NO332266B1 - Polypeptid som binder zcytor17-polypeptidet, dets polynukleotid, ekspresjonsvektor og dyrket celle med ekspresjonsvektoren, og fremgangsmate for fremstilling av polypeptidet, samt antistoff som bindes til polypeptidet og dets anvendelse til behandling, og fremgangsmate for ekspansjon av celler, og for pavisning av zcytor17lig-RNA i en biologisk prove. - Google Patents

Polypeptid som binder zcytor17-polypeptidet, dets polynukleotid, ekspresjonsvektor og dyrket celle med ekspresjonsvektoren, og fremgangsmate for fremstilling av polypeptidet, samt antistoff som bindes til polypeptidet og dets anvendelse til behandling, og fremgangsmate for ekspansjon av celler, og for pavisning av zcytor17lig-RNA i en biologisk prove. Download PDF

Info

Publication number
NO332266B1
NO332266B1 NO20043419A NO20043419A NO332266B1 NO 332266 B1 NO332266 B1 NO 332266B1 NO 20043419 A NO20043419 A NO 20043419A NO 20043419 A NO20043419 A NO 20043419A NO 332266 B1 NO332266 B1 NO 332266B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
cells
zcytorl
polypeptide
seq
amino acid
Prior art date
Application number
NO20043419A
Other languages
English (en)
Other versions
NO20043419L (no
Inventor
Cindy A Sprecher
Joseph L Kuijper
Julia E Novak
Angela K Hammond
Jane A Gross
Stacey R Dillon
Maria M Dasovich
Francis J Grant
Original Assignee
Zymogenetics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zymogenetics Inc filed Critical Zymogenetics Inc
Publication of NO20043419L publication Critical patent/NO20043419L/no
Publication of NO332266B1 publication Critical patent/NO332266B1/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/566—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds
    • G01N33/567—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds utilising isolate of tissue or organ as binding agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Dermatology (AREA)

Abstract

Foreliggende oppfinnelse gjelder zcytorl7lig-polynukleotid og -polypeptid, samt anti-zcytor17-antistoffmolekyler. Zcytorl7lig er et nytt cytokin. Polypeptidene kan anvendes i fremgangsmåter for stimulering av immunsystemet og for proliferasjon og/eller utvikling av hematopoietiske celler in vitro og in vivo. Foreliggende oppfinnelse omfatter også fremgangsmåter for fremstilling av proteinet, anvendelser derav og antistoffer mot det.

Description

Oppfinnelsens bakgrunn
Proliferasjon og differensiering av celler i multicellulære organismer kontrolleres av hormoner og polypeptidvekstfaktorer. Disse diffunderbare molekylene lar cellene kommunisere med hverandre og virke sammen slik at det dannes celler, vev og organer, og at ødelagt vev repareres. Eksempler på hormoner og vekstfaktorer omfatter steroidhormonene (f.eks. østrogen og testosteron), paratyreoidhormon, follikkelstimulerende hormon, interleukinene, blodplateavledet vekstfaktor (PDGF), epidermal vekstfaktor (EGF), granulocyttmakrofagkolonistimulerende faktor (GM-CSF), erytropoietin (EPO) og kalsitonin.
Hormoner og vekstfaktorer påvirker cellens metabolisme ved å bindes til reseptorer. Reseptorene kan være integrerte membranproteiner som er koblet til signalreaksjons-veier i cellen, f.eks. sekundære budbringersystemer. Andre klasser av reseptorer er løselige molekyler, f.eks. transkripsjonsfaktorene.
Cytokiner stimulerer generelt proliferasjon eller differensiering av celler i den hematopoietiske linje eller deltar i kroppens immunrespons- og inflammasjons-respons-mekanismer. Eksempler på cytokiner som påvirker hematopoesen, er erytropoietin (EPO), som stimulerer utvikling av røde blodceller; trombopoietin (TPO), som stimulerer utvikling av celler i megakaryocyttlinjen; og granulocyttkolonistimulerende faktor (G-CSF), som stimulerer utvikling av nøytrofile celler. Disse cytokinene er anvendbare for å gjenopprette normalt blodcellenivå hos pasienter som lider av anemi, trombocytopeni og nøytropeni, eller som gis kjemoterapi som kreftbehandling.
Interleukinene er en familie av cytokiner som formidler immunologiske responser, innbefattet inflammasjon. Interleukinene formidler en rekke inflammatoriske sykdomstilstander. Sentralt i immunresponsen er T-celler, som danner mange cytokiner og tilpasser immuniteten til antigenene. Cytokiner som dannes av T-celler, er blitt klassifisert som type 1 og type 2 (Kelso, A., Immun. Cell Biol., 76:300-317,1998). Type 1-cytokinene omfatter IL-2, IFN-y og LT-a, og deltar i inflammatoriske responser, virusimmunitet, intracellulær parasittimmunitet og allo-transplantatrejeksjon. Type 2-cytokinene omfatter IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 og IL-13, og deltar i humorale responser, immunitet mot ormer og den allergiske respons. Cytokiner som er felles for typene 1 og 2, omfatter IL-3, GM-CSF og TNF-a. Det foreligger noe bevismateriale som antyder at type 1- og type 2-produserende T-cellepopulasjoner fortrinnsvis migrerer inn i forskjellige typer betent vev.
Modne T-celler kan f.eks. aktiveres av et antigen eller et annet stimulus til å danne f.eks. cytokiner, biokjemiske signalmolekyler eller reseptorer som videre har innflytelse på T-cellepopulasjonens skjebne.
B-celler kan aktiveres via reseptorer på celleoverflaten, innbefattet B-cellereseptoren, og andre tilleggsmolekyler slik at de utfører tilleggscellefunksjoner, f.eks. dannelse av cytokiner.
Monocytter/makrofager og T-celler kan aktiveres av reseptorer på celleoverflaten og spille en viktig rolle i immunresponsen ved å presentere antigen overfor lymfocytter, og også fungere som tilleggsceller for lymfocyttene ved å utskille en rekke cytokiner.
Naturlige dreperceller (NK-celler) har en felles opphavscelle med T-cellene og B-cellene og spiller en rolle i immunovervåkningen. NK-celler, som utgjør opptil 15 % av lymfocyttene i blodet, uttrykker ikke antigenreseptorer og benytter derfor ikke MHC-gjenkjenning som krav for binding til en målcelle. NK-celler deltar i gjenkjenning og dreping av visse tumorceller og virusinfiserte celler. In vivo antas NK-celler å kreve aktivering, in vitro er imidlertid NK-celler blitt vist å drepe noen typer tumorceller uten aktivering.
De påviste in vzvø-aktivitetene til cytokinfamilien illustrerer det enorme kliniske potensialet av og behovet for andre cytokiner, cytokinagonister og cytokinantagonister. Foreliggende oppfinnelse oppfyller disse behovene ved å tilveiebringe et nytt cytokin som stimulerer celler fra den hematopoietiske cellelinje, så vel som tilhørende preparater og fremgangsmåter.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer slike polypeptider for disse og andre formål som bør være åpenbare for fagfolk ut fra den foreliggende beskrivelse.
Kort beskrivelse av figurene
Figur 1 er en illustrasjon av en flersekvenssammenstilling for human zcytorl71ig (SEQ ID NO: 2) (zcytorl71ig), muse-zcytorl71ig (SEQ ID NO: 11) (mzcytorl71ig), muse-IL-3 (mIL-3) (SEQ ID NO: 100) og humant IL-3 (hIL-3) (SEQ ID NO: 102). Figur 2 er en illustrasjon av en flersekvenssammenstilling for human zcytorl71ig (SEQ ID NO: 2) (zcytorl71ig) og muse-zcytorl71ig (SEQ ID NO: 11) (mzcytorl71ig). Figur 3 er et Hopp/Woods-hydrofilisitetsplott for human zcytorl71ig (SEQ ID NO: 2).
Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen
Før oppfinnelsen beskrives i detalj, kan det være nyttig for forståelsen av den å definere de påfølgende begreper: Begrepet "affinitetsmerkelapp" anvendes heri for å betegne et polypeptidsegment som kan kobles til et annet polypeptid, slik at rensing eller påvisning av dette andre polypeptidet lettes, eller at det tilveiebringes seter for kobling av det andre polypeptidet til et støttemedium. I prinsippet kan ethvert peptid eller protein som det er tilgjengelig et antistoff eller et annet spesifikt bindingsmiddel for, anvendes som affinitetsmerkelapp. Affinitetsmerkelapper omfatter et polyhistidinstrekk, protein A (Nilsson et al., EMBO J., 4:1075,1985; Nilsson et al, Methods Enzymol., 198:3,1991), glutation S-transferase (Smith og Johnson, Gene, 67:31,1988), Glu-Glu- affinitetsmerkelapp (Grussenmeyer et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 52:7952-4,1985), substans P, "Flag"-peptid (Hopp et al, Biotechnology, 6:1204-10,1988), streptavidinbindende peptid eller en annen antigen epitop eller et bindingsdomene. Se generelt Ford et al., Protein Expression and Purification, 2:95-107,1991. DNA som koder for affinitetsmerkelapper, er tilgjengelige fra kommersielle leverandører (f.eks. Pharmacia Biotech., Piscataway, NJ).
Begrepet "allelisk variant" anvendes heri for å betegne én av to eller flere alternative former av et gen som besitter det samme lokus i kromosomet. Allelisk variasjon oppstår naturlig ved mutasjon og kan føre til fenotypisk polymorfisme i populasjoner. Genmutasjoner kan være tause (ingen endring i det kodede polypeptid), eller de kan kode for polypeptider med endret aminosyresekvens. Begrepet "allelisk variant" anvendes også heri for å betegne et protein som kodes av en allelisk variant av et gen.
Begrepene "aminoterminal" og "karboksylterminal" anvendes heri for å angi posisjoner i polypeptider. Hvor sammenhengen tillater dette, anvendes disse begrepene med henvisning til en gitt sekvens eller en del av et polypeptid for å angi nærhet eller relativ posisjon. For eksempel er en gitt sekvens som er plassert karboksylterminalt for en referansesekvens i et polypeptid, plassert proksimalt til karboksylenden av referansesekvensen, men den foreligger ikke nødvendigvis i karboksylenden av det fullstendige polypeptid.
Begrepet "komplement-/antikomplementpar" betegner ikke-identiske grupper som kan danne et ikke kovalent sammenbundet, stabilt par under egnede betingelser. For eksempel er biotin og avidin (eller streptavidin) prototypiske medlemmer av et komplement-/antikomplementpar. Andre eksempler på komplemenWantikomplementpar omfatter reseptor-/ligandpar, antistoff-/antigen(eller hapten- eller epitop)par, "sense"-/"antisense"-polynukleotidpar og lignende. Dersom påfølgende dissosiering av komplemenWantikomplementparet er ønskelig, har komple- ment-/antikomplementparet fortrinnsvis en bindingsaffinitet på < 10<9>M"<1>.
Begrepet "komplementet til et polynukleotidmolekyl" betegner et polynukleotidmolekyl med komplementær basesekvens og reversorientering, sammenlignet med en referansesekvens. For eksempel er sekvensen 5' ATGCACGGG 3' komplementær til 5' CCCGTGCAT 3'.
Begrepet "contig" betegner et polynukleotid som har et kontinuerlig strekk med sekvens som er identisk eller komplementær til et strekk i et annet polynukleotid. Kontinuerlige sekvenser sies å "overlappe" et gitt strekk med polynukleotidsekvens, enten fullstendig eller langs et gitt strekk av polynukleotidet. For eksempel er representative contiger til polynukleotidsekvensen 5'-ATGGCTTAGCTT-3' 5'-TAGCTTgagtct-3' og 3'-gtcgacTACCGA-5'.
Begrepet "degenerert nukleotidsekvens" betegner en sekvens av nukleotider som omfatter ett eller flere degenererte kodoner (sammenlignet med et referansepolynukleotid-molekyl som koder for et polypeptid). Degenererte kodoner inneholder forskjellige tripletter av nukleotider, men koder for samme aminosyrerest (f.eks. koder triplettene GAU og GAC begge for Asp).
Begrepet "ekspresjonsvektor" anvendes for å betegne et DNA-molekyl, lineært eller sirkulært, som omfatter et segment som koder for et polypeptid av interesse, operativt koblet til ytterligere segmenter som sørger for transkripsjon av segmentet. Slike ytterligere segmenter omfatter promoter- og terminatorsekvenser, og kan også omfatte ett eller flere replikasjonsorigi, én eller flere seleksjonsmarkører, en enhancer, et polyadenyleringssignal osv. Ekspresjonsvektorer er generelt avledet fra plasmid-DNA eller virus-DNA, eller de kan inneholde elementer fra begge disse.
Begrepet "isolert" anvendt på et polynukleotid angir at polynukleotidet er blitt fjernet fra sitt naturlige genetiske miljø, og således er fritt for andre ekstra eller uønskede kodende sekvenser, og foreligger i en form som er egnet for anvendelse i produksjonssystemer for genetisk modifiserte proteiner. Slike isolerte molekyler er molekyler som er separert fra sitt naturlige miljø, og omfatter cDNA-kloner og genomiske kloner. Isolerte DNA-molekyler ifølge foreliggende oppfinnelse er frie for andre gener som de normalt er forbundet med, men kan omfatte naturlig forekommende 5'- og 3'-ikke-translaterte områder, f.eks. promotere og terminatorer. Identifisering av assosierte områder vil være åpenbar for en gjennomsnittsfagperson (se f.eks. Dynan og Tijan, Nature, 376:774-78,1985).
Et "isolert" polypeptid eller protein er et polypeptid eller protein som foreligger i en tilstand som er forskjellig fra dets naturlige miljø, f.eks. fjernet fra blod og dyrevev. I en foretrukket form er det isolerte polypeptid i det vesentlige fritt for andre polypeptider, særlig andre polypeptider med opphav i dyr. Det foretrekkes at polypeptidene foreligger i svært renset tilstand, f.eks. mer enn 95 % rene, mer foretrukket mer enn 99 % rene. Anvendt i denne sammenheng utelukker begrepet "isolert" ikke nærvær av samme polypeptid i alternative fysiske former, f.eks. dimerer eller alternativt glykosylerte eller derivatiserte former.
Anvendt på celler, betegner uttrykket "neoplastisk" celler som gjennomgår en ny og unormal proliferasjon, fortrinnsvis i et vev hvori proliferasjonen er ukontrollert og progressiv, noe som fører til en neoplasi. De neoplastiske cellene kan være enten ondartede, det vil si invasive og metastatiske, eller godartede.
Begrepet "operativt sammenkoblet" anvendt på DNA-segmenter, viser til at segmentene er arrangert slik at de fungerer sammen for sine påtenkte formål, f.eks. initieres transkripsjonen i promoteren og forløper gjennom det kodende segment til terminatoren.
Begrepet "ortolog" betegner et polypeptid eller protein erholdt fra én art som er det funksjonelle motstykke til et polypeptid eller protein fra en annen art. Sekvensforskjeller mellom ortologer er en følge av artsdannelse.
"Paraloger" er forskjellige, men strukturelt beslektede proteiner som fremstilles av en organisme. Paraloger antas å oppstå ved genduplikasjon. For eksempel er a-globin, P-globin og myoglobin paraloger til hverandre.
Et "polynukleotid" er en enkelt- eller dobbelttrådet polymer av deoksyribo-nukleotid- eller ribonukleotidbaser lest fra 5'- til 3'-ende. Polynukleotider omfatter RNA og DNA og kan være isolert fra naturlige kilder, syntetisert in vitro eller fremstilt ved en kombinasjon av naturlige og syntetiske molekyler. Størrelsen på polynukleotider uttrykkes som basepar (forkortet "bp"), nukleotider ("nt") eller kilobaser ("kb"). Dersom sammenhengen tillater dette, kan de to siste begrepene beskrive polynukleotider som er enkelttrådede eller dobbelttrådede. Dersom begrepet anvendes på dobbelttrådede molekyler, anvendes det for å angi totallengden, og vil forstås å være ekvivalent med begrepet "basepar". Fagfolk vil forstå at de to trådene i et dobbelttrådet polynukleotid kan være noe forskjellige i lengde, og at endene kan være forskjøvet i forhold til hverandre som følge av enzymatisk kutting; således foreligger ikke nødvendigvis alle nukleotider i et dobbelttrådet polynukleotidmolekyl i basepar.
Et "polypeptid" er en polymer av aminosyrerester sammenkoblet med peptidbindinger, fremstilt enten naturlig eller syntetisk. Polypeptider med mindre enn ca. 10 aminosyrerester betegnes ofte "peptider".
Begrepet "promoter" anvendes heri i sin anerkjente betydning innen faget for å betegne en del av et gen som inneholder DNA-sekvenser som sørger for binding av RNA-polymerase og initiering av transkripsjonen. Promotersekvenser foreligger ofte, men ikke alltid, i genenes 5'-ikke-kodende område.
Et "protein" er et makromolekyl som omfatter én eller flere polypeptidkjeder. Et protein kan også omfatte ikke-peptidholdige bestanddeler, f.eks. karbohydratgrupper. Karbohydrater og andre substituenter som ikke har peptidnatur, kan ha blitt addert til et protein av cellen som proteinet er dannet i, og vil variere med celletypen. Proteiner er definert heri ut fra aminosyreryggradstrukturen; substituenter som karbohydratgrupper er generelt ikke angitt, men de kan ikke desto mindre foreligge.
Begrepet "reseptor" betegner et celleassosiert protein som bindes til et bioaktivt molekyl (det vil si en ligand) og formidler ligandens virkning på cellen. Membranbundne reseptorer særpreges ved en flerpeptidstruktur som omfatter et ekstracellulært ligandbindende domene og et intracellulært effektordomene som typisk deltar i signaloverføring. Binding av ligand til reseptoren fører til en konformasjonsendring i reseptoren som gir en interaksjon mellom effektordomenet og ett eller flere andre molekyler i cellen. Denne interaksjonen fører i sin tur til en endring av cellens metabolisme. Metabolske begivenheter som er koblet til reseptor-ligandinteraksjoner, omfatter gentranskripsjon, fosforylering, defosforylering, økt produksjon av syklisk AMP, mobilisering av cellulært kalsium, mobilisering av membranlipider, celleadhesjon, hydrolyse av inositollipider og hydrolyse av fosfolipider. Generelt kan reseptorer være membranbundne, cytosoliske eller nukleære, monomere (f.eks. tyreoidstimulerende hormon-reseptor, P-adrenerg reseptor) eller multimere (f.eks. PDGF-reseptor, veksthormonreseptor, IL-3-reseptor, GM-CSF-reseptor, G-CSF-reseptor, erytropoietinreseptor og IL-6-reseptor).
Begrepet "sekretorisk signalsekvens" betegner en DNA-sekvens som koder for et polypeptid (et "sekretorisk peptid") som som bestanddel av et større polypeptid styrer det større polypeptidet gjennom en sekretorisk vei i en celle som det syntetiseres i. Det større polypeptidet spaltes vanligvis slik at det sekretoriske peptid fjernes under transporten gjennom sekresjonsveien.
Begrepet "spleisevariant" anvendes heri for å betegne alternative former av RNA transkribert fra et gen. Spleisevariasjon oppstår naturlig ved anvendelse av alternative spleise-seter i et transkribert RNA-molekyl, eller mindre hyppig mellom separat transkriberte RNA-molekyler, og kan føre til at flere mRNA transkriberes fra samme gen. Spleisevarianter kan kode for polypeptider med endret aminosyresekvens. Begrepet spleisevariant anvendes også heri for å betegne et protein som kodes av en spleisevariant av et mRNA som er transkribert fra et gen.
Molekylvekt og lengde av polymerer bestemt ved unøyaktige analytiske fremgangsmåter (f.eks. gelelektroforese) vil forstås å være tilnærmede verdier. Når en slik verdi uttrykkes som "ca." X eller "omtrent" X, vil den angitte verdi for X forstås å være nøyaktig innenfor ± 10 %.
Foreliggende oppfinnelse er delvis basert på oppdagelsen av en ny DNA-sekvens som koder for et protein som har en fireheliksbunt-cytokinstruktur. Ved hjelp av klonings-prosesser og proliferasjonsanalyser, som beskrives i detalj heri, er en polynukleotidsekvens som koder for en ny polypeptidligand blitt identifisert, hvor liganden har høy spesifisitet for reseptoren zcytorl7 (SEQ ID NO: 5), og ytterligere minst én subenhet som inngår i onkostatin M-reseptor beta (OSMRbeta) (SEQ ID NO: 7) og WSX-1 (SEQ ID NO: 9), er blitt påvist. Denne polypeptidliganden, som betegnes zcytorl71ig, ble isolert fra et cDNA-bibliotek fremstilt fra aktiverte celler fra humant perifert blod (hPBc), som var selektert for CD3. CD3 er en celleoverflatemarkør som er unik for celler av lymfoidopphav, fortrinnsvis T-celler.
I eksemplene som følger, ble en cellelinje som er avhengig av den OSMRbeta- og zcytorl7-reseptorkoblede reaksjonsvei eller avhengig av den OSMRbeta- og WSX-1- og den zcytorl7-reseptorkoblede reaksjonsvei for overlevelse og vekst i fravær av andre vekstfaktorer, anvendt for søk etter en kilde for cDNA som koder for zcytorl71ig. Den foretrukne vekstfaktoravhengige cellelinje som ble anvendt for transfeksjon og ekspresjon av zcytorl 7-reseptoern, var BaF3 (Palacios og Steinmetz, Cell, 41:727- 134, 1985; Mathey-Prevot et al., Mol. Cell. Biol., 6:4133-4135,1986). Imidlertid er andre vekstfaktoravhengige cellelinjer, f.eks. FDC-Pl (Hapel et al., Blood, 64:786-790,1984) og M07e (Kiss et al, Leukemia, 7:235-240,1993), egnet for dette formål.
Aminosyresekvensen for OSMR-, WSX1- og zcytorl 7-reseptorene tydet på at de kodede reseptorene tilhørte cytokinreseptorunderfamilien, klasse I, som omfatter reseptorene for IL-2, IL-4, IL-7, LiF, IL-12, IL-15, EPO, TPO, GM-CSF og G-CSF (for en oversikt, se Cosman, "The Hematopoietin Receptor Superfamily", i Cytokine, 5(2):95-106,1993). zcytorl 7-reseptoren beskrives fullt ut i oppfinnernes PCT-patentsøknad nr. US 01/20484 (WIPO-publikasjon WO
02/00721), og WSX-1 beskrives fullt ut i US patentskrift nr. 5 925 735. Analyse av vevsfordelingen av mRNA for zcytorl 7-reseptoren viste ekspresjon i undergrupper av aktiverte CD4<+->og CD8<+->T-celler, CD14<+->monocytter og svakere ekspresjon i CD19<+->B-celler. mRNA forelå videre i både hvilende og aktiverte celler fra monocyttcellelinjene THP-1 (ATCC nr. TIB-202), U937 (ATCC nr. CRL-1593.2) og HL60 (ATCC nr. CCL-240).
Ekspresjonen av WSX-1 er kraftigst i brissel, milt, PBL og lymfeknuter, videre ble forhøyet ekspresjon observert for aktiverte T-celler. Vevsfordelingen av OSMRbeta beskrives som svært bred. Vevsfordelingen av disse tre reseptorene tyder på at et mål for den antatte zcytorl 71ig er celler fra den hematopoietiske linje, nærmere bestemt T-celler, monocytter/makrofager, lymfoide forløperceller og lymfoide celler. Andre kjente fireheliksbunt-cytokiner som virker på lymfoide celler, omfatter IL-2, IL-4, IL-7 og IL-15. For en oversikt over fireheliksbunt-cytokiner, se Nicola et al., Advances in Protein Chemistry, 52:1-65,1999, og Kelso, A., Immun. Cell Biol., 76:300-317,1998.
Kondisjonert medium (CM) fra CD3<+->selekterte, PMA/ionomycinstimulerte celler fra humant perifert blod understøttet vekst av BaF3-celler som uttrykte zcytorl 7-reseptoren og reseptorene OSMRbeta og WSX-1, og som ellers var avhengige av IL-3. Kondisjonert medium fra celler som ikke var: 1) PMA-/ionomycinstimulerte eller 2) CD3-selekterte (med eller uten PMA-/ionomycinstimulering), understøttet ikke vekst av BaF3-celler som uttrykte zcytorl 7-, OSMRbeta- og WSX-1-(BaF3/zcytorl7/WSX-l/OSMRbeta)-reseptoruttrykkende celler. Kontrolleksperimenter viste at denne proliferative aktiviteten ikke skyldtes andre kjente vekstfaktorer, og at evnen til et slikt kondisjonert medium til å stimulere proliferasjon av zcytorl7/WSX-l/OSMRbeta-reseptoruttrykkende celler kunne nøytraliseres med en løselig form av zcytorl 7-reseptoren.
Kondisjonert medium fra CD3<+->selekterte celler aktivert med PMA-/ionomycin, understøttet også vekst av BaF3-celler som uttrykte zcytorl 7-reseptoren og OSMRbeta-reseptoren (zcytorl7/OSMRbeta), mens BaF3-celler som kun uttrykte zcytorl 7-reseptoren og WSX-1-reseptoren (zcytorl7/WSX-l), eller som kun inneholdt OSMRbeta-reseptoren, ikke ble stimulert av dette kondisjonerte medium.
Proliferasjon av zcytorl 7/WSX-l/OSMRbeta-reseptoruttrykkende BaF3-celler eksponert for CM fra CD3<+->selekterte, PMA-/ionomycinstimulerte celler fra humant perifert
blod ble påvist ved visuell undersøkelse av kulturene og/eller ved proliferasjonsanalyse. Mange egnede proliferasjonsanalyser er kjent innen faget og omfatter analyser for reduksjon av et fargestoff, f.eks. "Alamar Blue" (AccuMed International, Inc., Westlake, Ohio), 3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid (Mosman, J. Immunol. Meth., 65:55-63,1983); 3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-5-3-karboksymetoksyfenyl-2H-tetrazolium; 2,3-bis-(2-metoksy-4-nitro-5-sulfofenyl)-5-[(fenylamino)karbonyl]-2H-tetrazoliumhydroksid; og cyanditolyltetrazoliumklorid (som er kommersielt tilgjengelig fra Polysciences, Inc., Warrington, PA); mitogeneseanalyser,
f.eks. måling av inkorporering av<3>H-tymidin; fargeeksklusjonsanalyser ved anvendelse av f.eks. naftalensort eller trypanblått; fargeopptak ved anvendelse av diacetylfluorescein; og frigjøring av krom. Se generelt Freshney, Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 3. utgave, Wiley-Liss, 1994.
Et cDNA-bibliotek ble fremstilt fra CD3<+->selekterte, PMA- og ionomycinstimulerte primærceller fra humant perifert blod. cDNA-biblioteket fra de CD3<+->selekterte, PMA- og ionomycinstimulerte cellene fra humant perifert blod ble oppdelt i porsjoner som inneholdt flere forskjellige cDNA-molekyler og ble transfektert inn i en vertscellelinje, f.eks. BHK-570-celler (ATCC-aksesjonsnummer 10314). De transfekterte vertscellene ble dyrket i et medium som ikke inneholdt eksogene vekstfaktorer (f.eks. 5 % FBS), og kondisjonert medium ble oppsamlet. Det kondisjonerte medium ble analysert for evnen til å stimulere proliferasjon av BaF3-celler transfektert med reseptorene zcytorl 7, WSX-1 og OSMRbeta. cDNA-porsjoner som ga kondisjonert medium som stimulerte BaF3/zcytorl 7/WSX-l/OSMRbeta-reseptorceller, ble påvist. Dette sammenslåtte plasmid-cDNA ble elektroporert inn i E. coli. cDNA ble isolert fra enkeltkolonier og transfektert enkeltvis inn i BHK-570-eller. Positive kloner ble påvist med et positivt resultat i BaF3/zcytorl7/WSX-l/OSMRbeta-reseptorproliferasjonsanalysen, og aktiviteten ble bekreftet ved nøytralisering av proliferasjonen ved anvendelse av den løselige zcytorl 7-reseptoren.
