KR101557603B1

KR101557603B1 - 염증성 질환의 예방 또는 치료제

Info

Publication number: KR101557603B1
Application number: KR1020147017820A
Authority: KR
Inventors: 마사카즈 하세가와; 히데토모 기타무라; 히데키 아다치; 게이코 가스타니
Original assignee: 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤
Priority date: 2006-06-08
Filing date: 2007-06-08
Publication date: 2015-10-06
Also published as: UA100116C2; CA2654623C; CL2007001665A1; ES2544888T3; TW200810778A; US9028821B2; SI2047863T1; US20150315280A1; RU2008152827A; JP5043008B2; NO20090093L; AR061317A1; BRPI0712426A2; KR20140097495A; EP2371393A1; KR20150091545A; CN103272232A; US9745378B2; AU2007255753B2; PE20080333A1

Abstract

본 발명자들은, 인간 항체 파지 라이브러리로부터, IL-31 의존성 Ba/F3 세포증식 어세이계에서 강한 증식억제활성을 나타내는 클론 BM095를 얻었다. 이 항 마우스 NR10 중화항체를 사용하여 NC/Nga 마우스를 사용한 아토피성 피부염 모델 마우스, 염화피크릴의 반복 도포에 의한 만성 피부염 모델 마우스, 류머티즘성 관절염 모델 마우스, 변형성 관절증 모델 마우스에 투여한 바, 현저한 증상의 억제효과가 나타나, 실제로, 항 NR10 중화항체가 염증성 질환 치료제로서 유용한 것이 명확해졌다. 또한, 본 발명자들은, 항 인간 NR10 중화항체의 취득에도 성공하여, 실제로 임상 응용 가능한 극히 유용한 치료제를 제공하였다.

Description

염증성 질환의 예방 또는 치료제{Preventive or remedy for inflammatory disease}

본 발명은, NR10 안타고니스트를 유효성분으로 함유하는 신규한 염증성 질환의 예방 또는 치료제에 관한 것이다. 본 발명은 또한, NR10 안타고니스트를 사용한 염증성 질환을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.

각종 세포의 증식분화, 또는 분화 성숙한 세포 기능의 부활화(賦活化)에 관여하는 액성 인자로서, 많은 수의 사이토카인의 존재가 알려져 있다. 생체에서는, 사이토카인 자극을 받은 세포가 다른 사이토카인을 생산하여, 복수의 사이토카인에 의한 네트워크가 형성되어 있다. 생체의 항상성은, 이 네트워크가 서로 조절해 나가는 것에 의해 미묘한 밸런스 위에서 유지되고 있다. 많은 면역 염증성 질환은, 이들 사이토카인·네트워크의 파탄에 의해 발생하는 것으로 생각되어, 단일클론항체에 의한 항사이토카인 요법이 주목되고 있다. 예를 들어, 항 TNF 항체나 항 IL-6 수용체 항체는 임상에서 높은 효과를 나타내고 있다. 그러나 한편으로, 실제의 병태에서는 대상 경로(compensatory pathway)가 작용하여, IL-4 등 하나의 사이토카인을 차단한 것만으로는 치료 효과를 얻지 못하여, 실패한 예도 많다.

본 발명자들은, IL-6의 시그널 전달 수용체 gp130에 상동성이 높은 신규 사이토카인 수용체 NR10의 단리(isolating)에 성공하였다(특허문헌 1). NR10은, 온코스타틴M 수용체(OSMR)와 헤테로다이머를 형성하여 IL-31의 수용체로서 기능한다(비특허문헌 1). Zymogenetics사는, IL-31을 과잉발현시킨 트렌스제닉·마우스가 소양성 피부염(pruritic dermatitis)을 자연발증하는 것을 보고하였다(특허문헌 2).

그러나, 마우스에서의 사이토카인의 강제 발현이나, 병태 마우스에서의 혈중 사이토카인 농도의 높이가, 실제로 질환의 원인이 되고 있다고 단언할 수는 없다. 항체에 의해 시그널을 차단했을 때, 치료 효과를 얻을 수 있을지 여부는 전혀 명확하지 않다. 예를 들어, IL-18을 케라티노사이트로 과잉발현시킨 트랜스제닉·마우스는, 소양성 피부염을 발증한다. 또한, 아토피성 피부염 자연발증 모델 NC/Nga 마우스에서는, 혈중 IL-18 농도가 병태의 진행과 함께 상승한다. 이들로부터, IL-18의 과잉발현이 질환의 원인으로 추찰되었다. 그러나 실제로는, 중화항체 투여에 의한 치료 효과는 인정되지 않았다(비특허문헌 2).

이와 같이, 사이토카인의 발현이 상승하고 있는 질환에서, 그 사이토카인의 기능을 저해하였다 해도 반드시 치료 효과가 얻어지는 것은 아니기에, 사이토카인의 발현량으로부터 실제로 치료 효과가 얻어지는 질환을 추측하는 것은 곤란하다. 따라서, 타겟으로 하는 사이토카인의 시그널 전달의 저해에 의해 실제로 치료 효과가 얻어지는 질환을 찾아내는 것이 중요하다.

또한, 본 발명의 선행기술 문헌을 이하에 나타낸다.

특허문헌 1: WO00/75314

특허문헌 2: WO03/060090

비특허문헌 1: IL-31 is associated with cutaneous lymphocyte antigen-positive skin homing T cells in patients with atopic dermatitis., J Allergy Clin Immunol. 2006 Feb; 117(2):418-25.

비특허문헌 2: Administration of anti-interleukin 18 antibody fails to inhibit development of dermatitis in atopic dermatitis-model mice NC/Nga., British Journal of Dermatology 149:39-45, 2003

발명의 개시

발명이 해결하고자 하는 과제

본 발명은 전술한 배경에 비추어 이루어진 것으로, 본 발명의 과제는, 사이토카인 수용체 안타고니스트에 의한 염증성 질환에 대한 항사이토카인 요법을 제공하는 것이다. 보다 구체적으로는, 본 발명의 과제는, 항 NR10 중화항체에 의해 치료 효과가 얻어지는 염증성 질환을 찾아내, 그들 질환에 대한 새로운 치료 방법을 제공하는 것이다. 본 발명은 또한, 인간에 대한 임상 응용이 가능한 항 인간 NR10 중화항체를 제공하는 것도 과제로 한다.

과제를 해결하기 위한 수단

본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해, 예의 연구를 행하였다. 본 발명자들은, 다양한 병태 모델 마우스를 대상으로 한 항 마우스 NR10 중화항체의 약효 평가를 시도하였다. 그 결과, NC/Nga 마우스를 사용한 아토피성 피부염 모델 마우스, 염화피크릴의 반복 도포에 의한 만성 피부염 모델 마우스에서 현저한 증상의 억제효과가 나타나, 실제로 중화항체가 치료제로서 유용하다는 것이 명확해졌다. 또한, 류머티즘 모델인 콜라겐 관절염 및 변형성 관절증의 모델인 콜라게나제 관절염에서도 증상을 억제하는 효과가 확인되었다. 이들의 결과는, 본원의 NR10 중화항체가 만성 염증의 예방 또는 치료에 응용 가능하다는 것을 시사한다.

또한, 본 발명자들은, 인간 NR10 중화항체의 취득에도 성공하였다. 즉, 본 발명은 이하의 [1]~[17]을 제공하는 것이다.

[1] NR10 안타고니스트를 유효성분으로 함유하는, 염증성 질환의 예방 또는 치료제.

[2] NR10 안타고니스트가 NR10에 대한 중화활성을 갖는 항체인, [1]에 기재된 예방 또는 치료제.

[3] 항체가 단일클론항체인, [2]에 기재된 예방 또는 치료제.

[4] 항체가 인간 NR10에 대한 중화활성을 갖는 단일클론항체인, [2]에 기재된 예방 또는 치료제.

[5] 항체가 재조합 항체인, [2]~[4] 중 어느 하나에 기재된 예방 또는 치료제.

[6] 재조합 항체가 키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체인, [5]에 기재된 예방 또는 치료제.

[7] NR10에 대한 중화활성을 갖는 항체의 단편 및/또는 그의 수식물을 유효성분으로 함유하는, [2]~[6] 중 어느 하나에 기재된 예방 또는 치료제.

[8] 염증성 질환이 아토피성 피부염인, [1]~[7] 중 어느 하나에 기재된 예방 또는 치료제.

[9] 염증성 질환이 만성 피부염인 [1]~[7] 중 어느 하나에 기재된 예방 또는 치료제.

[10] 염증성 질환이 류머티즘인 [1]~[7] 중 어느 하나에 기재된 예방 또는 치료제.

[11] 염증성 질환이 변형성 관절증인 [1]~[7] 중 어느 하나에 기재된 예방 또는 치료제.

[12] NR10에 대한 중화활성을 갖는 항체.

[13] 단일클론항체인 [12]에 기재된 항체.

[14] NR10이 인간 NR10인 [12]에 기재된 항체.

[15] 재조합형 항체인, [12]~[14] 중 어느 하나에 기재된 항체.

[16] 재조합형 항체가 키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체인, [15]에 기재된 항체.

[17] [12]~[16] 중 어느 하나에 기재된 항체의 단편 및/또는 그의 수식물.

[18] NR10 안타고니스트를 염증성 질환을 나타내는 환자에게 투여하는 공정을 포함하는, 염증성 질환을 예방 또는 치료하는 방법.

[19] 염증성 질환의 예방 또는 치료를 위해서 사용하는 제(劑)의 제조에서의, NR10 안타고니스트의 사용.

도면의 간단한 설명
도 1은 BM095를 IL-31 의존성 Ba/F3 세포증식 어세이계에 첨가했을 때의, BM095에 의한 세포증식 억제효과를 관찰한 결과를 나타내는 그래프이다. 가로축은 어세이계 중의 추정 mIL-31 농도, 세로축(OD450(450 ㎜의 흡광도))은 세포량을 나타낸다. 범례는 BM095 첨가량(단위: ng/mL)을 나타낸다. BM095 첨가량에 의존하여 세포증식 억제효과가 관찰되었다.
도 2는 아토피성 피부염 모델 마우스에 항 NR10 항체를 투여했을 때의 치료 효과를 나타내는 그래프이다. 음성 대조군(vehicle군)과 비교하여, 항 NR10 항체 투여군에서는 유의(有意)한 염증 억제효과가 확인되었다.
도 3은 아토피성 피부염 모델 마우스에 항 NR10 항체를 투여했을 때의 경시적 체중 변화를 나타내는 그래프이다. 기존 항염증제 투여군에서는 체중 감소가 관찰되었음에도 불구하고, 항 NR10 투여군에서는 체중의 변화가 없어, 항 NR10 항체의 안전성이 확인되었다.
도 4는 만성 피부염 모델 마우스에 항 NR10 항체를 투여했을 때의 치료 효과를 나타내는 그래프이다. 항 NR10 항체 투여군에서는 유의한 이개(귓바퀴) 종창 억제효과가 확인되었다.
도 5는 만성 피부염 모델 마우스 이개의 면역조직 염색을 나타내는 사진이다. 인간과 동일하게, 비후한 표피에서 마우스 NR10의 발현 항진이 관찰되었다.
도 6은 콜라겐 유발 관절염 모델 마우스에 항 NR10 항체를 투여했을 때의 관절염 발증 억제효과를 나타내는 그래프이다.
도 7은 콜라게나제 유발 관절염(변형성 관절증) 모델에서, BM095의 투여 농도와 AUC와의 관계를 나타내는 그래프이다. 여기서 AUC란, 좌우 슬관절 폭의 차를 우 슬관절의 종창을 나타내는 값으로 하여, 그 추이의 곡선하 면적을 의미한다.
도 8은 IL-31 존재하에서의 인간 NR10 중화항체(정제항체)의 농도와 세포증식 억제활성의 상관을 나타내는 그래프이다. 항체 1, 항체 2, 항체 3은 높은 NR10 중화활성을 나타내었다.
도 9는 IL-31 존재하에서의 인간 NR10에 대한 키메라 항체 NA633의 농도와 세포증식 억제활성의 상관을 나타낸 그래프이다. NA633은 높은 NR10 중화활성을 나타내었다.
도 10은 게잡이원숭이 NR10과 인간 NR10의 아미노산 서열을 비교한 도면이다. 이중 하선을 그은 서열은, 세포막 관통영역을 나타내고 있다.
도 11은 키메라 NA633 항체의, 인간 IL-31자극 게잡이원숭이 NR10/인간 OSMR/BaF 세포주의 세포증식 억제활성을 나타내는 그래프이다. NA633은 게잡이원숭이 NR10에도 중화활성을 나타내었다.
도 12는 DSS 대장염 모델 마우스의 체중 변화율의 추이를 나타내는 그래프이다.
도 13은 급성 피크릴 클로라이드(Picryl chloride) 접촉성 피부염 모델의 이개의 두께 변화 추이를 나타내는 그래프이다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

본 발명은, NR10 안타고니스트를 활성 성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 또는 치료제에 관한 것이다. 본 발명은, 본 발명자들에 의해 NR10 안타고니스트(예를 들어, 항 NR10 중화항체)가 아토피성 피부염, 만성 피부염, 류머티즘, 변형성 관절증 등을 발증한 모델 마우스에서 그 증상의 현저한 억제효과가 발견된 것에 근거한다.

