PL211833B1 - Wyizolowany polipeptyd, białko fuzyjne, wyizolowana cząsteczka polinukleotydu, wektor ekspresji, hodowana komórka, sposób wytwarzania polipeptydu, sposób wytwarzania przeciwciała, przeciwciało, przeciwciało lub fragment przeciwciała, zastosowanie przeciwciała, sposób wykrywania obecności polipeptydu, sposób inhibicji proliferacji lub różnicowania komórek krwiotwórczych, zastosowanie polipeptydu, sposób rozprzestrzeniania komórek krwiotwórczych, sposób wykrywania obecności RNA, sposób zabijania komórek nowotworowych in vitro lub in vivo, zastosowanie polipeptydu, zastosowanie antagonisty polipeptydu i sposób wykrywania zapalenia u pacjenta - Google Patents

Abstract

Niniejszy wynalazek dotyczy polinukleotydu zcytor17lig, polipeptydu i cząsteczek przeciwciała anty-zcytorl7. Zcytor17lig jest nową cytokiną. Polipeptydy te mogą być stosowane w sposobach stymulowania układu immunologicznego i proliferacji i/lub rozwoju krwiotwórczych komórek in vitro i in vivo. Niniejszy wynalazek obejmuje także sposoby wytwarzania białka, zastosowania tego białka i przeciwciał do tego białka.

Description

Opis wynalazku

Wyizolowany polipeptyd, białko fuzyjne, wyizolowana cząsteczka polinukleotydu, wektor ekspresji, hodowana komórka, sposób wytwarzania polipeptydu, sposób wytwarzania przeciwciała, przeciwciało, przeciwciało lub fragment przeciwciała, zastosowanie przeciwciała, sposób wykrywania obecności polipeptydu, sposób inhibicji proliferacji lub różnicowania komórek krwiotwórczych, zastosowanie polipeptydu, sposób rozprzestrzeniania komórek krwiotwórczych, sposób wykrywania obecności RNA, sposób zabijania komórek nowotworowych in vitro lub in vivo, zastosowanie polipeptydu, zastosowanie antagonisty polipeptydu i sposób wykrywania zapalenia u pacjenta.

Tło wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest wyizolowany polipeptyd, białko fuzyjne, wyizolowana cząsteczka polinukleotydu, wektor ekspresji, hodowana komórka, sposób wytwarzania polipeptydu, sposób wytwarzania przeciwciała, przeciwciało, przeciwciało lub fragment przeciwciała, zastosowanie przeciwciała, sposób wykrywania obecności polipeptydu, sposób inhibicji proliferacji lub różnicowania komórek krwiotwórczych, zastosowanie polipeptydu, sposób rozprzestrzeniania komórek krwiotwórczych, sposób wykrywania obecności RNA, sposób zabijania komórek nowotworowych in vitro lub in vivo, zastosowanie polipeptydu, zastosowanie antagonisty polipeptydu i sposób wykrywania zapalenia u pacjenta.

Proliferacja i różnicowanie komórek wielokomórkowych organizmów jest kontrolowana przez hormony i polipeptydowe czynniki wzrostu. Te dyfundujące cząsteczki pozwalają komórkom na komunikowanie się ze sobą i działają razem z tworząc komórki, tkanki i narządy i naprawiają uszkodzone tkanki. Przykłady hormonów i czynników wzrostu obejmują steroidowe hormony (np. estrogen, testosteron), hormony przytarczyc, hormon folikulotropowy, interleukiny, pochodzący z płytek czynnik wzrostu (PDGF), naskórkowy czynnik wzrostu (EGF), czynnik stymulujący kolonii granulocytów-makrofagów (GM-CSF), erytropoetynę (EPO) i kalcytoninę.

Hormony i czynniki wzrostu wpływają na metabolizm komórkowy wiążąc się z receptorami. Receptory mogą być zintegrowanymi białkami błony połączonymi z szlakami sygnalizacyjnymi w komórce, takie jak wtórne systemy sygnalizacyjne. Inne klasy receptorów to rozpuszczalne cząsteczki, takie jak czynniki transkrypcji.

Cytokiny ogólnie stymulują proliferację lub różnicowanie komórek linii hematopoetycznej lub uczestniczą w mechanizmach reakcji odpornościowej i zapalnej ciała. Przykłady cytokin, które wpływają na hematopoezę, to erytropoetyna (EPO), która stymuluje rozwój czerwonych krwinek; trombopoetyna (TPO), która stymuluje rozwój komórek linii megakariocytów; i czynnik stymulujący kolonii granulocytów (G-CSF), który stymuluje rozwój neutrofili. Te cytokiny są przydatne w odtwarzaniu normalnych poziomów krwinek u pacjentów cierpiących na anemię, trombocytopenię i neutropenię lub przyjmujących chemioterapię przeciwrakową.

Interleukiny są rodzinę cytokin, która mediuje reakcje immunologiczne, w tym zapalenie. Interleukiny mediują wiele zapalnych patologii. Najważniejsze dla odpornościowej reakcji są komórki T, które wytwarzają wiele cytokin i adaptacyjną odporność na antygeny. Cytokiny wytwarzane przez komórki T zaklasyfikowano jako typ 1 i typ 2 (Kelso, A. Immun. Cell Biol. 76: 300-317, 1998). Typ 1 cytokin obejmuje IL-2, IFN-γ, LT-α i są zaangażowane w reakcje zapalne, odporność wirusową, wewnątrzkomórkową odporność na pasożyty i odrzucenie alo-przeszczepu. Typ 2 cytokin obejmuje IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 i IL-13 i są one zaangażowane w reakcje humoralne, odporność na robaczycę i reakcje alergiczne. Dzielone pomiędzy typ 1 i 2 cytokiny obejmują IL-3, GM-CSF i TNF-α. Istnieją pewne dowody sugerujące, że populacje komórek T wytwarzające typ 1 i typ 2 preferencyjnie migrują do różnych typów tkanki zapalnej.

Dojrzałe komórki T mogą być aktywowane, np., antygenem lub innym bodźcem, wytwarzając, np., cytokiny, biochemiczne cząsteczki sygnalizacyjne, lub receptory, które ponadto wpływają na los populacji komórek T.

Komórki B mogą być aktywowane przez receptory na ich powierzchni komórkowej, w tym receptor komórki B i inne pomocnicze cząsteczki wykonujące pomocnicze funkcje komórkowe, takie jak produkcja cytokin.

Monocyty/makrofagi oraz komórki T mogą być aktywowane przez receptory na powierzchni ich komórek i grają główną rolę w odpornościowej reakcji przez prezentowanie antygenu limfocytom i również działają jako pomocnicze komórki limfocytów wydzielając liczne cytokiny.

PL 211 833 B1

Komórki cytotoksyczne (NK) mają wspólne prekursory komórkowe z komórkami T i komórkami B i grają rolę w nadzorze odpornościowym. Komórki NK, które obejmują do 15% limfocytów krwi, nie eksprymują receptorów antygenów, a więc nie stosują rozpoznawania MHC jako wymagania dla wiązania z docelową komórką. Komórki NK są zaangażowane w rozpoznawanie i zabijanie pewnych komórek nowotworowych i wirusowe zainfekowane komórki. Uważa się, że in vivo komórki NK wymagają aktywacji, jednakże, wykazano in vitro, że komórki NK zabijają pewne typy komórek nowotworowych bez aktywacji.

Wykazane in vivo aktywności rodziny cytokin ilustrują nienormalny kliniczny potencjał, i zapotrzebowanie na inne cytokiny, związki agonistyczne cytokin i związki antagonistyczne cytokin. Niniejszy wynalazek spełnia te potrzeby dostarczając nową cytokinę, która stymuluje komórki hematopoetycznych komórek, jak też pokrewne kompozycje i sposoby.

Przedmiotem niniejszego wynalazku są takie polipeptydy dla tych i innych zastosowań, które powinny być oczywiste dla specjalistów w dziedzinie na podstawie opisu.

Przedmiotem wynalazku jest wyizolowany polipeptyd zawierający sekwencję reszt aminokwasowych, która jest w co najmniej 90% identyczna z sekwencją reszt aminokwasowych wybranych z grupy:

(a) polipeptydu ukazanego od reszt 38 (Val) do 152 (Leu), jak pokazano na SEQ ID nr: 2;

(b) polipeptydu ukazanego od reszt 27 (Leu) do 164 (Thr), jak pokazano na SEQ ID nr: 2;

(c) polipeptydu ukazanego od reszt 24 (Ser) do 164 (Thr), jak pokazano na SEQ ID nr: 2; i (d) polipeptydu ukazanego od reszt 1 (Met) do 164 (Thr), jak pokazano na SEQ ID nr: 2.

Korzystnie, wyizolowany polipeptyd zawiera reszty aminokwasowe 72, 133 i 147 stanowi cysteinę. Także korzystnie wyizolowany polipeptyd charakteryzuje się tym, że polipeptyd wiąże receptor Zcytor17, jak pokazano na SEQ ID nr: 5 lub SEQ ID nr:71.

Przedmiotem wynalazku jest także wyizolowany polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasowi wybraną z grupy:

(a) reszt aminokwasowych 38-52 z SEQ ID nr: 2;

(b) reszt aminokwasowych 83-98 z SEQ ID nr: 2;

(c) reszt aminokwasowych 104-117 z SEQ ID nr: 2;

(d) reszt aminokwasowych 137-152 z SEQ ID nr: 2;

(e) reszt aminokwasowych 38-52 z SEQ ID nr: 11;

(f) reszt aminokwasowych 33-38 z SEQ ID nr: 2;

(g) reszt aminokwasowych 35-40 z SEQ ID nr: 2;

(h) reszt aminokwasowych 53-58 z SEQ ID nr: 2;

(i) reszt aminokwasowych 54-59 z SEQ ID nr: 2;

(j) reszt aminokwasowych 129-134 z SEQ ID nr: 2;

(k) reszt aminokwasowych 34-39 z SEQ ID nr: 11;

(l) reszt aminokwasowych 46-51 z SEQ ID nr: 11;

(m) reszt aminokwasowych 101-105 z SEQ ID nr: 2;

(n) reszt aminokwasowych 113-118 z SEQ ID nr: 2;

(o) reszt aminokwasowych 114-119 z SEQ ID nr: 2;

(p) reszt aminokwasowych 126-131 z SEQ ID nr: 2;

(q) reszt aminokwasowych 158-162 z SEQ ID nr: 2;

lub stanowiącą sekwencję aminokwasowi wybraną z grupy aminokwasów 85-98, 104-118, 131-136, 141-157, 157-162 lub 158-163 sekwencji SEQ ID nr: 11.

Przedmiotem wynalazku jest także białko fuzyjne zawierające co najmniej cztery polipeptydy, przy czym porządek polipeptydów od końca N do końca C jest taki, że: pierwszy polipeptyd, który zawiera sekwencję reszt aminokwasowych od 38-52 z SEQ ID nr: 2; pierwsza sekwencja rozdzielająca o 6-27 resztach aminokwasowych; drugi polipeptyd, który zawiera sekwencję reszt aminokwasowych z grupy:

(a) IL-2 helisa B reszt aminokwasowych z SEQ ID nr: 168;

(b) IL-4 helisa B reszty 65-83 z SEQ ID nr: 164;

(c) IL-3 helisa B reszty 73-86 z SEQ ID nr: 102;

(d) GM-CSF helisa B reszty 72-81 z SEQ ID nr: 166 i (e) reszty aminokwasowe 83-98 z SEQ ID nr: 2;

druga sekwencja rozdzielająca o 5-11 resztach aminokwasowych; trzeci polipeptyd, który obejmuje sekwencję reszt aminokwasowych z grupy:

PL 211 833 B1 (a) IL-2 helisa C reszty 102-116 z SEQ ID nr: 162;

(b) IL-4 helisa C reszty 94-118 z SEQ ID nr: 164;

(c) IL-3 helisa C reszty 91-103 z SEQ ID nr: 102;

(d) GM-CSF helisa C reszty 85-103 z SEQ ID nr: 166 i (e) reszt aminokwasowych 104-117 z SEQ ID nr: 2;

trzecia sekwencja rozdzielająca o 3-29 resztach aminokwasowych;

i czwarty polipeptyd, który obejmuje sekwencję reszt aminokwasowych z grupy:

(a) IL-2 helisa D reszty 134-149 z SEQ ID nr: 162;

(b) IL-3 helisa D reszty 123-141 z SEQ ID nr: 102;

(c) IL-4 helisa D reszty 133-151 z SEQ ID nr: 164;

(d) GM-CSF helisa D reszty 120-131 z SEQ ID nr: 166 i (e) reszty aminokwasowe 137-152 z SEQ ID nr: 2.

Przedmiotem wynalazku jest również białko fuzyjne zawierające co najmniej cztery polipeptydy, przy czym porządek polipeptydów od końca N do końca C jest taki, że pierwszy polipeptyd, który zawiera sekwencję reszt aminokwasowych wybranych z grupy obejmującej:

(a) IL-2 helisa A reszty 27-48 z SEQ ID nr: 162;

(b) IL-4 helisa A reszty 30-42 z SEQ ID nr: 164;

(c) IL-3 helisa A reszty 35-45 z SEQ ID nr: 102;

(d) GM-CSF helisa A reszty 30-44 z SEQ ID nr: 166 i (e) reszty aminokwasowe 38-52 z SEQ ID nr: 2;

pierwsza sekwencja rozdzielająca o 6-27 resztach aminokwasowych;

drugi polipeptyd, który obejmuje sekwencję reszt aminokwasowych z grupy:

(a) IL-2 helisa B reszty z SEQ ID nr: 168;

(b) IL-4 helisa B reszty 65-83 z SEQ ID nr: 164;

(c) IL-3 helisa B reszty 73-86 z SEQ ID nr: 102;

(d) GM-CSF helisa B reszty 72-81 z SEQ ID nr: 166 i (e) reszty aminokwasowe 83-98 z SEQ ID nr: 2;

druga sekwencja rozdzielająca o 5-11 resztach aminokwasowych; trzeci polipeptyd, który obejmuje sekwencję reszt aminokwasowych z grupy:

(a) IL-2 helisa C reszty 102-116 z SEQ ID nr: 162;

(b) IL-4 helisa C reszty 94-118 z SEQ ID nr: 164;

(c) IL-3 helisa C reszty 91-103 z SEQ ID nr: 102;

(d) GM-CSF helisa C reszty 85-103 z SEQ ID nr: 166 i (e) reszty aminokwasowe 104-117 z SEQ ID nr: 2;

trzecia sekwencja rozdzielająca o 3-29 resztach aminokwasowych; i czwarty polipeptyd, który zawiera sekwencję reszt aminokwasowych od 137-152 z SEQ ID nr: 2.

Przedmiotem wynalazku jest także białko fuzyjne charakteryzujące się tym, że czwarty polipeptyd obejmuje reszty aminokwasowe 137-152 z SEQ ID nr: 2.

Następnym przedmiotem wynalazku jest również wyizolowana cząsteczka polinukleotydu stanowiąca sekwencje nukleotydów kodująca polipeptyd stanowiący sekwencję reszt aminokwasowych, która jest identyczna co najmniej w 90% z sekwencją aminokwasową wybraną z grupy:

(a) polipeptydu pokazanego od reszty 38 (Val) do 152 (Leu) jak pokazano na SEQ ID nr: 2;

(b) polipeptydu pokazanego od reszty 27 (Leu) do 164 (Thr) z SEQ ID nr: 2;

(c) polipeptydu pokazanego od reszty 24 (Ser) do 164 (Thr) z SEQ ID nr: 2; i (d) polipeptydu pokazanego od reszty 1 (Met) do 164 (Thr) z SEQ ID nr: 2.

Korzystnie, ta wyizolowana cząsteczka polinukleotydu według wynalazku charakteryzuje się tym, że nukleotydy są wybrane z grupy:

(a) polinukleotydu jak pokazano na SEQ ID nr: 1 od nukleotydu 139 do nukleotydu 483;

(b) polinukleotydu jak pokazano na SEQ ID nr: 1 od nukleotydu 106 do nukleotydu 519;

(c) polinukleotydu jak pokazano na SEQ ID nr: 1 od nukleotydu 97 do nukleotydu 519; i (d) polinukleotydu jak pokazano na SEQ ID nr: 1 od nukleotydu 28 do nukleotydu 519 lub tym, że wspomniane nukleotydy kodują polipeptyd według wynalazku.

Wynalazek dotyczy także wektora ekspresji, który zawiera następujące, operacyjnie powiązane elementy:

(a) promotor transkrypcji;

PL 211 833 B1 (b) segment DNA kodujący polipeptyd zawierający sekwencję reszt aminokwasowych wybranych z grupy:

(i) reszt aminokwasowych 38-52 z SEQ ID nr: 2;

(ii) reszt aminokwasowych 83-98 z SEQ ID nr: 2;

(iii) reszt aminokwasowych 104-117 z SEQ ID nr: 2;

(iv) reszt aminokwasowych 137-152 z SEQ ID nr: 2 lub stanowiący izolowany polinukleotyd według wynalazku; i (c) terminator transkrypcji.

Wynalazek dotyczy także hodowanej komórki obejmującej wektor ekspresji zdefiniowany powyżej.

Wynalazek dotyczy także sposobu wytwarzania polipeptydu obejmujący hodowlę komórki zdefiniowanej powyżej w warunkach, w których segment DNA ulega ekspresji i odzyskania polipeptydu kodowanego przez ten segment DNA.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania przeciwciała, które to przeciwciało wiąże polipeptyd według wynalazku, polegający na tym, że polipeptyd, którym wykonuje się inokulację jest wybrany z grupy:

(a) polipeptydu stanowiącego 9 do 141 aminokwasów, przy czym polipeptyd ten jest identyczny z sąsiadując ą sekwencją reszt aminokwasowych na SEQ ID nr: 2 od aminokwasu numer 24 (Ser) do aminokwasu numer 164 (Thr);

(b) polipeptyd według wynalazku;

(c) polipeptydu zawierającego sekwencję aminokwasową z SEQ ID nr: 2 od aminokwasu numer

38-52;

(d) polipeptydu zawierającego sekwencję aminokwasową z SEQ ID nr: 2 od aminokwasu numer

83-98;

(e) polipeptydu zawierającego sekwencję aminokwasową z SEQ ID nr: 2 od aminokwasu numer 104-117;

(f) polipeptydu zawierającego sekwencję aminokwasową z SEQ ID nr: 2 od aminokwasu numer 137-152;

(g) polipeptydu zawierającego sekwencję aminokwasową z SEQ ID nr: 2 od aminokwasu numer 38-152;

(h) polipeptydu zawierającego sekwencję aminokwasową z SEQ ID nr: 2 od aminokwasu numer 24-164;

(i) polipeptydu zawierającego sekwencję aminokwasową z SEQ ID nr: 2 od aminokwasu numer 27-164;

(j) polipeptydu zawierającego sekwencję aminokwasową z SEQ ID nr: 11 od aminokwasu numer 38-52;

(k) polipeptydu zawierającego sekwencję aminokwasową z SEQ ID nr: 11 od aminokwasu numer 85-98;

(l) polipeptydu zawierającego sekwencję aminokwasową z SEQ ID nr: 11 od aminokwasu numer 104-118;

(m) polipeptydu zawierającego sekwencję aminokwasową z SEQ ID nr: 11 od aminokwasu numer 141-157;

(n) polipeptydu zawierającego sekwencję aminokwasową z SEQ ID nr: 11 od aminokwasu numer 38-157;

(o) polipeptydu zawierającego sekwencję aminokwasową z SEQ ID nr: 11 od aminokwasu numer 24-163;

(p) polipeptydu zawierającego reszty aminokwasowe 54-59, 129-134, 53-58, 35-40 lun 33-38 z SEQ ID nr: 2 lub reszty aminokwasowe 34-39, 46-51, 131-136, 158-163 lub 157-162 z SEQ ID nr: 11; przy czym schowane reszty G, D i T oraz reszty wystawione H i W ignorowano; i przy czym polipeptyd wzbudza odpowiedź odpornością z utworzeniem przeciwciała; i izolowanie tego przeciwciała od zwierzęcia.

Przeciwciało wytworzone sposobem jak zdefiniowano powyżej, charakteryzuje się tym, że przeciwciało to wiąże się z polipeptydem z SEQ ID nr: 2 lub SEQ ID nr: 11.

Przedmiotem wynalazku jest także przeciwciało lub fragment przeciwciała, które specyficznie wiąże się z polipeptydem ukazanym na SEQ ID nr: 2 lub SEQ nr: 11 lub z polipeptydem zawierającym sekwencję reszt aminokwasowych wybranych z grupy:

(a) polipeptydu pokazanego od reszt 38 (Val) do 152 (Leu) jak pokazano na SEQ ID nr: 2;

PL 211 833 B1 (b) polipeptydu pokazanego od reszty 27 (Leu) do 164 (Thr) z SEQ ID nr: 2;

(c) polipeptydu pokazanego od reszty 24 (Ser) do 164 (Thr) z SEQ ID nr: 2; i (d) polipeptydu pokazanego od reszty 1 (Met) do 164 (Thr) z SEQ ID nr: 2.

Korzystnie, przeciwciało to wybrane jest z grupy:

(a) przeciwciała poliklonalnego, (b) monoklinalnego mysiego przeciwciała, (c) przeciwciała humanizowanego pochodzącego od (b), (d) fragmentu przeciwciała i (e) ludzkiego przeciwciała monoklonalnego.

Również korzystnie, przeciwciało to zawiera ponadto radionuklid, enzym, substrat, kofaktor, znacznik fluorescencyjny, znacznik chemiluminescencyjny, Tag polipeptydowy, cząstkę magnetyczną, lek lub toksynę.

Również w korzystnym rozwiązaniu, przeciwciało to jest do redukowania zapalenia indukowanego przez polipeptyd według wynalazku.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie przeciwciała zdefiniowanego powyżej do wytwarzania leku do zastosowania w metodzie supresji odpowiedzi zapalnej u ssaka z zapaleniem, przy czym metoda ta obejmuje:

(1) określenia poziomu cząsteczki zapalnej;

(2) podanie wspomnianego leku;

(3) określenie poziomu cząsteczki zapalnej po podaniu;

(4) porównanie poziomu cząsteczki zapalnej w etapie (1) z poziomem cząsteczki zapalnej w etapie (3), przy czym brak wzrostu lub spadek poziomu cząsteczki zapalnej jest wskazującym na zahamowanie odpowiedzi zapalnej.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób wykrywania obecności polipeptydu według wynalazku w próbce biologicznej, polegający na tym, że obejmuje etapy:

(a) zetknięcia próbki biologicznej z przeciwciałem, lub fragmentem przeciwciała zdefiniowanego powyżej, przy czym kontaktowanie prowadzi się w warunkach, które pozwalają na wiązanie się przeciwciała lub fragmentu przeciwciała do próbki biologicznej i (b) wykrywanie związanego przeciwciała lub fragmentu przeciwciała.

Wynalazek obejmuje także sposób inhibicji proliferacji lub różnicowania komórek krwiotwórczych i potomstwa komórek krwiotwórczych indukowanego polipeptydem według wynalazku, obejmujący hodowlę szpiku kostnego lub obwodowych krwinek z kompozycją obejmującą ilość przeciwciała według wynalazku wystarczającą do redukcji proliferacji lub różnicowania krwiotwórczych komórek w szpiku kostnym lub krwinek obwodowych, w porównaniu ze szpikiem kostnym lub krwinkami obwodowymi hodowanymi pod nieobecność rozpuszczalnego receptora cytokiny. W sposobie tym korzystnie komórkami krwiotwórczymi i krwiotwórczymi komórkami potomnymi są komórki limfoidalne, a komórkami limfoidalnymi są makrofagi lub komórki T.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie polipeptydu według wynalazku do wytwarzania leku do leczenia w metodzie stymulowania odpowiedzi odpornościowej u ssaka w zetknięciu z antygenem lub patogenem, obejmują cej etapy:

(1) określenia bezpośrednio lub pośrednio poziomu antygenu lub patogenu obecnego u wspomnianego ssaka;

(2) podania wspomnianego leku;

(3) określenia bezpośrednio lub pośrednio poziomu antygenu lub patogenu występującego w wymienionego ssaka; i (4) porównanie poziomu antygenu lub patogenu w etapie 1 z poziomem antygenu lub patogenu w etapie 3, przy czym zmiana poziomu jest wskaźnikiem stymulacji odpowiedzi odpornoś ciowej.

Sposób według wynalazku dodatkowo obejmuje:

(5) ponowne podanie wspomnianego leku;

(6) określenie bezpośrednio lub pośrednio poziomu antygenu lub patogenu u wymienionego ssaka; i (7) porównanie liczby poziomu antygenu lub patogenu w etapie 1 z poziomem antygenu w etapie 6, przy czym zmiana poziomu wskazuje stymulację odpowiedzi odpornościowej.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób rozprzestrzeniania komórek krwiotwórczych i potomstwa komórek krwiotwórczych, obejmujący hodowlę szpiku kostnego lub krwinek obwodowych z kompozycją obejmującą ilość polipeptydu wynalazku wystarczającą do wytworzenia wzrostu liczby komóPL 211 833 B1 rek limfoidalnych w szpiku kostnym lub komórkach krwinek obwodowych, w porównaniu ze szpikiem kostnym lub komórkami krwinek obwodowych hodowanymi pod nieobecność wspomnianego polipeptydu. W korzystnym wykonaniu komórki krwiotwórcze i krwiotwórcze komórki potomne są komórkami limfoidalnymi, a komórki limfoidalne są komórkami monocytowymi, makrofagami lub komórkami T.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie polipeptydu według wynalazku do wytwarzania leku do zastosowania w metodzie stymulowania odpowiedzi odpornościowej u ssaka w zetknięciu z antygenem lub patogenem, obejmują cy:

(1) określenie poziomu przeciwciała swoistego wobec antygenu lub patogenu;

(2) podanie wspomnianego leku;

(3) określenie poziomu przeciwciała swoistego wobec antygenu lub patogenu po podaniu;

(4) porównanie poziomu przeciwciała w etapie (1) z poziomem przeciwciała w etapie (3), przy czym wzrost poziomu przeciwciała jest wskaźnikiem stymulacji odpowiedzi odpornościowej.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób wykrywania obecności RNA kodującego polipeptyd według wynalazku w próbce biologicznej, obejmujący etapy:

(a) zetknięcia sondy kwasu nukleinowego w warunkach hybrydyzujących z albo (i) testowymi cząsteczkami RNA wyizolowanymi z próbki biologicznej lub (ii) cząsteczkami kwasu nukleinowego zsyntetyzowanego z wyizolowanych cząsteczek RNA, przy czym sonda posiada sekwencję nukleotydową obejmującą albo część sekwencji nukleotydowej cząsteczki kwasu nukleinowego według zastrz. 9 lub jej komplementu i (b) wykrywanie tworzenia się hybryd sondy kwasu nukleinowego i albo testowych cząsteczek RNA albo cząsteczek zsyntetyzowanego kwasu nukleinowego, przy czym obecność hybryd wskazuje na obecność RNA kodującego polipeptyd według któregokolwiek z zastrz. 1-4 w próbce biologicznej.

Wynalazek dotyczy także sposobu zabijania komórek nowotworowych in vitro lub in vivo obejmujący, wytworzenie polipeptydu sposobem zdefiniowanym powyżej, i opracowanie polipeptydu w farmaceutycznie akceptowalnym noś niku i wystawienie próbki tkanki lub próbki biologicznej zawierającej komórki nowotworowe na polipeptyd; przy czym polipeptyd ten zabija komórki.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie polipeptydu wytworzonego zgodnie z sposobem według wynalazku, do wytwarzania leku do zabijania komórek nowotworowych.

Korzystnie jest, gdy polipeptyd ten jest dodatkowo sprzężony z toksyną.

Wynalazek dotyczy także zastosowania antagonisty polipeptydu zdefiniowanego według wynalazku do wytwarzania leku do leczenia ssaka dotkniętego chorobą zapalną, przy czym antagonista jest przeciwciałem, które specyficznie wiąże się z polipeptydem według wynalazku lub fragmentem przeciwciała zdefiniowanym powyżej. W zastosowaniu chorobą korzystnie jest przewlekła choroba zapalna, a przewlekła choroba zapalna wybrana jest z grupy:

(a) zapalnej choroby jelit;

(b) wrzodziejącego zapalenia okrężnicy;

(c) choroby Crohna;

(d) atopowego zapalenia skóry;

(e) egzemy; i (f) łuszczycy.

Bardziej korzystnie chorobą jest ostra choroba zapalna. Również bardziej korzystnie chorobą jest ostra choroba zapalna z grupy:

(a) endotoksemii;

(b) posocznicy;

(c) zespołu wstrząsu toksycznego; i (d) choroby zakaźnej.

W zastosowaniu wedł ug wynalazku przeciwciał o dodatkowo obejmuje radionuklid, enzym, substrat, kofaktor, znacznik fluorescencyjny, znacznik chemiluminescencyjny, znacznik peptydowy, cząstkę magnetyczną, lek lub toksynę.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób wykrywania zapalenia u pacjenta, obejmujący: inkubację próbki tkanki lub próbki biologicznej od pacjenta z przeciwciałem według wynalazku w warunkach, w których przeciwciało wiąże się ze swym komplementarnym polipeptydem w tkance lub próbce biologicznej; uwidocznienie przeciwciała związanego w tkance lub próbce biologicznej; i porównanie poziomu przeciwciała związanego w tkance lub próbce biologicznej od pacjenta z normalną kontrolną tkanką lub próbką biologiczną, przy czym zwiększenie poziomu przeciwciała związanego z tkanką lub

PL 211 833 B1 próbką biologiczną od pacjenta w odniesieniu do normalnej tkanki kontrolnej lub próbki biologicznej jest wskaźnikiem zapalenia u pacjenta.

Kolejno, przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania zapalenia u pacjenta, obejmujący: znakowanie polinukleotydy obejmującego co najmniej 14 sąsiadujących nukleotydów z SEQ ID nr: 1 lub komplementu z SEQ ID nr: 1; inkubację próbki tkanki lub próbki biologicznej od pacjenta w warunkach, w których polinukleotydy będzie hybrydyzował z komplementarną sekwencją polinukleotydową; uwidocznienie wyznakowanego polinukleotydy w tkance lub próbce biologicznej; i porównanie poziomu hybrydyzacji wyznakowanego polinukleotydy w tkance lub próbce biologicznej od pacjenta z normalną tkanką kontrolną lub próbką biologiczną, przy czym zwiększenie hybrydyzacji wyznakowanego polinukleotydy z tkanką lub próbką biologiczną pacjenta w odniesieniu do normalnej tkanki kontrolnej lub próbki biologicznej jest wskaźnikiem zapalenia u pacjenta.

Krótki opis rysunków

Figura 1 jest ilustracją wielokrotnego dopasowania ludzkiego zcytor17lig (SEQ ID NO: 2) (zcytor17lig), mysiego zcytor17lig (SEQ ID NO: 11) (mzcytor17lig), mysiego IL-3 (mIL-3) (SEQ ID NO: 100) i ludzkiego IL-3 (hIL-3) (SEQ ID NO: 102).

Figura 2 jest ilustracją wielokrotnego dopasowania ludzkiego zcytor17lig (SEQ ID NO: 2) (zcytor17lig), i mysiego zcytor17lig (SEQ ID NO: 11) (mzcytor17lig).

Figura 3 jest wykresem wykresu hydrofilowości Hoppa/Woodsa ludzkiego zcytor17lig (SEQ ID NO: 2).

Szczegółowy opis wynalazku

Przed przedstawieniem wynalazku w szczegółach, może być pomocne w jego zrozumieniu zdefiniowanie następujących terminów.

Termin „marker powinowactwa” stosuje się w wynalazku dla określenia segmentu polipeptydowego, który może być związany z drugim polipeptydem dla uzyskania oczyszczania lub detekcji drugiego polipeptydu lub zapewnienia miejsc wiązania drugiego polipeptydu z substratem. W zasadzie, dowolny peptyd lub białko, dla którego jest dostępny przeciwciało lub inny specyficzny środek wiążący, można stosować jako marker powinowactwa. Markery powinowactwa obejmują drogę polihistydynową, białko A (Nilsson i in., EMBO J. 4: 1075, 1985; Nilsson i in., Methods Enzymol. 198: 3, 1991), transferazę glutationu S (Smith i Johnson, Gene 67: 31, 1988), marker powinowactwa Glu-Glu (Grussenmeyer i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 7952- 4,1985), substancję P, peptyd Flag™ (Hopp i in., Biotechnology 6: 1204-10,1988), peptyd wiążący streptawidynę lub inny antygenowy epitop, lub domena wiążąca; patrz, w ogólności, Ford i in., Protein Expression and Purification 2: 95-107,1991. DNA kodujące markery powinowactwa są dostępne od dostawców przemysłowych (np. Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).

Termin „wariant allelowy” stosuje się w wynalazku dla określenia dowolnych dwu lub większej liczby alternatywnych form genu zajmujących to samo miejsce chromosomowe. Allelowe odmiany powstają naturalnie przez mutację, i mogą powodować fenotypowy polimorfizm w populacji. Mutacje genu mogą być ciche (bez zmian w kodowanym polipeptydzie) lub mogą kodować polipeptydy mające zmienioną sekwencję aminokwasów. Termin wariant allelowy również stosuje się w wynalazku dla określenia białka kodowanego przez wariant allelowy genu.

Terminy „amino-terminalny” i „karboksy-terminalny” stosuje się w wynalazku dla określenia pozycji w polipeptydach. Gdzie kontekst pozwala, te terminy stosuje się w odniesieniu do konkretnej sekwencji lub porcji polipeptydu dla określenia bliskości lub względnej pozycji. Np., pewna sekwencja umieszczona karboksyterminalnie względem sekwencji odniesienia w polipeptydzie jest umieszczona proksymalnie względem karboksylowego końca sekwencji odniesienia, lecz nie jest koniecznie na karboksylowym końcu pełnego polipeptydu.

Termin „para komplement/anty-komplement” opisuje nie identyczne ugrupowania, które tworzą nie kowalencyjnie połączoną, trwałą parę w odpowiednich warunkach.

Na przykład, biotyna i awidyna (lub streptawidyna) są prototypowymi członami pary komplement/anty-komplement. Inne przykładowe pary komplement/anty-komplement obejmują pary receptor/ligand, pary przeciwciało/antygen (lub hapten lub epitop), pary polinukleotydowe sensowne/antysensowne i tym podobne. Gdy pożądana jest dalsza dysocjacja pary komplement /antykomplement, para komplement/anty-komplement korzystnie ma powinowactwo wiązania < 10⁹ M^-1.

Termin „komplementy cząsteczki polinukleotydu” oznacza cząsteczki polinukleotydu mające komplementarną sekwencję zasad i odwrotną orientację w porównaniu z sekwencją odniesienia. Np., sekwencja 5' ATGCACGGG 3' jest komplementarna do 5' CCCGTGCAT 3'.

PL 211 833 B1

Termin „kontyg” oznacza polinukleotyd, który ma sąsiadujący obszar identycznej lub komplementarnej sekwencji z innym polinukleotydem. Sąsiadujące sekwencje określa się jako „zachodzące” na dany obszar sekwencji polinukleotydowej w całości lub wzdłuż częściowego obszaru polinukleotydu. Np., reprezentatywne kontygi dla sekwencji polinukleotydowej 5'-ATGGCTTAGCTT-3' to 5'-TAGCTTgagtct-3' i 3'-gtcgacTACCGA-5'.

Termin „zdegenerowana sekwencja nukleotydowa” oznacza sekwencje nukleotydów, które obejmują jeden lub większą liczbę zdegenerowanych kodonów (w porównaniu odniesieniowymi cząsteczkami polinukleotydu, który koduje polipeptyd). Zdegenerowane kodony zawierają różne tryplety nukleotydów, lecz kodują te same reszty aminokwasowe (to jest tryplety GAU i GAC kodują Asp).

Termin „wektor ekspresji” stosuje się dla określenia cząsteczki DNA, liniowej lub kołowej, która obejmuje segment kodujący dany polipeptyd operacyjnie powiązany z dodatkowymi segmentami, które zapewniają jego transkrypcję. Takie dodatkowe segmenty obejmują sekwencje promotora i terminatora i mogą również obejmować jeden lub większą liczbę początków replikacji, jeden lub więcej markerów selekcyjnych, element wzmacniający, sygnał poliadenylacji, itp. Wektory ekspresji ogólnie pochodzą z plazmidowego lub wirusowego DNA, lub mogą zawierać elementy obu.

Termin „wydzielony”, gdy stosowany do polinukleotydu, oznacza, że polinukleotyd usunięto z jego naturalnego genetycznie ś rodowiska i jest on wolny od innych zewnę trznych lub niechcianych sekwencji kodujących, i jest w postaci odpowiedniej do stosowania w genetycznie przetwarzane układy wytwarzania białka. Takie wydzielone cząsteczki są tymi, które wydziela się z ich naturalnego środowiska i obejmują klony cDNA i genomowe. Wydzielone cząsteczki DNA według niniejszego wynalazku są wolne od innych genów, z którymi są zwykle związane, lecz można obejmować naturalnie występujące nie translowane regiony 5' i 3', takie jak promotory i terminatory. Identyfikacja związanych regionów będzie oczywista dla fachowca w dziedzinie (patrz np. Dynan i Tijan, Nature 316: 774-78, 1985).

„Wydzielony” polipeptyd lub białko oznacza polipeptyd lub białko, które jest znajdowane w warunkach innych niż jego natywne środowisko, tak jak poza tkanką krwi i zwierzęcą. W korzystnej postaci, wydzielony polipeptyd jest zasadniczo wolny od innych polipeptydów, szczególnie innych polipeptydów zwierzęcego pochodzenia. Korzystnie jest dostarczać polipeptydy w wysoce oczyszczonej postaci, to jest, o czystości większej niż 95%, korzystniej większej niż 99%. Gdy uż yty w tym kontekście, termin „wydzielony” nie wyklucza obecności tego samego polipeptydu w alternatywnej fizycznej postaci, takie jak dimery lub alternatywnie glikozylowane lub derywatyzowane postaci.

Termin „nowotworowy”, w odniesieniu do komórek, wskazuje komórki podlegające nowej i nienormalnej proliferacji, szczególnie w tkance, gdzie proliferacja jest niekontrolowana i progresywna, dająca nowotwór. Komórki nowotworowe mogą być złośliwe, to jest inwazyjne i przerzutowe lub dobrotliwe.

Termin „operacyjnie powiązany” w odniesieniu do segmentów DNA, wskazuje, że segmenty są ustawione tak, że działają wspólnie dla ich zamierzonych celów, np. transkrypcja zaczyna się w promotorze i przebiega przez segment kodujący do terminatora.

Termin „ortolog” oznacza polipeptyd lub białko otrzymane z jednego gatunku, który jest funkcjonalnym odpowiednikiem polipeptydów lub białek z innych gatunków. Różnice sekwencji pośród ortologów są wynikiem specjacji.

„Paralogi” są różnymi, lecz strukturalnie pokrewnymi białkami wytwarzanymi przez organizm.

Uważa się, że paralogi powstają przez duplikację genu. Np. α-globina, β-globina i mioglobina są swoimi paralogami.

„Polinukleotyd” jest jedno- lub dwuniciowym polimerem dezoksyrybonukleotydowych lub rybonukleotydowych zasad czytanych od końca 5' do 3'. Polinukleotydy obejmują RNA i DNA, i można je wydzielać z naturalnych źródeł, zsyntetyzować in vitro lub wytwarzać z kombinacji naturalnych i syntetycznych cząsteczek. Rozmiary polinukleotydów wyraża się jako pary zasad (skrót „bp”), nukleotydy („nt”), lub tysiące zasad („kb”). Gdzie pozwala kontekst, ostatnie dwa terminy mogą opisywać polinukleotydy, które są jednoniciowe lub dwuniciowe. Gdy termin jest stosowany do dwuniciowych cząsteczek, stosuje się go dla określenia łącznej długości i będzie rozumiany jako równoważnik terminu „pary zasad”. Specjaliści w dziedzinie zrozumieją, że dwie nici dwuniciowego polinukleotydu mogą się różnić nieco długością i że ich końce mogą być przesunięte w wyniku rozcinania enzymatycznego; tak więc wszystkie nukleotydy w dwuniciowych cząsteczkach polinukleotydu mogą nie być sparowane.

PL 211 833 B1 „Polipeptyd” oznacza polimer z reszt aminokwasowych połączonych wiązaniami peptydowymi, wytworzonych naturalnie lub syntetycznie. Polipeptydy mające mniej niż około 10 reszt aminokwasowych są pospolicie określane jako „peptydy”.

Termin „promotor” stosuje się w wynalazku w znaczeniu używanym w dziedzinie dla określenia części genu zawierającej sekwencje DNA zapewniające wiązanie polimerazy RNA i inicjowania transkrypcji. Sekwencje promotora są pospolicie, lecz nie zawsze, znajdowane w 5'-niekodującym regionach genów.

„Białko” jest makrocząsteczką zawierającą jeden lub większą liczbę łańcuchów polipeptydowych. Białko może również obejmować nie peptydowe składniki, takie jak grupy węglowodanowe. Węglowodany i inne nie peptydowe podstawniki może być dodawana do białka przez komórkę, w której jest wytwarzane biał ko i bę d ą się wahać z typem komórki. Biał ka są definiowane w wynalazku w kategoriach struktur ł a ń cucha gł ównego aminokwasu; podstawniki, takie jak grupy wę glowodanowe, są ogólnie nie specyfikowane, lecz mogą być niemniej obecne.

Termin „receptor” oznacza związane z komórką białko, które wiąże się z bioaktywną cząsteczką (to jest ligandem) i mediuje wpływ ligandu na komórkę. Związane z błoną receptory charakteryzują się wielopeptydową strukturą zawierającą pozakomórkową domenę wiążącą ligand i wewnątrzkomórkową efektorową domenę, która jest typowo zaangażowana w transdukcję sygnału. Wiązanie ligandu z receptorem powoduje zmianę konformacyjną w receptorze, która powoduje interakcję pomiędzy domeną efektora i innymi cząsteczkami w komórce. Ta interakcja z kolei prowadzi do zmiany w metabolizmie komórki. Metaboliczne zdarzenia powiązane z oddziaływaniami receptor-ligand obejmują transkrypcję genu, fosforylację, defosforylację, wzrost wytwarzania cyklicznego AMP, mobilizację komórkowego wapnia, mobilizację lipidów błony, adhezję komórek, hydrolizę lipidów inozytolowych i hydrolizę fosfolipidów. W ogólności, receptory mogą być związane z błoną, cytosolowe lub jądrowe; monomeryczne (np. receptor hormonu stymulującego tarczycę, receptor β-adrenergiczny) lub multimeryczne (np. receptor PDGF, receptor hormonu wzrostu, receptor IL-3, receptor GM-CSF receptor, receptor G-CSF, receptor erytropoetyny i receptor IL-6).

Termin „sekwencja sygnału sekrecji” oznacza sekwencję DNA kodującą polipeptyd („sekrecyjny peptyd”), który, jako składnik większego polipeptydu, kieruje większy polipeptyd przez sekrecyjny szlak komórki, w której jest syntetyzowany. Większy polipeptyd jest zwykle rozcinany dla usunięcia sekrecyjnego peptydu podczas przechodzenia przez szlak sekrecyjny.

Termin „wariant składania” stosuje się w wynalazku dla określenia alternatywnych form RNA transkrybowanego z genu. Zmienność składania pojawia się przez zastosowanie alternatywnych miejsc składania w transkrybowanej cząsteczce RNA, lub rzadziej pomiędzy oddzielnie transkrybowanymi cząsteczkami RNA, i może dać kilka mRNA transkrybowanych z tego samego genu. Warianty składania mogą kodować polipeptydy mający zmienioną sekwencję aminokwasową. Termin „wariant składania” stosuje się tutaj również dla określenia białka kodowanego przez wariant składania mRNA transkrybowanego z genu.

Masy cząsteczkowe i długości polimerów określone przez nieprecyzyjne metody analityczne (np., elektroforezę żelową) będą rozumiane jako przybliżone wartości. Gdy taką wartość wyraża się jako „około” X lub „w przybliżeniu” X, dana wartość X będzie rozumiana jako dokładna do 10%.

Wszystkie pozycje literaturowe cytowane w wynalazku są dołączane jako odnośnik w całości.

Niniejszy wynalazek opiera się w części na odkryciu nowej sekwencji DNA, która koduje białko mające strukturę cytokiny z czterohelisową wiązką. Przez procesy klonowania i testy proliferacji opisane w szczegółach w wynalazku, zidentyfikowano sekwencję polinukleotydową kodującą nowy polipeptyd ligandowy, który jest ligandem z wysoką specyficznością wobec receptora zcytor17 (SEQ ID NO: 5) i co najmniej jedną dodatkową podjednostkę zawierającą receptor beta OncostatinM (OSMR-beta) (SEQ ID NO: 7) i WSX-1 (SEQ ID NO: 9). Ten ligandowy polipeptyd, oznaczony zcytor17lig, wydzielono z biblioteki cDNA generowanej z aktywowanych ludzkich obwodowych krwinek (hPBC), które były wybrane na CD3. CD3 jest markerem powierzchni komórki jednoznacznym dla komórek pochodzenia limfoidalnego, szczególnie komórek T.

W poniższych przykładach, linię komórkową zależną od szlaku związanego z OSMRbeta i receptora zcytor17 lub zależną od szlaku związanego z OSMRbeta i WSX-1 i receptora zcytor17 dla przeżycia i wzrostu pod nieobecność innych czynników wzrostu użyto dla selekcji źródła cDNA kodującego zcytor17lig. Korzystną zależną od czynnika wzrostu linię komórkową, której użyto do transfekcji i ekspresji receptora zcytor17, była BaF3 (Palacios i Steinmetz, Cell. 41: 727-734, 1985; MatheyPrevot i in., Mol. Cell. Biol. 6: 41334135,1986). Jednakże, inne zależne od czynnika wzrostu linie koPL 211 833 B1 mórkowe, takie jak FDC-Pl (Hapel i in., Blood 64: 786-790,1984) i M07e (Kiss i in., Leukemia 7: 235-240,1993) są przydatne w tym celu.

Sekwencja aminokwasową dla OSMR, WSX-1 i receptorów zcytor17 wskazała, że kodowane receptory należały do klasy I podrodziny receptorów cytokinowych, która obejmuje, między innymi, receptory dla IL-2, IL-4, IL-7, Lif, IL-12, IL-15, EPO, TPO, GM-CSF i G-CSF (przegląd podaje Cosman, „The Hematopoietin Receptor Superfamily” w Cytokine 5 (2) 95-106, 1993). Receptor zcytor17 jest w peł ni opisany we wspólnie posiadanym zgł oszeniu patentowym PCT nr US 01/20484 (publikacja WIPO nr WO 02/00721) i WSX-1 jest w pełni opisany w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr US 5 925 735. Analiza rozmieszczenia tkankowego mRNA receptora zcytor17 ujawniła ekspresję w aktywowanych podzbiorach komórek T CD4+ i CD8+, monocytach CD14+ i słabszą ekspresję w komórkach B CD19+. Ponadto, mRNA występował w spoczywających lub aktywowanych monocytowych liniach komórkowych THP-1 (ATCC nr TIB-202), U937 (ATCC nr CRL-1593,2) i HL60 (ATCC nr CCL-240).

Ekspresja WSX-1 jest silniejsza w grasicy, śledzionie, PBL i węźle limfatycznym, jak też zwiększoną ekspresję obserwowano dla aktywowanych komórek T. Rozmieszczenie w tkance OSMRbeta opisano jako bardzo szerokie. Rozmieszczenie w tkance tych trzech receptorów sugeruje, że celem przewidywanego Zcytor17lig są komórki typu krwiotwórczego, w szczególności komórki T, monocyty/makrofagi i prekursory limfocytów i limfocyty. Inne znane cytokiny z czterohelisową wiązką działające na limfocyty obejmują IL-2, IL-4, IL-7 i IL-15. Przegląd cytokin z czterohelisową wiązką, patrz Nicola i in., Advances in Protein Chemistry 52: 1-65, 1999 i Kelso, A., Immunol. Cell Biol. 76: 300-317, 1998.

Kondycjonowana pożywka (CM) z selekcjonowanych CD3+, stymulowanych PMA/jonomycyną ludzkich obwodowych krwinek wspierała wzrost komórek BaF3 eksprymujących receptor zcytor17, OSMRbeta i receptor WSX-1 i była po tym zależna od IL-3. Kondycjonowane pożywki z komórek, które nie były: 1) stymulowane PMA/jonomycyną; lub nie były: 2) selekcjonowane CD3 (z lub bez stymulacji PMA/jonomycyną) nie wspierały wzrostu komórek Baf3 z ekspresją zcytor17, OSMRbeta i komórek eksprymują cych receptor WSX-1 (BaF3/zcytor17/WSX-1/OSMRbeta). Eksperymenty kontrolne wykazały, że tej proliferacyjnej aktywności nie można było przypisać innym znanym czynnikom wzrostu, i że zdolność takiej kondycjonowanej pożywki do stymulacji proliferacji komórek eksprymujących receptory zcytor17/WSX-1/OSMRbeta może być neutralizowana przez rozpuszczalną formę receptora zcytor17.

Kondycjonowana pożywka z selekcjonowanych CD3+ komórek aktywowana PMA/jonomycyną również wspierała wzrost komórek BaF3 eksprymujących receptor zcytor17 i receptor OSMRbeta (zcytor17/OSMRbeta), podczas gdy komórki BaF3 eksprymujące tylko receptor zcytor17 i receptor WSX-1 (zcytor17/WSX-1) lub zawierające tylko receptor OSMRbeta, nie były stymulowane przez tę kondycjonowaną pożywkę.

Proliferację eksprymujących receptor zcytor17/WSX-1/OSMRbeta komórek BaF3 wystawionych na CM z selekcjonowanych CD3+, stymulowanych PMA/jonomycyną ludzkich obwodowych krwinek zidentyfikowano przez wizualny przegląd kultur i/lub przez test proliferacji. Wiele odpowiednich testów proliferacji jest znanych w dziedzinie i obejmują one testy na redukcję barwnika, takiego jak Alamar-Blue (AccuMed International, Inc. Westlake, Ohio), bromku 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ilo)-2,5-difenylotetrazoliowego (Mosman, J. Immunol. Meth. 65: 55-63,1983); 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ilo)-5-3-karboksymetoksyfenylo-2H-tetrazolium; wodorotlenku 2,3-bis{2-metoksy-4-nitro-5-sulfofenylo)-5-[(fenyloamino)karbonylo]-2H-tetrazoliowego; i chlorku cyjanoditolilotetrazoliowego (które są dostępne w handlu z Polysciences, Inc., Warrington, PA); testy procesu wywoływania mitozy, takie jak pomiar włączania ³H-tymidyny; testy wykluczania barwnika z użyciem, np. czerni naftalenowej lub błękitu trypanowego; wychwyt barwnika z użyciem diacetylofluoresceiny; i uwalnianie chromu, patrz, w ogólności, Freshney, Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, wyd. 3, Wiley-Liss, 1994, dołączane jako odnośnik literaturowy.

Bibliotekę cDNA wytworzono z selekcjonowanych CD3+, stymulowanych PMA i jonomycyną pierwszorzędowych ludzkich obwodowych krwinek. Bibliotekę cDNA z selekcjonowanych CD3+, Stymulowanych PMA i jonomycyną ludzkich obwodowych krwinek podzielono na pule zawierające wielokrotne cząsteczki cDNA i transfekowano do linii komórkowej gospodarza, np., komórek BHK 570 (ATCC numer dostępu 10314). Transfekowane komórki gospodarza hodowano w pożywce, która not zawierała egzogennych czynników wzrostu (np. 5% FBS) i kondycjonowaną pożywkę zebrano. Kondycjonowaną pożywkę testowano na zdolność do stymulowania proliferacji komórek BaF3 transfekowanych receptorami zcytor17, WSX-1 i OSMRbeta. Zidentyfikowano pule CDNA wytwarzające kondy12

PL 211 833 B1 cjonowaną pożywkę, która stymulowała komórki z receptorami BaF3/zcytor17/WSX-1/OSMRbeta. Ten zebrany plazmid cDNA poddano elektroporacji do E. coli. CDNA wydzielono z pojedynczych kolonii i transfekowane osobno do komórek BHK 570. Pozytywne klony zidentyfikowano przez pozytywny wynik w teście proliferacji receptorów BaF3/zcytor17/WSX-1/OSMRbeta i aktywność potwierdzono przez neutralizację proliferacji z użyciem rozpuszczalnego receptora zcytor17.

Pozytywny klon wydzielono i analiza sekwencji ujawniła, że sekwencja polinukleotydową zawarta w plazmidzie DNA była nowa. Sekwencja sygnału sekrecji była złożona z reszt aminokwasowych 1 (Met) do 23 (Ala), a dojrzały polipeptyd był złożony z reszt aminokwasowych 24 (Ser) do 164 (Thr) (jak pokazano na SEQ ID NO: 2). Dalsza analiza N-terminalnego sekwencjonowania oczyszczonego zcytor17lig z komórek 293T wykazała N-koniec na reszcie 27 (Leu), jak pokazano na SEQ ID NO: 2, z dojrzałym polipeptydem obejmującym reszty aminokwasowe 27 (Leu) do 164 (Thr) (jak pokazano na SEQ ID NO: 2).

W ogólności, cytokiny powinny mieć strukturę czterech helis alfa, z helisami A, C i D najważniejszymi dla oddziaływań ligand-receptor i są silnie zachowawcze pośród członków rodziny. Powołując się na sekwencję aminokwasową ludzkiego zcytor17lig pokazaną na SEQ ID NO: 2, wyrównanie sekwencji aminokwasowych ludzkiego zcytor17lig, ludzkiego IL-3 i ludzkiej cytokiny, przewiduje się, że helisa A zcytor17lig jest zdefiniowana resztami aminokwasowymi 38-52; helisa B resztami aminokwasowych 83-98; helisa C resztami aminokwasowych 104-117; i helisa D resztami aminokwasowych 137-152; jak pokazano na SEQ ID NO: 2. Analiza strukturalna sugeruje, że pętla A/B jest długa, pętla B/C jest krótka i pętla C/D jest długa. Ta struktura pętlowa daje organizacji helis góra-góra-dół-dół. W oparciu o strukturę wiązki czterech helis, zachowane reszty cysteinowe w zcytor17lig odpowiadają resztom aminokwasowym 72, 133 i 147 z SEQ ID NO: 2; i 74, 137 i 151 z SEQ ID NO: 11 opisanych w wynalazku. Spójne położenie cystein jest kolejnym potwierdzeniem struktury wiązki czterech helis. Również wysoce konserwatywna w zcytor17lig jest reszta Glu, jak pokazano na SEQ ID NO: 2 na reszcie 43.

Ponadto, przewidywana sekwencja aminokwasową mysiego zcytor17lig pokazuje 31% identyczności z przewidywanym ludzkim białkiem na całej długości sekwencji (SEQ ID NO: 2 i SEQ ID NO: 11). W oparciu o porównanie pomiędzy sekwencjami ludzkiego i mysiego zcytor17lig zachowawcze reszty znaleziono w regionach przewidywanych dla kodowania helis alfa C i D. Odpowiednie polinukleotydy kodujące regiony polipeptydów, domeny, motywy, reszty i sekwencje ludzkiego zcytor17lig opisane w wynalazku są takie, jak pokazano na SEQ ID NO: 1.

Chociaż helisa D jest względnie zachowawcza pomiędzy ludzkim i mysim zcytor17lig, helisa C jest najsilniej zachowawcza. Chociaż oba gatunki mają dominujące kwasowe aminokwasy w tym regionie, różnice można zaliczyć do specyficzności gatunkowej w interakcjach pomiędzy zcytor17lig i jego receptorem, gdzie zcytor17 zawiera monomeryczne, heterodimeryczne (np. zcytor17/OSMRbeta, WSX-1/OSMRbeta, zcytor17/WSX-1) lub multimeryczne (np. zcytor17/OSMRbeta/WSX-1) receptory. Pętla A/B i helisa B zcytor17lig są słabo zachowawcze i helisa C przez pętlę C/D do helisy D jest najsilniej zachowawcza pomiędzy gatunkami; konserwacja w tym regionie sugeruje, że jest on funkcjonalnie znaczący. Helisy D ludzkiego i mysiego zcytor17lig są również zachowawcze.

Związki antagonistyczne receptora zcytor17 można zaprojektować przez mutacje w helisie D zcytor17lig. Mogą one obejmować obcięcie białek z reszty Thr156 (SEQ ID NO: 2) lub zachowanie reszt nadających wiązanie ligandu z receptorem, lecz zmniejszających aktywność sygnalizacyjną.

Cytokiny z wiązką czterech helis są również pogrupowane według długości ich składowych helis. Postać „długohelisowa” cytokin ogólnie składa się z helis mających pomiędzy 24-30 reszt i obejmuje IL-6, rzęskowy czynnik neurotroficzny (CNTF), czynnik hamujący białaczkę (LIF) i ludzki hormon wzrostu (hGH). „Krótkohelisowe” formy cytokin ogólnie składają się z helis mających pomiędzy 18-21 reszt i obejmują IL-2, IL-4 i GM-CSF. Uważa się, że zcytor17lig jest nowym członkiem grupy cytokin w formie krótkiej helisy. Badania z użyciem CNTF i IL-6 wykazały, że helisa CNTF może być wymieniana na równoważną helisę w IL-6, nadając właściwości wiązania CTNF chimerze. Tak więc, wydaje się, że funkcjonalne domeny czterohelisowych cytokin są zdeterminowane na podstawie strukturalnej homologii, niezależnie od identyczności sekwencji i może zachowywać funkcjonalną integralność w chimerze (Kallen i in., J. Biol. Chem. 274: 11859-11867,1999). Tak więc, domeny helikalne zcytor17lig będą przydatne do wytwarzania chimerycznych fuzyjnych cząsteczek, szczególnie z innymi krótkohelisowymi formami cytokin, dla określenia i modulowania specyficzności wiązania receptora. Szczególnie interesujące są fuzyjne białka wytworzone z helisą A i/lub helisą D i fuzyjne białka łącząPL 211 833 B1 ce helikalne i pętlowe domeny z innymi krótkimi cytokinami, takimi jak IL-2, IL-4, IL-15, Lif, IL-12, IL-3 i GM-CSF.

Sekwencję polinukleotydową ludzkiego IL-2 pokazano na SEQ ID NO: 161 i odpowiednią sekwencję aminokwasową pokazano na SEQ ID NO: 162. Sekwencja sygnału sekrecji była złożona z reszt aminokwasowych 1 (Met) do 20 (Ser) SEQ ID NO: 162; nukleotydy 48 do 107 z SEQ ID NO: 161. Dojrzały polipeptyd był złożony z reszt aminokwasowych 21 (Ala) do 156 (Thr) SEQ ID NO: 162; nukleotydy 108 do 515 z SEQ ID NO: 161. Helisa A ludzkiego IL-2 była złożona z reszt aminokwasowych 27 (Thr) do 48 (Leu) SEQ ID NO: 162; nukleotydy 126 do 191 SEQ ID NO: 161. Helisa B ludzkiego IL-2 obejmuje helisę B1 i helisę B2. Helisa B1 ludzkiego IL-2 była złożona z reszt aminokwasowych 73 (Ala) do 80 (Gin) SEQ ID NO: 162; nukleotydów 264 do 287 z SEQ ID NO: 161. Helisa B2 ludzkiego IL-2 była złożona z reszt aminokwasowych 83 (Glu) do 92 (Val) z SEQ ID NO: 162; nukleotydów 294 do 323 SEQ ID NO: 161. Tak więc, Helisa B (zawierająca helisy B1 i B2) IL-2 jest reprezentowana sekwencją aminokwasową SEQ ID NO: 168 (sekwencja nukleotydową SEQ ID NO: 167), gdzie reszty aminokwasowe 9 i 10 mogą być dowolnymi aminokwasami. SEQ ID NO: 168 jest identyczna z aminokwasami 73 (Ala) do 92 (Val) z SEQ ID NO: 162 w której aminokwasami 81 i 82 są dowolne aminokwasy. W korzystnej postaci. Helisa B IL-2 obejmuje aminokwasy 73 (Ala) do 92 (Val) z SEQ ID NO: 162; nukleotydy 264 do 323 z SEQ ID NO: 161. Helisa C ludzkiego IL-2 była złożona z reszt aminokwasowych 102 (His) do 116 (Val) z SEQ ID NO: 162 nukleotydów 351 do 395 z SEQ ID NO: 161. Helisa D ludzkiego IL-2 była złożona z reszt aminokwasowych 134 (Thr) do 149 (Gin) z SEQ ID NO: 162; nukleotydów 447 do 494 z SEQ ID NO: 161.

Sekwencję polinukleotydową ludzkiego IL-4 pokazano na SEQ ID NO: 163 i odpowiednią sekwencję aminokwasową pokazano na SEQ ID NO: 164. Sekwencja sygnału sekrecji była złożona z reszt aminokwasowych 1 (Met) do 24 (Gly) z SEQ ID NO: 164; nukleotydów 64 do 135 z SEQ ID NO: 163. Dojrzały polipeptyd obejmuje reszty aminokwasowe 25 (His) do 153 (Ser) z SEQ ID NO: 164; nukleotydy 136 do 522 z SEQ ID NO: 163. Helisa A ludzkiego IL-4 była złożona z reszt aminokwasowych 30 (Thr) do 42 (Thr) z SEQ ID NO: 164; nukleotydów 151 do 189 z SEQ ID NO: 163. Helisa B ludzkiego IL-4 była złożona z reszt aminokwasowych 65 (Glu) do 83 (His) z SEQ ID NO: 164; nukleotydów 256 do 312 z SEQ ID NO: 163. Helisa C ludzkiego IL-4 była złożona z reszt aminokwasowych 94 (Ala) do 118 (Ala) z SEQ ID NO: 164; nukleotydów 343 do 417 z SEQ ID NO: 163. Helisa D ludzkiego IL-4 była złożona z reszt aminokwasowych 133 (Leu) do 151 (Cys) z SEQ ID NO: 164; nukleotydów 460 do 516 z SEQ ID NO: 163.

Sekwencję polinukleotydową ludzkiego GM-CSF pokazano na SEQ ID NO: 165 i odpowiednią sekwencję aminokwasową pokazano na SEQ ID NO: 166. Sekwencja sygnału sekrecji była złożona z reszt aminokwasowych 1 (Met) do 17 (Ser) z SEQ ID NO: 166; nukleotydów 9 do 59 z SEQ ID NO: 165. Dojrzały polipeptyd był złożony z reszt aminokwasowych 18 (Ala) do 144 (Glu) z SEQ ID NO: 166; nukleotydów 60 do 440 z SEQ ID NO: 165. Helisa A ludzkiego GM-CSF była złożona z reszt aminokwasowych 30 (Trp) do 44 (Asn) z SEQ ID NO: 166; nukleotydów 96 do 140 z SEQ ID NO: 165. Helisa B ludzkiego GM-CSF była złożona z reszt aminokwasowych 72 (Leu) do 81 (Gin) z SEQ ID NO: 166; nukleotydów 222 do 251 z SEQ ID NO: 165. Helisa C ludzkiego GM-CSF była złożona z reszt aminokwasowych 85 (Gly) do 103 (Gin) z SEQ ID NO: 166; nukleotydów 261 do 317 z SEQ ID NO: 165. Helisa D ludzkiego GM-CSF była złożona z reszt aminokwasowych 120 (Phe) do 131 (Leu) z SEQ ID NO: 166; nukleotydów 366 do 401 z SEQ ID NO: 165.

Reszty aminokwasowe zawierające helisy A, B, C, i D, dla ludzkiego zcytor17lig, IL-3, IL-2, IL-4, i GM-CSF pokazano w tablicy 1.

T a b l i c a 1

	Helisa A	Helisa B	Helisa C	Helisa D
zcytor17lig	38-52	83-98	104-117	137-152	z SEQ ID NO: 2
IL-3	35-45	73-86	91-103	123-141	z SEQ ID NO: 102
IL-2	27-48	73-92	102-116	134-149	z SEQ ID NO: 162; lub helisa B jak opisano w SEQ ID NO: 168
IL-4	30-42	65-83	94-118	133-151	z SEQ ID NO: 164
GM-CSF	30-44	72-81	85-103	120-131	z SEQ ID NO: 166

PL 211 833 B1

Przedmiotem niniejszego wynalazku są cząsteczki polinukleotydowe, obejmujące cząsteczki DNA i RNA, które kodują polipeptydy zcytor17lig ujawnione w wynalazku. Specjaliści w dziedzinie łatwo zauważą, że w świetle degeneracji kodu genetycznego, możliwa jest znaczna zmienność sekwencji pośród tych cząsteczek polinukleotydowych. SEQ ID NO: 3 jest zdegenerowana sekwencją DNA, która obejmuje wszystkie DNA kodujące polipeptyd zcytor17lig, oraz jego fragmenty, z SEQ ID NO: 2. Specjaliści w dziedzinie zauważą, że zdegenerowana sekwencja z SEQ ID NO: 3 również dostarcza wszystkich sekwencji RNA kodujących SEQ ID NO: 2 przez użycie U zamiast T. Tak więc, polinukleotydy kodujące polipeptyd zcytor17lig zawierające nukleotyd 1 lub 70 do nukleotydu 492 z SEQ ID NO: 3 i ich równoważniki RNA bierze się pod uwagę w niniejszym wynalazku. Tablica 2 przedstawia jednoliterowe kody użyte w SEQ ID NO: 3 dla określenia pozycji zdegenerowanego nukleotydu. „Rozróżnienie” oznacza nukleotydy oznaczane kodową literą. „Komplement” wskazuje na kod komplementarnego (nukleotydów). Np. kod Y oznacza C lub T, a jego komplement R oznacza A lub G, z A komplementarną dla T i G komplementarną dla C.

T a b l i c a 2

Nukleotyd	Rozróżnienie	Komplement	Rozróżnienie
A	A	T	T
C	C	G	G
G	G	C	C
T	T	A	A
R	A|G	Y	C|T
Y	C|T	R	A|G
M	A|C	K	C|T
K	G|T	M	A|C
S	C|G	S	C|G
W	A|T	W	A|T
H	A|C|T	D	A|G|T
B	C|G|T	V	A|C|G
V	A|C|G	B	C|G|T
D	A|G|T	H	AlC|T
N	A|C|G|T	N	A|C|G|T

Zdegenerowane kodony użyte z SEQ ID NO: 3, obejmujące wszystkie możliwy kodony dla danego aminokwasu, przedstawiono w tablicy 3.

T a b l i c a 3

Aminokwas	Jednoliterowy kod	Kodony	Zdegenerowany kodon
1	2	3	4
Cys	C	TGC TGT	TGY
Ser	S	AGC AGT TCA TCC TCG TCT	WSN
Thr	T	AGA ACC ACG ACT	ACN
Pro	P	CCA CCC CCG CCT	CCN
Ala	A	GCAGCCGCGGCT	GCN
Gly	G	GGA GGC GGG GGT	GGN
Asn	N	AAC AAT	AAY
Asp	D	GAC GAT	GAY

PL 211 833 B1 cd tablicy 3

Glu	E	GAA GAG	GAR
Gin	Q	CAA CAG	CAR
His	H	CAC CAT	CAY
Arg	R	AGA AGG CGA CGC CGG CGT	MGN
Lys	K	AAAAAG	AAR
Met	M	ATG	ATG
Ile	I	ATA ATC ATT	ATH
Leu	L	CTA CTC CTG CTT TTA TTG	YTN
Val	V	GTA GTC GTG GTT	GTN
Phe	F	TTCTTT	TTY
Tyr	Y	TAC TAT	TAY
Trp	W	TGG	TGG
Ter		TAA TAG TGA	TRR
Asn|Asp	B		RAY
Glu|Gln	Z		SAR
Dowolny	X		NNN

Fachowiec w dziedzinie zauważy, że pewna dwuznaczność pojawia się w określaniu zdegenerowanego kodonu, reprezentatywnego dla wszystkich możliwych kodonów kodujących każdy aminokwas. Np. zdegenerowany kodon dla seryny (WSN) może, w pewnych okolicznościach, kodować argininę (AGR) i zdegenerowany kodon dla argininy (MGN) może, w pewnych okolicznościach, kodować serynę (AGY). Podobna zależność istnieje pomiędzy kodonami kodującymi fenyloalaninę i leucynę. Tak więc, pewne polinukleotydy obejmowane zdegenerowana sekwencją mogą kodować wariant sekwencji aminokwasowych, lecz fachowiec w dziedzinie może łatwo zidentyfikować takie wariantowe sekwencje przez odniesienie do sekwencji aminokwasowej z SEQ ID NO: 2. Wariantowe sekwencje mogą być łatwo testowane na funkcjonalność, jak opisano niniejszym.

Fachowiec w dziedzinie również zauważy, że różne gatunki mogą wykazywać „preferowane użycie kodonów”. W ogólności, patrz Grantham i in., Nuc. Acids Res. 8: 1893-912, 1980; Haas, i in. Curr. Biol. 6: 315-24, 1996; Wain-Hobson, i in., Gene 13: 355-64, 1981; Grosjean i Fiers, Gene 18: 199-209, 1982; Holm, Nuc. Acids Res. 14: 3075-87, 1986; Ikemura, J. Mol. Biol. 158: 573-97, 1982. W niniejszym wynalazku, termin „preferowane uż ycie kodonów” lub „preferowane kodony” jest terminem z dziedziny odnoszącym się do translacji kodonów białek najczęściej używanych w komórkach pewnego gatunku, tak więc sprzyjających jednemu lub kilku przedstawicielom możliwych kodonów kodujących każdy aminokwas (patrz tablica 3). Np. aminokwas treonina (Thr) może być kodowany przez ACA, ACC, ACG lub ACT, lecz w komórkach ssaka ACC jest najczęściej używanym kodonem; w innych gatunkach, np. komórkach owadzich, droż dż y, wirusach lub bakteriach, mogą być preferowane inne kodony Thr. Preferowane kodony dla konkretnego gatunku można wprowadzić do polinukleotydów według niniejszego wynalazku wieloma sposobami znanymi w dziedzinie. Wprowadzenie preferowanych sekwencji kodonowych do rekombinacyjnego DNA może, np. polepszyć wytwarzanie białka powodując bardziej wydajną translację białka w konkretnym typie komórki lub gatunku. Tak więc, zdegenerowana sekwencja kodonowa ujawniona w SEQ ID NO: 3 służy jako wzorzec dla optymalizacji ekspresji polinukleotydów w różnych typach komórek i gatunkach zwykle stosowanych w dziedzinie i ujawnionych w wynalazku. Sekwencje zawierające preferowane kodony można testować i optymalizować dla ekspresji w różnych gatunkach i testować na funkcjonalność, jak ujawniono w wynalazku.

Jak zauważono poprzednio, wydzielone polinukleotydy według niniejszego wynalazku obejmują DNA i RNA. Sposoby wytwarzania DNA i RNA są dobrze znane w dziedzinie. W ogólności, RNA wydziela się z tkanki lub komórki wytwarzającej znaczne ilości RNA zcytor17lig. Takie tkanki i komórki są

PL 211 833 B1 identyfikowane przez hybrydyzację Northern (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 5201, 1980) lub przez selekcjonowanie kondycjonowanej pożywki od różnych typów komórek na aktywność na docelowej komórce lub tkance. Po zidentyfikowaniu aktywności wytwarzającej RNA komórki lub tkanki, całość RNA można wytworzyć z użyciem ekstrakcji izotiocyjanianem guanidyniowym, a następnie wydzielenie przez odwirowanie z gradientem CsCl (Chirgwin i in., Biochemistry 18: 52-94, 1979). Poli(A) + RNA wytwarza się z całkowitego RNA stosując sposób Aviva i Ledera (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 1408-12, 1972). Komplementarny DNA (cDNA) wytwarza się z poli(A) + RNA stosując znane sposoby. Alternatywnie, genomowy DNA można wydzielić. Polinukleotydy kodujące polipeptydy zcytor17lig są ponadto zidentyfikowane i wydzielone przez, np., hybrydyzację lub PCR.

Pełnej długości klon kodujący zcytor17lig można otrzymać przez procedury konwencjonalnego klonowania. Komplementarne klony DNA (cDNA) są korzystne, podczas gdy dla pewnych zastosowań (np., ekspresja w transgenicznych zwierzętach) może być korzystnie stosować genomowy klon lub modyfikować klon cDNA tak, aby obejmował co najmniej one genomowy intron. Sposoby wytwarzania cDNA i genomowych klonów są dobrze znane i mieszczą się w zakresie wiedzy fachowca w dziedzinie i obejmują zastosowanie sekwencji ujawnionych w wynalazku lub ich części, do sondowania lub rozruchu biblioteki. Biblioteki ekspresji można sondować przeciwciałami wobec fragmentów zcytor17lig, rozpuszczalnymi receptorami zawierającymi zcytor17 lub innymi specyficznymi partnerami wiązania.

Sekwencje polinukleotydowe zcytor17lig ujawnione w wynalazku można również stosować jako sondy lub startery do klonowania 5' nie kodujących regionów genu zcytor17lig. W świetle specyficznej dla tkanki ekspresji obserwowanej dla zcytor17lig ten region genowy powinien zapewnić uzyskanie krwiotwórczej i specyficznej dla limfocytów ekspresji. Elementy promotorowe z genu zcytor17lig można więc stosować do kierowania specyficznej dla tkanki ekspresji heterologicznych genów np. u transgenicznych zwierząt lub pacjentów leczonych terapią genową. Klonowanie flankujących 5' sekwencji również ułatwia wytwarzanie białek zcytor17lig przez „aktywację genu”, jak ujawniono w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5 641 670. Krótko, ekspresja endogennego genu zcytor17lig w komórce jest zmieniana przez wprowadzenie do miejsca zcytor17lig konstruktu DNA zawierającego co najmniej docelową sekwencję, sekwencję regulatora, ekson i nie sparowane miejsce donora składania. Docelową sekwencją jest 5' nie kodująca sekwencja zcytor17lig, która pozwala na homologiczną rekombinację konstruktu z endogennym miejscem zcytor17lig, dzięki czemu sekwencje w konstrukcie stają się operacyjnie powią zany z endogenną sekwencją kodują c ą zcytor17lig. W ten sposób, endogenny promotor zcytor17lig może być zastąpiony lub uzupełniony innymi regulacyjnymi sekwencjami dając polepszoną, specyficzną dla tkanki lub inaczej regulowaną ekspresję.

Niniejszy wynalazek dostarcza ponadto odpowiedniki polipeptydów i polinukleotydów z innych gatunków (ortologi). Te gatunki obejmują między innymi ssaki, ptaki, płazy, gady, ryby, owady i inne gatunki kręgowców i bezkręgowców. Szczególnie interesujące są polipeptydy zcytor17lig z innych gatunków ssaków, w tym, np., polipeptydy mysie, świńskie, owcze, wołowe, psie, kocie, końskie i innych naczelnych. Ortologi ludzkiego zcytor17lig można klonować stosując informacje i kompozycje dostarczane w niniejszym wynalazku w kombinacji z konwencjonalnymi technikami klonowania. Np. cDNA można klonować stosując mRNA otrzymany z tkanki lub komórki typu eksprymującego zcytor17lig, jak ujawniono w wynalazku. Odpowiednie źródła mRNA można zidentyfikować przez sondowanie hybrydyzacją Northern z sondami zaprojektowanymi z sekwencji ujawnionych w wynalazku. Następnie, wytwarza się bibliotekę z mRNA pozytywnych tkanek lub linii komórkowych. cDNA kodujący zcytor17lig można następnie wydzielić różnymi sposobami, takimi jak sondowanie kompletnym lub częściowym ludzkim cDNA lub jednym lub kilkoma zestawami zdegenerowanych sond opartych na ujawnionych sekwencjach. cDNA można również klonować stosując reakcje łańcuchowe polimerazy, lub PCR (Mullis, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 683 202), stosując startery zaprojektowane z reprezentatywnej ludzkiej sekwencji zcytor17lig ujawnionej w wynalazku. W dodatkowym sposobie, biblioteki cDNA można stosować do transformowania lub transfekowania komórek gospodarza i ekspresję tego cDNA można wykrywać przeciwciałem wobec polipeptydu zcytor17lig, badaniem wiązania lub testami aktywności. Podobne techniki można również stosować do izolowania klonów genomowych.

Sekwencję polinukleotydową dla mysiego ortologu zcytor17lig zidentyfikowano i pokazano na SEQ ID NO: 10 i SEQ ID NO: 90 i odpowiednią sekwencję aminokwasową pokazano na SEQ ID NO: 11 i SEQ ID NO: 91. Zdegenerowaną sekwencję polinukleotydową kodującą polipeptyd z SEQ ID NO: 11 pokazano na SEQ ID NO: 12. Dla mysiej sekwencji aminokwasowej cytokiny zcytor17lig przewiduje

PL 211 833 B1 się, że helisa A jest zdefiniowana resztami aminokwasowymi 38-52; helisa B resztami aminokwasowymi 85-98; helisa C resztami aminokwasowymi 104-118; i helisa D resztami aminokwasowymi 141157; jak pokazano na SEQ ID NO: 11 i SEQ ID NO: 91. Istnieje 31% identyczności pomiędzy mysimi i ludzkimi sekwencjami na całej długości sekwencji aminokwasowych (SEQ ID NO: 2 i SEQ ID NO: 11) zcytor17lig. Dojrzała sekwencja mysiego zcytor17lig próbnie rozpoczyna się na Met1, jak pokazano na SEQ ID NO: 11, co odpowiada Met1, jak pokazano na SEQ ID NO: 2, w ludzkiej sekwencji. Analiza tkanki ujawniła, że ekspresja mysiego zcytor17lig jest znajdowana w jądrach, mózgu, komórkach CD90+, komórkach stercza, gruczole ślinowym i skórze. Ponadto, analiza N-terminalnego sekwencjonowania oczyszczonego zcytor17lig z komórek 293T wykazała N-koniec na reszcie 31 (Ala), jak pokazano na SEQ ID NO: 11 i SEQ ID NO: 91, z dojrzałym polipeptydem obejmującym reszty aminokwasowe 31 (Ala) do 163 (Cys) (jak pokazano na SEQ ID NO: 11 i SEQ ID NO: 91).

Specjaliści w dziedzinie zauważą, że sekwencja ujawniona na SEQ ID NO: 1 oznacza pojedynczy allel ludzkiego zcytor17lig i że może zajść zmienność allelowa i alternatywne składanie. Allelowe warianty tej sekwencji można klonować przez sondowanie cDNA lub genomowej biblioteki od różnych osobników, zgodnie ze standardowymi procedurami. Allelowe warianty sekwencji DNA pokazanej na SEQ ID NO: 1, w tym te zawierające milczące mutacje i te, w których mutacje powodują zmiany sekwencji aminokwasowej, mieszczą się w zakresie niniejszego wynalazku, jak i białka, które są wariantami allelowymi z SEQ ID NO: 2. cDNA generowane z alternatywnie składanych mRNA, które zachowują właściwości polipeptydu zcytor17lig, są obejmowane zakresem niniejszego wynalazku, jak i polipeptydy kodowane przez takie cDNA i mRNA. Allelowe warianty i warianty składania tych sekwencji można klonować przez sondowanie cDNA lub genomowej biblioteki od różnych osobników lub tkanek zgodnie ze standardowymi procedurami znanymi w dziedzinie.

Niniejszy wynalazek dostarcza również reagentów, które znajdą zastosowanie w diagnostyce. Np. gen zcytor17lig, sondę zawierającą DNA lub RNA zcytor17lig lub ich podsekwencję, można stosować dla określania, czy gen zcytor17lig jest obecny na ludzkim chromosomie, takim jak chromosom 12, lub czy zaszła mutacja genu. Zcytor17lig jest umieszczony w regionie 12q24.31 chromosomu 12 (przykład 13). Wykrywalne aberacje chromosomowe na miejscu genu zcytor17lig obejmują między innymi aneuploidię, zmiany liczby kopii, utratę heterozygotyczności (LOH), translokacje, insercje, delecje, zmiany miejsc restrykcji i przegrupowania. Takie aberacje można wykrywać stosując polinukleotydy według niniejszego wynalazku i techniki genetyki molekularnej, takie jak analiza polimorfizmu długości fragmentu restrykcyjnego (RFLP), analiza krótkiego posobnego powtórzenia (STR) wykorzystująca techniki PCR i inne techniki analiza wiązania genetycznego znane w dziedzinie (Sambrook i in., ibid.; Ausubel et. al., ibid.; Marian, Chest 108: 255-65, 1995).

Dokładna wiedza o pozycji genu może być przydatna do wielu celów, w tym:

1) określenia, czy sekwencja jest częścią istniejącego kontygu i otrzymania dodatkowych otaczających genetycznych sekwencji w różnych formach, takich jak klony YAC, BAC lub cDNA;

2) dostarczenia możliwego genu kandydata dla dziedzicznej choroby, który wykaże powiązanie z tym samym obszarem chromosomowym; i

3) krzyżowe organizmy modelowe, takie jak mysie, które mogą pomóc w określaniu, jaką funkcję może mieć dany gen.

Specjalista w dziedzinie zauważy, że region 12q24 jest często zaangażowany w wielkie genomowe przegrupowania, w tym translokacje, delecje, inwersje i duplikacje, które są związane z różnymi rakami. Mitelman Database of Chromosomal Aberrations in Cancer, przy Cancer Genome Anatomy Project, National Insitutes of Health, Bethesda, Md umieszczona w Internecie wymienia 199 przypadków raków z genomowymi przegrupowaniami angażującymi 12q24. Spośród nich, większość jest częścią kompleksowych kariotypów z innymi przegrupowaniami; jednakże, w pewnych przypadkach przegrupowanie obejmujące 12q24 jest jedyną genomową zmianą. Przy danej ekspresji receptora dla zcytor17lig w komórkach linii limfoidalnej i szpikowej, szczególnie ważna jest uwaga, że istnieją co najmniej 4 przypadki szpikowej białaczki opisane w literaturze, w których translokacja (2 przypadki: Yamagata i in., Cancer Genet Cytogenet 97: 90-93,1997; Dunphy i Batanian, Cancer Genet Cytogenet 114: 51-57, 1999) lub duplikacja (2 przypadki: Bonomi et al, Cancer Genet Cytogenet 108: 75-78,1999) są jedynymi genomowymi zmianami. To sugeruje, że gen lub geny rezydujące w 12q24 mogą być bezpośrednio zaangażowane w złośliwe transformacje komórek tych pacjentów. Nieodpowiednia nadekspresja zcytor17lig może dawać wkład do złośliwych transformacji przez sprzyjanie aberacyjnej proliferacji niosących receptor komórek, przez mechanizmy autokrynowe lub parakrynowe. Inhibicja aktywności zcytor17lig może tak więc hamować wzrost takich komórek. Alternatywnie,

PL 211 833 B1 przekształcenie genomowe powodujące dezaktywację genu zcytor17lig może sprzyjać złośliwej transformacji i/lub przerzutom przez usuwanie funkcji immunoregulacyjnych zcytor17lig. Istotnie, tłumiące gen przerzuty w raku stercza przemapowano na 12q24-qter (Ichikawa i in., Asian J. Androl. 2: 167-171, 2000). Jeśli zcytor17lig jest genem w tym regionie odpowiedzialnym za tłumienie przerzutów, następnie sam zcytor17lig może mieć wartość leczniczą w terapii raka.

Diagnosta może pomóc lekarzom w określaniu typu choroby i odpowiedniej związanej terapii lub pomocy w doradztwie genetycznym. Jako takie, przeciwciała, polinukleotydy i polipeptydy antizcytor17lig według wynalazku można stosować do detekcji polipeptydu zcytor17lig, mRNA lub przeciwciałami anty-zcytor17lig, tak więc, mogą służyć jako znaczniki i być bezpośrednio stosowane do wykrywania genetycznych chorób lub raków, jak opisano tutaj, stosując sposoby znane w dziedzinie i opisane w wynalazku. Ponadto, sondy z polinukleotydu zcytor17lig można stosować do wykrywania nienormalności lub genotypów związanych z delecjami i translokacjami chromosomu 12q24.3 związanymi z ludzkimi chorobami, lub innymi translokacj ami zaangażowanymi w złośliwe postępy nowotworów lub inne mutacje 12q24.3, które mogą być zaangażowane w chromosomowe przegrupowania w złośliwych nowotworach; lub w innych rakach.

Podobnie, sondę z polinukleotydu zcytor17lig można stosować do wykrywania nienormalności lub genotypów związanych z trisomią chromosomu 12 i utratą chromosomu związaną z ludzkimi chorobami lub spontaniczną aborcją. Tak więc, sondę z polinukleotydu zcytor17lig można stosować do wykrywania nienormalności lub genotypów związanych z tymi defektami.

Specjalista w dziedzinie zauważy, że sondy z polinukleotydu zcytor17lig są szczególnie przydatne do diagnozowania wielkich chromosomowych nienormalności związanych z utratą heterogeniczności (LOH), wzmocnienie chromosomu (np. trisomia), translokacja, wzmocnienie DNA i tym podobne. Translokacje w miejscu chromosomowym 12q24.3, w którym umieszczony jest gen zcytor17lig, są znane jako związane z chorobą ludzi. Np., delecje i translokacje, duplikacje i trisomia 12q24, są związane z rakami, jak omówiono wyżej. Tak więc, ponieważ gen zcytor17lig mapuje się na ten krytyczny region, sonda z polinukleotydu zcytor17lig według niniejszego wynalazku można stosować do wykrywania nienormalności lub genotypów związanych z translokacja, delecją i trisomią 12q24, i tym podobnymi, opisanymi powyżej.

Jak omówiono wyżej, defekty w samym genie zcytor17lig mogą powodować dziedziczne stany chorobowe ludzi. Cząsteczki według niniejszego wynalazku, takie jak polipeptydy, związki antagonistyczne, związki agonistyczne, polinukleotydy i przeciwciała według niniejszego wynalazku, pomogą w detekcji, diagnozie, zapobieganiu i leczeniu związanego z zcytor17lig genetycznego defektu. Ponadto, sondę z polinukleotydu zcytor17lig można stosować do wykrywania allelowych różnic pomiędzy chorymi i zdrowymi osobnikami na poziomie miejsca chromosomowego zcytor17lig. Jako takie, sekwencje zcytor17lig można stosować jako diagnostyki w profilowaniu DNA na potrzeby sądowe.

W ogólności, sposoby diagnozy użyte w analizie powiązań genetycznych, dla wykrywania genetycznych nienormalności lub aberacji u pacjenta, są znane w dziedzinie. Analityczne sondy będą miały ogólnie długość co najmniej 20 nt, chociaż można stosować raczej krótsze sondy (np. 14-17 nt). Startery PCR mają długość co najmniej 5 nt, korzystnie 15 lub więcej, korzystniej 20-30 nt. Dla zgrubnej analizy genów lub chromosomalnego DNA, sonda z polinukleotydu zcytor17lig może obejmować cały ekson lub więcej. Eksony łatwo określi specjalista w dziedzinie porównując sekwencje zcytor17lig (SEQ ID NO: 1) z genomowym DNA dla mysiego zcytor17lig (SEQ ID NO: 76). W ogólności, sposoby diagnozy użyte w analiza sprzężenia genetycznego, dla wykrywania genetycznych nienormalności lub aberacji u pacjenta, są znane w dziedzinie, większość diagnostycznych metod obejmuje etapy:

(a) otrzymania genetycznej próbki od potencjalnie chorego pacjenta, chorego pacjenta lub potencjalnie zdrowego nośnika recesywnego chorobowego allelu;

(b) wytworzenie produktu pierwszej reakcji przez inkubowanie genetycznej próbki z sondą z polinukleotydu zcytor17lig, gdzie polinukleotyd będzie hybrydyzował do komplementarnej sekwencji polinukleotydowej, tak jak w analizie RFLP lub przez inkubowanie genetycznej próbki z sensownymi i antysensownymi starterami w reakcji PCR w odpowiednich warunkach reakcjach PCR;

(iii) wizualizację produktu pierwszej reakcji metodą elektroforezy żelowej i/lub innymi znanymi sposobami, takimi jak wizualizacja produktu pierwszej reakcji z sondą polinukleotydową zcytor17lig, gdzie polinukleotyd będzie hybrydyzował z komplementarną sekwencją polinukleotydową z pierwszej reakcji; i (iv) porównanie zwizualizowanego produktu pierwszej reakcji z produktem drugiej kontrolnej reakcji genetycznej próbki od pacjenta dzikiego typu, albo normalnego lub kontrolnego osobnika.

PL 211 833 B1

Różnica pomiędzy produktem pierwszej reakcji i produktem kontrolnej reakcji wskazuje na genetyczną nienormalność u chorego lub potencjalnie chorego pacjenta, lub obecność heterozygotycznego recesywnego nośnikowego fenotypu dla nie chorego pacjenta, lub obecność genetycznego defektu w nowotworze od chorego pacjenta, lub obecności genetycznych nienormalności u płodu lub przedimplantacyjnego embrionu. Np., różnica w wzorze, długości restrykcyjnego fragmentu produktów PCR, długości powtarzalnej sekwencji przy miejscu genetycznym zcytor17lig i tym podobne, wskazują na genetyczne nienormalności, genetyczną aberację lub różnicę allelową w porównaniu z normalnymi próbkami kontrolnymi dzikiego typu. Próbki kontrolne mogą pochodzić od nie dotkniętych chorobą członków rodziny lub niespokrewnionych osobników, w zależności od testu i dostępności próbek.

Genetyczne próbki do stosowania w niniejszym wynalazku obejmują genomowy DNA, mRNA i cDNA wydzielone z dowolnych tkanek lub innych biologicznych próbek od pacjenta, które obejmują , między innymi, krew, ślinę, nasienie, komórki embrionalne, płyn owodniowy i tym podobne. Sonda polinukleotydowa lub starter może być RNA lub DNA i będzie obejmował część SEQ ID NO: 1, komplement SEQ ID NO: 1 lub ich równoważnik RNA. Takie sposoby pokazywania analizy sprzężenia genetycznego dla fenotypów ludzkich chorób są dobrze znane w dziedzinie. Źródła literaturowe dla opartych na PCR metod w diagnostyce, to ogólnie, Mathew (red.), Protocols in Human Molecular Genetics (Humana Press, Inc. 1991), White (red.), PCR Protocols: Current Methods and Applications (Humana Press, Inc. 1993), Cotter (red.), Molecular Diagnosis Of Cancer (Humana Press, Inc. 1996), Hanausek i Walaszek (red.), Tumor Marker Protocols (Humana Press, Inc. 1998), Lo (red.), Clinical Applications of PCR (Humana Press, Inc. 1998) i Meltzer (red.), PCR in Bioanalysis (Humana Press, Inc. 1998).

Mutacje związane z miejscem zcytor17lig można wykrywać stosując cząsteczki kwasu nukleinowego według niniejszego wynalazku przez wykorzystanie standardowych metod analizy bezpośrednich mutacji, takiej jak analizy polimorfizmu długości fragmentu restrykcyjnego, analiza krótkiego posobnego powtórzenia z użyciem technik PCR, analiza systemu wzmocnienie-refrakcyjna mutacja, detekcja polimorfizmu konformacji pojedynczych nici, metody rozcinania RNazy, elektroforeza żelowa z denaturują cym gradientem, wspomagana fluorescencją analiza niezgodności i inne techniki analizy genetycznej znane w dziedzinie (patrz np. Mathew (red.), Protocols in Human Molecular Genetics (Humana Press, Inc. 1991), Marian, Chest 108: 255 (1995), Coleman i Tsongalis, Molecular Diagnostics (Human Press, Inc. 1996), Elles (red.) Molecular Diagnosis of Genetic Diseases (Humana Press, Inc. 1996), Landegren (red.), Laboratory Protocols for Mutation Detection (Oxford University Press 1996), Birren i in. (red.), Genome Analysis, tom 2: Detecting Genes (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1998), Dracopoli i in. (red.), Current Protocols in Human Genetics (John Wiley & Sons 1998) i Richards i Ward, „Molecular Diagnostic Testing”, w Principles of Molecular Medicine, str. 83-88 (Humana Press, Inc. 1998). Bezpośrednią analizę genu zcytor17lig dla mutacji można przeprowadzać stosując genomowy DNA osobnika. Metody wzmacniania genomowego DNA, otrzymanego np. z limfocytów obwodowej krwi, są dobrze znane specjalistom w dziedzinie (patrz np. Dracopoli i in. (red.), Current Protocols in Human Genetics, na str. 7.1.6 do 7.1.7 (John Wiley & Sons 1998)).

Pozycje intronów w mysim genie zcytor17lig określono przez identyfikację genomowych klonów, a nastę pnie analizę połączeń intron/ekson. Mysi genomowy DNA pokazano na SEQ ID NO: 76. W odniesieniu do SEQ ID NO: 76, trzy kodują ce eksony oddzielone intronaitii są oczywiste: pierwszy kodujący ekson leży pomiędzy kwasami nukleinowymi o numerach 1104-1119 z SEQ ID NO: 76, drugi ekson pomiędzy kwasami nukleinowymi o numerach 1300-1451 z SEQ ID NO: 76, i trzeci ekson pomiędzy kwasami nukleinowymi o numerach 2411-2998 z SEQ ID NO: 76.

W odmianach według wynalazku, wydzielone kodują ce zcytor17lig cząsteczki kwasu nukleinowego mogą hybrydyzować w ostrych warunkach z cząsteczkami kwasu nukleinowego mającymi sekwencję nukleotydową z SEQ ID NO: 1, z cząsteczkami kwasu nukleinowego mającymi sekwencję nukleotydową nukleotydów 28 do 519 z SEQ ID NO: 1 lub cząsteczkami kwasu nukleinowego mającymi sekwencję nukleotydową komplementarną do SEQ ID NO: 1. W ogólności, ostre warunki wybiera się jako około 5°C poniżej termicznej temperatury topnienia (Tm) dla określonej sekwencji przy zdefiniowanej sile jonowej i pH. Tm jest temperaturą (przy zdefiniowanej sile jonowej i pH), przy której 50% docelowej sekwencji hybrydyzuje z doskonale pasującą sondą.

Para cząsteczek kwasu nukleinowego, taka jak DNA-DNA, RNA-RNA i DNA-RNA, może hybrydyzować, jeśli sekwencje nukleotydowe mają pewien stopień komplementarności. Hybrydy mogą tolerować niedopasowane pary zasad w podwójnej helisie, lecz na stabilność hybrydu wpływa stopień niedopasowania. Tm niedopasowanego hybrydu spada o 1°C na każde 1-1,5% niedopasowania par

PL 211 833 B1 zasad. Zmienianie ostrości warunków hybrydyzacji pozwala na kontrolowanie stopnia niedopasowania, które będzie obecne w hybrydzie. Stopień ostrości wzrasta ze wzrostem temperatury hybrydyzacji i siła jonowa buforu hybrydyzacji spada.

W zakresie możliwości specjalisty w dziedzinie jest przystosowanie tych warunków do użycia z określonym polinukleotydowym hybrydem. Tm dla określonej docelowej sekwencji jest temperaturą (w zdefiniowanych warunkach), przy której 50% docelowej sekwencji hybrydyzuje z doskonale pasującą sekwencją sondy. Te warunki, które wpływają na Tm, obejmują rozmiary i zawartość par zasad sondy polinukleotydowej, siłę jonową roztworu hybrydyzacji oraz obecność środków destabilizujących w roztworze hybrydyzacji. Liczne równania obliczania Tm są znane w dziedzinie i są specyficzne dla DNA, RNA i hybrydów DNA-RNA oraz polinukleotydowych sekwencji sond o różnej długości (patrz np. Sambrook i in., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, wyd. 2 (Cold Spring Harbor Press 1989); Ausubel i in. (red.), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley i Sons, Inc. 1987); Berger i Kimmel (red.), Guide to Molecular Cloning Techniques, (Academic Press, Inc. 1987); i Wetmur, Crit. Rev. Blochem. Mol. Biol. 26: 227 (1990)). Oprogramowanie do analizy sekwencji, takie jak OLIGO 6.0 (LSR; Long Lake, MN) i Primer Premier 4.0 (Premier Biosoft International; Palo Alto, CA), jak też witryny w Internecie, są dostępnymi narzędziami do analizy danej sekwencji i obliczania Tm w oparciu o zdefiniowane przez użytkownika kryteria. Takie programy mogą również analizować daną sekwencję w zdefiniowany warunkach i zidentyfikować odpowiednie sekwencje sondy. Typowo, hybrydyzację dłuższych sekwencji polinukleotydowych, > 50 par zasad, przeprowadza się w temperaturach około 20-25°C poniżej obliczonej Tm. Dla mniejszych sond, < 50 par zasad, hybrydyzację typowo prowadzi się przy Tm 5-10°C poniżej obliczonej Tm. To pozwala na maksimum szybkości hybrydyzacji dla hybrydów DNA-DNA i DNA-RNA.

Po hybrydyzacji, cząsteczki kwasu nukleinowego można przemyć dla usunięcia niezhybrydyzowanych cząsteczek kwasu nukleinowego w ostrych warunkach lub w bardzo ostrych warunkach. Typowe ostre warunki przemywania obejmują przemywanie w roztworze 0,5 x-2 x SSC 0,1% dodecylosiarczanu sodu (SDS) w temperaturze 55-65°C. To jest, cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące wariant polipeptydu zcytor17lig hybrydyzują z cząsteczką kwasu nukleinowego mającą sekwencję nukleotydową SEQ ID NO: 1 (lub jej komplement) w ostrych warunkach przemywania, gdzie ostrość przemywania jest równoważna 0,5 x-2 x SSC z 0,1% SDS w temperaturze 55-65°C, w tym 0,5 x SSC z 0,1% SDS w temperaturze 55°C lub 2 x SSC z 0,1% SDS w temperaturze 65°C. Specjalista w dziedzinie może łatwo ustalić równoważne warunki, np. przez użycie SSPE zamiast SSC w roztworze myjącym.

Typowe wysoce ostre warunki przemywania obejmują przemywanie w roztworze 0,1 x-0,2 x SSC z 0,1% dodecylosiarczanu sodu (SDS) w temperaturze 50-65°C. Innymi słowy, cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące wariant polipeptydu zcytor17lig hybrydyzują z cząsteczką kwasu nukleinowego mającą sekwencję nukleotydową z SEQ ID NO: 1 (lub jej komplement) w wysoce ostrych warunkach przemywania, gdzie ostrość przemywania jest równoważna 0,1 x-0,2 x SSC z 0,1% SDS w temperaturze 50-65°C, w tym 0,1 x SSC z 0,1% SDS w temperaturze 50°C lub 0,2 x SSC z 0,1% SDS w temperaturze 65°C.

Niniejszy wynalazek również dostarcza wydzielone polipeptydy zcytor17lig, które mają zasadniczo podobną identyczność sekwencji z polipeptydami z SEQ ID NO: 2 lub ich ortologami. Termin „zasadniczo podobna identyczność sekwencji” stosuje się w wynalazku dla określenia polipeptydów mających co najmniej 70%, co najmniej 80%, co najmniej 90%, co najmniej 95%, co najmniej 96%, co najmniej 97%, co najmniej 98%, co najmniej 99% lub ponad 99% identyczności sekwencji z sekwencjami pokazanymi na SEQ ID NO: 2, lub ich ortologami. Niniejszy wynalazek obejmuje również polipeptydy, które obejmują sekwencję aminokwasową mającą co najmniej 70%, co najmniej 80%, co najmniej 90%, co najmniej 95%, co najmniej 96%, co najmniej 97%, co najmniej 98%, co najmniej 99% lub ponad 99% identyczności sekwencji z sekwencją z reszt aminokwasowych 1 do 162 lub 33 do 162 z SEQ ID NO: 2. Niniejszy wynalazek ponadto obejmuje cząsteczki kwasu nukleinowego, które kodują takie polipeptydy. Sposoby określania procentowej identyczności są opisane poniżej.

Niniejszy wynalazek również uwzględnia wariantowe cząsteczki kwasu nukleinowego zcytor17lig, które można zidentyfikować stosując dwa kryteria: określenie podobieństwa pomiędzy kodowanym polipeptydem z sekwencją aminokwasową z SEQ ID NO: 2 i/lub test hybrydyzacji, jak opisano wyżej. Takie warianty zcytor17lig obejmują cząsteczki kwasu nukleinowego:

(1) które hybrydyzują z cząsteczką kwasu nukleinowego mającą sekwencję nukleotydową z SEQ ID NO: 1 (lub jej komplement) w ostrych warunkach przemywania, gdzie ostrość przemywania jest równoważna 0,5 x-2 x SSC z 0,1% SDS w temperaturze 55-65°C; lub

PL 211 833 B1 (2) które kodują polipeptyd mający co najmniej 70%, co najmniej 80%, co najmniej 90%, co najmniej 95%, co najmniej 96%, co najmniej 97%, co najmniej 98%, co najmniej 99% lub ponad 99% identyczności z sekwencją aminokwasową z SEQ ID NO: 2.

Alternatywnie, warianty zcytor17lig można charakteryzować jako cząsteczki kwasu nukleinowego:

(1) które hybrydyzują z cząsteczką kwasu nukleinowego mającą sekwencję nukleotydową z SEQ ID NO: 1 (lub jej komplement) w wysoce ostrych warunkach przemywania, gdzie ostrość przemywania jest równoważna 0,1 x-0,2 x SSC z 0,1% SDS w temperaturze 50-65°C; i (2) które kodują polipeptyd mający co najmniej 70%, co najmniej 80%, co najmniej 90%, co najmniej 95%, co najmniej 96%, co najmniej 97%, co najmniej 98%, co najmniej 99% lub ponad 99% identyczności sekwencji z sekwencją aminokwasową z SEQ ID NO: 2.

Procent identyczności sekwencji określa się konwencjonalnymi sposobami, patrz, np. Altschul i in., Bull. Math. Bio. 48: 603 (1986) i Henikoff i Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 (1992). Krótko, dwie sekwencje aminokwasowe są wyrównywane dla optymalizacji ocen wyrównania stosując karę za otwarcie luki 10, karę za przedłużenie luki 1 i matrycę ocen „BLOSUM62” Henikoffa i Henikoffa (ibid.) jak pokazano w tablicy 4 (aminokwasy są opisane standardowymi jednoliterowymi kodami).

Łączna liczba identycznych dopasowań x 100 / [długość dłuższej sekwencji plus liczba luk wprowadzonych do dłuższej sekwencji dla wyrównania dwu sekwencji]

T a b l i c a 4

	A	R	N	D	C	Q	E	G	H	I	L	K	M	F	P	S	T	W	Y	V
A	4
R	-1	5
N	-2	0	6
D	-2	-2	1	6
C	0	-3	-3	-3	9
Q	-1	1	0	0	-3	5
E	-1	0	0	2	-4	2	5
G	0	-2	0	-1	-3	-2	-2	6
H	-2	0	1	-1	-3	0	0	-2	8
I	-1	-3	-3	-3	-1	-3	-3	-4	-3	4
L	-1	-2	-3	-4	-1	-2	-3	-4	-3	2	4
K	-1	2	0	-1	-3	1	1	-2	-1	-3	-2	5
M	-1	-1	-2	-3	-1	0	-2	-3	-2	1	2	-1	5
F	-2	-3	-3	-3	-2	-3	-3	-3	-1	0	0	-3	0	6
P	-1	-2	-2	-1	-3	-1	-1	-2	-2	-3	-3	-1	-2	-4	7
S	1	-1	1	0	-1	0	0	0	-1	-2	-2	0	-1	-2	-1	4
T	0	-1	0	-1	-1	-1	-1	-2	-2	-3	-2	-1	1	-2	-1	1	5
W	-3	-3	-4	-4	-2	-2	-3	-2	-2	-3	-2	-3	-1	1	-4	-3	-2	11
Y	-2	-2	-2	-3	-2	-1	-2	-3	2	-1	-1	-2	-1	3	-3	-2	-2	2	7
V	0	-3	-3	-3	-1	-2	-2	-3	-3	3	1	-2	1	-1	-2	-2	0	-3	-1	4

Specjaliści w dziedzinie zauważą, że istnieje wiele ustalonych algorytmów dostępnych dla wyrównania dwu sekwencji aminokwasowych. Algorytm poszukiwania podobieństwa „FASTA” Pearsona i Lipmana jest odpowiednim sposobem wyrównania białka dla badania poziomu identyczności wspólnego dla sekwencji aminokwasowej ujawnionej w wynalazku i sekwencji aminokwasowej próbnego wariantu zcytor17lig. Algorytm FASTA opisuje Pearson i Lipman, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988) i Pearson, Meth. Enzymol. 183: 63 (1990).

PL 211 833 B1

Krótko, FASTA najpierw charakteryzuje sekwencję podobieństwa przez identyfikację regionów wspólnych dla badanej sekwencji (np. SEQ ID NO: 2) i testowej sekwencji, która ma największą gęstość identyczności (jeśli zmienna ktup wynosi 1) lub pary identyczności (jeśli ktup = 2), bez rozważania konserwatywnych aminokwasowych podstawień, insercji lub delecji. Dziesięć regionów z największą gęstością identyczności ponadto jest przeliczanych przez porównanie podobieństwa wszystkich sparowanych aminokwasów stosując matrycę podstawienia aminokwasów i końce regionów „przycina się”, aby obejmowały tylko te reszty, które dają wkład do najwyższej oceny. Jeśli istnieje kilka regionów z ocenami ponad „wartość odcięcia” (obliczoną w określonym wzorze w oparciu o długość sekwencji i wartość ktup), następnie przycięte początkowe regiony bada się dla określenia, czy regiony można łączyć otrzymując przybliżone wyrównanie z lukami. Na koniec, najwyżej oceniane regiony dwu sekwencji aminokwasowych wyrównuje się stosując modyfikację algorytmu Needleman-Wunsch-Sellers (Needleman i Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 444 (1970); Sellers, SIAM J. Appl. Math. 26: 787 (1974)), która pozwala na insercje i delecje. Korzystnymi parametrami dla analizy FASTA są: ktup = 1, kara za otwarcie luki = 10, kara za przedłużenie luki = 1 i matryca podstawienia = BLOSUM62. Te parametry można wprowadzać do programu FASTA przez modyfikowanie pliku matrycy ocen („SMATRIX”), jak wyjaśniono w dodatku 2 Pearsona, Meth. Enzymol. 183: 63 (1990).

FASTA można również użyć dla określenia identyczności sekwencji cząsteczek kwasu nukleinowego stosując stosunek, jak ujawniono powyżej. Dla porównań sekwencja nukleotydowych, wartości ktup mogą się wahać pomiędzy jeden do sześciu, korzystnie od trzech do sześciu, najkorzystniej trzy, z innymi parametrami ustawionymi jako domyślne.

Wariantowe polipeptydy zcytor17lig lub polipeptydy z zasadniczo podobną identycznością sekwencji charakteryzują się jako mające jedno lub więcej podstawień, delecji lub addycji aminokwasowych. Te zmiany są korzystnie niewielkiej natury, to jest są konserwatywnymi aminokwasowymi podstawieniami (jak pokazano w tablicy 5 poniżej) i innymi podstawieniami, które nie wpływają znacząco na zwijanie lub aktywność polipeptydu; małymi delecjami, typowo jednego do około 30 aminokwasów; i wydł u ż eniami amino- lub karboksyterminalnymi, takimi jak aminoterminalna reszta metioninowa, mał y łączący peptyd mający do około 20-25 reszt lub marker powinowactwa. Tak więc, niniejszy wynalazek obejmuje polipeptydy mające od około 108 do 216 reszt aminokwasowych, które obejmują sekwencję, która jest co najmniej 70%, co najmniej 80%, co najmniej 90%, co najmniej 95%, co najmniej 96%, co najmniej 97%, co najmniej 98%, co najmniej 99% lub ponad 99% identyczna z odpowiednim regionem z SEQ ID NO: 2. Polipeptydy zawierające znaczniki powinowactwa mogą ponadto obejmować miejsce rozcinania proteolitycznego pomiędzy polipeptydem zcytor17lig i znacznikiem powinowactwa. Korzystnie takie miejsca obejmują miejsca rozcinania trombiny i miejsca rozcinania czynnika Xa.

T a b l i c a 5

Konserwatywne podstawienia aminokwasowe

Zasadowe:	arginina lizyna histydyna
Kwasowe:	kwas glutaminowy kwas asparaginowy
Polarne:	glutamina asparagina
Hydrofobowe:	leucyna izoleucyna walina
Aromatyczne:	fenyloalanina tryptofan tyrozyna
Małe:	glicyna alanina seryna treonina metionina

PL 211 833 B1

Można określić reszty aminokwasowych, które obejmują regiony lub domeny krytyczne dla zachowania strukturalnej integralności. W tych regionach można określić konkretne reszty, które będą bardziej lub mniej tolerancyjne na zmiany i zachowają ogólną trzeciorzędową strukturę cząsteczki. Sposoby analizowania struktury sekwencji obejmują między innymi wyrównanie wielu sekwencji z wysoką aminokwasową lub nukleotydową identycznością, skłonności do drugorzę dowej struktury, wzory binarne, komplementarne upakowanie i głębsze polarne oddziaływaniami (Barton, Current Opin. Struct. Biol. 5: 372-376, 1995 i Cordes i in., Current Opin. Struct. Biol. 6: 3-10, 1996). Ogólnie, przy projektowaniu modyfikacji cząsteczek lub identyfikacji specyficznych fragmentów, określeniu struktury będzie towarzyszyła ocena aktywności zmodyfikowanych cząsteczek.

Zmian w sekwencji aminokwasowej dokonuje się w polipeptydach zcytor17lig, aby zminimalizować zrywanie struktury wyższego rzędu znaczącej dla biologicznej aktywności. Np., gdy polipeptyd zcytor17lig obejmuje jedną lub więcej helis, zmiany w resztach aminokwasowych będzie się dokonywać tak, aby nie zerwać geometrii helisy i innych składników cząsteczki, gdzie zmiany w konformacji osłabiają pewne krytyczne funkcje, np., wiązanie cząsteczki do jej partnerów wiązania, np. helis A i D, reszt 43 (Glu), 44 (Glu) i 136 (Phe) z SEQ ID NO: 2. Wpływy zmian sekwencji aminokwasowej mogą być przewidywane dzięki, np., komputerowemu modelowaniu, jak ujawniono powyżej lub określono metodą analizy struktury kryształu (patrz np. Lapthorn i in., Nat. Struct. Biol. 2: 266-268, 1995). Inne techniki, które są dobrze znane w dziedzinie, porównują zwijanie wariantowego białka w standardową cząsteczkę (np. natywnego białka). Np. można wykonać porównanie cysteinowego wzoru w wariantowej i standardowej cząsteczce. Spektrometria masowa i chemiczne modyfikacje z użyciem redukcji i alkilowania dostarczają sposobów określania reszt cysteinowych, które są związane z wiązaniami dwusiarczkowymi lub są wolne od takich powiązań (Bean i in., Anal. Biochem. 201: 216-226, 1992; Gray, Protein Sci. 2: 1732-1748, 1993; i Patterson i in., Anal. Chem. 66: 3727-3732, 1994). Ogólnie sądzi się, że jeśli zmodyfikowana cząsteczka nie ma takiego samego wzoru cysteinowego jak standardowa cząsteczka, oddziałuje to na fałdowanie. Inną dobrze znaną i akceptowaną metodą pomiaru fałdowania jest kołowy dichroizm (CD). Pomiar i porównywanie widm CD generowanych przez zmodyfikowaną cząsteczkę i standardową cząsteczką są rutynowe (Johnson, Proteins 7: 205-214, 1990). Krystalografia jest inną dobrze znaną metodą analizy zwijania i struktury. Jądrowy rezonans magnetyczny (NMR), mapowanie peptydów przez trawienie i mapowanie epitopu są również znanymi sposobami analizy fałdowania i strukturalnych podobieństw pomiędzy białkami i polipeptydami (Schaanan i in.; Science 257: 961-964, 1992).

Można wytworzyć profil hydrofilowości Hoppa/Woodsa sekwencji białka zcytor17lig, jak pokazuje SEQ ID NO: 2 (Hopp i in., Proc. Natl. Acad. Sci. 78: 3824-3828, 1981; Hopp, J. Immun. Meth. 88: 1-18, 1986 i Triquier i in., Protein Engineering 11: 153-169, 1998). Profil opiera się na przesuwaniu sześcioresztowego okna. Ukryte reszty G, S, i T i odsłonięte reszty H, Y i W były ignorowane. Np. w ludzkim zcytor17lig, hydrofilowe regiony obejmują reszty aminokwasowe 54-59 z SEQ ID NO: 2, reszty aminokwasowe 129-134 z SEQ ID NO: 2, reszty aminokwasowe 53-58 z SEQ ID NO: 2, reszty aminokwasowe 35-40 z SEQ ID NO: 2, i reszty aminokwasowe 33-38 z SEQ ID NO: 2. Np. w mysim zcytor17lig, hydrofilowe regiony obejmują reszty aminokwasowe 34-39 z SEQ ID NO: 11, reszty aminokwasowe 46-51 z SEQ ID NO: 11, reszty aminokwasowe 131-136 z SEQ ID NO: 11, reszty aminokwasowe 158-163 z SEQ ID NO: 11 i reszty aminokwasowe 157-162 z SEQ ID NO: 11.

Specjaliści w dziedzinie zauważą, że hydrofilowość lub hydrofobowość będzie brana pod uwagę przy projektowaniu modyfikacji w sekwencji aminokwasowej polipeptydu zcytor17lig, aby nie zerwać ogólnego strukturalnego i biologicznego profilu. Szczególnie interesujące dla zastępowania są hydrofobowe reszty wybrane z grupy obejmującej Val, Leu i Ile lub grupa złożona z Met, Gly, Ser, Ala, Tyr i Trp. Np. reszty tolerują ce podstawienie mogą obejmować Val, Leu i Ile lub grupę złożoną z reszt Met, Gly, Ser, Ala, Tyr i Trp, jak pokazano w SEQ ID NO: 2. Zachowawcze reszty cysteinowe w pozycjach w SEQ ID NO: 2 i SEQ BD NO: 11, będą względnie nietolerancyjne na podstawienie.

O identycznoś ci podstawowych aminokwasów można również wnioskować z analizy podobieństwa sekwencji pomiędzy IL-3, Lif, IL12, IL-15, IL-2, IL-4 i GM-CSF z zcytor17lig. Stosując sposoby takie jak analiza „FASTA” opisana poprzednio, regiony wysokiego podobieństwa są identyfikowane w rodzinie biał ek i uż yte do analizowania sekwencji aminokwasowej dla zachowawczych regionów. Alternatywne podejście do identyfikowania wariantu polinukleotydu zcytor17lig na podstawie struktury to określanie, czy cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca potencjalny wariant genu zcytor17lig może hybrydyzować z cząsteczką kwasu nukleinowego mającą sekwencję nukleotydową SEQ ID NO: 1, jak omówiono wyżej.

PL 211 833 B1

Innymi sposobami identyfikowania podstawowych aminokwasów w polipeptydach według niniejszego wynalazku są procedury znane w dziedzinie, takie jak skierowana na miejsce mutageneza lub mutageneza ze skanowaniem alaniny (Cunningham i Wells, Science 244: 1081 (1989), Bass i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 4498 (1991) Coorabs i Corey, „Site-directed Mutagenesis and Protein Engineering”, w Proteins: Analysis and Design, Angeletti (red.), str. 259-311 (Academic Press, Inc. 1998)). W tej ostatniej technice, pojedyncze alaninowe mutacje wprowadza się na każdej reszcie w cząsteczce i powstałe zmutowane cząsteczki są testowane na biologiczną lub biochemiczną aktywność, jak ujawniono poniżej, dla zidentyfikowania reszt aminokwasowych, które są krytyczne dla aktywności cząsteczki, patrz również Hilton i in., J. Biol. Chem. 271: 4699 (1996).

Niniejszy wynalazek obejmuje również funkcjonalne fragmenty polipeptydów zcytor17lig i cząsteczek kwasu nukleinowego kodujących takie funkcjonalne fragmenty. „Funkcjonalny” zcytor17lig lub jego fragment, jak zdefiniowano w wynalazku, charakteryzuje się proliferacyjną lub różnicującą aktywnością, przez swoją zdolność do indukowania lub hamowania specjalizowanych funkcji komórki lub przez zdolność do wiązania się specyficznie z przeciwciałem anty-zcytor17lig lub przeciwciałem receptora zcytor17 albo receptorem lub heterodimerami zcytor17, WSX-1 lub OSMRbeta (np. zcytor17/WSX-1 lub zcytor17/0SMRbeta) lub multimerami (np. zcytor17/WSX-1/OSMRbeta) tych receptorów (rozpuszczalnych lub unieruchomionych). Jak opisano wyżej w wynalazku, zcytor17lig charakteryzuje się strukturą czterohelisowej wiązki zawierającą helisę A (reszty aminokwasowe 38-52), helisą B (reszty aminokwasowe 83-98), helisą C (reszty aminokwasowe 104-117) i helisą D (reszty aminokwasowe 137-152), jak pokazano na SEQ ID NO: 2. Tak więc, niniejszy wynalazek dostarcza ponadto fuzyjne białka obejmujące:

(a) cząsteczki polipeptydowe zawierające jedną lub większą liczbę helis opisanych powyżej; i (b) funkcjonalne fragmenty zawierające jeden lub większą liczbę tych helis. Inna część polipeptydu fuzyjnego białka może być wnoszona przez inną cytokinę z czterohelisową wiązką, taką jak IL-15, IL-2, IL-4 i GM-CSF, lub przez nie natywny i/lub nie spokrewniony sekrecyjny peptyd sygnałowy, który ułatwia sekrecję fuzyjnego białka.

Tak więc, przedmiotem niniejszego wynalazku są fuzyjne białka zawierające co najmniej cztery polipeptydy, gdzie porządek polipeptydów od końca N do końca C to: pierwszy polipeptyd, który obejmuje aminokwasy wybrane z grupy obejmującej:

(a) IL-2, helisa A, reszty aminokwasowe 27-48 z SEQ ID NO: 162;

(b) IL-3, helisa A, reszty aminokwasowe 35-45 z SEQ ID NO: 102;

(c) IL-4, helisa A, reszty aminokwasowe 30-42 z SEQ ID NO: 164;

(d) GM-CSF, helisa A, reszty aminokwasowe 30-44 z SEQ ID NO: 166; i (e) reszty aminokwasowe 38 do 52 z SEQ ID NO: 2.

Pierwszy przerywnik z 6-27 aminokwasów; i drugi polipeptyd, który obejmuje reszty aminokwasowe wybrane z grupy obejmującej:

(a) IL-2, helisa B, reszty aminokwasowe z SEQ ID NO: 168;

(b) IL-4, helisa B, reszty aminokwasowe 65-83 z SEQ ID NO: 164;

(c) IL-3, helisa B, reszty aminokwasowe 73-86 z SEQ ID NO: 102;

(d) GM-CSF, helisa B, reszty aminokwasowe 72-81 z SEQ ID NO: 166; i (e) reszty aminokwasowe 83-98 z SEQ ID NO: 2.

Drugi przerywnik z 5-11 reszt aminokwasowych; trzeci polipeptyd, który obejmuje sekwencję z reszt aminokwasowych wybranych z grupy obejmującej:

(a) IL-2, helisa C, reszty 102-116 z SEQ ID NO: 162;

(b) IL-4, helisa C, reszty 94-118 z SEQ ID NO: 164;

(c) IL-3, helisa C, reszty 91-103 z SEQ ID NO: 102;

(d) GM-CSF, helisa C, reszty 85-103 z SEQ ID NO: 166; i (e) reszty aminokwasowe 104-117 z SEQ ID NO: 2.

