BR112019007714B1

BR112019007714B1 - Anticorpos anti-4-1bb, uso do mesmo, composição farmacêutica, métodos para determinar uma dose, para aumentar a secreção de ifn-gama por uma célula in vitro e para proliferação ex vivo ou isolamento de células t ativadas e uso das mesmas

Info

Publication number: BR112019007714B1
Application number: BR112019007714-6A
Authority: BR
Inventors: Byoung S. Kwon; Seoung-Joo Lee; Young Ho Kim; Ho-Sik Oh; Joong Won Lee
Original assignee: Eutilex Co., Ltd
Priority date: 2017-01-06
Filing date: 2018-01-05
Publication date: 2022-01-18
Also published as: BR112019007714A2; AU2021202474A1; AU2018206015A1; KR20190095919A; NZ753036A; KR102427192B1; US10919972B2; RU2020120077A3; US10174122B2; ES2905890T3; KR20200029618A; JP7153626B2; US10774151B2; EP3523332A1; SG11201903021WA; JP6609724B1; RU2725811C1; EP4032911A1; CA3039772A1; EP3523332A4

Abstract

são fornecidos anticorpos de 4-1bb anti-humanos e fragmentos dos mesmos com um ou mais aspectos estruturais que não são encontrados em um anticorpo de 4-1bb anti-humano de referência, onde os referidos aspectos podem melhorar certas características do anticorpo com relação ao anticorpo de referência. vários métodos in vitro e in vivo e reagentes relacionados aos anticorpos de 4-1bb anti-humanos descritos aqui são também fornecidos. métodos incluem, por exemplo, indução de proliferação de célula t, indução de secreção de célula t de ifn¿, bem como detecção, prevenção, e/ou tratamento terapêutico de câncer usando um anticorpo de 4-1bb anti-humano ou fragmento do mesmo.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica prioridade a e o benefício de Pedidode Patente dos Estados Unidos n° 62/443.281, depositado em 06 de Janeiro de 2017, a descrição do qual é incorporada aqui por referência em sua totalidade.

ANTECEDENTES

[002] O câncer continua sendo uma das principais causas demorte no mundo. Estatísticas recentes reportam que 13% da população mundial morrem de câncer. De acordo com as estimativas da International Agency for Research on Cancer (IARC), em 2012, houve 14,1 milhões de novos casos de câncer e 8,2 milhões de mortes por câncer em todo o mundo. Até 2030, espera-se que a carga global cresça para 21,7 milhões de novos casos de câncer e 13 milhões de mortes por câncer devido ao crescimento populacional e envelhecimento e exposição a fatores de risco como tabagismo, dieta inadequada e inatividade física. Além disso, a dor e as despesas médicas para o tratamento do câncer causam redução da qualidade de vida tanto para pacientes com câncer quanto para suas famílias. É evidente que, acima de tudo, o câncer é uma doença para a qual é necessário ender urgentemente métodos de tratamento melhorados.

SUMÁRIO

[003] A presente invenção fornece, entre outras coisas, anticorpose fragmentos dos mesmos que se ligam a um polipeptídeo 4-1BB humano. Em alguns aspectos, anticorpos de anti-4-1BB humano fornecidos e fragmentos dos mesmos são variantes de um anticorpo de anti-4-1BB humano de referência pelo fato de que elas contêm um ou mais características estruturais particulares que não são encontradas no anticorpo de anti-4-1BB humano de referência. A presente invenção abrange um reconhecimento de que anticorpos de anti-4-1BB humano variantes fornecidos têm propriedades melhoradas com relação a um anticorpo de anti-4-1BB humano de referência sem uma ou mais características estruturais descritas aqui. Em algumas modalidades, os anticorpos de anti-4-1BB humanos fornecidos e fragmentos dos mesmos têm uma ou mais propriedades melhoradas, tais como, por exemplo, afinidade de ligação melhorada, indução melhorada de proliferação de célula T (por exemplo, proliferação de células T CD8+), capacidade aumentada de induzir a produção de IFNY por células T (por exemplo, proliferação de células T CD8+), capacidade melorada de reduzir e/ou eliminar a proliferação de câncer in vivo (por exemplo, em uma dose menor).

[004] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-4-1BB oufragmento de anticorpo de ligação ao antígeno inclui 1, 2, ou 3sequências de CDR de cadeia pesada que são ou incluem uma sequência de SEQ ID NOs: 5 a 8. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-4-1BB ou fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno inclui uma ou mais de: uma CDR1 de cadeia pesada que é ou inclui uma sequência de SEQ ID NO: 5, uma CDR2 de cadeia pesada que é ou inclui uma sequência de SEQ ID NO: 6 e uma CDR3 de cadeia pesada que é ou inclui uma sequência de SEQ ID NO: 7 ou 8. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-4-1BB ou fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno inclui cada uma de: uma CDR1 de cadeia pesada que é ou inclui uma sequência de SEQ ID NO: 5, uma CDR2 de cadeia pesada que é ou inclui uma sequência de SEQ ID NO: 6 e uma CDR3 de cadeia pesada que é ou inclui uma sequência de SEQ ID NO: 7 ou 8.

[005] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-4-1BB oufragmento de anticorpo de ligação ao antígeno inclui 1, 2, ou 3sequências de CDR de cadeia leve que são ou incluem uma sequência de SEQ ID NOs: 1-4. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-4- 1BB ou fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno inclui uma ou mais de: uma CDR1 de cadeia leve que é ou inclui uma sequência de SEQ ID NO: 1, uma CDR2 de cadeia leve que é ou inclui uma sequência de SEQ ID NO: 2 euma CDR1 de cadeia leve que é ou inclui uma sequência de SEQ ID NO: 3 ou 4. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-4-1BB ou fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno inclui cada uma de: uma CDR1 de cadeia leve que é ou inclui uma sequência de SEQ ID NO: 1, uma CDR2 de cadeia leve que é ou inclui uma sequência de SEQ ID NO: 2 e uma CDR1 de cadeia leve que é ou inclui uma sequência de SEQ ID NO: 3 ou 4.

[006] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-4-1BB oufragmento de anticorpo de ligação ao antígeno inclui um domínio variável de cadeia pesada que inclui uma CDR1 de cadeia pesada que é ou inclui uma sequência de SEQ ID NO: 5, uma CDR2 de cadeia pesada que é ou inclui uma sequência de SEQ ID NO: 6 and uma CDR3 de cadeia pesada que é ou inclui uma sequência de SEQ ID NO: 7 ou 8, e/ou um domínio variável de cadeia leve que inclui uma CDR1 de cadeia leve que é ou inclui uma sequência de SEQ ID NO: 1, uma CDR2 de cadeia leve que é ou inclui uma sequência de SEQ ID NO: 2 e uma CDR1 de cadeia leve que é ou inclui uma sequência de SEQ ID NO: 4.

[007] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-4-1BB oufragmento de anticorpo de ligação ao antígeno inclui um domínio variável de cadeia pesada que inclui uma região estrutural de cadeia leve 1 (FR1) compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 16 ou 17. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-4-1BB ou fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno inclui um domínio variável de cadeia pesada que inclui uma região estrutural de cadeia pesada 3 (FR3) compreendendo uma sequência de qualquer uma de SEQ ID NOs: 1820. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-4-1BB ou fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno inclui um domínio variável de cadeia pesada que inclui uma região estrutural de cadeia leve 1 (FR1)compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 16 ou 17 e uma região estrutural de cadeia pesada 3 (FR3) compreendendo uma sequência de qualquer uma de SEQ ID NOs: 18-20.

[008] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-4-1BB oufragmento de anticorpo de ligação ao antígeno inclui homologia substancial a um anticorpo ou fragmento de anticorpo que inclui um domínio variável de cadeia pesada que is ou inclui a sequence selected from SEQ ID NOs: 11-14. Em algumas modalidades, um anticorpo anti- 4-1BB ou fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno inclui um domínio variável de cadeia pesada que é ou inclui uma sequência pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4% ou 99,5% idêntica a uma sequência selecionada de SEQ ID NOs: 11-14. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-4- 1BB ou fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno inclui um domínio variável de cadeia pesada que é ou inclui uma sequência selecionada de SEQ ID NOs: 11-14.

[009] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-4-1BB oufragmento de anticorpo de ligação ao antígeno inclui homologia substancial a um anticorpo ou fragmento de anticorpo que inclui um domínio variável de cadeia leve que é ou inclui uma sequência de SEQ ID NO: 9 ou 10. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-4-1BB ou fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno inclui um domínio variável de cadeia leve que é ou inclui uma sequência pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99,4% ou 99,5% idêntica a uma sequência de SEQ ID NO: 9 ou 10. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-4-1BB ou fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno inclui um domínio variável de cadeia leve que é ou inclui uma sequência de SEQ ID NO: 9 ou 10.

[0010] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-4-1BB oufragmento de anticorpo de ligação ao antígeno inclui homologia substancial a um anticorpo ou fragmento de anticorpo que inclui um domínio variável de cadeia pesada que é ou inclui uma sequência selecionada de SEQ ID NOs: 11-14 e um domínio variável de cadeia leve que é ou inclui uma sequência de SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-4-1BB ou fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno inclui um domínio variável de cadeia pesada que é ou inclui uma sequência pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4% ou 99,5% idêntica a uma sequência selecionada de SEQ ID NOs: 11-14 e um domínio variável de cadeia leve que é ou inclui uma sequência pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4% ou 99,5% idêntica a uma sequência de SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-4-1BB ou fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno inclui um domínio variável de cadeia pesada que é ou inclui uma sequência selecionada de SEQ ID NOs: 1114 e um domínio variável de cadeia leve que é ou inclui uma sequência de SEQ ID NO: 10.

[0011] Em algumas modalidades, um anticorpo de anti-4-1BBhumano fornecido ou fragmento do mesmo é um anticorpo agonístico. Em algumas modalidades, um anticorpo de anti-4-1BB humano fornecido ou fragmento do mesmo é caracterizado como tendo atividade agonística maior do que um anticorpo de anti-4-1BB humano humanizado 94G1 (isto é, um anticorpo incluindo domínios variáveis de cadeia leve e cadeia pesada de SEQ ID NOs: 9 e 11, respectivamente). Em algumas modalidades, um anticorpo de anti-4-1BB humanofornecido ou fragmento do mesmo é caracterizado como tendo afinidade de ligação melhor do que um anticorpo de anti-4-1BB humanohumanizado 94G1 (isto é, um anticorpo incluindo domínios variáveis de cadeia leve e cadeia pesada de SEQ ID NOs: 9 e 11, respectivamente).

[0012] Em algumas modalidades, um anticorpo de anti-4-1BBhumano fornecido ou fragmento do mesmo é ou compreende um anticorpo humanizado. Em algumas modalidades, um anticorpo de anti- 4-1BB humano fornecido ou fragmento do mesmo inclui um domínio constante de imunoglobulina humana, em que o domínio constante é selecionado de uma IgG1 ou uma variante da mesma, uma IgG2 ou uma variante da mesma, uma IgG4 ou uma variante da mesma, uma IgA ou uma variante da mesma, uma IgE ou uma variante da mesma, uma IgM ou uma variante da mesma, e uma IgD ou uma variante da mesma. Em algumas modalidades, um anticorpo de anti-4-1BB humano fornecido ou fragmento do mesmo é ou compreende uma IgG1 humana. Em algumas modalidades, uma IgG1 é ou compreende uma sequência que é pelo menos 95% idêntica a SEQ ID NO: 22 ou 23.

[0013] Em algumas modalidades, um anticorpo de anti-4-1BBhumano fornecido ou fragmento do mesmo é um anticorpo monoclonal.

[0014] Em algumas modalidades, um anticorpo de anti-4-1BBhumano fornecido ou fragmento do mesmo é um anticorpo de tamanho natural. Em algumas modalidades, um anticorpo de anti-4-1BB humano fornecido ou fragmento do mesmo é um fragmento de Fab, um fragmento de Fab’, um fragmento de F(ab’)2, um fragmento de Fv, um fragmento de Fv ligado por dissulfeto, um fragmento de scFv, um anticorpo de domínio simples, humacorpo, nanocorpo, ou um diacorpo.

[0015] Em algumas modalidades, um anticorpo de anti-4-1BBhumano fornecido ou fragmento do mesmo tem uma afinidade de ligação (KD) para uma molécula de 4-1BB humana de 1xio-7 a ixio-12 M. Em algumas modalidades, um anticorpo de anti-4-1BB humano fornecido ou fragmento do mesmo tem uma afinidade de ligação (KD) para uma molécula de 4-1BB humana de 1xio-8 a ixio-12 M. Em algumas modalidades, um anticorpo de anti-4-1BB humano fornecido ou fragmento do mesmo tem uma afinidade de ligação (KD) para uma molécula de 4-1BB humana de 1x10-9 a 1x10-12 M. Em algumas modalidades, um anticorpo de anti-4-1BB humano fornecido ou fragmento do mesmo tem uma afinidade de ligação (KD) para uma molécula de 4-1BB humana de 1x10-10 a 1x10-12 M.

[0016] Em algumas modalidades, um anticorpo de anti-4-1BBhumano fornecido ou fragmento do mesmo liga-se a um epitopo dentro do domínio extracelular de um polipeptídeo de 4-1BB humana. Em algumas modalidades, um anticorpo de anti-4-1BB humano fornecido ou fragmento do mesmo liga-se a um epitopo dentro do domínio extracelular de human 4-1BB. Em algumas modalidades, a ligação de um anticorpo de anti-4-1BB humano fornecido ou fragmento do mesmo é anulada por uma ou mais mutações nas posições N30, D38, N39, e R41 de SEQ ID NO: 44.

[0017] Em algumas modalidades, um anticorpo de anti-4-1BBhumano fornecido ou fragmento do mesmo não se liga ou liga fracamente a um polipeptídeo de 4-1BB não-primata. Em algumas modalidades, um anticorpo de anti-4-1BB humano fornecido ou fragmento do mesmo não se liga ou liga fracamente a um polipeptídeo de 4-1BB canina.

[0018] Em algumas modalidades, a presente invenção fornecemoléculas de ácido nucleico codificando um anticorpo anti-4-1BB ou fragmento de ligação ao antígeno. Em algumas modalidades, a presente invenção fornece vetores que incluem uma molécula de ácido nucleico codificando um anticorpo anti-4-1BB ou fragmento de ligação ao antígeno. Em algumas modalidades, a presente invenção fornece células hospedeiras que incluem um vetor e/ou molécula de ácido nucleico codificando um anticorpo anti-4-1BB ou fragmento de ligação ao antígeno. Em algumas modalidades, uma célula hospedeira é selecionada de uma célula bacteriana, levedura, inseto ou mamífera. Em algumas modalidades, a é selecionado do grupo que consiste em E.coli, P.pastoris, Sf9, COS, HEK293, CHO e um linfócito de mamífero.

[0019] Em algumas modalidades, a presente invenção fornececomposições farmacêuticas que incluem um anticorpo anti-4-1BB ou fragmento de ligação ao antígeno e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, a presente invenção fornece composições farmacêuticas que incluem um ácido nucleico e/ou vetor codificando um anticorpo anti-4-1BB ou fragmento de ligação ao antígeno e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0020] Em algumas modalidades, a presente invenção fornecemétodos de tratamento de um indivíduo em necessidade dos mesmos, o método compreendendo administrar ao indivíduo uma composição que compreende ou libera um anticorpo anti-4-1BB ou fragmento de ligação ao antígeno. Em algumas modalidades, a presente invenção fornece métodos de tratamento de um indivíduo em necessidade dos mesmos, o método compreendendo administrar ao indivíduo uma composição que compreende ou libera um ácido nucleico e/ou vetor codificando um anticorpo anti-4-1BB ou fragmento de ligação ao antígeno. Em algumas modalidades, um indivíduo tem ou está em risco de desenvolver câncer.

[0021] Em algumas modalidades, a presente invenção fornecemétodos de indução de uma resposta imunológica in um indivíduo em necessidade dos mesmos, o método compreendendo administrar ao indivíduo uma composição que compreende ou libera um anticorpo anti- 4-1BB ou fragmento de ligação ao antígeno. Em algumas modalidades, a presente invenção fornece métodos de indução de uma resposta imunológica em um indivíduo em necessidade dos mesmos, o método compreendendo administrar ao indivíduo uma composição que compreende ou libera um ácido nucleico e/ou vetor codificando um anticorpo anti-4-1BB ou fragmento de ligação ao antígeno. Em algumas modalidades, um indivíduo tem ou está em risco de desenvolver câncer.

[0022] Em algumas modalidades, a presente invenção fornecemétodos de realce de uma resposta imunológica em um indivíduo em necessidade dos mesmos, o método compreendendo administrar ao indivíduo uma composição que compreende ou libera um anticorpo anti- 4-1BB ou fragmento de ligação ao antígeno. Em algumas modalidades, a presente invenção fornece métodos de realce de uma resposta imunológica em um indivíduo em necessidade dos mesmos, o método compreendendo administrar ao indivíduo uma composição que compreende ou libera um ácido nucleico e/ou vetor codificando um anticorpo anti-4-1BB ou fragmento de ligação ao antígeno. Em algumas modalidades, um indivíduo tem ou está em risco de desenvolver câncer.

[0023] Em algumas modalidades, um câncer a ser tratado por ummétodo da presente invenção em um indivíduo é selecionado de um câncer de bexiga, câncer de mama, câncer cervical, câncer de cólon, câncer de endométrio, câncer esofágico, câncer das trompas de falópio, câncer da vesícula biliar, câncer gastrointestinal, câncer de cabeça e pescoço, câncer hematológico, câncer de laringe, câncer de fígado, câncer de pulmão, linfoma, melanoma, mesotelioma, câncer ovariano, câncer peritoneal primário, câncer da glândula salivar, sarcoma, câncer de estômago, câncer de tireoide, câncer pancreático, e câncer de próstata.

[0024] Em algumas modalidades, uma composição compreende oulibera um anticorpo de anti-4-1BB humano da presente invenção ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo em uma dose de 0,01 mg/kg a 100 mg/kg. Em algumas modalidades, uma composição compreende ou libera um anticorpo de anti-4-1BB humano ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo em uma dose de cerca de 0,01 mg/kg, 0,025 mg/kg, 0,05 mg/kg, 0,075 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,25 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,75 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 8 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg, 50 mg/kg, 50 mg/kg, 70 mg/kg, 80 mg/kg, 90 mg/kg, ou 100 mg/kg.

[0025] Em algumas modalidades, anticorpos de anti-4-1BBhumanos e/ou fragmentos dos mesmos e/ou composições compreendendo os mesmos são caracterizados por indução de proliferação de célula T aumentada (por exemplo, proliferação de célula T CD8+) e/ou secreção de IFNY aumentada por células T (por exemplo, células T CD8+) em um indivíduo.

[0026] Em algumas modalidades, a presente invenção fornecemethods que incluem administrar ao indivíduo uma composição que compreende ou libera um anticorpo anti-4-1BB ou fragmento de ligação ao antígeno a um indivíduo que foi administrado ou será administrado com uma ou mais terapias anticâncer adicionais. Em algumas modalidades, a presente invenção fornece métodos que incluem administrar ao indivíduo uma composição que compreende ou libera um anticorpo anti-4-1BB ou fragmento de ligação ao antígeno a um indivíduo que foi administrado ou será administrado com uma ou mais de radiação ionizante, um agente quimioterapêutico, um agente anticorpo, e uma terapia com base em célula, de modo que o indivíduo receba o tratamento com ambos.

[0027] Em algumas modalidades, a presente invenção fornecemétodos que incluem administrar ao indivíduo uma composição que compreende ou libera um anticorpo anti-4-1BB ou fragmento de ligação ao antígeno a um indivíduo que foi administrado ou será administrado com uma ou mais de um inibidor de ponto de verificação imunológica, IL-12, GM-CSF, um agente anti-CD4, fluorouracil, doxorrubicina, irinotecano, paclitaxel, cisplatina, ou ciclofosfamida.

[0028] Em algumas modalidades, a presente invenção fornecemétodos que incluem administrar ao indivíduo uma composição que compreende ou libera um anticorpo anti-4-1BB ou fragmento de ligação ao antígeno a um indivíduo que foi administrado ou será administrado com uma composição compreendendo um inibidor de ponto de verificação imunológica, de modo que o indivíduo receba o tratamento com ambos. Em algumas modalidades, um inibidor de ponto de verificação imunológica é um agente que inibe a sinalização de PD-1. Em algumas modalidades, um agente que inibe a sinalização de PD-1 é um anticorpo anti-PD-1. Em algumas modalidades, um anticorpo anti- PD-1 é nivolumab, pembrolizumab, atezolizumab, durvalumab ou avelumab.

[0029] Em algumas modalidades, a presente invenção fornecemétodos de determinação de uma dose de um anticorpo anti-4-1BB ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo para o tratamento terapêutico de um indivíduo em necessidade dos mesmos. Em algumas modalidades, tal método inclui (i) fornecer ou obter uma medição de IFN-gama secretada em uma amostra biológica do indivíduo, em que o indivíduo foi administrado com uma composição que compreende ou libera uma quantidade de um anticorpo anti-4-1BB ou fragmento de ligação ao antígeno descrito aqui; e (ii) comparar a medição de IFN- gama secretada a um valor de referência, onde ser a medição de IFN- gama secretada for maior ou menor do que o valor de referência, o ajuste de um anticorpo anti-4-1BB ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo será administrado, desse modo determinando uma dose para o tratamento terapêutico de um indivíduo. Em algumas modalidades, um valor de referência compreende um valor de índice que inclui um valor derivado de um ou mais indivíduos saudáveis, um valor derivado de um ou mais indivíduos diagnosticados com câncer ou um valor derivado de um algoritmo de predição de risco de câncer. Em algumas modalidades, uma mostra biológica é uma amostra de sangue completo, plasma, ou soro. Em algumas modalidades, um indivíduo tem ou está em risco de desenvolver câncer. Em algumas modalidades, a cancer é selecionada de a câncer de bexiga, câncer de mama, câncer cervical, câncer de cólon, câncer de endométrio, câncer esofágico, câncer das trompas de falópio, câncer da vesícula biliar, câncer gastrointestinal, câncer de cabeça e pescoço, câncer hematológico, câncer de laringe, câncer de fígado, câncer de pulmão, linfoma, melanoma, mesotelioma, câncer ovariano, câncer peritoneal primário, câncer da glândula salivar, sarcoma, câncer de estômago, câncer de tireoide, câncer pancreático, e câncer de próstata.

[0030] Em algumas modalidades, a presente invenção fornecemétodos para aumentar a secreção de IFN-Y por uma célula in vivo ou in vitro que incluem: contatar a célula com um anticorpo anti-4-1BB ou fragmento de ligação ao antígeno descrito aqui.

[0031] Em algumas modalidades, a presente invenção fornecemétodos proliferação de proliferação ex vivo ou isolamento de células T ativadas que incluem: contatar uma população de células T com um anticorpo anti-4-1BB ou fragmento de ligação ao antígeno descrito aqui, desse modo aumentando a proliferação de células T ativadas.

[0032] Em algumas modalidades, a presente invenção fornecemétodos para isolamento de células T ativadas não específicas de antígeno que incluem uma ou mais etapas de: (a) cultura de células mononucleares de sangue periférico (PBMC) em um meio juntamente com um peptídeo de um epitopo de interesse e IL-2; (b) indução de expressão de 4-1BB nas células cultivadas adicionando o peptídeo do epitopo de interesse; (c) contato das células cultivadas com uma superfície revestida com um anticorpo anti-4-1BB ou fragmento de ligação ao antígeno descrito aqui, em que as células cultivadas expressando 4-1BB se aderem à superfície revestida; e (d) remoção das células não ligadas, desse modo isolando as células T ativadas específicas de antígeno. Em algumas modalidades, células T ativadas são células T CD8+.

[0033] Em algumas modalidades, a presente invenção fornecemétodos para tratamento ou prevenção de câncer em um indivíduo em necessidade dos mesmos que inclui administrar ao indivíduo uma composição que inclui uma quantidade terapeuticamente eficaz de células T ativadas produzidas por qualquer um dos métodos descritos aqui. Em algumas modalidades, a câncer é selecionado de um câncer de bexiga, câncer de mama, câncer cervical, câncer de cólon, câncer de endométrio, câncer esofágico, câncer das trompas de falópio, câncer da vesícula biliar, câncer gastrointestinal, câncer de cabeça e pescoço, câncer hematológico, câncer de laringe, câncer de fígado, câncer de pulmão, linfoma, melanoma, mesotelioma, câncer ovariano, câncer peritoneal primário, câncer da glândula salivar, sarcoma, câncer de estômago, câncer de tireoide, câncer pancreático, e câncer de próstata. Em algumas modalidades, uma composição inclui menos de 109, pelo menos 1010 células, ou mais do que 1010 células T ativadas. Em algumas modalidades, células T ativadas são células T CD8+.

[0034] Também fornecidas, entre outras coisas, são tecnologiaspara caracterização de anticorpos de anti-4-1BB humanos e/ou fragmentos dos mesmos como descrito aqui e/ou composições compreendendo os mesmos. Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para caracterização de anticorpos de anti-4-1BB humanos e/ou fragmentos dos mesmos e/ou composições compreendendo os mesmos que se ligam às células AML (por exemplo, HL60). Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para caracterização de anticorpos de anti-4-1BB humanos e/ou fragmentos dos mesmos e/ou composições compreendendo os mesmos são por ELISA, imuno- histoquímica, ensaios de ligação Biacore, espectrometria de massa, cromatografia de focalização isoelétrica (IEF), e/ou western blot.

[0035] A presente invenção fornece várias tecnologias relacionadaspara preparar ou fabricar os anticorpos de anti-4-1BB humanos e/ou fragmentos dos mesmos como descrito aqui e/ou composições contendo os referidos anticospos ou fragmentos dos mesmos.

[0036] Como usado neste pedido, os termos "cerca de" e"aproximadamente" são usados como equivalentes. Quaisquer citações à publicações, patentes ou pedidos de patente aqui são incorporadas por referência em sua totalidade. Quaiquer numerais usados neste pedido com ou sem cerca de/aproximadamente não se destinam abranger quaisquer flutuações normais apreciadas por alguém versado na técnica relevante.

[0037] Outras características, objetos e vantagens da presenteinvenção são evidentes na descrição detalhada que segue. Deve ser entendido, no entanto, que a descrição detalhada, embora indicando modalidades da presente invenção, é dada apenas de modo ilustrativo, não limitante. Várias alterações e modificações no escopo da invenção tornar-se-ão evidentes para os versados na técnica a partir da descrição detalhada.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0038] O desenho incluso aqui, que é compreendido das seguintesFiguras, é para propósitos de ilustração apenas e não para limitação. Os anteriores e outros objetos, aspectos, características e vantagens da presente invenção tornar-se-ão mais evidentes e melhor entendidos referindo-se à seguinte descrição feita em conjunto com as figuras acompanhantes em que:

[0039] FIG. 1A descreve construções de domínio extracelular(ECD) de 4-1BB humana. No topo é um esquemático de um ECD de 4- 1BB de tamanho natural (167 aminoácidos), e abaixo são mostrados vários fragmentos de um ECD de 4-1BB: R1 (1-55 aa), R2 (56-110 aa), R3 (110-167 aa), R1.1 (1-45 aa), R1.2 (1-35 aa), R1.3 (11-55 aa), R1.4 (21-55 aa) R1.5 (1-25 aa) e R1.6 (1-30 aa). Cada uma destasconstruções de ECD de 4-1BB foram fundidas com GST. FIG. 1B descreve um western blot mostrando a ligação de um anticorpo anti-4- 1BB humanizada exemplar às construções de fusão de ECD de 4-1BB como descrito na FIG. 1A. Como mostrado, um anticorpo anti-4-1BB humanizada exemplar liga-se a um polipeptídeo de fusão de ECD de 4- 1BB de tamanho natural e ao polipeptídeo de fusão de R1, porém não aos polipeptídeos de fusão de R2 ou R3. Marcadores de tamanho molecular são indicados em kDa à esquerda.

[0040] FIG. 2A descreve um gel de SDS-PAGE de extratos decélula inteira de células que expressam de construções de fusão de ECD de 4-1BB. Construções de fusão como descrito acima na FIG. 2A foram expressas em células BL21 de E. coli induzidas com IPTG a 1 mM, e extratos de célula inteira resolvidos por 12% de SDS-PAGE. Como mostrado, todas as construções de fusão (ECD, R1, R1.1, R1.2, R1.3, R1.4, R1.5, e R1.6) têm expressão de proteína robusta. FIG. 2B descreve um western blot mostrando a ligação de um anticorpo anti-4- 1BB humanizada exemplar ao peptídeo de fusão de ECD de 4-1BB de tamanho natural, e polipeptídeos de fusão de R1.1, R1.2, R1.3, e R1.6, porém não aos polipeptídeos de fusão de R1.4 ou R1.5. Immunoblots foram reportados com anticorpo de anti-4-1BB humano exemplar. Marcadores de tamanho molecular são indicados em kDa à esquerda.

