MX2008015568A

MX2008015568A - Agentes para prevenir o tratar enfermedades inflamatorias.

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Publication number: MX2008015568A
Application number: MX2008015568A
Authority: MX
Inventors: Masakazu Hasegawa; Hidetomo Kitamura; Hideki Adachi; Keiko Kasutani
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2006-06-08
Filing date: 2007-06-08
Publication date: 2009-01-13
Also published as: TW200810778A; TWI419703B; CN103272232B; US20150315280A1; EP2371393B1; KR101557603B1; CA2654623C; KR20090024243A; BRPI0712426A2; RU2511406C2; AU2007255753A1; PL2047863T3; UA100116C2; EP2371393A1; ES2544888T3; DK2047863T3; EP2047863A1; US9745378B2; CN103272232A; CL2007001665A1

Abstract

Se obtiene de una biblioteca de fagos de anticuerpo humano un clon BM095, que muestra una potente actividad inhibidora de proliferación en un sistema de análisis de proliferación de células Ba/F3 dependiente de IL-31. Cuando se le administra a un animal modelo de dermatitis atópica con el uso de un ratón Nc/Nga, un modelo de dermatitis crónica en ratón inducido por la aplicación repetida de cloruro de picrilo, un ratón modelo de artritis reumatoide y un ratón modelo de artritis deformante, este anticuerpo neutralizante de NR10 anti-ratón muestra un efecto notable de inhibición de los síntomas. Así, queda claro que este anticuerpo neutralizador anti-NR10 es útil en la práctica como un remedio para enfermedades inflamatorias. Además, el anticuerpo neutralizante NR10 anti-humano es adquirido exitosamente, y por ello, se proporciona un remedio muy útil que es aplicable clínicamente en la práctica.

Description

AGENTES PARA PREVENIR O TRATAR ENFERMEDADES INFLAMATORIAS Campo de la invención La presente invención se relaciona con novedosos agentes para prevenir o tratar enfermedades inflamatorias, que contienen antagonistas NR 10 como ingredientes activos. La presente invención también se relaciona con métodos para prevenir o tratar enfermedades inflamatorias, que emplean antagonistas NR 10. Antecedentes de la invención Muchas citoquinas son conocidas como factores humorales relacionados con el crecimiento y la diferenciación de diversos tipos de células, o con la activación de las funciones de células maduras diferenciadas. Las células estimuladas con citoquinas producen diferentes tipos de citoquinas, formando de esa manera redes de múltiples citoquinas en el cuerpo. La homeostasis biológica se mantiene gracias a un delicado equilibrio de regulación mutua entre las citoquinas que conforman estas redes. Se cree que muchas enfermedades inflamatorias son el resultado de una falla de dichas redes de citoquinas. Por lo tanto, hay una inclinación hacia las terapias anticitoquina basadas en anticuerpos monoclonales. Por ejemplo, se ha demostrado que los anticuerpos anti-TNF y los anticuerpos anti-receptor de IL-6 son muy eficaces en aplicaciones clínicas. Por otro lado, hay muchos ejemplos de fallas en donde no se producían efectos terapéuticos cuando se bloqueaba una sola citoquina, tal como IL-4, debido a la activación de vías compensatorias en afecciones patológicas reales. Los inventores de la presente pudieron aislar un nuevo receptor de citoquina NR 10 que era altamente homólogo al gp130, un receptor para la transducción de señales de IL-6 (Documento 1, Patente). La NR 10 forma un heterodímero con el receptor de oncostatina M (OSMR) y funciona como un receptor de IL-31 (Documento 1, no patente). Zymogenetics, Inc. Informaron que ratones transgénicos que sobreexpresan IL-31 desarrollan espontáneamente dermatitis prurítica (Documento 2, patente). Sin embargo, no es posible asegurar que la expresión forzada de una citoquina en ratones o un alto nivel en sangre de una citoquina en modelos patológicos de ratones sea realmente la causa de enfermedades. No hay información que permita afirmar un efecto terapéutico cuando se bloquea una señal con un anticuerpo. Por ejemplo, se observa desarrollo de dermatitis prurítica en ratones transgénicos que sobreexpresan IL-18 en queratinocitos. Además, la concentración sanguínea de IL-18 aumenta con el progreso de afecciones patológicas en modelos de ratones NC/Nga de dermatitis atópica espontánea. Sobre la base de los hallazgos anteriores, se predijo que la sobreexpresión de IL-18 era la causa de la enfermedad. Sin embargo, en realidad la administración de anticuerpos neutralizantes no produjo efectos terapéuticos (Documento 2, no patente). Como se describiera previamente, la inhibición de la función de una citoquina no produce necesariamente efectos terapéuticos en aquellas enfermedades donde el nivel de expresión de una citoquina sea elevada. Es difícil efectuar una predicción de enfermedades en las cuales realmente se producen efectos terapéuticos basado en el nivel de expresión de una citoquina. Por lo tanto es importante hallar las enfermedades en las cuales la inhibición de la transducción de señales de una citoquina blanco produce realmente efectos terapéuticos. Los documentos de la técnia anterior a la presente invención se describen a continuación: Documento 1, patente: WO 00/75314 Documento 2, patente: WO 03/060090 Documento 1, no patente: IL-31 is associated with cutaneous lymphocyte antien-positive skin homing T cells in patients with atopic dermatitis, J Allergy Clin Immunol. 2006 Feb; 117(2): 418-25. Documento 2, no patente: Administration of anti-interleukin 18 antibody fails to inhibit development of dermatitis in atopic dermatitis-model mice NC/Nga, British Journal of Dermatology 149: 39-45, 2003. Breve descripción de la invención Problemas que va a resolver la invención La presente invención se realizó en vista de las circunstancias descritas precedentemente. Un objetivo de la presente invención comprende proveer terapias anticitoquina basadas en antagonistas del receptor de citoquinas para enfermedades inflamatorias. Más específicamente, el objetivo de la presente invención es descubrir enfermedades inflamatorias en las cuales se pueda obtener un efecto terapéutico usando anticuerpos neutralizantes anti-NR 10 y proveer nuevos métodos para tratar dichas enfermedades. Otro objetivo de la presente invención comprende proveer anticuerpos neutralizantes anti-NR 10 humano que sean de aplicación clínica en seres humanos. Medios para resolver los problemas Los inventores de la presente realizaron estudios dedicados para resolver los objetivos mencionados. Los inventores de la presente trataron de evaluar la eficacia como drogas de los anticuerpos neutralizantes anti-NR 10 de ratón en modelos de ratón para diversas afecciones patológicas. Los resultados demostraron que los anticuerpos neutralizantes produjeron el efecto de suprimir marcadamente los síntomas en un modelo de ratones con dermatitis atópica usando ratones NC/Nga y en modelos de ratones con dermatitis crónica, que fueron desarrollados por aplicación repetida de cloruro de picrilo. Esto demostró que los anticuerpos neutralizantes eran realmente de utilidad como agente terapéutico. Además, se demostró que los anticuerpos producían el efecto de suprimir los síntomas en la artritis inducida por colágeno, un modelo de reumatismo, y en la artritis inducida por colagenasa, un modelo de osteoartritis. Estos resultados sugieren que el anticuerpo neutralizante de NR 10 de la presente invención se puede usar para prevenir o tratar una inflamación crónica. Los inventores de la presente también pudieron obtener anticuerpos neutralizantes del NR 10 humano. Específicamente, la presente invención provee: [1] un agente para prevenir o tratar una enfermedad inflamatoria, en donde dicho agente comprende un antagonista de NR 10 como ingrediente activo; [2] el agente preventivo o terapéutico de [1], en donde el antagonista de NR 10 es un anticuerpo que tiene actividad neutralizante de NR 10; [3] el agente preventivo o terapéutico de [2], en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal; [4] el agente preventivo o terapéutico de [2], en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal que tiene actividad neutralizante de NR 10 humano; [5] el agente preventivo o terapéutico de cualquiera de [2] a [4], en donde el anticuerpo es un anticuerpo recombinante; [6] el agente preventivo o terapéutico de [5], en donde el anticuerpo recombinante es un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo humano; [7] el agente preventivo o terapéutico de cualquiera de [2] a [6], en donde dicho agente comprende como ingrediente activo un fragmento y/o un fragmento modificado del anticuerpo con actividad neutralizante de NR 10; [8] el agente preventivo o terapéutico de cualquiera de [1] a [7], en donde la enfermedad inflamatoria es dermatitis atópica; [9] el agente preventivo o terapéutico de cualquiera de [1] a [7], en donde la enfermedad inflamatoria es una enfermedad crónica; [10] el agente preventivo o terapéutico de cualquiera de [1] a [7], en donde la enfermedad inflamatoria es reumatismo; [11] el agente preventivo o terapéutico de cualquiera de [1] a [7], en donde la enfermedad inflamatoria es osteoartritis; [12] un anticuerpo que tiene actividad neutralizante de NR 10; [13] el anticuerpo de [12], que es un anticuerpo monoclonal; [14] el anticuerpo de [12], en donde NR 10 es NR 10 humano; [15] el anticuerpo de cualquiera de [12] a [14], que es un anticuerpo recombinante; [16] el anticuerpo de [15], en donde el anticuerpo recombinante es un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo humano; [17] un fragmento y/o un fragmento modificado del anticuerpo de cualquiera de [12] a [16] [18] un método para prevenir o tratar una enfermedad inflamatoria, que comprende el paso de administrar un antagonista de NR 10 a un paciente con una enfermedad inflamatoria; y [19] el uso de un antagonista de NR 10 para producir un agente para prevenir o tratar una enfermedad inflamatoria. Breve descripción de las figuras La Figura 1 es un gráfico que muestra el efecto supresor del crecimiento celular debido a la adición de BM095 a un sistema de ensayo para el crecimiento celular usando células Ba/F3 dependientes de IL-31. El eje horizontal indica las concentraciones estimadas de mlL-31 en el sistema de ensayo y el eje vertical indica el recuento de células (DO450 (absorbancia a 450 nm)). Las cantidades de BM095 que se agregaron (unidad: ng/ml) se muestran en la leyenda. Se observó un efecto supresor del crecimiento celular dependiente de la cantidad que se agregó de BM095. La Figura 2 es un gráfico que muestra el efecto terapéutico producido cuando se administraban anticuerpos anti-NR 10 al modelo de ratones de dermatitis atópica. Se observó un efecto supresor de la inflamación significativo en el grupo que recibió anticuerpo anti-NR 10 en comparación con el grupo de control negativo (grupo de vehículo). La Figura 3 es un gráfico que muestra un cambio sucesivo en el peso corporal después de administrar los anticuerpos anti-NR 10 en un modelo de ratones de dermatitis atópica. Se observó pérdida de peso en el grupo que recibió un agente antiinflamatorio existente. Por el contrario, no se detectó cambio de peso en el grupo que recibió anticuerpo anti-NR 10. Por lo tanto, se demostró que el anticuerpo anti-NR 10 es seguro. La Figura 4 es un gráfico que muestra un efecto terapéutico producido cuando se administraron anticuerpos anti-NR 10 en un modelo de ratones de dermatitis crónica. Se encontró un efecto significativo supresor de la hinchazón auricular en el grupo que recibió anticuerpo anti-NR 10. La Figura 5 es una fotografía que muestra la tinción inmunohistoquímica de la aurícula de un modelo de ratones con dermatitis crónica. Al igual que en el caso de los humanos, se encontró que la expresión del NR 10 de ratón estaba aumentada en la epidermis engrosada. La Figura 6 es un gráfico que muestra el efecto supresor de artritis producido cuando se administraron anticuerpos anti-NR 10 en modelos de ratones de artritis inducida por colágeno. La Figura 7 es un gráfico que muestra la relación entre el área bajo la curva (AUC) y la concentración de BM095 administrado en el modelo de artritis inducida por colagenasa (osteoartritis). AUC significa el área bajo la curva de transición de la diferencia entre el ancho de la articulación de rodilla derecha e izquierda definido como un valor que representa el hinchamiento en la articulación de la rodilla derecha. - La Figura 8 es un gráfico que muestra la correlación entre la concentración de anticuerpos neutralizantes NR 10 humanos (anticuerpo purificado) y una actividad supresora del crecimiento celular en presencia de IL-31. Los anticuerpos 1, 2 y 3 exhibieron una fuerte actividad neutralizante de NR 10. La Figura 9 es un gráfico que muestra la correlación entre la concentración del anticuerpo quimérico NA633 contra NR 10 humano y la actividad supresora del crecimiento celular en presencia de IL-31. El NA633 mostró una fuerte actividad neutralizante de NR 10. La Figura 10 es un diagrama que compara las secuencias de aminoácidos del NR 10 humano y el NR 10 de un mono cinomolgo. La secuencia con subrayado doble indica la región transmembrana. La Figura 11 es un gráfico que muestra la actividad supresora del crecimiento celular del anticuerpo quimérico NA633 en la línea celular OSMR/BaF humana/NR 10 de mono cinomolgo estimulada con IL-31 humano. El NA633 también mostró actividad neutralizante del NR 10 de mono cinomolgo. La Figura 12 es un gráfico que muestra la transición del porcentaje de cambio en el peso corporal en el modelo de colitis DSS en ratones. La Figura 13 es un gráfico que muestra la transición del cambio en el espesor de la aurícula en el modelo de dermatitis por contacto agudo usando cloruro de picrilo. Descripción detallada de la invención La presente invención se relaciona con agentes para prevenir o tratar enfermedades inflamatorias, que comprenden antagonistas de NR 10 como ingredientes activos. La presente invención se basa en el hallazgo de los inventores de la presente que los antagonistas de NR 10 (por ejemplo, anticuerpos neutralizantes anti-NR 10) suprimen significativamente los síntomas en modelos de ratones con dermatitis atópica, dermatitis crónica, reumatismo, osteoartritis o semejantes. El NR 10 es una proteína que forma un heterodímero con el receptor de oncostatina M (OSMR) y funciona como un receptor de IL-31. El NR 10 también se conoce con otros nombres, tal como glm-r (J Biol Chem 277, 16831-6, 2002), GPL (J Biol Chem 278, 49850-9, 2003) e IL31RA (Nat Immunol 5, 752-60, 2004). El NR 10 de la presente invención incluye a las proteínas conocidas por dichos nombres. El NR 10 de la presente invención también incluye los NR 10 derivados de humanos, ratones y otros mamíferos. Los NR 10 preferidos incluyen los NR 10 derivados de humanos y de ratón, pero no se limitan a los mismos. Existen múltiples variantes de procesamiento conocidos del NR 10 derivado de humanos (WO 00/075314). Entre las variantes de procesamiento descritas previamente, el NR 10.1 está constituido por 662 aminoácidos y comprende un dominio transmembrana. El NR 10.2 es una proteína soluble de tipo receptor que está constituido por 252 aminoácidos sin el dominio transmembrana. Además, las variantes de procesamiento de NR 10 que funcionan como proteínas tipo receptor transmembrana incluyen NR 10.3 e IL31RAv3. El NR 10 humano de la presente invención no está particularmente limitado, siempre que forme un heterodímero con el receptor de oncostatina M (OSMR) y funcione como un receptor de IL-31. Los NR 10 preferidos incluyen NR 10.3 (también denominado ILRAv4 (Nat Immunol 5, 752-60, 2004)) e IL31RAv3. El NR 10.3 (IL31RAv4) está constituido por 662 aminoácidos (WO 00/075314; Nat Immunol 5, 752-60, 2004) e IL31RAv3 está constituido por 732 aminoácidos (N° Acceso: NM_139017). La secuencia de aminoácidos de IL31RAv4 se muestra en la SEQ ID N°: 6 y la secuencia de aminoácidos de IL31RAv3 se muestra en la SEQ ID N°: 7. Además, el NR 10 derivado de ratón incluye proteínas que comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°: 5. Los antagonistas de NR 10 de la presente invención se refieren a sustancias que se unen a NR 10 y bloquean la transducción de señales intracelulares con base en la activación de NR 10, causando así la pérdida o supresión de las actividades fisiológicas de las células. En la presente, las actividades fisiológicas incluyen, por ejemplo, actividades de inducción o supresión de la producción de sustancias fisiológicamente activas (por ejemplo, quimioquinas y citoquinas inflamatorias), actividades de aumento o supresión de la secreción de sustancias, actividad de crecimiento, actividad de inducción del crecimiento, actividad de supervivencia, actividad de diferenciación, actividad inductora de la diferenciación, actividad de transcripción, actividad de transporte a través de membranas, actividad de unión, actividad proteolítica, actividad de fosforilación/desfosforilación, actividad de oxidación-reducción, actividad de transferencia, actividad nucleol ítica , actividad de deshidratación, actividad inductora de muerte celular y actividad inductora de apoptosis, pero no se limitan a las mismas. La presencia de actividad antagonista puede determinarse mediante métodos conocidos por los especialistas en la técnica. Por ejemplo, los compuestos de prueba se ponen en contacto con NR 10 expresados sobre la superficie de las células en presencia de un ligando y se determina si se genera, o no, una transducción de señales intracelular, que es un indicador de la activación de NR 10. Dicha determinación se puede efectuar, por ejemplo, con el método que se describe en el documento de "Dillon SR, et al., Interleukin 31, a cytokine produced by activated T cells, induces dermatitis in mice. Nat Immunol., julio de 2004; 5(7):752-60". Se cree que los compuestos que inhiben la transduccion de señales intracelulares como respuesta a la estimulación del ligando sirven como antagonistas de NR 10. Los antagonistas de la presente invención pueden ser compuestos naturales o artificiales. Se pueden usar compuestos conocidos como antagonistas de la presente invención. También se pueden usar compuestos nuevos para quienes se haya determinado actividad antagonista usando los métodos descritos previamente. En una modalidad de la presente invención, los antagonistas de NR 10 incluyen anticuerpos que tienen actividad neutralizante de NR 10. Los "anticuerpos que tienen actividad neutralizante de NR 10" de la presente invención se refieren a anticuerpos cuya actividad suprime las actividades fisiológicas basadas en NR 10. Los "anticuerpos que tienen actividad neutralizante NR 10" de la presente invención pueden ser anticuerpos policlonales o monoclonales, y como una realización preferida, son anticuerpos monoclonales. Dichos anticuerpos monoclonales que tienen actividad neutralizante de NR 10, se pueden obtener, por ejemplo, mediante el siguiente procedimiento: se preparan anticuerpos monoclonales anti-NR 10 usando NR 10 como antígeno, o un fragmento del mismo, obtenido de un mamífero, tal como un ser humano o un ratón, mediante métodos conocidos, y luego se seleccionan los anticuerpos que tienen actividad neutralizante de NR 10 entre los anticuerpos monoclonales así obtenidos. Específicamente, la inmunización se efectúa mediante métodos de inmunización convencionales usando como antígeno sensibilizante el antígeno deseado o células que expresan al antígeno deseado. Los anticuerpos monoclonales anti-NR 10 se pueden preparar fusionando las células inmunes con células progenitoras conocidas usando métodos de fusión celular convencionales y rastreando las células productoras de anticuerpos monoclonales (hibridomas) usando métodos de rastreo convencionales. Los animales a inmunizar incluyen, por ejemplo, mamíferos, tales como ratones, ratas, conejos, ovejas, monos, cabras, burros, vacas, caballos y cerdos. El antígeno se puede preparar usando la secuencia genética conocida de NR 10 de acuerdo con métodos conocidos, por ejemplo, con métodos que emplean baculovirus (por ejemplo, WO 98/46777). Como se describe más adelante en los ejemplos, los anticuerpos con actividad neutralizante de NR 10 se pueden seleccionar, por ejemplo, evaluando el efecto de supresión del crecimiento de una línea celular dependiente de IL-31 después de agregar el anticuerpo candidato a las células de dicha línea celular dependiente de IL-31. Se considera que los anticuerpos que suprimen el crecimiento de la línea celular dependiente de IL-31 en el método descrito tienen actividad neutralizante de NR 10.

