含抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段与人PSMA特异性结合，并且包含具有根据SEQ ID NO.374的氨基酸序列的重链和具有根据SEQ ID NO.376的氨基酸序列的轻链，并且其缀合至化合物HDP30.1699。最优选地，在所述ADC中，化合物HDP30.1699直接连接到所述抗体的半胱氨酸D265C的硫原子。
本发明还涉及抗体-药物缀合物(ADC)，其包含抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段与人PSMA特异性结合，并且包含具有根据SEQ ID NO.374的氨基酸序列的重链和具有根据SEQ ID NO.376的氨基酸序列的轻链，并且其缀合至化合物HDP30.2371。最优选地，在所述ADC中，化合物HDP30.2371直接连接到所述抗体的半胱氨酸D265C的硫原子。
本发明还涉及抗体-药物缀合物(ADC)，其包含抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段与人PSMA特异性结合，并且包含具有根据SEQ ID NO.374的氨基酸序列的重链和具有根据SEQ ID NO.376的氨基酸序列的轻链，并且其缀合至化合物HDP30.0880。最优选地，在所述ADC中，化合物HDP30.0880直接连接到所述抗体的半胱氨酸D265C的硫原子。
本发明还涉及抗体-药物缀合物(ADC)，其包含抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段与人PSMA特异性结合，并且包含具有根据SEQ ID NO.374的氨基酸序列的重链和具有根据SEQ ID NO.376的氨基酸序列的轻链，并且其缀合至化合物HDP30.2867。最优选地，在所述ADC中，化合物HDP30.2867直接连接到所述抗体的半胱氨酸D265C的硫原子。
在根据本发明的所述抗体-药物缀合物(ADC)中，药物抗体比(DAR)为约1、2、3或4，优选地DAR为2。
本发明的另一方面涉及所述ADC，其用于治疗患者的癌症，特别地其中所述癌症选自乳腺癌、胰腺癌、胆管癌、结直肠癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、肾癌、恶性黑色素瘤、血液癌、白血病和恶性淋巴瘤。
本发明还涉及所述ADC中任一种用于治疗患者的癌症的用途，特别地其中所述癌症选自乳腺癌、胰腺癌、胆管癌、结直肠癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、肾癌、恶性黑色素瘤、血液癌、白血病和恶性淋巴瘤。
根据本发明的另一优选的实施方案，所述抗体-药物缀合物(ADC)包含抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段与在造血干细胞(HSC)，优选人HSC的细胞表面上表达的抗原特异性结合。
本发明的另一个实施方案涉及消耗人个体中细胞群的方法，所述方法包括向所述个体给药所述ADC，其中所述ADC包含抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段与所述细胞群中的细胞所表达的细胞外抗原特异性结合。
本发明的另一个实施方案涉及调理人个体以进行细胞移植的方法，所述方法包括向人个体给药所述ADC，使得人个体中的内源性干细胞或内源性免疫细胞被消耗，其中所述ADC与内源性干细胞或内源性免疫细胞所表达的细胞外抗原特异性结合。
本发明的另一个实施方案涉及所述方法，其进一步包括向人个体给药同种异体干细胞或同种异体免疫细胞。
本发明的另一个实施方案涉及所述方法，其中所述ADC与在免疫细胞上表达的细胞外抗原特异性结合，并且其中个体患有移植物抗宿主病(GVHD)或者有发展移植物抗宿主病的风险。
本发明还涉及药物组合物，其包含所述ADC中的任一种或其组合和至少药学上可接受的载体。
定义
除非另有说明，否则本文中使用的以下术语和短语旨在具有以下含义。
如本文所用，术语“酰基”是指-C(＝O)R，其中R是氢(“醛”)、C1-C12烷基、C2-C12烯基、C2-C12炔基、C3-C7碳环基、C6-C20芳基、5-10元杂芳基或5-10元杂环基(如本文所定义)。非限制性实例包括甲酰基、乙酰基、丙酰基、苯甲酰基和丙烯酰基。
如本文所用，术语“G1-C12烷基”是指具有1至12个碳原子的直链或支链饱和烃。代表性的C1-C12烷基包括但不限于-甲基、-乙基、-正丙基、-正丁基、-正戊基和-正己基；而支链C1-C12烷基包括但不限于-异丙基、-仲丁基、-异丁基、-叔丁基、-异戊基和2-甲基丁基。C1-C12烷基可以是未取代的或取代的。
如本文所用，术语“烯基”是指含有具有至少一个不饱和位点(即碳-碳sp2双键)的伯碳、仲碳或叔碳原子的C2-C12烃。实例包括但不限于：乙烯或乙烯基、-烯丙基、-1-丁烯基、-2-丁烯基、-异丁烯基、-1-戊烯基、-2-戊烯基、-3-甲基-1-丁烯基、-2-甲基-2-丁烯基、-2，3-二甲基-2-丁烯基等。烯基可以是未取代的或取代的。
如本文所用，术语“炔基”是指含有具有至少一个不饱和位点(即碳-碳sp三键)的伯碳、仲碳或叔碳原子的C2-C12烃。实例包括但不限于乙炔基和炔丙基。炔基可以是未取代的或取代的。
如本文所用，“芳基”是指C6-C20碳环芳族基团。芳基的实例包括但不限于苯基、萘基和蒽基。芳基可以是未取代的或取代的。
如本文所用，“芳基烷基”是指其中与碳原子(通常为末端或sp3碳原子)键连的氢原子之一被芳基替代的无环烷基。代表性的芳基烷基包括但不限于苄基、2-苯基乙-1-基、2-苯基乙烯-1-基、萘基甲基、2-萘基乙-1-基、2-萘基乙烯-1-基、萘基苄基、2-萘并苯基乙-1-基等。所述芳基烷基包含6至20个碳原子，例如芳基烷基的烷基部分(包括链烷基、烯基或炔基)为1至6个碳原子，并且芳基部分为5至14个碳原子。烷芳基可以是未取代的或取代的。
如本文所用，“环烷基”是指饱和碳环基团，其可以为单环或双环。环烷基包括具有作为单环的3至7个碳原子或作为双环的7至12个碳原子的环。单环环烷基的实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。环烷基可以是未取代的或取代的。
如本文所用，“环烯基”是指不饱和碳环基团，其可以为单环或双环。环烯基包括具有作为单环的3至6个碳原子或作为双环的7至12个碳原子的环。单环环烯基的实例包括1-环戊-1-烯基、1-环戊-2-烯基、1-环戊-3-烯基、1-环己-1-烯基、1-环己-2-烯基和1-环己-3-烯基。环烯基可以是未取代的或取代的。
如本文所用，“杂芳烷基”是指其中与碳原子(通常为末端或sp3碳原子)键连的氢原子之一被杂芳基取代的无环烷基。代表性的杂芳基烷基包括但不限于2-苯并咪唑基甲基、2-呋喃基乙基等。杂芳基烷基包含6至20个碳原子，例如杂芳基烷基的烷基部分(包括链烷基、烯基或炔基)为1至6个碳原子，并且杂芳基部分为5至14个碳原子和1至3个选自N、O、P和S的杂原子。杂芳基烷基的杂芳基部分可以是具有3至7个环成员(2至6个碳原子)的单环或具有7至10个环成员(4至9个碳原子和1至3个选自N、O、P和S的杂原子)的双环，例如：双环[4，5]、[5，5]、[5，6]或[6，6]系统。
如本文所用，“杂芳基”和“杂环烷基”分别是指芳族或非芳族环系统，其中一个或多个环原子是杂原子，例如氮、氧和硫。杂芳基或杂环烷基包含2至20个碳原子和1至3个选自N、O、P和S的杂原子。杂芳基或杂环烷基可以是具有3至7个环成员(2至6个碳原子和1至3个选自N、O、P和S的杂原子)的单环，或具有7至10个环成员(4至9个碳原子和1至3个选自N、O、P和S的杂原子)的双环，例如：双环[4，5]、[5，5]、[5，6]或[6，6]系统。杂芳基和杂环烷基可以是未取代的或取代的。
杂芳基和杂环烷基描述于Paquette，Leo A.；″Principles of ModernHeterocyclic Chemistry″(W.A.Benjamin，NewYork，1968)，特别是第1、3、4、6、7和9章；″The Chemistry ofHeterocyclic Compounds，A series ofMonographs″(John Wiley&Sons，New York，1950至今)，特别是第13、14、16、19和28卷；和J.Am.Chem.Soc.(1960)82：5566中。
杂芳基的实例包括例如但不限于吡啶基、噻唑基、四氢噻吩基、嘧啶基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、四唑基、苯并呋喃基、硫杂萘基(thianaphthalenyl)、吲哚基、吲哚啉基(indolenyl)、喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、异噁唑基、吡嗪基、哒嗪基、吲嗪基、异吲哚基、3H-吲哚基、1H-吲唑基、嘌呤基、4H-喹嗪基、酞嗪基、萘啶基、喹喔啉基、喹唑啉基、噌啉基、蝶啶基、4aH-咔唑基、咔唑基、菲啶基、吖啶基、嘧啶基、菲罗啉基、吩嗪基、吩噻嗪基、呋咱基、吩噁嗪基、异色满基、色满基、咪唑烷基、咪唑啉基、吡唑烷基、吡唑啉基、苯并三唑基、苯并异噁唑基和靛红酰基(isatinoyl)。
杂环烷基的实例包括例如但不限于二氢吡啶基、四氢吡啶基(哌啶基)、四氢噻吩基、哌啶基、4-哌啶酮基、吡咯烷基、2-吡咯烷酮基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、双-四氢吡喃基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、十氢喹啉基、八氢异喹啉基、哌嗪基、奎宁环基和吗啉基。
作为示例而非限制，碳键连的杂芳基和杂环烷基在吡啶的2、3、4、5或6位，哒嗪的3、4、5或6位，嘧啶的2、4、5或6位，吡嗪的2、3、5或6位，呋喃、四氢呋喃、硫代呋喃、噻吩、吡咯或四氢吡咯的2、3、4或5位，噁唑、咪唑或噻唑的2、4或5位，异噁唑、吡唑或异噻唑的3、4或5位，氮丙啶的2或3位，氮杂环丁烷的2、3或4位，喹啉的2、3、4、5、6、7或8位，或异喹啉的1、3、4、5、6、7或8位处键连。更代表性地，碳键连的杂环包括2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、5-吡啶基、6-吡啶基、3-哒嗪基、4-哒嗪基、5-哒嗪基、6-哒嗪基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-嘧啶基、6-嘧啶基、2-吡嗪基、3-吡嗪基、5-吡嗪基、6-吡嗪基、2-噻唑基、4-噻唑基或5-噻唑基。
作为示例而非限制，氮键连的杂芳基和杂环烷基在氮丙啶、氮杂环丁烷、吡咯、吡咯烷、2-吡咯啉、3-吡咯啉、咪唑、咪唑烷、2-咪唑啉、3-咪唑啉、吡唑、吡唑啉、2-吡唑啉、3-吡唑啉、哌啶、哌嗪、吲哚、二氢吲哚、1H-吲唑的1位，异吲哚或异吲哚啉的2位，吗啉的4位，和咔唑或β-咔啉的9位处键连。更代表性地，氮键连的杂环包括1-氮丙啶基、1-氮杂环丁二烯基(azetedyl)、1-吡咯基、1-咪唑基、1-吡唑基和1-哌啶基。
如本文所用和应用于上述烷基、烯基、炔基、芳基、芳基烷基、环烷基、杂芳基、杂环基等中的任一个的“取代”是指一个或多个氢原子各自独立地被取代基取代。除非另外受各个取代基的定义的限制，否则前述化学部分，诸如“烷基”、“亚烷基”、“杂烷基”、“亚杂烷基”、“烯基”、“亚烯基”、“杂烯基”、“亚杂烯基”、“炔基”、“亚炔基”、“杂炔基”、“亚杂炔基”、“环烷基”、“亚环烷基”、“杂环烷基”、亚杂环烷基”、“芳基”、“亚芳基”、“杂芳基”和“亚杂芳基”基团可任选地被取代。代表性的取代基包括但不限于-X、-R、-OH、-OR、-SH、-SR、NH2、-NHR、-N(R)2、-N+(R)3、-CX3、-CN、-OCN、-SCN、-NCO、-NCS、-NO、-NO2、-N3、-NC(＝O)H、-NC(＝O)R、-C(＝O)H、-C(＝O)R、-C(＝O)NH2、-C(＝O)N(R)2、-SO3-、-SO3H、-S(＝O)2R、-OS(＝O)2OR、-S(＝O)2NH2、-S(＝O)2N(R)2、-S(＝O)R、-OP(＝O)(OH)2、-OP(＝O)(OR)2、-P(＝O)(OR)2、-PO3、-PO3H2、-C(＝O)X、-C(＝S)R、-CO2H、-CO2R、-CO2-、-C(＝S)OR、-C(＝O)SR、-C(＝S)SR、-C(＝O)NH2、-C(＝O)N(R)2、-C(＝S)NH2、-C(＝S)N(R)2、-C(＝NH)NH2和-C(＝NR)N(R)2；其中每个X针对每种情况独立地选自F、Cl、Br和I；并且每个R针对每种情况独立地选自C1-C12烷基、C6-C20芳基、C3-C14杂环烷基或杂芳基、保护基团和前药部分。在将基团描述为“任选取代的”的情况下，对于每种情况，该基团都可以独立地被一个或多个上述取代基取代。
应当理解，根据上下文，某些基团命名惯例可以包括单价基团或二价基团。例如，当取代基需要与分子的其余部分的两个连接点时，应理解该取代基是二价基团。例如，被确定为需要两个连接点的烷基的取代基包括二价基团诸如-CH2-、-CH2CH2-、-CH2CH(CH3)CH2-等。其他基团命名惯例清楚地表明该基团是二价基团诸如“亚烷基”、“亚烯基”、“亚芳基”、“亚杂环烷基”等。
例如，在取代基被描述为二价基团(即，具有与分子的其余部分的两个连接点)的情况下，应理解，除非另有说明，否则该取代基可以以任何定向构型连接。
“异构”是指具有相同分子式但其原子键连顺序或其原子空间排列不同的化合物。原子空间排列不同的异构体称为“立体异构体”。彼此不是镜像的立体异构体被称为“非对映异构体”，而是彼此不可重叠的镜像的立体异构体被称为“对映异构体”，或有时称为“旋光异构体”。
与四个不同取代基键连的碳原子称为“手性中心”。“手性异构体”是指具有至少一个手性中心的化合物。具有多于一个手性中心的化合物可以以单独的非对映异构体或以非对映异构体的混合物(称为“非对映异构混合物”)存在。当存在一个手性中心时，立体异构体的特征可能在于该手性中心的绝对构型(R或S)。绝对构型是指与手性中心连接的取代基的空间排列。所考虑的与手性中心连接的取代基根据Cahn、Ingold和Prelog的排序规则排名的(Cahn等人，Angew.Chem.Inter.Edit.1966，5，385；errata511；Cahn等人，Angew.Chem.1966，78，413；Cahn和Ingold，J.Chem.Soc.1951(London)，612；Cahn等人，Experientia 1956，12，81；Cahn，J.Chem.Educ.1964，41，116)。含有等量的相反手性的各个对映异构体形式的混合物被称为“外消旋混合物”。
本说明书和权利要求中公开的化合物可包含一个或多个不对称中心，并且可能存在每种化合物的不同非对映异构体和/或对映异构体。除非另有说明，否则本说明书和权利要求中对任何化合物的描述意在包括所有对映异构体、非对映异构体及其混合物。此外，除非另有说明，否则在本说明书和权利要求中对任何化合物的描述意在包括各个对映异构体以及对映异构体的任何混合物、外消旋或其他形式。当化合物的结构被描述为特定对映异构体时，应理解本申请的发明不限于该特定对映异构体。因此，本文考虑了本公开的每个结构式的对映异构体、旋光异构体和非对映异构体。在本说明书中，为方便起见，在某些情况下，化合物的结构式表示某种异构体，但本公开包括所有异构体，诸如几何异构体、基于不对称碳的旋光异构体、立体异构体、互变异构体等，应当理解，并非所有异构体都具有相同水平的活性。化合物可以以不同的互变异构形式存在。除非另有说明，否则根据本公开的化合物意在包括所有互变异构形式。当化合物的结构被描述为特定互变异构体时，应理解本申请的发明不限于该特定互变异构体。
如果适用，本文描述的任何式的化合物包括化合物本身，以及它们的盐和它们的溶剂合物。例如，盐可以在阴离子和本公开的化合物上的带正电荷的基团(例如，氨基)之间形成。合适的阴离子包括氯离子、溴离子、碘离子、硫酸根、硫酸氢根、氨基磺酸根、硝酸根、磷酸根、柠檬酸根、甲磺酸根、三氟乙酸根、谷氨酸根、葡糖醛酸根、戊二酸根、苹果酸根、马来酸根、琥珀酸根、富马酸根、酒石酸根、甲苯磺酸根、水杨酸根、乳酸根、萘磺酸根和乙酸根(例如，三氟乙酸根)。术语“药学上可接受的阴离子”是指适合形成药学上可接受的盐的阴离子。同样，也可以在阳离子和本公开化合物上的带负电荷的基团(例如，羧酸根)之间形成盐。合适的阳离子包括钠离子、钾离子、镁离子、钙离子和铵阳离子诸如四甲基铵离子。一些合适的取代铵离子的实例是衍生自以下的那些：乙胺、二乙胺、二环己胺、三乙胺、丁胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪、苄胺、苯基苄胺、胆碱、葡甲胺和氨丁三醇，以及氨基酸诸如赖氨酸和精氨酸。本公开的化合物还包括含有季氮原子的那些盐。
合适的无机阴离子的实例包括但不限于衍生自以下无机酸的那些：盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、亚硫酸、硝酸、亚硝酸、磷酸和亚磷酸。合适的有机阴离子的实例包括但不限于衍生自以下有机酸的那些：2-乙酰氧基苯甲酸、乙酸、抗坏血酸、天冬氨酸、苯甲酸、樟脑磺酸、肉桂酸、柠檬酸、依地酸、乙二磺酸、乙磺酸、富马酸、葡庚糖酸、葡糖酸、谷氨酸、乙醇酸、羟基马来酸、羟基萘羧酸、羟乙磺酸、乳酸、乳糖醛酸、月桂酸、马来酸、苹果酸、甲磺酸、粘液酸、油酸、草酸、棕榈酸、扑酸、泛酸、苯乙酸、苯磺酸、丙酸、丙酮酸、水杨酸、硬脂酸、琥珀酸、磺胺酸、酒石酸、甲苯磺酸和戊酸。合适的聚合有机阴离子的实例包括但不限于衍生自以下聚合酸的那些：单宁酸、羧甲基纤维素。
此外，本公开的化合物(例如化合物的盐)可以水合或未水合(无水)形式或以与其他溶剂分子的溶剂合物的形式存在。水合物的非限制性实例包括一水合物、二水合物等。溶剂合物的非限制性实例包括乙醇溶剂合物、丙酮溶剂合物等。“溶剂合物”是指含有化学计量或非化学计量量的溶剂的溶剂加成形式。一些化合物倾向于在结晶固体形态中捕获固定摩尔比的溶剂分子，从而形成溶剂合物。如果溶剂是水，则形成的溶剂合物是水合物；如果溶剂是醇，则形成的溶剂合物是醇化物。水合物是由一个或多个水分子与一分子物质结合形成的，其中水将其分子形态保持为H2O。水合物是指例如一水合物、二水合物、三水合物等。
此外，由本文公开的式表示的化合物或其盐可能存在晶体多晶型现象。应注意，任何晶型、晶型混合物或其酸酐或水合物均包括在本公开的范围内。
如本文所用，术语“约”是指在所描述的值之上或之下10％以内的值。例如，术语“约5nM”表示4.5nM至5.5nM的范围。
如本文所用，术语“鹅膏毒素”是指由鬼笔鹅膏(Amanita phalloides)蘑菇产生的肽的鹅膏毒素家族的成员，或其变体或衍生物，诸如其能够抑制RNA聚合酶II活性的变体或衍生物。下文进一步描述了合适的鹅膏毒素及其衍生物。如本文所述，鹅膏毒素可以缀合至抗体或其抗原结合片段，例如，通过连接基部分(L)(从而形成缀合物(即，ADC))。下面描述了用于此类过程的鹅膏毒素缀合的示例性方法和连接基。
在本发明的上下文中，术语“鹅膏毒素”包括如从鹅膏(Amanita)属分离的并且在Wieland，T.和Faulstich H(Wieland T，Faulstich H.，CRC Crit Rev Biochem.5(1978)185-260)中描述的由8个氨基酸组成的所有环肽、其另外的所有的化学衍生物；其另外的所有半合成类似物；其根据天然化合物的基本结构(环形，8个氨基酸)从合成砌块建立的所有合成类似物、另外的含有代替羟基化氨基酸的非羟基化氨基酸的所有合成或半合成的类似物、另外的所有合成和半合成的类似物(其中亚砜部分被砜、硫醚或者被不同于硫的原子(例如鹅膏蕈碱的卡巴类似物(carbanalog)中的碳原子)代替)。
如本文所用，化合物的“衍生物”是指具有与化合物相似的化学结构但还含有化合物中不存在的至少一个化学基团和/或缺少化合物中存在的至少一个化学基团的物质。衍生物所比较的化合物被称为“母体”化合物。通常，“衍生物”可以在一个或多个化学反应步骤中由母体化合物产生。
如本文所用的，化合物的“类似物”与化合物结构上相关但是不相同，并且表现出化合物的至少一种活性。类似物所比较的化合物被称为“母体”化合物。前文提及的活性包括但不限于：与另一种化合物的结合活性；抑制活性例如酶抑制活性；毒性效应；活化活性，例如酶活化活性。不需要类似物表现出与母体化合物相同程度的这种活性。如果化合物表现出母体化合物的活性的至少1％(更优选地至少5％、更优选地至少10％、更优选地至少20％、更优选地至少30％、更优选地至少40％和更优选地至少50％)的程度的相关活性，则化合物被认为是本申请语境下的类似物。因此，如其在本文所用的，“鹅膏毒素的类似物”是指与α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱、γ-鹅膏蕈碱、ε-鹅膏蕈碱、三羟鹅膏毒肽(amanin)、三羟鹅膏毒肽酰胺(amaninamide)、一羟鹅膏毒肽酰胺(amanullin)和一羟鹅膏毒肽羧酸(amanullinic acid)结构上相关并且表现出与α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱、γ-鹅膏蕈碱、ε-鹅膏蕈碱、三羟鹅膏毒肽、三羟鹅膏毒肽酰胺、一羟鹅膏毒肽酰胺和一羟鹅膏毒肽羧酸中的至少一种相比至少1％(更优选地至少5％、更优选地至少10％、更优选地至少20％、更优选地至少30％、更优选地至少40％以及更优选地至少50％)的抗哺乳动物RNA聚合酶II的抑制性活性的化合物。适于在本发明中使用的“鹅膏毒素的类似物”甚至可表现出比α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱、γ-鹅膏蕈碱、ε-鹅膏蕈碱、三羟鹅膏毒肽、三羟鹅膏毒肽酰胺、一羟鹅膏毒肽酰胺或一羟鹅膏毒肽羧酸中的任何一种更高的抗哺乳动物RNA聚合酶II的抑制性活性。抑制性活性可通过测定发生50％抑制时的浓度(IC50值)来测量。抗哺乳动物RNA聚合酶II的抑制活性可通过测量对细胞增殖的抑制性活性来间接测量。
“半合成类似物”是指通过使用来自天然来源的化合物(例如植物材料、细菌培养物、真菌培养物或细胞培养物)作为起始原料的化学合成获得的类似物。通常，本发明的“半合成类似物”是从自鹅膏科的蘑菇分离的化合物开始来合成的。相反，“合成类似物”是指通过从小的(通常石油化学的)合成砌块的所谓全合成来合成的类似物。通常，在没有生物方法辅助的情况下进行该全合成。
根据本发明的一些实施方案，所述鹅膏毒素可选自α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱、三羟鹅膏毒肽、三羟鹅膏毒肽酰胺及其类似物、衍生物和盐。
功能上，鹅膏毒素被定义为抑制哺乳动物RNA聚合酶II的肽或酯肽。优选的鹅膏毒素是具有能够与下文所定义的连接基分子或靶结合部分发生反应的官能团(例如羧基、氨基、羟基、硫醇或巯基捕获基团)的那些。
在本发明的上下文中，术语“鹅膏蕈碱”特别地是指双环结构，该双环结构是基于1位天冬氨酸或天冬酰胺残基、2位脯氨酸残基(特备是羟基脯氨酸残基)、3位异亮氨酸、羟基异亮氨酸或二羟基异亮氨酸、4位色氨酸或羟基色氨酸残基、5位和7位甘氨酸残基、6位异亮氨酸残基和8位半胱氨酸残基，特别是被氧化成亚砜或砜衍生物的半胱氨酸的衍生物(鹅膏蕈碱的编号和代表性实例见图1)，并且另外包括其所有化学衍生物；其另外的所有半合成类似物；其根据天然化合物的主结构(环形，8个氨基酸)从合成砌块建立的所有合成类似物、另外的含有代替羟基化氨基酸的非羟基化氨基酸的所有合成或半合成的类似物、另外的所有合成和半合成的类似物，在每种情况下其中任何此类衍生物或类似物通过抑制哺乳动物RNA聚合酶II而具功能活性。
如本文所用，术语“抗体”是指与特定抗原特异性结合或发生免疫反应的免疫球蛋白分子，并且包括抗体的单克隆、基因工程和其他修饰形式，包括但不限于嵌合抗体、人源化抗体、异源结合抗体(例如，双、三和四特异性抗体、双抗体、三抗体和四抗体)和抗体的抗原结合片段，包括例如Fab′、F(ab′)2、Fab、Fv、rlgG和scFv片段。除非另有说明，否则术语“单克隆抗体”(mAb)旨在包括完整分子以及能够与靶蛋白特异性结合的抗体片段(包括，例如，Fab和F(ab′)2片段)。如本文所用，Fab和F(ab′)2片段是指缺少完整抗体的Fc片段的抗体片段。本文描述了这些抗体片段的实例。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指源自单个克隆的抗体，包括任何真核、原核或噬菌体克隆，而不是指生产它的方法。
本发明的抗体通常是分离的或重组的。当在本文中使用时，“分离的”是指已经从表达它的细胞或细胞培养物中分离和/或回收的多肽，例如抗体。因此，“分离的抗体”是指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体。例如，与CD117特异性结合的分离的抗体基本上不含特异性结合CD117以外的抗原的抗体。
如本文所用，术语“抗原结合片段”是指保留与靶抗原特异性结合的能力的抗体的片段。抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段来执行。抗体片段可以是，例如，Fab、F(ab’)2、scFv、双抗体、三抗体、亲和体(affibody)、纳米抗体、适配体或域抗体。涵盖在术语抗体的“抗原结合片段”的结合片段的实例包括但不限于：(i)Fab片段，其为由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，其为包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，(v)包括VH和VL结构域的dAb；(vi)由VH结构域组成的dab片段(参见例如，Ward等人，Nature 341：544-546，1989)；(vii)由VH或VL结构域组成的dAb；(viii)分离的互补决定区(CDR)；和(ix)两个或更多个(例如，两个、三个、四个、五个或六个)分离的CDR(其可以任选地通过合成连接基连接)的组合。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由不同的基因编码，但可以使用重组方法经由连接基将它们连接起来，该连接基使它们能够制成单个蛋白质链，其中VL和VH区配对以形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如，Bird等人，Science 242：423-426，1988和Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883，1988)。可以使用本领域技术人员已知的常规技术获得抗体片段，并且可以与完整抗体相同的方式筛选片段以供使用。抗原结合片段可以通过重组DNA技术、完整免疫球蛋白的酶促或化学裂解，或在某些情况下，通过本领域已知的化学肽合成程序制备。
如本文所用，术语“抗CD117抗体”或“与CD117结合的抗体”是指能够以足够的亲和力结合CD117(例如人CD117)，使得该抗体可用作靶向CD117的诊断和/或治疗剂的抗体。人CD117的两种主要同种型的氨基酸序列提供于SEQ ID NO：145(同种型1)和SEQ ID NO：146(同种型2)。“抗CD117ADC”是指其中抗体是抗CD117抗体的ADC。
如本文所用，术语“抗CD45抗体”或“与CD45结合的抗体”是指能够以足够的亲和力结合CD45(例如人CD117)，使得该抗体可用作靶向CD45的诊断和/或治疗剂的抗体。“抗CD45ADC”是指其中抗体是抗CD45抗体的ADC。
如本文所用，术语“抗CD137抗体”或“与CD137结合的抗体”是指能够以足够的亲和力结合CD137(例如人CD137)，使得该抗体可用作靶向CD137的诊断和/或治疗剂的抗体。“抗CD137ADC”是指其中抗体是抗CD137抗体的ADC。
如本文所用，术语“抗CD2抗体”或“与CD2结合的抗体”是指能够以足够的亲和力结合CD2(例如人CD2)，使得该抗体可用作靶向CD2的诊断和/或治疗剂的抗体。“抗CD2ADC”是指其中抗体是抗CD2抗体的ADC。
如本文所用，术语“抗CD5抗体”或“与CD5结合的抗体”是指能够以足够的亲和力结合CD5(例如人CD5)，使得该抗体可用作靶向CD5的诊断和/或治疗剂的抗体。“抗CD5ADC”是指其中抗体是抗CD5抗体的ADC。
如本文所用，术语“双特异性抗体”是指例如单克隆抗体，通常是能够结合至少两种不同抗原的人或人源化抗体。例如，结合特异性之一可以针对造血干细胞表面抗原CD117(例如，GNNK+CD117)，而另一个可以特异性结合不同的造血干细胞表面抗原或另一种细胞表面蛋白，诸如参与促进细胞生长的信号转导通路的受体或受体亚基等。
如本文所用，术语“互补决定区”(CDR)是指在抗体的轻链和重链的可变结构域中均发现的高变区。可变域的更高度保守的部分被称为框架区(FR)。根据上下文和本领域已知的各种定义，描述抗体高变区的氨基酸位置可以变化。可变域内的一些位置可被视为混合高变位置，因为这些位置在一组标准下可被视为在高变区内，而在不同标准组下被视为在高变区外。这些位置中的一个或多个也可以在扩展的高变区中找到。本文所述的抗体可在这些混合高变位置中包含修饰。天然重链和轻链的可变结构域各自包含主要采用β-折叠结构的四个框架区，所述β-折叠结构由三个CDR连接，该三个CDR形成连接的环，并且在某些情况下形成B-折叠结构的一部分。每条链中的CDR通过框架区以FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的顺序紧密结合在一起，并且与来自其他抗体链的CDR一起有助于形成抗体的靶结合位点(参见Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，National Institute of Health，Bethesda，MD.，1987)。在某些实施方案中，除非另有说明，否则根据Kabat等人的免疫球蛋白氨基酸残基编号系统对免疫球蛋白氨基酸残基进行编号(尽管可以使用任何抗体编号方案，包括但不限于IMGT和Chothia)。
如本文所用，术语“调理(condition)”和“调理(conditioning)”是指患者通过其为接受移植物(例如含有造血干细胞的移植物)做好准备的方法。这样的程序促进了造血干细胞移植物的植入(例如，如在调理程序和随后的造血干细胞移植之后从患者分离的血液样本中活的造血干细胞量的持续增加推断的)。根据本文所述的方法，可通过向患者给药能够结合由造血干细胞表达的抗原，诸如CD117(例如，GNNK+CD117)的ADC，使患者适应造血干细胞移植疗法。向需要造血干细胞移植治疗的患者给药能够结合HSC抗原的ADC可以促进造血干细胞移植物的植入，例如，通过选择性消耗内源性造血干细胞，从而产生由外源性造血干细胞移植填补的空缺。
如本文所用，术语“缀合物”是指通过一个分子(诸如抗体或其抗原结合片段)的反应性官能团与另一分子(诸如本文描述的细胞毒素)的适当反应性官能团化学键连形成的化合物。缀合物可包括相互结合的两个分子之间的连接基。可用于形成缀合物的连接基的实例包括含肽的连接基，诸如含有天然存在或非天然存在的氨基酸诸如D-氨基酸的那些。连接基可以使用本文描述的和本领域已知的多种策略来制备。根据其中的反应性组分，连接基可以例如通过酶促水解、光解、酸性条件下的水解、碱性条件下的水解、氧化、二硫键还原、亲核裂解或有机金属裂解来裂解(参见例如Leriche等人，Bioorg.Med.Chem.，20：571-582，2012)。值得注意的是，术语“缀合物”(当提及化合物时)在本文中也可互换地称为“药物缀合物”、“抗体药物缀合物”或“ADC”。
如本文所用，术语“偶联反应”是指其中两个或更多个适合彼此反应的取代基反应以形成连接(例如，共价)各取代基结合的分子片段的化学部分的化学反应。偶联反应包括其中与为细胞毒素(诸如本领域已知或本文所述的细胞毒素)的片段结合的反应性取代基与为抗体或其抗原结合片段(诸如本领域已知或本文所述的结合CD117(诸如GNNK+CD117)的抗体、其抗原结合片段或特异性抗CD117抗体)的片段结合的适当反应性取代基反应的那些。合适的反应性取代基的实例包括亲核体/亲电体对(例如硫醇/卤代烷基对、胺/羰基对，或硫醇/α，β-不饱和羰基对等)、二烯/亲二烯体对(例如，叠氮化物/炔对等)等。偶联反应包括但不限于硫醇烷基化、羟基烷基化、胺烷基化、胺缩合、酰胺化、酯化、二硫键形成、环加成(例如[4+2]Diels-Alder环加成、[3+2]Huisgen环加成等)、亲核芳族取代、亲电芳族取代和本领域已知或本文所述的其他反应形式。
如本文所用，“CRU(竞争性再植单位)”是指长期移植干细胞的度量单位，其可在体内移植后检测到。
如本文所用，术语“供体”是指在将细胞或其后代给药至受体之前从其中分离出一种或多种细胞的人或动物。所述一种或多种细胞可以是例如造血干细胞群。
如本文所使用的，术语“双抗体”是指包含两条多肽链的二价抗体，其中每条多肽链包括通过连接基连接的VH和VL结构域，所述连接基太短(例如，由五个氨基酸构成的连接基)而不允许VH和VL结构域在同一肽链上进行分子内缔合。这种构型迫使每个结构域与另一条多肽链上的互补结构域配对，从而形成同源二聚体结构。相应地，术语“三抗体”是指包含三条肽链的三价抗体，每一条肽链含有通过连接基连接的一个VH结构域和一个VL结构域，所述连接基极其短(例如，由1-2个氨基酸构成的连接基)而不允许VH和VL结构域在同一肽链上进行分子内缔合。为了折叠成其天然结构，以这种方式构造的肽通常三聚化从而将相邻肽链的VH和VL结构域在空间上彼此邻近地定位(参见例如Holliger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90∶6444-48，1993。
如本文所用，“药物与抗体比”或“DAR”是指连接到缀合物的抗体上的药物(例如鹅膏毒素)的数量。ADC的DAR可以为1至8，尽管根据抗体上连接位点的数量，更高的负载也是可能的。在某些实施方案中，缀合物具有1、2、3、4、5、6、7或8的DAR。
如本文所用，术语“内源性”描述在特定生物体(诸如，人患者)中天然发现的物质，诸如分子、细胞、组织或器官(例如，造血干细胞或造血谱系的细胞，诸如巨核细胞、凝血细胞、血小板、红细胞、肥大细胞、成髓细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、小胶质细胞、粒细胞、单核细胞、破骨细胞、抗原呈递细胞、巨噬细胞、树突细胞、自然杀伤细胞、T淋巴细胞或B淋巴细胞)。
如本文所用，术语“植入潜力”用于指造血干细胞和祖细胞重新进入组织的能力，无论这些细胞是自然循环的还是通过移植提供的。该术语涵盖围绕或导致移植的所有事件，诸如细胞的组织归巢和细胞在目标组织内的定植。植入效率或植入率可以使用本领域技术人员已知的任何临床上可接受的参数来评估或量化，并且可以包括例如对竞争性再植单位(CRU)的评估；在干细胞已归巢、定植或移植的组织中加入或表达标记物；或通过疾病进展、造血干细胞和祖细胞的存活率或受体的存活率来评估个体的进展。也可以通过在移植后期间测量外周血中的白血细胞计数来确定移植。还可以通过测量骨髓穿刺样本中供体细胞对骨髓细胞的恢复来评估移植。