[0041] FIG. 3 descreve a afinidade de ligação de anticorposmonoclonais anti-4-1BB para anticorpos monoclonais para antígeno de 4-1BB humana recombinante, como medido por ELISA. Os valores de OD450nm são representados no eixo y, e concentrações crescentes de anticorpos anti-4-1BB (em μg/ml) ao longo do eixo x. BBK-4 (círculos) é um anticorpo anti-4-1BB humano de murino, 94G1 (quadrados), 94K (triângulos apontanto para cima), 94KV (diamantes), 94KVT (estrelas) e EU101 (triângulos apontando para baixo) são anticorpos anti-4-1BB variante humanizados exemplares.

[0042] FIG. 4 descreve a ligação de anticorpos monoclonais anti-4-1BB à 4-1BB expressando células T Jurkat (Jurkat 8-1). Valores de Intensidade de Fluorescência Média (MFI) são representados no eixo y e concentração de Log10 de anticorpo (em μg/ml) ao longo do eixo x. BBK-4 (círculos) é um anticorpo anti-4-1BB humano de murino, 94G1 (quadrados), 94K (triângulos apontanto para cima), 94KV (diamantes), 94KVT (estrelas) e EU101 (triângulos apontando para baixo) são anticorpos anti-4-1BB variante humanizados exemplares.

[0043] FIG. 5 fornece uma tabela listando afinidades de ligações invitro de anticorpos anti-4-1BB variante para 4-1BB. A afinidade de ligação foi medida usando ressonância de plasmônio de superfície (SPR, Biacore 3000). 94G1 e EU101 são anticorpos anti-4-1BB variante humanizados exemplares.

[0044] FIG. 6 descreve a ligação de anticorpos monoclonais anti-4-1BB à 4-1BB expressando células T CD8+. Células T CD8+ foram isoladas de PBMCs humanas e ativadas por anticorpo anti-CD3 durante 2 dias. 4-1BB-PE é um anticorpo anti-4-1BB comercialmente disponível, BBK-4 é um anticorpo anti-4-1BB humano de murino, 94G1, 94K, 94KV, 94KVT e EU101 são anticorpos anti-4-1BB variante humanizados exemplares. O gráfico no painel inferior reflete os valores mostrados para cada anticorpo nos dados de FACS nos painéis superiores.

[0045] FIG. 7 descreve um gráfico quantificando a proliferação invitro de células T CD8+ tratadas com anticorpos anti-4-1BB. Células T CD8+ proliferantes foram tratadas sem nenhum anticorpo, IgG humana sozinha, BBK-4, ou anticorpo anti-4-1BB variante humanizado exemplar: 94G1, 94K, 94KV, 94KVT e EU101 e tratadas com WST-1 (sal de tetrazólio solúvel em água) para manchar as células proliferantes (isto é, metabolicamente ativas).

[0046] FIG. 8 descreve um gráfico quantificando a secreção de IFNYin vitro por células T CD8+ tratadas com anticorpos anti-4-1BB. As células T CD8+ foram isoladas de PBMCs humanas e tratadas sem nenhum anticorpo, IgG humana sozinha, ou 1 μg/ml de um anticorpo anti-4-1BB: BBK-4, 94G1, 94K, 94KV, 94KVT e EU101. Secreção de IFNy foi avaliada nos dias 1, 3, e 5.

[0047] FIG. 9 mostra os gráficos que descrevem a secreção de IFN-y em (A) CD4+ e (B) CD8+. Depois de serem isoladas de PBMCs de um doador saudável, células T ativadas presentes nas PBMCs foram repousadas em meio de RPMI-1640+2% de FBS durante 24 horas, e as PBMCs repousadas foram tratadas com anticorpo anti-CD4 ou anticorpo anti-CD8 ligado a contas de ferro, e células CD4+ ou células CD8+ foram isoladas usando um separador magnético MACS. As células T CD4+ isoladas ou células T CD8+ foram tratadas com um ativador de célula T, anti-CD3, para induzir a expressão de 4-1BB, e tratadas com EU101 em diferentes concentrações (0,5, 1,0, 2,5, e 5,0 μg/ml) ou uma IgG humana de controle (5,0 μg/ml) durante 3 dias. Após 3 dias, um meio de cultura excluindo as células foi obtido, e a fluorescência de IFN-y humana no meio de cultura foi avaliada por ELISA (ebioscience). Os resultados foram comparados com uma curva padrão como fornecido em um kit ELISA de IFN-y.

[0048] FIG. 10A mostra um gráfico descrevendo a citotoxicidadedependente de anticorpo (ADCC) de anticorpos de anti-4-1BB humanos exemplares BBK4, 94G1, 94KVT e EU101. FIG. 10B mostra um gráfico descrevendo a citotoxicidade de complemento (CDC) de anticorpos de anti-4-1BB humanos exemplares BBK4, 94G1, e EU101.

[0049] FIG. 11 mostra efeitos anticâncer in vivo de um anticorpo deanti-4-1BB humano exemplar (EU101) por concentração, que são medidos como tamanhos de tumor após as células de tumor de câncer de cólon (HT29) serem subcutaneamente injetadas em camundongos humanizados, e quando tamanhos de tumor alcançam 100 a 200 mm3, um anticorpo de anti-4-1BB humano exemplar (EU101) foi intravenosamente administrado aos camundongos em doses de 1,0 mg, 5,0 mg e 10,0 mg por 1 kg de um peso corporal uma vez a cada 5 dias 3 vezes (dados representativos).

[0050] FIG. 12 mostra os efeitos anticâncer de um anticorpo de anti-4-1BB humano exemplar (EU101) e um anticorpo anti-PD-1 exemplar (Keytruda, "KD") por concentração. Os efeitos anticâncer foram medidos como tamanhos de tumor após injeção subcutânea de células de tumor de câncer de cólon (HT29) em camundongos humanizados e tratamento com anticorpo. Quando os tamanhos de tumor alcançaram 100 a 150 mm3, os camundongos foram tratados com um anticorpo de anti-4-1BB humano exemplar (EU101) ou um anticorpo anti-PD-1 exemplar (Keytruda) por injeção intraperitoneal em uma dose de 5,0 mg e 10,0 mg por 1 kg de peso corporal uma vez a cada 5 dias três vezes.

[0051] FIG. 13 mostra efeitos anticâncer comparativos detratamento individual e terapia de combinação de um anticorpo de anti- 4-1BB humano exemplar (EU101) e um anticorpo anti-PD-1 exemplar (Keytruda). Os efeitos anticâncer foram medidos como tamanhos de tumor após células de tumor de câncer de cólon (HT29) serem subcutaneamente injetadas em camundongos humanizados e tratamento com anticorpo. Quando os tamanhos de tumor alcançaram 300 a 450 mm3, um anticorpo de anti-4-1BB humano exemplar (EU101) foi administrado a 2,5 mpk para tratamento individual, um anticorpo anti- PD-1 exemplar (Keytruda) foi administrado a 2,5 mpk para tratamento individual, e EU101, 2,5 mpk + Keytruda, 2,5 mpk foram administrados para terapia de combinação. Administração foi por injeção intraperitoneal de camundongos, uma vez a cada três dias, durante um total de três vezes.

[0052] FIG. 14A mostra os números de células T CD4+ e células TCD8+ circuladas em sangue de camundongo ou 1 grama de tecido tumoral em 34 dias após o tratamento com um anticorpo de anti-4-1BB humano exemplar (EU101) e um anticorpo anti-PD-1 exemplar (Keytruda), individualmente e em combinação, em camundongos humanizados implantados com tumor, como descrito na FIG. 13. O número de linfócitos infiltrantes de célula T (TILs) em tumor foi medido calculando as relações proporcionais dos números de célula totais medindo as relações (%) de células T CD4+ e células T CD8+ usando um citômetro de fluxo. Citometria de fluxo foi realizada para medir as relações (%) das células T CD4+ e células T CD8+ após as células serem manchadas com anticorpo CD4 rotulado com FITC, um anticorpo CD8 rotulado com BV510 fluorescente e um anticorpo CD45 rotulado com APC-cy7 fluorescente, e um marcador de célula de sangue humano, células positivas de CD45 foram separadas de um programa de citometria de fluxo (gating). FIG. 14B mostra uma relação de Treg (células T CD4+Foxp3high) por relação de células T CD8+IFN-Y+ medida calculando uma relação proporcional entre a relação das células T CD8+IFN-Y+ e a relação de Treg (células T CD4+Foxp3high) usando um citômetro de fluxo após as células serem manchadas com anticorpo CD45 rotulado com APC-cy7 fluorescente, anticorpo CD8 rotulado com BV510 fluorescente, uma anticorpo CD4 rotulado com FITC fluorescente, anticorpo INFY rotulado com PE fluorescente, e anticorpo Foxp3 rotulado com APC fluorescente.

[0053] FIG. 15A e FIG. 15B mostram os resultados de análise deIFN-Y através de soro e fluido tumoral após tratamento individual e de combinação de um anticorpo de anti-4-1BB humano exemplar (EU101) e um anticorpo anti-PD-1 exemplar (Keytruda). Após dissecação realizada em todos os grupos tratados mostrados nas FIGS. 15A e 15B, 10 μl de soro e 100 μl de fluido tumoral foram analisados com kits ELISA de IFN-Y humana e TGF-β humano.

[0054] FIG. 16A mostra relações de célula T CD8+ específica deantígeno (relação de células T 4-1BB+CD8+: 43,2%, relação de células T CD8+: 58,6%) medidas antes da paniculação com um anticorpo de anti-4-1BB humano exemplar (EU101). FIG. 16B mostra relações de célula T CD8+ específica de antígeno (relação de células T pCMV+CD8+: 60,0%, relação de células T CD8+: 79,3%) medidas após paniculação com um anticorpo de anti-4-1BB humano exemplar (EU101).

CERTAS DEFINIÇÕES

[0055] Na descrição que segue, diversos termos usados em DNArecombinante e imunologia são extensamente utilizados. A fim de fornecer um entendimento mais claro e consistente da especificação e reivindicações, incluindo o escopo a ser dado tais termos, as seguintes definições são fornecidas.

[0056] Cerca de: O termo "cerca de", quando usado aqui emreferência a um valor, refere-se a um valor que é similar, no contexto, ao valor referenciado. Em geral, aqueles versados na técnica, familiares com o contexto, apreciarão com o grau relevante de variância abrangida por "cerca de" naquele contexto. Por exemplo, em algumas modalidades, o termo "cerca de" pode abranger uma faixa de valores que inclui 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, ou menos do valor referenciado.

[0057] Administração: Como usado aqui, o termo "administração"tipicamente se refere à administração de uma composição a um indivíduo ou sistema para obter a liberação de um agente que é, ou está incluso na composição. Aqueles versados na técnica estarão cientes de uma variedade de rotinas que pode, em circunstâncias apropriadas, ser utilizada para administração a um indivíduo, por exemplo, um humano. Por exemplo, em algumas modalidades, a administração pode ser ocular, oral, parenteral, tópica, etc. Em algumas modalidades particulares, administração pode ser brônquica (por exemplo, por instilação brônquica), bucal, dérmica (que pode ser ou compreender, por exemplo, uma ou mais de tópica à derme, intradérmica, interdérmica, transdérmica, etc), entérica, intra-arterial, intradérmica, intragástrica, intramedular, intramuscular, intranasal, intraperitoneal, intratecal, intravenosa, intraventricular, dentro de um órgão específico (por exemplo, intra-hepática), mucosal, nasal, oral, retal, subcutânea, sublingual, tópica, traqueal (por exemplo, por instalação intratraqueal), vaginal, vítrea, etc. Em algumas modalidades, a administração pode envolver apenas uma dose simples. Em algumas modalidades, a administração pode envolver a aplicação de um número fixo de doses. Em algumas modalidades, administração pode envolver dosagem que é dosagem intermitente (por exemplo, uma pluralidade de doses separadas em tempo) e/ou periódica (por exemplo, doses individuais separadas por um período comum de tempo). Em algumas modalidades, a administração pode envolver dosagem contínua (por exemplo, perfusão) durante pelo menos um período selecionado de tempo.

[0058] Afinidade: Como é conhecido na técnica, "afinidade" é umamedida da tensão com a qual um ligante em particular se liga ao seu parceiro. Afinidades podem ser medidas de maneiras diferentes. Em algumas modalidades, a afinidade é medida por um ensaio quantitativo. Em algumas tais modalidades, a concentração do parceiro de ligação pode ser fixada para estar em excesso de concentração de ligante a fim de imitar as condições fisiológicas. Alternativa ou adicionalmente, em algumas modalidades, a concentração de parceiro de ligação e/ou concentração de ligante pode ser variada. Em algumas tais modalidades, a afinidade pode ser comparada a uma referência sob condições comparáveis (por exemplo, concentrações).

[0059] Agonista: Aqueles versados na técnica apreciarão que otermo "agonista" pode ser usado para se referir a uma condição de agente, ou evento cuja presença, nível, grau, tipo ou forma se correlaciona com um nível aumentado de atividade de outro agente. (isto é, o agente agonizado). Em geral, um agonista pode ser ou incluir um agente de qualquer classe química incluindo, por exemplo, moléculas pequenas, polipeptídeos, ácidos nucléicos, carboidratos, lipídios, metais, e/ou qualquer outra entidade que mostra a atividade de ativação relevante. Em algumas modalidades, um agonista pode ser direto (em cujo caso ele exerce sua influência diretamente sobre seu alvo); em algumas modalidades, um agonista pode ser indireto (em cujo caso ele exerce sua influência por outro que não seja ligando a seu alvo; por exemplo, interagindo com um regulador do alvo, de modo que o nível ou atividade do alvo seja alterado).

[0060] Animal: como usado aqui refere-se a qualquer membro doreino animal. Em algumas modalidades, "animal" refere-se a humanos, de qualquer sexo e em qualquer estágio de desenvolvimento. Em algumas modalidades, "animal" refere-se a animais não humanos, em qualquer estágio de desenvolvimento. Em certas modalidades, o animal não humano é um mamífero (por exemplo, um roedor, um camundongo, um rato, um coelho, um macaco, um cachorro, um gato, uma ovelha, gado vacum, um primata, e/ou um porco). Em algumas modalidades, animais incluem, porém não estão limitados a, mamíferos, aves, répteis, anfíbios, peixes, insetos, e/ou vermes. Em algumas modalidades, um animal pode ser um animal transgênico, animal geneticamente modificado, e/ou um clone.

[0061] Antagonista: Aqueles versados na técnica apreciarão que otermo "antagonista", como usado aqui, pode ser usado para referir-se a uma condição de agente, ou evente cuja presença, nível, grau, tipo ou forma correlaciona-se com um grau ou atividade diminuída de outro agente (isto é, o agente inibido, ou alvo). Em geraI, um antagonista pode ser ou incluir um agente de qualquer classe química incluindo, por exemplo, moléculas pequenas, polipeptídeos, ácidos nucleicos, carboidratos, lipídios, metais, e/ou qualquer outra entidade que mostra a atividade inibitória relevante. Em algumas modalidades, um antagonista pode ser direto (em cujo caso ele exerce sua influência diretamente sobre seu alvo); em algumas modalidades, um antagonista pode ser indireto (em cujo caso ele exerce sua influência por outro que não seja ligando a seu alvo; por exemplo, interagindo com um regulador do alvo, de modo que o nível ou atividade do alvo seja alterado).

[0062] Anticorpo: Como usado aqui, o termo "anticorpo" refere-sea um polipeptídeo que inclui elementos de sequência de imunoglobulina canônica suficientes para conferir ligação específica a um antígeno alvo em particular. Como é conhecido na técnica, anticorpos intactos como produzidos na natureza são agentes tetraméricos de aproximadamente 150 kD constituídos por dois polipeptídeos de cadeia pesada idênticos (cerca de 50 kD cada) e dois polipeptídeos de cadeia leve idênticos (cerca de 25 kD cada) que se associam entre si no que é comumente referida como uma estrutura "em forma de Y". Cada cadeia pesada é compreendida de pelo menos quatro domínios (cada cerca de 110 aminoácidos longos) - um domínio (VH) variável de terminal amino (localizado nas pontas da estrutura Y), seguido por três domínios constantes: CH1, CH2, e o CH3 de terminal carbóxi (localizado na base do tronco de Y). Uma curta região, como conhecida como "permutador", conecta as regiões constantes e variáveis de cadeia pesada. A "dobradiça" conecta os domínios CH2 e CH3 ao resto do anticorpo. Duas ligações de dissulfuto nesta região dobradiça ligam os dois polipéptidos da cadeia pesada entre si em um anticorpo intacto. Cada cadeia leve é compreendida de dois domínios - um domínio (VL) variável de terminal amino, seguido por um domínio (CL) constante de terminal carbóxi, separado de um outro por outro "permutador". Tetrâmeros de anticorpo intacto são compreendidos de dois dímeros de cadeia pesada-cadeia leve em que as cadeias pesadas e leves são ligadas entre si por uma ligação de dissulfeto; duas outras ligações de dissulfeto conectam as regiões de dobradiça de cadeia pesada a uma outra, de modo que os dímeros sejam conectados entre si e o tetrâmero seja formado. Anticorpos naturalmente produzidos são também glicosilados, tipicamente no domínio CH2. Cada domínio em um anticorpo natural tem uma estrutura caracterizada por uma "dobra de imunoglobulina" formada a partir de duas folhas beta (por exemplo, folhas de 3-, 4-, ou 5 filamentos) embaladas uma contra a outra em um tambor beta antiparalelo comprimido. Cada domínio variável contém três alças hipervariáveis conhecidas como "regiões determinantes de complemento" (CDR1, CDR2 e CDR3) e quatro regiões "estruturais" um tanto invariáveis. (FR1, FR2, FR3 e FR4). Quando os anticorpos naturais se dobram, as regiões FR formam as folhas beta que fornecem a armação estrutural para os domínios, e as regiões das alças CDR tanto de cadeias pesadas quanto leves são conduzidas juntamente no espaço tridimensional para criar um único sítio hipervariável de ligação ao antígeno localizado na ponta da estrutura Y. A região Fc de anticorpos de ocorrência natural liga-se aos elementos do sistema complemento, e também aos receptores em células efetoras, incluindo, por exemplo, células efetoras que mediam a citotoxicidade. Como é conhecido na técnica, afinidade e/ou outros atributos de ligação de regiões Fc para receptores de Fc podem ser modulados através glicosilação ou outra modificação. Em algumas modalidades, anticorpos produzidos e/ou utilizados de acordo com a presente invenção incluem domínios Fc glicosilados, incluindo domínios Fc modificados ou engenheirados com tal glicosilação. Para os propósitos da presente invenção, em certas modalidades, qualquer polipeptídeo ou complexo de polipeptídeos que inclui sequências de domínio de imunoglobulina suficientes como encontrado em anticorpos naturais pode ser referido e/ou usado como "anticorpo", se tal polipeptídeo é naturalmente produzido (por exemplo, gerado por um organismo reagindo a um antígeno), ou produzido por engenharia recombinante, síntese química ou outro sistema artificial ou metodologia. Em algumas modalidades, um anticorpo é policlonal, em algumas modalidades, um anticorpo é monoclonal. Em algumas modalidades, um anticorpo é policlonal; em algumas modalidades, um anticorpo é monoclonal. Em algumas modalidades, um anticorpo tem sequências de região constante que são características de anticorpos de camundongo, coelho, primata ou humano. Em algumas modalidades, elementos de sequência de anticorpo são humanizados, primatizados, quiméricos, etc, como é conhecido na técnica. Além disso, o termo "anticorpo" como usado aqui, pode referir-se em modalidades apropriadas (a menos que de outro modo estabelecido ou claro a partir do contexto) a qualquer um dos formatos ou construções conhecidas na técnica ou desenvolvidas para utilizar as características estruturais e funcionais do anticorpo em apresentação alternativa. Por exemplo, em modalidades, um anticorpo utilizado de acordo com a presente invenção está em um formato selecionado de, porém não limitado a, anticorpos de IgA, IgG, IgE ou IgM intactos; anticorpos bi- ou multi- específicos (por exemplo, Zybodies®, etc); fragmentos de anticorpo tais como fragmentos de Fab, fragmentos de Fab’, fragmentos de F(ab’)2, fragmentos de Fd’, fragmentos de Fd, e CDRs isoladas ou grupos dos mesmos; Fvs de cadeia simples; fusões de polipeptídeo-Fc; anticorpos de domínio simples (por exemplo, anticorpos de domínio único de tubarão tais como IgNAR ou fragmentos dos mesmos); anticorpos de cameloide; anticorpos mascarados (por exemplo, Probodies®); Small Modular ImmunoPharmaceuticals ("SMIPsTM"); diacorpos de cadeia simples ou Tandem (TandAb®); humacorpos, VHHs; Anticalins®; Nanobodies® minicorpos; BiTE®s; proteínas de repetição de ancirina ou DARPINs®; Avimers®; DARTs; anticorpos semelhantes a TCR; Adnectins®; Affilins®; Trans-bodies®; Affibodies®; TrimerX®; MicroProteínas; Fynomers®, Centyrins®; e KALBITOR®s. Em algumas modalidades, um anticorpo pode faltar uma modificação covalente (por exemplo, fixação de um glicano) que teria se fosse produzida naturalmente. Em algumas modalidades, um anticorpo pode conter uma modificação covalente (por exemplo, ligação de um glicano, uma carga útil [por exemplo, uma porção detectável, uma porção terapêutica, uma porção fotocatalítica, etc.], ou outro grupo pendente [por exemplo, polietilenoglicol, etc.]

[0063] Fragmento de anticorpo: Como usado aqui, um "fragmentode anticorpo" refere-se a uma porção de um anticorpo ou agente de anticorpo como descrito aqui, e tipicamente refere-se a uma porção que inclui uma porção de ligação ao antígeno ou região variável da mesma. Um fragmento de anticorpo pode ser produzido por qualquer meio. Por exemplo, em algumas modalidades, um fragmento de anticorpo pode ser enzimática ou quimicamente produzida por fragmentação de um anticorpo intacto ou agente de anticorpo. Alternativamente, em algumas modalidades, um fragmento de anticorpo pode ser recombinantemente produzido (isto é, por expressão de uma sequência de ácido nucleico engenheirada). Em algumas modalidades, um fragmento de anticorpo pode ser total ou parcialmente produzido de forma sintética. Em algumas modalidades, um fragmento de anticorpo (particularmente, um fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno) pode ter um comprimento de pelo menos cerca de 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 aminoácidos ou mais, em algumas modalidades pelo menos cerca de 200 aminoácidos.

[0064] Ligação: será entendido que o termo "ligação", como usado aqui, tipicamente refere-se a uma associação não covalente entre ou dentr duas ou mais entidades. Ligação "direta" envolve o contato físico entre entidades ou porções; a ligação indireta envolve a interação física por meio de contato físico com uma ou mais entidades intermediárias. A ligação entre as duas ou mais entidades pode tipicamente ser avaliada em qualquer uma variedade de contextos - incluindo onde as interações de entidades ou porções são estudadas em isolamento ou no contexto de sistemas mais complexos (por exemplo, enquanto covalentemente ou de outro modo associada com uma entidade portadora e/ou em um sistema biológico ou célula).

[0065] Câncer: Os termos "câncer", "malignidade", "neoplasma","tumor", e "carcinoma", são usados aqui para referir-se às células que exibem o crescimento relativamente anormal, descontrolado, e/ou autônomo, de modo que elas exibam um fenótipo de crescimento aberrante caracterizado por uma perda significante de controle de proliferação celular. Em algumas modalidades, um tumor pode ser ou compreender células que são pré-cancerosas (por exemplo, benignas), malignas, pré-metastática, metastática, e/ou não metastática. A presente invenção especificamente identifica certos cânceres aos quais seus ensinamentos podem ser particularmente relevantes. Em algumas modalidades, um câncer relevante pode ser caracterizado por um tumor sólido. Em algumas modalidades, um câncer relevant epode ser caracterizado por um tumor hematológico. Em geral, exemplos de diferentes tipos de cânceres conhecidos na técnica incluem, por exemplo, cânceres hematopoieticos incluindo leucemias, linfomas (Hodgkin e não Hodgkin), mielomas e distúrbios mieloproliferativos; sarcomas, melanomas, adenomas, carcinomas de tecido sólido, carcinomas de célula escamosa da boca, garganta, laringe e pulmão, câncer de fígado, cânceres genitourinários tais como câncer de próstata, cervical, bexiga, uterino, endométrio e carcinomas da célula renal, câncer ósseo, câncer pancreático, câncer de pele, melanoma cutâneo ou intraocular, câncer do sistema endócrino, câncer da glândula da tireoide, câncer da glândula paratiroide, cânceres de cabeça e pescoço, câncer de mama, cânceres gastrointestinais e cânceres do sistema nervoso, lesões benignas tais como papilomas, e similares.

[0066] CDR: como usado aqui, refere-se a uma região determinantede complementaridade dentro de uma região variável de anticorpo. Existem três CDRs em cada uma das regiões variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve, que são designadas CDR1, CDR2 e CDR3, para cada uma das regiões variáveis. Um "grupo de CDRs" ou "grupo de CDR" refere-se a um grupo de três ou seis CDRs que ocorrem em uma região variável simples capaz de ligar o antígeno ou nas CDRs de regiões variáveis de cadeia pesada e leve cognatas. Certos sistemas foram estabelecidos na técnica para definição de limites de CDR (por exemplo, Kabat, Chothia, etc.); aqueles versados na técnica apreciam as diferenças entre e dentre estes sistemas e são capazes de entender os limites de CDR até o nível requerido para entender e praticar a invenção reivindicada.

[0067] Agente quimioterapêutico: O termo "agentequimioterapêutico", como usado aqui tem seu significado entendido na técnica referindo-se a um ou mais agentes pró-apoptótico, citostáticos e/ou citotóxicos, por exemplo, especificamente incluindo agentes utilizados e/ou recomendados para uso no tratamento de uma ou mais doenças, distúrbios ou ou condições associadas com proliferação de célula indesejável. Em umas modalidades, agentes quimioterapêuticos são úteis no tratamento de câncer. Em algumas modalidades, um agente quimioterapêutico pode ser ou compreender um ou mais agentes de alquilação, uma ou mais antraciclinas, um ou mais disruptores citoesqueletais (por exemplo, agentes de alvejamento de microtúbulo tais como taxanos, maitansina e análogos dos mesmos, de), um ou mais epotilonas, um ou mais inibidores de histona desacetilase, HDACs), um ou mais inibidores de topoisomerase (por exemplo, inibidores de topoisomerase I e/ou topoisomerase II), um ou mais inibidores de cinase, um ou mais análogos de nucleotídeo ou análogos de precursor de nucleotídeo, um ou mais antibióticos de peptídeo, um ou mais agentes com base em platina, um ou mais retinoides, um ou mais alcaloides de vinca, e/ou um ou mais análogos de um ou mais dos seguintes (isto é, que compartilham um atividade antiproliferativa relevante). Em algumas modalidades particulares, um agente quimioterapêutico pode ser ou compreender uma ou mais de Actinomicina, áciso totalmente-trans retinoico, uma Auiristatina, Azacitidina, Azatioprina, Bleomicina, Bortezomib, Carboplatina,Capecitabina, Cisplatina, Clorambucil, Ciclofosfamida, Curcumin,Citarabina, Daunorubicin, Docetaxel, Doxifluridine, Doxorrubicina,Epirubicina, Epotilone, Etoposido, Fluorouracil, Gencitabina, Hidroxiureia, Idarrubicina, Imatinibe, Irinotecano, Maitansina e/ouanálogos dos mesmos (por exemplo, DM1) Mecloretamina,Mercaptopurina, Metotrexato, Mitoxantrona, um Maitansinoide, Oxaliplatina, Paclitaxel, Pemetrexed, Teniposida, Tioguanina, Topotecan, Valrubicina, Vinblastina, Vincristina, Vindesina, Vinorelbina, e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, um agente quimioterapêutico pode ser utilizado no contexto de um conjugado de anticorpo-fármaco. Em algumas modalidades, um agente quimioterapêutico é aquele encontrado em um conjugado de anticorpo- fármaco selecionado do grupo que consiste em: hLL1-doxorrubicina, hRS7-SN-38, hMN-14-SN-38, hLL2-SN-38, hA20-SN-38, hPAM4-SN- 38, hLL1-SN-38, hRS7-Pro-2-P-Dox, hMN-14-Pro-2-P-Dox, hLL2-Pro- 2-P-Dox, hA20-Pro-2-P-Dox, hPAM4-Pro-2-P-Dox, hLL1-Pro-2-P-Dox, P4/D10-doxorrubicina, gentuzumab ozogamicina, brentuximab vedotina, trastuzumab entansina, inotuzumab ozogamicina, glembatumomab vedotina, SAR3419, SAR566658, BIIB015, BT062, SGN-75, SGN-CD19A, AMG-172, AMG-595, BAY-94-9343, ASG-5ME, ASG-22ME, ASG-16M8F, MDX-1203, MLN-0264, anti-PSMA ADC, RG- 7450, RG-7458, RG-7593, RG-7596, RG-7598, RG-7599, RG-7600, RG-7636, ABT-414, IMGN-853, IMGN-529, vorsetuzumab mafodotina, e lorvotuzumab mertansina.

