WO2010107110A1 - 抗体定常領域改変体 - Google Patents
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Definitions
- the cause of heterogeneity is removed by modification of the amino acid sequence. Therefore, an antibody with low heterogeneity can be produced by constructing an antibody with the constant region of the present invention. That is, high homogeneity of the antibody can be maintained by introducing the modification provided by the present invention into the heavy chain constant region of the antibody. Keeping antibody heterogeneity low means improving heterogeneity and is an important issue in maintaining the quality of pharmaceuticals. Therefore, the constant region of the present invention contributes to the maintenance of the quality of pharmaceuticals including antibodies.
- the present invention contributes to improvement of antibody pharmacokinetics. Specifically, when a specific amino acid residue is modified in the constant region of the antibody in the present invention, the blood concentration of the antibody composed of the constant region is compared with that in which the amino acid sequence is not modified. And maintained for a long time. Maintaining the blood concentration as long as possible means that when the antibody is administered as a pharmaceutical, the therapeutic effect can be maintained over a long period of time with a smaller amount of antibody. Alternatively, the frequency of administration can be reduced by increasing the administration interval of the antibody.
- the antibody constant region of the present invention can further contain additional modifications in addition to the modifications of the amino acid sequence introduced based on the present invention. Additional alterations can be selected from, for example, any of amino acid substitutions, deletions, modifications, or combinations thereof. Specifically, any constant region containing the following modifications in its amino acid sequence is included in the present invention.
- a modification according to the present invention is introduced into the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 (human IgG2 constant region).
- the modification based on the present invention is introduced into the amino acid sequence of the modified SEQ ID NO: 8 (human IgG2 constant region).
- Modifications according to the present invention are introduced into the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 (human IgG2 constant region), and additional modifications are also introduced.
- IgG2 constant region is an IgG2 constant region in which the 325th Gly and 326th Lys are further deleted in order to reduce the C-terminal heterogeneity in the above-mentioned constant region.
- An example of such an antibody is an antibody having a constant region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 (M82). These antibody constant regions have reduced Fc ⁇ receptor binding activity, reduced immunogenicity risk, improved stability under acidic conditions, reduced heterogeneity, improved pharmacokinetics and / or IgG1 constant region It is an optimized antibody constant region with the property of high stability in the formulation compared to.
- the present invention also provides an antibody comprising the antibody constant region described above.
- the antibody of the present invention includes a modified product of an antibody containing any of the amino acid substitutions described above.
- the origin of the antibody is not particularly limited, and examples thereof include a human antibody, a mouse antibody, a rat antibody, and a rabbit antibody.
- the antibody of the present invention may be a chimeric antibody, a humanized antibody, a fully humanized antibody or the like.
- a preferred embodiment of the antibody of the present invention includes a humanized antibody.
- the present invention relates to a method for producing an antibody comprising the following steps (a) and (b).
- (A) a step of expressing DNA encoding an H chain in which one or a plurality of amino acid residues in the constant region are substituted or deleted by another amino acid of interest, and DNA encoding an L chain
- (b) step (a) a step of expressing DNA encoding an H chain in which one or a plurality of amino acid residues in the constant region are substituted or deleted by another amino acid of interest, and DNA encoding an L chain
- step a
- DNA encoding the antibody H chain wherein one or more amino acid residues in the constant region are substituted with other amino acids of interest or DNA encoding the deficient H chain and DNA encoding the L chain of the antibody are expressed.
- DNA encoding an H chain in which one or more amino acid residues in the constant region are substituted or deleted with other amino acids of interest for example, obtain a constant region portion of DNA encoding a wild type H chain, It can be obtained by introducing appropriate substitutions so that a codon encoding a specific amino acid in the constant region encodes another amino acid of interest.
- the host cell is cotransformed with the antibody expression vector prepared by the above method.
- host cells include microorganisms such as Escherichia coli, yeast and Bacillus subtilis, and animals and plants (Nature Biotechnology 25, 563-565 (2007), NatureNBiotechnology 16). , 773-777 (1998), Biochemical and Biophysical Research Communications 255, 444-450 (1999), Nature Biotechnology 23, 1159-1169 (2005), Journal of Virology 75, 2803-2809 (2001), Biochemical and Biophysical Research Communications 308, 94-100-100 (2003)).
- the lipofectin method (RWMalone et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,6077 (1989), PLFelgner et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84,7413 ( 1987), electroporation method, calcium phosphate method (FL GrahamGra & AJvan der Eb, Virology 52,456-467 (1973)), DEAE-Dextran method and the like are preferably used.
- L0-k0 SEQ ID NO: 2
- the DNA encoding the heavy chain and the light chain for obtaining the antibody of the present invention can be obtained, for example, by synthesizing DNA encoding these amino acid sequences.
- the DNA encoding the heavy chain and the light chain can be incorporated into an appropriate expression vector by adding an additional sequence such as a signal sequence, if necessary.
- Vectors can include promoters and enhancers for expressing DNA encoding the antibody incorporated in a suitable host.
- the present invention also relates to an antibody composed of a heavy chain constant region comprising a modified amino acid sequence provided by the present invention. That is, the present invention relates to an antibody comprising a heavy chain composed of a constant region and a variable region, wherein the amino acid sequence of the constant region is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 with at least the following two amino acids as other amino acids: An antibody comprising an altered amino acid sequence is provided. Modified amino acid residues: Cys at position 102 (EU numbering 219) and Cys at position 103 (EU numbering 220)
- the amino acid residue can be modified by substituting the 102nd Cys and the 103rd Cys with Ser.
- the constant region constituting the antibody of the present invention can further contain additional modifications. That is, the present invention relates to an antibody comprising a constant region in which at least one of the following amino acid residues is additionally modified in addition to the above modification. Modified amino acid residue: His at position 147 (EU numbering 268) 234th (EU numbering 355th) Arg, and 298th (EU numbering 419th) Gln
- the antibody of the present invention can contain a light chain in addition to the above heavy chain.
- a preferred light chain in the present invention is an IgG1 or IgG2 light chain.
- the light chain like the heavy chain, can contain a variable region and a constant region. Amino acid modifications can also be introduced into the variable region or constant region of the light chain. Alternatively, light chains that do not involve alteration or modification of the amino acid sequence can be combined.
- variable region constituting the antibody of the present invention can be a variable region that recognizes any antigen.
- a variable region of an antibody having an antigen neutralizing action can be shown.
- the variable region of an antibody having a neutralizing action on IL6 receptor can be used as the variable region constituting the antibody of the present invention.
- the variable region of an immunoglobulin heavy chain represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 can be shown. As long as the antigen binding activity of the amino acid sequence constituting the heavy chain variable region is maintained, modification of one or more amino acid residues is allowed.
- variable region of an antibody that can obtain high biological activity only with IgG4 isotype due to the influence of the disulfide bond pattern near the hinge region can be shown.
- the antibody constant region of the present invention it is possible to reduce the binding to the Fc ⁇ receptor while maintaining high biological activity, and to further improve the pharmacokinetics compared to the IgG1 isotype.