Trzeci przerywnik mający 3-29 reszt aminokwasowych; i czwarty polipeptyd, który obejmuje reszty aminokwasowe wybrane z grupy obejmującej:

(a) IL-2, helisa D, reszty aminokwasowe 134-149 z SEQ ID NO: 162;

(b) IL-3, helisa D, reszty aminokwasowe 123-141 z SEQ ID NO: 102;

(c) IL-4, helisa D, reszty aminokwasowe 133-151 z SEQ ID NO: 164;

(d) GM-CSF, helisa D, reszty aminokwasowe 120-131 z SEQ ID NO: 166; i (e) reszty aminokwasowe 137-152 z SEQ ID NO: 2, gdzie co najmniej jeden z czterech polipeptydów pochodzi z zcytor17lig.

PL 211 833 B1

W innych odmianach peptydy przerywnika będą wybrane spośród pętli A/B, B/C i C/D z zcytor17lig i IL-3, jak pokazano w tablicy 1.

Analizy rutynowej delecji cząsteczek kwasu nukleinowego można prowadzić otrzymując funkcjonalne fragmenty cząsteczek kwasu nukleinowego, które kodują polipeptyd zcytor17lig. Przykładowo, cząsteczki DNA mające sekwencję nukleotydową z SEQ ID NO: 1 lub jej fragmenty, można trawić nukleazą Bal31 otrzymując serię zagnieżdżonych delecji. Te fragmenty DNA wstawia się następnie do wektorów ekspresji w odpowiedniej ramce odczytu i eksprymowane polipeptydy wydziela się i testuje na aktywność zcytor17lig lub na zdolność do wiązania przeciwciał anty-zcytor17lig lub receptora zcytor17. Jedną z alternatyw do trawienia egzonukleazą jest zastosowanie skierowanej na oligonukleotyd mutagenezy dla wprowadzenia delecji lub kodonów stopu dla wskazania wytwarzania żądanego fragmentu zcytor17lig. Alternatywnie, konkretne fragmenty genu zcytor17lig można zsyntetyzować stosując reakcję łańcuchową polimerazy.

Standardowe sposoby identyfikacji funkcjonalnych domen są dobrze znane specjalistom w dziedzinie. Np. studia nad obcinaniem jednego lub obu koń ców interferonów podsumował Horisberger i Di Marco, Pharmac. Ther. 66: 507 (1995). Ponadto, standardowe techniki funkcjonalnej analizy białek opisuje np. Treuter i in., Molec. Gen. Genet. 240: 113 (1993); Content i in., „Expression and preliminary deletion analysis of the 42 kDa 2-SA synthetase induced by human interferon”, w Biological Interferon Systems, Proceedings of ISIR-TNO Meeting on Interferon Systems, Cantell (red.), str. 65-72 (Nijhoff 1987); Herschman, „The EGF Receptor”, w Control of Animal Cell Proliferation 1, Boynton i in., (red.) str. 169-199 (Academic Press 1985); Coumailleau i in., J. Biol. Chem. 270: 29270 (1995); Fukunaga i in., J. Biol. Chem. 270: 25291 (1995); Yamaguchi i in., Blochem. Pharmacol. 50: 1295 (1995); i Meisel i in., Plant Molec. Biol. 30: 1 (1996).

Można prowadzić i testować wielokrotne aminokwasowe podstawienia stosując znane sposoby mutagenezy i skriningu, takie jak ujawnione przez Reidhaara-Olsona i Sauera (Science 241: 53 (1988)) lub Bowie i Sauera (Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86: 2152 (1989)). Krótko, autorzy ujawniają sposoby równoczesnej randomizacji dwu lub większej liczby pozycji w polipeptydzie, wybierając funkcjonalny polipeptyd, a następnie sekwencjonowania mutagenizowanych polipeptydów dla określenia spektrum możliwych podstawień na każdej pozycji. Inne sposoby, które można stosować, obejmują wystawianie faga (np. Lowman i in., Blochem. 30: 10832 (1991), Ladner i in., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5 223 409, Huse, międzynarodowa publikacja nr WO 92/06204) i skierowana na region mutageneza (Derbyshire i in., Gene 46: 145 (1986), i Ner i in., DNA 7: 127, (1988)).

Warianty ujawnionych nukleotydowych i polipeptydowych sekwencji zcytor17lig można również generować przez tasowanie DNA, jak ujawnia Stemmer, Nature 370: 389 (1994), Stemmer, Proc. Natl Acad. Sci. USA 91: 10747 (1994), i międzynarodowa publikacja nr WO 97/20078. Krótko, wariant DNA cząsteczki generuje się przez in vitro homologiczną rekombinację metodą przypadkowej fragmentacji macierzystego DNA, a następnie zestawiane z użyciem PCR, co daje losowo wprowadzone punktowe mutacje. Tę technikę można zmodyfikować stosując rodzinę macierzystych cząsteczek DNA, taką jak warianty allelowe lub cząsteczki DNA z różnych gatunków, dla wprowadzenia dodatkowej zmienności do procesu. Selekcja lub skrining na żądaną aktywność, a następnie dodatkowe iteracje mutagenezy i test pozwala na szybką „ewolucję” sekwencji przez selekcję pożądanych mutacji z równoczesną selekcją odrzucającą szkodliwe zmiany.

Metody mutagenezy ujawnione w wynalazku można połączyć z wysokowydajnymi zautomatyzowanymi metodami skriningu dla wyrywania aktywności klonowanych, mutagenizowanych polipeptydów w komórkach gospodarza. Mutagenizowane cząsteczki DNA, które kodują biologicznie czynne polipeptydy, lub polipeptydy wiążące się z przeciwciałami anty-zcytor17lig lub rozpuszczalnym receptorem zcytor17, lub rozpuszczalnym WSX-1 lub rozpuszczalnym OSMR, lub hetero dimerami, lub multimerami tych rozpuszczalnych receptorów, jak opisano w wynalazku, można odzyskać z komórek gospodarza i szybko sekwencjonować stosując nowoczesny sprzęt. Te sposoby pozwalają na szybkie określenie istotności indywidualnych reszt aminokwasowych w danym polipeptydzie i można je zastosować do polipeptydów o nieznanej strukturze.

Ponadto, białka według niniejszego wynalazku (lub ich polipeptydowe fragmenty) można łączyć z innymi bioaktywnymi czą steczkami, szczególnie innymi cytokinami, otrzymują c wielofunkcyjne cząsteczki. Np., jedną lub większą liczbę helis z zcytor17lig można połączyć z innymi cytokinami dla polepszenia ich biologicznych właściwości lub wydajności wytwarzania.

Niniejszy wynalazek dostarcza więc serię nowych, hybrydowych cząsteczek, w których segment zawierający jeden lub większą liczbę helis zcytor17lig jest sklejany z innym polipeptydem. Fuzji ko26

PL 211 833 B1 rzystnie dokonuje się przez składanie na poziomie DNA dla umożliwienia ekspresji chimerycznych cząsteczek w systemach wytwarzania rekombinacyjnego. Powstałe cząsteczki testuje się następnie na takie właściwości jak polepszona rozpuszczalność, polepszona trwałość, przedłużony czas półtrwania klirensu, polepszone poziomy ekspresji i sekrecji oraz farmakodynamika. Takie hybrydowe cząsteczki mogą ponadto obejmować dodatkowe reszty aminokwasowe (np. linker polipeptydowy) pomiędzy składowymi białkami lub polipeptydami.

Nie występujące naturalnie aminokwasy obejmują, bez ograniczeń, trans-3-metyloprolinę, 2,4-metanoprolinę, cis-4-hydroksyprolinę, trans-4-hydroksyprolinę, N-metyloglicynę, allotreoninę, metylotreoninę, hydroksyetylocysteinę, hydroksyetylohomocysteinę, nitroglutaminę, homoglutaminę, kwas pipekolowy, kwas tiazolidynokarboksylowy, dehydroprolinę, 3- i 4-metyloprolinę, 3,3-dimetyloprolinę, t-leucynę, norwalinę, 2-azafenyloalaninę, 3-azafenyloalaninę, 4-azafenyloalaninę i 4-fluorofenyloalaninę. W dziedzinie znanych jest kilka sposobów włączania nie występujących naturalnie reszt aminokwasowych do białek. Np. można stosować system in vitro, w którym nonsensowne mutacje są tłumione z użyciem chemicznie amino-acylowanych supresorów tRNA. Sposoby syntezy aminokwasów i aminoacylowania tRNA są znane w dziedzinie. Transkrypcja i translacja plazmidów zawierają cych nonsensowne mutacje jest typowo prowadzona w bezkomórkowym systemie zawierającym ekstrakt E. coli S30 i dostępne w handlu enzymy i inne reagenty. Białka oczyszcza się metodą chromatografii, patrz, np. Robertson i in., J. Am. Chem. Soc. 113: 2722 (1991), Ellman i in., Methods Enzymol. 202: 301 (1991), Chung i in., Science 259: 806 (1993) i Chung i in., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90: 10145 (1993).

W drugim sposobie, translację prowadzi się w Xenopus oocytach przez mikrowstrzykiwanie zmutowanego mRNA i chemicznie aminoacylowanych supresorowych tRNA (Turcatti i in., J. Biol. Chem. 271: 19991 (1996)). W trzecim sposobie, komórki E. coli hoduje się pod nieobecność naturalnego aminokwasu, który musi być zastąpiony (np. fenyloalanina) i w obecności żądanego nie występującego naturalnie aminokwasu (aminokwasów) (np. 2-azafenyloalaniny, 3-azafenyloalaniny, 4-azafenyloalaniny lub 4-fluorofenyloalaniny). Nie występujący naturalnie aminokwas jest włączany w białko w miejsce jego naturalnego odpowiednika, patrz Koide i in., Biochem. 33: 7470 (1994).

Naturalnie występujące reszty aminokwasowe można przekształcić w nie występujące naturalnie gatunki przez chemiczną modyfikację in vitro. Chemiczna modyfikacja może być połączona ze skierowaną na miejsce mutagenezą dla dalszego rozszerzenia zakresu podstawień (Wynn i Richards, Protein Sci. 2: 395 (1993). Może być korzystne stabilizowanie zcytor17lig dla poszerzenia czasu półtrwania cząsteczki, szczególnie dla przedłużenia metabolicznej trwałości w stanie czynnym. Dla uzyskania dłuższego czasu półtrwania, cząsteczki zcytor17lig można chemicznie modyfikować stosując sposoby opisane w wynalazku. Traktowanie PEG jest jednym ze zwykle stosowanych sposobów, który, jak wykazano, zwiększa czas półtrwania osocza, zwiększa rozpuszczalność i zmniejsza antygenność i immunogenność (Nucci i in., Advanced Drug Delivery Reviews 6: 133-155, 1991 i Lu i in., Int. J. Peptide Protein Res. 43: 127-138,1994).

Ograniczoną liczbę nie konserwatywnych aminokwasów, aminokwasów, które nie są kodowane przez kod genetyczny, nie występujących naturalnie aminokwasów i nienaturalnych aminokwasów można stosować zamiast reszt aminokwasowych zcytor17lig.

Niniejszy wynalazek dostarcza również fragmenty polipeptydowe lub peptydy zawierające niosącą epitop część polipeptydu zcytor17lig opisanego w wynalazku. Takie fragmenty lub peptydy mogą obejmować „immunogenny epitop”, który jest częścią białka wywołującego reakcję przeciwciała, gdy całe białko stosuje się jako immunogen. Immunogenne niosące epitop peptydy można zidentyfikować stosując standardowe sposoby (patrz np. Geysen i in., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 81: 3998 (1983)).

W przeciwieństwie do tego, fragmenty polipeptydów lub peptydy mogą obejmować „antygenowy epitop”, który jest regionem cząsteczki białka, z którym może się specyficznie wiązać przeciwciało. Pewne epitopy składają się z liniowego lub sąsiadującego ciągu aminokwasów i antygenność takiego epitopu nie jest zrywana denaturującymi środkami. Wiadomo w dziedzinie, że względnie krótkie syntetyczne peptydy, które mogą naśladować epitopy białek, można stosować do stymulacji wytwarzania przeciwciał wobec białka (patrz np. Sutcliffe i in., Science 219: 660 (1983)). Odpowiednio, antygenowe niosące epitop peptydy i polipeptydy według niniejszego wynalazku są przydatne do wywoływania przeciwciał (np. neutralizujących przeciwciał) wiążących się z polipeptydami opisanymi w wynalazku. Profile hydrofilowości Hoppa/Woodsa można stosować dla określenia regionów, które mają największy antygenowy potencjał (Hopp i in., 1981, ibid. i Hopp, 1986, ibid.). Np. w ludzkim zcytor17lig, hydrofilowe regiony obejmują reszty aminokwasowe 54-59 z SEQ ID NO: 2, reszty aminokwasowe 129-134

PL 211 833 B1 z SEQ ID NO: 2, reszty aminokwasowe 53-58 z SEQ ID NO: 2, reszty aminokwasowe 35-40 z SEQ ID NO: 2 i reszty aminokwasowe 33-38 z SEQ ID NO: 2. Np. w mysim zcytor17lig, hydrofilowe regiony obejmują reszty aminokwasowe 34-39 z SEQ ID NO: 11, reszty aminokwasowe 46-51 z SEQ ID NO: 11, reszty aminokwasowe 131-136 z SEQ ID NO: 11, reszty aminokwasowe 158-163 z SEQ ID NO: 11 i reszty aminokwasowe 157-162 z SEQ ID NO: 11.

Antygenowe niosące epitop peptydy i polipeptydy korzystnie zawierają co najmniej cztery do dziesięciu aminokwasów, co najmniej dziesięć do czternastu aminokwasów lub około czternastu do około trzydziestu aminokwasów z SEQ ID NO: 2 lub SEQ ID NO: 11. Takie niosące epitop peptydy i polipeptydy można wytwarzać przez fragmentowanie polipeptydu zcytor17lig lub przez chemiczną syntezę peptydów, jak opisano niniejszym. Ponadto, epitopy można wybierać przez wystawianie faga z losowej biblioteki peptydów (patrz np. Lane i Stephen, Curr. Opin. Immunol. 5: 268 (1993); i Cortese i in., Curr. Opin. Biotechnol. 7: 616 (1996)). Standardowe sposoby na identyfikację epitopów i wytwarzanie przeciwciał z małych peptydów, które obejmują epitop, opisuje np. Mole, „Epitope Mapping”, w Methods in Molecular Biology, tom 10, Manson (red.), str. 105-116 (The Humana Press, Inc. 1992); Price, „Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies”, w Monoclonal Antibodies: Production, Engineering, and Clinical Application, Ritter i Ladyman (red.), str. 60-84 (Cambridge University Press 1995) i Coligan i in. (red.), Current Protocols in Immunology, str. 9.3.1-9.3.5 i str. 9.4.1-9.4.11 (John Wiley & Sons 1997).

Niezależnie od konkretnej sekwencji nukleotydowej wariantu polinukleotydu zcytor17lig, polinukleotyd koduje polipeptyd, który charakteryzuje się proliferacyjną lub różnicującą aktywnością, zdolnością do indukowania lub hamowania specjalizowanych funkcji komórek, lub zdolnością do wiązania specyficznie z przeciwciałem anty-zcytor17lig lub receptorem zcytor17. Konkretniej, wariantowe polinukleotydy zcytor17lig będą kodowały polipeptydy, które wykazują co najmniej 50% i korzystnie co najmniej 70%, co najmniej 80%, co najmniej 90%, co najmniej 95%, co najmniej 96%, co najmniej 97%, co najmniej 98%, co najmniej 99% lub ponad 99%, aktywności polipeptydu, jak pokazano na SEQ ID NO: 2.

Dla dowolnego polipeptydu zcytor17lig, w tym wariantów i fuzyjnych białek, fachowiec w dziedzinie może łatwo wygenerować w pełni zdegenerowaną sekwencję polinukleotydową kodującą ten wariant stosując informacje podane w tablicach 112 powyżej.

Niniejszy wynalazek ponadto dostarcza wiele innych polipeptydowych białek fuzyjnych (i pokrewnych multimerycznych białek zawierających jeden lub większą liczbę polipeptydowych fuzji). Np. polipeptyd zcytor17lig można wytwarzać jako fuzję z dimeryzującym białkiem, jak ujawniono w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5 155 027 i nr 5 567 584. Korzystne dimeryzujące białka w tym względzie obejmują domeny stałego regionu immunoglobuliny. Polipeptydowe fuzje immunoglobulina-zcytor17lig można eksprymować w genetycznie przetworzonych komórkach (z wytworzeniem licznych multimerycznych analogów zcytor17lig). Pomocnicze domeny można kondensować z polipeptydami zcytor17lig dla nakierowania ich na specyficzne komórki, tkanki lub makrocząsteczki. Np. polipeptyd lub białko zcytor17lig można nakierować na predeterminowany typ komórek przez fuzję polipeptydu zcytor17lig z ligandem, który specyficznie wiąże się z receptorem na powierzchni tej docelowej komórki. W ten sposób, polipeptydy i białka mogą być kierowane dla celów leczniczych lub diagnostycznych. Polipeptyd zcytor17lig można skondensować z dwoma lub większą liczbą ugrupowań, takich jak znacznik powinowactwa dla oczyszczania i docelowa domena. Fuzje polipeptydowe mogą również obejmować jeden lub większą liczbę miejsc rozcinania, szczególnie pomiędzy domenami, patrz Tuan i in., Connective Tissue Research 34: 1-9,1996.

Stosując sposoby omówione w wynalazku, fachowiec w dziedzinie może zidentyfikować i/lub wytworzyć wiele polipeptydów, które mają zasadniczo podobną identyczność sekwencji jak reszty 1-164 lub 24-164 z SEQ ID NO: 2 lub ich funkcjonalne fragmenty i fuzje, takie jak helisy A-D (reszty 38-152 z SEQ ID NO: 2) gdzie takie polipeptydy lub fragmenty, lub fuzje zachowują właściwości białka dzikiego typu, takie jak zdolność do stymulowania proliferacji, różnicowania, indukowania specjalizowanych funkcji komórki lub wiązania przeciwciał receptora zcytor17 lub zcytor17lig.

Polipeptydy zcytor17lig według niniejszego wynalazku, w tym pełnej długości polipeptydy, funkcjonalne fragmenty, i fuzyjne polipeptydy, można wytwarzać w genetycznie przetworzonych komórkach gospodarza zgodnie ze konwencjonalnymi technikami. Odpowiednie komórki gospodarza są takimi typami komórek, które można transformować lub transfekować egzogennym DNA i hodować w kulturze, i obejmują one bakterie, komórki grzybów i hodowane wyższe eukariotyczne komórki. Eukariotyczne komórki, szczególnie hodowane komórki wielokomórkowych organizmów, są korzystne.

PL 211 833 B1

Techniki manipulowania klonowanymi cząsteczkami DNA i wprowadzania egzogennego DNA do wielu komórek gospodarza ujawnia Sambrook i in., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, wyd. 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, i Ausubel i in., red., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987.

W ogólności, sekwencja DNA kodująca polipeptyd zcytor17lig może być operacyjnie powiązana z innymi genetycznymi elementami koniecznymi do jego ekspresji, ogólnie obejmującymi promotor i terminator transkrypcji, w wektorze ekspresji. Wektor będzie również zwykle zawierał jeden lub większą liczbę znaczników selekcyjnych i jeden lub większą liczbę początków replikacji, chociaż specjaliści w dziedzinie zauważą, że w pewnych systemach znaczniki selekcyjne mogą być dostarczane na odrębnych wektorach i replikacja egzogennego DNA może zachodzić przez integrację z genomem komórki gospodarza. Dobór promotorów, terminatorów, znaczników selekcyjnych, wektorów i innych elementów jest kwestą rutynowego projektowania mieszczącego się w zakresie zwykłej wiedzy w dziedzinie. Wiele takich elementów opisano w literaturze i są one dostępne w handlu.

Dla skierowania polipeptydu zcytor17lig na sekrecyjny szlak komórki gospodarza, sekwencja sygnału sekrecji (również znana jako sekwencja liderowa, sekwencja prepro lub presekwencja) jest umieszczana w wektorze ekspresji. Sekwencją sygnału sekrecji może być sekwencja zcytor17lig lub może ona pochodzić z innych wydzielanych białek (np. t-PA) lub być zsyntetyzowana de novo. Sekwencja sygnału sekrecji jest operacyjnie powiązana z sekwencją DNA zcytor17lig, to jest dwie sekwencje są połączone w poprawnej ramce odczytu i umieszczone tak, aby skierować nowo zsyntetyzowany polipeptyd na sekrecyjny szlak komórki gospodarz. Sekwencje sygnału sekrecyjnego są zwykle umieszczone w położeniu 5' względem sekwencji DNA kodujących dany polipeptyd, chociaż pewne sekwencje sygnału sekrecyjnego mogą być umieszczona gdzie indziej w danej sekwencji DNA (patrz np. Welch i in., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5 037 743; Holland i in., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5 143 830).

Alternatywnie, sekwencję sygnału sekrecji zawartą w polipeptydach według niniejszego wynalazku stosuje się dla skierowania innych polipeptydów na sekrecyjny szlak. Przedmiotem niniejszego wynalazku są takie fuzyjne polipeptydy. Można wytworzyć sygnałowy fuzyjny polipeptyd, w którym sekwencja sygnału sekrecji pochodząca z reszt aminokwasowych 1-23 z SEQ ID NO: 2 lub reszty 1-23 z SEQ ID NO: 11 jest operacyjnie powiązane z sekwencją DNA kodującą inny polipeptyd z użyciem sposobów znanych w dziedzinie i ujawnionych w wynalazku. Sekwencja sygnału sekrecji zawarta w fuzyjnych polipeptydach według niniejszego wynalazku jest korzystnie skondensowana aminoterminalnie z dodatkowym peptydem dla skierowania dodatkowego peptydu na szlak sekrecyjny. Takie konstrukty mają liczne zastosowania znane w dziedzinie. Np., te nowe fuzyjne konstrukty sekwencji sygnału sekrecji mogą kierować sekrecję czynnego składnika normalnie nie ulegającego sekrecji białka. Takie fuzje można stosować in vivo lub in vitro dla skierowania peptydów na szlak sekrecyjny.

Hodowane komórki ssaka są przydatnymi gospodarzami w niniejszym wynalazku. Sposoby wprowadzania egzogennych DNA do komórek gospodarza ssaka obejmują mediowaną fosforanem wapnia transfekcję (Wigier i in., Cell 14: 725,1978; Corsaro i Pearson, Somatic Cell Genetics 7: 603, 1981: Graham i Van der Eb, Virology 52: 456, 1973), elektroporacja (Neumann i in., EMBO J. 1: 841-5, 1982), transfekcja mediowaną DEAE-dekstranem (Ausubel i in., ibid.) i mediowana liposomem transfekcja (Hawley-Nelson i in., Focus 15: 73,1993; Ciccarone i in., Focus 15: 80,1993 oraz wirusowe wektory (Miller i Rosman, Bio-Techniques 7: 980-90,1989; Wang i Finer, Nature Med. 2: 714-6, 1996). Wytwarzanie rekombinacyjnych polipeptydów w hodowanych komórkach ssaka ujawnia, np., Levinson i in., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 713 339; Hagen i in., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 784 950; Palmiter i in., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 579 821; i Ringold, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 656 134. Odpowiednie hodowane komórki ssaka obejmują linie komórkowe COS-1 (ATCC nr CRL 1650), COS-7 (ATCC nr CRL 1651), BHK (ATCC nr CRL 1632), BHK 570 (ATCC nr CRL 10314), 293 (ATCC nr CRL 1573; Graham i in., J. Gen. Virol. 36: 59-72, 1977) i jajnika chińskiego chomika (np. CHO-K1; ATCC nr CCL 61). Dodatkowe odpowiednie linie komórkowe są znane w dziedzinie i dostępne z publicznych składnic, takich jak American Typ Culture Collection, Manassas, VA. W ogólności, korzystne są silne promotory transkrypcji, takie jak promotory z SV-40 lub cytomegalowirusa, patrz, np., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 956 288. Inne odpowiednie promotory obejmują promotory z genów metalotioneiny (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 579 821, 4 601 978) i główny późny promotor adenowirusa.

PL 211 833 B1

Selekcję lekiem ogólnie stosuje się dla wybrania hodowanych komórek ssaka, do których wstawiono obcy DNA. Takie komórki są zwykle określane jako „transfektanty”. Komórki, które hodowano w obecnoś ci ś rodka selekcyjnego i są zdolne do przekazania danego genu do swojego potomstwa, są określane jako „trwałe transfektanty”. Korzystnym markerem selekcyjnym jest gen kodujący oporność na antybiotyk neomycynę. Selekcję prowadzi się w obecności leku typu neomycyny, takiego jak G-418 lub tym podobne. Systemów selekcji można również użyć dla zwiększenia poziomów ekspresji danego genu, procesu określanego jako „wzmacnianie”. Wzmacnianie prowadzi się hodując transfektanty w obecności małych ilości środka selekcyjnego i następnie zwiększając ilość środka selekcyjnego dla wybrania komórek wytwarzających znacznie ilości produktów wprowadzonych genów. Korzystnym nadającym się do wzmacniania markerem selekcyjnym jest reduktaza dihydrofolanu, który nadaje oporność na metotreksat. Można również użyć innych genów oporności na lek (np. oporności na hygromycynę, oporności na wiele leków, acetylotransferazy puromycyny). Alternatywne znaczniki, które wprowadzają zmieniony fenotyp, takie jak białko zielonej fluorescencji, lub białka powierzchni komórki, takie jak CD4, CD8, MHC klasy I, zasadową fosfatazę łożyska, można stosować do oddzielania transfekowanych komórek od nietransfekowanych komórek takimi środkami, jak sortowanie FACS lub technika oddzielania magnetycznymi kulkami.

Inne wyższe eukariotyczne komórki można również stosować jako gospodarzy, w tym komórki roślinne, komórki owadzie i komórki ptasie. Zastosowanie Agrobacterium rhizogenes jako wektora dla ekspresji genów w komórkach roślin opisał Sinkar i in., J. Biosci. (Bangalore) 11: 47-58, 1987. Transformacja komórek owadzich i wytwarzanie w nich obcych polipeptydów ujawnił Guarino i in., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5 162 222 i publikacja WIPO nr WO 94/06463. Komórki owadzie można zakażać rekombinacyjnym bakulowirusem, zwykle pochodzącym z wirusa jądrowej polihedrozy Autographa californica (AcNPV), patrz King, L. A. i Possee, R. D., The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide, London, Chapman & Hall; O'Reilly, D. R. i in., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, New York, Oxford University Press., 1994; i red. Richardson, C. D., Baculovirus Expression Protocols. Methods in Molecular Biology, Totowa, NJ, Humana Press, 1995. Drugi sposób wytwarzania rekombinacyjnego bakulowirusa wykorzystuje oparty na transpozonach system opisany przez Luckowa (Luckow, V. A. i in., J. Virol. 67: 4566-79,1993). Taki system jest sprzedawany w zestawie Bac-to-Bac (Life Technologies, Rockville, MD). System wykorzystuje wektor przenoszenia, pFastBacl™ (Life Technologies) zawierający transpozon Tn7 dla przeniesienia DNA kodującego polipeptyd zcytor17lig do genomu bakulowirusa trzymanego w E. coli jako dużego plazmidu nazywanego „bakmidem”. Wektor przeniesienia PFastBacl™ wykorzystuje promotor polihedryny AcNPV dla napędzania ekspresji danego genu, w tym przypadku zcytor17lig. Jednakże, pFastBaclTM może być modyfikowany w znaczącym stopniu. Promotor polihedrynowy można usuwać i podstawiać podstawowym białkowym promotorem bakulowirusa (również znanym jako promotor Pcor, p6.9 lub MP), który jest eksprymowany wcześniej w infekcji bakulowirusowej i wykazano, że jest korzystny do ekspresji wydzielanych białek, patrz Hill-Perkins, M. S. i Possee, R. D., J. Gen. Virol. 71: 971-6, 1990; Bonning, B. C. i in., J. Gen. Virol. 75: 1551-6, 1994; i Chazenbalk, G. D., Rapoport, B., J. Biol. Chem. 270: 1543-9, 1995. W takich konstruktach wektora przeniesienia, można stosować krótką lub długą wersję podstawowego białkowego promotora. Ponadto, można konstruować wektory przeniesienia, które zastępują sekwencje natywnego sygnału sekrecyjnego zcytor17lig sekwencjami sygnału sekrecyjnego pochodzącymi z białek owadów. Np. sekwencja sygnału sekrecji z glukozylotransferazy ecdysterydu (EGT), melityny pszczół miodnych (Invitrogen, Carlsbad, CA) lub bakulowirusa gp67 (PharMingen, San Diego, CA) może stosować w konstruktach dla zastępowania natywnej sekwencji sygnału sekrecji zcytor17lig. Ponadto, wektory przeniesienia mogą obejmować fuzję w ramce z DNA kodującym znacznik epitopu na końcu C lub N eksprymowanego polipeptydu zcytor17lig, np. znacznik epitopu Glu-Glu (Grussenmeyer, T. i in., Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 7952-4, 1985). Stosując techniki znane w dziedzinie, wektor przeniesienia zawierający zcytor17lig transformuje się do E. coli i selekcjonuje na bakmidy, które zawierają przerwany gen lacZ wskazujący na rekombinacyjny bakulowirus. Bakmidowe DNA zawierające genom rekombinacyjnego bakulowirusa wydziela się, stosując zwykłe techniki, i stosuje do transfekowania komórek Spodoptera frugiperda, np. komórek Sf9. Z kolei wytwarza się rekombinacyjnego wirusa eksprymującego zcytor17lig. Zapas rekombinacyjnego wirusa wytwarza się sposobami zwykle stosowanymi w dziedzinie.

Rekombinacyjny wirus jest stosowany do infekowania komórek gospodarza, typowo linii komórkowej pochodzącej z owada o amerykańskiej nazwie zwyczajowej fali armyworm, Spodoptera frugiperda, patrz, ogólnie, Glick i Pasternak, Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Re30

PL 211 833 B1 combinant DNA, ASM Press, Washington, D. C. 1994. Inną odpowiednią linią komórkową jest linia komórek High FiveO™ (Invitrogen) pochodząca z Trichoplusia ni (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5 300 435).

Komórki grzybów, w tym komórki drożdży, można również stosować w niniejszym wynalazku. Gatunki drożdży szczególnie interesujące w tym sensie obejmują Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris i Pichia metanolica. Sposoby transformowania komórek S. cerevisiae egzogennym DNA i wytwarzania z nich rekombinacyjnych polipeptydów ujawnia np. Kawasaki, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 599 311; Kawasaki i in., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 931 373; Brake, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 870 008; Welch i in., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5 037 743; i Murray i in., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 845 075. Transformowane komórki są wybierane według fenotypu zdeterminowanego przez marker selekcyjny, zwykle oporność na lek lub zdolność do wzrostu pod nieobecność konkretnego środka odżywczego (np. leucyny). Korzystny systemem wektora do stosowania w Saccharomyces cerevisiae jest POT7 system wektorów ujawniony przez Kawasaki i in. (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 931 373), który pozwala na dobór transformowanych komórek przez wzrost w zawierającej glukozę pożywce.

Odpowiednie promotory i terminatory do stosowania w drożdżach obejmują te z genów enzymu glikolitycznego (patrz np. Kawasaki, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 59 9311; Kingsman i in., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 615 974; i Bitter, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 977 092) i geny dehydrogenazy alkoholowej, patrz również w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 990 446; 5 063 154; 5 139 936 i 4 661 454. Systemy transformacji dla innych drożdży, w tym Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Ustilago maydis, Pichia pastors, Pichia metanolica, Pichia guillermondii i Candida maltosa są znane w dziedzinie, patrz np. Gleeson i in., J. Gen. Microbiol. 132: 3459-65, 1986 i Cregg, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 882 279. Komórki Aspergillus można stosować zgodnie ze sposobami McKnighta i in., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 935 349. Sposoby transformowania Acremonium chrysogenum są ujawnione przez Sumino i in., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5 162 228. Sposoby transformowania Neurospora są ujawnione przez Lambowitza, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 486 533.

Zastosowanie Pichia metanolica jako gospodarza do wytwarzania rekombinacyjnych białek ujawniono w publikacji WIPO nr WO 97/17450, WO 97/17451, WO 98/02536 i WO 98/02565. Cząsteczki DNA do stosowania w transformowaniu P. metanolica będą zwykle wytwarzane jako dwuniciowe, kołowe plazmidy, które są korzystnie linearyzowane przed transformacją. Dla wytwarzania polipeptydu w P. metanolica, korzystnie jest, aby promotor i terminator w plazmidzie pochodziły z genu P. metanolica, tak jak gen utylizacji alkoholu P. metanolica (AUG1 lub AUG2). Inne przydatne promotory obejmują geny syntazy dihydroksyacetonu (DHAS), dehydrogenazy mrówczanu (FMD) i katalazy (CAT). Dla ułatwienia integracji z DNA z chromosomami gospodarza, korzystnie jest mieć cały segment ekspresji plazmidu flankowane na obu końcach przez sekwencje DNA gospodarza. Korzystnym markerem selekcyjnym do stosowania w Pichia metanolica jest gen P. metanolica ADE2, który koduje karboksylazę fosforybozylo-5-aminoimidazolu (AIRC; EC 4.1.1.21), który pozwala na wzrost komórek gospodarza ade2 pod nieobecność adeniny. W dużej skali przemysłowych procesach, w których jest pożądane zminimalizowanie stosowania metanolu, korzystne jest stosowanie komórek gospodarza, w których wycię te są oba geny utylizacji alkoholu (AUG1 i AUG2). Dla wytwarzania wydzielanych białek, korzystne są komórki gospodarza bez wodniczkowych genów proteazy (PEP4 i PRO1). Elektroporację stosuje się dla ułatwiania wprowadzania plazmidu zawierającego DNA kodujący dany polipeptyd do komórek P. metanolica. Korzystnie jest transformować komórki P. metanolica przez elektroporację z uż yciem wykładniczo zanikającego, pulsacyjnego elektrycznego pola o sile od 2,5 do 4,5 kV/cm, korzystnie około 3,75 kV/cm i stałej czasowej (Q) od 1 do 40 ms, najkorzystniej około 20 ms.

Prokariotyczne komórki gospodarzy, w tym szczepy bakterii Escherichia coli, Bacillus i innych rodzajów są również przydatnymi komórkami gospodarza w niniejszym wynalazku. Techniki transformowania tych gospodarzy i ekspresji obcych sekwencji DNA klonowanych tam są dobrze znane w dziedzinie (patrz np. Sambrook i in., ibid.). Przy ekspresji polipeptydu zcytor17lig w bakterii takiej jako E. coli, polipeptyd może być zachowywany w cytoplazmie, typowo jako nierozpuszczalne granulki, lub mogą być kierowane do przestrzeni okołoplazmatycznej przez sekwencja bakteryjnej sekrecji. W tym ostatnim przypadku, komórki ulegają lizie, i granulki są odzyskiwane i denaturowane z użyciem

PL 211 833 B1 np. izotiocyjanianu guanidyny lub mocznika. Denaturowany polipeptyd można następnie zwinąć i dimeryzować przez rozcieńczanie denaturantu, tak jak przez dializę wobec roztworu mocznika i kombinacji zredukowanego i utlenionego glutationu, a następnie dializę wobec buforowanego roztworu solanki. W tym ostatnim przypadku, polipeptyd można odzyskiwać z przestrzeni okołoplazmatycznej w rozpuszczalnej i funkcjonalnej formie przez rozrywanie komórki (przez np. sonifikację lub szok osmotyczny) dla uwolnienia zawartości przestrzeni okołoplazmatycznej i odzyskania białka, tym samym zapobiegając potrzebie denaturacji i ponownego fałdowania.

Transformowane lub transfekowane komórki gospodarza hoduje się zgodnie z konwencjonalnymi procedurami w pożywce kultury zawierającej pożywki i inne składniki konieczne dla wzrostu wybranych komórek gospodarza. Wiele odpowiednich pożywek, w tym zdefiniowane pożywki i złożone pożywki, są znane w dziedzinie i ogólnie obejmują źródło węgla, źródło azotu, aminokwasy egzogenne, witaminy i minerały. Pożywki mogą również zawierać takie składniki, jak czynniki wzrostu lub surowicę, stosownie do potrzeb. Pożywka wzrostowa będzie ogólnie dobierana dla komórek zawierających egzogennie dodany DNA przez np. selekcję lekiem lub brak istotnego składnika pokarmowego, który zastępuje marker selekcyjny niesiony na wektorze ekspresji lub kotransfekowany do komórki gospodarza. Komórki P. metanolica hoduje się w pożywce zawierającej odpowiednie źródła węgla, azotu i śladowe substancje odżywcze w temperaturze od około 25°C do 35°C. Ciekłe kultury są zaopatrywane w dostateczne napowietrzenie środkami konwencjonalnymi, takimi jak wytrząsanie małych kolb lub barbotowanie fermentatorów. Korzystną pożywką kultury dla P. metanolica jest YEPD (2% D-glukozy, 2% Bacto™ Peptone (Difco Laboratories, Detroit, MI), 1% ekstraktu drożdży Bacto™ (Difco Laboratories), 0,004% adeniny i 0,006% L-leucyny).

Korzystnie jest oczyścić polipeptydy według niniejszego wynalazku do 80% czystości, korzystniej do > 90% czystości, jeszcze korzystniej 95% czystości i szczególnie korzystny jest stan czystości farmaceutycznej, to jest czystości ponad 99,9% względem zanieczyszczających makrocząsteczek, szczególnie innych białek i kwasów nukleinowych, i bez zakaźnych i pirogennych środków.

Korzystnie, oczyszczony polipeptyd jest zasadniczo wolny od innych polipeptydów, szczególnie innych polipeptydów pochodzenia zwierzęcego.

Eksprymowane rekombinacyjne polipeptydy zcytor17lig (lub chimeryczne polipeptydy zcytor17lig) można oczyszczać stosując frakcjonowanie i/lub konwencjonalne sposoby oczyszczania i pożywki. Strącanie siarczanem amonu i ekstrakcję kwasem lub chaotropem można stosować do frakcjonowania próbek. Przykładowe etapy oczyszczania mogą obejmować hydroksyapatytową, z wykluczaniem rozmiarów, FPLC i wysokowydajną cieczową chromatografię z odwrotnymi fazami. Odpowiednie chromatograficzne media obejmują derywatyzowane dekstrany, agarozę, celulozę, poliakryloamid, specjalne krzemionki, i tym podobnych. Korzystne są pochodne PEI, DEAE, QAE i Q. Przykładowe chromatograficzne media obejmują media derywatyzowane grupami fenylo-wymi, butylowymi lub oktylowymi, takie jak Phenyl-Sepharose FF (Pharmacia), Toyopearl butyl 650 (Toso Haas, Montgomeryville, PA), Octyl-Sepharose (Pharmacia) i tym podobne; lub żywice poliakrylowe, takie jak Amberchrom CG 71 (Toso Haas) i tym podobne. Odpowiednie stałe nośniki obejmują szklane kulki, żywice oparte na krzemionce, żywice celulozowe, kulki agarozowe, kulki z sieciowanej agarozy, kulki polistyrenowe, sieciowane poliakryloamidowe żywice i tym podobne, które są nierozpuszczalne w warunkach, w których mają być stosowane. Te nośniki mogą być modyfikowane reaktywnymi grupami, które pozwalają na przyłączanie białek przez grupy aminowe, grupy karboksylowe, grupy sulfhydrylowe, grupy hydroksylowe i/lub ugrupowania węglowodanowe. Przykłady chemii sprzęgania obejmują aktywację bromkiem dwucyjanu, aktywacji N-hydroksysukcynimidem, aktywację epoksydem, aktywacji sulfhydrylem, aktywacji hydrazydem i pochodne karboksylowe i aminowe dla chemii sprzęgania karbodiimidu. Te i inne stałe media są dobrze znane i szeroko stosowane w dziedzinie i są dostępne od dostawców przemysłowych. Sposoby wiązania receptorowych polipeptydów do mediów nośnikowych są dobrze znane w dziedzinie. Dobór konkretnego sposób jest kwestią rutynowego projektowania i jest określany w części przez właściwości wybranego nośnika, patrz np. Affinity Chromatography: Principles & Methods, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Szwecja, 1988.

Polipeptydy według niniejszego wynalazku można wydzielać przez wykorzystanie ich fizycznych lub biochemicznych właściwości. Np. chromatografię adsorpcyjną na unieruchomionym jonie metalu (IMAC) można stosować do oczyszczania bogatych w histydynę białek, w tym zawierających znaczniki polihistydynowe. Krótko, żel najpierw napełnia się dwuwartościowymi jonami metalu otrzymując chelat (Sulkowski, Trends in Biochem. 3: 1-7, 1985).

PL 211 833 B1

Białko bogate w histydynę będzie adsorbowane w matrycy z różnymi powinowactwami, w zależności od użytego jonu metalu i będzie ono eluowane przez współzawodniczącą elucję, obniżanie pH lub zastosowanie silnych środków chelatujących. Inne sposoby oczyszczania obejmują oczyszczanie glikozylowanych białek przez chromatografię powinowactwa z lektyną i jonowymienną chromatografię (Methods in Enzymol., tom 182, „Guide to Protein Purification”, M. Deutscher (red.), Acad. Press, San Diego, 1990, str. 529-39) i zastosowanie rozpuszczalnego receptora zcytor17. W dodatkowych odmianach wynalazku, fuzję danego polipeptydu i znacznika powinowactwa (np. białka wiążącego maltozę, domeny immunoglobuliny) można skonstruować dla ułatwienia oczyszczania.

Ponadto, stosując sposoby opisane w dziedzinie, konstruuje się fuzje polipeptydu lub białka hybrydowego zcytor17lig, stosując regiony lub domeny zcytor17lig według wynalazku w kombinacji z tymi z innych ludzkich biał ek rodziny cytokin (np. interleukin lub GM-CSF) lub heterologicznych białek (Sambrook i in., ibid., Altschul i in., ibid., Picard, Cur. Opin. Biology, 5: 511-5, 1994 i odnośniki tamże). Te sposoby pozwalają na określenie biologicznego znaczenia większych domen lub regionów w danych polipeptydach. Takie hybrydy mogą zmieniać kinetykę reakcji, wiązania, zawężać lub poszerzać specyficzność substratu, lub zmieniać lokalizację w tkance i komórce polipeptydu i można je stosować do polipeptydów o nieznanej strukturze.

Fuzyjne białka można wytwarzać sposobami znanymi specjalistom w dziedzinie przez wytworzenie każdego składnika fuzyjnego białka i chemiczne ich sprężenie. Alternatywnie, polinukleotyd kodujący oba składniki fuzyjnego białka w odpowiedniej ramce odczytu można generować stosując znane techniki i ekspresję sposobami opisanymi w wynalazku. Np. część lub całość helisy nadającej biologiczną funkcję można wymieniać pomiędzy zcytor17lig według niniejszego wynalazku i funkcjonalnie równoważnymi helisami z innych członków rodziny, takich jak IL-15, IL-2, IL-4 lub GM-CSF. Takie składniki obejmują między innymi sekwencję sygnału sekrecji; helisy A, B, C, D; pętle A/B, B/C, C/D; cytokiny z czterohelisową wiązką. Takie fuzyjne białka powinny mieć biologicznie funkcjonalny profil, który jest taki sam lub podobny do polipeptydów według niniejszego wynalazku lub innych znanych białek rodziny cytokin, w zależności od skonstruowanej fuzji. Ponadto, takie fuzyjne białka mogą wykazywać inne właściwości, jak ujawniono w wynalazku.

Standardowe techniki biologii molekularnej i klonowania można stosować dla zamiany między sobą równoważnych domen pomiędzy polipeptydem zcytor17lig i polipeptydami, z którymi jest w fuzji. Ogólnie, segment DNA kodujący daną domenę, np. helisy A do D zcytor17lig lub inne opisane w wynalazku domeny, jest operacyjnie powiązany w ramce z co najmniej jednym innym segmentem kodującym DNA dodatkowego polipeptydu (na przykład domeny lub regionu z innej cytokiny, takiej jak IL-2 lub tym podobne) i wstawiony do odpowiedniego wektora ekspresji, jak opisano w wynalazku. Ogólnie, konstrukty DNA wytwarza się tak, że kilka segmentów DNA kodujących odpowiednie regiony polipeptydów jest operacyjnie powiązanych w ramce dla stworzenia pojedynczego konstruktu, który koduje całe fuzyjne białko lub jego funkcjonalną część. Np. konstrukt DNA będzie kodował od końca N do końca C fuzyjne białko zawierające sygnałowy polipeptyd, a następnie fuzyjne białko dojrzałej wiązki czterohelisowej cytokiny zawierające helisę A, a następnie helisę B, a następnie helisę C, a następnie helisę D. Takie fuzyjne białka można eksprymować, wydzielać i testować na aktywność, jak opisano w wynalazku.

Polipeptydy zcytor17lig lub ich fragmenty można również wytwarzać przez chemiczną syntezę. Polipeptydy zcytor17lig mogą być monomerami lub multimerami; glikozylowanymi lub nie glikozylowanymi; potraktowanymi PEG lub nie; i mogą, lecz nie muszą, obejmować początkową metioninową resztę aminokwasową. Np. polipeptydy można wytwarzać metodą syntezy peptydowej w fazie stałej, np. jak opisuje Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149, 1963. Aktywność cząsteczek według niniejszego wynalazku można mierzyć stosując wiele testów mierzących proliferację i/lub wiązanie do komórek eksprymujących receptor zcytor17. Szczególnie interesujące są zmiany w zależnych od zcytor17lig komórkach. Odpowiednie linie komórkowe do przetwarzania na zależne od zcytor17lig obejmują zależną od IL-3 linię komórkową BaF3 (Palacios i Steinmetz, Cell 41: 727-734, 1985; MatheyPrevot i in., Mol. Cell. Biol. 6: 4133-4135, 1986), FDC-Pl (Hapel i in., Blood 64: 786-790, 1984) i MO7e (Kiss i in., Leukemia 7: 235-240, 1993). Zależne od czynnika wzrostu linie komórkowe można wytwarzać zgodnie z opublikowanymi sposobami (np. Greenberger i in., Leukemia Res. 8: 363-375, 1984; Dexter i in., w Baum i in. red., Experimental Hematology Today, 8^th Ann. Mtg. Int. Soc. Exp. Hemato. 1979, 145-156,1980).

Białka według niniejszego wynalazku są przydatne dla stymulowania proliferacji, aktywacji, różnicowania i/lub indukcji lub inhibicji specjalizowanych funkcji komórkowych komórek zaangażowanych

PL 211 833 B1 w homeostazę hematopoezy i funkcji odpornościowych. W szczególności, polipeptydy zcytor17lig są przydatne do stymulowania proliferacji, aktywacji, różnicowania, indukcji lub inhibicji specjalizowanych funkcji komórkowych komórek linii krwiotwórczych, w tym, między innymi, komórek T, komórek B, monocytów/makrofagów, komórek NK, neutrofili, komórek śródbłonka, fibroblastów, eozynofili, chondrocytów, komórek tucznych, komórek Langerhansa, monocytów i makrofagów, jak też komórek nabłonka. Komórki nabłonka obejmują np. ameloblasty, komórki główne, chromatofory, komórki chromochłonne, komórki podobne do chromochłonnych, komórki kubkowe, komórki warstwy ziarnistej jajnika, keratynocyty, komórki dendrytyczne, komórki wspierające błędnik, melanocyty, komórki Merkela, komórki Panetha, komórki okładzinowe, komórki Sertolego, i tym podobne. Proliferacja i/lub różnicowanie krwiotwórczych komórek można mierzyć in vitro stosując hodowane komórki lub in vivo podają cząsteczki według niniejszego wynalazku w odpowiednim modelu zwierzęcym. Testy mierzące proliferację lub różnicowanie komórek są dobrze znane w dziedzinie.

Np. testy mierzące proliferację obejmują takie testy, jak chemiowrażliwości na obojętny czerwony barwnik (Cavanaugh i in., Investigational New Drugs 8: 347-354, 1990, dołączany w wynalazku jako odnośnik), włączania radioznakowanych nukleotydów (Cook i in., Analytical Biochem. 179: 1-7, 1989, dołączany w wynalazku jako odnośnik), włączania 5-bromo-2'-dezoksyurydynu (BrdU) w DNA rozrastającej się komórki (Porstmann i in., J. Immunol. Methods 82: 169-179, 1985, dołączany w wynalazku jako odnośnik), i zastosowanie soli tetrazoliowych (Mosmann, J. Immunol. Methods 65: 55-63, 1983; Alley i in., Cancer Res. 48: 58 9-601,198 8; Marshal i in., Growth Reg. 5: 69-84, 1995; i Scudiero i in., Cancer Res. 48: 4827-4833,1988; wszystkie dołączane w wynalazku jako odnośniki). Testy mierzące różnicowanie obejmują, np., mierzenie powierzchniowych komórkowych znaczników związanych ze specyficzną dla etapu ekspresją tkanki, enzymatyczną aktywność, funkcjonalną aktywność lub morfologiczne zmiany (Watt, FASEB, 5: 281-284,1991; Francis, Differentiation 57: 63-75,1994; Raes, Adv. Anim. Cell. Biol. Technol. Bioprocesses, 161-171,1989; wszystkie dołączane w wynalazku jako odnośniki).

Cząsteczki według niniejszego wynalazku można testować in vivo stosując wirusowe układy podawania. Przykładowe wirusy w tym celu obejmują adenowirus, wirus opryszczki, retrowirusy, wirus krowianki i związany z gruczołami wirus (AAV). Adenowirus, dwuniciowy wirus DNA, jest obecnie najlepiej zbadanym wektorem przenoszenia genów dla dostarczania heterologicznego kwasu nukleinowego (przegląd, patrz T. C. Becker i in., Meth. Cell. Biol. 43: 161-89, 1994; i J. T. Douglas i D. T. Curiel, Science & Medicine 4: 44-53, 1997).

Aktywność polipeptydu zcytor17lig jako ligandu można mierzyć opartym na silikonie biosensorowym mikrofizjometrem, który mierzy szybkość pozakomórkowego zakwaszenia lub wydzielanie protonu związane z wiązaniem receptora i dalszymi fizjologicznymi reakcjami komórki. Przykładowym urządzeniem jest Cytosensor Microphysiometer produkcji Molecular Devices, Sunnyvale, CA. Wiele reakcji komórkowych, takich jak proliferacja komórki, transport jonów, wytwarzanie energii, zapalna reakcja, aktywacja regulująca i receptora, i tym podobne, może mierzyć tym sposobem, patrz np. McConnell, H. M. i in., Science 257: 1906-1912, 1992; Pitchford, S. i in., Meth. Enzymol. 228: 84-108, 1997; Arimilli, S. i in., J. Immunol. Meth. 212: 49-59, 1998; Van Liefde, I. i in., Eur. J. Pharmacol. 346: 87-95,1998.

Ponadto, zcytor17lig można stosować dla zidentyfikowania komórek, tkanek lub linii komórkowych, które reagują na szlak stymulowany zcytor17lig. Mikrofizjometr, opisany powyżej, można stosować do szybkiej identyfikacji reagujących na ligand komórek, takich jak komórki reagujące na zcytor17lig według niniejszego wynalazku. Komórki mogą być hodowane w obecności lub nieobecności polipeptydu zcytor17lig. Te komórki, które dają mierzalną zmianę pozakomórkowego zakwaszenia w obecności zcytor17lig, reagują na zcytor17lig. Takie komórki lub linie komórkowe można stosować dla zidentyfikowania antagonistów i agonistów polipeptydu zcytor17lig, jak opisano wyżej.

W świetle rozmieszczenia tkankowego obserwowanego dla receptora zcytor17 związki agonistyczne (w tym naturalny zcytor17lig/substratu/kofaktora/itp.) i/lub związki antagonistyczne mają ogromny potencjał w zastosowaniach in vitro i in vivo. Związki zidentyfikowane jako związki agonistyczne zcytor17lig są przydatne do rozszerzania, proliferacji, aktywacji, różnicowania i/lub indukcji lub inhibicji specjalizowanych funkcji komórkowych komórek zaangażowanych w homeostazę hematopoezy i funkcje odpornościowe. Np. zcytor17lig i związki agonistyczne są przydatne jako składniki zdefiniowanych pożywek kultur komórkowych, i można je stosować same lub w kombinacji z innymi cytokinami i hormonami dla zastąpienia surowicy, którą się zwykle stosuje w kulturze komórek. Zwiążki agonistyczne są więc przydatne w specyficznym sprzyjaniu wzrostowi i/lub rozwojowi komórek T, ko34

PL 211 833 B1 mórek B, monocytów/makrofagów, komórek NK, cytotoksycznych limfocytów i innych komórek linii limfoidalnej i szpikowej w kulturze.

Związki antagonistyczne są również przydatne jako badawcze reagenty do charakteryzacji miejsc interakcji ligand-receptor. Związki antagonistyczne są przydatne do inhibicji rozszerzania, proliferacji, aktywacji i/lub różnicowania komórek zaangażowanych w regulowanie hematopoezy. Inhibitory aktywności zcytor17lig (związki antagonistyczne zcytor17lig) obejmują przeciwciała anty-zcytor17lig i rozpuszczalne receptory zcytor17lig, jak też inne środki peptydowe i nie peptydowe (w tym rybozymy).

Zcytor17lig można również stosować dla zidentyfikowania inhibitorów (antagonistów) jego aktywności. Testowane związki stosuje się w testach ujawnionych w wynalazku dla zidentyfikowania związków, które hamują aktywność zcytor17lig. Poza tymi testami ujawnionymi w wynalazku, próbki można testować na inhibicję aktywności zcytor17lig w wielu testach zaprojektowanych do pomiaru wiązania receptora, stymulacji/inhibicji zależnych od zcytor17lig reakcji komórkowych lub proliferacji komórek eksprymujących receptor zcytor17.

Polipeptyd zcytor17lig można eksprymować jako fuzję ze stałym regionem ciężkiego łańcucha immunoglobuliny, typowo fragmentem Fc, który zawiera dwie domeny stałego regionu i nie ma zmiennego regionu. Sposoby wytwarzania takich fuzji są ujawnione w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5 155 027 i 5 567 584. Takie fuzje są typowo wydzielane jako multimeryczne cząsteczki, w których części są dwusiarczkowo związane ze sobą i dwa polipeptydy nie-Ig są ułożone w znacznej bliskości ze sobą.

Fuzje tego typu można stosować np. do dimeryzacji, zwiększając stabilność i czas półtrwania in vivo, do oczyszczania przez powinowactwo ligandu, jako in vitro narzędzie testowe lub antagonista. Przy stosowaniu w testach, chimery wiąże się z nośnikiem przez region Fc i stosuje w formacie ELISA.

Polipeptyd wiążący zcytor17lig można również stosować do oczyszczania ligandu. Polipeptyd jest unieruchamiany na stałym nośniku, takim jak kulki z agarozy, sieciowanej agarozy, szkła, celulozowe żywice, oparte na krzemionce żywice, polistyren, sieciowany poliakryloamid lub podobne materiały, które są trwałe w warunkach stosowania.

Sposoby wiązania polipeptydów ze stałymi nośnikami są znane w dziedzinie i obejmują chemię amin, aktywację bromocyjanem, aktywację N-hydroksysukcynimidem, aktywację epoksydu, aktywację sulfhydrylową i aktywację hydrazydu. Powstałe medium będzie ogólnie skonfigurowane w postaci kolumny i płyny zawierające ligand przepuszcza się przez kolumnę jeden lub więcej razy, aby pozwolić ligandowi związać się z polipeptydem receptora. Ligand następnie eluuje się stosując zmiany stężenia soli, środki chaotropowe (guanidyna · HCl) lub pH dla zerwania wiązania ligand-receptor.

Można korzystnie stosować system testowy wykorzystujący ligand-receptor wiążący (lub przeciwciało, jeden człon pary komplement/antykomplement) lub jego wiążący fragment i dostępny w handlu instrument biosensorowy (BIAcore, Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ). Taki receptor, przeciwciało, człon pary komplement/antykomplement lub fragment jest unieruchamiany na powierzchni kostki receptora. Zastosowanie tego instrumentu ujawnia Karlsson, J. Immunol. Methods 145: 229-40, 1991 i Cunningham i Wells, J. Mol. Biol. 234: 554-63, 1993. Receptor, przeciwciało, element lub fragment jest kowalencyjnie związany, z użyciem chemii aminowej lub sulfhydrylowej, z dekstranowymi włóknami, które są związane z warstwą złota w komorze przepływowej. Testową próbkę przepuszcza się przez komórkę. Jeśli ligand, epitop lub przeciwny człon pary komplement//antykomplement jest obecny w próbce, zwiąże się z unieruchomionym receptorem, przeciwciałem lub członem, odpowiednio, powodując zmianę w współczynniku załamania środowiska, którą jest wykrywana jako zmiana w powierzchniowym rezonansie plazmonu na warstwie złota. Ten system pozwala na określenie szybkości włączania i wyłączania, z której można obliczyć powinowactwo wiązania i ocenić stechiometrię wiązania. Alternatywnie, ligand/receptor wiążący można zanalizować stosując SELDI^(TM) technikę (Ciphergen, Inc., Palo Alto, CA).

Polipeptydy ligand-receptor wiążący można również stosować w innym systemach testowych znanych w dziedzinie. Takie systemy obejmują analizę Scatcharda na określenie powinowactwa wiązania (patrz Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51: 660-72, 1949) i testy kalorymetryczne (Cunningham i in., Science 253: 545-48, 1991; Cunningham i in., Science 245: 821-25, 1991).

Polipeptydy zcytor17lig można również stosować do wytwarzania przeciwciał wiążących się z epitopami, peptydami lub polipeptydami zcytor17lig. Polipeptyd zcytor17lig lub jego fragment służy jako antygen (immunogen) do zaszczepienia zwierzęcia i wywołania reakcji odpornościowej. Takie przeciwciała można stosować do blokowania biologicznego działania prozapalnego zcytor17lig i są przydatne jako przeciwzapalny środki lecznicze w wielu chorobach, jak opisano w wynalazku. SpecjaPL 211 833 B1 lista w dziedzinie zauważy, że antygenowe, niosące epitop polipeptydy zawierają sekwencję co najmniej 6, korzystnie co najmniej 9 i korzystniej co najmniej 15 do około 30 sąsiadujących reszt aminokwasowych polipeptydu zcytor17lig (np. SEQ ID NO: 2). Obejmowane są polipeptydy zawierające większą porcję polipeptydu zcytor17lig, to jest od 30 do 100 reszt do pełnej długości sekwencji aminokwasowej. Antygeny lub immunogenne epitopy mogą również obejmować przyłączone znaczniki, adiuwanty, zaróbki i nośniki, jak opisano w wynalazku. Odpowiednie antygeny obejmują polipeptyd zcytor17lig kodowany SEQ ID NO: 2 od aminokwasu numer 24 do aminokwasu numer 164, lub jego fragment sąsiadujących aminokwasów 9 do 141. Inne odpowiednie antygeny obejmują pełnej długości i dojrzał e zcytor17lig, helisy A-D i indywidualne lub wielokrotne helisy A, B, C i D struktury czterohelisowej wiązki zcytor17lig, jak opisano w wynalazku. Korzystnymi peptydami do stosowania jako antygeny są hydrofilowe peptydy, takie jak te przewidywane przez specjalistę w dziedzinie z wykresu hydrofobowości, jak opisano w wynalazku, np. reszt aminokwasowych 114-119,101-105, 126-131,113-118 i 158-162 z SEQ ID NO: 2; i reszt aminokwasowych 34-39,46-51, 131-136, 158-163 i 157-162 z SEQ ID NO: 11. Ponadto, antygenowe epitopy zcytor17lig, jak przewiduje wykres Jamesona-Wolfa, np. z użyciem programu Protean DNASTAR (DNASTAR, Inc., Madison, WI) służą jako korzystne antygeny i są określane przez specjalistę w dziedzinie.

Przeciwciała z odpornościowej reakcji generowanej przez zaszczepienie zwierzęcia tymi antygenami można wydzielić i oczyścić, jak opisano w wynalazku. Sposoby wytwarzania i izolowania poliklonalnych i monoklonalnych przeciwciał są dobrze znane w dziedzinie, patrz np. Current Protocols in Immunology, Cooligan i in. (red.), National Institutes of Health, John Wiley and Sons, Inc., 1995; Sambrook i in., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, wyd. 2, Cold Spring Harbor, NY, 1989; i Hurrell, J. G. R., Ed., Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, 1982.

Jak będzie oczywiste dla fachowca w dziedzinie, poliklonalne przeciwciała można generować przez szczepienie różnych stałocieplnych zwierząt, takich jak konie, krowy, kozy, owce, psy, kurczęta, króliki, myszy i szczury polipeptydem zcytor17lig lub jego fragmentem. Immunogenność polipeptydu zcytor17lig można zwiększać przez zastosowanie adiuwantu, takiego jak ałun (wodorotlenek glinu) albo pełny lub niepełny adiuwant Freunda. Polipeptydy przydatne do immunizacji również obejmują fuzyjne polipeptydy, takie jak fuzje zcytor17lig lub jego części z immunoglobulinowym polipeptydem lub z białkiem wiążącym maltozę. Polipeptydowy immunogen może być pełnej długości cząsteczką lub jej częścią. Jeśli część polipeptydu oznacza „haptenopodobna”, taka część może być korzystnie przyłączana lub wiązana z makromolekularnym nośnikiem (takim jak hemocyjanina skałotocza (KLH), albumina surowicy wołowej (BSA) lub anatoksyna tężca) do immunizacji.

W niniejszym wynalazku, termin „przeciwciał a” obejmuje poliklonalne przeciwciał a, oczyszczone przez powinowactwo poliklonalne przeciwciałami, monoklonalne przeciwciała i wiążące antygen fragmenty, takie jak F(ab')2 i Fab. Obejmowane są również genetycznie przetworzone nietknięte przeciwciała lub fragmenty, takie jak chimeryczne przeciwciała, fragmenty Fv, jednołańcuchowe przeciwciała i tym podobne, jak też syntetyczne wiążące antygen peptydy i polipeptydy. Nieludzkie przeciwciała można humanizować przez zaszczepienie nieludzkiego CDR na ludzką strukturę szkieletową i stałe regiony, lub przez włączenie całej nieludzkiej zmiennej domeny (ewentualnie „nakrycie” jej podobną do ludzkiej powierzchnią przez zastąpienie wystawionych reszt, czego wynikiem jest „fornirowane” przeciwciało). W pewnych przypadkach, humanizowane przeciwciała mogą zachować nieludzkie reszty w domenach szkieletu ludzkiego zmiennego regionu dla polepszenia charakterystyki wiązania. Przez humanizowanie przeciwciał, można zwiększyć biologiczny czas półtrwania i zmniejsza się potencjał szkodliwych odpornościowych reakcji przy podawaniu ludziom. Ponadto, ludzkiego przeciwciała można wytwarzać w transgenicznych, nie będących ludźmi zwierzętach, które zmieniono tak, że zawierają geny ludzkiej immunoglobuliny, jak ujawnia publikacja WIPO nr WO 98/24893.

Korzystnie, geny endogennej immunoglobuliny w tych zwierzętach są inaktywowane lub eliminowane, np. przez homologiczną rekombinację.

Przeciwciała uważa się za specyficznie związane, jeśli:

1) wykazują poziom progowy aktywności wiązania i

2) znacząco nie reagują krzyżowo z pokrewnymi cząsteczkami polipeptydowymi.

Poziom progowy wiązania jest określony, jeśli przeciwciała anty-zcytor17lig w wynalazku wiążą się z polipeptydem, peptydem lub epitopem zcytor17lig z powinowactwem co najmniej 10-krotnym ponad powinowactwo wiązania z kontrolnym (nie zcytor17lig) polipeptydem.

PL 211 833 B1

Korzystnie, aby przeciwciało wykazywało powinowactwo wiązania (Ka) 10⁶ M^-1 lub większe, korzystnie 10⁷ M^-1 lub większe, korzystniej 10⁸ M^-1 lub większe i najkorzystniej 10⁹ M^-1 lub większe. Powinowactwo wiązania przeciwciała może łatwo określić fachowiec w dziedzinie, np. metodą analizy Scatcharda (Scatchard, G., Ann. NY Acad. Sci. 51: 660-672,1949).

Czy przeciwciałami anty-zcytor17lig znacząco nie reagują krzyżowo z pokrewnymi cząsteczkami polipeptydowymi, pokazano, np. dzięki wykrywaniu przez przeciwciało polipeptydu zcytor17lig, lecz nie znanych pokrewnych polipeptydów, z użyciem standardowej analizy hybrydyzacji Western (Ausubel i in., ibid.). Przykładami znanych pokrewnych polipeptydów są ujawnione dotychczas w dziedzinie, takie jak znane ortologi i paralogi oraz podobne znane elementy rodziny białek. Skriningu można również dokonać stosując nieludzkie zcytor17lig i zmutowane polipeptydy zcytor17lig. Ponadto, przeciwciała można „przesiewać wobec” znanych pokrewnych polipeptydów, dla wydzielenia populacji, która specyficznie wiąże się z polipeptydami zcytor17lig. Np. przeciwciała wytworzone wobec zcytor17lig są adsorbowane na pokrewnych polipeptydach przywartych do nierozpuszczalnej matrycy; przeciwciała specyficzne wobec zcytor17lig przepłyną przez matrycę w odpowiednich warunkach buforowych. Skrining pozwala na wydzielenie poliklonalnych i monoklonalnych przeciwciał nie reagujących krzyżowo ze znanymi blisko pokrewnymi polipeptydami (Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow i Lane (red.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988; Current Protocols in Immunology, Cooligan i in. (red.), National Institutes of Health, John Wiley and Sons, Inc., 1995). Skrining i wydzielanie specyficznych przeciwciał są dobrze znane w dziedzinie, patrz Fundamental Immunology, Paul (red.), Raven Press, 1993; Getzoff i in., Adv. in Immunol. 43: 1-98, 1988; Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Goding, J. W. (red.), Academic Press Ltd., 1996; Benjamin i in., Ann. Rev. Immunol. 2: 67-101, 1984. Specyficzne wiązanie przeciwciał anty-zcytor17lig można wykrywać wieloma sposobami z dziedziny, oraz ujawnionymi poniżej.

Wiele testów znanych specjalistom w dziedzinie można stosować do wykrywania przeciwciał, które wiążą się z białkami lub polipeptydami zcytor17lig. Przykładowe testy opisano w szczegółach w Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow i Lane (Eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988. Reprezentatywne przykłady takich testów obejmują: równoległą immunoelektroforezę, test radioimmunologiczny, strącanie radioimmunologiczne, test immunosorpcji enzymozależnej (ELISA), hybrydyzację punktową lub test hybrydyzacji Western, test inhibicji lub współzawodnictwa i test sandwiczowy. Ponadto, przeciwciała można selekcjonować na wiązanie z dzikiego typu względem zmutowanego białka lub polipeptydu zcytor17lig.

Przeciwciała wobec zcytor17lig można stosować do znakowania komórek, które eksprymują zcytor17lig; do wydzielania zcytor17lig przez oczyszczanie przez powinowactwo; do testów diagnostycznych określania poziomów w krążeniu polipeptydów zcytor17lig; do wykrywania lub oceny ilościowej rozpuszczalnego zcytor17lig jako sygnału przyczynowej patologii lub choroby; w metodach analitycznych z użyciem FACS; do skriningu biblioteki ekspresji; do generowania antyidiotypowych przeciwciał; i jako zobojętniające przeciwciała lub jako związki antagonistyczne do blokowania aktywności zcytor17lig in vitro i in vivo. Odpowiednie bezpośrednie znaczniki lub etykiety obejmują radionuklidy, enzymy, substraty, kofaktory, inhibitory, znaczniki fluorescencyjne, znaczniki chemiluminescencyjne, cząstki magnetyczne i tym podobne; pośrednie znaczniki lub etykiety mogą wykorzystywać biotynę-awidynę lub inne pary komplement/antykomplement jako związki pośrednie. Przeciwciałami w wynalazku mogą również być bezpośrednio lub pośrednio sprzężone z lekami, toksynami, radionuklidami i tym podobnymi i takie koniugaty zastosowane do in vivo diagnostycznych lub leczniczych zastosowań. Ponadto, przeciwciała wobec zcytor17lig lub ich fragmenty można stosować in vitro do wykrywania denaturowanego zcytor17lig lub jego fragmentów w testach, np. hybrydyzacji Western lub innych testach znanych w dziedzinie.

Odpowiednie wykrywalne cząsteczki można bezpośrednio lub pośrednio przyłączać do polipeptydu lub przeciwciała, i obejmują one radionuklidy, enzymy, substraty, kofaktory, inhibitory, znaczniki fluorescencyjne, znaczniki chemiluminescencyjne, cząstki magnetyczne i tym podobne. Odpowiednie cząsteczki cytotoksyczne mogą być bezpośrednio lub pośrednio związane z polipeptydem lub przeciwciałem i obejmują one bakteryjne lub roślinne toksyny (na przykład toksynę błonicy, saporynę, egzotoksynę Pseudomonas, rycynę, abrynę i tym podobne), jak też lecznicze radionuklidy, takie jak jod-131, ren-188 lub itr-90 (na przykład bezpośrednio związane z polipeptydem lub przeciwciałem, lub pośrednio związane za pomocą ugrupowania chelatującego). Polipeptydy lub przeciwciała mogą również być sprzężone z cytotoksycznymi lekami, takimi jak adriamycyna. Do pośredniego wiązania wykrywalnej lub cytotoksycznej cząsteczki, wykrywalną lub cytotoksyczną cząsteczkę można złączyć

PL 211 833 B1 z członem komplementarnej/antykomplementarnej pary, gdzie drugi człon jest związany z częścią będącą polipeptydem lub przeciwciałem. Dla tych celów biotyna/streptawidyna jest przykładową parą komplementarną/antykomplementarną.

Wiążące polipeptydy mogą również działać jako „związki antagonistyczne” zcytor17lig blokując wiązanie zcytor17lig i transdukcję sygnału in vitro i in vivo. Te polipeptydy anty-wiążące zcytor17lig będą przydatne do hamowania aktywności zcytor17lig lub wiązania białka.

Fuzyjne białka polipeptyd-toksyna lub fuzyjne białka przeciwciało-toksyna można stosować do inhibicji lub ablacji docelowej komórki lub tkanki (na przykład do leczenia raka komórki lub tkanki). Alternatywnie, jeśli polipeptyd ma wiele funkcjonalnych domen (to jest, domenę aktywacji lub domenę wiążącą receptor plus docelową domenę), fuzyjne białko obejmujące tylko docelową domenę może być odpowiednie do kierowania wykrywalnej cząsteczki, cytotoksycznej cząsteczki lub komplementarnej cząsteczki do danego typu komórki lub tkanki. W przypadkach, gdy tylko domenowe fuzyjne białko obejmuje komplementarną cząsteczkę, antykomplementarna cząsteczka może być sprzężona z wykrywalną lub cytotoksyczną cząsteczką. Takie fuzyjne białka domena-komplementarna cząsteczka stanowią więc ogólny docelowy nośnik lub zaróbkę dla specyficznego wobec komórki/tkanki dostarczania ogólnych antykomplementarnych-wykrywalnych/cytotoksycznych koniugatów cząsteczkowych.

W innej odmianie, fuzyjne biał ka cytokinowe zcytor17lig lub fuzyjne biał ka przeciwciał o-cytokina można stosować do in vivo zabijania docelowych tkanek (np. białaczki, chłoniaka, raka płuc, raka okrężnicy, czerniaka, raka trzustki, raka jajników, raków skóry, krwi i szpiku lub innych raków, w których eksprymowane są receptory zcytor17lig) (patrz, ogólnie, Hornick i in., Blood 89: 4437-47, 1997). Opisane fuzyjne białka pozwalają na celowanie cytokiną w żądane miejsce działania, tym samym zapewniając podwyższone lokalne stężenie cytokiny. Odpowiednie polipeptydy zcytor17lig lub przeciwciała anty-zcytor17lig celują w niepożądaną komórkę lub tkankę (to jest nowotwór lub białaczkę) i skondensowana cytokina mediuje polepszoną lizę docelowej komórki przez komórki efektorowe. Odpowiednie do tego celu cytokiny obejmują na przykład interleukinę 2 i czynnik stymulujący kolonie granulocytów-makrofagów (GM-CSF).

W kolejnej odmianie, jeś li polipeptyd zcytor17lig lub przeciwciało anty-zcytor17lig celuje w komórki lub tkankę naczyniową, taki polipeptyd lub przeciwciało mogą sprzęgać z radionuklidem, a szczególnie emitującym promieniowanie beta radionuklidem, dla osłabienia nawrotu zwężenia. Takie lecznicze podejście jest mniej niebezpieczne dla klinicystów podających radioaktywną terapię. Na przykład, taśmy impregnowane irydem-192 umieszczone w naczyniach ze stentami pacjentów, aż do podania żądanej dawki promieniowania wykazywały spadek przyrostu tkanki w naczyniu i większe światło niż w grupie kontrolnej, która otrzymała taśmy placebo. Ponadto, rewaskularyzacja i zakrzepica na stencie były znacząco niższe w grupie terapii. Podobne wyniki przewiduje się nakierowywaniu bioaktywnego koniugatu zawierającego radionuklid, jak opisano w wynalazku.

Bioaktywne koniugaty polipeptydu lub przeciwciała opisane w wynalazku można podawać dożylnie, dotętniczo lub doprzewodowo, lub można wprowadzać lokalnie w żądanym miejscu działania.

Ponadto, zapalenie jest ochronną reakcją organizmu broniącą przed atakującym środkiem. Zapalenie jest kaskadowym zdarzeniem, które angażuje wiele komórkowych i humoralnych mediatorów. Z jednej strony, t ł umienie reakcji zapalnej moż e pozostawić gospodarza z gorszą odpornoś cią ; jednakże, pozostawione samo sobie, zapalenie może prowadzić do poważnych komplikacji, w tym przewlekłych zapalnych chorób (np. reumatoidalnego zapalenia stawów, stwardnienia rozsianego, zapalnej choroby jelit i tym podobnych), szoku septycznego i niewydolności wielu narządów. Co ważne, te różne stany chorobowe mają wspólne zapalne mediatory. Zbiorcze choroby charakteryzujące się zapaleniem mają wielki wpływ na zachorowalność i śmiertelność ludzi. Tak więc jest jasne, że przeciwzapalne przeciwciała i wiążące polipeptydy, takie jak przeciwciała anty-zcytor17lig i wiążące polipeptydy opisane w wynalazku, mogą mieć istotny leczniczy potencjał dla wielkiej liczby chorób ludzi i zwierząt, od astmy i alergii do autoalergii i szoku septycznego. Jako takie, przeciwzapalne przeciwciała anty-zcytor17lig i wiążące polipeptydy opisane w wynalazku można stosować terapeutycznie, jak związki antagonistyczne zcytor17lig opisane w wynalazku, szczególnie w chorobach takich, jak zapalenie stawów, endotoksemia, zapalna choroba jelit, łuszczyca, pokrewne choroby i tym podobne.

1. Zapalenie stawów

Zapalenie stawów, w tym zapalenie stawów i kości, reumatoidalne zapalenie stawów, zapalenie stawów wskutek urazu i tym podobne, są pospolitymi zapalnymi stanami, które skorzystają z leczniczego zastosowania przeciwzapalnych przeciwciał i wiążących polipeptydów, takich jak przeciwciała anty-zcytor17lig i wiążące polipeptydy według niniejszego wynalazku. Np. reumatoidalne zapalenie

PL 211 833 B1 stawów (RA) jest układową chorobą, która dotyka całe ciało i jest jedną z najpospolitszych postaci zapalenia stawów. Charakteryzuje się zapaleniem błony wyściełającej staw, co powoduje ból, sztywność, ogrzanie, zaczerwienienie i obrzęk. Zapalne komórki uwalniają enzymy, które mogą trawić kości i chrząstki. Wskutek reumatoidalnego zapalenia stawów, bę d ą cy w stanie zapalnym wykł adzina stawu, maziówka, może atakować i uszkadzać kości i chrząstki prowadząc do degradacji stawu i ostrego bólu, pośród innych fizjologicznych efektów. Zaatakowany staw może stracić kształt i położenie, powodując ból i utratę ruchliwości.

Reumatoidalne zapalenie stawów (RA) jest mediowaną immunologicznie chorobą szczególnie charakteryzującą się zapaleniem i dalszym uszkodzeniem tkanki prowadzącym do poważnego kalectwa i zwiększonej śmiertelności. Wiele cytokin powstaje lokalnie w reumatoidalnych stawach. Liczne badania wykazały, że IL-1 i TNF-alfa, dwie prototypowe prozapalne cytokiny, grają ważną rolę w mechanizmach zaangażowanych w zapalenie maziówki i w postępujące niszczenie stawu. Istotnie, podawanie inhibitorów TNF-alfa i IL-1 u pacjentów z RA doprowadziło do ogromnego polepszenia klinicznych i biologicznych oznak zapalenia i osłabienia radiologicznych oznak erozji kości i niszczenia chrząstki. Jednakże, pomimo tych zachęcających wyników, znaczący procent pacjentów nie reaguje na te środki, co sugeruje, że inne mediatory są również zaangażowane w patofizjologię zapalenia stawów (Gabay, Expert. Opin. Biol. Ther. 2 (2): 135-149,2002). Jednym z tych mediatorów może być zcytor17lig i jako taka cząsteczka wiążąca lub hamująca zcytor17lig, taka jak przeciwciało antyzcytor17lig lub partner wiązania, może służyć jako wartościowy lek do zmniejszania zapalenia w reumatoidalnym zapaleniu stawów i innych chorobach artretycznych.

Istnieje kilka zwierzęcych modeli reumatoidalnego zapalenia stawów znanych w dziedzinie. Np., w modelu indukowanego kolagenem zapalenia stawów (CIA), myszy uzyskują chroniczne zapalenie stawów blisko przypominające ludzkie reumatoidalne zapalenie stawów. Ponieważ CIA wykazuje podobne immunologiczne i patologiczne cechy jak RA, daje to idealny model skriningu potencjalnych ludzkich związków przeciwzapalnych. Model CIA jest dobrze znanym modelem u myszy, zależnym, jeśli chodzi o zajście, od odpornościowej reakcji i zapalnej reakcji. Odpornościowa reakcja obejmuje oddziaływania komórek B i komórek T CD4+ w reakcji na kolagen, który jest podawany jako antygen i prowadzi do wytwarzania antykolagenowych przeciwciał . Zapalna faza jest wynikiem reakcji tkanki z mediatorami zapalenia, jako konsekwencja krzyżowej reakcji pewnych z tych przeciwciał z mysim natywnym kolagenem i aktywacji kaskady komplementu. Korzyścią ze stosowania modelu CIA jest to, że podstawowe mechanizmy patogenezy są znane. Zidentyfikowano odpowiednie epitopy komórek T i B na kolagenie typu II i różne parametry immunologiczne (np. opóź nionego typu nadwrażliwość i przeciwciało antykolagenowe) i zapalne (np. cytokiny, chemokiny i okre ś lono enzymy degradujące substancję międzykomórkową) związane z mediowanym odpornościowe zapaleniem stawów, a więc mogą być użyte do oceny skuteczności testowanych związków w modelu CIA (Wooley, Curr. Opin. Rheum. 3: 407-20, 1999; Williams i in., Immunol. 89: 9784-788, 1992; Myers i in., Life Sci. 61: 18 61-78, 1997; i Wang i in., Immunol. 92: 8955-959, 1995).

Podawanie rozpuszczalnych zawierających zcytor17 polipeptydów (w tym heterodimerycznych i multimerycznych receptorów opisanych w wynalazku), takich jak zcytor17-Fc4 lub inne rozpuszczalne i fuzyjne białka zcytor17 myszom w tym modelu CIA użyto do oceny zastosowania zcytor17 do łagodzenia objawów i zmieniania przebiegu choroby. Ponieważ cząsteczka, które moduluje odpornościowe i zapalne reakcje, zcytor17lig, może indukować wytwarzanie SAA, który jest zaangażowany w patogenezę reumatoidalnego zapalenia stawów, zwią zki antagonistyczne zcytor17lig mogą redukować aktywność SAA in vitro i in vivo, układowe lub lokalne podawaniu związków antagonistycznych zcytor17lig, takich jak przeciwciała antyzcytor17lig lub partnerzy wiązania, polipeptydy zawierające zcytor17 (w tym heterodimeryczne i multimeryczne receptory opisane w wynalazku), takie jak zcytor17-Fc4 lub inne rozpuszczalne i fuzyjne białka zcytor17, mogą potencjalnie tłumić zapalną reakcję w RA. Inne potencjalne leki obejmują polipeptydy zcytor17, rozpuszczalne heterodimeryczne i multimeryczne polipeptydy receptorowe, lub przeciwciała anty-zcytor17lig lub partnerów wiązania według niniejszego wynalazku i tym podobne.

PL 211 833 B1

2. Endotoksemia

Endotoksemia jest poważnym stanem, zwykle powodowanym przez środki zakaźne, takie jak bakterie i inne zakaźne środki chorobowe, posocznicę, zespół szoku toksycznego lub u pacjentów z gorszą odpornością poddanych oportunistycznym infekcjom i tym podobnych. Terapeutycznie przydatne przeciwzapalne przeciwciała i wiążące polipeptydy, takie jak przeciwciała anty-zcytor17lig i wiążące polipeptydy według niniejszego wynalazku, mogą pomagać w zapobieganiu i leczeniu endotoksemii u ludzi i zwierząt. Inne potencjalne leki obejmują polipeptydy zcytor17, rozpuszczalne heterodimeryczne i multimeryczne polipeptydy receptorowe lub przeciwciała anty-zcytor17lig, lub partnerzy wiązania według niniejszego wynalazku i tym podobne, i mogą służyć jako cenne leki do osłabiania zapalenia i patologicznych skutków w endotoksemii.

Endotoksemia indukowana lipopolisacharydem (LPS) angażuje wiele prozapalnych mediatorów, które dają patologiczne efekty w zakaźnych chorobach i endotoksemia indukowana LPS u gryzoni jest szeroko stosowanym i dopuszczalnym modelem do studiów skutków farmakologicznych potencjalnych środków prozapalnych lub immunomodulacyjnych. LPS, powstający w Gram-ujemnych bakteriach, jest główną przyczyną patogenezy szoku septycznego (Glausner i in., Lancet 338: 732, 1991). Stan podobny do szoku można istotnie indukować eksperymentalnie przez pojedynczy zastrzyk LPS zwierzęciu. Cząsteczki wytwarzane przez komórki reagujące na LPS mogą celować w patogeny bezpośrednio lub pośrednio. Chociaż te biologiczne reakcje chronią gospodarza przed atakującymi patogenami, mogą również spowodować szkody. Tak więc, silna stymulacja wrodzonej odporności, występująca wskutek poważnej infekcji Gram-ujemnymi bakteriami, prowadzi do nadmiernego wytwarzania cytokin i innych cząsteczek, i rozwoju śmiertelnego zespołu, zespołu szoku septycznego, który charakteryzuje się gorączką, niedociśnieniem, rozproszoną naczyniową koagulacją i niewydolnością wielu narządów (Dumitru i in. Cell 103: 1071-1083,2000).

Te toksyczne skutki LPS są głównie pokrewne makrofagowej aktywacji prowadzącej do uwalniania wielu zapalnych mediatorów. Pośród tych mediatorów, TNF wydaje się grać najważniejszą rolę, jak wskazuje zapobieganie toksyczności LPS przez podawanie zobojętniających przeciwciał anty-TNF (Beutler i in., Science 229: 869, 1985). Dobrze wiadomo, że zastrzyk 1 μg LPS E. coli wykonany myszy C57B1/6 spowoduje znaczący wzrost ilości w krążeniu IL-6, TNF-alfa, IL-1 i białek ostrej fazy (np. SAA) w przybliżeniu 2 godziny po zastrzyku. Toksyczność LPS wydaje się być mediowaną tymi cytokinami, jako że pasywna immunizacja przeciwko tym mediatorom może dać spadek śmiertelności (Beutler i in., Science 229: 869, 1985). Potencjalne strategie interwencji immunologicznej dla zapobiegania i/lub leczenia szoku septycznego obejmują mAb anty-TNF, antagonistę receptora IL-1, LIF, IL-10 i G-CSF. Ponieważ LPS indukuje wytwarzanie prozapalnych czynników, dających zapewne wkład w patologię endotoksemii, zobojętnienie aktywności zcytor17lig, SAA lub innych prozapalnych czynników przez antagonizowanie polipeptydu zcytor17lig można stosować dla osłabienia objawów endotoksemii, takich jak widoczne przy szoku endotoksycznym. Inne potencjalne leki obejmują polipeptydy zcytor17, rozpuszczalne heterodimeryczne i multimeryczne polipeptydy receptorowe lub przeciwciała anty-zcytor17lig, lub partnerów wiązania według niniejszego wynalazku i tym podobne.

3. Zapalna choroba jelit, IBD

W Stanach Zjednoczonych Ameryki w przybliżeniu 500000 ludzi cierpi na zapalną chorobę jelit (IBD), która może wpływać na okrężnicę i odbyt (wrzodziejące zapalenie okrężnicy) lub jelito cienkie i grube (choroba Crohna). Patogeneza tych chorób jest niejasna, lecz obejmują one przewlekłe zapalenie dotkniętych tkanek. Potencjalne leki obejmują polipeptydy zcytor17, rozpuszczalne heterodimeryczne i multimeryczne polipeptydy receptorowe lub przeciwciała anty-zcytor17lig, lub partnerów wiązania według niniejszego wynalazku i tym podobne, i mogą służyć jako wartościowe leki do zmniejszania zapalenia i patologicznych efektów w IBD i pokrewnych chorobach.

Wrzodziejące zapalenie okrężnicy (UC) jest zapalną chorobą jelita grubego, zwykle nazywanego okrężnicą, charakteryzującą się zapaleniem i owrzodzeniem śluzówki lub wewnętrznego wyłożenia okrężnicy. Takie zapalenie powoduje częste opróżnianie okrężnicy, dając biegunkę. Objawy obejmują wolny stolec i związane z tym kurcze brzuszne, gorączkę i utratę masy ciała. Chociaż dokładna przyczyna UC jest nieznana, ostanie badania sugerują, że naturalna obrona ciała działa przeciwko białkom w ciele, które ciało uważa za obce („autoalergiczna reakcja”). Może z powodu przypominania bakteryjnych białek w jelicie, te białka mogą wywoływać lub stymulować zapalny proces zaczynający niszczenie wyściółki okrężnicy. W miarę niszczenia wyściółki okrężnicy pojawiają się wrzody uwalniające śluz, ropę i krew. Choroba zwykle zaczyna się przy odbycie i może na koniec sięgnąć przez całe jelito grube. Powtarzane epizody zapalenia prowadzą do zgrubienia ścianki jelita i odbytu bliznami.

PL 211 833 B1

Śmierć tkanki okrężnicy lub posocznica może zajść jako poważna choroba. Objawy wrzodziejącego zapalenia okrężnicy mają różną ostrość i ich nastąpienie może być stopniowe lub nagłe. Ataki mogą być prowokowane wieloma czynnikami, w tym infekcją dróg oddechowych lub stresem.

Chociaż nie istnieje obecnie lekarstwo na UC, terapia skupia się na tłumieniu nienormalnego zapalnego procesu w wyściółce okrężnicy. Leczenie obejmujące tłumiące odporność kortykosterydu (np. azatioprin, merkaptopuryna i metotreksat) i aminosalicylany jest dostępne dla leczenia choroby. Jednakże, długoterminowe stosowanie immunosupresyjnych leków, takich jak kortykosterydy i azatioprin może spowodować poważne skutki uboczne, w tym cienienie kości, zaćma, infekcje i wpływ na wątrobę i szpik kostny. U pacjentów, u których bieżące terapie nie są pomyślne, pozostaje chirurgia. Chirurgia obejmuje usuwanie całej okrężnicy i odbytu.

Istnieje kilka modeli zwierzęcych, które mogą częściowo udawać przewlekłe wrzodziejące zapalenie okrężnicy. Najczęściej stosowanym modelem jest indukowany kwasem 2,4,6-trinitrobenosulfonowym/etanolem (TNBS) model zapalenia okrężnicy, który indukuje przewlekłe zapalenie i owrzodzenie w okrężnicy. Gdy TNBS jest wprowadzana do okrężnicy podatnych myszy przez kropienie do odbytu, indukuje mediowaną limfocytem T odpornościową reakcję w śluzówce okrężnicy, w tym przypadku prowadząc do wielkiego zapalenia śluzówki charakteryzującego się gęstą infiltracją komórek T i makrofagów przez całą ściankę jelita grubego. Ponadto, takiemu histopatologicznemu obrazowi towarzyszy kliniczny obraz postępującej utraty wagi (wyniszczenie), krwawa biegunka, wypadanie odbytu i cienienie ścianek jelita grubego (Neurath i in., Intern. Rev. Immunol. 19: 51-62, 2000).

Inny model zapalenia okrężnicy wykorzystuje dekstranosiarczan sodu (DSS), który indukuje ostre zapalenie okrężnicy manifestujące się krwawą biegunką, utratą wagi, skracaniem okrężnicy i owrzodzeniem śluzówki z infiltracją neutrofili. Indukowane DSS zapalenie okrężnicy charakteryzuje się histologicznie infiltracją zapalnych komórek do lamina propria, z limfoidalną hiperplazją, uszkodzenie mieszka ogniskowego i owrzodzenia nabłonka. Uważa się, że te zmiany powstają wskutek toksycznego wpływu DSS na nabłonek i fagocytozy lamina propria komórki i wytwarzania TNF-alfa, i IFN-gamma. Pomimo częstego stosowania, kilka kwestii związanych z mechanizmami DSS co do odniesienia do ludzkiej choroby pozostaje nierozwiązanych. DSS uważa się za niezależny od komórek T model, ponieważ jest zauważany u zwierząt z deficytem komórek T, takich jak myszy SCID.

Podawanie przeciwciała anty-zcytor17lig lub partnerów wiązania, rozpuszczalnych zawierających zcytor17 polipeptydów (w tym heterodimerycznych i multimerycznych receptorów), takich jak zcytor17-Fc4 lub inne rozpuszczalne i fuzyjne białka zcytor17 w takich modelach TNBS lub DSS można stosować do oceny stosowania antagonistów zcytor17lig do łagodzenia objawów i zmieniania przebiegu choroby przewodu pokarmowego. Zcytor17lig może grać rolę w zapalnej reakcji w zapaleniu okrężnicy i neutralizacja aktywności zcytor17lig przez podawanie antagonistów zcytor17lig jest potencjalnym leczniczym podejściem dla IBD. Inne potencjalne leki obejmują polipeptydy zcytor17, rozpuszczalne heterodimeryczne i multimeryczne polipeptydy receptorowe lub przeciwciała anty-zcytor17lig lub partnerzy wiązania według niniejszego wynalazku i tym podobne.

4. Łuszczyca

Łuszczyca jest przewlekłym stanem skóry, na który cierpi więcej niż siedem milionów Amerykanów. Łuszczyca zachodzi, gdy nowe komórki skóry rosną nienormalnie, dając będące w stanie zapalnym, obrzmiałe i złuszczające się łaty na skórze, gdzie stara skóra nie zeszła dość szybko. Płytkowa łuszczyca, najpospolitsza forma, charakteryzuje się będącymi w stanie zapalnym łatami skóry („zmianami”) pokrytymi srebrno-białą łuską. Łuszczyca może być ograniczona do kilku łat lub obejmować średnie do wielkich obszarów skóry, pojawiając się zwykle na czaszce, kolanach, łokciach i tułowiu. Chociaż jest bardzo widoczna, łuszczyca nie jest chorobą zaraźliwą. Patogeneza chorób obejmuje przewlekłe zapalenie narażonej tkanki. Polipeptydy zcytor17, rozpuszczalne heterodimeryczne i multimeryczne polipeptydy receptorowe lub przeciwciała anty-zcytor17lig, lub partnerzy wiązania według niniejszego wynalazku i tym podobne, mogą służyć jako cenne leki dla zmniejszania zapalenia i patologicznych efektów w łuszczycy, innych zapalnych chorobach skóry, alergiach skóry i śluzówki i pokrewnych chorobach.

Łuszczyca jest mediowanym limfocytami T zapalnym zaburzeniem skóry, które może powodować znaczny dyskomfort. Jest to choroba, na którą nie ma leku i dotyka ludzi w każdym wieku. Łuszczyca dotyka w przybliżeniu 2% populacji Europy i Północnej Ameryki. Chociaż osobnicy z łagodną łuszczycą mogą często kontrolować chorobę środkami miejscowymi, ponad jeden milion pacjentów na świecie wymaga terapii nadfioletem lub układową immunosupresją. Niestety, niedogodności i ryzyko promieniowania nadfioletowego i toksyczność wielu terapii ogranicza ich długookresowe stosowanie.

PL 211 833 B1

Ponadto, pacjenci zwykle mają nawroty łuszczycy, a w pewnych przypadkach nasilenie objawów, krótko po zakończeniu terapii immunosupresyjnej.

Różnicowanie jest progresywnym i dynamicznym procesem, rozpoczynającym się od macierzystej komórki o wielu możliwościach i kończącym na ostatecznie zróżnicowanej komórce. Macierzyste komórki o wielu możliwościach, które mogą regenerować się bez przypisywania do linii, eksprymują zestaw znaczników różnicowania, który tracą po przypisaniu do linii komórkowej. Komórki prekursorowe eksprymują zestaw znaczników różnicowania, które mogą nadal być lub mogą nie być eksprymowane, gdy komórki przechodzą po linii komórkowej do dojrzałości. Znaczniki różnicowania, które są eksprymowane wyłącznie przez dojrzałe komórki, są zwykle właściwościami funkcjonalnymi, takimi jak produkty komórkowe, enzymy dające produkty komórkowe oraz receptory. Etap różnicowania populacji komórek jest monitorowany przez identyfikację znaczników obecnych w populacji komórek.

Istnieją dowody sugerujące, że czynniki stymulujące specyficzne typy komórek w dół szlaku w kierunku końcowego różnicowania lub odróżnicowania wpływają na całą populację komórek pochodzących od wspólnego prekursora lub macierzystej komórki. Tak więc, niniejszy wynalazek obejmuje stymulowanie lub inhibicję proliferacji limfocytów, krwiotwórczych komórek i komórek nabłonka.

Zcytor17lig wydzielono z tkanki znanej z ważnych immunologicznych funkcji, które zawierają komórki grające rolę w systemie odpornościowym. Zcytor17lig jest eksprymowany w selekcjonowanych CD3+, aktywowanych obwodowych krwinek i wykazano, że ekspresja zcytor17lig rośnie po aktywacji komórek T. Ponadto, wyniki eksperymentów opisanych w dziale przykładów w wynalazku sugerują, że polipeptydy według niniejszego wynalazku mogą mieć wpływ na wzrost/rozszerzanie monocytów/makrofagów, komórek T, komórek B, komórek NK i/lub zróżnicowanego stanu monocytów/makrofagów, komórek T, komórek B, komórek NK lub tych komórek prekursorowych. Czynniki, które stymulują proliferację krwiotwórczych prekursorów i aktywują dojrzałe komórki, są ogólnie znane, jednakże proliferacja i aktywacja może również wymagać dodatkowych czynników wzrostu. Np. wykazano, że IL-7 i Steel Factor (ligand c-kit) były konieczne do tworzenia kolonii prekursorów NK. IL-15 + IL-2 w kombinacji z IL-7 i Steel Factor były bardziej skuteczne (Mrozek i in., Blood 87: 2632-2640, 1996). Jednakże, niezidentyfikowane cytokiny mogą być konieczne dla proliferacji f specyficznych podzbiorów komórek NK i/lub prekursorów NK (Robertson i in., Blood 76: 2451-2438, 1990). Podobnie, zcytor17lig może działać sam lub wspólnie lub synergicznie z innymi cytokinami dla polepszenia wzrostu, proliferacji, rozszerzania i modyfikacji różnicowania monocytów/makrofagów, komórek T, komórek B lub komórek NK.

Testy mierzące różnicowanie obejmują np. mierzenie znaczników komórkowych związanych ze specyficzną dla etapu ekspresją tkanki, enzymatyczną aktywnością, funkcjonalną aktywnością lub morfologicznymi zmianami (Watt, FASEB, 5: 281-284, 1991; Francis, Differentiation 57: 63-75,1994; Raes, Adv. Anim. Cell Biol. Technol. Bioprocesses, 161-171, 1989; wszystkie dołączane w wynalazku jako odnośnik). Alternatywnie, polipeptyd zcytor17lig sam może służyć jako dodatkowy znacznik z powierzchni komórki lub wydzielany związany ze specyficzną dla etapu ekspresji tkanki. Jako takie, bezpośrednie pomiary polipeptydu zcytor17lig lub jego utraty ekspresji w tkance w czasie różnicowania, mogą służyć jako znacznik dla różnicowania tkanek.

Podobnie, bezpośredni pomiar polipeptydu zcytor17lig lub utraty jego ekspresji w tkance można określić w tkance lub w komórkach, gdy przechodzą nowotworowe postępy. Wzrost inwazyjności i ruchliwości komórek albo uzyskanie lub utrata ekspresji zcytor17lig w przedrakowym lub rakowym stanie, w porównaniu z normalną tkanką, może służyć jako narzędzie diagnostyczne transformacji, inwazji i przerzutów przy postępach nowotworu. Jako taka, wiedza o etapie postępów lub przerzutach nowotworu pomoże lekarzowi w wyborze najlepszej terapii lub agresywności terapii, dla danego pacjenta z rakiem. Sposoby pomiaru uzyskania i utraty ekspresji (mRNA lub białka) są dobrze znane w dziedzinie i opisane w wynalazku i mogą być stosowane do ekspresji zcytor17lig. Np. pojawienie lub zanik polipeptydów regulujących ruchliwość komórek można stosować dla wspomagania diagnozy i prognozy raka stercza (Banyard, J. i Zetter, B. R., Cancer and Metast. Rev. 17: 449-458, 1999). Jako efektor ruchliwości komórek, zcytor17lig uzyskanie lub utrata ekspresji może służyć jako środek diagnostyczny dla raków limfocytów, komórek B, nabłonka, krwiotwórczych i innych.

Ponadto, aktywność i wpływ zcytor17lig na postępy i przerzuty nowotworu można mierzyć in vivo. Kilka izogenicznych mysich modeli opracowano dla zbadania wpływu polipeptydów, związków lub innych terapii na postępy nowotworu. W tych modelach, komórki nowotworowe pasażowane w kulturze są implantowane w myszy tego samego szczepu jako dawca nowotworu. Komórki rozwiną się w nowotwory mające podobne cechy w przyjmujących myszach i przerzuty zajdą również w pew42

PL 211 833 B1 nych z tych modeli. Odpowiednie modele nowotworów dla naszych badań obejmują raka płuc Lewisa (ATCC nr CRL-1642) i czerniaka B16 (ATCC nr CRL-6323), między innymi. Są to zwykle stosowane linie nowotworowe, izogeniczne z mysimi C57BL6/J, które są łatwo hodowane i manipulowane in vitro. Nowotwory wynikające z implantacji jednej z tych linii komórkowych są zdolne do przerzutów do płuc u myszy C57BL6/J. Model raka płuc Lewisa ostatnio użyto u myszy dla zidentyfikowania inhibitora angiogenezy (O'Reilly MS, i in. Cell 79: 315-328, 1994). Myszy C57BL6/J traktuje się eksperymentalnym środkiem przez codzienny zastrzyk rekombinacyjnego białka, agonisty lub antagonisty, lub jednorazowy zastrzyk rekombinacyjnego adenowirusa. Trzy dni po tej terapii, 10⁵ do 10⁶ komórek implantuje się pod skórę grzbietu. Alternatywnie, same komórki mogą być zainfekowane rekombinacyjnym adenowirusem, takim jak eksprymujący zcytor17lig, przed implantacji tak, że białko jest syntetyzowane w miejscu nowotworu lub wewną trzkomórkowe, a nie ukł adowo. Myszy normalnie uzyskują widoczne nowotwory w czasie 5 dni. Nowotwory pozostawia się do rośnięcia przez czas do 3 tygodni, podczas którego mogą osiągnąć rozmiary 1500-1800 mm³ w potraktowanej kontrolnie grupie. Rozmiary nowotworu i masę ciała starannie monitoruje się przez czas eksperymentu. Po zabiciu myszy, nowotwór usuwa się i waży wraz z płucami i wątrobą. Masa płuc okazała się korelować dobrze z ładunkiem przerzutowego nowotworu. Jako dodatkową miarę, policzono powierzchnię przerzutów w płucach. Wycięty nowotwór, płuca i wątrobę preparuje się do histopatologicznego badania, immunohistochemii, i hybrydyzację in situ, stosują c sposoby znane w dziedzinie i opisane w wynalazku. Moż na wię c ocenić wpływ danego eksprymowanego polipeptydu, np. zcytor17lig, na zdolność nowotworu do rekrutacji unaczynienia i podlegania przerzutom. Ponadto, poza stosowaniem adenowirusa, implantowane komórki można przemijające transfekować zcytor17lig. Użycie stabilnych transfektantów zcytor17lig, jak też zastosowanie indukowanych promotorów dla aktywowania ekspresji zcytor17lig in vivo są znane w dziedzinie i moż na je stosować w tym systemie do oceny indukcji przerzutów przez zcytor17lig. Ponadto, oczyszczone zcytor17lig lub kondycjonowaną pożywka zcytor17lig może być bezpośrednio wstrzyknięta w tym mysim modelu, a zatem użyta w tym systemie. Ogólne odnośniki podaje O'Reilly M. S. i in., Cell 79: 315-328, 1994; i Rusciano D. i in., Murine Models of Liver Metastasis. Invasion Metastasis 14: 349-361, 1995.

Zcytor17lig lub jego przeciwciała będą przydatne w leczeniu nowotworzenia, a więc przydatne w leczeniu raka. Zcytor17lig jest eksprymowany w aktywowanych komórkach T, monocytach i makrofagach, i jest związany z regionem ludzkiego chromosomu, w którym translokacje są pospolite w białaczkach. Ponadto, wykazano, że zcytor17lig działa przez receptor cytokinowy, zcytor17, który jest również eksprymowany w aktywowanych komórkach T, monocytach i makrofagach. Nadmierna stymulacja aktywowanych komórek T, monocytów i makrofagów przez zcytor17lig może spowodować u czł owieka stan chorobowy, taki jak na przykł ad raka komórek odpornoś ciowych lub inne raki.

Jako takie, identyfikując ekspresję zcytor17lig, polipeptydy (np. przez przeciwciała anty-zcytor17lig, rozpuszczalne receptory zcytor17 (np. receptor zcytor17, heterodimery (np. zcytor17-/OSMRbeta, zcytor17/WSX-1), multimery (np. zcytor17/OSMRbeta/WSX-1)) lub inni partnerzy wiązania zcytor17lig) mogą służyć jako środki diagnostyczne i mogą służyć jako związki antagonistyczne proliferacyjnej aktywności zcytor17lig. Ligand może być podawany w kombinacji z innymi środkami już w użyciu, w tym obydwoma konwencjonalnymi ś rodkami chemioterapeutycznymi, jak też modulatorami odporności, takimi jak interferon alfa. Okazało się, że alfa/beta interferony są skuteczne w leczeniu pewnych białaczek i zwierzęcych modeli chorób i działanie hamujące wzrost interferonu alfa i zcytor17lig może być addytywne.

Sądzi się, że komórki NK grają główną rolę w eliminacji przerzutowych komórek nowotworowych i pacjenci z przerzutami i litymi nowotworami mają obniżone poziomy aktywności komórek NK (Whiteside i in., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 230: 221-244, 1998). Środek stymulujące komórki NK byłby przydatny w eliminacji nowotworów.

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób redukowania proliferacji nowotworowych monocytów/makrofagów obejmujący podawanie ssakowi z nowotworem monocytowym/makrofagowym ilości kompozycji zcytor17lig lub anty-zcytor17lig dostatecznej do zmniejszenia proliferacji nowotworowych monocytów/makrofagów.

W innych odmianach, kompozycja może obejmować co najmniej jedną inną cytokinę. Druga cytokina może być wybrana z grupy obejmującej IL-2, IL-3, IL-12, IL-21, IL-22, IL-15, IL-4, GM-CSF, ligand Flt3 lub czynnik komórki macierzystej.

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób hamowania aktywacji lub różnicowania monocytów/makrofagów. Monocyty są niezupełnie zróżnicowanymi komórkami, które migrują do różnych

PL 211 833 B1 tkanek, gdzie dojrzewają i zostają makrofagami. Makrofagi grają główną rolę w odpornościowej reakcji prezentując antygen limfocytom i grają pomocniczą rolę jako pomocnicze komórki dla limfocytów, wydzielając liczne cytokiny. Makrofagi mogą internalizować pozakomórkowe cząsteczki i po aktywacji mają zwiększoną zdolność zabijania wewnątrzkomórkowych mikroorganizmów i komórek nowotworowych. Aktywowane makrofagi są również zaangażowane w stymulację ostrego lub lokalnego zapalenia.

W innym aspekcie, przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób osłabiania proliferacji nowotworowych komórek B lub T obejmujący podawanie ssakowi z nowotworem komórki B lub T ilości kompozycji antagonisty zcytor17lig dostatecznej do osłabienia proliferacji nowotworowych monocytów/makrofagów. W innej odmianie, kompozycja może obejmować co najmniej jedną inną cytokinę, gdzie cytokina może być wybrana z grupy obejmującej IL-2, IL-3, IL-12, IL-21, IL-22, IL-15, IL-4, GM-CSF, ligand FltS lub czynnik komórki macierzystej. Ponadto, antagonistą zcytor17lig może być fuzyjne białko ligand/toksyna.

Fuzyjną toksynę zcytor17lig-saporyna można stosować wobec podobnego zestawu białaczek i chłoniaków, rozszerzając zakres białaczek, które można potraktować zcytor17lig. Np., takimi białaczkami mogą być te, które cechują się nadekspresja receptorów zcytor17 (np., receptora zcytor17, heterodimerów (np. zcytor17/OSMRbeta, zcytor17/WSX-1), multimerów (np. zcytor17/OSMRbeta/WSX)). Mediowaną fuzyjną toksyną aktywacja receptora zcytor17, heterodimerów lub multimerów receptora zcytor17 (np. zcytor19/OSMRbeta, zcytor17/WSX-1 lub zcytor19/WSX-1/OSMR) dostarcza dwu niezależnych sposobów inhibicji wzrostu docelowych komórek, pierwszego identycznego z wpływami samego ligandu i drugiego spowodowanego dostarczaniem toksyny przez internalizację receptora. Wzór ekspresji ograniczony do limfocytów i monocytów receptora zcytor17 sugeruje, że koniugat ligand-saporyna może być tolerowany przez pacjentów.

Gdy terapia nowotworów złośliwych obejmuje allogeniczny przeszczep szpiku kości lub komórek macierzystych, zcytor17lig może być cenny z powodu polepszania efektu reakcji przeszczepu na nowotwór. Zcytor17lig może stymulować generowanie litycznych komórek NK z prekursorów szpiku i może stymulować proliferację monocytów i makrofagów po aktywacji receptorów antygenowych. Tak więc, gdy pacjenci otrzymują allogeniczny przeszczep szpiku, zcytor17lig polepszy generowanie reakcji przeciwnowotworowej, z infuzją lub bez infuzji limfocytów dawcy.

Rozmieszczenie w tkance receptorów dla danej cytokiny daje wyraźną wskazówkę co do potencjalnych miejsc działania cytokiny. Ekspresję zcytor17 obserwowano w monocytach i komórkach B, z ostrym wzrostem ekspresji po aktywacji na komórki T CD3+, CD4+ i CD8+. Ponadto, dwie monocytowe linie komórkowe, THP-1 (Tsuchiya i in., Int. J. Cancer 26: 171-176, 1980) i U937 (Sundstrom i in., Int. J. Cancer 17: 565-577, 1976), były również pozytywne dla ekspresji zcytor17.

Analiza Northern receptora WSX-1 ujawniła transkrypty we wszystkich badanych tkankach, ze zwiększonymi poziomami ekspresji w ludzkiej śledzionie, grasicy, węźle limfatycznym, szpiku kości i leukocytach obwodowej krwi. Również poziomy ekspresji WSX-1 zwiększały się po aktywacji komórek T.

Ekspresja OSMR jest opisywana jako bardzo szeroka (Mosley i in., JBC 271: 32635-32643, 1996). Takie rozmieszczenie receptorów zcytor17, WSX-1 i OSM wspiera rolę zcytor17lig w reakcjach odpornościowych, zwłaszcza ekspansję komórek T po aktywacji lub rolę części monocytowej/makrofagowej systemu odpornościowego.

Tak więc, konkretne odmiany niniejszego wynalazku są skierowane na zastosowanie rozpuszczalnych heterodimerów zcytor17/WSX-1/OSMR i zcytor17/OSMR jako antagonistów w zapalnych i odpornościowych chorobach lub stanach, takich jak zapalenie trzustki, cukrzyca typu I (IDDM), rak trzustki, zapalenie trzustki, choroba Gravesa, zapalna choroba jelit (IBD), choroba Crohna, rak okrężnicy i jelit, uchyłkowatość, autoalergia, posocznica, przeszczep narządu lub szpiku kości; zapalenie spowodowane urazem, zabiegiem chirurgicznym lub infekcją; skrobiawica; splenomegalia; reakcja przeszczepu przeciw gospodarzowi; i przy inhibicji zapalenia, tłumienia odporności, osłabiania proliferacji komórek krwiotwórczych, odpornościowych, zapalnych lub limfocytów, makrofagów, komórek T (w tym komórek Th1 i Th2, komórek CD4+ i CD8 +), tłumienie odpornościowej reakcji na patogen lub antygen. Poza tym, obecność ekspresji zcytor17 w aktywowanych odpornościowych komórkach, takich jak aktywowane CD4+ i CD19+, wykazała, że receptor zcytor17 może być zaangażowany w odpornościowe obronne reakcje ciała przeciwko obcym napastnikom: takim jak mikroorganizmy i resztki komórek, i może grać rolę w odpornościowych reakcjach podczas zapalenia i powstawania raka. Jako takie, przeciwciała i partnerzy wiązania według niniejszego wynalazku, o właściwościach agonistycz44

PL 211 833 B1 nych lub antagonistycznych wobec funkcji receptora zcytor17, takie jak zcytor17lig, można stosować do modyfikowania reakcji odpornościowej i zapalenia.

Struktura zcytor17lig i ekspresja w tkankach sugeruje rolę we wczesnym rozwoju krwiotwórczym lub tymocytowym i regulacji odpornościowej reakcji lub zapalenia. Te procesy obejmują stymulację proliferacji i różnicowania komórek w reakcji na wiązanie jednej lub większej liczby cytokin z ich pokrewnymi receptorami. W świetle rozmieszczenia tkankowego obserwowanego dla zcytor17lig, związki agonistyczne (w tym naturalny receptor (receptory)) i związki antagonistyczne mają ogromny potencjał w zastosowaniach in vitro i in vivo. Związki zidentyfikowane jako związki agonistyczne zcytor17lig są przydatne do stymulacji proliferacji i rozwoju docelowych komórek in vitro i in vivo. Np. związki agonistyczne, zcytor17lig lub przeciwciała anty-zcytor17lig, są przydatne jako składniki zdefiniowanych pożywek kultur komórkowych i można je stosować same lub w kombinacji z innymi cytokinami i hormonami do zastępowania surowicy, którą zwykle stosuje się w kulturze komórek. Związki agonistyczne są więc przydatne konkretnie sprzyjając wzrostowi i/lub rozwojowi lub aktywacji monocytów, komórek T, komórek B i innych komórek linii limfoidalnej i szpikowej oraz komórek krwiotwórczych w kulturze.

Zcytor17lig mogą być przydatne w stymulowaniu mediowanej komórkowe odporności i stymulowaniu proliferacji limfocytów, takiej jak w terapii infekcji obejmującej immunosupresję, w tym pewne wirusowe infekcje. Dodatkowe zastosowania obejmują tłumienie nowotworu, gdzie złośliwa transformacja daje komórki nowotworowe, które są antygenowe. Zcytor17lig można użyć do indukowania cytotoksyczności, która może być mediowaną przez aktywację efektorowych komórek, takich jak komórki T, komórki NK (naturalnie cytotoksyczne) lub komórki LAK (limfoidalnie aktywowane cytotoksyczne), lub indukowana bezpośrednio przez szlaki apoptozy. Zcytor17lig może również być przydatny w leczeniu leukopenii przez zwiększanie poziomów dotkniętych typów komórek i polepszaniu regeneracji repertuaru limfocytu T po transplantacji szpiku kostnego; lub polepszaniu proliferacji lub aktywacji monocytów i do celów diagnostycznych i innych zastosowań opisanych w wynalazku.

Zcytor17lig może znaleźć zastosowanie w tłumieniu systemu odpornościowego, tak jak w terapii autoalergii, w tym reumatoidalnego zapalenia stawów, stwardnienia rozsianego, cukrzycy, zapalnej choroby jelit, choroby Crohna, itp. Tłumienie odporności można również stosować do osłabiania odrzucania przeszczepów tkanki lub narządu i leczenia specyficznych dla limfocytu T, komórki B lub monocytu białaczek lub chłoniaków i innych raków, przez hamowanie proliferacji dotkniętego typu komórek. Ponadto zcytor17lig można stosować do wykrywania monocytów, makrofagów i aktywowanych komórek T i wspomagania diagnozowania takich autoalergii, szczególnie w stanach chorobowych, w których monocyty są na wyższym poziomie lub aktywowane.

Polipeptydy zcytor17lig, peptydy, przeciwciała i tym podobne można również użyć w systemach diagnostycznych do detekcji poziomów w krążeniu zcytor17lig. W pokrewnych odmianach, przeciwciała lub inne środki specyficznie wiążące się z polipeptydami zcytor17lig można stosować do wykrywania polipeptydów zcytor17lig w krążeniu. Podwyższone lub zmniejszone poziomy ligandowych polipeptydów mogą być wskaźnikiem patologicznych stanów, w tym raka. Polipeptydy zcytor17 mogą dawać wkład do patologicznych procesów i mogą być pośrednią oznaką ukrytej choroby.

Również zcytor17lig można stosować do wykrywania lub nakierowywania na jego receptor (receptory) w pewnych stanach chorobowych. Np., podwyższone poziomy rozpuszczalnego receptora IL-2 w ludzkiej surowicy zwią zano z wieloma stanami zapalnymi i nowotworowymi, takimi jak zawał mię śnia sercowego, astma, osłabienie mięśni, reumatoidalne zapalenie stawów, ostra białaczka limfocytów T, chłoniaki komórek B, przewlekła limfocytowa białaczka, rak okrężnicy, rak sutka i rak jajników (Heaney i in., Blood 87: 847-857, 1996). Podobnie, receptor zcytor17 ma podwyższony poziom w aktywowanych monocytach, a zatem receptor zcytor17 i/lub jego rozpuszczalne receptory moż na powiązać lub może on służyć jako znacznik dla zapalnych i nowotworowych stanów z tym związanych. Zcytor17lig, w tym cytotoksyczne koniugaty, można zatem stosować do wykrywania lub nakierowywania na takie tkanki i stany chorobowe.

Cząsteczki według niniejszego wynalazku mają szczególne zastosowanie w części monocytowo/makrofagowej układu odpornościowego. Znane są sposoby sprawdzania takiej aktywności. Np.

interferon gamma (ZFNy) jest silnym aktywatorem monojądrowych fagocytów. Np. wzrost ekspresji zcytor17 po aktywacji komórek THP-1 (ATCC nr TIB-202) interferonem gamma może sugerować, że ten receptor jest zaangażowany w aktywację monocytów. Monocyty są niezupełnie zróżnicowanymi komórkami, które migrują do różnych tkanek, gdzie dojrzewają i stają się makrofagami. Makrofagi grają główną rolę w odpornościowej reakcji prezentując antygen limfocytom i grają pomocniczą rolę

PL 211 833 B1 jako pomocnicze komórki dla limfocytów, wydzielając liczne cytokiny. Makrofagi mogą internalizować pozakomórkowe cząsteczki i po aktywacji mają zwiększoną zdolność zabijania wewnątrzkomórkowych mikroorganizmów i komórek nowotworowych. Aktywowane makrofagi są również zaangażowane w stymulację ostrego lub lokalnego zapalenia. Ponadto wykazano, ż e funkcja monocytów-makrofagów jest nienormalna w wielu stanach chorobowych, np. patrz Johnston, RB, New Eng. J. Med. 318: 747-752, 1998.

Specjalista w dziedzinie zauważy, że związki agonistyczne receptora zcytor17, takie jak zcytor17lig, są przydatne. Np. stwierdzono zahamowaną migrację monocytów w populacjach z predyspozycją do infekcji, takich jak noworodki, pacjenci przyjmujący kortykosterydy lub inną immunosupresyjną terapię i pacjenci z cukrzycą, oparzeniami lub AIDS. Związki agonistyczne dla zcytor17, takie jak zcytor17lig, mogą spowodować wzrost zdolności monocytów do migracji i zapewne zapobiegać infekcji w tych populacjach. Istnieje również głęboki defekt zabijania fagocytów przez monojądrowe fagocyty od pacjentów z przewlekłą chorobą ziarninową. Powoduje to powstawanie podskórnych ropni, jak też ropni w wątrobie, płucach, śledzionie i węzłach limfatycznych. Agonista receptora zcytor17, taki jak zcytor17lig, może skorygować lub poprawić ten fagocytowy defekt. Ponadto, wadliwą cytotoksyczność monocytów opisano u pacjentów z rakiem i zespołem Wiskott-Aldrich (egzema, trombocytopenia i nawracające infekcje). Aktywacja monocytów przez zwią zki agonistyczne receptora zcytor17, takie jak zcytor17lig, może pomóc w terapii tych stanów. Układ monocyt-makrofag jest silnie zaangażowany w kilka chorób magazynowania lipidów (sfingolipidoz) takich jak choroba Gauchera. Oporność na infekcję może być upośledzona ze względu na defekt w funkcji makrofagów, który można leczyć agonistami receptora zcytor17, takimi jak zcytor17lig.

Ponadto, specjalista w dziedzinie zauważy, że związki antagonistyczne zcytor17lig są przydatne. Np. w zmianach miażdżycowych tętnic, jedną z pierwszych nienormalności jest lokalizacja monocytów/makrofagów w komórkach śródbłonka. Takim zmianom można zapobiegać stosując związki antagonistyczne zcytor17lig. Przeciwciała anty-zcytor17lig (np. przeciwciało neutralizujące zcytor17lig), rozpuszczalne receptory, heterodimery i multimery zcytor17 i partnerów wiązania zcytor17lig może również użyć jako związki antagonistyczne zcytor17lig. Ponadto, białaczka monoblastyczna jest związana z wieloma klinicznymi nienormalnościami, które odzwierciedlają uwalnianie biologicznych produktów makrofagów, a przykłady obejmują wysoki poziomy lizozymu w surowicy i moczu i wysokie gorączki. Ponadto, takie białaczki wykazują nienormalny wzrost monocytowych komórek. Tym efektom można zapewne zapobiegać przy pomocy antagonistów zcytor17lig, takich jak opisano w wynalazku. Ponadto, anty-zcytor17lig można sprzęgać z cząsteczkami, takimi jak toksyczne ugrupowania i cytokiny, jak opisano w wynalazku, dla skierowania na zabijanie białaczkowych monocytycznych komórek.