En positiv klon ble isolert, og sekvensanalyse viste at polynukleotidsekvensen som inngikk i plasmid-DNA var ny. Den sekretoriske signalsekvens består av aminosyrerestene 1 (Met) til 23 (Ala), og det modne polypeptid består av aminosyrerestene 24 (Ser) til 164 (Thr)
(som vist i SEQ ID NO: 2). Videre N-terminal sekvensanalyse av renset zcytorl71ig fra 293T-celler viste en aminoende ved aminosyrerest 27 (Leu), som vist i SEQ ID NO: 2, hvor det modne polypeptid bestod av aminosyrerestene 27 (Leu) til 164 (Thr) (som vist i SEQ ID NO: 2).
Generelt forventes cytokiner å ha en fire-a-heliksstruktur, hvor heliksene A, C og D er de viktigste for ligand-reseptoirnteraksj onene og er høyere konservert blant medlemmer av familien. Med henvisning til den humane zcytorl 71ig-aminosyresekvens som er vist i SEQ ID NO: 2 og sammenstilling av human zcytorl 71ig, humant IL-3 og humane cytokinaminosyre-sekvens er kan det forutsis zcytorl71ig-heliks A er definert av aminosyrerestene 38-52, heliks B av aminosyrerestene 83-98, heliks C av aminosyrerestene 104-117, og heliks D av aminosyrerestene 137-152, som vist i SEQ ID NO: 2. Strukturanalyse tyder på at A/B-løkken er lang, B/C-løkken er kort, og C/D-løkken er lang. Denne løkkestrukturen fører til en opp-opp-ned-ned-organisering av heliksene. Basert på 4-heliksbuntstrukturen tilsvarer cysteinrestene i zcytorl 7 som er konserverte, aminosyrerestene 72,133 og 147 i SEQ ID NO: 2, og 74, 37 og 151 i SEQ ID NO: 11, som beskrives heri. En konsistent plassering av cysteinrestene er en ytterligere en bekreftelse på fireheliksbuntstrukturen. Også høyt konservert i zcytorl 71ig er Glu-resten, som vises i SEQ ID NO: 2 som aminosyrerest 43.
Videre viser den utledede aminosyresekvens for zcytorl71ig fra mus 31 % identitet med det utledede humane protein over sekvensenes fulle lengde (SEQ ID NO: 2 og SEQ ID NO: 11). Basert på sammenligning av sekvensen til zcytorl 71ig fra menneske og mus ble godt konserverte aminosyrerester funnet i områdene som antas å kode for a-heliksene C og D. De tilsvarende polynukleotider som koder for polypeptidområdene, domenene, motivene, aminosyrerestene og sekvensene for human zcytorl 71ig som beskrives heri, er vist i SEQ ID NO: 1.
Mens heliks D er relativt konservert i zcytorl 71ig fra menneske og mus, er heliks C den mest konserverte. Mens begge arter hovedsakelig har sure aminosyrerester i dette området, kan forskjellene skyldes artsspesifisitet i interaksjonen mellom zcytorl 71ig og reseptoren,
zcytorl 7, innbefattet monomere, heterodimere (f.eks. zcytorl 7/OSMRbeta, WSX-1/OSMRbeta, zcytorl 7/WSX-l) eller multimere (f.eks. zcytorl 7/OSMRbeta/WSX-l) reseptorer. Løkke A/B og heliks B i zcytorl71ig er marginalt konservert, og området som omfatter heliks C via løkke C/D inn i heliks D, er det mest konserverte mellom artene, konservasjonen i dette området tyder på at det er av betydning for funksjonen. D-heliksene i zcytorl 71ig fra menneske og mus er også
konservert. Zcytorl7-reseptorantagonister kan utformes ved å innføre mutasjoner i zcytorl71ig-heliks D. Disse kan omfatte avkorting av proteinet fra aminosyreresten Thr 156 (SEQ ID NO: 2) eller innføring av aminosyrerester som tillater binding mellom ligand og reseptor, men som reduserer signalaktiviteten.
Fireheliksbunt-cytokiner grupperes også ut fra lengden av heliksene de består av. Cytokiner med "lang heliks"-form består generelt av helikser med mellom 24 og 30 aminosyrerester og omfatter IL-6, ciliær nøytrotrofisk faktor (CNTF), leukemiinhiberende faktor (LIF) og humant veksthormon (hGH). Cytokiner av "kort heliks"-type består generelt av helikser på mellom 18 og 21 aminosyrerester og omfatter IL-2, IL-4 og GM-CSF. Zcytorl 7 antas å være et nytt medlem av cytokingruppen med kort heliksform. Undersøkelser som benyttet CNTF og IL-6, viste at en CNTF-heliks kan utbyttes med den tilsvarende heliks i IL-6 og i CNTF-bindende egenskaper til kimæren. Det ser således ut til at funksjonelle domener i fireheliks-cytokiner bestemmes basert på strukturell homologi, uavhengig av sekvensidentitet, og kan opprettholde funksjonell integritet i en kimære (Kallen et al., J. Biol. Chem., 274:11859-11867,1999). Heliksdomenene i zcytorl71ig vil derfor være anvendbare for fremstilling av kimære fusjons-molekyler, fortrinnsvis med andre cytokiner med kort heliksform, for å bestemme og modulere reseptorbindingsspesifisiteten. Av spesiell interesse er fusjonsproteiner utformet med heliks A og/eller heliks D, og fusjonsproteiner som omfatter heliksdomener og løkkedomener fra andre cytokiner av kort type, f.eks. IL-2, IL-4, IL-15, Lif, IL-12, IL-3 og GM-CSF.
Polynukleotidsekvensen til humant IL-2 eT vist i SEQ ID NO: 161, og den tilsvarende aminosyresekvens er vist i SEQ ID NO: 162. Den sekretoriske signalsekvens består av aminosyrerestene 1 (Met) til 20 (Ser) i SEQ ID NO: 162, nukleotidene 48 til 107 i SEQ ID NO: 161. Det modne polypeptid består av aminosyrerestene 21 (Ala) til 156 (Thr) i SEQ ID NO: 162, nukleotidene 108 til 515 i SEQ ID NO: 161. Heliks A i humant IL-2 består av aminosyrerestene 27 (Thr) til 48 (Leu) i SEQ ID NO: 162, nukleotidene 126 til 191 i SEQ ID NO: 161. Heliks B i humant IL-2 omfatter heliks Bl og heliks B2. Heliks Bl i humant IL-2 består av aminosyrerestene 73 (Ala) til 80 (Gin) i SEQ ID NO: 162, nukleotidene 264 til 287 i SEQ ID NO: 161. Heliks B2 i humant IL-2 består av aminosyrerestene 83 (Glu) til 92 (Val) i SEQ ID NO: 162, nukleotidene 294 til 323 i SEQ ID NO: 161. Således representeres heliks B (som omfatter heliksene Bl og B2) i IL-2 av aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO: 168 (nukleotidsekvensene ifølge SEQ ID NO: 167), hvori aminosyrerester 9 og 10 kan være hvilken som helst aminosyre. SEQ ID NO: 168 er identisk med sekvensen fra aminosyrene 73 (Ala) til 92 (Val) i SEQ ID NO: 162, hvori aminosyrene 81 og 82 er hvilke som helst aminosyrer. I en foretrukket form omfatter heliks B fra IL-2 aminosyrene 73 (Ala) til 92 (Val) i SEQ ID NO: 162, nukleotidene 264 til 323 i SEQ ID NO: 161. Heliks C i humant IL-2 består av aminosyrerestene 102 (His) til 116 (Val) i SEQ ID NO: 162, nukleotidene 351 til 395 i SEQ ID NO: 161. Heliks D i humant IL-2 består av aminosyrerestene 134 (Thr) til 149 (Gin) i SEQ ID NO: 162, nukleotidene 447 til 494 i SEQ ID NO: 161.
Polynukleotidsekvensen til humant IL-4 er vist i SEQ ID NO: 163, og den tilsvarende aminosyresekvens er vist i SEQ ID NO: 164. Den sekretoriske signalsekvens består av aminosyrerestene 1 (Met) til 24 (Gly) i SEQ ID NO: 164, nukleotidene 64 til 135 i SEQ ID NO: 163. Det modne polypeptid består av aminosyrerestene 25 (His) til 153 (Ser) i SEQ ID NO: 164, nukleotidene 136 til 522 i SEQ ID NO: 163. Heliks A i humant IL-4 består av aminosyrerestene 30 (Thr) til 42 (Thr) i SEQ ID NO: 164, nukleotidene 151 til 189 i SEQ ID NO: 163. Heliks B i humant IL-4 består av aminosyrerestene 65 (Glu) til 83 (His) i SEQ ID NO: 164, nukleotidene 256 til 312 i SEQ ID NO: 163. Heliks C i humant IL-4 består av aminosyrerestene 94 (Ala) til 118 (Ala) i SEQ ID NO: 164, nukleotidene 343 til 417 i SEQ ID NO: 163. Heliks D i humant IL-4 består av aminosyrerestene 133 (Leu) til 151 (Cys) i SEQ ID NO: 164, nukleotidene 460 til 516 i SEQ ID NO: 163.
Polynukleotidsekvensen til human GM-CSF er vist i SEQ ID NO: 165, og den tilsvarende aminosyresekvens er vist i SEQ ID NO: 166. Den sekretoriske signalsekvens består av aminosyrerestene 1 (Met) til 17 (Ser) i SEQ ID NO: 166, nukleotidene 9 til 59 i SEQ ID NO: 165, Det modne polypeptid består av aminosyrerestene 18 (Ala) til 144 (Glu) i SEQ ID NO: 166, nukleotidene 60 til 440 i SEQ ID NO: 165. Heliks A i human GM-CSF består av aminosyrerestene 30 (Trp) til 44 (Asn) i SEQ ID NO: 166, nukleotidene 96 til 140 i SEQ ID NO: 165. Heliks B i human GM-CSF består av aminosyrerestene 72 (Leu) til 81 (Gin) i SEQ ID NO: 166, nukleotidene 222 til 251 i SEQ ID NO: 165. Heliks C i human GM-CSF består av aminosyrerestene 85 (Gly) til 103 (Gin) i SEQ ID NO: 166, nukleotidene 261 til 317 i SEQ ID NO: 165. Heliks D i human GM-CSF består av aminosyrerestene 120 (Phe) til 131 (Leu) i SEQ ID NO: 166, nukleotidene 366 til 401 i SEQ ID NO: 165.
Aminosyrerestene som utgjør heliksene A, B, C og D, for human zcytorl 71ig, IL-3, IL-2, IL-4 og GM-CSF, er vist i tabell 1.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer polynukleotidmolekyler, innbefattet DNA-og RNA-molekyler, som koder for zcytorl 71ig-polypeptidene som beskrives heri. Fagfolk vil lett forstå at betydelig sekvens variasjon er mulig blant disse polynukleotidmolekylene i lys av den genetiske kodes degenererthet. SEQ ID NO: 3 er en degenerert DNA-sekvens som omfatter alle DNA som koder for zcytorl71ig-polypeptidet og fragmenter av dette ifølge SEQ ID NO: 2. Fagfolk vil forstå at den degenererte sekvensen ifølge SEQ ID NO: 3 også tilveiebringer alle RNA-sekvenser som koder for SEQ ID NO: 2 dersom T erstattes med U. Således omfattes zcytorl 7lig-polypeptidkodende polynukleotider som omfatter sekvensen fra nukleotid 1 eller 70 til nukleotid 492 i SEQ ID NO: 3, og deres RNA-ekvivalenter, av foreliggende oppfinnelse. Tabell 2 beskriver enbokstavkoden som anvendes i SEQ ID NO: 3 for å angi degenererte nukleotidposisjoner. "Oppløsning" er nukleotidene som angis av én kodebokstav. "Komplement" angir koden for det eller de komplementære nukleotid(er). For eksempel angir koden Y enten C eller T, og dens komplement R angir A eller G, hvor A er komplementær til T, og G er komplementær til C.
De degenererte kodoner som anvendes i SEQ ID NO: 3, og som omfatter alle mulige kodoner for en gitt aminosyre, er gitt i tabell 3.
En gjennomsnittsfagperson vil forstå at en viss ambiguitet innføres ved å angi et degenerert kodon som skal representere alle mulige kodoner som koder for en gitt aminosyre. For eksempel kan det degenererte kodon for serin (WSN) i noen tilfeller kode for arginin (AGR), og det degenererte kodon for arginin (MGN) kan i noen tilfeller kode for serin (AGY). Et tilsvarende forhold foreligger mellom kodonene som koder for fenylalanin og leucin. Således kan noen polynukleotider som omfattes av den degenererte sekvensen, kode for aminosyre-sekvensvarianter, men en gjennomsnittsfagperson kan lett påvise slike variante sekvenser ved henvisning til aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO: 2. Variante sekvenser kan lett analyseres for funksjonalitet, som beskrevet heri.
En gjennomsnittsfagperson vil også forstå at forskjellige arter kan vise "preferensiell kodonbruk". Se generelt Grantham et al, Nuc. Acids Res., 5:1893-912,1980; Haas et al, Curr. Biol., 6:315-24,1996; Wain-Hobson et al., Gene, 73:355-64,1981; Grosjean og Fiers, Gene, 75:199-209,1982; Holm, Nuc. Acids Res., 74:3075-87,1986; Ikemura, J. Mol. Biol., 755:573-97,1982. Som anvendt heri, er begrepet "preferensiell kodonbruk" eller "foretrukne kodoner" et faguttrykk som viser til de proteintranslasjonskodoner som hyppigst brukes i celler fra en gitt art, slik at én eller noen få representanter for de mulige kodonene som koder for en gitt aminosyre favoriseres (se tabell 3). For eksempel kan aminosyren treonin (Thr) kodes av ACA, ACC, ACG eller ACT, men i pattedyrceller er ACC det vanligst anvendte kodon. I andre arter, f.eks. insektceller, gjær, virus eller bakterier, kan andre Thr-kodoner være foretrukket. Foretrukne kodoner for en gitt art kan innføres i polynukleotidene ifølge foreliggende oppfinnelse ved en rekke fremgangsmåter som er kjent innen faget. Innføring av foretrukne kodonsekvenser i rekombinant DNA kan f.eks. forsterke dannelsen av proteinet ved at proteintranslasjonen går mer effektiv i en gitt celletype eller -art. Den degenererte kodonsekvens som beskrives i SEQ ID NO: 3, fungerer derfor som templat for optimalisering av ekspresjonen av polynukleotider i forskjellige celletyper og -arter som vanligvis anvendes innen faget, og som beskrives heri. Sekvenser som inneholder foretrukne kodoner, kan analyseres og optimaliseres for ekspresjon i forskjellige arter og analyseres for funksjonalitet, som beskrevet heri.
Som angitt tidligere, omfatter de isolerte polynukleotidene ifølge foreliggende oppfinnelse DNA og RNA. Fremgangsmåter for fremstilling av DNA og RNA er vel kjent innen faget. Generelt isoleres RNA fra et vev eller en celle som danner store mengder zcytorl 71ig-RNA. Slike vev og celler identifiseres ved Northern-blotting (Thomas, Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 77:5201,1980), eller ved analyse av kondisjonert medium fra forskjellige celletyper for aktivitet på målceller eller -vev. Når først aktiviteten eller den RNA-produserende celle eller det RNA-produserende vev er påvist, kan total-RNA fremstilles ved anvendelse av guanidinium-isocyanatekstraksjon, fulgt av isolering ved sentrifugering i en CsCl-gradient (Chirgwin et al., Biochemistry, 75:52-94,1979). Poly(A)<+->RNA fremstilles fra total-RNA ved anvendelse av fremgangsmåten til Aviv og Leder (Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 69:1408-12,1972). Komplementært DNA (cDNA) fremstilles fra poly(A)<+->RNA ved anvendelse av kjente fremgangsmåter. Alternativt kan genomisk DNA isoleres. Polynukleotider som koder for zcytorl 71ig-polypeptider, påvises så og isoleres ved f.eks. hybridisering eller PCR.
En fullengdeklon som koder for zcytorl71ig, kan erholdes ved konvensjonelle
kloningsfremgangsmåter. Kloner av komplementært DNA (cDNA) foretrekkes, selv om det for noen anvendelser (f.eks. i transgene dyr) kan være foretrukket å anvende en genomisk klon eller å modifisere en cDNA-klon slik at den omfatter minst ett genomisk intron. Fremgangsmåter for fremstilling av cDNA-kloner og genomiske kloner er vel kjent og ligger innenfor det gjennomsnittlige kunnskapsnivå innen faget, og omfatter anvendelse av sekvensen som beskrives heri, eller deler av denne, for probing eller priming av et bibliotek. Ekspresjonsbiblioteker kan
probes med antistoffer mot zcytorl 71ig-fragmenter, zcytorl 71ig-omfattende løselige reseptorer eller andre spesifikke bindingspartnere.
Zcytorl 71ig-polynukleotidsekvensene som beskrives heri, kan også anvendes som prober eller primere for kloning av 5-ikke-kodende områder fra et zcytorl 71ig-gen. I lys av den vevsspesifikke ekspresjon som observeres for zcytorl 71ig, forventes dette genområdet å gi ekspresjon spesifikk for hematopoietiske og lymfoide celler. Promoterelementer fra et zcytorl 7lig-gen kan således anvendes for å styre vevsspesifikk ekspresjon av heterologe gener i f.eks. transgene dyr eller pasienter som er behandlet med genterapi. Kloning av 5'-flankerende sekvenser forenkler også produksjonen av zcytorl 71ig-proteiner ved "genaktivering", som beskrevet i US patentskrift nr. 5 641 670. Kort beskrevet endres ekspresjonen av et endogent zcytorl 71ig-gen i en celle ved å innføre i zcytorl 71ig-lokus en DNA-konstruksjon som omfatter minst én målstyringssekvens, en regulatorisk sekvens, et ekson og et uparet spleisedonorsete. Målstyringssekvensen er en 5'-ikke-kodende zcytorl 71ig-sekvens som tillater homolog rekombinasjon mellom konstruksjonen og det endogene zcytorl 71ig-lokus, hvorved sekvensene i konstruksjonen blir operativt koblet til den endogene zcytorl71ig-kodende sekvens. På denne måten kan en endogen zcytorl 71ig-promoter erstattes eller suppleres med andre regulatoriske sekvenser for erholdelse av forsterket, vevsspesifikk eller på annet vis regulert ekspresjon.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre tilsvarende polypeptider og polynukleotider fra andre arter (ortologer). Disse artene omfatter pattedyr, fugler, amfibier, reptiler, fisk, insekter og andre vertebrat- og invertebrat-arter. Av spesiell interesse er zcytorl 71ig-polypeptider fra andre pattedyrarter, innbefattet f.eks. polypeptider fra mus, gris, sau, storfe, hund, katt, hest og andre primater. Ortologer av human zcytorl 71ig kan klones ved anvendelse av innformasjon og sammensetninger som tilveiebringes av foreliggende oppfinnelse i kombinasjon med konvensjonelle kloningsteknikker. For eksempel kan et cDNA klones ved anvendelse av mRNA erholdt fra et vev eller en celletype som uttrykker zcytorl 71ig, som beskrevet heri. Egnede mRNA-kilder kan påvises ved å probe Northern-blott med prober utformet fra sekvensene som beskrives heri. Et bibliotek fremstilles så fra mRNA fra et positivt vev eller en positiv cellelinje. Et zcytorl71ig-kodende cDNA kan så isoleres ved en rekke fremgangsmåter, f.eks. ved probing med et fullstendig eller partielt humant cDNA, eller med ett eller flere sett av degenererte prober, basert på de beskrevne sekvenser. Et cDNA kan også klones ved anvendelse av polymerasekjedereaksjonen eller PCR (Mullis, US patentskrift nr. 4 683 202) ved anvendelse av primere utformet fra den representative humane zcytorl 71ig-sekvens som beskrives heri. I ytterligere en fremgangsmåte kan cDNA-biblioteket anvendes for transformasjon eller transfeksjon av vertsceller, og ekspresjon av cDNA av interesse kan påvises med et antistoff mot zcytorl 71ig-polypeptid, ved bindingsundersøkelser eller ved aktivitets-analyser. Tilsvarende teknikker kan også anvendes for isolering av genomiske kloner.
Polynukleotidsekvensen for museortologen til zcytorl 71ig er blitt påvist og vises i SEQ ID NO: 10 og SEQ ID NO: 90, og den tilsvarende aminosyresekvens vises i SEQ ID NO: 11 og SEQ ID NO: 91. Den degenererte polynukleotidsekvens som koder for polypeptidet ifølge SEQ ID NO: 11, er vist i SEQ ID NO: 12. For aminosyresekvensen til musecytokinet zcytorl71ig kan det utledes at heliks A er definert ved aminosyrerestene 38-52, heliks B ved aminosyrerestene 85-98, heliks C ved aminosyrerestene 104-118, og heliks D ved aminosyrerestene 141-157, som vist i SEQ ID NO: 11 og SEQ ID NO: 91. Det er 31 % identitet mellom musesekven-sen og den humane sekvens over zcytorl71ig-aminosyresekvensenes fulle lengde (SEQ ID NO: 2 og SEQ ID NO: 11). Den modne sekvens for zcytorl71ig fra mus begynner angivelig ved Meti, som vist i SEQ ID NO: 11, som tilsvarer Meti, som vist i SEQ ID NO: 2, i den humane sekvens. Vevsanalyser viste at ekspresjon av zcytorl 71ig i mus forefinnes i testis, hjerne, CD90<+->celler, prostataceller, spyttkjertel og hud. Videre N-terminal sekvensanalyse av renset zcytorl 71ig fra 293T-celler viste en aminoende ved aminosyrerest 31 (Ala), som vist i SEQ ID NO: 11 og SEQ ID NO: 91, slik at det modne polypeptid bestod av sekvensen fra aminosyrerester 31 (Ala) til 163 (Cys) (som vist i SEQ ID NO: 11 og SEQ ID NO: 91).
Fagfolk vil forstå at sekvensen som beskrives i SEQ ID NO: 1, representerer ett enkelt allel av human zcytorl71ig, og at allelisk variasjon og alternativ spleising forventes å fore-komme. Alleliske varianter av denne sekvensen kan klones ved å probe cDNA-biblioteker eller genomiske biblioteker fra forskjellige individer ifølge standardfremgangsmåter. Alleliske varianter av DNA-sekvensen som vises i SEQ ID NO: 1, innbefattende varianter som inneholder tause mutasjoner og varianter hvori mutasjonene fører til endret aminosyresekvens, ligger innenfor foreliggende oppfinnelses område, og likeså proteiner som er alleliske varianter av SEQ ID NO: 2. cDNA fremstilt fra alternativt spleisede mRNA som bibeholder egenskapene til zcytorl71ig-polypeptidet, omfattes innenfor foreliggende oppfinnelses område, og likeså polypeptider som kodes av slike cDNA og mRNA. Alleliske varianter og spleisevarianter av disse sekvensene kan klones ved å probe cDNA-biblioteker eller genomiske biblioteker fra forskjellige individer eller vev ifølge standardfremgangsmåter som er kjent innen faget.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også reagenser som vil finne anvendelse i diagnostisk sammenheng. For eksempel kan zcytorl 71ig-genet, en probe som omfatter zcytorl 71ig-DNA eller -RNA eller en undersekvens av disse, anvendes for å fastslå hvorvidt zcytorl 71ig-genet foreligger på et humant kromosom, f.eks. kromosom 12, eller hvorvidt en genmutasjon har skjedd. Zcytorl 71ig er lokalisert i 12q24.31-området på kromosom 12 (eksempel 13). Påvisbare kromosomunormaliteter i zcytorl 71ig-genlokus omfatter aneuplodi, endringer i genkopitall, tap av heterozygositet (LOH), translokasjoner, insersjoner, delesjoner, restriksjonsseteendringer og rearrangeringer. Slike unormaliteter kan påvises ved anvendelse av polynukleotider ifølge foreliggende oppfinnelse ved å benytte molekylærgenetiske teknikker som restriksjonsfragmentlengdepolymorfianalyse (RFLP-analyse), kort tandemrepetisjon (STR-analyse) ved anvendelse av PCR-teknikker, og andre analyseteknikker for genetisk kobling som er kjent innen faget (Sambrook et al., ibid. ; Ausubel et. al., ibid. ; Marian, Chest, 705:255-65, 1995).
Nøyaktig kunnskap om et gens posisjon kan være nyttig for en rekke formål, innbefattet: 1) å fastslå hvorvidt en sekvens er del av et eksisterende "contig", og for erholdelse av ytterligere omgivende genetiske sekvenser i forskjellige former, f.eks. YAC, BAC eller cDNA-kloner; 2) erholdelse av et mulig kandidatgen for en arvelig sykdom som viser kobling til det samme kromosomale området; og 3) kryssreferanser til modellorganismer, f.eks. mus, noe som kan bidra til å fastslå hvilken funksjon et gitt gen kan ha.
En fagperson vil innse at 12q24-området ofte inngår i større genomiske rearrangementer, innbefattet translokasjoner, delesjoner, inversjoner og duplikasjoner, som er forbundet med forskjellige kreftformer. The Mitelman Database of Chromosomal Aberrations in Cancer, ved Cancer Genome Anatomy Project, National Institutes of Health, Bethesda, Md, som er plassert på Internett, opplister 199 tilfeller av kreft med genomiske rearrangementer som omfatter 12q24. Av disse er de fleste en del av komplekse karyotyper med andre rearrangementer, i noen tilfeller er imidlertid rearrangementet som omfatter 12q24 den eneste genomiske endring. Tatt i betraktning ekspresjonen av reseptoren for zcytorl 71ig på celler fra lymfoide og myeloide linjer, er det spesielt signifikant å bemerke at det er minst fire tilfeller av myeloid leukemi rapportert i litteraturen hvori enten translokasjon (to tilfeller: Yamagata et al., Cancer Genet. Cytogenet., 97:90-93,1997; Dunphy og Batanian, Cancer Genet. Cytogenet., 774:51-57,1999) eller duplikasjon (to tilfeller: Bonomi et al., Cancer Genet. Cytogenet., 705:75-78,1999) er den eneste genomiske endring. Dette antyder at et gen eller flere gener som ligger i 12q24-område kan være direkte involvert i den ondartede transformasjon av disse pasientenes celler. Uheldig overekspresjon av zcytorl71ig kan bidra til ondartet transformasjon ved å fremme avvikende proliferasjon av reseptorbærende celler via enten autokrine eller parakrine mekanismer. Inhibering av zcytorl 71ig-aktiviteten kan derfor tenkes å inhibere veksten av slike celler. Alternativt kan det tenkes at et genomisk rearrangement som fører til inaktivering av zcytorl 71ig-genet, kan fremme ondartet transformasjon og/eller metastase ved at de immunregulerende funksjoner til zcytorl71ig fjernes. Faktisk er et gen som undertrykker metastase ved prostatakreft, blitt kartlagt til 12q24-qter (Ichikawa et al, Asian J. Androl., 2:167-171, 2000). Dersom zcytorl 71ig er det gen i dette området som er ansvarlig for undertrykkelsen av metastase, kan zcytorl 71ig selv ha terapeutisk verdi ved behandling av kreft.