Los hibridomas se pueden preparar, por ejemplo, de acuerdo con el método de Milstein et al. (Kohler, G. y Milstein, C, Methods Enzymol. (1981) 73: 3-46) o semejantes. Cuando la inmunogenicidad de un antígeno es baja, la inmunización se puede efectuar después de ligar el antígeno a una macromolécula que tiene inmunogenicidad, tal como albúmina. En una modalidad preferida de la presente invención, los anticuerpos que tienen actividad neutralizante de NR 10 incluyen anticuerpos monoclonales que presentan la actividad de neutralizar el NR 10 humano. No hay ninguna limitación particular con respecto al inmunógeno para preparar anticuerpos monoclonales con actividad de neutralizar el NR 10 humano, siempre y cuando permita preparar anticuerpos con dicha actividad de neutralizar el NR 10 humano. Por ejemplo, se conocen múltiples variantes del NR 10 humano. Se puede usar cualquiera de las variantes como inmunógeno, siempre que permita preparar anticuerpos con actividad neutralizante del NR 10 humano. Como alternativa, se puede usar un fragmento de péptido del NR 10 o una secuencia natural de NR 10 introducida con mutaciones artificiales como inmunógeno bajo las mismas condiciones. El NR 10.3 humano constituye un inmunógeno preferido para preparar los anticuerpos de la presente invención que tienen actividad neutralizante de NR 10. En la presente, los anticuerpos de la presente invención descritos previamente no están particularmente limitados, siempre que presenten actividad neutralizante de NR 10. Los anticuerpos también incluyen anticuerpos recombinantes, tales como anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados y anticuerpos humanos. Los anticuerpos quiméricos comprenden, por ejemplo, las regiones constantes de las cadenas pesada y liviana de un anticuerpo humano, y las regiones variables de las cadenas pesada y liviana de un mamífero no humano, tal como el ratón. Los anticuerpos quiméricos se pueden producir mediante métodos conocidos. Por ejemplo, los anticuerpos se pueden producir por clonación del gen de un anticuerpo a partir de hibridomas, inserción del mismo en un vector apropiado e introducción de la construcción en huéspedes (véase, por ejemplo, Cari, A. K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, publicada en el Reino Unido por MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990). Específicamente, se sintetizan los ADNc de las regiones variables (regiones V) del anticuerpo a partir de ARNm de hibridomas usando transcriptasa inversa. Una vez que se obtuvieron los ADN que codifican las regiones V de un anticuerpo de interés, se ligan con los ADN que codifica las regiones constantes (regiones C) del anticuerpo humano deseado. Las construcciones resultantes se insertan en vectores de expresión. Como alternativa, los ADN que codifican las regiones V del anticuerpo se pueden insertar en vectores de expresión que comprenden los ADN que codifican las regiones C de un anticuerpo humano. Los ADN se insertan en vectores de expresión se modo que se expresan bajo la regulación de regiones reguladoras de la expresión, por ejemplo, potenciadores y promotores. En el paso siguiente, se pueden transformar células huésped con los vectores de expresión para la expresión de los anticuerpos quiméricos. Un anticuerpo humanizado, que también se conoce como un anticuerpo humano remodelado, se obtiene transfiriendo la región determinante de complementariedad (CDR) del anticuerpo de un mamífero no humano, tal como un ratón, con la CDR de un anticuerpo humano. Las técnicas de recombinación genética convencionales para la preparación de dichos anticuerpos también son conocidas. Específicamente, se sintetiza por PCR una secuencia de ADN diseñada para unir una CDR de un anticuerpo de ratón con las regiones de marco de trabajo (FR) de un anticuerpo humano, usando diversos oligonucleótidos construidos para comprender porciones superpuestas por sus extremos. El anticuerpo humanizado se puede obtener por (1) ligación del ADN resultante a un ADN que codifica una región constante del anticuerpo humano; (2) incorporación del mismo en un vector de expresión; y (3) transfección del vector en un huésped para producir el anticuerpo (véase la Solicitud de Patente Europea N°: EP 239.400 y la Publicación de la Solicitud de Patente Internacional N°: WO 96/02576). Se seleccionan los FR del anticuerpo humano ligados a través de la CDR cuando la CDR forma un sitio de unión al antígeno. Según necesidad, se pueden sustituir los aminoácidos en la región del marco de trabajo de la región variable del anticuerpo de manera tal que la CDR del anticuerpo humano remodelado forma un sitio de unión al antígeno apropiado (Sato, K. et al., Cáncer Res. (1993) 53, 851-856). Los métodos para obtener anticuerpos humanos también son conocidos. Por ejemplo, los anticuerpos humanos deseados con actividad de unión al antígeno se pueden obtener por (1) sensibilización de linfocitos humanos con los antígenos de interés o células que expresan los antígenos de interés in vitro; y (2) fusión de los linfocitos sensibilizados con células de mieloma humano tal como U266 (véase Solicitud de Patente de Japón, Publicación Kokoku N° (JP-B) H01-59878 (examinado, Solicitud de Patente de Japón aprobada publicada para oposición)). Como alternativa, el anticuerpo humano deseado también se puede obtener usando el antígeno deseado para inmunizar un animal transgénico que comprende un repertorio completo de genes de anticuerpos humanos (véase las publicaciones de Solicitudes de Patente Internacional N° WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096 y WO 96/33735). Además, son conocidas asimismo las técnicas para obtener anticuerpos humanos por paneo de una biblioteca de fagos con anticuerpos humanos. Por ejemplo, la región variable del anticuerpo humano se expresa como un anticuerpo de cadena simple (scFv) sobre la superficie de un fago, usando un método de expresión en fagos, y se pueden seleccionar los fagos que se unen al antígeno. El análisis de los genes de los fagos seleccionados permite determinar las secuencias de ADN que codifican las regiones variables de los anticuerpos humanos que se unen al antígeno. Si se identifican las secuencias de ADN de los scFv que se unen al antígeno, se pueden construir vectores de expresión apropiados que comprenden estas secuencias para obtener los anticuerpos humanos. Dichos métodos son bien conocidos (véase WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438 y WO 95/15388). La secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada o de la región variable de cadena ligera puede ser una secuencia de aminoácidos con una sustitución, supresión, adición y/o inserción de uno o más aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada o de la región variable de cadena ligera de un anticuerpo con actividad neutralizante de NR 10 confirmada, siempre y cuando se retenga la actividad neutralizante de NR 10. Hay métodos bien conocidos por los especialistas en la técnica para preparar la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada o de la región variable de cadena ligera del anticuerpo que tiene actividad neutralizante de NR 10, que comprende una sustitución, supresión, adición y/o inserción de uno o más aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada o de la región variable de cadena ligera, que incluyen métodos conocidos para introducir mutaciones en proteínas. Por ejemplo, los especialistas en la técnica pueden preparar mutantes funcionalmente equivalentes a la región variable de cadena pesada o a la región variable de cadena ligera del anticuerpo que tiene actividad neutralizante de NR 10 por introducción de mutaciones apropiadas en la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada o de la región variable de cadena ligera del anticuerpo que tiene actividad neutralizante de NR 10 usando mutagénesis dirigida al sitio (Hashimoto-Gotoh, T, Mizuno, T, Ogasahara, Y. y Nakagawa, M. (1995) An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagénesis. Gene 152, 271-275, Zoller, MJ. y Smith, M. (1983) Oligonucleotide-directed mutagénesis of DNA fragmente cloned into M13 vectors. Methods Enzymol. 100, 468-500, Kramer, W, Drutsa, V, Jansen, HW, Kramer, B, Pflugfelder, M. y Fritz, HJ (1984) The gapped dúplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction. Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456, Kramer W. y Fritz HJ (1987) Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped dúplex DNA, Methods. Enzymol. 154, 350-367, Kunkel, TA (1985) Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc Nati Acad Sci EE.UU. 82, 488-492) o semejantes. De esta manera, las regiones variables de cadena pesada o las regiones variables de cadena ligera que comprenden mutaciones en uno o más aminoácidos en la región variable de cadena pesada o en la región variable de cadena ligera del anticuerpo que tiene actividad neutralizante de NR 10 también están incluidas en la región variable de cadena pesada o en la región variable de cadena ligera de la presente invención. Cuando se altera un residuo de aminoácido, el aminoácido está mutado preferentemente por uno o más aminoácidos diferentes que conservan las propiedades de la cadena lateral del aminoácido. Los ejemplos de propiedades de cadenas laterales de aminoácidos son: aminoácidos hidrofóbicos (A, I, L, M, F, P, W, Y y V), aminoácidos hidrofílicos (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S y T), aminoácidos que comprenden cadenas laterales alifáticas (G, A, V, L, I y P), aminoácidos que comprenden cadenas laterales que contienen grupos hidroxilo (S, T e Y), aminoácidos que comprende cadenas laterales que contienen azufre (C y M), aminoácidos que comprende ácido carboxílico y cadenas laterales que contienen amida (D, N, E y Q), aminoácidos que comprende cadenas laterales básicas (R, K y H) y aminoácidos que comprende cadenas laterales aromáticas (H, F, Y y W) (los aminoácidos están representados por el código de una letra entre paréntesis). Las sustituciones de aminoácidos dentro de cada grupo se denominan sustituciones conservadoras. Ya se sabe que un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos modificada en donde uno o más residuos de aminoácidos en una secuencia de aminoácidos dada se ha suprimido, agregado y/o substituido por otros aminoácidos puede retener la actividad biológica original (Mark, D. F. et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU.; (1984) 81:5662-6; Zoller, M. J. y Smith, M., Nucleic Acids Res. (1982) 10:6487-500; Wang, A. et al., Science (1984) 224:1431-3; Dalbadie-McFarland, G. ef al., Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. (1982) 79:6409-13). Tales mutantes comprenden una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada o de la región variable de cadena ligera de la presente invención, más preferentemente al menos un 75%, aún más preferentemente al menos un 80%, más preferentemente aún al menos un 85%, aún más preferentemente al menos un 90% y con mayor preferencia al menos un 95% idéntica. En la presente, la identidad de secuencia se define como el porcentaje de residuos idénticos a los de la secuencia de aminoácidos original de la región variable de cadena pesada o de la región variable de cadena ligera, determinada después de alinear las secuencias y de introducir apropiadamente espacios para maximizar la identidad de secuencia según necesidad. La identidad de las secuencias de aminoácidos puede determinarse con el método que se describió previamente. Como alternativa, la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada o de la región variable de cadena ligera que comprende una sustitución, supresión, adición y/o inserción de uno o más aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada o de la región variable de cadena ligera y que retiene la actividad neutralizante de NR 10, se puede obtener a partir de un ácido nucleico que se híbrida bajo condiciones severas con un ácido nucleico que comprende a la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada o de la región variable de cadena ligera. Las condiciones de hibridación severas para aislar un ácido nucleico que se híbrida bajo condiciones severas con un ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos que codifican la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada o de la región variable de cadena ligera incluyen, por ejemplo, condiciones de urea 6 M, SDS 0,4%, SSC 0,5x y 37 °C, o condiciones de hibridación severas equivalentes de las mismas. Bajo condiciones más severas, por ejemplo, condiciones de urea 6M, SDS 0,4%, SSC 0,1x y 42 °C, se pueden aislar ácidos nucleicos con una homología mucho mayor. Las secuencias de los ácidos nucleicos aislados pueden determinarse con los métodos conocidos que se describirán más adelante. La homología general de secuencias de nucleótidos del ácido nucleico aislado es de al menos 50% o mayor identidad de secuencia, preferentemente del 70% o mayor, más preferentemente 90% o mayor (por ejemplo, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor). Un ácido nucleico que se híbrida bajo condiciones severas con un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada o de la región variable de cadena ligera también se puede aislar usando, en lugar de los métodos descritos previamente que emplean técnicas de hibridación, métodos de amplificación de genes usando cebadores sintetizados sobre la base de la información de secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada o de la región variable de cadena ligera, por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Específicamente, se puede determinar la identidad de una secuencia de nucleótidos o de una secuencia de aminoácidos con otra secuencia usando el algoritmo BLAST, de Karlin y Altschul (Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. (1993) 90, 5873-7). Los programas tales como BLASTN y BLASTX fueron desarrollados sobre la base de este algoritmo (Altschul et al., J. Mol. Biol. (1990) 215, 403-10). Para analizar las secuencias de nucleótidos de acuerdo con BLASTN basado en BLAST, los parámetros se definen, por ejemplo, en puntaje = 100 y longitud de palabra = 12. Por otro lado, los parámetros usados para el análisis de secuencias de aminoácidos por BLASTX basado en BLAST incluyen, por ejemplo, puntaje = 50 y longitud de palabra = 3. Se emplean los parámetros predeterminados de cada programa cuando se emplean los programas BLAST y Gapped BLAST. Las técnicas específicas para dichos análisis son conocidas en la técnica (véase el sitio de internet de National Center for Biotechnology Information (NCBI), Basic Local Alignment Search Tool (BLAST); http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Como alternativa, los anticuerpos de la presente invención pueden ser minianticuerpos. Los minianticuerpos de la presente invención incluyen fragmentos de anticuerpo a los cuales les faltan algunas porciones del anticuerpo completo (por ejemplo, la IgG completa), y no están particularmente limitados siempre que retengan la actividad neutralizante de NR 10. Los minianticuerpos de la presente invención no están particularmente limitados, siempre que sean porciones de anticuerpos completos. Los minianticuerpos comprenden preferentemente una región variable de cadena pesada (VH) o una región variable de cadena ligera (VL). Los minianticuerpos particularmente preferidos comprenden ambos VH y VL. Los minianticuerpos de la presente invención tienen preferentemente un menor