NR10은, 온코스타틴 M 수용체(OSMR)와 헤테로다이머를 형성하여, IL-31의 수용체로서 기능하는 단백질이다. glm-r(J Biol Chem 277, 16831-6, 2002), GPL(J Biol Chem 278, 49850-9, 2003), IL-31RA(Nat Immunol 5, 752-60, 2004)등의 이름으로도 알려져 있어, 본 발명의 NR10에는 이러한 이름으로 불리는 단백질도 포함된다. 또한, 본 발명의 NR10에는, 인간이나 마우스, 기타 포유동물에 유래하는 NR10도 포함되며, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 바람직한 NR10으로서 인간이나 마우스 유래의 NR10을 들 수 있다. 인간 유래의 NR10으로서, 복수의 스플라이싱 베어리언트(Splicing variant)가 알려져 있다(WO00/075314). 상기 스플라이싱 베어리언트 중, NR10.1은 662 아미노산으로 되며, 세포막 관통영역을 갖는 것을 특징으로 한다. 또한, NR10.2는, 252 아미노산 서열로 되는 막 관통영역을 갖지 않는 가용성 수용체 유사 단백질이다. 한편, 세포막 관통형 수용체 단백질로서 기능하는 NR10 스플라이싱 베어리언트로서, NR10.3 및 IL-31RAv3가 알려져 있다. 본 발명에서의 인간 NR10은, 온코스타틴 M 수용체(OSMR)와 헤테로다이머를 형성하여, IL-31의 수용체로서 기능하는 것이라면 특별히 제한되는 것은 아니지만, 바람직한 NR10으로는 NR10.3(ILRAv4라고도 불린다(Nat Immunol 5, 752-60, 2004)) 및 IL-31RAv3를 들 수 있다. NR10.3(IL-31RAv4)는 662 아미노산으로 되고(WO00/075314, Nat Immunol 5, 752-60, 2004), IL-31RAv3는 732 아미노산으로 된다(GenBank Accession No: NM_139017). IL-31RAv4의 아미노산 서열을 서열번호: 6에, IL-31RAv3의 아미노산 서열을 서열번호 :7에 나타낸다. 한편, 마우스 유래의 NR10으로는, 서열번호: 5에 기재된 아미노산 서열로 되는 단백질을 들 수 있다.

본 발명에서 NR10 안타고니스트는, NR10에 결합함으로써 NR10 활성화에 기인하는 세포내 시그널 전달을 차단하여, 세포의 생리적 활성을 상실시키거나 또는 억제하는 물질을 의미한다. 여기서 생리적 활성이란, 예를 들어 생리 활성 물질(예를 들어, 케모카인, 염증성 사이토카인 등)의 생산 유도 활성, 생산 억제 활성, 분비 촉진 활성, 분비 억제 활성, 증식 활성, 증식 유도 활성, 생존 활성, 분화 활성, 분화 유도 활성, 전사활성, 막 수송 활성, 결합 활성, 단백질 분해 활성, 인산화/탈인산화 활성, 산화 환원 활성, 전이 활성, 핵산 분해 활성, 탈수 활성, 세포사 유도 활성, 아포토시스 유도 활성 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.

안타고니스트 활성의 유무 판정은 당업자에게 공지의 방법에 의해 행하는 것이 가능하다. 예를 들어, 세포 표면 상에 발현시킨 NR10에, 리간드의 존재하에서 피검 화합물을 접촉시켜, NR10 활성화의 지표가 되는 세포내 시그널 전달이 생기는지 여부를 판정하면 된다. 이러한 판정은 예를 들어, 문헌 「Dillon SR, et al., Interleukin 31, a cytokine produced by activated T cells, induces dermatitis in mice. Nat Immunol. 2004 Jul; 5(7):752-60.」에 기재된 방법에 의해 행할 수 있다. 리간드 자극에 응답한 세포내 시그널 전달을 저해하는 화합물은, NR10의 안타고니스트라고 생각되어진다.

본 발명에서의 안타고니스트는, 천연 화합물이어도 되고, 인공 화합물이어도 된다. 본 발명에서의 안타고니스트로서는 공지의 것을 사용할 수 있다. 또한, 상기 방법에 의해 안타고니스트 활성을 가지는 것으로 판정된 신규 화합물을 사용하는 것도 가능하다.

본 발명에서의 NR10 안타고니스트의 하나의 태양으로는, NR10에 대한 중화활성을 갖는 항체를 들 수 있다. 본 발명에서의 「NR10에 대한 중화활성을 갖는 항체」란, NR10에 기인하는 생리활성을 억제하는 작용을 갖는 항체를 의미한다. 본 발명에서의 「NR10에 대한 중화활성을 갖는 항체」는 다중클론항체여도 되고 단일클론항체여도 되지만, 바람직한 태양으로는 단일클론항체를 들 수 있다.

NR10에 대한 중화활성을 갖는 단일클론항체는, 예를 들어, 인간이나 마우스 등의 포유동물에 유래하는 NR10 또는 그의 단편 펩티드를 면역원으로 하여, 공지 방법에 의해 항 NR10 단일클론항체를 조제한 후, 얻어진 항 NR10 단일클론항체 중에서 NR10 중화활성을 갖는 항체를 선별함으로써 얻을 수 있다. 즉, 목적하는 항원이나 목적하는 항원을 발현하는 세포를 감작 항원으로 사용하여, 이것을 통상의 면역방법에 따라 면역한다. 얻어진 면역세포를 통상의 세포융합법에 의해 공지의 친세포와 융합시켜, 통상의 스크리닝법에 의해 단일클론의 항체 생산 세포(하이브리도마)를 스크리닝함으로써, 항 NR10 단일클론항체를 제작하는 것이 가능하다. 면역되는 동물로는, 예를 들어, 마우스, 랫트, 토끼, 양, 원숭이, 염소, 당나귀, 소, 말, 돼지 등의 포유동물을 사용할 수 있다. 항원의 조제는 공지 NR10 유전자 서열을 사용하여, 공지의 방법, 예를 들어 베큘로 바이러스(Baculovirus)를 사용한 방법(WO98/46777 등) 등에 준하여 행할 수 있다. NR10 중화활성을 갖는 항체의 선별은, 예를 들어, 실시예에서 후술하는 바와 같이, IL-31 의존성 세포주에 후보의 항체를 첨가했을 때의, 그 IL-31 의존성 세포주의 증식 억제효과를 관찰하는 방법으로, 그 항체가 NR10 중화활성을 갖는 항체인지를 판정할 수 있다. 상기 방법에서 IL-31 의존성 세포주의 증식을 억제하는 항체는, NR10에 대한 중화활성을 갖는 항체라고 생각된다.

하이브리도마의 제작은, 예를 들어, 밀스테인 등의 방법(Kohler. G. and Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73:3-46) 등에 준하여 행할 수 있다. 항원의 면역 원성이 낮은 경우에는, 알부민 등의 면역 원성을 갖는 거대분자와 결합시켜, 면역을 행해도 된다.

본 발명의 NR10에 대한 중화활성을 갖는 항체의 바람직한 태양으로서, 인간 NR10에 대한 중화활성을 갖는 단일클론항체를 들 수 있다. 인간 NR10에 대한 중화활성을 갖는 단일클론항체를 제작하기 위한 면역원으로서는, 인간 NR10에 대한 중화활성을 갖는 항체를 제작할 수 있는 한, 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, 인간 NR10에는 복수의 베어리언트의 존재가 알려지지만, 인간 NR10에 대한 중화활성을 갖는 항체를 제작할 수 있는 한, 어떤 베어리언트를 면역원으로 해도 된다. 또는 동일한 조건하에서, NR10의 단편 펩티드나, 천연의 NR10 서열에 인위적인 변이를 가한 것을 면역원으로 해도 된다. 인간 NR10.3는 본 발명의 NR10에 대한 중화활성을 갖는 항체를 제작하는데 있어서, 바람직한 면역원의 하나이다.

여기서, 본 발명의 상기 항체는, NR10에 대한 중화활성을 갖는 것이라면 특별히 한정되지 않고, 키메라(chimeic) 항체, 인간화(humanized) 항체, 인간 항체 등의 재조합 항체도 포함된다. 키메라 항체란, 인간 이외의 포유동물, 예를 들어, 마우스 항체의 중쇄, 경쇄의 가변영역(heavy and light chain variable region)과 인간 항체의 중쇄, 경쇄의 정상영역(heavy and light chain constant region)으로 되는 항체이다. 키메라 항체는 기지의 방법을 사용해서 제조할 수 있다. 예를 들어, 항체 유전자를 하이브리도마로부터 클로닝하여, 적당한 벡터에 삽입하고, 이것을 숙주로 도입함으로써 행하는 것이 가능하다(예를 들어, Carl, A.K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990 참조). 구체적으로는, 하이브리도마의 mRNA로부터 역전사효소를 사용해서 항체의 가변영역(V영역)의 cDNA를 합성한다. 목적으로 하는 항체의 V영역을 코드하는 DNA가 얻어지면, 이것을 목적하는 인간 항체 정상영역(C영역)을 코드하는 DNA와 연결하여, 이것을 발현벡터에 삽입한다. 또는, 항체의 V영역을 코드하는 DNA를, 인간 항체 C영역의 DNA를 포함하는 발현벡터에 삽입해도 된다. 발현 제어영역, 예를 들어, 인핸서, 프로모터의 제어하에서 발현하도록 발현벡터에 삽입한다. 다음으로, 이 발현벡터에 의해 숙주세포를 형질전환하여, 키메라 항체를 발현시킬 수 있다.

인간화 항체는 재구성(reshaped) 인간 항체라고도 불리며, 인간 이외의 포유동물, 예를 들어 마우스 항체의 상보성 결정영역(CDR; complementarity determining region)을 인간 항체의 상보성 결정영역으로 이식한 것으로, 그 일반적인 유전자 재조합 수법도 알려져 있다. 구체적으로는, 마우스 항체의 CDR과 인간 항체의 프레임 워크 영역(framework region; FR)을 연결하도록 설계한 DNA서열을, 말단부에 오버랩하는 부분을 가지도록 제작한 수 개의 올리고뉴클레오티드로부터 PCR법으로 합성한다. 얻어진 DNA를 인간 항체 정상영역을 코드하는 DNA와 연결하여, 이어서 발현벡터에 삽입하고, 이것을 숙주에 도입하여 생산시킴으로써 얻어진다(유럽특허출원 공개번호 EP239400, 국제특허출원 공개번호 WO 96/02576 참조). CDR을 매개로 연결된 인간 항체의 FR은, 상보성 결정영역이 양호한 항원 결합부위를 형성하는 것이 선택된다. 필요에 따라, 재구성 인간 항체의 상보성 결정영역이 적절한 항원 결합부위를 형성하도록 항체 가변영역의 프레임 워크 영역의 아미노산을 치환해도 된다(Sato, K. et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856).

또한, 인간 항체의 취득방법도 알려져 있다. 예를 들어, 인간 림프구를 인 비트로(in vitro)에서 목적하는 항원 또는 목적하는 항원을 발현하는 세포로 감작하고, 감작 림프구를 인간 골수종 세포, 예를 들어 U266과 융합시켜, 항원으로의 결합활성을 갖는 목적하는 인간 항체를 얻는 것도 가능하다(일본국 특허공고 평1-59878 참조). 또한, 인간 항체 유전자의 모든 레퍼토리를 갖는 트랜스제닉 동물을 목적하는 항원으로 면역함으로써 목적하는 인간 항체를 취득할 수 있다(국제특허출원 공개번호 WO93/12227, WO92/03918, WO94/02602, WO94/25585, WO96/34096, WO96/33735 참조).

