WO2021251459A1 - ヒト化抗ｇｐｃ－１抗体 - Google Patents

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WO2021251459A1
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cancer
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antibody
light chain
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哲治 仲
聡 世良田
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国立大学法人高知大学
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    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
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Definitions

  • the present disclosure relates to humanized antibodies that specifically bind to Glypican-1 (GPC-1), as well as related techniques, methods, drugs, and the like.
  • GPC-1 Glypican-1
  • Glypican-1 molecule is significantly more strongly expressed in esophageal cancer cells than in normal cells and can be used as a tumor marker (Patent Document 1).
  • an antibody that specifically binds to Glypican-1 has also been isolated (Patent Document 1).
  • the present disclosure provides a humanized anti-GPC-1 monoclonal antibody having high affinity for GPC-1 and high internalizing activity in GPC-1 positive cells.
  • No humanized anti-GPC-1 antibody has been developed so far, and it has not been predicted that the humanized anti-GPC-1 antibody will have high activity.
  • the antibodies of the present disclosure can be used for a variety of therapeutic uses.
  • the present disclosure also provides a composition for preventing or treating Glypican-1 positive cancer, which comprises a complex of a humanized anti-GPC-1 monoclonal antibody and a drug having cytotoxic activity. do.
  • Such an antibody or a fragment thereof can be applied as a companion diagnostic agent and a targeted treatment or personalized medicine in combination with a companion diagnostic agent.
  • (Item 1) A humanized anti-GPC-1 antibody or an antigen-binding thereof humanized based on an antibody containing a heavy chain variable region having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5 and a light chain variable region having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6.
  • the humanized antibody or its antigen-binding fragment (A) contains heavy chain CDRs 1-3 having the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 28-30, respectively, or (b) 3 or less amino acid substitutions, deletions and / or in heavy chain CDRs 1-3 in (a).
  • the composition according to item 1. (Item 3) The humanized antibody or its antigen-binding fragment (A) contains light chain CDR1 to CDR3 having the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 31 to 33, respectively, or (b) contains light chain CDR1 to CDR3 having the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 34 to 36, respectively.
  • the humanized antibody or antigen-binding fragment thereof according to item 1 or 2.
  • (Item 6) The humanized antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of Items 1 to 5, which comprises a light chain variable region having an amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 8 to 27.
  • (Item 7) The humanization according to any one of items 1 to 6, comprising a light chain variable region having an amino acid sequence that is at least 90% identical to the amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 8 to 17.
  • the humanized antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of Items 1 to 7, which comprises a light chain variable region having an amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 8 to 17.
  • the antibody binds to Glypican-1 at 1.02E -8 following a K D based on the analysis by surface plasmon resonance, the humanized antibody or antigen binding fragment thereof according to any one of items 1-9.
  • (Item 11) A pharmaceutical composition for intracellular transfer of an active ingredient, which comprises the humanized antibody according to any one of items 1 to 10 or an antigen-binding fragment thereof.
  • (Item 12) A complex of a humanized antibody according to any one of items 1 to 10 or an antigen-binding fragment thereof and a drug having cytotoxic activity.
  • (Item 13) 12 The complex of item 12, wherein the humanized antibody or antigen-binding fragment thereof is operably linked to the cytotoxic agent via a linker.
  • the drug having cytotoxic activity comprises monomethyl auristatin E (MMAE), monomethyl auristatin F (MMAF), DM1, DM4, calikeamycin, duocarmycin, pyrolobenzodiazepine (PBD), and a topoisomerase inhibitor.
  • MMAE monomethyl auristatin E
  • MMAF monomethyl auristatin F
  • DM1, DM4 calikeamycin
  • duocarmycin pyrolobenzodiazepine
  • PBD pyrolobenzodiazepine
  • a topoisomerase inhibitor a topoisomerase inhibitor.
  • the complex according to item 12 or 13 selected from the group.
  • the complex according to item 13 or 14, wherein the agent having cytotoxic activity is cell membrane permeability.
  • Item 16 The complex according to any one of items 13 to 15, wherein the agent having cytotoxic activity is selected from MMAE, PBD, Eribulin, SN-38, Dxd, and DM4.
  • (Item 17) The complex according to any one of items 13 to 16, wherein the linker is selected from the group consisting of an enzyme-cleaving linker, an acid instability linker, and a disulfide linker.
  • (Item 18) The complex according to any one of items 13 to 17, wherein the linker is a cleavage-type linker cleaved by cathepsin B.
  • (Item 19) The complex, in Glypican-1-positive cells, indicating an IC 50 of less than about 0.1 nM, composite according to any one of items 12-18.
  • (Item 20) A composition for preventing or treating Glypican-1 positive cancer, which comprises the complex according to any one of items 12 to 19.
  • the Glypican-1 positive cancers include esophageal cancer, pancreatic cancer, bile duct cancer, cervical cancer, lung cancer, head and neck cancer, breast cancer, uterine leiomyosarcoma, prostate cancer, oral squamous epithelial cancer or 20.
  • CAF cancer-related fibroblasts
  • (Item 26) A composition for preventing or treating metastatic cancer of Glypican-1 positive cancer, which comprises the complex according to any one of items 12 to 19.
  • the Glypican-1 positive cancers include esophageal cancer, pancreatic cancer, bile duct cancer, cervical cancer, lung cancer, head and neck cancer, breast cancer, uterine leiomyosarcoma, prostate cancer, and oral squamous epithelial cancer. 26.
  • the composition according to item 26 which is selected from any combination thereof.
  • (Item 28) The composition according to item 26 or 27, wherein the metastatic cancer is a metastatic cancer of pancreatic cancer.
  • the metastatic cancer is metastatic cancer that has spread to the liver, esophagus, bile duct, cervix, lung, head and neck, breast, uterine smooth muscle, prostate, oral squamous epithelium, brain, bone, peritoneum, or adrenal gland.
  • the composition according to any one of items 26 to 28.
  • (Item 2A) A method for preventing or treating Glypican-1 positive cancer in a subject, comprising the step of administering to the subject the complex according to any one of items 12-19.
  • the Glypican-1 positive cancers include esophageal cancer, pancreatic cancer, bile duct cancer, cervical cancer, lung cancer, head and neck cancer, breast cancer, uterine leiomyosarcoma, prostate cancer, oral squamous epithelial cancer or The method of item 2A, selected from any combination of these.
  • Item 5A The method according to any one of items 2A to 4A, wherein the cancer has cancer-related fibroblasts (CAF).
  • (Item 6A) The method according to any one of items 2A to 5A, further comprising the step of administering an immune checkpoint inhibitor.
  • (Item 7A) The method of item 6A, wherein the immune checkpoint inhibitor is an anti-PD-1 antibody.
  • (Item 8A) A method for preventing or treating metastatic cancer of Glypican-1 positive cancer in a subject, comprising the step of administering to the subject the complex according to any one of items 12 to 19.
  • the Glypican-1 positive cancers include esophageal cancer, pancreatic cancer, bile duct cancer, cervical cancer, lung cancer, head and neck cancer, breast cancer, uterine leiomyosarcoma, prostate cancer, and oral squamous epithelial cancer.
  • the metastatic cancer is metastatic cancer that has spread to the liver, esophagus, bile duct, cervix, lung, head and neck, breast, uterine smooth muscle, prostate, oral squamous epithelium, brain, bone, peritoneum, or adrenal gland.
  • (Item 1B) Use of the humanized antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of items 1 to 10 in the manufacture of a pharmaceutical agent for intracellular transfer of an active ingredient.
  • the Glypican-1 positive cancers include esophageal cancer, pancreatic cancer, bile duct cancer, cervical cancer, lung cancer, head and neck cancer, breast cancer, uterine leiomyosarcoma, prostate cancer, oral squamous epithelial cancer or Use according to item 2B, selected from any combination of these.
  • (Item 5B) The use according to any one of items 2B to 4B, wherein the cancer has cancer-related fibroblasts (CAF).
  • (Item 6B) The use according to any one of items 2B-5B, wherein the complex is administered with an immune checkpoint inhibitor.
  • (Item 7B) The use according to item 6B, wherein the immune checkpoint inhibitor is an anti-PD-1 antibody.
  • (Item 8B) Use of the complex according to any one of items 12 to 19 in the manufacture of a pharmaceutical agent for preventing or treating metastatic cancer of Glypican-1 positive cancer in a subject.
  • the Glypican-1 positive cancers include esophageal cancer, pancreatic cancer, bile duct cancer, cervical cancer, lung cancer, head and neck cancer, breast cancer, uterine leiomyosarcoma, prostate cancer, and oral squamous epithelial cancer. Or the use according to item 8B, selected from any combination of these.
  • the metastatic cancer is metastatic cancer that has spread to the liver, esophagus, bile duct, cervix, lung, head and neck, breast, uterine smooth muscle, prostate, oral squamous epithelium, brain, bone, peritoneum, or adrenal gland. Use according to any one of items 8B to 10B.
  • the humanized antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of items 1 to 10 for intracellular transfer of the active ingredient.
  • the complex according to any one of items 12 to 19, for preventing or treating Glypican-1 positive cancer in a subject.
  • the Glypican-1 positive cancers include esophageal cancer, pancreatic cancer, bile duct cancer, cervical cancer, lung cancer, head and neck cancer, breast cancer, uterine leiomyosarcoma, prostate cancer, oral squamous epithelial cancer or The complex according to item 2C, which is selected from any combination of these.
  • Item 5C The complex according to any one of items 2C to 4C, wherein the cancer has cancer-related fibroblasts (CAF).
  • the Glypican-1 positive cancers include esophageal cancer, pancreatic cancer, bile duct cancer, cervical cancer, lung cancer, head and neck cancer, breast cancer, uterine leiomyosarcoma, prostate cancer, and oral squamous epithelial cancer.
  • the complex according to item 8C selected from any combination thereof.
  • the metastatic cancer is metastatic cancer that has spread to the liver, esophagus, bile duct, cervix, lung, head and neck, breast, uterine smooth muscle, prostate, oral squamous epithelium, brain, bone, peritoneum, or adrenal gland.
  • a humanized anti-Glypican-1 antibody that is clinically applicable is provided.
  • Such an antibody can be used as a detection agent used for diagnosis and companion treatment of Glypican-1 positive cancer, and further, a complex of the antibody and a drug can be used for treatment of Glypican-1 positive cancer. It is extremely effective for.
  • FIG. 1 shows a Biacore equilibrium dissociation constant of the 20 clones was determined by (TM) (K D).
  • FIG. 2 shows a schematic diagram of the ADC assay of Example 2.
  • FIG. 3 shows the results of cytotoxic activity (IC 50 ) of 20 clones in the TE14 cell line.
  • FIG. 4 shows the results of antigen affinity analysis by FACS of anti-GPC-1 chimeric antibody (01a033) and clone T2.
  • FIG. 5 shows a schematic diagram of an exemplary ADC structure.
  • FIG. 6 shows a schematic diagram of the setting of Drug-to-Antibody Ratio (DAR).
  • FIG. 7 shows the results of antigen affinity analysis by FACS of humanized GPC1-ADC and unlabeled antibody.
  • FIG. 8 shows the results of an intracellular internalization assay for humanized anti-GPC-1 antibody (clone T2) and humanized GPC1-ADC (MMAE).
  • Green indicates GPC1 staining
  • red indicates CD107a staining
  • blue indicates DAPI staining.
  • the scale shows 10 ⁇ m.
  • the left bar of each group in the graph indicates 4 ° C and the right bar indicates 37 ° C.
  • FIG. 9 shows the results of GPC1 expression analysis by FACS in various cell lines.
  • FIG. 10 shows the results of an in vitro ADC assay using humanized GPC1-ADC (MMAE).
  • FIG. 11 shows the results of GPC1 expression analysis and ADC assay in HeLa, Detroit562, FaDu cell lines.
  • FIG. 12 shows the results of GPC1 expression analysis and ADC assay in Ho-1-u-1, KOSC2 cl3-43, and KON cell lines.
  • FIG. 13 shows the results of an in vivo drug efficacy test of humanized GPC1-ADC (MMAE) using pancreatic cancer PDX (PK565) having heterogeneous GPC1 expression.
  • MMAE humanized GPC1-ADC
  • PK565 pancreatic cancer PDX
  • FIG. 14 shows the results of an in vivo drug efficacy test of humanized GPC1-ADC (MMAE) using pancreatic cancer PDX (PK175) in which GPC1 is expressed in both cancer cells and CAF.
  • Body weight increased slightly in humanized GPC1-ADC (10 mg / kg) and humanized GPC1-ADC (3 mg / kg).
  • Tumor volume decreased and was the smallest in humanized GPC1-ADC (10 mg / kg), slightly increased in humanized GPC1-ADC (3 mg / kg), followed by humanized GPC-ADC (1 mg / kg) and Vehicle.
  • the control gradually increased, and the Vehicle control was the largest.
  • FIG. 14 shows the results of an in vivo drug efficacy test of humanized GPC1-ADC (MMAE) using pancreatic cancer PDX (PK175) in which GPC1 is expressed in both cancer cells and CAF.
  • FIG. 15 shows the results of an in vivo drug efficacy test of humanized GPC1-ADC (MMAE) using esophageal cancer PDX (ESCC14) in which GPC1 is uniformly highly expressed. Body weight did not fluctuate significantly in either group. Tumor volume was comparable and smallest in humanized GPC1-ADC (10 mg / kg) and humanized GPC1-ADC (3 mg / kg), followed by humanized GPC-ADC (1 mg / kg), which remained almost unchanged. , Vehicle control gradually increased.
  • FIG. 16 shows the results of GPC1 expression analysis and ADC assay in a mGPC1 forced expression mouse colon cancer cell line (mGPC1-MC38).
  • FIG. 17 shows the quantitative results of HMGB-1 in the culture supernatant by ELISA.
  • FIG. 18 shows the results of the antitumor effect of the combined use of humanized GPC1-ADC (MMAE) and anti-PD1 antibody using colorectal cancer syngenic model mice. Body weight did not fluctuate significantly in either group. Tumor volume is the smallest in humanized GPC1-ADC (10 mg / kg) + anti-PD1 Ab (3 mg / kg), anti-PD1 Ab (3 mg / kg), humanized GPC1-ADC (10 mg / kg), Vehicle control. It became larger in the order of. FIG.
  • FIG. 19 shows the measurement results of a G2 / M phase cell cycle marker (phospho-Histone H3 (Ser10)) in pancreatic cancer PDX (PK565).
  • the scale bar indicates 100 ⁇ m.
  • FIG. 20 shows the analysis results of GPC1 expression by immunohistochemical staining in pancreatic cancer distant metastatic tissue.
  • the scale bar indicates 100 ⁇ m.
  • FIG. 21 shows an outline of preparation of a pancreatic cancer liver metastasis model and a drug efficacy test using humanized GPC1-ADC. i. v. Administration was performed on days 0, 3, 7, and 10. IVIS measurements were performed on days 0, 7, 14, 21, 21, 28, 35, 42 and 49.
  • FIG. 22 shows the results of a drug efficacy test using humanized GPC1-ADC in a pancreatic cancer liver metastasis model.
  • PBS administration group: n 13
  • GPC1-ADC 10 mg / kg administration group: n 10, *: p ⁇ 0.05, **: p ⁇ 0.01.
  • Glypican-1 glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchored cell surface proteoglycans, and have heparan sulfate. It is a thing. It has been implicated in cell adhesion, migration, lipoprotein metabolism, growth factor activity regulation and blood coagulation inhibition. It is said to bind to several fibroblast growth factors (FGFs) such as FGF-1, FGF-2 and FGF-7. Glypican-1 is said to function as an extracellular chaperone of VEGF165 and help restore the ability to bind receptors after oxidation.
  • FGFs fibroblast growth factors
  • Glypican-1 is registered with UniProt as accession number P35052 (see http://www.uniprot.org/uniprot/P35052), and in NCBI, NP_002072.2 (precursor amino acid sequence). In NM_002081.2. All of these are information that can be used herein, and that information is incorporated herein by reference. For Glypican-1, David G et al. , J Cell Biol.
  • the nucleic acid sequence (full length) of human Glypican-1 is represented by SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequence is represented by SEQ ID NO: 2.
  • the nucleic acid sequence (overall length) of mouse Glypican-1 is represented by SEQ ID NO: 3, and the amino acid sequence is represented by SEQ ID NO: 4.
  • Glypican-1 As used herein, “Glypican-1", “GPC-1” or “GPC1” may be assigned to a particular sequence number or accession number as long as it meets the specific purposes of the present disclosure. Not only the protein having the amino acid sequence described (or the nucleic acid encoding it), but also its functionally active analogs or derivatives, or its functionally active fragments, or homologues thereof, or high stringency conditions. Alternatively, it is understood that, under low stringency conditions, a nucleic acid-encoded variant that hybridizes to the nucleic acid encoding this protein can also be used in the present disclosure.
  • derivatives are preferably not intended to be limiting, but are substantially relative to the protein of interest (eg, Glypican-1, antibody).
  • Such molecules include, in various embodiments, sequences that are aligned over amino acid sequences of the same size or by a computer homology program known in the art. At least 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% identical or such molecules.
  • the encoding nucleic acid is capable of hybridizing to a sequence encoding a component protein under (highly) stringent, moderately stringent, or non-stringent conditions.
  • Glypican-1 chimpanzees (K7B6W5), lizards (Maca mulatta) (F6VPW9), mice (Mus mammals) (Q9QZF2), rats (Rattus53) , Glypican-1 protein is known to be expressed in many non-human animals such as Rattus norvegicus (F1P150). Therefore, these animals, especially mammals, are also within the scope of the present disclosure. It is understood to enter.
  • the functional domain of Glypican-1 eg, the extracellular domain (about 500 amino acids, containing 12 cysteine residues) and the C-terminal hydrophobic region (GPI-anchor domain) are conserved. Is preferable.
  • protein protein
  • polypeptide oligopeptide
  • peptide refers to a polymer of amino acids of any length.
  • the polymer may be linear, branched or cyclic.
  • the amino acid may be natural or non-natural, or may be a modified amino acid.
  • the term may also include those assembled into a complex of multiple polypeptide chains.
  • the term also includes naturally or artificially modified amino acid polymers. Such modifications include, for example, disulfide bond formation, glycosylation, lipidation, acetylation, phosphorylation or any other manipulation or modification (eg, conjugation with a labeling component).
  • amino acid is a general term for organic compounds having an amino group and a carboxyl group.
  • amino acid sequence may be chemically modified.
  • any amino acid in the amino acid sequence may form a salt or a solvate.
  • any amino acid in the amino acid sequence may be L-type or D-type.
  • the protein according to the embodiment of the present disclosure contains the above-mentioned "specific amino acid sequence”.
  • Chemical modifications that amino acids contained in proteins undergo in vivo include, for example, N-terminal modification (eg, acetylation, myristoylation, etc.), C-terminal modification (eg, amidation, glycosylphosphatidylinositol addition, etc.), or side chain. Modifications (eg, phosphorylation, sugar chain addition, etc.) are known. Amino acids may be natural or non-natural as long as they meet the purposes of the present disclosure.
  • polynucleotide As used herein, "polynucleotide”, “oligonucleotide” and “nucleic acid” are used interchangeably herein to refer to a polymer of nucleotides of any length. The term also includes “oligonucleotide derivatives" or “polynucleotide derivatives”. The "oligonucleotide derivative” or “polynucleotide derivative” refers to an oligonucleotide or polynucleotide containing a derivative of a nucleotide or having an unusual bond between nucleotides, and is used interchangeably.
  • oligonucleotide examples include, for example, 2'-O-methyl-ribonucleotide, an oligonucleotide derivative in which a phosphate diester bond in an oligonucleotide is converted into a phosphorothioate bond, and a phosphate diester bond in an oligonucleotide.
  • oligonucleotide derivative in which cytosine in the oligonucleotide is replaced with C-5 propynyl citosine
  • oligo An oligonucleotide derivative in which cytosine in a nucleotide is replaced with phenoxazine-modified cytosine, an oligonucleotide derivative in which ribose in DNA is replaced with 2'-O-propylribose, and ribose in an oligonucleotide is 2.
  • nucleic acid sequences are also conservatively modified variants (eg, degenerate codon substitutions) and complementary sequences, as are the expressly indicated sequences. Is intended to be included.
  • the degenerate codon substituent creates a sequence in which the third position of one or more selected (or all) codons is replaced with a mixed base and / or deoxyinosine residue.
  • nucleic acid is also used interchangeably with genes, cDNAs, mRNAs, oligonucleotides, and polynucleotides.
  • nucleotide may be natural or non-natural.
  • the "gene” refers to a factor that defines a genetic trait, and the “gene” may refer to a "polynucleotide", an “oligonucleotide”, and a “nucleic acid”.
  • homology of a gene means the degree of identity of two or more gene sequences to each other, and generally, having “homology” means a high degree of identity or similarity. Say. Therefore, the higher the homology of two genes, the higher the identity or similarity of their sequences. Whether or not the two genes have homology can be examined by direct sequence comparison or, in the case of nucleic acids, hybridization methods under stringent conditions. When directly comparing two gene sequences, the DNA sequences are typically at least 50% identical, preferably at least 70% identical, and more preferably at least 80%, 90%. , 95%, 96%, 97%, 98% or 99% are homologous.
  • a “homologous” or “homologous gene product” is a protein in another species, preferably a mammal, that exerts the same biological functions as the protein components of the complex further described herein. Means. Such homologues are also sometimes referred to as “ortholog gene products.” It is understood that such homologues, homologous gene products, ortholog gene products and the like can also be used as long as they meet the purposes of the present disclosure.
  • Amino acids can be referred to herein by either their generally known three-letter symbols or the one-letter symbols recommended by the IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Communication. Nucleotides can also be referred to by the generally recognized one-letter code.
  • comparisons of amino acid and base sequence similarity, identity and homology are calculated using default parameters using BLAST, a tool for sequence analysis.
  • the identity search can be performed using, for example, NCBI's BLAST 2.2.28 (issued 2013.4.2).
  • the value of identity in the present specification is usually the value when the above BLAST is used and aligned under the default conditions. However, if a higher value is obtained by changing the parameter, the highest value is used as the identity value. When identity is evaluated in multiple regions, the highest value among them is set as the identity value. Similarity is a numerical value that takes into account similar amino acids in addition to identity.
  • “90% or more” may be, for example, 90, 95, 96, 97, 98, 99, or 100% or more, and is within the range of any two of them. May be good.
  • the above-mentioned "homology” may be calculated by calculating the ratio of the number of amino acids homologous in an amino acid sequence between two or a plurality of amino acids according to a method known in the art. Before calculating the ratio, the amino acid sequences of the amino acid sequences to be compared are aligned, and a gap is introduced in a part of the amino acid sequence if necessary for maximizing the ratio of the same amino acid.
  • the term "functional equivalent” refers to any entity that has the same target function but a different structure with respect to the original entity of interest.
  • the functional equivalent of "Glypican-1" or its antibody is not Glypican-1 or its antibody itself, but in variants or variants of Glypican-1 or its antibodies (eg, amino acid sequence variants, etc.). It has the biological action of Glypican-1 or its antibody, and at the time of action, it changes to Glypican-1 or its antibody itself or a variant or variant of this Glypican-1 or its antibody.
  • Can include eg, including nucleic acids encoding Glypican-1 or its antibodies themselves or variants or variants of Glypican-1 or its antibodies, and vectors, cells, etc.
  • Glypican-1 or an antibody thereof can be used in the same manner as Glypican-1 or an antibody thereof, without particular mention.
  • Functional equivalents can be found by searching databases and the like.
  • searching means finding another nucleobase sequence having a specific function and / or property by utilizing one nucleobase sequence electronically, biologically, or by other methods.
  • BLAST Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)
  • FASTA Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad.
  • Bio searches include stringent hybridization, macroarrays with genomic DNA attached to nylon membranes or the like, or microarrays (microarray assays) attached to glass plates, PCR and in situ hybridization, and the like. Not limited. As used herein, it is intended that the genes used in the present disclosure should also include the corresponding genes identified by such electronic and biological searches.
  • one or more amino acids inserted, substituted or deleted, or added to one or both ends of the amino acid sequence can be used.
  • "insertion, substitution or deletion of one or more amino acids in an amino acid sequence, or addition to one or both ends” is a well-known technical technique such as a site-specific mutagenesis method. It means that the modification has been made by a method or by a natural mutation, such as by substituting a plurality of amino acids that can occur naturally.
  • the modified amino acid sequence may include, for example, 1 to 30, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 9, still more preferably 1 to 5, particularly preferably 1 to 2 amino acids inserted, substituted, or missing. It can be lost, or added to one or both ends.
  • the modified amino acid sequence is preferably an amino acid sequence in which the amino acid sequence has one or more (preferably one or several or 1, 2, 3, or 4) conservative substitutions in the Glypican-1 amino acid sequence. May be.
  • conservative substitution means substituting one or more amino acid residues with another chemically similar amino acid residue so as not to substantially alter the function of the protein. For example, there is a case where one hydrophobic residue is replaced with another hydrophobic residue, a case where one polar residue is replaced with another polar residue having the same charge, and the like. Functionally similar amino acids capable of making such substitutions are known in the art for each amino acid.
  • non-polar (hydrophobic) amino acids such as alanine, valine, isoleucine, leucine, proline, tryptophan, phenylalanine, and methionine.
  • polar (neutral) amino acid examples include glycine, serine, threonine, tyrosine, glutamine, asparagine, and cysteine.
  • positively charged (basic) amino acids examples include arginine, histidine, lysine and the like.
  • negatively charged (acidic) amino acids include aspartic acid and glutamic acid.
  • the "anti-Glypican-1 antibody” comprises an antibody having binding to Glypican-1.
  • the method for producing this anti-Glypican-1 antibody is not particularly limited, and for example, Glypican-1 may be produced by immunizing mammals or birds.
  • An "antigen-binding fragment" of an anti-Glypican-1 antibody refers to a fragment of an antibody that retains its ability to bind Glypican-1.
  • antigen-binding fragments include, but are not limited to, single chain antibodies, scFv, Fab fragments, F (ab') 2 fragments, and the like.
  • the antibody class of the anti-Glypican-1 antibody according to one embodiment of the present disclosure is not particularly limited, but may be, for example, IgM, IgD, IgG, IgA, IgE, or IgY.
  • the anti-Glypican-1 antibody according to one embodiment of the present disclosure may be an antibody fragment having an antigen-binding activity (hereinafter, may be referred to as an “antigen-binding fragment”). In this case, there are effects such as increased stability or antibody production efficiency.
  • the anti-Glypican-1 antibody may be a fusion protein.
  • This fusion protein may be one in which a polypeptide or oligopeptide is bound to the N- or C-terminal of the anti-Glypican-1 antibody.
  • the oligopeptide may be a His tag.
  • the anti-Glypican-1 antibody according to one embodiment of the present disclosure may be, for example, an antibody obtained through a step of immunizing an organism with a purified Glypican-1, Glypican-1 expressing cell, or a Glypican-1 containing lipid membrane. good. From the viewpoint of enhancing the therapeutic effect on Glypican-1 positive cancer, it is preferable to use Glypican-1 expressing cells for immunity.
  • the anti-Glypican-1 antibody is an antibody having a CDR set of an antibody obtained through a step of immunizing an organism with purified Glypican-1, Glypican-1 expressing cells or a lipid membrane containing Glypican-1. May be. From the viewpoint of enhancing the therapeutic effect on Glypican-1 positive cancer, it is preferable to use Glypican-1 expressing cells for immunity.
  • the CDR set is a set of heavy chain CDRs 1, 2, and 3, and light chain CDRs 1, 2, and 3.
  • the "Glypican-1 expressing cell” may be obtained, for example, by introducing a polynucleotide encoding Glypican-1 into a cell and then expressing Glypican-1.
  • Glypican-1 contains a Glypican-1 fragment.
  • the "Glypican-1 containing lipid membrane” may be obtained, for example, by mixing Glypican-1 and a lipid bilayer membrane.
  • Glypican-1 contains a Glypican-1 fragment.
  • the anti-Glypican-1 antibody according to one embodiment of the present disclosure is an antibody obtained through a step of immunizing a chicken with an antigen, or a CDR set of the antibody, from the viewpoint of enhancing the therapeutic effect on Glypican-1 positive cancer.
  • Antibodies with are preferred.
  • the anti-Glypican-1 antibody of the present disclosure may have any binding force as long as the object is achieved.
  • the anti-Glypican-1 antibody of the present disclosure may have internalization activity and / or ADC activity even if it has a low affinity for Glypican-1.
  • the KD value (kd / ka) is 1.0 ⁇ 10-7 (M) or less, 1.0 ⁇ 10-8 (M) or less, 1.0 ⁇ 10-9 (M) or less, or 1.0. It can be x10-10 (M) or less.
  • the binding force of the anti-Glypican-1 antibody for diagnostic or companion reagent purposes is 1.0 ⁇ 10-8 (M) or less in KD value (kd / ka).
  • the anti-Glypican-1 antibody may be an antibody that binds to a wild type or a variant of Glypican-1. Mutants include those due to differences in DNA sequences between individuals.
  • the amino acid sequence of wild-type or mutant Glypican-1 is preferably 80% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and particularly preferably 98% or more with respect to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. Has the homology of.