peso molecular que los anticuerpos completos. Sin embargo, los minianticuerpos pueden formar multímeros, por ejemplo, dímeros, trímeros o tetrámeros, y entonces sus pesos moleculares pueden ser mayores que los pesos de los anticuerpos completos. Los minianticuerpos de la presente invención incluyen, por ejemplo, anticuerpos scFv. Los anticuerpos ScFv son polipéptidos de cadena simple construidos por ligación de una región variable de cadena pesada ([VH]) y una región variable de cadena ligera ([VL]) mediante un ligador o semejantes (Huston, J. S. et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. (1988) 85, 5879-5883; Plickthun "The Pharmacology of Monoclonal Antibodies" Vol. 113, eds., Resenburg y Moore, Springer Verlag, Nueva York, págs. 269-315, (1994)). El orden de la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera que serán ligadas no está particularmente limitado y se pueden disponer en cualquier orden. A continuación se muestran ejemplos de cómo se pueden disponer. [VH] ligador [VL] [VL] ligador [VH] Las secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena pesada o de la región variable de cadena ligera pueden comprender una sustitución, supresión, adición y/o inserción. Además, a la región variable de cadena pesada y a la región variable de cadena ligera también le puede faltar algunas porciones o se pueden agregar otros polipéptidos, siempre que muestren capacidad de unión al antígeno cuando se ligan entre sí. Como alternativa, las regiones variables se pueden quimerizar o humanizar. En la presente invención, los enlazantes que unen a la región variable del anticuerpo comprenden enlazantes peptídicos arbitrarios que se pueden introducir usando ingeniería genética o enlazantes sintéticos (por ejemplo, los enlazantes que se describen en "Protein Engineering, 9(3), 299-305, 1996"). Los enlazantes preferidos en la presente invención son enlazantes peptídicos. La longitud de los enlazantes peptídicos no son particularmente importantes y los especialistas en la técnica pueden seleccionar apropiadamente la longitud dependiendo de la finalidad. Las longitudes típicas comprenden entre uno y 100 aminoácidos, preferentemente entre 3 y 50 aminoácidos, más preferentemente entre 5 y 30 aminoácidos y con particular preferencia entre 12 y 18 aminoácidos (por ejemplo, 15 aminoácidos). Las secuencias de aminoácidos de dichos enlazantes peptídicos incluyen, por ejemplo: Ser Gly · Ser GlyGlySer Ser- Gly · Gly GlyGlyGlySer (SEQ ID N°: 8) Ser-Gly Gly Gly (SEQ ID N°: 9) Gly · Gly · Gly · Gly · Ser (SEQ ID N°: 10) Ser-Gly Gly Gly Gly (SEQ ID N°: 11) Gly Gly Gly Gly Gly Ser (SEQ ID N°: 12) Ser-Gly Gly Gly Gly Gly (SEQ ID N°: 13) Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser (SEQ ID N°: 14) Ser-Gly Gly Gly Gly Gly Gly (SEQ ID N°: 15) (Gly Gly Gly Gly Ser (SEQ ID N°: 10))n (Ser-Gly Gly Gly Gly (SEQ ID N°: 11))n donde n es un número entero de 1 o mayor. Los enlazantes sintéticos (agentes de entrecruzamiento químico) incluyen los agentes de entrecruzamiento que habitualmente se usan para entrecruzar péptidos, por ejemplo, N-hidroxisuccinimida (NHS), suberato de disuccinimidilo (DSS), bi(succinimidil)suberato (BS3), propionato de ditiobi(succinimidilo) (DSP), propionato de ditiobi(succinimidilo) (DTSSP), bi(succinimidilsuccinato) de etilenglicol (EGS), bi(sulfosuccinimidilsuccinato) de etilenglicol (sulfo-EGS), tartrato de disuccinimidilo (DST), tartrato de disulfosuccinimidilo (sulfo-DST), b i [2- (succinimidoxicarboniloxi)etil]sulfona (BSOCOES) y bi [2-(succinimidoxicarboniloxi)etil]sulfona (sulfo-BSOCOES ). Estos agentes de entrecruzamiento se encuentran disponibles comercialmente. Los anticuerpos de la presente invención incluyen anticuerpos a los cuales se han agregado dos o más residuos de aminoácidos a la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo de la presente invención. Además, las proteínas de fusión que son el resultado de una fusión entre uno de los anticuerpos anteriores y un segundo péptido o proteína están incluidas en la presente invención. Las proteínas de fusión se pueden preparar ligando un polinucleótido que codifica un anticuerpo de la presente invención y un polinucleótido que codifica un segundo péptido o polipéptido en-marco, insertando esto en un vector de expresión y expresando la construcción de fusión en un huésped. Existen algunas técnicas conocidas por los especialistas en la técnica para tal fin. El otro miembro peptídico o polipeptídico a fusionar con un anticuerpo de la presente invención puede ser un péptido conocido, por ejemplo, FLAG (Hopp, T. P. et al., BioTechnology 6, 1204-1210 (1988)), 6x His que está constituido por seis residuos His (histidina), 10x His, hemaglutinina (HA) de la influenza, fragmento c-myc humano, fragmento VSV-GP, fragmento p18HIV, marca T7, marca HSV, marca E, fragmento de antígeno SV40 T, marca Ick, fragmento de a-tubulina, marca B, fragmento de Proteína C. Otros miembros polipeptídicos que se pueden fusionar con los anticuerpos de la presente invención incluyen, por ejemplo, GST (glutatión-S-transferasa), HA (hemaglutinina de la influenza), región constante de inmunoglobulina, ß-galactosidasa y MBP (proteína de unión a maltosa). El polinucleótido que codifica uno de estos péptidos o polipéptidos disponibles comercialmente se puede fusionar con un polinucleótido que codifica un anticuerpo de la presente invención. El polipéptido de fusión se puede preparar por expresión de la construcción de fusión. Los anticuerpos de la presente invención pueden diferir en cuanto a secuencia de aminoácidos, peso molecular, punto isoeléctrico, presencia/ausencia de cadenas de azúcares y conformación dependiendo de la célula o huésped productora del anticuerpo o del método de purificación. Sin embargo, el anticuerpo resultante está incluido en la presente invención siempre que sea funcionalmente equivalente a un anticuerpo de la presente invención. Por ejemplo, cuando un anticuerpo de la presente invención se expresa en células procariotas, por ejemplo E. coli, se agrega un residuo de metionina al extremo N-terminal de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo original. Dichos anticuerpos están incluidos en la presente invención. El scFv de la presente invención se puede preparar mediante métodos conocidos por los especialistas en la técnica. El scFv se puede preparar, por ejemplo, mediante técnicas de recombinación genética conocidos por los especialistas en la técnica en base a la secuencia de un anticuerpo que reconoce a NR 10. Específicamente, dicho scFv se puede preparar por construcción de un polinucleótido que codifica al scFv en base a la secuencia de un anticuerpo que reconoce a NR 10, inserción de la construcción en un vector de expresión y posterior expresión del mismo en células huésped apropiadas (véase por ejemplo, Co, M. S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976; Better, M. y Horwitz, A. H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496; Pluckthun, A. y Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515; Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663; Rousseaux, J. et al., Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669; Bird, R. E. y Walker, B. W., Trends Biotechnol. (1991 ) 9, 132-137). Los vectores incluyen vectores M13, vectores pUC, pBR322, pBluescript y pCR-Script. Como alternativa, cuando se busca subclonar y recortar el ADNc, los vectores incluyen, por ejemplo, pGEM-T, pDIRECT y pT7, además de los vectores descritos previamente. Los vectores de expresión son de particular utilidad cuando se usa vectores para producir los anticuerpos de la presente invención. Por ejemplo, cuando se desea una expresión en E. coli, tal como JM109, DH5a, HB101 y XL1-Blue, los vectores de expresión no solo presentan las características descritas previamente que permite la amplificación del vector en E. coli, sino que también deben contener un promotor que permita una expresión eficaz en £. coli, por ejemplo, el promotor lacZ (Ward et al., Nature (1989) 341, 544-546; FASEB J. (1992) 6, 2422-2427), el promotor araB (Better er al., Science (1988) 240, 1041-1043), el promotor T7 o semejantes. Dichos vectores incluyen pGEX-5X-1 (Pharmacia), "QIAexpress system" (Quiagen), pEGFP o pET (en este caso, el huésped es preferentemente BL21 que expresa la T7 ARN polimerasa) además de los vectores que se describieron previamente. Los vectores pueden comprender secuencias señal para la secreción del anticuerpo. Como secuencia señal para la secreción del anticuerpo, se puede usar la secuencia señal pelB (Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379) cuando la proteína será secretada hacia el periplasma de E. coli. El vector se puede introducir en las células huésped utilizando, por ejemplo, métodos con cloruro de calcio o electroporación. Además de los vectores para E. coli, los vectores para producir los anticuerpos de la presente invención incluyen vectores de expresión de mamífero (por ejemplo, pcDNA3 (Invitrogen), pEF-BOS (Nucleic Acids Res.. 1990, 18(17), p5322), pEF y pCDM8), vectores de expresión derivados de células de insecto (por ejemplo, el "sistema de expresión en baculovirus Bac-a-BAC" (Gibco-BRL) y pBacPAK8), vectores de expresión derivados de plantas (por ejemplo, pMH1 y pMH2), vectores de expresión derivados de virus de animales (por ejemplo, pHSV, pMV y pAdexLcw), vectores de expresión retrovirales (por ejemplo, pZIPneo), vectores de expresión de levadura (por ejemplo, el "estuche para expresión en Pichia" (Invitrogen), pNV11 y SP-Q01) y vectores de expresión de Bacillus subtilis (por ejemplo, pPL608 y pKTH50). Cuando se busca la expresión en células de animales, tal como células CHO, COS y NIH3T3, los vectores deben contener un promotor esencial para la expresión en dichas células, por ejemplo, el promotor SV40 (Mulligan et al., Nature (1979) 277, 108), el promotor MMLV-LTR, el promotor EF1 a (Mizushima et al., Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322) y el promotor CMV, y más preferentemente contienen un gen para seleccionar las células transformadas (por ejemplo, un gen de resistencia a drogas que permite evaluarlas usando un agente (neomicina, G418 o semejantes). Los vectores con tales características incluyen, por ejemplo, pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV y pOP13. Además, se puede usar el siguiente método para lograr una expresión genética estable y amplificación de genes en células: en células CHO deficientes en un ácido nucleico de una vía de síntesis se introduce un vector (por ejemplo, pSV2-dhfr (Molecular Cloning, 2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) que contiene al gen DHFR que compensa dicha deficiencia y el vector se amplifica usando metotrexato (MTX). Como alternativa, se puede usar el siguiente método para una expresión genética transitoria: se transforman células COS con un gen que expresa al antígeno SV40 T en su cromosoma con un vector (pcD y semejantes) que contiene un origen de replicación SV40. También se pueden usar orígenes de replicación derivados del virus polioma, adenovirus, virus de papiloma bovino (BPV) y semejantes. Para amplificar el número de copias de genes en células huésped, los vectores de expresión pueden contener además marcadores de selección, tales como el gen de la aminoglicósido transferasa (APH), el gen de la timidina quinasa (TK), el gen de la xantina-guanina fosforibosiltransferasa de E. coli (Ecogpt) y el gen de la dihidrofolato reductasa (dhfr). Los anticuerpos deseados obtenidos con los métodos descritos previamente se pueden aislar del interior de células huésped o del exterior de las células (el medio o semejantes) y purificar hasta homogeneidad. Los anticuerpos se pueden aislar y purificar mediante los métodos que habitualmente se usan para aislar y purificar anticuerpos, y el tipo de método no se limita a ninguno en particular. Por ejemplo, los anticuerpos se pueden aislar y purificar mediante una selección y combinación apropiada de cromatografía en columna, filtración, ultrafiltración, desalado, precipitación por solvente, extracción con solvente, destilación, inmunoprecipitación, electroforesis sobre gel de SDS-poliacrilamida, enfoque isoeléctrico, diálisis, recristalización y semejantes. Las cromatografías incluyen, por ejemplo, cromatografía por afinidad, cromatografía por intercambio iónico; cromatografía hidrofóbica, filtración sobre gel, cromatografía de fase reversa y cromatografía de adsorción (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et a/., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). Los métodos cromatográficos descritos previamente se pueden realizar usando cromatografía líquida, por ejemplo, HPLC y FPLC. Las columnas que se pueden usar para una cromatografía por afinidad incluyen columnas de proteína A y columnas de proteína G. Las columnas que emplean proteína A incluyen, por ejemplo, Hyper D, POROS y Sepharose FF (GE Amersham Biosciences). La presente invención comprende anticuerpos de gran purificación empleando estos métodos de purificación. La presente invención también provee agentes para prevenir o tratar enfermedades inflamatorias, que comprenden como ingredientes activos fragmentos y/o productos modificados de un anticuerpo de la presente invención. Los fragmentos y/o productos modificados de los anticuerpos de la presente invención incluyen fragmentos de anticuerpo que no contienen algunas porciones de los anticuerpos de la presente invención (anticuerpos completos (por ejemplo, IgG completa), anticuerpos recombinantes (por ejemplo, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados y anticuerpos humanos) y minianticuerpos (por ejemplo, anticuerpos scFv)), y no están particularmente limitados siempre que retengan la capacidad para unirse a sus antígenos. Los fragmentos de anticuerpo de la presente invención no se limitan a ninguno en particular, siempre que sean porciones de anticuerpos completos. Los fragmentos comprenden preferentemente una región variable de cadena pesada (VH) y/o una región variable de cadena ligera (VL). La secuencia de aminoácidos de VH o VL puede comprender sustituciones, supresiones, adiciones y/o inserciones. A la VH y/o a la VL le puede faltar algunas porciones, siempre que se retenga la capacidad de unirse al antígeno. Además, la región variable puede ser quimerizada o humanizada. Específicamente, los fragmentos de anticuerpo incluyen, por ejemplo, Fab, Fab', F(ab')2 y Fv. Dichos fragmentos de anticuerpo se pueden obtener por construcción de genes que codifican los fragmentos de anticuerpo, introducción de los mismos en vectores de expresión y posterior expresión de ellos en células huésped apropiadas (véase, por ejemplo, Co, M. S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976; Better, M. y Horwitz, A. H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496; Pluckthun, A. y Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515; Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663; Rousseaux, J. et al., Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669; Bird, R. E. y Walker, B. W., Trends Biotechnol. (1991) 9, 132-137). Además, los anticuerpos de la presente invención se pueden conjugar con anticuerpos que están ligados a cualquiera de diversas moléculas, tales como polietilenglicol (PEG), sustancias radioactivas, sustancias fluorescentes, sustancias luminescentes, enzimas y toxinas. Dichos anticuerpos conjugados se pueden obtener por modificación química de los anticuerpos