TW202144395A - 用於癌症之治療的抗cd137抗原結合分子 - Google Patents

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三上紘史
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Abstract

［課題］本揭示的目的在於提供具有免疫細胞的活化作用、細胞毒性、或抗腫瘤活性、同時對正常組織等的非腫瘤組織的作用低、副作用少之抗癌劑、該抗癌劑和其他抗癌劑的合併療法、以及用於該合併療法的醫藥組合物。 ［解決手段］經由使用依賴標靶組織中的各種物質（例如小分子化合物）而改變對於CD137的結合活性的本揭示之CD137抗原結合分子作為有效成分，提供具有免疫細胞的活化作用、細胞毒性、或抗腫瘤活性、同時對正常組織等的非腫瘤組織的作用低、副作用少之期待應用於各種癌症種類的抗癌劑、該抗癌劑和其他抗癌劑的合併療法、以及用於該合併療法的醫藥組合物。

Description

用於癌症之治療的抗CD137抗原結合分子
本揭示關於包含抗CD137抗原結合分子的抗癌劑以及和其他抗癌劑的合併療法。
癌症，除了部分外，是難根治的致死疾病之一。使用主要治療方法的化療劑之治療成效也不能說絕對地高。有文獻指出癌症治療困難的要因不只是癌細胞本身的異質性，腫瘤的微環境也扮演大的作用之事（非專利文獻1）。近年顯示，藉由抑制可抑制免疫反應的CTLA-4的功能而促進T細胞的活化之抗CTLA-4抗體，可能治癒不能切除的惡性黑色素腫瘤等（非專利文獻2）。在2011年，抗人類CTLA-4單株抗體（Ipilimumab）經美國食品藥物管理局（FDA）被承認是世界第一個免疫活化抗體藥物。而且，對於CTLA-4以外的免疫檢查點分子之PD-1或PD-L1的阻斷抗體的治療效果也被報導（非專利文獻3），經FDA承認。 在腫瘤免疫中具有重要作用的T細胞的活化，被瞭解是經由1）T細胞受體（TCR）對經由1分子的主要組織相容性複合體（MHC）class I所呈現的抗原胜肽的結合及活化；2）T細胞表面上的共同刺激分子對抗原表現細胞上的配體的結合及活化；的兩個信號而進行。而且也提出，以T細胞表面上的CD137（4-1BB）為首的腫瘤壞死因子受體超級家族（TNFRSF）所屬的副刺激分子的活化，在T細胞活性化中是重要的（非專利文獻4）。
TNFRSF包含CD137、CD40、OX40、RANK、GITR等的分子。有報導指出CD137不只在T細胞表面，在樹突細胞（DC）、B細胞、NK細胞、巨噬細胞、嗜中性球等的其他免疫細胞表面也被表現（非專利文獻5）。 CD137激動抗體顯示抗腫瘤效果一事已在小鼠模式中被證實，在小鼠模式中實驗顯示其主要依賴CD8陽性T細胞和NK細胞的活化（非專利文獻6）。但是，在臨床及非臨床中，因CD137激動抗體的非特異性肝毒性所導致的副作用成為問題，藥物的開發沒有如預期地進展（非專利文獻7、非專利文獻8）。此副作用的主要原因推測是因為，和透過抗體恆定區域和Fcγ受體的結合有關聯的肝臟等的腫瘤以外的非免疫組織的免疫細胞的活化（非專利文獻9）。另一方面，有報導屬於TNF受體超級家族的受體的激動抗體，為了在活體內呈現促效劑活性，經由Fcγ受體表現細胞（FcγRII表現細胞）的抗體交聯是必要的（非專利文獻10）。亦即，CD137激動抗體的抗腫瘤效果的藥效和肝毒性等的副作用都和抗體對FcγR受體的結合相關，因此能夠認為如果使抗體和Fcγ受體的結合增加，可期待藥效的提高，但是肝毒性的副作用也增加，如果使抗體和Fcγ受體的結合下降，雖然副作用減少但藥效也降低，至今沒有分離藥效和副作用的CD137激動抗體被報導。再者，臨床上對於CD137激動抗體的抗腫瘤效果本身也不是絕對地強，期望迴避毒性同時更增大藥效。因此，期望開發可以抑制如此的副作用且誘導抗腫瘤免疫反應的新穎藥劑。
在活體內投予治療用抗體的情形，期望成為其標靶的抗原只在病變部位特異性表現，但是多數情形也會在非病變部位的正常組織表現相同抗原，從治療觀點來看，這成為不期望的副作用的原因。例如，對腫瘤抗原的抗體經ADCC等可顯示對腫瘤細胞的傷害活性，另一方面，在正常組織也表現相同抗原的情形，也有可能傷害正常細胞。為了解決如上的問題，著眼於在成為標靶的組織（例如腫瘤組織）多量地存在特定的化合物的現象，開發搜尋根據如此化合物的濃度而對抗原的結合活性改變的抗原結合分子之技術（例如，專利文獻1）。
近年來，以CTLA-4、PD-1、PD-L1等的免疫檢查點（immune checkpoint）分子為標靶的抑制劑作為代表的免疫治療藥的藥效，在臨床上已被證明。然而，這些藥劑並非對所有患者都有效，希望進一步的藥效增強。關於免疫療法彼此的合併使用，已確認在黑色素瘤中，納武利尤（Nivlolumab）、易普利姆瑪（Ipilimumab）的合併使用，相較於易普利姆瑪（Ipilimumab）單劑，藥效增強（非專利文獻11）。 ［先前技術文獻］ ［專利文獻］
專利文獻1：國際專利公開案號WO2013/180200號公報 ［非專利文獻］
非專利文獻1：Hanahan, Cell, 2011, 144, 646-74 非專利文獻2：Prieto, Clin Cancer Res. 2012, 18, 2039-47 非專利文獻3：Hamid, Expert Opin. Biol. Ther., 2013, 6, 847-61 非專利文獻4：Summers, Nat Rev Immunol, 2012, 12, 339-51 非專利文獻5：Vinay, Cellular & Molecular Immunology, 2011, 8, 281-284 非專利文獻6：Houot, Blood, 2009, 114, 3431-8 非專利文獻7：Ascierto, Semin Oncol, 2010, 37, 508-16 非專利文獻8：Dubrot, Cancer Immunol Immunother, 2010, 59, 1223-33 非專利文獻9：Schabowsky, Vaccine, 2009, 28, 512-22 非專利文獻10：Li, Proc Natl Acad Sci U S A. 2013, 110（48）, 19501-6 非專利文獻11：N Eng J Med （2015） vol.373, p.23-34
［發明所欲解決之問題］
本揭示關於包含抗CD137抗原結合分子的抗癌劑以及和其他抗癌劑的合併療法。 ［解決問題之技術手段］
本揭示由於提供具有免疫細胞的活化作用、細胞毒性、或抗腫瘤活性，同時對正常組織等的非腫瘤組織的作用低、副作用少的抗CD137抗原結合分子及使用該等之方法，因此提供包含具有依賴標靶組織（例如腫瘤組織）中的各種物質（例如小分子化合物）而使改變對於CD137的結合活性的特徵之抗CD137抗原結合分子為有效成分的抗癌劑。又本揭示提供使用包含上述抗CD137抗原結合分子的抗癌劑和其他藥劑的合併療法。 亦即，本揭示具體提供以下舉例記載之包含抗CD137抗原結合分子的抗癌劑、其使用方法、使用該抗癌劑和其他抗癌劑的合併療法、套組（kit）等。 ［1］一種抗癌劑，包含抗CD137抗原結合分子為有效成分，該抗CD137抗原結合分子包括選自下列（a）至（m）之任一的HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2、及HVR-L3之組合： （a）包含序列識別號：7之胺基酸序列的HVR-H1，包含序列識別號：8之胺基酸序列的HVR-H2，包含序列識別號：17之胺基酸序列的HVR-H3，包含序列識別號：21之胺基酸序列的HVR-L1，包含序列識別號：26之胺基酸序列的HVR-L2，及包含序列識別號：27之胺基酸序列的HVR-L3； （b）包含序列識別號：7之胺基酸序列的HVR-H1，包含序列識別號：9之胺基酸序列的HVR-H2，包含序列識別號：17之胺基酸序列的HVR-H3，包含序列識別號：22之胺基酸序列的HVR-L1，包含序列識別號：26之胺基酸序列的HVR-L2，及包含序列識別號：27之胺基酸序列的HVR-L3； （c）包含序列識別號：7之胺基酸序列的HVR-H1，包含序列識別號：10之胺基酸序列的HVR-H2，包含序列識別號：17之胺基酸序列的HVR-H3，包含序列識別號：22之胺基酸序列的HVR-L1，包含序列識別號：26之胺基酸序列的HVR-L2，及包含序列識別號：27之胺基酸序列的HVR-L3； （d）包含序列識別號：7之胺基酸序列的HVR-H1，包含序列識別號：11之胺基酸序列的HVR-H2，包含序列識別號：18之胺基酸序列的HVR-H3，包含序列識別號：21之胺基酸序列的HVR-L1，包含序列識別號：26之胺基酸序列的HVR-L2，及包含序列識別號：27之胺基酸序列的HVR-L3； （e）包含序列識別號：7之胺基酸序列的HVR-H1，包含序列識別號：8之胺基酸序列的HVR-H2，包含序列識別號：18之胺基酸序列的HVR-H3，包含序列識別號：21之胺基酸序列的HVR-L1，包含序列識別號：26之胺基酸序列的HVR-L2，及包含序列識別號：27之胺基酸序列的HVR-L3； （f）包含序列識別號：7之胺基酸序列的HVR-H1，包含序列識別號：12之胺基酸序列的HVR-H2，包含序列識別號：18之胺基酸序列的HVR-H3，包含序列識別號：21之胺基酸序列的HVR-L1，包含序列識別號：26之胺基酸序列的HVR-L2，及包含序列識別號：28之胺基酸序列的HVR-L3； （g）包含序列識別號：7之胺基酸序列的HVR-H1，包含序列識別號：13之胺基酸序列的HVR-H2，包含序列識別號：18之胺基酸序列的HVR-H3，包含序列識別號：21之胺基酸序列的HVR-L1，包含序列識別號：26之胺基酸序列的HVR-L2，及包含序列識別號：29之胺基酸序列的HVR-L3； （h）包含序列識別號：7之胺基酸序列的HVR-H1，包含序列識別號：14之胺基酸序列的HVR-H2，包含序列識別號：19之胺基酸序列的HVR-H3，包含序列識別號：23之胺基酸序列的HVR-L1，包含序列識別號：26之胺基酸序列的HVR-L2，及包含序列識別號：27之胺基酸序列的HVR-L3； （i）包含序列識別號：7之胺基酸序列的HVR-H1，包含序列識別號：15之胺基酸序列的HVR-H2，包含序列識別號：20之胺基酸序列的HVR-H3，包含序列識別號：24之胺基酸序列的HVR-L1，包含序列識別號：26之胺基酸序列的HVR-L2，及包含序列識別號：27之胺基酸序列的HVR-L3； （j）包含序列識別號：7之胺基酸序列的HVR-H1，包含序列識別號：15之胺基酸序列的HVR-H2，包含序列識別號：20之胺基酸序列的HVR-H3，包含序列識別號：25之胺基酸序列的HVR-L1，包含序列識別號：26之胺基酸序列的HVR-L2，及包含序列識別號：27之胺基酸序列的HVR-L3； （k）包含序列識別號：7之胺基酸序列的HVR-H1，包含序列識別號：16之胺基酸序列的HVR-H2，包含序列識別號：20之胺基酸序列的HVR-H3，包含序列識別號：25之胺基酸序列的HVR-L1，包含序列識別號：26之胺基酸序列的HVR-L2，及包含序列識別號：27之胺基酸序列的HVR-L3； （l）包含序列識別號：7之胺基酸序列的HVR-H1，包含序列識別號：14之胺基酸序列的HVR-H2，包含序列識別號：19之胺基酸序列的HVR-H3，包含序列識別號：24之胺基酸序列的HVR-L1，包含序列識別號：26之胺基酸序列的HVR-L2，及包含序列識別號：27之胺基酸序列的HVR-L3；以及 （m）包含序列識別號：7之胺基酸序列的HVR-H1，包含序列識別號：14之胺基酸序列的HVR-H2，包含序列識別號：17之胺基酸序列的HVR-H3，包含序列識別號：21之胺基酸序列的HVR-L1，包含序列識別號：26之胺基酸序列的HVR-L2，及包含序列識別號：27之胺基酸序列的HVR-L3。 ［1.1］一種抗癌劑，包含抗CD137抗原結合分子為有效成分，該抗CD137抗原結合分子包括： （a）和序列識別號：43至53之任一個胺基酸序列具有至少95%的序列相同性的VH；或 （b）和序列識別號：54至60之任一個胺基酸序列具有至少95%的序列相同性的VL。 ［1.2］一種抗癌劑，包含抗CD137抗原結合分子，該抗CD137抗原結合分子包括選自以下（a）至（m）任一之VH及VL的組合： （a）和序列識別號：43之胺基酸序列具有至少95%的序列相同性的VH，及和序列識別號：54之胺基酸序列具有至少95%的序列相同性的VL； （b）和序列識別號：44之胺基酸序列具有至少95%的序列相同性的VH，及和序列識別號：55之胺基酸序列具有至少95%的序列相同性的VL； （c）和序列識別號：45之胺基酸序列具有至少95%的序列相同性的VH，及和序列識別號：55之胺基酸序列具有至少95%的序列相同性的VL； （d）和序列識別號：46之胺基酸序列具有至少95%的序列相同性的VH，及和序列識別號：54之胺基酸序列具有至少95%的序列相同性的VL； （e）和序列識別號：47之胺基酸序列具有至少95%的序列相同性的VH，及和序列識別號：54之胺基酸序列具有至少95%的序列相同性的VL； （f）和序列識別號：48之胺基酸序列具有至少95%的序列相同性的VH，及和序列識別號：56之胺基酸序列具有至少95%的序列相同性的VL； （g）和序列識別號：49之胺基酸序列具有至少95%的序列相同性的VH，及和序列識別號：57之胺基酸序列具有至少95%的序列相同性的VL； （h）和序列識別號：50之胺基酸序列具有至少95%的序列相同性的VH，及和序列識別號：58之胺基酸序列具有至少95%的序列相同性的VL； （i）和序列識別號：51之胺基酸序列具有至少95%的序列相同性的VH，及和序列識別號：59之胺基酸序列具有至少95%的序列相同性的VL； （j）和序列識別號：51之胺基酸序列具有至少95%的序列相同性的VH，及和序列識別號：60之胺基酸序列具有至少95%的序列相同性的VL； （k）和序列識別號：52之胺基酸序列具有至少95%的序列相同性的VH，及和序列識別號：60之胺基酸序列具有至少95%的序列相同性的VL； （l）和序列識別號：50之胺基酸序列具有至少95%的序列相同性的VH，及和序列識別號：59之胺基酸序列具有至少95%的序列相同性的VL；以及 （m）和序列識別號：53之胺基酸序列具有至少95%的序列相同性的VH，及和序列識別號：54之胺基酸序列具有至少95%的序列相同性的VL。 ［2］一種抗癌劑，包含抗CD137抗原結合分子，該抗CD137抗原結合分子包括選自以下（a）至（m）任一VH及VL的組合： （a）包含序列識別號：43之胺基酸序列的VH，及包含序列識別號：54之胺基酸序列的VL； （b）包含序列識別號：44之胺基酸序列的VH，及包含序列識別號：55之胺基酸序列的VL； （c）包含序列識別號：45之胺基酸序列的VH，及包含序列識別號：55之胺基酸序列的VL； （d）包含序列識別號：46之胺基酸序列的VH，及包含序列識別號：54之胺基酸序列的VL； （e）包含序列識別號：47之胺基酸序列的VH，及包含序列識別號：54之胺基酸序列的VL； （f）包含序列識別號：48之胺基酸序列的VH，及包含序列識別號：56之胺基酸序列的VL； （g）包含序列識別號：49之胺基酸序列的VH，及包含序列識別號：57之胺基酸序列的VL； （h）包含序列識別號：50之胺基酸序列的VH，及包含序列識別號：58之胺基酸序列的VL； （i）包含序列識別號：51之胺基酸序列的VH，及包含序列識別號：59之胺基酸序列的VL； （j）包含序列識別號：51之胺基酸序列的VH，及包含序列識別號：60之胺基酸序列的VL； （k）包含序列識別號：52之胺基酸序列的VH，及包含序列識別號：60之胺基酸序列的VL； （l）包含序列識別號：50之胺基酸序列的VH，及包含序列識別號：59之胺基酸序列的VL；以及 （m）包含序列識別號：53之胺基酸序列的VH，及包含序列識別號：54之胺基酸序列的VL。 ［2.1］如［1］至［2］任一項之抗癌劑，其中，該抗CD137抗原結合分子具有小分子化合物依賴的CD137結合活性。 ［2.2］一種抗癌劑，包含具有在10μM以上、50μM以上、100μM以上、150μM以上、200μM以上、或250μM以上的小分子化合物的存在下，對CD137的結合，和上述［1］至［2.1］任一項之抗原結合分子競爭的具有該小分子化合物依賴的CD137結合活性之抗CD137抗原結合分子。 ［2.3］一種抗癌劑，包含具有小分子化合物依賴的CD137結合活性之抗CD137抗原結合分子， 其中，該抗CD137抗原結合分子，在10μM以上、50μM以上、100μM以上、150μM以上、200μM以上、或250μM以上的該小分子化合物的存在下，結合於和上述［1］至［2.1］任一項之抗原結合分子所結合的相同的CD137的抗原決定位。 ［2.4］如［2.1］至［2.3］任一項之抗癌劑，其中，該小分子化合物為含腺苷化合物。 ［2.5］如［2.1］至［2.4］任一項之抗癌劑，其中，該小分子化合物為ATP。 ［2.6］如［1］至［3.4］任一項之抗癌劑，其中，該抗CD137抗原結合分子為單株抗體或其抗原結合片段。 ［3］如［1］至［2.6］任一項之抗癌劑，其中，該抗CD137抗原結合分子為人類抗體、人源化抗體、或嵌合抗體、或其任一者的抗原結合片段。 ［3.1］如［1］至［3］任一項之抗癌劑，其中，該抗CD137抗原結合分子為全長IgG1抗體。 ［3.2］如［1］至［3.1］任一項之抗癌劑，其中，該抗CD137抗原結合分子包含至少一個胺基酸經改變的改變Fc區域，該改變Fc區域和不包含該胺基酸改變的親代Fc區域相比，對FcγRIIb的結合活性增加。 ［3.3］如［3.2］之抗癌劑，其中，該至少一個胺基酸改變為選自基於EU編號G236N、H268D及A330K所組成的群組之至少一個胺基酸取代。 ［3.4］如［3.2］或［3.3］之抗癌劑，其中，該至少一個胺基酸改變為基於EU編號G236N/H268D/A330K之胺基酸取代的組合。 ［3.5］如［1］至［3.4］任一項所述之抗癌劑，其中，該抗CD137抗原結合分子包含至少一個胺基酸經改變的改變Fc區域，和含有不含該胺基酸改變的親代Fc區域的親代抗CD137抗原結合分子相比，等電點（pI）增加。 ［3.6］如［3.5］之抗癌劑，其中，該至少一個胺基酸改變為選自基於EU編號Q311R、P343R、及D413K所組成的群組之至少一個胺基酸取代。 ［3.7］如［3.5］或［3.6］之抗癌劑，其中，該至少一個胺基酸改變為基於EU編號（i）P343R的胺基酸取代、（ii）Q311R/P343R的胺基酸取代、或（iii）Q311R/D413K的胺基酸取代之組合。 ［4］如［1］至［3.7］任一項之抗癌劑，其中，該抗CD137抗原結合分子包含改變Fc區域，該改變Fc區域包含選自以下基於EU編號任一個胺基酸改變之組合： L235W/G236N/H268D/Q295L/K326T/A330K/P343R/D413K； K214R/L235W/G236N/H268D/Q295L/K326T/A330K/P343R/D413K； L234Y/P238D/T250V/V264I/T307P/A330K/P343R/D413K； L234Y/P238D/V264I/A330K/P343R/D413K； L234Y/G237D/P238D/T250V/T307P/A330K/P343R/D413K； L234Y/G237D/P238D/A330K/P343R/D413K； L235W/G236N/H268D/Q295L/K326T/A330K/Q311R/P343R； L234Y/P238D/T250V/V264I/T307P/A330K/Q311R/P343R； L234Y/P238D/V264I/A330K/Q311R/P343R； L234Y/G237D/P238D/T250V/T307P/A330K/Q311R/P343R； L234Y/G237D/P238D/A330K/Q311R/P343R； L235W/G236N/H268D/Q295L/K326T/A330K/P343R； K214R/L235W/G236N/H268D/Q295L/K326T/A330K/P343R； L235W/G236N/H268D/Q295L/K326T/A330K/D413K； K214R/G236N/H268D/A330K/P343R； K214R/L235W/G236N/H268D/A330K/P343R； K214R/G236N/H268D/A330K/D413K； K214R/G236N/H268D/A330K/P343R/D413K； K214R/L235W/G236N/H268D/A330K/P343R/D413K； K214R/G236N/H268D/A330K/Q311R； K214R/L235W/G236N/H268D/A330K/Q311R； K214R/G236N/H268D/A330K/Q311R/P343R； K214R/L235W/G236N/H268D/A330K/Q311R/P343R； K214R/G236N/H268D/A330K/Q311R/D413K； K214R/L235W/G236N/H268D/A330K/Q311R/D413K；以及 K214R/L235W/G236N/H268D/Q295L/K326T/A330K/Q311R。 ［4.1］如［3.2］至［4］任一項之抗癌劑，其中，該改變Fc區域來自人類IgG1 Fc區域。 ［4.2］如［3.2］至［4.1］任一項之抗癌劑，其中，該改變Fc區域更包含EU編號第446和447位的缺失。 ［4.3］如［1］至［4.2］任一項之抗癌劑，其中，該抗CD137抗原結合分子包括含有序列識別號：64至85之任一個胺基酸序列之重鏈恆定區。 ［5］一種抗癌劑，包含抗CD137抗原結合分子，該抗CD137抗原結合分子包括選自下列（i）至（xxxviii）之任一個VH、VL、CH、及CL之組合： （i）包含序列識別號：43之胺基酸序列的VH、包含序列識別號：64之胺基酸序列的CH、包含序列識別號：54之胺基酸序列的VL、及包含序列識別號：63之胺基酸序列的CL； （ii）包含序列識別號：43之胺基酸序列的VH、包含序列識別號：66之胺基酸序列的CH、包含序列識別號：54之胺基酸序列的VL、及包含序列識別號：63之胺基酸序列的CL； （iii）包含序列識別號：43之胺基酸序列的VH、包含序列識別號：67之胺基酸序列的CH、包含序列識別號：54之胺基酸序列的VL、及包含序列識別號：63之胺基酸序列的CL； （iv）包含序列識別號：43之胺基酸序列的VH、包含序列識別號：68之胺基酸序列的CH、包含序列識別號：54之胺基酸序列的VL、及包含序列識別號：63之胺基酸序列的CL； （v）包含序列識別號：43之胺基酸序列的VH、包含序列識別號：69之胺基酸序列的CH、包含序列識別號：54之胺基酸序列的VL、及包含序列識別號：63之胺基酸序列的CL； （vi）包含序列識別號：43之胺基酸序列的VH、包含序列識別號：70之胺基酸序列的CH、包含序列識別號：54之胺基酸序列的VL、及包含序列識別號：63之胺基酸序列的CL； （vii）包含序列識別號：43之胺基酸序列的VH、包含序列識別號：71之胺基酸序列的CH、包含序列識別號：54之胺基酸序列的VL、及包含序列識別號：63之胺基酸序列的CL； （viii）包含序列識別號：43之胺基酸序列的VH、包含序列識別號：73之胺基酸序列的CH、包含序列識別號：54之胺基酸序列的VL、及包含序列識別號：63之胺基酸序列的CL； （ix）包含序列識別號：43之胺基酸序列的VH、包含序列識別號：75之胺基酸序列的CH、包含序列識別號：54之胺基酸序列的VL、及包含序列識別號：63之胺基酸序列的CL； （x）包含序列識別號：43之胺基酸序列的VH、包含序列識別號：78之胺基酸序列的CH、包含序列識別號：54之胺基酸序列的VL、及包含序列識別號：63之胺基酸序列的CL； （xi）包含序列識別號：43之胺基酸序列的VH、包含序列識別號：80之胺基酸序列的CH、包含序列識別號：54之胺基酸序列的VL、及包含序列識別號：63之胺基酸序列的CL； （xii）包含序列識別號：43之胺基酸序列的VH、包含序列識別號：82之胺基酸序列的CH、包含序列識別號：54之胺基酸序列的VL、及包含序列識別號：63之胺基酸序列的CL； （xiii）包含序列識別號：43之胺基酸序列的VH、包含序列識別號：84之胺基酸序列的CH、包含序列識別號：54之胺基酸序列的VL、及包含序列識別號：63之胺基酸序列的CL； （xiv）包含序列識別號：43之胺基酸序列的VH、包含序列識別號：85之胺基酸序列的CH、包含序列識別號：54之胺基酸序列的VL、及包含序列識別號：63之胺基酸序列的CL； （xv）包含序列識別號：51之胺基酸序列的VH、包含序列識別號：65之胺基酸序列的CH、包含序列識別號：59之胺基酸序列的VL、及包含序列識別號：63之胺基酸序列的CL； （xvi）包含序列識別號：51之胺基酸序列的VH、包含序列識別號：72之胺基酸序列的CH、包含序列識別號：59之胺基酸序列的VL、及包含序列識別號：63之胺基酸序列的CL； （xvii）包含序列識別號：51之胺基酸序列的VH、包含序列識別號：74之胺基酸序列的CH、包含序列識別號：59之胺基酸序列的VL、及包含序列識別號：63之胺基酸序列的CL； （xviii）包含序列識別號：51之胺基酸序列的VH、包含序列識別號：75之胺基酸序列的CH、包含序列識別號：59之胺基酸序列的VL、及包含序列識別號：63之胺基酸序列的CL； （xix）包含序列識別號：51之胺基酸序列的VH、包含序列識別號：77之胺基酸序列的CH、包含序列識別號：59之胺基酸序列的VL、及包含序列識別號：63之胺基酸序列的CL； （xx）包含序列識別號：51之胺基酸序列的VH、包含序列識別號：78之胺基酸序列的CH、包含序列識別號：59之胺基酸序列的VL、及包含序列識別號：63之胺基酸序列的CL； （xxi）包含序列識別號：51之胺基酸序列的VH、包含序列識別號：79之胺基酸序列的CH、包含序列識別號：59之胺基酸序列的VL、及包含序列識別號：63之胺基酸序列的CL； （xxii）包含序列識別號：51之胺基酸序列的VH、包含序列識別號：80之胺基酸序列的CH、包含序列識別號：59之胺基酸序列的VL、及包含序列識別號：63之胺基酸序列的CL； （xxiii）包含序列識別號：51之胺基酸序列的VH、包含序列識別號：81之胺基酸序列的CH、包含序列識別號：59之胺基酸序列的VL、及包含序列識別號：63之胺基酸序列的CL； （xxiv）包含序列識別號：51之胺基酸序列的VH、包含序列識別號：82之胺基酸序列的CH、包含序列識別號：59之胺基酸序列的VL、及包含序列識別號：63之胺基酸序列的CL； （xxv）包含序列識別號：51之胺基酸序列的VH、包含序列識別號：83之胺基酸序列的CH、包含序列識別號：59之胺基酸序列的VL、及包含序列識別號：63之胺基酸序列的CL； （xxvi）包含序列識別號：51之胺基酸序列的VH、包含序列識別號：84之胺基酸序列的CH、包含序列識別號：59之胺基酸序列的VL、及包含序列識別號：63之胺基酸序列的CL； （xxvii）包含序列識別號：51之胺基酸序列的VH、包含序列識別號：72之胺基酸序列的CH、包含序列識別號：60之胺基酸序列的VL、及包含序列識別號：63之胺基酸序列的CL； （xxviii）包含序列識別號：51之胺基酸序列的VH、包含序列識別號：74之胺基酸序列的CH、包含序列識別號：60之胺基酸序列的VL、及包含序列識別號：63之胺基酸序列的CL； （xxix）包含序列識別號：51之胺基酸序列的VH、包含序列識別號：75之胺基酸序列的CH、包含序列識別號：60之胺基酸序列的VL、及包含序列識別號：63之胺基酸序列的CL； （xxx）包含序列識別號：51之胺基酸序列的VH、包含序列識別號：77之胺基酸序列的CH、包含序列識別號：60之胺基酸序列的VL、及包含序列識別號：63之胺基酸序列的CL； （xxxi）包含序列識別號：51之胺基酸序列的VH、包含序列識別號：78之胺基酸序列的CH、包含序列識別號：60之胺基酸序列的VL、及包含序列識別號：63之胺基酸序列的CL； （xxxii）包含序列識別號：51之胺基酸序列的VH、包含序列識別號：79之胺基酸序列的CH、包含序列識別號：60之胺基酸序列的VL、及包含序列識別號：63之胺基酸序列的CL； （xxxiii）包含序列識別號：51之胺基酸序列的VH、包含序列識別號：80之胺基酸序列的CH、包含序列識別號：60之胺基酸序列的VL、及包含序列識別號：63之胺基酸序列的CL； （xxxiv）包含序列識別號：51之胺基酸序列的VH、包含序列識別號：81之胺基酸序列的CH、包含序列識別號：60之胺基酸序列的VL、及包含序列識別號：63之胺基酸序列的CL； （xxxv）包含序列識別號：51之胺基酸序列的VH、包含序列識別號：82之胺基酸序列的CH、包含序列識別號：60之胺基酸序列的VL、及包含序列識別號：63之胺基酸序列的CL； （xxxvi）包含序列識別號：51之胺基酸序列的VH、包含序列識別號：83之胺基酸序列的CH、包含序列識別號：60之胺基酸序列的VL、及包含序列識別號：63之胺基酸序列的CL； （xxxvii）包含序列識別號：51之胺基酸序列的VH、包含序列識別號：84之胺基酸序列的CH、包含序列識別號：60之胺基酸序列的VL、及包含序列識別號：63之胺基酸序列的CL；以及 （xxxviii）包含序列識別號：51之胺基酸序列的VH、包含序列識別號：85之胺基酸序列的CH、包含序列識別號：60之胺基酸序列的VL、及包含序列識別號：63之胺基酸序列的CL。 ［6］如［1］至［5］任一項之抗癌劑，其係用於投予具有（i）選自B細胞、樹突細胞、自然殺手細胞、巨噬細胞、及CD8陽性T細胞之1種以上的細胞浸潤的固態腫瘤，及/或（ii）調節T（Treg）細胞或CD4陽性T細胞浸潤的固態腫瘤；之癌症患者。 ［6.1］如［1］至［6］任一項之抗癌劑，其係用於投予具有CD8陽性T細胞浸潤的固態腫瘤之癌症患者。 ［7］如［1］至［6.1］任一項之抗癌劑，其係用於投予患有對以免疫檢查點抑制劑的治療為不反應性的癌症之患者。 ［8］如［1］至［7］任一項之抗癌劑，其係用於投予患有選自胃癌、頭頸癌、食道癌、大腸癌、肺癌、間皮瘤、肝癌、卵巢癌、乳癌、結腸癌、腎臟癌、皮膚癌、肌肉瘤、胰臟癌、前列腺癌、睪丸癌、子宮癌、膽管癌、默克細胞癌（Merkel Cell Carcinoma）、膀胱癌、甲狀腺癌、神經鞘瘤、腎上腺癌、肛門癌、中樞神經系統腫瘤、神經內分泌組織腫瘤、陰莖癌、胸膜腫瘤、唾液腺腫瘤、外陰癌、胸腺腫瘤、淋巴瘤、骨髓性白血病、及兒童癌症所組成的群組之1種或1種以上的癌症之癌症患者。 ［8.1］如［1］至［8］任一項之抗癌劑，其係用於投予患有選自胃癌、肺癌、間皮瘤、肝癌、乳癌、皮膚癌、淋巴瘤、及骨髓性白血病所組成的群組之1種或1種以上的癌症之癌症患者。 ［9］如［1］至［5］任一項之抗癌劑，其係用於和至少1種其他抗癌劑合併使用。 ［9.1］如［9］之抗癌劑，其特徵在於，該抗癌劑和該其他抗癌劑同時投予。 ［9.2］如［9］之抗癌劑，其特徵在於，該抗癌劑在該其他抗癌劑投予前或投予後投予。 ［10］如［9］至［9.2］任一項之抗癌劑，其中，該其他抗癌劑為選自化療劑、T細胞活化促效劑、免疫檢查點抑制劑、T細胞重導向抗原結合分子、抗纖維化藥物、及血管新生抑制劑之至少1個的抗癌劑。 ［10.1］如［10］之抗癌劑，其中，該其他抗癌劑為化療劑。 ［10.2］如［10］或［10.1］之抗癌劑，其中，該其他抗癌劑為選自代謝拮抗劑、植物鹼、及鉑製劑之至少1個的化療劑。 ［10.3］如［10］之抗癌劑，其中，該其他抗癌劑為T細胞活化促效劑。 ［10.4］如［10］或［10.3］之抗癌劑，其中，該其他抗癌劑為TNFRSF的促控抗體（agonist antibody）。 ［11］如［10］之抗癌劑，其中，該其他抗癌劑為免疫檢查點抑制劑。 ［12］如［10］或［11］之抗癌劑，其中，該其他抗癌劑為選自抗PD1抗體、抗PDL1抗體、抗TIGIT抗體、抗TIM3抗體、及抗LAG3抗體之至少1個的免疫檢查點抑制劑。 ［12.1］如［10］、［11］及［12］任一項之抗癌劑，其中，該其他抗癌劑為抗PDL1抗體及/或抗TIGIT抗體。 ［12.2］如［9］至［12.1］任一項之抗癌劑，其係用於投予具有對以免疫檢查點抑制劑的治療為不反應性的癌症之患者。 ［12.3］如［12.2］之抗癌劑，其中，該對以免疫檢查點抑制劑的治療為不反應性的癌症為在JAK1、JAK2、及/或B2M具有基因變異的癌症。 ［13］如［10］之抗癌劑，其中，該其他抗癌劑為T細胞重導向抗原結合分子。 ［13.1］如［10］或［13］之抗癌劑，其中，該其他抗癌劑為對CD3及癌抗原具有結合活性的多特異性抗體。 ［13.2］如［13.1］之抗癌劑，其中，該多特異性抗體為雙特異性抗體。 ［14］如［9］至［9.2］任一項之抗癌劑，其中，該其他抗癌劑為去除選自調節T細胞、CD4陽性T細胞、B細胞、NK細胞、及巨噬細胞之1者以上的細胞及/或使其去活性化的藥劑。 ［15］如［9］至［14］任一項之抗癌劑，其係用於投予患有選自胃癌、頭頸癌、食道癌、大腸癌、肺癌、間皮瘤、肝癌、卵巢癌、乳癌、結腸癌、腎臟癌、皮膚癌、肌肉瘤、胰臟癌、前列腺癌、睪丸癌、子宮癌、膽管癌、默克細胞癌（Merkel Cell Carcinoma）、膀胱癌、甲狀腺癌、神經鞘瘤、腎上腺癌、肛門癌、中樞神經系統腫瘤、神經內分泌組織腫瘤、陰莖癌、胸膜腫瘤、唾液腺腫瘤、外陰癌、胸腺腫瘤、淋巴瘤、骨髓性白血病、及兒童癌症所組成的群組之1種或1種以上的癌症之癌症患者。 ［15.1］如［9］至［15］任一項之抗癌劑，其係用於投予患有選自胃癌、大腸癌、肺癌、間皮瘤、肝癌、乳癌、皮膚癌、淋巴瘤、及骨髓性白血病所組成的群組之1種或1種以上的癌症之癌症患者。 ［16］如［1］至［5］任一項之抗癌劑，其係用於和至少1個其他抗癌劑的合併療法中使用，以使在個體的腫瘤組織中的T細胞的活化增強。 ［16.1］如［16］之抗癌劑，其中，當選自CD8b1、Gzmb、Prf1、及Ifng之至少1個的基因的表現量在腫瘤組織中增加時，判斷為在腫瘤組織中的T細胞的活化增強。 ［17］如［1］至［5］任一項之抗癌劑，其係用於和至少1個其他抗癌劑的合併療法中使用，以促進在個體的腫瘤組織中的CD8陽性T細胞的增殖。 ［17.1］如［16］至［17］任一項之抗癌劑，其特徵在於，和該其他抗癌劑同時投予。 ［17.2］如［16］至［17］任一項之抗癌劑，其特徵在於，在該其他抗癌劑投予前或投予後投予。 ［17.3］如［16］至［17.2］任一項之抗癌劑，其中，該其他抗癌劑為選自化療劑、T細胞活化促效劑、免疫檢查點抑制劑、T細胞重導向抗原結合分子、抗纖維化藥物、及血管新生抑制劑之至少1個的抗癌劑。 ［17.4］如［16］至［17.2］任一項之抗癌劑，其中，該其他抗癌劑為去除選自調節T細胞、CD4陽性T細胞、B細胞、NK細胞、及巨噬細胞之1者以上的細胞及/或使其去活性化的藥劑。 ［18］一種用於治療癌症的醫藥組合物，其係組合如［1］至［5］任一項之抗CD137抗原結合分子、及至少1個其他抗癌劑而成。 ［18.1］如［18］之醫藥組合物，其特徵在於，該抗CD137抗原結合分子用於和該其他抗癌劑同時投予至患者。 ［18.2］如［18］之醫藥組合物，其特徵在於，該抗CD137抗原結合分子用於在該其他抗癌劑投予前或投予後投予至患者。 ［19］如［18］至［18.2］任一項之醫藥組合物，其中，該其他抗癌劑為選自化療劑、T細胞活化促效劑、免疫檢查點抑制劑、T細胞重導向抗原結合分子、抗纖維化藥物、及血管新生抑制劑之至少1個的抗癌劑。 ［19.1］如［19］之醫藥組合物，其中，該其他抗癌劑為化療劑。 ［19.2］如［19］或［19.1］之醫藥組合物，其中，該其他抗癌劑為選自代謝拮抗劑、植物鹼、及鉑製劑之至少1個的化療劑。 ［19.3］如［19］之醫藥組合物，其中，該其他抗癌劑為T細胞活化促效劑。 ［19.4］如［19］或［19.3］之醫藥組合物，其中，該其他抗癌劑為TNFRSF的促控抗體。 ［20］如［19］之醫藥組合物，其中，該其他抗癌劑為免疫檢查點抑制劑。 ［21］如［19］或［20］之醫藥組合物，其中，該其他抗癌劑為選自抗PD1抗體、抗PDL1抗體、抗TIGIT抗體、抗TIM3抗體、及抗LAG3抗體之至少1個的免疫檢查點抑制劑。 ［21.1］如［19］、［20］及［21］任一項之醫藥組合物，其中，該其他抗癌劑為抗PDL1抗體及/或抗TIGIT抗體。 ［21.2］如［18］至［21.1］任一項之醫藥組合物，其係用於對以免疫檢查點抑制劑的治療為不反應性的癌症之治療。 ［21.3］如［21.2］之醫藥組合物，其中，該對以免疫檢查點抑制劑的治療為不反應性的癌症為在JAK1、JAK2、及/或B2M具有基因變異的癌症。 ［22］如［19］之醫藥組合物，其中，該其他抗癌劑為T細胞重導向抗原結合分子。 ［22.1］如［19］或［22］之醫藥組合物，其中，該其他抗癌劑為對CD3及癌抗原具有結合活性的多特異性抗體。 ［22.2］如［22.1］之醫藥組合物，其中，該多特異性抗體為雙特異性抗體。 ［23］如［18］至［18.2］任一項之醫藥組合物，其中，該其他抗癌劑為去除選自調節T細胞、CD4陽性T細胞、B細胞、NK細胞、及巨噬細胞之1者以上的細胞及/或使其去活性化的藥劑。 ［24］如［18］至［23］任一項之醫藥組合物，其中，癌症為選自胃癌、頭頸癌、食道癌、大腸癌、肺癌、間皮瘤、肝癌、卵巢癌、乳癌、結腸癌、腎臟癌、皮膚癌、肌肉瘤、胰臟癌、前列腺癌、睪丸癌、子宮癌、膽管癌、默克細胞癌（Merkel Cell Carcinoma）、膀胱癌、甲狀腺癌、神經鞘瘤、腎上腺癌、肛門癌、中樞神經系統腫瘤、神經內分泌組織腫瘤、陰莖癌、胸膜腫瘤、唾液腺腫瘤、外陰癌、胸腺腫瘤、淋巴瘤、骨髓性白血病、及兒童癌症所組成的群組之1種或以上的癌症。 ［24.1］如［18］至［24］任一項之醫藥組合物，其中，癌症為選自胃癌、大腸癌、肺癌、間皮瘤、肝癌、乳癌、皮膚癌、淋巴瘤、及骨髓性白血病所組成的群組之1種或以上的癌症。 ［25］一種如［1］至［5］任一項之抗CD137抗原結合分子及至少1個其他抗癌劑之組合，其係用於治療癌症。 ［25.1］如［25］之組合，其特徵在於，該抗CD137抗原結合分子用於和該其他抗癌劑同時投予至患者。 ［25.2］如［25］之組合，其特徵在於，該抗CD137抗原結合分子用於在該其他抗癌劑投予前或投予後投予至患者。 ［26］如［25］至［25.2］任一項之組合，其中，該其他抗癌劑為選自化療劑、T細胞活化促效劑、免疫檢查點抑制劑、T細胞重導向抗原結合分子、抗纖維化藥物、及血管新生抑制劑之至少1個的抗癌劑。 ［26.1］如［26］之組合，其中，該其他抗癌劑為化療劑。 ［26.2］如［26］或［26.1］之組合，其中，該其他抗癌劑為選自代謝拮抗劑、植物鹼、及鉑製劑之至少1個的化療劑。 ［26.3］如［26］之組合，其中，該其他抗癌劑為T細胞活化促效劑。 ［26.4］如［26］或［26.3］之組合，其中，該其他抗癌劑為TNFRSF的促控抗體。 ［27］如［26］之組合，其中，該其他抗癌劑為免疫檢查點抑制劑。 ［28］如［26］或［27］之組合，其中，該其他抗癌劑為選自抗PD1抗體、抗PDL1抗體、抗TIGIT抗體、抗TIM3抗體、及抗LAG3抗體之至少1個的免疫檢查點抑制劑。 ［28.1］如［26］、［27］及［28］任一項之組合，其中，該其他抗癌劑為抗PDL1抗體及/或抗TIGIT抗體。 ［28.2］如［25］至［28.1］任一項之組合，其係用於對以免疫檢查點抑制劑的治療為不反應性的癌症之治療。 ［28.3］如［28.2］之組合，其中，該對以免疫檢查點抑制劑的治療為不反應性的癌症為在JAK1、JAK2、及/或B2M具有基因變異的癌症。 ［29］如［26］之組合，其中，該其他抗癌劑為T細胞重導向抗原結合分子。 ［29.1］如［26］或［29］之組合，其中，該其他抗癌劑為對CD3及癌抗原具有結合活性的多特異性抗體。 ［29.2］如［29.1］之組合，其中，該多特異性抗體為雙特異性抗體。 ［30］如［25］至［25.2］任一項之組合，其中，該其他抗癌劑為去除選自調節T細胞、CD4陽性T細胞、B細胞、NK細胞、及巨噬細胞之1者以上的細胞及/或使其去活性化的藥劑。 ［31］如［25］至［30］任一項之組合，其中，癌症為選自胃癌、頭頸癌、食道癌、大腸癌、肺癌、間皮瘤、肝癌、卵巢癌、乳癌、結腸癌、腎臟癌、皮膚癌、肌肉瘤、胰臟癌、前列腺癌、睪丸癌、子宮癌、膽管癌、默克細胞癌（Merkel Cell Carcinoma）、膀胱癌、甲狀腺癌、神經鞘瘤、腎上腺癌、肛門癌、中樞神經系統腫瘤、神經內分泌組織腫瘤、陰莖癌、胸膜腫瘤、唾液腺腫瘤、外陰癌、胸腺腫瘤、淋巴瘤、骨髓性白血病、及兒童癌症所組成的群組之1種或1種以上的癌症。 ［31.1］如［25］至［31］任一項之組合，其中，癌症為選自胃癌、大腸癌、肺癌、間皮瘤、肝癌、乳癌、皮膚癌、淋巴瘤、及骨髓性白血病所組成的群組之1種或1種以上的癌症。 ［32］一種作為抗癌劑之用途，其係如［1］至［5］任一項之抗CD137抗原結合分子及至少1個其他抗癌劑之組合作為抗癌劑之用途。 ［32.1］如［32］之用途，其特徵在於，該抗CD137抗原結合分子用於和該其他抗癌劑同時投予至患者。 ［32.2］如［32］之用途，其特徵在於，該抗CD137抗原結合分子用於在該其他抗癌劑投予前或投予後投予至患者。 ［33］如［32］至［32.2］任一項之用途，其中，該其他抗癌劑為選自化療劑、T細胞活化促效劑、免疫檢查點抑制劑、T細胞重導向抗原結合分子、抗纖維化藥物、及血管新生抑制劑之至少1個的抗癌劑。 ［33.1］如［33］之用途，其中，該其他抗癌劑為化療劑。 ［33.2］如［33］或［33.1］之用途，其中，該其他抗癌劑為選自代謝拮抗劑、植物鹼、及鉑製劑之至少1個的化療劑。 ［33.3］如［33］之用途，其中，該其他抗癌劑為T細胞活化促效劑。 ［33.4］如［33］或［33.3］之用途，其中，該其他抗癌劑為TNFRSF的促控抗體。 ［34］如［33］之用途，其中，該其他抗癌劑為免疫檢查點抑制劑。 ［35］如［33］或［34］之用途，其中，該其他抗癌劑為選自抗PD1抗體、抗PDL1抗體、抗TIGIT抗體、抗TIM3抗體、及抗LAG3抗體之至少1個的免疫檢查點抑制劑。 ［35.1］如［33］、［34］及［35］任一項之組合，其中，該其他抗癌劑為抗PDL1抗體及/或抗TIGIT抗體。 ［35.2］如［32］至［35.1］任一項之用途，其係用於對以免疫檢查點抑制劑的治療為不反應性的癌症之治療。 ［35.3］如［35.2］之用途，其中，該對以免疫檢查點抑制劑的治療為不反應性的癌症為在JAK1、JAK2、及/或B2M具有基因變異的癌症。 ［36］如［33］之用途，其中，該其他抗癌劑為T細胞重導向抗原結合分子。 ［36.1］如［33］或［36］之用途，其中，該其他抗癌劑為對CD3及癌抗原具有結合活性的多特異性抗體。 ［36.2］如［36.1］之用途，其中，該多特異性抗體為雙特異性抗體。 ［37］如［32］至［32.2］任一項之用途，其中，該其他抗癌劑為去除選自調節T細胞、CD4陽性T細胞、B細胞、NK細胞、及巨噬細胞之1者以上的細胞及/或使其去活性化的藥劑。 ［38］如［32］至［37］任一項之用途，其中，癌症為選自胃癌、頭頸癌、食道癌、大腸癌、肺癌、間皮瘤、肝癌、卵巢癌、乳癌、結腸癌、腎臟癌、皮膚癌、肌肉瘤、胰臟癌、前列腺癌、睪丸癌、子宮癌、膽管癌、默克細胞癌（Merkel Cell Carcinoma）、膀胱癌、甲狀腺癌、神經鞘瘤、腎上腺癌、肛門癌、中樞神經系統腫瘤、神經內分泌組織腫瘤、陰莖癌、胸膜腫瘤、唾液腺腫瘤、外陰癌、胸腺腫瘤、淋巴瘤、骨髓性白血病、及兒童癌症所組成的群組之1種或1種以上的癌症。 ［38.1］如［32］至［38］任一項之用途，其中，癌症為選自胃癌、大腸癌、肺癌、間皮瘤、肝癌、乳癌、皮膚癌、淋巴瘤、及骨髓性白血病所組成的群組之1種或1種以上的癌症。 ［39］一種用於癌症治療之套組，包括： （1）包含如［1］至［5］任一項之抗CD137抗原結合分子作為有效成分的醫藥組合物；以及 （2）指示在該醫藥組合物的投予前、投予同時、或投予後，投予至少1個的其他抗癌劑之仿單或標籤。 ［39.1］如［39］之套組，其特徵在於，該醫藥組合物填充於容器。 ［39.2］如［39］至［39.2］任一項之套組，其特徵在於，該包含該抗CD137抗原結合分子作為有效成分的醫藥組合物用於和該其他抗癌劑同時投予至患者。 ［39.3］如［39］或［39.1］之套組，其特徵在於，該包含該抗CD137抗原結合分子作為有效成分的醫藥組合物用於在該其他抗癌劑投予前或投予後投予至患者。 ［40］如［39］至［39.2］任一項之套組，其中，該其他抗癌劑為選自化療劑、T細胞活化促效劑、免疫檢查點抑制劑、T細胞重導向抗原結合分子、抗纖維化藥物、及血管新生抑制劑之至少1個的抗癌劑。 ［40.1］如［40］之套組，其中，該其他抗癌劑為化療劑。 ［40.2］如［40］或［40.1］之套組，其中，該其他抗癌劑為選自代謝拮抗劑、植物鹼、及鉑製劑之至少1個的化療劑。 ［40.3］如［40］之套組，其中，該其他抗癌劑為T細胞活化促效劑。 ［40.4］如［40］或［40.3］之套組，其中，該其他抗癌劑為TNFRSF的促控抗體。 ［41］如［40］之套組，其中，該抗癌劑為免疫檢查點抑制劑。 ［42］如［40］或［41］之套組，其中，該抗癌劑為選自抗PD1抗體、抗PDL1抗體、抗TIGIT抗體、抗TIM3抗體、及抗LAG3抗體之至少1個的免疫檢查點抑制劑。 ［42.1］如［40］、［41］及［42］任一項之套組，其中，該抗癌劑為抗PDL1抗體及/或抗TIGIT抗體。 ［42.2］如［39］至［42.1］任一項之套組，其係用於對以免疫檢查點抑制劑的治療為不反應性的癌症之治療。 ［42.3］如［42.2］之套組，其中，該對以免疫檢查點抑制劑的治療為不反應性的癌症為在JAK1、JAK2、及/或B2M具有基因變異的癌症。 ［43］如［40］之套組，其中，該抗癌劑為T細胞重導向抗原結合分子。 ［43.1］如［40］或［43］之套組，其中，該抗癌劑為對CD3及癌抗原具有結合活性的多特異性抗體。 ［43.2］如［43.1］之套組，其中，該多特異性抗體為雙特異性抗體。 ［44］如［39］至［39.2］任一項之套組，其中，該其他抗癌劑為去除選自調節T細胞、CD4陽性T細胞、B細胞、NK細胞、及巨噬細胞之1者以上的細胞及/或使其去活性化的藥劑。 ［45］如［39］至［44］任一項之套組，其中，癌症為選自胃癌、頭頸癌、食道癌、大腸癌、肺癌、間皮瘤、肝癌、卵巢癌、乳癌、結腸癌、腎臟癌、皮膚癌、肌肉瘤、胰臟癌、前列腺癌、睪丸癌、子宮癌、膽管癌、默克細胞癌（Merkel Cell Carcinoma）、膀胱癌、甲狀腺癌、神經鞘瘤、腎上腺癌、肛門癌、中樞神經系統腫瘤、神經內分泌組織腫瘤、陰莖癌、胸膜腫瘤、唾液腺腫瘤、外陰癌、胸腺腫瘤、淋巴瘤、骨髓性白血病、及兒童癌症所組成的群組之1種或以上的癌症。 ［45.1］如［39］至［44］任一項之套組，其中，癌症為選自胃癌、大腸癌、肺癌、間皮瘤、肝癌、乳癌、皮膚癌、淋巴瘤、及骨髓性白血病所組成的群組之1種或1種以上的癌症。 ［46］一種治療癌症之方法，包括： 將如［1］至［5］任一項之抗CD137抗原結合分子，投予下述癌症患者：具有（i）選自B細胞、樹突細胞、自然殺手細胞、巨噬細胞、及CD8陽性T細胞之1種以上的細胞浸潤的固態腫瘤，及/或（ii）調節T（Treg）細胞或CD4陽性T細胞浸潤的固態腫瘤。 ［46.1］如［46］之方法，其中，該患者為具有CD8陽性T細胞浸潤的固態腫瘤之患者。 ［47］如［46］或［46.1］之方法，其中，該患者為患有對以免疫檢查點抑制劑的治療為不反應性的癌症之患者。 ［48］如［46］至［47］任一項之方法，其中，該患者為患有選自胃癌、頭頸癌、食道癌、大腸癌、肺癌、間皮瘤、肝癌、卵巢癌、乳癌、結腸癌、腎臟癌、皮膚癌、肌肉瘤、胰臟癌、前列腺癌、睪丸癌、子宮癌、膽管癌、默克細胞癌（Merkel Cell Carcinoma）、膀胱癌、甲狀腺癌、神經鞘瘤、腎上腺癌、肛門癌、中樞神經系統腫瘤、神經內分泌組織腫瘤、陰莖癌、胸膜腫瘤、唾液腺腫瘤、外陰癌、胸腺腫瘤、淋巴瘤、骨髓性白血病、及兒童癌症所組成的群組之1種或1種以上的癌症之患者。 ［48.1］如［46］至［48］任一項之方法，其中，該患者為患有選自胃癌、肺癌、間皮瘤、肝癌、乳癌、皮膚癌、淋巴瘤、及骨髓性白血病所組成的群組之1種或1種以上的癌症之患者。 ［49］一種治療癌症之方法，包括將如［1］至［5］任一項之抗CD137抗原結合分子和至少1種其他抗癌劑組合投予至患者。 ［49.1］如［49］之方法，其特徵在於，該抗CD137抗原結合分子和該其他抗癌劑同時投予至患者。 ［49.2］如［49］之方法，其特徵在於，該抗CD137抗原結合分子在該其他抗癌劑投予前或投予後投予患者。 ［50］如［49］至［49.2］任一項之方法，其中，該其他抗癌劑為選自化療劑、T細胞活化促效劑、免疫檢查點抑制劑、T細胞重導向抗原結合分子、抗纖維化藥物、及血管新生抑制劑之至少1個的抗癌劑。 ［50.1］如［50］之方法，其中，該其他抗癌劑為化療劑。 ［50.2］如［50］或［50.1］之方法，其中，該其他抗癌劑為選自代謝拮抗劑、植物鹼、及鉑製劑之至少1個的化療劑。 ［50.3］如［50］之方法，其中，該其他抗癌劑為T細胞活化促效劑。 ［50.4］如［50］或［50.3］之方法，其中，該其他抗癌劑為TNFRSF的促控抗體。 ［51］如［50］之方法，其中，該其他抗癌劑為免疫檢查點抑制劑。 ［52］如［50］或［51］之方法，其中，該其他抗癌劑為選自抗PD1抗體、抗PDL1抗體、抗TIGIT抗體、抗TIM3抗體、及抗LAG3抗體之至少1個的免疫檢查點抑制劑。 ［52.1］如［50］、［51］及［52］任一項之方法，其中，該其他抗癌劑為抗PDL1抗體及/或抗TIGIT抗體。 ［52.2］如［49］至［52.1］任一項之方法，其係用於對以免疫檢查點抑制劑的治療為不反應性的癌症之治療。 ［52.3］如［52.2］之方法，其中，該對以免疫檢查點抑制劑的治療為不反應性的癌症為在JAK1、JAK2、及/或B2M具有基因變異的癌症。 ［53］如［50］之方法，其中，該其他抗癌劑為T細胞重導向抗原結合分子。 ［53.1］如［50］或［53］之方法，其中，該其他抗癌劑為對CD3及癌抗原具有結合活性的多特異性抗體。 ［53.2］如［53.1］之方法，其中，該多特異性抗體為雙特異性抗體。 ［54］如［49］至［49.2］任一項之方法，其中，該其他抗癌劑為去除選自調節T細胞、CD4陽性T細胞、B細胞、NK細胞、及巨噬細胞之1者以上的細胞及/或使其去活性化的藥劑。 ［55］如［49］至［54］任一項之方法，其中，癌症為選自胃癌、頭頸癌、食道癌、大腸癌、肺癌、間皮瘤、肝癌、卵巢癌、乳癌、結腸癌、腎臟癌、皮膚癌、肌肉瘤、胰臟癌、前列腺癌、睪丸癌、子宮癌、膽管癌、默克細胞癌（Merkel Cell Carcinoma）、膀胱癌、甲狀腺癌、神經鞘瘤、腎上腺癌、肛門癌、中樞神經系統腫瘤、神經內分泌組織腫瘤、陰莖癌、胸膜腫瘤、唾液腺腫瘤、外陰癌、胸腺腫瘤、淋巴瘤、骨髓性白血病、及兒童癌症所組成的群組之1種或1種以上的癌症。 ［55.1］如［49］至［55］任一項之方法，其中，癌症為選自胃癌、大腸癌、肺癌、間皮瘤、肝癌、乳癌、皮膚癌、淋巴瘤、及骨髓性白血病所組成的群組之1種或1種以上的癌症。 ［56］一種如［1］至［5］任一項之抗CD137抗原結合分子，其係用於下述固態腫瘤之治療：（i）選自B細胞、樹突細胞、自然殺手細胞、巨噬細胞、及CD8陽性T細胞之1種以上的細胞浸潤的固態腫瘤，及/或（ii）調節T（Treg）細胞或CD4陽性T細胞浸潤的固態腫瘤。 ［56.1］如［56］之抗CD137抗原結合分子，其中，該癌症為CD8陽性T細胞浸潤的固態腫瘤。 ［57］如［56］或［56.1］之抗CD137抗原結合分子，其中，該癌症為對以免疫檢查點抑制劑的治療為不反應性的癌症。 ［58］如［56］至［57］任一項之抗CD137抗原結合分子，其中，該癌症為選自胃癌、頭頸癌、食道癌、大腸癌、肺癌、間皮瘤、肝癌、卵巢癌、乳癌、結腸癌、腎臟癌、皮膚癌、肌肉瘤、胰臟癌、前列腺癌、睪丸癌、子宮癌、膽管癌、默克細胞癌（Merkel Cell Carcinoma）、膀胱癌、甲狀腺癌、神經鞘瘤、腎上腺癌、肛門癌、中樞神經系統腫瘤、神經內分泌組織腫瘤、陰莖癌、胸膜腫瘤、唾液腺腫瘤、外陰癌、胸腺腫瘤、淋巴瘤、骨髓性白血病、及兒童癌症所組成的群組之1種或1種以上的癌症。 ［58.1］如［56］至［58］任一項之抗CD137抗原結合分子，其中，該癌症為選自胃癌、肺癌、間皮瘤、肝癌、乳癌、皮膚癌、淋巴瘤、及骨髓性白血病所組成的群組之1種或1種以上的癌症。 ［59］一種如［1］至［5］任一項之抗CD137抗原結合分子，其係用於和至少1個其他抗癌劑組合的癌症之治療的用途。 ［59.1］如［59］之抗CD137抗原結合分子，其特徵在於，該治療為抗CD137抗原結合分子和該其他抗癌劑同時投予。 ［59.2］如［59］之抗CD137抗原結合分子，其特徵在於，該治療為該抗CD137抗原結合分子在該其他抗癌劑投予前或投予後投予。 ［60］如［59］至［59.2］任一項之抗CD137抗原結合分子，其中，該其他抗癌劑為選自化療劑、T細胞活化促效劑、免疫檢查點抑制劑、T細胞重導向抗原結合分子、抗纖維化藥物、及血管新生抑制劑之至少1個的抗癌劑。 ［60.1］如［60］之抗CD137抗原結合分子，其中，該其他抗癌劑為化療劑。 ［60.2］如［60］或［60.1］之抗CD137抗原結合分子，其中，該其他抗癌劑為選自代謝拮抗劑、植物鹼、及鉑製劑之至少1個的化療劑。 ［60.3］如［60］之抗CD137抗原結合分子，其中，該其他抗癌劑為T細胞活化促效劑。 ［60.4］如［60］或［60.3］之抗CD137抗原結合分子，其中，該其他抗癌劑為TNFRSF的促控抗體。 ［61］如［60］之抗CD137抗原結合分子，其中，該其他抗癌劑為免疫檢查點抑制劑。 ［62］如［60］或［61］之抗CD137抗原結合分子，其中，該其他抗癌劑為選自抗PD1抗體、抗PDL1抗體、抗TIGIT抗體、抗TIM3抗體、及抗LAG3抗體之至少1個的免疫檢查點抑制劑。 ［62.1］如［60］、［61］及［62］任一項之抗CD137抗原結合分子，其中，該其他抗癌劑為抗PDL1抗體及/或抗TIGIT抗體。 ［62.2］如［59］至［62.1］任一項之抗CD137抗原結合分子，其係用於在對以免疫檢查點抑制劑的治療為不反應性的癌症之治療的用途。 ［62.3］如［62.2］之抗CD137抗原結合分子，其中，該對以免疫檢查點抑制劑的治療為不反應性的癌症為在JAK1、JAK2、及/或B2M具有基因變異的癌症。 ［63］如［60］之抗CD137抗原結合分子，其中，該其他抗癌劑為T細胞重導向抗原結合分子。 ［63.1］如［60］或［63］之抗CD137抗原結合分子，其中，該其他抗癌劑為對CD3及癌抗原具有結合活性的多特異性抗體。 ［63.2］如［63.1］之抗CD137抗原結合分子，其中，該多特異性抗體為雙特異性抗體。 ［64］如［59］至［59.2］任一項之抗CD137抗原結合分子，其中，該其他抗癌劑為去除選自調節T細胞、CD4陽性T細胞、B細胞、NK細胞、及巨噬細胞之1者以上的細胞及/或使其去活性化的藥劑。 ［65］如［59］至［64］任一項之抗CD137抗原結合分子，其中，癌症為選自胃癌、頭頸癌、食道癌、大腸癌、肺癌、間皮瘤、肝癌、卵巢癌、乳癌、結腸癌、腎臟癌、皮膚癌、肌肉瘤、胰臟癌、前列腺癌、睪丸癌、子宮癌、膽管癌、默克細胞癌（Merkel Cell Carcinoma）、膀胱癌、甲狀腺癌、神經鞘瘤、腎上腺癌、肛門癌、中樞神經系統腫瘤、神經內分泌組織腫瘤、陰莖癌、胸膜腫瘤、唾液腺腫瘤、外陰癌、胸腺腫瘤、淋巴瘤、骨髓性白血病、及兒童癌症所組成的群組之1種或1種以上的癌症。 ［65.1］如［59］至［65］任一項之抗CD137抗原結合分子，其中，癌症為選自胃癌、大腸癌、肺癌、間皮瘤、肝癌、乳癌、皮膚癌、淋巴瘤、及骨髓性白血病所組成的群組之1種或1種以上的癌症。 ［66］一種如［1］至［5］任一項之抗CD137抗原結合分子之用於製造癌症的治療用醫藥品的用途，該癌症為 （i）選自B細胞、樹突細胞、自然殺手細胞、巨噬細胞、及CD8陽性T細胞之1種以上的細胞浸潤的固態腫瘤，及/或（ii）調節T（Treg）細胞或CD4陽性T細胞浸潤的固態腫瘤。 ［66.1］如［66］之用途，其中，該癌症為CD8陽性T細胞浸潤的固態腫瘤。 ［67］如［66］或［66.1］之用途，其中，該癌症為對以免疫檢查點抑制劑的治療為不反應性的癌症。 ［68］如［66］至［67］任一項之用途，其中，該癌症為選自胃癌、頭頸癌、食道癌、大腸癌、肺癌、間皮瘤、肝癌、卵巢癌、乳癌、結腸癌、腎臟癌、皮膚癌、肌肉瘤、胰臟癌、前列腺癌、睪丸癌、子宮癌、膽管癌、默克細胞癌（Merkel Cell Carcinoma）、膀胱癌、甲狀腺癌、神經鞘瘤、腎上腺癌、肛門癌、中樞神經系統腫瘤、神經內分泌組織腫瘤、陰莖癌、胸膜腫瘤、唾液腺腫瘤、外陰癌、胸腺腫瘤、淋巴瘤、骨髓性白血病、及兒童癌症所組成的群組之1種或1種以上的癌症。 ［68.1］如［66］至［68］任一項之用途，其中，該癌症為選自胃癌、肺癌、間皮瘤、肝癌、乳癌、皮膚癌、淋巴瘤、及骨髓性白血病所組成的群組之1種或1種以上的癌症。 ［69］一種如［1］至［5］任一項之抗CD137抗原結合分子之用於製造癌症的治療用醫藥品的用途，其特徵在於，該醫藥品和至少1個其他抗癌劑組合使用。 ［69.1］如［69］之用途，其特徵在於，該醫藥品和該其他抗癌劑同時投予。 ［69.2］如［69］之用途，其特徵在於，該醫藥品在該其他抗癌劑投予前或投予後投予。 ［70］如［69］至［69.2］任一項之用途，其中，該其他抗癌劑為選自化療劑、T細胞活化促效劑、免疫檢查點抑制劑、T細胞重導向抗原結合分子、抗纖維化藥物、及血管新生抑制劑之至少1個的抗癌劑。 ［70.1］如［70］之用途，其中，該其他抗癌劑為化療劑。 ［70.2］如［70］或［70.1］之用途，其中，該其他抗癌劑為選自代謝拮抗劑、植物鹼、及鉑製劑之至少1個的化療劑。 ［70.3］如［70］之用途，其中，該其他抗癌劑為T細胞活化促效劑。 ［70.4］如［70］或［70.3］之用途，其中，該其他抗癌劑為TNFRSF的促控抗體。 ［71］如［70］之用途，其中，該其他抗癌劑為免疫檢查點抑制劑。 ［72］如［70］或［71］之用途，其中，該其他抗癌劑為選自抗PD1抗體、抗PDL1抗體、抗TIGIT抗體、抗TIM3抗體、及抗LAG3抗體之至少1個的免疫檢查點抑制劑。 ［72.1］如［70］、［71］及［72］任一項之用途，其中，該其他抗癌劑為抗PDL1抗體及/或抗TIGIT抗體。 ［72.2］如［69］至［72.1］任一項之用途，其係用於在對以免疫檢查點抑制劑的治療為不反應性的癌症之治療的用途。 ［72.3］如［72.2］之用途，其中，該對以免疫檢查點抑制劑的治療為不反應性的癌症為在JAK1、JAK2、及/或B2M具有基因變異的癌症。 ［73］如［70］之用途，其中，該其他抗癌劑為T細胞重導向抗原結合分子。 ［73.1］如［70］或［73］之用途，其中，該其他抗癌劑為對CD3及癌抗原具有結合活性的多特異性抗體。 ［73.2］如［73.1］之用途，其中，該多特異性抗體為雙特異性抗體。 ［74］如［69］至［69.2］任一項之用途，其中，該其他抗癌劑為去除選自調節T細胞、CD4陽性T細胞、B細胞、NK細胞、及巨噬細胞之1者以上的細胞及/或使其去活性化的藥劑。 ［75］如［69］至［74］任一項之用途，其中，癌症為選自胃癌、頭頸癌、食道癌、大腸癌、肺癌、間皮瘤、肝癌、卵巢癌、乳癌、結腸癌、腎臟癌、皮膚癌、肌肉瘤、胰臟癌、前列腺癌、睪丸癌、子宮癌、膽管癌、默克細胞癌（Merkel Cell Carcinoma）、膀胱癌、甲狀腺癌、神經鞘瘤、腎上腺癌、肛門癌、中樞神經系統腫瘤、神經內分泌組織腫瘤、陰莖癌、胸膜腫瘤、唾液腺腫瘤、外陰癌、胸腺腫瘤、淋巴瘤、骨髓性白血病、及兒童癌症所組成的群組之1種或1種以上的癌症。 ［75.1］如［69］至［75］任一項之用途，其中，癌症為選自胃癌、大腸癌、肺癌、間皮瘤、肝癌、乳癌、皮膚癌、淋巴瘤、及骨髓性白血病所組成的群組之1種或1種以上的癌症。
［用以實施發明之型態］
I.定義
「結合活性（binding activity）」一詞是指分子（例如抗體）的1個或1個以上的結合部位和分子的結合伙伴（例如抗原）之間的非共價鍵結的交互作用之合計的強度。在此，「結合活性（binding activity）」非嚴格限定為某結合對的成員（例如抗體和抗原）之間的1：1交互作用。例如在反映結合對的成員為1價的1：1交互作用的情形，此結合活性特別稱為固有的結合親和性（「親和性」）。在反映結合對的成員可為1價結合及多價結合之兩者的情形，結合活性為此等的結合力之總和。分子X對其伙伴Y的結合活性一般能夠以解離常數（KD）或「每單位配體（ligand）量的分析物結合量」（以下稱為「結合量」）來表示。一般而言，如此領域之技術人士所理解，解離常數（KD）的數值越低則結合活性越高，「每單位配體（ligand）量的分析物結合量」或「結合量」的數值越高則結合活性越高。結合活性，包含本說明書所記載者，可根據此技術領域已知之通常方法測量。測量結合活性的具體實例及態樣例在以下述之。
「結合活性成熟」抗體結合分子或抗體、或者「結合活性增加（增強）」抗體結合分子或抗體為，和不具有改變的親代抗原結合分子或親代抗體相比，帶有在1個或複數個超可變區域（hypervariable region：HVR）中導致抗體結合分子或抗體對抗原的結合活性改善的1個或複數個改變之抗體。
「抗CD137抗原結合分子」、「抗CD137抗體」或「和CD137結合的抗原結合分子」、「和CD137結合的抗體」之詞是指能夠以充分的結合活性和CD137結合之抗原結合分子或抗體，結果在該抗原結合分子或抗體在以CD137標靶化時可用作診斷劑及/或治療劑之抗原結合分子或抗體。在特定態樣，抗CD137抗體和來自不同種的CD137間所保留的CD137抗原決定位（epitope）結合。
「具有小分子化合物依賴的CD137結合活性」之抗CD137抗原結合分子或抗CD137抗體是指，在該小分子化合物存在下對CD137的結合活性，和該小分子化合物不存在下對CD137的結合活性相比，為高的抗原結合分子或抗體。在一態樣中，所謂「小分子化合物的存在下」為該小分子化合物以10μM以上、50μM以上、100μM以上、150μM以上、200μM以上、或250μM以上存在的條件下。在一態樣中，小分子化合物存在下，抗CD137抗原結合分子或抗體對無關係的非CD137蛋白質的結合活性的程度，在（例如以放射線免疫測量法（radioimmunoassay：RIA）或表面電漿共振分析法（surface plasmon resonance：SPR））測量時，抗原結合分子或抗體對CD137的結合為低於約10%。在特定態樣中，抗CD137抗原結合分子或抗體在小分子化合物存在下具有≦1μM、≦100nM、≦10nM、≦1nM、≦0.1nM、≦0.01nM、或≦0.001nM（例如10-6 M以下、10-7 M以下、10-8 M以下、10-9 M以下、10-10 M以下，例如10-6 M~10-10 M、10-7 M~10-9 M，例如10-7 M~10-8 M）的解離常數 （KD）。
本說明書中，「抗原結合分子」，以其最廣義使用，為和抗原決定位特異性結合的分子。在一態樣中，抗原結合分子為抗體、抗體片段、或抗體衍生物。
本說明書中所使用之「促效劑（agonist）抗原結合分子」或「促控抗體」為生物學上有意義的誘導或增強和其結合之抗原（例如CD137、CD3）之抗原結合分子或抗體。 因此，例如，在抗原為CD137的情形，具有如此的促效劑作用的抗原結合分子或抗體分別稱為「CD137促控抗原結合分子」或「CD137促控抗體」。相同地，例如，在抗原為CD3的情形，具有如此的促效劑作用的抗原結合分子或抗體分別稱為「CD3促控抗原結合分子」或「CD3促控抗體」。
本說明書中之「抗體」以最廣義使用，只要表現所希望的抗原結合活性，不限於此等，包括單株抗體、多株抗體、多特異性抗體（例如雙特異性抗體）及抗體片段之多種抗體結構。
「抗體片段」為包含和完整抗體結合的抗原結合之該完整抗體的一部分之該完整抗體以外的分子。抗體片段之例，不限於此等，包括Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F（ab'）2 ；雙鏈抗體（diabody）；線狀抗體；單鏈抗體分子（例如scFv）；及由抗體片段所形成的多特異性抗體。
參考抗原結合分子或參考抗體及「和相同的抗原決定位結合之抗原結合分子」或「和相同的抗原決定位結合之抗體」為，在競爭分析中，阻止50%以上的該參考抗體或參考抗原結合分子對自身的抗原的結合的抗體或抗原結合分子，或者反過來說，參考抗體在競爭分析中阻止50%以上的該抗體對自身的抗原的結合。競爭分析之例提供於本說明書。在一態樣中，參考抗原結合分子或參考抗體，在具有小分子化合物依賴的抗原結合活性的情形，競爭分析在該小分子化合物存在下進行。
「嵌合」抗體是指重鏈及/或輕鏈的一部分來自特定的供給源或種，另一方面，重鏈及/或輕鏈的其餘部分來自不同的供給源或種之抗體。
抗體的「種類」（class）是指抗體重鏈所具有的恆定區（constant domain）或恆定區域（constant region）的型態。抗體有5個主要種類：IgA、IgD、IgE、IgG、及IgM。這些之中可更細分為次種類（subclass）（同型體；isotype）。例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、及IgA2。不同種類的免疫球蛋白所對應的重鏈恆定區分別稱為α、δ、ε、γ、及μ。
「效應（effector）功能」是指起因於抗體的Fc區域之因抗體的同型體而不同的生物學活性。抗體的效應功能之例包含下述者：C1q結合及補體依賴性細胞毒性（complement dependent cytotoxicity：CDC）；Fc受體結合；抗體依賴性細胞媒介的細胞毒性（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity：ADCC）；吞噬作用；細胞表面受體（例如B細胞受體）的下游調控；及B細胞的活化。
「細胞毒性」是指損害或妨礙細胞功能及/或引起細胞死亡或破壞的活性。細胞毒性可為例如抗體依賴性細胞媒介的細胞毒性（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity：ADCC）、補體依賴性細胞毒性（complement dependent cytotoxicity：CDC）、及因T細胞的細胞毒性等，也可以是如免疫共軛物（immunoconjugate）等之細胞毒性劑（例如放射線同位素或化療劑等）所引起者。
本說明書中「Fc區域」用於定義至少包含恆定區域的一部分之免疫球蛋白的重鏈C端區域。此用語包括天然型序列的Fc區域及突變體Fc區域。在一態樣中，人類IgG重鏈Fc區域從Cys226或從Pro230延伸至重鏈的羧基端。但是，Fc區域的C端的賴胺酸（Lys447）或甘胺酸-賴胺酸（Gly446-Lys447）可存在也可不存在。本說明書中只要沒有特別限定，Fc區域或恆定區域中的胺基酸殘基的編號根據Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD 1991所記載的EU編號系統（也稱為EU index）。
本說明書中「突變Fc區域」包括因至少1個胺基酸修飾，較佳為1個或複數個胺基酸取代，和天然型序列Fc區域不同的胺基酸序列。較佳為，突變Fc區域，和天然型序列Fc區域或親代多胜肽的Fc區域相比，在天然型序列Fc區域中或親代多胜肽的Fc區域中有至少1個胺基酸取代，例如約1~約10個胺基酸取代，較佳為約1~約5個胺基酸取代。本說明書的突變Fc區域較佳具有和天然型序列Fc區域或親代多胜肽的Fc區域至少約80%的相同性，最佳和此等有至少約90%的相同性，更佳和此等有至少約95%的相同性。
本說明書中，Fc區域或恆定區域中的胺基酸改變或取代能夠以EU編號系統和胺基酸之組合來表示。例如，S424N表示EU編號第424位的絲胺酸（Ser）被取代為天門冬醯酸（Asn）。又EU424N表示第424位的胺基酸（不管種類）被取代為天門冬醯酸（Asn）。
本說明書中「含Fc區域的抗體」表示含有Fc區域的抗體。Fc區域C端的賴胺酸（根據EU編號系統為殘基447）或Fc區域C端的甘胺酸-賴胺酸（殘基446-447）可經由例如在抗體的純化之間或編碼抗體的核酸的重組操作而去除。因此，根據本揭示含有具Fc區域的抗體之組合物可包含帶有G446-K447的抗體、帶有G446但不帶有K447的抗體、完全去除G446-K447的抗體、或上述3種的抗體混合物。
「全長抗體」、「完整抗體」、「全部抗體」之詞在本說明書可相互替換，為具有實質上類似天然型抗體結構之結構的抗體，或具有包含以本說明書所定義之Fc區域或突變Fc區域的重鏈之抗體。
「人類抗體」為經人或人類細胞所產生之抗體，或具有對應使用人類抗體組庫（repertory）或其他的人類抗體編碼序列之來自非人類供給源的抗體的胺基酸序列之胺基酸序列的抗體。人類抗體的定義明確排除包含非人類的抗原結合殘基之人源化抗體。
「框架（framework）」或「FR」表示在超可變區域（HVR）殘基以外的可變區殘基。可變區的FR通常由4個FR區：FR1、FR2、FR3、及FR4所構成。據此，HVR及FR的序列通常依下列順序在VH（或VL）出現：FR1-H1（L1）-FR2-H2（L2）-FR3-H3（L3）-FR4。
根據本說明之旨趣，「人類接受者框架（acceptor human framework）」為以下定義之包含來自人類免疫球蛋白框架或人類共有框架（human consensus frameworks）之輕鏈可變區（VL）框架或重鏈可變區（VH）框架的胺基酸序列之框架。「來自」人類免疫球蛋白框架或人類共有框架之人類接受者框架也可包含和該等相同的胺基酸序列，或也可包含胺基酸序列的變更。在一些態樣中，胺基酸的變更的數為10以下、9以下、8以下、7以下、6以下、5以下、4以下、3以下、或2以下。在一些態樣中，VL人類接受者框架和VL人類免疫球蛋白框架序列或人類共有框架序列為相同序列。
「人類共有框架」為人類免疫球蛋白VL或VH框架序列的選擇群中顯示最共同產生的胺基酸殘基之框架。一般，人類免疫球蛋白VL或VH序列的選擇來自可變區序列的次群（subclass）。通常序列的次群為Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD （1991）, vols. 1-3中之次群。在一態樣中，對於VL，次群為上述Kabat等人所述之次群κI （subclass κI）。在一態樣中，對於VH，次群為上述Kabat等人所述之次群III（subclass III）。
「人源化」抗體包括來自非人類HVR的胺基酸殘基及來自人類FR的胺基酸殘基，稱為嵌合抗體。在某態樣中，人源化抗體包含至少1個、典型為2個可變區的實質上的全部，該可變區域中，全部的或實質上全部的HVR（如CDR）對應非人類抗體，且全部的或實質上全部的FR對應人類抗體。人源化抗體也可任意的包含來自人類抗體之抗體恆定區域的至少一部分。抗體（如非人類抗體）的「人源化型態」是指經過人源化的抗體。
「可變區域」或「可變區」是指關於抗體和抗原結合之抗體的重鏈或輕鏈的區域。天然型抗體的重鏈及輕鏈的可變區（分別為VH及VL）通常具有各區包含4個保留的框架區域（FR）及3個超可變區域（HVR）的類似結構（例如參照Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 （2007））。在1個VH或VL區足以賦予抗原結合特異性。而且，與某特定抗原結合的抗體也可使用來自和該抗原結合的抗體之VH或VL區，分別篩選VH或VL區的互補庫而分離。例如參照Portolano et al., J. Immunol. 150：880-887 （1993）； Clarkson et al., Nature 352：624-628 （1991）。
本說明書中使用之「超可變區域」或「HVR」是指在序列中為超可變（「互補性決定區域」或「CDR」（complementarity determining region））、及/或形成結構上定義的環（loop）（「超可變環」）、及/或包含抗原接觸殘基（「抗原接觸」）之抗體的可變區的各區域。通常抗體包含6個HVR：VH有3個（H1、H2、H3）、及VL有3個（L1、L2、L3）。本說明書所例示的HVR包括以下： （a）在胺基酸殘基26-32（L1）、50-52（L2）、91-96（L3）、26-32（H1）、53-55（H2）、及96-101（H3）處產生的超可變環（Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196：901-917（1987））； （b）在胺基酸殘基24-34（L1）、50-56（L2）、89-97（L3）、31-35b（H1）、50-65（H2）、及95-102（H3）處產生的CDR（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD （1991））； （c）在胺基酸殘基27c-36（L1）、46-55（L2）、89-96（L3）、30-35b（H1）、47-58（H2）、及93-101（H3）處產生的抗原接觸（MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262：732-745 （1996））；以及 （d）包含HVR胺基酸殘基46-56（L2）、47-56（L2）、48-56（L2）、49-56（L2）、26-35（H1）、26-35b（H1）、49-65（H2）、93-102（H3）、及94-102（H3）之（a）、（b）、及/或（c）之組合。 除非另有說明，HVR殘基及可變區中的其他殘基（如FR殘基）在本說明書根據上述Kabat等人編號。又本說明書中HVR殘基及可變區中的其他殘基（如FR殘基）、以及該殘基中的胺基酸改變或取代根據Kabat編號系統和胺基酸的組合來表示。例如，N99表示Kabat編號第99位的天冬醯胺酸（Asn），N99A表示Kabat編號第99位的天冬醯胺酸（Asn）取代為丙胺酸（Ala）。
「免疫共軛物（immunoconjugate）」為1個或複數個不同種的分子交聯的抗體（不同種的分子包括但不限於細胞毒性劑）。
本說明書之用語「細胞毒性劑」係指損害或妨礙細胞機能、及/或成為細胞死亡或破壞的原因之物質。細胞毒性劑包括但不限於放射線同位素（例如211 At、131 I、125 I、90 Y、186 Re、188 Re、153 Sm、212 Bi、32 P、212 Pb及Lu的放射線同位素）；化療劑或化療藥（例如氨甲蝶呤（Methotrexate）、阿黴素（Adriamycin）、長春花生物鹼（Vinca alkaloid）類（長春新鹼（Vincristine）、長春花鹼（vinblastine）、依托泊苷（Etoposide））、艾黴素（doxorubicin）、美法侖（Melphalan）、絲裂黴素C（Mitomycin C）、苯丁酸氮芥（chlorambucil）、道諾黴素（daunorubicin）、或其他的嵌入劑（intercalating agents））；增殖抑制劑；核酸分解酵素等的酵素及其片段；抗生素；例如小分子毒素或來自細菌、真菌、植物、或動物之酵素性活性毒素（包括其片段及/或突變體）等的毒素；以及如下揭示之多種抗腫瘤劑或抗癌劑。
「分離的」抗體為從其原本環境的成分分離者。在一些態樣中，抗體以例如電泳（如SDS-PAGE、等電點分離法（isoelectric focusing：IEF）、毛細管電泳法）或柱層析法（如離子交換或逆相HPLC）測量，純化至純度超過95%或99%。抗體純度的評價方法之總說例如參照Flatman et al., J. Chromatogr. B 848：79-87（2007）。
「分離的」核酸是指從其原本環境的成分分離的核酸分子。分離的核酸包括，通常包含該核酸分子的細胞中所含的核酸分子，但該核酸分子存在染色體外或者存在和本來的染色體上的位置不同的染色體上的位置。
本說明書所使用之「載體（vector）」是指可增加連結該等的1個核酸之核酸分子。此用語包含作為自身複製核酸結構的載體，以及重組至導入該等之宿主細胞的基因組（genome）中的載體。某載體可導致本身操作性連結的核酸的表現。此種載體在本說明書也稱為「表現載體」。
「編碼抗CD137抗原結合分子之編碼核酸」是指編碼構成抗原結合分子的多胜肽之1個或複數個核酸分子。「編碼抗CD137抗體之分離核酸」是指編碼抗體的重鏈及輕鏈（或其片段）之1個或複數個核酸分子，包含載於1個載體或別的載體之核酸分子，以及存在宿主細胞中的1個或複數個位置之核酸分子。
「宿主細胞」、「宿主細胞株」、及「宿主細胞培養物」互相交替使用，是指導入外來核酸的細胞（包含此細胞之子代）。宿主細胞包含「轉形體」及「轉形細胞」，這些包含初代的轉形細胞及不論幾代的來自該細胞的子代。子代能夠以和親代細胞的核酸內容完全不一樣，也可以包含突變。具有和在篩選或選擇原始的轉形細胞之時所使用者相同的功能或生物學活性的突變體子代，也包含於本說明書中。
本說明書之「單株抗體」是指從實質上均一的抗體群所得到的抗體。亦即，構成該群的各個抗體，除了可產生的突變抗體（如含自然產生的突變的突變抗體，或在單株抗體製作物的製造中所發生的突變抗體，此種突變抗體通常存在若干量）外，為相同及/或和相同的抗原結合位結合。和典型包含對不同抗原決定位（epitope）的不同抗體之多株抗體製作物對照地，單株抗體製作物的各單株抗體是對抗原上的單一決定位者。因此形容詞「單株」一詞是顯示從實質上均一的抗體群所得到之抗體的特徵，不應解釋為需要任何特定方法製造抗體者。例如根據本揭示所使用之單株抗體包含但不限於利用包含融合瘤法、重組DNA法、噬菌體展示法、人類免疫球蛋白基因座的全部或部分之轉殖動物的方法，可經由多種方法做成，製作單株抗體的方法及其他方法之例記載於本說明書。
「裸抗體」是指沒有交聯不同種的部分（如細胞毒性部分）或放射線標記之抗體。裸抗體也可存在藥物製劑中。
「天然型抗體」是指帶有天然產生的各種結構之免疫球蛋白分子。例如天然型IgG抗體為由雙硫鍵鍵結的2個相同的輕鏈和2個相同的重鏈所構成的約150,000道爾頓的異四聚體糖蛋白。從N端向C端，各重鏈具有也稱為可變重鏈區或重鏈可變區之可變區域（VH），其次是3個恆定區（CH1、CH2、及CH3）。同樣地，從N端向C端，各輕鏈具有也稱為可變輕鏈區或輕鏈可變區之可變區域（VL），其次是恆定輕鏈（CL）區。抗體的輕鏈，根據其恆定區的胺基酸序列，稱為kappa（κ）及lamda（λ），可歸結為2種類型之一。
對參考多胜肽序列之「百分率（%）胺基酸序列相同性」定義為，以得到最大百分率的序列相同性而調整序列且視需要導入間隔（gap）之後，且不考慮任何保留性取代是序列相同性的一部分時，和參考多胜肽序列中的胺基酸殘基相同的候補序列中的胺基酸殘基的百分率。用於確定百分率胺基酸序列相同性的比對（alignment）可使用該技術領域中技術範圍的多種方法，如BLAST、BLAST-2、ALIGN、Megalign（DNASTAR）軟體、或GENETYX（登錄商標）（Genetyx Corporation）等之公開可獲得的電腦軟體而達到。此技術領域之人士可決定在被比較的序列全長中包含達到最大比對所必須的任意演算法之獲得序列比對用的適當參數。
ALIGN-2序列比較電腦程式為Genentech公司的著作，軟體在美國著作權局（U.S. Copyright Office, Wasington D.C., 20559）和使用說明一起提出，登錄為美國著作權登錄號TXU510087。ALIGN-2程式為可公開自Genentech社（Genentech, Inc., South San Francisco, California）獲得，也可從原始碼編輯。ALIGN-2程式為了在含Digital UNIX V4.0D的UNIX操作系統上使用而編輯。所有的序列比較參數根據ALIGN-2程式而設定、不變動。 在胺基酸序列比較上使用ALIGN-2的情形，所給的胺基酸序列A對所給的胺基酸序列B、或者和該等、或對該等的%胺基酸序列相同性（或者也可說是，具有或包含對所給的胺基酸序列B、或者和該等、或對該等的某%胺基酸序列相同性之所給的胺基酸序列A）如以下計算：分率X╱Y的100倍。在此，X為根據序列比對程式ALIGN-2，在該程式的A和B的比對中為相同的一致而給分的胺基酸殘基數，Y為B中的胺基酸殘基的全數。在胺基酸序列A的長度和胺基酸序列B的長度不相等時，應理解A對B的%胺基酸序列相同性和B對A的胺基酸序列相同性不同。除非有另外說明，本說明書所使用的所有%胺基酸序列相同性的值，如前段所述，為使用ALIGN-2電腦程式所得者。
「藥物製劑」是指其中所含的有效成分之生物學活性可發揮效果之形態的調配物，且不包含有投予製劑的被試驗體不能容許的程度的毒性的追加要件之調配物。
「藥學上容許載劑」是指對被試驗體無毒的、在藥物製劑中的有效成分以外的成分。藥學上容許載劑包含但不限於緩衝液、賦形劑、穩定劑、或防腐劑。
某劑（如藥物製劑）的「有效量」為達到所欲治療或預防之結果的有效之必要用量及必要期間的量。
「個體」或「被試驗體」為哺乳動物。哺乳動物包括但不限於飼養動物（如牛、羊、貓、狗、馬）、靈長類（如人、及猿等的非人靈長類）、兔、以及囓齒類（如小鼠及大鼠）。在特定態樣中，個體或被試驗體為人類。
本說明書所述之「CD137」，除非有特別說明，為包含來自靈長類（如人類）及囓齒類（如小鼠及大鼠）等的哺乳動物之任意脊椎動物供給源之任意天然型CD137。此用語也包含未接受「全長」加工（processing）的CD137，也包含細胞中加工結果所產生的任何形態的CD137。此用語也包含自然產生的CD137的突變體，例如剪接突變體或對偶基因突變體。人類CD137的全長胺基酸序列之例，如序列識別號：1（NCBI Reference Sequence：NP_001552.2），人類CD137的細胞外區域的胺基酸序列之例，如序列識別號：2。小鼠CD137的全長胺基酸序列之例，如序列識別號：3（NCBI Reference Sequence：NP_035742.1），小鼠CD137的細胞外區域的胺基酸序列之例，如序列識別號：4。猿CD137的全長胺基酸序列之例，如序列識別號：5（NCBI Reference Sequence：ABY47575.1），猿CD137的細胞外區域的胺基酸序列之例，如序列識別號：6。 CD137為腫瘤壞死因子（TNF）受體家族的成員。代替的名稱為腫瘤壞死因子受體超家族成員9（TNFRSF9）、4-1BB、ILA。除了在已活化的CD4+ 及CD8+ T細胞上的表現外，CD137也在B細胞、樹突細胞、自然殺手細胞（NK）及NK-T細胞、巨噬細胞、單核球、嗜中性球、CD4+ CD25+ 調節T細胞、及血管內皮細胞被表現。也顯示在癌細胞中也被表現（Labiano等, Oncoimmunology, 24卷：e1062967（2015年））。其天然的配體之CD137L在B細胞、單核球/巨噬細胞、及樹突細胞等的抗原呈現細胞上呈現（Watts等, Annu.Rev.Immunol., 23卷：23-68頁（2005年））。在和其配體的交互作用中，CD137會導致TCR誘導性的T細胞增殖的增加、細胞激素的產生、功能上的成熟、細胞自滅的抑制、及長期的CD8+ T細胞的生存（Nam等, Curr.Cancer Drug Targets, 5卷：357-363頁（2005年）; Watts等, Annu.Rev.Immunol., 23卷：23-68頁（2005年））。
所謂「調節T細胞」或「Treg細胞」為負責免疫反應的抑制的調節（免疫耐受）的T細胞。在一態樣，調節T細胞為CD4陽性及/或CD25陽性T細胞。
所謂「癌症」、「癌」、「癌性」是指或說明因未調節的細胞成長/增殖的典型特徵之哺乳動物中的生理學狀態。
所謂「腫瘤」是指不管惡性或良性，所有新生物性細胞成長及增殖以及所有的前癌性及癌性細胞及組織。所謂「癌症」、「癌」、「癌性」、「細胞增殖性障礙」、「增殖性障礙」及「腫瘤」，在本說明書所述，彼此不互相排斥。
所謂「細胞增殖性障礙」及「增殖性障礙」是指一定程度的異常細胞增殖相關的障礙。在一態樣中，細胞增殖性障礙為癌。
本說明書所使用之「治療」（及其文法上的衍生字，如「進行治療」、「進行治療者」等）表示企圖改變被治療的個體的自然經過之臨床的介入，也可為了預防，在臨床的病態經過的期間實施。治療的期望效果包括但不限於疾病的發生或復發的防止、症狀的減緩、因疾病之任意的直接或間接的病理上的影響的減弱、轉移的防止、疾病進行速度的減慢、疾病狀態的回復或和緩、及紓解或改善的預後。在一些態樣中，本揭示之抗體延緩疾病的發作或用於使疾病的進行延緩。
II.組合物及方法（抗CD137促控抗原結合分子） 在一方面，本揭示為基於抗CD137促控抗原結合分子及該等的使用部分。在特定態樣中，提供和CD137結合的抗體。本揭示之抗體因可發揮免疫細胞的活化作用、細胞毒性、或抗腫瘤活性，例如可用於癌症的診斷或治療。