Stosując sposoby znane w dziedzinie i ujawnione w wynalazku, specjalista może łatwo ocenić aktywność agonistów i antagonistów zcytor17lig w stanach chorobowych ujawnionych w wynalazku, zapaleniu, chorobach odpornościowych (np. autoalergii), raku lub infekcji, jak też innych stanach chorobowych angażujących monocytowe komórki. Ponadto, ponieważ zcytor17lig ulega ekspresji w sposób jak w limfocytach T, makrofagach i monocytach i takie choroby obejmują nienormalności w monocytowych komórkach, takie jak proliferacja komórek, funkcja, lokalizacja i aktywacja, polinukleotydy, polipeptydy i przeciwciała według niniejszego wynalazku można stosować jako środki diagnostyczne do wykrywania takich nienormalności komórek monocytowych i wskazywania obecności choroby. Takie sposoby obejmują pobieranie biologicznej próbki od pacjenta, takiej jak krew, ślina lub biopsja i porównanie jej z normalną kontrolną próbką. Histologiczne, cytologiczne, cytometryczne przepływowe, biochemiczne i inne sposoby można stosować dla określenia względnych poziomów lub lokalizacji zcytor17lig lub komórek eksprymujących zcytor17lig, to jest monocytów, w próbce pacjenta porównanie jej z normalną kontrolną próbką. Zmiana poziomu (wzrost lub spadek) ekspresji zcytor17lig lub zmiana liczby lub lokalizacji monocytów (np. wzrost lub infiltracja monocytowych komórek w tkankach, gdzie nie są one normalnie obecne) w porównaniu z kontrolną będzie wskaźnikiem choroby. Takie diagnostyczne sposoby mogą również obejmować użycie radiometrycznych, fluorescencyjnych i kolorymetrycznych znaczników związanych z polinukleotydami, polipeptydami lub przeciwciałami według niniejszego wynalazku. Takie sposoby są dobrze znane w dziedzinie i ujawnione w wynalazku.

Sekwencje aminokwasowe mające aktywność zcytor17lig można stosować do modulowania układu odpornościowego przez wiązanie receptora zcytor17, a więc zapobiegania wiązania zcytor17lig z endogennym receptorem zcytor17lig. Związki antagonistyczne zcytor17lig, takie jak przeciwciała anty-zcytor17lig, można również stosować do modulowania układu odpornościowego przez ha46

PL 211 833 B1 mowanie wiązania zcytor17lig z endogennym receptorem zcytor17lig. Odpowiednio, niniejszy wynalazek obejmuje zastosowanie białek, polipeptydów i peptydów mających aktywność zcytor17lig (takich jak polipeptydy zcytor17lig, analogi zcytor17lig (np. przeciwciała antyidiotypowe anty-zcytor17lig) i fuzyjne białka zcytor17lig) wobec osobnika, któremu brakuje odpowiedniej ilości tego polipeptydu lub który wytwarza nadmiar zawierającego zcytor17 receptora (receptorów). Związki antagonistyczne zcytor17 (np. przeciwciałami anty-zcytor17) można również stosować do traktowania osobnika, który wytwarza nadmiar zcytor17lig lub zawierającego Zcytor17 receptora (receptorów). Odpowiedni pacjenci obejmują ssaki, takie jak ludzie.

Wykazano, że zcytor17lig eksprymuje aktywowane monojądrowe komórki i może być zaangażowany w regulowanie zapalenia. Jako takie, polipeptydy według niniejszego wynalazku mogą być testowane i stosowane dla ich zdolności do modyfikowania zapalenia lub można je stosować jako znaczniki zapalenia. Sposoby określania prozapalnej i antyzapalnej jakości zcytor17lig są znane w dziedzinie i omówione w wynalazku. Ponadto, może być zaangażowany w regulację w górę wytwarzania reagentów ostrej fazy, takich jak amyloid surowicy A (SAA), alantychymotrypsyna i haptoglobina i ekspresja receptora ligandu zcytor17 może być zwiększona po zastrzyku lipopolisacharydu (LPS) in vivo, który jest zaangażowany w zapalną reakcję (Dumoutier, L. i in., Proc. Nat'l. Acad. Sci. 97: 10144-10149, 2000). Wytwarzanie białek ostrej fazy, takich jak SAA, jest uważany za krótkoterminowy mechanizm przeżyciowy, w którym zapalenie jest korzystne; jednakże, podtrzymywanie białek ostrej fazy przez dłuższe okresy powoduje przewlekłe zapalenie i może być szkodliwe dla zdrowia człowieka. Przegląd podaje Uhlar, CM i Whitehead, AS, Eur. J. Biochem. 265: 501-523, 1999, i Baumann H. i Gauldie, J. Immunology Today 15: 74-80, 1994. Ponadto, białko ostrej fazy SAA jest zaangażowane w patogenezę kilku przewlekłych zapalnych chorób, jest zaangażowane w miażdżycę tętnic i reumatoidalne zapalenie stawów, i jest prekursorem amyloidowego białka A odkładanego przy skrobiawicy (Uhlar, CM i Whitehead, supra). Tak więc, gdy ligand, taki jak zcytor17lig, który działa jako prozapalna cząsteczka i indukuje wytwarzanie SAA, związki antagonistyczne będą przydatne w leczeniu zapalnej choroby i innych chorób związanych z białkami ostrej fazy reakcji indukowanymi przez ligand. Takie związki antagonistyczne są dostarczane w niniejszym wynalazku. Np. sposób osłabiania zapalenia obejmuje podawanie ssakowi z zapaleniem ilości kompozycji zcytor17lig lub przeciwciała antyzcytor17lig (np. neutralizującego przeciwciała), która jest dostateczna do osłabienia zapalenia. Ponadto, sposób hamowania zapalnej reakcji u ssaka z zapaleniem może obejmować:

(1) określanie poziomów białka amyloidu A surowicy;

(2) podawanie kompozycji zawierającej polipeptyd zcytor17lig lub przeciwciało anty-zcytor17lig, jak opisano w wynalazku, w dopuszczalnym farmaceutycznia nośniku;

(3) określenie poziomu białka amyloidu A surowicy po podawaniu;

(4) porównanie poziomu białka amyloidu A surowicy w etapie (1) z poziomem białka amyloidu A surowicy w etapie (3), gdzie brak wzrostu lub spadek poziomu białka amyloidu A surowicy wskazuje na tłumienie zapalnej reakcji.

Receptory wiążące zcytor17lig według niniejszego wynalazku obejmują co najmniej jedną podjednostkę receptora zcytor17. Drugi receptorowy polipeptyd obejmowany heterodimerycznym rozpuszczalnym receptorem należy do podrodziny receptorów, która obejmuje klasę I podjednostek receptora cytokiny i konkretniej OSMRbeta i WSX-1. Według niniejszego wynalazku, poza monomerycznym lub homodimerycznym receptorem polipeptydu zcytor17, heterodimeryczny rozpuszczalny receptor zcytor17, jak przedstawiono w odmianie zawierającej rozpuszczalny receptor zcytor17 + rozpuszczalny klasy I składnik heterodimerycznego receptora, taki jak OSMRbeta lub WSX-1, może działać jako antagonista zcytor17lig. Inne odmiany obejmują rozpuszczalne multimeryczne receptory zawierające zcytor17, takie jak receptor zcytor17 + rozpuszczalny klasy I składnik multimerycznego receptora, taki jak OSMRbeta i WSX-1.

Jak dla zcytor17lig, analiza rozmieszczenia tkankowego mRNA odpowiadającego jego CDNA receptora zcytor17 wykazała, że poziom mRNA był najwyższy w monocytach i komórkach stercza i jest podwyższony w aktywowanych monocytach i aktywowanych CD4+, aktywowanych CD8+ i aktywowanych CD3+ komórkach. Zatem, receptor zcytor17 jest również zaangażowany w indukowanie zapalnych i odpornościowych reakcji. Tak więc, konkretne odmiany niniejszego wynalazku są skierowane na stosowanie przeciwciał zcytor17lig i zcytor17lig, jak też rozpuszczalnych heterodimerów receptora zcytor17 jako antagonistów w chorobach zapalnych i odpornościowych lub stanach, takich jak zapalenie trzustki, cukrzyca typu I (IDDM), rak trzustki, zapalenie trzustki, choroba Gravesa, zapalna choroba jelit (IBD), choroba Crohna, rak okrężnicy i jelit, uchyłkowatość, autoalergia, posocznica,

PL 211 833 B1 transplant narządu lub szpiku kostnego; zapalenie spowodowane urazem, zabiegiem chirurgicznym lub infekcją; skrobiawica; splenomegalia; reakcja przeszczepu przeciw gospodarzowi; i przy inhibicji zapalenia, tłumieniu odporności, osłabianiu proliferacji komórek krwiotwórczych, odpornościowych, zapalnych lub limfocytów, makrofagów, komórek T (w tym komórek Th1 i Th2, komórki CD4+ i CD8+), tłumieniu odpornościowej reakcji na patogen lub antygen. Ponadto, obecność ekspresji receptora zcytor17 i zcytor17lig w aktywowanych odpornościowych komórkach, takich jak aktywowane komórki CD3+, monocyty, komórki CD4+ i CD19+ pokazała, że receptor zcytor17 może być zaangażowany w odpornoś ciowe obronne reakcje ciał a przeciwko obcym napastnikom, takim jak mikroorganizmy i resztki komórek, i mo ż e grać rolę w odpornoś ciowych reakcjach podczas zapalenia i powstawania raka. Jako takie, zcytor17lig i przeciwciała zcytor17lig według niniejszego wynalazku, które są agonistyczne lub antagonistyczne wobec funkcji receptora zcytor17, można stosować do modyfikowania odpornościowej reakcji i zapalenia.

Ponadto, polipeptydy zcytor17lig, które wiążą polipeptydy receptora zcytor17 i ich przeciwciała, są przydatne do:

1) Antagonizowania lub blokowania sygnalizacji przez zawierające zcytor17 receptory w leczeniu ostrego zapalenia, zapalenie wskutek urazu, uszkodzenia tkanki, operacji chirurgicznej, posocznicy lub infekcji i przewlekłych zapalnych chorób, takich jak astma, zapalna choroba jelit (IBD); przewlekłe zapalenie okrężnicy, splenomegalia, reumatoidalne zapalenie stawów, nawracające ostre zapalne epizody (np. gruźlica) oraz leczenia skrobiawicy i miażdżycy tętnic, choroby Castlemana, astmy i innych chorób związanych z indukcją reakcji ostrej fazy.

2) Antagonizowania lub blokowania sygnalizacji przez receptor zcytor17 w leczeniu autoalergii, takich jak IDDM, stwardnienia rozsianego (MS), układowego tocznia rumieniowatego (SLE), osłabienia mięśni, reumatoidalnego zapalenia stawów i IBD, dla zapobiegania lub hamowania sygnalizacji w odpornościowych komórkach (np. limfocytach, monocytach, leukocytach) przez receptor zcytor17 (Hughes C i in., J. Immunol 153: 3319-3325, 1994). Alternatywnie, przeciwciała, takie jak monoklonalne przeciwciała (MAb) wobec zcytor17lig, można również stosować jako antagonistów do usuwania niechcianych odpornościowych komórek przy leczeniu autoalergii. Astma, alergia i inne atopowe choroby można potraktować MAb przeciwko, np. przeciwciału anty-zcytor17lig, rozpuszczalnemu receptorowi zcytor17, rozpuszczalnym receptorom lub heterodimerom zcytor17/CRF2-4, dla hamowania odpornościowej reakcji lub usuwania szkodliwych komórek. Blokowanie lub hamowanie sygnalizacji przez zcytor17, z użyciem polipeptydów i przeciwciał według niniejszego wynalazku, może również być korzystne przy chorobach trzustki, nerki, przysadki i komórek nerwowych. Korzyści odniesie się przy IDDM, NIDDM, zapaleniu trzustki i raku trzustki. Zcytor17 może służyć jako cel dla terapii raka Mab, gdzie antagonizowanie MAb hamuje wzrost raka i nakierowuje się na mediowane odpornościowe zabijanie (Holliger P. i Hoogenboom, H.: Nature Biotech. 16: 1015-1016, 1998). Mab wobec rozpuszczalnych monomerów, homodimerów, heterodimerów i multimerów receptora zcytor17 może również być przydatny do leczenia nefropatii, takich jak stwardnienie kłębków nerkowych, błonowej neuropatii, skrobiawicy (która również wpływa na nerki, pośród innych tkanek), stwardnienia tętnic nerkowych, zapalenia kłębków nerkowych o różnego pochodzenia, fibroproliferacyjnych chorób nerek, jak też dysfunkcji nerek związanej z SLE, IDDM, cukrzycą typu II (NIDDM), nowotworami nerek i innymi chorobami.

3) Agonizowania lub inicjowania sygnalizacji przez receptory zcytor17 w leczeniu autoalergii, takich jak IDDM, MS, SLE, osłabienie mięśni, reumatoidalne zapalenie stawów i IBD. Zcytor17lig może sygnalizować limfocytom lub innym odpornościowym komórkom o różnicowaniu, zmianie proliferacji, lub zmianie wytwarzania cytokin lub białek powierzchni komórki, które łagodzą autoalergię. Konkretnie, modulacja reakcji komórki pomocniczej T do alternatywnego wzoru sekrecji cytokin może zmienić reakcję autoalergiczną na łagodzenie choroby (Smith JA i in., J. Immunol. 160: 4 841-484 9,1998). Podobnie, zcytor17lig można stosować do sygnalizacji, usuwania i odchylania odpornościowych komórek zaangażowanych w astmę, alergię i atopową chorobę. Sygnalizacja przez receptor zcytor17 może również być korzystna w przypadku chorób trzustki, nerek; przysadki i komórek nerwowych. Korzyści odniesie się przy IDDM, NIDDM, zapaleniu trzustki i raku trzustki. Zcytor17 może służyć jako cel dla terapii MAb raka trzustki, gdzie sygnalizacja MAb hamuje wzrost raka i nakierowuje się na mediowane odpornościowe zabijanie (Tutt, AL i in., J. Immunol. 161: 3175-3185,1998). Podobnie, specyficzne dla limfocytu T białaczki, chłoniaki, dyskrazja komórek osocza (np. szpiczak mnogi) i rak moż na leczyć monoklonalnymi przeciwciał ami (np. neutralizują cym przeciwciał em) wobec zawierających zcy-tor17 rozpuszczalnych receptorów według niniejszego wynalazku.

PL 211 833 B1

Przeciwciała anty-zcytor17lig, rozpuszczalne receptory zcytor17, monomeryczne, homodimeryczne, heterodimeryczne i multimeryczne polipeptydy opisane w wynalazku można stosować do zobojętniania/blokowania aktywności receptora ligandu zcytor17 w leczeniu autoalergii, atopowej choroby, NIDDM, zapalenia trzustki i dysfunkcji nerki, jak opisano wyżej. Rozpuszczalną formę receptora zcytor17 można stosować do sprzyjania reakcji przeciwciała mediowanej komórką T i/lub do sprzyjania wytwarzaniu IL-4 lub innych cytokin przez limfocyty, lub inne odpornościowe komórki.

Przeciwciała anty-zcytor17lig, i rozpuszczalne zawierające zcytor17 receptory są przydatne jako związki antagonistyczne zcytor17lig. Takie antagonistyczne efekty można uzyskać przez bezpośrednie zobojętnianie lub wiązanie z jego naturalnym ligandem. Poza zastosowaniami antagonistycznymi, rozpuszczalne receptory mogą wiązać zcytor17lig i działać jako nośnik lub białka nośnikowe, dla transportowania zcytor17lig do różnych tkanek, narządów i komórek w ciele. Jako takie, rozpuszczalne receptory można kondensować lub sprzęgać z cząsteczkami, polipeptydami lub chemicznymi ugrupowaniami, które kierują kompleks rozpuszczalny receptor-ligand do specyficznego miejsca, takiego jak tkanka, specyficzna odpornościowa komórka, monocyty lub nowotwór. Np. w ostrej infekcji lub pewnych rakach, może być korzystna indukcja zapalenia i lokalne białka reakcji ostrej fazy. Tak więc, rozpuszczalne receptory opisane w wynalazku lub przeciwciała według niniejszego wynalazku można stosować do specyficznego kierowania działaniem prozapalnego ligandu zcytor17lig, patrz Cosman, D. Cytokine 5: 95-106,1993; i Fernandez-Botran, R. Exp. Opin. Invest. Drugs 9: 49T513, 2000.

Ponadto, można stosować rozpuszczalne receptory do stabilizacji zcytor17lig, w celu zwiększenia dostępności biologicznej, trwałości terapeutycznej i/lub skuteczności ligandu poprzez zabezpieczenie ligandu przed degradacją lub usuwaniem, lub ukierunkowanie ligandu na konkretne miejsce działania w organizmie. Przykładowo, naturalnie występujący kompleks IL-6/rozpuszczalny IL-6R stabilizuje IL-6 i może przekazywać sygnały za pośrednictwem receptora gp130, patrz Cosman, D., jak powyżej oraz Fernandez-Botran, R., jak powyżej. Ponadto, zcytor17 może łączyć się z ligandem pokrewnym takim jak własny ligand tworząc kompleks ligand/rozpuszczalny receptor. Takie kompleksy można stosować w celu wywołania odpowiedzi z komórek mających na swojej powierzchni podjednostkę receptora z tej samej rodziny. Swoistość komórkowa kompleksów receptor zcytor17/zcytor17lig może różnić się w stosunku do tej, obserwowanej przy podaniu samego ligandu. Ponadto, kompleksy te mogą charakteryzować się odmiennymi właściwościami farmakokinetycznymi, takimi, które wpływają na okres półtrwania, swoistość dawka/odpowiedź i organ lub tkanka. W związku z tym, kompleksy zcytor17/ligand mogą przejawiać działanie agonistyczne w zwiększaniu reakcji odpornościowej lub stymulacji komórek mesangium lub stymulacji komórek wątroby. Alternatywnie, podobny do reakcji na kompleksy IL6/IL6R efekt wywierany jest tylko na tkanki zawierające podjednostkę sygnałową zdolną do tworzenia heterodimerów z kompleksem (Hirota H. i in., Proc. Nat'l. Acad. Sci. 92: 4862-4866, 1995; Hirano, T. w Thomason, A. (ed.) „The Cytokine Handbook”, wyd. 3, str. 208-209).

Kompleksy rozpuszczalny receptor/cytokina dla IL12 i CNTF wykazują podobne działanie.

Zcytor17lig można również stosować w systemach diagnostycznych do wykrywania poziomów krążących ligandów i do wykrywania reakcji zapalnej stanu ostrego. W podobnej odmianie, w celu wykrycia krążących polipeptydów zcytor17lig można stosować przeciwciała lub inne czynniki łączące się swoiście z zcytor17lig i odwrotnie, można stosować sam zcytor17lig w celu wykrycia krążących lub polipeptydowych receptorów o działaniu miejscowym. Podwyższony lub obniżony poziom polipeptydów ligandu lub receptora może wskazywać na stany patologiczne, w tym zapalenie lub rak. Ponadto, stwierdzenie obecności białek ostrej fazy lub cząsteczek takich jak zcytor17lig może w pewnych stanach chorobowych wskazywać na przewlekły stan zapalny (np. reumatoidalne zapalenie stawów). Stwierdzenie takich stanów pomaga w ustaleniu diagnozy jak również ułatwia lekarzowi wybór odpowiedniego leczenia.

Polipeptydy i białka według wynalazku można również stosować ex vivo, na przykład w autologicznej hodowli szpiku. W skrócie, przed chemioterapią lub przeszczepem narządu od pacjenta pobiera się szpik kostny i poddaje się go działaniu zcytor17lig, ewentualnie w połączeniu z jedną lub więcej innych cytokin. Następnie, szpik podaje się ponownie pacjentowi po chemioterapii, aby przyspieszyć odnowę szpiku lub po przeszczepie, aby stłumić chorobę przeszczep przeciw gospodarzowi. Ponadto, białka według wynalazku można również stosować do namnażania ex vivo szpiku monocyty/makrofagi lub obwodowych prekursorów komórek krwi (PBPC). Przed poddaniem go działaniu zcytor17lig, szpik można stymulować czynnikiem wzrostowym komórek pnia (SCF) w celu uwolnienia do krążenia wczesnych komórek prekursorowych. Aby doprowadzić do zróżnicowania i proliferacji w hodowlach limfaPL 211 833 B1 tycznych o wysokiej gęstości, które następnie można podać ponownie pacjentowi po chemoterapii lub przeszczepie, prekursory te można zebrać i zagęścić z krwi obwodowej, następnie w hodowli poddać działaniu zcytor17lig, ewentualnie w połączeniu z jedną lub więcej innych cytokin, obejmujących ale nie ograniczonych do SCF, IL-2, IL-4, IL-7, Lif, IL-3, IL-12, IL-21 lub IL-15.

Przedmiotem wynalazku jest sposób namnażania komórek krwiotwórczych i prekursorów komórek krwiotwórczych poprzez łączenie szpiku kostnego lub krwinek obwodowych z kompozycją zawierającą wystarczającą ilość zcytor17lig do spowodowania wzrostu liczby limfocytów w szpiku kostnym lub krwinek obwodowych w porównaniu z szpikiem kostnym lub krwinkami obwodowymi hodowanymi bez obecności zcytor17lig. W innych odmianach, komórki krwiotwórcze i krwiotwórcze komórki prekursorowe są limfocytami. W kolejnej odmianie, limfocyty są komórkami NK lub cytotoksycznymi limfocytami T. Ponadto, kompozycja może również obejmować co najmniej jedną inną cytokinę wybraną z grupy obejmują cej IL-2, IL-15, IL-4, Lif, IL-3, IL-12, IL-21, GM-CSF, ligand Flt3 i czynnik wzrostu komórek pnia.

Alternatywnie, zcytor17lig może aktywować układ odpornościowy, co byłoby istotne w zwiększaniu odporności na choroby zakaźne, w leczeniu pacjentów z niedoborem odporności, takich jak pacjenci HIV+, pacjenci nowotworowi lub w ulepszaniu szczepionek. W szczególności, pobudzanie lub namnażanie monocytów/makrofagów, limfocytów T, limfocytów B, komórek NK lub ich prekursorów przez zcytor17lig, znalazłoby zastosowanie w leczeniu zakażeń wirusowych oraz jako czynnik przeciwnowotworowy.

Podobnie, pobudzanie reakcji odpornościowej przez zcytor17lig przeciwko wirusowym i nie wirusowym czynnikom chorobotwórczym (w tym bakteriom, pierwotniakom i grzybom) znalazłoby zastosowanie w leczeniu takich zakażeń poprzez hamowanie wzrostu takich czynników zakaźnych. Za pomocą wielu znanych w dziedzinie i opisanych tutaj sposobów można bezpośrednio lub pośrednio określić poziom patogenu lub antygenu, takiego jak komórka nowotworowa, obecnego w organizmie.

Wynalazek ten obejmuje sposób pobudzania reakcji odpornościowej u ssaka wystawionego na działanie antygenu lub patogenu, na który składają się następujące etapy:

(1) bezpośrednie lub pośrednie określanie poziomu antygenu lub patogenu obecnego u tego ssaka;

(2) podawanie kompozycji zawierającej polipeptyd zcytor17lig w dopuszczalnym farmaceutycznie nośniku;

(3) bezpośrednie lub pośrednie określanie poziomu antygenu lub patogenu u tego ssaka; i (4) porównywanie poziomu antygenu lub patogenu z etapu 1 do poziomu antygenu lub patogenu z etapu 3, gdzie zmiana w poziomie wskazuje na pobudzanie reakcji odpornościowej.

W innej odmianie, kompozycję zawierają c ą zcytor17lig podaje się ponownie. W innych odmianach, antygen oznacza guz z komórek B; wirus; pasożyt lub bakterię.

W innym aspekcie, przedmiotem wynalazku jest sposób pobudzania reakcji odpornościowej u ssaka wystawionego na działanie antygenu lub patogenu, na który sk łada się:

(1) określenie poziomu przeciwciała swoistego dla antygenu lub patogenu;

(2) podania kompozycji zawierającej polipeptyd zcytor17lig w dopuszczalnym farmaceutycznie nośniku;

(3) ponownego określenie poziomu przeciwciała swoistego dla antygenu lub patogenu;

(4) porównania poziomu przeciwciała z etapu (1) do poziomu przeciwciała z etapu (3), przy czym wzrost poziomu przeciwciała wskazuje na pobudzenie reakcji odpornościowej.

Polinukleotydy kodujące polipeptydy zcytor17lig są przydatne w zastosowaniu terapii genowej, w której pożądane jest zwię kszenie lub hamowanie aktywnoś ci zcytor17lig. Jeś li u ssaka znajduje się zmutowany gen zcytor17lig lub go brak, gen zcytor17lig można wprowadzić do komórek ssaka. W jednej odmianie, gen kodują cy polipeptyd zcytor17lig wprowadza się in vivo za pomocą wektora wirusowego. Takie wektory obejmują atenuowany lub wadliwy wirus DNA, taki jak, ale nie tylko, wirus opryszczki pospolitej (HSV), wirus brodawczaka, wirus Epsteina Barra (EBV), adenowirus, wirus związany z gruczolakiem (AAV) i tym podobne. Korzystne są wadliwe wirusy, całkowicie lub niemal całkowicie pozbawione genów wirusowych. Wadliwy wirus nie jest zakaźny po wprowadzeniu do komórki. Zastosowanie wadliwych wirusów jako wektorów pozwala na podawanie materiału do komórek w konkretny, umiejscowiony obszar, bez obawy o zakażenie wektorem innych komórek. Przykłady konkretnych wektorów obejmują między innymi wadliwy wirus opryszczki pospolitej 1 (HSV1) jako wektor (Kaplitt i in., Molec. Cell. Neurosci. 2: 320-30, 1991); atenuowany adenowirus jako wektor, taki jak wektor opisany przez Stratford-Perricaudet i in., J. Clin. Invest. 90: 626-30, 1992; i wadliwy wirus

PL 211 833 B1 związany z gruczolakiem jako wektor (Samulski i in., J. Virol. 61: 3096-101, 1987; Samulski i in., J. Virol. 63: 3822-8, 1989).

Gen zcytor17lig można wprowadzić za pomocą wektora retrowirusowego, np. jak opisano w: Anderson i in., w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5 399 346; Mann i in. Cell 33: 153, 1983; Temin i in. w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 650 764; Temin i in. w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 980 289; Markowitz i in., J. Virol. 62: 1120, 1988; Temin i in. w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5 124 263; International Patent Publication nr WO 95/07358, opublikowanym 16 marca, 1995 przez Dougherty i in.; oraz Kuo i in., Blood 82: 845, 1993. Alternatywnie, wektor można wprowadzić przez lipofekcję in vivo z zastosowaniem liposomów. W celu przygotowania liposomów do transfekcji in vivo genu kodują cego marker, można stosować syntetyczne lipidy kationowe (Felgner i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-7, 1987; Mackey i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8027-31, 1988). Stosowanie lipofekcji do wprowadzenia egzogennych genów do konkretnych narządów in vivo ma pewne zalety praktyczne. Kierowanie na poziomie molekularnym liposomów do konkretnych komorek stanowi jeden obszar korzyści. Konkretniej, kierowanie transfekcji na konkretne komórki stanowi jeden obszar korzyści. Na przykład, kierowanie transfekcji na konkretne typy komórek byłoby szczególnie korzystne w tkance niejednorodnej komórkowe, takiej jak układ odpornościowy, trzustka, wątroba, nerka i mózg. Aby ukierunkować lipidy można je sprzęgać chemicznie z innymi cząsteczkami. Docelowe peptydy (np. hormony lub neuroprzekażniki), białka, takie jak przeciwciała lub cząsteczki niepeptydowe można sprzęgać z liposomami chemicznie.

Istnieje możliwość usunięcia komórek docelowych z organizmu; wprowadzenia wektora w postaci plazmidu z nagą nicią DNA; następnie ponownie wszczepić transformowane komórki do organizmu. Wektory z nagą nicią DNA do terapii genowej można wprowadzić do pożądanych komórek gospodarza sposobami znanymi w dziedzinie, np. przez transfekcję, elektroporację, mikroiniekcję, transdukcję, fuzję komórkową, dekstran DEAE, wytrącanie fosforanu wapnia, za pomocą strzelby genowej lub transportera wektorów DNA, patrz np. Wu i in., J. Biol. Chem. 267: 963-7, 1992; Wu i in., J. Biol. Chem. 263: 14621-4, 1988.

W celu hamowania transkrypcji genu zcytor17lig można stosować metodologię antysensowną tak, aby zahamować proliferację komórek in vivo. Polinukleotydy komplementarne do segmentu polinukleotydu kodującego zcytor17lig (np. polinukleotyd, jak przedstawiono w SEQ ID NO: 1) są zaprojektowane aby łączyć się z mRNA kodującym zcytor17lig i aby hamować translację takiego mRNA. Takie polinukleotydy antysensowe stosuje się do hamowania ekspresji genów kodujących polipeptyd zcytor17lig w hodowli komórkowej lub u żywego osobnika.

Można również uzyskać modyfikowane genetycznie myszy, u których zachodzi ekspresja genu zcytor17lig, określane jako „myszy transgeniczne” oraz myszy charakteryzujące się całkowitym brakiem funkcji genu zcytor17lig, określane jako „myszy knockout” (Snouwaert i in., Science 257: 1083, 1992; Lowell i in., Nature 366: 740-42, 1993; Capecchi, M. R., Science 244: 1288-1292, 1989; Palmiter, R. D. i in. Annu Rev Genet. 20: 465-499, 1986). Przykładowo, do odpowiedzi na pytanie, czy nadmierna ekspresja znajduje odzwierciedlenie w fenotypie można stosować myszy transgeniczne, u których zachodzi nadmierna ekspresja zcytor17lig, we wszystkich tkankach lub zależ nie od wystę powania specyficznego dla tkanki lub ograniczonego do określonej tkanki promotora. Przykładowo, nadmierna ekspresja dzikiego typu polipeptydu zcytor17lig, fragmentu polipeptydu lub jego zmutowanego odpowiednika może zaburzyć prawidłowe procesy komórkowe, konsekwencją czego jest fenotyp identyfikujący tkankę, w której ekspresja zcytor17lig jest funkcjonalnie istotna i może wykazać cel terapeutyczny dla zcytor17lig, jego agonistów lub antagonistów. Przykładowo, korzystną myszą transgeniczną jest taka, u której nadmiernej ekspresji ulega zcytor17lig (reszty aminokwasowe 23-164 z SEQ ID NO: 2; lub 24-163 z SEQ ID NO: 11). Ponadto, ta nadmierna ekspresja moż e prowadzić do fenotypu, który wykazuje podobieństwo do chorób ludzkich. Podobnie, do określenia miejsc gdzie zcytor17lig jest niezbędnie wymagany in vivo, można stosować myszy knockout pod względem zcytor17lig. Fenotyp myszy knockout można przewidzieć na podstawie działania in vivo jakie może przejawiać antagonista zcytor17lig, taki jak te opisane tutaj. W celu stworzenia myszy knockout można stosować opisane tutaj cDNA ludzkiego lub mysiego zcytor17lig. Myszy te mogą znaleźć zastosowanie w badaniu genu zcytor17lig i kodowanego przez niego białka w układzie in vivo oraz jako modele in vivo odpowiednich ludzkich chorób. Ponadto, analogicznie do myszy transgenicznych opisanych powyżej, można stosować ekspresję przez myszy transgeniczne polinukleotydów antysensowych

PL 211 833 B1 zcytor17lig lub enzymów rybosomalnych skierowanych przeciwko zcytor17lig. Dodatkowo, można przeprowadzić badania poprzez podawanie oczyszczonego białka zcytor17lig.

Wyniki doświadczeń sugerują, że zcytor17lig odgrywa rolę w postępowaniu chorób dotyczących skóry lub nabłonka powierzchni wewnętrznych, takich jak, na przykład, jelito grube, jelito cienkie, trzustka, płuco, gruczoł krokowy, macica i tym podobne. Po pierwsze, jak ujawniono, receptory zcytor17, w tym zarówno OSM receptor beta, jak i zcytor17, ulegają ekspresji w kilku typach komórek zlokalizowanych na powierzchniach nabłonka, w tym linie komórkowe z nabłonka płuc, fibroblastów płuc, gruczołu krokowego, jelita grubego, piersi, nabłonka wątroby, kości i nabłonka skóry, fibroblastów kości i tym podobnych. Ponadto, jak ujawniono, przykłady każdego z tych typów komórek również wykazywały odpowiedź na aktywację konstrukcji reportera STAT przez zcytor17lig. Ponadto, kilka linii komórkowych przejawiało odpowiedź na stymulację zcytor17lig powodując wzrost poziomu IL-6, IL-8, MCP-1 (czynnik chemotaktyczny) jak tu opisano. Ogólnie rzecz biorąc, dane te wskazują na rolę zcytor17lig w chorobach dotyczących nabłonka, takich jak, na przykład, atopowe zapalenie skóry; zapalenie skóry; łuszczyca; łuszczycowe zapalenie stawów; wyprysk; zapalenie dziąseł; paradontoza; przewlekłe choroby zapalne jelit (IBD) (np. wrzodziejące zapalenie okrężnicy, choroba Crohna); zaburzenie dotyczące narządów płciowych, takie jak, na przykład, dysplazja szyjki macicy, rak szyjki macicy; inne choroby skóry, takie jak nowotwory: mięsaki; raki; czerniaki, itd., nie tylko choroby zapalne, ze względu na fakt, że układ odpornościowy jest zaangażowany w aktywowanie/zwalczanie nowotworów; choroby dotyczące zaburzeń barier ochronnych, takie jak, na przykład, choroba przeszczep przeciw gospodarzowi (GVHD) i zespół nadwrażliwości jelita grubego (IBS); oraz choroby dotyczące nabłonka płuc, takie jak astma, rozedma i tym podobne. Ponadto, uwalnianie cytokin IL-6, IL-8 i MCP-1 przez komórki wystawione na działanie zcytor17lig sugeruje, że zcytor17lig odgrywa rolę w zapaleniu. Dlatego też regulacja zcytor17lig może być przydatna w leczeniu chorób autoimmunologicznych, zapalnych lub nowotworowych dotyczących tkanek, w których zachodzi ekspresja receptora. Choroby te obejmują np. zapalenie gruczołu krokowego, zapalenie wątroby, zapalenie stawów i kości i tym podobne. Zcytor17lig może wywierać dodatni lub ujemny, bezpośredni lub pośredni wpływ na te choroby. Dlatego też, podawanie zcytor17lig można stosować w leczeniu opisanych tu chorób bezpośrednio lub za pomocą cząsteczek, które hamują aktywność zcytor17lig w tym np. zarówno przeciwciała monoklonalne zcytor17lig lub przeciwciała monoklonalne zcytor17 lub przeciwciała monoklonalne rozpoznające kompleks zcytor17 i receptor beta OSM.

Dane wskazują również, że zcytor17lig może brać udział w regulacji chorób TH2 za pośrednictwem limfocytów T. Po pierwsze, zcytor17lig jest wytwarzany przez podgrupę TH2 aktywowanych komórek T. Komórki TH2 eksprymują więcej zcytor17lig w porównaniu z komórkami TH1. Ponadto, w celu zwiększenia ilości mRNA receptora IL13 alpha-2 w odpowiedzi na opisaną tu stymulację ligandu zcytolT stymulowano co najmniej dwie linie komórkowe nabłonka płucnego (SK-LU-1, A549). Istnieje związek pomiędzy łańcuchem alpha2 receptora IL-13 powstawaniem raka piersi i guzów trzustki u ludzi. Sugeruje to, że zcytor17lig może odgrywać rolę w regulacji powstawania tych typów raków, jak również innych nowotworów. Dlatego też, podawanie antagonisty zcytor17lig lub bezpośrednie zastosowanie zcytor17lig mogą być przydatne w leczeniu tych typów nowotworów, łagodnych lub złośliwych w różnych stopniach (stopnie I-IV) i różnych stadiach (np. metody klasyfikacji TNM lub AJC) rozwoju guza, u ssaków, korzystnie u ludzi.

Jest rzeczą wiadomą w dziedzinie, że IL13 przyczynia się do powstawania aktywowanych komórek TH2 i bierze udział w chorobach wywoływanych za pośrednictwem TH2, takich jak astma, atopowe zapalenie skóry i tym podobne. Antagoniści zcytor17lig lub zcytor17lig mogą być przydatni w leczeniu chorób dotyczących komórek T typu TH2. Dotyczy to takich chorób jak, na przykład, atopowe zapalenie skóry, astma, jak też inne choroby, które ulegają zaostrzeniu przez aktywowane komórki TH2. Na udział zcytor17lig w chorobach, takich jak, na przykład, atopowe zapalenie skóry, wskazuje również fenotyp myszy transgenicznych, u których zachodzi nadmierna ekspresja zcytor17lig, które przejawiają objawy atopowego zapalenia skóry, jak opisano.

Pomimo preferencyjnej ekspresji zcytor17lig przez komórki TH2, w pewnym stopniu istnieje ekspresja zcytor17lig w komórkach TH1 i w komórki T typu CD8+. Dlatego też, zcytor17lig lub jego antagoniści mogą być przydatne w leczeniu chorób dotyczących modulacji odporności przez aktywowane komórki T, w tym np. zakażeń wirusowych, nowotworów, odrzucania przeszczepu i tym podobnych.

Zcytor17lig może również brać udział w rozwoju nowotworu. Ekspresja receptorów zcytor17 i OSM beta zachodzi w kostniakomięsakach fibroblastów kostnych u człowieka, ludzkim czerniaku fibroblastów skóry, raku nabłonka jelita grubego, gruczolakoraku, gruczolakoraku nabłonka gruczołu

PL 211 833 B1 sutkowego, gruczolakomięsaku nabłonka gruczołu krokowego oraz gruczolakoraku i raku płuc. Dlatego też, przydatne może być leczenie za pomocą zcytor17lig, jego fragmentów lub antagonistów zcytor17lig guzów pochodzenia nabłonkowego, do których należą między innymi rak, gruczolakorak i czerniak. Niemniej jednak, w leczeniu raka lub łagodzeniu jednego lub więcej objawów raka można stosować zcytor17lig lub antagonistę zcytor17lig, dotyczy to raków obejmujących, ale nie ograniczonych do takich jak rak płaskokomórkowy lub naskórkowy, rak podstawnokomórkowy, gruczolakorak, rak brodawczakowaty, torbielakogruczoloakorak, rak oskrzelopochodny, gruczolak oskrzeli, czerniak, rak jasnokomórkowy nerek, rak wątrobowokomórkowy, rak z nabłonka przejściowego, nabłoniak kosmówkowy złośliwy, nasieniak, rak zarodkowy, złośliwy mieszany guz pochodzący z gruczołów ślinowych, guz Wilmsa, potworniak zarodkowy, potworniak złośliwy i inne guzy składające się, co najmniej w części, z komórek pochodzenia nabłonkowego.

Ogólnie, dawkowanie podawanego polipeptydu zcytor17lig (lub analogu zcytor17 lub białka fuzyjnego) będzie różne w zależności od takich czynników jak wiek, masa ciała, wzrost, płeć, stan ogólny i historia choroby pacjenta. Zazwyczaj, pożądane jest zapewnienie pacjentowi takiego dawkowania polipeptydu zcytor17lig, które mieści się w zakresie od około 1 pg/kg do 10 mg/kg (ilość środka/masa ciała pacjenta), chociaż, zależnie od okoliczności, można też podać mniejszą lub większą dawkę. Za pomocą sposobów znanych w dziedzinie, fachowiec łatwo określi taką dawkę i ustali jej regulację.

Podawanie polipeptydu zcytor17lig pacjentowi może być miejscowe, wziewne, dożylne, dotętnicze, dootrzewnowe, domięśniowe, podskórne, doopłucnowe, dotchawicze, za pomocą perfuzji przez miejscowy cewnik lub przez bezpośrednie wstrzyknięcie do zmienionego obszaru. Podawanie białek leczniczych przez wstrzyknięcie można przeprowadzić jako wlew ciągły lub jako pojedynczy lub wielokrotne bolusy.

Dodatkowe drogi podawania obejmują doustnie, przez błonę śluzową, do płuc i przezskórnie. Podawanie doustne jest odpowiednie dla mikrosfer poliestrowych, mikrosfer zeinowych, mikrosfer białkowych, mikrosfer policyjanoakrylowych i układów lipidowych (patrz np. DiBase i Morrel, „Oral Delivery of Microencapsulated Proteins” w Protein Delivery: Physical Systems, Sanders i Hendren (ed.), str. 255-288 (Plenum Press 1997)). Możliwość podawania drogą donosową jest zilustrowana na przykładzie takiego sposobu podawania insuliny (patrz np. Hinchcliffe i Illum, Adv. Drug Deliv. Rev. 35: 199 (1999)). Suche lub płynne cząstki, z jakich składa się zcytor17lig można wytworzyć i podawać wziewnie za pomocą rozpraszaczy suchego proszku, urządzeń wytwarzających płynny aerozol lub nebulizatorów (np. Pettit i Gombotz, TIBTECH 16: 343 (1998); Patton i in., Adv. Drug Deliv. Rev. 35: 235 (1999)). Technika ta jest zilustrowana na przykładzie systemu do leczenia cukrzycy AERX, na który składa się trzymany w ręku elektroniczny inhalator dostarczający rozpyloną insulinę do płuc. Badania wykazały, że białka o tak dużych cząsteczkach jak 48000 kDa podawano przez skórę w stężeniach terapeutycznych przy pomocy fal ultradźwiękowych o małej częstotliwości, co ilustruje możliwość podawania przezskórnego (Mitragotri i in., Science 269: 850 (1995)). Podawanie przezskórne przy użyciu elektroporacji jest kolejnym sposobem podawania cząsteczki o aktywności wiązania zcytor17lig (Potts i in., Pharm. Biotechnol. 10: 213 (1997)).

Kompozycję farmaceutyczną zawierającą białko, polipeptyd lub peptyd o aktywności wiązania zcytor17lig można skomponować według znanych sposobów przygotowania kompozycji przydatnych farmaceutycznie, gdzie białka terapeutyczne łączy się w mieszaninie z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem. Kompozycję określa się mianem „farmaceutycznie dopuszczalny nośnik” jeśli jej podawanie jest dobrze tolerowane przez otrzymującego ją pacjenta. Jałowa sól fizjologiczna buforowana fosforanem jest przykładem farmaceutycznie dopuszczalnego nośnika. Inne odpowiednie nośniki są dobrze znane fachowcom w dziedzinie, patrz np. Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, wyd. 19 (Mack Publishing Company 1995).

Dla celów leczniczych, cząsteczki o aktywności wiązania zcytor17lig i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik podaje się pacjentowi w ilości skutecznej terapeutycznie. Połączenie białka, polipeptydu lub peptydu o aktywności wiązania zcytor17lig z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem określa się jako podanie „terapeutycznie skutecznej ilości” jeśli podana ilość jest istotna fizjologicznie. Środek jest istotny fizjologicznie, a jego obecność powoduje wykrywalną zmianą w fizjologii otrzymującego go pacjenta. Przykładowo, środek użyty w leczeniu zapalenia jest istotny fizjologicznie jeśli jego obecność powoduje co najmniej częściowe zniesienie stanu zapalnego.

Kompozycję farmaceutyczną zawierającą zcytor17lig (lub analog zcytor17lig, lub białko fuzyjne) można dostarczać w postaci płynnej, w postaci aerozolu lub w postaci stałej. Przykładami płynnych postaci są roztwory do wstrzykiwania, aerozole, preparaty w kropelkach, roztwory topologiczne oraz

PL 211 833 B1 zawiesiny do podawania doustnego. Przykładowe postacie stałe obejmują kapsułki, tabletki i postacie o kontrolowanym uwalnianiu. Przykładami tych ostatnich postaci są miniosmotyczne pompy i implanty (Bremer i in., Pharm. Biotechnol. 10: 239 (199T); Ranade, „Implants in Drug Delivery” w Drug Delivery Systems, Ranade i Hollinger (redaktorzy), str 95-123 (CRC Press 1995); Bremer i in., „Protein Delivery with Infusion Pumps” w Protein Delivery: Physical Systems, Sanders i Hendren (redaktorzy), strony 239-254 (Plenum Press 199T); Yewey i in., „Delivery of Proteins from Controlled Release Injectable Implant” w Protein Delivery: Physical Systems, Sanders i Hendren (redaktorzy), strony 93-117 (Plenum Press 1997)). Inne postacie stałe obejmują kremy, pasty, inne zastosowania topologiczne, itp.

Jednym sposobem dostarczania pacjentowi leczniczych polipeptydów jest dożylne, dootrzewnowe, dooponowe, śródmięśniowe, podskórne lub doustne, wziewne lub donosowe podawanie liposomów. Liposomy są mikroskopijnymi pęcherzykami zbudowanymi z jednej lub więcej dwuwarstw lipidowych otaczających przedziały wodne (patrz, ogólnie, Bakker-Woudenberg i in., Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 12 (Suplement 1): S61 (1993), Kim, Drugs 46: 618 (1993) i Ranade, „Site-Specific Drug Delivery Using Liposomes as Carriers” w Drug Delivery Systems, Ranade i Hollinger (redaktorzy), strony 3-24 (CRC Press 1995)). Liposomy mają budowę podobną do błon komórkowych z tego powodu, liposomy można bezpiecznie podawać i są one biodegradowalne. Zależnie od zastosowanej metody wytwarzania, liposomy mogą być jednowarstwowe lub wielowarstwowe liposomy mogą różnić się wielkością, ze średnicami w zakresie od 0,02 μm do powyżej 10 μτη. W liposomach można zawrzeć wiele różnych środków: środki hydrofobowe występują w dwuwarstwach środki hybrofilowe występują w wewnętrznej przestrzeni wodnej (przestrzeniach wodnych) (patrz np. Machy i in., Liposomes In Cell Biology And Pharmacology (John Libbey 1987) i Ostro i in., American J. Hosp. Pharm. 46: 1576 (1989)). Ponadto, możliwe jest kontrolowanie dostępności terapeutycznej zamkniętego środka poprzez zmienianie wielkości liposomu, liczby dwuwarstw, składu lipidów, jak również ładunku i charakterystyki powierzchni liposomów.

Liposomy mogą adsorbować niemal do każdego typu komórki, następnie powoli uwalniać zamknięty środek. Alternatywnie, komórki fagocytujące mogą wchłaniać liposom poprzez endocytozę. Po endocytozie wewnątrz lizosomu następuje degradacja lipidów liposomalnych i uwalnianie zamkniętych środków (Scherphof i in., Ann. N. Y. Acad. Sci. 446: 368 (1985)). Po podaniu dożylnym, komórki o rozbudowanym układzie retikulum endo-plazmatycznego rozmieszczone głównie w wątrobie i śledzionie pobierają typowo małe liposomy (0,1 do 1,0 μm), podczas gdy liposomy większe niż 3,0 μm osadzają się w płucu. Ten preferencyjny wychwyt mniejszych liposomów przez komórki o rozbudowanym układzie retikulum endoplazmatycznego zastosowano w celu dostarczania środków chemoterapeutycznych do makrofagów oraz guzów wątroby.

Układ retikulum endoplazmatycznego można otoczyć przy zastosowaniu wielu metod w tym nasycania cząsteczkami liposomów w dużych dawkach lub selektywnej inaktywacji makrofagów przy zastosowaniu środków farmakologicznych (Claassen i in., Biochim. Biophys. Acta 802: 428 (1984)). Ponadto wykazano, że wbudowanie do błon liposomów fosfolipidów derywatyzowanych glikolipidem lub glikolem polietylenowym powoduje znaczne obniżenie wychwytu przez układ retikulum endoplazmatycznego (Allen i in., Biochim. Biophys. Acta 1068: 133 (1991); Allen i in., Biochim. Biophys. Acta 1150: 9 (1993)).

Liposomy można również wytworzyć tak, aby trafiły do konkretnych komórek lub narządów zmieniając skład fosfolipidowy lub wprowadzając do liposomów receptory lub ligandy. Przykładowo, aby dotrzeć do wątroby zastosowano liposomy zawierające znaczną ilość niejonowego surfaktanta (Hayakawa i in., japoński opis patentowy 04-244018; Kato i in., Biol. Pharm. Bull. 16: 960 (1993)). Preparaty te wytworzono mieszając fosfatydylocholinę sojową, tokoferol α i etoksylowany uwodorniony olej rycynowy (HCO-60) w metanolu, zatężając mieszaninę pod zmniejszonym ciśnieniem następnie odtwarzając mieszaninę przy użyciu wody. Wykazano, że również preparat liposomowy dipalmitoilofosfatydylocholiny (DPPC) z mieszaniną sojowego steryloglikozydu (SG) i cholesterolu (Ch) dociera do wątroby (Shimizu i in., Biol. Pharm. Bull. 20: 881 (1997)).

Alternatywnie, z powierzchnią liposomu można wiązać różne ligandy dające efekt dostarczana docelowego, takie jak przeciwciała, fragmenty przeciwciał, węglowodany, witaminy i białka transportowe. Przykładowo, liposomy można modyfikować dodając rozgałęzione galaktozylolipidowe pochodne do docelowych receptorów glikoproteiny śliny (galaktoza), które ulegają ekspresji jedynie na powierzchni komórek wątroby (Kato i Sugiyama, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 14: 287 (1997); Murahashi i in., Biol. Pharm. Bull. 20: 259 (1997)).

PL 211 833 B1

Podobnie, Wu i in., Hepatology 27: 772 (1998), wykazali, że znakowanie liposomów przy zastosowaniu asialofetuiny powoduje skrócenie okresu półtrwania liposomu w osoczu i ogromnie nasila wychwyt wyznakowanego asialofetuiną liposomu przez hepatocyty. Z drugiej strony, gromadzenie w wątrobie liposomów zawierających rozgałęzione pochodne galaktozylolipidowe można zahamować stosując uprzednie nastrzykiwanie asialofetuiną (Murahashi i in., Biol. Pharm. Bull. 20: 259 (1997)). Innym sposobem dotarcia do komórek wątrobowych jest zastosowanie poliakonitylowanych liposomów zawierających ludzką albuminę osoczową (Kamps i in., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 94: 11681 (1997)). Ponadto, Geho i in. w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 603 044, opisali ukierunkowany na hepatocyt układ dostarczania na bazie pęcherzyków liposomalnych, specyficznych względem receptorów wątrobowożółciowych związanych z wyspecjalizowanymi komórkami metabolicznymi wątroby.

W bardziej ogólnym podejściu docierania do tkanek, komórki docelowe znakuje się wstępnie przeciwciałami z dołączoną grupą biotynową, specyficznymi względem liganda ulegającego ekspresji w komórce docelowej (Harasym i in., Adv. Drug Deliv. Rev. 32: 99 (1998)). Po usunięciu z osocza niezwiązanego przeciwciała, podaje się liposomy sprzężone ze streptawidyna. W innym podejściu bezpośrednio do liposomów dołącza się przeciwciała nakierowuj ące na cel (Harasym i in., Adv. Drug Deliv. Rev. 32: 99 (1998)).

Liposomy mogą zawierać polipeptydy wykazujące aktywności wiązania zcytor17lig wprowadzane standardowymi technikami mikroenkapsulacji białka (patrz np. Anderson i in., Infect. Immun. 31: 1099 (1981), Anderson i in., Cancer Res. 50: 1853 (1990) i Cohen i in., Biochim. Biophys. Acta 1063: 95 (1991), Alving i in., „Preparation and Use of Liposomes in Immunological Studies” w Liposome Technology, wydanie 2, tom III, Gregoriadis (redaktor), strona 317 (CRC Press 1993), Wassef i in., Meth. Enzymol. 149: 124 (1987)). Jak wspomniano powyżej, terapeutycznie przydatne liposomy mogą zawierać wiele różnych składników. Przykładowo, liposomy mogą zawierać lipidowe pochodne glikolu polietylenowego (Allen i in., Biochim. Biophys. Acta 1150: 9 (1993)).

Degradowalne mikrosfery polimerowe zaprojektowano tak, aby ich pomocą można było utrzymywać duże stężenie białek terapeutycznych w organizmie. Mikrosfery wytwarza się z degradowalnych polimerów, takich jak poli(laktydo-ko-glikolid) (PLG), polibezwodniki, poli(orto-estry), nie biodegradowalne polimery etylowinylooctanowe, w których białka uwięzione są w polimerze (Gombotz i Pettit, Bioconjugate Chem. 6: 332 (1995); Ranade, „Role of Polimers in Drug Delivery” w Drug Delivery Systems, Ranade i Hollinger (redaktorzy), strony 51-93 (CRC Press 1995); Roskos i Maskiewicz, „Degradable Controlled Release Systems Useful for Protein Delivery” w Protein Delivery: Physical Systems, Sanders i Hendren (redaktorzy), strony 45-92 (Plenum Press 1997); Bartuś i in., Science 281: 1161 (1998); Putney i Burke, Nature Biotechnology 16: 153 (1998); Putney, Curr. Opin. Chem. Biol. 2: 548 (1998)). Jako nośniki do dożylnego podawania białek terapeutycznych można zastosować także nanosfery powleczone glikolem polietylenowym (PEG) (patrz np. Gref i in., Pharm. Biotechnol. 10: 167 (1997)).

Przedmiotem wynalazku są również zmodyfikowane chemicznie polipeptydy o aktywności zcytor17lig, takie jak polipeptyd zcytor17lig, agoniści zcytor17lig i antagoniści zcytor17lig, np. przeciwciała anty-zcytor17lig, w których polipeptyd połączony jest z polimerem w sposób omówiony powyżej.

Specjaliści w dziedzinie mogą zaprojektować inne postacie dawkowania, takie jak przedstawili np. Ansel i Popovich, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, wydanie 5 (Lea & Febiger 1990), Gennaro (redaktor). Remington's Pharmaceutical Sciences, wydanie 19 (Mack Publishing Company 1995) oraz Ranade i Hollinger, Drug Delivery Systems (CRC Press 1996).

Dla ilustracji, kompozycje farmaceutyczne można dostarczyć w postaci zestawu składającego się z pojemnika zawierającego polipeptyd zcytor17lig lub antagonistę zcytor17lig (np. przeciwciało lub fragment przeciwciała wiążące polipeptyd zcytor17lig).

Polipeptydy o działaniu terapeutycznym można dostarczać w postaci roztworu do wstrzykiwania w dawkach pojedynczych lub wielokrotnych lub w postaci jałowego proszku do rozpuszczenia przed wstrzyknięciem. Alternatywnie, taki zestaw może składać się z dozownika suchego proszku, urządzenia wytwarzającego aerozol płynu lub nebulizatora do podawania polipeptydu o działaniu terapeutycznym. Taki zestaw mogą zawierać dodatkowo pisemną informację o wskazaniach i zastosowaniu kompozycji farmaceutycznej. Ponadto, taka informacja może zawierać stwierdzenie, że przeciwwskazaniem dla zastosowania kompozycji zcytor17lig jest nadwrażliwość pacjentów na zcytor17lig.

PL 211 833 B1

W jednym aspekcie, przedmiotem wynalazku jest wydzielony polipeptyd zawierają cy sekwencję reszt aminokwasowych, będącą w co najmniej 90% identyczną z sekwencją reszt aminokwasowych wybraną z grupy obejmującej:

(a) polipeptyd zbudowany z reszt 38 (Val) do 152 (Leu) tak jak pokazano na SEQ ID NO: 2;

(b) polipeptyd zbudowany z reszt 27 (Leu) do 164 (Thr) jak pokazano na SEQ ID NO: 2;

(c) polipeptyd zbudowany z reszt 24 (Thr) do 164 (Thr) jak pokazano na SEQ ID NO: 2 i (d) polipeptyd zbudowany z reszt 1 (Met) do 164 (Thr) jak pokazano na SEQ ID NO: 2.

W jednym rozwią zaniu, wydzielony polipeptyd jest taki jak opisano powyżej, przy czym reszty aminokwasowe 73, 1-33 i 147 oznaczają cysteinę. W innym rozwiązaniu, wydzielony polipeptyd jest taki jak opisano powyżej, przy czym polipeptyd wiąże się z receptorem zcytor17, takim jak pokazano na SEQ ID NO: 5 lub SEQ ID NO: 71.

W innym rozwiązaniu, wydzielony polipeptyd sk ł ada się co najmniej z 14 kolejnych reszt aminokwasowych z SEQ ID NO: 2 lub SEQ ID NO: 11.

W innym rozwiązaniu, wydzielony polipeptyd jest taki jak opisano powyż ej, przy czym reszty aminokwasowe wybiera się z grupy obejmującej:

(a) reszty aminokwasowych 38-52 z SEQ ID NO: 2;

(b) reszty aminokwasowe 83-98 z SEQ ID NO: 2;

(c) reszty aminokwasowe 104-117 z SEQ ID NO: 2; i (d) reszty aminokwasowe 137-152 z SEQ ID NO: 2.

Drugi aspekt wynalazku dotyczy białka fuzyjnego składającego się co najmniej z czterech polipeptydów, przy czym porządek polipeptydów od N-końca do C-końca jest taki jak następuje: pierwszy polipeptyd zawiera sekwencję reszt aminokwasowych od 38-52 z SEQ ID NO: 2; pierwsza sekwencja przerywnikowa zawiera 6-27 reszt aminokwasowych; drugi polipeptyd zawiera sekwencję reszt aminokwasowych wybranych z grupy obejmującej:

(a) helisę B z reszt aminokwasowych IL-2 SEQ ID NO: 168;

(b) helisę B z reszt 65-83 IL-4 z SEQ ID NO: 164;

(c) helisę B z reszt 73-86 IL-3 z SEQ ID NO: 102;

(d) helisę B reszt 72-81 GM-CSF z SEQ ID NO: 166; i (e) reszty aminokwasowe 83-98 z SEQ ID NO: 2.

Druga sekwencja przerywnikowa zawiera 5-11 reszt aminokwasowych; trzeci polipeptyd zawiera sekwencję reszt aminokwasowych wybranych z grupy obejmującej:

(a) helisę C z reszt 102-116 IL-2 z SEQ ID NO: 162;

(b) helisę C z reszt 94-118 IL-4 z SEQ ID NO: 164;

(c) helisę C z reszt 91-103 IL-3 z SEQ ID NO: 102; (d) helisę C z reszt 85-103 GM-CSF z SEQ ID NO: 166; i (e) reszty aminokwasowe 104-117 z SEQ ID NO: 2.

Trzecia sekwencja przerywnikowa z 3-29 reszt aminokwasowych; i czwarty polipeptyd zawierający sekwencję z reszt aminokwasowych wybranych z grupy obejmującej:

(a) helisę D z reszt 134-149 IL-2 z SEQ ID NO: 162;

(b) helisę D z reszt 123-141 IL-3 z SEQ ID NO: 102;

(c) helisę D z reszt 133-151 IL-4 z SEQ ID NO: 164;

(d) helisę D z reszt 120-131 GM-CSF z SEQ ID NO: 166; i (e) reszty aminokwasowe 137-152 z SEQ ID NO: 2.

Trzecim aspektem wynalazku jest białko fuzyjne zawierające co najmniej cztery polipeptydy, przy czym porządek aminokwasów od N-końca do C-końca jest taki jak następuje: pierwszy polipeptyd zawiera sekwencję z reszt aminokwasowych wybranych z grupy obejmującej:

(a) helisę A z reszty 27-48 IL-2 z SEQ ID NO: 162;

(b) helisę A z reszty 30-42 IL-4 z SEQ ID NO: 164;

(c) helisę A z reszt 35-45 IL-3 z SEQ ID NO: 102;

(d) helisę A z reszt 30-44 GM-CSF z SEQ ID NO: 166; i (e) reszty aminokwasowe 38-52 z SEQ ID NO: 2.

Pierwsza sekwencja przerywnikowa zawiera 6-27 reszt aminokwasowych; drugi polipeptyd zawiera sekwencję z reszt aminokwasowych wybranych z grupy obejmującej:

(a) helisę B z reszt aminokwasowych IL-2 z SEQ ID NO: 168;

(b) helisę B z reszt 65-83 IL-4 z SEQ ID NO: 164;

(c) helisę B z reszt 73-86 IL-3 z SEQ ID NO: 102;

PL 211 833 B1 (d) helisę B z reszt 72-81 GM-CSF z SEQ ID NO: 166; i (e) reszty aminokwasowe 83-98 z SEQ ID NO: 2.

Druga sekwencja przerywnikowa składa się z 5-11 reszt aminokwasowych; trzeci polipeptyd zawiera sekwencję z reszt aminokwasowych wybranych z grupy obejmującej:

(a) helisę C z reszt 102-116 IL-2 z SEQ ID NO: 162;

(b) helisę C z reszt 94-118 IL-4 z SEQ ID NO: 164;

(c) helisę C z reszt 91-103 IL-3 z SEQ ID NO: 102;

(d) helisę C z reszt 85-103 GM-CSF z SEQ ID NO: 166; i (e) reszty aminokwasowe 104-117 z SEQ ID NO: 2.

Trzecia sekwencja przerywnikowa składa się z 3-29 reszt aminokwasowych; a czwarty polipeptyd zawiera sekwencję z reszt aminokwasowych od 137-152 z SEQ ID NO: 2. W innym rozwiązaniu, białko fuzyjne jest takie jak opisano powyżej, przy czym czwarty polipeptyd składa się z reszt aminokwasowych 137-152 z SEQ ID NO: 2.

W innym aspekcie, przedmiotem wynalazku jest wydzielona cz ąsteczka polinukleotydu zawierająca sekwencję nukleotydów kodujących polipeptyd taki jak opisano powyżej.

W jednym rozwią zaniu, wydzielony polinukleotyd jest taki jak opisano powyż ej, przy czym nukleotydy wybrano z grupy obejmującej:

(a) polinukleotyd taki jak pokazano na SEQ ID NO: 1 od nukleotydu 139 do nukleotydu 483;

(b) polinukleotyd taki jak pokazano na SEQ ID NO: 1 od nukleotydu 106 do nukleotydu 519;

(c) polinukleotyd taki jak pokazano na SEQ ID NO: 1 od nukleotydu 97 do nukleotydu 519; i d) polinukleotyd taki jak pokazano na SEQ ID NO: 1 od nukleotydu 28 do nukleotydu 519.

W innym aspekcie, przedmiotem wynalazku jest wydzielona cz ąsteczka polinukleotydu zawierająca sekwencję nukleotydów kodującą opisany tu polipeptyd.

W innym aspekcie, przedmiotem wynalazku jest wektor ekspresyjny składający się z następujących powiązanych operacyjnie elementów:

(a) promotor transkrypcji;

(b) segment DNA kodujący polipeptyd zawierający sekwencję reszt aminokwasowych wybranych z grupy obejmującej:

(i) reszty aminokwasowe 38-52 z SEQ ID NO: 2;

(ii) reszty aminokwasowe 83-98 z SEQ ID NO: 2;

(iii) reszty aminokwasowe 104-117 z SEQ ID NO: 2;

(iv) reszty aminokwasowe 137-152 z SEQ ID NO: 2; i (v) ich kombinacje; i (c) terminator transkrypcji.

W innym aspekcie, przedmiotem wynalazku jest wektor ekspresyjny jest wektor ekspresyjny składający się z następujących powiązanych operacyjnie elementów:

(a) promotora transkrypcji;

(b) segmentu DNA kodującego polipeptyd zawierającego sekwencję reszt aminokwasowych będącą w co najmniej 90% identyczną z resztami od 38 (Val) do 152 (Leu) tak jak pokazano na SEQ ID NO: 2; i (c) terminator transkrypcji.

W jednym rozwią zaniu, wektor ekspresyjny jest taki jak opisano powyż ej, skł adają cy się z następujących powiązanych operacyjnie elementów:

(a) promotora transkrypcji;

(b) segmentu DNA kodującego polipeptyd zawierającego reszty aminokwasowe od 38 (Val) do 152 (Leu) z SEQ ID NO: 2; i (c) terminator transkrypcji.

W innym aspekcie, przedmiotem wynalazku jest hodowana komórka zawierająca opisany powyżej wektor ekspresyjny.

W innym aspekcie, przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania białka obejmujący: hodowanie komórek w sposób opisany powyżej w warunkach, w którym ulega ekspresji segment DNA; i wydzielanie biał ka kodowanego przez segment DNA.

W innym aspekcie, przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania przeciwciała względem polipeptydu zcytor17lig obejmujący zaszczepienie zwierzęcia przy zastosowaniu polipeptydu wybranego z grupy obejmującej:

PL 211 833 B1 (a) polipeptyd zbudowany z 9 do 141 aminokwasów, przy czym polipeptyd jest identyczny z sekwencją kolejnych reszt aminokwasowych na SEQ ID NO: 2 od aminokwasu numer 24 (Ser) do aminokwasu numer 164 (Thr);

(b) polipeptyd taki jak opisano powyżej;

(c) polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową z SEQ ID NO: 2 od aminokwasu numer

3852;

(d) polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową z SEQ ID NO: 2 od aminokwasu numer

83-98;

(e) polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową z SEQ ID NO: 2 od aminokwasu numer 104-117;

(f) polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową z SEQ ID NO: 2 od aminokwasu numer 137-152;

(g) polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową z SEQ ID NO: 2 od aminokwasu numer 38-152;

(h) polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową z SEQ ID NO: 2 od aminokwasu numer 24-164;

(c) polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową z SEQ ID NO: 11 od aminokwasu numer

38-52;

(d) polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową z SEQ ID NO: 11 od aminokwasu numer

85-98;

(e) polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową z SEQ ID NO: 11 od aminokwasu numer 104-118;

(f) polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową z SEQ ID NO: 11 od aminokwasu numer 141-157;

(g) polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową z SEQ ID NO: 11 od aminokwasu numer 38-157;

(h) polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową z SEQ ID NO: 11 od aminokwasu numer 24-163;

(i) polipeptyd zawierający epitop antygenowy zgodny z profilem hydrofilowości Hopp/Woods z SEQ ID NO: 2 lub SEQ I NO 11, przy czym profil opiera się na przesuwającym się okienku obejmującym sześć reszt.

Ukryte reszty G, S i T i eksponowane reszty H, Y, a reszty W nie są brane pod uwagę; przy czym polipeptyd wywołuje u zwierzęcia reakcję odpornościową prowadzącą do wytwarzania przeciwciał; i izolowanie przeciwciała ze zwierzęcia.

W innym aspekcie, przedmiotem wynalazku jest przeciwciało (np. przeciwciało neutralizujące) wytwarzane w sposób opisany powyżej, przy czym przeciwciało wiąże się z polipeptydem z SEQ IDN NO: 2 lub SEQ ID NO: 11. W jednym rozwiązaniu, opisane powyżej przeciwciało wiąże się specyficznie z polipeptydem o sekwencji SEQ ID NO: 2 lub SEQ ID NO: 11.

W innym aspekcie, przedmiotem wynalazku jest sposób pobudzania reakcji odpornościowej u ssaka wystawionego na działanie antygenu lub patogenu obejmujący etapy:

(1) bezpośredniego lub pośredniego określania poziomu antygenu lub patogenu u tego ssaka;

(2) podawania kompozycji zawierającej polipeptyd zcytor17lig w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku;

(3) bezpośredniego lub pośredniego określania poziomu antygenu lub patogenu u tego ssaka; i (4) porównania poziomu antygenu lub patogenu z etapu 1 z poziomem antygenu lub patogenu z etapu 3, przy czym zmiana poziomu wskazuje na pobudzenie reakcji odpornościowej.

W jednym rozwiązaniu, opisano powyżej sposób pobudzania reakcji odpornościowej u ssaka obejmuje dodatkowo:

(5) ponowne podanie kompozycji zawierającej polipeptyd zcytor17lig w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku;

(6) bezpośrednie lub pośrednie określenie poziomu antygenu lub patogen u tego ssaka; oraz (7) porównanie poziomu antygenu lub patogenu z etapu 1 z poziomem antygenu z etapu 6, przy czym zmiana poziomu wskazuje na pobudzenie reakcji odpornościowej.

W innym aspekcie, przedmiotem wynalazku jest sposób namnażania komórek krwiotwórczych oraz prekursorsorowych komórek krwiotwórczych obejmujący hodowlę komórek szpiku kostnego lub krwinek obwodowych z kompozycją zawierającą zcytor17lig w ilości wystarczającej do wywołania

PL 211 833 B1 wzrostu liczby limfocytów szpiku kostnego lub krwinek obwodowych w porównaniu z komórkami szpiku kostnego lub krwinkami obwodowymi hodowanymi bez zcytor17lig. W jednym rozwiązaniu, sposób namnażania komórek krwiotwórczych i prekursorsorowych komórek krwiotwórczych jest taki jak opisano powyżej, przy czym komórkami krwiotwórczymi i hemopoetycznymi komórkami progenitorowymi są limfocyty. W innym rozwiązaniu, sposób namnażania komórek krwiotwórczych i prekursorowych komórek krwiotwórczych jest taki jak opisano powyżej, przy czym limfocytami są monocyty, makrofagi lub komórki T.

W innym aspekcie, przedmiotem wynalazku jest sposób pobudzania reakcji odpornoś ciowej u ssaka wystawionego na dział anie antygenu lub patogenu obejmują cy:

(1) określenie poziomu przeciwciała specyficznego względem antygenu lub patogenu;

(2) podanie kompozycji zawierającej polipeptyd zcytor17lig w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku;

(3) określenie poziomu przeciwciała specyficznego względem antygenu lub patogenu po podaniu kompozycji;

(4) porównanie poziomu przeciwciała z etapu (1) z poziomem przeciwciała z etapu (3), przy czym wzrost poziomu przeciwciała wskazuje na pobudzenie reakcji odpornościowej.

W innym aspekcie, przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania RNA zcytor17lig w próbce biologicznej, obejmujący etapy:

(a) kontaktowania sondy kwasu nukleinowego zcytor17lig w warunkach hybrydyzacyjnych z:

(i) testowymi cząsteczkami RNA wydzielonymi z próbki biologicznej lub (ii) cząsteczkami kwasu nukleinowego zsyntetyzowanymi na bazie wydzielonych cząsteczek RNA, przy czym sekwencja nukleotydową sondy zawiera fragment sekwencji nukleotydowej opisanej powyżej cząsteczki kwasu nukleinowego lub fragment komplementarny i (b) wykrywania formacji hybryd sondy kwasu nukleinowego i testowych cząsteczek RNA lub zsyntetyzowanych cząsteczek kwasu nukleinowego, przy czym obecność hybryd wskazuje na obecność w próbce biologicznej RNA zcytor17lig.

W innym aspekcie, przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywanie obecnoś ci zcytor17lig w próbce biologicznej, obejmują cy etapy:

(a) kontaktowania próbki biologiczna z przeciwciałem lub fragmentem przeciwciała jak to opisano powyżej, przy czym kontaktowanie przeprowadza się w warunkach umożliwiających wiązanie przeciwciała lub fragmentu przeciwciała z próbką biologiczną i (b) wykrywania każdego związanego przeciwciała lub związanego fragmentu przeciwciała.

W innym aspekcie, przedmiotem wynalazku jest sposób uśmiercania komórek nowotworowych obejmujący, otrzymanie ex vivo tkanki lub próbki biologicznej zawierającej komórki nowotworowe od pacjenta lub identyfikację komórek nowotworowych in vivo; wytwarzanie polipeptydu w opisany tu sposób; komponowanie polipeptydu z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem; oraz podanie polipeptyd pacjentowi lub poddawanie komórek nowotworowych działaniu polipeptydu; przy czym polipeptyd uśmierca komórki. W jednym rozwiązaniu sposób uśmiercania komórek nowotworowych jest taki jak opisano powyżej, przy czym polipeptyd sprzęga się dodatkowo z toksyną.

W jednym rozwią zaniu przeciwciał o jest takie jak opisano powyż ej, przy czym przeciwciał o wybiera się z grupy obejmującej:

(a) przeciwciało poliklonalne, (b) mysie przeciwciało monoklonalne, (c) humanizowane przeciwciało uzyskane z (b), (d) fragment przeciwciała i (e) ludzkie przeciwciało monoklonalne.

W innym aspekcie, przedmiotem wynalazku jest przeciwcia ło lub fragment przeciwciała wiążące się specyficznie z polipeptydem zawierającym sekwencję reszt aminokwasowych wybranych z grupy obejmującej:

(a) polipeptyd zbudowany z reszt 38 (Val) do 152 (Leu) jak pokazano na SEQ ID NO: 2;

(b) polipeptyd zbudowany z reszt 27 (Leu) do 164 (Thr) jak pokazano na SEQ ID NO: 2;

(c) polipeptyd zbudowany z reszt 24 (Thr) do 164 (Thr) jak pokazano na SEQ ID NO: 2; i (d) polipeptyd zbudowany z reszt 1 (Met) do 164 (Thr) jak pokazano na SEQ ID NO: 2.

W innym rozwiązaniu przeciwciało jest takie jak opisano powyż ej, przy czym przeciwciało zawiera dodatkowo radionuklid, enzym, substrat, kofaktor, marker fluorescencyjny, marker chemiluminescencyjny, znacznik peptydowy, cząstkę magnetyczną, lek lub toksynę.

PL 211 833 B1

W innym aspekcie, przedmiotem wynalazku jest sposób hamowania wywołanej przez zcytor17lig proliferacji lub różnicowania komórek krwiotwórczych i prekursorsorowych komórek krwiotwórczych obejmujący hodowlę komórek szpiku kostnego lub krwinek obwodowych z kompozycją zawierającą opisane tu przeciwciała w ilości wystarczającej do zmniejszenia proliferacji lub różnicowania komórek krwiotwórczych w szpiku kostnym lub krwinek obwodowych w porównaniu z komórkami szpiku kostnego lub krwinkami obwodowymi hodowanymi rozpuszczalnego receptora cytokin.

W jednym rozwiązaniu sposób hamowania wywołanej przez zcytor17lig proliferacji lub różnicowania komórek krwiotwórczych i prekursorsorowych komórek krwiotwórczych jest taki jak opisano powyżej, przy czym komórkami krwiotwórczymi i krwiotwórczymi komórkami prekursorowymi są limfocyty.

W innym rozwiązaniu sposób hamowania wywołanej przez zcytor17lig proliferacji lub różnicowania komórek krwiotwórczych i prekursorsorowych komórek krwiotwórczych jest taki jak opisano powyżej, przy czym limfocytami są makrofagi lub komórki T.

W innym aspekcie, przedmiotem wynalazku jest sposób zmniejszania wywołanego przez zcytor17lig zapalenia obejmujący podanie ssakowi z zapaleniem opisanej tu kompozycji przeciwciał w ilości wystarczającej do zmniejszenia zapalenia.

W innym aspekcie, przedmiotem wynalazku jest sposób tłumienia reakcji zapalnej u ssaka z zapaleniem obejmujący:

(1) określenie poziomu cząsteczki zapalnej;

(2) podanie kompozycji zawierającej opisane tu przeciwciało w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku;

(3) określenie poziomu cząsteczki zapalnej po podaniu kompozycji;

(4) porównania poziomu cząsteczki zapalnej z etapu (1) z poziomem cząsteczki zapalnej z etapu (3), przy czym brak wzrostu lub obniżenie poziomu cząsteczki zapalnej wskazuje na tłumienie reakcji zapalnej.

W jednym rozwiązaniu, przeciwciało jest takie jak opisano powyżej, przy czym przeciwciało zawiera dodatkowo radionuklid, enzym, substrat, kofaktor, marker fluorescencyjny, marker chemiluminescencyjny, znacznik peptydowy, cząstkę magnetyczną, lek lub toksynę.

W innym aspekcie, przedmiotem wynalazku jest sposób hamowania wywołanej przez zcytor17lig proliferacji lub różnicowania komórek krwiotwórczych i prekursorsorowych komórek krwiotwórczych obejmujący hodowlę komórek szpiku kostnego lub krwinek obwodowych z kompozycją jak to tu opisano z przeciwciałami w ilości wystarczającej do zmniejszenia proliferacji lub różnicowania komórek krwiotwórczych w szpiku kostnym lub krwinek obwodowych w porównaniu z komórkami szpiku kostnego lub krwinek obwodowych hodowane bez rozpuszczalnego receptora cytokin.

W jednym rozwiązaniu sposób hamowania wywołanej przez zcytor17lig proliferacji lub różnicowania komórek krwiotwórczych i prekursorsorowych komórek krwiotwórczych jest taki jak opisano powyżej, przy czym komórkami krwiotwórczymi i krwiotwórczymi komórkami prekursorowymi są limfocyty.

W innym rozwiązaniu sposób hamowania wywołanej przez zcytor17lig proliferacji lub różnicowania komórek krwiotwórczych i prekursorsorowych komórek krwiotwórczych jest taki jak opisano powyżej, przy czym limfocytami są makrofagi lub komórki T.

W innym aspekcie, przedmiotem wynalazku jest sposób zmniejszania wywołanego przez zcytor17lig zapalenia obejmujący podanie ssakowi z zapaleniem kompozycji przeciwciała jak to tu opisano w ilości wystarczającej do zmniejszenia zapalenia.

W innym aspekcie, przedmiotem wynalazku jest sposób tłumienia reakcji zapalnej u ssaka z zapaleniem obejmujący:

(1) określenie poziomu cząsteczki zapalnej;

(2) podanie kompozycji zawierającej przeciwciało jak to tu opisano w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku;

(3) określenie poziomu cząsteczki zapalnej po podaniu kompozycji;

(4) porównanie poziomu cząsteczki zapalnej z etapu (1) z poziomem cząsteczki zapalnej z etapu (3), przy czym brak wzrostu lub spadek poziomu cząsteczki zapalnej wskazuje na tłumienie reakcji zapalnej.

W innym aspekcie, przedmiotem wynalazku jest sposób leczenia ssaka dotkniętego chorobą zapalną, w której pewną rolę gra zcytor17lig, obejmujący: podanie ssakowi antagonisty zcytor17lig tak aby zmniejszyć zapalenie, przy czym antagonistę wybiera się z grupy obejmującej przeciwciało lub polipeptyd wiążący, który wiąże się specyficznie z polipeptydem lub fragmentem polipeptydu zcytor17lig (SEQ ID NO: 2).

PL 211 833 B1

W jednym rozwiązaniu, sposób leczenia ssaka dotkniętego chorobą zapalną jest taki, jak to opisano powyżej, przy czym chorobą jest przewlekła choroba zapalna.

W innym rozwiązaniu, sposób leczenia ssaka dotkniętego chorobą zapalną jest taki jak to opisano powyżej, przy czym chorobą jest przewlekła choroba zapalna wybrana z grupy obejmującej: choroba zapalna pęcherza; wrzodziejące zapalenie okrężnicy; choroba Crohn'a; atopowe zapalenie skóry; egzema; oraz łuszczyca.

W innym aspekcie, sposób leczenia ssaka dotknię tego chorobą zapalną jest taki jak opisano powyżej, przy czym chorobą jest ostra choroba zapalna.

W innym rozwią zaniu, sposób leczenia ssaka dotknię tego chorobą zapalną jest taki jak opisano powyżej, przy czym chorobą jest ostra choroba zapalna wybrana z grupy obejmującej: endotoksemia; posocznica; zespół szoku toksycznego; oraz choroba zakaźna.

W innym rozwią zaniu, sposób leczenia ssaka dotknię tego chorobą zapalną jest taki jak opisano powyżej, przy czym przeciwciało zawiera dodatkowo radionuklid, enzym, substrat, kofaktor, marker fluorescencyjny, marker chemiluminescencyjny, znacznik peptydowy, cząstkę magnetyczna, lek lub toksyna.

W innym aspekcie, przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania zapalenia u pacjenta, obejmujący pobieranie od pacjenta tkanki lub próbki biologicznej; inkubację tkanki lub próbki biologicznej z przeciwciałem jak to tu opisano, w warunkach w których przeciwciało wiąże się z komplementarnym polipeptydem w tkance lub próbce biologicznej; wizualizację przeciwciała związanego z tkanką lub próbką biologiczną; i porównanie poziomów przeciwciał związanych z tkanką lub próbką biologiczna od pacjenta z prawidłową kontrolną tkanką lub próbką biologiczną, przy czym wzrost poziomu przeciwciał związanych z tkanką lub próbką biologiczną pacjenta w porównaniu z prawidłową kontrolną tkanką lub próbką biologiczną wskazuje na zapalenie u pacjenta.

W innym aspekcie, przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania zapalenie u pacjenta, obejmujący: pobieranie od pacjenta tkanki lub próbki biologicznej; znakowanie przy zastosowaniu polinukleotydu zawierającym co najmniej 14 sąsiadujących nukleotydów z SEQ ID NO: 1 lub sekwencję komplementarną z SEQ ID NO: 1; inkubację tkanki lub próbki biologicznej w warunkach w którym polinukleotyd będzie hybrydyzował z komplementarną sekwencją polinukleotydową; wizualizację wyznakowanego polinukleotydu w tkance lub próbce biologicznej; oraz porównania poziomu hybrydyzacji wyznakowanego polinukleotydu z tkanką lub próbką biologiczną od pacjenta z prawidłową kontrolną tkanką lub próbką biologiczną, przy czym zwiększenie hybrydyzacji znakowanego polinukleotydu z tkanką lub próbką biologiczną od pacjenta w porównaniu z prawidł ową kontrolną tkanką lub próbką biologiczną wskazuje na zapalenie u pacjenta.

Wynalazek ten następnie zilustrowano posługując się poniższymi nieograniczającymi przykładami.

Przykłady

P r z y k ł a d 1

Konstrukcja chimery polipeptydowej MPL-zcytor17: pozakomórkowa domena MPL i TM połączona z wewnątrzkomórkową domeną sygnalizującą zcytor17

Pozakomórkową domenę 5' mysiego receptora MPL wydzielono z plazmidu zawierającego mysi receptor MPL (plazmid PHZl/MPL) poprzez trawienie z zastosowaniem EcoRI i BamHI uzyskując fragment o wielkości 1164 pz. Proces trawienia prowadzono na 1% żelu agarozowym, a fragment wydzielono stosując zestaw do ekstrakcji na żelu Qiaquick (Qiagen) zgodnie z zaleceniami producenta. Pozostałą część pozakomórkowej domeny MPL i przezbłonowej domeny uzyskano stosując metodę PCR ze starterami ZC6,673 (SEQ ID NO: 13) i ZC29,082 (SEQ ID NO: 14). Warunki reakcji były następujące: 15 cykli w temperaturze 94°C przez 1 minutę, 55°C przez 1 minutę, 72°C przez 2 minuty; a następnie 72°C przez 7 minut; po czym zakończono reakcję w temperaturze 4°C. Uzyskany w wyniku PCR produkt przepuszczono przez 1% żel agarozowy i stosując zestaw do ekstrakcji na żelu Qiaquick (Qiagen) zgodnie z zaleceniami producenta wydzielono fragment receptora MPL o wielkości w przybliż eniu 400 pz.

Wewnątrzkomórkową domenę ludzkiego zcytor17 wydzielono z plazmidu zawierającego cDNA receptora zcytor17 (nr 23/pCAP) stosując metodę PCR ze starterami ZC29,083 (SEQ ID NO: 15) i ZC29, 145 (SEQ ID NO: 16). Sekwencję polinukleotydową , która odpowiada sekwencji kodującej receptora zcytor17 pokazano na SEQ ID NO: 5. Stosowano warunki reakcji przedstawione powyżej. Uzyskany w wyniku PCR produkt przepuszczono przez 1% żel agarozowy i stosując zestaw do eksPL 211 833 B1 trakcji na żelu Qiaquick, zgodnie z zaleceniami producenta, wydzielono fragment zcytor17 o wielkości w przybliż eniu 320 pz.

Każdy spośród opisanych powyżej wydzielonych fragmentów PCR zmieszano w stosunku objętościowym 1:1 i użyto w reakcji PCR, stosując ZC66T3 (SEQ ID NO: 13) i ZC29145 (SEQ ID NO: 16) w celu uzyskania wszystkich elementów z wyjątkiem części 5'MPL chimery MPL-zcytor17. Warunki reakcji były następujące: 15 cykli w temperaturze 94°C przez 1 minutę, 55°C przez 1 minutę, 72°C przez 2 minuty; a następnie 72°C przez 7 minut; po czym reakcje zakończono w temperaturze 4°C. Cały uzyskany w wyniku PCR produkt przepuszczono przez 1% żel agarozowy i stosując zestaw do ekstrakcji na żelu Qiaquick (Qiagen), zgodnie z zaleceniami producenta, wydzielono fragment chimery MPL-zcytor17 o wielkości w przybliżeniu 700 pz. Fragment chimery MPL-zcytor17 strawiono z zastosowaniem BamHI (BRL) i Xbal (Boehringer Mannheim) zgodnie z zaleceniami producenta.

Cały strawiony produkt przepuszczono przez 1% żel agarozowy i stosując zestaw do ekstrakcji na żelu Qiaquick (Qiagen), zgodnie z zaleceniami producenta, wydzielono odciętą chimerę MPL-zcytor17. Uzyskaną w ten sposób odciętą chimerę MPL-zcytor17 wraz z opisanym powyżej fragmentem 5'MPL EcoRI/BamHI wprowadzono do wektora ekspresyjnego w celu uzyskania opisanego poniżej chimerycznego receptora MPL-zcytor17 o pełnej długości.

Biorcę, wektor ekspresyjny pZP-T, strawiono stosując EcoRI (BRL) i Xbal (BRL), zgodnie z zaleceniami producenta oraz oczyszczono na żelu w sposób opisany powyżej.

Ten fragment wektora połączono z odciętą przez EcoRI i Xbal wydzieloną w opisany powyżej sposób otrzymaną metodą PCR chimerą MPL-zcytor17 i fragmentem 5'MPL wydzielonym przy zastosowaniu EcoRI i BamHI w sposób opisany powyżej w reakcji ligacji. Ligację prowadzono stosując ligazę T4 (Epicentre Technologies), w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę zgodnie z zaleceniami producenta. Próbkę z roztworu ligacyjnego wprowadzono metodą elektroporacji do elektrokompetentnych komórek E. coli DH10B ElectroMAX (25 μF, 200 Ω, 1,8 V). Komórki transformowane wysiano na płytki LB + ampicylina i pojedyncze kolonie badano przesiewowe na małą skalę (Qiagen) i trawiono z zastosowaniem EcoRI pod kątem chimery MPL-zcytor17. W wyniku trawienia właściwych klonów z zastosowaniem EcoRI uzyskano fragment o wielkości około 2 kb. Sekwencję chimery MPL-zcytor17 potwierdzono wykonując analizy sekwencji. Wstawiony fragment miał wielkość w przybliżeniu 3,1 kb i był pełnej długości.

P r z y k ł a d 2

Proliferacja komórek zawierających chimerę MPL-zcytor17 w teście BAF3 z zastosowaniem Alamar Blue

A. Konstrukcja komórek BaF3, w których dochodzi do ekspresji chimery MPL-zcytor17

BaF3, prelimfoidalną linię komórkową zależną od interleukiny-3 (IL-3) pochodzącą z mysiego szpiku kostnego (Palacios i Steinmetz, Cell 41: 727-734, 1985; Mathey-Prevot i in., Mol. Cell. Biol. 6: 4133-4135, 1986) utrzymywano w pełnych podłożach (podłoże RPMI, JRH Bioscience Inc., Lenexa, KS) uzupełnionych 10% inaktywowaną wysoką temperaturą płodową surowicą bydlęcą, 1-2 ng/ml mysiej IL-3 (mIL-3) (R & D, Minneapolis, MN), 2 mM L-glutaMax-1^TM (Gibco BRL), 1 mM pirogronianem sodu (Gibco BRL) i antybiotykiem PSN (GIBCO BRL)).

Przed elektroporacją, przygotowano DNA plazmidu pZP-7/MPL-zcytor17 (przykład 1) i oczyszczono stosując zastaw Qiagen Maxi Prep (Qiagen) zgodnie z zaleceniami producenta. Komórki BaF3 do elektroporacji przemyto dwukrotnie podłożem RPMI, po czym zawieszono ponownie w podłożu RPMI przy gęstości komórek 107 komórek/ml.

Jeden ml zawieszonych ponownie komórek BaF3 zmieszano z 30 μg DNA plazmidu pZP-7/MPL-zcytor17 i przeniesiono do oddzielnych jednorazowych komór do elektroporacji (GIBCO BRL). W temperaturze pokojowej komórki rażono prądem 5 x 1 milisekunda przy 800 woltach, a następnie 5 x 2 milisekundy przy 600 woltach wytwarzanym przez urządzenie do elektroporacji (Cyto-Pulse).

Alternatywnie, komórki poddano elektroporacji stosując dwie serie impulsów (800 μFAD/300 V; a następnie 1180 μFAD/300 V) wytwarzanych przez urządzenie do elektroporacji Cell-Porator (GibcoBRL). Komórki poddane elektroporacji przeniesiono do 50 ml pełnych pożywek i umieszczono w inkubatorze na 15-24 godzin (37°C, 5% CO2). Następnie, do komórek w kolbie T-162 dodano substancję selekcjonującą, genetycynę (Gibco) (1 mg/ml G418) w celu wyizolowania puli opornej na G418. Pule transfekowanych komórek BaF3, zwanych dalej komórkami BaF3/MPL-zcytor17, testowano w opisany poniżej sposób pod kątem zdolności do sygnalizacji.

PL 211 833 B1

B. Badanie zdolności do sygnalizacji komórek BaF3/MPL-zcytor17 z zastosowaniem testu proliferacji z wykorzystaniem Alamar Blue

Komórki BaF3/MPL-zcytor17 odwirowano i przemyto opisanym powyżej pełnym podłożem, lecz bez mIL-3 (dalej określanym jako „podłoże bez mIL-3”). Komórki wirowano i przemyto 3 razy w celu zapewnienia usunięcia mIL-3.

Potem komórki zliczono w hemocytometrze. Komórki wysiano na płytki w formacie 96-studzienkowym przy gęstości 5000 komórek na studzienkę w objętości 100 μl na studzienkę stosując podłoża bez mIL-3.

Proliferację komórek BaF3/MPL-zcytor17 określono stosując mysią trombopoetynę (mTPO) rozcieńczoną podłożami bez mIL-3 do stężenia 200 ng/ml, 100 ng/ml, 50 ng/ml, 25 ng/ml, 12,5 ng/ml, 6,25 ng/ml, 3,1 ng/ml, 1,5 ng/ml. Do komórek BaF3/MPL-zcytor17 dodano sto mikrolitrów rozcieńczonej mTPO. Całkowita objętość próbki testowej wynosiła 200 pi. Kontrole negatywne prowadzono równolegle stosując jedynie podłoża bez mIL-3, bez dodatku mTPO.

Próbki na płytkach testowych inkubo-wano w temperaturze 37°C, 5% CO2 przez 3 dni, w trakcie których dodano Alamar Blue (Accumed, Chicago, IL) w ilości 20 pl/studzienkę. Alamar Blue daje odczyt fluorometryczny w oparciu o aktywność metaboliczną komórek i jest to zatem, w porównaniu z kontrolą negatywną, bezpośredni pomiar proliferacji komórkowej.

Próbki na płytkach inkubowano ponownie w temperaturze 37°C, 5% CO2 przez 24 godziny. Płytki odczytano w czytniku płytkowym Fmax^TM (Molecular Devices Sunnyvale, CA) stosując program SoftMax^TM Pro, przy długościach fali 544 (wzbudzenie) i 590 (emisja) lub czytnik płytkowy Wallac Victor 2 (PerkinElmer Life Sciences, Boston, MA).

Wyniki potwierdziły zdolność do sygnalizacji części wewnątrzkomórkowej receptora zcytor17, jako że trombopoetyna, w stężeniach mTPO 50 ng/ml i wyższych, indukowała proliferację około 9-13krotnie wyższą w porównaniu z tłem.

P r z y k ł a d 3

Konstrukcja wektora ekspresyjnego dającego ekspresję zcytor17 o pełnej długości: p7p7pX//zcytor17 A

Klonowanie pełnej długości cDNA zcytor17 do ekspresji: w celu uzyskania pełnej długości cDNA zcytor17, wydzielono uzyskane w wyniku PCR produkty 5' 13' i połączono wykorzystując miejsce wewnętrzne Pstl. Startery PCR zaprojektowano stosując sekwencję nukleotydową SEQ ID NO: 4 w tym miejsca restrykcyjne BamHI i XhoI dla celów klonowania.

Uzyskany w wyniku PCR produkt 5' wytworzono stosując jako sondę biblioteki cDNA WI-38 oraz oligonukleotydy ZC29,359 (SEQ ID NO: 18) i ZC27, 899 (SEQ ID NO: 19) jako startery. WI-38 jest własną biblioteką cDNA uzyskaną z ludzkiej embrionalnej linii komórek płuc (ATCC CRL-2221). Tę reakcję 5'PCR przeprowadzono w sposób następujący: 30 cykli w temperaturze 94°C przez 1 minutę, 65°C przez 1 minutę, 72°C przez 2 minuty, następnie 72°C przez 7 minut; reakcję zakończono w temperaturze 10°C. W reakcji PCR wykorzystano w przybliżeniu 3 pg plazmidu wytworzonego z biblioteki cDNA, 20 pmoli każdego oligonukleotydu oraz pięć jednostek polimerazy DNA PWO (Roche). Stosując etanol wytrącono około 90% uzyskanego w wyniku PCR produktu 5', strawiono stosując BamHI i Pstl i oczyszczono na 1,0% żelu agarozowym. Wycięto prążek dla DNA o wielkości około 600 pz i zastosowane w celu ligacji z wektorem do klonowania pUClB strawionym przy zastosowaniu BamHI i Pstl. Otrzymane w ten sposób transformanty zsekwencjonowano w celu potwierdzenia sekwencji cDNA zcytor17. Dla jednego spośród tych transformantów, wytworzono plazmid DNA i strawiono stosując BamHI i Pstl. Otrzymany w ten sposób prążek DNA o wielkości około 600 pz oczyszczono na żelu i użyto w celu opisanej poniżej ligacji uzyskując cDNA pełnej długości.

Uzyskany w wyniku PCR produkt 3' wytworzono stosując jako sondę własną bibliotekę cDNA ludzkich jąder oraz jako startery oligonukleotydy ZC27,895 (SEQ ID NO: 20) i ZC29,122 (SEQ ID NO: 21). Tę reakcję 3'PCR przeprowadzono w sposób następujący: 30 cykli w temperaturze 94°C przez 45 sekund, 65°C przez 45 sekund, 72°C przez 2 minuty, następnie 72°C przez 7 minut; reakcję zakończono w temperaturze 10°C. Cały produkt reakcji 3'PCR oczyszczono na 1,0% żelu agarozowym i wycięto największy prążek DNA o wielkości 1500 pz. Prążek ten wklonowano do wektora PCR Blunt II TOPO stosując zestaw Zeroblunt TOPO (Invitrogen). Otrzymane w ten sposób transformanty zsekwencjonowano w celu potwierdzenia sekwencji cDNA zcytor17. Dla jednego spośród tych transformantów, wytworzono plazmid DNA i strawiono stosując Pstl i XhoI. Otrzymany w ten sposób prążek DNA o wielkości około 1500 pz oczyszczono na żelu. Przeprowadzono trzyetapową ligację łącząc 5'BamHI z opisanym powyżej fragmentem PstI, 3'Pstl z fragmentem Xhol i wektor ekspresyjny pZp7pX

PL 211 833 B1 strawiono stosując BamHI i XhoI. W wyniku tego otrzymano plazmid pZp7pX zawierający cDNA zcytor17 pełnej długości (SEQ ID NO: 4), oznaczony jako pZp7p/zcytor17. Zcytor17 o pełnej długości cDNA w pZp7p/zcytor17 posiada mutację bezobjawową, w wyniku której T w pozycji 1888 z SEQ ID NO: 4 ulega zamianie na G (kodującą resztę Gly na reszcie 464 z SEQ ID NO: 5). Jako, że mutacja ta była bezobjawową, cDNA zcytor17 w pZp7p/zcytor17 koduje polipeptyd taki jak pokazano na SEQ ID NO: 5. Plazmid pZp7pX jest ssaczym wektorem ekspresyjnym zawierającym kasetę ekspresyjną, w której skład wchodzi promotor CMV, intron A, miejsca dla wielu enzymów restrykcyjnych dla wbudowania fragmentów sekwencji kodujących i terminator ludzkiego hormonu wzrostu. Plazmid posiada również miejsce rozpoczęcia replikacji E. coli, dającą się wyselekcjonować ssaczą jednostkę markerową ekspresji zawierającą promotor SV40, sekwencję wzmacniającą oraz miejsce rozpoczęcia replikacji, gen oporności na puromycynę i terminator SV40.

B. Konstrukcja wektora ekspresyjnego dającego ekspresję WSX-1 o pełnej długości

Cały receptor WSX-1 (SEQ ID NO: 9) wydzielono z plazmidu zawierającego cDNA receptora WSX-1 (SEQ ID NO: 8) (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5 925 735). DNA plazmidu hWSX-1/pBluescript SK (+) (Stratagene, La Jolla, CA) strawiono stosując EcoRI i XhoI w celu uzyskania fragmentu o wielkości 1075 pz, a w celu uzyskania fragmentu o wielkości 900 pz strawiono stosując również Xhol i Xbal. Oba strawione produkty przepuszczono przez 1% żel agarozowy i wydzielono odcięte fragmenty WSX-1.

Biorcę, wektor ekspresyjny pZp7Z, strawiono stosując EcoRI i Xbal i oczyszczono na żelu w sposób opisany powyżej. Ten fragment wektora połączono z dwoma odciętymi fragmentami zcytor17 wydzielonymi w sposób opisany powyżej dla reakcji ligacji stosując ligazę T4 (BRL). Roztwór ligacyjny inkubowano w temperaturze pokojowej przez noc. Próbkę z roztworu ligacyjnego wprowadzono metodą elektroporacji do elektrokompetentnych komórek E. coli DH10B electroMAX (25 μηΤ, 200 Ω, 2,3 V). Hodowla obejmowała sześć kolonii, a DNA uzyskano metodą miniprep i strawiono w celu potwierdzenia wstawienia właściwego fragmentu pełnej długości WSX-1 o wielkości 2,0 kb. W ten sposób otrzymano plazmid pZPZ7Z/WSX-1.

P r z y k ł a d 4

Proliferacja komórek zawierających zcytor17 w teście BAF3 z zastosowaniem Alamar Blue

A. Konstrukcja komórek BaF3, w których dochodzi do ekspresji receptora zcytor17, receptora

WSX-1 i OSMR

Komórki BaF3 eksprymujące receptor zcytor17 pełnej długości skonstruowano jak to opisano powyżej w przykładzie 2A, wykorzystując 30 μg wektora ekspresyjnego zcytor17, opisanego w przykładzie 3A. Jedynym wyjątkiem jest to, że zamiast środka selekcjonującego, genetycyny, w celu wyizolowania puli opornej na puromycynę do transfekowanych komórek w kolbie T-162, dodano 2 μg/ml puromycyny (ClonTech). Komórki BaF3 eksprymujące mRNA receptora zcytor17 oznaczono jako BaF3/zcytor17. W celu uzyskania klonów, komórki Baf3/zcytor17 zliczono w hemocytometrze i wysiano stosując gęstość 1 komórka/studzienkę, 0,5 komórki/studzienkę, 0,1 komórki/studzienkę i 0,01 komórki/studzienkę w płytkach 96-studzienkowych. Piętnaście klonów rozdzielono do kolb T75 i pięć klonów testowano pod kątem ekspresji zcytor17. Z osadów komórkowych wydzielono całkowite RNA posługując się zestawem do izolacji całkowitego RNA S.N.A.P.™ Total RNA Isolation Kit (InVitrogen). Pierwszą nić cDNA zsyntetyzowano stosując zestaw proSTARTM First Strand RT-PCR, po czym przeprowadzono PCR wykorzystując specyficzne dla zcytor17 startery ZC29, 180 (SEQ ID NO: 22) i ZC29,122 (SEQ ID NO: 23) w celu przetestowania klonów pod kątem ekspresji zcytor17. Do namnożenia wybrano jeden klon, BaF3/zcytor17 nr 15 i transfekcji z zastosowaniem wektora ekspresyjnego WSX-1.

Komórki BaF3 eksprymujące zcytor17 oraz WSX-1 pełnej długości skonstruowano tak, jak w powyższym przykładzie 2A, wykorzystując 30 μg wektora ekspresyjnego WSX-1 WSX-1/pZp7Z (przykład 3B) w celu przeprowadzenia elektroporacji komórek BaF3/zcytor17 nr 15. Jedynym wyjątkiem jest to, że zamiast środka selekcjonującego, genetycyny, w celu wyizolowania puli opornej na zeocynę do transfekowanych komórek w kolbie T-162 dodano 200 μg/ml zeocyny (InVitrogen). Komórki BaF3 eksprymujące zcytor17 oraz WSX-1 oznaczono jako BaF3/zcytor17/hWSX-1. W celu uzyskania klonów, pule komórek Baf3/zcytor17/hWSX-1 wysiano na 96-studzienkowe płytki w rozcieńczeniu ograniczającym. Otrzymane w ten sposób klony namnożono i wyizolowano całkowite RNA, posługując się zestawem do izolacji całkowitego RNA S.N.A.P.™ Total RNA Isolation Kit (InVitrogen). Pierwszą nić cDNA zsyntetyzowano stosując zestaw proSTAR First Strand RT-PCR, przeprowadzono PCR wykorzystując specyficzne dla WSX-1 startery ZC9791 (SEQ ID NO: 24) i ZC9793 (SEQ ID NO: 25

PL 211 833 B1 w celu przetestowania klonów pod kątem ekspresji WSX-1. Do namnożenia wybrano jeden klon, BaF3/zcytor17/hWSX-1 nr 5 następnie i transfekcji z zastosowaniem wektora ekspresyjnego OSMRbeta.

Komórki BaF3 eksprymujące zcytor17, WSX-1 i pełnej długości OSMRbeta skonstruowano tak, jak w powyższym przykładzie 2A, wykorzystując 30 μg wektora ekspresyjnego OSMRbeta OSMR/pZp7NX opisanego w przykładzie 29 w celu przeprowadzenia elektroporacji komórek BaF3/zcytor17/hWSX-1 nr 5. Komórki BaF3 eksprymujące mRNA zcytor17, WSX-1 i OSMRbeta oznaczono jako BaF3/zcytor17/WSX-1/OSMR. W celu uzyskania klonów, pule komórek BaF3/zcytor17/WSX-1/OSMRbeta wysiano na 96-studzienkowe płytki w rozcieńczeniu ograniczającym. Konkretne klony namnożono i wyizolowano całkowite RNA posługując się zestawem do izolacji całkowitego RNA S.N.A.P.^TM Total RNA Isolation Kit (InVitrogen). Pierwszą nić cDNA zsyntetyzowano stosując zestaw proSTARTM First Strand RT-PCR, po czym w celu przetestowania klonów pod kątem ekspresji zcytor17, WSX-1 i OSMR zastosowano metodę PCR ze specyficznymi dla OSMRbeta starterami ZC40109 (SEQ ID NO: 26) i ZC40112 (SEQ ID NO: 27). Wyselekcjonowano jeden klon, BaF3/zcytor17/WSX-1/OSMR nr 5 i komórek tych użyto w celu przetestowania pod kątem obecności zcytor17lig jak opisano poniżej w przykładach 5 i 6.

Konstrukcja komórek BaF3, w których dochodzi do ekspresji receptora zcytor17 i OSMR.

Komórki BaF3 eksprymujące receptor zcytor17 pełnej długości skonstruowano tak, jak w powyższym przykładzie 2A, wykorzystując 30 μq wektora ekspresyjnego zcytor17, jak opisano w przykładzie 3A. Jedynym wyjątkiem jest to, że zamiast środka selekcjonującego, genetycyny, w celu wyizolowania puli opornej na puromycynę do transfekowanych komórek w kolbie T-162 dodano 2 μg/ml puromycyny (ClonTech). Komórki BaF3 eksprymujące mRNA receptora zcytor17 oznaczono jako BaF3/zcytor17. W celu uzyskania klonów, pule komórek Baf3/zcytor17 wysiano na 96-studzienkowe płytki w rozcieńczeniu ograniczającym. Klony te namnożono w hodowli i wyizolowano całkowite RNA posługując się zestawem do izolacji całkowitego RNA S.N.A.P.^TM Total RNA Isolation Kit (InVitrogen). Pierwszą nić cDNA zsyntetyzowano stosując zestaw proSTAR First Strand RT-PCR, po czym w celu przetestowania klonów pod kątem ekspresji zcytor17 zastosowano metodę PCR. Do namnożenia wybrano jeden klon, BaF3/zcytor17 nr 15 i transfekcji z zastosowaniem wektora ekspresyjnego OSMRbeta.

Komórki BaF3 eksprymujące zcytor17 i pełnej długości OSMRbeta skonstruowano tak, jak w powyższym przykładzie 2A, wykorzystując 30 μq wektora ekspresyjnego OSMRbeta OSMR//pZp7NX (przykład 29) w celu przeprowadzenia elektroporacji komórek BaF3/zcytor17 nr 15. Komórki BaF3 eksprymujące zcytor17 i OSMRbeta mRNA oznaczono jako BaF3/zcytor17/OSMR. Komórki te użyto w celu przetestowania pod kątem obecności zcytor17lig jak opisano poniżej w przykładzie 5.

P r z y k ł a d 5

Test przesiewowy pod kątem obecności zcytor17lig z wykorzystaniem komórek BaF3//zcytor17/WSX-1/OSMRbeta na bazie testu proliferacji z zastosowaniem Alamar Blue

A. Aktywacja komórek CCRF-CEM i CCRF-HSB2 w celu przeprowadzenia testu na obecność zcytor17lig

Komórki CCRF-CEM i CCRF-HSB2 otrzymano z ATCC i stymulowano w hodowli w celu uzyskania kondycjonowanej pożywki do przeprowadzenia opisanego poniżej testu na aktywność zcy55 tor17lig. Komórki w zawiesinie wysiano w gęstości 2 x 10⁵ komórek/ml lub 5 x 10⁵ komórek/ml w podłożu RPMI-1640 uzupełnionym 10% FBS, 2 mM L-glutaminą (GibcoBRL), 1 x PSN (GibcoBRL) i aktywowano z zastosowaniem 10 ng/ml 12-mirystyniano-13-octanu forbolu (PMA) (Calbiochem, San Diego, CA) i 0,5 μg/ml jonomycyny (Calbiochem) przez 24 lub 48 godzin. Supernatant uzyskany znad stymulowanych komórek użyto w celu określenia proliferacji komórek BaF3/zcytor17/WSX-1//OSMRbeta lub komórek BaF3/zcytor17/OSMRbeta w sposób opisany poniżej.

B. Test przesiewowy pod kątem obecności zcytor17lig z wykorzystaniem komórek BaF3/zcytor17/WSX-1/OSMRbeta lub komórek BaF3/zcytor17/OSMRbeta na bazie testu proliferacji z zastosowaniem Alamar Blue

Komórki BaF3/zcytor17/WSX-1/OSMRbeta lub komórki BaF3/zcytor17/OSMRbeta odwirowano i przemyto stosując podłoże bez mIL-3. Komórki wirowano i przemyto 3 razy w celu zapewnienia usunięcia mIL-3. Potem komórki zliczono w hemocytometrze. Komórki wysiano na płytki w formacie 96-studzienkowym przy gęstości 5000 komórek na studzienkę w objętości 100 μl na studzienkę stosując podłoża bez mIL-3.

Proliferację komórek BaF3/zcytor17/WSX-1/OSMRbeta lub komórek BaF3/zcytor17/OSMRbeta określono stosując kondycjonowaną pożywkę uzyskaną od aktywowanych komórek CCRFCEM

PL 211 833 B1 i -CRF-HSB2 (patrz przykład 5A). Kondycjonowaną pożywkę rozcieńczono stosując podłoża bez mIL-3 do stężenia 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,125%, 1,5%, 0,75% i 0,375%.

Do komórek BaF3/zcytor17/WSX-l/OSMRbeta lub komórek BaF3/zcytor17/OSMRbeta dodano sto mikrolitrów rozcieńczonej pożywki kondycjonowanej. Całkowita objętość próbki testowej wynosiła 200 pi. Próbki na płytkach testowych inkubowano w temperaturze 37°C, 5% CO₂ przez 3-5 dni w trakcie których dodano Alamar Blue (Accumed, Chicago, IL) w ilości 20 pl/studzienkę.

Próbki na płytkach inkubowano ponownie w temperaturze 37°C, 5% CO2 przez 24 godziny. Płytki odczytano w czytniku płytkowym Fmax^TM (Molecular devices) w sposób opisany powyżej (przykład 2).

Wyniki potwierdziły odpowiedź proliferacyjną komórek BaF3/zcytor17/WSX-1/OSMRbeta lub komórek BaF3/zcytor17/OSMRbeta na czynnik występujący w kondycjonowanej pożywce aktywowanych CCRF-CEM i CCRF-HSB2. Jak określono, przy stężeniu 25% odpowiedź była w przybliżeniu 10-krotnie wyższa w porównaniu z tłem. Nietransfekowane komórki BaF3 nie proliferowały w odpowiedzi na ten czynnik, tak samo jak nie proliferowały komórki BaF3 transfekowane zcytor17 i WSX-1 (komórki BaF3/zcytor17/WXS-1), co wskazuje, że czynnik ten był specyficzny względem receptorów zcytor17/OSMRbeta lub zcytor17/OSMRbeta/WSX-1. Ponadto, rozpuszczalny receptor zcytor17 zmniejszał tę aktywność proliferacyjną zcytor17lig w komórkach BaF3/zcytor17/WSX-1/OSMRbeta (patrz przykład 11). Podobnych wyników oczekiwano dla komórek BaF3/zcytor17/OSMRbeta.

C. Źródło pierwotnych komórek ludzkich zastosowanych do wyizolowania zcytor17lig

Od każdego z sześciu dawców pobrano sto mililitrów krwi. Krew zebrano stosując 10 x 10 ml probówki Vacutainer zawierające heparynę. Krew od sześciu dawców (600 ml) połączono, rozcieńczono 1:1 w PBS i rozdzielono stosując Ficoll-Paquet PLUS (Pharmacia Biotech). W wyniku rozdzielania z zastosowaniem gradientu Ficoll'u uzyskano pierwotne komórki ludzkie w ilości 1,2 x 10⁹.

Komórki zawieszono w 9,6 ml buforze MACS (PBS, 0,5% EDTA, 2 mM EDTA). Pobrano 1,6 ml zawiesiny komórkowej i dodano 0,4 ml mikrokulek opłaszczonych CD3 (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Mieszaninę inkubowano przez 15 minut w temperaturze 4°C. Komórki te wyznakowano z stosowaniem kulek opłaszczonych CD3, przemyto 30 ml buforu MACS, po czym zawieszono ponownie w 2 ml buforu MACS.

Kolumnę VS+ (Miltenyi) przygotowano zgodnie ze wskazaniami producenta. Potem, kolumnę VS+ umieszczono w polu magnetycznym wytworzonym przez VarioMACS^TM (Miltenyi). Kolumnę zrównoważono stosując 5 ml buforu MACS. Dalej do kolumny wprowadzono pierwotne komórki ludzkie. Kolumnę mogły opuścić komórki nie posiadające markera CD3. Kolumnę przepłukano 9 ml (3 x 3 ml) buforu MACS. Potem kolumnę usunięto z pola magnetycznego i umieszczono nad probówką typu Falcon o objętości 15 ml.

Komórki CD3+ eluowano dodając do kolumny 5 ml buforu MACS i wypłukano związane komórki posługując się tłokiem dostarczonym przez producenta. Opisane powyżej inkubacje komórek z kulkami magnetycznymi opłaszczonymi CD3, płukania i etapy z wykorzystaniem kolumny VS+ (inkubacja wraz z wymywaniem) powtórzono dodatkowo pięć razy. Otrzymane w ten sposób frakcje zawierające CD3+ uzyskane z sześciu rozdziałów w kolumnie połączono. Uzyskano 3 x 10⁸ wszystkich ludzkich komórek selekcjonowanych pod kątem CD3+.

Pobrano próbkę połączonych selekcjonowanych ludzkich komórek CD3+ w celu przeprowadzenia barwienia i sortowania w urządzeniu sortującym komórki wyznakowane przeciwciałem fluoroscencyjnym (FACS), w celu oceny ich czystości. Wyselekcjonowane ludzkie komórki CD3+ były w 91% komórkami CD3+.

Wyselekcjonowane ludzkie komórki CD3+ aktywowano inkubu-jąc je w RPMI + 5% FBS + PMA 10 ng/ml i jonomycyną 0,5 pg/ml (Calbiochem) przez 13 godzin 37°C. Supernatant znad tych aktywowanych wyselekcjonowanych ludzkich komórek CD3+ badano pod kątem aktywności zcytor17lig w sposób opisany poniżej. Ponadto, aktywowane wyselekcjonowane CD3+ ludzkie komórki użyto w celu przygotowania biblioteki cDNA, jak opisano w przykładzie 6, poniżej.

D. Badanie supernatantu znad aktywowanych wyselekcjonowanych ludzkich komórek CD3+ pod kątem obecności zcytor17lig z wykorzystaniem komórek BaF3/Zcytor17/WSX-1/OSMRbeta oraz testu proliferacji z zastosowaniem Alamar Blue

Komórki BaF3/zcytor17/WSX-1/OSMRbeta lub komórki BaF3/zcytor17/OSMRbeta odwirowano i przemyto stosując podłoże bez mIL-3. Komórki wirowano i przemyto 3 razy w celu zapewnienia usunięcia mIL-3. Potem komórki zliczono w hemocytometrze. Komórki wysiano na płytki w formacie

PL 211 833 B1

96-studzienkowym przy gęstości 5000 komórek na studzienkę w objętości 100 μ! na studzienkę stosując podłoża bez mIL-3.

Proliferację komórek BaF3/zcytor17/WSX-1/OSMRbeta lub komórek BaF3/zcytor17/OSMRbeta oszacowano stosując kondycjonowaną pożywkę znad aktywowanych wyselekcjonowanych ludzkich komórek CD3+ (patrz przykład 5C) rozcieńczoną podłożem bez mIL-3 do stężenia 25%, 12,5%, 6,25%, 3,125%, 1,5%, 0,75%, 0,375% i 0,187%. Do komórek BaF3/zcytor17/WSX-1/OSMRbeta lub komórek BaF3/zcytor17/OSMRbeta dodano sto mikrolitrów rozcieńczonej pożywki kondycjonowanej. Całkowita objętość próbki testowej wynosiła 200 μΚ Próbki na płytkach testowych inkubowano i testowano w sposób opisany w przykładzie 5B.

Wyniki potwierdziły odpowiedź proliferacyjną komórek BaF3/zcytor17/WSX-1/OSMRbeta lub komórek BaF3/zcytor17/OSMRbeta na czynnik występujący w kondycjonowanym podłożu aktywowanych wyselekcjonowanych ludzkich komórek CD3+. Jak określono, przy stężeniu 25% odpowiedź była w przybliżeniu 15-krotnie wyższa w porównaniu z tłem. Nietransfekowane komórki BaF3 nie proliferowały w odpowiedzi na ten czynnik, tak samo jak nie proliferowały komórki BaF3 transfekowane zcytor17 i WSX-1 (komórki BaF3/zcytor17/WXS-1), co wskazuje, że czynnik ten był specyficzny względem receptorów zcytor17/OSMRbeta lub zcytor17/OSMRbeta/WSX-1.

P r z y k ł a d 6

Klonowanie ludzkiego zcytor17lig z biblioteki ludzkich wyselekcjonowanych komórek CD3+

Test przesiewowy biblioteki cDNA pierwotnych ludzkich aktywowanych wyselekcjonowanych komórek CD3+ ujawniło wydzielone cDNA, nowego członka rodziny cytokin o strukturze „pęczka” zbudowanego z czterech helis. To cDNA kodowało zcytor17lig. To cDNA zidentyfikowano przeprowadzając test przesiewowy na aktywność zcytor17lig stosując receptory zcytorl T/WSX-1/OSM.

A. Wektor do konstrukcji biblioteki selekcjonowanych CD3 +

Do konstrukcji biblioteki selekcjonowanych CD3+ zastosowano wektor pZP7NK. Wektor pZP7NX skonstruowano w sposób następujący: region kodujący selektywny marker DHFR w wektorze pZP7 usunięto trawiąc DNA przy zastosowaniu enzymów restrykcyjnych Ncol i Pstl (Boehringer Mannheim). Strawione DNA przepuszczono przez 1% żel agarozowy, wycięto i oczyszczono na żelu stosując zastaw Qiagen Gel Extraction Kit (Qiagen) zgodnie z zaleceniami producenta. Fragment DNA reprezentujący region kodujący selektywnego markera zeocyny powielono stosując metodę PCR posługując się starterami ZC13,946 (SEQ ID NO: 28) i ZC13,945 (SEQ ID NO: 29) i wykorzystując pZeoSV2(+) jako sondę. W starterze ZC13,946 (SEQ ID NO: 28) występują dodatkowe miejsca restrykcyjne Pstl i Bell, a w starterze ZC13,945 (SEQ ID NO: 29) występują dodatkowe miejsca Ncol i Sful. Uzyskany metodą PCR fragment pocięto stosując enzymy restrykcyjne Pstl i Ncol i wklonowano do wektora pZP7 uzyskanego przy zastosowaniu trawienia tymi samymi dwoma enzymami i dalszego oczyszczania na żelu. Wektor ten nazwano pZP7Z. Potem, usunięto region kodujący zeocynę trawiąc DNA wektora pZP7Z stosując enzymy restrykcyjne Bell i Sful. Strawione DNA przepuszczono przez 1% żel agarozowy, wycięto i oczyszczono na żelu, po czym ligowano z fragmentem DNA regionu kodującego neomycynę wyciętego z wektora pZem228 (zdeponowany w American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA; nr depozytu w ATCC 69446) przy zastosowaniu tych samych enzymów restrykcyjnych (Bell i Sful).

W tym nowym wektorze nazwanym pZP7N, region kodujący selektywny marker DHFR zastąpiono regionem kodującym selektywny marker neomycynę z wektora pZem228. W celu uzyskania wektora odpowiedniego do bardzo wydajnego kierunkowego klonowania cDNA do pZP7N dodano jeszcze fragment zawierający miejsce Xhol; ten nowy wektor nazwano pZP7NX. W celu przygotowania wektora dla cDNA, przez 5 godzin w temperaturze 37°C, potem 68°C przez 15 minut trawiono 20 μg pZP7NX stosując 20 jednostek EcoRI (Life Technologies Gaithersberg, MD) i 20 jednostek Xhol (Boehringer Mannheim Indianapolis, IN). Strawiony produkt następnie przepuszczono przez 0,8% żel agarozowy 1XTAE o niskiej temperaturze topnienia, w celu oddzielenia tego dodatkowego fragmentu od wektora. Prążek zawierający wektor wycięto i strawiono stosując „beta-Agarase” (New England Biolabs, Beverly, MA) zgodnie z zaleceniami producenta. Po wytrąceniu przy użyciu etanolu strawiony wektor zawieszono ponownie w wodzie do wartości 45 ng/ml przygotowując do opisanej poniżej ligacji cDNA biblioteki wyselekcjonowanych CD3+.