obtenidos. Los métodos para modificar anticuerpos son bien conocidos en este campo (por ejemplo, US 5057313 y US 5156840). Los "anticuerpos" de la presente invención también incluyen dichos anticuerpos conjugados. La actividad de unión a NR 10 del anticuerpo puede determinarse mediante métodos conocidos por los especialistas en la técnica. Los métodos para determinar la actividad de unión al antígeno de un anticuerpo incluyen, por ejemplo, ELISA (ensayo de inmunoabsorción ligado a enzima), EIA (inmunoensayo con enzimas), RIA (radioinmunoensayo) y método de anticuerpos fluorescentes. Por ejemplo, cuando se usa un inmunoensayo con enzimas, se agregan muestras que contienen anticuerpos, tal como anticuerpo purificados y sobrenadantes cultivo de células productoras de anticuerpos, a placas recubiertas con antígeno. Se agrega un anticuerpo secundario marcado con una enzima, tal como la fosfatasa alcalina, y se incuban las placas. Después de un lavado, se agrega un sustrato de enzima, tal como fosfato de p-nitrofenilo y se mide la absorbancia para evaluar la actividad de unión al antígeno. Aún más, la actividad neutralizante de NR 10 de un anticuerpo puede determinarse, por ejemplo, con el método que se describe en los ejemplos, que comprende evaluar el efecto de suprimir el crecimiento de una línea celular dependiente de IL-31. Los antagonistas de NR 10 o anticuerpos que tienen actividad neutralizante de NR 10 de la presente invención se pueden usar como agentes para prevenir o tratar enfermedades inflamatorias. Los inventores de la presente demostraron que la administración de anticuerpos neutralizantes de NR 10 de ratón produjo efectos terapéuticos marcados en modelos de animales de diversas enfermedades inflamatorias. Además, se ha informado que la expresión de NR 10 humano está aumentada en la epidermis engrosada de pacientes con dermatitis atópica (Documento 1, no patente). Los inventores de la presente confirmaron mediante tinción inmunohistoquímica que, al igual que en el caso del ser humano, la expresión de NR 10 de ratón estaba aumentada en la epidermis engrosada de las aurículas en el modelo de ratones de dermatitis crónica como se describió previamente (Ejemplo 5). Estos hallazgos sugieren que NR 10 está comprometida de manera similar en las enfermedades inflamatorias en todas las especies de animales y que, al igual que los anticuerpos neutralizantes de NR 10 de ratón, los anticuerpos neutralizantes de NR 10 humanos eran eficaces en la prevención y el tratamiento de diversas enfermedades inflamatorias. Aún más, al igual que con los hallazgos que se describen en este ejemplo, también se espera que los antagonistas de NR 10 distintos de anticuerpos tienen efectos terapéuticos en diversas enfermedades inflamatorias. En la presente invención, una enfermedad inflamatoria se refiere a las enfermedades con características patológicas involucradas en las reacciones citológicas e histológicas que tienen lugar en los vasos sanguíneos afectados y tejidos adyacentes como respuesta a una lesión o estimulación anormal causada por agentes físicos, químicos o biológicos (Stedman's Medical Dictionary, 5a Ed., MEDICAL VIEW CO., 2005). En general, las enfermedades inflamatorias incluyen dermatitis (dermatitis atópica, dermatitis crónica y semejantes), enfermedades de intestino inflamatorio (colitis y semejantes), asma, artritis (artritis reumatoide, osteoartritis y semejantes), bronquitis, enfermedades autoinmunes Th2, lupus sistémica eritematosa, miastenia gravis, GVHD crónica, enfermedad de Crohn, espondilitis deformante, dolor lumbar, gota, inflamación después una cirugía o de lesiones, hinchamiento, neuralgia, laringofaringitis, cistitis, hepatitis (esteatohepatitis no alcohólica, hepatitis alcohólica y semejantes), hepatitis B, hepatitis C y arteriosclerosis. Los ejemplos preferidos de las enfermedades inflamatorias que constituyen el sujeto de la presente invención incluyen dermatitis atópica, dermatitis crónica, reumatismo, osteoartritis y asma crónica. Los inventores de la presente descubrieron que los anticuerpos antagonistas de NR 10 tienen efectos terapéuticos contra dermatitis atópica, dermatitis crónica, reumatismo y osteoartritis. Por otro lado, se reveló que los anticuerpos antagonistas de NR 10 no producen efectos terapéuticos en los modelos de dermatitis por contacto aguda y de colitis aguda DSS. Los agentes para prevenir o tratar enfermedades inflamatorias de la presente invención comprenden, como ingrediente activo, un antagonista de NR 10 o un anticuerpo que tiene actividad neutralizante de NR 10 descrito previamente. La frase "comprende un antagonista de NR 10 como ingrediente activo" significa que comprende un antagonista de NR 10 como al menos uno de los ingredientes activos y no limita el contenido a los mismos. Además, los agentes para prevenir o tratar enfermedades inflamatorias de la presente invención también pueden comprender, en combinación con un antagonista de NR 10, otros ingredientes que aumentan la prevención o el tratamiento de la enfermedad inflamatoria. El antagonista de NR 10 de la presente invención se puede formular de acuerdo con métodos estándar (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Science, última edición, Mark Publishing Company, Easton, EE.UU.). Además, pueden comprender vehículos y/o aditivos aceptables para uso farmacéutico, si fuera necesario. Por ejemplo, pueden contener agentes tensoactivos (por ejemplo, PEG y Tween), excipientes, antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico), agentes colorantes, agentes saborizantes, conservantes, estabilizadores, agentes reguladores (por ejemplo, ácido fosfórico, ácido cítrico y otros ácidos orgánicos), agentes quelantes (por ejemplo, EDTA), agentes de suspensión, agentes isotonizantes, aglutinantes, desintegradores, lubricantes, promotores de la fluidez y modificadores. Sin embargo, los vehículos que se pueden incluir en los agentes para prevenir o tratar enfermedades inflamatorias de la presente invención no se limitan a esta lista. De hecho, se pueden incluir apropiadamente otros vehículos de uso común, tales como ácido silícico ligeramente anhidro, lactosa, celulosa cristalina, manitol, almidón, carmelosa de calcio, carmelosa de sodio, hidroxipropil celulosa, hidroxipropilmetil celulosa, polivinilacetaldietilaminoacetato, polivinilpirrolidona, gelatina, triglicéridos de ácidos grasos de cadena mediana, polioxietileno, aceite de ricino hidrogenado 60, sacarosa, carboximetilcelulosa, almidón de maíz, sal inorgánica y otros. Las composiciones también pueden contener otros polipéptidos de bajo peso molecular, proteínas tal como albúmina sérica, gelatina e ¡nmunoglobulina, y aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina y lisina. Cuando la composición se prepara como una solución acuosa para inyectables, los antagonistas de NR 10 se pueden disolver en una solución isotónica que comprende, por ejemplo, salina fisiológica, dextrosa y otros adyuvantes. Los adyuvantes pueden incluir, por ejemplo, D-sorb¡tol, D-manosa, D-man¡tol y cloruro de sodio. Además, se pueden usar concomitantemente agentes solubilizantes apropiados, por ejemplo, alcoholes (por ejemplo, etanol), polialcoholes (por ejemplo, propilenglicoles y PEGs) y detergentes no iónicos (polisorbato 80 y HCO-50). Si fuera necesario, los antagonistas de NR 10 se pueden encapsular en microcápsulas (microcápsulas de hidroxicelulosa, gelatina, polimetilmetacrilato, y semejantes) y conformar como componentes de sistemas de administración de drogas coloidales (liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) (por ejemplo, véase "Remington's Pharmaceutical Science 16a edición" y Oslo Ed. (1980)). Más aún, se conocen métodos para elaborar drogas de liberación sostenida y se pueden aplicar con los antagonistas de NR 10 (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. (1981 ) 15, 167-277; Langer, Chem. Tech. (1982) 12, 98-105; Patente de los EE.UU. N°: 3.773.919; Solicitud de Patente Europea (EP) N° 58.481; Sidman eí al., Biopolymers (1983) 22, 547-56; EP 133.988). Los agentes para prevenir o tratar enfermedades inflamatorias de la presente invención se pueden administrar por vía oral o parenteral, pero preferentemente se administran por vía parenteral. Específicamente, los agentes se administran a los pacientes por inyección o administración percutánea. Las inyecciones incluyen, por ejemplo, inyecciones intravenosas, inyecciones intramusculares e inyecciones subcutáneas, para una administración sistémica o local. Los agentes se pueden administrar en el sitio donde se desea suprimir la inflamación o en las áreas que rodean a los sitios por infusión local, en particular inyección intramuscular. Los métodos de administración se pueden seleccionar apropiadamente de acuerdo con la edad y condición del paciente. Se puede seleccionar una dosis de administración única, por ejemplo, dentro de un rango entre 0.0001 y 100 mg de ingrediente activo por kg de peso corporal. Como alternativa, cuando los agentes se administran a pacientes humanos, la dosis de ingrediente activo se puede seleccionar dentro del rango entre 0.001 y 1.000 mg/kg de peso corporal. Dicha dosis de administración única comprende preferentemente, por ejemplo, antagonista de NR 10 entre 0.01 y 50 mg/kg de peso corporal aproximadamente. Sin embargo, la dosis del agente para prevenir o tratar enfermedades inflamatorias de la presente invención no se limita a estos ejemplos. La presente invención también provee anticuerpos que tienen actividad neutralizante de NR 10 (incluyendo fragmentos de anticuerpos que tienen actividad neutralizante de NR 10 y/o productos modificados de los mismos; se usa la misma definición en toda la descripción). Los anticuerpos que tienen actividad neutralizante de NR 10 de la presente invención son de utilidad como ingredientes activos en los agentes descritos previamente para prevenir o tratar enfermedades inflamatorias. Los anticuerpos que tienen actividad neutralizante de NR 10 de la presente invención pueden ser anticuerpos policlonales o monoclonales, pero preferentemente son anticuerpos monoclonales. Dichos anticuerpos monoclonales que tienen actividad neutralizante de NR 10 se pueden obtener mediante los métodos descritos previamente. Los anticuerpos monoclonales de la presente invención tienen la actividad de neutralizar el NR 10 derivado de mamíferos, o fragmentos del mismo, preferentemente tienen la actividad de neutralizar el NR 10 derivado de humanos o ratones, o fragmentos de los mismos, y más preferentemente la actividad de neutralizar el NR 10 derivado de humanos, o fragmentos del mismos. El NR 10 humano, o un fragmento peptídico del mismo, se puede usar como un inmunógeno para preparar anticuerpos monoclonales que tienen la actividad de neutralizar el NR 10 humano. Como alternativa, los anticuerpos que tienen actividad neutralizante de NR 10 de la presente invención pueden ser anticuerpos recombinantes. Los anticuerpos recombinantes que tienen actividad neutralizante de NR 10 de la presente invención incluyen, en un sentido no taxativo, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos y minianticuerpos. En la presente invención, los anticuerpos que tienen actividad neutralizante de NR 10 incluyen, por ejemplo, anticuerpos anti-NR 10 de ratón que comprenden una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°: 1 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°: 3. La presente invención también incluye anticuerpos monoclonales que tiene la actividad de neutralizar el NR 10 humano. Los anticuerpos monoclonales que tienen actividad neutralizante del NR 10 humano de la presente invención se pueden obtener preparando anticuerpos monoclonales usando el NR 10 humano, o un fragmento peptídico del mismo, como inmunógeno y seleccionando luego entre los anticuerpos monoclonales anti-NR 10 humano, a los anticuerpos que tienen actividad neutralizante del NR 10 humano, en base del sistema de ensayo descrito previamente usando una línea celular dependiente de IL-31. En la presente invención, los anticuerpos que tienen actividad para neutralizar el NR 10 humano incluyen los anticuerpos que se describen en cualquiera de: (a) anticuerpos que tienen una región variable de cadena pesada que comprende una CDR1, CDR2 y CDR3 y que están constituidos por las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID N°: 18, 19 y 20, respectivamente. (b) anticuerpos que tienen una región variable de cadena ligera que comprende una CDR1, CDR2 y CDR3 y que están constituidos por las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID N°: 21, 22 y 23, respectivamente; (c) anticuerpos que tienen la región variable de cadena pesada de (a) y la región variable de cadena ligera de (b); y (d) anticuerpos que reconocen el mismo epítope que el reconocido por los anticuerpos de cualquiera de (a) a (c). Se puede confirmar si un anticuerpo reconoce el mismo epítope que el reconocido por otro anticuerpo por la competencia entre los dos anticuerpos contra el epítope. Dicha competencia entre los anticuerpos puede detectarse mediante ensayos de unión competitiva usando medios tales como ELISA, un método de transferencia de energía por resonancia fluorescente (FRET) y tecnología de ensayos con microvolúmenes fluorométrico (FMAT (R)). La cantidad de los anticuerpos unidos al antígeno se correlaciona indirectamente con la capacidad de unión de los anticuerpos candidato competidores (anticuerpos de prueba) que se unen competitivamente al mismo epítope. En otras palabras, a medida que aumenta la cantidad o afinidad de los anticuerpos de prueba contra el mismo epítope, disminuye la cantidad de anticuerpos unidos al antígeno y aumenta la cantidad de los anticuerpos de prueba unidos al antígeno. Específicamente, se agregan simultáneamente anticuerpos apropiadamente marcados y anticuerpos a evaluar a los antígenos, y luego se detectan los anticuerpos unidos usando la marca. La cantidad de anticuerpo unido al antígeno puede determinarse fácilmente por marcación previa de los anticuerpos. Esta marca no está particularmente limitada y el método de marcación se selecciona según la técnica de ensayo utilizada. El método de marcación incluye marcación con marcas fluorescentes, marcas radioactivas, marcas enzimáticas y semejantes. Por ejemplo, se agregan simultáneamente anticuerpos marcados con fluorescencia y anticuerpos no marcados o anticuerpos de prueba a células de animales que expresan NR 10 y los anticuerpos marcados se detectan usando tecnología de ensayo de microvolúmenes fluorométrico. La IC50 es la concentración en donde la cantidad de anticuerpo marcado unido al epítope se ha reducido al 50% por unión de los anticuerpos no marcados. En la presente, los anticuerpos que reconocen al mismo epítope son anticuerpos que pueden reducir la cantidad de anticuerpos marcados unidos al epítope en al menos un 50% cuando la concentración de los anticuerpos de prueba es diez veces mayor que la IC50 de los anticuerpos no marcados. Los anticuerpos que tienen la actividad de neutralizar el NR 10 humano utilizados en la presente invención, preferentemente presentan también actividad de unión al NR 10 de monos cinomolgos y más preferentemente presentan actividad neutralizante del NR 10 de monos cinomolgos. El NR 10 de monos cinomolgos que contiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°: 24 se puede usar para medir la actividad neutralizante o de unión al NR 10 del mono cinomolgo.