如本文所用，术语“外源性”描述没有在特定生物体(诸如，人患者)中天然发现的物质，诸如分子、细胞、组织或器官(例如，造血干细胞或造血谱系的细胞，诸如巨核细胞、凝血细胞、血小板、红细胞、肥大细胞、成髓细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、小胶质细胞、粒细胞、单核细胞、破骨细胞、抗原呈递细胞、巨噬细胞、树突细胞、自然杀伤细胞、T淋巴细胞或B淋巴细胞)。外源性物质包括从外部来源提供给生物体或从其提取的培养物质的那些。
如本文所用，术语“Fc”、“Fc区”和“Fc结构域”是指与通过IgG分子的木瓜蛋白酶消化获得的可结晶片段相关的IgG抗体部分。Fc区包含通过二硫键连接的IgG分子的两条重链的C端一半。它不具有抗原结合活性，但含有碳水化合物部分以及补体和Fc受体(包括FcRn受体)的结合位点。Fc区包含第二恒定结构域CH2(例如，IgG1的EU位置231-340处的残基)和第三恒定结构域CH3(例如，人IgG1的EU位置341-447处的残基)。如本文所用，Fc区包括“下部铰链区”(例如，IgG1的EU位置233-239处的残基)。Fc可以指孤立的该区域，或在抗体、抗体片段或Fc融合蛋白的语境中的该区域。已在Fc结构域的多个位置(包括但不限于EU位置270、272、312、315、356和358)处观察到多态性，因此本申请中提供的序列与本领域中已知的序列之间存在细微差异。因此，“野生型IgG Fc结构域”或“WT IgG Fc结构域”是指任何天然存在的IgG Fc区(即任何等位基因)。人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的重链的序列可以在许多序列数据库中找到，例如，在Uniprot数据库(www.uniprot.org)中，分别在登录号P01857(IGHG1_HUMAN)、P01859(IGHG2_HUMAN)、P01860(IGHG3_HUMAN)和P01861(IGHG1_HUMAN)下找到。“WT”Fc区的实例提供于SEQ ID NO：122(其提供含有Fc区的重链恒定区)。
如本文所用，术语“修饰的Fc区”或“变体Fc区”是指包含在Fc区内任何位置引入的一个或多个氨基酸置换、缺失、插入或修饰的IgG Fc结构域。
术语“全长抗体”和“完整抗体”在本文中可互换使用，指以其基本上完整形式的抗体，而不是本文定义的抗体片段。在一个实施方案中，本文所述的ADC包含完整抗体。因此，对于IgG抗体，完整抗体包含各自包含可变区、恒定区和Fc区的两条重链，和各自包含可变区和恒定区的两条轻链。更具体地，完整的IgG包含各自包含轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)的两条轻链，并且包含各自包含重链可变区(VH)和三个重链恒定区(CH1、CH2和CH3)的两条重链。CH2和CH3代表重链的Fc区。
如本文所用，术语“框架区”或“FW区”包括与抗体或其抗原结合片段的CDR相邻的氨基酸残基。FW区残基可以存在于例如人抗体、人源化抗体、单克隆抗体、抗体片段、Fab片段、单链抗体片段、scFv片段、抗体结构域和双特异性抗体等中。
如本文所用，术语“造血干细胞”(“HSC”)是指具有自我更新并分化为包含不同谱系的成熟血细胞的能力的未成熟血细胞，该不同谱系的成熟血细胞包括但不限于粒细胞(例如，早幼粒细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞)、红细胞(例如，网织红细胞、红细胞)、凝血细胞(例如，原始巨核细胞、产生血小板的巨核细胞、血小板)、单核细胞(例如单核细胞、巨噬细胞)、树突细胞、小胶质细胞、破骨细胞和淋巴细胞(例如NK细胞、B细胞和T细胞)。这样的细胞可以包括CD34+细胞。CD34+细胞是表达CD34细胞表面标志物的未成熟细胞。在人类中，CD34+细胞被认为包括具有上文定义的干细胞特性的细胞亚群，而在小鼠中，HSC是CD34-。此外，HSC还指长期再植HSC(LT-HSC)和短期再植HSC(ST-HSC)。LT-HSC和ST-HSC是基于功能潜力和细胞表面标志物表达来区分的。例如，人HSC是CD34+、CD38-、CD45RA-、CD90+、CD49F+和lin-(对包括CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、CD10、CD11B、CD19、CD20、CD56、CD235A在内成熟谱系标志物呈阴性)。在小鼠中，骨髓LT-HSC是CD34-、SCA-1+、C-kit+、CD135-、Slamfl/CD150+、CD48-和lin-(对于包括Ter119、CD11b、Gr1、CD3、CD4、CD8、B220、IL7ra在内的成熟谱系标志物呈阴性)，而ST-HSC是CD34+、SCA-1+、C-kit+、CD135-、Slam(l/CD150+和lin-(对于包括Ter119、CD11b、Gr1、CD3、CD4、CD8、B220、IL7ra在内的成熟谱系标志物呈阴性)。此外，在稳态条件下，ST-HSC比LT-HSC更少地静止并且更多地增殖。然而，LT-HSC具有更大的自我更新潜力(即，它们可以在整个成年期存活，并且可以通过连续的受体进行连续移植)，而ST-HSC具有有限的自我更新能力(即，它们仅存活有限的时间段，且不具备连续移植潜力)。这些HSC中的任何一个都可以在本文描述的方法中使用。ST-HSC特别有用，因为它们具有高度增殖性，并且因此可以更快地产生分化的后代。
如本文所用，术语“造血干细胞功能潜力”是指造血干细胞的功能特性，其包括1)多潜能性(其是指分化成多种不同血系的能力，包括但不限于粒细胞(例如，早幼粒细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞)、红细胞(例如，网织红细胞、红细胞)、凝血细胞(例如，原始巨核细胞、产生血小板的巨核细胞、血小板)、单核细胞(例如单核细胞、巨噬细胞)、树突细胞、小胶质细胞、破骨细胞和淋巴细胞(例如NK细胞、B细胞和T细胞)，2)自我更新(其是指造血干细胞产生与母细胞具有同等潜力的子细胞的能力，且进一步地这种能力可以在个体的一生中反复出现而不会耗尽)，和3)造血干细胞或其后代被重新引入移植受体，接着他们进入造血干细胞生态位并重新建立生产性和持续性的造血功能的能力。
如本文所用，术语“人抗体”旨在包括具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。人抗体可以包括不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或在基因重排期间或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，如本文所用，术语“人抗体”不意图包括其中源自另一哺乳动物物种(诸如小鼠)的种系的CDR序列已移植到人框架序列上的抗体。可以在人细胞中(例如，通过重组表达)，或者通过能够功能性地表达重排的人免疫球蛋白(诸如，重链和/或轻链)基因的非人动物或原核或真核细胞，来产生人抗体。当人抗体是单链抗体时，其可以包括没有在天然人抗体中发现的连接基肽。例如，Fv可以包含连接基肽，诸如两个至约八个甘氨酸或其他氨基酸残基，该连接基肽连接重链的可变区和轻链的可变区。这种连接基肽被认为是人类来源的。人抗体可以通过在本领域中已知的多种方法来制造，包括使用衍生自人免疫球蛋白序列的抗体文库的噬菌体展示方法。人抗体还可以使用转基因小鼠来产生，该转基因小鼠不能表达功能内源性免疫球蛋白，但是可以表达人免疫球蛋白基因(参见例如PCT公开号WO 98/24893；WO92/01047；WO 96/34096；WO 96/33735；美国专利号5,413,923；5,625,126；5,633,425；5,569,825；5,661,016；5,545,806；5,814,318；5,885,793；5,916,771；以及5,939,598)。
“人源化”抗体是指含有源自非人免疫球蛋白的最少序列的抗体。因此，非人(例如，鼠)抗体的“人源化”形式是包含源自非人抗体的最少序列的嵌合抗体。全部或基本上全部的FW区还可以是人免疫球蛋白序列中的那些。人源化抗体还可以包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白共有序列的一部分。抗体人源化的方法是本领域已知的并且已经描述于例如Riechmann等人，Nature332：323-7，1988；美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,761；5,693,762；和6,180,370中。
如本文所用，术语“抗体样蛋白”指被工程化(例如通过Ig环的突变形成)以特异性结合靶分子的蛋白。通常，这样的抗体样蛋白包含在两端与蛋白质骨架连接的至少一个可变肽环。这一双重结构约束将抗体样蛋白的结合亲和力大大增加至与抗体相当的水平。可变肽环的长度通常由10至20个氨基酸组成。骨架蛋白可以是具有良好溶解特性的任意蛋白。优选地，骨架蛋白是小的球蛋白。抗体样蛋白包括但不限于亲和体、anticalin和设计的锚蛋白重复蛋白(Binz等人，2005)。抗体样蛋白可来源于突变体的大文库，例如通过从大的噬菌体展示文库淘选，并且可类似于常规抗体进行分离。同样，抗体样结合蛋白可以通过球蛋白中表面暴露残基的组合突变获得。
如本文所用，术语“Fab”涉及包含抗原结合区的IgG片段，所述片段由来自抗体的每条重链和轻链的一个恒定域和一个可变域构成。
如本文所用，术语“F(ab)2”涉及由通过二硫键彼此连接的两个Fab片段组成的IgG片段。
如本文所用，术语“scFv”涉及单链可变片段，其作为通过短连接基连接在一起的免疫球蛋白的重链和轻链可变区的融合物，通常包含丝氨酸(S)和/或甘氨酸(G)残基。尽管去除了恒定区并引入了连接基肽，但该嵌合分子保留了原始免疫球蛋白的特异性。
根据本发明的一个方面，本发明涉及所述缀合物或药物组合物，其用于治疗癌症。
根据本发明的一个方面，本发明涉及所述缀合物或所述药物组合物，其用于治疗B淋巴细胞相关恶性肿瘤或B细胞介导的自身免疫疾病，特别是用于治疗非霍奇金淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、类风湿性关节炎、肉芽肿性多血管炎和显微镜下多血管炎，以及寻常型天疱疮。
如本文所用，“需要”造血干细胞移植的患者包括表现出一种或多种血细胞类型的缺陷或缺乏的患者，以及患有干细胞疾病、自身免疫性疾病、癌症，或本文描述的其他病状的患者。造血干细胞通常表现出1)多潜能性，并且因此可以分化成多种不同的血系，包括但不限于粒细胞(例如，早幼粒细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞)、红细胞(例如，网织红细胞、红细胞)、凝血细胞(例如，原始巨核细胞、产生血小板的巨核细胞、血小板)、单核细胞(例如单核细胞、巨噬细胞)、树突细胞、小胶质细胞、破骨细胞和淋巴细胞(例如NK细胞、B细胞和T细胞)，2)自我更新，并且因此产生与母细胞具有同等潜力的子细胞，和3)重新引入移植受体，接着他们进入造血干细胞生态位并重新建立生产性和持续性的造血功能的能力。因此，可以将造血干细胞给药至一种或多种造血谱系细胞类型缺陷或缺乏的患者，以在体内重建缺陷或缺乏细胞群。例如，患者可能患有癌症，并且缺乏可能是由于给药选择性地或非特异性地消耗癌细胞群的化学治疗剂或其他药物引起的。此外或备选地，患者可能患有血红蛋白病(例如，非恶性血红蛋白病)，诸如镰状细胞性贫血、地中海贫血、范科尼贫血、再生障碍性贫血和维-奥二氏综合征。个体可以是患有腺苷脱氨酶严重联合免疫缺陷(ADA SCID)、HIV/AIDS、异染性脑白质营养不良、戴-布二氏贫血和Schwachman-Diamond综合征的个体。个体可能患有遗传性血液病(例如，镰状细胞性贫血)或自身免疫病或受其影响。另外或备选地，个体可能患有恶性肿瘤诸如成神经细胞瘤或血液学癌症，或受其影响。例如，个体可能患有白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。在一些实施方案中，个体患有急性髓性白血病、急性淋巴性白血病、慢性髓性白血病、慢性淋巴性白血病、多发性骨髓瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤。在一些实施方案中，个体患有骨髓增生异常综合征。在一些实施方案中，个体患有自身免疫疾病，诸如硬皮病、多发性硬化症、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、1型糖尿病或本文所述的另一种自身免疫病理。在一些实施方案中，个体需要嵌合抗原受体T细胞(CART)疗法。在一些实施方案中，个体患有代谢性贮积症或以其他方式受到代谢性贮积症的影响。个体可能患有选自以下的代谢障碍或以其他方式受选自以下的代谢障碍的影响：糖原沉积病、粘多糖累积病、高歇氏病、胡尔勒氏症、神经鞘脂贮积症、异染性脑白质营养不良或任何其他可受益于本文公开的治疗和疗法的疾病或病症，并且包括但不限于严重联合免疫缺陷病、威-奥二氏综合征、高免疫球蛋白M(IgM)综合征、切-希二氏病、遗传性淋巴组织细胞增生症、骨硬化症、成骨不全症、贮积症、重型地中海贫血、镰状细胞病、系统性硬化症、系统性红斑狼疮、多发性硬化症、幼年型类风湿性关节炎以及″BoneMarrow Transplantation for Non-Malignant Disease，″ASH Education Book，1∶319-338(2000)中描述的那些疾病或病症，其公开内容以其整体援引加入本文，因为它涉及可能通过施用造血干细胞移植疗法治疗的病状。另外或备选地，“需要”造血干细胞移植的患者可能患有或未患有前述病状之一，但仍然表现出降低水平(例如，与其他健康个体相比)的造血谱系中的一种或多种内源性细胞类型，诸如巨核细胞、凝血细胞、血小板、红细胞、肥大细胞、成髓细胞、嗜碱性粒细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、小胶质细胞、粒细胞、单核细胞、破骨细胞、抗原呈递细胞、巨噬细胞、树突细胞、自然杀伤细胞、T淋巴细胞和B淋巴细胞。本领域技术人员可以容易地确定一种或多种上述细胞类型或其他血细胞类型的个人水平是否相对于其他健康个体降低，例如，通过流式细胞术和荧光活化细胞分选(FACS)方法等本领域已知的操作。
如本文所用，“中性抗体”是指不能显著中和、阻断、抑制、废除、降低或干扰特定或指定靶标(例如，CD117)的活性，包括受体与配体的结合或酶与底物的相互作用的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，中性抗CD117抗体或其片段是基本上不抑制SCF依赖性细胞增殖并且不交叉阻断SCF与CD117结合的抗CD117抗体。中性抗体的一个实例是Ab67(或具有Ab67的结合区的抗体)。相反，“拮抗剂”抗CD117抗体抑制SCF依赖性增殖，并能够交叉阻断SCF与CD117的结合。拮抗剂抗体的实例是Ab55(或具有Ab55的结合区的抗体)。
如本文所用，术语“受体”是指接受移植物的患者，诸如含有造血干细胞群的移植物。给药至受体的移植细胞可以是例如自体、同基因或同种异体细胞。
如本文所用，术语“样本”是指取自个体的试样(例如血液、血液成分(例如血清或血浆)、尿、唾液、羊水、脑脊液、组织(例如、胎盘或真皮)、胰液、绒毛膜绒毛样本和细胞)。
如本文所用，术语“scFv”是指单链Fv抗体，其中来自抗体的重链和轻链的可变结构域已经连接形成一条链。scFv片段含有单一多肽链，该单一多肽链包含通过连接基分开的抗体轻链的可变区(VL)(例如，CDR-L1、CDR-L2和/或CDR-L3)和抗体重链的可变区(VH)(例如，CDR-H1、CDR-H2和/或CDR-H3)。连接scFv片段的VL和VH区的连接基可以是由蛋白原氨基酸组成的肽连接基。可以使用其它供选择的连接基以增加scFv片段对蛋白水解降解的抗性(例如，含有D-氨基酸的连接基)，以增强scFv片段的溶解性(例如，亲水连接基，如含聚乙二醇的连接基或含有重复的甘氨酸和丝氨酸残基的多肽)，以改善分子的生物物理稳定性(例如，含有形成分子内或分子间二硫键的半胱氨酸残基的连接基)，或减弱scFv片段的免疫原性(例如，含有糖基化位点的连接基)。本领域普通技术人员还将理解，本文所述的scFv分子的可变区可以被修饰，使得它们在氨基酸序列上与它们所源自的抗体分子不同。例如，可以进行导致氨基酸残基处的保守取代或改变的核苷酸或氨基酸置换(例如，在CDR和/或框架残基中)以保持或增强scFv与相应抗体所识别的抗原结合的能力。
如本文所用，术语“特异性结合”或“特异性地结合”是指抗体识别并结合特定蛋白质结构(表位)而不是一般蛋白质的能力。如果抗体对表位“A”具有特异性，则在含有标记的“A”和抗体的反应中含有表位A(或游离的、未标记的A)的分子的存在将减少与抗体结合的标记A的量。举例来说，如果抗体在被标记时可以被相应的未标记抗体竞争远离其靶标，则该抗体与靶标“特异性结合”。在一个实施方案中，如果抗体针对靶标(例如CD117、CD45、CD2、CD5、CD137、CD134或CD252)具有至少约10-4M、10-5M、10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M或更小(更小意味着小于10-12的数值，例如10-13)的KD，则抗体与靶标特异性地结合。在一个实施方案中，如本文所用，术语“与CD117特异性结合”或“与CD117特异性地结合”是指与CD117结合并具有1.0x10-7M或更小的离解常数(KD)(由表面等离子体共振测定)的抗体。在一个实施方案中，KD(M)是根据标准生物层干涉仪(BLI)测定的。在一个实施方案中，Koff(l/s)是根据标准生物层干涉仪(BLI)测定的。然而，应当理解，抗体可能能够与两个或更多个序列相关的抗原特异性地结合。例如，在一个实施方案中，抗体可以与CD117、CD45、CD2、CD5、CD137、CD134或CD252的人和非人(例如，小鼠或非人灵长目动物)直系同源物特异性地结合。
如本文所用的，术语“个体”和“患者”是指接受如本文所述的特定疾病或病症的治疗的生物体，诸如人。例如，患者，诸如人类患者，可以在造血干细胞移植疗法之前接受治疗以促进外源性造血干细胞的植入。
如本文所用，短语“基本上从血液中清除”是指在向患者给药治疗剂，例如包含鹅膏毒素的ADC后，从患者中分离的血液样本中的治疗剂浓度为治疗剂无法通过常规方式检测到(例如，使得在用于检测治疗剂的装置或测定法的噪声阈值之上无法检测到治疗剂)时的时间点。本领域已知的多种技术可用于检测抗体或抗体片段，诸如本领域已知的或本文所述的基于ELISA的检测分析。可用于检测抗体或抗体片段的其他分析包括免疫沉淀技术和免疫印迹分析等本领域已知的方法。
如本文所用，短语“干细胞病症”泛指可以通过调理个体的靶组织和/或通过消融靶组织中的内源性干细胞群(例如，从个体的骨髓组织中消融内源性造血干细胞或祖细胞群)和/或通过在个体的靶组织中植入或移植干细胞而治疗或治愈的任何疾病、病症或病况。例如，I型糖尿病已被证明可通过造血干细胞移植而治愈，并可受益于根据本文所述的组合物和方法的调理。可以使用本文所述的组合物和方法治疗的其他病症包括但不限于镰状细胞性贫血、地中海贫血、范科尼贫血、再生障碍性贫血、维-奥二氏综合征、ADA SCID、HIV/AIDS、异染性脑白质营养不良、Diamond-Blackfan贫血、和Schwachman-Diamond综合征。可以使用本文所述的患者调理和/或造血干细胞移植方法治疗的其他疾病包括遗传性血液病(例如镰状细胞性贫血)和自身免疫病，诸如硬皮病、多发性硬化症、溃疡性结肠炎和克罗恩氏病。可以使用本文所述的调理和/或移植方法治疗的其他疾病包括恶性肿瘤，例如成神经细胞瘤或血液学癌症，诸如白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。例如，癌症可以是急性髓性白血病、急性淋巴性白血病、慢性髓性白血病、慢性淋巴性白血病、多发性骨髓瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤。可使用本文所述的调理和/或移植方法治疗的其他疾病包括骨髓增生异常综合征。在一些实施方案中，个体患有代谢性贮积症或以其他方式受到代谢性贮积症的影响。例如，个体可能患有选自以下的代谢障碍或以其他方式受选自以下的代谢障碍的影响：糖原沉积病、粘多糖累积病、高歇氏病、胡尔勒氏症、神经鞘脂贮积症、异染性脑白质营养不良或任何其他可受益于本文公开的治疗和疗法的疾病或病症，并且包括但不限于严重联合免疫缺陷病、威-奥二氏综合征、高免疫球蛋白M(IgM)综合征、切-希二氏病、遗传性淋巴组织细胞增生症、骨硬化症、成骨不全症、贮积症、重型地中海贫血、镰状细胞病、系统性硬化症、系统性红斑狼疮、多发性硬化症、幼年型类风湿性关节炎以及″BoneMarrow Transplantation for Non-Malignant Disease，″ASH Education Book，1∶319-338(2000)中描述的那些疾病或病症，其公开内容以其整体援引加入本文，因为它涉及可能通过施用造血干细胞移植疗法治疗的病状。
如本文所用的，术语“转染”是指通常用于将外源性DNA引入原核或真核宿主细胞的多种技术中的任何一种，诸如电穿孔、脂质转染、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等。
如本文所用，术语“治疗”(treat)或“治疗(treatment)”是指降低疾病症状的严重性和/或频率，消除疾病症状和/或所述症状的潜在原因，降低疾病症状和/或其潜在原因的频率或可能性，并改善或补救由疾病直接或间接引起的损害。有益的或期望的临床结果包括但不限于在本文所述的抗体调理疗法和随后的造血干细胞移植疗法之后促进外源性造血细胞在患者中的植入。额外的有益结果包括在调理疗法和随后的向患者施用外源性造血干细胞移植物之后，需要造血干细胞移植的患者中的细胞计数或造血干细胞的相对浓度增加。本文所述疗法的有益结果还可以包括在调理疗法和随后的造血干细胞移植疗法之后，造血谱系(诸如巨核细胞、凝血细胞、血小板、红细胞、肥大细胞、成髓细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、小胶质细胞、粒细胞、单核细胞、破骨细胞、抗原呈递细胞、巨噬细胞、树突细胞、自然杀伤细胞、T淋巴细胞或B淋巴细胞)的一种或多种细胞的细胞计数或相对浓度的增加。其他的有益结果可能包括致病细胞群的数量减少，诸如癌细胞(例如CD117+白血病细胞)或自身免疫细胞(例如CD117+自身免疫淋巴细胞，诸如表达与自身抗原交叉反应的T细胞受体的CD117+T细胞)的群。就本发明的方法涉及预防疾病而言，应理解术语“预防”不需要完全阻止疾病状态。相反，如本文所用，术语预防是指技术人员识别易患疾病的群体，使得本发明的化合物的给药可在疾病发作之前进行的能力。该术语并不意味着完全避免疾病状态。
如本文所用，术语“变体”和“衍生物”可互换使用，并且是指本文所述的化合物、肽、蛋白质或其他物质的天然存在的、合成的和半合成的类似物。本文所述的化合物、肽、蛋白质或其他物质的变体或衍生物可以保留或改进原始材料的生物活性。
如本文所用，术语“载体”包括核酸载体，诸如质粒、DNA载体、质粒、RNA载体、病毒或其他适合的复制子。本文所述的表达载体可以包含多核苷酸序列以及例如用于表达蛋白质和/或将这些多核苷酸序列整合到哺乳动物细胞的基因组中的附加序列元件。可以用于表达本发明的抗体和抗体片段的某些载体包括含有指导基因转录的调控序列(诸如启动子和增强子区域)的质粒。用于表达抗体和抗体片段的其他有用的载体含有多核苷酸序列，该多核苷酸序列增强这些基因的翻译速率或改善由基因转录产生的mRNA的稳定性或核输出。这些序列元件包括例如5′和3′非翻译区和聚腺苷酸化信号位点，以便指导表达载体上携带的基因的有效转录。本文所述的表达载体还可以含有多核苷酸，该多核苷酸编码用于选择含有这种载体的细胞的标记物。适合的标记物的实例包括编码抗生素(如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素或诺尔丝菌素)抗性的基因。
抗体-药物缀合物(ADC)
如本文所述，抗体及其抗原结合片段可缀合(连接)至细胞毒性分子(即，细胞毒素)，从而形成抗体-药物缀合物(ADC)。如本文所用，术语“细胞毒素”、“细胞毒性部分”和“药物”可互换使用。
特别地，如本文公开的ADC包含缀合至鹅膏毒素例如式(V)中列出的鹅膏毒素的抗体(包括其抗原结合片段)，其中当未缀合至抗体时，细胞毒性部分具有细胞毒性或细胞抑制作用。在多种实施方案中，细胞毒性部分在结合在缀合物中时表现出降低的细胞毒性或没有细胞毒性，但在从连接基裂解后恢复细胞毒性。在多种实施方案中，在不从连接基裂解下，细胞毒性部分保持细胞毒性。在一些实施方案中，细胞毒性分子缀合至如本文公开的细胞内化抗体或其抗原结合片段，使得在抗体或其片段被细胞摄取后，细胞毒素可接近其细胞内靶标，并且例如，介导造血细胞死亡。因此，本公开的ADC可以具有通式
Ab-(Z-L-Cy)n，
其中抗体或其抗原结合片段(Ab)缀合(共价连接)至连接基(L)，通过化学部分(Z)缀合至细胞毒性部分(Cy)。
因此，抗体或其抗原结合片段可缀合至如整数n所示的多个药物部分，n代表每个抗体的细胞毒素的平均数，其范围可为例如约1至约20。任何数量的细胞毒素都可以缀合至抗体，例如1、2、3、4、5、6、7或8个。在一些实施方案中，n为1至4。在一些实施方案中，n为1。来自缀合反应的ADC制剂中每个抗体的平均药物部分数可以通过常规手段诸如质谱、ELISA测定和HPLC表征。也可以测定ADC在n方面的定量分布。在某些情况下，可以通过诸如反相HPLC或电泳的方法实现对均质ADC的分离、纯化和表征，其中n是具有其他载药量的ADC的特定值。
对于一些抗体-药物缀合物，n可能受抗体上连接位点的数量的限制。例如，当连接是半胱氨酸硫醇时，抗体可以仅具有一个或数个半胱氨酸硫醇基团，或者可以仅具有一个或数个可以通过其连接连接基的反应性足够的硫醇基团。通常，抗体不含许多可与药物部分连接的游离和反应性半胱氨酸硫醇基团；首先，抗体中的半胱氨酸硫醇残基以二硫键形式存在。在某些实施方案中，可以在部分或全部还原条件下用还原剂诸如二硫苏糖醇(DTT)或三羰基乙基膦(TCEP)来还原抗体，以产生反应性半胱氨酸硫醇基团。在某些实施方案中，更高的载药量，例如n＞5，可能导致某些抗体-药物缀合物的聚集、不溶性、毒性或细胞渗透性丧失。
在某些实施方案中，在缀合反应期间少于理论最大值的药物部分缀合至抗体。如下所述，抗体可包含例如不与药物-连接基中间体或连接基试剂反应的赖氨酸残基。只有最具反应性的赖氨酸基团才能与胺反应性连接基试剂反应。在某些实施方案中，抗体经受变性条件以显示反应性亲核基团，诸如赖氨酸或半胱氨酸。
ADC的负载(药物/抗体比)可以不同方式控制，例如，通过：(i)限制药物-连接基中间体或连接基试剂相对于抗体的摩尔过量，(ii)限制缀合反应时间或温度，(iii)半胱氨酸硫醇修饰的部分或限制性还原条件，(iv)通过重组技术改造抗体的氨基酸序列，使得修饰半胱氨酸残基的数量和位置以控制连接基-药物连接的数量和/或位置。
细胞毒素
本文所述的抗体-药物缀合物的细胞毒素是鹅膏毒素或其衍生物。鹅膏毒素是RNA聚合酶II的有效和选择性抑制剂，因此也抑制受影响细胞的转录和蛋白质生物合成。如本文所用，术语“鹅膏毒素”是指由鬼笔鹅膏(Amanita phalloides)蘑菇产生的肽的鹅膏毒素家族的成员，或其变体或衍生物，诸如其能够抑制RNA聚合酶II活性的变体或衍生物。鹅膏毒素是刚性双环八肽，其具有通过Cys硫与Trp吲哚环的2位之间的连接而交联(形成氨基羧乙基硫色氨酸(tryptathionine))的基本序列Ile-Trp-Gly-Ile-Gly-Cys-Asn(或Asp)-Pro。根据具体的鹅膏毒素，某些氨基酸置换基会因翻译后修饰而有所不同(即Pro至Hyp；Ile至DHIle；和Trp至5-OH Trp)。
鹅膏毒素可以从多种蘑菇物种(例如，鬼笔鹅膏、纹缘盔孢伞(Galerinamarginata)、肉褐鳞小伞(Lepiota brunneo-incarnata))中分离，或者可以半合成或合成制备。不同的蘑菇种类含有不同量的不同鹅膏毒素家族成员。已知该家族的一个成员α-鹅膏蕈碱是真核RNA聚合酶II的极其有效的抑制剂，并且在较小程度上是RNA聚合酶III的抑制剂，从而抑制转录和蛋白质生物合成。Wieland，Int.J.Pept.Protein Res.1983，22(3)：257-276。
各种天然存在的鹅膏毒素的结构由式(III)和附表1表示，并公开于例如Zanotti等人，Int.J.Peptide Protein Res.30，1987，450-459，将其整体援引加入本文。
Figure BDA0003429348370000221
表1：鹅膏毒素结构
名称 R<sub>1</sub> R<sub>2</sub> R<sub>3</sub>，R<sub>4</sub> R<sub>5</sub> R<sub>6</sub>，R<sub>7</sub> R<sub>8</sub> R<sub>9</sub>
α-鹅膏蕈碱 OH OH H OH H NH<sub>2</sub> OH
β-鹅膏蕈碱 OH OH H OH H OH OH
γ-鹅膏蕈碱 OH H H OH H NH<sub>2</sub> OH
ε-鹅膏蕈碱 OH H H OH H OH OH
三羟鹅膏毒肽 OH OH H H H OH OH
三羟鹅膏毒肽酰胺 OH OH H H H NH<sub>2</sub> OH
一羟鹅膏毒肽酰胺 H H H OH H NH<sub>2</sub> OH
一羟鹅膏毒肽羧酸 H H H OH H OH OH
羧基鹅膏毒肽酰胺原 H H H OH H NH<sub>2</sub> H
识别并结合在人干细胞或T细胞的细胞表面上表达的抗原的抗体或其抗原结合片段可以缀合至鹅膏毒素，诸如α-鹅膏蕈碱或其衍生物，如例如美国专利号9,233,173和9,399,681以及美国专利申请公开号2016/0089450、2016/0002298、2015/0218220、2014/0294865中所描述的，其各个公开内容通过援引加入本文，因为它涉及例如鹅膏毒素(诸如α-鹅膏蕈碱)，和可用于共价缀合的共价连接基。本文描述了用于此类过程的鹅膏毒素缀合的示例性方法和连接基。也在本文中描述了根据组合物和方法的可用于缀合至抗体或抗原结合片段的示例性含连接基的鹅膏毒素。
如本文所用，术语“鹅膏毒素衍生物”或“鹅膏蕈碱衍生物”是指已在相对于天然存在的鹅膏毒素(诸如α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱、γ-鹅膏蕈碱、ε-鹅膏蕈碱、三羟鹅膏毒肽、三羟鹅膏毒肽酰胺、一羟鹅膏毒肽酰胺、一羟鹅膏毒肽羧酸或羧基鹅膏毒肽酰胺原(proamanullin))的一个或多个位置处进行化学修饰的鹅膏毒素。在每种情况下，衍生物可以通过天然存在的化合物的化学修饰获得(“半合成的”)，或者可以从完全合成的来源获得。各种鹅膏毒素衍生物的合成路线公开于，例如，美国专利号9,676,702和Perrin等人，J.Am.Chem.Soc.2018，140，p.6513-6517中，它们中的每一个的关于制备和衍生化鹅膏毒素的合成方法均以其整体援引加入本文。
在一些实施方案中，鹅膏毒素或其衍生物由式(V)或其对映异构体或非对映异构体表示：
Figure BDA0003429348370000231
在一些实施方案中，Q是S。在一些实施方案中，Q是亚砜基团。
在一个实施方案中，鹅膏毒素或其衍生物由式(Va)表示：
Figure BDA0003429348370000232
在一些实施方案中，Q是S。在一些实施方案中，Q是亚砜基团。
在该特定实施方案中，鹅膏毒素或其衍生物由式(Vb)表示：
Figure BDA0003429348370000233
在一些实施方案中，Q是S。在一些实施方案中，Q是亚砜基团。
根据本文所述的组合物和方法的可用于与抗体或其抗原结合片段缀合的另外的鹅膏毒素描述于例如WO 2016/142049；WO 2016/071856；WO 2017/149077；WO 2018/115466；和WO 2017/046658中，其公开内容以其整体援引加入本文。
连接基
如本文所用，术语“连接基”是指包含共价键或原子链的二价化学部分，其将抗体或其片段(Ab)共价连接至如本文所述的鹅膏毒素，例如式(IV)、(IVa)、(IVb)、(V)、(Va)或(Vb)的鹅膏毒素，以形成抗体-药物缀合物(ADC)。
抗体和鹅膏毒素的共价连接要求连接基具有两个反应性官能团，即反应意义上的二价。用于连接两个或更多个官能或生物活性部分(诸如肽、核酸、药物、毒素、抗体、半抗原和报告基团)的二价连接基试剂是已知的，并且方法已经描述了它们产生的缀合物(Hermanson，G.T.(1996)Bioconjugate Techniques；Academic Press：New York，p.234-242)。
因此，本发明的连接基具有两个反应性末端，一个用于缀合至抗体，并且另一个用于缀合至鹅膏毒素。连接基的抗体缀合反应性末端(反应性部分，本文定义为Z′)通常是能够通过例如抗体上的半胱氨酸硫醇基团或赖氨酸胺基团缀合至抗体的化学部分，因此通常是硫醇反应性基团，诸如迈克尔受体(如在马来酰亚胺中)，离去基团(诸如氯、溴、碘或R-硫烷基)，或胺反应性基团(诸如羧基)。在下文更完整地描述连接基与抗体的缀合。
连接基的鹅膏毒素缀合反应性末端通常是能够通过与鹅膏毒素分子内的反应性取代基形成键而缀合至鹅膏毒素的化学部分。非限制性实例包括例如，分别经由连接基上的羧基或碱性胺基团与鹅膏毒素上的碱性胺或羧基形成酰胺键，或经由例如连接基上的离去基团，经由鹅膏毒素上的OH基团的烷基化来形成醚等。
当术语“连接基”用于描述缀合形式的连接基时，反应性末端中的一个或两个将不存在(诸如，已转化为化学部分Z的反应性部分Z′，如下文所述)或不完整的(例如仅是羧酸的羰基)，因为连接基和/或鹅膏毒素之间以及连接基和/或抗体或其抗原结合片段之间形成了键。在下文进一步描述此类缀合反应。
多种连接基可用于将所述的抗体、抗原结合片段和配体缀合至细胞毒性分子。通常，适用于本公开的连接基在循环中可以是基本稳定的，但允许在靶细胞内或紧邻靶细胞释放鹅膏毒素。在一些实施方案中，适用于本公开的某些连接基可归类为“可裂解的”或“不可裂解的”。通常，可裂解连接基包含一个或多个响应于生理环境而裂解的官能团。例如，可裂解连接基可包含在细胞内酶(例如组织蛋白酶B)存在下降解的酶底物(例如缬氨酸-丙氨酸)、在细胞区室的酸性环境下降解的酸性可裂解基团(例如腙)，或在细胞内还原环境中降解的可还原基团(例如，二硫键)。相比之下，通常在靶细胞内的ADC的抗体部分的降解(例如，溶酶体降解)期间从ADC释放不可裂解连接基。
不可裂解连接基
适用于本文的不可裂解连接基可进一步包含一个或多个选自以下的基团：键、-(C＝O)-、C1-C6亚烷基、C1-C6亚杂烷基、C2-C6亚烯基、C2-C6亚杂烯基、C2-C6亚炔基、C2-C6亚杂炔基、C3-C6亚环烷基、亚杂环烷基、亚芳基、亚杂芳基和它们的组合，其中每一个都可任选地被一个或多个杂原子(例如，S、N或O)取代，和/或可以包含代替一个或多个碳原子的一个或多个杂原子(例如，S、N或O)。此类基团的非限制性实例包括针对每种情况独立地选择的(CH2)p、(C＝O)(CH2)p和聚乙二醇(PEG；(CH2CH2O)p)单元，其中p是1-6的整数。