A.抗CD137抗原結合分子或抗體之例 在一方面，本揭示提供和CD137結合之分離的抗原結合分子或抗體。在特定態樣中，CD137抗原結合分子或抗體： ‧具有小分子化合物依賴的CD137結合活性； ‧和CD137的細胞外區域結合； ‧和小分子化合物及CD137共同形成三者複合體； ‧和來自人類及猿的CD137結合； ‧為CD137活性的促效劑； ‧在小分子化合物存在下，顯示對CD137的促效劑活性； ‧在小分子化合物不存在下，對CD137的促效劑活性低；及/或 ‧在小分子化合物不存在下，實質上不顯示對CD137的促效劑活性。
［抗原結合分子或抗體的結合活性］ 在特定態樣中，本說明書所提供之抗原結合分子或抗體的結合活性（binding activity），在小分子化合物的存在下，具有≦1μM、≦100nM、≦10nM、≦1nM、≦0.1nM、≦0.01nM或≦0.001nM（例如10-6 M以下、10-7 M以下、10-8 M以下、10-9 M以下、10-10 M以下，例如10-6 M~10-10 M、10-7 M~10-9 M，例如10-7 M~10-8 M）的解離常數（KD）。
在一態樣中，抗原結合分子或抗體的結合活性（binding activity）經放射性標記抗原結合測量法（radiolabeled antigen binding assay：RIA）測量，以KD表示。在一態樣中，RIA是使用目標抗體的Fab版及其抗原而實施。例如Fab對抗原的溶液中的結合親和性，經由在非標記抗原的漸增量系列存在下，經最小濃度的（125 I）標記抗原使Fab平衡化，之後經由已塗佈抗Fab抗體的微量盤來捕捉結合的抗原而測量（例如Chen et al., J. Mol. Biol. 293：865-881（1999））。為了建構測量條件，將MICROTITER（登錄商標）多孔微量盤（Thermo Scientific）以50mM碳酸鈉（pH9.6） 中5μg/ml的捕捉用抗Fab抗體（Cappel Labs）塗佈一晚，之後在室溫（約23℃）2~5小時，以PBS中2%（w/v）胎牛血清白蛋白阻斷。在非吸附微量盤（Nunc #269620）中，將100 pM或26 pM的［125 I］-抗原（同Presta et al., Cancer Res. 57：4593-4599 （1997）中的抗VEGF抗體、Fab-12的評價）和目標Fab的階段稀釋物混合。之後，將目標Fab培養一晚，但此培養可繼續更長的時間（如約65個小時）以確實達到平衡。之後將混合物移到室溫培養（如1小時）用的捕捉微量盤。之後去除溶液，用PBS中0.1％聚山梨醇酯20（TWEEN-20（登錄商標））清洗微量盤8次。使微量盤乾燥，添加150μl/孔的閃爍液（MICROSCINT-20（商標）, Packard），在TOPCOUNT（商標）Gamma計數器（Packard）中計數微量盤10分鐘。選擇產生最大結合的20%以下之各Fab的濃度，以用於競爭結合分析法中。
在一態樣中，抗體的結合活性（binding activity）使用以表面電漿共振分析法作為測量原理之如BIACORE（登錄商標）T200或BIACORE（登錄商標）4000（GE Healthcare, Uppsala, Sweden）的配體捕捉法。機器操作使用BIACORE（登錄商標）控制軟體。在一態樣中，根據提供方的指示使用胺偶聯套組（GE Healthcare, Uppsala, Sweden），在塗佈羧甲基糊精的感應晶片（GE Healthcare, Uppsala, Sweden），固定如抗tag抗體、抗IgG抗體、蛋白A等的配體捕捉用分子。配體捕捉用分子使用適當的pH之10mM乙酸鈉溶液稀釋，以適當的流速及時間注入。結合活性的測量使用含有0.05%聚山梨醇酯20（其他名稱為Tween（登錄商標）-20）的緩衝液作為測量用緩衝液，在流速10~30μL/分、測量溫度較佳為25℃或37℃測量。在配體捕捉用分子以抗體作為配體而捕捉、實施測量之情形，在注入抗體並捕捉目標量後，使用測量用緩衝液注入所製作的抗原及/或Fc受體的階段稀釋物（分析物（analyte））。在配體捕捉用分子以抗原及/或Fc受體作為配體而捕捉、實施測量之情形，注入抗原及/或Fc受體並捕捉目標量後，使用測量用緩衝液注入所製作的抗體的階段稀釋物（分析物）。
在一態樣中，測量結果使用BIACORE（登錄商標）評價軟體來分析。使用動力學參數（kinetics parameter）計算1：1的結合模式，使結合及解離的感應柱同時符合而進行，可算得結合速度（kon或ka）、解離速度（koff或kd）、平衡解離常數（KD）。在結合活性弱、特別是解離快之動力學參數計算困難的情形，也可使用穩定狀態（steady state）模式計算平衡解離常數（KD）。結合活性的其他參數，將特定的濃度之分析物的結合量（resonance unit：RU）除以配體的捕捉量（RU），也可以算出「每單位配體量的分析物結合量」。
［小分子化合物依賴的結合活性］ 在一方面，抗CD137抗原結合分子或抗體具有小分子化合物依賴的CD137結合活性。在非限定的一態樣中，抗CD137抗原結合分子或抗體在小分子化合物的存在下對CD137的結合活性，比該小分子化合物不存在下的CD137的結合活性高。在不同的一態樣中，抗CD137抗原結合分子或抗體在高濃度小分子化合物的存在下對CD137的結合活性，比低濃度的該小分子化合物的存在下對CD137的結合活性高。在較佳一態樣中，抗CD137抗原結合分子或抗體在小分子化合物的存在下對CD137的結合活性，是該小分子化合物不存在下的CD137的結合活性的2倍以上、3倍以上、5倍以上、10倍以上、15倍以上、20倍以上、25倍以上、30倍以上、50倍以上、100倍以上、200倍以上、300倍以上、500倍以上、1×103 倍以上、2×103 倍以上、3×103 倍以上、5×103 倍以上、1×104 倍以上、2×104 倍以上、3×104 倍以上、5×104 倍以上、或1×105 倍以上。在不同的較佳一態樣中，抗CD137抗原結合分子或抗體在高濃度小分子化合物的存在下對CD137的結合活性，是該小分子化合物不存在下的CD137的結合活性的高於2倍、高於3倍、高於5倍、高於10倍、高於15倍、高於20倍、高於25倍、高於30倍、高於50倍、高於100倍、高於200倍、高於300倍、高於500倍、高於1×103 倍、高於2×103 倍、上、高於3×103 倍、高於5×103 倍、高於1×104 倍、高於2×104 倍、高於3×104 倍、高於5×104 倍、或高於1×105 倍。
小分子化合物的濃度只要可以檢驗出抗CD137抗原結合分子或抗體的結合活性的差異，可選擇任意的濃度。在一態樣中，「小分子化合物的存在下」及/或「高濃度小分子化合物的存在下」之小分子化合物的濃度，可例如100nM以上、500nM以上、1μM以上、3μM以上、5μM以上、10μM以上、50μM以上、100μM以上、150μM以上、200μM以上、250μM以上、300μM以上、400μM以上、500μM以上、或1mM以上的濃度。或者，也可以顯示各抗CD137抗原結合分子或抗體的最大結合活性的足夠量作為此述之濃度。又在一態樣中，「低濃度小分子化合物的存在下」之小分子化合物的濃度可例如500μM以下、250μM以下、200μM以下、150μM以下、100μM以下、50μM以下、10μM以下、1μM以下、500nM以下、100nM以下、50nM以下、10nM、或1nM以下的濃度。也可選擇小分子化合物的濃度為零或實質的濃度為零的情形作為低濃度的一態樣。 在此，「實質的濃度為零」可例如，雖然小分子化合物存在但以現今技術不能檢出其濃度之程度的極微量濃度。
在一態樣中，在10μM、50μM、100μM、150μM、200μM、或250μM的小分子化合物存在下對CD137的結合活性，是該小分子化合物不存在下對CD137的結合活性的2倍以上、5倍以上、10倍以上、15倍以上、16倍以上、17倍以上、18倍以上、19倍以上、或20倍以上。在一態樣中，抗CD137抗原結合分子或抗體在10μM以上的小分子化合物的存在下對CD137的結合活性，是該小分子化合物不存在下對CD137的結合活性的2倍以上、5倍以上、10倍以上、15倍以上、16倍以上、17倍以上、18倍以上、19倍以上、或20倍以上。在一態樣中，抗CD137抗原結合分子或抗體在100μM以上的小分子化合物的存在下對CD137的結合活性，是該小分子化合物不存在下對CD137的結合活性的2倍以上、5倍以上、10倍以上、15倍以上、16倍以上、17倍以上、18倍以上、19倍以上、或20倍以上。
在一態樣中，抗CD137抗原結合分子或抗體在10μM以上的小分子化合物的存在下對CD137的結合活性（KD）為9×10-7 M以下、8×10-7 M以下、7×10-7 M以下、6×10-7 M以下、5×10-7 M以下、或4×10-7 M以下的解離常數（KD），較佳為5×10-7 M以下的解離常數（KD）。在更一態樣中，抗CD137抗原結合分子或抗體在該小分子化合物不存在下對CD137的結合活性（KD）為，以Biacore不能計算的程度（結合活性弱）、或1×10-7 M以上、5×10-7 M以上、7×10-7 M以上、8×10-7 M以上、9×10-7 M以上、1×10-6 M以上、2×10-6 M以上、3×10-6 M以上、或4×10-6 M以上的解離常數（KD），較佳為1×10-6 M以上的解離常數（KD）。在別的一態樣中，抗CD137抗原結合分子或抗體在100μM以上的小分子化合物的存在下對CD137的結合活性（KD）為，9×10-7 M以下、8×10-7 M以下、7×10-7 M以下、6×10-7 M以下、5×10-7 M以下、4×10-7 M以下、3×10-7 M以下、2×10-7 M以下、1×10-7 M以下的解離常數（KD），較佳為2×10-7 M以下的解離常數（KD）。在更一態樣中，抗CD137抗原結合分子或抗體進一步在該小分子化合物不存在下對CD137的結合活性（KD）為，以Biacore不能計算的程度（結合活性弱）、或1×10-7 M以上、5×10-7 M以上、7×10-7 M以上、8×10-7 M以上、9×10-7 M以上、1×10-6 M以上、2×10-6 M以上、3×10-6 M以上、或4×10-6 M以上的解離常數（KD），較佳為1×10-6 M以上的解離常數（KD）。
在一態樣中，抗CD137抗原結合分子或抗體在10μM以上的小分子化合物的存在下對CD137的結合活性（KD）為，8×10-8 M以下的解離常數（KD），在該小分子化合物不存在下對CD137的結合活性（KD）為，以Biacore不能計算的程度（結合活性弱）。在別的一態樣中，抗CD137抗原結合分子或抗體在100μM以上的小分子化合物的存在下對CD137的結合活性（KD）為，2×10-8 M以下的解離常數（KD），在該小分子化合物不存在下對CD137的結合活性（KD）為，以Biacore不能計算的程度（結合活性弱）。
在一方面，本揭示提供，［在10μM以上的小分子化合物的存在下對CD137的結合活性（結合量）］╱［在該小分子化合物不存在下對CD137的結合活性（結合量）］之值，等於或大於參考抗CD137抗原結合分子之抗CD137抗原結合分子或抗體。在不同的一方面，本揭示提供，［在100μM以上的小分子化合物的存在下對CD137的結合活性（結合量）］╱［在該小分子化合物不存在下對CD137的結合活性（結合量）］之值，等於或大於參考抗CD137抗原結合分子之抗CD137抗原結合分子或抗體。在上述任一方面中，參考抗CD137抗原結合分子可選自包含和表37所載之A375/B167、A372/B040、A356/B040、A486/B167、A487/B167、A488/B226、A489/B223、A548/B376、A551/B256、A551/B379、A555/B379、A548/B256、或A549/B167所含之HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3的胺基酸序列相同之HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3之抗CD137抗體。
在一態樣中，參考抗CD137抗原結合分子為包含表37所載之A375/B167、A372/B040、A356/B040、A486/B167、A487/B167、A488/B226、A489/B223、A548/B376、A551/B256、A551/B379、A555/B379、A548/B256、或A549/B167之胺基酸序列為重鏈可變區/輕鏈可變區之組合的抗體。在一較佳態樣中，參考抗原結合分子為包含和A375/B167所含的HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3之胺基酸序列相同之HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3的抗CD137抗體。在更一態樣中，參考抗CD137抗原結合分子為包含A375/B167為重鏈可變區/輕鏈可變區之組合的抗CD137抗體。在不同的一較佳態樣中，參考抗原結合分子為包含和A551/B379所含之HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3的胺基酸序列相同之HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3的抗CD137抗體。在更一態樣中，參考抗CD137抗原結合分子為包含A551/B379為重鏈可變區/輕鏈可變區之組合的抗CD137抗體。在一較佳態樣中，參考抗原結合分子包含來自人類的重鏈恆定區及輕鏈恆定區（如重鏈恆定區為G1T3（序列識別號：138）及輕鏈恆定區為人類λ鏈Lamlib（序列識別號：63））。
在一方面，本揭示提供，在小分子化合物不存在下對CD137的結合活性（結合量）等於或小於參考抗CD137抗原結合分子，且在10μM以上的該小分子化合物的存在下對CD137的結合活性（結合量）等於或大於在相同條件下的參考抗CD137抗原結合分子對CD137的結合活性之抗CD137抗原結合分子或抗體。在不同的一方面，本揭示提供，在小分子化合物不存在下對CD137的結合活性等於或小於參考抗CD137抗原結合分子，且在10μM以上的該小分子化合物存在下對CD137的結合活性（結合量）等於或大於在相同條件下的參考抗CD137抗原結合分子對CD137的結合活性（結合量）之抗CD137抗原結合分子或抗體。在上述任一方面中，參考抗CD137抗原結合分子可選自包含表37所載之A375/B167、A372/B040、A356/B040、A486/B167、A487/B167、A488/B226、A489/B223、A548/B376、A551/B256、A551/B379、A555/B379、A548/B256、或A549/B167所含的HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3之胺基酸序列相同的HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3之抗CD137抗體。
在一態樣中，參考抗CD137抗原結合分子為包含表37所載之A375/B167、A372/B040、A356/B040、A486/B167、A487/B167、A488/B226、A489/B223、A548/B376、A551/B256、A551/B379、A555/B379、A548/B256、或A549/B167之胺基酸序列作為重鏈可變區/輕鏈可變區之組合的抗CD137抗體。在一較佳態樣中，參考抗CD137抗原結合分子為包含和A375/B167所含之HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3的胺基酸序列相同之HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3之抗CD137抗體。在又一態樣中，參考抗CD137抗原結合分子為包含A375/B167作為重鏈可變區/輕鏈可變區之組合的抗CD137抗體。在不同的一較佳態樣中，參考抗CD137抗原結合分子為包含和A551/B379所含之HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3的胺基酸序列相同之HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3之抗CD137抗體。再一態樣中，參考抗CD137抗原結合分子為包含A551/B379作為重鏈可變區/輕鏈可變區之組合的抗CD137抗體。在一較佳態樣中，參考抗原結合分子包含來自人類的重鏈恆定區及輕鏈恆定區（如重鏈恆定區為G1T3（序列識別號：138）及輕鏈恆定區為人類λ鏈Lamlib（序列識別號：63））。
在一方面，本揭示提供，［在1μM的小分子化合物的存在下對CD137的結合活性（KD）］╱［在10μM以上的該小分子化合物存在下對CD137的結合活性（KD）］之值等於或大於參考抗原結合分子之抗CD137抗原結合分子或抗體。在不同的一方面，本揭示提供，［在1μM的小分子化合物的存在下對CD137的結合活性（KD）］╱［在100μM以上的該小分子化合物存在下對CD137的結合活性（KD）］之值等於或大於參考抗原結合分子之抗CD137抗原結合分子或抗體。在上述任一方面中，參考抗原結合分子可選自包含和表37所載之A375/B167、A372/B040、A356/B040、A486/B167、A487/B167、A488/B226、A489/B223、A548/B376、A551/B256、A551/B379、A555/B379、A548/B256、或A549/B167所含的HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3之胺基酸序列相同的HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3之抗體。
在一態樣中，參考抗原結合分子為包含表37所載之A375/B167、A372/B040、A356/B040、A486/B167、A487/B167、A488/B226、A489/B223、A548/B376、A551/B256、A551/B379、A555/B379、A548/B256、或A549/B167之胺基酸序列作為重鏈可變區/輕鏈可變區之組合的抗體。在一較佳態樣中，參考抗原結合分子為包含和A375/B167所含之HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3的胺基酸序列相同之HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3之抗體。在更一態樣中，參考抗原結合分子為包含A375/B167為重鏈可變區/輕鏈可變區之組合的抗體。在不同的一較佳態樣中，參考抗原結合分子為包含和A551/B379所含之HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3的胺基酸序列相同之HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3之抗體。更一態樣中，參考抗原結合分子為包含A551/B379為重鏈可變區/輕鏈可變區之組合的抗體。在一較佳態樣中，參考抗原結合分子包含來自人類的重鏈恆定區及輕鏈恆定區（如重鏈恆定區為G1T3（序列識別號：138）及輕鏈恆定區為人類λ鏈Lamlib（序列識別號：63））。
在一態樣中，在小分子化合物存在下、不存在下、高濃度存在下及/或低濃度存在下之抗CD137抗體對CD137的結合活性以表面電漿共振分析法為測量原理，如使用BIACORE（登錄商標）T200的配體捕捉法測量。
詳細的抗CD137抗體對CD137的結合活性之測量方法之例如下所述。在一態樣中，抗CD137抗體對CD137的結合活性以BIACORE（登錄商標）T200來評價。在一較佳態樣，此測量使用20mM ACES（pH 7.4）、150 mM NaCl、2 mM MgCl2 、0.05 % Tween20作為實驗緩衝液（running buffer）在37℃實施。在一態樣中，本測量中，配體捕捉用分子以抗體為配體捕捉來進行測量。具體地說，首先，對系列S感應晶片CM3（GE Healthcare）上固定有確定蛋白A（Sure Protein A）（GE Healthcare）的晶片，和實驗緩衝液所製作的抗體溶液進行交互作用，捕捉適量（如約100RU、200RU、300RU、400RU、或500RU）的抗體。
在一較佳態樣中，捕捉約100～500RU、較佳約250～400RU的抗體。之後，以添加小分子化合物成為目標濃度（如1μM、10μM、50μM、或100μM）之實驗緩衝液所調配的CD137溶液，或者以不含該小分子化合物的實驗緩衝液所調配的CD137溶液進行交互作用，評價在小分子化合物存在下及該小分子化合物不存在下，和CD137的結合活性。CD137溶液中的CD137濃度可適當決定，例如在使用hCD137-HisBAP（參照參考實施例1-1）作為抗原的情形，在抗原濃度0 nM、15.625 nM、62.5 nM、250 nM、及1000nM分別測量。在一態樣中，抗CD137抗體對人類CD137的解離常數（KD）以Biacore T200評價軟體2.0計算。具體地說，經測量所得的感應柱以1：1朗繆爾結合模式（Langmuir binding model）整體擬合（global fitting），計算結合速率常數ka （L/mol/s）、解離速率常數kd （1/s），從該值算出解離常數KD （mol/L）。
進一步詳細的抗CD137抗體對CD137的結合活性之測量方法之例如下所述。抗CD137抗體對人類CD137的結合活性以Biacore T200來評價。對人類CD137的結合測量使用20mM ACES（pH 7.4）、150mM NaCl、2mM MgCl2 、0.05% Tween20作為實驗緩衝液（running buffer）在37℃實施。首先，對系列S感應晶片CM3（GE Healthcare）上固定有確定蛋白A（Sure Protein A）（GE Healthcare）的晶片，和實驗緩衝液所製作的抗體溶液進行交互作用，捕捉約250～400RU的抗體。之後，以添加ATP成為目標濃度（如1μM、10μM、50μM、或100μM）的實驗緩衝液所調配的人類CD137溶液，或者以不含ATP的實驗緩衝液所調配的人類CD137溶液進行交互作用，評價在ATP存在下及ATP不存在下，和人類CD137的結合活性。抗原人類CD137使用參考實施例（1-1）方法所製作的hCD137-HisBAP，在抗原濃度0nM、15.625nM、62.5nM、250nM、及1000nM分別進行測量。晶片使用25mM NaOH或10mM甘胺酸鹽酸鹽（glycine-HCl）（pH1.5）再生，重複捕捉抗體進行測量。各抗體對人類CD137的解離常數使用Biacore T200評價軟體2.0計算。具體地說，經測量所得的感應柱以1：1朗繆爾結合模式整體擬合，計算結合速率常數ka（L/mol/s）、解離速率常數kd（1/s），從該等值算出解離常數KD（mol/L）。
在一態樣中，抗CD137抗體對CD137（較佳對人類CD137）的結合活性也能夠以「每單位抗體量的CD137結合量」來表示。具體地說，使用上述BIACORE（登錄商標）T200的測量方法所得的感應柱，將對CD137的抗體的結合量（RU）除以抗體的捕捉量（RU），計算出「每單位抗體量的CD137結合量」。在一態樣中，抗CD137抗體對CD137（較佳對人類CD137）的結合活性能夠以參考實施例5-3或6-2所載的方法測量。
本說明書中所謂「小分子」、「小分子化合物」是指存在活體的「活體高分子」以外的來自天然的化學物質或來自非天然的化學物質。較佳為標靶組織特異性化合物或非天然化合物，但不限於此。在一態樣中，本揭示之「小分子化合物」為「癌組織特異性化合物」或「癌組織特異性代謝產物」。本揭示中所謂「癌組織特異的化合物（癌組織特異性化合物）」是指和非癌組織相比，在癌組織中差異性地存在之化合物。本說明書中，「癌」一般是用於表示惡性新生物，可以是轉移性或非轉移性。「代謝」是指生物組織內所產生的化學變化者，包含「同化」及「異化」。同化表示分子的生合成或蓄積，異化表示分子的分解。「代謝產物」是起因於物質代謝之中間產物或生成物。
所謂「標靶組織」是指以送達本揭示之抗原結合分子為目的之活體內的任意組織。標靶組織可以是各種臟器等的組織學上區別的組織，也可以是健康的組織及疾病狀態的組織等的病理上區別的組織。在特定態樣中，標靶組織為腫瘤組織。在一方面，「非標靶組織」表示活體內標靶組織以外的組織。
所謂「腫瘤組織」表示包含至少一個腫瘤組織之組織。腫瘤組織通常由腫瘤為主的腫瘤細胞的集團（實質）和存在於此等的支持腫瘤的結締組織或血管（間質）所成立。有兩者的區別明顯的，也有兩者混合的。腫瘤組織內也有免疫細胞等浸潤。在一方面，「非腫瘤組織」表示活體內腫瘤組織以外的組織。無疾病狀態的健康組織/正常組織為非腫瘤組織的代表例。
作為本揭示所使用的癌組織特異性化合物或癌組織特異性代謝產物之非限定的一態樣，宜舉例選自以下詳述之化合物之至少一個化合物。至少一個化合物表示，後述的相同抗原結合區對抗原的結合活性包含，一種癌組織特異性化合物、或癌組織特異性代謝產物依賴，及複數種癌組織特異性化合物、或癌組織特異性代謝產物依賴之情形。
本說明書中所使用之「標靶組織特異性化合物」是指和非標靶組織相比，在標靶組織中差異性存在的化合物。在一些態樣中，標靶組織特異性化合物存在標靶組織但不存在非標靶組織，或存在非標靶組織但不存在標靶組織等的定性的標靶組織特異性所規定之化合物。在別的態樣中，標靶組織特異性化合物可為，和非標靶組織相比，以不同的濃度（如高濃度或低濃度）存在標靶組織等的定量的標靶組織特異性所規定的化合物。在特定態樣中，標靶組織特異性化合物，和非標靶組織相比，以例如1.05倍以上、1.1倍以上、1.15倍以上、1.2倍以上、1.25倍以上、1.3倍以上、1.35倍以上、1.4倍以上、1.45倍以上、1.5倍以上、1.55倍以上、1.6倍以上、1.65倍以上、1.7倍以上、1.75倍以上、1.8倍以上、1.85倍以上、1.9倍以上、1.95倍以上、2倍以上、2.1倍以上、2.2倍以上、2.3倍以上、2.4倍以上、2.5倍以上、3倍以上、5倍以上、10倍以上、50倍以上、100倍以上、103 倍以上、104 倍以上、105 倍以上、106 倍以上、或該等以上的高濃度存在標靶組織。在別的態樣中，標靶組織特異性化合物，和非標靶組織相比，以例如1.05倍以上、1.1倍以上、1.15倍以上、1.2倍以上、1.25倍以上、1.3倍以上、1.35倍以上、1.4倍以上、1.45倍以上、1.5倍以上、1.55倍以上、1.6倍以上、1.65倍以上、1.7倍以上、1.75倍以上、1.8倍以上、1.85倍以上、1.9倍以上、1.95倍以上、2倍以上、2.1倍以上、2.2倍以上、2.3倍以上、2.4倍以上、2.5倍以上、3倍以上、5倍以上、10倍以上、50倍以上、100倍以上、103 倍以上、104 倍以上、105 倍以上、106 倍以上、或該等以上的高濃度存在非標靶組織。在特定態樣中，標靶組織特異性化合物，和非標靶組織相比，以統計學上有意義的高或低的濃度（亦即，使用Welch's t test或Wilcoxon的順位和檢定任一者而確定，p值未滿及/或q值未滿0.10）存在標靶組織。在特定態樣中，標靶組織特異性化合物為腫瘤組織特異性化合物。
在特定態樣中，腫瘤組織特異性化合物為腫瘤細胞特異性代謝所產生的代謝產物。代謝產物可以是生命活動所必須的代謝所生成的產物（一次代謝產物），也可以是生命活動不一定需要的代謝所生成的產物（二次代謝產物）。一次代謝產物可例如糖、蛋白質、脂質、核酸等。二次代謝產物可例如抗生素或色素等。代謝產物可以是活體高分子，也可以是小分子。在特定態樣中，活體高分子為一種以上的重複單位所構成的分子量約5000以上的分子，包含例如多醣類、多胜肽、及多核苷酸等。在特定態樣中，小分子為分子量約500以下的分子，存在活體內的化學物質。在另外的態樣中，腫瘤組織特異性化合物為腫瘤細胞中特異性生成的小分子代謝產物（Eva Gottfried, Katrin Peter and Marina P. Kreutz, From Molecular to Modular Tumor Therapy （2010） 3 （2）, 111-132）。在另外的態樣中，腫瘤組織特異性化合物為浸潤腫瘤組織的細胞（如免疫細胞等）或存在腫瘤組織的間質細胞（腫瘤相關纖維母細胞（CAF）等）特異性產生的代謝產物。浸潤腫瘤組織的免疫細胞例如樹突細胞、抑制性樹突細胞、調節T細胞（regulatory T cell）、耗竭T細胞（exhausted T cell）、來自骨髓的抑制細胞（myeloma derived suppressor cell，MDSC）等。在另外的態樣中，為存在腫瘤組織內的細胞（如腫瘤細胞、免疫細胞、間質細胞等）所產生的代謝產物，該等細胞經細胞自滅（apoptosis）或細胞壞死（necrosis）等在細胞死亡之際放出細胞外的代謝產物，也包含在本揭示之腫瘤組織特異性化合物。
為了鑑定腫瘤組織特異性化合物，除了轉錄組、水平的分析（例如，Dhanasekaran等（Nature（2001）412, 822-826）；Lapointe等（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. （2004） 101, 811-816）；或Perou等（Nature （2000） 406, 747-752）所舉例）或者蛋白質組、水平的分析（例如，Ahram等（Mol. Carcinog. （2002）33, 9-15）；Hood等（Mol. Cell. Proteomics （2005） 4, 1741-1753））之外，可適當使用以代謝體學剖析為中心的代謝體學（metabolomics）分析。亦即，為了鑑定被試驗樣本中的代謝產物，可適當使用單獨及/或組合高速液態柱層析法（HPLC）、核磁共振（NMR）（Brindle等（J. Mol. Recognit. （1997） 10, 182-187））、質量分析法（GC/MS及 LC/MS）（Gates及Sweeley（Clin. Chem. （1978） 24, 1663-1673））、及ELISA等之代謝體學剖析。
在特定態樣中，腫瘤組織特異性化合物為選自具有嘌呤環結構的核苷酸、胺基酸及其代謝產物、脂質及其代謝產物、糖代謝的一次代謝產物、以及菸鹼醯胺（nicotinamide）及其代謝產物所組成的群組之至少一個化合物。在另外的態樣中，腫瘤組織特異性化合物為選自下列（1）~（6） 之任一個化合物： (1)  腺苷（ADO）、三磷酸腺苷（ATP）、二磷酸腺苷（ADP）、單磷酸腺苷（AMP）、肌苷等的具有嘌呤環結構的核苷酸； (2)  丙胺酸（alanine）、麩胺酸（glutamic acid）、天冬胺酸（aspartic acid）等的胺基酸； (3)  犬尿胺酸（kynurenine）、鄰胺苯甲酸（anthranilic acid）、3-羥基犬尿胺酸、犬尿喹酸（kynurenic acid）等的胺基酸代謝產物； (4)  前列腺素E2（Prostaglandin E2）等的花生四烯酸（Arachidonic acid）的代謝產物； (5)  乳酸、琥珀酸、檸檬酸等的糖解作用或卡式循環的一次代謝產物；以及 (6)  1-甲基菸鹼醯胺（1-methylnicotinamide）等的菸鹼醯胺的代謝產物。
（1）腺苷（ADO）、三磷酸腺苷（ATP）、二磷酸腺苷（ADP）、單磷酸腺苷（AMP）、肌苷等的具有嘌呤環結構的核苷酸 已知腫瘤細胞在細胞死亡時細胞內大量的ATP釋出到細胞外。因此腫瘤組織中ATP的濃度比正常組織明顯較高（PLoS One. （2008） 3, e2599）。AMP經如細胞外-5’-核苷酸酶（eco-5'-nucleotidase）（CD73）的細胞表面酵素所代謝（Resta及Thompson（Immunol. Rev.（1998）161, 95-109）以及Sadej等（Melanoma Res.（2006）16, 213-222））。腺苷為以低濃度構成性存在細胞外環境的嘌呤核苷酸，被報導在發現固態腫瘤的低氧組織，細胞外腺苷濃度顯著增加（Blay及Hoskin（Cancer Res. （1997）57, 2602-2605））。CD73在腫瘤及免疫細胞的表面表現（Kobie等（J. Immunol. （2006） 177, 6780-6786）），被發現在乳癌（Canbolat等（Breast Cancer Res. Treat. （1996） 37, 189-193））、胃癌（Durak等（Cancer Lett. （1994） 84, 199-202））、胰臟癌（Flocke及Mannherz（Biochim. Biophys. Acta （1991） 1076, 273-281））、及神經膠質母細胞瘤（glioblastoma）（Bardot等（Br. J. Cancer （1994） 70, 212-218））中活性增加。腫瘤組織中腺苷的蓄積被提出可能是因為細胞質的5’-核苷酸酶而使AMP去磷酸化增加（Headrick及Willis（Biochem. J. （1989）261, 541-550））。而且浸潤腫瘤組織的調節T細胞也表現ATP分解酵素、產生腺苷（Proc. Natl. Acad. Sci. USA （2006） 103（35）, 13132-13137、Curr. Med. Chem. （2011）18, 5217-5223）。所產生的腺苷被認為透過A2A受體等的腺苷受體而成為免疫性抑制腫瘤組織的環境（Curr. Med. Chem.（2011） 18, 5217-5223）。根據上述，被認為因嘌呤核苷酸的代謝而在腫瘤組織中高濃度蓄積的ATP、ADP、AMP、或腺苷等，為本揭示所使用之腫瘤組織特異性化合物之例。再者，因為腺苷經腺苷脫氨酶而分解為肌苷，肌苷高濃度蓄積。
在特定態樣中，具有嘌呤環結構的核苷酸包括含腺苷化合物。在特定態樣中，含腺苷化合物可例如腺苷（ADO）、三磷酸腺苷（ATP）、二磷酸腺苷（ADP）、單磷酸腺苷（AMP）、環狀單磷酸腺苷（cAMP）、脫氧腺苷（dADO）、脫氧三磷酸腺苷（aATP）、脫氧二磷酸腺苷（dADP）、脫氧單磷酸腺苷（dAMP）、腺苷γ硫代三磷酸（ATPγS）等。在別的態樣中，具有嘌呤環結構的核苷酸包含為腺苷的代謝產物的肌苷。 又在特定態樣中，具有嘌呤環結構的核苷酸也包含ADPbetaS（Sigma公司）等的市售具有嘌呤環結構的核苷酸。
（2）丙胺酸（alanine）、麩胺酸（glutamic acid）、天冬胺酸（aspartic acid）等的胺基酸 在腫瘤細胞，在活體內作為氮搬運體作用的麩醯胺酸（glutamine）攝入細胞內的速度增加，這樣的麩醯胺酸的攝入，結果導致轉換為麩胺酸及乳酸（麩醯胺酸分解（glutaminolysis）），被認為是腫瘤細胞的特徵（Mazurek及Eigenbrodt （Anticancer Res. （2003） 23, 1149-1154；及Mazurek等（J. Cell. Physiol. （1999） 181, 136-146））。在癌症患者，血漿中麩醯胺酸水平減少，另一方面，麩胺酸濃度增加（Droge等（Immunobiology （1987） 174, 473-479）），又經由肺癌組織的13 C放射性標記的葡萄糖的代謝研究，觀察到13 C標記的琥珀酸、13 C標記的丙胺酸、13 C標記的麩胺酸、及13 C標記的檸檬酸的濃度之間相關。從上述可知，被認為經麩醯胺酸分解等而在腫瘤組織中高濃度蓄積的丙胺酸、麩胺酸、天冬胺酸等，為本揭示所使用之腫瘤組織特異性化合物之例。
（3）犬尿胺酸（kynurenine）、鄰胺苯甲酸（anthranilic acid）、3-羥基犬尿胺酸、犬尿喹酸（kynurenic acid）等的胺基酸代謝產物 吲哚胺2,3-雙加氧酶（IDO）為在黑色素瘤、直腸癌及腎臟癌等多種癌中高度表現的色胺酸代謝酵素（Uyttenhove等（Nat. Med. （2003） 9, 1269-1274）），IDO催化色胺酸轉變為犬尿胺酸。又在不表現IDO的膠質瘤（glioma），經肝臟的色胺酸2,3-雙加氧酶（TDO），由色胺酸生成犬尿胺酸（Opitz等（Nature （2011） 478（7368）, 197-203））。又IDO也在浸潤腫瘤組織的樹突細胞中表現，樹突細胞也產生犬尿胺酸（J. Immunol. （2008） 181, 5396-5404）。又IDO也在腫瘤組織的骨髓來源抑制細胞（MDSC）表現，MDSC也產生犬尿胺酸（Yu等（J. Immunol. （2013） 190, 3783-3797））。犬尿胺酸經犬尿胺酸酶轉變為鄰胺苯甲酸，經由犬尿胺酸3-羥化酶轉變為3-羥基犬尿胺酸。鄰胺苯甲酸及3-羥基犬尿胺酸都轉變為成為NAD前驅體的3-羥基鄰胺苯甲酸。犬尿胺酸經犬尿胺酸氨轉移酶轉變為犬尿喹酸。由上可知，犬尿胺酸、及其代謝產物之鄰胺苯甲酸、3-羥基犬尿胺酸、及犬尿喹酸等，可列舉如本揭示所使用之腫瘤組織特異性化合物、特別是腫瘤細胞特異性代謝產物之例。
（4）前列腺素E2（Prostaglandin E2）等的花生四烯酸（Arachidonic acid）的代謝產物 前列腺素E2（PGE2）促進結腸癌細胞的增殖，抑制其細胞自滅（Sheng等（Cancer Res.（1998）58, 362- 366））。主要發現，在PGE2的合成酵素中，相對於COX-1在幾乎所有組織中構成地表現，COX-2在腫瘤中經某種發炎性細胞激素及癌基因所誘導（Warner及Mitchell（FASEB J. （2004） 18, 790-804））。也報導COX-2的過度表現和乳癌的預後不良（Denkert等（Clin. Breast Cancer （2004） 4, 428-433））、及卵巢癌的急速疾病的進展（Denker等（Mod. Pathol. （2006） 19, 1261-1269））有關連性。又浸潤腫瘤組織的調節T細胞也產生PGE2（Curr. Med. Chem. （2011） 18, 5217-5223）。由上可知，PGE2等的花生四烯酸的代謝產物，可列舉如本揭示所使用之腫瘤組織特異性化合物、特別是腫瘤細胞特異性代謝產物或浸潤腫瘤組織之免疫細胞特異性代謝產物之例。除PGE2外，血栓素A2（Thromboxane A2）（TXA2）在大腸癌等的腫瘤組織的產生亢進（J. Lab. Clin. Med. （1993） 122, 518-523）。
（5）乳酸、琥珀酸、檸檬酸等的糖解作用或卡式循環的一次代謝產物 習知具有作為丙酮酸激酶（pyruvate kinase）、己糖激酶（hexokinase）、及乳酸脫氫酶（LDH）等的糖解作用（Embden-Myerhof路徑）酵素的上游調節（up regulation）之特徵的糖解作用表現型為瓦氏效應（Warburg effect）之固態腫瘤的特徵。已知糖解作用的最終產物之乳酸、經卡式循環所產生的琥珀酸及檸檬酸在腫瘤組織蓄積（Teresa等（Mol. Cancer （2009） 8, 41-59））。由上可知，經糖解作用所生成的一次代謝產物之乳酸、琥珀酸、檸檬酸等，可舉例如本揭示所使用之腫瘤組織特異性化合物、特別是腫瘤細胞特異性代謝產物之例。又已知因細胞死亡而在細胞內高濃度存在之琥珀酸移至細胞外（Nature Immunology, （2008） 9, 1261-1269）。因此認為，在細胞頻繁死亡的腫瘤組織中，琥珀酸的濃度增加。
（6）1-甲基菸鹼醯胺（1-methylnicotinamide）等的菸鹼醯胺的代謝產物 已知在複數個人類腫瘤組織中，菸鹼醯胺N-甲基轉移酶（nicotinamide N-methyltransferase）高度表現。已知因本酵素之菸鹼醯胺的穩定代謝產物之1-甲基菸鹼醯胺分泌於腫瘤細胞的細胞外（Yamada等（J. Nutr. Sci. Vitaminol. （2010） 56, 83-86））。由上可知，被認為經菸鹼醯胺的代謝而在腫瘤組織高濃度蓄積的1-甲基菸鹼醯胺等，可列舉如本揭示所使用之腫瘤組織特異性化合物之例。
本揭示之「抗原結合分子」包含「抗原結合區（domain）」。「抗原結合區」只要是和目標抗原結合，任何結構的區（domain）也可使用。在一態樣中，本揭示之抗原結合區例如，包含抗體的重鏈及/或輕鏈的可變區域、活體內的多種的細胞膜蛋白所含的約35個胺基酸的模組（A domain）的Avimer （國際專利公開案WO2004/044011、WO2005/040229）、包含在細胞膜表現的糖蛋白之纖連蛋白（fibronectin）中的10Fn3區之Adnectin （國際專利公開案WO2002/032925）、由蛋白A的58個胺基酸所構成的IgG結合區作為支架（scaffold）之Affibody （國際專利公開案WO1995/001937）、包含以33個胺基酸的重複序列之錨蛋白重複序列（ankyrin repeat； AR）作為骨架的DARPins （Designed Ankyrin Repeat proteins）（ 國際專利公開案WO2002/020565）、包含以嗜中性球明膠酶相關運載蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipocalin（NGAL））等的以運載蛋白作為骨架的Anticalin （國際專利公開案WO2003/029462）、在八目鰻、盲鰻等的無顎類的後天免疫系統中發揮功能的蛋白質、含有白胺酸殘基多的重複序列（leucine-rich-repeat（LRR））的模組的可變性淋巴球受體（variable lymphocyte receptor（VLR））（國際專利公開案WO2008/016854）等。在特定態樣中，本揭示之抗原結合區包含抗體的重鏈及輕鏈的可變區域。在另外的態樣中，本揭示之抗原結合區例如scFv（single chain Fv）、單鏈抗體（single chain antibody）、Fv、scFv2（single chain Fv 2）、Fab、或F（ab'）2等。
［HVR及可變區域］ 在一方面，本揭示提供包含，選自（a）包含序列識別號：7之胺基酸序列的HVR-H1；（b）包含選自序列識別號：8、9、10、11、12、13、14、15、及16之任一個胺基酸序列的HVR-H2；以及（c）包含選自序列識別號：17、18、19、或20之任一個胺基酸序列的HVR-H3；之至少1個、至少2個、或至少3個全部的VH HVR序列之抗CD137抗原結合分子或抗體。在一態樣中，抗CD137抗原結合分子或抗體包含，（a）包含序列識別號：7之胺基酸序列的HVR-H1；（b）包含選自序列識別號：8、9、10、11、12、13、14、15、及16之任一個胺基酸序列的HVR-H2；以及（c）包含選自序列識別號：17、18、19、或20之任一個胺基酸序列的HVR-H3。
在一態樣中，抗CD137抗原結合分子為包含表37所載之A375/B167、A372/B040、A356/B040、A486/B167、A487/B167、A488/B226、A489/B223、A548/B376、A551/B256、A551/B379、A555/B379、A548/B256、或A549/B167之胺基酸序列作為重鏈可變區╱輕鏈可變區之組合的抗體。在一較佳態樣中，抗CD137抗原結合分子為包含和A375/B167所含的HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3的胺基酸序列相同之HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3的抗CD137抗體。在更一態樣中，抗CD137抗原結合分子為包含A375/B167作為重鏈可變區╱輕鏈可變區之組合的抗體。在不同的一較佳態樣中，抗CD137抗原結合分子為包含和A551/B379所含的HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3的胺基酸序列相同之HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3的抗CD137抗體。在又一態樣中，抗CD137抗原結合分子為包含A551/B379作為重鏈可變區╱輕鏈可變區之組合的抗CD137抗體。
在一態樣中，抗CD137抗原結合分子或抗體包含，（a）包含序列識別號：7之胺基酸序列的HVR-H1；（b）包含序列識別號：8之胺基酸序列的HVR-H2；及（c）包含序列識別號：17之胺基酸序列的HVR-H3。
在一態樣中，抗CD137抗原結合分子或抗體包含，（a）包含序列識別號：7之胺基酸序列的HVR-H1；（b）包含序列識別號：9之胺基酸序列的HVR-H2；及（c）包含序列識別號：17之胺基酸序列的HVR-H3。
在一態樣中，抗CD137抗原結合分子或抗體包含，（a）包含序列識別號：7之胺基酸序列的HVR-H1；（b）包含序列識別號：10之胺基酸序列的HVR-H2；及（c）包含序列識別號：17之胺基酸序列的HVR-H3。
在一態樣中，抗CD137抗原結合分子或抗體包含，（a）包含序列識別號：7之胺基酸序列的HVR-H1；（b）包含序列識別號：11之胺基酸序列的HVR-H2；及（c）包含序列識別號：18之胺基酸序列的HVR-H3。
在一態樣中，抗CD137抗原結合分子或抗體包含，（a）包含序列識別號：7之胺基酸序列的HVR-H1；（b）包含序列識別號：8之胺基酸序列的HVR-H2；及（c）包含序列識別號：18之胺基酸序列的HVR-H3。
在一態樣中，抗CD137抗原結合分子或抗體包含，（a）包含序列識別號：7之胺基酸序列的HVR-H1；（b）包含序列識別號：12之胺基酸序列的HVR-H2；及（c）包含序列識別號：18之胺基酸序列的HVR-H3。
在一態樣中，抗CD137抗原結合分子或抗體包含，（a）包含序列識別號：7之胺基酸序列的HVR-H1；（b）包含序列識別號：13之胺基酸序列的HVR-H2；及（c）包含序列識別號：18之胺基酸序列的HVR-H3。
在一態樣中，抗CD137抗原結合分子或抗體包含，（a）包含序列識別號：7之胺基酸序列的HVR-H1；（b）包含序列識別號：14之胺基酸序列的HVR-H2；及（c）包含序列識別號：19之胺基酸序列的HVR-H3。
在一態樣中，抗CD137抗原結合分子或抗體包含，（a）包含序列識別號：7之胺基酸序列的HVR-H1；（b）包含序列識別號：15之胺基酸序列的HVR-H2；及（c）包含序列識別號：20之胺基酸序列的HVR-H3。
在一態樣中，抗CD137抗原結合分子或抗體包含，（a）包含序列識別號：7之胺基酸序列的HVR-H1；（b）包含序列識別號：16之胺基酸序列的HVR-H2；及（c）包含序列識別號：20之胺基酸序列的HVR-H3。
在一態樣中，抗CD137抗原結合分子或抗體包含，（a）包含序列識別號：7之胺基酸序列的HVR-H1；（b）包含序列識別號：14之胺基酸序列的HVR-H2；及（c）包含序列識別號：17之胺基酸序列的HVR-H3。
在別的方面，本揭示提供包含，選自（a）包含選自序列識別號：21、22、23、24、及25之任一個胺基酸序列的HVR-L1；（b）包含序列識別號：26之胺基酸序列的HVR-L2；以及（c）包含選自序列識別號：27、28、及29之任一個胺基酸序列的HVR-L3之至少1個、至少2個、或至少3個全部的VL HVR序列之抗CD137抗原結合分子或抗體。在一態樣中，抗CD137抗原結合分子或抗體包含，（a）包含選自序列識別號：21、22、23、24、及25之任一個胺基酸序列的HVR-L1；（b）包含序列識別號：26之胺基酸序列的HVR-L2；以及（c）包含選自序列識別號：27、28、及29之任一個胺基酸序列的HVR-L3。
在一態樣中，抗CD137抗原結合分子或抗體包含，（a）包含序列識別號：21之胺基酸序列的HVR-L1；（b）包含序列識別號：26之胺基酸序列的HVR-L2；及（c）包含序列識別號：27之胺基酸序列的HVR-L3。
在一態樣中，抗CD137抗原結合分子或抗體包含，（a）包含序列識別號：22之胺基酸序列的HVR-L1；（b）包含序列識別號：26之胺基酸序列的HVR-L2；及（c）包含序列識別號：27之胺基酸序列的HVR-L3。
在一態樣中，抗CD137抗原結合分子或抗體包含，（a）包含序列識別號：21之胺基酸序列的HVR-L1；（b）包含序列識別號：26之胺基酸序列的HVR-L2；及（c）包含序列識別號：28之胺基酸序列的HVR-L3。
在一態樣中，抗CD137抗原結合分子或抗體包含，（a）包含序列識別號：21之胺基酸序列的HVR-L1；（b）包含序列識別號：26之胺基酸序列的HVR-L2；及（c）包含序列識別號：29之胺基酸序列的HVR-L3。
在一態樣中，抗CD137抗原結合分子或抗體包含，（a）包含序列識別號：23之胺基酸序列的HVR-L1；（b）包含序列識別號：26之胺基酸序列的HVR-L2；及（c）包含序列識別號：27之胺基酸序列的HVR-L3。
在一態樣中，抗CD137抗原結合分子或抗體包含，（a）包含序列識別號：24之胺基酸序列的HVR-L1；（b）包含序列識別號：26之胺基酸序列的HVR-L2；及（c）包含序列識別號：27之胺基酸序列的HVR-L3。
在一態樣中，抗CD137抗原結合分子或抗體包含，（a）包含序列識別號：25之胺基酸序列的HVR-L1；（b）包含序列識別號：26之胺基酸序列的HVR-L2；及（c）包含序列識別號：27之胺基酸序列的HVR-L3。
在別的方面，本揭示之抗CD137抗原結合分子或抗體包含，（a）VH區（VH domain），包含選自（i）包含序列識別號：7之胺基酸序列的HVR-H1，（ii）包含選自序列識別號：8、9、10、11、12、13、14、15、及16之任一個胺基酸序列的HVR-H2，及（iii）包含選自序列識別號：17、18、19、或20之任一個胺基酸序列的HVR-H3之至少1個、至少2個、或至少3個全部的VH HVR序列之VH區；以及（b）VL區（VL domain），包含選自（i）包含選自序列識別號：21、22、23、24、及25之任一個胺基酸序列的HVR-L1，（ii）包含序列識別號：26之胺基酸序列的HVR-L2，及（iii）包含選自序列識別號：27、28、或29之任一個胺基酸序列的HVR-L3之至少1個、至少2個、或至少3個全部的VL HVR序列之VL區。
在別的方面，本揭示提供，包含：（a）包含序列識別號：7之胺基酸序列的HVR-H1；（b）包含序列識別號：8之胺基酸序列的HVR-H2；及（c）包含序列識別號：17之胺基酸序列的HVR-H3；以及（d）包含序列識別號：21之胺基酸序列的HVR-L1；（e）包含序列識別號：26之胺基酸序列的HVR-L2；及（f）包含序列識別號：27之胺基酸序列的HVR-L3之抗CD137抗原結合分子或抗體。
在別的方面，本揭示提供，包含：（a）包含序列識別號：7之胺基酸序列的HVR-H1；（b）包含序列識別號：9之胺基酸序列的HVR-H2；及（c）包含序列識別號：17之胺基酸序列的HVR-H3；以及（d）包含序列識別號：22之胺基酸序列的HVR-L1；（e）包含序列識別號：26之胺基酸序列的HVR-L2；及（f）包含序列識別號：27之胺基酸序列的HVR-L3之抗CD137抗原結合分子或抗體。
在別的方面，本揭示提供，包含：（a）包含序列識別號：7之胺基酸序列的HVR-H1；（b）包含序列識別號：10之胺基酸序列的HVR-H2；及（c）包含序列識別號：17之胺基酸序列的HVR-H3；以及（d）包含序列識別號：22之胺基酸序列的HVR-L1；（e）包含序列識別號：26之胺基酸序列的HVR-L2；及（f）包含序列識別號：27之胺基酸序列的HVR-L3之抗CD137抗原結合分子或抗體。
在別的方面，本揭示提供，包含：（a）包含序列識別號：7之胺基酸序列的HVR-H1；（b）包含序列識別號：11之胺基酸序列的HVR-H2；及（c）包含序列識別號：18之胺基酸序列的HVR-H3；以及（d）包含序列識別號：21之胺基酸序列的HVR-L1；（e）包含序列識別號：26之胺基酸序列的HVR-L2；及（f）包含序列識別號：27之胺基酸序列的HVR-L3之抗CD137抗原結合分子或抗體。
在別的方面，本揭示提供，包含：（a）包含序列識別號：7之胺基酸序列的HVR-H1；（b）包含序列識別號：8之胺基酸序列的HVR-H2；及（c）包含序列識別號：18之胺基酸序列的HVR-H3；以及（d）包含序列識別號：21之胺基酸序列的HVR-L1；（e）包含序列識別號：26之胺基酸序列的HVR-L2；及（f）包含序列識別號：27之胺基酸序列的HVR-L3之抗CD137抗原結合分子或抗體。
在別的方面，本揭示提供，包含：（a）包含序列識別號：7之胺基酸序列的HVR-H1；（b）包含序列識別號：12之胺基酸序列的HVR-H2；及（c）包含序列識別號：18之胺基酸序列的HVR-H3；以及（d）包含序列識別號：21之胺基酸序列的HVR-L1；（e）包含序列識別號：26之胺基酸序列的HVR-L2；及（f）包含序列識別號：28之胺基酸序列的HVR-L3之抗CD137抗原結合分子或抗體。
在別的方面，本揭示提供包含：（a）包含序列識別號：7之胺基酸序列的HVR-H1；（b）包含序列識別號：13之胺基酸序列的HVR-H2；及（c）包含序列識別號：18之胺基酸序列的HVR-H3；以及（d）包含序列識別號：21之胺基酸序列的HVR-L1；（e）包含序列識別號：26之胺基酸序列的HVR-L2；及（f）包含序列識別號：29之胺基酸序列的HVR-L3之抗CD137抗原結合分子或抗體。
在別的方面，本揭示提供包含：（a）包含序列識別號：7之胺基酸序列的HVR-H1；（b）包含序列識別號：14之胺基酸序列的HVR-H2；及（c）包含序列識別號：19之胺基酸序列的HVR-H3；以及（d）包含序列識別號：23之胺基酸序列的HVR-L1；（e）包含序列識別號：26之胺基酸序列的HVR-L2；及（f）包含序列識別號：27之胺基酸序列的HVR-L3之抗CD137抗原結合分子或抗體。
在別的方面，本揭示提供包含：（a）包含序列識別號：7之胺基酸序列的HVR-H1；（b）包含序列識別號：15之胺基酸序列的HVR-H2；及（c）包含序列識別號：20之胺基酸序列的HVR-H3；以及（d）包含序列識別號：24之胺基酸序列的HVR-L1；（e）包含序列識別號：26之胺基酸序列的HVR-L2；及（f）包含序列識別號：27之胺基酸序列的HVR-L3之抗CD137抗原結合分子或抗體。
在別的方面，本揭示提供包含：（a）包含序列識別號：7之胺基酸序列的HVR-H1；（b）包含序列識別號：15之胺基酸序列的HVR-H2；及（c）包含序列識別號：20之胺基酸序列的HVR-H3；以及（d）包含序列識別號：25之胺基酸序列的HVR-L1；（e）包含序列識別號：26之胺基酸序列的HVR-L2；及（f）包含序列識別號：27之胺基酸序列的HVR-L3之抗CD137抗原結合分子或抗體。
在別的方面，本揭示提供包含：（a）包含序列識別號：7之胺基酸序列的HVR-H1；（b）包含序列識別號：16之胺基酸序列的HVR-H2；及（c）包含序列識別號：20之胺基酸序列的HVR-H3；以及（d）包含序列識別號：25之胺基酸序列的HVR-L1；（e）包含序列識別號：26之胺基酸序列的HVR-L2；及（f）包含序列識別號：27之胺基酸序列的HVR-L3之抗CD137抗原結合分子或抗體。
在別的方面，本揭示提供包含：（a）包含序列識別號：7之胺基酸序列的HVR-H1；（b）包含序列識別號：14之胺基酸序列的HVR-H2；及（c）包含序列識別號：19之胺基酸序列的HVR-H3；以及（d）包含序列識別號：24之胺基酸序列的HVR-L1；（e）包含序列識別號：26之胺基酸序列的HVR-L2；及（f）包含序列識別號：27之胺基酸序列的HVR-L3之抗CD137抗原結合分子或抗體。
在別的方面，本揭示提供包含：（a）包含序列識別號：7之胺基酸序列的HVR-H1；（b）包含序列識別號：14之胺基酸序列的HVR-H2；及（c）包含序列識別號：17之胺基酸序列的HVR-H3；以及（d）包含序列識別號：21之胺基酸序列的HVR-L1；（e）包含序列識別號：26之胺基酸序列的HVR-L2；及（f）包含序列識別號：27之胺基酸序列的HVR-L3之抗CD137抗原結合分子或抗體。
在特定態樣中，在下列HVR位置之處，上述抗CD137抗體的任一個或複數個胺基酸被取代： -HVR-H2（序列識別號：30）中：位置5、6、7、10、13、14、及/或17 -HVR-H3（序列識別號：31）中：位置3、及/或6 -HVR-L1（序列識別號：32）中：位置4、5、9、及/或11 -HVR-L3（序列識別號：33）中：位置6、7、及/或8
在特定態樣中，本說明書所提供的取代為保留性取代。 在特定態樣中，下列任一個或複數個的取代也可以任意組合進行： -HVR-H2（序列識別號：8）中：K5H或S；S6G；T7S；E10Y；D13E；S14Q；V17G或L -HVR-H3（序列識別號：17）中：A3P、K或I；F6E -HVR-L1（序列識別號：21）中：R4S；Y5T；Y9F；E11N -HVR-L3（序列識別號：27）中：E6P；H7A；Q8I
上述可能取代的所有組合，關於HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1及HVR-L3，分別包含於序列識別號30、31、32及33的共有序列。
上述態樣的任一者中，抗CD137抗原結合分子或抗體經人源化。在一態樣中，抗CD137抗原結合分子或抗體包含在上述態樣之任意的HVR，更包含受體人類框架（如人類免疫球蛋白框架或人類共有框架）。在別的態樣中，抗CD137抗原結合分子或抗體包含在上述態樣之任意的HVR，更包含含有框架（FR）序列的重鏈可變區（VH）或輕鏈可變區（VL）。在一態樣中，重鏈可變區的FR1包含序列識別號：35之胺基酸序列、FR2包含序列識別號：36之胺基酸序列、FR3包含序列識別號：37之胺基酸序列、FR4包含序列識別號：38之胺基酸序列。在一態樣中，輕鏈可變區的FR1包含序列識別號：39之胺基酸序列、FR2包含序列識別號：40之胺基酸序列、FR3包含序列識別號：41之胺基酸序列、FR4包含序列識別號：42之胺基酸序列。
在別的方面中，抗CD137抗原結合分子或抗體包含對序列識別號：43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、或53之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%的序列相同性之重鏈可變區（VH）序列。在特定態樣中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%的序列相同性之VH序列，相對於參考序列，包含取代（如保留性取代）、插入、或缺失，但包含該序列之抗CD137抗原結合分子或抗體保持和CD137結合的能力。在特定態樣中，在序列識別號：43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、或53中，有總計1個至10個的胺基酸進行取代、插入、及/或缺失。在特定態樣中，取代、插入、或缺失在HVR的外側區域（即FR中）發生。任意地，抗CD137抗體包含序列識別號：43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、或53的VH序列，也包含含有該序列的轉譯後修飾者。在某特定態樣中，VH包含選自（a）包含序列識別號：7之胺基酸序列的HVR-H1；（b）包含選自序列識別號：8、9、10、11、12、13、14、15、及16任一個胺基酸序列的HVR-H2；及（c）包含選自序列識別號：17、18、19、或20任一個胺基酸序列的HVR-H3；之1個、2個、或3個的HVR。轉譯後修飾包含重鏈或輕鏈N端的麩醯胺酸或麩胺酸經焦麩胺酸化而成為焦麩胺酸的修飾，但不限於此。
在別的方面，提供包含對序列識別號：54、55、56、57、58、59、或60之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%的序列相同性之輕鏈可變區（VL）之抗CD137抗原結合分子或抗體。在特定態樣中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%的序列相同性之VL序列，相對於參考序列，包含取代（如保留性取代）、插入或缺失，但包含該序列之抗CD137抗原結合分子或抗體保持結合CD137的能力。在特定態樣中，在序列識別號：54、55、56、57、58、59、或60中，有總計1個至10個的胺基酸進行取代、插入、及/或缺失。在特定態樣中，取代、插入、或缺失在HVR的外側區域（即FR中）發生。任意地，抗CD137抗體包含序列識別號：54、55、56、57、58、59、或60的VL序列，也包含含有該序列的轉譯後修飾者。在某特定態樣中，VL包含選自（a）包含選自序列識別號：21、22、23、24、及25任一個胺基酸序列的HVR-L1；（b）包含序列識別號：26之胺基酸序列的HVR-L2；及（c）包含選自序列識別號：27、28、及29任一個胺基酸序列的HVR-L3；之1個、2個、或3個的HVR。轉譯後修飾包含重鏈或輕鏈N端的麩醯胺酸或麩胺酸經焦麩胺酸化而成為焦麩胺酸的修飾，但不限於此。
在別的方面，提供包含上述態樣任意之VH及上述態樣任意之VL的抗CD137抗原結合分子或抗體。 ‧在一態樣中，抗CD137抗原結合分子或抗體分別包含序列識別號：43及序列識別號：54之VH及VL序列，也包含含有該序列的轉譯後修飾者。 ‧在一態樣中，抗CD137抗原結合分子或抗體分別包含序列識別號：44及序列識別號：55之VH及VL序列，也包含含有該序列的轉譯後修飾者。 ‧在一態樣中，抗CD137抗原結合分子或抗體分別包含序列識別號：45及序列識別號：55之VH及VL序列，也包含含有該序列的轉譯後修飾者。 ‧在一態樣中，抗CD137抗原結合分子或抗體分別包含序列識別號：46及序列識別號：54之VH及VL序列，也包含含有該序列的轉譯後修飾者。 ‧在一態樣中，抗CD137抗原結合分子或抗體分別包含序列識別號：47及序列識別號：54之VH及VL序列，也包含含有該序列的轉譯後修飾者。 ‧在一態樣中，抗CD137抗原結合分子或抗體分別包含序列識別號：48及序列識別號：56之VH及VL序列，也包含含有該序列的轉譯後修飾者。 ‧在一態樣中，抗CD137抗原結合分子或抗體分別包含序列識別號：49及序列識別號：57之VH及VL序列，也包含含有該序列的轉譯後修飾者。 ‧在一態樣中，抗CD137抗原結合分子或抗體分別包含序列識別號：50及序列識別號：58之VH及VL序列，也包含含有該序列的轉譯後修飾者。 ‧在一態樣中，抗CD137抗原結合分子或抗體分別包含序列識別號：51及序列識別號：59之VH及VL序列，也包含含有該序列的轉譯後修飾者。 ‧在一態樣中，抗CD137抗原結合分子或抗體分別包含序列識別號：51及序列識別號：60之VH及VL序列，也包含含有該序列的轉譯後修飾者。 ‧在一態樣中，抗CD137抗原結合分子或抗體分別包含序列識別號：52及序列識別號：60之VH及VL序列，也包含含有該序列的轉譯後修飾者。 ‧在一態樣中，抗CD137抗原結合分子或抗體分別包含序列識別號：50及序列識別號：59之VH及VL序列，也包含含有該序列的轉譯後修飾者。 ‧在一態樣中，抗CD137抗原結合分子或抗體分別包含序列識別號：53及序列識別號：54之VH及VL序列，也包含含有該序列的轉譯後修飾者。 上述轉譯後修飾包含重鏈或輕鏈N端的麩醯胺酸或麩胺酸經焦麩胺酸化而成為焦麩胺酸之修飾，但不限於此。
本揭示之較佳抗CD137抗原結合分子或抗體的重鏈可變區及輕鏈可變區以及此等之HVR1、2、及3之胺基酸序列，和序列識別號之對應，如下列一覽表所示。
［表1］
重鏈/輕鏈 可變區域 可變區域之 序列識別號 超可變區域（HVR）之序列識別號
重鏈 輕鏈 H1 H2 H3 L1 L2 L3
A375/B167 43 54 7 8 17 21 26 27
A372/B040 44 55 7 9 17 22 26 27
A356/B040 45 55 7 10 17 22 26 27
A486/B167 46 54 7 11 18 21 26 27
A487/B167 47 54 7 8 18 21 26 27
A488/B226 48 56 7 12 18 21 26 28
A489/B223 49 57 7 13 18 21 26 29
A548/B376 50 58 7 14 19 23 26 27
A551/B256 51 59 7 15 20 24 26 27
A551/B379 51 60 7 15 20 25 26 27
A555/B379 52 60 7 16 20 25 26 27
A548/B256 50 59 7 14 19 24 26 27
A549/B167 53 54 7 14 17 21 26 27
當本說明書所提供之抗CD137抗原結合分子或抗體的重鏈或輕鏈N端之胺基酸為麩醯胺酸時，該胺基酸也可取代為麩胺酸。當本說明書所提供之抗CD137抗體的重鏈或輕鏈N端之胺基酸為麩胺酸時，該胺基酸也可取代為麩醯胺酸。
在一較佳態樣中，包含上述HVR、重鏈可變區、及/或輕鏈可變區之抗CD137抗原結合分子或抗體皆具有對上述小分子化合物依賴的CD137的結合活性。
［恆定區域］ 在別的方面，抗CD137抗原結合分子或抗體包含恆定區域。恆定區域可為重鏈恆定區（包含Fc區域）、輕鏈恆定區、或兩者。在別的一方面，抗CD137抗原結合分子或抗體包含Fc區域。在一些態樣中，恆定區域為天然型序列的恆定區域。來自天然型抗體的重鏈恆定區之例，可例如人類IgG1（序列識別號：61、62）、人類IgG2、人類IgG3、人類IgG4等的重鏈恆定區。又來自天然型抗體的輕鏈恆定區之例，可例如人類κ鏈、人類λ鏈（如序列識別號：63）。
本說明書所使用之「親代恆定區域」或「親代Fc區域」是指本說明書所記載之在導入胺基酸改變前的恆定區域或Fc區域。又「親代抗原結合分子」是指包含親代恆定區域或親代Fc區域的抗原結合分子。在一些態樣中，親代Fc區域為天然型序列的Fc區域（或天然型抗體的Fc區域）。抗體包含例如IgA（IgA1、IgA2）、IgD、IgE、IgG（IgG1、IgG2、IgG3、IgG4）、及IgM等。抗體可來自人類或猿（例如食蟹猴、恆河猴、新世界猴、黑猩猩、或狒狒）。天然型抗體也可包含天然存在的突變。因基因多型性的IgG的複數個同種異型（allotype）序列記載於「Sequences of proteins of immunological interest」,NIH Publication, No. 91-3242，但皆可在本揭示使用。在一態樣中，親代Fc區域為序列識別號：61、62或182之來自人類IgG1重鏈恆定區的Fc區域。
在一方面，抗CD137抗原結合分子或抗體，和含有天然型序列的Fc區域或親代Fc區域的抗CD137抗原結合分子或抗體相比，等電點（pI）增加。在一些態樣中，突變Fc區域包含至少1個胺基酸改變。在另外的態樣中，該胺基酸改變，和親代Fc區域相比，突變Fc區域的等電點（pI）增加。不限於特定理論，認為活體液（例如血漿）的pH在中性的pH範圍內。活體液中，pI增加的抗原結合分子或抗體的淨正電荷因增加的pI而增加，結果該抗原結合分子或抗體，和pI未增加的抗原結合分子或抗體相比，經物理化學的交互作用，被具有淨負電荷的內皮細胞表面更強力地吸引。因此，促控抗原結合分子（或抗體）、或和抗原結合的促控抗原結合分子（或抗體），因Fcγ受體表現細胞表面而靠近，使抗原結合分子或抗體和Fcγ受體表現細胞的結合可以增加。在對Fcγ受體的結合活性有助於CD137促效劑活性的抗CD137促控抗原結合分子或抗體中，因使pI增加的胺基酸改變而使對Fcγ受體表現細胞的結合增加之抗CD137促控抗原結合分子或抗體，和不包含使pI增加的胺基酸改變的抗CD137促控抗原結合分子或抗體相比，可顯示較高的CD137促效劑活性。
本揭示中，pI可以是理論上的pI，也可以是實測的pI。pI值可經由例如此技術領域公知的等電點分離法而測量。理論上的pI值可例如使用基因及胺基酸序列的序列分析軟體（Genetyx等）計算出來。此時，抗體的特性也可反映在計算式。例如，（i）通常在抗體內被保留的Cys形成雙硫鍵，不帶有側鏈的電荷。如此的Cys可以從計算中排除，只將不形成雙硫鍵的游離型Cys加入計算中。又（ii）關於抗體，可經轉譯後修飾，改變帶電狀態、即等電點。考量如此的轉譯後修飾，也可改變以下的計算式：（a）當重鏈N端為Q（麩醯胺酸）時，做為焦麩醯胺酸化發生者，N端的胺基酸從計算中排除；（b）當重鏈C端為K（賴胺酸）時，作為切斷發生者，K（1殘基分）從計算中排除；以及（c）一般保留位置的C（半胱胺酸）全部，作為在分子內形成雙硫鍵者，此等的C的側鏈從計算中排除。在一較佳態樣中，上述（i）及（ii）兩者都可以反映在計算式。
在一態樣中，pI值和改變前相比，可以增加例如至少0.01、0.03、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、或該等以上；至少0.6、0.7、0.8、0.9、或該等以上；至少1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、或該等以上；或者至少1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、3.0、或該等以上。
在一態樣中，關於pI值增加的胺基酸改變、以及抗原結合分子或抗體用於使pI值增加的方法，在本說明書之III.組合物及方法（包含等電點（pI）增加的突變Fc區域之促控抗原結合分子）中詳述。此技術領域將理解，III.組合物及方法（包含等電點（pI）增加的突變Fc區域之促控抗原結合分子）中所載的任意胺基酸改變及用於使pI增加的方法可應用於抗CD137抗原結合分子或抗體。
在一態樣中，抗CD137抗原結合分子或抗體具有pI增加的突變Fc區域，該突變Fc區域包含選自EU編號所表位置285、311、312、315、318、333、335、337、341、342、343、384、385、388、390、399、400、401、402、413、420、422、及431所組成的群組之至少1個位置的至少1個胺基酸改變。在另外的態樣中，pI增加的突變Fc區域在各所選位置中包含Arg或Lys。
在另外的態樣中，抗CD137抗原結合分子或抗體具有pI增加的突變Fc區域，該突變Fc區域包含選自EU編號所表位置311、343、及413之至少1個位置的至少1個胺基酸改變。在另外的態樣中，具有pI增加的突變Fc區域包含選自EU編號所表位置311、343、及413所組成的群組中的胺基酸改變。在另外的態樣中，pI增加的突變Fc區域在各所選位置中包含Arg或Lys。
在別的方面，本揭示提供，包含下列（1）~（3）任一個胺基酸改變、包含pI增加的突變Fc區域之抗CD137抗原結合分子或抗體：EU編號所表之（1）第311及343位；（2）第311及413位；以及（3）第343及413位。在另外的態樣中，pI增加的突變Fc區域在各所選位置中包含Arg或Lys。
在一態樣中，本揭示之抗CD137抗原結合分子或抗體包括含有下表2所載之胺基酸改變之突變Fc區域。
Fc區域的使pI增加的胺基酸改變 ［表2］
編號 胺基酸取代（EU編號）
1 P343R/D413K
2 Q311R/P343R
3 P343R
4 D413K
5 Q311R
6 Q311R/D413K
在一態樣中，抗CD137抗原結合分子或抗體包含在天然型序列的Fc區域加入胺基酸改變所製作的突變Fc區域。在一態樣中，突變Fc區域，和天然型序列的Fc區域或親代Fc區域相比，對選自FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa、FcγRIIIb所組成的群組的至少一個Fcγ受體的結合活性增加。較佳為，突變Fc區域，和天然型序列的Fc區域或親代Fc區域相比，對FcγRIIb的結合活性增加。被報導包含對FcγRIIb的結合活性增加的突變Fc區域之抗CD137抗體，和包含天然型序列的Fc區域之抗CD137抗體相比，促效劑活性增加。在一態樣中，對FcγRIIb的結合活性增加的胺基酸改變，也可使用例如WO2012/115241、WO2014/030728、WO2014/163101及/或WO2017/104783所記載之胺基酸改變。在一較佳態樣中，對FcγRIIb的結合活性增加的改變為，在選自EU編號所表之第234、235、236、237、238、264、268、295、326、及330位所組成的群組的至少一個位置的胺基酸改變。
「Fcγ受體」（本說明書中稱為Fcγ受體、FcγR、或FcgR）指可和IgG1、IgG2、IgG3、及IgG4單株抗體的Fc區域結合之受體，事實上意指Fcγ受體基因所編碼之蛋白質家族的任意成員。人類，在此家族包括，包含同型體FcγRIa、FcγRIb、及FcγRIc的FcγRI（CD64）；同型體FcγRIIa（包含同種異型H131（H型）及R131（R型））、FcγRIIb（包含FcγRIIb-1及FcγRIIb-2）、及包含FcγRIIc的FcγRII（CD32）；以及包含同型體FcγRIIIa（包含同種異型V158和F158）及FcγRIIIb（包含同種異型FcγRIIIb-NA1和FcγRIIIb-NA2）的FcγRIII（CD16）；以及，任何未被發現的人類FcγR、FcγR同型體或同種異型，但不限於此。FcγRIIb1及FcγRIIb2被報導作為人類FcγRIIb的切割突變體。而且，稱為FcγRIIb3的切割突變體被報導（J Exp Med, 1989, 170：1369-1385）。除了此等切割突變體外，人類FcγRIIb包含登錄於NCBI的AAI46679.1、及登錄於NCBI的所有切割突變體、NP_001002273.1、NP_001002274.1、NP_001002275.1、NP_001177757.1、及NP_003992.3。再者，人類FcγRIIb，除了FcγRIIb，還包含過去報導的全部基因多型（Arthritis Rheum. 48：3242-3252（2003）；Kono et al., Hum. Mol. Genet. 14：2881-2892（2005）；及Kyogoju et al., Arthritis Rheum. 46：1242-1254（2002））以及將來可能報導的所有基因多型。
FcγRIIa存在2種異種同型，一方面，FcγRIIa的第131位的胺基酸為組胺酸（H型），另一方面，第131位的胺基酸為精胺酸（R型）（Warrmerdam, J. Exp. Med. 172：19-25（1990））。
FcγR包含來自人類、小鼠、大鼠、兔、及猿的FcγR，但不限於此，可來自任意的生物體。小鼠FcγR包含FcγRI （CD64）、FcγRII （CD32）、FcγRIII （CD16）、及FcγRIII-2 （CD16-2）、以及任意的小鼠FcγR或FcγR同型體，但不限於此。
在別的方面，本揭示提供包含下列（1）~（8）任一個胺基酸改變之包含對FcγRIIb的結合活性增加的突變Fc區域之抗CD137抗原結合分子或抗體：EU編號所表之（1）第234、238、264、及330位；（2）第234、238、及330位；（3）第234、237、238、及330位；（4）第236、268、及330位；（5）第235、236、268、295、326、及330位。
在一態樣中，本揭示之抗CD137抗原結合分子或抗體包括含有下表3所記載之胺基酸改變的突變Fc區域。在又一態樣中，本揭示之抗CD137抗原結合分子或抗體包括，除了表2（帶有Fc的pI增加的胺基酸改變）記載之胺基酸改變，更包括含有下表3所記載之任何胺基酸改變的組合之突變Fc區域。
Fc區域的使FcγRIIb的結合活性增加的胺基酸改變 ［表3］
編號 胺基酸取代（EU編號）
1 L234Y/P238D/V264I/A330K
2 L234Y/P238D/A330K
3 L234Y/G237D/P238D/A330K
4 G236N/H268D/A330K
5 L235W/G236N/H268D/Q295L/K326T/A330K
在一態樣中，本揭示提供，包含至少一個胺基酸經改變的改變Fc區域，該改變Fc區域對FcγRIIb的結合活性等於或高於參考Fc區域之改變Fc區域。在一態樣中，參考Fc區域為包含上述表3所載之任一胺基酸改變之組合的Fc區域。在一較佳態樣中，參考Fc區域為重鏈恆定區TT14（序列識別號：149）、TT16（序列識別號：150）、MY201（序列識別號：153）或MY518（序列識別號：154）所含的Fc區域。在一較佳態樣中，參考Fc區域為重鏈恆定區MY201（序列識別號：153）或MY518（序列識別號：154）所含的Fc區域。
在別的方面，本揭示提供包含帶有Fcγ受體（較佳為FcγRIIb）結合活性增加及pI增加的突變Fc區域之分離的促控抗原結合分子或抗體。在特定態樣中，本說明書所記載之突變Fc區域包含親代Fc區域中至少2個胺基酸改變。如前所述，pI增加的抗原結合分子或抗體，和pI未增加的抗原結合分子或抗體相比，經物理化學的交互作用，被具有淨負電荷的內皮細胞表面強烈吸引。由此，在對Fcγ受體（較佳為FcγRIIb）的結合活性有助於促效劑活性的促控抗原結合分子或抗體中，因組合使Fcγ受體（較佳為FcγRIIb）增加的胺基酸改變及使pI增加的胺基酸改變，可使該抗原結合分子或抗體的促效劑活性上升。
在一態樣中，抗CD137抗原結合分子或抗體包括，含有使上述對Fcγ受體（如FcγRIIb）的結合活性增加的胺基酸改變及使等電點（pI）增加的胺基酸改變之兩者的突變Fc區域。如同前述，pI增加的抗原結合分子或抗體，和pI未增加的抗原結合分子或抗體相比，經物理化學的交互作用，被具有淨負電荷的內皮細胞表面強烈吸引。因此，在對Fcγ受體（較佳為FcγRIIb）的結合活性有助於促效劑活性的抗CD137促控抗原結合分子或抗體中，因組合使Fcγ受體（較佳為FcγRIIb）增加的胺基酸改變及使pI增加的胺基酸改變，可使該抗CD137抗原結合分子或抗體的促效劑活性上升。
在一方面，本揭示提供，包含（a）選自EU編號所表第234、235、236、237、238、264、268、295、326、及330位所組成的群組之至少一個位置的至少一個胺基酸改變、及（b）選自EU編號所表第311、343、及413位所組成的群組之至少二個位置的至少二個胺基酸改變之至少三個胺基酸改變的包含帶有FcγRIIb結合活性增加及pI增加的突變Fc區域之多胜肽。
在別的方面，本揭示提供，包含下列（1）~（26）任一個胺基酸改變之帶有FcγRIIb結合活性增加及pI增加的突變Fc區域之多胜肽：EU編號所表之 （1）第235、236、268、295、326、330、343、及413位； （2）第214、235、236、268、295、326、330、343、及413位； （3）第234、238、250、264、307、330、343、及413位； （4）第234、238、264、330、343、及413位； （5）第234、237、238、250、307、330、343、及413位； （6）第234、237、238、330、343、及413位； （7）第235、236、268、295、326、330、311、及343位； （8）第234、238、250、264、307、330、311、及343位； （9）第234、238、264、330、311、及343位； （10）第234、237、238、250、307、330、311、及343位； （11）第234、237、238、330、311、及343位； （12）第235、236、268、295、326、330、及343位； （13）第214、235、236、268、295、326、330、及343位； （14）第235、236、268、295、326、330、及413位； （15）第214、236、268、330、及343位； （16）第214、235、236、268、330、及343位； （17）第214、236、268、330、及413位； （18）第214、236、268、330、343、及413位； （19）第214、235、236、268、330、343、及413位； （20）第214、236、268、330、及311位； （21）第214、235、236、268、330、及311位； （22）第214、236、268、330、311、及343位； （23）第214、235、236、268、330、311、及343位； （24）第214、236、268、330、311、及413位； （25）第214、235、236、268、330、311、及413位； （26）第214、235、236、268、295、326、330、及311位。
在一態樣中，本揭示之突變Fc區域包含下表4所記載之任一胺基酸改變之組合。
［表4］
編號 胺基酸取代（EU編號）
1 L235W/G236N/H268D/Q295L/K326T/A330K/P343R/D413K
2 K214R/L235W/G236N/H268D/Q295L/K326T/A330K/P343R/D413K
3 L234Y/P238D/T250V/V264I/T307P/A330K/P343R/D413K
4 L234Y/P238D/V264I/A330K/P343R/D413K
5 L234Y/G237D/P238D/T250V/T307P/A330K/P343R/D413K
6 L234Y/G237D/P238D/A330K/P343R/D413K
7 L235W/G236N/H268D/Q295L/K326T/A330K/Q311R/P343R
8 L234Y/P238D/T250V/V264I/T307P/A330K/Q311R/P343R
9 L234Y/P238D/V264I/A330K/Q311R/P343R
10 L234Y/G237D/P238D/T250V/T307P/A330K/Q311R/P343R
11 L234Y/G237D/P238D/A330K/Q311R/P343R
12 L235W/G236N/H268D/Q295L/K326T/A330K/P343R
13 K214R/L235W/G236N/H268D/Q295L/K326T/A330K/P343R
14 L235W/G236N/H268D/Q295L/K326T/A330K/D413K
15 K214R/G236N/H268D/A330K/P343R
16 K214R/L235W/G236N/H268D/A330K/P343R
17 K214R/G236N/H268D/A330K/D413K
18 K214R/G236N/H268D/A330K/P343R/D413K
19 K214R/L235W/G236N/H268D/A330K/P343R/D413K
20 K214R/G236N/H268D/A330K/Q311R
21 K214R/L235W/G236N/H268D/A330K/Q311R
22 K214R/G236N/H268D/A330K/Q311R/P343R
23 K214R/L235W/G236N/H268D/A330K/Q311R/P343R
24 K214R/G236N/H268D/A330K/Q311R/D413K
25 K214R/L235W/G236N/H268D/A330K/Q311R/D413K
26 K214R/L235W/G236N/H268D/Q295L/K326T/A330K/Q311R
在一態樣中，包含上表4所載之任一胺基酸改變之組合的突變Fc區域，在EU編號第447位的胺基酸缺失。在較佳態樣中，包含上表4所載之任一胺基酸改變之組合的突變Fc區域，在EU編號第446及447位的胺基酸缺失。
此技術領域之人士應可理解，除上述舉例之改變之外，可使用如WO2013/047752、WO2013/125667、WO2014/030728、WO2014/163101、或WO2017104783所記載或教示，和親代Fc區域相比，使對含有FcγRIIb的FcγR的結合活性增加之至少一個的胺基酸改變，以及，如WO2017/104783、WO2017/046994所記載或教示，和親代Fc區域相比，使pI增加之至少一個的胺基酸改變，以及該等胺基酸改變之組合。