La presente invención también provee los métodos terapéuticos que se describen más adelante. La interpretación de NR 10, antagonistas, anticuerpos monoclonales, anticuerpos recombinantes, enfermedades inflamatorias y otros en los métodos, es como se describió en lo anterior. (1) un método para prevenir o tratar una enfermedad inflamatoria, que comprende el paso de administrar un antagonista de NR 10 a un paciente con una enfermedad inflamatoria; (2) el método de (1), en donde el antagonista de NR 10 es un anticuerpo que tiene la actividad de unión al NR 10; (3) el método de (2), en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal; (4) el método de (2), en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal que se une al NR 10 humano; (5) el método de cualquiera entre (2) y (4), en donde el anticuerpo es un anticuerpo recombinante; (6) el método de (5), en donde el anticuerpo recombinante es un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo humano; (7) el método de cualquiera entre (2) y (6), en donde se incluye un fragmento de un anticuerpo que tiene actividad neutralizante de NR 10 y/o un producto modificado del mismo como ingrediente activo; (8) el método de cualquiera entre (1) y (7), en donde la enfermedad inflamatoria es dermatitis atópica; (9) el método de cualquiera entre (1) y (7), en donde la enfermedad inflamatoria es dermatitis crónica; (10) el método de cualquiera entre (1) y (7), en donde la enfermedad inflamatoria es reumatismo; y (11) el método de cualquiera entre (1) y (7), en donde la enfermedad inflamatoria es osteoartritis. La presente invención también provee las invenciones que se describen a continuación. La explicación de NR 10, antagonistas, anticuerpos monoclonales, anticuerpos recombinantes, enfermedades inflamatorias y otros en los métodos, es como se describió en lo anterior. (1) uso de un antagonista de NR 10 para producir un agente para prevenir o tratar una enfermedad inflamatoria; (2) el uso de (1), en donde el antagonista de NR 10 es un anticuerpo que tiene la actividad de unirse a NR 10; (3) el uso de (2), en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal; (4) el uso de (2), en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal que se une al NR 10 humano; (5) el uso de cualquiera entre (2) y (4), en donde el anticuerpo es un anticuerpo recombinante; (6) el uso de (5), en donde el anticuerpo recombinante es un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo humano; (7) el uso de cualquiera entre (2) y (6), en donde se incluye un fragmento de un anticuerpo que tiene actividad neutralizante de NR 10 y/o un producto modificado del mismo como ingrediente activo; (8) el uso de cualquiera entre (1) y (7), en donde la enfermedad inflamatoria es dermatitis atópica; (9) el uso de cualquiera entre (1) y (7), en donde la enfermedad inflamatoria es dermatitis crónica; (10) el uso de cualquiera entre (1) y (7), en donde la enfermedad inflamatoria es reumatismo; y (11) el uso de cualquiera entre (1) y (7), en donde la enfermedad inflamatoria es osteoartritis. Todos los documentos de la técnica anterior citados en la presente se incorporan aquí a modo de referencia. Ejemplos A continuación, la presente invención se describirá específicamente con referencia a los ejemplos, pero no deben considerarse como una limitación de la misma. Ejemplo 1: Establecimiento de la línea celular Ba/F3 que expresa NR 10 y OSMR Se insertó el ADNc del NR 10 humano (SEQ ID N°: 1 de WO 0075314) en el vector de expresión pCOS1 (Biochem Biophys Res Commun. 228, págs. 838-45, 1996) para producir el pCosNR 10.3. Se aisló el ADNc del receptor de oncostatina M (OSMR, GenBank, N° Acceso NM003999) de una biblioteca de placenta humana por PCR y luego se construyó de manera similar el vector de expresión pCosI -hOSMR. Se introdujeron simultáneamente por electroporación 10 pg de cada uno de los vectores en células de la línea celular Ba/F3 derivada de células pro-B dependientes de IL-3 de ratón (BioRad Gene Pulser; 960 pF y 0.33 kV). Después de la introducción, se agregó IL-31 humana y se cultivaron las células. Así, se obtuvo una línea celular que proliferó de una manera dependiente de IL-31. Asimismo, también se preparó una línea celular dependiente de IL-31 de ratón a partir de células Ba/F3 que se habían preparado para expresar el NR 10 de ratón y genes OSMR. En ambas líneas celulares, se encontró que el valor de la ED50 era de varios ng/ml. De esta manera se obtuvieron líneas celulares bien proliferativas. La línea celular humana dependiente de IL-31 no exhibió respuesta a la IL-31 de ratón y el crecimiento era suprimido luego de la adición de la proteína NR 10 humana (dominio extracelular). La línea celular dependiente de IL-31 de ratón no exhibió respuesta a la IL-31 humana y no se suprimió el crecimiento con la adición de la proteína NR 10 de ratón (dominio extracelular). Ejemplo 2: Preparación de la proteína NR 10 (dominio extracelular) Se amplificó solamente el dominio extracelular por PCR usando ADNc de NR 10 como plantilla, se unió una secuencia de la marca FLAG al extremo C-terminal y se insertó en el vector de expresión pCXND3 (WO 2005/005636)(pCXN D3-N R 10-flag). Se introdujeron 10 pg de este vector lineal en células de la línea celular DG44 de ovario de hámster chino por electroporación (BioRad Gene Pulserll; 25 pF y 1.5 kV). Se obtuvo una línea celular de gran expresión. Se preparó una muestra purificada obtenida a partir del sobrenadante de un cultivo a gran escala de la línea celular en columna con el anticuerpo anti-FLAG (SIGMA) y filtración por gel, y se usó en los experimentos que se describirán más adelante. El NR 10 de ratón (dominio extracelular) con la secuencia de la marca FLAG unida por el extremo C-terminal se preparó de manera similar. Ejemplo 3: Aislamiento de scFv con actividad neutralizante anti-NR 10 de ratón, y preparación de BM095 como IgG quimerizada Los inventores de la presente trataron, específicamente, de determinar claramente los clones candidato a partir de una biblioteca de fagos con el anticuerpo humano por paneo usando la proteína biotinilada NR 10 de ratón (dominio extracelular). El scFv secretor se purificó a partir de los clones y se agregó al sistema de ensayo de crecimiento celular usando células Ba/F3 dependientes de IL-31 que se describieron en el ejemplo 1. Como resultado de ello, se obtuvo con éxito el clon BM095 que presentaba una fuerte actividad supresora del crecimiento.