- the amino acid sequence of the variable region when modifying the amino acid sequence of the variable region, it is preferable to preserve the CDR sequence. Therefore, it is desirable to preserve the amino acid sequence of all CDRs, at least one, preferably two, and more preferably three. By preserving the CDR amino acid sequence, the antigen-binding properties of the variable region can be maintained.
- the number of amino acid residues allowed to be modified in the variable region is usually 1 to 10, for example 1-5, preferably 1 or 2 amino acids.
- the amino acid sequence alteration may be at least one of amino acid residue substitution, addition, deletion, and modification.
- the antibody of the present invention comprises a variable region in which the heavy chain is modified with pyroglutamic acid when the N-terminus of the heavy chain is glutamine.
- the light chain constituting the antibody of the present invention can contain any variable region so long as it does not cause a significant change in the antigen binding properties determined by the variable region of the heavy chain. This is because the antigen-binding activity of an antibody is mainly determined by the variable region of the heavy chain. Alternatively, it is permissible to modify the light chain variable region for the purpose of improving the antibody properties to a more desirable state.
- the method for improving heterogeneity of the antibody of the present invention comprises a step of substituting Cys at position 102 (EU numbering position 219) with another amino acid in the amino acid sequence (IgG2) set forth in SEQ ID NO: 8 and position 103 ( Other amino acid substitutions may be included as long as it includes a step of substituting Cys of the EU numbering (No. 220) with another amino acid.
- the method of amino acid substitution is not particularly limited, and for example, it can be performed by the above-mentioned site-directed mutagenesis method or the method described in the examples.
- the present invention provides a method for producing an antibody with reduced heterogeneity derived from the hinge portion of the IgG2 constant region.
- the production method of the present invention comprises: (a) any one of Cys at position 102 (EU numbering 219) and Cys at position 103 (220 in EU numbering) in the amino acid sequence (IgG2) set forth in SEQ ID NO: 8; Alternatively, a step of expressing a DNA encoding an antibody H chain composed of a constant region in which both are substituted with other amino acids, and (b) a variable region, and a DNA encoding an antibody L chain, and the expressed antibody H A step of recovering an antibody molecule comprising a chain and an antibody L chain.
- the present invention also includes a step of deleting the 325th (EU numbering 446th) Gly and the 326th (EU numbering 447th) Lys in the IgG2 constant region having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8. And to a method for improving the heterogeneity of antibodies.
- the method of improving the heterogeneity of the antibody of the present invention is as follows.
- the present invention provides a 147th (EU268) His, a 234th (EU355) Arg and / or a 298th (EU419) Gln as another amino acid.
- the present invention relates to a method for improving the pharmacokinetics of an antibody, comprising the step of substituting
- the method for improving pharmacokinetics of the present invention may include other amino acid substitutions as long as it includes the steps described above.
- the amino acid after substitution is not particularly limited, but it is preferable that His at position 147 (EU268) is replaced with Gln, Arg at position 234 (EU355) is replaced with Gln, and Gln at position 298 (EU419) is replaced with Glu.
- the present invention provides a method for producing an antibody with improved pharmacokinetics.
- the production method of the present invention comprises: (a) an IgG2 constant region having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, from His at position 147 (EU268), Arg at position 234 (EU355), and Gln at position 298 (EU419).
- a DNA encoding an antibody H chain composed of a constant region in which at least one amino acid residue selected from the group is substituted with another amino acid, and (b) a variable region; and a DNA encoding an antibody L chain A step of expressing, and a step of recovering antibody molecules composed of the expressed antibody H chain and antibody L chain.
- the present invention also relates to a method for reducing heterogeneity derived from the hinge portion of IgG2, and a method for improving pharmacokinetics, comprising the steps described below in the IgG2 constant region having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8 And / or a method for reducing heterogeneity derived from the C-terminus.
- buffer for example, phosphate buffer, sodium acetate buffer, a soothing agent, for example, procaine hydrochloride, stabilizer, for example, benzyl alcohol, phenol, antioxidant.
- a soothing agent for example, procaine hydrochloride
- stabilizer for example, benzyl alcohol, phenol, antioxidant.
- TOCILIZUMAB (hereinafter abbreviated as IL6R H0 / L0-IgG1) consisting of H0-IgG1 (amino acid sequence number: 1) as the H chain and L0-k0 (amino acid sequence number: 2) as the L chain.
- IL6R H0 / L0-IgG1 amino acid sequence number: 1
- L0-k0 amino acid sequence number: 2
- a nucleotide sequence encoding the Ly at the 447th EU numbering and / or the Gly at the 446th EU numbering was introduced with a mutation using this as a stop codon.
- IL6R H0-IgG1 / L0-k0 composed of IL6R H0-IgG1 (amino acid SEQ ID NO: 1) as the H chain prepared in Example 1 and IL6R L0-k0 (amino acid SEQ ID NO: 2) as the L chain, and the H chain constant Expression and purification of IL6R H0-IgG2 / L0-k0 from IL6R H0-IgG2 (amino acid SEQ ID NO: 5) as the H chain converted from IgG2 to the normal region and IL6R L0-k0 (amino acid SEQ ID NO: 2) as the L chain
- the method described in Reference Example 1 was performed.
- the combinations of heavy chains and light chains of the above antibodies are summarized below.
- IL6R H0-IgG2 / L0-k0 SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO:
- IL6R H0-IgG2 / L0-k0 having a constant region of natural IgG2 has a plurality of peaks, and has a constant region of natural IgG1 consisting of only a single main peak. It was found that the heterogeneity was significantly higher than that of IL6R6H0-IgG1 / L0-k0.
- IL6R H0-M82 amino acid sequence number: 6
- IL6R H0-M82 amino acid sequence number: 6
- IL6R L0-k0 amino acid sequence number: 2
- expression and purification of IL6R H0-M82 / L0-k0 are described in Reference Example 1. It was carried out by the method described in.
- IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4 isotypes are known as IgG type antibodies.
- the plasma half-life in these humans is about 36 days for IgG1, IgG2, about 29 days for IgG3, and 16 for IgG4.
- IgG1 and IgG2 are considered to have the longest retention in plasma.
- antibody drug isotypes are IgG1, IgG2, and IgG4.
- the binding to the above-mentioned human FcRn is improved by modifying the sequence of the constant region of IgG. (J Biol Chem. 2007 Jan 19; 282 (3): 1709-17, J Immunol. 2006 Jan 1; 176 (1): 346-56).
- IL6R H0-IgG1 / L0-k0 and IL6R H0-M82 / L0-k0 were each administered intravenously at a dose of 1 mg / kg to mice, and blood was collected in a timely manner. The collected blood was immediately centrifuged at 4 ° C. and 15,000 rpm for 15 minutes to obtain plasma. The separated plasma was stored in a freezer set to ⁇ 20 ° C. or lower until measurement was performed. Plasma concentration was measured using ELISA (see Reference Example 3).
- IL6R H0-M82 / L0-k0 not only avoids heterogeneity derived from disulfide bonds of native IgG2 by replacing the cysteines at positions 219 and 220 of the heavy chain EU numbering with serine. Since the pharmacokinetics are improved compared to IgG1, and the heterogeneity derived from the H chain C terminus is also avoided by the modification of ⁇ GK of the H chain C terminus shown in Example 1, the antibody H chain / As the L chain constant region, M82 (SEQ ID NO: 13) / k0 (SEQ ID NO: 14) was considered to be extremely useful.