[0068] Terapia de combinação: Como usado aqui, o termo "terapiade combinação" refere-se àquelas situações em que um indivíduo é simultaneamente exposto a um ou mais regimes terapêuticos (por exemplo, dois ou mais agentes terapêuticos). Em algumas modalidades, os dois ou mais regimes terapêuticos podem ser administrados simultaneamente. Em algumas modalidades, os dois ou mais regimes terapêuticos podem ser administrados sequencialmente (por exemplo, um primeiro regime administrado antes da administração de qualquer uma das doses de um segundo regime). Em algumas modalidades, os dois ou mais regimes terapêuticos são administrados em regimes de dosagem sobrepostos. Em algumas modalidades, administração de terapia de combinação pode envolver administração de um ou mais agentes terapêuticos ou modaidades a um indivíduo recebendo o(s) outro(s) agente(s) ou modalidade.

[0069] Correspondendo a: Como usado aqui, o termo"correspondendo a" pode ser usado para designar a posição/identidade de um elemento estrutural em um composto ou composição através da comparação com um composto ou composição de referência apropriada. Por exemplo, em algumas modalidades, um resíduo monomérico em um polímero (por exemplo, um resíduo de aminoácido em um polipeptídeo ou um resíduo de ácido nucleico em um polinucleotídeo) pode ser identificado como "correspondendo a" um resíduo em um polímero de referência apropriada. Por exemplo, aqueles versados na técnica apreciarão que, para propósitos de simplicidade, resíduos em um polipeptídeo são frequentemente designados usando um sistema de numeração canônico com base em um polipeptídeo relacionado de referência, de modo que um aminoácido "correspondendo a" um resíduo na posição 190, por exemplo, não precisa realmente ser o 190° aminoácido em uma determinada cadeia de aminoácidos, porém sim corresponder ao resíduo encontrado em 190 no polipeptídeo de referência; aqueles versados na técnica facilmente apreciam como identificar os aminoácidos "correspondentes". Por exemplo, aqueles versados na técnica estarão cientes de várias estratégias de alinhamento de sequência, incluindo programas de software tais como, por exemplo, BLAST, CS-BLAST, CUSASW++, DIAMOND, FASTA, GGSEARCH/GLSEARCH, Genoogle, HMMER, HHpred/HHsearch, IDF, Infernal, KLAST, USEARCH, parasail, PSI-BLAST, PSI-Search, ScalaBLAST, Sequilab, SAM, SSEARCH, SWAPHI, SWAPHI-LS, SWIMM, ou SWIPE que podem ser utilizados, por exemplo, para identificar os resíduos "correspondentes" em polipeptídeos e/ou ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção.

[0070] Engenheirado: Em geral, o termo "engenheirado" refere-seao aspecto de ter sido manipulado pela mão do homem. Por exemplo, um polipeptídeo é considerado ser "engenheirado" quando a sequência de popipeptídeo manipulada pela mão do homem. Por exemplo, em algumas modalidades da presente invenção, um polipeptídeo engenheirado compreende uma sequência que inclui uma ou mais mutações, deleções e/ou inserções de aminoácido que foram introduzidas pela mão do home mem uma sequência de polipeptídeo de referência. Comparavelmente, uma célula ou organismo é considerada ser "engenheirada" se ela foi manipulada de modo que sua informação genética fosse alterada (por exemplo, novo material genético anteriormente não presente foi introduzido, por exemplo, por transformação, acasalamento, hibridização somática, transfecção, transdução, ou outro mecanismo, ou o material genético anteriormente presente é alterado ou removido, por exemplo, por substituição ou mutação de deleção, ou por protocolos de acasalamento). Como é prática comum e é entendido por aqueles na técnica, derivados e/ou progênie de um polipeptídeo engenheirado ou célula são ainda denominados "engenheirados" mesmo que a manipulação real tenha sido realizada em uma entidade anterior.

[0071] Epitopo: como usado aqui, inclui qualquer porção que éespecificamente reconhecida por um componente de ligação de imunoglobulina (por exemplo, anticorpo ou receptor). Em algumas modalidades, um epitopo é compreendido de uma pluralidade de átomos ou grupos químicos em um antígeno. Em algumas modalidades, tais grupos ou átomos químicos são expostos à superfície quando o antígeno adota uma conformação tridimensional relevante. Em algumas modalidades, tais grupos ou átomos químicos estão fisicamente próximos uns aos outros em espaço quando o antígeno adota tal conformação. Em algumas modalidades, pelo menos alguns tais átomos são grupos que são fisicamente separados uns dos outros quando o antígeno adota uma conformação alternativa (por exemplo, é linearizada).

[0072] Ex vivo: como usado aqui refere-se aos eventos biológicosque ocorrem for a do contexto de um organismo multicelular. Por exemplo, no contexto de sistemas com base em célula, o termo pode ser usado para referir-se aos eventos que ocorrem entre uma população de células (por exemplo, proliferação celular, secreção de citocina, etc.) em um ambiente artificial.

[0073] Estrutura ou região estrutural: como usado aqui, refere-seàs sequências da região variável menos as CDRs. Porque uma sequência de CDR pode ser determinada por diferentes sistemas, igualmente uma sequência estrutural é submetida à diferentes interpretações correspondentes. As seis CDRs dividem as regiões estruturais nas cadeias pesadas e leves em quatro sib-regiões (FRl, FR2, FR3 e FR4) em cada cadeia, em que CDRl é posicionada entre FRl e FR2, CDR2 entre FR2 e FR3, e CDR3 entre FR3 e FR4. Sem especificar as sub-regiões particulares como FR1, FR2, FR3 ou FR4, uma região estrutural, como referido por outros, representa as FRs combinadas com a região variável de uma cadeia de imunoglobulina simples de ocorrência natural. Como usado aqui, uma FR representa uma das quatro sub-regiões FR1, por exemplo, representa a primeira região estrutural próxima à extremidade de terminal amino da região variável e 5' com respeito à CDR1, e FRs representam duas ou mais sub-regiões constituindo uma região estrutural.

[0074] Humanizado: como é conhecido na técnica, o termo"humanizado" é comumente usado para referir-se aos anticorpos (ou componentes de anticorpo) cuja sequência de aminoácido inclui sequências de região VH e VL de um anticorpo de referência engenheirado em uma espécie humana (por exemplo, um camundongo), porém também inclui modificações naquelas sequências relativas ao anticorpo de referência destinadas a torná-las mais "semelhantes a humanos", isto é, mias similares às sequências variáveis germinativas humanas. Em algumas modalidades, um anticorpo "humanizado" (ou componente de anticorpo) é aquele que imunoespecificamente se liga a um antígeno de interesse e que tem uma região estrutural (FR) tendo substancialmente a sequência de aminoácido como aquela de um anticorpo humano, e uma região determinante complementar (CDR) tendo substancialmente a seqüência de aminoácidos como aquela de um anticorpo não humano. Um anticorpo humanizado compreende substacialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis (Fab, Fab', F(ab')2, FabC, Fv) em que todas ou substancialmente todas as regiões de CDR correspondem àquelas de uma imunoglobulina não humana (isto é, imunoglobulina doadora) e todas ou substancialmente todas as regiões estruturais são aquelas de uma sequência de consenso de imunoglobulina humana. Em algumas modalidades, um anticorpo humanizado também compreende pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de uma região constante de imunoglobulina humana. Em algumas modalidades, a humanized anticorpo contém tanto a cadeia leve bem como pelo menos o domínio variável de uma cadeia pesada. O anticorpo também pode incluir uma região CH1, dobradiça, CH2, CH3, e, opcionalmente, uma CH4 de uma região constante de cadeia pesada.

[0075] In vitro: O termo "in vitro" como usado aqui refere-se aoseventos que ocorrem em um ambiente artificial, por exemplo, em um tubo de teste ou vaso de reação, em uma cultura celular, etc., em vez de dentro de um organismo multicelular.

[0076] In vivo: como usado aqui refere-se aos eventos que ocorremdentro de um organismo multicelular, tal como um humano e um animal não humano. No contexto de sistemas com base em célula, o termo pode ser usado para referir-se aos eventos que ocorrem dentro de uma célula viva (como oposto aos, por exemplo, sistemas in vitro).

[0077] Isolado: como usado aqui, refere-se a uma substância e/ouentidade que foi (1) separada de pelo menos alguns componentes com os quais ela foi associada quando inicialmente produzida (seja na natureza e/ou em um cenárui experimental), e/ou (2) designada, produzida, preparada, e/ou fabricada pela mão de um homem. Substâncias e/ou entidades isoladas podem ser separadas de cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, ou mais do que cerca de 99% dos outros componentes com os quais elas foram inicialmente associadas. Em algumas modalidades, agentes isolados são cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, ou mais do que cerca de 99% puros. Como usado aqui, uma substância é "pura" se estiver substancialmente livre de outros componentes. Em algumas modalidades, como será entendido por aqueles versados na técnica, uma substância pode ainda ser considerada "isolada" ou mesmo "pura", após ter sido combinada com outros componentes, tais como, por exemplo, um ou mais veículos ou excipientes (por exemplo, tampão, solvente, água, etc.); em tais modalidades, a porcentagem de isolamento ou pureza da substância é calculada sem incluir tais veículos ou excipientes. Para fornecer, porém um exemplo, em algumas modalidades, um polímero biológico tal como um polipeptídeo ou polinucleotídeo que ocorre na natureza é considerado ser "isolado" quando, a) em virtude de sua origem ou fonte de derivação não está associada com alguns ou todos os componentes que o acompanham em seu estado nativo na natureza; b) ele é substancialmente livre de outros polipeptídeos ou ácidos nucléicos das mesmas espécies da espécie que o produz na natureza; c) é expresso por ou de outro modo em associação com componentes de uma célula ou outro sistema de expressão que não é da espécie que o produz na natureza. Desse modo, por exemplo, em algumas modalidades, um polipeptídeo que é quimicamente sintetizado ou sintetizado em um sistema celular diferente daquele que o produz na natureza é considerado um polipeptídeo "isolado". Alternativa ou adicionalmente, em algumas modalidades, um polipeptídeo que foi submetido a um ou mais técnicas de purificação pode ser considerado um polipeptídeo "isolado" na medida em que foi separado de outros componentes a) com o qual está associado na natureza; e/ou b) com o qual ele foi associado quando inicialmente produzido.

[0078] KD: como usado aqui, refere-se à constante de dissociaçãode um agente de ligação (por exemplo, um anticorpo de ligação ou componente de ligação do mesmo) de um complexo com seu parceiro (por exemplo, o epitopo ao qual o anticorpo ou componente de ligação do mesmo se liga).

[0079] Operavelmente ligado: como usado aqui, refere-se a umajustaposição, em que os componentes descritos estão em uma relação que os permite funcionar em sua maneira pretendida. Um elemento de controle "operavelmente ligado" a um elemento funcional está associado de tal modo que a expressão e/ou atividade do elemento funcional seja obtida sob condições compatíveis com o elemento de controle. Em algumas modalidades, elementos de controle "operavelmente ligados" são contíguos (por exemplo, covalentemente ligados) com os elementos de codificação de interesse; em algumas modalidades, elementos de controle age em trans a ou de outro modo a partir do elemento funcional de interesse.

[0080] Composição farmacêutica: Como usado aqui, o termo"composição farmacêutica" refere-se a uma composição em que um agente ativo é formulado juntamente com um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis. Em algumas modalidades, a composição é adequada para administração a um indivíduo human ou animal. Em algumas modalidades, o agente ativo está presente em uma quantidade de dose unitária apropriada para administração em um regime terapêutico que mostra a probabilidade estatisticamente significativa de atingir um efeito terapêutico predeterminado quando administrada a uma população relevante.

[0081] Polipeptídeo: O termo "polipeptídeo", como usado aqui, geralmente tem seu significado reconhecido na técnica de um polímero de pelo menos três aminoácidos. Aqueles versados na técnica apreciarão que o termo "polipeptídeo" é pretendido ser suficientemente geral para abranger não apenas polipeptídeos tendo uma sequência completa aqui citada, porém também abranger polipeptídeos que representam fragmentos funcionais (isto é, fragmentos mantendo pelo menos uma atividade) de tais polipeptideos completos. Além disso, aqueles versados na técnica entendem que as sequências de proteína geralmente toleram alguma substituição sem destruir a atividade. Desse modo, qualquer polipeptídeo que mantém a atividade e compartilha pelo menos cerca de 30-40% de identidade de sequência global, frequentemente maior do que cerca de 50%, 60%, 70%, ou 80%, e também geralmente incluindo pelo menos uma região de identidade muito maior, frequentemente maior que 90% ou ainda 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% em uma ou mais regiões altamente conservadas, geralmente abrangendo pelo menos 3-4 e frequentemente até 20 ou mais aminoácidos, com outro polipeptídeo da mesma classe, é abrangido dentro do tempo relevante "polipeptídeo" como usado aqui. Polipeptídeos podem conter L-aminoácidos, D-aminoácidos, ou ambos e podem conter qualquer um de uma variedade de modificações de aminoácido ou análogos conhecidos na técnica. Modificações úteis incluem, por exemplo, acetilação terminal, amidação, metilação, etc. Em algumas modalidades, proteínas podem compreender aminoácidos naturais, aminoácidos não naturais, aminoácidos sintéticos, e combinações dos mesmos. O termo "peptídeo" é geralmente usado para referir-se a um polipeptídeo tendo um comprimento menor do que cerca de 100 aminoácidos, menor do que cerca de 50 aminoácidos, menor do que 20 aminoácidos, ou menor do que 10 aminoácidos. Em algumas modalidades, proteínas são anticorpos, fragmentos de anticorpo, porções biologicamente ativas dos mesmos, e/ou porções características dos mesmos.

[0082] Prevenir ou prevenção: como usado aqui quando usado emconexão com a ocorrência de uma doença, distúrbio, e/ou condição, refere-se a reduzir o risco de desenvolver a doença, distúrbio e/ou condição e/ou a atrasar o início e/ou gravidade de um ou mais características ou sintomas da doença, distúrbio ou condição. Em algumas modalidades, a prevenção é avaliada em uma base populacional de modo que um agente seja considerado "prevenir" uma determinada doença, distúrbio ou condição se uma diminuição estatisticamente significativa no desenvolvimento, frequência, e/ou intensidade de um ou mais sintomas da doença, distúrbio condição é observada em uma população suscetível à doença, distúrbio ou condição.

[0083] Recombinante: como usado aqui, é pretendido referir-seaos polipeptídeos que são designados, engenheirados, preparados, expressos, engenheirados, fabricados, e/ou ou isolados por métodos recombinantes, tais como polipeptídeos expressos usando um vector de expressão recombinante transfectado em uma célula hospedeira; polipeptídeos isolados de uma biblioteca recombinante combinatória de polipeptídeos humanos; polipeptídeos isolados de um animal (por exemplo, um camundongo, coelho, ovelha, peixe, etc) que é transgênico para ou de outro modo foi manipulado para expressar um gene ou genes, ou componentes gênicos que codificam e/ou direcionam a expressão do polipeptídeo ou um ou mais componentes, porções, elementos, ou domínio dos mesmos; e/ou polipeptídeos preparados, expressos, engenheirados ou isolados por qualquer outro meio que envolve unir ou ligar elementos de sequência de ácido nucleico selecionados uns aos outros, sintetizar quimicamente os elementos de sequências selecionados, e/ou de outro modo gerar um ácido nucleico que codifica e/ou direciona a expressão do polipeptídeo ou um ou mais componentes, porções, elementos, ou domínios do mesmo. Em algumas modalidades, um ou mais de tais elementos de sequência selecionada são encontrados na natureza. Em algumas modalidades, um ou mais de tais elementos de sequência selecionados são designados in silico. Em algumas modalidades, um ou mais tais elementos de sequência selecionados resultam de mutagênese (por exemplo, in vivo ou in vitro) de um elemento de sequência conhecido, por exemplo, de uma fonte natural ou sintética tal como, por exemplo, na linha germinativa de um organismo fonte de interesse (por exemplo, de um humano, um camundongo, etc).

[0084] Ligação Específica: Como usado aqui, o termo "ligaçãoespecífica" refere-se a qualquer capacidade de discriminar-se entre possíveis parceiros de ligação no ambiente em que a ligação deve ocorrer. Um agente de ligação que interage com um alvo em particular quando outros alvos potenciais estão presentes é referido "ligar-se especificamente ao alvo com o qual ele interage. Em algumas modalidades, ligação específica é avaliada detectando ou determinando o grau de associação entre o agente de ligação e seu parceiro; em algumas modalidades, ligação específica é avaliada detectando ou determinando o grau de dissociação de um complexo de parceiro- agente de ligação; em algumas modalidades, ligação específica é avaliada detectando ou determinando a capacidade do agente de ligação de competir por uma interação alternativa entre seu parceiro e outra entidade. Em algumas modalidades, a ligação específica é avaliada realizando tais detecções ou determinações através de uma faixa de concentrações.

[0085] Indivíduo: Como usado aqui, o termo "indivíduo" refere-se aum organismo, tipicamente um mamífero (por exemplo, um humano, em algumas modalidades incluindo formas humanas pré-natais). Em algumas modalidades, um indivíduo é sofrendo de uma doença, distúrbio ou condição relevante. Em algumas modalidades, um indivíduo é suscetível a uma doença, distúrbio ou condição. Em algumas modalidades, um indivíduo exibe um ou mais sintomas ou características de uma doença, distúrbio ou condição. Em algumas modalidades, um indivíduo não exibe qualquer sintoma ou característica de uma doença, distúrbio ou condição. Em algumas modalidades, um indivíduo é alguém com um ou mais aspectos característicos de suscetibilidade ao risco de uma doença, distúrbio ou condição. Em algumas modalidades, um indivíduo é um paciente. Em algumas modalidades, um indivíduo é um indivíduo para quem o diagnóstico e/ou terapia é e/ou foi administrado.

[0086] Agente terapêutico: Como usado aqui, a frase "agenteterapêutico" em geral refere-se a qualquer que agente que evoca um efeito farmacológico desejado quando administrado a um organismo. Em algumas modalidades, um agente é considerado ser um agente terapêutico se ele demonstrar um efeito estatisticamente significante através de uma população apropriada. Em algumas modalidades, a população apropriada pode ser uma população de organismos modelos. Em algumas modalidades, uma população apropriada pode ser definida por vários critérios, tais como um grupo de certa idade, gênero, antecedente genético, condições clínicas pré-existentes, etc. Em algumas modalidades, um agente terapêutico é uma substância que pode ser usada para aliviar, melhorar, mitigar, inibir, prevenor retardar o início de, reduzir a gravidade de, e/ou reduzir a incidência de um ou mais sintomas ou aspectos de uma doença, distúrbio, e/ou condição. Em algumas modalidades, um "agente terapêutico" é um agente que foi ou é requerido ser aprovado por uma agência governamental antes de ele poder ser comercializado para administração aos humanos. Em algumas modalidades, um "agente terapêutico" é um agente para o qual uma prescrição médica é requerida para administração a humanos.

[0087] Quantidade Terapeuticamente Eficaz: Como usado aqui, otermo "quantidade terapeuticamente eficaz" significa uma quantidade que é suficiente, quando administrada a uma população sofrendo de ou suscetível a uma doença, distúrbio, e/ou condição de acordo com um regime de dosagem terapêutica, para tratar a doença, distúrbio, e/ou condição. Em algumas modalidades, uma quantidade terapeuticamente eficaz é aquela que reduz a incidência e/ou gravidade de, estabiliza uma ou mais características de, e/ou retarda o início de um ou mais sintomas da, distúrbio, e/ou condição. Aqueles versados na técnica apreciarão que o termo "quantidade terapeuticamente eficaz" na verdade, não é necessário um tratamento bem-sucedido em um determinado indivíduo. De preferência, uma quantidade terapeuticamente eficaz pode ser aquela quantidade que fornece uma resposta farmacológica desejada em particular em um número significante de indivíduos quando administrada a pacientes em necessidade de tal tratamento. Por exemplo, em algumas modalidades, o termo "quantidade terapeuticamente efica", refere-se a uma quantidade que, quando administrada a um indivíduo em necessidade da mesma no contexto da terapia inventiva, bloqueará, estabilizará, atenuará, ou reverterá um processo de apoio ao câncer que ocorre no referido indivíduo, ou realçará ou aumentará um processo supressor de câncer no referi indivíduo. No contexto de tratamento de câncer, uma "quantidade terapeuticamente eficaz" é uma quantidade que, quando administrada a um indivíduo diagnosticado com um câncer, previnirá, estabilizará, inibirá, ou reduzirá o outro desenvolvimento de câncer no indivíduo. Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" particularmente preferida de uma composição descrita aqui reverte (em um tratamento terapêutico) o tratamento de malignidade tal como um carcinoma pancreático ou ajudar a obter ou prolongar a remissão de uma maliganidade. Uma quantidade terapeuticamente eficaz administrada a um indivíduo para tratar um câncer naquele indivíduo pode ser igual ou diferente de uma quantidade terapeuticamente eficaz administrada para promover a remissão ou inibir a metástase. Como com a maioria das terapias de câncer, os métodos terapêuticos descritos aqui não devem ser interpretados como, restritos a, ou de outro modo limitados a uma "cura" para câncer; de preferência, os métodos de tratamento estão direcionados ao uso das composições descritas para "tratar" um câncer, isto é, para efetuar uma mudança benéfica ou desejável na saúde de um indivíduo que tem câncer. Tais benefícios são reconhecido por profissionais de saúde qualificados no campo da oncologia e incluem, porém não estão limitados a, uma estabilização da condição do paciente, um decréscimo no tamanho do tumor (regressão de tumor), uma melhora nas funções vitais (por exemplo, função melhorada dos tecidos ou órgãos cancerosos, diminuição ou inibição de novas metástases, diminuição das infecções oportunistas, aumento da capacidade de sobrevivência, diminuição da dor, melhora da função motora, melhora da função cognitiva, melhora da sensação de energia (vitalidade, diminuição do mal-estar) sensação melhorada de bem-estar, restauração do apetite normal, restauração do ganho de peso saudável e combinações dos mesmos. Além disso, A regressão de um tumor particular em um indivíduo (por exemplo, como resultado de tratamentos descritos aqui) pode também ser avaliada tirando amostras de células de câncer do sítio de um tumor, como um adenocarcinoma pancreático (por exemplo, durante o tratamento) e testando as células do câncer quanto ao nível de marcadores metabólicos e de sinalização para monitorar o estado das células do câncer para verificar, em nível molecular, a regressão das células do câncer a um fenótipo menos maligno. Por exemplo, a regressão tumoral induzida pelo emprego dos métodos desta invenção seria indicada encontrando-se uma diminuição em qualquer um dos marcadores pró-angiogênicos descritos acima, um aumento nos marcadores antiangiogênicos descritos aqui, a normalização (isto é, alteração em direção a um estado encontrado em indivíduos normais que não sofrem de câncer) de vias metabólicas, vias de sinalização intercelular, ou vias de sinalização intracelular que exibem atividade anormal em indivíduos com câncer diagnosticado. Aqueles versados na técnica apreciarão que, em algumas modalidades, uma quantidade terapeuticamente eficaz pode ser formulada e/ou administrada em uma única dose. Em algumas modalidades, uma quantidade terapeuticamente eficaz pode ser formulada e/ou administrada em uma pluralidade de doses, por exemplo, como parte de um regime de dosagem.

[0088] Variante: Como usado aqui no contexto de moléculas, porexemplo, ácidos nucleicos, proteínas, ou moléculas pequenas, o termo "variante" refere-se a uma molécula que mostra identidade estrutural significativa com uma molécula de referência, porém difere estruturalmente da molécula de referência, por exemplo, na presença ou ausência no nível de um ou mais porções químicas em relação à entidade de referência. Em algumas modalidades, uma variante também difere funcionalmente de sua molécula de referência. Em geral, se uma determinada molécula é apropriadamente considerada uma "variante" de uma molécula de referência é baseada em seu grau de identidade estrutural com a molécula de referência. Como será apreciado por aqueles versados na técnica, qualquer molécula de referência biológica ou química tem certos elementos estruturais característicos. Uma variante, por definição, é uma molécula distinta que compartilha um ou mais de tais elementos estruturais característicos, porém difere em pelo menos um aspecto da molécula de referência. Para fornecer apenas alguns exemplos, um polipeptídeo pode ter um elemento de sequência característico compreendido por uma pluralidade de aminoácidos tendo posições designadas entre si em espaço linear ou tridimensional e/ou contribuindo para um motif estrutural particular e/ou função biológica; um ácido nucleico pode ter um elemento de sequência característico compreendidos de uma pluralidade de resíduos de nucleotídeo tendo posições designadas em relação a outro em espaço linear ou tridimensional. Em algumas modalidades, um polipeptídeo ou ácido nucleico variante difere de um polipeptídeo ou ácido nucleico de referência como um resultado de um ou mais diferenças em sequência de nucleico ou aminoácido. Em algumas modalidades, um polipeptídeo ou ácido nucleico variante mostra uma identidade de sequência total com um polipeptídeo ou ácido nucleico de referência que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, ou 99%. Em algumas modalidades, um polipeptídeo ou ácido nucleico variante não compartilha pelo menos um elemento de sequência característico com um polipeptídeo ou ácido nucleico de referência. Em algumas modalidades, um polipeptídeo ou ácido nucleico de referência tem uma ou mais atividades biológicas. Em algumas modalidades, um polipeptídeo ou ácido nucleico variante compartilha uma ou mais das atividades biológicas do polipeptídeo ou ácid nucleico de referência.

[0089] Vetor: como usado aqui, refere-se a uma molécula de ácidonucleico capaz de transportar outro ácido nucleico ao qual ele foi ligado. Um tipo de vetor é um "plasmídeo", que se refere a uma alça de DNA de filamento duplo circular na qual segmentos de DNA adicionais podem ser ligados. Outro tipo de vetor é um vetor viral, em que segmentos adicionais de DNA podem ser ligados ao genoma viral. Certos vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira na qual eles são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos tendo uma origem bacteriana de replicação e vetores epissômicos de mamíferos).). Outros vetores (por exemplo, vetores de mamíferos não epissômicos) podem ser integrados no genoma de uma célula hospedeira quando da introdução na célula hospedeira, e assim são replicados juntamente com o genoma do hospedeiro. Além disso, certos vetores são capazes de direcionar a expressão de genes aos quais estão operativamente ligados. Tais vetores são aqui referidos como "vetores de expressão". Técnicas padrão podem ser usadas para DNA recombinante, síntese de oligonucleotídeos, e transformação de cultura de tecidos (por exemplo, eletroporação, lipofecção). Reações enzimáticas e técnicas de purificação podem ser realizadas de acordo com as especificações do fabricante ou como comumente realizado na técnica ou como descrito aqui. As técnicas e procedimentos anteriores podem ser geralmente realizados de acordo com métodos convencionais bem conhecidos na técnica, como descrito em várias referências gerais e mais específicas que são citadas e descritas ao longo da presente especificação. Veja, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)), que é incorporado aqui por referência para qualquer propósito. DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES EXEMPLARES

[0090] A presente invenção refere-se, inter alia, à 4-1BB, que é umamolécula coestimulatória induzível, e anticorpos terapêuticos que se ligam a ela que foi modificada para ter características melhoradas sobre um anticorpo anti-4-1BB de referência. Por exemplo, os anticorpos modificados fornecidos aqui foram modificados para realçar a afinidade de antígeno em relação àquela de um anticorpo de agonista de referência que especificamente reconhece um epitopo dentro do domínio extracelular de 4-1BB humana (Patente Coreana n° 100500286, Acesso n°: KCTC 0952BP). Especificamente, como descrito aqui, os inventores planejaram um anticorpo de 41BB anti-humano humanizado de referência, 94G1 (Patente dos Estados Unidos n° 7.932.045). Como exemplos descritos aqui, as sequências de CDR de cadeia leve e cadeia pesada de um anticorpo 94G1 de referência foram separadamente engenheirados para remover a afinidade de cada cadeia. Além disso, como descrito aqui, os anticorpos anti-4-1BB exemplarmanete engenheirados podem eficazmente induzir à proliferação de células T ativadas. Notavelmente, os anticorpos anti-4- 1BB exemplarmanete engenheirados são capazes de induzir atividades supreendentementeb melhoradas de células T CD8+ devido ao estímulo causado pela ligação ao anticorpo humanizado 4-1BB a uma molécula de 4-1BB e inibição de morte celular induzida por ativação (AICD). Desse modo, a presente invenção fornece anticorpos de anti-4-1BB humanos engenheirados com propriedades melhoradas sobre um anticorpo de referência, e, além disso, demonstra que estes anticorpos têm atividade surpreendentemente benéfica in vitro e in vivo.4-1BB

[0091] 4-1BB (além disso, referida como CD137, TNFRSF9, etc) éum receptor que pertencem à superfamília de receptor de fator de necrose de tumor (TNFR). 4-1BB é uma molécula coestimuladora geralmente expresssa em linfócitos T ativados e envolvidos em imunidade e doenças autoimunes (Kwon et al. PNAS 84:2896,1987; Kwon et al. PNAS (1989) 86:1963; Son et al. Journal of Immunological Methods (2004) 286(1-2):187-201, cada dos quais é incorporado aqui por referência em sua totalidade). 4-1BB humana é uma proteína de 255 aminoácidos (Acesso n°. NM_001561; NP_001552). A sequência de aminoácido humana de 4-1BB completa é fornecida em SEQ ID NO: 44. 4-1BB é expressa na superfície celular em formas de monômero (30 kDa) e dímero (55 kDa) e provavelmente trimeriza com ligante de 4-1BB a sinal.