在一些实施方案中，连接基L包含以下中的一种或多种：键、-(C＝O)-、-C(O)NH-基团、-OC(O)NH-基团、C1-C6亚烷基、C1-C6亚杂烷基、C2-C6亚烯基、C2-C6亚杂烯基、C2-C6亚炔基、C2-C6亚杂炔基、C3-C6亚环烷基、亚杂环烷基、亚芳基、亚杂芳基、-(CH2CH2O)p-基团(其中p为1-6的整数)，或增溶基团；
其中每个C1-C6亚烷基、C1-C6亚杂烷基、C2-C6亚烯基、C2-C6亚杂烯基、C2-C6亚炔基、C2-C6亚杂炔基、C3-C6亚环烷基、亚杂环烷基、亚芳基或亚杂芳基可任选地被1至5个针对每种情况独立地选自以下的取代基所取代：烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、烷芳基、烷基杂芳基、氨基、铵、酰基、酰氧基、酰氨基、氨基羰基、烷氧羰基、脲基、氨基甲酸酯、芳基、杂芳基、亚磺酰基、磺酰基、羟基、烷氧基、硫烷基(sulfanyl)、卤素、羧基、三卤代甲基、氰基、羟基、巯基和硝基；
在一些实施方案中，每个C1-C6亚烷基、C1-C6亚杂烷基、C2-C6亚烯基、C2-C6亚杂烯基、C2-C6亚炔基、C2-C6亚杂炔基、C3-C6亚环烷基、亚杂环烷基、亚芳基或亚杂芳基可任选地被一个或多个选自O、S和N的杂原子间断。
在一些实施方案中，每个C1-C6亚烷基、C1-C6亚杂烷基、C2-C6亚烯基、C2-C6亚杂烯基、C2-C6亚炔基、C2-C6亚杂炔基、C3-C6亚环烷基、亚杂环烷基、亚芳基或亚杂芳基可任选地被一个或多个选自O、S和N的杂原子间断，并且可任选地被1至5个针对每种情况独立地选自以下的取代基所取代：烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、烷芳基、烷基杂芳基、氨基、铵、酰基、酰氧基、酰氨基、氨基羰基、烷氧羰基、脲基、氨基甲酸酯、芳基、杂芳基、亚磺酰基、磺酰基、羟基、烷氧基、硫烷基、卤素、羧基、三卤代甲基、氰基、羟基、巯基和硝基。
在一些实施方案中，连接基L包含式-Oa-C(O)NH-SO2-N(R1)-的增溶基团，其中：
a是0或1；
R1选自氢、C1-C24烷基、C3-C24环烷基、C2-C24(杂)芳基、C3-C24烷基(杂)芳基和C3-C24(杂)芳基烷基，其中每一个可任选地被一个或多个选自O、S和NR3的杂原子取代或任选地被其间断，其中R3独立地选自氢和C1-C4烷基。此类增溶基团描述于例如美国专利号9,636,421和美国专利申请公开号2017/0298145中，它们中每一个的公开内容以其整体援引加入本文。
在一些实施方案中，式-Oa-C(O)NH-SO2-N(R1)-的增溶基团进一步包含C1-C6亚烷基或-(CH2CH2O)p-基团，其中p是1-6的整数。此类增溶基团的非限制性实例包括上表2中描述的那些。
表2：示例性增溶基团
Figure BDA0003429348370000251
在一些实施方案中，不可裂解连接基包含-(CH2)n-单元，其中n是2-12的整数，例如2-6。在一些实施方案中，不可裂解连接基包含-(CH2)n-，其中n是1、2、3、4、5或6。在一些实施方案中，不可裂解连接基是由下式表示的-(CH2)n-，其中n是6：
Figure BDA0003429348370000252
可裂解连接基
在一些实施方案中，缀合抗体或其抗原结合片段和鹅膏毒素的连接基在细胞内条件下是可裂解的，使得连接基的裂解在细胞内环境中从抗体释放药物单元。可裂解连接基旨在利用局部环境的差异，诸如细胞外和细胞内环境，包括例如pH、还原电位或酶浓度，来触发目标细胞中鹅膏毒素的释放。通常，可裂解连接基在循环中相对稳定，但在细胞内环境中通过一种或多种机制(例如，包括但不限于蛋白酶、肽酶和葡萄糖醛酸酶的活性)特别容易裂解。本文使用的可裂解连接基在循环血浆中和/或靶细胞外基本稳定，而可以在靶细胞内或在靶细胞附近以某种有效速率裂解。
合适的可裂解连接基包括可以例如通过酶促水解、光解、酸性条件下的水解、碱性条件下的水解、氧化、二硫键还原、亲核裂解或有机金属裂解而裂解的那些(参见例如Leriche等人，Bioorg.Med.Chem.，20：571-582，2012，其各个公开内容通过援引加入本文，因为其涉及适用于共价缀合的连接基)。合适的可裂解连接基可包括例如化学部分，诸如肼、二硫化物、硫醚或二肽。
在酸性条件下可水解的连接基包括例如腙、缩氨基脲、缩氨基硫脲、顺乌头酰胺、原酸酯、缩醛、缩酮等(参见例如，美国专利号5,122,368；5,824,805；5,622,929；Dubowchik和Walker，1999，Pharm.Therapeutics 83∶67-123；Neville等人，1989，Biol.Chem.264：14653-14661，其中每一个的公开内容以其整体援引加入本文，因为其涉及适用于共价缀合的连接基)。这种连接基在中性pH条件下(诸如血液中的那些)相对稳定，但在低于pH5.5或5.0(溶酶体的近似pH)下不稳定。
在还原条件下可裂解连接基包括例如二硫化物。多种二硫化物连接基是本领域已知的，包括例如可以使用SATA(N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫代乙酸酯)、SPDP(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯)、SPDB(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丁酸酯)和SMPT(N-琥珀酰亚胺基-氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫基)甲苯)、SPDB和SMPT形成的那些(参见，例如，Thorpe等人，1987，Cancer Res.47：5924-5931；Wawrzynczak等人，InImmunoconjugates：Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer(C.W.Vogel ed.，Oxford U.Press，1987)。还参见美国专利号4,880,935，其中每一个的公开内容以其整体援引加入本文，因为其涉及适用于共价缀合的连接基。
对酶水解敏感的连接基可以是例如被细胞内肽酶或蛋白酶裂解的含肽连接基，包括但不限于溶酶体或核内体蛋白酶。使用治疗剂的细胞内蛋白水解释放的一个优点是当缀合时该试剂通常被减弱并且缀合物的血清稳定性通常高。在一些实施方案中，肽基连接基为至少两个氨基酸长或至少三个氨基酸长。示例性氨基酸连接基包括二肽、三肽、四肽或五肽。合适的肽的实例包括含有氨基酸诸如缬氨酸、丙氨酸、瓜氨酸(Cit)、苯丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸和甘氨酸的那些。包含氨基酸连接基组分的氨基酸残基包括天然存在的那些，以及次要氨基酸和非天然存在的氨基酸类似物，诸如瓜氨酸。示例性二肽包括缬氨酸-瓜氨酸(vc或val-cit)和丙氨酸-苯丙氨酸(af或ala-phe)。示例性三肽包括甘氨酸-缬氨酸-瓜氨酸(gly-val-cit)和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(gly-gly-gly)。在一些实施方案中，连接基包括二肽，诸如Val-Cit、Ala-Val或Phe-Lys、Val-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit、Phe-Arg或Trp-Cit。含有二肽诸如Val-Cit或Phe-Lys的连接基公开于例如美国专利号6,214,345，其公开内容以其整体援引加入本文，因为其涉及适用于共价缀合的连接基。在一些实施方案中，连接基包含选自Val-Ala和Val-Cit的二肽。
适用于将本文所述的抗体、抗原结合片段缀合至细胞毒性分子的连接基包括能够通过1，6-消除过程释放鹅膏毒素的连接基。能够进行这种消除过程的化学部分包括对氨基苄基(PAB)基团、6-马来酰亚胺己酸、pH敏感碳酸酯和Jain等人，Pharm.Res.32：3526-3540，2015中描述的其他试剂，其公开内容以其整体援引加入本文，因为其涉及适用于共价缀合的连接基。
在一些实施方案中，连接基包括“自降解”基团诸如前述PAB或PABC(对氨基苄氧基羰基)，其公开于例如Carl等人，J.Med.Chem.(1981)24∶479-480；Chakravarty等人(1983)J.Med.Chem.26：638-644；US 6214345；US20030130189；US20030096743；US6759509；US20040052793；US6218519；US6835807；US6268488；US20040018194；W098/13059；US20040052793；US6677435；US5621002；US20040121940；W02004/032828)。能够进行该过程的其他此类化学部分(“自降解连接基”)包括亚甲基氨基甲酸酯和杂芳基诸如氨基噻唑、氨基咪唑、氨基嘧啶等。含有此类杂环自降解基团的连接基公开于例如美国专利公开号20160303254和20150079114，和美国专利号7,754,681；Hay等人(1999)Bioorg.Med.Chem.Lett.9∶2237；US2005/0256030；de Groot等人(2001)J.Org.Chem.66：8815-8830；和US7223837中。在一些实施方案中，二肽与自降解连接基组合使用。
在一些实施方案中，连接基L包含以下中的一种或多种：肼、二硫化物、硫醚、氨基酸、由至多10个氨基酸组成的肽、对氨基苄基(PAB)基团、杂环自降解基团、C1-C6烷基、C1-C6杂烷基、C2-C6烯基、C2-C6杂烯基、C2-C6炔基、C2-C6杂炔基、C3-C6环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、-(C＝O)-基团、-C(O)NH-基团、-OC(O)NH-基团、-(CH2CH2O)p-基团(其中p是1-6的整数)，或增溶基团；
其中每个C1-C6烷基、C1-C6杂烷基、C2-C6烯基、C2-C6杂烯基、C2-C6炔基、C2-C6杂炔基、C3-C6环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基可任选地被1至5个针对每种情况独立地选自以下的取代基所取代：烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、烷芳基、烷基杂芳基、氨基、铵、酰基、酰氧基、酰氨基、氨基羰基、烷氧羰基、脲基、氨基甲酸酯、芳基、杂芳基、亚磺酰基、磺酰基、羟基、烷氧基、硫烷基、卤素、羧基、三卤代甲基、氰基、羟基、巯基和硝基。
在一些实施方案中，每个C1-C6烷基、C1-C6杂烷基、C2-C6烯基、C2-C6杂烯基、C2-C6炔基、C2-C6杂炔基、C3-C6环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基可任选地被一个或多个选自O、S和N的杂原子间断。
在一些实施方案中，每个C1-C6烷基、C1-C6杂烷基、C2-C6烯基、C2-C6杂烯基、C2-C6炔基、C2-C6杂炔基、C3-C6环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基可任选地被一个或多个选自O、S和N的杂原子间断，并且可任选地被1至5个针对每种情况独立地选自以下的取代基所取代：烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、烷芳基、烷基杂芳基、氨基、铵、酰基、酰氧基、酰氨基、氨基羰基、烷氧羰基、脲基、氨基甲酸酯、芳基、杂芳基、亚磺酰基、磺酰基、羟基、烷氧基、硫烷基、卤素、羧基、三卤代甲基、氰基、羟基、巯基和硝基。
本领域技术人员将认识到，所列基团中的一个或多个可以以二价(双价基团)种类的形式存在，例如C1-C6亚烷基等。
在一些实施方案中，连接基L包含式-Oa-C(O)NH-SO2-N(R1)-的增溶基团，其中：
a是0或1；
R1选自氢、C1-C24烷基、C3-C24环烷基、C2-C24(杂)芳基、C3-C24烷基(杂)芳基和C3-C24(杂)芳基烷基，其中每一个可任选地被一个或多个选自O、S和NR3的杂原子取代或任选地被其间断，其中R3独立地选自氢和C1-C4烷基。此类增溶基团描述于例如美国专利号9,636,421和美国专利申请公开号2017/0298145中，它们中每一个的公开内容以其整体援引加入本文。
在一些实施方案中，式-Oa-C(O)NH-SO2-N(R1)-的增溶基团进一步包含C1-C6亚烷基或-(CH2CH2O)p-基团，其中p是1-6的整数。此类增溶基团的非限制性实例包括上表2中描述的那些。
在一些实施方案中，连接基包括对氨基苄基(PAB)。在一个实施方案中，对氨基苄基位于细胞毒性药物和连接基中的蛋白酶裂解位点之间。在一个实施方案中，对氨基苄基是对氨基苄氧基羰基单元的一部分。在一个实施方案中，对氨基苄基是对氨基苄基氨基单元的一部分。
在一些实施方案中，连接基包含选自Phe-Lys、Val-Lys、Phe-Ala、Phe-Cit、Val-Ala、Val-Cit和Val-Arg的二肽。在一些实施方案中，连接基包含PAB、Val-Cit-PAB、Val-Ala-PAB、Val-Lys(Ac)-PAB、Phe-Lys-PAB、Phe-Lys(Ac)-PAB、D-Val-Leu-Lys、Gly-Gly-Arg、Ala-Ala-Asn-PAB或Ala-PAB中的一种或多种。
在一些实施方案中，连接基包含肽、低聚糖、-(CH2)p-、-(CH2CH2O)p、-PAB、Val-Cit-PAB、Val-Ala-PAB、Val-Lys(Ac)-PAB、Phe-Lys-PAB、Phe-Lys(Ac)-PAB、D-Val-Leu-Lys、Gly-Gly-Arg、Ala-Ala-Asn-PAB或Ala-PAB中的一种或多种的组合。
在一些实施方案中，连接基包含-(C＝O)(CH2)p-单元，其中p是1-6的整数。
在一些实施方案中，连接基包含由下式表示的PAB-Ala-Val-丙酰基：
Figure BDA0003429348370000271
在一些实施方案中，连接基包含由下式表示的PAB-Cit-Val-丙酰基：
Figure BDA0003429348370000272
此类PAB-二肽-丙酰基连接基公开于例如国际专利申请公开号WO2017/149077中，其以其整体援引加入本文。此外，WO2017/149077中公开的细胞毒素通过援引加入本文。
本领域技术人员将认识到，本文公开的任何一种或多种化学基团、部分和特征可以多种方式组合以形成用于缀合如本文公开的抗体和鹅膏毒素的连接基。与本文所述的组合物和方法结合使用的其他连接基描述于例如美国专利申请公开号2015/0218220，其公开内容以其整体援引加入本文。
连接基-鹅膏毒素和连接基-抗体缀合
在某些实施方案中，连接基在适当条件下与根据式(V)、(Va)或(Vb)中任一个的鹅膏毒素或其衍生物反应以形成连接基-鹅膏毒素缀合物。在某些实施方案中，反应性基团用于鹅膏毒素或连接基上以形成共价连接。
鹅膏毒素-连接基缀合物随后在适当条件下与抗体、衍生抗体或其抗原结合片段反应以形成ADC。或者，连接基可首先与抗体、衍生抗体或其抗原结合片段反应以形成连接基-抗体缀合物，然后与鹅膏毒素反应以形成ADC。现在将更全面地描述此类缀合反应。
许多不同的反应可用于连接基或鹅膏毒素-连接基缀合物与抗体或其抗原结合片段的共价连接。抗体分子上合适的连接点包括但不限于赖氨酸的胺基、谷氨酸和天冬氨酸的游离羧酸基团、半胱氨酸的巯基和芳族氨基酸的多种部分。例如，可以使用碳二亚胺反应进行非特异性共价连接以将连接基上的羧基(或氨基)基团连接到抗体部分上的氨基(或羧基)基团。此外，双官能试剂诸如二醛或亚氨酸酯也可用于将连接基上的氨基连接到抗体部分上的氨基。还可用于将鹅膏毒素连接到抗体部分的是席夫碱反应。该方法涉及将抗体或连接基上的二醇或羟基进行高碘酸盐氧化，从而形成醛，该醛然后分别与连接基或抗体反应。共价键的形成是通过在醛和氨基之间形成席夫碱而发生的。异硫氰酸酯也可用作偶联剂以将鹅膏毒素或抗体部分共价连接至连接基。其他技术是技术人员已知的并且在本公开的范围内。
可用于缀合至本文所述的抗体或抗原结合片段的连接基包括但不限于含有化学部分Z的连接基，其通过抗体与如表3所述的连接基上的反应性化学部分(在本文中称为反应性取代基，Z′)之间的偶联反应形成。波浪线分别表示与抗体或抗原结合片段以及细胞毒性分子的连接点。
表3：通过在抗体-药物缀合物的形成中的偶联反应形成的示例性化学部分Z。
Figure BDA0003429348370000281
Figure BDA0003429348370000291
Figure BDA0003429348370000301
本领域技术人员将认识到，连接至连接基的反应性取代基Z′和抗体或其抗原结合片段上的反应性取代基参与共价偶联反应以产生化学部分Z，并且将识别反应性取代基Z′。因此，与本文所述的方法结合使用的抗体-药物缀合物可以通过抗体或其抗原结合片段与如本文所述的连接基或鹅膏毒素-连接基缀合物的反应形成，该连接基或鹅膏毒素-连接基缀合物包含适用于与抗体或其抗原结合片段上的反应性取代基反应以形成化学部分Z的反应性取代基Z′。
如表3所示，连接基上合适的反应性取代基Z′和抗体或其抗原结合片段上的反应性取代基的实例包括亲核体/亲电体对(例如硫醇/卤代烷基对、胺/羰基对，或硫醇/α，β-不饱和羰基对等)、二烯/亲二烯对(例如，叠氮化物/炔对，或二烯/α，β-不饱和羰基对等)等。用以形成化学部分Z的在反应性取代基之间的偶联反应包括但不限于硫醇烷基化、羟基烷基化、胺烷基化、胺或羟胺缩合、肼形成、酰胺化、酯化、二硫键形成、环加成(例如[4+2]Diels-Alder环加成、[3+2]Huisgen环加成等)、亲核芳族取代、亲电芳族取代和本领域已知或本文所述的其他反应形式。在一些实施方案中，反应性取代基Z′是适合与抗体或其抗原结合片段上的亲核官能团反应的亲电官能团。
如本文所公开的，可存在于抗体或其抗原结合片段中的反应性取代基包括但不限于亲核基团诸如(i)N-末端胺基团，(ii)侧链胺基团，例如赖氨酸，(iii)侧链硫醇基团，例如半胱氨酸，和(iv)糖羟基或氨基，其中抗体被糖基化。如本文所公开，可存在于抗体或其抗原结合片段中的反应性取代基包括但不限于丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基的羟基部分；赖氨酸残基的氨基部分；天冬氨酸和谷氨酸残基的羧基部分；和半胱氨酸残基的硫醇部分，以及非天然存在的氨基酸的炔丙基、叠氮基、卤代芳基(例如，氟芳基)、卤代杂芳基(例如，氟杂芳基)、卤代烷基和卤代杂烷基部分。在一些实施方案中，本文公开的抗体或其抗原结合片段中存在的反应性取代基包括胺或硫醇部分。某些抗体具有可还原的链间二硫键，即半胱氨酸桥。通过用还原剂例如DTT(二硫苏糖醇)处理，可以使抗体具反应性以与连接基试剂进行缀合。因此，理论上每个半胱氨酸桥将形成两个反应性硫醇亲核体。额外的亲核基团可以通过赖氨酸与2-亚氨基噻戊烷(Traut试剂)的反应引入到抗体中，从而导致胺转化为硫醇。可通过引入一个、两个、三个、四个或更多个半胱氨酸残基(例如，制备包含一个或多个非天然半胱氨酸氨基酸残基的突变抗体)将反应性硫醇基团引入抗体(或其片段)中。美国专利号7,521,541教导了通过引入反应性半胱氨酸氨基酸来改造抗体。
在一些实施方案中，连接至连接基的反应性取代基Z′是与抗体上存在的亲电子基团反应的亲核基团。抗体上有用的亲电子基团包括但不限于醛和酮羰基。亲核基团(例如，a)杂原子可与抗体上的亲电子基团反应并与抗体形成共价键。有用的亲核基团包括但不限于酰肼、肟、氨基、羟基、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸酯和芳酰肼。
在一些实施方案中，化学部分Z是抗体或其抗原结合片段内存在的反应性亲核取代基(诸如胺和硫醇部分)与连接到连接基的反应性亲电取代基Z′之间反应的产物。例如，Z′可以是迈克尔受体(例如马来酰亚胺)、活化酯、缺电子羰基化合物或醛等。
在表4中提供了反应性取代基Z′和所得化学部分Z的数个代表性和非限制性实例。
表4：互补的反应性取代基和化学部分
Figure BDA0003429348370000311
例如，适用于合成连接基-抗体缀合物和ADC的连接基包括但不限于连接至连接基的反应性取代基Z′，诸如马来酰亚胺或卤代烷基。这些可以通过例如，在例如Liu等人，18：690-697，1979中描述的试剂诸如4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-L-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)、碘乙酸N-琥珀酰亚胺酯(SIA)、磺基-SMCC、间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、磺基-MBS和碘乙酸琥珀酰亚胺酯等，其公开内容通过援引加入本文中，因为它涉及用于化学缀合的连接基。
在一些实施方案中，连接至连接基L的反应性取代基Z′是马来酰亚胺、叠氮化物或炔烃。含马来酰亚胺的连接基的一个实例是不可裂解的基于马来酰亚胺基己酰基的连接基，其对于微管破坏剂如澳瑞他汀的偶联特别有用。Doronina等人，Bioconjugate Chem.17∶14-24，2006描述了此类连接基，其公开内容通过援引加入本文，因为它涉及用于化学缀合的连接基。
在一些实施方案中，反应性取代基Z′是-(C＝O)-或-NH(C＝O)-，使得连接基可以分别通过酰胺或脲部分连接至抗体或其抗原结合片段，从而导致-(C＝O)-或-NH(C＝O)-基团与抗体或其抗原结合片段的氨基的反应。
在一些实施方案中，反应性取代基Z′是N-马来酰亚胺基、卤代N-烷基氨基、磺酰氧基N-烷基氨基、碳酸酯基、磺酰卤代基、硫醇基团或其衍生物、包含内部碳-碳三键的炔基、(杂)环炔基、双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基、包含内部碳-碳双键的烯基、环烯基、四嗪基、叠氮基、膦基、腈氧化物基、硝酮基、腈亚胺基、重氮基、酮基、(O-烷基)羟氨基、肼基、卤代N-马来酰亚胺基、1，1-双(磺酰基甲基)甲基羰基或其消除衍生物、羰基卤代基团或联烯酰胺(allenamide)基团，其中的每一个都可任选地被取代。在一些实施方案中，反应性取代基包含环烯基、环炔基或任选取代的(杂)环炔基。
在一些实施方案中，化学部分Z选自表3或表4。在一些实施方案中，化学部分Z是：
Figure BDA0003429348370000321
其中S是硫原子，其代表抗体或其抗原结合片段中存在的反应性取代基(例如，来自半胱氨酸残基的-SH基团)，该抗体或其抗原结合片段与在人类干细胞或T细胞的细胞表面上表达的抗原特异性地结合。
在一些实施方案中，在与抗体或其抗原结合片段缀合之前，连接基-反应性取代基团(共同构成L-Z′)具有以下结构：
Figure BDA0003429348370000322
其中波浪线表示与鹅膏毒素上的取代基的连接点。该连接基-反应性取代基团L-Z′也可以备选地称为N-β-马来酰亚胺基丙基-Val-Ala-对氨基苄基(BMP-Val-Ala-PAB)。连接基末端的波浪线表示与鹅膏毒素的连接点。在一些实施方案中，缀合至抗体之后的连接基L和化学部分Z(共同构成L-Z-Ab)具有以下结构：
Figure BDA0003429348370000323
其中S是硫原子，其代表抗体或其抗原结合片段中存在的反应性取代基(例如，来自半胱氨酸残基的-SH基团)，该抗体或其抗原结合片段与在人类干细胞或T细胞的细胞表面上表达的抗原特异性地结合。连接基末端的波浪线表示与鹅膏毒素的连接点。
在一些实施方案中，在与抗体或其抗原结合片段缀合之前，连接基-反应性取代基团(共同构成L-Z′)具有以下结构：
Figure BDA0003429348370000324
该连接基-反应性取代基团也可以备选地称为1-正己基-马来酰亚胺，其是不可裂解连接基。连接基末端的波浪线表示与鹅膏毒素的连接点。
在一些实施方案中，缀合至抗体之后的连接基L和化学部分Z(共同构成L-Z-Ab)具有以下结构：
Figure BDA0003429348370000325
其中S是硫原子，其代表抗体或其抗原结合片段中存在的反应性取代基(例如，来自半胱氨酸残基的-SH基团)，该抗体或其抗原结合片段与在细胞，例如肿瘤细胞或人类干细胞或T细胞的细胞表面上表达的抗原特异性地结合。连接基末端的波浪线表示与鹅膏毒素的连接点。本领域技术人员将认识到，在该实施方案中，连接基-反应性取代基结构L-Z′在与抗体或其抗原结合片段缀合之前包含马来酰亚胺作为基团Z′。与本文所述的组合物和方法结合使用的前述连接基部分和鹅膏毒素-连接基缀合物等描述于例如美国专利申请公开号2015/0218220和美国申请公开号WO2017/149077，其中的每一个的公开内容以其整体援引加入本文。
在一个方面，本文公开的ADC的细胞毒素是由式(V)、(Va)或(Vb)中任一个表示的鹅膏毒素或其衍生物。本领域技术人员将认识到这样的鹅膏毒素对与连接基的连接点具有多种可能性。
在一些实施方案中，鹅膏毒素具有式(V)的结构，并且连接基通过醚键连接至羟基色氨酸残基的OH基团。在此类实施方案中，ADC可以由式(I)或其立体异构体表示：
Figure BDA0003429348370000331
其中：
Q是S；
L是连接基；
Z是通过L上存在的反应性取代基与抗体或其抗原结合片段中存在的反应性取代基之间的偶联反应形成的化学部分；并且
Ab是抗体，
每一个均如本文所公开。
在一些实施方案中，鹅膏毒素具有式(Va)的结构，并且连接基通过醚键连接至羟基色氨酸残基的OH基团。在此类实施方案中，ADC可以由式(Ia)表示：
Figure BDA0003429348370000332
在一些实施方案中，鹅膏毒素具有式(Vb)的结构，并且连接基通过醚键连接至羟基色氨酸残基的OH基团。在此类实施方案中，ADC可以由式(Ib)表示：
Figure BDA0003429348370000341
在一些实施方案中，式(I)、(Ia)或(Ib)的ADC的连接基L是不可裂解连接基。在一些实施方案中，不可裂解连接基L包含以下中的一种或多种：键、-(C＝O)-、-C(O)NH-基团、-OC(O)NH-基团、C1-C6亚烷基、C1-C6亚杂烷基、C2-C6亚烯基、C2-C6亚杂烯基、C2-C6亚炔基、C2-C6亚杂炔基、C3-C6亚环烷基、亚杂环烷基、亚芳基、亚杂芳基、-(CH2CH2O)p-基团(其中p为1-6的整数)，或增溶基团；
其中每个C1-C6亚烷基、C1-C6亚杂烷基、C2-C6亚烯基、C2-C6亚杂烯基、C2-C6亚炔基、C2-C6亚杂炔基、C3-C6亚环烷基、亚杂环烷基、亚芳基或亚杂芳基可任选地被1至5个针对每种情况独立地选自以下的取代基所取代：烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、烷芳基、烷基杂芳基、氨基、铵、酰基、酰氧基、酰氨基、氨基羰基、烷氧羰基、脲基、氨基甲酸酯、芳基、杂芳基、亚磺酰基、磺酰基、羟基、烷氧基、硫烷基、卤素、羧基、三卤代甲基、氰基、羟基、巯基和硝基；或者
每个C1-C6亚烷基、C1-C6亚杂烷基、C2-C6亚烯基、C2-C6亚杂烯基、C2-C6亚炔基、C2-C6亚杂炔基、C3-C6亚环烷基、亚杂环烷基、亚芳基或亚杂芳基可任选地被一个或多个选自O、S和N的杂原子间断。
在一些实施方案中，不可裂解连接基L包含式-Oa-C(O)NH-SO2-NR1-的增溶基团，其中：
a是0或1；并且
R1选自氢、C1-C24烷基、C3-C24环烷基、C2-C24(杂)芳基、C3-C24烷基(杂)芳基和C3-C24(杂)芳基烷基，其中每一个可任选地被一个或多个选自O、S和NR3的杂原子取代、任选地间断或者二者，其中R3独立地选自氢和C1-C4烷基。
在一些实施方案中，不可裂解连接基L包含-(CH2)n-单元，其中n是2-6的整数。在一些实施方案中，不可裂解连接基L是-(CH2)n-，其中n是6。
在一些实施方案中，Ab、Z和不可裂解连接基L(共同构成Ab-Z-L)由下式表示：
Figure BDA0003429348370000342
其中S是硫原子，其代表抗体或其抗原结合片段中存在的反应性取代基(例如，来自半胱氨酸残基的-SH基团)，该抗体或其抗原结合片段与在细胞，例如人类干细胞或T细胞的细胞表面上表达的抗原特异性地结合。连接基末端的波浪线表示与鹅膏毒素的连接点。
在一些实施方案中，根据式(I)的ADC由式(II)、其立体异构体或其药学上可接受的盐表示：
Figure BDA0003429348370000351
在一些实施方案中，根据式(II)的ADC由式(IIa)、其立体异构体或其药学上可接受的盐表示：
Figure BDA0003429348370000352
在一些实施方案中，根据式(II)的ADC由式(IIb)、其立体异构体或其药学上可接受的盐表示：
Figure BDA0003429348370000353
令人惊讶地，根据本公开，已经发现，与包含鹅膏毒素和可裂解连接基的ADC相比，包含鹅膏毒素和将鹅膏毒素缀合至ADC的抗体部分的不可裂解连接基的ADC具有改善的耐受性。例如，在一些实施方案中，改善的耐受性可以是增加的治疗指数。在一些实施方案中，改善的耐受性可以是与包含可裂解连接基的ADC相比，在特定剂量的包含不可裂解连接基的ADC下，一种或多种血液肝酶水平(例如AST、ALT、ADH或总胆红素)的较小升高或不升高。
在一些实施方案中，式(I)、(Ia)或(Ib)的ADC的连接基L是可裂解连接基。在一些实施方案中，可裂解连接基L包含以下中的一种或多种：肼、二硫化物、硫醚、氨基酸、由至多10个氨基酸组成的肽、对氨基苄基(PAB)基团、杂环自降解基团、C1-C6烷基、C1-C6杂烷基、C2-C6烯基、C2-C6杂烯基、C2-C6炔基、C2-C6杂炔基、C3-C6环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、-(C＝O)-基团、-C(O)NH-基团、-OC(O)NH-基团、-(CH2CH2O)p-基团(其中p是1-6的整数)，或增溶基团；
其中每个C1-C6烷基、C1-C6杂烷基、C2-C6烯基、C2-C6杂烯基、C2-C6炔基、C2-C6杂炔基、C3-C6环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基可任选地被1至5个针对每种情况独立地选自以下的取代基所取代：烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、烷芳基、烷基杂芳基、氨基、铵、酰基、酰氧基、酰氨基、氨基羰基、烷氧羰基、脲基、氨基甲酸酯、芳基、杂芳基、亚磺酰基、磺酰基、羟基、烷氧基、硫烷基、卤素、羧基、三卤代甲基、氰基、羟基、巯基和硝基；
或者每个C1-C6烷基、C1-C6杂烷基、C2-C6烯基、C2-C6杂烯基、C2-C6炔基、C2-C6杂炔基、C3-C6环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基可任选地被一个或多个选自O、S和N的杂原子间断。
在一些实施方案中，可裂解连接基L包含式-Oa-C(O)NH-SO2-NR1-的增溶基团，其中：
a是0或1；并且
R1选自氢、C1-C24烷基、C3-C24环烷基、C2-C24(杂)芳基、C3-C24烷基(杂)芳基和C3-C24(杂)芳基烷基，其中每一个可任选地被一个或多个选自O、S和NR3的杂原子取代或任选地被其间断，其中R3独立地选自氢和C1-C4烷基。
在一些实施方案中，可裂解连接基L包含选自Phe-Lys、Val-Lys、Phe-Ala、Phe-Cit、Val-Ala、Val-Cit和Val-Arg的肽。
在一些实施方案中，可裂解连接基L进一步包含PAB基团。
在一些实施方案中，可裂解连接基L由下式表示：
Figure BDA0003429348370000361
抗体-药物缀合物的制备
在如本文公开的式Ab-(Z-L-Cy)n的ADC中，诸如式(I)、(Ia)或(Ib)，(II)、(IIa)或(IIb)中任一个的ADC中，抗体或其抗原结合片段(Ab)通过连接基L和化学部分Z(各自如本文所公开)缀合至一个或多个细胞毒性药物部分(Cy；例如，鹅膏毒素)，例如每个抗体约1至约20个细胞毒性部分。在一些实施方案中，n为1。在一些实施方案中，n为约1至约5、约1至约4、约1至约3或约3至约5。在一些实施方案中，n为约1、约2、约3或约4。
本公开的ADC可以通过采用本领域技术人员已知的有机化学反应、条件和试剂的多种途径制备，包括：(1)抗体或其抗原结合片段的反应性取代基与二价连接基试剂反应以形成如上文所述的Ab-Z-L，随后与细胞毒性部分Cy反应；或(2)细胞毒性部分的反应性取代基与二价连接基试剂反应以形成Cy-L-Z′，随后与上文所述的抗体或其抗原结合片段的反应性取代基反应，以形成式Ab-(Z-L-Cy)n的ADC。本文描述了用于制备ADC的其他方法。
在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段可以具有一个或多个碳水化合物基团，该碳水化合物基团可以被化学修饰以具有一个或多个巯氢基。然后通过如上所述的巯氢基的硫原子进行缀合来形成ADC。
在另一个实施方案中，抗体可具有一个或多个可被氧化以提供醛(-CHO)基团的碳水化合物基团(参见例如Laguzza，等人，J.Med.Chem.1989，32(3)，548-55)。然后通过如上所述的相应醛进行缀合来形成ADC。用于修饰蛋白质以连接或缔合细胞毒素的其他方案描述于通过援引加入本文的Coligan等人，Current Protocols in Protein Science，第2卷，John Wiley&Sons(2002)中。
将连接基-药物部分缀合至细胞靶向蛋白质诸如抗体、免疫球蛋白或其片段的方法可见于例如美国专利号5,208,020；美国专利号6,441,163；WO2005037992；WO2005081711和WO2006/034488，所有这些在此明确地通过援引加入。
或者，可以例如通过重组技术或肽合成制备包含抗体和细胞毒素剂的融合蛋白。DNA的长度可以包括编码缀合物的彼此相邻的或者被编码连接基肽(其不破坏缀合物的期望特性)的区域隔开的两个部分的相应区域。
在一些实施方案中，式(IIa)的ADC可以通过将抗体上的硫醇基团缀合至由以下结构表示的鹅膏毒素-连接基缀合物Cy-L-Z′来制备：
Figure BDA0003429348370000371
该鹅膏毒素-连接基缀合物可根据路线1至3从市售可得的6-羟色氨酸(1)开始制备。化合物1可用叔丁氧羰基酸酐((BOC)2O)保护。六氢吡咯并吲哚3可以在氧气和敏化剂(玫瑰红)存在下在照射受保护的羟色氨酸2时以顺式和反式异构体的混合物形式产生。国际专利申请公开号WO2019/030173中提供了化合物3的制备(以及制备化合物2至Va的操作)，其公开内容以其整体援引加入本文。市售9-芴甲氧羰基(FMOC)保护的4-羟脯氨酸(4)可以用烯丙基溴烷基化，然后在温和的酸性条件(对甲苯磺酸吡啶鎓；PPTS)下连接到四氢吡喃基(THP)聚苯乙烯树脂，以得到树脂结合的烯丙基酯5，其可以用钯四(三苯基磷)钯和二甲基巴比妥酸脱保护以得到中间体6。受保护的氨基酸7可以根据国际专利申请公开号WO2014/009025中报道的方法制备，其公开内容以其整体援引加入本文。然后可以将受保护的胺7缀合至树脂结合的羟脯氨酸6以提供肽8。
路线1.