- IgG antibodies not only have different effector functions such as ADCC activity depending on their isotype (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, or variants thereof), but also have significantly different antigen binding ability and biological activity derived from binding to antigen. It is known (Immunology, 1996, 88, 169-173, Mol Immunol. 1994 Jun; 31 (8): 577-84., Infection and Immunity, Mar 2007, 1424-1435, Nat Biotechnol. 2007 Dec; 25 (12): 1369-72., Nat Biotechnol. 2008 Feb; 26 (2): 209-11.). One reason for this may be that the degree of freedom of the hinge part of IgG differs depending on the isotype (J Immunol.
- the same disulfide bond pattern near the hinge region as the IgG4 isotype is required.
- IgG2 is considered preferable to IgG4 from the viewpoint of binding to Fc ⁇ receptor I and pharmacokinetics of each isotype (Nat Biotechnol. 2007 Dec; 25 (12): 1369-72).
- IgG2 and IgG4 The disulfide bond pattern near the hinge region is different.
- FcRn is a complex of FcRn and ⁇ 2-microglobulin. Oligo DNA primers were prepared based on the published human FcRn gene sequence (J. Exp. Med. 180 (6), 2377-2381 (1994)). A human cDNA (Human Placenta Marathon-Ready cDNA, Clontech) was used as a template, and a DNA fragment encoding the entire gene length was prepared by PCR using the prepared primer.
- Soluble human FcRn was expressed by the following procedure.
- the prepared human FcRn and human ⁇ 2-microglobulin plasmids were introduced into cells of the human fetal kidney cancer cell-derived HEK293H strain (Invitrogen) by the lipofection method using 10% Fetal Bovine Serum (Invitrogen).
- purification was performed using IgG ⁇ Sepharose 6 Fast Flow (Amersham Biosciences) according to the method of (J Immunol. 2002 Nov 1; 169 (9): 5171-80.). Thereafter, purification was performed using HiTrap Q HP (GE Healthcare).
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Abstract
Description
IgG1タイプの抗体は酸性条件下で比較的安定であり、ヒンジ領域のジスルフィド結合に由来するヘテロジェニティーも少ないが、製剤保存中にヒンジ領域のペプチド結合が非酵素的に溶液中で分解が進行し、不純物としてFab断片が生成することが報告されている(非特許文献11)。医薬品として開発するには不純物の生成は解決されることが望ましい。
また、抗体のC末端配列のヘテロジェニティーとして、C末端アミノ酸のリジン残基の欠損、および、C末端の2アミノ酸のグリシン、リジンの欠損によるC末端アミノ基のアミド化が報告されており(非特許文献12)、医薬品として開発する上にはこれらのヘテロジェニティーは存在しないことが望ましい。
このように抗原を中和することが目的の抗体医薬の定常領域は、これらの課題を全て解決した定常領域配列が望ましいが、これらの条件を全て満たす定常領域の報告はこれまでにない。
尚、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。
〔1〕配列番号:8(IgG2定常領域)のアミノ酸配列において、102番目(EUナンバリング219番目)のCysおよび103番目(EUナンバリング220番目)のCysが他のアミノ酸であるアミノ酸配列を有する抗体定常領域。
〔2〕147番目(EUナンバリング268番目)のHis、234番目(EUナンバリング355番目)のArgおよび298番目(EUナンバリング419番目)のGlnがさらに他のアミノ酸である〔1〕に記載の抗体定常領域。
〔3〕102番目のCysおよび103番目のCysがSerであることを特徴とする〔1〕に記載の抗体定常領域。
〔4〕147番目のHisはGlnに、234番目のArgはGlnに、298番目のGlnはGluであることを特徴とする〔2〕に記載の抗体定常領域。
〔5〕325番目(EUナンバリング446番目)のGlyおよび326番目(EUナンバリング447番目)のLysがさらに欠損したアミノ酸配列を有する〔1〕から〔4〕のいずれかに記載の抗体定常領域。
〔6〕以下の(1)~(5)のいずれかに記載の定常領域を有する抗体;
(1)配列番号:8(IgG2定常領域)のアミノ酸配列において、102番目(EUナンバリング219番目)のCysおよび103番目(EUナンバリング220番目)のCysが他のアミノ酸であるアミノ酸配列を有する抗体定常領域;
(2)102番目のCysおよび103番目のCysがSerであること(1)に記載の抗体定常領域;
(3)147番目(EUナンバリング268番目)のHis、234番目(EUナンバリング355番目)のArgおよび298番目(EUナンバリング419番目)のGlnがさらに他のアミノ酸である(1)または(2)に記載の抗体定常領域;
(4)147番目のHisがGln、234番目のArgがGln、そして298番目のGlnがGluである(2)に記載の抗体定常領域;および
(5)325番目(EUナンバリング446番目)のGlyおよび326番目(EUナンバリング447番目)のLysがさらに欠損したアミノ酸配列を有する(1)から(4)のいずれかに記載の抗体定常領域。
〔7〕〔6〕に記載の抗体を含む医薬組成物。
*抗体のヘテロジェニティーの低下:
あるアミノ酸配列をコードするDNAを発現させることによって得られるポリペプチドは、理論上は同じアミノ酸配列からなる均質なポリペプチド分子となるはずである。しかし抗体をコードするDNAを適当な宿主で発現させた場合、実際には、種々の要因によって構造の異なる異質なポリペプチドが生成することがある。抗体の製造においては、多くの異質なポリペプチドからなる抗体集団は、ヘテロジェニティーが高いと言うことができる。本発明の定常領域は、ヘテロジェニティーの原因がアミノ酸配列の改変によって除かれている。したがって、本発明の定常領域で抗体を構成することによって、ヘテロジェニティーの低い抗体を製造することができる。すなわち、抗体の重鎖定常領域に本発明によって提供された改変を導入することによって、抗体の均質性を高く維持することができる。抗体のヘテロジェニティーを低く抑えるとは、ヘテロジェニティーを改善することを意味し、医薬品の品質の維持において重要な課題である。したがって、本発明の定常領域は、抗体を含む医薬品の品質の維持に貢献する。
本発明は、好ましい態様において、抗体の薬物動態の向上に貢献する。具体的には、本発明における抗体の定常領域に、特定のアミノ酸残基の改変を加えたとき、当該定常領域で構成された抗体の血中濃度は、アミノ酸配列を改変していないものと比較して長い時間にわたって維持される。血中濃度をできるだけ長期間維持することは、抗体を医薬品として投与するときに、より少量の抗体で長期にわたって治療効果を維持できることを意味する。あるいは、抗体の投与間隔をより広くして、投与回数を少なくできる。
本発明において抗体の定常領域とはIgG1、IgG2、IgG4タイプの定常領域のことを意味する。抗体定常領域は好ましくはヒト抗体定常領域であり、特にIgG2定常領域が好ましい。以下のように、ヒトIgG1定常領域、ヒトIgG2定常領域およびヒトIgG4定常領域のアミノ酸配列は公知である。
ヒトIgG1定常領域:配列番号:7
ヒトIgG2定常領域:配列番号:8
ヒトIgG4定常領域:配列番号:9
本発明のヒトIgG1, IgG2, IgG4定常領域としては、遺伝子多形による複数のアロタイプ配列がSequences of proteins of immunological interest, NIH Publication No.91-3242に記載されているが、本発明においてはそのいずれであっても良い。
*配列番号:8(ヒトIgG2定常領域)のアミノ酸配列に対して本発明に基づく改変を導入する。
*改変された配列番号:8(ヒトIgG2定常領域)のアミノ酸配列に対して本発明に基づく改変を導入する。
*配列番号:8(ヒトIgG2定常領域)のアミノ酸配列に対して本発明に基づく改変を導入し、更に付加的な改変も導入する。
哺乳動物の抗体産生細胞
抗体をコードするDNAを含む発現ベクターで形質転換された真核細胞
ここに示した真核細胞には、酵母や動物細胞が含まれる。たとえばCHO細胞やHEK293H細胞は、抗体をコードするDNAを含む発現ベクターで形質転換するための代表的な動物細胞である。他方、当該位置に糖鎖修飾が無いものも本発明の定常領域に含まれる。定常領域が糖鎖で修飾されていない抗体は、抗体をコードする遺伝子を大腸菌などの原核細胞で発現させて得ることができる。
本発明は酸性での安定性が改善されたIgG2定常領域を提供する。
より具体的には、配列番号:8に記載のアミノ酸配列を有するIgG2定常領域において、276番目(EUナンバリングの397番目)のMetがMet以外のアミノ酸残基に置換されたIgG2定常領域を提供する。置換後のアミノ酸残基はMet以外の任意のアミノ酸残基とすることができる。本発明において、好ましいアミノ酸残基は、Valである。配列番号:8に記載のアミノ酸配列において276番目(EUナンバリングの397番目)のMetが他のアミノ酸であることにより、抗体の酸性条件下での安定性を向上させることが可能である。
本発明により提供される酸性での安定性が改善された定常領域は少なくとも上述のアミノ酸置換が行われていればよく、同時に他のアミノ酸の置換、欠失、付加および/または挿入などがおこなわれていてもよい。
より具体的には配列番号:8に記載のアミノ酸配列を有するIgG2定常領域において、102番目(EUナンバリング219番目)のCysおよび103番目(EUナンバリングの220番目)のCysが他のアミノ酸であるIgG2定常領域を提供する。他のアミノ酸は特に限定されないが、102番目(EUナンバリング219番目)のCysおよび103番目(EUナンバリングの220番目)のCysともにSerであることが好ましい。
これらの置換を行うことにより、IgG2のヒンジ領域に由来するヘテロジェニティーを低減することが可能である。
本発明により提供されるヘテロジェニティーが改善された定常領域は少なくとも上述のアミノ酸置換が行われていればよく、同時に他のアミノ酸の置換、欠失、付加および/または挿入などがおこなわれていてもよい。
より具体的には、配列番号:8に記載のアミノ酸配列を有するIgG2定常領域において、209番目(EU330)のAlaがSer、210番目(EU331)のProがSer、および/または218番目(EU339)のThrがAlaである定常領域を提供する。209番目(EU330)のAla、210番目(EU331)のProの置換によりFcγレセプターへの結合を低下させることが可能であることはすでに報告されているが(Eur J Immunol. 1999 Aug;29(8):2613-24.)、この改変ではT-cellエピトープになりうる非ヒト由来のペプチドが出現するため、免疫原性リスクの点からは好ましくない。そこで、218番目(EU339)のThrのAlaへの置換を同時に行うことにより、T-cellエピトープになりうる9~12アミノ酸としてはヒト由来のペプチドのみを用いたままIgG2のFcγレセプターへの結合を低下させることが可能である。
本発明により提供されるFcγレセプターへの結合活性が低減した定常領域は少なくとも上述のアミノ酸置換が行われていればよく、同時に他のアミノ酸の置換、欠失、付加および/または挿入などがおこなわれていてもよい。
より具体的には、配列番号:8に記載のアミノ酸配列を有するIgG2定常領域において、325番目(EUナンバリングの446番目)のGlyおよび326番目(EUナンバリングの447番目)のLysが欠損した定常領域を提供する。これらのアミノ酸を両方欠損させることにより、初めて抗体のH鎖C末端に由来するヘテロジェニティーを低減することが可能である。
本発明により提供されるC末端のヘテロジェニティーが改善された定常領域は少なくとも上述のアミノ酸の欠失が行われていればよく、同時に他のアミノ酸の置換、欠失、付加および/または挿入などがおこなわれていてもよい。
より具体的には、配列番号:8に記載のアミノ酸配列を有するIgG2定常領域において、147番目(EUナンバリングの268番目)のHis、234番目(EUナンバリングの355番目)のArg、298番目(EUナンバリングの419番目)のGlnが他のアミノ酸である定常領域を提供する。これらのアミノ酸に置換することにより抗体の薬物動態を向上させることが可能である。他のアミノ酸は特に限定されないが、147番目(EUナンバリング268番目)のHisはGlnであることが好ましく、234番目(EUナンバリングの355番目)のArgはGlnであることが好ましく、298番目(EUナンバリングの419番目)のGlnはGluであることが好ましい。本発明の定常領域には、上記3種類のアミノ酸置換のうち少なくとも1種類のアミノ酸が置換された定常領域が含まれるが、上記3種類全てのアミノ酸が置換されていることが好ましい。
配列番号:8に記載のアミノ酸配列からなるIgG2定常領域を有する抗体において、102番目のCys、103番目のCys、147番目のHis、234番目のArg、298番目のGlnが他のアミノ酸である抗体。
他のアミノ酸は特に限定されないが、102番目(EUナンバリング219)のCysがSer、103番目(EUナンバリング220)のCysがSer、147番目(EUナンバリング268)のHisがGln、234番目(EUナンバリング355)のArgがGln、298番目(EUナンバリング419)のGlnがGluであることが好ましい。