  • an "antibody” includes a molecule or a population thereof capable of specifically binding to a specific epitope on an antigen.
  • Antibodies can exist in various forms, eg, full-length antibodies (antibodies with Fab and Fc regions), Fv antibodies, Fab antibodies, F (ab') 2 antibodies, Fab'antibodies, diabody, single.
  • Chain (single chain) antibody eg, scFv), sc (Fv) 2 (single chain (Fv) 2), scFv-Fc, dsFv, multivalent specific antibody (eg, oligo-specific antibody, bivalent specific antibody) ), Diabodies, antigen-binding peptides or polypeptides, chimeric antibodies (eg, mouse-human chimeric antibodies, chicken-human chimeric antibodies, etc.), mouse antibodies, chicken antibodies, humanized antibodies, human antibodies, or their equivalents. It may be one or more forms selected from the group consisting of (or equivalents).
  • Antibodies also include antibody-modified or antibody-unmodified products. The antibody modification may have an antibody bound to various molecules such as polyethylene glycol.
  • the antibody modification can be obtained by chemically modifying the antibody using a known method. Further, such an antibody may be covalently linked or recombinantly fused to an enzyme such as alkaline phosphatase, horseradish peroxidase, alpha-galactosidase, or the like.
  • the anti-Glypican-1 antibody used in the present disclosure may bind to the Glypican-1 protein, regardless of its origin, type, shape, or the like. Specifically, known antibodies such as non-human animal antibodies (eg, mouse antibodies, rat antibodies, camel antibodies), human antibodies, chimeric antibodies, humanized antibodies and the like can be used.
  • the binding of the antibody to the Glypican-1 protein is preferably a specific binding.
  • Antibodies also include antibody-modified or antibody-unmodified products.
  • the antibody modification may have an antibody bound to various molecules such as polyethylene glycol.
  • the antibody modification can be obtained by chemically modifying the antibody using a known method.
  • a "monoclonal antibody” is an antibody corresponding to substantially a single epitope, except for antibodies in which the individual antibodies constituting the population have mutations that can occur spontaneously in small amounts. Including the case where. Alternatively, the individual antibodies that make up the population may be substantially identical, except for antibodies that have mutations that can occur spontaneously in small amounts. Monoclonal antibodies are highly specific and differ from conventional polyclonal antibodies, which typically contain different antibodies corresponding to different epitopes. In addition to its specificity, monoclonal antibodies are useful in that they can be synthesized from hybridoma cultures that are not contaminated with other immunoglobulins.
  • the description "monoclonal” may indicate that it is obtained from a substantially homogeneous population of antibodies, but does not imply that the antibody must be produced in any particular way.
  • the monoclonal antibody may be prepared by the same method as the hybridoma method described in "Kohler G, Milstein C., Nature. 1975 August 7; 256 (5517): 495-497.”.
  • the monoclonal antibody may be prepared by a method similar to the recombinant method described in US Pat. No. 4,816,567.
  • the monoclonal antibody is "Clackson et al., Nature. 1991 Aug 15; 352 (6336): 624-628.”, Or "Marks et al., J MolBiol.
  • any method known in the art can be used, and for example, the following can be exemplified as the construction of a typical mass production system for antibodies and antibody production. That is, CHO cells are transfected with an H-chain antibody expression vector and an L-chain antibody expression vector, cultured using the selective reagents G418 and Zeocin, and cloned by the limiting dilution method. After cloning, clones expressing the antibody stably are selected by the ELISA method. The selected CHO cells are expanded and cultured, and the culture supernatant containing the antibody is collected. Antibodies can be purified from the collected culture supernatant by purifying Protein A or Protein G.
  • the humanized antibody of the present disclosure can be obtained as a polyclonal fully human antibody by immunizing a human antibody-producing mouse with an antigen of interest, from which a monoclonal state can be obtained before use in the present disclosure.
  • a "humanized antibody” comprises, for example, one or more CDRs derived from a non-human species, a framework region (FR) derived from human immunoglobulin, and a constant region derived from human immunoglobulin. It is an antibody that binds to a desired antigen. Humanization of the antibody can be performed using various techniques known in the art (Almagro et al., Front Bioscii. 2008 Jan 1; 13: 1619-1633.). For example, CDR graphing (Ozaki et al., Blood. 1999 Jun 1; 93 (11): 3922-3930.), Re-surfing (Roguska et al., Proc Natl Acad Sci US A.
  • FR shuffle Damscroder et al., Mol Immunol. 2007 Apr; 44 (11): 3049-3060. Epub 2007 Jan 22.
  • amino acid residues in the human FR region may be replaced with the corresponding residues from the CDR donor antibody. This FR substitution can be carried out by a method well known in the art (Riechmann et al., Nature. 1988 Mar 24; 332 (6162): 323-327.).
  • FR residues important for antigen binding may be identified by modeling the interaction between CDRs and FR residues.
  • sequence comparison may be used to identify anomalous FR residues at specific positions.
  • humanized antibodies may be produced as described in the production examples of the present disclosure. Specifically, it may be screened from a heavy chain-fixed V ⁇ library in which the CDRs of non-human-derived antibodies are graphed into the human heavy chain framework. In this method of humanization, the heavy chain CDR is unchanged, but the light chain CDR can.
  • a "heavy chain” is typically the main component of a full-length antibody. Heavy chains are usually attached to light chains by disulfide and non-covalent bonds. In the domain on the N-terminal side of the heavy chain, there is a region called a variable region (VH) in which the amino acid sequence is not constant even for the same type of antibody of the same class, and in general, VH has a large specificity and affinity for an antigen. It is known to contribute. For example, when a VH-only molecule was prepared in "Reiter et al., J Mol Biol. 1999 Jul 16; 290 (3): 685-98.”, It was specifically bound to the antigen with high affinity. Is described. Furthermore, in “Wolfson W, Chem Biol. 2006 Dec; 13 (12): 1243-1244.”, It is found that among camel antibodies, only heavy chain antibodies having no light chain are present. Has been described.
  • a "CDR (complementarity determining region)" is a region of an antibody that actually contacts an antigen to form a binding site.
  • the CDRs are located on the Fv of the antibody, which includes the variable region: heavy chain variable region (VH) and light chain variable region (VL).
  • CDRs include CDR1, CDR2, and CDR3 consisting of about 5 to 30 amino acid residues.
  • the heavy chain CDR contributes to the binding of the antibody to the antigen.
  • CDR3 has the highest contribution to the binding of the antibody to the antigen.
  • the antibody binding ability was increased by modifying the heavy chain CDR3.
  • the Fv region other than the CDR is called the framework region (FR), which consists of FR1, FR2, FR3 and FR4, and is relatively well conserved among the antibodies (Kabat et al., "Sequence of Proteins of Immunological Interest”. US Dept. Health and Human Services, 1983.). That is, it can be said that the factor that characterizes the reactivity of the antibody lies in the CDR, and in particular, the heavy chain CDR.
  • the definition of Kabat (Sequences of Properties of Imperial Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, National Institutes of Health, Bethesda, Bethesda, I. ., 1987; 196: 901-917) may be adopted.
  • the definition of Kabat is adopted as a preferred example, but is not necessarily limited to this.
  • the determination may be made in consideration of both the definition of Kabat and the definition of Chothia. It can also be a CDR.
  • the term "antigen” refers to any substrate that can be specifically bound by an antibody molecule.
  • immunogen refers to an antigen capable of initiating lymphocyte activation that produces an antigen-specific immune response.
  • epitope or "antigen determinant” refers to a site in an antigen molecule to which an antibody or lymphocyte receptor binds. Methods of determining epitopes are well known in the art, and such epitopes can be determined by one of ordinary skill in the art when the primary sequence of nucleic acid or amino acid is provided. It is understood that the antibodies of the present disclosure can be similarly utilized even with antibodies having other sequences as long as the epitopes are the same.
  • the antibody used in the present specification may be any specific antibody as long as false positives are reduced.
  • “Cancer” covered by this disclosure includes lung cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, pancreatic cancer, kidney cancer, adrenal cancer, biliary tract cancer, breast cancer, colon cancer, small bowel cancer, etc.
  • ovarian cancer includes, for example, ovarian serous adenocarcinoma, or ovarian clear cell line cancer.
  • Uterine cancer includes, for example, endometrial cancer, or cervical cancer.
  • Head and neck cancers include, for example, oral cancer, pharyngeal cancer, laryngeal cancer, nasal cavity cancer, sinus cancer, salivary adenocarcinoma, or thyroid cancer.
  • Lung cancer includes, for example, non-small cell lung cancer or small cell lung cancer.
  • the malignant tumor may be PD-L1 positive.
  • Esophageal cancer is used in a normal sense and is used in a broad sense including cancer in the esophagus.
  • Esophageal cancer includes, but is not limited to, squamous cell carcinoma, adenocarcinoma, and lymph node metastasis site. It is understood that about half of Japanese esophageal cancers occur near the center of the esophagus in the chest, and then 1/4 occur in the lower part of the esophagus. ..
  • this disclosure can be used as an indicator of esophageal cancer as a whole, including squamous cell carcinoma, adenocarcinoma, and lymph node metastasis sites.
  • pancreatic cancer refers to a malignant tumor originating from the pancreas, but generally refers to pancreatic duct cancer, and also includes tumors of other parts of the pancreas.
  • cervical cancer is a type of cervical cancer, and cervical cancer includes cervical cancer and uterine body cancer, and cervical cancer is the cervical region at the entrance of the uterus. It is generated from the part called.
  • lung cancer is a malignant tumor derived from epithelial cells that develops in the lung, and includes small cell lung cancer and non-small cell lung cancer.
  • Non-small cell lung cancer includes adenocarcinoma, squamous cell carcinoma, and the like. I have large cell carcinoma.
  • head and neck cancer is a tumor of the head and neck, and refers to a tumor formed in a part from the face to the neck, for example, a part such as the nose, mouth, throat, upper chin, lower chin, and ears. ..
  • breast cancer is a tumor that occurs in the breast, and includes ductal cancer, lobular cancer, and the like.
  • uterine leiomyosarcoma refers to uterine sarcoma formed in the smooth muscle of the uterus among uterine sarcomas. Uterine leiomyosarcoma can be histologically diagnosed by cell density, cell division count, cell atypia, and the presence or absence of coagulative necrosis of tumor cells.
  • prostate cancer refers to a tumor that forms in the prostate.
  • oral squamous epithelial cancer is a type of oral cancer and refers to a tumor formed in the epithelium of the oral mucosa.
  • cholangiocarcinoma is a tumor that develops in the bile duct, including intrahepatic cholangiocarcinoma that occurs in the bile duct inside the liver, hilar region cholangiocarcinoma that occurs in the hilar region outside the liver, and liver. It is classified as a distal cholangiocarcinoma that occurs in the outer distal part.
  • cancer-assisted fibroblasts refers to fibroblasts constituting the interstitium of cancer.
  • CAF produces a lot of extracellular matrix such as collagen, which makes the interstitium of cancer very hard, and as a result, the blood vessels are crushed (collapse), so that the anticancer drug is efficient. Prevents penetration. The crushing of blood vessels also induces hypoxia in the cancerous tissue and further increases the malignancy of the cancer cells.
  • the increase in interstitial hardness itself is one of the factors that increase the growth and infiltration ability of cancer cells (the ability to spread to surrounding tissues).
  • CAF produces many growth factors that act on cancer cells to promote their growth and infiltration and suppress the antitumor immune response.
  • a cancer "interstitium” is a tissue that surrounds cancer cells in a cancer tissue and contains CAF as a major constituent, and other constituents include immune cells and bone marrow-derived cells.
  • Tumor refers to tissue containing blood vessels, lymph vessels, extracellular matrix produced by CAF, and the like.
  • subject refers to an organism subject to the diagnosis, detection, or treatment of the present disclosure (for example, an organism such as a human being, cells taken from an organism, blood, serum, etc.). ..
  • sample refers to any substance obtained from a subject or the like, and includes, for example, serum or the like. Those skilled in the art can appropriately select a preferable sample based on the description in the present specification.
  • drug As used herein, “drug”, “drug” or “factor” (both of which correspond to agents in English) are used interchangeably in a broad sense and as long as the intended purpose can be achieved. It may also be a substance or other element (eg, energy such as light, radioactivity, heat, electricity). Such substances include, for example, proteins, polypeptides, oligopeptides, peptides, polynucleotides, oligonucleotides, nucleotides, nucleic acids (eg, cDNA, DNA such as genomic DNA, RNA such as mRNA), poly.
  • cDNA DNA such as genomic DNA
  • RNA such as mRNA
  • Substances that bind to Glypican-1 can also be such agents.
  • Factors specific to a polynucleotide typically include polynucleotides that are complementary to the sequence of the polynucleotide with certain sequence homology (eg, 70% or more sequence identity). Examples include, but are not limited to, polypeptides such as transcription factors that bind to the promoter region.
  • Factors specific to a polypeptide typically include an antibody or derivative thereof or an analog thereof (eg, a single chain antibody) specifically directed to the polypeptide, wherein the polypeptide is a receptor.
  • an antibody or derivative thereof or an analog thereof eg, a single chain antibody
  • the polypeptide is a receptor.
  • a specific ligand or receptor in the case of a ligand, a substrate thereof when the polypeptide thereof is an enzyme, and the like can be mentioned, but the present invention is not limited thereto.
  • diagnosis identifies various parameters associated with a disease, disorder, condition (eg, esophageal cancer), etc. in a subject and determines the current or future of such disease, disorder, condition. To do.
  • condition within the body can be investigated and such information can be used to formulate a disease, disorder, condition, treatment to be administered or prophylaxis in the subject.
  • various parameters such as a method can be selected.
  • diagnosis in a narrow sense means diagnosing the current state, but broadly includes “early diagnosis”, “predictive diagnosis”, “preliminary diagnosis” and the like.
  • the diagnostic method of the present disclosure is industrially useful because it can be used from the body and can be carried out without the hands of medical personnel such as doctors.
  • "predictive diagnosis, pre-diagnosis or diagnosis” may be particularly referred to as "support” in order to clarify that it can be carried out without the hands of medical personnel such as doctors.
  • the term "detective agent (agent)” or “test agent (agent)” means any agent that can detect or inspect a target object in a broad sense.
  • the "diagnostic agent (agent)” means any agent capable of diagnosing a target condition (for example, a disease such as esophageal cancer) in a broad sense.
  • treatment refers to a disease or disorder (eg, esophageal cancer) that, in the event of such a condition, prevents the exacerbation of such disease or disorder, preferably maintains the status quo. More preferably, it refers to alleviation, more preferably withdrawal, and includes the ability to exert a symptom-improving effect or a preventive effect on a patient's disease or one or more symptoms associated with the disease. Diagnosis in advance and appropriate treatment is called “companion treatment”, and the diagnostic agent for that purpose is sometimes called “companion diagnostic agent”.
  • the "therapeutic agent (drug)” means any drug that can treat a target condition (for example, a disease such as esophageal cancer) in a broad sense.
  • the "therapeutic agent” may be a pharmaceutical composition comprising an active ingredient and one or more pharmacologically acceptable carriers.
  • the pharmaceutical composition can be produced, for example, by mixing the active ingredient with the above carrier and using any method known in the technical field of pharmaceutics.
  • the therapeutic agent is not limited in the form of use as long as it is used for treatment, and may be an active ingredient alone or a mixture of an active ingredient and an arbitrary ingredient.
  • the shape of the carrier is not particularly limited, and may be, for example, a solid or a liquid (for example, a buffer solution).
  • the therapeutic agent for esophageal cancer includes a drug (preventive agent) used for prevention of esophageal cancer or an agent for suppressing the growth of esophageal cancer cells.
  • prevention means to prevent a certain disease or disorder (for example, esophageal cancer) from becoming such a condition before it becomes such a condition.
  • the agents of the present disclosure can be used to make a diagnosis, and if necessary, the agents of the present disclosure can be used to prevent, for example, esophageal cancer, or to take preventive measures.
  • the "preventive drug (drug)” means any drug that can prevent a target condition (for example, a disease such as esophageal cancer) in a broad sense.
  • interaction refers to two substances, such as an intermolecular force (Van der Waals force), a hydrogen bond, or a hydrophobic interaction between one substance and the other substance. Etc.). Normally, the two substances that interact with each other are in an associated or bound state. The detection, testing and diagnosis of the present disclosure can be achieved utilizing such interactions.
  • detection or “quantification” of polynucleotide or polypeptide expression includes, for example, binding or interaction of a mRNA to a detection agent, test agent or diagnostic agent (including application as a companion reagent). It can be achieved using appropriate methods, including measurement and immunological measurement methods. Examples of the molecular biological measurement method include Northern blotting, dot blotting, PCR and the like. Examples of immunological measurement methods include ELISA method using a microtiter plate, RIA method, immunofluorescence method, luminescence immunoassay (LIA), immunoprecipitation method (IP), immunodiffusion method (SRID), and immunity.
  • DNA arrays are widely outlined in (Shujunsha ed., Cell Engineering Separate Volume "DNA Microarrays and Latest PCR Methods"). For protein arrays, see Nat Genet. It is described in detail in 2002 Dec; 32 Supplement: 526-532.
  • the method for analyzing gene expression includes, but is not limited to, RT-PCR, RACE method, SCSP method, immunoprecipitation method, two-hybrid system, and invitro translation.
  • RT-PCR RT-PCR
  • RACE method RACE method
  • SCSP method immunoprecipitation method
  • two-hybrid system two-hybrid system
  • invitro translation Such further analytical methods are described, for example, in the Genome Analysis Experimental Method / Yusuke Nakamura Lab Manual, edited by Yusuke Nakamura Yodosha (2002), and all of these descriptions are incorporated herein by reference. Will be done.
  • “reduction” or “suppression” of an activity, expression product eg, protein, transcript (RNA, etc.)
  • a synonym thereof is a reduction in the quantity, quality or effect of a particular activity, transcript or protein. , Or the activity to reduce.
  • “disappearing” out of the decrease it means that the activity, expression product, etc. are below the detection limit, and in particular, it may be called “disappearing”.
  • “disappearance” is included in “decrease” or “suppression”.
  • the term "label” refers to an entity (eg, substance, energy, electromagnetic wave, etc.) for identifying a molecule or substance of interest from others.
  • a labeling method include an RI (radioisotope) method, a fluorescence method, a biotin method, a chemiluminescence method and the like.
  • the markers of the present disclosure or a plurality of factors or means for capturing the markers are labeled by the fluorescence method, the labels are labeled with fluorescent substances having different fluorescence maximum wavelengths. The difference in the maximum wavelength of fluorescence emission is preferably 10 nm or more.
  • Alexa TM Fluor is a water-soluble fluorescent dye obtained by modifying coumarin, rhodamine, fluorescein, cyanine, etc., and is a series that supports a wide range of fluorescent wavelengths. It is stable, bright, and has low pH sensitivity.
  • Examples of the combination of fluorescent dyes having a maximum fluorescence wavelength of 10 nm or more include a combination of Alexa TM 555 and Alexa TM 633, a combination of Alexa TM 488 and Alexa TM 555, and the like.
  • any one that can bind to the base portion thereof can be used, but cyanine dyes (for example, Cy3, Cy5, etc. of CyDyeTM series), rhodamine 6G reagent, 2-acetylaminofluorene (AAF). ), AAIF (iodine derivative of AAF) and the like are preferably used.
  • the fluorescent substance having a difference in fluorescence emission maximum wavelength of 10 nm or more include a combination of Cy5 and Rhodamine 6G reagent, a combination of Cy3 and fluorescein, a combination of Rhodamine 6G reagent and fluorescein, and the like.
  • such a label can be used to modify an object of interest so that it can be detected by the detection means used. Such modifications are known in the art and those skilled in the art can optionally implement such methods depending on the label and the subject of interest.
  • in vivo refers to the inside of a living body. In a particular context, “in vivo” refers to the location where the substance of interest should be placed.
  • in vitro refers to a state in which a part of a living body is removed or released “in vitro” (for example, in vitro) for various research purposes. A term that contrasts with in vivo.
  • ex vivo refers to a series of actions that are performed outside the body but are intended to be returned to the body afterwards for a certain procedure. Also in the present disclosure, it is possible to envision an embodiment in which cells in a living body are treated with the agent of the present disclosure and returned to a patient again.
  • kits are a unit that is usually divided into two or more sections and is provided with parts to be provided (for example, a test drug, a diagnostic drug, a therapeutic drug, an antibody, a label, a manual, etc.).
  • the form of this kit is preferred when the purpose is to provide a composition such that it should not be mixed and provided for stability and the like, and it is preferable to mix and use immediately before use.
  • kits are preferably instructions or instructions describing how to use the provided parts (eg, test agents, diagnostic agents, therapeutic agents, or how reagents should be treated).
  • the kit When the kit is used as a reagent kit in the present specification, the kit usually includes an instruction manual or the like that describes how to use a test drug, a diagnostic drug, a therapeutic drug, an antibody, or the like. Is included.
  • the "instruction” describes the method of using this disclosure to a doctor or another user.
  • This instruction sheet contains words instructing the detection method of the present disclosure, how to use a diagnostic agent, or administration of a medicine or the like.
  • the instruction sheet may include words instructing administration to the esophagus (for example, by injection) orally as the administration site.
  • This instruction is prepared and approved by the regulatory agency of the country in which this disclosure is implemented (eg, Ministry of Health, Labor and Welfare in Japan, Food and Drug Administration (FDA) in the United States, etc.). It is clearly stated that it has been received.
  • the instruction sheet is a so-called package insert, which is usually provided in a paper medium, but is not limited thereto, and is in the form of, for example, an electronic medium (for example, a homepage provided on the Internet, an e-mail). But can be provided.
  • intracellular transfer refers to a substance in which a cell binds to an antigen by endocytosis or phagocytosis via a substance bound to the antigen on the cell surface.
  • a substance that binds to Glypian-1 having such activity causes the target active ingredient to be intracellularly transferred to cells expressing Glypian-1 on the cell surface, thereby achieving the desired effect.
  • the desired effect of the ingredients can be produced in Glypian-1 expressing cells.
  • the active ingredient of interest include, but are not limited to, agents having cytotoxic activity, anticancer agents, contrast agents, siRNA, antisense nucleic acids, ribozymes and the like.
  • the term "complex” means any construct that includes two or more parts.
  • the other portion may be a polypeptide and may be other substances (eg, sugars, lipids, nucleic acids, other hydrocarbons, low molecular weight compounds, etc.).
  • two or more portions constituting the complex may be bonded by covalent bonds or other bonds (for example, hydrogen bonds, ionic bonds, hydrophobic interactions, van der Waals forces, etc.). It may have been done. Therefore, as used herein, the term "complex” includes molecules formed by linking a plurality of molecules such as polypeptides, nucleic acids, lipids, sugars, and low molecular weight compounds. It was
  • linker refers to a molecule that connects at least two components and spatially separates them. Examples of the linker include, but are not limited to, an enzyme-cleaving linker, an acid instability linker, and a disulfide linker.
  • Enzyme-cleaving linker refers to a linker that is cleaved by an enzyme present in the cell.
  • Acid-instability linker refers to a linker that is cleaved under conditions of intracellular endosome or lysosome production.
  • disulfide linker refers to a linker that is cleaved in an intracellular reducing environment.
  • the term "antibody drug conjugate (ADC)” refers to an antibody or an antigen-binding fragment thereof that is chemically linked to one or more active ingredients of interest.
  • the ADC is operably linked via a linker.
  • “operably linked” refers to a relationship in which the linked components can be actuated to perform their function.
  • the target active ingredient that may be contained in the ADC includes, but is not limited to, a drug having cytotoxic activity, an anticancer agent, a contrast agent, siRNA, an antisense nucleic acid, a ribozyme, and the like.
  • What can be used as a linker may be a cleaved linker or a non-cleavable linker.
  • the cleaved linker include, but are not limited to, a linker having a cleavage sequence by a proteolytic enzyme, an acid instability linker, and a disulfide linker.
  • the non-cleavable linker include, but are not limited to, an MCC linker.
  • cell-damaging activity refers to, for example, causing pathological changes in cells, not only direct trauma, but also DNA cleavage, base dimer formation, chromosomal cleavage, and cell division. It refers to causing cell death by directly or indirectly blocking the function of cells due to any structural or functional damage to the cells such as system damage or decreased activity of various enzymes. Therefore, examples of the "drug having cytotoxic activity” include, but are not limited to, alkylating agents, tumor necrosis factor inhibitors, intercalators, microtubule inhibitors, kinase inhibitors, proteasome inhibitors, and topoisomerase inhibitors. Agents and the like can be mentioned.
  • IC 50 50% inhibitory concentration
  • affinity refers to the equilibrium constant for the reversible binding of, represented by the equilibrium dissociation constant (K D value).
  • the equilibrium dissociation constant can be measured by surface plasmon resonance (SPR) methods, such as Biacore®. In addition, it may be measured by MP-SPR Navi TM (BioNavis), OpenPlex (Horiba), Smart SPR (RIBM).
  • SPR surface plasmon resonance
  • the K D values indicated unless otherwise specified, it refers to a value measured by surface plasmon resonance (SPR) method.
  • the present disclosure is humanized based on an antibody comprising a heavy chain variable region having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5 and a light chain variable region having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6.
  • An anti-GPC-1 antibody or an antigen-binding fragment thereof is provided.
  • the inventors of the present invention are 01a033 (sequence), which is an anti-GPC-1 mouse monoclonal antibody having a high affinity for GPC-1 disclosed in International Publication No. 2018/199318 (incorporated herein by reference).
  • the humanized antibody of the present disclosure is GPC-1 as compared with an antibody containing a heavy chain variable region having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5 and a light chain variable region having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6. Can have a high affinity for.
  • the antibodies of the present disclosure or antigen-binding fragments thereof are the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7, or at least about 90%, at least about 95%, at least about 96%, at least about 97% of the amino acid sequence thereof. It may contain heavy chain variable regions having at least about 98%, or at least about 99%, identical amino acid sequences.
  • the antibodies of the present disclosure or antigen-binding fragments thereof are amino acid sequences selected from the group consisting of the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 8-27, or at least about 90%, at least about 95% thereof. , At least about 96%, at least about 97%, at least about 98%, or at least about 99% may contain a light chain variable region having the same amino acid sequence.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present disclosure is an amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 8 to 17, or at least about 90%, at least about 95%, at least. It may contain about 96%, at least about 97%, at least about 98%, or at least about 99% light chain variable regions having the same amino acid sequence.
  • the antibodies of the present disclosure may be of any class, eg, IgM, IgD, IgG, IgA, IgE, or IgY.
  • the antibodies of the present disclosure can be IgG.
  • the antibody of the present disclosure is a subclass selected from the group consisting of human IgG1, human IgG2, human IgG3, and human IgG4, preferably human IgG4.
  • Human IgG4 is known to undergo a reaction (Fab-arm exchange) in which the H chain of human IgG4 exchanges with another human IgG4 (https://www.nature.com/articles/nrneph.2015.95/figures). / 2).
  • an S228P mutation can be inserted (J Biol Chem. 2015 Feb 27; 290 (9): 5462-9.).
  • OPDIVOR nivolumab
  • KEYTRUDAR pembrolizumab
  • dupilumab has the amino acid residue at position 233 of the H chain replaced with Pro. Since Fab-arm exchange does not occur in classes other than human IgG4, it is not necessary to include amino acid mutations.
  • the antibodies of the present disclosure are the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 91, or at least about 90%, at least about 95%, at least about 96%, at least about 97%, at least about 98% of the amino acid sequence. Alternatively, it may contain a heavy chain constant region having at least about 99% identical amino acid sequence. In some embodiments, the antibodies of the present disclosure have the amino acid arrangement set forth in SEQ ID NO: 92, or at least about 90%, at least about 95%, at least about 96%, at least about 97%, at least about 98%, and the amino acids. Alternatively, it may contain a light chain constant region having at least about 99% identical amino acid sequence.
  • CDRs 1-3 of the heavy chain variable region may have the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 28-30, respectively.
  • the light chain variable regions CDR1-3 are SEQ ID NOs: 31-33, respectively, or SEQ ID NOs: 34-36, respectively, or SEQ ID NOs: 37-39, respectively, or SEQ ID NOs: 40-42, respectively.
  • the light chain variable regions CDR1-3 are SEQ ID NOs: 31-33, respectively, or SEQ ID NOs: 34-36, respectively, or SEQ ID NOs: 37-39, respectively, or SEQ ID NOs: 40-42, respectively, or SEQ ID NOs, respectively.
  • the epitope of the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present disclosure may comprise positions 339-358 and / or 388-421 of SEQ ID NO: 2 (full-length sequence of human GPC-1). In certain embodiments, the epitopes of the antibodies of the present disclosure may comprise positions 339-358 and 388-421 of SEQ ID NO: 2 (full-length sequence of human GPC-1).
  • the antibodies or antigen-binding fragments thereof of the present disclosure are about 5 ⁇ 10 -9 M, about 6 ⁇ 10 -9 M, about 7 ⁇ 10 -9 M, about 8 ⁇ 10 -9 M, about 9 ⁇ 10 -9 M, about 10 -8 M or less, about 2 ⁇ 10 -8 M, about 3 ⁇ 10 -8 M, about 4 ⁇ 10 -8 M, about 5 ⁇ 10 -8 M, about 10 - 7 M or capable of binding to Glypican-1 at approximately 5 ⁇ 10 -7 M affinity (K D value).