[0092] O entendimento atual de 4-1BB sugere que ela éconstitutivamente expressa em diversas células, embora em baixos níveis, incluindo Foxp3+ Tregs e células dendríticas (DC). (Veja, Vinay e Kwon (2014) BMB Rep. 47(3): 122-129, que é incorporado ór referência aqui). A ativação com diversos agonistos, tais como citocinas (por exemplo, IL-2, IL-4), ativadores policlonais (por exemplo, Con A e PHA), moléculas de superfície celular (por exemplo, anti-CD3 e anti- CD28) e promotores de indução de Ca2+ e atividade de PKC (por exemplo, acetato de miristato de ionomicina e fotbol) também realça a expressão de 4-1BB. Id.

[0093] Vários estudos de células T murinas e humanas indicam quea 4-1BB promove a proliferação celular realçada, sobrevivência, e produção de citocina (Croft, 2009, Nat. Rev. Immunol. 9:271-285). Os estudos indicaram que alguns anticorpos monoclonais de agonista de 4-1BB podem aumentar expressão de molécula coestimuladora e acentuadamente realçar as respostas de linfócito T citolíticas, resultando na eficácia antitumor em vários modelos. Os anticorpos monoclonais de agonista de 4-1BB têm eficácia demonstrada em configurações profiláticas e terapêuticas. Além disso, os modelos de tumor de terapia de combinação e monoterapia de 4-1BB estabeleceram respostas de memória de célula T protetora antitumor duráveis (Lynch (2008) Immunol. Rev. 22: 277-286). Os agonistas de 4- 1BB também foram mostrados inibir reações autoimunes em vários modelos de autoimunidade reconhecidas pela técnica (Vinay (2006) J. Mol. Med. 84:726-736). Esta atividade dual de 4-1BB fornece o potencial de fornecer a atividade antitumor, ao mesmo tempo em que amortecendo os efeitos colaterais autoimunes que podem ser associados com métodos de imunoterapia.Anticorpos de 4-1BB e fragmentos dos mesmos

[0094] A presente invenção fornece, pelo menos em parte,anticorpos de anti-4-1BB humanos engenheirados e fragmentos dos mesmos que exibem acentuadamente, e inesperadamente, características superiores in vitro e/ou in vivo. Por exemplo, certos anticorpos fornecidos aumentaram a afinidade em relação a um anticorpo de 41BB anti-humano humanizado de referência.

[0095] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-4-1BB oufragmento de anticorpo de ligação ao antígeno inclui 1, 2, ou 3sequências de CDR de cadeia pesada que são ou incluem uma sequência de SEQ ID NOs: 5 a 8. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-4-1BB ou fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno inclui uma ou mais de: uma CDR1 de cadeia pesada que é ou inclui uma sequência de SEQ ID NO: 5, uma CDR2 de cadeia pesada que é ou inclui uma sequência de SEQ ID NO: 6 e uma CDR3 de cadeia pesada que é ou inclui uma sequência de SEQ ID NO: 7 ou 8. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-4-1BB ou fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno inclui cada uma de: uma CDR1 de cadeia pesada que é ou inclui uma sequência de SEQ ID NO: 5, uma CDR2 de cadeia pesada que é ou inclui uma sequência de SEQ ID NO: 6 e uma CDR3 de cadeia pesada que é ou inclui uma sequência de SEQ ID NO: 7 ou 8.

[0096] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-4-1BB oufragmento de anticorpo de ligação ao antígeno inclui 1, 2, ou 3sequências de CDR de cadeia leve que são ou incluem uma sequência de SEQ ID NOs: 1-4. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-4- 1BB ou fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno inclui uma ou mais de: uma CDR1 de cadeia leve que é ou inclui uma sequência de SEQ ID NO: 1, uma CDR2 de cadeia leve que é ou inclui uma sequência de SEQ ID NO: 2 e uma CDR1 de cadeia leve que é ou inclui uma sequência de SEQ ID NO: 3 ou 4. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-4-1BB ou fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno inclui cada uma de: uma CDR1 de cadeia leve que é ou inclui uma sequência de SEQ ID NO: 1, uma CDR2 de cadeia leve que é ou inclui uma sequência de SEQ ID NO: 2 e uma CDR1 de cadeia leve que é ou inclui uma sequência de SEQ ID NO: 3 ou 4.

[0097] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-4-1BB oufragmento de anticorpo de ligação ao antígeno inclui um domínio variável de cadeia pesada que inclui uma CDR1 de cadeia pesada que é ou inclui uma sequência de SEQ ID NO: 5, uma CDR2 de cadeia pesada que é ou inclui uma sequência de SEQ ID NO: 6 e uma CDR3 de cadeia pesada que é ou inclui uma sequência de SEQ ID NO: 7 ou 8 e/ou um domínio variável de cadeia leve que inclui uma CDR1 de cadeia leve que é ou inclui uma sequência de SEQ ID NO: 1, uma CDR2 de cadeia leve que é ou inclui uma sequência de SEQ ID NO: 2 e uma CDR1 de cadeia leve que é ou inclui uma sequência de SEQ ID NO: 4.

[0098] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-4-1BB oufragmento de anticorpo de ligação ao antígeno inclui um domínio variável de cadeia pesada que inclui uma CDR2 de cadeia pesada que é ou inclui uma sequência de SEQ ID NO: 6 em que o 5° aminoácido, asparagina (N), foi substituído com glutamina (Q), ácido glutâmico (E) ou serina (S). Em algumas modalidades, um anticorpo anti-4-1BB ou fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno inclui um domínio variável de cadeia pesada que inclui uma CDR2 de cadeia pesada que é ou inclui uma sequência de SEQ ID NO: 6 em que o 5° aminoácido, asparagina (N), foi substituído com valina (V), glicina (G), ou prolina (P).

[0099] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-4-1BB oufragmento de anticorpo de ligação ao antígeno inclui um domínio variável de cadeia leve que inclui uma CDR1 de cadeia leve que é ou inclui uma sequência de SEQ ID NO: 3 ou 4 em que a 6a posição de aminoácido de LCDR3 é mudada.

[00100] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-4-1BB ou fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno inclui um domínio variável de cadeia pesada que inclui uma região estrutural de cadeia leve 1 (FR1) compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 16 ou 17. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-4-1BB ou fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno inclui um domínio variável de cadeia pesada que inclui uma região estrutural de cadeia pesada 3 (FR3) compreendendo uma sequência de qualquer uma de SEQ ID NOs: 1820. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-4-1BB ou fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno inclui um domínio variável de cadeia pesada que inclui uma região estrutural de cadeia leve 1 (FR1) compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 16 ou 17 e uma região estrutural de cadeia pesada 3 (FR3) compreendendo uma sequência de qualquer uma de SEQ ID NOs: 18-20.

[00101] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-4-1BB ou fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno inclui homologia substancial a um anticorpo ou fragmento de anticorpo que inclui um domínio variável de cadeia pesada que é ou inclui uma sequência selecionada de SEQ ID NOs: 11-14. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-4-1BB ou fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno inclui um domínio variável de cadeia pesada que é ou inclui uma sequência pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4% ou 99,5% idêntica a uma sequência selecionada de SEQ ID NOs: 11-14. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-4-1BB ou fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno inclui um domínio variável de cadeia pesada que é ou inclui uma sequência selecionada de SEQ ID NOs: 11-14.

[00102] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-4-1BB ou fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno inclui homologia substancial a um anticorpo ou fragmento de anticorpo que inclui um domínio variável de cadeia leve que tem ou inclui uma sequência de SEQ ID NO: 9 ou 10. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-4- 1BB ou fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno inclui um domínio variável de cadeia leve que é ou inclui uma sequência pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4% ou 99,5% idêntica a uma sequência de SEQ ID NO: 9 ou 10. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-4-1BB ou fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno inclui um domínio variável de cadeia leve que é ou inclui uma sequência de SEQ ID NO: 9 ou 10.

[00103] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-4-1BB ou fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno inclui homologia substancial a um anticorpo ou fragmento de anticorpo que inclui um domínio variável de cadeia pesada que é ou inclui uma sequência selecionada de SEQ ID NOs: 11-14 e um domínio variável de cadeia leve que é ou inclui uma sequência de SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-4-1BB ou fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno inclui um domínio variável de cadeia pesada que é ou inclui uma sequência pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4% ou 99,5% idêntica a uma sequência selecionada de SEQ ID NOs: 11-14 e um domínio variável de cadeia leve que é ou inclui uma sequência pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4% ou 99,5% idêntica a uma sequência de SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-4-1BB ou fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno inclui um domínio variável de cadeia pesada que é ou inclui uma sequência selecionada de SEQ ID NOs: 1114 e um domínio variável de cadeia leve que é ou inclui uma sequência de SEQ ID NO: 10.

[00104] As sequências de amoinoácido de fragmento ou anticorpo de anti-4-1BB humano de ligação às ligações de antígeno da presente invenção podem ser substituídas através da substituição conservadora. O termo "substituição conservadora" usado aqui refere-se à modificação de um polipeptídeo em que um ou mais aminoácidos são substituídos com um aminoácido tendo uma propriedade bioquímica similar para não causar a perda de uma função biológica ou bioquímica do polipeptídeo correspondente. O termo "variante de sequência conservadora" ou "substituição de aminoácido conservadora" usado aqui é a substituição de um resíduo de aminoácido com um resíduo de aminoácido tendo uma cadeia lateral similar. Os resíduos de aminoácido tendo uma cadeia lateral similar são definidos na técnica. Aqueles resíduos abrangem aminoácidos com uma cadeia lateral básica (por exemplo, lisina, arginina, e histidina), aminoácidos com uma cadeia lateral acídica (por exemplo, ácido aspártico e glutamato), aminoácidos com uma cadeia lateral polar não carregada (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, e cisteína), aminoácidos com uma cadeia lateral não polar (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, e triptofan), aminoácidos com uma cadeia lateral beta-ramificada (por exemplo, treonina, valina, e isoleucina) e aminoácidos com uma cadeia lateral aromática (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofan, e histidina). Consequentemente, espera-se que o anticorpo da presente invenção possa ter substituição de aminoácido conservadora, e ainda assegurar uma atividade.

[00105] Em algumas modalidades, um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção pode incluir uma região constante selecionada de um domínio constante de IgG1, um domínio constante de IgG2, um domínio constante híbrido de IgG1/IgG2, um domínio constante IgG4 humana, um domínio constante IgA, um domínio constante de IgE, um domínio constante de IgM, e um domínio constante de IgD.

[00106] Em algumas modalidades, um anticorpo de anti-4-1BBhumano ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção é ou inclui uma IgA, IgD, IgE, IgM, IgG, ou variantes do mesmo.

[00107] Em algumas modalidades, um anticorpo de anti-4-1BBhumano da presente invenção inclui uma região de Fc variante que tem mutações e/ou substituições de aminoácido em uma ou mais posições de 234, 235, 236, 237, 238, 239, 253, 254, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 288, 297, 298, 299, 307, 311, 322, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 434 e 435.

[00108] Em algumas modalidades, um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção é isótopo de IgG1 humana. Em algumas modalidades, um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção inclui uma IgG1 variante. Em algumas modalidades, um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno inclui um polipeptídeo de IgG1 que tem mutação de aminoácido em uma ou mais posições de 233, 234, 235, 236, 265, 297, 329, 331 e 322.

[00109] Em algumas modalidades, um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno inclui um polipeptídeo de IgG1 contendo uma ou mais mutações em L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 e P329. Em algumas modalidades, umanticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno inclui um polipeptídeo de IgG1 contendo dois, três, quatro, ou mais mutações em L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 e P329. Em algumas modalidades, um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno inclui um polipeptídeo de IgG1 com mutações em L234A e L235A.

[00110] Em algumas modalidades, um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno inclui uma região constante de cadeia leve. Em algumas modalidades, um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno inclui uma cadeia de kappa (K) e/ou lambda (À) e/ou uma variante da mesma.

[00111] Em algumas modalidades, um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno é um anticorpo monoclonal. Em algumas modalidades, um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno é um fragmento de Fab, um fragmento de Fab’, um fragmento de F(ab’)2, um fragmento de Fv, um fragmento de Fv ligado por dissulfeto, um fragmento de scFv, um anticorpo de domínio simples, humacorpo, nanocorpo, e/ou um diacorpo. Em algumas modalidades, um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno é um anticorpo monovalente. Em algumas modalidades, um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno é um anticorpomultivalente. Em algumas modalidades, um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno é um anticorpomultiespecífico (por exemplo, um anticorpo biespecífico).

[00112] Em algumas modalidades, a presente invenção abrange métodos de modificação do teor de carboidrato de um anticorpo da descrição adicionando-se ou excluindo um sítio de glicosilação. Os métodos para modificação do teor de carboidrato de anticorpos são bem conhecidos na técnica e abrangidos pela descrição, veja, por exemplo, Patente dos Estados Unidos n° 6.218.149; EP 0 359 096 B1; Publicação dos Estados Unidos n° US 2002/0028486; WO 03/035835; Publicação dos Estados Unidos n° 2003/0115614; Patente dos Estados Unidos n° 6.218.149; Patente dos Estados Unidos n° 6.472.511; todos dos quais são incorporados aqui por referência em sua totalidade. Em outras modalidades, a presente invenção abrange métodos de modificação do teor de carboidrato de um anticorpo da presente invenção excluindo-se uma ou mais porções de carboidrato endógenos do anticorpo. Em uma modalidade específica, a presente invenção abrange a exclusão do sítio de glicosilação da região de Fc de um anticorpo, modificando-se a posição 297 de asparagina para alanina. Em algumas modalidades, um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma mutação de N297A no domínio de CH2. Em algumas modalidades, a mutação de N297A resulta em glicosilação, que reduz a ligação de FcR ou C1q. Em algumas modalidades, um anticorpo de anti- 4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma cadeia pesada compreendendo uma região de Fc compreendendo uma mutação de N297A e uma mutação de K322A. Em algumas modalidades, um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma cadeia pesada compreendendo uma região de Fc compreendendo uma mutação de N297A e uma mutação de D265A. Em algumas modalidades, um anticorpo de anti-4- 1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma cadeia pesada compreendendo uma região de Fc compreendendo uma mutação de N297A, uma mutação de D265A, e uma mutação de K322A. Em algumas modalidades, um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região de Fc com uma mutação de L234A e/ou uma mutação de L235A. Em algumas modalidades, um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região de Fc com uma ou mais mutações selecionadas de L234A, L235A, N297A, D265A, e K322A. Em algumas modalidades, um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno compreende a região de Fc com duas ou mais mutações selecionadas de L234A, L235A, N297A, D265A, e K322A. Em algumas modalidades, um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno compreende a região de Fc com três, quatro, ou cinco mutações selecionadas de L234A, L235A, N297A, D265A, e K322A.

[00113] As glicoformas engenheiradas podem ser úteis para vários propósitos, incluindo, porém não limitdas a, realce ou redução da função efetora. As glicoformas engenheiradas podem ser geradas por qualquer método conhecido por alguém versado na técnica, por exemplo, usando-se linhagens de expressão engenheiradas ou variantes, por coexpressão com uma ou mais enzimas, por exemplo, DI N- acetilglicosaminiltransferase III (GnTI11), expressando-se uma molécula compreendendo uma região de Fc em vários organismos ou linhagens celulares de vários organismos, ou modificando-se carboidrato(s) após a molécula compreendendo a região de Fc ter sido expressa. Os métodos para geração de glicoformas engenheiradas são conhecidos na técnica, e incluem, porém não são limitados àqueles descritos em Umana et al, 1999, Nat. Biotechnol 17:176-180; Davies et al., 20017 Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields et al, 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278:34663473) Patente dos Estados Unidos n° 6.602.684; Estados Unidos Número de série 10/277.370; Estados Unidos Número de série 10/113,929; PCT WO 00/61739A1; PCT WO 01/292246A1; PCT WO 02/311140A1; PCT WO 02/30954A1; POTILLEGENT™ technology (Biowa, Inc. Princeton, N.J.); GLYCOMAB™glycosylation engineering technology (GLYCART biotechnology AG, Zurich, Switzerland); cada dos quais é incorporado aqui por referência em sua totalidade. Veja, por exemplo, WO 00061739; EA01229125; US 20030115614; Okazaki et al., 2004, JMB, 336: 1239-49 cada dos quais é incorporado aqui por referência em sua totalidade.

[00114] Em algumas modalidades, um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção é como um agonista para 4-1BB humana.

[00115] Em algumas modalidades, um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção ligase a uma molécula de 4-1BB humana. Em algumas modalidades, um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção especificamente liga-se a uma molécula de 4-1BB humana.

[00116] Em algumas modalidades, um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação às ligações de antígeno a uma ligação que é ou inclui aquela de SEQ ID NO: 15. Em algumas modalidades, um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação às ligações de antígeno a um epitopo de domínio extracelular de 4-1BB que é ou inclui uma sequência de SEQ ID NO: 15.

[00117] Em algumas modalidades, a ligação de um anticorpo de anti- 4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção com domínio extracelular de 4-1BB humana é anulada por uma ou mais mutações de SEQ ID NO: 44 selecionada de N30, D38, N39, R41, A56, G57, R60 ou T61.

[00118] Em algumas modalidades, um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção ligase a uma molécula de 4-1BB humana com uma afinidade de ligação (KD) de 1X10-7 a 1x10-12 M. Em algumas modalidades, um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção liga-se a uma molécula de 4-1BB humana com uma afinidade de ligação (KD) de 1X10-8 a 1x10-12 M. A afinidade de ligação (KD) pode ser medida, por exemplo, por ressonância plasmônica de superfície, por exemplo, usando um sistema de BIACORE.

[00119] Em algumas modalidades, um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção ligase a uma molécula humana de 4-1BB ou um fragmento da mesma em uma afinidade de ligação (KD) menor do que 1,0x10-8 M. Em algumas modalidades, um anticorpo de 4-1BB anti-humanizada ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção liga-se a uma molécula humana de 4-1BB ou um fragmento da mesma em uma afinidade de ligação (KD) menor do que 1,0x10-9 M. Em algumas modalidades, um anticorpo de 4-1BB anti-humanizada ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção liga-se a uma molécula humana de 4- 1BB ou um fragmento da mesma em uma afinidade de ligação (KD) menor do que 1,0x10-10 M.

[00120] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-4-1BB ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção não se liga ou liga fracamente a um polipeptídeo de 4-1BB não-primata (por exemplo, um polipeptídeo de 4-1BB de canino, camundongo e rato). Em algumas modalidades, um anticorpo anti-4-1BB ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção liga-se eficazmente à 4-1BB de ser humano ou macaco. Esta afinidade de ligação sugere que a estrutura e/ou sequência de epitopo para um primata 4-1BB anticorpo pode ser bastante diferente de canino, camundo e rato.

[00121] Em algumas modalidades, um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção é um anticorpo agonístico. Em algumas modalidades, um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção media a ativação de célula T. Em algumas modalidades, um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção liga-se a células T CD8+ e/ou CD4+ que expressam 4-1BB humana.

[00122] Em algumas modalidades, um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção não tem ou tem baixa atividade de ADCC. Em algumas modalidades, um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção não tem ou tem pouca atividade de CDC. Em algumas modalidades, um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção não tem ou tem baixa atividade de ADCC e atividade de CDC. Em algumas modalidades, um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção tem uma atividade de matança de célula de ADCC menor do que cerca de 20%, menor do que cerca de 10%, menor do que cerca de 8%, ou menor do que cerca de 5%. Em algumas modalidades, um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção tem uma atividade de matança de célula de ADCC menor do que cerca de 10%. Em algumas modalidades, um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção tem uma atividade de matança de célula CDC menor do que cerca de 30%, menor do que cerca de 20%, menor do que cerca de 10%, menor do que cerca de 8%, ou menor do que cerca de 5%. Em algumas modalidades, um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção tem uma atividade de matança de célula CDC menor do que cerca de 20%.

[00123] Em algumas modalidades, um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção é caracteriado por baixa toxicidade (por exemplo, um baixo grau de morte celular pós-administração). Em algumas modalidades, um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção é caracterizado por baixa hepatoxicidade. Em algumas modalidades, um indivíduo ao qual foi administrado um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção em uma dose terapêutica tem níveis de um ou mais de ALT, AST e bilirubina total em uma faixa normal. Em algumas modalidades, um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção é caracterizado por uma capacidade de tratar pacientes durante períodos prolongados com alívio mensurável de sintomas e toxicidade baixa e/ou aceitável. Imunogenicidade baixa ou aceitável e/ou alta afinidade, bem como outras propriedades adequadas, podem contribuir para os resultados terapêuticos obtidos. "Baixa imunogenicidade" é definida aqui como elevação das respostas de HAHA, HACA ou HAMA significativas menor do que cerca de 75%, ou preferivelmente menor do que cerca de 50% dos pacientes tratados e/ou elevação dos baixos títulos no paciente tratado (Elliott et al., Lancet 344:1125-1127 (1994), incorporado aqui em sua totalidade porreferência).

Ácidos Nucleicos

[00124] A descrição fornece polinucleotídeos compreendendo uma sequência de nucleotídeo que codifica anticorpos de anti-4-1BB humanos da presente invenção e fragmentos dos mesmos. Os anticorpos de anti-4-1BB humanos e fragmentos dos mesmos como descrito aqui pode ser produzidos de moléculas de ácido nucleico usando métodos biológicos moleculares conhecidos na técnica. Ácidos nucleicos da presente invenção incluem, por exemplo, DNA e/ou RNA.

[00125] Em algumas modalidades, as construções de ácido nucleico incluem regiões que codificam um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento do mesmo (por exemplo, 94K, 94KV, 94KVT, EU101). Em algumas modalidades, tais anticorpos ou fragmentos dos mesmos incluirão regiões VH e/ou VL. Um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento do mesmo pode ser identificado e/ou selecionado por proriedades funcionais e/ou ligação desejada, e regiões variáveis de referido anticorpo isolado, amplificado, clonado e/ou sequenciado. As modificações podem ser feitas para as sequências de nucleotídeo VH e VL, incluindo adições de sequências de nucleotídeo que codificam aminoácidos e/ou transportam sítios de restrição, e/ou substituição de sequências de nucleotídeo que codificam aminoácidos. Em algumas modalidades, uma sequência de ácido nucleico pode ou não pode incluir uma sequência de íntron.

[00126] Quando apropriadas, as sequências de ácido nucleico que codificam anticorpos de anti-4-1BB humanos e fragmentos dos mesmos (por exemplo, 94K, 94KV, 94KVT, EU101) podem ser modificadas para incluir códons que são otimizados para expressão em um tipo ou organismo celular particular (por exemplo, veja Patente dos Estados Unidos n° 5.670.356 e Estados Unidos Patent n° 5.874.304). As sequências otimizadas por códon são sequências sintéticas, e preferivelmente codificam o polipeptídeo idêntico (ou um fragmento biologicamente ativo de um polipeptídeo de comprimento total que tem substancialmente a mesma atividade que a do polipeptídeo de comprimento total) codificado pelo polinucleotídeo origem otimizado por não códon. Em algumas modalidades, a região de codificação do material genético que codifica os componentes de anticorpo, totalmente ou em parte, pode incluir uma sequência alterada para otimizar o uso do códon para um tipo celular particular (por exemplo, uma célula eucariótica ou procariótica). Por exemplo, uma sequência de codificação para uma região variável de cadeia pesada (ou leve) humanizada como descrita aqui pode ser otimizada for expression em uma célula bacteriana. Alternativamente, a sequência de codificação pode ser otimizada para expressão em uma célula de mamífero (por exemplo, uma célula de CHO). Tal sequência pode ser descrita como uma sequência otimizada por códon.

[00127] As construções de ácido nucleico da presente invenção podem ser inseridas em um vetor de expressão ou vetor viral por métodos conhecidos na técnica, e as moléculas de ácido nucleico podem ser operacionalmente ligadas a uma sequência de controle de expressão. Um vetor compreendendo qualquer das moléculas de ácido nucleico acima descritas, ou fragmentos dos mesmos, é também fornecido pela presente invenção. Quaisquer das moléculas de ácido nucleico acima, ou fragmentos dos mesmos, podem ser clonados em qualquer vetor adequado e podem ser usados para transformar ou transfectar qualquer hospedeiro adequado. A seleção de vetores e os métodos para os contruir são comumente conhecidos por pessoas versadas na técnica e são descritos nas referências técnicas gerais (Veja, em geral, "Recombinant DNA Part D," Métodos in Enzymology, Volume 153, Wu e Grossman, edições, Academic Press (1987)).

[00128] Em algumas modalidades, as técnicas convencionalmente usadas, tais como, por exemplo, eletroforese, precipitação de fosfato de cálcio, transfecção de DEA-dextrano, lipofecção, etc. podem ser usadas para introduzir um ácido nucleico estrangeiro (DNA ou RNA) em uma célula procariótica ou eucariótica. Desejavelmente, um vetor pode incluir sequêncis reguladoras, tais como iniciação de transcrição e translação e códons de terminação, que são específicos ao tipo de hospedeiro (por exemplo, bactéria, fungo, planta ou animal) em que o vetor deve ser introduzido, como apropriado e levando e consideração se o vetor é DNA ou RNA. Em algumas modalidades, um vetor compreende sequêncis reguladoras que são específicos ao gênero do hospedeiro. Preferivelmente, um vetor compreende sequêncis reguladoras que são específicas à espécie do hospedeiro.

[00129] Além do sistema de replicação e do ácido nucleico inserido, uma construção de ácido nucleico pode incluir um ou mais genes marcadores, que permitem a seleção de hospedeiros transformados ou transfectados. Os genes marcadores incluem resistência a biocida, por exemplo, resistência a antibióticos, metais pesados, etc., complementação em um hospedeiro auxotrófico pode fornecer prototrofia, e similares.

[00130] Os vetores adequados incluem aqueles engenheirados para propragação e expansão ou para expressão ou ambos. Por exemplo, um vetor de clonagem é selecionado do grupo que consiste na série de pUC, na série de pBluescript (Stratagene, LaJolla, Calif.), a série de pET (Novagen, Madison, Wis.), na série de pGEX (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden), e na série de pEX (Clontech, Palo Alto, Calif.). Os vetores de bacteriófago, tais como ÀGT10, ÀGT11, ÀZapII (Stratagene), ÀEMBL4, e ÀNM1149, também podem ser usados. Os exemplos de vetores de expressão de planta incluem pBI110, pBI101,2, pBI101,3, pBI121 e pBIN19 (Clontech). Os exemplos de vetores de expressão animais incluem pEUK-C1, pMAM e pMAMneo (Clontech). O sistema de clonagem de TOPO (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) também pode ser usado de acordo com as recomendações do fabricante.

[00131] Um vetor de expressão pode compreender um promotor nativo ou não nativo operavelmente ligado a uma molécula de ácido nucleico isolada ou purificada como descrito acima. A seleção de promotores, por exemplo, fortes, fracos, induzíveis, específicos de tecido e específicos para desenvolvimento, está dentro da técnica. Similarmente, a combinação de uma molécula de ácido nucleico, ou fragmento do mesmo, como descrito acima com um promotor está também dentro da técnica.

[00132] Os vetores virais adequados incluem, por exemplo, vetores retrovirais, os vetores baseados em parovírus, por exemplo, vetores baseados em vírus adeno-associados (AAV), vetores de quiméricos AAV-adenovirais, e vetores baseados em adenovírus, e vetores lentivirais, tais como vetores baseados em Herpes simplex (HSV). Estes vetores virais podem ser preparados usando técnicas de DNA recombinantes padrão descritas em, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2a edição, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); e Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates e John Wiley & Sons, Nova Iorque, N.Y. (1994).