PL 211 833 B1

B. Przygotowanie biblioteki cDNA pierwotnych ludzkich aktywowanych wyselekcjonowanych komórek CD3+

Po inkubacji w temperaturze 37°C przez 13 godzin (przykład 5C) i wirowaniu wyizolowano około 1,5 x 10⁸ pierwotnych wyselekcjonowanych ludzkich komórek CD3+ stymulowanych w jonomycynie/PMA. Z osadu komórkowego wydzielono całkowite RNA posługując się zestawem „RNeasy Midi” firmy Qiagen, Inc. (Valencia, CA). To mRNA wydzielono z 225 mikrogramów całkowitego RNA stosując zestaw do oczyszczania RNA „MPG mRNA purification kit” firmy CPG Inc. (Lincoln Park, NJ).

Wydzielono 3,4 mikrograma mRNA i przekształcono w dwuniciowy cDNA posługując się następującą procedurą.

Pierwszą nić cDNA ze stymulowanych wyselekcjonowanych ludzkich komórek CD3+ zsyntetyzowano w sposób następujący. Zmieszano dziewięć pl wyselekcjonowanych pod względem T oligo d(T)poli(A) RNA CD3+ w stężeniu 0,34 pg/pl i 1,0 pl 1 pg/pl startera pierwszej nici ZC18,698 (SEQ ID NO: 30) zawierającego miejsce restrykcyjne XhoI i ogrzewano w temperaturze 65°C przez 4 minuty i ochłodzono oziębiając na lodzie. Syntezę pierwszej nici cDNA rozpoczęto dodając do mieszaniny RNA-starter 9 pl buforu dla pierwszej nici (5 x bufor SUPERSCRIPT^®; (Life Technologies), 4 pl 100 mM ditiotreitolu i 2 pl roztworu trifosforanu deoksynukleotydu zawierającego 10 mM każdego spośród dATP, dGTP, dTTP i 5-metylo-dCTP (Pharmacia Biotech Inc.). Mieszaninę reakcyjną inkubowano w temperaturze 45°C przez 4 minuty, po czym dodano 8 pl 200 U/pl Superscriptll^®, RNazę H-odwrotną transkryptazę (Life Technologies). Mieszaninę reakcyjną inkubowano w temperaturze 45°C przez 45 minut przy wzrastającej stopniowo temperaturze inkubacji 1°C co 2 minuty do 50°C, w której to temperaturze prowadzono reakcję przez 10 minut. W celu zniszczenia każdej drugorzędowej struktury i umożliwienia dalszego przedłużenia cDNA roztwór reakcyjny ogrzewano dalej w temperaturze 70°C przez 2 minuty, po czym temperaturę obniżono do 55°C na 4 minuty, następnie _® dodano 2 pl SuperscriptII^® RT i inkubowano przez dalsze 15 minut, po czym temperaturę stopniowo zwiększano do 70°C w tempie 1 minuta/1°C. Niewbudowane nukleotydy usunięto z roztworu cDNA przeprowadzając dwukrotnie wytrącanie z zastosowaniem 2 pg nośnika glikogenowego, 2,0 M octan amonowy i 2,5 objętości etanolu, następnie przemyto 100 pl 70% etanolu. cDNA zawieszono ponownie w 98 pl wody w celu zastosowanie w syntezie drugiej nici.

Syntezę drugiej nici przeprowadzono przy zastosowaniu pierwszej nici cDNA w warunkach umożliwiających zastosowanie startera przy pierwszej nici dla syntezy drugiej nici, otrzymując w ten sposób formację DNA w kształcie szpilki do włosów. W reakcji syntezy drugiej nici zastosowano 98 pl pierwszej nici cDNA, 30 pl 5 x buforu dla polimerazy I (100 mM Tris:HCl, pH 7,5, 500 mM KCl, 25 mM MgCl2, 50 mM (NH4)2SO4), 2 pl 100 mM ditiotreitolu, 6 pl roztworu zawierającego 10 mM każdego trifosforanu deoksynukleotydu, 5 pl o5 mM b-NAD, 1 pl 3 U/pl E. coli ligazy DNA (New England Biolabs Inc.) i 4 pl 10 U/pl E. coli polimerazy DNA I (New England Biolabs Inc.). Mieszaninę reakcyjną przygotowano w temperaturze pokojowej i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 2 minuty, po czym dodano 4 pl 3,8 U/pl RNazy H (Life Technologies). Mieszaninę reakcyjną inkubowano w temperaturze 15°C przez dwie godziny, a następnie 15 minut w temperaturze pokojowej. Do mieszaniny reakcyjnej dodano dziesięć mikrolitrów 1 M TRIS pH 7,4 i ekstrahowano dwukrotnie stosując mieszaninę fenol/chloroform i jeden raz stosując chloroform, potem fazy organiczne ekstrahowano powtórnie stosując 50 pl TE (10 mM TRIS pH 7,4, 1 mM EDTA), połączono z roztworem wodnym i w etanolu, oraz wytrącono z zastosowaniem 0,3 M octanu sodu. Osad przemyto stosując 100 pl 70% etanolu, osuszono powietrzem i zawieszono ponownie w 40 pl wody.

Jednoniciowe DNA o strukturze w kształcie szpilki do włosów pocięto stosując nukleazę fasoli mung. Mieszanina reakcyjna zawierała 40 pl drugiej nici cDNA, 5 pl 10 x buforu dla nukleazy fasoli mung (Life Technologies), 5 pl nukleazy fasoli mung (Pharmacia Biotech Corp.) rozcieńczonej do lU/pl w 1 x buforze dla nukleazy fasoli mung. Mieszaninę reakcyjną inkubowano w temperaturze 37°C przez 45 minut. Reakcję zakończono dodając 10 pl 1 M Tris:HCl, pH 7,4, po czym przeprowadzono ekstrakcje z zastosowaniem mieszaniny fenol/chloroform i chloroformu w sposób opisany powyżej. Po ekstrakcjach, cDNA wytrącono przy użyciu etanolu z 0,3 M octanu sodu. Osad przemyto 100 pl 70% etanolu, suszono powietrzem i zawieszono ponownie w 38 wody.

W zawieszonym ponownie cDNA przeprowadzono reakcje otrzymywania tępych końców z polimerazy DNA T4.

Zawieszone ponownie w 38 pl wody cDNA zmieszano z 12 pl 5 x buforu dla polimerazy DNA T4 (250 mM Tris:HCl, pH 8,0, 250 mM KCI, 25 mM MgCl2), 2 pm 0,1 M ditiotreitolu, 6 pl roztworu zawierającego 10 mM każdego trifosforanu deoksynukleotydu i 2 pl 1 U/pl polimerazy DNA T4 (Boehringer

PL 211 833 B1

Mannheim Corp.). Po trwającej 45 minut inkubacji w temperaturze 15°C, reakcję zakończono dodając 30 μl TE, po czym przeprowadzono kolejno ekstrakcje z zastosowaniem mieszaniny fenol/chloroform i chloroformu i ekstrahowano ponownie stosując 20 μl TE w sposób opisany powyżej. DNA wytrącono przy użyciu etanolu w obecności 2 μl nośnika Pellet Paint^TM (Novagen) i 0,3 M octanu sodu i zawieszono ponownie w 11 μl wody.

Do końców 5' opisanego powyżej cDNA ligowano adaptery EcoRI w celu umożliwienia jego wklonowania do wektora ekspresyjnego. Zmieszano 11 μl cDNA i 4 μl 65 pmoli/pl Eco RI hemifosforylowanego adaptera (Pharmacia Biotech Corp) z 5 μl 5 x buforu dla ligazy (Life Technologies), 2 μl 10 mM ATP i 3 μl 1 U^l ligazy DNA T4 (Life Technologies), 1 μl 10 x buforu do ligacji (Promega Corp), 9 μl wody. Przeprowadzono dodatkowe rozcieńczenie z zastosowaniem 1 x buforu w celu zapobiegnięcia wytrącenia się Pellet Paint. Mieszaninę reakcyjną inkubowano 9 godzin w łaźni wodnej przy stopniowym wzroście temperatury od 10°C do 22°C w ciągu 9 godzin, po czym 45 minut w temperaturze 25°C. Reakcję zakończono prowadząc przez 15 minut inkubację w temperaturze 68°C.

W celu przeprowadzenia kierunkowego wklonowania cDNA do wektora ekspresyjnego, cDNA strawiono stosując XhoI, otrzymując w ten sposób cDNA o lepkich końcach 5'EcoRI i 3'XhoI. Miejsce restrykcyjne XhoI na końcu 3' cDNA wprowadzono uprzednio stosując starter ZC18698 (SEQ ID NO: 30).

Trawienie przy zastosowaniu enzymów restrykcyjnych prowadzono w mieszaninie reakcyjnej zawierającej 35 μl opisanej powyżej mieszaniny ligacyjnej, 6 μl 10 x buforu H (Boehringer Mannheim Corp.), 1 μl 2 mg/ml BSA (Biolabs Corp.), 17 μl wody i 1,0 μl 40 U^l XhoI (Boehringer Mannheim). Trawienie prowadzono w temperaturze 37°C przez 1 godzinę. Reakcję zakończono prowadząc przez 15 minut inkubację w temperaturze 68°C, po czym wytrącano stosując etanol, przemyto i osuszono w sposób opisany powyżej, a następnie zawieszono ponownie w 30 μl wody.

Zawieszone ponownie cDNA ogrzewano w temperaturze 65°C przez 5 minut i ochłodzono na lodzie, dodano 4 μl 5 x barwnika do żelu (Research Genetics Corp.), cDNA wprowadzono na 0,8% 1 x żel agarozowy o niskiej temperaturze topnienia TAE (agaroza o niskiej temperaturze topnienia SEA PLAQUE GTG™; EMC Corp.) i poddano elektroforezie. Z żelu wycięto zbędne adaptery i cDNA o długości mniejszej niż 0,6 Kb. Elektrody zamieniono miejscami, w celu wypełnienia studzienek dodano stopioną agarozę, zmieniono bufor i prowadzono elektroforezę do chwili aż cDNA zgromadziło się niedaleko linii wyjściowej. Fragmenty żelu zawierające nagromadzone cDNA wycięto i umieszczono w probówkach do mikrowirówki i stopiono agarozę, podgrzewając ją w temperaturze 65°C przez 15 minut. Po obniżeniu temperatury próbki do 45°C, dodano 2 μl 1 U^l Beta-agarazy I (Biolabs, Inc.) i mieszaninę inkubowano przez 90 minut w temperaturze 45°C w celu strawienia agarozy. Po inkubacji, do próbki dodano 1/10 objętości 3 M octanu sodu i mieszaninę inkubowano na lodzie przez 15 minut. Próbkę mieszaniny wirowano przy 14000 x g przez 15 minut w temperaturze pokojowej dla usunięcia niestrawionej agarozy, stosując etanol wytrącono cDNA, przemyto 70% etanolem, osuszono powietrzem i zawieszono ponownie w 40 μl wody.

Dla określenia optymalnej proporcji cDNA do wektora zebrano kilka mieszanin ligacyjnych i przeprowadzono proces elektroporacji. W skrócie, 2 μl 5 x buforu dla ligazy T4 (Life Technologies), 1 μl 10 mM ATP, 1 μl pZP7NX strawionego przy zastosowaniu EcoRl-Xhol, 1 μl ligazy DNA T4 rozcieńczonej do 0,25 U^l (Life Technologies) wodą do 10 μl i 0,5, 1,2 lub 3 μl cDNA zmieszano tworząc 4 oddzielne mieszaniny ligacyjne, inkubowano w temperaturze 22°C przez 4 godziny, 68°C przez 20 minut, wytrącono stosując octan sodu-etanol, przemyto, osuszono i zawieszono ponownie w 10 pl. Jeden mikrolitr z każdej mieszaniny ligacyjnej wprowadzono metodą elektroporacj i do 40 pl elektrokompetentnych bakterii DHlOb ElectroMax^TM (Life Technologies) posługując się kuwetką na 0,1 cm (Biorad) i urządzeniem Genepulser, pulse controller^TM (Biorad) przy ustawieniu 2,5 KV, 251 F, 200 omów. Komórki te natychmiast zawieszono ponownie w 1 ml bulionu SOC (Manniatis i in., jak wyżej), po czym dodano 500 pl układu 50% glicerol-SOC jako środek konserwujący. Kilka próbek zawierających te „glicerolowe roztwory podstawowe” zamrożono w temperaturze -70°C. Rozmrożono próbkę każdego roztworu i wysiano seryjnie na płytki LB-agar z dodatkiem ampicyliny w ilości 100 pg/ml. Na podstawie liczby kolonii stwierdzono, że optymalna proporcja cDNA CD3+ do wektora pZP7NX wynosi 1 pl do 45 ng; taki roztwór ligacyjny dał 4,5 miliona klonów pierwotnych.

W celu przeprowadzenia testu przesiewowego biblioteki z wykorzystaniem testu proliferacji BaF3 (przykład 5), glicerolowe roztwory podstawowe uzyskane w opisany powyżej sposób rozcieńczono do uzyskania płynnych hodowli zawierających 100 lub 250 klonów na pulę w głębokostudzienkowych płytkach do mikromiareczkowania, hodowano przez 24 godziny wytrząsając w temperaturze

PL 211 833 B1

37°C i wydzielono plazmid posługując się zestawem Qiagen zgodnie z zaleceniami producenta. Takim DNA z kolei transfekowano komórki BHK, utrzymywano je przez 72 godziny w kondycjonowanych pożywkach które zebrano i przechowywano w temperaturze -80°C po czym z kolei dodano do zawiesiny komórek 5KBaF3/zcytor17/WSX-1/OSMRbeta lub BaF3/zcytor17/OSMRbeta na 72 godziny po czym stosując test fluorescencji „Alamar blue” określono proliferację (przykład 5B i przykład 2B).

P r z y k ł a d 7

Klonowanie ulegającego ekspresji ludzkiego zcytor17lig

Glicerolowe roztwory podstawowe z biblioteki aktywowanych ludzkich wyselekcjonowanych komórek CD3+ (przykład 6) dodano do bulionu Super Broth II^TM (Becton Dickinson, Cockeysville, MD) wraz z 0,1 mg/ml ampicyliny (amp) w stężeniu 250 komórek na 800 mikrolitrów. E. coli pozostawiono na 24 godziny w temperaturze pokojowej. W chwili posiewu, 400 mikrolitrów wysiano na płytki LB + amp w celu określenia aktualnego miana inokulacji. Po 24 godzinach płytki zliczono, po czym końcowe stężenie Super Broth II + E. coli uregulowano w taki sposób, żeby wynosiło 250 komórek na 1,2 ml. Zaszczepiono trzy razy po 2 litry w celu uzyskania ogółem 6 litrów. Pożywki wysiano potem na głębokie 96-studzienkowe płytki (Qiagen). Wysiew przeprowadzono stosując 8-kanałowy dozownik Q-Fil12^TM (Genetix, Christchurch, Dorset, UK).

E. coli hodowano przez noc w temperaturze 37°C wytrząsając przy 250 obrotach/minutę stosując wielopoziomową wytrząsarkę New Brunswick Scientific Innova 4900. E. coli odwirowano z roztworu przy 3000 obrotów na minutę, stosując wirówkę Beckman GS-6KR. Te osady E. coli zamrożono w temperaturze -20°C lub użyto śwież ych przed wyizolowaniem plazmidowego DNA za pomocą techniki mini prep. Każdy osad zawiera około 250 klonów cDNA biblioteki ludzkich wyselekcjonowanych komórek CD3+.

Potem, w celu wyizolowania plazmidu zastosowano technikę mini prep wykorzystując te pule zawierające po 250 klonów cDNA, posługując się zestawem QIAprep^TM 96 Turbo Miniprep Kit (Qiagen). Plazmid DNA eluowano stosując 125 μl TE (10 mM Tris pH 8,1 mM EDTA). Potem to plazmidowe DNA użyto do transfekcji komórek BHK.

Transfekcja BHK

Komórki BHK wysiano na 96-studzienkowe płytki do hodowli tkankowej w gęstości 12000 komórek na studzienkę w objętości 100 μl na studzienkę. Pożywką hodowlaną był DMEM (GibcoBRL), 5% inaktywowaną wysoką temperaturą płodową surowica bydlęcą, 2 mM L-glutamina (GibcoBRL), 1 x PSN (GibcoBRL), 1 mM pirogronian sodu (GibcoBRL).

Następnego dnia, komórki BHK przemyto jeden raz 100 μl SFA. SFA oznacza podłoże bez surowicy, którym jest DMEM/F12 lub DMEM (Gibco/BRL), 2 mM GlutaMax™ (Gibco/BRL), 1 mM pirogronian sodu, 10 μ^ transferyny, 5 μ^ insuliny, 10 μ^ fetuiny, 2 μ^ selenu, 25mM HEPES (Gibco/BRL), 100 pM aminokwasów endogennych (Gibco/BRL).

Mieszaninę DNA/Lipofectamine™ przygotowano w sposób następujący: 2,2 μl Lipofectamine (Gibco/BRL) połączono z 102,8 μl SFA w temperaturze pokojowej; potem do mieszaniny Lipofectamine™/SFA dodano około 5 μl DNA plazmidowego (200 ng/μθ uzyskując mieszaninę DNA//Lipofectamine™, którą inkubowano w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Z zawiesiny komórek BHK usunięto SFA i inkubowano je z mieszaniną DNA/Lipofectamine'' w ilości 50 μl przez 5 godzin w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO2. Do każdej z dwóch studzienek zawierających komórki BHK dodano 50 μl mieszaniny DNA/Lipofectamine™ tak, że transfekcję przeprowadzono w dwóch powtórzeniach.

Po 5-godzinnej inkubacji komórek BHK z mieszaniną DNA/Lipofectamine™, usunięto mieszaninę DNA/Lipofectamine™ i dodano 100 μl podłoża hodowlanego. Komórki inkubowano przez noc, media usunięto i zastąpiono 100 μl podłoża hodowlanego. Po prowadzonej przez 48-72 godzin hodowli, usunięto kondycjonowaną pożywkę, zamrożono w temperaturze -80°C na co najmniej 20 minut, rozmrożono, po czym 50 μl zastosowano w teście proliferacji BafS, w sposób opisany w przykładzie 5, w celu identyfikacji puli zawierających 250 klonów z aktywnością liganda.

W jednym teście przesiewowym przebadano 20 96-studzienkowych płytek. To oznacza około 250 jednostek cDNA/studzienkę lub ogólnie 480000 jednostek cDNA. Spośród nich, w przypadku około 60 studzienek (z 250 jednostkami cDNA na studzienkę) kondycjonowana pożywka dała wynik pozytywny w teście proliferacji. Spośród tych pul dających wynik pozytywny wybrano jedną, rozbito i wyizolowano pojedynczy cDNA kodujący zcytor17lig. Była to pula 62A12.

W przypadku puli 62A12, do transformacji komórek ElectroMax™ DH10 B (Gibco/BRL) metodą elektroporacji użyto 1 μl DNA. Transformanty wysiano na płytki LB + amp (100 μΐ/ml) w celu uzyskania

PL 211 833 B1 pojedynczych kolonii. Z puli poddanej elektroporacji, 672 indywidualnych kolonii przeniesiono wykałaczką do siedmiu 96-studzienkowych płytek zawierających po 1,2 ml bulionu Super Broth II™ na studzienkę. Płytki te oznaczono numerami 62.1 do 62.7. Prowadzono inkubacje przez noc i wyizolowano DNA plazmidowe stosując technikę mini prep w sposób opisany powyżej. W przypadku wszystkich siedmiu płytek, uzyskanym z nich DNA plazmidowym transfekowano komórki BHK i przeprowadzono test proliferacji, w sposób opisany powyżej, z tym wyjątkiem, że transfekcji nie wykonywano w dwóch powtórzeniach.

Z łącznie 672 klonów zidentyfikowano dwa wykazujące aktywność pozytywną, 62,6C7 i 62,6E9. Plazmidowe DNA wyizolowane z klonu 62,6E9 przy zastosowaniu techniki mini prep zsekwencjonowano i otrzymano próbną identyfikację, lecz z tych wykazujących aktywność pozytywną klonów otrzymano sekwencję mieszaną. W celu dalszej izolacji cDNA zcytor17lig do pojedynczego klonu, w celu przeprowadzenia elektroporacji komórek DH10B użyto 1 pl DNA z puli 62,6E9, a transformanty wysiano na płytkach LB + amp (100 pg/ml) w celu uzyskania pojedynczych kolonii. Plazmidowe DNA wyizolowane techniką mini prep z kilku kolonii zsekwencjonowano uzyskując dokładną sekwencję DNA. Sekwencja polinukleotydową zcytor17lig miała pełną długość (SEQ ID NO: 1) i pokazano odpowiadającą jej sekwencję aminokwasową (SEQ ID NO: 2).

P r z y k ł a d 8

Konstrukcja ssaczych wektorów ekspresyjnych eksprymujących rozpuszczalne receptory zcytor17: zcytor17CEE zcytor17CFLG, zcytor17CHIS i zcytor17-Fc4

A. Konstrukcja ssaczego wektora ekspresyjnego zcytor17 zawierającego zcytor17CEE, zcytor17CFLG i zcytor17CHIS

W celu uzyskania ekspresji rozpuszczalnej, pozakomórkowej domeny polipeptydu zcytor17, pZp9zcytor17CEE, wytworzono wektor ekspresyjny, przy czym konstrukt zaprojektowano tak, aby eksprymował polipeptyd zcytor17 zawierający na początku przewidywaną metioninę i odcięty w pobliżu przewidywanej domeny przezbłonowej i wraz z C-końcowym znacznikiem Glu-Glu (SEQ ID NO: 32).

Posługując się techniką PCR uzyskano produkt o wielkości około 1500 pz stosując jako startery ZC29,451 (SEQ ID NO: 33) i ZC29,124 (SEQ ID NO: 34) po to aby dodać miejsca restrykcyjne EcoRI i BamHI. Jako sondę zastosowano własną bibliotekę cDNA ludzkiego HPVS, a powielanie metodą PCR przeprowadzono w sposób następujący: 30 cykli w temperaturze 94°C przez 1 minutę, 65°C przez 1 minutę, 72°C przez 1,5 minuty, po czym 72°C przez 7 minut; reakcję zakończono w temperaturze 10°C.

Dodając etanol do mieszaniny reakcyjnej PCR uzyskano osad i przeprowadzono proces trawienia stosując enzymy restrykcyjne EcoRI i BamHI. Strawiony, uzyskany w wyniku reakcji PCR produkt oczyszczono na 1,0% żelu agarozowym i wycięto prążek DNA o wielkości około 1500 pz. Prążek ten następnie namnożono ponownie stosując identyczne startery w następujących cyklach: 30 cykli w temperaturze 94°C przez 1 minutę, 65°C przez 1 minutę, 72°C przez 3 minuty, dalej 72°C przez 7 minut; reakcję zakończono w temperaturze 10°C. Dodając etanol do mieszaniny reakcyjnej PCR uzyskano osad i przeprowadzono proces trawienia stosując enzymy restrykcyjne EcoRI i BamHI. Strawiony, uzyskany w wyniku reakcji PCR, produkt oczyszczono na 1,0% żelu agarozowym i wycięto prążek DNA o wielkości około 1500 pz. Wycięte DNA wklonowano do plazmidu CEEpZp9 pociętego przy zastosowaniu enzymów EcoRI i BamHI, w celu uzyskania plazmidu z rozpuszczalnym receptorem zcytor17, zcytor17CEEpZp9 wyznakowanym na C-końcu sekwencją Glu-Glu. Domena pozakomórkową w cDNA zcytor17CEE w zcytor17CEEpZp9 posiada mutację bezobjawową, w wyniku której dochodzi do zamiany T na C w pozycji 1705 w SEQ ID NO: 4 (kodującą resztę Pro na reszcie 403 w SEQ ID NO: 5). Jako że mutacja ta była bezobjawowa, cDNA zcytor17 w zcytor17CEEpZp9 koduje polipeptyd taki jak pokazano w SEQ ID NO: 5. Ponadto, ze względu na zastosowany konstrukt, resztę Gly-Ser wstawiono w kierunku końca C względem końca sekwencji rozpuszczalnej, pozakomórkowej domeny zcytor17 i przed C-końcowym znacznikiem Glu-Glu (SEQ ID NO: 32). Jako taki, znacznikiem na C-końcu pozakomórkowej domeny zcytor17 był znacznik Glu-Glu, jak to pokazano w (SEQ ID NO: 17). Plazmid CEEpZp9 jest ssaczym wektorem ekspresyjnym zawierającym kasetę ekspresji, zawierającą mysi promotor metalotioneiny-1, miejsca dla wielu enzymów restrykcyjnych w celu wstawienia fragmentu sekwencji kodujących oraz terminator ludzkiego hormonu wzrostu. Plazmid posiada również miejsce rozpoczęcia replikacji E. coli, dającą się wyselekcjonować ssaczą jednostkę markerową ekspresji zawierającą promotor SV40, sekwencję wzmacniającą i miejsce rozpoczęcia replikacji, genu DHFR i terminator SV40. Stosując typowe techniki biologii molekularnej, elektroporację, do komórek kompetentnych DH10B (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD) wprowadzono zcytor17CEEpZp9, zgodnie

PL 211 833 B1 z zaleceniami producenta i wysiano na płytkach LB zawierających 100 pg/ml ampicyliny i inkubowano przez noc. Kolonie badano przesiewowo przy zastosowaniu analizy restrykcyjnej lub metodą PCR z DNA uzyskanego z indywidualnych kolonii. Wstawioną sekwencję z klonów o aktywności pozytywnej zweryfikowano przy zastosowaniu analizy sekwencji. Wytwarzanie plazmidu na dużą skalę przeprowadzono stosując zestaw OIAGENO Maxi Prep (Qiagen) zgodnie ze wskazaniami producenta.

Tę samą procedurę zastosowano do wytwarzania rozpuszczalnych receptorów zcytor17 z umieszczonym na C-końcu znacznikiem His, zbudowanym z 6 ustawionych pod rząd reszt His; i C-końcowym znacznikiem FLAG^®; (SEQ ID NO: 36), zcytor17CFLAG. W celu uzyskania tych konstruktów wykorzystano wspomniany powyżej wektor posiadający w miejscu znacznika Glu-Glu znacznik HIS lub FLAG^®; (np. SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO; 32 lub SEQ ID NO: 35).

B. Konstrukcja ulegającego ekspresji w komórkach ssaczych rozpuszczalnego ludzkiego receptora zcytor17: zcytor17-Fc4

Po to, aby uzyskać ekspresję w komórkach PF CHO wyznakowanej na C końcu znacznikiem Fc4 rozpuszczalnej odmiany hzcytor17 (ludzki zcytor17-Fc4) wytworzono wektor ekspresyjny, pEZE-2hzcytor17/Fc4. Komórki PF CHO są własną linią komórek CHO zaadaptowanych do namażania w pożywce bez białka (pożywka ExCell 325 PF; JRH Biosciences). Własną linię komórek CHO otrzymano pierwotnie z komórek CHO DG44 (G. Urlaub, J. Mitchell, E. Kas, L. A. Chasin, V. L. Funanage, T. T. Myoda i J. L. Hamlin, „Effect Of Gamma Rays at Dihydrofolate Reductase Locus: Deletions and Inversions, Somatic Cell and Molec. Genet., 12: 555-566 (1986). Fragment cDNA zcytor17 zawierający sekwencję polinukleotydową pozakomórkowej domeny receptora zcytor17 połączono w ramce z sekwencją polinukleotydową Fc4 (SEQ ID NO: 37) w celu uzyskania konstruktu zcytor17-Fc4 (SEQ ID NO: 38 i SEQ ID NO: 39). Wektor pEZE-2 jest ssaczym wektorem ekspresyjnym zawierającym sekwencję polinukleotydową Fc4 i miejsce klonowania umożliwiające szybką utworzenie C-końcowych konstruktów na drodze fuzji z Fc4 przy użyciu typowych technik biologii molekularnej.

Posługując się techniką PCR wytworzono fragment o długości 1566 par zasad, zawierający pozakomórkową domenę ludzkiego zcytor17 i pierwsze dwa aminokwasy Fc4 (Glu i Pro) wraz z sekwencjami kodującymi miejsca dla Fsel i Bglll odpowiednio na końcu 5' 13'. Ten fragment uzyskany przy zastosowaniu techniki PCR wytworzono wykorzystując startery ZC29,157 (SEQ ID NO: 40) i ZC29,150 (SEQ ID NO: 41) przez powielenie z plazmidu zawierającego pozakomórkową domenę ludzkiego zcytor17 (pZp9zcytor17CEE) (przykład 8A). Warunki PCR reakcji były następujące: 25 cykli w temperaturze 94°C przez 1 minutę, 60°C przez 1 minutę i 72°C przez 2 minuty; 1 cykl w temperaturze 72°C przez 10 minut; po czym reakcje zakończono w temperaturze 4°C. Fragment strawiono stosując endonukleazy restrykcyjne Fsel i Bglll, po czym oczyszczono metodą elektroforezy na żelu 1%, a prążek oczyszczono posługując się zestawem do ekstrakcji na żelu QiaQuick (Qiagen). Otrzymane w ten sposób oczyszczone DNA ligowano przez 5 godzin w temperaturze pokojowej z wektorem pEZE-2 strawionym uprzednio przy zastosowaniu Fsel i Bglll zawierającym Fc4 3' miejsc Fsel i Bglll.

Stosując metodę elektroporacji do 37 pl elektrokompetentnych komórek E. coli DH10B (Gibco) wprowadzono 2 pl mieszaniny ligacyjnej zgodnie z zaleceniami producenta. Transformowane komórki rozcieńczono w 400 pl pożywki LB i wysiano na płytki LB zawierające 100 pg/ml ampicyliny. Klony zanalizowano metodą analizy restrykcyjnej a klony o aktywności pozytywnej wysłano do zsekwencjonowania DNA w celu potwierdzenia sekwencji konstruktu fuzyjnego. Elektrokompetentne komórki E. coli DH10B (37 pl) transformowano stosując jeden mikrolitr klonu o aktywności pozytywnej i posiano pasmowo na płytce LB/amp. Z tej płytki pobrano pojedynczą kolonię w celu zapoczątkowania hodowli na LB/amp w objętości 250 ml, którą następnie inkubowano przez noc w temperaturze 37°C z wytrząsaniem przy 250 obrotach na minutę. Hodowlę tę użyto w celu uzyskania, przy zastosowaniu zestawu Qiagen plasmid Maxi (Qiagen), 750 pg oczyszczonego DNA.

P r z y k ł a d 9

Transfekcja i ekspresja rozpuszczalnych polipeptydów receptora zcytor17

Komórki BHK 570 (ATCC nr CRL-10314), DG-44 CHO, lub inne komórki ssaka powleczono w ilości około 1. 2 x 10⁶ komórek/studzienkę (płytka 6-studzienkowa) w 800 pl odpowiedniej pożywki pozbawionej surowicy (SF) (np. DMEM, Gibco/BRL High Glucose) (Gibco BRL, Gaithersburg, MD). Komórki transfekowano plazmidami ekspresji zawierającymi zcytor17CEE, zcytor17CFLG, zcytor17CHIS lub zcytor17-Fc4 (przykład 8), przy użyciu Lipofectin^TM (Gibco BRL), w pożywce pozbawionej surowicy (SF), zgodnie z instrukcjami producenta. Pojedyncze klony wykazujące ekspresję rozpuszczalnych receptorów wydzielono, przesiano, hodowano w pożywce do hodowli komórek i oczyszczono przy użyciu standardowych technik.

PL 211 833 B1

A. Ekspresja u ssaka rozpuszczalnego, ludzkiego receptora zcytor17CEE

Komórki BHK 570 (ATCC NO: CRL-10314) powleczono w kolbach do hodowli tkankowej T-75 i pozostawiono do wzrostu do konfluencji około 50-70% w temperaturze 37°C, 5% CO2, w pożywkach DMEM/FBS (DMEM, Gibco/BRL High Glucose, (Gibco BRL, Gaithersburg, MD), 5% surowicy płodu bydlęcego, 1 mM L-glutamina (JRH Biosciences, Lenea, KS), 1 mM pirogronian sodu (Gibco BRL)). Komórki następnie były transfekowane plazmidem zawierającym zcytor17CEE (przykład 8A), przy użyciu Lipofectamine (Gibco BRL), w preparacie pożywki pozbawionej surowicy (SF) (DMEM, 10 mg/ml transferyny, 5 mg/ml insuliny, 2 mg/ml fetuiny, 1% L-glutaminy i 1% pirogronian sodu). Dziesięć mikrogramów plazmidowego DNA pZp9zcytor17CEE (przykład 8A) rozcieńczono w 15 ml rurce do całkowitej końcowej objętości wynoszącej 500 μl z użyciem pożywek SF. Pięćdziesiąt mikrolitrów Lipofectamine wymieszano z 450 μl pożywki SF. Mieszaninę Lipofectamine dodano do mieszaniny DNA i pozostawiono do inkubacji, w przybliżeniu 30 minut, w temperaturze pokojowej. Cztery ml pożywek SF dodano do mieszaniny DNA:Lipofectamine. Komórki przepłukano raz 5 ml pożywek SF, aspirowano i dodano mieszaninę DNA:Lipofectamine. Komórki inkubowano w temperaturze 37°C przez pięć godzin i następnie dodano 5 ml pożywek DMEM/10% FBS. Kolbę inkubowano w temperaturze 37°C przez noc, po którym to czasie komórki rozdzielono do pożywek wybiórczych (pożywki DMEM/FBS jak wyżej, z dodatkiem 1 μM metotreksatu lub 10, μM Methotrexate (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) w 150 mm płytkach, w stosunku 1:2,1:10 i 1:50. Około 10 dni po transfekcji, jedną 150 mm płytkę kolonii opornej wobec 1 μM metotreksatu poddano działaniu trypsyny, komórki zlano i połowę komórek ponownie powleczono w 10 μM metotreksatu; dla dodatkowego powielenia ekspresji białka zcytor17CEE. Próbkę kondycjonowanej pożywki z tego zbioru powielonych komórek testowano pod względem poziomu ekspresji przy użyciu analizy SDS-PAGE i Western.

B. Ekspresja u ssaka rozpuszczalnego ludzkiego receptora zcytor17-Fc4

Pięć powtórzeń 200 μg DNA plazmidu pEZE-2hzcytor17Fc4 (przykład 8B) linearyzowano poprzez trawienie restrykcyjne z użyciem Fspl, enzymu restrykcyjnego, który tnie raz w wektorze i nie zakłóca genów koniecznych dla ekspresji. 200 μg genomowego DNA komórek CHO dodano do każdego powtórzenia w postaci nośnego DNA, a następnie DNA wytrącono przez dodanie 0,1 objętości 3M octanu sodu, pH 5,2 i 2,2 objętości etanolu, a następnie 15 minut inkubacji na lodzie i mikroodwirowanie w temperaturze 4°C. Uzyskane grudki DNA przemyto w 70% etanolu i osuszono na powietrzu przed ponownym zawieszeniem w 100 μl pozbawionych białka (PF), niewybiórczych wobec CHO pożywkach wzrostowych (21 g/l PF CHO Ex Cell 325/200 mM L-glutamina (Gibco)/lOO mM pirogronian sodu (Gibco)/lx HT Supplement (Gibco). Dziesięć milionów komórki PF CHO pasaż 61 dodano do DNA w 600 μl pożywek wzrostowych PF, niewybiórczych wobec CHO i następnie poddano elektroporacji w Gene Pulser II Electroporation system (BioRad), stosując pojemność 950 μF i 300 Kv, przy użyciu kuwety do elektroporacji Gene Pulser (BioRad) o szczelinie 0,4 cm. Wszystkie 5 powtórzeń komórek poddanych elektroporacji zlano i bezpośrednio poddano selekcji w pożywkach - HT (21 g/l PF CHO Ex Cell 325/200 mM L-glutamine (Gibco)/100 mM pirogronian sodu (Gibco). Komórki poddawano selekcji przez 15 dni w pożywkach -HT przed pasażowaniem w ilości 4 x 10⁵ ml do 50 nm wybiórczej MTX. Osiem dni później komórki posiano w ilości 3,5 x 10⁵ komórek/ml do 200 mM wybiórczej ₅

MTX. Po tygodniu, komórki posiano w ilości 4 x 10 komórek/ml do 1 μM wybiórczej MTX. Po dwóch tygodniach przy 1 μM MTX, komórki posiano w ilości 1 x 10⁶ komórek/ml do 50 ml, aby wytworzyć kondycjonowaną pożywkę. Uzyskane, 72-godzinne kondycjonowane pożywki zanalizowano za pomocą sondowania techniką western blots z przeciwciałem wytworzonym przeciwko ludzkiej Ig. Komórki wytwarzały białko hzcytor17/Fc4 w ilości wynoszącej w przybliżeniu 1 mg/l.

C. Ekspresja na większą skalę rozpuszczalnego ludzkiego receptora zcytor17-Fc4 u ssaka

Dwieście μg DNA plazmidu pEZE-2hzcytor17Fc4 (przykład 8B) linearyzowano poprzez trawienie restrykcyjne z użyciem Fspl, enzymu restrykcyjnego, który tnie raz w wektorze pEZE-2 i nie zakłóca genów koniecznych dla ekspresji. Dwieście mikrogramów genomowego DNA CHO (wytworzonego w laboratorium) dodano jako nośnikowego DNA i następnie ten DNA wytrącono przez dodanie 0,1 objętości 3M octanu sodu, pH 5,2 i 2,5 objętości etanolu, a następnie mikroodwirowanie w temperaturze pokojowej. Wykonano i transformowano pięć powtórzeń grudek DNA. Uzyskane grudki DNA przemyto w 70% etanolu i osuszono na powietrzu przed ponownym zawieszeniem w 100 μl pożywek wzrostowych PF, niewybiórczych wobec CHO (21 g/l PF CHO Ex Cell 325/200 mM L-glutamina (Gibco)/100 mM pirogronian sodu (Gibco)/1 x HT Supplement (Gibco). Dziesięć milionów komórek PF CHO dodano do DNA w 600 μl pożywek wzrostowych PF, nie wybiórczych wobec CHO i następnie poddano elektroporacji w Gene Pulser Electroporation System (BioRad), stosując pojemność 950 pF

PL 211 833 B1 i 300 woltów, przy użyciu kuwety do elektroporacji Gene Pulser (BioRad) o szczelinie 0,4 cm. Poddane elektroporacji komórki zlano i umieszczono bezpośrednio w wybiórczych pożywkach -HT (21 g/l PF CHO Ex Cell 325/200 mM L-glutamina (Gibco)/100 mM pirogronian sodu (Gibco). Komórki poddawano selekcji przez 14 dni w pożywkach -HT przed pasażowaniem w ilości 4 x 10⁵/ml, do 50 nm wybiórczej MTX. Komórki powielano do 200nM MTX, a następnie do 1 pM MTX. Zbiory -HT, 50 nM, i 1 μΜ posiano w ilości 1 x 10⁶ c/ml na 48 godzin i otrzymaną kondycjonowaną pożywkę zanalizowano przez sondowanie techniką western blots z przeciwciałem wytworzonym przeciwko ludzkiej Ig.

P r z y k ł a d 10

Oczyszczanie rozpuszczalnych receptorów zcytor17 z komórek BHK 570 i CHO

A. Krótkotrwała ekspresja u ssaka i oczyszczanie rozpuszczalnego ludzkiego receptora zcytor17-Fc4

DNA plazmidu pEZE-2hzcytor17Fc4 (przykład 8B) wprowadzono do 40 maxi płytek komórek BHK przy użyciu Lipofectamine (Gibco BRL), jak opisano niniejszym i w instrukcjach producenta. Komórki pozostawiono do powrotu przez noc, następnie przepłukano i ponownie zasilono pożywką pozbawioną surowicy (SL7V4, wykonaną na miejscu). Po 72 godzinach, pożywki zebrano i przesączono, a komórki ponownie zasilono pożywką pozbawioną surowicy. Po 72 godzin, pożywki ponownie zebrano i przesączono.

Pozbawioną surowicy kondycjonowaną pożywkę (partie 2 x 1,5 l) z krótkotrwale transfekowanych komórek BHK pompowano przez 1,5 ml kolumnę białko A-agaroza w 20 mM Tris, pH 7,5, 0,5 M NaCl. Kolumnę przemyto intensywnie tym buforem i następnie eluowano związane białko 1 ml 0,2 M glicyny, pH 2,5, 0,5 M NaCl. Eluowano białko zebrano do 0,1 ml 2 M Tris, pH 8,5. Równe ilości zebrano do elektroforezy żelowej SDS-poliakrylamid i masę zcytor17-Fc dializowano przez noc przeciwko PBS. Rozpuszczalny receptor jałowo przesączono i umieszczono w równych ilościach, w temperaturze -80°C.

B. Oczyszczanie zcytor17-Fc4

Rekombinacyjny, karboksyterminalny zcytor17 znakowany Fc4 (przykład 8 i przykład 9) wytworzono z transfekowanych komórek CHO. Transfekcję CHO przeprowadzono przy użyciu metod znanych w dziedzinie. Zebrano w przybliżeniu pięć litrów kondycjonowanej pożywki i jałowo przesączono przy użyciu filtrów Nalgene 0,2 μm.

Białko oczyszczono z przesączonych pożywek przez łączenie kolumny chromatografii powinowactwa Poros 50 białko A (PerSeptive Biosystems, 1-5559-01, Framingham, MA) i chromatografii żelowo-permeacyjnej Superdex 200 (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Pożywkę hodowlaną bezpośrednio załadowano na kolumnę powinowactwa 10 x 70 mm (objętość łoża 5,5 ml) białko A przy prędkości przepływu wynoszącej około 3-10 ml/minutę. Po przemyciu kolumny dziesięcioma objętościami kolumny PBS, związane białko eluowano przez pięć objętości kolumny 0,1 M glicyna, pH 3,0 przy 10 ml/minutę. Frakcje 2 ml każda zebrano do rurek zawierających 100 μl 2,0 M Tris, pH 8,0, w celu zobojętnienia eluowanych białek. Próbki z kolumny powinowactwa zanalizowano za pomocą SDS-PAGE z barwieniem Coomassie i Western Blotting, pod względem obecności zcytor17-Fc4, przy użyciu ludzkiej Ig-HRP. Frakcje zawierające zcytor17-Fc4 zlano i zatężono do 1-2 ml przy użyciu Biomax-30 urządzenia zatężajacego (Millipore) i załadowano na kolumnę do filtracji żelowej Superdex 20020 x 580 mm. Frakcje zawierające oczyszczony zcytor17-Fc4 zlano, przesączono przez filtr 0,2 μm, wyrównano objętość do 100 μl każda i zamrożono w temperaturze -80°C. Stężenie końcowo oczyszczonego białko określono za pomocą testu BCA (Pierce, Rockford, IL).

C. SDS-PAGE i Western analiza blotting zcytor17/Fc4

Rekombinacyjny zcytor17-Fc4 zanalizowano za pomocą metody SDS-PAGE (Nupage 4-12%, Invitrogen, Carlsbad, CA) z barwieniem Coomassie i Western Blotting przy użyciu ludzkiej Ig-HRP. Albo kondycjonowaną pożywkę, albo oczyszczone białko poddano elektroforezie przy użyciu Invitrogen Novex's Xcell II mini-cell i przeniesiono na nitrocelulozę (0,2 mm; Invitrogen, Carlsbad, CA) w temperaturze pokojowej przy użyciu modułu Novex's Xcell II Blot z mieszaniem, zgodnie ze zaleceniami podanymi w instrukcji obsługi. Przenoszenie uruchomiono przy 500 mA przez jedną godzinę w buforze zawierającym 25 mM Tris zasada, 200 mM glicynę i 20% metanol. Filtry następnie zablokowano 10% odtłuszczonym mlekiem w proszku w PBS, przez 10 minut, w temperaturze pokojowej. Nitrocelulozę szybko przepłukano, następnie dodano ludzkie przeciwciało Ig-HRP (1:2000) w PBS, zawierające 2,5% odtłuszczonego mleka w proszku. Odciski inkubowano przez dwie godziny w tem74

PL 211 833 B1 peraturze pokojowej, lub przez noc w temperaturze 4°C, przy delikatnym wytrząsaniu. Po inkubacji, odciski przemyto trzy razy przez 10 minut każda w PBS, następnie szybko przepłukano w H2O.

Odciski wywoływano przy użyciu dostępnych w handlu odczynników substratu chemiluminescencyjnego (odczynniki Super-Signal^® ULTRA 112 wymieszano 1:1; odczynniki otrzymano z Pierce, Rockford, IL) i sygnał uchwycono przy użyciu programu Lumi-Imager's Lumi Analyst 3.0 (Boehringer Mannheim GmbH, Niemcy) dla czasów ekspozycji w zakresie od 10 sekund do 5 minut lub tak, jak to konieczne.

Oczyszczony zcytor17-Fc4 pojawił się jako pojedynczy prążek, za pomocą barwienia albo coomassie albo srebrem, w ilości około 220 kDa w warunkach nieredukujacych i w ilości około 120 kDa w warunkach redukujących, sugerując dimeryczną postać zcytor17-Fc4 w warunkach nieredukujacych, zgodnie z oczekiwaniem.

P r z y k ł a d 11

Test przy użyciu rozpuszczalnego receptora zcytor17, rozpuszczalnego receptora zcytor17-Fc4 w teście inhibicji kompetytywnej

Komórki BaF3/zcytor17/WSX-1/OSMRbeta i komórki BaF3/zcytor17/OSMRbeta odwirowano i przemyto w pożywkach pozbawionych mIL-3. Komórki wirowano i przemyto 3 razy, aby zapewnić usunięcie mIL-3. Komórki następnie zliczono w hemocytometrze. Komórki powleczono w formacie 96-studzienkowym, w ilości 5000 komórek na studzienkę, w objętości wynoszącej 100 μ! na studzienkę, przy użyciu pożywek pozbawionych mIL-3.

Obie kondycjonowane pożywki z aktywacji komórkowej CCRF-CEM i CCRF-HSB2 i ludzkich selekcjonowanych komórek CD3+, opisanych w przykładzie 5, dodano w oddzielnych doświadczeniach, w stężeniach 25%, 12,5%, 6,25%, 3,125%, 1,5%, 0,75%, 0,375% i 0,187%, z rozpuszczalnymi receptorami zcytor17 lub bez (Zcytor17-Fc4; patrz przykład 9 i przykład 10) w ilości 1-10 g/ml. Całkowita objętość testu wynosiła 200 μΗ

Płytki testowe inkubowano w temperaturze 37°C, 5% CO2 przez 3-5 dni, w czasie których dodano Alamar Blue (Accumed) w ilości 20 μ!/studzienkę. Płytki ponownie inkubowano w temperaturze 37°C, 5% CO2 przez 16-24 godzin. Płytki odczytywano na czytniku płytek Fmax™ (Molecular Devices) jak opisano w przykładzie 2. Wyniki wykazały częściową inhibicję wzrostu komórek z rozpuszczalnym receptorem zcytor17-Fc4 w ilości 10 μg/ml, potwierdzając, że czynnik w każdej próbce był swoisty dla receptora zcytor17.

Krzywe mianowania, rozcieńczania rozpuszczalnego receptora lub heterodimerów rozpuszczalnego receptora obejmujących zcytor17/OSMR i zcytor17/WSX-1 również uruchomiono przy użyciu wyżej ustalonego testu dla określenia czy receptory zcytor17 były zdolne do całkowitej inhibicji wzrostu, np. w stężeniach niskich lub fizjologicznych.

Podobne testy inhibicji kompetytywnej prowadzono przy użyciu oczyszczonych, ludzkich rozpuszczalnych receptorów zcytor17lig (przykład 35) i w testach lucyferazy (przykład 20). Wyniki ukazują, że zarówno homodimeryczne zcytor17, jak i heterodimeryczne zcytor17/OSMR są zdolne do inhibicji aktywności zcytor17lig.

P r z y k ł a d 12

Test pułapki wydzielania

Test pułapki wydzielania wykorzystano do przetestowania wiązania zcytor17lig z receptorami obejmującymi receptor zcytor17, tak jak receptor zcytor17 lub heterodimery receptorów obejmujące zcytor17/OSMR i zcytor17/WSX-1. DNA plazmidu zcytorl17ig transfekowano do COS komórek i użyto do oceny wiązania zcytor17lig z receptorami obejmującymi receptor zcytor17, za pomocą pułapki wydzielania, jak opisano poniżej.

A. Transfekcje komórek COS

Transfekcję komórek COS przeprowadzono jak następuje: 800 ng cDNA zcytor17lig i 4 μl Lipofectamine mieszano w 80 μl pozbawionych surowicy pożywkach DMEM (55 mg pirogronian sodu, 146 mg L-glutamina, 5 mg transferyna, 2,5 mg insulina, 1 μg selenu i 5 mg fetuiny w 500 ml DMEM) i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie, dodano 320 μl pozbawionych surowicy pożywek DMEM. Te 500 μl mieszaniny dodano do 2 x 10 komórek COS/studzienkę powleczonych na 12-studzienkowej płytce do hodowli tkankowej i inkubowano przez 5 godzin w temperaturze 37°C. Następnie, dodano 500 μl pożywki DMEM z 20% FBS (100 ml FBS, 55 mg pirogronianu sodu i 146 mg L-glutaminy w 500 ml DMEM) i komórki inkubowano przez noc.

PL 211 833 B1

B. Test pułapki wydzielania

Pułapkę wydzielania przeprowadzono jak następuje: z pożywek wypłukano komórki za pomocą PBS, następnie komórki utrwalano przez 15 minut za pomocą 1,8% Formaldehyde w PBS. Komórki następnie przemyto PBS/0,1% BSA i uczyniono przepuszczalnymi za pomocą 0,1% Triton-X w PBS przez 15 minut i ponownie przemyto PBS/0,1% BSA. Komórki zablokowano przez 1 godzinę PBS/0,1% BSA. W zależności od tego, którego rozpuszczalnego receptora użyto, komórki inkubowano przez 1 godzinę w TNB z:

(A) 1-3 pg/ml białka fuzyjnego rozpuszczalny receptor zcytor17 zcytor17-Fc4 (przykład 10); lub (B) 1-3 pg/ml białka rozpuszczalnego receptora zcytor17/OSMRbeta.

Komórki następnie przemyto TNT. W zależności od tego, którego rozpuszczalnego receptora użyto (np., jeśli znakowano znacznikiem Fc4 (SEQ ID nr: 37), C-terminalnym znacznikiem FLAG (SEQ ID nr: 26) lub znacznikiem CEE (SEQ ID nr: 32; SEQ ID nr: 35)), komórki inkubowano przez drugą godzinę z:

(A) rozcieńczoną 1:200 kozią przeciwko ludzkiej Ig-HRP (swoista dla Fc);

(B) rozcieńczoną 1:1000 M2-HRP;

(C) rozcieńczonym 1:1000 przeciwciałem-HRP anty-GluGlu; lub (D) rozcieńczonym 1:300 streptawidyna-HRP (zestaw NEN) w TNB, np.

Ponownie komórki przemyto TNT.

Aby wykryć pozytywne wiązanie tyramidku fluoresceiny, odczynnik rozcieńczono 1:50 w buforze do rozcieńczania (zestaw NEN) i inkubowano przez 4-6 minut i przemyto TNT.

Komórki zabezpieczono za pomocą Vectashield Mounting Media (Vector Labs Burlingame, CA) rozcieńczonego 1:5 w TNT. Komórki uwidoczniono przy użyciu filtru FITC w mikroskopie fluorescencyjnym. Wyniki tego testu pokazały, że ludzki zcytor17lig nie wiąże się z żadnymi z rozpuszczalnych receptorów. Dane te sugeruję, że struktura zcytor17lig była wrażliwa do etapu utrwalenia w tym protokole, ponieważ była wyraźnie zdolna do wiązania z receptorami powierzchni komórkowej (patrz np. dane z cytometrii przepływowej przedstawione poniżej w przykładzie 39.

P r z y k ł a d 13

Przypisanie do chromosomu i umieszczenie sekwencji genu dla zcytor171i

Sekwencje genu zcytor17lig zmapowano w ludzkim chromosomie 12 przy użyciu dostępnej w handlu wersji „Stanford G3 Radiation Hybrid Mapping Panel” (Research Genetics, Inc., Huntsville, AL). „Stanford G3 RH Panel” zawiera DNA z każdego z 83 napromieniowanych klonów hybrydowych całego ludzkiego genomu, plus dwa kontrolne DNA (donor RM i biorca A3). Publicznie dostępny serwer WWW umieszczony w Internet na stronie www.stanford.edu pozwala na lokalizację na chromosomie markerów i genów.

W celu mapowania sekwencji genu zcytor17lig z użyciem „Stanford G3 RH Panel”, 20 pl reakcje ustawiano w 96-studzienkowej płytce do mikromianowania zgodnej z PCR (Stratagene, La Jolla, CA) i stosowano w cyklerze cieplnym „Robo-Cycler Gradient 96” (Stratagene). Każda z 95 reakcji PCR obejmowała 2 pl 10 x buforu reakcji PCR (Qiagen Inc., Valencia, CA), 1,6 pl mieszaniny dNTP (2,5 mM każdy, PERKIN-ELMER, Foster City, CA), 1 pl sensownego startera, ZC 41,458 (SEQ ID Nr: 42), 1 pl antysensownego startera, ZC 41,457 (SEQ ID Nr:43), 2 pl „RediLoad” (Research Genetics, Inc., Huntsville, AL), 0,1 pl Qiagen HotStarTaq DNA Polymerase (5 jednostek/pl), 25 ng DNA z poszczególnych klonów hybrydowych lub kontrolnych i wodę destylowaną do całkowitej objętości wynoszącej 20 pl. Reakcje nadlewano równą ilością oleju mineralnego i uszczelniano. Warunki w cyklerze PCR były następujące: początkowy 1 cykl 5 minut denaturacji w temperaturze 95°C, 35 cykli 45 sekund denaturacji w temperaturze 95°C, 1 minuta hybrydyzacji w temperaturze 53°C i 1 minuta i 15 sekund wydłużania w temperaturze 72°C, po czym końcowy 1 cykl wydłużania 7 minut w temperaturze 72°C. Reakcje rozdzielano przez elektroforezę na 2% żelu agarozowym (EM Science, Gibbstown, NJ) i uwidoczniono przez wybarwienie bromkiem etydium.

Wyniki wykazały powiązanie sekwencji genu zcytor17lig z markerem SHGC-83339 chromosomu 12 z wynikiem LOD wynoszącym > 11 i w odległości 17 cR_10000 od markera. Ten marker pozycjonuje gen zcytor17lig w regionie chromosomowym 12q24.31.

P r z y k ł a d 14

Identyfikacja i klonowanie mysiego zcytor17lig

A. Identyfikacja pełnej długości mysiego zcytor17lig

PL 211 833 B1

Przy użyciu sekwencji peptydu ludzkiego zcytor17lig (SEQ ID nr: 2) jako pytania dla miejscowej bazy danych DNA, mysi cDNA, Genbank numer dostępu AK005939, zidentyfikowano jako potencjalną, częściową sekwencję dla mysiego zcytor17lig. Sekwencji cDNA AK005939 użyto jako pytania dla bazy danych zawierającej mysie fragmenty genomowe. Złożono genomowy contyg mysiego zcytor17lig (SEQ ID nr: 76). Przewidywanie potencjału kodowania na tym fragmencie genomowym za pomocą programu Genscan ujawniło prawdopodobną sekwencję cDNA, o takiej samej strukturze genu jak ludzki zcytor17lig. Mysia sekwencja cDNA jest przedstawiona w SEQ ID nr: 10, a odpowiednią sekwencje polipeptydową pokazano w SEQ ID nr: 11.

B. Klonowanie mysiego zcytor17lig z biblioteki cDNA mysiego jądra, za pomocą PCR

W oparciu o sekwencję genomową (SEQ ID nr: 76), zaprojektowano dwa startery PCR i użyto do identyfikacji źródła cDNA mysiego zcytor17lig, za pomocą PCR.

Te startery, ZC41498 (SEQ ID nr: 86) i ZC41496 (SEQ ID nr: 87) zaprojektowano w stosunku do przypuszczalnych regionów nie podlegających translacji 5' i 3' mysich sekwencji (SEQ ID nr: 76 i SEQ ID nr: 10). Kilka źródeł DNA przesiano za pomocą PCR, łącznie z Marathon-Ready cDNA (Clontech) i równymi ilościami lokalnie wykonanych bibliotek cDNA. Produkty uwidoczniono na 1% żelach agarozowych. Prążki o oczekiwanej wielkości obserwowano w reakcjach wykorzystujących matrycę biblioteki cDNA jąder myszy. Te reakcje PCR pomyślnie przeprowadzono w objętości w przybliżeniu 50 z 10% DMSO lub bez, przy użyciu pfu turbo polimerase (Stratagene) zgodnie z zaleceniami producenta; z dodatkowym zastosowaniem wax hot-start wykorzystującym hot start 50 s (Molecular Bioproducts, Inc. San Diego, CA). Cykle cieplne PCR przeprowadzono z pojedynczym cyklem w temperaturze 94°C przez 4 min; a następnie 40 cykli w temperaturze 94°C: 30 sekund, 48°C: 30 sekund, 72°C: 50 sekund; z dodatkowym, końcowym wydłużaniem w temperaturze 72°C przez 7 minut. Dwie reakcje PCR zlano i oczyszczono przy użyciu niskotopliwej agarozy i enzymu trawiącego agarozę Gelase (Epicenter, Inc. Madison, WI) zgodnie z zaleceniami producenta.

Określenie sekwencji DNA tych produktów PCR ujawniło sekwencję cDNA mysiego zcytor17 (SEQ ID nr: 90), która obejmowała ORF identyczny jak SEQ ID nr: 10, potwierdzając, że SEQ ID nr: 10 kodowała polipeptyd mysiego zcytor17. Startery PCR, ZC41583 (SEQ ID nr: 88) i ZC41584 (SEQ ID nr: 89), użyto następnie do wprowadzenia miejsc restrykcji Fsel i AscI i częściowej sekwencji Kozaka, do otwartej ramki odczytu mcytor17lig i kodonu przestankowego (SEQ ID nr: 92). Cykler cieplny Robocycler 40 (Stratagene) użyto do uruchomienia gradientu temperatury temperatur wygrzewania i cyklingu jak następuje. Pfu turbo polimerase (Stratagene) stosowano jak opisano wyżej, lecz tylko w 10% DMSO. Cykling przeprowadzono z użyciem pojedynczego cyklu w temperaturze 94°C przez 4 min; a następnie 20 cykli w temperaturze 94°C: 30 sekund, gradient 65°C do 51°C: 30 sekund, 72°C: 1 minuta; i pojedyncze wydłużanie w temperaturze 72°C przez 7 minut.

Matrycą dla tej sekundowej reakcji termocyklingu był 1 pl początkowego, oczyszczonego w żelu, produktu PCR mcytor17lig, jak powyżej. Uzyskany produkt PCR z trzech reakcji o najniższej temperaturze zlano i oczyszczono w żelu przy użyciu metody Gelase (Epicenter) opisanej powyżej. Ten oczyszczony mzcytor17lig trawiono Fsel i AscI i i poddano ligacji z wektorem pZP7X zmodyfikowanym tak, aby posiadał miejsca Fsel i AscI w swym miejscu kloningowym. Plazmid pZP7X jest ssaczym wektorem ekspresji zawierającym kasetę ekspresji mającą mysi promotor metalotioneiny-1 (MT-1), wielokrotne miejsca restrykcji dla insercji sekwencji kodujących i terminator ludzkiego hormonu wzrostu. Ten plazmid posiada również początek replikacji E. coli, ugrupowanie ekspresji ssaczego markera selekcji mające promotor SV40, element wzmacniający i początek replikacji, gen DHFR i terminator SV40. Klonowana mysia sekwencja cDNA jest przedstawiona w SEQ ID nr: 90, a odpowiednia sekwencja polipeptydu pokazana w SEQ ID nr: 91 (która jest identyczna jak SEQ ID nr: 11).

P r z y k ł a d 15

Izolacja mysiego klonu cDNA zcytor17lig z aktywowanej biblioteki mysiej śledziony

A. Pierwotne źródło mysie stosowane do izolacji mysiego zcytor17lig

Mysie śledziony od myszy Balb/C, zbierano i rozcierano matowymi szkiełkami, aby utworzyć zawiesinę komórkową. Wydajność pierwotnych komórek mysich przypuszczalnie wynosiła 6,4 x 10⁸ komórek przed selekcją opisana poniżej.

Komórki śledziony zawieszano w 9,6 ml buforu MACS (PBS, 0,5% EDTA, 2mM EDTA). 1,6 ml zawiesiny komórkowej usuwano i dodawano 0,4 ml CD90 (Thy 1,2) mikrokulek (Miltenyi Biotec). Mieszaninę inkubowano przez 15 minut w temperaturze 4°C. Te komórki znakowane z użyciem mikrokulek CD90 przemywano 30 ml buforu MACS, a następnie ponownie zawieszano w 2 ml buforu MACS.

PL 211 833 B1

Sporządzono kolumnę VS+ (Miltenyi) zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie, kolumnę VS+ umieszczano w polu magnetycznym VarioMACS™ (Miltenyi). Kolumnę równoważono 5 ml buforu MACS. Następnie na kolumnę nakładano izolowane, pierwotne komórki mysie. Komórki ujemne pod względem CD3 pozostawiono do przejścia. Kolumnę przepłukiwano 9 ml (3 x 3 ml) buforu MACS. Kolumnę następnie usuwano z pola magnetycznego i umieszczano w 15 ml rurce falcon, komórki CD90+ wymywano przez dodanie do kolumny 5 ml buforu MACS, a związane komórki wypłukiwano stosując tłoczek dostarczony przez producenta. Inkubację komórek z magnetycznymi kulkami CD90, mycia, etapy kolumny VS+ (inkubacja do elucji) jak powyżej, powtarzano jeszcze raz. Otrzymane frakcje CD90+ z 2 separacji kolumnowych zlewano. Wydajność selekcjonowanych pod względem CD90+ ludzkich komórek T wynosiła 1 x 10⁸ wszystkich komórek.

Próbkę zlanych selekcjonowanych pod względem CD90+ komórek mysich usuwano do wybarwienia i sortowania na urządzeniu do sortowania komórek z przeciwciałem fluorescencyjnym (FACS), aby oszacować ich czystość. Do barwienia i sortowania komórek selekcjonowanych przez CD90+ stosowano chomicze przeciwciało antymysie CD3E (PharMingen). Mysie komórki selekcjonowane pod względem CD90+ stanowiły 93% komórek CD3+, sugerując, że komórki stanowiły 93% komórek T.

Selekcjonowane pod względem CD90+ komórki mysie aktywowano przez inkubację 3 x 10⁶ komórek/ml w RPMI + 5% FBS + PMA 10 ng/ml i lonomycin 0,5 μg/ml (Calbiochem), przez noc w temperaturze 37°C. Supernatant z tych aktywowanych, selekcjonowanych pod względem CD90+ mysich komórek testowano pod względem aktywności zcytor17lig, jak opisano poniżej. Ponadto, aktywowane selekcjonowane pod względem CD90+ komórki mysie stosowano do wytworzenia bilioteki cDNA, jak opisano w przykładzie 16 poniżej.

P r z y k ł a d 16

Kloning mysiego zcytor17lig z mysiej biblioteki komórek selekcjonowanych pod względem CD90+

Przesiew biblioteki cDNA pierwotnych mysich, aktywowanych, komórek selekcjonowanych pod względem CD90+, może ujawnić izolowany cDNA, który jest nowym członkiem rodziny cytokin o wiązce czterohelikalnej, jaki kodowałby mysi ortolog ludzkiego zcytor17lig. cDNA identyfikowano przez przesiew przez hybrydyzację.

A. Wektor do konstruowania biblioteki selekcjonowanej pod względem CD90+

Wektor pZP7N stosowano do konstrukcji biblioteki selekcjonowanej pod względem CD3+ (patrz przykład 6A).

B. Wytwarzanie biblioteki cDNA pierwotnych, aktywowanych komórek selekcjonowanych pod względem CD90+

Około 1,5 x 10⁸ pierwotnych mysich komórek selekcjonowanych pod względem CD90+ stymulowanych w jonomycynie/PMA (przykład 15) izolowano przez wirowanie. Całkowity RNA izolowano z grudki komórkowej i przekształcono w cDNA o podwójnej nici, jak opisano w przykładzie 6B. Ten DNA transfekowano potem do komórek BHK, jak opisano w przykładzie 6B i szacowano proliferację przy użyciu testu fluorescencyjnego „Alamar blue” (przykład 2B).

Dla celu przesiewu biblioteki przez kloning pułapki wydzielania, potrzebna była kompleksowa, powielona postać biblioteki do transfekcji komórek COS-7. 4,8 milionów klonów powlekano na 110 15 cm płytkach LB-agar, uzupełnionych 100 μg/ml ampicyliny, 10 μg/ml metycyliny. Po hodowli płytek przez noc w temperaturze 37°C, zbierano bakterie przez zdrapanie i granulowano. Plazmidowy DNA ekstrahowano z granulowanych bakterii przy użyciu Nucleobond-giga™ (Clonetech), zgodnie z instrukcjami producenta. Ten plazmid używano następnie do transfekcji komórek COS-7 na płytkach i przesiewano przy użyciu techniki pułapki wydzielania, opisanej poniżej (przykład 17).

C. Przesiew biblioteki aktywowanego mysiego cDNA

Około 5 x 10⁵ klonów powlekano na płytkach 10 LB/Amp Maxi. Kolonie podnoszono, denaturowano, zobojętniano i sieciowano przy użyciu standardowej procedury (Sambrook, J. i inni, jak wyżej.). Pięćdziesiąt nanogramów fragmentu 5' RACE PCR o 300 bp (przykład 14) wyznakowano P³² przy użyciu zestawu do znakowania ze statystycznym starterem Prime-Itr RmT (Stratagene). 10 filtrów hybrydyzowano z użyciem tej znakowanej sondy w temperaturze 65°C przez noc przy użyciu ExpressHyb™ Hybridization Solution (Clontech). Filtry następnie przemywano kolejno w temperaturze 60°C, przez 1 godzinę, trzy razy, stosując 0,2 x SSC (30 mM NaCl, 3 mM cytrynian sodu, pH 7,0), 0,1% SDS; a następnie w temperaturze 65°C przez 1 godzinę. Filtry poddawano ekspozycji w temperaturze -80°C przez noc i wywoływano błonę rentgenowską. Czopy agarowe zawierające pozytywne kolonie

PL 211 833 B1 wyciągano i klony powlekano na 10 cm płytkach LB/Amp. Kolonie następnie podnoszono na filtrze i hybrydyzowano ponownie zgodnie z taką samą procedurą opisaną powyżej. Pojedyncze klony DNA izolowano i sekwencjonowano przy użyciu standardowych metod, w celu identyfikacji mysiego cDNA.

P r z y k ł a d 17

Mysi zcytor17lig nie wiąże się z ludzkim rozpuszczalnym receptorem zcytor17lig w teście pułapki wydzielania

DNA dla mysiego klonu mzcytor17lig/pZP7 transfekowano do komórek COS i testowano wiązanie rozpuszczalnego receptora zcytor17 obejmującego rozpuszczalne receptory (ludzki rozpuszczalny receptor zcytor17-Fc4 (przykład 10)) lub heterodimery rozpuszczalnego receptora (zcytor171/WSX-1 lub BaF3/zcytor17/OSMRbeta) z transfekowanymi komórkami COS, za pomocą testu pułapki wydzielania (przykład 12). Test potwierdzał, że mysi zcytor17lig nie wiąże się z ludzkim rozpuszczalnym receptorem zcytor17.

Transfekcję komórek COS prowadzono jak dla przykładu 12, przy użyciu 0,7 pg cDNA zcytor17lig (przykład 16) w 3 pl.

Pułapkę wydzielania prowadzono jak dla przykładu 12 przy użyciu np. 1 pg/ml białka fuzyjnego rozpuszczalnego receptora zcytor17 Fc4 (przykład 10) (lub heterodimery rozpuszczalnego receptora zawierające zcytor17, jakie opisano w niniejszym) w TNB i rozcieńczonego 1:200 koziej, anty-ludzkiej Ig-HRP (swoistej dla Fc) w TNB dla wykrywalnego przeciwciała. Pozytywne wiązanie rozpuszczalnego ludzkiego receptora zcytor17 z wytworzonymi utrwalonymi komórkami, wykrywano z użyciem odczynnika tyramidku fluoresceiny, jak dla przykładu 12. Komórki zabezpieczono i uwidoczniono zgodnie z przykładem 12.

Wyniki wskazywały, że mysi zcytor17lig nie wiąże się z ludzkim rozpuszczalnym receptorem zcytor17 (lub heterodimerami rozpuszczalnego receptora zawierającymi zcytor17, jakie opisano w niniejszym).

P r z y k ł a d 18

Ekspresja mysiego zcytor17lig w komórkach ssaka

Ekspresja u ssaka mysiego zcytor17lig

Komórki BHK 570 (ATCC nr: CRL-10314) powlekano w 10 cm płytkach do hodowli tkankowej i pozostawiono do wzrostu do około 20% konfluencji przez noc, w temperaturze 37°C, 5% CO2, w pożywkach DMEM/FBS (DMEM, Gibco/BRL High Glucose; Gibco BRL, Gaithersburg, MD), 5% surowicy płodu bydlęcego (Hyclone, Logan, UT), 1 mM L-glutamina (JRH Biosciences, Lenexa, KS), 1 mM pirogronian sodu (Gibco BRL)). Następnie, komórki transfekowano plazmidem zawierającym mzcytor17/pZP7X (przykład 14), stosując zestaw do stabilnej transfekcji Lipofectamine (GibcoBRL) zgodnie z instrukcjami producenta.

Jeden dzień po transfekcji, komórki dzielono 1:10 i 1:20 do pożywek wybiórczych (pożywek DMEM/FBS z dodatkiem 1 pM metotreksatu (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.)) w 150 mm płytkach. Pożywki na komórkach zastępowano świeżymi pożywkami wybiórczymi w 5 dniu po transfekcji. Około 10 dni po transfekcji, kolonie oporne wobec metotreksatu poddawano działaniu trypsyny i komórki zlewano oraz powlekano w kolbach do hodowli na wielką skalę. Po wyhodowaniu komórek do około 90% konfluencji, przepłukiwano je trzykrotnie PBS i hodowano w pożywce ESTEP2 pozbawionej surowicy (DMEM (Gibco BRL), 0,11 g/l Na Pyruvate, 3,7 g/l NaHCO3, 2,5 mg/l insuliny, 5 mg/l transferyny, pH 7,0). Kondycjonowane pożywki zbierano trzy dni później i stosowano do testu proliferacji BaF3 przy użyciu Alamar Blue, opisanego w przykładzie 19 poniżej.

P r z y k ł a d 19

Mysi zcytor17lig nie aktywuje ludzkiego receptora zcytor17 w teście BaF3, przy użyciu Alamar

Blue

Proliferację komórek BaF3/zcytor17, BaF3/zcytor17/OSMRbeta i BaF3/zcytor17/WSX-1 (przykład 4 i 5B) szacowano przy użyciu kondycjonowanych pożywek pozbawionych surowicy z komórek BHK, wykazujących ekspresję mysiego zcytor17lig (przykład 18).

Komórki BaF3/zcytor17, BaF3/zcytor17/OSMRbeta i BaF3/zcytor17/WSX-1 odwirowywano, przemywano i powlekano w pożywkach pozbawionych mIL-3, jak opisano w przykładzie 5B. Kondycjonowane pożywki z komórek BHK wykazujących ekspresję mysiego zcytor17lig (przykład 18), rozcieńczono pożywką pozbawioną mIL-3, do stężeń: 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,125%, 1,5%, 0,75% i 0,375%. Test proliferacji prowadzono jak dla przykładu 5B. Wyniki tego testu były ujemne, wskazuPL 211 833 B1 jąc, że mysi zcytor17lig nie aktywuje kompleksów ludzkiego receptora zcytor17, zcytor17/OSMRbeta lub zcytor17/WSX-1.

P r z y k ł a d 20

Ludzki zcytor17lig aktywuje ludzki receptor zcytor17/OSMRbeta w teście lucyferazy

A. Konstrukcja linii komórkowej BaF3/KZ134/ zcytor17

Skonstruowano plazmid KZ134 z użyciem komplementarnych oligonukleotydów ZC12,749 (SEQ ID Nr: 44) i ZC12,748 (SEQ ID Nr: 45), które zawierają elementy wiążące czynnik transkrypcji STAT, z 4 genów, które obejmują modyfikowany, możliwy do indukcji element Sis c-fos (m67SIE lub hSIE) (Sadowski, H. i inni. Science 261: 1739-1744. 1993), p21 SIEI z genu p21 WAFl (Chin, Y. i inni. Science 272: 719-722, 1996), element odpowiedzi gruczołu sutkowego genu β-kazeiny (Schmitt-Ney, M. i inni. Mol. Cell. Biol. 11: 3745-3755, 1991) i możliwy do indukcji element STAT genu Fcg RI, (Seidel, H. i inni. Proc. Natl. Acad. Sci. 92: 3041-3045, 1995). Te oligonukleotydy zawierały zgodne końce Asp718-XhoI i poddawano je ligacji, przy użyciu standardowych metod, z biorczym wektorem reporterowym lucyferazy świetlika z promotorem c-fos (Poulsen, L. K. i inni, J. Biol. Chem. 273: 6229-6232, 1998) trawionym takimi samymi enzymami i zawierającym neomycynowy marker selekcji. Plazmid KZ134 stosowano do stabilnej transfekcji komórek BaF3, przy użyciu standardowych metod transfekcji i selekcji, do wykonania linii komórkowych BaF3/KZ134.

Stabilną, wskaźnikową linię komórkową BaF3/KZ134, wykazującą ekspresję pełnej długości receptora zcytor17 lub receptora zcytor17/OSMRbeta, skonstruowano jak dla przykładu 4. Klony rozcieńczano, powlekano i selekcjonowano przy użyciu standardowych technik. Klony przesiewano w teście lucyferazy (patrz przykład 20B, poniżej) przy użyciu kondycjonowanych pożywek białka ludzkiego zcytor17lig (patrz przykład 35, poniżej) jako induktora. Selekcjonowano klony z najwyższą odpowiedzią lucyferazy (przez lucyferazę STAT) i najniższym tłem. Wyselekcjonowano stabilna linie transfektantów. Linie komórkowe nazwano BaF3/KZ134/zcytor17 lub BaF3/KZ134/zcytor17/OSMRbeta, w zależności od receptorów transfekowanych do linii komórkowej.

Podobnie, skonstruowano także linie komórkowe BHK, stosując metodę opisaną w niniejszym i użyto ją w testach lucyferazy opisanych w niniejszym. Linie komórkowe nazwano BHK/KZ134/zcytor17 lub BHK/KZ134/zcytor17/OSMRbeta, w zależności od receptorów transfekowanych do linii komórkowej.

B. Ludzki zcytor17lig aktywuje ludzki receptor zcytor17 w teście lucyferazy BaF3/KZ-134/zcytor17/OSMRbeta lub BHK/KZ134/ zcytor17/OSMRbeta

Komórki BaF3/KZl34/zcytor17 lub BaF3/KZ134/zcytor17/OSMRbeta odwirowywano i przemywano w pożywce pozbawionej mIL-3. Komórki wirowano i przemywano 3 razy, aby zapewnić usunięcie mIL-3. Komórki następnie zliczano w liczniku krwinek. Komórki powlekano w formacie 96-studzienkowym w ilości około 30000 komórek na studzienkę, w objętości wynoszącej 100 pl na studzienkę, stosując pożywki pozbawione mIL-3. Taką samą procedurę stosowano dla nie transfekowanych komórek BaF3/KZ134 w celu użycia jako kontroli w kolejnym teście. Komórki BHK/KZ134/zcytor17 lub BHK/KZ134/zcytor17/OSMRbeta powlekano w formacie 96-studzienkowym w ilości 15000 komórek na studzienkę, w 100 pl pożywki. Rodzicielskie komórki lub BHK/KZ134 stosowano jako kontrole. Aktywację STAT komórek BaF3/KZ134/zcytor17, BaF3/KZ134/zcytor17/OSMRbeta, BHK/KZ134/zcytor17 lub BHK/KZ134/zcytor17/OSMRbeta szacowano przy użyciu:

(1) kondycjonowanej pożywki z komórek BHK570 transfekowanych ludzkim zcytor17lig (przykład 1), (2) kondycjonowanych pożywek z komórek BHK570 transfekowanych mysim zcytor17lig (przykład 18), (3) oczyszczonym, ludzkim zcytor17lig, lub (4) pożywkami pozbawionymi mIL-3, aby zmierzyć odpowiedz kontroli zawierających tylko pożywkę.

Kondycjonowane pożywki rozcieńczano pożywką RPMI pozbawioną mIL-3, do stężenia 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,125%, 1,5%, 0,75% i 0,375%. Sto mikrolitrów rozcieńczonych kondycjonowanych pożywek albo białka, dodawano do komórek BaF3/KZ134/zcytor17, BaF3/KZ134/zcytor17/OSMRbeta, BHK/KZ134/zcytor17 lub BHK/KZ134/zcytor17/OSMRbeta. Test przy użyciu kondycjonowanej pożywki wykonywano równolegle na nietransfekowanych komórkach BaF3/KZl34 lub BHK/KZ134 jako kontrola. Całkowita objętość testu wynosiła 200 pl. Płytki testowe inkubowano w temperaturze 37°C, 5% CO2 przez 24 godziny, w czasie których komórki granulowano przez wirowanie przy prędkości 2000 rpm przez 10 minut i pożywki aspirowano i dodawano 25 pl buforu do lizy (Promega). Dla linii komórkowych BHK, etap wirowania nie był konieczny, ponieważ komórki przylega80

PL 211 833 B1 ły. Po 10 minutach w temperaturze pokojowej, płytki mierzono pod względem aktywacji konstrukcji reporterowej STAT, przez odczytanie ich na luminometrze (Labsystems Luminoskan, model RS) z wykorzystaniem 40 μl substratu do testu lucyferazy (Promega) po pięciu sekundach integracji.

Wyniki tego testu potwierdzały, że odpowiedź reportera STAT komórek BaF3/KZ134/zcytor17/OSMRbeta lub BHK/KZ134/zcytor17/OSMRbeta wobec ludzkiego zcytor17lig, w porównaniu albo z komórkami BaF3/KZ134/zcytor17, BHK/KZ134/zcytor17, albo nie transfekowanymi, kontrolnymi komórkami BaF3/KZ134 lub BHK/KZ134, wykazały, ze odpowiedź występuje za pośrednictwem receptorów zcytor17/OSMRbeta. Wyniki pokazały również, ze mysi zcytor17lig nie aktywuje testu reportera STAT poprzez kompleks ludzkiego receptora.

P r z y k ł a d 21

Mysi zcytor17lig jest aktywny w teście mysiego szpiku kostnego

A. Izolacja nie przylegajacych komórek szpiku o niskiej gęstości

Świeży aspirat z kości udowej myszy (szpik) otrzymano od 6-10-tygodniowych samców myszy Balb/C lub C57BL/6. Szpik następnie przemywano RPMl + 10% FBS (JRH, Lenexa KS; Hyclone, Logan UT) i zawieszano w RPMl + 10% FBS w postaci zawiesiny komórkowej całego szpiku. Następnie, zawiesinę komórek całego szpiku poddawano gradientowi gęstości (Nycoprep, 1.077, Animal; Gibco BRL), aby wzbogacić komórki niskiej gęstości, w większości jednojądrzaste, następująco: zawiesinę komórkową całego szpiku (około 8 ml) ostrożnie pipetowano na wierzch około 5 ml roztworu gradientu Nycoprep w 15 ml rurce stożkowej, a następnie wirowano przy 600 x g przez 20 minut. Warstwę miedzyfazową, zawierającą komórki jednojądrzaste o niskiej gęstości, następnie usuwano, przemywano nadmiarem RPMl + 10% FBS i granulowano przez wirowanie przy 400 x g przez 5-10 minut. Grudkę tę ponownie zawieszano w RPMI + 10% FBS i powlekano w kolbie T-75 w ilości około 10 komórek/ml i inkubowano w temperaturze 37°C, 5% CO2 przez około 2 godziny. Otrzymane komórki w zawiesinie były nieprzylegającymi komórkami szpiku o niskiej gęstości (NA LD).

B. Test 96-studzienek

Komórki NA LD mysiego szpiku powlekano w ilości 25000 do 45000 komórek/studzienkę, w płytkach do hodowli tkankowej o 96 studzienkach, w RPMI + 10% FBS + 1 ng/mL mysiego czynnika komórek macierzystych (mSCF) (R & D Systems, Minneapolis, MN), plus 5% kodycjonowana pożywka z jednego z następujących:

(1) komórek BHK 570 wykazujących ekspresję mysiego zcytor17lig (przykład 18), (2) komórek BHK 570 wykazujących ekspresję ludzkiego zcytor17lig (przykład 7) lub (3) kontrolnych komórek BHK 570 zawierających wektor i nie wykazujących ekspresji żadnego liganda.

Te komórki następnie poddawano działaniu różnych cytokin, aby przetestować rozprzestrzenianie lub różnicowanie komórek krwiotwórczych ze szpiku. Dla przetestowania, powleczone komórki mysiego szpiku NA LD poddawano ludzkiej Interleukin-15 (hIL-15) (R & D Systems) lub jednej ze zbioru innych cytokin (R & D Systems). Testowano seryjne rozcieńczenie hIL-15 lub innych cytokin z 2-krotnym seryjnym rozcieńczeniem, od stężenia około 50 ng/ml do około 0,5 ng/ml. Po 8-12 dniach 96-studzienkowe testy oceniono pod względem proliferacji komórkowej za pomocą testu Alamar Blue, jak opisano w przykładzie 5B.

C. Wyniki z testu 96-studzienkowego NA LD mysiego szpiku

Kondycjonowane pożywki z komórek BHK wykazujących ekspresję zarówno mysiego, jak i ludzkiego zcytor17lig mogą pobudzić ekspansję populacji komórek krwiotwórczych albo pojedynczo, albo synergistycznie z innymi cytokinami, w NA LD mysiego szpiku, w porównaniu z kontrolną, kondycjonowaną pożywką BHK. Populacja komórek krwiotwórczych rozprzestrzeniona przez mysi zcytor17lig z innymi cytokinami lub bez i te komórki krwiotwórcze rozprzestrzenione przez ludzki zcytor17lig z innymi cytokinami lub bez, była namnażana dodatkowo w hodowli komórkowej. Te komórki krwiotwórcze barwiono wyznakowanym Phycoerythrin przeciwciałem przeciwko komórce NK Pan (PharMingen) i poddawano analizie cytometrii przepływowej, która pokazała, że rozprzestrzenione komórki barwiły się pozytywnie pod względem markera komórki naturalnego zabójcy (NK). Podobnie, można stosować inne swoiste markery komórek krwiotwórczych do określania ekspansji np. komórek T CD4+ lub CD8+, innych populacji komórek T, komórek B i innych markerów komórek odpornościowych.

Taki sam 96-studzienkowy test uruchamiano przy użyciu świeżych ludzkich komórek szpiku, zakupionych od Poietic Technologies, Gaithersburg, MD. Ponownie, pozytywne wyniki pokazały, że

PL 211 833 B1 mysi i ludzki zcytor17lig, pojedynczo lub synergistycznie z innymi cytokinami, mysi i ludzki zcytor17lig może rozprzestrzeniać populacje komórek krwiotwórczych, które barwiły się dodatnio dla markera komórki NK, przy użyciu markerów opisanych powyżej.

P r z y k ł a d 22

Konstrukcje do wytwarzania myszy transgenicznych z ludzkim zcytor17lig

A. Konstrukcja do ekspresji ludzkiego zcytor17lig z promotora swoistego dla MT-1

Zaplanowano oligonukleotydy aby utworzyć fragment PCR zawierający konsensusową sekwencję Kozaka i region kodujący ludzki zcytor17lig. Te oligonukleotydy zaplanowano z miejscem Fsel na końcu 5' i i miejscem AscI na końcu 3' aby ułatwić kloning do:

(a) pMTl2-8, standardowego transgenicznego wektora lub (b) pKFOSl, specyficznego dla limfoidu wektora transgenicznego (przykład 22B).

Reakcje PCR przeprowadzano z około 200 ng matrycy ludzkiego zcytor17lig (SEQ ID nr: 1) i oligonukleotydami zaplanowanymi do powielenia pełnej długości lub aktywnej części zcytor17lig. Warunki reakcji PCR określono przy użyciu metod znanych w technice. Produkty PCR rozdzielano przez elektroforezę na żelu agarozowym i oczyszczano przy użyciu zestawu do ekstrakcji żelowej QiaQuick™ (Qiagen). Izolowany fragment DNA o prawidłowej wielkości, trawiono Fsel i AscI (Boerhinger-Mannheim), wytrącano etanolem i poddawano ligacji do pMT12-8, wcześniej trawionego Fsel i AscI. Plazmid pMT12-8, przeznaczony do ekspresji badanego genu w wątrobie i innych tkankach myszy transgenicznej, zawiera kasetę ekspresji oskrzydlona przez 10 kb DNA MT-1 5' i 7 kb DNA MT-1 3'. Kaseta ekspresji zawiera promotor MT-1, intron insuliny II szczura, polilinker dla insercji zadanego klonu, oraz sekwencje poli A ludzkiego hormonu wzrostu (hGH).

Około jeden mikrolitr każdej reakcji ligacji poddawano elektroporacji do kompetentnych komórek DH10B ElectroMax™ (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD) zgodnie ze wskazówkami producenta i powlekano na płytkach LB zawierających 100 μg/ml ampicyliny i inkubowano przez noc. Kolonie zbierano i hodowano w pożywkach LB zawierających 100 μg/ml ampicyliny. Z zebranych klonów wytworzono Miniprep DNA i przesiewano pod względem insertu ludzkiego zcytor17lig, przez trawienie restrykcyjne samym EcoRI lub połączonymi Fsel i AscI, a następnie elektroforezę w żelu agarozowym. Przeprowadzano maxipreps prawidłowego pMT-ludzkiego zcytor17lig. Wytworzono fragment Sali zawierający sekwencje oskrzydlające 5' 13', promotor MT-1, intron szczurzej insuliny II, cDNA ludzkiego zcytor17lig i sekwencje poly A hGH w celu użycia do mikroiniekcji zapłodnionych oocytów mysich. Mikroiniekcje i wytwarzanie transgenicznych myszy wykonywano jak opisano u Hogan, B. i inni, Manipulating the Mouse Embryo, 2-gie wydanie, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1994.

B. Konstrukcja do ekspresji ludzkiego zcytor17lig z promotora swoistego dla limfoidu EμLCK

Zaplanowano oligonukleotydy, aby utv/orzyć fragment PCR zawierający konsensusową sekwencję Kozaka i region kodujący ludzki zcytor17lig. Te oligonukleotydy zaplanowano z miejscem Fsel na końcu 5' i i miejscem AscI na końcu 3', aby ułatwić kloning do pKF051, wektora transgenicznego swoistego dla limfoidu.

Reakcje PCR przeprowadzano z użyciem 200 ng matrycy ludzkiego zcytor17lig (SEQ ID nr: 1) i oligonukleotydami zaplanowanymi do powielania pełnej długości lub aktywnej części zcytor17lig. Reakcje PCR prowadzono metodami znanymi w technice. Izolowany fragment DNA o prawidłowej wielkości, trawiono Fsel i AscI (Boerhinger-Mannheim), wytrącano etanolem i poddawano ligacji do pKF051, wcześniej trawionego Fsel i AscI. Wektor transgeniczny pKF051 pochodzi od p1026X (Iritani, B. M. i inni, EMBO J. 16: 7019-31, 1997) i zawiera najbliższy promotor lek specyficzny dla komórek T, wzmacniacz łańcucha ciężkiego μ immunoglobuliny specyficznej dla komórek B/T, polilinker dla insercji zadanego klonu i zmutowany gen hGH, który koduje nieaktywne białko hormonu wzrostu (dostarczając introny 3' i sygnał poliadenylacji).

Około jednego mikrolitra każdej reakcji ligacji poddawano elektroporacji, powlekano, zbierano klony i przesiewano pod względem insertu ludzkiego zcytor17lig, poprzez trawienie restrykcyjne, jak opisano powyżej. Prawidłowy klon pKF051-zcytor17lig weryfikowano przez sekwencjonowanie i przeprowadzono maxiprep tego klonu. Wytworzono fragment Notl, zawierający najbliższy promotor lek i wzmacniacz immunoglobuliny p, ^LCK), cDNA zcytor17lig i zmutowany gen hGH w celu użycia do mikroiniekcji zapłodnionych oocytów myszy.

C. Konstrukcja do ekspresji mysiego zcytor17lig z promotora EFlalpha

Startery ZC41,498 (SEQ ID nr: 86) i ZC41,496 (SEQ ID nr: 87) użyto do PCR matrycy biblioteki cDNA jadra myszy. Te reakcje PCR pomyślnie przeprowadzono w około 50 μl objętości z 10% DMSO

PL 211 833 B1 lub bez, przy użyciu pfu turbo polimerase (Stratagene) zgodnie z zaleceniami producenta; z dodatkowym zastosowaniem wax hot start wykorzystującym hot start 50 s (Molecular Bioproducts, Inc. San Diego, CA). Cykling cieplny PCR przeprowadzono z pojedynczych cyklem w temperaturze 94°C przez 4 min; a następnie 40 cykli w temperaturze 94°C: 30 sekund, 48°C: 30 sekund, 72°C: 50 sekund; z dodatkowym, końcowym wydłużaniem w temperaturze 72°C, przez 7 minut. Dwie reakcje PCR zlano i oczyszczono przy użyciu niskotopliwej agarozy i enzymu trawiącego agarozę Gelase (Epicenter, Inc. Madison, WI), zgodnie z zaleceniami producenta.

Sekwencjonowany DNA produktów PCR ujawnił sekwencje cDNA mysiego zcytor17 (SEQ ID nr: 90), która obejmuje ORF identyczna jak SEQ ID nr: 10, potwierdzając, ze SEQ ID nr: 10 kodował polipeptyd mysiego zcytor17lig. Następnie użyto startery PCR, ZC41583 (SEQ ID nr: 88) i ZC41584 (SEQ ID nr: 89), do wprowadzenia miejsc restrykcji Fsel i AscI i częściowej sekwencji Kozaka do otwartej ramki odczytu mcytor17lig oraz kodonu przestankowego (SEQ ID nr: 92). Cykler cieplny Robocycler 40 (Stratagene) użyto do uruchomienia gradientu temperatury temperatur wygrzewania i cyklingu, jak następuje. Pfu turbo polimerase (Stratagene) stosowano jak opisano wyżej, lecz tylko w 10% DMSO. Cykling przeprowadzono stosując pojedynczy cykl w temperaturze 94°C przez 4 min; a następnie 20 cykli w temperaturze 94°C: 30 sekund, gradient 65°C do 51°C: 30 sekund, 72°C: 1 minutę; i pojedyncze wydłużanie w temperaturze 72°C, przez 7 minut. Matryca dla tej drugiej reakcji termocyklingu był 1 μl początkowego, oczyszczonego w żelu, produkt PCR mcytor17lig, jak powyżej. Uzyskany produkt PCR z trzech reakcji o najniższej temperaturze zlano i oczyszczono w żelu przy użyciu metody Gelase (Epicenter) opisanej powyżej. Ten oczyszczony fragment następnie trawiono Fsel i AscI i i poddano ligacji z wektorem pZP7X zmodyfikowanym tak, aby posiadał miejsca Fsel i AscI w swym miejscu kloningowym. Przesłano go do sekwencjonowania, aby potwierdzić prawidłową sekwencję. Klonowana sekwencja mysiego cDNA jest przedstawiona na SEQ ID nr: 90 i odpowiednia sekwencja polipeptydu pokazana na SEQ ID nr: 91 (która jest identyczna jak SEQ ID nr: 11).

Wyizolowany, o prawidłowej wielkości fragment DNA trawiony Fsel i AscI (BoerhingerMannheim) subklonowano do plazmidu zawierającego promotor EFlalpha, uprzednio trawiony Fsel i AscI. Przeprowadzono maxipreps prawidłowego mysiego zcytor17lig EFlalpha. Kaseta ekspresji zawiera promotor EFlalpha (z deletowanym miejscem Fsel), intron EFlalpha, miejsca podobne do SUR IRES dla ułatwienia ekspresji, polilinker oskrzydlony miejscami dla szczurzej insuliny II na końcu 5', który wprowadza miejsca Fsel Pmel AscI dla insercji zadanego klonu oraz sekwencje poli A ludzkiego hormonu wzrostu (hGH). Fragment Notl o wielkości 7,5kb, zawierający kasetę ekspresji promotor EFlalpha i mysiego zcytor17lig wytworzono tak, aby stosować je do mikroiniekcji do zapłodnionych oocytów mysich. Plazmid EFlalpha otrzymano od Louis-Marie z Laboratoire de Differenciation Cellulaire, jak opisano w Taboit-Dameron i in., 1999, Transgenic Research 8: 223-235.

D. Konstrukcja dla ekspresji mysiego zcytor17lig z promotora EpLCK swoistego dla limfoidu

Zaprojektowano oligonukleotydy, aby wytworzyć fragment PCR zawierający konsensusową sekwencję Kozaka i region kodujący mysiego zcytor17lig. Te oligonukleotydy zaprojektowano z miejscem Fsel na końcu 5' i miejscem AsnI na końcu 3', dla ułatwienia klonowania do pKF051 (patrz przykład 22B, powyżej).

Wyizolowany, prawidłowej wielkości fragment DNA zcytor17lig użyto w konstrukcjach EFlalpha, trawionych Fsel i AscI (Boerhinger-Mannheim), subklonowano do plazmidu zawierającego pKF051, wektora transgenicznego swoistego dla limfoidu. Wektor transgeniczny pKF051 pochodzi odp1026X (Iritani, B. M. i in., EMBO J. 16: 7019-31, 1997) i zawiera najbliższy promotor lek specyficzny dla komórek T, wzmacniacz łańcucha ciężkiego μ immunoglobuliny specyficznej dla komórek B/T, polilinker dla insercji zadanego klonu i zmutowany gen hGH, który koduje nieaktywne białko hormonu wzrostu (dostarczając introny 3' i sygnał poliadenylacji). Fragment Notl o wielkości 6,5 kb, zawierający najbliższy promotor lek i immuneglobulinowy wzmacniacz μ ^LCK), cDNA mysiego zcytor17lig i zmutowany gen hGH, wytworzone w celu zastosowania do mikroiniekcji zapłodnionych oocytów mysich (przykład 41).

P r z y k ł a d 23

Konstruowanie wektorów ekspresji ssaka, z ekspresją zcytor17lig-CEE

A. Konstruowanie zcytor17Lig-CEE/pZMP21

Skonstruowano plazmid ekspresji zawierający całość lub część polinukleotydu kodującego ludzki zcytor17lig poprzez rekombinację homologiczną. Plazmid nazwano zcytor17Lig-CEE/pZMP21.

Konstrukcję zcytor17Lig-CEE/pZMP21 uzyskano przez utworzenie fragmentu zcytor17Lig-CEE (SEQ ID nr: 95) (jego odpowiednia sekwencja kwasu amionowego pokazana na SEQ ID nr: 96) przy

PL 211 833 B1 użyciu powielania PCR. Matrycą DNA użytą do wytworzenia fragmentu zcytor17Lig-CEE była zcytor17Lig/pZP7nx. Startery użyte do wytworzenia fragmentu zcytor17Lig-CEE były:

(1) ZC41607 (SEQ ID nr: 97) (sekwencja sensowna), która obejmuje od końca 5' do 3': 28bp sekwencji oskrzydlającej wektor (5' insertu) i 21 bp odpowiadający sekwencji 5' zcytor17Lig; i (2) ZC41605 (SEQ ID nr: 98) (sekwencja antysensowna), która obejmuje od końca 5' do 3': 37 bp sekwencji oskrzydlającej wektor (3' insertu), 3 bp kodonu przestankowego, 21 bp kodujące C-terminalny znacznik EE i 21 bp odpowiadający końcowi 3' sekwencji zcytor17Lig.

Fragment otrzymany z powyższego powielania PCR jest kopią matrycowego zcytor17Lig z dodatkowym C-terminalnym znacznikiem EE, otrzymując produkt końcowy zcytor17Lig-CEE.

Reakcje PCR uruchamiano jak następuje: do 100 pl końcowej objętości dodano: 10 pl 10 x Taq Polimerase Reaction Buffer z 15 mM MgCl (Gibco), 1 pl Taq DNA Polimerase (5 jednostek/pl, Gibco), 3 pl 10 mM dNTP, 78 pl dH2O, 3 pl 20 pmol/pl roztworu macierzystego startera ZC41607 (SEQ ID nr: 97) 3 pl 20 pmol/pl roztworu macierzystego startera ZC41605 (SEQ ID nr: 98) i 2 pl 0,13 pg/pl roztworu macierzystego matrycowego DNA zcytor17lig. Do mieszaniny dodano objętość równą 50 pl oleju mineralnego. Mieszaninę reakcyjną ogrzewano do temperatury 94°C przez 5 minut, a następnie 35 cykli w temperaturze 94°C przez 1 minutę; 55°C przez 2 minuty; 72°C przez 3 minuty; a następnie 10 minut wydłużania w temperaturze 72°C i utrzymywanie w temperaturze 4°C do zebrania reakcji.

Plazmid pZMP21 trawiono restrykcyjnie enzymem Bglll, oczyszczano QiaQuick PCR Purification Kit (Qiagen) przy użyciu protokołu mikrowirowania i użyto do rekombinacji stosując fragment PCR. Plazmid pZMP21 skonstruowano z pZMP20, który skonstruowano z pZP9 (złożonym w American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209 i oznaczonym nr 98668) z drożdżowymi elementami genetycznymi wziętymi z pRS316 (złożony w American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209 i oznaczony nr 77145), elementem IRES od wirusa polio i pozakomórkową domeną CD8, skróconą na końcu karboksyterminalnym dpomeny transbłonowej. PZMP21 jest ssaczym wektorem ekspresji zawierającym kasetę ekspresji mającą promotor MPSV, intron peptydu sygnałowego immunoglobulin, wielokrotne miejsca restrykcji dla insercji sekwencji kodujących, kodon przestankowy i terminator ludzkiego hormonu wzrostu. Plazmid posiada również początek replikacji E. coli, ugrupowanie ekspresji ssaczego markera selekcji mające promotor SV40, element wzmacniający i początek replikacji, gen DHFR, terminator SV40, jak też sekwencje URA3 i CEN-ARS konieczne dla selekcji i replikacji w S. cerevisiae.

Pięćdziesiąt mikrolitrów kompetentnych komórek drożdżowych (S. cerevisiae) niezależnie łączono ze 100 ng pociętego plazmidu, 5 pl poprzednio opisanej mieszaniny PCR i przeniesiono do 0,2 cm kuwety do elektroporacji. Mieszaninę drożdże/DNA poddawano impulsom elektrycznym o napięciu 0,75 kV (5 kV/cm), nieskończone omy, 25 pF. Każda kuweta zawierała 600 pl dodanego 1,2 M sorbitolu i drożdże powlekano w jednej 100 pl równej ilości i jednej 300 pl równej ilości na dwóch URA-D płytkach i inkubowano w temperaturze 30°C. Po około 72 godzinach, transformanty drożdżowe Ura + z pojedynczych płytek ponownie zawieszono w 1 ml H2O i wirowano krótko, aby zgranulować komórki drożdży. Grudkę komórkową ponownie zawieszono w 500 pl buforu do lizy (2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA). 500 pl mieszaniny do lizy dodano do rurki Eppendorfa zawierającej 300 pl kwasu przemytego 600 pm szklanych paciorków i 300 pl mieszaniny fenol-chloroform, wirowano w 1-minutowych odstępach dwa lub trzy razy, a następnie wirowano przez 5 minut w wirówce Eppendorfa z maksymalną prędkością.

Trzysta mikrolitrów fazy wodnej przeniesiono do świeżej rurki i DNA wytrącono 600 pl 100% etanolu (EtOH), a następnie odwirowano przez 10 minut w temperaturze 4°C. Grudki DNA następnie przemyto 500 pl 70% EtOH, a następnie odwirowano przez 1 minutę w temperaturze 4°C. Grudki DNA ponownie zawieszono w 30 pl H2O.

Transformacji elektrokompetentnych komórek E. coli (MC1061) dokonano z użyciem 5 pl drożdżowego prep DNA i 50 pl komórek MC1061. Komórki poddawano impulsom elektrycznym o napięciu 2,0 kV, 25 pF i 400 omów (Ω). Po elektroporacji dodano 600 pl SOC (2% Bacto Tryptone (Difco, Detroit, MI), 0,5% ekstrakt drożdżowy (Difco), 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM, MgSO4, 20 mM glukoza). Poddane elektroporacji komórki E. coli powleczono w 200 pl i 50 pl równej ilości n dwóch płytkach LB AMP (bulion LB (Lennox), 1,8% Bacto Agar (Difco), 100 mg/l Ampicillin). Płytki inkubowano odwrócone przez około 24 godziny, w temperaturze 37°C. Trzy kolonie oporne wobec Ampicillin poddano losowej selekcji i poddano analizie sekwencji insertu. DNA plazmidu na wielką skalę wydzielono z klonu potwierdzonego pod względem sekwencji, przy użyciu zestawu Qiagen Maxi (Qiagen) zgodnie z instrukcjami producenta.

PL 211 833 B1

B. Ekspresja u ssaka ludzkiego zcytor17lig

Pełnej długości zcytor17Lig białko wytworzono w komórkach BHK transfekowanych zcytor17Lig-CEE/pZMP21 (przykład 23A). Komórki BHK 570 (ATCC CRL-10314) powleczono w kolbach do hodowli tkankowej T75 i pozostawiono do wzrostu do około 50-70% konfluencji, w temperaturze 37°C, 5% CO2, w pożywkach wzrostowych (SL7V4, 5% FBS, 1% pen/strep). Komórki następnie transfekowano zcytor17Lig-CEE/pZMP21 przez transfekcję za pośrednictwem liposomów (przy użyciu Lipofectamine; Life Technologies), w pożywce pozbawionej surowicy (SF) (SL7V4). Plazmid (16 pg) rozcieńczono do 1,5 ml rurek do całkowitej końcowej objętości wynoszącej 640 pl z użyciem pożywek SF. Trzydzieści pięć mikrolitrów mieszaniny lipidowej mieszano z 605 pl pożywki SF i uzyskaną mieszaninę pozostawiono do inkubacji, w przybliżeniu 15 minut, w temperaturze pokojowej. Pięć mililitrów pożywek SF dodano następnie do mieszaniny DNA:lipid. Komórki przepłukano raz 10 ml PBS, PBS zdekantowano i dodano mieszaninę DNA:lipid. Komórki inkubowano w temperaturze 37°C przez pięć godzin, następnie do każdej płytki dodano 15 ml pożywek (SL7V 4,5% FBS, 1% pen/strep). Płytki inkubowano w temperaturze 37°C przez noc i następnego dnia mieszaninę DNA:pożywki lipidowe ponownie umieszczono w pożywkach wybiórczych (SL7V4, 5% FBS, 1% pen/strep, 1 pM metotreksat). W przybliżeniu 10 dni po transfekcji, kolonie oporne wobec metotreksatu z kolby transfekcyjnej T75 poddano działaniu trypsyny, i komórki zlano i powleczono w kolbie T-162 i przeniesiono do hodowli na wielką skalę.

P r z y k ł a d 24

Ekspresja rozpuszczalnego receptora zcytor17 w E. coli

A. Konstruowanie wektora ekspresji pCMH01 z ekspresją fuzyjnego polipeptydu huzcytor-17/MBP-6H

Skonstruowano plazmid ekspresji zawierający polinukleotyd kodujący rozpuszczalny receptor zcytor17 w C-terminalnej fuzji z białkiem wiązania maltozy (MBP) poprzez rekombinację homologiczną. Polipeptyd fuzyjny zawiera na końcu N, około 388 aminokwasów części MBP w fuzji z każdym z rozpuszczalnych receptorów zcytor17 opisanych w niniejszym. Fragment cDNA zcytor17 (SEQ ID nr: 4) wydzielono przy użyciu PCR, jak opisano niniejszym. Użyto dwa startery do wytworzenia fragmentu zcytor17 w standardowej reakcji PCR:

(1) jeden zawierający około 40 bp sekwencji oskrzydlającej wektor i około 25 bp odpowiadających końcowi aminowemu zcytor17 i (2) drugi zawierający około 40 bp końca 3' odpowiadających sekwencji oskrzydlającej wektor i około 25 bp odpowiadających końcowi karboksylowemu zcytor17.

Dwa pl ze 100 pl reakcji PCR uruchomiono na 1,0% żelu agarozowym, z buforem 1 x TBE do analizy i widoczny był w przybliżeniu oczekiwany fragment. Pozostałą reakcję PCR połączono z drugą rurką PCR i wytrącono ilością 400 pl absolutnego etanolu. Wytrącony DNA użyto do połączenia z pociętym Smal wektorem biorczym pTAP170 z utrzworzeniem konstrukcji kodującej fuzyjny MBP-zcytor17, jak opisano poniżej.

Plazmid pTAP170 otrzymano z plazmidów pRS316 i pMAL- c2. Plazmid pRS316 jest wektorem przenoszącym Saccharomyces cerevisiae (Hieter P. i Sikorski, R., Genetics 122: 19-27, 1989). pMAL-C2 (NEB) jest plazmidem ekspresji E. coli. Niesie on promotor tac kierujący MalE (gen kodujący MBP), a następnie znacznik His, miejsce rozszczepienia trombiny, miejsce klonowania i terminator rrnB. Wektor pTAP170 skonstruowano przy użyciu drożdżowej rekombinacji homologicznej. 100 ng pMAL-c2 ciętego EcoRI ponownie połączono z 1 pg pRS316 pociętego Pvul, 1 pg linkera i 1 pg pRS316 ciętym Scal/EcoRI.

Linker składał się z oligo zc19, 372 (SEQ ID nr: 157) (100 pmoli): zc19, 351 (SEQ ID nr: 158) (1 pmol): zc19, 352 (SEQ ID nr: 159) (1 pmol) i zc19, 371 (SEQ ID nr: 160) (100 pmoli) połączonych w reakcji PCR. Warunki jak następują: 10 cykli w temperaturze 94°C przez 30 sekund, 50°C przez 30 sekund i 72°C przez 30 sekund; a następnie 4°C nasycania. Produkty PCR zatężono poprzez wytrącanie 100% etanolem.

Sto mikrolitrów kompetentnych komórek drożdżowych (S. cerevisiae) łączono z 10 pl mieszaniny zawierającej w przybliżeniu 1 pg insertu ludzkiego zcytor17 i 100 ng wektora pTAP170 trawionego Smal i przeniesiono do 0,2 cm kuwety do elektroporacji. Mieszaninę drożdże/DNA poddawano impulsom elektrycznym o napięciu 0,75 kV (5 kV/cm), nieskończone omy, 25 pF. Do każdej kuwety dodano 600 pl 1,2 M sorbitolu. Drożdże następnie powleczono w dwóch 300 pl równych ilościach, na dwie płytki -URA D i inkubowano w temperaturze 30°C.

PL 211 833 B1

Po około 48 godzinach, transformanty drożdżowe Ura+ z pojedynczych płytek zebrano, wydzielono DNA i transformowano do elektrokompetentnych komórek E. coli (np., MC1061, Casadaban i inni, J. Mol. Biol. 138,17 9-207) i powleczono na płytkach MM/CA + KAN 25 μg/l (Pryor i Leiting, Protein Expressinand Purification 10: 309-319, 1997) przy użyciu standardowych procedur. Komórki hodowano w MM/CA z 25 μg/ml Kanomyacin przez dwie godziny, z wytrząsaniem, w temperaturze 37°C. Jeden ml hodowli indukowano 1 mM IPTG. Dwie do czterech godzin później 250 μl każdej hodowli mieszano z 250 μl przemytych kwasem szklanych paciorków i 250 μl buforu Thorner, z 5% ME i barwnikiem (8 M mocznik, 100 mM Tris pH 7,0, 10% glicerol, 2 mM EDTA, 5% SDS). Próbki wirowano przez jedną minutę i ogrzewano do temperatury 65°C przez 10 minut. 20 μl załadowano na tor na 4%-12% żel PAGE (NOVEX). Żele uruchamiano w buforze 1 x MES. Pozytywne klony oznaczono pCMH01 i poddano analizie sekwencji.

Jeden mikrolitr sekwencjonowanego DNA użyto do transformowania szczepu BL21. Komórki poddano impulsom elektrycznym o napięciu 2,0 kV, 25 μF i 400 omów. Po elektroporacji, 0,6 ml MM/CA z 25 μg/l Kanomyacin. Komórki hodowano w MM/CA i induced z ITPG, jak opisano wyżej. Pozytywne klony użyto do hodowli dla oczyszczania białka białka fuzyjnego huzcytor17/MBP-6H przy użyciu standardowych technik.

B. Oczyszczanie rozpuszczalnego receptora huzcytor17/MBP-6H z fermentacji E. coli

O ile nie zapisano inaczej, wszystkie operacje prowadzono w temperaturze 4°C. Stosowano następującą procedurę do oczyszczenia rekombinacyjnego polipeptydu rozpuszczalnego receptora huzcytor17/MBP-6H. Komórki E. coli zawierające konstrukcję pCMH01 i ekspresję polipeptydu rozpuszczalnego receptora huzcytor17/MBP-6H skonstruowano przy użyciu standardowych metod biologii molekularnej i hodowano w SuperBroth II (12 g/l Casien, 24 g/l Yeast Extract, 11,4 g/l fosforanu dipotasowego, 1,7 g/l fosforanu monopotasowego; Becton Dickenson, Cockeysville, MD). Uzyskane komórki zebrano i zamrożono w 0,5% glicerolu. Dwadzieścia gramów zamrożonych komórek użyto dla oczyszczania białka.

Stopione komórki ponownie zawieszono w 500 mL buforu Amylose Equilibration (20 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8,0). Do lizy komórkowej użyto układu do rozbijania komórek French Press (Constant Systems Ltd., Warwick, UK) z nastawami temperatury -7°C do -10°C i 30K PSI. Ponownie zawieszone komórki sprawdzano pod względem rozbicia za pomocą odczytów A600 przed i po cyklingu za pomocą French Press. Zawiesinę rozbitych komórek granulowano przy 10000 G przez 30 minut. Supernatant zbierano z resztek grudek dla oczyszczania białka.

Dwadzieścia pięć mililitrów żywicy Amylose (New England Biolabs, Beverly, MA) wylano do kolumny szklanej Bio-Rad, 2,5 cm D x 10 cm H. Kolumnę upakowano i zrównoważono grawitacyjnie 10 objętościami kolumny (CV) buforu Amylose Equilibration. Zebrany supernatant komórkowy załadowano partiami na żywicę Amylose, przez noc z kołysaniem. Załadowaną żywicę zawrócono do kolumny szklanej, przemyto 10 CV buforu Amylose Equilibration i eluowano grawitacyjnie ~2 CV buforu Amylose Elution (bufor Amylose Equilibration, 10 mM Maltose, Fluka Biochemical, Szwajcaria). Dziesięć 5 ml frakcji zebrano przez profil elucji i testowano pod względem absorbancji przy 280 i 320 nM. Żywicę Amylose zregenerowano z użyciem 1 CV destylowanej H2O, 5 CV 0,1% (ciężar/objętość) SDS (Sigma), 5 CV destylowanej H2O, 5 CV buforu Amylose Equilibration i na koniec 1 CV buforu Amylose Storage (bufor Amylose Equilibration, 0,02% (ciężar/objętość) Sodium Azide) zregenerowaną żywicę składowano w temperaturze 4°C.

Frakcje badanego profilu elucji zlano i dializowano w komorze dializacyjnej 10K (Slide-A-Lyzer, Pierce Immunochemical) przeciwko 4 zmianom 4L PBS pH 7,4 (Sigma), przez 8 godzinny okres czasu. Po dializie, zebrany materiał reprezentował oczyszczony polipeptyd huzcytor17/MBP-6H. Oczyszczony polipeptyd huzcytor17/MBP-6H wyjaławiano filtracyjnie i zanalizowano poprzez SDS-PAGE z barwieniem Coomassie pod względem produktu o odpowiedniej masie cząsteczkowej. Stężenie polipeptydu huzcytor17/MBP-6H określono za pomocą analizy BCA jako 0,76 mg/ml.

Oczyszczony polipeptyd huzcytor17/MBP-6H odpowiednio opracowano do immunizacji królików i wysłano do R & R Research i Development (Stanwood, WA) dla wytworzenia przeciwciał poliklonalnych (przykład 25, poniżej).

P r z y k ł a d 25

Przeciwciało poliklonalne ludzkiego rozpuszczalnego receptora zcytor17

Przeciwciała poliklonalne wytwarzano przez immunizacje 2 samic białych królików New Zealand oczyszczanym rekombinowanym białkiem huzcytor17/MBP-6H (przykład 32). Królikom podawano początkową iniekcję dootrzewnową (ip) 200 μg oczyszczonego białka w Complete Freund's Adjuvant,

PL 211 833 B1 po czym przypominającą iniekcję ip 100 pg peptydu w Incomplete Freund's Adjuvant, co trzy tygodnie. Siedem do dziesięciu dni po podaniu drugiej iniekcji przypominającej (całość 3 iniekcji), zwierzęta skrwawiano i zbierano surowice. Następnie, zwierzętom podawano dawki przypominające i pobierano krew co trzy tygodnie.

Surowicę króliczą swoistą wobec huzcytor17/MBP-6H wstępnie adsorbowano z przeciwciał anty-MBP przy użyciu kolumny CNBr-SEPHAROSE 4B protein (Pharmacia LKB), którą sporządzano przy użyciu 10 mg oczyszczonego rekombinowanego białka wiążącego maltozę (MBP) na gram CNBr-SEPHAROSE. Przeciwciała poliklonalne swoiste dla liganda huzcytor17/MBP-6H oczyszczano przez powinowactwo z surowicy króliczej przy użyciu kolumny CNBr-SEPHAROSE 4B protein (Pharmacia LKB), którą wytworzono stosując 10 mg swoistego, oczyszczonego antygenem, rekombinowanego białka huzcytor17/MBP-6H. Po oczyszczeniu, przeciwciała poliklonalne dializowano z 4 zmianami 20 objętości przeciwciała w PBS przez okres czasu wynoszący co najmniej 8 godzin. Przeciwciała specyficzne dla liganda huzcytor17 charakteryzowano przez ELISA przy użyciu 500 ng/ml oczyszczonego rekombinowanego białka huzcytor17/MBP-6H jako celów dla przeciwciał. Dolna granica wykrywania (LLD) oczyszczonego przez powinowactwo króliczego przeciwciała anty-huzcytor17/MBP-6H wynosi 500 pg/ml na jego specyficznie oczyszczonym rekombinowanym antygenie huzcytor-17//MBP-6H.

B. SDS-PAGE i analiza Western Blotting króliczego, anty-ludzkiego przeciwciała zcytor17 MBP-6H

Królicze przeciwciało przeciwko ludzkiemu zcytor17 MBP-6H testowano za pomocą metody SDS-PAGE (NuPage 4-12%, Invitrogen, Carlsbad, CA) z barwieniem coomassie i Western Blotting przy użyciu koziej anty-króliczej IgG-HRP. Albo oczyszczono białko (200-25 ng) albo kondycjonowaną pożywkę zawierającą zcytor17 poddano elektroforezie przy użyciu Invitrogen Novex's Xcell II mini-cell i przeniesiono na nitrocelulozę (0,2 mm; Invitrogen, Carlsbad, CA), w temperaturze pokojowej, przy użyciu modułu Novex's Xcell Blot z mieszaniem, zgodnie z zaleceniami podanymi w instrukcji obsługi. Przenoszenie uruchomiono przy 300 mA przez jedną godzinę, w buforze zawierającym 25 mM Tris zasada, 200 mM glicynę i 20% metanol. Filtr następnie zablokowano buforem Western A (na miejscu, 50 mM Tris, pH 7,4, 5 mM EDTA, pH 8,0, 0,05% Igepal CA-630, 150 mM NaCl i 0,25% żelatyna), przez noc przy delikatnym kołysaniu w temperaturze 4°C.

Nitrocelulozę szybko przepłukano, następnie dodano królicze, anty-ludzkie zcytor17 MBP-6H (1:1000) w buforze Western A.

Odcisk inkubowano przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej, przy delikatnym kołysaniu. Odcisk przepłukano 3 razy po 5 minut każde w Western A, następnie dodano kozie przeciwciało, przeciwko króliczej IgG HRP (1:1000) w buforze Western A.

Odcisk inkubowano przez 1,25 godziny w temperaturze pokojowej, przy delikatnym kołysaniu. Odcisk przepłukano 3 razy po 5 minut każde w Western A, następnie szybko przepłukano w H2O. Odcisk wywoływano przy użyciu dostępnych w handlu odczynników substratu chemiluminescencyjnego (ECL Western Blotting odczynniki detekcji 1 i 2 mieszane 1:1; odczynniki otrzymano z Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, Anglia) i odcisk poddano ekspozycji wobec błony rentgenowskiej przez 15 minut.

Królicze antyludzkie zcytor17 MBP-6H było zdolne do wykrywania ludzkiego zcytor17 obecnego w kondycjonowanej pożywce, jak również oczyszczonego białka zcytor17 w postaci prążka, w ilości 120 kDa, w warunkach redukujących.

P r z y k ł a d 26

Rozmieszczenie tkankowe mysiego zcytor17 w panelu tkankowym, przy użyciu PCR

Panel cDNA z tkanek myszy przesiano pod względem ekspresji mysiego zcytor17, przy użyciu PCR. Panel wykonano na miejscu i zawierał 94 marathon cDNA, a próbki cDNA z różnych normalnych i nowotworowych tkanek mysich oraz linie komórkowe są ukazane w tablicy 6, poniżej. cDNA pochodziły z miejscowej biblioteki lub marathon cDNA z miejscowych prep RNA, Clontech RNA lub Invitrogen RNA.

Mysie marathon cDNA wykonano przy użyciu zestawu marathon-Ready (Clontech, Palo Alto, CA) i testowano QC z użyciem starterów mysiego receptora transferyny ZC10,651 (SEQ ID nr: 46) i ZC10,565 (SEQ ID nr: 47) i następnie rozcieńczono w oparciu o intensywność prążka transferyny. Aby zapewnić jakość powielanej biblioteki próbek w panelu, uruchamiano trzy testy kontroli jakości (QC):

PL 211 833 B1 (1) Do oceny jakości użyto RNA dla biblioteki, miejscowe cDNA testowano pod względem średniej wielkości insertu za pomocą PCR z wektor oligonukleotydowymi, które były swoiste wobec sekwencji wektorowych dla poszczególnej biblioteki cDNA;

(2) Standaryzację stężenia cDNA w panelu próbek uzyskano przy użyciu standardowych metod PCR powielania pełnej długości alfa tubuliny lub cDNA G3PDH przy użyciu oligo wektora 5': ZC 14,063 (SEQ ID nr: 48) i startera oligo 3' swoistego dla alfa tubu-lin ZC 17, 574 (SEQ ID nr: 49) lub starter oligo 3' swoistego dla G3PDH ZC 17,600 (SEQ ID nr: 50); i (3) próbkę wysłano do sekwencjonowania w celu sprawdzenia pod względem możliwych zanieczyszczeń rybosomowym lub mitochondrialnym DNA.

Panel ustawiono w formacie 96-studzienkowym, który obejmował pozytywną próbkę kontrolną mysiego genomowego DNA (Clontech, Palo Alto, CA). Każda studzienka zawierała w przybliżeniu 0,2-100 pg/pl cDNA. PCR ustawiono przy użyciu oligo ZC38,065 (SEQ ID nr: 51) i ZC38,068 (SEQ ID nr: 52), TaKaRa Ex Taq TM (TAKARA Shuzo Co LTD, Biomedicals Group, Japan) i barwnika Rediload (Research Genetics, Inc., Huntsville, AL).

