TWI605057B - 抗肌抑素抗體、含變異ｆｃ區之多肽及使用方法 - Google Patents

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Description

抗肌抑素抗體、含變異FC區之多肽及使用方法
本發明係關於抗肌抑素抗體及其使用方法。本發明亦關於包含變異Fc區域的多肽及其使用方法。
肌抑素(myostatin)，亦稱作生長分化因子8(GDF8)，為分泌蛋白且為蛋白的轉化生長因子β(TGF-β)超家族的一員。此超家族的成員具有生長調節及型態變化的特性(請參照，例如，非專利文獻1、非專利文獻2和專利文獻1)。肌抑素主要表現於發展中及成人的骨骼肌中，且作為肌肉生長的負調控物。在成年小鼠中肌抑素的系統的過度表現導致肌肉萎縮(請參照，例如，非專利文獻3)，而相反地，肌抑素敲除(knockout)小鼠以骨骼肌的肥大及增生為特徵，導致其肌肉量較它們的野生型同窩多兩至三倍(請參照，例如，非專利文獻4)。
像是其它TGF-β家族的成員，肌抑素被合成為大的前驅物蛋白，其包含N末端原胜肽域(domain)以及被視為活性分子的C末端域(請參照，例如，非專利文獻5和專利文獻 2)。肌抑素前驅物的兩種分子藉由存在於C末端成長因子域中的單一雙硫鍵共價地連接。活性成熟的肌抑素(由C末端成長因子域所組成的雙硫鍵結的同型二聚體)透過蛋白質水解處理的多個步驟自肌抑素前驅物被釋放。在肌抑素活化途徑的第一個步驟中，在N末端原胜肽域及C末端成長因子域之間的胜肽鍵，Arg266-Asp267，在同型二聚體前驅物的兩個鏈均被弗林型(furin-type)原蛋白轉化酶切割。但產生的三個胜肽(兩個原胜肽及一個成熟的肌抑素)(即，由成長因子域所組成的雙硫鍵結的同型二聚體))仍然結合，形成非共價鍵不具活性的複合物，其被稱為“潛伏性肌抑素”。成熟的肌抑素接著可透過原胜肽的分解從潛伏性肌抑素被釋放。金屬蛋白酶的骨成形蛋白1(BMP1)家族的成員切割原胜肽內的單一胜肽鍵，Arg98-Asp99，伴隨著釋放成熟的、活性肌抑素，一同型二聚體(請參照，例如，非專利文獻6)。此外，可藉由以酸抑或是熱處理解離複合物，以在體外(in vitro)活化潛伏性肌抑素(請參照，例如，非專利文獻7)。
肌抑素通過跨膜絲氨酸/蘇氨酸激酶異四聚體受體家族發揮其作用，其活化增強受體轉磷酸化，導致絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的刺激。已經顯示肌抑素途徑涉及活性肌抑素二聚體與高親和性的活化素受體型IIB(ActRIIB)結合，所述ActRIIB接著召集並活化低親和性受體類活化素激酶4(ALK4)/類活化素激酶5(ALK5)的轉磷酸化。亦已顯示蛋白質Smad 2及Smad 3接著被活化並與Smad 4形成複合物，然後移位至核，用於目標基因轉錄的活化。ActRIIB已被證實能夠體內(in vivo )介導肌抑素的影響，由於小鼠中顯性負相形式的ActRIIB的表達模擬肌抑素基因敲除(gene knockout)(請參照，例如，非專利文獻8)。
許多疾病及症狀與肌肉萎縮有關(例如，肌肉組織的減少或功能受損)，像是肌肉營養不良症(MD；包含Duchenne肌肉營養不良症)、肌萎縮性脊隨側索硬化症(ALS)、肌肉萎縮症、器官萎縮症、衰弱症、充血阻塞性肺病(COPD)、肌肉減少症、及由癌症或其它疾病所引起的惡病質，還有腎臟疾病、心臟的衰竭或疾病、及肝臟疾病。肌肉量及/或肌肉強度的增加將對患者有益，然而，目前可用於這些疾病的治療有限。因此，由於其作為骨骼肌成長的負調節者的角色，肌抑素成為用於此類疾病或症狀的治療性(therapeutic)或預防性干預、或用於監控此類疾病或症狀的進程之理想目標。特別地，抑制肌抑素的活性的試劑可為對治療有益的。
肌抑素表達的抑制導致肌肉肥大及增生(非專利文獻4)。肌抑素負向調節損傷後的肌肉再生，且肌抑素無效的(null)小鼠中肌抑素的缺乏導致加速的肌肉再生(請參照，例如非專利文獻9)。抗肌抑素(GDF8)抗體已於，例如，專利文獻3、專利文獻4、專利文獻5、專利文獻6和專利文獻7中描述，且專利文獻8、專利文獻9和專利文獻10已顯示在體外及體內結合肌抑素且抑制肌抑素活性，包含與骨骼肌量的負調節相關的肌抑素活性。在野生型小鼠的骨骼肌中(請參照，例如，非專利文獻10)及肌肉營養不良模型的mdx小鼠中(請參照，例如，非專利文獻11、非專利文獻12)，肌抑素-中和抗體增加體 重、骨骼肌量及肌肉尺寸和強度。然而，這些現有技術的抗體均是對成熟的肌抑素而非潛伏性肌抑素具有特異性，且所述用於抑制肌抑素活性的策略是利用可結合及中和成熟的肌抑素的抗體。
抗體在作為藥物上受到關注，由於它們在血液中高度穩定且副作用少(請參照，例如，非專利文獻13和非專利文獻14)。目前市場上的治療性抗體幾乎均為人類IgG1亞類(subclass)的抗體。IgG亞類抗體的已知功能之一為抗體依賴性細胞介導細胞毒性(此後以ADCC活性表示)(請參照，例如，非專利文獻15)。對於顯現ADCC活性的抗體，抗體Fc區域必須結合至Fcγ受體(此後以FcγR表示)，其為出現在效應細胞，像是殺手細胞、自然殺手細胞及活化的巨噬細胞，的表面上的抗體結合受體。
在人類中，FcγRIa(CD64A)、FcγRIIa(CD32A)、FcγRIIb(CD32B)、FcγRIIIa(CD16A)及FcγRIIIb(CD16B)同型異構物(isoform)已被報導為FcγR蛋白質家族，且各自的異型(allotype)也已被報導(請參照，例如，非專利文獻16)。FcγRIa、FcγRIIa及FcγRIIIa被稱為活化的FcγR，由於它們具有免疫活性功能，而FcγRIIb被稱為抑制的FcγR，由於其具有免疫抑制功能(請參照，例如，非專利文獻17)。
在Fc區域及FcγR之間的結合中，抗體絞鏈區及CH2域中的許多胺基酸殘基，及貼附在結合至CH2域在位置297(EU編號)的Asn的糖鏈已顯示為重要的(請參照，例如，非專利文獻18、非專利文獻19和非專利文獻20)。至今，許多 具有FcγR結合特性的變異體，主要為在這些位置被導入突變的抗體，已被研究；且已獲取對活化的FcγR具有較高結合活性的Fc區域變異體(請參照，例如，專利文獻11、專利文獻12、專利文獻13和專利文獻14)。
當活化的FcγR與免疫複合物交聯時，其磷酸化包含於細胞內域或FcR共有的γ鏈(相互作用配偶體)中的免疫受體酪胺酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activating motif,ITAM)，活化訊號轉換者SYK且藉由啟動活化訊號級聯引發發炎免疫反應(請參照，例如，非專利文獻21)。
FcγRIIb為表達於B細胞上的唯一FcγR(請參照，例如，非專利文獻22)。抗體Fc區域與FcγRIIb的相互作用已被報導可抑制B細胞的初級免疫反應(請參照，例如，非專利文獻23)。此外，已有報導當B細胞上的FcγRIIb及B細胞受體(BCR)在血液中藉由免疫複合物交聯時，B細胞的活化及B細胞的抗體生產被抑制(請參照，例如，非專利文獻24)。在此藉由BCR及FcγRIIb介導的免疫抑制訊號傳遞中，包含於FcγRIIb的細胞內域的免疫受體酪胺酸抑制基序(ITIM)為必要的(請參照，例如，如非專利文獻25和非專利文獻26)。當ITIM受到訊號而磷酸化時，包含SH2的肌醇多磷酸5-磷酸酶(SHIP)會被召集，其它活化的FcγR訊號級聯的傳遞會被抑制且發炎免疫反應會被抑制(請參照，例如，非專利文獻27)。此外，單獨FcγRIIb的聚集已被報導可短暫地抑制鈣離子內流，起因於以BCR非依賴性的方式，在不誘發IgM生產的B細胞的細胞凋亡的情況下的BCR交聯及B細胞增殖(請參照，例如，非專 利文獻28)。
FcγRIIb也表達於樹突細胞、巨噬細胞、活化的嗜中性球、肥大細胞及嗜鹼性球上。FcγRIIb抑制活化的FcγR的功能，像是這些細胞中的吞噬作用及發炎細胞激素的釋放，且抑制發炎免疫反應(請參照，例如，非專利文獻17)。
至今，FcγRIIb的免疫抑制功能的重要性已藉由使用FcγRIIb敲除小鼠的研究闡明。有報導指出在FcγRIIb敲除小鼠中，體液免疫未被適當地調控(請參照，例如，非專利文獻29)，對膠原誘導的關節炎(CIA)的敏感度增加(請參照，例如，非專利文獻30)，類似狼瘡的症狀出現，以及類似肺出血腎炎綜合症(Goodpasture's syndrome-like)的症狀出現(請參照，例如，非專利文獻31)。
此外，FcγRIIb的控制不足已被報導與人類自體免疫有關。例如，跨模區中的基因多型性及FcγRIIb的啟動子區之間的關係及全身性紅斑狼瘡(SLE)的發生的頻率(請參照，例如，非專利文獻32、非專利文獻33、非專利文獻34、非專利文獻35和非專利文獻36)，FcγRIIb在SLE患者的B細胞上的表達減少(請參照，例如，非專利文獻37和非專利文獻38)已被報導。
從上述老鼠模型及臨床發現，FcγRIIb被認為是通過與B細胞特定的關聯而扮演控制自體免疫疾病及發炎疾病的角色，且其為用於控制自體免疫疾病及發炎疾病之具有潛力的目標分子。
IgG1，主要作為市場上可取得的治療性抗體，已 知不僅結合至FcγRIIb，且亦強烈地活化FcγR(請參照，例如，非專利文獻39)。藉由利用相較於活化的FcγR具有增強的FcγRIIb結合或改善的FcγRIIb結合選擇性之Fc區域，發展相較於IgG1具有較強的免疫抑制特性的治療性抗體是可能的。例如，已有建議使用具有以增強的FcγRIIb結合力結合至BCR及Fc的變異區域的抗體可抑制B細胞活化(請參照，例如，非專利文獻40)。已有報導指出交聯FcγRIIb於結合至B細胞受體的B細胞及IgE上會抑制B細胞分化成血漿細胞，其結果導致IgE生產的抑制；且在人類PBMC-移植的小鼠中，人類IgG及IgM的濃度維持而人類IgE的濃度降低(請參照，例如，非專利文獻41)。除了IgE之外，已有報導指出當FcγRIIB及為B細胞受體複合物的組成分子的CD79b藉由抗體交聯時，體外的B細胞增殖被抑制，且在膠原性關節炎模型中的關節炎症狀被緩解(請參照，例如，非專利文獻42)。
除了B細胞之外，已有報導指出利用分子將肥大細胞上的FcεRI及FcγRIIb交聯，其中具有增強的FcγRIIb結合力的IgG的Fc部分被融合至IgE的Fc部分，其結合至IgE受體FcεRI，造成FcγRIIb的磷酸化，因而抑制FcεRI依賴性的鈣離子內流。這顯示藉由增強FcγRIIb結合力，經由FcγRIIb刺激的去顆粒作用的抑制是可能的(請參照，例如，非專利文獻43)。
因此，具有改善的FcγRIIb結合活性的Fc的抗體顯示具有潛力作為用於發炎疾病(像是自體免疫疾病)的治療試劑。
此外，已有報導指出起因於LPS刺激之透過類鐸受體4(Toll-like receptor 4)的巨噬細胞及樹突細胞的活化，在抗體-抗原免疫複合物的存在下被抑制，且此效應也顯示為透過FcγRIIb的免疫複合物的作用(請參照，例如，非專利文獻44和非專利文獻45)。因此，具有增強的FcγRIIb結合力的抗體之使用被預期能使TLR介導的活化訊號抑制作用增加；因此，這類抗體已顯示具有潛力作為用於發炎疾病(像是自體免疫疾病)的治療試劑。
此外，具有增強的FcγRIIb結合力的突變體已顯示具有潛力作為用於癌症的治療試劑，以及用於發炎疾病(像是自體免疫疾病)的治療試劑。至今，已發現FcγRIIb在針對抗TNF受體超家族的激動劑抗體的催動活性中扮演重要角色。特別地，已顯示與FcγRIIb的相互作用對於針對包含於TNF受體家族中的CD40、DR4、DR5、CD30及CD137的抗體的催動活性是需要的(請參照，例如，非專利文獻46、非專利文獻47、非專利文獻48、非專利文獻49、非專利文獻50、非專利文獻51和非專利文獻52)。非專利文獻46顯示具有增強的FcγRIIb結合力的抗體的使用增加了抗CD40抗體的抗腫瘤效果。因此，具有增強的FcγRIIb結合力的抗體被預期具有增加激動劑抗體的催動活性的效果，上述激動劑抗體包含針對抗TNF受體超家族的抗體。
此外，已顯示當使用辨識Kit的抗體以交聯FcγRIIb及Kit於表達Kit的細胞上時，細胞增殖被抑制，上述Kit為受體酪胺酸激酶(RTK)的一種。已有報導指出相似的效果 甚至發生在此種Kit持續地被活化且具有導致腫瘤形成的突變的情況下(請參照，例如，非專利文獻53)。因此，具有增強的FcγRIIb結合力的抗體的使用被預期可增加表達具有持續活化的突變的RTK之細胞的抑制效果。
具有改善的FcγRIIb結合活性的Fc的抗體已被報導(請參照，例如，非專利文獻40)。在此文獻中，FcγRIIb結合活性藉由對抗體Fc區域添加像是S267E/L328F、G236D/S267E及S239D/S267E的修改(alteration)加以改善。在它們之中，被導入S267E/L328F突變的抗體最強烈地結合至FcγRIIb，且對FcγRIa及H型FcγRIIa維持相同程度的結合，其在FcγRIIa的位置131的殘基為His，與自然存在的IgG1相同。然而，另一報導顯示此修改增加對R型FcγRIIa的結合數百倍至與FcγRIIb結合相同的程度，其中R型FcγRIIa在FcγRIIa的位置131的殘基為Arg，這代表相較於R型FcγRIIa,FcγRIIb的結合選擇性並未改善(請參照，例如，專利文獻15)。
只有增強FcγRIIa結合的效果而非FcγRIIb結合的增加，被認為對表達FcγRIIa而不表達FcγRIIb的細胞(像是血小板)有影響(請參照，例如，非專利文獻17)。例如，已知施用貝伐單抗(bevacizumab)的患者組有較高風險具有血栓栓塞，上述貝伐單抗為一種針對VEGF的抗體(請參照，例如，非專利文獻54)。此外，在針對CD40配體的抗體的臨床開發測試中已觀察到相似地血栓栓塞，且臨床測試被中斷(請參照，例如，如非專利文獻55)。在這些抗體的例子中，在使用動物模型等的之後的研究均顯示，施用的抗體透過結合於血小 板上的FcγRIIa凝集血小板，並形成血栓(請參照，例如，非專利文獻56和非專利文獻57)。在自體免疫疾病的系統性紅斑狼瘡中，血小板透過FcγRIIa依賴性機制被活化，且已有報導指出血小板活化與症狀的嚴重程度相關(請參照，例如，非專利文獻58)。施用具有增強的FcγRIIa結合之抗體於這類已具有較高血栓栓塞病發風險的患者，將會增加血栓栓塞發病的風險，因此相當危險。
此外，具有增強的FcγRIIa結合之抗體已被報導可增強巨噬細胞介導的抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)(請參照，例如，如非專利文獻59)。當被抗體結合的抗原被巨噬細胞吞噬時，抗體本身視為亦同時被吞噬。當抗體被作為藥物施用時，來自所施用抗體的胜肽片段被認為很可能也作為抗原被呈現，因而增加針對治療性抗體的抗體(抗治療性抗體)產生的風險。更具體而言，增強FcγRIIa的結合將增加針對治療性抗體的抗體產生的風險，且此將顯著地降低它們作為藥物的價值。此外，已顯示藉由由抗原與抗體之間形成的免疫複合物產生的樹突細胞活化的抑制、或藉由活化Fcγ受體抑制抗原呈現細胞給T細胞，樹突細胞上的FcγRIIb有助於外周耐受(請參照，例如，非專利文獻60)。由於FcγRIIa亦表達於樹突細胞上，因此當對FcγRIIb具有增強選擇性結合的Fc被作為藥物使用時，由於對FcγRIIb的選擇性結合增強，抗原不容易被樹突細胞呈現，抗藥物抗體產生的風險可相對地降低。在這方面，此類抗體也可為有用的。
更具體而言，當FcγRIIa的結合增強時，其導致通 過血小板凝集的血栓形成的風險增加，及起因於增加的免疫原性的抗治療性抗體產生的風險增加，而其作為藥物的價值將顯著降低。
從這樣的觀點來看，相較於自然存在的IgG1，上述具有增強的FcγRIIb結合的Fc變異體顯示顯著增強的R型FcγRIIa結合。因此，其作為用於帶有R型FcγRIIa的患者的藥物之價值顯著降低。H型及R型的FcγRIIa於高加索人及非裔美洲人中以大致相同程度的頻率被觀察到(請參照，例如，非專利文獻61和非專利文獻62)。因此，當此Fc變異體被用作自體免疫疾病的治療時，可安全地使用且享有其作為藥物的效果之患者的數量將為有限的。
此外，已有報導指出在缺乏FcγRIIb的樹突細胞、或在FcγRIIb及抗體Fc部分之間的相互作用被抗FcγRIIb抗體所抑制的樹突細胞中，樹突細胞為成熟的(請參照，例如，非專利文獻63和非專利文獻64)。此報導顯示在未發生發炎及未發生活化的穩定狀態下，FcγRIIb活躍地抑制樹突細胞的成熟。除了FcγRIIb之外，FcγRIIa亦表達於樹突細胞表面上；因此，即使與抑制性FcγRIIb的結合增強以及即使與活化的FcγR(像是FcγRIIa)的結合亦增強，樹突細胞的成熟可因而被促進。更具體而言，不僅是改善FcγRIIb結合活性，且改善FcγRIIb結合活性相對於FcγRIIa結合活性的比例，在提供抗體免疫抑制作用方面亦被視為重要的。
因此，當考慮到利用FcγRIIb結合介導的免疫抑制作用的藥物的生產時，Fc變異體不僅需具有增強的FcγRIIb結 合活性且亦需具有與H及R型FcγRIIa的異型的結合，其相較於自然存在的IgG1維持相同的程度或減弱至較低程度。
同時，目前已有報導指出在Fc區域中導入胺基酸改變以增加FcγRIIb結合選擇性的實例(請參照，例如，非專利文獻65)。然而，在此文獻的報導中，據稱具有改善的FcγRIIb選擇性的所有變異體，相較於自然存在的IgG1，顯示降低的FcγRIIb結合。因此，這些變異體被認為實際上難以比IgG1更強烈地誘發FcγRIIb介導的免疫抑制作用。
此外，由於FcγRIIb在前述的催動性抗體中扮演重要角色，因此增強它們的結合活性被預期可增強催動活性。然而，當FcγRIIa的結合同樣被增強，將會顯現非計畫中的作用(像是ADCC活性及ADCP活性)，且這可能造成負作用。亦由上述觀點而言，能夠選擇性增強FcγRIIb結合的活性是較佳的。
由這些結果可知，在利用FcγRIIb製造用於治療自體免疫疾病及癌症的治療性抗體時，與自然存在的IgG相比，對FcγRIIa異型的結合活性均維持或降低、且對FcγRIIb的結合增強是重要的。然而，FcγRIIb在胞外區域中，與活化的FcγR之一的FcγRIIa具有93%的序列相同性，它們在結構上非常相似。FcγRIIa具有異型，H型及R型，其在位置131的胺基酸為His(H型)或Arg(R型)，但它們與抗體的相互作用各不相同(請參照，例如，非專利文獻66)。因此，製造相較於FcγRIIa的各個異型均具有增強的選擇性FcγRIIb結合的Fc區域變異體可能為困難的課題，其涉及區分FcγRIIa及FcγRIIb之間的高度同源序列。儘管有這些困難，但藉由在Fc區域中實行綜 合胺基酸修飾分析，至今已有許多相較於FcγRIIa，對FcγRIIb具有選擇性結合活性的Fc區域變異體被辨識出來(請參照，例如，專利文獻16、專利文獻17、專利文獻18、專利文獻19和專利文獻20)。
目前已有與人類FcγR有關的對FcγRIIb具有結合選擇性之Fc區域變異體的報導，然而並沒有與猴子FcγR有關的對FcγRIIb具有結合選擇性之Fc區域變異體的報導。因為缺少了這種Fc變異體，Fc變異體與FcγRIIb選擇地結合的效果仍未在猴子中徹底地研究。
除了上述之外，已有報導指出藉由修飾可能暴露於抗體的表面的胺基酸殘基的電荷，以提高或降低抗體的等電點(pI)，使調整血液中的抗體的半生期為可能的(請參照，例如，專利文獻21和專利文獻22)。其顯示藉由降低抗體的pI以延長抗體的血漿半生期是有可能的，且反之亦然。
此外，已有報導指出可藉由修飾指定的胺基酸殘基的電荷，特別是在它的CH3域中以提高抗體的pI，藉此促進抗原併入至細胞中(請參照，例如，專利文獻23)。亦有報導指出修飾抗體恆定區(主要為CH1域)中的胺基酸殘基的電荷以降低pI，可延長抗體在血漿中的半生期(請參照，例如，專利文獻24)。
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本發明的目的係提供抗肌抑素之抗體、含變異Fc區域之多胜肽及其使用方法。
本發明提供抗肌抑素抗體及使用其方法。本發明亦提供包含變異的Fc區域的蛋白質及其使用方法。
在一些實施例中，本發明的分離的抗肌抑素抗體結合至潛伏性肌抑素。在又一些實施例中，抗體結合至由肌抑素原胜肽(序列辨識號：78)的胺基酸21-100所組成的片段中的抗原決定基。在一些實施例中，本發明的分離的抗肌抑素抗體抑制肌抑素的活化。在又一些實施例中，抗體阻擋成熟的肌抑素自潛伏性肌抑素釋放。在又一些實施例中，抗體阻擋成熟的肌抑素的蛋白質水解的釋放。在又一些實施例中，抗體阻擋成熟的肌抑素的自發性釋放。在又一些實施例中，抗體未結合至成熟的肌抑素。在又一些實施例中，抗體與表13所述之抗體結合至相同的抗原決定基。在又一些實施例中，抗體與包括表13所述之VH及VL對的抗體結合至相同的抗原決定基。在又一些實施例中，抗體與表2a所述之抗體結合至相同的抗原決定基。在又一些實施例中，抗體與包括表2a所述之VH及VL對的抗體結合至相同的抗原決定基。在又一些實施例中，抗體與表11a所述之抗體結合至相同的抗原決定基。在又一些實施例中，抗體與包括表11a所述之VH及VL對的抗體結合至相同的抗原決定基。在又一些實施例中，抗體與表2a、11a或13所述之抗體結合至相同的抗原決定基。在又一些實施例中，抗體與包括表2a、11a或13所述之VH及VL對的抗體結合至相同的抗原決定基。
在一些實施例中，本發明的分離的抗肌抑素抗體在中性pH比在酸性pH下，以較高的親和性結合至潛伏性肌抑素。在一些實施例中，抗肌抑素抗體在pH7.4比在pH5.8下，以較高的親和性結合至潛伏性肌抑素。在一些實施例中，本發 明的分離的抗肌抑素抗體在pH7.4比在pH5.8下，以較高的親和性結合至由肌抑素原胜肽(序列辨識號：78)的胺基酸21-100所組成的多肽片段。在一些實施例中，抗體在中性pH比在酸性pH下，以較高的親和性結合至肌抑素抗原決定基，其與表13所述之抗體所結合的肌抑素抗原決定基相同。在一些額外的實施例中，抗肌抑素抗體在pH7.4比在pH5.8下，以較高的親和性結合至抗原決定基，其與表13所述之抗體所結合的抗原決定基相同。在又一些實施例中，抗體在pH7.4比在pH5.8下，以較高的親和性結合至抗原決定基，其與包括表13所述之VH及VL對的抗體所結合的抗原決定基相同。在一些實施例中，抗體在中性pH比在酸性pH下，以較高的親和性結合至肌抑素抗原決定基，其與表2a所述之抗體所結合的肌抑素抗原決定基相同。在一些實施例中，抗體在pH7.4比在pH5.8下，以較高的親和性結合至肌抑素抗原決定基，其與表2a所述之抗體所結合的肌抑素抗原決定基相同。在又一些實施例中，抗體在pH7.4比在pH5.8下，以較高的親和性結合至抗原決定基，其與包括表2a所述之VH及VL對的抗體所結合的抗原決定基相同。在一些額外的實施例中，抗肌抑素抗體在中性pH比在酸性pH下，以較高的親和性結合至抗原決定基，其與表11a所述之抗體所結合的抗原決定基相同。在又一些實施例中，抗體在pH7.4比在pH5.8下，以較高的親和性結合至肌抑素抗原決定基，其與表11a所述之抗體所結合的肌抑素抗原決定基相同。在又一些實施例中，抗體在pH7.4比在pH5.8下，以較高的親和性結合至抗原決定基，其與包括表11a所述之VH及VL 對的抗體所結合的抗原決定基相同。在一些額外的實施例中，抗肌抑素抗體在中性pH比在酸性pH下，以較高的親和性結合至抗原決定基，其與表2a、11a或13所述之抗體所結合的抗原決定基相同。在又一些實施例中，抗體在pH7.4比在pH5.8下，以較高的親和性結合至肌抑素抗原決定基，其與表2a、11a或13所述之抗體所結合的肌抑素抗原決定基相同。在又一些實施例中，抗體在pH7.4比在pH5.8下，以較高的親和性結合至抗原決定基，其與包括表2a、11a或13所述之VH及VL對的抗體所結合的抗原決定基相同。
在一些實施例中，本發明的分離的抗肌抑素抗體與本文中提供的抗體競爭結合潛伏性肌抑素。在一些實施例中，本發明的分離的抗肌抑素抗體與表13所述之抗體競爭結合潛伏性肌抑素。在一些實施例中，本發明的分離的抗肌抑素抗體與包括表13所述之VH及VL對的抗體競爭結合潛伏性肌抑素。在一些實施例中，抗體與表2a所述之抗體競爭結合潛伏性肌抑素。在一些實施例中，本發明的分離的抗肌抑素抗體與包括表2a所述之VH及VL對的抗體競爭結合潛伏性肌抑素。在一些實施例中，抗體與表11a所述之抗體競爭結合潛伏性肌抑素。在一些實施例中，本發明的分離的抗肌抑素抗體與包括表11a所述之VH及VL對的抗體競爭結合潛伏性肌抑素。在一些額外的實施例中，抗肌抑素抗體與表2a、11a或13所述之抗體競爭結合潛伏性肌抑素。在一些額外的實施例中，抗肌抑素抗體與包括表2a、11a或13所述之VH及VL對的抗體競爭結合潛伏性肌抑素。在又一些實施例中，抗肌抑素抗體 在中性pH比在酸性pH下，以較高的親和性結合至潛伏性肌抑素。在又一些實施例中，抗肌抑素抗體在pH7.4比在pH5.8下，以較高的親和性結合至潛伏性肌抑素。在又一些實施例中，抗肌抑素抗體在pH7.4比在pH5.8下，以較高的親和性結合至由肌抑素原胜肽(序列辨識號：78)的胺基酸21-100所組成的多肽片段。用於評估抗體與參考抗體競爭結合潛伏性肌抑素的能力之方法描述於本文中，且為所屬領域所習知。
在一些實施例中，本發明的分離的抗肌抑素抗體為單株抗體。在一些實施例中，本發明的分離的抗肌抑素抗體為人類、人源化(humanized)或嵌合(chimeric)抗體。在一些實施例中，本發明的分離的抗肌抑素抗體為結合至肌抑素的抗體片段。在一些實施例中，本發明的分離的抗肌抑素抗體為結合至潛伏性肌抑素的抗體片段。在一些實施例中，本發明的分離的抗肌抑素抗體為結合至由肌抑素原胜肽(序列辨識號：78)的胺基酸21-100所組成的多肽片段的抗體片段。在一些實施例中，本發明的分離的抗肌抑素抗體為全長的IgG抗體。
在一些實施例中，本發明的抗肌抑素抗體包括：(a)(i)HVR-H3，包括胺基酸序列GVPAX1 SX2 GGDX3 ，其中X1 為Y或H、X2 為T或H、X3 為L或K(序列辨識號：128)；(ii)HVR-I3，包括胺基酸序列AGGYGGGX1 YA，其中X1 為L或R(序列辨識號：131)；以及(iii)HVR-H2，包括胺基酸序列IISX1 AGX2 X3 YX4 X5 X6 WAKX7 ，其中X1 為Y或H、X2 為S或K、X3 為T、M或K、X4 為Y或K、X5 為A、M或E、X6 為S或E、X7 為G或K(序列辨識號：127)； (b)(i)HVR-H1，包括胺基酸序列X1 X2 DIS，其中X1 為S或H、X2 為Y、T、D或E(序列辨識號：126)；(ii)HVR-H2，包括胺基酸序列IISX1 AGX2 X3 YX4 X5 X6 WAKX7 ，其中X1 為Y或H、X2 為S或K、X3 為T、M或K、X4 為Y或K、X5 為A、M或E、X6 為S或E、X7 為G或K(序列辨識號：127)；以及(iii)HVR-H3，包括胺基酸序列GVPAX1 SX2 GGDX3 ，其中X1 為Y或H、X2 為T或H、X3 為L或K(序列辨識號：128)；(c)(i)HVR-H1，包括胺基酸序列X1 X2 DIS，其中X1 為S或H、X2 為Y、T、D或E(序列辨識號：126)；(ii)HVR-H2，包括胺基酸序列IISX1 AGX2 X3 YX4 X5 X6 WAKX7 ，其中X1 為Y或H、X2 為S或K、X3 為T、M或K、X4 為Y或K、X5 為A、M或E、X6 為S或E、X7 為G或K(序列辨識號：127)；(iii)HVR-H3，包括胺基酸序列GVPAX1 SX2 GGDX3 ，其中X1 為Y或H、X2 為T或H、X3 為L或K(序列辨識號：128)；(iv)HVR-L1，包括胺基酸序列X1 X2 SQX3 VX4 X5 X6 NWLS，其中X1 為Q或T、X2 為S或T、X3 為S或E、X4 為Y或F、X5 為D或H、X6 為N、D、A或E(序列辨識號：129)；(v)HVR-L2，包括胺基酸序列WAX1 TLAX2 ，其中X1 為S或E、X2 為S、Y、F或W(序列辨識號：130)；以及(vi)HVR-L3，包括胺基酸序列AGGYGGGX1 YA，其中X1 為L或R(序列辨識號：131)；(d)(i)HVR-L1，包括胺基酸序列X1 X2 SQX3 VX4 X5 X6 NWLS，其中X1 為Q或T、X2 為S或T、X3 為S或E、X4 為Y或F、X5 為D或H、X6 為N、D、A或E(序列辨識號：129)；(ii)HVR-L2，包括胺基酸序列WAX1 TLAX2 ，其中X1 為S或E、X2 為S、Y、 F或W(序列辨識號：130)；以及(iii)HVR-L3，包括胺基酸序列AGGYGGGX1 YA，其中X1 為L或R(序列辨識號：131)。在一些實施例中，(b)的抗體更包括重鏈可變域框架FR1，包括序列辨識號：132-134中任一的胺基酸序列；FR2，包括序列辨識號：135-136中任一的胺基酸序列；FR3，包括序列辨識號：137的胺基酸序列；以及FR4，包括序列辨識號：138的胺基酸序列。在一些實施例中，(d)的抗體更包括輕鏈可變域框架FR1，包括序列辨識號：139的胺基酸序列；FR2，包括序列辨識號：140-141中任一的胺基酸序列；FR3，包括序列辨識號：142-143中任一的胺基酸序列；以及FR4，包括序列辨識號：144的胺基酸序列。
在一些實施例中，本發明的分離的抗肌抑素抗體包括：(a)HVR-H3，包括胺基酸序列GVPAX1 SX2 GGDX3 ，其中X1 為Y或H、X2 為T或H、X3 為L或K(序列辨識號：128)；(b)HVR-L3，包括胺基酸序列AGGYGGGX1 YA，其中X1 為L或R(序列辨識號：131)；以及(c)HVR-H2，包括胺基酸序列IISX1 AGX2 X3 YX4 X5 X6 WAKX7 ，其中X1 為Y或H、X2 為S或K、X3 為T、M或K、X4 為Y或K、X5 為A、M或E、X6 為S或E、X7 為G或K(序列辨識號：127)。
在一些實施例中，本發明的分離的抗肌抑素抗體包括：(a)HVR-H1，包括胺基酸序列X1 X2 DIS，其中X1 為S或H、X2 為Y、T、D或E(序列辨識號：126)；(b)HVR-H2，包括胺基酸序列IISX1 AGX2 X3 YX4 X5 X6 WAKX7 ，其中X1 為Y或H、X2 為S或K、X3 為T、M或K、X4 為Y或K、X5 為A、M 或E、X6 為S或E、X7 為G或K(序列辨識號：127)；以及(c)HVR-H3，包括胺基酸序列GVPAX1 SX2 GGDX3 ，其中X1 為Y或H、X2 為T或H、X3 為L或K(序列辨識號：128)。在又一些實施例中，抗體包括重鏈可變域框架FR1，包括序列辨識號：132-134中任一的胺基酸序列；FR2，包括序列辨識號：135-136中任一的胺基酸序列；FR3，包括序列辨識號：137的胺基酸序列；以及FR4，包括序列辨識號：138的胺基酸序列。在又一些實施例中，抗體額外地包括：(a)HVR-L1，包括胺基酸序列X1 X2 SQX3 VX4 X5 X6 NWLS，其中X1 為Q或T、X2 為S或T、X3 為S或E、X4 為Y或F、X5 為D或H、X6 為N、D、A或E(序列辨識號：129)；(b)HVR-L2，包括胺基酸序列WAX1 TLAX2 ，其中X1 為S或E、X2 為S、Y、F或W(序列辨識號：130)；以及(c)HVR-L3，包括胺基酸序列AGGYGGGX1 YA，其中X1 為L或R(序列辨識號：131)。
在一些實施例中，本發明的分離的抗肌抑素抗體包括：(a)HVR-L1，包括胺基酸序列X1 X2 SQX3 VX4 X5 X6 NWLS，其中X1 為Q或T、X2 為S或T、X3 為S或E、X4 為Y或F、X5 為D或H、X6 為N、D、A或E(序列辨識號：129)；(b)HVR-L2，包括胺基酸序列WAX1 TLAX2 ，其中X1 為S或E、X2 為S、Y、F或W(序列辨識號：130)；以及(c)HVR-L3，包括胺基酸序列AGGYGGGX1 YA，其中X1 為L或R(序列辨識號：131)。在又一些實施例中，抗體更包括：輕鏈可變域框架FR1，包括序列辨識號：139的胺基酸序列；FR2，包括序列辨識號：140-141中任一的胺基酸序列；FR3，包括序列辨識號：142-143中任 一的胺基酸序列；以及FR4，包括序列辨識號：144的胺基酸序列。
在一些實施例中，本發明的分離的抗肌抑素抗體包括：重鏈可變域框架FR1，包括序列辨識號：132-134中任一的胺基酸序列；FR2，包括序列辨識號：135-136中任一的胺基酸序列；FR3，包括序列辨識號：137的胺基酸序列；以及FR4，包括序列辨識號：138的胺基酸序列。在一些實施例中，本發明的分離的抗肌抑素抗體包括輕鏈可變域框架FR1，包括序列辨識號：139的胺基酸序列；FR2，包括序列辨識號：140-141中任一的胺基酸序列；FR3，包括序列辨識號：142-143中任一的胺基酸序列；以及FR4，包括序列辨識號：144的胺基酸序列。
在一些實施例中，本發明的分離的抗肌抑素抗體包括：(a)VH序列，其與序列辨識號：13、16-30、32-34及86-95中任一的胺基酸序列具有至少95%的序列相同性；(b)VL序列，其與序列辨識號：15、31、35-38及96-99中任一的胺基酸序列具有至少95%的序列相同性；或(c)如(a)所述之VH序列以及如(b)所述之VL序列。在又一些實施例中，抗體包括序列辨識號：13、16-30、32-34及86-95中任一的VH序列。在又一些實施例中，抗體包括序列辨識號：15、31、35-38及96-99中任一的VL序列。在一些實施例中，抗體包括序列辨識號：13、16-30、32-34及86-95中任一的VH序列。在又一些實施例中，抗體包括序列辨識號：13、16-30、32-34及86-95中任一的VH序列；以及序列辨識號：15、31、35-38及96-99中任一的VL 序列。
本發明亦提供編碼本發明之抗肌抑素抗體的分離的核酸。本發明亦提供包括本發明之核酸的宿主細胞。本發明亦提供製造抗體的方法，包括培養本發明之宿主細胞使得抗體被製造。
在一些態樣中，本發明提供一種製造抗肌抑素抗體的方法，包括：(a)培養本發明之宿主細胞使得抗體被製造；或(b)使動物對多肽免疫，其中上述多肽包括對應於肌抑素原胜肽(序列辨識號：78)在位置21-100的胺基酸的區域。
本發明更提供一種製造抗肌抑素抗體的方法。在一些實施例中，方法包括使動物對多肽免疫，其中上述多肽包括對應於肌抑素原胜肽(序列辨識號：78)在位置21-100的胺基酸的區域。
本發明亦提供提供一種醫藥配方，包括本發明之抗肌抑素抗體以及醫藥上可接受之載體。
本發明的抗肌抑素抗體可作用藥劑之用。在一些實施例中，抗體被用於製造下列用途之藥劑：(a)治療肌肉萎縮疾病；(b)增加肌肉組織的質量；(c)增加肌肉組織的力量；或(d)減少身體脂肪的累積。在一些實施例中，本發明的抗肌抑素抗體可用來治療肌肉萎縮疾病。本發明的抗肌抑素抗體可用來增加肌肉組織的質量。本發明的抗肌抑素抗體可用來增加肌肉組織的力量。本發明的抗肌抑素抗體可用來減少身體脂肪的累積。
在一些實施例中，在此提供的抗肌抑素抗體具有(a) 治療肌肉萎縮疾病；(b)增加肌肉組織的質量；(c)增加肌肉組織的力量；或(d)減少身體脂肪的累積的用途。
本發明的抗肌抑素抗體可被用於製造藥劑。在一些實施例中，抗體被用於製造用以：(a)治療肌肉萎縮疾病；(b)增加肌肉組織的質量；(c)增加肌肉組織的力量；或(d)減少身體脂肪的累積之藥劑。在一些實施例中，此藥劑係用來治療肌肉萎縮疾病。在一些實施例中，此藥劑係用來增加肌肉組織的質量。在一些實施例中，此藥劑係用來增加肌肉組織的力量。在一些實施例中，此藥劑係用來減少身體脂肪的累積。
本發明亦提供治療有肌肉萎縮疾病的個體的方法。在一些實施例中，此方法包含對此個體使用有效量之本發明的抗肌抑素抗體。本發明亦提供增加個體的肌肉組織的質量的方法。在一些實施例中，此方法包含對此個體使用有效量之本發明的抗肌抑素抗體，以增加肌肉組織的質量。本發明亦提供增加個體的肌肉組織的力量的方法。在一些實施例中，此方法包含對此個體使用有效量之本發明的抗肌抑素抗體，以增加肌肉組織的力量。本發明亦提供減少個體的身體脂肪的累積的方法。在一些實施例中，此方法包含對此個體使用有效量之本發明的抗肌抑素抗體，以減少身體脂肪的累積。
本發明提供包括變異的Fc區域的多肽以及其製造及使用的方法。
在一實施例中，本發明提供包括變異的Fc區域的FcγRIIB結合多肽及其使用方法。在一些實施例中，本發明的具有增強的FcγRIIB結合活性的變異的Fc區域包括至少一胺 基酸修改(alteration)於親本(parent)Fc區域中。在又一些實施例中，[親本Fc區域對猴子FcγRIIb的KD值]/[變異的Fc區域對猴子FcγRIIb的KD值]的比值為2或更大。在又一些實施例中，[親本Fc區域對猴子FcγRIIIa的KD值]/[變異的Fc區域對猴子FcγRIIIa的KD值]的比值為0.5或更小。在又一些實施例中，[親本Fc區域對人類FcγRIIb的KD值]/[變異的Fc區域對人類FcγRIIb的KD值]的比值為2或更大。在又一些實施例中，[親本Fc區域對人類FcγRIIIa的KD值]/[變異的Fc區域對人類FcγRIIIa的KD值]的比值為0.5或更小。在又一些實施例中，[親本Fc區域對人類FcγRIIa(H型)的KD值]/[變異的Fc區域對人類FcγRIIa(H型)的KD值]的比值為5.0或更小。在又一些實施例中，[親本Fc區域對人類FcγRIIa(R型)的KD值]/[變異的Fc區域對人類FcγRIIa(R型)的KD值]的比值為5.0或更小。在另一實施例中，變異的Fc區域對猴子FcγRIIb的KD值為1.0×10-6 M或更小。在另一實施例中，變異的Fc區域對猴子FcγRIIIa的KD值為5.0×10-7 M或更大。在另一實例中，變異的Fc區域對人類FcγRIIb的KD值為2.0×10-6 M或更小。在另一實施例中，變異的Fc區域對人類FcγRIIIa的KD值為1.0×10-6 M或更大。在另一實施例中，變異的Fc區域對人類FcγRIIa(H型)的KD值為1.0×10-7 M或更大。在另一實施例中，變異的Fc區域對人類FcγRIIa(R型)的KD值為2.0×10-7 M或更大。
在一些實施例中，本發明之具有增強的FcγRIIb結合活性的變異的Fc區域包括至少一胺基酸修改，其在至少 一擇自於：231、232、233、234、235、236、237、238、239、264、266、267、268、271、295、298、325、326、327、328、330、331、332、334及396所組成之群組的位置(根據EU編號)。
在又一些實施例中，具有增強的FcγRIIb結合活性的變異的Fc區域包括至少兩個胺基酸修改，包括：(a)在位置236的一胺基酸修改；以及(b)至少一胺基酸修改，其在至少一擇自於：(i)位置231、232、233、234、235、237、238、239、264、266、267、268、271、295、298、325、326、327、328、330、331、332、334及396；(ii)位置231、232、235、239、268、295、298、326、330及396；或(iii)位置268、295、326及330所組成之群組的位置(根據EU編號)。
在又一些實施例中，具有增強的FcγRIIb結合活性的變異的Fc區域包括至少兩個胺基酸修改，包括：(a)在位置236的一胺基酸修改；以及(b)至少一胺基酸修改，其在至少一擇自於：231、232、233、234、235、237、238、239、264、266、267、268、271、295、298、325、326、327、328、330、331、332、334及396所組成之群組的位置(根據EU編號)。
在又一些實施例中，具有增強的FcγRIIb結合活性的變異的Fc區域包括至少兩個胺基酸修改，包括：(a)在位置236的一胺基酸修改；以及(b)至少一胺基酸修改，其在至少一擇自於：231、232、235、239、268、295、298、326、330及396所組成之群組的位置(根據EU編號)。
在又一些實施例中，具有增強的FcγRIIb結合活性 的變異的Fc區域包括至少兩個胺基酸修改，包括：(a)在位置236的一胺基酸修改；以及(b)至少一胺基酸修改，其在至少一擇自於：268、295、326及330所組成之群組的位置(根據EU編號)。
在一些實施例中，本發明之具有增強的FcγRIIb結合活性的變異的Fc區域包括至少一胺基酸，其擇自於：(a)Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr在位置231；(b)Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr在位置232；(c)Asp在位置233；(d)Trp、Tyr在位置234；(e)Trp在位置235；(f)Ala、Asp、Glu、His、Ile、Leu、Met、Asn、Gln、Ser、Thr、Val在位置236；(g)Asp、Tyr在位置237；(h)Glu、Ile、Met、Gln、Tyr在位置238；(i)Ile、Leu、Asn、Pro、Val在位置239；(j)Ile在位置264；(k)Phe在位置266；(l)Ala、His、Leu在位置267；(m)Asp、Glu在位置268；(n)Asp、Glu、Gly在位置271；(o)Leu在位置295；(p)Leu在位置298；(q)Glu、Phe、Ile、Leu在位置325；(r)Thr在位置326；(s)Ile、Asn在位置327；(t)Thr在位置328；(u)Lys、Arg在位置330；(v)Glu在位置331；(w)Asp在位置332；(x)Asp、Ile、Met、Val、Tyr在位置334；以及(y)Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr在位置396(根據EU編號)所組成的群組。
在又一些實施例中，具有增強的FcγRIIb結合活性 的變異的Fc區域包括至少一胺基酸，其擇自於：(a)Gly、Thr在位置231；(b)Asp在位置232；(c)Trp在位置235；(d)Asn、Thr在位置236；(e)Val在位置239；(f)Asp、Glu在位置268；(g)Leu在位置295；(h)Leu在位置298；(i)Thr在位置326；(j)Lys、Arg在位置330；及(k)Lys、Met在位置396(根據EU編號)所組成的群組。
在另一實施例中，本發明提供包括等電點(pI)增加的變異的Fc區域的多肽及其使用方法。在一些實施例中，包括增加的pI的變異的Fc區域的多肽，包括至少兩個胺基酸修改於親本Fc區域。在又一些實施例中，相較於親本Fc區域的等電點(pI)，每一胺基酸修改增加變異的Fc區域的等電點。在又一些實施例中，胺基酸可暴露於變異的Fc區域的表面上。在又一些實施例中，多肽包括變異的Fc區域及抗原結合域。在又一些實施例中，抗原結合域的抗原結合活性根據離子濃度條件而改變。在又一些實施例中，本發明之具有增加的pI的變異的Fc區域包括至少兩個胺基酸修改，其在至少兩個擇自於：285、311、312、315、318、333、335、337、341、342、343、384、385、388、390、399、400、401、402、413、420、422及431所組成之群組的位置(根據EU編號)。在又一些實施例中，具有增加的pI的變異的Fc區域包括Arg或Lys在每一選擇的位置。
在一些實施例中，本發明的變異的Fc區域包括如表14-30所述之胺基酸修改。
在一些實施例中，多肽包括本發明的變異的Fc區 域。在又一些實施例中，親本Fc區域源自人類IgG1。在又一些實施例中，多肽為抗體。在又一些實施例中，多肽為Fc融合蛋白。
本發明提供一種多肽，包括序列辨識號：229-381中任一的胺基酸序列。
本發明亦提供編碼包括本發明的變異的Fc區域的多肽之分離的核酸。本發明亦提供包括本發明的核酸之宿主細胞。本發明亦提供製造包括變異的Fc區域的多肽之方法，包括培養本發明的宿主細胞使得多肽被製造。
本發明更提供一種醫藥配方，包括包含本發明之變異的Fc區域的多肽以及醫藥上可接受之載體。
[第1圖]
第1圖顯示藉由抗潛伏性肌抑素抗體抑制潛伏性肌抑素的蛋白質水解活，如實施例3所述。藉由BMP1蛋白酶而從潛伏性肌抑素釋放的活性肌抑素之活性，是在抗潛伏性肌抑素抗體存在下，使用HEK Blue分析進行測定。
[第2圖]
第2圖顯示藉由抗潛伏性肌抑素抗體抑制潛伏性肌抑素的自發性活化，如實施例4所述。藉由37℃培養從潛伏性肌抑素釋放的活性肌抑素之活性，是在抗潛伏性肌抑素抗體存在下，使用HEK Blue分析進行測定。
[第3圖]
第3圖顯示抗潛伏性肌抑素抗體對原胜肽域的結合，如實施例5所示。
[第4圖]
第4圖顯示針對肌抑素原胜肽的西方點墨分析，如實施例6所述。藉由BMP1的肌抑素原胜肽的蛋白酶切割，在抗潛伏性肌抑素抗體存在及不存在時，進行偵測。
[第5圖]
第5A-5C圖顯示抗潛伏性肌抑素抗體MST1032-G1m對於人類潛伏性肌抑素(A)、恆河猴(cynomolgus monkey)潛伏性肌抑素(B)、及老鼠潛伏性肌抑素(C)的BIACORE® 感測圖，如實施例7所述。
[第6A圖]
第6A圖顯示，在體內(in vivo)抗潛伏性肌抑素抗體及抗成熟肌抑素抗體對肌肉質量及脂肪質量的功效，如實施例8所述。抗潛伏性肌抑素抗體(MST1032-G1m，在圖中被描述為MST1032)或抗成熟肌抑素抗體(41C1E4)被使用在重度免疫缺陷(SCID)小鼠身上，且檢測全身肌肉質量(full body lean mass)(或瘦體質量(lean body mass，LBM))。
[第6B圖]
第6B圖顯示，在體內(in vivo)抗潛伏性肌抑素抗體及抗成熟肌抑素抗體對肌肉質量及脂肪質量的功效，如實施例8所述。抗潛伏性肌抑素抗體(MST1032-G1m，在圖中被描述為MST1032)或抗成熟肌抑素抗體(41C1E4)被使用在重度免疫缺陷(SCID)小鼠身上，檢測第0天到第14天的全身脂肪質量變 化。
[第6C圖]
第6C圖顯示，在體內(in vivo)抗潛伏性肌抑素抗體及抗成熟肌抑素抗體對肌肉質量及脂肪質量的功效，如實施例8所述。抗潛伏性肌抑素抗體(MST1032-G1m，在圖中被描述為MST1032)或抗成熟肌抑素抗體(41C1E4)被使用在重度免疫缺陷(SCID)小鼠身上，檢測腓腸肌(gastrocnemius)和四頭肌(quadriceps)的肌肉質量。
[第7A圖]
第7A圖顯示，比較多個抗肌抑素抗體在體內(in vivo)的功效，如實施例9所述。抗潛伏性肌抑素抗體(MST1032-G1m，在圖中被描述為MST1032)或抗成熟肌抑素抗體(41C1E4、REGN、OGD或MYO-029)被使用在重度免疫缺陷(SCID)小鼠身上，且檢測全身肌肉質量。
[第7B圖]
第7B圖顯示，比較多個抗肌抑素抗體在體內(in vivo)的功效，如實施例9所述。抗潛伏性肌抑素抗體(MST1032-G1m，在圖中被描述為MST1032)或抗成熟肌抑素抗體(41C1E4、REGN、OGD或MYO-029)被使用在重度免疫缺陷(SCID)小鼠身上，且檢測握力。
[第7C圖]
第7C圖顯示，比較多個抗肌抑素抗體在體內(in vivo)的功效，如實施例9所述。抗潛伏性肌抑素抗體(MST1032-G1m，在圖中被描述為MST1032)或抗成熟肌抑素抗體(41C1E4、 REGN、OGD或MYO-029)被使用在重度免疫缺陷(SCID)小鼠身上，且檢測第0天到第14天的全身脂肪質量變化。
[第8圖]
第8圖顯示藉由人源化抗潛伏性肌抑素抗體抑制潛伏性肌抑素的蛋白質水解及自發性活化，如實施例10所述。藉由BMP1(蛋白質水解)或在沒有BMP1下藉由37℃培養(自發性)而從潛伏性肌抑素釋放的活性肌抑素之活性，是在抗潛伏性肌抑素抗體存在下，使用HEK Blue分析進行測定。
[第9圖]
第9圖顯示抗潛伏性肌抑素抗體的組胺酸取代變異體的BIACORE® 感測圖，如實施例11所述。抗體/抗原複合物被允許在pH7.4解離，接著在pH5.8進一步解離(箭頭表示)，以評估pH依賴性相互作用。於此實驗中測試的抗體有：Ab001(黑色實線)、Ab002(黑色短虛線)、Ab003(黑色點線)、Ab004(灰色短虛線)、Ab005(灰色實線)、Ab006(灰色長虛線)、及Ab007(黑色長虛線)。
[第10圖]
第10圖顯示藉由pH依賴性抗潛伏性肌抑素抗體抑制潛伏性肌抑素的蛋白質水解及自發性活化，如實施例13所述。藉由BMP1(蛋白質水解)或在沒有BMP1下藉由37℃培養(自發性)而從潛伏性肌抑素釋放的活性肌抑素之活性，是在抗潛伏性肌抑素抗體存在下，使用HEK Blue分析進行測定。抗體MS1032LO01-SG1、MS1032LO02-SG1、MS1032LO03-SG1、及MS1032LO04-SG1在圖中分別以MSLO-01、MSLO-02、 MSLO-03、及MSLO-04描述。MS1032LO01-SG1、MS1032LO02-SG1、MS1032LO03-SG1及MS1032LO04-SG1達成與MS1032LO00-SG1類似的潛伏性肌抑素的蛋白質水解及自發性活化的抑制。
[第11圖]
第11A-11F圖顯示pH依賴性抗潛伏性肌抑素抗體的BIACORE® 感測圖，如實施例14所述。在中性pH及酸性pH下，測量MST1032-SG1(A)、MS1032LO00-SG1(B)、MS1032LO01-SG1(C)、MS1032LO02-SG1(D)、MS1032LO03-SG1(E)、及MS1032LO04-SG1(F)的動力學參數。
[第12圖]
第12圖顯示在靜脈施用抗肌抑素抗體於小鼠之後，血漿肌抑素濃度的時程變化，如實施例15所述。藉由比較具有FcγR結合的抗肌抑素抗體(MS1032LO00-SG1)與破壞FcγR結合的抗肌抑素抗體，評估抗體/抗原複合物的FcγR介導的細胞攝入對體內肌抑素清除(clearance)的影響。
[第13圖]
第13圖顯示在靜脈施用抗肌抑素抗體於小鼠之後，血漿肌抑素濃度的時程變化，如實施例16所述。藉由比較pH依賴性抗肌抑素抗體(MS1032LO01-SG1或MS1032LO01-F760)與非pH依賴性抗肌抑素抗體(MS1032LO00-SG1或MS1032LO00-F760)，評估抗肌抑素抗體的pH依賴性結合對體內肌抑素清除的影響。
[第14圖]
第14A-14E圖顯示，pH依賴性和非pH依賴性的抗潛伏性肌抑素抗體在體內的功效，如實施例17所述。pH依賴性抗潛伏性肌抑素抗體(MS1032LO01-SG1，在圖中描述為MSLO1)或非pH依賴性抗潛伏性肌抑素抗體(MS1032LO00-SG1，在圖中描述為MSLO0)被使用在重度免疫缺陷小鼠身上，且檢測全身肌肉質量(A)、全身脂肪質量(B)、四頭肌肌肉質量(C)、腓腸肌肌肉質量(D)及握力(E)。
[第15圖]
第15圖顯示抗潛伏性肌抑素抗體MST1032對潛伏性肌抑素及GDF11的結合活性，如實施例19所述。
[第16圖]
第16圖顯示抗潛伏性肌抑素抗體MST1032針對GDF11的蛋白質水解及自發性活化的抑制活性，如實施例20所述。 藉由BMP1蛋白酶(蛋白質水解)或在沒有BMP1下藉由37℃培養(自發性)而釋放的活性GDF11之活性，是在抗潛伏性肌抑素抗體存在下，使用HEK Blue分析進行測定。
[第17圖]
第17圖顯示藉由抗潛伏性肌抑素抗體抑制潛伏性肌抑素的蛋白質水解活化，如實施例22所述。藉由BMP1蛋白酶而從潛伏性肌抑素釋放的活性肌抑素的活性，是在抗潛伏性肌抑素抗體存在下，使用HEK Blue分析進行測定。
[第18圖]
第18圖顯示在靜脈施用抗肌抑素抗體於小鼠之後，血漿肌抑素濃度的時程變化，如實施例23所述。藉由比較非pH依 賴性抗肌抑素抗體(MS1032LO00-SG1)與不同的pH依賴性抗肌抑素抗體(MS1032LO01-SG1、MS1032LO06-SG1、MS1032LO11-SG1、MS1032LO18-SG1、MS1032LO19-SG1、MS1032LO21-SG1、及MS1032LO25-SG1)，評估pH依賴性對體內肌抑素清除的影響。
[第19圖]
第19A及19B圖顯示在靜脈施用抗肌抑素抗體於恆河猴之後，血漿肌抑素濃度的時程變化，如實施例24所述。(A)藉由比較非pH依賴性抗肌抑素抗體(MS1032LO00-SG1)與具有Fc工程改造的pH依賴性抗肌抑素抗體(MS1032LO06-SG1012、MS1032LO06-SG1016、MS1032LO06-SG1029、MS1032LO06-SG1031、MS1032LO06-SG1033、MS1032LO06-SG1034)，評估pH依賴性及Fc工程對體內肌抑素清除的影響。(B)藉由比較抗潛伏性肌抑素抗體(MS1032LO19-SG1079、MS1032LO19-SG1071、MS1032LO19-SG1080、MS1032LO19-SG1074、MS1032LO19-SG1081、及MS1032LO19-SG1077)，評估Fc工程對體內肌抑素清除的影響。
[第20A圖]
第20A圖，及第20B圖-第20I圖，顯示抗潛伏性肌抑素抗體(MS1032變異體)對身體肌肉質量、握力和身體脂肪質量在體內的功效，如實施例25所述。MS1032LO06-SG1、MS1032LO11-SG1和MS1032LO18-SG1被使用在重度免疫缺陷小鼠身上，且檢測身體肌肉質量(A)。
[第20B圖]
第20B圖，及第20A圖、第20C圖-第20I圖，顯示抗潛伏性肌抑素抗體(MS1032變異體)對身體肌肉質量、握力和身體脂肪質量在體內的功效，如實施例25所述。MS1032LO06-SG1、MS1032LO11-SG1和MS1032LO18-SG1被使用在重度免疫缺陷小鼠身上，且檢測身體肌肉質量(B)。
[第20C圖]
第20C圖，及第20A圖-第20B圖、第20D圖-第20I圖，顯示抗潛伏性肌抑素抗體(MS1032變異體)對身體肌肉質量、握力和身體脂肪質量在體內的功效，如實施例25所述。MS1032LO06-SG1、MS1032LO11-SG1和MS1032LO18-SG1被使用在重度免疫缺陷小鼠身上，且檢測身體肌肉質量(C)。
[第20D圖]
第20D圖，及第20A-第20C圖、第20E圖-第20I圖，顯示抗潛伏性肌抑素抗體(MS1032變異體)對身體肌肉質量、握力和身體脂肪質量在體內的功效，如實施例25所述。MS1032LO06-SG1、MS1032LO11-SG1和MS1032LO18-SG1被使用在重度免疫缺陷小鼠身上，且檢測握力(D)。
[第20E圖]
第20E圖，及第20A-第20D圖、第20F圖-第20I圖，顯示抗潛伏性肌抑素抗體(MS1032變異體)對身體肌肉質量、握力和身體脂肪質量在體內的功效，如實施例25所述。MS1032LO06-SG1、MS1032LO19-SG1和MS1032LO25-SG1被使用在重度免疫缺陷小鼠身上，且檢測握力(E)。
[第20F圖]
第20F圖，及第20A-第20E圖、第20G圖-第20I圖，顯示抗潛伏性肌抑素抗體(MS1032變異體)對身體肌肉質量、握力和身體脂肪質量在體內的功效，如實施例25所述。MS1032LO01-SG1、MS1032LO06-SG1和MS1032LO11-SG1被使用在重度免疫缺陷小鼠身上，且檢測握力(F)。
[第20G圖]
第20G圖，及第20A-第20F圖、第20H圖-第20I圖，顯示抗潛伏性肌抑素抗體(MS1032變異體)對身體肌肉質量、握力和身體脂肪質量在體內的功效，如實施例25所述。MS1032LO06-SG1、MS1032LO11-SG1和MS1032LO18-SG1被使用在重度免疫缺陷小鼠身上，且檢測身體脂肪質量(G)。
[第20H圖]
第20H圖，及第20A-第20G圖、第20I圖，顯示抗潛伏性肌抑素抗體(MS1032變異體)對身體肌肉質量、握力和身體脂肪質量在體內的功效，如實施例25所述。MS1032LO06-SG1、MS1032LO19-SG1和MS1032LO25-SG1被使用在重度免疫缺陷小鼠身上，且檢測身體脂肪質量(H)。
[第20I圖]
第20I圖，及第20A-第20H圖，顯示抗潛伏性肌抑素抗體(MS1032變異體)對身體肌肉質量、握力和身體脂肪質量在體內的功效，如實施例25所述。MS1032LO01-SG1、MS1032LO06-SG1和MS1032LO11-SG1被使用在重度免疫缺陷小鼠身上，且檢測身體脂肪質量(I)。
[第21圖]
第21圖顯示抗潛伏性肌抑素抗體對潛伏性肌抑素活化的抑制活性，如實施例26所述。藉由BMP1蛋白酶而從潛伏性肌抑素釋放的成熟的肌抑素的量，是在抗潛伏性肌抑素抗體(MST1032、MST1504、MST1538、MST1551、MST1558、MST1572、及MST1573)的存在下進行測量。
[第22A圖]
第22A圖顯示各為100個胺基酸的潛伏性肌抑素片段的示意圖，其是設計用於抗潛伏性肌抑素抗體的抗原決定基定位(epitope mapping)，如實施例26所述。
[第22B圖]
第22B圖顯示使用抗GST抗體針對GST標記的人類潛伏性肌抑素片段(GST-hMSTN)的西方點墨分析，如實施例26所述。每一欄代表：1、GST-hMSTN 1-100aa；2、GST-hMSTN 21-120aa；3、GST-hMSTN 41-140aa；4、GST-hMSTN 61-160aa；5、GST-hMSTN 81-180aa；6、GST-hMSTN 101-200aa；7、GST-hMSTN 121-220aa；8、GST-hMSTN 141-241aa；9、GST控制組。
[第22C圖]
第22C圖顯示藉由抗潛伏性肌抑素抗體(MST1032、MST1538、MST1572、及MST1573)，針對GST標記的人類潛伏性肌抑素片段(GST-hMSTN)的西方點墨分析，如實施例26所述。每一欄代表：1、GST-hMSTN 1-100aa；2、GST-hMSTN 21-120aa；3、GST-hMSTN 41-140aa；4、GST-hMSTN 61-160aa； 5、GST-hMSTN 81-180aa；6、GST-hMSTN 101-200aa；7、GST-hMSTN 121-220aa；8、GST-hMSTN 141-241aa；9、GST控制組；10、人類潛伏性肌抑素(100ng)。
[第22D圖]
第22D圖顯示西方點墨分析的總結結果以及抗潛伏性肌抑素抗體(MST1032、MST1538、MST1572、及MST1573)之推斷的抗原決定基位置，如實施例26所述。
[第23圖]
第23圖顯示恆河猴(cyno)FcγRIIa1、FcγRIIa2、FcγRIIa3、FcγRIIb、人類FcγRIIaH、FcγRIIaR、及FcγRIIb的胺基酸序列的比對。方塊區域代表與Fc域相互作用的假定殘基。
[第24圖]
第24圖顯示在靜脈施用具有增強FcγRIIb的Fc變異體的抗肌抑素抗體於全人類(all human)FcγR基因轉殖小鼠之後，血漿中總肌抑素濃度的時程變化，如實施例28所述。增強FcγRIIb的Fc變異體對於抗原消除的影響通過人類FcγRIIb進行評估。
[第25圖]
第25圖顯示在靜脈施用具有增強FcγRIIb的Fc變異體的抗肌抑素抗體於全人類FcγR基因轉殖小鼠之後，血漿中總肌抑素濃度的時程變化，如實施例28所述。評估增強FcγRIIb的Fc變異體對抗體藥物動力學的影響。
[第26圖]
第26A及26B圖顯示在靜脈施用抗肌抑素抗體於恆河猴之後，血漿肌抑素濃度的時程變化，如實施例29所述。(A)藉 由比較非pH依賴性抗肌抑素抗體(MS1032LO00-SG1)與具有Fc工程的pH依賴性抗肌抑素抗體(MS1032LO06-SG1012、MS1032LO06-SG1016、MS1032LO06-SG1029、MS1032LO06-SG1031、MS1032LO06-SG1033、MS1032LO06-SG1034)，評估pH依賴性及Fc工程對體內肌抑素清除的影響。(B)藉由比較抗潛伏性肌抑素抗體(MS1032LO19-SG1079、MS1032LO19-SG1071、MS1032LO19-SG1080、MS1032LO19-SG1074、MS1032LO19-SG1081、及MS1032LO19-SG1077)，評估Fc工程對體內肌抑素清除的影響。
[第27A圖]
第27A圖顯示在靜脈施用具有增加pI的Fc變異體的抗肌抑素抗體於人類FcRn基因轉殖小鼠之後，血漿中總肌抑素濃度的時程變化，如實施例30所述。評估pI增加的Fc變異體對抗原消除的影響。
[第27B圖]
第27B圖顯示在靜脈施用具有增加pI的Fc變異體的抗肌抑素抗體於人類FcRn基因轉殖小鼠之後，血漿中抗體濃度的時程變化，如實施例30所述。評估pI增加的Fc變異體對抗體抗體藥物動力學的影響。
[第28A圖]
第28A圖顯示在靜脈施用具有增加pI的Fc變異體的抗肌抑素抗體於人類FcRn基因轉殖小鼠之後，血漿中總肌抑素濃度的時程變化，如實施例30所述。評估pI增加的Fc變異體 對抗原消除的影響。在此分析中，為了模仿人類血漿的環境，過量的人類正常免疫球蛋白與抗肌抑素抗體被共同施用(co-administered)。
[第28B圖]
第28B圖顯示在靜脈施用具有增加pI的Fc變異體的抗肌抑素抗體於人類FcRn基因轉殖小鼠之後，血漿中抗體濃度的時程變化，如實施例30所述。評估pI增加的Fc變異體對抗體藥物動力學的影響。在此分析中，為了模仿人類血漿的環境，過量的人類正常免疫球蛋白與抗肌抑素抗體被共同施用(co-administered)。
[第29圖]
第29圖顯示在靜脈施用具有增強FcγRIIb的Fc變異體的抗肌抑素抗體於人類FcγRIIb基因轉殖小鼠之後，血漿中總肌抑素濃度的時程變化，如實施例31所述。FcγRIIb增強的Fc變異體對抗原消除的影響通過人類FcγRIIb進行評估。
[第30圖]
第30圖顯示在靜脈施用具有增強FcγRIIb的Fc變異體的抗肌抑素抗體於人類FcγRIIb基因轉殖小鼠之後，血漿中抗體濃度的時程變化，如實施例31所述。評估FcγRIIb增強的Fc變異體對抗體藥物動力學的影響。
[第31圖]
第31圖顯示具有增強FcγRIIb的Fc變異體的抗肌抑素抗體之細胞影像分析的結果，如實施例33所示。每一抗體被與螢光標記的肌抑素複合，及測量表達人類FcγRIIb的細胞中胞 內攝入的抗原/抗體複合物。