[00133] Um vetor retroviral é derivado de um retrovírus. O retrovirus é um vírus de RNA capaz de infectar uma ampla variedade de células hospedeiras. Na infecção, o genoma retroviral integra-se no genoma de sua célula hospedeira e é replicado junto com o DNA da célula hospedeira, desse modo constantemente produzindo RNA viral e qualquer sequência de ácido nucleico incorporada no genoma retroviral. Como tal, a expressão "a longo prazo" de um(uns) fator(es) terapêutico(s) é obtenível quando usando retrovírus. Os retrovírus contemplados para uso na terapia de gene são relativamente não patogênicos, embora existam os retrovirus patogênicos. Quando empregando-se retrovírus patogênicos, por exemplo, vírus da imunodeficiência humana (HIV) ou vírus linfotróficos de célula T humanas (HTLV), deve-se tomar cuidado com a alteração do genoma viral para eliminar a toxicidade ao hospedeiro. Um vetor retroviral adicionalmente pode ser manipulado para tornar a replicação do vírus deficiente. Como tais, os vetores retrovirais são considerados particularmente úteis para transferência estável de genes in vivo. Os vetores lentivirais, tais como vetores baseados em HIV, são exemplares de vetores retrovirais usados para liberação de gene. Ao contrário de outros retrovírus, os vetores baseados em HIV são conhecidos por incorporarem seus genes passageiros em células não divididas e, consequentemente, podem ser de uso no tratamento de formas persistentes de doenças.

[00134] As sequências adicionais podem ser adicionadas às tais sequências de clonagem e/ou expressão para otimizar sua função na clonagem e/ou expressão, para ajudar no isolamento do polinucleotídeo, ou melhorar a introdução do polinucleotídeo em uma célula. O uso de vetores de clonagem, vetores de expressão, adaptadores, e ligantes é bem conhecido na técnica. (Veja, por exemplo, Ausubel, supra; ou Sambrook, supra).

[00135] Em algumas modalidades, os ácidos e vetores nucleicos da presente invenção podem ser isolados e/purificados. A presente invenção também fornece uma composição compreendendo a molécula de ácido nucleico isolada ou purificada acima descrita, opcionalmente na forma de um vetor. Os vetores e ácidos nucleicos isolados podem ser preparados usando técnicas padrão conhecidas na técnica incluindo, por exemplo, tratamento de álcali/SDS, ligação de CsCl, cromatografia de coluna, eletroforese em gel de agarose e outras técnicas bem conhecidas na técnica. A composição pode compreender outros componentes, como também descrito aqui.

[00136] Em algumas modalidades, as moléculas de ácido nucleico são inseridas em um vetor que é capaz de expressar um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento do mesmo quando introduzido em uma célula hospedeira apropriada. As células hospedeiras apropriadas incluem, porém não estão limitadas a, células bacterianas, de levedura, de inseto, e de mamíferos. As células hospedeiras exemplares incluem procarióticas (por exemplo, E. coli) e eucarióticas (por exemplo, uma célula de COS ou uma de CHO). As células hospedeiras de mamífero que seriam usadas incluem células Hela 293, H9 e Jurkat humanas, células NIH3T3 e C127 de camundongo, Cos 1, Cos 7 e CV 1, células QC1-3 de codorna, células L de camundongo e células de ovári de hamster chinês (CHO) (por exemplo, células de DG44). Em algumas modalidades, uma célula hospedeira de mamífero adequada para a expressão do anticorpo may be uma célula de Ovário Hamster Chinês (CHO) (por exemplo, incluindo células de DHFR-CHO usadas junto com uma marcador selecionável de DHFR), uma célula de mieloma de NSO, uma célula de COS ou uma célula de SP2.

[00137] Qualquer método conhecido por alguém versado na técnica para a inserção de fragmentos de DNA em um vetor pode ser usado para contruir vetores de expressão que codificam um anticorpo de anti- 4-1BB humano ou fragmento do mesmo da presente invenção sob controle de sinais de controle transcricional/translacional. Estes métodos podem incluir em DNA recombinante in vitro e técnicas sintéticas e recombinação in vivo (Veja, por exemplo, Ausubel, supra; ou Sambrook, supra).

Produção de Anticorpos

[00138] Os anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno da presente invenção podem ser preparados e/purificados por qualquer técnica conhecida na arte, que permite a formação subsequente de de um anticorpo estável ou fragmento de anticorpo.

[00139] Um ácido nucleico codificando um anticorpo de anti-4-1BB humano e/ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção pode ser facilmente isolado e sequenciado por procedimentos convencionais. Por exemplo, um iniciador de oligonucleotídeo planejado para especificamente amplificar regiões de codificação de cadeia leve e cadeia pesada correspondentes de um DNA modelo de hibridoma ou fago pode ser usado. Ácido nucleicos isolados podem ser inseridos em um vetor de expressão, e, em seguida, os anticorpos monoclonais podem ser produzidos de uma célula hospedeira adequada (isto é, tranformante) transformada introduzindo-se o vetor de expressão à célula hospedeira. Em algumas modalidades, um método para preparação de anticorpo de anti-4-1BB humano e/ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção pode incluir a amplificação de um vetor de expressão incluindo um ácido nucleico codificando o anticorpo, porém não está limitado a isto.

[00140] Em algumas modalidades, uma célula hospedeira é célula hospedeira eucariótica, incluindo, por exemplo, células de levedura, planta superior, inseto e de mamífero. Dependendo do hospedeiro empregado em um procedimento de produção recombinante, anticorpos e fragmentos de anticorpo da presente invenção podem ser glicosilados ou podem ser não glicosilados. Em algumas modalidades, um vetor de expressão recombinante codificando um anticorpo de anti-4-1BB humano e/ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção é introduzido em uma célula hospedeira de mamífero e um anticorpo pode ser preparado cultivando-se a célula hospedeira durante um tempo suficiente para expressar o anticorpo. Em algumas modalidades, uma célula hospedeira de mamífero é cultivada durante um tempo suficiente para secretar um anticorpo ou fragmento de anticorpo da presente invenção em um meio de cultura.

[00141] Em algumas modalidades, um anticorpo expresso da presente invenção pode ser uniformemente purificado após ser isolado da célula hospedeira. O isolamento e/ou purificação de um anticorpo da presente invenção pode ser realizado por um método convencional para isolamento e purificação de uma proteína. Por exemplo, não querendo estar preso a uma teoria, um anticorpo de anti-4-1BB humano e/ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção pode ser recuperado e purificado de culturas celulares recombinants por métodos bem conhecidos incluindo, porém não limitados a, purificação de proteína A, purificação de proteína G, sulfato de amônio ou precipitação de etanol, extração de ácido, cromatografia de permuta de ânion e cátion, cromatografia fosfocelulose, cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia de afinidade, cromatografia de hidroxilapatita e cromatografia de lecitina. A cromatografia líquida de alto desempenho ("HPLC") pode também ser empregada para purificação. Veja, por exemplo, Colligan, Current Protocols in Immunology, ou Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001), por exemplo, capítulos 1, 4, 6, 8, 9, e 10, cada totalmente incorporado aqui por referência. Em algumas modalidades, um anticorpo da presente invenção pode ser isolado e/purificado adicionalmente combinando-se filtração, superfiltração, precipitação por saturação, diálise, etc.

[00142] Anticorpo purificados de anti-4-1BB humano e/ou fragmentos de ligação ao antígeno da presente invenção podem ser caracterizados por, por exemplo, ELISA, ELISPOT, citometria de fluxo, imunocitologia, análise de BIACORE™, ensaio de exclusão por cinética SAPIDYNE KINEXA™, mancha de SDS-PAGE e Western, ou por análise de HPLC bem como por diversos outros ensaios funcionais descritos aqui.

Aplicações terapêuticas

[00143] A presente invenção abrange um reconhecimento de que anticorpos de anti-4-1BB humanos engenheirados e fragmentos de ligação ao antígeno podem ser úteis para diagnóstico, prevenção, e/ou tratamento de certas doenças tal como, por exemplo, câncer. Quaisquer dos anticorpos anti-4-1BB ou fragmentos de ligação ao antígeno fornecidos aqui podem ser usados em métodos terapêuticos. Por exemplo, um anticorpo anti-4-1BB ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção pode ser usado como agentes imunoterapêuticos, por exemplo, no tratamento de uma doença maligna (por exemplo, câncer).

[00144] A presente invenção fornece métodos para tratamento e/ou prevenção de uma doença maligna, fereridos métodos que incluem administração de um anticorpo anti-4-1BB ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção a um indivíduo. Os métodos para modulação ou tratamento de pelo menos uma doença maligna em uma célula, tecido, órgão, animal ou paciente, incluem, porém não estão limitados a, câncer e/ou e ao tratamento de doenças inflamatórias.

[00145] Os tratamentos anticâncer em relação à presente invenção podem ser mediados através do aumento de células T citotóxicas e citocinas anticâncer. Geralmente, a imunidade mediada por célula específica de antígeno é causada por células T citotóxicas, e inclui dois eventos de sinalização: um primeiro evento de sinalização é induzido quando uma célula T reconhece um antígeno de uma célula de apresentação de antígeno por meio de um receptor, e uma segunda sinalização é induzida por moléculas coestimuladoras. Devios aos primeiro e segundo estímulos, a atividade de célula T e fatores relacionados são aumentados, desse modo formando células T especificamente funcionamento no tratamento de câncer, e as células T formadas são aumentadas em citotoxicidade, divisão celular, viabilidade celular e secreção de citocina anticâncer devido à estimulação com as moléculas coestimuladoras.

[00146] Especificamente, demonstrou-se que a estimulação por 4- 1BB pode realçar a atividade de células T CD8+, aumenta a secreção de citocinas anticâncer tais como interferon gama (IFNY), aumenta a expressão de moléculas antiapoptóticas tais como Bcl-2, BclXL e Bfl-1, e/ou inibe a morte celular induzida por ativação (AICD). Em algumas modalidades, um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção pode realçar ou aumentar uma ou mais de atividade de célula CD8+ T, secreção de citocinas anticâncer tais como interferon gama (IFNY), a expressão de moléculas antiapoptóticas tais como Bcl-2, BclXL e Bfl-1, e inibição da morte celular induzida por ativação (AICD). Em algumas modalidades, o tratamento terapêutico com um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção pode reduzir e/ou inibir o crescimento de células de câncer.

[00147] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece um método para retardar ou inibir o crescimento de tumor, compreendendo a regulação de secreção de citocinas in vivo ou in vitro administrando- se um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção. Em algumas modalidades, a presente invenção fornece um método para redução da carga tumoral, compreendendo a regulação de secreção de citocinas in vivo ou in vitro administrando-se um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção.

[00148] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece um método para tratamento de câncer ou tumor monitorando-se um indivíduo biológico de câncer ou tumor a ser tratados, compreendendo: (i) administrando-se um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção a um indivíduo, (ii) separando, em seguida, isolando uma mostra biológica do indivíduo, (iii) meindo uma quantidade de secreção de INFY ou TGFβ da amostra e estimando uma relação de proproção e (iv) determinando uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo comparando-se as amostras de controle que são administradas ou não administradas com o fragmento ou anticorpo de anti-4-1BB humano de ligação ao antígeno do mesmo.

[00149] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece um método de tratamento de um indivíduo em necessidade dos mesmos, o método compreendendo uma etapa de administração ao indivíduo de uma composição que compreende ou libera um anticorpo anti-4-1BB ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção e/ou um ácido nucleico dos mesmos. Em algumas modalidades, um indivíduo tem ou está em risco de desenvolver câncer. Em algumas modalidades, a presente invenção fornece um método para prevenção ou tratamento de câncer ou tumor de um paciente, que inclui administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo 4-1BB humanizada ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo a um paciente com câncer ou tumor.

[00150] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece um método de indução de uma resposta imunológica em um indivíduo em necessidade dos mesmos, o método compreendendo uma etapa de administração ao indivíduo de uma composição que compreende ou libera um anticorpo anti-4-1BB ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção e/ou um ácido nucleico dos mesmos. Em algumas modalidades, um indivíduo tem ou está em risco de desenvolver câncer.

[00151] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece um método de realce de uma resposta imunológica ou aumento da atividade de uma célula imune em um indivíduo em necessidade do mesmo, o método compreendendo uma etapa de administração ao indivíduo de uma composição que compreende ou libera um anticorpo anti-4-1BB ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção e/ou um ácido nucleico dos mesmos. Em algumas modalidades, um indivíduo tem ou está em risco de desenvolver câncer.

[00152] Os câncers adequados para tratamento com método da presente invenção podem incluir, porém não estão limitados a, câncer de bexiga, câncer de mama, câncer cervical, câncer de cólon, câncer de endométrio, câncer esofágico, câncer das trompas de falópio, câncer da vesícula biliar, câncer gastrointestinal, câncer de cabeça e pescoço, câncer hematológico, câncer de laringe, câncer de fígado, câncer de pulmão, linfoma, melanoma, mesotelioma, câncer ovariano, câncer peritoneal primário, câncer da glândula salivar, sarcoma, câncer de estômago, câncer de tireoide, câncer pancreático, e câncer de próstata. Em algumas modalidades, um câncer para tratamento com um anticorpo anti-4-1BB ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção pode incluir, porém não está limitado a, carcinoma, linfoma (por exemplo, linfomas de Hodgkin e não Hodgkin), blastoma, sarcoma e leucemia. Em algumas modalidades, câncer pode incluir carcinoma de célula escamosa, cãncer de pulmão de célula pequena, câncer de pulmão de célula não pequena, adenocarcinoma de pulmão, carcinoma de célula escamosa do pulmão, câncer peritonel, carcinoma hepatocelular, câncer gástrico, câncer pancreático, glioma, câncer cervical, câncer ovariano, câncer de fígado, câncer de bexiga, carcinoma hepatocelular, câncer de mama, câncer de cólon, câncer colorretal, carcinoma endometrial ou ulterino, carcinoma salivar, câncer de rim, câncer de próstata, câncer vulvular, câncer de tireoide, carcinoma de fígado, leucemia e outros distúrbios linfoproliferativos, e vários tipos de câncer de cabeça e pescoço.

[00153] Uma composição incluindo um anticorpo anti-4-1BB ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção pode ser administrado em uma quantidade farmaceuticamente eficaz para tratar célular de câncer ou metástase do mesmo, ou inibir o crescimento de câncer. Para uso em métodos terapêuticos, um anticorpo anti-4-1BB ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção seria formulado, dosado, e administrado em um modelo consistente com a boa prática médica. Os fatores para consideração neste contexto incluem o distúrbio particular sendo tratado, o mamífero particular sendo tratado, a condição clínica do paciente individual, a idade do paciente, o peso do paciente, a causa do distúrbio, o sítio de liberação do agente, o método de administração, o horário de administração, e outros fatores conhecidos outros fatores conhecidos por médicos.

[00154] A presente invenção fornece anticorpos de anti-4-1BB humanos de alta afinidade que pode ter propriedades superiores em relação a um anticorpo de referência. A presente invenção abrange um reconhecimento de que estes anticorpos podem ter capacidade melhorada de induzir ativação de célula T e/ou secreção de citocinas tal como IFNY. Consequentemente, a presente invenção abrange um reconhecimento de que um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação de antígeno da presente invenção pode ser administrado em dose menor do que a do anticorpo de referência.

[00155] Em algumas modalidades, a composição que inclui umanticorpo anti-4-1BB ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção pode ser administrada a um paciente como um bolo ou por injeção contínua quando necessário. Em algumas modalidades, a administração do bolo é de um Fab anti-4-1BB da presente invenção e pode ser administrada em uma dose de 0,0025 a 100 mg/kg, 0,025 a 0,25 mg/kg, 0,010 a 0,10 mg/kg, ou 0,10 a 0,50 mg/kg. No caso da injeção contínua, o anticorpo da presente invenção apresentado como um fragmento de Fab pode ser administrado em uma dose de 0,001 a 100 mg/kg/minuto, 0,0125 a 1,25 mg/kg/minuto, 0,010 a 0,75 mg/kg/minuto, 0,010 a 1,0 mg/kg/minuto ou 0,10 a 0,50 mg/kg/minuto durante 1 a 24 horas, 1 a 12 horas, 2 a 12 horas, 6 a 12 horas, 2 a 8 horas, ou 1 a 2 horas. Em alguma modalidade, um anticorpo da presente invenção é um anticorpo de tamanho natural (tendo um domínio constante completo). Em algumas modalidades, um anticorpo de tamanho natural é administrado em uma dose de aproximadamente 0,01 a 10 mg/kg, 1 a 8 mg/kg, ou 2 a 6 mg/kg. Em algumas modalidades, um anticorpo de tamanho natural é administrado por injeção durante 30 a 35 minutos. A frequência de administração pode variar dependendo da gravidade da condição. Por exemplo, a frequência pode ser uma vez a cada 2 a 7 dias, uma vez por semana, ou uma vez a cada 1, 2, 3 ou 4 semanas.

[00156] Em algumas modalidades, uma composição pode ser administrada a um paciente por injeção subcutânea. Especificamente, o anticorpo pode ser administrado a um paciente em uma dose de 0,1 a 100 mg por injeção subcutânea uma vez a cada 2 a 7 dias, a cada semana, uma vez a cada duas semanas, ou a cada mês.

Terapias de Combinação

[00157] A presente invenção fornece métodos terapêuticos que incluem administração de um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção em combinação com uma ou mais outras terapias.

[00158] Em algumas modalidades, um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno é administrado em combinação com uma ou mais terapias que foram aprovadas para tratamento de câncer. Por exemplo, o tratamento de combinação com um anticorpo anti-4-1BB e um material quimioterapêutico convencional, cisplatina, foi mostrado ter atividade sinérgica no extermínio de tumor e prevenção de toxicidade específica de órgão. (Kim et al., Cancer Research (2008) 68(18):7264-9)

[00159] Em algumas modalidades, um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção é administrado em combinação com uma segunda terapia selecionada de um inibidor de ponto de verificação imune, Interleucina 12 (IL-12), Fator deestimulação de colônia de macrófago de granulócito (GM-CSF), um agente anti-CD4, e um agente quimioterapêutico, de modo que o indivíduo receba o tratamento com ambos.

[00160] Em algumas modalidades, um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção é administrado a um indivíduo que foi administrado ou será administrado com uma composição compreendendo um agente quimioterapêutico, de modo que o indivíduo receba o tratamento com ambos. Os métodos terapêuticos da presente invenção podem incluir administração de qualquer agente quimioterapêutico conhecido na técnica. Em algumas modalidades, o agente quimioterapêutico é administrado a um indivíduo que foi administrado ou será administrado com uma composição compreendendo um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno.

[00161] Em algumas modalidades, um anticorpo de anti-4-1BBhumano ou fragmento de ligação ao antígeno é administrado a um indivíduo que foi administrado ou será administrado com uma composição compreendendo fluorouracil. Em algumas modalidades, fluorouracil é administrado a um indivíduo que foi administrado ou será administrado com uma composição compreendendo um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno. Em algumas modalidades, um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno é administrado a um indivíduo que foi administrado ou será administrado com uma composição compreendendo doxorrubicina. Em algumas modalidades, a doxorrubicina é administrada a um indivíduo que foi administrado ou será administrado com uma composição compreendendo um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno. Em algumas modalidades, um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno é administrado a um indivíduo que foi administrado ou será administrado com uma composição compreendendo irinotecano. Em algumas modalidades, o irinotecano é administrado a um indivíduo que foi administrado ou será administrado com uma composição compreendendo um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno. Em algumas modalidades, um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno é administrado a um indivíduo que foi administrado ou será administrado com uma composição compreendendo paclitaxel. Em algumas modalidades, paclitaxel é administrado a um indivíduo que foi administrado ou será administrado com uma composição compreendendo um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno.

[00162] Em algumas modalidades, um anticorpo de anti-4-1BBhumano ou fragmento de ligação ao antígeno é administrado a um indivíduo que foi administrado ou será administrado com uma composição compreendendo cisplatina. Em algumas modalidades, a cisplatina é administrada a um indivíduo que foi administrado ou será administrado com uma composição compreendendo um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno. Em algumas modalidades, um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno é administrado a um indivíduo que foi administrado ou será administrado com uma composição compreendendo ciclofosfamida. Em algumas modalidades, a ciclofosfamida é administrada a um indivíduo que foi administrado ou será administrado com uma composição compreendendo um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno.

[00163] Em algumas modalidades, um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção é administrado a um indivíduo que foi administrado ou será administrado com uma composição compreendendo GM-CSF, de modo que o indivíduo receba o tratamento com ambos. Em algumas modalidades, GM-CSF é administrado a um indivíduo que foi administrado ou será administrado com uma composição compreendendo um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno.

[00164] Em algumas modalidades, um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção é administrado a um indivíduo que foi administrado ou será administrado com uma composição compreendendo IL-12, de modo que o indivíduo receba o tratamento com ambos. Em algumas modalidades, IL-12 é administrado a um indivíduo que foi administrado ou será administrado com uma composição compreendendo um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno.

[00165] Em algumas modalidades, um anticorpo de anti-4-1BBhumano ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção é administrado a um indivíduo que foi administrado ou será administrado com uma composição compreendendo um agente anti-CD4, de modo que o indivíduo receba o tratamento com ambos. Em algumas modalidades, um agente anti-CD4 é administrado a um indivíduo que foi administrado ou será administrado com uma composição compreendendo um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno.

[00166] Em algumas modalidades, um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção é administrado a um indivíduo que foi administrado ou será administrado com uma composição compreendendo um inibidor de ponto de verificação (por exemplo, um inibidor de ponto de verificação imunológico), de modo que o indivíduo receba o tratamento com ambos. Em algumas modalidades, um inibidor de ponto de verificação imunológico é administrado a um indivíduo que foi administrado ou será administrado com uma composição compreendendo um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno.

[00167] Um inibidor de ponto de verificação usado em combinação com um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção pode ser, por exemplo, qualquer inibidor de ponto de verificação imunológico. Os exemplos de moléculas de ponto de verificação inibidoras incluem A2AR, B7-H3, B7-H4, BTLA, CTLA-4, CD277, IDO, KIR, PD-1, LAG-3, TIM-3, TIGIT e VISTA. Um inibidor de ponto de verificação imunológico pode se referir a qualquer composto que inibe a função de uma proteína de ponto de verificação imune. A inibição inclui redução de função e bloqueio total. Em algumas modalidades, um inibidor de ponto de verificação imunológico é um anticorpo que especificamente reconhece uma proteína de ponto de verificação imune. Diversos inibidores de ponto de verificação imunológico são conhecidos e em analogia a estes inibidores de ponto de verificação conhecidos, os inibidores alternativos de ponto de verificação imunológico podem ser desenvolvidos no future (próximo). Os inibidores de ponto de verificação imunológico incluem, porém não estão limitados a, peptídeos, anticorpos, moléculas de ácido nucleico e moléculas pequenas.

[00168] Em algumas modalidades, um inibidor de ponto de verificação imunológico é um inibidor de CTLA-4. Em algumas modalidades, um inibidor de ponto de verificação é um anticorpo que alveja CTLA-4, tal como, por exemplo, ipilimumabe. Em algumas modalidades, um inibidor de ponto de verificação alveja CD366, que é uma proteína de transmembrana também conhecida como imunoglobulina de célula T e domínio de mucina contendo proteína-3 (TIM-3). Em algumas modalidades, um inibidor de ponto de verificação imunológico é um agente que inibe a sinalização de PD-1.

[00169] PD-1 (isto é, proteína-1 de morte celular programada), é uma proteína que é distribuída na superfície de uma célula imune tais como uma célula T ou B e é também conhecida como CD279. Em um ser humano, PD-1 é expressa por um gene de PDCD1 localizado na posição 2p37,3 no cromossomo 2. A PD-1 é conhecida por se ligar a dois ligantes, PD-L1 e PD-L2.

[00170] Em algumas modalidades, um agente de anti-PD-1 é administrado ao paciente que está recebendo, recebeu ou receberá tratamento com um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção. Em algumas certas modalidades, um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção é administrado ao paciente que está recebendo, recebeu ou receberá tratamento com um agente anti-PD-1.

[00171] Em algumas modalidades, um agente anti-PD-L1 é administrado ao paciente que está recebendo, recebeu ou receberá tratamento com um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção. Em algumas certas modalidades, um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção é administrado ao paciente que está recebendo, recebeu ou receberá tratamento com um agente anti-PD-L1. Em algumas modalidades, os agentes que inibem PD-L1 incluem, por exemplo, AMP-244, MEDI-4736, MPDL328 OA, MIH1.

[00172] Em algumas modalidades, um agente anti-PD-1 é um agente que inibe PD-1. Em algumas modalidades, um agente anti-PD-1 é um agente que inibe PD-L1 e/ou PD-L2. Em algumas modalidades, um agente de anticorpo que inibe sinalização de PD-1 é um anticorpo monoclonal ou um fragmento do mesmo. Em algumas modalidades, um agente de anticorpo que inibe sinalização de PD-1 é um anticorpo anti- PD-1 ou fragmento do mesmo.

[00173] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-PD-1 é administrado ao paciente que está recebendo, recebeu ou receberá tratamento com um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção. Em algumas certas modalidades, um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção é administrado ao paciente que está recebendo, recebeu ou receberá tratamento com um anticorpo anti-PD-1. Os anticorpos anti-PD-1 incluem, por exemplo, nivolumabe, pembrolizumabe, atezolizumabe, durvalumabe, e avelumabe. Pembrolizumabe (Keytruda, Merck) é um anticorpo terapêutico que inibe atividade de PD-1.

[00174] Como descrito nos exemplos do presente pedido, a administração de um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção em combinação com um anticorpo anti-PD-1 pode realçar a eficácia em relação a qualquer tratamento sozinho, e também pode reduzir os efeitos colaterais convencionalmente conhecidos.

[00175] Em algumas certas modalidades, o pembrolizumabe é administrado ao paciente que está recebendo, recebeu ou receberá tratamento com um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção. Em algumas certas modalidades, um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção é administrado ao paciente que está recebendo, recebeu ou receberá tratamento com pembrolizumabe.

[00176] Em algumas modalidades, um inibidor de ponto de verificação imunológico (por exemplo, um agente anti-PD-1) é administrado a um paciente em uma quantidade de cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 100 mg/kg. Em algumas modalidades, um inibidor de ponto de verificação imunológico (por exemplo, um agente anti-PD-1) é administrado a um paciente em uma quantidade dentro de uma faixa ligada por um limite inferior e um limite superior, o limite superior sendo maior do que o limite inferior. Em algumas modalidades, o limite inferior pode ser de cerca de 0,01 mg/kg, 0,025 mg/kg, 0,05 mg/kg, 0,075 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,25 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,75 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 8 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg, 50 mg/kg, 50 mg/kg, 70 mg/kg, 80 mg/kg, ou 90 mg/kg. Em algumas modalidades, o limite superior pode ser de cerca de 0,025 mg/kg, 0,05 mg/kg, 0,075 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,25 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,75 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 8 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg, 50 mg/kg, 50 mg/kg, 70 mg/kg, 80 mg/kg, 90 mg/kg, ou 100 mg/kg. Em algumas modalidades, um inibidor de ponto de verificação imunológico (por exemplo, um agente anti-PD-1) pode ser administrado a um paciente em uma quantidade de cerca de 1 mg/kg a cerca de 20 mg/kg, from cerca de 1 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, from cerca de 1 mg/kg a cerca de 5 mg/kg, from cerca de 2 mg/kg a cerca de 5 mg/kg, from cerca de 2 mg/kg a cerca de 4 mg/kg, from cerca de 3 mg/kg a cerca de 5 mg/kg, ou from cerca de 3 mg/kg a cerca de 4 mg/kg. Em algumas modalidades, um inibidor de ponto de verificação imunológico (por exemplo, um agente anti-PD-1) pode ser administrado a um paciente em uma quantidade de cerca de 1 mg/kg, cerca de 2 mg/kg, cerca de 3 mg/kg, cerca de 4 mg/kg, ou cerca de 5 mg/kg.

[00177] Em algumas modalidades, o tratamento com uma combinação de um inibidor de ponto de verificação imunológico e um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção pode realçar a proliferação, migração, persistência e/ou atividade citotóxica de células T CD8+ em um indivíduo.

Aplicações baseadas em Célula

[00178] Ainda outro objetivo da presente invenção é fornecer um método para proliferação de células T ativadas ex vivo administrando- se o anticorpo de 4-1BB humanizada ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.

[00179] Em algumas modalidades, um método para proliferação ex vivo e/ou isolamento de células T ativadas inclui contatar uma população de células T com um anticorpo anti-4-1BB ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção, desse modo aumentando a proliferação de células T ativadas.

