NO344849B1

NO344849B1 - Et anti-NR10/IL-31RA-antistoff som har NR10/IL-31RA-nøytraliserende aktivitet til anvendelse for å forebygge eller behandle atopisk dermatitt, revmatisme, eller osteoartritt, eller et middel derav.

Info

Publication number: NO344849B1
Application number: NO20090093A
Authority: NO
Inventors: Masakazu Hasegawa; Hidetomo Kitamura; Hideki Adachi; Keiko Kasutani
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2006-06-08
Filing date: 2009-01-07
Publication date: 2020-06-02
Also published as: CN103272232B; KR20150091545A; US20150315280A1; NO20090093L; TWI419703B; IL195361A0; ES2429407T3; KR20140097495A; AU2007255753B2; CN101500608A; EP2371393A1; CL2007001665A1; KR101557603B1; TW200810778A; KR20090024243A; CA2654623C; DK2047863T3; SI2047863T1; MY157796A; RU2511406C2

Description

Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse vedrører nye midler for å forhindre eller behandle inflammatoriske sykdommer, som omfatter NR 10-antagonister som aktive ingredienser. Foreliggende oppfinnelse vedrører også fremgangsmåter for å forhindre eller behandle inflammatoriske sykdommer som anvender NR 10-antagonister.

Oppfinnelsens bakgrunn

Mange cykokiner er kjent som humorale faktorer som er involvert i veksten og differensieringen av forskjellige celletyper eller i aktiveringen av differensierte, modne cellefunksjoner. Cytokinstimulerte celler produserer forskjellige typer cytokiner og danner derved nettverk av flere cytokiner i kroppen. Biologisk homeostase opprettholdes ved en fin balanse av den gjensidige regulering mellom cytokiner i disse nettverkene. Mange inflammatoriske sykdommer er antatt å resultere fra svikt i slike cytokinnettverk.

Monoklonal, antistoffbasert anticytokinterapi tiltrekker seg derved mye oppmerksomhet. Anti-TNF-antistoffer og anti-IL-6-reseptorantistoffer har for eksempel blitt vist å være meget effektive klinisk. På den annen side er det mange eksempler på svikt hvor ingen terapeutiske effekter ble produsert når et enkelt cytokin, slik som IL-4, ble blokkert alene som følge av aktiveringen av kompensatoriske veier ved virkelige patologiske tilstander.

De foreliggende oppfinnerne lyktes i å isolere en ny cytokinreseptor NR 10, som var meget homolog med gp130 som er en reseptor for IL-6-signaloverføring (patentdokument 1). NR 10 danner en heterodimer med onkostatin M-reseptor (OSMR) og fungerer som en IL-31-reseptor (ikke-patentdokument 1). Zymogenetics, Inc. rapporterte at transgene mus som overuttrykker IL-31 spontant, utviklet pruritisk dermatitt (patentdokument 2).

Man kan imidlertid ikke være sikker på at den tvungne ekspresjon av et cytokin i mus eller et høyt blodnivå av et cytokin i patologisk musemodell virkelig er årsaken til en sykdom. Det er ingen informasjon om noen terapeutiske effekter produseres når et signal blokkeres av et antistoff. Pruritisk dermatitt utvikles for eksempel i transgene mus, hvor IL-18 overuttrykkes i keratinocytter. Videre forhøyes IL-18-konsentrasjonen i blod med progresjonen av patologiske tilstander i NC/Nga-modellmus for spontan atopisk dermatitt. Basert på funnene ovenfor ble overekspresjonen av IL-18 forutsett å være årsaken til sykdom. I virkeligheten produserte imidlertid administreringen av nøytraliserende antistoffer ingen terapeutiske effekter (ikke-patentdokument 2).

Som beskrevet ovenfor, produserer inhibering av funksjonen til et cytokin ikke nødvendigvis terapeutiske effekter i sykdommer, hvor ekspresjonsnivået av et cytokin er forhøyet. Prediksjon av sykdommer i hvilke terapeutiske effekter virkelig produseres er vanskelig å foreta, basert på uttrykksnivået av et cytokin. Det er dermed viktig å finne sykdommer hvor inhibering av signaloverføring av et målcytokin virkelig produserer terapeutiske effekter.

Dokumenter som viser teknikkens stand ifølge foreliggende oppfinnelse er beskrevet nedenfor.

Patentdokument 1: WO 00/75314

Patentdokument 2: WO 03/060090

Patentdokument 3: WO 2002077230 A1 beskriver identifiseringen av NR10 genet og dets full-lengde cDNA.

Ikke-patentdokument 1: IL-31 er assosiert med kutane lymfocytt-antigenpositive hudtilhørende T-celler hos pasienter med atopisk dermatitt. J Allergi Clin Immunol. 2006 feb., 117 (2): 418-25

Ikke-patentdokument 2: Administration of anti-interleukin 18 antibody fails to inhibit development of dermatitis in atopic dermatitis-model mice NC/Nga, British Journal of Dermatology 149: 39-45, 2003.

Ikke-patentdokument 3: Predominant expression of the long isoform of GP130 like (GPL) receptor is required for interleukin-31 signaling, European Cytokine Network, vol. 15, no. 4, 2004, side 291-302 omtaler den signaliserende kapasiteten til OSMR underenheten og viste at tilsetning av et anti-OSMR monoklonalt antistoff til en glioblastoma cellelinjekultur resulterte i en fullstendig nøytralisering av STAT3 responsen.

Beskrivelse av oppfinnelsen

(Problemer som skal løses ved oppfinnelsen)

Foreliggende oppfinnelse ble oppnådd i lys av omstendighetene som er beskrevet ovenfor. Et mål ifølge foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe cytokinreseptorantagonist-baserte anti-cytokinterapier for inflammatoriske sykdommer. Mer spesifikt er målet ifølge foreliggende oppfinnelse å oppdage inflammatoriske sykdommer, hvor en terapeutisk effekt kan tilveiebringes ved anti-NR 10-nøytraliserende antistoffer og å tilveiebringe nye fremgangsmåter for å behandle slike sykdommer. Et annet mål ifølge foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe anti-humane NR 10- nøytraliserende antistoffer som er klinisk anvendbare på mennesker.

(Fremgangsmåte for å løse problemene)

De foreliggende oppfinnerne utførte dedikerte studier for å løse ovenfor beskrevne mål. De foreliggende oppfinnerne forsøkte å vurdere medikamenteffektiviteten til anti-mus-NR 10-nøytraliserende antistoffer i musemodeller for forskjellige patologiske tilstander. Resultatene viste at de nøytraliserende antistoffene produserte effekten av markert å undertrykke symptomer i modellmus for atopisk dermatitt ved anvendelse av NC/Nga-mus, og i modellmus for kronisk dermatitt, som ble utviklet ved gjentatt anvendelse av pikrylklorid. Dette beviste at de nøytraliserende antistoffene virkelig var nyttige som et terapeutisk middel. I tillegg ble antistoffene vist å produsere effekten av å undertrykke symptomer i kollagenartritt som er en modell for reumatisme, og i kollagenaseartritt, som er en modell for osteoartritt. Disse resultatene indikerer at det NR 10-nøytraliserende antistoffet ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes for å forhindre eller behandle kronisk betennelse. De foreliggende oppfinnerne lyktes også i å tilveiebringe humane NR 10-nøytraliserende antistoffer. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer spesifikt: P30667NO00-VN

Patentkrav

[1] Et anti-NR10/IL-31RA-antistoff som har NR10/IL-31RA-nøytraliserende aktivitet til anvendelse for å forebygge eller behandle en inflammatorisk sykdom, hvor den inflammatoriske sykdommen er

a. atopisk dermatitt hvor antistoffet undertrykker minst ett av symptomene på atopisk dermatitt valgt fra gruppen som består av (1) kløe, (2) rødhet og blødning, (3) ødem, (4) skade og vevskader og 5) skorpedannelse og tørrhet;

b. revmatisme; eller

c. osteoartritt.

[2] Et middel til anvendelse for å forebygge eller behandle en inflammatorisk sykdom, hvor midlet omfatter antistoffet ifølge [1] som en aktiv ingrediens, og hvor den inflammatoriske sykdommen er

b. revmatisme; eller

c. osteoartritt.

[3] Antistoff til anvendelse ifølge [1] eller middel for anvendelse ifølge [2], hvor antistoffet er et monoklonalt antistoff.

[4] Antistoff til anvendelse ifølge [1] eller [3] eller midlet for anvendelse ifølge [2] eller [3], hvor NR10/IL-31RA er humant NR10/IL-31RA.

[5] Antistoff til anvendelse ifølge et hvilket som helst av [1], [3] eller [4] eller midlet for bruk ifølge et hvilket som helst av [2] til [4], hvor antistoffet er et rekombinant antistoff.

[6] Antistoff eller middel for anvendelse ifølge [5], hvor det rekombinante antistoffet er et kimært antistoff, humanisert antistoff eller humant antistoff.

[7] Fragment og/eller et kjemisk modifisert fragment av et antistoff som definert i et hvilket som helst av [1] eller [3] til [6] for anvendelse for å forebygge eller behandle en inflammatorisk sykdom, hvor den inflammatoriske sykdommen er

b. revmatisme; eller

c. osteoartritt.

hvor nevnte fragment er et Fab, Fab', F(ab')2 eller Fv fragment.

[8] Et middel som omfatter fragmentet for anvendelse ifølge [7].

Kort beskrivelse av figurene

Fig. 1 er en graf som viser et resultat, som er tilveiebrakt ved å observere den cellevekstundertrykkende effekten av BM095 som er tilsatt til et cellevekstanalysesystem ved anvendelse av IL-31-avhengige Ba/F3-celler. Den horisontale aksen indikerer beregnede konsentrasjoner av mIL-31 i analysesystemet, og den vertikale aksen indikerer celletall (OD450 (absorbans ved 450 nm)). Mengder av BM095 tilsatt (enhet: ng/ml) er vist i figurteksten. En cellevekstundertrykkende effekt avhengig av mengden av BM095 som ble tilsatt, ble observert.

Fig. 2 er en graf som viser en terapeutisk effekt, som ble produsert når anti-NR 10-antistoffer ble administrert til atopiske modellmus for dermatitt. En signifikant betennelsesundertrykkende effekt ble observert i den anti-NR 10-antistoffadministrerte gruppen, sammenlignet med den negative kontrollgruppen (bæremiddelgruppe).

Fig. 3 er en graf som viser en sekvensiell forandring i kroppsvekt etter at anti-NR 10-antistoffer ble administrert til atopiske modellmus for dermatitt. Vekttap ble observert i gruppen som ble administrert med et eksisterende anti-inflammatorisk middel. Derimot ble ingen vektforandring observert i den anti-NR 10-antistoffadministrerte gruppen. Anti-NR 10-antistoffet ble dermed bevist å være trygt.

Fig. 4 er en graf som viser en terapeutisk effekt som ble produsert når anti-NR 10-antistoffer ble administrert til modellmus for kronisk dermatitt. En signifikant undertrykkende effekt på aurikkelopphovning ble funnet i den anti-NR 10-antistoffadministrerte gruppen.

Fig. 5 er et fotografi som viser immunhistokjemisk farging av aurikkelen fra en modellmus for kronisk dermatitt. Som ved tilfellet for mennesker, ble ekspresjonen av NR 10 fra mus funnet å være økt i fortykket epidermis.

Fig. 6 er en graf som viser en artrittundertrykkende effekt, som ble produsert når anti-NR 10-antistoffer ble administrert til modellmus for kollagenindusert artritt.