La secuencia BM095 de la región variable de la cadena H (VH) humana se ligó, usando PCR, en la región constante de la lgG2a de ratón (después de CH1) y la secuencia BM095 de la región variable de la cadena L (VL) humana se ligó en la región constante de la cadena ? de ratón para construir un vector de expresión. La secuencia de aminoácidos de VH se muestra en la SEQ ID N°: 1 y la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos se muestra en la SEQ ID N°: 2. La secuencia de aminoácidos de VL se muestra en la SEQ ID N°: 3 y la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos se muestra en la SEQ ID N°: 4. Los respectivos vectores lineales de expresión se introdujeron simultáneamente en la línea celular DG44 y luego se seleccionó una línea celular que expresa la IgG quimerizada a un nivel alto. Se obtuvo una muestra purificada a partir del sobrenadante de un cultivo a gran escala de esta línea celular usando una columna con proteína A (rProtein A Sepharose Fast Flow, GE Amersham Biosciences) y cromatografía en columna de intercambio catiónico (SP-TOYOPEARL 650M, TOSOH). Además, se eliminó el pirógeno usando la resina ActiClean Etox (Sterogen) para reducir la concentración hasta por debajo del límite de detección. La muestra se usó en los experimentos con animales que se describen más adelante. En la Figura 1 se muestra el resultado obtenido por adición de BM095 al sistema de análisis descrito previamente.