これらの抗体定常領域は、Fcγレセプターへの結合活性の低下、免疫原性リスクの低減、酸性条件下での安定性の向上、ヘテロジェニティーの低減、薬物動態の向上および/または、IgG1定常領域と比較した製剤中での高い安定性という性質を有する、最適化された抗体定常領域である。
又、本発明は上述のいずれかに記載の抗体定常領域を含む抗体を提供する。すなわち本発明は以下の(1)~(5)のいずれかに記載の定常領域を有する抗体に関する。
(1)配列番号:8(IgG2定常領域)のアミノ酸配列において、102番目(EUナンバリング219番目)のCysおよび103番目(EUナンバリング220番目)のCysが他のアミノ酸であるアミノ酸配列を有する抗体定常領域;
(2)102番目のCysおよび103番目のCysがSerであること(1)に記載の抗体定常領域;
(3)147番目(EUナンバリング268番目)のHis、234番目(EUナンバリング355番目)のArgおよび298番目(EUナンバリング419番目)のGlnがさらに他のアミノ酸である(1)または(2)に記載の抗体定常領域;
(4)147番目のHisがGln、234番目のArgがGln、そして298番目のGlnがGluである(2)に記載の抗体定常領域;および
(5)325番目(EUナンバリング446番目)のGlyおよび326番目(EUナンバリング447番目)のLysがさらに欠損したアミノ酸配列を有する(1)から(4)のいずれかに記載の抗体定常領域。
本発明の抗体は上述の抗体定常領域を有する限り、抗原の種類、抗体の由来などは限定されず、いかなる抗体でもよい。
また本発明の抗体には、上述のいずれかに記載の定常領域を含む抗体であればその修飾物も含まれる。
抗体の修飾物の例としては、例えば、ポリエチレングリコール(PEG)や細胞障害性物質等の各種分子と結合させた抗体を挙げることができる。このような抗体修飾物は、本発明の抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。
上述の抗体定常領域は任意の抗原に対する抗体の定常領域として使用することが可能であり、抗原は特に限定されない。
(a)定常領域中の1又は複数のアミノ酸残基が目的の他のアミノ酸に置換または欠損されたH鎖をコードするDNA、及びL鎖をコードするDNAを発現させる工程
(b)工程(a)の発現産物を回収する工程
本発明の製造方法においては、まず、抗体のH鎖をコードするDNAであって、定常領域中の1又は複数のアミノ酸残基が目的の他のアミノ酸に置換または欠損されたH鎖をコードするDNA、および抗体のL鎖をコードするDNAを発現させる。定常領域中の1又は複数のアミノ酸残基が目的の他のアミノ酸に置換または欠損されたH鎖をコードするDNAは、例えば、野生型のH鎖をコードするDNAの定常領域部分を取得し、該定常領域中の特定のアミノ酸をコードするコドンが目的の他のアミノ酸をコードするよう、適宜置換を導入することによって得ることが出来る。
アミノ酸置換の種類としては、これに限定されるものではないが、本明細書に記載の置換が挙げられる。
(a)可変領域と定常領域を含む抗体の重鎖と、軽鎖をコードするDNAを宿主細胞で発現させる工程;、および
(b)(a)において発現された抗体を回収する工程;
改変するアミノ酸残基:102番目(EUナンバリング219番目)のCys、および
103番目(EUナンバリング220番目)のCys
改変するアミノ酸残基:147番目(EUナンバリング268番目)のHis、
234番目(EUナンバリング355番目)のArg、および
298番目(EUナンバリング419番目)のGln
147番目のHis=>Gln
234番目のArg=>Gln
298番目のGln=>Glu
あるいは本発明の抗体を構成する定常領域には、上記の改変に加え、更に付加的な改変を含むことができる。すなわち本発明は、上記の改変の少なくとも1つを導入された定常領域であって、更に付加的に次のアミノ酸残基が欠失した定常領域を含む抗体に関する。
欠失させるアミノ酸残基:325番目(EUナンバリング446番目)のGly、および
326番目(EUナンバリング447番目)のLys
また、たとえば、ヒンジ領域近傍のジスルフィド結合パターンの影響でIgG4アイソタイプのみでしか高い生物活性が得られない抗体の可変領域を示すことができる。本発明の抗体定常領域を用いれば、高い生物活性を維持しつつ、Fcγレセプターヘの結合を低下させ、さらに薬物動態をIgG1アイソタイプよりも向上させることが可能である。
重鎖の可変領域によって決定された抗原結合特性に有意な変化をもたらさない限り、本発明の抗体を構成する軽鎖は任意の可変領域を含むことができる。抗体の抗原結合活性は主に重鎖の可変領域によって決定されているためである。あるいは、抗体の特性をより望ましい状態に向上させることを目的として軽鎖の可変部を改変することは許容される。好ましい軽鎖の可変領域は、重鎖の可変領域が由来する抗体の軽鎖可変領域である。したがって、重鎖可変領域に配列番号:6のアミノ酸配列に含まれる可変領域を用いる場合には、たとえばL0-k0(配列番号:2)のアミノ酸配列からなる軽鎖を組み合わせることができる。L0-k0のアミノ酸配列(配列番号:2)中、可変領域は1-107、定常領域は108-214(配列番号:14)である。
また本発明は、配列番号:8に記載のアミノ酸配列(IgG2)において、102番目(EUナンバリング219番目)のCysを他のアミノ酸に置換する工程および103番目(EUナンバリングの220番目)のCysを他のアミノ酸に置換する工程を含む、抗体のヘテロジェニティーを改善する方法に関する。置換後のアミノ酸は特に限定されないが、102番目のCysおよび103番目のCysともにSerに置換されることが好ましい。本発明の抗体のヘテロジェニティーを改善する方法は、配列番号:8に記載のアミノ酸配列(IgG2)において、102番目(EUナンバリング219番目)のCysを他のアミノ酸に置換する工程および103番目(EUナンバリングの220番目)のCysを他のアミノ酸に置換する工程を含む限り、他のアミノ酸置換を含むものであってもよい。アミノ酸置換の方法は特に限定されるものではないが、例えば上述の部位特異的変異誘発法や実施例の記載の方法によって行うことが出来る。
あるいは本発明は、IgG2定常領域のヒンジ部分に由来するヘテロジェニティーが低減された抗体の製造方法を提供する。本発明の製造方法は、(a) 配列番号:8に記載のアミノ酸配列(IgG2)において、102番目(EUナンバリング219番目)のCysおよび103番目(EUナンバリングの220番目)のCysのいずれか、または両方を他のアミノ酸に置換した定常領域、および(b)可変領域とで構成される抗体H鎖をコードするDNAと、抗体L鎖をコードするDNAを発現させる工程と、発現された抗体H鎖と抗体L鎖からなる抗体分子を回収する工程を含む。
また本発明は、配列番号:8に記載のアミノ酸配列を有するIgG2定常領域において、325番目(EUナンバリングの446番目)のGlyおよび326番目(EUナンバリングの447番目)のLysを欠損させる工程を含む、抗体のヘテロジェニティーを改善する方法に関する。本発明の抗体のヘテロジェニティーを改善する方法は、配列番号:8に記載のアミノ酸配列を有するIgG2定常領域において、325番目(EUナンバリングの446番目)のGlyおよび326番目(EUナンバリングの447番目)のLysを欠損させる工程を含む限り、他のアミノ酸置換を含んでもよい。アミノ酸置換の方法は特に限定されるものではないが、例えば上述の部位特異的変異誘発法や実施例の記載の方法によって行うことが出来る。