Powielanie prowadzono jak następuje: 1 cykl w temperaturze 94°C przez 5 minut; 5 cykli w temperaturze 94° przez 30 sekund, 68°C przez 30 sekund; 35 cykli w temperaturze 94°C przez 30 sekund, 56°C przez 30 sekund i 72°C przez 30 sekund, a następnie 1 cykl w temperaturze 72°C przez 5 minut. Około 10 pl produktu reakcji PCR poddano standardowej elektroforezie żelowej na Agarose przy użyciu 4% żelu agarozowego.

Prawidłowa, przewidywana wielkość fragmentu DNA była obserwowana w mózgu, komórkach CD90+, dendrytycznych, zarodkowych, MEWt #2, linii komórkowej prostaty Tuvak, gruczole ślinowym, skórze i jądrze.

Fragment DNA dla skóry i jądra wycięto i oczyszczono przy użyciu Gel Extraction Kit (Qiagen, Chatsworth, CA) zgodnie z instrukcjami producenta.

Fragmenty ukazują, jak potwierdzono przez sekwencjonowanie, że był to w istocie mysi zcytor17.

T a b l i c a 6

Tkanka/Linia komórkowa	# próbek		Tkanka/Linia komórkowa	# próbek
229	1		Trzustki	1
7F2	1		Łożyska	2
Komórki tłuszczowe-powielany	1		Linia komórek prostaty Jakotay	1
aTCl.9	1		Linia komórek prostaty Nelix	1
Mózg	4		Linia komórek prostaty Paris	1
CCC4	1		Linia komórek prostaty Torres	1
CD90+ powielany	1		Linia komórek prostaty Tuvak	1
OC10B	1		Gruczołu ślinowego	2
Dendrytyczne	1		Mięśnia szkieletowego	1
Zarodkowe	1		Skóry	2
Serca	2		Jelita cienkiego	1
Nerki	3		Mięśnia gładkiego	2
Wątroby	2		Śledziony	2
Płuca	2		Żołądka	1
MEW #2	1		Jądra	3
P388D1	1		Grasicy	1

PL 211 833 B1

P r z y k ł a d 27

Ekspresja ludzkiego Zcytor17 w różnych tkankach przy użyciu ilościowej RT/PCR w czasie rzeczywistym

A. Startery i sondy dla ludzkiego Zcytor17, OSMRbeta Zcytor17lig dla konwencjonalnej i ilościowej RT-PCR

Ilościowa RT-PCR w czasie rzeczywistym przy użyciu ABI PRISM 7900 Sequence Detection System (PE Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) została opisana poprzednio (patrz Heid, C. A. i in., Genome Research 6: 98 6-994,1996; Gibson, U. E. M. i in., Genome Research 6: 995-1001, 1996; Sundaresan, S. i in., Endocrinology 139: 4756-4764, 1998). Metoda ta wprowadza stosowanie sondy swoistej dla genu zawierającej zarówno reporterowe jak i wygaszające barwniki fluorescencyjne. Gdy sonda jest nieuszkodzona emisja barwnika reporterowego jest negowana z powodu dużej bliskości barwnika wygaszającego. Podczas wydłużania PCR przy użyciu dodatkowych starterów swoistych wobec genu zgodnego i odwrotnego, sondę odcina się przez aktywność 5' nukleazy polimerazy Taq, która uwalnia barwnik reporterowy z sondy co daje zwiększenie emisji fluorescencji.

Startery i sondy użyte do analiz ilościowej RT-PCR w czasie rzeczywistym ekspresji ludzkiego Zcytor17, OSMRbeta i Zcytor17lig, zaprojektowano przy użyciu programu do projektowania starterów Primer Express™ (PE Applied Biosystems, Foster City, CA). Startery dla ludzkiego Zcytor17 zaprojektowano tak, że przekraczają łączenie intron-egzon eliminując możliwe powielenie genomowego DNA. Zgodny starter, ZC37,877 (SEQ ID nr: 53) i odwrotny starter, ZC37,876 (SEQ ID nr: 54) użyto w reakcji PCR przy stężeniu 200 nM aby syntetyzować produkt o wielkości 73 bp. Odpowiednią sondę Zcytor17 TaqMan (E), oznaczoną ZC37,776 (SEQ ID nr: 55) zsyntetyzowano i wyznakowano w PE Applied Biosystems i użyto w każdej reakcji PCR przy stężeniu 200 nM. Sondę ZC37,776 (SEQ ID nr: 55) wyznakowano na końcu 5' reporterowym barwnikiem fluorescencyjnym (6-karboksyfluoresceina) (FAM) (PE Applied Biosystems) i na końcu 3' wygaszającym barwnikiem fluorescencyjnym (6-karboksytetrametylorodamina) (TAMRA) (Epoch Biosciences, Bothell, WA).

Startery dla ludzkiego OSMRbeta zaprojektowano tak, że obejmują łączenie intron-egzon eliminując możliwe powielenie genomowego DNA. Zgodny starter, ZC43,891 (SEQ ID nr: 122) i odwrotny starter, ZC43,900 (SEQ ID nr: 123) użyto w reakcji PCR (poniżej) przy stężeniu 200 nM. Odpowiednią sondę OSMRbeta TaqMan (E), oznaczoną ZC43,896 (SEQ ID nr: 124) zsyntetyzowano i wyznakowano w PE Applied Biosystems i użyto w każdej reakcji PCR przy stężeniu 200 nM. Sondę ZC43,896 (SEQ ID nr: 124) was wyznakowano na końcu 5' reporterowym barwnikiem fluorescencyjnym (6-karboksyfluoresceina) (FAM) (PE Applied Biosystems) i na końcu 3' nieflurescencyjnym barwnikiem wygaszającym (ECLIPSE) (Epoch Biosciences).

Startery dla ludzkiego Zcytor17lig zaprojektowano tak, że obejmują łączenie intron-egzon eliminując możliwe powielenie genomowego DNA. Zgodny starter, ZC43,280 (SEQ ID nr: 125) i odwrotny starter, ZC43,281 (SEQ ID nr: 126) użyto w reakcji PCR (poniżej) w stężeniu około 200 nM. Odpowiednią sondę Zcytorl17ig TaqMan (E), oznaczoną ZC43,275 (SEQ ID nr: 127) zsyntetyzowano i wyznakowano w PE Applied Biosystems i użyto w każdej reakcji PCR przy stężeniu 200 nM. Sondę ZC43,275 (SEQ ID nr: 127) wyznakowano na końcu 5' reporterowym barwnikiem fluorescencyjnym (6-karboksyfluoresceina) (FAM) (PE Applied Biosystems) i na końcu 3' nie flurescencyjnym barwnikiem wygaszającym (ECLIPSE) (Epoch Biosciences).

Jako kontrolę do testowania spójności i jakości testowanych próbek RNA, wszystkie próbki RNA przesiano pod względem albo rRNA albo GUS, przy użyciu zestawów startera i sondy albo zamówiono z PE Applied Biosystems (rRNA zestaw) lub zaprojektowano na miejscu (GUS). Zestaw rRNA zawierał zgodny starter (SEQ ID nr: 56), odwrotny starter rRNA (SEQ ID nr: 57) i sondę rRNA TaqManO (SEQ ID nr: 58). Sonda rRNA była wyznakowana na końcu 5' reporterowym barwnikiem fluorescencyjnym VIC (PE Applied Biosystems) i na końcu 3' wygaszającym barwnikiem fluorescencyjnym TAMRA (PE Applied Biosystems). Startery GUS i sondę wytworzono na miejscu i użyto w każdej reakcji PCR przy 200 nM i 100 nM, odpowiednio. Zgodnym starterem był ZC40,574 (SEQ ID nr: 128) i odwrotnym starterem był ZC40,575 (SEQ ID nr: 129). Sondę GUS ZC43,017 (SEQ ID nr: 130) wyznakowano na końcu 5' reporterowym barwnikiem fluorescencyjnym (Yakima-Yellow) (Epoch Biosciences) i na końcu 3' nie flurescencyjnym barwnikiem wygaszającym (ECLIPSE) (Epoch Biosciences). Wyniki rRNA i GUS służą również jako endogenna kontrola i pozwalają na normalizację wyników ekspresji mRNA Zcytor17 widocznych w próbkach testowych.

Dla konwencjonalnej, nieilościowej RT-PCR, startery zaprojektowano przy użyciu programu do projektowania starterów Primer Express™ (PE Applied Biosystems, Foster City, CA). Startery ludzkiePL 211 833 B1 go zcytor17 generują produkt o wielkości w przybliżeniu 1000 par zasad i są następujące: zgodny starter ZC28,917 (SEQ ID nr: 83), i odwrotny starter ZC28,480 (SEQ ID nr: 131). Startery ludzkiego OSMRbeta generują produkt o wielkości 202 par zasad i są następujące: zgodny starter ZC41,653 (SEQ ID nr: 132) i odwrotny starter ZC41,655 (SEQ ID nr: 133). Startery ludzkiego Zcytor17lig generują produkt o wielkości 305 par zasad i są następujące: zgodny starter ZC41,703 (SEQ ID nr: 134) i odwrotny starter ZC41,704 (SEQ ID nr: 135).

B. Startery i sondy dla mysiego Zcytor17, OSMRbeta i Zcytor17lig dla konwencjonalnej i ilościowej RT-PCR

Startery i sondy użyte do analiz ilościowej RT-PCR w czasie rzeczywistym ekspresji mysiego Zcytor17, OSMRbeta i Zcytor17lig, zaprojektowane przy użyciu programu do projektowania starterów Primer Express™ (PE Applied Biosystems, Foster City, CA). Startery dla mysiego Zcytor17 zaprojektowano tak, że obejmują łączenie intron-egzon eliminując możliwe powielenie genomowego DNA. Zgodny starter, ZC43,272 (SEQ ID nr: 136) i odwrotny starter, ZC43,273 (SEQ ID nr: 137) użyto w reakcjach PCR (poniżej) przy stężeniu 300 nM. Odpowiednią sondę Zcytor17 TaqManO, oznaczoną ZC43,478 (SEQ ID nr: 138), zsyntetyzowano i wyznakowano w PE Applied Biosystems. Sondę ZC43,478 (SEQ ID nr: 138) wyznakowano na końcu 5' reporterowym barwnikiem fluorescencyjnym (6-karboksyfluoresceina) (FAM) (PE Applied Biosystems) i na końcu 3' wygaszającym barwnikiem fluorescencyjnym (6-karboksytetrametylorodamina) (TAMRA) (PE Applied Biosystems). Sondę ZC43,478 (SEQ ID nr: 138) użyto w reakcjach PCR przy stężeniu 100 nM.

Startery dla mysiego Zcytor17lig zaprojektowano tak, że obejmują łączenie intron-egzon eliminując możliwe powielenie genomowego DNA. Zgodny starter, ZC43,278 (SEQ ID nr: 139) i odwrotny starter, ZC43,279 (SEQ ID nr: 140) użyto w reakcjach PCR przy stężeniu 500 nM. Odpowiednią sondę Zcytor17lig TaqManO, oznaczoną ZC43,276 (SEQ ID nr: 141) zsyntetyzowano i wyznakowano w PE Applied Biosystems. Sondę ZC43,478 (SEQ ID nr: 138) wyznakowano na końcu 5' reporterowym barwnikiem fluorescencyjnym (6-karboksyfluoresceina) (FAM) (PE Applied Biosystems) i na końcu 3' nie flurescencyjnym barwnikiem wygaszającym (ECLIPSE) (Epoch Biosciences). Sondę ZC43,276 (SEQ ID nr: 141) użyto w reakcjach PCR (poniżej) przy stężeniu 200 nM.

Startery dla mysiego OSMRbeta zaprojektowano tak, że obejmują łączenie intron-egzon eliminując możliwe powielenie genomowego DNA. Zgodny starter, ZC43,045 (SEQ ID nr: 142) i odwrotny starter, ZC43,046 (SEQ ID nr: 143) użyto w reakcjach PCR przy stężeniu 300 nM. Odpowiednią sondę OSMRbeta TaqMan (E), oznaczoną ZC43,141 (SEQ ID nr: 144) zsyntetyzowano i wyznakowano w Epoch Biosciences. Sondę ZC43,141 (SEQ ID nr: 144) wyznakowano na końcu 5' reporterowym barwnikiem fluorescencyjnym (6-karboksyfluoresceina) (FAM) (PE Applied Biosystems) i na końcu 3' nie flurescencyjnym barwnikiem wygaszającym (ECLIPSE) (Epoch Biosciences). Sondę ZC43,141 (SEQ ID nr: 144) użyto w reakcjach PCR (poniżej) przy stężeniu 100 nM.

Jako kontrolę do testowania spójności i jakości testowanych próbek RNA, wszystkie próbki RNA przesiano pod względem albo mysiego GUS albo receptora transferyny, przy użyciu starterów i sond zaprojektowanych przy użyciu programu do projektowania starterów Primer Express™ (PE „Applied Biosystems Inc., Foster City, CA). Mysie startery GUS są następujące: zgodny starter, ZC43,004 (SEQ ID nr: 145), odwrotny starter, ZC43,005 (SEQ ID nr: 146), i sonda TaqManX ZC43,018 (SEQ ID nr: 147). Mysią sondę GUS ZC43,018 (SEQ ID nr: 147) wyznakowano na końcu 5' reporterowym barwnikiem fluorescencyjnym Yakima-Yellow (Epoch Biosciences) i na końcu 3' niefluorescencyjnym barwnikiem wygaszającym ECLIPSE (Epoch Biosciences). Mysie startery GUS użyto w reakcjach PCR przy 300 nM, a sondę, ZC43,018 (SEQ ID nr: 147), użyto w ilości 100 nM. W niektórych przypadkach użyto mysi Transferrin Receptor zamiast GUS jako kontrolę endogenną. Zgodny starter receptora transferyny, ZC40,269 (SEQ ID nr: 148) i odwrotny starter, ZC40,268 (SEQ ID nr: 149) użyto przy 300 nM. Sondę receptora transferyny, ZC40,298 (SEQ ID nr: 150) użyto w PCR w ilości 100 nM i wyznakowano na końcu 5' reporterowym barwnikiem fluorescencyjnym VIC (PE Applied Biosystems) i na końcu 3' fluorescencyjnym barwnikiem wygaszającym (TAMRA) (PE Applied Biosystems). Wyniki mysiego GUS i receptora transferyny służą również jako endogenna kontrola i pozwalają na normalizację wyników ekspresji mRNA Zcytor17, OSMRbeta i Zcytor17lig widocznych w próbkach testowych.

Dla konwencjonalnej, pół-ilościowej RT-PCR, startery zaprojektowano przy użyciu programu do projektowania starterów Primer Express™ (PE Applied Biosystems). Startery mysiego Zcytor17 generują produkt o wielkości 276 par zasad i są następujące: zgodny starter ZC43,140 (SEQ ID nr: 151) i odwrotny starter ZC43,139 (SEQ ID nr: 152). Startery mysiego OSMRbeta generują produkt o wielkości 575 par zasad i są następujące: zgodny starter ZC41,608 (SEQ ID nr: 153) i odwrotny starter

PL 211 833 B1

ZC41,609 (SEQ ID nr: 154). Startery mysiego Zcytor17lig generują produkt o wielkości 657 bp i są następujące: zgodny starter ZC41,502 (SEQ ID nr: 155) i odwrotny starter ZC41,500 (SEQ ID nr: 156).

C. Protokoły dla ilościowej RT-PCR w czasie rzeczywistym i konwencjonalnej półilościowej RT-PCR

Względny poziom Zcytor17, OSMRbeta i Zcytor17lig mRNA określono przez analizę próbki całkowitego RNA przy użyciu jednoetapowej metody RT-PCR (PE Applied Biosystems). Całkowity RNA z komórek BAF transfekowanych Zcytor17 i OSMRbeta (ludzkiego) lub komórek BHK (mysiego) wydzielono standardowymi metodami i użyto do wytworzenia krzywej standardowej stosowanej przy ocenie ilościowej Zcytor17 i OSMRbeta. Krzywa składała się z 10-krotnych rozcieńczeń seryjnych w zakresie od 100-0,01 ng/pl, przy czym każdy punkt krzywej standardowej zanalizowano potrójnie. Podobnie, dla Zcytor17lig, RNA aktywowanej komórki T CD4+ (poprzednio sprawdzonej, że wytwarza Zcytor17lig) użyto do wytworzenia krzywej standardowej w tym samym zakresie 100-0,01 ng/pl. Całkowity RNA z komórek ludzkich lub mysich, zanalizowano potrójnie dla poziomu transkryptu albo ludzkiego lub mysiego Zcytor17, OSMRbeta i Zcy-tor17lig i dla jednego z następujących genów kontroli endogennej: rRNA, GUS lub receptora transferyny. W całkowitej ob jętości wynoszącej 10 pl, każda RNA próbka była poddana jednoetapowej reakcji RT-PCR zawierając: około 50-100 ng całkowitego RNA we wstępnie opracowanej 2 x mieszaninie macierzystej zawierającej wewnętrzny barwnik kontrolny (ROX) (karboksy-x-rodamina) i Thermo-Start^® DNA Polimerase (Abgene, Surrey, UK); odpowiednie startery dla badanego genu (patrz części A i B tego przykładu); odpowiednią sondę (patrz części A

B dla stężenia); Superscript (D odwrotną transkryptazę (50 U/l) (PE Applied Biosystems) i odpowiednią objętość wody pozbawionej RNase. Warunki cieplne cyklingu PCR były następujące: początkowy etap odwrotnej transkrypcji (RT) jeden cykl w temperaturze 48°C przez 30 minut; a następnie etap aktywacji enzymu Thermo-Start^®, jeden cykl w temperaturze 95°C przez 10 minut; a następnie 40 cykli w temperaturze powielania 95°C przez 15 sekund i 60°C przez 1 minutę. Względny poziom Zcytor17, OSMRbeta i Zcytor17lig RNA określono przy użyciu Standard Curve Method, jak opisano przez producenta, PE Biosystems (User Bulletin #2: ABI Prism 7700 Sequence Detection System, Relative Quantitation of Gene Expression, 11 grudzień, 1997). Pomiary rRNA, GUS lub receptora transferyny użyto do normalizacji poziomu badanego genu.

Reakcje półilościowej RT-PCR użyto do Superscript One-Step RT-PCR System with Platinum Tag' (Invitrogen, Carlsbad, GA). Każde 25 pl mieszaniny reakcyjnej składały się z następujących: 12,5 pl x Reaction Buffer, 0,5 pl (20 pmol/pl) zgodnego startera, 0,5 pl (20 pmoli/pl) odwrotnego startera, 0,4 pl mieszanki polimerazy RT/Taq, 5,0 pl Rediload Gel Loading Buffer (Invitrogen), 5,1 pl wody pozbawionej RNase i 1,0 pl całkowitego RNA (100 ng/pl). Powielanie prowadzono jak następuje: jeden cykl w temperaturze 45°C przez 30 minut, a lastępnie 35-38 cykli w temperaturze 94°C, 20 sekund; zmienne temperatury wygrzewania (patrz tablica 7 poniżej), 20 sekund; 72°C, 45 sekund; następnie zakończenie z końcowym wydłużaniem w temperaturze 72°C przez 5 minut. Osiem do dziesięciu mikrolitrów produktu reakcji PCR poddano standardowej agarozowej elektroforezie żelowej przy użyciu 2% żelu agarozowego.

T a b l i c a 7

Mysi Zcytor17	Temperatura wygrzewania 58°C
Mysi OSMRbeta	Temperatura wygrzewania 60°C
Mysi Zcytor17lig	Temperatura wygrzewania 52°C
Ludzki Zcytor17	Temperatura wygrzewania 55°C
Ludzki OSMRbeta	Temperatura wygrzewania 59°C
Ludzki Zcytor17lig	Temperatura wygrzewania 59°C

D. Izolacja RNA z podzbiorów i linii komórkowych ludzkich i mysich PBMC

Pobrano krew od kilku anonimowych dawców i wyizolowano jednojądrzaste komórki z krwi obwodowej (PBMC) przy użyciu standardowej metodologii z gradientem Ficoll. Następnie wyizolowano monocyty przy użyciu Monocyte Isolation Kit i Magnetic Cell Separation System (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Następnie, monocyty powleczono na 24-studzienkowych płytkach ultraniskiego przylegania, w pożywkach pozbawionych endotoksyny. Były albo nie stymulowane, albo potraktowane rekombinacyjną ludzką IFNg (R & D Systems Inc.) w ilości 10 ng/ml. Komórki zebrano po 24 i 48 godzinach.

PL 211 833 B1

W podobny sposób, wyizolowano komórki T CD4+ i CD8+ z PBMC, przy użyciu paciorków magnetycznych anty-CD4 lub anty-CD8 od Miltenyi Biotec. Komórki następnie aktywowano przez 4 lub 16 godzin w płytkach do hodowli tkankowej powleczonych 0,5 μg/ml przeciwciał anty-CD3 w pożywkach zawierających 5 μg/ml przeciwciał anty-CD28. Komórki NK również wyizolowano z PBMC przy użyciu powlekanych anty-CD56 paciorków magnetycznych Miltenyi. Niektóre komórki NK zebrano w czasie zero dla RNA, a inne powleczono w pożywkach zawierających Phorbol Myristate Octan (PMA) (5ng/ml) i jonomycynę (0,5 μg/ml) przez 24 godziny. Dodatkowo, zebrano kilka ludzkich linii komórkowych podobnych do monocytów, U937, THP-1 i HL-60, w stanie albo spoczynkowym, albo aktywowanym. Komórki U937 aktywowano przez noc PMA (10 ng/ml). HL-60's aktywowano przez noc PMA (10 ng/ml) lub przez 72 i 96 godzin IFNg (10 ng/ml) aby nakierować je na szlak monocytowy. Komórki THP-1 aktywowano przez noc kombinacją LPS (10 ng/ml) i IFNg (10 ng/ml). RNA wytworzono ze wszystkich pierwszorzędowych komórek, przy użyciu zestawu RNeasy Midiprep Kit (Qiagen, Valencia, CA) zgodnie z instrukcjami producenta. Ładunek DNA usunięto przy użyciu zestawu DNAFree (Ambion, Inc., Austin, TX). Stężenie RNA określono przy użyciu standardowej spektrofotometrii, a jakość RNA określono przy użyciu Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA).

RNA mysich komórek T zebrano przy użyciu różnych metod dobrze znanych w dziedzinie. Pierwszorzędowe komórki T śledziony CD4+ i CD8+ wyizolowano ze śledzion myszy C57B1/6 przy użyciu powlekanych przeciwciałem paciorków magnetycznych i Magnetic Cell Separation System od Miltenyi Biotec. Następnie, komórki T CD4+ i CD8+ aktywowano przez hodowlę komórek w 24-studzienkowych płytkach powleczonych przeciwciałami anty-CD3 (500 ng/ml) w pożywkach zawierających przeciwciała anty-CD28 w ilości 5 μg/ml. Komórki zebrano dla RNA po 0,4 i 16 godzinach. Podobnie, wyizolowano komórki T CD4+ i następnie zeskosowano w kierunku fenotypu Th1 lub Th2 przy użyciu następującego protokołu. Ponieważ komórki T C57B1/6 już są zeskosowane w kierunku Th1, wszystko czego było trzeba to aktywacja przez 6 godzin z użyciem 0,5 μg/ml PMA i 10 ng/ml jonomycyny. Skosowanie „Th2” otrzymano powleczenie niekatywowanych komórek T CD4+ 2,5 μl antyCD28, 10 ng/ml mIL-2 (R & D Systems Inc.) i 25 ng/ml mIL-4 (R & D Systems) na płytkach powleczonych 0,5 μl anty-CD3. Po 2 dniach w hodowli, komórki ponownie zawieszono w pożywkach zawierających 10 ng/ml mIL-2 (R & D Systems) i 25 ng/ml mIL-4. Komórki hodowano przez dodatkowe trzy dni, następnie aktywowano PMA i jonomycyną przez 6 godzin.

Otrzmano jeden dodatkowy zbiór zeskosowanych komórek T, Th1 i Th2, przy użyciu linii komórek T, T Cell Receptor Transgenic DO11.10. Wszystkie komórki powleczono na płytkach powlekanych anty-CD3 i anty-CD28. Komórki „Th1” powleczono w pożywkach zawierających mIL-12 (1 ng/ml) i anty-IL-4 (10 μg/ml). Komórki „Th2” powleczono w pożywkach zawierających mIL-4 (10 ng/ml) i antyIFNg (10 μg/ml). Po 24 godzinach, do wszystkich hodowli dodano mIL-2 (10 ng/ml). Po jeszcze dwóch dniach, pożywki na komórkach wymieniono dodano nowe pożywki zawierające wyżej wymienione cytokiny i komórki hodowano dodatkowe 4 dni przed zbiorem. Cały RNA mysich komórek T wytworzony przy użyciu RNeasy Midiprep Kit (Qiagen) i zanieczyszczający DNA usunięto przy użyciu zestawu DNA-freeT™ od Ambion.

E. Izolacja RNA z mysiego modelu zapalenia trzustki i choroby wrażliwego jelita

Aby indukować stan podobny do ludzkiej choroby wrażliwego jelita (IBD), użyto hybrydowy szczep mysiego C57BI6/129S6F1. Myszy podzielono do 4 grup o średniej wielkości sześciu myszy na grupę. Grupie 1 nie podawano Dextran Siarczan Sodu (DSS) i uśmiercono w dniu 14. Grupa 2 otrzymywała 2% DSS przez dwia dni przed uśmierceniem. Grupa 3 otrzymywała 2% DSS przez siedem dni przed uśmierceniem. Grupa 4 otrzymywała 2% DSS przez siedem dni następnie pozostawiono do wyzdrowienia przez siedem dni i uśmiercono w dniu 14. W dniu uśmiercenia, uunięto najdalszy odcinek okrężnicy i umieszczono w RNAlater (Ambion). Wycinki okrężnicy homogenizowano przy użyciu standardowych technik i RNA wyizolowano przy użyciu RNeasy Midiprep Kit (Qiagen). Zanieczyszczający DNA usunięto przez traktowanie DNA-free™ (Ambion) zgodnie z instrukcjami producenta.

W innym badaniu, indukowano ostre zapalenie trzustki u samców myszy CD-1 poprzez iniekcję ceruleiny. Myszy podzielono na trzy grupy (n = 8 myszy/grupę). Grupa 1 zwierząt dostała siedem iniekcji i.p. (1 iniekcję na godzinę) podłoża (solanka), a następnie uśmiercono w 12 i 24 godzin po pierwszej iniekcji. Grupy 2 i 3 dostały siedem iniekcji i.p. ceruleiny (Sigma) (Catalog #C-9026) w dawce 50 μg/kg/godzinę przez sześć godzin (1 iniekcję na godzinę). Grupę 2 uśmiercono w 12 godzin po pierwszej iniekcji i grupę 3 uśmiercono w 24 godziny po pierwszej iniekcji. Trzustki usunięto w czasie uśmiercania i szybko zamrożono dla izolacji RNA. Tkanki homogenizowano i RNA wyizolowano przy użyciu Qiagen RNeasy Midiprep Kit.

PL 211 833 B1

W jeszcze innym badaniu, wytworzono myszy transgeniczne z mysim Zcytor17lig i obserwowano pod względem zmian fenotypowych (patrz przykład 41). Nastroszenie i utratę włosa obserwowano u wielu myszy transgenicznych. Cztery myszy transgeniczne uśmiercono i próbki skóry zarówno z obszarów normalnych jak i bezwłosych usunięto i szybko zamrożono do późniejszej izolacji RNA. Pobrano również wycinki skóry od dwóch kontrolnych myszy nietransgenicznych. Próbki skóry homogenizowano i następnie trawiona Proteinase K (Qiagen) (Catalog # 19133) przez 20 minut w temperaturze 60°C. Następnie wyizolowano RNA przy użyciu Qiagen RNeasy Midiprep Kit zgodnie z instrukcjami producenta. Zanieczyszczający DNA usunięto przy użyciu zestawu DNA-free™ od Ambion.

F. Wyniki ilościowej i półilościowej RT-PCR dla ludzkiego Zcytor17, OSMRbeta i Zcytor17lig

Ekspresję Zcytor17 i OSMRbeta badano za pomocą ilościowej RT-PCR w czterech zbiorach pierwszorzędowych ludzkich monocytów, będących albo w stanie spoczynku albo aktywowanych IFNg przez 24 lub 48 godzin. Ekspresja Zcytor17 była poniżej detekcji w niestymulowanych komórkach, lecz zwiększyła się dramatycznie po 24-godzinnej aktywacji IFNg i była najwyższa po 48 godzinach aktywacji. We wszystkich przypadkach OSMRbeta była poniżej detekcji. Zcytor17lig nie testowano w tych próbkach. W pierwszorzędowych komórkach T, Zcytor17 był poniżej detekcji w obu podzbiorach CD4+ i CD8+. Po czterogodzinnej aktywacji, jednakże, ekspresja Zcytor17 wzrosła w obu podzbiorach, a następnie spadła do nieco niższego poziomu w 16 godzinie. OSMRbeta był poniżej detekcji w tych próbkach. Ekspresję Zcytor17lig badano przy użyciu półilościowej RT-PCR. Nie wykryto ekspresji w nie stymulowanych komórkach T CD4+ i CD8+. Jednakże, po czterogodzinnej aktywacji, wykryto wysoki poziom Zcytor17lig.

Poziom ten raczej spadał w 16 godzinie. Ekspresji Zcytor17 nie badano w komórkach NK. OSMRb był poniżej detekcji w tych próbkach. Ekspresja Zcytor17lig była poniżej detekcji w spoczynkowych komórkach NK, jednakże był słabiutki sygnał wytworzony przez aktywowane komórki NK sugerując, że te komórki mogą wytworzyć Zcytor17lig w pewnych warunkach.

W ludzkich liniach komórkowych podobnych do monocytów, U93T, THP-1 i HL-60, ekspresja OSMRbeta była poniżej detekcji we wszystkich spoczywających i aktywowanych próbkach z wyjątkiem aktywowanych próbkach THP-1 gdzie wykrywano słaby sygnał. Ekspresja Zcytor17 była wysoka w obu U93T i THP-1 spoczywających liniach komórkowych i wykazywała silne pobudzenie po aktywacji. Ekspresja w U937 była najsilniejsza z każdego typu komórek. W HL-60's, ekspresja Zcytor17 była średnia w niestymulowanych komórkach i spadła po stymulacji PMA. Jednakże, ekspresja Zcytor17 wzrosła dramatycznie w HL-60's po stymulacji IFNg przez 72 i 96 godzin. Wszystkie dane ludzkiej ekspresji omówiono w tablicy 8 poniżej.

T a b l i c a 8

Pierwszorzędowe ludzkie monocyty	Stan aktywacji	Zcytor17	OSMRbeta	Zcytor17lig
1	2	3	4	5
Ludzkie monocyty	Niestym.	-	-
Ludzkie monocyty	Akt. 24 godzIFNg	+	-
Ludzkie monocyty	Akt. 48 godzIFNg	++	-
Ludzkie CD4+	Niestym.	-	-	-
Ludzkie CD4+	Akt. 4 godz.	++	-	++
Ludzkie CD4+	Akt. 16 godz.	+	-	+
Ludzkie CD8+	Niestym.	-	-	-
Ludzkie CD8+	Akt. 4 godz.	++	-	++
Ludzkie CD8+	Akt. 16 godz.	+	-	+
Ludzkie komórki NK	Niestym.		-	-
Ludzkie komórki NK	Akt. 24 godz.		-	+
U937	Niestym.	++	-	-
U937	Akt. 16 godz.	+++	-	-

PL 211 833 B1 cd. tablicy 8

1	2	3	4	5
THP-1	Niestym.	+ +	-	-
THP-1	Akt. 16 godz.	+++	+	-
HL-60	Niestym.	++	-	-
HL-60	Akt. 16 godz.PMA	+	-	-
HL-60	Akt. 72 godz.IFNg	+++	-	-
HL-60	Akt. 72 godz. IFNg	+++	-	-

G. Wyniki ilościowej i półilościowej RT-PCR dla mysiego Zcytor17, OSMRbeta i Zcytor17lig Poziom ekspresji mysiego Zcytor17, OSMRbeta i Zcytor17lig badano w kilku populacjach mysich komórek T i wyniki omówiono w tablicy 9 poniżej. Ekspresję mysiego Zcytor17 testowano za pomocą półilościowej RT-PCR i okazało się, że jest na niskim poziomie zarówno w spoczynkowych, jak i aktywowanych pierwszorzędowych komórkach T CD4+. Ekspresję Zcytor17 wykrywano na spoczywających komórkach T CD8+ i następnie wydawało się, że spada ona po aktywacji przeciwciałami anty-CD3 i anty-CD28 zarówno po 4, jak i po 16-godzinach. Ekspresję OSMRbeta mierzono za pomocą ilościowej RT-PCR i jego ekspresja zachodziła w spoczynkowych i aktywowanych komórkach T CD4+ i CD8+. Ekspresja OSMRbeta rosła po 4-godzinnej aktywacji i następnie powracała do poziomu niestymulowanego przez 16 godzin w obu komórkach T CD4+ i CD8+. Zcytor17lig wykrywano za pomocą ilościowej RT-PCR i jego ekspresja zachodziła na bardzo niskim poziomie w niestymulowanych komórkach T CD4+. Jednakże, po 4-godzinnej aktywacji, ekspresja Zcytor17lig rosła dramatycznie i następnie spadała nieco do 16 godziny. W komórkach T CD8+, nie wykrywano Zcytor17lig w komórkach niestymulowanych. Występowała niewielka ekspresja Zcytor17lig w 4 godzinie, lecz do 16 godziny poziom ekspresji spadał znowu poniżej detekcji. W komórkach T DO11.10, ekspresję Zcytor17 wykrywano w komórkach nie stymulowanych i skosowanych Th2, ale nie w komórkach skosowanych Th1. Ekspresja OSMRbeta była na niskim poziomie w niestymulowanych komórkach DO11.10. Zachodził dramatyczny wzrost poziomu ekspresji OSMRbeta w komórkach skosowanych Th1 i średni wzrost ekspresji w skosowanych komórkach Th2. Ekspresja Zcytor17lig w tych komórkach okazała się zachodzić głównie w podzbiorze skosowanym Th2. Niski poziom wykrywano w podzbiorze Th1 i nie wykrywano ekspresji w nie stymulowanych komórkach. Te wyniki omówiono w tablicy 9 poniżej. W pierwszorzędowych komórkach T CD4+, które były skoso-wane albo w kierunku Th1 albo Th2, Zcytor17 nie był badany. Ekspresję OSMRbeta wykrywano we wszystkich trzech próbkach o najwyższym poziomie znalezionym w próbce Th2. Podobnie jak wyniki DO11.10, ekspresję Zcytor17lig wykrywano na wysokim poziomie w podzbiorze skosowanym Th2, z małą ilością wykrytą w podzbiorze Th1 i poziom był poniżej detekcji w komórkach niestymulowanych. Te wyniki omówiono w tablicy 9, poniżej.

T a b l i c a 9

Mysie komórki T	Zcytor17	OSMRbeta	Zcytor17lig
1	2	3	4
Komórki T CD4 + niestym.	+	+	+ /-
Komórki T CD4 + 4 godz. aktywacja	+	++	++
Komórki T CD4 + 16 godz. aktywacja	+	+	+
Komórki T CD8 + niestym.	+	+	-
Komórki T CD8 + 4 godz. aktywacja	+/-	++	+
Komórki T CD8 + 16 godz, aktywacja	-	+	-
DO11.10 naiwne	+	+	-
DO11.10	-	+++	+
Th1

PL 211 833 B1 cd. tablicy 9

1	2	3	4
DO11.10	+	++	+ +
Th2
Komórki T CD4 + niestym.		++	-
Komórki T CD4 + skos Th1		+++	+
Komórki T CD4 + skos Th2		++	+++

W transgenicznych próbkach skóry poziom ekspresji Zcytor17lig, Zcytor17, OSMRbeta i Zcytor17lig określono przy użyciu ilościowej RT-PCR. Zcytor17 okazał się występować we wszystkich próbkach na mniej więcej takim samym poziomie. Dramatycznie wyższy poziom ekspresji OSMRbeta miał miejsce w nietransgenicznych zwierzątach kontrolnych niż w próbkach transgenicznych. Ekspresja Zcytor17lig była poniżej detekcji u kontrolnych zwierząt nietransgenicznych, prz średnim do wysokiego poziomu ekspresji u zwierząt transgenicznych. Wyniki omówiono w tablicy 10 poniżej.

T a b l i c a 10

Mysi Zcytor17lig	Skóra
Skóra transgeniczna	Fenotyp	Zcytor17	OSMRbeta	Zcytor17lig
Mysz dzikiego typu	Normalny	+	+++	-
Mysz dzikiego typu	Normalny	+	+++	-
Transgeniczna #1	Normalny	+	+	+
Transgeniczna #1	Utrata włosa	+	+	+
Transgeniczna #2	Normalny	+	+	+
Transgeniczna #2	Utrata włosa	+	+	+
Transgeniczna #3	Normalny	+	+	+
Transgeniczna #3	Utrata włosa	+	+	+
Transgeniczna #4	Normalny	+	+	+++
Transgeniczna #4	Utrata włosa	+	+	+++

W innym doświadczeniu, poziom ekspresji Zcytor17, OSMRbeta i Zcytor17lig mierzono za pomocą ilościowej RT-PCR w trzustkach myszy poddanej ostremu zapaleniu trzustki.

Ekspresja Zcytor17 była poniżej detekcji we wszystkich próbkach.

Ekspresja OSMRbeta była widoczna na niskim poziomie w normalnych próbkach kontrolnych (grupa 1), lecz wykazywała silny wzrost 12 godzinie (grupa 2) i nieco niższy poziom w 24 godzinie (grupa 3).

Ekspresja Zcytor17lig była poniżej detekcji u zwierząt kontrolnych, lecz wykazywała wysoki poziom w obu grupach z iniekcją ceruleiny.

Dane są omówione w tablicy 11 poniżej.

T a b l i c a 11

Model zapalenia trzustki	Opis	Zcytor17	OSMRbeta	Zcytor17lig
Grupa 1	Normalna kontrolna	-	+	-
Grupa 2	12 godz. po iniekcji	-	+++	++
Grupa 3	24 godz. po iniekcji	-	++	++

W innym doświadczeniu, poziom ekspresji Zcytor17 i OSMRbeta badano w najdalszych odcinkach okrężnicy myszy poddanych traktowaniu DSS.

PL 211 833 B1

W tym modelu mysiej choroby zapalnej jelita, poziom ekspresji obu genów określono za pomocą ilościowej RT-PCR i omówiono w tablicy 12 poniżej.

Poziom ekspresji Zcytor17 rósł wraz z ciężkością choroby, przy niskim poziomie ekspresji u normalnych zwierząt w grupie 1 i rosnącej ilości widocznej w grupach 2 i 3.

W grupie 4 zwierząt, poziom Zcytor17 powrócił do bardziej normalnego poziomu. Inaczej niż ekspresja Zcytor17, poziom OSMRbeta był najwyższy u zwierząt kontrolnych i poziom właściwie spadał we wszystkich trzech grupach traktowanych DSS.

T a b l i c a 12

Model IBD	Opis	Dzień SAC		Zcytor17	OSMRbeta
Grupa 1	Normalna kontrola	14		+	++
Grupa 2	Traktowane DSS 2 dni	2		++	+
Grupa 3	Traktowane DSS 7 dni	7		+++	+
Grupa 4	Traktowane DSS 7 dni	14		+	+

P r z y k ł a d 28

Rozmieszczenie tkankowe ekspresji ludzkiego Zcvtor17lig na podstawie RT-PCR analizy wielokrotnych tkankowych jednoniciowych cDNA

Ekspresję genową zcytor17lig badano przy użyciu dostępnego w handlu znormalizowanych wielokrotnych tkankowych paneli jednoniciowego cDNA (OriGene Technologies, Inc. Rockville, MD; BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA). Obejmują one OriGene „Human Tissue Rapid-Scan™ Panel” (Cat. #; CHSCA-101, zawierający 22 różne tkanki, szpik kostny i leukocyty osocza krwi) i BD Biosciences Clontech „Human Blood Fractions MTC™ Panel” (Cat. #K1428-1, zawierający 9 różnych frakcji krwi).

Reakcje PCR ustawiono przy użyciu swoistych oligo starterów zcytor17lig ZC41,458 (SEQ ID nr: 60) i ZC41,457 (SEQ ID nr: 61), co daje produkt wielkości 139 bp oraz ZC41,459 (SEQ ID nr: 62) i ZC41,460 (SEQ ID nr: 63), co daje produkt wielkości 92 bp, polimerazy DNA Qiagen HotStarTaq i buforu (Qiagen, Inc., Valencia, CA), dH2O i barwnika RediLoad™ (Research Genetics, Inc., Huntville, AL). Warunki cyklera PCR były następujące: początkowy 1 cykl 15 minut denaturacji w temperaturze 95°C, 35 cykli 45 sekund denaturacji w temperaturze 95°C, 1 minuta wygrzewania w temperaturze 53°C lub 56°C i 1 minuta i 15 sekund wydłużania w temperaturze 72°C, a następnie końcowy 1 cykl wydłużania 7 minut w temperaturze 72°C. Mieszaninę reakcyjną rozdzielono za pomocą elektroforezy na 2% żelu agarozowym (EM Science, Gibbstown, NJ) i uwidoczniono przez wybarwienie bromkiem etydium.

Fragment DNA prawidłowej wielkości obserwowano w następujących tkankach dorosłego człowieka, przy użyciu OriGene „Human Tissue Rapid-Scan™ Panel”: jądra, leukocytów osocza krwi (PBL) i szpiku kostnego.

Fragment DNA prawidłowej wielkości obserwowano w następujących frakcji ludzkiej krwi, przy użyciu BD Biosciences Clontech „Human Blood Fractions MTC™ Panel”: aktywowane jednojądrzaste komórki (B- & komórki T i monocyty), aktywowane komórki CD8+ (T-supresorowe/cytotoksyczne), aktywowane komórki CD4+ (T-helper/inducer) i słabo w spoczynkowych komórkach CD8+.

P r z y k ł a d 29

Klonowanie ludzkiego receptora onkostatyny M

Beta receptor onkostatyny M (OSMRbeta) jest receptorem cytokiny typu I o podobieństwie strukturalnym do IL12R-B2. ZcytoR17 odznacza się podobieństwem strukturalnym wobec IL12R-B1. OSMRbeta i zcytor17 testowano, aby sprawdzić czy mogą ulegać interakcjom jako podjednostki w kompleksie sygnalizacyjnym cytokin i czy razem mogą działać jako receptor sygnalizacyjny lub antagonista rozpuszczalnego receptora, dla zcytor17lig.

Aby wyizolować OSM-Rbeta, zaprojektowano startery oligonukleotydowe PCR ZC39982 (SEQ ID nr: 64) i ZC39983 (SEQ ID nr: 65) do powielenia pełnej długości cDNA regionu kodującego ludzkie sekwencje OncostatinM beta (SEQ ID nr: 6) (Genbank numer dostępu U60805; Mosley B, JBC tom 271, numer 50, wydanie z 20 grudnia, 1996 str. 32635-32643).

PL 211 833 B1

Reakcje PCR uruchamiano na szeregu matryc bibliotek cDNA przy użyciu silnej polimerazy, Advantage II (Clonetech, Palo-Alto, CA), w celu identyfikacji źródła cDNA. Wykorzystana matryca DNA pochodziła z powielonej biblioteki cDNA plazmidu, każda zawierającs 5 milionów niezależnych klonów cDNA. Reakcje montowano zgodnie z instrukcjami producenta przy użyciu 400 fmol^l każdego oligonukleotydu i 2-20 ng^l biblioteki oczyszczonego plazmidowego DNA jako matrycy. Biblioteki cDNA otrzymano z następujących tkanek i linii komórkowych człowieka: mózgu płodu, mięśni gładkich prostaty, szpiku kostnego, RPMI1588, tarczycy, WI-38, jądra, stymulowanych obwodowych komórek jednojądrzastych krwi, stymulowanych komórek CD3+, THP-1, aktywowanego migdałka, HACAT i wątroby płodu. Reakcje przeprowadzono na termocyklerze stosując następujące warunki: 30 cykli w temperaturze 95°C przez 20 sekund, 68°C przez 3 minuty. Na zakończenie 30 cykli przeprowadzono dodatkowy, pojedynczy cykl wydłużania przez 8 minut w temperaturze 68°C. Produkty PCR uwidoczniono za pomocą agarozy TAE, elektroforezy żelowej w obecności bromku etydium, a następnie naświetlono UV. Najbardziej liczny produkt okazał się pochodzić z biblioteki cDNA mięśni gładkich prostaty. Reakcje PCR przy użyciu matrycy mięśni gładkich prostaty i oligonukleotydów ZC39982 (SEQ ID nr: 64) i ZC39983 (SEQ ID nr: 65) powtórzono przy użyciu słabszej lecz bardziej termostabilnej polimerazy DNA „turboPFu” (Stratagene, La Jolla, CA). Przeprowadzono trzydzieści cykli powielania w nastęupjących warunkach: denaturacja w temperaturze 94°C, 30 sekund, wygrzewanie w temperaturze 63°C 45 sekund, wydłużanie w temperaturze 72°C 3,5 minut. Produkt w postaci pojedynczego prążka oczyszczono na 0,8% TAE, żelu agarozowym.

Ten DNA następnie powielano ponownie przy użyciu starterów ZC39980 (SEQ ID nr: 66) i ZC39981 (SEQ ID nr: 67) zaprojektowano tak, że obejmują sekwencje rozpoznawania enzymu restrykcyjnego pozwalające na klonowanie tego cDNA do ssaczego wektora ekspresji.

Reakcję PCR przeprowadzono przy użyciu „TurboPfu” i oczyszczono produkt PCR przez 15 cykli w temperaturze: 95°C 1 minutę, 64°C 1 minutę 20 sekund, 72°C 4,5 minut. Mieszaninę reakcyjną PCR następnie trawiono EcoRI i XhoI (Invitrogen, Carlsbad, CA) i oczyszczono w żelu, jak opisano wyżej. Wektor ekspresji ssaka, pZ7NX, wytworzono przez trawienie EcoRI i XhoI i produkt PCR ligowano z tym wektorem i poddano elektroporacji do komórek E. coli DH10b. Wyizolowano kilka bakteryjny kolonii i sekwencjonowano. Jeden klon był prawidłowy z wyjątkiem pojedynczych niekonserwatywnych mutacji. W celu zmiany tej zasady na pasującą do oczekiwanej sekwencji, oligonukleotyd obejmujący mutację i sąsiadujące miejsce restrykcji Pstl użyto w reakcji PCR z „TurboPfu” przy użyciu pZP7Nx-h. Plazmid OncostatinM R poprzednio sekwencjonowano jako matrycę. DNA powielany PCR trawiono Pstl i XhoI i kolonowano z powrotem do plazmidu pZP7Nx-h OncostatinM R w miejsce fragmentu PstI/XhoI zawierającego szkodliwą mutację. Ten nowy plazmid sekwencjonowano przez ostatnio powielany region Pstl do XhoI, aby potwierdzić poprawkę i upewnić się co do innych błędów powstałych w procesie powielania. Ta analiza potwierdziła sekwencję, która pasowała do oczekiwanej sekwencji przez region kodujący. Sekwencja jest pokazana na SEQ ID nr: 6 i odpowiadająca sekwencja aminokwasową ukazana na SEQ ID nr: 7.

P r z y k ł a d 30

Konstrukcje dla tworzenia ludzkiego heterodimeru receptora Zcytor17/OncostatinM (OSMRbeta)

Układ do kontruowania, ekspresji i oczyszczania takich rozpuszczalnych heterodimerycznych receptorów jest znany w dziedzinie, i został dostosowany do pary receptorów, ludzkiego receptora onkostatyny M M (OSMRbeta) i ludzkiego zcytor17. Dla tej konstrukcji, polinukleotyd dla rozpuszczalnego receptora dla OSMRbeta, pokazano na SEQ ID nr: 68 i odpowiadający polipeptyd pokazano na SEQ ID nr: 69; i polinukleotyd dla rozpuszczalnego receptora dla ludzkiego zcytor17 pokazano na SEQ ID nr: 70 i odpowiadający polipeptyd pokazano na SEQ ID nr: 71.

Aby skonstruować linię komórkową wykazującą ekspresję wydzielonego, rozpuszczalnego heterodimeru hzcytor17/ludzki OSMRbeta, wykonano konstrukcję tak, że uzyskany heterodimeryczny, rozpuszczalny receptor obejmuje pozakomórkową domenę ludzkiego OSMRbeta w fuzji z łańcuchem ciężkim IgG gammal (Fc4) (SEQ ID nr: 37) ze znacznikiem Glu-Glu (SEQ ID nr: 35) na końcu C; podczas gdy domena pozakomórkową zcytoR17 była w fuzji z Fc4 (SEQ ID nr: 37) ze znacznikiem His (SEQ ID nr: 72) na końcu C. Dla obu ramion hzcytor17 i ludzkiego OSMRbeta heterodimeru skonstruowano sekwencję rozdzielającą Gly-Ser o 12 aminokwasach (SEQ ID nr: 73) pomiędzy pozakomórkową częścią receptora i końcem N Fc4.

A. Konstruowanie ludzkiego rozpuszczalnego OSMRbeta/Fc4-CEE

Dla konstrukcji części ludzkiego rozpuszczalnego OSMRb-ta/Fc4-CEE heterodimeru część pozakomórkową ludzkiego OSMRbeta wyizolowano przy użyciu PCR z oligonukleotydami ZC14063

PL 211 833 B1 (SEQ ID nr: 48) i ZC41557 (SEQ ID nr: 74) w następujących warunkach reakcji PCR: 30 cykli w temperaturze 95°C przez 60 sek., 57°C przez 30 sek.; i 72°C przez 100 sek.; i 72°C przez 7 min. Produkty PCR oczyszczono przy użyciu QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen), trawiona EcoRI i Bglll (Boerhinger-Mannheim), oddzielono przez elektroforezę żelową i oczyszczono przy użyciu zestawu do ekstrakcji żelowej QIAquick (Qiagen).

Kaseta ekspresji, szkielet plazmidu i część znacznika Fc4-GluGlu chimery były zawarte w uprzednio wykonanym na miejscu wektorze plazmidowym. Plazmid wektora trawiono EcoRI i BamHI (Boerhinger-Mannheim), oddzielono przez elektroforezę żelową i oczyszczono przy użyciu zestawu do ekstrakcji żelowej QIAquick (Qiagen). Trawione i oczyszczone fragmenty ludzkiego OSMRbeta i Fc4-cEE zawierające plazmid ligowano razem przy użyciu T4 DNA Ligase (Life Technologies, Bethesda, MD) przy użyciu standardowych metod ligacji. Minipreps uzyskanej ligacji przesiano pod względem insertu EcoRI/Smal o prawidłowej wielkości (772 bp) pod względem rozpuszczalnego OSMRbeta i pozytywne minipreps sekwencjonowano aby potwierdzić dokładność reakcji PCR. Tę nową konstrukcję plazmidową określono pZP9-ONCOMR-Fc4CEE.

B. Konstruowanie ludzkiego rozpuszczalnego Zcytor17/Fc4-CHIS

Dla skonstruowania części hzcytor17/Fc4-CHIS heterodimeru, wyizolowano pozakomórkową część ludzkiego zcytor17 przez trawienie plazmidu poprzednio zawierającego rozpuszczalny receptora Zcytor17-Fc4. Plazmid najpierw trawiony SalI (New England Biolabs, Beverly, MA) po czym reakcję seryjnie ekstrahowano mieszaniną fenol-chloroform i wytrącono etanolem. Trawiony DNA następnie potraktowano T4 DNA Polimerase (Boerhinger-Mannheim), aby wypełnić nawisy 5' utworzone przez tawienie SalI, pozostawiając lepkie końce DNA, po czym reakcję seryjnie ekstrahowano mieszaniną fenol-chloroform i wytrącono etanolem. Lepkie końce DNA następnie trawiono Bglll, aby pociąć na końcu 3', oddzielono za pomocą elektroforezy żelowej i oczyszczono przy użyciu zestawu do ekstrakcji żelowej QIAquick (Qiagen) zgodnie z instrukcjami producenta. Uzyskany fragment DNA zawierający sekwencję kodującą pozakomórkową domenę zcytor17 poddano ligacji z wektorem ekspresji ssaka zawierającym znacznik Fc4-CHIS, wytworzonym jak następuje.

Kaseta ekspresji, szkielet plazmidu i część znacznika Fc4-CHIS chimery były zawarte w wektorze plazmidowym uprzednio wykonanym na miejscu. Ten wektor plazmidowy trawiono EcoRI (Boerhinger-Mannheim), po czym reakcję ekstrahowano seryjnie mieszaniną fenol chloroform i wytrącono etanolem. Trawiony DNA następnie potraktowano T4 DNA Polimerase (Boerhinger-Mannheim), aby wypełnić nawisy 5' utworzone przez trawienie EcoRI, pozostawiając lepkie końce DNA, po czym reakcję seryjnie ekstrahowano mieszaniną fenol chloroform i wytrącono etanolem. Lepkie końce DNA następnie trawiono BamHI (Boerhinger-Mannheim) aby pociąć na końcu 3', oddzielono za pomocą elektroforezy żelowej i oczyszczono przy użyciu zestawu do ekstrakcji żelowej QIAquick (Qiagen). Trawione i oczyszczone fragmenty ludzkiego zcytor17 i Fc4-CHIS zawierające plazmid ligowano razem przy użyciu T4 DNA Ligase (Life Technologies, Bethesda, MD) przy użyciu standardowych metod ligacji.

Minipreps uzyskanej ligacji przesiano za pomocą PCR przy użyciu swoistego sensownego dla zcytor17 startera ZC29180 (SEQ ID nr: 22) i swoistego dla Fc4 antysensownego startera ZC29232 (SEQ ID nr: 15) w następujących warunkach reakcji PCR: 30 cykli w temperaturze 94°C przez 60 sek., 68°C przez 150 sec; i 72°C przez 7 min. Produkt o oczekiwanej wielkości 848 bp potwierdził prawidłową budowę plazmidu nazwanego pZEM228 hzcytor17/Fc4HIS.

Drugą zcytor17-Fc4 konstrukcję wytworzono do stosowania w generowaniu homodimerycznego białka z komórek COS. Krótko, region kodujący dla pełnego białka fuzyjnego wyizolowano przez trawienie plazmidu uprzednio zawierającego rozpuszczalny receptor Zcytor17-Fc4 z SalI (Boerhinger-Mannheim). Mieszaninę reakcyjną seryjnie ekstrahowano mieszaniną fenol chloroform i wytrącono etanolem. Trawiony DNA następnie potraktowano T4 DNA Polimerase (Boerhinger-Mannheim), aby wypełnić nawisy 5' utworzone przez trawienie EcoRI, pozostawiając lepkie końce DNA, po czym reakcję seryjnie ekstrahowano mieszaniną fenol-chloroform i wytrącono etanolem. Lepkie końce DNA następnie trawiono Notl (Boerhinger-Mannheim), aby pociąć na końcu 3', oddzielono za pomocą elektroforezy żelowej i oczyszczono przy użyciu zestawu do ekstrakcji żelowej QIAquick (Qiagen). Wektor ekspresji ssaka zawierający kasetę ekspresji kierowania CMV trawiono, aby wytworzyć zgodne końce i 2 fragmenty ligowano razem. Minipreps uzyskanej ligacji przesiano za pomocą PCR przy użyciu sensownego startera swoistego dla wektora ZC14063 (SEQ ID nr: 48) i swoistego dla zcytor17 antysensownego startera ZC27899 (SEQ ID nr: 19) w następujących warunkach reakcji PCR: 30 cykli w temperaturze 94°C przez 30 sek., 64°C przez 30 sek; 70°C przez 90 sek; i 72°C przez 7 min. Produkt o oczekiwanej wielkości o około 1000 bp potwierdził prawidłową budowę plazmidu nazwanego

PL 211 833 B1 pZP7NX-hzcytor17-Fc4. Ten plazmid z kolei transfekowano do komórek COS przy użyciu Lipofectamine (Gibco/BRL), zgodnie z instrukcjami producenta. Komórki kondycjonowano przez 60 godzin w DMEM + 5% FBS (Gibco/BRL), po czym białko oczyszczono na kolumnie chromatograficznej białko G-sepharose 4B i udostępniono do testów biologicznych in vitro, np. tak, jak te opisane w niniejszym.

C. Wytwarzanie ludzkiego receptora Zcytor17/OncostatinM (OSMRbeta)

Około 16 pg każdego z pZP9-ONCOMR-Fc4CEE i pZEM228 hzcytor17/Fc4HIS kotransfekowano do komórek BHK-570 (ATCC nr CRL-10314) przy użyciu Lipofectamine (Gibco/BRL), zgodnie z instrukcjami producenta. Transfekowane komórki poddano selekcji przez 10 dni w DMEM + 5% FBS (Gibco/BRL) zawierającej 0,5 mg/ml G418 (Gibco/BRL) i 250 nM metylotreksatu (MTX) (Sigma, St. Louis, MO) przez 10 dni.

Uzyskany zbiór podwójnie selekcjonowanych komórek użyto do wytworzenia heterodimerycznego białka. Trzy komórkowe Factories (Nunc, Denmark) z tego zbioru użyto do wytworzenia 10 L pozbawionej surowicy, kondycjonowanej pożywki. Tę kondycjonowaną pożywkę przepuszczono przez 1 ml kolumnę białka-A i eluowano w (10) 750 mikrolitrowych frakcjach. Cztery te frakcje, które miały najwyższe stężenie zlano i dializowano (10 kD MW odcięcia) przeciwko PBS. Żądane heterodimeryczne białko kompleksu rozpuszczalnego zcytor17/OSMRbeta wyizolowano z innych składników pożywki przez przepuszczenie zbioru przez kolumnę Nickel i przemycie kolumny różnymi stężeniami Imidazole. Rozpuszczalne białko zcytor17/OSMRbeta eluowano przy pośrednich stężeniach Imidazole, podczas gdy homodimer hzcytor17/Fc4HIS eluowano przy wyższych stężeniach Imidazole.

P r z y k ł a d 31

Rozmieszczenie tkankowe ludzkiego zcytor17 w panelu tkankowym przy użyciu Northern Blot i PCR

A. Rozmieszczenie tkankowe ludzkiego zcytor17 przy użyciu Northern Blot

Human Multiple Tissue Northern Blots (Human 12-lane MTN Blot I i II, i Human Immune System MTN Blot II; Human Endocrine MTN, Human Fetal MTN Blot II, Human Multiple Tissue Array) (Clontech) jak też miejscowe odciski zawierające różne tkanki, sondowano dla określenia rozmieszczenia w tkance ekspresji ludzkiego zcytor17. Odciski wytworzone na miejscu obejmują mRNA następujących tkanek i linii komórkowych: komórki SK-Hep-1, THPl komórki, gruczoł nadnerczowy (Clontech); nerkę (Clontech), wątrobę (Clontech i Invitrogen); rdzeń kręgowy (Clontech), jądra (Clontech), ludzkie komórki T CD4+, ludzkie komórki T CD8+, ludzkie komórki T CD19+, ludzkie mieszane limfocyty reakcji (MLR), linia komórkowa THP1 (ATCC nr TlB-202), linia komórkowa U937, p388D1 linia komórkowa mysiego limfoblastu (ATCC nr CCL-46) z lub bez stymulacji lonomycin; i linia komórkowa płuca zarodka ludzkiego WI-38 (ATCC nr CRL-2221) z lub bez stymulacji lonomycin. Około 500 bp sondę otrzymaną przez PCR dla zcytor17 (SE ID nr: 4) powielono przy użyciu oligonukleotydów ZC28,575 (SEQ ID nr: 77) i ZC27,899 (SEQ ID nr: 19) jako starterów. Powielanie PCR prowadzono jak następuje: 30 cykli w temperaturze 94°C przez 1 minutę, 65°C przez 1 minutę i 72°C przez 1 minutę; a następnie cykl w temperaturze 72°C przez 7 minut. Produkt PCR uwidoczniono przez agarozową elektroforezę żelową i około produkt PCR wielkości 500 bp oczyszczono w żelu jak opisano niniejszym. Sondę wyznakowano radioaktywnie przy użyciu PRIME IT RTm Random Primer Labeling Kit (Stratagene) zgodnie z instrukcjami producenta. Sondę oczyszczono przy użyciu kolumny NUCTRAPTM push (Stratagene). Roztwór EXPRESSHYBTM (Clontech) użyto do wstępnej hybrydyzacji i jako roztwór hybrydyzujący dla Northern blots. Wstępną hybrydyzację prowadzono w temperaturze 68°C przez godziny. Hybrydyzacja miała miejsce przez noc w temperaturze 68°C z około 1,5 x 10⁶ cpm/ml wyznakowanej sondy. Odciski przemyto trzy razy w temperaturze pokojowej w 2 x SSC, 0,05% SDS, a następnie 1 mycie przez 10 minut w 2 x SSC, 0,1% SDS w temperaturze 50°C. Po kilku dniach ekspozycji widocznych było kilka słabych prążków. Około 9 kb transkrypt był widoczny w tchawicy, mięśniu szkieletowym i grasicy; około 2 kb transkrypt był widoczny w komórkach PBL, HPV, U937 i THP-1; i około, a 1,2 kb transkrypt był widoczny w łożysku, szpiku kostnym i tarczycy i komórkach HPV i U937. We wszystkich tkankach wymienionych powyżej, intensywność sygnału była słaba. Uwidoczniła się niewielka ekspresja w większości normalnych tkanek sugerując, że ekspresja zcytor17 może być zależna od aktywacji komórek lub tkanek, w których zachodzi jego ekspresja.

B. Rozmieszczenie tkankowe w panelach tkanek, przy użyciu PCR

Panel cDNA z ludzkich tkanek przesiano pod względem ekspresji zcytor17, przy użyciu PCR. Panel wykonano na miejscu i zawierał 94 marathon cDNA i próbki cDNA z różnych normalnych i nowotworowych tkanek ludzkich, a linie komórkowe pokazano w tablicy 13, poniżej. cDNA pochodziły

PL 211 833 B1 z miejscowych bibliotek lub marathon cDNA zmiejscowych preps RNA, Clontech RNA, lub Invitrogen RNA. Marathon cDNA wykonano przy użyciu zestawu marathon-Ready™ (Clontech, Palo Alto, CA) i testowano QC z użyciem starterów klatrynowych ZC21195 (SEQ ID nr: 78) i ZC21196 (SEQ ID nr: 79), a następnie rozcieńczono w oparciu o intensywność prążka klatrynowego. Aby zapewnić jakość próbki panelowej, przeprowadzono trzy testy pod względem kontroli jakości (QC):

(1) do oceny jakości RNA użytego do bibliotek, miejscowe cDNA testowano pod względem średniej wielkości insertu za pomocą PCR, z wektorami oligonukleotydowymi, które były swoiste dla sekwencji wektora dla poszczególnej biblioteki cDNA;

(2) standaryzację stężenia cDNA w panelu próbek uzyskano przy użyciu standardowych metod PCR do powielenia pełnej długości cDNA alfa tubuliny lub G3PDH przy użyciu oligo wektora 5' ZC 14,063 (SEQ ID nr: 48) i swoistego dla alfa tubuliny oligo startera 3' ZC17, 574 (SEQ ID nr: 49) lub oligo startera 3' swoistego dla G3PDH ZC17,600 (SEQ ID nr: 50); i (3) , a próbkę wysłano do sekwencjonowania aby sprawdzić możliwe zanieczyszczenie rybosomowym lub mitochondrialnym DNA. Panel ustawiono w formacie 96-studzienkowym, który obejmował ludzki genomowy DNA (Clontech, Pało Alto, CA), pozytywną próbkę kontrolną.

Każda studzienka zawierała w przybliżeniu 0,2-100 pl cDNA. Reakcje PCR ustawiono przy użyciu oligo ZC26,358 (SEQ ID nr: 80) i ZC26,359 (SEQ ID nr: 81), TaKaRa Ex Taq (TAKARA Shuzo Co LTD, Biomedicals Group, Japonia) i barwnika Rediload (Research Genetics, Inc., Huntsville, AL). Powielanie prowadzono jak następuje: 1 cykl w temperaturze 94°C przez 2 minuty, 35 cykli w temperaturze 94°C przez 30 sekund, 66,3°C przez 30 sekund i 72°C przez 30 sekund, a następnie 1 cykl w temperaturze 72°C przez 5 minut. Około 10 pl produktu reakcji PCR poddano standardowej agarozowej elektroforezie żelowej przy użyciu 4% żelu agarozowego. Prawidłowa, przewidywana wielkość fragmentu DNA była obserwowana w węźle limfatycznym, prostacie, tarczycy, HPV (nabłonek prostaty), HPVS (nabłonek prostaty, poddany selekcji), noworze płuc, reakcjach nowotworu macicy, razem z reakcją genomowego DNA.

Fragment DNA dla tkanki prostaty (2 próbki), HPV (nabłonek prostaty), HPVS (nabłonek prostaty, poddany selekcji), i genomowy, wycięto i oczyszczono przy użyciu Gel Extraction Kit (Qiagen, Chatsworth, CA) zgodnie z instrukcjami producentów. Fragmenty potwierdzone przez sekwencjonowanie aby ukazać, że są one w istocie zcytor17.

T a b l i c a 13

Tkanka/linia komórkowa	# próbek	Tkanka/linia komórkowa	# próbek
1	2	3	4
Gruczoł nadnerczy	1	Szpik kostny	3
Pęcherz	1	Mózg płodu	3
Szpik kostny	1	Wysepki trzustki	2
Mózg	1	Prostata	3
Szyjka macicy	1	RPMI #1788 (ATCC #CCL-156)	2
Okrężnicą	1	Jądra	4
Mózg płodu	1	Tarczyca	2
Serce płodu	1	WI38 (ATCC #CCL-75)	2
Nerka płodu	1	ARIP (ATCC #CRL-1674-szczur)	1
Wątroba płodu	1	HaCat-ludzkie keratynocyty	1
Płuco płodu	1	Gruczoł nadnerczy	1
Mięsień płodu	1	Prostata SM	2
Skóra płodu	1	PBMC selekcja CD3+	1
Serce	2	HPVS (ATCC #CRL-2221)-selekcja	1
K562 (ATCC # CCL-243)	1	Serce	1
Nerka	1	Przysadka	1

100

PL 211 833 B1 cd. tablicy 13

1	2	3	4
Wątroba	1	Łożysko	2
Płuco	1	Gruczoł ślinowy	1
Węzeł chłonny	1	HL60 (ATCC #CCL-240)	3
Czerniak	1	Płytka krwi	1
T rzustka	1	HBL-100	1
Przysadka	1	Mezangium nerki	1
Łożysko	1	Komórka T	1
Prostata	1	Neutrofil	1
Odbytnica	1	MPG	1
Gruczoł śłinowy	1	Hut-102 (ATCC #TIB-162)	1
Mięsień szkieletowy	1	Śródbłonek	1
Jełito cienkie	1	HepG2 (ATCC #HB-8065)	1
Rdzeń kręgowy	1	Fibroblast	1
Śledziona	1	E. Histo	1
Żołądek	1
Jądra	2
Grasica	1
Tarczyca	1
Tchawica	1
Macica	1
Nowotwór przełyku	1
Nowotwór żołądka	1
Nowotwór nerki	1
Nowotwór wątroby	1
Nowotwór płuca	1
Nowotwór jajnika	1
Nowotwór odbytu	1
Nowotwór macicy	1

C. Analiza ekspresji zcytor17 za pomocą PCR i Northern

Adnotacja rodzajów komórek i warunków wzrostu, jakie wpływają na ekspresję receptora, jest przydatnym środkiem naświetlenia jego funkcji i przewidywania źródła liganda.

W tym celu badano rozmaite tkanki i typy komórek za pomocą PCR.

Wykorzystano termostabilną polimerazę Advantage II™ (Clontech, La Jolla, CA) ze starterami oligonukleotydowymi ZC29,180 (SEQ ID nr: 22) i ZC29,179 (SEQ ID nr: 82) i 1-10 ng różnych matryc cDNA wymienionych poniżej, przez 30 cykli powielania w temperaturze (94°C, 30 sek.; 66°C, 20 sek.; 68°C, 1 min. 30 sek.).

Następnie, 20% każdej reakcji uruchomiono na 0,8% agarozie, żelach TAE/bromek etydium i uwidoczniono w świetle UV. Próbki następnie oceniano punktowo na podstawie intensywności prążka, patrz tablica 14 poniżej.

PL 211 833 B1

101

T a b l i c a 14

Komórki i warunki	Wynik 0-5
Hel stymulowane PMA	0
U937	3
MCF-7	0
HuH7	1
Ludzki pęcherzyk	0
HT-29	0
HEPG2	0
HepG2 stymulowane IL6	0
Ludzki nabłonek skóry	0
Ludzki śródbłonek naczyniowy	0
Ludzki CD4+	0
BEWO	0
Ludzki CD19+	1
Ludzkie PBMC stymulowane PHA, PMA, lonomycin, EL2, IL4, TNFa, 24 godziny	0
Ludzkie PBMC stymulowane LPS, PWM, IFNy, TNFa, 24 godziny	0
Ludzkie PBMC wszystkie powyższe warunki, 48 godzin	4
HUVEC p.2	4
RPMI 1788	0
TF1	0
Małpie komórki T śledziony stymulowane PMA, lonomycin	0
Ludzki nabłonek prostaty transformowany HPV	5
Ludzkie migdałki, zapalenie	0
HACAT	0
Ludzki chondrocyt	1
Ludzka komórka maziowa	1
THP1	5
REH	0

Z silnie pozytywnych sygnałów PCR, dwa pochodziły z ludzkich monocytowych linii komórkowych U937 i THP1.

Te dwie linie komórkowe wraz z linią nabłonka prostaty poddano selekcji do następnej analizy za pomocą Northern blot. Wcześniejsze próby uwidaczniania transkryptu analizą northern przy użyciu mRNA z różnych tkanek dawały słabe i i rozmyte sygnały w niespodziewanie wielkim zakresie wielkości wynoszącym 7-10 kb, czyniąc te dane trudnymi do interpretacji. Wytworzono denaturujący formaldehyd/MOPS/0,8% żel agarozowy (RNA Methodologies, Farrell, RE Academic Press) i uruchomiono 2 μg polyA+ mRNA dla każdej próbki wraz z boczną drabinką RNA (Life Technologies, Bethesda, MD). Żel następnie przeniesiono na nylon Hybond (Amersham, Buckinghamshire, UK), usieciowano UV i hybrydyzowano w roztworze ExpressHyb (Clontech, LaJolla, CA) w temperaturze 68°C, przez noc, przy użyciu sondy wobec ludzkiego zcytor17, wytworzonego za pomocą PCR z oligo ZC28,575 (SEQ ID nr: 77) i ZC27,899 (SEQ ID nr: 19) i wyznakowanego z użyciem zestawu Megaprime 32p (Amersham). Northern Blot z kolei przemyto 0,2 x SSC + 0,1% SDS w temperaturze 65°C przez 15 minut i poddano ekspozycji na błonie przez 7 dni z ekranami wzmacniającymi. Główny 8 kb prążek

102

PL 211 833 B1 był widoczny zarówno w torach nabłonka prostaty, jak i U937, chociaż słabszy prążek występował w torze THP1.

Aby zoptymalizować cDNA użyty jako sondę hybrydyzacji, cztery różne regiony pełnej długości sekwencję ludzkiego zcytoR17 powielano za pomocą PCR, wyznakowano i hybrydyzowano jak opisano wyżej do southern blots zawierających genomowe i powielane biblioteki cDNA DNA. Cztery sondy, w niniejszym oznaczone jako sondy A-D, powielano przy użyciu następujących par starterów:

(A) ZC28,575 (SEQ ID nr: 77), ZC27,899 (SEQ ID nr: 19);

(B) ZC27,895 (SEQ ID nr: 20), ZC28,917 (SEQ ID nr: 83);

(C) ZC28,916 (SEQ ID nr: 84), ZC28,918 (SEQ ID nr: 85); i (D) ZC28,916 (SEQ ID nr: 84), ZC29,122 (SEQ ID nr: 21).

Ludzki, genomowy DNA wraz z powielonymi bibliotekami cDNA zawierający zcytor17 za pomocą PCR trawiono EcoRI i XhoI, aby uwolnić inserty i uruchomiono podwójnie na TAE/0,8% żelach agarozowych, denaturowano 0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl, odciśnięto na Hybond, usieciowano UV i każdy hybrydyzowano oddzielną sondą. Sonda B okazał się posiadać najmniejsze nieswoiste wiązanie najsilniejszy sygnał. Tak więc, sondę B użyto do wszystkich następnych hybrydyzacji.

Zakładając, że komórki THP1 są doskonałym modelem krążących monocytów i wykazują ekspresję zcytor17 na niskim poziomie potraktowaliśmy je różnymi związkami w próbie zwiększenia ekspresji zcytoR17. Komórki hodowano do gęstości 2e5/ml, przemyto i ponownie zawieszono w różnych stymulujących pożywkach, hodowano przez cztery lub trzydzieści godzin i zbierano do preparatów RNA. Każdą pożywkę uzupełniano jednym z następujących leków lub pary cytokin: LPS, 2 pg/ml (Sigma Chemicals, St. Louis, MO), hTNFa 2 ng/ml (R & D Systems, Minneapolis, MN), hGM-CSF ng/ml (R & D Systems, Minneapolis, MN), hlFN 50 ng/ml (R & D Systems, Minneapolis, MN), hMCSF 1 ng/ml (R & D Systems, Minneapolis, MN), hIL6 1 ng/ml (R & D Systems, Minneapolis, MN), mIL-p 2 ng/ml (R & D Systems, Minneapolis, MN), hlFN 50 ng/ml + hILA 0,5 ng/ml (R & D Systems, Minneapolis, MN), hTFNY 50 ng/ml + hIL10 1 ng/ml (R & D Systems, Minneapolis, MN), PMA 10 ng/ml (Calbiochem, SanDiego, CA) i nietraktowaną kontrolą. Na końcu okresu hodowli wytworzono całkowity RNA przy użyciu zestawu RNAeasy Midi- (Qiagen, Valencia, CA). Z całkowitego RNA wyselekcjonowano RNA poli A+ przy użyciu zestawu MPG (CPG, Lincoln Park, NJ). 2 pg RNA poliA+ z każdych warunków uruchomiono na formaldehyd/MOPS/żelach agarozowych, przeniesiono na nylon i usieciowano UV, jak opisano wyżej. Te northern blots następnie hybrydyzowano, jak powyżej, z sondą B w temperaturze 68°C przez noc, przemyto w bardzo surowych warunkach 0,2 x SSC, 0,1% SDS w temperaturze 65°C, poddano ekspozycji na błonie przez noc, następnie poddano ekspozycji wobec ekranów fosforowych dla oceny ilościowej sygnału. Dominujący 8 kb mRNA, jak również raczej słabszy prążek o 2,8 kb były widoczne na wszystkich torach. 20-krotny wzrost mRNA zcytor17 był widoczny w RNA z komórek potraktowanych hlFNY przez 30 godzin, efekt ten był nieco zagłuszony równoczesnym traktowaniem IL4. Pomniejszy 3-krotny wzrost mRNA był widocznyh w RNA z komórek potraktowanych LPS, TNFa i GM-CSF, chociaż MCSF, IL6, i IL1 β nie miały wpływu na poziom zcytor17 mRNA. Dane te sugerują rolę receptora zcytor17 i jego liganda w biologii monocytów i makrofagów i przez to każdej liczbie procesów chorobowych, w których uczestniczą te komórki.

P r z y k ł a d 32

Rozmieszczenie tkankowe ludzkiego zcytor17lig w panelu tkankowym, przy użyciu Northern Blot i PCR

Ludzki fragment cDNA zcytor17lig otrzymano przy użyciu PCR ze swoistymi dla genu starterami: sensowny starter ZC41438 (SEQ ID nr: 93) i antysensowny starter ZC41437 (SEQ ID nr: 94) i matrycą ludzkiego cDNA zcytor17lig (SEQ ID nr: 90). Ten fragment oczyszczono przy użyciu standardowych metod i około 25 ng wyznakowano ¹²P alfa dCTP przy użyciu zestawu Prime-It RmT do znakowania losowych starterów (Stratagene) i hybrydyzowano w Ultrahyb (Ambion) i użyto do ekspozycji wobec błony Biomax/ekranów wzmacniających, zgodnie z zaleceniami producenta, w każdym przypadku. Nowe, poprzednio nieużywane odciski łącznie z torem 12 ludzkiego MTN od Clontech, ludzkiego mózgu MTN II i ludzkiego mózgu MTN odcisk IV, ludzkiego układu odpornościowego MTN II i ludzkiego MTE szereg II, od Clontech, hybrydyzowano przez noc w temperaturze 42°C metodą Ambion ultrahyb. Nieswoiste odczyty radioaktywne wymyto przy użyciu 1 SSC/5% SDS w temperaturze 55°C. Pozytywne odciski obejmowały ludzki tor 12 MTN (Clontech). Z 12 badanych tkanek, tylko łożysko było pozytywne pod względem transkrypt wielkości około 1,2 KB.

PL 211 833 B1

103

P r z y k ł a d 33

Konstruowanie wektorów ekspresji ssaka, z ekspresją ludzkiego zcytor17lig-CEE

A. Konstruowanie zcytor17Lig-CEE/pZMP21

Skonstruowano plazmid ekspresji zawierający całość lub część polinukleotydu kodującego zcytor17Lig-CEE (SEQ ID nr: 95), poprzez rekombinację homologiczną. Plazmid nazwano zcytor17Lig-CEE/pZMP21.

Konstrukcję zcytor17Lig-CEE/pZMP21 uzyskano przez utworzenie fragmentu zcytor17Lig-CEE, przy użyciu powielania PCR. Matrycą DNA użytą do wytworzenia fragmentu zcytor17Lig-CEE był zcytor17Lig/pZP7nx. Starterami użytymi do wytworzenia fragmentu zcytor17Lig-CEE były:

(1) ZC41,607 (SEQ ID nr: 97) (sekwencja sensowna), który obejmuje od 5' do końca 3': 28 bp sekwencji oskrzydlającej wektor (insertu 5') i 21 bp odpowiadające sekwencji 5' zcytor17Lig; i (2) ZC41, 605 (SEQ ID nr: 98) (sekwencja antysensowna), która obejmuje od 5' do końca 3': 37 bp sekwencji oskrzydlającej wektor (insertu 3'), 3 bp kodonu przestankowego, 21 bp kodujący C-terminalny znacznik EE i 21 bp odpowiadające końcowi 3' sekwencji zcytor17Lig.

Fragment wynikający z powyższego powielania PCR był kopią matrycy zcytor17Lig z dodatkiem C-terminalnego znacznika EE, otrzymując produkt końcowy zcytor17Lig-CEE.

Reakcje PCR uruchamiano jak następuje: do 100 μl końcowej objętości dodano: 10 μl 10 x Taq Polimerase Reaction Buffer z 15 mM MgCl (Gibco), 1 μl Taq DNA Polimerase (5 jednostek^l, Gibco), 3 μl 10 mM dNTP, 78 μl dH₂O, 3 μl 20 pmol^l roztworu macierzystego startera ZC41,607 (SEQ ID nr: 97) 3 μl 20 pmol^l roztworu macierzystego startera ZC41,605 (SEQ ID nr: 98) i 2 μl z 0,13, μg/μl roztworu macierzystego zcytor17lig matrycowego DNA. Do mieszaniny dodano objętość równą 50 μl oleju mineralnego. Mieszaninę reakcyjną ogrzewano do temperatury 94°C przez 5 minut, a następnie 35 cykli w temperaturze 94°C przez 1 minutę; 55°C przez 2 minuty; 72°C przez 3 minuty; a następnie 10 minut wydłużania w temperaturze 72°C i utrzymywano w temperaturze 4°C do zebrania reakcji.

Plazmid pZMP21 trawiono restrykcyjnie enzymem Bglll, oczyszczano QiaQuick PCR Purification Kit (Qiagen) przy użyciu protokołu mikrowirowania i użyto do rekombinacji z fragmentem PCR. Plazmid pZMP21 skonstruowano z pZMP20, który skonstruowano z pZP9 (złożony w American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110- 2209 i oznaczono nr 98668) z drożdżowymi elementami genetycznymi z pRS316 (złożony w American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209 i oznaczony nr 77145), elementem IRES z wirusa polio i pozakomórkową domeną CD8, skróconą na końcu karboksyterminalnym domeny transbłonowej. PZMP21 jest ssaczym wektorem ekspresji zawierającym kasetę ekspresji mającą promotor MPSV, immunoglobulinowy intron peptydu sygnałowego, wielokrotne miejsca restrykcji dla insercji sekwencji kodujących, kodon przestankowy i terminator ludzkiego hormonu wzrostu. Plazmid posiada również początek replikacji E. coli, ugrupowanie ekspresji ssaczego markera selekcji mającego promotor SV40, element wzmacniający i początek replikacji, gen DHFR, terminator SV40, jak też sekwencje URA3 i CEN-ARS konieczne dla selekcji i replikacji w S. cerevisiae.

Pięćdziesiąt mikrolitrów kompetentnych komórek drożdżowych (S. cerevisiae) niezależnie łączono z 100 ng pociętego plazmidu, 5 μl poprzednio opisanej mieszaniny PCR i przeniesiono do 0,2 cm kuwety do elektroporacj!. Mieszaninę drożdże/DNA poddawano impulsom elektrycznym o napięciu 0,75 kV (5 kV/cm), 8 omów, 25 μF. Każda kuweta posiadała 600 μl dodanego 1,2 M sorbitolu i drożdże powlekano w jednej, 100 μl równej ilości i jednej 300 μl równej ilości na dwóch płytkach URA-D i inkubowano w temperaturze 30°C. Po około 72 godzinach, transformanty drożdżowe Ura+ z pojedynczych płytek ponownie zawieszono w 1 ml H2O i wirowano krótko aby zgranulować komórki drożdżowe. Grudkę komórkową ponownie zawieszono w 500 μl buforu do lizy (2% Triton Χ-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA). 500 μl mieszaniny do lizy dodano do rurki Eppendorfa zawierającej 300 μl przemytych kwasem 600 μm szklanych paciorków i 300 μl mieszaniny fenol-chloroform, wirowano w 1-minutowych odstępach dwa lub trzy razy, a następnie wirowano 5 minut w wirówce Eppendorfa, z maksymalną prędkością. Trzysta mikrolitrów fazy wodnej przeniesiono do świeżej rurki i DNA wytrącono 600 μl 100% etanolu (EtOH), a następnie odwirowano przez 10 minut w temperaturze 4°C. Grudki DNA następnie przemyto 500U1 70% EtOH, a następnie odwirowano przez 1 minutę w temperaturze 4°C. Grudki DNA ponownie zawieszono w 30 μl H₂O.

Transformacji elektrokompetentnych komórek E. coli (MC1061) dokonano z użyciem 5 μl prep drożdżowego DNA i 50 μl komórek MC1061. Komórki poddano impulsom elektrycznym o napięciu 2,0 kV, 25pF i 400 omów (Ω). Po elektroporacji, dodano 600 μl SOC (2% Bacto'Tryptone (Difco, Detroit, MI), 0,5% ekstrakt drożdżowy (Difco), 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4,

104

PL 211 833 B1 mM glukoza). Poddane elektroporacji komórki E. coli powleczono w 200 μl i 50 μl równych ilościach na dwóch płytkach LB AMP (bulion LB (Lennox), 1,8% Bacto Agar (Difco), 100 mg/l Ampicillin). Płytki inkubowano odwrócone przez około 24 godziny, w temperaturze 37°C. Trzy kolonie opornej wobec Ampicillin poddano losowej selekcji i poddano analizie sekwencji insertu. DNA plazmidu na wielką skalę wyizolowano z klonu o potwierdzonej sekwencji przy użyciu zestawu Qiagen Maxi (Qiagen) zgodnie z instrukcjami producenta.

B. Konstruowanie mysiego zcytor17Lig (m)-CEE/pZMP21

Skonstruowano również plazmid ekspresji zawierający cały polinukleotyd kodujący mysi zcytor17Lig-CEE (SEQ ID nr: 104 i SEQ ID nr: 105), poprzez rekombinację homologiczną, przy użyciu metody opisanej w przykładzie 33A powyżej. Użytymi starterami były:

(1) ZC41643 (SEQ ID nr: 106) (zgodny, 5' do 3' sensowny) mający wektor o 28bp zachodzący na punkt insercji 5'; 21 bp końca 5' zcytor17lig (m) i (2) ZC41641 (SEQ ID nr: 107) (odwrotny, 5' do 3' antysensowny) mający wektor o 37bp zachodzący na punkt insercji 3'; kodon przestankowy o 3 bp; C-terminalny znacznik EE o 21 bp; 24 bp końca 3' zcytor17Lig(m)-CEE.

Plazmid nazwano zcytor17lig(m)-CEE/pZMP21. Sekwencję polinukleotydową zcytor17lig(m)-CEE pokazano na SEQ ID nr: 104 i odpowiedni polipeptyd sekwencja pokazano na SEQ ID nr: 105.

P r z y k ł a d 34

Transfekcja i ekspresja polipeptydów zcytor17lig-CEE

A. Ekspresja ludzkiego zcytor17lig-CEE/pZMP21 w komórkach 293T

Zcytor17Lig-CEE poddano krótkotrwałej ekspresji w komórkach 293T (Stanford University School of Medicine, Stanford, CA, ATCC (SD-3515)), aby wytworzyć początkowe, oczyszczono białko. W dniu przed transfekcja, komórki 293T posiano w ilości 6,5 x 10⁴ komórek/cm² w 30 kolbach do hodowli tkankowej T162 o całkowitej objętości 30 ml pożywki hodowlanej (SL7V4 + 5% FBS + 1% Pen/strep) na kolbę. Komórki pozostawiono do inkubacji na 24 godziny w temperaturze 37°C.

Mieszaninę DNA/Liposome wytworzono jak następuje: dwie 50 ml stożkowe rurki napełniono 25 ml pożywek do transfekcji (SL7V4 +1% Pen/strep) i do każdej dodano 1,13 mg zcytor17Lig-CEE/pZMP21 (przykład 33). Oddzielny zbiór dwóch 50 ml stożkowych rurek napełniono 22 ml pożywek do transfekcji (powyżej) i do każdej dodano 3 ml liposomów (Lipofectamine, Gibco). Dla każdego zbioru rurek, jedną rurkę DNA dodano do jednej rurki z liposomami i mieszankę DNA/liposomy inkubowano przez 30 minut. Dwie 50 ml stożkowe rurki zawierające mieszaninę DNA/liposomy zlano (około 100 ml) i 300 ml dodano pożywki do transfekcji.

kolb z komórkami 293T zdekantowano, przemyto 1 x około 15 ml PBS i do każdej kolby dodano 12,5 ml rozcieńczonej mieszaniny DNA/liposomy. Kolby inkubowano przez 3 godziny w temperaturze 37°C. Po okresie inkubacji, 25 ml pożywki hodowlanej (powyżej) dodano do każdej kolby T162. Pożywkę transfekcyjną zbierano po około 96 godzinach i użyto dla oczyszczania białka (przykład 35).

B. Ekspresja ludzkiego zcvtorl71ig-CEE/pZMP21 w komórkach BHK

Pełnej długości białko zcytor17Lig wytworzono w komórkach BHK transfekowanych zcytor17Lig-CEE/pZMP21 (patrz przykład 33 powyżej). Komórki BHK 570 (ATCC CRL-10314) powleczono w kolbach do hodowli tkankowej T75 i pozostawiono do wzrostu do około 50 do 70% konfluencji, w temperaturze 37°C, 5% CO2, w pożywce wzrostowej (SL7V4, 5% FBS, 1% pen/strep). Komórki następnie transfekowano zcytor17Lig-CEE/pZMP21 za pośrednictwem transfekcji liposomami (przy użyciu LipofectamineTM; Life Technologies), w pożywce pozbawionej surowicy (SF) (SL7V4). Plazmid (16 g) rozcieńczono do 1,5 ml rurek, do całkowitej końcowej objętości wynoszącej 640 μl z pożywkami SF. Trzydzieści pięć mikrolitrów mieszaniny lipidów wymieszano z 605 μl pożywki SF i uzyskaną mieszaninę pozostawiono do inkubacji na około 15 minut, w temperaturze pokojowej. Następnie do mieszaniny DNA:lipid dodano pięć mililitrów pożywek SF. Komórki przepłukano raz 10 ml PBS, PBS zdekantowano i dodano mieszaninę DNA:lipid. Komórki inkubowano w temperaturze 37°C przez pięć godzin, następnie do każdej płytki dodano 15 ml pożywek (SL7V 4,5% FBS, 1% pen/strep). Płytki inkubowano w temperaturze 37°C przez noc i mieszaninę DNA:pożywka lipidowa ponownie umieszczono z pożywkami wybiórczymi (SL7V 4,5% FBS, 1% pen/strep, 1/tM metotreksatu), następnego dnia. Około 10 dni po transfekcji, kolonie oporne wobec metotreksatu z kolby transfekcyjnej T75, poddano działaniu trypsyny i komórki zlano i powleczono w kolbie T-162 i przeniesiono do hodowli na wielką skalę.

PL 211 833 B1

105

C. Ekspresja mysiego zcvtor17lig-CEE (m)/pZMP21 w komórkach 293T

Wywołano krótkotrwałą ekspresję mysiego zcytor17lig (m)-CEE w komórkach 293T, jak opisano w przykładzie 34A i hodowano pożywkach użytych dla oczyszczania białka (przykład 35).

P r z y k ł a d 35

Oczyszczanie Zcytor17lig-CEE z komórek 293T

O ile nie zapisano inaczej, wszystkie operacje prowadzono w temperaturze 4°C. Wykorzystano następującą procedurę do oczyszczenia zarówno mysiego, jak i ludzkiego Zcytor17lig zawierającego C-terminalny znacznik Glu-Glu (EE) (SEQ ID nr: 103). Oczyszczono kondycjonowaną pożywkę z komórek 293T wykazujących ekspresję Zcytor17lig-CEE (przykład 34). Całkowite docelowe stężenia białek w kondycjonowanej pożywce określono poprzez SDS-PAGE i analizę Western Blot z przeciwciałem anty-EE.

5,5 ml kolumnę anty-EE Poros 50 A (PE BioSystems, Framingham, MA) (wytworzoną jak opisano poniżej) wylano do szklanej kolumny Waters AP-1, 1 cm x 7 cm (Waters, Milford, MA). Kolumnę upakowano przez przepływ i zrównoważono na Bio-Cad Sprint (PE BioSystems, Framingham, MA) za pomocą solanki boforowanej fosforanem (PBS) pH 7,4. Kondycjonowaną pożywkę wyregulowano NaCl do 0,3 M i pH wyregulowano do 7,2. Kondycjonowaną pożywkę następnie załadowano na kolumnę na noc z prędkością przepływu około 3 ml/minutę. Kolumnę przemyto 10 objętości kolumny (CV) PBS pH 7,4, i ponownie przemyto 3 CV 5 x Sigma PBS pH 7,4. Wymywano ja etapami 0,5 M octan, 0,5 M NaCl, pH 2,5 z prędkością 3 ml/minutę. Rurki z frakcjami zawierały 1 ml Tris zasada (brak regulacji pH) do natychmiastowego zobojętnienia płynu z wymywania. Kolumnę ponownie przemyto 2 CV 5 x Sigma PBS, pH 7,4 do zobojętnienia kolumny i następnie zrównoważono w PBS (pH 7,4). Dwa ml frakcji zbierano przez całą chromatografię wymywania i monitorowano absorbancje przy 280 i 215 nM; zbiory przejścia i przemywania również zachowano i zanalizowano. Frakcje pikowe 5 x PBS i wymywania kwasem zanalizowano pod względem docelowego białka, poprzez SDS-PAGE z barwieniem Silver i Western Blotting z pierwszorzędowym przeciwciałem anty-EE i drugorzędowym antymysim przeciwciałem sprzężonym z HRP. Badane frakcje wymywanie kwasem zlano i zatężono od 38 ml do 0,8 ml przy użyciu spinowego urządzenia do zatężania z błoną odcięcia ciężaru cząsteczkowego 5000 Dalton (Millipore, Bedford, MA), zgodnie z instrukcjami producenta.

Aby oddzielić Zcytor17lig-CEE od nagromadzonego materiału i jakiegokolwiek innego zanieczyszczającego przy współoczyszczaniu białka, zlane, zatężone frakcje poddano chromatografia żelowej na kolumnie 1,6 x 60 cm (120 ml) Superdex 75 (Pharmacia, Piscataway, NJ) zrównoważonej i załadowanej w PBS przy prędkości przepływu wynoszącej 1,0 ml/min, przy użyciu a BioCad Sprint. Trzy ml frakcji zebrano przez całą chromatografię i monitorowano absorbancje przy 280 i 215 nM. Frakcje pikowe charakteryzowano poprzez SDS-PAGE z barwieniem Silver i zlano tylko najczystsze frakcje. Ten materiał przedstawiał oczyszczone białko Zcytor17lig-CEE.

Na Western Blotted, żelach SDS-PAGE barwionych Coomassie Blue i Silver, Zcytor17lig-CEE był jednym głównym prążkiem. Zatężanie białka oczyszczonego materiału przeprowadzono za pomocą analizy BCA (Pierce, Rockford, IL) i białko było w równej ilości i przechowywano w temperaturze -80°C zgodnie ze standardowymi procedurami.

Aby wytworzyć PorosASO anty-EE, 65 ml objętości łoża Poros ASO (PE Biosystems) przemyto 100 ml wody i następnie 0,1 M trietanolaminą, pH 8,2 (TEA, ICN, Aurora, Ohio), 1 M Na2SO4, pH 8,8 zawierającym 0,02% azydek sodu, przy użyciu modułu kolby z filtrem próżniowym. Roztwór przeciwciała monoklonalnego EE, o stężeniu 2 mg/ml, w objętości wynoszącej 300 ml, mieszano z przemytą żywicą oobjętości wynoszącej 250 ml.

Po całonocnej inkubacji w temperaturze pokojowej, niezwiązane przeciwciało usunięto przez przemycie żywicy 5 objętościami 200 mM TEA, 1 M NaSO4, pH 8,8 zawierającym 0,02% azydek sodu, jak opisano wyżej. Żywicę ponownie zawieszono w 2 objętości TEA, 1 M Na2SO4, pH 8,8 zawierającym 0,02% azydek sodu i przeniesiono do odpowiedniego pojemnika. Dodano trzy ml 25 mg/ml (68 mM) suberynianu disukcynoimidylu (w DMSO dostarczonego przez Pierce, Rockford, IL) i roztwór inkubowano przez trzy godzin w temperaturze pokojowej.

Nieswoiste miejsca na żywicy następnie zablokowano przez inkubację przez 10 min w temperaturze pokojowej z 5 objętościami 20 mM etanolaminy (Sigma, St. Louis, MO) w 200 mM TEA, pH 8,8 przy użyciu modułu kolby z filtrem próżniowym. Żywicę przemyto PBS, pH 7,4, a następnie 0,1 M Glycine, pH 3 i następnie zobojętniono 10 x PBS.

Po przemyciu wodą destylowaną, ostatecznie sprzężoną żywicę anty-EE Poros-A 50 przechowywano w temperaturze 4°C w 20% etanolu.

106

PL 211 833 B1

P r z y k ł a d 36

N-terminalne sekwencjonowanie ludzkiego i mysiego Zcytor17lig

A. N-terminalne sekwencjonowanie ludzkiego Zcytor17lig

Przeprowadzono standardowe, automatyczne N-terminalne sekwencjonowaniae polipeptydu (rozkład Edmana) przy użyciu odczynników od Applied Biosystems. N-terminalną analizę sekwencji przeprowadzono na Model 494 Protein Sequencer System (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). Analizę danych przeprowadzono z użyciem Model 610A Data Analiza System for Protein Sequencing, wersja 2.1a (Applied Biosystems).

Zapewniono oczyszczoną próbkę ludzkiego zcytor17lig-CEE (przykład 35). Próbkę załadowano na przygotowany filtr z włókna szklanego, dla sekwencjonowania N-terminalnego. Filtr z włókna szklanego wytworzono przez wstępną cykliczną obróbkę z użyciem Biobrene™.

N-terminalna analiza sekwencji wydzielonego ludzkiego polipeptydu zcytor17lig nie zweryfikowała przewidywanego miejsca rozszczepienia sekwencji sygnałowej, lecz dała dojrzały start na reszcie 27 (Leu) na SEQ ID nr: 2 ludzkiej prekursorowej sekwencji zcytor17lig.

B. N-terminalne sekwencjonowanie mysiego Zcytor17lig

Przeprowadzono standardowe, automatyczne, N-terminalne sekwencjonowanie polipeptydu (rozkład Edmana) przy użyciu odczynników od Applied Biosystems. N-terminalną analizę sekwencji przeprowadzono na Model 494 Protein Sequencer System (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). Analizę danych przeprowadzono z użyciem Model 610A Data Analysis System for Protein Seąuencing, wersja 2.1a (Applied Biosystems). Oczyszczoną próbkę mysiego zcytor17lig-CEE dostarczono jak wychwycone na Protein G Sepharose/paciorki anty-EE (przykład 35). Paciorki umieszczono w redukującym buforze SDS PAGE dla próbek i na łaźni z gotująca wodą, przed uruchomieniem na SDS PAGE, przy użyciu układu Novex SDS PAGE (4-12% Bis-Tris MES NuPAGE; Invitrogen) zgodnie z instrukcjami producenta. Żel poddano elektrotransferowi na błonę Novex PVDF (Invitrogen) i wybarwiono Coomassie Blue (Sigma, St. Louis, MO) przy użyciu standardowej metody. Przeprowadzono odpowiednie Western blots anty-EE w celu identyfikacji prążka zcytor17lig do N-terminalnego sekwencjonowania białka. Użyto mysiego przeciwciała anty-EE IgG sprzężonego z HRP, wytworzonego na miejscu.

N-terminalna analiza sekwencji wydzielonego mysiego polipeptydu zcytor17Hg zweryfikowała przewidywane miejsce rozszczepienia sekwencji sygnałowej, dając dojrzały start przy 31 (Ala) w odniesieniu do SEQ ID nr: 11 i SEQ ID nr: 91 mysiej prekursorowej sekwencji zcytor17lig.

P r z y k ł a d 37

Test wiązania komórek COS

Testu wiązania użyto do przetestowania wiązania zcytor17lig z receptorami obejmującymi receptor zcytor17, taki jak receptor zcytor17 lub heterodimery i trimers receptora obejmujące receptor zcytor17 (np. zcytor17/OSMR, zcytorlT/WSX-1 lub zcytor17/OSMR/WSX-1, lub inne podjednostki receptora cytokin klasy I). DNA plazmidu receptora zcytor17 transfekowano do komórek COS i transfekowane komórki COS użyto do oceny wiązania zcytor17lig z receptorami obejmującymi receptor zcytor17, jak opisano poniżej.

A. Transfekcje komórek COS

Transfekcję komórek COS przeprowadzono jak następuje: mieszankę 800 ng DNA plazmidu receptora w następujących kombinacjach: p7p7pX/zcytor17 sam; p7p7Z/WSX-1 sam; p7p7NX/OSMR sam; p7p7pX/zcytor17 + p7p7NX/OSMR; p7p7pX/zcytor17 + p7p7Z/WSX-1; p7p7NX/OSMR + p7p7Z/WSX-1; p7p7pX/zcytor17 + p7p7NX/OSMR + p7p7Z/WSX-1) i 4 μl Lipofectamine w 80 μl pozbawionych surowicy pożywkach DMEM (55 mg pirogronian sodu, 146 mg L-glutaminy, 5 mg transferyny, 2,5 mg insuliny, 1 μg selenu i 5 mg fetuiny w 500 ml DMEM), inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut i następnie dodać 320 μl pozbawionych surowicy pożywek DMEM. Dodać tę 400 μl mieszaninę do 2 x 10⁵ komórek COS/studzienkę powleczonych na 12-studzienkowej płytce do hodowli tkankowej (powleczonej fibronektyną) i inkubować 5 godzin w temperaturze 37°C. Dodać 500 μl pożywki DMEM z 20% FBS (100 ml FBS, 55 mg pirogronian sodu i 146 mg L-glutaminy w 500 ml DMEM) i inkubować przez noc.

B. Test wiązania

Test wiązania przeprowadzono jak następuje: z pożywki wypłukano komórki za pomocą PBS + 0,1% BSA i następnie komórki zablokowano przez 60 minut tym samym roztworem. Komórki następnie inkubowano przez 1 godzinę w PBS + 0,1% BSA z 1,0 μg/ml oczyszczonego białka zcyPL 211 833 B1

107 tor17ligCEE. Komórki następnie przemyto PBS + 0,1% BSA i inkubowano przez drugą godzinę z rozcieńczonym 1:1000 mysim przeciwciałem anty-GluGlu. Ponownie komórki przemyto PBS + 0,1% BSA, następnie inkubowano przez 1 godzinę z rozcieńczonym 1:200 antymysim przeciwciałem sprzężonym z HRP.

Pozytywne wiązanie wykrywano odczynnikiem tyramidkiem fluoresceiny rozcieńczonym 1:50 w buforze do rozcieńczania (zestaw NEN) i inkubowano przez 4-6 minut i przemywano PBS + 0,1% BSA. Komórki utrwalano przez 15 minut z użyciem 1,8% Formaldehyde w PBS, następnie przemywano PBS + 0,1% BSA. Komórki zabezpieczono za pomocą Vectashield Mounting Media (Vector Labs Burlingame, CA) rozcieńczonych 1:5 w PBS. Komórki uwidoczniono przy użyciu filtru FITC w mikroskopie fluorescencyjnym.

Pozytywne wiązanie wykrywano dla komórek transfekowanych tylko zcytor17, zcytor17 + OSMRbeta, zcytor17 + WSX-1 i zcytor17 + OSMRbeta + WSX-1. Brak wiązania wykrywano dla komórek transfekowanych WSX-1 + OSMRbeta, tylko OSMRbeta lub tylko WSX-1.

P r z y k ł a d 38

Mysi zcytor17lig aktywuje mysi receptor zcytor17 /OSMRbeta w teście lucyferazy

A. Klonowanie pełnej długości mysiego zcytor17 i mysiego OSMRbeta dla ekspresji

Mysie biblioteki cDNA jąder przesiano pod względem pełnej długości klonu mysiego zcytor17. Bibliotekę powlekano w ilości 65500 cfu/płytkę, na 24 płytkach LB + Amp. Podniesione filtry wytworzono przy użyciu Hybond N (Amersham-Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ) na łącznie około 1,6 miliona kolonii. Filtry zaznaczano gorącą igłą dla orientacji i następnie denaturowano przez 6 minut w 0,5 M NaOH i 1,5 M Tris-HCl, pH 7,2. Filtry następnie zobojętniono w 1,5 M NaCl i 0,5 M Tris-HCl, pH 7,2 przez 6 minut. DNA przymocowano do filtrów przy użyciu urządzenia do sieciowania w świetle UV (Stratalinker (3), Stratagene, La Jolla, CA) z energią 1200 dżuli. Filtry następnie pozostawiono do wyschnięcia przez noc w temperaturze pokojowej.

Następnego dnia, filtry wstępnie przemyto w temperaturze 65°C w buforze do wstępnego przemywania, zawierającym 0,25 x SSC, 0,25% SDS i 1 mM EDTA. Resztki komórkowe usunięto ręcznie przy użyciu Kimwipes^® (Kimberly-Clark) i roztwór wymieniano 3 razy przez okres 1 godziny. Filtry osuszono na powietrzu i przechowywano w temperaturze pokojowej do użycia. Filtry następnie wstępnie hybrydyzowano przez około 3 godziny w temperaturze 63°C, w 20 ml ExpressHyb™ Hybrydyzation Solution (Clontech, Palo Alto, CA).

Sondę B (przykład 31) wytworzono za pomocą PCR, z ludzkiej matrycy zcytoR17, przy użyciu starterów oligonukleotydowych ZC27,895 (SEQ ID nr: 20) i ZC28,917 (SEQ ID nr: 83) i radioaktywnie wyznakowano ³²P przy użyciu dostępnego w handlu zestawu (Megaprime DNA Labeling System; Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) zgodnie z instrukcjami producenta. Sondę oczyszczono przy użyciu kolumny Stratagene™ push (kolumna NucTrap^®); Stratagene, La Jolla, CA). Sondę denaturowano w temperaturze 100°C przez 15 minut i dodano do ExpressHyb. Filtry hybrydyzowano w 15 ml roztworu hybrydyzacyjnego zawierającego 1,6 x 10 cpm/ml sondy, w temperaturze 63°C, przez noc. Filtry przemyto w temperaturze 55°C, w 2 x SSC, 0,1% SDS i 1 mM EDTA i poddano ekspozycji wobec błony rentgenowskiej w temperaturze -80°C, przez 4 1/2 dnia. Trzynaście pozytywów zebrano z płytek w postaci czopów i umieszczono w 1 ml LB + amp w 1,7 ml rurkach. Rurki umieszczono w temperaturze 4°C przez noc. Te 13 pozytywów poddano dwóm następnym okrążeniom oczyszczania. Trzeciorzędowe płytki wyhodowano w temperaturze 37°C po pobraniu kolonii podniesionych z filtra i zebrano pojedyncze kolonie i wysłano do sekwencjonowania. Trzy z nich określono jako zawierające sekwencję mysiego ortologa zcytoR17.

Ponadto, wytworzono produktu PCR przy użyciu cDNA CTLL-2 jako matrycy i oligonukleotydów ZC38,239 (SEQ ID nr: 108) i ZC38,245 (SEQ ID nr: 109) jako starterów. CTLL-2 jest mysią linią komórkową cytotoksycznych limfocytów T (ATCC nr TIB-214). Tę reakcję PCR uruchomiono jak następuje: 1 cykl w temperaturze 95°C przez 1 minutę, 30 cykli w temperaturze 95°C przez 15 sekund, 68°C przez 3 minuty, następnie 68°C przez 10 minut; 4°C nasycanie. Reakcja PCR wykorzystywała około 0,5 ng cDNA, 20 pmoli każdego oligonukleotydu i 1 pl mieszanki polimerazy Advantage II (ClonTech). Około 6% produktu PCR użyto jako matrycę w nowej reakcji PCR, jak powyżej, z wyjątkiem oligonukleotydów ZC38,239 (SEQ ID nr: 108) i ZC38,238 (SEQ ID nr: 110). Tę reakcję PCR uruchomiono jak następuje: 30 cykli w temperaturze 94°C przez 45 sekund, 65°C przez 45 sekund, 72°C przez 1 minutę, następnie 72°C przez 7 minut; 10°C nasycenie. Większość reakcji PCR załadowano na 1,0% żel agarozowy i wycięto dominujący prążek o około 360 bp, fragment DNA eluowano i przeprowadzono sekwencjonowanie DNA.

108

PL 211 833 B1

Sekwencja mysiego polinukleotydu zcytor17 jest ukazana na SEQ ID nr: 111 i odpowiadająca sekwencja aminokwasową ukazana jest na SEQ ID nr: 112. Ponadto, skrócona postać rozpuszczalnego mysiego polinukleotydu zcytor17 jest pokazana na SEQ ID nr: 113 i odpowiadająca sekwencja aminokwasowa ukazana jest na SEQ ID nr: 114.

Aby otrzymać pełnej długości cDNA mysiego OSMRbeta, wyizolowano produkty PCR 5'i 3' i połączono przy użyciu wewnętrznego miejsca BamHI. Startery PCR zaprojektowano przy użyciu sekwencji nukleotydowej SEQ ID nr: 119 i obejmują EcoRI i Xbal miejsca restrykcyjne dla celów klonowania. Sekwencję genomowego kwasu nukleinowego mysiego OSMRbeta pokazano na SEQ ID nr: 119, w którym sekwencja kodująca obejmuje reszty 780 do 3692 kodujące polipeptyd mysiego OSMRbeta o 970 aminokwasach, który pokazano na SEQ ID nr: 120. Zdegenerowaną sekwencję kwasu nukleinowego, która koduje polipeptyd z SEQ ID NO: 120 pokazano na SEQ ID nr: 121.

Produkt PCR 5' wytworzono przy użyciu biblioteki cDNA miejscowego 3T3-L1 (zróżnicowane mysie komórki tłuszczowe) jako matrycy i oligonukleotydów ZC41,764 (SEQ ID nr: 115) i ZC41,598 (SEQ ID nr: 116) jako starterów. Tę reakcję PCR 5' uruchomiono jak następuje: 30 cykli w temperaturze 95°C przez 45 sekund, 55°C przez 45 sekund, 72°C przez 1 minutę 30 sekund, następnie 72°C przez 7 minut; 4°C nasycenie. Reakcja PCR wykorzystywała około 3 μg plazmidu wytworzonego z biblioteki cDNA, 20 pmoli każdego oligonukleotydu i pięć jednostek polimerazy DNA Pwo (Roche). Około 90% produktu PCR 5' trawiono EcoRI i BamHI i oczyszczono na 1,0% żelu agarozowym. Prążek o około 1446 bp wycięto i użyto do ligacji (patrz poniżej).

Produkt PCR 3' wytworzono przy użyciu miejscowej biblioteki cDNA mysiego łożyska, jako matrycy i oligonukleotydów ZC41,948 (SEQ ID nr: 117) i ZC41,766 (SEQ ID nr: 118) jako starterów. Tę reakcję PCR 3' uruchomiono jak następuje: 30 cykli w temperaturze 95°C przez 45 sekund, 55°C przez 45 sekund, 72°C przez 1 minutę 30 sekund, następnie 72°C przez 7 minut; 4°C nasycenie. Reakcja PCR wykorzystywała około 3 μg plazmidu wytworzonego z biblioteki cDNA, 20 pmoli każdego oligonukleotydu i pięć jednostek polimerazy DNA Pwo (Roche). Około 90% produktu PCR 3' trawiono BamHI i Xbal i oczyszczono na 1,0% żelu agarozowym. Prążek o około 2200 bp wycięto i użyto do ligacji razem z produktem PCR 5' (opisanym powyżej), z wektorem ekspresji pZP-5Z trawionym EcoRI i Xbal. Trzyczęściową ligację przeprowadzono za pomocą EcoRI 5' do fragmentu BamHI powyżej, BamHI 3' do fragmentu Xbal i wektora ekspresji pZP-5Z trawionego EcoRI i Xbal. Ten wytworzony plazmid pZP-5Z zawierający pełnej długości cDNA dla mysiego OSMRbeta (nukleotydy 780 do 3692 z SEQ ID nr: 119), oznaczono pZP-5Z/OSMRbeta. Pełnej długości cDNA mysiego OSMRbeta w pZP5Z/OSMRbeta posiada dwie insercje aminokwasowe z SEQ ID nr: 120. W pozycji 370 występuje podwojenie aminokwasu glicyny i podwojenie aminokwasu kwasu glutaminowego w pozycji 526. Plazmid pZP-5Z jest ssaczym wektorem ekspresji zawierającym kasetę ekspresji mającą promotor CMV, wielokrotne miejsca restrykcji dla insercji sekwencji kodujących i terminator ludzkiego hormonu wzrostu. Plazmid posiada również początek replikacji E. coli, ugrupowanie ekspresji ssaczego markera selekcji mającego promotor SV40, element wzmacniający i początek replikacji, gen oporności na zeocynę i terminator SV40. Uzyskane transformanty sekwencjonowano aby potwierdzić sekwencje cDNA mysiego OSMRbeta.

B. Konstruowanie linii komórkowych BaF3/KZ134/zcytor17m, BaF3/KZ134/zcvtor17m/-OSMRbetam, BHK/KZ134/zcetor17ms i BHK/KZ134/zcvtor17m/OSMRbetam

Stabilne linie komórkowe BaF3/KZ134 i BHK/KZ134 (przykład 20) transfekowano plazmidem ekspresji kodującym pełnej długości mysie zcytor17, pZP-7P/zcytor17m (przykład 38A), aby utworzyć komórki BaF3/KZ134/zcytor17m i BHK/KZ134/zcytor17m, odpowiednio. Następnie, plazmid ekspresji mysiego OSMRbeta, pZP-5Z/OSMRbetam (przykład 38A), transfekowano do tych komórek z utworzeniem linii komórkowych BaF3/KZ134/zcytor17m/OSMRbetam i BHK/KZ134/zcytor17m/OSMRbetam, odpowiednio. Metody były takie jak opisano w przykładzie 4 z wyjątkiem, że Baf3/KZ134/zcytor17m i BHK/KZ134/zcytor17m poddano selekcji z, oprócz Geneticin, 2 μg/ml puromycyny podczas gdy Baf3/KZ134/zcytor17m/OSMRbetam i BHK/KZ134/zcytor17m/OSMRbetam poddano selekcji z, oprócz Geneticin, 2 μg/ml puromycyny i 200 μg/ml zeocyny.

Klony rozcieńczono, powleczono i poddano selekcji przy użyciu standardowych technik. Klony przesiano w teście lucyferazy (patrz przykład 20, powyżej) przy użyciu kondycjonowanej pożywki mysiego zcytor17lig lub oczyszczono mysiego białka zcytor17lig (przykład 35) jako induktora. Wybrano klony z najwyższą reakcją z lucyferazą (poprzez lucyferazę STAT) i najniższym tłem. Wybrano stabilne linie komórkowe transfektantów.

PL 211 833 B1

109

C. Mysi Zcytor17lig aktywuje mysi receptor zcytor17 w teście lucyferazy BaF3/KZ134/zcytor17m/OSMRbetam lub BHK/KZ134/zcvtor17m/OSMRbetam

Linie komórkowe powleczono do testów lucyferazy jak opisano w przykładzie 20 powyżej. Oceniano aktywację STAT komórek BaF3/KZ134/Zcytor17m, BaF3/KZ134/zcytor17m/OSMRbetam, BHK/KZ134/zcytor17m lub BHK/KZ134/zcytor17m/OSMRbetam, przy użyciu:

(1) kondycjonowanej pożywki z komórek BHK570 transfekowanych ludzkim zcytor17lig (przykład 7), (2) kondycjonowanej pożywki z komórek BHK570 transfekowanych mysim zcytor17lig (przykład 18), (3) oczyszczonego mysiego i ludzkiego zcytor17lig (przykład 35) i (4) pożywek pozbawionych mIL-3 do pomiaru odpowiedzi kontrolnych tylko pożywek.

Testy lucyferazy przeprowadzono jak opisano w przykładzie 20.

Wyniki tego testu potwierdzają odpowiedź reportera STAT komórek BaF3/KZ134/zcytor17m/OSMRbetam i BHK/KZ134/zcytor17m/OSMRbetam wobec mysiego zcytor17lig w porównaniu albo z komórkami BaF3/KZ134/zcytor17m, komórkami BHK/KZ134/zcytor17m albo nie transfekowanymi kontrolnymi komórkami BaF3/KZ134 lub BHK/KZ134 i ukazują, że w reakcji pośredniczy mysi receptor zcytor17/OSMRbeta. Wyniki również ukazują, że ludzki zcytor17lig nie aktywuje testu reportera STAT przez kompleks mysiego receptora.

P r z y k ł a d 39

Wiązanie ludzkiego zcytor17lig z zcytor17 i zcytor17/OSMRbeta za pomocą cytometrii przepływowej

Biotynylowania ludzkiego zcytor17L dokonano jak następuje: 100 pl zcytor17 w ilości 5,26 mg//mL połączono z 30 pl 10 mg/ml biotyny EZ-link Sulfo-NHS-LC- (Pierce, Rockford, IL) rozpuszczonej w ddH2O. Ten roztwór inkubowano na kołysce przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po biotynylacji roztwór dializowano w PBS przy użyciu kasety do dializy Slide-A-Lyzer. Do testowania właściwości wiązania ludzkiego zcytor17lig z różnymi kombinacjami receptora, zarówno komórki BHK, jak i BAF3 transfekowano z użyciem plazmidów ekspresji, stosując standardowe techniki, dobrze znane w dziedzinie. Te plazmidy transfekowano do obu linii komórkowych w następujących kombinacjach: zcytor17 sam, OSMRbeta sam i oba zcytor17 i OSMRbeta. Transfekcję przeprowadzono jak wyszczególniono powyżej.

Nie transfekowane komórki BHK i BAF3 użyto jako kontroli. Komórki wybarwiono za pomocą FACS jak następuje: komórki 2E5 wybarwiono albo z użyciem: 2,0 pg/ml, 100 ng/ml, 10 ng/ml, 1,0 ng/ml, 100 pg/ml, 10 pg/ml, 1,0 pg/ml biotynylowanego zcytor17L lub pozostawiono niewybarwione przez 30 minut na lodzie w buforze FACS (PBS + 2% BSA + 2% NHS (Gemini) + 2% NGS). Komórki przemyto 1,5 raza i następnie wybarwiono SA-PE (Jackson Immuno Laboratories) w stosunku 1:250 przez 30 minut na lodzie.

Komórki następnie przemyto 1,5 raza buforem FACS i ponownie zawieszono w buforze FACS i zanalizowano za pomocą FACS na urządzeniu BD FACSCaliber przy użyciu programu CellQuest (Becton Dickinson, Mountain View, CA).

Zarówno komórki BHK, jak i BAF3 pokazały, że zcytor17lig wiązał się z samym zcytor17 i w kombinacji z OSMRbeta, przy czym wiązanie z heterodimerom zcytor17/OSMRbeta jest nieco silniejsze. Brak wiązania był widoczny w każdej linii komórkowej z ekspresją samego OSMRbeta. zcytor17lig wiązał w sposób zależny od stężenia. Średnie wartości intensywności fluorescencj! (MFI) dla wiązania BHK są ukazane poniżej, w tablicy 15.

T a b l i c a 15

zcytor17	2,0	0,10	0,01	0,00	0, 000	0,0000	0,00000	0,0
pg/ml		0	0	1	1	1	1
BHK C17 + OSMRbeta	3780	2126	328	53	17	15	14	13
BHK-C17	3032	1600	244	39	16	15	14	15
BHK-OSMRbeta	13	X	X	X	X	X	X	0
BHK-WT	15	14	13	X	X	X	X	13

110

PL 211 833 B1 cd. tablicy 15

zcytor17/pg/mL	10,0	3,33	1,11	0,37	0,12	0,04	0,00
BAF3-C17 + OSMRbeta	531	508	489	441	364	247	7
BAF3-OSMRbeta	6	5	5	5	5	5	11
BAF3-WT	13	13	12	12	12	12	13

zcytor17 ng/mL	100,0	10,0	1,0	0,0
BAF3-C17	347	72	17	7

P r z y k ł a d 40

Analiza szeregowa ekspresji genu komórek potraktowanych ludzkim Zcytor17lig

RNA wyizolowano z komórek A549 potraktowanych ludzkim zcytor17lig, komórek SK-LU-1 potraktowanych zcytor17lig i nietraktowanych komórek kontrolnych przy użyciu RNeasy Midi Kit (Qiagen, Valencia, CA) zgodnie z instrukcjami producenta.