또한, 인간 항체 파지 라이브러리를 사용하여, 패닝법(panning)에 의해 인간 항체를 취득하는 기술도 알려져 있다. 예를 들어, 인간 항체의 가변영역을 단일 사슬 항체(scFv)로서 파지 디스플레이법으로 파지의 표면에 발현시켜, 항원에 결합하는 파지를 선택할 수 있다. 선택된 파지의 유전자를 해석하면, 항원에 결합하는 인간 항체의 가변영역을 코드하는 DNA서열을 결정할 수 있다. 항원에 결합하는 scFv의 DNA서열이 명확해지면, 당해 서열을 갖는 적당한 발현벡터를 제작하여, 인간 항체를 취득할 수 있다. 이들 방법은 주지로써, WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388 등을 참고로 할 수 있다.

중쇄 가변영역 또는 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은, NR10에 대한 중화활성을 갖는 한, NR10에 대한 중화활성이 확인된 항체의 중쇄 가변영역 또는 경쇄 가변영역의 아미노산 서열에 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입되어 있어도 된다. 중쇄 가변영역 또는 경쇄 가변영역의 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입되어 있어, NR10에 대한 중화활성을 갖는 항체의 중쇄 가변영역 또는 경쇄 가변영역의 아미노산 서열을 조제하기 위한, 당업자에게 잘 알려진 방법으로서는, 단백질에 변이를 도입하는 방법이 알려져 있다. 예를 들어, 당업자라면, 부위 특이적 변이 유발법(Hashimoto-Gotoh, T, Mizuno, T, Ogasahara, Y, and Nakagawa, M.(1995) An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis. Gene 152, 271-275, Zoller, MJ, and Smith, M.(1983) Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors. Methods Enzymol. 100, 468-500, Kramer, W, Drutsa, V, Jansen, HW, Kramer, B, Pflugfelder, M, and Fritz, HJ(1984) The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction. Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456, Kramer W, and Fritz HJ(1987) Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA Methods. Enzymol. 154, 350-367, Kunkel, TA(1985) Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc Natl Acad Sci U S A. 82, 488-492) 등을 사용해서, NR10에 대한 중화활성을 갖는 항체의 중쇄 가변영역 또는 경쇄 가변영역의 아미노산 서열에 적절히 변화를 도입함으로써, NR10에 대한 중화활성을 갖는 항체의 중쇄 가변영역 또는 경쇄 가변영역과 기능적으로 동등한 변이체를 조제할 수 있다. 이와 같이, 중쇄 가변영역 또는 경쇄 가변영역에서, 1 또는 복수의 아미노산이 변이되어 있어, NR10에 대한 중화활성을 갖는 항체의 중쇄 가변영역 또는 경쇄 가변영역도 또한 본 발명의 중쇄 가변영역 또는 경쇄 가변영역에 포함된다.

아미노산 잔기를 개변하는 경우에는, 아미노산 측쇄의 성질이 보존되어 있는 다른 아미노산으로 변이되는 것이 바람직하다. 예를 들어, 아미노산 측쇄의 성질로는, 소수성 아미노산(A, I, L, M, F, P, W, Y, V), 친수성 아미노산(R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T), 지방족 측쇄를 갖는 아미노산(G, A, V, L, I, P), 수산기 함유 측쇄를 갖는 아미노산(S, T, Y), 황원자 함유 측쇄를 갖는 아미노산(C, M), 카르복실산 및 아미드 함유 측쇄를 갖는 아미노산(D, N, E, Q), 염기 함유 측쇄를 갖는 아미노산(R, K, H), 및, 방향족 함유 측쇄를 갖는 아미노산(H, F, Y, W)을 들 수 있다(괄호 안은 모두 아미노산의 1문자 표기를 나타낸다). 이들의 각 그룹 내의 아미노산의 치환을 보존적 치환이라 부른다. 어떤 아미노산 서열에 대한 1 또는 복수 개의 아미노산 잔기의 결실, 부가 및/또는 다른 아미노산에 의한 치환에 의해 수식된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드가 그 생물학적 활성을 유지하는 것은 이미 알려져 있다(Mark, D. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1984) 81: 5662-6; Zoller, M. J. and Smith, M., Nucleic Acids Res.(1982) 10: 6487-500; Wang, A. et al., Science(1984) 224: 1431-3; Dalbadie-MeFarland, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1982) 79: 6409-13). 이러한 변이체는, 본 발명의 중쇄 가변영역 또는 경쇄 가변영역의 아미노산 서열과 70% 이상, 보다 바람직하게는 75% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 85% 이상, 더욱 보다 바람직하게는 90% 이상, 그리고, 가장 바람직하게는 95% 이상의 아미노산 서열의 동일성을 가진다. 본 명세서에서 서열의 동일성은, 서열 동일성이 최대가 되도록 필요에 따라 서열을 정렬화하고, 적절히 갭을 도입한 후, 토대가 된 중쇄 가변영역 또는 경쇄 가변영역의 아미노산 서열의 잔기와 동일한 잔기의 비율로 정의된다. 아미노산 서열의 동일성은, 전술의 방법에 의해 결정할 수 있다.

또한, 중쇄 가변영역 또는 경쇄 가변영역의 아미노산 서열에서, 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입되어, NR10에 대한 중화활성을 갖는 중쇄 가변영역 또는 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은, 그 중쇄 가변영역 또는 경쇄 가변영역의 아미노산 서열을 코드하는 염기서열로 되는 핵산에 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 핵산으로부터 얻는 것도 가능하다. 중쇄 가변영역 또는 경쇄 가변영역의 아미노산 서열을 코드하는 염기서열로 되는 핵산에 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 핵산을 단리하기 위한, 스트린젠트한 하이브리다이제이션 조건으로는, 6M 요소, 0.4% SDS, 0.5×SSC, 37℃의 조건 또는 이것과 동등한 스트린젠시의 하이브리다이제이션 조건을 예시할 수 있다. 보다 스트린젠시가 높은 조건, 예를 들어 6M 요소, 0.4% SDS, 0.1×SSC의 조건, 42℃를 이용한다면, 보다 상동성이 높은 핵산의 단리를 기대할 수 있다. 단리한 핵산의 서열의 결정은, 후술하는 공지의 방법에 의해 행하는 것이 가능하다. 단리된 핵산의 상동성은, 염기서열 전체에서 적어도 50% 이상, 보다 바람직하게는 70% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상)의 서열의 동일성을 갖는다.

상기 하이브리다이제이션 기술을 이용하는 방법 대신에, 중쇄 가변영역 또는 경쇄 가변영역의 아미노산 서열을 코드하는 염기서열 정보를 토대로 합성한 프라이머를 사용하는 유전자 증폭법, 예를 들어, 폴리메라아제 연쇄반응(PCR)법을 이용하여, 중쇄 가변영역 또는 경쇄 가변영역의 아미노산 서열을 코드하는 염기서열로 되는 핵산과 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 핵산을 단리하는 것도 가능하다.

염기서열 및 아미노산 서열의 동일성은, Karlin and Altschul에 의한 알고리즘 BLAST(Proc. Natl. Acad. USA(1993) 90: 5873-7)에 의해 결정할 수 있다. 이 알고리즘을 토대로, BLASTN이나 BLASTX로 불리는 프로그램이 개발되어 있다(Altschul at al., J. Mol. Biol.(1990) 215:403-10). BLAST를 토대로 BLASTN에 의해 염기서열을 해석하는 경우에는, 파라미터는 예를 들어 score=100, wordlength=12로 한다. 또한, BLAST를 토대로 BLASTX에 의해 아미노산 서열을 해석하는 경우에는, 파라미터는 예를 들어 score=50, wordlength=3으로 한다. BLAST와 Gapped BLAST 프로그램을 사용하는 경우에는, 각 프로그램의 디폴트 파라미터를 사용한다. 이들 해석방법의 구체적인 수법은 공지이다(NCBI(National Center For Biotechnology Information)의 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)의 웹사이트를 참조; http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

또한 본 발명에서의 항체는, 저분자화 항체여도 된다. 본 발명의 저분자화 항체는, 전장 항체(whole antibody, 예를 들어 whole IgG 등)의 일부분이 결손되어 있는 항체 단편을 포함하고, NR10으로의 중화활성을 갖는 한 특별히 한정되지 않는다. 본 발명의 저분자화 항체는, 전장 항체의 일부분이라면 특별히 한정되지 않지만, 중쇄 가변영역(VH) 또는 경쇄 가변영역(VL)을 포함하고 있는 것이 바람직하고, 특히 바람직하게는 VH와 VL 양쪽을 포함하는 저분자화 항체이다.

본 발명에서의 저분자화 항체는, 전장 항체보다도 분자량이 작아지는 것이 바람직하지만, 예를 들어, 다이머, 트리머, 테트라머 등의 다량체를 형성하는 경우 등도 있어, 전장 항체보다도 분자량이 커지는 경우도 있다.

본 발명에서의 저분자화 항체의 하나로서, scFv 항체를 들 수 있다. scFv 항체는, 중쇄 가변영역([VH]) 및 경쇄 가변영역([VL])을 링커 등으로 결합하여 단일 사슬 폴리펩티드로 한 항체이다(Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988)85,5879-5883, Plickthun「The Pharmacology of Monoclonal Antibodies」Vol.113, Resenburg 및 Moore편, Springer Verlag, New York, pp.269-315,(1994)). 결합되는 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역의 순서는 특별히 한정되지 않고, 어떤 순서로 배치되어 있어도 되며, 예를 들어 이하와 같은 배치를 들 수 있다.

[VH] 링커 [VL]

[VL] 링커 [VH]

중쇄 가변영역 또는 경쇄 가변영역의 아미노산 서열은, 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입되어 있어도 된다. 추가적으로, 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역을 회합시킨 경우에, 항원결합 활성을 갖는 한, 일부를 결손시켜도 되며, 다른 폴리펩티드를 부가해도 된다. 또한, 가변영역은 키메라화나 인간화되어 있어도 된다.

본 발명에서, 항체의 가변영역을 결합하는 링커는 유전자 공학에 의해 도입 가능한 임의의 펩티드 링커, 또는 합성 화합물 링커, 예를 들어, Protein Engineering, 9(3), 299-305, 1996에 개시되는 링커를 사용할 수 있다.

본 발명에서 바람직한 링커는 펩티드 링커이다. 펩티드 링커의 길이는 특별히 한정되지 않고, 목적에 따라 당업자가 적절히 선택하는 것이 가능하지만, 통상, 1~100 아미노산, 바람직하게는 3~50 아미노산, 더욱 바람직하게는 5~30 아미노산, 특히 바람직하게는 12~18 아미노산(예를 들어, 15 아미노산)이다.

펩티드 링커의 아미노산 서열로서는, 예를 들어 이하와 같은 서열을 들 수 있다.

Ser

Gly·Ser

Gly·Gly·Ser

Ser·Gly·Gly

Gly·Gly·Gly·Ser(서열번호: 8)

Ser·Gly·Gly·Gly(서열번호: 9)

Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(서열번호: 10)

Ser·Gly·Gly·Gly·Gly(서열번호: 11)

Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(서열번호: 12)

Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly(서열번호: 13)

Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(서열번호: 14)

Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly(서열번호: 15)

(Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(서열번호: 10))n

(Ser·Gly·Gly·Gly·Gly(서열번호: 11))n

[n은 1 이상의 정수이다] 등을 들 수 있다.

합성 화학물 링커(화학 가교제)는, 펩티드의 가교에 통상 사용되고 있는 가교제, 예를 들어, N-히드록시숙신이미드(NHS) 디숙신이미딜 스베레이트(DSS), 비스(설포숙신이미딜) 스베레이트(BS3), 디티오비스(숙신이미딜 프로피오네이트)(DSP), 디티오비스(설포숙신이미딜 프로피오네이트)(DTSSP), 에틸렌글리콜 비스(숙신이미딜 숙시네이트)(EGS), 에틸렌글리콜 비스(설포숙신이미딜 숙시네이트)(설포-EGS), 디숙신이미딜 타르타르산염(DST), 디설포숙신이미딜 타르타르산염(설포-DST), 비스[2-(숙신이미드옥시카르보닐옥시)에틸]설폰(BSOCOES), 비스[2-(설포숙신이미드옥시카르보닐옥시)에틸]설폰(설포-BSOCOES) 등이며, 이들 가교제는 시판되고 있다.