Figure BDA0003429348370000372
然后肽8可以进行多次偶联和脱保护反应以提供单环中间体9(路线2)。氨基酸FmocAsn(Trt)OH、FmocCys(OTrt)OH、FmocGlyOH、FmocIleOH、FmocGlyOH和六氢吡咯并吲哚3可用于连续固相偶联反应以产生中间体9。在二异丙基乙胺(DIEA)存在下，每个氨基酸都可以使用PyBOP/HOBT在二氯甲烷和二甲基甲酰胺(DMF)中进行偶联。脱保护可以用20％哌啶的DMF溶液进行。
路线2.
Figure BDA0003429348370000381
在最后的偶联反应之后，可以在三异丙基硅烷的存在下用三氟乙酸从固相支持树脂中裂解中间体9，以得到肽10。用叠氮磷酸二苯酯(DPPA)和DIEA处理10诱导大环化，并且用氨甲醇进行脱保护以提供鹅膏毒素衍生物11(即式Va，其中Q＝S)。
马来酰亚胺基己基鹅膏毒素缀合物14可以根据路线3由化合物11制备。Diels-Alder加合物12可以由马来酰亚胺和2，5-二甲基呋喃制备，然后用1，6-二溴己烷烷基化以得到受保护的连接基13。化合物11可以在氢氧化钠的存在下，在二甲亚砜(DMSO)中用化合物13烷基化，随后在DMSO中加热至100℃，以得到鹅膏毒素-连接基缀合物14。制备化合物12和13的操作，以及相关鹅膏毒素(α-鹅膏蕈碱)的O-烷基化已经在先前报道于美国专利申请公开号2018/0043033，其公开内容以其整体援引加入本文。
路线3.
Figure BDA0003429348370000382
抗体
本文公开的ADC组合物和方法包含促进此类ADC选择性递送至靶组织中的细胞群(例如，癌症或肿瘤细胞，或骨髓干细胞生态位的造血干细胞)的试剂。ADC的细胞靶特异性由抗原结合蛋白诸如抗体或其抗原结合部分决定。
在一个实施方案中，本发明包括包含与以下特异性地结合的抗体及其抗原结合片段的ADC：人CD45、CD49d(VLA-4)、CD49f(VLA-6)、CD51、CD84、CD90、CD117、CD133、CD134、CD184(CXCR4)、HLA-DR、CD11a、CD18、CD34、CD41/61、CD43、CD58、CD71、CD97、CD162、CD166、CD205和CD361、CD13、CD33、CD34、CD44、CD4、CD59、CD84/CD150、CD90/Thy1、CD93、CD105/内皮素、CD123/IL-3R、CD126/IL-6R、CD133、CD135/Flt3受体、CD166/ALCAM、Prominin2、促红细胞生成素R、内皮细胞选择性粘附分子、CD244、Tie1、Tie2、MPL、G-CSFR、CSF3R、IL-1R、gp130、白血病抑制因子受体、制瘤素M受体、Embigin和IL-18R。可被本文公开的ADC结合的抗原的其他实例包括但不限于CD7、CDw12、CD13、CD15、CD19、CD21、CD22、CD29、CD30、CD33、CD34、CD36、CD38、CD40、CD41、CD42a、CD42b、CD42c、CD42d、CD43、CD45RA、CD45RB、CD45RC、CD45RO、CD48、CD49b、CD49d、CD49e、CD49f、CD50、CD53、CD55、CD64a、CD68、CD71、CD72、CD73、CD81、CD82、CD85A、CD85K、CD90、CD99、CD104、CD105、CD109、CD110、CD111、CD112、CD114、CD115、CD123、CD124、CD126、CD127、CD130、CD131、CD133、CD135、CD138、CD151、CD157、CD162、CD164、CD168、CD172a、CD173、CD174、CD175、CD175s、CD176、CD183、CD191、CD200、CD201、CD205、CD217、CD220、CD221、CD222、CD223、CD224、CD225、CD226、CD227、CD228、CD229、CD230、CD235a、CD235b、CD236、CD236R、CD238、CD240、CD242、CD243、CD277、CD292、CDw293、CD295、CD298、CD309、CD318、CD324、CD325、CD338、CD344、CD349或CD350。可被本文公开的ADC结合的抗原的其他实例包括但不限于CD11a、CD18、CD37、CD47、CD52、CD58、CD62L、CD69、CD74、CD97、CD103、CD132、CD156a、CD179a、CD79b、CD184、CD232、CD244、CD252、CD302、CD305、CD317和CD361。
在某些实施方案中，本文描述的ADC中的抗体或其抗原结合片段具有一定的解离速率，这在用作缀合物的一部分时特别有利。例如，在某些实施方案中，抗CD117抗体针对人CD117和/或恒河猴CD117具有1x10-2至1x10-3、1x10-3至1x10-4、1x10-5至1x10-6、1x10-6至1x10-7或1x10-7至1x10-8的解离速率常数(Koff)(通过生物层干涉法(BLI)测量)。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段以约100nM或更小、约90nM或更小、约80nM或更小、约70nM或更小、约60nM或更小、约50nM或更小、约40nM或更小、约30nM或更小、约20nM或更小、约10nM或更小、约8nM或更小、约6nM或更小、约4nM或更小、约2nM或更小、约1nM或更小的KD(如通过生物层干涉(BLI)测定确定)来结合细胞表面抗原(例如，人CD117和/或恒河猴CD117)。
抗CD117抗体
在一个实施方案中，本发明包括ADC，该ADC包含与CD117(例如GNNK+CD117)特异性地结合的抗体及其抗原结合片段。此类ADC可用作治疗剂以例如(i)治疗以CD117+细胞为特征的癌症和自身免疫疾病和(ii)促进移植的造血干细胞在需要移植疗法的患者中的植入。这些治疗活性可以由例如结合分离的抗CD117抗体、其抗原结合片段(其与在细胞诸如癌细胞、自身免疫细胞或造血干细胞的表面上表达的CD117(例如GNNK+CD117)结合)并随后诱导细胞死亡引起。内源性造血干细胞的消耗可以为移植的造血干细胞提供生态位，然后建立生产性造血。以这种方式，移植的造血干细胞可以成功地植入到患者中，诸如患有本文所述的干细胞病症的人类患者。
能够结合人CD117的抗体和抗原结合片段(也称为c-Kit、mRNANCBI参考序列：NM_000222.2，蛋白质NCBI参考序列：NP_000213.1)，包括能够结合GNNK+CD117的那些，可以与本文所述的组合物和方法结合使用，以便调理患者进行造血干细胞移植疗法。在非肿瘤适应症中，影响很大比例群体中的CD117的编码区或细胞外结构域的多态性目前尚不为人所知。已鉴定出至少四种CD117的同种型，具有在肿瘤细胞中表达其他同种型的可能。CD117同种型中有两个位于蛋白质的细胞内结构域上，并且两个存在于外部近膜区。在4个氨基酸序列的存在(GNNK+)或不存在(GNNK-)下，两种细胞外同种型GNNK+和GNNK-有所不同。据报道，这些同种型对配体(SCF)具有相同的亲和力，但据报道配体与GNNK同种型结合会增加内化和降解。GNNK+同种型可用作免疫原以产生能够结合CD117的抗体，因为针对该同种型产生的抗体将包括GNNK+和GNNK-蛋白。人CD117同种型1和2的氨基酸序列分别以SEQ ID No：145和146描述。在某些实施方案中，本文公开的抗人CD117(hCD117)抗体能够与人CD117的同种型1和同种型2结合。
如下所述，进行了人抗体的酵母文库筛选以鉴定具有诊断和治疗用途的新型抗CD117抗体及其片段。抗体54(Ab54)、抗体55(Ab55)、抗体56(Ab56)、抗体57(Ab57)、抗体58(Ab58)、抗体61(Ab61)、抗体66(Ab66)、抗体67(Ab67)、抗体68(Ab68)和抗体69(Ab69)是在此筛选中鉴定的人抗体。这些抗体与人CD117和恒河猴CD117发生交叉反应。进一步地，本文所述的这些抗体能够与人CD117的两种同种型(即，同种型1(SEQ ID NO：145)和同种型2(SEQ ID NO：146))结合。
在以下序列表中描述了抗CD117抗体(包括Ab54、Ab55、Ab56、Ab57、Ab58、Ab61、Ab66、Ab67、Ab68和Ab69)的各种结合区的氨基酸序列。本发明所包括的是ADC，该ADC含有包含以下序列表中所列的CDR的人抗CD117抗体，和包含以下序列表中所列的可变区的人抗CD117抗体。
在一个实施方案中，本发明提供包含抗CD117抗体或其抗原结合片段(其包含与抗体55的结合区相对应的结合区，例如CDR、可变区)的ADC。抗体55(即Ab55)的重链可变区(VH)氨基酸序列列于SEQ ID NO：19(参见序列表)中。抗体55的VH CDR结构域氨基酸序列列于SEQ ID NO：21(VH CDR1)；SEQ ID NO：22(VH CDR2)和SEQ ID NO：23(VH CDR3)中。抗体55的轻链可变区(VL)氨基酸序列描述于SEQ ID NO：20(参见序列表)中。抗体55的VL CDR结构域氨基酸序列列于SEQ ID NO：24(VL CDR1)；SEQ ID NO：25(VL CDR2)和SEQ ID NO：26(VLCDR3)中。抗体55的重链恒定区列于SEQ ID NO：122中。抗体55的轻链恒定区列于SEQ IDNO：121中。因此，在某些实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQ ID No：21、22和23中所列的可变重链CDR组(CDR1、CDR2和CDR3)，和如SEQ ID No：24、25和26中所列的轻链可变区CDR组。在其他实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分含有包含SEQ IDNO：20中所列的氨基酸残基的可变轻链，和如SEQ ID NO：19中所列的重链可变区。
在一个实施方案中，本发明提供包含抗CD117抗体或其抗原结合片段(其包含与抗体54的结合区相对应的结合区，例如CDR、可变区)的ADC。抗体54(即Ab54)的重链可变区(VH)氨基酸序列列于SEQ ID NO：29(参见序列表)中。抗体54的VH CDR结构域氨基酸序列列于SEQ ID NO：31(VH CDR1)；SEQ ID NO：32(VH CDR2)和SEQ ID NO：33(VH CDR3)中。抗体54的轻链可变区(VL)氨基酸序列描述于SEQ ID NO：30(参见序列表)中。抗体54的VL CDR结构域氨基酸序列列于SEQ IDNO：34(VL CDR1)；SEQ ID NO：35(VL CDR2)和SEQ ID NO：36(VLCDR3)中。抗体54的重链恒定区列于SEQ ID NO：122中。抗体54的轻链恒定区列于SEQ IDNO：121中。因此，在某些实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQ ID No：31、32和33中所列的可变重链CDR组(CDR1、CDR2和CDR3)，和如SEQ ID No：34、35和36中所列的轻链可变区CDR组。在其他实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分含有包含SEQ IDNO：30中所列的氨基酸残基的可变轻链，和如SEQ ID NO：29中所列的重链可变区。
在一个实施方案中，本发明提供包含抗CD117抗体或其抗原结合片段(其包含与抗体56的结合区相对应的结合区，例如CDR、可变区)的ADC。抗体56(即Ab56)的重链可变区(VH)氨基酸序列列于SEQ ID NO：39(参见序列表)中。抗体56的VH CDR结构域氨基酸序列列于SEQ ID NO：41(VH CDR1)；SEQ ID NO：42(VH CDR2)和SEQ ID NO：43(VH CDR3)中。抗体56的轻链可变区(VL)氨基酸序列描述于SEQ ID NO：40(参见序列表)中。抗体56的VL CDR结构域氨基酸序列列于SEQ ID NO：44(VL CDR1)；SEQ ID NO：45(VL CDR2)和SEQ ID NO：46(VLCDR3)中。抗体56的重链恒定区列于SEQ ID NO：122中。抗体56的轻链恒定区列于SEQ IDNO：121中。因此，在某些实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQ ID No：41、42和43中所列的可变重链CDR组(CDR1、CDR2和CDR3)，和如SEQ ID No：44、45和46中所列的轻链可变区CDR组。在其他实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分含有包含SEQ IDNO：40中所列的氨基酸残基的可变轻链，和如SEQ ID NO：39中所列的重链可变区。
在一个实施方案中，本发明提供包含抗CD117抗体或其抗原结合片段(其包含与抗体57的结合区相对应的结合区，例如CDR、可变区)的ADC。抗体57(即Ab57)的重链可变区(VH)氨基酸序列列于SEQ ID NO：49(参见序列表)中。抗体57的VH CDR结构域氨基酸序列列于SEQ ID NO：51(VH CDR1)；SEQ ID NO：52(VH CDR2)和SEQ ID NO：53(VH CDR3)中。抗体57的轻链可变区(VL)氨基酸序列描述于SEQ ID NO：50(参见序列表)中。抗体57的VL CDR结构域氨基酸序列列于SEQ ID NO：54(VL CDR1)；SEQ ID NO：55(VL CDR2)和SEQ ID NO：56(VLCDR3)中。抗体57的重链恒定区列于SEQ ID NO：122中。抗体57的轻链恒定区列于SEQ IDNO：121中。因此，在某些实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQ ID No：51、52和53中所列的可变重链CDR组(CDR1、CDR2和CDR3)，和如SEQ ID No：54、55和56中所列的轻链可变区CDR组。在其他实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分含有包含SEQ IDNO：50中所列的氨基酸残基的可变轻链，和如SEQ ID NO：49中所列的重链可变区。
在一个实施方案中，本发明提供包含抗CD117抗体或其抗原结合片段(其包含与抗体58的结合区相对应的结合区，例如CDR、可变区)的ADC。抗体58(即Ab58)的重链可变区(VH)氨基酸序列列于SEQ ID NO：59(参见序列表)中。抗体58的VH CDR结构域氨基酸序列列于SEQ ID NO：61(VH CDR1)；SEQ ID NO：62(VH CDR2)和SEQ ID NO：63(VH CDR3)中。抗体58的轻链可变区(VL)氨基酸序列描述于SEQ ID NO：60(参见序列表)中。抗体58的VL CDR结构域氨基酸序列列于SEQ ID NO：64(VL CDR1)；SEQ ID NO：65(VL CDR2)和SEQ ID NO：66(VLCDR3)中。抗体58的重链恒定区列于SEQ ID NO：122中。抗体58的轻链恒定区列于SEQ IDNO：121中。因此，在某些实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQ ID No：61、62和63中所列的可变重链CDR组(CDR1、CDR2和CDR3)，和如SEQ ID No：64、65和66中所列的轻链可变区CDR组。在其他实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分含有包含SEQ IDNO：60中所列的氨基酸残基的可变轻链，和如SEQ ID NO：59中所列的重链可变区。
在一个实施方案中，本发明提供包含抗CD117抗体或其抗原结合片段(其包含与抗体61的结合区相对应的结合区，例如CDR、可变区)的ADC。抗体61(即Ab61)的重链可变区(VH)氨基酸序列列于SEQ ID NO：69(参见序列表)中。抗体61的VH CDR结构域氨基酸序列列于SEQ ID NO：71(VH CDR1)；SEQ ID NO：72(VH CDR2)和SEQ ID NO：73(VH CDR3)中。抗体61的轻链可变区(VL)氨基酸序列描述于SEQ ID NO：70(参见序列表)中。抗体61的VL CDR结构域氨基酸序列列于SEQ ID NO：74(VLCDR1)；SEQ ID NO：75(VLCDR2)和SEQ ID NO：76(VLCDR3)中。抗体61的重链恒定区列于SEQ ID NO：122中。抗体61的轻链恒定区列于SEQ IDNO：121中。因此，在某些实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQ ID No：71、72和73中所列的可变重链CDR组(CDR1、CDR2和CDR3)，和如SEQ ID No：74、75和76中所列的轻链可变区CDR组。在其他实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分含有包含SEQ IDNO：70中所列的氨基酸残基的可变轻链，和如SEQ ID NO：69中所列的重链可变区。
在一个实施方案中，本发明提供包含抗CD117抗体或其抗原结合片段(其包含与抗体66的结合区相对应的结合区，例如CDR、可变区)的ADC。抗体66(即Ab66)的重链可变区(VH)氨基酸序列列于SEQ ID NO：79(参见序列表)中。抗体66的VH CDR结构域氨基酸序列列于SEQ ID NO：81(VH CDR1)；SEQ ID NO：82(VH CDR2)和SEQ ID NO：83(VH CDR3)中。抗体66的轻链可变区(VL)氨基酸序列描述于SEQ ID NO：80(参见序列表)中。抗体66的VL CDR结构域氨基酸序列列于SEQ ID NO：84(VL CDR1)；SEQ ID NO：85(VL CDR2)和SEQ ID NO：86(VLCDR3)中。抗体66的重链恒定区列于SEQ ID NO：122中。抗体66的轻链恒定区列于SEQ IDNO：121中。因此，在某些实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQ ID No：81、82和83中所列的可变重链CDR组(CDR1、CDR2和CDR3)，和如SEQ ID No：84、85和86中所列的轻链可变区CDR组。在其他实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分含有包含SEQ IDNO：80中所列的氨基酸残基的可变轻链，和如SEQ ID NO：79中所列的重链可变区。
在一个实施方案中，本发明提供包含抗CD117抗体或其抗原结合片段(其包含与抗体67的结合区相对应的结合区，例如CDR、可变区)的ADC。抗体67的重链可变区(VH)氨基酸序列列于SEQ ID NO：9(见表2)中。抗体67的VH CDR结构域氨基酸序列列于SEQ ID NO：11(VH CDR1)；SEQ ID NO：12(VH CDR2)和SEQ ID NO：13(VH CDR3)中。抗体67的轻链可变区(VL)氨基酸序列描述于SEQ ID NO：10(参见表2)中。抗体67的VLCDR结构域氨基酸序列列于SEQ ID NO：14(VLCDR1)；SEQ ID NO：15(VL CDR2)和SEQ ID NO：16(VL CDR3)中。抗体67的全长重链(HC)列于SEQ ID NO：110中，并且抗体67的全长重链恒定区列于SEQ ID NO：122中。抗体67的轻链(LC)列于SEQ ID NO：109中。抗体67的轻链恒定区列于SEQ ID NO：121中。因此，在某些实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQ ID No：11、12和13中所列的可变重链CDR组(CDR1、CDR2和CDR3)，和如SEQ ID No：14、15和16中所列的轻链可变区CDR组。在其他实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分含有包含SEQ ID NO：9中所列的氨基酸残基的可变重链，和如SEQ ID NO：10中所列的重链可变区。在进一个实施方案中，抗CD117抗体包含包含SEQ ID NO：110的重链和包含SEQ ID NO：109的轻链。
在一个实施方案中，本发明提供包含抗CD117抗体或其抗原结合片段(其包含与抗体68的结合区相对应的结合区，例如CDR、可变区)的ADC。抗体68(即Ab68)的重链可变区(VH)氨基酸序列列于SEQ ID NO：89(参见序列表)中。抗体68的VH CDR结构域氨基酸序列列于SEQ ID NO：91(VH CDR1)；SEQ ID NO：92(VH CDR2)和SEQ ID NO∶93(VH CDR3)中。抗体68的轻链可变区(VL)氨基酸序列描述于SEQ ID NO：90(参见序列表)中。抗体68的VL CDR结构域氨基酸序列列于SEQ ID NO：94(VL CDR1)；SEQ ID NO：95(VL CDR2)和SEQ ID NO：96(VLCDR3)中。抗体68的重链恒定区列于SEQ ID NO：122中。抗体68的轻链恒定区列于SEQ IDNO：121中。因此，在某些实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQ ID No：91、92和93中所列的可变重链CDR组(CDR1、CDR2和CDR3)，和如SEQ ID No：94、95和96中所列的轻链可变区CDR组。在其他实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分含有包含SEQ IDNO：90中所列的氨基酸残基的可变轻链，和如SEQ ID NO：89中所列的重链可变区。
在一个实施方案中，本发明提供包含抗CD117抗体或其抗原结合片段(其包含与抗体69的结合区相对应的结合区，例如CDR、可变区)的ADC。抗体69(即Ab69)的重链可变区(VH)氨基酸序列列于SEQ ID NO：99(参见序列表)中。抗体69的VH CDR结构域氨基酸序列列于SEQ ID NO∶101(VH CDR1)；SEQ ID NO：102(VH CDR2)和SEQ ID NO∶103(VH CDR3)中。抗体69的轻链可变区(VL)氨基酸序列描述于SEQ ID NO：100(参见序列表)中。抗体69的VLCDR结构域氨基酸序列列于SEQ ID NO：104(VL CDR1)；SEQ ID NO：105(VL CDR2)和SEQ IDNO：106(VL CDR3)中。抗体69的重链恒定区列于SEQ ID NO：122中。抗体69的轻链恒定区列于SEQ ID NO：121中。因此，在某些实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQID No：101、102和103中所列的可变重链CDR组(CDR1、CDR2和CDR3)，和如SEQ ID No：104、105和106中所列的轻链可变区CDR组。在其他实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分含有包含SEQ ID NO：100中所列的氨基酸残基的可变轻链，和如SEQ ID NO：99中所列的重链可变区。
此外，在下面提供的序列表中描述了抗CD117抗体Ab77、Ab79、Ab81、Ab85、Ab86、Ab87、Ab88和Ab89的各种结合区的氨基酸序列。具有这些序列的抗CD117抗体也可用于本文所述的ADC。
在一个实施方案中，本发明提供包含抗CD117抗体或其抗原结合片段(其包含与抗体77的结合区相对应的结合区，例如CDR、可变区)的ADC。抗体77(即Ab77)的重链可变区(VH)氨基酸序列列于SEQ ID NO：147(参见序列表)中。抗体77的VH CDR结构域氨基酸序列列于SEQ ID NO：263(VH CDR1)；SEQ ID NO：2(VH CDR2)和SEQ ID NO：3(VH CDR3)中。抗体77的轻链可变区(VL)氨基酸序列描述于SEQ ID NO：231(参见序列表)中。抗体77的VL CDR结构域氨基酸序列列于SEQID NO：264(VL CDR1)；SEQ ID NO：265(VL CDR2)和SEQ ID NO：266(VL CDR3)中。抗体77的重链恒定区列于SEQ ID NO：269中。抗体77的轻链恒定区列于SEQ ID NO：283中。因此，在某些实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQ IDNo：263、2和3中所列的可变重链CDR组(CDR1、CDR2和CDR3)，和如SEQ ID No：264、265和266中所列的轻链可变区CDR组。在其他实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分含有包含SEQ ID NO：231中所列的氨基酸残基的可变轻链，和如SEQ ID NO：147中所列的重链可变区。
在一个实施方案中，本发明提供包含抗CD117抗体或其抗原结合片段(其包含与抗体79的结合区相对应的结合区，例如CDR、可变区)的ADC。抗体79(即Ab79)的重链可变区(VH)氨基酸序列列于SEQ ID NO：147(参见序列表)中。抗体79的VH CDR结构域氨基酸序列列于SEQ ID NO：263(VH CDR1)；SEQ ID NO：2(VH CDR2)和SEQ ID NO：3(VH CDR3)中。抗体79的轻链可变区(VL)氨基酸序列描述于SEQ ID NO：233(参见序列表)中。抗体79的VL CDR结构域氨基酸序列列于SEQ ID NO：267(VL CDR1)；SEQ ID NO：265(VL CDR2)和SEQ ID NO：266(VL CDR3)中。抗体79的重链恒定区列于SEQ ID NO：269中。抗体79的轻链恒定区列于SEQ ID NO：283中。因此，在某些实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQ IDNo：263、2和3中所列的可变重链CDR组(CDR1、CDR2和CDR3)，和如SEQ ID No：267、265和266中所列的轻链可变区CDR组。在其他实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分含有包含SEQ ID NO：233中所列的氨基酸残基的可变轻链，和如SEQ ID NO：147中所列的重链可变区。
在一个实施方案中，本发明提供包含抗CD117抗体或其抗原结合片段(其包含与抗体81的结合区相对应的结合区，例如CDR、可变区)的ADC。抗体81(即Ab81)的重链可变区(VH)氨基酸序列列于SEQ ID NO：147(参见序列表)中。抗体81的VH CDR结构域氨基酸序列列于SEQ ID NO：263(VH CDR1)；SEQ ID NO：2(VH CDR2)和SEQ ID NO：3(VH CDR3)中。抗体81的轻链可变区(VL)氨基酸序列描述于SEQ ID NO：235(参见序列表)中。抗体81的VL CDR结构域氨基酸序列列于SEQID NO：264(VL CDR1)；SEQ ID NO：268(VL CDR2)和SEQ ID NO：266(VL CDR3)中。抗体81的重链恒定区列于SEQ ID NO：269中。抗体81的轻链恒定区列于SEQ ID NO：283中。因此，在某些实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQ IDNo：263、2和3中所列的可变重链CDR组(CDR1、CDR2和CDR3)，和如SEQ ID No：264、268和266中所列的轻链可变区CDR组。在其他实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分含有包含SEQ ID NO：235中所列的氨基酸残基的可变轻链，和如SEQ ID NO：147中所列的重链可变区。
在一个实施方案中，本发明提供包含抗CD117抗体或其抗原结合片段(其包含与抗体85的结合区相对应的结合区，例如CDR、可变区)的ADC。抗体85(即Ab85)的重链可变区(VH)氨基酸序列列于SEQ ID NO：243(参见序列表)中。抗体85的VH CDR结构域氨基酸序列列于SEQ ID NO：245(VH CDR1)；SEQ ID NO：246(VH CDR2)和SEQ ID NO：247(VH CDR3)中。抗体85的轻链可变区(VL)氨基酸序列描述于SEQ ID NO：242(参见序列表)中。抗体85的VLCDR结构域氨基酸序列列于SEQ ID NO：248(VL CDR1)；SEQ ID NO：249(VL CDR2)和SEQ IDNO：250(VL CDR3)中。抗体85的重链恒定区列于SEQ ID NO：269中。抗体85的轻链恒定区列于SEQ ID NO：283中。因此，在某些实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQID No：245、246和247中所列的可变重链CDR组(CDR1、CDR2和CDR3)，和如SEQ ID No∶248、249和250中所列的轻链可变区CDR组。在其他实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分含有包含SEQ ID NO：244中所列的氨基酸残基的可变轻链，和如SEQ ID NO：243中所列的重链可变区。
在一个实施方案中，本发明提供包含抗CD117抗体或其抗原结合片段(其包含与抗体86的结合区相对应的结合区，例如CDR、可变区)的ADC。抗体86(即Ab86)的重链可变区(VH)氨基酸序列列于SEQ ID NO：251(参见序列表)中。抗体86的VH CDR结构域氨基酸序列列于SEQ ID NO：245(VH CDR1)；SEQ ID NO：253(VH CDR2)和SEQ ID NO：3(VH CDR3)中。抗体86的轻链可变区(VL)氨基酸序列描述于SEQ ID NO：252(参见序列表)中。抗体86的VLCDR结构域氨基酸序列列于SEQID NO：254(VL CDR1)；SEQ ID NO：249(VL CDR2)和SEQ IDNO：255(VL CDR3)中。抗体86的重链恒定区列于SEQ ID NO：269中。抗体86的轻链恒定区列于SEQ ID NO：283中。因此，在某些实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQID No：245、253和3中所列的可变重链CDR组(CDR1、CDR2和CDR3)，和如SEQ ID No：254、249和255中所列的轻链可变区CDR组。在其他实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分含有包含SEQ ID NO：252中所列的氨基酸残基的可变轻链，和如SEQ ID NO：251中所列的重链可变区。
在一个实施方案中，本发明提供包含抗CD117抗体或其抗原结合片段(其包含与抗体87的结合区相对应的结合区，例如CDR、可变区)的ADC。抗体87(即Ab87)的重链可变区(VH)氨基酸序列列于SEQ ID NO：243(参见序列表)中。抗体87的VH CDR结构域氨基酸序列列于SEQ ID NO：245(VH CDR1)；SEQ ID NO：246(VH CDR2)和SEQ ID NO：247(VH CDR3)中。抗体87的轻链可变区(VL)氨基酸序列描述于SEQ ID NO：256(参见序列表)中。抗体87的VLCDR结构域氨基酸序列列于SEQ ID NO：257(VLCDR1)；SEQ ID NO：5(VLCDR2)和SEQ ID NO：255(VLCDR3)中。抗体87的重链恒定区列于SEQ ID NO：269中。抗体87的轻链恒定区列于SEQID NO：283中。因此，在某些实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQ ID No：245、246和247中所列的可变重链CDR组(CDR1、CDR2和CDR3)，和如SEQ ID No：257、5和255中所列的轻链可变区CDR组。在其他实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分含有包含SEQID NO：256中所列的氨基酸残基的可变轻链，和如SEQ ID NO：243中所列的重链可变区。
在一个实施方案中，本发明提供包含抗CD117抗体或其抗原结合片段(其包含与抗体88的结合区相对应的结合区，例如CDR、可变区)的ADC。抗体88(即Ab88)的重链可变区(VH)氨基酸序列列于SEQ ID NO：258(参见序列表)中。抗体88的VH CDR结构域氨基酸序列列于SEQ ID NO：245(VH CDR1)；SEQ ID NO：259(VH CDR2)和SEQ ID NO：3(VH CDR3)中。抗体88的轻链可变区(VL)氨基酸序列描述于SEQ ID NO：256(参见序列表)中。抗体88的VLCDR结构域氨基酸序列列于SEQ ID NO：257(VLCDR1)；SEQ ID NO：5(VLCDR2)和SEQ ID NO：255(VLCDR3)中。抗体88的重链恒定区列于SEQ ID NO：269中。抗体88的轻链恒定区列于SEQID NO：283中。因此，在某些实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQ ID No：245、259和3中所列的可变重链CDR组(CDR1、CDR2和CDR3)，和如SEQ ID No：257、5和255中所列的轻链可变区CDR组。在其他实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分含有包含SEQID NO：256中所列的氨基酸残基的可变轻链，和如SEQ ID NO：258中所列的重链可变区。
在一个实施方案中，本发明提供包含抗CD117抗体或其抗原结合片段(其包含与抗体89的结合区相对应的结合区，例如CDR、可变区)的ADC。抗体89(即Ab89)的重链可变区(VH)氨基酸序列列于SEQ ID NO：260(参见序列表)中。抗体89的VH CDR结构域氨基酸序列列于SEQ ID NO：245(VH CDR1)；SEQ ID NO：2(VH CDR2)和SEQ ID NO：3(VH CDR3)中。抗体89的轻链可变区(VL)氨基酸序列描述于SEQ ID NO：252(参见序列表)中。抗体89的VL CDR结构域氨基酸序列列于SEQID NO：254(VL CDR1)；SEQ ID NO：249(VL CDR2)和SEQ ID NO：255(VL CDR3)中。抗体89的重链恒定区列于SEQ ID NO：269中。抗体89的轻链恒定区列于SEQ ID NO：283中。因此，在某些实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQ IDNo：245、2和3中所列的可变重链CDR组(CDR1、CDR2和CDR3)，和如SEQ ID No：254、249和255中所列的轻链可变区CDR组。在其他实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分含有包含SEQ ID NO：252中所列的氨基酸残基的可变轻链，和如SEQ ID NO：260中所列的重链可变区。
在一个实施方案中，本发明提供包含抗CD117抗体或其抗原结合片段(其包含与抗体249的结合区相对应的结合区，例如CDR、可变区)的ADC。抗体249(即Ab249)的重链可变区(VH)氨基酸序列列于SEQ ID NO：238(参见序列表)中。抗体249的VH CDR结构域氨基酸序列列于SEQ ID NO：286(VH CDR1)；SEQ ID NO：2(VH CDR2)和SEQ ID NO：287(VH CDR3)中。抗体249的轻链可变区(VL)氨基酸序列描述于SEQ ID NO：242(参见序列表)中。抗体249的VLCDR结构域氨基酸序列列于SEQ ID NO：288(VL CDR1)；SEQ ID NO：249(VL CDR2)和SEQ IDNO：289(VL CDR3)中。抗体249的重链恒定区列于SEQ ID NO：269中。抗体249的轻链恒定区列于SEQ ID NO：283中。因此，在某些实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQ ID No：286、2和287中所列的可变重链CDR组(CDR1、CDR2和CDR3)，和如SEQ ID No：288、249和289中所列的轻链可变区CDR组。在其他实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分含有包含SEQ ID NO：242中所列的氨基酸残基的可变轻链，和如SEQ ID NO∶238中所列的重链可变区。