  • an antibody or antigen-binding fragment thereof of the present disclosure, linked to Glypican-1 at 3.16 ⁇ 10 -8 M or an affinity of about 1.02 ⁇ 10 -8 M (K D value) obtain.
  • the present disclosure provides a pharmaceutical composition for intracellular translocation of an active ingredient, comprising the humanized antibody of the present disclosure or an antigen-binding fragment thereof.
  • the antibodies of the present disclosure unexpectedly have intracellular translocation (internalization) activity equal to or higher than 01a033.
  • the present disclosure provides a complex of the humanized antibody of the present disclosure or an antigen-binding fragment thereof and an agent having cytotoxic activity.
  • Drugs with cytotoxic activity can be operably linked to a humanized antibody or antigen-binding fragment thereof via a linker.
  • Drugs with cytotoxic activity include monomethyl auristatin E (MMAE), monomethyl auristatin F (MMAF), DM1, DM4, calikeamycin, duocarmycin, pyrolobenzodiazepines (PBD), and topoisomerase inhibitors.
  • MMAE monomethyl auristatin E
  • MMAF monomethyl auristatin F
  • agents having cytotoxic activity are preferably those having a bystander effect.
  • Bystander refers to the effect that a drug released in a cancer cell permeates the cell membrane and is effective against surrounding cancer cells. Therefore, in some embodiments, the agent having cytotoxic activity can be cell permeable.
  • the drug having a cytotoxic activity having a bystander effect include, but are not limited to, MMAE, PBD, Eribulin, SN-38
  • the linker may be one that is cleaved in cancer cells, and examples thereof include enzyme-cleaving linkers, acid instability linkers, and disulfide linkers.
  • the linker can be a truncated linker cleaved by a cathepsin (eg, cathepsin B), such as maleimide caproyl-valine-citrulline-p-aminobenzyloxycarbonyl.
  • the complex of the present disclosure is about 0.04 nM or less, about 0.05 nM or less, about 0.06 nM or less, about 0.07 nM or less, about 0.08 nM or less in Glypican-1 positive cells. , About 0.09 nM or less, about 0.1 nM or less, about 0.11 nM or less, about 0.12 nM or less, about 0.13 nM or less, about 0.14 nM or less, or about 0.15 nM or less, IC 50 .
  • the IC 50 can be the value measured in the ADC assay of Example 2.
  • the Glypican-1 positive cells may exhibit an IC 50 less than or equal to about 0.1 nM.
  • the linker used in the complex of the present disclosure may be an acid instability linker.
  • Acidic pH in endosomes or lysosomes after intracellular translocation can be utilized and linkers responsive to acidic and unstable pH can be used. Examples of such a linker include hydrazone and the like.
  • the linker used in the complex of the present disclosure may be a disulfide linker, such a linker being N-succinimidyl 4- (2-pyridyldithio) butanoate (SPDB),.
  • a linker being N-succinimidyl 4- (2-pyridyldithio) butanoate (SPDB),.
  • SPDB N-succinimidyl 4- (2-pyridyldithio) butanoate
  • SPP N-succinimidyl 4- (2-pyridyldithio) pentanoate
  • the linker used in the complex of the present disclosure may be a non-cleavable linker.
  • the non-cleavable linker include, but are not limited to, maleimide methylcyclohexane-1-carboxylic acid (MCC linker).
  • the present disclosure provides a composition comprising the complex of the present disclosure for preventing or treating Glypican-1 positive cancer.
  • the Glypican-1 positive cancer can be esophageal cancer or pancreatic cancer.
  • composition for the treatment of metastatic cancer in a further aspect, there is provided a composition comprising the complex of the present disclosure for preventing or treating metastatic cancer of Glypican-1 positive cancer.
  • the present inventors can treat metastatic cancers of Glypican-1 positive cancers expressing Glypican-1 and metastatic cancers of Glypican-1 positive cancers with the complex of the present disclosure. I found out what I could do.
  • the antigen expressed at the primary site does not always express the same antigen in metastatic cancer. Therefore, it is necessary to confirm whether or not the cancer antigen expressed at the primary site is expressed in metastatic cancer.
  • GPC1 is positively expressed in the metastatic tumor tissues such as pancreatic cancer lymph node metastasis, pancreatic cancer liver metastasis, and esophageal cancer lymph node metastasis, and is significant as a therapeutic target.
  • Glypican-1 positive cancers include esophageal cancer, pancreatic cancer, bile duct cancer, cervical cancer, lung cancer, head and neck cancer, breast cancer, uterine leiomyosarcoma, prostate cancer, It can be selected from oral squamous epithelial cancer, or any combination thereof.
  • the Glypican-1 positive cancer can be pancreatic cancer.
  • the metastatic cancer has spread to the liver, esophagus, bile duct, cervix, lung, head and neck, breast, uterine smooth muscle, prostate, oral squamous epithelium, brain, bone, peritoneum, adrenal gland, and the like. It can be metastatic cancer.
  • the cancer may have cancer-related fibroblasts (CAFs).
  • CAFs cancer-related fibroblasts
  • the complex of the present disclosure may be administered with an immune checkpoint inhibitor.
  • the immune checkpoint inhibitor include, but are not limited to, anti-PD-1 antibody, anti-PD-L1 antibody, anti-CTLA-4 antibody, anti-VISTA antibody and the like.
  • the variants are 3 or less amino acid substitutions, deletions and / or additions, preferably 2 or less amino acid substitutions, deletions in each CDR of the antibodies or antigen-binding fragments thereof of the present disclosure. And / or additions, more preferably one or less amino acid substitutions, deletions and / or additions. These variants may have an affinity for GPC-1 equal to or higher than 01a033 or the antibodies of the present disclosure.
  • the anti-GPC1 monoclonal antibody (clone 01a033) found as an antibody having high intracellular internalizing activity is humanized, and the internalizing activity into cells higher than that before humanization is screened for humanization anti-humanization.
  • the purpose of this study is to create a humanized GPC1-ADC in which an anticancer drug is bound to a GPC1 monoclonal antibody via a linker, and to clarify the antitumor effect of the humanized GPC1-ADC in vitro and in vivo.
  • the payload MMAE since the payload MMAE has the property of inducing immunogenic cell death, it is also an object to confirm that a synergistic antitumor effect can be obtained by the combined use of humanized GPC1-ADC and an immune checkpoint inhibitor. ..
  • humanization was briefly performed by library construction, antigen panning and screening, binding ELISA, and affinity determination.
  • a human V ⁇ library was constructed with CDRs of mouse antibodies and fixed heavy chains of the human framework, followed by antigen panning and screening.
  • a total of 30 humanized anti-glycican-1 antibodies were found from the panning of the V ⁇ library and confirmed by phage ELISA. Twenty of them were selected for antibody expression and purification, after which affinity was determined by Biacore® 8K.
  • VL region For the VL region, a library of human VL gene pools (LC-Library: Library diversity 4.53 ⁇ 10 5 / Library size 1.06 ⁇ 10 13 ) was used.
  • the VL library gene + Ck gene + the above-mentioned humanized VH gene + CH1 were incorporated into the N-terminal side of the phage GIII antigen in this order.
  • a phage library was prepared (humanized antibody library) in which a random human L chain (k) and a humanized H chain (VH + CH1) having a CDR sequence of 01a033 were presented.
  • Panning was performed to select phages expressing antibodies that actually bind to GPC-1 from the humanized antibody library.
  • GPC-1 which is an antigen, was bound to a solid phase (test tube, particles), a population of phage was added thereto, and the cells were washed to recover the bound phage.
  • the phage was cloned by binding to the antigen by panning, infecting the eluted phage with a plate sowed with E. coli, and copying the resulting lytic plaque to a filter.
  • the obtained phage clone was amplified, the binding property to the ELISA method (fixed human GPC-1 antigen) was examined for each clone, and the clones obtained with a binding signal of a certain value or higher were selected.
  • Antibodies IgGed from the genes of the selected phage 20 clones were expressed in HEK293 cells (vector: pFUSE2ss-CLIg-hkpFUSE2ss-CLIg-hk (light chain, Invitrogen, catalog number: pfuse2ss-hclk) and pFUSEss-CHIg-hG1. (Heavy chain, Invitrogen, catalog number: pfusss-hchg1); Cell line: FreeStyle TM 293F Cells (Invitrogen, catalog number: R790-07)). Antibodies were purified from the culture supernatant 4 days after transfection, quantified and confirmed by SDS-PAGE. Antibody production (presence and molecular weight of H chain and L chain) was confirmed for all 20 clones.
  • ⁇ Measurement of antigen-binding affinity of mouse antibody (01a033) by surface plasmon resonance method The binding affinity of mouse antibodies for human GPC-1 was measured by surface plasmon resonance method (Biacore® 8K). An anti-mouse Fc antibody was immobilized on a chip, and a mouse antibody (01a033) was flowed to bind to the chip. After washing, human GPC-1 was flowed to measure the binding constant (Ka) and dissociation constant (Kd).
  • a human antibody chimeric gene was prepared by connecting the VH / VL gene of 01a033 to the human Ck / CH gene. It was expressed in HEK293F cells.
  • Example 1 Affinity analysis of humanized anti-GPC1 monoclonal antibody
  • Humanized mouse anti-human GPC1 monoclonal antibody (subclass IgG4) and 20 types of clones (T1, T2, T3, T7, T8, T10, T11, T22, T26, T28, T29, T31, T32, T33, T34, T36, T43, T56, T57, T59) were prepared.
  • anti-human IgG Fc
  • the anti-Glypican-1 (GPC-1) monoclonal antibody (01a033) was independently humanized, and as a result, 20 kinds of candidate clones were obtained. These 20 types of clones were measured Biacore (registered trademark) by the equilibrium dissociation constant (K D) (Fig. 1). As a result, 7 types of clones (clones T1, T2, T3, T8, T10, T36, T56) showing stronger affinity than the chimeric mouse antibody (01a033), which is an antibody before humanization, were confirmed (FIG. 1). ).
  • Example 2 ADC assay combining a humanized anti-GPC-1 antibody and an MMAF-binding secondary antibody
  • material and method confirmation of anticancer drug sensitivity of TE14 cells
  • 2000 TE14 cells were added to a 96-well plate in 80 ⁇ l. The cells were cultured overnight at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator, and the next day, 10 ⁇ l of each clone of the humanized anti-GPC1 antibody concentrated 10-fold with respect to the final concentration was added as the primary antibody per well.
  • Fab anti-human IgG antibody
  • MMAF anti-cancer agent
  • ADC used for assay A schematic diagram of the ADC used in the assay is shown in FIG. From 20 types of clones, clones having high intracellular internalization activity were screened by the method shown in FIG. In this method, the humanized anti-GPC1 antibody of the clone obtained in the above production example is added to the TE14 cell line, which is an esophageal cancer cell line expressing GPC1, as the primary antibody, and the anti-cancer agent (anti-cancer agent) is used as the secondary antibody.
  • the humanized anti-GPC1 antibody of the clone obtained in the above production example is added to the TE14 cell line, which is an esophageal cancer cell line expressing GPC1, as the primary antibody, and the anti-cancer agent (anti-cancer agent) is used as the secondary antibody.
  • MMAF By adding a conjugated anti-human IgG antibody, an anti-cancer drug is incorporated into cancer cells as a complex of a primary antibody and a secondary antibody, and cell death is induced by the action of the anti-cancer drug.
  • the assay system is used.
  • Example 3 Antigen affinity analysis by FACS
  • clone T2 showed the highest activity, so clone T2 was selected as a humanized anti-GPC1 antibody having high intracellular internalization activity and analyzed.
  • TE8-GPC1 KO cells in which GPC1 was knocked out using CRISPR-Cas9 technology as GPC1 negative cells.
  • Human / mouse chimeric anti-GPC1 antibody (clone 01a033) and humanized anti-GPC1 antibody (clone T2) are used as the primary antibody, and the secondary antibody is FITC-labeled anti-human IgG-FITC (Jackson Immunoresearch, model number: 109-). It was measured using FACS CantoII (BD) using 095-098), and the measured data was analyzed using BD FACSDiva software (BD).
  • Human / mouse chimeric anti-GPC1 antibody (clone 01a033) and humanized anti-GPC1 antibody (clone T2) were used as primary antibodies of various concentrations, and FITC-labeled anti-human IgG-FITC (Jackson Immunoresearch) was used as the secondary antibody. , Model No .: 109-095-098), measured using FACS CantoII (BD), and the measurement data was analyzed using BD FACSDiva software (BD).
  • Example 4 Preparation of ADC
  • the ADC was prepared as follows.
  • the humanized anti-GPC1 antibody (clone T2) was conjugated with mAb with maleimide caproyl-valine-citrulline-p-aminobenzyloxycarbonyl-monomethyl auristatin E (MC-vc-PAB-MMAE). Conjugation was performed by a maleimide-cysteine based method in which the interchain disulfide bond of mAb was first reduced by TCEP at 37 ° C. and then the maleimide portion of the drug was bound to the reduced cysteine.
  • ADC is desalted with Amicon Ultra-0.5 mL Centrifugal filters-30K (Millipore) to remove unreacted toxins, then ADC formation buffer (20 mM histidine, 7% sucrose, 0.02% (w / w /). v) The buffer was replaced with PS80, pH 5.5).
  • the distribution of drug-antibody ratio (DAR) was analyzed by hydrophobic interaction chromatography- (HIC) and the degree of aggregation was analyzed by size exclusion chromatography- (SEC). The conjugate condition was set so that the drug-antibody ratio (DAR) was 4.
  • FIG. 5 A schematic diagram of the structure of an exemplary ADC is shown in FIG.
  • the cysteine residue of the humanized anti-GPC1 antibody (clone T2) was conjugated with MMAE, which is a payload having a bystander effect, via a cleavage-type linker cleaved by cathepsin B.
  • Humanized GPC1-ADC showed DAT4.0 (FIG. 6).
  • Example 5 Antigen affinity analysis of humanized GPC1-ADC and unlabeled antibody by FACS (material and method)
  • human pancreatic cancer cell line (BxPC-3) cells were used as GPC1-positive cells.
  • Humanized anti-GPC1 antibody (clone T2) and humanized GPC1-ADC (MMAE) were used as primary antibodies of various concentrations, and the secondary antibody was FITC-labeled anti-human IgG-FITC (Jackson Immunoresearch, model number: It was measured using FACS CantoII (BD) using 109-095-098), and the measured data was analyzed using BD FACSDiva software (BD).
  • Example 6 Intracellular internalization assay of humanized anti-GPC-1 antibody (clone T2) and humanized GPC1-ADC (MMAE)).
  • humanized GPC1-ADC (MMAE) was examined for internalization (intracellular transfer) activity using a GPC1-positive BxPC-3 cell line using FACS.
  • the BxPC-3 cell line was peeled off from one 10 cm plate using 0.02% EDTA and recovered. Cells were suspended in RPMI 1640 + 10% FBS + 1% GlutaMAX TM I + 100 U / ml penicillin + 100 ⁇ g / ml streptomycin and prepared in 1.5 ml tubes as 2.0x10 6 cells / 0.9 ml. It was allowed to stand on ice for 1 hour to reduce the internalization activity.
  • incubation group 12 cells were used.
  • the incubation time was 0h, 1h, 2h, 3h, 4h, 6h.
  • cells were centrifuged at 1500 rpm, 4 ° C. for 5 minutes and the supernatant was removed.
  • the cells were washed with 100 ⁇ l of ice-cold PBS + 0.2% BSA and centrifuged. The cleaning operation was performed a total of 3 times.
  • humanized anti-GPC1 antibody clone T2
  • humanized GPC1 when internalized using the GPC1-positive BxPC-3 cell line for humanized anti-GPC1 antibody (clone T2) and humanized GPC1-ADC (MMAE).
  • the intracellular localization of ADC was investigated using a fluorescent microscope.
  • BxPC-3 cells were seeded at 7.5x10 4 cells / well (1 ml / well) in a 12-well plate (Corning: 3513) containing 18 mm microcover glass (matsunami), and the cells were seeded at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator. Incubated overnight.
  • the antibody solution was aspirated, 1.0 ml ice-cold RPMI 1640 + 10% FBS + 1% GlutaMAX TM I + 100 U / ml penicillin + 100 ⁇ g / ml streptomycin was added, and the cells were washed. The sample at this point was collected as a 0-hour sample (0h).
  • the cells were washed 3 times with 1 ml PBS, the cover glass to which the cells were adhered was taken out, sealed on a slide glass with a Vectorshield (Vectashield H1200), and with an all-in-one fluorescence microscope (Keyence, BZ-X800). Observed.
  • both the humanized anti-GPC1 antibody (T2) and the humanized anti-GPC1-ADC were found to be CD107a. From the co-localization, it was confirmed that the humanized anti-GPC1 antibody (T2) and the humanized anti-GPC1-ADC bind to GPC1 and then transfer to lysosomes (FIG. 8).
  • Example 7 in vitro ADC assay using humanized GPC1-ADC (MMAE)) (material and method) GPC1 expression analysis by FACS was performed.
  • the mouse anti-GPC1 antibody (clone 01a033) whose expression of GPC1 was analyzed by FACS analysis was used as the primary antibody, and FITC-labeled goat anti-mouse IgG (H + L chain specific) (southern biothech) was used as the secondary antibody. Measurements were made using FACS Canto II (BD) and the measurement data were analyzed using FlowJo TM software (T
  • the in vitro ADC assay using the humanized GPC1-ADC (MMAE) prepared in Example 4 was performed as follows. (1) The cells were sprinkled on a 96-well white plate (model number 136101) manufactured by Thermo Fisher Scientific (model number 136101) (cell suspension 90 ⁇ L).
  • the medium used was RPMI1640 + 10% FBS + 100U / ml penicillin + 100 ⁇ g / ml streptomycin (RPMI1640 + 10% FBS + 1% GlutaMAX TM I + 100U / ml penicillin + 100 ⁇ g / ml streptomycin, Detroit562, Detroit 562, FaDU / Ml streptomycin, Ho-1-u-1 used DMEM / F12 + 10% FBS + 100U / ml penicillin + 100 ⁇ g / ml streptomycin).
  • Cells were seeded in 60 wells in the center of the plate and 100 ⁇ L of medium was added to the outer 36 wells. The cells were cultured at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator.
  • IC50 10 ⁇ (Log [A] [B] ⁇ (50C) / (DC) + Log [B]) A: High concentration sandwiching 50% B: Inhibition rate at low concentration C: B sandwiching 50% D: Inhibition rate at A.
  • humanized GPC1-ADC exerted a medicinal effect on GPC1-positive cancer cell lines, but showed no medicinal effect on GPC1-negative cancer cell lines. It was confirmed that the drug efficacy was dependent on the expression of GPC1 (Fig. 10). It was confirmed that humanized GPC1-ADC shows efficacy in a GPC1 expression-dependent manner against cervical cancer, head and neck tumor, and oral squamous cell carcinoma cell lines in addition to pancreatic cancer and esophageal cancer cell lines. (Figs. 11 and 12).
  • Example 9 In vivo drug efficacy test of humanized GPC1-ADC (MMAE) using pancreatic cancer PDX (PK565)) (material and method) The expression of GPC1 in pancreatic cancer PDX (PK565) was confirmed as follows.
  • GPC1 After deparaffinizing thin slices of paraffin-embedded tissue, dehydration was performed with alcohol.
  • the immunohistochemical staining method for GPC1 was performed using an anti-GPC-1 antibody (Genetex: GTX104557) and Chemmate Envision kit HRP 500T (Dako: K5007).
  • the expression of GPC1 in PK565 was confirmed to be a heterogeneous tumor in which positive and negative were mixed in pancreatic cancer cells.
  • Pancreatic cancer PDX was subcutaneously transplanted into 6-week-old NOG female mice, and when the tumor size became about 100 mm 3 after transplantation, PBS, control ADC (10 mg / kg), and humanized anti-humanization prepared in Example 4 were performed.
  • Intravenous administration was performed on the 0th day, the 7th day, the 14th day and the 21st day, with the day when the administration was started as the 0th day. Tumor volume and body weight were measured from day 0 to day 42 twice a week.
  • Example 10 In vivo drug efficacy test of humanized GPC1-ADC (MMAE) using pancreatic cancer PDX (PK175)) (material and method)
  • the expression of GPC1 in pancreatic cancer PDX (PK175) was confirmed as follows.
  • GPC1 After deparaffinizing thin slices of paraffin-embedded tissue, dehydration was performed with alcohol.
  • the immunohistochemical staining method for GPC1 was performed using an anti-GPC-1 antibody (Genetex: GTX104557) and Chemmate Envision kit HRP 500T (Dako: K5007). Expression of GPC1 in PK175 was confirmed to be a positive tumor in both pancreatic cancer cells and cancer-related fibroblasts (CAF).
  • Pancreatic cancer PDX was subcutaneously transplanted into 6-week-old NOG female mice, and when the tumor size became about 100 mm 3 after transplantation, PBS and humanized anti-GPC1-ADC (MMAE) (1 mg / kg), ( Administration of 3 mg / kg) and (10 mg / kg) was started. Intravenous administration was performed on the 0th day, the 7th day, the 14th day and the 21st day, with the day when the administration was started as the 0th day. Tumor volume and body weight were measured from day 0 to day 42 twice a week.
  • MMAE humanized anti-GPC1-ADC
  • Example 11 In vivo drug efficacy test of GPC1-ADC using esophageal cancer PDX (ESCC14)) (material and method)
  • the expression of GPC1 in esophageal cancer PDX (ESCC14) was confirmed as follows.
  • GPC1 After deparaffinizing thin slices of paraffin-embedded tissue, dehydration was performed with alcohol.
  • the immunohistochemical staining method for GPC1 was performed using an anti-GPC-1 antibody (Genetex: GTX104557) and Chemmate Envision kit HRP 500T (Dako: K5007). It was confirmed that the expression of GPC1 in ESCC14 is a homogeneous tumor that is uniformly and highly expressed in esophageal cancer cells.
  • Esophageal cancer PDX was subcutaneously transplanted into 6-week-old NOG female mice, and when the tumor size became about 100 mm 3 after transplantation, PBS was used as a control and the humanized anti-GPC1-ADC (MMAE) prepared in Example 4 was used. ) (1 mg / kg), (3 mg / kg), and (10 mg / kg) were started. Intravenous administration was performed on the 0th day, the 7th day, the 14th day and the 21st day, with the day when the administration was started as the 0th day. Tumor volume and body weight were measured from day 0 to day 42 twice a week.
  • MMAE humanized anti-GPC1-ADC
  • Example 12 GPC1 expression analysis by FACS analysis of mGPC1 forced expression mouse colon cancer cell line (mGPC1-MC38)) (material and method)
  • mGPC1-MC38 cells humanized anti-GPC1 antibody (clone T2) was used as the primary antibody, and the secondary antibody was FITC-labeled anti-human IgG-FITC (Jackson Immunoresearch, model number: 109-095-098).
  • BD FACS CantoII
  • MMAE immunogenic cell death
  • DAMPs damage-assisted tumor patches
  • Example 13 Quantification of HMGB-1 in culture supernatant by ELISA
  • Control-ADC, humanized GPC1-ADC and MMAE were added in vitro to MC38-mGPC1, and the culture supernatant was collected after 48 hours.
  • the concentration of HMGB-1 in the culture supernatant was carried out using HMGB1 ELISA KIT II-HMGB1 measurement reagent (Sinotest, model number SNO-326054329).
  • HMGB1 high mobility group box-1
  • DAMPs damage-associated molecular patterns
  • Example 14 Confirmation of synergistic effect by combined use of humanized GPC1-ADC (MMAE) and anti-PD1 antibody using colorectal cancer syngenic model mouse) (material and method)
  • MMAE humanized GPC1-ADC
  • anti-PD1 antibody using colorectal cancer syngenic model mouse material and method
  • MC38-mGPC1 was subcutaneously transplanted into 8-week-old C57BL / 6 female mice, and when the tumor size became about 75 mm 3 after transplantation, the cells were divided into 4 groups, and PBS was used to prepare the humanized anti-GPC1-ADC (Example 4).
  • MMAE (10 mg / kg), anti-mouse PD1 antibody (clone RMP1-14) (3 mg / kg), humanized anti-GPC1-ADC (MMAE) (10 mg / kg) + anti-mouse PD1 antibody (clone RMP1-14) ( Administration of 3 mg / kg) was started. With the day when the administration was started as the 0th day, the ADC was intravenously administered on the 0th day, the 3rd day, the 7th day and the 10th day, and the anti-mouse PD1 antibody was intraperitoneally administered. Tumor volume and body weight were measured from day 0 to day 21 twice a week.
  • Example 15 In vivo mechanism of action analysis of humanized GPC1-ADC (MMAE) using pancreatic cancer PDX (PK565))
  • Pancreatic cancer PDX (material and method) Pancreatic cancer PDX (PK565) was subcutaneously transplanted into 6-week-old NOG female mice, and when the tumor size became about 100 mm 3 after transplantation, PBS, control ADC (10 mg / kg), and Example 4 were prepared.
  • Humanized anti-GPC1-ADC (MMAE) (1 mg / kg), (3 mg / kg), (10 mg / kg) was administered. The tumor was removed 24 hours after administration. The excised tissue was fixed with 10% neutral formalin buffer, and then a paraffin-embedded tissue was prepared to prepare slices. For each slice, the expression of phosphor-histone H3 (Ser10) was analyzed by immunohistochemical staining to evaluate cancer cells whose cell cycle was arrested in the G2 / M phase.
  • phosphor-histone H3 (Ser10) was analyzed by immunohistochemical staining to evaluate cancer cells whose cell cycle was arrested in the G2 / M phase.
  • Example 16 Analysis of GPC1 expression by immunohistochemical staining in distant metastatic tissue of pancreatic cancer
  • pancreatic cancer distant metastasis such as lymph node metastasis and liver metastasis is known as a poor prognosis factor. Therefore, if GPC1 is expressed not only in the primary lesion of pancreatic cancer but also in distant metastatic lesions, it is considered to be highly useful as a therapeutic target. Therefore, the expression of GPC1 was evaluated for lymph node metastasis, liver metastasis, and adrenal metastasis of pancreatic cancer by immunohistochemical staining.
  • the humanized GPC1-ADC (MMAE) of the present invention is effective for the treatment or prevention of metastatic cancer of GPC1-positive cancer.
  • Example 16 In order to confirm the therapeutic or preventive effect of humanized GPC1-ADC (MMAE) on metastatic cancer suggested in Example 16, a pancreatic cancer liver metastasis model was created.
  • MMAE humanized GPC1-ADC
  • BxPC3-Luc cells were administered into the spleen of SCID mice, and the spleen was removed 1 to 2 weeks after the administration to prepare a pancreatic cancer liver metastasis model.
  • the proliferation of BxPC3-Luc cells metastasized in the liver was monitored by measuring luciferase activity using IVIS.
  • Liver metastasis model mice were divided into two groups, a PBS-administered group and a humanized anti-GPC1-ADC (MMAE) (10 mg / kg) -administered group prepared in Example 4, and a drug efficacy test was conducted in the same procedure as in Example 16. rice field.
  • MMAE humanized anti-GPC1-ADC
  • Example 18 Drug efficacy test with humanized GPC1-ADC in metastatic cancer
  • Humanized GPC1-ADC exerts a medicinal effect on both the primary and metastatic lesions, and is expected to have an effect of prolonging the survival period.
  • the humanized anti-GPC1-ADC (MMAE) of the present invention can be provided as the following intravenous injection preparations.
  • Humanized anti-GPC1-ADC 100 mg Polysorbate 80 5 mg Sodium chloride 100 mg Sodium citrate hydrate 80 mg Acidity regulator Appropriate amount Total amount 10mL
  • a drug for the treatment or prevention of cancer was provided. Technologies that can be used in industries (pharmaceuticals, etc.) based on such technologies are provided.