再者，可在本說明書所記載之突變Fc區域中，組合為了其他目的所進行的胺基酸改變。例如，也可加入，增加FcRn結合活性之胺基酸取代（Hinton et al., J. Immunol. 176（1）：346-356 （2006）；Dall'Acqua et al., J. Biol. Chem. 281（33）：23514-23524 （2006）；Petkova et al., Intl. Immunol. 18（12）：1759-1769（2006）；Zalevsky et al., Nat. Biotechnol. 28（2）：157-159 （2010）；WO2006/019447; WO2006/053301；及WO2009/086320），及為了改善抗體的異質性或穩定性的胺基酸取代（WO2009/041613）。或者，可將WO2011/122011、WO2012/132067、WO2013/046704、或WO2013/180201所記載之具有促進抗原廓清（antigen clearance）的特性之多胜肽、WO2013/180200所記載對標靶組織有特異性結合特性之多胜肽、WO2009/125825、WO2012/073992、或WO2013/047752所載對複數個抗原分子具有重複結合特性之多胜肽，和本說明書所載之突變Fc區域組合。或者也可以在本說明書所載之突變Fc區域的CH3，組合以提供對其他抗原的結合活性為目的之EP1752471及EP1772465所揭示之胺基酸改變。
在一態樣中，本揭示之抗CD137抗原結合分子或抗體包括，含有選自序列識別號：64~85之至少一個胺基酸序列之重鏈恆定區。較佳為，本揭示之抗CD137抗原結合分子或抗體包括，含有序列識別號：75或82之胺基酸序列之重鏈恆定區。
在一較佳態樣中，包含上述突變Fc區域之抗CD137抗原結合分子或抗體，具有對上述小分子化合物依賴的CD137的結合活性。
在一態樣中，本揭示之抗CD137抗原結合分子或抗體包括以下之可變區域及恆定區域：包含上述HVR、重鏈可變區及/或輕鏈可變區之可變區域；及上述突變Fc區域。在一較佳態樣中，本揭示之抗CD137抗原結合分子或抗體也可為選自表72所記載之抗體的任一個抗CD137抗體。
在另外的方面，本揭示提供，在小分子化合物存在下（如10 μM以上、50μM以上、100μM以上、150μM以上、200μM以上、或250μM以上的小分子化合物存在下），和本說明書所提供的抗CD137抗原結合分子或抗體相同之CD137的抗原決定位結合的抗原結合分子或抗體。例如，在特定態樣中，提供和包含表37所載之A375/B167、A372/B040、A356/B040、A486/B167、A487/B167、A488/B226、A489/B223、A548/B376、A551/B256、A551/B379、A555/B379、A548/B256、及/或A549/B167作為重鏈可變區/輕鏈可變區之組合的抗CD137抗原結合分子或抗體相同的抗原決定位結合的抗原結合分子或抗體。在一態樣中，本揭示之具有小分子化合物依賴之抗原結合活性依賴的CD137結合活性之抗CD137抗原結合分子或抗體，辨識由抗原（如CD137）和小分子化合物（如ATP）的複合體所形成的抗原決定位。
在另外的方面，本揭示提供，在小分子化合物的存在下（如10 μM以上、50μM以上、100μM以上、150μM以上、200μM以上、或250μM以上的小分子化合物存在下），關於和CD137的結合，和本說明書所提供之抗CD137抗原結合分子或抗體競爭的抗原結合分子或抗體。例如，在特定態樣中，關於和CD137的結合位，和包含表37所載之A375/B167、A372/B040、A356/B040、A486/B167、A487/B167、A488/B226、A489/B223、A548/B376、A551/B256、A551/B379、A555/B379、A548/B256、及/或A549/B167作為重鏈可變區/輕鏈可變區之組合的抗CD137抗原結合分子或抗體競爭。
在本揭示的另外的方面，根據上述態樣之任意者，抗CD137抗原結合分子或抗體為，包含嵌合、人源化、或人類抗體之單株抗體。在一態樣中，抗CD137抗體為如Fv、Fab、Fab’、scFv、雙特異性抗體（diabody）、或F（ab’）2 片段等之抗體片段。在別的態樣中，抗體為，例如完全IgG1抗體、或本說明書所定義之其他抗體族（class）或同型體（isotype）之全長抗體。
在另外的方面，根據上述態樣之任意者，抗CD137抗原結合分子或抗體也可單獨或組合載入下列項目1~7所載之任意特徵。
1. 抗CD137抗原結合分子或抗體的促效劑活性 在特定態樣中，本揭示之抗CD137抗原結合分子或抗體具有CD137促效劑活性。已知CD137的訊息傳遞，不只是刺激NK細胞的IFN-γ的分泌和增殖（Buechele et al., 2012; Lin et al., 2008; Melero et al., 1998），還有促進該等的存活增加以及因細胞激素的分泌及共同刺激分子的上游調控所顯示的DC活化（Choi et al., 2009; Futagawa et al., 2002; Wilcox et al., 2002）。然而，CD137在T細胞CD4+亞群（subset）及CD8+亞群兩者中做為調節TCR誘導活性的共同刺激分子具有最佳特徵。和TCR誘導組合，抗CD137促控抗體使T細胞的增殖增強、刺激淋巴介質（lymphokine）分泌、使對活化誘導細胞死亡的T淋巴球的敏感性降低（Snell et al., 2011評論）。此等現象之中，在T細胞上的CD137訊息傳遞之後所觀察到的生理現象，經由CD137訊息而活化的下游訊息RAF2、TRAF1、特別是NF-kappaB、JNK、Erk、Akt、survivin、Bcl-XL、及/或Bcl-2等所媒介（Ward-Kavanagh等, Immunity, 44卷：1005頁（2016年））。
在一態樣中，「抗CD137促控抗原結合分子」或「抗CD137促控抗體」為，經由和CD137結合而傳遞CD137訊息，有意義地誘導或增強NK細胞的IFN-γ分泌、增殖、存活增加；經細胞激素的分泌及共同刺激分子的上游調控所顯示之DC活性化；TCR誘導；T細胞增殖；及/或淋巴介質分泌之抗原結合分子或抗體。在不同的一態樣中，「抗CD137促控抗原結合分子」或「抗CD137促控抗體」為，經由和T細胞上的CD137結合而傳遞CD137訊息，有意義地誘導該T細胞的NF-kappaB活化之抗原結合分子或抗體。又抗原結合分子或抗體「顯示CD137促效劑活性」是指，該抗原結合分子或抗體經由和CD137結合而使上述任一生理現象被觀察到。對於CD137促效劑活性的測量方法，在後述「C. 測量法（分析法）」一項詳細說明。
在特定態樣中，本揭示之抗CD137抗原結合分子或抗體具有小分子化合物依賴的CD137促效劑活性。在非限定的一態樣中，抗CD137抗原結合分子或抗體在小分子化合物存在下對CD137的CD137促效劑活性，高於該小分子化合物不存在下對CD137的CD137促效劑活性。在不同的一態樣中，抗CD137抗原結合分子或抗體在高濃度的小分子化合物存在下的CD137促效劑活性，高於在低濃度的該小分子化合物存在下的CD137促效劑活性。在另外的態樣中，抗CD137抗原結合分子或抗體在小分子化合物存在下的CD137促效劑活性，是該小分子化合物不存在下的CD137促效劑活性的2倍以上、3倍以上、5倍以上、10倍以上、20倍以上、30倍以上、50倍以上、100倍以上、200倍以上、300倍以上、500倍以上、1×103 倍以上、2×103 倍以上、3×103 倍以上、5×103 倍以上、1×104 倍以上、2×104 倍以上、3×104 倍以上、5×104 倍以上、或1×105 倍以上。
小分子化合物的濃度只要是可檢測出抗CD137抗原結合分子或抗體的結合活性的差異，可以選擇任意濃度。在一態樣中，抗CD137抗原結合分子或抗體經由和細胞表面上的CD137結合而傳遞CD137訊息。因此，此技術領域之人士應可理解，具有小分子化合物依賴的CD137結合活性的抗CD137抗原結合分子或抗體，具有該小分子化合物依賴的CD137促效劑活性。但是，在另一方面，因為結合活性的測量和促效劑活性的測量在測量方法上不同，對於結合活性檢測出差異的小分子化合物的濃度，不同於對於促效劑活性檢測出差異的小分子化合物的濃度，應可為此技術領域之人士理解（例如，在10μM的小分子化合物存在下的CD137結合活性是該小分子化合物不存在下的CD137結合活性的2倍以上之抗CD137抗原結合分子或抗體中，在10μM的小分子化合物存在下的CD137促效劑活性（測量值）小於該小分子化合物不存在下的CD137促效劑活性（測量值）的2倍）。又根據CD137促效劑活性的測量方法（參照C. 測量方法（分析法）），促效劑活性的判斷不同，應可為此技術領域之人士理解。
在一態樣中，抗CD137抗原結合分子或抗體，（i）在10μM、50μM、100μM、150μM、200μM、或250μM的小分子化合物存在下，顯示對CD137的促效劑活性，且（ii）在該小分子化合物不存在下，實質上不顯示對CD137的促效劑活性，或者在該小分子化合物不存在下，對CD137的促效劑活性（和該小分子化合物存在下相比）低。
在一態樣中，抗CD137抗原結合分子或抗體的促效劑活性，在C. 測量方法（分析法）所詳述的a）促效劑活性測量法（PBMC）中被評價時，抗CD137抗原結合分子或抗體，（i）在250μM的小分子化合物存在下，顯示對CD137的促效劑活性，且（ii）在該小分子化合物不存在下，對CD137的促效劑活性（和該小分子化合物存在下相比）低。在更一態樣中，抗CD137抗原結合分子或抗體，（i） 在250μM的小分子化合物存在下，顯示對CD137的促效劑活性，且（ii） 在該小分子化合物不存在下，實質上不顯示對CD137的促效劑活性。
在一態樣中，抗CD137抗原結合分子或抗體的促效劑活性，在C. 測量方法（分析法）所詳述的b）促效劑活性測量法（報導基因分析法）中被評價時，抗CD137抗原結合分子或抗體，（i） 在10μM、50μM、100μM、150μM、200μM、或250μM的小分子化合物存在下，顯示對CD137的促效劑活性，且（ii） 在該小分子化合物不存在下，實質上不顯示對CD137的促效劑活性，或者促效劑活性（和該小分子化合物存在下相比）低。報導基因分析法中的抗體濃度可以任意選擇，例如抗體的最終濃度為0、0.001、0.01、0.1、1、或10μg/mL。在一較佳態樣中，抗體的最終濃度為0.1μg/mL或1μg/mL。
在一態樣中，在C. 測量方法（分析法）所詳述的b）促效劑活性測量法（報導基因分析法）中，抗體的最終濃度為0.1μg/mL時，（i） 在10μM的小分子化合物存在下的抗CD137抗原結合分子或抗體的CD137促效劑活性（相對發光量），（ii） 和該小分子化合物不存在下的CD137促效劑活性（相對發光量）相比，高2倍以上、3倍以上、5倍以上、10倍以上、20倍以上、30倍以上、50倍以上、60倍以上、70倍以上、80倍以上、或90倍以上。在一態樣中，在C. 測量方法（分析法）所詳述的b）促效劑活性測量法（報導基因分析法）中，抗體的最終濃度為0.1μg/mL時，（i） 在100μM的小分子化合物存在下的抗CD137抗原結合分子或抗體的CD137促效劑活性（相對發光量），（ii） 和該小分子化合物不存在下的CD137促效劑活性（相對發光量）相比，高2倍以上、3倍以上、5倍以上、10倍以上、20倍以上、30倍以上、50倍以上、60倍以上、70倍以上、80倍以上、或90倍以上。在一態樣中，在C. 測量方法（分析法）所詳述的b）促效劑活性測量法（報導基因分析法）中，抗體的最終濃度為0.1μg/mL時，（i） 在250μM的小分子化合物存在下的抗CD137抗原結合分子或抗體的CD137促效劑活性（相對發光量），（ii） 和該小分子化合物不存在下的CD137促效劑活性（相對發光量）相比，高2倍以上、3倍以上、5倍以上、10倍以上、20倍以上、30倍以上、50倍以上、60倍以上、70倍以上、80倍以上、或90倍以上。在上述一些態樣中，更進一步地，0.1μg/mL的抗CD137抗原結合分子或抗體，在該小分子化合物不存在下，實質上不顯示CD137促效劑活性。
在一態樣中，在C. 測量方法（分析法）所詳述的b）促效劑活性測量法（報導基因分析法）中，抗體的最終濃度為1μg/mL時，（i） 在10μM的小分子化合物存在下的抗CD137抗原結合分子或抗體的CD137促效劑活性（相對發光量），（ii） 和該小分子化合物不存在下的CD137促效劑活性（相對發光量）相比，高2倍以上、3倍以上、5倍以上、10倍以上、20倍以上、30倍以上、50倍以上、60倍以上、70倍以上、80倍以上、或90倍以上。在一態樣中，在C. 測量方法（分析法）所詳述的b）促效劑活性測量法（報導基因分析法）中，抗體的最終濃度為0.1μg/mL時，（i） 在100μM的小分子化合物存在下的抗CD137抗原結合分子或抗體的CD137促效劑活性（相對發光量），（ii） 和該小分子化合物不存在下的CD137促效劑活性（相對發光量）相比，高2倍以上、3倍以上、5倍以上、10倍以上、20倍以上、30倍以上、50倍以上、60倍以上、70倍以上、80倍以上、或90倍以上。在一態樣中，在C. 測量方法（分析法）所詳述的b）促效劑活性測量法（報導基因分析法）中，抗體的最終濃度為0.1 μg/mL時，（i） 在250μM的小分子化合物存在下的抗CD137抗原結合分子或抗體的CD137促效劑活性（相對發光量），（ii） 和該小分子化合物不存在下的CD137促效劑活性（相對發光量）相比，高2倍以上、3倍以上、5倍以上、10倍以上、20倍以上、30倍以上、50倍以上、60倍以上、70倍以上、80倍以上、或90倍以上。在上述一些態樣中，且1μg/mL的抗CD137抗原結合分子或抗體，在該小分子化合物不存在下，實質上不顯示CD137促效劑活性。
2. 抗體片段 在特定態樣中，本說明書所提供的抗體為抗體片段。抗體片段包含但不限於Fab、Fab’、Fab’-SH、F（ab’）2 、Fv、及 scFv、以及後述的其他片段。作為特定的抗體片段的評論參照Hudson et al. Nat. Med. 9：129-134 （2003）。作為scFv片段的評論參照例如Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., （Springer-Verlag, New York）, pp.269-315 （1994）；以及WO93/16185；及美國專利號第5,571,894號及第5,587,458號。對於包含補救受體（salvage receptor）結合的抗原決定位殘基、活體內（in vivo）半衰期延長的Fab及F（ab'）2 片段的評論，參照美國專利第5,869,046號。
雙特異性抗體（diabody）可為二價或雙特異性，有2個抗原結合部位的抗體片段。參照例如EP404,097號; WO1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9：129-134 （2003）; Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90：6444-6448 （1993）。三特異性抗體（triabody）或四特異性抗體 （tetrabody） 也記載於Hudson et al., Nat. Med. 9：129-134 （2003）。
單域抗體（single-domain antibody） 為包含抗體的重鏈可變區的全部或一部分、或輕鏈可變區的全部或一部分之抗體片段。在特定態樣中，單域抗體為人類單域抗體（Domantis, Inc., Waltham, MA；參照如美國專利第6,248,516號B1）。
抗體片段包含但不限於本說明書所記載之因完全抗體的蛋白質分解性消化、重組宿主細胞（如大腸桿菌（E. coli）或噬菌體）所產生者，可經多種方法製作。
3. 嵌合及人源化抗體 在特定態樣中，本說明書提供之抗體為嵌合抗體。特定的嵌合抗體如美國專利第4,816,567號；及Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81：6851-6855 （1984）所記載。在一例中，嵌合抗體包含非人類可變區域（如來自小鼠、大鼠、豚鼠、兔、或猿等的非人類的靈長類的可變區域）及人類恆定區域。在另一例，嵌合抗體為改變來自親代抗體的家族或亞族的「類型轉換」（class switch）抗體。嵌合抗體也包含其抗原結合片段。
在特定態樣中，嵌合抗體為人源化抗體。典型地說，非人類抗體以維持親代非人類抗體的特異性及親和性的狀態，為了減少對人類的免疫原性而人源化。通常人源化抗體包含一個或複數個可變區，該可變區中HVR（如CDR（或其部分））來自非人類抗體，FR（或其部分）來自人類抗體序列。人源化抗體任意地包含人類恆定區域的至少一部分。在一些態樣中，人源化抗體中的一些FR殘基，例如為了恢復或改善抗體特異性或親和性，以來自非人類抗體（如HVR殘基來源的抗體）的對應殘基取代。
人源化抗體及其製作方法在Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13：1619-1633 （2008）中被評論，又在例如Riechmann et al., Nature 332：323-329 （1988）； Queen et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 86：10029-10033 （1989）； 美國專利第5,821,337號、第7,527,791號、第6,982,321號、及第7,087,409號；Kashmiri et al., Methods 36：25-34 （2005）（記載特異性決定區域 （specificity determining region：SDR）接枝）；Padlan, Mol. Immunol. 28：489-498 （1991） （記載重塑（resurfacing））； Dall’Acqua et al., Methods 36：43-60 （2005） （記載FR shuffling）；以及更記載於Osbourn et al., Methods 36：61-68 （2005） 及Klimka et al., Br. J. Cancer, 83：252-260 （2000）（記載因FR shuffling的「選擇指南」方法）。
可使用於人源化的人類框架（framework）區域包含但不限於：使用「最合適」法（參照Sims et al. J. Immunol. 151：2296 （1993））所選擇的框架區域；來自輕鏈或重鏈可變區的特定亞群的人類抗體的共有序列之框架區域（參照Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89：4285 （1992）及Presta et al. J. Immunol., 151：2623 （1993））；人類成熟（體細胞突變）框架區域或人類生殖細胞系框架區域（參照如Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13：1619-1633 （2008））；以及，來自FR庫的篩選的框架區域（參照Baca et al., J. Biol. Chem. 272：10678-10684 （1997）及Rosok et al., J. Biol. Chem. 271：22611-22618 （1996））。
4. 人類抗體 在特定態樣中，本說明書所提供之抗體為人類抗體。人類抗體可根據該技術領域已知的多種方法製造。人類抗體概說於van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5：368-74 （2001） 及 Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20：450-459 （2008）。
人類抗體可經由投予改變以反應抗原挑戰（challenge）（負擔）而產生完全人類抗體或帶有人類可變區域的完全抗體之轉殖動物免疫原而製造。如此的動物典型包含全部或部分的人類免疫球蛋白基因座，全部或部分的人類免疫球蛋白基因座取代內因性的免疫球蛋白基因座，或者以任意加入染色體外或該動物的染色體內的狀態存在。在此種轉殖基因小鼠中，內因性的免疫球蛋白基因座通常不活化。從轉殖基因動物獲得人類抗體的方法的評論，參照Lonberg, Nat. Biotech. 23：1117-1125 （2005）。又例如記載XENOMOUSE（商標）技術的美國專利第6,075,181號及第6,150,584號；記載HUMAB（登錄商標）技術的美國專利第5,770,429號；記載K-M MOUSE（登錄商標）技術的美國專利第7,041,870號；以及記載VELOCIMOUSE（登錄商標）技術的美國專利公開案第2007/0061900號合併參照。來自由如此動物所產生的完全抗體的人類可變區域，例如和不同的人類恆定區域組合等，也可進一步修飾。
人類抗體也可以根據融合瘤的方法製作。用於製造人類單株抗體的人類骨髓瘤（myeloma）及小鼠-人類異骨髓瘤（heteromyeloma）細胞株已有記載（例如參照Kozbor J. Immunol., 133：3001 （1984）；Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63 （Marcel Dekker, Inc., New York, 1987）；及Boerner et al., J. Immunol., 147：86 （1991））。透過人類B細胞融合瘤技術所產生的人類抗體也記載於Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103：3557-3562 （2006）。增加的方法包含例如美國專利第7,189,826號（記載從融合瘤細胞株製造單株人類IgM抗體）、及Ni, Xiandai Mianyixue, 26（4）：265-268 （2006）（記載人類-人類融合瘤）所記載者。人類融合瘤技術（三源雜交瘤（trioma）技術）也記載於Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20（3）：927-937 （2005）及Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27（3）：185-91 （2005）。
人類抗體也可從分離來自人類的噬菌體展示庫所選擇的Fv選殖株的可變區序列而產生。如此的可變區序列可和以下所希望的人類恆定區組合。從抗體庫篩選人類抗體的方法如下述之。
5. 來自庫（library）的抗體 本揭示之抗體，對帶有所希望的一個或複數個活性的抗體，也可經由篩選組合庫（combinatorial library）而分離。例如噬菌體展示庫的產生、或對於具有所希望的結合特性的抗體而用於篩選此庫的各種方法，為此技術領域已知。如此的方法在Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178：1-37 （O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001）中評論，又記載於如McCafferty et al., Nature 348：552-554；Clackson et al., Nature 352：624-628 （1991）； Marks et al., J. Mol. Biol. 222：581-597 （1992）； Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248：161-175 （Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003）； Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338（2）：299-310 （2004）； Lee et al., J. Mol. Biol. 340（5）：1073-1093 （2004）； Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101（34）：12467-12472 （2004）；及Lee et al., J. Immunol. Methods 284（1-2）：119-132（2004）。
在特定的噬菌體展示法中，VH及VL基因的庫（repertory）經聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction：PCR）個別選殖，在噬菌體庫中隨機重組，該噬菌體庫如Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12：433-455 （1994）所述，可篩選出抗體結合噬菌體。噬菌體典型地以作為單鏈Fv（scFv）片段或作為Fab片段任一者而展示抗體片段。來自已免疫的供給來源的庫，不需要構築融合瘤，提供對免疫源高親和性的抗體。或者，如Griffiths et al., EMBO J, 12：725-734 （1993）所記載，對原始庫（repertory）（例如來自人類）進行選殖，在不進行免疫下，也可對廣泛的非自身及自身抗原提供抗體的單一供給來源。最後，原始庫也可以，如Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227：381-388 （1992）所記載，經由從幹細胞選殖重組前的V-基因部分，編碼超可變CDR3區域且使用含有用於活體外（in vitro）達成重組的隨機序列之PCR引子而製作。記載人類抗體噬菌體庫的專利文獻包含如美國專利第5,750,373號、以及美國專利公開案第2005/0079574號、2005/0119455號、第2005/0266000號、第2007/0117126號、第2007/0160598號、第2007/0237764號、第2007/0292936號、及第2009/0002360號。
從人類抗體庫分離的抗體或抗體片段，在本說明書被視為人類抗體或人類抗體片段。
本揭示之具有小分子化合物依賴的抗原結合活性之抗原結合分子或抗體，也可經由篩選抗原結合分子庫而選擇。作為庫也可使用上述之組合庫。又抗原結合分子庫（library）可以是抗原結合分子庫的組庫（repertoire）中不帶偏好（bias）的庫（原始庫（naïve library）），也可以是帶有偏好的庫。後者的庫例如，事先提供對指定化合物的結合能力之抗原結合分子的庫。在特定態樣中，抗原結合分子的庫為，為了提供對指定化合物的結合能力而事先導入胺基酸改變之抗原結合分子的庫。此類的庫例如可參照國際專利公開案WO2015/083764所載之庫。
6. 多特異性抗體 在特定態樣中，本說明書提供的抗體為多特異性抗體（如雙特異性抗體）。多特異性抗體為具有對至少2個不同部位有結合特異性的單株抗體。在特定態樣中，結合特異性之一個為對CD137者，另一個為對其他任意抗原者。在特定態樣中，雙特異性抗體也和CD137的二個不同抗原決定位結合。雙特異性抗體也可用於使細胞毒性劑局部在表現CD137的細胞。雙特異性抗體可製成全長抗體或抗體片段。
在一態樣中，本揭示之抗CD137抗原結合分子或抗體為，一臂具有小分子化合物依賴的CD137結合活性，另一臂和CD137不同的抗原結合之雙特異性抗體。CD137不同的「抗原」，其結構沒有限定為特別結構。在另一種意義上，抗原可以是無機物也可以是有機物。抗原之例在下述中揭示。在一態樣中，作為抗原，以在癌組織或發炎組織的癌細胞、免疫細胞、基質細胞等表現的抗原為佳。
本說明書中，「抗原」只要是包含本發明之抗原結合分子結合的抗原決定位，其結構沒有特別限定。抗原可以是無機物，也可以是有機物。在一些態樣中，抗原例如17-IA、4-1BB、4Dc、6-keto-PGF1a、8-iso-PGF2a、8-oxo-dG、A1腺苷受體、A33、ACE、ACE-2、促進素（activin）、促進素A、促進素AB、促進素B、促進素C、促進素RIA、促進素RIA ALK-2、促進素RIB ALK-4、促進素RIIA、促進素RIIB、ADAM、ADAM10、ADAM12、ADAM15、ADAM17/TACE、ADAM8、ADAM9、ADAMTS、ADAMTS4、ADAMTS5、住所素（addressin）、aFGF、ALCAM、ALK、ALK-1、ALK-7、α-1-抗胰蛋白酶（α-1 antitrypsin）、α-V/β-1 拮抗劑、ANG、Ang、APAF-1、APE、APJ、APP、APRIL、AR、ARC、ART、Artemin、抗Id、ASPARTIC、心房性鈉利尿因子、av/b3整合素（integrin）、Axl、b2M、B7-1、B7-2、B7-H、B-淋巴球刺激因子（BlyS）、BACE、BACE-1、Bad、BAFF、BAFF-R、Bag-1、BAK、Bax、BCA-1、BCAM、Bcl、BCMA、BDNF、b-ECGF、bFGF、BID、Bik、BIM、BLC、BL-CAM、BLK、BMP、BMP-2、BMP-2a、BMP-3 成骨素（Osteogenin）、BMP-4、BMP-2b、BMP-5、BMP-6、Vgr-1、BMP-7（OP-1）、BMP-8（BMP-8a、OP-2）、BMPR、BMPR-IA（ALK-3）、BMPR-IB（ALK-6）、BRK-2、RPK-1、BMPR-II（BRK-3）、BMP、b-NGF、BOK、鈴蟾肽（Bombesin）、骨衍生神經營養因子、BPDE、BPDE-DNA、BTC、補體因子3（C3）、C3a、C4、C5、C5a、C10、CA125、CAD-8、降鈣素（calcitonin）、cAMP、癌胚胎抗原（CEA）、腫瘤關聯抗原、組織蛋白酶A （cathepsin A）、組織蛋白酶B、組織蛋白酶C/DPPI、組織蛋白酶D、組織蛋白酶E、組織蛋白酶H、組織蛋白酶L、組織蛋白酶O、組織蛋白酶S、組織蛋白酶V、組織蛋白酶X/Z/P、CBL、CCI、CCK2、CCL、CCL1、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL2、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9/10、CCR、CCR1、CCR10、CCR10、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CD1、CD2、CD3、CD3E、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD27L、CD28、CD29、CD30、CD30L、CD32、CD33 （p67蛋白質）、CD34、CD38、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD49a、CD52、CD54、CD55、CD56、CD61、CD64、CD66e、CD74、CD80 （B7-1）、CD89、CD95、CD123、CD137、CD138、CD140a、CD146、CD147、CD148、CD152、CD164、CEACAM5、CFTR、cGMP、CINC、肉毒桿菌毒素、產氣莢膜桿菌毒素、CKb8-1、Claudin-6、CLC、CMV、CMV UL、CNTF、CNTN-1、COX、C-Ret、CRG-2、CT-1、CTACK、CTGF、CTLA-4、PD1、PDL1、LAG3、TIM3、半乳糖凝集素-9 （galectin-9）、CX3CL1、CX3CR1、CXCL、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCR、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、角蛋白（cytokeratin）腫瘤關聯抗原、DAN、DCC、DcR3、DC-SIGN、補體控制因子（Decay accelerating factor）、des（1-3）-IGF-I （腦IGF-1）、Dhh、地高辛（Digoxin）、DLL3、DNAM-1、Dnase、Dpp、DPPIV/CD26、Dtk、ECAD、EDA、EDA-A1、EDA-A2、EDAR、EGF、EGFR（ErbB-1）、EMA、EMMPRIN、ENA、內皮素（endothelin） 受體、腦啡胜肽酶（enkephalinase）、eNOS、Eot、伊紅趨素1 （eotaxin 1）、EpCAM、肝配蛋白（ephrin） B2/EphB4、EPO、ERCC、E-選擇素（E-selectin）、ET-1、第IIa凝血因子、第VII凝血因子、第VIIIc凝血因子、第IX凝血因子、成纖維細胞活化蛋白（fibroblast activation protein）（FAP）、Fas、FcR1、FEN-1、鐵蛋白（Ferritin）、FGF、FGF-19、FGF-2、FGF-3、FGF-8、FGFR、FGFR-3、纖維蛋白（fibrin）、FL、FLIP、Flt-3、Flt-4、卵泡刺激賀爾蒙、趨化因子配體（fractalkine）、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、FZD10、G250、Gas6、GCP-2、GCSF、GD2、GD3、GDF、GDF-1、GDF-3 （Vgr-2）、GDF-5 （BMP-14、CDMP-1）、GDF-6 （BMP-13、CDMP-2）、GDF-7 （BMP-12、CDMP-3）、GDF-8（Myostatin）、GDF-9、GDF-15（MIC-1）、GDNF、GDNF、GFAP、GFRa-1、GFR-α1、GFR-α2、GFR-α3、GITR、昇糖素（glucagon）、Glut4、糖蛋白IIb/IIIa （GPIIb/IIIa）、GM-CSF、gp130、gp72、GRO、成長賀爾蒙釋出因子、半抗原（hapten） （NP-cap或NIP-cap）、HB-EGF、HCC、HCMV gB病毒包膜糖蛋白、HCMV gH病毒包膜糖蛋白、HCMV UL、造血生長因子（HGF）、Hep B gp120、乙醯肝素酶（heparanase）、Her2、Her2/neu （ErbB-2）、Her3 （ErbB-3）、Her4 （ErbB-4）、單純皰疹病毒（HSV） gB糖蛋白、HSV gD糖蛋白、HGFA、高分子量黑色素關聯抗原 （HMW-MAA）、HIV gp120、HIV IIIB gp 120 V3環（loop）、HLA、HLA-DR、HM1.24、HMFG PEM、HRG、Hrk、人類心臟肌凝蛋白（myosin）、人類巨細胞病毒（HCMV）、人類生長激素（HGH）、HVEM、I-309、IAP、ICAM、ICAM-1、ICAM-3、ICE、ICOS、IFNg、Ig、IgA受體、IgE、IGF、IGF結合蛋白、IGF-1R、IGFBP、IGF-I、IGF-II、IL、IL-1、IL-1R、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-4R、IL-5、IL-5R、IL-6、IL-6R、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、IL-18R、IL-21、IL-23、IL-27、干擾素（INF）-α、INF-β、INF-γ、抑制素（inhibin）、iNOS、胰島素A鏈、胰島素B鏈、類胰島素增殖因子1、整合素（integrin）α2、整合素α3、整合素α4、整合素α4/β1、整合素α4/β7、整合素α5（αV）、整合素α5/β1、整合素α5/β3、整合素α6、整合素β1、整合素β2、干擾素γ、IP-10、I-TAC、JE、激肽釋放素 2 （kallikrein 2） 、激肽釋放素5、激肽釋放素6、激肽釋放素11、激肽釋放素12、激肽釋放素14、激肽釋放素15、激肽釋放素L1、激肽釋放素L2、激肽釋放素L3、激肽釋放素L4、KC、KDR、角質細胞（keratinocytes）增殖因子（KGF）、板素5 （laminin 5）、LAMP、LAP、LAP（TGF-1）、潛在性TGF-1、潛在性TGF-1 bp1、LBP、LDGF、LECT2、Lefty、Lewis-Y抗原、Lewis -Y關連抗原、LFA-1、LFA-3、Lfo、LIF、LIGHT、脂蛋白、LIX、LKN、Lptn、L-選擇素（L-selectin）、LT-a、LT-b、LTB4、LTBP-1、肺表面、黃體素、淋巴毒素（lymphotoxin）β受體、Mac-1、MAdCAM、MAG、MAP2、MARC、MCAM、MCAM、MCK-2、MCP、M-CSF、MDC、Mer、METALLOPROTEASES、MGDF受體、MGMT、MHC（HLA-DR）、MIF、MIG、MIP、MIP-1-α、MK、MMAC1、MMP、MMP-1、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-2、MMP-24、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MPIF、Mpo、MSK、MSP、黏液素（Muc1）、MUC18、抗穆氏管荷爾蒙（Müllerian-inhibiting hormone）、Mug、MuSK、NAIP、NAP、NCAD、N-C Adoherin、NCA 90、NCAM、NCAM、腦啡肽酶（neprilysin）、神經營養因子（neurotrophin）-3、-4、或-6、神經生長因子（Neurturin）、神經生長因子（NGF）、NGFR、NGF-β、nNOS、NO、NOS、Npn、NRG-3、NT、NTN、OB、OGG1、OPG、OPN、OSM、OX40L、OX40R、p150、p95、PADPr、副甲狀腺素、PARC、PARP、PBR、PBSF、PCAD、P-鈣黏蛋白（P-cadherin）、PCNA、PDGF、PDGF、PDK-1、PECAM、PEM、PF4、PGE、PGF、PGI2、PGJ2、PIN、PLA2、胎盤型鹼性磷酸酶（PLAP）、PlGF、PLP、PP14、前胰島素（proinsulin）、前鬆弛素（prorelaxin）、蛋白質C、PS、PSA、PSCA、前列腺特異性膜抗原（PSMA）、PTEN、PTHrp、Ptk、PTN、R51、RANK、RANKL、RANTES、RANTES、鬆弛素（relaxin）A鏈、鬆弛素（relaxin）B鏈、腎素（renin）、呼吸道融合病毒（RSV）F、RSV Fgp、Ret、類風濕性因子（Rheumatoid Factor）、RLIP76、RPA2、RSK、S100、SCF/KL、SDF-1、SERINE、血清白蛋白、sFRP-3、Shh、SIGIRR、SK-1、SLAM、SLPI、SMAC、SMDF、SMOH、SOD、SPARC、Stat、STEAP、STEAP-II、TACE、TACI、TAG-72 （腫瘤關聯糖蛋白-72）、TARC、TCA-3、T細胞受體（例如T細胞受體α/β）、TdT、TECK、TEM1、TEM5、TEM7、TEM8、TERT、睪丸PLAP狀鹼性磷酸酶（ testicular PLAP-like alkaline phosphatase）、TfR、TGF、TGF-α、TGF-β、TGF-β泛特異性、TGF-βRI（ALK-5）、TGF-βRII、TGF-βRIIb、TGF-βRIII、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4、TGF-β5、凝血酶（thrombin）、胸腺Ck-1、甲狀腺刺激賀爾蒙、Tie、TIMP、TIQ、組織因子、TMEFF2、Tmpo、TMPRSS2、TNF、TNF-α、TNF-αβ、TNF-β2、TNFc、TNF-RI、TNF-RII、TNFRSF10A（TRAIL R1 Apo-2、DR4）、TNFRSF10B（TRAIL R2 DR5、KILLER、TRICK-2A、TRICK-B）、TNFRSF10C（TRAIL R3 DcR1、LIT、TRID）、TNFRSF10D（TRAIL R4 DcR2、TRUNDD）、TNFRSF11A（RANK ODF R、TRANCE R）、TNFRSF11B（OPG OCIF、TR1）、TNFRSF12（TWEAK R FN14）、TNFRSF13B（TACI）、TNFRSF13C（BAFF R）、TNFRSF14（HVEM ATAR、HveA、LIGHT R、TR2）、TNFRSF16（NGFR p75NTR）、TNFRSF17（BCMA）、TNFRSF18（GITR AITR）、TNFRSF19（TROY TAJ、TRADE）、TNFRSF19L（RELT）、TNFRSF1A（TNF RI CD120a、p55-60）、TNFRSF1B（TNF RII CD120b、p75-80）、TNFRSF26（TNFRH3）、TNFRSF3（LTbR TNF RIII、TNFC R）、TNFRSF4（OX40 ACT35、TXGP1 R）、TNFRSF5（CD40 p50）、TNFRSF6（Fas Apo-1、APT1、CD95）、TNFRSF6B（DcR3 M68、TR6）、TNFRSF7（CD27）、TNFRSF8（CD30）、TNFRSF9（4-1BB CD137、ILA）、TNFRSF21（DR6）、TNFRSF22（DcTRAIL R2 TNFRH2）、TNFRST23（DcTRAIL R1 TNFRH1）、TNFRSF25（DR3 Apo-3、LARD、TR-3、TRAMP、WSL-1）、TNFSF10（TRAIL Apo-2配體、TL2）、TNFSF11（TRANCE/RANK配體 ODF、OPG配體）、TNFSF12（TWEAK Apo-3配體、DR3配體）、TNFSF13（APRIL TALL2）、TNFSF13B（BAFF BLYS、TALL1、THANK、TNFSF20）、TNFSF14（LIGHT HVEM配體、LTg）、TNFSF15（TL1A/VEGI）、TNFSF18（GITR配體AITR配體、TL6）、TNFSF1A （TNF-a 連接素（Conectin）、DIF、TNFSF2）、TNFSF1B （TNF-b LTa、TNFSF1）、TNFSF3 （LTb TNFC、p33）、TNFSF4 （OX40配體 gp34、TXGP1）、TNFSF5 （CD40配體 CD154、gp39、HIGM1、IMD3、TRAP）、TNFSF6 （Fas配體 Apo-1配體、APT1配體）、TNFSF7 （CD27配體 CD70）、TNFSF8 （CD30配體 CD153）、TNFSF9 （4-1BB配體 CD137配體）、TP-1、t-PA、Tpo、TRAIL、TRAIL-R、TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRANCE、轉鐵蛋白受體、TRF、Trk、TROP-2、TLR （Toll-like receptor） 1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TSG、TSLP、腫瘤關聯抗原CA125、腫瘤關聯抗原表現 Lewis Y關聯碳水化合物、TWEAK、TXB2、Ung、uPAR、uPAR-1、尿激酶（urokinase）、VCAM、VCAM-1、VECAD、VE-鈣黏蛋白（cadherins）、VE-鈣黏蛋白-2、VEFGR-1（flt-1）、VEGF、VEGFR、VEGFR-3（flt-4）、VEGI、VIM、病毒抗原、VLA、VLA-1、VLA-4、VNR整合素（ integrin）、溫韋伯氏因子（von Willebrand factor）、WIF-1、WNT1、WNT2、WNT2B/13、WNT3、WNT3A、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A、WNT9B、WNT10A、WNT10B、WNT11、WNT16、XCL1、XCL2、XCR1、XEDAR、XIAP、XPD、HMGB1、IgA、Aβ、CD81、CD97、CD98、DDR1、DKK1、EREG、Hsp90、IL-17/IL-17R、IL-20/IL-20R、氧化LDL、PCSK9、前激肽釋放酶（prekallikrein）、RON、TMEM16F、SOD1、嗜鉻粒蛋白 A （Chromogranin A）、嗜鉻粒蛋白B、tau、VAP1、高分子激肽原（kininogen）、IL-31、IL-31R、Nav1.1、Nav1.2、Nav1.3、Nav1.4、Nav1.5、Nav1.6、Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9、EPCR、C1、C1q、C1r、C1s、C2、C2a、C2b、C3、C3a、C3b、C4、C4a、C4b、C5、C5a、C5b、C6、C7、C8、C9、B因子、D因子、 H因子、備解素（properdin）、抑硬素（sclerostin）、纖維蛋白原（fibrinogen）、血纖維蛋白（fibrin）、凝血酶原（prothrombin）、凝血酶（thrombin）、組織因子、第V因子、第Va因子、第 VII因子、第VIIa因子、第VIII因子、第VIIIa因子、第IX因子、第 IXa因子、第X因子、第Xa因子、第XI因子、第Xia因子、第 XII因子、第 XIIa因子、第 XIII因子、第 XIIIa因子、TFPI、抗凝血酶（antithrombin） III、EPCR、凝血酶調節素（thrombomodulin）、TAPI、tPA、織維蛋白溶酶原（plasminogen）、胞漿素（plasmin）、PAI-1、PAI-2、GPC3、多配體蛋白聚糖-1 （Syndecan-1）、多配體蛋白聚糖-2 （Syndecan-2）、多配體蛋白聚糖-3 （Syndecan-3）、多配體蛋白聚糖-4 （Syndecan-4）、LPA、S1P等。在一些態樣中，抗原為例如賀爾蒙及生長因子的受體等。在特定態樣中，抗原為腫瘤組織所含之細胞（例如腫瘤細胞、免疫細胞、間質細胞等）表現或分泌之抗原。
製作多特異性抗體的方法包含但不限於，具有不同特異性的2個免疫球蛋白的重鏈-輕鏈對的重組共同表現（參照Milstein and Cuello, Nature 305：537 （1983）、WO93/08829、及Traunecker et al., EMBO J. 10：3655 （1991））。多特異性抗體也可以經由操作用以製作Fc異二聚體分子的靜電轉向效應（electrostatic steering effects）（WO2009/089004A1）；使2個以上的抗體或片段交聯（參照美國專利第4,676,980號及Brennan et al., Science, 229：81 （1985））；使用白胺酸拉鏈（leucine zipper）製作具有2個特異性的抗體（參照Kostelny et al., J. Immunol., 148（5）：1547-1553 （1992））；使用「DIABODY」技術製作雙特異性抗體片段（參照Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90：6444-6448 （1993））；以及使用單鏈Fv（scFv）二聚體（參照Gruber et al., J. Immunol., 152：5368 （1994））；及如Tutt et al. J. Immunol. 147：60 （1991）所載製備三特異性抗體來製造。
包含「章魚抗體（octopus antibody）」之帶有3個以上功能性抗原結合部位的改變抗體也包含於本說明書中（參照美國專利公開案第2006/0025576號A1）。
本說明書中，抗體或片段包含和CD137不同的其他抗原結合之1個抗原結合部位，也包含「雙動Fab」（dual-acting Fab）或「DAF」（參照美國專利公開案第2008/0069820號）。
7. 抗體突變體 在特定態樣中，本說明書所提供之抗體的胺基酸序列突變體也在考慮之內。例如，使抗體的結合親和性及/或其他生物學特性改善者，也是所期望的。抗體的胺基酸序列突變體也可經由在編碼抗體的核苷酸序列導入適當的修飾或經由胜肽的合成而製作。如此之修飾包含例如抗體的胺基酸序列的缺失、及/或抗體的胺基酸序列中的插入、及/或抗體的胺基酸序列中的殘基的取代。以最終構築體具有所希望的特徵（如抗原結合特性）為前提，可以進行缺失、插入、及取代之任意組合以達到最終構築體。
a） 取代、插入、及缺失突變體 在特定態樣中，提供具有1個或複數個胺基酸取代之抗體突變體。取代的突變導入之目標部位包含HVR及FR。保留性取代顯示於表1之「較佳的取代」之標題下方。更實質的變更提供於表1之「取代之例」之標題下方，並且在下文中提及胺基酸側鏈的類別進行詳述。胺基酸取代也可導入目標抗體，產物也可對於所希望的活性例如維持/改善的抗原結合性、降低的免疫原性、或改善的ADCC或CDC等進行篩選。
［表5］
原始殘基 取代之例 較佳的取代
Ala （A） Val; Leu; Ile Val
Arg （R） Lys; Gln; Asn Lys
Asn （N） Gln; His; Asp, Lys; Arg Gln
Asp （D） Glu; Asn Glu
Cys （C） Ser; Ala Ser
Gln （Q） Asn; Glu Asn
Glu （E） Asp; Gln Asp
Gly （G） Ala Ala
His （H） Asn; Gln; Lys; Arg Arg
Ile （I） Leu; Val; Met; Ala; Phe; 正白胺酸 Leu
Leu （L） 正白胺酸;Ile; Val; Met; Ala; Phe Ile
Lys （K） Arg; Gln; Asn Arg
Met （M） Leu; Phe; Ile Leu
PIle （F） Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Tyr
Pro （P） Ala Ala
Ser （S） Thr Thr
Thr （T） Val; Ser Ser
Trp （W） Tyr; Phe Tyr
Tyr （Y） Trp; Phe; Thr; Ser PIle
Val （V） Ile; Leu; Met; Phe; Ala; 正白胺酸 Leu
胺基酸可根據共同的側鏈特性分類： （1） 疏水性：正白胺酸、甲硫胺酸 （Met）、丙胺酸 （Ala）、纈胺酸 （Val）、白胺酸（Leu）、異白胺酸 （Ile）； （2） 中性的親水性：半胱胺酸（Cys）、絲胺酸 （Ser）、蘇胺酸 （Thr）、天門冬醯酸（Asn）、麩醯胺酸 （Gln）； （3） 酸性：天門冬胺酸 （Asp）、麩胺酸 （Glu）； （4） 鹼性：組胺酸 （His）、賴胺酸 （Lys）、精胺酸 （Arg）； （5） 影響鏈配向的殘基：甘胺酸 （Gly）、脯胺酸 （Pro）； （6） 芳香族性：色胺酸 （Trp）、酪胺酸 （Tyr）、苯丙胺酸 （Phe）。 非保留性取代是指將此等的類別的1個成員和其他類別成員交換。
取代突變體之1個類型包含親代抗體（如人源化或人類抗體）的1個或複數個超可變區域殘基的取代。通常，該結果產生，為了新的研究所選的突變體，應該和親代抗體相比具有特定生物學上的特性之修飾（例如改善）（例如增加的親和性、降低的免疫原性）、及/或實質上保留親代抗體的特定生物學特性。取代突變體之例為親和性成熟抗體，這些可使用例如基於噬菌體展示的親和性成熟技術（例如本說明書所記載者）而適當製作。簡要言之，使1個或複數個HVR殘基突變，之後於噬菌體上展示突變抗體，進行關於特定生物學活性（例如結合親和性）的篩選。
改變（例如取代）可例如為了改善抗體的親和性而在HVR進行。如此改變可在HVR的「熱點」，即在體細胞成熟過程之間高頻率發生突變的密碼子所編碼的殘基（參照Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207：179-196 （2008）），及/或在和抗原接觸的殘基進行，可測試所得的突變VH或VL的結合親和性。經由從二次庫構築及再篩選的親和性成熟如Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178：1-37 （O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, （2001））所記載。在親和性成熟的一些態樣中，多樣性可經由任意的多種方法（例如易錯PCR（error-prone PCR）、鏈替換（chain shuffling）或寡核苷酸定向突變 （oligonucleotide-directed mutagenesis） 導入），導入用於成熟而被篩選的可變基因。之後，製作二次庫。其次，篩選此庫以鑑定具有所希望的親和性之任意的抗體突變體。導入多樣性的其他方法包含使一些HVR殘基（例如一次4~6個殘基）隨機化的HVR導向方法。關於抗原結合的HVR殘基，可使用例如丙胺酸掃描突變導入或建立模型而具體的確定。特別是CDR-H3及CDR-L3常常被標的化。
在特定態樣中，取代、插入、或缺失，此等改變只要實質上不降低和抗原結合的能力，可在1個或複數個的HVR內進行。例如，實質上不降低結合親和性的保留性改變（例如本說明書所提供之保留性取代）可在HVR中進行。如此的改變可例如在HVR的抗原接觸殘基之外側進行。在上述突變的VH及VL序列的特定態樣中，各HVR雖不改變但包含約1個、2個或3個胺基酸取代。
可用於鑑定為了導入突變而可標靶化的抗體的殘基或區域之方法，如Cunningham and Wells （1989） Science, 244：1081-1085所記載之稱為「丙胺酸掃描（alanine scanning）突變導入」。此方法中，鑑定一殘基或一群標靶殘基（例如帶電殘基，如精胺酸、天冬胺酸、組胺酸、賴胺酸、及麩胺酸），以中性或帶負電的胺基酸（如丙胺酸或聚丙胺酸）取代，確認抗體和抗原的交互作用是否受到影響。在對此初期取代顯示功能上敏感性的胺基酸位置，可以進一步導入取代。或者或除此之外，也可以分析抗原抗體複合體的結晶構造以鑑定抗體和抗原之間的接觸點。如此的接觸殘基及相鄰的殘基也可作為取代候選而標靶化，或者也可以排除於取代候補外。可篩選突變體以確認該等是否包含所希望的活性。
胺基酸序列的插入，和序列內部的單一個或複數個胺基酸殘基的插入相同，也包括在胺基末端及/或羧基末端含有1個至100個殘基以上之多胜肽的長度範圍內的融合。末端插入之例，包括N端帶有甲硫胺酸殘基的抗體。除抗體分子以外的插入突變體，包含在抗體的N-或C-端融合使酵素（例如ADEPT用）或抗體的血漿半衰期延長的多胜肽者。
b） 糖基化突變體 在特定態樣中，本說明書所提供之抗體，以使抗體糖基化的程度增加或減少而改變。對抗體的糖基化部位的追加或消除，可經由改變胺基酸序列以作出或去除1個或複數個糖基化部位而簡便地達成。
在抗體包含Fc區域的情形，也可改變加成於此處的碳水化合物。由哺乳動物細胞所產生的天然型抗體，典型含有支鏈的二支鏈寡糖，該寡糖通常在Fc區域的CH2區的Asn297經N-鍵結（N-linkage）而被加成。例如參照Wright et al. TIBTECH 15：26-32 （1997）。寡糖包含例如甘露糖（mannose）、N-乙醯葡糖胺（GlcNAc）、半乳糖、及唾液酸等的多種碳水化合物，或二支鏈的寡糖結構的「主幹」中加成GlcNAc的鹿角藻糖（fucose）。在一些態樣中，本揭示之抗體中的寡糖的修飾，也可以為了製作出帶有特定改善的特性之抗體突變體而進行。
在一態樣中，提供缺少（直接或間接）加成於Fc區域的鹿角藻糖之具有碳水化合物結構的抗體突變體。例如在如此抗體中的鹿角藻糖的量，可為1％～80％、1％～65％、5％～65％或20％～40％。鹿角藻糖的量，如WO2008/077546所記載，經由經MALDI-TOF質量分析測量，計算相對於加成於Asn297的所有糖結構體（如複合、雜交、及高甘露糖結構體）的和，在Asn297的糖鏈內的鹿角藻糖的平均量而確定。Asn297表示位於Fc區域的第297位附近的天冬醯胺酸殘基（Fc區域殘基的EU編號）。但是，由於複數個抗體之間一點點的序列多樣性，Asn297也可以位於第297位的±3個胺基酸上游或下游，即第294位~第300位之間。如此的鹿角藻糖化突變體，可具有改良的ADCC功能。例如參照美國專利公開案第2003/0157108號（Presta, L.） ；第2004/0093621號 （Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd）。關於「去鹿角藻糖化」或「鹿角藻糖缺失」抗體突變體的刊物包含例如US2003/0157108; WO2000/61739; WO2001/29246; US2003/0115614; US2002/0164328; US2004/0093621; US2004/0132140; US2004/0110704; US2004/0110282; US2004/0109865; WO2003/085119; WO2003/084570; WO2005/035586; WO2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336：1239-1249 （2004）; Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87：614 （2004）。可產生去鹿角藻糖化抗體的細胞株，包含例如缺少蛋白質的鹿角藻糖化的Lec13 CHO細胞（Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249：533-545 （1986）；美國專利公開案第US2003/0157108號A1, Presta, L；及WO2004/056312A1, Adams et al., 特別是實施例11）及剔除（knock-out）細胞株如alpha-1,6-鹿角藻糖基轉移酶基因FUT8剔除CHO細胞（參照如Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87：614 （2004）；Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94（4）：680-688 （2006）；及WO2003/085107）。
更提供例如在抗體Fc區域加成的二支鏈型寡糖因GlcNAc而二等分之具有二等分寡糖的抗體突變體。如此的抗體突變體可具有降低的鹿角藻糖化及/或改良的ADCC功能。如此的抗體突變體例如WO2003/011878 （Jean-Mairet et al.） ；美國專利第6,602,684號 （Umana et al.）；及US2005/0123546 （Umana et al.）所記載。也提供在Fc區域加成的寡糖中具有至少1個半乳糖殘基的抗體突變體。如此的抗體突變體可具有改良的CDC功能。如此的抗體突變體例如WO1997/30087 （Patel et al.）；WO1998/58964 （Raju, S.）； 及WO1999/22764 （Raju, S.） 所記載。
c） Fc區域突變體 在特定態樣中，本說明書所提供之抗體在Fc區域導入1個或複數個胺基酸修飾，也可因此產生Fc區域突變體（或也稱為「改變Fc區域」）。Fc區域突變體包含在1個或複數個胺基酸位置的胺基酸修飾（如取代），也包含人類Fc區域序列（例如人類IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4的Fc區域）。
在特定態樣中，具有一些但不是所有的效應（effector）功能的抗體突變體，也在本揭示的考慮之內，該效應功能對於抗體在活體內（in vivo）的半衰期是重要的，但是特定的效應功能（補體及ADCC等）在不欲或有害的情形的應用，為希望的候補者。為了確認CDC及/或ADCC的活性降低/欠缺，可進行活體外（in vitro）及/或活體內（in vivo）的細胞毒性測試。例如，可進行Fc受體（FcR）的結合測量，以確認抗體欠缺FcγR結合活性（因而缺少ADCC活性的機率高）、另一方面維持FcRn結合活性。媒介ADCC的初代細胞（primary cell）之NK細胞只表現FcγRIII，但是另一方面，單核球表現FcγRI、FcγRII、FcγRIII。造血細胞上的FcR的表現總結於Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9：457-492 （1991） 的第464頁的表 3。評價目標分子的ADCC活性之活體外測量法（分析法）的非限定例如美國專利第5,500,362號（例如參照Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83：7059-7063 （1986）及Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82：1499-1502 （1985）；美國專利第5,821,337號（Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166：1351-1361 （1987））。或者，也可使用非放射性的測量法（例如參照ACT1（商標）non-radioactive cytotoxicity assay for flow cytometry （CellTechnology, Inc. Mountain View, CA）；及CytoTox 96（登錄商標）non-radioactive cytotoxicity assays （Promega, Madison, WI））。如此的測量法之有用的效應細胞包含末梢血液單核球（peripheral blood mononuclear cell：PBMC）及自然殺手（natural killer：NK）細胞。或者或除此之外，目標分子的ADCC活性也可在如Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95：652-656 （1998）所載之動物模式中活體內評價。又抗體不能和C1q結合者，因此為了確認缺乏CDC活性，也可進行C1q結合測量。例如參照WO2006/029879及WO2005/100402的C1q和C3c結合ELISA。又為了評價補體活化，也可進行CDC測量（例如Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202：163 （1996）；Cragg, M.S. et al., Blood 101：1045-1052 （2003）；及Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103：2738-2743 （2004））。再者，FcRn結合性及活體內的清除/半衰期的決定，可使用此技術領域已知方法進行（例如Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18（12）：1759-1769 （2006））。
帶有降低的效應功能的抗體，包含在Fc區域殘基238、265、269、270、297、327、及329有1個或複數個取代者（美國專利第6,737,056號）。如此的Fc突變體包含在殘基265及297有丙胺酸取代之所謂的「DANA」Fc突變體（美國專利第7,332,581號），包含在胺基酸位置265、269、270、297、及327有2個以上的取代之Fc突變體。
已有記載具有對FcRs增強或降低的結合性的特定抗體突變體（美國專利第6,737,056號；WO2004/056312、及Shields et al., J. Biol. Chem. 9（2）：6591-6604 （2001））。
在特定態樣中，抗體突變體包含具有改善ADCC的1個或複數個胺基酸取代（例如在Fc區域的位置298、333、及/或334（EU編號的殘基）處的取代）的Fc區域。
在一些態樣中，如美國專利第6,194,551號、WO99/51642、及Idusogie et al. J. Immunol. 164：4178-4184 （2000）所記載，導致已改變（即增加或減少任一者）的C1q結合性及/或補體依賴性細胞毒性（CDC）的改變，在Fc區域進行。
對於增加的半衰期及新生兒Fc受體（FcRn：負責母體的IgG類移至胎兒的角色（Guyer et al., J. Immunol. 117：587 （1976） and Kim et al., J. Immunol. 24：249 （1994））具有增加的結合性之抗體記載於美國專利公開案第2005/0014934號A1（Hinton et al.）。此等抗體包含其中具有增加Fc區域對FcRn的結合性的1個或複數個取代之Fc區域。此Fc突變體包含在Fc區域殘基：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424、或434的1處或複數處有取代（如Fc區域殘基434的取代（美國專利第7,371,826號））者。
關於Fc區域突變體的其他例也可參照Duncan & Winter, Nature 322：738-40 （1988）；美國專利第5,648,260號；美國專利第5,624,821號；及WO94/29351。
在一態樣中，抗體Fc區域（包含突變Fc區域。以下亦同）對各人類Fcγ受體（FcγR）的結合活性，根據以表面電漿共振分析法作為測量原理，使用例如BIACORE（登錄商標）T200的配體捕捉法來測量。
抗體Fc區域對各人類Fcγ受體（FcγR）的結合活性的測量方法之例如下詳述。在一態樣中，抗體Fc區域對FcγR的結合活性以BIACORE（登錄商標）T200評價。在一較佳態樣中，此測量使用50 mM磷酸、150 mM NaCl、0.05 w/v%-P20、pH7.4作為測量用緩衝液在25℃實施。具體為，首先使用固定有作為配體捕捉用分子之CaptureSelect（商標）人類Fab-λ動態生物素共軛物（ThermoFisher scientific）的感應晶片，捕捉含有改變Fc區域的抗體約1000RU。人類FcγR以測量用緩衝液將FcγRIa稀釋至8 nM，其他的FcγR稀釋至1000 nM，和被捕捉的抗體結合。各抗體對各Fcγ的結合活性使用Biacore T200評價軟體2.0計算每單位抗體量的FcγR結合量（RU）而評價。在一態樣中，抗體Fc區域對各人類Fcγ受體（FcγR）的結合活性能夠以參考實施例7-4記載之方法進行測量。
在一較佳態樣中，上述測量方法所使用之FcγR也可為下列方法所製作的FcγR的細胞外區域。首先，FcγR的細胞外區域的基因合成以此技術領域公知方法實施。此時，各FcγR的序列根據登錄於NCBI的資訊製作。具體地說，FcγRI根據NCBI accession # NM_000566.3的序列、FcγRIIa根據NCBI accession # NM_001136219.1的序列、FcγRIIb根據NCBI accession # NM_004001.3的序列、FcγRIIIa根據NCBI accession # NM_001127593.1的序列製作，C端加上His tag。又FcγRIIa的多型部位可參考J. Exp. Med., 1990, 172, 19-25製作，FcγRIIIa的多型部位可參考J. Clin. Invest., 1997, 100, 1059-1070製作。所得的基因片段插入動物細胞表現載體，製作表現載體。所製作的表現載體暫時導入來自人類胎兒腎癌細胞的FreeStyle293細胞（Invitrogen社），使目標蛋白質表現。收集培養上清液後，注入0.22 μm過濾器，原則上以下述的4步驟純化。第1步驟進行陽離子交換柱層析法（SP Sepharose FF），第2步驟進行對His tag的親和性柱層析法（HisTrap HP），第3步驟進行膠過濾柱層析法（Superdex200），第4步驟進行無菌過濾。但是，FcγRI在第1步驟進行使用Q sepharose FF的陰離子交換柱層析法。純化的蛋白質的濃度，以分光光度計測量在280nm的吸光度，從所得的值經PACE等方法計算出的吸光係數來計算（Protein Science, 1995, 4, 2411-2423）。
在一態樣中，抗體Fc區域對人類FcRn的結合活性以表面電漿共振分析法作為測量原理，使用例如BIACORE（登錄商標）T200的配體捕捉法來測量。
抗體Fc區域對人類FcRn的結合活性的測量方法之例詳細如下述。在一態樣中，抗體Fc區域對人類FcRn的結合活性以BIACORE（登錄商標）T200評價。在一較佳態樣，此測量使用50 mM磷酸、150 mM NaCl、0.05 w/v%-P20、pH6.0作為測量用緩衝液在25℃實施。具體為，首先使用固定有作為配體捕捉用分子之CaptureSelect（商標）人類Fab-λ動態生物素共軛物（ThermoFisher scientific）的感應晶片，捕捉含有Fc區域的抗體約400RU，和測量用緩衝液稀釋的人類FcRn結合。各抗體對FcRn的結合活性使用Biacore T200 評價軟體2.0，以穩定狀態（steady state）模式計算KD （M）而評價。在一較佳態樣中，本測量所使用之人類FcRn蛋白質以WO2010107110的參考例2所記載之方法調配。在一態樣中，抗體Fc區域對人類FcRn的結合活性能夠以參考實施例7-5記載之方法進行測量。
d） 半胱胺酸（cysteine）改變抗體突變體 在特定態樣中，抗體的1個或複數個殘基以半胱胺酸殘基取代、做出半胱胺酸改變抗體（如「thioMAbs」）是所希望的。在特定態樣中，接受取代的殘基存在抗體的可通過部位。經由將該等殘基取代為半胱胺酸，反應性的巰基（thiol group）配置於抗體的可通過部位，該反應性巰基和該抗體在其他部分（藥物部分或配體-藥物部分等）形成共軛（conjugation），也可被使用於做出如本說明書進一步詳述之免疫共軛物。在特定態樣中，下列的殘基之任意1個或複數個可取代為半胱胺酸：輕鏈的V205（Kabat編號）；重鏈的A118（EU編號）；及重鏈Fc領域的S400（EU編號）。半胱胺酸改變抗體也可如美國專利第7,521,541號所記載而製造。
e） 抗體衍生物 在特定態樣中，本說明書所提供之抗體也可進一步被修飾以包含此技術領域已知且容易獲得的額外的非蛋白質部分。抗體的衍生物化中較佳部分包含但不限於水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限定例包含但不限於，聚乙二醇（PEG）、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纖維素、右旋糖酐（dextran）、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone）、聚1,3二噁烷（poly 1,3 dioxolane）、聚1,3,6三噁烷（poly 1,3,6 trioxane）、乙烯/順丁烯二酸酐共聚物、聚胺基酸（同元聚合物或無規共聚物任一者）、以及右旋糖酐或聚（n-乙烯吡咯烷酮）聚乙二醇、聚丙二醇同元聚合物、聚環氧丙烷/環氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇（如甘油）、聚乙烯醇、以及此等之混合物。聚乙二醇丙醛由於對水的穩定性而有利於製造。聚合物可以具有任意的分子量，可有支鏈也可沒有支鏈。加成於抗體的聚合物的數量範圍廣，如果加成1個以上的聚合物，該等可以為相同分子，也可以是不同分子。一般來說，用於衍生物化的聚合物的數量及/或型態不限於此等，但是可根據應改良的抗體特定特性或功能、抗體衍生物在限定的條件下是否使用於療法等的考量來決定。
在別的態樣中，提供抗體、和經由暴露於放射線可選擇性加熱的非蛋白部分之共軛物（conjugate）。在一態樣中，非蛋白質部分為奈米碳管（carbon nanotube）（Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102：11600-11605 （2005））。放射線可為任何波長，又雖然不限於此等，但包含對通常細胞無害、卻達到接近抗體-非蛋白質部分的細胞死亡的溫度而使非蛋白質部分變熱的波長。
B. 重組方法及構成 例如，如美國專利第4,816,567號所記載，抗體可使用重組的方法或構成來製造。在一態樣中，提供本說明書所記載之編碼抗CD137抗原結合分子或抗體的分離的核酸。如此之核酸也可編碼含抗體VL的胺基酸序列及/或含VH的胺基酸序列（例如抗體的輕鏈及/或重鏈）。在另外的態樣中，提供包含如此核酸之1個或複數個載體（例如表現載體）。在另外的態樣中，提供包含如此核酸的宿主細胞。在如此態樣的1個，宿主細胞包含（1） 含有編碼含抗體VL的胺基酸序列及含抗體VH的胺基酸序列之核酸的載體，或（2） 含有編碼含抗體VL的胺基酸序列之核酸的第一載體及含有編碼含抗體VH的胺基酸序列之核酸的第二載體（例如經轉形）。在一態樣中，宿主細胞為真核（例如中國豚鼠卵巢（CHO）細胞或淋巴系統的細胞（如Y0、NS0、Sp2/0細胞））。在一態樣中，提供製作抗CD137抗原結合分子或抗體的方法，包括在抗CD137抗原結合分子或抗體適合表現的條件下，培養含有如上述之編碼該抗體之核酸的宿主細胞，以及任意地從宿主細胞（或宿主細胞培養基）收集該抗體。
為了抗CD137抗原結合分子或抗體的重組製造，分離編碼（如上所述者等）抗體的核酸，又進一步為了選殖（cloning）及/或在宿主細胞中表現，插入1個或複數個載體。如此核酸應可使用習知步驟輕易的分離及確定序列（例如使用可特異性結合編碼抗體的重鏈及輕鏈之基因的寡核苷酸探針）。
編碼抗體的載體之選殖或適合表現的宿主細胞，包含本說明書所載之原核細胞或真核細胞。例如，抗體，特別是在不需要糖解及Fc效應功能的情形，也可在細菌製造。關於在細菌的抗體片段及多胜肽的表現，例如參照美國專利第5,648,237號、第5,789,199號、以及第5,840,523號 （以及，對於在大腸桿菌的抗體片段的表現所記載之Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 （B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003）, pp.245-254）。表現後，抗體也可從細菌細胞糊（cell paste）在可溶性分層中分離，又可進一步純化。
除了原核生物，包含帶有具部分或完全的人類糖解模式的抗體的產生、糖解路徑被「人源化」的菌類及酵母菌株之絲狀菌或酵母菌等的真核微生物，為編碼抗體載體的較佳選殖株或表現宿主。參照Gerngross, Nat. Biotech. 22：1409-1414 （2004）及Li et al., Nat. Biotech. 24：210-215 （2006）。
來自多細胞生物（無脊椎動物及脊椎動物）也是用於糖解抗體的表現之合適宿主細胞。無脊椎生物細胞之例，包含植物及昆蟲。和昆蟲細胞的接合，特別是用於秋行軍蟲（Spodoptera frugiperda）細胞的轉形，許多的桿狀病毒（Baculovirus）株被鑑定。
植物細胞培養物也可作為宿主利用。例如參照美國專利5,959,177號、第6,040,498號、第6,420,548號、第7,125,978號、及第6,417,429號（記載用於以轉殖基因植物產生抗體之PLANTIBODIES（商標）技術）。
脊椎動物細胞也可作為宿主利用。例如適應以浮游狀態增殖的哺乳動物細胞株應該有用。有用的哺乳動物宿主細胞株的其他例為，以SV40轉形的猿腎CV1株 （COS-7）；人類胎兒腎株（記載於Graham et al., J. Gen Virol. 36：59 （1977） 等記載的293或293細胞）；幼豚鼠腎細胞 （BHK）；小鼠塞爾托利氏細胞（Sertoli cell）（記載於Mather, Biol. Reprod. 23：243-251（1980）等的TM4細胞）；猿腎細胞 （CV1）；非洲綠猴腎細胞 （VERO-76）；人類子宮頸癌細胞 （HELA）；狗腎細胞 （MDCK）；水牛鼠肝細胞 （BRL 3A）；人類肺細胞 （W138）；人類肝細胞 （Hep G2）；小鼠乳癌 （MMT 060562）；TRI細胞（例如記載於Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383：44-68 （1982））；MRC5細胞；及FS4細胞等。其他有用的哺乳動物宿主細胞株包含，含有DHFR- CHO細胞 （Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77：4216 （1980）） 中國豚鼠卵巢 （CHO） 細胞；及Y0、NS0、及Sp2/0等的骨髓瘤細胞株。適合抗體產生的特定哺乳動物宿主細胞的評論例如參照Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 （B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ）, pp. 255-268 （2003）。
C. 測量方法（分析法） 本說明書所提供的抗CD137抗原結合分子或抗體，也可根據此技術領域已知之多種測量方法，對於鑑定、篩選、或物理/化學特性及/或生物學活性清楚揭示。
1. 結合測量方法及其他測量方法 在一方面，本揭示之抗原結合分子或抗體以例如ELISA、西方點漬法等的公知方法，試驗其抗原結合活性。
在別的方面，在小分子化合物存在下（例如10 μM以上、50μM以上、100μM以上、150μM以上、200μM以上、或250μM以上的小分子化合物存在下），關於和CD137的結合，為了鑑定和包含表37所記載之A375/B167、A372/B040、A356/B040、A486/B167、A487/B167、A488/B226、A489/B223、A548/B376、A551/B256、A551/B379、A555/B379、A548/B256、及/或A549/B167作為重鏈可變區/輕鏈可變區的組合之抗CD137抗原結合分子或抗體競爭的抗原結合分子或抗體，可使用在小分子化合物存在下的競爭分析法。在特定態樣中，如此的競爭抗原結合分子或抗體和包含表37所記載之A375/B167、A372/B040、A356/B040、A486/B167、A487/B167、A488/B226、A489/B223、A548/B376、A551/B256、A551/B379、A555/B379、A548/B256、及/或A549/B167作為重鏈可變區/輕鏈可變區的組合之抗CD137抗原結合分子或抗體所結合的相同抗原決定位（例如線狀或立體結構的抗原決定位）結合。定位（mapping）抗原結合分子或抗體所結合的抗原決定位之方法之詳細例子提供於Morris （1996） “Epitope Mapping Protocols,” in Methods in Molecular Biology vol. 66 （Humana Press, Totowa, NJ）。在一態樣中，具有本揭示之小分子化合物依賴的抗原結合活性所依賴的CD137結合活性之抗CD137抗原結合分子或抗體，辨識經抗原（如CD137）和小分子化合物（如ATP）的複合體所形成的抗原決定位。
在使用抗體的競爭分析法之例中，固定的CD137在小分子化合物存在下（例如10 μM以上、50μM以上、100μM以上、150μM以上、200μM以上、或250μM以上的小分子化合物存在下），培養於含有和CD137結合的第1標記抗體（例如包含表37所載之A375/B167、A372/B040、A356/B040、A486/B167、A487/B167、A488/B226、A489/B223、A548/B376、A551/B256、A551/B379、A555/B379、A548/B256、及/或A549/B167作為重鏈可變區/輕鏈可變區的組合之抗CD137抗體）及在CD137的結合上測試和第1抗體競爭的能力的第2未標記抗體的溶液中。第2抗體可存在融合瘤上清液。作為對照，固定的CD137培養於含有第1標記抗體但不含第2未標記抗體的溶液中。在容許第1抗體對CD137結合的條件下培養後，去除其餘未結合的抗體，測量和固定的CD137結合的標記的量。和固定的CD137結合的標記的量與對照樣本相比，在試驗樣本實質地減少的情形，顯示第2抗體在CD137的結合上和第1抗體競爭。參照Harlow and Lane （1988） Antibodies：A Laboratory Manual ch.14 （Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY）。此技術領域之人士應可理解，該分析法對於抗體以外的抗原結合分子也能同樣實施。
2. 活性測量方法 在一方面，提供鑑定具有生物學活性之抗CD137抗原結合分子或抗體的測量方法。生物學活性可包含例如CD137促效劑活性；血漿中半衰期；抗腫瘤活性；及在低的或受抑制的腫瘤以外的組織之全身反應。又，提供活體內（in vivo）及/或活體外（in vitro）具有如此生物學活性之抗原結合分子或抗體。
在特定態樣中，本揭示之抗原結合分子（例如抗CD137抗原結合分子）或抗體，對於此述之生物學活性進行試驗。
a） 促效劑活性測量方法（PBMC） 在一態樣中，對CD137的促效劑活性（agonist activity），以添加或不添加小分子化合物的溶液中，使CD137表現細胞和抗CD137抗原結合分子或抗體接觸，進行測量。在一態樣中，在添加小分子化合物的溶液中對CD137的促效劑活性，及在未添加小分子化合物的溶液中對CD137的促效劑活性，分別經由使CD137表現細胞和抗CD137抗原結合分子或抗體在該溶液中接觸後，在18小時、24小時、36小時、48小時或72小時以內測量細胞激素的產生量（例如IL-2、IFN-γ、及/或IL-6的產生量），進行評價。在一態樣中，添加小分子化合物的溶液，調整後的小分子化合物的濃度調整為10μM、50μM、100μM、150μM、200μM、或250μM。在另外的一態樣中，上述CD137表現細胞使用分離的人類末梢血液單核細胞（PBMC）、或來自分離的人類PBMC擴大培養的T細胞。
在一態樣中，人類PBMC使用來自健康人的採血，進行400xg、室溫離心30分鐘所分離者。較佳為，人類PBMC使用以下二步驟分離。第1步驟將添加Ficoll-Paque PLUS（GE Healthcare）的Leucosep（greiner bio-one）進行1000xg、室溫離心1分鐘後，添加PBS稀釋的血液，進行400xg、室溫離心30分鐘。第2步驟從離心後的管取出膚色血球層（buffy coat）後，以60 mL的PBS（Wako）洗淨。 使用人類PBMC的CD137促效劑活性的測量方法之例如下詳述。在下述例子，使用ATP做為小分子化合物，但是不排除其他小分子化合物。在一態樣中，分離的人類PBMC在培養基（5%人類血清（SIGMA）、95%AIM-V（Thermo Fischer Scientific））稀釋至細胞密度為5×106 /mL。之後，使該分離的人類PBMC和抗人類CD3ε抗體及/或抗人類CD28抗體接觸。 因此，在人類PBMC的CD137表現被誘導。較佳為，在該分離的人類PBMC （細胞密度5×106 /mL，100μL），添加以培養基稀釋的0.04μg/mL抗人類CD3ε抗體（BD社製，選殖株SP34） 及20μg/mL抗人類CD28抗體（BD，選殖：CD28.2） 50μL。
添加抗人類CD3ε抗體及/或抗人類CD28抗體的人類PBMC，之後進一步添加：（i） 含或不含ATP的培養基；及（ii） 抗CD137抗原結合分子或抗體。包含或不包含該ATP的培養基較佳添加25μL。抗CD137抗原結合分子或抗體較佳以40μg/mL添加25μL。更佳為，上述（i）及（ii）從人類PBMC接觸抗人類CD3ε抗體及/或抗人類CD28抗體的約6個小時後添加。在一態樣中，較佳為在測量IFN-γ的產生量之前先測量IL-2的產生量。在一態樣中，IL-2的產生量在人類PBMC接觸抗人類CD3ε抗體及/或抗人類CD28抗體後約24個小時以內測量。較佳為，IL-2的產生量從人類PBMC接觸抗人類CD3ε抗體及/或抗人類CD28抗體的約24個小時後、且從添加抗CD137抗原結合分子或抗體後約18個小時後測量。
在別的一態樣中，IFN-γ的產生量在人類PBMC接觸抗人類CD3ε抗體及/或抗人類CD28抗體後約48個小時以內測量。較佳為，IFN-γ的產生量從人類PBMC接觸抗人類CD3ε抗體及/或抗人類CD28抗體的約48個小時後、且從添加抗CD137抗原結合分子或抗體後約42個小時後測量。在一態樣中，IL-2的產生量及/或IFN-γ的產生量為測量收集的培養上清液中IL-2的產生量及/或IFN-γ的產生量。在一態樣中，添加抗人類CD3ε抗體及/或抗人類CD28抗體的人類PBMC到所有測量結束為止，在37℃、5%CO2 的培養箱內靜置。