Et diagnostisk middel kan hjelpe leger til å bestemme sykdomstype og egnet behandling, eller være en hjelp ved genetisk rådgivning. Som sådanne kan anti-zcytorl71ig-antistoffene, polynukleotidene og polypeptidene ifølge oppfinnelsen også anvendes for påvisning av zcytorl 71ig-polypeptid, mRNA eller anti-zcytorl71ig-antistoffer, og således fungere som markører og anvendes direkte for påvisning av genetiske sykdommer eller kreft, som beskrevet heri, ved anvendelse av fremgangsmåter som er kjent innen faget og som beskrives heri. Videre kan zcytorl71ig-polynukleotid-prober anvendes for påvisning av unormaliteter eller genotyper forbundet med kromosom 12q24.3-delesjoner og -translokasjoner forbundet med sykdommer hos mennesket, eller andre translokasjoner forbundet med ondartet utvikling av tumorer, eller andre 12q24.3-mutasjoner som forventes å inngå i kromosomrearrangeringer ved ondartede tilstander, eller i andre kreftformer. På tilsvarende måte kan zcytorl 71ig-polynukleotidprober anvendes for å påvise unormaliteter eller genotyper forbundet med kromosom 12-trisomi og kromosomtap forbundet med sykdommer hos mennesket eller spontan abort. Således kan zcytor-171ig-polynukleotidprober anvendes for å påvise unormaliteter eller genotyper som er forbundet med disse defektene.
En fagperson vil innse at zcytorl 71ig-polynukleotidprober er spesielt anvendbare for diagnose av større kromosomale unormaliteter forbundet med tap av heterozygositet (LOH), kromosomgevinst (f.eks. trisomi), translokasjon, DNA-amplifisering og lignende. Translokasjoner innen det kromosomale lokus 12q24.3 hvori zcytorl 71ig-genet er lokalisert, vites å være forbundet med sykdom hos mennesket. For eksempel er 12q24-delesjoner og - translokasjoner, -duplikasjoner og -trisomi forbundet med kreft, som diskutert ovenfor. Siden zcytorl 71ig-genet er kartlagt til dette avgjørende området, kan zcytorl 71ig-polynukleotidprober ifølge foreliggende oppfinnelse anvendes for å påvise unormaliteter eller genotyper som er forbundet med 12q24-translokasjon, -delesjon og -trisomi og lignende, beskrevet ovenfor.
Som diskutert ovenfor, kan defekter i zcytorl 71ig-genet selv tenkes å føre til en arvelig human sykdomstilstand. Molekyler ifølge foreliggende oppfinnelse, f.eks. polypeptidene, antagonistene, agonistene, polynukleotidene og antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse, vil være en hjelp for påvisning, diagnose, forebyggelse og behandling forbundet med en genetisk zcytorl 71ig-defekt. I tillegg kan zcytorl71ig-polynukleotidprober anvendes for å påvise alleliske forskjeller mellom syke og friske individer i det kromosomale lokus for zcytorl 71ig. Som sådanne kan zcytorl71ig-sekvensene anvendes som diagnostiske midler ved rettsmedisinsk DNA-profilering.
Generelt er de diagnostiske fremgangsmåter som anvendes i genetisk koblingsanalyse for å påvise en genetisk unormalitet eller et genetisk avvik hos en pasient, kjent innen faget. Analytiske prober vil generelt være minst 20 nt lange, selv om noe kortere prober kan anvendes (f.eks. 14-17 nt). PCR-primere er minst 5 nt lange, fortrinnsvis 15 eller mer, mer foretrukket 20-30 nt. For grovanalyse av gener eller kromosomalt DNA kan en zcytorl 71ig-polynukleotidprobe omfatte et helt ekson eller mer.
Eksoner kan lett bestemmes av en fagperson ved å sammenligne zcytorl 71ig-sekvenser (SEQ ID NO: 1) med genomisk DNA for zcytorl71ig fra mus (SEQ ID NO: 76). Generelt er de diagnostiske fremgangsmåtene som anvendes i genetisk koblingsanalyse, og for påvisning av en genetisk unormalitet eller et avvik hos en pasient, kjent innen faget. De fleste diagnostiske fremgangsmåtene omfatter trinnene: (i) erholdelse av en genetisk prøve fra en muligens syk pasient, en syk pasient eller en mulig frisk bærer av et recessivt sykdomsallel; (ii) fremstilling av et første reaksjonsprodukt ved å inkubere den genetiske prøve med en zcytorl 71ig-polynukleotid-probe, hvori polynukleotidet vil hybridisere til den komplementære polynukleotidsekvens, f.eks. som ved RFLP-analyse, eller ved å inkubere den genetiske prøve med "sense"- og "antisense"-primere i en PCR-reaksjon under egnede PCR-reaksjonsbetingelser; (iii) synliggjøring av det første reaksjonsprodukt ved gelelektroforese og/eller andre kjente fremgangsmåter, f.eks. synlig-gjøring av det første reaksjonsprodukt med en zcytorl71ig-polynukleotidprobe, hvori polynukleotidet vil hybridisere til den komplementære polynukleotidsekvens fra den første reaksjon; og (iv) sammenligning av det synliggjorte første reaksjonsprodukt med et andre kontrollreaksjonsprodukt fra en genetisk prøve fra en pasient av villtype, et normalt individ eller et kontrollindivid. En forskjell mellom det første reaksjonsprodukt og kontrollreaksjonsproduktet viser en genetisk unormalitet i den syke eller muligens syke pasient, eller nærvær av en heterozygotisk, recessiv bærerfenotype for en ikke syk pasient, eller nærvær av en genetisk defekt i en tumor fra en syk pasient, eller nærvær av en genetisk unormalitet i et foster eller et preimplantasjonsembryo. For eksempel er en forskjell i restriksjonsfragmentmønster, lengde av PCR-produkter, lengde av repetitive sekvenser i det genetiske lokus for zcytorl 71ig og lignende tegn på en genetisk unormalitet, et genetisk avvik eller en allelisk forskjell sammenlignet med den normale villtypekontroll. Kontrollene kan være fra ikke sykdomsrammede familie-medlemmer eller ubeslektede individer, avhengig av analysen og tilgjengeligheten av prøver. Genetiske prøver for anvendelsen i foreliggende oppfinnelse omfatter genomisk DNA, mRNA og cDNA isolert fra ethvert vev eller en annen biologisk prøve fra en pasient, innbefattet blod, spytt, sæd, embryoceller, amnionvæske og lignende. Polynukleotidproben eller primeren kan være RNA eller DNA og vil omfatte en del av SEQ ID NO: 1, komplementet til SEQ ID NO: 1 eller en RNA-ekvivalent derav. Slike fremgangsmåter for bruk av genetisk koblingsanalyse på humane sykdomsfenotyper er vel kjent innen faget. For referanser til PCR-baserte fremgangsmåter innen diagnostikk, se generelt Mathew (red.), Protocols in Human Molecular Genetics (Humana Press, Inc., 1991); White (red.), PCR Protocols: Current Methods and Applications (Humana Press, Inc., 1993); Cotter (red.), Molecular Diagnosis of Cancer (Humana Press, Inc., 1996); Hanausek og Walaszek (red.), Tumor Marker Protocols (Humana Press, Inc. 1998); Lo (red.), Clinical Applications of PCR (Humana Press, Inc., 1998); og Meltzer (red.), PCR in Bioanalysis (Humana Press, Inc. 1998).
Mutasjoner forbundet med zcytorl 71ig-lokus kan påvises ved anvendelse av nukleinsyremolekyler ifølge foreliggende oppfinnelse ved å benytte standardfremgangsmåter for direkte mutasjonsanalyse, f.eks. restriksjonsfragmentlengdepolymorfianalyse, analyse av korte tandemrepetisjoner ved anvendelse av PCR-teknikker, amplifikasjonsrefraktorisk mutasjons-systemanalyse, påvisning av enkelttråd-konformasjonspolymorfi, RNase-kløyvingsfremgangs-måter, denaturerende gradientgelelektroforese, fluorescensassi stert feiltilpasningsanalyse og andre genetiske analyseteknikker som er kjent innen faget (se f.eks. Mathew (red.), Protocols in Human Molecular Genetics (Humana Press, Inc., 1991); Marian, Chest, 108:255 (1995); Coleman og Tsongalis, Molecular Diagnostics (Humana Press, Inc., 1996); Elles (red.), Molecular Diagnosis of Genetic Diseases (Humana Press, Inc. 1996); Landegren (red.), Laboratory Protocols for Mutation Detection (Oxford University Press, 1996); Birren et al.
(red.), Genome Analysis, vol. 2: Detecting Genes (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1998); Dracopoli et al. (red.), Current Protocols in Human Genetics (John Wiley & Sons 1998); og Richards og Ward, "Molecular Diagnostic Testing," i Principles of Molecular Medicine. s. 83-88 (Humana Press, Inc., 1998). Direkte analyse av et zcytorl 71ig-gen for en mutasjon kan utføres ved å anvende genomisk DNA fra et individ. Fremgangsmåter for amplifisering av genomisk
DNA, f.eks. erholdt fra lymfocytter fra perifert blod, er vel kjent blant fagfolk (se f.eks. Dracopoli et al. (red.), Current Protocols in Human Genetics, s. 7.1.6-7.1.7 (John Wiley & Sons 1998)).
Posisjon til introner i muse-zcytorl71ig-genet ble bestemt ved påvisning av
genomiske kloner, fulgt av analyse av intron-/eksonovergangene. Genomisk DNA fra mus er vist i SEQ ID NO: 76. Ved henvisning til SEQ ID NO: 76 er tre kodende eksoner separert av introner åpenbare: Det første kodende ekson ligger mellom nukleotider 1104-1119 i SEQ ID NO: 76, det andre ekson mellom nukleotider 1300-1451 i SEQ ID NO: 76, og det tredje ekson mellom nukleotider 2411-2998 i SEQ ID NO: 76.
I forskjellige utførelser av oppfinnelsen kan isolerte zcytorl71ig-kodende nukleinsyremolekyler hybridisere under stringente betingelser til nukleinsyremolekyler med nukleotidsekvensen ifølge SEQ ID NO: 1, til nukleinsyremolekyler med nukleotidsekvensen fra nukleotid 28 til 519 i SEQ ID NO: 1, eller til nukleinsyremolekyler med en nukleotidsekvens som er komplementær til SEQ ID NO: 1. Generelt utvelges stringente betingelser slik at de er ca. 5 °C lavere enn smeltepunktet (Tm) for den spesifikke sekvens ved definert ionestyrke og pH. Tm er den temperatur (under definert ionestyrke og pH) hvor 50 % av målsekvensen hybridiserer til en perfekt tilpasset probe.
Et par av nukleinsyremolekyler, f.eks. DNA-DNA, RNA-RNA og DNA-RNA, kan hybridisere dersom nukleotidsekvensene har en viss grad av komplementaritet. Hybrider kan tåle feiltilpassede basepar i dobbeltheliksen, men hybridens stabilitet påvirkes av graden av feiltilpasning. Tm for den feiltilpassede hybrid avtar med 1 °C for hver 1-1,5 % feiltilpassede basepar. Variasjon av stringensen under hybridiseringsbetingelsene tillater kontroll over graden av feiltilpasning som vil foreligge i hybriden. Stringensgraden øker med økende hybridiseringstemperatur og avtakende ionestyrke i hybridiseringsbufferen.
Det ligger godt innenfor fagpersonens kunnskapsområde å tilpasse disse betingelsene for anvendelse med en gitt polynukleotidhybrid. Tm for en gitt målsekvens er den temperatur (under definerte betingelser) hvor 50 % av målsekvensen vil hybridisere til en perfekt tilpasset probesekvens. Betingelsene som påvirker Tm, omfatter størrelse og baseparinnhold i polynukleotidproben, ionestyrken i hybridiseringsløsningen og nærvær av destabiliserende midler i hybridiseringsløsningen. En rekke ligninger for beregning av Tm er kjent innen faget og er spesifikke for DNA-, RNA- og DNA-RNA-hybrider og polynukleotidprobesekvenser av forskjellig lengde (se f.eks. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual,
2. utgave, Cold Spring Harbor Press, 1989); Ausubel et al. (red.), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Inc., 1987); Berger og Kimmel (red.), Guide to Molecular
Cloning Techniques (Academic Press, Inc., 1987); og Wetmur, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol., 26:221 (1990)). Programvare for Sekvensanalyse, f.eks. OLIGO 6.0 (LSR; Long Lake, MN) og Primer Premier 4.0 (Premier Biosoft International, Palo Alto, CA), så vel som steder på Internett, er tilgjengelige verktøy for analyse av en gitt sekvens og beregning av Tm basert på bruker-definerte kriterier. Slike programmer kan også analysere en gitt sekvens under definerte betingelser og påvise egnede probesekvenser. Typisk utføres hybridisering av lengre poly-nukleotidsekvenser, > 50 basepar, ved temperaturer på ca. 20-25 °C under den beregnede Tm. For mindre prober, < 50 basepar, utføres hybridiseringen typisk ved Tm eller 5-10 °C under den beregnede Tm. Dette tillater maksimal hybridiseringshastighet for DNA-DNA- og DNA-RNA-hybrider.
Etter hybridiseringen kan nukleinsyremolekylene vaskes for å fjerne ikke-hybridiserte nukleinsyremolekyler under stringente betingelser eller under svært stringente betingelser. Typiske stringente vaskebetingelser omfatter vask i en løsning av 0,5 x-2 x SSC, med 0,1 % natriumdodecylsulfat (SDS) ved 55-65 °C. Det vil si at nukleinsyremolekyler som koder for en zcytorl71ig-polypeptidvariant, hybridiserer med et nukleinsyremolekyl med nukleotidsekvensen ifølge SEQ ID NO: 1 (eller dens komplement) under stringente vaskebetingelser, hvor stringensen under vasken tilsvarer 0,5 x-2 x SSC, med 0,1 % SDS ved 55-65 °C, innbefattende 0,5 x SSC med 0,1 % SDS ved 55 °C, eller 2 x SSC med 0,1 % SDS ved 65 °C. En fagperson kan lett utforme ekvivalente betingelser ved f.eks. å erstatte SSC med SSPE i vaskeløsningen.
Typiske svært stringente vaskebetingelser omfatter vask i en løsning av 0,1 x-0,2 x SSC, med 0,1 % natriumdodecylsulfat (SDS) ved 50-65 °C. Med andre ord hybridiserer nukleinsyremolekyler som koder for en zcytorl 71ig-polypeptidvariant med et nukleinsyremolekyl med nukleotidsekvensen ifølge SEQ ID NO: 1 (eller dens komplement) under svært stringente vaskebetingelser, hvor vaskestringensen tilsvarer 0,1 x-0,2 x SSC, med 0,1 % SDS ved 50-65 °C, innbefattende 0,1 x SSC med 0,1 % SDS ved 50 °C, eller 0,2 x SSC med 0,1 % SDS ved 65 °C.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også isolerte zcytorl 71ig-polypeptider som har en sekvens som i det vesentlige er identisk med polypeptidene ifølge SEQ ID NO: 2 eller deres ortologer. Begrepet "i det vesentlige identisk sekvens" anvendes heri for å betegne polypeptider som omfatter minst 70 %, minst 80 %, minst 90 %, minst 95 %, minst 96 %, minst 97 %, minst 98 %, minst 99 % eller mer enn 99 % sekvensidentitet med sekvensene vist i SEQ ID NO: 2 eller deres ortologer. Foreliggende oppfinnelse omfatter også polypeptider som omfatter en aminosyresekvens som har minst 70 %, minst 80 %, minst 90 %, minst 95 %, minst 96 %, minst 97 %, minst 98 %, minst 99 % eller mer enn 99 % sekvensidentitet med sekvensen fra aminosyrerest 1 til 162 eller fra 33 til 162 i SEQ ID NO: 2. Foreliggende oppfinnelse omfatter videre nukleinsyremolekyler som koder for slike polypeptider. Fremgangsmåter for å bestemme prosent identitet er beskrevet nedenfor.
Foreliggende oppfinnelse omfatter også zcytorl71ig-nukleinsyremolekylvarianter som kan påvises ved anvendelse av to kriterier: en bestemmelse av likheten mellom det kodede polypeptid og aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO: 2, og/eller en hybridiseringsanalyse som beskrevet ovenfor. Slike zcytorl 71ig-varianter omfatter nukleinsyremolekyler som: (1) hybridiserer med et nukleinsyremolekyl med nukleotidsekvensen ifølge SEQ ID NO: 1 (eller dennes komplement) under stringente vaskebetingelser, hvor vaskestringensen tilsvarer 0,5 x-2 x SSC, med 0,1 % SDS ved 55-65 °C; eller (2) koder for et polypeptid med minst 70 %, minst 80
%, minst 90 %, minst 95 %, minst 96 %, minst 97 %, minst 98 %, minst 99 % eller mer enn 99 % identitet med aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO: 2. Alternativt kan zcytorl 71ig-varianter karakteriseres som nukleinsyremolekyler som: (1) hybridiserer med et nukleinsyremolekyl med nukleotidsekvensen ifølge SEQ ID NO: 1 (eller dens komplement) under svært stringente vaskebetingelser, hvor vaskestringensen tilsvarer 0,1 x-0,2 x SSC, med 0,1 % SDS ved 50-65 °C; og (2) koder for et polypeptid med minst 70 %, minst 80 %, minst 90 %, minst 95 %, minst 96 %, minst 97 %, minst 98 %, minst 99 % eller mer enn 99 % sekvensidentitet med aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO: 2.
Prosent sekvensidentitet bestemmes ved konvensjonelle fremgangsmåter. Se f.eks. Altschul et al., Bull. Math. Bio., 45:603 (1986); og Henikoff og Henikoff, Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 59:10915 (1992). Kort beskrevet sammenstilles to aminosyresekvenser slik at poengsummen for sammenstillingen optimaliseres ved anvendelse av en gapåpningsstraff på 10, en gaputvidelsesstraff på 1 og substitusjonsmatrisen "BLOSUM62" i Henikoff og Henikoff ( ibid.), som vist i tabell 4 (aminosyrene er angitt med standard enbokstavkoder).
Fagfolk vil vite at det finnes mange tilgjengelige etablerte algoritmer for sammenstilling av to aminosyresekvenser. Likhetssøkalgoritmen "FASTA" utviklet av Pearson og Lipman er en egnet proteinsammenstillingsfremgangsmåte for å undersøke graden av identitet mellom en aminosyresekvens beskrevet heri og aminosyresekvensen til en mulig zcytorl 71ig-variant. FASTA-algoritmen beskrives av Pearson og Lipman, Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 55:2444 (1988), og av Pearson, Meth. Enzymol., 755:63 (1990).
Kort beskrevet bestemmer FASTA først sekvenslikheten ved å identifisere områder som er felles for spørresekvensen (f.eks. SEQ ID NO: 2) og en analysesekvens som enten har den høyeste tetthet av identiteter (dersom variabelen ktup er 1) eller par av identiteter (dersom ktup = 2), uten å ta i betraktning konservative aminosyresubstitusjoner, -innføyelser eller -delesjoner. De ti områdene med den høyeste tetthet av identiteter analyseres så på nytt ved å sammenligne likheten mellom alle parede aminosyrer ved anvendelse av en aminosyresubsti-tusjonsmatrise, og områdenes ender "trimmes", slik at de bare omfatter aminosyrerester som bidrar til den høyeste poengsum. Dersom det er flere områder med poengsummer som er høyere enn "grense"-verdien (beregnet ved en på forhånd bestemt formel basert på sekvensens lengde og ktup-verdien), undersøkes de trimmede utgangsområdene for å fastslå hvorvidt områdene kan sammenkobles slik at det dannes en tilnærmet sammenstilling med gap. Endelig sammenstilles områdene med den høyeste poengsum i de to aminosyresekvensene ved anvendelse av en modifikasjon avNeedleman-Wunsch-Sellers-algoritmen (Needleman og Wunsch, J. Mol. Biol., 45:444 (1970); Sellers, SIAM J. Appl. Math., 2(5:787 (1974)), som muliggjør aminosyre-innføyelser og -delesjoner. Foretrukne parametere for FASTA-analyse er: ktup = 1, gapåpningsstraff = 10, gaputvidelsesstraff = 1 og substitusjonsmatrisen = BLOSUM62. Disse parametere kan innføres i et FASTA-program ved å modifisere poengmatrisefilen ("SMATRIX"), som forklart i etterord 2 til Pearson, Meth. Enzymol., 753:63 (1990).
FASTA kan også anvendes for å bestemme sekvensidentiteten mellom nukleinsyremolekyler ved anvendelse av en brøk, som beskrevet ovenfor. For nukleotidsekvens-sammenligninger kan ktup-verdien variere mellom 1 og 6, fortrinnsvis mellom 3 og 6, mest foretrukket 3, med standardverdier brukt for andre parametere.
zcytorl 71ig-polypeptidvarianter eller polypeptider med i det vesentlige identisk sekvens særpreges ved at de har én eller flere aminosyresubstitusjoner, -delesjoner eller -addi-sjoner. Disse endringene er fortrinnsvis mindre av natur, det vil si konservative aminosyresubstitusjoner (som vist i tabell 5 nedenfor) og andre substitusjoner som ikke i vesentlig grad påvirker polypeptidets folding eller aktivitet, små delesjoner, typisk fra 1 til ca. 30 aminosyrer, og amino- eller karboksylterminale forlengelser, f.eks. en aminoterminal metioninrest, et kort linkerpeptid på opptil ca. 20-25 aminosyrerester eller en affinitetsmerkelapp. Foreliggende oppfinnelse omfatter således polypeptider på fra ca. 108 til ca. 216 aminosyrerester, som omfatter en sekvens som er minst 70 %, minst 80 %, minst 90 %, minst 95 %, minst 96 %, minst 97 %, minst 98 %, minst 99 % eller mer enn 99 % identisk med det tilsvarende området i SEQ ID NO: 2. Polypeptider som omfatter affinitetsmerkelapper, kan videre omfatte et proteolytisk kløyvingssete mellom zcytorl71ig-polypeptidet og affinitets-merkelappen. Foretrukne seter av denne typen omfatter trombinkløyvingsseter og faktor Xa-kløyvingsseter.
Bestemmelse av aminosyrerester som omfatter områder eller domener som er avgjørende for opprettholdelse av strukturell integritet, kan utføres. Innen disse områdene kan man identifisere spesifikke aminosyrerester som vil være mer eller mindre tolerante overfor endring, og opprettholde molekylets totale tertiærstruktur. Fremgangsmåter for analyse av sekvensstruktur omfatter sammenstilling av flere sekvenser med høy aminosyre- eller nukleotididentitet, sekundærstrukturtilbøyelighet, binære mønstre, komplementær pakking og begravde polare interaksjoner (Barton, Current Opin. Struct. Biol., 5:372-376,1995; og Cordes et al., Current Opin. Struct. Biol., 6:3-10,1996). Generelt vil bestemmelse av struktur ved utføring av modifikasjoner i molekyler eller påvisning av spesifikke fragmenter ledsages av en evaluering av de modifiserte molekylenes aktivitet.
Aminosyresekvensendringer utføres i zcytorl 71ig-polypeptider, slik at man minimaliserer forstyrrelsen av den høyere ordens struktur som er avgjørende for biologisk aktivitet. Hvor zcytorl 71ig-polypeptidet omfatter én eller flere helikser, vil f.eks. endringer i aminosyrerester utføres slik at man ikke forstyrrer heliksgeometrien og andre bestanddeler i molekylet hvor konformasjonsendringer fjerner en avgjørende funksjon, f.eks. binding av molekylet til dets bindingspartnere, f.eks. A- og D-heliksene, aminosyrerestene 43 (Glu), 44 (Glu) og 136 (Phe) i SEQ ID NO: 2. Virkningen av aminosyresekvensendringer kan f.eks. forutsies ved datamaskinbasert modellering, som beskrevet ovenfor, eller bestemmes ved analyse av krystall strukturen (se f.eks. Lapthorn et al., Nat. Struct. Biol., 2:266-268, 1995). I andre teknikker som er vel kjent innen faget, sammenlignes folding av en protein variant med foldingen av et standardmolekyl (f.eks. det native protein). For eksempel kan man sammenligne cystein-mønsteret i en variant og standardmolekyler. Massespektrometri og kjemisk modifikasjon ved anvendelse av reduksjon og alkylering ligger til grunn for fremgangsmåter for bestemmelse av cysteinrester som er forbundet med disulfidbindinger, eller som ikke deltar i slike assosiasjoner (Bean et al., Anal. Biochem., 207:216-226,1992; Gray, Protein Sei., 2:1732-1748,1993; og Patterson et al., Anal. Chem., 66:3727-3732,1994). Det antas generelt at dersom et modifisert molekyl ikke har det samme cysteinmønster som standardmolekylet, vil foldingen påvirkes. En annen velkjent og akseptert fremgangsmåte for måling av folding er sirkulær dikroisme (CD). Måling og sammenligning av CD-spektrene som erholdes fra et modifisert molekyl og et standardmolekyl, er rutinemessig (Johnson, Proteins, 7:205-214,1990). Krystallografi er en annen velkjent fremgangsmåte for analyse av folding og struktur. Kjernemagnetisk resonans (NMR), peptidkartlegging etter kløyving og epitopkartlegging er også kjente fremgangsmåter for analyse av folding og strukturelle likheter mellom proteiner og polypeptider (Schaanan et al., Science, 257:961-964,1992).
En Hopp/Woods-hydrofilisitetsprofil for zcytorl 71ig-proteinsekvensen, som vist i SEQ ID NO: 2, kan fremstilles (Hopp et al., Proe. Nati. Acad. Sei., 75:3824-3828,1981; Hopp, J. Immun. Meth., 55:1-18,1986; og Triquier et al., Protein Engineering, 77:153-169,1998). Profilen bygger på et glidende vindu som omfatter seks aminosyrerester. Begravde G-, S- og T-rester og eksponerte H-, Y- og W-rester ble ignorert. I human zcytorl 71ig omfatter f.eks. hydrofile områder aminosyrerestene 54-59 i SEQ ID NO: 2, aminosyrerestene 129-134 i SEQ ID NO: 2, aminosyrerestene 53-58 i SEQ ID NO: 2, aminosyrerestene 34-40 i SEQ ID NO: 2 og aminosyrerestene 33-38 i SEQ ID NO: 2.1 zcytorl71ig fra mus omfatter f.eks. hydrofile områder aminosyrerestene 34-39 i SEQ ID NO: 11, aminosyrerestene 46-51 i SEQ ID NO: 11, aminosyrerestene 131-136 i SEQ ID NO: 11, aminosyrerestene 158-163 i SEQ ID NO: 11 og aminosyrerestene 157-162 i SEQ ID NO: 11.
Fagfolk vil innse at hydrofilisitet eller hydrofobisitet vil tas i betraktning ved innføring av modifikasjoner i aminosyresekvensen til et zcytorl 71ig-polypeptid, slik at den totale struktur og den biologiske profil ikke forstyrres. Av spesiell interesse for erstatning er hydrofobe aminosyrerester utvalgt fra gruppen bestående av Val, Leu og Ile, eller gruppen bestående av Met, Gly, Ser, Ala, Tyr og Trp. Aminosyrerester som er tolerante overfor substitusjon, kan f.eks. omfatte Val, Leu og Ile eller gruppen bestående av Met, Gly, Ser, Ala, Tyr og Trp, som vist i SEQ ID NO: 2. Konserverte cysteinrester i posisjoner i SEQ ID NO: 2 og SEQ ID NO: 11 vil være relativt lite tolerante overfor substitusjon.