此外，本公开内容包括抗CD117抗体药物缀合物(ADC)，其包含如SEQ ID No：147至168中所列的结合区(重链和轻链CDR或可变区)。在一个实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQ ID NO：147的氨基酸序列所列的重链可变区和如SEQ ID NO：148的氨基酸序列所列的轻链可变区。在一个实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQ ID NO：147的氨基酸序列所列的重链可变区和如SEQ ID NO：149的氨基酸序列所列的轻链可变区。在一个实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQ ID NO：147的氨基酸序列所列的重链可变区和如SEQ ID NO：150的氨基酸序列所列的轻链可变区。在一个实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQ ID NO：147的氨基酸序列所列的重链可变区和如SEQ ID NO：151的氨基酸序列所列的轻链可变区。在一个实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQ ID NO：147的氨基酸序列所列的重链可变区和如SEQ ID NO：152的氨基酸序列所列的轻链可变区。在一个实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQ ID NO：147的氨基酸序列所列的重链可变区和如SEQ ID NO：153的氨基酸序列所列的轻链可变区。在一个实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQ ID NO：147的氨基酸序列所列的重链可变区和如SEQ ID NO：154的氨基酸序列所列的轻链可变区。在一个实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQ ID NO：147的氨基酸序列所列的重链可变区和如SEQ ID NO：155的氨基酸序列所列的轻链可变区。在一个实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQ ID NO：147的氨基酸序列所列的重链可变区和如SEQ ID NO：156的氨基酸序列所列的轻链可变区。在一个实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQ ID NO：147的氨基酸序列所列的重链可变区和如SEQ ID NO：157的氨基酸序列所列的轻链可变区。在一个实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQ ID NO：147的氨基酸序列所列的重链可变区和如SEQ ID NO：158的氨基酸序列所列的轻链可变区。在一个实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQ ID NO：147的氨基酸序列所列的重链可变区和如SEQ ID NO：159的氨基酸序列所列的轻链可变区。在一个实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQ ID NO：147的氨基酸序列所列的重链可变区和如SEQ ID NO：160的氨基酸序列所列的轻链可变区。在一个实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQ ID NO：147的氨基酸序列所列的重链可变区和如SEQ ID NO：161的氨基酸序列所列的轻链可变区。在一个实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQ ID NO：147的氨基酸序列所列的重链可变区和如SEQ ID NO：162的氨基酸序列所列的轻链可变区。在一个实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQ ID NO：147的氨基酸序列所列的重链可变区和如SEQ ID NO：163的氨基酸序列所列的轻链可变区。在一个实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQ ID NO：164的氨基酸序列所列的重链可变区和如SEQ ID NO：165的氨基酸序列所列的轻链可变区。在一个实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQ ID NO：166的氨基酸序列所列的重链可变区和如SEQ ID NO：167的氨基酸序列所列的轻链可变区。在一个实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQ ID NO：168的氨基酸序列所列的重链可变区和如SEQ ID NO：169的氨基酸序列所列的轻链可变区。在一个实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQ ID NO：170的氨基酸序列所列的重链可变区和如SEQ ID NO：171的氨基酸序列所列的轻链可变区。在一个实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQ ID NO：172的氨基酸序列所列的重链可变区和如SEQ ID NO：173的氨基酸序列所列的轻链可变区。在一个实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQ ID NO：174的氨基酸序列所列的重链可变区和如SEQ ID NO：175的氨基酸序列所列的轻链可变区。在一个实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQ ID NO：176的氨基酸序列所列的重链可变区和如SEQ ID NO：177的氨基酸序列所列的轻链可变区。在一个实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQ ID NO：178的氨基酸序列所列的重链可变区和如SEQ ID NO：179的氨基酸序列所列的轻链可变区。在一个实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQ ID NO：180的氨基酸序列所列的重链可变区和如SEQ ID NO：181的氨基酸序列所列的轻链可变区。在一个实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQ ID NO：172的氨基酸序列所列的重链可变区和如SEQ ID NO∶182的氨基酸序列所列的轻链可变区。在一个实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQ ID NO：183的氨基酸序列所列的重链可变区和如SEQ ID NO：184的氨基酸序列所列的轻链可变区。在一个实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQ ID NO：185的氨基酸序列所列的重链可变区和如SEQ ID NO：186的氨基酸序列所列的轻链可变区。在一个实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQ ID NO：187的氨基酸序列所列的重链可变区和如SEQ ID NO：188的氨基酸序列所列的轻链可变区。在一个实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQ ID NO：189的氨基酸序列所列的重链可变区和如SEQ ID NO：190的氨基酸序列所列的轻链可变区。在一个实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQ ID NO：191的氨基酸序列所列的重链可变区和如SEQ ID NO：192的氨基酸序列所列的轻链可变区。在一个实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQ ID NO：193的氨基酸序列所列的重链可变区和如SEQ ID NO：194的氨基酸序列所列的轻链可变区。在一个实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQ ID NO：195的氨基酸序列所列的重链可变区和如SEQ ID NO：196的氨基酸序列所列的轻链可变区。在一个实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQ ID NO：197的氨基酸序列所列的重链可变区和如SEQ ID NO：198的氨基酸序列所列的轻链可变区。在一个实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQ ID NO：199的氨基酸序列所列的重链可变区和如SEQ ID NO：200的氨基酸序列所列的轻链可变区。在一个实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQ ID NO：201的氨基酸序列所列的重链可变区和如SEQ ID NO：190的氨基酸序列所列的轻链可变区。在一个实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQ ID NO：202的氨基酸序列所列的重链可变区和如SEQ ID NO：203的氨基酸序列所列的轻链可变区。在一个实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQ ID NO：204的氨基酸序列所列的重链可变区和如SEQ ID NO：205的氨基酸序列所列的轻链可变区。在一个实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQ ID NO：206的氨基酸序列所列的重链可变区和如SEQ ID NO：207的氨基酸序列所列的轻链可变区。在一个实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQ ID NO：208的氨基酸序列所列的重链可变区和如SEQ ID NO：209的氨基酸序列所列的轻链可变区。在一个实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQ ID NO：210的氨基酸序列所列的重链可变区和如SEQ ID NO：211的氨基酸序列所列的轻链可变区。在一个实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQ ID NO：212的氨基酸序列所列的重链可变区和如SEQ ID NO：213的氨基酸序列所列的轻链可变区。在一个实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQ ID NO：214的氨基酸序列所列的重链可变区和如SEQ ID NO：215的氨基酸序列所列的轻链可变区。在一个实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQ ID NO：216的氨基酸序列所列的重链可变区和如SEQ ID NO：217的氨基酸序列所列的轻链可变区。在一个实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQ ID NO：218的氨基酸序列所列的重链可变区和如SEQ ID NO：219的氨基酸序列所列的轻链可变区。在一个实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQ ID NO：220的氨基酸序列所列的重链可变区和如SEQ ID NO：221的氨基酸序列所列的轻链可变区。在一个实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQ ID NO：222的氨基酸序列所列的重链可变区和如SEQ ID NO：223的氨基酸序列所列的轻链可变区。在一个实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQ ID NO：224的氨基酸序列所列的重链可变区和如SEQ ID NO：225的氨基酸序列所列的轻链可变区。在一个实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQ ID NO：226的氨基酸序列所列的重链可变区和如SEQ ID NO：227的氨基酸序列所列的轻链可变区。在一个实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQ ID NO：147的氨基酸序列所列的重链可变区和如SEQ ID NO∶228的氨基酸序列所列的轻链可变区。在一个实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQ ID NO：147的氨基酸序列所列的重链可变区和如SEQ ID NO：229的氨基酸序列所列的轻链可变区。在一个实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQ ID NO：147的氨基酸序列所列的重链可变区和如SEQ ID NO：230的氨基酸序列所列的轻链可变区。在一个实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQ ID NO：147的氨基酸序列所列的重链可变区和如SEQ ID NO：231的氨基酸序列所列的轻链可变区。在一个实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQ ID NO：147的氨基酸序列所列的重链可变区和如SEQ ID NO：232的氨基酸序列所列的轻链可变区。在一个实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQ ID NO：147的氨基酸序列所列的重链可变区和如SEQ ID NO：233的氨基酸序列所列的轻链可变区。在一个实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQ ID NO：147的氨基酸序列所列的重链可变区和如SEQ ID NO∶234的氨基酸序列所列的轻链可变区。在一个实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQ ID NO：147的氨基酸序列所列的重链可变区和如SEQ ID NO：235的氨基酸序列所列的轻链可变区。在一个实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQ ID NO：147的氨基酸序列所列的重链可变区和如SEQ ID NO：236的氨基酸序列所列的轻链可变区。
在一个实施方案中，本文所述的ADC的抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQID NO：147的氨基酸序列所列的重链可变区和如SEQ ID NO：237的氨基酸序列所列的轻链可变区。在一个实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQ ID NO：243的氨基酸序列所列的重链可变区和如SEQ ID NO∶244的氨基酸序列所列的轻链可变区。在一个实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQ ID NO：251的氨基酸序列所列的重链可变区和如SEQ ID NO：252的氨基酸序列所列的轻链可变区。在一个实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQ ID NO：243的氨基酸序列所列的重链可变区和如SEQ IDNO：256的氨基酸序列所列的轻链可变区。在一个实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQ ID NO：258的氨基酸序列所列的重链可变区和如SEQ ID NO：256的氨基酸序列所列的轻链可变区。在一个实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQ IDNO：260的氨基酸序列所列的重链可变区和如SEQ ID NO：252的氨基酸序列所列的轻链可变区。在一个实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQ ID NO：238的氨基酸序列所列的重链可变区和如SEQ ID NO：239的氨基酸序列所列的轻链可变区。在一个实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQ ID NO：147的氨基酸序列所列的重链可变区和如SEQ ID NO：239的氨基酸序列所列的轻链可变区。在一个实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQ ID NO：147的氨基酸序列所列的重链可变区和如SEQ ID NO∶240的氨基酸序列所列的轻链可变区。在一个实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQ ID NO：238的氨基酸序列所列的重链可变区和如SEQ ID NO：241的氨基酸序列所列的轻链可变区。在一个实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合部分包含如SEQ ID NO：238的氨基酸序列所列的重链可变区和如SEQ ID NO：242的氨基酸序列所列的轻链可变区。
本文所述的某些抗CD117抗体是中性抗体，因为这些抗体基本上不抑制CD117表达细胞上的CD117活性。中性抗体可以使用例如体外干细胞因子(SCF)依赖性细胞增殖测定来鉴定。在SCF依赖性细胞增殖测定中，中性CD117抗体不会杀死依赖SCF分裂的CD34+细胞，因为中性抗体不会阻止SCF与CD117结合以抑制CD117活性。
考虑它们具有与人CD117特异性结合的能力，中性抗体可用于诊断目的，但在缀合至细胞毒素(例如本文所述的那些)时也可有效杀死表达CD117的细胞。通常，缀合物中使用的抗体具有抗体独有的激动或拮抗活性。然而，本文描述的是缀合物的独特方法，尤其是在其中缀合物被用作干细胞移植之前的调理剂的情况下。虽然考虑到除细胞毒素外的单独的抗体的杀伤能力，拮抗性抗体单独或与细胞毒素组合作为缀合物可能是有效的，但是用包含中性抗CD117抗体的缀合物进行调理提供了一种替代策略，其中抗体的活性对于细胞毒素的作用是次要的，但是抗体的内化和亲和特性，例如解离速率，对于细胞毒素的有效递送是重要的。
中性抗CD117抗体的实例包括Ab58、Ab61、Ab66、Ab67、Ab68和Ab69。中性抗CD117抗体CDR的CDR氨基酸序列的比较揭示了所鉴定的两组中性抗体之间的共有序列。Ab58和Ab61共享相同的轻链CDR和HC CDR3，在HC CDR1和HC CDR2方面略有不同。HC CDR1和CDR2的共有序列描述于SEQ ID No：133和134中。Ab66、Ab67、Ab68和Ab69也是中性抗体。虽然Ab66、Ab67、Ab68和Ab69共享相同的轻链CDR和相同的HC CDR3，但这些抗体在其HC CDR1和HCCDR2区内具有可变性。这些抗体在HC CDR1和HC CDR2区中的共有序列分别提供于SEQ IDNo：139和140。
本文还提供拮抗剂抗体，包括Ab54、Ab55、Ab56和Ab57。虽然Ab54、Ab55、Ab56和Ab57共享相同的轻链CDR和相同的HC CDR3，但这些抗体在其HC CDR1和HC CDR2区内具有可变性。这些抗体在HC CDR1和HC CDR2区中的共有序列分别提供于SEQ ID No：127和128。
在一个实施方案中，抗CD117抗体或其抗原结合片段包含具有与本文公开的SEQID No至少95％、96％、97％或99％相同性的氨基酸序列的可变区。或者，抗CD117抗体或其抗原结合片段含有包含本文公开的SEQ ID No的CDR，其中本文所述可变区的框架区具有与本文公开的SEQ ID No至少95％、96％、97％或99％相同性的氨基酸序列。
本文描述的抗CD117抗体可以是全长抗体、双特异性抗体、双可变结构域抗体、多链或单链抗体和/或特异性结合人CD117的结合片段的形式，包括但不限于Fab、Fab′、(Fab′)2、Fv)、scFv(单链Fv)、替代抗体(surrobody)(包括替代轻链构建体)、单域抗体、骆驼化抗体等。它们也可以属于或源自任何同种型，包括例如IgA(例如IgA1或IgA2)、IgD、IgE、IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)或IgM。在一些实施方案中，抗CD117抗体是IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)。
与本文所述的方法结合使用的抗体包括上述那些抗体的变体(诸如含有或缺乏Fc结构域的抗体片段)，以及本文所述的非人抗体的人源化变体和含有本文所述的抗体或抗体片段的一个或多个或所有CDR或其等效区域的抗体样蛋白支架(例如，10Fn3结构域)。前述抗体的示例性抗原结合片段包括双可变免疫球蛋白结构域、单链Fv分子(scFv)、双抗体、三抗体、纳米抗体、抗体样蛋白支架、Fv片段、Fab片段、F(ab’)2分子和串联di-scFv等。
在一个实施方案中，提供了包含一种或多种放射性标记氨基酸的抗CD117抗体。放射性标记抗CD117抗体可用于诊断和治疗目的(与放射性标记分子的缀合是另一个可能的特征)。多肽标记的非限制性实例包括但不限于3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc和125I、131I和186Re。制备放射性标记氨基酸和相关肽衍生物的方法是本领域已知的(参见例如Junghans等人，in Cancer Chemotherapy and Biotherapy655-686(2d edition，Chafner andLongo，eds.，Lippincott Raven(1996))和美国专利号4,681,581、美国专利号4,735,210、美国专利号5,101,827、美国专利号5，102,990(U.S.RE35,500)、美国专利号5,648,471和美国专利号5,697,902。例如，可以通过氯胺T方法缀合放射性同位素。
抗CD45抗体
在一个实施方案中，本发明包括ADC及其用途，该ADC包含与CD45多肽(例如人CD45多肽)特异性地结合的抗体及其抗原结合片段。在示例性实施方案中，与CD45多肽特异性地结合的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区。
CD45是对T和B细胞抗原受体介导的信号转导至关重要的造血细胞特异性跨膜蛋白酪氨酸磷酸酶。CD45包括大的细胞外结构域和含磷酸酶的细胞溶质结构域。根据刺激的性质和所涉及的细胞类型，CD45可以充当正调节因子和负调节因子。尽管CD45基因中可能存在大量置换，但传统上仅在人类中鉴定出六种同种型。该同种型是RA、RO、RB、RAB、RBC和RABC(Hermiston等人2003“CD45：a critical regulator of signaling thresholds inimmune cells.”Annu Rev Immunol.2∶107-137.)。CD45RA在初始T细胞上表达，并且CD45RO在活化和记忆T细胞、一些B细胞亚群、活化的单核细胞/巨噬细胞和粒细胞上表达。CD45RB在外周B细胞、初始T细胞、胸腺细胞上表达，在巨噬细胞和树突细胞上表达较弱。
在某些实施方案中，抗CD45抗体选自艾妥单抗(apamistamab)(还称为90Y-BC8、Iomab-B、BC8；如例如US20170326259、WO2017155937和Orozco等人Blood.127.3(2016)：352-359中所述)或BC8-B10(如例如Li等人PloS one13.10(2018)：e0205135中所述)，其中每一个均援引加入。其他抗CD45抗体已经描述于例如WO2003048327、WO2016016442、US20170226209、US20160152733、US9701756；US20110076270或US7825222，其中每一个均援引加入。
抗CD137抗体
本发明包括ADC及其用途，该ADC包含与CD137多肽(例如人CD137多肽)特异性地结合的抗体及其抗原结合片段。在示例性实施方案中，与CD137多肽特异性地结合的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区。
T细胞已被证明表达CD137，因为该抗原是共刺激分子的跨膜TNF受体超家族，并且在多种造血细胞上表达并促进T细胞活化且调节T细胞的增殖和存活(参见，例如，Cannons等人，J.Immunol.167：1313-1324，2001，其各个公开内容通过援引加入本文，因为它涉及通过T细胞表达CD137)。CD137备选地称为肿瘤坏死因子受体超家族成员9(TNFRSF9)、4-1BB，或通过淋巴细胞活化(ILA)来诱导。
在某些实施方案中，抗CD137抗体选自ADG106(如例如US20190055314、WO2019037711、WO2019036855中所述)；AGEN2373(如例如WO2018191502、US20180344870中所述)；ATOR-1017(如例如WO2018091740、US20180118841中所述)；PE0166(如例如Song等人AACR2019，Abstract 2397/21中所述)、乌瑞芦单抗(urelumab)(还称为BMS-663513；如例如WO2004010947、WO2005035584、US20090068192、US7659384、US8475790、US8137667、US20100183621、US8716452、US20120141494、US9382328、US20140193422、WO2016029073、US20160368998、WO2017181034、US20190062445、Chin等人Nature communications.9.1(2018)：4679；Segal等人Clinical Cancer Research.23.8(2017)：1929-1936中所述)；和乌托鲁单抗(utomilumab)(还称为PF-05082566，MOR-7480；如例如WO2012032433、US20120237498、US20140178368、WO2012145183、WO2015119923、WO2015179236、US20160152722、US20190031765、WO2017130076、Chin等人Nature communications.9.1(2018)：4679；Segal等人Clinical CancerResearch.24.8(2018)：1816-1823；Fisher等人CancerImmunology，Immunotherapy.61.10(2012)：1721-1733中所述)，其中每一个援引加入。
其他抗CD137抗体描述于例如WI2018134787、WI2019020774、WI2017077085、US20180327504、US20190099488、US2019006045、US20190015508、WO2019014328、US20190071510、WO2018127787、US20180258177、US10174122、WO2016110584、WO2018017761、WO2018098370、US20130149301、WO2019027754、WO2018156740、US20160244528、WO2016134358、US10233251、US20170226215、US20160083474、WO2017049452、US20180282422、WO2015188047、WO2010132389、US20120076722、US20110177104、WO2011031063、US20080305113、US20080008716、US7829088、US20090041763、WO2006126835、
Figure BDA0003429348370000482
al.CirculationJ.81.12(2017)：1945-1952；Makkouk等人Annals of Oncology28.2(2016)：415-420；Martinez-Forero等人J.ofImmunology.190.12(2013)：6694-6706；Dubrot等人Cancer immunology，immunotherapy.59.8(2010)：1223-1233；其中每一个援引加入。
在另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含与本文的抗CD137抗体具有至少95％相同性，例如与本文中的抗CD137抗体具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％的相同性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗体包含修饰的重链(HC)可变区，该修饰的重链可变区包含本文的抗CD137抗体或其变体的HC可变域，该变体(i)与抗CD137抗体的不同之处在于1、2、3、4或5个氨基酸置换、添加或缺失；(ii)与抗CD137抗体的不同之处在于至多5、4、3、2或1个氨基酸置换、添加或缺失；(iii)与抗CD137抗体的不同之处在于1-5、1-3、1-2、2-5或3-5个氨基酸置换、添加或缺失，和/或(iv)包含与抗CD137抗体至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的氨基酸序列，其中在(i)-(iv)中的任一项中，氨基酸置换可以是保守氨基酸置换或非保守氨基酸置换；并且其中修饰的重链可变区相对于抗CD137抗体的重链可变区可以具有增强的生物活性，同时保留抗体的CD137结合特异性。
在一个实施方案中，可用于本文所述的方法和组合物(包括ADC)的抗CD137抗体是鼠抗CD137抗体BBK2(Thermo Fisher；MS621PABX)或包含对应于BBK2抗体的抗原结合区的抗CD137抗体。BBK2抗体(其也可称为BBK-2抗体或抗4-1BB抗体)是与人4-1BB重组蛋白(4-1BB也称为CD137)的胞外域结合的小鼠单克隆抗体(IgG1，kappa)。在某些实施方案中，本公开的方法和组合物包括包含BBK2抗体的结合区(例如，CDR)的抗CD137抗体。在另一个实施方案中，本公开的方法和组合物包含竞争性抑制BBK2抗体与其在CD137上的表位结合的抗体。在某些实施方案中，抗CD137抗体是人源化BBK2或嵌合BBK2。
在一个实施方案中，本文所述的方法和组合物包括嵌合抗CD137(ch-BBK2)抗体，其包含BBK2的可变重链和轻链区。在某些实施方案中，嵌合BBK2抗体是包含人恒定区的IgG1抗体。ch-BBK2的重链氨基酸序列描述于SEQ ID NO：290，并且ch-BBK2的轻链氨基酸序列描述于SEQ ID NO：291。重链和轻链序列中的每一个的CDR区(CDR1、CDR2和CDR3)在下面以粗体描述。BBK2的CDR区可以根据Kabat编号进行定义。下文针对重链和轻链序列中的每一个描述了由Kabat编号所定义的CDR(下文以粗体描述)。BBK2的可变区用斜体表示。
Figure BDA0003429348370000481
因此，在一个实施方案中，抗CD137抗体BBK2(包括ch-BBK2)的VH CDR氨基酸序列如下：SYWIN(VH CDR1；SEQ ID NO：292)；NIYPSDSYTNYNQKFKD(VH CDR2；SEQ ID NO：293)和NGVEGYPHYYAMEY(VH CDR3；SEQ ID NO：294)，并且抗CD137抗体BBK2(包括ch-BBK2)的VLCDR氨基酸序列如下：RASQDLSNHLY(VL CDR1；SEQ ID NO：295)；YTSRLHS(VL CDR2；SEQ IDNO：296)和QQGYTLPYT(VL CDR3；SEQ ID NO：297)。
BBK2的重链可变区在SEQ ID NO：298中以QVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTSYWINWVKQRPGQGLEWIGNIYPSDSYTNYNQKFKDKATLTVDKSSNTVYMQLNSPTSEDSAVYYCTRNGVEGYPHYYAMEYWGQGTSVTVSS列出。BBK2的轻链可变区在SEQ ID NO：299中以DIQMTQTTSALSASLGDRVTIGCRASODLSNHLYWYQOKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTIRNLEQEDVATYFCQQGYTLPYTFGGGTKLEIK列出。抗CD137抗体(包括抗CD137 ADC)可包含分别如SEQ ID No：298和299中所列出的重链和轻链可变区氨基酸序列。
在一个实施方案中，抗CD137抗体，例如嵌合(ch-BBK2)抗体或人源化BBK2抗体，包含重链可变区，所述重链可变区含有包含氨基酸序列SEQ ID NO：292的CDR1、包含氨基酸序列SEQ ID NO：293的CDR2和包含氨基酸序列SEQ ID NO：294的CDR3；并且包含轻链可变区，所述轻链可变区含有包含氨基酸序列SEQ ID NO：295的CDR1、包含氨基酸序列SEQ ID NO：296的CDR2和包含氨基酸序列SEQ ID NO：297的CDR3。
在一个实施方案中，抗CD137抗体，例如嵌合(ch-BBK2)抗体或人源化BBK2抗体，包含重链可变区，所述重链可变区含有包含氨基酸序列SEQ ID NO：292的CDR1、包含氨基酸序列SEQ ID NO：293的CDR2和包含氨基酸序列SEQ ID NO：294的CDR3；并且包含轻链可变区，所述轻链可变区含有包含氨基酸序列SEQ ID NO：295的CDR1、包含氨基酸序列SEQ ID NO：296的CDR2和包含氨基酸序列SEQ ID NO：297的CDR3。
因此，BBK2、人源化BBK2或嵌合BBK2抗体可用于本文所述的抗CD137ADC和方法。可以使用本领域已知的方法和本文所述的那些方法将这些抗体中的每一种缀合至下文所述的任何细胞毒素。
抗CD5抗体
在某些实施方案中，本文所述的组合物和方法包括包含与人CD5特异性地结合的抗体或其片段的ADC。人CD5也称为LEU1或T1。人CD5是一种发现于胸腺细胞、T淋巴细胞和B淋巴细胞亚群的表面的I型跨膜糖蛋白。已经鉴定了人CD5的两种同种型。同种型1包含438个氨基酸，并且描述于Jones等人(1988)Nature 323(6086)，346-349以下(NCBI参考序列：NP_001333385.1)：
MVCSQSWGRS SKQWEDPSQASKVCQRLNCG VPLSLGPFLV TYTPQSSIICYGQLGSFSNCSHSRNDMCHS LGLTCLEPQKTTPPTTRPPPTTTPEPTAPP RLQLVAQSGGQHCAGVVEFYSGSLGGTISY EAQDKTQDLE NFLCNNLQCG SFLKHLPETE AGRAQDPGEPREHQPLPIQWKIQNSSCTSL EHCFRKIKPQ KSGRVLALLC SGFQPKVQSR LVGGSSICEGTVEVRQGAQWAALCDSSSAR SSLRWEEVCR EQQCGSVNSY RVLDAGDPTS RGLFCPHQKL SQCHELWERNSYCKKVFVTCQDPNPAGLAAGTVASIILAL VLLVVLLVVC GPLAYKKLVKKFRQKKQRQWIGPTGMNQNMSFHRNHTATV RSHAENPTAS HVDNEYSQPP RNSHLSAYPA LEGALHRSSMQPDNSSDSDY DLHGAQRL(SEQID NO：363)
T细胞已被证明表达CD5，CD5是细胞粘附分子，并与活化的T细胞的增殖反应和T细胞辅助功能有关。它还显示出起受体的作用，从而通过与CD72(一种B细胞独有的细胞表面蛋白)相互作用，将共刺激信号传递给T细胞。结合CD5的抗体或其抗原结合片段可以抑制T细胞活化和T细胞介导的针对造血干细胞移植物的免疫应答，例如，通过抑制CD5和CD72之间的相互作用来进行。结合CD5的抗体及其抗原结合片段也可用于直接杀死CD5+T细胞，例如，通过将抗体或其抗原结合片段缀合至细胞毒素(诸如本文所述或本领域已知的细胞毒素)或通过使用能够将补体蛋白募集到T细胞的未缀合抗体或其抗原结合片段。
此外，活化的B细胞亚群已被证明表达CD5，并且这种表达模式在自身反应性B细胞中特别常见(Werner-Favre等人，European Journal of Immunology 19：1209-1231(1989)，其公开内容以其整体援引加入本文)。CD5也已被证明由NK细胞亚群表达；特别是在患有已显示出含有低密度CD5+(CD5LOW+)NK细胞群的多发性骨髓瘤的患者中，并且这种表面抗原与NK细胞活化有关(Ishiyama等人，Anticancer Research 14：725-730(1994)，其公开内容以其整体援引加入本文)。因此，特异性结合CD5的抗体或其抗原结合片段可用于减弱B细胞和NK细胞的活化。结合CD5的抗体或其抗原结合片段也可用于直接杀死CD5+B细胞和NK细胞，例如，通过将抗体或其抗原结合片段缀合至细胞毒素(诸如本文所述或本领域已知的细胞毒素)或通过使用能够将补体蛋白募集到B细胞或NK细胞的未缀合抗体或其抗原结合片段。
本发明包括ADC及其用途，该ADC包含与CD5多肽(例如人CD5多肽)特异性地结合的抗体及其抗原结合片段。在示例性实施方案中，与CD5多肽特异性地结合的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区。
在一个实施方案中，ADC含有包含重链可变区的抗体，该重链可变区包含一个或多个互补决定区(CDR)。在一个实施方案中，重链可变区含有包含氨基酸序列SEQ ID NO：341的VH CDR1。在一个实施方案中，重链可变区含有包含氨基酸序列SEQ ID NO：342的VHCDR2。在一个实施方案中，重链可变区含有包含氨基酸序列SEQ ID NO：343的VH CDR3。在一个实施方案中，重链可变区包含一个或多个选自SEQ ID NO：341、SEQ ID NO：342和SEQ IDNO：343的VH CDR。在一个实施方案中，重链可变区包含两个或更多个选自SEQ ID NO：341、SEQ ID NO：342和SEQ ID NO：343的VH CDR。在一个实施方案中，重链可变区含有包含SEQID NO：341的VH CDR1、包含SEQ ID NO：342的VH CDR2和包含SEQ ID NO：343的VH CDR3。
在一个实施方案中，ADC含有包含轻链可变区的抗体，该轻链可变区包含一个或多个互补决定区(CDR)。在一个实施方案中，轻链可变区含有包含氨基酸序列SEQ ID NO：344的VL CDR1。在一个实施方案中，轻链可变区含有包含氨基酸序列SEQ ID NO：345的VLCDR2。在一个实施方案中，轻链可变区含有包含氨基酸序列SEQ ID NO：346的VL CDR3。在一个实施方案中，轻链可变区包含一个或多个选自SEQ ID NO：344、SEQ ID NO：345和SEQ IDNO：346的VLCDR。在一个实施方案中，轻链可变区包含两个或更多个选自SEQ ID NO：344、SEQ ID NO：345和SEQ ID NO：346的VL CDR。在一个实施方案中，轻链可变区含有包含SEQID NO：344的VL CDR1、包含SEQ ID NO：345的VLCDR2和包含SEQ ID NO：346的VLCDR3。
在示例性实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区含有包含SEQ ID NO：341的VH CDR1、包含SEQ ID NO：342的VH CDR2和包含SEQID NO：343的VH CDR3，该轻链可变区含有包含SEQ ID NO：344的VL CDR1、包含SEQ ID NO：345的VL CDR2和包含SEQ ID NO∶346的VLCDR3。
在某些实施方案中，一个或多个CDR(即，一个或多个具有SEQ ID NO：341-343的重链CDR，和/或一个或多个具有SEQ ID NO：344-346的轻链CDR)可以包含保守的氨基酸置换(或2、3、4或5个氨基酸置换)，同时保留抗体的CD5特异性(即，类似于包含SEQ ID NO：341-343的重链CDR，和SEQ ID NO：344-346的轻链CDR的抗体或其抗原结合片段的特异性)。
在某些实施方案中，抗CD5抗体或其抗原结合片段是鼠抗体5D7或其人源化形式。鼠抗体5D7与人CD5结合并描述于美国专利公开号20008/0245027中，其与其中公开的抗体序列相关的内容通过援引加入本文。序列汇总表中描述的SEQ ID No：353-358对应于鼠抗CD5抗体5D7的CDR。抗CD5抗体5D7的人源化形式描述于SEQ ID NO：359(人源化重链可变区)和SEQ ID NO：360(人源化轻链可变区)。在一个实施方案中，本文所述的ADC及其用途包括包含SEQ ID No：353-358中所列的CDR的抗体。在一个实施方案中，本文所述的ADC及其用途包括包含分别如SEQ ID No：359和360所列的重链和轻链可变区的抗体。
在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO：359所列的氨基酸序列。在另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO：359具有至少95％相同性，例如与SEQ ID NO：359具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％的相同性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗体包含修饰的重链(HC)可变区，该修饰的重链可变区含有包含SEQ ID NO：359或SEQ IDNO：359的变体的HC可变域，该变体(i)与SEQ ID NO：359的不同之处在于1、2、3、4或5个氨基酸置换、添加或缺失；(ii)与SEQ ID NO：359的不同之处在于至多5、4、3、2或1个氨基酸置换、添加或缺失；(iii)与SEQ ID NO：359的不同之处在于1-5、1-3、1-2、2-5或3-5个氨基酸置换、添加或缺失，和/或(iv)包含与SEQ ID NO：359至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的氨基酸序列，其中在(i)-(iv)中的任一项中，氨基酸置换可以是保守氨基酸置换或非保守氨基酸置换；并且其中修饰的重链可变区相对于SEQ IDNO：359的重链可变区可以具有增强的生物活性，同时保留抗体的CD5结合特异性，即具有类似于包含SEQ ID NO：359的抗体或其抗原结合片段的结合特异性。
在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO：360所列的氨基酸序列。在另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO：360具有至少95％相同性，例如与SEQ ID NO：360具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％的相同性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗体包含修饰的轻链(LC)可变区，该修饰的轻链可变区含有包含SEQ ID NO：360或SEQ IDNO：360的变体的LC可变域，该变体(i)与SEQ ID NO：360的不同之处在于1、2、3、4或5个氨基酸置换、添加或缺失；(ii)与SEQ ID NO：360的不同之处在于至多5、4、3、2或1个氨基酸置换、添加或缺失；(iii)与SEQ ID NO：360的不同之处在于1-5、1-3、1-2、2-5或3-5个氨基酸置换、添加或缺失，和/或(iv)包含与SEQ ID NO：360至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的氨基酸序列，其中在(i)-(iv)中的任一项中，氨基酸置换可以是保守氨基酸置换或非保守氨基酸置换；并且其中修饰的轻链可变区相对于SEQ IDNO：360的轻链可变区可以具有增强的生物活性，同时保留抗体的CD5结合特异性，即具有类似于包含SEQ ID NO：360的抗体或其抗原结合片段的结合特异性。
在示例性实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO：359具有至少95％相同性，例如与SEQ ID NO：359具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％的相同性的氨基酸序列，该轻链可变区包含与SEQ IDNO：360具有至少95％相同性，例如与SEQ ID NO∶360具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％的相同性的氨基酸序列。在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段含有包含SEQID NO：359的重链可变区和包含SEQ ID NO：360的轻链可变区。