Fig. 7 er en graf som viser forholdet mellom arealet under kurven (AUC) og konsentrasjonen av BM095 som ble administrert til den kollagenaseinduserte artritt (osteoartritt)-modellen. AUC betyr arealet under kurven for forskjellen mellom de høyre og venstre kneleddsvidder, definert som en verdi som representerer opphovning i det høyre kneledd.

Fig. 8 er en graf som viser korrelasjonen mellom konsentrasjonen av humane NR 10-nøytraliserende antistoffer (renset antistoff) og cellevekstundertrykkende aktivitet i nærvær av IL-31. Antistoffene 1, 2 og 3 viste sterk NR 10-nøytraliserende aktivitet.

Fig. 9 er en graf som viser korrelasjonen mellom konsentrasjonen av kimært antistoff NA633 mot humant NR 10 og cellevekstundertrykkende aktivitet i nærvær av IL-31. NA633 viste sterk NR 10-nøytraliserende aktivitet.

Fig. 10 er et diagram som sammenligner aminosyresekvensen av humant NR 10 og en NR 10 fra en cynomolgusape. Den dobbeltunderstrekede sekvensen indikerer transmembranregionen.

Fig. 11 er en graf som viser den cellevekstundertrykkende aktiviteten til det kimære antistoffet NA633 i human-IL-31-stimulert cynomolgusape NR 10-/human OSMR-/BAF-cellelinje. NA633 viste også cynomolgusape NR 10-nøytraliserende aktivitet.

Fig. 12 er en graf som viser prosentvis forandring i kroppsvekt i modellmus for DSS-kolitt.

Fig. 13 er en graf som viser forandring i tykkelsen av aurikkelen i modellen for akutt kontaktdermatitt ved anvendelse av pikrylklorid.

Best fremgangsmåte for å utføre oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse vedrører midler for å forhindre eller behandle inflammatoriske sykdommer som omfatter NR 10-antagonister som aktive ingredienser. I henhold til oppfinnelsen er NR10 antagonisten et anti-NR10/IL-31RA antistoff.

Foreliggende oppfinnelse er basert på de foreliggende oppfinneres funn av at NR 10-antagonister (for eksempel anti-NR 10-nøytraliserende antistoffer) signifikant undertrykker symptomer i modellmus med atopisk dermatitt, kronisk dermatitt, reumatisme, osteoartritt og lignende. Antistoffet i henhold til oppfinnelsen har NR10/IL-31RA nøytraliserende aktivitet.

NR 10 er et protein som danner en heterodimer med onkostatin M-reseptor (OSMR) og fungerer som en IL-31-reseptor. NR 10 er også kjent ved andre navn, slik som glm-r (J Biol Chem 277, 16831-6, 2002), GPL (J Biol Chem 278, 49850-9, 2003) og IL-31RA (Nat Immunol 5, 752-60, 2004). NR 10 ifølge foreliggende oppfinnelse inkluder proteiner som kalles ved slike navn. NR 10 ifølge foreliggende oppfinnelse inkluderer også NR 10 som er avledet fra mennesker, mus og andre pattedyr. NR 10 inkluderer fortrinnsvis human- og museavledet NR 10. Det finnes flere kjente spleisevarianter av human-avledet NR 10 (WO 00/07314). Av de ovenfor beskrevne spleisevariantene består NR 10 av 662 aminosyrer og omfatter et trans-membrandomene. NR 10.2 er et løselig reseptorlignende protein som består av 252 aminosyrer uten transmembrandomenet. Kjente NR 10-spleisevarianter som fungerer som transmembranreseptorproteiner inkluderer imidlertid NR 10.3 og IL-31Rav3. Den humane NR 10 ifølge foreliggende oppfinnelse er ikke spesielt begrenset så lenge den danner en heterodimer med onkostatin M-reseptor (OSMR) og fungerer som en IL-31-reseptor. NR 10 inkluderer fortrinnsvis NR 10.3 (også referert til som ILRAv4 (Nat Immunol 5, 752-60, 2004)) og IL-31Rav3, NR 10.3 (IL-31Rav4) består av 662 aminosyrer (WO 00/075314, Nat Immunol 5, 752-60, 2004) består av 732 aminosyrer (GenBank-tilgangsnummer: NM_139017).

Aminosyresekvensen til IL-31RAv4 er kjent i SEKV. ID. NR.: 6, og aminosyresekvensen til IL-31RAv3 er vist i SEKV. ID. NR.: 7. Museavledet NR 10 inkluderer imidlertid proteiner som omfatter aminosyresekvensen ifølge SEKV. ID. NR.: 5.

NR 10-antagonistene i i foreliggende oppfinnelse refererer til substanser som binder til NR 10 og blokkerer NR 10-aktiveringsbasert, intracellulær signaloverføring og derved forårsaker tap eller undertrykking av fysiologiske celleaktiviteter. Fysiologiske aktiviteter inkluderer her for eksempel aktiviteter av å indusere eller undertrykke produksjonen av fysiologisk aktive substanser (for eksempel kjemokiner og inflammatoriske cytokiner), aktiviteter for å forsterke eller undertrykke utskillelsen av substansene, vekstaktivitet, veksinduserende aktivitet, overlevelsesaktivitet, differensieringsaktivitet, differensieringsinduserende aktivitet, transkripsjonell aktivitet, membrantransportaktivitet, bindingsaktivitet, proteolytisk aktivitet, fosforylerings/-defosforyleringsaktivitet, oksidasjon-reduksjonsaktivitet, overføringsaktivitet, nukleolytisk aktivitet, dehydreringsaktivitet, celledødsinduserende aktivitet og apoptoseinduserende aktivitet.

Tilstedeværelsen av antagonistaktivitet kan bestemmes ved fremgangsmåter som er kjent for fagfolk på området. Testforbindelser settes for eksempel i kontakt med NR 10 uttrykt på overflaten til celler, i nærvær av en ligand, og det bestemmes om intracellulær signaloverføring, som er en indikator for NR 10- aktivering, genereres eller ikke. En slik bestemmelse kan utføres, for eksempel ved fremgangsmåten som er beskrevet i dokumentet ”Dillon SR, et al., Interleukin 31, a cytokine produced by activated T-cells, induces dermatitis in mice. Nat Immunol. 2004 juli, 5(7):752-60”.

Forbindelser som inhiberer intracellulær signaloverføring i respons til ligandstimulering, er tenkt å fungere som NR 10-antagonister.

Antagonistene ifølge foreliggende oppfinnelse kan være naturlige eller kunstige forbindelser. Kjente forbindelser kan anvendes som antagonistene ifølge foreliggende oppfinnelse. Nye forbindelser som er funnet å ha antagonistaktivitet ved fremgangsmåtene som er beskrevet ovenfor, kan også anvendes.

Ifølge den foreliggende oppfinnelsen er NR 10-antagonistene antistoffer som har aktiviteten å nøytralisere NR 10. ”Antistoffene som har NR 10-nøytraliserende aktivitet” ifølge foreliggende oppfinnelse, refererer til antistoffer som har aktiviteten å undertrykke NR 10-baserte, fysiologiske aktiviteter. ”Antistoffene som har NR 10-nøytraliserende aktivitet” ifølge foreliggende oppfinnelse kan være polyklonale eller monoklonale antistoffer og inkluderer som en foretrukket utførelsesform, monoklonale antistoffer.

Slike monoklonale antistoffer som har NR 10-nøytraliserende aktivitet, kan for eksempel tilveiebringes ved den følgende fremgangsmåte: anti-NR 10-monoklonale antistoffer fremstilles ved å anvende NR 10 som et antigen eller et fragment derav som er avledet fra et pattedyr, slik som menneske eller mus, ved kjente fremgangsmåter, og antistoffer som har NR 10-nøytraliserende aktivitet, selekteres så fra de derved tilveiebrakte anti-NR 10-monoklonale antistoffene. Spesifikt oppnås immunisering ved konvensjonelle immuniseringsfremgangsmåter ved anvendelse av et ønsket antigen eller celler som uttrykker det ønskede antigen som et sensibiliserende antigen. Anti-NR 10-monoklonale antistoffer kan fremstilles ved å fusjonere de tilveiebrakte immuncellene med kjente opphavsceller ved anvendelse av konvensjonelle fremgangsmåter for cellefusjonering og screene dem for monoklonalt antistoffproduserende celler (hybridomer) ved konvensjonelle fremgangsmåter for screening. Dyr som skal immuniseres, inkluderer for eksempel pattedyr, slik som mus, rotter, kaniner, sauer, apekatter, geiter, esler, kyr, hester og griser. Antigenet kan fremstilles ved anvendelse av den kjente NR 10-gensekvensen ifølge kjente fremgangsmåter, for eksempel ved fremgangsmåter som anvender baculovirus (for eksempel WO 98/46777). Som beskrevet i eksemplene her nedenfor, kan antistoffer som har NR 10-nøytraliserende aktivitet velges for eksempel ved å teste effekten av å undertrykke veksten av en IL-31-avhengig cellelinje etter at kandidatantistoffet tilsettes til celler fra den IL-31-avhengige cellelinjen. Antistoffer som undertrykker veksten av IL-31-avhengig cellelinje i fremgangsmåten som er beskrevet ovenfor, er ansett å ha NR 10-nøytraliserende aktivitet.

Hybridomer kan for eksempel fremstilles ifølge fremgangsmåten til Milstein et al., (Kohler, G. og Milstein C., Methods Enzymol. (1981) 73: 3-46) eller tilsvarende. Når immunogenisiteten til et antigen er lav, kan immunisering utføres etter kobling av antigenet med et makromolekyl som har immunogenisitet, slik som albumin.

I en foretrukket utførelsesform ifølge foreliggende oppfinnelse inkluderer antistoffer som har NR 10-nøytraliserende aktivitet monoklonale antistoffer, som har aktiviteten å nøytralisere humant NR 10. Det er ingen spesiell begrensing på immunogenet for fremstilling av monoklonale antistoffer som har aktiviteten å nøytralisere humant NR 10, så lenge som det tillater fremstilling av antistoffer som har aktiviteten å nøytralisere humant NR 10. Flere varianter av humant NR 10 er for eksempel kjent å eksistere. Hvilke som helst av variantene kan anvendes som immunogener så lenge de tillater fremstilling av antistoffer som har humant NR10-nøytraliserende aktivitet. Alternativt kan et peptidfragment fra NR 10 eller en naturlig NR 10-sekvens introduseres med kunstige mutasjoner som anvendes som immunogenet under de samme betingelsene. Humant NR 10.3 er et foretrukket immunogen for å fremstille antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse, som har NR 10-nøytraliserende aktivitet.

Her er de ovenfor beskrevne antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse ikke spesielt begrenset så lenge de har NR 10-nøytraliserende aktivitet. Antistoffene inkluderer også rekombinante antistoffer, slik som kimære antistoffer, humaniserte antistoffer og humane antistoffer. De kimære antistoffene omfatter for eksempel de tung- og lettkjede konstante regionene til et humant og de tung- og lettkjede variable regionene til et ikkehumant pattedyr, slik som en mus. De kimære antistoffene kan produseres ved kjente fremgangsmåter. For eksempel kan antistoffene produseres ved å klone et antistoff-gen fra hybridomer, innsette det i en passende vektor og introdusere konstruktet i verter (se for eksempel Carl, A. K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Publisert i Storbritannia av MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990). Spesifikt syntetiseres cDNA fra antistoff-variable regioner (V-regioner) fra mRNA fra hybridomer ved anvendelse av revers transkriptase. Når DNA som koder for V-regionene til et antistoff av interesse er tilveiebrakt, kobles disse til DNA som koder for de konstante regionene (C-regioner) av et ønsket humant antistoff. De resulterende konstruktene blir satt inn i ekspresjonsvektorer. Alternativt kan DNAene som koder for antistoff-V-regionene settes inn i ekspresjonsvektorer som omfatter DNAer som koder for C-regionene til et humant antistoff. DNAene settes inn i ekspresjonsvektorer, slik at de uttrykkes under reguleringen av de ekspresjonsregulerende regionene, for eksempel enhansere og promoterer. I det neste trinn kan vertscellene transformeres med ekspresjonsvektorene for å tillate ekspresjon av kimære antistoffer.