Ejemplo 4: Evaluación de la eficacia del fármaco en un modelo de dermatitis atópica usando ratones NC/Nga Se produjo un modelo de dermatitis por aplicación repetida de cloruro de picrilo (PiCI) a intervalos de una semana. Específicamente, 4 días después de sensibilización con PiCI 5% (150 µ?) sobre abdomen y almohadilla plantar, se logró inducción de dermatitis por aplicación repetida de PiCI 0,8% (150 µ?) sobre el dorso y aurícula a intervalos semanales. Los síntomas resultantes se observaron dos veces por semana sobre el período de tres a seis semanas y se evaluaron independientemente cinco aspectos ((1) prurito, (2) enrojecimiento y hemorragia, (3) edema, (4) lesiones y daño tisular y (5) incrustación y sequedad) en una escala de 0 a 3. El anticuerpo fue administrado a razón de 10 mg/kg en la cavidad peritoneal el día antes de la sensibilización y de cada inducción, 6 veces en total (grupo BM095) o el día antes de cada inducción después de la tercera semana, tres veces en total (grupo V/B). Como control positivo, se administró por vía oral dexametasona 1 mg/kg todos los días después de la tercera semana (grupo DEX). Cada grupo comprendía 10 ratones NC/Nga machos. Tal como se muestra en la Figura 2, se encontró un efecto supresor significativo en el grupo que recibió anticuerpo en comparación con el grupo de vehículo que recibió solvente. Además, como se puede observar en la Figura 2, mientras que se observó una pérdida de peso significativa en el grupo DEX, no se observó cambio en el peso en el grupo que recibió anticuerpo. Esto sugiere que el anticuerpo es un agente muy seguro. Ejemplo 5: Evaluación de la eficacia del fármaco usando un modelo de dermatitis crónica creada por aplicación repetida de cloruro de picrilo Se sensibilizaron ratones BALB/c hembra de seis semanas de vida mediante aplicación de 20 µ? de cloruro de picrilo al 0.5% (solución de acetona/aceite de oliva (1:4 v/v)) en la oreja derecha. La inducción se logró aplicando repetidamente 20 ?? de cloruro de picrilo 0,25% (acetona/aceite de oliva (1:4 v/v)) en la oreja derecha cada dos días desde el octavo día después de la sensibilización. Se administró BM095 10 mg/kg en la cavidad peritoneal una vez por semana desde el día anterior a la sensibilización en el grupo de evaluación del efecto preventivo de BM095 o desde el día 20 después de comenzar la inducción en el grupo de evaluación del efecto terapéutico de BM095. El hinchamiento auricular se evaluó por medición sucesiva del espesor de la oreja derecha usando un calibre analógico para medir el espesor. Como resultado de ello, se encontró un efecto supresor significativo en el grupo que recibió anticuerpo, como se puede observar en la Figura 4. Se informó que la expresión del NR 10 humano había aumentado en la epidermis engrosada de los pacientes con dermatitis atópica (Documento 1 no patente). Las aurículas del modelo de ratones con dermatitis crónica descrito previamente fueron teñidas usando técnicas de inmunohistoquímica. Al igual que en el caso de seres humanos, se observó un aumento de la expresión de NR 10 de ratón en la epidermis engrosada (Figura 5; BM095 con la región constante reemplazada por la de la IgG humana preparada en el Ejemplo 3 y usada en la tinción inmunohistoquímica. Las porciones teñidas de marrón son los sitios de expresión de NR 10). Este hallazgo sugiere que NR 10 está involucrada de manera similar en las enfermedades inflamatorias, tanto en seres humanos como en ratón. Ejemplo 6: Evaluación de la eficacia del fármaco usando un modelo de artritis inducida por colágeno (reumatismo) La preparación del modelo de ratones y la evaluación de la eficacia del fármaco se efectuaron según el procedimiento que se describe a continuación. Se administraron, por vía intracutánea, 140 µ? de gel de colágeno, que se preparó por combinación de cantidades iguales de adyuvante completo H37Ra y colágeno tipo II 0,3% derivado de articulación bovina, a ratones DBA/UN hembra de 9 semanas de edad en la cabeza de la cola (Día 0; sensibilización). Después de tres semanas, se administró gel de colágeno preparado según el mismo procedimiento por vía intracutánea en el dorso para inducir el comienzo de la artritis (Día 21; inducción). Dos días antes de la sensibilización (Día -2), se dividieron 16 ratones en dos grupos, cada uno de 8 ratones, de acuerdo con los pesos corporales, para establecer un grupo que recibió medio y un grupo que recibió BM095. El medio usado comprendía solución amortiguadora de acetato 20 mmol/l (pH 5,5) (NaCI 200 mmol/l) diluida 6 veces con PBS, y la sustancia de prueba, BM095, se administró por vía intravenosa a los 8 ratones del grupo que recibió BM095 a una dosis de 10 mg/kg de peso el día antes de la sensibilización (Día -1). Al mismo tiempo, se administró el mismo volumen de medio por unidad de peso corporal a los 8 ratones del grupo que recibió medio como control el Día -1. Se observó hinchamiento en las cuatro extremidades y se evaluó asignando un puntaje (con una escala de 0 a 4 para cada extremidad: puntaje total de 16) desde el día antes de la inducción (Día 20) a intervalos de 2 a 3 días. Como resultado de ello, se encontró que el puntaje para el hinchamiento en las cuatro extremidades disminuía después del Día 20 en el grupo que recibió BM095, como se puede observar en la Figura 6. Esto sugiere que BM095 tiene el efecto de suprimir el comienzo de la artritis. Ejemplo 7: Evaluación de la eficacia del fármaco usando un modelo de artritis inducida por colaqenasa (osteoartritis) La preparación del modelo de ratones y la evaluación de la eficacia del fármaco se efectuaron según el procedimiento que se describe a continuación. Se administraron (5 ml/kg) medio control (solución amortiguadora de acetato 20 mmol/l (pH 5,5) diluida 6 veces con PBS, NaCI 200 mmol/l (n = 5)), BM095 2 mg/kg (n = 5) y BM095 20 mg/kg (n = 6) por vía intravenosa en la vena caudal de ratones C57BL/6J Jcl macho de 8 semanas de vida (CLEA Japan Inc.). Después se administraron 6 µ? de solución de colagenasa 1,5% (Tipo II; Sigma) filtrada a través de filtro de 0,45 Clm (MILLIPORE) en la articulación derecha de las cavidades de la rodilla bajo anestesia por inhalación de isoflurano 3% (Am J Pathol 1989; 135(6): 1001 -14). Los valores del ancho de las articulaciones de rodilla derecha e izquierda se determinaron usando calibres (Mitsutoyo CO.) inmediatamente antes de la administración de colagenasa y 3, 7 y 14 días después de la administración de colagenasa para calcular la diferencia entre las rodilla derecha e izquierda. La diferencia se definió como un valor representativo del hinchamiento de la articulación de la rodilla derecha. El área bajo la curva (AUC) de la transición de esta diferencia se determinó sobre la base de la regla trapezoidal y se definió como un indicador de la eficacia del fármaco. Se condujo una prueba t de Student para la AUC del grupo control de medio y para el grupo que recibió CNP usando un software de análisis estadístico (SAS Institute Inc.) (diferencia significativa cuando p<0,05). Como resultado de ello, el AUC del grupo que recibió BM095 era significativamente menor a cualquier dosis que el valor del grupo control de medio, como se puede observar en la Figura 7. Este resultado demuestra que BM095 suprime la artritis en el modelo de osteoartritis. Ejemplo 8: Preparación del anticuerpo neutralizante anti-NR 10 humano Se inmunizaron ratones con la proteína NR 10 humana (dominio extracelular){descrito en el Ejemplo 2} y se prepararon hibridomas usando métodos convencionales. Se evaluaron los sobrenadantes de cultivo de los hibridomas por su actividad neutralizante usando la línea celular dependiente de IL-31 humana (células hNR 10/hOSMR/BaF3) que se describió en el ejemplo 1. Se obtuvieron múltiples clones que presentaban una fuerte actividad neutralizante de NR 10 (Figura 8). Ejemplo 9: Preparación del anticuerpo humano quimérico La secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada de NA633, que mostraba la actividad más fuerte entre los anticuerpos neutralizantes, se muestra en la SEQ ID N°: 16 y la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera se muestra en la SEQ ID N°: 17. Además, las secuencias de aminoácidos de las CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de cadena pesada de NA633 se muestran en las SEQ ID N°: 18, 19 y 20, respectivamente; y las secuencias de aminoácidos de las CDR1 , CDR2 y CDR3 de la región variable de cadena ligera se muestran en las SEQ ID N°: 21, 22 y 23, respectivamente. Aún más, el anticuerpo quimérico que comprende la región variable de ratón y la región constante humana (cadena H tipo lgG1; cadena L tipo ?) descrito previamente se preparó mediante un método convencional y se determinó la actividad neutralizante. Tal como se muestra en la Figura 9, el anticuerpo quimérico NA633 mostró una fuerte actividad neutralizante a concentraciones bajas. Ejemplo 10: Aislamiento del NR 10 de mono cinomolqo Los inventores trataron de aislar el gen del NR 10 de mono cinomolgo, porque se creía que la reactividad cruzada y la actividad neutralizante con el NR 10 de monos cinomolgos eran importantes en el paso preclínico de evaluación de la seguridad. Los cebadores se diseñaron sobre la base de la información genómica descrita para mono Rhesus y semejantes, y el gen de NR 10 se amplificó con éxito a partir de órganos de mono cinomolgo por PCR. En la Figura 10 se muestra una alineación de las secuencias de aminoácidos de NR 10 humano y de NR 10 aislada de mono cinomolgo. La secuencia de aminoácidos de NR 10 de mono cinomolgo se muestra en la SEQ ID N°: 24. Se estableció una línea celular proliferativa de manera dependiente de IL-31 humana por introducción del gen NR 10 de mono cinomolgo junto con el gen de OSMR humano en células Ba/F3, como se describió en el ejemplo 1. Se evaluó la actividad neutralizante del anticuerpo quimérico NA633 descrito en el ejemplo 9 usando esta línea celular. El resultado demostró que el anticuerpo también mostraba una fuerte actividad neutralizante en mono cinomolgo (Figura 11). Ejemplo de referencia 1: Eficacia del fármaco BM095 en la colitis inducida por dextransulfato de sodio (DSS) Se preparó el modelo de colitis inducida por DSS (J Immunol (2003) 171:5507-5513), que se informó como un modelo patológico para la enfermedad de intestino inflamatorio (IBD), para evaluar el efecto de BM095, un anticuerpo neutralizante anti-NR 10 de ratón. Se preparó una solución acuosa de la sal de dextransulfato de sodio (Wako Puré Chemical Industries) 5% (p/v) usando agua destilada filtrada y esterilizada con un filtro de 0.22 pm (Millipore). Se emplearon ratones Balb/cAnN Crj macho de seis semanas de vida (Charles River Laboratories, Japón) y se dejaron beber libremente la solución de botellas de agua durante 7 días. Se midieron los pesos corporales y se usaron los porcentajes de cambio de peso con relación al peso del primer día de administración de DSS como índice de eficacia del fármaco. Usando este modelo, se administró el anticuerpo neutralizante anti-NR 10 de ratón BM095 por vía intravenosa en una dosis de 10 mg/kg el día antes de la administración de DSS y se evaluó la pérdida de peso resultante (n = 10) para evaluar si había mejorado la condición patológica por neutralización del señalamiento de IL-31. El grupo (grupo de vehículo; n = 10) en el cual se administró vehículo (una mezcla de solución amortiguadora de acetato [acetato de sodio 20 mmol/l y cloruro de sodio 20 mmol/l] y solución salina fosfato amortiguada [PBS; GIBCO], mezcladas a una relación de volumen de 1:5) por vía intravenosa el día antes de la administración de DSS, se usó como grupo control de vehículo. Además, también se investigó el transcurso de cambio en el porcentaje de peso en ratones Balb/cAnN Crj del mismo sexo y edad (n = 1) que los del grupo que recibió DSS, con el fin de conocer el transcurso en el tiempo del porcentaje de cambio de peso en ratones normales. El transcurso del peso se muestra en la Figura 12. La administración de DSS redujo el porcentaje de cambio de peso en el grupo de vehículo. El transcurso del porcentaje de cambio de peso en el grupo que recibió BM095 era similar al observado en el grupo de vehículo. Sin embargo, cuatro y cinco días después de la administración de DSS, el porcentaje de cambio de peso se redujo significativamente en el grupo BM095 en comparación con el grupo de vehículo. Estos resultados mostraron que la administración de BM095 no produjo un efecto terapéutico sobre la colitis del modelo. Se ha informado que la expresión de IL-31RA está aumentada en este modelo (WO 2004/003140). Los resultados experimentales descritos previamente demuestran que los anticuerpos neutralizantes de la molécula no tienen un efecto terapéutico sobre la colitis de este modelo. Ejemplo de referencia 2: Eficacia del fármaco BM095 en el modelo de dermatitis por contacto aguda inducida por cloruro de picrilo Para evaluar el efecto del anticuerpo neutralizante anti-NR 10 de ratón BM095, se desarrolló una dermatitis definida como un modelo de dermatitis por contacto aguda (Clin Immunol (2003) 108: 257-262). Esta dermatitis es el resultado de una reacción de hipersensibilidad demorada debido a sensibilización e inducción por aplicación de cloruro de picrilo. Se aplicaron 50 µ? de una solución de cloruro de picrilo 7% (Nacalai Tesque, Inc.; etanol :acetona = 3:1 (v/v)) sobre la piel abdominal para sensibilizar a ratones Balb/cAnN Crj hembra de 8 semanas de vida (CHARLES RIVER LABORATORIES JAPAN), y después de 5 días se aplicaron 20 µ? de solución al 1% de cloruro de picrilo (acetona:oliva = 1:4 (v/v)) sobre la piel de la aurícula derecha de los ratones para generar una dermatitis por contacto (inducción). Se aplicaron 20 pl de vehículo (acetona:oliva = 1:4 (v/v)) sobre la piel de la aurícula izquierda de los mismos ratones como control para evaluar el efecto del vehículo sobre el espesor de la aurícula (grupo positivo; n = 6). Se midieron los espesores de las orejas derecha e izquierda usando un calibre analógico para medir el espesor (OZAKI MFG.) inmediatamente antes de la inducción y 24, 48 y 72 horas después de la inducción, y se usó el cambio en el espesor de aurícula con respecto al espesor inmediatamente previo a la inducción como índice de la eficacia del fármaco. El grupo (grupo negativo; n = 6) en el cual se aplicó una mezcla de etanol-acetona (3:1 (v/v)) sin cloruro de picrilo sobre la piel abdominal en el momento de la sensibilización y después de 5 días se aplicaron 20 µ? de solución de cloruro de picrilo 1% sobre la piel de la aurícula derecha y luego se aplicaron 20 ?? de vehículo (acetona:oliva = 1:4 (v/v)) sobre la piel de la aurícula izquierda que se usó como grupo control para evaluar el establecimiento de afecciones patológicas. El grupo (grupo BM095; n = 6) en el cual se indujo dermatitis por contacto aguda usando el mismo método que el empleado para el grupo positivo descrito previamente, recibió BM095 por vía intravenosa a una dosis de 10 mg/kg los días previos a la sensibilización e inducción y el grupo (grupo de vehículo; n = 5) con en los mismos tiempos recibió vehículo (solución amortiguadora de acetato [acetato de sodio 20 mmol/l y cloruro de sodio 20 mmol/l] y solución salina fisiológica amortiguada con fosfato [PBS; GIBCO], que se combinaron a una relación de volumen de 1:5), se usaron para evaluar el efecto de la administración de los anticuerpos anti-NR 10 sobre las afecciones patológicas en este modelo. Los cambios en el espesor de aurícula hasta 72 horas después de la inducción se muestran en la Figura 13. Se encontró un engrosamiento significativo de la aurícula en el grupo positivo en cada uno de los tiempos de 24, 48 y 72 horas después de la inducción en comparación con el grupo negativo, lo que sugiere el establecimiento de afecciones patológicas. La transición del espesor de aurícula en el grupo B 095 era similar a la del grupo de vehículo, y por lo tanto, no se observó una supresión significativa. Los resultados descritos previamente demuestran que la administración de BM095 no produce un efecto terapéutico sobre la dermatitis por contacto aguda en este modelo. Aplicabilidad industrial La presente invención provee novedosos agentes para prevenir o tratar enfermedades inflamatorias. Los agentes para prevenir o tratar enfermedades inflamatorias provistos por la presente invención contienen como ingrediente activo un antagonista de NR 10, más preferentemente, un anticuerpo que tiene actividad neutralizante de NR 10. En los últimos años, se ha centrado la atención a las terapias anti-citoquina basadas en anticuerpos monoclonales. Sin embargo, en muchas afecciones patológicas reales ha sido difícil producir efectos terapéuticos por bloqueo de una citoquina individual debido a la activación de vías compensadoras. Además, era difícil estimar el tipo de enfermedades en donde era posible obtener efectos terapéuticos por bloqueo de la citoquina diana. Bajo las circunstancias descritas previamente, los inventores de la presente descubrieron que los anticuerpos neutralizantes anti-NR 10 podían suprimir significativamente los síntomas en modelos de ratones con dermatitis atópica, dermatitis crónica, reumatismo, osteoartritis o semejantes. Los inventores de la presente también tuvieron éxito en la preparación de anticuerpos neutralizantes del NR 10 humano. Los agentes para prevenir o tratar enfermedades inflamatorias, que comprenden como ingrediente activo anticuerpos neutralizantes del NR 10 humano, son de gran utilidad en aplicaciones clínicas en seres humanos.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un agente para prevenir o tratar una enfermedad inflamatoria, caracterizado porque dicho agente comprende como ingrediente activo un antagonista de NR 10.