在本文所述或引用之技術或步驟通常為所屬領域之技術人員熟知且常使用的傳統方法，例如，舉例而言，如Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual 3d edition(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人編輯(2003))；the series Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.)：PCR 2：A Practical Approach(M.J.MacPherson,B.D.Hames及G.R.Taylor編輯(1995))，Harlow及Lane編輯(1988)Antibodies,A Laboratory Manual,and Animal Cell Culture(R.I.Freshney,ed.(1987))；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait編輯，1984)；Methods in Molecular Biology,Humana Press；Cell Biology：A Laboratory Notebook(J.E.Cellis編輯，1998)Academic Press；Animal Cell Culture(R.I.Freshney)編輯，1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather及P.E.Roberts，1998)Plenum Press；Cell and Tissue Culture：Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths及D.G.Newell編輯，1993-8)J.Wiley及Sons；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir及C.C.Blackwell編輯)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller及M.P.Calos編輯，1987)；PCR：The Polymerase Chain Reaction,(Mullis等人編輯，1994)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan等人編輯，1991)；Short Protocols in Molecular Biology(Wiley及Sons，1999)；Immunobiology(C.A.Janeway及P.Travers，1997)；Antibodies(P.Finch，1997)；Antibodies：A Practical Approach(D.Catty.編輯，IRL Press,1988-1989)；Monoclonal Antibodies：A Practical Approach(P.Shepherd及C.Dean編輯，Oxford University Press,2000)；Using Antibodies：A Laboratory Manual(E.Harlow及D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999)；The Antibodies(M.Zanetti及J.D.Capra編輯，Harwood Academic Publishers,1995)；以及Cancer：Principles and Practice of Oncology(V.T.DeVita等人編輯，J.B.Lippincott Company,1993)中所述被廣泛利用的方法。
I. 定義
除非另有定義，在本文所使用的技術和科學術語具有之意義與本發明所屬領域之技術人員通常理解的相同。Singleton等人，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed.,J.Wiley & Sons(New York,N.Y.1994)以及March,Advanced Organic Chemistry Reactions,Mechanisms and Structure 4th ed.,John Wiley & Sons(New York,N.Y.1992)提供本領域之技術人員對於本申請所使用的許多術語之概括性指導。在本文所引用之文獻，包含專利申請及出版物，均以參考方式完整併入本文。
為了解釋本說明書，將使用以下定義，並且只要適當，以單數形式使用的術語也可以包含複數，且反之亦然。應理解的是，在本文所使用的術語僅是為了描述具體的實施 例，並未有限制的意圖。在以下所述的任何定義與以參考方式併入本文中的任何文獻衝突的情況下，將以下述之定義為准。
用於本文目的之“受體人類框架”是包含衍生自下文定義的人類免疫球蛋白框架或人類共有框架的輕鏈可變域(VL)框架或重鏈可變域(VH)框架的胺基酸序列之框架。“衍生自”人類免疫球蛋白框架或人類共有框架的受體人類框架可包括其相同的胺基酸序列，或者它可包含胺基酸序列改變。在一些實施例中，胺基酸改變的數目是10個或更少、9個或更少、8個或更少、7個或更少、6個或更少、5個或更少、4個或更少、3個或更少、或2個或更少。在一些實施例中，VL受體人類框架在序列上與VL人類免疫球蛋白框架序列或人類共有框架序列相同。
“親和性”指分子(例如，抗體)的單一結合部位與其結合配偶體(例如，抗原)之間非共價相互作用的總計強度。除非另有說明，在本文所使用的“結合親和性”指內在的結合親和性，其反映結合對(例如，抗體及抗原)的成員之間的1：1相互作用。分子X對其配偶體Y的親和性一般可藉由解離常數(dissociation constant,Kd)來表示。親和性可藉由本領域公知的方法來測量，包含本文中描述的那些。用於測量結合親和性之具體說明及示例性的實施例將於下文中描述。
“親和性成熟”抗體指與不具有這類改變的親本抗體(parent antibody)相比，在一個或多個高變異區域(hypervariable region,HVR)中具有一個或多個改變的抗體，這類改變導致抗體對抗原的親和性的改善。
術語“抗肌抑素抗體”及“結合至肌抑素的抗體”指一抗體，其能夠以足夠的親和性結合肌抑素使得抗體可以在標靶肌抑素中用作為診斷及/或治療劑。在一實施例中，例如藉由放射免疫分析(RIA)測量，抗肌抑素抗體與不相關的非肌抑素蛋白結合的程度小於該抗體與肌抑素的結合的約10%。在特定實施例中，結合至肌抑素的抗體具有1μM、100nM、10nM、1nM、0.1nM、0.01nM、或0.001nM(例如10-8 M或更小、例如由10-8 M至10-13 M、例如由10-9 M至10-13 M)之解離常數(Kd)。在特定實施例中，抗肌抑素抗體結合至肌抑素的抗原決定基，其與來自不同物種的肌抑素之間為保守的(conserved)。
術語“抗體”在本文中以最廣泛的含義使用並涵蓋多種抗體結構，包含但不限於單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)及抗體片段，只要它們展現所希望的抗原結合活性。
“抗體片段”指除完整抗體以外之包括完整抗體的部分的分子，其結合該完整抗體所結合的抗原。抗體片段的實例包含但不限於Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2 ；雙抗體(diabody)；線性抗體；單鏈抗體分子(例如，scFv)；以及從抗體片段形成之多特異性抗體。
“結合相同抗原決定基的抗體”作為參考抗體是指在競爭分析(competition assay)中，將參考抗體與其抗原的結合阻斷之抗體，及/或相反地，參考抗體在競爭分析中將抗體與其抗原的結合阻斷。本文提供示例性競爭分析。
術語“嵌合(chimeric)”抗體指一抗體其中部分的重鏈及/或輕鏈來自特定來源或物種，而重鏈及/或輕鏈的其餘部分則來自不同的來源或物種。
抗體的“種類”指其重鏈所具有的恆定域(constant domain)或恆定區(constant region)的類型。存在五個主要種類的抗體：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，這些種類中的數種可進一步劃分為亞型(subgroup)(同型(isotype))，例如，IgG1 、IgG2 、IgG3 、IgG4 、IgA1 及IgA2 。對應於不同種類的免疫球蛋白之重鏈恆定域分別稱為α、δ、ε、γ及μ。
本文所使用的術語“細胞毒劑(cytotoxic agent)”指抑制或阻止細胞功能及/或引起細胞死亡或破壞的物質。細胞毒劑包含但不限於放射性同位素(例如，At211 、I131 、I125 、Y90 、Re186 、Re188 、Sm153 、Bi212 、P32 、Pb212 以及Lu的放射性同位素)；化療劑或藥物(例如，甲氨喋呤、阿黴素(adriamicin)、長春花屬生物鹼(長春新生物鹼(vincristine)、長春花生物鹼(vinblastine)、依妥普賽(etoposide))、艾黴素(doxorubicin)、氮芥苯丙胺酸(melphalan)、絲裂黴素C、氮芥苯丁酸(chlorambucil)、道諾黴素(daunorubicin)或其他嵌入劑)；生長抑制劑；酶及其片段，例如核溶解酶；抗生素；毒素，例如細菌、真菌、植物或動物來源的小分子毒素或酶活性毒素，包含其片段及/或變異體；及下文揭露的多種抗腫瘤或抗癌劑。
“效應物功能”指可歸因於抗體的Fc區域的那些生物活性，其隨抗體同型(isotype)而不同。抗體效應物功能的 例子包含：C1q結合及補體依賴性細胞毒性(complement dependent cytotoxicity,CDC)；Fc受體結合；抗體依賴性細胞調節細胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體(例如B細胞受體)的負調控；及B細胞活化。
試劑，例如醫藥配方，的“有效量”指在劑量及所需的時間內，可有效達成希望的治療或預防結果的量。
術語“抗原決定基”包含能夠被抗體結合之任何決定位(determinant)。抗原決定基是被標靶該抗原之抗體結合的抗原的區域，且包含特定的胺基酸，其直接接觸抗體。抗原決定基決定位可包含分子(例如胺基酸、醣支鏈、磷酸基或磺醯基)的化學活性表面群集，且可具有特定的三維結構特性，及/或特定電荷特性。一般而言，對特定目標抗原具有特異性的抗體在蛋白及/或巨分子的複合混合物中將優先地辨識目標抗原上的抗原決定基。
“Fc受體”或“FcR”描述結合至抗體的Fc區域的受體。在一些實施例中，FcR為自然的人類FcR。在一些實施例中，FcR為結合至IgG抗體的受體(γ受體)且包含FcγRI、FcγRII及FcγRIII亞類的受體，其包含這些受體的等位基因變異體及可變剪接形式(alternatively spliced form)。FcγRII受體包含FcγRIIA(“活化的受體”)及FcγRIIB(“抑制的受體”)，其具有相似的胺基酸序列，主要在其胞質域中不同。活化的受體FcγRIIA包含免疫受體酪胺酸活化基序(ITAM)於它的胞質域中。抑制的受體FcγRIIB包含免疫受體酪胺酸抑制 基序(ITIM)於它的胞質域中(請參照，例如，Daëron,Annu.Rev.Immunol. 15：203-234(1997))。FcR已綜述於，例如Ravetch及Kinet，Annu.Rev.Immunol. 9：457-92(1991)；Capel等人，Immunomethods 4：25-34(1994)；及de Haas等人，J.Lab.Clin.Med. 126：330-41(1995)。其它FcR，包含那些於未來被辨識的，均涵蓋於本文的術語“FcR”中。
術語“Fc受體”或“FcR”也包含新生受體，FcRn，其負責將母親的IgG傳送至胎兒(Guyer等人，J.Immunol. 117：587(1976)及Kim等人，J.Immunol. 24：249(1994))以及免疫球蛋白的恆定的調控。與FcRn結合的測量方法為已知的(請參照，例如，Ghetie及Ward，Immunol.Today 18(12)：592-598(1997)；Ghetie等人，Nature Biotechnology 15(7)：637-640(1997)；Hinton等人，J.Biol.Chem. 279(8)：6213-6216(2004)；WO 2004/92219(Hinton等人)。體內與人類FcRn的結合及人類FcRn高親和性結合的多肽的血漿半生期可被分析，例如，在基因轉殖小鼠或轉染(transfect)表達人類FcRn的人類細胞系，或在靈長類中施用具有變異Fc區域的多肽。WO 2000/42072(Presta)描述對FcR具有改善或減少的結合的抗體變異體。亦參照，例如，Shields等人，J.Biol.Chem. 9(2)：6591-6604(2001)。
本文的術語“Fc區域”是用來定義免疫球蛋白重鏈的C末端區域，其包含至少一部分的恆定區。此術語包含自然序列Fc區域和變異體Fc區域。在一實施例中，人類IgG重鏈Fc區域自Cys226或自Pro230延伸至重鏈的羧基末端。然 而，Fc區域的C末端賴胺酸(Lys447)或甘胺酸-賴胺酸(Gly446-Lys447)可存在或不存在。除非本文另有說明，Fc區域或恆定區中的胺基酸殘基的編號是按照EU編號系統，亦稱為EU指數，如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Intere st 5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中所述。
術語“包括Fc區域的抗體(Fc region-comprising antibody)”指一抗體，其包括Fc區域。Fc區域的C末端賴胺酸(殘基477，根據EU編號系統)或C末端甘胺酸-賴胺酸(殘基446-447)可被移除，例如，在抗體純化或藉由編碼抗體的核酸之重組工程期間。因此，包括本發明之具有Fc區域的抗體之組成物，可包括具有G446-K447的抗體、具有G446且不具有K447、所有G446-K447被移除的抗體、或上述三種抗體的混合物。
“框架”或“FR”指高變異區(HVR)殘基以外的可變域殘基。可變域的FR一般由四個FR域所組成：FR1、FR2、FR3及FR4。因此，HVR和FR序列一般按以下順序出現在VH(或VL)中：FR1-H1(LI)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
術語“全長抗體”、“完整抗體”及“全抗體”在本文中可互換使用，指具有實質上(substantially)相似於自然抗體結構的結構或具有包含本文定義之Fc區域的重鏈的抗體。
“功能性Fc區域”擁有自然序列Fc區域的“效應物功能”。示例性“效應物功能”包含C1q結合；CDC；Fc受體結合；ADCC；吞噬作用；細胞表面受體(例如B細胞受體) 的負調控等。這類效應物功能通常需要Fc區域以與結合域(例如，抗體可變域)結合，且可利用多種揭示的分析，例如，於本文定義中，進行評估。
術語“宿主細胞”、“宿主細胞系”和"宿主細胞培養物"可互換使用，指已將外源核酸引入其中的細胞，包含這類細胞的子代。宿主細胞包含“轉化體”及“轉化細胞”，其包含最初轉化的細胞及從其衍生的子代，並不考慮傳代數。子代的核酸含量可以不與親本細胞完全相同，而可包含突變。本文包含具有與在最初轉化的細胞中篩選或選擇之相同功能或生物活性之突變體後代。
“人類抗體”是具有對應於由人類或人類細胞產生的抗體或衍生自非人類來源的胺基酸序列者，上述非人類來源的胺基酸序列利用人類抗體庫或其它人類抗體編碼序列。人類抗體的此定義具體排除了包括非人類抗原結合殘基的人源化抗體。
“人類共有框架”是代表人類免疫球蛋白VL或VH框架序列的選擇中最常出現之胺基酸殘基的框架。一般而言，人類免疫球蛋白VL或VH序列的選擇來自可變域序列的亞型。通常，序列的亞型是Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest ,Fifth Edition,NIH Publication 91-3242,Bethesda MD(1991),vols.1-3中的亞型。在一實施例中，對於VL，亞型是如Kabat等人，supra 中的亞型kappa I。在一實施例中，對於VH，亞型是如Kabat等人，supra 中的亞型III。
“人源化(humanized)”抗體指包括來自非人類HVR的胺基酸殘基以及來自人類FR的胺基酸殘基的嵌合抗體。在特定實施例中，人源化抗體將包括實質上全部之至少一個且通常為兩個的可變域，其中全部或實質上全部之HVR(例如，CDRs)對應於非人類抗體的那些，而全部或實質上全部之FR對應於人類抗體的那些。人源化抗體可選擇地包括源自人類抗體的抗體恆定區的至少一部分。抗體(例如非人類抗體)的"人源化形式"指已進行人源化之抗體。
本文所用的術語“高變異區”或“HVR”指抗體可變域在序列上高變異(“互補決定區”或“CDR”)、及/或形成結構上定義的環(“高變異環”)、及/或包含抗原接觸殘基(“抗原接觸”)的每一區域。一般而言，抗體包括六個HVR：三個在VH中(H1、H2、H3)，三個在VL中(L1、L2、L3)。本文中示例性HVR包含：(a)出現於胺基酸殘基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)以及96-101(H3)(Chothia，J.Mol.Biol. 196：901-917(1987))的高變異環；(b)出現於胺基酸殘基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)以及95-102(H3)(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest ,5th Ed.Public Health Service,NIH,Bethesda,MD(1991))的CDR；(c)出現於胺基酸殘基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)以及93-101(H3)(MacCallum等人，J.Mol.Biol. 262：732-745(1996))的抗原接觸；以及(d)(a)、(b)及/或(c)之組合，包含HVR胺基酸殘基46-56(L2)、47-56(L2)、48-56(L2)、 49-56(L2)、26-35(H1)、26-35b(H1)、49-65(H2)、93-102(H3)以及94-102(H3)。
除非另有說明，本文中HVR殘基及在可變域中的其它殘基(例如，FR殘基)依照Kabat等人，supra 編號。
“免疫偶聯物”是與一或多種異源(heterogeneous)分子(包含但不限於細胞毒劑)偶聯的抗體。
“個體(individual)”或“對象(subject)”是哺乳動物。哺乳動物包含但不限於飼養的動物(例如牛、綿羊、貓、狗及馬)、靈長類(例如人類及非人類靈長類，如猴子)、兔及齧齒類(例如小鼠和大鼠)。在特定實施例中，個體或對象為人類。
“分離的”抗體是已從其自然環境的成分分離的抗體。在一些實施例中，抗體被純化至大於95%或99%的純度，其藉由例如，電泳(例如SDS-PAGE、等電聚焦(IEF)、毛細管電泳)或層析(例如離子交換或反相HPLC)方法進行測定。評估抗體純度的方法的綜述可參照，例如，Flatman等人，J.Chromatogr.B 848：79-87(2007)。
“分離的”核酸指已從其自然環境的成分分離的核酸分子。分離的核酸包括包含在通常含有該核酸分子的細胞中的核酸分子，但該核酸分子存在於染色體外或在不同於其自然染色體位置的染色體位置上。
“編碼抗肌抑素抗體的分離的核酸”指編碼抗體重鏈及輕鏈(或其片段)的一或多個核酸分子，包含於單一載體或分開的載體中的此種核酸分子，以及存在於宿主細胞中的一或多個位置的此種核酸分子。
本文所用的術語“單株抗體”指獲得自實質上同源的(homogeneous)抗體族群的抗體，即，包括相同的族群及/或結合至相同抗原決定基的單獨抗體，除了例如：包含自然存在的突變或在產生單株抗體製備期間出現之可能的變異體抗體(這類變異體通常以較小量存在)以外。不同於通常包含針對不同決定位(抗原決定基)的不同抗體之多株抗體的製備，單株抗體製備的每一單株抗體是針對抗原上的單一決定位。因此，修飾詞“單株”指獲取自實質上同源的抗體族群的抗體特徵，而不解釋為需要藉由任何具體方法以生產抗體。例如，將根據本發明被使用的單株抗體可藉由多種技術加以製備，其包含但不限於融合瘤技術、重組DNA法、噬菌體展示法以及利用含有全部或部分人類免疫球蛋白基因座(loci)的轉殖基因動物的方法，這類方法及其它用以製造單株抗體的示例性方法將於文中描述。
“裸抗體”指未與異源部分(例如細胞毒性部分)或放射標記偶聯的抗體。裸抗體可存在於醫藥配方中。
“自然抗體”指具有不同結構之自然存在的免疫球蛋白分子。例如，自然IgG抗體為約150,000道爾頓(dalton)的異源四聚體醣蛋白，由雙硫鍵結的兩個相同輕鏈及兩個相同重鏈所組成。從N至C末端，每一重鏈具有可變區(VH)，也稱為可變重鏈域或重鏈可變域，隨後是三個恆定域(CH1、CH2及CH3)。相似地，從N至C末端，每一輕鏈具有可變區(VL)，也稱為可變輕鏈域或輕鏈可變域，隨後是恆定輕鏈(CL)域。根據其恆定域的胺基酸序列，抗體的輕鏈可歸類於兩種類型之 一，稱為κ及λ。
“自然序列Fc區域”包括與自然中發現的Fc區域的胺基酸序列相同之胺基酸序列。自然序列人類Fc區域包含自然序列人類IgG1 Fc區域(非A及A異型)；自然序列人類IgG2 Fc區域；自然序列人類IgG3 Fc區域；及自然序列人類IgG4 Fc區域，以及其自然產生的變異體。
術語“藥品仿單(package insert)”用來指通常包含在治療產品的商業包裝中的說明，其包含關於適應症、用法、劑量、施用、結合療法、禁忌症的資訊及/或有關這類治療產品的使用之警告。
相對於參考多肽序列的“百分比(%)胺基酸序列相同性”定義為在比對序列及在必要時引入缺口(gap)以達到最大的百分比序列相同性之後，且不將任何保守取代視為序列相同性的部分的情況下，候選序列中與參考多肽序列中的胺基酸殘基相同的胺基酸殘基的百分比。可以以本技術領域之內的各種方式以達到以測定百分比胺基酸序列相同性為目的之比對，例如，使用公開可取得的電腦軟體，如BLAST、BLAST-2、ALIGN、Megalign(DNASTAR)軟體或GENETYX(註冊商標)(Genetyx Co.,Ltd.)。本領域之技術人員可以決定用於比對序列的適當參數，包含在所比較的序列的全長內達到最大比對所需的任一演算法。ALIGN-2序列比較電腦程式由Genentech,Inc.編寫，且原始程式碼已隨用戶文件提交美國版權辦公室，Washington D.C.,20559，它在美國版權辦公室註冊在美國版權註冊號TXU510087之下。ALIGN-2程式可公開取得於 Genentech,Inc.,South San Francisco,California，或者可從原始程式碼編譯。ALIGN-2程式應編譯用在UNIX作業系統上，包括數位UNIX V4.0D。所有序列比較參數由ALIGN-2程式設定且不變動。
在利用ALIGN-2以進行胺基酸序列比較的情況下，給定的胺基酸序列A比上、以及或相對給定的胺基酸序列B的%胺基酸序列相同性(或者其可表達為給定的胺基酸序列A，其具有或包括特定%胺基酸序列相同性比上、以及或相對給定的胺基酸序列B)以下列計算：100乘以分數X/Y，其中X是在該程式的A及B比對中藉由序列比對程式ALIGN-2評分為相同匹配(match)的胺基酸殘基數目，以及其中Y是B中的胺基酸殘基的總數。應理解的是，在胺基酸序列A的長度不等於胺基酸序列B的長度時，A比上B的%胺基酸序列相同性將不等於B比上A的%胺基酸序列相同性。除非明確地另有說明，本文中使用的所有%胺基酸序列相同性值均是如前面段落中所述利用ALIGN-2電腦程式所得。
術語“醫藥配方”指一製備物，其處於允許包含在其中的活性成分的生物活性有效的此種形式，且其不包含對將要施用該配方的對象具有不可接受的毒性之附加成分。
“醫藥上可接受之載體”指醫藥配方中除了活性成分以外的一成分，其對對象無毒性。醫藥上可接受之載體包含但不限於緩衝劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。
本文所用的術語“肌抑素”可指來自任一脊椎動物源的任一自然肌抑素，包含哺乳動物，例如靈長類(例如， 人類)以及齧齒類(例如，小鼠及大鼠)。除非另有說明，術語“肌抑素”是指具有序列辨識號：1所示之胺基酸序列以及包含序列辨識號：75或78所示之人類肌抑素的末端原胜肽域之人類肌抑素蛋白。此術語涵蓋“全長”、未經處理的肌抑素以及由細胞內加工產生的任一形式之肌抑素。此術語亦涵蓋肌抑素之自然存在的變異體，例如，剪接(splice)變異體或等位基因(allelic)變異體。示例性人類肌抑素的胺基酸序列如序列辨識號：1(原肌抑素(promyostatin))所示。示例性人類肌抑素的C末端成長因子域的胺基酸序列如序列辨識號：2所示。示例性人類肌抑素的N末端原胜肽域的胺基酸序列如序列辨識號：75或78所示。活性成熟的肌抑素是由兩個C末端成長因子域所組成的雙硫鍵結的同型二聚體。不具活性的潛伏性肌抑素是兩個原胜肽及成熟的肌抑素之非共價連接的複合物。如本文中所揭示，本發明的抗體與不具活性的潛伏性肌抑素結合，但不與成熟的活性肌抑素同型二聚體結合。在一些實施例中，本發明的抗體與由肌抑素原胜肽(序列辨識號：78)的胺基酸21-100所組成的片段內的抗原決定基結合，但不與成熟的活性肌抑素同型二聚體結合。示例性恆河猴及鼠類(murine)肌抑素(原肌抑素)的胺基酸序列分別如序列辨識號：3及5所示。示例性恆河猴及鼠類肌抑素的C末端成長因子域的胺基酸序列分別如序列辨識號：4及6所示。示例性恆河猴及鼠類肌抑素的N末端原胜肽域的胺基酸序列分別如序列辨識號：76或79、及77或80所示。GDF-11(BMP-11)為與肌抑素密切相關的分子，它們均為TGF-β超家族的成員。與肌抑素相似地，GDF11首先被合 成為前驅原胜肽，接著被切割成N末端原域(prodomain)及C末端成熟的GDF11。人類GDF11(前驅物)的胺基酸序列如序列辨識號：81所示。C末端成熟的人類GDF11的胺基酸序列如序列辨識號：82所示。人類GDF11的N末端原域的胺基酸序列如序列辨識號：83或84所示。序列辨識號：1、3、5、78、79、80、81及84的胺基酸序列包含訊息序列，其對應於它們的胺基酸1-24，且訊息序列在細胞中加工時被移除。
本文所使用的“治療(treatment)”(及其語法的變形)指試圖改變受治療的個體的自然病程之臨床干預，且可以為了預防而進行或在臨床病理的過程中進行。希望得到的治療作用包含但不限於防止疾病的發生或復發、減輕症狀、減少疾病的任一直接或間接的病理結果、防止轉移、降低疾病進展的速率、改善或緩和疾病狀態以及緩減或改善的預後。在一些實施例中，本發明的抗體用以延遲疾病的發展或減慢疾病的進展。
術語“可變區”或“可變域”指涉及結合抗體至抗原的抗體重鏈或輕鏈的域。自然抗體的重鏈及輕鏈的可變域(分別為VH和VL)通常具有相似的結構，每一域包括四個保守的框架區(FR)及三個高變異區(HVR)(請參照，例如Kindt等人，Kuby Immunology ,6th ed.,W.H.Freeman and Co.，第91頁(2007))。單一VH或VL域可足以賦予抗原結合的特異性。此外，結合至特定抗原的抗體，可使用來自結合該抗原之抗體的VH或VL域以分別篩選互補的VL或VH域資料庫加以分離。請參照，例如Portolano等人，J.Immunol. 150：880-887 (1993)；Clarkson等人，Nature 352：624-628(1991)。
由於至少一個的胺基酸修飾(修改)，較佳為一或多個胺酸取代，“變異Fc區域”包括與自然序列Fc區域不同的胺基酸序列。較佳地，相較於自然序列Fc區域或親本多肽的Fc區域，變異Fc區具有至少一胺基酸取代，例如，約1至10個胺基酸取代，較佳約1至5個胺基酸取代於自然序列Fc區域或親本多肽的Fc區域中。本文的變異Fc區域與自然序列Fc區域及/或親本多肽的Fc區域較佳將具有至少約80%的同源性，且最佳具有至少約90%的同源性，更佳具有至少約95%的同源性。
本文使用的術語“載體”指一核酸分子，其能夠繁殖與它連接的另一核酸。此術語包含作為自主複製核酸結構的載體，以及併入它已引入的宿主細胞之基因組中的載體。特定載體能夠指示與它們有效連接的核酸之表現。這類載體在本文中稱為“表現載體”。
II. 組成及方法
在一態樣中，發明是，部分地，以抗肌抑素抗體及其使用為基礎。在特定實施例中，提供結合至肌抑素的抗體。本發明的抗體有益於，例如，肌肉萎縮疾病的診斷及治療。
在一態樣中，本發明是，部分地，以包括變異Fc區域的多肽及其使用為基礎。在一實施例中，提供包括具有增強的FcγRIIb結合活性的變異Fc區域的多肽。在另一實施例中，提供包括具有增加的pI的變異Fc區域的多肽。在一些特定的實施例中，本發明的多肽為抗體。本發明包括變異Fc區 域的多肽有益於，例如，疾病的診斷及治療。
A. 示例性抗肌抑素抗體及包括變異Fc區域的多肽
在一態樣中，本發明提供結合至肌抑素的分離的抗體。在一些特定實施例中，本發明的抗肌抑素抗體結合至潛伏性肌抑素。在又一些實施例中，本發明的抗肌抑素抗體結合至肌抑素原生肽(人類：序列辨識號：75或78；恆河猴：序列辨識號：76或79；鼠：序列辨識號：77或80)。在又一些實施例中，抗體結合至由肌抑素原生肽(序列辨識號：78)的胺基酸21-100所組成的片段內的抗原決定基。原生肽包含於潛伏性肌抑素中作為成分之一，如前述。在一些特定實施例中，本發明的抗肌抑素抗體抑制肌抑素的活化。在一些特定實施例中，抗肌抑素抗體阻礙成熟的肌抑素自潛伏性肌抑素釋放。已有報導指出成熟的肌抑素是藉由蛋白質水解及非蛋白質水解步驟自潛伏性肌抑素釋放。本發明的抗肌抑素抗體可阻礙成熟的肌抑素自潛伏性肌抑素的蛋白質水解及/或非蛋白質水解釋放。在一些特定實施例中，抗肌抑素抗體阻礙潛伏性肌抑素的蛋白質水解切割。在一些特定實施例中，抗肌抑素抗體阻礙蛋白酶接近潛伏性肌抑素(特別是接近潛伏性肌抑素的蛋白質水解的切割位置(Arg98-Asp99))。在又一些實施例中，蛋白酶可為BMP1/TLD家族的金屬蛋白酶，像BMP1、TED、tolloid樣蛋白質1(tolloid-like protein-1,TLL-1)或tolloid樣蛋白質2(TLL-2)。在另一實施例中，抗肌抑素抗體阻礙成熟的肌抑素自潛伏性肌抑素的非蛋白質水解釋放。本文中使用的非蛋白質水解釋放代表成熟的肌抑素自潛伏性肌抑素的自發性釋放，其 未伴隨著潛伏性肌抑素的蛋白質水解切割。非蛋白質水解的釋放包含，例如，藉由，如在37℃不存在切割潛伏性肌抑素的蛋白酶的條件下，培養潛伏性肌抑素而釋放成熟的肌抑素。在一些特定實施例中，本發明的抗肌抑素抗體未結合至成熟的肌抑素。在一些實施例中，抗肌抑素抗體與表2a所述之抗體結合至相同的抗原決定基。在一些實施例中，抗肌抑素抗體與表2a所述之抗體競爭結合潛伏性肌抑素。在一些額外的實施例中，抗肌抑素抗體與包括表2a所述之VH及VL對的抗體競爭結合潛伏性肌抑素。在一些實施例中，抗肌抑素抗體與表2a所述之抗體競爭結合由肌抑素原生肽(序列辨識號：78)的胺基酸21-100所組成的片段。在又一些實施例中，抗肌抑素抗體與表11a或13所述之抗體結合至相同的抗原決定基。在一些實施例中，抗肌抑素抗體與表11a或13所述之抗體競爭結合潛伏性肌抑素。在一些實施例中，抗肌抑素抗體與表11a或13所述之抗體競爭結合由肌抑素原生肽(序列辨識號：78)的胺基酸21-100所組成的片段。在一些實施例中，本發明的抗肌抑素抗體結合至潛伏性肌抑素且抑制肌抑素的活化。在又一些實施例中，抗體：(a)阻礙成熟的肌抑素自潛伏性肌抑素的釋放；(b)阻礙成熟的肌抑素的蛋白質水解釋放；(c)阻礙成熟的肌抑素的自發性釋放；或(d)未結合至成熟的肌抑素；或結合至由肌抑素原生肽(序列辨識號：78)的胺基酸21-100所組成的片段內的抗原決定基。在又一些實施例中，抗體與包括表2a、11a或13所述之VH及VL對的抗體競爭結合潛伏性肌抑素、或與包括表2a、11a或13 所述之VH及VL對的抗體結合至相同的抗原決定基。在又一些實施例中，抗體在中性pH(例如，pH7.4)比在酸性pH(例如，pH5.8)下，以較高的親和性結合至潛伏性肌抑素。在又一些實施例中，抗體為(a)單株抗體；(b)人類、人源化或嵌合抗體；(c)全長IgG抗體；或(d)結合潛伏性肌抑素或肌抑素原生肽的抗體片段。
在另一實施例中，本發明的抗肌抑素抗體未結合至GDF11。在一些特定實施例中，本發明的抗肌抑素抗體未抑制GDF11的活化。在一些特定實施例中，抗肌抑素抗體未阻礙成熟的GDF11自潛伏性GDF11的釋放。本發明的抗肌抑素抗體未阻礙成熟的GDF11自潛伏性GDF11的蛋白質水解及非蛋白水解釋放。在一些特定實施例中，抗肌抑素抗體未阻礙潛伏性GDF11的蛋白質水解切割。在一些特定實施例中，抗肌抑素抗體未阻礙蛋白酶接近潛伏性GDF11(特別是接近潛伏性GDF11的蛋白質水解的切割位置)。在又一些實施例中，蛋白酶可為BMP1/TLD家族的金屬蛋白酶，像BMP1、TED、tolloid樣蛋白質1(TLL-1)或tolloid樣蛋白質2(TLL-2)。本文中使用的非蛋白質水解釋放代表成熟的GDF11自潛伏性GDF11的自發性釋放，其未伴隨著潛伏性GDF11的蛋白質水解切割。非蛋白質水解的釋放包含，例如，藉由，如在37℃不存在切割潛伏性GDF11的蛋白酶的條件下，培養潛伏性GDF11而釋放成熟的GDF11。目前已知的多數抗肌抑素抗體對於肌抑素不具專一性。這些抗體對TGF-β超家族的其它成員(像是GDF11)具有高親和性且中和它們的生物活性。GDF11在胚胎形成的期間扮 演重要角色，並負責中軸骨骼的同源轉化。同型合子的(homozygous)GDF11敲除小鼠為周產期致死(perinatal lethal)，具有一野生型GDF11基因的複製的小鼠可存活，但具有骨骼缺陷。由於GDF11在胚胎形成的期間扮演重要角色，抑制GDF11的拮抗劑造成理論上的安全風險，其可能在治療的病患中引起毒性或在，例如育齡婦女，中引起生殖毒性。因此，專一性抑制肌抑素活性在與肌抑素相關病症的治療上是被需要的，其中所述治療是希望能夠增加肌肉質量、大小、力量等，且在育齡婦女中特別地被需要。
在另一態樣中，發明提供顯示pH依賴性結合特性之抗肌抑素抗體。如本文所使用，措詞“pH依賴性”是指抗體顯示“相較於在中性pH，在酸性pH與肌抑素之結合降低”(就本揭露之目的，兩種用辭均可互換使用)。例如，“具有pH依賴性結合特性”的抗體包含相較於在酸性pH，在中性pH以較高親和性結合至肌抑素的抗體。在特定實施例中，相較於在酸性pH，本發明的抗體在中性pH以至少2、3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、400、1000、10000或更多倍之親和性結合至肌抑素。在一些實施例中，抗體在pH7.4比在pH5.8下，以較高親和性結合至肌抑素(例如，潛伏性肌抑素或原胜肽肌抑素)。在又一些實施例中，本發明之抗體在pH7.4比在pH5.8下，以至少2、3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、400、1000、10000或更多倍之親和性結合至肌抑素。
當抗原為可溶蛋白質時，抗體對抗原的結合可導致抗原在血漿中半生期的延長(即，減少抗原從血漿的清除)，因為抗體比抗原本身在血漿中可具有較長的半生期，且可作為抗原的載具。這起因於抗原-抗體複合物藉由FcRn透過細胞中胞內體路徑的回收利用(Roopenian，Nat.Rev.Immunol. 7(9)：715-725(2007))。然而，具有pH依賴性結合特性的抗體，其在中性的細胞外環境中結合至它的抗原，而隨著其進入細胞中，釋放抗原至酸性的胞內體腔室中，上述具有pH依賴性結合特性的抗體被預期在抗原中和及清除的項目具有較優越的性能，其關係到它對應之以pH依賴性方式的結合(Igawa等人，Nature Biotechnol. 28(11)：1203-1207(2010)；Devanaboyina等人，mAbs 5(6)：851-859(2013)；WO 2009/125825)。
抗體對肌抑素的“親和性”，就本揭露之目的，是以抗體的KD之術語表示。抗體的KD是指抗體-抗原相互作用的平衡解離常數。一抗原結合至其抗原的KD值越大，其對那特定抗原的結合親和性越弱。因此，如文中所用，“相較於酸性pH，在中性pH具較高親和性”(或等同表述“pH依賴性結合”)是指抗體在酸性pH下結合至肌抑素的KD大於抗體在中性pH下結合至肌抑素的KD。例如，在本發明的內容中，若抗體在酸性pH下結合至肌抑素的KD至少大於抗體在中性pH下結合至肌抑素的KD之兩倍，抗體被視為在中性pH比在酸性pH下，以較高親和性結合至肌抑素。因此，本發明包含在酸性pH結合至肌抑素的KD至少大於抗體在中性pH結合至肌抑素的KD之2、3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、 50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、400、1000、10000或更多倍之抗體。在另一實施例中，抗體在中性pH的KD值可為10-7 M、10-8 M、10-9 M、10-10 M、10-11 M、10-12 M或更小。在另一實施例中，抗體在酸性pH的KD值可為10-9 M、10-8 M、10-7 M、10-6 M或更大。
在又一些實施例中，若抗體在pH5.8下結合至肌抑素(例如，潛伏性肌抑素或原胜肽肌抑素)的KD至少大於抗體在pH7.4下結合至肌抑素的KD之兩倍，抗體被視為相較於酸性pH，在中性pH以較高親和性結合至肌抑素。在一些實施例中，提供之抗體在pH5.8結合至肌抑素的KD至少大於抗體在pH7.4結合至肌抑素的KD之3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、400、1000、10000或更多倍。在另一實施例中，抗體在pH7.4的KD值可為10-7 M、10-8 M、10-9 M、10-10 M、10-11 M、10-12 M或更小。在另一實施例中，抗體在pH5.8的KD值可為10-9 M、10-8 M、10-7 M、10-6 M或更大。
抗體對於特定抗原之結合特性亦可藉由抗體的kd來表示。抗體的kd指抗體對於特定抗原之解離速率常數，以秒的倒數表示(即sec-1 )。kd值增加表示抗體對其抗原之結合較弱。本發明因此包含，相較於中性pH，在酸性pH以較高kd值與肌抑素結合的抗體。本發明包含在酸性pH結合至肌抑素的kd至少大於在中性pH結合至肌抑素的kd之2、3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、400、1000、10000或更多倍之抗體。 在另一實施例中，抗體的kd值在中性pH可為10-2 1/s、10-3 1/s、10-4 1/s、10-5 1/s、10-6 1/s或更小。在另一實施例中，抗體的kd值在酸性pH可為10-3 1/s、10-2 1/s、10-1 1/s或更大。本發明亦包含相較於在pH7.4，在pH5.8以較大kd值結合至肌抑素(例如，潛伏性肌抑素或原胜肽肌抑素)的抗體。本發明包含在pH5.8結合至肌抑素的kd至少大於在pH7.4結合至肌抑素的kd之3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、400、1000、10000或更多倍之抗體。在另一實施例中，抗體在pH7.4的kd值可為10-2 1/s、10-3 1/s、10-4 1/s、10-5 1/s、10-6 1/s或更小。在另一實施例中，抗體在pH5.8的kd值可為10-3 1/s、10-2 1/s、10-1 1/s或更大。
在特定的例子中，“相較於在中性pH，在酸性pH與肌抑素之結合降低”以在酸性pH抗體結合至肌抑素之KD值比上在中性pH抗體結合至肌抑素之KD值的比值來表示(或反之亦然)。例如，就本發明之目的，若抗體具有2或更大的酸性/中性KD比值，則該抗體可被視為“相較於在中性pH，在酸性pH與肌抑素之結合降低”。在一些特定實施例中，本發明之抗肌抑素抗體的pH5.8/pH7.4 KD比值可為2或更大。在一些特定示例性實施例中，本發明之抗體的酸性/中性KD比值可為2、3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、400、1000、10000或更大。在另一實施例中，抗體在中性pH的KD值可為10-7 M、10-8 M、10-9 M、10-10 M、10-11 M、10-12 M或更小。在 另一實施例中，抗體在酸性pH的KD值可為10-9 M、10-8 M、10-7 M、10-6 M或更大。在進一步的例子中，若抗體的pH5.8/pH7.4 KD比值為2或更大，則抗體可被視為“相較於在中性pH，在酸性pH與肌抑素(例如，潛伏性肌抑素)之結合降低”。在一些特定示例性實施例中，抗體的pH5.8/pH7.4 KD比值可為3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、400、1000、10000或更大。在另一實施例中，抗體在pH7.4的KD值可為10-7 M、10-8 M、10-9 M、10-10 M、10-11 M、10-12 M或更小。在另一實施例中，抗體在pH5.8的KD值可為10-9 M、10-8 M、10-7 M、10-6 M或更大。
在特定例子中，“相較於在中性pH，在酸性pH與肌抑素之結合降低”以在酸性pH抗體結合至肌抑素之kd值比上在中性pH抗體結合至肌抑素之kd值的比值來表示(或反之亦然)。例如，就本發明之目的，若抗體具有2或更大的酸性/中性kd比值，則該抗體可被視為“相較於在中性pH，在酸性pH與肌抑素之結合降低”。在一些特定示例性實施例中，本發明之抗體的pH5.8/pH7.4 kd比值可為2或更大。在一些特定示例性實施例中，本發明之抗體的酸性/中性kd比值可為2、3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、400、1000、10000或更大。在另一實施例中，抗體在中性pH的kd值可為10-2 1/s、10-3 1/s、10-4 1/s、10-5 1/s、10-6 1/s或更小。在另一實施例中，抗體在酸性pH的kd值可為10-3 1/s、10-2 1/s、10-1 1/s 或更大。在一些特定示例性實施例中，抗體的pH5.8/pH7.4 kd比值可為2、3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、400、1000、10000或更大。在另一實施例中，抗體在pH7.4的kd值可為10-2 1/s、10-3 1/s、10-4 1/s、10-5 1/s、10-6 1/s或更小。在另一實施例中，抗體在pH5.8的kd值可為10-3 1/s、10-2 1/s、10-1 1/s或更大。
如本文中使用，術語“酸性pH”是指4.0至6.5的pH。術語“酸性pH”包含4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4以及6.5中任一之pH值。在特定態樣中，“酸性pH”為5.8。
如本文中使用，術語“中性pH”是指6.7至約10.0的pH。術語“中性pH”包含6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9以及10.0中任一之pH值。在特定態樣中，“中性pH”為7.4。
KD值及kd值，如本文中表示，可利用表面電漿共振基礎之生物感知器加以測定，以表徵抗體-抗原的相互作用(請參照，例如，文中的實施例7)。KD值及kd值可於25℃或37℃測定。
在一些特定實施例中，本發明的抗肌抑素抗體與來自多於一物種的肌抑素結合。在又一些實施例中，抗肌抑素 抗體與來自人類及非人類的肌抑素結合。在又一些實施例中，抗肌抑素抗體與來自人類、鼠及猴(恆河猴、恆河獼猴、狨猿、黑猩猩或狒狒)的肌抑素結合。
在一些特定實施例中，本發明的抗肌抑素抗體與來自多於一物種的潛伏性肌抑素結合。在又一些實施例中，抗肌抑素抗體與來自人類及非人類的潛伏性肌抑素結合。在又一些實施例中，抗肌抑素抗體與來自人類、鼠及猴的潛伏性肌抑素結合。
在一些特定實施例中，本發明的抗肌抑素抗體與來自多於一物種的原胜肽肌抑素結合。在又一些實施例中，抗肌抑素抗體與來自人類及非人類的原胜肽肌抑素結合。在又一些實施例中，抗肌抑素抗體與來自人類、鼠及猴的原胜肽肌抑素結合。
在又一態樣中，發明提供抗肌抑素抗體，其與肌抑素形成免疫複合物(即，抗原-抗體複合物。在一些特定實施例中，兩個或多個抗肌抑素抗體結合至兩個或多個肌抑素分子以形成免疫複合物。這是有可能的因為肌抑素以包含兩個肌抑素分子的同型二聚體存在，而一抗體具有兩個抗原結合位。抗肌抑素抗體可結合至肌抑素分子上相同的抗原決定基，或可結合至肌抑素分子上不同的抗原決定基，很類似雙特異性抗體。一般而言，當兩個或多個抗體與兩個或多個抗原形成免疫複合物時，產生的免疫複合物可強烈地結合至存在於細胞表面上的Fc受體，因為透過複合物中抗體的Fc區域的親和力(avidity)效應並可接著以高效率被攝入於細胞中。因此，上述能夠形成 包含兩個或多個抗肌抑素抗體及兩個或多個肌抑素分子的免疫複合物之抗肌抑素抗體，可導致肌抑素在活體中自血漿快速的清除，其透過歸因於親和力效應之與Fc受體的強烈結合。
此外，具有pH依賴性結合特性的抗體被認為在抗原中和及清除的項目具有較優越的性能，其關係到它對應之以pH依賴性方式的結合(Igawa等人，Nature Biotech. 28(11)：1203-1207(2010)；Devanaboyina等人，mAbs 5(6)：851-859(2013)；WO 2009/125825)。因此，具有上述兩種性能的抗體，即，具有pH依賴性結合特性以及形成包含兩個或多個抗體及兩個或多個抗原的免疫複合物之抗體，被預期甚至具有更優越的性能以高度加速抗原自血漿的消除(WO 2013/081143)。
在另一態樣中，發明提供抗肌抑素抗體，其包括至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個高變異區(HVR)，擇自於(a)包括序列辨識號：55-57、114-115、126中任一之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包括序列辨識號：58-60、116-120、127中任一之胺基酸序列的HVR-H2；(c)包括序列辨識號：61-64、121、128中任一之胺基酸序列的HVR-H3；(d)包括序列辨識號：65-69、122-124、129中任一之胺基酸序列的HVR-L1；(e)包括序列辨識號：70-72、125、130中任一之胺基酸序列的HVR-L2；及(f)包括序列辨識號：73-74、131中任一之胺基酸序列的HVR-L3。
在另一態樣中，發明提供抗肌抑素抗體，其包括至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個HVR，擇自於(a)包 括序列辨識號：55-57中任一之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包括序列辨識號：58-60中任一之胺基酸序列的HVR-H2；(c)包括序列辨識號：61-64中任一之胺基酸序列的HVR-H3；(d)包括序列辨識號：65-69中任一之胺基酸序列的HVR-L1；(e)包括序列辨識號：70-72中任一之胺基酸序列的HVR-L2；及(f)包括序列辨識號：73-74中任一之胺基酸序列的HVR-L3。
在另一態樣中，發明提供抗肌抑素抗體，其包括至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個高變異區(HVR)，擇自於(a)包括序列辨識號：114-115中任一之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包括序列辨識號：116-120中任一之胺基酸序列的HVR-H2；(c)包括序列辨識號：121之胺基酸序列的HVR-H3；(d)包括序列辨識號：122-124中任一之胺基酸序列的HVR-L1；(e)包括序列辨識號：125之胺基酸序列的HVR-L2；及(f)包括序列辨識號：73-74中任一之胺基酸序列的HVR-L3。
在另一態樣中，發明提供抗肌抑素抗體，其包括至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個HVR，擇自於(a)包括序列辨識號：114之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包括序列辨識號：58之胺基酸序列的HVR-H2；(c)包括序列辨識號：63之胺基酸序列的HVR-H3；(d)包括序列辨識號：122之胺基酸序列的HVR-L1；(e)包括序列辨識號：71之胺基酸序列的HVR-L2；及(f)包括序列辨識號：74之胺基酸序列的HVR-L3。在另一態樣中，發明提供抗肌抑素抗體，其包括至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個HVR，擇自於(a)包 括序列辨識號：114之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包括序列辨識號：58之胺基酸序列的HVR-H2；(c)包括序列辨識號：63之胺基酸序列的HVR-H3；(d)包括序列辨識號：123之胺基酸序列的HVR-L1；(e)包括序列辨識號：71之胺基酸序列的HVR-L2；及(f)包括序列辨識號：74之胺基酸序列的HVR-L3。
在一態樣中，發明提供抗肌抑素抗體，其包括至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個HVR，擇自於(a)包括序列辨識號：126之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包括序列辨識號：127之胺基酸序列的HVR-H2；(c)包括序列辨識號：128之胺基酸序列的HVR-H3；(d)包括序列辨識號：129之胺基酸序列的HVR-L1；(e)包括序列辨識號：130之胺基酸序列的HVR-L2；及(f)包括序列辨識號：131之胺基酸序列的HVR-L3。
在一態樣中，發明提供抗體，包括至少一個、至少兩個或全部三個擇自於(a)包括序列辨識號：55-57、114-115、126中任一之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包括序列辨識號：58-60、116-120、127中任一之胺基酸序列的HVR-H2；及(c)包括序列辨識號：61-64、121、128中任一之胺基酸序列的HVR-H3之VH HVR序列。在一實施例中，抗體包括HVR-H3，其包括序列辨識號：61-64、121、128中任一之胺基酸序列。在另一實施例中，抗體包括：HVR-H3，其包括序列辨識號：61-64、121、128中任一之胺基酸序列，以及HVR-L3，其包括序列辨識號：73-74、131中任一之胺基酸序列。在又一實施例中，抗體包括：HVR-H3，其包括序列辨識號：61-64、121、128中任一之胺基酸序列、HVR-L3，其包括序列辨識號：73-74、 131中任一之胺基酸序列、以及HVR-H2，其包括序列辨識號：58-60、116-120、127中任一之胺基酸序列。在又一實施例中，抗體包括(a)包括序列辨識號：55-57、114-115、126中任一之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包括序列辨識號：58-60、116-120、127中任一之胺基酸序列的HVR-H2；及(c)包括序列辨識號：61-64、121、128中任一之胺基酸序列的HVR-H3。
在一態樣中，發明提供抗體，其包括至少一個、至少兩個或全部三個擇自於(a)包括序列辨識號：55-57中任一之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包括序列辨識號：58-60中任一之胺基酸序列的HVR-H2；及(c)包括序列辨識號：61-64中任一之胺基酸序列的HVR-H3之VH HVR序列。在一實施例中，抗體包括HVR-H3，其包括序列辨識號：61-64中任一之胺基酸序列。在另一實施例中，抗體包括：HVR-H3，其包括序列辨識號：61-64中任一之胺基酸序列，以及HVR-L3，其包括序列辨識號：73-74中任一之胺基酸序列。在又一實施例中，抗體包括：HVR-H3，其包括序列辨識號：61-64中任一之胺基酸序列、HVR-L3，其包括序列辨識號：73-74中任一之胺基酸序列、以及HVR-H2，其包括序列辨識號：58-60中任一之胺基酸序列。在又一實施例中，抗體包括(a)包括序列辨識號：55-57中任一之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包括序列辨識號：58-60中任一之胺基酸序列的HVR-H2；及(c)包括序列辨識號：61-64中任一之胺基酸序列的HVR-H3。
在一態樣中，發明提供抗體，其包括至少一個、至少兩個或全部三個擇自於(a)包括序列辨識號：114-115中任 一之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包括序列辨識號：116-120中任一之胺基酸序列的HVR-H2；及(c)包括序列辨識號：121之胺基酸序列的HVR-H3之VH HVR序列。在一實施例中，抗體包括HVR-H3，其包括序列辨識號：121之胺基酸序列。在另一實施例中，抗體包括：HVR-H3，其包括序列辨識號：121之胺基酸序列，以及HVR-L3，其包括序列辨識號：73-74中任一之胺基酸序列。在又一實施例中，抗體包括：HVR-H3，其包括序列辨識號：121之胺基酸序列、HVR-L3，其包括序列辨識號：73-74中任一之胺基酸序列、以及HVR-H2，其包括序列辨識號：116-120中任一之胺基酸序列。在又一實施例中，抗體包括(a)包括序列辨識號：114-115中任一之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包括序列辨識號：116-120中任一之胺基酸序列的HVR-H2；及(c)包括序列辨識號：121之胺基酸序列的HVR-H3。在另一態樣中，發明提供抗體，其包括至少一個、至少兩個或全部三個擇自於(a)包括序列辨識號：114之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包括序列辨識號：58之胺基酸序列的HVR-H2；及(c)包括序列辨識號：63之胺基酸序列的HVR-H3之VH HVR序列。在一實施例中，抗體包括HVR-H3，其包括序列辨識號：63之胺基酸序列。在另一實施例中，抗體包括：HVR-H3，其包括序列辨識號：63之胺基酸序列，以及HVR-L3，其包括序列辨識號：74之胺基酸序列。在又一實施例中，抗體包括：HVR-H3，其包括序列辨識號：63之胺基酸序列、HVR-L3，其包括序列辨識號：74之胺基酸序列、以及HVR-H2，其包括序列辨識號：58 之胺基酸序列。在又一實施例中，抗體包括(a)包括序列辨識號：114之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包括序列辨識號：58之胺基酸序列的HVR-H2；及(c)包括序列辨識號：63之胺基酸序列的HVR-H3。
在另一態樣中，發明提供抗體，其包括至少一個、至少兩個或全部三個擇自於(a)包括序列辨識號：126之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包括序列辨識號：127之胺基酸序列的HVR-H2；及(c)包括序列辨識號：128之胺基酸序列的HVR-H3之VH HVR序列。在一實施例中，抗體包括HVR-H3，其包括序列辨識號：128之胺基酸序列。在另一實施例中，抗體包括：HVR-H3，其包括序列辨識號：128之胺基酸序列，以及HVR-L3，其包括序列辨識號：131之胺基酸序列。在又一實施例中，抗體包括：HVR-H3，其包括序列辨識號：128之胺基酸序列、HVR-L3，其包括序列辨識號：131之胺基酸序列、以及HVR-H2，其包括序列辨識號：127之胺基酸序列。在又一實施例中，抗體包括(a)包括序列辨識號：126之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包括序列辨識號：127之胺基酸序列的HVR-H2；及(c)包括序列辨識號：128之胺基酸序列的HVR-H3。
在另一態樣中，本發明提供抗體，其包括至少一個、至少兩個或全部三個擇自於(a)包括序列辨識號：65-69、122-124、129中任一之胺基酸序列的HVR-L1；(b)包括序列辨識號：70-72、125、130中任一之胺基酸序列的HVR-L2：及(c)包括序列辨識號：73-74、131中任一之胺基酸序列的HVR-L3之VL HVR序列。在一實施例中，抗體包括(a)包括 序列辨識號：65-69、122-124、129中任一之胺基酸序列的HVR-L1；(b)包括序列辨識號：70-72、125、130中任一之胺基酸序列的HVR-L2；及(c)包括序列辨識號：73-74、131中任一之胺基酸序列的HVR-L3。
在另一態樣中，本發明提供抗體，其包括至少一個、至少兩個或全部三個擇自於(a)包括序列辨識號：65-69中任一之胺基酸序列的HVR-L1；(b)包括序列辨識號：70-72中任一之胺基酸序列的HVR-L2：及(c)包括序列辨識號：73-74中任一之胺基酸序列的HVR-L3之VL HVR序列。在一實施例中，抗體包括(a)包括序列辨識號：65-69中任一之胺基酸序列的HVR-L1；(b)包括序列辨識號：70-72中任一之胺基酸序列的HVR-L2；及(c)包括序列辨識號：73-74中任一之胺基酸序列的HVR-L3。
在另一態樣中，本發明提供抗體，其包括至少一個、至少兩個或全部三個擇自於(a)包括序列辨識號：122-124中任一之胺基酸序列的HVR-L1；(b)包括序列辨識號：125之胺基酸序列的HVR-L2：及(c)包括序列辨識號：73-74中任一之胺基酸序列的HVR-L3之VL HVR序列。在一實施例中，抗體包括(a)包括序列辨識號：122-124中任一之胺基酸序列的HVR-L1；(b)包括序列辨識號：125之胺基酸序列的HVR-L2；及(c)包括序列辨識號：73-74中任一之胺基酸序列的HVR-L3。在另一態樣中，本發明提供抗體，其包括至少一個、至少兩個或全部三個擇自於(a)包括序列辨識號：122之胺基酸序列的HVR-L1；(b)包括序列辨識號：71之胺基酸序列的HVR-L2： 及(c)包括序列辨識號：74之胺基酸序列的HVR-L3之VL HVR序列。在一實施例中，抗體包括(a)包括序列辨識號：122之胺基酸序列的HVR-L1；(b)包括序列辨識號：71之胺基酸序列的HVR-L2；及(c)包括序列辨識號：74中任一之胺基酸序列的HVR-L3。在另一態樣中，本發明提供抗體，其包括至少一個、至少兩個或全部三個擇自於(a)包括序列辨識號：123之胺基酸序列的HVR-L1；(b)包括序列辨識號：71之胺基酸序列的HVR-L2：及(c)包括序列辨識號：74之胺基酸序列的HVR-L3之VL HVR序列。在一實施例中，抗體包括(a)包括序列辨識號：123之胺基酸序列的HVR-L1；(b)包括序列辨識號：71之胺基酸序列的HVR-L2；及(c)包括序列辨識號：74中任一之胺基酸序列的HVR-L3。
在另一態樣中，本發明提供抗體，其包括至少一個、至少兩個或全部三個擇自於(a)包括序列辨識號：129之胺基酸序列的HVR-L1；(b)包括序列辨識號：130之胺基酸序列的HVR-L2：及(c)包括序列辨識號：131之胺基酸序列的HVR-L3之VL HVR序列。在一實施例中，抗體包括(a)包括序列辨識號：129之胺基酸序列的HVR-L1；(b)包括序列辨識號：130之胺基酸序列的HVR-L2；及(c)包括序列辨識號：131中任一之胺基酸序列的HVR-L3。
在另一態樣中，發明之抗體包括(a)VH域，其包括至少一個、至少兩個或全部三個擇自於(i)包括序列辨識號：55-57、114、115、126中任一之胺基酸序列的HVR-H1、(ii)包括序列辨識號：58-60、116-120、127中任一之胺基酸序列的 HVR-H2、及(iii)包括序列辨識號：61-64、121、128中任一之胺基酸序列的HVR-H3之VH HVR序列；以及(b)VL域，其包括至少一個、至少兩個或全部三個擇自於(i)包括序列辨識號：65-69、122-124、129中任一之胺基酸序列的HVR-L1、(ii)包括序列辨識號：70-72、125、130中任一之胺基酸序列的HVR-L2、及(iii)包括序列辨識號：73-74、131中任一之胺基酸序列的HVR-L3之VL HVR序列。
在另一態樣中，發明之抗體包括(a)VH域，其包括至少一個、至少兩個或全部三個擇自於(i)包括序列辨識號：55-57中任一之胺基酸序列的HVR-H1、(ii)包括序列辨識號：58-60中任一之胺基酸序列的HVR-H2、及(iii)包括序列辨識號：61-64中任一之胺基酸序列的HVR-H3之VH HVR序列；以及(b)VL域，其包括至少一個、至少兩個或全部三個擇自於(i)包括序列辨識號：65-69中任一之胺基酸序列的HVR-L1、(ii)包括序列辨識號：70-72中任一之胺基酸序列的HVR-L2、及(iii)包括序列辨識號：73-74中任一之胺基酸序列的HVR-L3之VL HVR序列。
在另一態樣中，發明之抗體包括(a)VH域，其包括至少一個、至少兩個或全部三個擇自於(i)包括序列辨識號：114-115中任一之胺基酸序列的HVR-H1、(ii)包括序列辨識號：116-120中任一之胺基酸序列的HVR-H2、及(iii)包括序列辨識號：121之胺基酸序列的HVR-H3之VH HVR序列；以及(b)VL域，其包括至少一個、至少兩個或全部三個擇自於(i)包括序列辨識號：122-124中任一之胺基酸序列的HVR-L1、(ii) 包括序列辨識號：125之胺基酸序列的HVR-L2、及(iii)包括序列辨識號：73-74中任一之胺基酸序列的HVR-L3之VL HVR序列。在另一態樣中，發明之抗體包括(a)VH域，其包括至少一個、至少兩個或全部三個擇自於(i)包括序列辨識號：114之胺基酸序列的HVR-H1、(ii)包括序列辨識號：58之胺基酸序列的HVR-H2、及(iii)包括序列辨識號：63之胺基酸序列的HVR-H3之VH HVR序列；以及(b)VL域，其包括至少一個、至少兩個或全部三個擇自於(i)包括序列辨識號：122之胺基酸序列的HVR-L1、(ii)包括序列辨識號：71之胺基酸序列的HVR-L2、及(iii)包括序列辨識號：74之胺基酸序列的HVR-L3之VL HVR序列。在另一態樣中，發明之抗體包括(a)VH域，其包括至少一個、至少兩個或全部三個擇自於(i)包括序列辨識號：114之胺基酸序列的HVR-H1、(ii)包括序列辨識號：58之胺基酸序列的HVR-H2、及(iii)包括序列辨識號：63之胺基酸序列的HVR-H3之VH HVR序列；以及(b)VL域，其包括至少一個、至少兩個或全部三個擇自於(i)包括序列辨識號：123之胺基酸序列的HVR-L1、(ii)包括序列辨識號：71之胺基酸序列的HVR-L2、及(iii)包括序列辨識號：74之胺基酸序列的HVR-L3之VL HVR序列。