본 발명의 항체에는, 본 발명의 항체의 아미노산 서열에 복수 개의 아미노산 잔기가 부가된 항체도 포함된다. 또한, 이들 항체와 다른 펩티드 또는 단백질이 융합한 융합 단백질도 포함된다. 융합 단백질을 제작하는 방법은, 본 발명의 항체를 코드하는 폴리뉴클레오티드와 다른 펩티드 또는 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 프레임이 일치하도록 연결하여 이것을 발현벡터에 도입하여, 숙주에서 발현시키면 되고, 당업자는 공지의 수법을 사용할 수 있다. 본 발명의 항체와의 융합에 제공되는 다른 펩티드 또는 폴리펩티드로서는, 예를 들어, FLAG(Hopp, T, P, et al., BioTechnology(1988)6, 1204-1210), 6개의 His(히스티딘) 잔기로 되는 6×His, 10×His, 인플루엔자 응집소(HA), 인간 c-myc의 단편, VSV-GP의 단편, p18HIV의 단편, T7-tag, HSV-tag, E-tag, SV40T 항원의 단편, lck tag, α-tubulin의 단편, B-tag, Protein C의 단편 등 공지의 펩티드를 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 항체와의 융합에 제공되는 다른 폴리펩티드로서는, 예를 들어, GST(글루타티온-S-트랜스퍼라아제), HA(인플루엔자 응집소), 면역글로블린 정상영역, β-갈락토시다아제, MBP(말토오스 결합단백질) 등을 들 수 있다. 시판되고 있는 이들 펩티드 또는 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를, 본 발명의 항체를 코드하는 폴리뉴클레오티드와 융합시켜, 이것에 의해 조제된 융합 폴리뉴클레오티드를 발현시킴으로써 융합 폴리펩티드를 조제할 수 있다.

본 발명의 항체는, 후술하는 그것을 생산하는 세포나 숙주 또는 정제방법에 의해, 아미노산 서열, 분자량, 등전점 또는 당쇄의 유무나 형태 등이 상이할 수 있다. 그러나 얻어진 항체가, 본 발명의 항체와 동등한 기능을 가지고 있는 한, 본 발명에 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 항체를 원핵세포, 예를 들어 대장균에서 발현시킨 경우, 본래의 항체의 아미노산 서열의 N 말단에 메티오닌 잔기가 부가된다. 본 발명의 항체는 이와 같이 항체도 포함한다.

본 발명의 항체는 당업자에게 공지의 방법에 의해 제작할 수 있다. 예를 들어, NR10을 인식하는 항체의 서열을 토대로, 당업자에게 공지의 유전자 재조합 기술을 사용하여 제작하는 것이 가능하다. 구체적으로는, NR10을 인식하는 항체의 서열을 토대로 항체를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 구축하고, 이것을 발현벡터에 도입한 후, 적당한 숙주세포에서 발현시키면 된다(예를 들어, Co, M. S. et al., J. Immunol.(1994) 152, 2968-2976; Better, M. and Horwitz, A. H., Methods Enzymol.(1989) 178, 476-496; Pluckthun, A. and Skerra, A., Methods Enzymol.(1989) 178, 497-515; Lamoyi, E., Methods Enzymol.(1986) 121, 652-663; Rousseaux, J. et al., Methods Enzymol.(1986) 121, 663-669; Bird, R. E. and Walker, B. W., Trends Biotechnol.(1991) 9, 132-137 참조).

벡터의 예로는, M13계 벡터, pUC계 벡터, pBR322, pBluescript, pCR-Script 등을 들 수 있다. 또한, cDNA의 서브클로닝, 잘라내기를 목적으로 한 경우, 상기 벡터 외에, 예를 들어, pGEM-T, pDIRECT, pT7 등을 들 수 있다. 본 발명의 항체를 생산하는 목적에서 벡터를 사용하는 경우에는, 특히 발현벡터가 유용하다. 발현벡터로서는, 예를 들어, 대장균에서의 발현을 목적으로 한 경우는, 벡터가 대장균에서 증폭되는 상기 특징을 갖는 이외에, 숙주를 JM109, DH5α, HB101, XL1-Blue 등의 대장균으로 한 경우에 있어서는, 대장균에서 효율적으로 발현할 수 있는 프로모터, 예를 들어 lacZ 프로모터(Ward들, Nature(1989) 341, 544-546; FASEB J.(1992) 6, 2422-2427), araB 프로모터(Better들, Science(1988) 240, 1041-1043), 또는 T7 프로모터 등을 가지고 있는 것이 불가결하다. 이러한 벡터로서는, 상기 벡터 외에 pGEX-5X-1(파마시아제), 「QIAexpress system」(키아겐제), pEGFP, 또는 pET(이 경우, 숙주는 T7 RNA 폴리머라제를 발현하고 있는 BL21이 바람직하다) 등을 들 수 있다.

또한, 벡터에는, 항체 분비를 위한 시그널 서열이 포함되어 있어도 된다. 항체 분비를 위한 시그널 서열로는, 대장균의 페리플라즘에 생산시키는 경우, pelB 시그널 서열(Lei, S. P. et al J. Bacteriol.(1987) 169, 4379)을 사용하면 된다. 숙주세포로의 벡터의 도입은, 예를 들어 염화칼슘법, 전기천공법(electroporation)을 사용하여 행할 수 있다.

대장균 이외에도, 예를 들어 본 발명의 항체를 제조하기 위한 벡터로는, 포유동물 유래의 발현벡터(예를 들어, pcDNA3(인비트로겐사제)나, pEF-BOS(Nucleic Acids. Res. 1990, 18(17), p5322), pEF, pCDM8), 곤충세포 유래의 발현벡터(예를 들어,「Bac-to-BAC baculovairus expression system」(기브코 BRL제), pBacPAK8), 식물 유래의 발현벡터(예를 들어 pMH1, pMH2), 동물 바이러스 유래의 발현벡터(예를 들어, pHSV, pMV, pAdexLcw), 레트로바이러스 유래의 발현벡터(예를 들어 pZIPneo), 효모 유래의 발현벡터(예를 들어「Pichia Expression Kit」(인비트로겐제), pNV11, SP-Q01), 고초균 유래의 발현벡터(예를 들어 pPL608, pKTH50)를 들 수 있다.

CHO세포, COS세포, NIH3T3세포 등의 동물세포에서의 발현을 목적으로 한 경우에는, 세포 내에서 발현시키기 위해 필요한 프로모터, 예를 들어 SV40 프로모터(Mulligan들, Nature(1979) 277, 108), MMLV-LTR 프로모터, EP1α 프로모터(Mizushima들, Nucleic Acids Res. (1990) 18,5322), CMV 프로모터 등을 가지고 있는 것이 불가결하며, 세포로의 형질전환을 선발하기 위한 유전자(예를 들어, 약제(네오마이신, G418 등)에 의해 판별 가능한 약제 내성 유전자)를 가지면 더욱 바람직하다. 이러한 특성을 갖는 벡터로는, 예를 들어, pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV, pOP13등을 들 수 있다.

또한, 유전자를 안정적으로 발현시키는 한편, 세포 내에서의 유전자의 복제 수의 증폭을 목적으로 하는 경우에는, 핵산 합성 경로를 결손한 CHO세포에 그것을 상보하는 DHFR 유전자를 갖는 벡터(예를 들어, pSV2-dhfr(「Molecular Cloning 2nd edition」Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)) 등)를 도입하여, 메토트렉세이트(MTX)에 의해 증폭시키는 방법을 들 수 있고, 또한, 유전자의 일과성 발현을 목적으로 하는 경우에는, SV40 T 항원을 발현하는 유전자를 염색체 상에 갖는 COS세포를 사용해서 SV40의 복제기점을 갖는 벡터(pcD 등)으로 형질전환하는 방법을 들 수 있다. 복제 개시점으로는, 또한 폴리오마 바이러스(polyoma virus), 아데노바이러스(adenovirus), 소 유두종 바이러스(BPV) 등 유래의 것을 사용하는 것도 가능하다. 또한, 숙주세포계에서 유전자 복제 수 증폭을 위해, 발현벡터는 선택마커로서, 아미노글리코시드 트랜스퍼라아제(APH) 유전자, 티미딘 키나아제(TK) 유전자, 대장균 크산틴구아닌 포스포리보실트랜스퍼라아제(Ecogpt) 유전자, 디히드로엽산 환원효소(dhfr) 유전자 등을 포함할 수 있다.

이에 의해 얻은 본 발명의 항체는, 숙주세포내 혹은 세포외(배지 등)로부터 단리하여, 실질적으로 순수하고 균일한 항체로서 정제할 수 있다. 항체의 분리, 정제는, 통상의 항체의 정제에서 사용되고 있는 분리, 정제방법을 사용하면 되며, 조금도 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 크로마토그래피 칼럼, 필터, 한외여과, 염석, 용매침전, 용매추출, 증류, 면역침강, SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동, 등전점 전기영동법, 투석, 재결정 등을 적절히 선택, 조합하면 항체를 분리, 정제할 수 있다.

크로마토그래피로서는, 예를 들어, 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 겔 여과, 역상 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피 등을 들 수 있다(Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). 이들 크로마토그래피는, 액상 크로마토그래피, 예를 들어 HPLC, FPLC 등의 액상 크로마토그래피를 사용하여 행할 수 있다. 친화성 크로마토그래피에 사용하는 칼럼으로는, 프로테인 A 칼럼, 프로테인 G 칼럼을 들 수 있다. 예를 들어, 프로테인 A를 사용한 칼럼으로, Hyper D, POROS, Sepharose FF(GE Amersham Biosciences) 등을 들 수 있다. 본 발명은, 이들의 정제방법을 사용하여, 고도로 정제된 항체도 포함한다.

또한 본 발명은, 상기 본 발명의 항체의 단편 및/또는 그 수식물을 유효성분으로 함유하는, 염증성 질환의 예방 및 치료제를 제공한다. 본 발명의 항체의 단편 및/또는 그의 수식물은, 본 발명의 항체(전장 항체(whole antibody, 예를 들어, whole lgG 등), 재조합 항체(예를 들어, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체 등), 저분자화 항체(예를 들어, scFv 항체 등))의 일부가 결손된 항체 단편을 포함하고, 항원으로의 결합능을 가지고 있다면 특별히 한정되지 않는다. 본 발명의 항체 단편은 전장 항체의 일부분이라면 특별히 한정되지 않지만, 중쇄 가변영역(VH) 또는/및 경쇄 가변영역(VL)을 포함하고 있는 것이 바람직하다. VH 또는 VL의 아미노산 서열은, 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입되어 있어도 된다. 또한, 항원으로의 결합능을 갖는 한, VH 또는/및 VL의 일부를 결손시켜도 된다. 또한, 가변영역은 키메라화나 인간화되어 있어도 된다. 항체 단편의 구체예로는, Fab, Fab', F(ab')2, Fv 등을 들 수 있다. 이러한 항체 단편을 얻는 데에는, 이들 항체 단편을 코드하는 유전자를 구축하고, 이것을 발현벡터에 도입한 후, 적당한 숙주세포에서 발현시키면 된다(예를 들어, Co, M. S. et al., J. Immunol.(1994) 152, 2968-2976; Better, M. and Horwitz, A. H., Methods Enzymol.(1989) 178, 476-496; Pluckthun, A. and Skerra, A., Methods Enzymol.(1989) 178, 497-515; Lamoyi, E., Methods Enzymol.(1986) 121, 652-663; Rousseaux, J. et al., Methods Enzymol.(1986) 121, 663-669; Bird, R. E. and Walker, B. W., Trends Biotechnol.(1991) 9, 132-137 참조).

또한, 본 발명의 항체는, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 방사성 물질, 형광 물질, 발광 물질, 효소, 톡신 등의 각종 분자와 결합한 콘쥬게이트 항체여도 된다. 이러한 콘쥬게이트 항체는, 얻어진 항체에 화학적인 수식을 행하는 것에 의해 얻을 수 있다. 또한, 항체의 수식방법은 이 분야에서 이미 확립되어 있다(예를 들어, US5057313, US5156840). 본 발명에서의 「항체」에는 이들 콘쥬게이트 항체도 포함된다.

항체인 NR10에 대한 결합활성의 측정은, 당업자에게 공지의 방법에 의해 행하는 것이 가능하다. 예를 들어, 항체의 항원결합 활성을 측정하는 방법으로, ELISA(효소 결합 면역 흡착 검정법), EIA(효소 면역 측정법), RIA(방사 면역 측정법) 또는 형광 항체법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 효소 면역 측정법을 사용하는 경우, 항원을 코팅한 플레이트에 항체를 포함하는 시료, 예를 들어, 항체 생산 세포의 배양상청이나 정제항체를 첨가한다. 알칼리포스파타아제 등의 효소로 표지한 이차항체를 첨가하여, 플레이트를 인큐베이트하고, 세정한 후, p-니트로페닐인산 등의 효소기질을 첨가하여 흡광도를 측정함으로써 항원결합 활성을 평가할 수 있다.

또한, 항체인 NR10에 대한 중화활성의 측정은, 예를 들어, 실시예에 기재된 상기 IL-31 의존성 세포주의 증식 억제효과를 관찰하는 방법에 의해 행할 수 있다.