再一使用人類PBMC的CD137促效劑活性之測量方法之例詳如下述。分離的人類PBMC在培養基（5%人類血清（SIGMA）、95%AIM-V（Thermo Fischer Scientific））稀釋至細胞密度為5×106 /mL。之後，將人類PBMC調整為細胞密度為5×106 /mL，每100μL接種於96孔平底附蓋的多孔微量盤（Corning）。之後進行誘導在人類PBMC的CD137表現之操作。例如，添加以培養基稀釋的0.04μg/mL抗人類CD3ε抗體（BD社製，選殖株 SP34）及20μg/mL抗人類CD28抗體（BD，選殖株CD28.2） 50μL，在人類PBMC的CD137表現被誘導。
在人類PBMC的CD137表現被誘導後，使微量盤震盪，在37℃、5%CO2 的培養箱內靜置6小時。之後在各孔只添加以培養基稀釋的2 mM ATP （SIGMA）或不含ATP的培養基25μL及40μg/mL的各抗體25μL，使微量盤震盪，在37℃、5%CO2 的培養箱內靜置18小時。之後，收集部分培養上清液，使用培養上清液，培養上清液中所含的IL-2量以人類IL-2 DuoSetELISA套組（R&D systems）或人類IL-2 ELISA組 （BD Biosciences）定量。收集培養上清液後的微量盤再於37℃、5%CO2 的培養箱內靜置24小時。之後，收集部分培養上清液，培養上清液中所含的IFN-γ量以人類IFN-γ DuoSetELISA套組（R&D systems）或人類IFN-γ ELISA顯色套組（PeproTech）定量。ELISA根據原本套組所附的使用手冊進行。關於人類IL-2 DuoSetELISA套組（R&D systems）及人類IFN-γ DuoSetELISA套組（R&D systems），使用含有H2 O2 及四甲基聯苯胺（tetramethylbenzidine）的基質溶液（R&D systems）及1N H2 SO4 （Wako），根據使用手冊進行顯色或顯色停止。關於人類IL-2 ELISA組（BD Biosciences），使用1N H2 SO4 （Wako）進行顯色停止。
關於IFN-γ ELISA 顯色套組（PeproTech），可使用TMB Chromogen 溶液（Thermo Fischer Scientific）及1N H2 SO4 （Wako）進行顯色停止。之後以EnVision（PerkinElmer）進行吸光度的測量，使用操作手冊所製作的檢測線分別計算培養上清液中的IL-2及IFN-γ的量（pg/mL）。在該PBMC分析法中，CD137促效劑活性能夠以培養上清液中的IL-2量及IFN-γ量相對於陰性對照抗體（不結合CD137的抗體）的差異倍數（fold change）表示。在一態樣中，CD137促效劑活性能夠以參考實施例5-5-1及5-5-2所載之方法測量。
在一態樣中，在以人類PBMC分析法的細胞激素產生量（例如IL-2、IFN-γ、及/或IL-6產生量）評價對CD137的促效劑活性之情形，在添加抗CD137抗原結合分子或抗體的情形之10μM、50μM、100μM、150μM、200μM、或250μM的小分子化合物存在下的細胞激素產生量，是添加陰性對照抗體的情形的細胞激素的產生量的1.01倍以上、1.02倍以上、1.03倍以上、1.05倍以上、1.06倍以上、1.07倍以上、1.08倍以上、1.09倍以上、1.1倍以上、1.11倍以上、1.12倍以上、1.13倍以上、1.14倍以上或1.15倍以上、1.5倍以上、2倍以上、或3倍以上的情形時，可評價該抗CD137抗原結合分子或抗體在該小分子化合物存在下顯示對CD137的促效劑活性。
在一態樣中，在以人類PBMC分析法的IL-2產生量評價對CD137的促效劑活性之情形，在添加抗CD137抗原結合分子或抗體的情形之10μM、50μM、100μM、150μM、200μM、或250μM的小分子化合物存在下的IL-2產生量，是添加陰性對照抗體的情形的IL-2產生量的1.01倍以上、1.02倍以上、1.03倍以上、或1.05倍以上的情形時，在一較佳態樣中為1.05倍以上的情形時，可評價該抗CD137抗原結合分子或抗體在該小分子化合物存在下顯示對CD137的促效劑活性。
在一態樣中，在以人類PBMC分析法的IFN-γ產生量評價對CD137的促效劑活性之情形，在添加抗CD137抗原結合分子或抗體的情形之10μM、50μM、100μM、150μM、200μM、或250μM的小分子化合物存在下的IFN-γ產生量，是添加陰性對照抗體的情形的IFN-γ產生量的1.1倍以上、1.11倍以上、1.12倍以上、1.13倍以上、1.14倍以上或1.15倍以上的情形時，在一較佳態樣中為1.15倍以上的情形時，可評價該抗CD137抗原結合分子或抗體在該小分子化合物存在下顯示對CD137的促效劑活性。
在另外的一態樣中，和上述陰性對照抗體之比較中，從已評價出在小分子化合物存在下顯示對CD137的促效劑活性之抗CD137抗原結合分子或抗體，進一步確定被評價為在該小分子不存在下不顯示CD137促效劑活性、或CD137促效劑活性（和該小 子化合物存在下相比）低的抗體。具體地說，在下述（ii）大於（i）的情形，抗CD137抗原結合分子或抗體被評價為在該小分子化合物不存在下不顯示CD137促效劑活性或CD137促效劑活性低： （i） ［在添加抗CD137抗原結合分子或抗體的情形，小分子化合物不存在下的細胞激素產生量］╱［在添加陰性對照抗體的情形，小分子化合物不存下的細胞激素產生量］ （ii） ［在添加抗CD137抗原結合分子或抗體的情形，小分子化合物存在下的細胞激素產生量］╱［在添加陰性對照抗體的情形，小分子化合物存下的細胞激素產生量］。
在不同的一態樣中，在以人類PBMC分析法中的細胞激素產生量（例如IL-2、IFN-γ、及/或IL-6產生量），比較第一抗CD137抗原結合分子或抗體及第二抗CD137抗原結合分子或抗體之CD137促效劑活性的情形，（i）在10μM、50μM、100μM、150μM、200μM、或250μM的小分子化合物存在下，添加第一抗CD137抗原結合分子或抗體的情形的細胞激素產生量，是（ii） 在相同條件下，添加第二抗CD137抗原結合分子或抗體的情形的細胞激素產生量的1.01倍以上、1.02倍以上、1.03倍以上、1.04倍以上、1.05倍以上、1.06倍以上、1.07倍以上、1.08倍以上、1.09倍以上、1.1倍以上、1.11倍以上、1.12倍以上、1.13倍以上、1.14倍以上或1.15倍以上、1.5倍以上、2倍以上、或3倍以上的情形，可評價第一抗CD137抗原結合分子或抗體顯示較第二抗CD137抗原結合分子或抗體高的促效劑活性。
在一態樣中，在以人類PBMC分析法的IL-2產生量評價對CD137的促效劑活性之情形，（i）在10μM、50μM、100μM、150μM、200μM、或250μM的小分子化合物存在下，添加第一抗CD137抗原結合分子或抗體的情形的細胞激素產生量，是（ii） 在相同條件下，添加第二抗CD137抗原結合分子或抗體的情形的IL-2產生量的1.01倍以上、1.02倍以上、1.03倍以上、或1.04倍以上的情形，在一較佳態樣中為1.04倍以上的情形時，可評價第一抗CD137抗原結合分子或抗體顯示較第二抗CD137抗原結合分子或抗體高的促效劑活性。
在一態樣中，在以人類PBMC分析法的IFN-γ產生量評價對CD137的促效劑活性之情形，（i）在10μM、50μM、100μM、150μM、200μM、或250μM的小分子化合物存在下，添加第一抗CD137抗原結合分子或抗體的情形的細胞激素產生量，是（ii） 在相同條件下，添加第二抗CD137抗原結合分子或抗體的情形的1.05倍以上、1.06倍以上、1.07倍以上、1.08倍以上、1.09倍以上或1.1倍以上的情形，在一較佳態樣中為1.1倍以上的情形時，可評價第一抗CD137抗原結合分子或抗體顯示較第二抗CD137抗原結合分子或抗體高的促效劑活性。在一態樣中，第一抗CD137抗原結合分子或抗體為包含親代Fc區域之抗原結合分子或抗體，第二抗CD137抗原結合分子或抗體為包含突變Fc區域之抗原結合分子或抗體。
在一態樣中，使用人類PBMC分析法的CD137促效劑活性之測量方法，可使用參考實施例5-5-1及5-5-2所記載之方法，使用從分離的人類PBMC擴大培養的T細胞的CD137促效劑活性之測量方法，可使用參考實施例2-6所記載之方法。
又一態樣中，對CD137的促效劑活性也可經由在添加或不添加小分子化合物之溶液中，使從人類PBMC分離的CD8陽性T細胞、或CD4陽性T細胞和抗CD137抗原結合分子或抗體接觸，進行測量。此時，也可進一步在溶液中加入FcγRIIb表現細胞。或者，對CD137的促效劑活性也可經由使B細胞（也可分離自人類PBMC，也可使用公知的B細胞）和抗CD137抗原結合分子或抗體接觸，進行測量。在一態樣中，對CD137的促效劑活性可經由使CD8陽性T細胞、CD4陽性T細胞、或B細胞和抗CD137抗原結合分子或抗體在溶液中接觸後所測量的細胞激素產生量（例如IL-2、IFN-γ、及/或IL-6產生量）而評價。
在一態樣中，使用人類末梢血液單核球（PBMC）的促效劑活性的測量，分離自健康人的採血。因此，此技術領域之人士應可理解，即使在上述任一態樣，該測量方法的測量結果會因每個血液樣本的提供者（donor）而異。考量此點，對於從複數個提供者所分離的人類PBMC的一部分或過半數不顯示CD137促效劑活性之抗體，即使另一部分的人類PBMC符合促效劑活性的基準，也可不判定顯示CD137促效劑活性。又從複數個提供者所分離的人類PBMC以上述方法進行測量，在過半數的提供者符合CD137促效劑活性的基準之情形，也可判定顯示CD137促效劑活性。或者，從複數個提供者所分離的人類PBMC以上述方法進行測量，使用其測量值（例如IL-2、IFN-γ產生量及/或IL-6產生量）的平均值或中間值，也可確定有無CD137促效劑活性。在一態樣中，從複數個提供者所分離的人類PBMC以上述方法進行測量時，提供者數量也可為例如2人以上、3人以上、4人以上、5人以上、10人以上、15人以上或20人以上。
b） 促效劑活性測量方法（報導基因分析法） 在一態樣中，可經由在添加或不添加小分子化合物之溶液中，以報導基因分析法評價對CD137的促效劑活性。在一態樣中，在添加小分子化合物的溶液中對CD137的促效劑活性，以及在不添加小分子化合物的溶液中對CD137的促效劑活性，分別在該溶液中，各使NF-κB螢光素酶報導構築物及表現CD137的T細胞、和抗CD137抗原結合分子接觸後，靜置一定時間後所測量之螢光素酶的發光訊號而評價。在一態樣中，添加小分子化合物的溶液，調整為調整後的小分子化合物的濃度為10μM、50μM、100μM、150μM、200μM、或250μM。NF-κB螢光素酶報導構築物及表現CD137的T細胞較佳為GloResponseTM NF-kappaB-Luc2/4-1BB Jurkat細胞株（Promega, CS196004）。
使用報導基因分析法的CD137促效劑活性的測量方法之例如下詳述。又以下的例子使用ATP為小分子化合物之例，但不排除其他小分子化合物。在一態樣中，首先，FcγRIIB表現細胞經培養基（CHO培養基 （90% Ham’s F12, 10% FBS））調配成濃度5×104 /mL，在37℃、5%CO2 培養箱靜置一晚。在一態樣中，作為FcγRIIB表現細胞，不只可以使用FcγRIIB強迫表現細胞，也可以使用B細胞株等的內因性表現FcγRIIB的細胞株、或從活體內分離的B細胞等。在一較佳態樣中，FcγRIIB表現細胞為FcγRIIB CHO-K1細胞 （Promega）。之後，吸除培養基後，添加以不同培養基（99% RPMI, 1% FBS）調配成2×106 /mL的GloResponseTM NF-kappaB-Luc2/4-1BB Jurkat 細胞株（以下稱為「4-1BB Jurkat」）。在一較佳態樣，以培養基調整的FcγRIIB表現細胞每200μL加入以培養基調整的GloResponseTM NF-kappaB-Luc2/4-1BB Jurkat 細胞株25 μL。接著，分別加入以上述培養基（99% RPMI, 1% FBS）稀釋到目標濃度（如最終濃度0、0.001、0.01、0.1、1、10μg/mL）的抗CD137抗原結合分子25 μL，再加入以上述培養基（99% RPMI, 1% FBS）稀釋到目標濃度（如最終濃度0、10、50、100、150、200、250μM）的ATP溶液25 μL。在一態樣中，螢光素酶的發光訊號在4-1BB Jurkat添加抗CD137抗原結合分子後，靜置2小時或更短的時間、4小時或更短的時間、6小時或更短的時間、或24小時或更短的時間後測量。在一較佳態樣中，4-1BB Jurkat在37℃、5%CO2 培養箱靜置6小時。靜置之後，每個添加Bio-Glo試劑75μL，發光量以微量盤檢測儀（plate reader）測量。在一較佳態樣中，Bio-Glo試劑為Bio-Glo螢光素酶分析系統（緩衝液及基質）。在一態樣中，由於反應時的溫度一致，所以4-1BB Jurkat從培養箱取出後，宜在室溫靜置5分鐘、10分鐘、15分鐘或20分鐘。在一較佳態樣中，4-1BB Jurkat從培養箱取出後室溫靜置15分鐘。在一態樣中，添加抗CD137抗原結合分子的4-1BB Jurkat的發光值除以未添加抗CD137抗原結合分子的4-1BB Jurkat的發光值的比值為倍性變化（fold induction）（相對發光量），可作為評價各抗原結合分子的CD137促效劑活性的指標。
另一使用報導基因分析法的CD137促效劑活性的測量方法之例如下詳述。在96孔微量盤的各孔添加以培養基調配成5×104 /mL濃度的FcγRIIB CHO-K1細胞 （Promega） 200 μL，在37℃、5%CO2 培養箱內靜置一晚。培養基使用CHO培養基 （90% Ham’s F12, 10% FBS）。之後，吸去所有的培養基後，每孔加入以分析培養基（99% RPMI, 1% FBS）調配為2×106 /mL的GloResponseTM NF-κB-Luc2/4-1BB Jurkat細胞株25 μL。接著，分別加入以分析培養基稀釋成最終濃度為0、0.001、0.01、0.1、1、10μg/mL的各抗體溶液 25 μL，最後，加入以分析培養基稀釋成最終濃度為0、250μM的ATP溶液25 μL。將微量盤在37℃、5%CO2 培養箱靜置6小時後，在室溫下靜置15分鐘，各孔加入Bio-Glo試劑75μL。Bio-Glo試劑可使用例如Bio-Glo螢光素酶分析系統（緩衝液及基質）。之後，各孔的發光量以微量盤檢測儀（plate reader）測量。之後，各孔的發光值除以未添加抗體的孔的發光值為倍性變化（fold induction）。在該報導基因分析法中，可以添加各抗體的孔的發光量對未添加抗體的孔的發光量之倍性變化（FOLd induction）（相對發光量）來評價CD137促效劑活性。
另一使用報導基因分析法的CD137促效劑活性的測量方法之例如下詳述。在384孔微量盤的各孔，各添加以分析培養基（99% RPMI, 1% FBS）調配成2×106 /mL濃度的FcγRIIB CHO-K1細胞（Promega） 10μL。接著，每孔分別加入含ADP的抗體溶液、或含ATP的抗體溶液、或不含ATP或ADP的抗體溶液10μL。之後，每孔添加以分析培養基（99% RPMI, 1% FBS）調配為2×106 /mL的GloResponseTM NF-κB-Luc2/4-1BB Jurkat細胞株10 μL。ADP的最終濃度為50μM，ATP的最終濃度為50μM。將微量盤在37℃、5%CO2 培養箱靜置6小時後，在室溫下靜置15分鐘，各孔加入Bio-Glo試劑30μL。Bio-Glo試劑使用例如Bio-Glo螢光素酶分析系統（緩衝液及基質）。之後，各孔的發光量以微量盤檢測儀（plate reader）測量。能夠以添加各抗體的孔的發光量對未添加抗體的孔的發光量之相對發光量（也稱為發光倍數（luminescence fold）或倍性變化（fold change））來評價CD137促效劑活性。
另一使用報導基因分析法的CD137促效劑活性的測量方法之例如下詳述。在384孔微量盤的各孔，各添加以分析培養基（99% RPMI, 1% FBS）調配成4×105 /mL濃度的FcγRIIB CHO-K1細胞（Promega） 10μL。接著，每孔分別加入含ADP的抗體溶液、或含ATP的抗體溶液、或不含ATP或ADP的抗體溶液10μL。之後，每孔添加以分析培養基（99% RPMI, 1% FBS）調配為2×106 /mL的GloResponseTM NF-κB-Luc2/4-1BB Jurkat細胞株10 μL。ADP的最終濃度為10μM，ATP的最終濃度為10μM。將微量盤在37℃、5%CO2 培養箱靜置6小時後，在室溫下靜置15分鐘，各孔加入Bio-Glo試劑30μL。Bio-Glo試劑使用Bio-Glo螢光素酶分析系統（緩衝液及基質）。之後，各孔的發光量以微量盤檢測儀（plate reader）測量。能夠以添加各抗體的孔的發光量對未添加抗體的孔的發光量之相對發光量（也稱為發光倍數（luminescence fold）或倍性變化（fold change））來評價CD137促效劑活性。
在一態樣中，在使用報導基因分析法測量CD137促效劑活性的情形，在（i） 在10μM、50μM、100μM、150μM、200μM、或250μM的小分子化合物存在下，對CD137的促效劑活性（相對發光量），和（ii） 該小分子化合物不存在下，對CD137的促效劑活性（相對發光量）相比，高1.1倍以上、1.2倍以上、1.3倍以上、1.5倍以上、2倍以上、3倍以上、5倍以上、10倍以上、20倍以上、30倍以上、50倍以上、60倍以上、70倍以上、80倍以上、或90倍以上的情形，可評價該抗CD137抗原結合分子或抗體在該小分子化合物存在下對CD137顯示促效劑活性。在一態樣中，上述（i）及（ii）中的抗體最終濃度為0、0.001、0.01、0.1、1、或10μg/mL，在一較佳態樣為0.1μg/mL或1μg/mL。
在另外的一態樣中，在以特定濃度（例如，最終濃度為0.001、0.01、0.1、1、或10μg/mL，在一較佳態樣為0.1μg/mL或1μg/mL）添加抗CD137抗原結合分子或抗體的情形，當小分子化合物不存在下的倍性變化（fold induction）（相對發光量）為10以下的情形、9以下的情形、8以下的情形、一較佳態樣為5以下的情形、更一較佳態樣實質為1的情形，被評價為該抗CD137抗原結合分子或抗體在該小分子化合物不存在下對CD137實質上不顯示促效劑活性。在一態樣中，「小分子化合物不存在下的倍性變化（fold induction）（相對發光量） 實質為1」是指，小分子化合物不存在下的倍性變化（fold induction）（相對發光量）小於2倍、小於1.9倍、小於1.8倍、小於1.7倍、小於1.6倍、小於1.5倍、小於1.4倍、小於1.3倍、小於1.2倍或小於1.1倍之情形。
c） 血漿中濃度 在一態樣中，本揭示之抗CD137抗原結合分子或抗體的血中動態，使用人類CD137基因置入（knock-in）小鼠進行測量及/或比較。人類CD137基因置入小鼠，例如將人類CD137基因取代載體導入小鼠胚胎幹細胞（ES細胞），使小鼠CD137基因取代為人類CD137基因而製作。在一態樣中，本揭示之抗CD137抗原結合分子或抗體在單次靜脈內投予人類CD137基因置入小鼠，投予之後立即在約5日、10日、15日、20日、25日或30日後經時複數次採血。在一較佳態樣中，本揭示之抗CD137抗原結合分子或抗體在單次靜脈內投予人類CD137基因置入小鼠，在投予後5分鐘後至28日後經時複數次採血。從採集的血液快速分離血漿，以電致化學發光（ECL）法測量血漿中的抗體濃度。在一態樣中，血漿中的抗體濃度可參照參考實施例6-3-2所載之方法測量。
在使用人類CD137基因置入小鼠的血漿半衰期測量中，在抗CD137抗原結合分子或抗體顯示較參考分子慢消失於血漿中的情形，可評價該抗CD137抗原結合分子或抗體較參考分子具有改善的血中動態。又在具有小分子化合物依賴的抗CD137抗原結合分子或抗體（轉換分子或轉換抗體）顯示較不具有小分子化合物依賴的結合活性之抗CD137抗原結合分子或抗體（非轉換分子或非轉換抗體）慢消失於血漿中的情形，可評價轉換分子（或轉換抗體）和非轉換分子（或非轉換抗體）相比，和表現在腫瘤以外的組織之CD137不結合。
d） 抗腫瘤活性 在一方面，試驗抗CD137抗原結合分子或抗體在活體內（in vivo）抑制細胞生長或增殖之能力。在特定態樣中，試驗抗CD137抗原結合分子或抗體在活體內（in vivo）抑制腫瘤生長的能力。同種移植模式或異種移植模式等的活體模式系統，可用於如此之試驗。在異種移植系統之例中，將人類腫瘤細胞適當導入免疫不全的非人類動物、例如無胸腺「裸」鼠。將本揭示之抗體投予此動物。測量抑制或減少腫瘤生長的抗體能力。在上述異種移植系統的特定態樣中，人類腫瘤細胞為來自人類患者的腫瘤細胞。如此的異種移植模式，市售有Oncotest GmbH （Frieberg, Germany）。在特定態樣中，人類腫瘤細胞經皮下注射或移植至乳房脂肪墊等的適當部位，適當導入免疫不全的非人類動物。 在一態樣中，本揭示之抗CD137抗原結合分子或抗體的抗腫瘤活性，使用上述人類CD137基因置入小鼠的同系腫瘤移植模式進行測量及/或比較。試驗用的癌細胞株可適當選擇，但較佳為小鼠大腸癌細胞株MC38細胞株。在一態樣中，將MC38細胞株移植到小鼠腹部皮下，在腫瘤體積成為約50-300mm3 的時點建立模式。模式建立後，MC38細胞株移植小鼠進行分群後，投予各種抗CD137抗原結合分子或抗體。在一態樣中，用於抗腫瘤活性評價，腫瘤體積的測量以每周1-2次的頻率實施。又腫瘤體積以下計算式計算：腫瘤體積＝長徑×短徑×短徑/2。在一態樣中，抗CD137抗原結合分子或抗體的抗腫瘤活性能夠以參考實施例6-4記載之方法進行試驗及評價。
在一態樣中，在抗CD137抗原結合分子或抗體投予群的腫瘤體積較載劑（vehicle）群小、或者抗CD137抗原結合分子或抗體投予群的腫瘤體積增加量較載劑群小的情形，可評價該抗CD137抗原結合分子或抗體顯示抗腫瘤活性。
e） 全身反應 在一態樣中，本揭示之抗CD137抗原結合分子或抗體的全身反應，使用上述人類CD137基因置入小鼠的同系腫瘤移植模式進行測量及/或比較。測量全身反應用的臟器可適當選擇，但較佳為肝臟、脾臟、及/或淋巴結。在一態樣中，全身反應的評價在投予抗CD137抗原結合分子或抗體後的適當時點，從人類CD137基因置入小鼠取出肝臟、脾臟、及/或淋巴結來進行。在取出的臟器為脾臟及/或淋巴結的情形，進行此等臟器的重量測量及/或淋巴球分層的細胞數測量。此時，較佳為，在脾臟使用溶血後的淋巴球分層，在淋巴結使用磨碎得到的淋巴球分層。當取出的臟器為肝臟時，使用小鼠肝分離套組（Liver dissociation kit, mouse （Milteny Biotec））所得到的淋巴球分層，進行細胞數測量。再者，也可使用各種臟器（肝臟、脾臟、及/或淋巴結）的淋巴球分層，使用流式細胞分析儀（FCM）進行T細胞分析。在FCM分析中，使用例如在CD8α陽性T細胞的Granzyme B表現或PD-1表現或ICOS表現，或者對CD45陽性細胞的CD8α陽性T細胞的比例。在一態樣中，抗CD137抗原結合分子或抗體的全身反應能夠以參考實施例6-4記載之方法進行試驗及評價。
在一態樣中，在上述各指標的評價中，在抗CD137抗原結合分子或抗體投予群和同量的參考分子投予群相比為低值的情形，可評價該抗CD137抗原結合分子或抗體較參考分子抑制全身反應及/或在腫瘤以外的組織（如肝臟、脾臟及/或淋巴結）的免疫細胞的活性。又在上述各指標的評價中，具有小分子化合物依賴的結合活性之抗CD137抗原結合分子或抗體（轉換分子或轉換抗體）投予群，和不具有同量的小分子化合物依賴的結合活性之抗CD137抗原結合分子或抗體（非轉換分子或非轉換抗體）投予群相比為低值的情形，可評價轉換分子（或轉換抗體）較非轉換分子（或非轉換抗體） 抑制全身反應及/或在腫瘤以外的組織（如肝臟、脾臟及/或淋巴結）的免疫細胞的活性。
可理解任一上述測量方法皆可使用本揭示之免疫共軛物代替或額外增加於抗CD137抗原結合分子或抗體而實施。
D. 免疫共軛物 （immunoconjugate） 本揭示提供，包含和1個或複數個細胞毒性劑（例如化療劑或化療藥、增殖抑制劑、毒素（例如細菌、真菌、植物或動物來源的蛋白毒素、酵素活性的毒素、或該等的片段）或放射線同位素）共軛（conjugate）的本說明書之抗CD137抗原結合分子或抗體的免疫共軛物。
在一態樣中，免疫共軛物為抗體和包含但不限於以下1個或複數個藥物共軛之抗體-藥物共軛物（antibody-drug conjugate：ADC）：美登醇（maytansinoid） （參照美國專利第5,208,020號、第5,416,064號、及歐洲專利第0,425,235號B1）；例如微管相關抑制劑（MonoMethyl auristatin）藥物部分DE及DF（MMAE及MMAF）（美國專利第5,635,483號及第5,780,588號及第7,498,298號）等的有絲分裂抑制劑（auristatin）；尾海兔素（dolastatin）；卡奇霉素（calicheamicin）或其衍生物（參照美國專利第5,712,374號、第5,714,586號、第5,739,116號、第5,767,285號、第5,770,701號、第5,770,710號、第5,773,001號、及第5,877,296號；Hinman et al., Cancer Res. 53：3336-3342 （1993）；以及Lode et al., Cancer Res. 58：2925-2928 （1998） ）；道諾黴素（daunomycin）或艾黴素（Doxorubicin）等的蒽環類藥物（anthracycline）（參照Kratz et al., Current Med. Chem. 13：477-523 （2006）；Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16：358-362 （2006）；Torgov et al., Bioconj. Chem. 16：717-721 （2005）；Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97：829-834 （2000）；Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12：1529-1532 （2002）；King et al., J. Med. Chem. 45：4336-4343 （2002）；及美國專利第6,630,579號）；氨甲喋呤（methotrexate）；長春地辛（vindesine）； 歐洲紫杉醇（docetaxel ）、 （太平洋紫杉醇） paclitaxel 、拉洛他賽（larotaxel）、替西他賽（tesetaxel）、及沃塔紫杉醇（ortataxel）等的 紫杉烷（taxane）；單端孢霉烯族毒素類（trichothecenes）；以及CC1065。
在別的態樣中，免疫共軛物包括，和包含但不限於下列之酵素活性或其片段共軛之本說明書所載之抗體：白喉毒素A鏈（Diphtheria A chain）、白喉毒素的非結合活性片段、外毒素A鏈（來自綠膿桿菌 （Pseudomonas aeruginosa） ）、賴胺酸A鏈、雞母珠毒素A鏈（Abrin A chain）、蒴蓮根毒素A鏈（modeccin A chain）、核醣毒素（α-sarcin）、油桐（Aleurites fordii） 毒蛋白、香石竹（dianthin）毒蛋白、美洲商陸 （Phytolacca americana） 毒蛋白（PAPI、PAPII及PAP-S）、苦瓜（momordica charantia） 抑制劑、痲瘋樹毒蛋白 （curcin）、藏紅花素（crocin）、肥皂草（saponaria officinalis）抑制劑、白樹素（gelonin）、絲林黴素（mitogellin）、局限曲菌素（restrictocin）、酚黴素（phenomycin）、衣諾黴素（enomycin）、以及單端孢霉烯族毒素類（trichothecenes）。
別的態樣中，免疫共軛物包含用於形成放射性共軛物之和放射性原子形成共軛的本說明書所載之抗體。多種的放射性同位素可用於製造放射性共軛物。包含例如211 At、131 I、125 I、90 Y、186 Re、188 Re、153 Sm、212 Bi、32 P、212 Pb及Lu的放射性同位素。在使用放射性共軛物進行檢測時，放射性共軛物可包含閃爍圖術（scintigraphy）檢查用的放射性原子（例如Tc-99m或123 I）、或者核磁共振（NMR）顯影（也稱為磁共振顯影MRI）使用的自旋標記（例如，在這裡也是，碘-123、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳、或鐵）。
抗體及細胞毒性劑的共軛物可使用多種二官能性蛋白質連接劑製作。例如，3-（2-吡啶二硫代）丙酸N-琥珀醯亞胺酯（SPDP）、4-（N-馬來醯亞胺甲基）環己烷-1-羧酸琥珀醯亞胺酯（SMCC）、2-亞胺基硫烷（IT）、亞胺酯的二官能性衍生物（例如己二亞胺酸二甲酯二鹽酸鹽（adipimidic acid dimethyl ester dihydrochloride））、活性酯（例如二琥珀醯亞胺辛二酸酯）、醛類（例如戊二醛）、二疊氮化合物（例如，雙（p-疊氮苯甲醯基）己烷二胺）、二重氮（bisdiazonium）衍生物（例如雙-（p-重氮苯甲醯基）乙二胺）、二異氰酸酯（例如甲苯2,6-二異氰酸酯）、以及二活性氟化物（例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯）。例如賴胺酸免疫毒素可參照Vitetta et al., Science 238：1098 （1987）所記載調配。碳-14標記的1-異氰酸基苯基-3-甲基二乙三胺五乙酸（MX-DTPA）為用於抗體和放射性核種的共軛連接之螯合劑之例。參照WO94/11026。連接子（linker）可為促進細胞內細胞毒性藥的釋放的「可切斷連接子」。可使用例如酸不穩定性連接子、肽酶敏感性連接子、光不穩定性連接子、二甲基連接子、或含二硫化物的連接子（Chari et al., Cancer Res. 52：127-131 （1992）；美國專利第5,208,020號）。
本說明書之免疫共軛物或ADC明確地考慮使用包含但不限於（來自例如Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.A）市售的BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、硫代-EMCS、硫代-GMBS、硫代-KMUS、硫代-MBS、硫代-SIAB、硫代-SMCC、及硫代-SMPB、以及SVSB（琥珀醯亞胺-（4-乙烯碸）苯甲酸酯）之交聯試劑所製作的共軛物，但不限於此。
E. 用於診斷及檢測的方法及組合物 在特定態樣中，本說明書所提供之抗CD137抗原結合分子或抗體皆有用於檢測生物樣本中CD137抗原結合分子或其存在。本說明書所使用之「檢測」包含定量或定性的檢測。在特定態樣中，生物樣本包含細胞或組織。
在一態樣中，提供用於診斷方法或檢測方法的抗CD137抗原結合分子或抗體。在另外的方面，提供檢測生物樣本中CD137的存在之方法。在特定態樣中，此方法包含，在容許CD137和抗CD137抗原結合分子或抗體的結合之條件下，使本說明書所記載之抗CD137抗原結合分子或抗體和生物樣本接觸，及檢測在抗CD137抗原結合分子或抗體和CD137之間是否形成複合體。如此方法可為活體外的方法或活體內的方法。在一態樣中，抗CD137抗原結合分子或抗體，在例如CD137為選擇患者的生物標記（biomarker）的情形，用於選擇適合使用抗CD137抗原結合分子或抗體的治療之受試者。
使用本揭示之抗體可診斷的疾病之例為癌。
在特定態樣中，提供標記的抗CD137抗原結合分子或抗體。標記包含但不限於直接檢測出的標記或部分（例如螢光標記、顯色標記、高電子密度標記、化學發光標記、及放射性標記），以及例如透過酵素反應或分子間的交互作用而間接檢測出的部分（例如酵素或配體）。標記之例包含但不限於下述者：放射性同位素32 P、14 C、125 I、3 H及131 I、稀土類螯合劑等的發光團或螢光素（fluorescein）及其衍生物、羅丹明（rhodamine）及其衍生物、丹磺醯氯（dansyl）、繖形酮（umbelliferone） 、螢火蟲螢光素酶 （luciferase）及細菌螢光素酶（美國專利第4,737,456號）等的螢光素酶、螢光素（luciferin）、2,3-二氫酞肼二酮 （2,3-dihydrophthalazinedione）、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase；HRP）、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖澱粉酶（glucoamylase）、溶菌酶（lysozyme）、單醣氧化酶（例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶、及葡萄糖-6-磷酸去氫酶）、尿酸氧化酶（uricase）、及黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase）等的雜環氧化酶、連結於使用過氧化氫使色素前趨體氧化的酵素（例如HRP、乳過氧化酶（lactoperoxidase）、或微過氧化酶（microperoxidase））者、生物素/抗生物素蛋白、自旋標記、噬菌體標記、穩定的自由基類、及類似此等者。
F. 藥物製劑 本說明書所記載之抗CD137抗原結合分子或抗體的藥物製劑，經由混合具有所希望的純度的抗體和1個或複數個任意的藥學上容許之載劑（Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. （1980）），以冷凍乾燥製劑或水溶液的型態製作。藥學上容許之載劑通常為使用時的用量及濃度對接受者為非毒性，包含但不限於下述者：磷酸鹽、檸檬酸鹽、及其他有機酸等的緩衝液；包含抗壞血酸及甲硫胺酸的抗氧化劑；防腐劑（十八烷基二甲基苄基氯化銨；六甲基氯化銨（hexamethonium chloride）；苯扎氯銨（benzalkonium chloride）；氯化苯嗦寧（benzethonium chloride）；酚基、丁基、或苯甲基醇；甲基或丙基對羥基苯甲酸等的對羥基苯甲酸（paraben）；鄰苯二酚（catechol）； 間苯二酚（resorcinol）；環己醇；3-戊醇；及m-甲酚等）；小分子（少於約10個殘基）多胜肽；血清白蛋白、明膠、或免疫球蛋白等的蛋白質；聚乙烯吡咯酮等的親水性聚合物；甘胺酸、麩醯胺酸、天門冬醯胺、組胺酸、精胺酸、或賴胺酸等的胺基酸；包含葡萄糖、甘露糖、或右旋糖酐之單糖、雙糖、及其他碳水化合物；EDTA等的螯合劑；蔗糖、甘露醇、海藻糖、山梨糖醇等的砂糖類；鈉等的形成鹽類的對離子類；金屬錯合物（如Zn-蛋白質錯合物）；及/或聚乙二醇（PEG）等的非離子系表面活性劑。本說明書之藥學上容許之載劑之例更包含，可溶性中性活性型透明質酸酶糖蛋白（sHASEGP）（例如rHuPH20 （HYLENEX（登錄商標），Baxter International, Inc.）等的人類可溶性PH-20透明質酸酶糖蛋白）等的間質性藥物分散劑。特定例的sHASEGP及其使用方法（包含rHuPH20）記載於美國專利公開案第2005/0260186號及第2006/0104968號。在一方面，sHASEGP和軟骨素分解酵素（chondroitinase）等的1個或複數個增加的糖胺聚糖（glycosaminoglycan）組合。
冷凍乾燥抗體製劑之例記載於美國專利第6,267,958號。水溶液抗體製劑包含美國專利第6,171,586號及WO2006/044908所記載者，後者包含組胺酸-乙酸鹽緩衝液。
可將有效成分帶入經例如液滴形成（凝聚作用（coacervation））方法或界面聚合所製作的微膠囊（分別如羥甲基纖維素或明膠微膠囊、及聚（甲基丙烯酸甲基）微膠囊），也可以帶入膠體狀藥物遞送系統（例如微脂體、白蛋白小球體、微乳液、奈米粒子、及奈米膠囊），也可以帶入微乳液（microemulsion）。如此的方法揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. （1980）。
也可以製作緩釋製劑。緩釋製劑的較佳例包括含有抗體之固體疏水性聚合物的半透性基質，該基質為例如膜或微膠囊等的造型品型態。
用於活體內（in vivo）投予的製劑通常為無菌。無菌狀態可透過例如滅菌、通過膜過濾等而輕易達成。
G. 治療方法及治療用組合物 本說明書所提供之抗CD137抗原結合分子或抗體皆可用於治療的方法。 在一方面，本揭示提供做為醫藥品使用之抗CD137抗原結合分子或抗體。本揭示中，該醫藥品可例如，具體為，用於透過抗CD137抗原結合分子或抗體和T細胞等的免疫細胞上表現的CD137結合之細胞活化，而誘導抗腫瘤作用，例如腫瘤內的血管新生的抑制、腫瘤細胞增殖的抑制、腫瘤性B細胞枯耗竭等作為一例。 在另外的方面，本揭示提供，用於腫瘤的治療之抗CD137抗原結合分子或抗體。在特定態樣中，提供用於治療方法之抗CD137抗原結合分子或抗體。在特定態樣中，本揭示提供，用於治療具有腫瘤之個體的方法，包含對個體投予有效量的抗CD137抗原結合分子或抗體之步驟的方法之抗CD137抗原結合分子或抗體。在另外的態樣中，本揭示中，該腫瘤可例如B細胞、樹突細胞、自然殺手細胞、巨噬細胞、CD8陽性T細胞、及/或調節T細胞（Treg細胞）浸潤之固態腫瘤之一例。 在另外的方面，本揭示提供，用於個體中免疫細胞活化之方法，包含投予該個體有效量的抗CD137抗原結合分子或抗體，以使B細胞、樹突細胞、自然殺手細胞、巨噬細胞、及/或CD8陽性T細胞（更具體為浸潤腫瘤組織的此等免疫細胞）活化之步驟的方法之使用的抗CD137抗原結合分子或抗體。 在另外的方面，本揭示提供，用於個體中細胞（例如腫瘤細胞）毒性的方法，包含投予該個體有效量的抗CD137抗原結合分子或抗體之步驟的方法之使用的抗CD137抗原結合分子或抗體。在特定態樣中，該腫瘤可例如B細胞、樹突細胞、自然殺手細胞、巨噬細胞、CD8陽性T細胞、及/或調節T細胞（Treg細胞）浸潤之固態腫瘤之一例。上述任一態樣所述之「個體」較佳為人類。
在另外的方面，本揭示提供在醫藥品的製造或調配之抗CD137抗原結合分子或抗體之使用。在一態樣中，醫藥品為用於腫瘤（根據情況，也可稱為癌，以下相同）的治療。在另外的態樣中，醫藥品為用於，治療腫瘤（根據情況稱為癌）的方法，包含投予具有腫瘤（根據情況稱為癌）的個體之有效量的醫藥品之步驟的方法之使用。在另外的態樣中，醫藥品為用於，透過抗CD137抗原結合分子或抗體和T細胞等的免疫細胞上所表現的CD137結合之細胞活化，而誘導例如腫瘤內的血管新生的抑制、腫瘤細胞增殖的抑制、腫瘤性B細胞枯耗竭等。在另外的態樣中，醫藥品為用於，透過個體中抗CD137抗原結合分子或抗體和T細胞等的免疫細胞上所表現的CD137結合之細胞活化，而例如抑制腫瘤內的血管新生、抑制腫瘤細胞增殖、使腫瘤性B細胞枯耗竭等之方法，因此包含投予該個體有效量的醫藥品之步驟的方法的使用。任一上述態樣中所述之「個體」也可為人類。
在另外的方面，本揭示提供治療腫瘤之方法。在一態樣，方法包含投予具有如此腫瘤之個體有效量的抗CD137抗原結合分子或抗體之步驟。在另外的態樣中，本揭示中，作為一個例子，該腫瘤可例如B細胞、樹突細胞、自然殺手細胞、巨噬細胞、CD8陽性T細胞、及/或調節T細胞（Treg細胞）浸潤之固態腫瘤。 在另外的方面，本揭示提供用於個體的腫瘤組織中的免疫細胞的活化之方法。在一態樣中，該方法包括含有投予個體有效量的抗CD137抗原結合分子或抗體之步驟。在另外的態樣中，本揭示中，該免疫細胞可例如B細胞、樹突細胞、自然殺手細胞、巨噬細胞、及/或CD8陽性T細胞等的免疫細胞（更具體為浸潤腫瘤組織的此等免疫細胞）。在該方法中，當選自CD8b1、Gzmb、Prf1、及Ifng之至少1個基因的表現量在腫瘤組織中增加時，可判斷為腫瘤組織中T細胞的活化增強。 在另外的方面，本揭示提供用於使個體的腫瘤組織中的免疫細胞、特別是CD8陽性T細胞活化、或促進其增殖之方法。在一態樣中，該方法為包括含有投予個體有效量的抗CD137抗原結合分子或抗體之步驟的方法。在使CD8陽性T細胞活化的方法中，當選自OVA tetramer、Granzyme B、PD-1、DLRG-1、及ICOS之至少1個的CD8陽性T細胞的活化標誌物的陽性率（陽性率（%）＝腫瘤組織中的活化標誌物為陽性的CD8陽性T細胞數/腫瘤組織中的CD8陽性T細胞數×100）增加時，可判斷為腫瘤組織中的CD8陽性T細胞受到活化。 在另外的方面，本揭示提供用於在個體中傷害細胞（具體為腫瘤細胞）之方法。在一態樣中，該方法為包括含有投予該個體有效量的抗CD137抗原結合分子或抗體之步驟的方法。在特定態樣中，作為一例該腫瘤可例如B細胞、樹突細胞、自然殺手細胞、巨噬細胞、CD8陽性T細胞、及/或調節T細胞（Treg細胞）浸潤之固態腫瘤。任一上述態樣中所述之「個體」也可為人類。
在一些實施態樣中，個體為具有癌細胞或含有癌細胞的腫瘤組織之患者。在本揭示中的較佳癌症種類，例如胃癌（Gastric）、頭頸癌（H&N）、食道癌（Esophageal）、大腸癌（Colorectal）、肺癌（Lung）、間皮瘤（Mesothelioma）、肝癌（Liver）、卵巢癌（Ovary）、乳癌（Breast）、結腸癌（Colon）、腎臟癌（Kidney）、皮膚癌（Skin）、肌肉瘤（Muscle）、胰臟癌（Pancreas）、前列腺癌（Prostate）、睪丸癌（Testis）、子宮癌（Uterine）、膽管癌（Cholangiocarcinoma）、默克細胞癌（Merkel cell）、膀胱癌（Bladder）、甲狀腺癌（Thyroid）、神經鞘瘤（schwannoma）、腎上腺癌（Adrenal gland）、肛門癌（Anus）、中樞神經系統腫瘤（Central nervous system）、神經內分泌組織腫瘤（Neuroendocrine tissues）、陰莖癌（Penis）、胸膜腫瘤（Pleura）、唾液腺腫瘤（Salivary gland）、外陰癌（Vulva）、胸腺腫瘤（thymoma）、淋巴瘤（Lymphoma）、骨髓性白血病（Myeloid leukemia）、兒童癌症（威爾姆氏腫瘤（Wilms tumor）、神經母細胞瘤（neuroblastoma）、肉瘤（Sarcoma）、肝母細胞瘤（hepatoblastome）、生殖細胞瘤（germ cell tumor）），但不限於此。更佳的癌症種類例如胃癌（Gastric）、大腸癌（Colorectal）、肺癌（Lung）、間皮瘤（Mesothelioma）、肝癌（Liver）、乳癌（Breast）、皮膚癌（Skin）、淋巴瘤（Lymphoma）、骨髓性白血病（Myeloid leukemia），但不限於此等。（Tumori. （2012） 98, 478-484; Tumor Biol. （2015） 36, 4671-4679; Am J Clin Pathol （2008） 130, 224-230; Adv Anat Pathol （2014） 21, 450-460; Med Oncol （2012） 29, 663-669; Clinical Cancer Research （2004） 10, 6612-6621; Appl Immunohistochem Mol Morphol （2009） 17, 40-46; Eur J Pediatr Surg （2015） 25, 138-144; J Clin Pathol （2011） 64, 587-591; Am J Surg Pathol （2006） 30, 1570-1575; Oncology （2007） 73, 389-394; Diagnostic Pathoogy （2010） 64, 1-6; Diagnostic Pathoogy （2015） 34, 1-6; Am J Clin Pathol （2008） 129, 899-906; Virchows Arch （2015） 466, 67-76）。更佳的癌症種類例如胃癌、肺癌、間皮瘤、肝癌、乳癌、皮膚癌、淋巴瘤、骨髓性白血病。
包含本揭示之抗CD137抗原結合分子的抗癌劑可被用於為了治療具有對以免疫檢查點抑制劑的治療為不反應性的癌症之患者。例如，對於經免疫檢查點抑制劑的投予確認未產生所期望藥效的患者，能夠以本揭示之抗癌劑進行治療。所謂「對以免疫檢查點抑制劑的治療為不反應性的癌症」也可說是「已經以免疫檢查點抑制劑治療的癌症」、「在以免疫檢查點抑制劑的治療時或治療後惡化的癌症」、「免疫檢查點抑制劑無效的癌症」、「在以免疫檢查點抑制劑治療後復發的癌症」、「對免疫檢查點抑制劑有抗藥性的癌症」、「免疫檢查點抑制劑效果不足的癌症」、或「免疫檢查點抑制劑未奏效的癌症」。
上述對以免疫檢查點抑制劑的治療為不反應性的癌症，例如在JAK1、JAK2、及/或B2M （參照Shin, Daniel Sanghoon et al. "Primary Resistance to PD-1 Blockade Mediated by JAK1/2 Mutations." Cancer discovery vol. 7,2 （2017）: 188-201; 或Sade-Feldman, Moshe et al. "Resistance to checkpoint blockade therapy through inactivation of antigen presentation." Nature communications vol. 8,1 1136. 26 Oct. 2017等）具有基因變異的癌症，但不限於此等。
在另外的方面，本揭示中，上述治療方法、在治療的使用、用作為醫藥品的包含抗CD137抗原結合分子或抗體之藥物製劑，可包含有效量的、和不具有小分子化合物依賴的抗CD137抗原結合分子或抗體相比、在非腫瘤組織的免疫活性水平低的抗CD137抗原結合分子或其抗體。 在一態樣中，該非腫瘤組織可例如淋巴結、脾臟、及/或肝臟。 在另外的態樣中，上述治療方法、在治療的使用、用作為醫藥品的包含抗CD137抗原結合分子或抗體之藥物製劑，可包含有效量的、和在非腫瘤組織表現的CD137實質不結合的抗CD137抗原結合分子或抗體。 在另外的態樣中，上述治療方法、治療中使用、用作為醫藥品的包含抗CD137抗原結合分子或抗體之藥物製劑，可含有有效量的、和不具有小分子化合物依賴的抗CD137抗原結合分子或抗體相比、血中半衰期延長的抗CD137抗原結合分子或抗體。 在另外的態樣中，上述治療方法、治療中使用、用作為醫藥品的包含抗CD137抗原結合分子或抗體之藥物製劑，可含有有效量的、和不具有小分子化合物依賴的抗CD137抗原結合分子或抗體相比、副作用水平低的有效量的抗CD137抗原結合分子或抗體。 在另外的態樣中，該副作用可例如AST增加、ALT增加、發燒、噁心、急性肝炎、肝病、脾腫脹（splenomegaly）、腸炎、皮膚化膿性發炎、嗜中性球減少、淋巴球減少、血小板減少、轉氨酶的表現、及/或高膽紅素血症（hyperbilirubinemia）。 在一態樣中，本揭示之抗CD137抗原結合分子由於副作用小，所以可不擔心副作用而增加投予量，結果可發揮更強藥效（細胞毒性或抗腫瘤活性）。
在另外的方面，本揭示提供，包含本說明書所提供之抗CD137抗原結合分子或抗體任一者之藥物製劑（例如用於上述任一治療方法）。在一態樣，藥物製劑包含本說明書所提供之任一抗CD137抗原結合分子或抗體及醫藥上容許載劑。
本揭示之抗原結合分子或抗體可經由包括非經口投予、肺內投予、及經鼻投予，或在需要局部給藥的情形病兆內投予之任意的適當手段投予。非經口注入包含肌肉內、靜脈內、動脈內、腹腔內、或皮下投予。投藥可部分視短期或長期投予，例如靜脈內注射或皮下注射等的注射等之任意適宜路徑進行。不限於此等，包括單次投予或在多個時點反覆投予、定時少量投予（bolus injection）、及脈衝注入（pulse injection）之多種投藥方案皆在本說明書的考量內。
本揭示之抗體以符合優良醫療規範（good medical practice）進行製藥、投藥、或投予。從此觀點應考慮的因素，包括被治療的特定疾病、被治療的特定哺乳動物、個別患者的臨床症狀、疾病的原因、藥劑遞送部位、投予方法、投藥方案、以及醫療從事者公知之其他因素。抗體不一定但任意地和用於預防或治療問題的疾病所使用之1個或複數個藥劑一起進行製藥。其他藥劑的有效量賴於製藥中所存在的抗體量、疾病或治療的型態、及上述之其他因素。這些通常根據本說明書所述者相同用量及投藥路徑、或以本說明書所述之用量的約1%至99%、或經驗上/臨床上適當判斷之任意用量及任意路徑來使用。
用於疾病的預防或治療，本揭示之抗體的適當用量應賴於對治療的疾病種類、抗體種類、疾病的重症程度及經過、抗體是否以預防目的或治療目的投予、藥物履歷、患者的臨床履歷及對抗體的反應、以及主治醫師的裁量。對患者1次或接連處置，適當投予抗體。可根據疾病的種類及重症程度，以例如1次或複數次分別投予或連續注入約1μg/kg至15 mg/kg（例如0.1mg/kg～10mg/kg）的抗體，作為投予患者的最初候選用量。一個典型的1日用量可根據上述因素為約1μg/kg至100 mg/kg以上的寬度。在數日或更長的反覆投予的情形，視狀況，治療維持在通常對疾病症狀產生所希望的抑制。抗體的1個用量例在約0.05mg/kg至約 10mg/kg的範圍。因此，也可以投予患者約0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg、或 10mg/kg之一個或複數個用量（或者此等的任意組合）。如此的用量也可間斷的投予，例如每1周或每3周（例如使患者接受約2至20、或例如約6用量的抗體）。也可以在高的初次負荷用量之後，投予1次或複數次的低用量。此療法的過程根據習知方法及測量方法而輕易監測。
應理解對於上述任一製藥或治療的方法，皆可使用本揭示之免疫共軛物代替或額外增加於本揭示之抗CD137抗原結合分子或抗體而實施。所使用的抗CD137抗原結合分子為包含表37所載之A375/B167、A372/B040、A356/B040、A486/B167、A487/B167、A488/B226、A489/B223、A548/B376、A551/B256、A551/B379、A555/B379、A548/B256、或A549/B167之胺基酸序列為重鏈可變區/輕鏈可變區之組合的抗體。在一較佳態樣中，抗CD137抗原結合分子為包含和A375/B167所含的HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3之胺基酸序列相同之HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3的抗CD137抗體。在更一態樣中，抗CD137抗原結合分子為包含A375/B167為重鏈可變區/輕鏈可變區之組合的抗CD137抗體。在不同的一較佳態樣中，抗CD137抗原結合分子為包含和A551/B379所含之HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3的胺基酸序列相同之HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3的抗CD137抗體。在更一態樣中，抗CD137抗原結合分子為包含A551/B379為重鏈可變區/輕鏈可變區之組合的抗CD137抗體。又，所使用的抗CD137抗體也可為選自表72所載之抗體的任一個的抗CD137抗體。
H. 製品 在本揭示的另外的方面，提供包含有用於上述疾病的治療、預防、及/或診斷之器材的製品。製品包含容器、及該容器上的標籤或於該容器所附的說明書。較佳的容器例如含有瓶罐、小玻璃瓶、注射器、IV溶液包等。容器類可由玻璃或塑膠等的多種材料所形成。容器可將組合物單獨保存，或也可以具有無菌的連接端口 （例如容器可為具有可經皮下注射穿刺的塞子之靜脈內投予用溶液包或小玻璃瓶）。組合物中的至少1個有效成分為本揭示之抗體。標籤或仿單顯示組合物用於治療選擇的症狀。本揭示之此態樣中的製品也可進一步含有顯示組合物可用於治療特定症狀使用之仿單。或者或除此之外，製品也可更包含注射用殺菌水（BWFI）、磷酸緩衝生理食鹽水、連接子溶液、及右旋糖溶液等的藥學上容許緩衝液之第二（或第三）容器。從其他商業觀點或使用者立場，也可進一步含有其他緩衝液、稀釋液、過濾器、針、及注射器等的所希望的器材。
所謂「仿單」通常含於治療用品的商用包裝，用於包含關於此治療用品之使用的適應症、用法、用量、投予方法、併用療法、禁忌、及/或警告之資訊的使用說明書。
應理解對於上述任一製品，皆可包含本揭示之免疫共軛物以代替或額外增加於抗CD137抗原結合分子或抗體。
III. 合併療法 A.合併療法及用於合併療法的治療用組合物 本揭示關於包含上述抗CD137抗原結合分子、和其他抗癌劑合併使用的癌症的治療及/或預防方法。在一態樣中，本揭示關於包含抗CD137抗原結合分子，用於和其他抗癌劑的合併療法之醫藥組合物。在更一態樣中，本揭示關於包含其他抗癌劑，用於和本揭示之抗CD137抗原結合分子的合併療法之醫藥組合物。本揭示關於包含投予抗CD137抗原結合分子及其他抗癌劑之治療、預防個體的癌症、及/或使腫瘤組織內的免疫活化之方法。抗CD137抗原結合分子及/或其他抗癌劑經由合併使用，可治療癌症及/或發揮治療癌症的加乘效果或相加效果。
在一些實施態樣中，本揭示之合併療法提供一種方法，經由使用上述抗CD137抗原結合分子，在以其他抗癌劑進行癌症的治療或預防之際，增強該其他抗癌劑的治療或預防效果。又，本揭示之合併療法提供一種方法，經由使用其他抗癌劑，在以上述抗CD137抗原結合分子進行癌症的治療之際，增強該抗CD137抗原結合分子的治療或預防效果。此處，所謂治療或預防效果的增強是指例如治療的奏效率上升、為了治療而投予的抗癌劑的量減少、及/或以抗癌劑的治療期間縮短者，但不限於此。而且，本揭示之合併療法提供包含投予有效量的上述抗CD137抗原結合分子及其他抗癌劑，延長個體的無惡化存活期之方法。
在一些實施態樣中，本揭示之合併療法包含上述抗CD137抗原結合分子和其他抗癌劑之投予。該抗CD137抗原結合分子和其他抗癌劑能夠以該技術領域公知的任意適當方法投予。例如，可並行（即同時）或連續（即不同時點）投予該抗CD137抗原結合分子及其他抗癌劑。當連續（即不同時點）投予該抗CD137抗原結合分子及其他抗癌劑的情形時，該抗CD137抗原結合分子和其他抗癌劑的投予間隔沒有特別限定，可考慮投予路徑或劑型等的要因而設定。例如為0小時~168小時，較佳為0小時~72小時，又較佳為0~24小時，再更佳為0小時~12小時，但不限於此等。
上述抗CD137抗原結合分子和其他抗癌劑可同時投予。該抗CD137抗原結合分子可間隔（即間斷地）投予。該抗CD137抗原結合分子可在其他抗癌劑投予前投予。或者，該抗CD137抗原結合分子可在其他抗癌劑投予後投予。
又，其他抗癌劑可間隔（即間斷地）投予。其他抗癌劑可在該抗CD137抗原結合分子投予前投予。或者，其他抗癌劑可在該抗CD137抗原結合分子投予後投予。
在一些實施態樣中，本說明書所載之抗CD137抗原結合分子以及公知的或本說明書所載之抗癌劑，可使用於上述抗CD137抗原結合分子和其他抗癌劑之合併療法。
除了上述抗CD137抗原結合分子及其他抗癌劑的合併療法外，可再進行追加療法。追加於本揭示之合併療法的療法也可包含追加該抗CD137抗原結合分子及/或其他抗癌劑的投予。
一非限定態樣為，本揭示提供由上述抗CD137抗原結合分子、其他抗癌劑、或該抗CD137抗原結合分子和其他抗癌劑組合而成的對癌細胞或含有癌細胞的腫瘤組織之免疫反應活化劑、癌症治療劑、或癌症預防劑（以下稱為醫藥組合物等）。本揭示之醫藥組合物等可用於本揭示之合併療法。在一些實施態樣中，本揭示之醫藥組合物等，經由合併使用上述抗CD137抗原結合分子和其他抗癌劑，和此等的單獨療法相比，抑制細胞增殖、使對癌細胞或含有癌細胞的腫瘤組織的免疫活化、或者治療或預防癌症的效果高。又本揭示之醫藥組合物，經由合併使用上述抗CD137抗原結合分子和其他抗癌劑，具有抑制細胞增殖、使對癌細胞或含有癌細胞的腫瘤組織的免疫活化、或者治療或預防癌症的加乘效果或相加效果。
在一些實施態樣中，本揭示之「抗CD137抗原結合分子和其他抗癌劑組合而成」的醫藥組合物等，表示用於在疾病的治療或預防同時、各別、或依序投予上述抗CD137抗原結合分子及其他抗癌劑所組合的醫藥組合物等。例如，本揭示之醫藥組合物等能夠以共同含有抗CD137抗原結合分子及其他抗癌劑的調配劑的型態提供。又例如，本揭示之醫藥組合物等也可將含有抗CD137抗原結合分子的藥劑和含有其他抗癌劑的藥劑各別提供，此等藥劑也可同時或依序使用。上述疾病沒有特別限制，較佳為癌症。
本揭示提供，包含上述抗CD137抗原結合分子作為有效成分之用於和其他抗癌劑合併使用的醫藥組合物等。又本揭示提供，包含其他抗癌劑作為有效成分之用於和上述抗CD137抗原結合分子合併使用的醫藥組合物等。
本揭示提供，經由上述抗CD137抗原結合分子和其他抗癌劑組合，在以其他抗癌劑的癌症治療之際，用於增強該其他抗癌劑的治療效果的醫藥組合物等。又，本揭示提供，經由其他抗癌劑和上述抗CD137抗原結合分子組合，在以抗CD137抗原結合分子的癌症治療之際，用於增強該抗CD137抗原結合分子的治療效果的醫藥組合物等。
在一些實施態樣中，本揭示提供，用於製造包含上述抗CD137抗原結合分子及/或該其他抗癌劑作為有效成分之醫藥組合物等的該抗CD137抗原結合分子及/或該其他抗癌劑之用途。
又，本揭示中，所謂包含上述抗CD137抗原結合分子及/或該其他抗癌劑作為有效成分，表示包含該抗CD137抗原結合分子及/或該其他抗癌劑作為主要活性成分的意思，非限制該抗CD137抗原結合分子及/或該其他抗癌劑的含量比率。
在一些實施態樣中，本說明書所載的抗CD137抗原結合分子及公知的或本說明書所載的其他抗癌劑，可使用於上述醫藥組合物等。
在一非限定態樣中，和抗CD137抗原結合分子合併使用的其他抗癌劑，例如氮芥類似物（Nitrogen mustard analogues）、烷基磺酸鹽類（Alkyl sulfonates）、乙烯醯亞胺類（Ethylene imines）、亞硝基脲類（Nitrosoureas）、環氧化合物（Epoxides）、其他的烷化劑、葉酸類似物（Folic acid analogues）、嘌呤類似物（Purine analogues）、嘧啶類似物（Pyrimidine analogues）、其他的代謝拮抗劑、長春花生物鹼或其類似物（Vinca alkaloids or analogues）、鬼臼毒素衍生物（Podophyllotoxin derivatives）、喜樹鹼衍生物（Camptothecan analogs）、秋水仙素衍生物（Colchicine derivatives）、紫杉醇（Taxanes）、其他的植物鹼或天然物質、放射線菌素（Actinomycines）、蒽環類或相關的物質（Anthracyclines or related substances）、其他的細胞毒性抗生素、鉑製劑（Platinum compounds）、甲肼類（Methylhydrazines）、激酶抑制劑（Kinase inhibitors）、血管新生抑制劑、荷爾蒙劑、DNA修飾酵素抑制劑、免疫刺激劑、蛋白酶體抑制劑、酵素（Enzymes）、組胺酸脫乙醯酶抑制劑（Histone Deacetylase Inhibitors）、DNA修飾酵素抑制劑、細胞激素製劑、類視色素（Retinoids）、T細胞活化促效劑、免疫檢查點抑制劑、吲哚胺2,3-雙加氧酶（Indoleamine 2,3-Dioxygenase（IDO））抑制劑、共同刺激分子活化劑、自然殺手細胞活化劑、T細胞重導向抗原結合分子、抗纖維化藥劑、調節T細胞去除劑、CD4陽性T細胞去除劑、B細胞去除劑、自然殺手細胞去除劑、巨噬細胞去除劑、單株抗體、其他的分子標靶藥物、或該等以外的抗癌劑，但不限於此等。
本揭示中的「免疫檢查點」是指在免疫活性細胞（包含T細胞）上表現、經由和配體結合而對該免疫活性細胞傳遞抑制免疫反應的訊息的分子。免疫檢查點及其配體包含例如PD-1、CTLA-4、TIM3、LAG3、PD-L1、PD-L2、BTNL2、B7-H3、B7-H4、CD48、CD80、2B4、BTLA、CD160、CD60、CD86、VISTA、或TIGIT等的分子，但不限於此等。在一些實施態樣中，本揭示中的「免疫檢查點抑制劑」是指經由抑制免疫檢查點和其配體的結合而抑制以該免疫檢查點進行訊息傳遞之藥劑。較佳免疫檢查點抑制劑為，和免疫檢查點或其配體結合而抑制由該免疫檢查點進行訊息傳遞的抗原結合分子，較佳為抗體或抗體片段。
一非限定態樣提供，前述的其他抗癌劑為化療劑、T細胞活化促效劑、免疫檢查點抑制劑、T細胞重導向抗原結合分子、抗纖維化藥物、血管新生抑制劑、調節T細胞去除劑、CD4陽性T細胞去除劑、B細胞去除劑、自然殺手細胞去除劑、或巨噬細胞去除劑之醫藥組合物。
一非限定態樣為，化療劑例如代謝拮抗劑、植物鹼、或鉑製劑，但不限於此等。代謝拮抗劑的較佳例，如依諾他濱（Enocitabine）、卡培他濱（Capecitabine）、卡莫氟（Carmofur）、吉西他濱（Gemcitabine）、阿糖胞苷（Cytarabine）、替加氟（Tegafur）、替加氟‧脲嘧啶（Tegafur‧Uracil）、奈拉濱（Nelarabine）、氟脲嘧啶（Fluorouracil）、氟達拉濱（Fludarabine）、培美曲塞（Pemetrexed）、噴司他丁（Pentostatin）、氨甲蝶呤（Methotrexate），但不限於此等。特佳的代謝拮抗劑之例如卡培他濱（Capecitabine）。植物鹼的較佳例，如依瑞諾丁（Irinotecan）、依託泊苷（Etoposide）、索布佐生（Sobuzoxane）、歐洲紫杉醇（Docetaxel）、拓扑替康（Nogitecan）、紫杉醇（Paclitaxel）、溫諾平（Vinorelbine）、長春新鹼（Vincristine）、長春地辛（Vindesine）、長春花鹼（Vinblastine），但不限於此等。特佳的植物鹼之例如紫杉醇（Paclitaxel）。鉑製劑的較佳例，如奧沙利鉑（Oxaliplatin）、卡鉑（Carboplatin）、順鉑（Cisplatin）、奈達鉑（Nedaplatin），但不限於此等。特佳的鉑製劑之例如順鉑（Cisplatin）、卡鉑（Carboplatin）、或此等的合併使用。
一非限定態樣為，T細胞活化促效劑例如TNF受體超家族（TNFRSF）的促控抗體、或共同刺激分子的促控抗體，但不限於此等。 「共同刺激分子的促控抗體」的標靶分子例如TMIGD2、HHLA2、ICOS、ICOS配體、CD28、CD80、CD86等。較佳的共同刺激分子的促控抗體之例，如抗CD28抗體。
「TNF受體超家族的促控抗體」的標靶分子，只要是使表現TNF受體超家族之細胞（例如T細胞或NK細胞等）活化的因子，沒有特別限定，較佳為屬於「TNF超家族」或「TNF受體超家族」的因子。屬於「TNF超家族」或「TNF受體超家族」的因子，已知有助於各種免疫細胞活化之具有三聚體結構的配體和該配體結合的三聚體結構之受體（Nat. Rev. Immunol., 2012, 12, 339-51）。屬於TNF超家族或TNF受體超家族的因子，例如CD137、CD137L、CD40、CD40L、OX40、OX40L、CD27、CD70、HVEM、LIGHT、RANK、RANKL、CD30、CD153、GITR、GITRL、TNFRSF25、TL1A。OX40促控抗體之例，如MOXR0916、MEDI6469、MEDI0562、MEDI6383、PF-04518600、GSK-3174998或多種公知的OX40促控抗體。CD40促控抗體之例，如RG-7876、ADC-1013、SEA-CD40、APX005M、Dacetuzumab或多種公知的CD40促控抗體。GITR促控抗體之例，如AMG228、AMK-1248、MK-4166、BMS-986156、TRX518或多種公知的GITR促控抗體。CD27促控抗體之例，如Varlilumab（CAS編號：1393344-72-3）或多種公知的CD27促控抗體。CD137促控抗體之例，如Urelumab（CAS編號：934823-49-1）、PF-05082566或多種公知的CD137促控抗體。又，CD137促控抗體也可為和CD137結合的雙特異性抗原結合分子（例如和CD137及癌抗原結合的雙特異性抗體、或和CD137配體（4-1BBL）及癌抗原結合的融合蛋白質等）。
一非限定態樣為，免疫檢查點抑制劑之例，如抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗CTLA-4抗體、抗TIM3抗體、抗LAG3抗體、或抗TIGIT抗體，但不限於此等。例如，抗PD-1抗體之例，如Pembrolizumab（CAS編號：1374853-91-4）、Nivolumab（CAS編號：946414-94-4）、MEDI0680、PDR001、BGB-A317、REGN2810、SHR-1210、PF-06801591或多種公知的抗PD1抗體。抗PD-L1抗體之例，如Atezolizumab（CAS編號：1380723-44-3）、Avelumab（CAS編號：1537032-82-8）、Durvalumab（CAS編號：1428935-60-7）、MDX-1105或多種公知的抗PD-L1抗體。抗CTLA-4抗體之例，如Ipilimumab（CAS編號：477202-00-9）、Tremelimumab（CAS編號：745013-59-6）或多種公知的抗CTLA-4抗體。抗TIM3抗體之例，如MBG452或多種公知的抗TIM3抗體。抗LAG3抗體之例，如BMS-986016、LAG525或多種公知的抗LAG3抗體。抗TIGIT抗體之例，如Tiragolumab（RG6058）或多種公知的抗TIGIT抗體。又，免疫檢查點抑制劑也可為和（1）免疫檢查點分子及（2）TNF受體超家族（TNFRSF）或共同刺激分子結合的雙特異性抗原結合分子。在一態樣中，本揭示之合併療法也可為CD137抗原結合分子、抗PD-1抗體、及抗TIGIT抗體的三劑併用，或者為CD137抗原結合分子、抗PD-L1抗體、及抗TIGIT抗體的三劑併用。
在一態樣中，本揭示之抗CD137抗原結合分子及免疫檢查點抑制劑（較佳為抗PD-L1抗體），經由合併使用，可發揮治療癌症及/或治療癌症的加乘效果或相加效果，而且副作用為短暫性或輕微。雖不意圖侷限於特定理論，但經由投予個體抗CD137抗原結合分子，使該個體中的腫瘤組織內的免疫細胞活化。透過如此的免疫細胞的活化而誘導PD-L1的表現，PD-L1陽性細胞具有抑制活化的免疫反應的作用。因此，在抗CD137抗原結合分子和抗PD-L1抗體的合併療法中，經由抗PD-L1抗體而抑制PD-L1陽性細胞的作用，可發揮更強的抗腫瘤效果。副作用之例，如體重減少、及肝功能損傷（ASL值及/或ALT值的增加），但不限於此等。
一非限定態樣為，「T細胞重導向抗原結合分子」為包含「含有具T細胞受體複合體結合活性的抗體可變區域的區」及「含有具癌抗原結合活性的抗體可變區域的區」之多特異性抗原結合分子，較佳為多特異性抗體，更佳為雙特異性抗體。該多特異性（或雙特異性）抗體也可具有例如單鏈抗體的結構，例如以連接子（linker）結合抗體可變區域的結構。T細胞重導向抗原結合分子也可更包含對Fcγ受體的結合活性下降的Fc區域。
「含有具癌抗原結合活性的抗體可變區域的區」是指和一部分或全部的癌抗原特異性地結合，且包含互補區域而成的抗體部分。本說明書中，「癌特異性抗原」表示可區分癌細胞和正常健康細胞之癌細胞表現的抗原，例如，伴隨細胞惡化所表現的抗原，包含細胞在癌化之際呈現在細胞表面或蛋白質分子上的異常糖鏈。例如本說明書（例如「II.組合物及方法（抗CD137促控抗原結合分子）、A. 抗CD137抗原結合分子或抗體之例、6.多特異性抗體」）中揭示之各種抗原，但不限於此等。成為本揭示之癌特異性抗原結合區的對象的癌特異性抗原，特別以在細胞表面表現者為佳，該類抗原例如GPC3、CD19、CD20、EGFR、HER2、EpCAM、EREG、FAP、CEA、DLL3、Claudin-6、FGFR3。
在一態樣中，抗T細胞抗原結合分子為包含下述之多特異性抗體，較佳為雙特異性抗體：（1）含有具Glypican-3結合活性的抗體可變區域（variable region）之區（domain）、（2）含有具T細胞受體複合體結合活性的抗體可變區域之區、及（3）含有對Fcγ受體的結合活性下降的Fc區域（Fc region）之區。在一態樣中，具Glypican-3結合活性的抗體可變區域和具T細胞受體複合體結合活性的抗體可變區域所含的抗體L鏈可變區域，較佳取得對於對Glypican-3具有結合活性的H鏈和對T細胞受體複合體具有結合活性的H鏈兩者皆可提供結合能力的共同L鏈，將此等作為上述雙特異性抗體的共同L鏈可變區域使用。
在一態樣中，抗T細胞抗原結合分子為ERY974。ERY974為包含下述的雙特異性抗體：（1） 含有具Glypican-3結合活性的抗體可變區域之區、（2）含有具T細胞受體複合體結合活性的抗體可變區域之區、及（3）含有對Fcγ受體的結合活性下降的Fc區之域區，包含： ・WO2016/047722揭示的TR01H113為CD3側的重鏈可變區域； ・WO2016/047722揭示的E2702sKsc為CD3側的重鏈恆定區域（constant region）； ・WO2016/047722揭示的GCH065為GPC3側的重鏈可變區域； ・WO2016/047722揭示的E2704sEpsc為GPC3側的重鏈恆定區域； ・WO2016/047722揭示的L0011為共同輕鏈可變區域；及 ・WO2016/047722揭示的k0為共同輕鏈恆定區域。
「含有具T細胞受體複合體結合活性的抗體可變區域之區」較佳為含有具T細胞受體結合活性的抗體可變區域之區，更佳為含有具CD3結合活性的抗體可變區域之區。又上述「含抗體可變區域之區」由1個或複數個抗體的可變區所提供，較佳為，含抗體可變區域的區包含抗體輕鏈可變區域（VL）和抗體重鏈可變區域（VH）。如此包含抗體可變區域之區之例，較佳如各種抗體片段，例如「scFv（single chain Fv）」、「單鏈抗體（single chain antibody）」、「Fv」、「scFv2（single chain Fv 2）」、「Fab」或「F（ab'）2」等。
一非限定態樣為，「抗纖維化藥物」為阻礙或抑制纖維化的醫藥，例如吡非尼酮（Pirfenidone）、尼達尼布（Nintedanib），但不限於此等。又抗纖維化藥物也可為PEGPH20等的透明質酸酶（Hyaluronidase）藥物。
一非限定態樣為，血管新生抑制劑之例，如抗VEGF抗體、抗VEGFR2抗體，但不限於此等。例如，血管新生抑制劑之例，可例如貝伐單株抗體（Bevacizumab）、雷莫蘆單株抗體（Ramucirumab）、索拉非尼（Sorafenib）、依維莫司（Everolimus）、 坦羅莫司（temsirolimus）、樂伐替尼（Lenvatinib）、阿柏西普（Aflibercept）或多種公知的血管新生抑制劑。
一非限定態樣為，「調節T細胞去除劑」為去除（depletion）調節T細胞之藥劑，例如抗CD4抗體、抗CD25抗體、抗CCR4抗體、抗CTLA4抗體，但不限於此等。
一非限定態樣為，「CD4陽性細胞去除劑」為去除（depletion）CD4陽性細胞的藥劑，例如抗CD4抗體，但不限於此。
一非限定態樣為，「B細胞去除劑」、「自然殺手細胞去除劑」、及「巨噬細胞去除劑」分別為去除（depletion）B細胞、自然殺手細胞、巨噬細胞的藥劑，例如，B細胞去除劑如利妥昔單株抗體（Rituximab）或奧比妥珠單株抗體（Obinutuzumab），巨噬細胞去除劑例如抗CSF1R抗體，但不限於此等。
一非限定態樣為，「單株抗體」例如抗TGF β抗體、抗Latent-TGF β抗體、抗IL-8抗體等，但不限於此等。
在一些實施態樣中，本揭示中的其他抗癌劑，只要是在和本揭示之抗CD137抗原結合分子合併使用時，可增強該其他抗癌劑的治療或預防效果者、或增強該抗CD137抗原結合分子的治療或預防效果者，皆可使用，沒有特別限定。
一非限定態樣為，本揭示之合併療法也可包含上述抗CD137抗原結合分子和至少1個其他治療藥、免疫調節藥、癌症治療疫苗、過繼性T細胞療法等，但不限於此等。合適的癌症治療疫苗例如全腫瘤細胞疫苗、腫瘤抗原疫苗、載體疫苗、腫瘤溶解性病毒疫苗、及樹突細胞疫苗，但不限於此等。在上述療法以外，也可進行併用外科手術、放射線療法等的多學科治療。
一非限定療法為，本揭示的合併療法也可合併上述抗CD137抗原結合分子、和使用細胞激素作為抗腫瘤免疫反應增強藥物的細胞激素療法來進行，如此的療法例如IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-23、IL-27、GM-CSF、IFNα（干擾素-α）、IFNα-2b、IFNβ、IFNγ等的細胞激素，但不限於此等。
一非限定態樣為，本揭示提供包含上述醫藥組合物之細胞增殖抑制劑、細胞增殖阻礙劑、免疫反應活化劑、癌症治療劑或癌症預防劑。
投予上述抗CD137抗原結合分子及/或其他抗癌劑的「個體」可為人類。在一些實施態樣中，該個體為具有癌細胞或含癌細胞的腫瘤組織的患者。本揭示中的較佳癌症種類，例如胃癌（Gastric）、頭頸癌（H&N）、食道癌（Esophageal）、大腸癌（Colorectal）、肺癌（Lung）、間皮瘤（Mesothelioma）、肝癌（Liver）、卵巢癌（Ovary）、乳癌（Breast）、結腸癌（Colon）、腎臟癌（Kidney）、皮膚癌（Skin）、肌肉瘤（Muscle）、胰臟癌（Pancreas）、前列腺癌（Prostate）、睪丸癌（Testis）、子宮癌（Uterine）、膽管癌（Cholangiocarcinoma）、默克細胞癌（Merkel cell）、膀胱癌（Bladder）、甲狀腺癌（Thyroid）、神經鞘瘤（schwannoma）、腎上腺癌（Adrenal gland）、肛門癌（Anus）、中樞神經系統腫瘤（Central nervous system）、神經內分泌組織腫瘤（Neuroendocrine tissues）、陰莖癌（Penis）、胸膜腫瘤（Pleura）、唾液腺腫瘤（Salivary gland）、外陰癌（Vulva）、胸腺腫瘤（thymoma）、淋巴瘤（Lymphoma）、骨髓性白血病（Myeloid leukemia）、及兒童癌症（威爾姆氏腫瘤（Wilms tumor））、神經母細胞瘤（neuroblastoma）、肉瘤（Sarcoma）、肝母細胞瘤（hepatoblastome）、生殖細胞瘤（germ cell tumor），但不限於此。更佳的癌症種類例如胃癌（Gastric）、大腸癌（Colorectal）、肺癌（Lung）、間皮瘤（Mesothelioma）、肝癌（Liver）、乳癌（Breast）、皮膚癌（Skin）、淋巴瘤（Lymphoma）、骨髓性白血病（Myeloid leukemia），但不限於此等。（Tumori. （2012） 98, 478-484; Tumor Biol. （2015） 36, 4671-4679; Am J Clin Pathol （2008） 130, 224-230; Adv Anat Pathol （2014） 21, 450-460; Med Oncol （2012） 29, 663-669; Clinical Cancer Research （2004） 10, 6612-6621; Appl Immunohistochem Mol Morphol （2009） 17, 40-46; Eur J Pediatr Surg （2015） 25, 138-144; J Clin Pathol （2011） 64, 587-591; Am J Surg Pathol （2006） 30, 1570-1575; Oncology （2007） 73, 389-394; Diagnostic Pathoogy （2010） 64, 1-6; Diagnostic Pathoogy （2015） 34, 1-6; Am J Clin Pathol （2008） 129, 899-906; Virchows Arch （2015） 466, 67-76）。更佳的癌症種類例如胃癌、大腸癌、肺癌、間皮瘤、肝癌、乳癌、皮膚癌、淋巴瘤、骨髓性白血病。
在本揭示中，個體也可為，在上述抗CD137抗原結合分子和其他抗癌劑的合併療法之前，曾接受該抗CD137抗原結合分子及/或任何的其他抗癌劑治療之患者。或者，個體也可為，無法接受標準療法、或標準療法無效的個體。在一些實施態樣中，個體所具的癌症為初期或末期。
本揭示之包含抗CD137抗原結合分子及其他抗癌劑的合併療法、或用於該合併療法的醫藥組合物，可用於為了治療具有對以免疫檢查點抑制劑的治療為不反應性的癌症之患者。例如，對於經由免疫檢查點抑制劑的投予而確認未產生所預期藥效之患者，能夠以本揭示之合併療法（醫藥組合物）進行治療。「對以免疫檢查點抑制劑的治療為不反應性的癌症」也可稱為「已經以免疫檢查點抑制劑治療的癌症」、「在以免疫檢查點抑制劑的治療時或治療後惡化的癌症」、「免疫檢查點抑制劑無效的癌症」、「在以免疫檢查點抑制劑治療後復發的癌症」、「對免疫檢查點抑制劑有抗藥性的癌症」、「免疫檢查點抑制劑的效果不足的癌症」、或「免疫檢查點抑制劑不奏效的癌症」。該合併療法（醫藥組合物）所含的其他抗癌劑的較佳例，可例如免疫檢查點抑制劑或T細胞重導向抗原結合分子，但不限於此等。
上述對以免疫檢查點抑制劑的處理為不反應性的癌症，例如在JAK1、JAK2、及/或B2M具有基因變異的癌症（參照Shin, Daniel Sanghoon et al. "Primary Resistance to PD-1 Blockade Mediated by JAK1/2 Mutations." Cancer discovery vol. 7,2 （2017）: 188-201; 或Sade-Feldman, Moshe et al. "Resistance to checkpoint blockade therapy through inactivation of antigen presentation." Nature communications vol. 8,1 1136. 26 Oct. 2017等），但不限於此等。
或者，本揭示之合併療法（醫藥組合物）可用於為了治療具有對本揭示之抗癌劑的處理不反應性的癌症之個體。例如，對於在投予本揭示之抗癌劑後對該抗癌劑成為耐受性的個體、或者經由本揭示之抗癌劑的投予未產生所期望藥效的個體，能夠以本揭示之合併療法（醫藥組合物）進行治療。換句話說，對於已經以本揭示之抗癌劑療法治療的癌症，能夠以本揭示之合併療法（醫藥組合物）進行治療。該醫藥組合物所含的其他抗癌劑的較佳例，可例如免疫檢查點抑制劑或T細胞重導向抗原結合分子，但不限於此等。
在另外的方面，本揭示提供，經上述合併療法，用於使個體的腫瘤組織中的免疫細胞活化之方法。在一態樣中，該方法包括，包含投予個體有效量的含有抗CD137抗原結合分子的抗癌劑及其他抗癌劑之步驟的方法。在另外的態樣中，本揭示中，該免疫細胞可例如B細胞、樹突細胞、自然殺手細胞、巨噬細胞、及/或CD8陽性T細胞等的免疫細胞（更具體為浸潤腫瘤組織的此等免疫細胞）。在該方法中，當選自Cd3e、CD8b1、Gzmb、Prf1、及Ifng的至少1個基因的表現量在腫瘤組織中增加的情形時，可判斷為在腫瘤組織中的T細胞活化增強。 在另外的方面，本揭示提供，經由上述合併療法，用於使個體的腫瘤組織中的免疫細胞、特別是CD8陽性T細胞活化或促進其增殖之方法。在一態樣中，該方法包括，包含投予個體有效量的含有抗CD137抗原結合分子的抗癌劑及其他抗癌劑的步驟之方法。在使CD8陽性T細胞活化的方法中，當選自OVA tetramer、Granzyme B、PD-1、KLRG-1、及ICOS的至少1個CD8陽性T細胞的活化標誌物的陽性率（陽性率（%）＝腫瘤組織中的活化標誌物為陽性的CD8陽性T細胞數/腫瘤組織中的CD8陽性T細胞數×100）增加的情形時，可判斷為腫瘤組織中的CD8陽性T細胞被活化。
可理解，對於上述合併療法或合併療法用的治療用組合物任一者，也可使用本揭示之免疫共軛物以代替或追加本揭示之抗CD137抗原結合分子或抗體而實施。所使用的抗CD137抗原結合分子為，包含表37所載之A375/B167、A372/B040、A356/B040、A486/B167、A487/B167、A488/B226、A489/B223、A548/B376、A551/B256、A551/B379、A555/B379、A548/B256、或A549/B167之胺基酸序列為重鏈可變區/輕鏈可變區之組合的抗體。在一較佳態樣中，抗CD137抗原結合分子為包含和A375/B167所含的HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3之胺基酸序列相同之HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3的抗CD137抗體。在又一態樣中，抗CD137抗原結合分子為包含A375/B167為重鏈可變區/輕鏈可變區之組合的抗CD137抗體。在不同的一較佳態樣中，抗CD137抗原結合分子為包含和A551/B379所含之HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3的胺基酸序列相同之HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3的抗CD137抗體。在更一態樣中，抗CD137抗原結合分子為包含A551/B379為重鏈可變區/輕鏈可變區之組合的抗CD137抗體。又，所使用的抗CD137抗體也可為選自表72所載之抗體的任一個的抗CD137抗體。
B.套組 在本揭示的另外方面中，提供在上述「G. 治療方法及治療用組合物」中詳述的以腫瘤或癌症為例的多種疾病或障礙之在上述「A.合併療法及合併療法用的治療用組合物」詳述的本揭示之抗CD137抗原結合分子（或其免疫共軛物）或包含該等的醫藥組合物（或藥物製劑）、和其他至少1個抗癌劑組合的治療或預防中所使用的套組。本揭示之該套組可提供作為例如治療或預防癌症（或腫瘤）用的套組。 本揭示中的套組，不限於下列態樣，包括（1）作為有效成分之本揭示之抗CD137抗原結合分子（或其免疫共軛物）或包含該等的醫藥組合物（或藥物製劑），及（2）指示該醫藥組合物在投予患者前、投予同時、或投予後，投予至少1個其他抗癌劑的仿單或標籤。 本揭示之套組，該有效成分可填充於容器。 本揭示之套組包含該容器上的標籤或附於該容器的仿單。 本揭示之套組提供例如作為治療用品的商用包裝。 本揭示之該容器包含較佳例如瓶子（bottle）、小玻璃瓶（vial）、注射器、IV溶液包裝等。容器類可由玻璃或塑膠等的多樣材料所形成。容器可以單體保存有效成分，或者也可以具有無菌的輸入管（例如，容器可為可經皮下注射針筒刺穿的具有塞子的靜脈內投予用溶液包裝或小玻璃瓶）。 本揭示中的該標籤或仿單通常包含於本揭示之套組之一例的上述治療用品的商用包裝，用於說明包含關於此治療用品的使用之適應症、用法、用量、投予方法、合併療法、禁忌、及/或警語之資訊的使用說明書。該合併療法可顯示例如將該有效成分，和上述「A.合併療法及合併療法用的治療用組合物」詳述之本揭示的抗CD137抗原結合分子（或其免疫共軛物）或包含該等的醫藥組合物（或藥物製劑）、和其他至少1個的抗癌劑組合使用的指示內容。 本揭示之套組，更包含注射用無菌水（BWFI）、磷酸緩衝生理食鹽水、林格氏液、及右旋糖（dextrose）溶液等的藥學容許的緩衝液，也可包含第二（或第三）容器。本揭示之套組也可更包含其他的緩衝液、稀釋劑、過濾器、針、及注射器等的其他商業觀點或使用者立場所希望的器材。 ［實施例］
以下為本揭示之方法及組合物之實施例。應理解，依照上述一般記載，可實施各種其他態樣。
實施例1：以使用hCD137 KI小鼠的同系腫瘤細胞移植模式的抗CD137抗體的抗腫瘤活性的評價（LLC1/OVA/GPC3 clone C5細胞） （1-1）細胞株及同系腫瘤移植小鼠模式的製作、以及抗腫瘤活性的評價 本試驗使用在本公司內建立的小鼠肺癌細胞株LLC1/OVA/GPC3 clone C5細胞（記載於參考實施例9-4-1），及hCD137 KI小鼠（記載於參考實施例6-3）。將LLC1/OVA/GPC3 clone C5細胞株移植到小鼠腹部皮下，當腫瘤體積成為164-465mm3 的時點進行分群。分群在移植10日後進行。如下表6所示在移植11日後及14日後，在小鼠尾靜脈內投予A551-MB110/B379-ml0r抗體。使用含有0.05%Tween 20的PBS作為載劑對照（Vehicle control）。