在另一態樣中，發明之抗體包括(a)VH域，其包括至少一個、至少兩個或全部三個擇自於(i)包括序列辨識號：126之胺基酸序列的HVR-H1、(ii)包括序列辨識號：127之胺基酸序列的HVR-H2、及(iii)包括序列辨識號：128之胺基酸 序列的HVR-H3之VH HVR序列；以及(b)VL域，其包括至少一個、至少兩個或全部三個擇自於(i)包括序列辨識號：129之胺基酸序列的HVR-L1、(ii)包括序列辨識號：130之胺基酸序列的HVR-L2、及(iii)包括序列辨識號：131之胺基酸序列的HVR-L3之VL HVR序列。
在另一態樣中，發明提供抗體，其包括：(a)包括序列辨識號：55-57、114-115、126中任一之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包括序列辨識號：58-60、116-120、127中任一之胺基酸序列的HVR-H2；(c)包括序列辨識號：61-64、121、128中任一之胺基酸序列的HVR-H3；(d)包括序列辨識號：65-69、122-124、129中任一之胺基酸序列的HVR-L1；(e)包括序列辨識號：70-72、125、130中任一之胺基酸序列的HVR-L2；及(f)包括序列辨識號：73-74、131中任一之胺基酸序列的HVR-L3。
在另一態樣中，發明提供抗體，其包括：(a)包括序列辨識號：55-57、114-115中任一之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包括序列辨識號：58-60、116-120中任一之胺基酸序列的HVR-H2；(c)包括序列辨識號：61-64、121中任一之胺基酸序列的HVR-H3；(d)包括序列辨識號：65-69、122-124中任一之胺基酸序列的HVR-L1；(e)包括序列辨識號：70-72、125中任一之胺基酸序列的HVR-L2；及(f)包括序列辨識號：73-74中任一之胺基酸序列的HVR-L3。
在另一態樣中，發明提供抗體，其包括：(a)包括序列辨識號：114-115中任一之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包 括序列辨識號：116-120中任一之胺基酸序列的HVR-H2；(c)包括序列辨識號：121之胺基酸序列的HVR-H3；(d)包括序列辨識號：122-124中任一之胺基酸序列的HVR-L1；(e)包括序列辨識號：125之胺基酸序列的HVR-L2；及(f)包括序列辨識號：73-74中任一之胺基酸序列的HVR-L3。在另一態樣中，發明提供抗體，其包括：(a)包括序列辨識號：114之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包括序列辨識號：58之胺基酸序列的HVR-H2；(c)包括序列辨識號：63之胺基酸序列的HVR-H3；(d)包括序列辨識號：122之胺基酸序列的HVR-L1；(e)包括序列辨識號：71之胺基酸序列的HVR-L2；及(f)包括序列辨識號：74之胺基酸序列的HVR-L3。在另一態樣中，發明提供抗體，其包括：(a)包括序列辨識號：114之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包括序列辨識號：58之胺基酸序列的HVR-H2；(c)包括序列辨識號：63之胺基酸序列的HVR-H3；(d)包括序列辨識號：123之胺基酸序列的HVR-L1；(e)包括序列辨識號：71之胺基酸序列的HVR-L2；及(f)包括序列辨識號：74之胺基酸序列的HVR-L3。
在另一態樣中，發明提供抗體，其包括：(a)包括序列辨識號：126之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包括序列辨識號：127之胺基酸序列的HVR-H2；(c)包括序列辨識號：128之胺基酸序列的HVR-H3；(d)包括序列辨識號：129之胺基酸序列的HVR-L1；(e)包括序列辨識號：130之胺基酸序列的HVR-L2；及(f)包括序列辨識號：131之胺基酸序列的HVR-L3。
在一些特定實施例中，如以上提供之抗肌抑素抗 體的任一或多個胺基酸在下列HVR位置被取代：(a)於HVR-H1(序列辨識號：55)，在位置1及2；(b)於HVR-H2(序列辨識號：58)，在位置4、7、8、10、11、12及16；(c)於HVR-H3(序列辨識號：61)，在位置5、7及11；(d)於HVR-L1(序列辨識號：65)，在位置1、2、5、7、8及9；(e)於HVR-L2(序列辨識號：70)，在位置3及7；以及(f)於HVR-L3(序列辨識號：73)，在位置8。
在一些特定實施例中，抗肌抑素抗體的一或多個胺基酸取代為保守取代，如本文中所提供。在一些特定實施例中，下列取代的任一或多個可以任何組合進行：(a)於HVR-H1(序列辨識號：55)，S1H；Y2T、D或E；(b)於HVR-H2(序列辨識號：58)，Y4H；S7K；T8M或K；Y10K；A11M或E；S12E；G16K；(c)於HVR-H3(序列辨識號：61)，Y5H；T7H；L11K；(d)於HVR-L1(序列辨識號：65)，Q1T、S2T；S5E；Y7F；D8H；N9D或A或E；(e)於HVR-L2(序列辨識號：70)，S3E；S7Y或F或W；及(f)於HVR-L3(序列辨識號：73)，L8R。
以上取代之所有可能的組合被分別為HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3的共有序列之序列辨識號：126、127、128、129、130及131所涵蓋。
在上述之任一實施例中，抗肌抑素抗體可為人源化(humanized)。在一實施例中，抗肌抑素抗體包括如上述之任一實施例中的HVR，且更包括受體人類框架，例如，人類免疫球蛋白框架或人類共有框架。在另一實施例中，抗肌抑素抗體包括如上述之任一實施例中的HVR，且更包括VH或VL，其 包括FR序列。在又一實施例中，抗肌抑素抗體包括下列重鏈及/或輕鏈變異域FR序列。對於重鏈可變域，FR1包括序列辨識號：132-134中任一之胺基酸序列，FR2包括序列辨識號：135-136中任一之胺基酸序列，FR3包括序列辨識號：137之胺基酸序列，FR4包括序列辨識號：138之胺基酸序列。對於輕鏈可變域，FR1包括序列辨識號：139之胺基酸序列，FR2包括序列辨識號：140-141中任一之胺基酸序列，FR3包括序列辨識號：142-143中任一之胺基酸序列，FR4包括序列辨識號：144之胺基酸序列。
在一態樣中，發明提供抗肌抑素抗體，其包括至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個HVR，擇自於：(a)包括序列辨識號：157-162中任一之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包括序列辨識號：163-168中任一之胺基酸序列的HVR-H2；(c)包括序列辨識號：169-174中任一之胺基酸序列的HVR-H3；(d)包括序列辨識號：175-180中任一之胺基酸序列的HVR-L1；(e)包括序列辨識號：181-186中任一之胺基酸序列的HVR-L2；及(f)包括序列辨識號：187-192中任一之胺基酸序列的HVR-L3。
在一態樣中，發明提供抗體，包括至少一個、至少兩個或全部三個擇自於(a)包括序列辨識號：157-162中任一之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包括序列辨識號：163-168中任一之胺基酸序列的HVR-H2；及(c)包括序列辨識號：169-174中任一之胺基酸序列的HVR-H3之VH HVR序列。在一實施例中，抗體包括HVR-H3，其包括序列辨識號：169-174中任一之胺基酸序列。在另一實施例中，抗體包括：HVR-H3，其包括 序列辨識號：169-174中任一之胺基酸序列，以及HVR-L3，其包括序列辨識號：187-192中任一之胺基酸序列。在又一實施例中，抗體包括：HVR-H3，其包括序列辨識號：169-174中任一之胺基酸序列、HVR-L3，其包括序列辨識號：187-192中任一之胺基酸序列、以及HVR-H2，其包括序列辨識號：163-168中任一之胺基酸序列。在又一實施例中，抗體包括(a)包括序列辨識號：157-162中任一之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包括序列辨識號：163-168中任一之胺基酸序列的HVR-H2；及(c)包括序列辨識號：169-174中任一之胺基酸序列的HVR-H3。
在另一態樣中，發明之抗體包括至少一個、至少兩個或全部三個擇自於(a)包括序列辨識號：175-180中任一之胺基酸序列的HVR-L1；(b)包括序列辨識號：181-186中任一之胺基酸序列的HVR-L2；及(c)包括序列辨識號：187-192中任一之胺基酸序列的HVR-L3之VL HVR序列。在一實施例中，抗體包括(a)包括序列辨識號：175-180中任一之胺基酸序列的HVR-L1；(b)包括序列辨識號：181-186中任一之胺基酸序列的HVR-L2；及(c)包括序列辨識號：187-192中任一之胺基酸序列的HVR-L3之VL HVR序列。
在另一態樣中，發明之抗體包括(a)VH域，其包括至少一個、至少兩個或全部三個擇自於(i)包括序列辨識號：157-162中任一之胺基酸序列的HVR-H1、(ii)包括序列辨識號：163-168中任一之胺基酸序列的HVR-H2、及(iii)包括序列辨識號：169-174中任一之胺基酸序列的HVR-H3之VH HVR序列；以及(b)VL域，其包括至少一個、至少兩個或全部三個 擇自於(i)包括序列辨識號：175-180中任一之胺基酸序列的HVR-L1、(ii)包括序列辨識號：181-186中任一之胺基酸序列的HVR-L2、及(iii)包括序列辨識號：187-192中任一之胺基酸序列的HVR-L3之VL HVR序列。
在另一態樣中，發明提供抗體，其包括(a)包括序列辨識號：157-162中任一之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包括序列辨識號：163-168中任一之胺基酸序列的HVR-H2；(c)包括序列辨識號：169-174中任一之胺基酸序列的HVR-H3；(d)包括序列辨識號：175-180中任一之胺基酸序列的HVR-L1；(e)包括序列辨識號：181-186中任一之胺基酸序列的HVR-L2；及(f)包括序列辨識號：187-192中任一之胺基酸序列的HVR-L3。
在另一態樣中，抗肌抑素抗體包括重鏈可變域(VH)序列，其對於序列辨識號：13、16-30、32-34及86-95中任一之胺基酸序列，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之序列相同性。在一些特定實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%之相同性的VH序列，相對於參考序列，包含取代(例如，保守取代)、插入或刪除，但包括那序列的抗肌抑素抗體保有結合至肌抑素的能力。在一些特定實施例中，在序列辨識號：13、16-30、32-34及86-95任一者中，總計1至10個胺基酸是經取代、插入及/或刪除。在一些特定實施例中，取代、插入或刪除發生於HVR外的區域中(即，在FR中)。可選地，抗肌抑素抗體包括序列辨識號：13、16-30、32-34及86-95中任一的VH序列，其包含那序列的轉譯後修飾。在一特定實 施例中，VH包括一個、兩個或三個HVR，擇自於：(a)包括序列辨識號：55-57、114-115、126中任一之胺基酸序列的HVR-H1、(b)包括序列辨識號：58-60、116-120、127中任一之胺基酸序列的HVR-H2、及(c)包括序列辨識號：61-64、121、128中任一之胺基酸序列的HVR-H3。轉譯後修飾(post-translational modification)包含但不限於藉由焦谷化(pyroglutamylation)修飾在重鏈或輕鏈的N末端麩醯胺酸或谷胺酸為焦谷胺酸(pyroglutamic acid)。
在另一態樣中，抗肌抑素抗體包括重鏈可變域(VH)序列，其對於序列辨識號：13、16-30、32、33及34中任一之胺基酸序列，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之序列相同性。在一些特定實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%之相同性的VH序列，相對於參考序列，包含取代(例如，保守取代)、插入或刪除，但包括那序列的抗肌抑素抗體保有結合至肌抑素的能力。在一些特定實施例中，在序列辨識號：13、16-30、32、33及34任一者中，總計1至10個胺基酸是經取代、插入及/或刪除。在一些特定實施例中，取代、插入或刪除發生於HVR外的區域中(即，在FR中)。可選地，抗肌抑素抗體包括序列辨識號：13、16-30、32、33及34中任一的VH序列，其包含那序列的轉譯後修飾。在一特定實施例中，VH包括一個、兩個或三個HVR，擇自於：(a)包括序列辨識號：55-57中任一之胺基酸序列的HVR-H1、(b)包括序列辨識號：58-60中任一之胺基酸序列的HVR-H2、及(c)包括 序列辨識號：61-64中任一之胺基酸序列的HVR-H3。轉譯後修飾包含但不限於藉由焦谷化修飾在重鏈或輕鏈的N末端麩醯胺酸或谷胺酸為焦谷胺酸。
在另一態樣中，抗肌抑素抗體包括重鏈可變域(VH)序列，其對於序列辨識號：86-95中任一之胺基酸序列，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之序列相同性。在一些特定實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%之相同性的VH序列，相對於參考序列，包含取代(例如，保守取代)、插入或刪除，但包括那序列的抗肌抑素抗體保有結合至肌抑素的能力。在一些特定實施例中，在序列辨識號：86-95任一者中，總計1至10個胺基酸是經取代、插入及/或刪除。在一些特定實施例中，取代、插入或刪除發生於HVR外的區域中(即，在FR中)。可選地，抗肌抑素抗體包括序列辨識號：86-95中任一的VH序列，其包含那序列的轉譯後修飾。在一特定實施例中，VH包括一個、兩個或三個HVR，擇自於：(a)包括序列辨識號：57、114-115、126中任一之胺基酸序列的HVR-H1、(b)包括序列辨識號：58、116-120、127中任一之胺基酸序列的HVR-H2、及(c)包括序列辨識號：63、121、128中任一之胺基酸序列的HVR-H3。轉譯後修飾包含但不限於藉由焦谷化修飾在重鏈或輕鏈的N末端麩醯胺酸或谷胺酸為焦谷胺酸。在另一態樣中，抗肌抑素抗體包括重鏈可變域(VH)序列，其對於序列辨識號：86之胺基酸序列，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之序列相同 性。在一些特定實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%之相同性的VH序列，相對於參考序列，包含取代(例如，保守取代)、插入或刪除，但包括那序列的抗肌抑素抗體保有結合至肌抑素的能力。在一些特定實施例中，在序列辨識號：86中，總計1至10個胺基酸是經取代、插入及/或刪除。在一些特定實施例中，取代、插入或刪除發生於HVR外的區域中(即，在FR中)。可選地，抗肌抑素抗體包括序列辨識號：86的VH序列，其包含那序列的轉譯後修飾。在一特定實施例中，VH包括一個、兩個或三個HVR，擇自於：(a)包括序列辨識號：114之胺基酸序列的HVR-H1、(b)包括序列辨識號：58之胺基酸序列的HVR-H2、及(c)包括序列辨識號：63之胺基酸序列的HVR-H3。轉譯後修飾包含但不限於藉由焦谷化修飾在重鏈或輕鏈的N末端麩醯胺酸或谷胺酸為焦谷胺酸。在另一態樣中，抗肌抑素抗體包括重鏈可變域(VH)序列，其對於序列辨識號：92之胺基酸序列，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之序列相同性。在一些特定實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%之相同性的VH序列，相對於參考序列，包含取代(例如，保守取代)、插入或刪除，但包括那序列的抗肌抑素抗體保有結合至肌抑素的能力。在一些特定實施例中，在序列辨識號：92中，總計1至10個胺基酸是經取代、插入及/或刪除。在一些特定實施例中，取代、插入或刪除發生於HVR外的區域中(即，在FR中)。可選地，抗肌抑素抗體包括序列辨識號：92的VH 序列，其包含那序列的轉譯後修飾。在一特定實施例中，VH包括一個、兩個或三個HVR，擇自於：(a)包括序列辨識號：114之胺基酸序列的HVR-H1、(b)包括序列辨識號：58之胺基酸序列的HVR-H2、及(c)包括序列辨識號：63之胺基酸序列的HVR-H3。轉譯後修飾包含但不限於藉由焦谷化修飾在重鏈或輕鏈的N末端麩醯胺酸或谷胺酸為焦谷胺酸。
在另一態樣中，提供抗肌抑素抗體，其中抗體包括VL，其對於序列辨識號：15、31、35-38及96-99中任一之胺基酸序列，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之序列相同性。在一些特定實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%之相同性的VL序列，相對於參考序列，包含取代(例如，保守取代)、插入或刪除，但包括那序列的抗肌抑素抗體保有結合至肌抑素的能力。在一些特定實施例中，在序列辨識號：15、31、35-38及96-99任一者中，總計1至10個胺基酸是經取代、插入及/或刪除。在一些特定實施例中，取代、插入或刪除發生於HVR外的區域中(即，在FR中)。可選地，抗肌抑素抗體包括序列辨識號：15、31、35-38及96-99中任一的VL序列，其包含那序列的轉譯後修飾。在一特定實施例中，VL包括一個、兩個或三個HVR，擇自於：(a)包括序列辨識號：65-69、122-124、129中任一之胺基酸序列的HVR-L1、(b)包括序列辨識號：70-72、125、130中任一之胺基酸序列的HVR-L2、及(c)包括序列辨識號：73-74、131中任一之胺基酸序列的HVR-L3。轉譯後修飾包含但不限於藉由焦谷 化修飾在重鏈或輕鏈的N末端麩醯胺酸或谷胺酸為焦谷胺酸。
在另一態樣中，提供抗肌抑素抗體，其中抗體包括VL，其對於序列辨識號：15、31、35、36、37及38中任一之胺基酸序列，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之序列相同性。在一些特定實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%之相同性的VL序列，相對於參考序列，包含取代(例如，保守取代)、插入或刪除，但包括那序列的抗肌抑素抗體保有結合至肌抑素的能力。在一些特定實施例中，在序列辨識號：15、31、35、36、37及38任一者中，總計1至10個胺基酸是經取代、插入及/或刪除。在一些特定實施例中，取代、插入或刪除發生於HVR外的區域中(即，在FR中)。可選地，抗肌抑素抗體包括序列辨識號：15、31、35、36、37及38中任一的VL序列，其包含那序列的轉譯後修飾。在一特定實施例中，VL包括一個、兩個或三個HVR，擇自於：(a)包括序列辨識號：65-69中任一之胺基酸序列的HVR-L1、(b)包括序列辨識號：70-72中任一之胺基酸序列的HVR-L2、及(c)包括序列辨識號：73-74中任一之胺基酸序列的HVR-L3。轉譯後修飾包含但不限於藉由焦谷化修飾在重鏈或輕鏈的N末端麩醯胺酸或谷胺酸為焦谷胺酸。
在另一態樣中，提供抗肌抑素抗體，其中抗體包括VL，其對於序列辨識號：96-99中任一之胺基酸序列，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之序列相同性。在一些特定實施例中，具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%之相同性的VL序列，相對於參考序列，包含取代(例如，保守取代)、插入或刪除，但包括那序列的抗肌抑素抗體保有結合至肌抑素的能力。在一些特定實施例中，在序列辨識號：96-99任一者中，總計1至10個胺基酸是經取代、插入及/或刪除。在一些特定實施例中，取代、插入或刪除發生於HVR外的區域中。可選地，抗肌抑素抗體包括序列辨識號：96-99中任一的VL序列，其包含那序列的轉譯後修飾。在一特定實施例中，VL包括一個、兩個或三個HVR，擇自於：(a)包括序列辨識號：122-124、129中任一之胺基酸序列的HVR-L1、(b)包括序列辨識號：71、125、130中任一之胺基酸序列的HVR-L2、及(c)包括序列辨識號：74、131之胺基酸序列的HVR-L3。轉譯後修飾包含但不限於藉由焦谷化修飾在重鏈或輕鏈的N末端麩醯胺酸或谷胺酸為焦谷胺酸。在另一態樣中，提供抗肌抑素抗體，其中抗體包括VL，其對於序列辨識號：96之胺基酸序列，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之序列相同性。在一些特定實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%之相同性的VL序列，相對於參考序列，包含取代(例如，保守取代)、插入或刪除，但包括那序列的抗肌抑素抗體保有結合至肌抑素的能力。在一些特定實施例中，在序列辨識號：96中，總計1至10個胺基酸是經取代、插入及/或刪除。在一些特定實施例中，取代、插入或刪除發生於HVR外的區域中。可選地，抗肌抑素抗體包括 序列辨識號：96的VL序列，其包含那序列的轉譯後修飾。在一特定實施例中，VL包括一個、兩個或三個HVR，擇自於：(a)包括序列辨識號：122之胺基酸序列的HVR-L1、(b)包括序列辨識號：71之胺基酸序列的HVR-L2、及(c)包括序列辨識號：74之胺基酸序列的HVR-L3。轉譯後修飾包含但不限於藉由焦谷化修飾在重鏈或輕鏈的N末端麩醯胺酸或谷胺酸為焦谷胺酸。在另一態樣中，提供抗肌抑素抗體，其中抗體包括VL，其對於序列辨識號：97之胺基酸序列，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之序列相同性。在一些特定實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%之相同性的VL序列，相對於參考序列，包含取代(例如，保守取代)、插入或刪除，但包括那序列的抗肌抑素抗體保有結合至肌抑素的能力。在一些特定實施例中，在序列辨識號：97中，總計1至10個胺基酸是經取代、插入及/或刪除。在一些特定實施例中，取代、插入或刪除發生於HVR外的區域中。可選地，抗肌抑素抗體包括序列辨識號：97的VL序列，其包含那序列的轉譯後修飾。在一特定實施例中，VL包括一個、兩個或三個HVR，擇自於：(a)包括序列辨識號：123之胺基酸序列的HVR-L1、(b)包括序列辨識號：71之胺基酸序列的HVR-L2、及(c)包括序列辨識號：74之胺基酸序列的HVR-L3。轉譯後修飾包含但不限於藉由焦谷化修飾在重鏈或輕鏈的N末端麩醯胺酸或谷胺酸為焦谷胺酸。
在另一態樣中，提供抗肌抑素抗體，其中抗體包括如以上提供之任一實施例中的VH，以及如以上提供之任一 實施例中的VL。在一實施例中，抗體分別包括序列辨識號：13、16-30、32-34及86-95中任一的VH序列以及序列辨識號：15、31、35-38及96-99中任一的VL序列，其包含那些序列的轉譯後修飾。在一實施例中，抗體分別包括序列辨識號：13、16-30及32-34中任一的VH序列以及序列辨識號：15、31及35-38中任一的VL序列，其包含那些序列的轉譯後修飾。在一實施例中，抗體分別包括序列辨識號：86-95的VH序列，以及序列辨識號：96-99的VL序列，其包含那些序列的轉譯後修飾。轉譯後修飾包含但不限於藉由焦谷化修飾在重鏈或輕鏈的N末端麩醯胺酸或谷胺酸為焦谷胺酸。
在另一態樣中，提供抗肌抑素抗體，其中抗體包括如以上提供之任一實施例中的VH，以及如以上提供之任一實施例中的VL。在一實施例中，抗體分別包括序列辨識號：86的VH序列以及序列辨識號：96的VL序列，其包含那些序列的轉譯後修飾。在一實施例中，抗體分別包括序列辨識號：92的VH序列以及序列辨識號：97的VL序列，其包含那些序列的轉譯後修飾。轉譯後修飾包含但不限於藉由焦谷化修飾在重鏈或輕鏈的N末端麩醯胺酸或谷胺酸為焦谷胺酸。
在另一態樣中，提供抗肌抑素抗體，其中抗體包括VH序列，其對於序列辨識號：12、145-150中任一之胺基酸序列，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之序列相同性。在一些特定實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%之相同性的VH序列，相對於參考序列，包含取代(例 如，保守取代)、插入或刪除，但包括那序列的抗肌抑素抗體保有結合至肌抑素的能力。在一些特定實施例中，在序列辨識號：12、145-150任一者中，總計1至10個胺基酸是經取代、插入及/或刪除。在一些特定實施例中，取代、插入或刪除發生於HVR外的區域中(即，在FR中)。可選地，抗肌抑素抗體包括序列辨識號：12、145-150中任一的VH序列，其包含那序列的轉譯後修飾。在一特定實施例中，VH包括一個、兩個或三個HVR，擇自於：(a)包括序列辨識號：55、157-162中任一之胺基酸序列的HVR-H1、(b)包括序列辨識號：58、163-168中任一之胺基酸序列的HVR-H2、及(c)包括序列辨識號：61、169-174中任一之胺基酸序列的HVR-H3。轉譯後修飾包含但不限於藉由焦谷化修飾在重鏈或輕鏈的N末端麩醯胺酸或谷胺酸為焦谷胺酸。
在另一態樣中，提供抗肌抑素抗體，其中抗體包括輕鏈可變域(VL)，其對於序列辨識號：14、151-156中任一之胺基酸序列，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之序列相同性。在一些特定實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%之相同性的VL序列，相對於參考序列，包含取代(例如，保守取代)、插入或刪除，但包括那序列的抗肌抑素抗體保有結合至肌抑素的能力。在一些特定實施例中，在序列辨識號：14、151-156任一者中，總計1至10個胺基酸是經取代、插入及/或刪除。在一些特定實施例中，取代、插入或刪除發生於HVR外的區域中(即，在FR中)。可選地，抗肌 抑素抗體包括序列辨識號：14、151-156中任一的VL序列，其包含那序列的轉譯後修飾。在一特定實施例中，VL包括一個、兩個或三個HVR，擇自於：(a)包括序列辨識號：65、175-180中任一之胺基酸序列的HVR-L1、(b)包括序列辨識號：70、181-186中任一之胺基酸序列的HVR-L2、及(c)包括序列辨識號：73、187-192中任一之胺基酸序列的HVR-L3。轉譯後修飾包含但不限於藉由焦谷化修飾在重鏈或輕鏈的N末端麩醯胺酸或谷胺酸為焦谷胺酸。
在另一態樣中，提供抗肌抑素抗體，其中抗體包括如以上提供之任一實施例中的VH，以及如以上提供之任一實施例中的VL。在一實施例中，抗體分別包括序列辨識號：12、145-150中任一的VH序列以及序列辨識號：14、151-156中任一的VL序列，其包含那些序列的轉譯後修飾。轉譯後修飾包含但不限於藉由焦谷化修飾在重鏈或輕鏈的N末端麩醯胺酸或谷胺酸為焦谷胺酸。
在一些特定實施例中，本發明的抗肌抑素抗體包括如以上提供之任一實施例中的VH，以及包括序列辨識號：7、9、11、193、195-198、227、228、229-381中任一之胺基酸序列的重鏈恆定區。在一些特定實施例中，本發明的抗肌抑素抗體包括如以上提供之任一實施例中的VL，以及包括序列辨識號：8及10中任一之胺基酸序列的輕鏈恆定區。
在又一態樣中，發明提供抗體，其與本文提供之抗肌抑素抗體結合至相同的抗原決定基。在又一態樣中，發明提供抗體，其與表2a所述之抗體結合至相同的抗原決定基。 在又一態樣中，發明提供抗體，其與表11a或13所述之抗體結合至相同的抗原決定基。在一些特定實施例中，提供之抗體結合至由序列辨識號：78的胺基酸21-100所組成的肌抑素原胜肽的片段的抗原決定基。替代地，抗體結合至由序列辨識號：78的胺基酸21-80、41-100、21-60、41-80、61-100、21-40、41-60、61-80或81-100所組成的肌抑素原胜肽片段。
在又一態樣中，根據以上任一之實施例的抗肌抑素抗體為單株抗體，包含嵌合、人源化或人類抗體。在一實施例中，抗肌抑素抗體為抗體片段，例如，Fv、Fab、Fab'、scFv、雙抗體(diabody)、或F(ab')2 片段。在另一實施例中，抗體為全長IgG抗體，例如，完整的IgG1或IgG4抗體或如本文所定義之其它抗體種類或同型(isotype)。
在又一態樣中，根據以上任一實施例的抗肌抑素抗體可單一地或組合地合併任一特徵，如以下章節1-7所述。
1. 抗體親和性
在一些特定實施例中，本文提供之抗體具有1μm、100nM、10nM、1nM、0.1nM、0.01nM、或0.001nM(例如10-8 M或更小，例如從10-8 M至10-13 M、例如從10-9 M至10-13 M)之解離常數(Kd)。
在一實施例中，Kd藉由放射性標記抗原結合分析法(radiolabeled antigen binding assay,RIA)進行測量。在一實施例中，RIA是以感興趣的抗體及其抗原的Fab形式實行。例如，藉由在存在未標記抗原的滴定系列的條件下，用最小濃度的(125 I)-標記抗原平衡Fab，然後以抗Fab抗體被覆的盤捕捉 結合的抗原，以測量Fab對抗原的溶液結合親和性(請參照，例如Chen等人，J.Mol.Biol. 293：865-881(1999))。為了確立測定的條件，以於50mM碳酸鈉(pH9.6)中的5μg/ml捕捉用抗Fab抗體(Cappel Labs)被覆MICROTITER® 多孔盤(Thermo Scientific)過夜，接著以於PBS中的2%(w/v)牛血清蛋白在室溫(約23℃)進行阻斷2至5小時。在非吸附盤(Nunc#269620)中，將100pM或26pM[125 I]-抗原與連續稀釋的感興趣的Fab(例如，與Presta等人，Cancer Res. 57：4593-4599(1997)中抗VEGF抗體，Fab-12的評估一致)混合。接著將感興趣的Fab培養過夜；然而，培養可持續更長的時間(例如，約65小時)以確保達到平衡。此後，將混合物轉移至捕捉盤於室溫下培養(例如，1小時)。接著移除溶液並以含0.1%聚山梨醇酯20(TWEEN-20® )的PBS清洗盤8次。當盤已乾燥，加入150μl/孔的閃爍液(MICROSCINT-20TM ；Packard)，且於TOPCOUNTTM 伽馬計數器(Packard)上對盤計數10分鐘。選擇各Fab給出小於或等於最大結合之20%的濃度，用於競爭性結合分析法。
依照另一實施例，Kd是利用BIACORE® 表面電漿共振測定法進行測量。例如，使用BIACORE® -2000或BIACORE® -3000(BIACORE® ,Inc.,Piscataway,NJ)的測定法在25℃以固定化抗原CM5晶片在約10個回應單位(RU)下實行。在一實施例中，根據供應商的說明書，以N -乙基-N' -(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)及N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)活化羧甲基化聚葡萄糖生物感測器晶片(CM5,BIACORE® ,Inc.)。在以5μl/min的流速注入以獲得約10個回 應單位(RU)的偶聯蛋白質之前，以10mM乙酸鈉，pH4.8，將抗原稀釋至5μg/ml(約0.2μM)。在抗原的注入後，注入1M乙醇胺以阻斷未反應基團。為了進行動力學測量，將兩倍連續稀釋的Fab(0.78nM至500nM)在25℃以約25μl/min的流速注入於含0.05聚山梨醇酯20(TWEEN-20TM )介面活性劑的PBS(PBST)中。使用簡單一對一Langmuir結合模型(BIACORE® Evaluation Software version 3.2)藉由同時擬合結合及解離傳感圖計算結合速率(kon )及解離速率(koff )。平衡解離常數(Kd)以比例koff /kon 計算。請請參照，例如Chen等人，J.Mol.Biol. 293：865-881(1999)。若根據上述表面電漿共振測定法，結合速率超過106 M-1 s-1 ，那麼結合速率利用螢光淬滅技術加以測定，其在25℃下測量於PBS，pH7.2，中的20nM抗抗原抗體(Fab形式)的螢光發射強度(激發=295nm；發射=340nm，16nm帶通)的增加或減少，在分光計，例如配備了斷流(stop-flow)裝置的分光光度計(Aviv Instruments)或具攪拌比色管之8000系列SLM-AMINCOTM 分光光度計(ThermoSpectronic)，測量抗原的濃度增加的存在下。
2. 抗體片段
在一些特定實施例中，本文提供之抗體為抗體片段。抗體片段包含但不限於，Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2 、Fv、及scFv片段，及如下述之其它片段。對於特定抗體片段的綜述，請參照Hudson等人，Nat.Med. 9：129-134(2003)。對於特定scFv片段的綜述，請參照，例如Pluckthün，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies ,vol.113,Rosenburg 及Moore編輯，(Springer-Verlag,New York),pp.269-315(1994)；亦參照WO 93/16185；以及美國專利號5,571,894及5,587,458。關於包括補救(salvage)受體結合抗原決定基殘基且具有增加的體內(in vivo )半生期之Fab及F(ab')2 片段的討論，請參照美國專利號5,869,046。
雙抗體(diobody)是具有兩個抗原結合位的抗體片段，其可為二價的或雙特異性的，請參照，例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat.Med. 9：129-134(2003)；及Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)。三抗體及四抗體也記載於Hudson等人，Nat.Med. 9：129-134(2003)。
單域抗體是包括抗體的所有或部分的重鏈可變域或全部或部分的輕鏈可變域之抗體片段。在一些特定實施例中，單域抗體是人類單域抗體(Domantis,Inc.,Waltham,MA；請參照，例如美國專利號6,248,516 B1)。
可藉由多種技術形成抗體片段，包含但不限於完整抗體的蛋白質水解消化，以及藉由重組宿主細胞(例如，E.coli 或噬菌體)的產生，如本文中所述。
3. 嵌合及人源化抗體
在一些特定實施例中，本文提供之抗體為嵌合抗體。特定嵌合抗體記載於，例如，美國專利號4,816,567；及Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855(1984))。在一例子中，嵌合抗體包括非人類可變區(例如，源自小鼠、大鼠、齧齒類、兔或非人類靈長類，像是猴的可變區) 以及人類恆定區。在又一例子中，嵌合抗體為“類別交換的(class switched)”抗體，其中類別或亞類(subclass)已自親本抗體的類別或亞類改變。嵌合抗體包含其抗原結合片段。
在一些特定實施例中，嵌合抗體為人源化抗體。通常，非人類抗體經人源化以降低對人類的免疫原性，同時保有親本非人類抗體的特異性及親和性。一般而言，人源化的抗體包括一或多個可變域，其中HVR，例如，CDR(或其部分)源自非人類抗體，以及FR(或其部分)源自人類抗體序列。人源化抗體可選地也包括人類恆定區的至少一部分。在一些實施例中，人源化的抗體中的一些FR殘基被來自非人類抗體(例如，HVR殘基源自的抗體)對應之殘基取代，例如，以恢復或提高抗體特異性或親和性。
人源化抗體及製備其的方法綜述於，例如，Almagro，Front.Biosci. 13：1619-1633(2008)，以及進一步描述於，例如Riechmann等人，Nature 332：323-329(1988)；Queen等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 86：10029-10033(1989)；美國專利號5,821,337、7,527,791、6,982,321及7,087,409；Kashmiri等人，Methods 36：25-34(2005)(描述特異性決定區(SDR)移)；Padlan,Mol.Immunol. 28：489-498(1991)(描述“表面重修”)；Dall'Acqua等人，Methods 36：43-60(2005)(描述“FR改組”)；以及Osbourn等人，Methods 36：61-68(2005)以及Klimka等人，Br.J.Cancer 83：252-260(2000)(描述FR改組的“導向選擇”方法)。
可用於人源化的人類框架區包含但不限於：使用 “最適”方法選擇的框架區(請參照，例如，Sims等人，J.Immunol. 151：2296(1993)；源自特定的亞型的輕鏈或重鏈可變區的人類抗體的共有序列之框架區(請參照，例如，Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：4285(1992)；及Presta等人，J.Immunol. 151：2623(1993)；人類成熟(體細胞突變的)框架區或人類種系框架區(請參照，例如，Almagro及Fransson，Front.Biosci. 13：1619-1633(2008))；以及源自篩選FR資料庫的框架區(請參照，例如，Baca等人，J.Biol.Chem. 272：10678-10684(1997)以及Rosok等人，J.Biol.Chem. 271：22611-22618(1996))。
4. 人類抗體
在一些特定實施例中，本文提供之抗體為人類抗體。人類抗體可利用各種習知的技術加以製造。人類抗體大致的描述於van Dijk及van de Winkel，Curr.Opin.Pharmacol. 5：368-374(2001)以及Lonberg，Curr.Opin.Immunol. 20：450-459(2008)。
人類抗體可藉由向已經過修飾因而因應抗原攻擊產生完整人類抗體或具有人類可變區的完整抗體之基因轉殖動物施用免疫原，來製備人抗體。這類動物通常包含全部或部分的人類免疫球蛋白基因座，其取代了內源免疫球蛋白基因座，或其存在於染色體外或隨機整合於動物的染色體內。在這類基因轉殖小鼠中，內源免疫球蛋白基因座一般已不活化。關於自基因轉殖動物獲取人類抗體的方法之綜述，請參照Lonberg，Nat.Biotech. 23：1117-1125(2005)。請亦參照，例如 美國專利號6,075,181及6,150,584，其描述XENOMOUSETM 技術；美國專利號5,770,429，其描述HuMab®技術；美國專利號7,041,870，其描述K-M MOUSE®技術，以及美國專利公開號US 2007/0061900，其描述VelociMouse®技術)。藉由這類動物產生的完整抗體的人類可變區可進一步修飾，例如，藉由與不同人類恆定區組合。
人類抗體也可藉由基於融合瘤的方法形成。用於產生人類單株抗體的人類骨髓瘤及小鼠-人融合骨髓瘤細胞系已經描述。(請參照，例如Kozbor，J.Immunol. 133：3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal antibody Production Techniques and Applications ,pp.51-63(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；以及Boerner等人，J.Immunol. 147：86(1991)。藉由人類B細胞融合瘤技術產生的人抗體也在Li等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103：3557-3562(2006)中描述。其它方法包含那些描述於，例如，美國專利號7,189,826(描述由融合瘤細胞系產生單株人類IgM抗體)及Ni，Xiandai Mianyixue 26(4)：265-268(2006)(描述人-人融合瘤)的方法。人融合瘤技術(Trioma技術)也描述於Vollmers及Brandlein，Histology and Histopathology 20(3)：927-937(2005)以及Vollmers及Brandlein，Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27(3)：185-191(2005)。
亦可藉由分離選自源自人類噬菌體展示資料庫的Fv株可變域序列產生人類抗體。接著可將這類可變域序列與所需人類恆定域組合。下文描述自抗體資料庫選擇人類抗體的 技術。
5. 源自資料庫的抗體
可藉由在組合資料庫中篩選具有所需活性的抗體以分離本發明的抗體。例如，本領域中已知多種用於產生噬菌體展示資料庫並且在這類資料庫中篩選具有所需結合特徵的抗體的方法。這類方法綜述於，例如Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology 178：1-37(2000)；O'Brien等人編輯，Human Press,Totowa,NJ,2001，且進一步於，例如McCafferty等人，Nature 348：552-554；Clackson等人，Nature 352：624-628(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol. 222：581-597(1992)；Marks及Bradbury，Methods in Molecular Biology 248：161-175(Lo,ed.,Human Press,Totowa,NJ,2003)；Sidhu等人，J.Mol.Biol. 338(2)：299-310(2004)；Lee等人，J.Mol.Biol. 340(5)：1073-1093(2004)；Fellouse，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34)：12467-12472(2004)；以及Lee等人，J.Immunol.Methods 284(1-2)：119-132(2004)中描述。
在特定的噬菌體展示方法中，VH及VL基因的庫(repertoire)是藉由聚合酶連鎖反應(PCR)分別選殖並隨機地重組於噬菌體資料庫中，之後可藉由如Winter等人，Ann.Rev.Immunol. 12：433-455(1994)所述在其中篩選抗原結合噬菌體。噬菌體通常呈現單鏈Fv(ScFv)片段或Fab片段形式的抗體片段。來自免疫來源的資料庫無需建構融合瘤，即可提供免疫原的高親和性抗體。或者，天然庫可被轉殖(cloned)(例如，自人類)以在無任何免疫的情況下，提供針對廣泛範圍的非自體 抗原以及自體抗原的抗體單一來源，如Griffiths等人，EMBO J, 12：725-734(1993)所述。最後，也可藉由從幹細胞轉殖未重排的V基因片段，並使用含有隨機序列的PCR引子來編碼高度變異CDR3區，以及實現體外(in vitro )重排以合成地產生天然資料庫，如Hoogenboom及Winter，J.Mol.Biol. 227：381-388(1992)所述。描述人類抗體噬菌體資料庫的專利公開物包含，例如：美國專利號5,750,373，以及美國專利公開號2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936及2009/0002360。
自人類抗體資料庫分離的抗體或抗體片段被視為本文的人類抗體或人類抗體片段。
6. 多特異性抗體
在一些特定實施例中，本為提供之抗體為多特異性抗體，例如，雙特異性抗體。多特異性抗體是對至少兩個不同位置具有結合特異性的單株抗體。在一些特定實施例中，結合特異性的其中之一是針對肌抑素而另一種是針對任一其它抗原。在一些特定實施例中，雙特異性抗體可結合至肌抑素的兩個不同抗原決定基。雙特異性抗體也可用以將細胞毒性劑定位於表現肌抑素的細胞。雙特異性抗體可製成全長抗體或抗體片段。
製造多特異性抗體的技術包含但不限於，具有不同特異性的兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對的重組共表達(co-expression)(請參照Milstein及Cuello，Nature 305：537(1983))、WO 1993/08829、以及Traunecker等人，EMBO J. 10：3655(1991))，及“knob-in-hole”工程改造(請參照，例如美國專利號5,731,168)。也可藉由以下方法製得多特異性抗體：工程改造用於製備抗體Fc-異二聚分子的靜電導引作用(WO 2009/089004A1)；將兩種或兩種以上抗體或片段交聯(請參照，例如美國專利號4,676,980，以及Brennan等人，Science, 229：81(1985))；使用白胺酸拉鍊以產生雙特異性抗體(請參照，例如Kostelny等人，J.Immunol. 148(5)：1547-1553(1992))；利用“雙抗體”技術來產生雙特異性抗體片段(請參照，例如Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993))；及利用單鏈Fv(sFv)雙體(請參照，例如Gruber等人，J.Immunol. 152：5368(1994))；以及製備三特異性抗體，如，例如Tutt等人，J.Immunol. 147：60(1991)中所述。
本文中也包含具有三個或三個以上的功能性抗原結合位置的工程改造抗體，其包含“章魚抗體(Octopus antibodies)”(請參照，例如US 2006/0025576A1)。
本文中的抗體或片段亦包含“雙重作用FAb”或“DAF”，其包括結合至肌抑素以及另一不同抗原的抗原結合位置(請參照，例如，US 2008/0069820)。
7. 抗體變異體
在一些特定實施例中，本文提供之抗體的胺基酸序列變異體為經設想的。例如，提高抗體的結合親和性及/或其它生物性質可為理想的。可藉由引入適當的修飾至編碼抗體的核苷酸序列、或藉由肽合成，製備抗體的胺基酸序列變異體。此類修飾包含，例如，在抗體的胺基酸序列內刪除、及/ 或插入及/或取代殘基。可以使得刪除、插入及取代的任何組合達到最終的構建體中，前提為最終構建體具有期望的特徵，例如，抗原結合。
a. 取代、插入及刪除變異體
在一些特定實施例中，提供具有一或多個胺基酸取代的抗體變異體。取代誘變(mutagenesis)的感興趣的位置包含HVR及FR。表1中的標題“優選取代”下顯示保守取代。表1中的標題“示例性取代”下提供更實質的改變，並參考胺基酸側鏈類別在下文進一步描述。可將胺基酸取代引入至感興趣的抗體及篩選到期望的活性之產物中，例如，保留的/改善的抗體結合、降低的免疫原性、或改善的ADCC或CDC。
可根據共同的側鏈特性將胺基酸分類為：(1)疏水的：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性親水的：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性的：Asp、Glu；(4)鹼性的：His、Lys、Arg；(5)影響鏈方位的殘基：Gly、Pro；以及(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。非保守取代將使得這些群組中之一的成員與另一群組的成員交換。
取代變異體的一類涉及取代親本抗體(例如，人源化的或人類抗體)的一或多個高度變異區殘基。一般而言，選擇用於進一步研究的產生之變異體將在特定生物性質(例如，增加的親和性、降低的免疫原性)中相對於親本抗體具有修飾(例如改善)及/或將具有實質上保留的親本抗體的特定生物性質。示例性的取代變異體是親和性成熟的抗體，其可方便地被產生，例如，使用像是那些本文所述基於噬菌體展示的親和性成熟技術。簡言之，突變一或多個HVR殘基並且在噬菌體上展示變異體抗體，以及就特別的生物活性(例如，結合親和性)進行篩選。
可以在HVR中形成修改(alteration)(例如，取代)，例如，以改善抗體親和性。此類修改可形成在HVR“熱點”中，即由在體細胞成熟過程中以高頻率經歷突變的密碼子所編碼的殘基(請參照，例如，Chowdhury，Methods Mol.Biol. 207：179-196(2008)，及/或接觸抗原的殘基，且測試獲得的變異體VH或VL之結合親和性。藉由建構以及從第二資料庫重新選擇的親和性成熟已在，例如Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology 178：1-37(O'Brien等人編輯，Human Press, Totowa,NJ,(2001)中描述。在親和性成熟的一些實施例中，藉由多種方法中的任一種(例如，易錯PCR、鏈改組、或寡核苷酸定向誘變)將多樣性引入至選擇用於成熟的可變基因中。接著產生第二資料庫。然後篩選資料庫以辨識具有期望的親和性的任一抗體變異體。引入多樣性的另一種方法涉及HVR定向方法，其中隨機化數個HVR殘基(例如，一次4至6個殘基)。涉及抗原結合的HVR殘基可特異地被辨識，例如使用丙胺酸掃描誘變或建立模型。CDR-H3及CDR-L3特別常被標靶。
在一些特定的實施例中，取代、插入或刪除可發生在一或多個HVR內，只要此類修改未實質地降低抗體結合抗原的能力。例如，可在HVR中形成未實質地降低結合親和性的保守修改(例如，如本文提供的保守取代)。此類修改可，例如，在HVR中的抗原接觸殘基之外。在以上提供的變異體VH和VL序列的特定實施例中，每一HVR或未被修改，或含有不多於一個、兩個或三個胺基酸取代。
一種可用於辨識可被標靶用於誘變的抗體的殘基或區域的方法稱為“丙胺酸掃描誘變”，如Cunningham及Wells，(1989)Science, 244：1081-1085所述。在此方法中，殘基或一群殘基(例如，帶電的殘基，像是arg、asp、his、lys及glu)可被辨識並被中性或帶負電的胺基酸(例如，丙胺酸或多聚丙胺酸)取代，以測定是否影響抗體與抗原的相互作用。可在顯示對於初始取代的功能性敏感的胺基酸位置引入更多的取代。替代地、或額外地，抗原抗體複合物的晶體結構可經分析以辨識抗體及抗原之間的接觸點。此類接觸殘基及相鄰的殘基 可被標靶或消除，作為作為取代的候選對象。變異體可被篩選以測定它們是否包含期望的性質。
胺基酸序列插入物包含長度範圍從一個殘基至包含100個或更多殘基的多肽之胺基-及/或羧基-末端融合物，以及單一或多個胺基酸殘基的序列內插入物。末端插入物的例子包含具有N末端甲硫胺醯基殘基的抗體。抗體分子的其它插入變異體包含抗體的N或C末端對酶(例如，ADEPT)或多肽的融合，其增加抗體的血清半生期。
b. 糖化變異體
在一些特定的實施例中，本文提供的抗體被修改以增加或減少抗體被糖化的程度。可藉由修改胺基酸序列使得一或多個糖化位置被製造或移除，以方便地完成對抗體的糖化位置之添加或刪除。
當抗體包括Fc區域時，可以修改附著於其的糖。由哺乳動物細胞產生的自然抗體通常包括分支的、二天線(biantennary)的寡糖，其一般藉由N連接附著至Fc區域的CH2域的Asn297，請參照，例如，Wright等人，TIBTECH 15：26-32(1997)。寡糖可包含多種糖，例如甘露糖、N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖及唾液酸，以及附著至二天線寡糖結構的“主幹”中的GIcNAc的岩藻糖。在一些實施例中，可在本發明的抗體中的寡糖形成修飾，以產生具有特定改善性質的抗體變異體。
在一實施例中，提供的抗體變異體具有糖結構，其缺少附著(直接或間接)至Fc區域的岩藻糖。例如，此類抗體 中岩藻糖的量可為從1%至80%、從1%至65%、從5%至65%或從20%至40%。岩藻糖的量是藉由計算糖鏈內在Asn297處的平均岩藻糖的量，相對於如藉由MALDI-TOF質譜分析測量之附著於Asn297的所有糖基結構的總和(例如，複合物、雜合物及高甘露糖結構)加以測定，例如，如WO 2008/077546中所述。Asn297指位於Fc區域中約在位置297(Fc區域殘基的Eu編號)的天冬醯胺殘基；然而，由於抗體中微小的序列變異，Asn297也可位於位置297的約±3個胺基酸上游或下游，即位置294及300之間。此類岩藻糖化變異體可具有改善的ADCC功能，請參照，例如，美國專利公開號2003/0157108(Presta,L.)；2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。涉及“去岩藻糖化的”或“岩藻糖缺乏的”抗體變異體的公開刊物的例子包含：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO 2005/053742；WO 2002/031140；Okazaki等人，J.Mol.Biol. 336：1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人，Biotech.Bioeng. 87：614(2004)。能夠生產去岩藻糖化的抗體的細胞系的例子包含蛋白岩藻糖化缺乏的Lecl3 CHO細胞(Ripka等人，Arch.Biochem.Biophys. 249：533-545(1986)；美國專利公開號2003/0157108 A1，Presta,L；及WO 2004/056312，Adams等人，特別是在實施例11)，以及敲除(knockout)細胞系，像是α-1,6-岩藻糖轉移酶基因、FUT8 、敲除CHO細胞(請參照，例如，Yamane-Ohnuki等人，Biotech.Bioeng. 87：614(2004)；Kanda等人，Biotechnol.Bioeng. 94(4)：680-688(2006)；及WO2003/085107)。
更提供具有等分(bisected)寡糖的抗體變異體，例如，其中附著至抗體Fc區域的二天線寡糖被GIcNAc等分。此類抗體變異體可具有降低的岩藻糖化及/或改善的ADCC功能。此類抗體變異體的例子描述於，例如WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)、美國專利號6,602,684(Umana等人)；及US 2005/0123546(Umana等人)。也提供了在附著至Fc區域的寡糖中具有至少一個半乳糖殘基的抗體變異體。此類抗體變異體可具有改善的CDC功能。此類抗體變異體描述於，例如WO 1997/30087(Patel等人)；W0 1998/58964(Raju,S)；及WO 1999/22764(Raju,S)。
c. Fc區域變異體
在一些特定的實施例中，可將一或多個胺基酸修飾引入至本文提供的抗體的Fc區域中，從而產生Fc區域變異體。Fc區域變異體可包括人類Fc區域序列(例如，人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區域)，其在一或多個胺基酸位置包括胺基酸修飾(例如，取代)。
在一些特定的實施例中，本發明設想具有一些但並非全部效應物(effector)功能的抗體變異體，這使得其為應用的理想的候選者，所述應用中抗體的體內半生期是重要的，然而特定效應物功能(像是補體及ADCC)為不必要或有害的。可進行體外及/或體內細胞毒性測定法以確認CDC及/或ADCC活 性的降低/耗盡。例如，可進行Fc受體(FcR)結合分析法以確保抗體缺少FcγR結合(因此可能缺少ADCC活性)，但保留FcRn結合能力。調節ADCC的主要細胞，NK細胞，僅表達FcγRIII，然而單核細胞表FcγRI、FcγRII及FcγRIII。造血細胞上的FcR表達總結於Ravetch及Kinet，Annu.Rev.Immunol. 9：457-492(1991)的464頁上的表3中。用於評估感興趣的分子的ADCC活性的體外測定的非限制性例子描述於美國專利號5,500,362(請參照，例如Hellstrom等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 83：7059-7063(1986))及Hellstrom,I等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 82：1499-1502(1985)；美國專利號5,821,337(請參照，Bruggemann等人，J.Exp.Med. 166：1351-1361(1987))中。或者，可採用非放射性測定法(請參照，例如，流式細胞術的ACTITM 非放射性細胞毒性測定法(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)；及CytoTox 96® 非放射性細胞毒性測定法(Promega,Madison,WI))。用於此類測定法之有用的效應物細胞包含周邊血液單核細胞(PBMC)及自然殺手(NK)細胞。替代地、或額外地，感興趣的分子的ADCC活性可在體內評估，例如在動物模型中，像是Clynes等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 95：652-656(1998)中所公開。也可進行C1q結合分析法以確定抗體不能結合C1q並因此缺少CDC活性。請參照，例如，WO 2006/029879及WO 2005/100402中的C1q及C3c結合ELISA。為了評估補體活化，可進行CDC測定法(請參照，例如，Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods 202：163(1996)；Cragg等人，Blood 101：1045-1052(2003)；及Cragg，Blood 103：2738-2743(2004))。FcRn結合及體內清除/半生期測定也可使用本領域已知的方法進行(請參照，例如，Petkova等人，Int'l.Immunol. 18(12)：1759-1769(2006))。
具有降低的效應物功能的抗體包含在Fc區域殘基238、265、269、270、297、327及329中的一或多個具有取代的那些抗體(美國專利號6,737,056)。此類Fc突變體包含在胺基酸位置265、269、270、297及327中的兩個或多個具有取代的Fc突變體，包含具有殘基265及297取代為丙胺酸的所謂的“DANA”Fc突變體(美國專利號7,332,581)。
對FcR具有改善或減弱的結合之特定抗體變異體已被描述(請參照，例如美國專利號6,737,056；WO 2004/056312；及Shields等人，J.Biol.Chem. 9(2)：6591-6604(2001))。
在特定的一些實施例中，抗體變異體包括具有提高ADCC的一個或多個胺基酸取代的Fc區域，例如，在Fc區域的位置298、333及/或334(殘基的EU編號)的取代。
在一些實施例中，在Fc區域中形成改變，其導致改變的(即改善或減弱的)C1q結合及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)，例如，如美國專利號6,194,551、WO 1999/51642，及Idusogie等人，J.Immunol. 164：4178-4184(2000)中所述。
對新生兒Fc受體(FcRn)具有增加的半生期及改善的結合之抗體描述於US2005/0014934 A1(Hinton等人)中，所述新生兒Fc受體負責將母體IgG傳送至胎兒(Guyer等人，J.Immunol. 117：587(1976)及Kim等人，J.Immunol. 24：249 (1994))。那些抗體包括具有一個或多個取代於其中的Fc區域，其改善Fc區域對FcRn的結合。此類Fc變異體包含在Fc區域殘基：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434的一或多個具有取代的那些，例如Fc區域殘基434的取代(美國專利號7,371,826)。關於Fc區域變異體的其它例子，請亦參照Duncan，Nature 322：738-40(1988)；美國專利號US 5,648,260及US 5,624,821；及WO 1994/29351。
d)半胱胺酸改造的抗體變異體
在一些特定的實施例中，產生半胱胺酸改造的抗體是理想的，例如，“thioMAb”，於其中抗體的一或多個殘基被半胱胺酸殘基所取代。在特別的實施例中，被取代的殘基存在於抗體的易接近位置。藉由以半胱胺酸取代那些殘基，從而將反應性硫醇基團放置於抗體的易接近位置並可用於偶聯抗體至其它部分，像是藥物部分或連接藥物部分，以創造免疫偶聯物，如本文中進一步所述。在一些特定的實施例中，下列殘基的任一或多個可被半胱胺酸取代：輕鏈的V205(Kabat編號)；重鏈的A118(EU編號)；及重鏈Fc區域的S400(EU編號)。半胱胺酸改造的抗體可以，例如美國專利號7,521,541，所述加以產生。
e)抗體衍生物
在一些特定的實施例中，本文提供的抗體可進一步被修飾，以包含本領域已知且容易獲得的額外的非蛋白質部分(moiety)。適於抗體的衍生化的部分包含，但不限於水溶性 聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包含但不限於，聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纖維素、聚葡萄糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚-1,3-二氧戊環、聚-1,3,6-三 (poly-1,3,6-trioxane)、乙烯/順丁烯二酸酐共聚物、聚胺基酸(同聚物或隨機共聚物)，及聚葡萄糖或聚(n-乙烯基吡咯啶酮)聚乙二醇、聚丙二醇(polypropylene glycol)同聚物、聚環氧丙烷(polypropylene oxide)/環氧乙烷共聚物、聚氧乙烷化多元醇(例如，丙三醇)、聚乙烯醇、及其混合物。聚乙二醇丙醛可在生產中具有優勢由於其在水中的穩定性。多聚物可具有任一分子量，且可為分支或無分支的。附著於抗體的多聚物的數目可不同，且如果附著多於一個多聚物，它們可以是相同或不同的分子。一般而言，用於衍生化的多聚物的數量及/或類型可根據，包含但不限於，考慮待改善的抗體的特別的性質或功能、抗體衍生物是否將在定義的條件下用於療法中等加以決定。