Et humanisert antistoff, som også kalles et omformet, humant antistoff, tilveiebringes ved å overføre en komplementaritetsbestemmende region (CDR) av et antistoff fra et ikke-humant pattedyr, slik som en mus, med CDR fra et humant antistoff. Konvensjonelle, genetiske rekombineringsteknikker for fremstilling av slike antistoffer er også kjent. Spesifikt syntetiseres en DNA-sekvens som er utformet for å ligere en CDR fra et museantistoff med rammeverkregionene (FR) til humant antistoff ved PCR, ved anvendelse av flere oligonukleotider som er konstruert for å omfatte overlappende deler ved deres ender. Et humanisert antistoff kan tilveiebringes ved (1) å ligere det resulterende DNA til et DNA som koder for et humant antistoffs konstante region, (2) å inkorporere dette i en ekspresjonsvektor og (3) å transfektere vektoren inn i en vert for å produsere antistoffet (se europeisk patentsøknad nr. EP 239 400 og Internasjonal Patentsøknadspublikasjon nr. WO 96/02576). Humant antistoff-FRer som ligeres via CDRet, velges der CDRet danner et fordelaktig antigenbindende sete. Om nødvendig kan aminosyrer i rammeverkregionen til et antistoffs variable region bli substituert, slik at CDRet fra et omformet, humant antistoff danner et passende antigenbindende sete (Sato, K. et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856).

Fremgangsmåter for å tilveiebringe humane antistoffer er også kjent. For eksempel kan ønskede, humane antistoffer med antigenbindende aktivitet tilveiebringes ved (1) å sensibilisere humane lymfocytter med antigener av interesse eller celler som uttrykker antigener av interesse in vitro og (2) fusjonere de sensibiliserte lymfocyttene med humane myelomceller, slik som U266 (se japansk patentsøknad Kokoku publikasjon nr. (JP-B) H01-59878 (gransket, godkjent japansk patentsøknad, publisert for innsigelse). Alternativt kan det ønskede, humane antistoff også tilveiebringes ved å anvende et ønsket antigen for å immunisere et transgent dyr som omfatter et fullstendig repertoar av humane antistoff-gener (se internasjonale patentsøknader med publikasjonsnumrene WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096 og WO 96/33735).

Videre er teknikker for å tilveiebringe humane antistoffer ved panorering med et humant antistoff-fagbibliotek kjente. For eksempel er den variable regionen til et humant antistoff uttrykt som et enkeltkjede-antistoff (scFv) på overflaten til en fag, ved anvendelse av en fremgangsmåte for fagfremvisning og fag som binder til antigenet kan selekteres. Ved å analysere genene fra selekterte fag, kan DNA-sekvensene som koder de variable regionene til humane antistoffer som binder antigenet, bestemmes. Hvis DNA-sekvensene fra scFv som binder til antigenet er identifisert, kan passende ekspresjonsvektorer som omfatter disse sekvensene, konstrueres for å tilveiebringe humane antistoffer. Slike fremgangsmåter er velkjente (se (WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 19172, WO 95/01438 og WO 95/15388).

Aminosyresekvensen fra den tunge kjedens variable region eller den lette kjedens variable region kan være en aminosyresekvens med en substitusjon, delesjon, addisjon og/eller insersjon av én eller flere aminosyrer i aminosyresekvensen til den tunge kjedens variable region eller lette kjedens variable region fra et antistoff som har blitt bekreftet å ha NR 10-nøytraliserende aktivitet, så lenge NR 10-nøytraliserende aktivitet er beholdt. Fremgangsmåter som er velkjente for fagfolk på området kan anvendes for å fremstille aminosyresekvensen til den tunge kjedens variable region eller den lette kjedens variable region fra antistoffet som har NR 10-nøytraliserende aktivitet, som omfatter en substitusjon, delesjon, addisjon og/eller insersjon av én eller flere aminosyrer i aminosyresekvensen til den tunge kjedens variable region eller den lette kjedens variable region, inkludert kjente fremgangsmåter for å introdusere mutasjoner i proteiner. Videre kan fagfolk på området fremstille mutanter som er funksjonelt ekvivalente med den tunge kjedens variable region eller den lette kjedens variable region fra antistoffet som har NR 10-nøytraliserende aktivitet ved å introdusere passende mutasjoner i aminosyresekvensen til den tunge kjedens variable region eller den lette kjedens variable region til antistoffet som har NR 10-nøytraliserende aktivitet ved anvendelse av sekvensspesifikk mutagenese (Hashimoto-Gotoh, T, Mizuno, T, Ogasahara, Y, og Nakagawa, M. (1995) An oligodeoxyribonukleotid-directed dual amber method for site-directed mutagenesis. Gene 152, 271-275. Zoller, MJ og Smith, M. (1983) Oligoneotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors. Methods Enzymol. 100, 468-500, Kramer, W, Drutsa, V. Jansen, HW, Kramer, B, Pflugfelder, M, og Fritz, HJ (1984) The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction. Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456. Kramer W, og Fritz HJ (1987) Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA Methods.

Enzymol. 154, 350-367, Kunkel, TA (1985) Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc Natl Acad Sci USA. 82, 488-492) eller tilsvarende. Den tunge kjedens variable regioner eller den lette kjedens variable regioner som omfatter mutasjoner ved én eller flere aminosyrer i den tunge kjedens variable region eller den lette kjedens variable region av antistoffet som har NR 10-nøytraliserende aktivitet, er dermed også inkludert i den tunge kjedens variable region eller den lette kjedens variable region ifølge foreliggende oppfinnelse.

Når en aminosyreresidie endres, muteres aminosyren fortrinnsvis til forskjellig(e) aminosyre(r) som bevarer egenskapene til aminosyrens sidekjede. Eksempler på aminosyre-sidekjede-egenskaper er: hydrofobe aminosyrer (A, I, L, M, F, P, W, Y og V), hydrofile aminosyrer (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S og T), aminosyrer som omfatter alifatiske sidekjeder (G, A, V, L, I og P), aminosyrer som omfatter hydroksylgruppeinneholdende sidekjeder (S, T og Y), aminosyrer som omfatter svovelinneholdende sidekjeder (C og M), aminosyrer som omfatter karboksylsyre- og amidinneholdende sidekjeder (D, N, E og Q), aminosyrer som omfatter basiske sidekjeder (R, K og H), og aminosyrer som omfatter aromatiske sidekjeder (H, F, Y og W) (aminosyrer er representert ved én-bokstav-koder i parenteser). Aminosyresubstitusjoner innen hver gruppe kalles konservative substitusjoner. Det er allerede kjent at et polypeptid som omfatter en modifisert aminosyresekvens, hvor én eller flere aminosyrerester i en gitt aminosyresekvens er deletert, addert og/eller substituert med andre aminosyrer, kan beholde den opprinnelige, biologiske aktiviteten (Mark, D. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1984) 81:5662-6, Zoller, M. J. og Smith, M., Nucleic Acids Res. (1982) 10:6487-500, Wang, A. et al., Science (1984) 224:1431-3, Dalbadie-McFarland, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79:6409-13). Slike mutanter omfatter en aminosyresekvens som er minst 70 % identisk med aminosyresekvensen til en tung kjedes variable region eller en lett kjedes variable region ifølge foreliggende oppfinnelse, mer foretrukket minst 75 %, enda mer foretrukket minst 80 %, enda mer foretrukket minst 85 %, enda mer foretrukket minst 90 % og mest foretrukket minst 95 % identisk. Her er sekvensidentitet definert som prosentandelen av rester som er identiske med de i den opprinelige aminosyresekvensen fra den tunge kjedens variable region eller den lette kjedens variable region, bestemt etter at sekvensene er samstilt og tomrom er passende introdusert for å maksimere sekvensidentiteten som nødvendig. Identiteten til aminosyresekvenser kan bestemmes ved fremgangsmåten som er beskrevet ovenfor.

Alternativt kan en aminosyresekvens til den tunge kjedens variable region eller den lette kjedens variable region, som omfatter en substitusjon, delesjon, addisjon og/eller insersjon av én eller flere aminosyrer i aminosyresekvensen til den tunge kjedens variable region eller den lette kjedens variable region og beholder NR 10-nøytraliserende aktivitet, tilveiebringes fra nukleinsyre som hybridiserer under stringente betingelser til nukleinsyre som omfatter nukleotidsekvensen som koder for aminosyresekvensen til den tunge kjedens variable region eller den lette kjedens variable region. Stringente hybridiseringsbetingelser for å isolere en nukleinsyre som hybridiserer under stringente betingelser til en nukleinsyre som omfatter nukleotidsekvensen, som koder for aminosyresekvensen til den tunge kjedens variable region eller den lette kjedens variable region, inkluderer for eksempel betingelsene bestående 6M urea, 0,4 % SDS, 0,5 x SSC og 37 <o>C, eller hybridiseringsbetingelser med stringenser som er ekvivalente dertil. Med mer stringente betingelser, for eksempel betingelsene bestående av 6M urea, 0,4 % SDS, 0,1x SSC og 42 <o>C, kan isolering av nukleinsyrer med en mye høyere homologi forventes. Sekvensene til de isolerte nukleinsyrene kan bestemmes ved de kjente fremgangsmåtene som er beskrevet nedenfor. Den totale nukleotidsekvenshomologien til den isolerte nukleinsyren er minst 50 % eller høyere sekvensidentitet, fortrinnsvis 70 % eller høyere, mer foretrukket 90 % eller høyere (for eksempel 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % eller høyere).

En nukleinsyre som hybridiserer under stringente betingelser til en nukleinsyre som omfatter nukleotidsekvensen som koder for aminosyresekvensen til den tunge kjedens variable region eller den lette kjedens variable region, kan også isoleres ved å anvende, istedenfor de ovenfor beskrevne fremgangsmåter ved å anvende hybridiseringsteknikker, gen-amplifiserings metoder ved å anvende primere, som er syntetisert basert på informasjonen om nukleinsekvensen som koder for aminosyresekvensen til den tunge kjedens variable region eller den lette kjedens variable region, for eksempel polymerase-kjedereaksjon (PCR),.

Spesifikt kan identiteten av én nukleotidsekvens eller aminosyresekvens i forhold til en annen bestemmes ved anvendelse av algoritmen BLAST av Karling og Altschul (Procl. Natl. Aad. Sci. USA (1993) 90, 5873-7). Programmer, slik som BLASTN og BLASTX ble utviklet basert denne algoritmen (Altschul et al., J. Mol. Biol. (1990) 215, 403-10). For å analysere nukleotidsekvenser ifølge BLASTN basert på BLAST, settes parametrene for eksempel som poeng = 100 og ordlengde = 12. På den annen side inkluderer parametre som anvendes for analysen av aminosyresekvensene med BLASTX basert på BLAST, for eksempel poeng = 50 og ordlengde = 3. Standard parametre for hvert program anvendes når BLAST og Gapped BLAST-programmene anvendes. Spesifikke teknikker for slike analyser er kjent i faget (se internettsiden til National Center for Biotechnology Information (NCBI), Basic Local Alignment Search Tool (BLAST), http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

Alternativt kan antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse være ministoffer. Slike ministoffer ifølge foreliggende oppfinnelse inkluderer antistoff-fragmenter som mangler noen deler av et fullstendig antistoff (for eksempel hele IgG) og er ikke spesielt begrenset så lenge det beholder NR 10-nøytraliserende aktivitet. Ministoffene ifølge foreliggende oppfinnelse er ikke spesielt begrenset, så lenge de er deler av fullstendige antistoffer. Ministoffene omfatter fortrinnsvis en tungkjedes variable region (VH) eller en lettkjedes variable region (VL). Spesielt foretrukne ministoffer omfatter både VH og VL.