  • SEQ ID NO: 1 Human Glypican-1 nucleic acid sequence
  • SEQ ID NO: 2 Human Glypican-1 amino acid sequence
  • SEQ ID NO: 3 Mouse Glypican-1 nucleic acid sequence
  • SEQ ID NO: 4 Mouse Glypican-1 amino acid sequence
  • SEQ ID NO: 5 01a03 Chain variable region amino acid sequence
  • SEQ ID NO: 6 01a033
  • SEQ ID NO: 7 Humanized heavy chain variable region amino acid sequence
  • SEQ ID NO: 10 Amino acid sequence of the humanized light chain variable region of clone T8
  • 11 Amino acid sequence of the humanized light chain variable region of clone T1
  • SEQ ID NO: 12 Clone Amino acid sequence of the humanized light chain variable region of T36
  • 13 Amino acid

Abstract

本開示は、Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１（ＧＰＣ－１）に特異的に結合するヒト化抗体、ならび関連する技術、方法、および薬剤等を提供する。１つの局面において、本開示は、ＧＰＣ－１に対して高い親和性を有し、かつＧＰＣ－１陽性細胞において高いインターナライズ活性を有するヒト化抗ＧＰＣ－１モノクローナル抗体を提供する。別の局面では、本開示は、ヒト化抗ＧＰＣ－１モノクローナル抗体と細胞傷害活性を有する薬剤との複合体を含む、Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１陽性がんを予防または治療するための組成物も提供する。

Description

ヒト化抗ＧＰＣ－１抗体
　本開示は、Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１（ＧＰＣ－１）に特異的に結合するヒト化抗体、ならび関連する技術、方法、および薬剤等に関する。
　Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１分子は、正常細胞よりも食道がん細胞において有意に強く発現されており、腫瘍マーカーとして使用され得ることが見出された（特許文献１）。また、Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１に対して特異的に結合する抗体も単離されている（特許文献１）。
国際公開第２０１５／０９８１１２号
　１つの局面において、本開示は、ＧＰＣ－１に対して高い親和性を有し、かつＧＰＣ－１陽性細胞において高いインターナライズ活性を有するヒト化抗ＧＰＣ－１モノクローナル抗体を提供する。ヒト化された抗ＧＰＣ－１抗体は、これまでに開発されておらず、しかも、ヒト化抗ＧＰＣ－１抗体が高い活性を有することは予測されていなかった。本開示の抗体は様々な治療用途に使用され得る。
　したがって、別の局面では、本開示は、ヒト化抗ＧＰＣ－１モノクローナル抗体と細胞傷害活性を有する薬剤との複合体を含む、Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１陽性がんを予防または治療するための組成物も提供する。
　このような抗体またはそのフラグメントはコンパニオン診断薬およびコンパニオン診断薬と組み合わせた標的化治療または個別化医療などとして応用可能である。
　以上より、本開示は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
　配列番号５に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と配列番号６に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含む抗体に基づきヒト化されたヒト化抗ＧＰＣ－１抗体またはその抗原結合フラグメントであって、配列番号５に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と配列番号６に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含む抗体と比べて、ＧＰＣ－１に対して高い親和性を有する、ヒト化抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目２）
　前記ヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントが、
　（ａ）それぞれ配列番号２８～３０に記載のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１～３を含む、または
　（ｂ）（ａ）における重鎖ＣＤＲ１～３において３個以下のアミノ酸置換、欠失および／または付加を有する、
項目１に記載の組成物。
（項目３）
　前記ヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントが、
　（ａ）それぞれ配列番号３１～３３に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１～ＣＤＲ３を含む、または
　（ｂ）それぞれ配列番号３４～３６に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１～ＣＤＲ３を含む、または
　（ｃ）それぞれ配列番号３７～３９に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１～ＣＤＲ３を含む、または
　（ｄ）それぞれ配列番号４０～４２に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１～ＣＤＲ３を含む、または
　（ｅ）それぞれ配列番号４３～４５に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１～ＣＤＲ３を含む、または
　（ｆ）それぞれ配列番号４６～４８に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１～ＣＤＲ３を含む、または
　（ｇ）それぞれ配列番号４９～５１に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１～ＣＤＲ３を含む、または
　（ｈ）それぞれ配列番号５２～５４に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１～ＣＤＲ３を含む、または
　（ｉ）それぞれ配列番号５５～５７に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１～ＣＤＲ３を含む、または
　（ｊ）それぞれ配列番号５８～６０に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１～ＣＤＲ３を含む、または
　（ｋ）それぞれ配列番号６１～６３に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１～ＣＤＲ３を含む、または
　（ｌ）それぞれ配列番号６４～６６に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１～ＣＤＲ３を含む、または
　（ｍ）それぞれ配列番号６７～６９に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１～ＣＤＲ３を含む、または
　（ｎ）それぞれ配列番号７０～７２に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１～ＣＤＲ３を含む、または
　（ｏ）それぞれ配列番号７３～７５に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１～ＣＤＲ３を含む、または
　（ｐ）それぞれ配列番号７６～７８に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１～ＣＤＲ３を含む、または
　（ｑ）それぞれ配列番号７９～８１に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１～ＣＤＲ３を含む、または
　（ｒ）それぞれ配列番号８２～８４に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１～ＣＤＲ３を含む、または
　（ｓ）それぞれ配列番号８５～８７に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１～ＣＤＲ３を含む、または
　（ｔ）それぞれ配列番号８８～９０に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１～ＣＤＲ３を含む、または
　（ｕ）（ａ）～（ｔ）のいずれかにおける軽鎖ＣＤＲ１～３において３個以下のアミノ酸置換、欠失および／または付加を有する、
項目１または２に記載のヒト化抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目４）
　配列番号７に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、項目１～３のいずれか一項に記載のヒト化抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目５）
　配列番号８～２７に記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、項目１～４のいずれか一項に記載のヒト化抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目６）
　配列番号８～２７に記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、項目１～５のいずれか一項に記載のヒト化抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目７）
　配列番号８～１７に記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、項目１～６のいずれか一項に記載のヒト化抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目８）
　配列番号８～１７に記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、項目１～７のいずれか一項に記載のヒト化抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目９）
　前記抗体のエピトープが、配列番号２の３３９～３５８位および／もしくは３８８～４２１位を含む、項目１～８のいずれか一項に記載のヒト化抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目１０）
　前記抗体が、表面プラズモン共鳴法による解析に基づき１．０２Ｅ－８以下のＫＤでＧｌｙｐｉｃａｎ－１に結合する、項目１～９のいずれか一項に記載のヒト化抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目１１）
　項目１～１０のいずれか一項に記載のヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、有効成分を細胞内移行させるための医薬組成物。
（項目１２）
　項目１～１０のいずれか一項に記載のヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントと細胞傷害性活性を有する薬剤との複合体。
（項目１３）
　前記ヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントが、前記細胞傷害性活性を有する薬剤とリンカーを介して作動可能に連結されている、項目１２に記載の複合体。
（項目１４）
　前記細胞傷害性活性を有する薬剤が、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、ＤＭ１、ＤＭ４、カリケアマイシン、デュオカルマイシン、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、およびトポイソメラーゼ阻害剤からなる群から選択される、項目１２または１３に記載の複合体。
（項目１５）
　前記細胞傷害性活性を有する薬剤が、細胞膜透過性である、項目１３または１４に記載の複合体。
（項目１６）
　前記細胞傷害性活性を有する薬剤が、ＭＭＡＥ、ＰＢＤ、Ｅｒｉｂｕｌｉｎ、ＳＮ－３８、Ｄｘｄ、およびＤＭ４から選択される、項目１３～１５のいずれか一項に記載の複合体。
（項目１７）
　前記リンカーが、酵素切断型リンカー、酸不安定性リンカー、およびジスルフィドリンカーからなる群から選択される、項目１３～１６のいずれか一項に記載の複合体。
（項目１８）
　前記リンカーが、カテプシンＢにより切断される切断型リンカーである、項目１３～１７のいずれか一項に記載の複合体。
（項目１９）
　前記複合体が、Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１陽性細胞において、約０．１ｎＭ以下のＩＣ５０を示す、項目１２～１８のいずれか一項に記載の複合体。
（項目２０）
　項目１２～１９のいずれか一項に記載の複合体を含む、Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１陽性がんを予防または治療するための組成物。
（項目２１）
　前記Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１陽性がんは、食道がん、膵臓がん、胆管がん、子宮頸がん、肺がん、頭頸部がん、乳がん、子宮平滑筋肉腫、前立腺がん、口腔扁平上皮がんまたはこれらの任意の組合せから選択される、項目２０に記載の組成物。
（項目２２）
　前記Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１陽性がんは、食道がんまたは膵臓がんである、項目２０または２１に記載の組成物。
（項目２３）
　前記がんは、がん関連線維芽細胞（ＣＡＦ）を有する、項目２０～２２のいずれか一項に記載の組成物。
（項目２４）
　前記組成物が、免疫チェックポイント阻害剤と一緒に投与されることを特徴とする、項目２０～２３のいずれか一項に記載の組成物。
（項目２５）
　前記免疫チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ－１抗体である、項目２４に記載の組成物。
（項目２６）
　項目１２～１９のいずれか一項に記載の複合体を含む、Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１陽性がんの転移性がんを予防または治療するための組成物。
（項目２７）
　前記Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１陽性がんは、食道がん、膵臓がん、胆管がん、子宮頸がん、肺がん、頭頸部がん、乳がん、子宮平滑筋肉腫、前立腺がん、口腔扁平上皮がん、またはこれらの任意の組合せから選択される、項目２６に記載の組成物。
（項目２８）
　前記転移性がんが、膵臓がんの転移性がんである、項目２６または２７に記載の組成物。
（項目２９）
　前記転移性がんが、肝臓、食道、胆管、子宮頸、肺、頭頸部、乳房、子宮平滑筋、前立腺、口腔扁平上皮、脳、骨、腹膜、または副腎に転移した転移性がんである、項目２６～２８のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１Ａ）
　有効成分を細胞内移行させる方法であって、項目１～１０のいずれか一項に記載のヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントを細胞に投与する工程を含む、方法。
（項目２Ａ）
　被験体におけるＧｌｙｐｉｃａｎ－１陽性がんを予防または治療する方法であって、項目１２～１９のいずれか一項に記載の複合体を被験体に投与する工程を含む、方法。
（項目３Ａ）
　前記Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１陽性がんは、食道がん、膵臓がん、胆管がん、子宮頸がん、肺がん、頭頸部がん、乳がん、子宮平滑筋肉腫、前立腺がん、口腔扁平上皮がんまたはこれらの任意の組合せから選択される、項目２Ａに記載の方法。
（項目４Ａ）
　前記Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１陽性がんは、食道がんまたは膵臓がんである、項目２Ａまたは３Ａに記載の方法。
（項目５Ａ）
　前記がんは、がん関連線維芽細胞（ＣＡＦ）を有する、項目２Ａ～４Ａのいずれか一項に記載の方法。
（項目６Ａ）
　免疫チェックポイント阻害剤を投与する工程をさらに含む、項目２Ａ～５Ａのいずれか一項に記載の方法。
（項目７Ａ）
　前記免疫チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ－１抗体である、項目６Ａに記載の方法。
（項目８Ａ）
　被験体におけるＧｌｙｐｉｃａｎ－１陽性がんの転移性がんを予防または治療する方法であって、項目１２～１９のいずれか一項に記載の複合体を被験体に投与する工程を含む、方法。
（項目９Ａ）
　前記Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１陽性がんは、食道がん、膵臓がん、胆管がん、子宮頸がん、肺がん、頭頸部がん、乳がん、子宮平滑筋肉腫、前立腺がん、口腔扁平上皮がん、またはこれらの任意の組合せから選択される、項目８Ａに記載の方法。
（項目１０Ａ）
　前記転移性がんが、膵臓がんの転移性がんである、項目８Ａまたは９Ａに記載の方法。
（項目１１Ａ）
　前記転移性がんが、肝臓、食道、胆管、子宮頸、肺、頭頸部、乳房、子宮平滑筋、前立腺、口腔扁平上皮、脳、骨、腹膜、または副腎に転移した転移性がんである、項目８Ａ～１０Ａのいずれか一項に記載の方法。
（項目１Ｂ）
　有効成分を細胞内移行させるための医薬の製造における、項目１～１０のいずれか一項に記載のヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントの使用。
（項目２Ｂ）
　被験体におけるＧｌｙｐｉｃａｎ－１陽性がんを予防または治療するための医薬の製造における、項目１２～１９のいずれか一項に記載の複合体の使用。
（項目３Ｂ）
　前記Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１陽性がんは、食道がん、膵臓がん、胆管がん、子宮頸がん、肺がん、頭頸部がん、乳がん、子宮平滑筋肉腫、前立腺がん、口腔扁平上皮がんまたはこれらの任意の組合せから選択される、項目２Ｂに記載の使用。
（項目４Ｂ）
　前記Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１陽性がんは、食道がんまたは膵臓がんである、項目２Ｂまたは３Ｂに記載の使用。
（項目５Ｂ）
　前記がんは、がん関連線維芽細胞（ＣＡＦ）を有する、項目２Ｂ～４Ｂのいずれか一項に記載の使用。
（項目６Ｂ）
　前記複合体が、免疫チェックポイント阻害剤と一緒に投与されることを特徴とする、項目２Ｂ～５Ｂのいずれか一項に記載の使用。
（項目７Ｂ）
　前記免疫チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ－１抗体である、項目６Ｂに記載の使用。
（項目８Ｂ）
　被験体におけるＧｌｙｐｉｃａｎ－１陽性がんの転移性がんを予防または治療するための医薬の製造における、項目１２～１９のいずれか一項に記載の複合体の使用。
（項目９Ｂ）
　前記Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１陽性がんは、食道がん、膵臓がん、胆管がん、子宮頸がん、肺がん、頭頸部がん、乳がん、子宮平滑筋肉腫、前立腺がん、口腔扁平上皮がん、またはこれらの任意の組合せから選択される、項目８Ｂに記載の使用。
（項目１０Ｂ）
　前記転移性がんが、膵臓がんの転移性がんである、項目８Ｂまたは９Ｂに記載の使用。
（項目１１Ｂ）
　前記転移性がんが、肝臓、食道、胆管、子宮頸、肺、頭頸部、乳房、子宮平滑筋、前立腺、口腔扁平上皮、脳、骨、腹膜、または副腎に転移した転移性がんである、項目８Ｂ～１０Ｂのいずれか一項に記載の使用。
（項目１Ｃ）
　有効成分を細胞内移行させるための、項目１～１０のいずれか一項に記載のヒト化抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目２Ｃ）
　被験体におけるＧｌｙｐｉｃａｎ－１陽性がんを予防または治療するための、項目１２～１９のいずれか一項に記載の複合体。
（項目３Ｃ）
　前記Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１陽性がんは、食道がん、膵臓がん、胆管がん、子宮頸がん、肺がん、頭頸部がん、乳がん、子宮平滑筋肉腫、前立腺がん、口腔扁平上皮がんまたはこれらの任意の組合せから選択される、項目２Ｃに記載の複合体。
（項目４Ｃ）
　前記Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１陽性がんは、食道がんまたは膵臓がんである、項目２Ｃまたは３Ｃに記載の複合体。
（項目５Ｃ）
　前記がんは、がん関連線維芽細胞（ＣＡＦ）を有する、項目２Ｃ～４Ｃのいずれか一項に記載の複合体。
（項目６Ｃ）
　前記複合体が、免疫チェックポイント阻害剤と一緒に投与されることを特徴とする、項目２Ｃ～５Ｃのいずれか一項に記載の複合体。
（項目７Ｃ）
　前記免疫チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ－１抗体である、項目６Ｃに記載の複合体。
（項目８Ｃ）
　被験体におけるＧｌｙｐｉｃａｎ－１陽性がんの転移性がんを予防または治療するための、項目１２～１９のいずれか一項に記載の複合体。
（項目９Ｃ）
　前記Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１陽性がんは、食道がん、膵臓がん、胆管がん、子宮頸がん、肺がん、頭頸部がん、乳がん、子宮平滑筋肉腫、前立腺がん、口腔扁平上皮がん、またはこれらの任意の組合せから選択される、項目８Ｃに記載の複合体。
（項目１０Ｃ）
　前記転移性がんが、膵臓がんの転移性がんである、項目８Ｃまたは９Ｃに記載の複合体。
（項目１１Ｃ）
　前記転移性がんが、肝臓、食道、胆管、子宮頸、肺、頭頸部、乳房、子宮平滑筋、前立腺、口腔扁平上皮、脳、骨、腹膜、または副腎に転移した転移性がんである、項目８Ｃ～１０Ｃのいずれか一項に記載の複合体。
　本開示において、上記１または複数の特徴は、明示された組み合わせに加え、さらに組み合わせて提供されうることが意図される。本開示のなおさらなる実施形態および利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解すれば、当業者に認識される。
　本開示によれば、臨床応用可能なヒト化抗Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１抗体が提供される。このような抗体は、Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１陽性がんの診断・コンパニオン治療に使用される検出剤として利用することができ、さらに、当該抗体と薬物との複合体は、Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１陽性がんの治療に極めて有効である。
図１は、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）により測定された２０種類のクローンの平衡解離定数（ＫＤ）を示す。 図２は、実施例２のＡＤＣアッセイの概略図を示す。 図３は、ＴＥ１４細胞株における２０種類のクローンの細胞傷害活性（ＩＣ５０）の結果を示す。 図４は、抗ＧＰＣ－１キメラ抗体（０１ａ０３３）およびクローンＴ２のＦＡＣＳによる抗原親和性解析の結果を示す。 図５は、例示的なＡＤＣの構造の概略図を示す。 図６は、Ｄｒｕｇ－ｔｏ－Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｒａｔｉｏ　（ＤＡＲ）の設定の概略図を示す。 図７は、ヒト化ＧＰＣ１－ＡＤＣと未標識抗体のＦＡＣＳによる抗原親和性解析の結果を示す。 図８は、ヒト化抗ＧＰＣ－１抗体（ｃｌｏｎｅ　Ｔ２）およびヒト化ＧＰＣ１－ＡＤＣ（ＭＭＡＥ）の細胞内インターナライゼーションアッセイの結果を示す。緑はＧＰＣ１の染色、赤はＣＤ１０７ａの染色、青はＤＡＰＩの染色を示す。スケールは１０μｍを示す。グラフにおける各群の左のバーは４℃を示し、右のバーは３７℃を示す。 図９は、各種細胞株におけるＦＡＣＳによるＧＰＣ１発現解析の結果を示す。 図１０は、ヒト化ＧＰＣ１－ＡＤＣ（ＭＭＡＥ）を用いたｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ＡＤＣアッセイの結果を示す。 図１１は、ＨｅＬａ、Ｄｅｔｒｏｉｔ５６２、ＦａＤｕ細胞株におけるＧＰＣ１発現解析およびＡＤＣアッセイの結果を示す。 図１２は、Ｈｏ－１－ｕ－１、ＫＯＳＣ２　ｃｌ３－４３、ＫＯＮ細胞株におけるＧＰＣ１発現解析およびＡＤＣアッセイの結果を示す。 図１３は、ＧＰＣ１発現が不均一（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｏｕｓ）である膵臓がんＰＤＸ（ＰＫ５６５）を用いたヒト化ＧＰＣ１－ＡＤＣ（ＭＭＡＥ）のｉｎ　ｖｉｖｏでの薬効試験の結果を示す。いずれの群においても体重変化に大きな変化は無かった。ヒト化ＧＰＣ１－ＡＤＣ（１０ｍｇ／ｋｇ）において腫瘍体積はほぼ変化せず、ヒト化ＧＰＣ１－ＡＤＣ（３ｍｇ／ｋｇ）ではわずかに増加し、次にヒト化ＧＰＣ－ＡＤＣ（１ｍｇ／ｋｇ）およびＣｏｎｔｒｏｌ－ＡＤＣ（１０ｍｇ／ｋｇ）において増加し、ほぼ同じ大きさであり、Ｖｅｈｉｃｌｅ　ｃｏｎｔｒｏｌにおいて増加し、最も大きかった。 図１４は、ＧＰＣ１ががん細胞とＣＡＦの両方で発現している膵臓がんＰＤＸ（ＰＫ１７５）を用いたヒト化ＧＰＣ１－ＡＤＣ（ＭＭＡＥ）のｉｎ　ｖｉｖｏでの薬効試験の結果を示す。体重は、ヒト化ＧＰＣ１－ＡＤＣ（１０ｍｇ／ｋｇ）およびヒト化ＧＰＣ１－ＡＤＣ（３ｍｇ／ｋｇ）においてわずかに増加した。ヒト化ＧＰＣ－ＡＤＣ（１ｍｇ／ｋｇ）およびＶｅｈｉｃｌｅ　ｃｏｎｔｒｏｌでは大きな変化は無かった。ヒト化ＧＰＣ１－ＡＤＣ（１０ｍｇ／ｋｇ）において腫瘍体積は減少し、最も小さく、ヒト化ＧＰＣ１－ＡＤＣ（３ｍｇ／ｋｇ）ではわずかに増加し、次にヒト化ＧＰＣ－ＡＤＣ（１ｍｇ／ｋｇ）およびＶｅｈｉｃｌｅ　ｃｏｎｔｒｏｌは徐々に増大し、Ｖｅｈｉｃｌｅ　ｃｏｎｔｒｏｌが最も大きかった。 図１５は、ＧＰＣ１が均一に高発現する食道がんＰＤＸ（ＥＳＣＣ１４）を用いたヒト化ＧＰＣ１－ＡＤＣ（ＭＭＡＥ）のｉｎ　ｖｉｖｏでの薬効試験の結果を示す。体重はいずれの群においても大きな変動がなかった。腫瘍体積は、ヒト化ＧＰＣ１－ＡＤＣ（１０ｍｇ／ｋｇ）およびヒト化ＧＰＣ１－ＡＤＣ（３ｍｇ／ｋｇ）において同等で、最も小さく、次にヒト化ＧＰＣ－ＡＤＣ（１ｍｇ／ｋｇ）は、ほぼ横ばいであり、Ｖｅｈｉｃｌｅ　ｃｏｎｔｒｏｌは徐々に増大した。 図１６は、ｍＧＰＣ１強制発現マウス大腸がん細胞株（ｍＧＰＣ１－ＭＣ３８）におけるＧＰＣ１発現解析およびＡＤＣアッセイの結果を示す。 図１７は、ＥＬＩＳＡによる培養上清中のＨＭＧＢ－１の定量結果を示す。 図１８は、大腸がんシンジェニックモデルマウスを用いたヒト化ＧＰＣ１－ＡＤＣ（ＭＭＡＥ）と抗ＰＤ１抗体の併用による抗腫瘍効果の結果を示す。体重はいずれの群においても大きな変動がなかった。腫瘍体積は、ヒト化ＧＰＣ１－ＡＤＣ（１０ｍｇ／ｋｇ）＋ａｎｔｉ－ＰＤ１　Ａｂ（３ｍｇ／ｋｇ）において最も小さく、ａｎｔｉ－ＰＤ１　Ａｂ（３ｍｇ／ｋｇ）、ヒト化ＧＰＣ１－ＡＤＣ（１０ｍｇ／ｋｇ）、Ｖｅｈｉｃｌｅ　ｃｏｎｔｒｏｌの順に大きくなった。 図１９は、膵臓がんＰＤＸ（ＰＫ５６５）におけるＧ２／Ｍ期細胞周期マーカー（ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｈｉｓｔｏｎｅ　Ｈ３（Ｓｅｒ１０））の測定結果を示す。スケールバーは、１００μｍを示す。Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ　ｐｏｓｔ　ｈｏｃ　ｔｅｓｔの後のｏｎｅ－ｗａｙ　ＡＮＯＶＡ、＊＊Ｐ＜０．０１。 図２０は、膵臓がん遠隔転移組織における免疫組織化学染色法によるＧＰＣ１発現の解析結果を示す。スケールバーは１００μｍを示す。 図２１は、膵臓がん肝転移モデルの作製とヒト化ＧＰＣ１－ＡＤＣによる薬効試験の概要を示す。ｉ．ｖ．投与を０日目、３日目、７日目および１０日目に行った。ＩＶＩＳ計測を０日目、７日目、１４日目、２１日目、２８日目、３５日目、４２日目および４９日目に行った。 図２２は、膵臓がん肝転移モデルにおけるヒト化ＧＰＣ１－ＡＤＣによる薬効試験の結果を示す。ＰＢＳ投与群：ｎ＝１３，ＧＰＣ１－ＡＤＣ　１０ｍｇ／ｋｇ投与群：ｎ＝１０，＊：ｐ＜０．０５，＊＊：ｐ＜０．０１。
　以下、本開示を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語および科学技術用語は、本開示の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。「約」は、示される値の±１０％を意味する。
　（定義）
　最初に本開示において使用される用語および一般的な技術を説明する。
　本明細書において、「Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１」、「ＧＰＣ－１」または「ＧＰＣ１」は、交換可能に使用される用語であり、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー型細胞表面プロテオグリカンであり、ヘパラン硫酸を有するものである。細胞接着、移動、リポタンパク質代謝、増殖因子活性調節および血液凝固抑止に関連するとされている。いくつかの線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、例えば、ＦＧＦ－１、ＦＧＦ－２およびＦＧＦ－７に結合するといわれる。Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１は、ＶＥＧＦ１６５の細胞外シャペロンとして機能し、酸化後のレセプター結合能を回復することを支援するとされる。Ｇｌｙｐｉｃａｎは現在のところＧｌｙｐｉｃａｎ－１～Ｇｌｙｐｉｃａｎ－６の６種類が知られているが、がんとの関係ではＧｌｙｐｉｃａｎ－ファミリーメンバーであるからといっても必ずがんマーカーであると認識されているものではなく、メンバー相互は無関係であるようである。Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１は、ＵｎｉＰｒｏｔにアクセッション番号Ｐ３５０５２として登録されており（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｐ３５０５２を参照）、このほか、ＮＣＢＩでは、ＮＰ＿００２０７２．２（前駆体アミノ酸配列）、ＮＭ＿００２０８１．２（ｍＲＮＡ）、ＥＭＢＬ、ＧｅｎＢａｎｋおよびＤＤＢＪでは、Ｘ５４２３２．１（ｍＲＮＡ）、ＢＣ０５１２７９．１（ｍＲＮＡ）、ＡＣ１１０６１９．３（ｇｅｎｏｍｉｃ）として登録されている。これらはいずれも、本明細書において利用することができる情報であり、その情報を本明細書において参考として援用する。Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１については、Ｄａｖｉｄ　Ｇ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　１９９０　Ｄｅｃ；１１１（６　Ｐｔ　２）：３１６５－７６；Ｈａｅｃｋｅｒ　Ｕ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔ　Ｒｅｖ　Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　２００５　Ｊｕｌ；６（７）：５３０－４１；Ａｉｋａｗａ　Ｔ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｉｎｖｅｓｔ．　２００８Ｊａｎ；１１８（１）：８９－９９．；Ｍａｔｓｕｄａ　Ｋ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．　２００１　Ｊｕｌ　１５；６１（１４）：５５６２－９．等を参照。ヒトＧｌｙｐｉｃａｎ－１の核酸配列（全長）は、配列番号１が代表例であり、アミノ酸配列は配列番号２が代表例である。また、マウスＧｌｙｐｉｃａｎ－１の核酸配列（全長）は、配列番号３が代表例であり、アミノ酸配列は配列番号４が代表例である。本明細書の目的で使用される場合は、「Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１」、「ＧＰＣ－１」または「ＧＰＣ１」は、本開示の具体的な目的に合致する限り、特定の配列番号またはアクセッション番号に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質（あるいはそれをコードする核酸）のみならず、機能的に活性なその類似体もしくは誘導体、または機能的に活性なそのフラグメント、またはその相同体、または高ストリンジェンシー条件または低ストリンジェンシー条件下で、このタンパク質をコードする核酸にハイブリダイズする核酸にコードされる変異体もまた、本開示において用いることができることが理解される。
　本明細書で使用される「誘導体」、「類似体」または「変異体」は、好ましくは、限定を意図するものではないが、対象となるタンパク質（例えば、Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１、抗体）に実質的に相同な領域を含む分子を含み、このような分子は、種々の実施形態において、同一サイズのアミノ酸配列にわたり、または当該分野で公知のコンピュータ相同性プログラムによってアラインメントを行ってアラインされる配列と比較した際、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるか、あるいはこのような分子をコードする核酸は、（高度に）ストリンジェントな条件、中程度にストリンジェントな条件、またはストリンジェントでない条件下で、構成要素タンパク質をコードする配列にハイブリダイズ可能である。これは、それぞれ、アミノ酸置換、欠失および付加によって、タンパク質を改変した産物であり、その誘導体がなお元のタンパク質の生物学的機能を、必ずしも同じ度合いでなくてもよいが示すタンパク質を意味する。例えば、本明細書において記載されあるいは当該分野で公知の適切で利用可能なｉｎ　ｖｉｔｒｏアッセイによって、このようなタンパク質の生物学的機能を調べることも可能である。本明細書で使用される「機能的に活性な」は、本明細書において、本開示のポリペプチド、すなわちフラグメントまたは誘導体が関連する態様に従って、生物学的活性などの、タンパク質の構造的機能、制御機能、または生化学的機能を有する、ポリペプチド、すなわちフラグメントまたは誘導体を指す。