[00180] Em algumas modalidades, um método para proliferação de células T ativadas ex vivo inclui administração de um anticorpo anti-4- 1BB ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção. Em algumas modalidades, as células T ativadas são proliferadas e/ou isoladas de uma amostra de células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMC). As PBMCs podem ser obtidas/isoladas usando métodos conhecidos na técnica.

[00181] Em algumas modalidades, um método para proliferação ex vivo e/ou isolamento de células T ativadas inclui administração de um anticorpo monoclonal anti-CD3 ao meio de cultura (por exemplo, em uma concentração de pelo menos cerca de 0,5 ng/ml). Em algumas modalidades, um método para proliferação ex vivo e/ou isolamento de células T ativadas inclui administração de IL-2 e/ou IL-15 ao meio de cultura (por exemplo, em concentração que é pelo menos cerca de 10 unidades/ml).

[00182] Em algumas modalidades, um método para isolamento de células T ativadas não específicas de antígeno inclui (a) cultura de células mononucleares de sangue periférico (PBMC) em um meio juntamente com um peptídeo de um epitopo de interesse e IL-2; (b) indução de expressão de 4-1BB nas células cultivadas adicionando o peptídeo do epitopo de interesse; (c) contato das células cultivadas com uma superfície revestida com um anticorpo anti-4-1BB ou fragmento de ligação ao antígeno, em que as células cultivadas expressando 4-1BB se aderem à superfície revestida; e (d) remoção das células não ligadas, desse modo isolando as células T ativadas específicas de antígeno.

[00183] Em algumas modalidades, as células T ativadas são células T CD8+.

[00184] Em algumas modalidades, os linfócitos (por exemplo, células T) são cultivada em uma temperatura de pelo menos cerca de 25 °C, preferivelmente pelo menos cerca de 30 °C, mais preferivelmente cerca de 37 °C.

[00185] A presente invenção abrange o reconhecimento de que células T ativadas (por exemplo, células T CD8+), geradas pelos métodos descritos aqui, podem ser terapeuticamente úteis (por exemplo, para o tratamento de câncer).Terapias baseadas em Célula

[00186] A presente invenção fornece métodos para seletivamente isolar e cultivar células T CD8+ que reconhecem um antígeno de câncer outólogo (antígeno autotumoral), por exemplo, antígeno de câncer autólogo que superexpressou-se em células de câncer, ao mesmo tempo em que presente em uma relação baixa em células normais. A invenção apresenta que as células (por exemplo, CD8+ T) isoladas por estes métodos podem ser úteis para o tratamento de câncer.

[00187] Em algumas modalidades, um método para treating e/ou prevenção de câncer em um indivíduo em necessidade dos mesmos inclui administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de células T ativadas produzidas por um método ex vivo tais como aqueles descritos aqui.

[00188] Na reativação apropriada, as células T específicas de antígeno de tumor podem reconhecer e eliminar células de tumor autólogo. Por exemplo, as células T específicas de antígeno de tumor podem ser geradas ex vivo usando métodos como os descritos aqui. Na transferência adotiva, células T especificamente ativadas de pacientes de câncer podem eficazmente rejeitar tumores humanos autólogos in vivo.

[00189] A presente invenção fornece métodos para prevenção e/ou tratamento câncer e/ou tumor de um paciente, que inclui adminnistração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de células T ativadas preparadas ex vivo administrando-se um anticorpo anti-4-1BB ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção.

[00190] Em algumas modalidades, as células T para uso em um método terapêutico são alogênicas (das mesmas espécies, porém de doador diferente) como o indivíduo recipiente. Em algumas modalidades, as células T para uso em um método terapêutico sãoautólogas (o doador e o recipiente são os mesmos). Em algumasmodalidades, as células T para uso em um método terapêutico sãosinérgicas (o doador e os recipientes são diferentes, porém são gêmeos idênticos).

[00191] Em algumas modalidades, as células são formuladas, primeiro, colhendo-as de seu meio de cultura, e em seguida lavando e concentrando-as em um meio e sistema de recipiente adequados para administração (um veículo "farmaceuticamente aceitável") em uma quantidade eficaz em tratamento. O meio de infusão adequado pode ser qualquer formulação de meio isotônico, tipicamente salina formal, Normosol R (Abbott) ou Plasma-Lyte A (Baxter), porém também 5% de dextrose em água ou lactato de Ringer podem ser utilizados. O meio de infusão pode ser suplementado com albumina sérica humana.

[00192] Uma quantidade eficaz em tratamento de células na composição é pelo menos 108, tipicamente maior do que 108, pelo menos 109 células, e geralmente mais do que 1010. O número de células dependerá do uso final ao qual a composição é destinada, conforme será o tipo de células incluído aqui. Por exemplo, se as células que são específicas a um antígeno particular forem desejadas, em seguida a população conterá mais do que 70%, geralmente mais do que 80%, 85% e 90-95% de tais células. Para os usos fornecidos aqui, as células são geralmente em um volume de um litro ou menos. Em algumas modalidades, as células para administração são em um volume menor do que 500 ml, menor do que 250 ml, ou 100 ml ou menos. Em algumas modalidades, uma densidade das células desejadas é tipicamente maior do que 106 células/ml e geralmente é maior do que 107 células/ml, geralmente 108 células/ml ou maior. Um número clinicamente relevante de células imunes pode ser repartido em múltiplas infusões que cumulativamente igualam ou excedem 108 células, 109 células, 1010 células, 1011 células, ou 1012 células.

Composições

[00193] São fornecidas aqui composições compreendendo anticorpos e fragmentos de ligação de antígeno que especificamente se ligam a um epitopo de um polipeptídeo de 4-1BB humana. As composições da presente invenção (por exemplo, composições que liberam um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de anticorpo) podem incluir qualquer quantidade adequada ou eficaz de uma composição para uso na liberação de um dado anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de anticorpo para uma célula, tecido, órgão, animal ou paciente com necessidade de tal modulação, tratamento ou terapia. Além disso, são também fornecidas aqui composições que incluem populações celulares ativadas (por exemplo, população de célula T ativada) que foram geradas por meio de um método da presente invenção (por exemplo, um método que inclui uma etapa de por em contato uma célula com um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de anticorpo).

[00194] As composições da presente invenção incluem composições farmacêuticas que incluem um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno descrito aqui e/ou uma população celular obtida por um método descrito aqui. Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica pode incluir um tampão, um diluente, um excipiente, ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, uma composição, se desejada, pode também conter uma ou mais substâncias terapeuticamente eficazes adicionais.

[00195] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-4-1BB, fragmento de ligação ao antígeno e/ou população celular da presente invenção são adequados para administração a um mamífero (por exemplo, um se humano). Embora as descrições de composições farmacêuticas fornecidas aqui sejam principalmente direcionadas às composições farmacêuticas que são adequadas para administração ética aos seres humanos, entender-se-á pelo técnico versadoque tais composições são geralmente adequadas para administração a animais de todos os tipos. A modificação de composições farmacêuticas adequadas para administração a seres humanos para tornar as composições adequadas para administração a vários animais é bem entendida, e o farmacologista veterinário versado na técnica pode planejar e/ou realizar tal modificação com experimentação meramente ordinária, se houver.

[00196] Em algumas modalidades, as composições são formuladas para administração parenteral. Por exemplo, uma composição farmacêutica fornecida aqui pode ser fornecida em uma forma injetável estéril (por exemplo, uma forma que seja adequada para injeção subcutãnea ou infusão intravenosa). Por exemplo, em algumas modalidades, uma composição farmacêutica é fornecida em uma forma de dosage líquida que é adequada à injeção. Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica é fornecida como pós (por exemplo, liofilizado e/ou esterilizado), opcionalmente sob vácuo, que pode ser reconstituído com um diluente aquoso (por exemplo, água, tampão, solução de sal, etc.) antes da injeção. Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica é diluída e/ou reconstituída em água, solução de cloreto de sódio, solução de acetate de sódio, solução de álcool benzílico, salina tamponada por fosfato, etc. Em algumas modalidades, um pó deve ser misturado suavemente com o diluente aquoso (por exemplo, não agitado).

[00197] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-4-1BB, fragmento de ligação ao antígeno, e/ou população celular da presente invenção são formulados com um veículo parenteral farmaceuticamente aceitável. Os exemplos de tais veículos são água, salina, solução de Ringer, solução de dextrose, e albumina sérica humana a 1 a 10%. Os lipossomas e veículos não aquosos tais como óleos fixados podem também ser usados. Um veículo ou pó liofilizado pode conter aditivos que mantêm a isotonicidade (por exemplo, cloreto de sódio, manitol) e estabilidade química (por exemplo, tampões e conservantes). Em algumas modalidades, uma formulação é esterilizada por técnicas conhecidas ou adequadas.

[00198] As formulações das composições farmacêuticas descritas aqui podem ser preparadas por qualquer método conhecido ou aqui a seguir desenvolvido na técnica de farmacologia. Em geral, tais métodos preparatórios incluem a etapa de conduzir o ingredient ativo em associação com um diluente ou outro excipiente e/ou um ou mais outros ingredientes acessórios, e em seguida, se necessário e/ou desejável, modelar e/ou embalar o produto em uma unidade de dose única ou múltiplas doses desejadas.

[00199] Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica incluindo um anticorpo anti-4-1BB, fragmento de ligação ao antígeno, e/ou população celular da presente invenção podem ser incluídos em um recipiente para armazenamento ou administração, por exemplo, um frasconete, uma seringa (por exemplo, uma seringa de IV), ou um saco (por exemplo, um saco de IV). Uma composição farmacêutica de acordo com a presente invenção pode ser preparada, embalada, e/ou vendida a granel, como uma dose de unidade única, e/ou como uma pluralidade de doses de unidade única. Como usado aqui, uma "dose unitária" é quantidade discrete da composição farmacêutica compreendendo uma quantidade predeterminada do ingrediente ativo. A quantidade do ingrediente ativo é geralmente igual à dosagem do ingrediente ativo que seria administrada a um indivíduo e/ou uma fração conveniente de tal dosage tal como, por exemplo, um meio ou um terço de tal dosagem.

[00200] As quantidades relativas do ingrediente ativo, o excipiente farmaceuticamente aceitável, e/ou quaisquer ingredientes adicionais em uma composição farmacêutica de acordo com a descrição variará, dependendo da identidade, tamanho, e/ou condição do indivíduo tratado e também dependendo da rotina pela qual a composição deve ser administrada. Os exemplos abaixo descrevem, em parte, a dosagem de um anticorpo de anti-4-1BB humano exemplar a um roedor. Os métodos padrão são conhecidos na técnica de como medir a dosage em sistemas animais. Veja, por exemplo, J Basic Clin Pharm. March 2016-May 2016; 7(2): 27-31, que é incorporado aqui por referência em sua totalidade. Por meio de exemplo, a composição pode compreender entre 0,1% e 100% (peso/peso) de ingrediente ativo.

[00201] Em algumas modalidades, uma composição compreende ou libera um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção em uma dose de 0,01 mg/kg a 100 mg/kg. Em algumas modalidades, uma composição compreende ou libera um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno em uma dose em uma quantidade dentro de uma faixa ligada por um limite inferior e um limite superior, o limite superior sendo maior do que o limite inferior. Em algumas modalidades, o limite inferior pode ser de cerca de 0,01 mg/kg, 0,025 mg/kg, 0,05 mg/kg, 0,075 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,25 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,75 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 8 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg, 50 mg/kg, 50 mg/kg, 70 mg/kg, 80 mg/kg, ou 90 mg/kg. Em algumas modalidades, o limite superior pode ser de cerca de 0,025 mg/kg, 0,05 mg/kg, 0,075 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,25 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,75 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 8 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg, 50 mg/kg, 50 mg/kg, 70 mg/kg, 80 mg/kg, 90 mg/kg, ou 100 mg/kg.

[00202] Uma composição farmacêutica pode adicionalmente compreender um excipiente farmaceuticamente aceitável, que, como usado aqui, inclui quaisquer e todos os solventes, meios de dispersão, diluentes, ou outros veículos líquidos, auxiliaries de dispersão ou suspensão, agentes ativos de superfície, agentes isotônicos, agentes espessantes ou emulsificantes, conservantes, aglutinantes sólidos, lubrificantes e similares, conforme o adequado à forma de dosagem particular desejada. Remington's The Science e Practice of Pharmacy, 21a Edição, A. R. Gennaro (Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006) descreve vários excipientes usados na formulação de composições farmacêuticas e técnicas conhecidas para a preparação do mesmo. Exceto na medida em que qualquer meio excipiente convencional é incompatível com uma substância ou seus derivados, tais como por produção de qualquer efeito biológico indesejável ou de outro modo interagindo de uma maneira deletéria com qualquer outro(s) componente(s) da composição farmacêutica, seu uso é contemplado estar dentro do escopo desta descrição.

[00203] Em algumas modalidades, um excipiente farmaceuticamente aceitável é pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% puro. Em algumas modalidades, um excipiente é aprovado para uso em seres humanos e para uso veterinário. Em algumas modalidades, um excipiente é aprovado pela Administração de Medicamentos e Alimentos dos Estados Unidos. Em algumas modalidades, um excipiente é de grau farmacêutico. Em algumas modalidades, um excipiente atende aos padrões da Farmacopeia dos Estados Unidos (USP), da Farmacopeia Europeia (EP), da Farmacopeia Britânica, e/ou da Farmacopeia Internacional.

[00204] Os excipientes farmaceuticamente aceitáveis usados na fabricação de composições farmacêuticas incluem, porém não estão limitados a, diluentes inertes, agentes de dispersão e/ou granulação, agentes ativos de superfície e/ou emulsificantes, agentes de desintegração, agentes de ligação, conservantes, agentes de tamponamento, agentes lubrificantes, e/ou óleos. Tais excipientes podem opcionalmente ser incluídos em formulações farmacêuticas. Os excipientes tais como manteiga de cacau e ceras para supositório, agentes de coloração, agentes de revestimento, adoçante, aromatizante, e/ou agentes perfumantes podem estar presentes na composição, de acordo com a avaliação do formulador.

[00205] Em algumas modalidades, uma dada composiçãofarmacêutica compreende um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáves (por exemplo, conservante, diluente inerte, agente dedispersão, agente ativo de superfície e/ou emulsificante, agente de tamponamento, etc.). Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica compreende um ou mais conservantes. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas não compreendem nenhum conservante.

[00206] Em algumas modalidades, uma composição incluindo um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção é estavelmente formulada. Em algumas modalidades, uma formulação estável de um anticorpo de anti-4-1BB humano ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção pode compreender um tampão de fosfato com salina ou sal escolhido, bem como soluções e formulações preservadas contendo um conservante bem como formulações preservadas de múltiplos usos adequadas para uso farmacêutico ou veterinário. As formulações preservadas contêm pelo menos um conservante conhecido ou opcionalmente selecionado do grupo que consiste em pelo menos um fenol, m-cresol, p-cresol, o-cresol, clorocresol, álcool benzílico, nitrito fenilmercúrico, fenoxietanol, formaldeído, clorobutanol, cloreto de magnésio (por exemplo, hexahidrato), alquilparabeno (metila, etila, propila, butila e similares), cloreto de benzalcônio, cloreto de benzaltônio, desidroacetato de sódio e timerosal, ou misturas do mesmo em um diluente aquoso. Qualquer mistura ou concentração adequada pode ser usada confome o conhecido na técnica, tais como 0,001 a 5%, ou qualquer faixa ou valor aqui, tal como, porém não limitado a, 0,001,0,003, 0,005, 0,009, 0,01, 0,02, 0,03, 0,05, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5,0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1,2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7,3,8, 3,9, 4,0, 4,3, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, ou qualquer faixa ou valor aqui. Os exemplos não limitantes incluem, no conservante, 0,1 a 2% de m- cresol (por exemplo, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,9, 1,0%), 0,1 a 3% de álcool benzílico (por exemplo, 0,5, 0,9, 1,1, 1,5, 1,9, 2,0, 2,5%), 0,001 a 0,5% de timerosal (por exemplo, 0,005, 0,01), 0,001-2,0% de fenol (por exemplo, 0,05, 0,25, 0,28, 0,5, 0,9, 1,0%), 0,0005-1,0%alquilparabeno(s) (por exemplo, 0,00075, 0,0009, 0,001, 0,002, 0,005, 0,0075, 0,009, 0,01, 0,02, 0,05, 0,075, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,5, 0,75, 0,9, 1,0%), e similares.

[00207] Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica é fornecida em uma forma que pode ser refrigerada e/ou congelada. Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica é fornecida em uma forma que não pode ser refrigerada e/ou congelada. Em algumas modalidades, as soluções reconstituídas e/ou formas de dosagem líquidas podem ser armazenadas durante um certo período de tempo após reconstituição (por exemplo, 2 horas, 12 horas, 24 horas, 2 dias, 5 dias, 7 dias, 10 dias, 2 semanas, um mês, dois meses, ou mais longo). Em algumas modalidades, o armazenamento de composições de anticorpo durante um tempo mais longo do que o especificado resulta em degradação de anticorpo.

[00208] As formas de dosagem líquidas e/ou soluções reconstituídas podem compreender material particulado e/ou descoloração antes da administração. Em algumas modalidades, uma solução não deve ser usada se descolorida ou turvada e/ou se o material particulado permanecer após a filtração.

[00209] Considerações gerais na formulação e/ou fabricação de agentes farmacêuticos podem ser encontradas, por exemplo, em Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21a edição,Lippincott Williams & Wilkins, 2005.Kits

[00210] A presente invenção fornece ainda um pacote farmacêutico ou kit compreendendo um ou mais recipientes carregados com pelo menos um anticorpo anti-4-1BB humano ou fragmento de anticorpo como descrito aqui. Os kits podem ser usados em qualquer método aplicável, incluindo, por exemplo, métodos terapêuticos, métodos diagnósticos, métodos de proliferação celular e/ou de isolamento, etc. Opcionalmente, um aviso pode ser associado a esse(s) recipiente(s) na forma prescrita por um órgão governamental regulamentando a fabricação, utilização ou venda de produtos farmacêuticos ou biológicos, cujo aviso reflete (a) aprovação pelo órgão de fabricação, utilização ou venda para administração humana, (b) instruções de uso, ou ambos.

[00211] Em algumas modalidades, um kit pode incluir um ou mais reagentes para detecção (por exemplo, detecção de um anticorpo anti- 4-1BB humano ou fragmento de anticorpo). Em algumas modalidades, um kit pode incluir um anticorpo anti-4-1BB humano ou fragmento de anticorpo, de uma forma detectável (por exemplo, associada de forma covalente a uma porção ou entidade detectável).

[00212] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-4-1BB humano ou fragmento de anticorpo, como aqui fornecido, pode ser incluído em um kit utilizado para o tratamento de indivíduos. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-4-1BB humano ou fragmento de anticorpo, como aqui indicado, pode ser incluído em um kit utilizado para a proliferação e/ou isolamento de células T (por exemplo, células T CD8+).

[00213] O teor de todas as referências citadas (incluindo referências bibliográficas, patentes emitidas, pedidos de patente publicados, pedidos de patentes copendentes) citadas ao longo deste pedido são pelo presente expressamente incorporados por referência.

[00214] Outras características da invenção tornar-se-ão evidentes no curso das seguintes descrições de modalidades exemplificativas. Entretanto, os exemplos a seguir são meramente fornecidos para ilustrar a presente invenção, mas o escopo da presente invenção não está limitado aos seguintes exemplos.

EXEMPLOS

[00215] A presente invenção fornece, pelo menos em parte, anticorpos anti-humanos humanizados e fragmentos dos mesmos com propriedades melhoradas que contêm uma ou mais características estruturais que não são encontradas em um anticorpo anti-4-1BB humano humanizado de referência, 94G1. O 94G1 foi gerado por humanização do anticorpo BBK-4 de anticorpo anti-4-1BB humano murino. Sítios de reconhecimento de antígeno (regiões CDR) foram determinados usando a atribuição de alça CDR (IMGT: Lefranc, 1997) e um modelo 3-D (Swiss-Pdb Viewer (www.expasy.org)). Uma biblioteca de exibição de fagos foi preparada com diversidade em um total de 10 sítios incluindo 4 sítios na sequência de aminoácidos da cadeia leve e 6 sítios da cadeia pesada foram construídos. Após paniculação, aproximadamente 14 clones de anticorpo humanizado de 1.000 clones foram selecionados (para um total de seis scFvs humanizados), e dentre os clones selecionados, 94G1, foi obtido (Son et al., J. Immunol. Methods (2004) 286: 187 -201). Estes anticorpos humanizados,incluindo 94G1, tinham afinidades para o antígeno 4-1BB humano que eram menos do que 1 / 10° daquela do BBK-4, mas eram ativos in vitro. A presente invenção englobou o reconhecimento de que variantes estruturais de 94G1 podem ter propriedades melhoradas. Geração e caracterização de anticorpos anti-4-1BB humanos humanizados variantes e fragmentos dos mesmos são descritas em maiores detalhes nos exemplos a seguir.Exemplo 1 - Preparação de anticorpos anti-4-1BB humanoshumanizados

[00216] Este exemplo descreve a produção de um anticorpo anti-4- 1BB humano exemplar com afinidade melhorada em relação a um anticorpo 94G1 de referência. O 94G1 foi gerado por humanização de um anticorpo anti-4-1BB humano murino (BBK4) como descrito em Son et al. J. Immunol. Methods (2004) 286: 187-201, que é aqui incorporado por referência na sua totalidade. Também utilizado aqui é um antígeno H4-1BB (N° de Acesso: KCTC 0952BP) que é especificamente isolado de células T ativadas (por exemplo, linhagem de célula T ativada), e não foi identificado a partir de células T não estimuladas. Por exemplo, um antígeno H4-1BB pode ser isolado de células T que foram maturadas por acetato de miristato de forbol (PMA), ionomicina, Concanavalina A, ou anti-CD3i. Este antígeno H4-1BB tem um tamanho de 1,4 kb, e 60% de homologia com camundongo 4-1BB (Garni-Wagner et al., Cellular Immunology (1996) 169: 91-98, que é aqui incorporado por referência na sua totalidade). Neste exemplo, o 94G1 foi dividido em um vetor de cadeia leve e um de cadeia pesada, cada um otimizado para gerar anticorpos humanizados melhorados.

[00217] A presente invenção abrange um reconhecimento de que um método adequado para a geração de anticorpos anti-4-1BB humanos humanizados melhorados ou fragmentos dos mesmos é através de substituições simples de aminoácidos, etapa a etapa e/ou combinações das mesmas. A presente invenção fornece várias variantes estruturais de anticorpos anti-4-1BB humanos humanizados e fragmentos dos mesmos com uma ou mais características estruturais (por exemplo, substituições de aminoácidos) que não são encontradas em um anticorpo 94G1. A presente invenção também abrange um reconhecimento de que características estruturais podem ser combinadas para melhorias etapa a etapa em uma ou mais propriedades de anticorpos (por exemplo, afinidade de antígeno aumentada).

[00218] Primeiramente, um anticorpo anti-4-1BB humano humanizado com maior afinidade em relação ao anticorpo de referência 94G1 foi obtido alterando uma região CDR de uma cadeia leve, em vez de uma cadeia pesada. Esta variante estrutural de cadeia leve foi fixada, e combinada com variantes estruturais de cadeia pesada de anti- humano de anticorpo anti-4-1BB humano humanizado com, por exemplo, mutações na região CDR de 94G1. Outras características estruturais foram integradas para gerar anticorpos anti-4-1BB humanos humanizados com alta afinidade e/ou outras características melhoradas. Construção de Vetores

[00219] Vetores com uma cadeia leve de 94G1 e cadeia pesada de 94G1, respectivamente, foram construídos alterando pComb3H-HA a ser expresso em um tipo de Fab para melhorar uma cadeia pesada e uma cadeia leve de um anticorpo humanizado em E. coli (J. Immunol Methods (2008) 329 (1-2): 176-83; Virology (2004) 318: 598). Especificamente, uma cadeia leve de 94G1 foi inserida em um vetor designado alterando um marcador AP2 (SEQ ID NO: 42 - NANNPDWDFNP) com um marcador flag (SEQ ID NO: 43 -DYKDDDDK), um marcador flag foi designado estar localizado a jusante do mesmo, e ter uma sequência de cadeia pesada humana (N° de Acesso AB019438) obtida a de dados conhecidos do NCBI GenBank, colocada como um domínio constante em uma posição de cadeia pesada. Além disso, após uma sequência de cadeia leve de 94G1 ter sido clonada no vector, ela foi transferida para E. coli (por exemplo, TG1) (F'[traD36 proAB + lacIqlacZΔM15]supE thi-1 Δ (lac-proAB) Δ(mcrB- hsdSM)5, (rK-mK-) por transformação, seguido por seleção de um vector transformado chamado pCOM-Fab-94G1-L, que foi utilizado como uma cadeia principal para induzir a maturação de afinidade da cadeia leve (Tabela 1). O método acima descrito foi similarmente realizado para a cadeia pesada 94G1, e um vetor selecionado foi chamado pCOM-Fab-94G1-H. Uma cadeia leve melhorada, 94/w, foi designada como a cadeia leve de pCOM-Fab-94G1, que serviu como cadeia principal para a produção de variantes de cadeia pesada com afinidade melhorada.Tabela 1 - Sequências de aminoácidos LCDR 94G1 e 94/w

1.2 . Maturação de afinidade de cadeia leve de anticorpo anti-4-1BB humano humanizado

[00220] É descrito aqui o desenvolvimento de um anticorpo anti-4- 1BB humano humanizado com uma variante de cadeia leve que possui afinidade de ligação melhorada. Um anticorpo com uma alta afinidade foi obtido alterando a LCDR3 (SEQ ID NO: 3) de uma cadeia leve de 94G1 no contexto do vector pCOM-Fab-94G1-L descrito acima como se segue. Várias sequências de DNA codificando uma cadeia leve foram amplificadas por PCR utilizando "iniciadores" [utilizando NNS (N: A, T, C, G; S: C, G)] designados para inserir 19 diferentes aminoácidos em cada posição de aminoácido dos 9 aminoácidos SEQ. ID NO: 3, constituindo a parte LCDR3 da cadeia leve 94G1. Produtos amplificados foram ligados a uma posição de cadeia leve do vetor e então transformados em TG1 de E. coli. Todos os clones com variantes da estrutura de cadeia leve de LCDR3 foram substituídos de diferentes formas e coletados para preparar nove misturas de posição. Para avaliar se cada posição de aminoácido foi substituída por um aminoácido diferente, dois clones alterados nas respectivas posições foram escolhidos aleatoriamente e analisados por sequenciamento usando um sequenciador ABI-3730xl, que mostrou que os resíduos de aminoácidos nas respectivas posições foram substituídos em várias posições.

[00221] Para ver se as variantes de 94G1 Fab com mutações emdiferentes posições de LCDR3 tinham uma afinidade de anticorpo aumentada, cada mistura de posição foi expressa pela adição de IPTG (para uma concentração final de 1 mM) a E. coli TG1, e então anticorpo Fab presente em um sobrenadante foi submetido a ELISA. Especificamente, cada mistura de posição foi cultivada com agitação em um meio 2YT em uma incubadora de 37 °C até a cultura ter uma absorvência a 600 nm de 0,8 ou mais, em seguida cultivada durante a noite a 30 °C com IPTG (por exemplo, em uma concentração final de 1 mM). ELISA foi realizado no dia seguinte em um sobrenadante obtido por centrifugação a 12.000 rpm por 10 minutos a 4 °C. As afinidades de ligação foram determinadas para os vários Fabs variantes de 94G1 LCDR3, dividindo as atividades de ligação de cada clone em relação a Fab de 4-1BB pelos níveis de expressão para o respectivo clone mutante. Uma variante 94G1 LCDR3 com uma posição de mutação 6 de LCDR3 (LCDR3.6) apresentou a maior afinidade de ligação.

[00222] Subsequentemente, para determinar como várias mutações de 94G1 na posição LCDR3.6 impactaram a afinidade de anticorpo, 25 anticorpos monoclonais foram isolados da mistura de posição pCOM- Fab94G1-LCDR3.6 e expressos pela adição de IPTG (por exemplo, em uma concentração final de 1 mM) a E. coli (por exemplo, TG1), cultivada, e ELISA foi realizada em uma molécula de Fab presente em um sobrenadante. As afinidades de ligação foram determinadas para os vários clones de 94G1 LCDR3.6 dividindo as atividades de ligação de Fab de 4-1BB de cada clone pelos níveis de expressão para cada.