Ministoffene ifølge foreliggende oppfinnelse har fortrinnsvis lavere molekylvekt enn hele antistoffer. Ministoffene kan imidlertid danne multimere, for eksempel dimerer, trimerer eller tetramerer, og deres molekylvekt kan dermed være større enn de til hele antistoffer.

Ministoffene ifølge foreliggende oppfinnelse inkluderer for eksempel scFvantistoffer. ScFv-antistoffer er enkeltkjede-polypeptider som er konstruert ved å koble en tung kjedes variable region ([VH ]) eller en lett kjedes variable region ([VL]) via en lenke eller tilsvarende (Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 5879-5883, Plickthun ”The Pharmacology of Monoclonal Antibodies” bind 113, red., Resenburg og Moore, Springer Verlag. New York, s. 269-315, (1994)). Rekkefølgen til den tunge kjedens variable region og den lette kjedens variable region, som skal kobles sammen, er ikke spesielt begrenset, og de kan arrangeres i hvilken som helst rekkefølge. Eksempler på arrangementene er oppført nedenfor.

[VH] lenke [VL]

[VL] lenke [VH]

Aminosyresekvensen til den tunge kjedens variable region eller den lette kjedens variable region kan omfatte en substitusjon, delesjon, addisjon og/eller insersjon. Videre kan den tunge kjedens variable region og den lette kjedens variable region også mangle noen deler eller tilføyes med andre polypeptider, så lenge de har antigenbindende evne når de er sammenkoblet. Alternativt kan de variable regionene være kimeriserte eller humaniserte.

I foreliggende oppfinnelse omfatter lenker som binder den variable regionen til antistoffet, vilkårlige peptidlenker som kan introduseres ved anvendelse av genetisk konstruksjon eller syntetiske lenker (for eksempel lenker som er beskrevet i ”Protein Engineering, 9(3), 299-305, 1996”).

De foretrukne lenkene i foreliggende oppfinnelse er peptidlenker. Lengden til peptidlenkene er ikke spesielt begrenset, og fagfolk på området kan passende velge lengdene, avhengig av formålet. Typiske lengder er 1 til 100 aminosyrer, fortrinnsvis 3 til 50 aminosyrer, mer foretrukket 5 til 30 aminosyrer og spesielt foretrukket 12 til 18 aminosyrer (for eksempel 15 aminosyrer).

Aminosyresekvenser til slike peptidlenker inkluderer for eksempel:

Ser

Gly.Ser

Gly.Gly.Ser

Ser.Gly.Gly

Gly.Gly.Gly.Ser (SEKV. ID. NR.: 8)

Ser.Gly.Gly.Gly (SEKV. ID. NR.: 9)

Gly.Gly.Gly.Gly.Ser (SEKV. ID. NR.: 10)

Ser.Gly.Gly.Gly.Gly (SEKV. ID. NR.: 11)

Gly.Gly.Gly.Gly.Gly.Ser (SEKV. ID. NR.: 12)

Ser.Gly.Gly.Gly.Gly.Gly (SEKV. ID. NR.: 13)

Gly.Gly.Gly.Gly.Gly.Gly.Ser (SEKV. ID. NR.: 14)

Ser.Gly.Gly.Gly.Gly.Gly.Gly (SEKV. ID. NR.: 15)

(Gly.Gly.Gly.Gly.Ser (SEKV. ID. NR.: 10))n

(Ser.Gly.Gly.Gly.Gly (SEKV. ID. NR.: 11))n

hvor n er et heltall på 1 eller større.

Syntetiske lenker (kjemiske kryssbindende midler) inkluderer kryssbindende midler som rutinemessig anvendes for å kryssbinde peptider, for eksempel N-hydroksysuksinimid (NHS), disuksinimidylsuberat (DSS), bis(sulfosuksinimidyl) suberat (BS<3>), ditiobis(suksinimidylpropionat) (DSP), ditiobis(sulfosuksinimidylpropionat) (DTSSP), etylenglykolbis(suksinimidylsuksinat) (EGS), etylenglykolbis(sulfosuksinimidylsuksinat) (sulfo-EGS), disuksinimidyltartrat (DST), disulfosuksinimidyltartrat (sulfo-DST), bis[2-(suksinimidoksykarbonyloksy)etyl] sulfon (BSOCOES), og bis[2-(sulfosuksinimidoksykarbonyloksy)etyl] sulfon (sulfo-BSOCOES). Disse kryssbindende peptidene er kommersielt tilgjengelige.

Antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse inkluderer antistoffer, hvor to eller flere aminosyrerester er blitt tilføyd til aminosyresekvensen av et antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse. Videre er fusjonsproteiner som resulterer fra en fusjon mellom ett av antistoffene ovenfor og et andre peptid eller protein, inkludert i foreliggende oppfinnelse. Fusjonsproteinene kan fremstilles ved å ligere et polynukleotid som koder for et antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse og et polynukleotid som koder for et andre peptid eller polypeptid i leseramme, innsette dette i en ekspresjonsvektor og uttrykke fusjonskonstruktet i en vert. Noen teknikker som er kjent for fagfolk på området, er tilgjengelige for dette formål. Partnerpeptidet eller polypeptidet som skal fusjoneres med et antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse, kan være et kjent peptid, for eksempel FLAG (Hopp, T. P. et al,. Bio Technology 6, 1204-1210 (1988)). 6x His bestående av seks His (histidin) rester, 10x His, influensa-hemagglutinin (HA), humant c-myc-fragment, VSV-GP-fragment, p18HIV-fragment, T7-merke, HSV-merke, E-merke, SV40 T-antigenfragment, lck-merke, α-tubulinfragment, B-merke og protein C-fragment. Andre partnerpolypeptider som skal fusjoneres med antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse, inkluderer for eksempel GST (glutation-S-transferase), HA (influensahemagglutinin), konstant region fra immunglobulin, β-galaktosidase og MBP (maltosebindende protein). Et polynukleotid som koder for ett av disse kommersielt tilgjengelige peptidene eller polypeptidene, kan fusjoneres med et polynukleotid som koder for et antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse. Fusjonspolypeptidet kan fremstilles ved å uttrykke fusjonskonstruktet.

Antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse kan være forskjellige i aminosyresekvens, molekylvekt, isoelektrisk punkt, nærvær/fravær av sukkerkjeder og konformasjon, avhengig av cellen eller verten som produserer antistoffet eller fremgangsmåten for rensing. Et resulterende antistoff er imidlertid inkludert i foreliggende oppfinnelse, så lenge det er funksjonelt ekvivalent med et antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse. Når et antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse for eksempel uttrykkes i prokaryote celler, for eksempel E. coli, tilsettes en metionin-rest til den N-terminale enden av det originale antistoffets aminosyresekvens. Slike antistoffer er inkludert i foreliggende oppfinnelse.

Antistoffet ifølge foreliggende oppfinnelse kan fremstilles ved fremgangsmåter som er kjent for fagfolk på området. Antistoffet kan for eksempel fremstilles ved genetiske rekombineringsteknikker som er kjent for fagfolk på området, basert på sekvensen til et antistoff som gjenkjenner NR 10. Spesifikt kan et slikt antistoff fremstilles ved å konstruere et polynukleotid som koder for et antistoff, basert på sekvensen til et antistoff som gjenkjenner NR 10, innsette konstruktet i en ekspresjonsvektor og så uttrykke det i passende vertsceller (se for eksempel Co, M. S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976, Better, M. og Horwitz, A. H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496, Pluckthun, A. og Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515, Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663, Rousseaux, J. et al., Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669, Bird, R. E. og Walker, B. W., Trends Biotechnol. (1991) 9, 132-137).

Vektorene inkluderer M13-vektorer, pUC-vektorer, pBR322, pBluscript og pCR-Script. Når målet er å subklone og kutte ut cDNA, kan vektorene alternativt inkludere for eksempel pGEM-T, pDIRECT og pT7 i tillegg til vektorene som er beskrevet ovenfor.

Ekspresjonsvektorer er spesielt nyttige ved anvendelse av vektorer for å produsere antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse. Når målet for eksempel er ekspresjon i E. coli-stammer, slik som JM109, DH5- α, HB101 og XL1-Blue, har ekspresjonsvektorene ikke kun de ovenfor beskrevne karakteristikkene som tillater vektoramplifisering i E. coli, men må også inneha en promoter som tillater effektiv ekspresjon i E. coli, for eksempel lacZ-promoter (Ward et al., Nature (1989) 341, 544-546, FASEB J. (1992) 6, 2422-2427), araB-promoter (Better et al., Science (1988) 240, 1041-1043), T7-promoter eller tilsvarende. Slike vektorer inkluderer pGEX-5X-1 (Pharmacia), ”QIAexpress-system” (Quiagen), pEGFP eller pET (i dette tilfellet er verten fortrinnsvis BL21 som uttrykker T7 RNA-polymerase) i tillegg til vektorene som er beskrevet ovenfor.

Vektorene kan omfatte signalsekvenser for antistoffsekresjon. Som en signalsekvens for antistoffsekresjon kan en pelB-signalsekvens (Lei, S. P. et al., J.

Bacteriol. (1987) 169, 4379) anvendes når et protein skilles ut til E. coli periplasmaet. Vektoren kan introduseres inn i vertsceller for eksempel ved kalsiumklorid eller elektroporerings-fremgangsmåter.

I tillegg til vektorer for E. coli inkluderer vektorene for å produsere antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse for eksempel ekspresjonsvektorer for pattedyr (for eksempel pdDNA3 (Invitrogen), pEF-BOS (Nucleic Acids. Res. 1990, 18(17), p5322, pEF og pCDM8), insektcelleavledede ekspresjonsvektorer (for eksempel ”Bac-to-BAC baculovirus expression system” (Gibco-BRL) og pBacPAK8), planteavledede ekspresjonsvektorer (for eksempel pMH1 og pMH2), dyrevirusavledede ekspresjonsvektorer (for eksempel pHSV, pMV og pAdexLcw), retrovirus ekspresjonsvektorer (for eksempel pZIPneo), gjærekspresjonsvektorer (for eksempel ”Pichia Expression Kit” (Invitrogen), pNV11 og SP-Q01) og Bacillus subtilis-ekspresjonsvektorer (for eksempel pPL608 og pKTH50).

Når målet er ekspresjon i dyreceller, slik som CHO-, COS- og NIH3T3-celler, må vektorene ha en promoter som er nødvendig for ekspresjon i celler, for eksempel SV40-promoter (Mulligan et al., Nature (1979) 277, 108), MMLV-LTR-promoter EF1 α-promoter (Mizushima et al., Nucleic acids Res. (1990) 18, 5322) og CMV-promoter, og de har fortrinnsvis et gen for å selektere transformerte celler (for eksempel et medikamentresistens-gen som tillater evaluering ved anvendelse av et middel (neomycin, G418 eller tilsvarende). Vektorer med slike karakteristikker inkluderer for eksempel pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV og pOP13.