［表6］
群 隻數 藥劑 用量 （mg/kg） 投予日 投予路徑
1 7 載劑對照 （含0.05% Tween 20 的 PBS） - 移植11日後及14日後 尾靜脈内
2 7 A551-MB110/B379-ml0r 0.83
3 7 A551-MB110/B379-ml0r 2.5
4 7 A551-MB110/B379-ml0r 7.5
在移植10日後、14日後、17日後、21日後，測量腫瘤體積。 腫瘤體積（Tumor Volume，TV）以下列算式計算。 腫瘤體積（mm3 ） ＝ 長徑（mm） × 短徑（mm） × 短徑（mm）/2 腫瘤增殖抑制率（Tumor growth inhibition，TGI （%））根據下式計算。 腫瘤體積變化（TV change） （mm3 ） ＝ 測量時點的腫瘤體積-分群時的腫瘤體積 TGI （%） ＝ （1- （各群的腫瘤體積變化（TV change）的平均值/載劑對照群的腫瘤體積變化（TV change）的平均值）） × 100
結果顯示，A551-MB110/B379-ml0r抗體對LLC1/OVA/GPC3 clone C5細胞在7.5、2.5、0.83 mg/kg為103、101、106%的腫瘤增殖抑制率（圖1，表7）。亦即，A551-MB110/B379-ml0r抗體，在本實施例的用量，全部顯示同等的高抗腫瘤活性。在2.5mg/kg投予群的1個體，在腫瘤移植15日後腫瘤細胞向腹腔內擴散，全身狀態惡化，因此進行安樂死處置。
［表7］
投予抗體 用量（mg/kg） 腫瘤移植21日後的TGI（%）
  A551-MB110/B379-ml0r 0.83 106
2.5 101
7.5 103
（1-2）細胞株及同系腫瘤移植小鼠模式的製作、及腫瘤內反應的評價（基因表現量） 本試驗使用在本公司內建立的LLC1/OVA/GPC3 clone C5細胞（記載於參考實施例9-4-1），及hCD137 KI小鼠（記載於參考實施例6-3）。將LLC1/OVA/GPC3 clone C5細胞株移植到小鼠腹部皮下，當腫瘤體積成為100-180mm3 的時點進行分群。分群在移植10日後進行。如下表8所示在移植11日後及14日後，在小鼠尾靜脈內投予載劑對照、A551-MB110/B379-ml0r抗體。使用含有0.05%Tween 20的PBS作為載劑。
［表8］
群 隻數 藥劑 用量 （mg/kg） 投予日 投予路徑
1 5 載劑對照 （含0.05% Tween 20 的 PBS） - 移植11日後及14日後 尾靜脈内
2 5 A551-MB110/B379-ml0r 0.83
3 5 A551-MB110/B379-ml0r 2.5
4 5 A551-MB110/B379-ml0r 7.5
在移植後15日，採樣腫瘤。將採樣的腫瘤浸漬於RNA-later（QIAGEN）保存。從腫瘤樣本萃取total RNA。使用nCounter Pancancer Mouse Immune Profiling Panel （NanoString Technologies）及nCounter Digital analyser （NanoString Technologies）測量total RNA的基因表現量。
使用nSolver（NanoString Technologies）及Microsoft Excel 2013（Microsoft corporation）分析所測量的基因表現量。在測量表現量的基因之中，將和T細胞的細胞毒性相關的Cd8b1、Gzmb、Prf1、Ifng的表現量作圖（圖2）。和載劑對照群相比，A551-MB110/B379-ml0r單劑群在任一基因中的表現量增加（Dunnet檢定，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001））。 由以上顯示，在本試驗條件下，A551-MB110/B379-ml0r對LLC1/OVA/GPC3 clone C5荷瘤人類CD137基因置入（knock-in）小鼠，引發強的腫瘤內反應。
（1-3）腫瘤內作用的評價（CD8陽性T細胞中的各種活化標誌物的陽性率） （1-3-1）細胞株及同系腫瘤移植小鼠模式的製作、及腫瘤內作用的評價方法 本試驗使用在本公司內建立的小鼠肺癌細胞株LLC1/OVA/GPC3 clone C5細胞株（記載於參考實施例9-4-1），及hCD137 KI小鼠（記載於參考實施例6-3）。將LLC1/OVA/GPC3 clone C5細胞株移植到小鼠腹部皮下，當腫瘤體積成為69-195mm3 的時點進行分群。分群在移植12日後進行。如下表9所示在移植13日後及16日後，在小鼠尾靜脈內投予A551-MB110/B379-ml0r。使用含有0.05%Tween 20的PBS作為載劑對照。
在第1次投予的4日後，根據下述方法，取出腫瘤組織，製作淋巴球分層，再經由使用流式細胞技術（FCM）評價CD8陽性T細胞中的各種活化標誌物的陽性率，評價腫瘤內反應。在此等的各指標的評價中，和載劑投予群相比，當A551-MB110/B379-ml0r投予群顯示腫瘤內反應的指標為高值時，評價為腫瘤組織內的T細胞的活化增強。
［表9］
群 隻數 藥劑 用量 ［mg/kg］ 投予日 採樣日
1 4 載劑對照 （含0.05% Tween 20 的 PBS） - 移植13日後 及16日後 移植17日後
2 4 A551-MB110/B379-ml0r 2.5 移植13日後 及16日後 移植17日後
（1-3-2）從LLC1/OVA/GPC3 clone C5細胞株移植小鼠的腫瘤組織的取出及淋巴球分層之製作 對於取出的腫瘤組織，實施淋巴球分層的細胞數測量。淋巴球分層的細胞數的測量使用Tumor Dissociation Kit, mouse（Miltenyi Biotec）獲得的淋巴球分層。
（1-3-3）來自LLC1/OVA/GPC3 clone C5細胞株移植小鼠的淋巴球分層以FCM的活化標誌物陽性率的評價 關於FCM的評價，使用CD8陽性T細胞中的各種活化標誌物的陽性率。因此在FCM的分析，使用螢光標記的抗CD8抗體（MBL） 、OVA-Tetramer試劑（MBL）、抗Gramzyme B抗體（BioLegend）、抗PD-1抗體（BioLegend）、抗KLRG-1抗體（BD Biosciences）及抗ICOS抗體（invitrogen）。在BD LSRFortessa（商標）X-20（BD Biosciences）進行測量。
使用FCM進行CD8陽性T細胞中的各種活化標誌物的陽性率評價之結果，確認和載劑投予群相比，A551-MB110/B379-ml0r投予群在腫瘤組織內的各種活化標誌物的陽性率增加（圖3）。 由上可知，A551-MB110/B379-ml0r使腫瘤內的CD8陽性T細胞的活化增強。
實施例2：以使用hCD137KI小鼠的同系腫瘤細胞移植模式的抗CD137抗體的抗腫瘤活性的評價（E. G7-OVA細胞） （2-1） 細胞株及同系腫瘤移植小鼠模式的製作、以及A551-MB110/B379-ml0r抗體的抗腫瘤活性的評價 本試驗使用小鼠淋巴瘤細胞株E. G7-OVA細胞（ATCC，CRL-2113），及hCD137 KI小鼠（記載於參考實施例6-3）。將E. G7-OVA細胞株移植到小鼠腹部皮下，當腫瘤體積成為約200mm3 的時點進行分群。分群在移植7日後進行。如下表10所示在移植7日後及10日後，在小鼠尾靜脈內投予A551-MB110/B379-ml0r抗體。使用含有0.05%Tween 20的PBS作為載劑對照。
［表10］
群 隻數 藥劑 用量 （mg/kg） 投予日 投予路徑
1 10 載劑對照 （含0.05% Tween 20 的 PBS） - 移植7日後及10日後 尾靜脈内
2 10 A551-MB110/B379-ml0r 0.83
3 10 A551-MB110/B379-ml0r 2.5
在移植7日後、10日後、14日後、17日後、21日後、24日後、28日後，測量腫瘤體積。 腫瘤體積（Tumor Volume，TV）以下列算式計算。 腫瘤體積（mm3 ） ＝ 長徑（mm） × 短徑（mm） × 短徑（mm）/2
結果顯示，在E. G7-OVA細胞移植模式中，在移植後21日，載劑對照群的平均腫瘤體積為2611.8mm3 。A551-MB110/B379-ml0r的0.83及2.5mg/kg群的平均腫瘤體積分別為1755.7mm3 、1322.1mm3 。和載劑對照群相比，A551-MB110/B379-ml0r的0.83及2.5mg/kg群在移植後28日有顯著的低值（Williams檢定）。載劑對照群及A551-MB110/B379-ml0r的2.5mg/kg群的腫瘤體積的變化如圖4所示。
（2-2）細胞株及同系腫瘤移植小鼠模式的製作、及A375-mIgG1/B167-ml0r抗體的抗腫瘤活性的評價方法 本試驗使用獲自ATCC的小鼠淋巴瘤細胞株E. G7-OVA細胞（CRL-2113），及hCD137 KI小鼠（記載於參考實施例6-3）。將E. G7-OVA細胞移植到小鼠腹部皮下，當腫瘤體積成為約200-400mm3 的時點進行分群。分群在移植7日後進行。如下表11所示在移植7日後及10日後，在小鼠尾靜脈內投予A375-mIgG1/B167-ml0r抗體。使用含有0.05%Tween 20的PBS作為載劑。
［表11］
群 隻數 藥劑 用量 （mg/kg） 投予日 投予路徑
1 5 載劑對照 （含0.05% Tween 20 的 PBS） - 移植7日後及10日後 尾靜脈内
2 5 A375-mIgG1/B167-ml0r 2.5
在移植7日後、10日後、15日後、18日後、21日後、25日後、29日後、36日後，測量腫瘤體積。 腫瘤體積（Tumor Volume，TV）以下列算式計算。 腫瘤體積（mm3 ） ＝ 長徑（mm） × 短徑（mm） × 短徑（mm）/2
結果為，A375-mIgG1/B167-ml0r抗體對E. G7-OVA細胞顯示強的抗腫瘤效果，發現5隻中有4隻腫瘤完全退縮（圖5）。
實施例3：以使用hCD137 KI小鼠的同系腫瘤細胞移植模式的抗CD137抗體的抗腫瘤活性的評價（C1498細胞） 本試驗使用獲自ATCC的小鼠AML（急性骨髓性白血病；acute myeloid leukemia） 細胞株C1498細胞（ATCC，ITEM Number: TIB-49），及hCD137 KI小鼠（記載於參考實施例6-3）。將C1498細胞株移植到小鼠腹部皮下，當腫瘤體積成為約270mm3 的時點進行分群。分群在移植7日後進行。如下表12所示在移植7日後及10日後，在小鼠尾靜脈內投予A551-MB110/B379-ml0r抗體。使用含有0.05%Tween 20的PBS作為載劑。
［表12］
群 隻數 藥劑 用量 （mg/kg） 投予日 投予路徑
1 10 載劑對照 （含0.05% Tween 20 的 PBS） - 移植7日後及10日後 尾靜脈内
2 10 A551-MB110/B379-ml0r 2.5
在移植7日後、10日後、14日後、17日後、21日後、24日後、28日後，測量腫瘤體積。 腫瘤體積（Tumor Volume，TV）以下列算式計算。 腫瘤體積（mm3 ） ＝ 長徑（mm） × 短徑（mm） × 短徑（mm）/2
結果顯示，在C1498細胞移植模式中，在移植後17日，載劑對照群的平均腫瘤體積為3405.3 mm3 。A551-MB110/B379-ml0r的2.5mg/kg群的平均腫瘤體積為2181.3mm3 。和載劑對照群相比，A551-MB110/B379-ml0r的2.5mg/kg群在移植後17日顯示低值。載劑對照群及A551-MB110/B379-ml0r的2.5mg/kg群的腫瘤體積的變化如圖6所示。
實施例4：以使用hCD137 KI小鼠的同系腫瘤細胞移植模式的抗CD137抗體的抗腫瘤活性的評價（Hepa1-6/hGPC3細胞） （4-1） 細胞株及同系腫瘤移植小鼠模式的製作、以及A551-MB110/B379-ml0r抗體的抗腫瘤活性的評價 本試驗使用對獲自ATCC的Hepa1-6細胞（CRL-1830）導入人類Glypican-3（GPC3）的表現質體做成的小鼠肝癌細胞株Hepa1-6/hGPC3細胞（Science Translational Medicine 04 Oct 2017, Vol. 9, Issue 410, eaal4291），及hCD137 KI小鼠（記載於參考實施例6-3）。將Hepa1-6/hGPC3細胞株移植到小鼠腹部皮下，當腫瘤體積成為約200mm3 的時點進行分群。分群在移植10日後進行。如下表13所示在移植10日後及13日後，在小鼠尾靜脈內投予A551-MB110/B379-ml0r抗體。使用含有0.05%Tween 20的PBS作為載劑。
［表13］
群 隻數 藥劑 用量 （mg/kg） 投予日 投予路徑
1 10 載劑對照 （含0.05% Tween 20 的 PBS） - 移植10日後及13日後 尾靜脈内
2 10 A551-MB110/B379-ml0r 2.5
在移植10日後、13日後、17日後、20日後、24日後、27日後、31日後，測量腫瘤體積。 腫瘤體積（Tumor Volume，TV）以下列算式計算。 腫瘤體積（mm3 ） ＝ 長徑（mm） × 短徑（mm） × 短徑（mm）/2
結果為，在Hepa1-6/hGPC3細胞移植模式中，在移植後31日，載劑對照群的平均腫瘤體積為1525.3 mm3 。A551-MB110/B379-ml0r的2.5mg/kg群的平均腫瘤體積為471.6mm3 。和載劑對照群相比，A551-MB110/B379-ml0r的2.5mg/kg群在移植後31日顯示低值。載劑對照群及A551-MB110/B379-ml0r的2.5mg/kg群的腫瘤體積的變化如圖7所示。
（4-2） 細胞株及同系腫瘤移植小鼠模式的製作、及A375-mIgG1/B167-ml0r抗體的抗腫瘤活性的評價 本試驗使用對獲自ATCC的Hepa1-6細胞（CRL-1830）導入人類Glypican-3（GPC3）的表現質體做成的小鼠肝癌細胞株Hepa1-6/GPC3細胞（Science Translational Medicine 04 Oct 2017, Vol. 9, Issue 410, eaal4291），及hCD137 KI小鼠（記載於參考實施例6-3）。將Hepa1-6/GPC3細胞株移植到小鼠腹部皮下，當腫瘤體積成為約200-300mm3 的時點進行分群。分群在移植7日後進行。如下表14所示在移植7日後及10日後，在小鼠尾靜脈內投予A375-mIgG1/B167-ml0r抗體。使用含有0.05%Tween 20的PBS作為載劑。
［表14］
群 隻數 藥劑 用量 （mg/kg） 投予日 投予路徑
1 5 載劑對照 （含0.05% Tween 20 的 PBS） - 移植7日後 及10日後 尾靜脈内
2 5 A375-mIgG1/B167-ml0r 7.5
在移植7日後、10日後、13日後、18日後、20日後，測量腫瘤體積。 腫瘤體積（Tumor Volume，TV）以下列算式計算。 腫瘤體積（mm3 ） ＝ 長徑（mm） × 短徑（mm） × 短徑（mm）/2
結果為，A375-mIgG1/B167-ml0r抗體對Hepa1-6/GPC3細胞顯示抗腫瘤效果（圖8）。
實施例5：以使用hCD137 KI小鼠的同系腫瘤細胞移植模式的各種免疫細胞對於抗CD137抗體的抗腫瘤活性的影響之評價（LLC1/OVA/GPC3 clone C5） 本試驗使用在本公司內建立的小鼠肺癌細胞株LLC1/OVA/GPC3 clone C5細胞（記載於參考實施例9-4-1），及hCD137 KI小鼠（記載於參考實施例6-3）。將LLC1/OVA/GPC3 clone C5細胞株移植到小鼠腹部皮下，當腫瘤體積成為約200-300mm3 的時點進行分群。分群在移植9日後進行。如下表15所示在移植10日後及14日後，在小鼠尾靜脈內投予A551-MB110/B379-ml0r抗體。使用含有0.05%Tween 20的PBS作為載劑對照。再者，如下表16所示投予用於去除（Depletion）各種免疫細胞的藥劑。
［表15］
群 隻數 藥劑 用量 （mg/kg） 投予日 投予路徑
1 5 載劑對照 （含0.05% Tween 20 的 PBS） - 移植10日後 及14日後 尾靜脈内
2至8 5 A551-MB110/B379-ml0r 2.5
［表16］
群 隻數 藥劑 用量 投予日 投予路徑
3 5 抗小鼠CD4抗體 （BioXCell，BP0003-1） 500 μg 移植9日後、 13日後及 17日後 尾靜脈内
4 5 抗小鼠CD8α抗體 （BioXCell，BP0061） 500 μg 移植9日後、 13日後及 17日後
5 5 抗小鼠CD20抗體 （BioLegend，152104） 250 μg 移植9日後
6 5 抗小鼠NK1.1抗體 （BioXCell，BP0036） 500 μg 移植9日後、 13日後及 17日後
7 5 抗小鼠Ly-6G抗體 （BioXCell，BP0075-1） 500 μg 移植9日後、 13日後及 17日後
8 5 Clodronate Liposomes （LIPOSOMA research） 300 uL 移植9日後 及13日後
在移植9日後、14日後、17日後、20日後，測量腫瘤體積。 腫瘤體積（Tumor Volume，TV）以下列算式計算。 腫瘤體積（mm3 ） ＝ 長徑（mm） × 短徑（mm） × 短徑（mm）/2
結果為，A551-MB110/B379-ml0r抗體對LLC1/OVA/GPC3 clone C5細胞的藥效，因去除CD8 T細胞而顯著受損（圖9）。由此推測，在此模式的藥效主要經由CD8 T細胞所發揮。在一方面發現，經由去除（depeletion） CD4 T細胞、B細胞、NK細胞及巨噬細胞有使藥效增強的傾向（圖9）。由此暗示，去除此等免疫細胞的藥劑、和A551-MB110/B379-ml0r抗體合併使用，於藥效增強是有效的。
實施例6：經由使用hCD137 KI小鼠的同系腫瘤細胞移植模式的抗CD137抗體單劑或和抗PD-L1抗體的合併療法之評價（MC38細胞） （6-1）細胞株及同系腫瘤移植小鼠模式的製作、以及A551-MB110/B379-ml0r抗體（單劑或併用）的抗腫瘤活性及體重變化率的評價 本試驗使用從美國國立癌症研究所授權的小鼠大腸癌細胞株MC38細胞，及hCD137 KI小鼠（記載於參考實施例6-3）。將MC38細胞株移植到小鼠腹部皮下，當腫瘤體積成為約100-240mm3 的時點，建立模式。模式建立後，將MC38細胞株移植小鼠實施分群後，如下表17所示用量，投予A551-MB110/B379-ml0r抗體及/或抗小鼠PD-L1（BioXcell社，clone 10F.9G2）。A551-MB110/B379-ml0r的投予，在移植15日後及18日後，共計2次經尾靜脈路徑實施。抗小鼠PD-L1抗體的投予，在移植15日後及18日後，共計2次經腹腔內路徑實施。載劑對照使用含有0.05%Tween 20的PBS。
［表17］
群 隻數 藥劑 用量 ［mg/kg］ 投予日 投予路徑
1 6 載劑對照 （含0.05% Tween 20 的 PBS） - 移植15日後 及18日後 尾靜脈及 腹腔内
2 6 A551-MB110/B379-ml0r 2.5 尾靜脈内
載劑對照 （含0.05% Tween 20 的 PBS） - 腹腔内
3 6 載劑對照 （含0.05% Tween 20 的 PBS） - 尾靜脈内
抗小鼠PD-L1抗體 10 腹腔内
4 6 A551-MB110/B379-ml0r 2.5 尾靜脈内
抗小鼠PD-L1抗體 10 腹腔内
在移植14日後、18日後、21日後、25日後，測量腫瘤體積及體重。 腫瘤體積（Tumor Volume, TV）以下列算式計算。 腫瘤體積（mm3 ） ＝ 長徑（mm） × 短徑（mm） × 短徑（mm）/2
腫瘤增殖抑制率（Tumor growth inhibition，TGI （%））根據下式計算。 腫瘤體積變化（TV change） （mm3 ） ＝ 移植25日後時點的腫瘤體積-分群時的腫瘤體積 TGI （%） ＝ （1- （各群的腫瘤體積變化（TV change）的平均值/載劑對照群的腫瘤體積變化（TV change）的平均值）） × 100 體重變化率以下列算式計算。 體重變化率（%）＝100×測量日時點的體重/移植14日後時點的體重
結果觀察到，對於MC38細胞，相較於A551-MB110/B379-ml0r單劑群或抗小鼠PD-L1抗體單劑群，A551-MB110/B379-ml0r和抗小鼠PD-L1抗體的併用群的腫瘤增殖抑制作用增強。具體為，相對於A551-MB110/B379-ml0r單劑群的腫瘤增殖抑制率為82%，A551-MB110/B379-ml0r和抗小鼠PD-L1抗體的併用群顯示117%的腫瘤增殖抑制率（圖10，表18）。在所有的投予群中，和投予開始時相比，發現有6.5%以內的短暫性的體重減少，但之後有回復的傾向（圖11）。
［表18］
  載劑對照 （含0.05% Tween 20 的 PBS） A551-MB110/B379-ml0r 抗小鼠 PD-L1抗體 A551-MB110/B379-ml0r +抗小鼠PD-L1抗體
腫瘤增殖抑制 （TGI） - 82% 85% 117%
（6-2）基於異體同質（syngenic）移植小鼠模式的RNA-seq數據，顯示藥劑投予前後（特別是抗PD-L1抗體併用群）的免疫相關基因的表現變化之熱圖（heat map）繪製 從使用hCD137 KI小鼠（記載於參考實施例6-3）的同系腫瘤移植小鼠模式的RNA-seq數據，根據RSEM法（version 1.2.31）計算表現值FPKM。參考mRNA目錄（基因目錄）為GRCm38。細胞株利用MC38。群為載劑對照群、A551-MB110/B379-ml0r投予群、抗小鼠PD-L1抗體（BioXcell社，clone 10F.9G2）投予群、A551-MB110/B379-ml0r及抗小鼠PD-L1抗體的併用群之4群。
將表現量以FPKM的單位加1，使單位由［FPKM］轉換為［FPKM+1］。這是因為當表現值存在0時不能log轉換，事先加上微小值的緣故。之後實施log2轉換。
接著，對小鼠基因分配人類異種同源物（ortholog）。原則根據NCBI homologene的數據組進行分配。但是，雖然在NCBI homologene沒有進行異種同源物（ortholog），但在2019年9月的時間點在NCBI gene網頁上，有異種同源物分配的人類CXCL9和小鼠Cxcl9、人類GZMB和小鼠Gzmb作為另外的異種同源物處理。之後，從腫瘤免疫相關文獻，收集腫瘤免疫相關基因群（包含CD3D、CD8A等的全部54個基因）。之後，從該54個基因，排除沒有小鼠異種同源物的基因的51個基因作為討論對象。
之後，從RNA-seq所得的GRCm38的基因目錄（mRNA目錄）之中，只選出上述腫瘤免疫相關基因群中的基因。因為RNA-seq是小鼠數據，腫瘤免疫相關基因群是人類基因群，透過異種同源物轉換，作為小鼠的基因群。之後，利用程式語言R的程式，繪製熱圖。此處，熱圖以對各基因、所有樣本的平均為0、分散為1，進行標準化。從各基因的表現量的平均的變化，以梯度表示（圖12）。
（6-3）抗CD137抗體單劑或抗PD-L1抗體的合併使用的腫瘤內作用的評價（在腫瘤組織的CD8表現及PD-L1表現） （6-3-1）細胞株及同系腫瘤移植小鼠模式的製作、及腫瘤內作用的評價方法 本試驗使用從美國國立癌症研究所授權的小鼠大腸癌細胞株MC38細胞，及hCD137 KI小鼠（記載於參考實施例6-3）。將MC38細胞株移植到小鼠腹部皮下，當腫瘤體積成為約100mm3 的時點，建立模式。模式建立後，將MC38細胞株移植小鼠實施分群後，如下表19所示用量，投予A551-MB110/B379-ml0r抗體及/或抗小鼠PD-L1（BioXcell社，clone 10F.9G2）。A551-MB110/B379-ml0r的投予，在移植14日後共計1次經尾靜脈路徑實施。抗小鼠PD-L1抗體的投予，在移植14日後共計1次經腹腔內路徑實施。載劑對照使用含有0.05%Tween 20的PBS。
腫瘤內作用的評價是以在腫瘤組織的CD8表現及PD-L1表現的增加作為指標進行分析。CD8表現及PD-L1表現以免疫組織化學染色法評價。在這些評價中，當A551-MB110/B379-ml0r單劑群、抗小鼠PD-L1抗體單劑群、或A551-MB110/B379-ml0r及抗小鼠PD-L1抗體併用群中的腫瘤組織的CD8表現量或PD-L1表現量比載劑對照群多時，或者併用群比各單劑投予群多時，評價為CD8陽性細胞或PD-L1表現細胞增加。
［表19］
群 隻數 藥劑 用量 ［mg/kg］ 投予日 投予路徑 採樣日
1 3 載劑對照 （含0.05% Tween 20 的 PBS） - 移植14日後 尾靜脈内 及腹腔内 移植16日後
2 3 A551-MB110/B379-ml0r 2.5 移植14日後 尾靜脈内 移植16日後
3 3 抗小鼠PD-L1抗體 10 移植14日後 腹腔内 移植16日後
4 3 A551-MB110/B379-ml0r 2.5 移植14日後 尾靜脈内 移植16日後  
抗小鼠PD-L1抗體 10 腹腔内
（6-3-2）從MC38細胞株移植小鼠的腫瘤組織的取出和腫瘤組織樣本的製作 將取出的腫瘤組織在10%中性緩衝福馬林液浸透1日。之後將進行石蠟包埋的腫瘤組織切片後，進行免疫組織化學染色。
（6-3-3）從MC38細胞株移植小鼠的腫瘤組織樣本的免疫組織化學染色和CD8陽性細胞及PD-L1陽性細胞向腫瘤組織內的浸潤之評價 關於CD8的免疫組織化學染色，使用抗CD8α抗體（Cell Signaling Technology社，clone D4W2Z）及OptiView DAB kit（Ventana Medical Systems社）。關於檢測的二級抗體、檢測的三級抗體，使用抗兔-HQ抗體及HRP標記抗HQ抗體。關於PD-L1的免疫組織化學染色，使用多株抗PD-L1抗體（R&D社）及ultraView DAB kit（Ventana Medical Systems社）。關於檢測的二級抗體，使用HRP標記抗羊抗體。染色使用BenchMark XT auto-stainner（Ventana Medical Systems社）。
CD8的免疫組織化學染色的結果顯示如圖13，PD-L1的免疫組織化學染色的結果顯示如圖14。和載劑對照投予群及各單劑投予群相比，A551-MB110/B379-ml0r和抗小鼠PD-L1抗體的併用群的腫瘤組織的CD8表現及PD-L1表現增加。又，和載劑對照投予群相比，A551-MB110/B379-ml0r的單劑群及抗小鼠PD-L1抗體投予的單劑投予群，腫瘤組織的CD8表現及PD-L1表現增加。 又，使用明視野顯微鏡用病理掃瞄系統（Aperio ScanScope CS2 slide scanner，Leica Biosystems社）、物鏡20倍，進行免疫組織化學染色標本的全組織的高解析度數位影像的捕捉。對於腫瘤中的CD8或PD-L1的免疫組織化學染色陽性細胞的計算，分別使用HALO影像分析軟體（Indica Labs社，v2.3）的分析演算法「Immune Cell v1.3」或「Membrane v1.7」。各組織中的腫瘤領域由病理專家親手註解進行評價。各陽性細胞數以每腫瘤面積（mm2 ）的數量顯示。經數位影像分析的陽性閾值的品質以目視檢查（圖82、83、及84）。
以上結果顯示，經由A551-MB110/B379-ml0r及抗小鼠PD-L1抗體的單劑投予，腫瘤組織的CD8陽性細胞及PD-L1陽性細胞增加。又，經由A551-MB110/B379-ml0r及抗小鼠PD-L1抗體的合併投予，較各單劑投予，顯示腫瘤組織的CD8陽性細胞及PD-L1陽性細胞更增加。推測由於CD8陽性細胞對癌細胞具有細胞毒性，因此經由腫瘤組織中的CD8陽性細胞增加，發揮更強的抗腫瘤效果。此處，PD-L1的表現經IFN-γ等的腫瘤免疫相關基因（參照圖12）所誘導，PD-L1陽性細胞有抑制異常活化的免疫反應的作用。如前述，腫瘤免疫相關基因在A551-MB110/B379-ml0r投予群中顯示上升（實施例6-2，圖12）。因此推測，在A551-MB110/B379-ml0r及抗小鼠PD-L1抗體的併用群中，因抗小鼠PD-L1抗體而阻礙PD-L1的作用，發揮更強的抗腫瘤效果。推測這些現象導致實施例6-1所示的合併投予中的強藥效。
（6-4） 抗CD137抗體單劑或和抗PD-L1抗體合併使用的肝臟作用及腫瘤內作用的評價 （6-4-1） 細胞株及同系腫瘤移植小鼠模式的製作、以及肝臟作用及腫瘤內作用之評價方法 本試驗使用從美國國立癌症研究所授權的小鼠大腸癌細胞株MC38細胞，及hCD137 KI小鼠（記載於參考實施例6-3）。將MC38細胞株移植到小鼠腹部皮下，當腫瘤體積成為約111-200mm3 的時點，建立模式。模式建立後，將MC38細胞株移植小鼠實施分群後，如下表20所示用量，投予A551-MB110/B379-ml0r抗體及抗小鼠PD-L1（BioXcell社，clone 10F.9G2）。A551-MB110/B379-ml0r的投予，在移植11日後及14日後，共計2次經尾靜脈路徑實施。抗小鼠PD-L1抗體的投予，在移植11日後及14日後，共計2次經腹腔內路徑實施。載劑對照使用含有0.05%Tween 20的PBS。
肝臟作用使用第1次投予後4日後所採的血液進行評價。將所得的血液離心，分離血漿。以下列詳述方法，評價血漿中的各種標誌物的測量值。在此等的各指標的評價中，當A551-MB110/B379-ml0r單劑群、抗小鼠PD-L1抗體單劑群、或A551-MB110/B379-ml0r和抗小鼠PD-L1抗體的併用群中顯示肝功能障礙的指標，較載劑對照群為高值時，評價為肝功能受損。
腫瘤內反應以下述方法在第1次投予後4日後，取出腫瘤組織，再實施淋巴球分層的細胞數測量。在此評價中，當A551-MB110/B379-ml0r單劑群、抗小鼠PD-L1抗體單劑群、或A551-MB110/B379-ml0r和抗小鼠PD-L1抗體的併用群的腫瘤組織內的CD8陽性細胞數，較載劑對照群為高值時，評價為促進腫瘤組織內的CD8陽性T細胞的增殖。
［表20］
群 隻數 藥劑 用量 ［mg/kg］ 投予日 投予路徑 採樣日
1 5 載劑對照 （含0.05% Tween 20 的 PBS） - 移植11日後及14日後 尾靜脈及 腹腔内 移植15日後
2 5 A551-MB110/B379-ml0r 2.5 尾靜脈内 移植15日後
載劑對照 （含0.05% Tween 20 的 PBS） - 腹腔内
3 5 載劑對照 （含0.05% Tween 20 的 PBS） - 尾靜脈内 移植15日後
抗小鼠PD-L1抗體 10 腹腔内
4 5 A551-MB110/B379-ml0r 2.5 尾靜脈内 移植15日後
抗小鼠PD-L1抗體 10 腹腔内
（6-4-2）以MC38細胞株移植小鼠的血液檢查的肝功能標誌物值的評價 對於採集的血液，以檢體檢查系統TBA-120FR（Canon Medical Systems）實施肝功能標誌物的測量。 以血液檢查的肝功能標誌物測量的結果，確認A551-MB110/B379-ml0r單劑群及抗小鼠PD-L1抗體單劑投予群、及A551-MB110/B379-ml0r和抗小鼠PD-L1抗體併用群任一者，和載劑投予群相比，皆無AST值及ALT值的變動（圖15）。 由上可知，A551-MB110/B379-ml0r和抗小鼠PD-L1抗體任一者皆不損害肝功能。
（6-4-3）從MC38細胞株移植小鼠的腫瘤組織的取出和淋巴球分層的製作 對於取出的腫瘤組織，實施淋巴球分層的細胞數測量。在淋巴球分層的細胞數測量上，使用以Tumor Dissociation Kit, mouse（Miltenyi Biotec）所得的淋巴球分層。
（6-4-4）來自MC38細胞株移植小鼠的淋巴球分層的評價 使用FCM的淋巴球分層的細胞數的測量結果，確認A551-MB110/B379-ml0r和抗小鼠PD-L1抗體併用群，和載劑投予群相比，腫瘤組織內的CD8陽性T細胞數增加（圖16）。 由上可知，A551-MB110/B379-ml0r及抗小鼠PD-L1抗體的合併使用促進腫瘤內的CD8陽性T細胞的增殖。
實施例7：以使用hCD137 KI小鼠的同系腫瘤細胞移植模式的抗CD137抗體單劑或和抗PD-L1抗體的合併使用的抗腫瘤活性之評價（LLC1/OVA/GPC3 clone C5細胞） 本試驗使用在本公司內建立的小鼠肺癌細胞株LLC1/OVA/GPC3 clone C5細胞株（記載於參考實施例9-4-1），及hCD137 KI小鼠（記載於參考實施例6-3）。將LLC1/OVA/GPC3 clone C5細胞株移植到小鼠皮下，當腫瘤體積成為148-495mm3 的時點進行分群。分群在移植11日後進行。如下表21所示在移植11日後及14日後，在小鼠尾靜脈內投予載劑對照及A551-MB110/B379-ml0r抗體。又如下表21所示在移植11日後及14日後，在小鼠腹腔內投予載劑對照及抗小鼠PD-L1抗體（BioXcell社，clone： 10F.9G2）。使用含有0.05%Tween 20的PBS作為載劑對照。
［表21］
群 隻數 藥劑 用量 （mg/kg） 投予日 投予路徑
1 5 載劑對照 （含0.05% Tween 20 的 PBS） -     移植11日後及14日後 尾靜脈内及 腹腔内
2 5 A551-MB110/B379-ml0r 0.093 尾靜脈内
載劑對照 （含0.05% Tween 20 的 PBS） - 腹腔内
3 5 載劑對照 （含0.05% Tween 20 的 PBS） - 尾靜脈内
抗小鼠PD-L1抗體 10 腹腔内
4 5 A551-MB110/B379-ml0r 0.093 尾靜脈内
抗小鼠PD-L1抗體 10 腹腔内
在移植11日後、14日後、17日後、20日後、25日後、28日後、31日後、35日後，測量腫瘤體積。腫瘤體積（TV）以下列算式計算。 腫瘤體積（mm3 ） ＝ 長徑（mm） × 短徑（mm） × 短徑（mm）/2
結果為，在移植35日後，A551-MB110/B379-ml0r和抗小鼠PD-L1抗體的併用群的平均腫瘤體積為782mm3 ，但A551-MB110/B379-ml0r單劑群的平均腫瘤體積為1812 mm3 （表22）。因此， A551-MB110/B379-ml0r和抗小鼠PD-L1抗體的併用群，相較於A551-MB110/B379-ml0r單劑群或抗小鼠PD-L1抗體單劑群，顯示強的腫瘤增殖抑制作用。特別是，在抗小鼠PD-L1抗體單劑群，相較於載劑對照，儘管幾乎未觀察到腫瘤增殖抑制作用，但是在A551-MB110/B379-ml0r和抗小鼠PD-L1抗體的併用群則顯示高的腫瘤增殖抑制作用（圖17）。由此暗示，對於以PD1及/或PD-L1抑制劑等的免疫檢查點抑制劑的治療不能充分奏效的癌症種類，A551-MB110/B379-ml0r和免疫檢查點抑制劑的合併使用是有效的。
［表22］
投予抗體 用量（mg/kg）     腫瘤移植35日後的腫瘤體積（mm3 ）
A551-MB110/B379-ml0r 0.093 1812
A551-MB110/B379-ml0r 0.093 782
抗小鼠PD-L1抗體 10
實施例8-1：以使用hCD137 KI小鼠的同系腫瘤細胞移植模式的抗CD137抗體單劑或和抗PD-L1抗體合併使用的抗腫瘤活性的評價（C1498細胞） 本試驗使用小鼠AML（急性骨髓性白血病；acute myeloid leukemia） 細胞株C1498細胞（ATCC，ITEM Number: TIB-49），及hCD137 KI小鼠（記載於參考實施例6-3）。將C1498細胞株移植到小鼠皮下，當腫瘤體積成為約173-381mm3 的時點進行分群。分群在移植8日後進行。如下表23所示在移植8日後及12日後，在小鼠尾靜脈內投予載劑對照、A375-mIgG1/B167-ml0r抗體、及抗小鼠PD-L1抗體（BioXcell社，clone 10F.9G2）。使用含有0.05%Tween 20的PBS作為載劑對照。
［表23］
群 隻數 藥劑 用量 （mg/kg） 投予日 投予路徑
1 5 載劑對照 （含0.05% Tween 20 的 PBS） -   移植8日後 及12日後   尾靜脈内
2 5 A375-mIgG1/B167-ml0r 7.5
3 5 抗小鼠 PD-L1抗體 5
4 5 A375-mIgG1/B167-ml0r 7.5
抗小鼠PD-L1抗體 5
在移植8日後、10日後、12日後、15日後，測量腫瘤體積（TV）。 腫瘤體積以下列算式計算。 腫瘤體積（mm3 ） ＝ 長徑（mm） × 短徑（mm） × 短徑（mm）/2 腫瘤增殖抑制率（Tumor growth inhibition，TGI （%））根據下式計算。 腫瘤體積變化（TV change） （mm3 ） ＝ 測量時點的腫瘤體積-分群時的腫瘤體積 TGI （%） ＝ （1- （各群的腫瘤體積變化（TV change）的平均值/載劑對照群的腫瘤體積變化（TV change）的平均值）） × 100
結果為，相較於A375-mIgG1/B167-ml0r單劑群或抗小鼠PD-L1抗體單劑群，A375-mIgG1/B167-ml0r和抗小鼠PD-L1抗體的併用群對C1498細胞，觀察到腫瘤增殖抑制作用的增強。具體為，相對於A375-mIgG1/B167-ml0r單劑群的腫瘤增殖抑制率為62%，A375-mIgG1/B167-ml0r和抗小鼠PD-L1抗體的併用群顯示82%的腫瘤增殖抑制率（圖18，表24）。
［表24］
投予抗體 用量（mg/kg） 腫瘤移植15日後的TGI（%）
A375-mIgG1/B167-ml0r 7.5 62
A375-mIgG1/B167-ml0r 7.5 82
抗小鼠PD-L1抗體 5
實施例8-2：以使用hCD137 KI小鼠的同系腫瘤細胞移植模式的轉換（switch）抗CD137抗體單劑或轉換抗CD137抗體和抗TIGIT抗體合併使用的抗腫瘤活性的評價（C1498細胞） 本試驗使用小鼠AML（急性骨髓性白血病；acute myeloid leukemia） 細胞株C1498細胞（ATCC ITEM Number: TIB-49），及hCD137 KI小鼠（記載於參考實施例6-3）。將C1498細胞株移植到小鼠右腹部皮下，移植7日後進行分群。使用腫瘤體積成為約270-546mm3 的個體，進行分群。在移植7日後，在小鼠尾靜脈內投予載劑及A551-MB110/B379-ml0r抗體。如下表所示，在移植7日後、9日後、11日後、13日後、15日後、及18日後，對小鼠腹腔內投予載劑及抗TIGIT抗體（Clone：1G9；Catalog #：BE0274；BioXcell）。使用含有0.05%Tween 20的PBS作為載劑。
［表86］
群 隻數 藥劑 用量或 每1個體的投予量 投予日 （移植後） 投予路徑
1 5 載劑對照 （含0.05% Tween 20 的 PBS） - 7 尾靜脈内
載劑 - 7, 9, 11, 13, 15, 18 腹腔内
2 5 A551-MB110/B379-ml0r 2.5 mg/kg 7 尾靜脈内
載劑 - 7, 9, 11, 13, 15, 18 腹腔内
3 5 載劑 - 7 尾靜脈内
抗小鼠TIGIT抗體 200 µg/小鼠 7, 9, 11, 13, 15, 18 腹腔内
4 5 A551-MB110/B379-ml0r 2.5 mg/kg 7 尾靜脈内
抗小鼠TIGIT抗體 200 µg/小鼠 7, 9, 11, 13, 15, 18 腹腔内
在移植7日後、9日後、11日後、13日後、15日後、17日後、19日後、22日後、25日後、27日後、29日後、32日後，測量腫瘤體積。根據本公司內的安樂死基準，在腫瘤體積1000mm3 換算為1g、腫瘤體積超過體重的10%的時點，實施各個體的安樂死處理。對於各群，求得全個體存活間的平均腫瘤體積。 腫瘤體積以下列算式計算。 腫瘤體積（mm3 ） ＝ 長徑（mm） × 短徑（mm） × 短徑（mm）/2
結果為，在轉換抗CD137抗體A551-MB110/B379-ml0r單劑、轉換抗CD137抗體A551-MB110/B379-ml0r和抗TIGIT抗體的併用之任一群，皆顯示腫瘤增殖抑制作用。 移植22日後的轉換抗CD137抗體A551-MB110/B379-ml0r單劑的投予群的平均腫瘤體積為1588 mm3 ，在轉換抗CD137抗體A551-MB110/B379-ml0r和抗TIGIT抗體的併用群的平均腫瘤體積為734 mm3 ，顯示轉換抗CD137抗體和抗TIGIT抗體的併用群的腫瘤增殖抑制作用，較轉換抗CD137抗體單劑的投予群的腫瘤增殖抑制作用強的傾向（圖105）。
實施例9：以使用hCD137 KI小鼠的同系腫瘤細胞移植模式的抗CD137抗體單劑或和抗PD-L1抗體合併使用的抗腫瘤活性的評價（AE17細胞） 本試驗使用小鼠惡性間皮瘤AE17細胞（DS Pharma Biomedical），及hCD137 KI小鼠（記載於參考實施例6-3）。在活體（in vivo）繼代培養的AE17腫瘤移植到小鼠皮下，在腫瘤體積成為70-306mm3 的時點，進行分群。移植9日後進行分群。如下表25所示在移植9日後及12日後，在小鼠尾靜脈內投予載劑對照、A375-mIgG1/B167-ml0r抗體、及抗小鼠PD-L1抗體（BioXcell社，clone 10F.9G2）。使用含有0.05%Tween 20的PBS作為載劑對照。
［表25］
群 隻數 藥劑 用量 （mg/kg） 投予日 投予路徑
1 5 載劑對照 （含0.05% Tween 20 的 PBS） -   移植9日後 及12日後   尾靜脈内
2 5 A375-mIgG1/B167-ml0r 7.5
3 5 抗小鼠 PD-L1抗體 5
4 5 A375-mIgG1/B167-ml0r 7.5
抗小鼠 PD-L1抗體 5
在移植9日後、12日後、15日後、19日後，測量腫瘤體積。 腫瘤體積（TV）以下列算式計算。 腫瘤體積（mm3 ） ＝ 長徑（mm） × 短徑（mm） × 短徑（mm）/2 腫瘤增殖抑制率（Tumor growth inhibition，TGI （%））根據下式計算。 腫瘤體積變化（TV change） （mm3 ） ＝ 測量時點的腫瘤體積-分群時的腫瘤體積 TGI （%） ＝ （1- （各群的腫瘤體積變化（TV change）的平均值/載劑對照群的腫瘤體積變化（TV change）的平均值）） × 100
結果為，相較於A375-mIgG1/B167-ml0r單劑群或抗小鼠PD-L1抗體單劑群，A375-mIgG1/B167-ml0r和抗小鼠PD-L1抗體的併用群對AE17細胞，觀察到腫瘤增殖抑制作用的增強。具體為，相對於A375-mIgG1/B167-ml0r單劑群的腫瘤增殖抑制率為39%，A375-mIgG1/B167-ml0r和抗小鼠PD-L1抗體的併用群顯示60%的腫瘤增殖抑制率（圖19，表26）。
［表26］
投予抗體 用量（mg/kg） 腫瘤移植19日後的TGI（%）
A375-mIgG1/B167-ml0r 7.5 39
A375-mIgG1/B167-ml0r 7.5 60
抗小鼠PD-L1抗體 5
實施例10：以使用hCD137 KI小鼠的同系腫瘤細胞移植模式的抗CD137抗體單劑或和抗hGPC3-mCD抗體合併使用的評價（LLC1/hGPC3細胞） （10-1）細胞株及同系腫瘤移植小鼠模式的製作、以及A551-MB110/B379-ml0r（單劑或併用）的抗腫瘤活性的評價 本試驗使用在本公司內建立的小鼠肺癌細胞株LLC1/hGPC3細胞（Science Translational Medicine 04 Oct 2017, Vol. 9, Issue 410, eaal4291），及hCD137 KI小鼠（記載於參考實施例6-3）。將LLC1/hGPC3細胞株移植到小鼠腹部皮下，當腫瘤體積成為約287mm3 的時點進行分群。分群在移植11日後進行。如下表27所示，在移植11日後，在小鼠尾靜脈內投予載劑對照、A551-MB110/B379-ml0r抗體、及抗hGPC3-mCD3抗體（和人類GPC3及小鼠CD3結合的雙特異性抗體）。使用含有0.05%Tween 20的PBS作為載劑對照。
［表27］
群 隻數 藥劑 用量 （mg/kg） 投予日 投予路徑
1 5 載劑對照 （含0.05% Tween 20 的 PBS） -   移植11日後   尾靜脈内
2 5 A551-MB110/B379-ml0r抗體 2.5
3 5 抗hGPC3-mCD3抗體 1.0
4 5 A551-MB110/B379-ml0r抗體 2.5
抗hGPC3-mCD3抗體 1.0
在移植11日後、14日後、17日後、21日後，測量腫瘤體積（TV）。 腫瘤體積以下列算式計算。 腫瘤體積（mm3 ） ＝ 長徑（mm） × 短徑（mm） × 短徑（mm）/2
結果如圖20所示。在移植後21日，載劑對照群的平均腫瘤體積為2393mm3 。抗hGPC3-mCD3抗體單劑群、A551-MB110/B379-ml0r抗體單劑群、抗hGPC3-mCD3抗體及A551-MB110/B379-ml0r抗體併用群的平均腫瘤體積，分別為1592mm3 、1340mm3 、35mm3 。和載劑對照群相比，A551-MB110/B379-ml0r抗體單劑群、及抗hGPC3-mCD3抗體單劑群皆為平均腫瘤體積的低值。而且，和A551-MB110/B379-ml0r抗體單劑群、及抗hGPC3-mCD3抗體單劑群相比，抗hGPC3-mCD3抗體及A551-MB110/B379-ml0r併用群的平均腫瘤體積大幅減小。 由上述可知，抗hGPC3-mCD3抗體和A551-MB110/B379-ml0r的合併使用，對LLC1/hGPC3荷瘤人類CD137基因置入小鼠，顯示加乘的增強抗腫瘤作用。
（10-2）細胞株及同系腫瘤移植小鼠模式的製作、以及腫瘤內反應的評價方法 本試驗使用在本公司內建立的小鼠肺癌細胞株LLC1/hGPC3細胞（Science Translational Medicine 04 Oct 2017, Vol. 9, Issue 410, eaal4291），及hCD137 KI小鼠（記載於參考實施例6-3）。將LLC1/hGPC3細胞株移植到小鼠腹部皮下，當腫瘤體積成為約230mm3 的時點進行分群。分群在移植10日後進行。如下表28所示，在移植10日後，在小鼠尾靜脈內投予載劑對照、A551-MB110/B379-ml0r抗體、及抗hGPC3-mCD3抗體（和人類GPC3及小鼠CD3結合的雙特異性抗體）。使用含有0.05%Tween 20的PBS作為載劑對照。
［表28］
群 隻數 藥劑 用量 （mg/kg） 投予日 投予路徑
1 3 載劑對照 （含0.05% Tween 20 的 PBS） -   移植10日後   尾靜脈内
2 3 A551-MB110/B379-ml0r抗體 2.5
3 3 抗hGPC3-mCD3抗體 1.0
4 3 A551-MB110/B379-ml0r抗體 2.5
抗hGPC3-mCD3抗體 1.0
用於上述分群的腫瘤體積，以下列算式計算。 腫瘤體積（mm3 ） ＝ 長徑（mm） × 短徑（mm） × 短徑（mm）/2
在移植後13日，採樣腫瘤。採樣的腫瘤浸漬於RNA-later（QIAGEN）保存。使用RNeasy Mini kit（QIAGEN）從腫瘤樣本萃取total RNA。使用nCounter Pancancer Mouse Immune Profiling Panel （NanoString Technologies） 及nCounter Digital analyser （NanoString Technologies）測量total RNA的基因表現量。
測量的基因表現量使用nSolver（NanoString Technologies） 及Microsoft Excel 2013（Microsoft corporation）分析。在測量表現量的基因中，將T細胞的細胞毒性有關的Cd3e、Cd8b1、Gzmb、Prf1、Ifng的表現量作圖（圖21）。和載劑對照群相比，A551-MB110/B379-ml0r及抗hGPC3-mCD3抗體併用群在Cd3e、Cd8b1、Gzmb、Prf1基因中表現量增加（Dunnet檢定，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001））。和載劑對照群相比，A551-MB110/B379-ml0r及抗hGPC3-mCD3抗體併用群在Ifng也有表現量增加的傾向。和A551-MB110/B379-ml0r抗體單劑群、抗hGPC3-mCD3抗體單劑群相比，A551-MB110/B379-ml0r及抗hGPC3-mCD3抗體併用群在任一個基因皆有表現量增加的傾向。又，和載劑相比，各單劑群的細胞毒性相關基因的表現量有增加的傾向。 由上述顯示，在本試驗條件下，A551-MB110/B379-ml0r及抗hGPC3-mCD3抗體的合併使用，對LLC1/hGPC3荷瘤人類CD137基因置入小鼠，引發強的腫瘤內反應。
實施例11：以使用hCD137 KI小鼠的同系腫瘤細胞移植模式的抗CD137抗體的抗腫瘤活性的評價（乳癌細胞株） 本試驗中使用一般可購得或建立的乳癌細胞株，及hCD137 KI（Knock-In）小鼠。將乳癌細胞株移植到小鼠，在腫瘤體積達到一定程度的時間點進行分群。之後投予小鼠抗CD137抗體及載劑。
移植後複數次測量腫瘤體積。當抗CD137抗體投予群顯示較載劑投予群高的腫瘤增殖抑制率時，可評價為抗CD137抗體對該乳癌細胞株具有抗腫瘤活性。
實施例12：以使用hCD137 KI小鼠的同系腫瘤細胞移植模式的抗CD137抗體單劑或和抗PD-L1抗體的合併療法的評價（乳癌細胞株） 本試驗中使用一般可購得或建立的乳癌細胞株，及hCD137 KI小鼠。將乳癌細胞株移植到小鼠，在腫瘤體積達到一定程度的時間點進行分群。之後分別投予抗CD137抗體單劑、抗PD-L1抗體單劑、抗CD137抗體和抗PD-L1抗體的合併使用、載劑至小鼠。
移植後複數次測量腫瘤體積。當抗CD137抗體投予群顯示較載劑投予群高的腫瘤增殖抑制率時，可評價為抗CD137抗體對該乳癌細胞株具有抗腫瘤活性。又在抗CD137抗體和抗PD-L1抗體的併用投予群顯示較任何單劑投予群高的腫瘤增殖抑制率時，可評價為經由合併使用而有腫瘤增殖抑制作用加乘或相加的增強。
實施例13：以使用hCD137 KI小鼠的同系腫瘤細胞移植模式的抗CD137抗體單劑、或和抗PD-L1抗體及/或抗TIGIT抗體的合併療法的評價（乳癌細胞株） 本試驗中使用一般可購得或建立的乳癌細胞株，及hCD137 KI小鼠。將乳癌細胞株移植到小鼠，在腫瘤體積達到一定程度的時間點進行分群。之後分別投予小鼠（1）抗CD137抗體單劑、（2）抗PD-L1抗體單劑、（3）抗CD137抗體及抗PD-L1抗體的二劑併用、（4）抗CD137抗體及抗TIGIT抗體的二劑併用、（5）抗CD137抗體、抗PD-L1抗體及抗TIGIT抗體的三劑併用、（6）載劑之任一者。
移植後複數次測量腫瘤體積。當抗CD137抗體投予群顯示較載劑投予群高的腫瘤增殖抑制率時，可評價為抗CD137抗體對該乳癌細胞株具有抗腫瘤活性。又在抗CD137抗體和抗PD-L1抗體的二劑併用投予群、或抗CD137抗體及抗TIGIT抗體的二劑併用投予群，顯示較此等的單劑投予群高的腫瘤增殖抑制率時，可評價為經由合併使用而有腫瘤增殖抑制作用加乘或相加的增強。再者，在抗CD137抗體、抗PD-L1抗體及抗TIGIT抗體的三劑併用群，顯示較上述單劑群或二劑併用群高的腫瘤增殖抑制率時，可評價為經由三劑合併使用而有腫瘤增殖抑制作用加乘或相加的增強。
實施例14：以使用hCD137 KI小鼠的同系腫瘤細胞移植模式的抗CD137抗體單劑、或和抗PD-L1抗體及/或抗TIGIT抗體的合併療法的評價（肺癌細胞株） 本試驗中使用一般可購得或建立的肺癌細胞株，及hCD137 KI小鼠。將肺癌細胞株移植到小鼠，在腫瘤體積達到一定程度的時間點進行分群。之後分別投予小鼠（1）抗CD137抗體單劑、（2）抗PD-L1抗體單劑、（3）抗CD137抗體及抗PD-L1抗體的二劑併用、（4）抗CD137抗體及抗TIGIT抗體的二劑併用、（5）抗CD137抗體、抗PD-L1抗體及抗TIGIT抗體的三劑併用、（6）載劑之任一者。
移植後複數次測量腫瘤體積。當抗CD137抗體投予群顯示較載劑投予群高的腫瘤增殖抑制率時，可評價為抗CD137抗體對該肺癌細胞株具有抗腫瘤活性。又在抗CD137抗體和抗PD-L1抗體的二劑併用投予群、或抗CD137抗體及抗TIGIT抗體的二劑併用投予群，顯示較此等的單劑投予群高的腫瘤增殖抑制率時，可評價為經由合併使用而有腫瘤增殖抑制作用加乘或相加的增強。再者，在抗CD137抗體、抗PD-L1抗體及抗TIGIT抗體的三劑併用群，顯示較上述單劑群或二劑併用群高的腫瘤增殖抑制率時，可評價為經由三劑合併使用而有腫瘤增殖抑制作用加乘或相加的增強。
實施例15：以使用hCD137 KI小鼠的同系腫瘤細胞移植模式的抗CD137抗體單劑、或和抗PD-L1抗體及/或抗TIGIT抗體的合併療法的評價（黑色素瘤細胞株） 本試驗中使用一般可購得或建立的黑色素瘤細胞株，及hCD137 KI小鼠。將黑色素瘤癌細胞株移植到小鼠，在腫瘤體積達到一定程度的時點進行分群。之後分別投予小鼠（1）抗CD137抗體單劑、（2）抗PD-L1抗體單劑、（3）抗CD137抗體及抗PD-L1抗體的二劑併用、（4）抗CD137抗體及抗TIGIT抗體的二劑併用、（5）抗CD137抗體、抗PD-L1抗體及抗TIGIT抗體的三劑併用、（6）載劑之任一者。
移植後複數次測量腫瘤體積。當抗CD137抗體投予群顯示較載劑投予群高的腫瘤增殖抑制率時，可評價為抗CD137抗體對該黑色素瘤細胞株具有抗腫瘤活性。又在抗CD137抗體和抗PD-L1抗體的二劑併用投予群、或抗CD137抗體及抗TIGIT抗體的二劑併用投予群，顯示較此等的單劑投予群高的腫瘤增殖抑制率時，可評價為經由合併使用而有腫瘤增殖抑制作用加乘或相加的增強。再者，在抗CD137抗體、抗PD-L1抗體及抗TIGIT抗體的三劑併用群，顯示較上述單劑群或二劑併用群高的腫瘤增殖抑制率時，可評價為經由三劑合併使用而有腫瘤增殖抑制作用加乘或相加的增強。
實施例16：以使用hCD137 KI小鼠的同系腫瘤細胞移植模式的抗CD137抗體單劑、或和抗TIGIT抗體的合併療法的評價（大腸癌細胞株） 本試驗中使用一般可購得或建立的大腸癌細胞株，及hCD137 KI小鼠。將大腸癌細胞株移植到小鼠，在腫瘤體積達到一定程度的時點進行分群。之後分別投予小鼠抗CD137抗體單劑、抗TIGIT抗體單劑、抗CD137抗體及抗TIGIT抗體的合併使用、載劑之任一者。
移植後複數次測量腫瘤體積。當抗CD137抗體投予群顯示較載劑投予群高的腫瘤增殖抑制率時，可評價為抗CD137抗體對該大腸癌細胞株具有抗腫瘤活性。又在抗CD137抗體及抗TIGIT抗體的併用投予群，顯示較任一單劑投予群高的腫瘤增殖抑制率時，可評價為經由合併使用而有腫瘤增殖抑制作用加乘或相加的增強。
實施例17：以使用hCD137 KI小鼠的同系腫瘤細胞移植模式的抗CD137抗體單劑、或和抗PD-L1抗體及/或抗TIGIT抗體的合併療法的評價（JAK1剔除癌細胞株） 本試驗中使用一般可購得或建立的JAK1剔除（knock-out）癌細胞株，及hCD137 KI小鼠。將JAK1剔除癌細胞株移植到小鼠，在腫瘤體積達到一定程度的時點進行分群。之後分別投予小鼠（1）抗CD137抗體單劑、（2）抗PD-L1抗體單劑、（3）抗CD137抗體及抗PD-L1抗體的二劑併用、（4）抗CD137抗體及抗TIGIT抗體的二劑併用、（5）抗CD137抗體、抗PD-L1抗體及抗TIGIT抗體的三劑併用、（6）載劑之任一者。
移植後複數次測量腫瘤體積。當抗CD137抗體投予群顯示較載劑投予群高的腫瘤增殖抑制率時，可評價為抗CD137抗體對該JAK1剔除癌細胞株具有抗腫瘤活性。又在抗CD137抗體和抗PD-L1抗體的二劑併用投予群、或抗CD137抗體及抗TIGIT抗體的二劑併用投予群，顯示較此等的單劑投予群高的腫瘤增殖抑制率時，可評價為經由合併使用而有腫瘤增殖抑制作用加乘或相加的增強。再者，在抗CD137抗體、抗PD-L1抗體及抗TIGIT抗體的三劑併用群，顯示較上述單劑群或二劑併用群高的腫瘤增殖抑制率時，可評價為經由三劑合併使用而有腫瘤增殖抑制作用加乘或相加的增強。
實施例18-1：以使用hCD137 KI小鼠的同系腫瘤細胞移植模式的抗CD137抗體單劑、或和抗PD-L1抗體及/或抗TIGIT抗體的合併療法的評價（B2M剔除癌細胞株） 本試驗中使用一般可購得或建立的B2M剔除癌細胞株，及hCD137 KI小鼠。將B2M剔除癌細胞株移植到小鼠，在腫瘤體積達到一定程度的時點進行分群。之後分別投予小鼠（1）抗CD137抗體單劑、（2）抗PD-L1抗體單劑、（3）抗CD137抗體及抗PD-L1抗體的二劑併用、（4）抗CD137抗體及抗TIGIT抗體的二劑併用、（5）抗CD137抗體、抗PD-L1抗體及抗TIGIT抗體的三劑併用、（6）載劑之任一者。
移植後複數次測量腫瘤體積。當抗CD137抗體投予群顯示較載劑投予群高的腫瘤增殖抑制率時，可評價為抗CD137抗體對該B2M剔除癌細胞株具有抗腫瘤活性。又在抗CD137抗體和抗PD-L1抗體的二劑併用投予群、或抗CD137抗體及抗TIGIT抗體的二劑併用投予群，顯示較此等的單劑投予群高的腫瘤增殖抑制率時，可評價為經由合併使用而有腫瘤增殖抑制作用加乘或相加的增強。再者，在抗CD137抗體、抗PD-L1抗體及抗TIGIT抗體的三劑併用群，顯示較上述單劑群或二劑併用群高的腫瘤增殖抑制率時，可評價為經由三劑合併使用而有腫瘤增殖抑制作用加乘或相加的增強。
實施例18-2：以使用hCD137 KI小鼠的同系腫瘤細胞移植模式的轉換抗CD137抗體的抗腫瘤活性的評價 （18-2-1）腫瘤細胞株及同系腫瘤移植小鼠模式的製作，以及抗腫瘤活性的評價方法 已知在β2微球蛋白（B2M）基因具有變異（b2m變異）的腫瘤，對於以抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體等的治療具有抗藥性（Sharma P., et al., Cell. 168,（9）, 707-23 2017；及Zaretsky JM. et al., N Engl J Med. 375（9）: 819-29. 2016）。 本試驗使用本公司內建立的β2微球蛋白（B2M）基因剔除的小鼠大腸癌細胞株MC38-hGPC3#G64 B2M KO clone5細胞，及hCD137KI小鼠（記載於參考實施例6-3）。將MC38-hGPC3#G64 B2M KO clone5細胞株移植到小鼠右側腹部皮下，移植14日後進行分群。使用腫瘤體積成為111-228mm3 的個體，進行分群。在移植14日後及21日後，在小鼠尾靜脈內投予轉換抗CD137抗體A551-MB110/B379-ml0r。使用含有0.05%Tween 20的PBS作為載劑。
［表87］
群 隻數 藥劑 用量 （mg/kg） 投予日 投予路徑
1 5 載劑對照 （含0.05% Tween 20 的 PBS） - 移植14日後及21日後 尾靜脈内
2 5 A551-MB110/B379-ml0r 2.5
在移植14日後、17日後、21日後、24日後、27日後、31日後，測量腫瘤體積。 腫瘤體積以下列算式計算。 腫瘤體積（mm3 ） ＝ 長徑（mm） × 短徑（mm） × 短徑（mm）/2
腫瘤增殖抑制率（Tumor growth inhibition，TGI （%））根據下式計算。 腫瘤體積變化（TV change） （mm3 ） ＝ 測量時點的腫瘤體積-分群時的腫瘤體積 TGI （%） ＝ （1- （各群的腫瘤體積變化（TV change）的平均值/載劑對照群的腫瘤體積變化（TV change）的平均值）） × 100
結果為，轉換抗CD137抗體A551-MB110/B379-ml0r對MC38-hGPC3#G64 B2M KO clone5細胞，和對照相比，在整個腫瘤移植後的全期間顯示腫瘤增殖抑制效果，在腫瘤移植31日後顯示29%的腫瘤增殖抑制率（圖106）。 本案發明之CD137轉換抗體，對於已知具有對以抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體等的治療有抗藥性的b2m變異的腫瘤，也顯示具有極顯著的抗腫瘤活性。
實施例19：以使用hCD137 KI小鼠的同系腫瘤細胞移植模式的抗CD137抗體單劑、或和抗PD-L1抗體合併使用的抗腫瘤活性的評價（MC38細胞）
（19-1）腫瘤細胞株及同系腫瘤移植小鼠模式的製作，以及A551-MB110/B379-ml0r及UreH-MB110/UreL-mk1（單劑或和抗小鼠PD-L1抗體的合併使用）的抗腫瘤活性的評價 本試驗使用美國國立癌症研究所授權的小鼠大腸癌細胞株MC38細胞，及hCD137 KI小鼠（記載於參考實施例6-3）。將MC38細胞株移植到小鼠腹部皮下，在腫瘤體積成為約106-200mm3 的時點，建立模式。模式建立後，將MC38細胞株移植小鼠實施分群之後，以表77所示用量，投予轉換抗體A551-MB110/B379-ml0r或非轉換抗體UreH-MB110/UreL-mk1（陽性對照）、及/或抗小鼠PD-L1抗體（BioXcell社，clone 10F.9G2）。轉換抗體A551-MB110/B379-ml0r或非轉換抗體UreH-MB110/UreL-mk1的投予，在移植11日後及14日後共計2次經尾靜脈路徑實施。抗小鼠PD-L1抗體的投予，在移植11日後及14日後共計2次經腹腔內路徑實施。使用含有0.05%Tween 20的PBS作為載劑對照。 又，作為陽性對照使用的非轉換抗體UreH-MB110/UreL-mk1為具有以公知的抗CD137抗體Urelumab（CAS編號：934823-49-1）的可變區域作為可變區域，以WO2014030750記載的MB110 （序列識別號：145）作為重鏈恆定區域，以具有小鼠κ鎖mk1［和小鼠κ鎖mk0 （序列識別號：147）相同胺基酸序列］為輕鏈恆定區域的非轉換CD137抗體。
［表77］
群 隻數 藥劑 用量 （mg/kg） 投予日 投予路徑
1 8 載劑對照 （含0.05% Tween 20 的 PBS） - 移植11日後及14日後 尾靜脈内
載劑 - 腹腔內
2 8 A551-MB110/B379-ml0r 2.5 尾靜脈内
載劑 - 腹腔內
3 8 UreH-MB110/UreL-mk1 7.5 尾靜脈内
載劑 - 腹腔內
4 8 載劑 - 尾靜脈内
抗小鼠PD-L1抗體 10 腹腔內
5 8 A551-MB110/B379-ml0r 2.5 尾靜脈内
抗小鼠PD-L1抗體 10 腹腔內
6 8 UreH-MB110/UreL-mk1 7.5 尾靜脈内
抗小鼠PD-L1抗體 10 腹腔內
在移植10日後、14日後、18日後、22日後、25日後、29日後、32日後，測量腫瘤體積及體重。 腫瘤體積（TV）以下列算式計算。 腫瘤體積（mm3 ） ＝ 長徑（mm） × 短徑（mm） × 短徑（mm）/2
腫瘤增殖抑制率（Tumor growth inhibition，TGI （%））根據下式計算。 腫瘤體積變化（TV change） （mm3 ） ＝ 移植32日後的時點的腫瘤體積-分群時的腫瘤體積 TGI （%） ＝ （1- （各群的腫瘤體積變化（TV change）的平均值/載劑對照群的腫瘤體積變化（TV change）的平均值）） × 100
結果為，相較於載劑群，轉換抗體A551-MB110/B379-ml0r的單劑投予群、轉換抗體A551-MB110/B379-ml0r和抗小鼠PD-L1抗體的併用群、以及非轉換抗體UreH-MB110/UreL-mk1和抗小鼠PD-L1抗體的併用群，對MC38細胞顯示顯著的腫瘤增殖抑制效果，腫瘤增殖抑制率分別為78%、109%、81%（圖85，表78）。因此，轉換抗體A551-MB110/B379-ml0r和抗小鼠PD-L1抗體的併用群，顯示具有和非轉換抗體UreH-MB110/UreL-mk1和抗小鼠PD-L1抗體的併用群相同程度以上的抗腫瘤效果。
［表78］ 在移植32日後的時點的腫瘤增殖抑制率（Tumor growth inhibition）
  載劑對照 （含0.05% Tween 20 的 PBS） A551-MB110/ B379-ml0r UreH-MB110/ UreL-mk1 抗小鼠PD-L1抗體 A551-MB110/ B379-ml0r+ 抗小鼠PD-L1抗體 UreH-MB110/ UreL-mk1+ 抗小鼠PD-L1抗體
腫瘤增殖抑制率（TGI） - 78 77 63 109 81
實施例20：以使用hCD137 KI小鼠的同系腫瘤細胞移植模式的抗CD137抗體單劑、或和抗PD-L1抗體合併使用的全身性作用的評價 （20-1）腫瘤細胞株及同系腫瘤移植小鼠模式的製作，以及腫瘤內作用的評價方法 本試驗使用美國國立癌症研究所授權的小鼠大腸癌細胞株MC38細胞，及hCD137 KI小鼠（記載於參考實施例6-3）。將MC38細胞株移植到小鼠腹部皮下，在腫瘤體積成為約200mm3 的時點，建立模式。模式建立後，MC38細胞株移植小鼠實施分群之後，以表79所示用量，投予轉換抗體A551-MB110/B379-ml0r及抗小鼠PD-L1抗體（BioXcell社，clone 10F.9G2）。投予非轉換抗CD137抗體之UreH-MB110/UreL-mk1（如上）及抗小鼠PD-L1抗體作為陽性對照物質。 轉換抗體A551-MB110/B379-ml0r或非轉換抗體UreH-MB110/UreL-mk1的投予，在移植15日後及18日後共計2次經尾靜脈路徑實施。抗小鼠PD-L1抗體的投予，在移植15日後及18日後共計2次經腹腔內路徑實施。使用含有0.05%Tween 20的PBS作為載劑對照。
（20-2）從MC38細胞株移植小鼠取出脾臟、腫瘤所屬淋巴結（DLN）、肝臟，以及淋巴球分層的製作及末梢血液的採血 關於末梢血液，實施從下大靜脈採血，獲得血液。對於取出的脾臟、腫瘤所屬淋巴結、肝臟，實施淋巴球分層分離。關於取出的脾臟、腫瘤所屬淋巴結，在進行淋巴球分層分離之前，測量臟器重量。關於脾臟、腫瘤所屬淋巴結，淋巴球分層使用組織破碎後、使用細胞過濾器（cell strainer）所得的淋巴球分層。關於肝臟，淋巴球分層使用Liver Dissociation Kit, mouse（Miltenyi Biotec）、組織破碎後、使用細胞過濾器所得的淋巴球分層。所得的末梢血液經血球分析裝置分析，來自所得脾臟、腫瘤所屬淋巴結、及肝臟的淋巴球分層，進行流式細胞技術（FCM）分析。
［表79］
群 隻數 藥劑 用量 ［mg/kg］ 投予日 投予路徑 採樣日
1 5 載劑對照 （含0.5% Tween 20 的 PBS） -   移植15日後及18日後 尾靜脈内及 腹腔內           移植19日後
2 5 A551-MB110/B379-ml0r 2.5 尾靜脈内
3 5 UreH-MB110/UreL-mk1 7.5 尾靜脈内
4 5 抗小鼠PD-L1抗體 10 腹腔內
5 5 A551-MB110/B379-ml0r 2.5 尾靜脈内
抗小鼠PD-L1抗體 10 腹腔內
6 5 UreH-MB110/UreL-mk1 7.5 尾靜脈内
抗小鼠PD-L1抗體 10 腹腔內
（20-3）經由MC38細胞株移植小鼠的血液檢查之血液參數值評價 對於採集的血液，以檢體檢查系統XT-2000iV （Sysmex corp.），實施血液參數的測量。 經由血液檢查的血液參數測量結果，未確認到在A551-MB110/B379-ml0r單劑群中，白血球濃度、血小板濃度、及淋巴球濃度的變動。確認到在抗小鼠PD-L1抗體單劑群中，白血球濃度及淋巴球濃度有輕度的變動，相對地，確認到在A551-MB110/B379-ml0r和抗小鼠PD-L1抗體的併用群，有和抗小鼠PD-L1抗體單劑群相同程度的白血球濃度及淋巴球濃度的輕度變動（圖86）。 另一方面，在UreH-MB110/UreL-mk1單劑群中，白血球濃度及淋巴球濃度大幅下降（圖86）。進而，在UreH-MB110/UreL-mk1和抗小鼠PD-L1抗體的併用群，除了大幅的白血球濃度及淋巴球濃度的下降外，血小板濃度也下降（圖86）。 由上述可知，和UreH-MB110/UreL-mk1相比、A551-MB110/B379-ml0r即使是和抗小鼠PD-L1抗體合併使用時，也不會引發血液參數的變動，對末梢血液的作用極為有限。
（20-4） MC38細胞株移植小鼠的臟器重量測量及以流式細胞技術（FCM）分析的免疫細胞活化評價 脾臟及腫瘤所屬淋巴結（DLN）的臟器重量評價結果，在A551-MB110/B379-ml0r單劑群、抗小鼠PD-L1抗體單劑群、及A551-MB110/B379-ml0r和抗小鼠PD-L1抗體的併用群，各臟器的臟器重量沒有增加（圖87）。 另一方面，在UreH-MB110/UreL-mk1單劑群中，各臟器的臟器重量增加。又，在UreH-MB110/UreL-mk1和抗小鼠PD-L1抗體的併用群，和UreH-MB110/UreL-mk1單劑群相比，有更顯著的各臟器的臟器重量的增加（圖87）。
接著，對於來自脾臟、腫瘤所屬淋巴結、及肝臟的T細胞活化，使用FCM進行分析。在經由FCM的免疫細胞活化評價中，使用在CD8陽性T細胞中活化標誌物的表現比例、在CD4陽性T細胞中Foxp3陽性調節T細胞的增加比例、以及在CD45陽性細胞中Foxp3陽性調節T細胞的增加比例。在CD8陽性T細胞中活化標誌物使用KLRG-1、ICOS、PD-1、LAG-3。在FCM分析，使用抗CD45抗體（BD Biosciences）、抗CD3抗體（BioLegend）、抗CD8抗體（BioLegend）、抗CD4抗體（BioLegend） 、抗KLRG-1抗體（BD Biosciences）、抗ICOS抗體（BioLegend）、抗PD-1抗體（BioLegend）、抗LAG-3抗體（BD Biosciences）、及抗Foxp3抗體（BD Biosciences）。測量使用BD LSRFortessa X-20 （BDBiosciences）。
在脾臟的評價結果，在CD8陽性T細胞中的KLRG-1、ICOS、PD-1、LAG-3的表現比例、及在CD45陽性細胞中各活化標誌物陽性CD8陽性T細胞的比例、以及在CD4陽性T細胞中Foxp3陽性調節T細胞的比例及在CD45陽性細胞中Foxp3陽性調節T細胞的比例的任一者，A551-MB110/B379-ml0r和抗小鼠PD-L1抗體併用群相較於UreH-MB110/UreL-mk1和抗小鼠PD-L1抗體併用群，皆沒有顯著的增加（圖88、89）。
在腫瘤所屬淋巴結的評價結果，在CD8陽性T細胞中的KLRG-1、ICOS、PD-1、LAG-3的表現比例及其絕對數、以及在CD4陽性T細胞中Foxp3陽性調節T細胞的比例及其絕對數的任一者，A551-MB110/B379-ml0r和抗小鼠PD-L1抗體併用群相較於UreH-MB110/UreL-mk1和抗小鼠PD-L1抗體併用群，皆沒有顯著的增加（圖90、91）。
在肝臟的評價結果，在CD8陽性T細胞中的KLRG-1、ICOS、PD-1、LAG-3的表現比例、及在CD45陽性細胞中各活化標誌物陽性CD8陽性T細胞的比例、以及在CD4陽性T細胞中Foxp3陽性調節T細胞的比例及在CD45陽性細胞中的Foxp3陽性調節T細胞的比例的任一者，A551-MB110/B379-ml0r和抗小鼠PD-L1抗體併用群相較於UreH-MB110/UreL-mk1和抗小鼠PD-L1抗體併用群，皆沒有顯著的增加（圖92、93）。
由上述可知，轉換抗體A551-MB110/B379-ml0r和非轉換抗體UreH-MB110/UreL-mk1相比，即使是和抗小鼠PD-L1抗體合併使用時，儘管顯示同等的腫瘤增殖抑制效果，但是對於正常臟器之末梢血液、脾臟、腫瘤所屬淋巴結、及肝臟中的免疫細胞的作用極為有限。
實施例21：抗CD137抗體的組織分布評價 （21-1） 腫瘤細胞株及同系腫瘤移植小鼠模式的製作，以及抗體組織分布的評價方法 本試驗使用美國國立癌症研究所授權的小鼠大腸癌細胞株MC38細胞，及hCD137 KI小鼠（記載於參考實施例6-3）。將MC38細胞株移植到小鼠腹部皮下，在腫瘤體積成為約200mm3 的時點建立模式。模式建立後，MC38細胞株移植小鼠實施分群之後，以表80所示用量，投予Alexa488標記的A551-MB110/B379-ml0r。投予Alexa488標記的IC17HdK-MB110/IC17L-mk作為陰性對照物質。投予非轉換抗CD137抗體之Alexa488標記的UreH-MB110/UreL-mk1作為陽性對照物質。各抗體的Alexa488標記使用Alexa Fluor 488 Antibody Labeling Kit （ThermoFisher Scientific）。Alexa488標記的IC17HdK-MB110/IC17L-mk或Alexa488標記的A551-MB110/B379-ml0r或Alexa488標記的UreH-MB110/UreL-mk1的投予，在移植14日後共計1次由尾靜脈路徑實施。
（21-2）從MC38細胞株移植小鼠取出腫瘤、脾臟、及肝臟，以及淋巴球分層的製作 對於取出的腫瘤、脾臟、及肝臟，實施淋巴球分層分離。關於脾臟，使用組織破碎後、使用細胞過濾器（cell strainer）所得的淋巴球分層。關於腫瘤或肝臟，使用Tumor Dissociation Kit, mouse（Miltenyi Biotec）或Liver Dissociation Kit, mouse（Miltenyi Biotec）、組織破碎後、使用細胞過濾器所得的淋巴球分層。來自所得的腫瘤、肝臟、及脾臟的淋巴球分層，進行流式細胞技術（FCM）分析。
［表80］
群 隻數 藥劑 用量 ［mg/kg］ 投予日 投予路徑 取出日
1 4 Alexa488標記的IC17HdK-MB110/IC17L-mk 2.5 移植14日後 尾靜脈内     移植15日後
2 4 Alexa488標記的A551-MB110/B379-ml0r 2.5 尾靜脈内
3 4 Alexa488標記的UreH-MB110/UreL-mk1 2.5 尾靜脈内
（21-3） MC38細胞株移植小鼠之以流式細胞技術（FCM）分析的抗體組織分布評價 對於結合於來自腫瘤、脾臟、及肝臟的淋巴球分層的各Alexa488標記抗體，使用FCM進行分析。關於以FCM的評價，使用CD8陽性T細胞中的Alexa488的表現比例。在FCM的分析，使用抗CD45抗體（BD Biosciences）、抗CD3抗體（BioLegend）、 抗CD8抗體（BioLegend） 、抗CD19抗體（Biolegend）、抗CD11b抗體（Biolegend）。測量使用BD LSRFortessa X-20 （BD Biosciences）。 和浸潤於腫瘤的CD8陽性T細胞結合的各Alexa488標記抗體的評價結果，相較於Alexa488標記的IC17HdK-MB110/IC17L-mk投予群，Alexa488標記的A551-MB110/B379-ml0r投予群或Alexa488標記的UreH-MB110/UreL-mk1投予群以高比例結合（圖94）。在脾臟及肝臟中，轉換抗體之Alexa488標記的A551-MB110/B379-ml0r投予群，和陰性對照物質之Alexa488標記的IC17HdK-MB110/IC17L-mk投予群相比，對CD8陽性T細胞的結合比例幾乎相等（圖94）。 另一方面，非轉換抗體之Alexa488標記的UreH-MB110/UreL-mk1投予群，和Alexa488標記的IC17HdK-MB110/IC17L-mk投予群或Alexa488標記的A551-MB110/B379-ml0r投予群相比，對CD8陽性T細胞的結合比例非常高（圖94）。 由上述可知，轉換抗體之A551-MB110/B379-ml0r只和存在於腫瘤組織的淋巴球結合，和存在於正常組織之一的脾臟及肝臟的淋巴球的結合有限。
實施例22：腫瘤組織中和細胞外ATP相關、顯示表現變化的基因群的檢驗 （22-1）基於同系腫瘤移植小鼠模式的RNA-seq數據，和細胞外ATP相關、顯示表現變化的基因群的熱圖（heat map）的繪製 從移植MC38細胞株、LLC/OVA/hGPC3細胞株、LLC/OVA細胞株或Hepa1-6/hGPC3細胞株至C57BL/6小鼠分別製作的同系腫瘤移植小鼠模式所獲得的RNA-seq數據，以RSEM法（version 1.2.31）計算表現値（單位FPKM）。參考mRNA目錄（基因目錄）為GRCm38。又從C57BL/6小鼠的各正常組織獲得的RNA-seq數據，同樣以RSEM法計算表現値。12種正常臟器的RNA-seq原始數據（.fastq file）使用論文公開的數據（Sollner,Sci Data, 2017,4:170185 ）。
基因的表現量以FPKM的單位加1，單位從［FPKM］轉換為［FPKM+1］。這是因為當表現值存在0時不能轉換成log而事先加上微小值的緣故。之後進行log2的轉換。
接著，對小鼠基因分配人類異種同源物（ortholog）。原則根據NCBI homologene的數據組進行分配。 之後，從文獻中收集和細胞外ATP相關的基因群（Hu, Clin Cancer Res, 2019, 25（4）, 1318-1330; Li, Cancer Discov, 2019, 9（12）, 1754-1773; Yang, Cancer Sci, 2019, 110（8）, 2456-2470; Gombault, Front Immunol, 2013, 3:414）。 又，從文獻中收集以添加ATP而表現增加的EMT相關基因群（Yang, Cancer Sci, 2019, 110（8）, 2456-2470）（EMT: epithelial-mesenchymal transition）。
接著，從RNA-seq所得的GRCm38的基因目錄（mRNA目錄）之中，只選出上述ATP相關基因群及EMT相關基因群中的基因。由於RNA-seq是小鼠數據，ATP相關基因群及EMT相關基因群是人類基因群，透過異種同源物轉換，作為小鼠的基因群。之後，以t檢定選出在各癌細胞株中比在正常組織群中有顯著高表現的基因（p＜0.05）。 接著，利用程式語言R的程式，繪製熱圖。此處，熱圖以對各基因、所有樣本的平均為0、分散為1，進行標準化。從各基因的表現量的平均的變化，以梯度表示（圖95）。
結果顯示，和12種的正常臟器相比，在腫瘤組織的ATP相關基因群及EMT相關基因群中，存在複數個顯著地高表現的基因。因此推測，A551-MB110/B379-ml0r只在腫瘤組織內和免疫細胞結合，在所謂的肝臟或脾臟的正常組織不和免疫細胞結合（實施例21）。又推測，在ATP存在下和抗原結合的轉換抗體只在腫瘤組織引起強的免疫反應（實施例20），在肝臟、脾臟、腫瘤所屬淋巴結、末梢血液為首的正常臟器不會引起免疫反應（實施例20）。
實施例23：以流式細胞技術（FCM）分析的各種癌細胞中CD73及CD39的表現評價 （23-1）各種癌細胞株中CD73的表現評價 本試驗使用從ATCC購買的小鼠急性骨髓性白血病細胞株C1498細胞（記載於實施例3）、及小鼠白血病細胞株E. G7-OVA細胞（記載於實施例2）、從美國國立癌症研究所授權的小鼠大腸癌細胞株MC38細胞（記載於實施例6）、本公司內建立的小鼠肝癌細胞株Hepa1-6/hGPC3細胞（記載於實施例4）、小鼠肺癌細胞株LLC1/OVA/GPC3 clone C5（記載於參考實施例9-4-1）、及小鼠肺癌細胞株LLC1/OVA clone 17細胞。 小鼠肺癌細胞株LLC1/OVA clone 17細胞是對來自小鼠肺癌細胞的細胞株LLC1［LL/2 （別名：LLC1），販售源：ATCC，商品編號：CRL-1642］導入雞白蛋白（OVA）的表現質體所製作。在各細胞株的FCM分析，使用抗CD73抗體 （BioLegend）。測量使用FACS Lyric （BD Biosciences）。 評價各細胞株中CD73的膜表面表現的結果，在C1498細胞及E. G7-OVA細胞的細胞膜上，幾乎沒有CD73的表現，相對的，在MC38細胞、Hepa1-6/hGPC3細胞、LLC1/OVA/GPC3 clone C5細胞、及LLC1/OVA clone 17細胞的細胞膜上有CD73的表現（圖96）。已知CD73是AMP分解為腺苷的膜酵素。因此暗示，MC38細胞、Hepa1-6/hGPC3細胞、LLC1/OVA/GPC3 clone C5細胞、及LLC1/OVA clone 17細胞儘管具有為了使轉換抗體和抗原結合而將必要的AMP分解為腺苷的性質，但是轉換抗體也可顯示抗腫瘤效果（實施例1至10），因此轉換抗體不受CD73的表現的影響，在腫瘤組織顯示作用。
（23-2）從移植LLC1/OVA/GPC3 clone C5細胞株的小鼠的腫瘤組織的CD39及CD73的表現評價
（23-2-1）細胞株及同系腫瘤細胞移植小鼠模式的製作，以及腫瘤內浸潤免疫細胞及腫瘤細胞的CD39及CD73的表現評價方法 本試驗使用在本公司內建立的小鼠肺癌細胞株LLC1/OVA/GPC3 clone C5細胞，及hCD137 KI小鼠（記載於參考實施例6-3）。將LLC1/OVA/GPC3 clone C5細胞株移植到小鼠腹部皮下，當腫瘤體積成為約500mm3 以上的時點取樣。取樣在移植14日後進行。取樣後，根據下述方法，取出腫瘤組織，製作腫瘤細胞分層或淋巴球分層，而且使用流式細胞技術（FCM），評價在腫瘤細胞上、CD4陽性T細胞上、CD8陽性T細胞上、及非T細胞分層上的CD39或CD73的表現。
（23-2-2） 從移植LLC1/OVA/GPC3 clone C5細胞株的小鼠取出腫瘤組織，及腫瘤細胞分層或淋巴球分層的製作 關於取出的腫瘤組織，進行腫瘤細胞分層或淋巴球分層的細胞製作。細胞製作使用Tumor Dissociation Kit, mouse（Miltenyi Biotec），所得的腫瘤細胞分層或淋巴球分層用於FCM分析。
（23-2-3） 從移植LLC1/OVA/GPC3 clone C5細胞株的小鼠的腫瘤細胞分層或淋巴球分層以FCM的CD39及CD73的表現評價 關於以FCM的評價，使用腫瘤細胞上、CD4陽性T細胞上、CD8陽性T細胞上、及非T細胞分層上的CD39或CD73的陽性率。因此，在FCM分析使用抗CD45抗體（BD Biosciences）、抗CD3抗體（BioLegend）、 抗CD8抗體（BioLegend） 、抗CD4抗體（BioLegend） 、抗CD39抗體（BioLegend） 及抗CD73抗體（BioLegend）。測量使用BD LSRFortessa X-20 （BD Biosciences）。
分析各分層中CD39的表現的結果，在腫瘤細胞、CD4陽性T細胞、CD8陽性T細胞、及非T細胞中的CD39的表現，在腫瘤細胞確認到一部分的細胞有表現，在CD4陽性T細胞、CD8陽性T細胞、及非T細胞，幾乎所有細胞有表現（圖97）。之後，分析各分層中的CD73的表現的結果，在腫瘤細胞、CD8陽性T細胞、及非T細胞，確認到一部分的細胞有表現，在CD4陽性T細胞，幾乎所有細胞有表現（圖97）。各數據的代表例顯示於圖98。
（23-3） 來自移植MC38細胞株的小鼠的腫瘤細胞組織的CD39及CD73的表現評價
（23-3-1）細胞株及同系腫瘤細胞移植小鼠模式的製作，以及腫瘤內浸潤免疫細胞及腫瘤細胞的CD39及CD73的表現評價方法 本試驗使用美國國立癌症研究所授權的小鼠大腸癌細胞株MC38細胞，及hCD137 KI小鼠（記載於參考實施例6-3）。將MC38細胞株移植到小鼠腹部皮下，當腫瘤體積成為約163-204mm3 以上的時點進行分群。分群在移植14日後進行，採樣在移植16日後進行。根據下述方法，取出腫瘤組織，製作腫瘤細胞分層或淋巴球分層，而且使用流式細胞技術（FCM），評價在腫瘤細胞上、CD4陽性T細胞上、CD8陽性T細胞上、及非T細胞分層上的CD39或CD73的表現。
（23-3-2） 從移植MC38細胞株的小鼠取出腫瘤組織，及腫瘤細胞分層或淋巴球分層的製作 關於取出的腫瘤組織，進行腫瘤細胞分層或淋巴球分層的細胞製作。細胞製作使用Tumor Dissociation Kit, mouse（Miltenyi Biotec），所得的腫瘤細胞分層或淋巴球分層用於FCM分析。
（23-3-3） 從移植MC38細胞株的小鼠的腫瘤細胞分層或淋巴球分層以FCM的CD39及CD73的表現評價 關於以FCM的評價，使用在腫瘤細胞上、CD4陽性T細胞上、CD8陽性T細胞上、及非T細胞分層上的CD39或CD73的陽性率。因此，在FCM分析使用抗CD45抗體（BD Biosciences）、抗CD3抗體（BioLegend）、 抗CD8抗體（BioLegend） 、抗CD4抗體（BioLegend） 、抗CD39抗體（BioLegend） 及抗CD73抗體（BioLegend）。測量使用BD LSRFortessa X-20 （BD Biosciences）。