[00223] Uma variante 94G1 LCDR3.6 com fenilalanina na posição LCDR3.6 substituída com triptofano exibiu a maior afinidade de ligação. Um anticorpo Fab preparado substituindo a cadeia pesada constante de pCOM-Fab94Gl-L com a cadeia pesada da cadeia principal 94G1 na cadeia leve 94G1 melhorada foi denominado 94/w. Desse modo, uma variante 94/w inclui uma cadeia leve 94G1 melhorada em que o 6° aminoácido de LCDR3 é substituído com triptofano (W) (QDGHSWPPT - SEQ ID NO: 4) e uma cadeia pesada 94G1. A expressão induzida por IPTG em E. coli e ELISA de um Fab de 94/w foi utilizada para determinar a afinidade de ligação como descrito acima. Usando este método, determinou-se que um anticorpo Fab de 94/w tem uma atividade de ligação 3,5 vezes maior do que aquela de 94G1 (anticorpo Fab) (dados não mostrados).1.3 . Maturação por afinidade de CDRs de cadeia pesada de anticorpo anti-4-1BB humano humanizado

[00224] É descrito aqui o desenvolvimento de anticorpos anti-4-1BB humanos humanizados com variantes estruturais da cadeia pesada que têm afinidade de ligação melhorada. Para conseguir mais anticorpos anti-4-1BB humanos melhorados, foi utilizada uma cadeia leve de 94/w como descrito acima e a cadeia pesada 94G1 foi maturada por afinidade. Na Tabela 2, são apresentadas as sequências de aminoácidos de HCDR para uma cadeia pesada de anticorpo 94G1 de referência.Tabela 2 - Sequências de aminoácidos 94G1 e 94K HCDR

[00225] A melhoria de uma cadeia pesada utilizando 94/w como uma sequência de partida foi realizada por métodos similares aos descritos para a cadeia leve de 94G1 acima. Particularmente, para melhorar uma cadeia pesada de 94G1, resíduos de aminoácidos foram substituídos com vários aminoácidos nas respectivas posições de aminoácidos de HDR2 e/ou HCDR3. No caso da terceira CDR da cadeia pesada (HCDR3, SEQ ID NO: 7), clones que foram produzidos com resíduos de aminoácidos de substituição aleatória de 94/w HCDR3 por diferentes aminoácidos foram coletados para preparar 12 misturas de posições. Um clone mutante que aumenta o comprimento do HCDR3 também foi preparado. Quando o 5° resíduo de aminoácido do HCDR3 foi substituído por um aminoácido diferente, foi observado um aumento de afinidade. Posteriormente, para determinar como várias mutações na posição HCDR3.5 impactaram a afinidade do anticorpo 94/w, 19anticorpos monoclonais foram isolados de uma mistura de posição na qual a posição HCDR3.5 do anticorpo 94/w foi aleatoriamente substituída. Fabs variante de HCDR3.5 foram expressos em E. coli por adição de IPTG (por exemplo, para uma concentração de 1 mM) e ELISA foi realizado utilizando um anticorpo Fab presente em um sobrenadante. O sequenciamento identificou que quando treonina foi substituída por lisina na posição HCDR3.5 (5a posição) (SEQ ID NO: 8 - ARSFKTARAFAY), a maior afinidade foi mostrada, e o produto resultante foi chamado 94K/w.

[00226] No caso da segunda CDR da cadeia pesada (HCDR2), uma mistura de posição foi preparada por substituição aleatória de cada um dos 9 aminoácidos de uma 94G1 HCDR2 (SEQ ID NO: 6) para ELISA. Os resultados do ELISA mostraram que quando os resíduos de aminoácidos na 2a., 5a. e 6a. posições foram alterados, a afinidade aumentou. De cada uma das misturas de posição 94/w HCDR2.2, HCDR2.5 e HCDR2.6, os anticorpos monoclonais 22, 19, e 36 foram isolados, respectivamente, e a atividade de ligação de cada clone em relação a 4-1BB foi analisada dependendo de um nível de expressão de Fab. No caso do HCDR2.5, um valor de ELISA foi relativamente maior do que quando asparagina foi substituída por valina (V), glicina (G), ou prolina (P). Além disso, de acordo com dados de sequenciamento para cadeias pesadas de anticorpos, houve um risco de desaminação no 5° aminoácido, asparagina (N), de HCDR2 (SEQ ID NO: 6), e sequências HCDR2 variantes foram também preparadas com substituições neste resíduo com cada uma de glutamina (Q), ácido glutâmico (E), e serina (S).

[00227] DNAs de variantes estruturais de 94G1 com mutações em HCDR3 e/ou HDR2 da cadeia pesada, preparadas como descrito acima, foram amplificados por PCR usando uma sequência de três bases NNS, ligada à posição da cadeia pesada de um vetor tendo um domínio constante da cadeia leve de 94/w, e em seguida transformada em E. coli TG1 pelo método usado na melhoria da cadeia leve como descrito acima.1.4 Otimização de regiões de estrutura de cadeia pesada de anticorpo anti-4-1BB humano humanizado

[00228] Também foram produzidas variantes de cadeia pesada com sequências de estrutura otimizadas. Por exemplo, as regiões de estrutura 1 de cadeia pesada (FR1) foram produzidas onde FR1 de cadeia pesada (SEQ ID NO: 16) foi modificada de modo que o 5° aminoácido, glutamina (Q), foi substituído pela valina (V). Regiões FR1 exemplares são fornecidas na Tabela 3 abaixo.Tabela 3 - FR1 de cadeia pesada de 94G1 e variações da mesma.

[00229] Além disso, as regiões de estrutura 3 (FR3) foramproduzidas onde a FR3 de cadeia pesada (SEQ ID NO: 18) foimodificada como tal: o 10° aminoácido, alanina (A), e/ou o 33°aminoácido, serina (S), que eram sequências murinas, foramsubstituídas por valina (V) e treonina (T), respectivamente. Regiões FR3 exemplificativas são fornecidas na Tabela 4 abaixo.Tabela 4 - FR3 de cadeia pesada de 94G1 e variações da mesma

1.5 Preparação de regiões variáveis anti-4-1BB humanos humanizadas e anticorpos de tamanho natural

[00230] As regiões variáveis de anticorpo anti-4-1BB humano foram produzidas contendo várias combinações das CDRs da cadeia pesada e da cadeia leve acima descritas e regiões estruturais. Por exemplo, um anticorpo 94KVT/w tipo Fab foi produzido com o 5° aminoácido, treonina, na CDR3 de uma cadeia pesada foi substituída por lisina (K), e o 10° aminoácido da FR3 de cadeia pesada, alanina, e o 33° aminoácido de FR3 de cadeia pesada, serina, foram substituídos por valina (V) e treonina (T), respectivamente, para produzir sequência de região variável de cadeia pesada e cadeia leve que são ou incluem SEQ ID NO: 30 e SEQ ID NO: 34, respectivamente. Além disso, foram produzidas variantes da cadeia pesada de 94KVT onde o 5° aminoácido de HCDR2 (SEQ ID NO: 6), (asparagina (N) foi substituído por glutamina (Q), ácido glutâmico (E) ou serina (S). Sequências de domínio variável de cadeia pesada e cadeia leve exemplificativas são fornecidas na Tabela 5 abaixo (sequências CDR sublinhadas).Tabela 5 - Domínios variáveis de anticorpo anti-4-1BB humanohumanizado exemplificativos

[00231] Para a conversão em um anticorpo anti-4-1BB humano detamanho natural (tipo Ig inteiro), um domínio Fc foi conectado ao respectivo Fab. Por exemplo, um Fab de 94K/w composto de uma cadeia pesada em que a treonina é substituída por lisina em HCDR3.5 e uma cadeia leve com variante de 94/w em que o 6° aminoácido deLCDR3 é substituído por triptofano (W), e respectivas regiões estendidas dos domínios CH2 e CH3 e uma sequência de IgG1 humana foram amplificadas por PCR para se sobrepor e submetidas PCR de união para produzir DNA de IgG completo, e então o DNA resultante foi clonado em um vetor de expressão de mamífero. Anticorpos de tamanho natural para outros anticorpos anti-4-1BB humanos humanizados descritos aqui foram produzidos de uma maneira similar. Sequências de região constante de imunoglobulina exemplares são fornecidas na Tabela 6 abaixo.Tabela 6 - Domínios constantes de imunoglobulinaexemplificativos

[00232] Como usado aqui um anticorpo 94KVT/w d e tamanho naturalinclui uma sequência de IgG1, tal como aquela de SEQ ID NO: 22. Adicionalmente, foi produzido um anticorpo de tamanho natural, aqui referido como EU101, que inclui domínios variáveis de 94KVT/w descritos acima (SEQ ID NOs: 10 e 14, para domínios variáveis de cadeia leve e cadeia pesada, respectivamente), com um domínio constante de IgG1 variante que inclui 3 mutações: L234, L235, e K322 (SEQ ID NO: 23). Desse modo, o exemplo fornece vários exemplos de anticorpos anti-4-1BB humanos humanizados e fragmentos de anticorpos que foram modificados para potencialmente realçar a afinidade de ligação a antígeno. Estes anticorpos exemplares e fragmentos são caracterizados nos seguintes exemplos.Exemplo 2 - Caracterização de ligação de anticorpos anti-4-1BB humanos humanizados2.1 Determinação do epitopo de ligação de anticorpos anti-4-1BB humanos

[00233] A presente invenção abrange um reconhecimento de que anticorpos anti-4-1BB humanos humanizados aqui fornecidos podem ser úteis para a coestimulação de 4-1BB. Aplicações terapêuticas de anticorpos da presente invenção podem incluir a promoção da imunidade anticâncer e/ou imunidade antiviral. Entretanto, para aplicações clínicas, é importante identificar qual parte do 4-1BB humano é reconhecida por e/ou reage com um anticorpo 4-1BB anti-humanizado (isto é, um epitopo de ligação). Anticorpos 4-1BB que reconhecem diferentes epitopos da molécula de 4-1BB foram identificados, e estes anticorpos podem ter sido provados ter efeitos clínicos diferentes. (Ver, por exemplo, Kwon et al., Eur. J. Immunogenetics (2002) 29: 449-452, aqui incorporado por referência na sua totalidade). O mapeamento de epitopo abrange métodos para identificar um determinante molecular de reconhecimento de antígeno de anticorpo. Este exemplo descreve o mapeamento de epitopo de um anticorpo anti-4-1BB humano exemplar como modificado no Exemplo 1 acima. Especificamente, este exemplo avalia o epitopo de ligação de um anticorpo anti-4-1BB humano humanizado com domínios variáveis de 94KVT/w, EU101.

[00234] Um antígeno 4-1BB humano para investigação de um epitopo do anticorpo 4-1BB humanizado é derivado de uma biblioteca de cDNA fabricada de linfócitos de sangue periférico humano que foi gerada por pelo menos alguns dos inventores do presente pedido (ver, por exemplo, Kwon et al., Cellular Immunology (1996) 169: 91-98; Immunol Lett. (1995) 45: 67-73; e Patente Coreana No. 10-0500286, cada uma das quais é aqui incorporada por referência). O cDNA codificando um domínio extracelular (ECD) do homólogo humano obtido do cDNA 4-1BB (daqui em diante referido como H4-1BB) foi selecionado, fundido com GST, e em seguida inserido em um vetor (pGEX-6T) para expressar. Uma linhagem celular produzindo um polipeptídeo de fusão GST-4-1BB como usado aqui, foi depositada como parte da invenção da Patente Coreana No. 10-0500286, N° de Acesso: KCTC 0952BP. Uma sequência de tamanho natural de 4-1BB humano é fornecida como SEQ ID NO: 44, abaixo. O domínio extracelular de 4-1BB humano corresponde aos aminoácidos 1 a 167 da sequência H4-1BB de tamanho natural.SEQ ID NO:44 -Sequência 4-1BB humana de tamanho natural MGNSCYNIVATLLLVLNFERTRSLQDPCSNCPAGTFCDNNRNQICSP CPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAECDCTPGF HCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGCKDCCFGTFNDQKRGICRPW TNCSLDGKSVLVNGTKERDVVCGPSPADLSPGASSVTPPAPAREPG HSPQIISFFLALTSTALLFLLFFLTLRFSVVKRGRKKLLYIFKQPFMRPV QTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL

[00235] Para determinar um epitopo de 4-1BB reconhecido por anticorpos anti-4-1BB humanos humanizados da presente invenção, foram geradas construções com fragmentos de um domínio extracelular 4-1BB de vários tamanhos (por exemplo, R1, R2, R3), fundido a GST, e replicado. Um esquemático de polipeptídeos GST-4-1BB como utilizado no presente exemplo é fornecido na FIG. 1a, e sequências iniciadoras exemplares usadas aqui para gerar diferentes construções de domínio extracelular de 4-1BB são fornecidas na Tabela 7 abaixo. Construções GST-H-4-1BB recombinantes individuais foram cultivadas com IPTG a 1 mM de cultura e produzidas em células BL21DX5α de E. coli, e os polipeptídeos de fusão foram purificados utilizando uma coluna de glutationa-agarose.Tabela 7 - Iniciadores exemplares usados para gerar fragmentos de domínio extracelular de 4-1BB úteis para mapeamento de epitopo

[00236] Amostras de proteínas purificadas foram obtidas de célulasbacterianas transformadas por um tampão de lise (por exemplo, Tris- HCl a 10 mM - pH 7,4, NaCl a 50 mM, EDTA a 5 mM, NaF a 30 mM, Na3VO4 a 0,1 mM, 1% de Triton X-100, 0,5% de Nonidet P-40, PMSF a 1 mM e mistura inibidora de protease). Aproximadamente 20 μg de cada amostra de polipeptídeo de fusão foram diluídos em um tampão amostra de 4X SDS, submetidos à eletroforese em géis de SDS-PAGE, e em seguida transferidos para membranas de nitrocelulose (Millipore, Bedford, MA). Nas membranas de celulose, mAb de anti-4-1BB humano foi reagido com peróxido de rábano picante (HRP) de IgG anticamundongo. Anticorpos de ligação foram reconhecidos por quimioluminescência realçada (ECL) (Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, UK).

[00237] Como descrito acima e mostrado na FIG. 1B, quando cada um dos três polipeptídeos de fusão GST-fragmento H4-1BB ECD não sobrepostos, R1, R2, e R3, foram tratados com ligação a GST,respectivamente. Determinou-se que um anticorpo humanizado anti-4- 1BB exemplar englobado pela presente invenção (EU101) liga-se a uma construção de fusão de construção de fragmento N-terminal (R1) de aproximadamente 32 kDa (aminoácidos 1 a 55 de 4-1BB) por Western Blotting. Além disso, essa ligação foi específica, uma vez que não foi observada nenhuma ligação com qualquer das construções de fusão R2 ou R3. Veja a FIG. 1B.

[00238] Além disso, para determinar o sítio de ligação mínimo do anticorpo anti-4-1BB humanizado, um fragmento de domínio extracelular R1 foi ainda dividido em 6 fragmentos menores: fragmentos de polipeptídeo R1.1 (aminoácidos 1 a 45 de 4-1BB), R1. 2 (aminoácidos 1 a 35 de 4-1BB), R1.3 (aminoácidos 11 a 55 de 4-1BB), R1.4 (aminoácidos 21 a 55 de 4-1BB), R1.5 (aminoácidos 1 a 25 de 4 - 1BB), e R1.6 (aminoácidos 1 a 30 de 4-1BB), como representado na FIG. 1A, e fundido a GST (Glutationa S-Transferase, 27 kDa). Pares de iniciadores exemplificativos utilizados para a geração destas construções são fornecidos na Tabela 7 acima. As construções de polipeptídeo de fusão foram produzidas em células E. coli BL21 com indução IPTG (por exemplo, IPTG 1 mM) e o extrato celular bacteriano inteiro foi resolvido por SDS-PAGE a 12%. Como mostrado na FIG. 2A, SDS-PAGE confirmou que polipeptídeos de fusão 4-1BB individuais são bem expressos.

[00239] SDS-PAGE foi transferido para uma membrana de nitrocelulose e imunomanchamento foi feito utilizando um anticorpo anti- 4-1BB humano exemplar, EU101. Como mostrado na FIG. 2B, confirmou-se que uma sequência de aminoácidos 10 a 30 do domínio extracelular de H4-1BB é significativa para ligação de um anticorpo anti- 4-1BB humanizado exemplar. Esta análise indica que um anticorpo anti- 4-1BB humano exemplar da presente invenção (EU101) liga-se a um epitopo de 4-1BB humano cuja sequência é ou inclui CPAGTFCDNNRNQICSPCPP (SEQ ID NO: 15). Foi confirmado também que uma sequência incluindo aminoácidos 35 a 50 do domínio extracelular 4-1BB não é significante para a ligação de um anticorpo humanizado exemplar aqui descrito (Figura 2B).2.2 Avaliação da afinidade de ligação de anticorpos anti-4-1BB humanos humanizados exemplares ao antígeno 4-1BB Capacidade de ligação de anticorpos anti-4-1BB humanosexemplares

[00240] Para examinar a capacidade de ligação de anticorpos anti-4- 1BB humanos humanizados exemplares descritos no Exemplo 1 a um antígeno 4-1BB humano (H4-1BB), ELISA foi realizado. Foi utilizado 4- 1BB humano recombinante expresso por E. coli para o antígeno.

[00241] Um anticorpo BBK-4 murino, um anticorpo humanizado 94G1 de referência, e anticorpos modificados exemplares 94K, 94KV, 94KVT e EU101 como descrito no Exemplo 1 foram cada um tratado em placas de 96 cavidades revestidas com a proteína recombinante de domínio extracelular 4-1BB marcado com histidina (H4-1BB). A análise de afinidade ELISA exemplificativa empregou um volume total de 100 μl em uma concentração de 1,0 μg/ml, e a reação foi deixada prosseguir em temperatura ambiente durante 1 hora. IgG anti-humano marcado por peroxidase de rábano picante (HRP) e anti-mIgG-HRP, conforme apropriado, reconhecendo um anticorpo foi tratado por ele, e deixado reagir em temperatura ambiente por 40 minutos. Após lavagem, tratamento com solução de ABTS (Sigma-Aldrich), que é um substrato para uma reação de coloração, e a reação para permitir prosseguir em temperatura ambiente por 30 minutos, e uma absorvência a 450 nm na reação de coloração foi detectada usando uma leitora de ELISA para analisar uma atividade de ligação dos anticorpos. Os resultados são mostrados na FIG. 3. Como mostrado na FIG. 3, à medida que aumenta a concentração de anticorpos, a ligação entre cada anticorpo e o antígeno 4-1BB (H4-1BB) é melhorada. Estes dados confirmam que os anticorpos abrangidos pela presente invenção ligam-se especificamente a 4-1BB.Ligação de anticorpos anti-4-1BB humanos exemplares aoantígeno expresso na célula

[00242] A capacidade de anticorpos anti-4-1BB humanoshumanizados exemplares para se ligar a um antígeno 4-1BB humano (H4-1BB) em um contexto celular foi avaliada. Células Jurkat 8-1 foram geneticamente modificadas para superexpressão de 4-1BB. Anticorpos modificados exemplificativos 94K, 94KV, 94KVT e EU101 como descrito no Exemplo 1, juntamente com o de um anticorpo BBK-4 de murino, e um anticorpo humanizado 94G1 de referência foram avaliados quanto à ligação a células Jurkat 8-1 utilizando um anticorpo secundário anti- mIgG-HRP ou anti-hIgG-HRP, como apropriado, e analisados por FACS. Como mostrado na FIG. 4, cada um dos anticorpos foi capaz de se ligar eficazmente a 4-1BB expresso pelas células Jurkat 8-1 e a afinidade de 94KVT e EU101 foi maior do que a de BBK-4 e 94G1.Afinidade de ligação in vitro de anticorpos anti-4-1BB humanos exemplares ao antígeno

[00243] Afinidade de ligação in vitro do anticorpo EU101 modificado exemplar como descrito no Exemplo 1, juntamente com a de um anticorpo humanizado 94G1 de referência, foi cada uma determinada por análise Biacore. IgG anti-humano foi imobilizado em um chip CM5, e acoplado aos anticorpos Fab preparados acima fluindo sobre o chip, e finalmente reagiu com um antígeno 4-1BB humano (H4-1BB) para medir a atividade de ligação entre o anticorpo e o antígeno (Biacore3000, chip sensor CM5). Os resultados da medição de afinidade são mostrados na FIG. 5. Os valores Ka (1/Ms) e Kd (1/s) representam a rapidez com que um anticorpo associa-se com e dissocia-se de um antígeno, respectivamente. Uma constante de dissociação (KD) é obtida dividindo-se Kd por Ka (Kd / Ka = KD).

[00244] À medida que uma constante de dissociação diminui, pode- se interpretar que a dissociação ocorre em uma menor concentração e que a afinidade está aumentando. Como mostrado na FIG. 5, o anticorpo anti-4-1BB humano modificado exemplar tinha afinidade de ligação melhorada relativa a um 94G1 de referência.Anticorpos anti-4-1BB humanos exemplares reconhecem 4-1BB expresso por células T CD8+ ativadas

[00245] As células T CD8+ foram isoladas a partir de PBMCs humanas e ativadas com 1 μg/mL de anticorpo anti-CD3 por 2 dias. A capacidade de anticorpos anti-4-1BB humanos humanizados exemplares (94K, 94KV, 94KVT e EU101) descritos no Exemplo 1 para detectar um 4-1BB sobre a superfície de células T CD8+ ativadas foi avaliada em relação a um anticorpo anti-4-1BB comercialmente disponível exemplar (4-1BB-PE). É também mostrada a detecção com um anticorpo anti-4-1BB humano murino BBk-4 e um anticorpo humanizado de referência 94G1. Tratamento com anticorpos 4-1BB foi em uma concentração de 25 ng/ml.

[00246] Anticorpos exemplares foram detectados com um anti-mIgG- Dylight488 ou anti-hIgG-Dylight488, conforme apropriado, e analisados por FACS. Os resultados são mostrados na FIG. 6. Enquanto um anticorpo de 94G1 de referência detectou 4-1BB em 17,93% de células T CD8+, cada de um anticorpo 94KVT e EU101 apresentou detecção robusta de 25,3% e 28,33%, respectivamente. Demonstrando que anticorpos exemplificativos 94KVT e EU101 ambos apresentavam propriedades de ligação melhoradas em relação a BBK-4 e 94G1. Desse modo, anticorpos variantes humanizados da presente invenção têm ligação superior às células T ativadas in vitro.Exemplo 3 - Análise de eficácia in vitro de anticorpos anti-4-1BB humanos humanizados

[00247] Anticorpos anti-4-1BB demonstraram anteriormente fornecer estimulação de sinal a uma molécula de coestimulação expressa em células T CD8+ ativadas, 4-1BB, para ativar as células T CD8+, induzir proliferação e aumentar expressão de citocinas do tipo TH1. Neste exemplo, foi examinada a atividade de anticorpos anti-4-1BB humanos humanizados exemplares descrita no Exemplo 1 induzir a proliferação de células T CD8+ e expressão de citocina do tipo TH1.3.1 Os anticorpos anti-4-1BB humanos exemplares induzem a proliferação celular de células T CD8+

[00248] Para avaliar a proliferação de células T CD8+, células foram manchadas com WST-1 (sal de tetrazólio solúvel em água) que é um reagente de proliferação celular. As células T CD8+ marcadas com WST-1 foram preparadas e ativadas com 0,5 μg/ml de anticorpo anti- CD3. As células T CD8+ ativadas foram tratadas com 1,0 μg/ml de anticorpo de controle de isótipo, anticorpo BBK-4 murino, anticorpo 94G1 de referência, e anticorpos anti-4-1BB humanos humanizados exemplares (94K, 94KV, 94KVT e EU101) descritos no Exemplo 1. As células foram analisadas usando um sistema MACS e os resultados são mostrados na FIG. 7. Com referência à FIG. 7, confirmou-se que anticorpos anti-4-1BB humanos humanizados exemplares da presente invenção induzem a proliferação celular de células T CD8+. Além disso, um grau de ativação de célula T CD8+ aumenta em uma ordem de 94G1 < 94K / 94KV < 94KVT / EU101.3.2 Anticorpos anti-4-1BB humanos exemplares estimulam a secreção de citocina

[00249] O IFN-Y é uma citocina representativa primariamente secretada de um linfócito T ou uma célula exterminadora natural (célula NK) e exibindo atividades de proliferação e antivirais. Além disso, o IFN- y é um importante ativador para um macrófago e, particularmente, uma importante citocina que distingue as células TH1 de outros tipos de células. A secreção de IFN-Y desempenha um papel importante na ativação de células T citotóxicas, fagócitos e células B. Consequentemente, a eficiência de um agente anticâncer pode ser avaliada com uma quantidade aumentada de IFN-Y indutor de TH1. Por esta razão, a medição da secreção de IFN-Y por estimulação específica pode ser um padrão ideal que pode ser usado como um critério quantitativo para uma mudança funcional de células T.

[00250] Células T CD8+ foram isoladas de PBMCs humanas etratadas com 0,5 μg/ml de um anticorpo mAb anti-CD3 e, em seguida, tratadas sem nenhum anticorpo, ou com 1,0 μg/ml de um anticorpo anti- 4-1BB: BBK-4, 94G1,94K, 94KV, 94KVT e EU101. A secreção de IFNY foi avaliada nos dias 1, 3, e 5. Os resultados são mostrados na FIG. 8. Como pode ser visto na FIG. 8, a secreção de IFNYaumentou em todas as amostras de tratadas com o anticorpo anti-4-1BB, e este aumento correlacionou-se com a duração do tratamento com o anticorpo. Tratamento com os anticorpos 94KVT e EU101 atingiu um nível de secreção que foi 13 vezes maior do que o grupo de controle no dia 5. Por conseguinte, os anticorpos humanizados exemplares 94KVT e EU101 podem ambos induzir a secreção de IFNy mais eficientemente do que o anticorpo de referência 94G1.3.3 Aumento do nível de IFN-Y de acordo com o tratamento de células T CD4+ ativadas ou células T CD8+ com um anticorpo anti- 4-1BB humano exemplar

[00251] O sangue foi coletado de três doadores saudáveis, PBMCs obtidas deles foram isoladas por centrifugação gradiente de placa Ficoll, células T ativas presentes nas PBMCs foram descansadas em um meio RPMI-1640 + FBS a 2% durante 24 horas. As PBMCs descansadas foram tratadas com um anticorpo anti-CD4 ou anticorpo anti-CD8 ligado a contas de ferro, e células T CD4+ ou células T CD8+ foram isoladas, usando um separador magnético de MACS. As células T CD4+ ou células T CD8+ isoladas foram tratadas com um ativador de célula T, anti-CD3, para induzir expressão de 4-1BB, e tratadas com EU101 em diferentes concentrações (0,5, 1,0, 2,5, e 5,0 μg/ml) durante 3 dias. Após 3 dias, um meio de cultura excluindo as células foi obtido, e fluorescência de IFN-y no meio de cultura foi avaliado por ELISA (ebioscience), e o resultado foi comparado com a curva padrão fornecida em um kit IFNy-ELISA (FIG. 9).

[00252] Como mostrado na FIG. 9, os níveis de expressão de IFN-y nas células T CD4+ e células T CD8+ aumentaram de forma dependente da dose. Particularmente, quando 5,0 μg/ml de EU101 foram tratados, comparado com um aumento de 278% nas células T CD4+, o nível de expressão de IFN-y aumentou 612% nas células T CD8+. De acordo com o padrão de expressão específico de células T de IFN-y envolvido na conversão das células T em TH1, um anticorpo anti-4-1BB humano exemplar da presente invenção, EU101, tem atividade in vitro suficiente para sugerir que pode ser eficaz para prevenção e/ou tratamento de câncer.3.4 Medição das atividades de ADCC e CDC de um anticorpo anti- 4-1BB humano exemplar

[00253] Um sistema imunológico reconhece e ataca células infectadas por vírus ou células de câncer, e anticorpos podem ser usados para induzir a apoptose mediada por citotoxicidade. Para tal sistema imunológico, dois tipos de mecanismos, tal como a citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) e citotoxicidade dependente de complemento (CDC), podem ser usados. Em ambos os casos, a apoptose pode ser mediada por um anticorpo que se liga a um alvo na superfície celular. Isto é, quando um anticorpo tem uma atividade ADCC, uma célula reconhecida pela molécula resulta em apoptose mediada por uma célula exterminadora natural (NK), e quando um anticorpo tem uma atividade de CDC, a morte é mediada por uma proteína do complemento. Portanto, no caso do desenvolvimento de uma terapêutica antagonística de anticorpo, um grau de células exterminadoras reconhecidas por um anticorpo pode ser identificado através de análises das atividades das ADCC e CDC. Entretanto, um alvo para o anticorpo 4-1BB humanizado descrito na presente invenção é células T, não células de câncer. Isto é, considerando-se um mecanismo para induzir a ativação de células T pela ligação de um anticorpo 4-1BB como um anticorpo agonístico, um anticorpo que não tenha as atividades de ADCC e CDC pode ser preferivelmente para usos terapêuticos.