　本開示では、Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１についてヒトが主に論じられるが、チンパンジー（Ｐａｎｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）（Ｋ７Ｂ６Ｗ５）、アカゲザル（Ｍａｃａｃａ　ｍｕｌａｔｔａ）（Ｆ６ＶＰＷ９）、マウス（Ｍｕｓ　ｍｕｓｃｕｌｕｓ）（Ｑ９ＱＺＦ２）、ラット（Ｒａｔｔｕｓ　ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）（Ｐ３５０５３）、ニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ　ｇａｌｌｕｓ）（Ｆ１Ｐ１５０）等、ヒト以外の多くの動物がＧｌｙｐｉｃａｎ－１タンパク質を発現していることが知られているため、これらの動物、特に哺乳動物についても、本開示の範囲内に入ることが理解される。好ましくは、Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１の機能的ドメイン、例えば、細胞外ドメイン（約５００アミノ酸であり、１２のシステイン残基を含む）やＣ末端の疎水性領域（ＧＰＩ－アンカードメイン）は保存されていることが好ましい。
　本明細書において「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変されたアミノ酸であってもよい。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとアセンブルされたものを包含し得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変（例えば、標識成分との結合体化）が包含される。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の１または２以上のアナログを含むポリペプチド（例えば、非天然アミノ酸などを含む）、ペプチド様化合物（例えば、ペプトイド）および当該分野において公知の他の改変が包含される。本明細書において、「アミノ酸」は、アミノ基とカルボキシル基を持つ有機化合物の総称である。本開示の実施形態に係る抗体が「特定のアミノ酸配列」を含むとき、そのアミノ酸配列中のいずれかのアミノ酸が化学修飾を受けていてもよい。また、そのアミノ酸配列中のいずれかのアミノ酸が塩、または溶媒和物を形成していてもよい。また、そのアミノ酸配列中のいずれかのアミノ酸がＬ型、またはＤ型であってもよい。それらのような場合でも、本開示の実施形態に係る蛋白質は、上記「特定のアミノ酸配列」を含むといえる。蛋白質に含まれるアミノ酸が生体内で受ける化学修飾としては、例えば、Ｎ末端修飾（例えば、アセチル化、ミリストイル化等）、Ｃ末端修飾（例えば、アミド化、グリコシルホスファチジルイノシトール付加等）、または側鎖修飾（例えば、リン酸化、糖鎖付加等）等が知られている。アミノ酸は、本開示の目的を満たす限り、天然のものでも非天然のものでもよい。
　本明細書において「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。この用語はまた、「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」を含む。「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、２’－Ｏ－メチル－リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’－Ｐ５’ホスホロアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ－５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ－５チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ－５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、ＤＮＡ中のリボースが２’－Ｏ－プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体およびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’－メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体などが例示される。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、１またはそれ以上の選択された（または、すべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る（Ｂａｔｚｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６０：　２６０５－２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ　８：９１－９８（１９９４））。本明細書において「核酸」はまた、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと互換可能に使用される。本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよい。
　本明細書において「遺伝子」とは、遺伝形質を規定する因子をいい、「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」をさすことがある。
　本明細書において遺伝子の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいい、一般に「相同性」を有するとは、同一性または類似性の程度が高いことをいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。従って本明細書において「相同体」または「相同遺伝子産物」は、本明細書にさらに記載する複合体のタンパク質構成要素と同じ生物学的機能を発揮する、別の種、好ましくは哺乳動物におけるタンパク質を意味する。このような相同体はまた、「オルソログ遺伝子産物」とも称されることもある。本開示の目的に合致する限り、このような相同体、相同遺伝子産物、オルソログ遺伝子産物等も用いることができることが理解される。
　アミノ酸は、その一般に公知の３文字記号か、またはＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ　Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に認知された１文字コードにより言及され得る。本明細書では、アミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一性および相同性の比較は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。同一性の検索は例えば、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ２．２．２８（２０１３．４．２発行）を用いて行うことができる。本明細書における同一性の値は通常は上記ＢＬＡＳＴを用い、デフォルトの条件でアラインした際の値をいう。ただし、パラメータの変更により、より高い値が出る場合は、最も高い値を同一性の値とする。複数の領域で同一性が評価される場合はそのうちの最も高い値を同一性の値とする。類似性は、同一性に加え、類似のアミノ酸についても計算に入れた数値である。
　本開示の一実施形態において「９０％以上」は、例えば、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％以上であってもよく、それらいずれか２つの値の範囲内であってもよい。上記「相同性」は、２つもしくは複数間のアミノ酸配列において相同なアミノ酸数の割合を、当該技術分野で公知の方法に従って算定してもよい。割合を算定する前には、比較するアミノ酸配列群のアミノ酸配列を整列させ、同一アミノ酸の割合を最大にするために必要である場合はアミノ酸配列の一部に間隙を導入する。整列のための方法、割合の算定方法、比較方法、およびそれらに関連するコンピュータプログラムは、当該技術分野で従来からよく知られている（例えば、ＢＬＡＳＴ、ＧＥＮＥＴＹＸ等）。本明細書において「相同性」は、特に断りのない限りＮＣＢＩのＢＬＡＳＴによって測定された値で表すことができる。ＢＬＡＳＴでアミノ酸配列を比較するときのアルゴリズムには、Ｂｌａｓｔｐをデフォルト設定で使用できる。測定結果はＰｏｓｉｔｉｖｅｓまたはＩｄｅｎｔｉｔｉｅｓとして数値化される。
　本明細書において「機能的等価物」とは、対象となるもとの実体に対して、目的となる機能が同じであるが構造が異なる任意のものをいう。従って、「Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１」またはその抗体の機能的等価物は、Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１またはその抗体自体ではないが、Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１またはその抗体の変異体または改変体（例えば、アミノ酸配列改変体等）であって、Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１またはその抗体の持つ生物学的作用を有するもの、ならびに、作用する時点において、Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１またはその抗体自体またはこのＧｌｙｐｉｃａｎ－１またはその抗体の変異体もしくは改変体に変化することができるもの（例えば、Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１またはその抗体自体またはＧｌｙｐｉｃａｎ－１またはその抗体の変異体もしくは改変体をコードする核酸、およびその核酸を含むベクター、細胞等を含む）が包含されることが理解される。本開示において、Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１またはその抗体の機能的等価物は、格別に言及していなくても、Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１またはその抗体と同様に用いられうることが理解される。機能的等価物は、データベース等を検索することによって、見出すことができる。本明細書において「検索」とは、電子的にまたは生物学的あるいは他の方法により、ある核酸塩基配列を利用して、特定の機能および／または性質を有する他の核酸塩基配列を見出すことをいう。電子的な検索としては、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０））、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ　＆　Ｌｉｐｍａｎ，　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ　８５：２４４４－２４４８（１９８８））、Ｓｍｉｔｈ　ａｎｄ　Ｗａｔｅｒｍａｎ法（Ｓｍｉｔｈ　ａｎｄ　Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５－１９７（１９８１））、およびＮｅｅｄｌｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｗｕｎｓｃｈ法（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３（１９７０））などが挙げられるがそれらに限定されない。生物学的な検索としては、ストリンジェントハイブリダイゼーション、ゲノムＤＮＡをナイロンメンブレン等に貼り付けたマクロアレイまたはガラス板に貼り付けたマイクロアレイ（マイクロアレイアッセイ）、ＰＣＲおよびｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書において、本開示において使用される遺伝子には、このような電子的検索、生物学的検索によって同定された対応遺伝子も含まれるべきであることが意図される。
　本開示の機能的等価物としては、アミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸の挿入、置換もしくは欠失、またはその一方もしくは両末端への付加されたものを用いることができる。本明細書において、「アミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸の挿入、置換もしくは欠失、またはその一方もしくは両末端への付加」とは、部位特異的突然変異誘発法等の周知の技術的方法により、あるいは天然の変異により、天然に生じ得る程度の複数個の数のアミノ酸の置換等により改変がなされていることを意味する。改変アミノ酸配列は、例えば１～３０個、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～９個、さらに好ましくは１～５個、特に好ましくは１～２個のアミノ酸の挿入、置換、もしくは欠失、またはその一方もしくは両末端への付加がなされたものであることができる。改変アミノ酸配列は、好ましくは、そのアミノ酸配列が、Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１のアミノ酸配列において１または複数個（好ましくは１もしくは数個または１、２、３、もしくは４個）の保存的置換を有するアミノ酸配列であってもよい。ここで「保存的置換」とは、タンパク質の機能を実質的に改変しないように、１または複数個のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置換えることを意味する。例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場合、ある極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合などが挙げられる。このような置換を行うことができる機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎に当該分野において公知である。具体例を挙げると、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
　本開示の一実施形態において「抗Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１抗体」は、Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１に結合性を有する抗体を含む。この抗Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１抗体の生産方法は特に限定されないが、例えば、Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１を哺乳類または鳥類に免疫することによって生産してもよい。抗Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１抗体の「抗原結合フラグメント」とは、Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１に結合する能力を保持する抗体のフラグメントを指す。かかる抗原結合フラグメントとしては、以下に限定されないが、例えば、単鎖抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂフラグメント、またはＦ（ａｂ’）２フラグメントなどが挙げられる。
　本開示の一実施形態に係る抗Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１抗体の抗体クラスは特に限定されないが、例えばＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、またはＩｇＹであってもよい。
　本開示の一実施形態に係る抗Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１抗体は、抗原結合活性を有する抗体フラグメント（以下、「抗原結合性フラグメント」と称することもある）であっても良い。この場合、安定性または抗体の生産効率が上昇する等の効果がある。
　本開示の一実施形態に係る抗Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１抗体は、融合蛋白質であってもよい。この融合蛋白質は、抗Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１抗体のＮまたはＣ末端に、ポリペプチドまたはオリゴペプチドが結合したものであってもよい。ここで、オリゴペプチドは、Ｈｉｓタグであってもよい。
　本開示の一実施形態に係る抗Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１抗体は、例えば、精製Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１、Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１発現細胞、またはＧｌｙｐｉｃａｎ－１含有脂質膜で生物を免疫する工程を経て得られる抗体であってもよい。Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１陽性がんに対する治療効果を高める観点からは、Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１発現細胞を免疫に使用することが好ましい。
　本開示の一実施形態に係る抗Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１抗体は、精製Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１、Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１発現細胞またはＧｌｙｐｉｃａｎ－１含有脂質膜で生物を免疫する工程を経て得られる抗体の、ＣＤＲセットを有する抗体であってもよい。Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１陽性がんに対する治療効果を高める観点からは、Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１発現細胞を免疫に使用することが好ましい。ＣＤＲセットとは、重鎖ＣＤＲ１、２、および３、並びに、軽鎖ＣＤＲ１、２、および３のセットである。
　本開示の一実施形態において「Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１発現細胞」は、例えば、Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１をコードするポリヌクレオチドを細胞に導入後、Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１を発現させることによって得てもよい。ここでＧｌｙｐｉｃａｎ－１は、Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１フラグメントを含む。また本開示の一実施形態において「Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１含有脂質膜」は、例えば、Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１と脂質二重膜を混合することによって得てもよい。ここでＧｌｙｐｉｃａｎ－１は、Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１フラグメントを含む。また本開示の一実施形態に係る抗Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１抗体は、Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１陽性がんに対する治療効果を高める観点からは、抗原をニワトリに免疫する工程を経て得られる抗体、またはその抗体のＣＤＲセットを有する抗体が好ましい。
　本開示の抗Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１抗体は、目的を達成する限り、どのような結合力を有していてもよい。例えば、本開示の抗Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１抗体は、Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１に対して低い親和性を有していたとしても、インターナライゼーション活性および／またはＡＤＣ活性を有していればよい。ただし診断やコンパニオン試薬目的では、強い結合力があるほうが好ましい。例えば、ＫＤ値（ｋｄ／ｋａ）が、１．０×１０－７（Ｍ）以下、１．０×１０－８（Ｍ）以下、１．０×１０－９（Ｍ）以下あるいは１．０×１０－１０（Ｍ）以下でありうる。好ましくは、診断やコンパニオン試薬目的における抗Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１抗体の結合力は、ＫＤ値（ｋｄ／ｋａ）で１．０×１０－８（Ｍ）以下である。
　本開示の一実施形態に係る抗Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１抗体は、Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１の野生型または変異型に結合する抗体であってもよい。変異型とは、個体間のＤＮＡ配列の差異に起因するものを含む。野生型または変異型のＧｌｙｐｉｃａｎ－１のアミノ酸配列は、配列番号２に示すアミノ酸配列に対し、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の相同性を有している。
　本明細書において「抗体」は、抗原上の特定のエピトープに特異的に結合することができる分子またはその集団を含む。抗体は、様々な形態で存在することができ、例えば、全長抗体（Ｆａｂ領域とＦｃ領域を有する抗体）、Ｆｖ抗体、Ｆａｂ抗体、Ｆ（ａｂ’）２抗体、Ｆａｂ’抗体、ｄｉａｂｏｄｙ、一本鎖（単鎖）抗体（例えば、ｓｃＦｖ）、ｓｃ（Ｆｖ）２（ｓｉｎｇｌｅ　ｃｈａｉｎ（Ｆｖ）２）、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、ｄｓＦｖ、多価特異的抗体（例えば、オリゴ特異的抗体、二価特異的抗体）、ダイアボディー、抗原結合性を有するペプチドまたはポリペプチド、キメラ抗体（例えば、マウス－ヒトキメラ抗体、ニワトリ－ヒトキメラ抗体等）、マウス抗体、ニワトリ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、またはそれらの同等物（または等価物）からなる群から選ばれる１種以上の形態であってもよい。また抗体は、抗体修飾物または抗体非修飾物を含む。抗体修飾物は、抗体と、例えばポリエチレングリコール等の各種分子が結合していてもよい。抗体修飾物は、抗体に公知の手法を用いて化学的な修飾を施すことによって得ることができる。さらにこのような抗体を、酵素、例えばアルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、αガラクトシダーゼなど、に共有結合させまたは組換えにより融合させてよい。本開示で用いられる抗Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１抗体は、Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１のタンパク質に結合すればよく、その由来、種類、形状などは問われない。具体的には、非ヒト動物の抗体（例えば、マウス抗体、ラット抗体、ラクダ抗体）、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体などの公知の抗体が使用できる。抗体のＧｌｙｐｉｃａｎ－１タンパク質への結合は特異的な結合であることが好ましい。また抗体は、抗体修飾物または抗体非修飾物を含む。抗体修飾物は、抗体と、例えばポリエチレングリコール等の各種分子が結合していてもよい。抗体修飾物は、抗体に公知の手法を用いて化学的な修飾を施すことによって得ることができる。
　本開示の一実施形態において「モノクローナル抗体」は、集団を構成する個々の抗体が、少量自然に生じることが可能な突然変異を有する抗体を除いて、実質的に単一のエピトープに対応する抗体である場合を含む。または、集団を構成する個々の抗体が、少量自然に生じることが可能な突然変異を有する抗体を除いて、実質的に同一である抗体であってもよい。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、異なるエピトープに対応する異なる抗体を典型的に含むような、通常のポリクローナル抗体とは異なる。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の免疫グロブリンによって汚染されていないハイブリドーマ培養から合成できる点で有用である。「モノクローナル」という形容は、実質的に均一な抗体集団から得られるという特徴を示していてもよいが、抗体を何か特定の方法で生産しなければならないことを意味するものではない。例えば、モノクローナル抗体は、“ＫｏｈｌｅｒＧ，　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ　Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ．　１９７５　Ａｕｇ　７；２５６（５５１７）：４９５－４９７．”に掲載されているようなハイブリドーマ法と同様の方法によって作製してもよい。あるいは、モノクローナル抗体は、米国特許第４８１６５６７号に記載されているような組換え法と同様の方法によって作製してもよい。または、モノクローナル抗体は、“Ｃｌａｃｋｓｏｎｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔｕｒｅ．　１９９１　Ａｕｇ　１５；３５２（６３３６）：６２４－６２８．”、または“Ｍａｒｋｓ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ　ＭｏｌＢｉｏｌ．　１９９１　Ｄｅｃ　５；２２２（３）：５８１－５９７．”に記載されているような技術と同様の方法を用いてファージ抗体ライブラリーから単離してもよい。または、“タンパク質実験ハンドブック，羊土社（２００３）：９２－９６．”に掲載されている方法でよって作製してもよい。
　抗体の大量生産については、当該分野で公知の任意の手法を用いることができるが、例えば、代表的な抗体の大量生産系の構築および抗体製造としては、以下を例示することができる。すなわち、ＣＨＯ細胞にＨ鎖抗体発現ベクターおよびＬ鎖抗体発現ベクターをトランスフェクションし、選択試薬であるＧ４１８およびＺｅｏｃｉｎを用いて培養を行い、限界希釈法によるクローニングを行う。クローニング後、安定的に抗体を発現しているクローンをＥＬＩＳＡ法により選択する。選択したＣＨＯ細胞を用いて拡大培養し、抗体を含む培養上清を回収する。回収した培養上清からＰｒｏｔｅｉｎ　ＡもしくはＰｒｏｔｅｉｎＧ精製により抗体を精製することができる。本開示のヒト化抗体は、ヒト抗体産生マウスに目的とする抗原を免疫するとポリクロ―ナルな完全ヒト抗体を得ることができ、ここからモノクローナルな状態にしてから本開示において利用することができる。
　本開示の一実施形態において「ヒト化抗体」は、例えば、非ヒト種由来の１つ以上のＣＤＲ、およびヒト免疫グロブリン由来のフレームワーク領域（ＦＲ）、さらにヒト免疫グロブリン由来の定常領域を有し、所望の抗原に結合する抗体である。抗体のヒト化は、当該技術分野で既知の種々の手法を使用して実施可能である（Ａｌｍａｇｒｏ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｆｒｏｎｔ　Ｂｉｏｓｃｉ．　２００８　Ｊａｎ　１；１３：１６１９－１６３３．）。例えば、ＣＤＲグラフティング（Ｏｚａｋｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．１９９９　Ｊｕｎ　１；９３（１１）：３９２２－３９３０．）、Ｒｅ－ｓｕｒｆａｃｉｎｇ　（Ｒｏｇｕｓｋａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳ　Ａ．１９９４Ｆｅｂ　１；９１（３）：９６９－９７３．）、またはＦＲシャッフル（Ｄａｍｓｃｈｒｏｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　２００７　Ａｐｒ；４４（１１）：３０４９－３０６０．　Ｅｐｕｂ　２００７　Ｊａｎ　２２．）などが挙げられる。抗原結合を改変するために（好ましくは改善するために）、ヒトＦＲ領域のアミノ酸残基は、ＣＤＲドナー抗体からの対応する残基と置換してもよい。このＦＲ置換は、当該技術分野で周知の方法によって実施可能である（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔｕｒｅ．　１９８８　Ｍａｒ　２４；３３２（６１６２）：３２３－３２７．）。例えば、ＣＤＲとＦＲ残基の相互作用のモデリングによって抗原結合に重要なＦＲ残基を同定してもよい。または、配列比較によって、特定の位置で異常なＦＲ残基を同定してもよい。ヒト化において、ＣＤＲ内のアミノ酸を変更しなくてもよく、変更してもよい。上記に加えて、本開示の製造例に記載のとおりヒト化抗体を製造してもよい。具体的には、非ヒト由来の抗体のＣＤＲをヒト重鎖フレームワークにグラフティングした、重鎖が固定されたＶκライブラリーから、スクリーニングされてもよい。このヒト化方法においては、重鎖ＣＤＲは変更されないが、軽鎖ＣＤＲは変更され得る。
　本開示の一実施形態において「重鎖」は、典型的には、全長抗体の主な構成要素である。重鎖は、通常、軽鎖とジスルフィド結合および非共有結合によって結合している。重鎖のＮ末端側のドメインには、同種の同一クラスの抗体でもアミノ酸配列が一定しない可変領域（ＶＨ）と呼ばれる領域が存在し、一般的に、ＶＨが抗原に対する特異性、親和性に大きく寄与していることが知られている。例えば、“Ｒｅｉｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ．　１９９９　Ｊｕｌ　１６；２９０（３）：６８５－９８．”にはＶＨのみの分子を作製したところ、抗原と特異的に、高い親和性で結合したことが記載されている。さらに、“Ｗｏｌｆｓｏｎ　Ｗ，Ｃｈｅｍ　Ｂｉｏｌ．　２００６　Ｄｅｃ；１３（１２）：１２４３－１２４４．”には、ラクダの抗体の中には、軽鎖を持たない重鎖のみの抗体が存在していることが記載されている。
　本開示の一実施形態において「ＣＤＲ（相補性決定領域）」は、抗体において、実際に抗原に接触して結合部位を形成している領域である。一般的にＣＤＲは、抗体のＦｖ（可変領域：重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む）上に位置している。また一般的にＣＤＲは、５～３０アミノ酸残基程度からなるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３が存在する。そして、特に重鎖のＣＤＲが抗体の抗原への結合に寄与していることが知られている。またＣＤＲの中でも、ＣＤＲ３が抗体の抗原への結合における寄与が最も高いことが知られている。例えば、“Ｗｉｌｌｙｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ　Ｖｏｌｕｍｅ　３５６，　Ｉｓｓｕｅ　１，　２７　Ａｐｒｉｌ　２００７，　Ｐａｇｅｓ　１２４－１２８”には、重鎖ＣＤＲ３を改変させることで抗体の結合能を上昇させたことが記載されている。ＣＤＲ以外のＦｖ領域はフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれ、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４からなり、抗体間で比較的よく保存されている（Ｋａｂａｔ　ｅｔ　ａｌ．，「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」ＵＳ　Ｄｅｐｔ．　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，　１９８３．）。即ち、抗体の反応性を特徴付ける要因はＣＤＲにあり、特に重鎖ＣＤＲにあるといえる。
　ＣＤＲの定義およびその位置を決定する方法は複数報告されている。例えば、Ｋａｂａｔの定義（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，　５ｔｈ　ｅｄ．，　Ｐｕｂｌｉｃ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｓｅｒｖｉｃｅ，　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ，　Ｂｅｔｈｅｓｄａ，　ＭＤ．　（１９９１））、またはＣｈｏｔｈｉａの定義（Ｃｈｏｔｈｉａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９８７；１９６：９０１－９１７）を採用してもよい。本開示の一実施形態においては、Ｋａｂａｔの定義を好適な例として採用するが、必ずしもこれに限定されない。また、場合によっては、Ｋａｂａｔの定義とＣｈｏｔｈｉａの定義の両方を考慮して決定しても良く、例えば、各々の定義によるＣＤＲの重複部分を、または各々の定義によるＣＤＲの両方を含んだ部分をＣＤＲとすることもできる。そのような方法の具体例としては、Ｋａｂａｔの定義とＣｈｏｔｈｉａの定義の折衷案である、Ｏｘｆｏｒｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ’ｓＡｂＭ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｍｏｄｅｌｉｎｇ　ｓｏｆｔｗａｒｅを用いたＭａｒｔｉｎらの方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９；８６：９２６８－９２７２）がある。このようなＣＤＲの情報を用いて、本開示に使用されうる変異体を生産することができる。このような抗体の変異体では、もとの抗体のフレームワークに１または数個（例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個）の置換、付加もしくは欠失を含むが、該ＣＤＲには変異を含まないように生産することができる。
　本明細書において「抗原」（ａｎｔｉｇｅｎ）とは、抗体分子によって特異的に結合され得る任意の基質をいう。本明細書において「免疫原」（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ）とは、抗原特異的免疫応答を生じるリンパ球活性化を開始し得る抗原をいう。本明細書において「エピトープ」または「抗原決定基」とは、抗体またはリンパ球レセプターが結合する抗原分子中の部位をいう。エピトープを決定する方法は、当該分野において周知であり、そのようなエピトープは、核酸またはアミノ酸の一次配列が提供されると、当業者はそのような周知慣用技術を用いて決定することができる。本開示の抗体は、エピトープが同じであれば、他の配列を有する抗体であっても同様に利用することができることが理解される。
　本明細書において使用される抗体は、擬陽性が減じられる限り、どのような特異性の抗体を用いても良いことが理解される。
　本開示が対象とする「がん」は、肺がん、食道がん、胃がん、肝臓がん、膵臓がん、腎臓がん、副腎がん、胆道がん、乳がん、大腸がん、小腸がん、卵巣がん、胆管がん、子宮がん、膀胱がん、前立腺がん、尿管がん、腎盂がん、尿管がん、陰茎がん、精巣がん、脳腫瘍、中枢神経系のがん、末梢神経系のがん、頭頸部がん、グリオーマ、多形性膠芽腫、皮膚がん、メラノーマ、甲状腺がん、唾液腺がん、悪性リンパ腫、がん腫、肉腫、白血病および血液悪性腫瘍からなる群から選ばれる１種以上を含む。「癌」および「腫瘍」と交換可能に使用される。ここで、卵巣がんは、例えば、卵巣漿液性腺がん、または卵巣明細胞線がんを含む。子宮がんは、例えば、子宮内膜がん、または子宮頸がんを含む。頭頸部がんは、例えば、口腔がん、咽頭がん、喉頭がん、鼻腔がん、副鼻腔がん、唾液腺がん、または甲状腺がんを含む。肺がんは、例えば、非小細胞肺がん、または小細胞肺がんを含む。また悪性腫瘍は、ＰＤ－Ｌ１陽性であってもよい。