分析各分層中CD39的表現的結果，在腫瘤細胞、CD4陽性T細胞、CD8陽性T細胞、及非T細胞中的CD39的表現，在CD4陽性T細胞及CD8陽性T細胞中有一部分的細胞表現，又，在非T細胞，幾乎所有細胞有表現（圖99）。之後，分析各分層中的CD73的表現的結果，在腫瘤細胞中有一部分細胞有表現，在CD4陽性T細胞及CD8陽性T細胞，幾乎所有細胞有表現（圖99）。在非T細胞，則幾乎未確認到表現。各數據的代表例顯示於圖100。
由上述結果顯示，在從小鼠大腸癌細胞株MC38細胞及小鼠肺癌細胞株LLC1/OVA/GPC3 clone C5細胞移植小鼠的腫瘤組織，除了腫瘤組織，在腫瘤內浸潤免疫細胞，CD39及CD73廣泛表現。已知膜酵素之CD39或CD73為將ATP分解為腺苷的酵素。轉換抗體在ATP或ADP、AMP的存在下顯示抗原結合能力，但是在腺苷存在下不顯示抗原結合能力（參照WO2020/032230）。然而，即使是在從小鼠大腸癌細胞株MC38細胞及小鼠肺癌細胞株LLC1/OVA/GPC3 clone C5細胞移植小鼠的腫瘤組織等的CD39或CD73廣泛表現的腫瘤組織中，轉換抗體也顯示和免疫細胞結合（實施例21）、抗腫瘤效果（實施例1-10），因此轉換抗體不受CD39或CD73表現的影響，在腫瘤組織顯示作用。
實施例24：以使用hCD137 KI小鼠的同系腫瘤細胞移植模式的抗CD137抗體單劑、或和抗PD-L1抗體合併使用的抗腫瘤活性的評價（LLC1/OVA clone 17細胞的皮下移植）
（24-1）腫瘤細胞株及同系腫瘤移植小鼠模式的製作，以及A551-MB110/B379-ml0r （單劑或和抗小鼠PD-L1抗體的合併使用）的抗腫瘤活性的評價 本試驗使用本公司內建立的小鼠肺癌細胞株LLC1/OVA clone 17細胞（記載於實施例23。以下，在本實施例簡稱為LLC1/OVA細胞株），及hCD137 KI小鼠（記載於參考實施例6-3）。將LLC1/OVA細胞株移植到小鼠腹部皮下，在腫瘤體積成為約79-199mm3 的時點建立模式。模式建立後，LLC1/OVA細胞株移植小鼠實施分群之後，以表81所示用量，投予轉換抗體A551-MB110/B379-ml0r及抗小鼠PD-L1抗體（BioXcell社，clone 10F.9G2）。投予非轉換抗體之UreH-MB110/UreL-mk1及抗小鼠PD-L1抗體作為陽性對照物質。轉換抗體A551-MB110/B379-ml0r或非轉換抗體UreH-MB110/UreL-mk1的投予，在移植10日後及13日後共計2次經尾靜脈路徑實施。抗小鼠PD-L1抗體的投予，在移植10日後及13日後共計2次經腹腔內路徑實施。使用含有0.05%Tween 20的PBS作為載劑對照。
［表81］
群 隻數 藥劑 用量 （mg/kg） 投予日 投予路徑
1 8 載劑對照 （含0.5% Tween 20 的 PBS） -   移植10日後及13日後 尾靜脈内及 腹腔內
2 8 A551-MB110/B379-ml0r 2.5 尾靜脈内
3 8 UreH-MB110/UreL-mk1 7.5 尾靜脈内
4 8 抗小鼠PD-L1抗體 10 腹腔內
5 8 A551-MB110/B379-ml0r 2.5 尾靜脈内
抗小鼠PD-L1抗體 10 腹腔內
6 8 UreH-MB110/UreL-mk1 7.5 尾靜脈内
抗小鼠PD-L1抗體 10 腹腔內
在移植10日後、13日後、17日後、20日後，測量腫瘤體積。 腫瘤體積（TV）以下列算式計算。 腫瘤體積（mm3 ） ＝ 長徑（mm） × 短徑（mm） × 短徑（mm）/2
腫瘤增殖抑制率（Tumor growth inhibition，TGI （%））根據下式計算。 腫瘤體積變化（TV change） （mm3 ） ＝ 移植20日後的時點的腫瘤體積-分群時的腫瘤體積 TGI （%） ＝ （1- （各群的腫瘤體積變化（TV change）的平均值/載劑對照群的腫瘤體積變化（TV change）的平均值）） × 100
結果為，轉換抗體A551-MB110/B379-ml0r及抗小鼠PD-L1抗體的併用群、非轉換抗體UreH-MB110/UreL-mk1及抗小鼠PD-L1抗體的併用群、及轉換抗體A551-MB110/B379-ml0r的單劑群對LLC1/OVA腫瘤，為幾乎相同的腫瘤增殖抑制效果。 具體為，相對於轉換抗體A551-MB110/B379-ml0r及抗小鼠PD-L1抗體的併用群的腫瘤增殖抑制率為95%，非轉換抗體UreH-MB110/UreL-mk1及抗小鼠PD-L1抗體的併用群為93%、轉換抗體A551-MB110/B379-ml0r的單劑群為101%的腫瘤增殖抑制率（圖101，表82）。 由上述結果可知，轉換抗體A551-MB110/B379-ml0r及抗小鼠PD-L1抗體的併用群和非轉換抗體UreH-MB110/UreL-mk1和抗小鼠PD-L1抗體的併用群，顯示相同的腫瘤增殖抑制效果（圖101，表82）。
［表82］ 在移植20日後的腫瘤增殖抑制率（Tumor growth inhibition，%）
  載劑對照   A551-MB110/ B379-ml0r UreH-MB110/ UreL-mk1 抗小鼠PD-L1抗體 A551-MB110/ B379-ml0r+ 抗小鼠PD-L1抗體 UreH-MB110/ UreL-mk1+ 抗小鼠PD-L1抗體
腫瘤增殖抑制率（%） - 101 78 42 95 93
實施例25：以使用hCD137 KI小鼠的同系腫瘤細胞移植模式的抗CD137抗體單劑、或和抗PD-L1抗體合併使用的全身性作用的評價（LLC1/OVA細胞）
（25-1）腫瘤細胞株及同系腫瘤移植小鼠模式的製作、以及腫瘤內作用的評價方法 本試驗使用本公司內建立的小鼠肺癌細胞株LLC1/OVA細胞（記載於實施例23），及hCD137 KI小鼠（記載於參考實施例6-3）。將LLC1/OVA細胞株移植到小鼠腹部皮下，在腫瘤體積成為91-205mm3 的時點建立模式。模式建立後，LLC1/OVA細胞株移植小鼠實施分群之後，以表83所示用量，投予轉換抗體A551-MB110/B379-ml0r及抗小鼠PD-L1抗體（BioXcell社，clone 10F.9G2）。 投予非轉換抗CD137抗體之UreH-MB110/UreL-mk1及抗小鼠PD-L1抗體作為陽性對照物質。轉換抗體A551-MB110/B379-ml0r或非轉換抗體UreH-MB110/UreL-mk1的投予，在移植14日後及17日後共計2次經尾靜脈路徑實施。抗小鼠PD-L1抗體的投予，在移植14日後及17日後共計2次經腹腔內路徑實施。使用含有0.05%Tween 20的PBS作為載劑對照。
（25-2）從LLC1/OVA細胞株移植小鼠取出腫瘤所屬淋巴結及淋巴球分層的製作 對於取出的腫瘤所屬淋巴結，淋巴球分層使用組織破碎後、使用細胞過濾器所得的淋巴球分層。來自所得腫瘤所屬淋巴結的淋巴球分層，進行流式細胞技術（FCM）分析。
［表83］
群 隻數 藥劑 用量 （mg/kg） 投予日 投予路徑 採樣日
1 3 載劑對照 （含0.5% Tween 20 的 PBS） -   移植14日後及17日後 尾靜脈内及 腹腔內           移植18日後
2 3 A551-MB110/B379-ml0r 2.5 尾靜脈内
3 3 UreH-MB110/UreL-mk1 7.5 尾靜脈内
4 3 抗小鼠PD-L1抗體 10 腹腔內
5 3 A551-MB110/B379-ml0r 2.5 尾靜脈内
抗小鼠PD-L1抗體 10 腹腔內
6 3 UreH-MB110/UreL-mk1 7.5 尾靜脈内
抗小鼠PD-L1抗體 10 腹腔內
（25-3） LLC1/OVA細胞株移植小鼠以流式細胞技術（FCM）分析的免疫細胞活化評價 對於來自腫瘤所屬淋巴結的T細胞活化，使用FCM進行分析。關於經由FCM的評價，使用在CD8陽性T細胞中活化的標誌物的表現比例。在FCM分析，使用抗CD45抗體（BD Biosciences）、抗CD3抗體（BioLegend）、抗CD8抗體（BioLegend）、抗KLRG-1抗體（BD Biosciences）、抗ICOS抗體（BioLegend）、及抗PD-1抗體（BioLegend）。測量使用BD LSRFortessa X-20 （BDBiosciences）。 在腫瘤所屬淋巴結的評價結果，在CD8陽性T細胞中的KLRG-1、ICOS、PD-1的表現比例及其絕對數的任一者，在A551-MB110/B379-ml0r單劑群、抗小鼠PD-L1抗體單劑群、及A551-MB110/B379-ml0r和抗小鼠PD-L1抗體的併用群，皆沒有增加（圖102、103）。另一方面，在UreH-MB110/UreL-mk1單劑群、及UreH-MB110/UreL-mk1和抗小鼠PD-L1抗體的併用群，有顯著的增加（圖102、103）。 由此結果可知，如實施例24所示，轉換抗體A551-MB110/B379-ml0r及非轉換抗體UreH-MB110/UreL-mk1的任一者，即使是和抗小鼠PD-L1抗體合併使用時，皆顯示同等的腫瘤增殖抑制效果，但是轉換抗體A551-MB110/B379-ml0r，在單劑及和抗小鼠PD-L1抗體合併使用時，相較於非轉換抗體UreH-MB110/UreL-mk1，皆對正常臟器之一的腫瘤所屬淋巴結中的T細胞的作用極為有限。
實施例26：以使用hCD137 KI小鼠的同系腫瘤移植模式的抗CD137抗體的抗腫瘤活性的評價（LLC1/OVA細胞的靜脈內投予） （26-1）腫瘤細胞株及同系腫瘤移植小鼠模式的製作、以及抗腫瘤活性的評價 本試驗使用本公司內建立的小鼠肺癌細胞株LLC1/OVA clone 17細胞（記載於實施例23），及hCD137 KI小鼠（記載於參考實施例6-3）。將LLC1/OVA clone 17細胞株移植到小鼠尾靜脈內，移植7日後進行分群。如下表84所示，在移植7日後及14日後在小鼠尾靜脈內投予A551-MB110/B379-ml0r抗體。使用含有0.05%Tween 20的PBS作為載劑對照。在腫瘤移植18日後測量體重，麻醉下放血安樂死後，測量肺重量。對於非細胞移植的正常小鼠10隻，也在同日以相同方法進行樣本化。肺重量以每100g體重的肺重量值計算。
［表84］
群 隻數 藥劑 用量 （mg/kg） 投予日 投予路徑
1 15 載劑對照 （含0.05% Tween 20 的 PBS） -   移植7日後及14日後 尾靜脈内
2 15 A551-MB110/B379-ml0r 2.5
結果為，轉換抗體A551-MB110/B379-ml0r投予群，和載劑投予群相比，顯著地抑制肺重量（圖104，表85）。因此，轉換抗體A551-MB110/B379-ml0r不只對皮下移植腫瘤（記載於實施例24），對肺的微轉移也具有藥效。載劑投予群的1個體在腫瘤移植11日後死亡。在死亡個體的肺確認有聯想到腫瘤的小痕跡或隆起。
［表85］ 在移植18日後的時點的肺重量
  載劑對照 （含0.05% Tween 20 的 PBS） A551-MB110/B379-ml0r 非細胞移植的正常小鼠
肺重量 （/100g體重） 0.708 0.553 0.480
參考實施例1：抗原的製作 （1-1） 人類CD137細胞外區域的製作 人類CD137細胞外區域（也稱為hCD137）以此技術領域公知方法製作。具體為，在編碼人類CD137的細胞外區域的基因片段的下游，連接編碼組胺酸標籤（histidine tag）的基因片段、及編碼生物素（biotin）附加之特異性序列（AviTag序列，序列識別號：86）的基因片段。將編碼連接人類CD137的細胞外區域、組胺酸標籤和AviTag的蛋白質（人類CD137或hCD137-HisBAP，序列識別號：87）之基因片段，重組於動物細胞表現用載體。使用293 Fectin （Invitrogen），將已構築的質體載體（plasmid vector）導入FreeStyle293細胞（Invitrogen）。此時，同時導入包含表現EBNA1（序列識別號：88） 的基因之質體載體。根據上述順序，將導入基因的細胞培養於37℃、8% CO2 ，目標蛋白質（人類CD137的細胞外區域）被分泌於培養上清液中。以0.22μm過濾器過濾此細胞培養液，得到培養上清液。 將培養上清液加入HisTrap-HP（GE healthcare），使人類CD137的細胞外區域結合於管柱。使用20mM磷酸鈉、500mM氯化鈉、500mM咪唑、pH7.5溶液，溶出人類CD137細胞外區域。之後，藉由Superdex 200 26/600 （GE healthcare）的膠過濾柱層析法，去除締合物，得到純化的人類CD137細胞外區域。 人類CD137的濃度，根據扣除序列識別號：87所推測的訊號序列的胺基酸序列（序列識別號：183），以Pace等人的方法算出（Pace, C.N., et al. Protein Science 1995; 4; 2411-2423）。
（1-2） 人類CD137細胞外區域（hCD137（分解的FXa））的製作 人類CD137細胞外區域（也稱為hCD137（分解的FXa））以此技術領域公知方法製作。具體為，在編碼人類CD137的細胞外區域的基因片段的下游，連接編碼第Xa因子（Factor Xa）切斷序列的基因片段及編碼抗體恆定區域的基因片段。將編碼有連結人類CD137的細胞外區域、第Xa因子切斷序列和抗體恆定區域之蛋白質（hCD137-F-Fc，序列識別號：89）之基因片段，重組於動物細胞表現用載體。使用293 Fectin （Invitrogen），將已構築的質體載體導入FreeStyle293細胞（Invitrogen）。此時，同時導入包含表現EBNA1（序列識別號：88） 的基因之質體載體。根據上述順序，將導入基因的細胞培養於37℃、8% CO2 ，hCD137-F-Fc被分泌於培養上清液中。以0.22μm過濾器過濾此細胞培養液，收集培養上清液。
將培養上清液加入填充有蛋白A （MabSelect SuRe, GE Healthcare）的管柱。hCD137-F-Fc結合於管柱，以50mM醋酸溶液溶出。溶出液以1M Tris-HCl、pH8.0中和，將hCD137-F-Fc的溶劑取代為20mM Tris、100mM 氯化鈉、2mM氯化鈣、pH8.0。之後，添加第Xa因子蛋白酶（NEW ENGLAND BioLabs, Cat#.P8010L），分解hCD137-F-Fc。之後添加蛋白酶抑制劑（DNS-GGACK, calbiochem, Cat#251700），使反應停止。在蛋白酶反應液中添加5 mM 氯化鈉，將所製作的溶液全部加入HiTrap苯甲脒（HiTrap Benzamidine）（GE Healthcare, Cat# 17-5143-01）。通過管柱的溶液再加入蛋白A （MabSelect SuRe, GE Healthcare）柱，收集通過分層。通過分層經過使用Superdex 200 Increase, 10/30 （GE Healthcare、Cat#28990944）的膠過濾柱層析法，去除締合體，得到純化的人類CD137細胞外區域。
（1-3） 生物素化的Fc融合型人類CD137的製作 生物素（biotin）化的Fc融合型人類CD137 （也稱為「生物素化hCD137-Fc」或「bio-hCD137-Fc」、hCD137-Fc-Bio） 以此技術領域公知方法製作。具體為，在編碼人類CD137的細胞外區域的基因片段的下游，連接編碼抗體的恆定區域的基因片段及編碼生物素（biotin）附加之特異性序列（AviTag序列，序列識別號：86）的基因片段。將編碼連接人類CD137的細胞外區域、抗體的恆定區域和AviTag的蛋白質（Fc融合型人類CD137，序列識別號：90）之基因片段，重組於動物細胞表現用載體。使用293 Fectin （Invitrogen），將已構築的質體載體（plasmid vector）導入FreeStyle293細胞（Invitrogen）。此時，同時導入包含表現EBNA1（序列識別號：88） 的基因及表現生物素連接酶（ligase）（BirA，序列識別號：91）的基因，而且使Fc融合型人類CD137生物素化為目的，添加生物素。根據上述順序，將導入基因的細胞培養於37℃、8% CO2 ，目標蛋白質（生物素化Fc融合型人類CD137）被分泌於培養上清液中。以0.22μm過濾器過濾此細胞培養液，得到培養上清液。 將培養上清液提供於填充有蛋白A （MabSelect SuRe, GE Healthcare）的管柱，生物素化Fc融合型人類CD137結合於管柱。使用50mM醋酸溶液溶出生物素化Fc融合型人類CD137。之後，藉由使用Superdex 200 26/600 （GE healthcare）的膠過濾柱層析法去除締合物，得到純化的生物素化Fc融合型人類CD137。
（1-4） Fc融合型人類CD137的製作 Fc融合型人類CD137（也稱為hCD137-Fc） 以此技術領域公知方法製作。具體為，在編碼人類CD137的細胞外區域的基因片段的下游，連接編碼抗體的恆定區域的基因片段及編碼生物素附加之特異性序列（AviTag序列，序列識別號：86）的基因片段。將編碼連接人類CD137的細胞外區域、抗體的恆定區域和AviTag的蛋白（Fc融合型人類CD137，序列識別號：90）之基因片段，重組於動物細胞表現用載體。使用293 Fectin （Invitrogen），將已構築的質體載體導入FreeStyle293細胞（Invitrogen）。此時，同時導入包含表現EBNA1（序列識別號：88） 的基因。根據上述順序，將導入基因的細胞培養於37℃、8% CO2 ，目標蛋白質（Fc融合型人類CD137）被分泌於培養上清液中。以0.22μm過濾器過濾此細胞培養液，得到培養上清液。 將培養上清液提供於填充有蛋白A （MabSelect SuRe, GE Healthcare）的管柱，Fc融合型人類CD137結合於管柱。使用50mM醋酸溶液溶出Fc融合型人類CD137。之後，藉由使用Superdex 200 26/600 （GE healthcare）的膠過濾柱層析法去除締合物，得到純化的Fc融合型人類CD137。
（1-5） 生物素化的Fc融合型猿CD137的製作 生物素化的Fc融合型猿CD137（也稱為「cyCD137-Fc-BAP」） 以此技術領域公知方法製作。具體為，在編碼猿CD137的細胞外區域的基因片段的下游，連接編碼抗體的恆定區域的基因片段及編碼生物素附加之特異性序列（AviTag序列，序列識別號：86）的基因片段。將編碼連結猿CD137的細胞外區域、抗體的恆定區域和AviTag的蛋白（Fc融合型猿CD137，序列識別號：92）之基因片段，重組於動物細胞表現用載體。 使用293 Fectin （Invitrogen），將已構築的質體載體（plasmid vector）導入FreeStyle293細胞（Invitrogen）。此時，同時導入包含表現EBNA1（序列識別號：88） 的基因及表現生物素連接酶（ligase）（BirA，序列識別號：91）的基因，而且使Fc融合型猿CD137進行生物素標記為目的，添加生物素。根據上述順序，將導入基因的細胞培養於37℃、8% CO2 ，目標蛋白質（生物素化Fc融合型猿CD137）被分泌於培養上清液中。以0.22μm過濾器過濾此細胞培養液，得到培養上清液。 將培養上清液加入填充有蛋白A （MabSelect SuRe, GE Healthcare）的管柱，生物素化Fc融合型猿CD137結合於管柱。使用50mM醋酸溶液溶出生物素化Fc融合型猿CD137。之後，藉由Superdex 200 increase 10/300 （GE healthcare）的膠過濾柱層析法去除締合物，得到純化的生物素化Fc融合型猿CD137。
參考實施例2：ATP依賴性CD137抗體之獲得 （2-1） 從利用ATP的理論設計庫（rational design library）獲得具有小分子依賴的抗原結合活性之抗體（小分子轉換抗體）（1） （2-1-1） 淘選（panning） 從先前專利WO2015/083764中所構築的理論設計抗體噬菌體展示庫，獲得在三磷酸腺苷（adenosine 5'-triphosphate; ATP）的存在下顯示對抗原的結合活性之抗體。又，具有小分子依賴的抗原（例如CD137）的結合活性之抗體，稱為「轉換抗體」（switch antibody）或「小分子轉換抗體」，具有ATP依賴的抗原（例如CD137）的結合活性之抗體，稱為「轉換抗體」（switch antibody）或「ATP轉換抗體」。為了獲得，收集展示在ATP存在下對珠（bead）所捕捉的抗原顯示結合活性之抗體的噬菌體。之後，在ATP不存在下，從珠溶出的溶出液收集噬菌體。
從保有已構築的噬菌體展示用的噬菌粒（phagemid）的大腸桿菌，以一般方法產生噬菌體。具體為，使保有已構築的噬菌粒載體（phagemid vector）的大腸桿菌感染M13KO7ΔpIII （稱為「超噬菌體（hyperphage）」）（PROGEN Biotechnik），在30℃培養一晚，從上清液中收集噬菌體。將在產生噬菌體的大腸桿菌培養液添加2.5M NaCl/10% PEG而沉澱的噬菌體群以Tris緩衝生理食鹽水（TBS）稀釋，得到噬菌體庫液。之後在該噬菌體庫液添加BSA以達到終濃度為4%。使用固定於磁珠的抗原，進行淘選。磁珠使用Sera-Mag NeutrAvidin beads （Thermo Fisher Scientific）、或Dynabeads M-280 StreptAvidin （Life Technologies）。抗原使用購自Jena Bioscience社的生物素化的三磷酸腺苷（adenosine 5'-triphosphate; ATP）、利用No weight Premeasured NHS-PEO4-Biotin （PIERCE）而使參考實施例1-2及1-3製作的hCD137-Fc-Bio（序列識別號：90）或hCD137（分解的FXa）生物素化的bio-hCD137（序列識別號：89）。
進行用於有效率獲得在癌組織可完成轉換作用的小分子依賴的小分子轉換抗體之淘選。具體為，使在小分子ATP存在下和抗原結合、在ATP不存在下和抗原不結合的抗體濃縮之淘選，參考先前專利WO2015/083764所示方法實施。第1輪，將生物素化hCD137（bio-hCD137）、hCD137-Fc-Bio及生物素化ATP（bio-ATP）全都添加事先將生物素化抗原固定於磁珠上後所製作的噬菌體庫溶液之方法（稱為「珠固定法」），進行淘選。對於bio-ATP，在作為小分子化合物的ATP不存在下，使可結合於抗原（bio-ATP）的抗體濃縮之淘選，可參考上述先前專利WO2015/083764所載之方法實施。對於hCD137-Fc-Bio，為了除去和Fc區域結合的抗體，添加未生物素化的人類IgG1 Fc區域4 nmol。收集的噬菌體加入大腸桿菌ER2738，使噬菌體感染大腸桿菌後，對收集的大腸桿菌以超噬菌體（hyperphage）感染，在30℃培養一晚，從上清液中收集噬菌體。
第2輪以後，只對生物素化hCD137（bio-hCD137）及hCD137-Fc-Bio，使以珠固定法在ATP存在下和抗原結合、在ATP不存在下和抗原不結合之抗體濃縮的淘選，參考先前專利WO2015/083764所示方法實施。在任何情形也對hCD137-Fc-Bio，為了除去和Fc區域結合的抗體，添加未生物素化的人類IgG1 Fc區域4nmol。同樣的淘選重複進行至第5輪，濃縮目標的抗體序列。
（2-1-2） 以噬菌體ELISA評價ATP存在下及不存在下的結合活性 從上述方法所得到的大腸桿菌單一菌群，根據常法（Methods Mol. Biol. （2002） 178, 133-145），收集含有噬菌體的培養上清液。使用NucleoFast 96 （MACHEREY-NAGEL），使收集的培養上清液進行超過濾（ultrafiltration）。將各孔（well）加入培養上清液各100μL的NucleoFast 96進行離心（4,500 g，45分鐘），去除上清液（flow through）。將各孔加入100 μL的H2 O的該NucleoFast 96再次離心（4,500 g，30分鐘）洗淨。最後加入TBS 100 μL，室溫下靜置5分鐘，收集該NucleoFast 96各孔的上清液所含的噬菌體液。
添加TBS或ATP/TBS的純化噬菌體以下列步驟進行ELISA。將塗佈有鏈親和素（Streptavidin）的384孔微量盤（Greiner），在含有參考實施例1所製作之生物素化抗原（bio-hCD137、hCD137-Fc-Bio及bio-Fc）的10μL的TBS，進行塗佈一晚。以含有Tween20的Tris緩衝生理食鹽水（TBST）洗淨該微量盤各孔，去除未結合於微量盤的生物素化抗原後，將該孔於80 μL的2% SkimMilk-TBS阻斷1小時以上。以TBST洗淨去除2% SkimMilk-TBS，之後，各孔加入所製作的純化噬菌體的該微量盤在室溫靜置1小時，使展示抗體的噬菌體，在ATP不存在下及存在下，和存在於各孔的生物素化抗原結合。以TBST或ATP/TBST洗淨的各孔、加入經TBS或ATP/TBS稀釋的HRP結合抗M13抗體（GE Healthcare 27-9421-01）的微量盤，培養1小時。以TBST或ATP/TBST洗淨後，加入TMB 單組分溶液（ZYMED）的各孔中的溶液顯色反應，藉由加入硫酸而停止後，測量該顯色在450nm的吸光度。
結果，確認到複數的對bio-hCD137或hCD137-Fc-Bio，在ATP存在下及不存在下的結合活性改變的抗體。 使用淘選第4及5輪後的選殖株（clone）的噬菌體ELISA的結果如表29所示。 在此，ATP存在下的吸光度為0.2以上、且在抗原存在下/不存在下的吸光度的S/N比超過2的選殖株，判斷為陽性選殖株。而且，在該陽性選殖株中，在ATP存在下/不存在下的吸光度的S/N比超過2的選殖株，判斷為具有ATP依賴的抗原結合活性之選殖株（轉換選殖株）。
［表29］
用於淘選的抗原 生物素化hCD137 hCD137-Fc-Bio
輪數 4 5 4 5
ELISA實施的選殖株數 384 384 384 384
陽性選殖株數（ATP+的吸光度≧0.2；抗原+/-比＞2.0） 31 4 125 169
轉換選殖株數（ATP+/-比＞2.0） 12 2 118 164
（2-1-3） 因ATP存在下/不存在下對抗原的結合活性改變的轉換抗體的序列分析 從噬菌體ELISA的結果、將具有ATP依賴的抗原結合活性的選殖株（轉換選殖株），使用特異性引子pBAD-F、G1seq-R擴增，分析其基因的鹼基序列。分析結果，得到判斷為在ATP存在下和人類CD137結合、在ATP不存在下和人類CD137不結合的選殖株的鹼基序列。
（2-2） 從利用ATP的理論設計庫（rational design library）獲得在小分子存在下和抗原結合的抗體（2） （2-2-1） 淘選（panning） 從先前專利WO2015/083764中所構築的理論設計抗體噬菌體展示庫（phage display library），獲得在ATP存在下顯示對抗原的結合活性之抗體。為了獲得，收集展示在ATP存在下對抗原顯示結合活性之抗體的噬菌體，之後，在ATP不存在下，從珠溶出的溶出液中收集噬菌體。
從保有已構築的噬菌體展示用的噬菌粒（phagemid）的大腸桿菌，以一般方法產生噬菌體。具體為，使保有已構築的噬菌粒的大腸桿菌感染M13KO7TC （WO2015046554A1）或M13KO7ΔpIII （超噬菌體（hyperphage））（PROGEN Biotechnik），在30℃培養一晚，從上清液中收集噬菌體。將在產生噬菌體的大腸桿菌培養液添加2.5M NaCl/10% PEG而沉澱的噬菌體群以TBS稀釋，得到噬菌體庫液。之後在該噬菌體庫液以達到最終濃度為4%的方式添加BSA。使用固定於磁珠的抗原，進行淘選。磁珠使用NeutrAvidin coated beads （Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated）、NeutrAvidin beads （TAMAGAWA SEIKI）或Dynabeads MyOne StreptAvidin T1 （Thermo Fisher Scientific）。抗原使用參考實施例1製作的hCD137-Fc-Bio或bio-hCD137。
進行用於有效率獲得在癌組織可完成轉換作用的小分子依賴的小分子轉換抗體之淘選。具體為，使在小分子之三磷酸腺苷（adenosine 5'-triphosphate; ATP）存在下和抗原結合、在ATP不存在下和抗原不結合的抗體濃縮之淘選，參考先前專利WO2015/083764所示方法實施。對於bio-hCD137，實施事先在磁珠上固定生物素化抗原後、添加所製作的噬菌體庫溶液之方法（稱為「珠固定法」）、及事先將生物素抗原和所製作的噬菌體庫溶液混合後添加磁珠的方法（稱為「液相法」）。對於hCD137-Fc-Bio，為了除去和Fc區域結合的抗體，添加未生物素化的人類IgG1 Fc區域4 nmol，淘選只進行液相法。在收集的噬菌體加入大腸桿菌ER2738，使噬菌體感染大腸桿菌後，對收集的大腸桿菌以M13KO7TC （WO2015046554A1）或M13KO7ΔpIII （超噬菌體（hyperphage））（PROGEN Biotechnik）感染，在30℃培養一晚，從上清液中收集噬菌體。同樣的淘選重複進行至第5輪。
（2-2-2） 以噬菌體ELISA評價ATP存在下及不存在下的結合活性 根據上述方法所得到的各輪後的大腸桿菌單一菌群，根據常法（Methods Mol. Biol. （2002） 178, 133-145），收集含有噬菌體的培養上清液。使用NucleoFast 96 （MACHEREY-NAGEL），使收集的培養上清液進行超過濾（ultrafiltration）。將各孔加入培養上清液各100μL的NucleoFast 96進行離心（4,500 g，45分鐘），去除上清液（flow through）。將各孔加入100 μL的H2 O的該NucleoFast 96再次離心（4,500 g，30分鐘）洗淨。最後加入TBS 100 μL，室溫下靜置5分鐘，收集該NucleoFast 96各孔的上清液所含的噬菌體液。
添加TBS或ATP/TBS的純化噬菌體以下列步驟進行ELISA。StreptaWell 96孔微滴定盤（Roche）以含有參考實施例1所製作之生物素化抗原（hCD137-Fc-Bio或bio-hCD137）的100μL的TBS中一晚進行固定。以TBST洗淨該盤各孔，去除未結合於盤的生物素化抗原後，將該孔於250 μL的2% 脫脂牛奶-TBS阻斷1小時以上。去除2% 脫脂牛奶-TBS，之後，各孔加入所製作的純化噬菌體的該盤在37℃靜置1小時，使展示抗體的噬菌體，在ATP不存在下及存在下，和存在於各孔的生物素化抗原結合。以TBST或ATP/TBST洗淨的各孔、加入經TBS或ATP/TBS稀釋的HRP結合抗M13抗體（GE Healthcare 27-9421-01）之盤，培養1小時。以TBST或ATP/TBST洗淨後、加入TMB 單組分溶液（ZYMED）的各孔中的溶液顯色反應，藉由加入硫酸而停止後，測量該發色在450nm的吸光度。 結果，確認到複數的對bio-hCD137或hCD137-Fc-Bio、在ATP存在下及不存在下的結合活性改變的抗體。 作為例示，使用淘選第5輪後的選殖株的噬菌體ELISA的結果示於表30。 在此，ATP存在下的吸光度為0.2以上、且在抗原存在下/不存在下的吸光度的S/N比超過2的選殖株，判斷為陽性選殖株。而且，在該陽性選殖株中，在ATP存在下/不存在下的吸光度的S/N比超過2的選殖株，判斷為具有ATP依賴的抗原結合活性之選殖株（轉換選殖株）。
［表30］
用於淘選的抗原 hCD137-Fc-Bio hCD137-Fc-Bio 生物素化hCD137 生物素化hCD137
淘選方法 液相 液相 液相 珠固定
淘選使用的輔助噬菌體 M13KO7ΔpIII M13KO7ΔpIII及M13KO7TC M13KO7ΔpIII M13KO7ΔpIII
實施ELISA的選殖株數 384 96 96 96
陽性選殖株數（ATP+的吸光度≧0.2；抗原+/-比＞2） 383 79 41 29
轉換選殖株數（ATP+/-比＞2） 375 77 40 29
（2-2-3） 因ATP存在下/不存在下對抗原的結合活性改變的轉換抗體的序列分析 從噬菌體ELISA的結果、將具有ATP依賴的抗原結合活性的選殖株（轉換選殖株），使用特異性引子pBAD-F、G1seq-R擴增，分析其基因的鹼基序列。分析結果，得到判斷為在ATP存在下和人類CD137結合、在ATP不存在下和人類CD137不結合的選殖株的鹼基序列。
（2-3）  轉換抗體的選拔 從參考實施例2-1-3及2-2-3的分析的結果所獲得的判斷為具有ATP依賴的抗原結合活性之選殖株之中，選出17個檢體，如表31所載，再賦予選殖株名稱。
［表31］
　 噬菌體名 抗體可變區域的噬菌體名
1 dBBATkl4-4_003 dBBAT007
2 dBBATkl4-4_089 dBBAT013
3 dBBATkl7-4_002 dBBAT015
4 dBBATkl7-4_009 dBBAT017
5 dBBATkl7-4_075 dBBAT019
6 dBBATk05-5_052 dBBAT021
7 dBBATk05-5_076 dBBAT025
8 dBBATk12-5_038 dBBAT029
9 dBBATk12-5_048 dBBAT031
10 dBBATk14-5_012 dBBAT037
11 dBBATk14-5_053 dBBAT042
12 dBBAHk14SF-3_016 dBBAT053
13 dBBAHk14SF-3_032 dBBAT056
14 dBBAHk14FF-4_028 dBBAT091
15 dBBAHk14FS-5_074 dBBAT112
16 dBBAHk14MS-5_034 dBBAT118
17 dBBAHk14MS-5_093 dBBAT119
（2-4） ATP存在下/不存在下對抗原的結合活性改變的轉換抗體的表現和純化 將從理論設計噬菌體庫（rational design phage library）獲得、編碼如表31記載之抗體可變區域之基因，插入人類IgG1/Lambda的動物細胞表現用質體。用下列方法表現抗體。在FreeStyle 293 表現培養基（Invitrogen）中，以1.33 × 106 細胞/mL的細胞密度懸浮，在6孔微量盤的每孔接種3 mL來自人類胎兒腎細胞的FreeStyle 293-F株（Invitrogen），以脂質體法（lipofection）導入所製作的質體。在CO2 培養箱（37℃、8 %CO2 、90 rpm）培養4日的培養上清液，使用rProtein A SepharoseTM Fast Flow （Amersham Biosciences），以此技術領域公知方法純化抗體。使用分光光度計測量純化的抗體溶液在280nm的吸光度。從所得的測量值以PACE法計算出的吸光係數，計算純化的抗體的濃度（Protein Science （1995） 4, 2411-2423）。
（2-5） 以噬菌體展示法鑑定的抗CD137抗體之評價 （2-5-1） 因ATP及其代謝產物的有無而使對抗原的結合改變的轉換抗體之表現及純化 編碼從人類理論設計噬菌體庫獲得的抗體可變區域之基因，插入具有在改變的人類IgG1（P253）（序列識別號：93）的下游融合編碼Gly和Lys的基因之重鏈恆定區、及輕鏈恆定區λ鏈Lamlib（序列識別號：63）之動物細胞表現用質體。表32記載選殖株名稱及序列識別號。
評價的選殖株 ［表32］
選殖株名 重鏈序列識別號（全長） 輕鏈序列識別號（全長）
1 dBBAT007-P253 94 113
2 dBBAT013-P253 95 114
3 dBBAT015-P253 96 115
4 dBBAT017-P253 97 116
5 dBBAT019-P253 98 117
6 dBBAT025-P253 99 118
7 dBBAT029-P253 100 119
8 dBBAT031-P253 100 119
9 dBBAT037-P253 101 120
10 dBBAT042-P253 102 121
11 dBBAT053-P253 103 122
12 dBBAT056-P253 104 123
13 dBBAT021-P253 105 124
14 dBBAT091-P253 106 125
15 dBBAT112-P253 107 126
16 dBBAT118-P253 108 127
17 dBBAT119-P253 109 128
18 dBBAT121-P253 110 129
19 dBBAT122-P253 111 130
20 dBBAT134-P253 112 131
以此技術領域公知方法，使抗體表現、純化。使用分光光度計，測量純化的抗體溶液在280nm的吸光度。從所得的測量值以PACE法所計算出來的吸光係數，計算純化的抗體的濃度（Protein Science （1995） 4, 2411-2423）。
（2-5-2） 以表面電漿共振法評價ATP、ADP、AMP對人類CD137的結合的影響 使用Biacore T200（GE Healthcare），分析抗CD137抗體和hCD137（分解的FXa）的抗原抗體反應的交互作用。在以胺基偶合（amine coupling）法固定適量的蛋白G （CALBIOCHEM）的感應晶片CM3（GE Healthcare），捕捉抗CD137抗體，和參考實施例1-2所製作的hCD137（分解的FXa）進行交互作用。實驗緩衝液（running buffer）使用20mM ACES、150mM NaCl、2mM MgCl2 、0.05% Tween20 （pH7.4），再生溶液使用10 mM 甘胺酸鹽酸鹽 （pH 1.5）。 捕捉懸浮在TBS的抗CD137抗體後，以各流體細胞流速10 μL/min、3分鐘，注入500 nM的hCD137 （分解的FXa）。此3分鐘形成hCD137 （分解的FXa）的結合相，結合相結束後，換成實驗緩衝液（running buffer）的2分鐘形成hCD137 （分解的FXa）的解離相。解離相結束後，以流速30 μL/min、30秒注入再生溶液。以上作為抗CD137抗體的結合活性測量循環。在結合相和抗CD137抗體交互作用的hCD137 （分解的FXa）的結合量以對於捕捉的抗體量進行校正。使用Biacore T200評價軟體2.0版，顯示捕捉配體每1RU的結合量（RU），得到抗體捕捉量（捕捉到的抗體）、抗原結合量的數值。抗原結合量如表33所示。由於抗原結合量反映結合活性，和沒有小分子的值相比，在小分子（ATP、ADP或AMP）存在時的值高的情形，被認為有各小分子依賴性。特別是，差異越大，小分子依賴性越高。
［表33］
選殖株名稱 小分子種類、濃度條件
1mM ATP 100μM ATP 100μM ADP 10μM ADP 1mM AMP 100μM AMP 沒有小分子
dBBAT007-P253 49.2 29.5 89.0 70.0 28.5 16.5 3.6
dBBAT013-P253 26.2 8.1 77.3 48.5 13.8 6.6 2.7
dBBAT015-P253 8.3 3.1 41.8 17.9 11.9 5.5 1.5
dBBAT017-P253 9.8 5.0 39.7 18.8 6.8 4.8 4.4
dBBAT019-P253 3.8 3.0 25.7 7.4 11.1 4.6 3.7
dBBAT021-P253 9.2 2.4 56.6 19.6 5.7 3.0 2.9
dBBAT025-P253 28.5 10.0 89.1 55.7 16.4 6.1 4.4
dBBAT029-P253 10.9 6.9 53.3 38.5 17.4 11.4 3.7
dBBAT031-P253 8.4 5.0 47.8 33.3 14.8 8.3 2.8
dBBAT037-P253 27.5 15.9 72.1 62.9 21.7 13.8 3.8
dBBAT042-P253 11.7 4.3 58.7 19.1 7.8 4.7 2.9
dBBAT053-P253 15.0 8.4 46.9 40.4 9.6 6.9 1.9
dBBAT056-P253 20.3 13.4 59.4 50.7 12.8 9.7 3.7
dBBAT118-P253 27.7 14.1 76.9 62.9 14.9 8.7 3.3
dBBAT121-P253 11.5 4.8 42.3 24.7 6.1 2.6 1.9
dBBAT122-P253 11.5 4.7 55.5 19.2 5.7 4.1 3.3
dBBAT134-P253 5.2 4.4 29.3 16.2 3.7 4.5 3.0
dBBAT091-P253 6.2 3.0 33.0 20.0 2.9 3.3 1.5
dBBAT112-P253 12.6 6.3 43.0 27.4 6.5 4.8 3.7
dBBAT119-P253 45.7 12.9 112.5 67.2 58.6 26.9 3.3
（2-5-3） 對猿CD137抗原的結合活性評價 獲得的抗體是否和猿CD137結合，以ELISA評價。首先，將參考實施例1製作的cyCD137-Fc-BAP固定在Streptawell微滴定盤。將該盤各孔以清洗緩衝液（wash buffer）洗淨，去除未結合於盤的抗原後，該孔以阻斷緩衝液 （含2%BSA的TBS） 150 μL進行1小時以上的阻斷。在去除阻斷緩衝液的各孔，添加含終濃度1mM ADP的TBS或以含終濃度1mM ADP的TBS稀釋之純化的抗體各孔100μL。添加抗體的該盤以600rpm震盪1小時。以含終濃度1mM ADP的清洗緩衝液（含0.1%Tween20的TBS）洗淨後，以含終濃度1mM ADP的TBS稀釋的AP結合抗人類λ抗體（BETHYL）添加於各孔。1小時培養後，以含終濃度1mM ATP的清洗緩衝液洗淨後，添加BluePhos磷酸鹽基質（BluePhos phosphate substrate；KPL）。測量該顯色在600nm的吸光度。對抗體濃度為0μg/mL時的吸光度之增加率如表34所示。濃度依賴的吸光度的比增加的樣本，稱為和猿CD137結合。
吸光度的比 ［表34］
猿CD137 dBBAT007 dBBAT013 dBBAT015 dBBAT017 dBBAT019 dBBAT021 dBBAT025 dBBAT029 dBBAT037 dBBAT042
抗體濃度［μg/ml］ 10 30.5 43.2 42.9 25.6 40.5 40.5 72.0 50.3 32.5 41.8
2.5 30.2 42.4 32.4 8.7 40.3 14.0 67.6 42.7 12.7 40.0
0.625 29.2 33.3 14.4 3.1 39.1 4.6 49.7 26.7 4.6 31.3
0.156 22.0 15.3 3.6 1.4 23.7 1.7 20.7 9.7 1.9 12.2
0.039 0.7 4.2 1.5 1.2 8.2 1.2 4.5 2.0 1.3 2.9
0.010 3.8 1.5 1.1 1.2 2.5 0.9 1.6 1.1 1.1 1.3
0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
                       
    dBBAT053 dBBAT056 dBBAT091 dBBAT112 dBBAT118 dBBAT119 dBBAT121 dBBAT122 dBBAT134  
抗體濃度［μg/ml］ 10 17.9 23.1 15.1 19.8 35.4 55.3 26.0 31.9 33.9  
2.5 6.9 10.7 5.5 8.1 30.6 56.6 16.4 16.7 16.8  
0.625 2.3 3.6 1.7 2.8 18.1 57.2 5.9 5.7 5.8  
0.156 1.0 1.3 0.7 1.0 7.1 47.7 1.3 1.9 2.2  
0.039 0.7 0.8 0.5 0.6 1.8 26.6 0.6 1.0 1.2  
0.010 0.8 1.2 0.6 0.6 1.0 10.2 0.6 0.9 1.0  
0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0  
（2-5-4） 使用Jurkat細胞評價CD137促效劑活性 活體外（in vitro）抗體活性測量使用GloResponseTM NF-κB-Luc2/4-1BB Jurkat細胞株（Promega）。在384孔微量盤的各孔，各加入以分析培養基（99% RPMI, 1% FBS）調配成濃度2×106 /mL的FcγRIIB CHO-K1 細胞 （Promega） 10μL。接著，將含ADP的抗體溶液、或含ATP的抗體溶液、或不含ATP或ADP的抗體溶液分別加入孔10μL。之後，各孔加入以分析培養基（99% RPMI, 1% FBS）調配成2×106 /mL的GloResponseTM NF-κB-Luc2/4-1BB Jurkat細胞株10μL。ADP的最終濃度為50μM，ATP的最終濃度為50μM。將微量盤靜置於5% CO2 培養箱內37℃、6小時之後，在室溫靜置15分鐘，各孔加入Bio-Glo試劑（Bio-Glo reagent） 30μL。Bio-Glo試劑用於Bio-Glo螢光素酶分析系統（緩衝液和基質）。之後，各孔的發光量以微量盤檢測儀（plate reader）測量。各孔的發光值除以未添加抗體的孔的發光值之比值為發光倍數（luminescence fold），做為評價各抗體活性的指標。 所得結果如圖22及圖23所示。根據圖22及圖23，確認除了非轉換抗體NS1-P253以外，所有的抗體皆顯示ATP及ADP依賴的人類CD137促效劑活性。
（2-6） 使用人類T細胞評價淘選獲得的轉換抗體在活體外的CD137促效劑活性 （2-6-1） 人類T細胞的擴大培養 使用從健康自願者的血液分離的人類末梢血液單核球。在50ml血液混合0.5ml肝素，再以50ml的PBS稀釋。人類末梢血液單核球以下列2步驟分離。第1步驟，將添加有Ficoll-Paque PLUS （GE Healthcare）的Leucosep （greiner bio-one）室溫下離心1000xg、1分鐘後，添加以PBS稀釋的血液，室溫下離心400xg、30分鐘。第2步驟，從離心後的離心管收集膚色血球層（buffy coat）後，以60 mL的PBS （Wako）洗淨。之後，使用T 細胞活化/擴增套組/人類 （MACS Miltenyi biotec）進行T細胞的擴大培養。
（2-6-2） 使用人類T細胞評價活體外CD137促效劑活性 將來自人類末梢血液單核球的T細胞2×104 個及REC-1細胞2×104 個、對照抗體之IC17HdK-hIgG1/IC17L-k0、具有ATP非依賴的人類CD137結合活性的抗體（如實施例及參考實施例稱為「非轉換抗體」或「非轉換CD137抗體」） NS1-P253、或表32所記載之選殖株，皆懸浮於含有30 U/mL人類IL-2（SIGMA）、10 ng/mL PMA（SIGMA）、0.5 μg/mL 離子黴素（Ionomycin）、500 μM ADPbetaS（Sigma）、10% FBS （Sigma）的RPMI1640培養基100 μL，接種於96孔平底附蓋的多孔微量盤（Corning）。評價10 μg/mL的NS1-P253、IC17HdK-hIgG1/IC17L-k0、及表32所載之選殖株。也評價在不含ADPbetaS的培養基中的IFN-γ的產生。使微量盤震盪後，在37℃、5%CO2 的培養箱內靜置72小時。之後收集培養上清液，使用人類IFN-γ ELISA顯色套組（PeproTech）定量培養上清液中所含的IFN-γ量。ELISA根據套組業者（PeproTech）的說明進行。吸光度的測量在EnVision（PerkinElmer）進行。 結果如圖24所示。 確認dBBAT007-P253、dBBAT013-P253、dBBAT015-P253、dBBAT019-P253、dBBAT021-P253、dBBAT025-P253、dBBAT031-P253、dBBAT042-P253、dBBAT056-P253、dBBAT118-P253、dBBAT121-P253、dBBAT122-P253、dBBAT119-P253顯示ADPbetaS依賴的人類CD137促效劑活性。和ADP相比，ADPbetaS為不易被水解的ADP類似物（analogue）。由此顯示，這些人類CD137轉換抗體顯示ATP、ADP、AMP等的小分子依賴的人類CD137促效劑活性的可能性。
（2-6-3） 使用人類T細胞評價活體外CD137促效劑活性（2） 將來自人類末梢血液單核球的T細胞2×104 個及REC-1細胞2×104 個、NS1-P253（非轉換抗體）或dBBAT119-P253，皆懸浮於含有30 U/mL人類IL-2 （SIGMA）、10 ng/mL PMA （SIGMA）、0.5 μg/mL 離子黴素（Ionomycin）、500 μM ADPbetaS （Sigma）、10% FBS （Sigma）的RPMI1640培養基100 μL，接種於96孔平底附蓋的多孔微量盤（Corning）。評價10、2、0.4、0.08、0.016、0.0032、0.00064 μg/mL 的NS1-P253及dBBAT119-P253。使微量盤震盪後，在37℃、5%CO2 的培養箱內靜置72小時。之後收集培養上清液，使用人類IFN-γ ELISA顯色套組（PeproTech）定量培養上清液中所含的IFN-γ量。ELISA根據套組業者（PeproTech）的說明進行。吸光度的測量在EnVision（PerkinElmer）進行。 結果如圖25所示。 確認dBBAT119-P253在ADPbetaS存在下顯示人類CD137促效劑活性。由此顯示，dBBAT119-P253顯示ATP、ADP、AMP等的小分子依賴的人類CD137促效劑活性的可能性。
參考實施例3：使用理論設計的輕鏈及重鏈庫之小分子存在下和抗原結合之抗體的結合活性增加 （3-1） 使用理論設計的輕鏈庫構築結合活性增加用的庫 對於包含多數的參考實施例2-2-1所收集之具有ATP依賴的抗原結合活性之抗體的抗體庫，再將抗體輕鏈進行庫化，實施結合活性的增加。 為了構築增加結合活性用的抗體輕鏈庫及抗體重鏈庫，使用先前專利WO2015/083764所構築的理論設計抗體噬菌體展示庫的輕鏈區域和重鏈區域。上述輕鏈庫或參考實施例2-2-1所收集的噬菌粒載體庫導入輕鏈區域及重鏈區域，以電穿孔法導入大腸桿菌ER2738株。
（3-2） 使用理論設計庫之具有ATP依賴的抗原結合活性的抗體的結合活性增加 從保有已構築的噬菌體展示用的噬菌粒的大腸桿菌，以一般方法產生噬菌體。具體為，使保有已構築的噬菌粒載體的大腸桿菌感染M13KO7TC （WO2015/046554）或M13KO7ΔpIII （超噬菌體（hyperphage））（PROGEN Biotechnik），在30℃培養一晚，從上清液中收集噬菌體。將在產生噬菌體的大腸桿菌培養液添加2.5M NaCl/10% PEG而沉澱的噬菌體群以TBS稀釋，得到噬菌體庫液。之後在該噬菌體庫液以達到終濃度為4%的方式添加BSA。使用固定在磁珠的抗原，進行淘選。磁珠使用NeutrAvidin coated beads （Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated）、NeutrAvidin beads （TAMAGAWA SEIKI）或Dynabeads MyOne StreptAvidin T1 （Thermo Fisher Scientific）。抗原使用生物素化hCD137-Fc。
進行用於有效率獲得在癌組織可完成轉換作用的小分子依賴的小分子轉換抗體之淘選。具體為，使在小分子之三磷酸腺苷（adenosine 5'-triphosphate; ATP）存在下和抗原結合、在ATP不存在下和抗原不結合的抗體濃縮之淘選，參考先前專利WO2015/083764所示方法實施。
（3-3） 以噬菌體ELISA評價ATP存在下及不存在下的結合活性 從上述方法所得到的大腸桿菌單一菌群，根據常法（Methods Mol. Biol. （2002） 178, 133-145），收集含有噬菌體的培養上清液。之後根據參考實施例2-2-2記載之方法，以噬菌體ELISA確認ATP存在下及不存在下對人類CD137的結合活性。 結果如圖26所示。 獲得多數判定為在抗原存在下/不存在下的吸光度的S/N比超過2、且在ATP存在下/不存在下的吸光度的S/N比超過2之具有ATP依賴的抗原結合活性的選殖株（轉換選殖株）。
參考實施例4：改變的CD137抗體的製作及其活性評價 （4-1） 因dBBAT119H-P253/dBBAT119L-LamLib的改變之結合活性的增加 參考實施例2-4所獲得的抗CD137抗體（選殖名：dBBAT119H-P253 /dBBAT119L-LamLib）的重鏈可變區dBBAT119H、輕鏈可變區dBBAT119L的改變體，以PCR等的此技術領域公知方法製作。製作在重鏈可變區，dBBAT119H的D10（表示第10位（Kabat編號）的天冬胺酸（Asp））及G17（表示第17位（Kabat編號）的甘胺酸（Gly））分別被取代為甘胺酸（Gly）及絲胺酸（Ser）之dBBAT119H010的N99（表示第99位（Kabat編號）的天冬醯胺酸（Asn））、M100a（表示第100a位（Kabat編號）的甲硫胺酸（Met））、及N100b（表示第100b位（Kabat編號）的天冬醯胺酸（Asn））被其他胺基酸取代之改變體。製作在輕鏈可變區，dBBAT119L的 F87（表示第87位（Kabat編號）的苯丙胺酸（Phe））取代為酪胺酸（Tyr）之dBBAT119L010的D27b（表示第27b位（Kabat編號）的天冬胺酸（Asp））、N31（表示第31位（Kabat編號）的天冬醯胺酸 （Asn））、及D94（表示第94位（Kabat編號）的天冬胺酸（Asp））被其他胺基酸取代之改變體。
對於重鏈可變區的改變體，以表面電漿共振分析儀BiacoreT200 （GE Healthcare）測量對人類CD137的結合活性。對系列S感應晶片CM3 （GE Healthcare）上固定有蛋白G （protein G） （CALBIOCHEM）的晶片，和純化的改變體進行交互作用，捕捉抗體。之後，使添加ATP的人類CD137（分解的FXa）或未添加ATP的人類CD137（分解的FXa）溶液進行交互作用，評價在ATP存在下及ATP不存在下改變體和人類CD137（分解的FXa）的結合活性。實驗緩衝液（running buffer）使用20 mM ACES、150 mM NaCl、0.05% Tween20、2 mM MgCl2 、pH7.4，在25℃進行測量。測量結果，L100a改變體（第100a位（Kabat編號）的甲硫胺酸（Met）取代為白胺酸（Leu）的改變體），只有在ATP存在下，對人類CD137的結合活性增加（圖27）。該L100a改變體的重鏈可變區為dBBATk119H024（序列識別號：132）。人類CD137結合量以各改變體的捕捉量（1000RU）校正。
對於輕鏈可變區的改變體，以上述相同條件經BiacoreT200測量對人類CD137（分解的FXa）的結合活性。測量結果，E94改變體（第94位（Kabat編號）的天冬胺酸（Asp）取代為麩胺酸（Glu）的改變體），只有在ATP存在下，對人類CD137的結合活性增加（圖27）。該E94改變體的輕鏈可變區為dBBATk119L020 （序列識別號：133）。 組合此等重鏈改變體及輕鏈改變體之該改變體，簡稱為dBBATk119H024-P253/ dBBATk119L020-LamLib （重鏈可變區序列識別號：132，輕鏈可變區序列識別號：133，重鏈恆定區序列識別號：93，輕鏈恆定區序列識別號：63）。 本說明書中的抗體根據以下規則命名：（重鏈可變區）-（ 重鏈恆定區）/（輕鏈可變區）-（ 輕鏈恆定區）。 例如，稱為dBBAT119H-P253/dBBAT119L-LamLib的抗體名表示，該抗體的重鏈可變區為dBBAT119H，重鏈恆定區為P253，輕鏈可變區為dBBAT119L，輕鏈恆定區為LamLib。
（4-2） 使用人類T細胞評價改變的抗人類CD137抗體的活體外的CD137促效劑活性 （4-2-1） 人類T細胞的擴大培養 根據參考實施例2-6-1記載之方法，擴大培養人類T細胞。 （4-2-2） 使用人類T細胞評價活體外的CD137促效劑活性 根據參考實施例2-6-2記載之方法，評價NS1-P253（非轉換抗體）或dBBAT119H-P253/dBBAT119L-LamLib或dBBATk119H024-P253/ dBBATk119L020-LamLib、或者對照抗體IC17HdK-hIgG1/IC17L-k0各別在10、2、0.4、0.08、0.016 μg/mL存在下的IFN-γ的產生量。也評價在不含有ADPbetaS的培養基中的IFN-γ的產生量。 合併結果如圖28所示。 改變的dBBATk119H024-P253/dBBATk119L020-LamLib顯示較dBBAT119H-P253/dBBAT119L-LamLib強的ADPbetaS依賴的促效劑活性。由此顯示，dBBATk119H024-P253/dBBATk119L020-LamLib顯示較dBBAT119H-P253 /dBBAT119L-LamLib強的ATP、ADP、AMP等的小分子依賴的人類CD137促效劑活性的可能性。
參考實施例5：CD137的進一步改變 （5-1） 經由網羅性的導入而使結合活性增加的改變之探索 為了製作更優良的抗CD137抗體，對參考實施例4-1所製作的抗CD137抗體的重鏈可變區dBBATk119H024及輕鏈可變區dBBATk119L020，網羅性地導入胺基酸改變。經由PCR等此技術領域公知的方法，對各個構成dBBATk119H024及dBBATk119L020的CDR的全長胺基酸殘基，分別製作除了半胱胺酸外、全長18個胺基酸的取代的改變體。使用Biacore4000進行所製作的約1200個改變體對人類CD137的結合測量。對於系列S感應晶片CM3（GE Healthcare）上固定有蛋白G（CALBIOCHEM）的晶片，和改變體的培養上清液進行交互作用，捕捉抗體。之後，使添加小分子（ATP）的人類CD137或未添加小分子的人類CD137溶液交互作用，評價在小分子存在下及小分子不存在下的抗體對人類CD137的結合活性。實驗緩衝液（running buffer）使用20 mM ACES、150 mM NaCl、0.02% Tween20、2 mM MgCl2 、pH7.4、添加CaCl2 的溶液，在25℃進行測量。
（5-2） ATP結合的增加 對於重鏈可變區具有dBBATk119H024（序列識別號：132）、重鏈恆定區的人類IgG1導入S267E/L328F的改變、且去除C端的Gly及Lys的P253 （序列識別號：93）之dBBATk119H024-P253之基因，組合參考實施例5-1發現的在小分子存在下對人類CD137的結合活性增加的改變，製作抗體重鏈基因A002-P253 （序列識別號：134）。對於輕鏈可變區具有dBBATk119L020（序列識別號：133）、輕鏈恆定區具有人類λ鎖Lamlib （序列識別號：63）之抗體輕鏈dBBATk119L020-Lamlib，組合參考實施例5-1發現的在小分子存在下對人類CD137的結合活性增加的改變，製作抗體輕鏈基因B040-Lamlib （序列識別號：135）。組合這些基因，以此技術領域公知方法使抗體表現、純化，製作目標的抗CD137抗體A002-P253/B040-Lamlib。A002-P253/B040-Lamlib的重鏈可變區為A002（序列識別號：136），輕鏈可變區為B040（序列識別號：137），重鏈恆定區為P253（序列識別號：93），輕鏈恆定區為人類λ鏈Lamlib（序列識別號：63）。 對於本項目所製作的A002-P253/B040-Lamlib的重鏈可變區，  以增加ATP的結合活性為目的，製作將Kabat編號第53位、第54位或第55位的胺基酸取代為其他胺基酸的各種改變體。表35顯示在所製作的抗體的重鏈可變區，從A002開始的胺基酸改變（Kabat編號）。
［表35］
重鏈可變區域 從A002開始的胺基酸改變（Kabat編號）
A002 -
A146 S54A/N55S
A159 R53S/N55S
A160 R53T/N55S
A161 R53Q/N55S
A162 R53K/N55S
A163 R53H/N55S
A164 R53S/N55T
A165 R53T/N55T
A166 R53Q/N55T
A167 R53K/N55T
A168 R53H/N55T
A169 R53S/N55H
A170 R53T/N55H
A171 R53Q/N55H
所製作的改變體對ATP的結合活性及對人類CD137的結合活性，以Biacore T200評價。 對ATP的結合活性的測量，使用實驗緩衝液20 mM ACES （pH7.4）、150 mM NaCl、2 mM MgCl2 、0.05% Tween20，在37℃進行。首先，對系列S感應晶片 CM3（GE Healthcare）上固定有確定蛋白A （Sure Protein A） （GE Healthcare）的晶片，和實驗緩衝液所調配的抗體溶液進行交互作用，捕捉抗體。之後，和實驗緩衝液所調配的ATP溶液交互作用，評價和抗體的結合活性。晶片使用25 mM NaOH和10 mM 甘胺酸鹽酸鹽 （Glycine-HCl）（pH 1.5）再生，重複捕捉抗體進行測量。各抗體對ATP的結合量，以晶片表面捕捉的抗體的量校正注入100nm濃度的ATP時的結合量，計算每單位抗體量的ATP結合量。
對人類CD137的結合活性的測量，使用實驗緩衝液20 mM ACES（pH7.4）、150 mM NaCl、2 mM MgCl2 、0.05% Tween20，在37℃進行。首先，對系列S感應晶片 CM3（GE Healthcare）上固定有確定蛋白A （Sure Protein A） （GE Healthcare）的晶片，和實驗緩衝液所調配的抗體溶液進行交互作用，捕捉抗體。之後，和添加100 μM 的ATP的人類CD137溶液交互作用，評價和人類CD137的結合活性。做為抗原之人類CD137使用參考實施例（1-1）製作的hCD137-HisBAP，在抗原濃度0、15.625、62.5、250、1000nM時進行測量。晶片以25 mM NaOH和10 mM 甘胺酸鹽酸鹽 （pH 1.5）再生，重複捕捉抗體進行測量。各抗體對人類CD137的解離常數（KD）以Biacore T200 評價軟體2.0（Biacore T200 Evalution software 2.0）計算。具體為，從測量所得的傳感圖，以1：1朗繆耳結合模式（Langmuir binding model）整體擬合（global fitting），計算結合速度常數ka（L/mol/s）、解離速度常數kd（1/s），再由該等數值計算解離常數KD（mol/L）。 表36顯示此等測量結果。
對ATP及人類CD137的結合分析 ［表36］
對人類CD137的結合參數（ATP＝100μM）
抗體名稱 對ATP的結合 ka kd KD
A002-P253/B040-Lamlib -0.0001 3.94E+04 2.89E-03 7.35E-08
A146-P253/B040-Lamlib -0.0001 7.80E+04 2.32E-02 2.97E-07
A159-P253/B040-Lamlib 0.0013 8.21E+04 3.83E-02 4.66E-07
A160-P253/B040-Lamlib -0.0001 9.59E+03 2.46E-02 2.56E-06
A161-P253/B040-Lamlib 0.0010 1.87E+04 2.35E-02 1.25E-06
A162-P253/B040-Lamlib 0.0002 1.47E+05 3.17E-02 2.16E-07
A163-P253/B040-Lamlib 0.0016 5.60E+04 1.36E-02 2.43E-07
A164-P253/B040-Lamlib 0.0017 9.81E+04 4.38E-02 4.46E-07
A165-P253/B040-Lamlib 0.0002 1.14E+04 1.96E-02 1.72E-06
A166-P253/B040-Lamlib 0.0011 1.21E+04 1.92E-02 1.59E-06
A167-P253/B040-Lamlib 0.0001 8.45E+04 3.96E-02 4.69E-07
A168-P253/B040-Lamlib 0.0017 7.01E+04 1.81E-02 2.58E-07
A169-P253/B040-Lamlib 0.0011 1.15E+04 5.88E-03 5.11E-07
A170-P253/B040-Lamlib 0.0000 5.13E+03 5.36E-03 1.04E-06
A171-P253/B040-Lamlib 0.0012 4.93E+03 5.24E-03 1.06E-06
如表36所示，重鏈可變區的Kabat編號第53、54、或55號的胺基酸取代為其他胺基酸之改變體，除了A146-P253/B040-Lamlib及A160-P253/B040-Lamlib以外的所有改變體，和導入改變前的抗體A002-P253/B040-Lamlib相比，對ATP的結合活性增加。又從結合速度常數ka（L/mol/s）的比較來看，上述評價的抗體中，關於A146-P253/B040-Lamlib、A159-P253/B040-Lamlib、A162-P253/B040-Lamlib、A163-P253/B040-Lamlib、A164-P253/B040-Lamlib、A167-P253/B040-Lamlib及A168-P253/B040-Lamlib，顯示對人類CD137的結合速度常數增加。
（5-3） 因網羅性的改變的導入而使結合活性的增加 為了製作更優良的抗CD137抗體，組合參考實施例5-1發現的小分子存在下對人類CD137的結合活性增加的改變、及在小分子不存在的條件下對人類CD137的結合降低的改變、以及參考實施例5-2發現的對ATP的結合活性增加、對人類CD137的結合速度常數增加的改變，製作顯示更優良輪廓（profile）的抗人類CD137抗體。對於重鏈可變區具有A002 （序列識別號：136）、重鏈恆定區的人類IgG1導入K214R/Q419E的改變、且具有去除C端的Gly及Lys的G1T3 （序列識別號：138）的抗體重鏈A002-G1T3之基因，組合參考實施例5-1及5-2發現的改變，製作抗體重鏈基因。又，對於輕鏈可變區具有B040 （序列識別號：137）、輕鏈恆定區具有人類λ鎖Lamlib之抗體輕鏈B040-Lamilib，組合參考實施例5-1發現的改變，製作抗體輕鏈基因。
又，製作比較對象，組合US8137667記載之已知的抗CD137抗體的重鏈可變區20H4.9 （序列識別號：139）及作為重鏈恆定區具有P253 （序列識別號：93）之抗體重鏈20H4.9-P253的基因，以及輕鏈可變區20H4.9LC（序列識別號：140）及作為輕鏈恆定區之人類κ鏈k0 （序列識別號：141），製作抗體輕鏈的基因。又，製作別的比較對象，組合US8337850記載之構成已知抗CD137抗體MOR-7480.1的重鏈可變區MOR-7480.1H （序列識別號：142）及作為重鏈恆定區具有P253 （序列識別號：93）之抗體重鏈MOR-7480.1H-P253的基因，以及輕鏈可變區MOR-7480.1L （序列識別號：143）及作為輕鏈恆定區之人類λ鏈lam （序列識別號：63），製作抗體輕鏈MOR-7480.1L-lam的基因 （人類λ鏈Lamlib和lam皆為相同的胺基酸序列（序列識別號：63））。 組合此等基因，以此技術領域公知方法使抗體表現、純化，製作目標抗CD137抗體。表37為所製作的重鏈可變區、輕鏈可變區、重鏈恆定區、輕鏈恆定區、及超可變區域（Hyper Variable Region，也稱為HVR或CDR）的序列一覽表。
重鏈、輕鏈、及該等的超可變區域的胺基酸序列（以序列識別號表示） ［表37］
抗體名稱 可變區域 恆定區域 超可變區域（HVR）
重鏈 輕鏈 重鏈 輕鏈 H1 H2 H3 L1 L2 L3
A375-G1T3/B167-Lamlib 43 54 138 63 7 8 17 21 26 27
A372-G1T3/B040-Lamlib 44 55 138 63 7 9 17 22 26 27
A356-G1T3/B040-Lamlib 45 55 138 63 7 10 17 22 26 27
A486-G1T3/B167-Lamlib 46 54 138 63 7 11 18 21 26 27
A487-G1T3/B167-Lamlib 47 54 138 63 7 8 18 21 26 27
A488-G1T3/B226-Lamlib 48 56 138 63 7 12 18 21 26 28
A489-G1T3/B223-Lamlib 49 57 138 63 7 13 18 21 26 29
A548-G1T3/B376-Lamlib 50 58 138 63 7 14 19 23 26 27
A551-G1T3/B256-Lamlib 51 59 138 63 7 15 20 24 26 27
A551-G1T3/B379-Lamlib 51 60 138 63 7 15 20 25 26 27
A555-G1T3/B379-Lamlib 52 60 138 63 7 16 20 25 26 27
A548-G1T3/B256-Lamlib 50 59 138 63 7 14 19 24 26 27
A549-G1T3/B167-Lamlib 53 54 138 63 7 14 17 21 26 27
所製作的改變體對ATP的結合及對人類CD137的結合，以Biacore T200評價。對人類CD137的結合測量，使用實驗緩衝液20 mM ACES（pH7.4）、150 mM NaCl、2 mM MgCl2 、0.05% Tween20，在37℃進行。首先，對系列S感應晶片CM3 （GE Healthcare）上固定有確定蛋白A （Sure Protein A）（GE Healthcare）的晶片，和實驗緩衝液所調配的抗體溶液進行交互作用，捕捉250～400RU的抗體。之後，以成為目標濃度的方式添加ATP的實驗緩衝液所調配的人類CD137溶液、或者不含ATP的實驗緩衝液所調配的人類CD137溶液進行交互作用，評價ATP存在下、及ATP不存在下，和人類CD137的結合活性。作為抗原的人類CD137使用參考實施例（1-1）製作的hCD137-HisBAP，在抗原濃度0、15.625、62.5、250、1000nM時進行KD值的測量。關於結合量的評價，在抗原濃度為0、1000nM時進行測量。晶片以25 mM NaOH和10 mM 甘胺酸鹽酸鹽 （pH 1.5）再生，重複捕捉抗體進行測量。各抗體對人類CD137的解離常數以Biacore T200 評價軟體2.0計算。具體為，從測量所得的傳感圖，以1：1朗繆耳結合模式（Langmuir binding model）整體擬合，計算結合速度常數ka（L/mol/s）、解離速度常數kd（1/s），再由該等數值計算解離常數KD（mol/L）。 表38顯示此等測量結果。
改變抗體對人類CD137的結合分析 ［表38］
  對人類CD137的結合 對人類CD137的KD （M）
抗體名稱 無ATP ATP＝ 1µM ATP＝ 10µM ATP＝ 100µM ADP＝ 10µM AMP＝ 10µM 無ATP ATP＝ 1µM ATP＝ 10µM ATP＝ 100µM ADP＝ 10µM AMP＝ 10µM
20H4.9-P253/20H4.9LC-k0 0.280 0.283 0.283 0.283 0.287 0.287 2.68E-08 2.17E-08 2.03E-08 2.04E-08 1.90E-08 2.17E-08
MOR-7480.1H-P253/ MOR-7480.1L-lam 0.260 0.261 0.261 0.261 0.266 0.266 8.22E-08 8.40E-08 7.50E-08 6.31E-08 7.30E-08 8.46E-08
A375-G1T3/B167-Lamlib 0.053 0.179 0.255 0.275 0.280 0.276 N.A. 4.43E-07 6.17E-08 1.35E-08 5.43E-09 8.91E-07
A372-G1T3/B040-Lamlib 0.017 0.135 0.242 0.269 0.284 0.245 N.A. 1.14E-06 1.58E-07 5.25E-08 9.36E-09 1.47E-07
A356-G1T3/B040-Lamlib 0.008 0.083 0.211 0.262 0.278 0.255 N.A. N.A. 4.90E-07 1.19E-07 3.31E-08 1.34E-07
A486-G1T3/B167-Lamlib 0.128 0.260 0.282 0.292 0.294 0.289 1.04E-06* 7.30E-08 1.08E-08 3.22E-09 2.48E-09 4.33E-09
A487-G1T3/B167-Lamlib 0.110 0.229 0.270 0.282 0.283 0.279 1.43E-06* 1.63E-07 2.70E-08 7.33E-09 3.01E-09 3.86E-09
A488-G1T3/B226-Lamlib 0.042 0.135 0.232 0.268 0.281 0.261 N.A. 4.24E-07 1.33E-07 5.77E-08 1.60E-08 6.80E-08
A489-G1T3/B223-Lamlib 0.004 0.095 0.214 0.257 0.276 0.261 N.A. 4.42E-06 3.45E-07 1.59E-07 5.45E-08 1.05E-07
A548-G1T3/B376-Lamlib 0.012 0.149 0.245 0.270 0.270 0.262 N.A. 6.75E-07 7.69E-08 1.53E-08 1.55E-08 3.71E-08
A551-G1T3/B256-Lamlib 0.006 0.133 0.254 0.285 0.285 0.275 N.A. 1.23E-06 1.44E-07 2.91E-08 2.81E-08 6.12E-08
A551-G1T3/B379-Lamlib 0.014 0.173 0.271 0.290 0.291 0.283 N.A. 5.59E-07 7.17E-08 1.58E-08 1.51E-08 3.25E-08
A555-G1T3/B379-Lamlib 0.017 0.180 0.267 0.282 0.282 0.274 N.A. 4.77E-07 5.84E-08 1.35E-08 1.31E-08 2.75E-08
A548-G1T3/B256-Lamlib 0.009 0.156 0.257 0.284 0.287 0.276 N.A. 9.31E-07 1.08E-07 2.63E-08 2.14E-08 4.61E-08
A549-G1T3/B167-Lamltb 0.048 0.209 0.261 0.277 0.279 0.272 N.A. 2.04E-07 2.83E-08 6.12E-09 5.53E-09 1.35E-08
N.A.：在KD值的確認上過弱。 *KD值以穩定狀態模式確認。
上述表38中的「對人類CD137的結合」的值表示，在所記載的各ATP濃度條件下，人類CD137以1000nM進行交互作用之時的每單位抗體量之人類CD137的結合量，「對人類CD137的KD（M）」的值表示，在各ATP濃度條件下對人類CD137的解離常數。表中帶有*號的KD值，是在穩定狀態模式（steady state model）計算出來。所製作的改變體皆顯示，相較於ATP為1μM存在的條件，在ATP為10μM存在下的結合量較多，而且在100μM存在下的結合量更多，因此顯示ATP濃度依賴地和人類CD137的結合。另一方面，比較對象20H4.9-P253/20H4.9LC-k0及MOR-7480.1H-P253/MOR-7480.1L-lam未顯示ATP濃度依賴地和人類CD137的結合。
（5-4） 使用4-1BB Jurkat報導基因分析法評價改變的抗人類CD137抗體的活體外ATP依賴的CD137促效劑活性 所製作的改變體的活體外活性測量，使用GloResponseTM NF-κB-Luc2/4-1BB Jurkat細胞株 （Promega, CS196004）。在96孔微量盤的各孔，各加入以培養基調配成濃度5×104 /mL的FcγRIIB CHO-K1 細胞 （Promega） 200μL，於5% CO2 培養箱內37℃靜置一晚。培養基使用CHO培養基（90% Ham’s F12, 10% FBS）。之後，吸除所有培養基後，對各孔加入以分析培養基（99% RPMI, 1% FBS）調配成濃度2×106 /mL的GloResponseTM NF-κB-Luc2/4-1BB Jurkat細胞株25μL。接著，分別加入以分析培養基稀釋成最終濃度為0、0.001、0.01、0.1、1、10 μg/mL的各抗體溶液25μL，最後加入以分析培養基稀釋成最終濃度為0、250μM的ATP溶液25μL。將微量盤靜置於5% CO2 培養箱內37℃、6小時之後，在室溫靜置15分鐘，各孔加入Bio-Glo試劑（Bio-Glo reagent） 75μL。Bio-Glo試劑用於Bio-Glo螢光素酶分析系統（緩衝液和基質）。之後，各孔的發光量以微量盤檢測儀測量。各孔的發光值除以未添加抗體的孔的發光值之比值作為相對發光量（fold induction），做為評價各抗體的CD137促效劑活性的指標。 結果如圖29所示。
（5-5） 使用人類末梢血液單核球評價改變的抗人類CD137抗體的活體外ATP依賴的CD137促效劑活性 （5-5-1） 人類末梢血液單核球的分離 根據參考實施例2-6-1記載之方法，從申請人本公司內健康自願者的血液，分離出分離的人類末梢血液單核球（PBMC）。之後以培養基（5%人類血清（SIGMA）、95%AIM-V （Thermo Fischer Scientific）稀釋至細胞密度5×106 /mL。
（5-5-2） 使用人類末梢血液單核球評價CD137促效劑活性 將人類末梢血液單核球調整為細胞密度為5×106 /mL，以每100 μL接種於96孔平底附蓋的多孔微量盤（Corning）。之後，添加以培養基稀釋的0.04 μg/mL抗人類CD3ε抗體（BD社製，選殖株SP34）及20 μg/mL抗人類CD28抗體（BD，選殖株：CD28.2） 50 μL。使微量盤震盪後，在37℃、5%CO2 的培養箱內靜置6小時。之後各孔添加以培養基稀釋的2 mM ATP（SIGMA）或不含ATP只有培養基25 μL和40 μg/mL的各抗體25μL，使微量盤震盪後，在37℃、5%CO2 的培養箱內靜置18小時。之後收集部分的培養上清液，使用培養上清液，培養上清液中所含的IL-2量使用人類IL-2 DuoSetELISA套組（R&D systems）或人類 IL-2 ELISA組 （BD Biosciences）定量。收集培養上清液後，微量盤再於37℃、5%CO2 的培養箱內靜置24小時。之後收集部分的培養上清液，培養上清液中所含的IFN-γ量使用人類 IFN-γ DuoSetELISA套組（R&D systems）或人類IFN-γ ELISA 顯色套組（PeproTech） 定量。ELISA基本上根據套組所附的操作說明實施。關於人類IL-2 DuoSetELISA套組（R&D systems）及人類 IFN-γ DuoSetELISA套組（R&D systems），使用H2 O2 及含四甲基聯苯胺（tetramethylbenzidine）基質溶液（R&D systems）及1N H2 SO4 （Wako），根據操作說明進行顯色及停止顯色。關於人類 IL-2 ELISA 組（BD Biosciences），使用1N H2 SO4 （Wako）停止顯色。關於IFN-γ ELISA顯色套組（PeproTech），使用TMB 色母質溶液（TMB Chromogen Solution）（Thermo Fischer Scientific）及1N H2 SO4 （Wako）進行顯色及停止顯色。之後，吸光度的測量在EnVision（PerkinElmer）進行。 結果於參考實施例5-5-3以下詳述。
（5-5-3） 經由使重鏈恆定區對Fcγ受體的結合活性增加評價促效劑活性的增強 根據參考實施例5-5-1及參考實施例5-5-2所記載之使用人類末梢血液單核球的活體外評價，使用重鏈恆定區對FcγRIIb的結合活性增加的P587、MY518、TT14、TT16，評價對CD137促效劑活性的影響。 評價的抗體如表39所示。 表39所記載之抗體的製作，記載於參考實施例7-1。對於在250 μM ATP存在的條件下，和添加陰性對照抗體（IC17HdK-MY518/IC17L-k0、IC17HdK-G4d/IC17L-k0）的情形的培養上清液中IL-2及IFN-γ的量相比，確認因該抗體的添加而使培養上清液中IL-2的量增加1.05倍以上、且IFN-γ的量增加1.15倍以上之抗體，判斷為顯示CD137促效劑活性。又使用人類末梢血液單核球（PBMC）的促效劑活性的測量，每一位血液樣本供應者（提供者）之間會有差異。考慮此點，對於自複數個提供者分離的人類PBMC的一部分或過半數未顯示CD137促效劑活性之抗體，即使在另外一部份的人類PBMC符合促效劑活性的基準，也可不判定為顯示CD137促效劑。
判斷為在250 μM ATP存在的條件下顯示CD137促效劑活性之抗體如表39所示。由此顯示，在組合重鏈恆定區對FcγRIIb的結合活性增加的P587、TT16者，CD137促效劑活性增強（圖30及圖31）。在抗體對CD137表現細胞顯示促效劑活性之時，經由對必要的、成為交聯骨架的FcγRIIb表現細胞的結合活性增加，被認為促效劑活性增強（參照Protein Eng Des Sel. 2013 Oct; 26（10）：589-598. Published online 2013 Jun 5. doi：10.1093/protein）。
［表39］
評價的抗體名稱 判斷為在ATP存在下有活性的抗體名稱
A375-MY518/B167-LamLib A375-P587 /B167-LamLib
A356-MY518/B040-LamLib A356-P587 /B040-LamLib
A375-P587 /B167-LamLib A375-TT16/B167-LamLib
A356-P587 /B040-LamLib A356-TT16/B040-LamLib
A375-TT16/B167-LamLib  
A356-TT16/B040-LamLib  
A375-TT14/B167-LamLib  
（5-5-4） 可變區域的ATP依賴的CD137促效劑活性之評價 根據參考實施例5-5-1及參考實施例5-5-2所記載之使用人類末梢血液單核球的活體外評價，將重鏈恆定區P587及P253組合多種可變區域，評價各可變區域的ATP依賴的CD137促效劑活性。 評價的抗體如表40。表40所記載之抗體的製作，記載於參考實施例7-1。對於在250 μM ATP存在的條件下，和添加陰性對照抗體（IC17HdK-P253/IC17L-k0、IC17HdK-P587/IC17L-k0）的情形的培養上清液中IL-2及IFN-γ的量相比，確認因該抗體的添加而使培養上清液中IL-2的量增加1.05倍以上、且IFN-γ的量增加1.15倍以上之抗體，判斷為顯示CD137促效劑活性。又使用人類末梢血液單核球（PBMC）的促效劑活性的測量，每一位血液樣本供應者（提供者）之間會有差異。考慮此點，對於自複數個提供者分離的人類PBMC的一部分或過半數未顯示CD137促效劑活性之抗體，即使在另外一部份的人類PBMC符合促效劑活性的基準，也可不判定為顯示CD137促效劑。判定為在250 μM ATP存在的條件下顯示CD137促效劑活性之抗體如表40所示（圖32、圖33、圖34、圖35及圖36）。