Hvilke aminosyrer som er avgjørende, kan også utledes ved å sammenligne sekvensen til IL-3, Lif, IL-12, IL-15, IL-2, IL-4 og GM-CSF med zcytorl71ig. Ved anvendelse av fremgangsmåter som "FASTA"-analysen som er beskrevet tidligere, påvises områder med høy likhet i en proteinfamilie og anvendes for å analysere aminosyresekvensen for konserverte områder. En alternativ tilnærming for påvisning av en zcytorl71ig-polynukleotidvariant basert på strukturen er å fastslå hvorvidt et nukleinsyremolekyl som koder for en mulig zcytorl 71ig-genvariant, kan hybridisere til et nukleinsyremolekyl med nukleotidsekvensen ifølge SEQ ID NO: 1, som diskutert ovenfor.
Andre fremgangsmåter for påvisning av avgjørende aminosyrer i polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse er fremgangsmåter som er kjent innen faget, f.eks. setestyrt mutagenese eller alaninskannende mutagenese (Cunningham og Wells, Science, 244:1081
(1989); Bass et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 55:4498 (1991); Coombs og Corey, "Site-Directed Mutagenesis and Protein Engineering" i Proteins: Analysis and Design, Angeletti (red.), s. 259-311 (Academic Press, Inc., 1998)). I denne siste teknikken innføres enkeltvise alaninmutasjoner i hver aminosyrerest i molekylet, og de resulterende mutante molekylene analyseres for biologisk eller biokjemisk aktivitet, som beskrevet nedenfor, for påvisning av aminosyrerester som er avgjørende for molekylets aktivitet. Se også Hilton et al., J. Biol. Chem., 277:4699(1996). Foreliggende oppfinnelse omfatter også funksjonelle fragmenter av zcytorl 71ig-polypeptider og nukleinsyremolekyler som koder for slike funksjonelle fragmenter. En "funksjonell" zcytorl 71ig eller et fragment derav, som definert heri, særpreges ved sin proliferative eller differensierende aktivitet, ved sin evne til å indusere eller inhibere spesialiserte cellefunksjoner, eller ved sin evne til å bindes spesifikt til et anti-zcytorl71ig-antistoff, et zcytorl 71ig-reseptorantistoff eller til en zcytorl 7-, WSX-1- eller OSMRbeta-reseptor, eller til heterodimerer (f.eks. zcytorl 7/WSX-l eller zcytorl 7/OSMRbeta) eller multimerer (f.eks. zcytorl7/WSX-1/OSMRbeta) av disse reseptorene (enten løselige eller immobiliserte). Som beskrevet tidligere heri, særpreges zcytorl 71ig ved en fireheliksbunt-struktur som omfatter heliks A (aminosyrerestene 38-52), heliks B (aminosyrerestene 83-98), heliks C (aminosyrerestene 104-117) og heliks B (aminosyrerestene 137-152), som vist i SEQ ID NO: 2. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer således videre fusjonsproteiner som omfatter: (a) polypeptidmolekyler som omfatter én eller flere av heliksene beskrevet ovenfor, og (b) funksjonelle fragmenter som omfatter én eller flere av disse heliksene. Den andre polypeptiddelen av fusjonsproteinet kan stamme fra et annet fireheliksbunt-cytokin, f.eks. IL-15, IL-2, IL-4 og GM-CSF, eller fra et ikke-nativt og/eller et ubeslektet sekretorisk signalpeptid som letter sekresjonen av fusjonsproteinet. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer således fusjonsproteiner som omfatter minst fire polypeptider, hvori rekkefølgen av polypeptider fra N-enden til C-enden er: et første polypeptid som omfatter aminosyrer utvalgt fra gruppen bestående av: (a) IL-2-heliks A, aminosyrerestene 27-48 i SEQ ID NO: 162; (b) IL-3-heliks A, aminosyrerestene 35-45 i SEQ ID NO: 102; (c) IL-4-heliks A, aminosyrerestene 30-42 i SEQ ID NO: 164; (d) GM-CSF-heliks A, aminosyrerestene 30-44 i SEQ ID NO: 166; og (e) aminosyrerestene 38-52 i SEQ ID NO: 2; en første avstandsgiver som omfatter 6-27 aminosyrer; og et andre polypeptid som omfatter aminosyrerester utvalgt fra gruppen bestående av: (a) IL-2-heliks B, aminosyrerestene ifølge SEQ ID NO: 168; (b) IL-4-heliks B, aminosyrerestene 65-83 i SEQ ID NO: 164; (c) IL-3-heliks B, aminosyrerestene 73-86 i SEQ ID NO: 102; (d) GM-CSF-heliks B, aminosyrerestene 72-81 i SEQ ID NO: 166; og (e) aminosyrerestene 83-98 i SEQ ID NO: 2; en andre avstandsgiver bestående av 5-11 aminosyrerester; et tredje polypeptid som omfatter en sekvens av aminosyrerester utvalgt fra gruppen bestående av: (a) IL-2-heliks C, aminosyrerestene 102-116 i SEQ ID NO: 162; (b) IL-4-heliks C, aminosyrerestene 94-118 i SEQ ID NO: 164; (c) IL-3-heliks C, aminosyrerestene 91-103 i SEQ ID NO: 102; (d) GM-CSF-heliks C, aminosyrerestene 85-103 i SEQ ID NO: 166; og (e) aminosyrerestene 104-117 i SEQ ID NO: 2; en tredje avstandsgiver bestående av 3-29 aminosyrerester; og et fjerde polypeptid som omfatter aminosyrerester utvalgt fra gruppen bestående av: (a) IL-2-heliks D, aminosyrerestene 134-149 i SEQ ID NO: 162; (b) IL-3-heliks D, aminosyrerestene 123-141 i SEQ ID NO: 102; (c) IL-4-heliks D, aminosyrerestene 133-151 i SEQ ID NO: 164; (d) GM-CSF-heliks D, aminosyrerestene 120-131 i SEQ ID NO: 166; og (e) aminosyrerestene 137-152 i SEQ ID NO: 2, hvori minst ett av de fire polypeptidene er fra zcytorl 71ig. I andre utførelser vil de avstandsgivende peptider være utvalgt blant A/B-løkken, B/C-løkken og C/D-løkken i zcytorl71ig og IL-3, som vist i tabell 1. Rutinemessige delesjonsanalyser av nukleinsyremolekyler kan utføres for å erholde funksjonelle fragmenter av et nukleinsyremolekyl som koder for et zcytorl 71ig-polypeptid. Som en illustrasjon kan DNA-molekyler med nukleotidsekvensen ifølge SEQ ID NO: 1 eller fragmenter derav kuttes med Æa/5I-nuklease for erholdelse av en serie av overlappende delesjoner. Disse DNA-fragmentene innsettes så i ekspresjonsvektorer i korrekt leseramme, og de uttrykte polypeptidene isoleres og analyseres for zcytorl 71ig-aktivitet eller for evnen til å bindes til anti-zcytorl71ig-antistoffer eller til zcytorl 7-reseptor. Et alternativ til eksonukleasekutting er å anvende oligonukleotidstyrt mutagenese for innføring av delesjoner eller stoppkodoner som gir produksjon av et ønsket zcytorl 71ig-fragment. Alternativt kan spesielle fragmenter av zcytorl 71ig-genet syntetiseres ved anvendelse av polymerasekjedereaksjonen. Standardfremgangsmåter for påvisning av funksjonelle domener er vel kjent blant fagfolk. For eksempel er undersøkelser over avkorting i én eller begge ender av interferoner blitt oppsummert av Horisberger og Di Marco, Pharmac. Ther., 66:507 (1995). Videre beskrives standardteknikker for funksjonell analyse av proteiner f.eks. av Treuter et al., Molec. Gen. Genet., 240:113 (1993); Content et al., "Expression and preliminary deletion analysis of the 42 kDa 2-5A synthetase induced by human interferon", i Biological Interferon Systems, Proceedings of ISIR-TNO Meeting on Interferon Systems, Cantell (red.), s. 65-72 (Nijhoff 1987); Herschman, "The EGF Receptor", i Control of Animal Cell Proliferation, 1, Boynton et al. (red.), s. 169-199 (Academic Press 1985); Coumailleau et al., J. Biol. Chem., 270:29270
(1995); Fukunaga et al., J. Biol. Chem., 270:25291 (1995); Yamaguchi et al., Biochem. Pharmacol., 50:1295 (1995); og Meisel et al., Plant Molec. Biol., 50:1 (1996).
Flere aminosyresubstitusjoner kan innføres og analyseres ved anvendelse av kjente fremgangsmåter for mutagenese og analyse, f.eks. fremgangsmåtene beskrevet av Reidhaar-Olson og Sauer (Science, 241:53 (1988)), eller Bowie og Sauer (Proe. Nati. Acad. Sei. USA, §6:2152 (1989)). Kort beskrevet beskriver disse forfatterne fremgangsmåter for samtidig rando-misering av to eller flere posisjoner i et polypeptid, seleksjon av funksjonelle polypeptider og sekvensering av de mutageniserte polypeptidene for å bestemme spekteret av tillatte substitusjoner i hver posisjon. Andre fremgangsmåter som kan anvendes, omfatter bakteriofagfremvisning (f.eks. Lowman et al., Biochem, 50:10832 (1991); Ladner et al., US patentskrift nr. 5 223 409; Huse, internasjonal patentpublikasjon nr. WO 92/06204) og områdestyrt mutagenese (Derbyshire et al., Gene, 46:145, 1986; og Ner et al, DNA, 7:127 (1988)).
Varianter av de beskrevne zcytorl 71ig-nukleotid- og -polypeptidsekvenser kan også frembringes ved DNA-stokking, som beskrevet av Stemmer, Nature, 570:389 (1994); Stemmer, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 97:10747 (1994); og internasjonal patentpublikasjon nr. WO 97/20078. Kort beskrevet fremstilles DNA-molekylvarianter ved homolog rekombinasjon in vitro ved tilfeldig fragmentering av et utgangs-DNA, fulgt av gjenoppbygging ved anvendelse av PCR, noe som fører til tilfeldig innførte punktmutasjoner. Denne teknikken kan modifiseres ved å anvende en familie av utgangs-DNA-molekyler, f.eks. alleliske varianter eller DNA-molekyler fra forskjellige arter, for å innføre ytterligere variabilitet i prosessen. Seleksjon eller gjennom-søking etter den ønskede aktivitet, fulgt av ytterligere gjentakelser med mutagenese og analyse, gir en hurtig "evolusjon" av sekvenser ved at ønskede mutasjoner selekteres samtidig som det selekteres mot skadelige endringer.
Mutagenesefremgangsmåter som beskrives heri, kan kombineres med automatiske gjennomsøkingsfremgangsmåte med høy gjennomstrømning for påvisning av aktiviteten av klonede, mutageniserte polypeptider i vertsceller. Mutageniserte DNA-molekyler som koder for biologisk aktive polypeptider, for polypeptider som bindes til anti-zcytorl 71ig-antistoffer eller til løselig zcytorl 7-reseptor, løselig WSX-1 eller løselig OSMR, eller til heterodimerer eller multimerer av disse løselige reseptorene, som beskrevet heri, kan gjenvinnes fra vertscellene og sekvenseres hurtig ved anvendelse av moderne utstyr. Disse fremgangsmåtene tillater hurtig bestemmelse av betydningen av de enkelte aminosyrerestene i et polypeptid av interesse, og kan benyttes på polypeptider med ukjent struktur.
I tillegg kan proteinene ifølge foreliggende oppfinnelse (eller polypeptidfragmenter av disse) kobles til andre bioaktive molekyler, fortrinnsvis til andre cytokiner, slik at man erholder flerfunksjonelle molekyler. For eksempel kan én eller flere helikser fra zcytorl 71ig kobles til andre cytokiner for å forsterke deres biologiske egenskaper eller forbedre produksjons-effektiviteten.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer således en serie av nye hybridmolekyler hvor et segment som koder for én eller flere av heliksene i zcytorl 71ig, er fusjonert til et annet polypeptid. Fusjonen utføres fortrinnsvis ved spleising på DNA-nivå for å oppnå ekspresjon av kimære molekyler i rekombinante produksjonssystemer. De resulterende molekyler analyseres så for egenskaper som forbedret løselighet, forbedret stabilitet, forlenget halveringstid for fjerning, forbedret ekspresjon og forbedret sekresjonsnivå, samt farmakodynamiske egenskaper. Slike hybridmolekyler kan videre omfatte ytterligere aminosyrerester (f.eks. en polypeptidlinker) mellom proteinene eller polypeptidene de består av.
Ikke-naturlig forekommende aminosyrer omfatter trans-3-metylprolin, 2,4-metano-prolin, cis-4-hydroksyprolin, trans-4-hydroksyprolin, N-metylglysin, allotreonin, metyltreonin, hydroksyetylcystein, hydroksyetylhomocystein, nitroglutamin, homoglutamin, pipekolsyre, tiazolidinkarboksylsyre, dehydroprolin, 3- og 4-metylprolin, 3,3-dimetylprolin, tert.leucin, norvalin, 2-azafenylalanin, 3-azafenylalanin, 4-azafenylalanin og 4-fluorfenylalanin. Flere fremgangsmåter er kjent innen faget for innføring av ikke-naturlig forekommende aminosyrerester i proteiner. For eksempel kan det benyttes et in v/frø-system hvori "nonsense"-mutasjoner undertrykkes ved anvendelse av kjemisk aminoacylerte suppressor-tRNA. Fremgangsmåter for syntese av aminosyrer og aminoacylering av tRNA er kjent innen faget. Transkripsjon og trans-lasjon av plasmider som inneholder "nonsense"-mutasjoner, utføres typisk i et cellefritt system som omfatter en S30-ekstrakt fra E. coli og kommersielt tilgjengelige enzymer og andre reagenser. Proteinene renses ved kromatografi. Se f.eks. Robertson et al., J. Am. Chem. Soc, 773:2722
(1991); Ellman et al., Methods Enzymol., 202:301 (1991); Chung et al., Science, 259:806-9
(1993); og Chung et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 90:10145-9 (1993).
I en andre fremgangsmåte utføres translasjonen i Xenopus- ooc<y>Uer ved mikroinjeksjon av mutert mRNA og kjemisk aminoacylerte suppressor-tRNA (Turcatti et al., J. Biol. Chem., 277:1991 (1996)). I en tredje fremgangsmåte dyrkes E. co//-celler i fravær av en naturlig aminosyre som skal erstattes (f.eks. fenylalanin) og i nærvær av den eller de ønskede, ikke-naturlig forekommende aminosyrer (f.eks. 2-azafenylalanin, 3-azafenylalanin, 4-azafenylalanin eller 4-fluorfenylalanin). Den ikke-naturlig forekommende aminosyre innføres i proteinet i stedet for dens naturlige motstykke. Se Koide et al., Biochem., 33:7470 (1994). Naturlig forekommende aminosyrerester kan overføres til ikke-naturlig forekommende molekyler ved kjemisk modifisering in vitro. Kjemisk modifisering kan kombineres med setestyrt mutagenese for ytterligere å utvide substitusjonsområdet (Wynn og Richards, Protein Sei., 2:395 (1993). Det kan være fordelaktig å stabilisere zcytorl 71ig slik at molekylets halveringstid forlenges, særlig for å utvide den metabolske virketid i aktiv tilstand. For å oppnå forlenget halveringstid kan zcytorl71ig-molekyler modifiseres kjemisk ved anvendelse av fremgangsmåter som beskrives heri. Pegylering er én vanlig brukt fremgangsmåte som er blitt vist å forlenge halveringstiden i plasma, øke løseligheten og redusere antigenisitet og immunogenisitet (Nucci et al., Advanced Drug Delivery Reviews, 6:133-155,1991; og Lu et al., Int. J. Peptide Protein Res., 43:127-138, 1994).
Et begrenset antall ikke-konservative aminosyrer, aminosyrer som ikke kodes av den genetiske kode, ikke-naturlig forekommende aminosyrer og unaturlige aminosyrer kan erstatte aminosyrerester i zcytorl 71ig.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også polypeptidfragmenter eller peptider som omfatter en epitopbærende del av et zcytorl 71ig-polypeptid, som beskrevet heri. Slike fragmenter eller peptider kan omfatte en "immunogen epitop", som er en del av et protein som utløser en antistoffrespons når hele proteinet anvendes som immunogen. Immunogene epitopbærende peptider kan påvises ved anvendelse av standardfremgangsmåter (se f.eks. Geysen et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 57:3998 (1983)).
I motsetning til dette kan polypeptidfragmenter eller peptider omfatte en "antigen epitop", som er et område i et proteinmolekyl som et antistoff kan bindes spesifikt til. Visse epitoper består av lineære eller kontinuerlige strekk av aminosyrer, og antigenisiteten til en slik epitop forstyrres ikke av denaturerende midler. Det er kjent innen faget at relativt korte syntetiske peptider som kan etterligne epitoper i et protein kan anvendes for å stimulere dannelsen av antistoffer mot proteinet (se f.eks. Sutcliffe et al., Science, 279:660 (1983)). Følgelig er antigene, epitopbærende peptider og polypeptider ifølge foreliggende oppfinnelse anvendbare for utløsning av antistoffer (f.eks. nøytraliserende antistoffer) som bindes til polypeptidene som beskrives heri. Hopp/Woods-hydrofilisitetsprofiler kan anvendes for å påvise de områder som har det høyeste antigenpotensialet (Hopp et al., 1981, ibid. ; og Hopp, 1986, ibid.). I human zcytorl 71ig omfatter f.eks. de hydrofile områdene aminosyrerestene 54-59 i SEQ ID NO: 2, aminosyrerestene 129-134 i SEQ ID NO: 2, aminosyrerestene 53-58 i SEQ ID NO: 2, aminosyrerestene 35-40 i SEQ ID NO: 2 og aminosyrerestene 33-38 i SEQ ID NO: 2.
I zcytorl71ig fra mus omfatter de hydrofile områdene f.eks. aminosyrerestene 34-39 i SEQ ID NO: 11, aminosyrerestene 46-51 i SEQ ID NO: 11, aminosyrerestene 131-136 i SEQ ID NO: 11, aminosyrerestene 158-163 i SEQ ID NO: 11 og aminosyrerestene 157-162 i SEQ ID NO: 11.
Antigene, epitopbærende peptider og polypeptider inneholder fortrinnsvis minst 4-10 aminosyrer, minst 10-14 aminosyrer eller ca. 14-30 aminosyrer ifølge SEQ ID NO: 2 eller SEQ ID NO: 11. Slike epitopbærende peptider og polypeptider kan fremstilles ved å fragmentere et zcytorl 71ig-polypeptid eller ved kjemisk peptidsyntese, som beskrevet heri. Videre kan epitoper utvelges ved bakteriofagfremvisning av tilfeldige peptidbiblioteker (se f.eks. Lane og Stephen, Curr. Opin. Immunol., 5:268 (1993); og Cortese et al., Curr. Opin. Biotechnol., 7:616
(1996)). Standardfremgangsmåter for påvisning av epitoper og for dannelse av antistoffer fra små peptider som omfatter en epitop, er beskrives f.eks. av Mole, "Epitope Mapping", i Methods in Molecular Biology, vol. 10, Manson (red.), s. 105-116 (The Humana Press, Inc., 1992); Price, "Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies", i Monoclonal Antibodies: Production, Engineering, and Clinical Application, Ritter og Ladyman (red.), s. 60-84 (Cambridge University Press, 1995), og Coligan et al. (red.), Current Protocols in Immunology, s. 9.3.1-9.3.5 og s. 9.4.1-9.4.11 (John Wiley and Sons, 1997). Uavhengig av den spesielle nukleotidsekvens for en zcytorl 71ig-polynukleotid-variant koder polynukleotidet for et polynukleotid som særpreges ved sin proliferative eller differensierende aktivitet, sin evne til å indusere eller inhibere spesialiserte cellefunksjoner, eller ved evnen til spesifikt å bindes til et anti-zcytorl71ig-antistoff eller en zcytorl 7-reseptor. Nærmere bestemt vil zcytorl 71ig-polynukleotidvarianter kode for polypeptider som viser minst 50 %, og fortrinnsvis minst 70 %, minst 80 %, minst 90 %, minst 95 %, minst 96 %, minst 97 %, minst 98 %, minst 99 % eller mer enn 99 % av aktiviteten til polypeptidet som er vist i SEQ ID NO: 2. For ethvert zcytorl 71ig-polypeptid, innbefattet varianter og fusjonsproteiner, kan en gjennomsnittsfagperson lett frembringe en fullt ut degenerert polynukleotidsekvens som koder for varianten ved anvendelse av informasjonen som gis i tabellene 1 og 2 ovenfor. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre en rekke andre polypeptidfusjoner (og beslektede multimere proteiner som omfatter én eller flere polypeptidfusjoner). For eksempel kan et zcytorl71ig-polypeptid fremstilles som en fusjon med et dimeriserende protein, som beskrevet i US patentskrifter nr. 5 155 027 og 5 567 584. Foretrukne dimeriserende proteiner i denne sammenheng omfatter immunglobulindomener fra konstant område. Immunglobulin-zcytorl71ig-polypeptidfusjoner kan uttrykkes i genetisk modifiserte celler (slik at det dannes en rekke multimere zcytorl 71ig-analoger). Ytterligere domener kan fusjoneres til zcytorl 71ig-polypeptider for å styre dem til spesifikke celler, vev eller makromolekyler. For eksempel kan et zcytorl 71ig-polypeptid eller -protein målstyres til en på forhånd bestemt celletype ved å fusjonere et zcytorl71ig-polypeptid til en ligand som spesifikt bindes til en reseptor på målcellens overflate. På denne måten kan polypeptider og proteiner målstyres for terapeutiske eller diagnostiske formål. Et zcytorl 71ig-polypeptid kan være fusjonert til to eller flere grupper, f.eks. en affinitetsmerkelapp for rensing og et målstyringsdomene. Polypeptidfusjoner kan også omfatte ett eller flere kløyvingsseter, fortrinnsvis mellom domener. Se Tuan et al., Connective Tissue Research, 34:1- 9,1996. Ved anvendelse av fremgangsmåtene som diskuteres heri, kan en gjennomsnittsfagperson påvise og/eller fremstille en rekke polypeptider som har en sekvens som i det vesentlige er lik aminosyrerestene 1-164 eller 24-164 i SEQ ID NO: 2 eller funksjonelle fragmenter og fusjoner derav, f.eks. heliksene A-D (aminosyrerestene 38-152 i SEQ ID NO: 2), hvor slike polypeptider, fragmenter eller fusjoner bibeholder egenskapene til villtypeproteinet, f.eks. evnen til å stimulere proliferasjon og differensiering, indusere spesialiserte cellefunksjoner eller bindes til zcytorl 7-reseptoren eller zcytorl 71ig-antistoffer. Zcytorl71ig-polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse, innbefattet fullengde-polypeptider, funksjonelle fragmenter og fusjonspolypeptider, kan fremstilles i genetisk modifiserte vertsceller ifølge konvensjonelle teknikker. Egnede vertsceller er celletyper som kan transformeres eller transfekteres med eksogent DNA og dyrkes i kultur, og omfatter bakterier, soppceller og dyrkede høyere eukaryote celler. Eukaryote celler, fortrinnsvis dyrkede celler fra multicellulære organismer, foretrekkes. Teknikker for manipulering av klonede DNA-molekyler og innføring av eksogent DNA i en rekke vertsceller beskrives av Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. utgave, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989; og Ausubel et al., red., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987. Generelt kan en DNA-sekvens som koder for et zcytorl71ig-polypeptid være operativt koblet til andre genetiske elementer som er nødvendige for ekspresjonen, generelt omfattende en transkripsjonspromoter og en transkripsjonsterminator, i en ekspresjonsvektor. Vektoren vil også vanligvis inneholde én eller flere seleksjonsmarkører og ett eller flere replikasjonsorigi, selv om fagfolk vil forstå at i visse systemer kan seleksjonsmarkører foreligge på separate vektorer, og replikasjon av det eksogene DNA kan oppnås ved integrasjon i vertscellegenomet. Valg av promotere, terminatorer, seleksjonsmarkører, vektorer og andre elementer er et spørsmål om rutinemessig utforming som ligger innenfor det gjennomsnittlige kunnskapsnivå innen faget. Mange slike elementer er beskrevet i litteraturen og er tilgjengelige gjennom kommersielle leverandører. For å styre et zcytorl 71ig-polypeptid inn i en vertscelles sekretoriske vei foreligger en sekretorisk signalsekvens (også betegnet en ledersekvens, en pre-prosekvens eller en pre-sekvens) i ekspresjonsvektoren. Den sekretoriske signalsekvens kan være signalsekvensen til zcytorl 71ig eller være avledet fra et annet utskilt protein (f.eks. t-PA) eller syntetisert de novo. Den sekretoriske signalsekvens er operativt koblet til zcytorl 71ig-DNA-sekvensen, det vil si at de to sekvensene er sammenkoblet i korrekt leseramme og plassert slik at det nysyntetiserte polypeptid styres inn i vertscellens sekretoriske vei. Sekretoriske signal sekvenser er vanligvis plassert 5' for DNA-sekvensen som koder for polypeptidet av interesse, selv om visse sekretoriske signalsekvenser kan være plassert andre steder i DNA-sekvensen av interesse (se f.eks. Welch et al., US patentskrift nr. 5 037 743; Holland et al., US patentskrift nr. 5 143 830). Alternativt anvendes den sekretoriske signalsekvens som foreligger i polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse, for å styre andre polypeptider inn i sekresjonsveien. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer slike fusjonspolypeptider. Man kan fremstille et signalfusjonspolypeptid hvori en sekretorisk signalsekvens avledet fra aminosyrerestene 1-23 i SEQ ID NO: 2 eller aminosyrerestene 1-23 i SEQ ID NO: 11 er operativt koblet til en DNA-sekvens som koder for et annet polypeptid, ved anvendelse av fremgangsmåter som er kjent innen faget og beskrives heri. Den sekretoriske signalsekvens som foreligger i fusjonspolypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse, er fortrinnsvis fusjonert aminoterminalt til ytterligere et peptid slik at dette peptid føres inn i sekresjonsveien. Slike konstruksjoner har en rekke anvendelser som er kjent innen faget. De nye sekretoriske signal-sekvensfusjonskonstruksjonene kan f.eks. styre sekresjonen av en aktiv bestanddel av et normalt ikke-utskilt protein. Slike fusjoner kan anvendes in vivo eller in vitro for å styre peptider gjennom sekresjonsveien. Dyrkede pattedyrceller er egnede verter innen foreliggende oppfinnelse. Fremgangsmåter for innføring av eksogent DNA i pattedyrvertsceller omfatter kalsiumfosfat-formidlet transfeksjon (Wigler et al., Cell, 14:125,1978; Corsaro og Pearson, Somatic Cell Genetics, 7:603,1981; Graham og Van der Eb, Virology, 52:456,1973), elektroporering (Neumann et al., EMBO J., 7:841-5,1982), DEAE-dekstranformidlet transfeksjon (Ausubel et al., ibid.) og liposomformidlet transfeksjon (Hawley-Nelson et al., Focus, 75:73,1993; Ciccarone et al., Focus, 75:80,1993) og virusvektorer (Miller og Rosman, BioTechniques, 7:980-90,1989; Wang og Finer, Nature Med., 2:714-6,1996). Fremstilling av rekombinante polypeptider i dyrkede pattedyrceller beskrives f.eks. av Levinson et al., US patentskrift nr. 4 713 339; Hagen et al., US patentskrift nr. 4 784 950; Palmiter et al., US patentskrift nr. 4 579 821; og Ringold, US patentskrift nr. 4 656 134. Egnede dyrkede pattedyrceller omfatter cellelinjene COS-1 (ATCC nr. CRL 1650), COS-7 (ATCC nr. CRL 1651), BHK (ATCC nr. CRL 1632), BHK 570 (ATCC nr. CRL 10314), 293 (ATCC nr. CRL 1573); Graham et al., J. Gen. Virol, 36:59- 12,1977) og ovarieceller fra kinesisk hamster (f.eks. CHO-K1, ATCC nr. CCL 61). Ytterligere egnede cellelinjer er kjent innen faget og tilgjengelige fra offentlige depoter, f.eks. American Type Culture Collection, Manassas, VA. Generelt foretrekkes kratige transkrip-sjonspromotere, f.eks. promotere fra SV-40 eller cytomegalovirus. Se f.eks. US patentskrift nr. 4 956 288. Andre egnede promotere omfatter promoterne fra metallotioneingener (US patentskrifter nr. 4 579 821 og 4 601 978) og den sene hovedpromoter fra adenovirus. Medikamentseleksjon anvendes generelt for seleksjon av dyrkede pattedyrceller som fremmed DNA er blitt ført inn i. Slike celler betegnes ofte som "transfektanter". Celler som er blitt dyrket i nærvær av seleksjonsmidlet, og som kan overføre genet av interesse til sitt avkom, betegnes "stabile transfektanter". En foretrukket seleksjonsmarkør er et gen som koder for resistens overfor antibiotikumet neomycin. Seleksjonen utføres i nærvær av et medikament av neomycintype, f.eks. G-418 eller lignende. Seleksjonssystemer kan også anvendes til å øke ekspresjonsnivået for genet av interesse, en prosess som betegnes "amplifisering". Amplifisering utføres ved å dyrke transfektanter i nærvær av et lavt nivå av seleksjonsmidlet og så øke mengden seleksjonsmiddel for seleksjon av celler som danner produktene fra de innførte genene i høyt nivå. En foretrukket amplifiserbar seleksjonsmarkør er dihydrofolatreduktase, som gir resistens overfor metotreksat. Andre medikamentresistensgener (f.eks. hygromycinresistens, flermedikamentresistens, puromycinacetyltransferase) kan også anvendes. Alternative markører som innfører en endret fenotype, f.eks. grønt, fluorescerende protein, eller celleoverflateproteiner som CD4, CD8, klasse I-MHC eller alkalisk fosfatase fra placenta, kan anvendes for sortering av transfekterte celler fra ikke-transfekterte celler ved hjelp av midler som FACS-sortering eller separasjonsteknologi basert på magnetiske kuler. Andre høyere eukaryote celler kan også anvendes som verter, innbefattet planteceller, insektceller og fugleceller. Sinkar et al., J. Biosci. (Bangalore), 77:47-58,1987, gir en oversikt over anvendelsen av Agrobacterium rhizogenes som vektor for ekspresjon av gener i planteceller. Transformasjon av insektceller og fremstilling av fremmede polypeptider i disse beskrives av Guarino et al., US patentskrift nr. 5 162 222 og i WIPO-publikasjon WO 94/06463. Insektceller kan infiseres med rekombinant baculovirus, vanligvis avledet fra Autographa ca/(/br/j/ca-kjernepolyhedrosevirus (AcNPV). Se King, L.A. og Possee, R.D., The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide, London, Chapman & Hall; 0'Reilly, D.R. et al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, New York, Oxford University Press, 1994; og Richardson, C.D., red., Baculovirus Expression Protocols. Methods in Molecular Biology, Totowa, NJ, Humana Press, 1995. Den andre fremgangsmåten for fremstilling av rekombinant baculovirus benytter et transposonbasert system som beskrives av Luckow (Luckow, V.A. et al., J. Virol., 67:4566-79,1993). Dette systemet selges i "Bac-to-Bac"-settet (Life Technologies, Rockville, MD). Systemet benytter en overføringsvektor, "pFastBacl" (Life Technologies), som inneholder et Tn7-transposon, for å flytte DNA som koder for zcytorl 71ig-polypeptidet inn i et baculovirusgenom som opprettholdes i E. coli som et stort plasmid som betegnes et "bakmid". Overføringsvektoren "pFastBacl" benytter polyhedronpromoteren fra AcNPV for å styre ekspresjonen av genet av interesse, i dette tilfellet zcytorl71ig. Imidlertid kan "pFastBacl" modifiseres i betydelig grad. Polyhedrinpromoteren kan fjernes og erstattes med den basiske proteinpromoter fra baculovirus (også betegnet ?cor-, p6.9- eller MP-promoteren), som uttrykkes tidligere i baculovirusinfeksjonen og som er blitt vist å være fordelaktig for ekspresjon av utskilte proteiner. Se Hill-Perkins, M.S. og Possee, R.D., J. Gen. Virol., 77:971-6, 1990; Bonning, B.C. et al., J. Gen. Virol., 75:1551-6, 1994; og Chazenbalk, G.D. og Rapoport, B., J. Biol. Chem., 270:1543-9,1995.1 slike overføringsvektorkonstruksjoner kan en kort eller lang versjon av den basiske proteinpromoter anvendes. Videre kan det konstrueres overførings-vektorer som erstatter de native sekretoriske signalsekvensene i zcytorl 71ig med sekretoriske signalsekvenser avledet fra insektproteiner. For eksempel kan en sekretorisk signalsekvens fra Ecdysteroid glukosyltransferase (EGT), honningbiemelittin (Invitrogen, Carlsbad, CA) eller baculovirus gp67 (PharMingen, San Diego, CA) anvendes i konstruksjoner for å erstatte den native sekretoriske signalsekvens i zcytorl 71ig. I tillegg kan overføringsvektorene omfatte en fusjon med opprettholdt leseramme med DNA som koder for en epitopmerkelapp i C- eller N-enden av det uttrykte zcytorl 71ig-polypeptid, f.eks. en Glu-Glu-epitopmerkelapp (Grussenmeyer, T. et al., Proe. Nati. Acad. Sei., 52:7952-4,1985). Ved anvendelse av teknikker som er kjent innen faget, transformeres en overføringsvektor som inneholder zcytorl 71ig inn i E. Coli, og bakteriene gjennomsøkes for bakmider som inneholder et oppbrutt lacZ-gen, noe som viser et rekombinant baculovirus. Bakmid-DNA som inneholder det rekombinante baculovirusgenom, isoleres ved anvendelse av vanlige teknikker og anvendes for transfeksjon av Spodoptera frugiperda- celler, f.eks. Sf9-celler. Rekombinant virus som uttrykker zcytorl 71ig, dannes så. Lagersuspensjoner av rekombinant virus fremstilles ved fremgangsmåter som er hyppig anvendt innen faget. Det rekombinante virus anvendes for infeksjon av vertsceller, typisk en cellelinje avledet fra hærmygg, Spodoptera rfugiperda. Se generelt Glick og Pasternak, Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA, ASM Press, Washington, D.C., 1994. En annen egnet cellelinje er cellelinjen "High FiveO" (Invitrogen), som er avledet fra Trichoplusia ni (US patentskrift nr. 5 300 435). Soppceller, innbefattende gjærceller, kan også anvendes i foreliggende oppfinnelse. Gjærarter av spesiell interesse i denne sammenheng omfatter Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris og Pichia methanolica. Fremgangsmåter for transformering av S. cerevisiae- ccWer med eksogent DNA og fremstilling av rekombinante polypeptider fra disse beskrives f.eks. av Kawasaki, US patentskrift nr. 4 599 311; Kawasaki et al., US patentskrift nr. 4 931 373; Brake, US patentskrift nr. 4 870 008; Welch et al., US patentskrift nr. 5 037 743; og Murray et al., US patentskrift nr. 4 845 075. Transformerte celler selekteres ut fra fenotypen, som bestemmes av seleksjonsmarkøren, vanligvis medikamentresistens eller evnen til å vokse i fravær av et gitt næringsstoff (f.eks. leucin). Et foretrukket vektorsystem for anvendelse i Saccharomyces cerevisiae er P077-vektorsystemet, som beskrives av Kawasaki et al. (US patentskrift nr. 4 931 373), som tillater seleksjon av transformerte celler ved dyrkning i glukoseholdig medium. Egnede promotere og terminatorer for anvendelse i gjær omfatter promotere og terminatorer fra gener for glykolytiske enzymer (se f.eks. Kawasaki, US patentskrift nr. 4 599 311; Kingsman et al., US patentskrift nr. 4 615 974; og Bitter, US patentskrift nr. 4 977 092) og alkoholdehydrogenasegener. Se også US patentskrifter nr. 4 990 446, 5 063 154, 5 139 936 og 4 661 454. Transformasjonssystemer for andre gjærarter, innbefattet Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis,
Kluyveromyces fragilis, Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia guillermondii og Candida maltosa, er kjent innen faget. Se f.eks. Gleeson et al., J. Gen. Microbiol., 732:3459-3465,1986, og Cregg, US patentskrift nr. 4 882 279. Aspergillus- ceMer kan benyttes ifølge fremgangsmåtene til McKnight et al., US patentskrift nr. 4 935 349. Fremgangsmåter for transformering av Acremonium chrysogenum beskrives av Sumino et al., US patentskrift nr. 5 162 228. Fremgangsmåter for transformering av Neurospora beskrives av Lambowitz, US patentskrift nr. 4 486 533.
Anvendelse av Pichia methanolica som vert for fremstilling av rekombinante proteiner beskrives i WIPO-publikasjonene WO 97/17450, WO 97/17451, WO 98/02536 og WO 98/02565. DNA-molekyler for anvendelse ved transformasjon av P. methanolica vil ofte være fremstilt som dobbelttrådede, sirkulære plasmider som fortrinnsvis lineariseres før transformasjonen. For fremstilling av polypeptider i P. methanolica foretrekkes det at promoteren og terminatoren i plasmidet stammer fra et P. methanolica- gm, f.eks. et gen for utnyttelse av alkohol fra P. methanolica ( AUG1 eller AUG2). Andre anvendbare promotere omfatter promotere fra genene for dihydroksyacetonsyntase (DHAS), formiatdehydrogenase (FMD) og katalase (CAT). For å lette integreringen av DNA i vertskromosomet foretrekkes det at hele ekspresjonssegmentet i plasmidet er flankert i begge ender av verts-DNA-sekvenser. En foretrukket seleksjonsmarkør for anvendelse i Pichia methanolica er et ^4D7i2-gen fra P. methanolica, som koder for fosforibosyl-5-aminoimidazolkarboksylase (AIRC; EC 4.1.1.21), som tillater vekst av acfe2-vertsceller i fravær av adenin. For industrielle prosesser i stor skala hvor det er ønskelig å minimalisere bruken av metanol, foretrekkes det å anvende vertsceller hvori begge metanolutnyttelsesgenene ( AUG1 og AUG2) er delert. For fremstilling av utskilte proteiner foretrekkes vertsceller som mangler vakuolære proteasegener { PEP4 og PRB1). Elektroporering anvendes for å lette innføringen av plasmid som inneholder DNA som koder for et polypeptid av interesse i P. methanolica- céiler. Det foretrekkes å transformere P. methanolica-celler ved elektroporering og anvendelse av et eksponentielt avtakende, pulset elektrisk felt med en feltstyrke fra 2,5 til 4,5 kV/cm, fortrinnsvis ca. 3,75 kV/cm, og en tidskonstant (Q) fra 1 til 40 millisekunder, mest foretrukket ca. 20 millisekunder.
Prokaryote vertsceller, innbefattet stammer av bakteriene Escherichia coli, Bacillus og andre slekter, er også anvendbare vertsceller innen foreliggende oppfinnelse. Teknikker for transformering av disse vertene og ekspresjon av fremmede DNA-sekvenser som er klonet i dem, er vel kjent innen faget (se f.eks. Sambrook et al., ibid.). Ved ekspresjon av et zcytorl 71ig-polypeptid i bakterier, f.eks. E. coli, kan polypeptidet tilbakeholdes i cytoplasmaet, typisk som uløselige partikler, eller det kan styres til periplasmarommet ved hjelp av en bakteriell sekresjonssekvens. I det første tilfellet lyseres cellene, og partiklene gjenvinnes og denatureres ved anvendelse av f.eks. guanidinisotiocyanat eller urea. Det denaturerte polypeptid kan så gjenfoldes og dimeriseres ved å fortynne denatureringsmidlet, f.eks. ved dialyse mot en løsning av urea og en kombinasjon av redusert og oksidert glutation, fulgt av dialyse mot en bufret saltløsning. I det siste tilfellet kan polypeptidet gjenvinnes fra periplasmarommet i løselig og funksjonell form ved å bryte opp cellene (f.eks. ved ultralydbehandling eller osmotisk sjokk), slik at innholdet i periplasmarommet frigis, og gjenvinning av proteinet, hvorved man unngår behovet for denaturering og gjenfolding.
Transformerte eller transfekterte vertsceller dyrkes ifølge konvensjonelle fremgangsmåter i et dyrkningsmedium som inneholder næringsstoffer og andre bestanddeler som er nødvendige for vekst av de valgte vertsceller. En rekke egnede medier, innbefattet definerte medier og komplekse medier, er kjent innen faget og omfatter generelt en karbonkilde, en nitrogenkilde, essensielle aminosyrer, vitaminer og mineraler. Medier kan også inneholde bestanddeler som vekstfaktorer eller serum etter behov. Vekstmediet vil generelt selektere for celler som inneholder det eksogent tilsatte DNA, f.eks. ved medikamentseleksjon eller mangel på et essensielt næringsstoff som komplementeres av seleksjonsmarkøren som bæres på ekspresjonsvektoren eller som er kotransfektert inn i vertscellen. P. methanolica- ceUer dyrkes i et medium som omfatter tilstrekkelige kilder for karbon, nitrogen og spornæringsstoffer, ved en temperatur fra ca. 25 °C til 35 °C. Flytende kulturer tilføres tilstrekkelig luft ved hjelp av konvensjonelle midler, f.eks. ved risting av små kolber eller gjennomblåsing av fermentorer. Et foretrukket dyrkningsmedium for P. methanolica er YEPD (2 % D-glukose, 2 % "Bacto"-pepton (Difco Laboratories, Detroit, MI), 1 % "Bacto"-gjærekstrakt (Difco Laboratories), 0,004 % adenin og 0,006 % L-leucin).
Det foretrekkes å rense polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse til > 80 % renhet, mer foretrukket til > 90 % renhet, enda mer foretrukket til > 95 % renhet, og spesielt foretrukket er en farmasøytisk ren tilstand, det vil si mer enn 99,9 % rent når det gjelder kontaminerende makromolekyler, særlig andre proteiner og nukleinsyrer, og fritt for infeksiøse og pyrogene midler. Et renset polypeptid er fortrinnsvis i det vesentlige fritt for andre polypeptider, særlig andre polypeptider med opphav i dyr.
Uttrykte rekombinante zcytorl 71ig-polypeptider (eller kimære zcytorl 71 ig-polypeptider) kan renses ved anvendelse av fraksjonering og/eller konvensjonelle rensefremgangsmåter og medier. Ammoniumsulfatutfelling og ekstraksjon med syre eller et kaotropt middel kan anvendes for fraksjonering av prøver. Eksempler på rensetrinn kan omfatte hydroksyapatittkromatografi, størrelseseksklusjonskromatografi, FPLC og reversfasehøyytelses-væskekromatografi. Egnede kromatografimedier omfatter derivatiserte dekstraner, agarose, cellulose, polyakrylamid, spesielle kiselgeler og lignende. PEI-, DEAE-, QAE- og Q-derivater foretrekkes. Eksempler på kromatografimedier omfatter medier derivatisert med fenylgrupper, butylgrupper eller oktylgrupper, f.eks. fenyl-Sepharose FF (Pharmacia), Toypearl-butyl 650 (Toso Haas, Montgomeryville, PA), oktyl-Sepharose (Pharmacia) og lignende; eller polyakrylsyreresiner, slik som Amberchrom CG 71 (Toso Haas) og lignende. Egnede faste støttemidler omfatter glasskuler, kiselgelbaserte resiner, celluloseresiner, agarosekuler, kryssbundne agarosekuler, polystyrenkuler, kryssbundne polyakrylamidresiner og lignende, som er uløselige under de betingelser som de anvendes ved. Disse støttemidlene kan være modifisert med reaktive grupper som tillater tilkobling av proteiner via aminogrupper, karboksylgrupper, sulfhydrylgrupper, hydroksylgrupper og/eller karbohydratgrupper. Eksempler på kjemisk tilkobling omfatter cyanogenbromidaktivering, N-hydroksysuksinimidaktivering, epoksidaktivering, sulfhydrylaktivering, hydrazidaktivering og karboksyl- og aminoderivater for karbo-diimidbasert koblingskjemi. Disse og andre faste medier er vel kjent og anvendes hyppig innen faget, og er tilgjengelige fra kommersielle leverandører. Fremgangsmåter for binding av reseptorpolypeptider til støttemedier er vel kjent innen faget. Valg av en bestemt fremgangsmåte er et spørsmål om rutinemessig utforming og bestemmes delvis ut fra egenskapene til det valgte støttemiddel. Se f.eks. Affinity Chromatography: Principles & Methods, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sverige, 1988.
Polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse kan isoleres ved å utnytte deres fysiske og biokjemiske egenskaper. For eksempel kan immobilisert metallionadsorpsjons-(IMAC)kromatografi anvendes for rensing av histidinrike proteiner, innbefattet proteiner som omfatter polyhistidinmerkelapper. Kort beskrevet lades først en gel først med divalente metallioner slik at det dannes et chelat (Sulkowski, Trends in Biochem., 5:1-7,1985). Histidinrike proteiner vil adsorberes til dette støttemidlet med forskjellig affinitet, avhengig av det benyttede metallion, og vil elueres ved kompetitiv eluering, reduksjon av pH eller anvendelse av kraftige chelateringsmidler. Andre rensefremgangsmåter omfatter rensing av glykosylerte proteiner ved lektinaffinitetskromatografi og ionebytterkromatografi (Methods in Enzymol., vol. 182, "Guide to Protein Purification", M. Deutscher (red.), Acad. Press, San Diego, 1990, s. 529-39), og anvendelse av den løselige zcytorl 7-reseptoren. Ved ytterligere utførelser av oppfinnelsen kan en fusjon mellom polypeptidet av interesse og en affinitetsmerkelapp (f.eks. maltosebindende protein eller et immunglobulindomene) konstrueres for å lette rensingen.
Ved anvendelse av fremgangsmåter som er beskrevet innen faget, konstrueres videre polypeptidfusjoner eller hybride zcytorl71ig-proteiner ved anvendelse av områder eller domener fra zcytorl 71ig ifølge oppfinnelsen i kombinasjon med områder eller domener fra andre humane proteiner fra cytokinfamilien (f.eks. interleukiner eller GM-CSF) eller heterologe proteiner (Sambrook et al., ibid., Altschul et al., ibid., Picard, Cur. Opin. Biology, 5:511-5, 1994). Disse fremgangsmåtene tillater bestemmelse av den biologiske betydning av større domener eller områder i et polypeptid av interesse. Slike hybrider kan endre reaksjonskinetikken og bindingen, begrense eller utvide substratspesifisiteten eller endre vevslokaliseringen eller den cellulære lokalisering av et polypeptid, og kan benyttes på polypeptider med ukjent struktur.
Fusjonsproteiner kan fremstilles ved fremgangsmåter som er kjent blant fagfolk, ved å fremstille hver bestanddel av fusjonsproteinet og konjugere dem kjemisk. Alternativt kan et polynukleotid som koder for begge bestanddeler i fusjonsproteinet i korrekt leseramme, fremstilles ved anvendelse av kjente teknikker og uttrykkes ved fremgangsmåtene som beskrives heri. For eksempel kan en del av eller en hel heliks som gir en biologisk funksjon, utbyttes mellom zcytorl71ig ifølge foreliggende oppfinnelse og de funksjonelt ekvivalente heliksene fra et annet familiemedlem, f.eks. IL-15, IL-2, IL-4 eller GM-CSF. Slike bestanddeler omfatter den sekretoriske signalsekvens, heliksene A, B, C, D; løkkene A/B, B/C og C/D fra fireheliksbunt- cytokiner. Slike fusjonsproteiner vil forventes å ha en biologisk funksjonell profil som er den samme som eller ligner den funksjonelle profilen til polypeptider ifølge foreliggende oppfinnelse, eller andre kjente proteiner fra fireheliksbunt-cytokinfamilien, avhengig av den konstruerte fusjon. Videre kan slike fusjonsproteiner vise andre egenskaper, som beskrevet heri.
Standardteknikker innen molekylærbiologi og kloning kan anvendes for å utbytte ekvivalente domener mellom zcytorl71ig-polypeptidet og polypeptidene som de foreligger i. Generelt kobles et DNA-segment som koder for et domene av interesse, f.eks. zcytorl 71ig-heliksene A-D eller et annet domene som beskrives heri, operativt med opprettholdt leseramme til minst ett annet DNA-segment som koder for et annet polypeptid (f.eks. et domene eller område fra et annet cytokin, f.eks. IL-2 eller lignende) og innsettes i en egnet ekspresjonsvektor, som beskrevet heri. Generelt fremstilles DNA-konstruksjoner slik at de mange DNA-segmentene som koder for de tilsvarende områdene i et polypeptid, er operativt sammenkoblet med opprettholdt leseramme slik at det dannes en enkelt konstruksjon som koder for hele fusjonsproteinet eller en funksjonell del derav. En DNA-konstruksjon vil f.eks. kode fra N-enden til C-enden av et fusjonsprotein som omfatter et signalpolypeptid, fulgt av et modent fireheliksbunt-cytokinfusjonsprotein som inneholder heliks A, fulgt av heliks B, fulgt av heliks C, fulgt av heliks D. Slike fusjonsproteiner kan uttrykkes, isoleres og analyseres for aktivitet, som beskrevet heri.
Zcytorl 71ig-polypeptider eller fragmenter av disse kan også fremstilles ved kjemisk syntese. Zcytorl 71ig-polypeptider kan være monomerer eller multimerer, glykosylerte eller ikke-glykosylerte, pegylerte eller ikke-pegylerte, og kan, men må ikke, omfatte en innledende metioninaminosyrerest. Polypeptidene kan f.eks. fremstilles ved peptidsyntese i fast fase, f.eks. som beskrevet av Merrifield, J. Am. Chem. Soc, 55:2149,1963.
Molekylaktiviteten ifølge foreliggende oppfinnelse kan måles ved anvendelse av en rekke analyser som måler proliferasjon av og/eller binding til celler som uttrykker zcytorl7-reseptoren. Av spesiell interesse er endringer i zcytorl71ig-avhengige celler. Egnede cellelinjer som kan modifiseres slik at de blir zcytorl71ig-avhengige, omfatter den IL-3-avhengige cellelinje BaF3 (Palacios og Steinmetz, Cell, 47:727-734,1985; Mathey-Prevot et al., Mol. Cell. Biol., 6:4133-4135,1986), FDC-P1 (Hapel et al., Blood, 64:786-790,1984) og M07e (Kiss et al., Leukemia, 7:235-240,1993). Vekstfaktoravhengige cellelinjer kan etableres ifølge publiserte fremgangsmåter (se f.eks. Greenberger et al., Leukemia Res., 5:363-375,1984; Dexter et al., i Baum et al., red., Experimental Hematology Today, 8th Ann. Mtg. Int. Soc. Exp. Hematol., 1979,145-156,1980).
Proteinene ifølge foreliggende oppfinnelse er anvendbare for stimulering av proliferasjon, aktivering eller differensiering og/eller induksjon eller inhibering av spesialiserte cellefunksjoner i celler som inngår i homøostasen av hematopoesen og immunfunksjonen. Nærmere bestemt er zcytorl 71ig-polypeptider anvendbare for stimulering av proliferasjon, aktivering eller differensiering, for induksjon eller inhibering av spesialiserte cellefunksjoner i celler fra de hematopoietiske linjer, innbefattet T-celler, B-celler, monocytter/makrofager, NK- celler, nøytrofile celler, endotelceller, fibroblaster, eosinofiler, kondrocytter, mastceller, Langerhans-celler, monocytter og makrofager, så vel som epitelceller. Epitelceller omfatter f.eks. ameloblaster, sjefsceller, kromatoforer, enterokromaffinceller, enterokromaffinlignende celler, begerceller, granulosaceller, keratinocytter, dendrittceller, labyrintunderstøttende celler, melanocytter, merkelceller, panetceller, sertoliceller og lignende. Proliferasjon og/eller differensiering av hematopoietiske celler kan måles in vitro ved anvendelse av dyrkede celler eller in vivo ved tilførsel av molekyler ifølge foreliggende oppfinnelse til en egnet dyremodell. Analyser som måler celleproliferasjon eller -differensiering, er vel kjent innen faget. Analyser som måler proliferasjon, omfatter f.eks. analyser som kjemosensitivitet overfor fargestoffet nøytralrødt (Cavanaugh et al., Investigational New Drugs, 5:347-354,1990), inkorporering av radioaktivt merkede nukleotider (Cook et al., Analytical Biochem., 179:1- 7, 1989), inkorporering av 5-brom-2'-deoksyuridin (BrdU) i DNA hos prolifererende celler (Porstmann et al., J. Immunol. Methods, 52:169-179,1985), og anvendelse av tetrazoliumsalter (Mosmann, J. Immunol. Methods, 65:55-63,1983; Alley et al., Cancer Res., 45:589-601,1988; Marshall et al., Growth Reg., 5:69-84,1995; og Scudiero et al., Cancer Res., 45:4827-4833,1988). Analyser som måler differensiering, omfatter f.eks. måling av celleoverflatemarkører forbundet med stadiumspesifikk ekspresjon i et vev, enzymatisk aktivitet, funksjonell aktivitet eller morfologiske endringer (Watt, FASEB, 5:281-284,1991; Francis, Differentiation, 57:63-75, 1994; Raes, Adv. Anim. Cell Biol. Technol. Bioprocesses, 161-171,1989).
Molekylene ifølge foreliggende oppfinnelse kan analyseres in vivo ved anvendelse av virale tilførselssystemer. Eksempler på virus for dette formål omfatter adenovirus, herpes-virus, retrovirus, kukoppevirus og adenoassosiert virus (AAV). Adenovirus, et dobbelttrådet DNA-virus, er for tiden den best undersøkte genoverføringsvektor for tilførsel av heterolog nukleinsyre (for en oversikt, se T.C. Becker et al, Meth. Cell Biol., 45:161-89,1994; og J.T. Douglas og D.T. Curiel, Science & Medicine, 4:44-53,1997).
Som en ligand kan aktiviteten til zcytorl 71ig-polypeptidet måles med et silikonbasert biosensormikrofysiometer som måler den ekstracellulære surgjøringshastighet eller protonekskresjonen forbundet med reseptorbinding og påfølgende fysiologiske cellulære responser. Et eksempel på en slik innretning er mikrofysiometeret "Cytosensor", som fremstilles av Molecular Devices, Sunnyvale, CA. En rekke cellulære responser, f.eks. celleproliferasjon, ionetransport, energiproduksjon, inflammatoriske responser, regulatorisk aktivering og reseptoraktivering og lignende, kan måles ved denne fremgangsmåten. Se f.eks. McConnel, H.M. et al., Science, 257:1906-1912,1992; Pitchford, S. et al., Meth. Enzymol., 225:84-108, 1997; Arimilli, S. et al., J. Immunol. Meth., 272:49-59,1998; Van Liefde, I. et al., Eur. J. Pharmacol., 546:87-95,1998.
Videre kan zcytorl71ig anvendes for påvisning av celler, vev eller cellelinjer som responderer på en zcytorl 71ig-stimulert reaksjonsvei. Mikrofysiometeret som beskrives ovenfor, kan anvendes for hurtig påvisning av ligandresponderende celler, f.eks. celler som responderer på zcytorl 71ig ifølge foreliggende oppfinnelse. Cellene kan dyrkes i nærvær eller fravær av zcytorl71ig-polypeptid. Cellene som gir en målbar endring i den ekstracellulære surgjøring i nærvær av zcytorl71ig, responderer på zcytorl 71ig. Slike celler eller cellelinjer kan anvendes for påvisning av antagonister og agonister av zcytorl 71ig-polypeptidet, som beskrevet ovenfor.