あるいは本発明は、C末端アミノ酸欠損に由来するヘテロジェニティーが低減された抗体の製造方法を提供する。本発明の製造方法は、(a) 配列番号:8に記載のアミノ酸配列を有するIgG2定常領域において、325番目(EUナンバリングの446番目)のGlyおよび326番目(EUナンバリングの447番目)のLysを欠損させた定常領域、および(b)可変領域とで構成される抗体H鎖をコードするDNAと、抗体L鎖をコードするDNAを発現させる工程と、発現された抗体H鎖と抗体L鎖からなる抗体分子を回収する工程を含む。
また本発明は、配列番号:8に記載のアミノ酸配列を有するIgG2定常領域において、147番目(EU268)のHis、234番目(EU355)のArg及び/又は298番目(EU419)のGlnを他のアミノ酸に置換する工程を含む、抗体の薬物動態を向上する方法に関する。本発明の薬物動態を向上する方法は、上述の工程を含む限り、他のアミノ酸置換を含むものであってもよい。置換後のアミノ酸は特に限定されないが、147番目(EU268)のHisはGlnに、234番目(EU355)のArgはGlnに、298番目(EU419)のGlnはGluに置換されることが好ましい。
あるいは本発明は、薬物動態が向上した抗体の製造方法を提供する。本発明の製造方法は、(a) 配列番号:8に記載のアミノ酸配列を有するIgG2定常領域において、147番目(EU268)のHis、234番目(EU355)のArg及び298番目(EU419)のGlnからなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基を他のアミノ酸に置換した定常領域、および(b)可変領域とで構成される抗体H鎖をコードするDNAと、抗体L鎖をコードするDNAを発現させる工程と、発現された抗体H鎖と抗体L鎖からなる抗体分子を回収する工程を含む。
(a) 配列番号:8の102番目(EUナンバリング219)のCysを他のアミノ酸に置換する工程、
(b) 配列番号:8の103番目(EUナンバリング220)のCysを他のアミノ酸に置換する工程、
(c) 配列番号:8の147番目(EUナンバリング268)のHisを他のアミノ酸に置換する工程、
(d) 配列番号:8の234番目(EUナンバリング355)のArgを他のアミノ酸に置換する工程、
(e) 配列番号:8の298番目(EUナンバリング419)のGlnを他のアミノ酸に置換する工程、及び
(f) 配列番号:8の325番目のGly及び326番目のLys(EUナンバリング446および447)を欠損させる工程。
置換後のアミノ酸は特に限定されないが、102番目(EUナンバリング219)のCysをSer、103番目(EUナンバリング220)のCysをSer、147番目(EUナンバリング268)のHisをGln、234番目(EUナンバリング355)のArgをGln、298番目(EUナンバリング419)のGlnをGluに置換することが好ましい。
あるいは本発明は、前記(a)-(f)からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基の改変を有する抗体H鎖をコードするDNAと、抗体L鎖をコードするDNAを発現させる工程と、発現された抗体H鎖と抗体L鎖からなる抗体分子を回収する工程を含む、ヘテロジェニティーおよび薬物動態のいずれか、または両方が改善された抗体の製造方法に関する。
本発明は、本発明の抗体を含む、医薬組成物を提供する。
本発明の医薬組成物は、抗体に加えて医薬的に許容し得る担体を導入し、公知の方法で製剤化することが可能である。例えば、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。
また、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。抗体または抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する医薬組成物の投与量としては、例えば、一回につき体重1kgあたり0.0001mgから1000mgの範囲で選ぶことが可能である。あるいは、例えば、患者あたり0.001から100000mg/bodyの範囲で投与量を選ぶことができるが、これらの数値に必ずしも制限されるものではない。投与量、投与方法は、患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。
アラニン:Ala:A
アルギニン:Arg:R
アスパラギン:Asn:N
アスパラギン酸:Asp:D
システイン:Cys:C
グルタミン:Gln:Q
グルタミン酸:Glu:E
グリシン:Gly:G
ヒスチジン:His:H
イソロイシン:Ile:I
ロイシン:Leu:L
リジン:Lys:K
メチオニン:Met:M
フェニルアラニン:Phe:F
プロリン:Pro:P
セリン:Ser:S
スレオニン:Thr:T
トリプトファン:Trp:W
チロシン:Tyr:Y
バリン:Val:V
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
H鎖C末端ΔGK抗体の発現ベクター構築
IgG抗体のH鎖C末端配列のヘテロジェニティーとして、C末端アミノ酸のリジン残基の欠損、および、C末端の2アミノ酸のグリシン、リジン両方の欠損によるC末端カルボキシル基のアミド化が報告されている(Anal Biochem. 2007 Jan 1;360(1):75-83.)。抗IL-6レセプター抗体であるTOCILIZUMABにおいても、その主成分は塩基配列上存在するC末端アミノ酸のリジンが翻訳後修飾により欠損した配列であるが、リジンが残存している副成分およびグリシン、リジン両方の欠損によるC末端カルボキシル基のアミド化された副成分もヘテロジェニティーとして存在する。目的物質/関連物質のヘテロジェニティーの製造間差を維持しつつ医薬品として大量に製造することは容易ではなくコスト増につながり、可能な限り単一物質であることが望まれ、抗体を医薬品として開発する上にはこれらのヘテロジェニティーが低減されていることが望ましい。よって医薬品として開発する上ではH鎖C末端のヘテロジェニティーは存在しないことが望ましい。
そこで、C末端アミノ酸のヘテロジェニティーを低減させることを目的にC末端アミノ酸の改変を行った。具体的には、天然型IgG1のH鎖定常領域のC末端のリジンおよびグリシンを塩基配列上あらかじめ欠損させることで、C末端の2アミノ酸のグリシン、リジンの欠損によるC末端アミノ基のアミド化を抑制することが可能かどうかを検討した。
H鎖としてH0-IgG1(アミノ酸配列番号:1)、L鎖としてL0-k0 (アミノ酸配列番号:2)からなるIL6R H0-IgG1/L0-k0、H鎖としてH0-IgG1ΔK(アミノ酸配列番号:3)、L鎖としてL0-k0 (アミノ酸配列番号:2)からなるIL6R H0-IgG1ΔK /L0-k0、および、H鎖としてH0-IgG1ΔGK-k0(アミノ酸配列番号:4)、L鎖としてL0-k0 (アミノ酸配列番号:2)からなるIL6R H0-IgG1ΔGK /L0-k0の発現と精製は参考例1で記した方法で実施した。以上の抗体の重鎖と軽鎖の組み合わせを以下にまとめた。
抗体 重鎖 軽鎖
IL6R H0-IgG1 /L0-k0 配列番号:1 配列番号:2
IL6R H0-IgG1ΔK /L0-k0 配列番号:3 配列番号:2
IL6R H0-IgG1ΔGK /L0-k0 配列番号:4 配列番号:2
精製した抗体のヘテロジェニティーの評価を陽イオン交換クロマトグラフィーにより実施した。カラムとしてはProPac WCX-10, 4×250 mm (Dionex) を使用し、移動相Aは25 mmol/L MES/NaOH, pH 6.1、移動相Bは25 mmol/L MES/NaOH, 250 mmol/L NaCl, pH 6.1を使用し、適切な流量およびグラジエントを用いて実施した。精製したIL6R H0-IgG1/L0-k0、IL6R H0-IgG1ΔK /L0-k0およびIL6R H0-IgG1ΔGK /L0-k0陽イオン交換クロマトグラフィーによる評価を行った結果を図1に示した。