　本明細書において「食道がん」とは、通常の意味で使用され、食道におけるがんを含む広義の意味で使用される。食道がんとしては、扁平上皮がんのほか、腺がん、リンパ節転移部位のもの等も包含されるがこれに限定されない。日本人の食道がんは、約半数が胸の中の食道中央付近から発生し、次いで１／４が食道の下部に発生するとされており、本開示はいずれも対象とすることが理解される。理論に束縛されることを望まないが、本開示では、扁平上皮がんのほか、腺がん、リンパ節転移部位のものを含め食道がん全体の指標として使用されうることが期待される。
　本明細書において「膵臓がん」は、膵臓から発生した悪性の腫瘍のことをいうが、一般には膵管がんをいい、このほかの膵臓の部分の腫瘍も包含される。
　本明細書において「子宮頸がん」は、子宮がんの一種で、子宮がんには子宮頸がんと子宮体がんとがあり、子宮頸がんは、子宮の入り口の子宮頸部とよばれる部分から発生するものである。
　本明細書において「肺がん」は、肺に発生する上皮細胞由来の悪性腫瘍であり、小細胞肺がん、非小細胞肺がんなどがあり、非小細胞肺がんには、腺がん、扁平上皮がん、大細胞がんがある。
　本明細書において「頭頸部がん」は、頭頸部の腫瘍であり、顔面から頸部までの部分、例えば、鼻、口、のど、上あご、下あご、耳などの部分にできる腫瘍をいう。
　本明細書において「乳がん」は、乳房に生じる腫瘍であり、乳管がん、小葉がんなどがある。
　本明細書において、「子宮平滑筋肉腫」とは、子宮肉腫のうち子宮の平滑筋にできる子宮肉腫を指す。子宮平滑筋肉腫は、細胞密度、細胞分裂数、細胞異型、腫瘍細胞の凝固壊死の有無により組織学的に診断され得る。
　本明細書において、「前立腺がん」とは、前立腺にできる腫瘍をいう。
　本明細書において、「口腔扁平上皮がん」とは、口腔がんの一種であり、口腔粘膜の上皮にできる腫瘍をいう。
　本明細書において「胆管がん」は、胆管に生じる腫瘍であり、肝臓内の胆管に生じる肝内胆管がん、肝臓の外の肝門部に生じる肝門部領域胆管がん、および肝臓の外の遠位部に生じる遠位胆管がんに分類される。
　本明細書において「がん関連線維芽細胞（ｃａｎｃｅｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ（ＣＡＦ））」とは、がんの間質を構成する線維芽細胞を指す。ＣＡＦはコラーゲンなどの多くの細胞外基質を産生し、がんの間質を非常に硬くし、その結果、血管が押しつぶされること（虚脱）等に起因して、抗がん剤の効率的な浸透を妨げる。血管が押しつぶされることは、がん組織の低酸素状態も誘導し、さらに、がん細胞の悪性度を上昇させる。また、間質の硬度の上昇自体も、がん細胞の増殖や浸潤能（周囲組織にひろがる能力）を上昇させる因子の一つである。加えて、ＣＡＦは多くの増殖因子を産生し、これらはがん細胞に作用してその増殖や浸潤を促進し、抗腫瘍免疫応答を抑制する。
　本明細書において、がんの「間質」は、がん組織におけるがん細胞を取り囲む組織であって、ＣＡＦを主要な構成成分として含み、その他の構成成分として、免疫細胞、骨髄由来細胞、腫瘍血管、リンパ管、ＣＡＦによって産生される細胞外基質等を含む組織を指す。
　本明細書において「被験体（者）」とは、本開示の診断または検出、あるいは治療等の対象となる対象（例えば、ヒト等の生物または生物から取り出した細胞、血液、血清等）をいう。
　本明細書において「試料」とは、被験体等から得られた任意の物質をいい、例えば、血清等が含まれる。当業者は本明細書の記載をもとに適宜好ましい試料を選択することができる。
　本明細書において「薬剤」、「剤」または「因子」（いずれも英語ではａｇｅｎｔに相当する）は、広義には、交換可能に使用され、意図する目的を達成することができる限りどのような物質または他の要素（例えば、光、放射能、熱、電気などのエネルギー）でもあってもよい。そのような物質としては、例えば、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのようなＤＮＡ、ｍＲＮＡのようなＲＮＡを含む）、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、有機低分子（例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子、コンビナトリアルケミストリで合成された分子、医薬品として利用され得る低分子（例えば、低分子リガンドなど）など）、これらの複合分子が挙げられるがそれらに限定されない。Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１に結合する物質もまた、このような薬剤でありうる。ポリヌクレオチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリヌクレオチドの配列に対して一定の配列相同性を（例えば、７０％以上の配列同一性）もって相補性を有するポリヌクレオチド、プロモーター領域に結合する転写因子のようなポリペプチドなどが挙げられるがそれらに限定されない。ポリペプチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリペプチドに対して特異的に指向された抗体またはその誘導体あるいはその類似物（例えば、単鎖抗体）、そのポリペプチドがレセプターまたはリガンドである場合の特異的なリガンドまたはレセプター、そのポリペプチドが酵素である場合、その基質などが挙げられるがそれらに限定されない。
　本明細書において「診断」とは、被験体における疾患、障害、状態（例えば、食道がん）などに関連する種々のパラメータを同定し、そのような疾患、障害、状態の現状または未来を判定することをいう。本開示の方法、装置、システムを用いることによって、体内の状態を調べることができ、そのような情報を用いて、被験体における疾患、障害、状態、投与すべき処置または予防のための処方物または方法などの種々のパラメータを選定することができる。本明細書において、狭義には、「診断」は、現状を診断することをいうが、広義には「早期診断」、「予測診断」、「事前診断」等を含む。本開示の診断方法は、原則として、身体から出たものを利用することができ、医師などの医療従事者の手を離れて実施することができることから、産業上有用である。本明細書において、医師などの医療従事者の手を離れて実施することができることを明確にするために、特に「予測診断、事前診断もしくは診断」を「支援」すると称することがある。
　本明細書において「検出薬（剤）」または「検査薬（剤）」とは、広義には、目的の対象を検出または検査することができるあらゆる薬剤をいう。
　本明細書において「診断薬（剤）」とは、広義には、目的の状態（例えば、食道がん等の疾患など）を診断できるあらゆる薬剤をいう。
　本明細書において「治療」とは、ある疾患または障害（例えば、食道がん）について、そのような状態になった場合に、そのような疾患または障害の悪化を防止、好ましくは、現状維持、より好ましくは、軽減、さらに好ましくは消退させることをいい、患者の疾患、もしくは疾患に伴う１つ以上の症状の、症状改善効果あるいは予防効果を発揮しうることを含む。事前に診断を行って適切な治療を行うことは「コンパニオン治療」といい、そのための診断薬を「コンパニオン診断薬」ということがある。
　本明細書において「治療薬（剤）」とは、広義には、目的の状態（例えば、食道がん等の疾患など）を治療できるあらゆる薬剤をいう。本開示の一実施形態において「治療薬」は、有効成分と、薬理学的に許容される１つもしくはそれ以上の担体とを含む医薬組成物であってもよい。医薬組成物は、例えば有効成分と上記担体とを混合し、製剤学の技術分野において知られる任意の方法により製造できる。また治療薬は、治療のために用いられる物であれば使用形態は限定されず、有効成分単独であってもよいし、有効成分と任意の成分との混合物であってもよい。また上記担体の形状は特に限定されず、例えば、固体または液体（例えば、緩衝液）であってもよい。なお食道がんの治療薬は、食道がんの予防のために用いられる薬物（予防薬）、または食道がん細胞の増殖抑制剤を含む。
　本明細書において「予防」とは、ある疾患または障害（例えば、食道がん）について、そのような状態になる前に、そのような状態にならないようにすることをいう。本開示の薬剤を用いて、診断を行い、必要に応じて本開示の薬剤を用いて例えば、食道がん等の予防をするか、あるいは予防のための対策を講じることができる。
　本明細書において「予防薬（剤）」とは、広義には、目的の状態（例えば、食道がん等の疾患など）を予防できるあらゆる薬剤をいう。
　本明細書において「相互作用」とは、２つの物質についていうとき、一方の物質と他方の物質との間で力（例えば、分子間力（ファンデルワールス力）、水素結合、疎水性相互作用など）を及ぼしあうこという。通常、相互作用をした２つの物質は、会合または結合している状態にある。本開示の検出、検査および診断は、このような相互作用を利用して実現することができる。
　本明細書においてポリヌクレオチドまたはポリペプチド発現の「検出」または「定量」は、例えば、検出剤、検査剤または診断剤（コンパニオン試薬としての適用を含む）への結合または相互作用を含む、ｍＲＮＡの測定および免疫学的測定方法を含む適切な方法を用いて達成され得る。分子生物学的測定方法としては、例えば、ノーザンブロット法、ドットブロット法またはＰＣＲ法などが例示される。免疫学的測定方法としては、例えば、方法としては、マイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、発光イムノアッセイ（ＬＩＡ）、免疫沈降法（ＩＰ）、免疫拡散法（ＳＲＩＤ）、免疫比濁法（ＴＩＡ）、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などが例示される。また、定量方法としては、ＥＬＩＳＡ法またはＲＩＡ法などが例示される。アレイ（例えば、ＤＮＡアレイ、プロテインアレイ）を用いた遺伝子解析方法によっても行われ得る。ＤＮＡアレイについては、（秀潤社編、細胞工学別冊「ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法」）に広く概説されている。プロテインアレイについては、Ｎａｔ　Ｇｅｎｅｔ．２００２　Ｄｅｃ；３２　Ｓｕｐｐｌ：５２６－５３２に詳述されている。遺伝子発現の分析法としては、上述に加えて、ＲＴ－ＰＣＲ、ＲＡＣＥ法、ＳＳＣＰ法、免疫沈降法、ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄシステム、ｉｎｖｉｔｒｏ翻訳などが挙げられるがそれらに限定されない。そのようなさらなる分析方法は、例えば、ゲノム解析実験法・中村祐輔ラボ・マニュアル、編集・中村祐輔羊土社（２００２）などに記載されており、本明細書においてそれらの記載はすべて参考として援用される。
　本明細書において、活性、発現産物（例えば、タンパク質、転写物（ＲＮＡなど））の「減少」または「抑制」あるいはその類義語は、特定の活性、転写物またはタンパク質の量、質または効果における減少、または減少させる活性をいう。減少のうち「消失」した場合は、活性、発現産物等が検出限界未満になることをいい、特に「消失」ということがある。本明細書では、「消失」は「減少」または「抑制」に包含される。
　本明細書において「標識」とは、目的となる分子または物質を他から識別するための存在（例えば、物質、エネルギー、電磁波など）をいう。そのような標識方法としては、ＲＩ（ラジオアイソトープ）法、蛍光法、ビオチン法、化学発光法等を挙げることができる。本開示のマーカーまたはそれを捕捉する因子または手段を複数、蛍光法によって標識する場合には、蛍光発光極大波長が互いに異なる蛍光物質によって標識を行う。蛍光発光極大波長の差は、１０ｎｍ以上であることが好ましい。リガンドを標識する場合、機能に影響を与えないものならば何れも用いることができるが、蛍光物質としては、ＡｌｅｘａＴＭ　Ｆｌｕｏｒが望ましい。ＡｌｅｘａＴＭＦｌｕｏｒは、クマリン、ローダミン、フルオレセイン、シアニンなどを修飾して得られた水溶性の蛍光色素であり、広範囲の蛍光波長に対応したシリーズであり、他の該当波長の蛍光色素に比べ、非常に安定で、明るく、またｐＨ感受性が低い。蛍光極大波長が１０ｎｍ以上ある蛍光色素の組み合わせとしては、ＡｌｅｘａＴＭ５５５とＡｌｅｘａＴＭ６３３の組み合わせ、ＡｌｅｘａＴＭ４８８とＡｌｅｘａＴＭ５５５の組み合わせ等を挙げることができる。核酸を標識する場合は、その塩基部分と結合できるものであれば何れも用いることができるが、シアニン色素（例えば、ＣｙＤｙｅＴＭシリーズのＣｙ３、Ｃｙ５等）、ローダミン６Ｇ試薬、２－アセチルアミノフルオレン（ＡＡＦ）、ＡＡＩＦ（ＡＡＦのヨウ素誘導体）等を使用することが好ましい。蛍光発光極大波長の差が１０ｎｍ以上である蛍光物質としては、例えば、Ｃｙ５とローダミン６Ｇ試薬との組み合わせ、Ｃｙ３とフルオレセインとの組み合わせ、ローダミン６Ｇ試薬とフルオレセインとの組み合わせ等を挙げることができる。本開示では、このような標識を利用して、使用される検出手段に検出され得るように目的とする対象を改変することができる。そのような改変は、当該分野において公知であり、当業者は標識におよび目的とする対象に応じて適宜そのような方法を実施することができる。
　本明細書において「インビボ」（ｉｎ　ｖｉｖｏ）とは、生体の内部をいう。特定の文脈において、「生体内」は、目的とする物質が配置されるべき位置をいう。
　本明細書において「インビトロ」（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）とは、種々の研究目的のために生体の一部分が「生体外に」（例えば、試験管内に）摘出または遊離されている状態をいう。インビボと対照をなす用語である。
　本明細書において「エキソビボ」（ｅｘ　ｖｉｖｏ）とは、ある処置について、体外で行われるがその後体内に戻されることが意図される場合、一連の動作をエキソビボという。本開示においても、生体内にある細胞を本開示の薬剤で処置して再度患者に戻すような実施形態を想定することができる。
　本明細書において「キット」とは、通常２つ以上の区画に分けて、提供されるべき部分（例えば、検査薬、診断薬、治療薬、抗体、標識、説明書など）が提供されるユニットをいう。安定性等のため、混合されて提供されるべきでなく、使用直前に混合して使用することが好ましいような組成物の提供を目的とするときに、このキットの形態は好ましい。そのようなキットは、好ましくは、提供される部分（例えば、検査薬、診断薬、治療薬をどのように使用するか、あるいは、試薬をどのように処理すべきかを記載する指示書または説明書を備えていることが有利である。本明細書においてキットが試薬キットとして使用される場合、キットには、通常、検査薬、診断薬、治療薬、抗体等の使い方などを記載した指示書などが含まれる。
　本明細書において「指示書」は、本開示を使用する方法を医師または他の使用者に対する説明を記載したものである。この指示書は、本開示の検出方法、診断薬の使い方、または医薬などを投与することを指示する文言が記載されている。また、指示書には、投与部位として、経口、食道への投与（例えば、注射などによる）することを指示する文言が記載されていてもよい。この指示書は、本開示が実施される国の監督官庁（例えば、日本であれば厚生労働省、米国であれば食品医薬品局（ＦＤＡ）など）が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添付文書（ｐａｃｋａｇｅ　ｉｎｓｅｒｔ）であり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定されず、例えば、電子媒体（例えば、インターネットで提供されるホームページ、電子メール）のような形態でも提供され得る。
　本明細書で使用される「細胞内移行（インターナライズ／インターナライゼーション）」とは、細胞表面上の抗原に結合した物質を媒介してエンドサイトーシスまたは食作用によって細胞が抗原に結合した物質を取り込むことを指す。このような活性を有するＧｌｙｐｉａｎ－１に結合する物質（例えば、抗Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１抗体）は、Ｇｌｙｐｉａｎ－１を細胞表面に発現する細胞に対して目的の有効成分を細胞内移行させ、目的の有効成分による所望の効果をＧｌｙｐｉａｎ－１発現細胞において生じさせることができる。目的の有効成分としては、細胞傷害性活性を有する薬剤、抗がん剤、造影剤、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、リボザイムなどが挙げられるが、これらに限定されない。
　本明細書において「複合体」とは、２以上の部分を含む任意の構成体を意味する。例えば、一方の部分がポリペプチドである場合は、他方の部分は、ポリペプチドであってもよく、それ以外の物質（例えば、糖、脂質、核酸、他の炭化水素、低分子化合物等）であってもよい。本明細書において複合体を構成する２以上の部分は、共有結合で結合されていてもよくそれ以外の結合（例えば、水素結合、イオン結合、疎水性相互作用、ファンデルワールス力等）で結合されていてもよい。従って、本明細書において「複合体」は、ポリペプチド、核酸、脂質、糖、低分子化合物などの分子が複数種連結してできた分子を含む。　
　本明細書において「リンカ―」とは、少なくとも２つの構成要素を連結し、空間的に分離するための分子を指す。リンカーとしては、例えば、酵素切断型リンカー、酸不安定性リンカー、ジスルフィドリンカーなどが挙げられるが、これらに限定されない。「酵素切断型リンカー」は、細胞内に存在する酵素によって切断されるリンカーを指す。「酸不安定性リンカー」は、細胞内のエンドソームまたはリソソームの産生条件下で切断されるリンカーを指す。「ジスルフィドリンカー」は、細胞内の還元環境下で切断されるリンカーを指す。
　本明細書において「抗体薬物複合体（ＡＤＣ）」とは、１つまたは複数の目的の有効成分と化学的に連結された抗体またはその抗原結合フラグメントを指す。好ましい実施形態において、ＡＤＣは、リンカーを介して作動可能に連結されている。本明細書において「作動可能に連結されている」とは、連結される構成要素がその機能を発揮するように作動することが可能な関係にあることを指す。ＡＤＣに含まれ得る目的の有効成分としては、以下に限定されないが、細胞傷害性活性を有する薬剤、抗がん剤、造影剤、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、リボザイムなどが挙げられる。リンカーとして使用され得るものは、開裂型リンカーであっても、非開裂型のリンカーであってもよい。開裂型リンカーとしては、タンパク質分解酵素による切断配列を有するリンカー、酸不安定性のリンカー、ジスルフィドリンカーなどが挙げられるが、これらに限定されない。非開裂型リンカーとしては、ＭＣＣリンカーなどが挙げられるが、これに限定されない。
　本明細書において「細胞傷害活性」とは、例えば、細胞に病理的な変化をもたらすこと、直接的な外傷にとどまらず、ＤＮＡの切断や塩基の二量体の形成、染色体の切断、細胞分裂システムの損傷、各種酵素活性の低下などあらゆる細胞の構造や機能上の損傷により、細胞の機能を直接または間接的に遮断することによって細胞死をもたらすことをいう。したがって、「細胞傷害活性を有する薬剤」としては、例えば、以下に限定されないが、アルキル化剤、腫瘍壊死因子阻害剤、インターカレーター、微小管阻害剤、キナーゼ阻害剤、プロテアソーム阻害剤、及びトポイソメラーゼ阻害剤などが挙げられる。
　本明細書において「５０％阻害濃度（ＩＣ５０）」とは、５０％の細胞が死滅させるために必要な化合物の濃度をいう。本明細書では、実施例７に記載の方法を使用してＩＣ５０が測定される。
　本明細書において「親和性」とは、２つの物質（例えば、抗体と抗原）の可逆的結合の平衡定数を指し、平衡解離定数（ＫD値）で表される。平衡解離定数は表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法、例えばＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）により測定することができる。その他、ＭＰ－ＳＰＲ　ＮａｖｉＴＭ（ＢｉｏＮａｖｉｓ）、ＯｐｅｎＰｌｅｘ（Ｈｏｒｉｂａ）、Ｓｍａｒｔ　ＳＰＲ（ＲＩＢＭ）によって測定されてもよい。本開示において、示されるＫD値は、特段の定めがない限り、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法によって測定された値を意味する。
　（好ましい実施形態）
　以下に本開示の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本開示のよりよい理解のために提供されるものであり、本開示の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本開示の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。また、本開示の以下の実施形態は単独でも使用されあるいはそれらを組み合わせて使用することができることが理解される。
　（抗体）
　１つの局面において、本開示は、配列番号５に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と配列番号６に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含む抗体に基づきヒト化されたヒト化抗ＧＰＣ－１抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。本発明者らは、国際公開第２０１８／１９９３１８号（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるＧＰＣ－１に対して高い親和性を有する抗ＧＰＣ－１マウスモノクローナル抗体である０１ａ０３３（配列番号５の重鎖可変領域および配列番号６の軽鎖可変領域を含む）をヒト化したところ、予想外にも０１ａ０３３よりも高い親和性を有するヒト化抗体を取得することに成功した。したがって、本開示のヒト化抗体は、配列番号５に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と配列番号６に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含む抗体と比べて、ＧＰＣ－１に対して高い親和性を有し得る。
　いくつかの実施形態において、本開示の抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号７に記載のアミノ酸配列、またはこれと少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含み得る。
　いくつかの実施形態において、本開示の抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号８～２７に記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列、またはこれと少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含み得る。好ましい実施形態において、本開示の抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号８～１７に記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列、またはこれと少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含み得る。
　いくつかの実施形態において、本開示の抗体は、いずれのクラスであってもよく、例えば、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、またはＩｇＹであってもよい。特定の実施形態において、本開示の抗体は、ＩｇＧであり得る。さらなる特定の実施形態において、本開示の抗体は、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３、およびヒトＩｇＧ４からなる群から選択されるサブクラスであり、好ましくは、ヒトＩｇＧ４である。
　ヒトＩｇＧ４は、ヒトＩｇＧ４のＨ鎖が別のヒトＩｇＧ４と交換する反応（Ｆａｂ－ａｒｍ　ｅｘｃｈａｎｇｅ）が起きることが知られている（https://www.nature.com/articles/nrneph.2015.95/figures/2）。これを防ぐために、Ｓ２２８Ｐ変異を入れることができる（Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ．　２０１５　Ｆｅｂ　２７；２９０（９）：５４６２－９．）。例えば、ＯＰＤＩＶＯＲ（ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）やＫＥＹＴＲＵＤＡＲ（ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）は、Ｓ２２８Ｐ変異が導入されており、デュピルマブは、Ｈ鎖２３３番目のアミノ酸残基がＰｒｏに置換されている。ヒトＩｇＧ４以外のクラスではＦａｂ－ａｒｍ　ｅｘｃｈａｎｇｅは起きないため、アミノ酸変異を入れなくてもよい。
　いくつかの実施形態において、本開示の抗体は、配列番号９１に記載のアミノ酸配列、またはこれと少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一のアミノ酸配列を有する重鎖定常領域を含み得る。いくつかの実施形態において、本開示の抗体は、配列番号９２に記載のアミノ酸配、またはこれと少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖定常領域を含み得る。
　いくつかの実施形態において、重鎖可変領域のＣＤＲ１～３は、それぞれ配列番号２８～３０に記載のアミノ酸配列を有し得る。
　いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域のＣＤＲ１～３は、それぞれ配列番号３１～３３、またはそれぞれ配列番号３４～３６、またはそれぞれ配列番号３７～３９、またはそれぞれ配列番号４０～４２、またはそれぞれ配列番号４３～４５、またはそれぞれ配列番号４６～４８、またはそれぞれ配列番号４９～５１、またはそれぞれ配列番号５２～５４、またはそれぞれ配列番号５５～５７、またはそれぞれ配列番号５８～６０、またはそれぞれ配列番号６１～６３、またはそれぞれ配列番号６４～６６、またはそれぞれ配列番号６７～６９、またはそれぞれ配列番号７０～７２、またはそれぞれ配列番号７３～７５、または７６～７８、または７９～８１、または８２～８４、または８５～８７、またはそれぞれ配列番号８８～９０に記載のアミノ酸配列を有し得る。好ましい実施形態において、軽鎖可変領域のＣＤＲ１～３は、それぞれ配列番号３１～３３、またはそれぞれ配列番号３４～３６、またはそれぞれ配列番号３７～３９、またはそれぞれ配列番号４０～４２、またはそれぞれ配列番号４３～４５、またはそれぞれ配列番号４６～４８、またはそれぞれ配列番号４９～５１、またはそれぞれ配列番号５２～５４、またはそれぞれ配列番号５５～５７、またはそれぞれ配列番号５８～６０に記載のアミノ酸配列を有し得る。
　いくつかの実施形態において、本開示の抗体またはその抗原結合フラグメントのエピトープは、配列番号２（ヒトＧＰＣ－１の全長配列）の３３９～３５８位および／もしくは３８８～４２１位を含み得る。特定の実施形態において、本開示の抗体のエピトープは、配列番号２（ヒトＧＰＣ－１の全長配列）の３３９～３５８位および３８８～４２１位を含み得る。
　いくつかの実施形態において、本開示の抗体またはその抗原結合フラグメントは、約５×１０－９Ｍ、約６×１０－９Ｍ、約７×１０－９Ｍ、約８×１０－９Ｍ、約９×１０－９Ｍ、約１０－８Ｍ以下、約２×１０－８Ｍ、約３×１０－８Ｍ、約４×１０－８Ｍ、約５×１０－８Ｍ、約１０－７Ｍ、または約５×１０－７Ｍの親和性（ＫＤ値）でＧｌｙｐｉｃａｎ－１に結合し得る。特定の実施形態において、本開示の抗体またはその抗原結合フラグメントは、３．１６×１０－８Ｍまたは約１．０２×１０－８Ｍの親和性（ＫＤ値）でＧｌｙｐｉｃａｎ－１に結合し得る。
　さらなる局面において、本開示は、本開示のヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、有効成分を細胞内移行させるための医薬組成物を提供する。本開示の抗体は、予想外にも０１ａ０３３と同等またはそれ以上の細胞内移行（インターナライズ）活性を有する。
　（複合体）
　さらなる局面において、本開示は、本開示のヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントと細胞傷害性活性を有する薬剤との複合体を提供する。細胞傷害性活性を有する薬剤は、リンカーを介して作動可能にヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントに連結され得る。
　細胞傷害性活性を有する薬剤としては、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、ＤＭ１、ＤＭ４、カリケアマイシン、デュオカルマイシン、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、およびトポイソメラーゼ阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。限定を意図するものではないが、細胞傷害性活性を有する薬剤は、バイスタンダー効果を有するものであるのが好ましい。バイスタンダーとは、がん細胞内で遊離した薬剤が細胞膜を透過し、周囲のがん細胞に対しても有効性を示す効果をいう。したがって、いくつかの実施形態において、細胞傷害性活性を有する薬剤は、細胞透過性であり得る。バイスタンダー効果を有する細胞傷害性活性を有する薬剤としては、例えば、ＭＭＡＥ、ＰＢＤ、Ｅｒｉｂｕｌｉｎ、ＳＮ－３８、Ｄｘｄ、ＤＭ４等が挙げられるが、これらに限定されない。
　いくつかの実施形態において、リンカーは、がん細胞内において切断されるものであればよく、例えば、酵素切断型リンカー、酸不安定性リンカー、およびジスルフィドリンカーなどが挙げられる。特定の実施形態において、リンカーは、カテプシン（例えば、カテプシンＢ）により切断される切断型リンカー、例えば、マレイミドカプロイル－バリン－シトルリン－ｐ－アミノベンジルオキシカルボニルであり得る。
　いくつかの実施形態において、本開示の複合体は、Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１陽性細胞において、約０．０４ｎＭ以下、約０．０５ｎＭ以下、約０．０６ｎＭ以下、約０．０７ｎＭ以下、約０．０８ｎＭ以下、約０．０９ｎＭ以下、約０．１ｎＭ以下、約０．１１ｎＭ以下、約０．１２ｎＭ以下、約０．１３ｎＭ以下、約０．１４ｎＭ以下、または約０．１５ｎＭ以下のＩＣ５０を示し得る。ＩＣ５０は、実施例２のＡＤＣアッセイにおいて測定された値であり得る。好ましい実施形態において、Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１陽性細胞において、約０．１ｎＭ以下のＩＣ５０を示し得る。
　別の実施形態では、本開示の複合体で使用されるリンカーは、酸不安定性リンカーであってもよい。細胞内移行後のエンドソームまたはリソソーム内の酸性ｐＨを利用し、酸性で不安定なｐＨに応答性のリンカーを使用することができる。このようなリンカーとしては、例えば、ヒドラゾンなどが挙げられる。
　さらなる別の実施形態では、本開示の複合体で使用されるリンカーは、ジスルフィドリンカーであってもよく、このようなリンカーとしては、Ｎ－スクシンイミジル４－（２－ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）、Ｎ－スクシンイミジル４－（２－ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）などが挙げられる。
　本開示の複合体で使用されるリンカーは、非開裂型リンカーであってもよい。非開裂型リンカーとしてはマレイミドメチルシクロヘキサン－１－カルボン酸（ＭＣＣリンカー）などが挙げられるが、これらに限定されない。
　（医薬組成物）
　さらなる局面において、本開示は、本開示の複合体を含む、Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１陽性がんを予防または治療するための組成物を提供する。食道がん、膵臓がん、胆管がん、子宮頸がん、肺がん、頭頸部がん、乳がん、子宮平滑筋肉腫、前立腺がん、口腔扁平上皮がんまたはこれらの任意の組合せから選択され得る。特定の実施形態において、Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１陽性がんは、食道がんまたは膵臓がんであり得る。
　（転移性がんの治療のための組成物）
　さらなる局面において、本開示の複合体を含む、Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１陽性がんの転移性がんを予防または治療するための組成物を提供する。本発明者らは、Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１陽性がんの転移性がんがＧｌｙｐｉｃａｎ－１を発現していること、Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１陽性がんの転移性がんを本開示の複合体により治療することができることを見出した。原発部位において発現される抗原が、必ずしも転移がんにおいて同じ抗原を発現するとは限らない。そのため、原発部位で発現が確認されたがん抗原については、転移がんにおいて発現するかどうかを確認する必要がある。ＧＰＣ１について膵臓がんリンパ節転移、膵臓がん肝転移、食道がんリンパ節転移などの転移先の腫瘍組織に対して、発現が陽性であることを確認され、治療標的として意義がある。
　いくつかの実施形態において、Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１陽性がんは、食道がん、膵臓がん、胆管がん、子宮頸がん、肺がん、頭頸部がん、乳がん、子宮平滑筋肉腫、前立腺がん、口腔扁平上皮がん、またはこれらの任意の組合せから選択され得る。特定の実施形態において、Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１陽性がんは、膵臓がんであり得る。
　いくつかの実施形態において、転移性がんは、肝臓、食道、胆管、子宮頸、肺、頭頸部、乳房、子宮平滑筋、前立腺、口腔扁平上皮、脳、骨、腹膜、副腎などに転移した転移性がんであり得る。
　いくつかの実施形態において、がんは、がん関連線維芽細胞（ＣＡＦ）を有していてもよい。
　さらなる実施形態において、本開示の複合体は、免疫チェックポイント阻害剤と一緒に投与されてもよい。免疫チェックポイント阻害剤としては、例えば、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＶＩＳＴＡ抗体等が挙げられるが、これらに限定されない。
　（改変体の作成）
　当該分野で周知の方法に従って、当業者であれば、本開示における抗体の配列に基づき、ＧＰＣ－１に対して、０１ａ０３３または本開示の抗体と同等またはそれらよりも高い親和性を有する改変体を製造することが可能である。例えば、当業者であれば、ファージディスプレイ法を用いてＣＤＲ配列がわずかに異なる抗体を解析し、目的の抗体と同等またはそれより高い親和性を有する抗体をスクリーニングすることができる。その他の改変体を作成する方法としては、ＣＤＲ－ｗａｌｋｉｎｇ法、ランダム変異誘発法などが挙げられる。いくつかの実施形態において、改変体は、本開示の抗体またはその抗原結合フラグメントにおける各ＣＤＲにおいて、３個以下のアミノ酸置換、欠失および／または付加、好ましくは２個以下のアミノ酸置換、欠失および／または付加、より好ましくは１個以下のアミノ酸置換、欠失および／または付加を有し得る。これらの改変体は、ＧＰＣ－１に対して、０１ａ０３３または本開示の抗体と同等またはそれらよりも高い親和性を有し得る。
　本明細書において「または」は、文章中に列挙されている事項の「少なくとも１つ以上」を採用できるときに使用される。「もしくは」も同様である。本明細書において「２つの値の範囲内」と明記した場合、その範囲には２つの値自体も含む。
　本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