I lys av vevsfordelingen som er observert for zcytorl 7-reseptoragonister (innbefattet den naturlige zcytorl 71ig/det naturlige substrat/den naturlige kofaktor osv.) og/eller antagonister har et enormt potensial for anvendelser både in vitro og in vivo. Forbindelser som er vist å være zcytorl71ig-agonister, er anvendbare for ekspansjon, proliferasjon, aktivering, differensiering og/eller induksjon eller inhibering av spesialiserte cellefunksjoner i celler som deltar i homøostasen av hematopoesen og immunfunksjonen. For eksempel er zcytorl 71ig og agonistforbindelser anvendbare som bestanddeler i definerte celledyrkningsmedier, og kan anvendes alene eller i kombinasjon med andre cytokiner eller hormoner for å erstatte serum, som vanligvis anvendes ved celledyrkning. Agonister er således anvendbare for spesifikk fremming av vekst og/eller utvikling av T-celler, B-celler, monocytter/makrofager, NK-celler, cytotoksiske lymfocytter og andre celler fra den lymfoide linje og den myeloide linje i kultur.
Antagonister er også anvendbare som forskningsreagenser for karakterisering av seter for ligand-reseptorinteraksjon. Antagonister er anvendbare for inhibering av ekspansjon, proliferasjon, aktivering og/eller differensiering av celler som deltar i regulering av hematopoesen. Inhibitorer av zcytorl 71ig-aktivitet (zcytorl 71ig-antagonister) omfatter anti-zcytorl71ig-antistoffer og løselige zcytorl 71ig-reseptorer, så vel som andre peptidbaserte og ikke-peptidbaserte midler (innbefattet ribozymer).
Zcytorl 71ig kan også anvendes for påvisning av inhibitorer (antagonister) av ligandens aktivitet. Analyseforbindelser tilsettes analysene som beskrives heri for påvisning av forbindelser som inhiberer aktiviteten til zcytorl 71ig. I tillegg til analysene som beskrives heri, kan prøver analyseres for inhibering av zcytorl 71ig-aktivitet i et bredt utvalg av analyser som er utformet for måling av reseptorbinding, stimulering/inhibering av zcytorl 71ig-avhengige cellulære responser eller proliferasjon av zcytorl 7-reseptoruttrykkende celler.
Et zcytorl71ig-polypeptid kan uttrykkes som en fusjon med et konstant område fra en immunglobulintungkjede, typisk et Fc-fragment, som inneholder to konstant område-domener og mangler det variable området. Fremgangsmåter for fremstilling av slike fusjoner beskrives i US patentskrifter nr. 5 155 027 og 5 567 584. Slike fusjoner utskilles typisk som multimere molekyler, hvori Fc-delene er bundet til hverandre via disulfidbroer, og to ikke-Ig-polypeptider er sammenstilt svært nær hverandre. Fusjoner av denne typen kan f.eks. anvendes for dimerisering, for å øke stabiliteten og halveringstiden in vivo, for affinitetsrensing av ligand eller som in vtfro-analyseverktøy eller antagonist. For anvendelse i analyser bindes kimærene til et støttemiddel via Fc-området og anvendes i ELISA-format.
Et zcytorl71ig-bindende polypeptid kan også anvendes for rensing av ligand. Polypeptidet immobiliseres til et fast støttemiddel, f.eks. kuler av agarose, kryssbundet agarose, glass, celluloseresiner, kiselgelbaserte resiner, polystyren, kryssbundet polyakrylamid eller lignende materialer som er stabile under bruksbetingelsene. Fremgangsmåter for kobling av polypeptider til faste støttemidler er kjent innen faget og omfatter aminkjemi, cyanogenbromidaktivering, N-hydroksysuksinimidaktivering, epoksidaktivering, sulfhydrylaktivering og hydrazidaktivering. Det resulterende medium vil generelt benyttes i form av en kolonne, og væsker som inneholder ligand, får passere gjennom kolonnen én eller flere ganger, slik at liganden får bindes til reseptorpolypeptidet. Liganden elueres så ved å anvende endringer i saltkonsentrasjonen, kaotrope midler (guanidin-HCl) eller pH for å oppbryte ligand-reseptorbindingen.
Et analysesystem som anvender en ligandbindende reseptor (eller et antistoff, et medlem av et komplemenWantikomplementpar) eller et bindende fragment derav og et kommersielt tilgjengelig biosensorinstrument (BIAcore, Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ) kan med fordel benyttes. Slike reseptorer, antistoffer, medlemmer av et komplement/antikomplementpar eller fragmenter immobiliseres til overflaten av en reseptorbrikke. Anvendelse av dette instrumentet beskrives av Karlsson, J. Immunol. Methods, 745:229-240,1991, og Cunningham og Wells, J. Mol. Biol., 254:554-63,1993. En reseptor, et antistoff, et medlem eller et fragment tilkobles kovalent ved anvendelse av amin- eller sulfhydrylkjemi til dekstranfibrer som er koblet til en gullfilm i gjennomstrømningscellen. En analyseprøve sendes gjennom cellen. Dersom en ligand, en epitop eller det tilsvarende medlem av komplement/antikomplementparet foreligger i prøven, vil dette bindes til den immobiliserte reseptoren, antistoffet eller medlemmet, noe som gir en endring i mediets refraksjonsindeks, som påvises som en endring i gullfilmens overflateplasmonresonans. Dette systemet tillater bestemmelse av på- og av-hastigheter, fra hvilke bindingsaffiniteten kan beregnes, og en vurdering av bindings-støkiometrien. Alternativt kan ligandVreseptorbinding analyseres ved anvendelse av "SELDI"-teknologi (Ciphergen, Inc., Palo Alto, CA).
Ligandbindende reseptorpolypeptider kan også anvendes i andre analysesystemer som er kjent innen faget. Slike systemer omfatter Scatchard-analyse for bestemmelse av bindingsaffinitet (se Scatchard, Ann. NY Acad. Sei., 57:660-672,1949) og kalorimetriske analyser (Cunningham et al., Science, 255:545-48, 1991; Cunningham et al., Science, 245:821-25, 1991).
Zcytorl 71ig-polypeptider kan også anvendes for fremstilling av antistoffer som bindes til zcytorl71ig-epitoper, -peptider eller -polypeptider. Zcytorl71ig-polypeptidet eller et fragment derav fungerer som antigen (immunogen) for inokulering av et dyr og utløser en immunrespons. Slike antistoffer kan anvendes for å blokkere den biologiske virkningen av pro-inflammatorisk zcytorl71ig og er anvendbare som antiinflammatoriske, terapeutiske midler i en rekke sykdommer, som beskrevet heri. En fagperson vil innse at antigene, epitopbærende polypeptider inneholder en sekvens av minst 6, fortrinnsvis minst 9, og mer fortrukket fra minst 15 til ca. 30, på hverandre følgende aminosyrerester fra et zcytorl 71ig-polypeptid (f.eks. SEQ ID NO: 2). Polypeptider som omfatter en større del av et zcytorl71ig-polypeptid, det vil si 30-100 aminosyrerester og opp til hele lengden av aminosyresekvensen, omfattes. Antigener eller immunogene epitoper kan også omfatte tilkoblede merkelapper, adjuvanser, bærestoffer og bærere, som beskrevet heri. Egnede antigener omfatter zcytorl71ig-polypeptidet som kodes av SEQ ID NO: 2 fra aminosyre nr. 24 til aminosyre nr. 164, eller et kontinuerlig fragment på 9-141 aminosyrer derav. Andre egnede antigener omfatter zcytorl71ig av fullengde og moden zcytorl 71ig, heliksene A-D og enkeltvise eller flere av heliksene A, B, C og D fra fireheliksbuntstrukturen til zcytorl71ig, som beskrevet heri. Foretrukne peptider for anvendelse som antigener er hydrofile peptider, f.eks. peptider påvist av en fagperson ut fra et hydrofobisitetsplott, som beskrevet heri, f.eks. aminosyrerestene 114-119,101-105,126-131,113-118 og 158-162 i SEQ ID NO: 2, og aminosyrerestene 34-39,46-51,131-136,158-163 og 157-162 i SEQ ID NO: 11. Videre kan antatte antigene zcytorl 71ig-epitoper, påvist ved et Jameson-Wolf-plott, f.eks. ved anvendelse av programmet DNASTAR Protean (DNASTAR, Inc., Madison, WI), fungere som foretrukne antigener, og disse kan lett påvises av en fagperson.
Antistoffer fra en immunrespons frembrakt ved inokulering av et dyr med disse antigenene kan isoleres og renses som beskrevet heri. Fremgangsmåter for fremstilling og isolering av polyklonale og monoklonale antistoffer er vel kjent innen faget. Se f.eks. Current Protocols in Immunology, Cooligan et al. (red.), National Institutes of Health, John Wiley and Sons, Inc., 1995; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboraory Manual, 2. utgave, Cold Spring Harbor, NY, 1989; og Hurrell, J.G.R., red., Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, 1982.
Som åpenbart for en gjennomsnittsfagperson kan polyklonale antistoffer frembringes ved å inokulere et bredt utvalg av varmblodige dyr, f.eks. hester, kuer, geiter, sauer, hunder, kyllinger, kaniner, mus og rotter, med et zcytorl 71ig-polypeptid eller et fragment derav. Immunogenisiteten til et zcytorl71ig-polypeptid kan forsterkes ved anvendelse av et adjuvans, f.eks. alun (aluminiumhydroksid), eller Freunds komplette eller ukomplette adjuvans. Polypeptider som er anvendbare for immunisering, omfatter også fusjonspolypeptider, f.eks. fusjoner mellom zcytorl 71ig eller en del derav og et immunglobulinpolypeptid eller maltosebindende protein. Det immunogene polypeptid kan være et fullengdemolekyl eller en del derav. Dersom polypeptiddelen er "haptenlignende", kan en slik del med fordel kobles eller bindes til en makromolekylær bærer (f.eks. albuskjellhemocyanin (KLH), bovint serumalbumin (BSA) eller tetanustoksoid) for immunisering.
Som anvendt heri, omfatter begrepet "antistoffer" polyklonale antistoffer, affinitetsrensede polyklonale antistoffer, monoklonale antistoffer og antigenbindende fragmenter, f.eks. de proteolytiske fragmentene F(ab')2og Fab. Genetisk modifiserte, intakte antistoffer eller fragmenter, f.eks. kimære antistoffer, Fv-fragmenter, enkeltkjedede antistoffer og lignende, så vel som syntetiske antigenbindende peptider og polypeptider, omfattes også. Ikke-humane antistoffer kan humaniseres ved å transplantere ikke-humane CDR til humane rammeverksområder og konstante områder, eller ved å innføre hele ikke-humane variable domener (om ønskelig "tildekket" med en humanlignende overflate ved å erstatte eksponerte aminosyrerester, hvori resultatet er et "fernissert" antistoff'). I noen tilfeller kan humaniserte antistoffer ha beholdt ikke-humane aminosyrerester i de humane rammeverksdomenene i det variable området for å sikre korrekte bindingsegenskaper. Ved humanisering av antistoffer kan den biologiske halveringstid forlenges, og faren for uønskede immunreaksjoner ved tilførsel til mennesker reduseres. Videre kan humane antistoffer fremstilles i transgene, ikke-humane dyr som er blitt modifisert slik at de inneholder humane immunglobulingener, som beskrevet i WIPO-publikasjon WO 98/24893. Det foretrekkes at de endogene immunglobulingenene i disse dyrene er inaktivert eller fjernet, f.eks. ved homolog rekombinasjon.
Antistoffer anses å være spesifikt bindende dersom: 1) de viser en terskelverdi for bindingsaktivitet, og 2) de ikke i vesentlig grad kryssreagerer med beslektede polypeptidmolekyler. En terskelverdi for bindingen bestemmes dersom anti-zcytorl71ig-antistoffer heri bindes til et zcytorl 71ig-polypeptid, -peptid eller en -epitop med en affinitet som er minst ti ganger høyere enn bindingsaffiniteten overfor kontrollpolypeptid (ikke-zcytorl71ig). Det foretrekkes at antistoffene viser en bindingsaffinitet (Ka) på IO<6>M"<1>eller mer, fortrinnsvis IO<7>M'<1>eller mer, mer foretrukket IO<8>M"<1>eller mer, og mest foretrukket IO<9>M"<1>eller mer. Bindingsaffiniteten til et antistoff kan lett bestemmes av en gjennomsnittsfagperson, f.eks. ved Scatchard-analyse (Scatchard, G., Ann. NY Acad. Sei., 57:660-672,1949).
Hvorvidt zcytorl 71ig-antistoffer ikke i vesentlig grad kryssreagerer med beslektede polypeptidmolekyler, kan f.eks. vises ved at antistoffet påviser zcytorl71ig-polypeptid, men ikke kjente, beslektede polypeptider, ved anvendelse av en standard Western blot-analyse (Ausubel et al., ibid.). Eksempler på kjente, beslektede polypeptider er polypeptidene som er beskrevet innen teknikkens stand, f.eks. kjente ortologer og paraloger og lignende kjente medlemmer av en proteinfamilie. Analysen kan også utføres ved anvendelse av ikke-humane zcytorl71ig- og mutante zcytorl71ig-polypeptider. Videre kan antistoffene "analyseres mot" kjente, beslektede polypeptider for isolasjon av en populasjon som spesifikt bindes til zcytorl 71ig-polypeptidene. For eksempel adsorberes antistoffer rettet mot zcytorl 71ig til beslektede polypeptider som er koblet til et uløselig støttemiddel; antistoffer som er spesifikke for zcytorl 71ig, vil renne gjennom støttemidlet under passende bufferbetingelser. Denne behandlingen tillater isolering av polyklonale og monoklonale antistoffer som ikke kryssreagerer med kjente, nært beslektede polypeptider (Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow og Lane (red.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988; Current Protocols in Immunology, Cooligan et al. (red.), National Institutes of Health, John Wiley and Sons, Inc., 1995). Analyse og isolering av spesifikke antistoffer er vel kjent innen faget. Se Fundamental Immunology, Paul (red.), Raven Press, 1993; Getzoff et al., Adv. in Immunol, 45:1-98,1988; Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Goding, J.W. (red.), Academic Press Ltd., 1996; Benjamin et al., Ann. Rev. Immunol., 2:67-101, 1984. Spesifikt bindende anti-zcytorl71ig-antistoffer kan påvises ved en rekke fremgangsmåter som er kjent innen faget, og som beskrives nedenfor.
En rekke analyser som er kjent blant fagfolk, kan benyttes for påvisning av antistoffer som bindes til zcytorl 7-lig-proteiner eller -polypeptider. Eksempler på slike analyser beskrives i detalj i Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow og Lane (red.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988. Representative eksempler på slike analyser omfatter: samtidig immunelektroforese, radioimmunanalyse, radioimmunutfelling, enzymkoblet immun-absorpsjonsanalyse (ELISA), "dot blot"- eller Western blot-analyse, inhiberingsanalyse eller konkurranseanalyse, samt "sandwich"-analyse. I tillegg kan antistoffer analyseres for binding til villtype versus mutant zcytorl 71ig-protein eller -polypeptid.
Antistoffer mot zcytorl 71ig kan anvendes for merking av celler som uttrykker zcytorl 7lig; for isolering av zcytorl71ig ved affinitetsrensing; for diagnostiske analyser for bestemmelse av nivået i sirkulasjonen av zcytorl71ig-polypeptider; for påvisning eller kvantifisering av løselig zcytorl71ig som en markør for underliggende sykdomstilstander eller sykdommer; i analytiske fremgangsmåter som benytter FACS; for gjennomsøking av ekspresjonsbiblioteker; for frembringelse av antiidiotypiske antistoffer; og som nøytraliserende antistoffer eller antagonister for blokkering av zcytorl71ig-aktivitet in vitro og in vivo. Egnede direkte merkelapper eller merkinger omfatter radioaktive isotoper, enzymer, substrater, kofaktorer, inhibitorer, fluorescensmarkører, kjemiluminescensmarkører, magnetiske partikler og lignende; indirekte merkelapper eller merkinger kan omfatte bruk av biotin-avidin eller andre komplement-/antikomplementpar som intermediater. Antistoffer heri kan også konjugeres direkte eller indirekte til medikamenter, toksiner, radioaktive isotoper og lignende, og disse konjugatene anvendes for diagnostiske eller terapeutiske formål in vivo. Videre kan antistoffer mot zcytorl 71ig eller fragmenter derav anvendes in vitro for påvisning av denaturert zcytorl 71ig eller fragmenter derav i analyser, f.eks. Western blot-analyse eller andre analyser som er kjent innen faget.
Egnede påvisbare molekyler kan være direkte eller indirekte koblet til polypeptidet eller antistoffet og omfatter radioaktive isotoper, enzymer, substrater, kofaktorer, inhibitorer, fluorescensmarkører, kjemiluminescensmarkører, magnetiske partikler og lignende. Egnede cytotoksiske molekyler kan være direkte eller indirekte koblet til polypeptidet eller antistoffet, og omfatter bakterietoksiner eller plantetoksiner (f.eks. difteritoksin, saporin, Pseudomonas-eksotoksin, ricin, abrin og lignende), så vel som terapeutiske radioaktive isotoper, slik som jod-131, rhenium-188 eller yttrium-90 (enten direkte koblet til polypeptidet eller antistoffet, eller indirekte tilkoblet ved hjelp av f.eks. en chelaterende gruppe). Polypeptider eller antistoffer kan også være konjugert til cytotoksiske medikamenter, f.eks. adriamycin. For indirekte tilkobling av et påvisbart eller cytotoksisk molekyl kan det påvisbare eller cytotoksiske molekyl være konjugert til et medlem av et komplemenWantikomplementpar, hvor det andre medlemmet er bundet til polypeptid- eller antistoffdelen. For disse formål er biotin/streptavidin et eksempel på et komplement-/antikomplementpar.
Bindende polypeptider kan også fungere som zcytorl 71ig-"antagonister" ved å blokkere zcytorl 71ig-binding og signaloverføring in vitro og in vivo. Disse anti-zcytorl71ig-bindende polypeptidene kan være anvendbare for inhibering av zcytorl 71ig-aktivitet eller - proteinbinding.
Polypeptid-toksinfusjonsproteiner eller antistofftoksinfusjonsproteiner kan anvendes for målstyrt inhibering eller fjerning av celler eller vev (f.eks. for behandling av kreftceller eller kreftvev). Dersom polypeptidet har flere funksjonelle domener (f.eks. et aktiveringsdomene eller et reseptorbindende domene pluss et målstyringsdomene), kan et fusjonsprotein som kun omfatter målstyringsdomenet være egnet for å styre et påvisbart molekyl, et cytotoksisk molekyl eller et komplementært molekyl til en celle- eller vevstype av interesse. I de tilfeller hvor fusjonsproteinet som kun omfatter et domene, omfatter et komplementært molekyl, kan det antikomplementære molekyl være konjugert til et påvisbart eller cytotoksisk molekyl. Slike domene-komplementært molekyl-fusjonsproteiner representerer således en generisk målstyrende bærer eller et bærestoff for celle-/vevsspesifikk tilførsel av generiske antikomplementære-påvi sbare/cytotoksiske molekylkonj ugater.
I en annen utførelse kan zcytorl 71ig-cytokinfusjonsproteiner eller antistoff-cytokinfusjonsproteiner anvendes for dreping in vivo av målvev (f.eks. leukemi, lymfom, lungekreft, colonkreft, melanom, bukspyttkjertelkreft, ovariekreft, hudkreft, blodkreft, benkreft eller andre kreftformer hvori zcytorl 71ig-reseptorer uttrykkes) (se generelt Hornick et al., Blood, §9:4437-47,1997). De beskrevne fusjonsproteiner tillater målstyring av et cytokin til et ønsket virkningssete, hvorved det oppnås en forhøyet lokal cytokinkonsentrasjon. Egnede zcytorl 71ig-polypeptider eller anti-zcytorl71ig-antistoffer styres mot en uønsket celle eller et uønsket vev (f.eks. en tumor eller en leukemi), og det fusjonerte cytokin gir forbedret lysering av målcellen via effektorceller. Egnede cytokiner for dette formål omfatter interleukin 2 og granulocyttmakrofag-kolonistimulerende faktor (GM-CSF).
I nok en utførelse kan, dersom zcytorl 71ig-polypeptidet eller anti-zcytor-171ig-antistoffet målstyres mot vaskulære celler eller vev, et slikt polypeptid eller antistoff være konjugert til en radioaktiv isotop, fortrinnsvis til en beta-utsendende radioaktiv isotop, for reduksjon av restenose. Slike terapeutiske tilnærminger medfører mindre fare for leger som tilfører den radioaktive behandling. For eksempel viste iridium- 192-impregnerte bånd plassert i kar med stent hos pasienter inntil den nødvendige stråledose var tilført, redusert vevsvekst i karet og større luminal diameter enn kontroll-gruppen, som ble tilført placebobånd. Videre var revaskulariseringen og stenttrombosen signifikant lavere i den behandlede gruppe. Tilsvarende resultater forventes ved målstyring av et bioaktivt konjugat som omfatter en radioaktiv isotop, som beskrevet heri.
De bioaktive polypeptid- eller antistoffkonjugatene som beskrives heri, kan tilføres intravenøst, intraarterielt eller intraduktalt, eller de kan innføres lokalt i det påtenkte virkningssete.
Videre er inflammasjon en beskyttende respons hos en organisme for å bekjempe et invaderende middel. Inflammasjon er en kaskadebasert begivenhet som omfatter mange cellulære og humorale formidlere. På den ene side kan undertrykkelse av inflammatoriske responser gjøre at verten blir immunkompromittert, hvis den ikke behandles kan imidlertid inflammasjonen føre til alvorlige komplikasjoner, innbefattet kroniske inflammatoriske sykdommer (f.eks. reumatoid artritt, multippel sklerose, inflammatorisk tarmsykdom og lignende), septisk sjokk og flerorgansvikt. Det er av betydning at disse forskjellige sykdoms- tilstandene har felles inflammatoriske formidlere. Samlingen av sykdommer som særpreges ved inflammasjon, har stor betydning for sykdomsforekomst og dødelighet hos mennesket. Det er derfor åpenbart at antiinflammatoriske antistoffer og bindende polypeptider, f.eks. anti-zcytorl71ig-antistoffer og de bindende polypeptidene som beskrives heri, kan ha avgjørende terapeutisk potensial for et stort antall sykdommer hos mennesker og dyr, fra astma og allergi til autoimmunitet og septisk sjokk. Således kan anvendelse av antiinflammatoriske anti-zcytorl 71ig-antistoffer og bindende polypeptider som beskrives heri, benyttes terapeutisk som zcytorl 71ig-antagonister, som beskrevet heri, særlig ved sykdommer som artritt, endotoksemi, inflammatorisk tarmsykdom, psoriasis og beslektede sykdommer og lignende.
1. Artritt
Artritt, innbefattet osteoartritt, reumatoid artritt, artrittiske ledd som følge av skader og lignende, er vanlige inflammatoriske tilstander som ville dra nytte av terapeutisk anvendelse av antiinflammatoriske antistoffer og bindende polypeptider, f.eks. anti-zcytorl 71ig-antistoffer og -bindende polypeptider ifølge foreliggende oppfinnelse. For eksempel er reumatoid artritt (RA) en systemisk sykdom som påvirker hele kroppen, og som er en av de vanligste former for artritt. Sykdommen særpreges ved inflammasjon av membranen som bekler leddet, noe som gir smerte, stivhet, varme, rødhet og opphovning. Inflammatoriske celler frigir enzymer som kan fordøye ben og brusk. Som en følge av reumatoid artritt kan det betente leddbelegg, synovium, invadere og ødelegge ben og brusk, noe som fører til nedbrytning av leddet og alvorlige smerter, blant andre fysiologiske virkninger. Det angrepne ledd kan miste form og sammenstilling, noe som fører til smerte og tap av bevegelsesevne.
Reumatoid artritt (RA) er en immunformidlet sykdom som særlig særpreges ved inflammasjon og påfølgende vevsskader som fører til alvorlig invalidisering og forhøyet dødelighet. En rekke cytokiner dannes lokalt i de reumatoide ledd. Flere undersøkelser har vist at IL-1 og TNF-alfa, to prototypiske proinflammatoriske cytokiner, spiller en viktig rolle i mekanismene som inngår i synovial inflammasjon og i progressiv ødeleggelse av leddet. Faktisk har tilførsel av TNF-alfa- og IL-1-inhibitorer til pasienter med RA ført til en dramatisk forbedring av kliniske og biologiske tegn på inflammasjon, og en reduksjon av de radiologiske tegn på benerosjon og ødeleggelse av brusk. Trass i disse oppmuntrende resultatene responderer imidlertid en signifikant prosentandel av pasientene ikke på disse midlene, noe som tyder på at andre formidlere også deltar i patofysiologien forbundet med artritt (Gabay, Expert. Opin. Biol. Ther., 2(2):135-149,2002). Én av disse formidlerne kan være zcytorl71ig, og følgelig kan et molekyl som bindes til eller inhiberer zcytorl 71ig, f.eks. anti-zcytorl 71ig-antistoffer eller - bindingspartnere, fungere som et verdifullt terapeutisk middel for reduksjon av inflammasjonen ved reumatoid artritt og andre artrittiske sykdommer.
Flere dyremodeller for reumatoid artritt er kjent innen faget. I den kollagen-induserte artritt(CIA)modell utvikler f.eks. mus kronisk inflammatorisk artritt som ligner svært på human reumatoid artritt. Siden CIA har lignende immunologiske og patologiske egenskaper som RA, er dette en ideell modell for analyse av mulige antiinflammatoriske forbindelser hos mennesket. CIA-modellen er en velkjent modell i mus som avhenger av både en immunrespons og en inflammatorisk respons for å opptre. Den immunologiske respons omfatter interaksjonen mellom B-celler og CD4<+->T-celler som respons på kollagen, som gis som antigen, og fører til dannelse av antikollagenantistoffer. Den inflammatoriske fase er en følge av vevsresponser på inflammasjonsformidlere, som en følge av at noen av disse antistoffene kryssreagerer med musens native kollagen og aktiverer komplementkaskaden. En fordel ved å anvende CIA-modellen er at de basale mekanismene for sykdomsutviklingen er kjent. De relevante T-celle- og B-celleepitopene på kollagen av type II er blitt identifisert, og forskjellige immunologiske (f.eks. hypersensitivitet av forsinket type og antikollagenantistoff) og inflammatoriske (f.eks. cytokiner, kjemokiner og matriksdegraderende enzymer) parametere forbundet med immunformidlet artritt er blitt bestemt og kan således anvendes for å anslå virkningen av forbindelser i CIA-modellen (Wooley, Curr. Opin. Rheum., 3:407-20,1999; Williams et al., Immunol., 59:9784-788, 1992; Myers et al., Life Sei., 67:1861,1997; og Wang et al., Immunol., 92:8955-959,1995).
Tilførsel av polypeptider som omfatter løselig zcytorl7 (innbefattet heterodimere og multimere reseptorer som beskrives heri), f.eks. zcytorl 7-Fc4 eller andre løselige zcytorl 7-proteiner og zcytorl 7-fusjonsproteiner til disse CIA-modellmusene, ble anvendt for å evaluere anvendelse av zcytorl7 for å lindre symptomene og endre sykdomsutviklingen. Siden zcytorl 71ig er et molekyl som modulerer immunresponsen og den inflammatoriske respons, kan molekylet indusere dannelse av SAA, som inngår i sykdomsutviklingen ved reumatoid artritt. Dersom zcytorl 71ig-antagonister kan redusere SAA-aktiviteten in vitro og in vivo, kan systemisk eller lokal tilførsel av zcytorl71ig-antagonister, f.eks. anti-zcytorl 71ig-antistoffer eller -bindingspartnere, zcytorl7-holdige polypeptider (innbefattet heterodimere og multimere reseptorer som beskrives heri), f.eks. zcytorl 7-Fc4 eller andre løselige zcytorl7-proteiner og zcytorl 7-fusjonsproteiner, muligens undertrykke den inflammatoriske respons i RA. Andre mulige terapeutiske midler omfatter zcytorl7-polypeptider, løselige heterodimere og multimere reseptorpolypeptider og anti-zcytorl 71ig-antistoffer eller -bindingspartnere ifølge foreliggende oppfinnelse og lignende.