I tillegg kan den følgende fremgangsmåten anvendes for stabil genekspresjon og genamplifisering i celler: CHO-celler som mangler en nukleinsyre-syntesevei, introduseres med en vektor (for eksempel pSV2-dhfr (Molecular Cloning 2. utgave, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)) som bærer et DHFR-gen som kompenserer for mangelen, og vektoren amplifiseres ved anvendelse av metotreksat (MTX). Alternativt kan den følgende fremgangsmåten anvendes for transient genekspresjon: COS-celler med et gen som uttrykker SV40 T-antigen på deres kromosom, transformeres med en vektor (pcD og tilsvarende) med et SV40-replikasjonsorigo. Replikasjonsorigo som er avledet fra polyomvirus, adenovirus, bovint papillomvirus (BPV) og tilsvarende, kan også anvendes. For å amplifisere antallet av genkopier i vertsceller, kan ekspresjonsvektorene videre inneha seleksjonsmarkører, slik som aminoglykosid-transferase(APH)-gen, tymidin-kinase (TK)-gen, E. coli-xantin-guanin-fosforibosyltransferase (Ecogpt)-gen og dihydrofolatreduktase (dhfr)-gen.

Ønskede antistoffer som er tilveiebrakt ved fremgangsmåtene som er beskrevet ovenfor, kan isoleres fra innsiden av vertsceller eller fra utsiden av cellene (mediet eller tilsvarende), og renses til homogenitet. Antistoffene kan isoleres og renses ved fremgangsmåter som rutinemessig anvendes for isolering og rensing av antistoffer, og typen fremgangsmåte er ikke begrenset. For eksempel kan antistoffene isoleres og renses ved å passende velge å kombinere kolonnekromatografi, filtrering, ultrafiltrering, utsalting, løsemiddelpresipitering, løsemiddelekstraksjon, destillering, immunpresipitering, SDS-polyakrylamid-gel-elektroforese, isoelektrisk fokusering, dialyse, rekrystallisering og tilsvarende.

De kromatografiske inkluderer for eksempel affinitetskromatografi, ionebytterkromatografi, hydrofobisk kromatografi, gelfiltrering, revers fase-kromatografi og adsorpsjonskromatografi (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). De kromatografiske fremgangsmåtene som er beskrevet ovenfor, kan utføres ved anvendelse av væskekromatografi, for eksempel HPLC og FPLC. Kolonner som kan anvendes for affinitetskromatografi, inkluderer protein A-kolonner og protein G-kolonner. Kolonner ved anvendelse av protein A inkluderer for eksempel Hyper D, POROS og Sepharose FF (GE Amersham Biosciences). Foreliggende oppfinnelse omfatter antistoffer som er godt renset ved anvendelse av disse rense-fremgangsmåtene.

Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer også midler for å forhindre eller behandle inflammatoriske sykdommer som omfatter som aktive ingredienser fragmenter og/eller modifiseringsprodukter av et antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse.

Fragmentene og/eller modifiseringsproduktene av antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse inkluderer antistoff-fragmenter som mangler noen deler av antistoffene ifølge oppfinnelsen (hele antistoffer (for eksempel helt IgG), rekombinante antistoffer (for eksempel kimære antistoffer, humaniserte antistoffer og humane antistoffer) og ministoffer (for eksempel scFv-antistoffer)) og er ikke spesielt begrenset så lenge de beholder evnen til å binde til deres antigener. Antistoff-fragmentene ifølge foreliggende oppfinnelse er ikke spesielt begrenset så lenge de er deler av hele antistoffer.

Fragmentene omfatter fortrinnsvis en tung kjedes variable region (VH) og/eller en lett kjedes variable region (VL). Aminosyresekvensen til VH eller VL kan omfatte substitusjoner, delesjoner, addisjoner og/eller insersjoner. VH og/eller VL kan mangle noen deler, så lenge evnen til å binde til antigenet er beholdt. Videre kan den variable regionen være kimerisert eller humanisert. Spesifikt inkluderer antistoff-fragmenter for eksempel Fab, Fab’, F(ab’)2 og Fv. Slike antistoff-fragmenter kan tilveiebringes ved å konstruere gener som koder for antistoff-fragmentene, introdusere dem i ekspresjonsvektorer og så uttrykke dem i passende vertsceller (se for eksempel Co, M. S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976, Better, M. og Horwitz, A. H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496, Pluckthun, A. og Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515, Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663, Rousseaux, J. et al., Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669, Bird, R. E. og Walker, B. W., Trends Biotechnol. (1991) 9, 132-137).

Videre kan antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse være konjugerte antistoffer som er koblet til hvilke som helst av forskjellige molekyler, slik som polyetylenglykol (PEG), radioaktive substanser, fluorescerende substanser, luminescerende substanser, enzymer og toksiner. Slike konjugerte antistoffer kan tilveiebringes ved kjemisk å modifisere de tilveiebrakte antistoffene. Fremgangsmåter for å modifisere antistoffer er blitt etablert i dette feltet (for eksempel US 5057313 og US 5156840). ”Antistoffene” ifølge foreliggende oppfinnelse inkluderer også slike konjugerte antistoffer.

Antistoffets aktivitet ved binding til NR 10 kan bestemmes ved fremgangsmåter som er kjent for fagfolk på området. Fremgangsmåter for å bestemme den antigenbindende aktiviteten til et antistoff, inkluderer for eksempel ELISA (enzymlenket immunosorbentanalyse), EIA (enzymimmunanalyse, RIA (radioimmunanalyse) og fremgangsmåte for fluorescerende antistoff. Når enzymimmunalyse anvendes, tilsettes for eksempel antistoffinneholdende prøver, slik som rensede antistoffer og dyrkningssupernatanter fra antistoffproduserende celler til antigendekkede plater. Et sekundært antistoff som er merket med et enzym, slik som alkalisk fosfatase, tilsettes, og platene inkuberes. Etter vasking tilsettes et enzymsubstrat, slik som p-nitrofenylfosfat, og absorbansen måles for å evaluere den antigenbindende aktivitet.

Videre kan for eksempel den NR 10-nøytraliserende aktivitet av et antistoff bestemmes ved fremgangsmåten som er beskrevet i eksemplene, som involverer testing av effekten av å undertrykke veksten av den IL-31-avhengige cellelinjen.

NR 10-antagonistene eller antistoffene som har NR 10-nøytraliserende aktivitet ifølge oppfinnelsen, kan anvendes i midlene for å forhindre eller behandle inflammatoriske sykdommer. De foreliggende oppfinnerne viste at administrering av NR 10-nøytraliserende museantistoffer produserte markerte, terapeutiske effekter i modelldyr for forskjellige inflammatoriske sykdommer. Ekspresjonen av humant NR 10 har videre blitt rapportert å være økt i fortykket epidermis hos pasienter med atopisk dermatitt (ikke-patent dokument 1). De foreliggende oppfinnerne bekreftet ved immunhistokjemisk farging, som i tilfellet hos mennesker, at ekspresjonen av muse-NR 10 var økt i fortykket epidermis fra aurikler i den ovenfor beskrevne musemodellen for kronisk dermatitt (eksempel 5). Disse funnene indikerer at NR 10 er involvert på lik måte i inflammatoriske sykdommer hos alle dyrearter og at, som muse-NR 10-nøytraliserende antistoffer, er antistoffene som nøytraliserer humant NR 10 effektive i å forhindre og behandle forskjellige inflammatoriske sykdommer. Videre, som ved funnene som er beskrevet i dette eksemplet, er andre NR 10-antagonister enn antistoffene også forventet å ha terapeutiske effekter på forskjellige, inflammatoriske sykdommer.

I foreliggende oppfinnelse refererer inflammatorisk sykdom til sykdommer med patologiske uttrykk som er involvert i cytologiske og histologiske reaksjoner som forekommer i affiserte blodårer og nærliggende vev som respons på en skade eller unormal stimulering som er forårsaket av fysiske, kjemiske eller biologiske midler (Stedman’s Medical Dictionary, 5. utg. MEDICAL VIEW CO., 2005). Vanligvis inkluderer inflammatoriske sykdommer dermatitt (atopisk dermatitt, kronisk dermatitt og tilsvarende), inflammatorisk tarmsykdom (kolitt og tilsvarende), astma, artritt (reumatoid artritt, osteoartritt og tilsvarende), bronkitt, Th2-autoimmune sykdommer, systemisk lupus erytematosus, myasteni gravis, kronisk GVHD, Crohns sykdom, spondylitis deformans, lumbar smerte, gikt, betennelse etter kirurgi eller skade, opphovning, neuralgi, laryngofaryngitt, cystitt, hepatitt (ikke-alkoholisk steatohepatitt, alkoholisk hepatitt og tilsvarende), hepatitt B, hepatitt C og arteriosklerose.

Inflammatoriske sykdommer som er gjenstander for den foreliggende oppfinnelse er atopisk dermatitt, reumatisme, og osteoartritt.

De foreliggende oppfinnerne oppdaget at NR 10-antagonistantistoffer har terapeutiske effekter mot atopisk dermatitt, reumatisme og osteoartritt. På den annen side ble det avslørt at NR 10-antagonistantistoffer ikke produserer terapeutiske effekter i akutt kontakt-dermatitt og modeller for DSS akutt kolitt.

Midlene for å forhindre eller behandle inflammatoriske sykdommer ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter som en aktiv ingrediens en NR 10-antagonist eller et antistoff som har NR 10-nøytraliserende aktivitet, som beskrevet ovenfor. Utrykket ”omfatter en NR 10-antagonist som en aktiv ingrediens” betyr å omfatte en NR 10-antagonist som minst én av de aktive ingrediensene og begrenser ikke innholdet. I tillegg kan midlene for å forhindre eller behandle inflammatoriske sykdommer ifølge foreliggende oppfinnelse også omfatte andre ingredienser som forsterker forhindringen eller behandlingen av den inflammatoriske sykdommen i kombinasjon med en NR 10-antagonist.

NR 10-antagonisten ifølge foreliggende oppfinnelse kan formuleres ifølge standard fremgangsmåter (se for eksempel Remington’s Pharmaceutical Science, siste utgave, Mark Publishing Company, Easton, USA). Videre kan de omfatte farmasøytisk akseptable bærere og/eller tilsettingsstoffer om nødvendig. For eksempel kan de inneholde surfaktanter (for eksempel PEG og Tween), hjelpestoffer, antioksidanter (for eksempel askorbinsyre), fargestoffer, smaksstoffer, konserveringsstoffer, stabilisatorer, bufrende midler (for eksempel fosforsyre, sitronsyre og andre organiske syrer), chelaterende midler (for eksempel EDTA), suspensjonsmidler, isotoniserende midler, bindere, disintegratorer, fuktiggjørere, fluiditetsfremmere og korrigenter. Bærerne som kan omfattes i midlene for å forhindre eller behandle inflammatoriske sykdommer ifølge foreliggende oppfinnelse, er imidlertid ikke begrenset til denne listen. Andre vanlig anvendte bærere, slik som lett vannfri kiselsyre, laktose, krystallinsk cellulose, mannitol, stivelse, kalsiumkarmelose, natriumkarmelose, hydroksypropylcellulose, hydroksypropylmetylcellulose, polyvinylacetaldietylaminoacetat, polyvinylpyrrolidon, gelatin, triglyserider med middels lange fettsyrer, polyoksyetylenhydrogenert kastorolje 60, sukrose, karboksymetylcellulose, maisstivelse, uorganisk salt og så videre, kan passende omfattes. Sammensetningene kan også omfatte andre polypeptider av lav molekylvekt, proteiner, slik som serumalbumin, gelatin og immunglobulin og aminosyrer, slik som glysin, glutamin, asparagin, arginin og lysin. Når forbindelsen fremstilles som en vandig løsning for injisering, kan NR 10-antagonister løses i en isoton løsning som for eksempel omfatter fysiologisk saltløsning, dekstrose og andre adjuvanser. Adjuvansene kan for eksempel inkludere D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol og natriumklorid. I tillegg kan passende løseliggjøringsmidler som for eksempel alkoholer (for eksempel etanol), polyalkoholer (for eksempel propylenglykoler og PEG) og ikke-ioniske detergenter (polysorbat 80 og HCO-50), anvendes samtidig.