在另一實施例中，提供一抗體及可藉由暴露於輻射選擇性地被加熱的非蛋白質部分的偶聯物。在一實施例中，非蛋白質部分是碳納米管(Kam等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102：11600-11605(2005))。輻射可具有任何波長，且包含但不限於，不傷害普通細胞的波長，但其加熱非蛋白質部分至接近抗體-非蛋白質部分的細胞被殺死之溫度。
8. 變異Fc區域
在一態樣中，發明提供分離的多肽，其包括具有增強的FcγRIIb結合活性的變異Fc區域。在一些態樣中，多肽為抗體。在一些態樣中，多肽為Fc融合蛋白。在一些特定 實施例中，相較於自然或參考變異序列(在本文中通常統稱為“親本”Fc區域)的Fc區域中相應的序列，變異Fc區域包括至少一胺基酸殘基修改(例如，取代)。在一些特定實施例中，相較於親本Fc區域，發明的變異Fc區域對猴子FcγRIIb具有增加的結合活性。在一些特定實施例中，猴子FcγRIIb為恆河猴FcγRIIb(序列辨識號：223)。
在一些特定實施例中，[親本Fc區域對猴子FcγRIIb的KD值]/[變異Fc區域對猴子FcγRIIb的KD值]的比值可為2.0或更大、3.0或更大、4.0或更大、5.0或更大、6.0或更大、7.0或更大、8.0或更大、9.0或更大、10或更大、15或更大、20或更大、25或更大、30或更大、40或更大、或50或更大。在又一些實施例中，變異Fc區域對猴子FcγRIIIa具有降低的結合活性。在一些特定實施例中，[親本Fc區域對猴子FcγRIIIa的KD值]/[變異Fc區域對猴子FcγRIIIa的KD值]的比值可為0.50或更小、0.40或更小、0.30或更小、0.20或更小、0.10或更小、0.09或更小、0.08或更小、0.07或更小、0.06或更小、0.05或更小、0.04或更小、0.03或更小、0.02或更小、或0.01或更小。在一些特定實施例中，猴子FcγRIIb具有序列辨識號：223的序列(恆河猴)。在一些特定實施例中，猴子FcγRIIIa具有序列辨識號：224的序列(恆河猴)。
在又一些實施例中，變異Fc區域對人類FcγRIIb具有增強的結合活性。在一些特定實施例中，[親本Fc區域對人類FcγRIIb的KD值]/[變異Fc區域對人類FcγRIIb的KD值]的比值可為2.0或更大、3.0或更大、4.0或更大、5.0或更大、 6.0或更大、7.0或更大、8.0或更大、9.0或更大、10或更大、15或更大、20或更大、25或更大、30或更大、40或更大、或50或更大。在又一些實施例中，變異Fc區域對人類FcγRIIIa具有降低的結合活性。在一些特定實施例中，[親本Fc區域對人類FcγRIIIa的KD值]/[變異Fc區域對人類FcγRIIIa的KD值]的比值可為0.50或更小、0.40或更小、0.30或更小、0.20或更小、0.10或更小、0.09或更小、0.08或更小、0.07或更小、0.06或更小、0.05或更小、0.04或更小、0.03或更小、0.02或更小、或0.01或更小。在一些特定實施例中，人類FcγRIIb具有序列辨識號：212、213或214的序列。在一些特定實施例中，人類FcγRIIIa具有序列辨識號：215、216、217或218的序列。
在又一些實施例中，變異Fc區域對人類FcγRIIa(H型)具有比對人類FcγRIIb低的結合活性。在一些特定實施例中，[親本Fc區域對人類FcγRIIa(H型)的KD值]/[變異Fc區域對人類FcγRIIa(H型)的KD值]的比值可為5.0或更小、4.0或更小、3.0或更小、2.0或更小、1.0或更小、0.9或更小、0.8或更小、0.7或更小、0.6或更小、0.5或更小、0.4或更小、0.3或更小、0.2或更小、或0.1或更小。在又一些實施例中，變異Fc區域對人類FcγRIIa(R型)具有比對人類FcγRIIb低的結合活性。在一些特定實施例中，[親本Fc區域對人類FcγRIIa(R型)的KD值]/[變異Fc區域對人類FcγRIIa(R型)的KD值]的比值可為5.0或更小、4.0或更小、3.0或更小、2.0或更小、1.0或更小、0.9或更小、0.8或更小、0.7或更小、0.6或更小、0.5 或更小、0.4或更小、0.3或更小、0.2或更小、或0.1或更小。在一些特定實施例中，人類FcγRIIa(H型)具有序列辨識號：211的序列。在一些特定實施例中，人類FcγRIIa(R型)具有序列辨識號：210的序列。
在一些特定實施例中，[親本Fc區域對猴子FcγRIIa的KD值]/[變異Fc區域對猴子FcγRIIa的KD值]的比值可為2.0或更大、3.0或更大、4.0或更大、5.0或更大、6.0或更大、7.0或更大、8.0或更大、9.0或更大、10或更大、15或更大、20或更大、25或更大、30或更大、40或更大、或50或更大。在一些特定實施例中，猴子FcγRIIa是擇自於：猴子FcγRIIa1(例如，恆河猴FcγRIIa1(序列辨識號：220))、猴子FcγRIIa2(例如，恆河猴FcγRIIa2(序列辨識號：221))及猴子FcγRIIa3(例如，恆河猴FcγRIIa3(序列辨識號：222)。
在另一實施例中，變異Fc區域對猴子FcγRIIb的KD值可為1.0×10-6 M或更小、9.0×10-7 M或更小、8.0×10-7 M或更小、7.0×10-7 M或更小、6.0×10-7 M或更小、5.0×10-7 M或更小、4.0×10-7 M或更小、3.0×10-7 M或更小、2.0×10-7 M或更小、或1.0×10-7 M或更小。在另一實施例中，變異Fc區域對猴子FcγRIIIa的KD值可為5.0×10-7 M或更大、6.0×10-7 M或更大、7.0×10-7 M或更大、8.0×10-7 M或更大、9.0×10-7 M或更大、1.0×10-6 M或更大、2.0×10-6 M或更大、3.0×10-6 M或更大、4.0×10-6 M或更大、5.0×10-6 M或更大、6.0×10-6 M或更大、7.0×10-6 M或更大、8.0×10-6 M或更大、9.0×10-6 M或更大、或1.0×10-5 M或更大。在另一實施例中，變異Fc區 域對人類FcγRIIb的KD值可為2.0×10-6 M或更小、1.0×10-6 M或更小、9.0×10-7 M或更小、8.0×10-7 M或更小、7.0×10-7 M或更小、6.0×10-7 M或更小、5.0×10-7 M或更小、4.0×10-7 M或更小、3.0×10-7 M或更小、2.0×10-7 M或更小、或1.0×10-7 M或更小。在另一實施例中，變異Fc區域對人類FcγRIIIa的KD值可為1.0×10-6 M或更大、2.0×10-6 M或更大、3.0×10-6 M或更大、4.0×10-6 M或更大、5.0×10-6 M或更大、6.0×10-6 M或更大、7.0×10-6 M或更大、8.0×10-6 M或更大、9.0×10-6 M或更大、1.0×10-5 M或更大、2.0×10-5 M或更大、3.0×10-5 M或更大、4.0×10-5 M或更大、或5.0×10-5 M或更大。在另一實施例中，變異Fc區域對人類FcγRIIa(H型)的KD值可為1.0×10-7 M或更大、2.0×10-7 M或更大、3.0×10-7 M或更大、4.0×10-7 M或更大、5.0×10-7 M或更大、6.0×10-7 M或更大、7.0×10-7 M或更大、8.0×10-7 M或更大、9.0×10-7 M或更大、1.0×10-6 M或更大、2.0×10-6 M或更大、3.0×10-6 M或更大、4.0×10-6 M或更大、或5.0×10-6 M或更大。在另一實施例中，變異Fc區域對人類FcγRIIa(R型)的KD值可為2.0×10-7 M或更大、3.0×10-7 M或更大、4.0×10-7 M或更大、5.0×10-7 M或更大、6.0×10-7 M或更大、7.0×10-7 M或更大、8.0×10-7 M或更大、9.0×10-7 M或更大、1.0×10-6 M或更大、2.0×10-6 M或更大、3.0×10-6 M或更大、4.0×10-6 M或更大、或5.0×10-6 M或更大。
在另一實施例中，變異Fc區域對猴子FcγRIIa的KD值可為1.0×10-6 M或更小、9.0×10-7 M或更小、8.0×10-7 M或更小、7.0×10-7 M或更小、6.0×10-7 M或更小、5.0×10-7 M 或更小、4.0×10-7 M或更小、3.0×10-7 M或更小、2.0×10-7 M或更小、或1.0×10-7 M或更小。在一些特定實施例中，猴子FcγRIIa可擇自猴子FcγRIIa1、猴子FcγRIIa2及猴子FcγRIIa3中任一者。
當我們開發用於治療人類疾病的醫藥產品時，由於猴子與人類的生物接近性，在猴子中評估它的效率及安全性是重要的。由此觀點，將被開發的醫藥產品較佳為在目標結合活性中對人類及猴子兩者具有交叉反應。
“Fcγ受體”(於本文中，稱為Fcγ受體、FcγR或FcgR)是指可結合至IgG1、IgG2、IgG3及IgG4單株抗體的Fc區域的受體，且實際上代表由Fcγ受體基因所編碼的蛋白質家族的任一成員。在人類中，此家族包含FcγRI(CD64)，其包含同型異構物FcγRIa、FcγRIb及FcγRIc；FcγRII(CD32)，其包含同型異構物FcγRIIa(包含異型H131(H型)及R131(R型))、FcγRIIb(包含FcγRIIb-1及FcγRIIb-2)及FcγRIIc；以及FcγRIII(CD16)，其包含同型異構物FcγRIIIa(包含異型V158及F158)及FcγRIIIb(包含異型FcγRIIIb-NA1及FcγRIIIb-NA2)、及任一尚未被發現的FcγRs、FcγR同型異構物或異型，但不限於此。已有報導指出FcγRIIb1及FcγRIIb2為人類FcγRIIb的剪接變異體。此外，命名為FcγRIIb3的剪接變異體已被報導(J Exp Med,1989,170：1369-1385)。除了這些剪接變異體之外，人類FcγRIIb包含所有註冊於NCBI的剪接變異體，其為NP_001002273.1、NP_001002274.1、NP_001002275.1、NP_001177757.1及NP_003992.3。此外，人 類FcγRIIb包含先前報導的每一基因同質異型(genetic polymorphism)還有FcγRIIb(Arthritis Rheum. 48：3242-3252(2003)；Kono等人，Hum.Mol.Genet. 14：2881-2892(2005)；及Kyogoju等人，Arthritis Rheum. 46：1242-1254(2002))以及將於未來報導的每一基因同質異型。
在FcγRIIa中，有兩種異型，其一FcγRIIa在胺基酸位置131為組胺酸(H型)，另一在胺基酸位置131被精氨酸取代(R型)(Warrmerdam，J.Exp.Med. 172：19-25(1990))。
FcγR包含人類、小鼠、大鼠、兔子及猴子衍生的FcγRs，但不限於此，且可衍生自任一生物。小鼠FcγR包含FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、FcγRIII(CD16)及FcγRIII-2(CD16-2)及任一小鼠FcγR或FcγR同型異構物，但不限於此。除非另有說明，術語“猴子FcγR”或其變化型，指恆河猴FcγRIIa1(序列辨識號：220)、FcγRIIa2(序列辨識號：221)、FcγRIIa3(序列辨識號：222)、FcγRIIb(序列辨識號：223)或FcγRIIIaS(序列辨識號：224)。
人類FcγRI的多核苷酸序列如序列辨識號：199(NM_000566.3)所示；人類FcγRIIa的多核苷酸序列如序列辨識號：200(BC020823.1)或序列辨識號：201(NM_001136219.1)所示；人類FcγRIIb的多核苷酸序列如序列辨識號：202(BC146678.1)或序列辨識號：203(NM_004001.3)所示；人類FcγRIIIa的多核苷酸序列如序列辨識號：204(BC033678.1)或序列辨識號：205(NM_001127593.1)所示；以及人類FcγRIIIb的多核苷酸 序列如序列辨識號：206(BC128562.1)所示。
人類FcγRI的胺基酸序列如序列辨識號：207(NP_000557.1)所示；人類FcγRIIa的胺基酸序列如序列辨識號：208(AAH20823.1)、序列辨識號：209、序列辨識號：210或序列辨識號：211所示；人類FcγRIIb的胺基酸序列如序列辨識號：212(AAI46679.1)、序列辨識號：213或序列辨識號：214所示；人類FcγRIIIa的胺基酸序列如序列辨識號：215(AAH33678.1)、序列辨識號：216、序列辨識號：217或序列辨識號：218所示；以及人類FcγRIIIb的胺基酸序列如序列辨識號：219(AAI28563.1)所示。
恆河猴FcγRIIa的胺基酸序列如序列辨識號：220(FcγRIIa1)、序列辨識號：221(FcγRIIa2)或序列辨識號：222(FcγRIIa3)所示；恆河猴FcγRIIb的胺基酸序列如序列辨識號：223所示；以及恆河猴FcγRIIIa的胺基酸序列如序列辨識號：224所示。
在一態樣中，相較於對應的參考FcγRIIb結合多肽，發明提供包括具有增強的FcγRIIb結合活性的變異Fc區域的多肽。在又一些態樣中，發明的多肽包括至少一胺基酸修改，其在至少一個擇自於：231、232、233、234、235、236、237、238、239、264、266、267、268、271、295、298、325、326、327、328、330、331、332、334及396所組成之群組的位置，根據EU編號。在一些特定實施例中，FcγRIIb具有恆河猴FcγRIIb的序列(序列辨識號：223)。在一些特定實施例中，FcγRIIb具有人類FcγRIIb的序列(例如，序列辨識號：212、213、 或214)。
在一態樣中，發明提供包括具有增強的FcγRIIb結合活性的變異Fc區域的多肽，其包括至少兩個胺基酸修改，包括：(a)在位置236的一胺基酸修改；以及(b)至少一胺基酸修改，其在至少一擇自於：231、232、233、234、235、237、238、239、264、266、267、268、271、295、298、325、326、327、328、330、331、332、334及396所組成之群組的位置，根據EU編號。在一些特定實施例中，FcγRIIb具有恆河猴FcγRIIb的序列(序列辨識號：223)。在一些特定實施例中，FcγRIIb具有人類FcγRIIb的序列(例如，序列辨識號：212、213或214)。
在一態樣中，發明提供包括具有增強的FcγRIIb結合活性的變異Fc區域的多肽，其包括在位置236的胺基酸修改，根據EU編號。
在一態樣中，發明提供包括具有增強的FcγRIIb結合活性的變異Fc區域的多肽，其包括在至少兩個胺基酸修改，包括：(a)在位置236的一胺基酸修改；以及(b)至少一胺基酸修改，其在至少一擇自於：231、232、235、239、268、295、298、326、330及396所組成之群組的位置，根據EU編號。在又一實施例中，變異Fc區域包括一胺基酸修改，其在至少一擇自於：231、232、235、239、268、295、298、326、330及396所組成之群組的位置，根據EU編號。在又一實施例中，變異Fc區域包括一胺基酸修改，其在至少一擇自於：268、295、326及330所組成之群組的位置，根據EU編號。 在一些特定實施例中，FcγRIIb具有恆河猴FcγRIIb的序列(序列辨識號：223)。在一些特定實施例中，FcγRIIb具有人類FcγRIIb的序列(例如，序列辨識號：212、213或214)。
在另一態樣中，發明提供包括具有增強的FcγRIIb結合活性的變異Fc區域的多肽，其包括下列(1)-(37)中任一的胺基酸修改：(1)位置231、236、239、268及330；(2)位置231、236、239、268、295及330；(3)位置231、236、268及330；(4)位置231、236、268、295及330；(5)位置232、236、239、268、295及330；(6)位置232、236、268、295及330；(7)位置232、236、268及330；(8)位置235、236、268、295、326及330；(9)位置235、236、268、295及330；(10)位置235、236、268及330；(11)位置235、236、268、330及396；(12)位置235、236、268及396；(13)位置236、239、268、295、298及330；(14)位置236、239、268、295、326及330；(15)位置236、239、268、295及330；(16)位置236、239、268、298及330；(17)位置236、239、268、326及330；(18)位置236、239、268及330；(19)位置236、239、268、330及396；(20)位置236、239、268及396；(21)位置236及268；(22)位置236、268及295；(23)位置236、268、295、298及330；(24)位置236、268、295、326及330；(25)位置236、268、295、326、330及396；(26)位置236、268、295及330；(27)位置236、268、295、330及396；(28)位置236、268、298及330；(29)位置236、268、298及396；(30)位置236、268、326及330；(31)位置236、268、326、330及396；(32)位置236、268 及330；(33)位置236、268、330及396；(34)位置236、268及396；(35)位置236及295；(36)位置236、330及396；以及(37)位置236及396，根據EU編號。在一些特定實施例中，FcγRIIb具有恆河猴FcγRIIb的序列(序列辨識號：223)。在一些特定實施例中，FcγRIIb具有人類FcγRIIb的序列(例如，序列辨識號：212,213或214)。
在又一實施例中，具有增強的FcγRIIb結合活性的變異Fc區域包括至少一胺基酸，其擇自於：(a)Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr在位置231；(b)Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr在位置232；(c)Asp在位置233；(d)Trp、Tyr在位置234；(e)Trp在位置235；(f)Ala、Asp、Glu、His、Ile、Leu、Met、Asn、Gln、Ser、Thr、Val在位置236；(g)Asp、Tyr在位置237；(h)Glu、Ile、Met、Gln、Tyr在位置238；(i)Ile、Leu、Asn、Pro、Val在位置239；(j)Ile在位置264；(k)Phe在位置266；(l)Ala、His、Leu在位置267；(m)Asp、Glu在位置268；(n)Asp、Glu、Gly在位置271；(o)Leu在位置295；(p)Leu在位置298；(q)Glu、Phe、Ile、Leu在位置325；(r)Thr在位置326；(s)Ile、Asn在位置327；(t)Thr在位置328；(u)Lys、Arg在位置330；(v)Glu在位置331；(w)Asp在位置332；(x)Asp、Ile、Met、Val、Tyr在位置334；以及(y)Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr在位置39所組成的群組，根據EU 編號。在一些特定實施例中，FcγRIIb具有恆河猴FcγRIIb的序列(序列辨識號：223)。在一些特定實施例中，FcγRIIb具有人類FcγRIIb的序列(例如，序列辨識號：212、213或214)。
在又一實施例中，具有增強的FcγRIIb結合活性的變異Fc區域包括至少一胺基酸修改(例如，取代)，其擇自於(a)Gly、Thr在位置231；(b)Asp在位置232；(c)Trp在位置235；(d)Asn、Thr在位置236；(e)Val在位置239；(f)Asp、Glu在位置268；(g)Leu在位置295；(h)Leu在位置298；(i)Thr在位置326；(j)Lys、Arg在位置330；以及(k)Lys、Met在位置396所組成的群組，根據EU編號。在又一實施例中，具有增強的FcγRIIb結合活性的變異Fc區域包括：Asn在位置236、Glu在位置268、Lys在位置330及Met在位置396的胺基酸修改(例如，取代)，根據EU編號。在又一實施例中，具有增強的FcγRIIb結合活性的變異Fc區域包括：Asn在位置236、Asp在位置268及Lys在位置330的胺基酸修改(例如，取代)，根據EU編號。在又一實施例中，具有增強的FcγRIIb結合活性的變異Fc區域包括：Asn在位置236、Asp在位置268、Leu在位置295及Lys在位置330的胺基酸修改(例如，取代)，根據EU編號。在又一實施例中，具有增強的FcγRIIb結合活性的變異Fc區域包括：Thr在位置236、Asp在位置268及Lys在位置330的胺基酸修改(例如，取代)，根據EU編號。在又一實施例中，具有增強的FcγRIIb結合活性的變異Fc區域包括：Asn在位置236、Asp在位置268、Leu在位置295、Thr在位置326及Lys在位置330的胺基酸修改(例如，取代)，根據EU編號。在又 一實施例中，具有增強的FcγRIIb結合活性的變異Fc區域包括：Trp在位置235、Asn在位置236、Asp在位置268、Leu在位置295、Thr在位置326及Lys在位置330的胺基酸修改(例如，取代)，根據EU編號。
在一態樣中，發明提供包括具有增強的FcγRIIb結合活性的Fc區域的多肽，其包括一胺基酸修改在位置238，根據EU編號。
在一態樣中，發明提供包括具有增強的FcγRIIb結合活性的Fc區域的多肽，其包括至少一胺基酸修改，其在至少一擇自於：234、238、250、264、267、307及330所組成之群組的位置，根據EU編號。在又一些實施例中，多肽包括至少一胺基酸修改，其在至少一擇自於：234、250、264、267、307及330所組成之群組的位置，根據EU編號。在一些特定實施例中，FcγRIIb具有恆河猴FcγRIIb的序列(序列辨識號：223)。在一些特定實施例中，FcγRIIb具有人類FcγRIIb的序列(例如，序列辨識號：212、213或214)。
在另一態樣中，發明提供包括具有增強的FcγRIIb結合活性的Fc區域的多肽，其包括下列(1)-(9)中任一的胺基酸修改：(1)位置234、238、250、307及330；(2)位置234、238、250、264、307及330；(3)位置234、238、250、264、267、307及330；(4)位置234、238、250、267、307及330；(5)位置238、250、264、307及330；(6)位置238、250、264、267、307及330；(7)位置238、250、267、307及330；(8)位置238、250及307；以及(9)位置238、250、307及330， 根據EU編號。在一些特定實施例中，FcγRIIb具有恆河猴FcγRIIb的序列(序列辨識號：223)。在一些特定實施例中，FcγRIIb具有人類FcγRIIb的序列(例如，序列辨識號：212、213或214)。
在又一實施例中，具有增強的FcγRIIb結合活性的變異Fc區域包括至少一胺基酸修改(例如，取代)，其擇自於：(a)Tyr在位置234；(b)Asp在位置238；(c)Val在位置250；(d)Ile在位置264；(e)Ala在位置267；(f)Pro在位置307；及(g)Lys在位置330所組成的群組，根據EU編號。在又一實施例中，具有增強的FcγRIIb結合活性的變異Fc區域包括：Asp在位置238的胺基酸修改(例如，取代)，根據EU編號。在又一實施例中，具有增強的FcγRIIb結合活性的變異Fc區域包括：Asp在位置238、Val在位置250及Pro在位置307的胺基酸修改(例如，取代)，根據EU編號。在又一實施例中，具有增強的FcγRIIb結合活性的變異Fc區域包括：Asp在位置238、Val在位置250、Pro在位置307及Lys在位置330的胺基酸修改(例如，取代)，根據EU編號。在又一實施例中，具有增強的FcγRIIb結合活性的變異Fc區域包括：Asp在位置238、Val在位置250、Ile在位置264、Pro在位置307及Lys在位置330的胺基酸修改(例如，取代)，根據EU編號。在又一實施例中，具有增強的FcγRIIb結合活性的變異Fc區域包括：Asp在位置238、Val在位置250、Ala在位置267、Pro在位置307及Lys在位置330的胺基酸修改(例如，取代)，根據EU編號。在又一實施例中，具有增強的FcγRIIb結合活性的變異Fc區域包 括：Tyr在位置234、Asp在位置238、Val在位置250、Pro在位置307及Lys在位置330的胺基酸修改(例如，取代)，根據EU編號。在又一實施例中，具有增強的FcγRIIb結合活性的變異Fc區域包括：Tyr在位置234、Asp在位置238、Val在位置250、Ala在位置267、Pro在位置307及Lys在位置330的胺基酸修改(例如，取代)，根據EU編號。在又一實施例中，具有增強的FcγRIIb結合活性的變異Fc區域包括：Asp在位置238、Val在位置250、Ile在位置264、Ala在位置267、Pro在位置307及Lys在位置330的胺基酸修改(例如，取代)，根據EU編號。在又一實施例中，具有增強的FcγRIIb結合活性的變異Fc區域包括：Tyr在位置234、Asp在位置238、Val在位置250、Ile在位置264、Pro在位置307及Lys在位置330的胺基酸修改(例如，取代)，根據EU編號。在又一實施例中，具有增強的FcγRIIb結合活性的變異Fc區域包括：Tyr在位置234、Asp在位置238、Val在位置250、Ile在位置264、Ala在位置267、Pro在位置307及Lys在位置330的胺基酸修改(例如，取代)，根據EU編號。在一些特定實施例中，FcγRIIb具有恆河猴FcγRIIb的序列(序列辨識號：223)。在一些特定實施例中，FcγRIIb具有人類FcγRIIb的序列(例如，序列辨識號：212、213或214)。
在另一態樣中，發明提供分離的多肽，其包括具有增加的等電點(pI)的變異Fc區域。在一些特定實施例中，本文所述的變異Fc區域包括至少兩個胺基酸修改於親本Fc區域中。在一些特定實施例中，相較於親本Fc區域的等電點，每 一胺基酸修改增加變異Fc區域的等電點。它們是以至少兩個胺基酸殘基的修飾而具有增加pI的抗體可提升抗原自血漿消除的發現為基礎，例如當抗體施用於體內時。
在本發明中，pI可為理論的或實驗測定的pI。pI的值可，例如，藉由所屬領域具有通常知識者習知的等電聚焦(isoelectric focusing)加以測定。理論的pI值可，例如，利用基因及胺基酸序列分析軟體(Genetyx等)加以計算。
在一實施例中，相較於修飾前，pI值可增加，例如，至少0.01、0.03、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5或更多，至少0.6、0.7、0.8、0.9或更多，至少1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5或更多，或至少1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、3.0或更多。
在一些特定實施例中，用於增加pI的胺基酸可暴露於變異Fc區域的表面上。在本發明中，可暴露於表面上的胺基酸通常是指位於構成變異Fc區域的多肽的表面上的胺基酸殘基。位於多肽的表面上的胺基酸殘基指側鏈可與溶劑分子(其一般且大多為水分子)接觸的胺基酸殘基。然而，側鏈不一定要完全地與溶劑分子接觸，且甚至當一部分的側鏈與溶劑分子接觸，該胺基酸也定義為“位於表面上的胺基酸殘基”。多肽的位於表面上的胺基酸殘基也包含接近表面因而可被另一側鏈與溶劑分子接觸(甚至部分地)的胺基酸殘基影響電荷的胺基酸殘基。所屬領域具有通常知識者可製備多肽的同源模型，例如，利用市面上可取得的軟體。或者，可能利用所屬領域具有通常知識者習知的方法，像是X光晶體學。可暴露於表面上 的胺基酸殘基可，例如，利用三維模型的座標進行判定，其利用電腦程式像是InsightII程式(Accelrys)。可暴露的表面的位置可利用所屬技術領域習知的演算法(例如，Lee及Richards(J.Mol.Biol. 55：379-400(1971))；Connolly(J.Appl.Cryst. 16：548-558(1983))進行判定。可暴露的表面的位置可利用適用於蛋白質模型及三維結構資訊的軟體進行判定。可用於這類用途的軟體包含，例如，SYBYL Biopolymer Module軟體(Tripos Associates)。當演算法需要使用者輸入尺寸參數時，用於測量的探針(probe)的“尺寸”可設定為半徑約1.4埃(Å)或更小。此外，利用個人電腦軟體用以判定可暴露的表面的區域之方法已描述於Pacios(Comput.Chem. 18(4)：377-386(1994)；J.Mol.Model. 1：46-53(1995))。基於上述的這些資訊，位於構成變異Fc區域的多肽的表面上之合適的胺基酸殘基可被挑選。
在一些特定實施例中，多肽包括變異Fc區域以及抗原結合域。在又一些實施例中，抗原為可溶性抗原。在一實施例中，抗原出現於對象的生物液中(例如，血漿、組織液、淋巴液、腹水及胸膜液)。抗原亦可為膜抗原。
在又一些實施例中，抗原結合域的抗原結合活性根據離子濃度條件而改變。在一實施例中，離子濃度並未特別限定，是指氫離子濃度(pH)或金屬離子濃度。於本文中，金屬離子指除了氫之外的I族元素的離子，像是鹼金屬及銅(copper)族元素、II族元素如鹼土金屬及鋅族元素、除了硼之外的III族元素、除了碳及矽之外的IV族元素、VIII族元素如鐵族及鉑族元素、屬於V、VI及VII族的亞族A的元素、以及金屬 元素如銻、鉍及釙。在本發明中，金屬離子包含，例如，鈣離子，如WO 2012/073992及WO 2013/125667中所述。在一實施例中，“離子濃度條件”可為注重於抗原結合域在低離子濃度及高離子濃度之間生物行為不同的條件。此外，“抗原結合域的抗原結合活性根據離子濃度條件而改變”是指抗原結合域的抗原結合活性在低離子濃度及高離子濃度之間改變(例如，抗原結合域於本文中稱為“離子濃度依賴性抗原結合域”)。相較於在低離子濃度條件下，抗原結合域的抗原結合活性在高離子濃度條件下可為較高(較強)或較低(較弱)。在一實施例中，離子濃度依賴性抗原結合域(像是pH依賴性抗原結合域或鈣離子濃度依賴性抗原結合域)可藉由習知方法取得，例如，如WO 2009/125825、WO 2012/073992及WO 2013/046722中所述。
在本發明中，抗原結合域的抗原結合活性在高鈣離子濃度條件下可比在低鈣離子濃度條件下高。高鈣離子濃度並未特別限定，但可為擇自於100μM及10mM之間、200μM及5mM之間、400μM及3mM之間、200μM及2mM之間、400μM及1mM之間或500μM及2.5mM之間的濃度，其較佳為接近體內鈣離子的血漿(血液)濃度。與此同時，低鈣離子濃度並未特別限定，但可為擇自於0.1μM及30μM之間、0.2μM及20μM之間、0.5μM及10μM之間、1μM及5μM之間或2μM及4μM之間的濃度，其較佳為接近體內鈣離子在早期胞內體的濃度。
在一實施例中，抗體結合活性在低鈣離子濃度條件及高鈣離子濃度條件下的比值並未特別限定，但低鈣離子濃 度條件下的解離常數(KD)比上高鈣離子濃度條件下的KD的比值，即，KD(低鈣離子濃度條件)/KD(高鈣離子濃度條件)，為2或更大、10或更大、或40或更大。比值的上限可為400、1000或10000，只要這種抗原結合域可藉由所屬領域具有通常知識者習知的技術加以製造。或者，例如，可使用解離速率常數(kd)替代KD。在此情況下，低鈣離子濃度條件下的kd比上高鈣離子濃度條件下的kd的比值，即，kd(低鈣離子濃度條件)/kd(高鈣離子濃度條件)，為2或更大、5或更大、10或更大、或30或更大。比值的上限可為50、100或200，只要抗原結合域可基於所屬領域具有通常知識者的技術常識加以製造。
在本發明中，抗原結合域的抗原結合活性在低氫離子濃度下(中性pH)可比在高氫離子濃度下(酸性pH)來的高。酸性pH可為，例如，擇自於pH4.0至pH6.5、擇自於pH4.5至pH6.5、擇自於pH5.0至pH6.5、或擇自於pH5.5至pH6.5的pH，其較佳為接近早期胞內體的體內pH。酸性pH亦可為，例如，pH5.8或pH6.0。在一些特定實施例中，酸性pH為pH5.8。與此同時，中性pH可為，例如，擇自於pH6.7至pH10.0、擇自於pH6.7至pH9.5、擇自於pH7.0至pH9.0、或擇自於pH7.0至pH8.0的pH，其較佳為接近血漿(血液)中的體內pH。中性pH亦可為，例如，pH7.4或pH7.0。在一些特定實施例中，中性pH為pH7.4。
在一實施例中，抗體結合活性在酸性pH條件與在中性pH條件下的比值並未限定，但酸性pH條件下的解離常數(KD)比上中性pH條件下的KD的比值，即，KD(酸性pH條 件)/KD(中性pH條件)，為2或更大、10或更大、或40或更大。比值的上限可為400、1000或10000，只要這種抗原結合域可藉由所屬領域具有通常知識者習知的技術加以製造。或者，例如，可使用解離速率常數(kd)替代KD。在此情況下，酸性pH條件下的kd比上中性pH條件下的kd的比值，即，kd(酸性pH條件)/kd(中性pH條件)，為2或更大、5或更大、10或更大、或30或更大。比值的上限可為50、100或200，只要抗原結合域可基於所屬領域具有通常知識者的技術常識加以製造。
在一實施例中，例如，至少一胺基酸殘基被具有4.0-8.0的側鏈pKa的胺基酸殘基取代，及/或至少一具有4.0-8.0的側鏈pKa的胺基酸插入於抗體結合域中，如WO 2009/125825中所述。胺基酸可在任一位置被取代及/或插入，只要相較於取代或插入之前，抗原結合域的抗原結合活性在酸性pH條件下變得比在中性pH條件下弱。當抗原結合域具有可變區或CDR時，位置可在可變區或CDR內。被取代或插入的胺基酸數量可藉由習知方法適當地進行判定；且數量可為一或多個。具有4.0-8.0的側鏈pKa的胺基酸可用以改變抗原結合域的抗原結合活性，根據氫離子濃度條件。此類胺基酸包含，例如，中性胺基酸如His(H)及Glu(E)，及非中性胺基酸如組胺酸類似物(US2009/0035836)、m-NO2-Tyr(pKa 7.45)、3,5-Br2-Tyr(pKa 7.21)及3,5-I2-Tyr(pKa 7.38)(Heyl等人，Bioorg.Med.Chem. 11(17)：3761-3768(2003))。亦可使用具有6.0-7.0的側鏈pKa的胺基酸，其包含，例如，His(H)。
在另一實施例中，對於具有增加pI的變異Fc區 域，較佳的抗原結合域已被描述且可藉由日本專利申請號JP2015-021371及JP2015-185254所述之方法取得。
在一些特定實施例中，具有增加的pI的變異Fc區域包括至少兩個胺基酸修改，其在至少兩個擇自於：285、311、312、315、318、333、335、337、341、342、343、384、385、388、390、399、400、401、402、413、420、422及431所組成之群組的位置，根據EU編號。
在又一些實施例中，具有增加的pI的變異Fc區域包括至少兩個胺基酸修改，其在至少兩個擇自於：311、341、343、384、399、400、401、402及413所組成之群組的位置，根據EU編號。
在另一態樣中，發明提供包括具有增加的pI的變異Fc區域之多肽，其包括下列(1)-(10)中任一的胺基酸修改：(1)位置311及341；(2)位置311及343；(3)位置311、343及413；(4)位置311、384及413；(5)位置311及399；(6)位置311及401；(7)位置311及413；(8)位置400及413；(9)位置401及413；以及(10)位置402及413，根據EU編號。
增加蛋白質的pI的方法為，例如，減少帶有負電荷側鏈的胺基酸數量(例如，天門冬胺酸及谷胺酸)及/或增加帶有正電荷側鏈的胺基酸數量(例如，精胺酸、賴胺酸及組胺酸)於中性pH條件。帶有負電荷側鏈的胺基酸在充分地高於它們的側鏈pKa的pH條件下，具有表示為-1的負電荷，此為所屬領域具有通常知識者熟知的理論。例如，天門冬胺酸的側鏈的理論的pKa為3.9，且側鏈在中性pH條件(例如，在pH7.0的 溶液中)具有表示為-1的負電荷。相反地，帶有正電荷側鏈的胺基酸在充分地低於它們的側鏈pKa的pH條件下，具有表示為+1的正電荷。例如，精胺酸的側鏈的理論的pKa為12.5，且側鏈在中性pH條件(例如，在pH7.0的溶液中)具有表示為+1的正電荷。同時，中性pH條件下(例如，在pH7.0的溶液中)，側鏈不帶電荷的胺基酸已知包含15種中性胺基酸，即，丙胺酸、半胱胺酸、苯丙胺酸、甘胺酸、異白胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、天冬醯胺、脯胺酸、谷氨醯胺、絲胺酸、蘇胺酸、纈胺酸、色胺酸及酪胺酸。理所當然，可理解的是增加pI的胺基酸可為非中性胺基酸。
承前述，增加蛋白質在在中性pH條件(例如，在pH7.0的溶液中)的pI之方法可賦予感興趣的蛋白質+1的電荷改變，例如，藉由側鏈不帶電荷的胺基酸取代天門冬胺酸或谷胺酸(其側鏈具有-1的負電荷)於蛋白質的胺基酸序列。此外，可賦予蛋白質+1的電荷改變，例如，藉由精胺酸或賴胺酸(其側鏈具有+1的正電荷)取代側鏈不帶電荷的胺基酸。再者，可藉由精胺酸或賴胺酸(其側鏈具有+1的正電荷)取代天門冬胺酸或谷胺酸(其側鏈具有-1的負電荷)以同時賦予蛋白質+2的電荷改變。或者，為了增加蛋白質的pI，具有不帶電荷的側鏈的胺基酸及/或較佳地具有正電荷側鏈的胺基酸可被加入或插入至蛋白質的胺基酸列中，或具有不帶電荷的側鏈的胺基酸及/或較佳地具有負電荷側鏈的胺基酸可在蛋白質的胺基酸列中被刪除。可理解的是，例如，除了它們的側鏈衍生的電荷外，蛋白質的N末端及C末端胺基酸殘基具有主鏈衍生的電荷(在 N末端的胺基的NH3 + 以及在C末端的羧基的COO- )。因此，亦可藉由實行一些加入、刪除、取代或插入於主鏈衍生的官能基以增加蛋白質的pI。
用以增加pI的胺基酸取代包含，例如，以側鏈不帶電荷的胺基酸取代具有負電荷側鏈的胺基酸、以具有正電荷側鏈的胺基酸取代側鏈不帶電荷的胺基酸、及以具有正電荷側鏈的胺基酸取代具有負電荷側鏈的胺基酸於親本Fc區域的胺基酸序列中，其可單獨或以適當的組合實行。
用以增加pI的胺基酸插入或加入包含，例如，插入或加入側鏈不帶電荷的胺基酸及/或插入或加入具有正電荷側鏈的胺基酸於親本Fc區域的胺基酸序列中，其可單獨或以適當的組合實行。
用以增加pI的胺基酸刪除包含，例如，刪除側鏈不帶電荷的胺基酸及/或刪除具有負電荷側鏈的胺基酸於親本Fc區域的胺基酸序列中，其可單獨或以適當的組合實行。
在一實施例中，用於增加pI的自然胺基酸可歸類如下：(a)具有負電荷側鏈的胺基酸可為Glu(E)或Asp(D)；(b)側鏈不帶電荷的胺基酸可為Ala(A)、Asn(N)、Cys(C)、Gln(Q)、Gly(G)、His(H)、Ile(I)、Leu(L)、Met(M)、Phe(F)、Pro(P)、Ser(S)、Thr(T)、Trp(W)、Tyr(Y)或Val(V)；以及；(c)具有正電荷側鏈的胺基酸可為His(H)、Lys(K)或Arg(R)。在一實施例中，在修飾後的胺基酸插入或取代為Lys(K)或Arg(R)。
在另一態樣中，發明提供分離的多肽，其包括具 有增強的FcγRIIb結合活性及增加的pI的變異Fc區域。在一些特定實施例中，文中描述的變異Fc區域包括至少兩個胺基酸修改於親本Fc區域中。
在一態樣中，發明提供包括具有增強的FcγRIIb結合活性及增加的pI的變異Fc區域之多肽，其包括至少三個胺基酸修改，包括：(a)至少一胺基酸修改，其在至少一擇自於：231、232、233、234、235、236、237、238、239、264、266、267、268、271、295、298、325、326、327、328、330、331、332、334及396所組成之群組的位置，根據EU編號；以及(b)at至少兩個胺基酸修改，其在至少兩個擇自於：285、311、312、315、318、333、335、337、341、342、343、384、385、388、390、399、400、401、402、413、420、422及431所組成之群組的位置，根據EU編號。
在一態樣中，發明提供包括具有增強的FcγRIIb結合活性及增加的pI的變異Fc區域之多肽，且其包括至少三個胺基酸修改，包括：(a)至少一胺基酸修改，其在至少一擇自於：231、232、235、236、239、268、295、298、326、330及396所組成之群組的位置，根據EU編號；以及(b)至少兩個胺基酸修改，其在至少兩個擇自於：311、341、343、384、399、400、401、402及413所組成之群組的位置，根據EU編號。
在另一態樣中，發明提供包括具有增強的FcγRIIb結合活性及增加的pI的變異Fc區域之多肽，其包括下列(1)-(9)中任一的胺基酸修改：(1)位置235、236、268、295、311、326、330及343；(2)位置236、268、295、311、326、330及343； (3)位置236、268、295、311、330及413；(4)位置236、268、311、330、396及399；(5)位置236、268、311、330及343；(6)位置236、268、311、330、343及413；(7)位置236、268、311、330、384及413；(8)位置236、268、311、330及413；以及(9)位置236、268、330、396、400及413，根據EU編號。在一些特定實施例中，FcγRIIb具有恆河猴FcγRIIb的序列(序列辨識號：223)。在一些特定實施例中，FcγRIIb具有人類FcγRIIb的序列(例如，序列辨識號：212、213或214)。
在一態樣中，發明提供包括具有增強的FcγRIIb結合活性及增加的pI的變異Fc區域之多肽，其包括至少三個胺基酸修改，包括：(a)至少一胺基酸修改，其在至少一擇自於：234、238、250、264、267、307及330所組成之群組的位置，根據EU編號；以及(b)至少兩個胺基酸修改，其在至少兩個擇自於：285、311、312、315、318、333、335、337、341、342、343、384、385、388、390、399、400、401、402、413、420、422及431所組成之群組的位置，根據EU編號。在又一些實施例中，多肽包括至少兩個胺基酸修改，其在至少兩個擇自於：311、341、343、384、399、400、401、402及413所組成之群組的位置，根據EU編號。在一些特定實施例中，FcγRIIb具有恆河猴FcγRIIb的序列(序列辨識號：223)。在一些特定實施例中，FcγRIIb具有人類FcγRIIb的序列(例如，序列辨識號：212、213或214)。
在另一態樣中，發明提供包括具有增強的FcγRIIb結合活性及增加的pI的變異Fc區域之多肽，其包括下列 (1)-(16)中任一的胺基酸修改：(1)位置234、238、250、264、307、311、330及343；(2)位置234、238、250、264、307、311、330及413；(3)位置234、238、250、264、267、307、311、330及343；(4)位置234、238、250、264、267、307、311、330及413；(5)位置234、238、250、267、307、311、330及343；(6)位置234、238、250、267、307、311、330及413；(7)位置234、238、250、307、311、330及343；(8)位置234、238、250、307、311、330及413；(9)位置238、250、264、267、307、311、330及343；(10)位置238、250、264、267、307、311、330及413；(11)位置238、250、264、307、311、330及343；(12)位置238、250、264、307、311、330及413；(13)位置238、250、267、307、311、330及343；(14)位置238、250、267、307、311、330及413；(15)位置238、250、307、311、330及343；以及(16)位置238、250、307、311、330及413，根據EU編號。
在又一實施例中，變異Fc區域包括擇自於單一修改、單一修改的組合或如表14-30所述之修改的組合中任一的胺基酸修改。
在一些實施例中，多肽包括本發明的變異Fc區域。在又一實施例中，多肽為抗體重鏈恆定區。在又一實施例中，多肽為抗體重鏈。在又一實施例中，多肽為抗體。在又一實施例中，多肽為Fc融合蛋白。
在又一實施例中，發明提供包括序列辨識號：229-381中任一的胺基酸序列的多肽。
文中使用的“親本Fc區域”是指在本文所述的胺基酸修改導入之前的Fc區域。較佳的親本Fc區域的例子包含衍生自自然抗體的Fc區域。抗體包含，例如，IgA(IgA1、IgA2)、IgD、IgE、IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)及IgM等。抗體可衍生自人類或猴子(例如，恆河猴、恆河獼猴、狨猿、黑猩猩或狒狒)。自然抗體亦可包含自然產生的突變。起因於基因同質異型的許多IgG的異型序列已描述於“免疫學興趣的蛋白的序列”，NIH公開號91-3242，且它們的任一均可用於本發明。特別地，對於人類IgG1，在位置356至358(EU編號)的胺基酸序列可為DEL或EEM。親本Fc區域的較佳例子包含衍生自人類IgG1(序列辨識號：195)、人類IgG2(序列辨識號：196)、人類IgG3(序列辨識號：197)及人類IgG4(序列辨識號：198)的重鏈恆定區的Fc區域。親本Fc區域的另一較佳例子為衍生自重鏈恆定區SG1(序列辨識號：9)的Fc區域。此外，親本Fc區域可為藉由添加本文所述的胺基酸修改之外的胺基酸修改於衍生自自然抗體的Fc區域加以製造的Fc區域。
此外，為了其它目的而實行的胺基酸修改可結合於本文所述的變異Fc區域中。例如，可添加改善FcRn結合活性的胺基酸取代(Hinton等人，J.Immunol. 176(1)：346-356(2006)；Dall'Acqua等人，J.Biol.Chem. 281(33)：23514-23524(2006)；Petkova等人，Intl.Immunol. 18(12)：1759-1769(2006)；Zalevsky等人，Nat.Biotechnol. 28(2)：157-159(2010)；WO 2006/019447；WO 2006/053301；及WO 2009/086320)，以及用以改善抗體異質性或穩定性的胺基酸取代(WO 2009/041613)。或者，可將已於WO 2011/122011、WO 2012/132067、WO 2013/046704或WO 2013/180201中描述之具有提升抗原清除的特性的多肽，已於WO 2013/180200中描述之具有特定結合於目標組織的特性的多肽，已於WO 2009/125825、WO 2012/073992或WO 2013/047752中描述之具有重複結合於多個抗原分子的特性的多肽，與本文所述的變異Fc區域結合。或者，以賦予其它抗原結合能力為目的，可將揭示於EP1752471及EP1772465中的胺基酸修改結合於本文所述的變異Fc區域的CH3中。或者，以增加血漿保持(plasma retention)為目的，可將降低恆定區的pI的胺基酸修改(WO 2012/016227)結合於本文所述的變異Fc區域中。或者，以提升細胞攝入為目的，可將增加恆定區的pI的胺基酸修改(WO 2014/145159)結合於本文所述的變異Fc區域中。或者，以提升自血漿消除目標分子為目的，可將增加恆定區的pI的胺基酸修改(日本專利申請號JP2015-021371及JP2015-185254)結合於本文所述的變異Fc區域中。在一實施例中，此類修改可包含，例如，在至少一擇自於311、343、384、399、400及413所組成之群組的位置的取代，根據EU編號。在又一實施例中，此類取代可為在每一位置以Lys或Arg取代胺基酸。
在酸性pH下增強人類FcRn結合活性的胺基酸修改亦可結合於本文所述的變異Fc區域中。具體而言，此類修改可包含，例如，以Leu取代在位置428的Met以及以Ser取代在位置434的Asn，根據EU編號(Zalevsky等人，Nat.Biotechnol. 28：157-159(2010))；以Ala取代在位置434的 Asn(Deng等人，Metab.Dispos. 38(4)：600-605(2010))；以Tyr取代在位置252的Met、以Thr取代在位置254的Ser以及以Glu取代在位置256的Thr(Dall'Acqua等人，J.Biol.Chem. 281：23514-23524(2006))；以Gln取代在位置250的Thr以及以Leu取代在位置428的Met(Hinton等人，J.Immunol. 176(1)：346-356(2006))；以His取代在位置434的Asn(Zheng等人，Clin.Pharmacol.Ther. 89(2)：283-290(2011)，以及WO 2010/106180、WO 2010/045193、WO 2009/058492、WO 2008/022152、WO 2006/050166、WO 2006/053301、WO 2006/031370、WO 2005/123780、WO 2005/047327、WO 2005/037867、WO 2004/035752或WO 2002/060919中所述的修改。此類修改可包含，例如，至少一擇自於：以Leu取代在位置428的Met、以Ala取代在位置434的Asn以及以Thr取代在位置436的Tyr所組成之群組的修改。那些修改可進一步包含以Arg取代在位置438的Gln及/或以Glu取代在位置440的Ser(日本專利申請號JP2015-021371及JP2015-185254)。
包括本文所述的變異Fc區域的兩個或多個多肽可被包含於一個分子中，其中包括變異Fc區域的兩個多肽為結合的(associated)，很類似抗體。抗體的種類並未限定，可使用IgA(IgA1、IgA2)、IgD、IgE、IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)及IgM等。
包括變異Fc區域的兩個結合的多肽可為包括已導入相同胺基酸修改的變異Fc區域的多肽(此後稱為同源變異Fc 區域)、或包括已導入不同胺基酸修改的變異Fc區域的多肽、或者是包括胺基酸修改僅導入其一的Fc區域的變異Fc區域的多肽(此後稱為包括變異Fc區域的異源多肽)。較佳的胺基酸修改之一為Fc區域的CH2域中從位置233至239(EU編號)的環狀構造中的修改，其涉及與FcγRIIb及FcγRIIa的結合。較佳地，修改被導入在增強FcγRIIb結合活性及/或選擇性的其中一個Fc區域的CH2域的環狀構造中，而另一修改被導入在去穩定(destabilize)它的另一個Fc區域的CH2域的環狀構造中。可去穩定CH2域的環狀結構之胺基酸修改的例子可為以其它胺基酸取代至少一擇自於在位置235、236、237、238及239的胺基酸。具體而言，去穩定可藉由，例如，將在位置235的胺基酸修改為Asp、Gln、Glu或Thr，將在位置236的胺基酸修改為Asn，將在位置237的胺基酸修改為Phe或Trp，將在位置238的胺基酸修改為Glu、Gly或Asn，及將在位置239的胺基酸修改為Asp或Glu，根據EU編號。
關於包括變異Fc區域的異源多肽的結合，可採用抑制包括變異Fc區域的同源多肽之非計畫中的結合的技術，藉由導入靜電斥力於Fc區域的CH2或CH3域的界面，如WO 2006/106905所述。
例如，與Fc區域的CH2或CH3域的界面接觸的胺基酸殘基包含CH3域中在位置356的殘基(EU編號)、在位置439的殘基(EU編號)、在位置357的殘基(EU編號)、在位置370的殘基(EU編號)、在位置399的殘基(EU編號)以及在位置409的殘基(EU編號)。
更具體而言，例如，可製造Fc區域，其中具有相同電荷的一至三對胺基酸殘基擇自於如下所示的(1)至(3)：(1)CH3域中在位置356及439的胺基酸殘基(EU編號)；(2)CH3域中在位置357及370的胺基酸殘基(EU編號)；以及(3)CH3域中在位置399及409的胺基酸殘基(EU編號)。
此外，可製造包括變異Fc區域的異源多肽，其中擇自於上述之(1)至(3)的一至三對胺基酸殘基在第一Fc區域的CH3域中具有相同電荷，擇自於前述第一Fc區域的胺基酸殘基對在第二Fc區域的CH3域中亦具有相同電荷，但第一及第二Fc區域中的電荷為相反的。
在上述Fc區域中，例如，負電荷的胺基酸殘基較佳擇自於谷胺酸(E)及天門冬胺酸(D)，而正電荷的胺基酸殘基較佳擇自於賴胺酸(K)、精胺酸(R)及組胺酸(H)。
可額外地使用其它已知技術於包括變異Fc區域的異源多肽的結合。具體而言，這種技術是藉由以較大的側鏈(旋鈕(knob)；其代表“凸塊”)取代存在於其中一個Fc區域中的胺基酸側鏈，以及以較小的的側鏈(孔洞；其代表空穴)取代存在於Fc區域中的胺基酸側鏈，以放置旋鈕於孔洞內。這可提升彼此具有不同胺基酸序列的含Fc區域的多肽(Fc region-containing polypeptide)之間的有效結合(WO 1996/027011；Ridgway等人，Prot.Eng. 9：617-621(1996)；Merchant等人，Nat.Biotech. 16,677-681(1998))。
此外，亦可使用其它已知技術於包括變異Fc區域的多肽的異源結合。可利用股交換工程(strand-exchange engineered)域CH3異型二聚體(heterodimer)(Davis等人，Prot.Eng.Des.& Sel. ,23：195-202(2010))有效地誘發包括Fc區域的多肽結合。此技術亦可用於有效地誘發具有不同胺基酸序列的含變異Fc區域的多肽之間的結合。
此外，亦可使用，如WO 2011/028952所述之利用抗體CH1及CL的結合以及VH及VL的結合之異型二聚抗體製造技術。
如WO 2008/119353及WO 2011/131746中所述之方法，使用藉由預先製造兩種同型二聚抗體、在還原條件下培養抗體以分離它們，並使它們再次結合之製造異型二聚抗體的技術亦為可能的。
如Strop(J.Mol.Biol. 420：204-219(2012))中所述之方法，使用藉由導入帶電荷的殘基如Lys、Arg、Glu及Asp使得靜電斥力被導入於CH3域中之製造異型二聚抗體的技術亦為可能的。
此外，如WO 2012/058768中所述之方法，使用藉由添加修改於CH2及CH3域之製造異型二聚抗體的技術亦為可能的。
當同時表達包括具有不同胺基酸序列的變異Fc區域的兩個多肽時，為了產生包括異源變異Fc區域的多肽，包括同源變異Fc區域的多肽通常亦作為雜質被產生。在這種情況下，藉由使用習知技術將它們自包括同源變異Fc區域的多肽分離及純化，可有效地取得包括異源變異Fc區域的多肽。已有報導指出利用離子交換層析有效地自同型二聚抗體分離 及純化異型二聚抗體的方法，其藉由導入胺基酸修改於兩種抗體重鏈的可變區中，以創造同型二聚抗體及異型二聚抗體之間的等電點差異(WO 2007/114325)。已有報導指出另一種利用Protein A層析純化異型二聚抗體的方法，藉由建立異型二聚抗體，其包括衍生自與Protein A結合的小鼠IgG2a以及不與Protein A結合的大鼠IgG2b的兩種重鏈(WO 1998/050431及WO 1995/033844)。
此外，可利用Protein A層析、以胺基酸如Tyr或His取代在位置435及436的胺基酸殘基(EU編號)，其位於抗體重鏈的Protein A結合位置，以產生不同的Protein A結合親和性，進而有效地純化異型二聚抗體。
在本發明中，胺基酸修改指取代、刪除、加入、插入及修飾的任一者或上述之組合。在本發明中，胺基酸修改可改寫為胺基酸突變。
當取代胺基酸殘基時，可實行不同胺基酸殘基的取代，以如下列(a)-(c)所述之改變方面為目標：(a)在片狀結構或螺旋結構區域中的多肽主鏈結構；(b)在目標位置的電荷或疏水性；或(c)側鏈的尺寸。
根據它們一般的側鏈性質，胺基酸殘基被分類為下列群組：(a)疏水：正亮胺酸、Met、Ala、Val、Leu及Ile；(b)中性親水：Cys、Ser、Thr、Asn及Gln；(c)酸性：Asp及Glu；(d)鹼性：His、Lys及Arg；(e)影響鏈方位的殘基：Gly及Pro；以及(f)芳香族：Trp、Tyr及Phe。
藉由所屬領域具有通常知識者習知的各種方法胺 產生基酸修改。這類方法包含定位突變方法(Hashimoto-Gotoh等人，Gene 152：271-275(1995)；Zoller，Meth.Enzymol. 100：468-500(1983)；Kramer等人，Nucleic Acids Res. 12：9441-9456(1984))；Kramer及Fritz，Methods Enzymol. 154：350-367(1987)；以及Kunkel，Proc.Natl.Acad.Sci. USA 82：488-492(1985))、PCR突變方法及卡匣突變方法，但不限於此。
導入於Fc區域中的胺基酸修改的數目並未限定。在一些特定實施例中，其可為1、2或更少、3或更少、4或更少、5或更少、6或更少、8或更少、10或更少、12或更少、14或更少、16或更少、18或更少、或20或更少。
胺基酸修飾包含轉譯後修飾。特定的轉譯後修飾可為糖鏈的添加或刪除。例如，在IgG1恆定區中位置297(EU編號)的胺基酸殘基可為經糖鏈修飾的。修飾的糖鏈結構並未限定。例如，唾液酸可被添加至Fc區域的糖鏈(MAbs 2010 Sep-Oct,2(5)：519-527)。一般而言，表達於真核細胞中的抗體包括糖化(glycosylation)於恆定區中。例如，已知一些類型的糖鏈通常被添加至表達於細胞中的抗體，上述細胞例如為經包括編碼抗體的DNA的表達載體轉化(transform)之哺乳類或真核細胞的自然產生的產生抗體的細胞。
文中所示的真核細胞包含酵母及動物細胞。例如，CHO細胞及HEK293細胞為代表性的動物細胞，其用於與包括編碼抗體的DNA的表達載體的轉化。另一方面，沒有糖化的恆定區亦包含於本發明中。恆定區未經糖化的抗體可藉由 表達編碼抗體的基因於原核細胞如Escherichia coli 中而取得。
此外，包括本發明的變異Fc區域的多肽可以各種分子，如聚乙二醇(PEG)及細胞毒性物質，進行化學修飾。這類化學修飾多肽的方法已於所屬領域中建立。
在一態樣中，發明提供分離的多肽，其包括具有增強的FcγRIIb結合活性的變異Fc區域。在一些態樣中，多肽為抗體。在一些態樣中，多肽為Fc融合蛋白。在一些特定實施例中，抗體為嵌合抗體或人源化抗體。抗體的來源並未特別限定，但例如包含人類抗體、小鼠抗體、大鼠抗體及兔子抗體。在一些態樣中，多肽為Fc融合蛋白。
包括本文提供的變異Fc區域以及包括變異Fc區域的Fc融合蛋白的蛋白結合基序(motif)之抗體的可變區可辨識任一抗原。可被這類抗體及融合蛋白結合的抗原例子包含，但不限於，配體(細胞激素、趨化激素等)、受體、癌症抗原MHC抗原、分化抗原、免疫球蛋白及部分包含免疫球蛋白的免疫複合物。
可被包含發明的變異Fc區域及/或與包括揭示之變異Fc區域的多肽重組融合的抗體或融合蛋白結合的細胞激素之例子包含，但不限於，介白素1至18、群落刺激因子(G-CSF、M-CSF、GM-CSF等)、干擾素(IFN-α、IFN-β、IFN-γ等)、生長因子(EGF、FGF、IGF、NGF、PDGF、TGF、HGF等)、腫瘤壞死因子(TNF-α及TNF-β)、淋巴毒素、紅血球生成素、受體素、SCF、TPO、MCAF及BMP。
可被包含發明的變異Fc區域及/或與包括揭示之 變異Fc區域的多肽重組融合的抗體或融合蛋白結合的趨化激素之例子包含，但不限於，CC趨化激素，如CCL1至CCL28、CXC趨化激素，如CXCL1至CXCL17、C趨化激素，如XCL1至XCL2、以及CX3C趨化激素，如CX3CL1。
可被包含發明的變異Fc區域及/或與包括揭示之變異Fc區域的多肽重組融合的抗體或融合蛋白結合的受體之例子包含，但不限於，屬於受體家族，例如，造血生長因子受體家族、細胞激素受體家族、酪胺酸激酶型受體家族、絲胺酸/蘇胺酸激酶型受體家族、TNF受體家族、G蛋白耦合受體家族、GPI錨定型受體家族、酪胺酸磷酸酶型受體家族、黏著因子家族及激素受體家族，的受體。屬於這些受體家族的受體及它們的特性已在許多文獻中描述，例如，Cooke編輯，New Comprehesive Biochemistry Vol.18B "Hormones and their Actions Part II" pp.1-46(1988)Elsevier Science Publishers BV；Patthy(Cell 61(1)：13-14(1990))；Ullrich(Cell 61(2)：203-212(1990))；Massagué(Cell 69(6)：1067-1070(1992))；Miyajima等人(Annu.Rev.Immunol. 10：295-331(1992))；Taga等人(FASEB J. 6：3387-3396(1992))；Fantl等人(Annu.Rev.Biochem. 62：453-481(1993))；Smith等人(Cell 76(6)：959-962(1994))；以及Flower(Biochim.Biophys.Acta 1422(3)：207-234(1999))。