본 발명의 NR10 안타고니스트 또는 NR10에 대한 중화활성을 갖는 항체는, 염증성 질환의 예방 또는 치료제에 사용할 수 있다. 본 발명자들은, 마우스 NR10에 대한 중화항체를 각종 염증 모델 동물에 투여하여, 현저한 치료 효과가 얻어지는 것을 실증하였다. 또한, 아토피성 피부염 환자의 비후한 표피에서 인간 NR10의 발현이 항진되어 있다는 보고가 있고(비특허문헌 1), 한편, 본 발명자들은 상기 만성 피부염 모델 마우스 이개의 면역조직 염색을 행한 바, 인간과 동일하게, 비후한 표피에서 마우스 NR10의 발현이 항진되어 있는 것을 확인하였다(실시예 5). 이들 사실로부터, NR10은 염증성 질환에서 모든 동물종에서 동일하게 관여하고 있는 것으로 생각되어, 인간 NR10에 대한 중화항체는 마우스 NR10 중화항체와 동일하게 각종 염증성 질환의 예방 및 치료에 유효한 것으로 생각된다. 또한, 항체 이외의 NR10 안타고니스트에 대해서도, 본 실시예에서의 소견과 마찬가지로, 각종 염증성 질환에 대한 치료 효과를 갖는 것으로 생각된다.

본 발명에서 염증성 질환이란, 물리적, 화학적, 또는 생물학적 작용물질에 의한 손상이나 이상 자극에 의해, 이환(罹患)된 혈관 및 인접한 조직에서 일어나는 세포학적·조직학적 반응에 관한 병리학상의 소견을 동반하는 질환(스테드맨 의학 대사전 제5판, 주식회사 메디컬리뷰사, 2005년)을 말한다. 일반적으로 염증성 질환은 피부염(아토피성 피부염, 만성 피부염 등), 염증성 장질환(대장염 등), 천식, 관절염(관절 류머티즘, 변형성 관절증 등), 기관지염, Th-2형 자기면역질환, 전신성 에리테마토데스, 중증 근무력증, 만성 GVHD, 클론병, 변형성 척추염, 요통, 통풍, 수술 외상 후의 염증, 종창의 완해, 신경통, 인후두염, 방광염, 간염(비알코올성 지방성 간염, 알코올성 간염 등), B형 간염, C형 간염, 동맥경화 등을 들 수 있다.

본 발명의 대상이 되는 염증성 질환의 바람직한 예로서, 아토피성 피부염, 만성 피부염, 류머티즘, 변형성 관절증, 만성 천식을 들 수 있다.

본 발명자들은, NR10에 대한 안타고니스트 항체가 아토피성 피부염, 만성 피부염, 류머티즘, 변형성 관절증에 대해 치료 효과를 가지고 있는 것을 발견하였다. 한편, 급성 접촉성 피부염 및 DSS 급성 대장염 모델에 있어서는, NR10에 대한 안타고니스트 항체가 치료 효과를 갖지 않는 것이 판명되었다.

본 발명의 염증성 질환의 예방 또는 치료제는, 전술한 NR10 안타고니스트 또는 NR10에 대한 중화활성을 갖는 항체를 유효성분으로서 함유하는 것을 특징으로 한다. NR10 안타고니스트를 「유효성분으로서 함유하는」이란, NR10 안타고니스트를 활성성분의 하나 이상으로써 포함한다는 의미이며, 그 함유율을 제한하는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 염증성 질환의 예방 또는 치료제는, NR10 안타고니스트와 합하여 다른 염증성 질환의 예방 또는 치료를 촉진하는 성분을 함유해도 된다.

본 발명의 NR10 안타고니스트는, 통상적인 방법에 따라 제제화할 수 있다(예를 들어, Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton, U.S.A.). 또한, 필요에 따라, 의약적으로 허용되는 담체 및/또는 첨가물을 함께 포함해도 된다. 예를 들어, 계면활성제(PEG, Tween 등), 부형제, 산화 방지제(아스코르브산 등), 착색료, 착향료, 보존료, 안정제, 완충제(인산, 구연산, 다른 유기산 등), 킬레이트제(EDTA 등), 현탁제, 등장화제, 결합제, 붕괴제, 윤탁제, 유동성 촉진제, 교미제 등을 포함할 수 있다. 그러나, 본 발명의 염증성 질환의 예방 또는 치료제는, 이들에 제한되지 않고, 기타 상용의 담체를 적절히 포함하고 있어도 된다. 구체적으로는, 경질 무수 규산, 젖당, 결정 셀룰로오스, 만니톨, 전분, 카르멜로오스 칼슘, 카르멜로오스 나트륨, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 폴리비닐아세탈디에틸아미노아세테이트, 폴리비닐피롤리돈, 젤라틴, 중쇄 지방산 트리글리세라이드, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유 60, 백당, 카르복시메틸셀룰로오스, 콘스타치, 무기염류 등을 들 수 있다. 또한, 기타 저분자량의 폴리펩티드, 혈청 알부민, 젤라틴 및 면역 글로블린 등의 단백질, 및 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 및 리신 등의 아미노산을 포함하고 있어도 된다. 주사용의 수용액으로 하는 경우에는, NR10 안타고니스트를, 예를 들어 생리식염수, 포도당 또는 기타 보조제를 포함하는 등장액에 용해한다. 보조제로서는, 예를 들어, D-소르비톨, D-만노오스, D-만니톨, 염화나트륨 등을 들 수 있고, 또한, 적당한 용해보조제, 예를 들어 알코올(에탄올 등), 폴리알코올(프로필렌글리콜, PEG 등), 비이온성 계면활성제(폴리소르베이트80, HCO-50) 등과 병용해도 된다.

또한, 필요에 따라 NR10 안타고니스트를 마이크로캡슐(히드록시메틸셀룰로오스, 젤라틴, 폴리[메틸메타크릴산] 등의 마이크로캡슐)에 봉입(封入)하거나, 콜로이드드러그 딜리버리시스템(리포솜, 알부민마이크로스페어, 마이크로에멀전, 나노입자 및 나노캡슐 등)으로 하는 것도 가능하다(Remington's Pharmaceutical Science 16th edition &, Oslo Ed.(1980) 등 참조). 또한, 약제를 서방성의 약제로 하는 방법도 공지로, NR10 안타고니스트에 적용할 수 있다(Langer at al., J. Biomed. Master. Res.(1981) 15: 167-277; Langer, Chem. Tech.(1982) 12: 98-105; 미국특허 제3,773,919호; 유럽특허 출원공개(EP) 제58,481호; Sidman et al., Biopolymers(1983) 22: 547-56; EP 제133,988호).

본 발명의 염증성 질환의 예방 또는 치료제는, 경구 또는 비경구 중 어느 것으로도 투여 가능하지만, 바람직하게는 비경구 투여된다. 구체적으로는, 주사 및 경피투여에 의해 환자에게 투여된다. 주사제형의 예로는, 예를 들어 정맥내 주사, 근육내 주사 또는 피하주사 등에 의해 전신 또는 국소적으로 투여할 수 있다. 염증을 억제하고자 하는 부위 또는 그 주변에 국소주입, 특히 근육내 주사해도 된다. 또한, 환자의 연령, 증상에 따라 적절히 투여방법을 선택할 수 있다. 투여량으로는, 예를 들어 1회에 체중 1 ㎏당 활성성분이 0.0001 ㎎~100 ㎎의 범위에서 선택하는 것이 가능하다. 또는, 예를 들어, 인간 환자에게 투여하는 경우, 환자당 활성성분이 0.001~1000 ㎎/㎏·body·weight의 범위를 선택할 수 있으며, 1회당 투여량으로는, 예를 들어, NR10 안타고니스트가 0.01~50 ㎎/㎏·body·weight 정도의 양이 포함되는 것이 바람직하다. 그러나, 본 발명의 염증성 질환의 예방 또는 치료제는, 이들의 투여량에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명은, NR10에 대한 중화활성을 갖는 항체(NR10에 대한 중화활성을 갖는 항체의 단편 및/또는 그의 수식물을 포함한다. 이하 동일)를 제공한다. 본 발명의 NR10에 대한 중화활성을 갖는 항체는, 상기 염증 질환의 예방 또는 치료제에 있어서 유효성분으로 유용하다. 본 발명의 NR10에 대한 중화활성을 갖는 항체는, 다중클론항체여도 되고 단일클론항체여도 되지만, 바람직하게는 단일클론항체이다. NR10에 대한 중화활성을 갖는 단일클론항체는, 전술의 방법에 의해 얻는 것이 가능하다. 또한, 본 발명의 단일클론항체는, 포유동물 유래의 NR10 또는 그의 단편에 대한 중화활성을 가지고, 바람직하게는 인간이나 마우스 유래의 NR10 또는 그의 단편에 대한 중화활성을 가지며, 더욱 바람직하게는 인간 유래의 NR10 또는 그의 단편에 대한 중화활성을 갖는다. 인간 NR10에 대한 중화활성을 갖는 단일클론항체를 제작하기 위해서는, 면역원으로서 인간의 NR10 또는 그의 단편 펩티드를 사용하면 된다. 또한, 본 발명의 NR10에 대한 중화활성을 갖는 항체는, 재조합 항체여도 된다. 본 발명의 NR10에 대한 중화활성을 갖는 재조합 항체로는 이것에 한정되는 것은 아니지만, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 저분자화 항체를 들 수 있다.

본 발명에서, NR10에 대한 중화활성을 갖는 항체의 예로는, 서열번호: 1에 기재된 아미노산 서열로 되는 중쇄 가변영역, 서열번호: 3에 기재된 아미노산 서열로 되는 경쇄 가변영역을 갖는 항 마우스 NR10 항체를 들 수 있다.

본 발명에는, 인간 NR10에 대한 중화활성을 갖는 단일클론항체도 포함된다. 본 발명의 인간 NR10에 대한 중화활성을 갖는 단일클론항체는, 전술과 같이, 면역원으로서 인간의 NR10 또는 그의 단편 펩티드를 사용함으로써 단일클론항체를 제작하고, 또한 그들 항 인간 NR10 단일클론항체 중에서, 상기 IL-31 의존성 세포주를 사용한 어세이계에 의해, 인간 NR10 중화활성을 갖는 항체를 선발하는 것이 가능하다.

본 발명에서, 인간 NR10에 대한 중화활성을 갖는 항체의 예로는, 이하의 (a)에서 (d) 중 어느 하나에 기재된 항체를 들 수 있다.

(a) CDR1으로서 서열번호: 18에 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호: 19에 기재된 아미노산 서열, CDR3로서 서열번호: 20에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역을 갖는 항체.

(b) CDR1으로서 서열번호: 21에 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호: 22에 기재된 아미노산 서열, CDR3로서 서열번호: 23에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역을 갖는 항체.

(c) (a)의 중쇄 가변영역과 (b)의 경쇄 가변영역을 갖는 항체.

(d) (a)~(c) 중 어느 하나에 기재된 항체와 동일한 에피토프를 인식하는 항체.

어떤 항체가 다른 항체와 동일한 에피토프를 인식하는지의 여부는, 양자의 에피토프에 대한 경합에 의해 확인할 수 있다. 항체간의 경합은, 경합 결합 어세이에 의해 평가할 수 있고, 그 수단으로서 ELISA, 형광 에너지 전이 측정법(FRET)이나 형광 미량 측정 기술(FMAT(등록상표)) 등을 들 수 있다. 항원에 결합한 상기 항체의 양은, 동일한 에피토프로의 결합에 대해 경합하는 후보 경합 항체(피검항체)의 결합능에 간접적으로 상관하고 있다. 즉, 동일한 에피토프에 대한 피검항체의 양이나 친화성이 커질수록, 상기 항체의 항원으로의 결합량은 저하되고, 항원으로의 피검항체의 결합량은 증가한다. 구체적으로는, 항원에 대해 적당한 표지를 한 상기 항체와 평가해야 하는 항체를 동시에 첨가하여, 표지를 이용해서 결합되어 있는 상기 항체를 검출한다. 항원에 결합한 상기 항체 양은, 상기 항체를 미리 표지해 둠으로써 용이하게 측정할 수 있다. 이 표지는 특별히 제한되지 않지만, 수법에 따른 표지 방법을 선택한다. 표지 방법은 구체적으로 형광표지, 방사표지, 효소표지 등을 들 수 있다.

예를 들어, NR10을 발현시킨 동물세포에 형광표지한 상기 항체와, 비표지의 상기 항체 또는 피검항체를 동시에 첨가하고, 표지된 상기 항체를 형광 미량 측정 기술로 검출한다.

여기서 말하는 동일한 에피토프를 인식하는 항체란, 표지 상기 항체에 대해, 비표지의 상기 항체의 결합에 의해 결합량을 50% 저하시키는 농도(IC₅₀)에 대해, 피검항체가 비표지 상기 항체의 IC₅₀의 10배 높은 농도에서 50% 이상, 표지 상기 항체의 결합량을 저하시킬 수 있는 항체이다.