在另一个实施方案中，抗CD5抗体或其抗原结合片段可含有重链可变区，该重链可变区含有包含氨基酸序列SEQ ID NO：353的VH CDR1。在一个实施方案中，重链可变区含有包含氨基酸序列SEQ ID NO：354的VH CDR2。在一个实施方案中，重链可变区含有包含氨基酸序列SEQ ID NO：355的VH CDR3。在一个实施方案中，重链可变区包含一个或多个选自SEQID NO：353、SEQ ID NO：354和SEQ ID NO：355的VH CDR。在一个实施方案中，重链可变区包含两个或更多个选自SEQ ID NO：353、SEQ ID NO：354和SEQ ID NO：355的VH CDR。在一个实施方案中，重链可变区含有包含SEQ ID NO：353的VH CDR1、包含SEQ ID NO：354的VH CDR2和包含SEQ ID NO：355的VH CDR3。
在一个实施方案中，轻链可变区包含一个或多个互补决定区(CDR)。在一个实施方案中，轻链可变区含有包含氨基酸序列SEQ ID NO：356的VL CDR1。在一个实施方案中，轻链可变区含有包含氨基酸序列SEQ ID NO：357的VL CDR2。在一个实施方案中，轻链可变区含有包含氨基酸序列SEQ ID NO：358的VL CDR3。在一个实施方案中，轻链可变区包含一个或多个选自SEQ ID NO：356、SEQ ID NO：357和SEQ ID NO：358的VL CDR。在一个实施方案中，轻链可变区包含两个或更多个选自SEQ ID NO：356、SEQ ID NO：357和SEQ ID NO：358的VLCDR。在一个实施方案中，轻链可变区含有包含SEQ ID NO：356的VLCDR1、包含SEQ ID NO：357的VLCDR2和包含SEQ ID NO：358的VLCDR3。
在示例性实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区含有包含SEQ ID NO：353的VH CDR1、包含SEQ ID NO：354的VH CDR2和包含SEQID NO：355的VH CDR3，该轻链可变区含有包含SEQ ID NO：356的VL CDR1、包含SEQ ID NO：357的VL CDR2和包含SEQ ID NO：358的VLCDR3。
在某些实施方案中，一个或多个CDR(即，一个或多个具有SEQ ID NO：353-355的重链CDR，和/或一个或多个具有SEQ ID NO：356-358的轻链CDR)可以包含保守的氨基酸置换(或2、3、4或5个氨基酸置换)，同时保留抗体的CD5特异性(即，类似于包含SEQ ID NO：353-355的重链CDR，和SEQ ID NO：356-358的轻链CDR的抗体或其抗原结合片段的特异性)。
能够结合CD5抗原的抗体及其抗原结合片段可以使用本领域已知的和本文描述的技术来鉴定，诸如通过免疫、计算建模技术和体外选择方法，诸如下文所述的噬菌体展示和基于细胞的展示平台。
可与本文所述的组合物和方法结合使用的抗CD5抗体包括具有以下可变区之一或两者的那些抗体，或与其具有至少85％序列相同性的氨基酸序列(例如，与其具有85％、90％、95％、97％、98％、99％或更高的序列相同性的氨基酸序列)：
具有氨基酸序列DIQMTQSPSSMSASLGDRVTITCRASQDINSYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQYEDFGIYYCQQYDESPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO：325)的VL；和
具有氨基酸序列QIQLVQSGPGLKKPGGSVRISCAASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLRWMGWINTHTGEPTYADDFKGRFTFSLDTSKSTAYLQINSLRAEDTATYFCTRRGYDWYFDVWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：326)的VH。
包含前述VL和VH序列的抗体及其抗原结合片段描述于例如美国专利号5,869,619中，其各个公开内容通过援引加入本文，因为它涉及抗CD5抗体及其抗原结合片段，诸如he1抗体。在一些实施方案中，抗CD5抗体或其抗原结合片段包括SEQ ID NO：325和SEQ ID NO：326的VL和VH链。在一些实施方案中，抗CD5抗体或其抗原结合片段包括SEQ ID NO：325和SEQID NO：326的VL和VH链中所包含的CDR。在一些实施方案中，抗CD5抗体或其抗原结合片段包括SEQ ID NO：325和SEQ ID NO：326的VL和VH链中所包含的CDR，并且VL和VH序列的其余部分具有与SEQ ID NO：325和SEQ ID NO：326的VL和VH序列至少85％的序列相同性(例如，85％、90％、95％、97％、98％、99％或更高的序列相同性)。
在一些实施方案中，抗CD5抗体或其抗原结合片段包括以下CDR：
具有氨基酸序列GYTFTNY(SEQ ID NO：327)的CDR-H1；
具有氨基酸序列NTHTGE(SEQ ID NO：328)的CDR-H2；
具有氨基酸序列RGYDWYFDV(SEQ ID NO：329)的CDR-H3；
具有氨基酸序列RASQDINSYLS(SEQ ID NO：330)的CDR-L1；
具有氨基酸序列RANRLVD(SEQ ID NO∶331)的CDR-L2；和
具有氨基酸序列QQYDESPWT(SEQ ID NO：332)的CDR-L3。
可与本文所述的组合物和方法结合使用的另外的抗CD5抗体包括具有以下可变区之一或两者的那些抗体，或与其具有至少85％序列相同性的氨基酸序列(例如，与其具有85％、90％、95％、97％、98％、99％或更高的序列相同性的氨基酸序列)：
具有氨基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDINSYLSWFQQKPGKAPKTLIYRANRLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTIS SLQYEDFGIYYCQQYDESPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO：333)的VL；和
具有氨基酸序列EIQLVQSGGGLVKPGGSVRISCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWMGWINTHYGEPTYADSFKGTRTFSLDDSKNTAYLQINSLRAEDTAVYFCTRRGYDWYFDVWGQGGTTVTVSS(SEQ ID NO：334)的VH。
包含前述VL和VH序列的抗体及其抗原结合片段描述于例如美国专利号5,869,619中，其公开内容通过援引加入本文，因为它涉及抗CD5抗体及其抗原结合片段，诸如he3抗体。在一些实施方案中，抗CD5抗体或其抗原结合片段包括抗体的VL和VH链中所包含的CDR，该抗体包括SEQ ID NO：327和SEQ ID NO：328的VL和VH链。在一些实施方案中，抗CD5抗体或其抗原结合片段包括SEQ ID NO：327和SEQ ID NO：328的VL和VH链中所包含的CDR，并且VL和VH序列的其余部分具有与SEQ ID NO：327和SEQ ID NO：328的VL和VH序列至少85％的序列相同性(例如，85％、90％、95％、97％、98％、99％或更高的序列相同性)。
在一些实施方案中，抗CD5抗体或其抗原结合片段包括以下CDR：
具有氨基酸序列GYTFTNY(SEQ ID NO：335)的CDR-H1；
具有氨基酸序列NTHYGE(SEQ ID NO：336)的CDR-H2；
具有氨基酸序列RRGYDWYFDV(SEQ ID NO：337)的CDR-H3；
具有氨基酸序列RASQDINSYLS(SEQ ID NO：338)的CDR-L1；
具有氨基酸序列RANRLES(SEQ ID NO：339)的CDR-L2；和
具有氨基酸序列QQYDESPWT(SEQ ID NO：340)的CDR-L3。
包含前述CDR序列的抗体及其抗原结合片段描述于例如美国专利号5,869,619中，其公开内容通过援引加入本文，因为它涉及抗CD5抗体及其抗原结合片段。
可与本文所述的组合物和方法结合使用的其他抗CD5抗体包括例如美国专利号5,821,123；5,766,886；5,770,196；7,153,932；5,621,083；6,649,742；6,146,631；5,756,699；5,744,580；6,376,217；5,837,491；和6,146,850中描述的抗CD5抗体，它们中的每一个的公开内容通过援引加入本文，因为它们涉及抗CD5抗体及其抗原结合片段。
可以与本文所述的组合物和方法结合使用的其他抗CD5抗体包括例如，由保藏为ATCC CRL8000(抗CD5鼠抗体OKT1)的杂交瘤细胞系产生的那些。此类抗体描述于美国专利号4,515,894；4,657,760；和4,363,799，它们中的每一个的公开内容通过援引加入本文，因为它们涉及抗CD5抗体及其抗原结合片段。
可以与本文所述的组合物和方法结合使用的抗CD5抗体包括具有以下CDR中的一个或多个或所有的那些：
具有氨基酸序列GYSITSGYY(SEQ ID NO：341)的CDR-H1；
具有氨基酸序列ISYSGFT(SEQ ID NO：342)的CDR-H2；
具有氨基酸序列AGDRTGSWFAY(SEQ ID NO：343)的CDR-H3；
具有氨基酸序列QDISNY(SEQ ID NO：344)的CDR-L1；
具有氨基酸序列ATS(SEQ ID NO：345)的CDR-L2；和
具有氨基酸序列LQYASYPFT(SEQ ID NO：346)的CDR-L3。
包含前述CDR序列的抗体及其抗原结合片段描述于例如美国专利号8,679,500中，其公开内容通过援引加入本文，因为它涉及抗CD5抗体及其抗原结合片段。
可以与本文所述的组合物和方法结合使用的抗CD5抗体包括具有以下CDR中的一个或多个或所有的那些：
具有氨基酸序列GYIFTNYG(SEQ ID NO∶347)的CDR-H1；
具有氨基酸序列INTYNGEP(SEQ ID NO：348)的CDR-H2；
具有氨基酸序列ARGDYYGYEDY(SEQ ID NO：349)的CDR-H3；
具有氨基酸序列QGISNY(SEQ ID NO：350)的CDR-L1；
具有氨基酸序列YTS(SEQ ID NO：351)的CDR-L2；和
具有氨基酸序列QQYSKLPWT(SEQ ID NO：352)的CDR-L3。
包含前述CDR序列的抗体及其抗原结合片段描述于例如美国专利号8,679,500中。
可以与本文所述的组合物和方法结合使用的抗CD5抗体包括具有以下CDR中的一个或多个或所有的那些：
具有氨基酸序列FSLSTSGMG(SEQ ID NO：353)的CDR-H1；
具有氨基酸序列WWDDD(SEQ ID NO：354)的CDR-H2；
具有氨基酸序列RRATGTGFDY(SEQ ID NO：355)的CDR-H3；
具有氨基酸序列QDVGTA(SEQ ID NO：356)的CDR-L1；
具有氨基酸序列WTSTRHT(SEQ ID NO：357)的CDR-L2；和
具有氨基酸序列YNSYNT(SEQ ID NO：358)的CDR-L3。
包含前述CDR序列的抗体及其抗原结合片段描述于例如美国专利申请公开号2008/0254027中，其公开内容通过援引加入本文，因为它涉及抗CD5抗体及其抗原结合片段。
可以与本文所述的组合物和方法结合使用的其他抗CD5抗体包括，例如，PCT申请公开号WO1992/014491中描述的抗CD5抗体，诸如由在1991年1月10在巴斯德研究所(Institut Pasteur)以No.1-1025保藏的杂交瘤细胞系产生的抗CD5抗体。PCT申请公开号WO1992/014491的公开内容通过援引加入本文，因为它涉及抗CD5抗体及其抗原结合片段。
可与本文所述的组合物和方法结合使用的其他抗CD5抗体包括例如美国专利号6,010,902和7,192,736，美国专利申请公开号2011/0250203和2017/0129128，和PCT申请公开号WO2016/172606；WO1994/023747；和WO1996/041608中描述的抗CD5抗体，它们中的每一个的公开内容通过援引加入本文，因为它们涉及抗CD5抗体及其抗原结合片段。
在一些实施方案中，可与本文所述的组合物和方法结合使用的抗CD5抗体包括包含下表所列的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3区的组合的那些。
表5
Figure BDA0003429348370000531
Figure BDA0003429348370000541
Figure BDA0003429348370000542
Figure BDA0003429348370000551
包含上表的前述CDR序列的抗体及其抗原结合片段描述于例如美国专利申请公开号2011/0250203中，其公开内容通过援引加入本文，因为它涉及抗CD5抗体及其抗原结合片段。
抗CD2抗体
在某些实施方案中，本文所述的组合物和方法包括与人CD2特异性地结合的抗体或其片段。人CD2也称为T细胞表面抗原T11/Leu-5、T11、CD2抗原(p50)和绵羊红细胞受体(SRBC)。CD2在T细胞上表达。已经鉴定了人CD2的两种同种型。含有351个氨基酸的同种型1描述于Seed，B.等人(1987)84：3365-69(还参见Sewell等人(1986)83：8718-22)和以下(NCBI参考序列：NP_001758.2)：
msfpckfvas fllifnvssk gavskeitna letwgalgqd inldipsfqm sddiddikwe
ktsdkkkiaq frkeketfke kdtyklfkng tlkikhlktd dqdiykvsiy dtkgknvlek
ifdlkiqerv skpkiswtci nttltcevmn gtdpelnlyq dgkhlklsqr vithkwttsl
sakfkctagn kvskessvep vscpekgldi yliigicggg sllmvfvall vfyitkrkkq
rsrrndeele trahrvatee rgrkphqipa stpqnpatsq hpppppghrs qapshrpppp
ghrvqhqpqk rppapsgtqv hqqkgpplpr prvqpkpphg aaenslspss n(SEQ ID NO：312)
CD2的第二种同种型是377个氨基酸，并且在本文中被标示为NCBI参考序列：NP_001315538.1。
T细胞和NK细胞已被证明表达CD2，其是一种细胞粘附分子和此类淋巴细胞的特异性标志物。例如，CD2与其他粘附分子(诸如淋巴细胞功能相关抗原3(LFA-3/CD58)相互作用，以增强T细胞活化。能够结合CD2的抗体或其抗原结合片段可以抑制T细胞活化和T细胞介导的针对造血干细胞移植物的免疫应答，例如，通过抑制CD2和LFA-3之间的相互作用来进行。与该细胞表面抗原结合的抗体及其抗原结合片段可以使用本领域已知的和本文描述的技术来鉴定，包括免疫、计算建模技术和体外选择方法，诸如下文所述的噬菌体展示和基于细胞的展示平台。
在某些实施方案中，本发明涵盖包含与CD2多肽(例如人CD2多肽)特异性结合的抗体或其抗原结合片段的ADC及其用途。
在一个实施方案中，ADC含有包含重链可变区的抗CD2抗体，该重链可变区包含一个或多个互补决定区(CDR)。在一个实施方案中，重链可变区含有包含氨基酸序列SEQ IDNO：300的VH CDR1。在一个实施方案中，重链可变区含有包含氨基酸序列SEQ ID NO：301的VH CDR2。在一个实施方案中，重链可变区含有包含氨基酸序列SEQ ID NO：302的VH CDR3。在一个实施方案中，重链可变区包含一个或多个选自SEQ ID NO：300、SEQ ID NO：301和SEQID NO：302的VH CDR。在一个实施方案中，重链可变区包含两个或更多个选自SEQ ID NO：300、SEQ ID NO：301和SEQ ID NO：302的VH CDR。在一个实施方案中，重链可变区含有包含SEQ ID NO：300的VH CDR1、包含SEQ ID NO：301的VH CDR2和包含SEQ ID NO：302的VHCDR3。
在一个实施方案中，ADC含有包含轻链可变区的抗CD2抗体，该轻链可变区包含一个或多个互补决定区(CDR)。在一个实施方案中，轻链可变区含有包含氨基酸序列SEQ IDNO：303的VL CDR1。在一个实施方案中，轻链可变区含有包含氨基酸序列SEQ ID NO：304的VL CDR2。在一个实施方案中，轻链可变区含有包含氨基酸序列SEQ ID NO∶305的VL CDR3。在一个实施方案中，轻链可变区包含一个或多个选自SEQ ID NO：303、SEQ ID NO：304和SEQID NO：305的VL CDR。在一个实施方案中，轻链可变区包含两个或更多个选自SEQ ID NO：303、SEQ ID NO：304和SEQ ID NO：305的VL CDR。在一个实施方案中，轻链可变区含有包含SEQ ID NO：303的VL CDR1、包含SEQ ID NO：304的VLCDR2和包含SEQ ID NO：305的VLCDR3。
在示例性实施方案中，抗CD2抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区含有包含SEQ ID NO：300的VH CDR1、包含SEQ ID NO：301的VH CDR2和包含SEQ ID NO：302的VH CDR3，该轻链可变区含有包含SEQ ID NO：303的VL CDR1、包含SEQID NO：304的VLCDR2和包含SEQ ID NO：305的VLCDR3。
在某些实施方案中，一个或多个CDR(即，一个或多个具有SEQ ID NO：300-302的重链CDR，和/或一个或多个具有SEQ ID NO：303-305的轻链CDR)可以包含保守的氨基酸置换(或2、3、4或5个氨基酸置换)，同时保留抗体的CD2特异性(即，类似于包含SEQ ID NO：300-302的重链CDR，和SEQ ID NO：303-305的轻链CDR的抗体或其抗原结合片段的特异性)。
在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO：306所列的氨基酸序列。在另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO：306具有至少95％相同性，例如与SEQ ID NO：306具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％的相同性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗体包含修饰的重链(HC)可变区，该修饰的重链可变区含有包含SEQ ID NO：306或SEQ IDNO：306的变体的HC可变域，该变体(i)与SEQ ID NO：306的不同之处在于1、2、3、4或5个氨基酸置换、添加或缺失；(ii)与SEQ ID NO：306的不同之处在于至多5、4、3、2或1个氨基酸置换、添加或缺失；(iii)与SEQ ID NO：306的不同之处在于1-5、1-3、1-2、2-5或3-5个氨基酸置换、添加或缺失，和/或(iv)包含与SEQ ID NO：306至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的氨基酸序列，其中在(i)-(iv)中的任一项中，氨基酸置换可以是保守氨基酸置换或非保守氨基酸置换；并且其中修饰的重链可变区相对于SEQ IDNO：306的重链可变区可以具有增强的生物活性，同时保留抗体的CD2结合特异性，即具有类似于包含SEQ ID NO：306的抗体或其抗原结合片段的结合特异性。在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区在一个、两个、三个或四个氨基酸处不同于SEQ ID NO：306所列的氨基酸序列。例如，抗体或其抗原结合片段可以包含重链可变区，该重链可变区在位置12、13、28和/或48中的一个、两个、三个或四个处不同于SEQ ID NO：306所列的氨基酸序列。在一个实施方案中，重链可变区在位置12、13、28和48处不同于SEQID NO：306中列出的氨基酸序列。在一个实施方案中，重链可变区包含相对于SEQ ID NO：306：K12Q；K13R；T28I和M48V中列出的序列的以下置换中的一个、两个、三个或四个：K12Q；K13R；T28I；和M48V。在一个实施方案中，重链可变区包含相对于SEQ ID NO：306的置换K12Q；K13R；T28I；和M48V。
在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO：307中所列的氨基酸序列。在另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO：307具有至少95％相同性，例如与SEQ ID NO：307具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％的相同性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗体包含修饰的轻链(LC)可变区，该修饰的轻链可变区含有包含SEQ ID NO：307或SEQID NO：307的变体的LC可变域，该变体(i)与SEQ ID NO：307的不同之处在于1、2、3、4或5个氨基酸置换、添加或缺失；(ii)与SEQ ID NO：307的不同之处在于至多5、4、3、2或1个氨基酸置换、添加或缺失；(iii)与SEQ ID NO：307的不同之处在于1-5、1-3、1-2、2-5或3-5个氨基酸置换、添加或缺失，和/或(iv)包含与SEQ ID NO：307至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的氨基酸序列，其中在(i)-(iv)中的任一项中，氨基酸置换可以是保守氨基酸置换或非保守氨基酸置换；并且其中修饰的轻链可变区相对于SEQ IDNO：307的轻链可变区可以具有增强的生物活性，同时保留抗体的CD2结合特异性，即具有类似于包含SEQ ID NO：307的抗体或其抗原结合片段的结合特异性。
在示例性实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO：306具有至少95％相同性，例如与SEQ ID NO：306具有至少约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％的相同性的氨基酸序列，该轻链可变区包含与SEQ ID NO：307具有至少约95％相同性，例如与SEQ ID NO：307具有至少约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％的相同性的氨基酸序列。在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段含有包含SEQ ID NO∶306的重链可变区和包含SEQ ID NO：307的轻链可变区。在一个实施方案中，该抗体是含有包含SEQ ID NO：306的重链可变区和包含SEQ ID NO：307的轻链可变区的Ab1抗体。
在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO：308中所列的氨基酸序列。在另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO：308具有至少95％相同性，例如与SEQ ID NO：308具有至少约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％的相同性的氨基酸序列。在示例性实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO：308具有至少95％相同性，例如与SEQ ID NO∶308具有至少约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％的相同性的氨基酸序列，该轻链可变区包含与SEQ ID NO：309具有至少约95％相同性，例如与SEQ ID NO：309具有至少约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％的相同性的氨基酸序列。在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段含有包含SEQ ID NO：308的重链可变区和包含SEQ ID NO：309的轻链可变区。在一个实施方案中，该抗体是含有包含SEQ ID NO：308的重链可变区和包含SEQ ID NO：309的轻链可变区的Ab1a抗体。
在一个实施方案中，重链可变区包含一个或多个互补决定区(CDR)。在一个实施方案中，重链可变区含有包含氨基酸序列SEQ ID NO：3131的VH CDR1。在一个实施方案中，重链可变区含有包含氨基酸序列SEQ ID NO：314的VH CDR2。在一个实施方案中，重链可变区含有包含氨基酸序列SEQ ID NO：315的VH CDR3。在一个实施方案中，重链可变区包含一个或多个选自SEQ ID NO：313、SEQ ID NO：314和SEQ ID NO：315的VH CDR。在一个实施方案中，重链可变区包含两个或更多个选自SEQ ID NO：313、SEQ ID NO：314和SEQ ID NO：315的VH CDR。在一个实施方案中，重链可变区含有包含SEQ ID NO：313的VH CDR1、包含SEQ IDNO：314的VH CDR2和包含SEQ ID NO：315的VH CDR3。
在一个实施方案中，重链可变区包含一个或多个互补决定区(CDR)。在一个实施方案中，重链可变区含有包含氨基酸序列SEQ ID NO：313的VH CDR1。在一个实施方案中，重链可变区含有包含氨基酸序列SEQ ID NO：314的VH CDR2。在一个实施方案中，重链可变区含有包含氨基酸序列SEQ ID NO：316的VH CDR3。在一个实施方案中，重链可变区包含一个或多个选自SEQ ID NO：313、SEQ ID NO：314和SEQ ID NO：316的VH CDR。在一个实施方案中，重链可变区包含两个或更多个选自SEQ ID NO：313、SEQ ID NO：314和SEQ ID NO：316的VHCDR。在一个实施方案中，重链可变区含有包含SEQ ID NO：313的VH CDR1、包含SEQ ID NO：314的VH CDR2和包含SEQ ID NO：316的VH CDR3。
在一个实施方案中，轻链可变区包含一个或多个互补决定区(CDR)。在一个实施方案中，轻链可变区含有包含氨基酸序列SEQ ID NO：317的VL CDR1。在一个实施方案中，轻链可变区含有包含氨基酸序列SEQ ID NO：318的VL CDR2。在一个实施方案中，轻链可变区含有包含氨基酸序列SEQ ID NO：319的VL CDR3。在一个实施方案中，轻链可变区包含一个或多个选自SEQ ID NO：317、SEQ ID NO：318和SEQ ID NO：319的VL CDR。在一个实施方案中，轻链可变区包含两个或更多个选自SEQ ID NO：317、SEQ ID NO：318和SEQ ID NO：319的VLCDR。在一个实施方案中，轻链可变区含有包含SEQ ID NO：317的VLCDR1、包含SEQ ID NO：318的VLCDR2和包含SEQ ID NO：319的VLCDR3。
在示例性实施方案中，该抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区含有包含SEQ ID NO：313的VH CDR1、包含SEQ ID NO：314的VH CDR2和包含SEQ ID NO：315的VH CDR3，该轻链可变区含有包含SEQ ID NO：317的VL CDR1、包含SEQ IDNO：318的VL CDR2和包含SEQ ID NO：319的VLCDR3。
在示例性实施方案中，该抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区含有包含SEQ ID NO：313的VH CDR1、包含SEQ ID NO：314的VH CDR2和包含SEQ ID NO：316的VH CDR3，该轻链可变区含有包含SEQ ID NO：317的VL CDR1、包含SEQ IDNO：318的VL CDR2和包含SEQ ID NO：319的VLCDR3。
在某些实施方案中，一个或多个CDR(即，一个或多个具有SEQ ID NO：313-316的重链CDR，和/或一个或多个具有SEQ ID NO：317-318的轻链CDR)可以包含保守的氨基酸置换(或2、3、4或5个氨基酸置换)，同时保留抗体的CD2特异性(即，类似于包含SEQ ID NO：313-315的重链CDR，和SEQ ID NO：18-20的轻链CDR；或包含SEQ ID NO：313、314和316的重链CDR，和SEQ ID NO：317-319的轻链CDR的抗体或其抗原结合片段的特异性)。
在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO：320中所列的氨基酸序列。在另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO：320具有至少约95％相同性，例如与SEQ ID NO：320具有至少约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％的相同性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗体包含修饰的重链(HC)可变区，该修饰的重链可变区含有包含SEQ IDNO：320或SEQ ID NO：320的变体的HC可变域，该变体(i)与SEQ ID NO：320的不同之处在于1、2、3、4或5个氨基酸置换、添加或缺失；(ii)与SEQ ID NO：320的不同之处在于至多5、4、3、2或1个氨基酸置换、添加或缺失；(iii)与SEQ ID NO：320的不同之处在于1-5、1-3、1-2、2-5或3-5个氨基酸置换、添加或缺失，和/或(iv)包含与SEQ ID NO：320至少约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％相同性的氨基酸序列，其中在(i)-(iv)中的任一项中，氨基酸置换可以是保守氨基酸置换或非保守氨基酸置换；并且其中修饰的重链可变区相对于SEQ ID NO：320的重链可变区可以具有增强的生物活性，同时保留抗体的CD2结合特异性，即具有类似于包含SEQ ID NO：320的抗体或其抗原结合片段的结合特异性。
在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO：321中所列的氨基酸序列。在另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO：321具有至少约95％相同性，例如与SEQ ID NO：321具有至少约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％的相同性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗体包含修饰的重链(HC)可变区，该修饰的重链可变区含有包含SEQ IDNO：320或SEQ ID NO：321的变体的HC可变域，该变体(i)与SEQ ID NO：321的不同之处在于1、2、3、4或5个氨基酸置换、添加或缺失；(ii)与SEQ ID NO：321的不同之处在于至多5、4、3、2或1个氨基酸置换、添加或缺失；(iii)与SEQ ID NO：321的不同之处在于1-5、1-3、1-2、2-5或3-5个氨基酸置换、添加或缺失，和/或(iv)包含与SEQ ID NO：321至少约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％相同性的氨基酸序列，其中在(i)-(iv)中的任一项中，氨基酸置换可以是保守氨基酸置换或非保守氨基酸置换；并且其中修饰的重链可变区相对于SEQ ID NO：321的重链可变区可以具有增强的生物活性，同时保留抗体的CD2结合特异性，即具有类似于包含SEQ ID NO：321的抗体或其抗原结合片段的结合特异性。
在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO：322中所列的氨基酸序列。在另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO：322具有至少约95％相同性，例如与SEQ ID NO：322具有至少约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％的相同性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗体包含修饰的轻链(LC)可变区，该修饰的轻链可变区含有包含SEQ IDNO：322或SEQ ID NO：322的变体的LC可变域，该变体(i)与SEQ ID NO：322的不同之处在于1、2、3、4或5个氨基酸置换、添加或缺失；(ii)与SEQ ID NO：322的不同之处在于至多5、4、3、2或1个氨基酸置换、添加或缺失；(iii)与SEQ ID NO：322的不同之处在于1-5、1-3、1-2、2-5或3-5个氨基酸置换、添加或缺失，和/或(iv)包含与SEQ ID NO：322至少约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％相同性的氨基酸序列，其中在(i)-(iv)中的任一项中，氨基酸置换可以是保守氨基酸置换或非保守氨基酸置换；并且其中修饰的轻链可变区相对于SEQ ID NO：322的轻链可变区可以具有增强的生物活性，同时保留抗体的CD2结合特异性，即具有类似于包含SEQ ID NO：322的抗体或其抗原结合片段的结合特异性。
在示例性实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO：320具有至少95％相同性，例如与SEQ ID NO∶320具有至少约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％的相同性的氨基酸序列，该轻链可变区包含与SEQ ID NO：322具有至少约95％相同性，例如与SEQ ID NO：322具有至少约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％的相同性的氨基酸序列。在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段含有包含SEQ ID NO：320的重链可变区和包含SEQ ID NO：322的轻链可变区。
在示例性实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO：321具有至少约95％相同性，例如与SEQ ID NO：321具有至少约95％、约96％、约97％、约98％或约99％或100％的相同性的氨基酸序列，该轻链可变区包含与SEQ ID NO：322具有至少约95％相同性，例如与SEQ ID NO：322具有至少约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％的相同性的氨基酸序列。在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段含有包含SEQ ID NO：321的重链可变区和包含SEQ ID NO：322的轻链可变区。
可以与本文所述的组合物和方法结合使用的抗CD2抗体包括具有以下CDR中的一个或多个或所有的那些：
a.具有氨基酸序列EYYMY(SEQ ID NO：300)的CDR-H1；
b.具有氨基酸序列RIDPEDGSIDYVEKFKK(SEQ ID NO：301)的CDR-H2；
c.具有氨基酸序列GKFNYRFAY(SEQ ID NO：302)的CDR-H3；
d.具有氨基酸序列RSSQSLLHSSGNTYLN(SEQ ID NO：303)的CDR-L1；
e.具有氨基酸序列LVSKLES(SEQ ID NO：304)的CDR-L2；和
f.具有氨基酸序列MQFTHYPYT(SEQ ID NO：305)的CDR-L3。
包含前述CDR序列的抗体及其抗原结合片段描述于例如美国专利号6,849,258中，其公开内容通过援引加入本文，因为它涉及抗CD2抗体及其抗原结合片段。
美国专利号5,730,979；5,817,311；5,951,983和7,592,006中公开的抗体及其片段，诸如LO-CD2a、BTI-322，和由以ATCC保藏号HB 11423保藏的杂交瘤细胞系产生的抗体(例如，含有从以ATCC保藏号HB 11423保藏的杂交瘤细胞系中分离的抗体LO-CD2a的一个或多个或所有CDR序列的抗体或其抗原结合片段)可以与本文公开的组合物和方法结合使用。可与本文所述的组合物和方法结合使用的示例性抗体包括人源化抗体，其含有从以ATCC保藏号HB 11423保藏的杂交瘤细胞系中分离的抗体的一个或多个或所有CDR序列，例如MEDI-507。MEDI-507是人源化抗CD2单克隆抗体，其含有以上(a)至(t)的CDR-H和CDR-L序列，并且描述于Branco等人，Transplantation 68：1588-1596(1999)中。MEDI-507另外描述于WO99/03502A1和WO1994/020619A1；美国专利号US7,592,006、US6,849,258、US5,951,983、US5,817,311和US5,730,979；和美国专利公开号US2011/0280868、US2004/0265315和2011/0091453中，它们中的每一个的公开内容通过援引加入本文，因为它们涉及抗CD2抗体及其抗原结合片段，诸如抗CD2抗体MEDI-507。在一个实施方案中，抗CD2抗体是西利珠单抗(Siplizumab)或其抗原结合片段。
可与本文所述的组合物和方法结合使用的其他抗CD2抗体包括例如美国专利号6,541,611和7,250,167中描述的抗CD2抗体，它们中的每一个的公开内容通过援引加入本文，因为它们涉及抗CD2抗体及其抗原结合片段，诸如抗CD2抗体LO-CD2b和通过以ATCC保藏号PTA-802保藏的杂交瘤细胞系产生的抗体。可与本文所述的组合物和方法结合使用的示例性抗体包括人源化抗体，其含有从以ATCC保藏号PTA-802保藏的杂交瘤细胞系中分离的抗体的一个或多个或所有CDR序列。
可与本文所述的组合物和方法结合使用的其他抗CD2抗体包括例如美国专利号5,795,572和5,807,734中描述的抗CD2抗体，它们中的每一个的公开内容通过援引加入本文，因为它们涉及抗CD2抗体及其抗原结合片段，诸如通过以ATCC保藏号HB 69277保藏的杂交瘤细胞系产生的抗CD2抗体。例如，可与本文所述的组合物和方法结合使用的抗CD2抗体及其抗原结合片段包括含有具有氨基酸序列EPKSSDKTHTSPPSP(SEQ ID NO：316)的铰链区的那些，诸如包含具有氨基酸序列EPKSSDKTHTSPPSP(SEQ ID NO：316)的铰链区的scFv片段。掺入具有氨基酸序列SEQ ID NO：316的铰链区可能是有益的，因为该铰链基序相对于野生型铰链区序列已经发生突变，以消除可能促进单链抗体片段诸如scFv片段的不希望氧化二聚反应的潜在反应性半胱氨酸残基。
可与本文所述的组合物和方法结合使用的其他抗CD2抗体包括例如美国专利号6,764,688中描述的抗CD2抗体，诸如抗CD2抗体TS2/18和通过以ATCC保藏号HB-195保藏的杂交瘤细胞系产生的抗体。美国专利号6,764,688的公开内容通过援引加入本文，因为它涉及抗CD2抗体及其抗原结合片段。
可与本文所述的组合物和方法结合使用的其他抗CD2抗体包括例如美国专利号6,162,432、6,558,662、7,408,039、7,332,157、7,638,121、7,939,062和7,115,259，美国专利申请公开号2006/0084107、2014/0369974、2002/0051784和2013/0183322，和PCT公开号WO1992/016563中描述的抗CD2抗体，它们中的每一个的公开内容通过援引加入本文，因为它们涉及抗CD2抗体及其抗原结合片段。
抗Her2抗体
对Her2抗原特异性的抗体是本领域技术人员已知的，例如曲妥珠单抗。
抗PSMA抗体
对包含在根据本发明的ADC中的前列腺特异性膜抗原(PSMA)特异性的抗体已在WO2020/025564A1中公开，其公开内容以其整体援引加入本文。
Fc突变
如本领域已知的，本文所述的抗体或结合片段还可包括改变抗体和/或片段的特性的修饰和/或突变，诸如增加半衰期、增加或减少ADCC等的那些。