　以上、本開示を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本開示を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本開示を限定する目的で提供したのではない。従って、本開示の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
　以下に実施例を記載する。必要な場合、以下の実施例で用いる動物の取り扱いは、必要な場合、医薬基盤研究所において規定される基準を遵守し、ヘルシンキ宣言に基づいて行った。試薬類は具体的には実施例中に記載した製品を使用したが、他メーカー（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃ、和光純薬、ナカライ、Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＣＮ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ＩＮＣ等）の同等品でも代用可能である。
　本実施例では、細胞内にインターナライズする活性が高い抗体として発見した抗ＧＰＣ１モノクローナル抗体（クローン０１ａ０３３）をヒト化し、ヒト化前よりも高い細胞内へのインターナライズ活性をスクリーニングし、ヒト化抗ＧＰＣ１モノクローナル抗体にリンカーを介して抗がん剤を結合させたヒト化ＧＰＣ１－ＡＤＣの創出と、ヒト化ＧＰＣ１－ＡＤＣの抗腫瘍効果をｉｎ　ｖｉｔｒｏ、ｉｎ　ｖｉｖｏで明らかにすることを目的とする。また、ペイロードのＭＭＡＥがｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ　ｃｅｌｌ　ｄｅａｔｈを誘導する性質を持つことから、ヒト化ＧＰＣ１－ＡＤＣと免疫チェックポイント阻害剤の併用による相乗的な抗腫瘍効果が得られることを確認することも目的とする。
　（製造例：ヒト化抗体の製造）
　本開示のヒト化抗体の製造をHD　Biosciences　(China)　Co.,　Ltdに依頼した。
　簡潔にいうと、ヒト化は、簡潔には、ライブラリーの構築、抗原のパニングおよびスクリーニング、結合ＥＬＩＳＡ、ならびに親和性の決定により行われた。ヒトＶκライブラリーを、マウス抗体のＣＤＲおよびヒトフレームワークの固定重鎖によって構築し、それに続いて抗原パニングおよびスクリーニングを行った。Ｖκライブラリーのパニングから、合計３０のヒト化抗ｇｌｙｐｉｃａｎ－１抗体を見出し、ファージＥＬＩＳＡによって確認した。それらのうち２０を、抗体発現および精製のために選択し、その後Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）　８Ｋにより親和性を決定した。
　（材料および方法）
　＜抗体ライブラリー作成＞
　マウス抗体（０１ａ０３３）のＣＤＲグラフティングによるヒト化Ｈ鎖ＶＨ領域作成
　０１ａ０３３のＶＨと相同性の高いＡｌｌｅｌｅをａｂＹｓｉｓのデータベースで検索し、ヒト生殖系列配列ＶＨ１－４６のフレームワークを選択して０１ａ０３３のＶＨのＣＤＲ配列をグラフティングしたアミノ酸配列となる遺伝子を作成した。
　ＶＬ領域はヒトＶＬの遺伝子プールのライブラリー（ＬＣ－Ｌｉｂｒａｒｙ：Ｌｉｂｒａｒｙ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　４．５３×１０５／Ｌｉｂｒａｒｙ　ｓｉｚｅ　１．０６×１０１３）を使用した。ファージＧＩＩＩ抗原のＮ末端側にＶＬライブラリー遺伝子＋Ｃｋ遺伝子＋上記ヒト化ＶＨ遺伝子＋ＣＨ１の順番になるように組み込んだ。
　ランダムなヒトＬ鎖（ｋ）と０１ａ０３３のＣＤＲ配列を持つヒト化Ｈ鎖（ＶＨ＋ＣＨ１）が提示されたファージライブラリーを作成（ヒト化抗体ライブラリー）した。
　＜パンニング＞
　ヒト化抗体ライブラリーの中で、実際にＧＰＣ－１に結合する抗体を発現しているファージを選択するため、パンニングを実施した。
　抗原であるＧＰＣ－１を固相（試験管、パーティクル）に結合させ、そこにファージの集団を加え、洗浄し、結合したファージを回収した。
　＜Ｆｉｌｔｅｒ　ｌｉｆｔｉｎｇによるファージクローン単離と抗原結合性の検証＞
　パンニングで抗原に結合し、溶出されたファージを大腸菌を蒔いたプレートで感染させ、生じた溶菌プラークをフィルターに写し取って、ファージをクローニングした。
　得られたファージクローンを増幅し、個々のクローンについてＥＬＩＳＡ法（ヒトＧＰＣ－１抗原を固定）への結合性を調べ、一定値以上の結合シグナルが得られたクローンを選択した。
　＜ＩｇＧ化した抗体クローンの発現と精製＞
　選択したファージ２０クローンの遺伝子からＩｇＧ化した抗体をＨＥＫ２９３細胞で発現させた（ベクター：ｐＦＵＳＥ２ｓｓ－ＣＬＩｇ－ｈｋｐＦＵＳＥ２ｓｓ－ＣＬＩｇ－ｈｋ（軽鎖、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ，カタログ番号：ｐｆｕｓｅ２ｓｓ－ｈｃｌｋ）およびｐＦＵＳＥｓｓ－ＣＨＩｇ－ｈＧ１（重鎖、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ，カタログ番号：ｐｆｕｓｅｓｓ－ｈｃｈｇ１）；細胞系：ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ　２９３Ｆ　Ｃｅｌｌｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ番号：Ｒ７９０－０７））。トランスフェクション後４日での培養上清から抗体を精製して定量とＳＤＳ－ＰＡＧＥでの確認を行った。２０クローンすべてについて抗体産生（Ｈ鎖、Ｌ鎖の存在と分子量）を確認した。
　＜表面プラズモン共鳴法での各クローンの抗原結合親和性の測定＞
　表面プラズモン共鳴法（Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）８Ｋ）で取得した２０クローンの抗体の抗原結合親和性を測定した。チップに抗ヒトＩｇＧ抗体を固定化し、そこにそれぞれの抗体を流して抗体を結合させ、洗浄後ヒトＧＰＣ－１抗原を流して結合定数（Ｋａ）及び解離定数（Ｋｄ）を測定した。７クローンがマウス抗体よりも高い親和性を示した。
　＜表面プラズモン共鳴法でのマウス抗体（０１ａ０３３）の抗原結合親和性の測定＞
　表面プラズモン共鳴法（Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）８Ｋ）でマウス抗体のヒトＧＰＣ－１への結合親和性を測定した。チップに抗マウスＦｃ抗体を固定化し、そこにマウス抗体（０１ａ０３３）を流して結合させ、洗浄後にヒトＧＰＣ－１を流して結合定数（Ｋａ）及び解離定数（Ｋｄ）を測定した。
　＜マウス抗ＧＰＣ－１キメラ抗体の作成＞
　０１ａ０３３のＶＨ／ＶＬ遺伝子をヒトＣｋ／ＣＨ遺伝子につないでヒト抗体キメラ遺伝子を作成した。ＨＥＫ２９３Ｆ細胞で発現させた。
　（実施例１：ヒト化抗ＧＰＣ１モノクローナル抗体の親和性解析）
　（材料および方法）
　マウス抗ヒトＧＰＣ１モノクローナル抗体をヒト化（サブクラスはＩｇＧ４）し、得られた２０種類のクローン（Ｔ１，Ｔ２，Ｔ３，Ｔ７，Ｔ８，Ｔ１０，Ｔ１１，Ｔ２２，Ｔ２６，Ｔ２８，Ｔ２９，Ｔ３１，Ｔ３２，Ｔ３３，Ｔ３４，Ｔ３６，Ｔ４３，Ｔ５６，Ｔ５７，Ｔ５９）を調製した。これらのクローンについて、組換えヒトＧＰＣ１タンパク質（Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ社）との親和性をＨｕｍａｎ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｃａｐｔｕｒｅ　ｋｉｔ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）をｓＣＭ５　ｓｅｎｓｏｒ　ｃｈｉｐ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に固相化し、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）８Ｋ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて測定した。
　（結果）
　抗Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１（ＧＰＣ－１）モノクローナル抗体（０１ａ０３３）を独自にヒト化し、その結果、２０種類の候補クローンを取得した。これらの２０種類のクローンについて、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）により平衡解離定数（ＫＤ）を測定した（図１）。その結果、ヒト化する前の抗体であるキメラマウス抗体（０１ａ０３３）よりも強い親和性を示すクローンが７種類（クローンＴ１，Ｔ２，Ｔ３，Ｔ８，Ｔ１０，Ｔ３６，Ｔ５６）確認された（図１）。
　（実施例２：ヒト化抗ＧＰＣ－１抗体とＭＭＡＦ結合２次抗体を組み合わせたＡＤＣアッセイ）
　（材料および方法）
　（ＴＥ１４細胞の抗がん剤感受性の確認）
　９６ウェルプレートに２０００個のＴＥ１４細胞を８０μｌで添加した。一晩、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで培養し、翌日、最終濃度に対して１０倍濃縮したヒト化抗ＧＰＣ１抗体の各種クローンを１次抗体として１ウェルあたり１０μｌずつ添加した。続いて、２次抗体として抗がん剤（ＭＭＡＦ）をリンカーを介して結合した抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｆａｂ）（ＭＯＲＡＤＥＣ、型番ＡＨ－２０２ＡＦ－５０）を１ウェルあたり１０μｌずつ添加して合計１００μｌとした。３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで６日間培養しＣｅｌｌ　Ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏ　Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ａｓｓａｙ試薬を用いてＡＴＰ量を検出することで細胞の生存を測定した。培地は、ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ＋１％ＰＳを使用した。
　（アッセイに使用するＡＤＣ）
　アッセイに使用するＡＤＣの概略図を図２に示す。２０種類のクローンの中から細胞内インターナライズ活性の高いクローンを図２に示す方法によりスクリーニングした。本手法はＧＰＣ１を発現する食道がん細胞株であるＴＥ１４細胞株に、上記製造例で得られたクローンのヒト化抗ＧＰＣ１抗体を１次抗体として添加し、２次抗体として抗がん剤（ＭＭＡＦ）コンジュゲート抗ヒトＩｇＧ抗体を添加することで、がん細胞内に１次抗体と２次抗体の複合体として抗がん剤を取り込ませ、抗がん剤の作用により細胞死が誘導されるアッセイ系を用いている。
　（結果）
　キメラマウス抗体（０１ａ０３３）よりも高い細胞内インターナライズ活性を示すクローンが１０種類確認された（クローンＴ２，Ｔ７，Ｔ８，Ｔ１，Ｔ３６，Ｔ５７，Ｔ１０，Ｔ３４，Ｔ５６，Ｔ３）（図３）。
　（実施例３：ＦＡＣＳによる抗原親和性解析）
　実施例２の結果、クローンＴ２が最も高い活性を示したため、クローンＴ２を細胞内インターナライズ活性の高いヒト化抗ＧＰＣ１抗体として選出し、解析を行った。
　（材料および方法）
　抗体を用いたＦＡＣＳ解析を行うにあたり、ＧＰＣ１陽性細胞として、ヒト食道がん細胞株（ＴＥ８）細胞を、ＧＰＣ１陰性細胞としてＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９技術を用いてＧＰＣ１をノックアウトしたＴＥ８－ＧＰＣ１　ＫＯ細胞を用いた。ヒト／マウスキメラ抗ＧＰＣ１抗体（クローン０１ａ０３３）およびヒト化抗ＧＰＣ１抗体（クローンＴ２）を１次抗体として用い、２次抗体としてはＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＧ－ＦＩＴＣ（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏ　ｒｅｓｅａｒｃｈ社、型番：１０９－０９５－０９８）を用い、ＦＡＣＳ　ＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤ社）を用いて測定し、測定データはＢＤ　ＦＡＣＳＤｉｖａ　ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢＤ社）を用いて解析した。
　（材料および方法）
　ヒト／マウスキメラ抗ＧＰＣ１抗体（クローン０１ａ０３３）およびヒト化抗ＧＰＣ１抗体（クローンＴ２）を、種々の濃度の１次抗体として用い、２次抗体としてはＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＧ－ＦＩＴＣ（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏ　ｒｅｓｅａｒｃｈ社、型番：１０９－０９５－０９８）を用い、ＦＡＣＳ　ＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤ社）を用いて測定し、測定データはＢＤ　ＦＡＣＳＤｉｖａ　ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢＤ社）を用いて解析した。
　（結果）
　ＧＰＣ１陽性の食道がん細胞株であるＴＥ８と、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムによりＧＰＣ１をノックアウトしたＴＥ８－ＧＰＣ１－ＫＯ細胞に対して、キメラマウス抗体（０１ａ０３３）、および、ヒト化抗ＧＰＣ１抗体（Ｔ２）を用いてＦＡＣＳ解析を行った結果、ＴＥ８－ＧＰＣ１－ＫＯ細胞とは反応性を示さず、ＴＥ８細胞のみ反応性を示したため、ヒト化抗ＧＰＣ１抗体（Ｔ２）がＧＰＣ１特異的に結合していることが確認された（図４）。また、ＴＥ８細胞表面上のＧＰＣ１との反応性についても、ヒト化抗ＧＰＣ１抗体（Ｔ２）はキメラマウス抗体（０１ａ０３３）よりも高い親和性を示すことを明らかにした（図４）。
　（実施例４：ＡＤＣの作製）
　本実施例において、ＡＤＣを以下のとおり作製した。
　ヒト化抗ＧＰＣ１抗体（クローンＴ２）にｍＡｂを、マレイミドカプロイル－バリン－シトルリン－ｐ－アミノベンジルオキシカルボニル－モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ）とコンジュゲートさせた。コンジュゲートは、最初に３７℃でＴＣＥＰによりｍＡｂの鎖間ジスルフィド結合を還元し、次いで薬物のマレイミド部分を還元されたシステインに結合させるマレイミド－システインベースの方法で行った。ＡＤＣをＡｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ　－　０．５　ｍＬ　Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ　ｆｉｌｔｅｒｓ　－　３０　Ｋ（ミリポア社）で脱塩し、未反応の毒素を取り除き、次いで、ＡＤＣ　ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎバッファー（２０ｍＭヒスチジン，７％スクロース，０．０２％（ｗ／ｖ）ＰＳ８０，ｐＨ５．５）にバッファーを交換した。薬物抗体比（ＤＡＲ）の分布は疎水性相互作用クロマトグラフィ－（ＨＩＣ）で、凝集の程度はサイズ排除クロマトグラフィ－（ＳＥＣ）により分析した。薬物抗体比（ＤＡＲ）は４となるようにコンジュゲート条件を設定した。
　（結果）
　例示的なＡＤＣの構造の概略図を図５に示す。図５に示す通り、ヒト化抗ＧＰＣ１抗体（クローンＴ２）のシステイン残基に、カテプシンＢにより切断される切断型リンカーを介してバイスタンダー効果を有するペイロードであるＭＭＡＥをコンジュゲートした。ヒト化ＧＰＣ１－ＡＤＣはＤＡＲ４．０を示した（図６）。
　（実施例５：ヒト化ＧＰＣ１－ＡＤＣと未標識抗体のＦＡＣＳによる抗原親和性解析）
　（材料および方法）
　抗体を用いたＦＡＣＳ解析を行うにあたり、ＧＰＣ１陽性細胞として、ヒト膵臓がん細胞株（ＢｘＰＣ－３）細胞を用いた。ヒト化抗ＧＰＣ１抗体（クローンＴ２）およびヒト化ＧＰＣ１－ＡＤＣ（ＭＭＡＥ）を、種々の濃度の１次抗体として用い、２次抗体としてはＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＧ－ＦＩＴＣ（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏ　ｒｅｓｅａｒｃｈ社、型番：１０９－０９５－０９８）を用い、ＦＡＣＳ　ＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤ社）を用いて測定し、測定データはＢＤ　ＦＡＣＳＤｉｖａ　ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢＤ社）を用いて解析した。
　（結果）
　ヒト化抗ＧＰＣ１抗体（Ｔ２）にペイロードをコンジュゲートしたことによる抗原親和性への影響について、ＧＰＣ１発現陽性のＢｘＰＣ３細胞を用いて、抗体濃度依存的な結合能をＦＡＣＳ解析により評価した。その結果、ヒト化抗ＧＰＣ１－ＡＤＣはヒト化抗ＧＰＣ１抗体（Ｔ２）と同等のＫＤ値を示したため、ペイロードのコンジュゲートにより抗原親和性の大きな低下は起きていないことが確認された（図７）。
　（実施例６：ヒト化抗ＧＰＣ－１抗体（ｃｌｏｎｅ　Ｔ２）およびヒト化ＧＰＣ１－ＡＤＣ（ＭＭＡＥ）の細胞内インターナライゼーションアッセイ）
　本実施例では、ヒト化ＧＰＣ１－ＡＤＣ（ＭＭＡＥ）について、ＧＰＣ１陽性ＢｘＰＣ－３細胞株を用いてインターナライズ（細胞内移行）活性を、ＦＡＣＳを用いて調べた。
　（材料および方法）
　ヒト化抗ＧＰＣ１抗体（ｃｌｏｎｅ　Ｔ２）およびヒト化ＧＰＣ１－ＡＤＣ（ＭＭＡＥ）で処理した細胞に対してａｎｔｉ－ＧＰＣ１　ｍＡｂ（ビオチン標識０２ｂ００６）とＰＥ標識ストレプトアビジンで検出した。
　ＢｘＰＣ－３細胞株を１０ｃｍプレート１枚から０．０２％ＥＤＴＡを用いてはがし、回収した。細胞をＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ＋１％ＧｌｕｔａＭＡＸＴＭ　Ｉ　＋１００Ｕ／ｍｌペニシリン＋１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンに懸濁し、１．５ｍｌチューブに、２．０ｘ１０６細胞／０．９ｍｌとして作成した。インターナライゼーション活性を下げるため、氷上で１時間静置した。１ｍｇ／ｍｌのヒト化抗ＧＰＣ１抗体（クローンＴ２）およびヒト化ＧＰＣ１－ＡＤＣ（ＭＭＡＥ）を氷冷ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ＋１％　ＧｌｕｔａＭＡＸＴＭ　Ｉ　＋１００Ｕ／ｍｌペニシリン＋１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンで２４μｇ／ｍｌ（１６０ｎＭ）に希釈した。細胞懸濁液に上記抗体を１００μｌ加え懸濁し、氷上で３０分間静置し、細胞表面の抗原を染色した。３０分後に、細胞懸濁液を１００μｌずつ６本ずつに分注した。細胞懸濁液は４℃インキュベート群と、３７℃インキュベート群に分け１２本とした。インキュベート時間は０ｈ、１ｈ、２ｈ、３ｈ、４ｈ、６ｈとした。インキュベート時間に達した後、細胞を１５００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心上清除いた。１００μｌの氷冷ＰＢＳ＋０．２％ＢＳＡで洗浄し、遠心を行い細胞を洗浄した。洗浄操作を合計３回行った。１μｇ／ｍｌの濃度のビオチン標識された抗ＧＰＣ１抗体０２ｂ００６（国際公開第２０１８／１９９３１８号）を５０μＬ加え、懸濁した。氷上で３０分間、細胞表面の抗原を染色した（インターナライズされなかったＧＰＣ１が染まる）。インキュベート時間に達した後、細胞を１５００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心上清除いた。１００μｌの氷冷ＰＢＳ＋０．２％ＢＳＡで洗浄し、遠心を行い細胞を洗浄した。洗浄操作を合計３回行った。Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＰＥ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、＃５５４０６１）を氷冷ＰＢＳ＋０．２％ＢＳＡで２００倍希釈し、細胞に５０μＬ加え、懸濁した。氷上で３０分間、遮光下で反応させた。インキュベート時間に達した後、細胞を１５００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心上清除いた。１００μｌの氷冷ＰＢＳ＋０．２％ＢＳＡで洗浄し、遠心を行い細胞を洗浄した。洗浄操作を合計３回行った。氷冷ＰＢＳ＋０．２％ＢＳＡを１５０μＬ加え、ＦＡＣＳ　ＣａｎｔｏＩＩで測定し、ＢＤ　ＦＡＣＳＤｉｖａ　ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢＤ社）で解析した。
　さらに、ヒト化抗ＧＰＣ１抗体（クローンＴ２）およびヒト化ＧＰＣ１－ＡＤＣ（ＭＭＡＥ）について、ＧＰＣ１陽性ＢｘＰＣ－３細胞株を用いてインターナライズした際のヒト化抗ＧＰＣ１抗体（クローンＴ２）およびヒト化ＧＰＣ１－ＡＤＣ（ＭＭＡＥ）の細胞内の局在を、蛍光顕微鏡を用いて調べた。
　１８ｍｍ　ｍｉｃｒｏｃｏｖｅｒ　ｇｌａｓｓ（ｍａｔｓｕｎａｍｉ）を入れた１２ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ：　３５１３）にＢｘＰＣ－３細胞を７．５ｘ１０４　ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（１ｍｌ／ｗｅｌｌ）で播種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで細胞を一晩培養した。
　翌日、培地を除去し、ウェルに１．０ｍｌの氷冷ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ＋１％ＧｌｕｔａＭＡＸＴＭ　Ｉ　＋１００Ｕ／ｍｌペニシリン＋１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを加え、４℃で１時間インキュベートし、細胞のインターナライズ活性を下げた。
　続いて、ウェル内部の培地を除去し、１０μｇ／ｍｌの１次抗体（氷冷したヒト化抗ＧＰＣ１抗体（クローンＴ２）およびヒト化ＧＰＣ１－ＡＤＣ（ＭＭＡＥ）を５００μｌ／ｗｅｌｌ添加し、４℃で１５分インキュベートした。
　１５分後に抗体溶液をアスピレートし、１．０ｍｌの氷冷ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ＋１％ＧｌｕｔａＭＡＸＴＭ　Ｉ　＋１００Ｕ／ｍｌペニシリン＋１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを加え、細胞を洗浄した。この時点のサンプルを０時間サンプル（０ｈ）として回収した。
　インターナライズさせるサンプルについては、溶液をアスピレートし、１．０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ＋１％ＧｌｕｔａＭＡＸＴＭ　Ｉ　＋１００Ｕ／ｍｌペニシリン＋１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（３７℃で温めたもの）を加え３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで４時間培養し、この時点のサンプルを４時間サンプル（４ｈ）として回収した。
　０時間および４時間の時点でのサンプルについては、ウェル内の培地を除去し、１ｍｌ氷冷ＰＢＳで細胞を洗浄した。
　次に、１ｍｌの１００％（氷冷）メタノールを加え、－２０℃で１５分インキュベートすることで細胞を固定した。固定した後、１ｍｌのＰＢＳで３回洗浄し、１％ＢＳＡ，　０．３％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００／ＰＢＳ（－）を１ｍｌ加え、１時間、室温でブロッキング処理をした。ブロッキング後、溶液を除去し、１％ＢＳＡ，０．３％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００／ＰＢＳ（－）で１００倍希釈した１次抗体（抗ＣＤ１０７ａモノクローナル抗体（ＣＳＴ社　型番＃９０９１　ＬＡＭＰ１（Ｄ２Ｄ１１）ＸＰ（登録商標）Ｒａｂｂｉｔ　ｍＡｂ））を０．５ｍｌ／ｗｅｌｌ添加し、４℃で遮光して一晩反応させた。
　１次抗体反応を一晩行った後、１ｍｌのＰＢＳで３回洗浄し、１％ＢＳＡ，　０．３％
　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００／ＰＢＳ（－）で２００倍希釈した吸着済み２次抗体のヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）－Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８（Ｌｉｆｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社，　Ａ－１１０１３　ｌｏｔ　２１１０８４２）と２００倍希釈したロバ抗ウサギＩｇＧ－Ａｌｅｘａ６４７（Ｌｉｆｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社，Ａ３１５７３，　ｌｏｔ　１６２６６１３）を０．５ｍｌ／ｗｅｌｌずつ添加し、室温、遮光して１時間反応させた。
　２次抗体反応後、１ｍｌのＰＢＳで３回洗浄し、細胞が接着したカバーガラスを取り出し、スライドガラス上で、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ　Ｈ１２００）で封入し、オールインワン蛍光顕微鏡（キーエンス社、ＢＺ－Ｘ８００）で観察した。
　（結果）
　細胞内へのインターナライズ活性を評価した。ＢｘＰＣ３細胞を用いたＦＡＣＳ解析の結果、ヒト化抗ＧＰＣ１抗体（Ｔ２）およびヒト化抗ＧＰＣ１－ＡＤＣはいずれもＢｘＰＣ３細胞に添加後、２時間で６０から７０％以上のＧＰＣ１が細胞内に速やかにインターナライズしたことが確認された（図８）。本ＡＤＣが抗腫瘍効果を発揮するにはリソソーム内の酵素のカテプシンＢによりＡＤＣのリンカー部分が切断される必要がある。そこで、細胞内局在について、リソソームマーカーであるＣＤ１０７ａとＧＰＣ１との局在を蛍光二重染色法で評価した結果、ヒト化抗ＧＰＣ１抗体（Ｔ２）およびヒト化抗ＧＰＣ１－ＡＤＣはいずれもＣＤ１０７ａと共局在したことから、ヒト化抗ＧＰＣ１抗体（Ｔ２）およびヒト化抗ＧＰＣ１－ＡＤＣはＧＰＣ１と結合した後、リソソームに移行することが確認された（図８）。
　（実施例７：ヒト化ＧＰＣ１－ＡＤＣ（ＭＭＡＥ）を用いたｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ＡＤＣアッセイ）
　（材料および方法）
　ＦＡＣＳによるＧＰＣ１発現解析を行った。
　食道がん細胞株（ＴＥ８、ＴＥ１４）、膵臓がん細胞株（ＢｘＰＣ３、ＫＰ－２、ＰＫ－８）およびＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９技術を用いてＧＰＣ１をノックアウトしたＴＥ８－ＧＰＣ１　ＫＯ、ＴＥ１４－ＧＰＣ１　ＫＯ細胞、ＢｘＰＣ３－ＧＰＣ１　ＫＯ細胞、子宮頸がん細胞株（ＨｅＬａ）、頭頸部腫瘍細胞株（Ｄｅｔｒｏｉｔ５６２、ＦａＤｕ）、口腔扁平上皮がん細胞株（Ｈｏ－１－ｕ－１、ＫＯＳＣ２　ｃｌ３－４３、ＫＯＮ）について、ＦＡＣＳ解析によりＧＰＣ１の発現を解析したマウス抗ＧＰＣ１抗体（クローン０１ａ０３３）を１次抗体として用い、２次抗体としてはＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ　ｃｈａｉｎ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ）（ｓｏｕｔｈｅｒｎ　ｂｉｏｔｈｅｃｈ社）を用い、ＦＡＣＳ　ＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤ社）を用いて測定し、測定データは、ＦｌｏｗＪｏＴＭソフトウェア（Ｔｒｅｅ　ｓｔａｒ社）を用いて解析した。
　実施例４において作製したヒト化ＧＰＣ１－ＡＤＣ（ＭＭＡＥ）を用いたｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ＡＤＣアッセイを、以下のとおりを行った。
（１）細胞をＴｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社の９６ウェルホワイトプレート（型番１３６１０１）にまいた（細胞懸濁液９０μＬ）。培地はＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ＋１００Ｕ／ｍｌペニシリン＋１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを使用した（ＢｘＰＣ－３細胞はＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ＋１％　ＧｌｕｔａＭＡＸＴＭ　Ｉ　＋１００Ｕ／ｍｌペニシリン＋１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、Ｄｅｔｒｏｉｔ５６２、ＦａＤｕ、ＫＯＮはＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１００Ｕ／ｍｌペニシリン＋１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、Ｈｏ－１－ｕ－１はＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ＋１００Ｕ／ｍｌペニシリン＋１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを用いた）。細胞をプレート中央の６０ウェルに播種し、培地１００μＬを外側の３６ウェルに添加した。３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで培養した。
（２）翌日、細胞にＡＤＣ１０μＬを加えた（総量１００μＬ）
（３）１４４時間培養後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ　Ｃｅｌｌ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ａｓｓａｙ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を１００μＬ／ウェル加え混合した。
（４）プレートリーダーで測定した。
（５）ＧｒａｐｈＰａｄ　Ｐｒｉｓｍ６で解析した。
　ＩＣ５０値は以下の式から計算した（Ｈｏｓｓａｉｎ　ＭＭ，　Ｈｏｓｏｎｏ－Ｆｕｋａｏ　Ｔ，　Ｔａｎｇ　Ｒ，　Ｓｕｇａｙａ　Ｎ，　ｖａｎ　Ｋｕｐｐｅｖｅｌｔ　ＴＨ，　Ｊｅｎｎｉｓｋｅｎｓ　ＧＪ，　Ｋｉｍａｔａ　Ｋ，　Ｒｏｓｅｎ　ＳＤ，　Ｕｃｈｉｍｕｒａ　Ｋ　（２０１０）　Ｄｉｒｅｃｔ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＨＳｕｌｆ－１　ａｎｄ　ＨＳｕｌｆ－２　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ｏｎ　ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｈｅｐａｒａｎ　ｓｕｌｐｈａｔｅ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｂｙ　ＰＩ－８８．　Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ　２０（２）：　１７５-１８６．）。
ＩＣ５０＝１０＾（Ｌｏｇ［Ａ］［Ｂ］×（５０Ｃ）／（ＤＣ）＋Ｌｏｇ［Ｂ］）
Ａ：５０％を挟む高い濃度
Ｂ：５０％を挟む低い濃度
Ｃ：Ｂでの阻害率
Ｄ：Ａでの阻害率。
　（結果）
　作成したヒト化ＧＰＣ１－ＡＤＣの薬効を評価するためにＧＰＣ１発現が陽性および陰性の細胞株の調製を行った。ＧＰＣ１陽性の食道がん細胞株としてＴＥ８、ＴＥ１４、膵臓がん細胞株のＢｘＰＣ３について、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムによりＧＰＣ１をノックアウトしたＴＥ８－ＧＰＣ１－ＫＯ細胞、ＴＥ１４－ＧＰＣ１－ＫＯ細胞、ＢｘＰＣ３－ＧＰＣ１－ＫＯ細胞を作成し、ＦＡＣＳ解析によりＧＰＣ１がノックアウトされていることを確認した（図９）。ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ＡＤＣアッセイを行った結果、ヒト化ＧＰＣ１－ＡＤＣはＧＰＣ１陽性がん細胞株に対して薬効を発揮したが、ＧＰＣ１陰性がん細胞株には薬効を示さなかったため、ヒト化ＧＰＣ１－ＡＤＣがＧＰＣ１発現依存的に薬効を示すことが確認された（図１０）。膵臓がん、食道がん細胞株以外に、子宮頸がん、頭頸部腫瘍、口腔扁平上皮がん細胞株に対しても、ヒト化ＧＰＣ１－ＡＤＣはＧＰＣ１発現依存的に薬効を示すことが確認された（図１１、１２）。
　（実施例９：膵臓がんＰＤＸ（ＰＫ５６５）を用いたヒト化ＧＰＣ１－ＡＤＣ（ＭＭＡＥ）のｉｎ　ｖｉｖｏでの薬効試験）
　（材料および方法）
　以下のとおり、膵臓がんＰＤＸ（ＰＫ５６５）のＧＰＣ１発現の確認を行った。
　パラフィン包埋組織の薄切を脱パラフィン後、アルコールによる脱水を行った。ＧＰＣ１に対する免疫組織化学染色法は抗ＧＰＣ－１抗体（Ｇｅｎｅｔｅｘ：ＧＴＸ１０４５５７）とＣｈｅｍＭａｔｅ　Ｅｎｖｉｓｉｏｎ　ｋｉｔ　ＨＲＰ　５００Ｔ（Ｄａｋｏ社：Ｋ５００７）を用いて行った。ＰＫ５６５におけるＧＰＣ１の発現は膵臓がん細胞で陽性と陰性が混在するヘテロジニアスな腫瘍であることが確認された。
　６週齢のＮＯＧ雌性マウスに膵臓がんＰＤＸを皮下移植し、移植後腫瘍サイズが約１００ｍｍ３となったところで、ＰＢＳ、コントロールＡＤＣ（１０ｍｇ／ｋｇ）および、実施例４において作製したヒト化抗ＧＰＣ１－ＡＤＣ（ＭＭＡＥ）（１ｍｇ／ｋｇ）、（３ｍｇ／ｋｇ）、（１０ｍｇ／ｋｇ）の投与を開始した。投与を開始した日を０日目として、０日目、７日目、１４日目および２１日目に静脈内投与した。腫瘍体積および体重を０日目以降週２回の頻度で４２日目まで計測した。
　（結果）
　ｉｎ　ｖｉｖｏにおける薬効試験では、ＧＰＣ１陽性の膵臓がんＰＤＸマウス（ＰＫ５６５）に対しても、薬剤を１週間毎に合計４回静脈内投与した結果、ヒト化ＧＰＣ１－ＡＤＣは濃度依存的な高い抗腫瘍効果を発揮した（図１３）。この際、体重減少など認められなかったため、ＧＰＣ１－ＡＤＣはコントロールＡＤＣと比較して特徴的な毒性を示さなかった。このことはｉｎ　ｖｉｖｏにおいて、抗がん剤を全身投与することと比較して、ＧＰＣ１－ＡＤＣを用いることで抗がん剤をＧＰＣ１陽性のがん細胞の特異的にデリバリーすることで、高い薬効と低い毒性を達成することでＧＰＣ１陽性のがんに対する画期的な治療薬の開発につながる。
　（実施例１０：膵臓がんＰＤＸ（ＰＫ１７５）を用いたヒト化ＧＰＣ１－ＡＤＣ（ＭＭＡＥ）のｉｎ　ｖｉｖｏでの薬効試験）
　（材料および方法）
　以下のとおり、膵臓がんＰＤＸ（ＰＫ１７５）のＧＰＣ１発現の確認を行った。
　パラフィン包埋組織の薄切を脱パラフィン後、アルコールによる脱水を行った。ＧＰＣ１に対する免疫組織化学染色法は抗ＧＰＣ－１抗体（Ｇｅｎｅｔｅｘ：ＧＴＸ１０４５５７）とＣｈｅｍＭａｔｅ　Ｅｎｖｉｓｉｏｎ　ｋｉｔ　ＨＲＰ　５００Ｔ（Ｄａｋｏ社：Ｋ５００７）を用いて行った。ＰＫ１７５におけるＧＰＣ１の発現は膵臓がん細胞とがん関連線維芽細胞（ＣＡＦ）の両方で陽性の腫瘍であることが確認された。
　６週齢のＮＯＧ雌性マウスに膵臓がんＰＤＸを皮下移植し、移植後腫瘍サイズが約１００ｍｍ３となったところで、ＰＢＳ、および、ヒト化抗ＧＰＣ１－ＡＤＣ（ＭＭＡＥ）（１ｍｇ／ｋｇ）、（３ｍｇ／ｋｇ）、（１０ｍｇ／ｋｇ）の投与を開始した。投与を開始した日を０日目として、０日目、７日目、１４日目および２１日目に静脈内投与した。腫瘍体積および体重を０日目以降週２回の頻度で４２日目まで計測した。
　（結果）