[00254] Na presente invenção, para um ensaio de ADCC, PBMCs humanas foram isoladas por centrifugação Ficoll utilizando a mesma diferença de densidade. As PBMCs foram incubadas em RPMI (Thermo Fisher Scientific) e 10% de FBS com IL-2 (100 U/ml) durante a noite cultivadas. Células-alvo (linhagens celulares expressando 4-1BB) foram coletadas, ressuspensas em meio de cultura a 1 ml, e marcadas com 5μM de CFSE a 37°C por 5 minutos. As células efetoras/alvo da presente invenção foram lavadas em uma relação de 10:1, contadas e então dispensadas. Para análise, um anticorpo da presente invenção foi preparado para uma concentração final de 10 nM (1,5 μg/mL), e cultivado em uma placa a 37°C durante 4 horas. Foram adicionados 5 μl de 7-AAD a cada cavidade e transferidos para um tubo FACS, e em seguida a amostra foi analisada por FACS fabricado por BDFACScan. As frequências de células-alvo não viáveis (CFSE+ 7-AAD+) e células- alvo viáveis (CFSE+ 7-AAD-) foram medidas. A ADCC foi avaliada com uma frequência de células viáveis das células totais (FIG. 10A).

[00255] Um ensaio de citotoxicidade dependente de complemento (CDC) foi conduzido de forma similar ao ensaio ADCC descrito acima, utilizando FACS como um valor de leitura, com as células alvo acima incubadas com anticorpos anti-4-1BB em gelo por 30 minutos e em seguida adicionado o soro suplementado humano em uma concentração final de 20% a 37°C durante 30 minutos. Posteriormente, as amostras resultantes foram transferidas para um tubo FACS, e avaliadas por FACS fabricadas pela BDFACScan (FIG. 10B). Os resultados na FIG. 10A e FIG. 10B confirmam que um anticorpo 4-1BB humanizado exemplar, EU101, quase não tem efeitos de ADCC e CDC. Portanto, pode-se dizer que um anticorpo EU101 exemplar da presente invenção tem propriedades ADCC e CDC benéficas para um anticorpo agonista, e é um bom candidato para tratamento anticâncer in vivo.Exemplo 4 - Confirmação da eficiência in vivo de um anticorpo anti- 4-1BB humano humanizado exemplar

[00256] O anticorpo anti-4-1BB humano, EU101, da presente invenção mostrou um efeito dose-dependente em um exemplo in vitro, e mostrou um efeito consideravelmente superior a um anticorpo convencional. Este exemplo é para verificar se o anti-humano anti-4- 1BB humano, EU101, é capaz de ser utilizado isoladamente ou em combinação com uma composição diferente para diagnosticar, prevenir ou tratar câncer ou tumor in vivo, e para inibir eficazmente o crescimento de tumor.4.1 Enxerto de camundongos NOD-scid IL2Rgamanull de células mononucleares de sangue periférico humano e atividade antitumoral de anticorpo anti-4-1BB humano.

[00257] O sangue venoso periférico coletado de um doador sadio do tipo HLA-A24 foi tratado com heparina, e submetido à centrifugação em gradiente de concentração em Ficoll-paque (GE Healthcare, Piscataway, NJ) para colher PBMCs. As PBMCs foram lavadas com o meio RPMI-1640, e 3x106 das células foram injetadasintraperitonealmente em camundongos imunodeficientes, isto é, camundongos NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ; NOD-scid IL2rynull, Jackson Laboratory).

[00258] A análise de camundongos humanizados foi realizada por citometria de fluxo para verificar se as células T humanas estavam presentes no sangue coletado de camundongo por coleta de sangue orbital de camundongo após 5 semanas do enxerto de PBMCs humanas. Camundongos NSG de 7 semanas de idade (Jackson Laboratory, Barharbor, ME) foram engenheirados sob um ambiente isento de patógenos específico (SPF).

[00259] Citometria de fluxo foi realizada para verificar as relações de CD4 e CD8 após as células serem manchadas com marcadores de células sanguíneas humanas tal como um anticorpo CD45 marcado por fluorescência APC-cy7 e um anticorpo CD4 marcado com fluorescência FITC e um anticorpo CD8 marcado por fluorescência BV510. Após a coleta de sangue orbital de cada camundongo, células T humanas de amostras de sangue de camundongo foram observadas para verificar se um sistema imunológico humano é enxertado no camundongo. Células tumorais humanas foram preparadas em um modelo de camundongo humanizado tipo HLA e 1 x 107 células foram subcutaneamente injetadas no dorso de cada camundongo. Quando um tamanho de tumor atingiu 100 a 200 mm3, uma preparação de anticorpo anti-4-1BB humano exemplar (EU101) foi intravenosamenteadministrada a 1,0 mg, 5,0 mg ou 10,0 mg por 1 kg de peso corporal uma vez a cada 5 dias em um total de 3 vezes. Como um controle, IgG humana foi usada. O volume do tumor (mm3) de cada camundongo foi medido a cada 3 dias (FIG. 11). Resultados mostrados na FIG. 11 confirmam que o tamanho do tumor em camundongos tratados com um anticorpo anti-4-1BB humano exemplar (EU101) foi reduzido em relação aos camundongos tratados com IgG humana, e além disso que essa redução foi proporcional à concentração de anticorpo. Particularmente, a regressão do tumor em um grupo administrado 5 mg/kg de anticorpo ocorreu rapidamente. Dentro de uma semana após administração a uma dose de 5 mg / kg, o tamanho do tumor estabeleceu-se em um camundongo humanizado e o crescimento do tumor foi erradicado. Portanto, um anticorpo exemplar EU101 da presente invenção mostra um efeito anticâncer in vivo.

[00260] Consequentemente, os resultados acima mostram que um anticorpo anti-4-1BB humano exemplar (EU101) que reconhece especificamente um epitopo (SEQ ID NO: 15) de H4-1BB, porém devido a características melhoradas deste anticorpo exemplar, tal como, por exemplo, afinidade melhorada, este anticorpo mostra efeitos superiores em um modelo de camundongo in vivo. Desse modo, o exemplo sugere que um anticorpo englobado pela presente invenção pode ser usado como um agente anticâncer em uma dosagem menor que o anticorpo de referência.4.2 Efeitos da inibição do crescimento tumoral com um anticorpo anti-4-1BB humano exemplar e um agente anti-PD-1Comparação de efeitos causados por tratamento individual de um anticorpo anti-4-1BB humano exemplar (EU101) e um agente anti- PD-1 exemplar após injeção de tumor a camundongos humanizados.

[00261] Camundongos humanizados foram preparados pelo mesmo método descrito no Exemplo 4.1 acima. Para realizar um experimento confirmando um aumento em efeito anticâncer de acordo com doses de um anticorpo anti-4-1BB humano exemplar (EU101) e um agente anti- PD-1 exemplar (Keytruda) (adquirido da MSD, GER), 1x107 células de uma linhagem celular de adenocarcinoma colorrectal humano combinado com o HLA-A, HT29, foram subcutaneamente injetadas nos camundongos humanizados previamente preparados. Quando o volume do tumor injetado atingiu 100 a 150 mm3, os camundongos foram divididos em um total de 5 grupos de três camundongos, e para comparar o efeito do EU101 sobre a inibição tumoral, cada grupo de camundongos foi tratado com cada de três condições de administração (Controle: IgG, grupo tratado 1: 5 mg/kg, e grupo tratado 2: 10 mg/kg) em intervalos de 5 dias 3 vezes, e para anti-PD-1, os mesmos procedimentos foram realizados (FIG. 12). Como resultado do experimento, em ambos os casos de EU101 e keytruda (anti-PD1), os volumes tumorais foram reduzidos de forma dependente da dose. Entretanto, na FIG. 12, 5 mg/kg de EU101 não tiveram uma influência no crescimento do tumor, porém de acordo com o tratamento com 5 mg/kg e 10 mg/kg de EU101, uma atividade antitumoral foi exibida de modo dependente da dose. Além disso, foi confirmado que EU101 exibiu maior eficiência em uma dose menor do que keytruda (anti-PD- 1), e o crescimento do tumor foi completamente bloqueado particularmente pelo tratamento com 5 mg/kg de EU101.Tratamento de camundongos humanizados com combinação de EU101 e um agente anti-PD-1 após injeção de tumor

[00262] Visto que sinais de receptores co-inibitórios (PD-1 e CTLA- 4) e um sinal de célula T de coestimulação (CD137), são diferenciados para o mesmo propósito de inibir o crescimento tumoral, a estimulação dos dois receptores pode esperar um efeito sinérgico (Chen et al., Cancer Imunol. Res. (2015) 3: 149-160; Bartkowiak et al., Front. Oncol. (2015) 5: 117, ambos aqui incorporados por referência). Além disso, a imunoterapia de PD1 mostrou a possibilidade de um efeito detratamento anticâncer para algumas populações de pacientes de câncer, porém a administração de uma baixa dose em terapia decombinação com um diferente agente anticâncer pode ainda serrequerida em uma população de pacientes mais extensa. Parainvestigar o efeito antitumoral causado por uma terapia de combinação de um anticorpo anti-4-1BB humano exemplar (EU101) e um agente anti-PD-1 exemplar (Keytruda), camundongos humanizados transportando tumor foram tratados com a terapia de combinação de EU101 e Keytruda. A preparação de camundongos humanizados foi realizada pelo mesmo método como descrito no Exemplo 4.1.

[00263] Sangramento ocular foi realizado para identificar camundongos humanizados. Entre os camundongos humanizados, HT29, o carcinoma de cólon foi subcutaneamente injetado em camundongos HLA-A24 mantendo uma condição normal a 1x107 células / camundongos. Quando o tamanho do tumor era 300 a 450 mm3, um experimento foi realizado como segue.

[00264] Como conhecido a partir deste exemplo, embora o crescimento do tumor não tenha sido retardado com a injeção individual na concentração mínima ou menos (EU101: 2,5 mg/kg, Keytruda(fabricado por MSD, GER): 2,5 mg/kg), tumor foi enormemente regredido com terapia de combinação de EU101 e Keytruda. Este é o resultado que mostra que anticorpos anti-4-1BB humanos exemplares aqui fornecidos (por exemplo, EU101) são bons candidatos para a terapia de combinação com diferentes agentes anticâncer, incluindo em combinação com um ou mais inibidores do ponto de verificação imunológico. (FIG. 13).Análises de linfócitos infiltrantes de células T (TILs) em tecido normal e tecido de adenocarcinoma colorretal humano após o tratamento individual e em combinação de um anticorpo anti-4-1BB humano exemplar e um agente anti-PD-1 exemplar.

[00265] Após administração individual de um anticorpo anti-4-1BB humano exemplar (EU101) e um agente anti-PD-1 exemplar (Keytruda) (adquirido da MSD, GER) e administração de combinação de EU101 e Keytruda a camundongos humanizados implantados HT29, no dia em que a análise de efeito é terminada, todos os grupos foram dissecados para separar tumor e sangue. Após o tumor separado ser tratado com colagenase IV a 37°C por 30 minutos, as células do tecido tumoral foram dissociadas por um método mecânico e em seguida lavadas com 1xPBS. As PBMCs foram separadas do sangue separado por centrifugação gradiente de Ficoll, e as células tumorais separadas e as PBMCs foram submetidas ao seguinte experimento. Os glóbulos vermelhos (RBCs) foram removidos das células lavadas usando tampão de lise RBC e em seguida lavadas com 1xPBS. Os fragmentos celulares emaranhados foram removidos das células lavadas utilizando um filtro celular de náilon de 40 μm para criar um estado de células individuais, e as células individuais foram lavadas com 1xPBS, seguido por contagem de células T separadas de cada grupo utilizando uma contadora de células.

[00266] As células T separadas foram manchadas com marcadores de células sanguíneas humanas tal como um anticorpo CD45 (marcado por APC-cy7 fluorescente), um anticorpo CD4 humano marcado com FITC fluorescente e um anticorpo CD8 humano marcado com BV510 fluorescente e em seguida submetidas a ensaio FACS. O ensaio FACS foi realizado com base em uma relação (%) de grupos de células CD4 e CD8, que foram excluídas do grupo CD45 (FIG. 14A).

[00267] Particularmente, para identificar um grupo Treg entre as células T separadas, as superfícies das células foram manchadas com marcadores de células sanguíneas humanas, tal como um anticorpo CD45 (marcado com APC-cy7 fluorescente), um anticorpo CD4 marcado por FITC humano fluorescente e um anticorpo CD25 marcado com PE-cy5 fluorescente humano, e manchamento intracelular e intranuclear com um fator de transcrição celular Foxp3 (anticorpo Foxp3 marcado com APC fluorescente humano) foi realizado utilizando um kit Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set (ebioscience). No ensaio FACS, um grupo CD45 foi separado para fechar o canal R1, um grupo CD4+ CD25high foi separado para fechar R2, e uma relação (%) de um grupo Foxp3high foi medida nos grupos R1 e R2. Para identificar as células T IFN-y+ CD8+ nas células separadas, as superfícies celulares foram manchada com os marcadores de célula sanguínea tal como o anticorpo CD45 humano marcado com APC-cy7 fluorescente e o anticorpo CD8 humano marcado com BV510 fluorescente, fixadas com PFA a 2%, e reagidas com uma solução de saponina a 0,5% e anticorpo IFN-y humano IFN-Y marcado com PE-cy7 fluorescente. Posteriormente, células IFN-y+ de citocina no grupo de células T CD8 foram medidas por ensaio FACS. As células foram identificadas em uma relação pelo mesmo método como descrito acima e uma relação proporcional da relação CD8+IFN-y+ e a relação de Treg foi calculada, mostrada na FIG. 14B.

[00268] De acordo com o resultado desta modalidade, diferente da administração individual, a administração de combinação de EU101 e Keytruda aumentou enormemente a infiltração da combinação de tecido tumoral e um linfócito T. Outros resultados mais específicos do tratamento com combinação são como segue. Quando o tratamento de com combinação foi realizado nas PBMCs no camundongo humanizado sadio como um controle, o número de linfócitos aumentou aproximadamente 3 vezes, e os linfócitos infiltrados por 1 g de tumor aumentaram 76 vezes no tecido tumoral. Isto significa que a maioria dos linfócitos específicos de tumor foram ativados e recrutados para o tecido tumoral para matar as células alvo. Particularmente, quando PBMCs no grupo de terapia de combinação foram medidas, como mostrado na FIG. 14A, as células T CD4+ não aumentaram muito, mas as células citotóxicas T CD8+ foram aumentadas em aproximadamente 5 vezes. Além disso, o grupo de terapia de combinação mostrou um aumento de 100 vezes na contagem de células T CD8+ por 1 g de tecido tumoral. Além disso, como um resultado, uma relação de células T CD8+ secretando IFN-y e células T regulatórias foi também enormemente aumentada (FIG. 14B). Isto é, pode-se dizer que o tratamento com combinação de EU101 e agente anti-PD-1 proporciona um aumento acentuado das células T efetoras e, desse modo, a inibição do tumor é efetivamente realizada.Análises de IFN-Y em soro ou fluido tumoral obtido de tecido de adenocarcinoma colorretal humano após tratamento individual e de combinação com um anticorpo anti-4-1BB humano exemplar (EU101) e um agente anti-PD-1 exemplar (Keytruda)

[00269] Após administração individual e uma administração de combinação de um anticorpo anti-4-1BB humano exemplar (EU101) e um agente anti-PD-1 exemplar (Keytruda) a camundongos humanizados implantados com HT29. No dia em que as análises de efeito foram terminadas, todos os grupos foram dissecados para separar tumor e sangue. Na dissecação do tumor para separar um fluido tumoral presente no tumor separado, 300 μl de 1x PBS foi injetado na porção superior de uma membrana tumoral usando uma seringa de 1 cc, e uma solução fluente é retirada da porção inferior da membrana do tumor usando uma seringa de insulina. Além disso, na dissociação do tecido tumoral, a solução tomada foi adicionada para dissociar o tecido tumoral e em seguida armazenada. Além disso, como soro, o soro foi armazenado quando PBMCs foram separadas do sangue por centrifugação gradiente de Ficoll. O soro armazenado e um fluido tumoral foram dissolvidos e filtrados usando uma unidade filtrante de 0,22 μm (fabricante: Corning). Foram utilizados 10 μl de soro para cada grupo, e 100 μl do fluido tumoral foram usados para medir o IFN-y humano e o TGF-β humano usando um kit Human IFN-Y ELISA Ready-SET-Go (eBioscience) e um kit Human TGF beta 1 ELISA Ready-SET- Go (eBioscience). Os resultados foram analisados comparando a curva padrão fornecida em cada kit ELISA.

[00270] Como resultado, comparado à administração individual de EU101 e Keytruda, na administração de combinação, a concentração de interferon no soro do grupo tumoral foi a mais alta. Uma vez que um mecanismo EU101 pode ser explicado com uma correlação entre IFN-y e um efeito antitumoral, níveis de expressão de IFN-y e TGF-β em soro de um doador saudável e soro de um grupo de tumor, ao qual a terapia de combinação foi aplicada, foram avaliados. De acordo com o material do exemplo no soro do dador saudável, no grupo de terapia de combinação mostrado na FIG. 15A, IFN-y foi aumentado aproximadamente 16 vezes, porém uma citocina secretada de células Treg, TGF-β, foi reduzido aproximadamente 65%. Além disso, na FIG. 15B, a concentração de IFN-y causada pela administração de combinação no fluido tumoral foi consideravelmente maior (aproximadamente 213 vezes) do que no controle. Como resultado dos exemplos, devido a EU101, particularmente, em comparação com o grupo de controle, o grupo de combinação mostrou aumentos acentuados na secreção de IFN-y. Portanto, pode ser confirmado que o efeito anticâncer causado por um melhorado anticorpo 4-1BB anti- humanizado da presente invenção fornece uma infiltração de tumor eficaz de células T efetoras diretamente relacionadas com a apoptose de células de câncer, e um efeito consideravelmente específico no tecido de tumor, em comparação com o grupo não-tratado. Em outras palavras, na presente invenção, foi confirmado que EU101, como um agente anticâncer, tem as condições ideais para apoptose de células de câncer. Convencionalmente, em pacientes com câncer, a citocina anticâncer e a imunidade celular anticâncer foram consideravelmente reduzidas, porém pode-se esperar na presente invenção que EU101 induza os aumentos da citocina anticâncer e da imunidade celular anticâncer, resultando em considerável efeito terapêutico.

[00271] Desse modo, um anticorpo anti-4-1BB humano exemplar EU101 exibe um efeito antitumor mediado pela alta expressão de IFN- y, e tal efeito é exibido de forma dependente da dose, como tal, uma concentração de IFN-y em um soro de um paciente com câncer pode ser usada como um biomarcador para diagnosticar e estimar o tumor. Portanto, de acordo com o tratamento eficaz de câncer ou tumor através do tratamento de combinação de EU101 e anti-PD-1 e prognóstico através da mensuração de uma concentração de IFN-y, espera-se realizar tratamento mais eficaz com relação a cada paciente. Exemplo 5 - Separação e proliferação massiva de células T 4- 1BB+CD8+ ex vivo utilizando um anticorpo anti-4-1BB humano humanizado exemplificativo

[00272] Os inventores usaram a expressão de 4-1BB em células T CD8+ ativadas especificamente por antígeno em isolamento e purificação de células T 4-1BB+CD8+ específicas para vários antígenos utilizando um anticorpo anti-4-1BB (Patente Coreana No. 10-1503341). Um subsequente experimento foi realizado para examinar se o anticorpo EU101 desenvolvido aqui é também utilizado para isolamento e proliferação em massa de células T CD8+ específicas de antígeno.

[00273] Construção de PBMCs de sangue periférico de um paciente com câncer foi realizada conforme descrito no Exemplo 4.1. Entretanto, neste exemplo, células T não diferenciadas específicas de antígeno de câncer podem ser obtidas pelo método descrito no Pedido de Patente Coreano No. 10-2016-0165224, depositado pelos inventores. Neste exemplo, para separação eficaz de células T 4-1BB+CD8+ e produção em massa de células T 4-1BB+CD8+ com alta pureza, um método de paniculação usando um anticorpo anti-4-1BB humano (EU101) foi usada. 10 μg/ml do anticorpo anti-4-1BB humano (EU101) diluído em PBS foram adicionados a um frasco de 10 ml e armazenados a 4 °C por 20 a 24 horas. Após armazenamento, um sobrenadante contendo o anticorpo foi removido, e sem lavagem, uma solução de BSA dissolvida a 2,5% em PBS foi adicionada às péletes celulares no frasco de 10 ml e em seguida armazenados a 4 °C por 20 a 24 horas. Posteriormente, a solução de BSA foi removida, e cada frasco foi lavado duas vezes com 15 ml de PBS. As células previamente preparadas foram suspensas em meio X-VIVO10, adicionadas a um frasco revestido com anticorpo EU101 e em seguida incubadas a 37°C em incubadora de CO2 por 1 hora. Após incubação, um sobrenadante foi removido, e as péletes celulares foram lavadas duas vezes com 10 ml de meio RPMI1640 para remover células de ligação não específica. 1% de autossoro e um meio X-VIVO10 contendo IL-2 foram a 1000 IU/ml foram adicionados ao frasco, seguido por cultura por 14 dias. No exemplo, algumas células foram colhidas e em seguida manchadas para medir a pureza e os fenótipos das células isoladas. Como mostrado nas FIGS. 16A e 16B, foi confirmado que, antes da paniculação com o anticorpo 94 kvt, uma relação de células T 4-1BB+CD8+ específicas de antígeno aumentou 43,2% (relação de células T CD8+: 58,6%), e em após paniculação com o anticorpo EU101, uma relação de células T pCMV+CD8+ específicas de antígeno aumentou 60,0% (relação de células T CD8+: 79,3%). Isto significa que as células T 4-1BB+CD8+ específicas de antígeno podem ser isoladas com alta pureza usando um EU101. Células T 4-1BB+CD8+ específicas de antígeno isoladas como descrito acima podem ser facilmente produzidas em massa pelo o descrito no Pedido de Patente Coreana No. 10-2016-0165224 apresentado pelos inventores.

[00274] A partir da descrição acima, será entendido por aqueles versados na técnica que a presente invenção pode ser realizada em diferentes formas específicas sem alterar a idéia técnica ou características essenciais da presente invenção. Entretanto, não há intenção de limitar a presente invenção às modalidades exemplares específicas, e deve-se entender que todas as modificações ou formas modificadas deduzidas do significado e âmbito das reivindicações que se seguem e equivalentes das mesmas são incluídas no escopo da presente invenção, em vez da descrição detalhada.

[00275] Anticorpos de anti-4-1BB humanos abrangidos pela presente invenção demonstraram diversas propriedades benéficas, tal como, por exemplo, afinidade superior a um anticorpo de referência, e/ou podem ser usados sozinhos ou em combinação com outro agente anticâncer para diagnosticar, prevenir ou tratar câncer ou tumor, ou usado para inibir o crescimento de câncer.

[00276] Acima, a presente invenção foi descrita com referência aos exemplos, porém pode ser entendido aqueles versados na técnica que a presente invenção pode ser mudada ou modificada em várias formas sem afastar-se do espírito e escopo da presente invenção, que é descrita nas reivindicações acompanhantes.EQUIVALENTES

[00277] Aqueles versados na técnica reconhecerão, ou serão capazes de verificar usando não mais do que experimentação de rotina, muitos equivalentes às modalidades específicas da invenção descrita aqui. O escopo da presente invenção não se destina ser limitado pela descrição acima, porém em vez disso é como estabelecido nas reivindicações.

Claims

1. Anticorpo anti-4-1BB, caracterizado por um domínio variável de cadeia pesada consistindo em SEQ ID NO: 14, um domínio variável de cadeia leve consistindo em SEQ ID NO: 10 e um domínio constante da cadeia pesada consistindo em SEQ ID NO: 23.

2. Anticorpo anti-4-1BB de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que tem uma afinidade de ligação (KD) para uma molécula de 4-1BB humana de 1xio-7 a ixio-12 M.

3. Anticorpo anti-4-1BB de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que se liga a um epítopo dentro do domínio extracelular de polipeptídeo de 4-1BB humana.

4. Anticorpo anti-4-1BB de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a ligação a um epítopo dentro do domínio extracelular de 4-1BB humana é anulada por uma ou mais mutações nas posições N30, D38, N39, e R41 de SEQ ID NO: 44.

5. Anticorpo anti-4-1BB de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o anticorpo não se liga ou liga-se fracamente a um polipeptídeo de 4-1BB canina.

6. Anticorpo anti-4-1BB de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo humanizado.

7. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de compreender:(a) o anticorpo anti-4-1BB como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6; e(b) um veículo farmaceuticamente aceitável.

8. Uso de um anticorpo anti-4-1BB como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento e/ou composição para tratar um indivíduo em necessidade dos mesmos.

9. Uso de um anticorpo anti-4-1BB como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento e/ou composição para induzir uma resposta imunológica em um indivíduo em necessidade do mesmo.

10. Uso de um anticorpo anti-4-1BB como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento e/ou composição para realçar uma resposta imunológica ou aumento da atividade de uma célula imunológica em um indivíduo em necessidade do mesmo.

11. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10, caracterizado pelo fato de que o indivíduo tem ou está em risco de desenvolver câncer.

12. Uso de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o câncer é selecionado de um câncer de bexiga, câncer de mama, câncer cervical, câncer de cólon, câncer de endométrio, câncer esofágico, câncer das trompas de falópio, câncer da vesícula biliar, câncer gastrointestinal, câncer de cabeça e pescoço, câncer hematológico, câncer de laringe, câncer de fígado, câncer de pulmão, linfoma, melanoma, mesotelioma, câncer ovariano, câncer peritoneal primário, câncer da glândula salivar, sarcoma, câncer de estômago, câncer de tireoide, câncer pancreático, e câncer de próstata.

13. Método de determinação de uma dose de um anticorpo anti-4-1BB do mesmo para o tratamento terapêutico de um indivíduo em necessidade dos mesmos, caracterizado pelo fato de compreender;(a) fornecer ou obter uma medição de IFN-gama secretada em uma amostra biológica do indivíduo, em que o indivíduo foi administrado com uma composição que compreende ou libera uma quantidade de um anticorpo anti-4-1BB como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6; e(b) comparar a medição de IFN-gama secretada a um valor de referência,em que se a medição de IFN-gama secretada for maior ou menor do que o valor de referência, ajustar a quantidade de um anticorpo anti-4-1BB do mesmo será administrado, para determinar uma dose para o tratamento terapêutico de um indivíduo.

14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o valor de referência compreende um valor de índice que inclui um valor derivado de um ou mais indivíduos saudáveis, um valor derivado de um ou mais indivíduos diagnosticados com câncer ou um valor derivado de um algoritmo de predição de risco de câncer.

15. Método de acordo com a reivindicação 13 ou 14, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é uma amostra de sangue completo, plasma ou soro.

16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 15, caracterizado pelo fato de que o indivíduo tem ou é em risco de desenvolver câncer.

17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o câncer é selecionado de um câncer de bexiga, câncer de mama, câncer cervical, câncer de cólon, câncer de endométrio, câncer esofágico, câncer das trompas de falópio, câncer da vesícula biliar, câncer gastrointestinal, câncer de cabeça e pescoço, câncer hematológico, câncer de laringe, câncer de fígado, câncer de pulmão, linfoma, melanoma, mesotelioma, câncer ovariano, câncer peritoneal primário, câncer da glândula salivar, sarcoma, câncer de estômago, câncer de tireoide, câncer pancreático, e câncer de próstata.

18. Uso de um anticorpo anti-4-1BB como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento e/ou composição para para aumentar a secreção de IFN-Y por uma célula in vivo, em que a célula entra em contato com o anticorpo anti-4-1BB.

19. Método para aumentar a secreção de IFN-y por uma célula in vitro, caracterizado pelo fato de compreender: contatar a célula com um anticorpo anti-4-1BB como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.

20. Método para proliferação ex vivo ou isolamento de células T ativadas, caracterizado pelo fato de compreender: contatar uma população de células T com um anticorpo anti-4-1BB como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, desse modo aumentando a proliferação de células T ativadas.

21. Método para isolamento de células T ativadas específicas de antígeno, caracterizado pelo fato de compreender:(a) cultivar as células mononucleares de sangue periférico (PBMC) em um meio juntamente com um peptídeo de um epítopo de interesse e IL-2;(b) induzir a expressão de 4-1BB nas células cultivadasadicionando o peptídeo do epítopo de interesse;(c) contatar as células cultivadas com uma superfície revestida com um anticorpo anti-4-1BB como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que as células cultivadas expressando 4-1BB se aderem à superfície revestida; e(d) remover as células não ligadas, desse modo isolando as células T ativadas específicas de antígeno.

22. Método de acordo com a reivindicação 23 ou 24, caracterizado pelo fato de que as células T ativadas são células T CD8+.

23. Uso de células T ativadas produzidas pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 23 a 25, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento e/ou composição para tratar ou prevenir câncer em um indivíduo.