在一个实施方案中，抗体或其结合片段包含变体Fc区，其中所述变体Fc区包含相对于野生型Fc区的至少一个氨基酸修饰，使得所述分子对FcγR具有改变的亲和力。通过晶体学研究已知Fc区内的某些氨基酸位置与FcγR直接接触。特别是氨基酸234-239(铰链区)、氨基酸265-269(B/C环)、氨基酸297-299(C′/E环)和氨基酸327-332(F/G)环。(参见Sondermann等人，2000Nature，406：267-273)。因此，本文所述的抗体(例如，抗CD117、CD45、CD137、CD2、CD5、CD262或CD134)可包含变体Fc区，该Fc区包含形成与Fcγ R的直接接触的至少一个残基的修饰(基于结构和晶体学分析)。在一个实施方案中，抗体(或其片段)的Fc区包含根据如Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，5thEd.Public Health Service，NH1，MD(1991)(明确通过援引加入本文)中的EU索引在氨基酸265处的氨基酸置换。“如Kabat中的EU索引”是指人IgG1 EU抗体的编号。EU索引或如Kabat或EU编号方案中的EU索引是指EU抗体的编号(Edelman等人，1969，Proc Natl AcadSci USA63：78-85，在此整体援引加入)。在一个实施方案中，Fc区包含D265A突变。在一个实施方案中，Fc区包含D265C突变。在一些实施方案中，抗体(或其片段)的Fc区包含根据如Kabat中的EU索引在氨基酸234处的氨基酸置换。在一个实施方案中，Fc区包含L234A突变。在一些实施方案中，抗体(或其片段)的Fc区包含根据如Kabat中的EU索引在氨基酸235处的氨基酸置换。在一个实施方案中，Fc区包含L235A突变。在又一个实施方案中，Fc区包含L234A和L235A突变。在进一个实施方案中，本文所述ADC的抗体的Fc区包含D265C、L234A和L235A突变。
在某些方面，与不包含一个或多个氨基酸置换的野生型Fc结构域相比，变体IgGFc结构域包含一个或多个氨基酸置换，导致对Fc.γ.R和/或C1q的结合亲和力降低或消除。Fc结合相互作用对于多种效应子功能和下游信号转导事件(包括但不限于抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC))至关重要。因此，在某些方面，包含修饰的Fc区(例如，包含L234A、L235A和D265C突变)的抗体具有显著降低或消除的效应子功能。
可以使用本领域已知的多种技术来确定对Fc区的亲和力，例如但不限于平衡方法(例如，酶联免疫吸附测定(ELISA)；KinExA，Rathanaswami等人Analytical Biochemistry，Vol.373：52-60，2008；或放射免疫测定(RIA))，或通过表面等离子体共振测定或其他基于动力学的测定机制(例如BIACORETM分析或OctetTM分析(forteBIO))，以及其他方法诸如间接结合测定、竞争性结合测定、荧光共振能量转移(FRET)、凝胶电泳和色谱法(例如凝胶过滤)。这些和其他方法可以利用一种或多种被检查成分上的标记和/或采用多种检测方法，包括但不限于显色、荧光、发光或同位素标记。结合亲和力和动力学的详细描述可见于Paul，W.E.，ed.，Fundamental Immunology，第4版，Lippincott-Raven，Philadelphia(1999)，其关注抗体-免疫原相互作用。竞争性结合测定的一个实例是放射免疫测定，其包括在增加量的未标记抗原的存在下将标记抗原与目标抗体一起孵育，并检测与标记抗原结合的抗体。目标抗体对特定抗原的亲和力和结合解离率可以通过scatchard作图分析由数据确定。与第二抗体的竞争也可以使用放射免疫测定法来确定。在这种情况下，在增加量的未标记的第二抗体的存在下，将抗原与缀合至标记的化合物的目标抗体一起孵育。
抗体可以被进一步改造以通过引入另外的Fc突变(诸如描述于例如(Dall′Acqua等人(2006)J Biol Chem 281∶23514-24)、(Zalevsky等人(2010)Nat Biotechnol 28：157-9)、(Hinton等人(2004)J Biol Chem 279∶6213-6)、(Hinton等人(2006)J Immunol 176：346-56)、(Shields等人(2001)J Biol Chem 276：6591-604)、(Petkova等人(2006)IntImmunol 18：1759-69)、(Datta-Mannan等人(2007)Drug Metab Dispos 35：86-94)、(Vaccaro等人(2005)Nat Biotechnol 23：1283-8)、(Yeung等人(2010)Cancer Res 70：3269-77)和(Kim等人(1999)Eur J Immunol 29：2819-25)中的那些)来进一步调节抗体半衰期，并且包括位置250、252、253、254、256、257、307、376、380、428、434和435。可以单独或组合形成的示例性突变是T250Q、M252Y、1253A、S254T、T256E、P2571、T307A、D376V、E380A、M428L、H433K、N434S、N434A、N434H、N434F、H435A和H435R突变。
因此，在一个实施方案中，Fc区包含导致半衰期缩短的突变。具有短半衰期的抗体在预期将抗体用作短期治疗剂的某些情况下(例如，本文所述的给药抗体随后是HSC的调理步骤)可能是有利的。理想地，在递送HSC之前抗体将被基本清除，与内源性干细胞不同HSC通常也表达本文所述的ADC所靶向的抗原，例如CD117，但不是ADC的靶标。在一个实施方案中，Fc区包含位置435(根据Kabat的EU索引)处的突变。在一个实施方案中，突变是H435A突变。
在一个实施方案中，本文所述的抗体具有等于或小于24小时的半衰期、等于或小于22小时的半衰期、等于或小于20小时的半衰期、等于或小于18小时的半衰期、等于或小于16小时的半衰期、等于或小于14小时的半衰期、等于或小于13小时的半衰期、等于或小于12小时的半衰期，或等于或小于11小时的半衰期。在一个实施方案中，抗体的半衰期为11小时至24小时；12小时至22小时；10小时至20小时；8小时至18小时；或14小时至24小时。
在一些方面，Fc区包含两个或更多个突变，该突变赋予缩短的半衰期并大大减少或完全消除抗体的效应子功能。在一些实施方案中，Fc区包含导致半衰期缩短的突变和可与FcγR形成直接接触(例如，基于结构和晶体学分析)的至少一个残基的突变。在一个实施方案中，Fc区包含H435A突变、L234A突变和L235A突变。在一个实施方案中，Fc区包含H435A突变和D265C突变。在一个实施方案中，Fc区包含H435A突变、L234A突变、L235A突变和D265C突变。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段通过抗体或其抗原结合片段的Fc结构域中的半胱氨酸残基缀合至细胞毒素(例如，鹅膏毒素)。在一些实施方案中，半胱氨酸残基通过抗体或其抗原结合片段的Fc结构域中的突变引入。例如，半胱氨酸残基可以选自Cys118、Cys239和Cys265。在一个实施方案中，抗CD117抗体(或其片段)的Fc区包含根据如Kabat中的EU索引在氨基酸265处的氨基酸置换。在一个实施方案中，Fc区包含D265C突变。在一个实施方案中，Fc区包含D265C和H435A突变。在一个实施方案中，Fc区包含D265C、L234A和L235A突变。在一个实施方案中，Fc区包含D265C、L234A、L235A和H435A突变。
在这些方面的一些实施方案中，半胱氨酸残基天然存在于抗体或其抗原结合片段的Fc结构域中。例如，Fc结构域可以是IgG Fc结构域，例如人IgG1 Fc结构域，并且半胱氨酸残基可以选自Cys261、Csy321、Cys367和Cys425。
例如，在一个实施方案中，抗体67的Fc区被修饰以包含D265C突变(例如，SEQ IDNO：111)。在另一个实施方案中，抗体67的Fc区被修饰以包含D265C、L234A和L235A突变(例如，SEQ ID NO：112)。在又一个实施方案中，抗体67的Fc区被修饰以包含D265C和H435A突变(例如，SEQ ID NO：113)。在进一个实施方案中，抗体67的Fc区被修饰以包含D265C、L234A、L235A和H435A突变(例如，SEQ ID NO：114)。
对于抗体55，在一个实施方案中，抗体55的Fc区被修饰为包含D265C突变(例如，SEQ ID NO：117)。在另一个实施方案中，抗体55的Fc区被修饰以包含D265C、L234A和L235A突变(例如，SEQ ID NO：118)。在又一个实施方案中，抗体55的Fc区被修饰以包含D265C和H435A突变(例如，SEQ ID NO：119)。在进一个实施方案中，抗体55的Fc区被修饰以包含D265C、L234A、L235A和H435A突变(例如，SEQ ID NO：120)。
抗体54、抗体55、抗体56、抗体57、抗体58、抗体61、抗体66、抗体67、抗体68或抗体69中任一个的Fc区可以被修饰以包含D265C突变(例如，如SEQ ID NO：123中)；D265C、L234A和L235A突变(例如，如SEQ ID NO：124中)；D265C和H435A突变(例如，如SEQ ID NO：125中)；或D265C、L234A、L235A和H435A突变(例如，如SEQ ID NO：126中)。
本文所述的变体Fc结构域是根据构成它们的氨基酸修饰来定义的。对于本文讨论的关于Fc区的所有氨基酸置换，编号总是根据EU索引。因此，例如，D265C是一种Fc变体，其相对于母体Fc结构域，在EU位置265处的天冬氨酸(D)被半胱氨酸(C)置换。同样，例如，D265C/L234A/L235A定义了相对于母体Fc结构域在EU位置265(D至C)、234(L至A)和235(L至A)处具有置换的变体Fc变体。还可以根据其在突变的EU氨基酸位置中的最终氨基酸组成来命名变体。例如，L234A/L235A突变体可称为LALA。注意，提供置换的顺序是任意的。
在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含具有与本文公开的SEQ ID No至少95％、96％、97％或99％相同性的氨基酸序列的可变区。或者，抗体或其抗原结合片段含有包含本文公开的SEQ ID No的CDR，其中本文所述可变区的框架区具有与本文公开的SEQID No至少95％、96％、97％或99％相同性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含具有本文公开的氨基酸序列的重链可变区和重链恒定区。在另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含具有本文公开的氨基酸序列的轻链可变区和轻链恒定区。在又一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含具有本文公开的氨基酸序列的重链可变区、轻链可变区、重链恒定区和轻链恒定区。
鉴定抗体的方法
本文提供了可用于例如干细胞移植的调理方法中的新型ADC。鉴于本文的公开内容，可以鉴定可用于本发明的ADC和方法中的其他抗体。
高通量筛选抗体或抗体片段文库中能够结合细胞表面抗原(例如CD117、CD45、CD2、CD5、CD134、CD252、CD137)的分子的方法可用于鉴定和亲和用于治疗癌症、自身免疫疾病和调理需要如本文所述的造血干细胞疗法的患者(例如，人类患者)的成熟抗体。此类方法包括本领域已知的体外展示技术，诸如噬菌体展示、细菌展示、酵母展示、哺乳动物细胞展示、核糖体展示、mRNA展示和cDNA展示等。已经在例如Felici等人，Biotechnol.AnnualRev.1∶149-183，1995；Katz，Annual Rev.Biophys.Biomol.Struct.26：27-45，1997；和Hoogenboom等人，Immunotechnology 4∶1-20，1998中综述了使用噬菌体展示以分离结合生物相关分子的配体，它们中的每一个的公开内容通过援引加入本文，因为它们涉及体外展示技术。已经构建了随机组合肽文库来选择结合细胞表面抗原的多肽，如Kay，Perspect.Drug Discovery Des.2∶251-268，1995和Kay等人，Mol.Divers.1∶139-140，1996中所述，它们中的每一个的公开内容通过援引加入本文，因为它们涉及抗原结合分子的发现。蛋白质，诸如多聚体蛋白质，已经成功地噬菌体展示为功能性分子(参见，例如，EP0349578；EP 4527839和EP 0589877，以及Chiswell和McCafferty，Trends Biotechnol.10：80-841992，它们中的每一个的公开内容通过援引加入本文，因为它们涉及体外展示技术用于发现抗原结合分子的用途)。此外，功能性抗体片段，诸如Fab和scFv片段，已经以体外展示形式表达(参见，例如，McCafferty等人，Nature 348：552-554，1990；Barbas等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：7978-7982，1991；和Clackson等人，Nature 352：624-628，1991，它们中的每一个的公开内容通过援引加入本文，因为它们涉及用于发现抗原结合分子的体外展示平台)。这些技术尤其可用于鉴定和改善结合例如CD117、CD45、CD2、CD5、CD134、CD252、CD137(例如GNNK+CD117)的抗体的亲和力，这些抗体进而可用于消耗需要造血干细胞移植治疗的患者(例如，人类患者)中的内源性造血干细胞。
除了体外展示技术之外，计算建模技术可用于经由计算机设计和鉴定结合细胞表面抗原(例如，CD117、CD45、CD2、CD5、CD134、CD252、CD137)的抗体和抗体片段。例如，使用计算建模技术，本领域技术人员可以经由计算机筛选抗体和抗体片段文库中能够结合特定表位，诸如该抗原的细胞外表位的分子。通过这些计算技术鉴定的抗体及其抗原结合片段可与本文所述的治疗方法结合使用，诸如本文所述的癌症和自身免疫疾病治疗方法以及本文所述的患者调理程序。
可使用其他技术来鉴定抗体及其抗原结合片段，它们结合细胞(例如，癌细胞、自身免疫细胞或造血干细胞)的表面上的细胞表面抗原(例如，CD117)并且被细胞内化，例如通过受体介导的内吞作用来进行。例如，上述体外展示技术可适于筛选抗体及其抗原结合片段，它们结合癌细胞、自身免疫细胞或造血干细胞的表面上的细胞表面抗原(例如，CD117)并且随后被内化。噬菌体展示代表了一种可以与这种筛选范例结合使用的技术。为了鉴定结合细胞表面抗原(例如，CD117)并随后被癌细胞、自身免疫细胞或造血干细胞内化的抗体及其片段，本领域技术人员可以采用例如Williams等人，Leukemia 19：1432-1438，2005中描述的噬菌体展示技术，其公开内容以其整体援引加入本文。例如，使用本领域已知的诱变方法，可以产生重组噬菌体文库，该重组噬菌体文库编码抗体、抗体片段(诸如scFv片段、Fab片段)、双抗体、三抗体和10Fn3结构域等，或者包含随机化氨基酸盒(例如，在一个或多个或所有CDR或其等效区域或抗体或抗体片段中)的配体。可以设计抗体或抗体片段的框架区、铰链区、Fc结构域和其他区域，使得它们在人中是非免疫原性的，例如，凭借具有人种系抗体序列或相对于人类种系抗体仅表现出微小的变化的序列。
使用本文描述的或本领域已知的噬菌体展示技术，可以将包含共价结合到噬菌体颗粒的随机化抗体或抗体片段的噬菌体文库与细胞表面靶抗原(例如，CD117)抗原一起孵育，例如，通过首先将噬菌体文库与封阻剂(例如，乳蛋白、牛血清白蛋白和/或IgG)一起孵育以去除编码显示非特异性蛋白质结合的抗体或其片段的噬菌体和编码结合Fc结构域的抗体或片段的噬菌体，然后将噬菌体文库与造血干细胞群一起孵育。噬菌体文库可以与靶细胞，诸如癌细胞、自身免疫细胞或造血干细胞一起孵育足够长的时间，以允许细胞表面抗原特异性抗体或其抗原结合片段(例如，CD117特异性抗体或其抗原结合片段)结合细胞表面抗原(例如，细胞表面CD117)抗原并随后被癌细胞、自身免疫细胞或造血干细胞内化(例如，在4℃下30分钟至6小时，诸如在4℃下1小时)。含有对这些抗原中的一种或多种没有表现出足够亲和力以便允许与癌细胞、自身免疫细胞或造血干细胞结合并被它们内化的抗体或其片段的噬菌体随后可以通过洗涤细胞(例如，使用pH 2.8的冷的(4℃)0.1M甘氨酸缓冲液进行洗涤)而去除。与已经被癌细胞、自身免疫细胞或造血干细胞内化的抗体或其片段结合的噬菌体可以通过例如裂解细胞并从细胞培养基中回收内化的噬菌体来鉴定。然后可以在细菌细胞中扩增噬菌体，例如，通过使用本领域已知的方法将细菌细胞与回收的噬菌体在2xYT培养基中一起孵育。然后可以表征从该培养基中回收的噬菌体，例如，通过确定插入噬菌体基因组内的编码抗体或其片段的基因的核酸序列。编码的抗体或其片段随后可通过化学合成(例如，抗体片段，诸如scFv片段)或通过重组表达(例如，全长抗体)而重新制备。
用于与本文所述的组合物和方法一起使用的细胞表面抗原抗体(例如，抗CD117)抗体的体外进化的示例性方法是噬菌体展示。噬菌体展示文库可以通过在抗体的CDR或抗体样支架的类似区域(例如10Fn3结构域的BC、CD和DE环)的编码序列内进行一系列设计的突变或变异来创建。引入这些突变的模板抗体编码序列可以是例如初始的人种系序列。这些突变可以使用本领域已知的标准诱变技术进行。因此，除了一个或多个氨基酸变异外，每个突变序列编码对应于模板的抗体。可以使用本领域已知的标准载体构建技术来改造逆转录病毒和噬菌体展示载体。P3噬菌体展示载体以及相容的蛋白质表达载体可用于生成用于抗体多样化的噬菌体展示载体。
突变的DNA提供序列多样性，并且每个转化体噬菌体展示由DNA编码的初始模板氨基酸序列的一种变体，导致噬菌体群体(文库)展示了大量不同但结构相关的氨基酸序列。由于抗体高变区的明确结构，在噬菌体展示筛选中引入的氨基酸变异预计会改变结合肽或结构域的结合特性，而不会显著改变其整体分子结构。
在典型的筛选中，噬菌体文库可以与前述抗原之一或其表位接触并结合前述抗原之一或其表位。为了促进结合物和非结合物的分离，将靶标固定在固体支持物上是很方便的。带有细胞表面结合部分的噬菌体可以与固体支持物上的靶标形成复合物，而非结合的噬菌体保留在溶液中，并且可以用过量的缓冲液洗掉。然后可以通过将缓冲液更改为极端pH(pH2或pH10)、改变缓冲液的离子强度、添加变性物质或其他已知方法，将结合的噬菌体从靶标中释放出来。
然后可以通过感染细菌细胞来扩增回收的噬菌体，并且可以使用新库来重复筛选过程，该新库现在已耗尽非结合抗体并富含结合靶抗原(例如CD117)的抗体。即使少数结合噬菌体的回收也足以扩增噬菌体用于随后的筛选迭代。在几轮选择之后，通过常规方法确定结合库中源自所选噬菌体克隆的编码抗体或其抗原结合片段的基因序列，从而揭示赋予噬菌体对靶标的结合亲和力的肽序列。在淘选过程中，群体的序列多样性随着每轮选择而减少，直到保留所需的肽结合抗体。序列可能会汇聚在少数相关抗体或其抗原结合片段上。在每轮选择中回收的噬菌体数量增加表明在筛选中已经发生文库的收敛。
鉴定抗体的另一种方法包括例如，根据以下程序使用结合细胞表面靶抗原(例如CD117)的人源化非人抗体。共有的人抗体重链和轻链序列是本领域已知的(参见例如“VBASE”人种系序列数据库；Kabat等人Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH PublicationNo.91-3242，1991；Tomlinson等人，J.Mol.Bio1.227：776-798，1992和Cox等人.Eur.J.Immunol.24：827-836，1994，它们中的每一个的公开内容通过援引加入本文，因为它们涉及共有的人抗体重链和轻链序列。使用已建立的程序，本领域技术人员可以鉴定共有抗体序列的可变域框架残基和CDR(例如，通过序列比对)。可以将共有人抗体的重链和/或轻链可变结构域的一个或多个CDR替换为如本文所述的结合细胞表面抗原(例如CD117)的非人抗体的一个或多个相应CDR以产生人源化抗体。这种CDR交换可以使用本文描述的或本领域已知的基因编辑技术进行。
为了产生人源化抗体，可以重组地表达编码上述共有序列的多核苷酸，其中一个或多个可变区CDR已被结合细胞表面靶抗原(例如，CD117)的非人抗体的一个或多个可变区CDR序列替换。由于抗体对造血干细胞抗原的亲和力主要由CDR序列决定，因此预期所得人源化抗体表现出与由其衍生出人源化抗体的非人抗体大致相同的对造血干细胞抗原的亲和力。确定抗体对靶抗原的亲和力的方法包括例如本文描述的和本领域已知的基于ELISA的技术，以及表面等离子体共振、荧光各向异性和等温滴定量热法等。
例如，可以使用本领域已知的放射性核素内化测定来评估抗体或其片段的内化能力。例如，使用本文所述的或本领域已知的体外展示技术鉴定的抗体或其片段可以通过掺入放射性同位素诸如18F、75Br、77Br、122I、123I、124I、125I、129I、131I、211At、67Ga、111In、99Tc、169Yb、186Re、64Cu、67Cu、177Lu、77As、72As、86Y、90Y、89Zr、212Bi、213Bi或225Ac而功能化。例如，放射性卤素，诸如18F、75Bt、77Bt、122I、123I、124I、125I、129I、131I、211At，可以使用含有亲电子卤素试剂的珠，诸如聚苯乙烯珠(例如，碘化珠，Thermo Fisher Scientific，Inc.，Cambridge，MA)而加入抗体或其片段中。放射性标记的抗体或其片段可以与癌细胞、自身免疫细胞或造血干细胞一起孵育足以允许内化的时间(例如，在4℃下30分钟至6小时，诸如在4℃下1小时)。然后可以洗涤细胞以去除非内化抗体或其片段(例如，使用pH 2.8的冷(4℃)0.1M甘氨酸缓冲液)。内化抗体或其片段可以通过检测与所回收的洗涤缓冲液的发射的辐射(例如，γ-辐射)相比，所得癌细胞、自身免疫细胞或造血干细胞的发射辐射(例如，γ-辐射)来鉴定。
可以使用例如美国专利号4,816,567中所述的重组方法和组合物来制备抗体。在一个实施方案中，提供了编码本文所述抗体的分离核酸。此类核酸可编码包含VL的氨基酸序列和/或包含抗体VH(例如，抗体的轻链和/或重链)的氨基酸序列。在另一个实施方案中，提供了一种或多种包含此类核酸的载体(例如，表达载体)。在另一个实施方案中，提供了包含这种核酸的宿主细胞。在一个这样的实施方案中，宿主细胞包含(例如，已被其转化)：(1)包含编码包含抗体的VL的氨基酸序列和包含抗体的VH的氨基酸序列的核酸的载体，或(2)包含编码包含抗体的VL的氨基酸序列的核酸的第一载体，和包含编码包含抗体的VH的氨基酸序列的核酸的第二载体。在一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴细胞(例如Y0、NS0、Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供制备抗CLL-1抗体的方法，其中该方法包括在适合于表达抗体的条件下培养包含编码如上文提供的抗体的核酸的宿主细胞，并且任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收抗体。
对于抗体的重组生产，编码例如如上所述的抗体的核酸，被分离并插入一种或多种载体中以用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以使用常规操作(例如，通过使用能够与编码抗体的重链和轻链的基因特异性地结合的寡核苷酸探针)容易地分离和测序此类核酸。
用于克隆或表达编码抗体的载体的合适宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如，抗体可以在细菌中产生，特别是当不需要糖基化和Fc效应子功能时。对于抗体片段和多肽在细菌中的表达，参见例如，美国专利号5,648,237、5,789,199和5,840,523(还参见Charlton，Methods in Molecular Biology，Vol.248(B.K.C.Lo，ed.，Humana Press，Totowa，N.J.，2003)，pp.245-254，其描述抗体片段在大肠杆菌中的表达)。表达后，抗体可从细菌细胞糊中以可溶部分分离，并可进一步纯化。
脊椎动物细胞也可用作宿主。例如，适于悬浮生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例是由SV40(COS-7)转化的猴肾CV1系；人胚胎肾系(293或293细胞，如例如Graham等人，J.Gen Virol.36∶59(1977)中所述)；乳仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠支持细胞(TM4细胞，如例如Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980)中所述)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿长尾猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；水牛鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺肿瘤(MMT060562)；TRI细胞(如例如Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci.383∶44-68(1982)中所述)；MRC 5细胞；和FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))；和骨髓瘤细胞系诸如Y0、NS0和Sp2/0。有关适用于抗体生产的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，请参见例如Yazaki和Wu，Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo，ed.，Humana Press，Totowa，N.J.)，pp.255-268(2003)。
药物组合物
根据本发明的一个方面，本发明涉及药物组合物，其包含所述缀合物。
所述药物组合物可包含一种或多种药学上可接受的缓冲剂、表面活性剂、稀释剂、载体、赋形剂、填充剂、粘合剂、润滑剂、助流剂、崩解剂、吸附剂和/或防腐剂。
在水性形式中，所述药物制剂可以准备好用于给药，而在冻干形式中，所述制剂可以在给药前转变成液体形式，例如通过添加注射用水，该注射用水可以包含或不包含防腐剂(例如但不限于，苄醇)、抗氧化剂(如维生素A、维生素E、维生素C、视黄醇棕榈酸酯和硒)、氨基酸(半胱氨酸和甲硫氨酸)、柠檬酸和柠檬酸钠、合成防腐剂(如对羟基苯甲酸酯(对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯))。
所述药物制剂可进一步包含一种或多种稳定剂，其可以是例如氨基酸、糖多元醇、二糖和/或多糖。所述药物制剂可进一步包含一种或多种表面活性剂、一种或多种等渗剂、和/或一种或多种金属离子螯合剂、和/或一种或多种防腐剂。
如本文所述的药物制剂可适合用于至少静脉内、肌肉内或皮下给药。或者，根据本发明的所述缀合物可以允许生物活性剂在一定时间段内持续释放的储库制剂(depotformulation)提供。
在本发明的又一方面，提供了初级包装，诸如预充式注射器或笔、小瓶或输液袋，其包含根据本发明前述方面的所述制剂。
预充式注射器或笔可以包含冻干形式(其然后必须溶解，例如在给药前用注射用水溶解)或水性形式的制剂。所述注射器或笔通常是一次性制品，仅供单次使用，并且可以具有0.1至20ml的体积。然而，注射器或笔也可以是多用途或多剂量注射器或笔。
所述小瓶还可以包含冻干形式或水性形式的制剂并且可以用作单次或多次使用装置。作为多用途装置，所述小瓶可以具有更大的体积。所述输液袋通常包含水性形式的制剂并且可以具有20至5000m1的体积。
本文所述的ADC可以多种剂型给药至患者(例如，患有免疫疾病或癌症的人类患者)。例如，本文所述的ADC可以水溶液(诸如含有一种或多种药学上可接受的赋形剂的水溶液)的形式给药至患有免疫疾病或癌症的患者。与本文所述的组合物和方法一起使用的合适的药学上可接受的赋形剂包括粘度调节剂。可以使用本领域已知的技术对水溶液进行灭菌。
包含如本文所述的ADC的药物制剂通过将此类ADC与一种或多种任选存在的药学上可接受的载体混合(Remington′s Pharmaceutical Sciences 16th edition，Osol，A.Ed.(1980))而以冻干制剂或水溶液的形式制备。药学上可接受的载体在所采用的剂量和浓度下通常对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；形成盐的反离子，诸如钠；金属络合物(例如锌-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(PEG)。
使用方法
本文所述的ADC可以通过多种途径给药，诸如口服、透皮、皮下、鼻内、静脉内、肌肉内、眼内或肠胃外。在任何给定情况下最合适的给药途径将取决于给药的特定抗体或抗原结合片段、患者、药物制剂方法、给药方法(例如给药时间和给药途径)、患者的年龄、体重、性别、所治疗疾病的严重程度、患者的饮食和患者的排泄率。
本文所述的ADC、抗体或其抗原结合片段的有效剂量可以为每个单次(例如，推注)给药、多次给药或连续给药例如约0.001至约100mg/kg体重，或者以实现抗体、其抗原结合片段的最佳血清浓度(例如，0.0001-5000μg/mL的血清浓度)。该剂量可以每天、每周或每月向患有癌症、自身免疫疾病或正在接受调理疗法以准备接受造血干细胞移植的个体(例如，人)给药一次或多次(例如，2-10次)。在造血干细胞移植之前的调理程序的情况下，ADC、抗体或其抗原结合片段可以在最佳地促进外源性造血干细胞植入的时间给药至患者，例如在施用外源性造血干细胞移植物之前1小时至1周(例如，约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天或约7天)或更长时间。
实施例
提出以下实施例以向本领域的普通技术人员提供可以如何使用、制备和评价本文所述的组合物和方法的描述，并且旨在纯粹是本发明的示例且不旨在限制发明人视为他们的发明的范围。
实施例1：鹅膏蕈碱的对比研究
平行测试了三种不同的鹅膏蕈碱，以确定它们作为毒素的动力学和耐受性。图1提供了三种鹅膏蕈碱/连接基缀合物的结构。图1A提供了由式(IV)表示的鹅膏蕈碱/连接基缀合物(也称为“缀合物A”或“ADC A”)，其中鹅膏蕈碱在AA1(Asn)上具有可裂解连接基(BMP-Val-Ala-PAB)连接基。式(IV)中的鹅膏蕈碱是基于具有硫代色氨酸部分的鹅膏毒素。图1B提供了由式(VI)表示的鹅膏蕈碱/连接基缀合物(也称为“缀合物B”或“ADC B”，其中鹅膏蕈碱缀合至吲哚6′氧上的不可裂解连接基。式(VI)中描述的鹅膏蕈碱是基于具有6-羟基-色氨酸亚砜部分的鹅膏毒素。图1C提供了本文中描述的式(IIa)的鹅膏蕈碱/连接基缀合物(也称为“缀合物C”或“ADC C”，包括在吲哚6′氧上的不可裂解连接基，其中鹅膏蕈碱是基于具有6-羟基-硫代色氨酸部分的鹅膏毒素。
在人血清中进行或者不进行预孵育的情况下，在表达CD117的细胞上平行测试了缀合物A、B和C的效力。在37℃下将ADC A、B和C在不含人血清或50％人血清的细胞培养基中预孵育48小时。然后将滴定的ADC添加到Kasumi-1细胞并在37℃下孵育3天，并使用CellTiter-Glo确定细胞杀伤。如图2中所述，在没有血清孵育的情况下，可裂解缀合物A和不可裂解的缀合物C在第3天达到相似的功效，其中不可裂解的缀合物B在较高浓度下表现出降低的最大杀伤。每个ADC缀合物都表现出皮摩尔IC50杀伤。当ADC在人血清存在下预孵育48小时时，不可裂解的缀合物B的效力显著降低，但可裂解缀合物A和不可裂解的缀合物C的效力得以保持。因此，可裂解和不可裂解的缀合物A和C是血清稳定的，而不可裂解的缀合物B在人血清存在下被灭活(如通过体外细胞毒性所测量)。
为了确定ADC介导的细胞毒性动力学的差异，在滴定可裂解缀合物A或不可裂解的缀合物C的情况下将Kasumi-1细胞在37℃下孵育3-7天，并在第3、4、5、6和7天通过CellTiter-Glo测量细胞生存力。如图3所示，观察到可裂解和不可裂解的ADC在高浓度下的最大细胞杀伤存在显著差异。当细胞在37℃下与ADC一起孵育总计6天时，可裂解缀合物A和不可裂解的缀合物C都能够在高浓度下实现几乎完全的细胞杀伤。与160pM不可裂解的缀合物C一起培养的Kasumi-1细胞的大于80％的杀伤只能在Kasumi-1细胞孵育5天或更长时间后才能实现，而可裂解缀合物A在3天或更长时间的孵育后达到类似的阈值。
总之，图1A的酶可裂解鹅膏蕈碱(缀合物A)和不可裂解的鹅膏蕈碱(图1C中的缀合物C)显示出在血清中的长期稳定性，而鹅膏蕈碱/连接基B显示出在血清中的不稳定性和失活。与类似的可裂解鹅膏蕈碱缀合物(缀合物A)相比，不可裂解的缀合物C显示出延长的细胞毒性动力学(如在体外测定中所测量)。
实施例2：抗CD117 ADC表明了AML细胞和人CD34+细胞的体外有效杀伤，在人源化小鼠中选择性消耗人CD34+细胞，并且表明了异种移植模型中的抗AML活性
抗CD117抗体(具有Fc修饰L234A、L235A、D265C和H435A的Ab85)缀合至缀合物C，形成抗CD117 ADC C。在体外和体内测试了抗CD117 ADC C靶向和杀死表达CD117的细胞和人HSC。
使用抗CD117 ADC C进行了两次体外测定。第一次测试了ADC杀伤表达人CD117的Kasumi-1细胞(一种AML细胞系)的能力。如图4A中所述，滴定抗CD117 ADC C(在图4A中称为“抗CD117-AM”)，并与Kasumi-1细胞一起在37℃下孵育6天，并通过CellTiter-Glo评估生存力。对照是非特异性同种型匹配的ADC C。不可裂解的缀合物C显示出IC50为6.4pM的对Kasumi-1细胞的有效杀伤。在图4B中，使用收集的人CD34+骨髓细胞进行了类似的细胞毒性测定。将人CD34+骨髓细胞与不可裂解的缀合物C或相应的同种型对照ADC一起孵育6天。通过流式细胞术测定细胞杀伤。不可裂解的缀合物C显示出IC50为5.1pM的对原代人CD34+CD90+细胞的有效杀伤。
还进行了体内测定以测试抗CD117 ADC C选择性消耗人CD34+细胞的能力。将单剂量的0.1、0.3或1.0mg/kg的抗CD117 ADC C给药至人源化NSG小鼠。对照由1mg/kg剂量的未缀合抗体组成，该抗体包含不可裂解的缀合物C和载体(PBS)治疗剂的一部分。在第21天，通过流式细胞术分析从处理过的人源化NSG小鼠的股骨收集的骨髓，以确定人CD34+细胞的数量。如图5所示，抗CD117 ADC C能够有效消耗人CD34+细胞，实现了与0.3和1mg/kg剂量的PBS相比，超过95％的消耗率。与媒介物对照相比，未缀合的抗体显示出没有消耗。
为了评估ADC的体内抗肿瘤活性，对人源化NSG小鼠植入Kasumi-1细胞，然后用媒介物、30mg/kg QDx5阿糖胞苷(ARA-C)、可裂解缀合物A(1mg/kg 1x，1mg/kg QODx2)或缀合至可裂解鹅膏蕈碱(图1A)的10mg/kg同种型进行处理。此外，将植入Kasumi-1的小鼠用不可裂解的缀合物C(1mg/kg 1x，3mg/kg 1x，10mg/kg 1x)或缀合至不可裂解的鹅膏蕈碱(图1C)的10mg/kg同种型进行处理。图6中示出了表明按所示进行处理的动物的存活率的Kaplan-Meier曲线。与同种型、ARA-C或媒介物处理的动物相比，用可裂解缀合物A处理的植入Kasumi-1的小鼠显示出针对用1mg/kg或1mg/kg QODx2处理的组，在第130天50％以上的中位存活率。与同种型、ARA-C、1mg/kg不可裂解的缀合物C或媒介物处理的动物相比，用3mg/kg或10mg/kg不可裂解的缀合物C处理的小鼠在第130天显示完全存活。
总之，不可裂解的缀合物C显示出对Kasumi-1细胞、AML细胞系和原代人CD34+CD90+骨髓细胞的有效体外细胞杀伤。缀合物C能够从人源化NSG小鼠的骨髓中消耗超过95％的人CD34+细胞。可裂解和不可裂解的缀合物均显示出有效的体内抗肿瘤活性。
实施例3：ADC C在非人灵长类(NHP)中的功效和耐受性
为了确定不可裂解的缀合物C在非人灵长类中的功效，用单剂量的不可裂解的缀合物C以0.5、1.0和2.0mg/kg处理雄性食蟹猴。0.5和1.0mg/kg剂量是对于具有以下Fc修饰的Ab85：缀合至不可裂解的鹅膏蕈碱C(图1C)的D265C H435A(EU编号)。2.0mg/kg剂量包含具有以下Fc修饰的Ab85：缀合至不可裂解的鹅膏蕈碱C(图1C)的L234A L235A D265C H435A(EU编号)。在第7天从处理的动物中收集骨髓抽吸物，并通过流式细胞术定量CD34+CD90+CD45RA-群体来评估功效。在0.5和1.0mg/kg剂量下观察到显著消耗。在整个28天研究过程中收集外周血样品。以0.5、1.0和2.0mg/kg处理的动物的网织红细胞计数从第2天开始显著下降，其中网织红细胞反弹以剂量依赖性方式发生。这是预期的切中要害的药理学，因为网织红细胞是短命的，并且在该造血谱系中的祖细胞群强烈表达CD117。对于所有处理组，从第18天开始观察到嗜中性粒细胞消耗。这也是预期的切中要害的药理学，因为中性粒细胞依赖于造血干细胞分化进行再生。
除了功效之外，还在NHP中测试了包含抗CD117 ADCA或抗CD117 ADC C的ADC的耐受性。如图8中所述，用0.3mg/kg剂量的缀合至抗体CK6(Fc修饰D265C和H435A)的可裂解缀合物A处理食蟹猴在研究的过程中导致天冬氨酸转氨酶(AST)水平的轻微瞬时和可逆升高，其中对于丙氨酸转氨酶(ALT)、乳酸脱氢酶(LDH)或总胆红素(TBIL)，没有升高超过正常范围。用0.6mg/kg剂量的缀合物A处理动物导致AST、ALT、LDH和TBIL的更显著升高。
在用0.5和1.0mg/kg不可裂解缀合物C处理的食蟹猴中，缀合至不可裂解鹅膏蕈碱C(图1C)的具有以下Fc修饰的Ab85：D265C H435A(EU编号)，在整个研究过程中显示出AST的轻微瞬时和可逆升高，其中对于ALT、LDH和TBIL，没有升高超过正常范围。在用2.0mg/kg不可裂解缀合物C处理的动物中，缀合至不可裂解鹅膏蕈碱C(图1C)的具有以下Fc修饰的Ab85：L234A L235A D265C H435A(EU编号)，观察到AST和ALT的更显著升高。
还研究了抗CD117 ADC A与C的药物代谢动力学特征。如图9中所述，与ADC缀合物A相比，良好耐受剂量的ADC缀合物C在NHP中实现了饱和暴露。还分析了具有各种Fc突变的ADC缀合物C的药物代谢动力学数据。对于抗CD117 ADC A和抗CD117 ADC C，离体细胞毒性测定表明，对于这两种ADC，在低于100ng/ml的血浆浓度下存在功效损失(数据未显示)。
总之，在食蟹猴中，抗CD117 ADC C在低至0.5mg/kg的剂量下表现出功效，并且在2.0mg/kg的单剂量下耐受，而可裂解缀合物A在低至0.3mg/kg的剂量下有效，但在0.6mg/kg的单剂量下不能耐受，从而支持不可裂解鹅膏蕈碱(图1C)耐受性更好的发现。
实施例4：抗CD2 ADC C和CD5 ADC C的原代人T细胞杀伤
进行研究以确定ADC C(如上文和图1中所述)中所用的抗CD2和抗CD5 D265CH435A抗体在杀伤原代T细胞方面是否与缀合物A一样有效。因此，使用了体外细胞杀伤测定。研究方案提供如下：
Figure BDA0003429348370000671
抗CD2 ADC A和C包括具有FC修饰D265C/H435A的抗CD2抗体RPA。裸RPA用作对照。抗CD5 ADC A和C包括具有Fc修饰D265C/H435A的抗CD5抗体5D7。裸5D7用作对照。如图12中所述，缀合物C表现出与缀合物A相当的T细胞消耗。下表还提供了功效结果。
Figure BDA0003429348370000672
图13提供的结果表明CD2在第5天饱和，而一些细胞仍表达CD5。
上面的以及图12和13中的结果表明，抗CD2和抗CD5 ADC C(D265C H435A)在体外对原代人T细胞与缀合物A一样有效。
实施例5：抗CD45ADC C的功效
除了CD2、CD5和CD117，在抗CD45抗体的背景下，还测试了缀合物C，并与缀合物A对比。嵌合抗CD45抗体3D6用于以下实验(鼠3D6可变区和具有Fc修饰D265C和H435A的人IgG1框架)。
进行了比较抗CD45 ADC A和抗CD45 ADC C的体外细胞杀伤测定。如图14A中所述，ADC A和C都能够杀伤人骨髓CD34+细胞以及PBMC。还测试了同种型阴性对照。如图14A所呈现的表中所述，抗CD45 ADC A和C均能有效杀伤CD34+骨髓和PBMC细胞。用抗CD45 ADC A和B重复该测定。如图14B中所述，与抗CD45 ADC B相比，抗CD45ADCA显示出更高的杀伤CD34+骨髓细胞的效率。两种分子都以类似的方式有效杀伤人和食蟹猴PBMC。
还使用抗CD45 ADC A和C进行了第二次体外细胞杀伤测定，观察每个ADC杀伤表达SKNO-1或REH的细胞的能力。结果提供于图13中(左图是暴露于抗CD45ADCA或C后活SKNO-1细胞的数量；右图是暴露于抗CD45ADCA或C后活REH细胞的数量)。在图13的表中描述了这些测定中每种分子的效率。
进一步测试了抗CD45 ADC A和C，以确定每种ADC在体内消耗CD45+细胞的能力。在人源化NSG小鼠模型中，ADC A(可裂解)和ADC C(不可裂解)都能够有效消耗CD45+细胞。在图14中提供了研究的结果。如图16中所述，两种ADC都能够消耗外周CD45+细胞以及骨髓(BM)CD34+细胞。小鼠中抗CD45ADCA的最大总剂量为3mg/kg，而对于抗CD45ADC C，耐受超过51mg/kg的更高剂量的ADC C。因此，对于两种抗CD45 ADC都观察到了功效，但小鼠可以耐受更高剂量下的ADC C。
还测试了抗CD45 ADC A和C在人源化NSG小鼠中消耗外周淋巴细胞、骨髓(BM)HSC和淋巴细胞的能力。抗CD45 ADC A和C各自以1mg/kg的剂量递送至小鼠。这些研究的结果在图15中进行了描述，并表明在注射后第7天，抗CD45 ADC A和C在1mg/kg下具有相当的外周淋巴细胞、HSC和BM淋巴细胞的消耗。抗CD45 ADCA在1mg/kg下表现出轻微、短暂的可逆肝酶升高，而相同1mg/kg剂量下的抗CD45 ADC C几乎没有至没有观察到肝酶升高。