屬於上述受體家族的特定受體的例子包含人類或老鼠紅血球生成素(EPO)受體(Jones等人，Blood 76(1)：31-35(1990)；D’Andrea等人，Cell 57(2)：277-285(1989))、人類或 老鼠顆粒球群落刺激因子(G-CSF)受體(Fukunaga等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87(22)：8702-8706(1990)，mG-CSFR；Fukunaga等人，Cell 61(2)：341-350(1990))、人類或老鼠血小板生成素(TPO)受體(Vigon等人，Proc.Natl.Acad.Sci. USA.89(12)：5640-5644(1992)；Skoda等人，EMBO J. 12(7)：2645-2653(1993))、人類或老鼠胰島素受體(Ullrich等人，Nature 313(6005)：756-761(1985))、人類或老鼠Flt-3配體受體(Small等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 91(2)：459-463(1994))、人類或老鼠血小板衍生生長因子(PDGF)受體(Gronwald等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 85(10)：3435-3439(1988))、人類或老鼠干擾素(IFN)-α及β受體(Uze等人，Cell 60(2)：225-234(1990)；Novick等人，Cell 77(3)：391-400(1994))、人類或老鼠瘦體素受體、人類或老鼠生長激素(GH)受體、人類或老鼠介白素(IL)-10受體、人類或老鼠類胰島素生長因子(IGF)-I受體、人類或老鼠白血病抑制因子(LIF)受體以及人類或老鼠睫狀神經營養因子(CNTF)受體。
癌症抗原為表達細胞變成惡性的抗原，且它們亦稱為腫瘤特異性抗原。當細胞變成癌腫的時，出現於細胞表面或蛋白質分子上的異常的糖鏈亦為癌症抗原，且它們亦稱為糖鏈癌症抗原。可被包含發明的變異Fc區域的抗體或融合蛋白結合的癌症抗原之例子包含，但不限於，GPC3，其為屬於上述GPI錨定型受體家族的受體且亦表達於許多癌中，包含肝癌(Midorikawa等人，Int.J.Cancer 103(4)：455-465(2003))，以及EpCAM，其表達於許多癌中，包含肺癌(Linnenbach等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1)：27-31(1989))、CA19-9、CA15-3及唾液酸SSEA-1(SLX)。
MHC抗原大致上分類為MHC I型抗原及MHC II型抗原。MHC I型抗原包含HLA-A、-B、-C、-E、-F、-G及-H，而MHC II型抗原包含HLA-DR、-DQ及-DP。
可被包含發明的變異Fc區域及/或與包括揭示之變異Fc區域的多肽重組融合的抗體或融合蛋白結合的分化抗原之例子包含，但不限於，CD1、CD2、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD15s、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD23、CD25、CD28、CD29、CD30、CD32、CD33、CD34、CD35、CD38、CD40、CD41a、CD41b、CD42a、CD42b、CD43、CD44、CD45、CD45RO、CD48、CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD51、CD54、CD55、CD56、CD57、CD58、CD61、CD62E、CD62L、CD62P、CD64、CD69、CD71、CD73、CD95、CD102、CD106、CD122、CD126及CDw130。
免疫球蛋白包含IgA、IgM、IgD、IgG及IgE。免疫合物包含至少任一的免疫球蛋白的成分。
可被包含發明的變異Fc區域及/或與包括揭示之變異Fc區域的多肽重組融合的抗體或融合蛋白結合的抗原之其它例子包含，但不限於，17-IA、4-1BB、4Dc、6-酮基-PGF1a、8-異-PGF2a、8-氧基-dG、A1腺苷受體、A33、ACE、ACE-2、活化素、活化素A、活化素AB、活化素B、活化素C、活化素RIA、活化素RIA ALK-2、活化素RIB ALK-4、活化素RIIA、 活化素RIIB、ADAM、ADAM10、ADAM12、ADAM15、ADAM17/TACE、ADAM8、ADAM9、ADAMTS、ADAMTS4、ADAMTS5、位址素(addressin)、aFGF、ALCAM、ALK、ALK-1、ALK-7、α-1-抗胰蛋白酶、α-V/β-1拮抗劑、ANG、Ang、APAF-1、APE、APJ、APP、APRIL、AR、ARC、ART、青蒿琥酯(artemin)、anti-Id、ASPARTIC、心鈉素、av/b3整合蛋白、Ax1、b2M、B7-1、B7-2、B7-H、B-淋巴球刺激因子(BlyS)、BACE、BACE-1、Bad、BAFF、BAFF-R、Bag-1、BAK、Bax、BCA-1、BCAM、Bcl、BCMA、BDNF、b-ECGF、bFGF、BID、Bik、BIM、BLC、BL-CAM、BLK、BMP、BMP-2 BMP-2a、BMP-3 Osteogenin、BMP-4、BMP-2b、BMP-5、BMP-6 Vgr-1、BMP-7(OP-1)、BMP-8(BMP-8a、OP-2)、BMPR、BMPR-IA(ALK-3)、BMPR-IB(ALK-6)、BRK-2、RPK-1、BMPR-II(BRK-3)、BMP、b-NGF、BOK、鈴蟾素(bombesin)、骨源性營養因子、BPDE、BPDE-DNA、BTC、補體因子3(C3)、C3a、C4、C5、C5a、C10、CA125、CAD-8、抑鈣素、cAMP、癌胚抗原(CEA)、癌症相關抗原、細胞自溶酶A、細胞自溶酶B、細胞自溶酶C/DPPI、細胞自溶酶D、細胞自溶酶E、細胞自溶酶H、細胞自溶酶L、細胞自溶酶O、細胞自溶酶S、細胞自溶酶V、細胞自溶酶X/Z/P、CBL、CCI、CCK2、CCL、CCL1、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL2、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9/10、CCR、CCR1、CCR10、CCR11、CCR2、CCR3、 CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CD1、CD2、CD3、CD3E、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD27L、CD28、CD29、CD30、CD30L、CD32、CD33(p67蛋白)、CD34、CD38、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD49a、CD52、CD54、CD55、CD56、CD61、CD64、CD66e、CD74、CD80(B7-1)、CD89、CD95、CD123、CD137、CD138、CD140a、CD146、CD147、CD148、CD152、CD164、CEACAM5、CFTR、cGMP、CINC、肉毒桿菌毒素、產氣莢膜梭菌毒素、CKb8-1、CLC、CMV、CMV UL、CNTF、CNTN-1、COX、C-Ret、CRG-2、CT-1、CTACK、CTGF、CTLA-4、CX3CL1、CX3CR1、CXCL、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCR、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、細胞角質蛋白腫瘤相關抗原、DAN、DCC、DcR3、DC-SIGN、補體調節因子(衰變加速因子)、去(1-3)-IGF-I(腦IGF-1)、Dhh、地高辛(digoxin)、DNAM-1、Dnase、Dpp、DPPIV/CD26、Dtk、ECAD、EDA、EDA-A1、EDA-A2、EDAR、EGF、EGFR(ErbB-1)、EMA、EMMPRIN、ENA、內皮素受體、腦啡肽酶、eNOS、Eot、伊紅麴素1(eotaxin 1)、EpCAM、肝配蛋白(ephrin)B2/EphB4、EPO、ERCC、E-選滯蛋白、ET-1、因子IIa、因子VII、因子VIIIc、因子IX、成纖維細胞活化蛋白(FAP)、Fas、FcR1、FEN-1、鐵蛋白、FGF、FGF-19、FGF-2、FGF3、FGF-8、 FGFR、FGFR-3、血纖維蛋白、FL、FLIP、Flt-3、Flt-4、濾泡刺激素、不規則趨(fractalkine)、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、FZD10、G250、Gas6、GCP-2、GCSF、GD2、GD3、GDF、GDF-1、GDF-3(Vgr-2)、GDF-5(BMP-14、CDMP-1)、GDF-6(BMP-13、CDMP-2)、GDF-7(BMP-12、CDMP-3)、GDF8(肌抑素)、GDF-9、GDF-15(MIC-1)、GDNF、GFAP、GFRa-1、GFR-α1、GFR-α2、GFR-α3、GITR、升糖素、Glut4、糖蛋白IIb/IIIa(GPIIb/IIIa)、GM-CSF、gp130、gp72、GRO、生長激素釋放激素、半抗原(NP-cap或NIP-cap)、HB-EGF、HCC、HCMV gB封套糖蛋白、HCMV gH封套糖蛋白、HCMV UL、造血生長因子(HGF)、Hep B gp120、肝素酶(heparanase)、Her2、Her2/neu(ErbB-2)、Her3(ErbB-3)、Her4(ErbB-4)、單純皰疹病毒(HSV)、gB糖蛋白、HSV gD糖蛋白、HGFA、高分子量黑色素瘤相關抗原(HMW-MAA)、HIV gp120、HIV IIIB gp 120 V3環、HLA、HLA-DR、HM1.24、HMFG PEM、HRG、Hrk、人類心臟肌凝蛋白、人類巨細胞病毒(HCMV)、人類生長激素(HGH)、HVEM、I-309、IAP、ICAM、ICAM-1、ICAM-3、ICE、ICOS、IFNg、Ig、IgA受體、IgE、IGF、IGF結合蛋白、IGF-1R、IGFBP、IGF-I、IGF-II、IL、IL-1、IL-1R、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-4R、IL-5、IL-5R、IL-6、IL-6R、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、IL-18R、IL-23、干擾素(IFN)-α、IFN-β、IFN-γ、抑制素、iNOS、胰島素A鏈、胰島素B鏈、類胰島素生長因子1、整合蛋白α2、整合蛋白α3、整合蛋白α4、整合蛋白α4/β1、整合蛋白α4/β7、整合蛋白α5(α V)、整合蛋白α5/β1、整合蛋白α5/β3、整合蛋白α6、整合蛋白β1、整合蛋白β2、干擾素γ、IP-10、I-TAC、JE、激肽釋放素(kallikrein)2、激肽釋放素5、激肽釋放素6、激肽釋放素11、激肽釋放素12、激肽釋放素14、激肽釋放素15、激肽釋放素L1、激肽釋放素L2、激肽釋放素L3、激肽釋放素L4、KC、KDR、角質細胞生長因子(KGF)、基膜素5、LAMP、LAP、LAP(TGF-1)、潛伏性TGF-1、潛伏性TGF-1 bp1、LBP、LDGF、LECT2、lefty、Lewis-Y抗原、Lewis-Y相關抗原、LFA-1、LFA-3、Lfo、LIF、LIGHT、脂蛋白、LIX、LKN、Lptn、L-選滯蛋白、LT-a、LT-b、LTB4、LTBP-1、肺表面、黃體化激素、淋巴毒素β受體、Mac-1、MAdCAM、MAG、MAP2、MARC、MCAM、MCK-2、MCP、M-CSF、MDC、Mer、METALLOPROTEASES、MGDF受體、MGMT、MHC(HLA-DR)、MIF、MIG、MIP、MIP-1-α、MK、MMAC1、MMP、MMP-1、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-2、MMP-24、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MPIF、Mpo、MSK、MSP、黏液素(Muc1)、MUC18、苗勒(Mullerian)抑制物質、Mug、MuSK、NAIP、NAP、NCAD、N-鈣年素、NCA 90、NCAM、腦啡肽酶、神經營養因子-3、-4或-6、neurturin、神經生長因子(NGF)、NGFR、NGF-β、nNOS、NO、NOS、Npn、NRG-3、NT、NTN、OB、OGG1、OPG、OPN、OSM、OX40L、OX40R、p150、p95、PADPr、副甲狀腺素、PARC、PARP、PBR、PBSF、PCAD、P-鈣黏素、PCNA、PDGF、PDK-1、PECAM、PEM、PF4、PGE、PGF、PGI2、PGJ2、PIN、 PLA2、胎盤鹼性磷酸酶(PLAP)、PIGF、PLP、PP14、前胰島素、前舒張素、蛋白質C、PS、PSA、PSCA、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、PTEN、PTHrp、Ptk、PTN、R51、RANK、RANKL、RANTES、舒張素A鏈、舒張素B鏈、腎活素、呼吸道融合病毒(RSV)F、RSV Fgp、Ret、類風濕性因子、RLIP76、RPA2、RSK、S100、SCF/KL、SDF-1、絲胺酸、血清白蛋白、sFRP-3、Shh、SIGIRR、SK-1、SLAM、SLPI、SMAC、SMDF、SMOH、SOD、SPARC、Stat、STEAP、STEAP-II、TACE、TACI、TAG-72(腫瘤相關糖蛋白-72)、TARC、TCA-3、T-細胞受體(例如，T-細胞受體α/β)、TdT、TECK、TEM1、TEM5、TEM7、TEM8、TERT、睪丸類PLAP鹼性磷酸酶、TfR、TGF、TGF-α、TGF-β、TGF-β Pan特異性、TGF-βRI(ALK-5)、TGF-βRII、TGF-βRIIb、TGF-βRIII、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4、TGF-β5、凝血蛋白酶、胸腺Ck-1、甲狀腺刺激激素、Tie、TIMP、TIQ、組織因子、TMEFF2、Tmpo、TMPRSS2、TNF、TNF-α、TNF-αβ、TNF-β2、TNFc、TNF-RI、TNF-RII、TNFRSF10A(TRAIL R1 Apo-2、DR4)、TNFRSF10B(TRAIL R2 DR5、KILLER、TRICK-2A、TRICK-B)、TNFRSF10C(TRAIL R3 DcR1、LIT、TRID)、TNFRSF10D(TRAIL R4 DcR2、TRUNDD)、TNFRSF11A(RANK ODF R、TRANCE R)、TNFRSF11B(OPG OCIF、TR1)、TNFRSF12(TWEAK R FN14)、TNFRSF13B(TACI)、TNFRSF13C(BAFF R)、TNFRSF14(HVEM ATAR、HveA、LIGHT R、TR2)、TNFRSF16(NGFR p75NTR)、TNFRSF17(BCMA)、TNFRSF18(GITR AITR)、TNFRSF19(TROY TAJ、TRADE)、TNFRSF19L (RELT)、TNFRSF1A(TNF RI CD120a、p55-60)、TNFRSF1B(TNF RII CD120b、p75-80)、TNFRSF26(TNFRH3)、TNFRSF3(LTbR TNF RIII、TNFC R)、TNFRSF4(OX40 ACT35、TXGP1 R)、TNFRSF5(CD40 p50)、TNFRSF6(Fas Apo-1、APT1、CD95)、TNFRSF6B(DcR3 M68、TR6)、TNFRSF7(CD27)、TNFRSF8(CD30)、TNFRSF9(4-1BB CD137、ILA)、TNFRSF21(DR6)、TNFRSF22(DcTRAIL R2 TNFRH2)、TNFRST23(DcTRAIL R1 TNFRH1)、TNFRSF25(DR3 Apo-3、LARD、TR-3、TRAMP、WSL-1)、TNFSF10(TRAIL Apo-2配體、TL2)、TNFSF11(TRANCE/RANK配體ODF、OPG配體)、TNFSF12(TWEAK Apo-3配體、DR3配體)、TNFSF13(APRIL TALL2)、TNFSF13B(BAFF BLYS、TALL1、THANK、TNFSF20)、TNFSF14(LIGHT HVEM配體、LTg)、TNFSF15(TL1A/VEGI)、TNFSF18(GITR配體AITR配體、TL6)、TNFSF1A(TNF-a Conectin、DIF、TNFSF2)、TNFSF1B(TNF-b LTa、TNFSF1)、TNFSF3(LTb TNFC、p33)、TNFSF4(OX4配體、gp34、TXGP1)、TNFSF5(CD40配體CD154、gp39、HIGM1、IMD3、TRAP)、TNFSF6(Fas配體Apo-1配體、APT1配體)、TNFSF7(CD27配體CD70)、TNFSF8(CD30配體CD153)、TNFSF9(4-1BB配體CD137配體)、TP-1、t-PA、Tpo、TRAIL、TRAIL R、TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRANCE、運鐵蛋白受體、TRF、Trk、TROP-2、TSG、TSLP、腫瘤相關抗原CA125、腫瘤相關抗原表達Lewis-Y相關碳水化合物、TWEAK、TXB2、Ung、uPAR、uPAR-1、尿激酶、VCAM、VCAM-1、VECAD、VE-鈣黏素、VE-鈣黏素-2、VEFGR-1 (flt-1)、VEGF、VEGFR、VEGFR-3(flt-4)、VEGI、VIM、virus antigen、VLA、VLA-1、VLA-4、VNR整合素、血管性血友病(von Willebrand)因子、WIF-1、WNT1、WNT2、WNT2B/13、WNT3、WNT3A、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A、WNT9B、WNT10A、WNT10B、WNT11、WNT16、XCL1、XCL2、XCR1、XCR1、XEDAR、XIAP、XPD、HMGB1、IgA、Aβ、CD81、CD97、CD98、DDR1、DKK1、EREG、Hsp90、IL-17/IL-17R、IL-20/IL-20R、氧化LDL、PCSK9、激肽釋放素原(prekallikrein)、RON、TMEM16F、SOD1、染色顆粒素A、染色顆粒素B、tau、VAP1、高分子量激肽原、IL-31、IL-31R、Nav1.1、Nav1.2、Nav1.3、Nav1.4、Nav1.5、Nav1.6、Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9、EPCR、C1、C1q、C1r、C1s、C2、C2a、C2b、C3、C3a、C3b、C4、C4a、C4b、C5、C5a、C5b、C6、C7、C8、C9、因子B、因子D、因子H、備解素(properdin)、硬化素(sclerostin)、血纖維蛋白原、血纖維蛋白、前凝血蛋白酶、凝血蛋白酶、組織因子、因子V、因子Va、因子VII、因子VIIa、因子VIII、因子VIIIa、因子IX、因子IXa、因子X、因子Xa、因子XI、因子XIa、因子XII、因子XIIa、因子XIII、因子XIIIa、TFPI、抗凝血蛋白酶III、EPCR、凝血調節素、TAPI、tPA、血纖維蛋白溶酶原(plasminogen)、血纖維蛋白溶酶(plasmin)、PAI-1、PAI-2、GPC3、多配體聚糖(Syndecan)-1、多配體聚糖-2、多配體聚糖-3、多配體聚糖-4、LPA及S1P；以及激素及生長因子的受體。
如文中討論，在構成可變區的胺基酸序列中，一 或多個胺基酸殘基修改是可容許的，只要可維持它們的抗原結合活性。當修改可變區胺基酸序列時，並未特別限定修改的位置及修改的胺基酸的數量。例如，出現在CDR及/或FR中的胺基酸可適當地被修改。當修改的胺基酸在可變區中時，結合活性較佳為維持且未特別限定；例如，相較於修改前，結合活性可為50%或更大、80%或更大及100%或更大。此外，結合活性可藉由胺基酸修改而增加。例如，結合活性可比修改前高出2、5、10倍等。胺基酸序列的修改至少可為胺基酸殘基取代、加入、刪除及修飾中任一者。
例如，藉由焦谷化(pyroglutamylation)修飾可變區的N末端的谷氨醯胺為焦谷氨酸(pyroglutamic acid)為所屬領域具有通常知識者熟知的修飾。因此，當重鏈N末端為谷氨醯胺時，本文所述的抗體可能包括谷氨醯胺被修飾為焦谷氨酸的可變區。
本文所述的抗體可變區可具有任一序列，且它們可為任一來源的抗體可變區，例如小鼠抗體、大鼠抗體、兔子抗體、山羊抗體、駱駝抗體、藉由人源化這些非人類抗體產生的人源化抗體以及人類抗體。此外，這些抗體可具有各種胺基酸取代導入於它們的可變區中，以改善它們的抗原結合、藥物動力學、穩定性及免疫原性。由於它們的在抗原結合中的pH依賴性，可變區可能能夠與抗原重複地結合(WO 2009/125825)。
κ鏈及λ鏈存在於抗體輕鏈恆定區中，且任一者均為可接受的。此外，它們可具有一些胺基酸修改，例如，取代、 刪除、加入及/或插入。
此外，本文所述之包括變異Fc區域的多肽可藉由與其它蛋白質，如生理活性胜肽，連結而成為Fc融合蛋白。此種融合蛋白可為包括變異Fc區域的至少兩種多肽之多聚體。其它蛋白質的例子包含受體、黏著分子、配體及酶，但不限於此。
Fc融合蛋白的例子包含以Fc區域融合至與目標分子結合的受體的蛋白質，包含TNFR-Fc融合蛋白、IL1R-Fc融合蛋白、VEGFR-Fc融合蛋白及CTLA4-Fc融合蛋白(Economides等人，Nat.Med. 9(1)：47-52(2003)；Dumont等人，BioDrugs. 20(3)：151-60(2006))。此外，被融合的蛋白質可為具有目標結合活性的其它分子，例如，scFvs(WO 2005/037989)、單域抗體(WO 2004/058821；WO 2003/002609)、類抗體分子(Davinder，Curr.Op.Biotech. 17：653-658(2006)；Current Opinion in Biotechnology 18：1-10(2007)；Nygren等人，Curr.Op.Struct.Biol. 7：463-469(1997)；及Hoss.Protein Science 15：14-27(2006))例如DARPins(WO 2002/020565)、親合體(WO 1995/001937)、Avimer(WO 2004/044011；WO 2005/040229)以及Adnectin(WO 2002/032925)。此外，抗體及Fc融合蛋白可為多特異性的(multispecific)，且可結合至多種類型的目標分子或抗原決定基。
B.重組方法及組合物
可使用重組方法及組合物產生抗體，例如，如US 4,816,567中所述。在一實施例中，提供編碼本文所述的抗肌 抑素抗體的分離的核酸。在另一實施例中，提供編碼多肽之分離的核酸，上述多肽包括本文所述的變異Fc區域或親本Fc區域。此類核酸可編碼包括VL的胺基酸序列及/或包括抗體的VH的胺基酸序列(例如，抗體的輕及/或重鏈)。在又一實施例中，提供包括此類核酸的一或多個載體(例如，表達載體)。在又一實施例中，提供包括此類核酸的宿主細胞。在一實施例中，宿主細胞包括(例如已經轉化具有)：(1)載體，包括核酸，其編碼包括抗體的VL的胺基酸序列及包括抗體的VH的胺基酸序列，或(2)第一載體，包括核酸，其編碼包括抗體的VL的胺基酸序列，及第二載體，包括核酸，其編碼包括抗體的VH的胺基酸序列。在一實施例中，宿主細胞為真核生物，例如，中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或淋巴球細胞(例如，Y0、NS0及Sp20細胞)。在一實施例中，提供製備抗肌抑素抗體的方法，其中所述方法包括在適於抗體的表達的條件下培養如上文提供之包括編碼抗體的核酸的宿主細胞，及可選地從宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收抗體。在另一實施例中，提供製備包括變異Fc區域或親本Fc區域的多肽之方法，其中所述方法包括在適於多肽表達的條件下培養包括編碼多肽的核酸之宿主細胞，所述多肽如以上提供的抗體、Fc區域或變異Fc區域，及可選地從宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收多肽。
為了抗肌抑素抗體的重組生產，例如，如上文所述之編碼抗體的核酸，被分離並插入至一或多個載體中用於進一步選殖及/或在宿主細胞中表達。為了Fc區域的重組生產，編碼Fc區域的核酸被分離並插入至一或多個載體中用於進一 步選殖及/或在宿主細胞中表達。使用常規流程可容易地分離及定序此類核酸(例如，使用寡核苷酸探針，其能夠特異性地結合至編碼抗體的重鏈及輕鏈的基因)。
用於編碼抗體的載體的選殖或表達的合適的宿主細胞包含本文所述的原核或真核細胞。例如，可在細菌中生產抗體，特別是當不需糖化及Fc效應物功能時。對於在細菌中表達抗體片段及多肽，請參照，例如，US 5,648,237、US 5,789,199及US 5,840,523。(請亦參照，Charlton，Methods in Molecular Biology,Vol.248 (B.K.C.Lo編輯，Humana Press,Totowa,NJ,2003),pp.245-254，其描述在大腸桿菌中抗體片段的表達)。在表達後，抗體可從可溶級分的細菌細胞糊中分離並可進一步純化。
除了原核生物，真核微生物像是絲狀真菌或酵母，是編碼抗體的載體的合適的選殖或表達宿主，包含真菌及酵母菌株，其糖化途徑已經“人源化”，導致具有部分或全部人類糖化模式的抗體之產生。請參照Gerngross，Nat.Biotech. 22：1409-1414(2004)及Li等人，Nat.Biotech. 24：210-215(2006)。
適於糖化抗體的表達之宿主細胞亦源自多細胞生物(無脊椎生物及脊椎生物)。無脊椎生物細胞的例子包含植物及昆蟲細胞。已鑒定多種桿狀病毒株，其可與昆蟲細胞共同使用，特別地用於草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)細胞的轉染(transfection)。
植物細胞培養物也可用作宿主。請參照，例如美 國專利號5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978及6,417,429(描述用於在基因轉殖植物中產生抗體的PLANTIB0DIESTM 技術)。
脊椎動物細胞也可用作宿主。例如，可使用適應於懸浮液中生長的哺乳動物細胞系。有用的哺乳動物宿主細胞系的其它例子為經SV40轉化的猴腎臟CV1細胞系(COS-7)；人類胚胎腎臟細胞系(293或如，例如，Graham等人，J.Gen Virol. 36：59(1977)中所述之293細胞)；幼倉鼠腎臟細胞(BHK)；小鼠支持細胞(如，例如Mather，Biol.Reprod. 23：243-251(1980)中所述的TM4細胞)；猴腎臟細胞(CV1)；非洲綠猴腎臟細胞(VERO-76)；人類子宮頸癌細胞(HELA)；犬腎臟細胞(MDCK；水牛鼠肝臟細胞(BRL 3A)；人類肺臟細胞(W138)；人類肝臟細胞(Hep G2)；小鼠乳腺腫瘤(MMT 060562)；如，例如Mather等人，AnnalsN.Y.Acad.Sci. 383：44-68(1982)中所述的TRI細胞；MRC 5細胞；及FS4細胞。其它有用的哺乳動物宿主細胞系包含中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，其包含DHFR- CHO細胞(Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))；及骨髓瘤細胞系，像是Y0、NS0及Sp2/0。適合用於抗體產生的特定哺乳動物宿主細胞系的綜述請參照，例如Yazaki及Wu，Methods in Molecular Biology,Vol.248 (B.K.C.Lo編輯，Humana Press,Totowa,NJ),pp.255-268(2003)。
具有pH依賴性特性的抗體可藉由，例如，如WO 2009/125825中所述之篩選方法及/或突變方法而取得。篩選方 法可包括藉由在對特定抗原具有特異性的抗體族群中辨識出具有pH依賴性結合特性的抗體的任一程序。在一些特定實施例中，篩選方法可包括在酸性及中性pH下，測量原始族群的抗體中的單一抗體的一或多個結合參數(例如，KD或kd)。抗體的結合參數的測量可利用，例如表面電漿共振或得以定量或定性評估抗體對特定抗原的結合特性的任一其它分析方法。在一些特定實施例中，篩選方法可包括辨識以酸性/中性KD為2或更大的比值結合至抗原的抗體。在又一些實施例中，篩選方法可包括辨識以pH5.8/pH7.4KD為2或更大的比值結合至抗原的抗體。或者，篩選方法可包括辨識以酸性/中性kd為2或更大的比值結合至抗原的抗體。在又一些實施例中，篩選方法可包括辨識以pH5.8/pH7.4kd為2或更大的比值結合至抗原的抗體。
在另一實施例中，突變方法可包括導入刪除、取代或加入胺基酸於抗體的重鏈及/或輕鏈中，以增強抗體對抗原的pH依賴性結合。在一些特定實施例中，可實行突變於抗體的一或多個可變域中，例如，於一或多個HVR(例如，CDR)。例如，突變可包括以另一胺基酸取代抗體的一或多個HVR(例如，CDR)中的胺基酸。在一些特定實施例中，突變可包括以組胺酸取代抗體的至少一HVR(例如，CDR)中的一或多個胺基酸。在一些特定實施例中，“增強的pH依賴性結合”意指相較突變前之抗體的原始“親本”(即，較低的pH依賴性)形式，抗體的突變形式顯示較大的酸性/中性KD比值、或較大的酸性/中性kd比值。在一些特定實施例中，抗體的突變形式具有2 或更大的酸性/中性KD比值。在一些特定實施例中，抗體的突變形式具有2或更大的pH5.8/pH7.4KD比值。或者，抗體的突變形式具有2或更大的酸性/中性kd比值。在又一些實施例中，抗體的突變形式具有2或更大的pH5.8/pH7.4kd比值。
多株抗體較佳是藉由在動物中多次皮下(sc)或腹膜內(ip)注射相關抗原及佐劑以產生。使用雙功能或衍生試劑(例如，馬來醯亞胺苯甲醯磺基琥珀醯亞胺酯(maleimidobenzoyl sulfosuccinimide ester)(藉由半胱胺酸殘基偶聯)、N-羥基琥珀醯亞胺(藉由賴氨酸殘基)、戊二醛、琥珀酐、SOCl2 、或R1 N=C=NR，其中R及R1 是不同的烷基)以偶聯相關抗原至蛋白是有用的，所述蛋白對將被賦予免疫性的物種(例如，鎖眼帽貝血藍蛋白(keyhole limpet hemocyanin)、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑)是產生免疫的。
藉由將，例如100μg或5μg蛋白或偶聯物(分別對兔及小鼠而言)與3倍體積的弗氏完全佐劑組合，且在多個位置皮內注射溶液使動物(通常為非人類哺乳類)對抗原、免疫原性偶聯物或衍生物免疫。1個月後，藉由在多個位置皮下注射，利用1/5至1/10的原始量的弗氏完全佐劑中的肽或偶聯物對動物進行加強免疫。加強注射後第7-14天，將動物放血，測定血清的抗體滴定濃度。加強免疫動物直至達到滴定濃度平臺(titer plateaus)。較佳地，以相同抗原的偶聯物對動物進行加強免疫，但偶聯至不同的蛋白及/或藉由不同的交聯劑。偶聯物亦可在重組細胞培養物中以蛋白質融合物的形式產生。凝聚 劑像是明礬，亦適合用於增強免疫反應。
單株抗體可從實質上均質的抗體族群獲得，即包括族群的單個抗體為相同的，除了可以少量存在之可能自然地發生的突變及/或轉譯後修飾(例如，異構化、醯胺化)。因此，修飾詞“單株”表示抗體的特性，它不是分散的抗體的混合物。
例如，單株抗體可用Kohler等人，Nature 256(5517)：495-497(1975)最先描述之融合瘤方法形成。在融合瘤方法中，小鼠或其它合適的宿主動物，例如倉鼠，經如本文所述免疫接種以誘導淋巴球，其產生或能夠產生將特異性結合至免疫接種用蛋白的抗體。或者，淋巴球可在體外受免疫。
免疫試劑通常將包含抗原的蛋白或其融合變異體。一般而言，若所需為人類來源的細胞，則使用外周血液淋巴細胞(PBL)，或若所需為非人類哺乳動物來源的細胞，則使用脾細胞或淋巴結細胞。接著使用合適的融合劑，例如聚乙二醇，將淋巴細胞與永生細胞系融合以形成融合瘤細胞(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice,Academic Press(1986),pp.59-103)。
永生細胞系通常是經轉化的哺乳動物細胞，特別是齧齒類、牛及人來源的骨髓瘤細胞。通常，使用大鼠或小鼠的骨髓瘤細胞系。由此製備的融合瘤細胞被接種及生長於合適的培養基中，其較佳包含一或多種抑制未融合、親本骨髓瘤細胞的生長或存活的物質。例如，若親本骨髓瘤細胞缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(HGPRT或HPRT)，融合瘤的培養基通常將包含次黃嘌呤、胺基蝶呤及胸腺嘧啶(HAT培養基)，這 些物質防止HGPRT-缺陷型細胞的生長。
較佳的永生骨隨瘤細胞為有效地融合、支持藉由選擇的抗體-製造細胞支持抗體的穩定高度產生的那些，且對於培養基(像是HAT培養基)敏感。於這些之中，較佳為小鼠骨髓瘤系，例如自MOPC-21及MPC-11鼠腫瘤獲得的那些，可從Salk Institute Cell Distribution Center,San Diego,California USA取得，以及可從American Type Culture Collection,Manassas,Virginia USA取得的SP-2細胞(及其衍生物，例如X-63-Ag8-653)。人類骨髓瘤及鼠-人類雜骨髓瘤細胞系亦已被描述用於人類單株抗體的製造(Kozbor等人，J Immunol. 133(6)：3001-3005(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications；Marcel Dekker,Inc.,New York,pp.51-63(1987))。
測定融合瘤細胞生長的培養基中是否產生對抗抗原的單株抗體。較佳地，藉由融合瘤細胞產生的單株抗體的結合特異性，是藉由免疫沉澱法或藉由體外結合檢測(例如，放射性免疫測定(RIA)或酶連接免疫吸附測定(ELISA))加以測定。此類技術及檢測為本領域習知的。結合親合力可藉由Munson,Anal Biochem. 107(1)：220-239(1980)的Scatchard分析進行測定。
在辨識出具有想要的特異性、親和性及/或活性的融合瘤細胞後，這些殖株可利用標準方法(Goding，supra)藉由限制稀釋程序及生長加以次選殖。適於此目的培養基包含，例如，D-MEM或RPMI-1640培養基。此外，融合瘤細胞可生長 於體內作為哺乳動物中的腫瘤。
藉由傳統免疫球蛋白純化程序像是，例如蛋白A-瓊脂糖、羥磷石灰層析、膠體電泳、透析或親合性層析，將由次殖株分泌的單株抗體從培養基、腹水(ascites fluid)或血清合適地分離。
可藉由免疫針對一抗原的適當的宿主動物產生抗體。在一實施例中，抗原為包括全長的肌抑素的多肽。在一實施例中，抗原為包括潛伏性肌抑素的多肽。在一實施例中，抗原為包括肌抑素原胜肽的多肽。在一實施例中，抗原為包括對應於肌抑素原生肽(序列辨識號：78)在位置21-100的胺基酸的區域之多肽。在一實施例中，抗原為包括肌抑素原生肽(序列辨識號：78)在位置21-80、41-100、21-60、41-80、61-100、21-40、41-60、61-80或81-100的胺基酸之多肽。本發明亦包含藉由免疫針對上述抗原的動物所產生之抗體。抗體可單一地或組合地合併任一特徵，如上“示例性抗肌抑素抗體”所述。
可藉由在利用蛋白酶，如胃蛋白酶，部分地分解IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等單株抗體之後，再次洗提吸附於蛋白質A管柱上的級分以取得Fc區域。蛋白酶並未特別限定，只要其可分解全長抗體使得Fab及F(ab')2’將可藉由適當地設定酶反應條件，如pH，而以限制性方式被產生，而例子包含胃蛋白酶及木瓜蛋白酶。
此外，本發明提供包括變異Fc區域之多肽的製造方法，上述多肽相較於包括親本Fc區域的多肽具有增強的FcγRIIb結合活性，此方法包括導入至少一胺基酸修改至親本 Fc區域。在一些態樣中，產生的多肽為抗體。在一些特定實施例中，抗體為嵌合抗體或人源化抗體。在一些態樣中，產生的多肽為Fc融合蛋白。
在一些特定實施例中，製造方法包括下列步驟：(a)製備包括親本Fc區域的多肽；(b)導入至少一胺基酸修改至多肽內的親本Fc區域；(c)測量包括親本Fc區域的多肽及包括步驟(b)中的Fc區域的多肽之猴子FcγRIIb結合活性；以及(d)選擇相較於包括親本Fc區域的多肽，包括具有增強的猴子FcγRIIb結合活性的變異Fc區域的多肽。
在一些特定實施例中，製造方法包括下列步驟：(a)製備包括親本Fc區域的多肽；(b)導入至少一胺基酸修改至多肽內的親本Fc區域；(c)測量包括親本Fc區域的多肽及包括步驟(b)中的Fc區域的多肽之猴子FcγRIIIa結合活性；以及(d)選擇相較於包括親本Fc區域的多肽，包括具有降低的猴子FcγRIIIa結合活性的變異Fc區域的多肽。
在一些特定實施例中，製造方法包括下列步驟：(a)製備包括親本Fc區域的多肽；(b)導入至少一胺基酸修改至多肽內的親本Fc區域；(c)測量包括親本Fc區域的多肽及包括步驟(b)中的Fc區域的多肽之人類FcγRIIb結合活性；以及(d)選擇相較於包括親本Fc區域的多肽，包括具有增強的人類FcγRIIb結合活性的變異Fc區域的多肽。
在一些特定實施例中，製造方法包括下列步驟：(a)製備包括親本Fc區域的多肽；(b)導入至少一胺基酸修改至多肽內的親本Fc區域；(c)測量包括親本Fc區域的多肽及包括 步驟(b)中的Fc區域的多肽之人類FcγRIIIa結合活性；以及(d)選擇相較於包括親本Fc區域的多肽，包括具有降低的人類FcγRIIIa結合活性的變異Fc區域的多肽。
在一些特定實施例中，製造方法包括下列步驟：(a)製備包括親本Fc區域的多肽；(b)導入至少一胺基酸修改至多肽內的親本Fc區域；(c)測量包括親本Fc區域的多肽及包括步驟(b)中的Fc區域的多肽之人類FcγRIIa(H型)結合活性；以及(d)選擇相較於包括親本Fc區域的多肽，包括具有降低的人類FcγRIIa(H型)結合活性的變異Fc區域的多肽。
在一些特定實施例中，製造方法包括下列步驟：(a)製備包括親本Fc區域的多肽；(b)導入至少一胺基酸修改至多肽內的親本Fc區域；(c)測量包括親本Fc區域的多肽及包括步驟(b)中的Fc區域的多肽之人類FcγRIIa(R型)結合活性；以及(d)選擇相較於包括親本Fc區域的多肽，包括具有降低的人類FcγRIIa(R型)結合活性的變異Fc區域的多肽。
在一態樣中，在上述用以製造包括具有增強的FcγRIIb結合活性的變異Fc區域的多肽之方法中，至少一胺基酸被修改，其在至少一擇自於：231、232、233、234、235、236、237、238、239、264、266、267、268、271、295、298、325、326、327、328、330、331、332、334及396所組成之群組的位置，根據EU編號。在一些特定實施例中，FcγRIIb具有恆河猴FcγRIIb的序列(序列辨識號：223)。在一些特定實施例中，FcγRIIb具有人類FcγRIIb的序列(例如，序列辨識號：212、213或214)。
在另一態樣中，在上述用以製造包括具有增強的FcγRIIb結合活性的變異Fc區域的多肽之方法中，一個胺基酸被修改，其在位置236。
在另一態樣中，在上述用以製造包括具有增強的FcγRIIb結合活性的變異Fc區域的多肽之方法中，至少兩個胺基酸被修改，修改包括：(a)在位置236的一胺基酸修改；以及(b)至少一胺基酸修改，其在至少一擇自於：231、232、233、234、235、237、238、239、264、266、267、268、271、295、298、325、326、327、328、330、331、332、334及396所組成之群組的位置，根據EU編號。在一些特定實施例中，FcγRIIb具有恆河猴FcγRIIb的序列(序列辨識號：223)。在一些特定實施例中，FcγRIIb具有人類FcγRIIb的序列(例如，序列辨識號：212、213或214)。
在另一態樣中，在上述用以製造包括具有增強的FcγRIIb結合活性的變異Fc區域的多肽之方法中，至少兩個胺基酸被修改，修改包括：(a)在位置236的一胺基酸修改；以及(b)至少一胺基酸修改，其在至少一擇自於：231、232、235、239、268、295、298、326、330及396所組成之群組的位置，根據EU編號。在一些特定實施例中，FcγRIIb具有恆河猴FcγRIIb的序列(序列辨識號：223)。在一些特定實施例中，FcγRIIb具有人類FcγRIIb的序列(例如，序列辨識號：212、213或214)。
在另一態樣中，在上述用以製造包括具有增強的FcγRIIb結合活性的變異Fc區域的多肽之方法中，至少兩個胺 基酸被修改，修改包括：(a)在位置236的一胺基酸修改；以及(b)至少一胺基酸修改，其在至少一擇自於：268、295、326及330所組成之群組的位置，根據EU編號。在一些特定實施例中，FcγRIIb具有恆河猴FcγRIIb的序列(序列辨識號：223)。在一些特定實施例中，FcγRIIb具有人類FcγRIIb的序列(例如，序列辨識號：212、213或214)。
在另一態樣中，在上述用以製造包括具有增強的FcγRIIb結合活性的變異Fc區域的多肽之方法中胺基酸被修改，在下列(1)-(37)中任一的位置：(1)在位置231、236、239、268及330；(2)在位置231、236、239、268、295及330；(3)在位置231、236、268及330；(4)在位置231、236、268、295及330；(5)在位置232、236、239、268、295及330；(6)在位置232、236、268、295及330；(7)在位置232、236、268及330；(8)在位置235、236、268、295、326及330；(9)在位置235、236、268、295及330；(10)在位置235、236、268及330；(11)在位置235、236、268、330及396；(12)在位置235、236、268及396；(13)在位置236、239、268、295、298及330；(14)在位置236、239、268、295、326及330；(15)在位置236、239、268、295及330；(16)在位置236、239、268、298及330；(17)在位置236、239、268、326及330；(18)在位置236、239、268及330；(19)在位置236、239、268、330及396；(20)在位置236、239、268及396；(21)在位置236及268；(22)在位置236、268及295；(23)在位置236、268、295、298及330；(24)在位置236、268、295、326及330；(25)在位置236、268、295、 326、330及396；(26)在位置236、268、295及330；(27)在位置236、268、295、330及396；(28)在位置236、268、298及330；(29)在位置236、268、298及396；(30)在位置236、268、326及330；(31)在位置236、268、326、330及396；(32)在位置236、268及330；(33)在位置236、268、330及396；(34)在位置236、268及396；(35)在位置236及295；(36)在位置236、330及396；及(37)在位置236及396；根據EU編號。在一些特定實施例中，FcγRIIb具有恆河猴FcγRIIb的序列(序列辨識號：223)。在一些特定實施例中，FcγRIIb具有人類FcγRIIb的序列(例如，序列辨識號：212、213或214)。
在又一態樣中，在上述用以製造包括具有增強的FcγRIIb結合活性的變異Fc區域的多肽之方法中的胺基酸修改，自下列所組成之群組的每一位置選擇：(a)Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr在位置231；(b)Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr在位置232；(c)Asp在位置233；(d)Trp、Tyr在位置234；(e)Trp在位置235；(f)Ala、Asp、Glu、His、Ile、Leu、Met、Asn、Gln、Ser、Thr、Val在位置236；(g)Asp、Tyr在位置237；(h)Glu、Ile、Met、Gln、Tyr在位置238；(i)Ile、Leu、Asn、Pro、Val在位置239；(j)Ile在位置264；(k)Phe在位置266；(l)Ala、His、Leu在位置267；(m)Asp、Glu在位置268；(n)Asp、Glu、Gly在位置271；(o)Leu在位置295；(p)Leu在位置298；(q)Glu、Phe、Ile、Leu在位置325； (r)Thr在位置326；(s)Ile、Asn在位置327；(t)Thr在位置328；(u)Lys、Arg在位置330；(v)Glu在位置331；(w)Asp在位置332；(x)Asp、Ile、Met、Val、Tyr在位置334；以及(y)Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr在位置396；根據EU編號。在一些特定實施例中，FcγRIIb具有恆河猴FcγRIIb的序列(序列辨識號：223)。在一些特定實施例中，FcγRIIb具有人類FcγRIIb的序列(例如，序列辨識號：212、213或214)。
在又一態樣中，在上述用以製造包括具有增強的FcγRIIb結合活性的變異Fc區域的多肽之方法中的胺基酸修改，自下列所組成之群組的每一位置選擇：(a)Gly、Thr在位置231；(b)Asp在位置232；(c)Trp在位置235；(d)Asn、Thr在位置236；(e)Val在位置239；(f)Asp、Glu在位置268；(g)Leu在位置295；(h)Leu在位置298；(i)Thr在位置326；(j)Lys、Arg在位置330；以及(k)Lys、Met在位置396；根據EU編號。在一些特定實施例中，the FcγRIIb具有恆河猴FcγRIIb的序列(序列辨識號：223)。在一些特定實施例中，FcγRIIb具有人類FcγRIIb的序列(例如，序列辨識號：212、213或214)。在又一態樣中，在上述用以製造包括具有增強的FcγRIIb結合活性的變異Fc區域的多肽之方法中的胺基酸修改為：Asn在位置236、Glu在位置268、Lys在位置330以及Met在位置396；根據EU編號。在又一態樣中，在上述用以製造包括具有增強的FcγRIIb結合活性的變異Fc區域的多肽之方法中的胺基酸修改為：Asn在位置236、Asp在位置268及Lys在位置 330；根據EU編號。在又一態樣中，在上述用以製造包括具有增強的FcγRIIb結合活性的變異Fc區域的多肽之方法中的胺基酸修改為：Asn在位置236、Asp在位置268、Leu在位置295及Lys在位置330；根據EU編號。在又一態樣中，在上述用以製造包括具有增強的FcγRIIb結合活性的變異Fc區域的多肽之方法中的胺基酸修改為：Thr在位置236、Asp在位置268及Lys在位置330；根據EU編號。在又一態樣中，在上述用以製造包括具有增強的FcγRIIb結合活性的變異Fc區域的多肽之方法中的胺基酸修改為：Asn在位置236、Asp在位置268、Leu在位置295、Thr在位置326及Lys在位置330；根據EU編號。在又一態樣中，在上述用以製造包括具有增強的FcγRIIb結合活性的變異Fc區域的多肽之方法中的胺基酸修改為：Trp在位置235、Asn在位置236、Asp在位置268、Leu在位置295、Thr在位置326及Lys在位置330；根據EU編號。
在一態樣中，在上述用以製造包括具有增強的FcγRIIb結合活性的變異Fc區域的多肽之方法中，至少一胺基酸被修改，在擇自於：234、238、250、264、267、307及330所組成之群組的至少一位置；根據EU編號。在一些特定實施例中，FcγRIIb具有恆河猴FcγRIIb的序列(序列辨識號：223)。在一些特定實施例中，FcγRIIb具有人類FcγRIIb的序列(例如，序列辨識號：212、213或214)。
在另一態樣中，在上述用以製造包括具有增強的FcγRIIb結合活性的變異Fc區域的多肽之方法中，胺基酸被修改，在位置238。
在另一態樣中，在上述用以製造包括具有增強的FcγRIIb結合活性的變異Fc區域的多肽之方法中，至少兩個胺基酸被修改，上述修改包括：(i)在位置238的一胺基酸修改；以及(ii)至少一胺基酸修改，其在至少一擇自於：234、250、264、267、307及330所組成之群組的位置；根據EU編號。在一些特定實施例中，FcγRIIb具有恆河猴FcγRIIb的序列(序列辨識號：223)。在一些特定實施例中，FcγRIIb具有人類FcγRIIb的序列(例如，序列辨識號：212、213或214)。
在另一態樣中，在上述用以製造包括具有增強的FcγRIIb結合活性的變異Fc區域的多肽之方法中胺基酸被修改，在下列(1)-(9)中任一的位置：(1)在位置234、238、250、307及330；(2)在位置234、238、250、264、307及330；(3)在位置234、238、250、264、267、307及330；(4)在位置234、238、250、267、307及330；(5)在位置238、250、264、307及330；(6)在位置238、250、264、267、307及330；(7)在位置238、250、267、307及330；(8)在位置238、250及307；以及(9)在位置238、250、307及330；根據EU編號。
在又一態樣中，在上述用以製造包括具有增強的FcγRIIb結合活性的變異Fc區域的多肽之方法中胺基酸被修改，其自下列所組成之群組的每一位置選擇：(a)Tyr在位置234；(b)Asp在位置238；(c)Val在位置250；(d)Ile在位置264；(e)Ala在位置267；(f)Pro在位置307；以及(g)Lys在位置330；根據EU編號。在又一態樣中，在上述用以製造包括具有增強的FcγRIIb結合活性的變異Fc區域的多肽之方法 中的胺基酸修改為：Asp在位置238；根據EU編號。在又一態樣中，在上述用以製造包括具有增強的FcγRIIb結合活性的變異Fc區域的多肽之方法中的胺基酸修改為：Asp在位置238、Val在位置250及Pro在位置307；根據EU編號。在又一態樣中，在上述用以製造包括具有增強的FcγRIIb結合活性的變異Fc區域的多肽之方法中的胺基酸修改為：Asp在位置238、Val在位置250、Pro在位置307及Lys在位置330；根據EU編號。在又一態樣中，在上述用以製造包括具有增強的FcγRIIb結合活性的變異Fc區域的多肽之方法中的胺基酸修改為：Asp在位置238、Val在位置250、Ile在位置264、Pro在位置307及Lys在位置330；根據EU編號。在又一態樣中，在上述用以製造包括具有增強的FcγRIIb結合活性的變異Fc區域的多肽之方法中的胺基酸修改為：Asp在位置238、Val在位置250、Ala在位置267、Pro在位置307及Lys在位置330；根據EU編號。在又一態樣中，在上述用以製造包括具有增強的FcγRIIb結合活性的變異Fc區域的多肽之方法中的胺基酸修改為：Tyr在位置234、Asp在位置238、Val在位置250、Pro在位置307及Lys在位置330；根據EU編號。在又一態樣中，在上述用以製造包括具有增強的FcγRIIb結合活性的變異Fc區域的多肽之方法中的胺基酸修改為：Tyr在位置234、Asp在位置238、Val在位置250、Ala在位置267、Pro在位置307及Lys在位置330；根據EU編號。在又一態樣中，在上述用以製造包括具有增強的FcγRIIb結合活性的變異Fc區域的多肽之方法中的胺基酸修改為：Asp在位置238、Val在位置250、 Ile在位置264、Ala在位置267、Pro在位置307及Lys在位置330；根據EU編號。在又一態樣中，在上述用以製造包括具有增強的FcγRIIb結合活性的變異Fc區域的多肽之方法中的胺基酸修改為：Tyr在位置234、Asp在位置238、Val在位置250、Ile在位置264、Pro在位置307及Lys在位置330；根據EU編號。在又一態樣中，在上述用以製造包括具有增強的FcγRIIb結合活性的變異Fc區域的多肽之方法中的胺基酸修改為：Tyr在位置234、Asp在位置238、Val在位置250、Ile在位置264、Ala在位置267、Pro在位置307及Lys在位置330；根據EU編號。在一些特定實施例中，FcγRIIb具有恆河猴FcγRIIb的序列(序列辨識號：223)。在一些特定實施例中，FcγRIIb具有人類FcγRIIb的序列(例如，序列辨識號：212、213或214)。
此外，本發明提供包括變異Fc區域之多肽的製造方法，上述多肽相較於包括親本Fc區域的多肽具有增加的pI，此方法包括導入至少兩個胺基酸修改至親本Fc區域。
在一些特定實施例中，用以製造包括本文提供的變異Fc區域的多肽之製造方法包括下列步驟：(a)製備包括親本Fc區域的多肽；(b)導入至少兩個胺基酸修改至多肽內的親本Fc區域；(c)測量包括親本Fc區域的多肽及包括步驟(b)中的Fc區域的多肽之pI；以及(d)選擇相較於對應之包括親本Fc區域的多肽，包括具有增加的pI的變異Fc區域的多肽。
在一態樣中，在上述用以製造包括具有增加的pI的變異Fc區域的多肽之方法中，至少兩個胺基酸被修改，在 至少兩個擇自於：285、311、312、315、318、333、335、337、341、342、343、384、385、388、390、399、400、401、402、413、420、422及431所組成之群組的位置，根據EU編號。在又一態樣中，產生的多肽包括具有增加的pI，的變異Fc區域，其包含至少兩個胺基酸修改，在至少兩個擇自於：311、341、343、384、399、400、401、402及413所組成之群組的位置，根據EU編號。
在另一態樣中，在上述用以製造包括具有增加的pI的變異Fc區域的多肽之方法中胺基酸被修改，在下列(1)-(10)中任一的位置：(1)在位置311及341；(2)在位置311及343；(3)在位置311、343及413；(4)在位置311、384及413；(5)在位置311及399；(6)在位置311及401；(7)在位置311及413；(8)在位置400及413；(9)在位置401及413；以及(10)在位置402及413；根據EU編號。在又一態樣中，在上述用以製造包括具有增加的pI的變異Fc區域的多肽之方法中的胺基酸修改為：Arg在位置400及Lys在位置413；根據EU編號。在又一態樣中，在上述用以製造包括具有增加的pI的變異Fc區域的多肽之方法中的胺基酸修改為：Arg在位置311及Lys在位置413；根據EU編號。在又一態樣中，在上述用以製造包括具有增加的pI的變異Fc區域的多肽之方法中的胺基酸修改為：Arg在位置311及Arg在位置399；根據EU編號。在又一態樣中，在上述用以製造包括具有增加的pI的變異Fc區域的多肽之方法中的胺基酸修改為：Arg在位置311及Arg在位置343；根據EU編號。在又一態樣中，在上述用以製造包括 具有增加的pI的變異Fc區域的多肽之方法中的胺基酸修改為：Arg在位置311及Arg在位置413；根據EU編號。在又一態樣中，在上述用以製造包括具有增加的pI的變異Fc區域的多肽之方法中的胺基酸修改為：Arg在位置311、Arg在位置343及Arg在位置413；根據EU編號。在又一態樣中，在上述用以製造包括具有增加的pI的變異Fc區域的多肽之方法中的胺基酸修改為：Arg在位置311、Arg在位置384及Arg在位置413；根據EU編號。
在又一態樣中，在上述用以製造包括具有增加的pI的變異Fc區域的多肽之方法中的胺基酸修改，是擇自於每一位置的Lys或Arg。
在又一態樣中，在上述製造方法中的胺基酸修改擇自於單一修改、單一修改的組合或表14-30所述之修改的組合。
可選地，當多肽更包括抗原結合域時，上述用以製造包括變異Fc區域的多肽之方法可包含下列額外的步驟：(e)在施用包括親本Fc區域的多肽及包括變異Fc區域的多肽於動物中，如小鼠、大鼠、兔子、狗猴子及人類，之後，評估血漿中抗原的藥物動力學；以及(f)選擇相較於包括親本Fc區域的多肽，包括具有增強自血漿清除抗原能力的變異Fc區域的多肽。
本發明包含藉由上述任一方法或所屬領域習知的其它方法所製造之包括變異Fc區域的多肽。
C. 分析
可藉由本領域習知的各種分析法，辨識、篩選或表徵本文提供之抗肌抑素抗體的物理/化學性質及/或生物活性。
可藉由本文所述或其它所屬領域習知的各種分析法，辨識、篩選或表徵本文提供之本文提供的變異Fc區域的物理/化學性質及/或生物活性。
1. 結合分析及其它分析
在一態樣中，藉由習知方法，像是ELISA、西方點墨、BIACORE® 等，測試本發明的抗體的抗原結合活性。在一態樣中，藉由習知方法，像是BIACORE® 等，測試本發明的包括變異Fc區域的多肽的Fc受體結合活性。
在另一態樣中，可使用競爭分析以辨識與本文所述的抗肌抑素抗體競爭結合至肌抑素的抗體。在一些特定的實施例中，當這類競爭抗體過量存在時，它阻礙(例如，降低)參考抗體對肌抑素的結合至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%或更多。在一些例子中，結合被抑制至少80%、85%、90%、95%或更多。在一些特定的實施例中，這類競爭抗體結合的抗原決定基(例如，線性或構象抗原決定基)與被本文所述的抗肌抑素抗體(例如，如表2a、11a或13所述之抗肌抑素抗體)結合的抗原決定基相同。在又一些態樣中，參考抗體具有如表2a、11a或13所述之VH及VL對。用於定位抗體結合的抗原決定基之詳細示例性方法在Morris，(1996)“Epitope Mapping Protocols,”inMethods in Molecular Biology vol.66(Humana Press,Totowa, NJ)中提供。
在一示例性競爭分析中，固定的潛伏性肌抑素或肌抑素原胜肽培養於一溶液中，其包括結合至肌抑素的第一標記之抗體，以及經測試其與第一抗體競爭結合至肌抑素的能力的第二未標記之抗體。第二抗體可存在於融合瘤上清液中。作為控制組，固定的肌抑素培養於包括第一標記之抗體但不包括第二標記之抗體的溶液中。在允許第一抗體結合至肌抑素的條件下培養後，移除過量未結合的抗體，以及測量與固定的肌抑素結合的標記量。若相對於控制組樣品，在測試樣品中與固定的肌抑素結合的標記量實質上減少，那麼其表示第二抗體與第一抗體競爭結合至肌抑素。請參照，Harlow及Lane，(1988)Antibodies：A Laboratory Manual ch.14(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)。
用於判定包含變異Fc區域的多肽對一或多個FcγR家族成員的結合活性的分析已於文中描述或者為所屬領域已知的。這類結合分析包含但不限於，利用表面電漿共振(SPR)現象的BIACORE® 分析、放大發光鄰近同質性分析(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay,ALPHA)篩選、ELISA及流式細胞分選(FACS)(Lazar等人，Proc.Natl.Acad.Sci. USA(2006)103(11)：4005-4010)。
在一實施例中，BIACORE®分可用以評估包括變異Fc區域的多肽的結合活性，相對特定的FcγR家族成員是否增強、或維持、或減少，例如，藉由觀察從感測圖分析取得之解離常數(KD)是否降低或增加，其中許多FcγR被作為分析物 以與被固定或捕捉於感測晶片上的包括變異Fc區域的多肽相互作用，其利用習知的方法及試劑，如蛋白質A、蛋白質L、蛋白質A/G、蛋白質G、抗λ鏈抗體、抗κ鏈抗體、抗原肽、抗原蛋白。亦可藉由比較在一或多種FcγR被作為分析物以與被捕捉之包括變異Fc區域的多肽相互作用之前及之後，感測圖上共振單元(RU)值的改變，進而判定結合活性的改變。或者，可將FcγR固定或捕捉於感測晶片上，並將包括變異Fc區域的多肽作為分析物。
在BIACORE®分析中，將觀察相互作用的物質的一方(配體)固定在感測晶片的金薄膜上，從感測晶片的背面照射光，使得在金薄膜及玻璃的界面產生全反射，反射光的一部分形成了反射強度降低的部分(SPR訊號)。當使觀察相互作用的物質的另一方(分析物)流過感測晶片的表面時，分析物與配體結合，被固定的配體分子的質量增加，感測晶片表面的溶劑的折射係數改變。由於該折射係數的變化，SPR訊號的位置產生位移(另一方面，當此結合解離，訊號位置恢復)。BIACORE®系統是以上述位移量，或更具體而言，感測晶片表面的質量變化為縱軸，以質量的時間變化作為測定資料表示(感測圖)。可由感測圖判定分析物與被捕捉於感測晶片表面的配體的結合量。藉由感測圖的曲線可判定動力學參數，如結合速率常數(ka)及解離速率常數(kd)，且由這些常數的比值判定解離常數(KD)。在BIACORE®方法中，較佳使用測定抑制的方法。測量抑制的方法的例子記載於Lazar等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103(11)：4005-4010(2006)。
ALPHA篩選可藉由ALPHA技術加以實行，其利用兩個珠粒(bead)，供體及受體，以下列原則為基礎。只有當結合於供體珠粒的分子與結合於受體珠粒的分子實體上相互作用且兩個珠粒彼此相當接近時，才會偵測到發光訊號。供體珠粒中的雷射激發光敏劑將環境的氧氣轉化為激發態的單態氧。單態氧分散在供體珠粒周圍，且當它傳到鄰近的受體珠粒時，珠粒中的化學發光反應被誘發，且最終發出光。當結合於供體珠粒的分子與結合於受體珠粒的分子不相互作用時，化學發光反應不會發生，因為供體珠粒產生的單態氧不會傳到受體珠粒。