Profilowanie ekspresji genu komórek potraktowanych zcytor17lig i odpowiadających komórek kontrolnych, prowadzono przy użyciu szeregów ekspresji cDNA GEArray serii Q (SuperAr-ray Inc., Bethesda, MD). Szeregi ekspresji cDNA Q Series zawierają do fragmentów 96 cDNA związanych ze swoistym szlakiem biologicznym lub geny o podobnych funkcjach lub cechach strukturalnych. Porównanie szeregów z komórek potraktowanych i kontrolnych pozwala na określenie regulacji w górę i w dół swoistych genów. Znakowanie sondą, hybrydyzację i detekcję prowadzono zgodnie instrukcjami producenta. Detekcję sygnału chemiluminescencji i akwizycję danych prowadzono na stanowisku LumiImager (Roche, Indianapolis, IN). Uzyskane dane dla obrazu zanalizowano przy użyciu ImageQuant 5,2 (Amersham Biosciences, Inc., Piscataway, NJ) i programu GEArray Analyzer 1,2 (SuperArray Inc., Bethesda, MD).

Analiza wyników z szeregów HS-014N serii Q Human Interleukin and Receptor wykazała, po znormalizowaniu, przybliżone 4,7-krotne zwiększenie sygnału IL13RA2 w komórkach SK-LU-1 potraktowanych ludzkim zcytor17lig i przybliżone 2,2-krotne zwiększenie sygnału IL13RA2 w komórkach A549 potraktowanych ludzkim zcytor17lig.

Te wyniki pokazują, że zcytor17lig znacząco regulował w górę IL13RA2 w komórkach SK-LU-1 i A549. Obie są ustalonymi liniami komórkowymi otrzymanymi od ludzkiego raka płuc (Blobel i in., Virchows Arch B Cell Pathol. Incl. Mol. Pathol., 1984; 45 (4): 407-29). Konkretniej, A549 jest scharakteryzowana jako linia komórkowa ludzkiego nabłonka płuc (Lin i in., J Pharm Pharmacol., wrzesień 2002; 54 (9): 1271-8; Martinez i in., Toxicol. Sci., 2002 pażdziernik 69 (2): 409-23).

Interleukina-13 (IL13), cytokina wydzielana przez aktywowane limfocyty T, okazała się być zarówno konieczna jak i wystarczająca dla ekspresji alergicznej astmy i dla stosowania w doświadczalnych modelach astmy, które obejmują nadwrażliwość dróg oddechowych, rekrutację eozynofilów i nadmierną produkcję śluzu (Wills-Karp i in., Science, 1998; 282: 2258-2261). Wykazano, że selektywne zobojętnianie IL13 złagodzi fenotyp astmy (Grunig i in., Science, 1998; 282: 2261-2263). Donoszono również, że IL13 jest zaangażowana w regulację w górę ekspresji genu mucyny MUC8 w nabłonku ludzkiego polipa nosowego i hodowanym nabłonku nosa (Kimm i in., Acta Otolaryngol., 2002; wrzesień; 122 (6): 638-643; Seong i in., Acta Otolaryngol., 2002; czerwiec 122 (4): 401-407). MUC8, główna glikoproteina mucyny dróg oddechowych, jest związana jako pełniąca rolę w patogenezie nadmiernego wydzielania śluzu w przewlekłym zapaleniu zatok z polipami (Seong i in., Acta Otolaryngol., 2002; czerwiec; 122 (4): 401-407).

Czynnościowo, IL13 sygnalizuje przez kompleks receptorowy składający się z łańcucha alfa-1 receptora interleukiny-13 (IL13RA1) i receptora alfa IL-4 (IL4RA) (Daines i Hershey, J. Biol. Chem., 2002; 22 (12): 10387-10393). Wykazano również, że receptor alfa-2 interleukiny-13 (IL13RA2) wiąże IL13 z dużym powinowactwem, lecz tylko ją (Daines i Hershey, J. Biol. Chem., 2002; 22 (12): 10387-10393). Ten receptor nie osiada, jednakże, domeny cytoplazmatycznej koniecznej dla sygnalizacji, a więc jest uważana za receptor wabikowy. Wykazano, że IL13RA2 jest głównie wewnątrzkomórkową cząsteczką, która może być szybko zmobilizowana z zasobów wewnątrzkomórkowych i ulegać ekspresji na powierzchni w następstwie traktowania komórki interferonem (IFN)-gamma. Powierzchniowa

PL 211 833 B1

111 ekspresja IL13RA2 po traktowaniu IFN-gamma nie obejmuje syntezy białka i powoduje zanikającą sygnalizację IL13 (Daines i Hershey, J. Biol. Chem., 2002; 22 (12): 10387-10393).

Wyniki szeregowej analizy ekspresji genu dla zcytor17lig pokazują działanie zcytor17lig jako nowe w stosunku do tego dla IFN-gamma pod tym względem, że traktowanie zcytor17lig linii komórkowych pochodzących z nabłonka płuc powodowało znaczny wzrost ekspresji genu IL13RA2. Tak więc, traktowanie zcytor17lig może być korzystne w przypadku, gdy pożądana jest długoterminowa regulacja w górę ekspresji IL13RA2 i regulacja w dół IL13, tak jak w astmie, nadaktywności dróg oddechowych (AHR) i regulacji mucyny, łącznie z przewlekłym zapaleniem zatok z polipami.

P r z y k ł a d 41

Mysz transgeniczna z mysim zcytor17lig

Aby ocenić wpływ in vivo nadekspresji zcytor17lig, wytworzono wielokrotne założycieli myszy transgenicznych z ekspresją mysiej postaci genu, kierowane przez dwa różne promotory: promotor swoisty dla limfocytu Εμ/lck i powszechny promotor EF1a (przykład 22). Poziom białka surowicy występuje w zakresie od około 20-300 ng/ml. Promotor Ep/lck generował myszy z wyższym poziomem białka surowicy niż te u myszy transgenicznych EF1a-zcytor17lig.

Myszy transgeniczne zcytor17lig rozwinęły fenotyp skóry w wieku około 4-8 tygodni. Futro myszy transgenicznych stało się „zmierzwione”, „z wyraźnym nastroszeniem i łagodną do ciężkiej utratą włosa, zwykle na grzbietach, bokach i wokół oczu”. Ten fenotyp był jednoznacznie znajdowany u myszy z wykrywalnym poziomem białka zcytor17lig w surowicy. Wśród założycieli, zanotowano 100% występowania wśród myszy z ekspresją genu kierowanego Ep/lck i 50% występowania u myszy transgenicznych EF1a-zcytor17lig, co dobrze koreluje z względnym poziomem zcytor17lig, który wykrywano w ich surowicy. Transgeniczna skóra okazała się być swędząca, uwidoczniona przez zachowanie drapania myszy, czasami wystarczająco nadmierne, aby indukować zadrapania i ubytki skóry, które zwykle ulegały zakażeniu (co najmniej Staphylococcus aureus).

Myszy były pierwotnie identyfikowane za pomocą metalowego znacznika usznego, lecz w większości przypadków, znaczniki uszne były siłą usuwane przez same myszy. Prowadziło to często do ciężkiego uszkodzenia ucha zewnętrznego. Te zranione uszy ears często nie goiły się właściwie, co odzwierciedlała obecność długotrwałych krost i strupów i sączące, rozprzestrzeniające się rany rozwijały się u wiele zwierząt, za i pomiędzy uszami. Niektóre myszy transgeniczne również rozwijały zastrupiałe rany na barkach i szyi. Ubytki skórne obserwowano w podzbiorze zwierząt, ogólnie rozwijające się na obszarach skóry gdzie utrata włosa była już widoczna i były często zaostrzone przez drapanie się myszy.

Zastosowano ilościową RT-PCR w czasie rzeczywistym do wykrywania transkryptów RNA zcytor17lig w transgenicznych (ale nie nietransgenicznych) próbkach skóry, przy ekspresji skóry transgenicznej Εμ/lck więcej RNA zcytor17lig niż skóry od myszy transgenicznych EF1a-zcytor17lig. Geny kodujące podjednostki receptora zcytor17, zcytor17 i OSM-Rbeta ulegały ekspresji w skórze zarówno nietransgenicznych, jak i transgenicznych myszy zcytor17lig.

Badanie tkanek limfoidalnych z podzbioru transgenicznych założycieli Ep/lck za pomocą cytometrii przepływowej, ujawniło znanczy wzrost w udziału aktywowanych komórek T w śledzionie i węzłach limfatycznych tych myszy. Dwie na cztery zanalizowane myszy miały poważnie powiększone szyjne węzły limfatyczne, prawdopodobnie z powodu obecności ubytków na szyjach. Obserwowano delikatny wzrost ciężaru śledziony i delikatny wzrost ilości monocytów i neutrofili krążących we krwi myszy transgenicznych. Nie było wzrostu różnych testowanych cytokin, ani nie było zmian w krążącym poziomie amyloidu A surowicy u tych myszy. Wpływ na komórki odpornościowe u myszy transgenicznych może być bezpośrednim lub pośrednim wynikiem zcytor17lig, lub drugorzędowym skutkiem uszkodzeń skóry.

Przeprowadzono histopatologię na wielu tkankach innych niż skóra, łącznie z wątrobą, grasicą, śledzioną, nerką i jądrami i nie zanotowano znaczących zaburzeń w tych narządach. Analiza skóry transgenicznej, jednakże, ujawniła liczne zmiany, które zmieniały się ogromnie w zależności od źródła i położenia skóry (np. normalna, bezwłosa lub uszkodzona). W wielu przypadkach, uszy myszy transgenicznych miały zgrubiały naskórek w porównaniu z nietransgenicznymi kontrolami (np. około 4 warstwy w stosunku do 2 warstw) i tkanki pod spodem zawierały małą do średniej liczby komórek zapalnych, którymi były przede wszystkim jednojądrzaste okazjonalnymi neutrofilami.

Zapalenie skóry na brzuchu pojawiło się wieloogniskowo nieco grubsze u transgenicznych, lecz nie było znacznego wzrostu ilości komórek zapalnych w leżącej pod spodem skórze lub tkance podskórnej. W bezwłosych częściach skóry u tych myszy, występowały rozszerzone pęcherzyki włosowe,

112

PL 211 833 B1 które zawierały nieco resztek, lecz nie trzonów włosa (np. włosy wypadły do korzeni). W obszarach uszkodzonych, miało miejsce zapalenie skóry ze zgrubieniami (akantoza), zwiększona ilość keratyny na powierzchni skóry (hyperkeratoza), rozsiane owrzodzenia różnej wielkości i znaczna liczba komórek zapalnych w skórze właściwej (głównie neutrofili, ze zmienną liczbą makrofagów i limfocytów).

Skóra właściwa zawierała również liczne komórki tuczne na brzegach uszkodzeń. Niektóre z korzeni włosowych w uszkodzonych obszarach skóry transgenicznej były w stadium aktywnym (anagen), w przeciwieństwie do wielu korzeni włosowych w obszarach „normalnych”, które były w stadium inwolucji (katagen) do stadium nieaktywnego (telogen).

Fenotyp myszy transgenicznych zcytor17lig silnie przypomina ten od pacjentów z atopowym zapaleniem skóry (AD) i mysich modeli AD. AD jest powszechną przewlekłą chorobą zapalną, która charakteryzuje się nadaktywowanymi cytokinami helperowego podzbioru 2 komórek T (Th2). Zcytor17lig ulega ekspresji preferencyjnie przez komórki Th2 w stosunku do Th1, co daje dodatkową wiarę temu porównaniu. Chociaż dokładna etiologia AD jest nieznana, wiąże się z nią wiele czynników, łącznie z nadaktywną odpowiedzią odpornościową Th2, autoodpornością, infekcją, alergenami, predyspozycją genetyczną.

Kluczowe cechy choroby obejmują nadmierne rogowacenie (suchość skóry), świąd (swędzenie skóry), zapalenie tkanki łącznej, zapalne uszkodzenia skóry, infekcję Staphylococcus aureus, podwyższony poziom eozynofilów krwi, podwyższenie IgE i IgGl surowicy i przewlekłe zapalenie skóry z naciekanie komóreki T, komórek tucznych, makrofagów i eozynofilów. Kolonizacja lub infekcja S. aureus została rozpoznana jako zaostrzająca AD i przedłużająca tę chorobę skóry.

AD jest często znajdowane u pacjentów z astmą i katarem alergicznym i jest często początkowym przejawem choroby alergicznej. Około 20% populacji w krajach zachodnich cierpi z powodu tych chorób alergicznych, a występowanie AD w krajach rozwiniętych rośnie z nieznanych powodów. AD typowo zaczyna się w dzieciństwie i może często trwać przez dojrzewanie do dorosłości. Aktualne sposoby leczenia AD obejmują miejscowe kortykosteroidy, doustną cyklosporynę A, niesteroidalne środki immunosupresyjne takie jak tacrolimus (FK506 w formie maści) i interferon-gamma. Mimo różnych rodzajów leczenia AD, wiele objawów pacjentów nie poprawia się lub mają oni szkodliwe reakcje na leki, wymagając poszukiwania innych, skutecnziejszych środków leczniczych.

Komórki nabłonka, które wykazują ekspresję heterodimerycznego receptora dla zcytor17lig (zcytor17 i OSM-Rbeta), sa umiejscowione w miejscach (np. skóra, jelito, płuco, itd.) wchodzenia alergenu do ustroju i ulegają interakcji blisko z komórkami dendrytycznymi (wyspecjalizowane komórki prezentujące antygen) in situ. Komórki dendrytyczne pełnią ważną rolę w patogenezie chorób alergicznych i zcytor17lig może ulegać interakcji ze swym receptorem na komórkach nabłonka w skórze płucu i wpływają na odpornościową odpowiedź w tych narządach. Zcytor17lig i jego receptor(y) mogą się więc przyczyniać do patogenezy chorób alergicznych, takich jak AD i astma. Ponadto, fenotyp myszy transgenicznych zcytor17lig sugeruje, że ten ligand może pełnić rolę w gojeniu ran, ponieważ myszy wydają się niezdolne do naprawy uszkodzeń uszu i często noszą długotrwałe uszkodzenia na grzbiecie i bokach. Antagonista zcytor17lig mógłby więc oznaczać żywotny środek terapeutyczny dla tego innych wskazań.

P r z y k ł a d 42

Test lucyferazy na ludzkich transformowanych liniach komórkowych nabłonka poprzez krótkotrwałą infekcję adenowirusowym genem reporterowym STAT/SRE

Rozmaite ludzkie, transformowane linie komórkowe nabłonka (patrz tablica 16 poniżej) posiano w 96-studzienkowych płaskodennych płytkach, w ilości 10000 komórek/studzienkę w normalnych pożywkach wzrostowych, jaki wymieniono dla każdego rodzaju komórki.

Następnego dnia, komórki zakażono adenowirusowa konstrukcją reporterową, KZ136, przy wielokrotności zakażenia wynoszącej 5000. Reporter KZ136 zawiera elementy STAT oprócz do elementu reakcji surowicy. Całkowita objętość wynosiła 100 μl/studzienkę przy użyciu DMEM uzupełnionej mM L-glutaminą (GibcoBRL), 1 mM pirogronianu sodu (GibcoBRL) i suplementem 1 x Insulin-Transferrin-Selenium (GibcoBRL) (dalej określane jako pożywki pozbawione surowicy). Komórki hodowano przez noc.

Następnego dnia, pożywki usunięto i ponownie umieszczono z 100 μl pożywek indukcyjnych. Pożywki indukcyjne były ludzkim zcytor17lig rozcieńczonym w pozbawionej surowicy pożywce w ilości 100 ng/ml, 50 ng/ml, 25 ng/ml, 12,5 ng/ml, 6,25 ng/ml, 3,125 ng/ml i 1,56 ng/ml. Pozytywną kontrolę 20% FBS użyto sprawdzania testu i aby zapewnić powodzenie zakażenia przez adenowirusa. Komórki indukowano przez 5 godzin, w czasie których pożywki aspirowano.

PL 211 833 B1

113

Komórki następnie przemyto w 50 μl/studzienkę PBS i z kolei poddano lizie w 30 μl/studzienkę 1 x buforu do lizy komórkowej (Promega). Po 10-minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej, 25 μl/studzienkę lizatu przeniesiono mętno białej płytki 96-studzienkowej. Płytki następnie odczytywano na Luminometer przy użyciu 5-sekundowej integracji z 40 μl/studzienkę wstrzykniętego substratu lucyferazy (Promega).

Wyniki ujawniły zdolność wielu nabonkowych linii komórkowych do odpowiedzi na zcytor17lig, jak pokazano w tablicy 16, poniżej.

T a b e l a 16

Linia komórkowa	Gatunek	Tkanka	Morfologia	Choroba	Krotność indukcji
A549	Ludzka	Płuco	Nabłonkowa	Rak	2 x
Sk-Lu-1	Ludzka	Płuco	Nabłonkowa	Gruczolak	6 x
WI-38	Ludzka	Płuco zarodka	Fibroblast		Negatywna
MRC-5	Ludzka	Płuco	Fibroblast		Negatywna
DU145	Ludzka	Prostata	Nabłonkowa	Rak	10 x
PZ-HPV-7	Ludzka	Prostata	Nabłonkowa	Transformowana HPV	5 x
PC-3	Ludzka	Prostata	Nabłonkowa	Gruczolakorak	Negatywna
U2OS	Ludzka	Kość	Nabłonkowa	Kostniakomięsak	15,5 x
SaOS2	Ludzka	Kość	Nabłonkowa	Kostniakomięsak	22 x
MG-63	Ludzka	Kość	Fibroblast	Kostniakomięsak	Negatywna
143B	Ludzka	Kość	Fibroblast	Kostniakomięsak	3,5 x
HOS	Ludzka	Kość	Fibroblast i nabłonkowa		8 x
TRBMeC	Ludzka	Naczyniowy szpik kostny	Nab ł onkowa		2 x
HT144	Ludzka	Skóra	Fibroblast	Czerniak	5 x
C32	Ludzka	Skóra		Czerniak	Negatywna
Sk-Mel-2	Ludzka	Skóra	Wielościenna	Czerniak	2,7 x
WM-115	Ludzka	Skóra	Nabłonkowa	Czerniak	2 x
HCT-116	Ludzka	Okrężnica	Nabłonkowa	Rak	Negatywna
HT-29	Ludzka	Okrężnica	Nabłonkowa	Rak	Negatywna
CaCo2	Ludzka	Okrężnica	Nabłonkowa	Gruczolakorak	3 x
HBL-100	Ludzka	Pierś	Nabłonkowa		1.5 x
ME-180	Ludzka	Szyjka	Nabłonkowa	Rak	Negatywna
HeLa 299	Ludzka	Szyjka	Nabłonkowa	Gruczolakorak	Negatywna
SK-N-SH	Ludzka	Mózg	Nabłonkowa	Neuroblastoma	Negatywna
U138 MG	Ludzka	Mózg	Wielościenna	Glejak	Negatywna
Hep02	Ludzka	Wątroba	Nabłonkowa	Rak	Negatywna
Wątroba Chang	Ludzka	Wątroba	Nab ł onkowa		Negatywna
Sk-Hep-1	Ludzka	Wątroba	Nabłonkowa	Gruczolakorak	4 x
Int407	Ludzka	Jelito	Nabłonkowa		Negatywna
3a-Sub E	Ludzka	Łożysko			Negatywna

114

PL 211 833 B1

P r z y k ł a d 43

Wytwarzanie cytokin przez ludzkie nabłonkowe linie komórkowe hodowane z ludzkim zcytor17lig

Ludzkie nabłonkowe linie komórkowe w stanie choroby (A549, ludzki rak nabłonkowy płuca; SkLul, ludzki gruczolakorak nabłonkowy płuca; DU145, ludzki rak nabłonka prostaty; PZ-HPV-7, HPV ludzkiego nabłonka prostaty transformowany; U20S, ludzki kostniakomięsak kości) przesiano pod względem produkcji cytokin w odpowiedzi wobec zcytor17lig in vitro.

Te linie komórkowe posiadały zarówno zcytor17, jak i OSMR-beta, zidentyfikowane przez RT-PCR i odpowiadają na ludzki zcytor17lig, gdy testowano z adenowirusową konstrukcją reportera lucyferazy, KZ136 (przykład 42).

Produkcję cytokin przez te linie komórkowe określono w odpowiedzi na ludzki zcytor17lig w serii trzech doświadczeń.

A. Produkcja cytokin przez ludzkie nabłonkowe linie komórkowe w stanie choroby, hodowane z ludzkim zcytor17lig ₅

Komórki powleczono przy gęstości 4,5 x 10⁵ komórek na studzienkę w 6-studzienkowych płytkach (Costar) i hodowano w odpowiednich pożywkach wzrostowych.

Komórki hodowano odczynnikami testowymi; 100 ng/ml zcytor17lig, 10 ng/ml Interferon gamma (IFN gamma) (R & D Systems, Minneapolis, MN), 10 ng/ml Tumor Necrosis Factor alfa (TNF alpha) (R & D Systems, Minneapolis, MN), 10 ng/ml IL-1beta (R & D Systems, Minneapolis, MN) lub 100 μg//ml Lipopolysaccharide (LPS) (Sigma).

Supernatanty zebrano w 24 i 48 godzinie i testowano pod względem cytokin; GM-CSF (czynnik stymulujący kolonii granulocytów-makrofagów), IL-1b, IL-6, IL-8, MCP-1 (białko-1 przyciągające chemicznie makrofagi) i TNFa.

Multiplex Antibody Bead zestawy od BioSource International (Camarillo, CA) użyto do pomiaru cytokin w próbkach.

Testy odczytywano na instrumencie Luminex-100 (Luminex, Austin, TX) i dane nalizowano przy użyciu programu MasterPlex (MiraiBio, Alameda, CA).

Wytwarzanie cytokin (pg/ml) dla każdej linii komórkowej w 24-godzinnych próbkach pokazano poniżej, w tablicy 17.

T a b l i c a 17 GM-CSF pg/mL

	A549	SkLul	DU145	U20S	PZ-HPV-7
zcytor17L	18,80	10,26	16,19	13,26	14,10
IFN-g	16,19	13,36	11,56	16,26	11,81
IL-1 b	104,60	126,44	76,77	338,25	27,32
TNFa	106,67	33,20	58,50	107,09	33,79
LPS	17,64	10,62	11,81	25,47	18,34
Kontrola	14,81	8,56	13,26	21,67	13,96

IL-1b pg/m

	A549	SkLul	DU145	U20S	PZ-HPV-7
zcytor17L	26,90	30,17	28,77	29,07	28,00
IFN-g	29,07	35,33	21,96	26,90	26,73
IL-1 b	1332,88	1256,17	979,02	1107,35	998,60
TNFa	31,11	33,28	35,33	31,24	25,66
LPS	33,28	28,77	29,07	31,11	31,24
Kontrola	28,77	28,77	26,73	31,24	29,07

PL 211 833 B1

115

IL-6 pg/Ml

	A549	SkLul	DU145	U20S	PZ-HPV-7
zcytor17L	20,09	26,89	193,05	19,37	17,30
IFN-g	17,52	33,64	217,58	27,02	17,63
IL-1 b	175,44	5920,19	2375,29	304,08	18,44
TNFa	354,16	1002,51	1612,17	103,58	18,33
LPC	18,06	35,65	162,18	22,42	17,30
Kontrola	17,63	27,80	71,23	19,32	17,19

IL-8 pg/mL

	A549	SkLul	DU145	U20S	PZ-HPV-7
zcytor17L	86,33	150,81	150,61	45,92	6,81
IFN-g	24,07	72,82	163,31	81,78	1,35
IL-1 b	1726,24	4083,12	4407,79	5308,83	124,17
TNFa	3068,68	3811,75	2539,39	3324,02	69,65
LPS	20,28	167,13	230,39	115,08	7,95
Kontrola	14,92	109,78	107,27	93,44	9,49

MCP-1 pg/Ml

	A549	SkLul	DU145	U20S	PZ-HPV-7
zcytor17L	8,97	187,29	26,84	105,15	7,20
IFN-g	7,30	267,99	17,05	88,68	7,71
IL-1 b	8,11	8039,84	88,78	3723,81	4,70
TNFa	8,50	7100,37	153,26	3826,80	2,80
LPS	9,40	185,83	26,84	61,62	5,61
Kontrola	8,16	167,93	17,05	47,78	5,61

TNFa pg/mL

	A549	SkLul	DU145	U20S	PZ-HPV-7
zcytor17L	16,23	17,52	16,67	15,80	17,09
IFN-g	15,80	17,09	15,80	16,65	15,80
IL-1b	16,66	17,09	15,80	17,95	16,23
TNFa	1639,92	1648,83	2975,07	1348,33	3554,82
LPS	16,87	15,80	15,37	17,09	17,52
Kontrola	16,23	15,80	15,80	17,09	16,66

Wszystkie testowane linie komórkowe wytwarzały GM-CSF i IL-8 w odpowiedzi na stymulację kontrolnymi cytokinami IL-1b i TNFa. Większość linii komórkowych wytwarzała lL-6 i MCP-1 w odpowiedzi na stymulację IL-1b i TNFa. Zcytor17lig stymulował produkcję IL-6 w linii komórkowej DU145, w porównaniu z kontrolą (193 pg/ml przeciwko 71 pg/ml). Zcytor17lig stymulował 3 z 5 linii komórkowych z utrzworzeniem IL-8 z największym skutkiem widocznym w komórkach A549 (5 krotnych) i redukował produkcję IL-8 w komórkach U2OS do 2-krotnej. Wystąpił niewielki wpływ na produkcję MCP-1 przez komórki DU145 i U2OS, gdy hodowano je z zcytor17lig.

116

PL 211 833 B1

B. Wytwarzanie cytokin przez normalne, ludzkie, nabłonkowe linie komórkowe hodowane z ludzkim zcytor17lig

Oprócz ludzkich nabłonkowych linii komórkowych, testowano również normalne ludzkie komórki nabłonka oskrzeli (NHBE, Clonetics). Komórki powleczono przy gęstości 1 x 10⁵ komórek na studzienkę, w 24 studzienkowej płytce i hodowano z odczynnikami testowymi; 1000 ng/ml, 100 ng/ml i 10 ng/ml zcytor17lig (A760F), 10 ng/ml TNFa, 10 ng/ml OSM, 10 ng/ml IFNa, 10 ng/ml TGFe lub 10 ng/ml Lymphotactin. Supernatanty zebrano w 24 i 48 godzinie i testowano pod względem cytokin; IL-6, IL-8, MCP-1, MlP-1a, RANTES i Eotaxin. Cytokiny testowano jak opisano poprzednio.

Produkcja cytokin (pg/ml) dla każdej linii komórkowej w 48-godzinnych próbkach, pokazano poni ż ej, w tablicy 18.

T a b l i c a 18 IL-6 pg/ml

	A549	DU145	SkLul	U20S	NHBE
r17L 1000 ng/ml	24,5	56,3	32,1	25,2	64,5
r171L 100 ng/ml	25,0	65,0	31,0	25,4	50,2
r17L 10 ng/ml	24,8	51,8	30,2	25,3	54,3
TNFa	272,9	355,4	437,5	36,1	299,3
OSM	26,4	73,5	112,4	25,6	80,4
IFNa	24,6	109,3	33,7	26,4	52,4
TGFp	24,4	102,6	42,7	27,8	268,9
Kontrola	24,5	36,3	29,9	25,2	47,9

IL-8 pg/ml

	A549	DU145	SkLul	U20S	NHBE
r17L 1000 ng/ml	35,0	243,3	45,6	18,6	402,0
r171L 100 ng/ml	31,0	290,7	40,1	21,3	296,0
r17L 10 ng/ml	30,4	240,4	33,4	18,9	361,8
TNFa	2809,3	2520,9	1385,2	784,9	1486,3
OSM	37,8	60,6	68,0	22,5	494,6
IFNa	18,9	315,3	39,5	33,1	231,6
TGFp	9,9	77,5	19,6	88,9	246,9
Kontrola	10,9	238,0	38,0	39,7	315,8

MCP-1 pg/ml

	A549	DU145	SkLul	U20S	NHBE
r17L 1000 ng/ml	nd	nd	149,1	81,0	nd
r171L 100 ng/ml	nd	nd	130,6	81,9	nd
r17L 10 ng/ml	nd	nd	111,7	49,1	nd
TNFa	nd	22,1	2862,6	1104,7	nd
OSM	nd	17,2	448,2	85,8	nd
IFNa	nd	nd	131,7	10,5	nd
TGFp	nd	1,7	54,5	27,6	nd
Kontrola	nd	nd	113,0	1,7	nd

nd = nie wykryto

PL 211 833 B1

117

Komórki DU145 wytwarzały IL-6 w odpowiedzi na zcytor17lig, powtarzając wcześniejsze wyniki w przykładzie 43A. Jednakże, tylko A549 i U2OS miały podobne IL-8 odpowiedzi, jak widać w przykładzie 43A. Komórki SkLul i U20S both wytwarzały MCP-1 w odpowiedzi na zcytor17lig. Produkcja cytokinprzezy komórki NHBE była marginalna w porównaniu z kontrolami.

C. Produkcja cytokin przez ludzkie nabłonkowe linie komórkowe w stanie choroby, współhodowane z ludzkim zcytor17lig i IFN gamma

Komórki powleczono przy gęstości 2 x 10⁵ komórek na studzienkę, w 24 studzienkowej płytce i współhodowano z 10 ng/ml IFN gamma +/- zcytor17lig w ilości 100 ng/ml, 10 ng/ml lub 1 ng/ml. Supernatanty zebrano w 24 i 48 godzinie i testowano pod względem IL-8 i MCP-1, jak opisano wyżej.

Produkcję cytokin (pg/ml) dla każdej linii komórkowej w 24-godzinnych próbkach, pokazano poniżej w tablicy 19.

T a b l i c a 19

10 ng/mL IFNg + 100 ng/mL
A549 r17L	86,7	nd
10 ng/mL IFNg + 10 ng/mL r17L	75,1	nd
10 ng/mL IFNg + 1 ng/mL r17L	63,6	nd
10 ng/ml IFNg	35,4	nd
kontrola	36,6	nd
10 ng/mL IFNg + 100 ng/mL
DU145 r17L	102,3	nd
10 ng/mL IFNg + 10 ng/mL r17L	92,9	nd
10 ng/mL IFNg + 1 ng/mL r17L	79,9	nd
10 ng/ml IFNg	70,7	nd
kontrola	79,4	nd
10 ng/mL IFNg + 100 ng/mL
SkLul r17L	152,2	604,9
10 ng/mL IFNg + 10 ng/mL r17L	194,4	870,7
10 ng/mL IFNg + 1 ng/mL r17L	138,7	585,4
10 ng/ml IFNg	170,8	652,6
kontrola	203,0	292,3
10 ng/mL IFNg + 100 ng/mL
U20S r17L 10 ng/mL	106,8	357,0
10 ng/mL IFNg + 10 ng/mL r17L	108,2	347,7
10 ng/mL IFNg + 1 ng/mL r17L	109,9	293,3
10 ng/ml IFNg	118,8	159,8
kontrola	146,8	7,0

Komórki A54 9 wytwarzały IL-8 w odpowiedzi na zcytor17lig, jednakże nie było wpływu współhodowania komórek z dodatkiem IFN gamma. Komórki U2OS wytworzyły 20-krotnie więcej MCP-1, gdy hodowano z IFNg i 50-krotnie więcej MCP-1, gdy hodowano z IFN gamma + zcytor17lig.

P r z y k ł a d 44 ₃

Zcytor17lig wpływa na włączenie ³H-TdR w komórkach DU145 raka nabłonka prostaty

Komórki posiano w 96-studzienkowych ugrupowaniach tkankowych (Falcon) przy gęstości wynoszącej 25000/studzienkę w pożywce wzrostowej MEM (Life Technologies) uzupełnionej glutaminą, pirogronianem, nie podstawowymi aminokwasami (Life Technologies) i 10% surowicą płodu bydlęce118

PL 211 833 B1 go (Hyclone). Przy konfluencji (24 godziny później), komórki przełączono na pożywki zatrzymujące wzrost przez zastąpienie 0,1% BSA (Life Technologies) w miejsce surowicy.

Po 48 godzinach do uzyskania synchronizacji komórkowej, pożywkę zatrzymującą wzrost ponownie umieszczono ze świeżą pożywką. Następnie, dodano ludzki rekombinacyjny zcytor17lig (odczynnik testowy) o różnych stężeniach (od 0,24 do 60 ng/ml) (patrz tablica 16 poniżej), do testowania pod względem wpływu białka na podstawową replikację DNA. Niektóre otrzymywały 2,5% FBS (Hyclone) oprócz zcytor17lig, w celu testowania wpływu białka na podniesiony poziom włączania TdR. FBS 10% i 20 ng/ml pochodzący z płytek czynnik wzrostu-BB (PDGF-BB) (R & D) użyto do kontroli pozytywnej.

Osiemnaście godzin po dodaniu zcytor17lig i reszty odczynników testowych, komórki poddano impulsom 250 nCi/ml [³H]-tymidyny (NEN) przez 4 godziny. Po 4-godzinnych impulsach, pożywki usunięto i do każdej studzienki dodano 100 pl roztworu trypsyny (Life Technologies), aby opróżnić komórki. Radioaktywność wprowadzoną przez DU145 określono przez zebranie komórek za pomocą urządzenia do zbierania komórek Packard Filtermate 196 i przez zliczenie wprowadzonego znacznika przy użyciu licznika scyntylacyjnego do mikropłytek Packard TopCount NXT.

Jak widać w tablicy 20 poniżej, zcytor17lig indukował włączanie tymidyny do nieruchomych komórek (w 0,1% BSA), w sposób zależny od stężenia. Efekt ten osiągnął 2,5-krotność kontroli BSA przy największym użytym stężeniu, 60 ng/ml.

Ponadto, ten efekt zcytor17lig był również wykrywalny, gdy linia podstawna włączania była podniesiona przez dodanie 2,5% FBS (w tym szeregu tak silny mitogen, jak 10% FBS). The wyniki wskazują więc, że zarówno w podstawowych, jak i stymulowanych warunkach zcytor17lig może działać jako czynnik mitogenny komórek raka DU145.

Tablica 16 ukazuje wpływ zcytor17lig na włączanie tymidyny przez komórki DU145. Wyniki są wyrażone w cpm/studzienkę i liczby średnia ± st. odch. potrójnych studzienek

T a b l i c a 20

	0,1% BSA	2,5% FBS
Kontrola BSA	1139±336	4228 ± 600
Zcytor17lig (0,24 ng/mL)	1430± 136	4894±1037
Zcytor17lig (0,24 ng/mL)	1657± 32	5038± 810
Zcytor17lig (2,22 ng/mL)	1646± 57	5162± 808
Zcytor17lig (6,67 ng/mL)	2226±189	6385±1613
Zcytor17lig (20 ng/mL)	2168±108	5880±1085
Zcytor17lig (60 ng/mL)	2512±111	6165±417
PDGF-BB (20 ng/mL)	4094 ± 202	5927 ± 360

P r z y k ł a d 45

Ekspresja huzcytor17lig w E. coli

A. Konstruowanie wektora ekspresji pRPS01 z ekspresją fuzyjnego polipeptydu huzcytor17-Lig/MBP-6H

Skonstruowano plazmid ekspresji zawierający polinukleotyd kodujący huzcytor17lig w fuzji C-terminalnej z Maltose Binding Protein (MBP), poprzez rekombinację homologiczną. Fuzyjny polipeptyd zawiera N-terminalne, w przybliżeniu 388 aminokwasów części MBP w fuzji z huzcytor17Lig, opisanym w niniejszym.

Fragment huzcytor17lig cDNA wyizolowano przy użyciu metody PCR jak opisano w niniejszym. Użyto dwa startery w wytwarzaniu fragmentu zcytor17lig w standardowej reakcji PCR:

(1) jeden zawierający 40 bp sekwencję oskrzydlającą wektor i 20 bp odpowiadających końcowi aminowemu huzcytor17lig i (2) drugi zawierający 40 bp końca 3' odpowiadających sekwencji oskrzydlającej wektor i 20 bp odpowiadających końcowi karboksylowemu huzcytor17lig.

Dwa mikrolitry 100 pl reakcji PCR uruchomiono na 1,0% żelu agarozowym z buforem do analizy 1 x TBE i obserwowano fragment o oczekiwanej masie cząsteczkowej. Pozostałą reakcję PCR łączoPL 211 833 B1

119 no z drugą rurką PCR i wytrącono ilością 400 μl absolutnego etanolu. Wytrącony DNA użyto do rekombinacji do ciętego Smal wektor biorczego pTAP98 z utworzeniem konstrukcji kodującej fuzję MBP-huzcytor17lig, jak opisano poniżej.

Wektor pTAP98 skonstruowano przy użyciu drożdżowej rekombinacji homologicznej. Sto nanogramów ciętego EcoRI pMAL-c2 ponownie połączono z 1 μg ciętego Pvul pRS316, 1 μg linkera i 1 μg ciętego Scal/EcoRI pRS316 łączono w reakcji PCR. Produkty PCR zatężono poprzez wytrącanie 100% etanolem. Kompetentny szczep komórek drożdży (S. cerevisiae), SF838-9Da, łączono z 10 μl mieszaniny zawierającej w przybliżeniu 1 μg produktu huzcytor17lig PCR (powyżej) i 100 ng trawionego Smal wektora pTAP98 i poddano elektroporacji o napięciu 0,75 kV, 25 μF i 8 omów. Uzyskaną mieszaninę reakcyjną powleczono na płytkach URA-D i inkubowano w temperaturze 30°C.

Po 48 godzinach, transformanty drożdżowe Ura+ z pojedynczych płytek poddano selekcji. DNA wyizolowano i transformowano do elektrokompetentnych komórek E. coli (np. MC1061, Casadaban i inni, J. Mol. Biol. 138, 179-207). Uzyskane komórki E. coli powleczono na płytkach MM/CA + AMP 100 mg/l (Pryor i Leiting, Protein Expression and Purification 10: 309-319, 1997) przy użyciu standardowych procedur. Cztery poszczególne klony zebrano z płytek i zaszczepiono w MM/CA z 100 g/ml Ampicillin, przez dwie godzin w temperaturze 37°C. Jeden mililitr z każdej hodowli indukowano 1 mM IPTG. Około 2-4 godziny później, 250 μl każdej indukowanej hodowli mieszano z 250 μl przemytych kwasem szklanych paciorków i 250 μl buforu Thomer z 5% OME i barwnikiem (8 M mocznik, 100 mM Tris pH 7,0, 10% glicerol, 2 mM EDTA, 5% SDS). Próbki wirowano przez jedną minutę i ogrzewano do temperatury 65°C przez 10 minut. Dwadzieścia mikrolitrów każdej próbki ładowano na tor, na 4%-12% żel PAGE (NOVEX). Żele uruchamiano w buforze 1 x MES. Pozytywne klony oznaczono pRPS01 i poddano analizie sekwencji.

Jeden mikrolitr sekwencjonowanego DNA użyto do transformowania szczepu elektrokompetentnych komórek MC1061 E. coli. Komórki poddano impulsom elektrycznym o napięciu 2,0 kV, 25 pF

400 omów. Po elektroporacji, komórki odzyskano w 0,6 ml SOC i hodowano na płytkach LB + Amp w temperaturze 37°C, przez noc, ze 100 mg/l Ampicillin. Cztery hodowle indukowano ITPG i przesiano pod względem pozytywów, jak opisano wyżej. Pozytywne klony rozprzestrzeniono dla oczyszczania białka fuzyjnego huzcytor17lig/MBP-6H, przy użyciu standardowych technik.

B. Oczyszczanie huzcytor17Lig/MBP-6H z fermentacji E.coli

O ile nie zapisano inaczej, wszystkie operacje prowadzono w temperaturze 4°C. Stosowano następującą procedurę do oczyszczenia rekombinacyjnego polipeptydu huzcytor17Lig/MBP-6H. Komórki E. coli zawierające konstrukcję pRPS01 i ekspresję huzcytor17Lig/MBP-6H, skonstruowano przy użyciu standardowych metod biologii molekularnej i hodowano w 50,0 g/l SuperBroth II (12 g/l Casien, 24 g/l Yeast Extract, 11,4 g/l fosforanu dipotasowego, 1,7 g/l fosforanu potasu; Becton Dickenson, Cockeysville, MD), 5 g/l glicerol i 5 ml/L 1 M Magnesium Sulfate. Dwadzieścia gramów komórek zebrano i zamrożono dla oczyszczania białka.

Stopione komórki ponownie zawieszono w 500 ml buforu Amylose Equilibration (20 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8,0). Układ rozbijania komórek French Press (Constant Systems Ltd., Warwick, UK) z nastawami temperaturowymi -7°C do -10°C i 30K PSI użyto do lizy komórek. Ponownie zawieszone komórki testowano pod względem rozbiciaprzy odczytach A600 przed i po cyklingu za pomocą French Press. Obrobioną zawiesinę komórkową granulowano przy 10000 G przez 30 minut, dla usunięcia resztek komórkowych i supernatant zbierano dla oczyszczania białka.

ml kolumnę żywicy Amylose (New England Biolabs, Beverly, MA) (wytworzonej jak opisano poniżej) wylano do kolumny szklanej Bio-Rad, 2,5 cm D x 10 cm H. Kolumnę upakowano i zrównoważono grawitacyjnie 10 objętościami kolumny (CV) buforu Amylose Equilibration. Obrobiony supernatant komórkowy załadowano partiami na żywicę Amylose na noc, z kołysaniem. Żywicy zawrócono do kolumny Bio-Rad i przemyto 10 CV buforu Amylose Euilibration przez grawitację. Kolumnę eluowano

CV buforu Amylose Elution (bufor Amylose Equilibration + 10 mM Maltose, Fluka Biochemical, Szwajcaria) przez grawitację. Dziesięć 5 ml frakcji zebrano przez profil elucji i testowano pod względem absorbancji przy 280 i 320 nM. Żywicę Amylose poniwnie wytworzono z użyciem 1 CV destylowanej H2O, 5 CV 0,1% (ciężar/objętość) SDS (Sigma), 5 CV destylowanej H2O, 5 CV buforu Amylose Equilibration i na koniec 1 CV buforu Amylose Storage (bufor Amylose Equilibration + 0,02% Sodium Azide). Zregenerowaną kolmnę przechowywano w temperaturze 4°C.

Badane frakcje profilu wymywania zlano i dializowano w 10K komorze dializacyjnej (Slide-A-Lyzer, Pierce Immunochemicals) przeciwko 4 x 4L PBS pH 7,4 (Sigma) przez 8-godzinny okres czasu, dla usunięcia zanieczyszczeń o niskiej masie cząsteczkowej, wymieniano bufor i odsalano. Po

120

PL 211 833 B1 dializie, zebrany materiał przedstawiał oczyszczony polipeptyd huzcytor17Lig/MBP-6H. Oczyszczony polipeptyd huzcytor17Lig/MBP-6H wyjałowiono przez filtrowanie i zanalizowano poprzez SDS-PAGE z barwieniem Coomassie pod względem produktu o odpowiadającej masie cząsteczkowej. Stężenie polipeptydu huzcytor17Lig/MBP-6H określono za pomocą analizy BCA jako 1,28 mg/ml.

P r z y k ł a d 46

Ludzkie przeciwciało poliklonalne zcytor17lig

A. Otrzymywanie i oczyszczanie

Przeciwciała poliklonalne wytworzono przez immunizację 2 samic New Zealand białych królików oczyszczonym białkiem rekombinacyjnym hzcytor17L/MBP-6H (przykład 45). Każdy królik dostał początkową dootrzewnową (IP) iniekcję 200 μg oczyszczonego białka w Complete Freund's Adjuvant, a następnie przypominającą iniekcję IP wynosząca 100 μg białka w Incomplete Freund's Adjuvant co trzy tygodnie. Siedem do dziesięciu dni po podaniu drugiej iniekcji przypominającej (całkowite 3 iniekcje), zwierzęta skrwawiono i zebrano surowicę. Zwierzęta następnie dostały dawkę przypominającą i skrwawiano je co trzy tygodnie.

Surowicę króliczą swoistą wobec hzcytor17L/MBP-6H wstępnie adsorbowano przeciwciałami anty-MBP przy użyciu kolumny białka 4B CNBr-SEPHAROSE (Pharmacia LKB), którą wytworzono przy użyciu 10 mg nieswoistego, oczyszczonego rekombinacyjnego białka fuzyjnego MBP na gram CNBr-SEPHAROSE.

Swoiste wobec hzcytor17L/MBP-6H- przeciwciała poliklonalne oczyszczono przez powinowactwo z wstępnie adsorbowanej surowicy królika, przy użyciu kolumny białka 4B CNBr-SEPHAROSE (Pharmacia LKB), którą wytworzono przy użyciu 10 mg swoistego, oczyszczonego antygenem, rekombinacyjnego białka hzcytor17L/MBP-6H.

Po oczyszczeniu, przeciwciała poliklonalne dializowano z 4 zmianami 20 razy objętość przeciwciała PBS przez okres czasu wynoszący co najmniej 8 godzin. Przeciwciała swoiste wobec liganda Hzcytor17 scharakteryzowano przez ELISA przy użyciu 500 ng/ml oczyszczonego, rekombinacyjnego białka hzcytor17L/MBP-6H lub hzcytor17L-CEE wytwarzonego w bakulowirusowym układzie ekspresji jako celami dla przeciwciała. Dolna granica detekcji (LLD) króliczego przeciwciała anty-hzcytor17L/MBP-6H oczyszczonego przez powinowactwo wynosiła 100 pg/ml na swym swoistym, oczyszczonym rekombinacyjnym antygenie hzcytor17L/MBP-6H i 500 pg/ml na oczyszczonym rekombinacyjnym hzcytor17L-CEE, wytwarzonym w układzie ekspresji bakulowirusa.

B. SDS-PAGE i analiza Western Blotting króliczego przeciwciała przeciwko ludzkiemu Zcytor17lig MBP-6H

Królicze przeciwciało przeciwko ludzkiemu Zcytor17lig MBP-6H testowano za pomocą SDS-PAGE (NuPage 4-12%, Invitrogen, Carlsbad, CA) metodą barwienia coomassie i Western Blotting przy użyciu koziej, antykróliczej IgG-HRP. Ludzkie i mysie oczyszczone białko zcytor17lig (200-25 ng) poddano elektroforezie przy użyciu nvitrogen Novex's Xcell II mini-cell i przeniesiono na nitrocelulozę (0,2 mm; Invitrogen, Carlsbad, CA) w temperaturze pokojowej przy użyciu modułu Novex's Xcell blot z mieszaniem, zgodnie z zaleceniami podanymi w instrukcji obsługi.

Przenoszenie uruchomiono przy 300 mA przez jedna godzinę w buforze zawierającym 25 mM Tris zasada, 200 mM glicyny i 20% metanol. Filtr następnie zablokowano buforem Western A (miejscowy, 50 mM Tris, pH 7,4, 5 mM EDTA, pH 8,0, 0,05% Igepal CA-630,150 mM NaCl i 0,25% żelatyna) przez noc przy delikatnym kołysaniu, w temperaturze 4°C. Nitrocelulozę szybko przepłukano, następnie króliczy anty-ludzki zcytor17lig MBP-6H (1:1000) dodano do buforu Western A.

Odcisk inkubowano przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej, przy delikatnym kołysaniu. Odcisk przepłukano 3 razy przez 5 minut każda w Western A, następnie dodano kozie przeciwciało przeciw króliczej IgG HRP (1: 5000) w buforze Western A.

Odcisk inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, przy delikatnym kołysaniu. Odcisk przepłukano 3 razy przez 5 minut każda w Western A, następnie szybko przepłukano w H2O. Odcisk wywoływano przy użyciu dostępnych w handlu odczynników substratu chemiluminescencyjnego (odczynniki detekcji ECL Western Blotting 1 i 2 mieszano 1:1; odczynniki otrzymano od Amersham Pharmacia Biotech., Buckinghamshire, England) i odcisk poddano ekspozycji wobec błony rentgenowskiej przez 5 minut.

Oczyszczony ludzki zcytor17lig pojawił się jako wielki prążek o wielkości około 30 kDa i mnniejszy prążek wielkości około 20 kDa w warunkach redukujących. Mysi zcytor17lig nie był wykrywany przez królicze przeciwciało przeciwko ludzkiemu zcytor17lig.

PL 211 833 B1

121

P r z y k ł a d 47

Wpływ Zcvtor17lig na przyleganie monocytów U93T do jednej warstwy komórek śródbłonka transformowanego szpiku kostnego (TRBMEC)

Transformowane komórki śródbłonkowe szpiku kostnego (TRBMEC) posiano w 96-studzienkowych zgrupowaniach tkankowych (Falcon) przy gęstości wynoszącej 25000/studzienkę w pożywce M131 (Cascade Biologics) uzupełnionej Microvascular Growth Supplement (MVGS) (Cascade Biologics). Przy konfluencji (24 godzin później), komórki przełączono na M199 (Gibco-Life Technologies) uzupełnione 1% surowicy płodu bydlęcego (Hyclone).

Ludzki rekombinacyjny zcytor17lig (odczynnik testowy) dodano w różnych stężeniach (od 0,4 do 10 ng/ml) (patrz tablica 21 poniżej), do testowania pod względem wpływu białka na interakcje komórek śródbłonka z komórkami odpornościowymi, dających przyleganie.

Niektóre studzienki otrzymały 0,3 ng/ml Tumor Necrosis Factor (TNFalpha R & D Systems), znanej prozapalnej cytokiny, oprócz zcytor17lig, do testowania wpływu białka na komórki śródbłonka w warunkach zapalnych.

TNFalpha sam w ilości 0,3 ng/ml użyto jako pozytywną kontrolę i użyte stężenie oznacza w przybliżeniu 70% maksymalnego wpływu TNFalpha w tym układzie, to jest nie indukuje on maksymalnego przylegania komórek U937 (ludzka linia komórkowa podobna do monocytów) do śródbłonka. Z tego powodu, to ustawienie może wykrywać zarówno regulacje w górę, jak i regulacje w dół wpływu TNFalpha.

Podstawowy poziom adhezji zarówno z, jak i bez TNFalpha użyto jako linii podstawnej do oceny wpływu odczynników testowych.

Po całonocnej inkubacji komórek śródbłonka z odczynnikami testowymi (zcytor17ligand TNFalpha), komórki U937, wybarwione 5 μM markerem fluorescencyjnym Calcein-AM (sonda molekularna), komórki ponownie zawieszono w RPMI 1640 (brak czerwieni fenolowej) uzupełnionej 1% FBS i powleczono w ilości 100000 komórek/studzienkę na przepłukanej TRBMEC pojedynczej warstwie.

Poziom fluorescencji przy długości fali wbudzenia/emisji wynoszącej 485/538 nm (Molecular Devices czytnik mikropłytek, stosowanie CytoFluor) mierzono 30 minut później, przed i po przepłukaniu studzienki trzy razy ciepłym RPMI 1640 (brak czerwieni fenolowej), dla usunięcia nieprzylegającego U937.

Poziom fluorescencji przed płukaniem (całkowite) i po płukaniu (swoiste wobec przylegania) użyto dla określenia procentu przylegania (przyległe netto/całkowite netto x 100 = % przylegania).

Jak widać w tablicy 21 poniżej, zcytor17lig dodany sam, wpływał na podstawowe przyleganie komórek U937 do pojedynczej warstwy śródbłonka w stosowanym zakresie stężeń (mniej niż 2-krotny wzrost, p < 0,01 za pomocą testu ANOVA). Sama pozytywna kontrola, 0,3 ng/ml TNFalpha, zwiększała przyleganie komórek U937 z podstawowego 5,8% do 35% (6-krotnie).

W obecności TNFalpha, zcytor17lig działał synergistycznie z TNFalpha i następnie wzmacniał przyleganie U93T w sposób zależny od stężenia, między 0,4 i 10 ng/ml (p < 0,01 test ANOVA). W ilości 10 ng/ml, zcytor17lig wzmacniał wpływ TNFalpha o 62%.

Te wyniki wskazują, że zcytor17lig może być sam czynnikiem prozapalnym. Zcytor17lig był zdolny do synergii z submaksymalnymi stężeniami TNFalfa zwiększając przyleganie monocytów do komórek śródbłonka.

Te wyniki ukazują również, że komórki śródbłonka, zwłaszcza po ekspozycji wobec prozapalnych cytokin, takich jak TNFalfa, są prawdopodobnym celem tkankowym działania zcytor17lig. Konsekwencją zcytor17ligand dla komórek śródbłonka może być zwiększenie przylegania monocytów lub makrofagów do miejsca aktywności prozapalnej.

Aktywowane monocyty i makrofagi sa ważna w wielu chorobach zapalny. Zatem inhibicja przylegania monocytów/makrofagów może zapewnić racjonale terapeutyczne dla antagonistów zcytor17ligand.

Dane te podtrzymują stosowanie antagonistów zcytor17ligand do leczenia chorób płuc, chorób naczyniowych, autoodporności, przerzutów nowotworowych, chorób obejmujących reakcje alergiczne, gojenia ran i chorób skóry łącznie z kontaktowym, alergicznym lub niealergicznym stanem zapalnym skóry lub łuszczycą oraz choroby zapalnej jelita.

Tablica 21 ukazuje wpływ zcytor17lig na U937 przyleganie monocytów do pojedynczej warstwy śródbłonka TRBMEC. Wyniki wyrażone sa w procencie przylegania, a liczby są średnią ± st. odch potrójnych studzienek.

122

PL 211 833 B1

T a b l i c a 21

	Basal	0,3 ng/ml TNFalfa
Basal	5,8 ± 1,2	35,0 ± 5,5
zcytor17lig 0,4 ng/ml	9,0 ± 0,7	44,7 ± 2,5
zcytor17lig 1,1 ng/ml	10,4 ± 0,8	45,2 ± 0,6
zcytor17lig 3,3 ng/ml	7,9 ± 1,7	51,1 ± 4,0
zcytor17lig 10 ng/ml	9,5 ± 0,5	56,6 ± 3,9

Z powyższego, należy rozumieć, że chociaż swoiste odmiany wynalazku zostały opisane w niniejszym dla celów ilustracyjnych, różne modyfikacje można wykonać bez odchodzenia od ducha i kształtu wynalazku. Odpowiednio, wynalazek nie jest ograniczony z wyjątkiem załączonych zastrzeżeń.

LISTA SEKWENCJI <110> ZymoGenetics, Inc.

<120> NOWY CYTOKINOWY LIGAND ZCYTOR17 <130> 02-01PC <150> US 60/350,325 <151> 2002-01-18 <150> US 60/375,323 <151> 2002-04-25 <150> US 60/435,315 <151> 2002-12-19 <160> 168 <170> FastSEO for Windows Version 3.0 <210> 1 <211> 904 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<221> CD5 <222> (28)...(519) <400> 1 ctgaagctgg ccttgctctc tctcgcc atg gcc tct cac tca ggc ccc tcg acg 54 Het Ala Ser His Ser Gly Pro Ser Thr

PL 211 833 B1

123

5

tct gtg ctc

ttt ctg Phe Leu

ttc tgc tgc ctg gga ggc tgg ctg gcc

tcc Ser

cac His 25

102

Ser 10

Val

Leu

Phe Cys 15

Cys

Leu Gly

Gly 20

Trp

Leu

Al a

acg

ttg

ccc

gtc

cgt

tta

eta

ega

cca

agt

gat gat

gta

cag

aaa

ata

150

Thr

Leu

Pro

Val

Arg

Leu

Leu Arg

Pro

Ser

Asp Asp

Val

Gin

Lys

Ile

30

35

40

gtc

gag

gaa

tta

cag

tcc

ctc

teg

aag

atg

ctt

ttg

aaa

gat

gtg

gag

198

Val

Glu

Glu

Leu

Gin

Ser

Leu

Ser

Lys

Met

Leu

Leu

Lys

Asp

Val

Glu

45

50

55

gaa

gag

aag

ggc

gtg

ctc

gtg

tcc

cag

aat

tac

acg

ctg

ccg

tgt

ctc

246

Glu

Glu

Lys

Gly

Val

Leu

Va1

Ser

Gin

Asn

Tyr

Thr

Leu

Pro

Cys

Leu

60

65

70

agc

cct

gac

gcc

cag

ceg

cca

aac

aac

atc

cac

agc

cca

gcc

atc

cgg

294

Ser

Pro

Asp

Ala

Gin

Pro

Pro

Asn

Asn

Ile

His

Ser

Pro

Ala

Ile

Arg

75

80

85

gca

tat

ctc

aag

aca

atc

aga

cag

eta

gac

aac

aaa

tct

gtt

att

gat

342

Ala

Tyr

Leu

Lys

Thr

Ile

Arg

Gin

Leu

Asp Asn Lys

Ser

Val

Ile

Asp

90

95

100

105

gag

atc

ata

gag

cac

ctc

gac

aaa

ctc

ata

ttt

caa

gat

gca

cca

•gaa

390

Glu

Ile

Ile

Glu

His

Leu

Asp Lys

Leu

Ile

Phe

Gin

Asp

Ala

Pro

Glu

110

115

120

aca

aac

att

tct

gtg

cca

aca

gac

acc

cat

gaa

tgt

aaa

cgc

ttc

atc

438

Thr

Asn

Ile

Ser

Val

Pro

Thr

Asp

Thr

His

Glu

Cys

Lys

Arg

Phe

Ile

125

130

135

ctg

act

att

tct

caa

cag

ttt

tea

gag

tgc

atg

gac

ctc

gca

eta

aaa

486

Leu

Thr

Ile

Ser

Gin

Gin

Phe

Ser

Glu

Cys

Met

Asp

Leu

Al a

Leu

Lys

140

145

150

tea

ttg

acc

tct

gga

gcc

caa

cag

gcc

acc

act

taaggccatc

tcttcctttc

539

Ser

Leu

Thr

Ser

Gly

Ala

Gin

Gin

Ala

Thr

Thr

155

160

ggattggcag gaacttaagg agccttaaaa agatgaccga cagctaagtg tgggaactct 599

124

PL 211 833 B1 gccgtgattc agtcccggga tattagtctt ccctcgtgag ttgtcaatgc tcata cttaagtaca tttttccaat gaataatctc agggacccct catatgggct gggctgagat gtgaatttgt gaattacctt gaaaaacatt aggttattgt ggtatttatg gaatgctttt cttctgcagg cttąagtctt acttattata ggtgggaggt ggcagctatg ttaatttatt gatatttatt gtactaagag tccctggggg agccctcgga atctatttaa taaattatat tgaatttttc

659

719

779

839

899

904

<210 2 <211> 164 <212> PRT

<213>

Homo sap

liens

<4OO>

2

Met

Ala

Ser

Hi s

Ser Gly

Pro

Ser Thr

Ser

Val

Leu

Phe

Leu

Phe Cys

1

5

10

15

Cys

Leu

Gly Gly

Trp

Leu

Al a

Ser

His

Thr

Leu

Pro

Val

Arg

Leu

Leu

20

25

30

Arg

Pro

Ser Asp Asp

Val

Gin

Lys

Ile

V al

Glu

Glu

Leu

Gin

Ser

Leu

35

40

45

Ser

Lys

Met

Leu

Leu

Lys

Asp

Val

Glu

Glu

Glu

Lys Gly

Val

Leu

Val

50

55

60

Ser

Gin

Asn

Tyr

Thr

Leu

Pro

Cys

Leu

Ser

Pro

Asp

Ala

Gin

Pro

Pro

65

70

75

80

Asn

Asn

Ile

His

Ser

Pro

Ala

Ile

Arg

Ala

Tyr

Leu

Lys

Thr

Ile

Arg

85

90

95

Gin

Leu

Asp

Asn

Lys

Ser

Val

Ile

Asp

Glu

Ile

Ile

Glu

His

Leu

Asp

100

105

110

Lys

Leu

Ile

Phe

Gin

Asp

Ala

Pro

Glu Thr

Asn

Ile

Ser

Val

Pro. Thr

115

120

125

Asp

Thr

His

Glu

Cys

Lys

Arg

Phe

Ile

Leu

Thr

Ile

Ser

Gin

Gin

Phe

130

135

140

Ser

Glu

Cys

Met

Asp

Leu

Ala

Leu

Lys

Ser

Leu

Thr

Ser

Gly

A i a

Gin

145

150

155

160

Gin Ala Thr Thr <21Q> 3 <211> 492 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

PL 211 833 B1

125 <223> Ludzki zdegenerowany poi inukleotyd zcytorl71ig SEQ ID NO:2 <221> misc_feature <222> (1).. .(492) <223> n = A,T,C or G <400> 3 atggcnwsnc aywsnggncc nwsnacnwsn gtnytnttyy tnttytgytg yytnggnggn 60 tggytngcnw sncayacnyt nccngtnmgn ytnytnmgnc cnwsngayga ygtncaraar 120 athgtngarg arytncarws nytnwsnaar atgytnytna argaygtnga rgargaraar 180 ggngtnytng tnwsncaraa ytayacnytn ccntgyytnwsnccngaygc ncarccnccn 240 aayaayathc aywsnccngc nathmgngcn tayytnaara cnathmgnca rytngayaay 300 aarwsngtna thgaygarat hathgarcay ytngayaary tnathttyca rgaygcriccn 360 garacnaaya thwsngtncc nacngayacn caygartgya armgnttyat hytnacnath 420 wsncarcart tywsngartg yatggayytn gcnytnaarw snytnacnws nggngcncar 480 cargcnacna cn 492 <210> 4 <211> 2903 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS <222> (497)...(2482) <400> 4 tgaaaągaca tgtgtgtgca gtatgaaaat tgagacagga aggcagagtg tcagcttgtt 60 'ccacctcagc tgggaatgtg catcaggcaa ctcaagtttt tcaccacggc atgtgtctgt 120 gaatgtccgc aaaacattag tttcactctt gtcgccaggt tggagtacaa tggcacgatc 180 ttggctcact gcaacctctg cctcccgggt tcaagcgatt ctcctgcctc agcctcccga 240 gtagctggga ttacagttaa caataatgca atccatttcc cagcataagt gggtaagtgc 300 cactttgact tgggctgggc ttaaaagcac aagaaaagct cgcagacaat cagagtggaa 360 acactcccac atcttagtgt ggataaatta aagtccagat tgttcttcct gtcctgactt 420 gtgctgtggg aggtggagtt gcctttgatg caaatccttt gagccagcag aacatctgtg 480 gaacatcccc tgatac atg aag ctc tct ccc cag cct tca tgt gtt aac ctg 532

Met Lys Leu Ser Pro Gin Pro Ser Cys Val Asn Leu 15 10 ggg atg atg tgg acc tgg gca ctg tgg atg ctc cct tca ctc tgc aaa 580

Gly Met Met Trp Th‘r Trp Ala Leu Trp Met-Leu Pro Ser Leu Cys Lys

20 25

126

PL 211 833 B1

ttc age ctg gca

gct Ala

ctg Leu

cca gct aag cct gag aac.att tcc tgt gtc

628

Phe Ser Leu 30

Ala

Pro 35

Ala Lys

Pro

Glu

Asn 40

He

Ser

Cys

Val

tac

tac

tat

agg

aaa

aat

tta

acc

tgc

act

tgg

agt

cca

gga

aag

gaa

676

Tyr Tyr

Tyr Arg

Lys

Asn

Leu

Thr

Cys

Thr

Trp

Ser

Pro

Gly

Lys

Glu

45

50

55

60

acc

agt

tat

4cc

cag

tac

aca

gtt

aag

aga

act

tac

gct

ttt

gga

gaa

724

Thr

Ser

Tyr

Thr

Gin

Tyr

Thr

Val

Lys

Arg

Thr

Tyr

Al a

Phe

Gly

Glu

65

70

75

aaa

cat

gat

aat

tgt

aca

acc

aat

agt

tct

aca

agt

gaa

aat

cgt

gct

772

Lys

Hi s

Asp

Asn

Cys

Thr

Thr Asn

Ser

Ser

Thr

Ser

Glu

Asn

Arg

Al a

80

85

90

teg

tgc

tct

ttt

ttc

ctt

cca

aga

ata

acg

atc

cca

gat

aat

tat

acc

820

Ser

Cys

Ser

Phe

Phe

Leu

Pro

Arg

Ile

Thr

Ile

Pro

Asp

Asn

Tyr

Thr

95

100

105

att

gag

gtg

gaa

gct

gaa

aat

gga

gat ggt gta

att

aaa

tct

cat

atg

868

Ile

Glu

Val

Glu

Al a

Glu

Asn

Gly Asp Gly

Val

Ile

tys

Ser

His

Met

110

115

120

aca

tac

tgg

aga

tta

gag

aac

ata

gcg

aaa

act

gaa

cca

cct

aag

att

916

Thr

Tyr Trp Arg

Leu

Glu

Asn

Ile

Ala

Lys

Thr

Glu

Pro

Pro

Lys

Ile

125

130

135

140

ttć

cgt

gtg

aaa

cca

gtt ttg

ggc

atc

aaa

ega

atg

att

caa. att

gaa

.964

Phe

Arg

Val

Lys

Pro

Val

Leu

Gly

Ile

Lys

Arg

Met

Ile

Gin

Ile

Glu

145

150

155

tgg

ata

aag

cct

gag

ttg

gcg

cct

gtt

tea

tct

gat

tta

aaa

tac

aca

1012

Trp

Ile

Lys

Pro

Glu

Leu

Ala

Pro

Val

Ser

Ser

Asp

Leu

Lys

Tyr

Thr

160

165

170

ctt

ega

ttc

agg

aca

.gtc

aac

agt

acc

age

tgg

atg

gaa

gtc

aac

ttc

1060

Leu

Arg

Phe

Arg

Thr

Val

Asn

Ser

Thr

Ser

Trp

Met

Glu

Val

Asn

Phe

175

180

185

gct

aag

aac

cgt

aag

gat

aaa

aac

caa

acg

tac

aac

ctc

acg

ggg

ctg

1108

Al a

Lys

Asn

Arg

Lys

Asp

Lys

Asn

Gin

Thr

Tyr

Asn

Leu

Thr

Gly

Leu

PL 211 833 B1

127

190 195 200

cag

cct

ttt

aca

gaa

tat

gtc

ata

gct

ctg

ega tgt

gcg

gtc

aag gag

1156

Gin

Pro

Phe

Thr

Glu

Tyr

Val

Ile

Al a

Leu

Arg Cys

Ala

Val

Lys Glu

205

210

215

220

tca

aag

ttc

tgg

agt

gac

tgg

agc

caa

gaa

aaa

atg

gga

atg

act gag

1204.

Ser

Lys

Phe

Trp

Ser

Asp Tnp

Ser

Gin

Glu

Lys

Met

Gly

Met

Thr Glu

225

230

235

gaa

gaa

gct

cca

tgt

ggc

ctg

gaa

ctg

tgg

aga

gtc

ctg

aaa

cca gct

1252

Glu

Glu Ala

Pro

Cys

Gly

Leu

Glu

Leu

Trp Arg

Val

Leu

Lys

Pro Ala

240

245

250

gag

gcg gat

gga

aga. agg

cca

gtg

cgg

ttg

tta

tgg

aag

aag

gca aga

1300

Glu

Ala Asp

Gly Arg Arg

Pro

Val

Arg

Leu

Leu

Trp

Lys

Lys

Ala Arg

255

260

265

gga

gcc

cca

gtc

eta

gag

aaa

aca

ctt

ggc

tac

aac

ata

tgg

tac tat

1348

Gly

Ala

Pro

Val

Leu

Glu

Lys

Thr

Leu

Gly Tyr

Asn

Ile

Trp Tyr Tyr

270

275

280

cca

gaa

agc

aac

act

aac

ctc

aca

gaa

aca

atg

aac

act

act

aac cag

1396

Pro

Glu

Ser

Asn

Thr

Asn

Leu

Thr

Glu

Thr

Met

Asn

Thr

Thr

Asn Gin

285

290

295

300

cag

ctt

gaa

ctg

cat

ctg

gga

ggc

gag

agc

ttt

tgg

gtg

tct

atg -att

1444

Gin

Leu

Glu

Leu

His

Leu

Gly

Gly

Glu

Ser

Phe

Trp

Val

Ser

Met Ile

305

310

315

tct

tat

aat

tct

ctt

ggg

aag

tct

cca

gtg

gcc

acc

ctg

agg

att cca

1492

Ser

Tyr

Asn

Ser

Leu

Gly

Lys

Ser

Pro

Val

Ala

Thr

Leu

Arg

Ile Pro

320

325

330

gct

att

caa

gaa

aaa

tca

ttt

cag

tgc

att

gag

gtc

atg

cag

gcc tgc

1540

Ala

Ile

Gin

Glu

Lys

Ser

Phe

Gin

Cys

He

Glu

Val

Met

Gin

Ala Cys

335

340

345

gtt

gct

gag

gac

cag

eta

gtg

gtg

aag

tgg

caa

agc

tct

gct

eta gac

1588

Val

Al a

Glu

Asp

•Gin

Leu

Val

Val

Lys

Trp

Gin

Ser

Ser

Al a

Leu Asp

350

355

360

gtg

aac

act

tgg

atg

att

gaa

tgg

ttt

ccg

gat

gtg

gac

tca

gag ccc

1636

128

PL 211 833 B1

Val 365

Asn

Thr Trp Met

Ile 370

Glu Trp Phe Pro Asp Val Asp Ser Glu Pro

375

380

acc

acc

ctt

tcc

tgg

gaa

tct

gtg

tct

cag gcc

acg

aac

tgg

acg

atc

1684

Thr

Thr

Leu

Ser

Trp

Glu

Ser

Val

Ser

Gin Ala

Thr

Asn

Trp

Thr

Ile

385

390

395

cag

caa

gat

aaa

tta

aaa

cct

ttc

tgg

tgc tat

aac

atc

tct

gtg

tat

1732

Gin

Gin

Asp

Lys

Leu

Lys

Pro

Phe

Trp

Cys Tyr

Asn

Ile

Ser

Val

Tyr

400

405

410

cca

atg

ttg.

cat'

gac

aaa

gtt

ggc

gag

cca

tat

tcc

atc

cag

gct

tat

1780

Pro

Met

Leu

His

Asp

Lys

Val

Gly

Glu

Pro

Tyr

Ser

Ile

Gin

Ala

Tyr

415

420

425

gcc

aaa

gaa

ggc

gtt

cca

tca

gaa

ggt

cct

gag

acc

aag

gtg

gag

aac

1828

Ala

Lys

Glu

Gly

Val

Pro

Ser

Glu

Gly

Pro

Glu

Thr

Lys

Val

Glu

Asn

430

435

440

att

ggc

gtg

aag

acg

gtc

acg

atc

aca

tgg

aaa

gag

att

ccc

aag

agt

1876

Ile

Gly

Val

Lys

Thr

Val

Thr

Ile

Thr

Trp Lys

Glu

Ile

Pro

Lys

Ser

445

450

455

460

gag

aga

aag

ggt

atc

atc

tgc

aac

tac

acc

atc

ttt

tac

caa

gct

gaa

1924

Glu

Arg

Lys Gly

Ile

Ile

Cys

Asn

Tyr

Thr

Ile

Phe

Tyr

Gin

Ala

Glu

465

470

475

ggt

gga

aaa

gga

ttc

tcc

aag

aca

gtc

aat

tcc

agc

atc

ttg

cag

tac

1972

Gly

Gly

Lys

Gly

Phe

Ser

Lys

Thr

Val

Asn

Ser

Ser

Ile

Leu

Gin

Tyr

480

485

490

ggc

ctg

gag

tcc

ctg

aaa

ega

aag

acc

tct

tac

att

gtt

cag

gtc

atg

2020

Gly

Leu

Glu

Ser

Leu

Lys Arg

Lys

Thr

Ser

Tyr

Ile

Val

Gin

Val

Met

495

500

505

gcc

agc

acc

agt gct

ggg

gga

acc

aac

ggg

acc

agc

ata

aat

ttc

aag

2068

Ala

Ser

Thr

Ser

Ala

Gly Gly

Thh

Asn

Gly

Thr

Ser

Ile

Asn

Phe

Lys

510

515

520

aca

ttg

tca

ttc

agt

gtc

ttt

gag

att

atc

ctc

ata

act

tct

ctg

att

2116

Thr

Leu

Ser

Phe

Ser

Val

Phe

Glu

Ile

Ile

Leu

Ile

Thr

Ser

Leu

Ile

525

530

535

540

PL 211 833 B1

129

ggt Gly

gga ggc

ctt ctt Leu Leu 545

att Ile

ctc att atc ctg aca gtg gca tat ggt ctc

2164

Gly

Gly

Leu

Ile

Ile

Leu Thr 550

Val

Ala

Tyr -Gly 555

Leu

aaa

aaa

ccc

aac

aaa

ttg

act

cat

ctg

tgt

tgg

ccc

acc

gtt

ccc

aac

2212

Lys

Lys

Pro

Asn

Lys

Leu

Thr

Hi s

Leu

Cys Trp

Pro

Thr

Val

Pro Asn

560

565

570

cct

gct

gaa

agt agt

ata

gcc

aca

tgg

cat

gga

gat gat

ttc

aag gat

2260

Pro

Ala

GTu

Ser

Ser

Ile

Ala

Thr

Trp

His

Gly Asp Asp

Phe

Lys Asp

575

580

585

aag

eta

aac

ctg

aag

gag

tct

gat

gac

tct

gtg

aac

aca

gaa

gac

agg

2308

Lys

Leu

Asn

Leu

Lys

Glu

Ser

Asp Asp

Ser

Val

Asn

Thr

Glu

Asp Arg

590

595

600

atc

tta

aaa

cca

tgt

tcc

acc

ccc agt

gac

aag

ttg gtg

att

gac

aag

2356

Ile

Leu

Lys

Pro

Cys

Ser

Thr

Pro

Ser

Asp

Lys

Leu

Val

Ile

Asp

Lys

605

610

615

620

ttg gtg

gtg

aac

ttt

ggg

aat

gtt ctg

caa

gaa

att

ttc

aca

gat

gaa

2404

Leu

Val

Val

Asn

Phe

Gly

Asn

Val

Leu

Gin

Glu

Ile

Phe

Thr

Asp

Glu

625

630

635

gcc

aga

acg

ggt

cag

gaa

aac

aat

tta

gga

ggg

gaa

•aag

aat

ggg

act

2452

Ala

Arg

Thr

Gly

Gin

Glu

Asn

Asn

Leu

Gly

Gly

Glu

Lys

Asn

Gly

Thr

640

645

650

aga

att

ctg

tct

tcc

tgc

cca

act

tca

ata

taagtgtgga ctaaaatgcg

2502

Arg

Ile

Leu

Ser

Ser

Cys

Pro

Thr

Ser

Ile

655

660

agaaaggtgt cctgtggtct atgcaaatta gaaaggacat gcagagtttt ccaactagga 2562 agactgaatc tgtggcccca agagaaccat ctctgaagac tgggtatgtg gtcttttcca 2622 cacatggacc acctacggat gcaatctgta atgcatgtgc atgagaagtc tgttattaag 2682 tagagtgtga aaacatggtt atggtaatag gaacagcttt taaaatgctt ttgtatttgg 2742 gcctttcata caaaaaagcc ataataccat tttcatgtaa tgctatactt ctatactatt 2802 ttcatgtaat actatacttc tatactattt tcatgtaata ctatacttct atactatttt 2862 catgtaatac tatacttcta tattaaagtt ttacccactc a 2903 <210> 5 <211> 662 <212> PRT

130

PL 211 833 B1

<

!13>

Homo.sapiens

i00>

5

Met

Lys

Leu

Ser

Pro

Gin

Pro

Ser

Cys

Val

Asn

Leu

Gly

Met

Met

Trp

1

5

10

15

Thr

Trp

Ala

Leu

Trp

Met

Leu

Pro

Ser

Leu

Cys

Lys

Phe

Ser

Leu

Ala

20

25

30

Ala

Leu

Pro

Ala

Lys

Pro

Glu

Asn

Ile

Ser

Cys

Val

Tyr

Tyr

Tyr

Arg

35

40

45

Lys

Asn

Leu

-Thr

Cys

Thr'

Trp

Ser

Pro

Gly

Lys

Glu

Thr

Ser

Tyr

Thr

50

55

60

Gin

Tyr

Thr

Va1

Lys

Arg

Thr

Tyr

Ala

Phe

Gly

Glu

Lys

His

Asp

Asn

65

70

75

80

Cys

Thr

Thr

Asn

Ser

Ser

Thr

Ser

Glu

Asn

Arg

Ala

Ser

Cys

Ser

Phe

85

90

95

Phe

Leu

Pro

Arg

ile

Thr

Ile

Pro

Asp

Asn

Tyr

Thr

Ile

Glu

Val

Glu

100

105

110

Ala

Glu

Asn

Gly

Asp

Gly

Val

Ile

Lys

Ser

His

Met

Thr

Tyr

Trp

Arg

115

120

125

Leu

Glu

Asn

Ile

Ala

Lys

Thr

Glu

Pro

Pro

Lys

Ile

Phe

Arg

Val

Lys

130

135

140

Pro

Val

Leu

Gly

Ile

Lys

Arg

Met

Ile

Gin

Ile

Glu

Trp

Ile

Lys

Pro

145

150

155

160

Glu

Leu

Ala

Pro

Val

Ser

Ser

Asp

Leu

Lys

Tyr

Thr

Leu

Arg

Phe

Arg

165

170

175

Thr

Val

Asn

Ser

Thr

Ser

Trp

Met

Glu

Val

Asn

Phe

Ala

Lys

Asn

Arg

180

185

190

.Lys

Asp

Lys

Asn

Gin

Thr

Tyr

Asn

Leu

Thr

Gly

Leu

Gin

Pro

Phe

Thr

195

200

205

Glu

Tyr

Val

Ile

Ala

Leu

Arg

Cys

Ala

Val

Lys

Glu

Ser

Lys

Phe

Trp

210

215

220

Ser

Asp

Trp

Ser

Gin

Glu

Lys

Met

Gly

Met

Thr

Glu

Glu

Glu

Ala

Pro

225

230

235

240

Cys

Gly

Leu

Glu

Leu

Trp

Arg

Val

Leu

Lys

Pro

Ala

Glu

Ala

Asp

Gly

245

250

255

Arg

Arg

Pro

Val

Arg

Leu

Leu

Trp

Lys

Lys

Ala

Arg

Gly

Ala

Pro

Val

260

265

270

Leu

Glu

Lys

Thr

Leu

Gly

Tyr

Asn

Ile

Trp

Tyr

Tyr

Pro

Glu

Ser

Asn

275

280

285

Thr

Asn

Leu

Thr

Glu

Thr

Met

Asn

Thr

Thr

Asn

Gin

Gin

Leu

Glu

Leu

290

295

300

His

Leu

Gly

Gly

Glu

Ser

Phe

Trp

Val

Ser

Met

Ile

Ser

Tyr

Asn

Ser

305 310 315 320

PL 211 833 B1

131

Leu

Gly

Lys Ser

Pro 325

Yal Ala łhr Leu

Arg Ile Pro Ala Ile Gin Glu

330

'335

Lys

Ser

Phe

Gin

Cys

Ile

Glu

Yal

Met

Gin

Al a

Cy.s

Val

Ala

Glu

Asp

340

345

350

Gin

Leu

Yal

Val

Lys

Trp

Gin

Ser

Ser

Ala

Leu

Asp

Val

Asn

Thr

Trp

355

360

365

Met

Ile

Glu

Trp

Phe

Pro

Asp

Va1

Asp

Ser

Glu

Pro

Thr

Thr

Leu

Ser

370

375

380

Trp

Glu

Ser

Yal

Ser

Gin

Ala

Thr

Asn

Trp

Thr

Ile

Gin

Gin

Asp Lys

385

390

395

400

Leu

Lys

Pro

Phe

Trp

Cys Tyr

Asn

Ile

Ser

Yal

Tyr

Pro

Met

Leu

His

405

410

415

Asp

Lys

Val

Gly

Glu

Pro

Tyr

Ser

Ile

Gin

Ala

Tyr

Ala

Lys

Glu

Gly

420

425

430

Yal

Pro

Ser

Glu

Gly

Pro

G-lu

Thr

Lys

Val

Glu

Asn

Ile

Gly

Yal

Lys

435

440

445

Thr

Yal

Thr

Ile

Thr

Trp Lys

Glu

Ile

Pro

Lys

Ser

Glu

Arg

Lys Gly

450

455

460

Ile

Ile

Cys

Asn

Tyr

Thr

Ile

Phe

Tyr

Gin

Ala

Glu

Gly Gly

Lys Gly

465

470

475

480

Phe

Ser

Lys

Thr

Val

Asn

Ser

Ser

Ile

Leu

Gin

Tyr Gly

Leu

Glu

Ser

485

490

495

Leu

Lys Arg Lys

Thr

Ser

Tyr

Ile

Val

Gin

Va?

Met

Al a

Ser

Thr

Ser

500

505

510

Ala

Gly Gly

Thr

Asn

Gly

Thr

Ser

Ile

Asn

Phe

Lys

Thr

Leu

Ser

Phe

515

520

525

Ser

Val

Phe

Glu

Ile

Ile

Leu

Ile

Thr

Ser

Leu

Ile

Gly Gly Gly·

Leu

530

535

540

Leu

Ile

Leu

Ile

Ile

Leu

Thr Val

Ala

Tyr Gly

Leu

Lys

Lys

Pro

Asn

545

550

555

560-

Lys

Leu

Thr

His

Leu

Cys Trp Pro

Thr

Yal

Pro

Asn

Pro

Ala

Glu

Ser

565

570

575

Ser

Ile

Ala

Thr

Trp

His

Gly Asp Asp

Phe

Lys

Asp Lys

Leu

Asn

Leu

580

585

590

Lys

Glu

Ser

Asp Asp

Ser

Yal

Asn

Thr

Glu

Asp Arg

Ile

Leu

Lys

Pro

595

600

605

Cys

Ser

Thr

Pro

Ser

Asp Lyś

Leu

Yal

Ile

Asp Lys

Leu

Val

Val

Asn

610

615

620

Phe

Gly

Asn

Yal

Leu

Gin

Glu

Ile

Phe

Thr

Asp

Glu

Ala

Arg

Thr

Gly

625

630

635

640

Gir

Glu Asn

Asn

Leu

Gly

Gly

Glu

Lys

Asn

Gly

Thr

Arg

Ile

Leu

Ser

645

650

655

Ser

Cys Pro

Thr

Ser

Ile

132

PL 211 833 B1

660 <210> 6 <211> 2964 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<221> TD5 <222> (13)...(2949) <400> 6 gaattcgcca cc atg gct eta ttt gca gtc ttt cag aca aca ttc ttc tta 51 Met Ala. Leu Phe Ala Val Phe Gin Thr Thr Phe Phe Leu

5 10

aca ttg ctg Thr Leu Leu 15

tcc ttg

agg Arg

act tac cag agt gaa gtc ttg gct gaa cgt

99

Ser

Leu

Thr 20

Tyr

Gin

Ser Glu

Val 25

Leu

Al a

Glu

Arg

tta

cca

ttg

act

cct

gta

tca

ctt

aaa

gtt

tcc

acc

aat

tct

acg

cgt

147

Leu

Pro

Leu

Thr

Pro

Val

Ser

Leu

Lys

Val

Ser

Thr·

Asn

Ser

Thr

Arg

30

35

40

45

cag

agt

ttg

cac

tta

caa

tgg

act

gtc

cac

aac

ctt

cct

tat

cat

cag

195

Gin

Ser

Leu

His

Leu

Gin

Trp

Thr

Val

His

Asn

Leu

Pro

Tyr

His

Gin

50

55

60

gaa

ttg

aaa

atg gta

ttt

cag

atc

cag

atc

agt

agg

att

gaa·

aca

tcc

243

Glu

Leu

Lys

Met Val

Phe

Gin

Ile

Gin

Ile

Ser

Arg

Ile

Glu

Thr

Ser

65

70

75

aat

gtc

atc

tgg gtg

ggg

aat

tac

agc

acc

act

gtg

aag

tgg

aac

cag

291

Asn

Val

Ile Trp

Val

Gly

Asn

Tyr

Ser

Thr

Thr

Val

Lys

Trp

Asn

Gin

80

85

90

gtt

ctg

cat

tgg

agc

tgg

gaa

tct

gag

ctc

cct

ttg

gaa

tgt

gcc

aca

339

Val

Leu

His

Trp

Ser

Trp

Glu

Ser

Glu

Leu

Pro

Leu

Glu

Cys.

Ala

Thr

95

100

105

cac

ttt

gta

aga

ata

aag

agt

ttg

gtg

gac

gat

gcc

aag

ttc

cct

gag

387

Hi s

Phe

Val

Arg

Ile

Lys

Ser

Leu

Val

Asp Asp

Ala

Lys

Phe

Pro

Glu

PL 211 833 B1

133

110

115

120

125

cca

aat

ttc

tgg

age

aac

tgg

agt

tcc

tgg

gag

ga?

gtc

agt

gta

caa

435

Pro

Asn

Phe

Trp

Ser

Asn

Trp

Ser

Ser

Trp

Glu

Glu

Val

Ser

Val

Gin

130

135

140

gat

tct

act

gga

cag

gat

ata

ttg

ttc

gtt

ttc

cct

aaa

gat

aag

ctg

483

Asp

Ser

Thr

Gly

Gin

Asp

Ile

Leu

Phe

Val

Phe

Pro

Lys

Asp

Lys

Leu

145

150

155

gtg

gaa

gaa

ggc

acc

aat

gtt

acc

att

tgt

tac

gtt

tct

agg

aac

att

531

Val

Glu

Glu

Gly

Thr

Asn

Val

Thr

Ile

Cys

Tyr

Val

Ser

Arg

Asn

Ile

160

165

170

caa

aat

aat

gta

tcc.

tgt

tat

ttg

gaa

ggg

aaa

cag

att

cat

gga

gaa

579

Gin

Asn

Asn

Val

Ser

Cys

Tyr

Leu

Glu

Gly

Lys

Gin

Ile

His

Gly

Glu

175

180

185

caa

ctt

gat

cca

cat

gta

act

gca

ttc

aac

ttg

aat

agt

gtg

cct

ttc

627

Gin

Leu

Asp

Pro

His

Val

Thr

Ala

Phe

Asn

Leu

Asn

Ser

Val

Pro

Phe

190

195

200

205

att

agg

aat

aaa

ggg

aca

aat

atc

tat

tgt

gag

gca

agt

caa

gga

aat

675

Ile

Arg

Asn

Lys

Gly

Thr

Asn

Ile

Tyr

Cys

Glu

Ala

Ser

Gin

Gly

Asn

210

215

220

gtc

agt

gaa

ggc

atg

aaa

ggc

atc

gtt

ctt

ttt

gtc

tea

aaa

gta

ctt

723

Val

Ser

Glu

Gly

Met

Lys

Gly

Ile

Val

Leu

Phe

Val

Ser

lys

Val

Leu

225

230

235

gag

gag

ccc

aag

gac

ttt

tct

tgt

gaa

acc

gag

gac

ttc

aag

act

ttg

771

Glu

Glu

Pro

Lys

Asp

Phe

Ser

Cys

Glu

Thr

Glu

Asp

Phe

Lys

Thr

Leu

240

245

250

cac

tgt

act

tgg

gat

cct

ggg

acg

gac

act

gcc

ttg

ggg

tgg

tct

aaa

819

His

Cys

Thr

Trp

Asp

Pro

Gly

Thr

Asp

Thr

Ala

Leu

Gly

Trp

Ser

Lys

255

260

265

caa

cct

tcc

caa

age

tac

act

tta

ttt

gaa

tea

ttt

tct

ggg

gaa

aag

867

Gin

Pro

Ser

Gin

'Ser

Tyr

Thr

Leu

Phe

Glu

Ser

Phe

Ser

Gly

Glu

Lys

270

275

280

285

aaa

ctt

tgt

aca

cac

aaa

aac

tgg

tgt

aat

tgg

caa

ata

act

caa

gac

915

134

PL 211 833 B1

Lys

Leu Cys Thr

His 290

Lys

Asn

Trp Cys Asn Trp Gin Ile Thr Gin Asp

295

300

tea

caa

gaa

acc

tat

aac

ttc

aca

ctc

ata

get

gaa

aat

tac

tta

agg

963

Ser

Gin

Glu

Thr

Tyr

Asn

Phe

Thr

Leu

Ile

Ala

Glu

Asn

Tyr

Leu

Arg

305

310

315

aag

aga

agt

gtc

aat

atc

ctt

ttt

aac

ctg

act

cat

ega

gtt

tat

tta

1011

Lys Arg

Ser

Va1

Asn

Hę

Leu

Phe

Asn

Leu

Thr

His

Arg

Val

Tyr

Leu

320

325

330

atg

aat

cct

ttt

agt gtc

aac

ttt

gaa

aat

gta

aat

gcc

aca

aat

gcc

1059

Met

Asn

Pro

Phe'

Ser

Val

Asn

Phe

Glu

Asn

Val

Asn

Ala

Thr

Asn

Ala

335

340

345

atc

atg

acc

tgg

aag

gtg

cac

tcc

ata

agg

aat

aat

ttc

aca

tat

ttg

1107

Ile

Met

Thr Trp Lys

Val

His

Ser

Ile

Arg

Asn Asn

Phe

Thr

Tyr

Leu

350

355

360

365

tgt

cag

att

gaa

ctc

cat

ggt

gaa

gga

aaa

atg

atg

caa

tac

aat

gtt

1155

Cys

Gin

Ile

Glu

Leu

His

Gly

Glu

Gly

Lys

Met

Met

Gin

Tyr

Asn

Val

370

375

380

tcc

atc

aag

gtg

aac

ggt

gag

tac

ttc

tta

agt

gaa

ctg

gaa

QCt

gcc

1203

Ser

Ile

Lys

Val

Asn

Gly

Glu

Tyr

Phe

Leu

Ser

Glu

Leu

Glu

Pro

Ala

385

390

395

aca

gag

tac

atg

gcg

ega

gta

cgg

tgt

get

gat

gcc

agc

cac

ttc

tgg

1251

Thr

Glu

Tyr

Met

Ala

Arg

Val

Arg

Cys

Ala

Asp

Al a

Ser

His

Phe

Trp

400

405

410

aaa

tgg

agt

gaa

tgg

agt

ggt

cag

aac

ttc

acc

aca

ctt

gaa

get

get

1299

Lys

Trp

Ser Glu

Trp

Ser

Gly

Gin

Asn

Phe·

Thr

Thr

Leu

Glu

Ala

Ala

415

420

425

ccc

tea

gag

gcc

Cct

gat

gtc

tgg

aga

att

gtg

agc

ttg

gag

cca

gga

1347

Pro

Ser

Glu

Al a

Pro

Asp

Val

Trp Arg

Ile

Val

Ser

Leu

Glu

Pro

Gly

430

435

440

445

aat

cat

act

gtg

acc

tta

ttc

tgg aag

cca

tta

tea

aaa

ctg

cat

gcc

1395

Asn

His

Thr

Val

Thr

Leu

Phe

Trp Lys

Pro

Leu

Ser

Lys

Leu

His

Ala

450

455

460

PL 211 833 B1

135

aat gga aag atc Asn Gly Lys Ile

ctg ttc tat

aat gta gtt gta gaa aac eta gac aaa Asn Val Val Val Glu Asn Leu 'Asp Lys

1443

Leu Phe

Tyr

465

470

475 '

cca

tcc agt

tca

gag

ctc

cat

tcc

att

cca

gca

cca

gcc

aac agc aca

1491

Pro

Ser Ser

Ser

Glu

Leu

His

Ser

Ile

Pro

Ala

Pro

Al a

Asn Ser Thr

480 485 490

aaa eta Lys Leu

atc I-le

ctt gac

agg Arg

tgt Cys 500

tcc tac caa atc tgc gtc ata gcc aac

1539

Leu

Asp

Ser

Tyr

Gin

Ile

Cys Val 505

Ile

Ala

Asn

495

aac

agt

gtg

ggt

gct

tct

cct

gct

tct

gta

ata

gtc

atc

tct

gca

gac

1587

Asn

Ser

Val

Gly

Ala

Ser

Pro

Ala

Ser

Val

Ile

Val

Ile

Ser

Ala

Asp

510

515

520

525

ccc

gaa

aac

aaa

gag

gtt

gag

gaa

gaa

aga

att

gca

ggc

aca

gag

ggt

1635

Pro

Glu

Asn

Lys

Glu

Val

Glu

Glu

Glu

Arg

Ile

Ala

Gly

Thr

Glu

Gly

530

535

540

gga

ttc

tct

ctg

tct

tgg

aaa

ccc

caa

cct

gga

gat

gtt

ata

ggc

tat

1683

Gly

Phe

Ser

Leu

Ser

Trp

Lys

Pro

Gin

Pro

Gly

Asp

Val

Ile

Gly

Tyr

545 550 555

gtt

gtg

gac

tgg

tgt

gac

cat

acc

cag

gat

gtg

ctc

ggt gat

ttc

cag

1731

Val

Val

Asp

Trp

Cys

Asp

His

Thr

Gin

Asp

Val

Leu

Gly Asp

Phe

Gin

560

565

570

tgg

aag

aat

gta

ggt

ccc

aat

acc

aca

agc

aca

gtc

att agc

aca

gat

1779

Trp

Lys

Asn

Val

Gly

Pro

Asn

Thr

Thr

Ser

Thr

Val

Ile Ser

Thr

Asr.

575 580 585

gct

ttt

agg

cca

gga

gtt

ega

tat

gac

ttc

aga

att

tat

ggg

tta

tct

Ala

Phe

Arg

Pro

Gly

Val

Arg

Tyr

Asp

Phe

Arg

Ile

Tyr

Gly

Leu

Ser

590

595

600

605

aca

aaa

agg

att

gct

tgt

tta'

tta

gag

aaa

aaa

aca

gga

tac

tct

cag

Thr

Lys

Arg

Ile

Ala

Cys

Leu

Leu

Glu

Lys

Lys

Thr

Gly

Tyr

Ser

Gin

610 615 620.

gaa ctt gct cct tca gac aac cct cac gtg ctg gtg gat aca ttg aca 1923

Glu Leu Ala Pro Ser Asp Asn Pro His Val Leu Val Asp Thn Leu Thr

625 630 635

136

PL 211 833 B1

tcc cac tcc

ttc act

ctg agt Leu Ser

tgg aaa gat tac tct. act gaa

tct caa Ser Gin

1971

Ser

Hi s

Ser 640

Phe

Thr

Trp Lys 645

Asp Tyr

Ser

Thr 650

Glu

cct

ggt

ttt

ata

caa

ggg

tac

cat

gtc

tat

ctg

aaa

tcc

aag

gcg

agg

2019

Pro

Gly

Phe

Ile

Gin

Gly Tyr

His

Val

Tyr

Leu

Lys

Ser

Lys

Al a

Arg

655

660

665

cag

tgc

cac

tca

ega

ttt

gaa

aag·

gca

gtt

ctt

tca

gat ggt

tca

gaa

2067

Gin

Cys

His

Pro

Arg

Phe

Glu

Lys

Ala

Val

Leu

Ser

Asp Gly

Ser

Glu

670

675

680

685

tgt

tgc

aaa

tac

aaa

att

gac

aac

ccg

gaa·

gaa

aag

gca

ttg

att

gtg

2115

Cys

Cys

Lys Tyr

Lys

Ile

Asp -Asn

Pro Glu

Glu

Lys

Ala

Leu

Ile

Val

690

695

700

gac

aac

eta

aag

cca

gaa

tcc

ttc

tat

gag

ttt

ttc

atc

act

cca

ttc

2163

Asp

Asn

Leu

Lys

Pro

Glu

Ser

Phe

Tyr

Glu

Phe

Phe

Ile

Thr

Pro

Phe

705

710

715

act

agt

gct

ggt

gaa

ggc

ccc

agt

gct

acg

ttc

acg

aag

gtc

acg

act

2211

Thr

Ser

Ala

Gly

Glu

Gly

Pro

Ser

Ala

Thr

Phe

Thr

Lys

Val

Thr

Thr

720

725

730

ccg

gat

gaa

cac

tcc

tcg

atg

ctg

att

cat

atc

eta

ctg

ccc

atg gtt

2259

Pro

Asp

Glu

His

Ser

Ser

Met

Leu

Ile

His

Ile

Leu

Leu

Pro

Met

Val

735

740

745

ttć

tgc

gtc

ttg

ctc

atc

atg gtc

atg

tgc

tac

ttg

aaa

agt.

cag

tgg

2307

Phe

Cys

Val

Leu

Leu

Ile

Met

Val

Met

Cys

Tyr

Leu

Lys

Ser

Gin

Trp

750

755

760

765

atc

aag

gag

acc

tgt

tat

cct

gac

atc

cct

gac

cct

tac

aag

agc

agc

2355

Ile

Lys

Glu

Thr

Cys

Tyr

Pro

Asp

Ile

Pro

Asp

Pro

Tyr Lys

Ser

Ser

770

775

780

atc

ctg

tca

tta

ata

.aaa

ttc

aag

gag

aac

cct

cac

eta

ata

ata

atg

2403

Ile

Leu

Ser

Leu

Ile

Lys

Phe

Lys

Glu

Asn

Pro

His

Leu

Ile

Ile

Met

785

790

795

aat

gtc

agt

gac

tgt

atc

cca

gat

gct

att

gaa

gtt gta

agc

aag

cca

2451

Asn

Val

Ser

Asp Cys

Ile

Pro

Asp

Ala

Ile

Glu

Val

Val

Ser

Lys

Pro

PL 211 833 B1

137

800 805 810

gaa ggg aca aag

ata Ile

cag ttc eta ggc act agg aag tca ctc

aca Thr

gaa Glu

2499

Glu Gly 815

Thr

Lys

Gin

Phe 820

Leu

Gly Thr Arg

Lys 825

Ser

Leu

acc

gag

ttg

act

aag

cct

aac

tac

ctt

tat

ctc

ctt

cca

aca

gaa

aag

2547

Thr

Glu

Leu

Thr

Lys

Pro

Asn

Tyr

Leu

Tyr

Leu

Leu

Pro

Thr

Glu

Lys

830

835

840

845

aat

cac

tct

ggc

cct

ggc

ccc

tgc

atc

tgt

ttt

gag

aac

ttg

acc

tat

2595

Asn

His

Ser

Gly

Pro

Gly

Pro

Cys

Ile

Cys

Phe

Glu

Asn

Leu

Thr

Tyr

850

855

860

aac

cag

gca

gct

tct

gac

tct

ggc

tct

tgt

ggc

cat

gtt

cca

gta

tcc

2643

Asn

Gin

Al a

Ala

Ser

Asp

Ser

Gly

Ser

Cys

Gly

His

Val

Pro

Val

Ser

865

870

875

cca

aaa

gcc

cca

agt

atg ctg

gga

eta

atg

acc

tca

cct

gaa

aat

gta

2691

Pro

Lys

Al a

Pro

Ser

Met

Leu

Gly

Leu

Met Thr

Ser

Pro

Glu

Asn

Val

880

885

890

eta

aag

gca

eta

gaa

aaa

aac

tac

atg

aac

tcc

ctg

gga

gaa

atc

cca

2739

Leu

Lys

Ala

Leu

Glu

Lys

Asn

Tyr

Met

Asn

Ser

Leu

Gly

Glu

Ile

Pro

895

900

905

gct

gga

gaa

aca

agt ttg

aat

tat

gtg

tcc

cag

ttg

gct

tca

ccc

-atg

2787

Ala

Gly

Glu

Thr

Ser

Leu

Asn

Tyr

Val

Ser

Gin

Leu

Ala

Ser

Pro

Met

910

915

920

925

ttt

gga

gac

aag

gac

agt

ctc

cca

aca

aac

cca

gta

gag

gca

cca

cac

2835

Phe

Gly

Asp Lys

Asp

Ser

Leu

Pro

Thr

Asn

Pro

Val

Glu

Ala

Pro

His

930

935

940

tgt

tca

gag

tat

aaa

atg

caa

atg

gca

gtc

tcc

ctg

cgt

ctt

gcc

ttg

2883

Cys

Ser

Glu

Tyr

Lys

Met

Gin

Met

Ala

Val

Ser

Leu

Arg

Leu

Ala

Leu

945

950

955

cct

ccc

ccg

acc

gag

aat

agc

agc

ctc

tcc

tca

att

acc

ctt

tta

gat

2931

Pro

Pro

Pro

Thr

Glu

Asn

Ser

Ser

Leu

Ser

Ser

Ile

Thr

Leu

Leu

Asp

960

965

970

cca

ggt

gaa

cac

tac

tgc

taaccagcac

tegag

2964

138

PL 211 833 B1

Pro Gly Glu His Tyr Cys 975 <210> 7 <211> 979 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> '7

Met

Ala

Leu

Phe

Ala

Val

Phe

Gin

Thr

Thr

Phe

Phe

Leu

Thr

Leu

Leu

1

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Thr'

Tyr

Gin

Ser

Glu

Val

Leu

Ala

Glu

Arg

Leu

Pro

Leu

20

25

30

Thr

Pro

Val

Ser

Leu

Lys

Val-

Ser

Thr

Asn

Ser

Thr

Arg

Gin

Ser

Leu

35

40

45

His

Leu

Gin

Trp

Thr

Val

His

Asn

Leu

Pro

Tyr

His

Gin

Glu

Leu

Lys

50

55

60

Met

Val

Phe

Gin

Ile

Gin

Ile

Ser

Arg

Ile

Glu

Thr

Ser

Asn

Val

Ile

65

70

75

80

Trp

Val

Gly

Asn

Tyr

Ser

Thr

Thr

Val

Lys

Trp

Asn

Gin

Val

Leu

His

85

90

95

Trp

Ser

Trp

Glu

Ser

Glu

Leu

Pro

Leu

Glu

Cys

Ala

Thr

His

Phe

Val

100

105

110

Arg

Ile

Lys

Ser

Leu

Val

Asp

Asp

Ala

Lys

Phe

Pro

Glu

Pro

Asn

Phe

115

120

125

Trp

Ser

Asn

Trp

Ser

Ser

Trp

GI u

Glu

Val

Ser

Val

Gin

Asp

Ser

Thr

130

135

140

Gly

Gin

Asp

Ile

Leu

Phe

Val

Phe

Pro

Lys

Asp

Lys

Leu

Val

Glu

Glu

145

150

155

160

Gly

Thr

Asn

Val

Thr

Ile

Cys

Tyr

Val

Ser

Arg

Asn

Ile

Gin

Asn

Asn

165

170

175

Val

Ser

Cys

Tyr

Leu

Glu

Gly

Lys

Gin

Ile

His

Gly

Glu

Gin

Leu

Asp

180

185

190

Pro

His

Val

Thr

Al a

Phe

Asn

Leu

Asn

Ser

Val

Pro

Phe

Ile

Arg

Asn

195

200

205

Lys

Gly

Thr

Asn

ile

Tyr

Cys

Glu

Ala

Ser

Gin

Gly

Asn

Val

Ser

Glu

210

215

220

Gly

Met

Lys

Gly

Ile

Val

Leu

Phe

Val

Ser

Lys

Val

Leu

Glu

Glu

Pro

225

230

235

240

Lys

Asp

Phe

Ser

Cys

Glu

Thr

Glu

Asp

Phe

Lys

Thr

Leu

His

Cys

Thr

245

250

255

Trp

Asp

Pro

Gly

Thr

Asp

Thr

Al a

Leu

Gly

Trp

Ser

Lys

Gin

Pro

Ser

PL 211 833 B1

139

260

265

270

Gin

Ser

Tyr

Thr

Leu

Phe

Glu

Ser

Phe

Ser

Gly

Glu

Lys

Lys

Leu

Cys

275

280

285

Thr

His

Lys

Asn

Trp

Cys

Asn

Trp

Gin

Ile

Thr

Gin

Asp

Ser

Gin

Glu

290

295

300

Thr

Tyr

Asn

Phe

Thr

Leu

Ile

Ala

Glu

Asn

Tyr

Leu

Arg

Lys

Arg

Ser

305

310

315

320

Yal

Asn

Ile

Leu

Phe

Asn

Leu

Thr

His

Arg

Val

Tyr

Leu

Met

Asn

Pro

325

330

335

Phe

Ser

Val

Asn

Phe

Glu

Asn

Val

Asn

Ala

Thr

Asn

Ala

Ile

Met

Thr

340

345

350

Trp

Lys

Val

His

Ser

Ile

Arg

Asn

Asn

Phe

Thr

Tyr

Leu

Cys

Gin

Ile

355

360

365

Glu

Leu

His

Gly

Glu

Gly

Lys

Met

Met

Gin

Tyr

Asn

Val

Ser

Ile

Lys

370

375

380

Yal

Asn

Gly

Glu

Tyr

Phe

Leu

Ser

Gl U

Leu

Glu

Pro

Ala

Thr

Glu

Tyr

385

390

395

400

Met

Ala

Arg

Yal

Arg

Cys

Ala

Asp

Ala

Ser

His

Phe

Trp

Lys

Trp

Ser

405

410

415

Glu

Trp

Ser

Gly

Gin

Asn

Phe

Thr

Thr

Leu

Glu

Ala

Ala

Pro

Ser

Glu

420

425

430

Al a

Pro

Asp

Yal

Trp

Arg

Ile

Val

Ser

Leu

Glu

Pro

Gly

Asn

His

Thr

435

440

445

Yal

Thr

Leu

Phe

Trp

Lys

Pro

Leu

Ser

Lys

Leu

His

Ala

Asn

Gly

Lys

450

455

460

Ile

Leu

Phe

Tyr

Asn

Val

Val

Val

Glu

Asn

Leu

Asp

Lys

Pro

Ser

Ser

465

470

475

480

Ser

Glu

Leu

His

Ser

Ile

Pro

Ala

Pro

Ala

Asn

Ser

Thr

Lys

Leu

Ile

485

490

495

Leu

Asp

Arg

Cys

Ser

Tyr

Gin

Ile

Cys

Val

Ile

Ala

Asn

Asn

Ser

Val

500

505

510

Gly

Al a

Ser

Pro

Ala

Ser

Val

Ile

Yal

Ile

Ser

Ala

Asp

Pro

Glu

Asn

515

520

525

Lys

Glu

Val

Glu

Glu

Glu

Arg

Ile

Ala

Gly

Thr

Glu

Gly

Gly

Phe

Ser

530

535

540

Leu

Ser

Trp

Lys

Pro

Gin

Pro

Gly

Asp

Val

Ile

Gly

Tyr

Yal

Val

Asp

545

550

555

56D

Trp

Cys

Asp

His

Thr

Gin

Asp

'Yal

Leu

Gly

Asp

Phe

Gin

Trp

Lys

Asn

565

570

575

Va'l

Gly

Pro

Asrl

Thr

Thr

Ser

Th

Val

Ile

Ser

Thr

Asp

Ala

Phe

Arg

580

585

590

Pro

Gly

Yal

Arg

Tyr

Asp

Phe

Arg

Ile

Tyr

Gly

Leu

Ser

Thr

Lys

Arg

595 600 605

140

PL 211 833 B1

Ile

Ala 610

Cys Leu Leu Glu

Lys Lys Thr Gly Tyr Ser

Gin Glu

Leu

Ala

615

620

Pro Ser

Asp

Asn

Pro His

Val

Leu

Val

Asp Thr

Leu

Thr

Ser

His

Ser

625

630

635

640

Phe Thr

Leu

Ser

Trp Lys Asp Tyr

Ser

Thr

Glu

Ser

Gin

Pro

Gly

Phe

645

650

655

Ile Gin

Gly Tyr

His

Val

Tyr

Leu

Lys

Ser

Lys

Ala

Arg

Gin

Cys

His

660

665

670

Pro Arg

Phe

Glu

Lys

Ala

Val

Leu

Ser

Asp Gly

Ser

Glu

Cys

Cys

Lys

675

680

685

Tyr Lys

Ile

Asp Asn

Pro

Glu

Glu

Lys

Ala

Leu

Ile

Val

Asp

Asn

Leu

690

695

700

Lys

Pro

Glu

Ser

Phe

Tyr

Glu

Phe

Phe

Ile

Thr

Pro

Phe

Thr

Ser

Ala

705

710

715

720

Gly

Glu

Gly

Pro

Ser

Ala

Thr

Phe

Thr

Lys

Val

Thr

Thr

Pro

Asp

Glu

725

730

735

His

Ser

Ser

Met

Leu

Ile

His

Ile

Leu

Leu

Pro

Met

Val

Phe

Cys

Val

740

745

750

Leu

Leu

Ile

Met

Val

Met

Cys Tyr

Leu

Lys

Ser

Gin

Trp

Ile

Lys

Glu

755

760

765

Thr

Cys Tyr

Pro

Asp

Ile

Pro

Asp

Pro

Tyr Lys

Ser

Ser

Ile

Leu

Ser

770

775

780

Leu

Ile

Lys

Phe

Lys

Glu

Asn

Pro

His

Leu

Ile

Ile

Met

Asn

Val

5er

785

790

795

800

Asp Cys

Ile

Pro Asp

Al a

Ile

Glu

Val

Val

Ser

Lys

Pro

Glu

Gly

Thr

805

810

815

Lys

Ile

Gin

Phe

Leu

Gly

Thr

Arg Lys

Ser

Leu

Thr

Glu. Thr

Glu

Leu

820

825

830

Thr

Lys

Pro

Asn

Tyr

Leu

Tyr

Leu

Leu

Pro

Thr

Glu

Lys

Asn

His

Ser

835

840

845

Gly

Pro

Gly

Pro

Cys

Ile

Cys

Phe

Glu

Asn

Leu

Thr

Tyr

Asn

Gin

Ala

850

855

860

Ala

Ser

Asp

Ser

Gly

Ser

Cys Gly

His

Val

Pro

Val

Ser

Pro

Lys

Ala

865

870

875

880

Pro

Ser

Met

Leu

Gly

Leu

Met

Thr

Ser

Pro

Glu

Asn

Val

Leu

Lys

Ala

885

890

895

Leu

Glu

Lys

Asn

Tyr

Met

Asn

Ser

Leu

Gly

Glu

Ile

Pro

Ala

Gly

Glu

900

905

910

Thr

Ser

Leu

Asn

Tyr

Val

Ser

Gin

Leu

Ala

Sevr

Pro

Met

Phe

Gly Asp

915

920

925

Lys Asp

Ser

Leu

Pro

Thr

Asn

Pro

Val

Glu

Al a

Pro

His

Cys

Ser Glu

930

935

940

Tyr Lys

Met

Gin

Met

Ala

Val

Ser

Leu

Arg

Leu

Ala

Leu

Pro

Pro Pro

PL 211 833 B1

141

945 950 955 960

Thr Glu Asn Ser Ser Leu Ser Ser Ile Thr Leu Leu Asp Pro Gly Glu

965 970 975

His Tyr Cys <210 8 <211> 2657 <210 DNA <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS <222> (133). ...(2040) <400> 8 cggaggcggc ctgccggggt ggttcggctt cccgttgccg cctcgggcgc tgtacccaga 60 gctcgaagag gagcagcgcg gccgcgcgga cccggcaagg ctgggccgga ctcggggctc 120 ccgagggacg cc atg cgg gga ggc agg ggc gcc cct ttc tgg ctg tgg ccg 171

Met Arg Gly Gly Arg Gly Ala Pro Phe Trp Leu Trp Pro 1 5 10

ctg

ccc

aag

ctg

gcg

ctg

ctg

cct

ctg

ttg

tgg

gtg

ctt

ttc

cag

cgg

219

Leu

Pro

Lys

Leu

Ala

Leu

Leu

Pro

Leu

Leu

Trp

Val

'Leu

Phe

Gin

Arg

15

20

25

acg

cgt

ccc

cag

ggc

agc

gcc

ggg

cca

ctg

cag

tgc

tac

gga

gtt

gga

267

Thr

Arg

Pro

Gin

Gly

Ser

Ala

Gly

Pro

Leu

Gin

Cys

Tyr

Gly

Val

Gly

30

35

40

45

ccc

ttg

ggc

gac

ttg

aac

tgc

tcg

tgg

gag

cct

ctt

ggg

gac

ctg

gga

315

Pro

Leu

Gly

Asp

Leu

Asn

Cys

Ser

Trp

Glu

Pro

Leu

Gly

Asp

Leu

Gly

50

55

60

gcc

ccc

tcc

gag

tta

cac

ctc

cag

agc

caa

aag

tac

cgt

tcc

aac

aaa

363

Ala

Pro

Ser

Glu

Leu

His

Leu

Gin

Ser

Gin

Lys

Tyr

Arg.

Ser

Asn

Lys

65

70

75

acc

cag

act

gtg·

gca

gtg

gca

gcc

gga

cgg

agc

tgg

gtg

gcc

att

cct

411

Thr

Gin

Thr

Val

Al a

Val

Ala

Ala

Gly

Arg

Ser

Trp

Val

Al a

Ile

Pro

80

85

90

142

PL 211 833 B1

cgg gaa cag ctc

acc atg

tct gac aaa ctc ctt gtc tgg ggc act aag

459

Arg Glu Gin 95

Leu

Thr

Met

Ser 100

Asp Lys

Leu

Leu

Val 105

Trp

Gly

Thr

Lys

gca

ggc

cag

cct

ctc

tgg

ccc

ccc

gtc

ttc

gtg

aac

eta

gaa

acc

caa

507

Ala

Gly

Gin

Pro

Leu

Trp

Pro

Pro

Val

Phe

Val

Asn

Leu

Glu

Thr

Gin

110

115

120

125

atg

aag

cca

aac

gcc

ccc

cgg

ctg

ggc

cct

gac

gtg

gac

ttt

tcc

gag

555

Met

Lys

Pro

Asn

Ala

Pro

Arg

Leu

Gly

Pro

Asp

Val

Asp

Phe

Ser

Glu

130

135

140

gat

gac

ccc

ctg

gag

gcc

act

gtc

cat

tgg

gcc

cca

cct

aca

tgg

cca

603

Asp Asp

Pro

Leu

Glu

Ala

Thr

Val

His

Trp

Ala

Pro

Pro

Thr

Trp

Pro

145

150

155

tct

cat

aaa

gtt ctg

atc

tgc

cag

ttc

cac

tac

ega

aga

tgt

cag

gag

651

Ser

His

Lys

Val

Leu

Ile

Cys

Gin

Phe

His

Tyr Arg Arg

Cys

Gin

Glu

160

165

170

gcg

gcc

tgg

acc

ctg ctg

gaa

ccg

gag

ctg

aag

acc

ata

ccc

ctg

acc

699

Al a

Ala

Trp

Thr

Leu

Leu

Glu

Pro

Glu

Leu

Lys

Thr

Ile

Pro

Leu

Thr

175

180

185

cct

gtt

gag

atc

caa

gat

ttg

gag

eta

gcc

act

ggc

tać

aaa

gtg

tat

747

Pro

Val

Glu

Ile

Gin

Asp

Leu

Glu

Leu

Ala

Thr

Gly Tyr

Lys

Val

Tyr

190

195

200

205

ggc

ege

tgc

cgg

atg

gag

aaa

gaa

gag

gat

ttg

tgg ggc

gag

tgg

age

795

Gly Arg

Cys Arg

Met

G1 u

Lys

Glu

Glu

Asp

Leu

Trp Gly

Glu Trp

Ser

210

215

220

ccc

att

ttg

tcc

ttc

cag

aca

ccg

cct

tct

gct

cca

aaa

gat

gtg

tgg

843

Pro

Ile

Leu

Ser

Phe Gin

Thr

Pro

Pro

Ser

Ala

Pro

Lys

Asp

Val

Trp

225

230

235

gta

tea

ggg

aac

ctc

tgt

ggg

acg

cct

gga

gga

gag

gaa

cct

ttg

ctt

891

Val

Ser

Gly

Asn

Leu

-Cys

Gly

Thr

Pro

Gly

Gly

Glu

Glu

Pro

Leu

Leu

240

245

250

eta

tgg

aag

gcc

cca

ggg

ccc

tgt gtg

cag

gtg

age

tac

aaa

gtc

tgg

939

Leu

Trp

Lys

Ala

Pro

Gly

Pro

Cys Val

Gin

Val

Ser

Tyr Lys

Val

Trp

255 260 265

PL 211 833 B1

143

ttc Phe 270

tgg gtt gga ggt cgt gag

ctg Leu

agt cca gaa gga att acc tgc tgc

987

Trp

Val

Gly Gly

Arg Glu 275

Ser Pro Glu 280

Gly

Ile

Thr

Cys

cys 285

tgc

tcc

eta

att

ccc

agt

ggg

gcg

gag

tgg

gcc

agg

gtg

tcc

gct

gtc

1035

Cys

Ser

Leu

Ile

Pro

Ser

Gly

Al a

Glu

Trp

Al a

Arg

Val

Ser

Ala

Val

290

295

300

aac

gcc

aca

agc

tgg

gag.

cct

ctc

acc

aac

ctc

tct

ttg

gtc

tgc

ttg

1083

Asn

Ala

Thr

Ser

Trp

Glu

Pro

Leu

Thr

Asn

Leu

Ser

Leu

Val

Cys

Leu

305

310

315

gat

tca

gcc

tct

gcc

ccc

cgt

agc

gtg

gca

gtc

agc

agc

atc

gct

ggg

1131

Asp

Ser

Ala

Ser

Ala. Pro

Arg

Ser

Val

Ala

Val

Ser

Ser

Ile

Ala

Gly

320

325

330

agc

acg

gag

eta

ctg

gtg

acc

tgg

caa

ccg

ggg

cct

ggg

gaa

cca

ctg

1179

Ser

Thr

Glu

Leu

Leu

Val

Thr

Trp

Gin

Pro

Gly

Pro

Gly

Glu

Pro

Leu

335

340

345

gag

cat

gta

gtg

gac

tgg

gct

ega

gat

ggg

gac

ccc

ctg

gag

aaa

ctc

1227

Glu

His

Val

Val

Asp Trp

Ala

Arg Asp Gly Asp

Pro

Leu

Glu

Lys

Leu

350

355

360

365

aac

tgg

gtc

cgg

ctt

ccc

cct

ggg

aac

ctc

agt

gct ctg

tta

cca

ggg

1275

Asn

Trp

Val

Arg

Leu

Pro

Pro

Gly

Asn

Leu

Ser

Ala

Leu

Leu

Pro -Gly

370

375

380

aat

ttc

act

gtc

ggg

gtc

ccc

tat

ega

atc

act

gtg

acc

gca

gtc

tct

1323

Asn

Phe

Thr

Val

Gly

Val

Pro

Tyr

Arg

Ile

Thr

Val

Thr

Al a

Val

Ser

385

390

395

gct

tca

ggc

ttg

gcc

tct

gca

tcc

tcc

gtc

tgg

ggg

ttc

agg

gag

gaa

1371

Al a

Ser

Gly

Leu

Al a

Ser

Al a

Ser

Ser

Val

Trp Gly

Phe

Arg

Glu

Glu

400

405

410

tta

gca

ccc

eta

gtg

ggg

cca

acg

ctt

tgg

ega

ctc

caa

gat

gcc

cct

1419

Leu

Al a

Pro

Leu

Val

Gly

Pro

Thr

Leu

Trp Arg

Leu

Gin

Asp

Ala

•Pro

415

420

425

cca

ggg

acc

ccc

gcc

ata

gcg

tgg

gga

gag gtc

cca

agg

cac

cag

ctt

1467

Pro

Gly

Thr

Pro

Al a

Ile

Al a

Trp

Gly

Glu

Val

Pro

Arg

Hi 5

Gin

Leu

144

PL 211 833 B1

430

435

440

445

ega

ggc

cac

ctc

acc

cac

tac

acc

ttg

tgt

gca

cąg

agt

gga

acc

agc

1515

Arg

Gly

His

Leu

Thr

His

Tyr

Thr

Leu

Cys

Ala

Gin

Ser

Gly

Thr

Ser

450

455

460

ccc

tcc

gtc

tgc

atg

aat

gtg

agt

ggc

aac

aca

cag

agt

gtc

acc

ctg

1563

Pro

Ser

Val

Cys

Met

Asn

Val

Ser

Gly

Asn

Thr

Gin

Ser

Val

Thr

Leu

465

470

475

cct

gac

ctt

cct

tgg

ggt

ccc

tgt

gag

ctg

tgg

gtg

aca

gca

tct

acc

1611

Pro

Asp

Leu

Pro

Trp

Gly

Pro

Cys

Glu

Leu

Trp

Val

Thr

Al a

Ser

Thr

480

485

490

atc

gct

gga

cag

ggc

cct

cct

ggt

ccc

atc

ctc

cgg

ctt

cat

eta

cca

1659

Ile

Ala

Gly

Gin

Gly

Pro

Pro

Gly

Pro

Ile

Leu

Arg

Leu

Hi s

Leu

Pro

495

500

505

gat

aac

acc

ctg

agg

tgg

aaa

gtt

ctg

cca

ggc

atc

eta

ttc

ttg

tgg

1707

Asp

Asn

Thr

Leu

Arg

Trp

Lys

Val

Leu

Pro

Gly

Ile

Leu

Phe

Leu

Trp

510

515

520

525

ggc

ttg

ttc

ctg

ttg

ggg

tgt

ggc

ctg

agc

ctg

gcc

acc

tct

gga

agg

1755

Gly

Leu

Phe

Leu

Leu

Gly

Cys

Gly

Leu

Ser

Leu

Ala

Thr

Ser

Gly

Arg

530

535

540

tgc

tac

cac

eta

agg

cac

aaa

gtg

ctg

ccc

cgc

tgg

gtc

tgg

gag

aaa

1803

Cys

Tyr

His

Leu

Arg

His

Lys

vai

Leu

Pro

Arg

Trp

Val

Trp

Glu

Lys

545

550

555

gtt

cct

gat

cct

gcc

aac

agc

agt

tca

ggc

cag

ccc

cac

atg

gag

caa

1851

Val

Pro

Asp

Pro

Ala

Asn

Ser

Ser

Ser

Gly

Gin

Pro

His

Met

Glu

Gin

560

565

570

gta

cct

gag

gcc

cag

ccc

ctt

ggg

gac

ttg

ccc

atc

ctg

gaa

gtg

gag

1899

Val

Pro

Glu

Ala

Gin

Pro

Leu

Gly

Asp

Leu

Pro

Ile

Leu

Glu

Val

Glu

575

580

585

gag

atg

gag

ccc

ccg

ccg

gtt

atg

gag

tcc

tcc

cag

ccc

gcc

cag

gcc

1947

Glu

Met

Glu

Pro

Pro

Pro

Val

Met

Glu

Ser

Ser

Gin

Pro

Ala

Gin

Ala

590

595

600

605

acc

gcc

ccg

ctt

gac

tct

ggg

tat

gag

aag

cac

ttc

ctg

ccc

aca

cct

1995

PL 211 833 B1

145

Thr

Ala

Pro

Leu

Asp

Ser

Gly

Tyr

Glu

Lys

His

Phe

Leu

Pro

Thr Pro

610

615

620

gag

gag

ctg

ggc

ctt

ctg

ggg

ccc

ccc

agg

cca

cag

gtt

ctg

gcc

Glu

Glu

Leu

Gly

Leu

Leu

Gly

Pro

Pro

Arg

Pro

Gin

Val

Leu

Ala

625

630

635

tgaaccacac gtctggctgg gggctgccag ccaggctaga gggatgctca tgcaggttgc 2100 accccagtcc tggattagcc ctcttgatgg atgaagacac tgaggactca gagaggctga 2160 gtcacttacc tgaggacacc ćagccaggca gagctgggat tgaaggaccc ctatagagaa 2220 gggcttggcc cccatgggga agacacggat ggaaggtgga gcaaaggaaa atacatgaaa 2280 ttgagagtgg .cagctgcctg ccaaaatctg ttccgctgta acagaactga atttggaccc 2340 cagcacagtg gctcacgcct gtaatcccag cactttggca ggccaaggtg gaaggatcac 2400 ttagagctag gagtttgaga ccagcctggg caatatagca agacccctca ctacaaaaat 2460 aaaacatcaa aaacaaaaac. aattagctgg gcatgatggc acacacctgt agtccgagcc 2520 acttgggagg ctgaggtggg aggatcggtt gagcccagga gttcgaagct gcagggacct 2580 ctgattgcac cactgcactc caggctgggt aacagaatga gaccttatct caaaaataaa 2640 caaactaata aaaagca 2657 <210> 9 <211> 636 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9

Met Arg Gly Gly Arg Gly Ala Pro Phe Trp Leu Trp Pro Leu Pro Lys 15 10 15

Leu Ala Leu Leu Pro Leu Leu Trp Val Leu Phe Gin Arg Thr Arg Pro 20 25 30

Gin Gly Ser Ala Gly Pro Leu Gin Cys Tyr Gly Val Gly Pro. Leu Gly 35 40 45

Asp Leu Asn Cys Ser Trp Glu Pro Leu Gly Asp Leu Gly Ala Pro Ser 50 55 60

Glu Leu His Leu Gin Ser Gin Lys Tyr Arg Ser Asn Lys Thr Gin Thr

70 75 80

Val Ala Val Ala Ala Gly Arg Ser Trp Val Ala Ile Pro Arg Glu Gin

90 95

Leu Thr Met Ser Asp Tys Leu Leu Val Trp Gly Thr Lys Ala Gly Gin

100 105 110.