その結果、H鎖定常領域のC末端のリジンだけでなく、H鎖定常領域のC末端のリジンおよびグリシンを両方を塩基配列上あらかじめ欠損させることで初めてC末アミノ酸のヘテロジェニティーを低減可能であることが見出された。ヒト抗体定常領域IgG1、IgG2、IgG4において、C末端配列はいずれもEUナンバリング(Sequences of proteins of immunological interest, NIH Publication No.91-3242 を参照)447番目がリジン、446番目がグリシンになっていることから、本検討で見出されたC末アミノ酸のヘテロジェニティーを低減させる方法はIgG2定常領域とIgG4定常領域、あるいはそれらの改変体にも適用可能であると考えられた。
天然型IgG1と天然型IgG2のヘテロジェニティー
標的細胞をエフェクター機能等で殺傷するような癌に対する抗体医薬の場合は、エフェクター機能を有するIgG1の定常領域(アイソタイプ)が好ましいが、標的抗原の機能を中和するような抗体医薬、あるいは、標的細胞に対して結合はするが殺傷することは避ける必要がある抗体医薬の場合は、Fcγレセプターへの結合は好ましくない。
Fcγレセプターへの結合を低下させる方法としては、IgG抗体のアイソタイプをIgG1からIgG2あるいはIgG4に変える方法が考えられ(Ann Hematol. 1998 Jun;76(6):231-48.)、FcγレセプターIへの結合および各アイソタイプの薬物動態の観点からはIgG4よりはIgG2が望ましいと考えられた(Nat Biotechnol. 2007 Dec;25(12):1369-72)。一方、抗体を医薬品として開発するにあたり、そのタンパク質の物性、中でも均一性と安定性は極めて重要であり、IgG2アイソタイプは、ヒンジ領域のジスルフィド結合の掛け違いに由来するヘテロジェニティーが極めて多いことが報告されている(J Biol Chem. 2008 Jun 6;283(23):16194-205. 、J Biol Chem. 2008 Jun 6;283(23):16206-15. 、Biochemistry. 2008 Jul 15;47(28):7496-508.)。
抗体 重鎖 軽鎖
IL6R H0-IgG1 /L0-k0 配列番号:1 配列番号:2
IL6R H0-IgG2 /L0-k0 配列番号:5 配列番号:2
このヘテロピークを単一化する方法として、US20060194280(A1)においては精製工程におけるリフォールディングが報告されているが、製造においてこれらの工程を用いることはコストがかかり煩雑であるため、好ましくはアミノ酸置換によりジスルフィド結合が単一なパターンで形成されるIgG2変異体を作製することでヘテロピークが単一化することが望ましいと考えられた。しかしながら、これまでにジスルフィド結合が単一なパターンで形成されるようなIgG2変異体に関する報告はない。
天然型IgG2のジスルフィド結合の掛け違いによるヘテロジェニティーを低減する方法として、H鎖のヒンジ領域に存在するEUナンバリング219番目のシステインのみをセリンに改変する方法、および、220番目のシステインのみをセリンに改変する方法が考えられる(Biochemistry. 2008 Jul 15;47(28):7496-508.)。この戦略を天然型IgG2のH鎖定常領域のアミノ酸配列(アミノ酸番号:8)に適用すると、次のような改変体が考えられる。
*SC:EUナンバリング219番目のシステインをセリンに改変したH鎖定常領域(配列番号:10)
*CS:EUナンバリング220番目のシステインをセリンに改変したH鎖定常領域(配列番号:11)
しかしながら、これらH鎖定常領域であるSCおよびCSについては、図5に示すとおり、天然型IgG2と同様、ジスルフィド結合のパターンが単一ではなく、複数のパターンが考えられるため依然として多数のヘテロジェニティーが存在すると考えられる。
そこで、IL6R H0-M82(アミノ酸配列番号:6)の発現ベクターの構築を参考例1に記した方法で実施した。H鎖としてIL6R H0-M82(アミノ酸配列番号:6)を用い、L鎖としてIL6R L0-k0 (アミノ酸配列番号:2)を用い、IL6R H0-M82/L0-k0の発現および精製を参考例1で記した方法で実施した。
H0-M82/L0-k0のヘテロジェニティーの評価方法として、上述に記載した陽イオン交換クロマトグラフィーによる方法を用いて実施した。IL6R H0-IgG1/L0-k0、IL6R H0-IgG2/L0-k0およびIL6R H0-M82/L0-k0の陽イオン交換クロマトグラフィーによる評価を行った結果を図7に示した。
その結果、図7に示すとおり、H鎖定常領域をIgG1からIgG2に変換することでヘテロジェニティーが増大したが、H鎖定常領域をM82に変換することでヘテロジェニティーが大幅に低減された。
IgG分子の血漿中滞留性が長い(消失が遅い)のは、IgG分子のサルベージレセプターとして知られているFcRnが機能しているためである(Nat Rev Immunol. 2007 Sep;7(9):715-25)。ピノサイトーシスによってエンドソームに取り込まれたIgG分子は、エンドソーム内の酸性条件下(pH6.0付近)においてエンドソーム内に発現しているFcRnに結合する。FcRnに結合できなかったIgG分子はライソソームへ進みライソソームで分解されるが、FcRnへ結合したIgG分子は細胞表面へ移行し血漿中の中性条件下(pH7.4付近)においてFcRnから解離することで再び血漿中に戻る。
IgGタイプの抗体として、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4のアイソタイプが知られているが、これらのヒトでの血漿中半減期は、IgG1、IgG2が約36日、IgG3が約29日、IgG4が16日であることが報告されており(Nat Biotechnol. 2007 Dec;25(12):1369-72.)、IgG1およびIgG2の血漿中滞留性が最も長いと考えられている。一般に抗体医薬のアイソタイプはIgG1、IgG2、IgG4であるが、これらのIgG抗体の薬物動態をさらに向上する方法として、IgGの定常領域の配列を改変することで上述のヒトFcRnへの結合性を向上させる方法が報告されている(J Biol Chem. 2007 Jan 19;282(3):1709-17、J Immunol. 2006 Jan 1;176(1):346-56)。
ヒトFcRnの調製は参考例2に記された方法で実施した。ヒトFcRnへの結合評価にはBiacore 3000 を用い、センサーチップに固定化したProtein Lあるいはウサギ抗ヒトIgG Kappa chain抗体へ結合させた抗体に、アナライトとしてヒトFcRnを相互作用させた際のヒトFcRnの結合量よりaffinity(KD)を算出した。具体的には、ランニングバッファーとして150mM NaClを含む50mM Na-phosphate buffer、pH6.0を用い、アミンカップリング法によりセンサーチップ CM5 (BIACORE) にProtein Lあるいはウサギ抗ヒトIgG Kappa chain抗体を固定化した。その後、IL6R H0-IgG1/L0-k0およびIL6R H0-M82/L0-k0をそれぞれ0.02% Tween20を含むランニングバッファーで希釈してインジェクトしチップに抗体を結合させた後、ヒトFcRnをインジェクトし、ヒトFcRnの抗体への結合性を評価した。
Affinityの算出にはソフトウエア、BIAevaluationを用いた。得られたセンサーグラムより、ヒトFcRnインジェクト終了直前の抗体へのhFcRn結合量を求め、これをsteady state affinity法でフィッティングしてヒトFcRnに対する抗体のaffinityを算出した。