例如，生物素化的多肽複合物結合於供體珠粒，且被穀胱甘肽S轉移酶(GST)標記的Fcγ受體連接至受體珠粒。在包括變異Fc區域的競爭多肽複合物不存在時，包括親本Fc區域的多肽複合物與Fcγ受體反應且產生520-620nm訊號。包括未標記的變異Fc區域的多肽複合物與包括親本Fc區域的多肽複合物競爭與Fcγ受體相互作用。可藉由量化觀察到由競爭所導致的減少的螢光，判定相關的結合活性。多肽複合物的生物素化，例如利用磺基-NHS-生物素等的抗體已為熟知的。表達Fcγ受體及GST於帶有融合基因的細胞中的方法，可被適當採用做為以GST標記Fcγ受體的方法，上述融合基因是藉由將編碼Fcγ受體的多核苷酸與編碼GST的多核苷酸框內融合於可表達的載體中，以及利用谷胱甘肽管柱進行純化而產生。所取得的信號較佳經過分析，例如，將它們與單點競爭(one-site competition)模型擬合，其藉由軟體，如GRAPHPAD PRISM(GraphPad,San Diego)，利用非線性回歸分析。
具有降低的FcγR結合活性的變異Fc區域是指，當使用實質上相同量的對應親本Fc區域及變異Fc區域實行分析時，相較於親本Fc區域，以實質上較弱的結合活性結合至FcγR的Fc區域。此外，具有增強的FcγR結合活性的變異Fc區域是指，當使用實質上相同量的親本Fc區域及變異Fc區域實行分析時，相較於對應的親本Fc區域，以實質上較強的結合活性結合至FcγR的Fc區域。具有維持的FcγR結合活性的變異Fc區域是指，當使用實質上相同量的對應親本Fc區域及包含變異Fc區域的多肽實行分析時，以與親本Fc區域相同或實質上沒有不同的結合活性結合至FcγR的Fc區域。
Fc區域對各種FcγR的結合活性是否增加或減少，可由各種FcγR對Fc區域之結合量的增加或減少進行判定，其是根據上述測量方法進行測定。於此，各種FcγR對Fc區域的結合量可被評估為值，藉由將感測圖的RU值差(在各種FcγR作為分析物與Fc區域相互作用之前及之後改變)除以感測圖的RU值差(在捕捉Fc區域於感測晶片之前及之後改變)以獲得。
在本發明中，增強的FcγRIIb結合活性較佳是指，例如，在藉由上述測量方法量測的KD值中[親本Fc區域對FcγRIIb的KD值]/[變異Fc區域對FcγRIIb的KD值]的比值較佳變成2.0或更大、3.0或更大、4.0或更大、5.0或更大、6.0或更大、7.0或更大、8.0或更大、9.0或更大、10或更大、15或更大、20或更大、25或更大、30或更大、35或更大、40 或更大、45或更大、或甚至50或更大、55或更大、60或更大、65或更大、70或更大、75或更大、80或更大、85或更大、90或更大、95或更大、或100或更大。
本文所述的變異Fc區域對FcγRIIb的KD值(mol/L)較佳小於親本Fc區域對FcγRIIb的KD值，且可為，例如，2.0×10-6 M或更小、1.0×10-6 M或更小、9.0×10-7 M或更小、8.0×10-7 M或更小、7.0×10-7 M或更小、6.0×10-7 M或更小、5.0×10-7 M或更小、4.0×10-7 M或更小、3.0×10-7 M或更小、2.0×10-7 M或更小、1.0×10-7 M或更小、9.0×10-8 M或更小、8.0×10-8 M或更小、7.0×10-8 M或更小、6.0×10-8 M或更小、5.0×10-8 M或更小。
此外，對FcγRIIb比對FcγRIIa具有增強的結合選擇性的變異Fc區域指一Fc區域，其中：(a)FcγRIIb結合活性增強，且FcγRIIa結合活性維持或降低；(b)FcγRIIb結合活性增強且FcγRIIa結合活性亦增強，但FcγRIIa結合活性增強的程度較FcγRIIb結合活性增強的程度小；或(c)FcγRIIb結合活性降低，且FcγRIIa結合活性亦降低，但FcγRIIb結合活性降低的程度較FcγRIIa結合活性降低的程度小。判定變異Fc區域是否對FcγRIIb而非對FcγRIIa具有增強的結合選擇性，可藉由，例如，比較變異Fc區域對FcγRIIa的KD值比上對FcγRIIb的KD值的比例([變異Fc區域對FcγRIIa的KD值]/[變異Fc區域對FcγRIIb的KD值]的比值)以及親本Fc區域對FcγRIIa的KD值比上對FcγRIIb的KD值的比例([親本Fc區域對FcγRIIa的KD值]/[親本Fc區域對FcγRIIb的KD值]的比 值)，其根據上述例子進行測定。具體而言，當變異Fc區域的KD比例大於親本Fc區域的KD比例時，可判定相較於親本Fc區域，變異Fc區域對FcγRIIb而非對FcγRIIa具有增強的結合選擇性。特別是在人類中，FcγRIIb結合活性很可能與FcγRIIa(R型)而非FcγRIIa(H型)的結合活性相關，由於相較於FcγRIIa(H型)，FcγRIIb的胺基酸序列與FcγRIIa(R型)享有較高的相同性。因此，找出相較於對人類FcγRIIa(R型)，可增強對人類FcγRIIb的結合選擇性的胺基酸修改，對於在人類中增強對FcγRIIb之結合選擇性相較於對FcγRIIa是重要的。
當本發明的變異Fc區域相較於親本Fc區域，對於FcγRIIb具有較高的結合活性且對於FcγRIII(如FcγRIIIa或FcγRIIIb)具有較低的結合活性時，變異Fc區域可說是有FcγRIIb特異性。
2. 活性分析
在一態樣中，提供測定以辨識關於抗肌抑素抗體具有的生物活性。生物活性可包含，例如，抑制肌抑素的活化、阻礙成熟的肌抑素自潛伏性肌抑素釋放、抑制潛伏性肌抑素的蛋白質水解切割、阻礙蛋白酶接近潛伏性肌抑素等。亦提供於體內及/或體外具有這類生物活性的抗體。在一些特定的實施例中，測試發明的抗體的這類生物活性。
在一些特定的實施例中，測試抗體是否抑制潛伏性肌抑素的裂解是藉由偵測潛伏性肌抑素(肌抑素)的裂解產物進行判定，其在測試抗體存在或不存在下，於可裂解潛伏性肌抑素的蛋白酶與潛伏性肌抑素接觸之後，利用所屬領域習知的 方法，如電泳、層析、免疫點墨分析、酶連接免疫吸附測定(ELISA)或質譜分析(請參照，例如，Thies等人，Growth Factors 18(4)：251-259(2001))。在測試抗體存在下(或與其接觸之後)，若偵測到潛伏性肌抑素(例如，人類肌抑素原胜肽)的裂解產物量減少，則該測試抗體被認定為可抑制潛伏性肌抑素裂解的抗體。在一些特定實施例中，測試抗體是否阻礙蛋白酶接近潛伏性肌抑素，是藉由用以偵測蛋白酶及潛伏性肌抑素之間的蛋白質相互作用之方法進行判定，例如，ELISA或BIACORE® 。在測試抗體存在下(或與其接觸之後)，若偵測到蛋白酶及潛伏性肌抑素之間的相互作用減少，則該測試抗體被認定為可阻礙蛋白酶接近潛伏性肌抑素的抗體。
在一些特定實施例中，測試抗體是否阻礙成熟的肌抑素自潛伏性肌抑素釋放，是藉由偵測成熟的肌抑素活性進行判定，例如，對肌抑素受體的結合活性、或在表達肌抑素受體(例如，ActRIIb)的細胞中介導訊號傳導的活性。有益於這些分析的細胞可為表達內源肌抑素受體的那些，例如L6肌原細胞，或可為經短暫地或穩定地基因修飾以表達編碼肌抑素受體的轉殖基因的那些，例如活化素受體，如活化素第II型受體(Thies等人，Supra)。肌抑素對肌抑素受體的結合可利用受體結合分析進行偵測。訊號傳導途徑中任一程度之肌抑素介導的訊號傳導可被偵測，例如，藉由檢視Smad多肽的磷酸化、檢視肌抑素調節的基因(包含受體基因)的表達、或測量肌抑素依賴性細胞的增殖。在測試抗體存在下(或與其接觸之後)，若偵測到成熟的肌抑素活性降低，則該測試抗體被認定為可阻礙成 熟的肌抑素自潛伏性肌抑素釋放的抗體。
肌抑素活化的抑制亦可使用操作實施例中例舉及示例的方法進行偵測及/或測量。利用這些或其它類型的分析，測試抗體可被篩選為能夠抑制肌抑素的活化的那些。在一些特定實施例中，相較在相似條件下的負控制組，肌抑素活化的抑制包含在測定中至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、或40%、或更多肌抑素活性的減少。在一些實施例中，其代表至少45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、或95%、或更多的肌抑素活化的抑制。
在另一態樣中，提供用以辨識與肌抑素形成免疫複合物(即，抗原-抗體複合物)的抗肌抑素抗體。亦提供在體內及/或體外具有這類生物活性的抗體。
在一些特定實施例中，測試發明的抗體的這類生物活性。
在一些特定實施例中，免疫複合物的形成是藉由如尺寸排除(膠體過濾)層析、超高速離心、光散射、電子顯微鏡或質譜分析的方法進行評估(Mol.Immunol. 39：77-84(2002)、Mol.Immunol. 47：357-364(2009))。這些方法是利用相較於單獨抗體或單獨抗原，免疫複合物為較大分子的特性。在測試抗體及抗原存在下，若偵測到包含兩個或多個抗體及兩個或多個抗原(例如，肌抑素分子)的免疫複合物，則該測試抗體被認定為可形成包含兩個或多個抗體及兩個或多個肌抑素的分子之免疫複合物的抗體。在另一實施例中，免疫複合物的形成是藉由如ELISA、FACS或SPR(表面電漿共振分析；例如， 利用BIACORE® )的方法進行評估(Shields等人，J.Biol.Chem. 276(9)：6591-6604(2001)；Singh等人，J.Immunol.Methods 50：109-114(1982)；Suzuki等人，J.Immunol. 184(4)：1968-1976(2010)；Luo等人，mAbs 1(5)：491-504(2009))。這些方法是利用相較於單獨抗體或單獨抗原，包含兩個或多個抗體及兩個或多個抗原的免疫複合物可更強烈地結合與Fc受體或補體成分的特性。相較於單獨抗體存在下，若偵測到在測試抗體及抗原均存在下與Fc受體或補體成分的結合增加，則該測試抗體被認定為可形成包含兩個或多個抗體及兩個或多個肌抑素的分子之免疫複合物的抗體。在另一實施例中，免疫複合物的形成是藉由施用測試抗體於動物(例如，老鼠)並測量抗原自血漿的清除進行評估。如前述，形成包含兩個或多個抗體及兩個或多個抗原的免疫複合物之抗體被預期可加速抗原從血漿的消除。因此，若觀察到相較於在參考施用抗體的老鼠，在測試施用抗體的老鼠中肌抑素自血漿的消除加速，則該測試抗體被認定為相較於參考抗體，可更有效率地形成包含兩個或多個抗體及兩個或多個肌抑素的分子之免疫複合物的抗體。
D. 免疫偶聯物
在一些實施例中，發明亦提供免疫偶聯物，其包括本文之抗肌抑素抗體偶聯至一或多個細胞毒性劑，例如，化療劑或藥物、生長抑制劑、毒素(例如，細菌、真菌、植物或動物來源的蛋白毒素、酶活性毒素、或其片段)或放射性同位素。
在一些實施例中，發明提供包括多肽的免疫偶聯 物，上述多肽包括本文的變異Fc區域與一或多個細胞毒性試劑偶聯，如化療試劑或藥物、生長抑制劑、毒素(例如，蛋白質毒素、細菌、真菌、植物或動物來源的酶促活性毒素或其片段)或放射性同位素。
在一實施例中，免疫偶聯物是抗體-藥物偶聯物(ADC)，其中抗體與一或多種藥物偶聯，包含但不限於美登木素生物鹼(maytansinoid)(請參照，美國專利號5,208,020、5,416,064及歐洲專利EP 0 425 235 B1)；auristatin例如單甲基auristatin藥物部分DE及DF(MMAE及MMAF)(請參照，美國專利號5,635,483及5,780,588及7,498,298)；尾海兔素(dolastatin)；加利車黴素(calicheamicin)或其衍生物(請參照，美國專利號5,712,374、5,714,586、5,739,116、5,767,285、5,770,701、5,770,710、5,773,001及5,877,296；Hinman等人，Cancer Res. 53：3336-3342(1993)；及Lode等人，Cancer Res. 58：2925-2928(1998))；蒽環類抗生素例如道諾黴素(daunomycin)或多柔比星(doxorubicin)(請參照Kratz等人，Current Med.Chem. 13：477-523(2006)；Jeffrey等人，Bioorganic & Med.Chem.Letters 16：358-362(2006)；Torgov等人，Bioconj.Chem. 16：717-721(2005)；Nagy等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：829-834(2000)；Dubowchik等人，Bioorg.& Med.Chem.Letters 12：1529-1532(2002)；King等人，J.Med.Chem. 45：4336-4343(2002)；及美國專利號6,630,579)；甲氨蝶呤；長春地辛(vindesine)；紫杉烷(taxane)例如多烯紫杉醇(docetaxel)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、Iarotaxel、tesetaxel、 及ortataxe；單端孢黴素(trichothecene)；及CC1065。
在另一實施例中，免疫偶聯物包括如本文所述的抗體偶聯至酶活性毒素或其片段，其包含但不限於白喉A鏈、白喉毒素的非結合活性片段、外毒素A鏈(來自綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白(ricin)A鏈、相思豆毒蛋白(abrin)A鏈、蒴蓮根毒蛋白(modeccin)A鏈、α-帚曲毒蛋白(sarcin)、油桐(Aleutites fordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陸(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜(Momordica charantia)抑制物、麻瘋樹毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制劑、白樹毒蛋白(gelonin)、米托黴素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚黴素(phenomycin)、依諾黴素(enomycin)和單端孢黴素(trichothecene)。
在另一實施例中，免疫偶聯物包括本文所述的抗體偶聯至放射性原子以形成放射性偶聯物。多種放射性同位素可用於製造放射性偶聯物。例子包含At211 、I131 、I125 、Y90 、Re186 、Re188 、Sm153 、Bi212 、P32 、Pb212 及Lu的放射性同位素。在使用放射性偶聯物進行檢測時，它可包括供閃爍法研究用的放射性原子，例如tc99m或I123，或供核磁共振(NMR)成像(又稱為磁共振成像，mri)用的自旋標記物，例如再次的碘-123、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳及鐵。
可使用多種雙功能蛋白偶合劑以形成抗體及細胞毒劑的偶聯物，例如N-琥珀醯亞氨基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀醯亞氨基-4-(N-馬來醯亞氨基甲基)環己烷-I- 羧酸酯(SMCC)、亞氨基硫烷(IT)、亞氨酸酯(例如鹽酸己二醯亞氨酸二甲酯)的雙功能衍生物、活性酯類(例如辛二酸二琥珀醯亞氨基酯)、醛類(例如戊二醛)、雙疊氮化合物(例如雙(對-疊氮苯甲醯基)己二胺)、雙重氮衍生物(例如雙(對-重氮苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(例如甲苯2,6-二異氰酸酯)、及雙活性氟化合物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，可以如Vitetta等人，Science 238：1098(1987)中所述製備蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14標記的1-異硫氰酸苄基-3-甲基二亞乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用於將放射性核苷酸與抗體偶聯的示例性螯合劑。請參照WO1994/11026。連接子(linker)可為有利於在細胞中釋放細胞毒性藥物的“可切割連接子”。例如，可使用酸不穩定連接子、肽酶敏感性連接子、光不穩定連接子、二甲基連接子或含二硫化物連接子(Chari等人，Cancer Res. 52：127-131(1992)；美國專利號5,208,020)。
本文的免疫偶聯物或ADC明確設想，但不限於用交聯劑製備的此類偶聯物，所述交聯劑包含但不限於BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、sulfo-EMCS、sulfo-GMBS、sulfo-KMUS、sulfo-MBS、sulfo-SIAB、sulfo-SMCC、及sulfo-SMPB，及SVSB(琥珀醯亞氨基-(4-乙烯基碸)苯甲酸酯)，其為市售的(例如，取自Pierce Biotechnology,Inc.,Rockford,IL.,U.S.A)。
E. 用於診斷及偵測的方法及組合物
在一些特定實施例中，本文提供之任一抗肌抑素 抗體對偵測肌抑素在生物樣品中的存在是有用的。用詞“偵測”，如本文所使用，涵蓋定量或定性偵測。在一些特定實施例中，生物樣品包括細胞或組織，例如血清、全血液、血漿、切片樣品、組織樣品、細胞懸浮液、唾液、痰、口腔液、腦脊髓液、羊膜液、腹水、乳汁、初乳、乳腺分泌物、淋巴、尿液、汗、淚液、胃液、關節液、腹腔液、眼內液或黏液。
在一實施例中，提供用於診斷或偵測方法霧中的抗肌抑素抗體。在又一態樣中，提供在生物樣品中偵測潛伏性肌抑素或肌抑素原胜肽的存在的方法。在一些特定實施例中，此方法包括在允許抗肌抑素抗體結合至肌抑素的條件下，使生物樣品與如本文所述之抗肌抑素抗體接觸，以及偵測是否有複合物形成於抗肌抑素抗體及肌抑素之間。此種方法可為體外或體內的方法。在一實施例中，抗肌抑素抗體被用以選擇適合抗肌抑素抗體療法的對象，例如，在肌抑素為用於患者的選擇之生物標記的情況下。
可使用本發明的抗體進行診斷的示例性疾病包含，但不限於，肌肉營養不良症(MD；包含Duchenne肌肉營養不良症)、肌萎縮性脊隨側索硬化症(ALS)、肌肉萎縮症、器官萎縮症、腕隧道症候群、衰弱症、充血阻塞性肺病(COPD)、肌肉減少症、惡病質、肌肉萎縮症候群、人類免疫缺乏病毒(HIV)引起的肌肉萎縮、第二型糖尿病、受損的葡萄糖耐受性、代謝症候群(包含X症候群)、胰島素抗性(包含損傷引起的抗性，例如，燒傷或氮失衡)、脂肪組織疾病(例如，肥胖、異常血脂症、非酒精性脂肪肝疾病等)、骨質疏鬆症(osteoporosis)、骨 質不足(osteopenia)、骨關節炎(osteoarthritis)及代謝性骨病(包含低骨質量、性腺早衰、雄激素抑制、維生素D缺乏、次發性副甲狀腺機能亢進症(secondary hyperparathyroidism)、營養不足及神經性厭食症(anorexia nervosa)。
在一些特定實施例中，提供標記的抗肌抑素抗體。標記包含但不限於，直接被偵測的標記或部分(例如，螢光、發色、電子密集、化學發光及放射性標記)，以及間接(例如藉由酶反應或分子相互作用)被偵測的部分，像是酶或配體。示例性標記包含但不限於，放射性同位素32 P、14 C、125 I、3 H及131 I、螢光團如稀土螯合物或螢光素及其衍生物、若丹明(rhodamine)及其衍生物、丹醯(dansyl)、傘形酮(umbellifeixme)、螢光素酶(luceriferase)，例如，螢火蟲螢光素酶和細菌螢光素酶(美國專利號4,737,456)、螢光素(luciferin)、2,3-二氫酞嗪二酮、辣根過氧化酶(HRP)、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖澱粉酶、溶解酶、糖類氧化酶，例如，葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶及葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、雜環氧化酶如尿酸酶及黃嘌呤氧化酶，結合利用過氧化氫以氧化染料前驅物的酶如HRP、乳過氧化酶、或微過氧化酶(microperoxidase)、生物素/親和素、自旋標記物、噬菌體標記、穩定的自由基等。
F. 醫藥配方
如本文所述的抗肌抑素抗體的醫藥配方藉由將具有所需程度純度的這種抗體與一或多種可選的醫藥上可接受的載體(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol, A.Ed.(1980))混合，以凍乾配方或水溶液的形式製備。
包括本文所述的變異Fc區域的多肽的醫藥配方，是藉由將具有想要程度的純度的此種多肽與一或多種可選的醫藥上可接受載體混合，以凍乾配方或水溶液的形式製備。
醫藥上可接受的載體通常在所使用的劑量及濃度對接受者無毒，且包含但不限於：緩衝劑，如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其它有機酸；抗氧化劑，包含抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(如氯化十八烷基二甲基苄銨；氯化六羥季銨；苯紮氯銨；苄索氯銨；苯酚；丁醇或苄醇；對羥基苯甲酸烷酯，如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質，如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，如甘胺酸、穀胺醯胺、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或賴胺酸；單糖、雙糖和其它糖類，包含葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，如EDTA；糖類，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽平衡離子，如鈉；金屬複合體(例如Zn-蛋白質複合體)；及/或非離子表面活性劑，如聚乙二醇(PEG)。本文中的示例性醫藥上可接受的載體尚包含藥物間質分散劑，如可溶性中性-活性透明質酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如，人類可溶性PH-20透明質酸酶糖蛋白，如rHuPH20(HYLENEX® ，Baxter International,Inc.))。特定的示例性sHASEGP及使用方法，包含rHuPH20，描述於美國專利公開號2005/0260186及2006/0104968中。在一態樣中，sHASEGP與一或多種額外的葡糖胺聚糖酶，例如軟骨素酶，組合。
示例性凍乾的抗體配方描述於美國專利號6,267,958中。水溶液抗體配方包含描述於美國專利號6,171,586及WO 2006/044908中的那些，後者配方包含組胺酸-醋酸鹽緩衝液。
本文的配方亦可包含多於一種的活性成分，若為被治療的特定適應症所需，較佳地具有不會不利地影響彼此的互補活性的那些活性成分。此種活性成分以對於目的用途有效的量合適地組合存在。
可將活性成分截留於例如藉由凝聚技術或藉由介面聚合所製備的微膠囊中，例如，羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊，分別地，在膠狀藥物傳遞系統(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米顆粒及奈米膠囊)中或在粗滴乳狀液中。這類技術揭露於Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980)中。
可製備持續釋放配方。持續釋放配方的合適例子包含含有抗體的固體疏水聚合物的半滲透基質，所述基質呈成形物品，例如薄膜或微膠囊形式。
將被用於體內施用的配方通常為無菌的。無菌可例如，藉由通過無菌過濾膜的過濾，而輕易地實現。
G. 治療方法和組合物
本文提供的任一抗肌抑素抗體可用於治療方法。相似地，本文提供的任一包括變異Fc區域的多肽可用於治療方法。
在一態樣中，提供用作藥物的抗肌抑素抗體。在 又一態樣中，提供用於治療肌肉萎縮疾病的抗肌抑素抗體。在一些特定的實施例中，提供用於治療方法中的抗肌抑素抗體。在一些特定的實施例中，本發明提供抗肌抑素抗體，其用於治療具有肌肉萎縮疾病的個體的方法，所述方法包括對個體施用有效量的抗肌抑素抗體。在這樣一實施例中，所述方法尚包括對個體施用有效量的至少一種額外的治療劑。在又一些實施例中，本發明提供用於增加肌肉組織質量的抗肌抑素抗體。在一些特定實施例中，本發明提供抗肌抑素抗體，其用於增加個體的肌肉組織質量的方法，所述方法包含對個體施用有效量的抗肌抑素抗體，以增加肌肉組織質量。在又一些實施例中，本發明提供用於增加肌肉組織力量的抗肌抑素抗體。在一些特定實施例中，本發明提供抗肌抑素抗體，其用於增加個體的肌肉組織力量的方法，所述方法包含對個體施用有效量的抗肌抑素抗體，以增加肌肉組織力量。在又一些實施例中，本發明提供用於減少身體脂肪累積的抗肌抑素抗體。在一些特定實施例中，本發明提供抗肌抑素抗體，其用於減少個體的身體脂肪累積的方法，所述方法包含對個體施用有效量的抗肌抑素抗體，以減少身體脂肪累積。根據以上任一實施例，“個體”較佳為人類。
本發明的抗肌抑素抗體可顯現pH依賴性結合特性。在又一些實施例中，發明提供用於增強肌抑素自血漿清除的用途的抗肌抑素抗體。在一些特定實施例中，發明提供抗肌抑素抗體，其使用於在個體中增進肌抑素自血漿清除的方法，包括施用有效量的抗肌抑素抗體於個體以增強肌抑素自抗原的清除。在一實施例中，相較於不具有pH依賴性結合特性的 常規抗肌抑素抗體，具有pH依賴性結合特性的抗肌抑素抗體增強肌抑素自血漿的清除。在又一實施例中，相較於不具有pH依賴性結合特性的常規抗肌抑素抗體，在pH5.8及pH7.4之間具有pH依賴性結合特性的抗肌抑素抗體增強肌抑素自血漿的清除。根據以上任一實施例，“個體”較佳為人類。
在又一態樣中，本發明提供抗肌抑素抗體在生產或製備藥物中的用途。在一實施例中，藥物是用於肌肉萎縮疾病的治療。在又一實施例中，藥物是用於治療肌肉萎縮疾病的方法中，其包括向具有肌肉萎縮疾病的個體施用有效量的藥物。在一實施例中，所述方法更包括對個體施用有效量的至少一種額外的治療劑。在又一實施例中，藥物是用於增加肌肉組織質量。在又一實施例中，藥物是用於增加個體的肌肉組織質量的方法中，其包含向個體施用有效量的藥物，以增加肌肉組織質量。在又一實施例中，藥物是用於增加肌肉組織力量。在又一實施例中，藥物是用於增加個體的肌肉組織力量的方法中，其包含向個體施用有效量的藥物，以增加肌肉組織力量。在又一實施例中，藥物是用於減少身體脂肪的累積。在又一實施例中，藥物是用於減少個體的身體脂肪的累積的方法中，其包含向個體施用有效量的藥物，以減少身體脂肪的累積。根據以上任一實施例，“個體”可為人類。
本發明的抗肌抑素抗體可顯示pH依賴性結合特性。在又一實施例中，藥物是用以增強肌抑素自血漿清除。在又一實施例中，藥物是使用於在個體中加強肌抑素自血漿清除的方法，包括施用有效量的藥物於個體以加強肌抑素自抗原的 清除。在一實施例中，相較於不具有pH依賴性結合特性的常規抗肌抑素抗體，具有pH依賴性結合特性的抗肌抑素抗體增強肌抑素自血漿的清除。在又一實施例中，抗肌抑素抗體在pH5.8及pH7.4之間顯示不同的pH依賴性結合特性。根據以上任一實施例，“個體”較佳為人類。
在另一態樣中，發明提供用於治療肌肉萎縮疾病的方法。在一實施例中，方法包括向具有所述的肌肉萎縮疾病的個體施用有效量之本文提供的抗肌抑素抗體。在一實施例中，所述方法更包括對個體施用有效量的至少一種額外的治療劑。根據以上任一實施例，“個體”可為人類。
在另一態樣中，發明提供用於增加個體的肌肉組織質量的方法。在一實施例中，方法包含對個體施用有效量之本文提供的抗肌抑素抗體，以增加個體的肌肉組織質量。在一實施例中，“個體”為人類。
在另一態樣中，發明提供用於增加個體的肌肉組織力量的方法。在一實施例中，方法包含對個體施用有效量之本文提供的抗肌抑素抗體，以增加個體的肌肉組織力量。在一實施例中，“個體”為人類。
在另一態樣中，發明提供用於減少個體的身體脂肪的累積的方法。在一實施例中，方法包含對個體施用有效量之本文提供的抗肌抑素抗體，以減少個體的身體脂肪的累積。在一實施例中，“個體”為人類。
本發明的抗肌抑素抗體可顯示pH依賴性結合特性。在又一實施例中，發明提供用於在個體中增強肌抑素自血 漿清除的方法。在一實施例中，方法包括對個體施用有效量之本文提供的抗肌抑素抗體，以增強肌抑素自血漿的清除。在一實施例中，相較於不具有pH依賴性結合特性的常規抗肌抑素抗體，具有pH依賴性結合特性的抗肌抑素抗體增強肌抑素自血漿的清除。在又一實施例中，抗肌抑素抗體在pH5.8及pH7.4之間顯示不同的pH依賴性結合特性。在一實施例中，“個體”為人類。
在又一態樣中，發明提供醫藥配方，其包括任一本文提供的抗肌抑素抗體，例如，用於任一以上的治療方法。在一實施例中，醫藥配方包括任一本文提供的抗肌抑素抗體及醫藥上可接受的載體。在另一實施例中，醫藥配方包括任一本文提供的抗肌抑素抗體以及至少一種額外的治療劑。
在又一態樣中，醫藥配方是用於肌肉萎縮疾病的治療。在又一實施例中，醫藥配方是用於增加肌肉組織的質量。在又一實施例中，醫藥配方是用於增加肌肉組織的力量。在又一實施例中，醫藥配方是用於減少身體脂肪的累積。本發明的抗肌抑素抗體可顯示pH依賴性結合特性。在又一實施例中，醫藥配方是用於增強肌抑素自血漿的清除。在一實施例中，醫藥配方被施用於具有肌肉萎縮疾病的個體。根據以上任一實施例，“個體”較佳為人類。
在又一態樣中，本發明提供用於製備藥物或醫藥配方的方法，包括將本文提供的任一抗肌抑素抗體與醫藥上可接受的載體混合，例如，用於以上任一的治療方法中。在一實施例中，用於製備藥物或醫藥配方的方法，更包括將至少一額 外的治療劑加入於藥物或醫藥配方中。
在一些特定實施例中，肌肉萎縮疾病是選自於由肌肉營養不良症(MD；包含Duchenne肌肉營養不良症)、肌萎縮性脊隨側索硬化症(ALS)、肌肉萎縮症、器官萎縮症、腕隧道症候群、衰弱症、充血阻塞性肺病(COPD)、肌肉減少症、惡病質、肌肉萎縮症候群、人類免疫缺乏病毒(HIV)引起的肌肉萎縮、第二型糖尿病、受損的葡萄糖耐受性、代謝症候群(包含X症候群)、胰島素抗性(包含損傷引起的抗性，例如，燒傷或氮失衡)、脂肪組織疾病(例如，肥胖、異常血脂症、非酒精性脂肪肝疾病，等等)、骨質疏鬆症(osteoporosis)、骨質不足(osteopenia)、骨關節炎(osteoarthritis)及代謝性骨病(包含低骨質量、性腺早衰、雄激素抑制、維生素D缺乏、次發性副甲狀腺機能亢進症(secondary hyperparathyroidism)、營養不足及神經性厭食症(anorexia nervosa)所組成的群組。
本文提供的任一包括Fc變異區域的多肽可用於治療方法中。在又一態樣中，本發明提供包括多肽的醫藥配方，上述多肽包括本文提供之任一包括Fc變異區域的多肽，例如，用於治療方法中。在一實施例中，醫藥配方包括多肽以及醫藥上可接受的載體，上述多肽包括本文提供之任一包括Fc變異區域的多肽。在另一實施例中，醫藥配方包括本文提供之包括任一Fc變異的多肽以及至少一額外的治療劑。
在一態樣中，提供用於作為藥物之包括變異Fc區域的多肽。在又一態樣中，提供用以治療病症之包括變異Fc區域的多肽。在一些特定實施例中，提供使用於治療的方法之 包括變異Fc區域的多肽。在一些特定實施例中，本文中提供包括變異Fc區域的多肽，其用於治療具有病症的個體之方法，包括對個體施用有效量之包括變異Fc區域的多肽。在一實施例中，方法更包括對個體施用有效量之至少一額外的治療劑。在一實施例中，“個體”為人類。
在又一態樣中，本發明提供包括變異Fc區域的多肽於製造或製備藥物的用途。在一實施例中，藥物是用於病症的治療。在一些態樣中，多肽為抗體。在一些態樣中，多肽為Fc融合蛋白。在又一實施例中，藥物是用於治療病症的方法中，包括對具有待治療病症的個體施用有效量的藥物。在一實施例中，方法更包括對個體施用有效量之至少一額外的治療劑。在一實施例中，“個體”為人類。
在又一態樣中，本發明提供用於治療病症的方法。在一實施例中，方法包括對具有所述病症的個體施用有效量之包括變異Fc區域的多肽。在一實施例中，方法更包括對個體施用有效量之至少一額外的治療劑。在一實施例中，“個體”為人類。
在又一態樣中，本發明提供包括多肽的醫藥配方，上述多肽包括本文提供的變異Fc區域，於治療方法中的使用，如本文所述之任一治療方法。在一實施例中，醫藥配方包括多肽及醫藥上可接受的載體，上述多肽包括本文提供的變異Fc區域。在另一實施例中，醫藥配方包括多肽及至少一額外的治療劑，上述多肽包括本文提供的變異Fc區域。
在又一態樣中，醫藥配方是用於治療病症。在一 實施例中，醫藥配方被施用於具有病症的個體。在一實施例中，“個體”為人類。
在又一些實施例中，本發明提供包含變異Fc區域的多肽於抑制B細胞、肥大細胞(mast cell)、樹突細胞(dendritic cell)和/或嗜鹼性白血球(basophil)活化的使用。在一些特定實施例中，本發明提供包含變異Fc區域的多肽於抑制B細胞、肥大細胞、樹突細胞和/或嗜鹼性白血球活化的方法的使用，所述方法包括對個體施用有效量的包含變異Fc區域的多肽，以抑制B細胞、肥大細胞、樹突細胞和/或嗜鹼性白血球的活化。在一實施例中，“個體”為人類。
在又一態樣中，本發明提供包括變異Fc區域的多肽於製造或製備藥物的用途。在一些態樣中，多肽為抗體。在一些態樣中，多肽為Fc融合蛋白。在又一實施例中，藥物是用於抑制B細胞、肥大細胞、樹突細胞和/或嗜鹼性白血球活化的使用。在又一些實施例中，藥物是用於抑制個體的B細胞、肥大細胞、樹突細胞和/或嗜鹼性白血球活化的方法的使用，其包括對個體施用有效量的藥物，以抑制B細胞、肥大細胞、樹突細胞和/或嗜鹼性白血球的活化。在一實施例中，“個體”為人類。
在又一態樣中，本發明提供用於抑制個體的B細胞、肥大細胞、樹突細胞和/或嗜鹼性白血球活化的方法。在一實施例中，方法包括對個體施用有效量的包含變異Fc區域的多肽，以抑制B細胞、肥大細胞、樹突細胞和/或嗜鹼性白血球的活化。在一實施例中，“個體”為人類。在一實施例中， “個體”為人類。
在又一態樣中，本發明提供包括多肽的醫藥配方，上述多肽包變異Fc區域。在又一實施例中，醫藥配方是用於抑制B細胞、肥大細胞、樹突細胞和/或嗜鹼性白血球的活化。
包括本發明的變異Fc區域的多肽可抑制B細胞、肥大細胞、樹突細胞和/或嗜鹼性白血球的活化。不期望受限於理論，相信這樣被抑制的活化是提供的變異Fc區域與FcγRIIb的選擇性結合，且不活化活化的FcγR的結果。如本文所使用的，“B細胞活化”包含增生、IgE產生、IgM產生及IgA產生。不期望受限於理論，相信這樣被抑制的B細胞活化是包括本發明的變異Fc區域的多肽上提供的變異Fc區域用IgE交聯FcγRIIb以抑制B細胞產生IgE、用IgM交聯FcγRIIb以抑制B細胞產生IgM及用IgA交聯FcγRIIb以抑制IgA產生的能力的結果。除了上述以外，與上述類似的抑制效果，藉由直接或間接使用表現在B細胞上且包含細胞內的免疫受體酪胺酸活化基序(ITAM)域或與免疫受體酪胺酸活化基序(ITAM)域，例如，BCR、CD19及CD79b交互作用的分子，交聯FcγRIIb而表現。如本文所使用的，”肥大細胞的活化”包含被IgE增生、活化及去顆粒作用(degranulation)。不期望受限於理論，相信抑制肥大細胞的活化是包括本發明的變異Fc區域的多肽上提供的變異Fc區域直接或間接以分子與FcγRIIb交聯之能力的結果，所述分子表現在肥大細胞上且包含細胞內的免疫受體酪胺酸活化基序(ITAM)域或與免疫受體酪胺酸活化基序 (ITAM)域，例如，FcεRI、DAP12及CD200R3交互作用。如本文所使用的，”樹突細胞的活化”包含樹突細胞的增生及去顆粒作用(degranulation)。不期望受限於理論，相信抑制樹突細胞的活化是包括本發明的變異Fc區域的多肽上提供的變異Fc區域直接或間接以表現在細胞膜上的分子與FcγRIIb交聯之能力的結果，所述分子包含細胞內的免疫受體酪胺酸活化基序(ITAM)域或與免疫受體酪胺酸活化基序(ITAM)域交互作用。
在又一些實施例中，本發明提供包括本文的變異Fc區域的多肽，於治療免疫發炎疾病的方法的使用。在一些特定實施例中，本發明提供包括本文的變異Fc區域的多肽，於個體中治療免疫發炎疾病的方法的使用，其包括對個體施用有效量的包括變異Fc區域的多肽，以治療免疫發炎疾病。在一實施例中，“個體”為人類。
在又一態樣中，本發明提供包括本文的變異Fc區域的多肽於製造或製備藥物的用途。在一些態樣中，多肽為抗體。在一些態樣中，多肽為Fc融合蛋白。在又一實施例中，藥物是用於治療免疫發炎疾病。在又一實施例中，藥物是用於治療個體的免疫發炎疾病的方法，其包括對個體施用有效量的藥物，以治療免疫發炎疾病。“個體”，根據上述實施例中的任一，可為人類。
在又一態樣中，本發明提供治療個體的免疫發炎疾病的方法。在一實施例中，方法包括對個體施用有效量的包括變異Fc區域的多肽，以治療免疫發炎疾病。在一實施例中，“個體”為人類。
在又一態樣中，本發明提供包括任一多肽的醫藥配方，上述任一多肽包括本文提供的Fc變異區域。在又一實施例中，醫藥配方是用於治療免疫發炎疾病。
如上所述，因為包括本發明的變異Fc區域的多肽可抑制B細胞、樹突細胞及/或嗜鹼性白血球的活化，施用包括本發明的變異Fc區域的多肽可因此治療或預防免疫發炎疾病。
在一些特定實施例中，治療的免疫發炎疾病係選自由類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis)、自體免疫性肝炎(autoimmune hepatitis)、自體免疫性甲狀腺炎(autoimmune thyroiditis)、自體免疫性起泡疾病(autoimmune blistering diseases)、自體免疫性腎上腺皮質疾病(autoimmune adrenocortical disease)、自體免疫性溶血性貧血(autoimmune hemolytic anemia)、自體免疫性血小板減少紫癜症(autoimmune thrombocytopenic purpura)、巨紅血球性貧血症(megalocytic anemia)、自體免疫性萎縮性胃炎(autoimmune atrophic gastritis)、自體免疫性嗜中性白血球減少症(autoimmune neutropenia)、自體免疫性睪丸炎(autoimmune orchitis)、自體免疫腦脊髓炎(autoimmune encephalomyelitis)、自體免疫性受體疾病(autoimmune receptor disease)、自體免疫性不孕症(autoimmune infertility)、慢性活動性肝炎(chronic active hepatitis)、腎小球性腎炎(glomerulonephritis)、間質性肺纖維化(interstitial pulmonary fibrosis)、多發性硬化症(multiple sclerosis)、佩吉特氏病(Paget's disease)、骨質疏鬆症 (osteoporosis)、多發性骨髓瘤(multiple myeloma)、葡萄膜炎(uveitis)、急性及慢性脊椎炎(acute and chronic spondylitis)、痛風性關節炎(gouty arthritis)、發炎性腸道疾病(inflammatory bowel disease)、成人呼吸窘迫症候群(adult respiratory distress syndrome(ARDS))、牛皮癬(psoriasis)、克隆氏病(Crohn's disease)、巴塞多氏病(Basedow's disease)、幼年型糖尿病(juvenile diabetes)、艾迪森氏病(Addison's disease)、重症肌無力症(myasthenia gravis)、鏡頭引起葡萄膜炎(lens-induced uveitis)、全身性紅斑性狼瘡(systemic lupus erythematosus)、過敏性鼻炎(allergic rhinitis)、過敏性皮膚炎(allergic dermatitis)、潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis)、過敏(hypersensitivity)、肌肉變性(muscle degeneration)、惡病質(cachexia)、全身性硬皮病(systemic scleroderma)、局部性硬皮病(localized scleroderma)、謝格連氏症候群(Sjogren's syndrome)、貝塞特氏病(Behchet's disease)、雷特氏症候群(Reiter's syndrome)、第一及第二型糖尿病(type I and type II diabetes)、骨吸收障礙(bone resorption disorder)、移植物對宿主反應(graft-versus-host reaction)、缺血-再灌流傷害(ischemia-reperfusion injury)、動脈粥狀硬化症(atherosclerosis)、腦外傷(brain trauma)、腦型瘧(cerebral malaria)、敗血症(sepsis)、敗血性休克(septic shock)、毒性休克症候群(toxic shock syndrome)、發燒(fever)、因染色的肌膜炎(malgias due to staining)、再生不良性貧血(aplastic anemia)、溶血性貧血(hemolytic anemia)、原發性血小板減少 症(idiopathic thrombocytopenia)、古巴士德氏症候群(Goodpasture's syndrome)、格巴二氏症候群(Guillain-Barre syndrome)、橋本甲狀腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、天疱瘡(pemphigus)、免疫球蛋白A腎病變(IgA nephropathy)、花粉症(pollinosis)、抗磷脂質抗體症候群(antiphospholipid antibody syndrome)、多發性肌炎(polymyositis)、韋格氏肉芽腫(Wegener's granulomatosis)、結節性動脈炎(arteritis nodosa)、混合性結締組織疾病(mixed connective tissue disease)、肌纖維痛(fibromyalgia)、氣喘(asthma)、異位性皮膚炎(atopic dermatitis)、慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis)、原發性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis)、原發性硬化性膽管炎(primary sclerosing cholangitis)、自體免疫性胰膜炎(autoimmune pancreatitis)、主動脈炎症候群(aortitis syndrome)、快速進行性腎絲球腎炎(rapidly progressive glomerulonephritis)、巨紅血球性貧血(megaloblastic anemia)、自發性血小板減少紫瘢(idiopathic thrombocytopenic purpura)、原發性甲狀腺低下症(primary hypothyroidism)、原發性艾迪森氏症(idiopathic Addison's disease)、胰島素依賴性糖尿病(insulin-dependent diabetes mellitus)、慢性圓盤狀紅斑性狼瘡(chronic discoid lupus erythematosus)、類天疱瘡(pemphigoid)、妊娠疱疹(herpes gestationis)、線狀免疫球蛋白A疱性皮膚病(linear IgA bullous dermatosis)、後天性水庖性表皮鬆解症(epidermolysis bullosa acquisita)、圓禿(alopecia areata)、尋常性白斑症(vitiligo vulgaris)、薩頓的離心性後天 性白斑病(leukoderma acquisitum centrifugum of Sutton)、原田氏症(Harada's disease)、自體免疫性視神經病變(autoimmune optic neuropathy)、自發性精子缺乏症(idiopathic azoospermia)、習慣性流產(habitual abortion)、低血糖症(hypoglycemia)、慢性蕁麻疹(chronic urticaria)、僵直性背椎炎(ankylosing spondylitis)、牛皮癬性關節炎(psoriatic arthritis)、腸病性關節炎(enteropathic arthritis)、反應性關節炎(reactive arthritis)、脊椎關節疾病(spondyloarthropathy)、接骨點病變(enthesopathy)、剌激性腸症候群(irritable bowel syndrome)、慢性疲勞症候群(chronic fatigue syndrome)、皮膚肌炎(dermatomyositis)、包涵體肌炎(inclusion body myositis)、施密特氏症(Schmidt's syndrome)、葛瑞夫茲氏症(Graves' disease)、惡性貧血(pernicious anemia)、類狼瘡性肝炎(lupoid hepatitis)、早老年痴呆(presenile dementia)、阿茲海默症(Alzheimer's disease)、脫髓鞘障礙(demyelinating disorder)、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis)、副甲狀腺機能減退症(hypoparathyroidism)、德雷斯勒症候群(Dressler's syndrome)、伊頓-藍伯症候群(Eaton-Lambert syndrome)、疱疹性皮膚炎(dermatitis herpetiformis)、脫髮(alopecia)、進行性全身性硬皮症(progressive systemic sclerosis)、CREST症候群(鈣沉著(calcinosis)、雷諾現象(Raynaud's phenomenon)、食道功能異常(esophageal dysmotility)、指(趾)硬化(sclerodactyly)及微血管擴張(telangiectasia))、類肉瘤病(sarcoidosis)、風濕熱(rheumatic fever)、多形性紅斑(erythema multiforme)、庫欣氏症候群(Cushing's syndrome)、輸血反應(transfusion reaction)、韓森氏病(Hansen's disease)、高安氏動脈炎(Takayasu arteritis)、風濕性多肌痛(polymyalgia rheumatica)、顳動脈炎(temporal arteritis)、巨細胞動脈炎(giant cell arthritis)、濕疹(eczema)、類淋巴瘤性肉芽腫(lymphomatoid granulomatosis)、川崎氏症(Kawasaki disease)、心內膜炎(endocarditis)、心肌內膜纖維化(endomyocardial fibrosis)、眼內炎(endophthalmitis)、胎兒紅血球母細胞增多症(fetal erythroblastosis)、嗜伊紅球性筋膜炎(eosinophilic fasciitis)、費爾蒂症候群(Fe1tysyndrome)、類過敏性紫斑症(Henoch-Schonlein purpura)、移植排斥(transplant rejection)、腮腺炎(mumps)、心肌病變(cardiomyopathy)、化膿性關節炎(purulent arthritis)、家族性地中海型發熱病(familial Mediterranean fever)、穆-韋二氏症候群(Muckle-Wells syndrome)及hyper-IgD症候群組成的群組。
在又一些實施例中，本發明提供包括變異Fc區域的多肽於治療或預防自體免疫性疾病的用途，前述自體免疫性疾病可由針對自體抗原的抗體的產生所導致或與針對自體抗原的抗體(自體抗體)的產生有關。在一些特定實施例中，本發明提供包括變異Fc區域的多肽於治療或預防個體的自體免疫性疾病的方法的用途，前述自體免疫性疾病可由針對自體抗原的抗體的產生所導致或與針對自體抗原的抗體(自體抗體)的產生有關，所述方法包括對個體施用有效用量的包括變異Fc區域的多肽，以治療或預防自體免疫性疾病。根據以上任一實施 例，“個體”較佳為人類。
在又一態樣中，本發明提供包括變異Fc區域的多肽於製造或製備藥物的用途。在一些態樣中，多肽為抗體。在一些態樣中，多肽為Fc融合蛋白。在又一實施例中，藥物用於治療或預防自體免疫性疾病，前述自體免疫性疾病可由針對自體抗原的抗體的產生所導致或與針對自體抗原的抗體(自體抗體)有關。在又一實施例中，藥物用於治療或預防個體的自體免疫性疾病的方法的用途，前述自體免疫性疾病可由針對自體抗原的抗體的產生所導致或與針對自體抗原的抗體(自體抗體)有關，所述方法包括對個體施用有效用量的藥物，以治療或預防自體免疫性疾病。根據以上任一實施例，“個體”可為人類。
在又一些實施例中，本發明提供治療或預防個體的自體免疫性疾病的方法，前述自體免疫性疾病可由針對自體抗原的抗體的產生所導致或與針對自體抗原的抗體(自體抗體)的產生有關。在一實施例中，方法包括對個體施用有效量的包括變異Fc區域的多肽，以治療或預防自體免疫性疾病。在一實施例中，“個體”為人類。
在又一態樣中，本發明提供醫藥配方，其包括任一本文提供的包括變異Fc區域的多肽。在又一實施例中，醫藥配方用於治療或預防自體免疫性疾病，前述自體免疫性疾病可由針對自體抗原的抗體的產生所導致或與針對自體抗原的抗體(自體抗體)的產生有關。
包括本發明的變異Fc區域的多肽可治療或預防自 體免疫性疾病，前述自體免疫性疾病可由針對自體抗原的抗體的產生所導致或與針對自體抗原的抗體(自體抗體)的產生有關，藉由抑制那些自體抗體的產生。抗體Fc部分與AchR(肌無力症的自體抗原)的融合分子的使用已被報導能抑制表現辨認AchR的BCR的B細胞的增生，且引發細胞凋亡(J.Neuroimmunol 227：35-43(2010))。形成於本發明的變異Fc區域與被自體抗體辨識的抗原之間的融合蛋白的使用使FcγRIIb能夠與在B細胞上的自體抗原的BCR交聯，導致B細胞增生的抑制和/或導致B細胞細胞凋亡的誘發。
在一些特定實施例中，可被治療或預防的自體免疫疾病係選自由格巴二氏症候群、重症肌無力症、慢性萎縮性胃炎、自體免疫性肝炎、原發性膽汁性肝硬化、原發性硬化性膽管炎、自體免疫性胰膜炎、主動脈炎症候群古巴士德氏症候群、快速進行性腎絲球腎炎、巨紅血球性貧血、自體免疫性溶血性貧血、自體免疫性嗜中性白血球減少症、自發性血小板減少紫瘢、巴塞多氏病、橋本甲狀腺炎、原發性甲狀腺低下症、原發性艾迪森氏症、胰島素依賴性糖尿病、慢性圓盤狀紅斑性狼瘡、局部性硬皮病、天疱瘡、類天疱瘡、線狀免疫球蛋白A疱性皮膚病、後天性水疱性表皮鬆解症、圓禿、尋常性白斑症、薩頓的離心性後天性白斑病、原田氏症、自體免疫性視神經病變、自發性精子缺乏症、習慣性流產、第二型糖尿病、低血糖症及慢性蕁麻疹所組成的群組。
在又一些實施例中，本發明提供包括變異Fc區域的多肽於治療與缺乏生物必需蛋白質有關的疾病的用途。在一 些特定實施例中，本發明提供包括變異Fc區域的多肽於治療個體中與缺乏生物必需蛋白質有關的疾病的用途，其包括對個體施用有效量的包括變異Fc區域的多肽，以治療疾病。根據以上任一實施例，“個體”較佳為人類。
在又一態樣中，本發明提供包括變異Fc區域的多肽於製造或製備藥物的用途。在一些態樣中，多肽為抗體。在一些態樣中，多肽是Fc融合蛋白。在又一實施例中，藥物用於治療與缺乏生物必需蛋白質有關的疾病。在又一實施例中，藥物用於治療個體的與缺乏生物必需蛋白質有關的疾病之方法中，其包括對個體施用有效量的藥物，以治療疾病。根據以上任一實施例，“個體”可為人類。
在又一態樣中，本發明提供治療個體中與缺乏生物必需蛋白質有關的疾病的方法。在一實施例中，方法包括對個體施用有效量的包括變異Fc區域的多肽，以治療疾病。在一實施例中，“個體”為人類。
在又一態樣中，本發明提供醫藥配方，其包括任一本文提供的包括變異Fc區域的多肽。在又一實施例中，醫藥配方用於治療與缺乏生物必需蛋白質有關的疾病。
對於缺乏生物必需蛋白質的疾病，使用施用及補充此蛋白質作為醫藥試劑的治療方法。然而，因為患者在一開始就缺少此蛋白質，所以從外在補充的蛋白質被認為是外來物質，且產生針對所述蛋白質的抗體。因此，此蛋白質變得容易被移除，且作為醫藥的效果也降低。使用包括這樣的蛋白質和本發明的變異Fc區域的融合蛋白，使FcγRIIb及能辨認在B 細胞上的蛋白質的BCR能夠進行交聯，而導致抑制針對前述蛋白質的抗體的產生。
在一些特定實施例中，用於補充的蛋白質係選自由第八因子(Factor VIII)、第九因子(Factor IX)、甲狀腺過氧化酶(TPO)、紅血球生成素(EPO)、艾杜糖醛酸酶(α-iduronidase)、艾杜糖醛酸硫酸酯酶(iduronate sulfatase)、A型乙醯肝素N-硫酸酯酶(A-type heparan N-sulfatase)、B型α-N-乙醯葡萄糖胺苷酶(B type α-N-acetylglucosaminidase)、C型乙醯輔酶A：α-葡萄糖胺乙醯轉移酶(C type acetyl CoA：α-glucosaminidase acetyltransferase)、D型N-乙醯葡萄糖胺6硫酸酯酶(D type N-acetylglucosamine 6-sulfatase)、半乳糖6硫酸酯酶(galactose 6-sulfatase)、N-乙醯半乳糖胺4-硫酸酯酶(N-acetylgalactosamine 4-sulfatase)、β-葡萄醣醛酸酶(β-glucuronidase)、α-半乳糖水解酵素(α-galactosidase)、酸性α-半乳糖水解酵素(acidic α-galactosidase)及葡萄糖腦苷脂酶(glucocerebrosidase)所組成的群組。為了，例如：血友病(hemophilia)、自發性血小板減少紫瘢(idiopathic thrombocytopenic purpura)、腎性貧血(renal anemia)及溶小體疾病(lysosomal disease：黏多醣儲積症(mucopolysaccharidosis)、費勃來氏病(Fabry's disease)、龐貝氏症(Pompe disease)及高歇氏病(Gaucher's disease))，可補充這些蛋白質，而不受限於前述疾病。
在又一些實施例中，本發明提供包括變異Fc區域的多肽於治療病毒感染的用途。在一些實施例中，本發明提供 包括變異Fc區域的多肽於治療個體的病毒感染的方法的用途，其包括對個體施用有效量的包括變異Fc區域的多肽，以治療病毒感染。根據以上任一實施例，“個體”較佳為人類。
在又一態樣中，本發明提供包括本文提供的變異Fc區域的多肽於製造或製備藥物的用途。在一些態樣中，多肽為抗體。在一些態樣中，多肽為Fc融合蛋白。在又一實施例中，藥物係用於治療病毒感染。在又一實施例中，藥物用於治療個體中病毒感染之方法，其包括對個體施用有效量的藥物，以治療病毒感染。根據以上任一實施例，“個體”可為人類。
在又一態樣中，本發明提供用於治療個體的病毒感染的方法。在一實施例中，方法包括對個體施用有效量的包括變異Fc區域的多肽，以治療病毒感染。在一實施例中，“個體”為人類。
在又一態樣中，本發明提供醫藥配方，其包括任一本文提供的包括變異Fc區域的多肽。在又一實施例中，醫藥配方係用於治療病毒感染。
包括本發明的變異Fc區域的抗病毒抗體可用傳統抗病毒抗體觀察抑制抗體依賴性增強(antibody-dependent enhancement)。抗體依賴性增強是與抗體結合的病毒透過活化的FcγR被細胞吞噬，使得病毒對細胞的感染被增強的現象。抗登革熱病抗體與FcγRIIb的結合已被報導在抑制抗體依賴性增強中扮演重要角色(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 108：12479-12484,(2011))。藉由抗登革熱病毒抗體和登革熱病毒的免疫複合體，交聯FcγRIIb分子，可抑制FcγR-媒介的細胞吞 噬作用，而導致抗體依賴性增強作用的抑制。這樣子的病毒的實例包含登革熱病毒(第一型登革熱病毒株、第二型登革熱病毒株、第三型登革熱病毒株及第四型登革熱病毒株)及人類免疫缺乏病毒(HIV)，但不限於前面所述。
在又一些實施例中，本發明提供包括變異Fc區域的多肽於預防或治療動脈硬化症(arteriosclerosis)的用途。在一些特定實施例中，本發明提供包括變異Fc區域的多肽於預防或治療個體的動脈硬化症的方法的用途，其包括對個體施用有效量的包括變異Fc區域的多肽，以預防或治療動脈硬化症。在一些態樣中，多肽為抗體。在一些態樣中，多肽為Fc融合蛋白。根據以上任一實施例，“個體”較佳為人類。
在又一態樣中，本發明提供包括變異Fc區域的多肽於製造或製備藥物的用途。在一些態樣中，多肽為抗體。在一些態樣中，多肽為Fc融合蛋白。在又一實施例中，藥物係用於預防或治療動脈硬化症。在又一實施例中，藥物係用預防或治療個體的動脈硬化症之方法，其包括對個體施用有效量的藥物，以預防或治療動脈硬化症。根據以上任一實施例，“個體”可為人類。
在又一態樣中，本發明提供預防或治療個體的動脈硬化症的方法。在一實施例中，方法包括對個體施用有效量的包括變異Fc區域的多肽，以預防或治療動脈硬化症。在一實施例中，“個體”為人類。
在又一態樣中，本發明提供醫藥配方，其包括任一本文提供的包括變異Fc區域的多肽。在一些態樣中，多肽 為抗體。在一些態樣中，多肽為Fc融合蛋白。在又一實施例中，醫藥配方係用於預防或治療動脈硬化症。
針對氧化態低密度脂蛋白(LDL)的抗體，亦即，動脈硬化的成因，其包括本發明的變異Fc區域，可預防發炎細胞的FcγRIIa依賴性附著。已報導，當抗氧化態低密度脂蛋白抗體抑制氧化態低密度脂蛋白及CD36的交互作用時，抗氧化態低密度脂蛋白抗體與內皮細胞結合，單核球以FcγRIIa依賴性或FcγRI依賴性方法，辨認它們的Fc部分(Immunol.Lett. 108：52-61，(2007))。使用包括本發明的變異Fc區域的抗體可抑制FcγRIIa依賴性結合且藉由FcγRIIb媒介的抑制訊號，抑制單核球附著。
在又一些實施例中，本發明提供包括變異Fc區域的多肽於預防或治療癌症的用途。在一些特定實施例中，本發明提供包括變異Fc區域的多肽於個體的預防或治療癌症的方法的用途，其包括對個體施用有效量的包括變異Fc區域的多肽，以預防或治療癌症。根據以上任一實施例，“個體”較佳為人類。
在又一態樣中，本發明提供包括本文提供的變異Fc區域的多肽於藥物製造或製備的用途。在一些態樣中，多肽為抗體。在一些態樣中，多肽為Fc融合蛋白。在又一實施例中，藥物用於預防或治療癌症。在又一實施例中，藥物於個體預防或治療癌症的方法的用途，包括對個體施用有效量的藥物，以預防或治療癌症。根據以上任一實施例，“個體”可為人類。
在又一態樣中，本發明提供個體預防或治療癌症的方法。在一實施例中，方法包括對個體施用有效量的包括變異Fc區域的多肽，以預防或治療癌症。在一些態樣中，多肽為抗體。在一些態樣中，多肽為Fc融合蛋白。在一實施例中，“個體”為人類。
在又一態樣中，本發明提供醫藥配方，其包括任一本文提供的包括變異Fc區域的多肽。在一些態樣中，多肽為抗體。在一些態樣中，多肽為Fc融合蛋白。在又一實施例，醫藥配方係用於預防或治療癌症。
如以上所述，為人所熟知的是，加強FcγRIIb的結合增加促效抗體(agonist antibody)的催動作用，且加強抗體的抗腫瘤效果。因此，包括本發明的變異Fc區域的促效抗體在治療或預防癌症上很有用。具體地，本發明的變異Fc區域加強針對，例如，腫瘤壞死因子受體家族的受體，如：CD120a、CD120b、淋巴毒素β受體(Lymphotoxin β receptor)、CD134、CD40、FAS、TNFRSF6B、CD27、CD30、CD137、TNFRSF10A,TNFRSF10B、TNFRSF10C、TNFRSF10D、RANK、蝕骨細胞抑制因子(Osteoprotegerin)、TNFRSF12A、TNFRSF13B、TNFRSF13C、TNFRSF14、神經生長因子受體(Nerve growth factor receptor)、TNFRSF17、TNFRSF18、TNFRSF19、TNFRSF21、TNFRSF25及Ectodysplasin A2 receptor，的抗體催動作用，且可被用於治療或預防癌症。再者，針對透過與FcγRIIb的交互作用而表現催動作用之其它分子的抗體的催動作用也被加強。此外，藉由將本發明的變異Fc區域併入針對 受體酪胺酸激酶(RTK)，如Kit的抗體，抗體針對細胞生長的抑制效果可被加強，前述Kit一與FcγRIIb交聯便抑制細胞增生。