Om nødvendig kan NR 10-antagonister innkapsles i mikrokapsler (mikrokapsler fremstilt fra hydroksycellulose, gelatin, polymetylmetakrylat og dets like) og fremstilles i komponenter av kolloidale medikamentleveringssystemer (liposomer, albuminmikrosfærer, mikroemulsjoner, nanopartikler og nanokapsler), se for eksempel ”Remington’s Pharmaceutical Science 16. utgave” &, Oslo utg. (1980)). Videre er fremgangsmåter for å fremstille medikamenter for forlenget frigjøring kjente, og disse kan anvendes for NR 10-antagonister (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. (1981) 15, 167-277, Langer, Chem. Tech. (1982) 12, 98-105, US Patent nr. 3 773 919, europeisk patentsøknad (EP) nr. 58 481, Sidman et al., Biopolymers (1983) 22, 547-56,

EP 133 988).

Midlene for å forhindre eller behandle inflammatoriske sykdommer ifølge foreliggende oppfinnelse kan administreres enten oralt eller parenteralt, men administreres fortrinnsvis parenteralt. Spesifikt administreres midlene til pasienter ved injisering eller perkutan administrering. Injiseringer inkluderer for eksempel intravenøse injiseringer, intramuskulære injiseringer og subkutane injiseringer for systemisk eller lokal administrering. Midlene kan gis til steder hvor betennelse skal undertrykkes eller områder omkring stedene ved lokal infusjon og spesielt intramuskulær injisering.

Fremgangsmåtene for administrering kan passende velges ifølge pasientens alder og tilstand. Enkeltdose-administreringen kan for eksempel velges fra innen området på 0,0001 til 100 mg av den aktive ingrediens per kg kroppsvekt. Når midlene administreres til humane pasienter, kan alternativt dosen av den aktive ingrediens velges fra innen området på 0,001 til 1 000 mg/kg kroppsvekt. Enkeltdose-administreringen omfatter fortrinnsvis for eksempel NR 10-antagonister på omtrent 0,01 til 50 mg/kg kroppsvekt. Dosen av et middel for å forhindre eller behandle inflammatoriske sykdommer ifølge foreliggende oppfinnelse er imidlertid ikke begrenset til disse eksemplene.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også antistoffer som har NR 10-nøytraliserende aktivitet (inkludert fragmenter av antistoffer som har NR 10-nøytraliserende aktivitet og/eller modifiserte produkter derav, den samme definisjon anvendes gjennom beskrivelsen nedenfor). Antistoffene som har NR 10-nøytraliserende aktivitet ifølge foreliggende oppfinnelse, er nyttige som aktive ingredienser i de ovenfor beskrevne midler for å forhindre eller behandle inflammatoriske sykdommer. Antistoffene som har NR 10-nøytraliserende aktivitet ifølge foreliggende oppfinnelse, kan være polyklonale eller monoklonale antistoffer, men er fortrinnsvis monoklonale antistoffer. Slike monoklonale antistoffer som har NR 10-nøytraliserende aktivitet, kan tilveiebringes ved fremgangsmåtene som er beskrevet ovenfor. De monoklonale antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse har aktiviteten å nøytralisere NR 10 eller fragmenter derav, som er avledet fra pattedyr, fortrinnsvis har aktiviteten å nøytralisere NR 10 eller fragmenter derav, som er avledet fra mennesker eller mus, og mer foretrukket aktiviteten å nøytralisere NR 10 eller fragmenter derav, som er avledet fra mennesker. Humant NR 10 eller et peptidfragment derav kan anvendes som et immunogen for å fremstille monoklonale antistoffer, som har aktiviteten å nøytralisere humant NR 10. Alternativt kan antistoffene som har NR 10-nøytraliserende aktivitet ifølge foreliggende oppfinnelse, være rekombinante antistoffer. Rekombinante antistoffer som har NR 10-nøytraliserende aktivitet ifølge foreliggende oppfinnelse inkluderer kimære antistoffer, humaniserte antistoffer, humane antistoffer og ministoffer.

I foreliggende oppfinnelse inkluderer antistoffene som har NR 10-nøytraliserende aktivitet for eksempel anti-NR 10-museantistoffer, som omfatter en tung kjedes variable region, som omfatter aminosyre-sekvensen ifølge SEKV. ID. NR.: 1 og en lett kjedes variable region som omfatter aminosyre-sekvensen ifølge SEKV. ID. NR.: 3.

Foreliggende oppfinnelse inkluderer også monoklonale antistoffer som har aktiviteten å nøytralisere humant NR 10. De monoklonale antistoffene som har aktiviteten å nøytralisere humant NR 10 ifølge foreliggende oppfinnelse, kan tilveiebringes ved å fremstille monoklonale antistoffer ved anvendelse av humant NR 10 eller et peptidfragment derav som et immunogen og så velge antistoffer som har aktiviteten å nøytralisere humant NR 10 fra de monoklonale anti-human-NR 10-antistoffene, basert på det ovenfor beskrevne analysesystemet ved anvendelse av den IL-31-avhengige cellelinjen.

I foreliggende oppfinnelse inkluderer antistoffene som har aktiviteten å nøytralisere humant NR 10 antistoffene som er beskrevet i hvilken som helst av:

(a) antistoffer som har tung kjedes variable region som omfatter CDR1, CDR2 og CDR3, som består av aminosyresekvensene ifølge henholdsvis SEKV. ID. NR.: 18, 19 og 20, (b) antistoffer som har en lett kjedes variable region som omfatter CDR1, CDR2 og CDR3, som består av aminosyresekvensene ifølge henholdsvis SEKV. ID. NR.: 21, 22 og 23, (c) antistoffer som har den tunge kjedens variable region ifølge (a) og den lette kjedens variable region ifølge (b) og

(d) antistoffer som gjenkjenner den samme epitop som den som gjenkjennes av antistoffene ifølge hvilken som helst av (a) til (c).

Om et antistoff gjenkjenner den samme epitopen som den som gjenkjennes av et annet antistoff, kan bekreftes ved konkurransen mellom de to antistoffene mot epitopen. Konkurranse mellom antistoffene kan evalueres ved konkurrerende bindingsanalyser ved anvendelse av fremgangsmåter, slik som ELISA, fluorescerende energioverføringsmetode (FRET), og fluorometrisk mikrovolumanalyseteknologi (FMAT(R)). Mengden av bundne antistoffer til et antigen korrelerer indirekte med bindingsevnen til de konkurrerende kandidatantistoffene (testantistoffer), som i konkurranse binder til den samme epitop. Med andre ord, mens mengden eller affiniteten av testantistoffer mot den samme epitop økes, reduseres mengden av antistoffer som er bundet til antigenet, og mengden av testantistoffer som er bundet til antigenet, øker. Spesifikt tilsettes passende, merkede antistoffer og antistoffer som skal evalueres samtidig til antigenet, og de dermed bundne antistoffene detekteres ved anvendelse av merket. Mengden av antistoffer som er bundet til antigenet, kan enkelt bestemmes ved å merke antistoffene på forhånd. Dette merket er ikke spesielt begrenset, og fremgangsmåten for merking velges ifølge analyseteknikken som anvendes. Fremgangsmåten for merkingen inkluderer fluorescerende merking, radiomerking, enzymatisk merking og tilsvarende.

Fluorescensmerkede antistoffer og umerkede antistoffer eller testantistoffer tilsettes for eksempel samtidig til dyrecellene som uttrykker NR 10, og de merkede antistoffene detekteres ved fluorometrisk mikrovolumanalyseteknologi.

IC50 er konsentrasjonen hvor mengden av merkede antistoffer som er bundet til epitopen reduseres til 50 % ved bindingen av umerkede antistoffer. Her er antistoffene som gjenkjenner den samme epitop, antistoffene som kan redusere mengden av merkede antistoffer som er bundet til epitopen til minst 50 %, når konsentrasjonen av testantistoffer er 10 ganger høyere enn IC50 til de umerkede antistoffene.

Antistoffer som har aktiviteten å nøytralisere humant NR 10 som anvendes i foreliggende oppfinnelse, har videre fortrinnsvis bindingsaktivitet til NR 10 fra cynomolgusape og har fortrinnsvis aktiviteten å nøytralisere NR 10 fra cynomolgusape. NR 10 fra cynomolgusape som omfatter aminosyresekvensen ifølge SEKV. ID. NR.: 24 kan anvendes i målinger av aktiviteten av nøytralisering eller binding til NR 10 fra cynomolgusape.

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også de terapeutiske anvendelsene som er beskrevet nedenfor. Tolkingen av NR 10, antagonister, monoklonale antistoffer, rekombinante antistoffer, inflammatoriske sykdommer og annet i fremgangsmåtene er som beskrevet ovenfor.

d. atopisk dermatitt hvor antistoffet undertrykker minst ett av symptomene på atopisk dermatitt valgt fra gruppen som består av (1) kløe, (2) rødhet og blødning, (3) ødem, (4) skade og vevskader og 5) skorpedannelse og tørrhet;

e. revmatisme; eller

f. osteoartritt.

e. revmatisme; eller

f. osteoartritt.

e. revmatisme; eller

f. osteoartritt.

hvor nevnte fragment er et Fab, Fab', F(ab')2 eller Fv fragment.

[8] Et middel som omfatter fragmentet for anvendelse ifølge [7].

Eksempler

Her nedenfor vil foreliggende oppfinnelse spesifikt beskrives med referanse til eksempler.

[Eksempel 1] Etablering av Ba/F3-cellelinje som uttrykker NR 10 og OSMR Et humant NR 10 cDNA (SEKV. ID. NR.: 1 ifølge WO 0075314) ble satt inn i ekspresjonsvektoren pCOS1 (Biochem Biophys Res commun. 228, s. 838-45, 1996) for å produsere pCosNR 10.3. Et cDNA for onkostatin M-reseptor (OSMR, GenBank tilgangsnr. NM003999) ble isolert fra et humant placentabibliotek ved PCR, og ekspresjonsvektoren pCos1-hOSMR ble konstruert på lignende måte. 10 μg av hver av vektorene ble samtidig introdusert ved elektroporering i celler fra cellelinjen Ba/F3, som var avledet fra IL-3-avhengige pro-B-celler fra mus (BioRad Gene Pulser, 960 μF og 0,33 kV). Etter introduksjon ble humant IL-31 tilsatt, og cellene ble dyrket. En cellelinje som prolifererte på en IL-31-avhengig måte, ble derved tilveiebrakt. Likeledes ble en IL-31-avhengig cellelinje fra mus også fremstilt fra Ba/F3-celler, som ble fremstilt for å uttrykke NR 10 og OSMR-genene fra mus. I begge cellelinjer ble ED50 funnet å være flere ng/ml. Godtproliferende cellelinjer ble dermed tilveiebrakt. Den humane IL-31-avhengige cellelinjen viste ingen respons mot IL-31 fra mus, og veksten ble undertrykket ved tilsetting av humant NR 10-protein (ekstracellulært domene). Den IL-31-avhengige cellelinjen fra mus viste ingen respons mot humant IL-31, og veksten ble ikke undertrykket ved det tilsatte NR 10-proteinet fra mus (ekstracellulært domene).

[Eksempel 2] Fremstilling av NR 10-protein (ekstracellulært domene) Det ekstracellulære domenet alene ble amplifisert ved PCR ved anvendelse av NR 10-cDNA som et templat, en FLAG-merkesekvens ble koblet til den C-teminale enden og ble satt inn i ekspresjonsvektoren pCXND3 (WO 2005/005636) (pCXND3-NR 10-flagg).