본 발명에서 사용되는 인간 NR10에 대한 중화활성을 갖는 항체는 추가적으로, 게잡이원숭이 NR10에 대해 결합활성을 갖는 것이 바람직하고, 게잡이원숭이 NR10에 대한 중화활성을 갖는 것이 더욱 바람직하다. 게잡이원숭이 NR10으로의 결합활성 또는 중화활성의 측정에는, 서열번호: 24에 기재된 아미노산 서열로 되는 게잡이원숭이 NR10을 사용하는 것이 가능하다.

또한, 본 발명은, 이하에 나타내는 치료 방법도 또한 제공한다. 여기서, NR10, 안타고니스트, 단일클론항체, 재조합 항체, 염증성 질환 등의 설명은 전술한 바와 같다.

(1) NR10 안타고니스트를 염증성 질환을 나타내는 환자에게 투여하는 공정을 포함하는, 염증성 질환을 예방 또는 치료하는 방법

(2) NR10 안타고니스트가 NR10으로의 결합활성을 갖는 항체인, (1)에 기재된 방법

(3) 항체가 단일클론항체인, (2)에 기재된 방법

(4) 항체가 인간 NR10에 결합하는 단일클론항체인, (2)에 기재된 방법

(5) 항체가 재조합 항체인, (2)~(4) 중 어느 하나에 기재된 방법

(6) 재조합 항체가 키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체인, (5)에 기재된 방법

(7) NR10에 대한 중화활성을 갖는 항체의 단편 및/또는 그의 수식물을 유효성분으로서 함유하는, (2)~(6) 중 어느 하나에 기재된 방법

(8) 염증성 질환이 아토피성 피부염인 (1)~(7) 중 어느 하나에 기재된 방법

(9) 염증성 질환이 만성피부염인 (1)~(7) 중 어느 하나에 기재된 방법

(10) 염증성 질환이 류머티즘인 (1)~(7) 중 어느 하나에 기재된 방법

(11) 염증성 질환이 변형성 관절증인 (1)~(7) 중 어느 하나에 기재된 방법

또한 본 발명은, 이하에 나타내는 발명도 또한 제공한다. 여기서, NR10, 안타고니스트, 단일클론항체, 재조합 항체, 염증성 질환 등의 설명은 전술한 바와 같다.

(1) 염증성 질환의 예방 또는 치료를 위해 사용되는 제(劑)의 제조에서의, NR10 안타고니스트의 사용

(2) NR10 안타고니스트가 NR10으로의 결합활성을 갖는 항체인, (1)에 기재된 사용

(3) 항체가 단일클론항체인, (2)에 기재된 사용

(4) 항체가 인간 NR10에 결합하는 단일클론항체인, (2)에 기재된 사용

(5) 항체가 재조합 항체인, (2)~(4) 중 어느 하나에 기재된 사용

(6) 재조합 항체가 키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체인, (5)에 기재된 사용

(7) NR10에 대한 중화활성을 갖는 항체의 단편 및/또는 그의 수식물을 유효성분으로서 함유하는, (2)~(6) 중 어느 하나에 기재된 사용

(8) 염증성 질환이 아토피성 피부염인 (1)~(7) 중 어느 하나에 기재된 사용

(9) 염증성 질환이 만성 피부염인 (1)~(7) 중 어느 하나에 기재된 사용

(10) 염증성 질환이 류머티즘인 (1)~(7) 중 어느 하나에 기재된 사용

(11) 염증성 질환이 변형성 관절증인 (1)~(7) 중 어느 하나에 기재된 사용

또한, 본 명세서에서 인용된 모든 선행기술 문헌은 참조로써 본 명세서에 포함된다.

[ 실시예 ]

이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명하지만 본 발명은 이들 실시예에 제한되는 것은 아니다.

[실시예 1] NR10 및 OSMR 발현 Ba/F3 세포주의 수립

인간 NR10 cDNA(WO 0075314 SEQ ID No: 1)를 발현벡터 pCOS1(Biochem Biophys Res Commun. 228, p838-45, 1996)에 삽입하여, pCosNR10.3로 하였다. 온코스타틴 M 수용체 cDNA(OSMR, GenBank accession No.NM003999)를 인간 태반 라이브러리로부터 PCR법에 의해 단리하고, 동일하게 발현벡터 pCos1-hOSMR을 구축하였다. 마우스 IL-3 의존성 pro-B 세포 유래 세포주 Ba/F3에, 각각의 벡터 10 ㎍씩을 동시에 전기천공법으로 도입하였다(BioRad Gene Pulser, 960 ㎌, 0.33 kV). 도입 후에는, 인간 IL-31을 첨가·배양하여, IL-31 의존성에 증식을 나타내는 세포주를 얻었다. 동일하게, 마우스 IL-31 의존성 세포주도, 마우스 NR10 및 마우스 OSMR 유전자를 발현시킨 Ba/F3 세포로부터 제작하였다.

모두 수 ng/mL의 ED50을 나타내, 양호하게 증식하는 세포주가 얻어졌다. 인간 IL-31 의존성 세포주는 마우스 IL-31에 반응하지 않고, 인간 NR10 단백(세포외영역) 첨가에 의해 억제되었다. 마우스 IL-31 의존성 세포주는 인간 IL-31에 반응하지 않고, 마우스 NR10 첨가 단백(세포외영역)에 의해 억제되지 않았다.

[실시예 2] NR10 단백(세포외영역)의 조제

인간 NR10 cDNA를 주형으로, PCR법에 의해 세포외영역만을 증폭하고, 또한 C 말단에 FLAG 태그서열을 부가하여, 발현벡터 pCXND3(WO2005/005636)에 삽입하였다(pCXND3-NR10-flag). 직쇄상으로 한 이 벡터 10 ㎍을 차이니즈 햄스터 난소 세포주 DG44에 전기천공법에 의해 도입하여(BioRad Gene PulserII, 25 ㎌, 1.5 ㎸), 고발현을 나타내는 세포주를 얻었다. 이 세포주를 대량 배양한 배양상청으로부터 항 FLAG 항체 칼럼(SIGMA제), 겔 여과법에 의해 정제 표품을 얻어, 이하의 실험에 제공하였다. C 말단에 FLAG 태그서열을 부가한 마우스 NR10(세포외영역)도 동일하게 조제하였다.

[실시예 3] 항 마우스 NR10 중화활성을 갖는 scFv의 단리와 키메라 IgG화 BM095의 조제

구체적으로는, 본 발명자들은, 인간 항체 파지 라이브러리로부터, 비오틴화 한 마우스 NR10 단백(세포외영역)을 사용해서 패닝법으로 후보 클론의 폭을 좁혔다. 이들의 클론으로부터 분비 scFv를 정제하여, 이것을 실시예 1에 기재된 IL-31 의존성 Ba/F3 세포 증식 어세이계에 첨가하였다. 그 결과, 강한 증식억제 활성을 나타내는 클론 BM095를 얻는 데에 성공하였다.

PCR법에 의해 BM095의 인간 H쇄 가변영역 서열(VH)을 마우스 IgG2a 정상영역(CH1 이하)에, 인간 L쇄 가변영역 서열(VL)을 마우스 λ쇄 정상영역에 연결하여, 발현벡터를 구축하였다. 이때의 VH의 아미노산 서열을 서열번호: 1에, 상기 아미노산 서열을 코드하는 염기서열을 서열번호: 2에 나타낸다. 또한, VL의 아미노산 서열을 서열번호: 3에, 상기 아미노산 서열을 코드하는 염기서열을 서열번호: 4에 나타낸다. 직쇄상으로 한 각각의 발현벡터를 동시에 DG44주에 도입하여, 키메라 IgG의 높은 발현량을 나타내는 세포주를 선별하였다. 이 세포주를 대량 배양한 배양상청으로부터, 프로테인 A(rProtein A Sepharose Fast Flow, GE Amersham Biosciences제)칼럼, 양이온 교환(SP-TOYOPEARL 650M, TOSOH제)칼럼 크로마토그래피에 의해, 정제 표품을 얻었다. 또한, ActiClean Etox(Sterogen제) 수지에 의해 파이로젠을 검출 한계 이하까지 저감하여, 이하의 동물실험에 제공하였다. 또한, 상기 어세이계에 BM095를 첨가했을 때의 결과를, 도 1에 나타낸다.

[실시예 4] NC/Nga 마우스를 사용한 아토피성 피부염 모델에서의 약효검토

피부염 모델은 염화피크릴(PiCl) 도포를 주 1회 반복함으로써 제작하였다. 즉, 5% PiCl(150 μL) 복부·족척으로의 감작 4일 후부터, 0.8% PiCl(150 μL) 배부(背部)·이개로의 주 1회 유발을 반복하였다. 3주째부터 6주에 걸쳐서, 주 2회 증상을 관찰하고, 5개의 시점((1) 소양증, (2) 발적·출혈, (3) 부종, (4) 손상·조직결손, (5) 가피(痂皮)형성·건조)에서 각 0~3점의 스코어링을 실시하였다. 항체는, 감작·각 유발 전일의 6회(BM095군), 또는 3주째 이후의 각 유발 전일의 3회(V/B군), 10 ㎎/㎏으로 복강내 투여하였다. 양성대조로서, 3주째 이후 매일 1 ㎎/㎏ 덱사메타손을 경구 투여하였다(DEX군). 각각 한 군 10마리의 NC/Nga 마우스♂를 사용하였다.

도 2에 나타내는 바와 같이, 용매 투여 vehicle군에 비해, 항체 투여군에서는 유의한 억제효과가 확인되었다. 또한 이때, 도 2에 나타내는 바와 같이, DEX군에서는 유의한 체중 감소가 확인되었지만, 항체 투여군에서는 변화는 없어, 매우 안전한 약제인 것이 시사되었다.

[실시예 5] 염화피크릴 반복 도포에 의한 만성 피부염 모델에서의 약효 검토

6주령의 자성 BALB/c 마우스에, 20 μL의 0.5% 염화피크릴(acetone/olive oil(1:4 v/v)용액)을 오른쪽 귀에 도포해서 감작을 행하였다. 감작 후 8일째부터 1일 간격으로 오른쪽 귀에 20 μL의 0.25% 염화피크릴(acetone/olive oil(1:4 v/v))을 도포함으로써 유발을 반복하였다. BM095의 예방효과 평가군에는 감작 전일부터, BM095 치료 효과 평가군에는 유발 개시 후 20일째부터, 주 1회, 10 ㎎/㎏의 BM095를 복강 내 투여하였다. Dial thickness gauge에 의해 오른쪽 귀의 두께를 경시적으로 측정함으로써, 이개 종창을 평가하였다.

그 결과, 도 4에 나타내는 바와 같이, 항체 투여군에서는 유의한 억제효과가 확인되었다. 아토피성 피부염 환자의 비후한 표피에서는 인간 NR10의 발현이 항진되어 있는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 1). 상기 만성 피부염 모델의 마우스 이개의 면역조직 염색을 행한 바, 인간과 동일하게 비후한 표피에서 마우스 NR10의 발현 항진이 관찰되었다(도 5. 실시예 3에서 정상영역을 인간 IgG로 변환한 BM095를 제작하여, 면역조직 염색에 이용하였다. 다갈색으로 발색되어 있는 부분이 NR10 발현부위). 본 소견은, 인간 및 마우스에서 염증성 질환에 대해 NR10이 동일하게 관여하고 있는 것을 시사한다.

[실시예 6] 콜라겐 유발 관절염(류머티즘) 모델에서의 약효 검토

모델 마우스의 제작 및 약효 평가는 이하와 같이 행하였다.

9주령의 암컷 DBA/1JN 마우스에 대해, 소 관절 유래 0.3% II형 콜라겐과 Complete Adjuvant H37Ra를 등량 혼합한 콜라겐 겔 140 μL를 미근부(尾根部) 피내에 투여하였다(Day 0, 감작). 3주간 후에 동일하게 조제한 콜라겐 겔을 배부 피내에 투여하여, 관절염의 발증을 유도하였다(Day 21, 유발). 감작 전전일(Day -2)의 체중을 토대로 마우스 16마리를 각 8마리의 2군으로 나누어, 용매 투여군과 BM095 투여군을 설정하였다. 피험물질인 BM095는 PBS로 6배 희석시킨 20 m㏖/L Acetate buffer(pH 5.5)(200 m㏖/L NaCl)를 용매로써, BM095 투여군의 8마리의 마우스에 대해 10 ㎎/㎏ 체중이 되도록 감작 전일(Day -1)에 정맥 내 투여하였다. 한편, 대조의 용매 투여군으로 한 8마리의 마우스에 대해서는, 체중당 동일 용량이 되도록 용매를 Day -1에 투여하였다. 또한, 유발 전일(Day 20)부터 2-3일 간격으로 사지의 종창을 관찰하고, 스코어링(1지당 0-4점: 16점 만점)으로 평가하였다.