实施例6：抗CD137ADC A和C表征
测试了抗CD137 ADC A和ADC C杀死T细胞的能力以及血清稳定性。本实施例中使用抗CD137抗体BBK2。进行了体外T细胞杀伤测定，其中图16中显示的结果表明，与同种型ADC A和C对照相比，抗CD137 ADC A和C都能够杀死活化的T细胞。此外，测试了抗CD137 ADCA和C在48小时内的细胞系血清稳定性，如图17中所述。
实施例7：S-脱氧-5′-羟基-三羟鹅膏毒肽酰胺的合成
根据本领域技术人员已知的标准方法，由相应的连接基-鹅膏毒素缀合物制备本文公开的式(IIa)的ADC。式(IIa)的ADC的倒数第二种鹅膏毒素-连接基缀合物(化合物14；路线3)可以按照美国专利申请号2018/0043033(其公开内容以其整体援引加入本文)中公开的相关鹅膏毒素(α-鹅膏蕈碱)的O-烷基化的一般操作由鹅膏毒素衍生物11制备。可以根据国际专利申请公开号WI2019/030173(其公开内容以其整体援引加入本文)中公开的操作制备鹅膏毒素衍生物11。化合物7(路线1)可以根据国际专利申请公开号WO2014/009025(其公开内容以其整体援引加入本文)中报道的方法制备。
实施例8：鹅膏蕈碱衍生物
各种鹅膏蕈碱衍生物用于与靶标特异性抗体缀合(图18、图19)。它们是根据WO2018/115466和WO2019/197654中公开的方法生成的，其公开内容以其整体援引加入本文。
表6：鹅膏毒素-连接基构建体的分子特征
申请人的标示 色氨酸(Trp) 硫桥 连接基位于 连接基
30.2867 6-羟基-Trp 硫醚 aa4 稳定的C6连接基
30.0880 6-羟基-Trp 亚砜 aa4 稳定的C6连接基
30.1699 6-羟基-Trp 亚砜 aa4 可裂解的Val-Ala
30.2371 6-羟基-Trp 硫醚 aa4 可裂解的Val-Ala
30.2060 6-羟基-Trp 亚砜 aa1 可裂解的Val-Ala
30.2115 Trp 硫醚 aa1 可裂解的Val-Ala
30.2347 6-羟基-Trp 硫醚 aa1 可裂解的Val-Ala
实施例9：缀合方法
通过所谓的Thiomab技术将针对Her2或前列腺特异性膜抗原(PSMA)的抗体缀合至鹅膏毒素连接基缀合物。在这种方法中，通过将毒素连接基构建体的马来酰亚胺残基缀合至抗体中改造的半胱氨酸残基的游离SH基团来进行缀合，如以下反应路线所示：
Figure BDA0003429348370000681
这种偶联方法的原理公开于Junutula等人(2008)中，其内容通过援引加入本文。
本实验中使用的针对Her2(曲妥珠单抗)或前列腺特异性膜抗原(PSMA)的抗体在两个Fc结构域中均包含D265C置换，以提供具有此类游离SH基团的半胱氨酸残基。相关技术在转让给本申请人的WO2016142049A1(其内容通过援引加入本文)中公开，并递送具有为2的固定药物抗体比(“DAR”)和位点特异性缀合的均质产品。
实施例10：抗Her2-ADC的体外细胞毒性测定
用靶标-阳性肿瘤细胞系和化学发光BrdU掺入测定(Roche Diagnostics)在体外评估了抗Her2鹅膏毒素缀合物的细胞毒活性。在37℃和5％CO2下与不同浓度的缀合物孵育96小时后，通过在BMG Labtech Optima酶标仪中使用抗BrdU-HRP抗体测量固定和透性化细胞来确定细胞生存力。通过Graphpad Prism 4.0软件计算剂量反应曲线的ECs0值。
在SKBR-3、NCI-N87、BT474和JIMT-1细胞系上测试了经由其D265C残基分别缀合至化合物30.2867(式(A))和化合物30.0880(式(B))的携带D265C突变(T-D265C)的曲妥珠单抗的细胞毒活性(图20)。T-D265C-30.2867在所有测试细胞系上略优于T-D265C-30.0880。
实施例11：人、小鼠和食蟹猴血浆中抗Her2-ADC的稳定性
将针对Her2抗原的ADC缀合物T-D265C-30.2867和T-D265C-30.0880分别与人、小鼠和食蟹猴血浆以及磷酸盐缓冲盐水(PBS，对照)一起孵育0、4和10天。对样品进行十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺(PAA)凝胶电泳SDS-PAGE)，并通过蛋白质印迹用鹅膏蕈碱特异性多克隆抗血清检测抗体重链分子(图21)。
与ADC缀合物T-D265C-30.0880相比，ADC缀合物T-D265C-30.2867显示出对所有测试种类的更高血浆稳定性。T-D265C-30.2867显示出在MP中分别比在HP和CP中更低的稳定性。
为了进一步评估稳定性，在SKBR-3细胞(图22)、NCI-N87细胞(图23)和JIMT-1(图24)上分析了ADC化合物T-D265C-30.2867分别在人血浆、小鼠血浆、食蟹猴血浆和PBS(磷酸盐缓冲盐水，对照)中孵育0、4和10天之后的体外细胞毒活性。
分别在人血浆、小鼠血浆和食蟹猴血浆中孵育4天后，T-D265C-30.2867对SKBR-3细胞的细胞毒性潜力仅略有降低。在人血浆和食蟹猴血浆中孵育10天后，细胞毒性潜力降低了20倍，而在小鼠血浆中，观察到降低了33倍。在PBS中于37℃孵育对T-D265C-30.2867对SKBR-3细胞的细胞毒性潜力几乎没有影响(图22，表7)。
表7：T-D265C-30.2867在人、小鼠和食蟹猴血浆中对SKBR-3细胞的稳定性和细胞毒性潜力；值为EC50值[nM]
基质 0天 4天 10天 与第0天相比的细胞毒性潜力降低
人血浆 14 35 260 18.6x
小鼠血浆 16 53 528 33.0x
食蟹猴血浆 22 83 382 17.4x
PBS 46 65 104 2.3x
分别在人血浆、小鼠血浆和食蟹猴血浆中孵育4天后，T-D265C-30.2867对NCI-N87细胞的细胞毒性潜力仅略有降低。在人血浆和食蟹猴血浆中孵育10天后，细胞毒性潜力降低了15倍，在食蟹猴血浆中孵育10天后，观察到约50％的残留细胞生存力。在小鼠血浆中孵育10天后，观察到降低了67倍。在PBS中于37℃孵育对T-D265C-30.2867对NCI-N87细胞的细胞毒性潜力具有低影响(图23)。
在人血浆和食蟹猴血浆中孵育4天后，T-D265C-30.2867对JIMT-1细胞的细胞毒性潜力仅略有降低。在小鼠血浆中孵育4天后，T-D265C-30.2867显示出对JIMT-1细胞完全没有细胞毒性潜力。在人血浆、小鼠血浆和食蟹猴血浆中孵育10天后，在JIMT-1细胞上完全没有观察到细胞毒性潜力。在PBS中于37℃孵育对T-D265C-30.2867对JIMT-1细胞的细胞毒性潜力几乎没有影响(图24)。
实施例12：抗Her2-ADC在体内小鼠异种移植肿瘤模型中的功效
在JIMT-1小鼠异种移植模型中，雌性NMRI裸鼠每只小鼠右肋皮下接种5x106个JIMT-1乳腺癌细胞。在～120mm3的平均肿瘤体积下，动物在第0天被分配到三个组。同一天，动物接受了单次静脉内剂量的基于鹅膏蕈碱的抗Her2抗体药物缀合物(ADC)。每周测定两次肿瘤体积和体重。
如图25所示，T-D265C-30.2867的体内功效优于T-D265C-30.0880。在处理后第113天，接受2mg/kg剂量的0/10只动物和接受6mg/kg T-D265C-30.2867剂量的4/10只动物存活；在后一组中，1/4动物没有肿瘤。相比之下，在处理后第113天，接受2mg/kg剂量的0/10只动物和接受6mg/kg T-D265C-30.0880剂量的0/10只动物存活。在处理后第113天，接受1mg/kg T-D265C-30.1699剂量的4/10动物存活，并且1/4动物没有肿瘤。
对于相应的NCI-N87小鼠肿瘤异种移植模型，如图26所示，T-D265C-30.2867的体内细胞毒性功效也优于T-D265C-30.0880。在处理后第141天，接受2mg/kg剂量的0/10只动物和接受6mg/kg T-D265C-30.2867剂量的3/10只动物存活；然而在后一组中，0/3动物没有肿瘤。相比之下，在处理后第141天，接受2mg/kg剂量的0/10只动物和接受6mg/kg T-D265C-30.0880剂量的0/10只动物存活。在处理后第141天，接受1mg/kg T-D265C-30.1699剂量的0/10动物亦存活。
实施例13：抗PSMA-ADC的体外细胞毒性测定
在LNCap-、22RV1-(二者均PSMA阳性)和PC3(PSMA阴性)细胞系上测试了经由其D265C残基分别缀合至化合物30.2867(式(A))和化合物30.0880(式(B))的携带D265C突变(h3/F11-D265C-Var16)的抗PSMA抗体的体外细胞毒活性(图27)。化合物h3/F11-D265C-Var16-30.2867在两种测试细胞系中的一种上略优于h3/F11-D265C-Var16-30.0880。在PSMA阴性细胞系PC3上未观察到细胞毒性潜力。
实施例14：人、小鼠和食蟹猴血浆中抗PSMA-ADC的稳定性
将针对PSMA抗原的ADC缀合物h3/F11-D265C-Var16-30.2867和h3/F11-D265C-Var16-30.0880分别在人、小鼠和食蟹猴血浆以及磷酸盐缓冲盐水(PBS，对照)中孵育0、4和10天。对样品进行十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺(PAA)凝胶电泳SDS-PAGE)，并通过蛋白质印迹用鹅膏蕈碱特异性多克隆抗血清检测抗体重链分子。
与h3/F11-D265C-Var16-30.0880相比，h3/F11-D265C-Var16-30.2867显示出对所有测试血浆种类的更高血浆稳定性。分别与在人血浆和食蟹猴血浆中相比，h3/F11-D265C-Var16-30.2867在小鼠血浆中显示出更低的稳定性。
实施例15：抗PSMA-ADC在体内小鼠异种移植肿瘤模型中的功效
在LNCap异种移植肿瘤小鼠模型中，雄性CB17 SCID小鼠每只小鼠右肋皮下接种2.5x106个LNCap前列腺癌细胞。在～150mm3的平均肿瘤体积下，动物在第0天被分配到组。同一天，动物接受了单次静脉内剂量的基于鹅膏蕈碱的抗PSMA抗体药物缀合物(ADC)。每周测定两次肿瘤体积和体重。
如图28所示，h3/F11-D265C-Var16-30.2867的体内功效优于h3/F11-D265C-Var16-30.0880。
实施例16：在猴中的耐受性研究
使用从1mg/kg逐步升高到20mg/kg的剂量，用非结合性抗地高辛ADC(DIG-D265C-30.2867)在猴中进行了耐受性研究。LDH、AST、ALT参数的评估结果表明具有良好的耐受性(图29)。ADC和鹅膏毒素在血清中的药物代谢动力学数据分别显示在图30和图31中。两只动物分别在最后一次给药(20mg/kg)后15天和19天死亡。最大耐受剂量(MTD)被评估为15mg/kg＜MTD＜20mg/kg。
实施例17：使用结构不同的鹅膏蕈碱衍生物进行体外细胞毒性测定
在JIMT-1细胞、NCI-N87细胞和SKBR-3细胞上测试了表8中列出的ADC的体外细胞毒活性，该ADC包含经由其D265C残基缀合至结构不同的鹅膏蕈碱衍生物的携带D265C突变(T-D265C，抗Her2-D265C)的抗Her2抗体。
表8：包含结构不同的鹅膏蕈碱衍生物的Her2特异性ADC
ADC化合物 DAR 说明
抗Her2-D265C-30.2060 1.92 SO；6-OH-Trp；aa1处的可裂解VA连接基
抗Her2-D265C-30.2115 2.0 S；Trp；aa1处的可裂解VA连接基
抗Her2-D265C-30.2347 1.90 S；6-OH-Trp；aa1处的可裂解VA连接基
抗Her2-D265C-30.1699 2.0 SO；6-OH-Trp；aa4处的可裂解VA连接基
抗Her2-D265C-30.2371 2.0 S；6-OH-Trp；aa4处的可裂解VA连接基
抗Her2-D265C-30.0880 2.0 SO；6-OH-Trp；aa4处的C6连接基
抗Her2-D265C-30.2867 2.0 S；6-OH-Trp；aa4处的C6连接基
各个ADC对JIMT-1细胞(图32)、NCI-N87细胞(图33)和SKBR-3细胞(图34)的细胞毒性功效分别示于表9中。
表9：包含结构不同的鹅膏蕈碱衍生物的Her2特异性ADC的细胞毒活性
Figure BDA0003429348370000701
在LNCap-和22RV1细胞系(均为PSMA阳性)上测试了表10中列出的ADC的体外细胞毒活性，该ADC包含经由其D265C残基缀合至结构不同的鹅膏蕈碱衍生物的携带D265C突变(h3/F11-D265C-Var16，抗PSMA-D265C)的抗PSMA抗体。
表10：包含结构不同的鹅膏蕈碱衍生物的PSMA特异性ADC
Figure BDA0003429348370000702
Figure BDA0003429348370000711
各个ADC对LNCap细胞(图35)和22RV1细胞(图36)的细胞毒性功效分别示于表11中。
表11：包含结构不同的鹅膏蕈碱衍生物的PSMA特异性ADC的细胞毒活性
Figure BDA0003429348370000712
实施例18：包含结构不同的鹅膏蕈碱衍生物的抗PSMA-ADC在体内小鼠异种移植肿瘤模型中的功效
在LNCap异种移植肿瘤小鼠模型中，雄性CB17 SCID小鼠每只小鼠右肋皮下接种2.5x106个LNCap前列腺癌细胞。在～150mm3的平均肿瘤体积下，动物在第0天被分配到组。同一天，动物接受了单次静脉内剂量的表6中所列的基于结构不同的鹅膏蕈碱的抗PSMA抗体药物缀合物(ADC)。每周测定两次肿瘤体积和体重。
包含不同结构的鹅膏蕈碱衍生物的ADC的结果显示在图37至42和表12中。与包含缀合至鹅膏毒素的氨基酸4或氨基酸1的可裂解连接基的ADC相比，包含缀合至鹅膏毒素的色氨酸(氨基酸4)的6′-羟基的不可裂解连接基的ADC，特别是在Trp和Cys之间具有硫醚桥的h3/F11-D265C-Var16-30.2867，显示出具有高的体内细胞毒性功效。
表12：存活率和肿瘤负荷
处理组 剂量 活动物 无肿瘤动物
媒介物对照 9/10 0/9
抗PSMA-D265C-30.0880 MTD 1/2 10/10 5/10
抗PSMA-D265C-30.0880 MTD 1/4 10/10 3/10
抗PSMA-D265C-30.1699 MTD 1/2 10/10 10/10
抗PSMA-D265C-30.1699 MTD 1/4 10/10 2/10
抗PSMA-D265C-30.2060 MTD 1/2 4/10 4/4
抗PSMA-D265C-30.2060 MTD 1/4 10/10 9/10
抗PSMA-D265C-30.2115 MTD 1/2 10/10 3/10
抗PSMA-D265C-30.2115 MTD 1/4 10/10 0/10
抗PSMA-D265C-30.2347 MTD 1/2 10/10 10/10
抗PSMA-D265C-30.2347 MTD 1/4 10/10 10/10
抗PSMA-D265C-30.2371 MTD 1/2 10/10 10/10
抗PSMA-D265C-30.2371 MTD 1/4 9/10 7/9
抗PSMA-D265C-30.2867 MTD 1/2 10/10 9/10
抗PSMA-D265C-30.2867 MTD 1/4 10/10 10/10
实施例19：包含具有LALA和/或D265C突变的抗体的ADC的功效
在细胞系衍生的肿瘤异种移植(CDX)小鼠模型中测试了包含具有L234A和L235A突变以及D265突变的抗体的ADC的功效。在Her2阳性NCI-N87细胞上测试了分别包含三重L234A/L235A/D265C突变和鹅膏毒素-连接基构建体HDP30.2060和HDP30.2867(分别为T-LALA-D265C-30.2060和T-LALA-D265C-30.2867)的抗Her2 ADC。结果如图43所示。在PSMA阳性LNCap细胞上测试了分别包含三重L234A/L235A/D265C突变和鹅膏毒素-连接基构建体HDP30.2060和HDP30.2867(分别为h3/F11-LALA-D265C Var16-30.2060和h3/F11-LALA-D265C Var16-30.2867)的抗PSMAADC。结果如图44所示。在这两项研究中，携带三重突变的ADC被证明有效减少相应CDX小鼠模型中的肿瘤体积。
与没有L234A/L235A/D265C突变的ADC相比，使用包含具有L234A/L235A突变和D265C突变的抗体的ADC，获得了相同范围的生产率。此外，与没有突变的抗体相比，突变对用相应抗体获得的缀合产率没有影响。
实施例20：对靶标和非靶标细胞的体外细胞毒性测定
如图45所示，包含携带L234A/L235A突变和/或D265C突变的抗体的Her2特异性ADC与没有突变的ADC和包含携带其他突变(A118C，D265A)的相同抗体的对照ADC相比的体外细胞毒性潜力(在96小时BrdU测定中对Her2阳性SKBR-3细胞进行评估)相当；观察到所有突变体和对照ADC的完全细胞毒性。
相反，当与在相同抗体主链中没有突变的相应ADC相比，在96小时CTG测定(图46)和120小时CTG测定(图47)中在Her2阴性巨噬细胞细胞系THP-1上评估包含携带L234A/L235A突变和/或D265C突变的抗体的Her2特异性ADC的体外细胞毒性潜力时，在高于10-10至10-9M的ADC浓度下观察到在抗体(T-30.1699，图46A、C；图47C)中没有突变的ADC的非特异性毒性。对于包含携带L234A/L235A(“LALA”)突变(T-LALA-30.1699)或D265C突变(T-D265C)或所有三种突变(T-LALA-D265C-30.1699)的抗体的ADC，在96小时CTG测定(图46A、B)中甚至在10至100倍的更高ADC浓度下未观察到对非靶标THP-1细胞的这种非特异性毒性。对于包含携带D265A突变(T-D265A-30.1699)的抗体的ADC，也未观察到对非靶标THP-1细胞的非特异性毒性。在120小时的CTG测定中，这些数据基本上得到了证实；在抗体中没有突变的ADC的非特异性毒性显著高于包含携带单突变或三突变的抗体的ADC(图47C)。LALA和D265C(或D265A)突变的组合在减少对非靶标细胞的非特异性毒性方面似乎具有加合或甚至协同作用(图47C、D)。对THP-1细胞的非特异性细胞毒性显示是Fcγ受体介导的，这证实了那些对THP-1细胞(LALA、D265C和D265A变体)不显示细胞毒性的ATAC降低了Fcγ受体相互作用，进而降低了FcγR介导的摄取。
总之，L234A/L235A和D265A/C突变消除了ADC在测试条件下对THP-1细胞的非特异性毒性。
实施例21：ADC中LALA和/或D265C突变对FcγR结合的影响
通过生物层干涉仪(BLI)对ADC的FcγR相互作用进行了测试。这些结合研究的结果显示在表13中。
表13：ADC的FcγR结合
Figure BDA0003429348370000721
如表13所示，将LALA、D265A或D265C突变引入ADC中所含的抗体中显著降低了对FcγRI的亲和力，并且还降低了与FcγRIIa和FcγRIIIa的结合。与D265突变(D265C、D265A)的组合进一步显著降低了FcγRI结合。
实施例22：ADC中LALA和/或D265C突变对体内耐受性的影响
在小鼠中评估了分别包含携带突变的Her2或PSMA特异性抗体的ADC的耐受性。结果如表14所示。所使用的所有抗体都具有相同的主链并且在小鼠中没有交叉反应性。
表14：包含携带LALA、D265C突变的抗体的ADC在小鼠中的耐受性
Figure BDA0003429348370000722
MTD，最大耐受剂量
如表14所示，对于包含鹅膏毒素/连接基化合物HDP 30.2060和携带LALA和D265C突变的抗体的ADC，最大耐受剂量显著高于包含所述鹅膏毒素/连接基化合物和仅携带D265C突变的抗体的ADC。对于包含鹅膏毒素/连接基化合物HDP 30.2867和携带LALA和D265C突变的抗体的ADC，耐受性甚至更高。
还在非人类灵长类中评估了包含携带相应突变的抗体的ADC的耐受性。所使用的所有抗体都具有相同的主链，并且在非人灵长类中是非结合剂。在食蟹猴中对抗PSMAADCsh3/F11-LALA-D265C Var16-30.2060(携带LALA和D265C突变)、h3/F11-D265CVar16-30.2060(仅携带D265C突变)和抗地高辛-ADC DIG-D265C-30.2060和DIG-D265C-30.2867(仅携带D265C突变)评估了剂量递增耐受性研究。
在第1天(1mg/kg)、第23天(3mg/kg)、第44天(5mg/kg)、第65天(6mg/kg)、第86天(7.5mg/kg)、第128天(10mg/kg)对2个雌性动物的组注射h3/F11-LALA-D265CVar16-30.2060，在第1天(1mg/kg)、第23天(3mg/kg)和第44天(5mg/kg)注射h3/F11-D265C Var16-30.2060，在第1天(1mg/kg)、第22天(3mg/kg)、第43天(5mg/kg)、第64天(7.5mg/kg)注射DIG-D265C-30.2060，或者在第1天(1mg/kg)、第22天(3mg/kg)、第43天(5mg/kg)、第64天(7.5mg/kg)、第106天(10mg/kg)、第148天(15mg/kg)和第196天(20mg/kg)注射DIG-D265C-30.2867。监测随着时间的推移动物的生化和血液学血液参数、体重、食物消耗、临床症状和死亡率。此外，还收集了血液样品用于药物代谢动力学研究。在实验结束时，组织样本用于组织病理学检查。
高达7.5mg/kg h3/F11-LALA-D265C Var16-30.2060(携带LALA和D265C突变)、3mg/kg h3/F11-D265C Var16-30.2060(仅携带D265C突变)、5mg/kg DIG-D265C-30.2060和15mg/kg DIG-D265C-30.2867(仅携带D265C突变)剂量耐受性良好，血清参数没有肾损伤迹象，体重和食物消耗不受影响。10mg/kg h3/F11-LALA-D265C Var16-30.2060、5mg/kg h3/F11-D265C Varl6-30.2060、7.5mg/kg DIG-D265C-30.2060和20mg/kg DIG-D265C-30.2867的剂量导致动物死亡。结果如表15所示。
表15：包含携带LALA、D265C突变的抗体的ADC在非人灵长类中的耐受性
Figure BDA0003429348370000731
MTD，最大耐受剂量
非人灵长类中的数据证实，对于包含携带LALA和D265C突变的抗体的ADC，最大耐受剂量显著高于包含仅携带D265C突变的抗体的ADC。对于包含鹅膏毒素/连接基化合物HDP30.2867和携带LALA和D265C突变的抗体的ADC，耐受性特别高。
序列表
Figure BDA0003429348370000741
Figure BDA0003429348370000751
Figure BDA0003429348370000761
Figure BDA0003429348370000771
Figure BDA0003429348370000781
Figure BDA0003429348370000791
Figure BDA0003429348370000801
Figure BDA0003429348370000811
Figure BDA0003429348370000821
Figure BDA0003429348370000831
Figure BDA0003429348370000841
Figure BDA0003429348370000851
Figure BDA0003429348370000861
Figure BDA0003429348370000871
Figure BDA0003429348370000881
Figure BDA0003429348370000891
Figure BDA0003429348370000901
Figure BDA0003429348370000911
Figure BDA0003429348370000921
Figure BDA0003429348370000931
Figure BDA0003429348370000941
Figure BDA0003429348370000951
Figure BDA0003429348370000961
Figure BDA0003429348370000971
Figure BDA0003429348370000981
Figure BDA0003429348370000991
Figure BDA0003429348370001001
Figure BDA0003429348370001011
Figure BDA0003429348370001021
Figure BDA0003429348370001031
Figure BDA0003429348370001041
Figure BDA0003429348370001051
Figure BDA0003429348370001061
Figure BDA0003429348370001071
Figure BDA0003429348370001081
Figure BDA0003429348370001091
Figure BDA0003429348370001101
其他实施方案
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均援引加入本文，其程度就如同每个独立出版物或专利申请被具体地和单独地指示为援引加入一样。
虽然已经结合其具体实施方案描述了本发明，但应当理解，它能够进行进一步的修改，并且本申请旨在涵盖通常遵循本发明的原理的对本发明的任何变化、使用或适应性修改，并且包括在本发明所属领域内的已知或惯用实践范围内的与本发明的这种偏离，并且可以应用于上文所述的基本特征，并且在权利要求的范围内。
其他实施方案在权利要求内。

Claims (53)

1.鹅膏毒素或其衍生物或类似物，其包含式(An)或式(Bn)的结构
Figure FDA0003429348360000011
其中n是2、3、4、5、6、7、8或9。
2.鹅膏毒素或其衍生物或类似物，其包含式(A)的结构
Figure FDA0003429348360000012
或其对映异构体或非对映异构体。
3.鹅膏毒素或其衍生物或类似物，其包含式(B)的结构
Figure FDA0003429348360000021
或其对映异构体或非对映异构体。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的鹅膏毒素或其衍生物或类似物，其用于制备抗体-药物缀合物(ADC)。
5.抗体-药物缀合物(ADC)，其包含经由连接基缀合至鹅膏毒素的抗体或其抗原结合片段，所述ADC具有式(I)的结构：
Figure FDA0003429348360000022
或其立体异构体；
其中：
Q是S或亚砜基团；
L是不可裂解连接基；
Z是通过L上存在的反应性取代基与抗体或其抗原结合片段中存在的反应性取代基之间的偶联反应形成的化学部分；并且
Ab是抗体或其抗原结合片段。
6.根据权利要求5所述的ADC，其具有式(Ia)的结构：
Figure FDA0003429348360000031
7.根据权利要求5所述的ADC，其具有式(Ib)的结构：
Figure FDA0003429348360000032
8.根据权利要求5-7中任一项所述的ADC，其中L包含以下中的一种或多种：键、-(C＝O)-、-C(O)NH-基团、-OC(O)NH-基团、C1-C6亚烷基、C1-C6亚杂烷基、C2-C6亚烯基、C2-C6亚杂烯基、C2-C6亚炔基、C2-C6亚杂炔基、C3-C6亚环烷基、亚杂环烷基、亚芳基、亚杂芳基、-(CH2CH2O)p-基团，其中p为1-6的整数，或增溶基团；
其中每个C1-C6亚烷基、C1-C6亚杂烷基、C2-C6亚烯基、C2-C6亚杂烯基、C2-C6亚炔基、C2-C6亚杂炔基、C3-C6亚环烷基、亚杂环烷基、亚芳基或亚杂芳基可任选地被1至5个针对每种情况独立地选自以下的取代基所取代：烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、烷芳基、烷基杂芳基、氨基、铵、酰基、酰氧基、酰氨基、氨基羰基、烷氧羰基、脲基、氨基甲酸酯、芳基、杂芳基、亚磺酰基、磺酰基、羟基、烷氧基、硫烷基、卤素、羧基、三卤代甲基、氰基、羟基、巯基和硝基；
或者每个C1-C6亚烷基、C1-C6亚杂烷基、C2-C6亚烯基、C2-C6亚杂烯基、C2-C6亚炔基、C2-C6亚杂炔基、C3-C6亚环烷基、亚杂环烷基、亚芳基或亚杂芳基可任选地被一个或多个选自O、S和N的杂原子间断。
9.根据权利要求8所述的ADC，其中所述增溶基团具有式-Oa-C(O)NH-SO2-NR1-，其中：
a是0或1；并且
R1选自氢、C1-C24烷基、C3-C24环烷基、C2-C24(杂)芳基、C3-C24烷基(杂)芳基和C3-C24(杂)芳基烷基，其中每一个可任选地被一个或多个选自O、S和NR3的杂原子取代或任选地被其间断，其中R3独立地选自氢和C1-C4烷基。
10.根据权利要求5-9中任一项所述的ADC，其中L包含-(CH2)n-单元，其中n是2-6的整数。
11.根据权利要求10所述的ADC，其中L是-(CH2)n-，其中n是6。
12.根据权利要求11所述的ADC，其中Ab、Z和L共同构成的Ab-Z-L由下式表示：
Figure FDA0003429348360000041
其中S是所述抗体或其抗原结合片段中存在的半胱氨酸残基的硫原子。
13.抗体-药物缀合物(ADC)，其包含经由连接基缀合至鹅膏毒素的抗体或其抗原结合片段，所述ADC具有式(I)的结构：
Figure FDA0003429348360000042
或其立体异构体；
其中：
Q是S或亚砜基团；
L是可裂解连接基；
Z是通过L上存在的反应性取代基与抗体或其抗原结合片段中存在的反应性取代基之间的偶联反应形成的化学部分；并且
Ab是抗体或其抗原结合片段。
14.根据权利要求13所述的ADC，其具有式(Ia)的结构：
Figure FDA0003429348360000043
15.根据权利要求13所述的ADC，其具有式(Ib)的结构：
Figure FDA0003429348360000051
16.根据权利要求13-15中任一项所述的ADC，其中L包含以下中的一种或多种：肼、二硫化物、硫醚、氨基酸、由至多10个氨基酸组成的肽、对氨基苄基(PAB)基团、杂环自降解基团、C1-C6烷基、C1-C6杂烷基、C2-C6烯基、C2-C6杂烯基、C2-C6炔基、C2-C6杂炔基、C3-C6环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、-(C＝O)-基团、-C(O)NH-基团、-OC(O)NH-基团、其中p是1-6的整数的-(CH2CH2O)p-基团，或增溶基团；
其中每个C1-C6烷基、C1-C6杂烷基、C2-C6烯基、C2-C6杂烯基、C2-C6炔基、C2-C6杂炔基、C3-C6环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基可任选地被1至5个针对每种情况独立地选自以下的取代基所取代：烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、烷芳基、烷基杂芳基、氨基、铵、酰基、酰氧基、酰氨基、氨基羰基、烷氧羰基、脲基、氨基甲酸酯、芳基、杂芳基、亚磺酰基、磺酰基、羟基、烷氧基、硫烷基、卤素、羧基、三卤代甲基、氰基、羟基、巯基和硝基；
或者每个C1-C6烷基、C1-C6杂烷基、C2-C6烯基、C2-C6杂烯基、C2-C6炔基、C2-C6杂炔基、C3-C6环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基可任选地被一个或多个选自O、S和N的杂原子间断。
17.根据权利要求16所述的ADC，其中所述增溶基团具有式-Oa-C(O)NH-SO2-NR1-，其中：
a是0或1；并且
R1选自氢、C1-C24烷基、C3-C24环烷基、C2-C24(杂)芳基、C3-C24烷基(杂)芳基和C3-C24(杂)芳基烷基，其中每一个可任选地被一个或多个选自O、S和NR3的杂原子取代或任选地被其间断，其中R3独立地选自氢和C1-C4烷基。
18.根据权利要求13-17中任一项所述的ADC，其中L包含选自Phe-Lys、Val-Lys、Phe-Ala、Phe-Cit、Val-Ala、Val-Cit和Val-Arg的肽。
19.根据权利要求18所述的ADC，其还包含PAB基团。
20.根据权利要求19所述的ADC，其中L由下式表示：
Figure FDA0003429348360000052
21.ADC，其包含缀合至鹅膏毒素的抗体，所述ADC具有式(II)的结构：
Figure FDA0003429348360000061
或其立体异构体。
22.根据权利要求21所述的ADC，其具有式(IIa)的结构：
Figure FDA0003429348360000062
23.根据权利要求21所述的ADC，其具有式(IIb)的结构：
Figure FDA0003429348360000063
24.根据权利要求5至23中任一项所述的ADC，其中所述抗体或其抗原结合片段与在癌细胞或人类干细胞，特别是造血干细胞(HSC)，或T细胞的细胞表面上表达的抗原特异性结合。
25.根据权利要求5至24中任一项所述的ADC，其中所述抗体或其抗原结合片段与人Her2、PSMA、CD37或CD123特异性结合。
26.根据权利要求5至25中任一项所述的ADC，其中所述抗体或其抗原结合片段包含Fc区，所述Fc区包含至少一个选自D265C、D265A、A118C、L234A或L235A(根据EU索引)的突变。
27.根据权利要求5至23中任一项所述的ADC，其中所述抗体或其抗原结合片段与PSMA特异性结合并且包含根据SEQ ID NO.378的CDRH1、根据SEQ ID NO.379的CDRH2、根据SEQID NO.380的CDRH3、根据SEQ ID NO.381的CDRL1、根据SEQ ID NO.382的CDRL2，和根据SEQID NO.383的CDRL3。
28.根据权利要求27所述的ADC，其中所述抗体或其抗原结合片段包含根据SEQ IDNO.375的重链可变区和根据SEQ ID NO.377的轻链可变区。
29.根据权利要求28所述的ADC，其中所述抗体包含根据SEQ ID NO.371、SEQ IDNO.372、SEQ ID NO.373或SEQ ID NO.374的重链，和根据SEQ ID NO.376的轻链，或其抗原结合片段。
30.抗体-药物缀合物(ADC)，其包含经由连接基缀合至鹅膏毒素或其衍生物或类似物的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含Fc区，所述Fc区包含至少两个由L234A和L235A(根据EU索引)组成的突变。
31.根据权利要求30所述的抗体-药物缀合物(ADC)，其中所述Fc区进一步包含由D265C(根据EU索引)组成的突变。
32.根据权利要求30或31中任一项所述的抗体-药物缀合物(ADC)，其中所述抗体或其抗原结合片段与在癌细胞，优选人癌细胞的细胞表面上表达的抗原特异性结合。
33.根据权利要求32所述的抗体-药物缀合物(ADC)，其中所述抗体或其抗原结合片段与前列腺特异性膜抗原(PSMA)、Her2抗原、CD37，或CD123特异性结合。
34.根据权利要求30至32中任一项所述的抗体-药物缀合物(ADC)，其中所述抗体或其抗原结合片段与PSMA特异性结合并且包含根据SEQ ID NO.378的CDRH1、根据SEQ IDNO.379的CDRH2、根据SEQ ID NO.380的CDRH3、根据SEQ ID NO.381的CDRL1、根据SEQ IDNO.382的CDRL2，和根据SEQ ID NO.383的CDRL3。
35.根据权利要求34所述的抗体-药物缀合物(ADC)，其中所述抗体或其抗原结合片段包含根据SEQ ID NO.375的重链可变区和根据SEQ ID NO.377的轻链可变区。
36.根据权利要求35所述的抗体-药物缀合物(ADC)，其中所述抗体包含根据SEQ IDNO.372、SEQ ID NO.373或SEQ ID NO.374的重链，和根据SEQ ID NO.376的轻链，或其抗原结合片段。
37.根据权利要求30至36中任一项所述的抗体-药物缀合物(ADC)，其中所述抗体或抗原结合片段缀合至选自HDP30.2060、HDP30.2115、HDP30.2347、HDP30.1699、HDP30.2371、HDP30.0880和HDP30.2867的任意化合物。
38.抗体-药物缀合物(ADC)，其包含抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段与人PSMA特异性结合，并且包含具有根据SEQ ID NO.374的氨基酸序列的重链和具有根据SEQ ID NO.376的氨基酸序列的轻链，并且其缀合至化合物HDP30.2060。
39.抗体-药物缀合物(ADC)，其包含抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段与人PSMA特异性结合，并且包含具有根据SEQ ID NO.374的氨基酸序列的重链和具有根据SEQ ID NO.376的氨基酸序列的轻链，并且其缀合至化合物HDP30.2115。
40.抗体-药物缀合物(ADC)，其包含抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段与人PSMA特异性结合，并且包含具有根据SEQ ID NO.374的氨基酸序列的重链和具有根据SEQ ID NO.376的氨基酸序列的轻链，并且其缀合至化合物HDP30.2347。
41.抗体-药物缀合物(ADC)，其包含抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段与人PSMA特异性结合，并且包含具有根据SEQ ID NO.374的氨基酸序列的重链和具有根据SEQ ID NO.376的氨基酸序列的轻链，并且其缀合至化合物HDP30.1699。
42.抗体-药物缀合物(ADC)，其包含抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段与人PSMA特异性结合，并且包含具有根据SEQ ID NO.374的氨基酸序列的重链和具有根据SEQ ID NO.376的氨基酸序列的轻链，并且其缀合至化合物HDP30.2371。
43.抗体-药物缀合物(ADC)，其包含抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段与人PSMA特异性结合，并且包含具有根据SEQ ID NO.374的氨基酸序列的重链和具有根据SEQ ID NO.376的氨基酸序列的轻链，并且其缀合至化合物HDP30.0880。
44.抗体-药物缀合物(ADC)，其包含抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段与人PSMA特异性结合，并且包含具有根据SEQ ID NO.374的氨基酸序列的重链和具有根据SEQ ID NO.376的氨基酸序列的轻链，并且其缀合至化合物HDP30.2867。
45.根据权利要求37至44中任一项所述的抗体-药物缀合物(ADC)，其中所述药物抗体比(DAR)为约1、2、3或4，优选地其中所述DAR为2。
46.根据权利要求5至45中任一项所述的ADC，其用于治疗患者的癌症，特别地其中所述癌症选自乳腺癌、胰腺癌、胆管癌、结直肠癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、肾癌、恶性黑色素瘤、血液癌、白血病和恶性淋巴瘤。
47.根据权利要求30或31中任一项所述的抗体-药物缀合物(ADC)，其中所述抗体或其抗原结合片段与在造血干细胞(HSC)，优选人HSC的细胞表面上表达的抗原特异性结合。
48.消耗人个体中的细胞群的方法，所述方法包括向所述个体给药根据权利要求5至24和47中任一项所述的ADC，其中所述ADC包含抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段与所述细胞群中的细胞所表达的细胞外抗原特异性结合。
49.调理人个体以进行细胞移植的方法，所述方法包括向所述人个体给药根据权利要求5至23和47中任一项所述的ADC，使得所述人个体中的内源性干细胞或内源性免疫细胞被消耗，其中所述ADC与所述内源性干细胞或所述内源性免疫细胞所表达的细胞外抗原特异性结合。
50.根据权利要求48或49所述的方法，其还包括向所述人个体给药同种异体干细胞或同种异体免疫细胞。
51.根据权利要求48至50中任一项所述的方法，其中所述ADC与在免疫细胞上表达的细胞外抗原特异性结合，并且其中所述个体患有移植物抗宿主病(GVHD)或者有发展移植物抗宿主病的风险。
52.药物组合物，其包含根据权利要求5至47中任一项所述的ADC和至少一种药学上可接受的载体。
53.根据权利要求5至45中任一项所述的ADC用于治疗患者的癌症的用途，特别地其中所述癌症选自乳腺癌、胰腺癌、胆管癌、结直肠癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、肾癌、恶性黑色素瘤、血液癌、白血病和恶性淋巴瘤。
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