Pro Leu Trp Pro Pro Val Phe Val Asn Leu Glu Thr Gin Met Lys Pro

115 120 125

Asn Ala Pro Arg Leu Gly Pro Asp Val Asp Phe Ser Glu Asp Asp Pro

130 135 140

146

PL 211 833 B1

Leu

Glu

Ala

Thr

Val

His

Trp

Ala

Pro

Pro

Thr

Trp

Pro

Ser

His

Lys

145

150

155

160

Val

Leu

Ile

Cys

Gin

Phe

His

Tyr

Arg

Arg

Cys

Gin

Glu

Ala

Al a

Trp

165

170

175

Thr

Leu

Leu

Glu

Pro

Glu

Leu

Lys

Thr

Ile

Pro

Leu

Thr

Pro

Val

Glu

180

185

190

Ile

Gin

Asp

Leu

Glu

Leu

Al a

Thr

Gly

Tyr

Lys

Val

Tyr

Gly

Arg

Cys

195

200

205

Arg

Met

Glu

Lys

Glu

Glu

Asp

Leu

Trp

Gly

Glu

Trp

Ser

Pro

Ile

Leu

210

215

220

Ser

Phe

Gin

Thr

Pro

Pro

Ser

Ala

Pro

Lys

Asp

Val

Trp

Val

Ser

Gly

225

230

235

240

Asn

Leu

Cys

Gly

Thr

Pro

Gly

Gly

Glu

Glu

Pro

Leu

Leu

Leu

Trp

Lys

245

250

255

Ala

Pro

Gly

Pro

Cys

Val

Gin

Val

Ser

Tyr

Lys

Val

Trp

Phe

Trp

Val

260

265

270

Gly

Gly

Arg

G1U

Leu

Ser

Pro

Glu

Gly

Ile

Thr

Cys

Cys

Cys

Ser

Leu

275

280

285

Ile

Pro

Ser

Gly

Al a

Glu

Trp

Al a

Arg

Val

Ser

Al a

Val

Asn

Ala

Thr

290

295

300

Ser

Trp

Glu

Pro

Leu

Thr

Asn

Leu

Ser

Leu

Val

Cys

Leu

Asp

Ser

Ala

305

310

315

320

Ser

Ala

Pro

Arg

Ser

Val

Al a

Val

Ser

Ser

Ile

Ala

Gly

Ser

Thr

Glu

325

330

335

Leu

Leu

Val

Thr

Trp

Gin

Pro

Gly

Pro

Gly

Glu

Pro

Leu

Glu

Hi 5

Val

340

345

350

Val

Asp

Trp

Ala

Arg

Asp

Gly

Asp

Pro

Leu

Glu

Lys

Leu

Asn

Trp

Val

355

360

365

Arg

Leu

Pro

Pro

Gly

Asn

Leu

Ser

Ala

Leu

Leu

Pro

Gly

Asn

Phe

Thr

370

375

380

Val

Gly

Val

Pro

Tyr

Arg

Ile

Thr

Val

Thr

Al a

Val

Ser

Ala

Ser

Gly

385

390

395

400

Leu

Ala

Ser

Ala

Ser

Ser

Val

Trp

Gly

Phe

Arg

Glu

Glu

Leu

Ala

Pro

405

410

415

Leu

Val

Gly

Pro

Thr

Leu

Trp

Arg

Leu

Gin

Asp

Ala

Pro

Pro

Gly

Thr

420

425

430

Pro

Ala

Ile

Ala

Trp

Gly

GIT

Val

Pro

Arg

His

Gin

Leu

Arg

Gly

His

435

440

445

Leu

Thr

His

Tyr

Thr

Leu

Cys

Ala

Gin

Ser

Gly

Thr

Ser

Pro

Ser·

Val

450

455

460

Cys

Met

Asn

Val

Ser

Gly

Asn

Thr

Gin

Ser

Val

Thn

Leu

Pro

Asp

Leu

465

470

475

480

Pro

Trp

Gly

Pro

Cys

Glu

Leu

Trp

Val

Thr

Al a

Sen

Thr

Ile

Ala

Gly

PL 211 833 B1

147

485

490

495

Gin

Gly

Pro

Pro

Gly

Pro

Ile

Leu

Arg

Leu

His

Leu

Pro

Asp

Asn

Thr

500

505

510

Leu

Arg

Trp

Lys

Val

Leu

Pro

Gly

Ile

Leu

Phe

Leu

Trp

Gly

Leu

Phe

515

520

525

Leu

Leu

Gly

Cys

Gly

Leu

Ser

Leu

Ala

Thr

Ser

Gly

Arg

Cys

Tyr

His

530

535

540

Leu

Arg

His

Lys

Val

Leu

Pro

Arg

Trp

Val

Trp

Glu

Lys

Val

Pro

Asp

545

550

555

560

Pro

Ala

Asn

Ser

Ser

Ser

Gly

Gin

Pro

His

Met

Glu

Gin

Val

Pro

Glu

565

570

575

Ala

Gin

Pro

Leu

Gly

Asp

Leu

Pro

Ile

Leu'

Glu

Val

Glu

Glu

Met

Glu

580

585

590

Pro

Pro

Pro

Val

Met

Glu

Ser

Ser

Gin

Pro

Ala

Gin

Ala

Thr

Ala

Pro

595

600

605

Leu

Asp

Ser

Gly

Tyr

Glu

Lys

His

Phe

Leu

Pro

Thr

Pro

Glu

Glu

Leu

610

615

620

Gly

Leu

Leu

Gly

Pro

Pro

Arg

Pro

Gin

Val

Leu

Ala

625

630

635

<210>

10

<211>

755

<212>

DNA

<213>

Mus

musculus

<220>

<221>

CDS

<222>

(1)

...(489)

<400>

10

atg

atc ttc

cac

aca

gga

aca

acg

aag

cct

acc

ctg

gtg

ctg

ctt

tgc

48

Met

Ile Phe

Hi s

Thr

Gly

Thr

Thr

Lys

Pro

Thr

Leu

Val

Leu

Leu

Cys

1

5

10

15

tgt

ata gga

acc

tgg

ctg

gcc

acc

tgc

agc

ttg

tcc

ttc

ggt

gcc

cca

96

Cys

Ile Gly

Thr

Trp

Leu

Al a

Thr

Cys

Ser

Leu

Ser

Phe

Gly

Ala

Pro

20

25

30

ata

tcg aag

gaa

gac

tta

aga

act

aca

att

gac

ctc

ttg

aaa

caa

gag

144

Ile

Ser Lys

Glu

Asp

Leu

Arg

Thr

Thr

Ile

Asp

Leu

Leu

Lys

Gin

Glu

40 45

148

PL 211 833 B1

tct cag

gat ctt tat aac

aac tat agc ata aag cag gca tct ggg atg

192

Ser

Gin 50

Asp Leu

Tyr

Asn

Asn 55

Tyr

Ser Ile

Lys Gin Ala 60

Ser

Gly

Met

tea

gca

gac

gaa

tea

ata

cag

ctg

ccg

tgt

ttc

agc

ctg

gac

cgg

gaa

240

Ser

Ala

Asp

Glu

Ser

Ile

Gin

Leu

Pro

Cys

Phe

Ser

Leu

Asp Arg

Glu

65

70

75

80

gca

tta

acc

aac

atc

teg

gtc

atc

ata

gca

cat

ctg

gag

aaa

gtc

aaa

288

Al a

Leu

Tłir

Asn

Ile

Ser.

Val

Ile

Ile

Ala

His

Leu

Glu

Lys

Val

Lys

85

90

95

gtg

ttg

agc

gag

aac

aca

gta gat

act

tct

tgg gtg

ata

aga

tgg

eta

336

Val

Leu

Ser

Glu

Asn

Thr

Val

Asp

Thr

Ser

Trp

Val

Ile

Arg

Trp

Leu

100

105

110

aca

aac

atc

agc

tgt

ttc

aac

cca

ctg

aat

tta

aac

att

tct

gtg

cct

384

Thr

Asn

Ile

Ser

Cys

Phe

Asn

Pro

Leu

Asn

Leu

Asn

Ile

Ser

Val

Pro

115

120

125

gga

aat

act

gat

gaa

tcc

tat

gat tgt

aaa

gtg

ttc

gtg

ctt

acg

gtt

432

Gly

Asn

Thr

Asp

Glu

Ser

Tyr Asp Cys

Lys

Val

Phe

Val

Leu

Thr

Val

130

135

140

tta

aag

cag

ttc

tea

aac

tgc atg gca

gaa

ctg

cag

get

aag

gac

aat

480

Leu

Lys

Gin

Phe

Ser

Asn

Cys Met Ala

Glu

Leu

Gin

Ala

Lys

Asp

Asn

145

150

155

160

act aca tgc tgagtgatgg gggggggggg ggtgcagtgt cctcagcagt 529

Thr Thr Cys gcctgtcctt cgagggctga gcttgcaacc caggacttaa ctccaaaggg actgtgcggt 589 cattactagt catgttattt atgtttttat tttgtccact gaaatcttgt tctgctaccc 649 tgtagggact ggaagtggca gctatattta tttatttatg tactgagttt gttaacgctc 709 catggaggag ccttcagagt ctatttaata aattatattg acatga 755

<210>	11
<211>	163
<212>	PRT
<213>	Mus musculus
<400>	11

PL 211 833 B1

149

Met

Ile

Phe

His

Thr

Gly

Thr

Thr

Lys

Pro

Thr

Leu

Yal

Leu

Leu

Cys

1

5

10

15

cys

Ile

Gly

Thr

Trp

Leu

Ala

Thr

Cys

Ser

Leu

Ser

Phe

Gly

Ala

Pro

20

25

30

Ile

Ser

Lys

Glu

Asp

Leu

Arg

Thr

Thr

Ile

Asp

Leu

Leu

Lys

Gin

Glu

35

40

45

Ser

Gin

Asp

Leu

Tyr

Asn

Asn

Tyr

Ser

Ile

Lys

Gin

Ala

Ser

Gly

Met

50

55

60

Ser

Ala

Asp

Glu

Ser

Ile

Gin

Leu

Pro

Cys

Phe

Ser

Leu

Asp

Arg

Glu

65

70

75

80

Ala

Leu

Thr

Asn

Ile

Ser

Yal

Ile

Ile

Ala

His

Leu

Glu

Lys

Val

Lys

85

90

95

Val

Leu

Ser

Glu

Asn

Thr

Yal

Asp

Thr

Ser

Trp

Val

Ile

Arg

Trp

Leu

100

105

110

Thr

Asn

Ile

Ser

Cys

Phe

Asn.

Pro

Leu

Asn

Leu

Asn

Ile

Ser

Val

Pro

115

120

125

Gly

Asn

Thr

Asp

Glu

Ser

Tyr

Asp

Cys

Lys

Yal

Phe

Yal

Leu

Thr

Val

130

135

140

Leu

Lys

Gin

Phe

Ser

Asn

Cys

Met

Ala

Glu

Leu

Gin

Al a

Lys

Asp

Asn

145

150

155

160

Thr Thr Cys <210 12 <211> 489 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220 <223> mysi zdegenerowany poi i nukl eotyd zcytorl71ig SEG ID NO:11 <221> misc_feature <222> (1)...(489) <223> n = A.T.C or G <400 12 atgathttyc ayacnggnac nacnaarccn acnytngtny tnytntgytg yathggnacn 60 tggytngcna cntgywsnyt nwsnttyggn gcnccnathw snaargarga yytnmgnacn 120 acnathgayy tnytnaarca rgarwsncar gayytntaya ayaaytayws nathaarcar 180 gcnwsnggna tgwsngcnga ygarwsnath carytnccnt gyttywsnyt ngaytngngar 240 gcnytnacna ayathwsngt nathathgcn cayytngara argtnaargt nytnwsngar 300

150

PL 211 833 B1 aayacngtng ayacnwsntg ggtnathmgn tggytnacna ayathwsntg yttyaayccn 360 ytnaayytna ayathwsngt nccnggnaay acngaygarw sntaygaytg yaargtntty 420 gtnytnacng tnytnaarca rttywsnaay tgyatggcng arytncargc naargayaay 480 acnacntgy 489 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC6673 <400> 13 gcgcaaggtg ccgttcaoag c 21 <210 14 <211» 36 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC9082 <400> 14 caatttgttg ggttttttta gcagcagtag gcccag 36 <210> 15 <211> 36 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC9083 <40 0> 15 ctgggcctac tgctgctaaa aaaaccęaac aaattg 36 <210» 16 <211» 36 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja

PL 211 833 B1

151 <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC29145 <400» 16 gcgtctagag ggttatattg aagttgggca ggaaga 36 <210> 17 <211> 8 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220 <223> Znacznik peptydowy Glu-Glu (CEE) zmodyfikowany Gly-Ser <400 17

Gly Ser Glu Tyr Met Pro Met Glu 1 6 <210> 18 <211» 33 <212> DNA <213» Sztuczna sekwencja <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC29359 <400> 18 gcgggatcca tgaagctctc tccccagcct tea 33 <210» 19 <211> 23 <212» DNA <213> Sztuczna sekwencja <220» <223> Starter oligonukleotydowy ZC27899 <400> 19 ccagaacttt gactccttga ccg 23 <210» 20 <211» 23

152

PL 211 833 B1 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC27895 <400> 20 gaagtcaact tcgctaagaa ccg 23 <2l0> 21 <211> 34 <212> DNA <213> Sz tuczna sekwencja <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC29122 <400> 21 ccgctcgagt tatattgaag ttgggcagga agac 34 <210> 22 <211> 22 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> starter oligonukleotydowy ZC29180 <400> 22 cctggagtcc ctgaaacgaa ag 22 <210 23 <211> 34 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220 <223> Star.ter ol i gonukl eotydowy ZC29122 <400> 23 ccgctcgagt tatattgaag ttgggcagga agac 34 <210> 24

PL 211 833 B1

153 <211> 20 <212» DNA <213» Sztuczna sekwencja <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC9791 <400> 24 cgttccaaca aaacccagac 20 <210> 25 <210 19 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC9793 <400> 25 tggcgttgac agcggacac 19 <210» 26 <211> 20 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC40109 <400> 26 ccattccagc accagccaac 20 <210» 27 <210 22 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC40112 <400> 27 tacaacttca atagcatctg gg 22

154

PL 211 833 B1 <210> 28 <211> 40 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC13496 <400> 28 ccctgcagtcf atcaacatgg ccaagttgac cagtgccgtt 40 <210> 29 <211> 45 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC13945 <400> 29 gcccatggac tagtttcgaa aggtcgagtg tcagtcctgc tcctc 45 <210> 30 <211> 34 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC18598 <400> 30 tttttttctc gagacttttt tttttttttt tttt 34 <210> 31 <220>

<223> Pominięta sekwencja <400> 31

000 <210> 32 <211> 10

PL 211 833 B1

155 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Znacznik peptydowy Glu-Glu (CEE) z resztą Gly-Ser <400> 32

Gly Ser Gly Gly Glu Tyr Met Pro Met Glu 1 5 10 <210> 33 <211> 33 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC29451 <400> 33 ccggaattcc cctgatacat gaagctctct ccc 33 <210> 34 <211> 33 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC29124 <400> 34 cgcggatccc tcaaagacac tgaatgacaa tgt 33 <210> 35 <211> 6 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Znacznik peptydowy Glu-Glu (CEE) bez reszty Gly-Ser

156

PL 211 833 B1 <400» 35

Glu Tyr Met Pro Met Glu 1 5 <210» 36 <2ił> a <212> PRT <213» Sztuczna sekwencja <220 <223> C-t erminalna sekwencja peptydowa FLAG <400> 36

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210» 37 <210 684 <212» DNA <213> Homo sapiens <400» 37 tcagacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aagccgaggg ggcaccgtca 60 gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 120 acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 180 gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 240 taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgąatgg caaggagtac 300 aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca tcctccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 360 aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc 420 aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 480 gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 540 tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 600 gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 660 agcctctccc tgtctccggg taaa 684 <210» 38 <210 2295 <212> DNA <213» Sztuczna sekwencja <220>

PL 211 833 B1

157 <223> Ludzki polipeptyd fuzyjny zcytor 17-FC-4 <221> CDS <222> (1)...(2295) <400> 38

atg

aag

ctc

tct

ccc

cag

cct

tca

tgt

gtt

aac

ctg

ggg

atg

atg

tgg

48

Met

Lys

Leu

Ser

Pro

Gin

Pro

Ser

Cys

Val

Asn

Leu

Gly

Met

Met

Trp

1

5

10

15

acc

tgg

gca

ctg

tgg

atg

ctc

cct

tca

ctc

tgc

aaa

ttc

agc

ctg

gca

96

Thr

Trp

Al a

Leu

Trp

Met

Leu

Pro

Ser

Leu

Cys

Lys

Phe

Ser

Leu

Ala

20

25

30

gct

ctg

cca

gct

aag

GCt

gag

aac

att

tcc

tgt

gtc

tac

tac

tat

agg

144

Ala

Leu

Pro

Al a

Lys

Pro

Glu

Asn

Ile

Ser

Cys

Val

Tyr

Tyr

Tyr

Arg

35

40

45

aaa

aat

tta

acc

tgc

act

tgg

agt

cca

gga

aag

gaa

acc

agt

tat

acc

192

Lys

Asn

Leu

Thr

Cys

Thr

Trp

Ser

Pro

Gly

Lys

Glu

Thr

Ser

Tyr

Thr

50

55

60

cag

tac

aca

gtt

aag

aga

act

tac

gct

ttt

gga

gaa

aaa

cat

gat

aat

240

Gin

Tyr

Thr

Val

Lys

Arg

Thr

Tyr

Al a

Phe

Gly

Glu

Lys

His

Asp

Asn

65

70

75

80

tgt

aca

acc

aat

agt

tct

aca

agt

gaa

aat

cgt

gct

tcg

tgc

tct

ttt

288

Cys

Thr

Thr

Asn

Ser

Ser

Thr

Ser

Glu

Asn

Arg

Ala

Ser

Cys

Ser

Phe

85

90

95

ttc

ctt

cca

aga

ata

acg

atc

-cca

gat

aat

tat

acc

att

gag

gtg

gaa

336

Phe

Leu

Pro

Arg

Ile

Thr

Ile

Pro

Asp

Asn

Tyr

Thr

Ile

Glu

Val

Glu

IDO

105

110

gct

gaa

aat

gga

gat

ggt

gta

att

aaa

tct

cat

atg

aca

tac

tgg

aga

384

Ala

Glu

Asn

Gly

Asp

Gly

Val

Ile

Lys

Ser

His

Met

Thr

Tyr

Trp

Arg

115

120

125

tta

gag

aac

ata

gcg

aaa

act

gaa

cca

cct

aag

att

ttc

cgt

gtg

aaa

432

Leu

Glu

Asn

Ile

Ala

Lys

Thr

Glu

Pro

Pro

Lys

Ile

Phe

Arg

Val

Lys

130

135

140

cca

gtt

ttg

ggc

atc

aaa

ega

atg

att

caa

att

gaa

tgg

ata

aag

cct

480

158

PL 211 833 B1

Pro 145

Val

Leu GTy

Ile

Lys Arg Met Ile Gin Ile Glu Trp Ile Lys Pro

150

155

160

gag

ttg

gcg

cct

gtt

tca

tct

gat

tta

aaa

tac

aca

ctt

ega

ttc

agg

528

Glu

Leu

Ala

Pro

Val

Ser

Ser

Asp

Leu

Lys Tyr

Thr

Leu

Arg

Phe

Arg

165

170

175

aca

gtc

aac

agt

acc

agc

tgg

atg

gaa

gtc

aac

ttc

gct

aag

aac

cgt

576

Thr

Val

Asn

Ser

Thr

Ser Trp

Met

Glu

Val

Asn

Phe

Ala

Lys

Asn

Arg

180

185

190

aag

gat

aaa

aac

caa

acg

tac

aac

ctc

acg

ggg

ctg

cag

cct

ttt

aca

624

Lys

Asp

Lys

Asn

Gin

Thr

Tyr

Asn

Leu

Thr

Gly

Leu

Gin

Pro

Phe

Thr

195

200

205

gaa

tat

gtc

ata

gct

ctg

ega

tgt

gcg

gtc

aag

gag

tca

aag

ttc

tgg

672

Glu

Tyr

Val

Ile

Ala

Leu

Arg Cys

Al a

Val

Lys

Glu

Ser

Lys

Phe

Trp

210

215

220

agt

gac

tgg

agc

caa

gaa

aaa

atg

gga

atg

act

gag

gaa

gaa

gct

cca

720

Ser

Asp Trp

Ser

Gin

Glu

Lys

Met

Gly

Met

Thr

Glu

Glu

Glu

Ala

Pro

225

230

235

240

tgt

ggc

ctg

gaa

ctg

tgg

aga

gtc

ctg

aaa

cca

gct gag

gcg

gat

gga

768

Cys

Gly

Leu

Glu

Leu

Trp Arg

Val

Leu

Lys

Pro

Ala

Glu

Ala

Asp

Gly

245

250

255

aga

agg

cca

gtg

cgg

ttg

tta

tgg

aag

aag

gca

aga

gga

gcc

cca

gtc

816

Arg Arg

Prc

Val

Arg

Leu

Leu

Trp Lys

Lys

Ala

Arg

Gly

Ala

Pro

Val

260

265

270

eta

gag

aaa

aca

ctt

ggc

tac

aac

ata

tgg

tac

tat

cca

gaa

agc

aac

864

Leu

Glu

Lys

Thr

Leu

Gly Tyr

Asn

Ile

Trp Tyr Tyr

Pro

Glu

Ser

Asn

275 280 285

act Thr

aac ctc aca Asn Leu Thr 290

gaa aca atg

aac act act aac cag cag ctt gaa ctg

912

Glu

Thr

Met 295

Asn

Thr Thr

Asn

Gin 300

Gin

Leu

Glu

Leu

cat

ctg

gga

ggc

gag

agc

ttt

tgg

gtg

tct

atg

att

tct

tat

aat

tct

960

His

Leu

Gly Gly

Glu

Ser

Phe

Trp

Val

Ser

Met

Ile

Ser

Tyr

Asn

Ser

305

310

315

320

PL 211 833 B1

159

ctt Leu

ggg aag tct cca gtg

gcc Ala

acc ctg agg att cca

gct att Ala Ile

caa Gin 335

gaa Glu

1008

Gly Lys

Ser Pro 325

Yal

Thr

Leu

Arg 330

Ile

Pro

aaa

tca

ttt

cag

tgc

att

gag

gtc

atg

cag

gcc

tgc gtt gct

gag

gac

1056

Lys

Ser

Phe

Gin

Cys

Ile

Glu

Val

Met

Gin

Ala

Cys

Val

Ala

Glu

Asp

340

345

350

cag

eta

gtg gtg

aag

tgg

caa

agc

tct

gct

eta

gac

gtg

aac

act

tgg

1104

Gin

Leu

Val

Val

Lys

Trp

G-ln

Ser

Ser

Ala

Leu

Asp

Val

Asn

Thr

Trp

355

360

365

atg

att

gaa

tgg

ttt

ccg

gat gtg

gac

tca

gag

ccc

acc

acc

ctt

tcc

1152

Met

Ile

Glu

Trp

Phe

Pro

Asp

Yal

Asp

Ser

Glu

Pro

Thr

Thr

Leu

Ser

370

375

380

tgg

gaa

tct

gtg

tct

cag

gcc

acg

aac

tgg

acg

atc

cag

caa

gat

aaa

1200

Trp

Glu

Ser

Yal

Ser

Gin

Ala

Thr

Asn

Trp

Thr

Ile

Gin

Gin

Asp

Lys

385

390

395

400

tta

aaa

ccc

ttc

tgg

tgc

tat

aac

atc

tct

gtg

tat

cca

atg

ttg

cat

1248

Leu

Lys

Pro

Phe

Trp

Cys

Tyr

Asn

Ile

Ser

Val

Tyr

Pro

Met

Leu

His

405

410

415

gac

aaa

gtt

ggc

gag

cca

tat

tcc

atc

cag

gct

tat

gcc

aaa

gaa

ggc

1296

Asp Lys

Val

Gly

Glu

Pro

Tyr

Ser

Ile

Gin

Ala

Tyr

Ala

Lys

Glu

Gly

420

425

430

gtt

cca

tca

gaa

ggt

cct

gag

acc

aag

gtg

gag

aac

att

ggc

gtg

aag

1344

Val

Pro

Ser

Glu

Gly

Pro

Glu

Thr

Lys

Yal

Glu

Asn

Ile

Gly.

Val

Lys

435

440

445

acg

gtc

acg

atc

aca

tgg

aaa

gag

att

ccc

aag

agt

gag

aga

aag

ggt

1392

Thr

Val

Thr

Ile

Thr

Trp

Lys

Glu

Ile

Pro

Lys

Ser

Glu

Arg

Lys Gly

450

455

460

atc

atc

tgc

aac

tac

acc

atc

ttt

tac

caa

gct

gaa

ggt

gga

aaa

gga

1440

Ile

Ile

Cys

Asn

Tyr

Thr

Ile

Phe

Tyr

Gin

Ala

Glu

Gly

Gly

Lys

Gly

465

470

475

480

ttc

tcc

aag

aca

gtc

ąat

tcc

agc

atc

ttg

cag

tac

ggc

ctg

gag

tcc

1488

Phe

Ser

Lys

Thr

Val

Asn

Ser

Ser

ile

Leu

Gin

Tyr Gly

Leu

Glu

Ser

485

490

495

160

PL 211 833 B1

ctg aaa ega aag

acc tct tac att gtt cag gtc atg gcc age acc

agt Ser

1536

Leu

Lys

Arg

Lys 500

Thr Ser

Tyr

Ile Val Gin 505

Val Met

Al a

Ser 510

Thr

gct

ggg

gga

acc

aac

ggg

acc

age

ata

aat

ttc

aag

aca

ttg

tea

ttc

1584

Al a

Gly

Gly

Thr

Asn

Gly

Thr

Ser

Ile

Asn

Phe

Lys

Thr

Leu

Ser

Phe

515

520

525

agt

gtc

ttt

gag

gag

ccc

aga

tct

tea

gac

aaa

act

cac

aca

tgc

cca

1632

Ser

Val

Phe

Glu

Glu

Pro

Arg

Ser

Ser

Asp

Lys

Thr

His

Thr

Cys

Pro

530

535

540

ccg

tgc

cca

gca

cct

gaa

gcc

gag

ggg

gca

ccg

tea

gtc

ttc

ctc

ttc

1680

Pro

Cys

Pro

Ala

Pra Glu

Al a

Glu

Gly

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

545

550

555

560

ccc

cca

aaa

ccc

aag gac

acc

ctc

atg

atc

tcc

cgg

acc

cct

gag

gtc

1728

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

565

570

575

aca

tgc

gtg

gtg

gtg

gac

gtg

age

cac

gaa

gac

cct

gag

gtc

aag

ttc

1776

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

580

585

590

aac

tgg

tac

gtg

gac

ggc

gtg

gag

gtg

cat

aat

gcc

aag

aca

aag

ccg

1824

Asn

Trp Tyr

Val

Asp Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

595

600

605

cgg

gag

gag

cag

tac

aac

age

acg

tac

cgt

gtg

gtc

age

gtc

ctc

acc

1872

Arg

Glu

Glu

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr Arg

Val

Val

Ser

Val

Leu

Thr

610

615

620

gtc

ctg

cac

cag

gac

tgg

ctg

aat

ggc

aag

gag

tac

aag

tgc

aag

gtc

1920

Val

Leu

His

Gin

Asp Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

625

630

635

640

tcc

aac

aaa

gcc

ctc

cca

tcc

tcc

atc

gag

aaa

acc

atc

tcc

aaa

gcc

1968

Ser

Asn

Lys

Al a

Leu

Pro

Ser

Ser

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

Ser

Lys

Ala

645

650

555

aaa

ggg

cag

ccc

ega

gaa

cca

cag

gtg

tac

acc

ctg

ccc

cca

tcc

cgg

2016

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

Pro

Ser

Arg

PL 211 833 B1

161

660

665

670

gat

gag

ctg

acc

aag

aac

cag

gtc

agc

ctg

acc

tgc

ctg

gtc

aaa

ggc

2064

Asp

Glu

Leu

Thr

lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

675

680

685

ttc

tat

ccc

agc

gac

atc

gcc

gtg

gag

tgg

gag

agc

aat

ggg

cag

ccg

2112

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

690

695

700

cag

aac

aac

tac

aag

acc

acg

cct

ccc

gtg

ctg

gac

tcc

gac

ggc

tcc

2160

Glu

Asn

Asn-

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

705

710

715

720

ttc

ttc

ctc

tac

agc

aag

ctc

•acc

gtg

gac

aag

agc

agg

tgg

cag

cag

2208

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gin

725

730

735

ggg

aac

gtc

ttc

tea

tgc

tcc

gtg

atg

cat

gag

get

ctg

cac

aac

cac

2256

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

740

745

750

tac

acg

cag

aag

agc

ctc

tcc

ctg

tct

ccg

ggt

aaa

taa

2295

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

*

755

760

<210>

39

<211>

764

<212>

PRT

<213>

Szt

uczna si

ekwe

nc ja

<22 0>

<223>

Lud:

zki

polipeptyd fu

izyjny zc

:ytor

17-

Fc-4

<400>

39

Met

Lys Leu

Ser

Pro

Gin

Pro

Ser

Cys

Val

Asn

Leu

Gly

Met

Met

Trp

1

5

10

15

Thr

Trp Al a

Leu

Trp

Met

Leu

Pro

Ser

Leu

Cys

Lys

Phe

Ser

Leu

Ala

20

25

30

Al a

Leu Pro

Ala

Lys

Pro

Glu

Asn

Ile

Ser

Cys

Val

Tyr

Tyr

Tyr

Arg

35

40

45

Lys

Asn Leu

Thr

Cys

Thr

Trp

Ser

Pro

Gly

Lys

Glu

Thr

Ser

Tyr

Thr

162

PL 211 833 B1

55 60

Gin

Tyr

Thr

Val

Lys

Arg

Thr

Tyr

Ala

Phe

Gly

Glu

Lys

His

Asp

Asn

65

70

75

80

Cys

Thr

Thr

Asn

Ser

Ser

Thr

Ser

Glu

Asn

Arg

Ala

Ser

Cys

Ser

Phe

85

90

95

Phe

Leu

Pro

Arg

Ile

Thr

Ile

Pro

Asp

Asn

Tyr

Thr

Ile

Glu

Val

Glu

100

105

110

Ala

Glu

Asn

Gly

Asp

Gly

Val

Ile

Lys

Ser

His

Met

Thr

Tyr

Trp

Arg

115

120

125

Leu

Glu

Aśn

Ile

Ala

Lys·

Thr

Glu

Pro

Pro

Lys

Ile

Phe

Arg

Val

Lys

130

135

140

Pro

Val

Leu

Gly

Ile

Lys

Arg

Met

Ile

Gin

Ile

Glu

Trp

Ile

Lys

Pro

145

150

155

160

Glu

Leu

Ala

Pro

Val

Ser

Ser

Asp

Leu

Lys

Tyr

Thr

Leu

Arg

Phe

Arg

165

170

175

Thr

Val

Asn

Ser

Thr

Ser

Trp

Met

Glu

Val

Asn

Phe

Ala

Lys

Asn

Arg

180

185

190

Lys

Asp

Lys

Asn

Gin

Thr

Tyr

Asn

Leu

Thr

Gly

Leu

Gin

Pro

Phe

Thr

195

200

205

G1 u

Tyr

Val

Ile

Ala

Leu

Arg

Cys

Ala

Val

Lys

Glu

Ser

Lys

Phe

Trp

210

215

220

Ser

Asp

Trp

Ser

Gin

Glu

Lys

Met

Gly

Met

Thr

Glu

Glu

Glu

Ala

Pro

225

230

235

240

Cys

Gly

Leu

Glu

Leu

Trp

Arg

Val

Leu

Lys

Pro

Ala

Glu

Al a

Asp

Gly

245

250

255

Arg

Arg

Pro

Val

Arg

Leu

Leu

Trp

Lys

Lys

Ala

Arg

Gly

Ala

Pro

Val

260

265

270

Leu

Glu

Lys

Thr

Leu

Gly

Tyr

Asn

Ile

Trp

Tyr

Tyr

Pro

Glu

Ser

Asn

275

280

285

Thr

Asn

Leu

Thr

Glu

Thr

Met

Asn

Thr

Thr

Asn

Gin

Gin

Leu

Glu

Leu

290

295

300

His

Leu

Gly

Gly

Glu

Ser

Phe

Trp

Val

Ser

Met

Ile

Ser

Tyr

Asn

Ser

305

310

315

320

Leu

Gly

Lys

Ser

Pro

Val

Ala

Thr

Leu

Arg

Ile

Pro

Al a

Ile

Gin

Glu

325

330

335

Lys

Ser

Phe

Gin

Cys

Ile

Glu

Val

Met

G1 n

Ala

Cys

Val

Ala

Glu

Asp

340

345

350

Gin

Leu

Val

Val

Lys

Trp

Gin

Ser

Ser

Ala

Leu

Asp

Val

Asn

Thr

Trp

355

360

365

Met

Ile

Glu

Trp

Phe

Pro

Asp

Val

Asp

Ser

Glu

Pro

Thr

Thr

Leu

Ser

370

375

380

Trp

Glu

Ser

val

Ser

Gin

Ala

Thr

Asn

Trp

Thr

Ile

Gin

Gin

Asp

Lys

385

390

395

400

PL 211 833 B1

163

Leu

Lys

Pro Phe

Trp 405

Cys Tyr Asn Ile

Ser Val Tyr Pro Met Leu His

410

415

Asp Lys

Val

Gly

Glu

Pro

Tyr

Ser

Ile

Gin

Ala

Tyr

Ala

Lys

Glu

Gly

420

425

430

Val

Pro

Ser

Glu

Gly

Pro

Glu

Thr

Lys

Val

Glu

Asn

Ile

Gly

Val

Lys

435

440

445

Thr

Val

Thr

Ile

Thr

Trp Lys

Glu

Ile

Pro

Lys

Ser

Glu

Arg Lys

Gly

450

455

460

Ile

Ile

Cys

Asn

Tyr

Thr

Ile

Phe

Tyr

Gin

Ala

Glu

Gly Gly Lys Gly

465

470

475

480

Phe

Ser

Lys

Thr

Val

Asn

Ser

Ser

Ile

Leu

Gin

Tyr Gly

Leu

Glu

Ser

485

490

495

Leu

Lys

Arg

Lyś

Thr

Ser

Tyr

Ile

Val

Gin

Val

Met Al a

Ser

Thr

Ser

500

505

510

Ala

Gly Gly

Thr

Asn

Gly

Thr

Ser

Ile

Asn

Phe

Lys

Thr

Leu

Ser

Phe

515

520

525

Ser

Val

Phe

Glu

Glu

Pro

Arg

Ser

Ser

Asp

Lys

Thr

Hi s

Thr

Cys

Pro

530

535

540

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

G1 u

Ala

Glu

Gly

Al a

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

545

550

555

560

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Va1

555

570

575

Thr

Cys

Val

Val

Val Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

Pro Glu

Val

Lys

Phe

580

585

590

Asn

Trp Tyr

Val

Asp Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

595

600

605

Arg

Glu

Glu

Gin

Tyr Asn

Ser

Thr

Tyr Arg

Val

Val

Ser

Val

Leu

Thr

610

615

620

Val

Leu

His

Gin

Asp Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr Lys Cys

Lys

Val

625

630

635

640

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ser

Ser

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

Ser

Lys

Ala

645

650

655

Lys Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

Pro

Ser

Arg

660

665

670

Asp Glu

Leu

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

675

680

685

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

690

695

700

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

Asp Gly

Ser

705

710

715

720

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg Trp Gin

Gin

725

730

735

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Al a

Leu His Asn

His

164

PL 211 833 B1

740 745 750

Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

755 760 <210> 40 <211> 34 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC29157 <400> 40 ctagtatggc cggccatgaa gctctctccc cagc 34 <210> 41 <211> 41 <212> DNA <213> Sz tuczna sekwencja <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC29150 <400> 41 gtctgaagat ctgggctcct caaagacact gaatgacaat g 41 <210> 42 <211> 21 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Starter ol1gonukleotydowy ZC41458 <400> 42 tggacctcgc actaaaatca t 21 <210> 43 <211> 22 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja

PL 211 833 B1

165 <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC41457 <400» 43 aatcacggca gagttcccac ac 22 <210» 44 <211» 100 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220».

<223> Starter oligonukleotydowy ZC12749 <400> 44 gtaccttccc gtaaatccct ccccttcccg gaattacacc cgcgtatttc ccagaaaagg 60 aactgtagat ttctaggaat tcaatccttg gccacgcgtc 100 <210> 45 <211» 100 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC12748 <400> 45 tcgagacgcg tggccaagga ttgaattcct agaaatctac agttcctttt ctgggaaata 60 cgcgggtgta attccgggaa ggggagggat ttacgggaag 100 <210> 46 <211» 20 <212> DNA <213» Sztuczna sekwencja <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC10651 <400> 46 agcttttctg cagcagctct 20 <210> 47 <211> 23

166

PL 211 833 B1 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC10565 <40 0> 47 tttgcagaaa aggttgcaaa tgc 23 <2l0> 48 <211> 25 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC14063 <400> 48 caccagacat aatagctgac agact 25 <210> 49 <211> 21 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC17574 <400> 49 ggtrttgctc agcatgcaca c 21 <210> 50 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC17600 <400> 50 catgtaggcc atgaggtcca ccac 24 <210> 51

PL 211 833 B1

167 <211> 21 <212> DNA <213» Sztuczna sekwencja <22D>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC38065 <400> 51 ctttcctggg aatctgtgtc t 21 <210» 52 <211» 18 <212» DNA <213» Sztuczna sekwencja <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC38068 <400> 52 cctccagctc tggtgctg 18 <210> 53 <211» 24 <212> DNA <213» Sztuczna sekwencja <220>

<223» Starter oligonukleotydowy ZC37877 <400 53 caaaaaaccc aacaaattga ctca 24 <210> 54 <211» 25 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <22 0>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC37876 <400> 54 catgtggcta tactactttc agcag 25

168

PL 211 833 B1 <210> 55 <211» 22 <212> DNA <213» Sztuczna sekwencja <220>

<223» Sonda receptora TaqMan® zcytorl7 <400» 55 ctgtgttggc ccaccgttcc ca 22 <210» 56 <211> 20 <212> DNA <213» Sztuczna sekwencja <220>

<223> Prosty starter rRNA <400> 56 cggctaccac atccaaggaa 20 <210> 57 <2łl> 18 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Odwrotny starter rRNA <400> 57 gctggaatta ccgcggct 18 <210> 58 <2U> 22 <212» DNA <213>Sztuczna sekwencja <220» <223> Sonda TaqMan® rRNA <400> 58 tgctggcacc agacttgccc tc 22

PL 211 833 B1

169 <210> 59 <220>

<223> Pomiηίęta sekwencja <400> 59

000 <210> '60 <211> 21 <212>‘DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223>Starter oligonukleotydowy ZC41458 <400> 60 tggacctcgc actaaaatca t 21 <210> 61 <211> 22 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC41457 <400 61 aatcacggca gagttcccac ac 22 <210> 62 <211> 19 <212> DNA ^<213^> Sztuczna sekwencja <22Q>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC41459 <400> 62 agaagggcgt gctcgtgtc 19 <21D> 63

170

PL 211 833 B1 <211> 18· <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC41460 <400 63 ccggatggct gggctgtg 18 <210 64 <211> 25 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Starter ol igonukleotydowy ZC39982 <400> 64 aatgtctgtg tagcataagg tatga 25 <210 65 <211> 22 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC39983 <400 65 cctgcctacc tgaaaaccag aa 22 <210> 66 <211> 36 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC39980 <400 66 tttgaattcg ccaccatggc tctatttgca gtcttt 36

PL 211 833 B1

171 <210> 67 <211> 28 <212» DNA <213> Sztuczna sekwencja <220» <223> Starter oligonukleotydowy ZC39981 <400> 67 ctgtctcgag tgctggttag cagtgttc 28 <210> 68 <211» 2217 <212> DNA <213» Homo sapiens <220>

<221» CDS <222> (1)...(2217) <400> 68

atg

gct

eta

ttt

gca

gtc

ttt

cag

aca

aca

ttc

ttc

tta

aca

ttg

ctg

48

Met

Ala

Leu

Phe

Ala

Val

Phe

Gin

Thr

Thr

Phe

Phe

Leu

Thr

Leu

Leu

1

5

10

15

tcc

ttg

agg

act

tac

cag

agt

gaa

gtc

ttg

gct

gaa

cgt

tta

cca

ttg

96

Ser

Leu

Arg

Thr

Tyr

Gin

Ser

Glu

Val

Leu

Ala

Glu

Arg

Leu

Pro

Leu

20

25

30

act

cct

gta

tea

ctt

aaa

gtt

tcc

acc

aat

tct

acg

cgt

cag.

agt

ttg

144

Thr

Pro

Val

Ser

Leu

Lys

Val

Ser

Thr

Asn

Ser

Thr

Arg

Gin

Ser

Leu

35

40

45

cac

tta

caa

tgg

act

gtc

cac

aac

ctt

cct

tat

cat

cag

gaa

ttg

aaa

192

His

Leu

Gin

Trp

Thr

Val

His

Asn

Leu

Pro

Tyr

His

Gin

Glu

Leu

Lys

50

55

60

atg

gta

ttt

cag

atc

cag

atc

agt

agg

att

gaa

aca

tcc

aat

gtc

atc

240

Met

Val

Phe

Gin

Ile

Gin

Ile

Ser

Arg

ile

Glu

Thr

Ser

Asn

Val

Ile

65

70

75

80

tgg

gtg

ggg

aat

tac

age

acc

act

gtg

aag

tgg

aac

cag

gtt

ctg

cat

288

Trp

Val

Gly

Asn

Tyr

Ser

Thr

Thr

Val

Lys

Trp

Asn

Gin

Val

Leu

Hi s

172

PL 211 833 B1

90 95

tgg agc tgg gaa

tct gag ctc

cct ttg gaa tgt gcc aca

cac His 110

ttt Phe

gta Val

336

Trp

Ser

Trp

Glu 100

Ser

Glu

Leu

Pro Leu 105

Glu

cys

Al a

Thr

aga

ata

aag

agt ttg

gtg

gac

gat

gcc

aag

ttc

cct

gag

cca

aat

ttc

384

Arg

Ile

Lys

Ser

Leu

Val

Asp Asp

Ala

Lys

Phe

Pro

Glu

Pro

Asn

Phe

115

120

125

tgg

agc

aac

tgg

agt

tcc

tgg gag

gaa

gtc

agt

gta

caa

gat

tct

act

432

Trp

Ser

Asn

Trp

Ser

Ser

Trp Glu

Glu

Val

Ser

Val' Gin

Asp

Ser

Thr

130

135

140

gga

cag

gat

ata

ttg

ttc

gtt

ttc.

cct

aaa

gat

aag

ctg

gtg

gaa

gaa

480

Gly

Gin

Asp

Ile

Leu

Phe

Val

Phe

Pro

Lys

Asp Lys

Leu

Val

Glu

Glu

145

150

155

160

ggc

acc

aat

gtt

acc

att

tgt

tac

gtt

tct

agg

aac

att

caa

aat

aat

528

Gly

Thr

Asn

Val

Thr

Ile

Cys Tyr

Val

Ser

Arg

Asn

Ile Gin

Asn

Asn

155

170

175

gta

tcc

tgt

tat

ttg

gaa

ggg

aaa

cag

att

cat

gga

gaa

caa

ctt

gat

575

Val

Ser

Cys

Tyr

Leu

Glu

Gly

Lys

Gin

Ile

His

Gly

Glu

Gin

Leu

Asp

180

185

190

cca

cat

gta

act

gca

ttc

aac

ttg

aat

agt

gtg

cct

ttc

att

agg

aat

624

Pro

His

Val

Thr

Ala

Phe

Asn

Leu

Asn

Ser

Val

Pro

Phe

Ile

Arg

Asn

195

200

205

aaa

ggg

aca

aat

atc

tat

tgt

gag

gca

agt

caa

gga

aat

gtc

agt

gaa

672

tys

Gly

Thr

Asn

Ile

Tyr Cys

Glu

Ala

Ser

Gin

Gly

Asn

Val

Ser

Glu

210

215

220

ggc

atg

aaa

ggc

atc

gtt

ctt

ttt

gtc

tea

aaa

gta

ctt

gag

gag

ccc

720

Gly

Met

Lys

Gly

Ile

Val

Leu

Phe

Val

Ser

Lys

Val

Leu

Glu

Glu

Pro

225

230

235

240

aag

gac

ttt

tct

tgt

gaa

acc

gag

gac

ttc

aag

act

ttg

cac

tgt

act

768

Lys Asp

Phe

Ser

Cys

Gl u

Thr

Glu

Asp

Phe

Lys

Thr

Leu

His

Cys

Thr

245

250

255

tgg gat

cct

ggg

acg

gac

act

gcc

ttg

ggg

tgg

tct

aaa

caa

cct

tcc

816

PL 211 833 B1

173

Trp Asp Pro Gly Thr Asp Thr Ala Leu Gly Trp Ser Lys Gin

Pro

Ser

260

265

270

caa

agc

tac

act

tta

ttt

gaa

tca

ttt

tct

ggg

gaa

aag

aaa

ctt

tgt

864

Gin

Ser

Tyr

Thr

Leu

Phe

Glu

Ser

Phe

Ser

Gly

Glu

Lys

Lys

Leu

Cys

275

230

285

aca

cac

aaa

aac

tgg

tgt

aat

tgg

caa

ata

act

caa

gac

tca

caa

gaa

912

Thr

His

Lys

Asn

Trp Cys

Asn

Trp

Gin

Ile

Thr

Gin

Asp

Ser

Gin

Glu

290

295

300

acc

tat

adc

ttc

aca

ctc

ata

gct

gaa

aat

tac

tta

agg

aag

aga

agt

960

Thr

Tyr

Asn

Phe

Thr

Leu

Ile

Ala

G1 u

Asn

Tyr

Leu

Arg

Lys Arg

Ser

305

310

315

320

gtc

aat

atc

ctt

ttt

aac

ctg

act

cat

ega

gtt

tat

tta

atg

aat

cct

1008

Val

Asn

Ile

Leu

Phe

Asn

Leu

Thr

His

Arg

Val

Tyr

Leu

Met

Asn

Pro

325

330

335

ttt

agt

gtc

aac

ttt

gaa

aat

gta

aat

gcc

aca

aat

gcc

atc

atg

acc

1056

Phe

Ser

Val

Asn

Phe

Glu

Asn

Val

Asn

Ala

Thr

Asn

Ala

Ile Met Thr

340

345

350

tgg

aag

gtg

cac

tcc

ata

agg

aat

aat

ttc

aca

tat

ttg

tgt

cag

att

1104

Trp

Lys

Val

His

Ser

Ile

Arg

Asn

Asn

Phe

Thr

Tyr

Leu

Cys

Gin

Ile

355

360

365

gaa

ctc

cat

ggt

gaa

gga

aaa

atg

atg

caa

tac

aat

gtt

tcc

atc

aag

1152

Glu

Leu

His

Gly

Glu

Gly

Lys

Met Met

Gin

Tyr

Asn

Val

Ser

Ile

Lys

370

375

380

gtg

aac

ggt

gag

tac

ttc

tta

agt

gaa

ctg

gaa

cct

gcc

aca

gag

tac

1200

Val

Asn

Gly

Glu

Tyr

Phe

Leu

Ser

Glu

Leu

Glu

Pro

Ala

Thr

Glu

Tyr

385

390

395

400

atg

gcg

ega

gta

cgg

tgt gct gat

gcc

agc

cac

ttc

tgg

aaa

tgg

agt

1248

Met

Ala

Arg

Val

Arg

Cys

Al a

Asp

Ala

Ser

His

Phe

Trp. Lys

Trp

Ser

405

410

415

gaa

tgg

agt

ggt

cag

aac

ttc

acc

aca

ctt

gaa

gct

gct ccc

tca

gag

1296

Glu

Trp

Ser

Gly

Gin

Asn

Phe

Thr

Thr

Leu

Glu

Ala

Ala

Pro

Ser

Glu

420 425 430

174

PL 211 833 B1

gcc Ala

cct gat

gtc tgg aga Val Trp Arg

att Ile

gtg agc ttg gag cca gga aat cat

act Thr

1344

Pro

Asp 435

Val 440

Ser Leu

Glu

pro

Gly 445

Asn

His

gtg

acc

tta

ttc

tgg aag

cca

tta

tca

aaa

ctg

cat

gcc

aat

gga

aag

1392

Val

Thr

Leu

Phe

Trp Lys

Pro

Leu

Ser

Lys

Leu

His

Ala

Asn

Gly

Lys

450

455

460

atc

ctg

ttc

tat

aat

gta gtt gta

gaa

aac

eta

gac

aaa

cca

tcc

agt

1440

Ile

Leu

Phe

Tyr

Asn

Val

Val

Val

Glu

Asn

Leu

Asp

Lys

Pro

Ser

Ser

465

470

475

480

tca

gag

ctc

cat

tcc

att

cca

gca

cca

gcc

aac

agc

aca

aaa

eta

atc

1488

Ser

Glu

Leu

His

Ser

Ile

Pro

Ala

Pro

Ala

Asn

Ser

Thr

Lys

Leu

Ile

485

490

495

ctt

gac

agg

tgt

tcc

tac

caa

atc

tgc

gtc

ata

gcc

aac

aac

agt

gtg

1536

Leu

Asp Arg Cys Ser Tyr

Gin

Ile

Cys

Val

Ile

Ala

Asn

Asn

Ser

Val

500

505

510

ggt gct

tct

cct

gct

tct

gta

ata

gtc

atc

tct

gca

gac

ccc

gaa

aac

1584

Gly

Ala

Ser

Pro

Ala

Ser

Val

Ile

Val

Ile

Ser

Ala

Asp

Pro

Glu

Asn

515

520

525

aaa

gag

gtt

gag

gaa

gaa

aga

att

gca

ggc

aca

gag

ggt

gga

ttc

tct

1632

Lys

Glu

Val

Glu

Glu

Glu

Arg

Ile

Ala

Gly

Thr

Glu

Gly Gly

Phe

Ser

530

535

540

ctg

tct

tgg

aaa

ccc

caa

cct

gga

gat

gtt

ata

ggc

tat

gtt

gtg

gac

1680

Leu

Ser

Trp Lys

Pro

Gin

Pro

Gly

Asp

Val

Ile

Gly Tyr

.Val

Val

Asp

545

550

555

560

tgg tgt

gac

cat

acc

cag

gat gtg

ctc

ggt

gat

ttc

cag

tgg

aag

aat

1728

Trp Cys Asp

His

Thr

Gin

Asp

Val

Leu

Gly

Asp

Phe

Gin

Trp

Lys

Asn

565

570

575

gta

ggt

ccc

aat

acc

aca

agc

aca

gtc

att

agc

aca

gat

gct

ttt

agg

1776

Val

Gly

Pro

Asn

Thr

Thr

Ser

Thr

Val

Ile

Ser

Thr

Asp

Al a

Phe

Arg

580

585

590

cca

gga

gtt

ega

tat

gac

ttc

aga

att

tat

ggg

tta

tct

aca

aaa

agg

1824

Pro

Gly

Val

Arg

Tyr Asp

Phe

Arg

Ile

Tyr Gly

Leu

Ser

Thr

Lys

Arg

595 600 605

PL 211 833 B1

175

att gct tgt Ile Ala Cys

tta tta gag

aaa aaa aca

gga tac tct cag gaa ctt gct

1872

Leu

Leu Glu

Lys 615

Lys

Thr

Gly

Tyr

Ser- 620

Gin

Glu

Leu

Ala

610

cct

tca

gac

aac

cct

cac

gtg

ctg gtg gat

aca

ttg

aca

tcc

cac

tcc

1920

Pro

Ser

Asp Asn

Pro

His

Val

Leu

Val

Asp

Thr

Leu

Thr

Ser

His

Ser

625

630

635

640

ttc

act

ctg agt tgg

aaa

gat

tac

tct

act

gaa

tct

caa

cct

ggt

ttt

1968

Phe Thr

Leu Ser Trp Lys

Asp Tyr

Ser

Thr

Glu

Ser

Gin

Pro

Gly

Phe

645

650

655

ata

caa

ggg

tac

cat

gtc

tat

ctg

aaa

tcc

aag

gcg

agg

cag

tgc

cac

2016

Ile

Gin

Gly Tyr

His

Val

Tyr

Leu

Lys

Ser

Lys

Ala

Arg

Gin

Cys

His

660

665

670

cca

ega

ttt

gaa

aag

gca

gtt

ctt

tca

gat ggt

tca

gaa

tgt

tgc

aaa

2064

Pro Arg

Phe

Glu

Lys

Ala

Val

Leu

Ser

Asp Gly

Ser

Glu

Cys

Cys

Lys

675

680

685

tac

aaa

att

gac

aac

ccg

gaa

gaa

aag

gca

ttg

att

gtg

gac

aac

eta

2112

Tyr Lys

Ile

Asp

Asn

Pro

Glu

Glu

Lys

Ala

Leu

Ile Val

Asp

Asn

Leu

690

695

700

aag

cca

gaa

tcc

ttc

tat

gag

ttt

ttc

atc

act

cca

ttc

act

agt

gct

2160

Lys

Pro

Glu

Ser

Phe

Tyr

Glu

Phe

Phe

Ile Thr

Pro

Phe

Thr

Ser

Ala

705

710

715

720

ggt

gaa

ggc

ccc

agt gct

acg

ttc

acg

aag

gtc

acg

act

ccg

gat

gaa

2208

Gly

Glu

Gly

Pro

Ser Ala

Thr

Phe

Thr

Lys

Val

Thr

Thr

Pro

Asp

Glu

725

730

735

cac tcc tcg 2217

His Ser Ser <210> 69 <211> 739 <212> PRT <213> Homo sapiens

176

PL 211 833 B1 <400> 69

Met

Ala

Leu

Phe

Ala

Val

Phe

Gin

Thr

Thr

Phe

Phe

Leu

ihr

Leu

Leu

1

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Thr

Tyr

Gin

Ser

Glu

Val

Leu

Ala

Glu

Arg

Leu

Pro

Leu

20

25

30

Thr

Pro

Val

Ser

Leu

Lys

Val

Ser

Thr

Asn

Ser

Thr

Arg

Gin

Ser

Leu

35

40

45

Hi s

Leu

Gin

Trp

Thr

Val

His

Asn

Leu

Pro

Tyr

His

Gin

Glu

Leu

Lys

50

55

60

Met

Val

Phe

Gin

Ile

Gin-

Ile

Ser

Arg

Ile

Glu

Thr

Ser

Asn

Val

Ile

65

70

75

80

Trp

Val

Gly

Asn

Tyr

Ser

Thr

Thr

Val

Lys

Trp

Asn

Gin

Val

Leu

His

85

90

95

Trp

Ser

Trp

Glu

Ser

Glu

Leu

Pro

Leu

Glu

Cys

Ala

Thr

His

Phe

Va1

100

105

110

Arg

Ile

Lys

Ser

Leu

Val

Asp

Asp

Ala

Lys

Phe

Pro

Glu

Pro

Asn

Phe

115

120

125

Trp

Ser

Asn

Trp

Ser

Ser

Trp

Glu

Glu

Val

Ser

Val

Gin

Asp

Ser

Thr

130

135

140

Gly

Gin

Asp

Ile

Leu

Phe

Val

Phe

Pro

Lys

Asp

Lys

Leu

Val

Glu

Glu

145

150

155

160

Gly

Thr

Asn

Val

Thr

Ile

Cys

Tyr

Val

Ser

Arg

Asn

Ile

Gin

Asn

Asn

165

170

175

Val

Ser

Cys

Tyr

Leu

Glu

Gly

Lys

Gin

Ile

His

Gly

Glu

Gin

Leu

Asp

180

185

190

Pro

His

Val

Thr

Al a

Phe

Asn

Leu

Asn

Ser

Val

Pro

Phe

Ile

Arg

Asn

195

200

205

Lys

Gly

Thr

Asn

Ile

Tyr

Cys

Glu

Ala

Ser

Gin

Gly

Asn

Val

Ser

Glu

210

215

220

Gly

Met

Lys

Gly

Ile

Val

Leu

Phe

Val

Ser

Lys

Val

Leu

Glu

Glu

Pro

225

230

235

240

Lys

Asp

Phe

Ser

Cys

Glu

Thr

Glu

Asp

Phe

Lys

Thr

Leu

His

Cys

Thr

245

250

255

Trp

Asp

Pro

Gly

Thr

Asp

Thr

Ala

Leu

Gly

Trp

Ser

Lys

Gin

Pro

Ser

260

265

270

Gin

Ser

Tyr

Thr

Leu

Phe

Glu

Ser

Phe

Ser

Gly

Glu

Lys

Lys

Leu

Cys

275

280

285.

Thr

His

Lys

Asn

Trp

Cys

Asn

Trp

Gin

Ile

Thr

Gin

Asp

Ser

Gin

Glu

290

295

300

Thr

Tyr

Asn

Phe

Thr

Leu

Ile

Al a

Glu

Asn

Tyr

Leu

Arg

Lys

Arg

Ser

305

310

315

320

Val

Asn

Ile

Leu

Phe

Asn

Leu

Thr

His

Arg

Val

Tyr

Leu

Met

Asr

Pro

325 330 335

PL 211 833 B1

177

Phe

Ser

Yal Asn Phe Glu Asn Yal Asn Ala Thr Asn Ala Ile Met Thr

340

345

350

Trp

Lys

Val

His

Ser

Ile Arg

Asn

Asn

Phe

Thr

Tyr -Leu

Cys

Gin

Ile

355

360

365

Glu

Leu

Hi s

Gly

Glu

Gly Lys

Met

Met

Gin

Tyr

Asn

Yal

Ser

Ile

Lys

370

375

380

Yal

Asn

Gly

Glu

Tyr

Phe

Leu

Ser

Glu

Leu

Glu

Pro

Ala

Thr

Glu

Tyr

385

390

395

400

Met

Ala

Arg

Val

Arg

Cys

Ala

Asp

Ala

Ser

His

Phe

Trp Lys Trp

Ser

405

410

415

Glu

Trp

Ser

Gly

Gin

Asn

Phe

Thr

Thr

Leu

Glu

Ala

Ala

Pro

Ser

Glu

420

425

430

Ala

Pro

Asp

Val

’Trp Arg

Ile

Val

Ser

Leu

Glu

Pro

Gly

Asn

His

Thr

435

440

445

Yal

Thr

Leu

Phe

Trp Lys

Pro

Leu

Ser

Lys

Leu

His

Al a

Asn

Gly

Lys

450

455

460

Ile

Leu

Phe

Tyr

Asn

Val

Val

Val

Glu

Asn

Leu

Asp Lys

Pro

Ser

Ser

465

470

475

480

Ser

Glu

Leu

His

Ser

Ile

Pro

Ala

Pro

Ala

Asn

Ser

Thr

Lys

Leu

Ile

485

490

495

Leu

Asp Arg Cys

Ser

Tyr

Gin

Ile

Cys

Val

Ile

Ala

Asn

Asn

Ser

Val

500

505

510

Gly

Ala

Ser

Pro Ala

Ser

Val

Ile

Yal

Ile

Ser

Ala

Asp

Pro

Glu

Asn

515

520

525

Lys

Glu

Yal

Glu

Glu

Glu

Arg

Ile

Al a

Gly

Thr

Glu

Gly Gly

Phe

Ser

530

535

540

Leu

Ser

Trp Lys

Pro

Gin

Pro

Gly Asp

Yal

Ile

Gly Tyr

Yal

Val

Asp

545

550

555

560

Trp Cys Asp

His

Thr

Gin

Asp

Val

Leu

Gly Asp

Phe

Gin

Trp

Lys

Asn

565

570

575

Val

Gly

Pro

Asn

Thr

Thr

Ser

Thr

Val

Ile

Ser

Thr

Asp

Ala

Phe

Arg

580

585

590

Pro

Gly

Val

Arg Tyr Asp

Phe

Arg

Ile

Tyr Gly

Leu

Ser

Thr

Lys

Arg

595

600

605

Ile

Ala

Cys

Leu

Leu Glu

Lys

Lys

Thr

Gly Tyr

Ser

Gin

Glu

Leu

Ala

610

615

620

Pro

Ser

Asp

Asn

Pro

His

Yal

Leu

Val

Asp

Thr

Leu

Thr

Ser

His

Ser

625

630

635

640

Phe

Thr

Leu

Ser

Trp Lys Asp Tyr

Ser

Thr

Glu

Ser

Gin

Pro. Gly

Phe

645

650

655

Ile

Gin

Gly Tyr His Yal Tyr

Leu

Lys

Ser

Lys

Ala

Arg

Gin

Cys

His

660

665

670

Pro

Arg

Phe Glu Lys

Ala

Yal

Leu

Ser

Asp Gly

Ser

Glu

Cys

Cys

Lys

178

PL 211 833 B1

675

680

685

Tyr

Lys

Ile

Asp

Asn

Pro

Glu

Glu

Lys

Al a

Leu

Ile

Val

Asp

Asn

Leu

690

695

700

Lys

Pro

Glu

Ser

Phe

Tyr

Glu

Phe

Phe

Ile

Thr

Pro

Phe

Thr

Ser

Ala

705

710

715

720

Gly

Glu

Gly

Pro

Ser

Al a

Thr

Phe

Thr

Lys

Val

Thr

Thr

Pro

Asp

Glu

725

730

735

His

Ser

Ser

<21.G> 70 <211> 1557 <212> DNA

<213> Homo

i sapiens

<220> <221>

CDS

<222>

(1).

..(1557)

<400>

70

atg

atg tgg

acc

tgg

gca

ctg

tgg

atg

ctc

ccc

tca

ctc

tgc

aaa

ttc

48

Met

Met Trp

Thr

Trp

Ala

Leu

Trp

Met

Leu

Pro

Ser

Leu

Cys

Lys

Phe

1

5

10

15

agc

ctg gca

gct ctg

cca

gct

aag

cct

gag

aac

att

tcc

tgt gtc

tac

96

Ser

Leu Ala

Ala

Leu

Pro

Ala

Lys

Pro

Glu

Asn

Il-e

Ser

Cys

Val

Tyr

20

25

30

tac

tat agg

aaa

aat

tta

acc

tgc

act

tgg

agt

cca

gga

aag

gaa

acc

144

Tyr Tyr Arg

Lys

Asn

Leu

Thr

Cys

Thr

Trp

Ser

Pro

Gly

Lys

Glu

Thr

35

40

45

agt

tat acc

cag

tac

aca

gtt

aag

aga

act

tac

gct

ttt

gga

gaa

aaa

192

Ser

Tyr Thr

Gin

Tyr

Thr

Val

Lys Arg

Thr

Tyr

Ala

Phe

Gly

Glu

Lys

50

55

60

cat

gat aat

tgt

aca

acc

aat

agt

tct

aca

agt

gaa

aat

cgt

gct

tcg

240

His

Asp Asn

Cys

Thr

Thr

Asn

Ser

Ser

Thr

Ser

Glu

Asn

Arg

Ala

Ser

65

70

75

80

tgc

tct ttt

ttc

ctt

cca

aga

ata

acg

atc

cca

gat

aat

tat

acc

att

288

Cys

Ser Phe

Phe

Leu

Pro

Arg

ile

Thr

Ile

Pro

Asp

Asn

Tyr

Thr

Ile

PL 211 833 B1

179

85

90

95

gag

gtg

gaa

gct

gaa

aat

gga

gat

ggt

gta

att

aaa

tct

cat

atg

aca

336

Glu

Val

Glu

Ala

Glu

Asn

Gly

Asp

Gly

Val

Ile

Lys

Ser

His

Met

Thr

100

105

110

tac

tgg

aga

tta

gag

aac

ata

gcg

aaa

act

gaa

cca

cct

aag

att

ttc

384

Tyr

Trp

Arg

Leu

Glu

Asn

ile

Ala

Lys

Thr

Glu

Pro

Pro

Lys

Ile

Phe

115

120

125

cgt

gtg

aaa

cca

gtt

ttg

ggc

atc

aaa

ega

atg

att

caa

att

gaa

tgg

432

Arg

Val

Ly$

Pro

Val

Leu

Gly

Ile

Lys

Arg

Met

Ile

Gin

Ile

G1 u

Trp

130

135

140

ata

aag

cct

gag

ttg

gcg

cct

gtt

tea

tct

gat

tta

aaa

tac

aca

ctt

480

Ile

Lys

Pro

Glu

Leu

Ala

Pro

Val

Ser

Ser

Asp

Leu

Lys

Tyr

Thr

Leu

145

150

155

160

ega

ttc

agg

aca

gtc

aac

agt

acc

age

tgg

atg

gaa

gtc

aac

ttc

gct

528

Arg

Phe

Arg

Thr

Val

Asn

Ser

Thr

Ser

Trp

Met

Glu

Val

Asn

Phe

Ala

165

170

175

aag

aac

cgt

aag

gat

aaa

aac

caa

acg

tac

aac

ctc

acg

ggg

ctg

cag

576

Lys

Asn

Arg

Lys

Asp

Lys

Asn

Gin

Thr

Tyr

Asn

Leu

Thr

Gly

Leu

Gin

180

185

190

cct

ttt

aca

gaa

tat

gtc

ata

gct

ctg

ega

tgt

gcg

gtc

aag

gag

tea

624

Pro

Phe

Thr

Glu

Tyr

Val

Ile

Ala

Leu

Arg

Cys

Al a

Val

Lys

Glu

Ser

195

200

205

aag

ttc

tgg

agt

gac

tgg

age

caa

gaa

aaa

atg

gga

atg

act

gag

gaa

672

Lys

Phe

Trp

Ser

Asp

Trp

Ser

Gin

Glu

Lys

Met

Gly

Met

Thr

Glu

Glu

210

215

220

gaa

gct

cca

tgt

ggc

ctg

gaa

ctg

tgg

aga

gtc

ctg

aaa

cca

gct

gag

720

Glu

Al a

Pro

Cys

Gly

Leu

Glu

Leu

Trp

Arg

Val

Leu

Lys

Pro

Ala

Glu

225

230

235

240

gcg

gat

gga

aga

agg

cca

gtg

cgg

ttg

tta

tgg

aag

aag

gca

aga

gga

768

Ala

Asp

Gly

Arg

Arg

Pro

Val

Arg

Leu

Leu

Trp

Lys

Lys

Al a

Arg

Gly

245

250

255

gcc

cca

gtc

eta

gag

aaa

aca

ctt

ggc

tac

aac

ata

tgg

tac

tat

cca

816

180

PL 211 833 B1

Ala

Pro

Val

Leu

Glu

Lys

Thr

Leu

Gly

Tyr

Asn

Ile

Trp

Tyr

Tyr

Pro

260

265

270

gaa

agc

aac

act

aac

ctc

aca

gaa

aca

atg

aac

act

act

aac

cag

cag

864

Glu

Ser

Asn

Thr

Asn

Leu

Thr

Glu

Thr

Met

Asn

Thr

Thr

Asn

Gin

Gin

275

280

285

ctt

gaa

ctg

cat

ctg

gga

ggc

gag

agc

ttt

tgg

gtg

tct

atg

att

tct

912

Leu

Glu

Leu

His

Leu

Gly

Gly

Glu

Ser

Phe

Trp

Val

Ser

Met

Ile

Ser

290

295

300

tat

aat

tct

ctt

ggg

aag

tct

cca

gtg

gcc

acc

ctg

agg

att

cca

gct

960

Tyr

Asn

Ser

Leu

Gly

Lys

Ser

Pro

Val

Ala

Thr

Leu

Arg

Ile

Pro

Ala

305

310

315

320

att

caa

gaa

aaa

tca

ttt

cag

tgc

att

gag

gtc

atg

cag

gcc

tgc

gtt

1001

Ile Gin Glu Lys Ser Phe Gin Cys Ile Glu Val Met Gin Ala Cys Val

325 330 335

gct

gag

gac

cag

eta

gtg

gtg

aag

tgg

caa

agc

tct

gct

eta

gac

gtg

1056

Ala

Glu

Asp

Gin

Leu

Val

Val

Lys

Trp

Gin

Ser

Ser

Ala

Leu

Asp

Val

340

345

350

aac

act

tgg

atg

att

gaa

tgg

ttt

ccg

gat

gtg

gac

tca

gag

ccc

acc

1104

Asn

Thr

Trp

Met

Ile

Glu

Trp

Phe

Pro

Asp

Val

Asp

Ser

G1 u

Pro

Thr

355 360 365 acc ctt tcc tgg gaa tct gtg tct cag gcc acg aac tgg acg atc cag 1152

Thr Leu Ser Trp Glu Ser Val Ser Gin Ala Thr Asn Trp Thr Ile Gin

370 375 380

caa

gat

aaa

tta

aaa

cct

ttc

tgg

tgc

tat

aac

atc

tct

gtg

tat.

cca

Gin

Asp

Lys

Leu

Lys

Pro

Phe

Trp

Cys

Tyr

Asn

Ile

Ser

Val

Tyr

Pro

385

390

395

400

atg

ttg

cat

gac

aaa

gtt

ggc

gag

cca

tat

tcc

atc

cag

gct

tat.

gcc

Met

Leu

His

Asp

Lys

Val

Gly

Glu

Pro

Tyr

Ser

Ile

Gin

Al a

Tyr

Ala

405 410 415 aaa gaa ggc gtt cca tca gaa ggt cct gag acc aag gtg gag aac att 1296

Lys Glu Gly Val Pro Ser Glu Gly Pro Glu Thr Lys Val Glu Asn Ile

420 425 430

PL 211 833 B1

181

ggc

gtg

aag

acg

gtc

acg

atc

aca

tgg

aaa

gag

att

ccc

aag

agt

gag

Gly

Val

Lys

Thr

Val

Thr

Ile

Thr

Trp

Lys

Glu

Ile

Pro

Lys

Ser

Glu.

435

440

445

aga

aag

ggt

atc

atc

tgc

aac

tac

acc

atc

ttt

tac

caa

gct

gaa

ggt

Arg

Lys

Gly

Ile

Ile

Cys

Asn

Tyr

Thr

Ile

Phe

Tyr

Gin

Ala

Glu

Gly

450

455

460

gga

aaa

gga

ttc

tcc

aag

aca

gtc

aat

tcc

agc

atc

ttg

cag

tac

ggc

Gly

Lys

Gly*

Phe

Ser

Lys

Thr

Val

Asn

Ser

Ser

Ile

Leu

Gin

Tyr

Gly

465

470

475

480

ctg

gag

tcc

ctg

aaa

ega

aag

acc

tct

tac

att

gtt

cag

gtc

atg

gcc

Leu

Glu

Ser

Leu

Lys

Arg

Lys

Thr

Ser

Tyr

Ile

Val

Gin

Val

Met

Ala

485

490

495

agc

acc

agt

gct

ggg

gga

acc

aac

ggg

acc

agc

ata

aat

ttc

aag

aca

Ser

Thr

Ser

Ala

Gly

Gly

Thr

Asn

Gly

Thr

Ser

Ile

Asn

Phe

Lys

Thr

500

505

510

ttg

tca

ttc

agt

gtc

ttt

gag

Leu

Ser

Phe

Ser

Val

Phe

Glu

515

<210>

71

<211>

519

<212>

PRT

<213>

Homo sapiens

<400>

71

Met

Met Trp

Thr

Trp

Ala

Leu

Trp

Met

Leu

Pro

Ser

Leu

Cys

Lys

Phe

1

5

10

15

Ser

Leu Ala

Ala

Leu

Pro

Al a

Lys

Pro

Glu

Asn

Ile

Ser

Cys

Val

Tyr

20

25

30

Tyr

Tyr Arg

Lys

Asn

Leu

Thr

Cys

Thr

Trp

Ser

Pro

Gly

Lys

Glu

Thr

35

40

45

Ser

Tyr Thr

Gin

Tyr

Thr

Val

Lys

Arg

Thr

Tyr

Al a

Phe

Gly

Glu

Lys

50

55

60

His

Asp Asn

Cys

Thr

Thr

Asn

Ser

Ser

Thr

Ser

G1 u

Asn

Arg

Al a

Ser

65

70

75

80

Cys

Ser Phe

Phe

Leu

Pro

Arg

Ile

Thr

Ile

Pro

Asp

Asn

Tyr

Thr

Ile

85

90

95

182

PL 211 833 B1

Glu

Val

Glu Ala Glu Asn Gly Asp Gly Val Ile Lys Ser His

Met

Thr

100

105

110

Tyr Trp Arg

Leu

Glu

Asn

Tle

Ala

Lys Thr

Glu

Pro

Pro

Lys

Ile

Phe

115

120

125

Arg Val

Lys

Pro

Val

Leu

Gly

Ile

Lys Arg

Met

Ile

Gin

Ile

Glu

Trp

130

135

140

Ile Lys

Pro

Glu

Leu

Ala

Pro

Val

Ser

Ser

Asp

Leu

Lys Tyr

Thr

Leu

145

150

155

160

Arg

Phe

Arg

Thr

Val

Asn

Ser

Thr

Ser

Trp

Met

Glu

Val

Asn

Phe

Ala

165

170

175

Lys

Asn

Arg

Lys

Asp Lys

Asn

Gin

Thr

Tyr

Asn

Leu

Thr

Gly

Leu

Gin

180

185

190

Pro

Phe

Thr

Glu

Tyr Val

Ile

Ala

Leu

Arg

Cys

Ala

Val

Lys

Glu

Ser

195

200

205

Lys

Phe

Trp

Ser

Asp Trp

Ser

Gin

Glu

Lys

Met Gly

Met

Thr

G1 u

Glu

210

215

220

Glu

Ala

Pro

Cys

Gly

Leu

Glu

Leu

Trp Arg

Val

Leu

Lys

Pro

Ala

Glu

225

230

235

240

Ala Asp Gly Arg Arg

Pro

Val

Arg

Leu

Leu

Trp Lys

Lys

Ala

Arg Gly

245

250

255

Ala

Pro

Val

Leu

Glu

Lys

Thr

Leu

Gly

Tyr

Asn

Ile

Trp Tyr Tyr

Pro

260

265

270

Glu

Ser

Asn

Thr

Asn

Leu

Thr Glu

Thr

Met

Asn

Thr

Thr Asn

Gin

Gin

275

280

285

Leu

Glu

Leu

His

Leu

Gly Gly

Glu

Ser

Phe

Trp

Val

Ser

Met

Ile

Ser

290

295

300

Tyr

Asn

Ser

Leu

Gly Lys

Ser

Pro

Val

Ala

Thr

Leu

Arg

Ile

Pro

Ala

305

310

315

320

Ile

Gin

Glu

Lys

Ser

Phe

Gin

Cys

ile

Glu

Val

Met

Gin

Ala

Cys

Val

325

330

335

Ala

Glu

Asp

Gin

Leu

Val

Val

Lys

Trp

Gin

Ser

Ser

Ala

Leu

Asp

Val

340

345

350

Asn

Thr

Trp

Met

Ile

Glu

Trp

Phe

Pro

Asp

Val

Asp

Ser

Glu

Pro

Thr

355

360

365

Thr

Leu

Ser

Trp

Glu

Ser

Val

Ser

Gin

Ala

Thr

Asn

Trp

Thr

Ile

Gin

370

375

380

Gin

Asp Lys

Leu

Lys

Pro

Phe

Trp Cys Tyr

Asn

Ile

Ser

Val

Tyr

Pro

385

390

395

400

Met

Leu

His

Asp

Lys

Val

Gly

Glu

Pro

Tyr

Ser

Ile

Gin

Ala

Tyr

Ala

405

410

415

Lys

Glu

Gly

Val

Pro

Ser

G1 u

Gly

Pro

Glu

Thr

Lys

Val

Glu

Asn

Ile

420

425

430

Gly

Val

Lys

Thr

Val

Thr

Ile

Thr

Trp

Lys

Glu

Ile

Pro

Lys

Ser

Glu

PL 211 833 B1

183

435

440

445

Arg

Lys

Gly

Ile

Ile

Cys

Asn

Tyr

Thr

Ile

Phe

Tyr

Gin

Ala

Glu

Gly

450

455

460

Gly

Lys

Gly

Phe

Ser

Lys

Thr

Val

Asn

Ser

Ser

Ile

Leu

Gin

Tyr

Gly

465

470

475

480

Leu

Glu

Ser

Leu

Lys

Arg

Lys

Thr

Ser

Tyr

Ile

Val

Gin

Val

Met

Ala

485

490

495

Ser

Thr

Ser

Ala

Gly

Gly

Thr

Asn

Gly

Thr

Ser

Ile

Asn

Phe

Lys

Thr

500

505

510

Leu

Ser

Phe

Ser

Val

Phe

Glu

515 <210> 72 <211> 10 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> C-terminalny znacznik peptydowy His <400> 72

Gly Ser Gly Gly His His His His His His 1 5 10 <210> 73 <211> 12 <212> PRT <213>Sztuczna sekwencja <220>

<223> Przerywnik Gly Ser z 12 aminokwasów <400> 73

Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Glu Pro Arg Ser 1 5 10 <210> 74 <211> 31 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja

184

PL 211 833 B1 <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC41557 <400> 74 ttatagatct cgaggagtgt tcatccggag t 31 <210> 75 <211> 65 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC29232 <400> 75 cgactgactc gagtcagtga tggtgatggt gatggccacc tgatccttta cccggagaca 60 gggag 65 <210> 76 <211> 3196 <212> DNA <213> Mus musculus <400 76 tgtatgtctg cacagtttgt gtatgcctgg tgcccacaga ggctcgagag tgtcagattc 60 cccccaaaac tggagttaca gttttgagcc gccccatgct tgatagcaat caaaectggg 120 tcctctgaaa gagcatccag tgcatgtaac cactgaacca tctctccaaa ccatgaacat 180 cactttaatt ttttttaata gttaaaggat attttgattc taaagatgta aaagaacgtc 240 tcacctattt tgaaatttgg taataaatgt ttcttcaaag cttaaaaaaa ttagttcacjg 300 tttttttttt ttttcagtca gtgatttgct aagctgccca aactggctta gaatttgtga 360 ccctcttgtc tcagcatact gagtgttaag attacaagtg caccccctac ccagttccca 420 taattaactg atccacc.ccc acccccatcc caccccactc ccattgcctg ggcaagtaac 480 tcttgagccc cattctggtt ctagagtctg aagtcacaaa ggtgcaggtg agaacgcaag 540 gacaagggca ggccctggag cacagatgcc ttctccttat gccttccctg tgttcactag 600 agccatcccc ctgcctccgg aattcccaca gatggatcgc tctgtggctt cttaaaactt.660 ccctgcaggg cactgaccct cagcccctct aagtcacttc ttccccagtg attgtacttt 720 tcaatcgggc ttcaaacttt cctctcatta aatcagcaag cactttccaa gaaaagagag 780 atgctcaaga tgccttcctg tgtggtatgt gtatgcgttt gtgtgtgtgc acgcatgtgt 840 gtgcatgtga ctcaatcttc tgccttgcct tgagggtaac ctcagcattt ccttccagcc 900 ctgctttccc caggccgagc cgaggctggc aaccttttga aaatgttttc tggagaaaag 960 ctgagcaatg gttttgccat gggcgggcct ttgatctgct tcctcatgac aaccctttat 1020 atattgcctg gtggccatgg cgaacacacc aggctccaga gaccacaggc aaagcgggcc 1080

PL 211 833 B1

185 ttcctcactc tcttaccgtc gccatgatct gctcagcatg gcttcagctc catggctctt tgcctcaggt ggttgctgga cagaggctgt ctgacctatc agctccatgg tatccttctt tgctgctttg ctgtatagga acctggctgg tatcgaagga agacttaaga actacaattg ataacaacta tgtaagtgcc cttgagattg tattttgcta tctaagcaca gctatccttt gaggcatggg gaaacattgg aattcggttg ctagcagaag aggcagaggc agactggtcc actacaggat gtatgctccc tgaattcttt ctaaacgage attcttgctg aaagggcatc cccccaagag caatgagagc cagtttcagc tgaggatctt cctttgggtc tccgttgact catcctggag ggccctctgc ctggccagag agtgtgaata cttcatttcc ttgggaccgc ggaaactgat ggagacacag ataacctccc gagaacaggt tgcagatggc taggggcagc agaagcatcc ttaggaacca cggccaacct agccaactag accttcgatt cctgtagaca gttgttgtac caattagata aggtctgagg gagctgttct gagctgtagg gttgttacaa ctttctacag agcataaagc aggcatctgg gtgtttcagc ctggaccggg aagcattaac gaaagtcaaa gtgttgagcg agaacacagt aaacatcagc tgtttcaacc cactgaattt atcctatgat tgtaaagtgt tcgtgcttac agaactgcag gctaaggaca atactacatg ęctcageagt gcctgtcctt cgagggctga actgtgcggt cattactagt catgttattt tctgctaccc tgtagggact ggaagtggca gttaacgctc catggaggag ccttcagagt ataatcagtt ttggaatttg tgatggggtt agtttatgct accctctccc tccattagac cacgtgcatg ataaacatct ttgttccagg gtaggctgga aactaa <210> 77 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

tccacacagg taccgctggc tccacacgca atcatgttag gggaaggagc cgggaatggc tgtaactgaa gctgggatgg gcaggggcat tttctccagg aacaacgaag cctaccctgg ccacctgcag cttgtccttc ggtgccccaa acctcttgaa acaagagtct caggatcttt ttttttctta accatttctt taaaatgtct ctcgatataa agccagctat ggaagccaga gggtgaaatg tttccaaggg ggtaaatgca agggactgaa accttggcag cttacgaaac atctcaaatc cacccggctc acagtcccta cttagagaag ggccagcttg attcaggaat agccaaagat gtcctagtgg aagcagggtg aactaggcaa ctgtctgtgt gttcttggag cctggcacag gtacagcaca ggacccagaa ttagataact tcagttgaag caagtaacag tgcccctctc acttcagtca ctgagcctcc ctcagccaga taggcggagg cagactgggt gggtgggtat gccatgtctt ctagctcata cagagttagt gatggcccaa gcttcagaag caggctagac acagaggaag ccctggaaat atgtcttcct tacaatattt caaacctcct gatgtcagca gacgaatcaa tacagctgcc caacatctcg gtcatcatag cacatctgga agatacttct tgggtgataa gatggctaac aaacatttct gtgcctggaa atactgatga ggttttaaag cagttctcaa actgcatggc ctgagtgatg gggggggggg ggtgcagtgf gcttgcaacc caggacttaa ctccaaaggg atgtttttat tttgtccact gaaatcttgt gctatattta tttatttatg tactgagttt ctatttaata aattatattg acatgatcac gaaatcaaag attaggaatg ttctggaaat agactcatga gcaaataatc ccagcagcat tcataagtac aatcactgtc cttttggtat

1140

1200

1260

1320

1380

1440

1500

1560

1620

1680

1740

1800

1860

1920

1980

2040

2100

2160

2220

2280

2340

2400

2460

2520

2580

2640

2700

2760

2820

2880

2940

3000

3060

3120

3180

3196

186

PL 211 833 B1 <223>Starter oligonukleotydowy ZC28575 <400> 77 ccaggaaagg aaaccagtta tace 24 <210 78 <211> 23 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

4223> Starter oligonukleotydowy ZC21195 <400> 78 gaggagacca taacccccga cag 23 <210> 79 <211> 23 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC21196 <400> 79 catagctccc accacacgat ttt 23 <210> 80 <211> 25 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

_<223> Starter oligonukleotydowy ZC26358 <400> 80 aaaaccaaac gtacaacctc acggg 25 <21Q> 81 <211> 25 <212> DNA ^<213> Sztuczna sekwencja

PL 211 833 B1

187 <220» <223» Starter oligonukleotydowy ZC26359 <400> 81 gagcagccat acaccagagc agaca 25 <210» 82 <211> 19 <212» DNA <213» Sztuczna sekwencja <220>

<223» Starter oligonukleotydowy ZC29179 <400> 82 gcagggttgg gaacggtgg 19 <210» 83 <211> 20 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223» Starter oligonukleotydowy ZC28917 <400> 83 tgcaagatgc tggaattgac 20 <210> 84 <211> 20 <212» DNA <213> Sztuczna sekwencja <220» <223» Starter oligonukleotydowy ZC28916 <400> 84 agtcaattcc agcatcttgc 20 <210» 85 <211» 20 <212» DNA <213> Sztuczna sekwencja

188

PL 211 833 B1 <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC28918 <400> 85 tcacagagtc atcagactcc 20 <210> 86 <211> 18 <2l2> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC41498 <400> 86 ggctccagag accacagg 18 <210> 87 <211> 22 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC41496 <400> 87 , atgactagta atgaccgcac ag . 22 <210> 88 <211> 39 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC41583 <400> 88 cgtacgggcc ggccaccatg atcttccaca caggaacaa 3!

<210 89 <211> 36 <212> DNA

PL 211 833 B1

189 <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC41584 <400> 89 tgacgaggcg cgcctcagca tgtagtattg tcctta 36 <210> 90 <211>^J650 <212> DNA <213? Mus musculus <220>

<221> CDS <222> (53)...(542) <400> 90 ggctccagag accacaggca aagcgggcct tcctcactct cttaccgtcg cc atg atc 58 Met Ile

ttc cac Phe His

aca gga aca acg

aag cct acc ctg gtg ctg ctt tgc tgt ata

106

Thr 5

Gly Thr Thr

Lys

Pro 10

Thr

Leu

Val

Leu

Leu 15

Cys

Cys

Ile

gga

acc

tgg ctg

gcc

acc

tgc

agc

ttg

tcc

ttc

ggt

gcc

cca

ata

tcg

154

Gly

Thr

Trp

Leu

Ala

Thr

Cys

Ser

Leu

Ser

Phe

Gly

Ala

Pro

Ile

Ser

20

25

30

aag

gaa

gac

tta

aga

act

aca

att

gac

ctc

ttg

aaa

caa

gag

tct

cag

202·

Lys

Glu

Asp

Leu

Arg

Thr

Thr

Ile

Asp

Leu

Leu

Lys

Gin

Glu

Ser

Gin

35

40

45

50

gat

ctt

tat

aac

aac

tat

agc

ata

aag

cag

gca

tct

ggg

atg

tca

gca

250

Asp

Leu

Tyr

Asn

Asn

Tyr

Ser

Ile

Lys

Gin

Ala

Ser

Gly

Met

Ser

Ala

55

60

65

gac

gaa

tca

ata

cag

ctg

ccg

tgt

ttc

agc

ctg

gac

cgg

gaa

gca

tta

298

Asp

Glu

Ser

Ile

GTn

Leu

Pro

Cys

Phe

Ser

Leu

Asp Arg

Glu

Ala

Leu

70

75

80

acc

aac

atc

tcg

gtc

atc

ata

gca

cat

ctg

gag

aaa gtc

aaa

gtg

ttg

346

190

PL 211 833 B1

Thr

Asn Ile 85

Ser

Val

Ile

Ile

Ala His 90

Leu

Glu

Lys

Val 95

Lys

Val

Leu

agc

gag

aac

aca

gta

gat

act

tct

tgg

gtg

ata

aga

tgg

eta

aca

aac

394

Ser

Glu

Asn

Thr

VaT

Asp

Thr

Ser

Trp

Val

Ile

Arg

Trp

Leu

Thr

Asn

.100

105

110

atc

agc

tgt

ttc

aac

cca

ctg

aat

tta

aac

att

tct

gtg

cct

gga

aat

442

Ile

Ser

Cys

Phe

Asn

Pro

Leu

Asn

Leu

Asn

Ile

Ser

Val

Pro

Gly

Asn

115

120.

125

130

act

gat

gaa

tcc

tat

gat

tgt

aaa

gtg

ttc

gtg

ctt

acg

gtt

tta

aag

490

Thr

Asp

Glu

Ser

Tyr

Asp

Cys

Lys

Val

Phe

Val

Leu

Thr

Val

Leu

Lys

135

140

145

cag

ttc

tca

aac

tgc

atg

gca

gaa

ctg

cag

gct

aag

gac

aat

act

aca

538

Gin

Phe

Ser

Asń

cys

Met

Ala

Glu

Leu

Gin

Ala

Lys

Asp

Asn

Thr

Thr

150

155

160

tgc t gagtgatggg gggggggtgc agtgtcctca gcagtgcctg tccttcgagg 592 Cys gctgagcttg caacccagga cttaactcca aagggactgt gcggtcatta ctagtcat 650 <210> 91 <211> 163 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 91

Met

Ile

Phe

Hi s

Thr

Gly

Thr

Thr

Lys

Pro

Thr

Leu

Val

Leu

Leu

Cys

1

5

10

15

Cys

Ile

Gly

Thr

Trp

Leu

Ala

Thr

Cys

Ser

Leu

Ser

Phe

Gly

Ala

Pro

20

25

30

Ile

Ser

Lys

Glu

Asp

Leu

Arg

Thr

Thr

Ile

Asp

Leu

Leu

Lys

Gin

Glu

35

40

45

Ser

Gin

Asp

Leu

Tyr

Asn

Asn

Tyr

Ser

Ile

Lys

Gin

Ala

Ser

Gly

Met

50

55

60

Ser

Ala

Asp

Glu

Ser

Ile

Gin

Leu

Pro

Cys

Phe

Ser

Leu

Asp

Arg

Glu

65

70

75

80

Ala

Leu

Thr

Asn

Ile

Ser

Val

Ile

Ile

Ala

His

Leu

Glu

Lys

Val

Lys

85

90

95

PL 211 833 B1

191

Val

Leu

Ser

Glu

Asn

Thr

Val Asp Thr

Ser

Trp

Val

Ile

Arg Trp

Leu

100

105

110

Thr

Asn

Ile

Ser

Cys

Phe

Asn Pro Leu

Asn

Leu

Asn

Ile

Ser Val

Pro·

115

120

125

Gly

Asn

Thr

Asp

Glu

Ser

Tyr Asp Cys

Lys

Val

Phe

Val

Leu Thr

Val

130

135

140

Leu

Lys

Gin

Phe

Ser

Asn

Cys Met Ala Glu

Leu

Gin

Ala

Lys Asp

Asn

145

150

155

160

Thr

Thr

Cys

<210> 92 <211> 511 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Klonowana mysia sekwencja cDNA (SEQ ID NO: 90} z miejscami restrykcji Ascl i częściową sekwencją Kozaka do otwartej ramki odczytu mcytorl71ig i kodonu końca <400> 92 ggccggccac catgatcttc cacacaggaa caacgaagcc taocctggtg gtataggaac ctggctggcc acctgcagct tgtccttcgg tgccccaata acttaagaac tacaattgac ctcttgaaac aagagtctca ggatctttat gcataaagca ggcatctggg atgtcagcag acgaatcaat acagctgccg tggaćcggga agcattaacc aacatctcgg teatcatagc acatctggag tgttgagcga gaacacagta gatacttctt gggtgataag atggetaaca gtttcaaccc actgaattta aacatttctg tgcctggaaa tactgatgaa gtaaagtgtt cgtgcttacg gttttaaagc agttctcaaa ctgcatggca ctaaggacaa tactacatgc tgaggcgcgc c ctgctttgct 60 tcgaaggaag 120 aacaactata 180 tgtttcagcc 240 aaagtcaaag 300 aacatcagct 360 tcctatgatt 420 gaactgcagg 480

511 <21G> 93 <211> 21 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> starter ol i góiiukl eotyćMy IC41A38 <400> 93

192

PL 211 833 B1 gccatggcct ctćactcagg c <210> 94 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220 <223> Starter oligonukleotydowy ZC41437 <40O 94 ccagggagca ttgacaactc ttag <210> 95 <211> 516 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Ludzki poi inukleotyd zCytorl7Lig-CEE <221> CDS <222> (1)...(516) <400> 95

atg Met 1

gcc tct cac

tca Ser 5

ggc ccc tcg acg tct gtg ctc ttt ćtg ttc tgc

48

Ala Ser

His

Gly

Pro

Ser

Thr Ser Yal Leu Phe Leu Phe'Cys

10

15

tgc ctg

gga

ggc

tgg

ctg

gcc

tcc

cac

acg

ttg

ccc

gtc

cgt

tta

eta

96

Cys

Leu

Gly Gly Trp

Leu

Ala

Ser

His

Thr

Leu

Pro

Yal

Arg

Leu

Leu

20

25

30

ega

cca

agt

gat gat

gta

cag

aaa

ata

gtc

gag

gaa

tta

cag

tcc

ctc

144

Arg

Pro

Ser

Asp Asp

Yal

Gin

Lys

Ile

Val

Glu

Glu

Leu

Gin

Ser

Leu

35

40

45

tcg

aag

atg

ctt

ttg

aaa

gat gtg

gag

gaa

gag

aag

ggc

gtg

ctc

gtg

192

Ser

Lys

Met

Leu

Leu

Lys

Asp

Val

Glu

Glu

Glu

Lys Gly

Yal

Leu

Val

50

55

60

tcc

cag

aat

tac

acg

ctg

ccg

tgt

ctc

agc

cct

gac

gcc

cag

ccg

cca

240

Ser

Gin

Asn

Tyr

Thr

Leu

Pro

Cys

Leu

Ser

Pro

Asp Ala

Gin

Pro

Pro

PL 211 833 B1

193

65

70

75

80

aac

aac

atc

cac

agc

cca

gcc

atc

cgg

gca

tat

ctc·

aag

aca

atc

aga

288

Asn

Asn

Ile

His

Ser

Pro

Ala

Ile

Arg

Ala

Tyr

Leu

Lys

Thr

Ile

Arg

85

90

95

cag

eta

gac

aac

aaa

tct

gtt

att

gat

gag

atc

ata

gag

cac

ctc

gac

336

Gin

Leu

Asp

Asn

Lys

Ser

Val

Ile

Asp

Glu

Ile

Ile

Glu

His

Leu

Asp

100

105

110

aaa

ctc

ata

ttt

caa

gat

gca

cca

gaa

aca

aac

att

tct

gtg

cca

aca

384

Lyś

Leu

Uje

Phe

Gin

Asp

Ala

Pro

Glu

Thr

Asn

Ile

Ser

Val

Pro

Thr

115

120

125

gac

acc

cat

gaa

tgt

aaa

cgc

ttc

atc

ctg

act

att

tct

caa

cag

ttt

432

Asp

Thr

His

Glu

Cys

Lys

Arg

Phe

Ile

Leu

Thr

Ile

Ser

Gin

Gin

Phe

130

135

140

tca

gag

tgc

atg

gac

ctc

gca

eta

aaa

tca

ttg

acc

tct

gga

gcc

caa

Ser

Glu

Cys

Met

Asp

Leu

Ala

Leu

Lys

Ser

Leu

Thr

Ser

Gly

Ala

Gin

145

150

155

160

cag

gcc

acc

act

gaa

gaa

tac

atg

ccg

atg

gaa

taa

Gin

Ala

Thr

Thr

Glu

Glu

Tyr

Met

Pro

Met

Glu

*

165

170

<210>

96

<211>

171

<212>

PRT

<213>

Sztuce^

na s

ekwencj

a

<220>

<223>

Ludzki

poi

ipeptyd

zCy

'tor

17 Li

g-ci

EE

<400>

96

Met

Ala Ser

His Ser

Gly

Pro

Ser

Thr

Ser

Val

Leu

Phe

Leu

Phe

Cys

1

5

10

15

Cys

Leu Gly

Gly Trp

Leu

Ala

Ser

His

Thr

Leu

Pro

Val

Arg

Leu

Leu

20

25

30

Arg

Pro Ser

Asp Asp

Val

Gin

Lys

Ile

Val

Glu

Glu

Leu

Gin

Ser

Leu

35

40

45

Ser

Lys Met

Leu Leu

Lys

Asp

Val

Glu

Glu

Glu

Lys

Gly

Val

Leu

Val

194

PL 211 833 B1

55 60

Ser	Gin Asn Tyr Thr Leu Pro Cys Leu	Ser Pro Asp Ala Gin Pro Pro
65 Asn	70 Asn Ile His Ser Pro Ala Ile Arg	75 80 Ala Tyr Leu Lys Thr Ile Arg
Gin	85 Leu Asp Asn Lys Ser Val Ile Asp	90 95 Glu Ile Ile Glu His Leu Asp
Lys	100 105 Leu Ile Phe Gin Asp Ala Pro Glu	110 Thr Asn Ile Ser Val Pro Thr
Asp	115 120 Thr His Glu Cys Lys· Arg Phe Ile	125 Leu Thr Ile Ser Gin Gin Phe
Ser	130 135 Glu Cys Met Asp Leu Ala Leu Lys	140 Ser Leu Thr Ser Gly Ala Gin
145 150 155 160 Gin Ala Thr Thr Glu Glu Tyr Met Pro Met Glu 165 170 <210> 97 <211> 49 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220> <223> Starter oligonukleotydowy ZC41607 <400> 97 tccagggaat tcatataggc cggccaccat ggcctctcac tcaggcccc <210> 98 <211> 82 <212» DNA <213> Sztuczna sekwencja <220> <223> Starter oligonukleotydowy ZC41605 <400» 98 caaccccaga gctgttttaa ggcgcgcctc tagattatta ttccatcggc atgtattctt
cagtggtggc ctgttgggct cc

<210> 99 <211> 629 <212» DNA

PL 211 833 B1

195 <213> Mus musculus <22Q>

<221> CDS <222> (28)...(528) <400 99 aaccccttgg aggaccagaa cgagaca atg gtt ctt gcc age tct acc acc age 54 Met Val Leu Ala Ser Ser Thr Thr Ser 1 5

atc cac

acc

atg ctg

ctc

ctg

ctc

ctg

atg

ctc

ttc

cac

ctg

gga

ctc

102

Ile His

Thr

Mdt

Leu

Leu

Leu

Leu

Leu

Met

Leu

Phe

His

Leu

Gly

Leu

10

15

20

25

caa gct

tea

atc agt

ggc

cgg

gat

acc

cac

cgt

tta

acc

aga

acg

ttg

150

Gin Ala

Ser

Ile Ser

Gly Arg Asp Thr

His

Arg

Leu

Thr

Arg

Thr

Leu

30

35

40

aat tgc

age

tct

att

gtc

aag

gag

att

ata

ggg

aag

ctc

cca

gaa

cct

198

Asn Cys

Ser

Ser

Ile

Val

Lys

Glu

Ile

Ile

Gly Lys

Leu

Pro

Glu

Pro

45

50

55

gaa ctc

aaa

act

gat gat

gaa

gga

ccc

tct

ctg

agg

aat

aag

age

ttt

246

Glu Leu

Lys

Thr

Asp Asp

Glu

Gly

Pro

Ser

Leu

Arg Asn

Lys

Ser

Phe

60

65

70

cgg aga

gta

aac

ctg

tcc

aaa

ttc

gtg

gaa

age

caa

gga

gaa

gtg

gat.

294

Arg Arg

Val

Asn

Leu

Ser

Lys

Phe

Val

Glu

Ser

Gin

Gly

Glu

Val

Asp

75

80

85

cct gag

gac

aga

tac

gtt

atc

aag

tcc

aat

ctt

cag

aaa

ctt

aac

tgt

342

Pro Glu

Asp Arg Tyr

Val

Ile

Lys

Ser

Asn

Leu

Gin

Lys

Leu

Asn

Cys

90

95

100

105

tgc ctg

cct

aca

tct

gcg

aat

gac

tct

gcg

ctg

cca

ggg

gtc

ttc

att

390

Cys Leu

Pro

Thr

Ser

Ala

Asn Asp

Ser

Ala

Leu

Pro

Gly

Val

Phe

Ile

1L0

115

120

ega gat ctg

gat

gac

ttt

cgg

aag

aaa

ctg

aga

ttc

tac

atg

gtc

cac

438

Arg Asp Leu Asp Asp

Phe

Arg Lys

Lys

Leu

Arg

Phe

Tyr

Met

Val

His

125

130

135

196

PL 211 833 B1

Ctt

aac

gat

ctg

gag

aca

gtg

eta

acc

tct

aga

cca

cct

cag

ccc

gca

486

Leu

Asn

Asp

Leu

Glu

Thr

Val

Leu

Thr

Ser

Arg

Pro

Pro

Gin

Pro

Ala

140

145

150

tct

ggc

tcc

gtc

tct

cct

aac

cgt

gga

acc

gtg

gaa

tgt

taa

528

Ser

Gly

Ser

Val

Ser

Pro

Asn

Arg

Gly

Thr

Val

Glu

Cys

Λ

155 160 165 aacagcaggc agagcaccta aagtctgaat gttcctcatg gcccatggtc aaaaggattt 588 tacattcctt tatgccatca aatgtcttat caatttatct a 629 <210> 100 ' <2U> 166 <212> PRT <213> Mus musculus

<400>

100

Met

Val

Leu

Ala

Ser

Ser

Thr

Thr

Ser

Ile

His

Thr

Met

Leu

Leu

Leu

1

5

10

15

Leu

Leu

Met

Leu

Phe

His

Leu

Gly

Leu

Gin

Ala

Ser

Ile

Ser

Gly

Arg

20

25

30

Asp

Thr

His

Arg

Leu

Thr

Arg

Thr

Leu

Asn

Cys

Ser

Ser

Ile

Val

Lys

35

40

45

Glu

Ile

Ile

Gly

Lys

Leu

Pro

Glu

Pro

Glu

Leu

Lys

Thr

Asp

Asp

Glu

50

55

60

Gly

Pro

Ser

Leu

Arg

Asn

Lys

Ser

Phe

Arg

Arg

Val

Asn

Leu

Ser

Lys

65

70

75

80

Phe

Val

Glu

Ser

Gin

Gly

Glu

Val

Asp

Pro

Glu

Asp

Arg

Tyr

Val

Ile

85

90

95

Lys

Ser

Asn

Leu

Gin

Lys

Leu

Asn

Cys

Cys

Leu

Pro

Thr

Ser

Ala

Asn

100

105

110

Asp

Ser

Ala

Leu

Pro

Gly

Val

Phe

Ile

Arg

Asp

Leu

Asp

Asp

Phe

Arg

115

120

125

Lys

Lys

Leu

Arg

Phe

Tyr

Met

Val

His

Leu

Asn

Asp

Leu

Glu

Thr

Val

130

135

140

Leu

Thr

Ser

Arg

Pro

Pro

Gin

Pro

Al a

Ser

Gly

Ser

Val

Ser

Pro

Asn

145

150

155

160

Arg

Gly

Thr

Val

G.lu

Cys

165

<210> 101 <211> 674

PL 211 833 B1

197 <212> DNA <213> Homo sapiens <220 <221> CDS <222> (10)...(464) <400> 101 gatccaaac atg agc cgc ctg ccc gtc ctg ctc ctg ctc caa ctc ctg gtc 51 Met Ser Arg Leu Pro Val Leu Leu Leu Leu Gin Leu Leu Val

5 10

cgc ccc gga ctc-caa gct ccc atg acc cag aca acg tcc ttg aag aca

99

Arg 15

Pro Gly

Leu

Gin

Ala 20

Pro

Met

Thr

Gin

Thr 25

Thr Ser

Leu

Lys

Thr 30

agc

tgg gtt

aac

tgc

tct

aac

atg

atc

gat

gaa

att

ata

aca

cac

tta

147

Ser

Trp

Val

Asn

Cys

Ser

Asn

Met

Ile

Asp

Glu

Ile

Ile Thr

His

Leu

35

40

45

aag

cag

cca

cct

ttg

cct

ttg

ctg

gac

ttc

aac

aac

ctc

aat

ggg

gaa

195

Lys

Gin

Pro

Pro

Leu

Pro

Leu

Leu

Asp

Phe

Asn

Asn

Leu

Asn

Gly

Glu

50

55

60

gac

caa

gac

att

ctg

atg

gaa

aat

aac

ctt

ega

agg

cca

aac

ctg

gag

24'3

Asp

Gin

Asp

Ile

Leu

Met

Glu

Asn

Asn

Leu

Arg Arg

Pro

Asn

Leu

Glu

65

70

75

gca

ttc

aac

agg

gct gtc

aag

agt

tta

cag

aac

gca

tca

gca

att

gag

291

Al a

Phe

Asn

Arg

Al a

Val

Lys

Ser

Leu

Gin

Asn

Ala

Ser

Ala

Ile

Glu

80

85

90

agc

att

ctt

aaa

aat

ctc

ctg

cca

tgt

ctg

ccc

ctg

gcc

acg

gcc

gca

339

Ser

Ile

Leu

Lys

Asn

Leu

Leu

Pro

Cys

Leu

Pro

Leu

Ala

Thr

Ala

Ala

95

100

105

110

ccc

acg

ega

cat

cca

atc

cat

atc

aag

gac

ggt

gac

tgg

aat

gaa

ttc

387

Pro

Thr

Arg

Hi s

Pro

Ile

His

Ile

Lys

Asp Gly Asp Trp

Asn

Glu

Phe

115

120

125

cgg

agg

aaa

ctg

acg

ttc

tat

ctg

aaa

acc

ctt

gag

aat

gcg

cag

gct

435

Arg

Arg

Lys

Leu

Thr

Phe

Tyr

Leu

Lyś

Thr

Leu

Glu Asn

Ala

Gin

Ala

130

135

140

198

PL 211 833 B1 caa cag acg act ttg age ctc gcg atc tt ttagtccaac gtccagctcg 484 Gin Gin Thr Thr Leu Ser Leu Ala Ile

145 150 ttctctgggc cttctcacca cagcgcctcg ggacatcaaa aacagcagaa cttctgaaac 544 ctctgggtca tctctcacac attccaggac cagaagcatt tcaccttttc ctgcggcatc 604 agatgaattg ttaattatct aatttctgaa atgtgcagct cccatttggc cttqtgcqgt 664 tgtgttctca 674 <210> 102 <211> 151 <212» PRT <213> Homo sapiens <400> 102

Met

Ser

Arg

Leu

Pro

Val

Leu

Leu

Leu

Leu

Gin

Leu

Leu

Val

Arg

Pro

1

5

10

15

Gly

Leu

Gin

Ala

Pro

Met

Thr

Gin

Thr

Thr

Ser

Leu

Lys

Thr

Ser

Trp

20

25

30

Val

Asn

Cys

Ser

Asn

Met

Ile

Asp

Glu

Ile

Ile

Thr

His

Leu

Lys

Gin

35

40

45

Pro

Pro

Leu

Pro

Leu

Leu

Asp

Phe

Asn

Asn

Leu

Asn

Gly

Glu

Asp

Gin

50

55

60

Asp

Ile

Leu

Met

Glu

Asn

Asn

Leu

Arg

Arg

Pro

Asn

Leu

Glu

Ala

Phe

65

70

75

80

Asn

Arg

Ala

Val

Lys

Ser

Leu

Gin

Asn

Al a

Ser

Ala

Ile

Glu

Ser-

Ile

85

90

95

Leu

Lys

Asn

Leu

Leu

Pro

Cys

Leu

Pro

Leu

Ala

Thr

Ala

Ala

Pro

Thr

100

105

110

Arg

His

Pro

Ile

His

Ile

Lys

Asp

Gly

Asp

Trp

Asn

Glu

Phe

Arg

Arg

115

120

125

Lys

Leu

Thr

Phe

Tyr

Leu

Lys

Thr

Leu

Glu

Asn

Ala

Gin

Ala

Gin

Gin

130

135

140

Thr

Thr

Leu

Ser

Leu

Ala

Ile

145

150

<210> 103 <211> 7 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja

PL 211 833 B1

199 <220>

<223>

Alternatywny znacznik Glu-Glu (CEE) bez pary reszt Gly Ser <400> 103

Glu Glu Tyr Met Pro Met Glu 1 5 <210> 104 <211> 513 <21*2> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220 <223> ^Mysi polinukleotyd zCytor!7Lig(m)-CEE <221> CDS <222> (1)...(513) <400> 104

atg atc ttc cac

aca Thr 5

gga aca acg aag cct acc ctg gtg ctg ctt tgc

48

Met.Ile Phe 1

His

Gly Thr

Thr

Lys

Pro 10

Thr

Leu

Val

Leu

Leu 15

Cys

tgt

ata

gga

acc

tgg

ctg

gcc

acc

tgc

agc

ttg

tcc

ttc

ggt

gcc

cca

96

Cys

Ile

Gly

Thr

Trp

Leu

Ala

Thr

Cys

Ser

Leu

Ser

Phe

Gly

Al a·

Pro

20

25

30

ata

tcg

aag

gaa

gac

tta

aga

act

aca

att

gac

ctc

ttg

.aaa

caa

gag

144

Ile

Ser

Lys

Glu

Asp

Leu

Arg

Thr

Thr

Ile

Asp

Leu

Leu

Lys

Gin

Glu

35

40

45

tct

cag

gat

ctt

tat

aac

aac

tat

agc

ata

aag

cag

gca

tct

ggg

atg

192

Ser

Gin

Asp

Leu

Tyr

Asn

Asn

Tyr

Ser

Ile

Lys

Gin

Ala

Ser

Gly

Met

50

55

60

tca

gca

gac

gaa

tca

ata

cag

ctg

ccg

tgt

ttc

agc

ctg

gac

cgg

gaa

240

Ser

Ala

Asp

Glu

Ser

Ile Gin

Leu

Pro

Cys

Phe

Ser

Leu

Asp Arg

Glu

65

70

75

80

gca

tta

acc

aac

atc

tcg gtc

atc

ata

gca

cat

ctg

gag

aaa gtc

aaa

288

Ala

Leu

Thr

Asn

Ile

Ser Val

Ile

Ile

Ala

His

Leu

Glu

Lys Val

Lys

200

PL 211 833 B1

90 95 gtg ttg agc gag aac aca gta gat act tct tgg gtg ata aga tgg eta 336

Val Leu Ser Glu Asn Thr Val Asp Thr Ser Trp Val Ile Arg Trp Leu

100 105 110

aca aac Thr Asn

atc Ile 115

agc Ser

tgt ttc aac cca

ctg aat tta aac

att tct gtg cct

384

Cys

Phe Asn Pro 120

Leu

Asn

Leu

Asn

Ile 125

Ser

Val

Pro

gga

aat

act

gat

gaa

tcc

tat

gat

tgt

aaa

gtg

ttc

gtg

ctt

acg

gtt

432

Gly

Asn

Thr

Asp

Glu

Ser

Tyr Asp Cys

Lys

Val

Phe

Val

Leu

Thr

Val

130 135 140

tta aag cag ttc tca

aac tgc atg gca gaa ctg cag gct aag gac aat

480

Leu 145

Lys Gin

Phe Ser

Asn 150

Cys

Met Ala

Glu

Leu Gin Ala Lys Asp Asn

155

160

act

aca

tgc

gaa

gaa

tac

atg

ccg

atg

gaa

tga

513

Thr

Thr

Cys

Glu

Glu

Tyr

Met

Pro

Met

Glu

*

165 170 <210> 105 <211> 170 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Mysi polipeptyd zCytorl7Lig(m)-CEE <400> 105

Met

Ile

Phe

His

Thr

Gly

Thr

Thr

Lys

Pro

Thr

Leu

Val

Leu

Leu

Cys

1

5

10

15

Cys

Ile

Gly

Thr

Trp

Leu

Al a

Thr

Cys

Ser

Leu

Ser

Phe

Gly

Ala

Pro

20

25

30

Ile

Ser

Lys

Glu

Asp

Leu

Arg

Thr

Thr

Ile

Asp

Leu

Leu

Lys

Gin

Glu

35

40

45

Ser

Gin

Asp

Leu

Tyr

Asn

Asn

Tyr

Ser

Ile

Lys

Gin

Ala

Ser

Gly'

Met

50

55

60

Ser

Ala

Asp

Glu

Ser

Ile

Gin

Leu

Pro

Cys

Phe

Ser

Leu

Asp

Arg

Glu

65

70

75

80

Ala

Leu

Thr

Asn

Ile

Ser

Val

Ile

Ile

Al a

Hi s

Leu

Glu

Lys

Val

Lys

PL 211 833 B1

201

85

90

95

Val

Leu

Ser

Gl u

Asn

Thr

Val

Asp

Thr

Ser

Trp

Val

Ile

Arg

Trp

Leu

100

105

110

Thr

Asn

Ile

Ser

Cys

Phe

Asn

Pro

Leu

Asn

Leu

Asn

Ile

Ser

Val

Pro

115

120

125

Gly

Asn

Thr

Asp

Glu

Ser

Tyr

Asp

Cys

Lys

Yal

Phe

Yal

Leu

Thr

Yal

130

135

140

Leu

Lys

Gl n

Phe

Ser

Asn

Cys

Met

Ala

Glu

Leu

Gin

Ala

Lys

Asp

Asn

145

150

155

160

Thr

Thr

Cys

Glu

Glu

Tyr

Met

Pro

Met

Glu

165

170

<210> 106 <21L> 49 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC41643 <40O> 106 tccagggaat tcatataggc cggccaccat gatcttccac acaggaaca 49 <210> 107 <211> 85 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC41641 <400> 107 caaccccaga gctgttttaa ggcgcgcctc tagattatca ttccatcggc atgtattctt 60 cgcatgtagt attgtcctta gcctg 85 <210> 108 <211> 19 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <22 D>

<223> ^starter oligonukleotydowy ZC38. 239

202

PL 211 833 B1 <400» 108 gccgactaag ccagagaac ¹⁹ <210» 109 <211> 20 <212> DNA <213» Sztuczna sekwencja <220>

<223> Starter oligonukleotydowy ZC38, 245 <400> 109 ctgttgacag ttctgaaccg ²⁰ <210» 110 <211> 20 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220» <223> Starter oligonukleotydowy ZC38, 238 <400> 110 cgcggtttcc attgtatctg ²⁰ <210> 111 <211> 2748 <212> DNA <213> Mus musculus <220>

<221> CDS <222> (237)...(2222) <400> 111 gatggggccc tgaatgttga tctgacagaa ttccagacca acctggtggt tattgtcctt 60 ttcatctggt catgct-gaat atactctcaa gatgtgctgg agaaggtgct gctgtccggg 120 ctctcagaga aggcagtgct ggaggcgttc ctggcccggg tctcctccta ctgttcctgg 180 tagcccagcc ttctcggggt ggaaggagaa gctggccagg tgagctctga ggaagc atg 239

Met

PL 211 833 B1

203

ctg agc agc cag aag gga

tcc tgc agc Ser Cys Ser 10

cag Gin

gaa cca ggg gca gcc

cac Hi s.