再者，在判斷為在250 μM ATP存在下顯示CD137促效劑活性的抗體之中，關於任何在未添加ATP的條件下培養上清液中的IL-2及IFN-γ的量，對陰性對照抗體（IC17HdK-P253/IC17L-k0、IC17HdK-P587/IC17L-k0）添加群的差異倍數（fold change），較在250 μM ATP存在下的陰性對照抗體的差異倍數（fold change）小的抗體，判斷為在ATP不存在的條件下CD137促效劑活性低。判定為在250 μM ATP存在條件下顯示CD137促效劑活性、且在ATP不存在下CD137促效劑活性低的抗體，如表40所示（圖32、圖33、圖34、圖35及圖36）。此等之抗體判斷為顯示ATP依賴的CD137促效劑活性。 由此等確認，對於可變區域，（重鏈可變區╱輕鏈可變區）的組合（A375/B167）、（A356/B040）、（A372/B040）、（A486/B167）、（A488/B226）、（A489/B223）、（A551/B256）、（A548/B256）、及（A551/B379），顯示ATP依賴的CD137促效劑活性。
［表40］
評價的抗體名稱 判斷為在ATP存在下有活性的抗體名稱 判斷為在ATP不存在下活性低的抗體名稱
A372-P253/B040-LamLib A372-P253/B040-LamLib A372-P253/B040-LamLib
A486-P253/B167-LamLib A486-P253/B167-LamLib A486-P253/B167-LamLib
A488-P253/B226-LamLib A488-P253/B226-LamLib A488-P253/B226-LamLib
A489-P253/B223-LamLib A489-P253/B223-LamLib A489-P253/B223-LamLib
A551-P587/B256-LamLib A551-P587/B256-LamLib A551-P587/B256-LamLib
A375-P587/B167-LamLib A375-P587/B167-LamLib A375-P587/B167-LamLib
A548-P587/B256-LamLib A548-P587/B256-LamLib A548-P587/B256-LamLib
A356-P587/B040-LamLib A356-P587/B040-LamLib A356-P587/B040-LamLib
A551-P587/B379-LamLib A551-P587/B379-LamLib A551-P587/B379-LamLib
（5-5-5） 經由組合對Fcγ受體的結合活性增加的重鏈恆定區和重鏈恆定區的pI增加的改變之CD137促效劑活性的增強效果之評價 根據參考實施例5-5-1及參考實施例5-5-2所記載之使用人類末梢血液單核球的活體外評價，對多種和FcγRIIb的結合活性增加的重鏈恆定區，導入重鏈恆定區的pI增加的各種胺基酸改變時，評價對CD137促效劑活性的影響。製作對重鏈恆定區TT16、MY518、TT14導入pI增加的胺基酸改變之重鏈恆定區TT16+P343R/D413K （SCF028）、TT16+Q311R/P343R（SCF033）、MY518+P343R/D413K （SCF025）、MY518+Q311R/P343R （SCF030）、TT14+P343R/D413K （SCF027）、TT14+Q311R/P343R （SCF032）。導入pI增加的胺基酸改變所評價的抗體名稱及對應的導入pI增加的胺基酸改變前的抗體名稱，如表41所示。表41所記載之抗體的製作，記載於參考實施例7-2。
關於經由導入pI增加的胺基酸改變而促效劑活性增強之評價，對於含有不含該胺基酸改變之重鏈恆定區的抗體A375-TT16/B167-LamLib、A375-MY518/B167-LamLib、A375-TT14/B167-LamLib添加群，確認因該抗體的添加而使培養上清液中IL-2的量增加1.04倍以上、且IFN-γ的量增加1.1倍以上者，判斷為CD137促效劑活性增強。在250 μM ATP存在的條件下，和含有不含使pI增加的胺基酸改變之重鏈恆定區的抗體相比，包含導入顯示CD137促效劑活性增強的胺基酸改變之重鏈恆定區之抗體，如表42所示（圖31）。
由此顯示，不依賴重鏈恆定區對FcγRIIb的結合活性的增加程度、使重鏈恆定區的pI增加的改變之導入，顯示增強抗人類CD137抗體的CD137促效劑活性。在重鏈恆定區對FcγRIIb的結合活性增加的改變，組合重鏈恆定區的pI增加的改變者，和帶負電的FcγRIIb表現細胞表面的交互作用增強，抗體或和抗原結合的抗體之免疫複合體因FcγRIIb表現細胞表面而靠近，在抗體對CD137表現細胞顯示促效劑活性之時，經由對必要的、成為交聯骨架的FcγRIIb表現細胞的結合活性更為增加，而使得促效劑活性更為增強之事被教示。
［表41］
導入使pI增加的胺基酸改變所評價的重鏈恆定區域的名稱 導入使pI增加的胺基酸改變前的對應的重鏈恆定區域的名稱 被導入的pI改變
A375-SCF028/B167-LamLib A375-TT16/B167-LamLib P343R/D413K
A375-SCF033/B167-LamLib A375-TT16/B167-LamLib Q311R/P343R
A375-SCF025/B167-LamLib A375-MY518/B167-LamLib P343R/D413K
A375-SCF030/B167-LamLib A375-MY518/B167-LamLib Q311R/P343R
A375-SCF027/B167-LamLib A375-TT14/B167-LamLib P343R/D413K
A375-SCF032/B167-LamLib A375-TT14/B167-LamLib Q311R/P343R
［表42］
 判斷為促效劑活性增強的抗體名稱
A375-SCF028/B167-LamLib
A375-SCF033/B167-LamLib
A375-SCF025/B167-LamLib
A375-SCF030/B167-LamLib
A375-SCF027/B167-LamLib
A375-SCF032/B167-LamLib
（5-5-6） 因導入使重鏈恆定區的pI增加的各改變而對促效劑活性的影響之評價 根據參考實施例5-5-1及參考實施例5-5-2所記載之使用人類末梢血液單核球的活體外評價，導入各種使重鏈恆定區MY201aPh及MY518的pI增加的胺基酸改變，評價該胺基酸改變對CD137促效劑活性的影響。製作導入使重鏈恆定區MY518及MY518a及MY201aPh的pI增加的胺基酸改變的MY518+P343R/D413K （SCF025）、MY518+Q311R/P343R （SCF030）、MY518+P343R （SCF039）、MY518+D413K （SCF040）、MY518a+Q311R （SCF060a）、MY201aPh+P343R （SCF041aPh）、MY201aPh+P343R/D413K （SCF043aPh）、MY201aPh+Q311R （SCF056aPh）、MY201aPh+Q311R/P343R （SCF057aPh）、MY201aPh+Q311R/ D413K （SCF059aPh）。導入使pI增加的胺基酸改變所評價的抗體名稱及對應的導入使pI增加的胺基酸改變前的抗體名稱如表43所示。表43所記載之抗體的製作，記載於參考實施例7-2。
關於經由導入使pI增加的胺基酸改變之促效劑活性增強的評價，對於含有不含該胺基酸改變之重鏈恆定區的抗體A375-MY518a/B167-LamLib、A375-MY201aPh/B167-LamLib添加群，確認因該抗體的添加而使培養上清液中IL-2的量增加1.04倍以上且IFN-γ的量增加1.1倍以上者，判斷為CD137促效劑活性增強。在250 μM ATP存在的條件下，和含有不含使pI增加的胺基酸改變之重鏈恆定區的抗體相比，含有導入顯示CD137促效劑活性增強的胺基酸改變之重鏈恆定區之抗體，如表44所示（圖37及圖38）。
［表43］
導入使pI增加的胺基酸改變所評價的重鏈恆定區域的名稱 導入使pI增加的胺基酸改變前的對應的重鏈恆定區域的名稱 被導入的pI改變
A375-SCF025/B167-LamLib A375-MY518/B167-LamLib P343R/D413K
A375-SCF030/B167-LamLib A375-MY518/B167-LamLib Q311R/P343R
A375-SCF039/B167-LamLib A375-MY518/B167-LamLib P343R
A375-SCF040/B167-LamLib A375-MY518/B167-LamLib D413K
A375-SCF060a/B167-LamLib A375-MY518a/B167-LamLib Q311R
A375-SCF041aPh/B167-LamLib A375-MY201aPh/B167-LamLib P343R
A375-SCF043aPh/B167-LamLib A375-MY201aPh/B167-LamLib P343R/D413K
A375-SCF056aPh/B167-LamLib A375-MY201aPh/B167-LamLib Q311R
A375-SCF057aPh/B167-LamLib A375-MY201aPh/B167-LamLib Q311R/P343R
A375-SCF059aPh/B167-LamLib A375-MY201aPh/B167-LamLib Q311R/D413K
［表44］
判斷為促效劑活性增強的抗體名稱
A375-SCF025/B167-LamLib
A375-SCF030/B167-LamLib
A375-SCF039/B167-LamLib
A375-SCF040/B167-LamLib
A375-SCF060a/B167-LamLib
A375-SCF041aPh/B167-LamLib
A375-SCF043aPh/B167-LamLib
A375-SCF056aPh/B167-LamLib
A375-SCF057aPh/B167-LamLib
A375-SCF059aPh/B167-LamLib
（5-5-7） 組合所製作的可變區域及恆定區域之抗人類CD137抗體的ATP依賴CD137促效劑活性之評價 根據參考實施例5-5-1及參考實施例5-5-2所記載之使用人類末梢血液單核球的活體外評價，組合上述製作之各可變區域、和使pI增加的重鏈恆定區，評價所製作之抗人類CD137抗體的ATP依賴CD137促效劑活性。評價的抗體如表45所示。 對於在250 μM ATP存在的條件下，和添加陰性對照抗體（IC17HdK-MY518a/IC17L-k0、IC17HdK-MY201aPh/IC17L-k0、IC17HdK-MY201/ IC17L-k0、IC17HdK-G4d/IC17L-k0、IC17HdK-MY518/IC17L-k0、或IC17HdK-TT16/ IC17L-k0）的情形的培養上清液中IL-2及IFN-γ的量相比，確認因該抗體的添加而使培養上清液中IL-2的量增加1.05倍以上、且IFN-γ的量增加1.15倍以上之抗體，判斷為顯示CD137促效劑活性。又使用人類末梢血液單核球（PBMC）的促效劑活性的測量，血液樣本供應者（提供者）之間會有差異。考慮此點，對於自複數個提供者分離的人類PBMC的一部分或過半數未顯示CD137促效劑活性之抗體，即使在另外一部份的人類PBMC符合促效劑活性的基準，也可不判定為顯示CD137促效劑。判定為在250 μM ATP存在的條件下顯示CD137促效劑活性之抗體，如表45所示（圖37、圖38、圖39、圖40、圖41、圖42、圖43、及圖44）。
再者，在這些抗體之中，判定為在250 μM ATP存在下顯示CD137促效劑活性之抗體之中，對於在未添加ATP的條件下培養上清液中的IL-2及IFN-γ任一者的量，對陰性對照抗體（IC17HdK-MY518a/IC17L-k0、IC17HdK-MY201aPh/IC17L-k0、IC17HdK-MY201/IC17L-k0、IC17HdK-G4d/IC17L-k0、IC17HdK-MY518/IC17L-k0、或IC17HdK-TT16/ IC17L-k0）添加群的差異倍數（fold change），較在250 μM ATP存在下的陰性對照抗體的差異倍數（fold change） 小的抗體，判斷為在ATP不存在下CD137促效劑活性低。判定為在ATP不存在下CD137促效劑活性低的抗體，如表45所示（圖37、圖38、圖39、圖40、圖41、圖42、圖43、及圖44）。顯示這些抗體顯示ATP依賴的CD137促效劑活性。
［表45］
        評價的抗體名稱 判斷為在ATP存在下有活性的抗體名稱 判斷為在ATP不存在下活性低的抗體名稱
A375-MY518/B167-LamLib A375-SCF025/B167-LamLib A375-SCF025/B167-LamLib
A375-SCF025/B167-LamLib A375-SCF030/B167-LamLib A375-SCF030/B167-LamLib
A375-SCF030/B167-LamLib A375-SCF039/B167-LamLib A375-SCF039/B167-LamLib
A375-SCF039/B167-LamLib A375-SCF040/B167-LamLib A375-SCF040/B167-LamLib
A375-SCF040/B167-LamLib A375-MY518a/B167-LamLib A375-MY518a/B167-LamLib
A375-MY518a/B167-LamLib A375-SCF060a/B167-LamLib A375-SCF060a/B167-LamLib
A375-SCF060a/B167-LamLib A375-SCF041aPh/B167-LamLib A375-SCF041aPh/B167-LamLib
A375-MY201aPh/B167-LamLib A375-SCF043aPh/B167-LamLib A375-SCF043aPh/B167-LamLib
A375-SCF041aPh/B167-LamLib A375-SCF056aPh/B167-LamLib A375-SCF056aPh/B167-LamLib
A375-SCF043aPh/B167-LamLib A375-SCF057aPh/B167-LamLib A375-SCF057aPh/B167-LamLib
A375-SCF056aPh/B167-LamLib A375-SCF059aPh/B167-LamLib A551-SCF041a/B256-LamLib
A375-SCF057aPh/B167-LamLib A551-SCF041a/B256-LamLib A551-SCF057a/B256-LamLib
A375-SCF059aPh/B167-LamLib A551-SCF057a/B256-LamLib A551-SCF059a/B256-LamLib
A551-SCF041a/B256-LamLib A551-SCF059a/B256-LamLib A551-SCF057aPh/B256-LamLib
A551-SCF056a/B256-LamLib A551-SCF057aPh/B256-LamLib A551-SCF025a/B256-LamLib
A551-SCF057a/B256-LamLib A551-SCF059aPh/B256-LamLib A551-SCF039a/B256-LamLib
A551-SCF059a/B256-LamLib A551-SCF025a/B256-LamLib A551-SCF043a/B256-LamLib
A551-SCF056aPh/B256-LamLib A551-SCF039a/B256-LamLib A551-SCF041aPh/B256-LamLib
A551-SCF057aPh/B256-LamLib A551-MY201a/B256-LamLib A551-SCF043aPh/B256-LamLib
A551-SCF059aPh/B256-LamLib A551-SCF043a/B256-LamLib A551-SCF039a/B379-LamLib
A551-MY518/B256-LamLib A551-SCF041aPh/B256-LamLib A551-SCF041a/B379-LamLib
A551-SCF025a/B256-LamLib A551-SCF043aPh/B256-LamLib A551-SCF043a/B379-LamLib
A551-SCF039a/B256-LamLib A551-SCF039a/B379-LamLib A551-SCF041aPh/B379-LamLib
A551-MY201a/B256-LamLib A551-SCF041a/B379-LamLib A551-SCF043aPh/B379-LamLib
A551-SCF043a/B256-LamLib A551-SCF043a/B379-LamLib A551-SCF060a/B379-LamLib
A551-MY201aPh/B256-LamLib A551-SCF041aPh/B379-LamLib A551-SCF057a/B379-LamLib
A551-SCF041aPh/B256-LamLib A551-SCF043aPh/B379-LamLib A551-SCF059a/B379-LamLib
A551-SCF043aPh/B256-LamLib A551-SCF060a/B379-LamLib A551-SCF056aPh/B379-LamLib
A551-MY518a/B379-LamLib A551-SCF057a/B379-LamLib A551-SCF057aPh/B379-LamLib
A551-SCF039a/B379-LamLib A551-SCF059a/B379-LamLib A551-SCF059aPh/B379-LamLib
A551-SCF041a/B379-LamLib A551-SCF056aPh/B379-LamLib A375-TT16/B167-LamLib
A551-SCF043a/B379-LamLib A551-SCF057aPh/B379-LamLib A356-TT16/B040-LamLib
A551-SCF041aPh/B379-LamLib A551-SCF059aPh/B379-LamLib A551-TT16/B379-LamLib
A551-SCF043aPh/B379-LamLib A375-TT16/B167-LamLib  
A551-SCF060a/B379-LamLib A356-TT16/B040-LamLib  
A551-SCF056a/B379-LamLib A551-TT16/B379-LamLib  
A551-SCF057a/B379-LamLib    
A551-SCF059a/B379-LamLib    
A551-SCF056aPh/B379-LamLib    
A551-SCF057aPh/B379-LamLib    
A551-SCF059aPh/B379-LamLib    
A375-TT16/B167-LamLib    
A356-TT16/B040-LamLib    
A551-TT16/B379-LamLib    
參考實施例6：抗人類CD137轉換抗體之人類CD137基因置入小鼠的投予試驗 （6-1） 用於人類CD137基因置入小鼠投予試驗之抗體製作 為了人類CD137基因置入（knock-in）小鼠投予試驗，製作具有小鼠恆定區域之抗人類CD137轉換抗體及非轉換抗體。具體為，製作抗人類CD137非轉換抗體（20H4.9-mIgG1/20H4.9LC-mk0 簡稱：NS1-mIgG1、20H4.9-MB110/20H4.9LC-mk0 簡稱：NS1-MB110、20H4.9-MB492/20H4.9LC-mk0 簡稱：NS1-MB492、MOR-7480.1H-MB110/MOR-7480.1L-ml0r 簡稱：NS2-MB110、MOR-7480.1H-MB492/MOR-7480.1L-ml0r 略名：NS2-MB492）、及抗人類CD137轉換抗體（A375-mIgG1/B167-ml0r、A372-mIgG1/B040-ml0r、A372-MB110/ B040-ml0r、A372-MB492/B040-ml0r、A356-MB110/B040-ml0r、A486-MB492/ B167-ml0r、A488-MB492/B226-ml0r、A489-MB492/B223-ml0r、A551-mIgG1/ B256-ml0r、A551-MB110/B379-ml0r、及A548-mIgG1/B256-ml0r）。
製作NS1-mIgG1、NS1-MB110及NS1-MB492抗體的重鏈為重鏈可變區域20H4.9 （序列識別號：139）組合下列任一者的重鏈恆定區域之抗體重鏈的基因， （i） 小鼠IgG1的重鏈恆定區域mIgG1 （序列識別號：144）， （ii） WO2014030750記載之MB110 （序列識別號：145），或 （iii） WO2014030750記載之MB492 （序列識別號：146）。 亦即，製作20H4.9-mIgG1、20H4.9-MB110、及20H4.9-MB492的基因。 製作NS1-mIgG1、NS1-MB110及NS1-MB492抗體的輕鏈為輕鏈可變區域20H4.9LC （序列識別號：140）組合小鼠κ鏈mk0 （序列識別號：147）的輕鏈恆定區域之抗體輕鏈20H4.9LC-mk0的基因。組合此等重鏈及輕鏈之基因，以此技術領域公知方法，使各抗體表現、純化。
製作NS2-MB110 及NS2-MB492抗體的重鏈為重鏈可變區域MOR-7480.1H （序列識別號：142） 組合（i） MB110 （序列識別號：145）或（ii） MB492 （序列識別號：146）任一者的重鏈恆定區域之抗體重鏈的基因。亦即，製作MOR-7480.1H-MB110及MOR-7480.1H-MB492的基因。 製作NS2-MB110 及NS2-MB492的輕鏈為輕鏈可變區域MOR-7480.1L （序列識別號：143） 組合小鼠λ鏈ml0r （序列識別號：148）作為輕鏈恆定區域之抗體輕鏈MOR-7480.1L-ml0r的基因。組合此等重鏈及輕鏈之基因，以此技術領域公知方法，使各抗體表現、純化。 抗CD137轉換抗體，以製作下表46及表47的抗體重鏈及抗體輕鏈之基因，組合此等基因，以此技術領域公知方法，使各抗體表現、純化。
具有小鼠恆定區域之抗CD137轉換抗體之抗體重鏈 ［表46］
重鏈全長 A375-mIgG1 可變區域 A375 （序列識別號：43）
    恆定區域 mIgG1 （序列識別號：144）
重鏈全長 A372-mIgG1 可變區域 A372 （序列識別號：44）
    恆定區域 mIgG1 （序列識別號：144）
重鏈全長 A372-MB110 可變區域 A372 （序列識別號：44）
    恆定區域 MB110 （序列識別號：145）
重鏈全長 A372-MB492 可變區域 A372 （序列識別號：44）
    恆定區域 MB492 （序列識別號：146）
重鏈全長 A356-MB110 可變區域 A356 （序列識別號：45）
    恆定區域 MB110 （序列識別號：145）
重鏈全長 A486-MB492 可變區域 A486 （序列識別號：46）
    恆定區域 MB492 （序列識別號：146）
重鏈全長 A488-MB492 可變區域 A488 （序列識別號：48）
    恆定區域 MB492 （序列識別號：146）
重鏈全長 A489-MB492 可變區域 A489 （序列識別號：49）
    恆定區域 MB492 （序列識別號：146）
重鏈全長 A548-mIgG1 可變區域 A548 （序列識別號：50）
    恆定區域 mIgG1 （序列識別號：144）
重鏈全長 A551-mIgG1 可變區域 A551 （序列識別號：51）
    恆定區域 mIgG1 （序列識別號：144）
重鏈全長 A551-MB110 可變區域 A551 （序列識別號：51）
    恆定區域 MB110 （序列識別號：145）
具有小鼠恆定區域之抗CD137轉換抗體之抗體輕鏈 ［表47］
輕鏈全長 B040-ml0r 可變區域 B040 （序列識別號：55）
    恆定區域 ml0r （序列識別號：148）
輕鏈全長 B167-ml0r 可變區域 B167 （序列識別號：54）
    恆定區域 ml0r （序列識別號：148）
輕鏈全長 B226-ml0r 可變區域 B226 （序列識別號：56）
    恆定區域 ml0r （序列識別號：148）
輕鏈全長 B223-ml0r 可變區域 B223 （序列識別號：57）
    恆定區域 ml0r （序列識別號：148）
輕鏈全長 B256-ml0r 可變區域 B256 （序列識別號：59）
    恆定區域 ml0r （序列識別號：148）
輕鏈全長 B379-ml0r 可變區域 B379 （序列識別號：60）
    恆定區域 ml0r （序列識別號：148）
（6-2） 用於人類CD137基因置入小鼠投予試驗所製作之抗體的對人類CD137的結合活性之評價 評價參考實施例6-1所製作之抗人類CD137非轉換抗體及抗CD137轉換抗體的對人類CD137的結合活性。對人類CD137的結合活性之測量，使用實驗緩衝液20 mM ACES （pH 7.4）、150 mM NaCl、2 mM MgCl2 、0.05 % Tween20在37℃實施。首先，對系列S 感應晶片CM5 （GE Healthcare）固定有兔抗小鼠IgG （Thermo Scientific）的晶片，和實驗緩衝液所製作的抗體溶液進行交互作用，捕捉抗體。之後，和添加ATP成為目標濃度以實驗緩衝液所調配的人類CD137溶液，或者不含ATP以實驗緩衝液所調配的人類CD137溶液進行交互作用，評價在ATP存在下及ATP不存在下，和人類CD137的結合活性。作為抗原之人類CD137，使用參考實施例（1-2）方法所製作的hCD137（分解的FXa），在抗原濃度0 nM、 15.625 nM、 62.5 nM、 250 nM、及1000Nm進行測量。晶片使用25 mM NaOH 或10 mM 甘胺酸鹽酸鹽 （pH 1.5）再生，重複捕捉抗體進行測量。各抗體對人類CD137的解離常數（KD）使用Biacore T200 評價軟體2.0計算。具體地說，經測量所得的感應柱以1：1 朗繆爾結合模式整體擬合，計算結合速率常數ka（L/mol/s）、解離速率常數kd（1/s），從該等值算出解離常數KD （mol/L）。 表48顯示此等測試結果。
具有小鼠恆定區域之抗CD137抗體對人類CD137的結合分析 ［表48］
  對人類CD137的KD （M）
抗體名稱 無ATP ATP＝1µM ATP＝10µM ATP＝100µM
NS1-mIgG1 6.17E-08 5.62E-08 5.44E-08 5.36E-08
NS1-MB110 6.10E-08 5.65E-08 5.39E-08 5.19E-08
NS1-MB492 6.16E-08 5.49E-08 5.35E-08 5.04E-08
NS2-MB110 1.88E-07 1.44E-07 1.02E-07 1.04E-07
NS2-MB492 2.16E-07 1.70E-07 1.12E-07 1.12E-07
A375-mIgG1/B167-ml0r N.A. 3.43E-07 1.14E-07 2.92E-08
A372-mIgG1/B040-ml0r N.A. 4.78E-07 2.59E-07 1.08E-07
A372-MB110/B040-ml0r N.A. 6.11E-07 2.64E-07 1.12E-07
A372-MB492/B040-ml0r N.A. 7.82E-07 2.51E-07 1.04E-07
A356-MB110/B040-ml0r N.A. 1.01E-06 4.10E-07 1.68E-07
A486-MB492/B167-ml0r N.A. 1.31E-07 2.70E-08 7.67E-09
A488-MB492/B226-ml0r N.A. N.D. 1.36E-07 8.25E-08
A489-MB492/B223-ml0r N.A. 1.62E-06 3.58E-07 1.54E-07
A551-mIgG1/B256-ml0r N.A. 7.55E-07 2.31E-07 6.22E-08
A551-MB110/B379-ml0r N.A. 5.12E-07 1.43E-07 3.51E-08
A548-mIgG1/B256-ml0r N.A. 8.61E-07 2.19E-07 5.58E-08
N.A.：在KD值的確認上過弱。 N.D.：未確認
確認上述製作之含有小鼠恆定區域的抗人類CD137非轉換抗體及抗人類CD137轉換抗體皆和人類CD137結合。又抗人類CD137轉換抗體皆顯示ATP濃度依賴的人類CD137結合。另一方面，在非轉換抗體，未觀察到如此的ATP濃度依賴的人類CD137的結合，在任何ATP濃度中皆顯示幾乎相等的結合。
（6-3） 改變的抗體在人類CD137基因置入小鼠的血漿中動態之評價 （6-3-1） 人類CD137基因置入小鼠的製作 對小鼠胚胎幹細胞（ES細胞）導入人類CD137基因取代載體，製作小鼠CD137基因取代為人類CD137基因的人類CD137基因置入小鼠。此小鼠記載為hCD137 KI小鼠。
（6-3-2） 在hCD137 KI小鼠模式的血漿中的抗人類CD137抗體濃度之測量 在參考實施例6-3-1的hCD137 KI小鼠製作後，如表49，將各抗體單次靜脈投予hCD137 KI小鼠。表49中，NS1-mIgG1、NS1-MB110、NS1-MB492皆為非轉換抗體，其他為轉換抗體。投予後5分鐘後至28日後，經時採血複數次。將所得血液離心，分離血漿。至測量前血漿保存於設定-20℃以下的冷凍庫。
用於血漿中動態評價試驗的群的詳細資料 ［表49］
群 隻數 藥劑 用量［mg/kg］
1 3 NS1-mIgG1 7.5　　單次投予
2 3 NS1-MB110 7.5　　單次投予
3 3 NS1-MB492 7.5　　單次投予
4 3 A375-mIgG1/B167-ml0r 7.5　　單次投予
5 3 A356-MB110/B040-ml0r 7.5　　單次投予
6 3 A372-mIgG1/B040-ml0r 7.5　　單次投予
7 3 A372-MB110/B040-ml0r 7.5　　單次投予
8 3 A372-MB492/B040-ml0r 7.5　　單次投予
9 3 A486-MB492/B167-ml0r 7.5　　單次投予
10 3 A488-MB492/B226-ml0r 7.5　　單次投予
11 3 A489-MB492/B223-ml0r 7.5　　單次投予
12 3 A548-mIgG1/B256-ml0r 7.5　　單次投予
13 3 A551-mIgG1/B256-ml0r 7.5　　單次投予
14 3 A551-MB110/B379-ml0r 7.5　　單次投予
血漿中各轉換抗體的濃度以電化學發光法（ECL）法測量。具體為，hCD137 （Sino Biological Inc.）以PBS（-）稀釋，添加於多陣列96孔微量盤 （Meso Scale Diagnostics, LLC）。添加hCD137的微量盤在室溫下震盪1小時，使hCD137固定於微量盤。之後添加含有1%BSA、0.05% Tween20的PBS，在室溫下震盪1小時，用以阻斷。各轉換抗體的校準曲線以血漿中濃度為64、32、16、8、4、2、1 ng/mL製作。在固定有hCD137的微量盤添加含有3mM ADP、1%BSA、0.05% Tween20的PBS溶液之後，添加以2倍量的含有1%BSA、0.05% Tween20的PBS溶液稀釋的血漿樣本及校準曲線樣本。之後，該微量盤在室溫下震盪1小時後，添加生物素化抗小鼠IgG抗體 （Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.）。再將該微量盤在室溫下震盪1小時後，添加SULFO-TAG標籤的鏈親和素 （Meso Scale Diagnostics, LLC）。再將該微量盤在室溫下震盪1小時後，添加以含有2mM ADP、1%BSA、0.05% Tween20的PBS溶液稀釋2倍稀釋的檢測緩衝液T （Meso Scale Diagnostics, LLC）。hCD137 KI小鼠血漿中的各抗體濃度的測量，使用SECTOR顯像儀（Meso Scale Diagnostics, LLC）檢測SULFO-TAG而進行。小鼠血漿中的各抗體濃度的計使用SOFTmax PRO （Molecular Devices）而進行。
血漿中各非轉換抗體的濃度以電化學發光法（ECL）法測量。具體為，hCD137 （Sino Biological Inc.）以PBS（-）稀釋，添加於多陣列96孔微量盤 （Meso Scale Diagnostics, LLC）。添加hCD137的微量盤在室溫下震盪1小時，使hCD137固定於微量盤。之後添加含有1%BSA、0.05% Tween20的PBS，在室溫下震盪1小時，用以阻斷。各非轉換抗體的校準曲線以血漿中濃度為32、16、8、4、2、1、0.5 ng/mL製作。在固定有hCD137的微量盤，添加以含有1%BSA、0.05% Tween20的PBS溶液稀釋的血漿樣本及校準曲線樣本。之後，該微量盤在室溫下震盪1小時後，添加生物素化抗小鼠IgG抗體（Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.）。再將該微量盤在室溫下震盪1小時後，添加SULFO-TAG標籤的鏈親和素（Meso Scale Diagnostics, LLC）。再將該微量盤在室溫下震盪1小時後，添加2倍稀釋的檢測緩衝液T （Meso Scale Diagnostics, LLC）。hCD137 KI小鼠血漿中的各抗體濃度的測量，和上述轉換抗體同樣進行。
結果如圖45、圖46、及圖47所示。 表49所示之各抗體中，Fc為mIgG1的抗體（非轉換抗體NS1-mIgG1，轉換抗體A375-mIgG1/B167-ml0r、A372-mIgG1/B040-ml0r、A548-mIgG1/B256-ml0r、及A551-mIgG1/B256-ml0r）在hCD137 KI小鼠的平均血漿中濃度的變化如圖45所示。Fc為MB110的抗體（非轉換抗體NS1-MB110，轉換抗體A356-MB110/B040-ml0r、A372-MB110/B040-ml0r、及A551-MB110/B379-ml0r）在hCD137 KI小鼠的平均血漿中濃度的變化如圖46所示。Fc為MB492的抗體（非轉換抗體NS1-MB492，轉換抗體A372-MB492/B040-ml0r、A486-MB492/B167-ml0r、A488-MB492/B226-ml0r、及A489-MB492/B223-ml0r）在hCD137 KI小鼠的平均血漿中濃度的變化如圖47所示。在圖47中，關於A488-MB492/B226-ml0r，在1例中確認疑因ADA而血漿中濃度的變化急遽降低，所以使用2例的平均值。
在hCD137 KI小鼠顯示，所有的Fc中，轉換抗體皆較非轉換抗體遲自血漿中消失。推論這是因為和轉換抗體相比，非轉換抗體和在體內表現的CD137結合，因此較早自血漿中消失的緣故。又教示在正常組織的細胞外ATP濃度在本實驗所用的轉換抗體不顯示和CD137結合的程度上非常的低。因此教示因使用轉換抗體可減低對全身表現的抗原的結合性，因此可製作血中動態良好的抗體。
（6-4） 使用hCD137 KI小鼠之同系統腫瘤細胞移植模式的抗CD137抗體的藥效及全身反應標記物（marker）的移動 （6-4-1） 細胞株及同系統腫瘤移植小鼠模式的製作、以及抗腫瘤效果及全身反應之評價方法 各種試驗使用美國國立癌症研究所授權的小鼠大腸癌細胞株MC38細胞及參考實施例6-3-1記載之hCD137 KI小鼠。將MC38細胞株移植到小鼠腹部皮下，在腫瘤體積成為約50-300mm3 的時點建立模式。模式建立後，MC38細胞株移植小鼠分群進行，投予各種抗CD137抗體。
用於評價抗腫瘤效果，腫瘤體積的測量以每周1-2次的頻率實施。腫瘤體積以下列計算式算出。 腫瘤體積（mm3 ）＝長徑（mm）×短徑（mm）×短徑（mm）/2
全身反應以在抗體投予後的適當時點取出肝臟及脾臟或淋巴結等，評價臟器重量或淋巴球分層細胞數、或使用流式細胞述（FCM）分析T細胞而評價。在此等各指標的評價，在對象的轉換抗體，和同量的非轉換抗體（不具有ATP依賴的人類CD137結合活性之抗人類CD137對照抗體）相比，顯示全身反應的指標為低值的情形，評價為在全身反應及/或腫瘤以外的組織（例如淋巴結、脾臟、及肝臟）的T細胞的活化受到抑制。 又各種試驗中使用參考實施例6-1（用於人類CD137基因置入小鼠投予試驗之抗體製作）所製作之抗體。
（6-4-2） 從MC38細胞株移植小鼠之各種臟器的取出及淋巴球分層的製作 將取出的脾臟、淋巴結進行重量測量或淋巴球分層的細胞數測量。肝臟的活性評價使用以小鼠肝臟解離套組（Milteny Biotec）所得的淋巴球分層。脾臟的活性評價使用溶血後的淋巴球分層，淋巴結的活性評價使用研磨得到的淋巴球分層。
（6-4-3） 使用各種臟器的淋巴球分層之FCM分析 以FCM進行活化標記物（marker）的評價，使用在CD8α陽性 T細胞的Granzyme B表現或PD-1表現或ICOS表現、或對CD45陽性細胞的CD8α陽性T細胞的比例。因此，在FCM分析，使用螢光標記的抗Granzyme B抗體、抗PD-1抗體、抗ICOS抗體、抗CD8α抗體及抗CD45抗體等。使用BD LSRFortessa （商標）X-20 （BD Biosciences）進行測量。
（6-4-4） 關於A375-mIgG1/B167-ml0r抗體的藥效（抗腫瘤效果）試驗 在參考實施例6-4-1的MC38移植小鼠模式製作後，以表50所示之量，投予載劑及A375-mIgG1/B167-ml0r。抗體的投予在分群當日及分群後4日後共計2次，經尾靜脈路徑投予。載劑使用含0.05% Tween-20的PBS。
用於A375-mIgG1/B167-ml0r抗體藥效試驗的群的詳細資料 ［表50］
群 隻數 藥劑 用量［mg/kg］ 投予日
1 5 載劑 - 分群當日及4日後
2 5 A375-mIgG1/B167-ml0r 22.5 分群當日及4日後
3 5 A375-mIgG1/B167-ml0r 7.5 分群當日及4日後
4 5 A375-mIgG1/B167-ml0r 2.5 分群當日及4日後
5 5 A375-mIgG1/B167-ml0r 0.83 分群當日及4日後
6 5 A375-mIgG1/B167-ml0r 0.28 分群當日及4日後
各群的抗腫瘤效果以參考實施例6-4-1記載之方法所計算的腫瘤體積來評價。結果確認A375-mIgG1/B167-ml0r抗體的用量依賴的抗腫瘤效果（圖48）。
（6-5-4） 用於A375-mIgG1/B167-ml0r的全身作用評價的抗體投予及採樣、及FCM分析 在參考實施例6-4-1的MC38移植小鼠模式製作後，以表51所示之量，投予載劑、NS1-mIgG1（非轉換抗體）及A375-mIgG1/B167-ml0r。抗體的投予在分群當日及分群後3日後共計2次，經尾靜脈路徑投予。載劑使用含0.05% Tween-20的PBS。 在第一次投予後5日後，以參考實施例6-4-2（從MC38細胞株移植小鼠之各種臟器的取出及淋巴球分層的製作）所示之方法，取出肝臟、淋巴結、脾臟。在脾臟、淋巴結，收集三隻份的臟器作為一組，以參考實施例6-4-3（使用各種臟器的淋巴球分層之FCM分析）所示方法進行FCM分析。
用於A375-mIgG1/B167-ml0r抗體的全身反應評價的群的詳細資料 ［表51］
群 隻數 藥劑 用量 ［mg/kg］ 投予日 採樣日
1 3 載劑 - 分群當日及3日後 分群5日後
2 3 NS1-mIgG1 0.06 分群當日及3日後 分群5日後
3 3 NS1-mIgG1 0.3 分群當日及3日後 分群5日後
4 3 NS1-mIgG1 1.5 分群當日及3日後 分群5日後
5 3 NS1-mIgG1 7.5 分群當日及3日後 分群5日後
6 3 NS1-mIgG1 37.5 分群當日及3日後 分群5日後
7 3 A375-mIgG1/B167-ml0r 1.5 分群當日及3日後 分群5日後
8 3 A375-mIgG1/B167-ml0r 7.5 分群當日及3日後 分群5日後
9 3 A375-mIgG1/B167-ml0r 37.5 分群當日及3日後 分群5日後
評價投予上述抗體的全身作用。淋巴結、脾臟的臟器重量評價之結果，確認投予NS1-mIgG1時在0.3 mg/kg臟器重量增加，觀察到在1.5 mg/kg、 7.5 mg/kg更強的臟器肥大化的現象。另一方面，在投予A375-mIgG1/B167-ml0r時，在1.5 mg/kg、7.5 mg/kg、37.5 mg/kg任一投予量皆沒有觀察到臟器的肥大化（圖49）。 又，以FCM評價的T細胞活性化評價結果，觀察到PD-1、ICOS、Granzyme B的標記物皆在NS1-mIgG1投予時在0.3 mg/kg表現增加。另一方面，在投予A375-mIgG1/B167-ml0r時，在1.5 mg/kg、7.5 mg/kg、37.5 mg/kg任一投予量，PD-1、ICOS、Granzyme B所有的標記物（marker），被認為顯著的表現抑制（圖50、圖51）。從A375-mIgG1/B167-ml0r的結果，在淋巴結及脾臟中顯示臟器重量和T細胞活性化標記物相關的結果，因此在以下的抗體評價中做為來自淋巴結及脾臟的免疫細胞活化的指標，主要使用臟器重量。
肝臟的T細胞活性化的評價結果，觀察到PD-1、Granzyme B皆在投予NS1-mIgG1時在0.3 mg/kg 表現增加。另一方面，在投予A375-mIgG1/B167-ml0r時，在1.5 mg/kg、7.5 mg/kg、37.5 mg/kg任一投予量，被認為皆表現抑制 （圖52）。 由上述可知，該轉換抗體，和同量的非轉換抗體相比，抑制在淋巴結、脾臟及肝臟的T細胞活性化。
（6-4-6） 關於A356-MB110/B040-ml0r抗體的藥效（抗腫瘤效果）試驗 在參考實施例6-4-1的MC38移植小鼠模式製作後，以表52所示之用量，投予載劑及A356-MB110/B040-ml0r。抗體的投予在分群當日及分群後3日後共計2次，經尾靜脈路徑投予。載劑使用含0.05% Tween-20的PBS。
用於A356-MB110/B040-ml0r抗體的藥效試驗的群的詳細資料 ［表52］
群 隻數 藥劑 用量 ［mg/kg］ 投予日
1 5 載劑 - 分群當日及3日後
2 5 A356-MB110/B040-ml0r 7.5 分群當日及3日後
3 5 A356-MB110/B040-ml0r 2.5 分群當日及3日後
各群的抗腫瘤效果以參考實施例6-4-1所載方法計算腫瘤體積而評價。結果確認A356-MB110/B040-ml0r的用量依賴的抗腫瘤效果（圖53）。
（6-4-7） 用於A356-MB110/B040-ml0r的全身作用評價的抗體投予及採樣、及FCM分析 在參考實施例6-4-1的MC38移植小鼠模式製作後，以表53所示，投予載劑、NS2-MB110 （非轉換抗體）及A356-MB110/B040-ml0r。抗體的投予在分群當日及分群後3日後共計2次，經尾靜脈路徑投予。載劑使用含0.05% Tween-20的PBS。 在第一次投予後7日後，以參考實施例6-4-2 （從MC38細胞株移植小鼠之各種臟器的取出及淋巴球分層的製作）所示之方法，取出肝臟、淋巴結、脾臟。脾臟、淋巴結只進行臟器重量測量。
用於A356-MB110/B040-ml0r抗體的全身反應評價的群的詳細資料 ［表53］
群 隻數 藥劑 用量 ［mg/kg］ 投予日 採樣日
1 3 載劑 - 分群當日及3日後 分群7日後
2 3 NS2-MB110 7.5 分群當日及3日後 分群7日後
3 3 NS2-MB110 2.5 分群當日及3日後 分群7日後
4 3 NS2-MB110 0.3 分群當日及3日後 分群7日後
5 3 A356-MB110/B040-ml0r 7.5 分群當日及3日後 分群7日後
6 3 A356-MB110/B040-ml0r 2.5 分群當日及3日後 分群7日後
評價投予上述抗體的全身作用。投予NS2-MB110及A356-MB110/B040-ml0r時的淋巴結、脾臟的臟器重量評價之結果，觀察到投予NS2-MB110時，即使投予2.5 mg/kg時也肥大化。另一方面，在投予A356-MB110/B040-ml0r時，被認為即使投予7.5 mg/kg淋巴結肥大化也受到抑制，對於脾臟，被認為在投予2.5 mg/kg時肥大化受到抑制 （圖54）。 又，肝臟的T細胞活性化的評價結果，觀察到投予NS2-MB110時即使投予0.3 mg/kg時CD8α陽性細胞的PD-1表現也增加。另一方面，在投予A356-MB110/B040-ml0r時，確認在7.5 mg/kg時PD-1表現抑制，在投予2.5 mg/kg時有顯著的表現抑制。在CD8α陽性細胞的ICOS表現，在投予NS2-MB110抗體0.3 mg/kg時觀察到略微增加。另一方面，在投予A356-MB110/B040-ml0r時，觀察到在投予2.5 mg/kg時被抑制到載劑程度的表現（圖55）。 由上述可知，該轉換抗體，和同量的非轉換抗體相比，抑制在淋巴結、脾臟及肝臟的T細胞活性化。
（6-4-8） 關於A372-mIgG1/B040-ml0r抗體的藥效（抗腫瘤效果）試驗 在參考實施例6-4-1的MC38移植小鼠模式製作後，以表54所示之用量，投予載劑及A372-mIgG1/B040-ml0r。抗體的投予在分群當日及分群後4日後、7日後、10日後共計4次，經尾靜脈路徑投予。載劑使用含0.05% Tween-20的PBS。
用於A372-mIgG1/B040-ml0r抗體的藥效試驗的群的詳細資料 ［表54］
群 隻數 藥劑 用量 ［mg/kg］ 投予日
1 5 載劑 - 分群當日、4日後、7日後、10日後
2 5 A372-mIgG1/B040-ml0r 7.5 分群當日、4日後、7日後、10日後
各群的抗腫瘤效果以參考實施例6-4-1所載方法計算腫瘤體積而評價。結果確認，在投予7.5 mg/kg時A372-mIgG1/B040-ml0r抗體的抗腫瘤效果（圖56）。
（6-4-9） 用於A372-mIgG1/B040-ml0r的全身作用評價的抗體投予及採樣、及FCM分析 在參考實施例6-4-1的MC38移植小鼠模式製作後，以表55所示，投予載劑及A372-mIgG1/B040-ml0r。抗體的投予在分群當日及分群後3日後、6日後共計3次，經尾靜脈路徑投予。載劑使用含0.05% Tween-20的PBS。 在第一次投予後7日後以參考實施例6-4-2（從MC38細胞株移植小鼠之各種臟器的取出及淋巴球分層的製作）所示之方法，取出肝臟、淋巴結、脾臟。脾臟只進行臟器重量測量，淋巴結在收集3隻分量為一組後，只進行淋巴球分層細胞數測量。
用於A372-mIgG1/B040-ml0r抗體的全身反應評價的群的詳細資料 ［表55］
群 隻數 藥劑 用量 ［mg/kg］ 投予日 採樣日
1 3 載劑 - 分群當日、3日後、6日後 分群7日後
2 3 A372-mIgG1/B040-ml0r 7.5 分群當日、3日後、6日後 分群7日後
評價投予上述抗體的全身作用。淋巴結的細胞數測量、脾臟的臟器重量評價之結果，在投予A372-mIgG1/B040-ml0r時，不認為淋巴結的細胞數增加及脾臟重量增加，確認為和載劑群有相同的臟器重量（圖57）。 肝臟的T細胞活性化的評價結果，觀察到投予A372-mIgG1/B040-ml0r時有和載劑群相同程度的Granzyme B表現水平（圖58）。 由上確認，該轉換抗體抑制在淋巴結、脾臟及肝臟的T細胞活性化。
（6-4-10） 關於A372-MB110/B040-ml0r抗體的藥效（抗腫瘤效果）試驗 在參考實施例6-4-1的MC38移植小鼠模式製作後，以表56所示之用量，投予載劑及A372-MB110/B040-ml0r。抗體的投予在分群當日及分群後4日後共計2次，經尾靜脈路徑投予。載劑使用含0.05% Tween-20的PBS。
用於A372-MB110/B040-ml0r抗體的藥效試驗的群的詳細資料 ［表56］
群 隻數 藥劑 用量 ［mg/kg］ 投予日
1 5 載劑 - 分群當日及3日後
2 5 A372-MB110/B040-ml0r 7.5 分群當日及3日後
各群的抗腫瘤效果以參考實施例6-4-1所載方法計算腫瘤體積而評價。結果確認A372-MB110/B040-ml0r的抗腫瘤效果（圖59）。
（6-4-11） 用於A372-MB110/B040-ml0r的全身作用評價的抗體投予及採樣、及FCM分析 在參考實施例6-4-1的MC38移植小鼠模式製作後，以表57所示，投予載劑、NS2-MB110 （非轉換抗體）及A372-MB110/B040-ml0r。抗體的投予在分群當日及分群後3日後共計2次，經尾靜脈路徑投予。載劑使用含0.05% Tween-20的PBS。 在第一次投予後7日後以參考實施例6-4-2（從MC38細胞株移植小鼠之各種臟器的取出及淋巴球分層的製作）所示之方法，取出肝臟、淋巴結、脾臟。脾臟、淋巴結只進行臟器重量測量。
用於A372-MB110/B040-ml0r抗體的全身反應評價的群的詳細資料 ［表57］
群 隻數 藥劑 用量 ［mg/kg］ 投予日 採樣日
1 3 載劑 - 分群當日及3日後 分群7日後
2 3 NS2-MB110 7.5 分群當日及3日後 分群7日後
3 3 NS2-MB110 2.5 分群當日及3日後 分群7日後
4 3 NS2-MB110 0.3 分群當日及3日後 分群7日後
5 3 A372-MB110/B040-ml0r 7.5 分群當日及3日後 分群7日後
6 3 A372-MB110/B040-ml0r 2.5 分群當日及3日後 分群7日後
評價投予上述抗體的全身作用。淋巴結、脾臟的臟器重量評價之結果，認為在投予NS2-MB110時在2.5 mg/kg、7.5 mg/kg臟器重量增加。另一方面，確認在投予A372-MB110/B040-ml0r時，在2.5 mg/kg、7.5 mg/kg任一投予量皆觀察到臟器肥大化的抑制（圖60）。 肝臟的T細胞活性化的評價結果，觀察到在投予NS2-MB110時PD-1的表現增加。在投予A372-MB110/B040-ml0r時同樣見到此現象（圖61）。 由上述確認，該轉換抗體，和非轉換抗體相比，抑制在淋巴結、脾臟的T細胞活性化。
（6-4-12） 關於A372-MB492/B040-ml0r抗體的藥效（抗腫瘤效果）試驗 在參考實施例6-4-1的MC38移植小鼠模式製作後，以表58所示之用量，投予載劑及A372-MB492/B040-ml0r。抗體的投予在分群當日及分群後3日後共計2次，經尾靜脈路徑投予。載劑使用含0.05% Tween-20的PBS。
用於A372-MB492/B040-ml0r抗體的藥效試驗的群的詳細資料 ［表58］
群 隻數 藥劑 用量 ［mg/kg］ 投予日
1 5 載劑 - 分群當日及3日後
2 5 A372-MB492/B040-ml0r 1.5 分群當日及3日後
3 5 A372-MB492/B040-ml0r 3.0 分群當日及3日後
4 5 A372-MB492/B040-ml0r 7.5 分群當日及3日後
各群的抗腫瘤效果以參考實施例6-4-1所載方法計算腫瘤體積而評價。結果認為，在任何投予量A372-MB492/B040-ml0r抗體皆有抗腫瘤效果（圖62）。
（6-4-13） 用於A372-MB492/B040-ml0r的全身作用評價的抗體投予及採樣、及FCM分析 在參考實施例6-4-1的MC38移植小鼠模式製作後，以表59所示，投予載劑、NS1-MB492 （非轉換抗體）及A372-MB492/B040-ml0r。抗體的投予在分群當日及分群後3日後共計2次，經尾靜脈路徑投予。載劑使用含0.05% Tween-20的PBS。 在第一次投予後8日後以參考實施例6-4-2（從MC38細胞株移植小鼠之各種臟器的取出及淋巴球分層的製作）所示之方法，取出肝臟、淋巴結、脾臟。脾臟只進行臟器重量測量，淋巴結只進行製作淋巴球分層後的細胞數測量。
用於A372-MB492/B040-ml0r抗體的全身反應評價的群的詳細資料 ［表59］
群 隻數 藥劑 用量 ［mg/kg］ 投予日 採樣日
1 3 載劑 - 分群當日及3日後 分群8日後
2 3 NS1-MB492 7.5 分群當日及3日後 分群8日後
3 3 A372-MB492/B040-ml0r 1.5 分群當日及3日後 分群8日後
4 3 A372-MB492/B040-ml0r 3.0 分群當日及3日後 分群8日後
5 3 A372-MB492/B040-ml0r 7.5 分群當日及3日後 分群8日後
評價投予上述抗體的全身作用。根據脾臟的臟器重量，認為投予NS1-MB492時臟器重量增加，根據細胞數測量，認為投予NS1-MB492時淋巴球分層增加。另一方面，投予A372-MB492/B040-ml0r時，觀察到在1.5 mg/kg、3.0 mg/kg、7.5 mg/kg任一投予量，和NS1-MB492相比，臟器肥大化受到抑制 （圖63）。 肝臟中T細胞活性化的評價結果，投予NS1-MB492、A372-MB492/B040-ml0r時，和載劑相比，皆觀察到Granzyme B的表現增加 （圖64）。 由上確認，該轉換抗體，和非轉換抗體相比，抑制在淋巴結、脾臟的T細胞活性化。
（6-4-14） 關於A486-MB492/B167-ml0r及A488-MB492/B226-ml0r抗體的藥效（抗腫瘤效果）試驗 在參考實施例6-4-1的MC38移植小鼠模式製作後，以表60所示之用量，投予載劑及A486-MB492/B167-ml0r、A488-MB492/B226-ml0r。在細胞移植後10日後進行分群，抗體的投予在細胞移植後11日後、15日後、18日後、22日後共計4次，經尾靜脈路徑投予。載劑使用含0.05% Tween-20的PBS。
用於A486-MB492/B167-ml0r、A488-MB492/B226-ml0r抗體的藥效試驗的群的詳細資料 ［表60］
群 隻數 藥劑 用量 ［mg/kg］ 投予日
1 5 載劑 - 移植後11日後、15日後、18日後、22日後
2 5 A486-MB492/B167-ml0r 7.5 移植後11日後、15日後、18日後、22日後
3 5 A488-MB492/B226-ml0r 7.5 移植後11日後、15日後、18日後、22日後
各群的抗腫瘤效果以參考實施例6-4-1所載方法計算腫瘤體積而評價。結果確認A486-MB492/B167-ml0r及A488-MB492/B226-ml0r的抗腫瘤效果（圖65）。
（6-4-15） 用於A486-MB492/B167-ml0r及A488-MB492/B226-ml0r的全身作用評價的抗體投予及採樣、及FCM分析 在參考實施例6-4-1的MC38移植小鼠模式製作後，以表61所示，投予載劑、NS1-MB492 （非轉換抗體）、及A486-MB492/B167-ml0r及A488-MB492/B226-ml0r。在細胞移植後10日後進行分群，抗體的投予在細胞移植後11日後、15日後、18日後、22日後共計4次，經尾靜脈路徑投予。載劑使用含0.05% Tween-20的PBS。 在第一次投予後13日後以參考實施例6-4-2（從MC38細胞株移植小鼠之各種臟器的取出及淋巴球分層的製作）所示之方法，取出肝臟、淋巴結、脾臟。脾臟只進行臟器重量測量，淋巴結只進行淋巴球分層的細胞數測量。
用於A486-MB492/B167-ml0r及A488-MB492/B226-ml0r抗體的全身反應評價的群的詳細資料 ［表61］
群 隻數 藥劑 用量 ［mg/kg］ 投予日 採樣日
1 3 載劑 - 移植後11日後、15日後、18日後、22日後 移植後24日後 （第一次投予後13日後）
2 3 NS1-MB492 7.5 移植後11日後、15日後、18日後、22日後 移植後24日後 （第一次投予後13日後）
3 3 A486-MB492/B167-ml0r 7.5 移植後11日後、15日後、18日後、22日後 移植後24日後 （第一次投予後13日後）
4 3 A488-MB492/B226-ml0r 7.5 移植後11日後、15日後、18日後、22日後 移植後24日後 （第一次投予後13日後）
淋巴結的淋巴球分層細胞數測量及脾臟的臟器重量測量之結果，認為投予NS1-MB492時淋巴球細胞數及脾臟重量增加。另一方面，觀察到投予A486-MB492/B167-ml0r及A488-MB492/B226-ml0r時，和投予NS1-MB492時相比，淋巴球細胞數及脾臟重量的增加受到抑制（圖66）。 肝臟的T細胞活性化的評價結果，投予NS1-MB492及A486-MB492/B167-ml0r、A488-MB492/B226-ml0r時皆觀察到，和載劑相比，CD8α陽性細胞的比例增加 （圖67）。 由上述確認，該轉換抗體，和非轉換抗體相比，抑制在淋巴結、脾臟的T細胞活性化。
（6-4-16） 關於A489-MB492/B223-ml0r抗體的藥效（抗腫瘤效果）試驗 在參考實施例6-4-1的MC38移植小鼠模式製作後，以表62所示用量，投予載劑及A489-MB492/B223-ml0r。抗體在分群隔日及分群後4日後、7日後、10日後共計4次，經尾靜脈路徑投予。載劑使用含0.05% Tween-20的PBS。
用於A489-MB492/B223-ml0r抗體的藥效試驗的群的詳細資料 ［表62］
群 隻數 藥劑 用量 ［mg/kg］ 投予日
1 5 載劑 - 分群當日、4日後、7日後、10日後
2 5 A489-MB492/B223-ml0r 7.5 分群當日、4日後、7日後、10日後
各群的抗腫瘤效果以參考實施例6-4-1所載方法計算腫瘤體積而評價。結果確認在7.5 mg/kg投予的抗腫瘤效果 （圖68）。
（6-4-17） 用於A489-MB492/B223-ml0r的全身作用評價的抗體投予及採樣、及FCM分析 在參考實施例6-4-1的MC38移植小鼠模式製作後，以表63所示，投予載劑、NS1-MB492 （非轉換抗體）及A489-MB492/B223-ml0r。抗體的投予在分群當日及分群後3日後、6日後共計3次，經尾靜脈路徑投予。載劑使用含0.05% Tween-20的PBS。 在第一次投予後7日後以參考實施例6-4-2 （從MC38細胞株移植小鼠之各種臟器的取出及淋巴球分層的製作）所示之方法，取出肝臟、淋巴結、脾臟。脾臟、淋巴結只進行調配淋巴球分層後的細胞數測量。
用於A489-MB492/B223-ml0r抗體的全身反應評價的群的詳細資料 ［表63］
群 隻數 藥劑 用量 ［mg/kg］ 投予日 採樣日
1 3 載劑 - 分群當日、3日後、6日後 分群7日後
2 3 NS1-MB492 7.5 分群當日、3日後、6日後 分群7日後
3 3 A489-MB492/B223-ml0r 7.5 分群當日、3日後、6日後 分群7日後
淋巴結、脾臟的淋巴球分層細胞數測量的結果，認為在投予NS1-MB492時細胞數增加。另一方面，在投予A489-MB492/B223-ml0r時，和投予NS1-MB492相比，觀察到抑制淋巴球增加的現象 （圖69）。 肝臟的T細胞活性化的評價結果，觀察到在投予NS1-MB492、A489-MB492/B223-ml0r時，和載劑相比，CD8α陽性細胞的比例增加 （圖70）。 由上確認，該轉換抗體，和非轉換抗體相比，抑制在淋巴結、脾臟的T細胞活性化。
（6-4-18） 關於A548-mIgG1/B256-ml0r及A551-mIgG1/B256-ml0r抗體的藥效（抗腫瘤效果）試驗 在參考實施例6-4-1的MC38移植小鼠模式製作後，以表64所示之用量，投予載劑及A548-mIgG1/B256-ml0r 、A551-mIgG1/B256-ml0r。抗體的投予在分群當日及分群後3日後共計2次，經尾靜脈路徑投予。載劑使用含0.05% Tween-20的PBS。
用於A548-mIgG1/B256-ml0r、 A551-mIgG1/B256-ml0r抗體的藥效試驗的群的詳細資料 ［表64］
群 隻數 藥劑 用量 ［mg/kg］ 投予日
1 5 載劑 - 分群當日及3日後
2 5 A548-mIgG1/B256-ml0r 7.5 分群當日及3日後
3 5 A548-mIgG1/B256-ml0r 37.5 分群當日及3日後
4 4 A548-mIgG1/B256-ml0r 100 分群當日及3日後
5 5 A551-mIgG1/B256-ml0r 7.5 分群當日及3日後
6 5 A551-mIgG1/B256-ml0r 37.5 分群當日及3日後
7 4 A551-mIgG1/B256-ml0r 100 分群當日及3日後
各群的抗腫瘤效果以參考實施例6-4-1所載方法計算腫瘤體積而評價。結果認為，在投予A548-mIgG1/B256-ml0r的37.5 mg/kg、100 mg/kg有抗腫瘤效果。又認為，在投予A551-mIgG1/B256-ml0r的100 mg/kg有顯著的抗腫瘤效果（圖71）。
（6-4-19） 用於A548-mIgG1/B256-抗體及A551-mIgG1/B256-抗體的全身作用評價的抗體投予及採樣、及FCM分析 在參考實施例6-4-1的MC38移植小鼠模式製作後，以表65所示，投予載劑、NS1-mIgG1 （非轉換抗體）及A548-mIgG1/B256-ml0r 、A551-mIgG1/B256-ml0r。抗體的投予在分群當日及分群後3日後共計2次，經尾靜脈路徑投予。載劑使用含0.05% Tween-20的PBS。 在第一次投予後5日後以參考實施例6-4-2 （從MC38細胞株移植小鼠之各種臟器的取出及淋巴球分層的製作）所示之方法，取出肝臟、淋巴結、脾臟。脾臟、淋巴結只進行臟器重量測量。
用於A548-mIgG1/B256-ml0r 、A551-mIgG1/B256-ml0r抗體的全身反應評價的群的詳細資料 ［表65］
群 隻數 藥劑 用量 ［mg/kg］ 投予日 採樣日
1 3 載劑 - 分群當日及3日後 分群5日後
2 3 NS1-mIgG1 0.3 分群當日及3日後 分群5日後
3 3 NS1-mIgG1 1.5 分群當日及3日後 分群5日後
4 3 NS1-mIgG1 7.5 分群當日及3日後 分群5日後
5 3 A548-mIgG1/B256-ml0r 1.5 分群當日及3日後 分群5日後
6 3 A548-mIgG1/B256-ml0r 7.5 分群當日及3日後 分群5日後
7 3 A548-mIgG1/B256-ml0r 37.5 分群當日及3日後 分群5日後
8 3 A548-mIgG1/B256-ml0r 100 分群當日及3日後 分群5日後
9 3 A551-mIgG1/B256-ml0r 1.5 分群當日及3日後 分群5日後
10 3 A551-mIgG1/B256-ml0r 7.5 分群當日及3日後 分群5日後
11 3 A551-mIgG1/B256-ml0r 37.5 分群當日及3日後 分群5日後
12 3 A551-mIgG1/B256-ml0r 100 分群當日及3日後 分群5日後
淋巴結、脾臟的臟器重量的評價結果，認為在投予NS1-mIgG1時在0.3 mg/kg、1.5 mg/kg、7.5 mg/kg，臟器重量增加。另一方面，在投予A548-mIgG1/B256-ml0r、A551-mIgG1/B256-ml0r時在1.5 mg/kg、7.5 mg/kg、37.5 mg/kg、100 mg/kg任一投予量皆未觀察到臟器的肥大化（圖72）。 肝臟的T細胞活性化的評價結果，Granzyme B 、PD-1皆在NS1-mIgG1投予時在0.3 mg/kg觀察到表現增加。另一方面，在投予A548-mIgG1/B256-ml0r 、A551-mIgG1/B256-ml0r時在1.5 mg/kg、7.5 mg/kg、37.5 mg/kg、100 mg/kg任一投予量皆被認為表現抑制（圖73）。 由上確認，該轉換抗體，和非轉換抗體相比，抑制在淋巴結、脾臟及肝臟的T細胞活性化。
（6-4-20） 關於A551-MB110/B379-ml0r抗體的藥效（抗腫瘤效果）試驗 在參考實施例6-4-1的MC38移植小鼠模式製作後，以表66所示之用量，投予載劑及A551-MB110/B379-ml0r。抗體的投予在分群當日及分群後3日後共計2次，經尾靜脈路徑投予。載劑使用含0.05% Tween-20的PBS。
用於A551-MB110/B379-ml0r抗體的藥效試驗的群的詳細資料 ［表66］
群 隻數 藥劑 用量 ［mg/kg］ 投予日
1 6 載劑 - 分群當日及3日後
2 5 A551-MB110/B379-ml0r 2.5 分群當日及3日後
3 6 A551-MB110/B379-ml0r 7.5 分群當日及3日後
4 6 A551-MB110/B379-ml0r 22.5 分群當日及3日後
各群的抗腫瘤效果以參考實施例6-4-1所載方法計算腫瘤體積而評價。結果確認在任一投予量皆有抗腫瘤效果 （圖74）。
（6-4-21） 用於全身作用評價的抗體投予及採樣、及FCM分析 在參考實施例6-4-1的MC38移植小鼠模式製作後，以表67所示，投予載劑、NS1-mIgG1 （非轉換抗體）及A551-MB110/B379-ml0r。抗體的投予在分群當日及分群後3日後共計2次，經尾靜脈路徑投予。載劑使用含0.05% Tween-20的PBS。 在第一次投予後5日後以參考實施例6-4-2（從MC38細胞株移植小鼠之各種臟器的取出及淋巴球分層的製作）所示之方法，取出肝臟、淋巴結、脾臟，以參考實施例6-4-3（使用各種臟器的淋巴球分層之FCM分析）所示方法進行FCM分析。
用於A551-MB110/B379-ml0r抗體的全身反應評價的群的詳細資料 ［表67］
群 隻數 藥劑 用量 ［mg/kg］ 投予日 採樣日
1 3 載劑 - 分群當日及3日後 分群5日後
2 3 NS1-mIgG1 7.5 分群當日及3日後 分群5日後
3 3 A551-MB110/B379-ml0r 0.83 分群當日及3日後 分群5日後
4 3 A551-MB110/B379-ml0r 2.5 分群當日及3日後 分群5日後
5 3 A551-MB110/B379-ml0r 7.5 分群當日及3日後 分群5日後
6 3 A551-MB110/B379-ml0r 22.5 分群當日及3日後 分群5日後
淋巴結、脾臟的臟器重量評價之結果，確認在投予NS1-mIgG1時在7.5 mg/kg臟器重量增加。另一方面，在投予A551-MB110/B379-ml0r時，在0.83 mg/kg、2.5 mg/kg、7.5 mg/kg、22.5 mg/kg任一投予量，皆沒有觀察到臟器的肥大化（圖75）。又，脾臟以FCM評價的T細胞活性化評價結果，在投予NS1-mIgG1時觀察到的活化標記物（PD-1, ICOS, Granzyme B）的增加，在投予A551-MB110/B379-ml0r時的任何投予量中皆未確認到 （圖76）。 肝臟的T細胞活性化的評價結果，觀察到在投予NS1-mIgG1時，PD-1、ICOS皆在7.5 mg/kg 表現增加。另一方面，在投予A551-MB110/B379-ml0r時，確認在0.83 mg/kg、 2.5 mg/kg將表現抑制到載劑水平，即使在7.5 mg/kg 投予時，也較NS1-mIgG1 抑制表現增加（圖77）。 由上可知，該轉換抗體，和非轉換抗體相比，抑制在淋巴結、脾臟及肝臟的T細胞活性化。
參考實施例7：可使促效劑活性增強的改變Fc之製作 （7-1） 使對FcγR的結合活性增加的改變體之製作 將WO2017104783所記載對FcγRIIb結合活性增加的重鏈恆定區TT14 （在含有序列識別號：182的胺基酸序列之Fc區域中，包含T250V/T307P的胺基酸改變、及對FcγRIIb的結合活性增加的胺基酸改變L234Y/P238D/V264I/A330K之重鏈恆定區（改變位置皆為EU編號））（序列識別號：149）、WO2017104783所記載對FcγRIIb的結合活性增加的重鏈恆定區TT11（在含有序列識別號：182的胺基酸序列之Fc區域中，包含T250V/T307P的胺基酸改變、及對FcγRIIb的結合活性增加的胺基酸改變L234Y/P238D/A330K之重鏈恆定區（改變位置皆為EU編號））導入G237D的胺基酸突變之TT16（序列識別號：150）、WO2014163101所記載對FcγRIIb的結合活性增加的重鏈恆定區P587（序列識別號：151）、以及和已知的對FcγRIIb的結合活性增加的重鏈恆定區P253（序列識別號：93），和轉換抗體的重鏈可變區（A375、A372、A356、A486、A488、A489、A548、及A551）、或陰性對照抗體的重鏈可變區（IC17HdK（序列識別號：152））組合。由此製作如下組合各恆定區域和各重鏈可變區之基因。
［表68］
重鏈全長 重鏈可變區域（序列識別號） 重鏈恆定區域（序列識別號）
A375-TT14 A375（序列識別號：43） TT14（序列識別號：149）
A375-TT16 A375（序列識別號：43） TT16（序列識別號：150）
A375-P587 A375（序列識別號：43） P587（序列識別號：151）
A372-P253 A372（序列識別號：44） P253（序列識別號：93）
A356-TT16 A356（序列識別號：45） TT16（序列識別號：150）
A356-P587 A356（序列識別號：45） P587（序列識別號：151）
A486-P253 A486（序列識別號：46） P253（序列識別號：93）
A488-P253 A488（序列識別號：48） P253（序列識別號：93）
A489-P253 A489（序列識別號：49） P253（序列識別號：93）
A548-P587 A548（序列識別號：50） P587（序列識別號：151）
A551-TT16 A551（序列識別號：51） TT16（序列識別號：150）
A551-P587 A551（序列識別號：51） P587（序列識別號：151）
IC17HdK-TT16 IC17HdK（序列識別號：152） TT16（序列識別號：150）
IC17HdK-P587 IC17HdK（序列識別號：152） P587（序列識別號：151）
IC17HdK-P253 IC17HdK（序列識別號：152） P253（序列識別號：93）
又，將WO2017104783所記載對FcγR的結合活性增加的重鏈恆定區MY201（在含有序列識別號：182的胺基酸序列之Fc區域中，包含對FcγRIIb的結合活性增加的胺基酸改變G236N/H268D/A330K之重鏈恆定區（改變位置皆為EU編號））（序列識別號：153）、MY518（在含有序列識別號：182的胺基酸序列之Fc區域中，包含對FcγRIIb的結合活性增加的胺基酸改變L235W/G236N/H268D/ Q295L/K326T/A330K之重鏈恆定區（改變位置皆為EU編號））（序列識別號：154）、以及在該等導入K214R改變之MY201a（序列識別號：155）、MY518a（序列識別號：156）、或在MY201a導入L235W的改變之MY201aPh（序列識別號：157），和轉換抗體的重鏈可變區（A375、A356、及A551） 、或陰性對照抗體的重鏈可變區（IC17HdK（序列識別號：152））組合。由此製作如下組合各恆定區域和各重鏈可變區之基因。
［表69］
重鏈全長 重鏈可變區域（序列識別號） 重鏈恆定區域（序列識別號）
A375-MY201aPh A375（序列識別號:43） MY201aPh（序列識別號:157）
A375-MY518 A375（序列識別號:43） MY518（序列識別號:154）
A375-MY518a A375（序列識別號:43） MY518a（序列識別號:156）
A356-MY518 A356（序列識別號:45） MY518（序列識別號:154）
A551-MIY201a A551（序列識別號:51） MY201a序列識別號:155）
A551-MY201aPh A551（序列識別號:51） MY201aPh（序列識別號:157）
A551-MY518 A551（序列識別號:51） MY518（序列識別號:154）
A551-MY518a A551（序列識別號:51） MY518a（序列識別號:156）
IC17HdK-MY201 IC17HdK（序列識別號:152） MY201（序列識別號:153）
IC17HdK-MY201aPh IC17HdK（序列識別號:152） MY201aPh（序列識別號:157）
IC17HdK-MY518 IC17HdK（序列識別號:152） MY518（序列識別號:154）
IC17HdK-MY518a IC17HdK（序列識別號:152） MY518a（序列識別號:156）
將此等的抗體重鏈基因，和轉換抗體的抗體輕鏈基因（參考實施例5-2及5-3所製作之B040-Lamlib、B167-Lamlib、B226-Lamlib、B223-Lamlib、B256-Lamlib、及B379-Lamlib）、及陰性對照抗體的抗體輕鏈基因（輕鏈可變區IC17L（序列識別號：158）和輕鏈恆定區人類κ鏈k0（序列識別號：141）組合所製作之，組合IC17L-k0者，以此技術領域公知方法，如表70所示，使目標抗體表現、純化。
對FcγRIIb的結合活性增加的各改變體 ［表70］
可變區域（重鏈/輕鏈） 重鏈恆定區域 輕鏈恆定區域 抗體名
A375/B167 MY201aPh Lamlib A375-MY201aPh/B167-Lamlib
MY518 Lamlib A375-MY518/B167-Lamlib
MY518a Lamlib A375-MY518a/B167-Lamlib
P587 Lamlib A375-P587/B167-Lamlib
TT14 Lamlib A375-TT14/B167-Lamlib
TT16 Lamlib A375-TT16/B167-Lamlib
A372/B040 P253 Lamlib A372-P253/B040-Lamlib
A356/B040 MY518 Lamlib A356-MY518/B040-Lamlib
P587 Lamlib A356-P587/B040-Lamlib
TT16 Lamlib A356-TT16/B040-Lamlib
A486/B167 P253 Lamlib A486-P253/B167-Lamlib
A488/B226 P253 Lamlib A488-P253/B226-Lamlib
A489/B223 P253 Lamlib A489-P253/B223-Lamlib
A548/B256 P587 Lamlib A548-P587/B256-Lamlib
A551/B256 MY201a Lamlib A551-MY201a/B256-Lamlib
MY201aPh Lamlib A551-MY201aPh/B256-Lamlib
MY518 Lamlib A551-MY518/B256-Lamlib
P587 Lamlib A551-P587/B256-Lamlib
A551/B379 MY518a Lamlib A551-MY518a/B379-Lamlib
P587 Lamlib A551-P587/B379-Lamlib
TT16 Lamlib A551-TT16/B379-Lamlib
1C17HdK/IC17L MY201 k0 1C17HdK-MY201/IC17L-k0
MY201aPh k0 1C17HdK-MY201aPh/IC17L-k0
MY518 k0 1C17HdK-MY518/IC17L-k0
MY518a k0 1C17HdK-MY518a/IC17L-k0
P253 k0 1C17HdK-P253/IC17L-k0
P587 k0 1C17HdK-P587/IC17L-k0
TT16 k0 1C17HdK-TT16/IC17L-k0
（7-2） 經恆定區域的胺基酸改變而使pI增加的改變體之製作 製作將WO2017046994所記載對FcγR的結合活性沒有大的變化而pI增加的胺基酸突變Q311R、P343R、D413K，組合參考實施例7-1所製作之對FcγR的結合活性增加的重鏈恆定區之重鏈恆定區。 具體為，如下所述，製作在各抗體的重鏈恆定區的基因導入胺基酸突變之重鏈恆定區的基因。
‧MY518（序列識別號：154） 導入P343R/D413K：SCF025（序列識別號：64） ‧MY518a（序列識別號：156） 導入P343R/D413K：SCF025a（序列識別號：65） ‧TT14（序列識別號：149） 導入P343R/D413K：SCF027（序列識別號：66） ‧TT16（序列識別號：150） 導入P343R/D413K：SCF028（序列識別號：67） ‧MY518（序列識別號：154） 導入Q311R/P343R：SCF030（序列識別號：68） ‧TT14（序列識別號：149） 導入Q311R/P343R：SCF032（序列識別號：69） ‧TT16（序列識別號：150） 導入Q311R/P343R：SCF033（序列識別號：70） ‧MY518（序列識別號：154） 導入P343R：SCF039 （序列識別號：71） ‧MY518a（序列識別號：156） 導入P343R：SCF039a （序列識別號：72） ‧MY518（序列識別號：154） 導入D413K：SCF040 （序列識別號：73） ‧MY201a（序列識別號：155） 導入P343R：SCF041a （序列識別號：74） ‧MY201aPh（序列識別號：157） 導入P343R：SCF041aPh （序列識別號：75） ‧MY201a（序列識別號：155） 導入D413K：SCF042a （序列識別號：76） ‧MY201a（序列識別號：155） 導入P343R/D413K：SCF043a（序列識別號：77） ‧MY201aPh（序列識別號：157） 導入P343R/D413K：SCF043aPh（序列識別號：78） ‧MY201a（序列識別號：155） 導入Q311R：SCF056a （序列識別號：79） ‧MY201aPh（序列識別號：157） 導入Q311R：SCF056aPh （序列識別號：80） ‧MY201a（序列識別號：155） 導入Q311R/P343R：SCF057a（序列識別號：81） ‧MY201aPh（序列識別號：157） 導入Q311R/P343R：SCF057aPh（序列識別號：82） ‧MY201a（序列識別號：155） 導入Q311R/D413K：SCF059a （序列識別號：83） ‧MY201aPh（序列識別號：157） 導入Q311R/D413K：SCF059aPh （序列識別號：84） ‧MY518a（序列識別號：156） 導入Q311R：SCF060a （序列識別號：85）
在此製作之重鏈恆定區之基因、和各重鏈可變區A375（序列識別號：43）或A551（序列識別號：51）之基因進行組合，如下表71所示，製作各抗體重鏈基因。
［表71］
重鏈全長 重鏈可變區域（序列識別號） 重鏈恆定區域（序列識別號）
A375-SCF025 A375（序列識別號:43） SCF025（序列識別號：64）
A375-SCF027 A375（序列識別號:43） SCF027（序列識別號：66）
A375-SCF028 A375（序列識別號:43） SCF028（序列識別號：67）
A375-SCF030 A375（序列識別號:43） SCF030（序列識別號：68）
A375-SCF032 A375（序列識別號:43） SCF032（序列識別號：69）
A375-SCF033 A375（序列識別號:43） SCF033（序列識別號：70）
A375-SCF039 A375（序列識別號:43） SCF039（序列識別號：71）
A375-SCF040 A375（序列識別號:43） SCF040（序列識別號：73）
A375-SCF041aPh A375（序列識別號:43） SCF041aPh（序列識別號：75）
A375-SCF043aPh A375（序列識別號:43） SCF043aPh（序列識別號：78）
A375-SCF056aPh A375（序列識別號:43） SCF056aPh（序列識別號：80）
A375-SCF057aPh A375（序列識別號:43） SCF057aPh（序列識別號：82）
A375-SCF059aPh A375（序列識別號:43） SCF059aPh（序列識別號：84）
A375-SCF060a A375（序列識別號:43） SCF060a（序列識別號：85）
A551-SCF025a A551（序列識別號:51） SCF025a（序列識別號：65）
A551-SCF039a A551（序列識別號:51） SCF039a（序列識別號：72）
A551-SCF041a A551（序列識別號:51） SCF041a（f序列識別號：74）
A551-SCF041aPh A551（序列識別號:51） SCF041aPh（序列識別號：75）
A551-SCF043a A551（序列識別號:51） SCF043a（序列識別號：77）
A551-SCF043aPh A551（序列識別號:51） SCF043aPh（序列識別號：78）
A551-SCF056a A551（序列識別號:51） SCF056a（序列識別號：79）
A551-SCF056aPh A551（序列識別號:51） SCF056aPh（序列識別號：80）
A551-SCF057a A551（序列識別號:51） SCF057a（序列識別號：81）
A551-SCF057aPh A551（序列識別號:51） SCF057aPh（序列識別號：82）
A551-SCF059a A551（序列識別號:51） SCF059a（序列識別號：83）
A551-SCF059aPh A551（序列識別號:51） SCF059aPh（序列識別號：84）
A551-SCF060a A551（序列識別號:51） SCF060a（序列識別號：85）
而且，將此等之抗體重鏈基因、組合參考實施例5-3所製作之B167-Lamlib、B256-Lamlib、B379-Lamlib的基因之抗體輕鏈基因，以此技術領域公知方法，如表72所示，使目標抗體表現、純化。
［表72］
可變區域（重鏈/輕鏈） 重鏈恆定區域 輕鏈恆定區域 抗體名
A375/B167 （A375 序列識別號：43） （B167 序列識別號：54） SCF025（序列識別號：64） Lamlib（序列識別號：63） A375-SCF025/B167-LamLib
SCF027（序列識別號：66） Lamlib（序列識別號：63） A375-SCF027/B167-LamLib
SCF028（序列識別號：67） Lamlib（序列識別號：63） A375-SCF028/B167-LamLib
SCF030（序列識別號：68） Lamlib（序列識別號：63） A375-SCF030/B167-LamLib
SCF032（序列識別號：69） Lamlib（序列識別號：63） A375-SCF032/B167-LamLib
SCF033（序列識別號：70） Lamlib（序列識別號：63） A375-SCF033/B167-LamLib
SCF039（序列識別號：71） Lamlib（序列識別號：63） A375-SCF039/B167-LamLib
SCF040（序列識別號：73） Lamlib（序列識別號：63） A375-SCF040/B167-LamLib
SCF041aPh（序列識別號：75） Lamlib（序列識別號：63） A375-SCF041aPh/B167-LamLib
SCF043aPh（序列識別號：78） Lamlib（序列識別號：63） A375-SCF043aPh/B167-LamLib
SCF056aPh（序列識別號：80） Lamlib（序列識別號：63） A375-SCF056aPh/B167-LamLib
SCF057aPh（序列識別號：82） Lamlib（序列識別號：63） A375-SCF057aPh/B167-LamLib