10 μg av denne lineære vektoren ble introdusert i celler fra ovarie-cellelinjen DG44 fra kinesisk hamster ved elektroporering (BioRad Gene PulserII, 25 μF og 1,5 kV). En cellelinje med høy ekspresjon ble tilveiebrakt. En renset prøve ble fremstilt fra en supernatant av storskala-kultur fra cellelinjen med anti-flagg-antistoffkolonne (SIGMA) og gelfiltrering og anvendt i eksperimentene som er beskrevet nedenfor. NR 10 fra mus (ekstracellulært domene) med FLAG-merkesekvens koblet til den C-terminale enden, ble fremstilt på lignende måte.

[Eksempel 3] Isolering av scFv som har anti-mus-NR 10-nøytraliserende aktivitet og fremstilling av BM095 som et kimerisert IgG Spesifikt forsøkte de foreliggende oppfinnere å begrense kandidatklonene fra et humant antistoff-fagbibliotek med panorering ved anvendelse av biotinylert NR 10-museprotein (ekstracellulært domene). Sekretorisk scFv ble renset fra klonene og tilsatt til analysesystemet for cellevekst ved anvendelse av IL-31-avhengige Ba/F3-celler som er beskrevet i eksempel 1. Som et resultat ble klonen BM095, som viste sterk vekstundertrykkende aktivitet, vellykket tilveiebrakt.

Ved anvendelse av PCR ble den humane H-kjedens sekvens fra variabel region (VH) fra BM095 koblet til IgG2a-konstant region fra mus (etter CH1), og human L-kjedes sekvens fra variabel region (VL) fra BM095 ble koblet til λ-kjede-konstant region fra mus for å konstruere en ekspresjonsvektor. Aminosyresekvensen til VH er vist i SEKV. ID. NR.: 1, og nukleotidsekvensen som koder for aminosyresekvensen er vist SEKV. ID. NR.: 2. Aminosyresekvensen til VL er vist i SEKV. ID. NR.: 3, og nukleotidsekvensen som koder for aminosyresekvensen er vist i SEKV. ID. NR.: 4. De respektive lineære ekspresjonsvektorene ble samtidig introdusert i cellelinjen DG44, og så ble en cellelinje som uttrykker høye nivåer av kimerisert IgG valgt. En renset prøve ble tilveiebrakt fra en supernatant fra en storskala-kultur fra denne cellelinjen ved anvendelse av en protein A (rProtein A Sepharose Fast Flow, GE Amersham Biosciences)-kolonne og kationbytterkolonnekromatografi (SP-TOYOPEARL 650M, TOSOH). Videre ble pyrogen fjernet ved anvendelse av ActiClean Etox(Sterogen)-resin for å redusere konsentrasjonen til under deteksjonsgrensen. Prøven ble anvendt i dyreeksperimentene som er beskrevet nedenfor. Et resultat som er tilveiebrakt ved å tilsette BM095 til analysesystemet, er beskrevet ovenfor og er vist i fig. 1.

[Eksempel 4] Vurdering av medikamenteffektivitet i en atopisk dermatittmodell ved anvendelse av NC/Nga-mus

En dermatittmodell ble produsert ved gjentatt påføring av pikrylklorid (PiCl) med ukentlige intervaller. Spesifikt ble induksjonen av dermatitt oppnådd 4 dager etter sensibilisering med 5 % PiCl (150 μl) på magen og fotsålen ved repetert påføring av 0,8 % PiCl (150 μl) på ryggen og aurikkelen med ukentlige intervaller. De resulterende symptomene ble observert to ganger ukentlig til etter den tredje til sjette ukeperioden, og fem uttrykk ((1) kløe, (2) rødhet og blødning, (3) ødem, (4) skade og vevsødeleggelse og (5) skorpedannelse og tørrhet) ble uavhengig poengsatt på en skala fra 0 til 3. Antistoffet ble administrert med 10 mg/kg i de peritoneale hulrom dagen før sensibilisering og hver induksjon, seks ganger totalt, (BM095-gruppe) eller dagen før hver induksjon etter den tredje uke, tre ganger totalt (V/B-gruppe). Som en positiv kontroll ble 1 mg/kg deksametason administrert oralt hver dag etter den tredje uken (DEX-gruppe). Hver gruppe inneholdt 10 NC/Nga-hannmus.

Som vist i fig. 2, ble en signifikant undertrykkende effekt funnet i den antistoffadministrerte gruppen, sammenlignet med den løsemiddel-administrerte bæremiddelgruppen. I tillegg som kan ses i fig. 2, var det ingen vektforandring i den antistoffadministrerte gruppen, mens signifikant vekttap ble funnet i DEX-gruppen. Dette indikerer at antistoffet er meget trygt middel.

[Eksempel 5] Vurdering av medikamenteffektivitet ved anvendelse av en kronisk dermatittmodell, dannet ved repetert påføring av pikrylklorid Seks uker gamle BALB/c-hunnmus ble sensibilisert ved å påføre 20 μl av 0,5 % pikrylklorid (aceton/olivenolje) (1:4 vol/vol) løsning på deres høyre ører. Induksjonen ble oppnådd ved repetert påføring av 20 μl av 0,25 % pikrylklorid (aceton/olivenolje (1:4 vol/vol)) på deres høyre ører hver andre dag etter den åttende dag etter sensibilisering. 10 mg/kg av BM095 ble administrert i de peritoneale hulrom én gang i uken etter dagen før sensibilisering i gruppen for evaluering av den profylaktiske effekt av BM095 eller etter den 20 dag etter starten av induksjonen i gruppen for evaluering av den terapeutiske effekt av MB095. Aurikkelopphovning ble evaluert ved å sekvensielt måle tykkelsen av høyre øre ved anvendelse av en skivetykkelsesmåler.

Som et resultat ble en signifikant undertrykkende effekt funnet i den antistoffadministrerte gruppen som ses i fig. 4. Ekspresjonen av humant NR 10 ble rapportert å være økt i fortykket epidermis hos pasienter med atopisk dermatitt (ikke-patentdokument 1). Aurikler fra de ovenfor beskrevne modellmus for kronisk dermatitt ble immunhistokjemisk farget. Som ved tilfellet hos mennesker ble ekspresjonen av NR 10 fra mus observert å være økt i den fortykkede epidermis (fig. 5, BM095, hvor den konstante regionen ble erstattet med den fra humant IgG, ble fremstilt i eksempel 3 og anvendt i immunhistokjemisk farging. Deler som er farget brunt er NR 10-uttrykkende seter). Dette funnet indikerer at NR 10 er tilsvarende involvert i inflammatoriske sykdommer både hos menneske og mus.

[Eksempel 6] Vurdering av medikamenteffektivitet ved anvendelse av kollagenindusert artritt (reumatisme)-modell

Fremstilling av modellmus og evaluering av medikamenteffektivitet ble oppnådd ved fremgangsmåten som er beskrevet nedenfor.

140 μl av kollagen-gel, som ble fremstilt ved å kombinere like mengder av komplett adjuvans H37Ra og 0,3 % av type II-kollagen, som var avledet fra bovint ledd, ble administrert intrakutant til 9-uker gamle DBA/1JN-hunnmus ved haleenden (dag 0, sensibilisering). Etter tre uker ble kollagen-gel som var fremstilt ved den samme fremgangsmåten, administrert intrakutant på ryggen for å indusere igangsetting av artritt (dag 21, induksjon). Ifølge kroppsvektene to dager før sensibilisering (dag 2), ble 16 mus delt inn i to grupper, hver inneholdende 8 mus for å gi en medium-administrert gruppe og en BM095-administrert gruppe. 20 mmol/l acetatbuffer (pH 5,5) 200 mmol/l NaCl) fortynnet 6 ganger med PBS, ble anvendt som et medium, og testsubstansen BM095 ble administrert intravenøst til de 8 musene fra den BM095-administrerte gruppen ved dosen 10 mg/vekt kg dagen før sensibilisering (dag 1). Samtidig ble det samme volum av mediet per enhet kroppsvekt administrert til de 8 musene i den medium-administrerte gruppen som en kontroll på dag 1. Opphovning i de 4 lemmene ble observert og evaluert ved poengsetting (på en skala fra 0 til 4 for hver lem: totalt antall poeng 16) fra dagen før induksjon (dag 20) ved 2-3 dagsintervaller.

Som et resultat ble poengene for opphovning i de 4 lemmene funnet å reduseres etter dag 20 i den BM095-administrerte gruppen som ses i fig. 6. Dette indikerer at BM095 har effekten av å undertrykke igangsettingen av artritt.

[Eksempel 7] Vurdering av medikamenteffektivitet ved anvendelse av kollagenase-indusert artritt (osteoartritt)-modell

Som kontrollmedium (20 mmol/l acetatbuffer (pH 5,5) fortynnet 6 ganger med PBS, 200 mmol/l NaCl (n=5)), 2 mg/kg BM095 (n=5) og 20 mg/kg BM095 (n=6) ble administrert (5 ml/kg) intravenøst i de kaudale venene fra 8 uker gamle C57BL/6J Jcl-hannmus (CLEA Japan Inc.). Så ble 6 μl av 1,5 % kollagenase-løsning (type II, Sigma) filtrert gjennom 0,45 μm filter (MILLIPORE) administrert i de høyre kneleddshulrom under anestesi ved inhalering av 3 % isofluran (Am J. Pathol 1989, 135 (6):1001-14).

Breddene til høyre og venstre kneledd ble bestemt ved anvendelse av krumpassere (Mitsutoyo CO.) like før kollagenaseadministrering og 3, 7 og 14 dager etter kollagenaseadministrering for å beregne forskjellen mellom høyre og venstre. Forskjellen ble definert som en representativ verdi for opphovning av høyre kneledd. Arealet under kurven (AUC) for denne forskjellen ble bestemt, basert på den trapesformede regel og definert som en indikator for medikamenteffektivitet. Student t-test ble utført for AUC av mediumkontrollgruppen og CNP-administrert gruppe ved anvendelse av programvare for statistisk analyse (SAS Institute Inc.) (en signifikant forskjell er antatt når p<0,05). Som et resultat var AUC fra den BM095-administrerte gruppen signifikant mindre ved alle doser enn den til medium-kontrollgruppen som ses i fig. 7. Dette resultat viser at BM095 undertrykker artritt i osteoartritt-modellen.

[Eksempel 8] Fremstilling av anti-humant NR 10-nøytraliserende antistoff Musene ble immunisert med humant NR 10-protein (ekstracellulært domene) {beskrevet i eksempel 2}, og hybridomer ble fremstilt ved konvensjonelle fremgangsmåter. Dyrkningssupernatantene fra hybridomene ble analysert for den nøytraliserende aktiviteten ved anvendelse av den IL-31-avhengige humane cellelinjen (hNR 10/hOSMR/BaF3-celler) beskrevet i eksempel 1. Flere kloner som viste sterk NR 10-nøytraliserende aktivitet ble tilveiebrakt (fig. 8).

[Eksempel 9] Fremstilling av humant kimært antistoff Aminosyresekvensen til den tunge kjedens variable region fra NA633, som viste den sterkeste aktiviteten blant nøytraliserende antistoffer, er vist i SEKV. ID. NO.: 16 og aminosyresekvensen til den lette kjedens variable region er vist i SEKV. ID. NO.: 17. I tillegg er aminosyresekvensene til CDR1, CDR2 og CDR3 fra den tunge kjedens variable region fra NA633 vist i henholdsvis SEKV. ID. NO.: 18, 19 og 20, og aminosyresekvensene fra CDR1, CDR2 og CDR3 fra den lette kjedens variable region er vist i henholdsvis SEKV. ID. NO.: 21, 22 og 23.