2. El agente preventivo o terapéutico de la reivindicación 1, caracterizado además porque el antagonista de NR 10 es un anticuerpo que tiene actividad neutralizante de NR 10.

3. El agente preventivo o terapéutico de la reivindicación 2, caracterizado además porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

4. El agente preventivo o terapéutico de la reivindicación 2, caracterizado además porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal que tiene actividad neutralizante de N R 10 humano.

5. El agente preventivo o terapéutico de cualquiera de las cláusulas 2 a 4, caracterizado además porque el anticuerpo es un anticuerpo recombinante.

6. El agente preventivo o terapéutico de la reivindicación 5, caracterizado además porque el anticuerpo recombinante es un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo humano.

7. El agente preventivo o terapéutico de cualquiera de las cláusulas 2 a 6, caracterizado además porque el agente comprende como ingrediente activo un fragmento y/o un fragmento modificado del anticuerpo con actividad neutralizante de NR 10.

8. El agente preventivo o terapéutico de cualquiera de las cláusulas 1 a 7, caracterizado además porque la enfermedad inflamatoria es dermatitis atópica.

9. El agente preventivo o terapéutico de cualquiera de las cláusulas 1 a 7, caracterizado además porque la enfermedad inflamatoria es dermatitis crónica.

10. El agente preventivo o terapéutico de cualquiera de las cláusulas 1 a 7, caracterizado además porque la enfermedad inflamatoria es reumatismo.

11. El agente preventivo o terapéutico de cualquiera de las cláusulas 1 a 7, caracterizado además porque la enfermedad inflamatoria es osteoartritis.

12. Un anticuerpo, caracterizado porque tiene actividad neutralizante de NR 10.

13. El anticuerpo de la reivindicación 12, caracterizado además porque es un anticuerpo monoclonal.

14. El anticuerpo de la reivindicación 12, caracterizado además porque NR 10 es NR 10 humano.

15. El anticuerpo de cualquiera de las cláusulas 12 a 14, caracterizado además porque es un anticuerpo recombinante.

16. El anticuerpo de la reivindicación 15, caracterizado además porque el anticuerpo recombinante es un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo humano.

17. Un fragmento y/o un fragmento modificado, caracterizado además porque es del anticuerpo de cualquiera de las cláusulas 12 a 16.

18. Un método para prevenir o tratar una enfermedad inflamatoria, caracterizado además porque comprende el paso de administrar un antagonista de NR 10 a un paciente que sufre de una enfermedad inflamatoria.

19. Uso de un antagonista de NR 10, caracterizado además porque es para producir un agente para prevenir o tratar una enfermedad inflamatoria.