SCF059aPh（序列識別號：84） Lamlib（序列識別號：63） A375-SCF059aPh/B167-LamLib
SCF060a（序列識別號：85） Lamlib（序列識別號：63） A375-SCF060a/B167-LamLib
A551/B256 （A551 序列識別號：51） （B256 序列識別號：59） SCF025a（序列識別號：65） Lamlib（序列識別號：63） A551-SCF025a/B256-LamLib
SCF039a（序列識別號：72） Lamlib（序列識別號：63） A551-SCF039a/B256-LamLib
SCF041a（序列識別號：74） Lamlib（序列識別號：63） A551-SCF041a/B256-LamLib
SCF041aPh（序列識別號：75） Lamlib（序列識別號：63） A551-SCF041aPh/B256-LamLib
SCF043a（序列識別號：77） Lamlib（序列識別號：63） A551-SCF043a/B256-LamLib
SCF043aPh（序列識別號：78） Lamlib（序列識別號：63） A551-SCF043aPh/B256-LamLib
SCF056a（序列識別號：79） Lamlib（序列識別號：63） A551-SCF056a/B256-LamLib
SCF056aPh（序列識別號：80） Lamlib（序列識別號：63） A551-SCF056aPh/B256-LamLib
SCF057a（序列識別號：81） Lamlib（序列識別號：63） A551-SCF057a/B256-LamLib
SCF057aPh（序列識別號：82） Lamlib（序列識別號：63） A551-SCF057aPh/B256-LamLib
SCF059a（序列識別號：83） Lamlib（序列識別號：63） A551-SCF059a/B256-LamLib
SCF059aPh（序列識別號：84） Lamlib（序列識別號：63） A551-SCF059aPh/B256-LamLib
A551/B379 （A551 序列識別號：51） （B379 序列識別號：60） SCF039a（序列識別號：72） Lamlib（序列識別號：63） A551-SCF039a/B379-LamLib
SCF041a（序列識別號：74） Lamlib（序列識別號：63） A551-SCF041a/B379-LamLib
SCF041aPh（序列識別號：75） Lamlib（序列識別號：63） A551-SCF041aPh/B379-LamLib
SCF043a（序列識別號：77） Lamlib（序列識別號：63） A551-SCF043a/B379-LamLib
SCF043aPh（序列識別號：78） Lamlib（序列識別號：63） A551-SCF043aPh/B379-LamLib
SCF056a（序列識別號：79） Lamlib（序列識別號：63） A551-SCF056a/B379-LamLib
SCF056aPh（序列識別號：80） Lamlib（序列識別號：63） A551-SCF056aPh/B379-LamLib
SCF057a（序列識別號：81） Lamlib（序列識別號：63） A551-SCF057a/B379-LamLib
SCF057aPh（序列識別號：82） Lamlib（序列識別號：63） A551-SCF057aPh/B379-LamLib
SCF059a（序列識別號：83） Lamlib（序列識別號：63） A551-SCF059a/B379-LamLib
SCF059aPh（序列識別號：84） Lamlib（序列識別號：63） A551-SCF059aPh/B379-LamLib
SCF060a（序列識別號：85） Lamlib（序列識別號：63） A551-SCF060a/B379-LamLib
（7-3） 促效劑活性之比較對照用的對照抗體之製作 製作作為促效劑活性之比較對照用的對照抗體之在重鏈可變區具有參考實施例7-1所製作之IC17HdK（序列識別號：152）之抗體（IC17HdK-MY201/IC17L-k0、IC17HdK-MY201aPh/IC17L-k0、IC17HdK-MY518/IC17L-k0、IC17HdK-MY518a/ IC17L-k0、IC17HdK-P253/IC17L-k0、IC17HdK-P587/IC17L-k0、IC17HdK-TT16/ IC17L-k0）。又將組合重鏈可變區IC17HdK （序列識別號：152）的基因、組合人類IgG4的重鏈恆定區的C端的Gly及Lys缺失的G4d （序列識別號：159）的基因，所製作的抗體重鏈IC17HdK-G4d，和抗體輕鏈IC17L-k0 （可變區域的序列識別號：158、恆定區域的序列識別號：141）的基因組合，以此技術領域公知方法，使目標抗體（IC17HdK-G4d/IC17L-k0）表現、純化。此等對照抗體使用於參考實施例5。
（7-4） 經恆定區域的胺基酸改變而使pI增加的改變體之對各人類Fcγ受體結合的評價 使用Biacore T200（GE Healthcare），評價對各人類Fcγ受體（以下以FcγR表示）的結合活性。使用50 mM磷酸、150 mM NaCl、0.05 w/v%-P20、pH7.4作為測量用緩衝液，在25℃實施。使用固定有作為配體捕捉用分子之CaptureSelect （商標）人類Fab-λ動態生物素共軛物（ThermoFisher scientific）的感應晶片，捕捉抗體約1000RU。人類FcγR以測量用緩衝液將FcγRIa稀釋至8 nM，其他的FcγR稀釋至1000 nM，和被捕捉的抗體交互作用。各抗體對各Fcγ的結合活性，使用Biacore T200 評價軟體2.0，計算每單位抗體量的FcγR結合量（RU）而評價。
FcγR的細胞外區以下列方法製作。首先，FcγR的細胞外區的基因合成以此技術領域公知方法實施。此時，各FcγR的序列根據登錄於NCBI的資訊製作。具體為，FcγRI根據NCBI accession # NM_000566.3的序列、FcγRIIa根據NCBI accession # NM_001136219.1的序列、FcγRIIb根據NCBI accession # NM_004001.3的序列、FcγRIIIa根據NCBI accession # NM_001127593.1的序列製作，C端加上His tag。又FcγRIIa的多型部位可參考J. Exp. Med., 1990, 172, 19-25製作，FcγRIIIa的多型部位可參考J. Clin. Invest., 1997, 100, 1059-1070製作。所得的基因片段插入動物細胞表現載體，製作表現載體。所製作的表現載體暫時導入來自人類胎兒腎癌細胞的FreeStyle293細胞（Invitrogen社），使目標蛋白質被表現。收集培養上清液後，通過0.22 μm過濾器，原則上以下述的4步驟純化。第1步驟進行陽離子交換柱層析法（SP Sepharose FF），第2步驟進行對His tag的親和性柱層析法（HisTrap HP），第3步驟進行膠過濾柱層析法（Superdex200），第4步驟進行無菌過濾。但是，FcγRI在第1步驟進行使用Q sepharose FF的陰離子交換柱層析法。純化的蛋白質的濃度，以分光光度計測量在280nm的吸光度，從所得的值使用經PACE等方法計算出的吸光係數來計算（Protein Science, 1995, 4, 2411-2423）。
表73顯示每單位抗體量的結合量，以及對A375-G1T3/B167-Lamlib的結合量的相對量。表73中，每一抗體之每單位抗體量的人類FcγRIIb結合量，皆較A375-G1T3/B167-Lamlib的多，以A375-G1T3/B167-Lamlib的人類FcγRIIb結合量作為1.0時，相對值為2.85-14.26。不論恆定區域有無pI增加的胺基酸改變，每單位抗體量的人類FcγRIIb結合量和結合量的相對值相同。又，包含L235W的改變之抗體對hFcgRIa的結合量較A375-TT14/B167-Lamlib的低。
各人類FcγR的結合活性 ［表73］
名稱 抗體每1RU的結合量（RU） 結合量的相對值
hFcgRIa hFcgRIIaH hFcgRIIaR hFcgRIIb hFcgRIIIaF hFcgRIIIaV hFcgRIa hFcgRIIaH hFcgRIIaR hFcgRIIb hFcgRIIIaF hFcgRIIIaV
A375-G1T3/B167-Lamlib 0.0813 0.0567 0.0463 0.0110 0.0213 0.0700 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
A375-MY201a/B167-Lamlib 0.0396 0.0534 0.0338 0.0401 0.0007 0.0024 0.49 0.94 0.73 3.66 0.04 0.03
A375-MY201aPh/B167-Lamlib 0.0040 0.0328 0.0335 0.0313 0.0007 0.0011 0.05 0.58 0.72 2.85 0.03 0.02
A375-MY518/B167-Lamlib 0.0020 0.0466 0.0460 0.0482 0.0009 0.0015 0.02 0.82 0.99 4.40 0.04 0.02
A375-MY518a/B167-Lamlib 0.0033 0.0479 0.0470 0.0489 0.0006 0.0009 0.04 0.84 1.01 4.46 0.03 0.01
A375-TT11/B167-Lamlib 0.0075 0.0020 0.0041 0.0477 -0.0009 -0.0010 0.09 0.03 0.09 4.35 -0.04 -0.01
A375-TT14/B167-Lamlib 0.0045 0.0042 0.0067 0.0805 0.0000 0.0003 0.05 0.07 0.14 7.34 0.00 0.00
A375-TT16/B167-Lamlib 0.0034 0.0126 0.0359 0.1090 0.0001 -0.0002 0.04 0.22 0.77 9.94 0.00 0.00
A375-P587/B167-Lamlib 0.0962 0.0029 0.0371 0.1427 0.0001 0.0001 1.18 0.05 0.80 13.02 0.00 0.00
A375-P253/B167-Lamlib 0.0937 0.0497 0.1678 0.1563 0.0056 0.0019 1.15 0.88 3.62 14.26 0.26 0.03
A375-SCF025/B167-Lamlib 0.0022 0.0514 0.0519 0.0512 0.0012 0.0014 0.03 0.91 1.12 4.67 0.06 0.02
A375-SCF025a/B167-Lamlib 0.0021 0.0514 0.0518 0.0511 0.0009 0.0016 0.03 0.91 1.12 4.67 0.04 0.02
A375-5CF027/B167-Lamlib 0.0044 0.0031 0.0058 0.0766 -0.0005 -0.0006 0.05 0.06 0.12 6.99 -0.02 -0.01
A375-SCF028/B167-Lamlib 0.0027 0.0101 0.0299 0.0995 -0.0009 0.0010 0.03 0.18 0.64 9.08 -0.04 -0.01
A375-SCF030/B167-Lamlib 0.0020 0.0533 0.0532 0.0532 0.0017 0.0020 0.02 0.94 1.15 4.85 0.08 0.03
A375-5CF032/B167-Lamlib 0.0049 0.0030 -0.0004 0.0782 -0.0007 -0.0007 0.06 0.05 -0.01 7.14 -0.03 -0.01
A375-SCF033/B167-Lamlib 0.0033 0.0103 0.0255 0.0979 0.0000 0.0002 0.04 0.18 0.55 8.94 0.00 0.00
A375-SCF039/B167-Lamlib 0.0018 0.0535 0.0542 0.0531 0.0008 0.0013 0.02 0.94 1.17 4.85 0.04 0.02
A375-SCF039a/B167-Lamlib 0.0018 0.0542 0.0554 0.0540 0.0012 0.0013 0.02 0.96 1.20 4.93 0.06 0.02
A375-SCF040/B167-Lamlib 0.0016 0.0454 0.0446 0.0465 0.0010 0.0013 0.02 0.80 0.96 4.24 0.05 0.02
A375-SCF041a/B167-Lamlib 0.0446 0.0571 0.0376 0.0433 0.0009 0.0022 0.55 1.01 0.81 3.95 0.04 0.03
A375-SCF042a/B167-Lamlib 0.0396 0.0522 0.0327 0.0393 0.0003 0.0014 0.49 0.92 0.71 3.59 0.01 0.02
A375-SCF043a/B167-Lamlib 0.0429 0.0552 0.0361 0.0419 0.0011 0.0025 0.53 0.97 0.78 3.82 0.05 0.04
A375-SCF056a/B167-Lamlib 0.0395 0.0529 0.0331 0.0399 0.0011 0.0023 0.49 0.93 0.71 3.64 0.05 0.03
A375-SCF057a/B167-Lamlib 0.0405 0.0525 0.0367 0.0412 0.0013 0.0025 0.50 0.93 0.79 3.76 0.06 0.04
A375-SCF059a/B167-Lamlib 0.0380 0.0502 0.0319 0.0358 0.0010 0.0021 0.47 0.88 0.69 3.27 0.05 0.03
A375-SCF060a/B167-Lamlib 0.0021 0.0463 0.0459 0.0472 0.0011 0.0008 0.03 0.82 0.99 4.31 0.05 0.01
A375-SCF041aPh/B167-Lamlib 0.0013 0.0371 0.0371 0.0350 0.0007 0.0005 0.02 0.65 0.80 3.20 0.03 0.01
A375-SCF043aPh/B167-Lamlib 0.0011 0.0349 0.0349 0.0339 0.0001 0.0001 0.01 0.62 0.75 3.10 0.00 0.00
A375-SCF056aPh/B167-Lamlib 0.0019 0.0314 0.0299 0.0292 0.0010 0.0010 0.02 0.55 0.64 2.67 0.05 0.01
A375-SCF057aPh/B167-Lamlib 0.0021 0.0365 0.0364 0.0345 -0.0003 0.0005 0.03 0.64 0.79 3.15 -0.02 0.01
A375-SCF059aPh/B167-Lamlib 0.0089 0.0332 0.0319 0.0291 0.0003 0.0028 0.11 0.59 0.69 2.66 0.01 0.04
（7-5） 經恆定區域的胺基酸改變而使pI增加的改變體之人類FcRn結合的評價 使用Biacore T200（GE Healthcare），評價對人類FcRn的結合活性。使用50 mM磷酸、150 mM NaCl、0.05 w/v%-P20、pH6.0作為測量用緩衝液，在25℃實施。本測量所使用之人類FcRn蛋白以WO2010107110所載之方法製作。使用固定有作為配體捕捉用分子之CaptureSelect （商標）人類Fab-lambda動態生物素共軛物（ThermoFisher scientific）的感應晶片，捕捉抗體約400RU後，和以測量用緩衝液稀釋的人類FcRn結合。各抗體對FcRn的結合活性使用Biacore T200 評價軟體2.0經穩定狀態（steady state）模式計算KD （mol/L）而評價。不論恆定區域有無pI增加的胺基酸改變，KD值相同。表74顯示人類FcRn和各抗體的KD （mol/L）。
［表74］
名稱 KD （mol/L）
A375-G1T3/B167-Lamlib 1.27E-06
A375-MY201a/B167-Lamlib 1.19E-06
A375-MY201aPh/B167-Lamlib 1.18E-06
A375-MY518/B167-Lamlib 1.27E-06
A375-MY518a/B167-Lamlib 1.32E-06
A375-TT11/B167-Lamlib 1.56E-06
A375-TT14/B167-Lamlib 1.77E-06
A375-TT16/B167-Lamlib 1.51E-06
A375-P587/B167-Lamlib 1.70E-06
A375-P253/B167-Lamlib 1.42E-06
A375-SCF025/B167-Lamlib 1.10E-06
A375-SCF025a/B167-Lamlib 1.13E-06
A375-5CF027/B167-Lamlib 1.33E-06
A375-SCF028/B167-Lamlib 1.27E-06
A375-SCF030/B167-Lamlib 8.63E-07
A375-5CF032/B167-Lamlib 9.66E-07
A375-SCF033/B167-Lamlib 8.74E-07
A375-SCF039/B167-Lamlib 1.09E-06
A375-SCF039a/B167-Lamlib 1.11E-06
A375-SCF040/B167-Lamlib 1.46E-06
A375-SCF041a/B167-Lamlib 1.10E-06
A375-SCF042a/B167-Lamlib 1.49E-06
A375-SCF043a/B167-Lamlib 1.18E-06
A375-SCF056a/B167-Lamlib 9.56E-07
A375-SCF057a/B167-Lamlib 9.28E-07
A375-SCF059a/B167-Lamlib 1.03E-06
A375-SCF060a/B167-Lamlib 1.01E-06
A375-SCF041aPh/B167-Lamlib 1.13E-06
A375-SCF043aPh/B167-Lamlib 1.21E-06
A375-SCF056aPh/B167-Lamlib 1.00E-06
A375-SCF057aPh/B167-Lamlib 9.09E-07
A375-SCF059aPh/B167-Lamlib 1.05E-06
參考實施例8：使用4-1BB Jurkat報導基因分析法，評價改變的抗人類CD137抗體在活體外的ATP及ADP依賴的CD137促效劑活性 參考實施例7-2（表72）所製作之改變體在活體外的活性測量，使用GloResponseTM NF-κB-Luc2/4-1BB Jurkat細胞株（Promega，CS196004）。在384孔微量盤的各孔各加入以分析培養基（99% RPMI, 1% FBS）調配成濃度4×105 /mL的FcγRIIB CHO-K1 細胞 （Promega） 10μL。接著，將含ADP的抗體溶液、或含ATP的抗體溶液、或不含ATP或ADP的抗體溶液分別加入孔10μL。之後，各孔加入以分析培養基（99% RPMI, 1% FBS）調配成2×106 /mL的GloResponseTM NF-κB-Luc2/4-1BB Jurkat細胞株10μL。ADP的最終濃度為10μM，ATP的最終濃度為10μM。將微量盤靜置於5% CO2 培養箱內37℃、6小時之後，在室溫靜置15分鐘，各孔各加入Bio-Glo試劑（Bio-Glo reagent） 30μL。Bio-Glo試劑用於Bio-Glo螢光素酶分析系統（緩衝液和基質）。之後，各孔的發光量以微量盤檢測儀測量。各孔的發光值除以未添加抗體的孔的發光值之比值為相對發光量（fold induction），做為評價各抗體的CD137促效劑活性的指標。 結果如圖78所示。從圖78確認，A375-P587/B167-LamLib、A551-P587/B256-LamLib、A551-P587/B379-LamLib、A375-SCF041aPh/B167-LamLib、A551-SCF041aPh/B256-LamLib、A551-SCF041aPh/B379-LamLib、A375-SCF043aPh/B167-LamLib、A551-SCF043aPh/B256-LamLib、A551-SCF043aPh/B379-LamLib、A375-SCF057aPh/B167-LamLib、A551-SCF057aPh/B256-LamLib、A551-SCF057aPh/B379-LamLib，顯示ATP及ADP依賴的人類CD137促效劑活性。
參考實施例9：經改變的抗CD137抗體之促效劑活性的增強 （9-1） 評價用的抗體的製作 在使和FcγRIIb的結合活性增加的重鏈恆定區導入使pI增加的各種胺基酸改變的情形中，該胺基酸改變對CD137促效劑活性的影響、及對hCD137KI/mFcγR2bKO/hFcγR2bTg#90小鼠的血漿中動態及藥效的影響，進行評價。首先，如參考實施例7-1、參考實施例7-2及參考實施例7-3之記載，製作A375-MY201aPh/B167-Lamlib、A375-SCF041aPh/B167-Lamlib、A375-SCF057aPh /B167-Lamlib、及IC17HdK-MY201aPh/IC17L-k0。
（9-2） 使用4-1BB Jurkat報導基因分析法評價改變的抗人類CD137抗體在活體外的ATP依賴的CD137促效劑活性 在使和FcγRIIb的結合活性增加的重鏈恆定區導入使pI增加的各種胺基酸改變的情形中，為了評價該胺基酸改變對CD137促效劑活性的影響，評價A375-MY201aPh/B167-Lamlib、A375-SCF041aPh/B167-Lamlib、A375-SCF057aPh /B167-Lamlib、及IC17HdK-MY201aPh/IC17L-k0的CD137促效劑活性。 所製作的抗體的活體外活性測量，使用GloResponseTM NF-κB-Luc2/4-1BB Jurkat細胞株（Promega，CS196004）。在96孔微量盤的各孔各加入以培養基調配成濃度5×104 /mL的FcγRIIB CHO-K1 細胞 （Promega） 200μL，於5% CO2 培養箱內37℃靜置一晚。培養基使用CHO培養基（90% Ham’s F12, 10% FBS）。之後，吸除所有培養基後，對各孔加入以分析培養基（99% RPMI, 1% FBS）調配成濃度2×106 /mL的GloResponseTM NF-κB-Luc2/4-1BB Jurkat細胞株25μL。接著，分別加入以分析培養基稀釋成最終濃度為0、0.001、0.01、0.1、1、10 μg/mL的各抗體溶液25μL。最後加入以分析培養基稀釋成最終濃度為250μM的ATP溶液25μL。將微量盤靜置於5% CO2 培養箱內37℃、6小時之後，在室溫靜置15分鐘，各孔加入Bio-Glo試劑 （Bio-Glo reagent）75μL。Bio-Glo試劑用於Bio-Glo螢光素酶分析系統（緩衝液和基質）。之後，各孔的發光量以微量盤檢測儀測量。各孔的發光值除以未添加抗體的孔的發光值之比值為相對發光量，做為評價各抗體的CD137促效劑活性的指標。 結果如圖79所示。從此結果顯示，經由導入使pI增加的各種胺基酸改變，使CD137促效劑活性增加。
（9-3） 改變的抗人類CD137抗體在小鼠的動態評價 （9-3-1） hCD137KI/mFcγR2bKO/hFcγR2bTg#90小鼠的製作 首先，將以小鼠Cd137為標靶的鋅指核酸酶（Zinc-finger nuclease, ZFN）和人類CD137基因取代載體，導入小鼠胚胎幹細胞（ES細胞），製作小鼠Cd137基因取代為人類CD137基因的人類CD137基因置入小鼠。之後，以小鼠Fcgr2b基因為標靶的ZFN mRNA，顯微注射於小鼠受精卵，篩選標靶區域導入突變的個體，製作小鼠Fcgr2b剔除小鼠。再將選殖人類FCGR2B基因的BAC載體顯微注射於小鼠受精卵，從如此得到的個體，篩選導入人類FCGR2B基因組區域的個體，製作人類FCGR2B轉殖基因小鼠（Iwayanagi. et al., J Immunol, 2015, 195, 3198-3205）。 使此等三個系統的小鼠雜交，建立人類CD137置入-Fcgr2b剔除•人類FCGR2B轉殖基因小鼠。此小鼠記載為hCD137KI/mFcγR2bKO/hFcγR2bTg#90小鼠。
（9-3-2） 在hCD137KI/mFcγR2bKO/hFcγR2bTg#90小鼠模式的血漿中的抗人類CD137抗體濃度的測量 對hCD137KI/mFcγR2bKO/hFcγR2bTg#90小鼠，如表75單次靜脈內投予各抗人類CD137抗體。投予後5分鐘後至28日後，經時複數次採血。將所得血液離心，分離血漿。至測量前將血漿保存於設定-20℃以下的冷凍庫。
［表75］
群 隻數 藥劑 用量［mg/kg］
1 3 A375-MY201aPh/B167-Lamlib 7.5　單次投予
2 3 A375-SCF041aPh/B167-Lamlib 7.5　單次投予
血漿中各抗人類CD137抗體的濃度以電化學發光法（ECL）法測量。hCD137（Sino Biological Inc.）以PBS（-）稀釋，添加於多陣列96孔微量盤 （Meso Scale Diagnostics, LLC）。添加hCD137的微量盤在室溫下震盪1小時，使hCD137固定於微量盤。之後添加含有1mM ADP 、1%BSA、0.05% Tween20的PBS溶液，在室溫下震盪1小時，用以阻斷。各抗人類CD137抗體的校準曲線，以血漿中濃度為640、320、160、80、40、20、10 ng/mL製作。在固定有hCD137的微量盤添加以含有1mM ADP、1%BSA、0.05% Tween20的PBS溶液稀釋的血漿樣本及校準曲線樣本。之後，該微量盤在室溫下震盪1小時後，將可特異性辨識此等抗人類CD137抗體的恆定區域之WO2019112027記載之抗體作為二次抗體添加。再將該微量盤在室溫下震盪1小時後，添加SULFO-TAG標記的山羊抗兔抗體 （Meso Scale Diagnostics, LLC）。再將該微量盤在室溫下震盪1小時後，添加以含有1mM ADP的2倍稀釋的檢測緩衝液T （Meso Scale Diagnostics, LLC）。小鼠血漿中的各抗體濃度的測量，使用SECTOR顯像儀（Meso Scale Diagnostics, LLC）檢測出SULFO-TAG而進行。小鼠血漿中的各抗體濃度的計算以SOFTmax PRO （Molecular Devices）進行。 結果如圖80所示。顯示A375-SCF041aPh/B167-Lamlib較A375-MY201aPh /B167-Lamlib早消失。這些被認為是因為在A375-SCF041aPh/B167-Lamlib的重鏈恆定區導入使pI增加的胺基酸改變的緣故。
（9-4） 在改變的抗人類CD137抗體的小鼠的藥效評價 （9-4-1） 細胞株及同系腫瘤株移植小鼠模式的製作 細胞使用對來自小鼠肺癌細胞的細胞株LLC1［LL/2 （別名：LLC1），販售源：ATCC，商品編號：CRL-1642］導入雞卵蛋白（OVA）的表現質體及人類磷脂肌醇聚糖-3 （Glypican-3；GPC3）的表現載體之LLC1/OVA/GPC3 選殖株 C5 （LLC1/OVA/GPC3）細胞株。小鼠使用上述（19-3-1）記載之hCD137KI/mFcγR2bKO/hFcγR2bTg#90小鼠（11周齡，雌）。LLC1/OVA/GPC3細胞株在含有9.8%胎牛血清 （Sigma-Aldrich, Co. LLC.）、0.44 mg/mL G418 （Nacalai Tesque, Inc.） 及0.88 mg/mL 腐草霉素 （Thermo Fisher Scientific, Inc.）的RPMI1640培養基 （Sigma-Aldrich, Co. LLC.）繼代培養。將LLC1/OVA/GPC3細胞株移植到小鼠腹部皮下，在腫瘤體積成為約250-500mm3 的時點建立模式。模式建立後，將LLC1/OVA/GPC3細胞株移植小鼠進行分群後，投予載劑及各抗人類CD137抗體。
（9-4-2） 投予藥劑的製作和投予及腫瘤測量 對於LLC1/OVA/GPC3細胞株移植小鼠，以成為如表76所示用量的含有0.05% Tween 20的PBS製作之A375-MY201aPh/B167-Lamlib 或A375-SCF041aPh /B167-Lamlib，在腫瘤移植後第11日及第14日投予。載劑群投予含有0.05% Tween 20的PBS。製作的投予液以10 mL/kg的用量從尾靜脈投予。
在LLC1/OVA/GPC3細胞株移植模式的抗腫瘤效果的測量 ［表76］
群 隻數 藥劑 用量 投予方法 投予日
1 5 含有0.05% Tween 20的PBS - 尾靜脈 移植後第11日及第14日
2 5 A375-MY201aPh/B167-Lamlib 2.50 mL/kg 尾靜脈 移植後第11日及第14日
3 5 A375-SCF041aPh /B167-Lamlib 2.50 mL/kg 尾靜脈 移植後第11日及第14日
抗腫瘤效果的評價以每周1-2次的頻率進行腫瘤體積測量。腫瘤體積以下計算式計算。 腫瘤體積（mm3 ）＝長徑（mm）×短徑（mm）×短徑（mm） /2。
結果，從參考實施例（9-3-2）的結果觀察到，不僅A375-SCF041aPh/B167-Lamlib投予小鼠的血漿濃度變化比A375-MY201aPh /B167-Lamlib低，A375-SCF041aPh/B167-Lamlib也較A375-MY201aPh /B167-Lamlib強的抗腫瘤效果（圖81）。 由上結果顯示，經由在重鏈恆定區導入使pI增加的胺基酸改變，使得在本小鼠模式中抗人類CD137抗體的抗腫瘤效果增加。
前述之發明係基於協助明確的理解之目的，使用實例及舉例詳細記載，但本說明書中之記載及舉例不應解釋為限定本發明之範圍。在本說明書所引用的所有專利文獻及科學文獻之揭示，全體參照明確併入本說明書。 ［產業可利用性］
本揭示之包含抗CD137抗原結合分子作為有效成分之抗癌劑、包含該抗CD137抗原結合分子作為有效成分之抗癌劑和其他抗癌劑的合併療法、以及用於該合併療法的醫藥組合物等，能夠應用於具有免疫細胞的活化作用、細胞毒性、及抗腫瘤活性、以及對正常組織等的非腫瘤組織的作用低、副作用少的醫藥之開發、製造、提供、使用等。
無。
［圖1］顯示在LLC1/OVA/GPC3 clone C5細胞移植的小鼠模式中，A551-MB110/B379-ml0r的抗腫瘤效果之圖。各點顯示1群（n＝7）的腫瘤體積的平均值。 ［圖2］顯示在LLC1/OVA/GPC3 clone C5細胞移植的小鼠模式中，經由投予A551-MB110/B379-ml0r的腫瘤樣本中的基因表現量之圖。 分圖（A）顯示CD8b1的表現量，分圖（B）顯示Gzmb的表現量，分圖（C）顯示Prf1的表現量，分圖（D）顯示Ifng的表現量。 ［圖3］顯示在LLC1/OVA/GPC3 clone C5細胞移植的小鼠模式中，經投予A551-MB110/B379-ml0r的腫瘤組織中的CD8陽性T細胞的活化程度之圖。 分圖（A）顯示CD8陽性T細胞的OVA tetramer陽性T細胞的比例。分圖（B）顯示CD8陽性T細胞的Granzyme B陽性T細胞的比例。分圖（C）顯示CD8陽性T細胞的PD-1陽性T細胞的比例。分圖（D）顯示CD8陽性T細胞的KLRG-1陽性T細胞的比例。分圖（E）顯示CD8陽性T細胞的ICOS陽性T細胞的比例。 ［圖4］顯示在E.G7-OVA細胞移植的小鼠模式中，A551-MB110/B379-ml0r的抗腫瘤效果之圖。 分圖（A）顯示載劑投予群之各小鼠的腫瘤體積變化。分圖（B）顯示A551-MB110/B379-ml0r（2.5mg/kg）投予群之各小鼠的腫瘤體積變化。 ［圖5］顯示在E.G7-OVA細胞移植的小鼠模式中，A375-mIgG1/B167-ml0r的抗腫瘤效果之圖。 分圖（A）顯示載劑投予群之各小鼠的腫瘤體積變化。分圖（B）顯示A375-mIgG1/B167-ml0r（2.5mg/kg）投予群之各小鼠的腫瘤體積變化。 ［圖6］顯示在C1498細胞移植的小鼠模式中，A551-MB110/B379-ml0r的抗腫瘤效果之圖。 分圖（A）顯示載劑投予群之各小鼠的腫瘤體積變化。分圖（B）顯示A551-MB110/B379-ml0r（2.5mg/kg）投予群之各小鼠的腫瘤體積變化。 ［圖7］顯示在Hepa1-6/hGPC3細胞移植的小鼠模式中，A551-MB110/B379-ml0r的抗腫瘤效果之圖。 分圖（A）顯示載劑投予群之各小鼠的腫瘤體積變化。分圖（B）顯示A551-MB110/B379-ml0r（2.5mg/kg）投予群之各小鼠的腫瘤體積變化。 ［圖8］顯示在Hepa1-6/hGPC3細胞移植的小鼠模式中，A375-mIgG1/B167-ml0r的抗腫瘤效果之圖。 分圖（A）顯示載劑投予群之各小鼠的腫瘤體積變化。分圖（B）顯示A375-mIgG1/B167-ml0r（7.5mg/kg）投予群之各小鼠的腫瘤體積變化。 ［圖9］顯示在LLC1/OVA/GPC3 clone C5細胞移植的小鼠模式中，對於A551-MB110/B379-ml0r的抗腫瘤效果，各種免疫細胞（CD4陽性T細胞、CD8陽性T細胞、B細胞、NK細胞、顆粒球、巨噬細胞）的去除（Depletion）造成的影響之圖。 ［圖10］顯示在MC38細胞移植的小鼠模式中，A551-MB110/B379-ml0r、抗小鼠PD-L1抗體、及此等之組合的抗腫瘤效果之圖。各點顯示1群（n＝6）的腫瘤體積的平均值。 ［圖11］顯示在MC38細胞移植的小鼠模式中，A551-MB110/B379-ml0r、抗小鼠PD-L1抗體、或此等之組合的抗腫瘤效果（體重變化）之圖。 分圖（A）顯示載劑投予群之各小鼠的體重變化。分圖（B）顯示A551-MB110/B379-ml0r投予群之各小鼠的體重變化。分圖（C）顯示抗小鼠PD-L1抗體投予群之各小鼠的體重變化。分圖（D）顯示A551-MB110/B379-ml0r及抗小鼠PD-L1抗體之組合的投予群之各小鼠的體重變化。 ［圖12］顯示在MC38細胞移植的小鼠模式中，經A551-MB110/B379-ml0r、抗小鼠PD-L1抗體、或此等之組合的投予，在各抗體或該等之組合的投予前後的各種免疫相關基因的表現變化之圖。 ［圖13］顯示在MC38細胞移植的小鼠模式中，經A551-MB110/B379-ml0r、抗小鼠PD-L1抗體、或此等之組合的投予，在腫瘤組織的CD8的表現程度之圖。 分圖（A）顯示載劑投予群，分圖（B）顯示A551-MB110/B379-ml0r投予群，分圖（C）顯示抗小鼠PD-L1抗體投予群，分圖（D）顯示A551-MB110/B379-ml0r及抗小鼠PD-L1抗體之組合的投予群之在腫瘤組織的CD8的表現程度。 ［圖14］顯示在MC38細胞移植的小鼠模式中，經A551-MB110/B379-ml0r、抗小鼠PD-L1抗體、或此等之組合的投予，在腫瘤組織的PD-L1的表現程度之圖。 分圖（A）顯示載劑投予群，分圖（B）顯示A551-MB110/B379-ml0r投予群，分圖（C）顯示抗小鼠PD-L1抗體投予群，分圖（D）顯示A551-MB110/B379-ml0r及抗小鼠PD-L1抗體之組合的投予群之在腫瘤組織的PD-L1的表現程度。 ［圖15］顯示在MC38細胞移植的小鼠模式中，經A551-MB110/B379-ml0r、抗小鼠PD-L1抗體、或此等之組合的投予，以血液檢查的肝功能標識物（marker）之圖。 分圖（上圖）顯示ALT（U/L）。分圖（下圖）顯示AST（U/L）。 ［圖16］顯示在MC38細胞移植的小鼠模式中，經A551-MB110/B379-ml0r、抗小鼠PD-L1抗體、或此等之組合的投予，在腫瘤組織內的CD8陽性T細胞數增加的程度之圖。 ［圖17］顯示在LLC1/OVA/GPC3 clone C5細胞移植的小鼠模式中，A551-MB110/B379-ml0r、抗小鼠PD-L1抗體、或此等之組合的抗腫瘤效果之圖。各點顯示1群（n＝5）的腫瘤體積的平均值。 ［圖18］顯示在C1498細胞移植的小鼠模式中，A375-mIgG1/B167-ml0r、抗小鼠PD-L1抗體、或此等之組合的抗腫瘤效果之圖。各點顯示1群（n＝5）的腫瘤體積的平均值。 ［圖19］顯示在AE17細胞移植的小鼠模式中，A375-mIgG1/B167-ml0r、抗小鼠PD-L1抗體、或此等之組合的抗腫瘤效果之圖。各點顯示1群（n＝5）的腫瘤體積的平均值。 ［圖20］顯示在LLC1/hGPC3細胞移植的小鼠模式中，A551-MB110/B379-ml0r、抗hGPC3-mCD3抗體、或此等之組合的抗腫瘤效果之圖。各點顯示1群（n＝5）的腫瘤體積的平均值。 ［圖21］顯示在LLC1/hGPC3細胞移植的小鼠模式中，經由A551-MB110/B379-ml0r、抗hGPC3-mCD3抗體、或此等之組合的投予，在腫瘤樣本中的基因表現量之圖。 分圖（A）顯示CD3e的表現量，分圖（B）顯示CD8b1的表現量，分圖（C）顯示Gzmb的表現量，分圖（D）顯示Prf1的表現量，分圖（E）顯示Ifng的表現量。 ［圖22］顯示使用Jurkat細胞試驗在ATP存在下或不存在下之各種抗CD137抗體的促效劑活性之圖。X軸表示抗體濃度（μg/mL），Y軸表示相對發光量。 ［圖23］顯示使用Jurkat細胞試驗在ADP存在下或不存在下之各種抗CD137抗體的促效劑活性之圖。X軸表示抗體濃度（μg/mL），Y軸表示相對發光量。 ［圖24］顯示使用人類T細胞試驗在ADPbetaS存在下或不存在下之各種抗CD137抗體的促效劑活性之圖。 ［圖25］顯示使用人類T細胞試驗在ADPbetaS存在下或不存在下dBBAT119-P253/dBBAT119L-LamLib（小分子轉換抗CD137抗體）或NS1-P253（非轉換抗CD137抗體）的促效劑活性之圖。X軸表示抗體濃度（μg/mL），Y軸表示IFNγ產生量（ng/mL）。 ［圖26］顯示經噬菌體ELISA試驗之各種抗CD137抗體（結合活性增加的轉換抗CD137抗體）的ATP依賴的抗原結合活性之圖。Y軸表示在ATP存在下/不存在下的吸光度S/N比，X軸表示在抗原存在下/不存在下的S/N比。 ［圖27］顯示抗CD137抗體（dBBAT119H-P253/dBBAT119L-LamLib）的各種改變體在ATP存在下或不存在下對人類CD137的結合活性之圖。上半部表示ATP不存在下對人類CD137的結合活性，下半部表示ATP存在下對人類CD137的結合活性。 ［圖28］顯示使用人類T細胞試驗在ADPbetaS存在下或不存在下的dBBAT119H-P253/dBBAT119L-LamLib、dBBATk119H024-P253/dBBATk119L020-LamLib、IC17HdK-hIgG1/IC17L-k0（對照組）、或NS1-P253（非轉換抗CD137抗體）的促效劑活性之圖。 分圖（A）顯示ADPbetaS不存在下的試驗結果，分圖（B）顯示在ADPbetaS存在下的試驗結果。X軸表示抗體濃度（μg/mL），Y軸表示IFNγ產生量（ng/mL）。 ［圖29］顯示使用4-1BB Jurkat報導基因分析法試驗ATP存在下或不存在下各種轉換抗CD137抗體的促效劑活性之圖。 分圖（A）顯示ATP不存在下的試驗結果，分圖（B）顯示ATP存在下的試驗結果。 ［圖30］顯示使用人類末梢血液單核球細胞試驗之因重鏈恆定區域對Fcγ受體的結合活性增加之各種轉換抗CD137抗體在ATP存在下的促效劑活性的增強之圖。 分圖（A）顯示以IL-2產生量為指標而測定的促效劑活性，分圖（B）顯示以IFN-γ產生量為指標而測定的促效劑活性。 ［圖31］顯示使用人類末梢血液單核球細胞試驗之因重鏈恆定區域對Fcγ受體的結合活性增加、或重鏈恆定區域的pI增加之各種轉換抗CD137抗體在ATP存在下的促效劑活性的增強之圖。 分圖（A）顯示以IL-2產生量為指標而測定的促效劑活性，分圖（B）顯示以IFN-γ產生量為指標而測定的促效劑活性。 ［圖32］顯示使用人類末梢血液單核球細胞試驗之因重鏈恆定區域對Fcγ受體的結合活性增加之各種轉換抗CD137抗體在ATP存在下或不存在下的促效劑活性的增強之圖。 分圖（A）顯示以IL-2產生量為指標而測定的促效劑活性，分圖（B）顯示以IFN-γ產生量為指標而測定的促效劑活性。 ［圖33］顯示使用人類末梢血液單核球細胞試驗之因重鏈恆定區域對Fcγ受體的結合活性增加之各種轉換抗CD137抗體在ATP存在下或不存在下的促效劑活性的增強之圖。 分圖（A）顯示以IL-2產生量為指標而測定的促效劑活性，分圖（B）顯示以IFN-γ產生量為指標而測定的促效劑活性。 ［圖34］顯示使用人類末梢血液單核球細胞試驗之因重鏈恆定區域對Fcγ受體的結合活性增加之各種轉換抗CD137抗體在ATP存在下或不存在下的促效劑活性的增強之圖。 分圖（A）顯示以IL-2產生量為指標而測定的促效劑活性，分圖（B）顯示以IFN-γ產生量為指標而測定的促效劑活性。 ［圖35］顯示使用人類末梢血液單核球細胞試驗之因重鏈恆定區域對Fcγ受體的結合活性增加之各種轉換抗CD137抗體在ATP存在下或不存在下的促效劑活性的增強之圖。 分圖（A）顯示以IL-2產生量為指標而測定的促效劑活性，分圖（B）顯示以IFN-γ產生量為指標而測定的促效劑活性。 ［圖36］顯示使用人類末梢血液單核球細胞試驗之因重鏈恆定區域對Fcγ受體的結合活性增加之各種轉換抗CD137抗體在ATP存在下或不存在下的促效劑活性的增強之圖。 分圖（A）顯示以IL-2產生量為指標而測定的促效劑活性，分圖（B）顯示以IFN-γ產生量為指標而測定的促效劑活性。 ［圖37］顯示使用人類末梢血液單核球細胞試驗之因重鏈恆定區域的pI增加之各種轉換抗CD137抗體在ATP存在下或不存在下的促效劑活性的增強之圖。 分圖（A）顯示以IL-2產生量為指標而測定的促效劑活性，分圖（B）顯示以IFN-γ產生量為指標而測定的促效劑活性。 ［圖38］顯示使用人類末梢血液單核球細胞試驗之因重鏈恆定區域的pI增加之各種轉換抗CD137抗體在ATP存在下或不存在下的促效劑活性的增強之圖。 分圖（A）顯示以IL-2產生量為指標而測定的促效劑活性，分圖（B）顯示以IFN-γ產生量為指標而測定的促效劑活性。 ［圖39］顯示使用人類末梢血液單核球細胞試驗之因重鏈恆定區域的pI增加之各種轉換抗CD137抗體在ATP存在下或不存在下的促效劑活性的增強之圖。 分圖（A）顯示以IL-2產生量為指標而測定的促效劑活性，分圖（B）顯示以IFN-γ產生量為指標而測定的促效劑活性。 ［圖40］顯示使用人類末梢血液單核球細胞試驗之因重鏈恆定區域的pI增加之各種轉換抗CD137抗體在ATP存在下或不存在下的促效劑活性的增強之圖。 分圖（A）顯示以IL-2產生量為指標而測定的促效劑活性，分圖（B）顯示以IFN-γ產生量為指標而測定的促效劑活性。 ［圖41］顯示使用人類末梢血液單核球細胞試驗之因重鏈恆定區域的pI增加之各種轉換抗CD137抗體在ATP存在下或不存在下的促效劑活性的增強之圖。 分圖（A）顯示以IL-2產生量為指標而測定的促效劑活性，分圖（B）顯示以IFN-γ產生量為指標而測定的促效劑活性。 ［圖42］顯示使用人類末梢血液單核球細胞試驗之因重鏈恆定區域的pI增加之各種轉換抗CD137抗體在ATP存在下或不存在下的促效劑活性的增強之圖。 分圖（A）顯示以IL-2產生量為指標而測定的促效劑活性，分圖（B）顯示以IFN-γ產生量為指標而測定的促效劑活性。 ［圖43］顯示使用人類末梢血液單核球細胞試驗之因重鏈恆定區域的pI增加之各種轉換抗CD137抗體在ATP存在下或不存在下的促效劑活性的增強之圖。 分圖（A）顯示以IL-2產生量為指標而測定的促效劑活性，分圖（B）顯示以IFN-γ產生量為指標而測定的促效劑活性。 ［圖44］顯示使用人類末梢血液單核球細胞試驗之因重鏈恆定區域對Fcγ受體的結合活性增加之各種轉換抗CD137抗體在ATP存在下或不存在下的促效劑活性的增強之圖。 分圖（A）圖顯示以IL-2產生量為指標而測定的促效劑活性，分圖（B）圖顯示以IFN-γ產生量為指標而測定的促效劑活性。 ［圖45］顯示使用人類CD137基因置入（knock-in）小鼠試驗各種轉換、非轉換之抗CD137抗體的血漿中抗體濃度之圖。Fc皆為mIgG1。 ［圖46］顯示使用人類CD137基因置入小鼠試驗各種轉換、非轉換之抗CD137抗體的血漿中抗體濃度之圖。Fc皆為MB110。 ［圖47］顯示使用人類CD137基因置入小鼠試驗各種轉換、非轉換之抗CD137抗體的血漿中抗體濃度之圖。Fc皆為MB492。 ［圖48］顯示在MC38細胞移植的小鼠模式中A375-mIgG1/B167-ml0r的抗腫瘤效果之圖。各點表示1群（n＝5）的腫瘤體積的平均值。 ［圖49］顯示在MC38細胞移植的小鼠模式中，經投予抗體（NO1-mIgG1、或A375-mIgG1/B167-ml0r）的臟器重量之圖。 分圖（A）顯示淋巴結的重量，分圖（B）顯示脾臟的重量。 ［圖50］顯示在MC38細胞移植的小鼠模式中，經投予NO1-mIgG1或A375-mIgG1/B167-ml0r在淋巴結的T細胞活性化的程度之圖。 分圖（A）顯示CD8陽性T細胞的PD-1陽性T細胞之比例，分圖（B）顯示CD8陽性T細胞的ICOS陽性T細胞之比例，分圖（C）顯示CD8陽性T細胞的GranzymeB陽性T細胞之比例。 ［圖51］顯示在MC38細胞株移植的小鼠模式中，經投予NO1-mIgG1或A375-mIgG1/B167-ml0r在脾臟的T細胞活性化的程度之圖。 分圖（A）顯示CD8陽性T細胞的PD-1陽性T細胞之比例，分圖（B）顯示CD8陽性T細胞的ICOS陽性T細胞之比例，分圖（C）顯示CD8陽性T細胞的Granzyme B陽性T細胞之比例。 ［圖52］顯示在MC38細胞株移植的小鼠模式中，經投予NO1-mIgG1或A375-mIgG1/B167-ml0r在肝臟的T細胞活性化的程度之圖。 分圖（A）顯示CD8陽性T細胞的PD-1陽性T細胞之比例，分圖（B）顯示CD8陽性T細胞的Granzyme B陽性T細胞之比例。 ［圖53］顯示在MC38細胞株移植的小鼠模式中A356-MB110/B040-ml0r的抗腫瘤效果之圖。各點表示1群（n＝5）的腫瘤體積的平均值。 ［圖54］顯示在MC38細胞株移植的小鼠模式中，經投予NS2-MB110或A356-MB110/B040-ml0r的臟器重量之圖。 分圖（A）表示淋巴結的重量，分圖（B）表示脾臟的重量。 ［圖55］顯示在MC38細胞株移植的小鼠模式中，經投予NS2-MB110或A356-MB110/B040-ml0r在肝臟的T細胞活性化的程度之圖。 分圖（A）顯示CD8陽性T細胞的PD-1陽性T細胞之比例，分圖（B）顯示CD8陽性T細胞的ICOS陽性T細胞之比例。 ［圖56］顯示在MC38細胞株移植的小鼠模式中A372-mIgG1/B040-ml0r的抗腫瘤效果之圖。各點表示1群n＝5的腫瘤體積的平均值。 ［圖57］顯示在MC38細胞株移植的小鼠模式中，經投予A372-mIgG1/B040-ml0r的淋巴結的細胞數（分圖（A）），及脾臟的重量（分圖（B））。 ［圖58］顯示在MC38細胞株移植的小鼠模式中，經投予A372-mIgG1/B040-ml0r在肝臟的T細胞活性化的程度（CD8陽性T細胞的GranzymeB陽性T細胞之比例）之圖。 ［圖59］顯示在MC38細胞株移植的小鼠模式中A372-MB110/B040-ml0r的抗腫瘤效果之圖。各點表示1群n＝5的腫瘤體積的平均值。 ［圖60］顯示在MC38細胞株移植的小鼠模式中，經投予NS2-MB110或A372-MB110/B040-ml0r的臟器重量之圖。 分圖（A）顯示淋巴結的重量，分圖（B）顯示脾臟的重量。 ［圖61］顯示在MC38細胞株移植的小鼠模式中，經投予NS2-MB110或A372-MB110/B040-ml0r在肝臟的T細胞活性化的程度（CD8陽性T細胞的PD-1陽性T細胞之比例）之圖。 ［圖62］顯示在MC38細胞株移植的小鼠模式中A372-MB492/B040-ml0r的抗腫瘤效果之圖。各點表示1群（n＝5）的腫瘤體積的平均值。 ［圖63］顯示在MC38細胞株移植的小鼠模式中，經投予NS1-MB492或A372-MB492/B040-ml0r的淋巴結的細胞數及脾臟的臟器重量之圖。 分圖（A）顯示淋巴結的細胞數，分圖（B）顯示脾臟的臟器重量。 ［圖64］顯示在MC38細胞株移植的小鼠模式中，經投予NS1-MB492或A372-MB492/B040-ml0r在肝臟的T細胞活性化的程度（CD8陽性T細胞的GranzymeB陽性T細胞之比例）之圖。 ［圖65］顯示在MC38細胞株移植的小鼠模式中A486-MB492/B167-ml0r或A488-MB492/B226-ml0r的抗腫瘤效果之圖。各點表示1群（n＝5）的腫瘤體積的平均值。 ［圖66］顯示在MC38細胞株移植的小鼠模式中，經投予NS1-MB492、A486-MB492/B167-ml0r或A488-MB492/B226-ml0r的每一個淋巴結的細胞數及脾臟的臟器重量之圖。 分圖（A）顯示每一個淋巴結的細胞數，分圖（B）顯示脾臟的臟器重量。 ［圖67］顯示在MC38細胞株移植的小鼠模式中，經投予NS1-MB492、A486-MB492/B167-ml0r或A488-MB492/B226-ml0r在肝臟的效應細胞（effector cell）的浸潤水平（CD45陽性T細胞中的CD3陽性CD8陽性T細胞等之比例）之圖。 ［圖68］顯示在MC38細胞株移植的小鼠模式中A489-MB492/B223-ml0r的抗腫瘤效果之圖。各點表示1群（n＝5）的腫瘤體積的平均值。 ［圖69］顯示在MC38細胞株移植的小鼠模式中，經投予NS1-MB492或A489-MB492/B223-ml0r的淋巴結的細胞數及脾臟的淋巴球分層的細胞數之圖。 分圖（A）顯示淋巴結的細胞數，分圖（B）顯示脾臟的淋巴球分層的細胞數。 ［圖70］顯示在MC38細胞株移植的小鼠模式中，經投予NS1-MB492或A489-MB492/B223-ml0r在肝臟的T細胞活性化的程度（CD45陽性T細胞的CD8陽性T細胞之比例）之圖。 ［圖71］顯示在MC38細胞株移植的小鼠模式中A548-mIgG1/B256-ml0r及A551-mIgG1/B256-ml0r的抗腫瘤效果之圖。 分圖（A）顯示A548-mIgG1/B256-ml0r的抗腫瘤效果，分圖（B）顯示A551-mIgG1/B256-ml0r的抗腫瘤效果。 ［圖72］顯示在MC38細胞株移植的小鼠模式中，經投予NS1-mIgG1、A548-mIgG1/B256-ml0r或A551-mIgG1/B256-ml0r的臟器重量之圖。 分圖（A）顯示淋巴結的重量，分圖（B）顯示脾臟的臟器重量。 ［圖73］顯示在MC38細胞株移植的小鼠模式中，經投予NS1-mIgG1、A548-mIgG1/B256-ml0r或A551-mIgG1/B256-ml0r在肝臟的T細胞活性化的程度之圖。 分圖（A）顯示CD8陽性T細胞的PD-1陽性T細胞之比例，分圖（B）顯示CD8陽性T細胞的Granzyme B陽性T細胞之比例。 ［圖74］顯示在MC38細胞株移植的小鼠模式中A551-MB110/B379-ml0r的抗腫瘤效果之圖。 ［圖75］顯示在MC38細胞株移植的小鼠模式中，經投予NS1-mIgG1或A551-MB110/B379-ml0r的臟器重量之圖。 分圖（A）表示淋巴結的重量，分圖（B）表示脾臟的重量。 ［圖76］顯示在MC38細胞株移植的小鼠模式中，經投予NS1-mIgG1或A551-MB110/B379-ml0r在脾臟的T細胞活性化的程度之圖。 分圖（A）顯示CD8陽性T細胞的PD-1陽性T細胞之比例，分圖（B）顯示CD8陽性T細胞的ICOS陽性T細胞之比例，分圖（C）顯示CD8陽性T細胞的Granzyme B陽性T細胞之比例。 ［圖77］顯示在MC38細胞株移植的小鼠模式中，經投予NS1-mIgG1或A551-MB110/B379-ml0r在肝臟的T細胞活性化的程度之圖。 分圖（A）顯示CD8陽性T細胞的PD-1陽性T細胞之比例，分圖（B）顯示CD8陽性T細胞的ICOS陽性T細胞之比例，分圖（C）顯示CD8陽性T細胞的Granzyme B陽性T細胞之比例。X軸表示抗體濃度（μg/mL），Y軸表示相對發光量。 ［圖78］顯示使用4-1BB Jurkat細胞試驗在小分子化合物（ATP或ADP）存在下或不存在下各種抗CD137抗體的促效劑活性之圖。X軸表示抗體濃度（μg/mL），Y軸表示相對發光量。 ［圖79］顯示使用4-1BB Jurkat報導基因分析法試驗在ATP存在下各種轉換抗CD137抗體的促效劑活性之圖。 ［圖80］顯示抗CD137轉換抗體之A375-SCF041aPh /B167-Lamli及A375-MY201aPh/B167-Lamlib個別的血漿中動態的比較之圖。圖的縱軸表示抗體的血漿中濃度。 ［圖81］顯示將LLC1/OVA/GPC3細胞株移植至hCD137KI/ mFcγR2bKO/ hFcγR2bTg#90小鼠所製作的小鼠模式中，A375/B167-SCF041aPh及A375/B167-MY201aPh的各別的抗腫瘤效果之圖。各點表示1群n＝5的腫瘤體積的平均值。 ［圖82］顯示在MC38細胞移植的小鼠模式中，A551-MB110/B379-ml0r、抗小鼠PD-L1抗體、或此等之組合的投予後，在腫瘤組織的CD8陽性細胞數之圖。 ［圖83］顯示在MC38細胞移植的小鼠模式中，A551-MB110/B379-ml0r、抗小鼠PD-L1抗體、或此等之組合的投予後，在腫瘤組織的PD-L1陽性細胞數之圖。 ［圖84］顯示在MC38細胞移植的小鼠模式中，A551-MB110/B379-ml0r、抗小鼠PD-L1抗體、或此等之組合的投予後，在腫瘤組織中PD-L1為中度表現或高度表現的細胞數之圖。 ［圖85］顯示在MC38細胞移植的小鼠模式中，經由A551-MB110/B379-ml0r（"Sta-MB"）、UreH-MB110/UreL-mk1（"Ure-MB"）或抗小鼠PD-L1抗體（"PD-L1-Ab"）的單劑投予，或者A551-MB110/B379-ml0r（"Sta-MB"）和抗小鼠PD-L1抗體（"PD-L1-Ab"）的組合投予，或者UreH-MB110/UreL-mk1（"Ure-MB"）和抗小鼠PD-L1抗體（"PD-L1-Ab"）的組合投予之腫瘤增殖抑制效果之圖。 ［圖86］顯示在MC38細胞移植的小鼠模式中，經由A551-MB110/B379-ml0r（"Sta-MB"）、UreH-MB110/UreL-mk1（"Ure-MB"）或抗小鼠PD-L1抗體（"PD-L1-Ab"）的單劑投予，或者A551-MB110/B379-ml0r（"Sta-MB"）和抗小鼠PD-L1抗體（"PD-L1-Ab"）的組合投予，或者UreH-MB110/UreL-mk1（"Ure-MB"）和抗小鼠PD-L1抗體（"PD-L1-Ab"）的組合投予之血液參數（白血球濃度、血小板濃度、及淋巴球濃度）變動程度之圖。 ［圖87］顯示在MC38細胞移植的小鼠模式中，經由A551-MB110/B379-ml0r（"Sta-MB"）、UreH-MB110/UreL-mk1（"Ure-MB"）或抗小鼠PD-L1抗體（"PD-L1-Ab"）的單劑投予，或者A551-MB110/B379-ml0r（"Sta-MB"）和抗小鼠PD-L1抗體（"PD-L1-Ab"）的組合投予，或者UreH-MB110/UreL-mk1（"Ure-MB"）和抗小鼠PD-L1抗體（"PD-L1-Ab"）的組合投予之脾臟及腫瘤所屬淋巴結（DLN）的臟器重量之圖。 ［圖88］顯示在MC38細胞移植的小鼠模式中，經由A551-MB110/B379-ml0r（"Sta-MB"）、UreH-MB110/UreL-mk1（"Ure-MB"）或抗小鼠PD-L1抗體（"PD-L1-Ab"）的單劑投予，或者A551-MB110/B379-ml0r（"Sta-MB"）和抗小鼠PD-L1抗體（"PD-L1-Ab"）的組合投予，或者UreH-MB110/UreL-mk1（"Ure-MB"）和抗小鼠PD-L1抗體（"PD-L1-Ab"）的組合投予之在脾臟中，CD8陽性T細胞中的KLRG-1、ICOS、PD-1、LAG-3的表現比例，以及CD4陽性T細胞中的Foxp3陽性調節T細胞比例之圖。 ［圖89］顯示在MC38細胞移植的小鼠模式中，經由A551-MB110/B379-ml0r（"Sta-MB"）、UreH-MB110/UreL-mk1（"Ure-MB"）或抗小鼠PD-L1抗體（"PD-L1-Ab"）的單劑投予，或者A551-MB110/B379-ml0r（"Sta-MB"）和抗小鼠PD-L1抗體（"PD-L1-Ab"）的組合投予，或者UreH-MB110/UreL-mk1（"Ure-MB"）和抗小鼠PD-L1抗體（"PD-L1-Ab"）的組合投予之在脾臟中，CD45陽性白血球中的各活化標誌物陽性CD8陽性T細胞的比例、以及CD45陽性白血球中的Foxp3陽性調節T細胞比例之圖。 ［圖90］顯示在MC38細胞移植的小鼠模式中，經由A551-MB110/B379-ml0r（"Sta-MB"）、UreH-MB110/UreL-mk1（"Ure-MB"）或抗小鼠PD-L1抗體（"PD-L1-Ab"）的單劑投予，或者A551-MB110/B379-ml0r（"Sta-MB"）和抗小鼠PD-L1抗體（"PD-L1-Ab"）的組合投予，或者UreH-MB110/UreL-mk1（"Ure-MB"）和抗小鼠PD-L1抗體（"PD-L1-Ab"）的組合投予之在腫瘤所屬淋巴結（DLN）中，CD8陽性T細胞中的KLRG-1、ICOS、PD-1、LAG-3的表現比例、以及CD4陽性T細胞中的Foxp3陽性調節T細胞比例之圖。 ［圖91］顯示在MC38細胞移植的小鼠模式中，經由A551-MB110/B379-ml0r（"Sta-MB"）、UreH-MB110/UreL-mk1（"Ure-MB"）或抗小鼠PD-L1抗體（"PD-L1-Ab"）的單劑投予，或者A551-MB110/B379-ml0r（"Sta-MB"）和抗小鼠PD-L1抗體（"PD-L1-Ab"）的組合投予，或者UreH-MB110/UreL-mk1（"Ure-MB"）和抗小鼠PD-L1抗體（"PD-L1-Ab"）的組合投予之在腫瘤所屬淋巴結（DLN）中，各活化標誌物陽性CD8陽性T細胞的絕對數、以及CD4陽性T細胞中的Foxp3陽性調節T細胞的絕對數之圖。 ［圖92］顯示在MC38細胞移植的小鼠模式中，經由A551-MB110/B379-ml0r（"Sta-MB"）、UreH-MB110/UreL-mk1（"Ure-MB"）或抗小鼠PD-L1抗體（"PD-L1-Ab"）的單劑投予，或者A551-MB110/B379-ml0r（"Sta-MB"）和抗小鼠PD-L1抗體（"PD-L1-Ab"）的組合投予，或者UreH-MB110/UreL-mk1（"Ure-MB"）和抗小鼠PD-L1抗體（"PD-L1-Ab"）的組合投予之在肝臟中，CD8陽性T細胞中的KLRG-1、ICOS、PD-1、LAG-3的表現比例、以及CD4陽性T細胞中的Foxp3陽性調節T細胞比例之圖。 ［圖93］顯示在MC38細胞移植的小鼠模式中，經由A551-MB110/B379-ml0r（"Sta-MB"）、UreH-MB110/UreL-mk1（"Ure-MB"）或抗小鼠PD-L1抗體（"PD-L1-Ab"）的單劑投予，或者A551-MB110/B379-ml0r（"Sta-MB"）和抗小鼠PD-L1抗體（"PD-L1-Ab"）的組合投予，或者UreH-MB110/UreL-mk1（"Ure-MB"）和抗小鼠PD-L1抗體（"PD-L1-Ab"）的組合投予之在肝臟中，CD45陽性白血球中的各活化標誌物陽性CD8陽性T細胞的比例、以及CD45陽性白血球中的Foxp3陽性調節T細胞比例之圖。 ［圖94］顯示以流式細胞技術（FCM）分析，在MC38細胞移植的小鼠模式中，Alexa488標記A551-MB110/B379-ml0r、Alexa488標記IC17HdK-MB110/IC17L-mk（陰性對照物質）、非轉換抗CD137抗體的Alexa488標記UreH-MB110/UreL-mk1（陽性對照物質），和腫瘤、脾臟、及肝臟中的淋巴球分層的結合程度之圖。 ［圖95］顯示在各種正常臟器組織以及各種腫瘤組織中，和細胞外ATP相關、顯示表現變化的基因群的熱圖（heatmap）之圖。 ［圖96］顯示以流式細胞技術（FCM）分析，在各種癌細胞株中，CD137的表現程度之圖。 ［圖97］顯示以流式細胞技術（FCM）分析，在取自LLC1/OVA/GPC3 clone C5細胞株移植小鼠的腫瘤細胞、CD4陽性T細胞、CD8陽性T細胞、及非T細胞中，各別的CD39和CD73的表現率之圖。 關於CD39和CD73的表現，係分別對於腫瘤細胞、CD4陽性T細胞、CD8陽性T細胞、及非T細胞使用各別試劑進行5次試驗的平均值。 ［圖98］顯示以流式細胞技術（FCM）分析，在取自LLC1/OVA/GPC3 clone C5細胞株移植小鼠的腫瘤細胞、CD4陽性T細胞、CD8陽性T細胞、及非T細胞中，各別的CD39和CD73的表現率之代表圖。 ［圖99］顯示以流式細胞技術（FCM）分析，在取自MC38細胞株移植小鼠的腫瘤細胞、CD4陽性T細胞、CD8陽性T細胞、及非T細胞中，各別的CD39和CD73的表現率之圖。 關於CD39和CD73的表現，係分別對於腫瘤細胞、CD4陽性T細胞、CD8陽性T細胞、及非T細胞使用各別試劑進行5次試驗的平均值。 ［圖100］顯示以流式細胞技術（FCM）分析，在取自MC38細胞株移植小鼠的腫瘤細胞、CD4陽性T細胞、CD8陽性T細胞、及非T細胞中，各別的CD39和CD73的表現率之代表圖。 ［圖101］顯示在LLC1/OVA細胞移植的小鼠模式中，經由A551-MB110/B379-ml0r（"Sta-MB"）、UreH-MB110/UreL-mk1（"Ure-MB"）或抗小鼠PD-L1抗體（"PD-L1-Ab"）的單劑投予，或者A551-MB110/B379-ml0r（"Sta-MB"）和抗小鼠PD-L1抗體（"PD-L1-Ab"）的組合投予，或者UreH-MB110/UreL-mk1（"Ure-MB"）和抗小鼠PD-L1抗體（"PD-L1-Ab"）的組合投予之抗腫瘤效果之圖。 ［圖102］顯示在LLC1/OVA細胞移植的小鼠模式中，經由A551-MB110/B379-ml0r（"Sta-MB"）、UreH-MB110/UreL-mk1（"Ure-MB"）或抗小鼠PD-L1抗體（"PD-L1-Ab"）的單劑投予，或者A551-MB110/B379-ml0r（"Sta-MB"）和抗小鼠PD-L1抗體（"PD-L1-Ab"）的組合投予，或者UreH-MB110/UreL-mk1（"Ure-MB"）和抗小鼠PD-L1抗體（"PD-L1-Ab"）的組合投予之在腫瘤所屬淋巴結（DLN）中，CD8陽性T細胞中的KLRG-1、ICOS、PD-1的表現比例之圖。 ［圖103］顯示在LLC1/OVA細胞移植的小鼠模式中，經由A551-MB110/B379-ml0r（"Sta-MB"）、UreH-MB110/UreL-mk1（"Ure-MB"）或抗小鼠PD-L1抗體（"PD-L1-Ab"）的單劑投予，或者A551-MB110/B379-ml0r（"Sta-MB"）和抗小鼠PD-L1抗體（"PD-L1-Ab"）的組合投予，或者UreH-MB110/UreL-mk1（"Ure-MB"）和抗小鼠PD-L1抗體（"PD-L1-Ab"）的組合投予之在腫瘤所屬淋巴結（DLN）中，各活化標誌物陽性CD8陽性T細胞的絕對數之圖。 ［圖104］顯示在LLC1/OVA細胞移植的小鼠模式中，經由A551-MB110/B379-ml0r（"Sta-MB"）的單劑投予之腫瘤增殖抑制效果之圖。 ［圖105］顯示在小鼠AML C1498細胞株移植的小鼠模式中，經由轉換抗CD137抗體A551-MB110/B379-ml0r或抗TIGIT抗體的單劑投予，或者轉換抗CD137抗體A551-MB110/B379-ml0r和抗TIGIT抗體的組合投予之腫瘤增殖抑制效果之圖。 ［圖106］顯示在MC38-hGPC3#G64 B2M KO clone5細胞株移植小鼠模式中，轉換抗CD137抗體A551-MB110/B379-ml0r的抗腫瘤效果之圖。
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Claims (15)

  1. 一種抗癌劑，包含抗CD137抗原結合分子為有效成分，該抗CD137抗原結合分子包括選自下列（a）至（m）之任一HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2、及HVR-L3之組合： （a） 包含序列識別號：7 之胺基酸序列的HVR-H1，包含序列識別號：8 之胺基酸序列的HVR-H2，包含序列識別號：17 之胺基酸序列的HVR-H3，包含序列識別號：21 之胺基酸序列的HVR-L1，包含序列識別號：26 之胺基酸序列的HVR-L2，及包含序列識別號：27 之胺基酸序列的HVR-L3； （b） 包含序列識別號：7 之胺基酸序列的HVR-H1，包含序列識別號：9 之胺基酸序列的HVR-H2，包含序列識別號：17 之胺基酸序列的HVR-H3，包含序列識別號：22 之胺基酸序列的HVR-L1，包含序列識別號：26 之胺基酸序列的HVR-L2，及包含序列識別號：27 之胺基酸序列的HVR-L3； （c） 包含序列識別號：7 之胺基酸序列的HVR-H1，包含序列識別號：10 之胺基酸序列的HVR-H2，包含序列識別號：17 之胺基酸序列的HVR-H3，包含序列識別號：22 之胺基酸序列的HVR-L1，包含序列識別號：26 之胺基酸序列的HVR-L2，及包含序列識別號：27 之胺基酸序列的HVR-L3； （d） 包含序列識別號：7 之胺基酸序列的HVR-H1，包含序列識別號：11 之胺基酸序列的HVR-H2，包含序列識別號：18 之胺基酸序列的HVR-H3，包含序列識別號：21 之胺基酸序列的HVR-L1，包含序列識別號：26 之胺基酸序列的HVR-L2，及包含序列識別號：27 之胺基酸序列的HVR-L3； （e）包含序列識別號：7之胺基酸序列的HVR-H1，包含序列識別號：8之胺基酸序列的HVR-H2，包含序列識別號：18之胺基酸序列的HVR-H3，包含序列識別號：21之胺基酸序列的HVR-L1，包含序列識別號：26之胺基酸序列的HVR-L2，及包含序列識別號：27之胺基酸序列的HVR-L3； （f）包含序列識別號：7之胺基酸序列的HVR-H1，包含序列識別號：12之胺基酸序列的HVR-H2，包含序列識別號：18之胺基酸序列的HVR-H3，包含序列識別號：21之胺基酸序列的HVR-L1，包含序列識別號：26之胺基酸序列的HVR-L2，及包含序列識別號：28之胺基酸序列的HVR-L3； （g）包含序列識別號：7之胺基酸序列的HVR-H1，包含序列識別號：13之胺基酸序列的HVR-H2，包含序列識別號：18之胺基酸序列的HVR-H3，包含序列識別號：21之胺基酸序列的HVR-L1，包含序列識別號：26之胺基酸序列的HVR-L2，及包含序列識別號：29之胺基酸序列的HVR-L3； （h）包含序列識別號：7之胺基酸序列的HVR-H1，包含序列識別號：14之胺基酸序列的HVR-H2，包含序列識別號：19之胺基酸序列的HVR-H3，包含序列識別號：23之胺基酸序列的HVR-L1，包含序列識別號：26之胺基酸序列的HVR-L2，及包含序列識別號：27之胺基酸序列的HVR-L3； （i）包含序列識別號：7之胺基酸序列的HVR-H1，包含序列識別號：15之胺基酸序列的HVR-H2，包含序列識別號：20之胺基酸序列的HVR-H3，包含序列識別號：24之胺基酸序列的HVR-L1，包含序列識別號：26之胺基酸序列的HVR-L2，及包含序列識別號：27之胺基酸序列的HVR-L3； （j）包含序列識別號：7之胺基酸序列的HVR-H1，包含序列識別號：15之胺基酸序列的HVR-H2，包含序列識別號：20之胺基酸序列的HVR-H3，包含序列識別號：25之胺基酸序列的HVR-L1，包含序列識別號：26之胺基酸序列的HVR-L2，及包含序列識別號：27之胺基酸序列的HVR-L3； （k）包含序列識別號：7之胺基酸序列的HVR-H1，包含序列識別號：16之胺基酸序列的HVR-H2，包含序列識別號：20之胺基酸序列的HVR-H3，包含序列識別號：25之胺基酸序列的HVR-L1，包含序列識別號：26之胺基酸序列的HVR-L2，及包含序列識別號：27之胺基酸序列的HVR-L3； （l）包含序列識別號：7之胺基酸序列的HVR-H1，包含序列識別號：14之胺基酸序列的HVR-H2，包含序列識別號：19之胺基酸序列的HVR-H3，包含序列識別號：24之胺基酸序列的HVR-L1，包含序列識別號：26之胺基酸序列的HVR-L2，及包含序列識別號：27之胺基酸序列的HVR-L3；以及 （m）包含序列識別號：7之胺基酸序列的HVR-H1，包含序列識別號：14之胺基酸序列的HVR-H2，包含序列識別號：17之胺基酸序列的HVR-H3，包含序列識別號：21之胺基酸序列的HVR-L1，包含序列識別號：26之胺基酸序列的HVR-L2，及包含序列識別號：27之胺基酸序列的HVR-L3。
  2. 一種抗癌劑，包含抗CD137抗原結合分子，該抗CD137抗原結合分子包括選自以下（a）至（m）任一VH及VL的組合： （a）包含序列識別號：43之胺基酸序列的VH，及包含序列識別號：54之胺基酸序列的VL； （b）包含序列識別號：44之胺基酸序列的VH，及包含序列識別號：55之胺基酸序列的VL； （c）包含序列識別號：45之胺基酸序列的VH，及包含序列識別號：55之胺基酸序列的VL； （d）包含序列識別號：46之胺基酸序列的VH，及包含序列識別號：54之胺基酸序列的VL； （e）包含序列識別號：47之胺基酸序列的VH，及包含序列識別號：54之胺基酸序列的VL； （f）包含序列識別號：48之胺基酸序列的VH，及包含序列識別號：56之胺基酸序列的VL； （g）包含序列識別號：49之胺基酸序列的VH，及包含序列識別號：57之胺基酸序列的VL； （h）包含序列識別號：50之胺基酸序列的VH，及包含序列識別號：58之胺基酸序列的VL； （i）包含序列識別號：51之胺基酸序列的VH，及包含序列識別號：59之胺基酸序列的VL； （j）包含序列識別號：51之胺基酸序列的VH，及包含序列識別號：60之胺基酸序列的VL； （k）包含序列識別號：52之胺基酸序列的VH，及包含序列識別號：60之胺基酸序列的VL； （l）包含序列識別號：50之胺基酸序列的VH，及包含序列識別號：59之胺基酸序列的VL；以及 （m）包含序列識別號：53之胺基酸序列的VH，及包含序列識別號：54之胺基酸序列的VL。
  3. 如請求項1或2所述之抗癌劑，其中，該抗CD137抗原結合分子為人類抗體、人源化抗體、或嵌合抗體、或其任一者的抗原結合片段。
  4. 如請求項1至3中任一項所述之抗癌劑，其中，該抗CD137抗原結合分子包含改變Fc區域，該改變Fc區域包含選自以下基於EU編號之任一個胺基酸改變之組合： L235W/G236N/H268D/Q295L/K326T/A330K/P343R/D413K； K214R/L235W/G236N/H268D/Q295L/K326T/A330K/P343R/D413K； L234Y/P238D/T250V/V264I/T307P/A330K/P343R/D413K； L234Y/P238D/V264I/A330K/P343R/D413K； L234Y/G237D/P238D/T250V/T307P/A330K/P343R/D413K； L234Y/G237D/P238D/A330K/P343R/D413K； L235W/G236N/H268D/Q295L/K326T/A330K/Q311R/P343R； L234Y/P238D/T250V/V264I/T307P/A330K/Q311R/P343R； L234Y/P238D/V264I/A330K/Q311R/P343R； L234Y/G237D/P238D/T250V/T307P/A330K/Q311R/P343R； L234Y/G237D/P238D/A330K/Q311R/P343R； L235W/G236N/H268D/Q295L/K326T/A330K/P343R； K214R/L235W/G236N/H268D/Q295L/K326T/A330K/P343R； L235W/G236N/H268D/Q295L/K326T/A330K/D413K； K214R/G236N/H268D/A330K/P343R； K214R/L235W/G236N/H268D/A330K/P343R； K214R/G236N/H268D/A330K/D413K； K214R/G236N/H268D/A330K/P343R/D413K； K214R/L235W/G236N/H268D/A330K/P343R/D413K； K214R/G236N/H268D/A330K/Q311R； K214R/L235W/G236N/H268D/A330K/Q311R； K214R/G236N/H268D/A330K/Q311R/P343R； K214R/L235W/G236N/H268D/A330K/Q311R/P343R； K214R/G236N/H268D/A330K/Q311R/D413K； K214R/L235W/G236N/H268D/A330K/Q311R/D413K；以及 K214R/L235W/G236N/H268D/Q295L/K326T/A330K/Q311R。
  5. 一種抗癌劑，包含抗CD137抗原結合分子，該抗CD137抗原結合分子包括選自下列（i）至（xxxviii）之任一個VH、VL、CH、及CL之組合： （i）包含序列識別號：43之胺基酸序列的VH、包含序列識別號：64之胺基酸序列的CH、包含序列識別號：54之胺基酸序列的VL、及包含序列識別號：63之胺基酸序列的CL； （ii）包含序列識別號：43之胺基酸序列的VH、包含序列識別號：66之胺基酸序列的CH、包含序列識別號：54之胺基酸序列的VL、及包含序列識別號：63之胺基酸序列的CL； （iii）包含序列識別號：43之胺基酸序列的VH、包含序列識別號：67之胺基酸序列的CH、包含序列識別號：54之胺基酸序列的VL、及包含序列識別號：63之胺基酸序列的CL； （iv）包含序列識別號：43之胺基酸序列的VH、包含序列識別號：68之胺基酸序列的CH、包含序列識別號：54之胺基酸序列的VL、及包含序列識別號：63之胺基酸序列的CL； （v）包含序列識別號：43之胺基酸序列的VH、包含序列識別號：69之胺基酸序列的CH、包含序列識別號：54之胺基酸序列的VL、及包含序列識別號：63之胺基酸序列的CL； （vi）包含序列識別號：43之胺基酸序列的VH、包含序列識別號：70之胺基酸序列的CH、包含序列識別號：54之胺基酸序列的VL、及包含序列識別號：63之胺基酸序列的CL； （vii）包含序列識別號：43之胺基酸序列的VH、包含序列識別號：71之胺基酸序列的CH、包含序列識別號：54之胺基酸序列的VL、及包含序列識別號：63之胺基酸序列的CL； （viii）包含序列識別號：43之胺基酸序列的VH、包含序列識別號：73之胺基酸序列的CH、包含序列識別號：54之胺基酸序列的VL、及包含序列識別號：63之胺基酸序列的CL； （ix）包含序列識別號：43之胺基酸序列的VH、包含序列識別號：75之胺基酸序列的CH、包含序列識別號：54之胺基酸序列的VL、及包含序列識別號：63之胺基酸序列的CL； （x）包含序列識別號：43之胺基酸序列的VH、包含序列識別號：78之胺基酸序列的CH、包含序列識別號：54之胺基酸序列的VL、及包含序列識別號：63之胺基酸序列的CL； （xi）包含序列識別號：43之胺基酸序列的VH、包含序列識別號：80之胺基酸序列的CH、包含序列識別號：54之胺基酸序列的VL、及包含序列識別號：63之胺基酸序列的CL； （xii）包含序列識別號：43之胺基酸序列的VH、包含序列識別號：82之胺基酸序列的CH、包含序列識別號：54之胺基酸序列的VL、及包含序列識別號：63之胺基酸序列的CL； （xiii）包含序列識別號：43之胺基酸序列的VH、包含序列識別號：84之胺基酸序列的CH、包含序列識別號：54之胺基酸序列的VL、及包含序列識別號：63之胺基酸序列的CL； （xiv）包含序列識別號：43之胺基酸序列的VH、包含序列識別號：85之胺基酸序列的CH、包含序列識別號：54之胺基酸序列的VL、及包含序列識別號：63之胺基酸序列的CL； （xv）包含序列識別號：51之胺基酸序列的VH、包含序列識別號：65之胺基酸序列的CH、包含序列識別號：59之胺基酸序列的VL、及包含序列識別號：63之胺基酸序列的CL； （xvi）包含序列識別號：51之胺基酸序列的VH、包含序列識別號：72之胺基酸序列的CH、包含序列識別號：59之胺基酸序列的VL、及包含序列識別號：63之胺基酸序列的CL； （xvii）包含序列識別號：51之胺基酸序列的VH、包含序列識別號：74之胺基酸序列的CH、包含序列識別號：59之胺基酸序列的VL、及包含序列識別號：63之胺基酸序列的CL； （xviii）包含序列識別號：51之胺基酸序列的VH、包含序列識別號：75之胺基酸序列的CH、包含序列識別號：59之胺基酸序列的VL、及包含序列識別號：63之胺基酸序列的CL； （xix）包含序列識別號：51之胺基酸序列的VH、包含序列識別號：77之胺基酸序列的CH、包含序列識別號：59之胺基酸序列的VL、及包含序列識別號：63之胺基酸序列的CL； （xx）包含序列識別號：51之胺基酸序列的VH、包含序列識別號：78之胺基酸序列的CH、包含序列識別號：59之胺基酸序列的VL、及包含序列識別號：63之胺基酸序列的CL； （xxi）包含序列識別號：51之胺基酸序列的VH、包含序列識別號：79之胺基酸序列的CH、包含序列識別號：59之胺基酸序列的VL、及包含序列識別號：63之胺基酸序列的CL； （xxii）包含序列識別號：51之胺基酸序列的VH、包含序列識別號：80之胺基酸序列的CH、包含序列識別號：59之胺基酸序列的VL、及包含序列識別號：63之胺基酸序列的CL； （xxiii）包含序列識別號：51之胺基酸序列的VH、包含序列識別號：81之胺基酸序列的CH、包含序列識別號：59之胺基酸序列的VL、及包含序列識別號：63之胺基酸序列的CL； （xxiv）包含序列識別號：51之胺基酸序列的VH、包含序列識別號：82之胺基酸序列的CH、包含序列識別號：59之胺基酸序列的VL、及包含序列識別號：63之胺基酸序列的CL； （xxv）包含序列識別號：51之胺基酸序列的VH、包含序列識別號：83之胺基酸序列的CH、包含序列識別號：59之胺基酸序列的VL、及包含序列識別號：63之胺基酸序列的CL； （xxvi）包含序列識別號：51之胺基酸序列的VH、包含序列識別號：84之胺基酸序列的CH、包含序列識別號：59之胺基酸序列的VL、及包含序列識別號：63之胺基酸序列的CL； （xxvii）包含序列識別號：51之胺基酸序列的VH、包含序列識別號：72之胺基酸序列的CH、包含序列識別號：60之胺基酸序列的VL、及包含序列識別號：63之胺基酸序列的CL； （xxviii）包含序列識別號：51之胺基酸序列的VH、包含序列識別號：74之胺基酸序列的CH、包含序列識別號：60之胺基酸序列的VL、及包含序列識別號：63之胺基酸序列的CL； （xxix）包含序列識別號：51之胺基酸序列的VH、包含序列識別號：75之胺基酸序列的CH、包含序列識別號：60之胺基酸序列的VL、及包含序列識別號：63之胺基酸序列的CL； （xxx）包含序列識別號：51之胺基酸序列的VH、包含序列識別號：77之胺基酸序列的CH、包含序列識別號：60之胺基酸序列的VL、及包含序列識別號：63之胺基酸序列的CL； （xxxi）包含序列識別號：51之胺基酸序列的VH、包含序列識別號：78之胺基酸序列的CH、包含序列識別號：60之胺基酸序列的VL、及包含序列識別號：63之胺基酸序列的CL； （xxxii）包含序列識別號：51之胺基酸序列的VH、包含序列識別號：79之胺基酸序列的CH、包含序列識別號：60之胺基酸序列的VL、及包含序列識別號：63之胺基酸序列的CL； （xxxiii）包含序列識別號：51之胺基酸序列的VH、包含序列識別號：80之胺基酸序列的CH、包含序列識別號：60之胺基酸序列的VL、及包含序列識別號：63之胺基酸序列的CL； （xxxiv）包含序列識別號：51之胺基酸序列的VH、包含序列識別號：81之胺基酸序列的CH、包含序列識別號：60之胺基酸序列的VL、及包含序列識別號：63之胺基酸序列的CL； （xxxv）包含序列識別號：51之胺基酸序列的VH、包含序列識別號：82之胺基酸序列的CH、包含序列識別號：60之胺基酸序列的VL、及包含序列識別號：63之胺基酸序列的CL； （xxxvi）包含序列識別號：51之胺基酸序列的VH、包含序列識別號：83之胺基酸序列的CH、包含序列識別號：60之胺基酸序列的VL、及包含序列識別號：63之胺基酸序列的CL； （xxxvii）包含序列識別號：51之胺基酸序列的VH、包含序列識別號：84之胺基酸序列的CH、包含序列識別號：60之胺基酸序列的VL、及包含序列識別號：63之胺基酸序列的CL；以及 （xxxviii）包含序列識別號：51之胺基酸序列的VH、包含序列識別號：85之胺基酸序列的CH、包含序列識別號：60之胺基酸序列的VL、及包含序列識別號：63之胺基酸序列的CL。
  6. 如請求項1至5中任一項所述之抗癌劑，其係用於投予至具有下述之癌症患者（i）選自B細胞、樹突細胞、自然殺手細胞、巨噬細胞、及CD8陽性T細胞之1種以上的細胞浸潤的固態腫瘤，及/或（ii）調節T（Treg）細胞或CD4陽性T細胞浸潤的固態腫瘤。
  7. 如請求項1至6中任一項所述之抗癌劑，其係用於投予至患有對免疫檢查點抑制劑的治療為不反應性的癌症之患者。
  8. 如請求項1至7中任一項所述之抗癌劑，其係用於投予至患有選自胃癌、頭頸癌、食道癌、大腸癌、肺癌、間皮瘤、肝癌、卵巢癌、乳癌、結腸癌、腎臟癌、皮膚癌、肌肉瘤、胰臟癌、前列腺癌、睪丸癌、子宮癌、膽管癌、默克細胞癌（Merkel Cell Carcinoma）、膀胱癌、甲狀腺癌、神經鞘瘤、腎上腺癌、肛門癌、中樞神經系統腫瘤、神經內分泌組織腫瘤、陰莖癌、胸膜腫瘤、唾液腺腫瘤、外陰癌、胸腺腫瘤、淋巴瘤、骨髓性白血病、及兒童癌症所組成的群組之1種或1種以上的癌症之癌症患者。
  9. 如請求項1至5中任一項所述之抗癌劑，其係用於和至少1種其他抗癌劑合併使用。
  10. 如請求項9所述之抗癌劑，其中，該其他抗癌劑為選自化療劑、T細胞活化促效劑、免疫檢查點抑制劑、T細胞重導向抗原結合分子、抗纖維化藥物、及血管新生抑制劑之至少1個的抗癌劑。
  11. 如請求項10所述之抗癌劑，其中，該其他抗癌劑為免疫檢查點抑制劑。
  12. 如請求項10或11所述之抗癌劑，其中，該其他抗癌劑為選自抗PD1抗體、抗PDL1抗體、抗TIGIT抗體、抗TIM3抗體、及抗LAG3抗體之至少1個的免疫檢查點抑制劑。
  13. 如請求項10所述之抗癌劑，其中，該其他抗癌劑為T細胞重導向抗原結合分子。
  14. 如請求項9所述之抗癌劑，其中，該其他抗癌劑為去除選自調節T細胞、CD4陽性T細胞、B細胞、NK細胞、及巨噬細胞之1者以上的細胞及/或使其去活性化的藥劑。
  15. 如請求項9至14中任一項所述之抗癌劑，其係用於投予至患有選自胃癌、頭頸癌、食道癌、大腸癌、肺癌、間皮瘤、肝癌、卵巢癌、乳癌、結腸癌、腎臟癌、皮膚癌、肌肉瘤、胰臟癌、前列腺癌、睪丸癌、子宮癌、膽管癌、默克細胞癌（Merkel Cell Carcinoma）、膀胱癌、甲狀腺癌、神經鞘瘤、腎上腺癌、肛門癌、中樞神經系統腫瘤、神經內分泌組織腫瘤、陰莖癌、胸膜腫瘤、唾液腺腫瘤、外陰癌、胸腺腫瘤、及兒童癌症所組成的群組之1種或1種以上的癌症之癌症患者。
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