2. Endotoksemi
Endotoksemi er en alvorlig tilstand som ofte skyldes infeksiøse midler som bakterier og andre infeksiøse sykdomsmidler, sepsis eller toksisk sjokksyndrom, eller som opptrer hos immunkompromitterte pasienter som er utsatt for opportunistiske infeksjoner og lignende. Terapeutisk anvendelse av antiinflammatoriske antistoffer og bindende polypeptider, f.eks. anti-zcytorl 71ig-antistoffer og -bindende polypeptider ifølge foreliggende oppfinnelse, kan bidra til å forhindre og behandle endotoksemi hos mennesker og dyr. Andre mulige terapeutiske midler omfatter zcytorl 7-polypeptider, løselige heterodimere og multimere reseptorpolypeptider og anti-zcytorl 71ig-antistoffer eller-bindingspartnere ifølge foreliggende oppfinnelse og lignende, og disse kan fungere som verdifulle terapeutiske midler for å redusere inflammasjonen og de patologiske virkninger ved endotoksemi.
Lipopolysakkarid(LPS)-indusert endotoksemi benytter mange av de proinflammatoriske formidlerne som gir patologiske virkninger ved infeksiøse sykdommer, og LPS-indusert endotoksemi hos gnagere er en hyppig anvendt og akseptert modell for å undersøke de farmakologiske virkningene av mulige proinflammatoriske eller immunmodulerende midler. LPS, som dannes i gramnegative bakterier, er en viktig komponent ved sykdomsutviklingen ved septisk sjokk (Glausner et al., Lancet, 338:132,1991). En sjokklignende tilstand kan faktisk induseres eksperimentelt ved en enkelt injeksjon av LPS i dyr. Molekyler som produseres av celler som responderer på LPS, kan være direkte eller indirekte rettet mot patogener. Selv om disse biologiske responsene beskytter verten mot invaderende patogener, kan de også gi skader. Således fører en massiv stimulering av den iboende immunitet, som opptrer som følge av en alvorlig infeksjon med gramnegative bakterier, til overdreven produksjon av cytokiner og andre molekyler og utvikling av et dødelig syndrom, septisk sjokksyndrom, som særpreges ved feber, hypotensjon, disseminert intravaskulær koagulasjon og flerorgansvikt (Dumitru et al., Cell, 705:1071-1083, 2000).
Disse toksiske virkningene av LPS er hovedsakelig forbundet med makrofag-aktivering, som fører til frigivelse av flere inflammatoriske formidlere. Blant disse formidlerne ser det ut til at TNF spiller en avgjørende rolle, som vist ved at LPS-toksisitet kan forhindres ved tilførsel av nøytraliserende anti-TNF-antistoffer (Beutler et al., Science, 229:869,1985). Det er veletablert at injeksjon av 1 jag LPS fra E. coli i en C57Bl/6-mus vil føre til signifikant økning i sirkulasjonen av IL-6, TNF-alfa, IL-1 og akutt fase-proteiner (f.eks. SAA) ca. 2 timer etter injeksjonen. Toksisiteten av LPS ser ut til å formidles av disse cytokinene, siden passiv immunisering mot disse formidlerne kan føre til redusert dødelighet (Beutler et al., Science, 229:869,1985). Mulige immun-intervenerende strategier for forebyggelse og/eller behandling av septisk sjokk omfatter anti-TNF-mAb, IL-l-reseptorantagonist, LIF, IL-10 og G-CSF. Siden LPS induserer dannelse av proinflammatoriske faktorer som muligens bidrar til sykdomsutviklingen ved endotoksemi, kan nøytralisering av zcytorl 71ig-aktivitet, SAA eller andre proinflammatoriske faktorer ved å antagonisere zcytorl 71ig-polypeptidet anvendes for å redusere symptomene på endotoksemi, som observert ved endotoksisk sjokk. Andre mulige terapeutiske midler omfatter zcytorl 7-polypeptider, løselige heterodimere og multimere reseptorpolypeptider og anti-zcytorl 71ig-antistoffer eller -bindingspartnere ifølge foreliggende oppfinnelse og lignende.
3. Inflammatorisk tarmsykdom. IBP
I De forente stater lider ca. 500 000 personer av inflammatorisk tarmsykdom (IBD), som kan påvirke enten colon og rektum (ulcerøs kolitt) eller begge, tynntarmen og tykktarmen (Crohns sykdom). Patogenesen av disse sykdommene er uklar, men omfatter kronisk inflammasjon av de angrepne vev. Mulige terapeutiske midler omfatter zcytorl 7-polypeptider, løselige heterodimere og multimere reseptorpolypeptider og anti-zcytor-171ig-antistoffer eller - bindingspartnere ifølge foreliggende oppfinnelse og lignende, og disse kan fungere som verdifulle terapeutiske midler for reduksjon av inflammasjonen og de patologiske virkninger ved IBD og beslektede sykdommer.
Ulcerøs kolitt (UC) er en inflammatorisk sykdom i tykktarmen, vanligvis betegnet colon, som særpreges ved inflammasjon og sårdannelse i slimhinnen eller det innerste lag av colon. Denne inflammasjonen gjør at colon tømmes hyppig, noe som fører til diaré. Symptomene omfatter løs avføring og tilhørende underlivskramper, feber og vekttap. Selv om den presise grunnen til UC er ukjent, tyder nyere undersøkelser på at kroppens naturlige forsvarsmekanismer opererer mot proteiner i kroppen som kroppen anser som fremmede (en "autoimmunreaksjon"). Kanskje på grunn av at de ligner bakterieproteiner i tarmen, kan disse proteinene enten innlede eller stimulere inflammasjonsprosessen som begynner å ødelegge veggen i colon. Etter hvert som colonveggen ødelegges, dannes sår som frigir slim, puss og blod. Sykdommen begynner vanligvis i rektumområdet og kan til slutt omfatte hele tykktarmen. Gjentatte inflammasjons-episoder fører til en fortykning av tarmveggen og rektum med arrvev. Colonvevsdød eller sepsis kan opptre med alvorlig sykdom. Symptomene på ulcerøs kolitt varierer i omfang, og sykdomsutviklingen kan være gradvis eller plutselig. Attakkene kan utløses av mange faktorer, innbefattet infeksjoner i respirasjonssystemet eller stress.
Selv om det i dag ikke er tilgjengelig noen kur for UC, fokuserer behandlingen på å undertrykke den unormale inflammasjonsprosess i colonveggen. Behandlingsformer som omfatter kortikosteroider, immunsupprimerende midler (f.eks. azatioprin, merkaptopurin og metotreksat) og aminosalisylater er tilgjengelige for behandling av sykdommen. Anvendelse over lang tid av immunsuppirmerende midler som kortikosteroider og azatioprin kan imidlertid føre til alvorlige bivirkninger, innbefattet fortynning av ben, katarakter, infeksjon og virkninger i lever og benmarg. Hos pasienter hvor dagens behandlingsformer ikke er vellykkede, er kirurgisk behandling en mulighet. Kirurgisk behandling omfatter fjerning av hele colon og rektum.
Det finnes flere dyremodeller som delvis kan etterligne kronisk ulcerøs kolitt. Den hyppigst anvendte modell er den 2,4,6-trinitrobenzensulfonsyre/-etanol(TNBS)-induserte kolittmodell, som induserer kronisk inflammasjon og ulcerasjon i colon. Når TNBS innføres i colon hos utsatte mus via intrarektal innføring, induseres en T-celleformidlet immunrespons i slimhinnene i colon, noe som i dette tilfellet fører til en massiv slimhinneinflammasjon som særpreges ved tett infiltrasjon av T-celler og makrofager gjennom hele tykktarmens vegg. Dette histopatologiske bildet er videre ledsaget av et klinisk bilde som omfatter progressivt vekttap (avmagring), blodig diaré, rektal prolaps og fortykkelse av tykktarmsveggen (Neurath et al., Intern. Rev. Immunol., 79:51-62,2000).
En annen kolittmodell benytter dekstransulfatnatrium (DSS), som induserer en akutt kolitt som manifesterer seg ved blodig diaré, vekttap, forkortelse av colon og sårdannelse i slimhinnene med nøytrofil infiltrasjon. DSS-indusert kolitt særpreges histologisk ved infiltrering av inflammatoriske celler i lamina propria med lymfoid hyperplasi, fokalkryptødeleggelse og sårdannelse i epitelet. Disse endringene antas å utvikles grunnet en toksisk virkning av DSS på epitelet og ved fagocytose av lamina propria-celler og dannelse av TNF-alfa og IFN-gamma. Trass i at modellen anvendes hyppig, er flere spørsmål vedrørende mekanismene for DSS og relevansen for sykdommen hos mennesker uløste. DSS anses som en T-celleuavhengig modell, siden den observeres hos T-cellemanglende dyr, f.eks. SCID-mus.
Tilførsel av anti-zcytorl 71ig-antistoffer eller -bindingspartnere, løselige zcytorl 7-holdige polypeptider (innbefattet heterodimere og multimere reseptorer), f.eks. løselige zcytorl 7-Fc4-proteiner eller andre zcytorl 7-fusjonsproteiner, til TNBS-modellen eller DSS-modellen kan anvendes for å evaluere anvendelse av zcytorl71ig-antagonister for å lindre symptomer og endre forløpet av mage-tarmsykdommer. Zcytorl 71ig kan spille en rolle i den inflammatoriske respons ved kolitt, og nøytralisering av zcytorl 71ig-aktiviteten ved tilførsel av zcytorl 71ig-antagonister er en mulig terapeutisk tilnærming for IBD. Andre mulige terapeutiske midler omfatter zcytorl 7-polypeptider, løselige heterodimere og multimere reseptorpolypeptider og anti-zcytorl 71ig-antistoffer eller-bindingspartnere ifølge foreliggende oppfinnelse og lignende.
4. Psoriasis
Psoriasis er en kronisk hudtilstand som rammer mer enn 7 millioner amerikanere. Psoriasis opptrer når nye hudceller vokser unormalt, noe som fører til betente, hovne og flassende områder på huden hvor den gamle huden ikke har løsnet hurtig nok. Plakkpsoriasis, den vanligste formen, særpreges ved betente områder på huden ("lesjoner") som er dekket med sølvaktige, hvite skjell. Psoriasis kan være begrenset til noen få plakk eller omfatte moderate til omfattende hudområder, og opptrer vanligvis på hodebunn, kne, albu og kropp. Selv om sykdommen er svært synlig, er psoriasis ikke en smittsom sykdom. Sykdomsutviklingen omfatter kronisk inflammasjon av de rammede vev. Zcytorl 71ig-polypeptider, løselige heterodimere og multimere reseptorpolypeptider og anti-zcytorl71ig-antistoffer eller-bindingspartnere ifølge foreliggende oppfinnelse og lignende kan fungere som verdifulle terapeutiske midler for å redusere inflammasjonen og de patologiske virkningene ved psoriasis, andre inflammatoriske hudsykdommer, allergi i hud og slimhinner og beslektede sykdommer.
Psoriasis er en T-celleformidlet inflammatorisk hudforstyrrelse som kan gi betydelig ubehag. Det er en sykdom som det ikke finnes noen kur for, og som påvirker personer i alle aldre. Psoriasis rammer ca. 2 % av befolkningen i Europa og Nord-Amerika. Selv om individer med mild psoriasis ofte kan kontrollere sykdommen med topiske midler, krever mer enn 1 million pasienter over hele verden ultrafiolett behandling eller systemisk immun-supprimerende behandling. Uheldigvis begrenser ulempene og farene forbundet med ultrafiolett stråling og giftigheten av mange terapeutiske midler anvendelse over lengre tid. Videre opplever pasientene vanligvis at psoriasisen vender tilbake, noen ganger kraftigere, kort tid etter at den immun-supprimerende behandling er opphørt.
Differensiering er en progressiv og dynamisk prosess som begynner med pluripotente stamceller og som avslutter med terminalt differensierte celler. Pluripotente stamceller som kan regenereres uten å være forpliktet til en gitt cellelinje, uttrykker et sett av differensieringsmarkører som går tapt når cellene forpliktes til en gitt cellelinje. Forløperceller uttrykker et sett av differensieringsmarkører som kan, men ikke må, fortsette å uttrykkes etter hvert som cellene beveger seg gjennom cellelinjens utviklingsvei mot modning. Differensier-ingsmarkører som kun uttrykkes av modne celler, har ofte funksjonelle egenskaper, f.eks. celleprodukter, enzymer som danner celleprodukter og reseptorer. Et cellepopulasjons-differensieringsstadium følges ved å identifisere markører som foreligger i cellepopulasjonen.
Det finnes materiale som antyder at faktorer som stimulerer spesifikke celletyper ned en differensieringsvei mot terminal differensiering eller dedifferensiering, og som påvirker hele cellepopulasjonen, har sitt opphav i en felles forløpercelle eller stamcelle. Foreliggende oppfinnelse omfatter således stimulering eller inhibering av proliferasjonen av lymfoide celler, hematopoietiske celler og epitelceller.
Zcytorl71ig ble isolert fra vev som vites å ha en viktig immunologisk funksjon, og som inneholder celler som spiller en rolle i immunsystemet. Zcytorl 71ig uttrykkes i CD3<+->selekterte, aktiverte celler fra perifert blod, og det er blitt vist at zcytorl71ig-ekspresjonen økes etter T-celleaktivering. Videre antyder resultatene fra eksperimenter som beskrives i eksempelseksjonen heri, at polypeptider ifølge foreliggende oppfinnelse kan ha en virkning på vekst/ekspansjon av monocytter/makrofager, T-celler, B-celler og NK-celler og/eller det differensierte stadium av monocytter/makrofager, T-celler, B-celler, NK-celler eller disse cellenes forløpere. Faktorer som både stimulerer proliferasjon av hematopoietiske forløperceller og som aktiverer modne celler, er generelt kjent, proliferasjon og aktivering kan imidlertid også kreve ytterligere vekstfaktorer. Det er f.eks. blitt vist at IL-7 og Steel-faktor (c-sett-ligand) var nødvendig for kolonidannelse av NK-forløperceller. IL-15 + IL-2 i kombinasjon med IL-7 og Steel-faktor var mer effektive (Mrozek et al., Blood, 57:2632-2640,1996). Ikke identifiserte cytokiner kan imidlertid være nødvendige for proliferasjon av spesielle undergrupper av NK-celler og/eller NK-forløperceller (Robertson et al., Blood, 76:2451-2438,1990). På tilsvarende måte kan zcytorl 71ig virke alene eller sammen med eller i synergi med andre cytokiner for å fremme vekst, proliferasjon, ekspansjon og modifisering av differensieringen av monocytter/- makrofager, T-celler, B-celler eller NK-celler.
Analyser som måler differensiering, omfatter f.eks. måling av cellemarkører som er forbundet med stadiumspesifikk ekspresjon i et vev, enzymatisk aktivitet, funksjonell aktivitet eller morfologiske endringer (Watt, FASEB, 5:281-284,1991; Francis, Differentiation, 57:63-75, 1994; Raes, Adv. Anim. Cell Biol. Technol. Bioprocesses, 161-171,1989). Alternativt kan zcytorl71ig-polypeptidet selv fungere som ytterligere en celleoverflatemarkør eller utskilt markør som er forbundet med stadiumspesifikk ekspresjon i et vev. Således kan direkte måling av zcytorl 71ig-polypeptid eller manglende ekspresjon i et vev etter hvert som det differensieres, fungere som en markør for differensiering av vev.
På tilsvarende måte kan direkte måling av zcytorl 7- lig-polypeptid eller tap av ekspresjonen i et vev utføres i et vev eller i celler etter hvert som de gjennomgår utvikling til en tumor. Økt invasivitet og motilitet av celler, eller vinst eller tap av ekspresjon av zcytorl 71ig i en tilstand som kan utvikles til kreft eller en krefttilstand, sammenlignet med normalt vev, kan fungere som et diagnostisk middel for transformasjon, invasjon og metastase i tumorutviklingen. Således vil kjennskap til en tumors utviklingsstadium eller metastasestadium hjelpe den behandlende lege ved valg av den mest egnede behandlingsform, eller hvor aggressiv behandlingen skal være for en gitt enkelt kreftpasient. Fremgangsmåter for måling av vinst eller tap av ekspresjon (av enten mRNA eller protein) er vel kjent innen faget og beskrives heri, og kan anvendes på zcytorl 71ig-ekspresjon. For eksempel kan forekomst eller forsvinning av polypeptider som regulerer cellemotiliteten, anvendes som diagnostisk og prognostisk hjelpemiddel for prostatakreft (Banyard, J. og Zetter, B.R., Cancer and Metast. Rev., 17:449-458, 1999). Som en effektor av cellemotilitet kan vinst eller tap av ekspresjon av zcytorl 71ig fungere som et diagnostisk middel for lymfoid kreft, B-cellekreft, epitelkreft, hematopoietisk kreft og andre kreftformer.
Videre kan aktiviteten og virkningen av zcytorl 71ig på tumorutvikling og metastase måles in vivo. Flere syngeneiske musemodeller er blitt utviklet for å undersøke virkningen av polypeptider, forbindelser eller andre behandlingsformer på tumorutviklingen. I disse modellene implanteres tumorceller som er blitt dyrket i kultur i mus fra samme stamme som tumordonoren. Cellene vil utvikles til tumorer med like egenskaper i mottakermusene, og metastase vil også opptre i noen av modellene. Egnede tumormodeller for våre undersøkelser omfatter blant annet Lewis-lungekarsinom (ATCC nr. CRL-1642) og B-16-melanom (ATCC nr. CRL-6323). Begge disse er vanlig anvendte tumorcellelinjer som er syngeneiske for C57BL6/J-mus, og som lett kan dyrkes og manipuleres in vitro. Tumorer som skyldes implantasjon av en av disse cellelinjene, kan metastasere til lungene hos C57BL6/J-mus. Lewis-lungekarsinom-modellen er nylig blitt anvendt i mus for å påvise en angiogeneseinhibitor (0'Reilly, M.S. et al., Cell, 79:315-328,1994). C57BL6/J-mus behandles med et eksperimentelt middel, enten ved daglig injeksjon av rekombinant protein, agonist eller antagonist, eller ved injeksjon én gang av rekombinant adenovirus. Tre dager etter behandlingen implanteres IO<5->IO<6>celler under rygghuden. Alternativt kan cellene selv infiseres med rekombinant adenovirus, f.eks. virus som uttrykker zcytorl 71ig, før implantasjonen, slik at proteinet syntetiseres i tumorsetet eller intracellulært, snarere enn systemisk. Musene utvikler vanligvis synlige tumorer i løpet av 5 dager. Tumorene får vokse over et tidsrom på opptil 3 uker, i løpet av hvilke de kan nå en størrelse på 1500-1800 mm ■a i den behandlede kontrollgruppe. Tumorens størrelse og kroppsvekten måles nøye gjennom hele eksperimentet. Når dyrene avlives, fjernes tumoren og veies sammen med lunger og lever. Lungevekten er blitt vist å korrelere godt med den metastatiske tumorbelastning. Som ytterligere et mål telles antall metastaser i lungeoverflaten. Tumor, lunge og lever forberedes for histopatologisk undersøkelse, immunhistokjemisk analyse og in s/fu-hybridisering ved anvendelse av fremgangsmåter som er kjent innen faget, og som beskrives heri. Virkningen av det uttrykte polypeptid det gjelder, f.eks. zcytorl71ig, på tumorens evne til å rekruttere vaskulatur og gjennomgå metastaser kan nå anslås. I tillegg til å anvende adenovirus, kan de implanterte cellene også transfekteres forbigående med zcytorl71ig. Anvendelse av stabile zcytorl 71ig-transfektanter, så vel som anvendelse av induserbare promotere for aktivering av zcytorl 71ig-ekspresjonen in vivo, er kjent innen faget og kan anvendes i dette systemet for å anslå metastaseinduksjon ved zcytorl71ig. Videre kan renset zcytorl71ig eller kondisjonert zcytorl 71ig-medium injiseres direkte i denne musemodellen, og således anvendes i dette systemet. For en generell referanse, se 0'Reilly, M.S. et al., Cell, 79:315-328,1994; og Rusciano, D. et al., Murine Models of Liver Metastasis, Invasion Metastasis, 74:349-361,1995.
Zcytorl71ig eller antistoffer rettet mot liganden vil være anvendbare ved behandling av tumorgenese, og vil derfor være anvendbar ved behandling av kreft. Zcytorl 71ig uttrykkes i aktiverte T-celler, monocytter og makrofager, og er koblet til et område i humane kromosomer hvor translokasjoner ofte opptrer ved leukemier. Videre er zcytorl 71ig blitt vist å virke gjennom en cytokinreseptor, zcytorl7, som også uttrykkes i aktiverte T-celler, monocytter og makrofager. Overstimulering av aktiverte T-celler, monocytter og makrofager med zcytorl71ig kan føre til en menneskelig sykdomstilstand, f.eks. en immuncellekreftform eller andre kreftformer. Således kan påvisning av zcytorl 71ig-ekspresjon, zcytorl71ig-polypeptider (f.eks. med anti-zcytorl71ig-antistoffer, løselige zcytorl7-reseptorer (f.eks. zcytorl 7-reseptor, heterodimerer (f.eks. zcytorl 7/OSMRbeta, zcytorl 7/WSX-l), multimerer (f.eks. zcytorl 7/OSMRbeta/WSX-1)) eller andre zcytorl71ig-bindingspartnere) fungere som et diagnostisk middel og fungere som antagonister av den proliferative aktivitet av zcytorl71ig. Liganden kan tilføres i kombinasjon med andre midler som allerede anvendes, innbefattet både konvensjonelle kjemoterapeutiske midler og immunmodulerende midler som interferon-alfa. Alfa-/beta-interferoner er blitt vist å være effektive ved behandling av noen leukemier og sykdomsmodeller i dyr, og de vekstinhiberende virkningene av interferon-alfa og zcytorl 71ig kan være additive.
NK-celler antas å spille en viktig rolle ved fjerning av metastatiske tumorceller, og pasienter med både metastaser og faste tumorer har redusert nivå av NK-celleaktivitet (Whiteside et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol., 230:221-244,1998). Et middel som stimulerer NK-celler, vil være anvendbart for fjerning av tumorer.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en fremgangsmåte for redusering av proliferasjonen av neoplastiske monocytter/makrofager som omfatter tilførsel til et pattedyr med en monocytt-/makrofagplasi av en mengde av et preparat av zcytorl71ig eller anti-zcytorl71ig som er tilstrekkelig til å redusere proliferasjonen av de neoplastiske monocyttene/makrofagene. I andre utførelser kan preparatet omfatte minst ett annet cytokin. Dette andre cytokinet kan være utvalgt fra gruppen bestående av IL-2, IL-3, IL-12, IL-21, IL-22, IL-15, IL-4, GM-CSF, Flt3-ligand og stamcellefaktor.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en fremgangsmåte for inhibering av aktivering eller differensiering av monocytter/makrofager. Monocytter er ikke fullstendig differensierte celler som migrerer til forskjellige vev hvor de modnes og blir makrofager. Makrofagene spiller en sentral rolle i immunresponsen ved at de presenterer antigen for lymfocytter og spiller en understøttende rolle som aksessoriske celler for lymfocytter ved at de utskiller flere cytokiner. Makrofager kan internalisere ekstracellulære molekyler og har etter aktivering økt evne til å drepe intracellulære mikroorganismer og tumorceller. Aktiverte makrofager deltar også i stimulering av akutt eller lokal inflammasjon.
I en annen utførelse tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for reduksjon av proliferasjonen av neoplastiske B- eller T-celler, som omfatter tilførsel til et pattedyr med en B- eller T-celleneoplasi av en mengde av et preparat av zcytorl71ig-antagonist som er tilstrekkelig til å redusere proliferasjonen av de neoplastiske monocyttene/makrofagene. I andre utførelser kan preparatet omfatte minst ett annet cytokin, hvori dette andre cytokin kan være utvalgt fra gruppen bestående av IL-2, IL-3, IL-12, IL-21, IL-22, IL-15, IL-4, GM-CSF, Flt3-ligand og stamcellefaktor. Videre kan zcytorl 71ig-antagonisten være et ligand-/toksinfusj onsprotein.
Et zcytorl71ig-saporinfusjonstoksin kan anvendes mot et tilsvarende sett av leukemier og lymfomer, slik at området av leukemier som kan behandles med zcytorl 7-lig utvides. Slike leukemier kan f.eks. være leukemier som overuttrykker zcytorl 7-reseptorer (f.eks. zcytorl 7-reseptor, heterodimerer (f.eks. zcytorl 7/OSMRbeta, zcytorl 7/WSX-l), multimerer
(f.eks. zcytorl 7/OSMRbeta/WSX-l)). Fusjontoksinformidlet aktivering av zcytorl 7-reseptoren, zcytorl 7-reseptorheterodimerer eller-multimerer (f.eks. zcytorl 7/OSMRbeta, zcytorl 7/WSX-l eller zcytorl9/WSX-1/OSMR) tilveiebringer to uavhengige midler for inhibering av målcellenes vekst, hvor den første er identisk med virkningene som oppnås med liganden alene, og hvor den andre skyldes tilførsel av toksinet ved internalisering av reseptoren. Det lymfoid- og monocytt-begrensede ekspresjonsmønster for zcytorl 7-reseptoren antyder at ligand-saporinkonjugatet kan tolereres av pasienter.
Dersom behandling av ondartede tilstander omfatter transplantasjon av allogeneisk benmarg eller stamceller, kan zcytorl 71ig være av verdi for å forsterke transplantat versus tumor-virkningen. Zcytorl 71ig kan stimulere dannelse av lyttiske NK-celler fra forløpere i benmarg og stimulere proliferasjon av monocytter og makrofager etter aktivering av antigen-reseptorene. Når pasienter gis allogeneiske benmargs-transplantater, vil derfor zcytorl 71ig fremme dannelse av antitumorresponser, med eller uten infusjon av donorlymfocytter.
Vevsfordelingen av reseptorer for et gitt cytokin gir sterke signaler om mulige virkningsseter for cytokinet. Ekspresjon av zcytorl 7 ble observert i monocytter og B-celler, med dramatisk økning av ekspresjonen etter aktivering for CD3<+->, CD4<+->og CD8<+->T-celler. I tillegg var to monocyttcellelinjer, THP-1 (Tsuchiya et al., Int. J. Cancer, 26:171-176,1980) og U937 (Sundstrom et al., Int. J. Cancer, 77:565-577,1976) også positive for zcytorl 7-ekspresjon.
Northern-analyse av WSX-1-reseptor viste transkripter i alle undersøkte vev med forhøyet ekspresjonsnivå i milt, brissel, lymfeknute, benmarg og leukocytter fra perifert blod hos mennesket. Ekspresjonsnivået av WSX-1 ble også forhøyet ved aktivering av T-celler.
Ekspresjonen av OSMR er rapportert å være svært bred (Mosley et al., JBC, 277:32635-32643,1996). Denne fordelingen av zcytorl7-reseptor, WSX-1-reseptor og OSM-reseptor antyder en rolle for zcytorl71ig i immunresponser, særlig ekspansjon av T-celler etter aktivering, eller en rolle i monocytt-/makrofaggrenen av immunsystemet.