　ｉｎ　ｖｉｖｏにおける薬効試験では、ＧＰＣ１陽性の膵臓がんＰＤＸマウス（ＰＫ１７５）に対しても、薬剤を１週間毎に合計４回静脈内投与した結果、ヒト化ＧＰＣ１－ＡＤＣは濃度依存的な高い抗腫瘍効果を発揮した（図１４）。この際、体重減少など認められなかったため、ＧＰＣ１－ＡＤＣはコントロールＡＤＣと比較して特徴的な毒性を示さなかった。このことはｉｎ　ｖｉｖｏにおいて、抗がん剤を全身投与することと比較して、ＧＰＣ１－ＡＤＣを用いることで抗がん剤をＧＰＣ１陽性のがん細胞の特異的にデリバリーすることで、高い薬効と低い毒性を達成することでＧＰＣ１陽性のがんに対する画期的な治療薬の開発につながる。
　（実施例１１：食道がんＰＤＸ（ＥＳＣＣ１４）を用いたＧＰＣ１－ＡＤＣのｉｎ　ｖｉｖｏでの薬効試験）
　（材料および方法）
　以下のとおり、食道がんＰＤＸ（ＥＳＣＣ１４）のＧＰＣ１発現の確認を行った。
　パラフィン包埋組織の薄切を脱パラフィン後、アルコールによる脱水を行った。ＧＰＣ１に対する免疫組織化学染色法は抗ＧＰＣ－１抗体（Ｇｅｎｅｔｅｘ：ＧＴＸ１０４５５７）とＣｈｅｍＭａｔｅ　Ｅｎｖｉｓｉｏｎ　ｋｉｔ　ＨＲＰ　５００Ｔ（Ｄａｋｏ社：Ｋ５００７）を用いて行った。ＥＳＣＣ１４におけるＧＰＣ１の発現は食道がん細胞で均一に高発現するホモジニアスな腫瘍であることが確認された。
　６週齢のＮＯＧ雌性マウスに食道がんＰＤＸを皮下移植し、移植後腫瘍サイズが約１００ｍｍ３となったところで、コントロールとしてＰＢＳ、および、実施例４において作製したヒト化抗ＧＰＣ１－ＡＤＣ（ＭＭＡＥ）（１ｍｇ／ｋｇ）、（３ｍｇ／ｋｇ）、（１０ｍｇ／ｋｇ）の投与を開始した。投与を開始した日を０日目として、０日目、７日目、１４日目および２１日目に静脈内投与した。腫瘍体積および体重を０日目以降週２回の頻度で４２日目まで計測した。
　（結果）
　ｉｎ　ｖｉｖｏにおける薬効試験では、ＧＰＣ１陽性の食道がんＰＤＸマウス（ＥＳＣＣ１４）に対しても、薬剤を１週間毎に合計４回静脈内投与した結果、ヒト化ＧＰＣ１－ＡＤＣは濃度依存的な高い抗腫瘍効果を発揮した（図１５）。この際、体重減少など認められなかったため、ＧＰＣ１－ＡＤＣはコントロールＡＤＣと比較して特徴的な毒性を示さなかった。このことはｉｎ　ｖｉｖｏにおいて、抗がん剤を全身投与することと比較して、ＧＰＣ１－ＡＤＣを用いることで抗がん剤をＧＰＣ１陽性のがん細胞の特異的にデリバリーすることで、高い薬効と低い毒性を達成することでＧＰＣ１陽性のがんに対する画期的な治療薬の開発につながる。
　（実施例１２：ｍＧＰＣ１強制発現マウス大腸がん細胞株（ｍＧＰＣ１－ＭＣ３８）のＦＡＣＳ解析によるＧＰＣ１発現解析）
　（材料および方法）
　ｍＧＰＣ１－ＭＣ３８細胞に対して、ヒト化抗ＧＰＣ１抗体（ｃｌｏｎｅ　Ｔ２）を１次抗体として用い、２次抗体としてはＦＩＴＣ標識ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ－ＦＩＴＣ（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏ　ｒｅｓｅａｒｃｈ社、型番：１０９－０９５－０９８）を用い、ＦＡＣＳ　ＣａｎｔｏＩＩ　（ＢＤ社）を用いて測定し、測定データはＢＤ　ＦＡＣＳＤｉｖａ　ｓｏｆｔｗａｒｅ　（ＢＤ社）を用いて解析した。
　さらに、実施例８に記載と同様の方法でｍＧＰＣ１－ＭＣ３８細胞に対して、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ＡＤＣアッセイを実施した。
　（結果）
　ＭＭＡＥなどＡＤＣに用いるペイロードの種類によっては、がん細胞に対してＩｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ　ｃｅｌｌ　ｄｅａｔｈ　（ＩＣＤ）を伴う細胞死を誘導することが知られている。ＩＣＤを起こしたがん細胞からはｄａｍａｇｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｐａｔｔｅｒｎｓ　（ＤＡＭＰｓ）として知られる核内タンパク質のＨＭＧＢ１などが細胞外に放出され、ＴＬＲ－４を介した樹状細胞の成熟・活性化が促進される抗原特異的Ｔ細胞が腫瘍内に浸潤し、抗腫瘍効果を発揮する。そのため、ヒト化ＧＰＣ１－ＡＤＣと免疫チェックポイント阻害剤を併用することで、相乗的な抗腫瘍効果が得られることが期待される。そこで、ＭＣ３８（マウス大腸がん細胞株）にマウスＧＰＣ１を安定発現させたＭＣ３８－ｍＧＰＣ１を用いてｉｎ　ｖｉｔｒｏおよびシンジェニックマウスを用いたｉｎ　ｖｉｖｏでの実験を実施した。ヒト化抗ＧＰＣ１－ＡＤＣはＭＣ３８－ｍＧＰＣ１に対してｉｎ　ｖｉｔｒｏで細胞増殖阻害活性を示した（図１６）。
　（実施例１３：ＥＬＩＳＡによる培養上清中のＨＭＧＢ－１の定量）
　（材料および方法）
　ＭＣ３８－ｍＧＰＣ１にｃｏｎｔｒｏｌ－ＡＤＣ、ヒト化ＧＰＣ１－ＡＤＣおよびＭＭＡＥをｉｎ　ｖｉｔｒｏで添加し、４８時間後に培養上清を回収した。培養上清中のＨＭＧＢ－１の濃度はＨＭＧＢ１　ＥＬＩＳＡ　ＫＩＴ　ＩＩ　－　ＨＭＧＢ１測定試薬（シノテスト社、型番ＳＮＯ－３２６０５４３２９）を用いて実施した。
　（結果）
　ＭＣ３８－ｍＧＰＣ１に実施例４において作製したヒト化抗ＧＰＣ１－ＡＤＣを添加し、ＥＬＩＳＡ法にて培養上清中のＨＭＧＢ１を定量した結果、ＨＭＧＢ１の細胞外放出が誘導されていることが確認された（図１７）。ＨＭＧＢ１（ｈｉｇｈ　ｍｏｂｉｌｉｔｙ　ｇｒｏｕｐ　ｂｏｘ－１）はＤＡＭＰｓ（損傷関連分子パターン）の１つとして知られている核内タンパク質である。ある種の抗がん剤はがん細胞が細胞死を起こす際にＨＭＧＢ１を細胞外に放出するため、免疫原性細胞死（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ　ｃｅｌｌ　ｄｅａｔｈ）の指標として知られている。細胞外に放出されたＨＭＧＢ１は樹状細胞上のＴＬＲ４と結合することで樹状細胞の活性化、成熟化を促進し、その結果、Ｔ細胞の腫瘍組織への浸潤などが促進される。
　（実施例１４：大腸がんシンジェニックモデルマウスを用いたヒト化ＧＰＣ１－ＡＤＣ（ＭＭＡＥ）と抗ＰＤ１抗体の併用による相乗効果の確認）
　（材料および方法）
　８週齢のＣ５７ＢＬ／６雌性マウスにＭＣ３８－ｍＧＰＣ１を皮下移植し、移植後腫瘍サイズが約７５ｍｍ３となったところで４群に分け、ＰＢＳ、実施例４において作製したヒト化抗ＧＰＣ１－ＡＤＣ（ＭＭＡＥ）（１０ｍｇ／ｋｇ）、抗マウスＰＤ１抗体（ｃｌｏｎｅ　ＲＭＰ１－１４）（３ｍｇ／ｋｇ）、ヒト化抗ＧＰＣ１－ＡＤＣ（ＭＭＡＥ）（１０ｍｇ／ｋｇ）＋抗マウスＰＤ１抗体（ｃｌｏｎｅ　ＲＭＰ１－１４）（３ｍｇ／ｋｇ）の投与を開始した。投与を開始した日を０日目として、０日目、３日目、７日目および１０日目にＡＤＣは静脈内投与し、抗マウスＰＤ１抗体は腹腔内投与した。腫瘍体積および体重を０日目以降週２回の頻度で２１日目まで計測した。
　（結果）
　ＭＣ３８－ｍＧＰＣ１をＣ５７ＢＬ／６マウス皮下に移植したシンジェニックモデルに対して、Ｖｅｈｉｃｌｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ、ヒト化抗ＧＰＣ１－ＡＤＣ、抗ＰＤ１抗体、ヒト化抗ＧＰＣ１－ＡＤＣ＋抗ＰＤ１抗体の４群に分け、薬剤を週２回の頻度で合計４回投与し、抗腫瘍効果を評価した。その結果、ヒト化ＧＰＣ１－ＡＤＣと抗ＰＤ１抗体は単剤投与群と比較し、併用投与群において有意な抗腫瘍効果が認められた。一方で、ヒト化ＧＰＣ１－ＡＤＣと抗ＰＤ１抗体の併用投与による体重減少は認められなかった（図１８）。これらの結果、ヒト化ＧＰＣ１－ＡＤＣはチェックポイント阻害剤との併用にすることで相乗的な抗腫瘍効果が得られることが期待される。
　（実施例１５：膵臓がんＰＤＸ（ＰＫ５６５）を用いたヒト化ＧＰＣ１－ＡＤＣ（ＭＭＡＥ）のｉｎ　ｖｉｖｏでの作用機序解析）
　（材料および方法）
　６週齢のＮＯＧ雌性マウスに膵臓がんＰＤＸ（ＰＫ５６５）を皮下移植し、移植後腫瘍サイズが約１００ｍｍ３となったところで、ＰＢＳ、コントロールＡＤＣ（１０ｍｇ／ｋｇ）および、実施例４において作製したヒト化抗ＧＰＣ１－ＡＤＣ（ＭＭＡＥ）（１ｍｇ／ｋｇ）、（３ｍｇ／ｋｇ）、（１０ｍｇ／ｋｇ）を投与した。投与２４時間後に腫瘍を摘出した。摘出した組織は１０％中性ホルマリン緩衝液で固定した後、パラフィン包埋組織を作成し、薄切を調製した。それぞれの薄切について、Ｇ２／Ｍ期での細胞周期が停止したがん細胞を評価するために、ｐｈｏｓｐｈｏ－ｈｉｓｔｏｎｅ　Ｈ３（Ｓｅｒ１０）の発現を免疫組織化学染色法により解析した。
　（結果）
　その結果、ＰＢＳ、および、コントロールＡＤＣ（１０ｍｇ／ｋｇ）投与群と比較して、ヒト化抗ＧＰＣ１－ＡＤＣ（ＭＭＡＥ）投与群では濃度依存的にＧ２／Ｍ期において細胞周期が停止したがん細胞の割合が有意に増加したことが確認された（図１９）。ＡＤＣのペイロードががん細胞に作用してＧ２／Ｍ期にて細胞周期を停止させるとがん細胞の増殖が停止し、がん患者の生存期間延長に貢献し得る。
　（実施例１６：膵臓がん遠隔転移組織における免疫組織化学染色法によるＧＰＣ１発現の解析）
　膵臓がんにおいてはリンパ節転移や肝転移など遠隔転移が予後不良因子として知られている。そこで、ＧＰＣ１が膵臓がんの原発巣だけでなく、遠隔転移巣においても発現していれば治療標的として有用性が高いと考えられる。そこで、膵臓がんのリンパ節転移、肝転移、副腎転移組織に対して、免疫組織化学染色法によりＧＰＣ１の発現を評価した。その結果、膵臓がんのリンパ節転移、肝転移、副腎転移のいずれの組織においてもＧＰＣ１の発現が陽性であることが確認された（図２０）。したがって、本願発明のヒト化ＧＰＣ１－ＡＤＣ（ＭＭＡＥ）は、ＧＰＣ１陽性がんの転移性がんの治療または予防に有効であることが示唆される。
　（実施例１７：膵臓がん肝転移モデルの作製とヒト化ＧＰＣ１－ＡＤＣによる薬効試験）
　実施例１６において示唆される、ヒト化ＧＰＣ１－ＡＤＣ（ＭＭＡＥ）の転移性がんの治療または予防の効果を確認するために、膵臓がん肝転移モデルを作成した。
　（材料および方法）
　図２１に示した手順で、ＢｘＰＣ３－Ｌｕｃ細胞をＳＣＩＤマウスの脾臓内に投与し、投与１～２週間後に脾臓を摘出することで膵臓がん肝転移モデルを作製した。ＩＶＩＳを用いてルシフェラーゼ活性を測定することで肝臓内に転移したＢｘＰＣ３－Ｌｕｃ細胞の増殖をモニターした。肝転移モデルマウスをＰＢＳ投与群と、実施例４において作製したヒト化抗ＧＰＣ１－ＡＤＣ（ＭＭＡＥ）（１０ｍｇ／ｋｇ）投与群の２群に分け、実施例１６と同様の手順で薬効試験を行った。
　（結果）
　その結果、図２２の左に示すようにＩＶＩＳにより計測した発酵の値はＰＢＳ投与群と比較し、ヒト化抗ＧＰＣ１－ＡＤＣ（ＭＭＡＥ）（１０ｍｇ／ｋｇ）投与群では有意に阻害されていた。また、生存解析を行った結果、ヒト化抗ＧＰＣ１－ＡＤＣ（ＭＭＡＥ）（１０ｍｇ／ｋｇ）は膵臓がん肝転移モデルの生存期間を有意に延長することが確認された。
　（実施例１８：転移性がんにおけるヒト化ＧＰＣ１－ＡＤＣによる薬効試験）
　肝臓、肺、脳、骨、腹膜、副腎などに転移する転移モデルを作成し、転移モデルにおけるヒト化ＧＰＣ１－ＡＤＣによる薬効を確認する。ヒト化ＧＰＣ１－ＡＤＣは原発と転移巣の両方に対して薬効を発揮し、生存期間の延長効果が期待される。
　（実施例１９：製剤例）
　本願発明のヒト化抗ＧＰＣ１－ＡＤＣ（ＭＭＡＥ）は、以下の静脈内注射用製剤として提供され得る。
　ヒト化抗ＧＰＣ１－ＡＤＣ　　　１００ｍｇ
　ポリソルベート８０　　　　　　５ｍｇ
　塩化ナトリウム　　　　　　　　１００ｍｇ
　クエン酸ナトリウム水和物　　　８０ｍｇ
　ｐＨ調整剤　　　　　　　　　　適量
　全量　　　　　　　　　　　　　１０ｍＬ
　以上のように、本開示の好ましい実施形態を用いて本開示を例示してきたが、本開示は、請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。本願は、２０２０年６月１１日に出願された日本国特許出願第２０２０－１０１８５６号の優先権の利益を請求し、その内容は参照によって本明細書に組み込まれる。
　がんの治療または予防のための医薬が提供された。このような技術に基づく産業（製薬等）において利用可能な技術が提供される。
配列番号１：ヒトＧｌｙｐｉｃａｎ－１の核酸配列
配列番号２：ヒトＧｌｙｐｉｃａｎ－１のアミノ酸配列
配列番号３：マウスＧｌｙｐｉｃａｎ－１の核酸配列
配列番号４：マウスＧｌｙｐｉｃａｎ－１のアミノ酸配列
配列番号５：０１ａ０３３重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号６：０１ａ０３３軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号７：ヒト化重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号８：クローンＴ２のヒト化軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号９：クローンＴ７のヒト化軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１０：クローンＴ８のヒト化軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１１：クローンＴ１のヒト化軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１２：クローンＴ３６のヒト化軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１３：クローンＴ５７のヒト化軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１４：クローンＴ１０のヒト化軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１５：クローンＴ３４のヒト化軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１６：クローンＴ５６のヒト化軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１７：クローンＴ３のヒト化軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１８：クローンＴ１１のヒト化軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１９：クローンＴ２８のヒト化軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号２０：クローンＴ４３のヒト化軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号２１：クローンＴ５９のヒト化軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号２２：クローンＴ３１のヒト化軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号２３：クローンＴ２２のヒト化軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号２４：クローンＴ２６のヒト化軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号２５：クローンＴ３２のヒト化軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号２６：クローンＴ３３のヒト化軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号２７：クローンＴ２９のヒト化軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号２８：ヒト化重鎖の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸
配列番号２９：ヒト化重鎖の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸
配列番号３０：ヒト化重鎖の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸
配列番号３１：クローンＴ２の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号３２：クローンＴ２の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号３３：クローンＴ２の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号３４：クローンＴ７の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号３５：クローンＴ７の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号３６：クローンＴ７の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号３７：クローンＴ８の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号３８：クローンＴ８の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号３９：クローンＴ８の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号４０：クローンＴ１の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号４１：クローンＴ１の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号４２：クローンＴ１の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号４３：クローンＴ３６の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号４４：クローンＴ３６の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号４５：クローンＴ３６の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号４６：クローンＴ５７の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号４７：クローンＴ５７の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号４８：クローンＴ５７の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号４９：クローンＴ１０の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号５０：クローンＴ１０の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号５１：クローンＴ１０の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号５２：クローンＴ３４の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号５３：クローンＴ３４の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号５４：クローンＴ３４の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号５５：クローンＴ５６の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号５６：クローンＴ５６の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号５７：クローンＴ５６の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号５８：クローンＴ３の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号５９：クローンＴ３の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号６０：クローンＴ３の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号６１：クローンＴ１１の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号６２：クローンＴ１１の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号６３：クローンＴ１１の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号６４：クローンＴ２８の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号６５：クローンＴ２８の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号６６：クローンＴ２８の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号６７：クローンＴ４３の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号６８：クローンＴ４３の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号６９：クローンＴ４３の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号７０：クローンＴ５９の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号７１：クローンＴ５９の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号７２：クローンＴ５９の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号７３：クローンＴ３１の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号７４：クローンＴ３１の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号７５：クローンＴ３１の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号７６：クローンＴ２２の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号７７：クローンＴ２２の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号７８：クローンＴ２２の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号７９：クローンＴ２６の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号８０：クローンＴ２６の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号８１：クローンＴ２６の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号８２：クローンＴ３２の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号８３：クローンＴ３２の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号８４：クローンＴ３２の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号８５：クローンＴ３３の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号８６：クローンＴ３３の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号８７：クローンＴ３３の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号８８：クローンＴ２９の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号８９：クローンＴ２９の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号９０：クローンＴ２９の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号９１：キメラ抗体およびヒト化抗体の重鎖定常領域のアミノ酸配列
配列番号９２：キメラ抗体およびヒト化抗体の軽鎖定常領域のアミノ酸配列

Claims (29)

  1. 　配列番号５に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と配列番号６に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含む抗体に基づきヒト化されたヒト化抗ＧＰＣ－１抗体またはその抗原結合フラグメントであって、配列番号５に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と配列番号６に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含む抗体と比べて、ＧＰＣ－１に対して高い親和性を有する、ヒト化抗体またはその抗原結合フラグメント。
  2. 　前記ヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントが、
    　（ａ）それぞれ配列番号２８～３０に記載のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１～３を含む、または
    　（ｂ）（ａ）における重鎖ＣＤＲ１～３において３個以下のアミノ酸置換、欠失および／または付加を有する、
    請求項１に記載の組成物。
  3. 　前記ヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントが、
    　（ａ）それぞれ配列番号３１～３３に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１～ＣＤＲ３を含む、または
    　（ｂ）それぞれ配列番号３４～３６に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１～ＣＤＲ３を含む、または
    　（ｃ）それぞれ配列番号３７～３９に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１～ＣＤＲ３を含む、または
    　（ｄ）それぞれ配列番号４０～４２に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１～ＣＤＲ３を含む、または
    　（ｅ）それぞれ配列番号４３～４５に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１～ＣＤＲ３を含む、または
    　（ｆ）それぞれ配列番号４６～４８に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１～ＣＤＲ３を含む、または
    　（ｇ）それぞれ配列番号４９～５１に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１～ＣＤＲ３を含む、または
    　（ｈ）それぞれ配列番号５２～５４に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１～ＣＤＲ３を含む、または
    　（ｉ）それぞれ配列番号５５～５７に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１～ＣＤＲ３を含む、または
    　（ｊ）それぞれ配列番号５８～６０に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１～ＣＤＲ３を含む、または
    　（ｋ）それぞれ配列番号６１～６３に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１～ＣＤＲ３を含む、または
    　（ｌ）それぞれ配列番号６４～６６に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１～ＣＤＲ３を含む、または
    　（ｍ）それぞれ配列番号６７～６９に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１～ＣＤＲ３を含む、または
    　（ｎ）それぞれ配列番号７０～７２に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１～ＣＤＲ３を含む、または
    　（ｏ）それぞれ配列番号７３～７５に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１～ＣＤＲ３を含む、または
    　（ｐ）それぞれ配列番号７６～７８に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１～ＣＤＲ３を含む、または
    　（ｑ）それぞれ配列番号７９～８１に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１～ＣＤＲ３を含む、または
    　（ｒ）それぞれ配列番号８２～８４に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１～ＣＤＲ３を含む、または
    　（ｓ）それぞれ配列番号８５～８７に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１～ＣＤＲ３を含む、または
    　（ｔ）それぞれ配列番号８８～９０に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１～ＣＤＲ３を含む、または
    　（ｕ）（ａ）～（ｔ）のいずれかにおける軽鎖ＣＤＲ１～３において３個以下のアミノ酸置換、欠失および／または付加を有する、
    請求項１または２に記載のヒト化抗体またはその抗原結合フラグメント。
  4. 　配列番号７に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のヒト化抗体またはその抗原結合フラグメント。
  5. 　配列番号８～２７に記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のヒト化抗体またはその抗原結合フラグメント。
  6. 　配列番号８～２７に記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のヒト化抗体またはその抗原結合フラグメント。
  7. 　配列番号８～１７に記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のヒト化抗体またはその抗原結合フラグメント。
  8. 　配列番号８～１７に記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載のヒト化抗体またはその抗原結合フラグメント。
  9. 　前記抗体のエピトープが、配列番号２の３３９～３５８位および／もしくは３８８～４２１位を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載のヒト化抗体またはその抗原結合フラグメント。
  10. 　前記抗体が、表面プラズモン共鳴法による解析に基づき１．０２Ｅ－８以下のＫＤでＧｌｙｐｉｃａｎ－１に結合する、請求項１～９のいずれか一項に記載のヒト化抗体またはその抗原結合フラグメント。
  11. 　請求項１～１０のいずれか一項に記載のヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、有効成分を細胞内移行させるための医薬組成物。
  12. 　請求項１～１１のいずれか一項に記載のヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントと細胞傷害性活性を有する薬剤との複合体。
  13. 　前記ヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントが、前記細胞傷害性活性を有する薬剤とリンカーを介して作動可能に連結されている、請求項１２に記載の複合体。
  14. 　前記細胞傷害性活性を有する薬剤が、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、ＤＭ１、ＤＭ４、カリケアマイシン、デュオカルマイシン、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、およびトポイソメラーゼ阻害剤からなる群から選択される、請求項１２または１３に記載の複合体。
  15. 　前記細胞傷害性活性を有する薬剤が、細胞膜透過性である、請求項１３または１４に記載の複合体。
  16. 　前記細胞傷害性活性を有する薬剤が、ＭＭＡＥ、ＰＢＤ、Ｅｒｉｂｕｌｉｎ、ＳＮ－３８、Ｄｘｄ、およびＤＭ４から選択される、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の複合体。
  17. 　前記リンカーが、酵素切断型リンカー、酸不安定性リンカー、およびジスルフィドリンカーからなる群から選択される、請求項１３～１６のいずれか一項に記載の複合体。
  18. 　前記リンカーが、カテプシンＢにより切断される切断型リンカーである、請求項１３～１７のいずれか一項に記載の複合体。
  19. 　前記複合体が、Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１陽性細胞において、約０．１ｎＭ以下のＩＣ５０を示す、請求項１２～１８のいずれか一項に記載の複合体。
  20. 　請求項１２～１９のいずれか一項に記載の複合体を含む、Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１陽性がんを予防または治療するための組成物。
  21. 　前記Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１陽性がんは、食道がん、膵臓がん、胆管がん、子宮頸がん、肺がん、頭頸部がん、乳がん、子宮平滑筋肉腫、前立腺がん、口腔扁平上皮がんまたはこれらの任意の組合せから選択される、請求項２０に記載の組成物。
  22. 　前記Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１陽性がんは、食道がんまたは膵臓がんである、請求項２０または２１に記載の組成物。
  23. 　前記がんは、がん関連線維芽細胞（ＣＡＦ）を有する、請求項２０～２２のいずれか一項に記載の組成物。
  24. 　前記組成物が、免疫チェックポイント阻害剤と一緒に投与されることを特徴とする、請求項２０～２３のいずれか一項に記載の組成物。
  25. 　前記免疫チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ－１抗体である、請求項２４に記載の組成物。
  26. 　請求項１２～１９のいずれか一項に記載の複合体を含む、Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１陽性がんの転移性がんを予防または治療するための組成物。
  27. 　前記Ｇｌｙｐｉｃａｎ－１陽性がんは、食道がん、膵臓がん、胆管がん、子宮頸がん、肺がん、頭頸部がん、乳がん、子宮平滑筋肉腫、前立腺がん、口腔扁平上皮がん、またはこれらの任意の組合せから選択される、請求項２６に記載の組成物。
  28. 　前記転移性がんが、膵臓がんの転移性がんである、請求項２６または２７に記載の組成物。
  29. 　前記転移性がんが、肝臓、食道、胆管、子宮頸、肺、頭頸部、乳房、子宮平滑筋、前立腺、口腔扁平上皮、脳、骨、腹膜、または副腎に転移した転移性がんである、請求項２６～２８のいずれか一項に記載の組成物。
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