在一些實施例中，本發明提供預防或治療癌症的方法，包含但不限於選自小細胞肺癌(small cell lung cancer)、非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer)、肺腺癌(pulmonary adenocarcinoma)及肺的鱗狀細胞癌(squamous cell carcinoma of the lung)、大腸癌(large intestine cancer)、直腸癌(rectal cancer)、大腸癌(colon cancer)，乳癌(breast cancer)、肝癌(liver cancer)、胃癌(gastric cancer)、胰臟癌(pancreatic cancer)、腎癌(renal cancer)、前列腺癌(prostate cancer)、卵巢癌(ovarian cancer)、甲狀腺癌(thyroid cancer)、膽管癌(cholangiocarcinoma)、腹膜癌(peritoneal cancer)、中皮瘤(mesothelioma)、鱗狀細胞癌(squamous cell carcinoma)、子宮頸癌(cervical cancer)、子宮內膜癌(endometrial cancer)、膀胱癌(bladder cancer)、食道癌(esophageal cancer)、頭頸部癌(head and neck cancer)、鼻咽癌(nasopharyngeal cancer)、唾液腺腫瘤(salivary gland tumor)、胸腺瘤(thymoma)、皮膚癌(skin cancer)、基底細胞瘤(basal cell tumor)、惡性黑色素瘤(malignant melanoma)及肛門癌(anal cancer)、陰莖癌(penile cancer)、睪丸癌(testicular cancer)，威爾姆氏癌Wilms' tumor、急性骨髓性白血病(acute myeloid leukemia)(包含acute myeloleukemia、急性骨髓母細胞性白血病(acute myeloblastic leukemia)、急性前骨髓性白血病(acute promyelocytic leukemia),急性骨髓性單核球白血病(acute myelomonocytic leukemia)及急性單核球白血病(acute monocytic leukemia)、慢性骨髓性白血病(chronic myelogenous leukemia)、急性淋巴母細胞性白血病(acute lymphoblastic leukemia)、慢性淋巴性白血病(chronic lymphatic leukemia)、何杰金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)、非何杰金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma：巴克斯淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、慢性淋巴球性白血病(chronic lymphocytic leukemia)、蕈狀肉芽腫(mycosis fungoides)、外套細胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma)、濾泡性淋巴瘤(follicular lymphoma)、瀰漫性大型細胞淋巴瘤(diffuse large-cell lymphoma)、邊緣區淋巴瘤(marginal zone lymphoma)、毛細胞性白血病漿細胞瘤(pilocytic leukemia plasmacytoma)、周邊T細胞淋巴瘤(peripheral T-cell lymphoma)及成人T細胞白血病/淋巴瘤(adult T cell leukemia/lymphoma))、蘭格罕細胞組織球增生症(Langerhans cell histiocytosis)、多發性骨髓瘤(multiple myeloma)、骨髓增生不良症候群(myelodysplastic syndrome)、腦瘤(brain tumor)(包含神經膠瘤(glioma)、星狀細胞瘤(astroglioma)、神經膠母細胞瘤(glioblastoma)、腦膜瘤(meningioma)及室管膜瘤(ependymoma))、神經母細胞瘤(neuroblastoma)、視網膜母細胞瘤(retinoblastoma)、骨肉瘤(osteosarcoma)、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、依汶氏肉瘤(Ewing's sarcoma)、血管肉瘤(angiosarcoma)及血管外皮細胞瘤(hemangiopericytoma)所組成的群組的成員。
已藉由至少一胺基酸殘基的修飾而對FcγR(包含FcγRIIb)具有增強的結合活性之經修飾的抗體，可提升抗原自血漿清除，例如，如WO 2013/047752、WO 2013/125667、WO 2014/030728或WO 2014/163101中所述或建議。
不受限於特定理論，在中性pH條件下具有增加的FcγR結合活性的抗體以及與抗體複合的其抗原會一起快速地被細胞攝入，導致當抗體被施用於體內時，抗原自血漿的清除提升。
已藉由至少一可暴露於抗體表面的胺基酸殘基的修飾而具有增加的pI之經修飾的抗體，可更快地被併入細胞中或可提升抗原自血漿消除，例如，如WO 2007/114319、WO 2009/041643、WO 2014/145159或WO 2012/016227中所述或建議。
不受限於特定理論，據信生物液(例如，血漿)的pH是在中性pH範圍中。在生物液中，pI增加的抗體的淨正電荷是由於增加的pI而增加，結果導致抗體藉由物理化學庫倫相互作用較強烈地被吸引至內皮細胞表面，其相較於不具有增加的pI的抗體，具有淨負電荷。這代表，藉由此類非特異性結合，攝入細胞的抗體及與其複合的抗原增加，其造成抗原自血漿的消除增強。這些現象被預期在體內經常發生，無論何種細胞類型、組織類型、器官類型等。
於本文中，抗體自血漿消除的增強代表，例如，相較於當施用包括未經修飾的對應Fc區域時的速率，抗原自血漿消除的速率增加。抗原自血漿消除的增加可藉由，例如， 測量抗原於血漿中的濃度加以評估。用於測量抗原於血漿中的濃度之各種方法在所屬領域中為習知的。
在又一些實施例中，本發明提供包括變異Fc區域的多肽，用於提升抗原自血漿的消除。在一些特定實施例中，本發明提供包括變異Fc區域的多肽，用於在個體中提升抗原自血漿消除的方法，包括對個體施用有效量之包括變異Fc區域的多肽，以提升抗原自血漿的消除。在那些實施例中，較佳為多肽更包括抗原結合域。根據以上任一實施例，“個體”較佳為人類。
在又一態樣中，本發明提供包括變異Fc區域的多肽於藥物的製造或製備之用途。在一些態樣中，多肽為抗體。在一些態樣中，多肽為Fc融合抗體。在又一實施例中，藥物是用以提升抗原自血漿的消除。在又一實施例中，藥物使用於在個體中提升抗原自血漿消除的方法，包括對個體施用有效量之藥物，以提升抗原自血漿的消除。在那些實施例中，較佳為多肽更包括抗原結合域。根據以上任一實施例，“個體”可為人類。
在又一實施例中，本發明提供用以在個體中提升抗原自血漿消除的方法。在一實施例中，方法包括對個體施用有效量之包括變異Fc區域的多肽，以提升抗原自血漿的消除。在那些實施例中，較佳為多肽更包括抗原結合域。在一實施例中，“個體”為人類。
在又一態樣中，本發明提供包括任一多肽的醫藥配方，上述任一多肽包括本文提供的Fc變異區域。在又一實 施例中，醫藥配方是用以提升抗原自血漿的消除。在所述實施例中，較佳為多肽更包括抗原結合域。
在一實施例中，當相較於胺基酸修飾之前，本發明具有變異Fc區域的抗體增強抗原自血漿消除，例如，至少1.1倍、1.1倍、1.25倍、1.5倍、1.75倍、2.0倍、2.25倍、2.5倍、2.75倍、3.0倍、3.25倍、3.5倍、3.75倍、4.0倍、4.25倍、4.5倍、4.75倍、5.0倍、5.5倍、6.0倍、6.5倍、7.0倍、7.5倍、8.0倍、8.5倍、9.0倍、9.5倍、或10.0倍或更多，當抗體施用於體內時。
在又一態樣中，發明提供用於製備藥物或醫藥配方的方法，包括將包含本文提供之變異Fc區域的任一多肽與醫藥上可接受的載體混合，例如，使用於以上任一治療方法中。在一實施例中，用於製備藥物或醫藥配方的方法更包括添加至少一種額外的治療劑至藥物或醫藥配方中。
在治療中，本發明的抗體可被單獨使用或與其它試劑組合使用。例如，本發明的抗體可與至少一種額外的治療劑共同施用(co-administered)。
同樣地，本發明包括變異Fc區域的多肽在治療中可被單獨使用或與其它試劑組合使用。例如，本發明包括變異Fc區域的多肽可能與至少一種額外的醫療藥劑共同施用。
如上述這樣的組合療法包含組合施用(其中兩種或更多的治療劑被包含在相同或分開的配方中)，及分別施用，在這情況下，發明的抗體或包括變異Fc區域的多肽的施用可以發生在額外的治療劑及/或試劑的施用前、同時及/或之 後。在一實施例中，抗肌抑素抗體的施用及額外治療劑的施用在約一個月內，或約一、二或三個星期內，或約一、二、三、四、五或六天內彼此發生。
在另一實施例中，包括變異Fc區域的多肽的施用及額外治療劑的施用在約一個月內，或約一、二或三個星期內，或約一、二、三、四、五或六天內彼此發生。
發明的抗體或包括變異Fc區域的多肽(以及可選地任一額外的治療劑)可藉由任何合適的方法施用，包含腸胃外施用、肺內施用及鼻內施用，並且，若局部治療需要，病變內施用。腸胃外輸注包含肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下施用。在一定程度上根據用藥是短期或長期性而定，可藉由任何適合途徑，例如藉由注射，例如靜脈內或皮下注射用藥。本文中涵蓋各種用藥時程，包含但不限於，單次施用或在多個時間點多次施用、推注施用及脈衝輸注。
發明的抗體或包括變異Fc區域的多肽可以與良好醫療實踐相符的方式進行配方、配量及施用。在此背景下考慮的因素包含待治療的特定病症、待治療的特定哺乳動物、個體患者的臨床狀態、病症的原因、遞送試劑的位置、施用方法、施用時間安排、及醫療從業者已知的其它因素。抗體不需要、但可選地，與目前用於預防或治療問題病症的一或多種試劑一起配製。其它試劑的有效量取決於配方中存在的抗體量、病症或治療的類型、及以上討論的其它因素。這些一般以相同劑量，及使用如本文所述的施用途徑，或以本文所述的劑量的約1至99%，或以藉由經驗/臨床確定合適的任一劑量及任一途徑 加以使用。
為了疾病的預防或治療，本發明的抗體的合適劑量(當單獨或與一或多種其它額外的治療劑組合使用時)將取決於待治療疾病的類型、抗體的種類、包括變異Fc區域的多肽的種類、疾病的嚴重性及進程、抗體或包括變異Fc區域的多肽是以預防或治療目的施用、以前的治療、患者的臨床病史和對抗體或包括變異Fc區域的多肽的反應、及主治醫師的判斷。發明的抗體或包括變異Fc區域的多肽以一次性治療或經過一系列治療合適地施用於患者。根據疾病的類型及嚴重性，約1μg/kg至15mg/kg(例如，0.1mg/kg-10mg/kg)的抗體可為用於對患者施用的最初候選劑量，無論，例如，藉由一次或多次分別施用，或藉由連續輸注。一典型的每日劑量可在約1μg/kg至100mg/kg或更多的範圍內，其取決於上文提及的因素。為了重複施用數日或更久，根據病症，通常將持續治療直至出現疾病症狀的理想抑制。抗體或包括變異Fc區域的多肽的一示例性劑量應為約0.05mg/kg-約10mg/kg的範圍內。因此，約0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其任意組合)的一或多個劑量可施用於患者。這樣的劑量可間隔地，例如每週或每三周施用(例如，以使得患者接受約2至約20，或例如約6個劑量的抗體或包括變異Fc區域的多肽)。可施用最初較高的負荷劑量，接著是一或多個較低的劑量。此療法的進展可藉由常規方法及測定容易進行監測。
應理解的是，上述任一配方或治療方法可利用發明的免疫偶聯物以替代或添加至抗肌抑素抗體加以實行。
類似地，應理解的是，上述任一配方或治療方法可利用發明的免疫偶聯物以替代或添加至本文提供之包括變異Fc區域的多肽加以實行。
H. 製品
在發明的另一態樣中，提供一種製品，其包含可用於治療、預防及/或診斷上述病症的材料。製品包括容器及於容器上或與容器結合的標籤或藥品仿單(package insert)。適合的容器包含，例如，瓶子、小瓶、注射器、IV溶液包等。容器可由各種材料如玻璃或塑膠製成。容器裝有組合物，所述組合物是單獨地或與可有效用於治療、預防及/或診斷病症的另一組合物結合，對於症狀的治療有效的組合物，且可具有無菌的存取口(例如，容器可具有可被皮下注射針刺穿的塞子的靜脈內溶液袋或小瓶)。組合物中至少一活性試劑為本發明的抗體。標籤或藥品仿單標明組合物是用於治療特定的病症。此外，所述製品可包含(a)包含組合物於其中的第一容器，其中組合物包括本發明的抗體；及(b)包含組合物於其中的第二容器，其中組合物包括另外的細胞毒性劑或其它的治療劑。在本發明的此實施例中的製品，可更包括標明組合物可用於治療特定症狀的藥品仿單。替代地或額外地，製品可更包括第二(或第三)容器，其包括醫藥上可接受的緩衝劑，如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、Ringer氏溶液及葡萄糖溶液。從商業及用戶立場，它尚可包涵所需的其它材料，包含其它緩衝劑、稀釋劑、濾膜、針頭及注射器。
應理解的是，上述任一製品可包含本發明的免疫 偶聯物以替代或添加至抗肌抑素抗體。
實施例
以下為本發明的方法及組合物的例子。應理解的是，根據以上提供的一般性描述，可實施多種其它的實施例。
實施例1
人類、恆河猴及老鼠潛伏及成熟形式肌抑素之表達及純化
利用FreeStyle293-F細胞(FS293-F細胞)(Thermo Fisher,Carlsbad,CA,USA)短暫地表達人類潛伏性肌抑素(本文中亦稱為人類肌抑素潛伏形式)(序列辨識號：1)。包含經表達之人類肌抑素潛伏形式的條件培養基被酸化至pH6.8，並以1/2體積的milliQ水被稀釋，接著應用於Q-sepharose FF陰離子交換管柱(GE healthcare,Uppsala,Sweden)。將流經的級分調整至pH5.0，並用於SP-sepharose HP陽離子交換管柱(GE healthcare,Uppsala,Sweden)，接著以NaCl梯度洗提。收集包含人類肌抑素潛伏形式的級分，接著施加於經1x PBS平衡的Superdex 200膠體過濾管柱(GE healthcare,Uppsala,Sweden)。收集包含人類肌抑素潛伏形式的級分並儲存於-80℃。
從經純化的人類肌抑素潛伏形式純化人類成熟的肌抑素(本文中亦稱為人類肌抑素成熟形式)(序列辨識號：2)。藉由加入0.1% trifluoroacetic acid(TFA)酸化人類肌抑素潛伏形式，且應用於Vydac 214TP C4逆相管柱(Grace,Deerfield,IL,USA)及以TFA/CH3 CN梯度洗提。收集包含人類成熟的肌抑素的級分並儲存於-80℃。為了重建，溶解人類成熟的肌抑素於 4mM HCl中。
恆河猴(cynomolgus或cyno)及老鼠的肌抑素潛伏及成熟形式(恆河猴的分別為序列辨識號：3及4；老鼠的分別為序列辨識號：5及6)的表達及純化均以和人類對應部分相同之方法實行。在人類、恆河猴及老鼠之間成熟形式的序列同源性為100%相同，因此，在所有需要的實驗中，不管物種的使用任一成熟的肌抑素作為成熟的肌抑素。
實施例2
抗潛伏性肌抑素抗體的辨識
以下列方式製備、選擇及分析抗潛伏性肌抑素抗體。
以老鼠潛伏性肌抑素及/或人類潛伏性肌抑素(50-100μg/劑量/兔)皮內地免疫12至16周大的NZW兔。在1個月的期間重複此劑量3-4次。在最後一次免疫的一星期後，收集經免疫的兔子的脾臟及血液。抗原特異性的B細胞被標記抗原染色，並被FCM細胞分選器分選(FACS aria III,BD)，以1個細胞/孔的密度與25,000個細胞/孔的EL4細胞一起分盤於96孔盤中(European Collection of Cell Cultures)，且以兔子T細胞條件培養基稀釋20倍，並培養7-12天。預先以絲裂黴素C(Sigma)處理EL4細胞2小時並清洗3次。藉由培養兔子胸腺細胞於包含植物血球凝集素-M(Roche)、佛波醇12-肉荳蔻酸酯13-乙酸酯(Sigma)及2% FBS的RPMI-1640中以製備兔子T細胞條件培養基。在培養後，收集B細胞培養上清液供進一步分析，以及冷凍保存沉澱物(pellet)。
使用ELISA分析以測試B細胞培養上清液中抗體 的特異性。將親和素(streptavidin)(GeneScript)被覆於384孔MAXISorp(Nunc)上，在50nM的PBS中放置常溫1小時。接著以稀釋5倍的Blocking One(Nacalai Tesque)阻斷盤。以NHS-PEG4-Biotin(PIERCE)標記人類或老鼠潛伏性肌抑素，並添加至經阻斷的ELISA盤，培養1小時並以具有0.05% Tween-20的Tris緩衝鹽水(TBS-T)清洗。將B細胞培養上清液加至ELISA盤，培養1小時並以TBS-T清洗。藉由山羊的抗-兔子IgG-辣根過氧化酶(BETHYL)接著加入ABTS(KPL)進行結合的偵測。
總共篩選17,818個B細胞系對老鼠及/或人類潛伏性肌抑素的結合特異性，299個系被選擇且指定為MST0255-287、630-632、677-759、910、932-1048、1050-1055、1057-1066、1068、1070-1073、1075-1110、1113-1119。使用ZR-96 Quick-RNA套組(ZYMO RESEARCH)由對應的細胞沉澱物純化RNA。
藉由反轉錄PCR將編碼各選擇的細胞系的重鏈及輕鏈的可變區的DNA放大，並分別選殖(clone)至具有重鏈恆定區G1m序列(序列辨識號：50(胺基酸序列如序列辨識號：7所示))及具有輕鏈恆定區k0MTC或k0MC序列(序列辨識號：53或194(胺基酸序列(均相同)如序列辨識號：8所示))的表達載體中。利用FreeStyle FS293-F細胞及293fectin(Life technologies)短暫地表達重組的抗體，根據製造商的使用說明。使用培養上清液或重組的抗體於篩選。以蛋白質A(GE Healthcare)純化重組的抗體並洗提於D-PBS或His緩衝液 (20mM組胺酸、150mM NaCl，pH6.0)中。視需要，可進一步進行尺寸排除層析以移除高分子量及/或低分子量成分。
實施例3
抗潛伏性肌抑素抗體的性質分析(HEK Blue分析(BMP1活化))
使用報導基因分析以取得活性肌抑素在體內的生物活性。表達可誘導Smad3/4結合元素(SBE)的SEAP報導基因之HEK-BlueTM TGF-β細胞(Invivogen)使藉由監測活化素第1及2型受體的活化之生物活性肌抑素的偵測得以進行。活性肌抑素刺激分泌至細胞上清液的SEAP的產生。接著利用QUANTIBlueTM (Invivogen)評估分泌的SEAP量。
將HEK-BlueTM TGF-β細胞維持於以10%胎牛血清、50μg/mL鏈黴素、50U/mL青黴素、100μg/mL NormocinTM 、30μg/mL的Blasticidin、200μg/mL的HygroGoldTM 及100μg/mL的ZeocinTM 補充的DMEM培養基(Gibco)中。在功能分析期間，將細胞換到分析培養基(具有0.1%牛血清白蛋白、鏈黴素、青黴素及NormocinTM 的DMEM)並接種至96孔盤中。將人類、恆河猴或老鼠潛伏性肌抑素與重組的人類BMP1(R&D Systems)及抗潛伏性抗體在37℃下隔夜培養。將樣品混合物轉移至細胞中。在24小時培養後，將細胞上清液與QUANTIBlueTM 混合，並於比色盤讀取器中測量在620nm的光學密度。如第1圖所示，mAb MST1032-G1m(胺基酸及核苷酸序列請參照表2a)防止人類、恆河猴及老鼠潛伏性肌抑素的蛋白酶介導活化，反映在分泌的SEAP降低的濃度。 MST1032-G1m對於人類、恆河猴及老鼠潛伏性肌抑素顯示類似的抑制活性。
實施例4
抗潛伏性肌抑素抗體的性質分析(HEK Blue分析(自發性活化))
將人類、恆河猴及老鼠潛伏性肌抑素與抗潛伏性肌抑素抗體在37℃下隔夜培養，並將樣品混合液轉移至HEK-BlueTM TGF-β細胞。在24小時培養後，將細胞上清液與QUANTIBlueTM 混合，並於比色盤讀取器中測量在620nm的光學密度。如第2圖所示，於37℃培養後，偵測到活性肌抑素形式自其潛伏形式的釋放。在mAb MST1032-G1m的存在下，肌抑素活化被抑制，因此在細胞上清液中偵測到SEAP程度降低。MST1032-G1m抑制了潛伏性肌抑素的自發性活化，且對於人類、恆河猴及老鼠潛伏性肌抑素顯示類似的抑制活性。
實施例5
抗潛伏性肌抑素抗體的性質分析(ELISA)
將未經被覆的ELISA盤(NUNC-IMMUNO plate MAXISORP surface,Nalge Nunc International)以20μL的50nM親和素(GenScript)在室溫下被覆1小時。接著以PBST清洗盤3次並以50μL 20% Blocking One(Nacalai Tesque)隔夜阻斷。隔日，以4nM/孔/20μL之生物素化的成熟肌抑素、人類或老鼠生物素化的潛伏性肌抑素或生物素化的重組老鼠肌抑素原胜肽-Fc嵌合蛋白(R&D Systems)培養每個盤的每個孔兩小時。在清洗後，將20μL的抗體樣品加入至孔中，且靜置盤1小時。清洗盤並加入20μL稀釋於HEPES緩衝鹽水中的抗人類IgG-辣根過氧化酶(HRP)(Abcam)，再次靜置盤1小時。接著再次清洗盤， 接著加入50μL ABTS(KPL)至每個孔中，及培養盤1小時。於比色盤讀取器中偵測在405nm的訊號。結合實驗的結果如第3圖所示。MST1032-G1m結合至潛伏性肌抑素(即，成熟的肌抑素及原胜肽的非共價複合物)及原胜肽，但未結合至成熟的肌抑素。這些結果顯示MST1032-G1m特異地結合至肌抑素原胜肽(例如，原胜肽部分)，但未特異地結合至活性肌抑素(例如，成熟的部分)。
實施例6
抗潛伏性肌抑素抗體的性質分析(西方點墨分析)
在MST1032-G1m存在或不存在下，將老鼠潛伏性肌抑素與重組的人類BMP1(R&D Systems)在37℃下隔夜培養。接著將樣品與4x還原的SDS-PAGE樣品緩衝液(Wako)混合，並在95下加熱5分鐘，接著裝載於SDS膠體電泳。藉由Trans-Blot® TurboTM Transfer System(Bio-rad)將蛋白質轉移至膜上。利用綿羊的抗-老鼠GDF8原胜肽抗體(R&D Systems)偵測肌抑素原胜肽，其接著被抗-綿羊IgG-HRP(Santa Cruz)偵測。以ECL基質培養膜，並利用ImageQuant LAS 4000(GE Healthcare)產生影像。如第4圖所示，MST1032-G1m抑制藉由BMP1的原胜肽裂解。
實施例7
抗潛伏性肌抑素抗體的性質分析(BIACORE® )
利用BIACORE® T200儀器(GE Healthcare)在pH7.4下於37℃評估抗潛伏性肌抑素抗體對人類、恆河猴(cyno)及老鼠潛伏性肌抑素的動力學參數。使用胺偶合套組(GE Healthcare)將 ProA/G(Pierce)固定於CM4晶片的所有流路(flow cell)上。在ACES pH7.4(20mM ACES、150mM NaCl、1.2mM CaCl2 、0.05% Tween 20、0.005% NaN3 )中製備抗潛伏性肌抑素抗體及分析物。抗體被ProA/G捕捉於感測表面上。抗體捕捉程度通常為150-220共振單位(RU)。接著，以經兩倍連續稀釋製備的3.125至50nM的濃度注射重組人類、恆河猴(cyno)或老鼠潛伏性肌抑素，接續為解離。以25mM NaOH再生感測表面。利用BIACORE® T200評估軟體，2.0版本(GE Healthcare)處理及擬合(fit)數據至1：1結合模型，以判定動力學參數。感測圖如第5圖所示，結合速率(ka)、解離速率(kd)及結合親和性(KD)列於表3。MST1032-G1m對人類、恆河猴及老鼠潛伏性肌抑素的動力學參數為類似的。
實施例8
體內抗潛伏性肌抑素抗體對肌肉質量及脂肪質量的功效
在小鼠體內評估mAb MST1032-G1m的體內功效。在此實驗中，抗成熟肌抑素抗體41C1E4(如美國專利號7,632,499所述)被用來當作正控制。為了避免小鼠抗人類抗體反應所造成之可 能的免疫調節作用，體內研究在重度免疫缺陷(immune-deficient Severe Combined Immunofeficient，SCID)小鼠中進行。五週大的SCID(C.B-17 SCID)小鼠(Charles River Laboratories Japan，Inc.(Kanagawa，JAPAN))以不同劑量的單株抗體或媒液(vehicle)(磷酸鹽緩衝生理食鹽水，PBS)進行處理，每個禮拜一次，維持兩個禮拜，進行靜脈注射。在第0、7及14天，利用核磁共振評估(nuclear magnetic resonance，NMR)(the minispec LF-50，Bruker Bio Spin，(Kanagawa，JAPAN))小鼠的全身肌肉質量和脂肪質量。小鼠在第14天安樂死，且解剖腓腸肌和四頭肌並稱重。
用JMP 9軟體(SAS，Inc.)由單因子變異數分析(ANOVA)、Student’s t檢定(Student’s t-test)及Dunnett’s檢定判定統計顯著性。p值小於0.05被認為有顯著性。
此實驗的結果顯示在第6A-C圖。兩個抗體(MST1032-G1m及41C1E4)皆劑量依賴性地增加肌肉質量，且與媒液組(PBS)相比，施用濃度為40mg/kg時，顯著降低脂肪質量。
兩週處理後，與媒液組相比，施用10mg/kg及40mg/kg抗體導致四頭肌和腓腸肌濕重顯著增加。
實施例9
不同肌抑素相關抗體體內功效的比較
所有用於比較的實驗設定都與實施例8相同。在五週大的重度免疫缺陷小鼠上測試各種肌抑素相關抗體41C1E4、REGN、OGD及MYO-029，為期兩週。REGN、OGD及MYO-029係抗 成熟肌抑素抗體，分別在WO 2011/150008中描述為H4H1657N2、在WO 2013/186719中描述為OGD1.0.0.及在WO 2004/037861中描述為MYO-029。一個禮拜一次，以靜脈注射施用這些抗體。在第0及14天，利用全身NMR掃描，檢驗肌肉質量及脂肪質量。在第14天，用握力檢測計(例如：GPM-100B，MELQUEST Ltd.，(Toyama，JAPAN))測量握力。如在第7A-C圖呈現的結果所示，除了MYO-029(P>0.05)以外的這些抗體都增加肌肉質量。在10mg/kg(P<0.05)的濃度下，施用MST1032-G1m組的握力，相較於媒液(PBS)組，顯著增加。與媒液(PBS)組相比，41C1E4及REGN也顯著增加握力。10mg/kg的MST1032-G1m有減少全身脂肪質量的趨勢。MST1032-G1m減少脂肪質量的功效比其它抗成熟肌抑素抗體強。
實施例10
抗潛伏性肌抑素抗體的人源化
抗體可變區的胺基酸殘基係根據Kabat編號(Kabat等人，Sequence of proteins of immunological interest,5th Ed.,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))。
設計人源化MST1032抗體的重鏈及輕鏈的可變區。一些人源化MST1032抗體包含回復突變於框架區中。藉由GenScript Inc.合成設計的重鏈及輕鏈可變區的多核苷酸，並分別選殖至包含重鏈恆定區SG1序列(序列辨識號：52(胺基酸序列如序列辨識號：9所示))及輕鏈恆定區SK1序列(序列辨 識號：54(胺基酸序列如序列辨識號：10所示))的表達載體中。將人源化抗體短暫地表達於FS293-F細胞中，且實行HEK Blue分析及BIACORE® 分析，如上所述。如第8圖及表4所示，與第1及2圖相比，人源化抗體(MS1032LO00-SG1)顯示與嵌合抗體(MST1032-G1m)類似的抑制活性及親和性。
實施例11
pH依賴性抗潛伏性肌抑素抗體的產生
為了生產pH依賴性抗潛伏性肌抑素抗體，對所有mAb MS1032LO00-SG1的CDR執行組胺酸掃描突變。利用In-Fusion HD選殖套組(Clontech Inc.或Takara Bio company)根據製造商的使用說明，將CDR中的各個胺基酸個別地突變為組胺酸。在透過定序確定每個變異體正確地突變後，藉由前述之方法短暫地表達並純化變異體。藉由相較於前述為經修改的BIACORE® 分析，評估組胺酸取代的所有變異體。簡言之，在pH7.4的解離相之後，立即將在pH5.8之額外的解離相結合於BIACORE® 分析中。這是為了評估在pH7.4形成的複合物之抗體(Ab)及抗原(Ag)之間的pH依賴性解離，相對於在pH5.8的對應的解離。利用Scrubber 2.0(BioLogic Software)曲線擬合 軟體處理及擬合數據，以判定在pH5.8緩衝液的解離常數。
如第9圖所示，相較於pH7.4的解離相，親本抗體(Ab001)在pH5.8的結合反應並未減少。一些單一組胺酸取代造成結合反應在pH5.8比起在pH7.4解離相中度至高度的減少。每一單一組胺酸取代變異體在pH5.8的解離速率如表5所示。如表5所示，Ab002在pH5.8顯示最快的Ab/Ag複合物解離速率，比親本抗體(Ab001)快了200倍。接著產生在CDR具有這些突變的組合的抗體。包含這些不同的突變的抗體之CDR序列如表6所示。
實施例12
pH依賴性抗潛伏性肌抑素抗體的親和性改善為了辨識在pH7.4改善親和性及/或體外抑制活性的突變，分別生產用於重鏈及輕鏈的500多種變異體，利用實施例11所生產的至少一變異體作為模板。這些變異體在CDR的每一胺基酸被其它18種胺基酸取代，排除原始的胺基酸及半胱胺酸。利用BIACORE® 4000儀器(GE Healthcare)在pH7.4下於37℃評估變異體對人類潛伏性肌抑素的結合能力。以含10mg/ml BSA及0.1mg/ml羧甲基葡聚糖(CMD)的ACES pH7.4緩衝液配製包含FS293-F細胞中表現的變異體的培養上清液。各個抗體被捕捉於流路上，直到捕捉程度約到達200RU。接著將25nM人類潛伏性肌抑素注入流路中。在pH7.4的解離相之後，立即將在pH5.8之額外的解離相結合於BIACORE® 分析中。此額外的解離相評估在pH7.4形成的複合物之抗體(Ab)及抗原(Ag)之間的pH依賴性解離。以25mM NaOH再生感測表面。利用BIACORE® 4000評估軟體2.0版本(GE Healthcare)判定動力學參數。利用Scrubber2(BioLogic Software)實行在pH5.8的額外解離的分析。
在pH7.4改善親和性及/或體外抑制活性的變異體被選擇，並與實施例11所辨識之改善pH依賴性的突變結合。在結合這些突變後，四種變異體(MS1032LO01、02、03及04)被選擇，並短暫地表達於SG1或F760(序列辨識號：11及51)中，以用於BIACORE® 結合動力學分析、體外及/或體內分析。SG1及F760均為人類重鏈恆定區。SG1對人類FcγR的結合親 和性與自然IgG1恆定區的類似，但F760的結合親和性則被Fc修飾破壞(本文中亦稱為沉默Fc(silent Fc))。上述四種抗肌抑素變異體的胺基酸及核苷酸序列如表2a所示。
實施例13
pH依賴性MS1032變異體的性質分析(HEK Blue分析(BMP1及自發性活化)
所有的實驗設置均與實施例3及4相同。如第10圖所示，所有變異體對人類潛伏性肌抑素均顯示與MS1032LO00-SG1類似的抑制活性。
實施例14
pH依賴性MS1032變異體的性質分析(BIACORE® )
所有的實驗設置均與實施例7相同，但測量除了在ACES pH7.4條件外，亦於ACES pH5.8緩衝液中實行。一些抗體僅針對人類潛伏性肌抑素測量。抗體捕捉程度以185RU及18.5RU為目標，分別用於親和力(avidity)及親和性(affinity)分析。利用BIACORE® T200評估軟體，2.0版本(GE Healthcare)，使用1：1結合擬合以判定動力學參數。以親和力條件，所有抗體對人類潛伏性肌抑素的感測圖如第11圖所示，且在不同條件下計算得到的ka、kd 及KD 列於表7-10中。在親和力條件下，除了MS1032LO00-SG1之外的所有抗體，在酸性pH比在中性pH下顯示較快的解離速率。在親和性條件下，除了MS1032LO00-SG1之外的所有抗體在酸性pH下，與潛伏性肌抑素顯示微弱的相互作用，因此無法判定動力學參數。
實施例15
於小鼠中比較具有FcγR結合的抗體及FcγR結合被破壞的抗體的血漿總肌抑素濃度
利用C.B-17 SCID小鼠的體內測試
在施用抗潛伏性肌抑素抗體於C.B-17 SCID小鼠(In Vivos,Singapore)後，於體內評估內源肌抑素的累積。將抗潛伏性肌抑素抗體(3mg/ml)以單次劑量10ml/kg施用於尾靜脈。在施用後的5分鐘、7小時、1天、2天、3天、7天、14天、21天及28天收集血液。收集的血液立即在4℃下以14,000rpm離心10分鐘，以分離血漿。將分離的血漿儲存於-80℃或-80℃以下，直到測量為止。使用的抗潛伏性肌抑素抗體為MS1032LO00-SG1及MS1032LO00-F760。
藉由電化學發光(ECL)測量血漿中的總肌抑素濃度
藉由ECL測量老鼠血漿中的總肌抑素濃度。將抗成熟的肌抑素抗體RK35(如WO 2009/058346所述)分配於MULTI-ARRAY 96孔盤(Meso Scale Discovery)之上，並在4℃隔夜培養，以製備固定有抗成熟的肌抑素的盤。配製稀釋40倍或更多的成熟的肌抑素校正曲線樣品及老鼠血漿樣品。將樣品於酸性溶液(0.2M甘胺酸-HCl，pH2.5)中混合，以使成熟的肌抑素自其結合的蛋白質(例如原胜肽)解離。接著，將樣品添加至固定有抗成熟的肌抑素的盤上，且在清洗前使其於室溫下進行結合1小時。之後，加入經SULFO TAG標記的抗成熟的肌抑素抗體RK22(如WO 2009/058346所述)，且在清洗前於室溫下培養1小時。接著立即將讀取緩衝液T(x4)(Meso Scale Discovery)加入盤中並藉由SECTOR Imager 2400(Meso Scale Discovery)偵測訊號。根據校正曲線的反應，利用分析軟體SOFTmax PRO(Molecular Devices)計算成熟的肌抑素濃度。藉由此方法測量在靜脈內施用抗潛伏性肌抑素抗體之後血漿中的總肌抑素濃度的時程，如第12圖所示。
FcγR結合對體內肌抑素累積的影響
在抗體MS1032LO00-F760的施用後，相較於第5分鐘的血漿總肌抑素濃度，第28天的血漿總肌抑素濃度累積了248倍。反之，在MS1032LO00-SG1的施用後，相較於第5分鐘的血漿總肌抑素濃度，第28天的血漿總肌抑素濃度累積了37倍。觀察到MS1032LO00-F760(沉默Fc)及MS1032LO00-SG1在第28天的血漿總肌抑素濃度相差約7倍，起因於FcγR結合。在人類可溶性IL-6R(hsIL-6R)中，在抗-hsIL-6R抗體-F760(沉默Fc)及-SG1之間未觀察到血漿hsIL-6R濃度的明顯差異，如WO 2013/125667中所述。由於hsIL-6R為單體抗原，抗體-hsIL-6R複合物僅包含1個Fc。因此，WO 2013/125667的結果顯示具有1個Fc的抗體-抗原複合物在體內未與FcγR顯著結合以加速細胞的免疫複合物攝入。另一方面，以多聚抗體(如肌抑素)，抗體可形成大的免疫複合物且抗體-抗原複合物包含兩個以上的Fc。因此，可觀察到F760及SG1之間顯著不同的血漿抗原濃度，起因於對FcγR的強烈親和力結合。結果顯示MST1032可形成大的免疫複合物，其包含多於兩個的抗體與肌抑素。
實施例16
於小鼠中比較非pH依賴性抗潛伏性肌抑素抗體及pH依賴性抗潛伏性肌抑素抗體的血漿總肌抑素濃度
利用C.B-17 SCID小鼠的體內測試
在施用抗潛伏性肌抑素抗體於C.B-17 SCID小鼠(In Vivos,Singapore)後，評估內源老鼠肌抑素的體內累積，如實施例15所述。使用的抗潛伏性肌抑素抗體為MS1032LO01-SG1及MS1032LO01-F760。
藉由電化學發光(ECL)測量血漿中的總肌抑素濃度
藉由ECL測量老鼠血漿中的總肌抑素濃度，如實施例15所述。藉由此方法測量在靜脈內施用抗潛伏性肌抑素抗體之後血漿中的總肌抑素濃度的時程，如第13圖所示。
pH依賴性肌抑素結合對體內肌抑素累積的影響
於體內測試pH依賴性抗潛伏性肌抑素抗體(MS1032LO01-SG1及MS1032LO01-F760)，並比較血漿總肌抑素濃度。如實施例15所述在MS1032LO00-SG1及MS1032LO00-F760施用後的總肌抑素濃度的測量結果亦在第13圖中顯示。MS1032LO00為非pH依賴性抗體而MS1032LO01為pH依賴性抗體。如第13圖所示，相較於MS1032LO00-F760，在MS1032LO01-F760施用後的總肌抑素濃度降低，起因於pH依賴性結合。此外，相較於MS1032LO00-SG1，在MS1032LO01-SG1施用後的總肌抑素濃度大幅降低，起因於pH依賴性結合及FcγR結合所增加的細胞攝入。MS1032LO01-SG1被預期具有增強自血漿清除肌抑而作為“清掃抗體(sweeping antiboody)”的較佳特性。
實施例17
pH依賴性抗潛伏性肌抑素抗體的體內功效
所有用於比較的實驗設定都與實施例8相同。如同在第14圖所示，當以靜脈注射對重度免疫缺陷小鼠施用劑量為0.2、1及5mg/kg時，MS1032LO00-SG1(非清掃抗體)及MS1032LO01-SG1(清掃抗體)於兩週後以劑量依賴性增加骨骼肌質量。劑量為1及5mg/kg的MS1032LO01-SG1顯著增加四頭肌濕重及握力，且劑量為5mg/kg時，與媒液(PBS)組相比，顯著增加肌肉質量及腓腸肌濕重。劑量為1及5mg/kg的MS1032LO01-SG1，與媒液(PBS)組相比，也顯著減少脂肪質量。劑量為0.2mg/kg的MS1032LO00-SG1顯示未增加肌肉質量。另一方面，劑量為0.2mg/kg的MS1032LO01-SG1大幅增加肌肉質量、四頭肌濕重、腓腸肌濕重及握力。因此，pH依賴性結合抗體，相較於非pH依賴性結合抗體，顯示出較好的肌肉質量成長及肌肉力量改善。
實施例18
人類及老鼠潛伏性GDF11的表達及純化
利用FreeStyle293-F細胞(Thermo Fisher)短暫地表達在N末端帶有Flag標記的人類GDF11(本文中亦稱為Flag-hGDF11、人類潛伏性GDF11、hGDF11或人類GDF11，序列辨識號：85)。將表達Flag-hGDF11的條件培養基使用於裝載抗Flag M2親合性樹脂(Sigma)的管柱，並以Flag胜肽(Sigma)洗提。收集包含Flag-hGDF11的級分，接著施加於經1x PBS平衡的Superdex 200膠體過濾管柱(GE healthcare)。收 集包含Flag-hGDF11的級分並儲存於-80℃。
實施例19
抗潛伏性肌抑素抗體的性質分析(ELISA)
將未經被覆的ELISA盤(NUNC-IMMUNO plate MAXISORP surface,Nalge Nunc International)以20μL的50nM親和素(GenScript)在室溫下被覆2小時。接著以PBST清洗盤3次並以50μL 20% Blocking One(Nacalai Tesque)隔夜阻斷。隔日，以2nM/孔/20μL之生物素化的人類潛伏性肌抑素、或2nM/孔/20μL之生物素化的人類潛伏性GDF11培養每個盤的每個孔兩小時。在清洗後，將20μL的抗體樣品加入至孔中，且靜置盤1小時。清洗盤並加入20μL稀釋於HEPES緩衝鹽水中的抗人類IgG-辣根過氧化酶(HRP)(Abcam)，再次靜置盤1小時。接著再次清洗盤，接著加入50μL ABTS(KPL)至每個孔中，及培養盤1小時。於比色盤讀取器中偵測在405nm的訊號。結合實驗的結果如第15圖所示。MST1032-G1m結合至潛伏性肌抑素(即，成熟的肌抑素及原胜肽的非共價複合物)，但未結合至hGDF11。這些結果顯示MST1032-G1m特異地結合至肌抑素，而非hGDF11。
實施例20
抗潛伏性肌抑素抗體的性質分析(HEK Blue分析(BMP1及自發性活化))
使用報導基因分析以取得活性GDF11在體內的生物活性。表達可誘導Smad3/4結合元素(SBE)的SEAP報導基因之HEK-BlueTM TGF-β細胞(Invivogen)使藉由監測活化素第1及2 型受體的活化之生物活性GDF11的偵測得以進行。活性GDF11刺激SEAP的產生及分泌至細胞上清液中。接著利用QUANTIBlueTM (Invivogen)評估分泌的SEAP量。
將HEK-BlueTM TGF-β細胞維持於以10%胎牛血清、50μg/mL鏈黴素、50U/mL青黴素、100μg/mL NormocinTM 、30μg/mL的Blasticidin、200μg/mL的HygroGoldTM 及100μg/mL的ZeocinTM 補充的DMEM培養基(Gibco)中。在功能分析期間，將細胞換到分析培養基(具有0.1%牛血清白蛋白、鏈黴素、青黴素及NormocinTM 的DMEM)並接種至96孔盤中。將人類GDF11與重組的人類BMP1(Calbiochem)及抗潛伏性抗體(MST1032-G1m)在37℃下隔夜培養。將樣品混合物轉移至細胞中。在24小時培養後，將細胞上清液與QUANTIBlueTM 混合，並於比色盤讀取器中測量在620nm的光學密度。如第16圖所示，MST1032-G1m並未阻止人類GDF11的蛋白酶介導或自發性活化，因而無法抑制SEAP的分泌。
實施例21
MS1032變異體的進一步最適化以增強清掃效果作為pH依賴性抗體，MS1032LO01-SG1，在老鼠中顯示較佳效能，可藉由導入突變於抗體CDR或藉由改變框架區，實行進一步最適化以增加pH依賴性、以增進細胞攝入、以增加穩定性等。一千多種變異體在如前述之BIACORE® 及/或HEK Blue分析中進行評估，且產生MS1032LO06-SG1、MS1032LO07-SG1、MS1032LO10-SG1、MS1032LO11-SG1、MS1032LO12-SG1、MS1032LO18-SG1、MS1032LO19-SG1、 MS1032LO21-SG1、MS1032LO23-SG1、MS1032LO24-SG1、MS1032LO25-SG1及MS1032LO26-SG1。這些產生的抗體的胺基酸及核苷酸序列如表11所示。
利用BIACORE® T200儀器(GE Healthcare)於37℃判定MS1032變異體在pH7.4及pH5.8下與人類、恆河猴(cyno)或老鼠潛伏性肌抑素結合的親和性，以評估pH對抗原結合的影響。使用胺偶合套組(GE Healthcare)將ProA/G(Pierce)固定於CM4晶片的所有流路上。在包含20mM ACES、150mM NaCl、1.2mM CaCl2 、0.05% Tween 20、0.005% NaN3 的ACES pH7.4或pH5.8緩衝液中製備所有抗體及分析物。各個抗體被ProA/G捕捉於感測表面上。抗體捕捉程度通常為130-240共振單位(RU)。接著，以經兩倍連續稀釋製備的3.125至50nM的濃度注射人類、恆河猴或老鼠潛伏性肌抑素，接續為解離。在每個周期以10mM甘胺酸pH 1.5再生感測表面。利用BIACORE® T200評估軟體，2.0版本(GE Healthcare)處理及擬合數據至1：1結合模型，以判定結合親和性。
MS1032變異體在pH7.4及pH5.8下與人類、恆河猴(cyno)或老鼠潛伏性肌抑素結合的親和性(KD)如表12所示。所有變異體的KD比值((在pH5.8的KD)/(在pH7.4的KD))均超過5，顯示對潛伏性肌抑素的pH依賴性結合。
實施例22
於HEK Blue分析中評估進一步最適化的變異體的中和活性
我們評估了針對人類潛伏性肌抑素的MS1032LO06-SG1、MS1032LO07-SG1、MS1032LO10-SG1、MS1032LO11-SG1、MS1032LO12-SG1、MS1032LO18-SG1、MS1032LO19-SG1、MS1032LO21-SG1、MS1032LO23-SG1及MS1032LO25-SG1的中和活性，如實施例3所述。如第17圖所示，所有變異體顯示與MS1032LO01-SG1類似的活性。
實施例23
於小鼠中比較非pH依賴性抗潛伏性肌抑素抗體及不同的pH依賴性抗潛伏性肌抑素抗體的血漿總肌抑素濃度
利用C.B-17 SCID小鼠的體內測試
在施用抗潛伏性肌抑素抗體於C.B-17 SCID小鼠(In Vivos,Singapore)中之後，於體內評估內源肌抑素的累積。將抗潛伏性肌抑素抗體(3mg/ml)以單次劑量10ml/kg施用於尾靜脈。在施用後的5分鐘、7小時、1天、2天、3天、7天、14天、21天及28天收集血液。經收集的血液立即在4℃下以14,000rpm離心10分鐘，以分離血漿。將分離的血漿儲存於-80℃或-80℃以下，直到測量為止。使用的抗潛伏性肌抑素抗體為MS1032LO00-SG1、MS1032LO01-SG1、MS1032LO06-SG1、MS1032LO11-SG1、MS1032LO18-SG1、MS1032LO19-SG1、MS1032LO21-SG1及MS1032LO25-SG1。
藉由電化學發光(ECL)測量血漿中的總肌抑素濃度
藉由ECL測量老鼠血漿中的總肌抑素濃度。將生物素化的抗成熟的肌抑素抗體RK35(如WO 2009/058346所述)分配於MULTI-ARRAY 96孔親和素盤(Meso Scale Discovery)之上，並在常溫下於阻斷緩衝液中培養2小時，以製備固定有抗成熟的肌抑素的盤。配製稀釋40倍或更多的成熟的肌抑素校正曲線樣品及老鼠血漿樣品。將樣品於酸性溶液(0.2M甘胺酸-HCl，pH2.5)中混合，以使成熟的肌抑素自其結合的蛋白質(例如原胜肽)解離。接著，將樣品添加至固定有抗成熟的肌抑素的盤上，且在清洗前使其於室溫下進行結合1小時。之後，加入經SULFO TAG標記的抗成熟的肌抑素抗體RK22(如WO 2009/058346所述)，且在清洗前於室溫下培養1小時。接著立即將讀取緩衝液T(x4)(Meso Scale Discovery)加入盤中並藉由SECTOR Imager 2400(Meso Scale Discovery)偵測訊號。根據校正曲線的反應，利用分析軟體SOFTmax PRO(Molecular Devices)計算成熟的肌抑素濃度。藉由此方法測量在靜脈內施用抗潛伏性肌抑素抗體之後血漿中的總肌抑素濃度的時程，如第18圖所示。
pH依賴性肌抑素結合對老鼠體內肌抑素累積的影響研究
利用非pH依賴性抗潛伏性肌抑素抗體(MS1032LO00-SG1)以及不同的pH依賴性抗潛伏性肌抑素抗體(MS1032LO01-SG1、MS1032LO06-SG1、MS1032LO11-SG1、MS1032LO18-SG1、MS1032LO19-SG1、MS1032LO21-SG1及MS1032LO25-SG1)比較小鼠中pH依賴性對肌抑素累積的影響。pH依賴性的導入顯著地加速肌抑素自SCID老鼠血漿的清 除。如第18圖所示，相較於非pH依賴性抗潛伏性肌抑素抗體(MS1032LO00-SG1)，pH依賴性抗潛伏性肌抑素抗體(MS1032LO01-SG1、MS1032LO06-SG1、MS1032LO11-SG1、MS1032LO18-SG1、MS1032LO19-SG1、MS1032LO21-SG1及MS1032LO25-SG1)在第28天可減少肌抑素累積。
實施例24
於恆河猴中比較非pH依賴性抗潛伏性肌抑素抗體及具有pH及Fc工程改造的抗潛伏性肌抑素抗體的血漿總肌抑素濃度
利用恆河猴的體內測試
在施用抗潛伏性肌抑素抗體於來自柬埔寨(Shin Nippon Biomedical Laboratories Ltd.,Japan)的2-4歲大的食蟹獼猴(Macaca fascicularis )(恆河猴)中之後，於體內評估內源肌抑素的累積。利用一次性注射器、延長管、留置針及輸液幫浦，注射30mg/kg的劑量於前臂的頭靜脈。給藥速度為每一個體30分鐘。在給藥的開始前以及給藥結束後的5分鐘、7小時以及1、2、3、7、14、21、28、35、42、49及56天、或給藥結束後的5分鐘、以及2、4及7小時、以及1、2、3、7、14、21、28、35、42、49及56天收集血液。以包含肝素鈉的注射器由股靜脈抽取血液，立即將血液放置冰上冷卻，且在4℃以1700×g 離心10分鐘以取得血漿。將血漿樣品儲存於低溫冷凍庫(可接受範圍：-70℃或以下)中直到測量為止。使用的抗潛伏性肌抑素抗體為MS1032LO00-SG1、MS1032LO06-SG1012、MS1032LO06-SG1016、MS1032LO06-SG1029、 MS1032LO06-SG1031、MS1032LO06-SG1033及MS1032LO06-SG1034(在本文中，SG1012、SG1016、SG1029、SG1031、SG1033及SG1034為根據下述之SG1所建立的重鏈恆定區)。
利用一次性注射器及留置針，以2mg/kg的劑量施用抗潛伏性肌抑素抗體MS1032LO19-SG1079、MS1032LO19-SG1071、MS1032LO19-SG1080、MS1032LO19-SG1074、MS1032LO19-SG1081及MS1032LO19-SG1077(在本文中，SG1079、SG1071、SG1080、SG1074、SG1081及SG1077為根據下述之SG1所建立的重鏈恆定區)於前臂的頭靜脈或隱靜脈中。在給藥的開始前以及給藥結束後的5分鐘、以及2、4及7小時、以及1、2、3、7及14天收集血液。如上述方法處理血液。將血漿樣品儲存於低溫冷凍庫(可接受範圍：-70℃或以下)中直到測量為止。
藉由電化學發光(ECL)測量血漿中的總肌抑素濃度
藉由ECL測量猴子血漿中的總肌抑素濃度，如實施例23中所述。藉由此方法測量在靜脈內施用抗潛伏性肌抑素抗體之後血漿中的總肌抑素濃度的時程，如第19圖所示。
藉由電化學發光(ECL)測量猴子血漿中的ADA
將生物素化的藥物被覆於MULTI-ARRAY 96孔親和素盤(Meso Scale Discovery)之上，並在常溫下於低交叉緩衝液(Candor)中培養2小時。在加入盤前，將猴子血漿樣品於低交叉緩衝液中稀釋20倍。將樣品於4℃隔夜培養。隔日，在加入SULFO TAG標記的抗猴子IgG二級抗體(Thermo Fisher Scientific)之前，以清洗緩衝液清洗盤三次。於室溫培養1小時之後，以清洗緩衝液清洗盤三次。接著立即將讀取緩衝液T(x4)(Meso Scale Discovery)加入盤中並藉由SECTOR Imager 2400(Meso Scale Discovery)偵測訊號。
pH依賴性及Fc工程改造對老鼠體內肌抑素累積的影響
在恆河猴中，非pH依賴性抗體(MS1032LO00-SG1)的施用造成肌抑素濃度在第28天從基準線增加至少60倍。在第28天，pH依賴性抗潛伏性肌抑素抗體MS1032LO06-SG1012及MS1032LO06-SG1033分別從基準線增加3倍及8倍。強烈的清掃主要是對恆河猴FcγRIIb增加的親和性所貢獻。在第28天，pH依賴性抗潛伏性肌抑素抗體MS1032LO06-SG1029、MS1032LO06-SG1031及MS1032LO06-SG1034可清掃抗原至基準線以下。MS1032LO06-SG1029、MS1032LO06-SG1031及MS1032LO06-SG1034的強烈清掃的原因是由於抗體的正電荷團增加，非特異性細胞攝入增加以及由於對FcγR的結合增強，FcγR介導的細胞攝入增加。
pH依賴性抗潛伏性肌抑素抗體MS1032LO19-SG1079、MS1032LO19-SG1071、MS1032LO19-SG1080、MS1032LO19-SG1074、MS1032LO19-SG1081及MS1032LO19-SG1077的施用從第1天降低恆河猴中肌抑素濃度至低於偵測極限(<0.25ng/mL)。於第14天，MS1032LO19-SG1079及MS1032LO19-SG1071的肌抑素的濃度增加至高於偵測極限，然而MS1032LO19-SG1080、MS1032LO19-SG1074、MS1032LO19-SG1081及 MS1032LO19-SG1077的肌抑素的濃度仍然低於偵測極限。MS1032LO19-SG1079及MS1032LO19-SG1071較弱的抑制可能是因為pI突變的不同。
上述數據顯示自血漿強烈的清掃肌抑素是可藉由增加對FcγRIIb結合的突變、或增加抗體的正電荷及增加對FcγRIIb結合的突變組合加以達成。肌抑素的強烈清掃被預期可藉由結合增加抗體的正電荷及增加對FcγR結合的突變以在人類中達成。
實施例25
進一步最佳化的變異體於小鼠中的體內功效
如同實施例8所述，使用MS1032LO06-SG1、MS1032LO11-SG1、MS1032LO18-SG1、MS1032LO19-SG1及MS1032LO25-SG1評估SCID小鼠的體內功效。進行三次獨立研究，且MS1032LO01被用來當作控制組。
這些實驗的結果顯示於第20A-20I圖。所有抗體(MS1032LO06-SG1、MS1032LO11-SG1、MS1032LO18-SG1、MS1032LO19-SG1及MS1032LO25-SG1)皆顯示劑量依賴性地增加肌肉質量以及四肢握力。抗體亦顯示劑量依賴性地減少體脂肪質量。
實施例26
抗潛伏性肌抑素抗體的抗原決定基定位
生產額外的抗人類潛伏性肌抑素抗體用於它們對應結合的抗原決定基的定位。免疫並收獲兩隻NZW兔，如實施例2所述。進一步篩選經辨識之製造B細胞系的1760種抗體，篩選它們 阻礙BMP1介導之人類潛伏性肌抑素的活化的能力。簡言之，在重組的人類BMP(R&D Systems)存在下，將包含分泌抗體的B細胞上清液與人類潛伏性肌抑素於37℃隔夜培養。接著將50μL的反應混合物轉移至以抗成熟的肌抑素抗體RK35(如WO 2009/058346所述)被覆的Meso Scale Discovery MULTI-ARRAY96孔盤。在室溫震盪培養1小時之後，將盤與生物素化的抗成熟的肌抑素抗體RK22(如WO 2009/058346所述)培養，接著與SULFO標記的親和素培養。接著將讀取緩衝液T(x4)(Meso Scale Discovery)加入盤中並藉由SECTOR Imager 2400(Meso Scale Discovery)偵測ECL訊號。選擇顯示不同程度中和活性的94個系(line)用於下游分析(MST1495-MST1588)。選殖這些被選擇的系的變異區，如同實施例2中所述，除了使用具有重鏈恆定區F1332m序列(列辨識號：193)的表達載體之外。
更進一步評估7個抗潛伏性肌抑素抗體的小組(MST1032、MST1504、MST1538、MST1551、MST1558、MST1572及MST1573；這些抗體的胺基酸序列的辨識號如表13所示)對人類潛伏性肌抑素活化的抑制活性。如第21圖所示，所有抗體均能夠以劑量依賴性方式抑制BMP1介導的人類潛伏性肌抑素活化。
選擇西方點墨分析中表現良好的4種抗體用於抗原決定基定位。將人類潛伏性肌抑素的N末端原胜肽編碼區的片段選殖於pGEX4.1載體中，以製造各為100個胺基酸之GST標記的原胜肽片段，具有80個胺基酸重疊(第22A圖)。以Overnight Express Autoinduction System(Merck Millipore)在轉化的BL21補體細胞中誘發蛋白質表達，並利用BugBuster蛋白質萃取試劑(Novagen)萃取蛋白質。藉由西方點墨分析確認約在37kDa的所欲蛋白質片段的表達，如實施例6所述(抗GST抗體(Abcam))(第22B圖)。當以抗人類潛伏性肌抑素抗體測試時，如第22C圖所示，雖然4種抗體均可抑制潛伏性肌抑素活化，但它們辨識人類潛伏性肌抑素上不同的抗原決定基。MST1032抗體可偵測前五個片段，在移除胺基酸81-100(序列辨識號：78)後，未偵測到條帶(band)。MST1538及MST1572抗體均只結合至前三個片段，在沒有序列辨識號：78的胺基酸41-60時，未偵測到條帶。抗體MST1573只強烈地結合至前兩個片段，顯示其抗原決定基系在序列辨識號：78的胺基酸21-40內(第22D圖)。
實施例27
發展新穎的增強FcγRIIb的Fc變異體
在此實施例中，將說明增強肌抑速清除的Fc工程改造。
WO 2013/125667已證實藉由施用包括對FcγRIIb表現增加親和性的Fc域之抗原結合分子，可增強可溶性抗源的清除。此外，可對人類FcγRIIb具有增強的結合的Fc變異體已於WO 2012/115241及WO 2014/030728中說明。其亦說明這些Fc變異體可對人類FcγRIIb顯示選擇性增強的結合，且對其它活性FcγR顯示降低的結合。此選擇性增強的FcγRIIb結合可不僅有利於可溶性抗源的清除，且可降低得到不想要的效應物功能及免疫反應之風險。
對於抗體藥物的發展，功效、藥物動力學及安全性應於非人類物中進行評估，且在上述非人類物中藥物具有藥理活性。若其僅在人類中具有活性，則需考慮替代方法，例如使用替代抗體(surrogate antibody)(Int.J.Tox. 28：230-253(2009))。然而，使用替代抗體將不易精確預測人類中Fc區域及FcγR之間的相互作用，因為在非人類動物中FcγR的表達型式及/或功能並非總是與人類中相同。較佳地，抗體藥物的Fc區域應對非人類動物具有交叉反應性，尤其是對恆河猴，其與人類具有相近的FcγR的表達型式及功能，因而由非人類動物所得到結果可推及至人類。
因此，此研究中發展對人類及恆河猴FcγR顯示交叉反應性的Fc變異體。
現存之FcγRIIb增強的Fc變異體對人類及猴子FcγR的親和性測量
藉由在MS1032LO06-SG1的重鏈中以Asp取代在位置238(EU編號)的Pro，以產生揭示於WO 2012/115241中的人類FcγRIIb增強的變異體(在本文中，“FcγRIIb增強的”代表“具有增強的FcγRIIb結合活”)的重鏈基因，其被命名為M103205H795-SG1(VH，序列辨識號：86；CH，序列辨識號：9)。產生的重鏈稱作M103205H795-MY009(VH，序列辨識號：86；CH，序列辨識號：252)。作為抗體輕鏈，使用M103202L889-SK1(VL，序列辨識號：96；CL，序列辨識號：10)。根據實施例34所示之方法，表達重組的抗體。
以下列方式製備FcγR的胞外域。根據註冊於NCBI的資訊，以所屬領域具有通常知識者習知的方法實行人類的FcγR的胞外域基因的合成。具體而言，FcγRIIa是根據NCBI登錄號NM_001136219.1的序列，FcγRIIb是根據NM_004001.3，FcγRIIIa是根據NM_001127593.1。分別根據關於FcγRIIa的同質異型(J.Exp.Med. 172：19-25(1990))及關於FcγRIIIa的同質異型(J.Clin.Invest. 100(5)：1059-1070(1997))的報導，製備FcγRIIa及FcγRIIIa的異型。利用所屬領域具有通常知識者習知的方法，選殖恆河猴各個FcγR的cDNA，以建立恆河猴FcγR的胞外域的基因的合成。建立的FcγR的胞外域之胺基酸序列，如序列表所示：(序列辨識號210代表人類FcγRIIaR、序列辨識號211代表人類FcγRIIaH、序列辨識號214代表人類FcγRIIb、序列辨識號217代表人類FcγRIIIaF、序列辨識號218代表人類FcγRIIIaV、序列辨識號220代表恆河猴FcγRIIa1、序列辨識號221代表恆河猴FcγRIIa2、序列辨 識號222代表恆河猴FcγRIIa3、序列辨識號223代表恆河猴FcγRIIb、序列辨識號224代表恆河猴FcγRIIIaS)。接著加入His標記於它們的C末端，且將得到的每個基因插入至設計用於哺乳動物細胞表達的表達載體中。將表達載體導入人類胚胎腎細胞衍生的FreeStyle293細胞(Invitrogen)中，以表達目標蛋白質。在培養之後，原則上藉由下列四個步驟將產生的培養上清液過濾及純化。利用SP Sepharose FF實行陽離子交換層析作為第一步驟，針對His標記(HisTrap HP)的親和性層析為第二步驟，膠體過濾管柱層析Superdex200)為第三步驟，而無菌過濾為第四步驟。利用分光光度計測量純化的蛋白質在280nm的吸光度，及利用以PACE的方法(Protein Science 4：2411-2423(1995))計算的吸光係數判定純化的蛋白質的濃度。
利用BIACORE® T200或BIACORE® 4000(GE Healthcare)進行這些抗體及FcγR之間的交互作用的動力學分析。使用HBS-EP+(GE Healthcare)作為電泳緩衝液(running buffer)，並將測量溫度設定於25℃。使用的晶片是利用胺偶合方法將蛋白質A、蛋白質A/G或老鼠抗人類IgG κ輕鏈(BD Biosciences)固定於S系列感測晶片CM4或CM5(GE Healthcare)上加以製造。感興趣的抗體被捕捉於此晶片上，以與經電泳緩衝液稀釋的各個FcγR反應，並測量對抗體的結合。在測量後，使其與10mM甘胺酸-HCl pH1.5及25mM NaOH反應以洗掉捕捉於晶片上的抗體，以便再生晶片及重複利用。利用BIACORE® 評估軟體以1：1 Langmuir結合模型分析作為測量結果所獲得的感測圖，以計算結合速率常數ka(L/mol/s)及 解離速率常數kd(1/s)，且利用這些值計算解離常數KD(mol/L)。由於MS1032LO06-MY009對人類FcγRIIaH、人類FcγRIIIaV及恆河猴FcγRIIIaS的結合微弱，動力學參數如KD無法由上述分析方法進行計算。關於此類交互作用，KD值是利用下列描述於BIACORE® T100軟體手冊BR1006-48版本AE中的1：1結合模型進行測量。
根據BIACORE® 的1：1結合模型，反應的分子的行為可由公式1描述：Req=C．R max/(KD+C)+RI，其中Req為對分析物濃度的穩定相結合程度的作圖，C為濃度，RI為樣品中整體折射係數的貢獻，以及Rmax為表面的分析物結合能力。重新整理此公式時，KD可以公式2表達：KD=C．Rmax/(Req-RI)-C。可藉由取代公式1或公式2之中的Rmax、RI及C值以計算KD。由目前的測量條件，可使用RI=0、C=2μmol/L。此外，當利用1：1 Langmuir結合模型全面地(globally)擬合獲得的感測圖作為每個FcγR與IgG1相互作用的分析結果時，所得到的Rmax值被除以被捕捉的SG1量，再乘以被捕捉的MY009量，產生的值作為Rmax。此計算是基於所有變異體的每個FcγR可被SG1結合的限制量保持不變的假設，上述變異體是藉由導入突變至SG1加以製造，且在測量時的Rmax與在測量時結合至晶片的抗體量成比例。Req被定義為在測量時觀測到之感測晶片上每個FcγR對每個變異體的結合的量。
表14顯示SG1及MY009對人類及恆河猴FcγR的動力學分析的結果。框格填入灰色的KD值是利用[公式2]進行計算，因為它們的親和性太弱而無法藉由動力學分析正確 地判定。KD倍數的值之計算是將SG1的KD值除以變異體對各個FcγR的KD值。
如表14所示，人類FcγRIIb增強的變異體MY009對cynoFcγRIIb未顯示增強的結合，但對人類FcγRIIb顯示增強的結合。相較於SG1，其對cynoFcγRIIb的親和性減少0.4倍，代表人類FcγRIIb增強的變異體MY009與cynoFcγR未具有交叉反應性。
發展新穎的Fc變異體，其對人類及恆河猴FcγRIIb均顯示增強的結合
理想上，新穎的Fc變異體應選擇性地增強對人類及恆河猴FcγRIIb的結合，並降低對其它活性FcγR的結合。然而，因為在cynoFcγRIIb中推定的Fc結合殘基與cynoFcγRIIa的任一異型完全相同(第23圖)，故達到選擇性增強cynoFcγRIIb的結合超過cynoFcγRIIa理論上為不可能的。因此，新穎的Fc變異體應選擇性地對人類FcγRIIb、cynoFcγRIIb及cynoFcγRIIa具有增強的結合。