Videre ble et kimært antistoff som omfatter den ovenfor beskrevne variable region fra mus og human konstant region (IgG1-type H-kjede, κ-type-L-kjede) fremstilt ved en konvensjonell fremgangsmåte, og den nøytraliserende aktiviteten ble bestemt. Som vist i fig. 9, viste det kimære antistoffet NA633 sterk nøytraliserende aktivitet ved lave

konsentrasjoner.

[Eksempel 10] Isolering av NR 10 fra cynomolgusape Oppfinnerne forsøkte å isolere NR 10-genet fordi kryssreaktiviteten og nøytraliserende aktivitet til NR 10 fra cynomolgusape ble antatt å være viktig i sikkerhetsvurdering ved det prekliniske trinnet. Primere ble utformet basert på beskrevet rhesusapegenomisk informasjon og tilsvarende, og NR 10-genet ble vellykket amplifisert fra organer fra cynomolgusape ved PCR. En samstilling av aminosyresekvenser fra humant NR 10 og det isolerte NR 10 fra cynomolgusape er vist i fig. 10. Aminosyresekvensen til NR 10 fra cynomolgusape er vist i SEKV. ID. NO.: 24. En cellelinje som prolifererer på en human IL-31-avhengig måte, ble etablert ved å introdusere NR 10-genet fra cynomolgusape sammen med det humane OSMR-genet i Ba/F3-celler som beskrevet i eksempel 1. Den nøytraliserende aktiviteten til det kimære antistoffet NA633, som er beskrevet i eksempel 9, ble testet ved anvendelse av denne cellelinjen. Resultatet viste at antistoffet også viste sterk nøytraliserende aktivitet i cynomolgusape (fig. 11).

[Referanseeksempel 1] Medikamenteffektivitet av BM095 i natriumdekstransulfat (DSS)-indusert kolitt

DSS-indusert kolitt-modell (J. Immunol (2003) 171:5513) som ble rapportert som en patologisk modell for inflammatorisk tarmsykdom (IBD), ble fremstilt for å evaluere effekten av BM095 som er et anti-mus-NR 10-nøytraliserende antistoff. En vandig løsning av 5 % (vekt/volum) natriumdekstransulfatsalt (Wako Pure Chemical Industries) ble fremstilt ved anvendelse av destillert vann som ble filtrert og sterilisert med 0,22 μm filter (Millipore). Seks uker gamle Balb/cAnN Crj-hannmus (CHARLES RIVER LABORATORIES JAPAN) ble tillatt å fritt drikke løsningen fra vannflasker i 7 dager. Kroppsvektene ble målt, og prosent vektforandringer i forhold til vektene på den første dagen av DSS-administrering ble anvendt som et mål på medikamenteffektivitet.

Ved anvendelse av denne modellen, ble det anti-mus-NR 10-nøytraliserende antistoffet BM095 intravenøst administrert ved en dose på 10 mg/kg dagen før DSS-administrering, og det resulterende vekttall ble evaluert (n=10) for å teste om den patologiske tilstanden var forbedret ved å nøytralisere IL-31-signalisering. Gruppen (bæremiddelgruppe, n=10), hvor et bæremiddel (en blanding av acetatbuffer [20 mmol/L natriumacetat og 20 mmol/L natriumklorid] og fosfatbufret saltløsning (PBS, GIBCO), som ble blandet ved et volumforhold på 1:5) ble administrert intravenøst dagen før DSS-administrering og anvendt som en bæremiddel-kontrollgruppe. Videre ble forløpet av prosent vektforandring i Balb/cAnN Crj-mus av samme kjønn og alder (n=1) som de i den DSS-administrerte gruppen også undersøkt for å vite tidsforløpet for prosent vektforandring i normale mus.

Forløpet for vekt er vist i fig. 12. DSS-administrering reduserte prosentandelen vektforandring i bæremiddel-gruppen. Forløpet av prosentandel vektforandring i den BM095-administrerte gruppen var lik den i bæremiddel-gruppen. Fire og fem dager etter DSSadministrering ble imidlertid prosentandel vektforandring signifikant redusert i BM095-gruppen, sammenlignet med bæremiddel-gruppen. Disse resultater viste at administreringen av BM095 ikke produserte terapeutisk effekt på kolitt i modellen.

Det er blitt rapportert at ekspresjonen av IL-31RA er økt i denne modellen (WO 2004/003140). De eksperimentelle resultatene som er beskrevet ovenfor, viser at antistoffene som nøytraliserer molekylet ikke produserer terapeutisk effekt på kolitt i denne modellen.

[Referanseeksempel 2] Medikamenteffektivitet av BM095 i pikrylklorid-indusert akutt kontaktdermatitt-modell

For å evaluere effekten av det anti-mus-NR 10-nøytraliserende antistoffet BM095, ble dermatitt rapportert som en akutt kontaktdermatitt-modell (Clin Immunol (2003) 108:257-262) utviklet. Denne dermatitten er et resultat av en forsinket hypersensitivitetsreaksjon som følge av sensibilisering og induksjon ved påføring av pikrylklorid. 50 μl av en løsning av 7 % pikrylklorid (nacalai tesque, Inc., etanol:acetat = 3:1 (vol/vol)) ble påført på magehud for å sensibilisere 8 uker gamle Balb/cAnN Crj-hunnmus (CHARLES RIVER LABORATORIES JAPAN), og etter 5 dager ble 20 μl av 1 % pikrylkloridløsning (aceton:olivenolje = 1:4 (volum/volum)) påført på huden til de høyre auriklene for å utløse kontaktdermatitt (induksjon). 20 μl av et bæremiddel (aceton:olivenolje = 1:4 (volum/volum)) ble applisert på huden til de venstre aurikler fra de samme musene som en kontroll for å evaluere effekten av bæremiddelet på tykkelsen av aurikkelen (positiv gruppe, n=6). Tykkelsen på de høyre og venstre ørene ble målt ved anvendelse av en skivetykkelsesmåler (OZAKI MFG.) like før induksjon og 24, 48 og 72 timer induksjon, og forandringen i tykkelsen av aurikkelen som var relevant for tykkelsen like før induksjon ble anvendt som et mål for medikamenteffektivitet.

Gruppen (negativ gruppe, n=6) hvor en etanol-acetonblanding (3:1 (volum/volum)) uten pikrylklorid ble påført på magehuden ved tidspunktet for sensibilisering, og også 20 μl av 1 % pikrylkloridløsning ble påsatt på huden til høyre aurikkel etter 5 dager, mens 20 μl av et bæremiddel (aceton:olivenolje = 1:4 (volum/volum)) ble påført på huden til venstre aurikkel, ble anvendt som en kontrollgruppe for å evaluere etableringen av patologiske tilstander.

Gruppen (BM095-gruppe, n=6) hvor akutt kontaktdermatitt ble indusert ved den samme fremgangsmåte som den som ble anvendt for den ovenfor beskrevne positive gruppen, og også BM095 ble administrert intravenøst med 10 mg/kg dagene før sensibilisering og induksjon, og gruppen (bæremiddel-gruppe, n=5) hvor ved det samme tidspunktet et bæremiddel (acetatbuffer [20 mmol/L natriumacetat og 20 mmol/L natriumklorid] og fosfatbufret fysiologisk saltløsning [PBS, GIBCO], som ble kombinert ved et volumforhold på 1:5) ble administrert, ble anvendt for evaluere effekten av å administrere anti-NR 10-antistoffer på de patologiske tilstandene i modellsystemet.

Forandringene i aurikkeltykkelse opptil 72 timer etter induksjon er vist i fig. 13. Aurikkelen ble funnet å være signifikant fortykket i den positive gruppen ved hvert tidspunkt på 24, 48 og 72 timer etter induksjon, sammenlignet med den negative gruppen som indikerer etablering av patologiske tilstander. Overgangen av aurikkeltykkelse i BM095-gruppen var lik den i bæremiddel-gruppen og dermed ble ingen signifikant undertrykkelse funnet.

Resultatene som er beskrevet ovenfor, viser at administreringen av BM095 ikke produserer terapeutisk effekt på akutt kontaktdermatitt observert i denne modellen.

Industriell anvendelse

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer nye midler for å forhindre eller behandle inflammatoriske sykdommer. Midlene for å forhindre eller behandle inflammatoriske sykdommer som er tilveiebrakt ifølge foreliggende oppfinnelse, omfatter som en aktiv ingrediens etanti-NR10/IL-31RA-antistoff, mer spesielt et antistoff som har NR 10/IL-31RA-nøytraliserende aktivitet.

Monoklonalt antistoffbasert anti-cytokin-terapi har tiltrukket seg mye oppmerksomhet i de senere år. Ved mange aktuelle patologiske tilstander har det imidlertid vært vanskelig å produsere terapeutiske effekter ved å blokkere et enkelt cytokin, fordi kompensatoriske veier aktiveres. Det var videre vanskelig å beregne i hvilke typer sykdommer terapeutiske effekter kunne tilveiebringes ved å blokkere mål-cytokinet. Under omstendighetene som er beskrevet ovenfor, oppdaget de foreliggende oppfinnerne at anti-NR 10-nøytraliserende antistoffer signifikant kunne undertrykke symptomer i modellmus med atopisk dermatitt, reumatisme, osteoartritt eller tilsvarende.

De foreliggende oppfinnere lyktes også i å fremstille humane NR 10-nøytraliserende antistoffer. Midler for å forhindre eller behandle inflammatoriske sykdommer som omfatter humane NR 10-nøytraliserende antistoffer som en aktiv ingrediens, er meget nyttige for klinisk anvendelse på mennesker.

Claims

Patentkrav

1. Et anti-NR10/IL-31RA-antistoff som har NR10/IL-31RA-nøytraliserende aktivitet til anvendelse for å forebygge eller behandle en inflammatorisk sykdom, hvor den inflammatoriske sykdommen er

g. atopisk dermatitt hvor antistoffet undertrykker minst ett av symptomene på atopisk dermatitt valgt fra gruppen som består av (1) kløe, (2) rødhet og blødning, (3) ødem, (4) skade og vevskader og 5) skorpedannelse og tørrhet;

h. revmatisme; eller

i. osteoartritt.

2. Et middel til anvendelse for å forebygge eller behandle en inflammatorisk sykdom, hvor midlet omfatter antistoffet ifølge krav 1 som en aktiv ingrediens, og hvor den inflammatoriske sykdommen er

h. revmatisme; eller

i. osteoartritt.

3. Antistoff til anvendelse ifølge krav 1 eller middel for anvendelse ifølge krav 2, hvor antistoffet er et monoklonalt antistoff.

4. Antistoff til anvendelse ifølge krav 1 eller 3 eller midlet for anvendelse ifølge krav 2 eller 3, hvor NR10/IL-31RA er humant NR10/IL-31RA.

5. Antistoff til anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1, 3 eller 4 eller midlet for bruk ifølge et hvilket som helst av kravene 2 til 4, hvor antistoffet er et rekombinant antistoff.

6. Antistoff eller middel for anvendelse ifølge krav 5, hvor det rekombinante antistoffet er et kimært antistoff, humanisert antistoff eller humant antistoff.

7. Fragment og/eller et kjemisk modifisert fragment av et antistoff som definert i et hvilket som helst av kravene 1 eller 3 til 6 for anvendelse for å forebygge eller behandle en inflammatorisk sykdom, hvor den inflammatoriske sykdommen er

h. revmatisme; eller

i. osteoartritt.

hvor nevnte fragment er et Fab, Fab', F(ab')2 eller Fv fragment.

8. Et middel som omfatter fragmentet for anvendelse ifølge krav 7.