그 결과, 도 6에 나타내는 바와 같이, BM095 투여군에서는 Day 20 이후의 사지의 종창에서 스코어의 저하가 보여, BM095는 관절염 발증 억제작용을 갖는 것이 나타났다.

[실시예 7] 콜라게나제 유발 관절염(변형성 관절증) 모델에서의 약효 검토

모델 마우스의 제작 및 약효평가는 이하와 같이 행하였다.

8주령의 수컷 C57BL/6J Jcl 마우스(일본 클레아제)에 대해, 용매 대조(PBS로 6배 희석시킨 20 m㏖/L Acetate buffer, pH 5.5, 200 m㏖/L NaCl, n=5), BM095 2 ㎎/㎏(n=5), BM095 20 ㎎/㎏(n=6)을 미정맥으로부터 정맥내 투여하였다(5 mL/㎏). 그 후 3% 이소플루란 흡입 마취하에서, 0.45 ㎛ 필터(MILLIPORE사제)로 여과한 1.5% 콜라게나제 용액(TypeII, Sigma사제) 6 μL를 우측 슬관절강 내에 투여하였다(Am J Pathol 1989; 135(6): 1001-14).

좌우의 슬관절 폭에 대해, 캘리퍼스(미츠토요제)를 사용해서 콜라게나제 투여직전, 투여 후 3, 7, 14일에 측정하여, 좌우의 차를 산출하였다. 이 차를 우측 슬관절의 종창을 나타내는 값으로 하고, 그 추이의 곡선하 면적(AUC)을 사다리꼴 법칙으로 산출하여, 약효의 지표로 하였다. AUC에 관해서, 용매 대조군과 BM095 투여군 사이에서 통계 해석 소프트웨어(SAS Institute사제)를 사용해서 Student t검정을 행하였다(p<0.05의 경우 유의차 있음). 그 결과, 도 7에 나타내는 바와 같이, BM095 투여군의 AUC는, 어떤 용량에서도 용매 대조군에 비해 유의하게 작았다. 이 결과로부터, BM095가 변형성 관절증 모델에서의 관절염을 억제하는 것이 명확해졌다.

[실시예 8] 항 인간 NR10 중화항체의 취득

인간 NR10 단백(세포외영역)[실시예 2에 기재]을 마우스에 면역하고, 통상의 방법으로 하이브리도마를 제작하였다. 이들 하이브리도마의 배양상청을, 실시예 1에서 나타낸 인간 IL-31 의존성 세포주(hNR10/hOSMR/BaF3 세포)를 사용한 중화활성으로 평가하고, 높은 NR10 중화활성을 갖는 몇 개의 클론을 얻었다(도 8).

[실시예 9] 인간·키메라 항체의 제작

중화항체 중에서 가장 활성이 높았던, NA633의 중쇄 가변영역의 아미노산 서열을 서열번호: 16에, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열을 서열번호: 17에 나타낸다. 또한, NA633의 중쇄 가변영역의 CDR1의 아미노산 서열을 서열번호: 18에, CDR2의 아미노산 서열을 서열번호: 19에, CDR3의 아미노산 서열을 서열번호: 20에, 경쇄 가변영역의 CDR1의 아미노산 서열을 서열번호: 21에, CDR2의 아미노산 서열을 서열번호: 22에, CDR3의 아미노산 서열을 서열번호: 23에 나타낸다.

또한, 통상적인 방법에 따라, 이들 마우스 가변영역과 인간 정상영역(H쇄는 IgG1, L쇄는 κ)의 키메라 항체를 제작하여, 중화활성을 측정하였다. 도 9에 나타내는 바와 같이, 키메라 NA633 항체는 저농도에서 강한 중화활성을 나타내었다.

[실시예 10] 게잡이원숭이 NR10의 단리

전(前)임상단계에서의 안전성 평가를 위해, 게잡이원숭이로의 교차성·중화활성이 중요하다고 생각되어, 게잡이원숭이 NR10 유전자의 단리를 시도하였다. 공개되어 있는 붉은털원숭이 게놈 정보 등으로부터 프라이머를 설계하여, PCR법에 의해 게잡이원숭이 장기로부터 NR10 유전자의 증폭에 성공하였다. 단리한 게잡이원숭이 NR10과 인간 NR10의 아미노산 서열의 얼라이먼트를 도 10에 나타낸다. 또한, 게잡이원숭이 NR10의 아미노산 서열을 서열번호: 24에 나타낸다. 이 게잡이원숭이 NR10 유전자를 사용하여, 실시예 1에서 기술한 바와 같이, 인간 OSMR 유전자와 함께 Ba/F3 세포에 도입하여, 인간 IL-31 의존성 증식을 나타내는 세포주를 수립하였다. 이 세포주를 사용하여 실시예 9의 키메라 항체 NA633의 중화활성을 조사한 결과, 게잡이원숭이에서도 강한 중화활성을 나타내는 것이 판명되었다(도 11).

[참고예 1] Dextran Sulfate Sodium (DSS) 유발 대장염에 대한 BM095의 약효

염증성 장질환(IBD)의 병태 모델로 보고되어 있는 DSS 유발 대장염 모델(J Immunol 2003; 171: 5507-5513)을 제작하여, 항 마우스 NR10 중화항체인 BM-095의 효과를 검토하였다. Dextran Sulfate Sodium Salt(와코순약제)의 5%(w/v) 수용액을, 0.22 ㎛ 필터(Millipore제)로 여과 멸균한 증류수를 사용하여 조제하고, 6주령의 수컷 Balb/cAnN Crj 마우스(일본 찰스·리버제)에 급수병으로 7일간 자유섭취시키고, 체중을 측정하여, DSS 투여 개시일의 체중에 대한 변화율을 약효의 평가 항목으로 하였다.

본 모델에서, IL-31 시그널링 중화에 의한 병태의 개선 여부를, 항 마우스 NR10 중화항체인 BM095를 DSS 투여 전일에 10 ㎎/㎏의 용량으로 정맥내 투여하여 체중 감소를 평가하였다(n=10). 용매 대조군으로, 용매(초산 완충액[20 m㏖/L 초산나트륨, 20 m㏖/L 염화나트륨]와 인산 완충 생리식염수[PBS, GIBCO제]를 용량비 1:5로 혼합한 것)를, DSS 투여 전일에 정맥내 투여한 군(Vehicle군, n=10)을 마련하였다. 또한, 정상 마우스의 체중 변화율의 추이를 파악하기 위해, DSS 투여군과 같은 주령, 성별의 Balb/cAnN Crj 마우스의 체중 변화율의 추이도 관찰하였다(n=1).

체중의 추이를 도 12에 나타내었다. Vehicle군에서는 DSS 투여에 의해 체중 변화율이 저하하였다. 한편, BM095 투여군에서도 Vehicle군과 동일한 체중 추이를 나타내었으나, DSS 투여 후 4 및 5일 후의 BM095군에서는 Vehicle군보다도 유의하게 체중 변화율이 저하하였다. 이들 결과로부터, BM095 투여에 의한 본 모델의 대장염 치료 효과가 인정되지 않았다.

본 모델에서는, IL-31RA의 발현이 항진되는 것이 보고되어 있지만(WO2004/003140), 상기 실험의 결과, 동 분자의 중화항체는 본 모델의 대장염에 대해 치료 효과가 없는 것이 명확해졌다.

[참고예 2] 급성 Picryl chloride 접촉성 피부염 모델에 대한 BM095의 약효

급성 접촉성 피부염의 모델로 보고되어 있는(Clin Immunol 2003; 108: 257-262), 염화피크릴 도포에 의한 감작·유발에 따른 지연형 과민증 반응의 결과 생기는 피부염을 제작하고, 항 마우스 NR10 중화항체인 BM-095의 효과를 검토하였다. 8주령의 암컷 Balb/cAnN Crj 마우스(일본 찰스·리버제)의 복부피부에, 50 μL의 7% 염화피크릴(nacalai tesque, Inc.)용액(에탄올:아세톤=3:1, v/v)을 도포하여 감작하고, 5일 후에 20 μL의 1% 염화피크릴 용액(아세톤:올리브=1:4, v/v)을 오른쪽 이개피부에 도포하여 접촉성 피부염을 야기하였다(유발). 용매의 이개의 두께로의 영향을 평가하기 위한 대조로써, 20 μL의 용매(아세톤:올리브=1:4, v/v)를 동일 마우스의 왼쪽의 이개피부에 도포하였다(양성 대조군, n=6). 유발 직전 및 유발 후 24, 48, 72시간에 좌우 귀의 두께를 Dial thickness gauge(오자키 제작소제)로 측정하고, 유발 직전의 이개의 두께에 대한 변화를 약효 평가항목으로 하였다.

병태의 성립을 평가하기 위한 대조군으로써, 감작시에 염화피크릴을 포함하지 않는 에탄올:아세톤 혼합액(3:1, v/v)을 복부피부에 도포하고, 그 5일 후에 20 μL의 1% 염화피크릴 용액을 오른쪽 이개피부에, 용매(아세톤:올리브=1:4, v/v) 20 μL를 왼쪽 이개피부에 도포한 군(음성 대조군, n=6)을 마련하였다.

본 계(係) 병태에서의 항 NR10 항체 투여의 효과를 평가하기 위해서, 상기 양성 대조군의 방법으로 급성 접촉성 피부염을 야기하고, 감작 전일 및 유발 전일에 BM095 10 ㎎/㎏을 정맥내 투여한 군(BM095군, n=6)과, 같은 타이밍으로 용매(초산 완충액[20 m㏖/L 초산나트륨, 20 m㏖/L 염화나트륨]과 인산 완충 생리식염수[PBS, GIBCO제]를 용량비 1:5로 혼합한 것)을 투여한 군(Vehicle군, n=5)을 마련하였다.

유발 후 72시간까지의 이개의 두께의 변화를 도 13에 나타내었다. 양성 대조군은 유발 후 24, 48, 72시간 중 어느 것에서도 음성 대조군에 대해 이개가 비후되어 있어, 병태가 성립한 것이 나타났다. 이 때, BM-095군은 Vehicle군과 동일한 이개 두께의 추이를 나타내, 유의한 억제는 확인되지 않았다.

이들 결과로부터, BM095 투여에 의한 본 모델에서 관찰되는 급성 접촉성 피부염에 대한 치료 효과는 인정되지 않는 것이 판명되었다.

본 발명에 의해서, 새로운 염증성 질환의 예방 또는 치료제가 제공되었다. 본 발명에 의해서 제공된 염증성 질환의 예방 또는 치료제는, 그 활성성분으로 NR10 안타고니스트, 보다 바람직하게는 NR10에 대한 중화활성을 갖는 항체를 함유한다.

최근, 단일클론항체에 의한 항사이토카인 요법이 주목받고 있다. 그러나 실제의 병태에서는 대부분의 경우, 하나의 사이토카인을 차단해도 그 대상 경로가 작용하여, 치료 효과를 얻는 것은 곤란한 상황이었다. 또한, 타겟으로 하는 사이토카인을 차단한 경우, 어떠한 질환에서 치료 효과가 얻어지는지를 예측하는 것은 곤란하였다. 이러한 가운데, 본 발명자들은, 항 NR10 중화항체가 아토피성 피부염, 만성 피부염, 류머티즘, 변형성 관절증 등을 발증한 모델 마우스에서, 그 병상을 현저히 억제할 수 있는 것을 발견하였다.

또한, 본 발명자들은, 인간 NR10 중화항체의 취득에도 성공하였다. 인간 NR10 중화항체를 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 또는 치료제는, 인간으로의 임상 응용면에서 매우 유용하다.