IL6R H0-IgG1/L0-k0とIL6R H0-M82/L0-k0のヒトFcRnへの結合性の評価をBIAcoreにより行った結果、表1に示すとおり、IL6R H0-M82/L0-k0の結合性はIL6R H0-IgG1/L0-k0よりも約1.34倍向上していることが見出された。
ヒト FcRnトランスジェニックマウス(B6.mFcRn-/-.hFcRn Tg line 276 +/+ マウス、Jackson Laboratories)における体内動態の評価は以下の通り行った。IL6R H0-IgG1/L0-k0およびIL6R H0-M82/L0-k0をそれぞれマウスに1 mg/kgの投与量で静脈内に単回投与し適時採血を行った。採取した血液は直ちに4℃、15,000 rpmで15分間遠心分離し、血漿を得た。分離した血漿は、測定を実施するまで-20℃以下に設定された冷凍庫に保存した。血漿中濃度はELISA法を用いて測定した(参考例3参照)。
IL6R H0-IgG1/L0-k0およびIL6R H0-M82/L0-k0のヒトFcRnトランスジェニックマウスにおける血漿中滞留性の評価を行った結果、図8に示すとおり、IL6R H0-M82/L0 -k0はIL6R H0-IgG1/L0-k0と比較して薬物動態の向上が確認された。これは上記に示したとおり、IL6R H0-M82/L0 -k0のヒトFcRnへの結合性がIL6R H0-IgG1/L0-k0と比較して向上しているからであると考えられた。
IL6R H0-M82/L0-k0は、H鎖EUナンバリング219番目と220番目のシステインをセリンに置換することで、天然型IgG2のジスルフィド結合に由来するヘテロジェニティーを回避するだけでなく、天然型IgG1と比較して薬物動態が向上し、さらに実施例1で示したH鎖C末端のΔGKの改変によりH鎖C末端に由来するヘテロジェニティーも回避されていることから、抗体のH鎖/L鎖定常領域として、M82(配列番号:13)/k0(配列番号:14)は極めて有用であると考えられた。
図9に示すとおり、本検討で見出された新規定常領域M82のヒンジ領域近傍のジスルフィド結合パターンはIgG4と同一であることから、IgG4アイソタイプと同様のヒンジ部分の自由度を有すると考えられる。そのため新規定常領域M82は、IgG4アイソタイプでのみ高い生物活性が得られる抗体に対して、IgG4アイソタイプの高い生物活性を維持しつつ、Fcγレセプターへの結合を低下させ、さらに薬物動態をIgG1よりも向上させることが可能であると考えられることから、極めて有用であると考えられた。
目的の抗体のH鎖およびL鎖の塩基配列をコードする遺伝子は、PCR等を用いて当業者公知の方法で行った。アミノ酸置換の導入はQuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)あるいはPCR等を用いて当業者公知の方法で行った。得られたプラスミド断片を動物細胞発現ベクターに挿入し、目的のH鎖発現ベクターおよびL鎖発現ベクターを作製した。得られた発現ベクターの塩基配列は当業者公知の方法で決定した。
FcRnはFcRnとβ2-microglobulinの複合体である。公開されているヒトFcRn遺伝子配列(J. Exp. Med. 180 (6), 2377-2381 (1994))を元に、オリゴDNAプライマーを作製した。ヒトcDNA(Human Placenta Marathon-Ready cDNA, Clontech)を鋳型とし、作製したプライマーを用いPCR法により遺伝子全長をコードするDNA断片を調整した。得られたDNA断片を鋳型に、PCR法によりシグナル領域を含む細胞外領域(Met1-Leu290)をコードするDNA断片を増幅し、動物細胞発現ベクターへ挿入した(ヒトFcRnアミノ酸配列番号:15)。同様に、公開されているヒトβ2-microglobulin遺伝子配列(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (26), 16899-16903 (2002))を元に、オリゴDNAプライマーを作製した。ヒトcDNA(Hu-Placenta Marathon-Ready cDNA, CLONTECH)を鋳型とし、作製したプライマーを用いPCR法により遺伝子全長をコードするDNA断片を調製した。得られたDNA断片を鋳型に、PCR法によりシグナル領域を含むβ2-microglobulin全長(Met1-Met119)をコードするDNA断片を増幅し、動物細胞発現ベクターへ挿入した(ヒトβ2-microglobulinアミノ酸配列 配列番号:16)。
マウス血漿中抗体濃度測定は、抗ヒトIgG抗体を用いたELISA法にて、それぞれの抗体をスタンダードとして使用して、当業者公知の方法で測定した。
また本発明は、定常領域のアミノ酸配列を改変することによって、薬物動態が改善された抗体を提供した。本発明によって薬物動態が改善された抗体は、生体中において、より長い時間にわたって活性を維持する。したがって、たとえばIL6レセプターに対する抗体であるTOCILIZUMAB(一般名)の定常領域を、本発明によって提供される定常領域と置換することによって、その薬物動態を改善し、生体内における作用濃度をより長期にわたって維持しうる抗体とすることができる。さらに本発明は、IgG4アイソタイプと同様のジスルフィド結合パターンを有することから、IgG4アイソタイプでのみ高い生物活性が得られる抗体の定常領域としても有用である。
Claims (7)
- 配列番号:8(IgG2定常領域)のアミノ酸配列において、102番目(EUナンバリング219番目)のCysおよび103番目(EUナンバリング220番目)のCysが他のアミノ酸であるアミノ酸配列を有する抗体定常領域。
- 147番目(EUナンバリング268番目)のHis、234番目(EUナンバリング355番目)のArgおよび298番目(EUナンバリング419番目)のGlnがさらに他のアミノ酸である請求項1に記載の抗体定常領域。
- 102番目のCysおよび103番目のCysがSerであることを特徴とする請求項1に記載の抗体定常領域。
- 147番目のHisはGlnに、234番目のArgはGlnに、298番目のGlnはGluであることを特徴とする請求項2に記載の抗体定常領域。
- 325番目(EUナンバリング446番目)のGlyおよび326番目(EUナンバリング447番目)のLysがさらに欠損したアミノ酸配列を有する請求項1から請求項4のいずれかに記載の抗体定常領域。
- 以下の(1)~(5)のいずれかに記載の定常領域を有する抗体;
(1)配列番号:8(IgG2定常領域)のアミノ酸配列において、102番目(EUナンバリング219番目)のCysおよび103番目(EUナンバリング220番目)のCysが他のアミノ酸であるアミノ酸配列を有する抗体定常領域;
(2)102番目のCysおよび103番目のCysがSerであること(1)に記載の抗体定常領域;
(3)147番目(EUナンバリング268番目)のHis、234番目(EUナンバリング355番目)のArgおよび298番目(EUナンバリング419番目)のGlnがさらに他のアミノ酸である(1)または(2)に記載の抗体定常領域;
(4)147番目のHisがGln、234番目のArgがGln、そして298番目のGlnがGluである(2)に記載の抗体定常領域;および
(5)325番目(EUナンバリング446番目)のGlyおよび326番目(EUナンバリング447番目)のLysがさらに欠損したアミノ酸配列を有する(1)から(4)のいずれかに記載の抗体定常領域。 - 請求項6に記載の抗体を含む医薬組成物。
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