287

Leu

Ser

Ser

Gin Lys Gly 5

Glu Pro Gly

Ala 15

Ala

gtc

cag

cct

ctg ggt gtg

aac

gct

gga

ata

atg

tgg

acc

ttg

gca

ctg

335

Val

Gin

Pro

Leu

Gly

Val

Asn

Ala

Gly

Ile

Met

Trp

Thr

Leu

Ala

Leu

20

25

30

tgg

gca

ttc

tct

ttc

ctc

tgc

aaa

ttc

agc

ctg

gca

gtc

ctg

ccg

act

383

Trp Ala

Phe

Ser

Phe

Leu

Cys

Lys

Phe

Ser

Leu

Ala

Val

Leu

Pro

Thr

35

40

45

aag

cca

gag

aac

att

tcc

tgc

gtc

ttt

tac

ttc

gac

aga

aat

ctg

act

431

Lys

Pro

Glu

Asn

Ile

Ser

Cys

Val

Phe

Tyr

Phe

Asp Arg

Asn

Leu

Thr

50

55

60

65

tgc

act

tgg

aga

cca

gag

aag

gaa

acc

aat

gat

acc

agc

tac

att

gtg

479

Cys

Thr

Trp Arg

Pro

Glu

Lys

Glu

Thr

Asn

Asp

Thr

Ser

Tyr

Ile

Val

70

75

80

act

ttg

act

tac

tcc

tat

gga

aaa

agc

aat

tat

agt

gac

aat

gct

aca

527

Thr

Leu

Thr

Tyr

Ser

Tyr Gly Lys

Ser

Asn

Tyr

Ser

Asp

Asn

Ala

Thr

85

90

95

gag

gct

tca

tat

tct

ttt

ccc

cgt

tcc

tgt

gca

atg

ccc

cca

gac

atc

575

Glu Ala

Ser

Tyr

Ser

Phe

Pro

Arg

Ser

Cys

Ala

Met

Pro

Pro

Asp

Ile

100

105

11D

tgc

agt

gtt

gaa

gta

caa

gct

caa

aat

gga

gat ggt

aaa

gtt

aaa

tct

623

Cys

Ser

Val

Glu

Val

Gin

Ala

Gin

Asn

Gly Asp Gly Lys

Val

Lys

Ser

115

120

125

gac

atc

aca

tat

tgg.

cat

tta

atc

tcc

ata

gca

aaa

acc

gaa

cca

cct

671

Asp

Ile

Thr

Tyr Trp

His

Leu

Ile

Ser

Ile

Ala

Lys

Thr

Glu

Pro

Pro

130

135

140

145

ata

att

tta

agt gtg

aat

cca

att

tgt

aat

aga

atg

ttc

cag

ata

caa

719

Ile

Ile

Leu

Ser

Va-1

Asn

Pro

Ile

Cys

Asn

Arg

Met

Phe

Gin

Ile

Gin

150

155

160

tgg

aaa

ccg

cgt

gaa.

aag

act

cgt

ggg

ttt

cct

tta

gta

tgc

atg

ctt

767

Trp Lys

Pro

Arg

Glu

Lys

Thr

Arg

Gly

Phe

Pro

Leu

Val

Cys

Met

Leu

155

170

175

204

PL 211 833 B1

cgg Arg

ttc aga

act gtc aac Thr Val Asn

agt Ser

age ege tgg acg gaa gtc aat ttt

gaa Glu

815

Phe

Arg 180

Ser 185

Arg Trp

Thr

Glu

Val 190

Asn

Phe

aac

tgt

aaa

cag

gtc

tgc

aac

ctc

aca

gga

ctt

cag

gct

ttc

aca

gaa

863

Asn

Cys

Lys

Gin

Val

Cys

Asn

Leu

Thr

Gly

Leu

Gin

Ala

Phe

Thr

Glu

195

200

205

tat

gtc

ctg

gct

eta

ega-

ttc

agg

ttc

aat

gac

tea

aga

tat

tgg

age

911

Tyr

Val

Leu

Ala

Leu

Arg

Phe

Arg

Phe

Asn

Asp

Ser

Arg Tyr

Trp

Ser

210

215

220

225

aag

tgg

age

aaa

gaa

gaa

acc

aga

gtg

act

atg

gag

gaa

gtt

cca

cat

959

Lys

Trp

Ser

Lys

Glu- G1 u

Thr

Arg

Val

Thr

Met

Glu

Glu

Val

Pro

His

230

235

240

gtc

ctg

gac

ctg

tgg aga

att

ctg

gaa

cca

gca

gac

atg

aac

gga

gac

1007

Val

Leu

Asp

Leu

Trp Arg

Ile

Leu

Glu

Pro

Ala

Asp

Met

Asn

Gly

Asp

245

250

255

agg

aag

gtg

ega

ttg

ctg

tgg

aag

aag

gca

aga

gga

gcc

ccc

gtc

ttg

1055

Arg Lys

Val

Arg

Leu

Leu

Trp

Lys

Lys

Ala

Arg

Gly

Ala

Pro

Val

Leu

250

255

270

gag

aaa

aca

ttt

ggc

tac

cac

ata

cag

tac

ttt

gca

gag

aac

age

act

1103

Glu

Lys

Thr

Phe

Gly Tyr

His

Ile

Gin

Tyr

Phe

Ala

Glu

Asn

Ser

Thr

275

280

285

aac

ctc

aca

gag

ata

aac

aac

atc

acc

acc

cag

cag

tat

gaa

ctg

ctt·

1151

Asn

Leu

Thr

Glu

Ile

Asn

Asn

Ile

Thr

Thr

Gin

Gin

Tyr

Glu

Leu

Leu

290

295

300

305

ctg

atg

age

cag

gca

cac

tct

gtg

tcc

gtg

act

tct

ttt

aat

tct

ctt

1199

Leu

Met

Ser

Gin

Ala

His

Ser

Val

Ser

Val

Thr

Ser

Phe

Asn

Ser

Leu

310

315

320

ggc

aag

tcc

caa

gag

acc

atc

ctg

agg

atc

cca

gat

gtc

cat

gag

aag

1247

Gly

Lys

Ser

Gin

Glu

Thr

Ile

Leu

Arg

Ile

Pro

Asp

Val

His

Glu

Lys

325

330

335

acc

ttc

cag

tac

att

aag

age

atg

cag

gcc

tac

ata

gcc

gag

ccc

ctg

1295

Thr

Phe

Gin

Tyr

Ile

Lys

Ser

Met

Gin

Al a

Tyr

Ile

Al a

Glu

Pro

Leu

PL 211 833 B1

205

340 345 350

ttg gtg gtg aac

tgg Trp

caa agc tcc att cct gcg gtg gac act

tgg Trp

ata Ile

1343

Leu Val 355

Val

Asn

Gin

Ser 360

Ser

Ile Pro Ala

Val 365

Asp

Thr

gtg

gag

tgg

ctc

cca

gaa

get

gcc

atg

teg

aag

ttc

cct

gcc

ctt

tcc

1391

Val

Glu

Trp

Leu

Pro

Glu

Ala

Ala

Met

Ser

Lys

Phe

Pro

Ala

Leu

Ser

370

375

380

385

tgg

gaa

tct

gtg

tct

cag

gtc

acg

aac

tgg

acc

atc

gag

caa

gat

aaa

1439

Trp

Glu

Sen

Val

Ser

Gin

Val

Thr

Asn

Trp

Thr

Ile

Glu

Gin

Asp Lys

390

395

400

eta

aaa

cct

ttc

aca

tgc

tat

aat

ata

tea

gtg

tat

cca

gtg

ttg

gga

1487

Leu

Lys

Pro

Phe Thr

Cys Tyr

Asn

Ile

Ser

Val

Tyr

Pro

Val

Leu

Gly

405

410

415

cac

ega

gtt

gga

gag

ccg

tat

tea

atc

caa

get

tat

gcc

aaa

gaa

gga

1535

His

Arg

Val

Gly Glu

Pro

Tyr

Ser

Ile

Gin

Ala

Tyr

Ala

Lys

Glu

Gly

420

425

430

act

cca

tta

aaa

ggt

cct

gag

acc

agg

gtg

gag

aac

atc

ggt ctg

agg

1583

Thr

Pro

Leu

Lys

Gly

Pro

Glu

Thr

Arg

Val

Glu

Asn

Ile

Gly

Leu

Arg

435

440

445

aca

gcc

acg

atc

aca

tgg

aag

gag

att

cct

aag

agt

get

agg

aat

ggu

1631

Thr

Ala

Thr

Ile

Thr

Trp

Lys

Glu

Ile

Pro

Lys

Ser

Ala

Arg

Asn

Gly

450

455

460

465

ttt

atc

aac

aat

tac

act

gta

ttt

tac

caa

get

gaa

ggt

gga

aaa

gaa

1679

Phe

Ile

Asn

Asn

Tyr

Thr

Val

Phe

Tyr

Gin

Ala

Glu

Gly

Gly

Lys

Glu

470

475

480

ctc

tcc

aag

act

gtt

aac

tct

cat

gcc

ctg

cag

tgt

gac

ctg

gag

tct

1727

Leu

Ser

Lys

Thr

Val

Asn

Ser

His

Ala

Leu

Gin

Cys Asp

Leu

Glu

Ser

485

490

495

ctg

aca

ega

agg

acc

tct

tat

act

gtt

tgg

gtc

atg

gcc

agc

acc

aga

1775

Leu

Thr

Arg

Arg

Thr

Ser

Tyr

Thr

Val

Trp

Val

Met

Ala

Ser

Thr

Arg

500

505

510

get

gga

ggt

acc

aac

ggg

gtg

aga

ata

aac

ttc

aag

aca

ttg

tea

atc

1823

206

PL 211 833 B1

Ala Gly 515

Gly

Thr

Asn Gly Val Arg 520

Ile Asn

Phe

Lys 525

Thr

Leu

Ser

Ile

agt gtg

ttt

gaa

att

gtc

ctt

eta

aca

tct

eta

gtt

gga

gga

ggc

ctt

1871

Ser

Va1

Phe

Glu

Ile

Val

Leu

Leu

Thr

Ser

Leu

Val

Gly Gly

Gly

Leu

530

535

540

545

ctt

eta

ctt

agc

atc

aaa

aca

gtg

act

ttt

ggc

ctc

aga

aag

cca

aac

1919

Leu

Leu

Leu

Ser

Ile

Lys

Thr

Val

Thr

Phe Gly

Leu

Arg Lys

Pro

Asn

550

555

560

cgg

ttg

act

ccc

ctg

tgt tgt

cct

gat

gtt

ccc

aac

cct

gct

gaa

agt

1967

Arg

Leu

Thr

Pro

Leu

Cys Cys

Pro

Asp

Val

Pro

Asn

Pro

Al a

Glu

Ser

565

570

575

agt

tta

gcc

aca

tgg

ctc

gga

gat

ggt

ttc

aag

aag

tca

aat

atg

aag

2015

Ser

Leu

Ala

Thr

Trp

Leu

Gly Asp

Gly

Phe

Lys

Lys

Ser

Asn

Met

Lys

580

585

590

gag

act

gga

aac

tct

ggg

aac

aca

gaa

gac

gtg gtc

eta

aaa

cca

tgt

2063

Glu

Thr

Gly

Asn

Ser

Gly

Asn

Thr

Glu

Asp

Val

Val

Leu

Lys

Pro

Cys

595

600

605

ccc

gtc

ccc

gcg

gat

ctc

att

gac

aag

ctg gta gtg

.aac

ttt

gag

aat

2111

Pro

Val

Pro

Ala

Asp

Leu

Ile

Asp

Lys

Leu

Val

Val

'Asn

Phe

Glu

Asn

610

615

620

625

ttt

ctg

gaa

gta gtt

ttg

aca

gag

gaa

gct

gga

aag

ggt

cag

gcg

agc

2159

Phe

Leu

Glu

Val

Val

Leu

Thr

Glu

Glu

Ala

Gly Lys

Gly

Gin

Ala

Ser

630

635

640

att

ttg

gga

gga

gaa

gcg

aat

gag

tat

atc

tta

tcc

cag

gaa

cca

agc

2207

Ile

Leu

Gly Gly Glu

Ala Asn

Glu

Tyr

Ile

Leu

Ser Gin Glu

Pro

Ser

645

650

655

tgt cct ggc cat tgc tgaagctacc ctcagggtcc aggacagctg tcttgttggc 2262 Cys Pro Gly His Cys

660 acttgactct ggcaggaacc tgatctctac ttttcttctc cctgtctccg gacactttct 2322 ctccttcatg cagagaęcag gactagagcg gattcctcat ggtttgccag gctcctcagt 2382 ccttgctcgg gctcaggatc ttcaacaatg ccctttctgg gacactccat catccactta 2442 tatttatttt ttgcaacatt gtggattgaa cccagggact tgtttatgcg cgcaacttca 2502

PL 211 833 B1

207 gtaactgtgg cagagactta ggaatggaga tctgaccctt tgcagaaggt ttctggacat 2562 ccgtccctgt gtgagcctca gacagcattg tctttacttt gaatcagctt ccaagttaat 2622 aaaagaaaaa cagagaggtg gćataacagc tcctgcttcc tgacctgctt gagttccagt 2682 tctgacttcc tttggtgatg aacagcaatg tgggaagtgt aagctgaata aaccctttcc 2742 tcccca 2748 <210> 112 <211> 662 <212> PRT <213>Tlus musculus <400> 112

Met

Leu

Ser

Ser

•Gin

Lys

Gly

Ser

Cys

Ser

Gin

Glu

Pro

Gly

Ala

Ala

1

5

10

15

His

Yal

Gin

Pro

Leu

G.ly

Yal

Asn

Ala

Gly

Ile

Met

Trp

Thr

Leu

Ala

20

25

30

Leu

Trp

Ala

Phe

Ser

Phe

Leu

Cys

Lys

Phe

Ser

Leu

Ala

Yal

Leu

Pro

35

40

45

Thr

Lys

Pro

Glu

Asn

Ile

Ser

Cys

Yal

Phe

Tyr

Phe

Asp

Arg

Asn

Leu

50

55

60

Thr

Cys

Thr

Trp

Arg

Pro

Glu

Lys

Glu

Thr

Asn

Asp

Thr

Ser

Tyr

Ile

65

70

75

80

Yal

Thr

Leu

Thr

Tyr

Ser

Tyr

Gly

Lys

Ser

Asn

Tyr

Ser

Asp

Asn

Ala

85

90

95

Thr

Glu

Al a

Ser

Tyr

Ser

Phe

Pro

Arg

Ser

Cys

Ala

Met

Pro

Pro

Asp

100

105

110

ile

Cys

Ser

Val

Glu

Val

Gin

Ala

Gin

Asn

Gly

Asp

Gly

Lys

Val

Lys

115

120

125

Ser

Asp

Ile

Thr

Tyr

Trp

His

Leu

Ile

Ser

Ile

Ala

Lys

Thr

Glu

Pro

130

135

140

Pro

ile

Ile

Leu

Ser

Val

Asn

Pro

Ile

Cys

Asn

Arg

Met

Phe

Gin

Ile

145

150

155

160

Gin

Trp

Lys

Pro

Arg

Glu

Lys

Thr

Arg

Gly

Phe

Pro

Leu

Val

Cys

Met

165

170

175

Leu

Arg

Phe

Arg

Thr

Val

Asn

Ser

Ser

Arg

Trp

Thr

Glu

Val

Asn

Phe

180

185

190

Glu

Asn

Cys

Lys

Gin

Yal

Cys

Asn

Leu

Thr

Gly

Leu’

Gin

Ala

Phe

Thr

195

200

205

Glu

Tyr

Val

Leu

Ala

Leu

Arg

Phe

Arg

Phe

Asn

Asp

Ser

Arg

Tyr

Trp

210

215

220

Ser

Lys

Trp

Ser

Lys

Glu

Glu

Thr

Arg

Yal

Thr

Met

Glu

Glu

Yal

Pro

225

230

235

240

His

Yal

Leu

Asp

Leu

Trp

Arg

Ile

Leu

Glu

Pro

Ala

Asp

Met

Asn

Gly

208

PL 211 833 B1

245

250

255

Asp

Arg

Lys

Val

Arg

Leu

Leu

Trp

Lys

Lys

Ala

Arg

Gly

Al a

Pro

Val

260

265

270

Leu

Glu

Lys

Thr

Phe

Gly

Tyr

His

Ile

Gin

Tyr

Phe

Al a

Glu

Asn

Ser

275

280

285

Thr

Asn

Leu

Thr

Glu

Ile

Asn

Asn

Ile

Thr

Thr

Gin

Gin

Tyr

Glu

Leu

290

295

300

Leu

Leu

Met

Ser

Gin

Ala

His

Ser

Val

Ser

Val

Thr

Ser

Phe

Asn

Ser

305

310

315

320

Leu

Gly

Lys

Ser

Gin

Glu

Thr

Ile

Leu

Arg

Ile

Pro

Asp

Val

His

Glu

325

330

335

Lys

Thr

Phe

Gin

Tyr

Ile

Lys

Ser

Met

Gin

Ala

Tyr

Ile

Ala

Glu

Pro

340

345

350

Leu

Leu

Val

Val

Asn

Trp

Gin

Ser

Ser

Ile

Pro

Ala

Va1

Asp

Thr

Trp

355

360

365

Ile

Val

Glu

Trp

Leu

Pro

Glu

Ala

Ala

Met

Ser

Lys

Phe

Pro

Ala

Leu

370

375

380

Ser

Trp

Glu

Ser

Val

Ser

Gin

Val

Thr

Asn

Trp

Thr

Ile

Glu

Gin

Asp

385

390

395

400

Lys

Leu

Lys

Pro

Phe

Thr

Cys

Tyr

Asn

Ile

Ser

Val

Tyr

Pro

Val

Leu

405

410

415

Gly

His

Arg

Val

Gly

Glu

Pro

Tyr

Ser

Ile

Gin

Ala

Tyr

Al a

Lys

Glu

420

425

430

Gly

Thr

Pro

Leu

Lys

Gly

Pro

Glu

Thr

Arg

Val

Glu

Asn

Ile

Gly

Leu

435

440

445

Arg

Thr

Ala

Thr

Ile

Thr

Trp

Lys

Glu

Ile

Pro

Lys

Ser

Al a

Arg

Asn

450

455

460

Gly

Phe

Ile

Asn

Asn

Tyr

Thr

Val

Phe

Tyr

Gin

Ala

Glu

Gly

Gly

Lys

465

470

475

480

Glu

Leu

Ser

Lys

Thr

Val

Asn

Ser

His

Ala

Leu

Gin

Cys

Asp

Leu

Glu

485

490

495

Ser

Leu

Thr

Arg

Arg

Thr

Ser

Tyr

Thr

Val

Trp

Val

Met

Ala

Ser

Thr

500

505

510

Arg

Ala

Gly

Gly

Thr

Asn

Gly

Val

Arg

Ile

Asn

Phe

Lys

Thr

Leu

Ser

515

520

525

Ile

Ser

Va1

Phe

Glu

Ile

Val

Leu

Leu

Thr

Ser

Leu

Val

Gly

Gly

Gly

530

535

540

Leu

Leu

Leu

Leu

Ser

Ile

Lys

Thr

Val

Thr

Phe

Gly

Leu

Arg

Lys

Pro

545

550

555

560

Asn

Arg

Leu

Thr

Pro

Leu

Cys

Cys

Pro

Asp

Val

Pro

Asn

Pro

Ala

Glu

565

570

575

Ser

Ser

Leu

Ala

Thr

Trp

Leu

Gly

Asp

Gly

Phe

Lys

Lys

Ser

Asn

Met

580

585

590

PL 211 833 B1

209

Lys

Glu

Thr

Gly

Asn

Ser

Gly

Asn

Thr.

Glu

Asp

Va1

Val

Leu

Lys

Pro

595

600

605

Cys

Pro

Val

Pro

Ala

Asp

Leu

Ile

Asp

Lys

Leu

Val

Val

Asn

Phe

Glu

610

615

620

Asn

Phe

Leu

Glu

Val

Val

Leu

Thr

Glu

Glu

Ala

Gly

Lys

Gly

Gin

Ala

625

630

635

640

Ser

Ile

Leu

Gly

Gly

Glu

Ala

Asn

Glu

Tyr

Ile

Leu

Ser

Gin

Glu

Pro

645

650

655

Ser

Cys

Pro

Gly

His

Cys

660 <210> 113 <211> 2728 <212> DNA <213> Mus musculus <220>

<221> CDS <222> (237)...(1877) <400> 113 gatggggccc tgaatgttga tctgacagaa ttccagacca acctggtggt tattgtcctt 60 ttcatctggt catgctgaat atactctcaa gatgtgctgg agaaggtgct gctgtccggg 120 ctctcagaga aggcagtgct ggaggcgttc ctggcccggg tctcctccta ctgttcctgg 180 tagcccagcc ttctcggggt ggaaggagaa gctggccagg tgagctctga ggaagc atg 239

Met

ctg Leu

agc agc cag aag

gga Gly

tcc tgc agc cag gaa cca ggg gca gcc cac

287

Ser Ser

Gin Lys 5

Ser Cys Ser 10

Gin

Glu

Pro

Gly

Ala 15

Ala

His

gtc

cag

cct

ctg ggt gtg

aac

gct

gga

ata

atg

tgg

acc

ttg

gca

ctg

335

Val

Gin

Pro

Leu

Gly

Val

Asn

Ala

Gly

Ile

Met

Trp

Thr

Leu

Ala

Leu

20

25

30

tgg

gca

ttc

tct

ttc

ctc

tgc

aaa

ttc

agc

ctg

gca

gtc

ctg

ccg

act

383

Trp

Ala

Phe

Ser

Phe

Leu

Cys

Lys

Phe

Ser

Leu

Ala

Val

Leu

Pro

Thr

35

40

45

aag

cća

gag

aac

att

tcc

tgc

gtc

ttt

tac

ttc

gac

aga

aat

ctg

act

431

Lys

Pro

Glu Asn

Ile

Ser

Cys

Val

Phe

Tyr

Phe

Asp Arg

Asn

Leu

Thr

210

PL 211 833 B1

55 60 65

tgc act tgg aga cca gag aag

gaa acc aat gat acc agc tac

att Ile 80

gtg Val

479

Cys Thr Trp Arg Pro

Glu Lys

Glu

Thr Asn 75

Asp

Thr

Ser

Tyr

70

act

ttg

act

tac

tcc

tat

gga

aaa

agc

aat

tat

agt

gac

aat

gct

aca

527

Thr

Leu

Thr

Tyr

Ser

Tyr Gly Lys

Ser

Asn

Tyr

Ser

Asp

Asn

Ala

Thr

85

90

95

gag

gct

tca

tat

tct

ttt

ccc

cgt

tcc

tgt

gca

atg

ccc

cca

gac

atc

575

Glu

Ala

Ser

Tyr

Ser

Phe

Pro

Arg

Ser

Cys

Ala

Met

Pro

Pro

Asp

Ile

100

105

110

tgc

agt

gtt

gaa

gta.

caa

gct

caa

aat

gga

gat

ggt

aaa

gtt

aaa

tct

623

Cys

Ser

Val

Glu

Val

Gin Ala Gin

Asn

Gly Asp Gly Lys

Val

Lys

Ser

115

120

125

gac

atc

aca

tat

tgg

cat

tta

atc

tcc

ata

gca

aaa

acc

gaa

cca

cct

671

Asp

Ile

Thr

Tyr

Trp

His

Leu

Ile

Ser

Ile

Ala

Lys

Thr

Glu

Pro

Pro

130

135

140

145

ata

att

tta

agt

gtg

aat

cca

att

tgt

aat

aga

atg

ttc

cag

ata

caa

719

Ile

Ile

Leu

Ser

Val

Asn

Pro

Ile

Cys

Asn

Arg Met

Phe

Gin

Ile

Gin

150

155

160

tgg

aaa

ccg

cgt

gaa

aag

act

cgt

ggg

ttt

cct

tta

gta

tgc

atg -ctt

767

Trp

Lys

Pro Arg

Glu

Lys- Thr

Arg

Gly

Phe

Pro

Leu

Val

Cys

Met

Leu

165

170

175

cgg

ttc

aga

act

gtc

aac

agt

agc

cgc

tgg

acg

gaa

gtc

aat

ttt

gaa

815

Arg

Phe

Arg

Thr

Val

Asn

Ser

Ser

Arg Trp

Thr

Glu

Val

Asn

Phe

Glu

180

185

190

aac

tgt

aaa

cag

gtc

tgc

aac

ctc

aca

gga

ctt

cag

gct

ttc

aca

gaa

863

Asn

Cys

Lys

Gin

Val

Cys

Asn

Leu

Thr

Gly

Leu

Gin

Ala

Phe

Thr

Glu

195

200

205

tat

gtc

ctg

gct

eta

ega

ttc

agg

ttc

aat

gac

tca

aga

tat

tgg'

agc

911

Tyr

Val

Leu

Ala Leu

Arg

Phe

Arg

Phe

Asn

Asp

Ser

Arg

Tyr Trp

Ser

210

215

220

225

aag

tgg

agc

aaa

gaa

gaa

acc

aga

gtg

act

atg

gag

gaa

gtt cca

cat

959

PL 211 833 B1

211

Lys

Trp Ser Lys Glu 230

Glu Thr Arg Val

Thr Met Glu 235

Glu

Val

Pro 240

Hi s

gtc

ctg

gac

ctg

tgg

aga

att

ctg

gaa

cca

gca

gac

atg

aac

gga

gac

1007

Val

Leu

Asp

Leu

Trp Arg

Ile

Leu

Glu

Pro

Ala

Asp

Met

Asn

Gly Asp

245

250

255

agg

aag

gtg

ega

ttg

ctg

tgg

aag

aag

gca

aga

gga

gcc

ccc

gtc

ttg

1055

Arg

Lys

Val

Arg

Leu

Leu

Trp

Lys

Lys

Ala

Arg

Gly

Ala

Pro

Val

Leu

260

265

270

gag

aaa

aca

ttt

ggc

tac

cac

ata

cag

tac

ttt

gca

gag

aac

age

act

1103

Glu

Lys

Thr

Phe'

Gly Tyr

His

Ile

Gin

Tyr

Phe

Al a

Glu

Asn

Ser

Thr

275

280

285

aac

ctc

aca

gag

ata

aac

aac

atc

acc

acc

cag

cag

tat

gaa

ctg

ctt

1151

Asn

Leu

Thr

Glu

ile

Asn

Asn

Ile

Thr

Thr

Gin

Gin

Tyr

Glu

Leu

Leu

290

295

300

305

ctg

atg

age

cag

gca

cac

tct

gtg

tcc

gtg

act

tct

ttt

aat

tct

ctt

1199

Leu

Met

Ser

Gin

Ala

His

Ser

Val

Ser

Val

Thr

Ser

Phe

Asn

Ser

Leu

310

315

320

ggc

aag

tcc

caa

gag

acc

atc

ctg

agg

atc

cca

gat gtc

cat

gag

aag

1247

Gly

Lys

Ser

Gin

Glu

Thr

Ile

Leu

Arg

Ile

Pro

Asp

Val

His

Glu

Lys

325

330

335

acc

ttc

cag

tac

att

aag

age

atg

cag

gcc

tac

ata

gcc

gag

ccc

ctg

1295

Thr

Phe

Gin

Tyr

Ile

Lys

Ser

Met

Gin

Ala

Tyr

Ile

Ala

Glu

Pro

Leu

340

345

350

ttg

gtg gtg

aac

tgg

caa

age

tcc

att

cct

gcg

gtg

gac

act

tgg

ata

1343

Leu

Val

Val

Asn

Trp

Gin

Ser

Ser

Ile

Pro

Ala

Val

Asp

Thr

Trp

Ile

355

360

365

gtg

gag

tgg

ctc

cca

gaa

gct

gcc

atg

teg

aag

ttc

cct

gcc

ctt

tcc

1391

Val

Glu

Trp

Leu

Pro

Glu

Al a-

Ala

Met

Ser

Lys

Phe

Pro

Ala

Leu

Ser

370

375

380

385

tgg

gaa

tct

gtg

tct

cag

gtc

acg

aac

tgg

acc

atc

gag

caa

gat

aaa

1439

Trp

Glu

Ser

Val

Ser

Gin

Val

Thr

Asn

Trp

Thr

Ile

Glu

Gin

Asp

Lys

390

395

400

212

PL 211 833 B1

eta aaa cct ttc aca tgc tat aat ata tca gtg tat cca gtg ttg gga

1487

Leu

Lys Pro

Phe Thr Cys Tyr Asn Ile

Ser Val

Tyr

Pro Val 415

Leu

Gly

405

410

cac

ega

gtt

gga

gag

ccg

tat

tca

atc

caa

gct

tat

gcc

aaa

gaa

gga

1535

Hi s

Arg

Val

Gly

Glu

Pro

Tyr

Ser

Ile Gin

Al a

Tyr

Ala

Lys

Glu

Gly

420

425

430

act

cca

tta

aaa

ggt

cct

gag

acc

agg

gtg

gag

aac

atc

ggt

ctg

agg

1583

Thr

Pro

Leu

Lys

Gly

Pro Glu

Thr

Arg

Val

Glu

Asn

Ile

Gly

Leu

Arg

435

440

445

aca

gcc

acg

atc

aca

tgg

aag

gag

att

cct

aag

agt gct

agg

aat

gga

1631

Thr

Al a

Thr

Ile

Thr

Trp

Lys

Glu

Ile

Pro

Lys

Ser

Al a

Arg

Asn

Gly

450

455

450

465

ttt

atc

aac

aat

tac

act

gta

ttt

tac

caa

gct

gaa

ggt

gga

aaa

gaa

1679

Phe

Ile

Asn

Asn

Tyr

Thr

Val

Phe

Tyr

Gin

Ala

Glu

Gly

Gly

Lys

Glu

470

475

480

ctc

tcc

aag

act

gtt

aac

tct

cat

gcc

ctg

cag

tgt

gac

ctg

gag

tct

1727

Leu

Ser

Lys

Thr

Val

Asn

Ser

His

Ala

Leu

Gin

Cys Asp

Leu

Glu

Ser

485

490

495

ctg

aca

ega

agg

acc

tct

tat

act

gtt tgg gtc

atg

gcc

agc

acc

aga

1775

Leu

Thr

Arg Arg Thr

Ser

Tyr

Thr

Val

Trp

Val

Met

Ala

Ser

Thr

Arg

500

505

510

gct

gga

ggt

acc

aac

ggg

gtg

aga

ata

aac

ttc

aag

aca

ttg

tca

atc

1823

Ala

Gly

Gly

Thr

Asn

Gly

Val

Arg

Ile

Asn

Phe

Lys

Thr

Leu

Ser

Ile

515

520

525

agt

gag

tac

tgg

ctt

cag

gcc

tca

ttc

tgg

agt

tta

ctt

cgg

gtt

gga

1871

Ser

Glu

Tyr Trp

Leu

Gin

Ala

Ser

Phe Trp

Ser

Leu

Leu

Arg

Val

Gly

530

535

540

545

aat gtt tgacaggagc aaggagagcc agcagagggc agcagagcat ggcttctcct 1927 Asn Val gctctctctg gctcactcac ctcccaggag ttactgagga gctggcaaag ggagggctga 1987 gttagaccaa caggccattt tgatccttgc tggtaagcag ccacaaataa tcttaagatg 2047 aagcaagcaa catccacttc agcctcagcc acgtcaaagg ctgttgcctg agctcacact 2107

PL 211 833 B1

213 ggccagttcc taaatgtcag cagaggtcac tgacaaggga gtttgtttgt tatgtgtatt caaatttgtt agatatcaca gctgagggca tgtaatagac gagttccagg acagccaggg tcaatcagtc aatcaatcaa aaccaaaaaa gtcatcttga taaagtagac cgtggctctg acaatgcctt cttggtattc ataaaaatca tgttacagct gagttgtgca atagaacctg cttaatgtta ccatctgcgg caacttatca gcttttacgt tataatgtga aatataatag agagggaaaa gaagaggaaa ctacatggag aaaccctgtc aattcaagca gcattgacaa tgtatctcag aagccccttg agaaccatga gcaagataac ttt-ttgatac aacttctaaa a ggaaggaaca actggttgat tggggctttt gtttcgtttt tgaaaacatg aaaagcaaga tttaataatt gagtaggaaa gccagtctgg tctacaaagt tcaatcaatc aatcaatcaa gttttgcaat aactactata ttatttatgt tcctgaagac acgttctgtc ctgcagccta ataacttttt tttaaaaaaa

2167

2227

2287

2347

2407

2467

2527

2587

2647

2707

2728 <210 114 <211> 547 <212> PRT <213> Mus musculus <40Q> 114

Met

Leu

Ser

Ser

Gin

Lys

Gly

Ser

Cys

Ser

Gin

Glu

Pro

Gly

Ala

Ala

1

5

10

15

His

Val

Gin

Pro

Leu

Gly

Val

Asn

Ala

Gly

Ile

Met

Trp

Thr

Leu

Ala

20

25

30

Leu

Trp

Ala

Phe

Ser

Phe

Leu

Cys

Lys

Phe

Ser

Leu

Ala

Val

Leu

Pro

35

40

45

Thr

Lys

Pro

Glu

Asn

Ile

Ser

Cys

Val

Phe

Tyr

Phe

Asp

Arg

Asn

Leu

50

55

60

Thr

Cys

Thr

Trp

Arg

Pro

Glu

Lys

Glu

Thr

Asn

Asp

Thr

Ser

Tyr

ITe

65

70

75

80

Val

Thr

Leu

Thr

Tyr

Ser

Tyr

Gly

Lys

Ser

Asn

Tyr

Ser

Asp

Asn

Ala

85

90

95

Thr

Glu

Ala

Ser

Tyr

Ser

Phe

Pro

Arg

Ser

Cys

Ala

Met

Pro

Pro

Asp

100

105

110

Ile

Cys

Ser

Val

Glu

Val

Gin

Ala

Gin

Asn

Gly

Asp

Gly

Lys

Val

Lys

115

120.

125

Ser

Asp

Ile

Thr

Tyr

Trp

His

Leu

Ile

Ser

rie

Ala

Lys

Thr

Glu

Pro

130

135

140

Pro

Ile

Ile

Leu

Ser

Val

Asn

Pro

Ile

Cys

Asn

Arg

Met

Phe

Gin

Ile

145

150

155

160

Gin

Trp

Lys

Pro

Arg

Glu

Lys

Thr

Arg

Gly

Phe

Pro

Leu

Val

Cys

Met

165

170

175

Leu

Arg

Phe

Arg

Thr

Val

Asn

Ser

Ser

Arg

Trp

Thr

Glu

Val

Asn

Phe

180

185

190

Glu

Asn

Cys

Lys

Gin

Val

Cys

Asn

Leu

Thr

Gly

Leu

Gin

Ala

Phe

Thr

214

PL 211 833 B1

195

200

205

Glu

Tyr Val

Leu

Ala

Leu

Arg

Phe

Arg

Phe

Asn Asp

Ser

Arg

Tyr Trp

210

215

22J0

Ser

Lys Trp

Ser

Lys

Glu

Glu

Thr

Arg

Val

Thr

Met

G1 u

Glu

Val

Pro

225

230

235

240

His

Val

Leu

Asp

Leu

Trp Arg

Ile

Leu

Glu

Pro

Ala

Asp

Met

Asn

Gly

245

250

255

Asp Arg

Lys

Val

Arg

Leu

Leu

Trp

Lys

Lys

Ala

Arg

Gly

Al a

Pro

Val

260

265

270

Leu

Glu

Lys

Thr

Phe

Gly- Tyr

His

Ile

Gin

Tyr

Phe

Ala

Glu

Asn

Ser

275

280

285

Thr

Asn

L-eu

Thr

Glu

Ile

Asn

Asn

Ile

Thr

Thr Gin

Gin

Tyr

Glu

Leu

290

295

300

Leu

Leu

Met

Ser

Gin

Ala

His

Ser

Val

Ser

Val

Thr

Ser

Phe

Asn

Ser

305

310

315

320

Leu

Gly Lys

Ser

Gin

Glu

Thr

Ile

Leu

Arg

Ile

Pro

Asp

Val

His

Glu

325

330

335

Lys

Thr

Phe

Gin

Tyr

Ile

Lys

Ser

Met

Gin

Ala

Tyr

Ile

Ala

Glu

Pro

340

345

350

Leu

Leu

Val

Val

Asn

Trp

Gin

Ser

Ser

Ile

Pro Ala

Val

Asp

Thr

Trp

355

360

365

Ile

Val

Glu

Trp

Leu

Pro

Glu

Ala

Ala

Met Ser

Lys

Phe

Pro

Ala

Leu

370

375

380

Ser

Trp

Glu

Ser

Val

Ser

Gin

Val

Thr

Asn Trp

Thr

Ile

Glu

Gin

Asp

385

390

395

400

Lys

Leu

Lys

Pro

Phe

Thr Cys

Tyr

Asn

Ile

Ser

Val

Tyr

Pro

Val

Leu

405

410

415

Gly

His

Arg

Val

Gly

G1 u

Pro

Tyr

Ser

Ile

Gin

Ala

Tyr

Ala

Lys

Glu

420

425

430

Gly

Thr

Pro

Leu

Lys

Gly

Pro

Glu

Thr

Arg

Val

Glu

Asn

Ile

Gly

Leu

435

440

445

Arg

Thr

Ala

Thr

Ile

Thr

Trp

Lys

Glu

Ile

Pro

Lys

Ser

Al a

Arg

Asn

450

455

460

Gly

Phe

Ile

Asn

Asn

Tyr

Thr

Val

Phe

Tyr

Gin

Ala

Glu

Gly Gly

Lys

465

470

475

480

Glu

Leu

Ser

Lys

Thr

Val

Asn

Ser

His

Al a

Leu

Gin

Cys Asp

Leu

Glu

485

490

495

Ser

Leu

Thr

Arg

Arg

Thr

Ser

Tyr

Thr

Val

Trp

Val

Met

Ala

Ser

Thr

500

505

510

Arg

Ala

Gly Gly

•Thr

Asn

Gly

Val

Arg

Ile

Asn

Phe

Lys

Thr

Leu

Ser

515

520

525

Ile

Ser

Glu

Tyr Trp

Leu

Gir

Al a

Ser

Phe

Trp

Ser

Leu

Leu

Arg

Val

530 535 540

PL 211 833 B1

215

Gly Asn Val 545 <21G> 115 <211> 30 .

<212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Starter ZC41, 764 <400> 115 atcgaattca gaccaatggc tttctctgtg 30 <210> 116 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Starter ZC41, 598 <400> 116 acagtagtgt tctgactcag ttgg 24 <210> 117 <211> 21 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Starter ZC41, 948 <400> 117 ggtactgttc tctttgtctc g 21 <210> 118 <211> 27 <212> DNA <213> Sztuczna, sekwencja <220

216

PL 211 833 B1 <223> Starter ZC41, 766 <400> 118 atctctagat gtttactgtt caccttg 27 <210» 119 <211> 4026 <212» DNA <213» Mus musculus <220>

<221> CDS <222> (780)...(3692) <400> 119 ctgtggacat tttąccatgc agccataaag agaggtcaaa aatgtctttc aagtgcccgg 60 ttagtaaaga tctgatggcg ttctaaggag agaaaggaac ttggatcttc gtggacaaag 120 aattcaggtc tgtagctgaa ggaggcgtgg ccacacaggg cgtttccagg tcctgtagag 180 gaagcacagt tcatagatct ctgttctaac acgtctgtct tgctctgaac gccgaaagtc 240 aactcgatca caagtttgat ccaacagttt gacatttcag gtaattttca gacggagcgc 300 tggggttgga tctcccaagc aacacaattg gctctgtgca ggacacctgg cacggggcac 360 tgggtcgcag ctcgtcccct ctccctccag gaacaacgat gctcaaggac cagcttttcc 420 tcccaggcct ctcccacttc ccttctcacc ggtgctgccc gcccggtccc gggaaccgcg 480 cccgtcgcag ggtcccgatc gttcccccta catcccttgg gaccąggagc.aaattcctgt 540 gggtcccagg agtgccaaaa gtgctcagcg agacgggaaa ttgcaacagt acttggccct 600 tcggccctcc cccggcgctt tcccgtaact cccgcccctg gacacttgtc ccgtagttga 660 ttcatagctg gggcgcgggg ccgcctccac acgcctggac agacgtccgc gcccgttccc 720 ctgtgaggcc gaggaccggc aaggctccgg agcaggtcgc caggcgggta atcagacca 779

.atg Met 1

gct Ala

ttc tct gtg

gtc Val

ctt cat Leu His

cca gcc ttc ctc ctg gca

gtg Val 15

ctg Leu*'

827

Phe

Ser

Val 5

Pro

Al a 10

Phe

Leu

Leu

Ala

tcc

ctg

agg

gca

tcc

ega

age

gaa

gtc

ttg

gag

gag

cct

tta

cca

ttg

875

Ser

Leu

Arg

Ala

Ser

Arg

Ser

Glu

Val

Leu

Glu

Glu

Pro

Leu

Pro

Leu

20

25

30

act

cct

gag-

ata

cat

aaa

gtt

tct

ttt

caa

ttg

aaa

ctt

caa

gaa

gtg

923

Thr

Pro

Glu

Ile

His

Lys

Val

Ser

Phe

Gin

Leu

Lys

Leu

Gin

Glu

Val

35

40

45

aat

tta

gaa

cgg

act

gtc

cca

gcc

ctt

act

cat

gaa

gaa

tta

aac

atg

971

Asn

Leu

Glu

Trp

Thr

Val

Pro

Al a

Leu

Thr

His

Glu

Glu

Leu

Asn

Met

55 60

PL 211 833 B1

217

ata Ile 65

ttt cag ata gag atc agt

aga Arg

ctg aac ata tcć aac acc atc tgg

1019

Phe

Gin

Ile Glu

Ile Ser 70

Leu Asn Ile 75

Ser

Asn

Thr

Ile

Trp 80

gtg

gag

aat

tat

agc

acc

act

gtg

aag

cgt

gaa

gaa

gct

gtg

cgt

tgg

1067

Yal

Glu

Asn

Tyr

Ser

Thr

Thr

Yal

Lys Arg

Glu

Glu

Al a

Val

Arg Trp

85

90

95

aac

tgg

acg

tct

gat

atc

cct

ttg

gag

tgt gtc

aaa

cat

ttc

ata

aga

1115

Asn

Trp

Thr

Ser

Asp

Ile

Pro

Leu

Glu

Cys

Val

Lys

His

Phe

Ile

Arg

100

105

110

atc

agg

gct ctg

gta

gat

gac

acc

aag

tcc

ctt

cca

cag

agt

tcc

tgg

1163

Ile

Arg

Ala

Leu

Val

Asp Asp'

Thr

Lys

Ser

Leu

Pro

Gin

Ser

Ser

Trp

115

120

125

ggc

aac

tgg

agt

tcc

tgg aaa

gaa

gtt

aat

gca

aag

gtt

tcc

gtt

gaa

1211

Gly

Asn

Trp

Ser

Ser

Trp Lys

Glu

Val

Asn

Ala

Lys

Val

Ser

Yal

Glu

130

135

140

cct

gat

aaa

tca

tta

ata

ttt

cct

aaa

gac

aaa

gtg

ttg

gaa

gaa

ggc

1259

Pro

Asp

Lys

Ser

Leu

Ile

Phe

Pro

Lys

Asp Lys

Val

Leu

Glu

Glu

Gly

145

150

155

160

tcc

aat

gtc

acc

atc

tgt

ctg

atg

tat

ggg

cag

aat

gta

tat

aat

gta

1307

Ser

Asn

Val

Thr

Ile

Cys

Leu

Met Tyr Gly Gin

Asn

Yal

Tyr

Asn

Val

165

170

175

tcc

tgt

aag

ttg

caa

gat

gag

cca

atc

cat

gga

gaa

caa

ctt'

gat

tcc

1355

Ser

Cys

Lys

Leu

Gin

Asp

Glu

Pro

Ile

His

Gly

Glu

Gin

Leu

Asp

Ser

180

185

190

cac

gtg

tca

tta

tta

aaa

ttg

aac

aat

gta

gtt

ttc

ctt

agt

gac

aca

1403

His

Yal

Ser

Leu

Leu

Lys

Leu

Asn

Asn

Val

Yal

Phe

Leu

Ser

Asp

Thr

195

200

205

ggg

aca

aac

atc

aat

tgt

caa

gcc

acg

aag

ggt

cct

aaa

aga

ata

ttt

1451

Gly

Thr

Asn

Ile

Asn

Cys

Gin

Ala

Thr

Lys Gly

Pro

Lys

Arg

Ile

Phe

210

215

220

ggt

act

gtt

ctc

ttt

gtc

tcg

aaa

gtg

ctc

gag

gaa

cct

aag

aat

gtt

1499

Gly

Thr

Yal

Leu

Phe

Yal

Ser

Lys

Yal

Leu Glu

Glu

Pro

Lys

Asn

Yal

218

PL 211 833 B1

225

230

235

240

tcc

tgt

gaa

acc

ega

gac

ttt

aag

act

ttg

gac

tgt

tea

tgg

gaa

cct

1547

Ser

Cys

Glu

Thr

Arg

Asp

Phe

Lys

Thr

Leu

Asp

Cys

Ser

Trp

Glu

Pro

245

250

255

ggg

gta

gat

acg

act

ttg

act

tgg

cgt

aaa

caa

aga

ttc

caa

aac

tac

1595

Gly

Val

Asp

Thr

Thr

Leu

Thr

Trp

Arg

Lys

Gin

Arg

Phe

Gin

Asn

Tyr

260

265

270

act

tta

tgt

gaa

teg

ttc

tct

aag

aga

tgt

gag

gtt

tct

aac

tac

agg

1643

Thr

Leu

Ćys

Glu

Ser

Phe

Ser

Lys

Arg

Cys

Glu

Val

Ser

Asn

Tyr

Arg

275

280

285

aac

tcc

tat

acc

tgg

caa

atc

act

gaa

ggc

tea

cag

gaa

atg

tat

aac

1691

Asn

Ser

Tyr

Thr

Trp

Gin

Ile

Thr

Glu

Gly

Ser

Gin

Glu

Met

Tyr

Asn

290

295

300

ttt

act

ctc

aca

get

gaa

aac

caa

eta

agg

aaa

aga

agt

gtc

aac

att

1739

Phe

Thr

Leu

Thr

Ala

Glu

Asn

Gin

Leu

Arg

Lys

Arg

Ser

Val

Asn

Ile

305

310

315

320

aat

ttt

aac

ctg

acc

cat

aga

gtt

cat

cca

aag

get

ccg

cag

gac

gtc

1787

Asn

Phe

Asn

Leu

Thr

His

Arg

Val

His

Pro

Lys

Ala

.Pro

Gin

Asp

Val

325

330

335

acc

ctt

aaa

att

ata

ggt

get

aca

aaa

gcc

aac

atg

act

tgg

aag

gtt

1835

Thr

Leu

Lys

Ile

Ile

Gly

Ala

Thr

Lys

Ala

Asn

Met

Thr

Trp

Lys

Val

340

345

350

cac

tcc

cat

gga

aac

aac

tac

aca

ctt.

ttg

tgt

cag

gtt

aaa

ctc

caa

1883

His

Ser

His

Gly

Asn

Asn

Tyr

Thr

Leu

Leu

Cys

Gin

Val

Lys

Leu

Gin

355

360

365

tat

gga

gaa

gtg

att

cat

gag

cac

aat

gtt

tct

gtc

cac

atg

agc

gca

1931

Tyr

Gly

Glu

Val

Ile

His

Glu

His

Asn

Val

Ser

Val

His

Met

Ser

Ala

370

375

380

aac

tac

ctc

ttc

agt

gat

ctg

gat

cca

gac

aca

aag

tac

aag

get

ttt

1979

Asn

Tyr

Leu

Phe

Ser

Asp

Leu

Asp

Pro

Asp

Thr

Lys

Tyr

Lys

Ala

Phe

385

390

395

400

gtg

cgc

tgt

gca

agt

gcc

aac

cac

ttc

tgg

aaa

tgg

agc

gac

tgg

acc

2027

PL 211 833 B1

219

Val

Arg

Cys Ala Ser 405

Ala

Asn

His

Phe Trp Lys Trp Ser Asp Trp Thr

410

415

caa

aaa

gag

ttc

agc

aca

ccc

gag

act

gct

ccc

tca

cag

gct

ctt

gat

2075

Gin

Lys

Glu

Phe

Ser

Thr

Pro

Glu

Thr

Ala

Pro

Ser

Gin

Ala

Leu

Asp

420

425

430

gta

tgg

aga

caa

gtg tgg

tcg

gag

aat

gga

aga

cgc

att

gtg

act

tta

2123

Val

Trp Arg

Gin

Val

Trp

Ser

Glu

Asn

Gly Arg Arg

Ile

Val

Thr

Leu

435

440

445

ttc

tgg aag

cca

eta

tta

aaa

tca

cag

gcc

aat

ggc

aaa

atc

ata

tcc

2171

Phe

Trp Lys

Pro

Leu

Leu

Lys

Ser

Gin

Ala

Asn

Gly

Lys

Ile

Ile

Ser

450

455

460

tat

aat

ata

gtt gta

gaa

aat

gaa

gcc

aaa

cca

act

gag

tca

gaa

cac

2219

Tyr

Asn

Ile

Val

Val

Glu

Asn

Glu

Ala

Lys

Pro

Thr

Glu

Ser

Glu

His

465

470

475

480

tac

tgt gtc tgg

gca

cca

gcc

ctc

agc

aca

aac

ctg

agc

ctt

gac

ctg

2267

Tyr Cys

Val

Trp

Ala

Pro

Ala

Leu

Ser

Thr

Asn

Leu

Ser

Leu

Asp

Leu

485

490

495

caa

cct

tac

aag

att

cgc

atc

aca

gcc

aac

aac

agc

atg

ggg

gca

tct

2315

Gin

Pro

Tyr

Lys

Ile

Arg

Ile Thr Ala

Asn

Asn

Ser

Met

Gly

Ala

Ser

500

505

510

cct

gag

tcc

ttg

atg gtc

ctt

tct

aat

gat

tct

gga

cac

gag

gtc

aag

2363

Pro

Glu

Ser

Leu

Met

Val

Leu

Ser Asn

Asp

Ser

Gly

His

Glu

Val

Lys

515

520

525

gaa

aag

aca

att

aaa

ggt

ata

aag gat

gca

ttc

aat

att

tct

tgg

gag

2411

Glu

Lys

Thr

Ile

Lys

Gly

Ile

Lys Asp Ala

Phe

Asn

Ile

Ser

Trp

Glu

530

535

540

ccc

gta

tct

gga

gac

acg

atg

ggc tat gtt gtg

gac

tgg

tgt

gca

cat

2459

Pro

Val

Ser

Gly Asp

Thr

Met

Gly Tyr Val

Val

Asp Trp Cys

Al a

His

545

550

555

560

tcc

cag

gac

caa

cgc

tgt gat

ttg cag tgg aag

aac ctt ggt

ccc

aat

2507

Ser

Gin

Asp Gin Arg

Cys Asp

Leu Gin Trp Lys Asn Leu Gly

Pro

Asn

565

570

575

220

PL 211 833 B1

acc aca age acc acc atc

acc tea gat Thr Ser Asp 585

gat Asp

ttt aaa Phe Lys

cca ggc gtc cgt

2555

Thr

Thr

Ser

Thr Thr Ile 580

Pro

Gly 590

Val

Arg

tac

aac

ttc

aga

att

ttt

gaa

agg

tct

gtg

gaa

cac

aaa

gct

cgg

tta

2603

Tyr

Asn

Phe

Arg

Ile

Phe

Glu

Arg

Ser

Val

Glu

His

Lys

Ala

Arg

Leu

595

600

605

gta

gag

aaa

caa

aga

gga

tac

acc

cag

gaa

ctg

gct

cct

ttg

gtg

aat

2651

Val

Glu

Lys

Gin

Arg Gly· Tyr

Thr

Gin Glu

Leu

Ala

Pro

Leu

Val

Asn

610

615

620

cca

aaa

gtg

gag

att

cct

tac

teg

acc

cct

aac

tcc

ttc

gtt

eta

aga

2699

Pro

Lys

Val

Glu

Ile

Pro

Tyr

Ser

Thr

Pro

Asn

Ser

Phe

Val

Leu Arg

625

630

635

640

tgg

cca

gat

tat

gac

age

gac

ttc

cag

gct ggt

ttt

ata

aaa

ggg

tac

2747

Trp

Pro

Asp Tyr

Asp

Ser

Asp

Phe

Gin

Ala

Gly

Phe

Ile

Lys

Gly Tyr

645

650

655

ctc

gtg

tat

gtg

aaa

tcc

aag

gag

atg

cag

tgc

aac

caa

ccc

tgg

gaa

2795

Leu

Val

Tyr

Val

Lys

Ser

Lys

Glu

Met

Gin

Cys

Asn

Gin

Pro

Trp

Glu

660

665

670

agg.

acc

ctc

ctt

cca

gat

aat

tea

gtc

ctc

tgt

aaa

tac

gac

atc

aat

2843

Arg

Thr

Leu

Leu

Pro

Asp

Asn

Ser

Val

Leu

Cys

Lys Tyr Asp

Ile

Asn

675

680

685

ggc

tea

gag

aca

aag

aca

ctc

acc

gtg

gaa

aac

ctt

cag

cca

gag

tcc

2891

Gly

Ser

Glu

Thr

Lys

Thr

Leu

Thr

Val

Glu

Asn

Leu

Gin

Pro

Glu

Ser

690

695

700

ctc

tat

gag

ttt

ttc

gtc

act

ccg

tac

acc

age

gct

ggc

cca

gga

ccc

2939

Leu

Tyr

Glu

Phe

Phe

Val

Thr

Pro

Tyr

Thr

Ser

Ala

Gly

Pro

Gly

Pro

705

710

715

720

aat

gaa

acg

ttc

aca

aag

gtc

aca

act

cca

gat

gca

ege

tcc

cac

atg

2987

Asn

Glu

Thr

Phe

Thr

Lys

Val

Thr

Thr

Pro

Asp

Al a

Arg

Ser

His

Met

725

730

735

ctg

ctg

cag

atc

ata

eta

ccc

atg

acc

ctc

tgc gtc

ttg

ctc

age

atc

3035

Leu

Leu

Gin

Ile

Ile

Leu

Pro

Met

Thr

Leu

Cys Val

Leu

Leu

Ser

Ile

740

745

750

PL 211 833 B1

221

att Ile

gtc tgc

tac tgg aaa Tyr Trp Lys

agt Ser

cag tgg gtg aag gag aag tgc tac

cct Pro

3083

Val

Cys 755

Gin 760

Trp Val

Lys

Glu

<ys 765

Cys

Tyr

gac

att

ccc

aat

ccg

tac

aag

agc

agc

att

ctg

tca

ctc

ata

aaa

tcc

3131

Asp

Ile

Pro

Asn

Pro

Tyr

Lys

Ser

Ser

Ile

Leu

Ser

Leu

Ile

Lys

Ser

770

775

780

aag

aag

aat

cct

cac

tta

ata

atg

aat

gtc

aaa

gac

tgc

att

cca

gat

3179

Lys

Lys

Asn

Pro

Hi s

Leu

Ile

Met

Asn

Val

Lys

Asp

Cys

Ile

Pro

Asp

785

790

795

800

gtc

ctt

gaa

gtg

ata

aac

aaa

gca

gaa

ggc

agc

aag

aca

cag

tgt gta

3227

Val

Leu

Glu

Val

Ile

Asn

Lys

Ala

Glu

Gly

Ser

Lys

Thr

Gin

Cys

Val

805

810

815

ggc

tct

ggg

aaa

ctt

cac

att

gaa

gat

gta

ccc

act

aag

ccg

cca

atc

3275

Gly

Ser

Gly

Lys

Leu

His

Ile Glu

Asp

Val

Pro

Thr

Lys

Pro

Pro

Ile

820

825

830

gtg

cca

aca

gaa

aag

gat

tcc

tca

ggg

cct

gtg

ccc

tgc

atc

ttc

ttt

3323

Val

Pro

Thr

Glu

Lys Asp

Ser

Ser

Gly

Pro

Val

Pro

Cys

Ile

Phe

Phe

835

840

845

gag

aat

ttt

act

tac gat

cag

tca

gct

ttt

gac

tct

ggt

tcc

cat

ggc

3371

Glu

Asn

Phe

Thr

Tyr Asp

Gin

Ser

Ala

Phe

Asp

Ser

Gly

Ser

His

Gly

850

855

860

ctc

att

cca

ggt

ccc

eta

aaa

gac

aca

gca

cac

caa

ctt

gga-

eta

ttg

3419

Leu

Ile

Pro

Gly

Pro

Leu

Lys Asp

Thr

Ala

His

Gin

Leu

Gly

Leu

Leu

855

870

875

880

gct

cca

cct

aac

aag

ttc

cag

aac

gta

tta

aaa

aat

gac

tac

atg

aag

3467

Ala

Pro

Pro Asn

Lys

Phe

Gin

Asn

Val

Leu

Lys

Asn Asp Tyr

Met

Lys

885

890

895

ccc

ctg

gtc

gaa

agt

cca

act

gaa

gaa

act

agc

ttg

att

tat

gtg

tca

3515

Pro

Leu

Val

Glu

Ser

Pro

Thr

Glu

Glu

Thr

Ser

Leu

He

Tyr

Val

Ser

900

905

910

cag

ctg

gct

tca

ccc

atg

tgc

gga

gac

aag

gac

acg

ctt

gcc

aca

gaa

3563

Gin

Leu

Al a

Ser

Pro

Met

Cys

Gly Asp Lys

Asp

Thr

Leu

Ala

Thr

Glu

222

PL 211 833 B1

915

920

925

cca

ccc

gtg

cca

gtg

cat

ggt

tea

gag

tat

aaa

agg

caa

atg

gta

gtt

3611

Pro

Pro

Val

Pro

Val

His

Gly

Ser

Glu

Tyr

Lys

Arg

Gin

Met

Val

Val

930

935

940

ccc

ggg

age

ctc

gca

tea

cct

tct

ctg

aag

gag

gat

aac

age

ttg

acc

3659

Pro

Gly

Ser

Leu

Ala

Ser

Pro

Ser

Leu

Lys

Glu

Asp

Asn

Ser

Leu

Thr

945

950

955

960

tea

acg

gtc

ctc

tta

ggc

caa

ggt

gaa

cag

taa

acaccacgca i

gcaci

aaataa

3712

Ser

Thr

Val

Leu

Leu

Gly

Gin

Gly

Glu

Gin

*

965

970

atgcactcca cacactatag gcaćtttggg agatgtagct gttaccatgc caacaccacg 3772 tgccctggtt ggttccaggg gtgggggttg aggggagact cattatctgc agtgctgatt 3832 tatcaacgat cactacagac caacagactt aaggaccata taatatggtg ttcaccctga 3892 aggcgttccc tagaaatggc agatccgaga gcatgctgac cttgctatta tttggtccag 3952 gctcaccctt attgcagtag cttgacatag ggtgtacacc agtcatttcg cagagcctac 4012 ctactcaaaa ctac 4026 <210> 120 <211> 970 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 120

Met

Ala

Phe

Ser

Val

Val

Leu

His

Pro

Ala

Phe

Leu

Leu

Ala

Val

Leu

1

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Ala

Ser

Arg

Ser

Glu

Val

Leu

Glu

Glu

Pro

Leu

Pro

Leu

20

25

30

Thr

Pro

Glu

Ile

His

Lys

Val

Ser

Phe

Gin

Leu

Lys

Leu

Gin

Glu

Val

35

40

45

Asn

Leu

Glu

Trp

Thr

Val

Pro

Ala

Leu

Thr

His

Glu

Glu

Leu

Asn

Met

50

55

60

Ile

Phe

Gin

Ile

Glu

Ile

Ser

Arg

Leu

Asn

Ile

Ser

Ash

Thr

Ile

Trp

65

70

75

80

Val

Glu

Asn

Tyr

Ser

Thr

Thr

Val

Lys

Arg

Glu

Glu

Ala

Val

Arg

Trp

85

90

95

Asn

Trp

Thr

Ser

Asp

Ile

Pro

Leu

Glu

Cys

Val

Lys

His

Phe

Ile

Arg

100

105

110

He

Arg

Ala

Leu

Val

Asp

Asp

Thr

Lys

Ser

Leu

Pro

Gin

Ser

Ser

Trp

115

120

125

PL 211 833 B1

223

Gly

Asn 130

Trp Ser

Ser

Trp Lys Glu Val Asn Ala Lys Val Ser Val Glu

135

140

Pro

Asp

Lys

Ser

Leu

Ile

Phe

Pro

Lys Asp

Lys

Val

Leu

Glu

Glu

Gly

145

150

155

160

Ser

Asn

Val

Thr

Ile

Cys

Leu

Met

Tyr Gly

Gin

Asn

Val

Tyr

Asn

Val

165

170

175

Ser

Cys

Lys

Leu

Gin

Asp

Glu

Pro

Ile

His

Gly

Glu

Gin

Leu

Asp

Ser

180

185

190

His

Val

Ser

Leu

Leu

Lys

Leu

Asn

Asn

Val

Val

Phe

Leu

Ser

Asp

Thr

195

200

205

Gly

Thr

Asn

Ile

Asn

Cys

Gin Ala

Thr

Lys Gly

Pro

Lys

Arg

Ile

Phe

210

215

220

Gly

Thr

Val

Leu

Phe

Val

Ser

Lys

Val

Leu

Glu

Glu

Pro

Lys

Asn

Val

225

230

235

240

Ser

Cys

Glu

Thr

Arg Asp

Phe

Lys

Thr

Leu

Asp Cys

Ser

Trp

Glu

Pro

245

250

255

Gly

Val

Asp

Thr

Thr

Leu

Thr

Trp Arg

Lys

Gin

Arg

Phe Gin

Asn

Tyr

260

265

270

Thr

Leu

Cys

Glu

Ser

Phe

Ser

Lys Arg

Cys

Glu

Val

Ser

Asn

Tyr Arg

275

280

285

Asn

Ser

Tyr

Thr

Trp

Gin

Ile

Thr

Glu

Gly

Ser

Gin G1u

Met

Tyr

Asn

290

295

300

Phe

Thr

Leu

Thr

Ala

Glu

Asn

Gin

Leu

Arg

Lys Arg

Ser

Val

Asn

Me

305

310

315

320

Asn

Phe

Asn

Leu

Thr

His

Arg

Val

His

Pro

Lys

Ala

Pro

Gin

Asp

Val

325

330

335

Thr

Leu

Lys

Ile

Ile Gly Ala

Thr

Lys

Ala

Asn

Met

Thr

Trp Lys

Val

340

345

350

His

Ser

His

Gly

Asn

Asn

Tyr

Thr

Leu

Leu

Cys

Gin

Val

Lys

Leu

Gin

355

360

365

Tyr Gly

Glu

Val

Ile

His

Glu

His

Asn

Val

Ser

Val

His

Met

Ser

Ala

370

375

380

Asn

Tyr

Leu

Phe

Ser

Asp

Leu

Asp

Pro

Asp

Thr

Lys Tyr

Lys

Ala

Phe

385

390

395

400

Val

Arg Cys

Ala

Ser

Ala

Asn

His

Phe

Trp

Lys

Trp

Ser

Asp Trp

Thr

405

410

415

Gin

Lys Glu

Phe

Ser

Thr

Pro

Glu

Thr

Ala

Pro

Ser

Gin

Ala

Leu

Asp

420

425

430

Val

Trp Arg

Gin

Val

Trp

Ser

Glu

Asn

Gly Arg Arg

Ile

Val

Thr

Leu

435

440

445

Phe Trp

Lys

Pro

Leu

Leu

Lys

Ser

Gin

Ala Asn Gly Lys

Ile

Ile

Ser

450

455

460

Tyr Asn

Ile

Val

Val

Glu

Asn

Glu

Al a

Lys

Pro Thr Glu

Ser

Glu

His

224

PL 211 833 B1

465

470

475

480

Tyr

Cys

Val

Trp

Ala

Pro

Ala

Leu

Ser

Thr

Asn

L-eu

Ser

Leu

Asp

Leu

485

490

495

Gin

Pro

Tyr

Lys

Ile

Arg

Ile

Thr

Ala

Asn

Asn

Ser

Met

Gly

Ala

Ser

500

505

510

Pro

Glu

Ser

Leu

Met

Val

Leu

Ser

Asn

Asp

Ser

Gly

His

Glu

Val

Lys

515

520

525

Glu

Lys

Thr

Ile

Lys

Gly

Ile

Lys

Asp

Ala

Phe

Asn

Ile

Ser

Trp

Glu

530

535

540

Pro

Val

Ser

Gly

Asp

Thr

Met

Gly

Tyr

Val

Val

Asp

Trp

Cys

Al a

His

545

550

555

560

Ser

Gin

Asp

Gin

Arg

Cys

Asp

Leu

Gin

Trp

Lys

Asn

Leu

Gly

Pro

Asn

565

570

575

Thr

Thr

Ser

Thr

Thr

Ile

Thr

Ser

Asp

Asp

Phe

Lys

Pro

Gly

Val

Arg

580

585

590

Tyr

Asn

Phe

Arg

Ile

Phe

Glu

Arg

Ser

Val

Glu

His

Lys

Ala

Arg

Leu

595

600.

605

Val

Glu

Lys

Gin

Arg

Gly

Tyr

Thr

Gin

Glu

Leu

Ala

Pro

Leu

Val

Asn

610

615

620

Pro

Lys

Val

Glu

Ile

Pro

Tyr

Ser

Thr

Pro

Asn

Ser

Phe

Val

Leu

Arg

625

630

635

640

Trp

Pro

Asp

Tyr

Asp

Ser

Asp

Phe

Gin

Al a

Gly

Phe

Ile

Lys

Gly

Tyr

645

650

655

Leu

Val

Tyr

Val

Lys

Ser

Lys

Glu

Met

Gin

Cys

Asn

Gin

Prp

Trp

Glu

660

665

670

Arg

Thr

Leu

Leu

Pro

Asp

Asn

Ser

Val

Leu

Cys

Lys

Tyr

Asp

Ile

Asn

675

680

685

Gly

Ser

Glu

Thr

Lys

Thr

Leu

Thr

Val

Glu

Asn

Leu

Gin

Pro-

Glu

Ser

690

695

700

Leu

Tyr

Glu

Phe

Phe

Val

Thr

Pro

Tyr

Thr

Ser

Ala

Gly

Pro

Gly

Pro·

705

710

715

720

Asn

Glu

Thr

Phe

Thr

Lys

Val

Thr

Thr

Pro

Asp

Ala

Arg

Ser

His

Met

725

730

735

Leu

Leu

Gin

Ile

Ile

Leu

Pro

Met

Thr

Leu

Cys

Val

Leu

Leu

Ser

Ile

740

745

750

Ile

Val

Cys

Tyr

Trp

Lys

Ser

Gin

Trp

Val

Lys

Glu

Lys

Cys

Tyr

Pro

755

760

765

Asp

Ile

Pro

Asn

Pro

Tyr

Lys

Ser

Ser

Ile

Leu

Ser

Leu

Ile

Lys

Ser

770

775

780

Lys

Lys

Asn

Pro

His

Leu

Ile

Met

Asn

Val

Lys

Asp

Cys

Ile

Pro

Asp

785

790

795

800

Val

Leu

Glu

Val

Ile

Asn

Lys

Al a

Glu

Gly

Ser

Lys

Thr

Gin

Cys

Val

805 810 815

PL 211 833 B1

225

Gly

Ser

Gly

Lys

Leu

His

Ile

Glu

Asp

Val

Pro

Thr

Lys

Pro

Pro

Ile

820

825

830

Val

Pro

Thr

Glu

Lys

Asp

Ser

Ser

Gly

Pro

Val

Pro

<ys

Ile

Phe

Phe

835

840

845

Glu

Asn

Phe

Thr

Tyr

Asp

Gin

Ser

Ala

Phe

Asp

Ser

Gly

Ser

His

Gly

850

855

860

Leu

Ile

Pro

Gly

Pro

Leu

Lys

Asp

Thr

Ala

His

Gin

Leu

Gly

Leu

Leu

865

870

875

880

Ala

Pro

Pro

Asn

Lys

Phe

Gin

Asn

Val

Leu

Lys

Asn

Asp

Tyr

Met

Lys

885

890

895

Pr.o

Leu

Val

Glu

Ser

Pro

Thr

Glu

Glu

Thr

Ser

Leu

Ile

Tyr

Val

Ser

900

905

910

Gin

Leu

Al a

Ser

Pro

Met

Cys

Gly

Asp

Lys

Asp

Thr

Leu

Ala

Thr

Glu

915

920

925

Pro

Pro

Val

Pro

Val

His

Gly'

Ser

Glu

Tyr

Lys

Arg

Gin

Met

Val

Val

930

935

940

Pro

Gly

Ser

Leu

Ala

Ser

Pro··

Ser

Leu

Lys

Glu

Asp

Asn

Ser

Leu

Thr

945

950

955

960

Ser

Thr

Val

Leu

Leu

Gly

Gin

Gly

Glu

Gin

965 970 <210» 121 <211» 2910 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Zdegenerowany polinukleotyd kodujący poi ipeptyd o sekwencji SEQ ID N0:120 <221> misc_feature <222» (1)...(2910) <223» N = A. T, G. or C <221» misc_feature <222» (1)...(2910) <223> n = A,T;C or G <400> 121 atggcnttyw sngtngtnyt ncayccngcn ttyytnytng cngtnytnws nytnmgngcn 60 wsnmgnwsng argtnytnga rgarccnytn ccnytnacnc cngarathca yaargtnwsn 120 ttycarytna arytncarga rgtnaayytn gartggacng tnccngcnyt nacncaygar 180

226

PL 211 833 B1 wsnmgnytna ayathwsnaa yacnathtgg 240 gargargcng tnmgntggaa ytggacnwsn 300 athmgnathm gngcnytngt ngaygayacn 360 tggwsnwsnt ggaargargt naaygcnaar 420 ttyccnaarg ayaargtnyt ngargarggn 480 caraaygtnt ayaaygtnws .ntgyaarytn 540 gaywsncayg tnwsnytnyt naarytnaay 600 aayathaayt gycargcnac naarggnccn 660 wsnaargtny tngargarcc naaraaygtn 720 gaytgywsnt gggarccngg ngtngayacn 780 aaytayacny tntgygarws nttywsnaar 840 tayacntggc arathacnga rggnwsncar 900 aaycarytnm gnaarmgnws ngtnaayath. 960 aargcnccnc argaygtnac nytnaarath 1020 aargtncayw sncayggnaa yaaytayacn 1080 gargtnathc aygarcayaa ygtnwsngtn 1140 ytngayccng ayacnaarta yaargcntty 1200 aartggwsng aytggacnca raargartty 1260 ytngaygtnt ggmgncargt rtggwsngar 1320 aarccnytny tnaarwsnca rgcnaayggn 1380 aaygargcna arccnacnga rwsngarcay 1440 aayytnwsny tngayytnca rccntayaar 1500 gcnwsnccng arwsnytnat ggtnytnwsn 1560 acnathaarg gnathaargą ygcnttyaay 1620 atgggntayg tngtngaytg gtgygcncay 1680 aaraayytng gnccnaayac nacnwsnacn 1740 gtnmgntaya ayttymgnat httytjarmgn 1800 aarcarrngng gntayacnca rgarytngcn 1860 taywsnacnc cnaaywsntt ygtnytnmgn 1920 ggnttyatha arggntayyt ngtntaygtn 1980 tgggarmgna cnytnytncc ngayaaywsn 2040 garacnaara cnytnacngt ngaraayytn 2100 acnccntaya cnwsngcngg nccnggnccn 2160 gaygcnmgnw sncayatgyt nytncarath 2220 wsnathathg tntgytaytg gaarwsncar 2280 ccnaayccnt ayaarwsnws nathytnwsn 2340 athatgaayg tnaargaytg yathccngay 2400 wsnaaracnc artgygtngg nwsnggnaar 2460 ccnathgtnc cnacngaraa rgaywsnwsn 2520 ttyacntayg aycarwsngc nttygaywsn 2580 aargayacng cncaycaryt nggnytnytn 2640 aaraaygayt ayatgaarcc nytngtngar 2700 gtnwsncary tngcnwsncc natgtgyggn 2760 garytnaaya tgathttyca rathgarath gtngaraayt aywsnacnac ngtnaarmgn gayathccny tngartgygt naarcaytty aarwsnytnc cncarwsnws ntggggnaay gtnwsngtng arccngayaa rwsnytnath wsnaaygtna cnathtgyyt natgtayggn cargaygarc cnathcaygg ngarcarytn aaygtngtnt tyytnwsnga yacnggnacn aarmgnatht tyggnacngt nytnttygtn wsntgygara cnmgngaytt yaaracnytn acnytnacnt ggmgnaarca rmgnttycar mgntgygarg tnwsnaayta ymgnaaywsn garatgtaya ayttyacnyt nacngcngar aayttyaayy tnacncaymg ngtncayccn athggngcna cnaargcnaa yatgacntgg ytnytntgyc argtnaaryt ncartayggn cayatgwsng cnaaytayyt nttywsngay gtnmgntgyg cnwsngcnaa ycayttytgg wsnacnccng aracngcncc nwsncargcn aayggnmgnm gnathgtnac nytnttytgg aarathathw sntayaayat hgtngtngar taytgygtnt gggcnccngc nytnwsnacn athmgnatha cngcnaayaa ywsnatgggn aaygaywsng gncaygargt naargaraar athwsntggg arccngtnws nggngayacn wsncargayc armgntgyga yytncartgg acnathacnw sngaygaytt yaarccnggn wsngtngarc ayaargcnmg nytngtngar ccnytngtna ayccnaargt ngarathccn tggccngayt aygaywsnga yttycargcn aarwsnaarg aratgcartg yaaycarccn gtnytntgya artaygayat haayggnwsn carccngarw snytntayga rttyttygtn aaygaracnt tyacnaargt nacnacnccn athytnccna tgacnytntg ygtnytnytn tgggtnaarg araartgyta yccngayath ytnathaarw.snaaraaraa yccncayytn gtnytngarg tnathaayaa rgcngarggn ytncayathg argaygtncc nacnaarccn ggnccngtnc cntgyathtt yttygaraay ggnwsncayg gnytnathcc nggnccnytn gcnccnccna ayaarttyca raaygtnytn wsnccnacng argaracnws nytnathtay

PL 211 833 B1

227 gayaargaya cnytngcnac ngarccnccn gtnccngtnc ayggnwsnga rtayaarmgn 2820 caratggtng tnccnggnws nytngcnwsn ccnwsnytna argargayaa ywsńytnacn 2880 wsnacngtny tnytnggnca rggngarcar 2910 <210> 122 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Starter ZC43891 <400> 122 gggcagtagg atatgaatca gcat 24 <210> 123 <211> 19 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Starter ZC43900 <4OO> 123 gaaggcccca gtgctacgt 19 <210> 124 <211> 24 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja , <220>

<223> Sonda ZC43896 OSMbeta <400> 124 tcatccggag tcgtgacctt cgtg 24 <210=* 125 <211> 20 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

228

PL 211 833 B1 <223> Starter ZC43280 <400> 125 gagcacgccc ttctcttcct <210> 126 <211> 20 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> StarterZC43281 <400 126 cgttgcccgt ccgtttacta <210> 127 <211> 40 <212> DNA _ <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Sonda ZC43275 zcytorl71ig <400> 127 ctgtaattcc tcgactattt tctgtacatc atcacttggt <210> 128 <211> 22 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Starter ZC40574 <400> 128 ctcatttgga attttgccga tt <210> 129 <211> 22 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja

PL 211 833 B1

229 <220 <223> Starter ZC40575 <400> 129 ccgagtgaag atcccctttt ta 22 <210 130 <211> 26 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <22(0 <223> Sonda ZC43017 GUS <400> 130 tgaacagtca ccgacgagag tgctgg 26 <210> 131 <211> 24 <2I2> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<?23> Starter ZC28480 <400 131 cgattcagga cagtcaacag tace 24 <210> 132 <211> 21 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Starter ZC41653 <400 132 ccttcgtgaa cgtagcactg g 21 <210> 133 <211> 19 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja

230

PL 211 833 B1 <220» <223> Starter ZC41655 <400» 133 ctgaaatcca aggcgaggc 19 <210» 134 <21ł> 20 <212» DNA <213» Szutczna sekwencja <220» <223> Starter ZC41703 <400> 134 tgaagctggc cttgctctct 20 <210» 135 <211> 19 <212» DNA ^<213> sztuczna sekwencja <220>

<223>Starter ZC41704 <400> 135 gagatatgcc cggatggct 19 <210» 136 <211> 24 <212» DNA <213» Sztuczna sekwencja <220» <223>Starter* ZC43272 <400» 136 gctggtatca ttggtttcct tctc 24 <210» 137 <211> 24 <212» DNA

PL 211 833 B1

231 ^<213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Starter ZC43273 <400> 137 cattctcttt cctctgcaaa ttca 24 <210> ,138 <211> 34 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Sonda ZC43478 zcytorl7 <40D> 138 tagagaacat ttcctgcgtc ttttacttcg acag 34 <210> 139 <211> 30 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Starter ZC43278 <400> 139 aaacaagagt ctcaggatct ttataacaac 30 <210> 140 <211> 21 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Starter ZC43279 <400> 140 acggcagctg tattgattcg t 21 <210> 141 <211> 26

232

PL 211 833 B1 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Sonda ZC43276 zcytorl71ig <400> 141 taaagcaggc atctgggatg tcagca 26 <210 142 <211> 33 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> starter ZC43045 <400 142 aaacatgata tttcagatag agatcagtag act 33 <210> 143 <211> 26 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> StarterZC43046 <400> 143 cttatgaaat gtttgacaca ctccaa 26 <210> 144 <211> 29 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220· <223> _Sonda ZC43141 OSMRbeta <400 144 ctgtgcgttg gaactggacg tctgatatc 2S <210> 145

PL 211 833 B1

233 <211> 21 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220 <223> Starter ZC43004 <400 145 gaaacccgcc gcatattact t 21 <210 146 <211> 19 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Starter ZC43005 <400 146 tggcgttgct cacaaaggt 19 <210> 147 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Sonda ZC43018 mysiego GUS <400> 147 acccacacca aagccctgga cctc 24 <210> 148 <211> 23 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Starter ZC40269 <400> 148 gccagtttca cacactcctc ttt 23

234

PL 211 833 B1 <210> 149 <211> 26 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Starter ZC40268 <400> 149 gcagctattg cactagtcat tttctt 26 <210> 150 <211> 29 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Sonda ZC40298 receptora transferyny <400> 150 cccaggtagc cactcatgaa tccaatcaa 29 <210> 151 <211> 20 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Starter ZC43140 <400> 151 ttcttccaca gcaatcgcac 20 <210> 152 <211> 21 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223>starter ZC43139 <40Q> 152 atgcatgctt cggttcagaa c 21

PL 211 833 B1

235 <210> 153 <211> 24 <212» DNA <213» Sztuczna sekwencja <220>

<223> Starter ZC41608 <400 153 gcagacaatg atgctgagca agac <210> 154 <211> 24 <212» DNA <213> Sztuczna sekwencja <220» <?23» Starter ZC41609 <400» 154 caacgctgtg atttgcagtg gaag <210» 155 <211» 18 <212» DNA <213» Sztuczna sekwencja <220>

<223> Starter ZC41502 <400> 155 agcgggcctt cctcactc <210> 156 <211> 24 <212> DNA <213» Sztuczrra sekwencja <220>

<223» Starter ZC41500 <400» 156

236

PL 211 833 B1 ggacaaaata aaaacataaa taac 24 <210> 157 <211> 40 <212» DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Łucznik <400> 157 tgtcgatgaa gccctgaaag acgcgcagac taattcgagc 40 <210> 158 <211» 60 <212» DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223» Łącznik <400> 158 acgcgcagac taattcgagc tcccaccatc accatcacca cgcgaattcg gtaccgctgg 60 <210» 159 <211> 60 <212» DNA ^<213^> sztuczna sekwencja <220>

<223> Łącznik <400> 159 actcactata gggcgaattg cccgggggat ccacgcggaa ccagcggtac cgaattcgcg 60 <210» 160 <211» 42 <212» DNA <213» Sztuczna sekwencja <220>

PL 211 833 B1

237 <223> Łącznik <400> 160 acggccagtg aattgtaata cgactcacta tagggcgaat tg 42 <210> 161 <211> 825 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<221>. CDS <222> (48)'... ¢518) <400> 161 atcactctct ttaatcacta ctcacattaa cctcaactcc tgccaca atg tac agg 56 Met Tyr Arg

atg caa ctc ctg tct

tgc Cys

att gca Ile Ala 10

eta att ctt gca ctt gtc

aca Thr

aac Asn

104

Met Gin Leu 5

Leu

Ser

Leu

Ile

Leu

Ala 15

Leu Val

agt

gca

cct

act

tea

agt

teg

aca

aag

aaa

aca

aag

aaa

aca

cag

eta

152

Ser

Ala

Pro

Thr

Ser

Ser

Ser

Thr

Lys

Lys

Thr

Lys

Lys

Thr

Gin

Leu

20

25

30

35

caa

ctg

gag

cat

tta

ctg

ctg

gat

tta

cag

atg

att

ttg

aat

gga

att

200

Gin

Leu

Glu

His

Leu

Leu

Leu

Asp

Leu

Gin

Met

Ile

Leu

Asn

Gly

Ile

40

45

50

aat

aat

tac

aag

aat

ccc

aaa

ctc

acc

agg

atg

ctc

aca

ttt

aag

ttt

248

Asn

Asn

Tyr Lys

Asn

Pro

Lys

Leu

Thr

Arg

Met

Leu

Thr

Phe

Lys

Phe

55

60

65

tac

atg

ccc

aag

aag

gcc

aca

gaa

ctg

aaa

cag

ctt

cag

tgt

eta

gaa

296

Tyr

Met

Pro

Lys

Lys

Ala

Thr

Glu

Leu

Lys

Gir

Leu

Gin

Cys

Leu

Glu

70

75

80

gaa

gaa

ctc

aaa

cct

ctg

gag

gaa

gtg

ctg

aat

tta

get

caa

agc

aaa

344

Glu

Glu

Leu

Lys

Pro

Leu

Glu

Glu

Val

Leu

Asn

Leu

Ala

Gin

Ser

Lys

85

90

95

238

PL 211 833 B1

aac ttt cac Asn Phe His 100

tta aga Leu Arg

ccc agg gac tta atc agc aat atc aac gta

ata Ile 115

392

Pro Arg 105

Asp

Leu Ile

Ser 110

Asn

Ile

Asn ’Val

gtt

ctg

gaa

eta

aag

gga

tct

gaa

aca

aca

ttc

atg

tgt

gaa

tat

gca

440

Val

Leu

Glu

Leu

Lys

Gly

Ser

Glu

Thr

Thr

Phe

Met

Cys

Glu

Tyr

Ala

120

125

130

gat

gag

aca

gca

acc

att

gta

gaa

ttt

ctg

aac

aga

tgg

att

acc

ttt

488

Asp

Glu

TKr

Ala

Thr

ile

Val

Glu

Phe

Leu

Asn

Arg Trp

Ile

Thr

Phe

135

140

145

tgt

caa

agc

atc

atc

tca

aca

eta

act

tga

taattaagtg cttcccactt

538

Cys

Gin

Ser

Ile

Ile

Ser

Thr

Leu

Thr

*

150

155

aaaacatatc aggccttcta tttatttatt taaatattta aattttatat ttattgttga 598 atgtatggtt gctacctatt gtaactatta ttcttaatct taaaactata aatatggatc 658 ttttatgatt ctttttgtaa gccctagggg ctctaaaatg gtttacctta tttatcccaa 718 aaatatttat’tattatgttg aatgttaaat atagtatcta tgtagattgg ttagtaaaac 778 tatttaataa atttgataaa tataaaaaaa aaaaacaaaa aaaaaaa 825 <210> 162 <211> 156 <212> PRT <213> Homo sapiens <40 0> 162

Met

Tyr

Arg

Met

Gin

Leu

Leu

Ser

Cys

Ile

Ala

Leu

Ile

Leu

Ala

Leu

1

5

10

15

Val

Thr

Asn

Ser

Al a

Pro

Thr

Ser

Ser

Ser

Thr

Lys

Lys

Thr

Lys

Lys

20

25

30

Thr

Gin

Leu

Gin

Leu

Glu

His

Leu

Leu

Leu

Asp

Leu

Gin

Met

Ile

Leu

35

40

45

Asn

Gly

Ile

Asn

Asn

Tyr

Lys

Asn

Pro

Lys

Leu

Thr

Arg

Met

Leu

Thr

50

55

60

Phe

Lys

Phe

Tyr

Met

Pro

Lys

Lys

Ala

Thr

Glu

Leu

Lys.

Gin

Leu

Gin

65

70

75

80

Cys

Leu

Glu

Glu

Glu

Leu

Lys

Pro

Leu

Glu

Glu

Val

Leu

Asn

Leu-

Ala

85

90

95

Gin

Ser

Lys

Asn

Phe

His

Leu

Arg

Pro

Arg

Asp

Leu

Ile

Ser

Asn

Ile

100

105

110

Asn

Val

Ile

val

Leu

Glu

Leu

Lys

Gly

Ser

Glu

Thr

Thr

Phe

Met

Cys

PL 211 833 B1

239

		115					120				125
Glu	Tyr	Ala	Asp	Glu	Thr	Ala	Thr	Ile	Val	Glu	Phe.Leu Asn Arg Trp
	130					135					140
Ile	Thr	Phe	Cys	Gin	Ser	Ile	Ile	Ser	Thr	Leu	Thr
145					150					155

<210> 163 <211> 614 <212> ύΝΑ <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS <222> (64)...(525) <400> 163 gatcgttagc ttctcctgat aaactaattg cctcacattg tcactgcaaa tcgacaccta 60

tta atg ggt ctc

acc Thr

tcc caa ctg ctt ccc cct ctg ttc ttc ctg eta

108

Met Gly 1

Leu

Ser Gin Leu Leu 5

Pro

Pro 10

Leu

Phe

Phe

Leu

Leu 15

gca

tgt

gcc

ggc

aac

ttt

gtc

cac

gga

cac

aag

tgc

gat

atc

acc

tta

156

Ala

Cys

Ala

Gly

Asn

Phe

Val

His

Gly

His

Lys

Cys

Asp

Ile

Thr

Leu

20

25

30

cag

gag

atc

atc

aaa

act

ttg

aac

agc

ctc

aca

gag

cag

aag

act

ctg

204

Gin

Glu

Ile

Ile

Lys

Thr

Leu

Asn

Ser

Leu

Thr

Glu

Gin

Lys

Thr

Leu

35

40

45

tgc

acc

gag

ttg

acc

gta

aca

gac

atc

ttt

gct

gcc

tcc

aag

aac

aca

2-52

Cys

Thr

Glu

Leu

Thr

V al

Thr

Asp

Ile

Phe

Ala

Ala

Ser

Lys

Asn

Thr

50

55

60

act

gag

aag

gaa

acc

ttc

tgc

agg

gct

gcg

act

gtg

ctc

cgg

cag

ttc

300

Thr

Glu

Lys

Glu

Thr

Phe

Cys

Arg

Ala

Ala

Thr

Val

Leu

Arg

Gin

Phe

65

70

75

tac

agc

cac

cat

gag

aag

gac

act

cgc

tgc

ctg

ggt

gcg

act

gca

cag

348

Tyr

Ser

Hi s

His

Glu

Lys Asp

Thr

Arg Cys

Leu

Gly

Ala

Thr

Al a

Gin

80

85

90

95

cag

ttc

cac

agg

cac

aag

cag

ctg

atc

ega

ttc

ctg

aaa

cgg

ctc

gac

396

240

PL 211 833 B1

Gin

Phe

His

Arg

His

Lys

Gin

Leu

Ile

Arg

Phe

Leu

Lys

Arg

Leu

Asp

100

105

110

agg

aac

ctc

tgg

ggc

ctg

gcg

ggc

ttg

aat

tcc

tgt

cct

gtg

aag

gaa

444

Arg

Asn

Leu

Trp

Gly

Leu

Ala

Gly

Leu

Asn

Ser

Cys

Pro

Val

Lys

Glu

115

120

125

gcc

aac

cag

agt

acg

ttg

gaa

aac

ttc

ttg

gaa

agg

eta

aag

acg

atc

492

Ala

Asn

Gin

Ser

Thr

Leu

Glu

Asn

Phe

Leu

Glu

Arg

Leu

Lys

Thr

Ile

1Ś0

135

140

atg

aga

gag

aaa

tat

tca

aag

tgt

tcg

agc

tga

atattttaat ttati

gagttt

545

Met

Arg

Glu

Lys

Tyr

Ser

Lys

Cys

Ser

Ser

jfc

145

150

ttgatagctt tattttttaa gtatttatat atttataact catcataaaa taaagtatat 605 atagaatct 614 <210> 164 <211> 153 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 164

Met

Gly

Leu

Thr

Ser

Gin

Leu

Leu

Pro

Pro

Leu

Phe

Phe

Leu

Leu

Ala

1

5

10

15

Cys

Al a

Gly

Asn

Phe

Val

His

Gly

His

Lys

Cys

Asp

Ile

Thr

Leu-

Gin

20

25

30

Glu

Ile

Ile

Lys

Thr

Leu

Asn

Ser

Leu

Thr

Glu

Gin

Lys

Thr

Leu

Cys

35

40

45

Thr

Glu

Leu

Thr

Val

Thr

Asp

Ile

Phe

Ala

Ala

Ser

Lys

Asn

Thr

Thr

50

55

60

Glu

Lys

Glu

Thr

Phe

Cys

Arg

Ala

Ala

Thr

Val

Leu

Arg

Gin

Phe

Tyr

65

70

75

80

Ser

His

Hi s

Glu

Lys

Asp

Thr

Arg

Cys

Leu

Gly

Al a

Thr

Ala

Gin

Gin

85

90

95

Phe

His

Arg

His

Lys

Gin

Leu

Ile

Arg

Phe

Leu

Lys

Arg

Leu

Asp

Arg

100

105

110

Asn

Leu

Trp

Gly

Leu

Ala

Gly

Leu

Asn

Ser

Cys

Pro

Val

Lys

Glu·

Ala

115

120

125

Asn

Gin

Ser

Thr

Lqu

Glu

Asn

Phe

Leu

Glu

Arg

Leu

Lys

Thr

Ile

Met

130

135

140

Arg

Glu

Lys

Tyr

Ser

Lys

Cys

Ser

Ser

PL 211 833 B1

241

145

150 <210> 165 <211> 756 <212» DNA <213> Homo sapiens <220>

<221> tDS <222> (9)...(443) <400> 165 gctggagg atg tgg ctg cag age ctg ctg ctc ttg ggc act gtg gcc tgc Met Trp Leu Gin Sep Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Ala Cys

5 10

age

atc

tct

gca

ccc

gcc

ege

teg

ccc

age

ccc

age

acg

cag

ccc

tgg

Ser

Ile

5er

Ala

Pro

Ala

Arg

Ser

Pro

Ser

Pro

Ser

Thr

Gin

Pro

Trp

15

20

25

30

gag

cat

gtg

aat

gcc

atc

cag

gag

gcc

cgg

cgt

ctc

ctg

aac

ctg

agt

Glu

His

Val

Asn

Al a

Tle

Gin

Glu

Ala

Arg

Arg

Leu

Leu

Asn

Leu

Ser

146

aga

gac

act

gct

gct

gag

atg

aat

gaa

aca

gta

gaa

gtc

atc

tea

gaa

194

Arg

Asp

Thr

Ala

Ala

Glu

Met

Asn

Glu

Thr

Val

Glu

Val

Ile

Ser

Glu

50

55

60

atg

ttt

gac

ctc

cag

gag

ccg

acc

tgc

eta

cag

acc

ege

ctg

gag

ctg

• 242

Met

Phe

Asp

Leu

Gin

Glu

Pro

Thr

Cys

Leu

Gin

Thr

Arg

Leu

Glu

Leu

tac

aag

cag

ggc

ctg

cgg

ggc

age

ctc

acc

aag

ctc

aag

ggc

ccc

ttg

290

Tyr

Lys

Gin

Gly

Leu

Arg Gly

Ser

Leu

Thr

Lys

Leu

Lys Gly

Pro

Leu

80

85

90

acc

atg

atg

gcc

age

.cac

tac

aag

cag

cac

tgc

cct

cca

acc

ccg

gaa

338

Thr

Met

Met

Ala

Ser

His

Tyr

Lys

Gin

His

Cys

Pro

Pro

Thr

Pro

Glu

95

100

105

110

act

tcc

tgt

gca

acc

cag

act

atc

acc

ttt

gaa

agt

ttc

aaa

gag

aac

386

Thr

Ser

Cys

Ala

Thr

Gin

Thr

Ile

Thr

Phe

Glu

Ser

Phe

Lys

Glu

Asn

242

PL 211 833 B1

115 120 125 ctg aag gac ttt ctg ctt gtc atc ccc ttt gac tgc tgg gag cca gtc 434

Leu Lys Asp Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro Val

130 135 140 cag gag tga gaccggccag atgaggctgg ccaagccggg gagctgctct 483

Gin Glu * ctcatgaaac aagagctaga aactcaggat ggtcatcttg gagggaccaa ggggtgggcc 543 acagccatgg tgggagtggc ctggacctgc cctgggccac actgaccctg atacaggcat 603 ggcagaagaa tgggaatatt ttatactgac agaaatcagt aatatttata tatttatatt 663 tttaaaatat ttatttattt atttatttaa gttcatattc catatttatt caagatgttt 723 taccgtaata attattatta aaaatatgct tct 756 <210> 166 <211> 144 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 166

Met

Trp

Leu

Gin

Ser

Leu

Leu

Leu

Leu

Gly

Thr

Va1

Ala

Cys

Ser

Ile

1

5

10

15

Ser

Ala

Pro

Ala

Arg

Ser

Pro

Ser

Pro

Ser

Thr

Gin

Pro

Trp

Glu

His

20

25

30

Val

Asn

Ala

Ile

Gin

Glu

Ala

Arg

Arg

Leu

Leu

Asn

Leu

Ser

Arg-

Asp

35

40

45

Thr

Ala

Ala

Glu

Met

Asn

Glu'

Thr

Val

Glu

Val

Ile

Ser

Glu

Met

Phe

50

55

60

Asp

Leu

Gin

Glu

Pro

Thr

Cys

Leu

Gin

Thr

Arg

Leu

Glu

Leu

Tyr

Lys

65

70

75

80

Gin

Gly

Leu

Arg

Gly

Ser

Leu

Thr

Lys

Leu

Lys

Gly

Pro

Leu

Thr

Met

85

90

95

Met

Al a

Ser

His

Tyr

Lys

Gin

His

Cys

Pro

Pro

Thr

Pro

Glu

Thr

Ser

100

105

110

Cys

Ala

Thr

Gin

Thr

Ile

Thr

Phe

Glu

Ser

Phe

Lys

Glu

Asn

Leu

Lys

115

120

125

Asp

Phe

Leu

Leu

Val

Ile

Pro

Phe

Asp

Cys

Trp

Glu

Pro

Val

Gin-

Glu

130

135

140

<210> 167

PL 211 833 B1

243 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS <222> (1)..,(60) <221> odmiana <222> (25)...(30) <223> η = A, G, C, or Τ <221> miscfeature <222> (1)...(60) <223> η = A.T.C- or G <400> 167 gcc aca gaa ctg aaa cag ctt cag nnn nnn gaa gaa gaa ctc aaa cct 48

Ala Thr Glu Leu Lys Gin Leu Gin Xaa Xaa Glu Glu Glu Leu Lys Pro 15 10 15 ctg gag gaa gtg 60

Leu Glu Glu Val <210> 168 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<221> VARIANT <222> (9)...(10) <223> Dowolny aminokwas <221> VARIANT <222> (1)...(20) <223> Xaa = _Dowoi_ny aminokwas <4O0> 168

Ala Thr Glu Leu Lys Gin Leu Gin Xaa Xaa Glu Glu Glu Leu Lys Pro 15 10 15

Leu Glu Glu Val 20

244

PL 211 833 B1

Claims (6)

1. Wyizolowany polipeptyd zawierający sekwencję reszt aminokwasowych, która jest w co najmniej 90% identyczna z sekwencją reszt aminokwasowych wybranych z grupy:

(a) polipeptydu ukazanego od reszt 38 (Val) do 152 (Leu), jak pokazano na SEQ ID nr: 2;

(b) polipeptydu ukazanego od reszt 27 (Leu) do 164 (Thr), jak pokazano na SEQ ID nr: 2;

(c) polipeptydu ukazanego od reszt 24 (Ser) do 164 (Thr), jak pokazano na SEQ ID nr: 2; i (d) polipeptydu ukazanego od reszt 1 (Met) do 164 (Thr), jak pokazano na SEQ ID nr: 2.

2. Wyizolowany polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że reszty aminokwasowe 72, 133 i 147 stanowią cysteinę .

3. Wyizolowany polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że polipeptyd wiąże receptor Zcytor17, jak pokazano na SEQ ID: 5 lub SEQ ID nr:71.

4. Wyizolowany polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową wybraną z grupy:

(a) reszt aminokwasowych 38-52 z SEQ ID nr: 2;

(b) reszt aminokwasowych 83-98 z SEQ ID nr: 2;

(c) reszt aminokwasowych 104-117 z SEQ ID nr: 2;

(d) reszt aminokwasowych 137-152 z SEQ ID nr: 2;

(e) reszt aminokwasowych 38-52 z SEQ ID nr: 11;

(f) reszt aminokwasowych 33-38 z SEQ ID nr: 2;

(g) reszt aminokwasowych 35-40 z SEQ ID nr: 2;

(h) reszt aminokwasowych 53-58 z SEQ ID nr: 2;

(i) reszt aminokwasowych 54-59 z SEQ ID nr: 2;

(j) reszt aminokwasowych 129-134 z SEQ ID nr: 2;

(k) reszt aminokwasowych 34-39 z SEQ ID nr: 11;

(l) reszt aminokwasowych 46-51 z SEQ ID nr: 11;

(m) reszt aminokwasowych 101-105 z SEQ ID nr: 2;

(n) reszt aminokwasowych 113-118 z SEQ ID nr: 2;

(o) reszt aminokwasowych 114-119 z SEQ ID nr: 2;

(p) reszt aminokwasowych 126-131 z SEQ ID nr: 2;

(q) reszt aminokwasowych 158-162 z SEQ ID nr: 2;

lub stanowiącą aekwencję aminokwasową wybraną z grupy aminokwasów 85-98, 104-118,

131-136, 141-157, 157-162 lub 158-163 sekwencji SEQ ID nr: 11.

5. Białko fuzyjne zawierające co najmniej cztery polipeptydy, przy czym porządek polipeptydów od końca N do końca C jest taki, że:

pierwszy polipeptyd, który zawiera sekwencję reszt aminokwasowych od 38-52 z SEQ ID nr: 2;

pierwsza sekwencja rozdzielająca o 6-27 resztach aminokwasowych;

drugi polipeptyd, który zawiera sekwencję reszt aminokwasowych z grupy:

(a) IL-2 helisa B reszt aminokwasowych z SEQ ID nr: 168;

(b) IL-4 helisa B reszty 65-83 z SEQ ID nr: 164;

(c) IL-3 helisa B reszty 73-86 z SEQ ID nr: 102;

(d) GM-CSF helisa B reszty 72-81 z SEQ ID nr: 166 i (e) reszty aminokwasowe 83-98 z SEQ ID nr: 2;

druga sekwencja rozdzielająca o 5-11 resztach aminokwasowych;

trzeci polipeptyd, który obejmuje sekwencję reszt aminokwasowych z grupy:

(a) IL-2 helisa C reszty 102-116 z SEQ ID nr: 162;

(b) IL-4 helisa C reszty 94-118 z SEQ ID nr: 164;

(c) IL-3 helisa C reszty 91-103 z SEQ ID nr: 102;

(d) GM-CSF helisa C reszty 85-103 z SEQ ID nr: 166 i (e) reszt aminokwasowych 104-117 z SEQ ID nr: 2;

trzecia sekwencja rozdzielająca o 3-29 resztach aminokwasowych; i czwarty polipeptyd, który obejmuje sekwencję reszt aminokwasowych z grupy:

(a) IL-2 helisa D reszty 134-149 z SEQ ID nr: 162;

(b) IL-3 helisa D reszty 123-141 z SEQ ID nr: 102;

(c) IL-4 helisa D reszty 133-151 z SEQ ID nr: 164;

(d) GM-CSF helisa D reszty 120-131 z SEQ ID nr: 166 i (e) reszty aminokwasowe 137-152 z SEQ ID nr: 2.

PL 211 833 B1

245

6. Białko fuzyjne zawierające co najmniej cztery polipeptydy, przy czym porzą dek polipeptydów od końca N do ica C jest taki, że pierwszy polipeptyd, który zawiera sekwencję reszt aminokwasowych wybranych z grupy obejmującej:

(a) IL-2 helisa A reszty 27-48 z SEQ ID nr: 162;

(b) IL-4 helisa A reszty 30-42 z SEQ ID nr: 164;

(c) IL-3 helisa A reszty 35-45 z SEQ ID nr: 102;

(d) GM-CSF helisa A reszty 30-44 z SEQ ID nr: 166 i (e) reszty aminokwasowe 38-52 z SEQ ID nr: 2;

pierwsza sekwencja rozdzielają ca o 6-27 resztach aminokwasowych;

drugi polipeptyd, który obejmuje sekwencję reszt aminokwasowych z grupy:

(a) IL-2 helisa B reszty z SEQ ID nr: 168;

(b) IL-4 helisa B reszty 65-83 z SEQ ID nr: 164;

(c) IL-3 helisa B reszty 73-86 z SEQ ID nr: 102;

(d) GM-CSF helisa B reszty 72-81 z SEQ ID nr: 166 i (e) reszty aminokwasowe 83-98 z SEQ ID nr: 2;

druga sekwencja rozdzielająca o 5-11 resztach aminokwasowych;

trzeci polipeptyd, który obejmuje sekwencj ę reszt aminokwasowych z grupy:

(a) IL-2 helisa C reszty 102-116 z SEQ ID nr: 162;

(b) IL-4 helisa C reszty 94-118 z SEQ ID nr: 164;

(c) IL-3 helisa C reszty 91-103 z SEQ ID nr: 102;

(d) GM-CSF helisa C reszty 85-103 z SEQ ID nr: 166 i (e) reszty aminokwasowe 104-117 z SEQ ID nr: 2; trzecia sekwencja rozdzielają ca o 3-29 resztach aminokwasowych; i czwarty polipeptyd, który zawiera sekwencję reszt aminokwasowych od 137-152 z SEQ ID nr: 2.

7. Białko fuzyjne według zastrz. 6, znamienne tym, ż e czwarty polipeptyd obejmuje reszty aminokwasowe 137-152 z SEQ ID nr: 2.

8. Wyizolowana cząsteczka polinukleotydu stanowiąca sekwencje nukleotydów kodująca polipeptyd stanowiący sekwencję reszt aminokwasowych, która jest identyczna co najmniej w 90% z sekwencją aminokwasową wybraną z grupy:

(a) polipeptydu pokazanego od reszty 38 (Val) do 152 (Leu) jak pokazano na SEQ ID nr: 2;

(b) polipeptydu pokazanego od reszty 27 (Leu) do 164 (Thr) z SEQ ID nr: 2;

(c) polipeptydu pokazanego od reszty 24 (Ser) do 164 (Thr) z SEQ ID nr: 2; i (d) polipeptydu pokazanego od reszty 1 (Met) do 164 (Thr) z SEQ ID nr: 2.

9. Wyizolowana cząsteczka zawierająca polinukleotydy według zastrz. 8, znamienna tym, że nukleotydy są wybrane z grupy:

(a) polinukleotydu jak pokazano na SEQ ID nr: 1 od nukleotydu 139 do nukleotydu 483;

(b) polinukleotydu jak pokazano na SEQ ID nr: 1 od nukleotydu 106 do nukleotydu 519;

(c) polinukleotydu jak pokazano na SEQ ID nr: 1 od nukleotydu 97 do nukleotydu 519; i (d) polinukleotydu jak pokazano na SEQ ID nr: 1 od nukleotydu 28 do nukleotydu 519 lub przy czym wspomniane nukleotydy kodują polipeptyd jak zdefiniowano w zastrz. 4.

10. Wektor ekspresji zawierający następujące, operacyjnie powiązane elementy:

(a) promotor transkrypcji;

(b) segment dna kodują cy polipeptyd zawierają cy sekwencję reszt aminokwasowych wybranych z grupy:

(i) reszt aminokwasowych 38-52 z SEQ ID nr: 2;

(ii) reszt aminokwasowych 83-98 z SEQ ID nr: 2;

(iii) reszt aminokwasowych 104-117 z SEQ ID nr: 2;

(iv) reszt aminokwasowych 137-152 z SEQ ID nr: 2, lub stanowiący izolowany polinukleotyd według zastrz. 8; i (c) terminator transkrypcji.

11. Hodowana komórka obejmująca wektor ekspresji zdefiniowany w zastrz. 10.

12. Sposób wytwarzania polipeptydu obejmujący hodowlę komórki zdefiniowanej w zastrz. 11 w warunkach, w których fragment DNA ulega ekspresji i odzyskania polipeptydu kodowanego przez ten segment DNA.

246

PL 211 833 B1

13. Sposób wytwarzania przeciwciała, które wiąże polipeptyd zdefiniowany w zastrz. 1, znamienny tym, że polipeptyd, którym wykonuje się inokulację jest wybrany z grupy:

(a) polipeptydu stanowiącego 9 do 141 aminokwasów, przy czym polipeptyd ten jest identyczny z sąsiadującą sekwencją reszt aminokwasowych na SEQ ID nr: 2 od aminokwasu numer 24 (Ser) do aminokwasu numer 164 (Thr);

(b) polipeptyd wed ł ug zastrz. 1;

(c) polipeptydu zawierającego sekwencję aminokwasową z SEQ nr: 2 od aminokwasu numer

38-52;

(d) polipeptydu zawierającego sekwencję aminokwasową z SEQ nr: 2 od aminokwasu numer

83-98;

(e) polipeptydu zawierającego sekwencję aminokwasową z SEQ nr: 2 od aminokwasu numer 104-117;

(f) polipeptydu zawierającego sekwencję aminokwasową z SEQ nr: 2 od aminokwasu numer 137-152;

(g) polipeptydu zawierającego sekwencję aminokwasową z SEQ nr: 2 od aminokwasu numer

38-152;

(h) polipeptydu zawierającego sekwencję aminokwasową z SEQ nr: 2 od aminokwasu numer

24-164;

(i) polipeptydu zawierającego sekwencję aminokwasową z SEQ nr: 2 od aminokwasu numer

27-164;

(j) polipeptydu zawierają cego sekwencję aminokwasową z SEQ nr: 11 od aminokwasu numer

38-52;

(k) polipeptydu zawierają cego sekwencję aminokwasową z SEQ nr: 11 od aminokwasu numer

85-98;

(l) polipeptydu zawierają cego sekwencję aminokwasową z SEQ nr: 11 od aminokwasu numer 104-118;

(m) polipeptydu zawierają cego sekwencję aminokwasową z SEQ nr: 11 od aminokwasu numer 141-157;

(n) polipeptydu zawierającego sekwencję aminokwasową z SEQ nr: 11 od aminokwasu numer

38-157;

(o) polipeptydu zawierającego sekwencję aminokwasową z SEQ nr: 11 od aminokwasu numer

24-163;

(p) polipeptydu zawierają cego reszty aminokwasowe 54-59, 1-134, 53-58, 35-40 lub 33-38 z SEQ ID nr: 2 lub reszty aminokwasowe 34-39, 46-51, 131-136, 158-163 lub 157-162 z SEQ nr: 11; przy czym schowane reszty G, D i T oraz reszty wystawione H i W ignorowano; i przy czym polipeptyd wzbudza odpowiedź odpornością z utworzeniem przeciwciała; i izolowanie tego przeciwciała od zwierzęcia.

14. Przeciwciało wytworzone sposobem według zastrz. 13, znamienne tym, że przeciwciało wiąże się z polipeptydem z SEQ ID nr: 2 lub SEQ ID nr: 11.

15. Przeciwciało lub fragment przeciwciała, które specyficznie wiąże się z polipeptydem ukazanym na SEQ ID nr: 2 lub SEQ ID nr: 11 lub z polipeptydem zawierającym sekwencję reszt aminokwasowych wybraną z grupy:

(a) polipeptydu pokazanego od reszt 38 (Val) do 152 (Leu) jak pokazano na SEQ ID nr: 2;

(b) polipeptydu pokazanego od reszty 27 (Leu) do 164 (Thr) z SEQ ID nr: 2;

(c) polipeptydu pokazanego od reszty 24 (Ser) do 164 (Thr) z SEQ ID nr: 2 i (d) polipeptydu pokazanego od reszty 1 (Met) do 164 (Thr) z SEQ ID nr: 2.

16. Przeciwciało według zastrz. 15, znamienne tym, że przeciwciało to wybrane jest z grupy:

(a) przeciwciał a poliklonalnego, (b) monokoinalnego mysiego przeciwciała, (c) przeciwciał a humanizowanego pochodzą cego od (b), (d) fragmentu przeciwciała i (e) ludzkiego przeciwciał a monoklonalnego.

17. Przeciwciało według zastrz. 15, znamienne tym, że zawriera ponadto radionuklid, enzym, substrat, kofaktor, znacznik fluorescencyjny, znacznik chemiluminescencyjny, Tag polipeptydowy, cząstkę magnetyczną, lek lub toksynę.

PL 211 833 B1

247

18. Przeciwciało według zastrz. 15 do redukowania zapalenia indukowanego przez polipeptyd zdefiniowany w zastrz. 1-4.

19. Zastosowanie przeciwciała zdefiniowanego w zastrz. 15 do wytwarzania leku do użycia w metodzie supresji odpowiedzi zapalnej u ssaka z zapaleniem, przy czym metoda ta obejmuje:

(1) określenia poziomu cząsteczki zapalnej;

(2) podanie wspomnianego leku;

(3) określenie poziomu cząsteczki zapalnej po podaniu;

(4) porównanie poziomu cząsteczki zapalnej w etapie (1) z poziomem cząsteczki zapalnej w etapie (3), przy czym brak wzrostu lub spadek poziomu cząsteczki zapalnej jest wskazujący na zahamowanie odpowiedzi zapalnej.

20. Sposób wykrywania obecności polipeptydu według ktoregokolwiek z zastrz. 1-4 w próbce biologicznej, znamienny tym, że obejmuje etapy:

(a) zetknięcia próbki biologicznej z przeciwciałem lub fragmentem przeciwciała według zastrz. 15, przy czym kontaktowanie prowadzi się w warunkach, które pozwalają na wiązanie się przeciwciała lub fragmentu przeciwciała do próbki biologicznej i (b) wykrywania związanego przeciwciała lub fragmentu przeciwciała.

21. Sposób inhibicji proliferacji lub różnicowania komórek krwiotwórczych i potomstwa komórek krwiotwórczych indukowanego polipeptydem według któregokolwiek z zastrz. 1-4, obejmujący hodowlę szpiku kostnego lub obwodowych krwinek z kompozycją obejmującą ilość przeciwciała według zastrz. 15, wystarczającą do redukcji proliferacji lub różnicowania krwiotwórczych komórek w szpiku kostnym lub krwinek obwodowych, w porównaniu ze szpikiem kostnym lub krwinkami obwodowymi hodowanymi pod nieobecność rozpuszczalnego receptora cytokiny.

22. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że komórkami krwiotwórczymi i krwiotwórczymi komórkami potomnymi są komórki limfoidaIne.

23. Sposób według zastrz. 22, znamienny tym, że komórkami limfoidalnymi są makrofagi lub komórki T.

24. Zastosowanie polipeptydu zdefiniowanego w zastrz. od 1 do 4 do wytwarzania leku do leczenia w metodzie stymulowania odpowiedzi odpornościowej u ssaka w zetknięciu z antygenem lub patogenem, obejmującej etapy:

(1) okreś lenia bezpoś rednio lub poś rednio poziomu antygenu patogenu obecnego u wspomnianego ssaka;

(2) podania wspomnianego leku;

(3) okreś lenia bezpośrednio lub pośrednio poziomu antygenu patogenu występującego u wymienionego ssaka; i (4) porównanie poziomu antygenu lub patogenu w etapie 1 z poziomem antygenu lub patogenu w etapie 3, przy czym zmiana poziomu jest wskaźnikiem stymulacji odpowiedzi odpornościowej.

25. Sposób według zastrz. 24, znamienny tym, że dodatkowo obejmuje:

(5) ponowne podanie wspomnianego leku;

(6) określenie bezpośrednio lub pośrednio poziomu antygenu patogenu u wymienionego ssaka; i (7) porównanie liczby poziomu antygenu lub patogenu w etapie 1 z poziomem antygenu w etapie 6, przy czym zmiana poziomu wskazuje stymulację odpowiedzi odpornościowej.

26. Sposób rozprzestrzeniania komórek krwiotwórczych i potomstwa komórek krwiotwórczych, obejmujący hodowlę szpiku kostnego lub krwinek obwodowych z kompozycją obejmującą ilość polipeptydu zdefiniowanego w zastrz. od 1 do 4 wystarczającą do wytworzenia wzrostu liczby komórek limfoidalnych w szpiku kostnym lub komórkach krwinek obwodowych, w porównaniu ze szpikiem kostnym lub komórkami krwinek obwodowych hodowanymi pod nieobecność wspomnianego polipeptydu.

27. Sposób według zastrz. 26, znamienny tym, że komórki krwiotwórcze i krwiotwórcze komórki potomne są komórkami limfoidalnymi.

28. Sposób według zastrz. 27, znamienny tym, że komórki limfoidalne są komórkami monocytowymi, makrofagami lub komórkami T.

29. Zastosowanie polipeptydu według zastrz. 1-4 do wytwarzania leku do zastosowania w metodzie stymulowania odpowiedzi odpornościowej u ssaka w zetknięciu z antygenem lub patogenem, obejmujący:

(1) okreś lenie poziomu przeciwciała swoistego wobec antygenu lub patogenu;

(2) podanie wspomnianego leku;

(3) okreś lenie poziomu przeciwciała swoistego wobec antygenu lub patogenu po podaniu;

248

PL 211 833 B1 (4) porównanie poziomu przeciwciał a w etapie (1) z poziomem przeciwciał a w etapie (3), przy czym wzrost poziomu przeciwciała jest wskaźnikiem stymulacji odpowiedzi odpornościowej.

30. Sposób wykrywania obecności RNA kodującego polipeptyd według któregokolwiek z zastrz. 1-4 w próbce biologicznej, obejmujący etapy:

(a) zetknię cia sondy kwasu nukleinowego w warunkach hybrydyzujących z albo (i) testowymi cząsteczkami RNA żelowanymi z próbki biologicznej lub (ii) cząsteczkami kwasu nukleinowego zsyntetyzowanego z wyizolowanych cząsteczek RNA, przy czym sonda posiada sekwencję nukleotydową obejmującą albo część sekwencji nukleotydowej cząsteczki kwasu nukleinowego według zastrz. 9 lub jej komplementu i (b) wykrywania tworzenia się hybryd sondy kwasu nukleinowego i testowych czą steczek RNA albo cząsteczek zsyntetyzowanego kwasu nukleinowego, przy czym obecność hybryd wskazuje na obecność RNA kodującego polipeptyd według któregokolwiek z zastrz. 1-4 w próbce biologicznej.

31. Sposób zabijania komórek nowotworowych in vitro lub in vivo obejmujący wytworzenie polipeptydu sposobem zdefiniowanym w zastrz. 12 i opracowanie polipeptydu w farmaceutycznie akceptowalnym nośniku i wystawienie próbki tkanki lub próbki biologicznej zawierającej komórki nowotworowe na polipeptyd; przy czym polipeptyd ten zabija komórki.

32. Zastosowanie polipeptydu wytworzonego zgodnie ze sposobem według zastrz. 12 do wytwarzania leku do zabijania komórek nowotworowych.

33. Sposób według zastrz. 31 lub zastosowanie według zastrz. 32, znamienne tym, że polipeptyd jest dodatkowo sprzężony z toksyną.

34. Zastosowanie antagonisty polipeptydu zdefiniowanego w zastrz. od 1 do 4 do wytwarzania leku do leczenia ssaka dotkniętego chorobą zapalną, przy czym antagonista jest przeciwciałem, które specyficznie wiąże się z polipeptydem zdefiniowanym w zastrz. od 1 do 4 lub fragmentem przeciwciała zdefiniowanym w zastrz. 15.

35. Zastosowanie według zastrz. 34, znamienne tym, że chorobą jest przewlekła choroba zapalna.

36. Zastosowanie według zastrz. 35, znamienne tym, że chorobą jest przewlekła choroba zapalna wybrana z grupy:

(a) zapalnej choroby jelit;

(b) wrzodziejącego zapalenia okrężnicy;

(c) choroby Crohna;

(d) atopowego zapalenia skóry;

(e) egzemy; i (f) ł uszczycy.

37. Zastosowanie według zastrz. 34, znamienne tym, że chorobą jest ostra choroba zapalna.

38. Zastosowanie według zastrz. 37, znamienne tym, że chorobą jest ostra choroba zapalna z grupy:

(a) endotoksemii;

(b) posocznicy;

(c) zespoł u wstrzą su toksycznego; i (d) choroby zakaź nej.

39. Zastosowanie według zastrz. 34, znamienne tym, że przeciwciało dodatkowo obejmuje radionuklid, enzym, substrat, kofaktor, znacznik fluorescencyjny, znacznik chemiluminescencyjny, znacznik peptydowy, cząstkę magnetyczną lub toksynę.

40. Sposób wykrywania zapalenia u pacjenta, obejmujący: inkubację próbki tkanki lub próbki biologicznej od pacjenta z przeciwciał em wedł ug zastrz. 15 w warunkach, w których przeciwciało wiąże się ze swym komplementarnym polipeptydem w tkance lub próbce biologicznej; uwidocznienie przeciwciała związanego w tkance lub próbce biologicznej; i porównanie poziomu przeciwciał a zwią zanego w tkance lub próbce biologicznej od pacjenta z normalną kontrolną tkanką lub próbką biologiczną, przy czym zwię kszenie poziomu przeciwciała związanego z tkanką lub próbką biologiczną od pacjenta w odniesieniu do normalnej tkanki kontrolnej lub próbki biologicznej jest wskaźnikiem zapalenia u pacjenta.

41. Sposób wykrywania zapalenia u pacjenta, obejmujący: znakowanie polinukleotydów obejmujące co najmniej 14 sąsiadują cych nukleotydów z SEQ ID nr: 1 lub komplementu z SEQ ID nr: 1;

PL 211 833 B1

249 inkubację próbki tkanki lub próbki biologicznej od pacjenta w warunkach, w których polinukleotyd będzie hybrydyzował z komplementarną sekwencją polinukleotydową;

uwidocznienie wyznakowanego polinukleotydu w tkance lub próbce biologicznej; i porównanie poziomu hybrydyzacji wyznakowanego polinukleotydu w tkance lub próbce biologicznej od pacjenta z normalną tkanką kontrolną lub próbką biologiczną, przy czym zwiększenie hybrydyzacji wyznakowanego polinukleotydu z tkanką lub próbką biologiczną pacjenta w odniesieniu do normalnej tkanki kontrolnej lub próbki biologicznej jest wskaźnikiem zapalenia u pacjenta.