SEQUENCE LISTING <110> CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA <120> PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING INFLAMMATORY DISEASE <130> C1-A0606P <150> JP 2006-160096 <151> 2006-06-08 <160> 24 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 125 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Asp Val Val Pro Ala Ala Met Ser Phe Tyr Tyr Gly Met 100 105 110 Asp Val Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 2 <211> 375 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 caggtccagc tggtacagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg 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Ala Pro 225 230 235 240 Cys Gly Leu Glu Leu Trp Arg Val Leu Lys Pro Ala Glu Ala Asp Gly 245 250 255 Arg Arg Pro Val Arg Leu Leu Trp Lys Lys Ala Arg Gly Ala Pro Val 260 265 270 Leu Glu Lys Thr Leu Gly Tyr Asn Ile Trp Tyr Tyr Pro Glu Ser Asn 275 280 285 Thr Asn Leu Thr Glu Thr Met Asn Thr Thr Asn Gln Gln Leu Glu Leu 290 295 300 His Leu Gly Gly Glu Ser Phe Trp Val Ser Met Ile Ser Tyr Asn Ser 305 310 315 320 Leu Gly Lys Ser Pro Val Ala Thr Leu Arg Ile Pro Ala Ile Gln Glu 325 330 335 Lys Ser Phe Gln Cys Ile Glu Val Met Gln Ala Cys Val Ala Glu Asp 340 345 350 Gln Leu Val Val Lys Trp Gln Ser Ser Ala Leu Asp Val Asn Thr Trp 355 360 365 Met Ile Glu Trp Phe Pro Asp Val Asp Ser Glu Pro Thr Thr Leu Ser 370 375 380 Trp Glu Ser Val Ser Gln Ala Thr Asn Trp Thr Ile Gln Gln Asp Lys 385 390 395 400 Leu Lys Pro Phe Trp Cys Tyr Asn Ile Ser Val Tyr Pro Met Leu His 405 410 415 Asp Lys Val Gly Glu Pro Tyr Ser Ile Gln Ala Tyr Ala Lys Glu Gly 420 425 430 Val Pro Ser Glu Gly Pro Glu Thr Lys Val Glu Asn Ile Gly Val Lys 435 440 445 Thr Val Thr Ile Thr Trp Lys Glu Ile Pro Lys Ser Glu Arg Lys Gly 450 455 460 Ile Ile Cys Asn Tyr Thr Ile Phe Tyr Gln Ala Glu Gly Gly Lys Gly 465 470 475 480 Phe Ser Lys Thr Val Asn Ser Ser Ile Leu Gln Tyr Gly Leu Glu Ser 485 490 495 Leu Lys Arg Lys Thr Ser Tyr Ile Val Gln Val Met Ala Ser Thr Ser 500 505 510 Ala Gly Gly Thr Asn Gly Thr Ser Ile Asn Phe Lys Thr Leu Ser Phe 515 520 525 Ser Val Phe Glu Ile Ile Leu Ile Thr Ser Leu Ile Gly Gly Gly Leu 530 535 540 Leu Ile Leu Ile Ile Leu Thr Val Ala Tyr Gly Leu Lys Lys Pro Asn 545 550 555 560 Lys Leu Thr His Leu Cys Trp Pro Thr Val Pro Asn Pro Ala Glu Ser 565 570 575 Ser Ile Ala Thr Trp His Gly Asp Asp Phe Lys Asp Lys Leu Asn Leu 580 585 590 Lys Glu Ser Asp Asp Ser Val Asn Thr Glu Asp Arg Ile Leu Lys Pro 595 600 605 Cys Ser Thr Pro Ser Asp Lys Leu Val Ile Asp Lys Leu Val Val Asn 610 615 620 Phe Gly Asn Val Leu Gln Glu Ile Phe Thr Asp Glu Ala Arg Thr Gly 625 630 635 640 Gln Glu Asn Asn Leu Gly Gly Glu Lys Asn Gly Thr Arg Ile Leu Ser 645 650 655 Ser Cys Pro Thr Ser Ile 660 <210> 7 <211> 732 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SIGNAL <222> (1)..(20) <220> <221> TRANSMEM <222> (520)..(543) <400> 7 Met Met Trp Thr Trp Ala Leu Trp Met Leu Pro Ser Leu Cys Lys Phe 1 5 10 15 Ser Leu Ala Ala Leu Pro Ala Lys Pro Glu Asn Ile Ser Cys Val Tyr 20 25 30 Tyr Tyr Arg Lys Asn Leu Thr Cys Thr Trp Ser Pro Gly Lys Glu Thr 35 40 45 Ser Tyr Thr Gln Tyr Thr Val Lys Arg Thr Tyr Ala Phe Gly Glu Lys 50 55 60 His Asp Asn Cys Thr Thr Asn Ser Ser Thr Ser Glu Asn Arg Ala Ser 65 70 75 80 Cys Ser Phe Phe Leu Pro Arg Ile Thr Ile Pro Asp Asn Tyr Thr Ile 85 90 95 Glu Val Glu Ala Glu Asn Gly Asp Gly Val Ile Lys Ser His Met Thr 100 105 110 Tyr Trp Arg Leu Glu Asn Ile Ala Lys Thr Glu Pro Pro Lys Ile Phe 115 120 125 Arg Val Lys Pro Val Leu Gly Ile Lys Arg Met Ile Gln Ile Glu Trp 130 135 140 Ile Lys Pro Glu Leu Ala Pro Val Ser Ser Asp Leu Lys Tyr Thr Leu 145 150 155 160 Arg Phe Arg Thr Val Asn Ser Thr Ser Trp Met Glu Val Asn Phe Ala 165 170 175 Lys Asn Arg Lys Asp Lys Asn Gln Thr Tyr Asn Leu Thr Gly Leu Gln 180 185 190 Pro Phe Thr Glu Tyr Val Ile Ala Leu Arg Cys Ala Val Lys Glu Ser 195 200 205 Lys Phe Trp Ser Asp Trp Ser Gln Glu Lys Met Gly Met Thr Glu Glu 210 215 220 Glu Ala Pro Cys Gly Leu Glu Leu Trp Arg Val Leu Lys Pro Ala Glu 225 230 235 240 Ala Asp Gly Arg Arg Pro Val Arg Leu Leu Trp Lys Lys Ala Arg Gly 245 250 255 Ala Pro Val Leu Glu Lys Thr Leu Gly Tyr Asn Ile Trp Tyr Tyr Pro 260 265 270 Glu Ser Asn Thr Asn Leu Thr Glu Thr Met Asn Thr Thr Asn Gln Gln 275 280 285 Leu Glu Leu His Leu Gly Gly Glu Ser Phe Trp Val Ser Met Ile Ser 290 295 300 Tyr Asn Ser Leu Gly Lys Ser Pro Val Ala Thr Leu Arg Ile Pro Ala 305 310 315 320 Ile Gln Glu Lys Ser Phe Gln Cys Ile Glu Val Met Gln Ala Cys Val 325 330 335 Ala Glu Asp Gln Leu Val Val Lys Trp Gln Ser Ser Ala Leu Asp Val 340 345 350 Asn Thr Trp Met Ile Glu Trp Phe Pro Asp Val Asp Ser Glu Pro Thr 355 360 365 Thr Leu Ser Trp Glu Ser Val Ser Gln Ala Thr Asn Trp Thr Ile Gln 370 375 380 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Leu Lys Pro Cys Ser Thr Pro Ser Asp Lys Leu Val Ile Asp Lys Leu 595 600 605 Val Val Asn Phe Gly Asn Val Leu Gln Glu Ile Phe Thr Asp Glu Ala 610 615 620 Arg Thr Gly Gln Glu Asn Asn Leu Gly Gly Glu Lys Asn Gly Tyr Val 625 630 635 640 Thr Cys Pro Phe Arg Pro Asp Cys Pro Leu Gly Lys Ser Phe Glu Glu 645 650 655 Leu Pro Val Ser Pro Glu Ile Pro Pro Arg Lys Ser Gln Tyr Leu Arg 660 665 670 Ser Arg Met Pro Glu Gly Thr Arg Pro Glu Ala Lys Glu Gln Leu Leu 675 680 685 Phe Ser Gly Gln Ser Leu Val Pro Asp His Leu Cys Glu Glu Gly Ala 690 695 700 Pro Asn Pro Tyr Leu Lys Asn Ser Val Thr Ala Arg Glu Phe Leu Val 705 710 715 720 Ser Glu Lys Leu Pro Glu His Thr Lys Gly Glu Val 725 730 <210> 8 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 8 Gly Gly Gly Ser 1 <210> 9 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 9 Ser Gly Gly Gly 1 <210> 10 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 10 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 11 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 11 Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 12 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 12 Gly Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 13 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 13 Ser Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 14 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 14 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 15 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 15 Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 16 <211> 119 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 16 Asp Val Gln Leu Arg Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp 20 25 30 Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp 35 40 45 Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Val Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe 65 70 75 80 Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Pro Met Ile Thr Thr Asp Trp Phe Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly 100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 17 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 17 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser His Asp Ile Ser Asp Phe 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Gly His Ser Phe Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 18 <211> 6 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 18 Ser Asp Tyr Ala Trp Asn 1 5 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290 295 300 Tyr Asn Ser Leu Gly Lys Ser Pro Val Thr Thr Leu Arg Ile Pro Ala 305 310 315 320 Ile Gln Glu Lys Ser Phe Arg Cys Ile Glu Val Met Gln Ala Cys Leu 325 330 335 Ala Glu Asp Gln Leu Val Val Lys Trp Gln Ser Ser Ala Leu Asp Val 340 345 350 Asn Thr Trp Met Ile Glu Trp Phe Pro Asp Met Asp Ser Glu His Pro 355 360 365 Thr Leu Ser Trp Glu Ser Val Ser Gln Ala Thr Asn Trp Thr Ile Gln 370 375 380 Gln Asp Lys Leu Lys Pro Phe Trp Cys Tyr Asn Ile Ser Val Tyr Pro 385 390 395 400 Met Leu His Asp Lys Val Gly Glu Pro Tyr Ser Ile Gln Ala Tyr Ala 405 410 415 Lys Glu Gly Ile Pro Ser Lys Gly Pro Glu Thr Lys Val Glu Asn Ile 420 425 430 Gly Val Lys Thr Val Thr Ile Thr Trp Lys Glu Ile Pro Lys Ser Glu 435 440 445 Arg Lys Gly Ile Ile Cys Asn Tyr Thr Ile Phe Tyr Gln Ala Glu Gly 450 455 460 Gly Lys Gly Phe Ser Lys Thr Val Asn Ser Ser Ile Leu Gln Tyr Gly 465 470 475 480 Leu Glu Ser Leu Lys Arg Lys Thr Ser Tyr Thr Val Arg Val Met Ala 485 490 495 Ser Thr Ser Ala Gly Gly Ile Asn Gly Thr Ser Ile Asn Phe Lys Thr 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710 715 720 Phe Leu Val Ser Gln Lys Leu Pro Glu His Thr Lys Gly Glu Val 725 730 735

Claims

인간 NR10 및 게잡이 원숭이 NR10 중 어느 것에 대해서도 결합하고, 또한, 중화활성을 갖는 항 NR10 항체를 유효성분으로 함유하는, 염증성 질환의 예방 또는 치료제로서, 염증성 질환이 아토피성 피부염, 만성 피부염, 류머티즘 또는 변형성 관절증이고, 상기 염증성 질환이 아토피성 피부염인 경우에는, 아토피성 피부염에 있어서 (1) 소양증, (2) 발적·출혈, (3) 부종, (4) 손상·조직결손, 및 (5) 가피(痂皮)형성·건조로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 증상을 억제하는 것을 특징으로 하는 예방 또는 치료제.
제1항에 있어서,
항체가 단일클론항체인, 예방 또는 치료제.
제1항에 있어서,
항체가 재조합 항체인, 예방 또는 치료제.
제3항에 있어서,
재조합 항체가 키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체인, 예방 또는 치료제.
제1항에 있어서,
인간 NR10 및 게잡이 원숭이 NR10 중 어느 것에 대해서도 결합하고, 또한, 중화활성을 갖는 항 NR10 항체의 Fab, Fab', F(ab')₂ 또는 Fv 단편 및/또는 이들에 화학적 수식을 행한 콘쥬게이트 항체를 유효성분으로 함유하는, 예방 또는 치료제.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
염증성 질환이 아토피성 피부염인 예방 또는 치료제.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
염증성 질환이 만성 피부염인 예방 또는 치료제.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
염증성 질환이 류머티즘인 예방 또는 치료제.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
염증성 질환이 변형성 관절증인 예방 또는 치료제.
염증성 질환의 예방 또는 치료를 위해 사용하는 제(劑)의 제조에서의, 인간 NR10 및 게잡이 원숭이 NR10 중 어느 것에 대해서도 결합하고, 또한, 중화활성을 갖는 항 NR10 항체의 사용방법으로서, 염증성 질환이 아토피성 피부염, 만성 피부염, 류머티즘 또는 변형성 관절증이고, 상기 염증성 질환이 아토피성 피부염인 경우에는, 아토피성 피부염에 있어서 (1) 소양증, (2) 발적·출혈, (3) 부종, (4) 손상·조직결손, 및 (5) 가피(痂皮)형성·건조로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 증상을 억제하는 것을 특징으로 하는 사용방법.
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