為了取得對人類及恆河猴FcγRIIb顯示選擇性增強的結合之新穎的Fc變異體，使用WO 2012/115241中實行的全面性突變(comprehensive mutagenesis)研究的結果。在全面性突變研究中，導入全面性突變至IgG1抗體的FcγR結合區的所有位置中，以及全面地分析對每個FcγR的結合，如下列步驟所述。
磷脂肌醇聚糖3(glypican 3)抗體的變異區包括GpH7的CDR，其為WO 2009/041062中揭示之具有改善的血漿動力學的抗磷脂肌醇聚糖3抗體，被使用作為抗體重鏈可變區(GpH7：序列辨識號：225)。相似地，對於抗體輕鏈，使用WO 2009/041062中揭示之具有改善的血漿動力學的磷脂肌醇聚糖3抗體的GpL16-k0(序列辨識號：226)。此外，使用導入K439E突變於G1d(序列辨識號：227)中的B3(序列辨識號：228)作為抗體H鏈恆定區，上述G1d係藉由移除IgG1的C末端的Gly及Lys而形成。此重鏈，已藉由融合GpH7及B3而形成，稱作為GpH7-B3(VH，序列辨識號：225；CH，序列辨識號：228)。
關於GpH7-B3，被認為與FcγR結合相關的胺基酸殘基及周圍的胺基酸殘基(位置234至239、265至271、295、296、298、300及324至337，根據EU編號)分別被除了原始胺基酸殘基及Cys之外的18種胺基酸殘基取代。這些Fc變異體被稱作B3變異體。表達B3變異體，且全面地評估經蛋白質-A純化的抗體對每個FcγR(FcγRIIa H型、FcγRIIa R型、FcγRIIb及FcγRIIIaF)的結合如下。如前述所製備的每個經修改的抗體及Fcγ受體之間的相互作用的分析是利用BIACORE® T100(GE Healthcare)、BIACORE® T200(GE Healthcare)、BIACORE® A100或BIACORE® 4000進行。使用HBS-EP+(GE Healthcare)作為電泳緩衝液，並將測量溫度設定為25℃。使用的晶片是利用胺偶合方法將蛋白質A(Thermo Scientific)、蛋白質A/G(Thermo Scientific)或蛋白質L(ACTIGEN或 BioVision)固定於S系列感測晶片CM4或CM5(GE Healthcare)上加以製造。在捕捉感興趣的抗體於這些感測晶片上之後，經電泳緩衝液稀釋的Fcγ受體使其反應，測量結合於抗體的量。然而，由於結合的Fcγ受體量取決於被捕捉的抗體量，將結合的Fcγ受體量除以每個被捕捉的抗體量以取得正確的值，並比較這些值。此外，以10mM甘胺酸-HCl pH1.5清洗被捕捉於晶片上的抗體，以再生晶片及重複利用。將每個B3變異體的FcγR結合量的值除以親本B3抗體(具有自然發生的人類IgG1於位置234至239、265至271、295、296、298、300及324至337的序列的抗體，根據EU編號)的FcγR結合量的值。使用此值乘以100所得到的值作為各個變異體之相關的FcγR結合活性的指標。
表15顯示依下列標準選出之有希望的取代之結合概況(profile)(相較於親本B3抗體，對人類FcγRIIb大於40%、對人類FcγRIIaR及FcγRIIaH低於100%、對人類FcγRIIIaF低於10%)。
在下個步驟中，評估這些取代對cynoFcγR的交叉反應。將這16個突變導入M103205H795-SG1中。利用M103202L889-SK1作為輕鏈表達變異體，並分析它們對cynoFcγRIIa1、IIa2、IIa3、IIb、IIIaS的親和性。
表16顯示這16個變異體對cynoFcγR的結合概況。FcγR結合量的值是藉由將結合的FcγR的量除以每個被捕捉的抗體的量所得到。進一步利用SG1的值作為100，以標準化此數值。
在挑選的16種Fc變異體之中，相較於SG1，只有MY001維持對cynoFcγRII的結合在85%。此外，MY001顯示對cynoFcγRIIIaS的結合降低，而它對cynoFcγRIIa1、IIa2及IIa3的結合則維持。因此，G236N突變為獨特的取代，其對人類及恆河猴FcγR均顯示相似的結合情況。
雖然G236N取代對人類及恆河猴FcγR均顯示交叉反應，但它對FcγRIIb的親和性低於SG1(對人類FcγRIIb為75%，對恆河猴FcγRIIb為85%，分別地)。為了增加它對FcγRIIb的親和性，對額外的取代進行評估。具體而言，選擇顯示對人類FcγRIIb結合增加、對人類FcγRIIIa結合減少以及對人類FcγRIIb的選擇性增加超過人類FcγRIIa的取代，根據全面性突變研究的結果(表17)。
在這些取代中，L234W及L234Y被選擇，因為對人類FcγRIIb的選擇性增加超過人類FcγRIIa。而G236A、G236S、A330R、A330K及P331E被選擇，因為對人類FcγRIIIa的結合降低。所有的其它取代被選擇，因為對人類FcγRIIb的結合增加。評估選擇的取代對cynoFcγR的交叉反應性。此外，亦評估三個取代，P396M、V264I及E233D。將取代導入M103205H795-SG1中，以及利用M103202L889-SK1作為輕鏈 表達變異體。
表18顯示含G236N的選擇的取代對於人類及恆河猴FcγR的動力學分析。具體而言，取代被導入M103205H795-SG1中。利用M103202L889-SK1作為輕鏈表達變異體，且評估它們對cynoFcγRIIa1、IIa2、IIa3、IIb、IIIaS的親和性。框格填入灰色的KD值是利用[公式2]進行計算，因為它們的親和性太弱而無法藉由動力學分析正確地判定。KD倍數的值之計算是將SG1的KD值除以變異體對各個FcγR的KD值。
G236N與SG1對cynoFcγRIIa1、cynoFcγRIIa2、cynoFcγRIIa3及cynoFcγRIIb顯示類似的結合親和性。雖然對人類FcγRIIb的親和性降低到0.6倍，但對人類FcγRIIaH及人類FcγRIIaR的親和性分別降低到0.2倍及0.1倍，代表此取代對人類FcγRIIb具有高選擇性超過人類FcγRIIa。此外，它對cynoFcγRIIIaS及人類FcγRIIIaV的親和性分別0.03倍及0.04倍，其有利於消除ADCC活性。根據此結果，G236N對人類及恆河猴FcγR顯示近乎理想的交叉反應性，雖然它對人類及恆河猴FcγRIIb的親和性均應增強。
在評估的額外的取代之中，S298L、G236A、P331E、E233D、K334Y、K334M、L235W、S239V、K334I、L234W、K328T、Q295L、K334V、K326T、P396M、I332D、H268E、P271G、S267A及H268D對人類及恆河猴FcγRIIb均顯示增加的結合。具體而言，H268D顯示最大的影響(對人類FcγRIIb為7倍，對恆河猴FcγRIIb為5.3倍)。關於降低FcγRIIIa 結合的影響，相較於SG1，G236S、A330K及G236D顯示低於0.5倍的親和性。
為了增強MY001對人類及恆河猴FcγRIIb兩者的親和性，評估示列於表18中的取代組合。具體而言，導入取代於M103205H795-SG1中。利用M103202L889-SK1作為輕鏈表達變異體，並分析它們的親和性。表19顯示針對人類及恆河猴FcγR的動力學分析的結果。框格填入灰色的KD值是利用[公式2]進行計算，因為它們的親和性太弱而無法藉由動力學分析正確地判定。KD倍數的值之計算是將SG1的KD值除以變異體對各個FcγR的KD值。
相較於SG1，所有變異體抑制對人類FcγRIIIaV的親和性到小於0.26倍以及抑制對cynoFcγRIIIaS的親和性到小於0.42倍。此外，除了MY047、MY051及MY141之外的所有變異體，相較於MY001，對人類及恆河猴FcγRIIb均成功地顯示增強的結合，且相較於SG1，它們對人類FcγRIIa的結合保持為小於2倍。在它們之中，MY201、MY210、MY206、MY144、MY103、MY212、MY105、MY205、MY109、MY107、MY209、MY101、MY518、MY198及MY197對人類及恆河猴FcγRIIb均顯示增強的結合到大於4倍，與SG1相比。尤其是，MY205、MY209、MY198及MY197對人類及恆河猴FcγRIIb顯示增強的結合到大於7倍。
WO2014030728中已說明CH3域中在位置396的取代會增強對人類FcγRIIb的親和性。將全面性突變導入M103205H795-MY052的位置396中，其包含G236N/H268E/P396M取代。利用M103202L889-SK1作為輕鏈表達所產生的變異體，且評估它們對人類及恆河猴FcγR的親和性(表20)。KD倍數的值之計算是將SG1的KD值除以變異體對各個FcγR的KD值。
在測試的取代中，P396I、P396K及P396L維持人類FcγRIIb結合到與SG1相比大於5倍，且相較於MY052，只有P396L取代增強對人類FcγRIIb的親和性。關於對cynoFcγRIIb的結合，親本MY052顯示最高的親和性，其自SG1增加了3.9倍。
由於G236N對人類及恆河猴FcγR顯示理想的交 叉反應性，測試在位置236的其它取代，其在前述實施例中並未評估。具體而言，以Met、His、Val、Gln、Leu、Thr及Ile取代M103205H795-MY201中的Asn。利用M103202L889-SK1作為輕鏈表達所產生的變異體，且評估它們對人類及恆河猴FcγR的親和性(表21)。框格填入灰色的KD值是利用[公式2]進行計算，因為它們的親和性太弱而無法藉由動力學分析正確地判定。KD倍數的值之計算是將SG1的KD值除以變異體對各個FcγR的KD值。
雖然相較於親本MY201及以Thr取代MY201在位置236的Asn所產生的MY265，所有變異體對人類及恆河猴FcγRIIb均顯示降低的親和性，但與SG1相比對人類FcγRIIb及cynoFcγRIIb分別維持增強的結合到2.1倍及3.1倍。MY265對人類及恆河猴FcγRIIIa亦均維持降低的結合。雖然相較於SG1，對人類FcγRIIaH及FcγRIIaR的親和性增加大於2.5倍，G236T為在位置236第二有利的取代。
為了改善MY265對人類FcγRIIb的選擇性及親和性，實行全面性突變研究於位置231及232中。具體而言，以除了原始胺基酸殘基及Cys之外的18種胺基酸殘基取代M103205H795-MY265的位置231及232。利用M103202L889-SK1作為輕鏈表達所產生的變異體，並評估它們對人類及恆河猴FcγR的親和性(表22)。KD倍數的值之計算是將SG1的KD值除以變異體對各個FcγR的KD值。
關於對FcγRIIb的親和性，相較於親本MY265，A231T、A231M、A231V、A231G、A231F、A231I、A231L、A231、A231W、P232V、P232Y、P232F、P232M、P232I、P232W、P232L的加入增加對人類及恆河猴FcγRIIb的結合。尤其是，相較於親本MY265，A231T及A231G的加入降低人類FcγRIIaR的結合。
評估在前述實施例中並未評估的取代組合。將經測試且顯示為有希望的取代結合導入M103205H795-SG1中。利用M103202L889-SK1作為輕鏈表達所產生的變異體，且評估它們對人類及恆河猴FcγR的親和性。表23顯示結果，框格 填入灰色的KD值是利用[公式2]進行計算，因為它們的親和性太弱而無法藉由動力學分析正確地判定。KD倍數的值之計算是將SG1的KD值除以變異體對各個FcγR的KD值。再次顯示在表19中被選擇作為有希望的變異體之MY209的值作為比較。
在測試的變異體之中，相較於MY209，只有MY213對人類及恆河猴FcγRIIb均顯示較高的結合親和性。然而，MY213對人類FcγRIIaH及人類FcγRIIaR的親和性大於MY209的。
實施例28
在全人類FcγR基因轉殖小鼠中利用FcγRIIb增強的Fc變異體評估肌抑素的清除
於老鼠中評估在實施例27中建立之FcγRIIb增強的Fc變異體清除肌抑素的效果，所述老鼠中的所有鼠類FcγR被刪除，且人類FcγR，編碼為轉基因，插入於老鼠基因組中(Proc.Natl.Acad.Sci.,2012,109,6181)。在此小鼠中，所有老鼠FcγR被人類的那些取代，因而可在老鼠中評估對人類FcγRIIb的親和性增強對於可溶性抗原清除的影響。此外，評估與實施例27建立的FcγRIIb增強的Fc變異體組合之pI增加的取代。
測試的抗體的製備及概況
測試的8種抗體及它們的結合概況統整於表24中。重鏈，MS103205H795-PK2，是藉由導入pI增加的取代(S400R/D413K)至MS103205H795-MY101中進行製備。MS103205H795-MY351、MS103205H795-MY344及MS103205H795-MY335分別是藉由導入另一pI增加的取代(Q311R/D413K)至MS103205H795-MY201、MS103205H795-MY205及MS103205H795-MY265中加以製備。根據實施例27所示之方法，以M103202L889-SK1作為輕鏈表達所有的MS1032LO06變異體，並利用實施例27的方法評估它們對人類及恆河猴FcγR的親和性。
根據統整於表24的SPR分析，已確認pI增加的取代不影響FcγRIIb增強的Fc變異體的FcγR結合。MY101及 PK2，其藉由導入S400R/D413K於MY101中加以製備，分別顯示9倍及8倍增強的人類FcγRIIb結合。MY101及PK2對人類FcγRIIa的親和性維持類似於SG1。關於其它人類及恆河猴FcγR，它們顯示幾乎相同的結合概況。相似地，MY351與親本MY201、MY344與親本MY205、以及MY335與親本MY265分別顯示相似的結合概況(表21)。這些結果代表任一對pI增加的取代，S400R/D413K或Q311R/D413K，不會影響對於人類及恆河猴FcγR的親和性。
PK研究於全人類FcγR基因轉殖小鼠
利用全人類FcγR基因轉殖小鼠的體內測試
在共同施用抗潛伏性肌抑素抗體及人類潛伏性肌抑素於全人類FcγR基因轉殖小鼠之後，於體內評估肌抑素及抗潛伏性肌抑素抗體的消除(第24及25圖)。將抗潛伏性肌抑素抗體(0.3mg/ml)及潛伏性肌抑素(0.05mg/ml)以單次劑量10ml/kg施用於尾靜脈。以單次劑量10ml/kg施用抗CD4抗體(1mg/ml)三次(每10天)於尾靜脈以抑制抗藥物抗體。在施用之後的5分鐘、15分鐘、1小時、4小時、7小時、1天、2天、7天、14天、21天及28天收集血液。將收集的血液立即在4℃以15,000rpm離心10分鐘，以分離血漿。將分離的血漿儲存於-20℃或-20℃以下直到測量為止。使用的抗潛伏性肌抑素抗體為MS1032LO06-SG1、MS1032LO06-MY101、MS1032LO06-PK2、MS1032LO06-MY201、MS1032LO06-MY351、MS1032LO06-MY205、MS1032LO06-MY344及MS1032LO06-MY335。
藉由電化學發光(ECL)測量血漿中的總肌抑素濃度
藉由ECL測量老鼠血漿中的總肌抑素濃度。將抗成熟的肌抑素抗體RK35(WO 2009/058346)分配於MULTI-ARRAY 96孔盤(Meso Scale Discovery)之上，並在4℃隔夜培養，以製備固定有抗成熟的肌抑素的盤。配製稀釋4倍或更多的成熟的肌抑素校正曲線樣品及老鼠血漿樣品。將樣品於酸性溶液(0.2M甘胺酸-HCl，pH2.5)中混合，以使成熟的肌抑素自其結合的蛋白質(例如原胜肽)解離。接著，將樣品添加至固定有抗成熟的肌抑素的盤上，且在清洗前使其於室溫下進行結合1小時。之後，加入經BIOTIN TAG標記的抗成熟的肌抑素抗體RK22(WO 2009/058346)，且在清洗前於室溫下培養1小時。之後，加入經SULFO TAG標記的親和素(Meso Scale Discovery)，且在清洗前於室溫下培養1小時。接著立即將讀取緩衝液T(x4)(Meso Scale Discovery)加入盤中並藉由SECTOR Imager 2400(Meso Scale Discovery)偵測訊號。根據校正曲線的反應，利用分析軟體SOFTmax PRO(Molecular Devices)計算成熟的肌抑素濃度。藉由此方法測量在靜脈內施用抗潛伏性肌抑素抗體及潛伏性肌抑素之後血漿中的總肌抑素濃度的時程，如第24圖所示。
藉由高效能液相層析-電噴霧串聯質譜(LC/ESI-MS/MS)測 量血漿中的抗潛伏性肌抑素抗體濃度
藉由LC/ESI-MS/MS測量老鼠血漿中抗潛伏性肌抑素抗體的濃度。於小鼠血漿中校正標準的濃度為1.56 25、3.125、6.25、12.5、25、50、100及200μg/mL。將3μL的校 正標準及血漿樣本加入至50μL的Ab-Capture Mag(ProteNova)中，並使其在室溫下培養2小時。之後，將磁珠從樣品中回收並以0.2mL具有0.05% Tween 20的10mmol/L PBS清洗兩次。接著，以10mmol/L PBS清洗磁珠以確保Tween 20的移除。在清洗後，使磁珠懸浮於25μL於含7.5mol/L尿素、8mmol/L二硫蘇糖醇及1μg/mL溶菌酶(雞蛋白)的50mmol/L碳酸氫銨中，並將懸浮樣品在56℃培養45分鐘。接著，加入2μL的500mmol/L碘乙醯胺(iodoacetoamide)並將樣品在黑暗中於37℃培養30分鐘。之後，加入150μL含0.67μg/mL生化用賴胺醯內肽酶(Lysyl Endopeptidase)(Wako)的50mmol/L碳酸氫銨，以實行賴胺醯內肽酶分解，且將樣品於37℃培養3小時。接著，加入10μL含10μg/mL定序級修飾蛋白酶(Promega)的50mmol/L碳酸氫銨，以實行胰蛋白酶分解。使樣品在37℃混合隔夜進行分解，且加入5μL的10%三氟醋酸進行淬滅(quench)。將50μL的分解樣品藉由LC/ESI-MS/MS進行分析。利用裝備有2D I級UPLC(Waters)的Xevo TQ-S三重四極儀器(Waters)實行LC/ESI-MS/MS。藉由選擇反應監測(SRM)監測作為內標準的抗潛伏性肌抑素抗體特異性胜肽YAFGQGTK及溶菌酶特異性胜肽GTDVQAWIR。抗潛伏性肌抑素抗體的SRM相變為[M+2H]2+(m/z 436.2)至y8離子(m/z 637.3)，而溶菌酶的SRM相變為[M+2H]2+(m/z 523.3)至y8離子(m/z 545.3)。利用波峰區對濃度作圖以加權(1/x或1/x2)線性回歸，建立內校正曲線。利用分析軟體Masslynx Ver.4.1(Waters)由校正曲線計算老鼠血漿中的濃度。藉由此方法測量在靜脈內施用抗潛 伏性肌抑素抗體及潛伏性肌抑素之後血漿中的抗體濃度的時程，如第25圖所示。
pI及FcγR結合對體內肌抑素濃度的影響
在MS1032LO06-SG1的施用後，相較於在5分鐘的血漿總肌抑素濃度，血漿總肌抑素濃度在7小時時降低5倍。相較之下，在MS1032LO06-MY101、MS1032LO06-MY201及MS1032LO06-MY205的施用後，相較於在5分鐘的血漿總肌抑素濃度，血漿總肌抑素濃在7小時時度降低28-200倍。此外，在MS1032LO06-PK2、MS1032LO06-MY351、MS1032LO06-MY344及MS1032LO06-MY335的施用後，相較於在5分鐘的血漿總肌抑素濃度，血漿總肌抑素濃度在7小時降低361-419倍。另一方面，相較於MS1032LO06-SG1的濃度，每個抗體在每個取樣點的濃度差異大約在2倍內，且pI變異體並未增加抗體自血漿的消除。人類FcγRIIb結合增強的抗體及pI增加的取代均增加肌抑素的消除，但未增加抗體的消除。高pI變異體在血漿中具有較多正電荷。由於此這電荷與與負電荷的細胞表面反應，高pI變異體的抗原-抗體免疫複合物更接近細胞表面，導致高pI變異體的抗原-抗體免疫複合物的細胞攝入增加。
實施例29
在猴子中利用FcγRIIb增強的Fc變異體評估肌抑素的清除
在恆河猴中評估實施例27中發展對cynoFcγRIIb結合增強的Fc變異體對肌抑素清掃的影響。且亦評估pI增加的取代的組 合效應。
測試的變異體的製備及概況
測試的14種抗體及它們的結合概況統整於表25中。已有報導指出在酸性pH對FcRn具有增強結合的Fc變異體改善體內的抗體半生期(J.Biol.Chem. 2006 281：23514-23524(2006)；Nat.Biotechnol. 28：157-159(2010),Clin Pharm.& Thera. 89(2)：283-290(2011))。為了改善抗體半生期，但不結合類風濕性因子，我們將這些取代與FcγRIIb增強及pI增加的Fc變異體結合。
藉由分別導入N434A取代於MS103205H795-MY101、MS103205 H795-MY344、MS103205H795-MY351、MS103205H795-MY201及MS103205H795-MY335以製備重鏈，MS103205H795-SG1012、MS103205H795-SG1029、MS103205H795-SG1031、MS103205H795-SG1033及MS103205H795-SG1034。藉由導入pI增加的取代(Q311R/D399K)於MS103205H795-SG1012以製備MS103205H795-SG1016。藉由分別導入M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E取代及N434A/Q438R/S440E取代於MS103240H795-MY344(MS103240H795：VH，序列辨識號：92)中以製備MS103240H795-SG1071及MS103240H795-SG1079。
藉由分別導入pI增加的取代Q311R/P343R及M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E取代於MS103240H795-MY209及MS103240H795-MY518中以製備 MS103240H795-SG1074及MS103240H795-SG1077。藉由分別導入pI增加的取代Q311R/P343R及N434A/Q438R/S440E取代於MS103240H795-MY209及MS103240H795-MY518中以製備MS103240H795-SG1080及MS103240H795-SG1081。藉由導入pI增加的取代Q311R/D413K及M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E取代於MS103240H795-MY205中以製備MS103240H795-SG1071。藉由導入pI增加的取代Q311R/D413K及N434A/Q438R/S440E取代以製備MS103240H795-SG1079。根據實施例34所示之方法，分別以M103202L889-SK1及M103202L1045-SK1(M103202L1045：VL，序列辨識號：97)作為輕鏈表達這些MS1032LO06變異體及MS1032LO19變異體，以及利用實施例27所述之方法評估它們對人類及恆河猴FcγR的親和性。在此實施例中，每個Fc變異體的KD倍數的值之計算是將親本SG1的KD值除以變異體對各個FcγR的KD值。例如，MS1032LO06-SG1012及MS1032LO19-SG1071的KD倍數的值的計算是將MS1032LO06-SG1及MS1032LO19-SG1的KD值分別除以MS1032LO06-SG1012及MS1032LO19-SG1071的KD值。
SPR分析結果統整表25中。在這些變異體中，SG1012、SG1016、SG1074及SG1080對人類FcγRIIb顯示最強的親和性，其相較於SG1，對人類FcγRIIb具有增強10倍的親和性。
29.2. PK研究於猴子
利用恆河猴的體內測試
在施用抗潛伏性肌抑素抗體於來自柬埔寨(Shin Nippon Biomedical Laboratories Ltd.,Japan)的2-4歲大的食蟹獼猴(Macaca fascicularis )(恆河猴)中之後，於體內評估內源肌抑素的累積。利用一次性注射器、延長管、留置針及輸液幫浦注射30mg/kg的劑量於前臂的頭靜脈。給藥速度為每一個體30分鐘。在給藥的開始前以及給藥結束後的5分鐘、7小時以及1、2、3、7、14、21、28、35、42、49及56天、或給藥結束後的5分鐘、以及2、4及7小時、以及1、2、3、7、14、21、28、35、42、49及56天收集血液。以包含肝素鈉的注射器由股靜脈抽取血液，立即將血液放置冰上冷卻，且在4℃以1700×g 離心10分鐘以取得血漿。將血漿樣品儲存於低溫冷凍庫(可接受範圍：-70℃或以下)中直到測量為止。使用的抗潛伏性肌抑素抗體為MS1032LO00-SG1、MS1032LO06-SG1012、MS1032LO06-SG1016、MS1032LO06-SG1029、MS1032LO06-SG1031、MS1032LO06-SG1033及MS1032LO06-SG1034(在本文中，SG1012、SG1016、SG1029、SG1031、SG1033及SG1034為根據下述之SG1所建立的重鏈恆定區)。
利用一次性注射器及留置針，以2mg/kg的劑量施用抗潛伏性肌抑素抗體MS1032LO19-SG1079、MS1032LO19-SG1071、MS1032LO19-SG1080、MS1032LO19-SG1074、MS1032LO19-SG1081及MS1032LO19-SG1077(在本文中，SG1079、SG1071、SG1080、SG1074、SG1081及SG1077為根據下述之SG1所建立的重鏈恆定區)於前臂的頭靜脈或隱靜脈中。在給藥的開始前以及給藥結束後的5分鐘、以及2、4及7小時、以及1、2、3、7及14天收集血液。如上述方法處理血液。將血漿樣品儲存於低溫冷凍庫(可接受範圍：-70℃或以下)中直到測量為止。
藉由電化學發光(ECL)測量血漿中的總肌抑素濃度
藉由ECL測量猴子血漿中的總肌抑素濃度，如實施例23中所述。藉由此方法測量在靜脈內施用抗潛伏性肌抑素抗體之後血漿中的總肌抑素濃度的時程，如第26圖所示。
藉由電化學發光(ECL)測量猴子血漿中的ADA
將生物素化的藥物被覆於MULTI-ARRAY 96孔親和素盤(Meso Scale Discovery)之上，並在常溫下於低交叉緩衝液(Candor)中培養2小時。在加入盤前，將猴子血漿樣品於低交叉緩衝液中稀釋20倍。將樣品於4℃隔夜培養。隔日，在加入SULFO TAG標記的抗猴子IgG二級抗體(Thermo Fisher Scientific)之前，以清洗緩衝液清洗盤三次。於室溫培養1小時之後，以清洗緩衝液清洗盤三次。接著立即將讀取緩衝液T(x4)(Meso Scale Discovery)加入盤中並藉由SECTOR Imager 2400(Meso Scale Discovery)偵測訊號。
pH依賴性及Fc工程改造對老鼠體內肌抑素累積的影響
在恆河猴中，非pH依賴性抗體(MS1032LO00-SG1)的施用造成肌抑素濃度在第28天從基準線增加至少60倍。在第28天，pH依賴性抗潛伏性肌抑素抗體MS1032LO06-SG1012及MS1032LO06-SG1033分別自基準線增加3倍及8倍。強烈的清掃主要是對恆河猴FcγRIIb增加的親和性所貢獻。在第28天，pH依賴性抗潛伏性肌抑素抗體MS1032LO06-SG1029、MS1032LO06-SG1031及MS1032LO06-SG1034可清掃抗原至基準線以下。MS1032LO06-SG1029、MS1032LO06-SG1031及MS1032LO06-SG1034的強烈清掃的原因是由於抗體的正電荷團增加，非特異性細胞攝入增加以及由於對FcγR的結合增強，FcγR介導的細胞攝入增加。
pH依賴性抗潛伏性肌抑素抗體MS1032LO19-SG1079、MS1032LO19-SG1071、MS1032LO19-SG1080、MS1032LO19-SG1074、MS1032LO19-SG1081及MS1032LO19-SG1077的施用從第1天降低恆河猴中肌抑素濃度至低於偵測極限(<0.25ng/mL)。於第14天，MS1032LO19-SG1079及MS1032LO19-SG1071的肌抑素的濃度增加至高於偵測極限，然而MS1032LO19-SG1080、MS1032LO19-SG1074、MS1032LO19-SG1081及MS1032LO19-SG1077的肌抑素的濃度仍然低於偵測極限。MS1032LO19-SG1079及MS1032LO19-SG1071較弱的抑制可能是因為pI突變的不同。
上述數據顯示自血漿強烈的清掃肌抑素是藉由增 加對FcγRIIb結合的突變、或增加抗體的正電荷及增加對FcγRIIb結合的突變組合加以達成。肌抑素的強烈清掃被預期可藉由結合增加抗體的正電荷及增加對FcγR結合的突變以在人類中達成。
實施例30
篩選pI增加的取代以增強肌抑素的清除
為了增強肌抑素的清除，在此實施例中評估抗體的Fc部分中的pI增加的取代。加入胺基酸取代於抗體恆定區以增加pI的方法並未特別限定，但例如，可藉由WO 2014/145159所述之方法實行。如具有可變區的情況下，導入至恆定區中的胺基酸取代較佳為減少帶負電荷的胺基酸(如天門冬胺酸及谷胺酸)而增加帶正電荷的胺基酸(如精胺酸及賴胺酸)數量的那些。此外，胺基酸取代可導入抗體恆定區中的任一位置，且可為單一胺基酸取代或多個胺基酸取代的組合。未特別限定地，導入胺基酸取代的位置較佳為胺基酸側鏈可暴露於抗體分子表面的位置。更佳的例子包含導入多個胺基酸取代的組合在可被暴露於抗體分子表面的位置之方法。或者，於此導入的多個胺基酸取代較佳為經配置因此它們在結構上彼此接近。此外，未特別限定地，於此導入的多個胺基酸取代較佳為取代成帶正電荷的胺基酸，因此較佳地它們造成多個正電荷呈現結構上相近的位置的狀態。
測試的變異體的製備及概況
測試的抗體統整於表26中。藉由導入pI增加的取代Q311R/D339R至MS103205H795-SG1中以製備重鏈 MS103205H795-SG141。亦藉由導入表26所示各自的取代至MS103205H795-SG1中以製備其他重鏈變異體。根據實施例34所示之方法，以M103202L889-SK1作為輕鏈表達所有MS1032LO06變異體
使用BIACORE ® 的pI增加的Fc變異體的老鼠FcγRII結合分析
關於包含產生的Fc區域變異體的抗體，利用BIACORE® T200(GE Healthcare)實行可溶性老鼠FcγRII及抗原-抗體複合物之間的結合分析。藉由所屬領域具有通常知識者習知的方法，以His標記的分子的形式製造可溶性老鼠FcγRII。使用His捕捉套組(GE Healthcare)以胺偶合方法將適量的抗His抗體固定於感測晶片CM5(GE Healthcare)之上，以捕捉老鼠FcγRII。之後，注射抗體-抗原複合物及電泳緩衝液(作為參考溶液)，允許其與捕捉於感測晶片上的老鼠FcγRII的相互作用發生。使用pH7.4的20mM N-(2-乙醯胺基)-2-胺乙磺酸、150mM NaCl、1.2mM CaCl2 及0.05%(w/v)Tween 20作為電泳緩衝液，且亦使用各自的緩衝液以稀釋可溶性老鼠FcγRII。為了再生感測晶片，使用pH1.5的10mM甘胺酸-HCl。於25℃實行所有測量。根據由感測圖計算而得的結合(RU)實行分析，所述感測圖是藉由測量取得，並顯示當SG1的結合量定義為1.00時的相關數值。為了計算參數，使用BIACORE® T100評估軟體(GE Healthcare)。
SPR分析結果統整於表26中。一些Fc變異體顯示對固定於BIACORE® 感測晶片上的老鼠FcγRII具有增強的 親和性。
然而不受限於特定理論，此結果可解釋如下。已知BIACORE® 感測晶片為帶負電荷的，此電荷狀態可被認為是與細胞膜表面相似的。更具體而言，抗原-抗體複合物對固定於帶負電荷的BIACORE® 感測晶片上的老鼠FcγRII的親和性，推測是與抗原-抗體複合物結合至存在於相似地帶負電荷的細胞膜表面上的老鼠FcγRII之方式類似。
於此，藉由導入pI增加的修飾於Fc區域中所產生的抗體，為相較於導入修飾之前，Fc區域的電荷較偏向正電的抗體。因此，Fc區域(正電荷)及感測晶片表面(負電荷)之間的電荷相互作用可被認為是已藉由pI增加的胺基酸修飾強化的。此外，此種效果被預期類似地發生在相同帶負電荷的細胞膜表面上；因此，它們亦被預期會具有加快體內細胞攝入速度的效果。
在從SG1中兩個胺基酸被取代的pI增加的Fc變異體中，由SG141、P1499m、P1501m及P1540m所形成的抗原-抗體複合物對人類FcγRIIb顯示最高的結合。在Q311R/D399R、Q311R/P343R、Q311R/D413R及D401R/D413K的胺基酸取代應對感測晶片上人類FcγRIIb的結合具有強烈的電荷效應。
pI增血的Fc變異體的細胞攝入
為了評估胞內攝入至表達人類FcγRIIb的細胞系的速率，實行下列分析。藉由習知方法產生組成地(constitutively)表達人類FcγRIIb的MDCK(Madin-Darby犬腎)細胞系。利用這些細胞，評估抗原-抗體複合物的細胞內攝入。
具體而言，根據已建立的實驗流程，使用pHrodoRed(Life Technlogies)標記人類潛伏性肌抑素(antigen)，且在抗體濃度為10mg/mL而抗原濃度為2.5mg/mL的培養溶液中形成抗原-抗體複合物。將包含抗原-抗體複合物的培養溶液加入上述組成地表達人類FcγRIIb的MDCK細胞的培養盤中，培養1小時，且接著利用InCell Analyzer 6000(GE healthcare)量化被攝入細胞中的抗原的螢光強度。被攝入的抗原量以對SG1的相對值表示，SG1值被當作1.00。
細胞攝入的量化結果統整於表26中。在數個Fc變異體中觀察到來自細胞中抗原的強烈螢光。
然而，不受限於特定理論，此結果可解釋如下。
加入細胞培養溶液的抗原及抗體形成抗原-抗體複合物於培養溶液中。抗原-抗體複合物藉由抗體Fc區域結合至表達於細胞膜上的人類FcγRIIb，且以受體依賴性方式被攝入於細胞中。此實驗中使用的抗體以pH依賴性方式結合至抗原；因此，抗體可自細胞內的胞內體(酸性pH條件)的抗原解離。由於解離的抗原經pHrodoRed標記如前述，故它在胞內體中發螢光。因此，細胞內強烈的螢光強度被認為是代表細胞攝入抗原-抗體複合物快速地或大量的發生。
在從SG1中兩個胺基酸被取代的pI增加的Fc變異體中，由SG141、P1375m、P1378m、P1499m、P1524m、P1525m、P1532m、P1533m、P1540m、P1541m及P1543m所形成的抗原-抗體複合物顯示抗原較強烈地被攝取進入細胞中。在Q311R/D399R、Q311R/D413K、S400R/D413K、Q311R/P343R、Q311R/G341R、Q311R/G341K、Q311R/D401R、Q311R/D401K、D401R/D413K、D401K/D413K及G402K/D413K的胺基酸取代應對細胞攝入抗原抗體複合物具有強烈的電荷效應。
PK研究於人類FcRn轉殖基因小鼠
利用人類FcRn轉殖基因小鼠的體內測試
在共同施用抗潛伏性肌抑素抗體及潛伏性肌抑素於人類FcRn基因轉殖小鼠之後，於體內評估肌抑素及抗潛伏性肌抑素抗體的消除，所述人類FcRn基因轉殖小鼠中的老鼠FcRn被人類FcRn取代。在實驗PK-2中(如第27圖所述)，將抗潛伏性肌抑素抗體(0.1mg/ml)及老鼠潛伏性肌抑素(0.05mg/ml)以單次劑量10ml/kg施用於尾靜脈。在PK-4實驗中(如第28圖所述)，以單次劑量10ml/kg施用抗潛伏性肌抑素抗體(0.3mg/ml)、人類潛伏性肌抑素(0.05mg/ml)及人類正常免疫球蛋白(CSL Behring AG)(100mg/ml)於尾靜脈中。在實驗PK-2中，在施用之後的5分鐘、15分鐘、1小時、4小時、7小時、1天、2天、7天、14天、21天及28天收集血液。在實驗PK-4中，在施用之後的5分鐘、1小時、4小時、7小時、1天、7天、14天、21天及30天收集血液。將收集的血液立即在4℃以15,000rpm離心5分鐘，以分離血漿。將分離的血漿儲存於-20℃或-20℃以下直到測量為止。在實驗PK-2中，使用的抗潛伏性肌抑素抗體為MS1032LO06-SG1、MS1032LO06-P1375m、MS1032LO06-P1378m及MS1032LO06-P1383m，而在實驗PK-4中，使用的抗潛伏性肌抑素抗體為MS1032LO06-P1375m及MS1032LO06-P1499m。
藉由電化學發光(ECL)測量血漿中的總肌抑素濃度
藉由ECL測量老鼠血漿中的總肌抑素的濃度，如實施例28所述(Ravetch PK)。藉由此方法測量在靜脈內施用抗潛伏性肌抑素抗體及潛伏性肌抑素之後血漿中的總肌抑素濃度的時程，如第27A及28A圖所示。
藉由酶連接免疫吸附測定(ELISA)測量血漿中的抗潛伏性肌抑素抗體濃度
在實驗PK-2中，藉由ELISA測量抗潛伏性肌抑素抗體在老鼠血漿中的濃度。將抗人類IgG(γ鏈特異性)F(ab')2抗體片段(Sigma)分配於Nunc-ImmunoPlate MaxiSorp(Nalge Nunc International)之上，並於4℃靜置隔夜以製備固定有抗人類IgG的盤。製備具有2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0.078及0.039μg/ml的血漿濃度的校正曲線樣品，以及經稀釋100倍或更多的老鼠血漿樣品。接著，將樣品分配於固定有抗人類IgG的盤上，並於室溫下靜置1小時。之後，加入山羊的抗人類IgG(γ鏈特異性)生物素偶聯物(Southern Biotech)以於室溫下反應1小時。接著，加入親和素-PolyHRP80(Stereospecific Detection Technologies)以於室溫下反應1小時，並利用TMB One Component HRP Microwell Substrate(BioFX Laboratories)作為基質進行顯色反應。在以1N硫酸(Showa Chemical)終止反應之後，藉由微盤分析儀測量在450nm的吸光度。利用分析軟體SOFTmax PRO(Molecular Devices)由校正曲線的吸光度計算老鼠血漿中的濃度。藉由此方法測量在靜脈內施用抗潛伏性肌抑素抗體及潛伏性肌抑素之後血漿中的抗體濃度的時程，如第27B圖所示。
在PK-4實驗中，藉由Gyrolab BioaffyTM CD(Gyros)測量老鼠血漿中抗潛伏性肌抑素抗體的濃度。使生物素化的抗人類IgG Fc抗體流過CD的微結構內的親和素珠粒管柱。製備具有0.5、1、2、4、8、16及32μg/ml的血漿濃度、 加強(spike)血漿濃度的5mg/mL的人類正常免疫球蛋白(CSL Behring AG)以及200μg/ml的老鼠潛伏性肌抑素的校正曲線樣品，以及經稀釋25倍或更多的老鼠血漿樣品，其加強小鼠潛伏性肌抑素的200μg/ml的血漿濃度。接著將樣品加入CD中並流經珠粒管柱。之後，將Alexa標記的山羊的抗人類IgG多株抗體(BETHYL)加入CD中並流經珠粒管柱。利用Gyrolab Evaluator Program由校正曲線的反應計算老鼠血漿中的濃度。藉由此方法測量在靜脈內施用抗潛伏性肌抑素抗體及潛伏性肌抑素之後血漿中的抗體濃度的時程，如第28B圖所示。
pI對體內肌抑素濃度的影響
在實驗PK-2中，在MS1032LO06-SG1的施用後，相較於在5分鐘的血漿總肌抑素濃度，血漿總肌抑素濃度在7小時時降低12倍。相較之下，在實驗PK-2中，在MS1032LO06-P1375m、MS1032LO06-P1378m及MS1032LO06-P1383m的施用後，相較於在5分鐘的血漿總肌抑素濃度，血漿總肌抑素濃度在7小時時降低26-67倍。在實驗PK-2中，相較於MS1032LO06-SG1的抗體濃度，MS1032LO06-P1378m及MS1032LO06-P1383m的抗體濃度降低多於3倍，雖然相較於MS1032LO06-SG1的濃度差異，MS1032LO06-P1375m在每個取樣點的濃度差異大約在2倍內。包含在Q311R/D413K的胺基酸取代的pI變異體顯示增強自血漿清除肌抑素，但未增強自血漿清除抗體。
此外，在MS1032LO06-P1499m的施用後，在共同施用人類正常免疫球蛋白以模擬人類血漿的條件下，評估總肌 抑素濃度及抗體濃度。在實驗PK-4中，在MS1032LO06-P1375m及MS1032LO06-P1499m的施用後，相較於在5分鐘的血漿總肌抑素濃度，血漿總肌抑素濃度在7小時時降低3.4及5.3倍，且相較於MS1032LO06-P1375m的，MS1032LO06-P1499m在每個取樣點的總肌抑素濃度及抗體濃度在1.5倍之內。包含在Q311R/P343R的胺基酸取代的pI變異體亦顯示增強自血漿清除肌抑素，但未增強自血漿清除抗體。
高pI變異體在血漿中具有較多正電荷。由於此這電荷與與負電荷的細胞表面反應，高pI變異體的抗原-抗體免疫複合物更接近細胞表面，導致高pI變異體的抗原-抗體免疫複合物的細胞攝入增加。
實施例31
結合pI增加的取代與FcγRIIb增強的Fc變異體
在人類FcγRIIb基因轉殖小鼠中評估結合FcγRIIb增強的Fc變異體及其它pI增加的取代對肌抑素的清除的影響。藉由標準技術，微注射包含人類FCGR2B基因的所有外顯子的BAC(細菌人工染色體)載體至C57BL/6N的受精卵的原核中以產生人類FcγRIIb基因轉殖的小鼠(請參照，例如，J.Immunol.,2015 Oct 1；195(7)：3198-205)。利用設計用於標靶外顯子1的鋅指核酸酶(ZFN)產生老鼠FcγRIIb缺失的小鼠。藉由使人類FcγRIIb基因轉殖小鼠與老鼠FcγRIIb KO小鼠交配以建立人源化FcγRIIb小鼠。利用此小鼠，可評估對人類FcγRIIb親和性的增強以及pI的增加之結合對可溶性抗原的清除的影響。
測試的變異體的製備及概況
測試的7種抗體及它們的結合概況統整於表27中。藉由導入pI增加的取代Q311R/D413R、Q311R/P343R、Q311R/P343R/D413R及Q311R/N384R/D413R至MS103205H795-MY201中以分別製備重鏈MS103205H795-MY35、MS103205H795-PK55、MS103205H795-PK56及MS103205H795-PK57。根據實施例30所示之方法，以M103202L889-SK1作為輕鏈表達所有MS1032LO06變異體，並利用實施例27所述之方法評估它們對人類及恆河猴FcγR的親和性。
根據統整於表27中的SPR分析，已確定pI增加的取代不會影響FcγRIIb增強的Fc變異體的FcγR結合。MY201及MY351，其藉由導入Q311R/D413K於MY201中加以製備，分別顯示6倍及5倍增強的人類FcγRIIb結合。關於其它人類及恆河猴FcγR，它們顯示幾乎相同的結合概況。相似地，MY352、PK55、PK56及PK57顯示與親本MY201相似的結合概況(表27)。這些結果代表任一對pI增加的取代不會影響對於人類及恆河猴FcγR的親和性。
PK研究於人類FcγRIIb基因轉殖小鼠
利用人類FcγRIIb基因轉殖小鼠的體內測試
在共同施用抗潛伏性肌抑素抗體及人類潛伏性肌抑素於人類FcγRIIb基因轉殖小鼠之後，於體內評估肌抑素及抗潛伏性肌抑素抗體的消除，所述人類FcγRIIb基因轉殖小鼠中的老鼠FcγRII被人類FcγRIIb取代。將抗潛伏性肌抑素抗體(0.3mg/ml)及潛伏性肌抑素(0.05mg/ml)以單次劑量10ml/kg施用於尾靜脈。以單次劑量10ml/kg施用抗CD4抗體(1mg/ml)三次(每10天)於尾靜脈以抑制抗藥物抗體。在施用之後的5分鐘、1小時、4小時、7小時、1天、7天、14天、21天及28天收集血液。將收集的血液立即在4℃以15,000rpm離心5分鐘，以分離血漿。將分離的血漿儲存於-20℃或-20℃以下直到測量為止。使用的抗潛伏性肌抑素抗體為MS1032LO06-SG1、MS1032LO06-MY201、MS1032LO06-MY351、MS1032LO06-MY352、MS1032LO06-PK55、MS1032LO06-PK56及 MS1032LO06-PK57。
藉由電化學發光測量血漿中的總肌抑素濃度
藉由電化學發光(ECL)測量老鼠血漿中的總肌抑素的濃度，如實施例28所述。藉由此方法測量在靜脈內施用抗潛伏性肌抑素抗體及潛伏性肌抑素之後血漿中的總肌抑素濃度的時程，如第29圖所示。
藉由酶連接免疫吸附測定(ELISA)測量血漿中的抗潛伏性 肌抑素抗體濃度
藉由ELISA測量抗潛伏性肌抑素抗體在老鼠血漿中的濃度。將抗人類IgG(γ鏈特異性)F(ab')2抗體片段(Sigma)分配於Nunc-ImmunoPlate MaxiSorp(Nalge Nunc International)之上，並於4℃靜置隔夜以製備固定有抗人類IgG的盤。製備具有2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0.078及0.039μg/ml的血漿濃度的校正曲線樣品，以及經稀釋100倍或更多的老鼠血漿樣品。接著，將樣品分配於固定有抗人類IgG的盤上，並於室溫下靜置1小時。之後，加入山羊的抗人類IgG(γ鏈特異性)生物素偶聯物(Southern Biotech)以於室溫下反應1小時。接著，加入親和素-PolyHRP80(Stereospecific Detection Technologies)以於室溫下反應1小時，並利用TMB One Component HRP Microwell Substrate(BioFX Laboratories)作為基質進行顯色反應。在以1N硫酸(Showa Chemical)終止反應之後，藉由微盤分析儀測量在450nm的吸光度。利用分析軟體SOFTmax PRO(Molecular Devices)由校正曲線的吸光度計算老鼠血漿中的濃度。藉由此方法測量在靜脈內施用抗潛伏性肌 抑素抗體及潛伏性肌抑素之後血漿中的抗體濃度的時程，如第30圖所示。
pI及FcγR結合對體內肌抑素濃度的影響
在MS1032LO06-MY201的施用後，相較於在5分鐘的血漿總肌抑素濃度，血漿總肌抑素濃度在7小時時降低8倍。相較之下，在MS1032LO06-PK57的施用後，相較於在5分鐘的血漿總肌抑素濃度，血漿總肌抑素濃在7小時時度降低376倍。其它高pI變異體自血漿清除肌抑素的增強顯示為相似的。相較於MS1032LO06-SG1的抗體濃度，高pI變異體的抗原濃度在第28天降低2-3倍，且pI變異體顯示稍微增強自血漿消除抗體。
高pI變異體在血漿中具有較多正電荷。由於此這電荷與與負電荷的細胞表面反應，高pI變異體的抗原-抗體免疫複合物更接近細胞表面，導致高pI變異體的抗原-抗體免疫複合物的細胞攝入增加。
實施例32
發展人類FcγRIIb增強的Fc變異體
建立具有抗肌抑素變異區的人類FcγRIIb增強的Fc變異體，並評估它們對人類FcγR的親和性。具體而言，藉由導入取代至MS103240H795-SG1(VH，序列辨識號：92；CH，序列辨識號：9)中及結合T250V/T307P取代，以建立人類FcγRIIb增強的Fc變異體。此外，亦導入取代(Q311R/D413K或Q311R/P343R)。使用M103202L1045-SK1作為輕鏈表達變異體，並根據實施例34的方法，分析它們對人類FcγR的親和 性。表28顯示對人類及恆河猴FcγR的動力學分析。框格填入灰色的KD值是利用[公式2]進行計算，因為它們的親和性太弱而無法藉由動力學分析正確地判定。
所有經評估的變異體相較於SG1，對人類FcγRIIb顯示增強的親和性，對人類FcγRIIaR、FcγRIIaH、FcγRIIIaV顯示降低的結合。相較於SG1，對人類FcγRIIb的親和性在增加4.1倍及30.5倍之間變化。對人類FcγRIIaR的親和性在0.02倍及0.22倍之間。對人類FcγRIIaH及人類FcγRIIIaV的親和性分別小於0.04倍及0.012倍。藉由比較MY009(P238D)及MY214(P238D/T250V/T307P)的親和性，顯示取代(T250V/T307P)不會影響對人類FcγR的結合概況。另一方面，相較於不包含pI增加的取代的變異體，兩對pI增加的取代(Q311R/D413K及Q311R/P343R)均降低結合親和性約0.5倍。例如，雖然TT14對人類FcγRIIb顯示高30.5倍的親和性，但它在結合Q311R/D413K(TT33)及Q311R/P343R(TT32)僅分別增加16.1倍及14.5倍。
此外，將使用於實施例29中用於改善抗體半生期及降低與類風濕性因子結合的取代導入人類FcγRIIb增強的Fc變異體中，並分析它們對人類FcγR的親和性(表29)。在此SPR分析中，所有數據的取得是利用老鼠的抗人類IgG κ輕鏈用於捕捉感興趣的抗體。表30顯示結果，而框格填入灰色的KD值是利用[公式2]進行計算，因為它們的親和性太弱而無法藉由動力學分析正確地判定。
再次評估SG1及TT33於此測量中，其中捕捉方法與表28的不同。結果TT33的“KD倍數”值與表28所取得的一致(對於人類FcγRIIb在表28中為16.1倍，而表30中為5.7倍)。TT92及TT93，其藉由導入N434A/Q438R/S440E及M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E至TT33中加以建立，顯示與TT33類似的結合概況。相似地，衍生自TT32的TT90及TT91、衍生自TT31的TT72及TT73、衍生自TT30的TT70及TT71、衍生自TT21的TT68及TT69、以及衍生自TT20的TT66及TT67顯示與表28所示的親本抗體類似的結合概況。這些表示用於改善抗體半生期及降低與類風濕性因子結合的取代不影響人類FcγRIIb增加的變異體對人類FcγR的結合概況。
實施例33
FcγRIIb增加的變異體的細胞影像分析
為了評估由實施例32所述之抗體所形成的抗原-抗體複合物的細胞內攝入，實行如實施例30所述之細胞影像分析。為了避免訊號飽和，在此實施例中，抗原-抗體複合物形成於抗體濃度為1.25mg/mL而抗原濃度為0.34mg/mL的培養溶液中。
分析結果如第31圖所示。隨著增加對人類FcγRIIb的結合親和性，抗原-抗體複合物的細胞攝入增加。就TT14而言，相較於SG1，其對人類FcγRIIb具有30倍增強的結合親和性，細胞內的抗原螢光強度相較於SG1的增加了7.5倍。
雖然相較於不包含pI增加的取代的變異體，pI增加的取代(Q311R/D413K及Q311R/P343R)對人類FcγRIIb的結 合親和性降低約0.5倍，但相較於不包含pI增加的取代的Fc變異體，具有pI增加取代的Fc變異體的抗原抗體複合物之胞內攝入是增加的。相較於SG1，TT33顯示增加36倍的細胞攝入抗原抗體，而它的親本TT14顯示增加7.5倍的細胞攝入。此外，相較於在恆河猴中顯示強烈清除的SG1071、SG1074、SG1077、SG1079、SG1080及SG1081，TT33顯示類似地細胞攝入抗原-抗體複合物於細胞內。這些結果暗示pI增加的取代與FcγRIIb增強的Fc變異體的結合為抗原清掃的強力工具。
實施例34
抗體表達載體的建立；以及抗體的表達及純化藉由所屬領域具有通常知識者習知的製造方法，如裝配PCR等，實行編碼抗體變異區的H鏈及L鏈的胺基酸序列之全長基因的合成。藉由所屬領域具有通常知識者習知的方法，如PCR等，實行胺基酸取代的導入。將取得的質體片段插入動物細胞表達載體中，並產生H鏈表達載體及L鏈表達載體。藉由所屬領域具有通常知識者習知的方法，判定取得的表達載體的核苷酸序列。將產生的質體短暫地導入至衍生自人類胚胎腎癌細胞(Invitrogen)的HEK293H細胞系中，或至FreeStyle293細胞中，用於表達抗體。收集得到的培養上清液，且接著通過0.22μm MILLEX(R)-GV過濾器(Millipore)或通過0.45μm MILLEX(R)-GV過濾器(Millipore)，以取得培養上清液。利用rProtein A Sepharose Fast Flow(GE Healthcare)或Protein G Sepharose 4 Fast Flow(GE Healthcare)以所屬領域具有通常知識者習知的方法，從取得的培養上清液純化抗體。關於純化的 抗體的濃度，利用分光光度計測量它們在280nm的吸光度。由得到的數值，利用如PACE之方法(Protein Science 4：2411-2423(1995))計算吸光係數，用於計算抗體濃度(Protein Sci. 4：2411-2423(1995))。
雖然前述發明已為了清楚理解的目的，藉由說明及實施例詳細描述，然此描述及實施例不應理解為用以限定本發明的範圍。本文引用的所有專利及科學文獻之內容明確地以參考方式完整併入於此。
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<220>
<223> 人工合成序列
<400> 74
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 75
<210> 76
<211> 242
<212> PRT
<213> 食蟹獼猴
<400> 76
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<211> 242
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 77
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 78
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<211> 266
<212> PRT
<213> 食蟹獼猴
<400> 79
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<211> 267
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 80
<210> 81
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<212> PRT
<213> 智人
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<210> 82
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<213> 智人
<400> 82
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<212> PRT
<213> 智人
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<212> PRT
<213> 智人
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<212> PRT
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<220>
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<220>
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<220>
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<212> DNA
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<220>
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<220>
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<220>
<223> 人工合成序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 120
<210> 121
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 121
<210> 122
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 122
<210> 123
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 123
<210> 124
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 124
<210> 125
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 125
<210> 126
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<220>
<221> 雜項_特徵
<222> (1)..(1)
<223> Xaa為Ser或His
<220>
<221> 雜項_特徵
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Tyr,Thr,Asp或Glu
<400> 126
<210> 127
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<220>
<221> 雜項_特徵
<222> (4)..(4)
<223> Xaa為Tyr或His
<220>
<221> 雜項_特徵
<222> (7)..(7)
<223> Xaa為Ser或Lys
<220>
<221> 雜項_特徵
<222> (8)..(8)
<223> Xaa為Thr,Met或Lys
<220>
<221> 雜項_特徵
<222> (10)..(10)
<223> Xaa為Tyr或Lys
<220>
<221> 雜項_特徵
<222> (11)..(11)
<223> Xaa為Ala,Met或Glu
<220>
<221> 雜項_特徵
<222> (12)..(12)
<223> Xaa為Ser或Glu
<220>
<221> 雜項_特徵
<222> (16)..(16)
<223> Xaa為Gly或Lys
<400> 127
<210> 128
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<220>
<221> 雜項_特徵
<222> (5)..(5)
<223> Xaa為Tyr或His
<220>
<221> 雜項_特徵
<222> (7)..(7)
<223> Xaa為Thr或His
<220>
<221> 雜項_特徵
<222> (11)..(11)
<223> Xaa為Leu或Lys
<400> 128
<210> 129
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<220>
<221> 雜項_特徵
<222> (1)..(1)
<223> Xaa為Gln或Thr
<220>
<221> 雜項_特徵
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Ser或Thr
<220>
<221> 雜項_特徵
<222> (5)..(5)
<223> Xaa為Ser或Glu
<220>
<221> 雜項_特徵
<222> (7)..(7)
<223> Xaa為Tyr或Phe
<220>
<221> 雜項_特徵
<222> (8)..(8)
<223> Xaa為Asp或His
<220>
<221> 雜項_特徵
<222> (9)..(9)
<223> Xaa為Asn,Asp,Ala或Glu
<400> 129
<210> 130
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<220>
<221> 雜項_特徵
<222> (3)..(3)
<223> Xaa為Ser或Glu
<220>
<221> 雜項_特徵
<222> (7)..(7)
<223> Xaa為Ser,Tyr,Phe或Trp
<400> 130
<210> 131
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<220>
<221> 雜項_特徵
<222> (8)..(8)
<223> Xaa為Leu或Arg
<400> 131
<210> 132
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 132
<210> 133
<211> 30
<212> PRT
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 379
<210> 380
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 380
<210> 381
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 381

Claims (7)

  1. 一種結合至潛伏性肌抑素的分離的抗體，其中該抗體包括：(a)序列辨識號：86的VH序列以及序列辨識號：96的VL序列；(b)序列辨識號：87的VH序列以及序列辨識號：96的VL序列；(c)序列辨識號：88的VH序列以及序列辨識號：96的VL序列；(d)序列辨識號：89的VH序列以及序列辨識號：96的VL序列；(e)序列辨識號：90的VH序列以及序列辨識號：96的VL序列；(f)序列辨識號：91的VH序列以及序列辨識號：96的VL序列；(g)序列辨識號：92的VH序列以及序列辨識號：97的VL序列；(h)序列辨識號：93的VH序列以及序列辨識號：97的VL序列；(i)序列辨識號：94的VH序列以及序列辨識號：97的VL序列；或(j)序列辨識號：95的VH序列以及序列辨識號：97的VL序列。
  2. 如申請專利範圍第1所述之抗體，其包括包含序列辨識號：352的胺基酸序列之重鏈恆定區，以及包含序列辨識號：10 的胺基酸序列之輕鏈恆定區。
  3. 如申請專利範圍第1或2項所述之抗體，其為一全長IgG抗體。
  4. 一種分離的核酸，其編碼為如申請專利範圍第1至3項中任一項所述之抗體。
  5. 一種宿主細胞，包括如申請專利範圍第4項所述之核酸。
  6. 一種製造抗肌抑素抗體的方法，包括：培養如申請專利範圍第5項所述之宿主細胞，使得抗體被製造。
  7. 一種醫藥配方，包括如申請專利範圍第1至3項中任一項所述之抗體以及一醫藥上可接受的載體。
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