Spesielle utførelser av foreliggende oppfinnelse er således rettet mot anvendelse av løselige zcytorl7/WSX-l/OSMR- og zcytorl7/OSMR-heterodimerer som antagonister ved inflammatoriske sykdommer og immunsykdommer eller tilstander som pankreatitt, diabetes av type I (IDDM), bukspyttkjertelkreft, pankreatitt, Graves sykdom, inflammatorisk tarmsykdom (IBD), Crohns sykdom, colonkreft og tramkreft, divertikulose, autoimmune sykdommer, sepsis, ved transplantasjon av organer eller benmarg, inflammasjon grunnet traume, kirurgisk behandling eller infeksjon, amyloidose, splenomegali, "graft versus host"-sykdom, og hvor det er ønskelig med inhibering av inflammasjon, immunsuppresjon, reduksjon av proliferasjonen av hematopoietiske celler, immunceller, inflammatoriske celler eller lymfoide celler, makrofager, T-celler (innbefattet Thl- og Th2-celler, CD4<+->og CD8<+->celler) eller suppresjon av immunresponsen mot et patogen eller antigen. Videre viste nærvær av zcytorl 7-ekspresjon i aktiverte immunceller, f.eks. aktiverte CD4<+->og CD19<+->celler, at zcytorl 7-reseptoren kan være involvert i kroppens immunforsvarsreaksjoner mot invasjon, f.eks. ved mikroorganismer og cellerester, og kan spille en rolle i immunresponser under inflammasjon og kreftutvikling. Således kan antistoffer og bindingspartnere ifølge foreliggende oppfinnelse som er agonistiske eller antagonistiske for zcytorl7-reseptorfunksjonen, f.eks. zcytorl 71ig, anvendes for å modifisere immunrespons og inflammasjon.
Strukturen og vevsekspresjonen av zcytorl 71ig tyder på en rolle i tidlig hematopoietisk utvikling eller tymocyttutvikling og immunresponsregulering eller inflammasjon. Disse prosessene omfatter stimulering av celleproliferasjon og differensiering som respons på binding av ett eller flere cytokiner til sine tilhørende reseptorer. I lys av vevsfordelingen som er observert for zcytorl71ig, har agonister (innbefattet den eller de naturlige reseptorene) og antagonister et enormt anvendelsespotensial, både in vitro og in vivo. Forbindelser som er vist å være zcytorl71ig-agonister, er anvendbare for å stimulere proliferasjon og utvikling av målceller in vitro og in vivo. For eksempel er agonistforbindelser, zcytorl 71ig eller anti-zcytorl 71ig-antistoffer anvendbare som bestanddeler i definerte celledyrkningsmedier og kan anvendes alene eller i kombinasjon med andre cytokiner og hormoner for å erstatte serum, som vanligvis anvendes ved celledyrkning. Agonister er således anvendbare for spesifikt å fremme vekst og/eller utvikling eller aktivering av monocytter, T-celler, B-celler og andre celler fra den lymfoide og myeloide linje og hematopoietiske celler i kultur.
Zcytorl 71ig kan være anvendbar for stimulering av celleformidlet immunitet og for stimulering av lymfocyttproliferasjon, f.eks. ved behandling av infeksjoner som omfatter immunsuppresjon, innbefattet visse virusinfeksjoner. Ytterligere anvendelser omfatter tumor-suppresjon, hvor ondartet transformasjon fører til tumorceller som er antigene. Zcytorl 71ig kan anvendes for å indusere cytotoksisitet som kan formidles ved aktivering av effektorceller som T- celler, NK-celler (naturlige dreperceller) eller LAK-celler (lymfoide aktiverte dreperceller) eller induseres direkte ved apoptotiske reaksjonsveier. Zcytorl 71ig kan også være anvendbar for behandling av leukopenier ved at nivået av den påvirkede celletype økes, og for å fremme re-generering av T-celle-repertoaret etter benmargstransplantasjon, eller for å forsterke proliferasjon eller aktivering av monocytter og for diagnostiske formål og andre formål som beskrives heri.
Zcytorl71ig kan finne anvendelser ved suppresjon av immunsystemet, f.eks. ved behandling av autoimmune sykdommer, innbefattet reumatoid artritt, multippel sklerose, diabetes mellitus, inflammatorisk tarmsykdom, Crohns sykdom osv. Immunsuppresjon kan også anvendes for å redusere avvisningen av vevs- eller organ-transplantater og for behandling av T-celle-, B-celle- eller monocyttspesifikke leukemier eller lymfomer og andre kreftformer ved at proliferasjonen av den påvirkede celletype inhiberes. Videre kan zcytorl71ig anvendes for påvisning av monocytter, makrofager og aktiverte T-celler og bidra til diagnose av slike autoimmune sykdommer, fortrinnsvis ved sykdomstilstander hvori monocyttnivået er forhøyet eller monocyttene er aktiverte.
Zcytorl 71ig-polypeptider, -peptider, -antistoffer og lignende kan også anvendes i diagnostiske systemer for bestemmelse av zcytorl71ig-nivået i sirkulasjonen. I en beslektet utførelse kan antistoffer eller andre midler som spesifikt bindes til zcytorl71ig-polypeptider, anvendes for påvisning av zcytorl71ig-polypeptider i sirkulasjonen. Forhøyet eller redusert nivå av ligandpolypeptider kan være en indikasjon på patologiske tilstander, innbefattet kreft. Zcytorl 71ig-polypeptider kan bidra til patologiske prosesser og kan være en indirekte markør for en underliggende sykdom.
Videre kan zcytorl 71ig anvendes for å påvise eller for styring til sin reseptor eller sine reseptorer ved visse sykdomstilstander. For eksempel er forhøyet nivå av løselig IL-2-reseptor i humant serum blitt forbundet med et bredt utvalg av inflammatoriske og neoplastiske tilstander, f.eks. myokardinfarkt, astma, myasthenia gravis, reumatoid artritt, akutt T-celle-leukemi, B-cellelymfomer, kronisk lymfocyttisk leukemi, colonkreft, brystkreft og ovariekreft (Heaney et al., Blood, 57:847-857,1996). På tilsvarende måte er zcytorl 7-reseptor forhøyet i aktiverte monocytter, og således kan zcytorl 7-reseptor og/eller dens løselige reseptorer være forbundet med eller fungere som en markør for inflammatoriske og neoplastiske tilstander som er forbundet med den. Zcytorl 71ig, innbefattet cytotoksiske konjugater, kan således anvendes for påvisning eller målstyring til slike vev og sykdomstilstander.
Molekylene ifølge foreliggende oppfinnelse har spesiell anvendelighet i monocytt-/makrofaggrenen av immunsystemet. Fremgangsmåter som kan anslå en slik aktivitet, er kjent. For eksempel er interferon-gamma (IFNy) en kraftig aktivator av mononukleære fagocytter. For eksempel kan en økning i ekspresjonen av zcytorl7 ved aktivering av TH.P-1 -celler (ATCC nr. TIB-202) med interferon-gamma tyde på at denne reseptoren deltar i monocyttaktivering. Monocytter er ufullstendig differensierte celler som migrerer til forskjellige vev hvor de modnes og blir makrofager. Makrofager spiller en sentral rolle i immunresponsen ved å presentere antigen for lymfocytter og spille en understøttende rolle som aksessoriske celler for lymfocytter ved at de skiller ut flere cytokiner. Makrofager kan internalisere ekstracellulære molekyler og har etter aktivering økt evne til å drepe intracellulære mikroorganismer og tumorceller. Aktiverte makrofager deltar også i stimulering av akutt eller lokal inflammasjon. Videre er monocytt-/makrofagfunksjonen blitt vist å være unormal i en rekke sykdomstilstander. Se f.eks. Johnston, R.B., New Eng. J. Med., 375:747-752,1998.
En fagperson vil innse at agonister av zcytorl 71ig-reseptor, f.eks. zcytorl 71ig, er anvendbare. For eksempel er redusert migrasjon av monocytter blitt rapportert i populasjoner som er predisponert for infeksjon, f.eks. nyfødte spedbarn, pasienter som gis kortikosteroid eller annen immunsupprimerende behandling og pasienter med diabetes mellitus, brannskader eller AIDS. Agonister for zcytorl7, f.eks. zcytorl71ig, kan bidra til en økning av monocyttenes evne til å migrere og muligens forhindre infeksjon i disse populasjonene. Det er også en omfattende defekt i fagocyttisk dreping ved mononukleære fagocytter fra pasienter med kronisk granulomatøs sykdom. Dette fører til dannelse av subkutane abscesser så vel som abscesser i lever, lunge, milt og lymfeknute. En agonist av zcytorl 7-reseptor, f.eks. zcytorl 71ig, kan tenkes å korrigere eller forbedre denne fagocyttiske defekten. I tillegg er defekt monocyttcytotoksisitet blitt rapportert hos pasienter med kreft og Wiskott-Aldrich-syndrom (eksem, trombocytopeni og tilbakevendende infeksjoner). Aktivering av monocytter med agonister av zcytorl 7-reseptor, f.eks. zcytorl 71ig, kan bidra til behandling av disse tilstandene. Monocytt-makrofagsystemet deltar i fremtredende grad i flere lipidlagringssykdommer (sfingolipidoser), f.eks. Gauchers sykdom. Resistens overfor infeksjon kan være svekket grunnet en defekt i makrofagfunksjonen, noe som kan behandles med agonister av zcytorl 7-reseptor, f.eks. zcytorl 71ig.
Videre vil en fagperson innse at antagonister av zcytorl 71ig er anvendbare. I aterosklerotiske lesjoner er f.eks. en av de første unormalitetene lokalisering av monocytter/- makrofager til endotelceller. Disse lesjonene kunne forhindres ved anvendelse av antagonister av zcytorl71ig. Anti-zcytorl71ig-antistoffer (f.eks. nøytraliserende zcytorl71ig-antistoff), løselige zcytorl7-reseptorer, heterodimerer og multimerer og zcytorl71ig-bindingspartnere kan også anvendes som antagonister av zcytorl 71ig. Videre er monoblastisk leukemi forbundet med en rekke kliniske unormaliteter som gjenspeiler frigivning av makrofagenes biologiske produkter, hvor eksempler omfatter høyt lysozymnivå i serum og urin, og kraftig feber. Videre viser slike leukemier en unormal økning i mengden monocyttiske celler. Disse virkningene kunne muligens forhindres av antagonister av zcytorl 71ig, som beskrevet heri. Videre kan anti-zcytorl 71ig konjugeres til molekyler, slik som toksiske grupper og cytokiner, som beskrevet heri, for å styre dreping av monocyttiske leukemiceller.
Ved anvendelse av fremgangsmåter som er kjent innen faget, og som beskrives heri, kan en fagperson lett anslå aktiviteten til zcytorl 71ig-agonister og -antagonister i sykdoms-tilstandene som beskrives heri, inflammasjon, immunsykdommer (f.eks. autoimmune sykdommer), kreft eller infeksjon, så vel som andre sykdomstilstander som omfatter monocyttiske celler. Siden zcytorl71ig uttrykkes på T-celle-, makrofag- og monocyttspesifikk måte, og disse sykdommene omfatter unormaliteter i monocyttiske celler, f.eks. celleproliferasjon, -funksjon, -lokalisering og -aktivering, kan i tillegg polynukleotidene, polypeptidene og antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse anvendes som diagnostiske midler for påvisning av slike monocyttcelleunormaliteter og indikere nærvær av sykdom. Slike fremgangsmåter omfatter erholdelse av en biologisk prøve fra en pasient, f.eks. blod, spytt eller en biopsi, og å sammenligne denne med en normal kontrollprøve. Histologiske, cytologiske, "flov/'-cytometriske, biokjemiske og andre fremgangsmåter kan anvendes for å bestemme det relative nivå eller lokaliseringen av zcytorl71ig eller celler som uttrykker zcytorl 71ig, det vil si monocytter, i pasientprøven sammenlignet med den normale kontroll. Endret nivå (en økning eller reduksjon) av zcytorl71ig-ekspresjonen eller en endring i antall eller lokalisering av monocytter (f.eks. en økning eller infiltrasjon av monocyttiske celler i vev hvor de normalt ikke foreligger) sammenlignet med en kontroll vil indikere en sykdom. Slike diagnostiske fremgangsmåter kan også omfatte radiometriske, fluorescerende og kolorimetriske merkelapper koblet til polynukleotider, polypeptider eller antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse. Slike fremgangsmåter er vel kjent innen faget og beskrives heri.
Aminosyresekvenser med zcytorl 71ig-aktivitet kan anvendes for modulering av immunsystemet ved at de bindes til zcytorl 7-reseptor og således forhindrer binding av zcytorl71ig til endogen zcytorl71ig-reseptor. Zcytorl 71ig-antagonister, f.eks. anti-zcytorl 71ig-antistoffer, kan også anvendes for modulering av immunsystemet ved at de inhiberer binding av zcytorl 71ig til den endogene zcytorl71ig-reseptor. Følgelig omfatter foreliggende oppfinnelse anvendelse av proteiner, polypeptider og peptider med zcytorl 71ig-aktivitet (f.eks. zcytorl 71ig-polypeptider, zcytorl71ig-analoger (f.eks. anti-zcytorl 71ig-antiidiotypiske antistoffer) og zcytorl 71ig-fusjonsproteiner) i et individ som mangler en adekvat mengde av dette polypeptidet, eller som danner et overskudd av zcytorl 7-omfattende reseptorer. Zcytorl 7-antagonister (f.eks. anti-zcytorl 7-antistoffer) kan også anvendes for behandling av et individ som produserer et overskudd av enten zcytorl 71ig eller zcytorl 7-omfattende reseptorer. Egnede individer omfatter pattedyr, f.eks. mennesker.
Zcytorl 7-reseptor er blitt vist å uttrykkes i aktiverte mononukleære celler og kan delta i regulering av inflammasjoner. Således kan polypeptider ifølge foreliggende oppfinnelse analyseres og anvendes for deres evne til å modifisere inflammasjon, eller anvendes som inflammasjonsmarkører. Fremgangsmåter for bestemmelse av de proinflammatoriske og antiinflammatoriske egenskaper til zcytorl 71ig er kjent innen faget og diskuteres heri. Liganden kan videre tenkes å delta i oppregulering av produksjonen av akutt fase-reaktanter, f.eks. serurnamyloid A (SAA), al-anti-chymotrypsin og haptoglobin, og at ekspresjonen av zcytorl71-reseptorligand kan bli forhøyet etter injeksjon av lipopolysakkarid (LPS) in vivo, som deltar i den inflammatoriske respons (Dumoutier, L. et al., Proe. Nati. Acad. Sei., 97:10144-10149,2000). Produksjon av akutt fase-proteiner, f.eks. SAA, anses å være en korttids-overlevelsesmekanisme hvori inflammasjon er gunstig, imidlertid bidrar opprettholdelse av akutt fase-proteiner over lengre tidsrom til kronisk inflammasjon og kan være skadelig for menneskers helse. For en oversikt, se Uhlar, CM. og Whitehead, A.S., Eur. J. Biochem., 265:501-523,1999, og Baumann, H. og Gauldie, J., Immunology Today, 75:74-80,1994. Videre anses akutt fase-proteinet SAA å delta i patogenesen av flere kroniske inflammatoriske sykdommer, å delta i aterosklerose og reumatoid artritt og å være forløperen til amyloid A-proteinet som deponeres ved amyloidose (Uhlar, CM. og Whitehead, supra). Således vil, hvor en ligand som zcytorl71ig fungerer som et pro-inflammatorisk molekyl og induserer produksjon av SAA, antagonister være anvendbare for behandling av inflammatorisk sykdom og andre sykdommer forbundet med akutt fase-responsproteiner indusert av liganden. Slike antagonister tilveiebringes av foreliggende oppfinnelse. For eksempel omfatter en fremgangsmåte for reduksjon av inflammasjon tilførsel til et pattedyr med inflammasjon av en mengde av et preparat av zcytorl 71ig eller anti-zcytorl71ig-antistoff (f.eks. et nøytraliserende antistoff) som er tilstrekkelig til at inflammasjonen reduseres. Videre kan en fremgangsmåte for undertrykkelse av en inflammatorisk respons i et pattedyr med inflammasjon omfatte: (1) bestemmelse av nivået av amyloid A-protein i serum, (2) tilførsel av et preparat som omfatter et zcytorl 71ig-polypeptid eller anti-zcytorl 71ig-antistoff som beskrevet heri i et aksepterbart farmasøytisk bærestoff, (3) bestemmelse av nivået etter tilførselen av amyloid A-protein i serum, (4) sammenligning av nivået av amyloid A-protein i serum fra trinn (1) med nivået av amyloid A-protein i serum fra trinn (3), hvori manglende økning eller en reduksjon av amyloid A-proteinnivået i serum indikerer suppresjon av en inflammatorisk respons.
Reseptorene som binder zcytorl 71ig ifølge foreliggende oppfinnelse, omfatter minst én zcytorl 7-reseptorsubenhet. Et andre reseptorpolypeptid som inngår i den heterodimere, løselige reseptor, tilhører reseptorunderfamilien som omfatter klasse I-cytokinreseptorsubenheter, nærmere bestemt OSMRbeta og WSX-1. Ifølge foreliggende oppfinnelse kan i tillegg til et monomert eller homodimert zcytorl7-reseptorpolypeptid en heterodimer, løselig zcytorl 7-reseptor, som eksemplifisert ved en utførelse som omfatter en løselig zcytorl 7-reseptor + løselig klasse I-reseptor som en heterodimer bestanddel, f.eks. OSMRbeta eller WSX-1, fungere som en antagonist av zcytorl 71ig. Andre utførelser omfatter løselige, multimere reseptorer som omfatter zcytorl 7, f.eks. zcytorl 7-reseptor + en multimer bestanddel av løselig klasse I-reseptor, f.eks. OSMRbeta og WSX-1.
I likhet med zcytorl71ig viste en analyse av vevsfordelingen av mRNA, som tilsvarer zcytorl 7-reseptor-cDNA, at mRNA-nivået var høyest i monocytter og prostataceller og er forhøyet i aktiverte monocytter, aktiverte CD4<+->celler, aktiverte CD8<+->celler og aktiverte CD3<+->celler. Således er også zcytorl 7-reseptoren implisert i induksjon av en inflammatorisk respons og en immunrespons. Således er spesielle utførelser av foreliggende oppfinnelse rettet mot anvendelse av zcytorl 71ig-antistoffer og zcytorl 71ig, så vel som løselige zcytorl 7-reseptorheterodimerer som antagonister i inflammatoriske sykdommer og immunsykdommer eller tilstander som pankreatitt, diabetes av type I (IDDM), bukspyttkjertelkreft, pankreatitt, Graves sykdom, inflammatorisk tarmsykdom (IBD), Crohns sykdom, colonkreft og tarmkreft, divertikulose, autoimmune sykdommer, sepsis, organ- eller benmargstransplantater, inflammasjon grunnet traume, kirurgisk behandling eller infeksjon, amyloidose, splenomegali, "graft versus host"-sykdom og hvor inhibering av inflammasjon, immunsuppresjon, reduksjon av proliferasjon av hematopoietiske celler, immunceller, inflammatoriske celler eller lymfoide celler, makrofager, T-celler (innbefattet Thl- og Th2-celler, CD4<+->og CD8<+->celler), og undertrykkelse av immunresponsen mot et patogen eller antigen. Videre viste nærvær av zcytorl 7-reseptor og zcytorl 71ig-ekspresjon i aktiverte immunceller, slik som aktiverte CD3<+->celler, monocytter, CD4<+->celler og CD19<+->celler, at zcytorl 7-reseptor kan være involvert i kroppens immunforsvarsreaksjoner mot invaderende agens som mikroorganismer og cellerester, og kan spille en rolle i immunresponser under inflammasjon og kreftdannelse. Således kan zcytorl 71ig og zcytorl 71ig-antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse, som er agonistiske eller antagonistiske for zcytorl 7-reseptorfunksjonen, anvendes for å modifisere immunrespons og inflammasjon.
Videre er zcytorl 71ig-polypeptider som bindes til zcytorl 7-reseptor-polypeptider, og antistoffer mot disse, anvendbare for: 1) Antagonisering eller blokksignalisering via zcytorl 7-holdige reseptorer ved behandling av akutt inflammasjon, inflammasjon som følge av traume, vevsskader, kirurgiske inngrep, sepsis eller infeksjon, og kroniske inflammatoriske sykdommer som astma, inflammatorisk tarmsykdom (IBD), kronisk kolitt, splenomegali, reumatoid artritt, tilbakevendende, akutte, inflammatoriske episoder (f.eks. tuberkulose) og behandling av amyloidose, aterosklerose, Castlemans sykdom, astma og andre sykdommer forbundet med induksjon av akutt fase-responsen. 2) Antagonisering eller blokksignalisering via zcytorl 7-reseptorer ved behandling av autoimmune sykdommer som IDDM, multippel sklerose (MS), systemisk lupus erythematosus (SLE), myasthenia gravis, reumatoid artritt og IBD for å forhindre eller inhibere signalisering i immunceller (f.eks. lymfocytter, monocytter, leukocytter) via zcytorl 7-reseptor (Hughes, C. et al., J. Immunol, 153, 3319-3325,1994). Alternativt kan antistoffer, f.eks. monoklonale antistoffer (MAb) mot zcytorl71ig, anvendes som antagonister for å fjerne uønskede immunceller for behandling av autoimmunsykdom. Astma, allergi og andre atopiske sykdommer kan behandles med et MAb mot f.eks. anti-zcytorl 71ig-antistoffer, løselig zcytorl 7-reseptor, løselige reseptorer eller zcytorl 7/CRF2-4-heterodimerer for inhibering av immunresponsen eller for å fjerne de uønskede cellene. Blokkering eller inhibering av signalisering via zcytorl 7 ved anvendelse av polypeptidene og antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse kan også være gunstig for sykdommer i bukspyttkjertel, nyre, hypofyse og neuronceller. IDDM, NIDDM, pankreatitt og pankreatisk karsinom kan dra nytte av dette. Zcytorl 7 kan fungere som mål for MAb-behandling av kreft, hvor et antagoniserende MAb inhiberer kreftveksten og styrer immunformidlet dreping (Holliger, P. og Hoogenboom, H., Nature Biotech., 16,1015-1016, 1998). MAb mot løselige zcytorl7-reseptormonomerer, -homodimerer, -heterodimerer og - multimerer kan også være anvendbare for behandling av nefropatier som glomerulosklerose, membranøs nevropati, amyloidose (som også påvirker nyre blant andre vev), renal arteriosklerose, glomerulonefritt av forskjellig opphav, fibroproliferative sykdommer i nyren, så vel som nyrefeilfunksjon forbundet med SLE, IDDM, diabetes av type II (NIDDM), nyretumorer og andre sykdommer. 3) Agonisere eller innlede signalisering via zcytorl7-reseptorene ved behandling av autoimmune sykdommer som IDDM, MS, SLE, myasthenia gravis, reumatoid artritt og IBD. Zcytorl 71ig kan sende signaler til lymfocytter eller andre immunceller slik at de differensieres, endrer proliferasjonen eller endrer produksjonen av cytokiner eller celleoverflateproteiner som lindrer autoimmune tilstander. Nærmere bestemt kan modulering av en T-hjelpercellerespons på et endret cytokinutskillelsesmønster avlede en autoimmun respons slik at sykdommen lindres (Smith, J.A. et al, J. Immunol, 160,4841-4849,1998). Påtilsvarende måte kan zcytorl71ig anvendes for signalisering til, fjerning og avsporing av immunceller som deltar i astma, allergi og atopisk sykdom. Signalisering via zcytorl 7-reseptoren kan også være gunstig for sykdommer i bukspyttkjertel, nyre, hypofyse og nevronceller. IDDM, NIDDM, pankreatitt og pankreatisk karsinom kan dra nytte av dette, zcytorl7 kan fungere som et mål for MAb-behandling av bukspyttkjertelkreft hvor et signaliserende MAb inhiberer kreftveksten og styrer immunformidlet dreping (Tutt, A.L. et al, J. Immunol, 161, 3175-3185,1998). På tilsvarende måte kan T-cellespesifikke leukemier, lymfomer, plasmacelledyskrasi (f.eks. multippelt myelom) og karsinom behandles med monoklonale antistoffer (f.eks. nøytraliserende antistoffer) mot zcytorl 7-holdige, løselige reseptorer ifølge foreliggende oppfinnelse.
Anti-zcytorl 71ig-antistoffer og monomere, homodimere, heterodimere og multimere, løselige zcytorl 7-reseptorpolypeptider som beskrives heri, kan anvendes for å nøytralisere/blokkere zcytorl 7-reseptorligandaktivitet ved behandling av autoimmune sykdommer, atopiske sykdommer, NIDDM, pankreatitt og nyrefeilfunksjon, som beskrevet ovenfor. En løselig form av zcytorl 7-reseptor kan anvendes for å fremme en antistoffrespons som formidles av T-celler og/eller for å fremme dannelsen av IL-4 eller andre cytokiner ved lymfocytter eller andre immunceller.
Anti-zcytorl 71ig-antistoffer og løselige zcytorl 7-holdige reseptorer er anvendbare som antagonister av zcytorl 71ig. Slike antagonistiske virkninger kan oppnås ved direkte nøytralisering eller ved binding til den naturlige ligand. I tillegg til antagonistisk anvendelse kan de løselige reseptorene binde zcytorl 71ig og fungere som bærere eller bærerproteiner for transport av zcytorl 71ig til forskjellige vev, organer og celler i kroppen. Således kan de løselige reseptorene fusjoneres eller kobles til molekyler, polypeptider eller kjemiske grupper som styrer det løselige reseptor-ligandkompleks til et spesifikt sete, f.eks. et vev, en spesifikk immuncelle, monocytter eller en tumor. I f.eks. akutt infeksjon eller visse kreftformer kan det være nyttig å indusere inflammasjon og lokale akutt fase-responsproteiner. De løselige reseptorene som beskrives heri, eller antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse, kan således anvendes for spesifikt å styre virkningen av en proinflammatorisk zcytorl 71ig-ligand. Se Cosman, D., Cytokine, 5:95-106,1993; og Fernandez-Botran, R., Exp. Opin. Invest. Drugs., 9:497-513, 2000.
Videre kan de løselige reseptorene anvendes for stabilisering av zcytorl 71ig, for økning av biotilgjengeligheten, den terapeutiske halveringstid og/eller virkningen av liganden ved at liganden stabiliseres mot degradering eller fjerning, eller ved å målstyre liganden til et virkningssete i kroppen. For eksempel stabiliserer det naturlig forekommende IL-6/løselig IL-6R-kompleks IL-6 og kan signalisere via gpl30-reseptoren. Se Cosman, D., supra; og Fernandez-Botran, R., supra. Videre kan zcytorl 7 kombineres med en passende ligand, f.eks. sin egen ligand, slik at det dannes et kompleks av ligand og løselig reseptor. Slike komplekser kan anvendes for å stimulere responser fra celler som presenterer en tilhørende reseptorsubenhet. Cellespesifisiteten for zcytorl 7-reseptor/zcytorl71ig-komplekser kan avvike fra hva som observeres for liganden tilført alene. Videre kan kompleksene ha spesielle farmakokinetiske egenskaper som påvirker halveringstid, dose/respons og organ- eller vevsspesifisitet. Zcytorl 7/ligandkomplekser kan således ha agonistaktivitet som forsterker en immunrespons eller stimulerer mesangialceller eller som stimulerer leverceller. Alternativt kan det tenkes at kun vev som uttrykker en signaliserende subenhet som heterodimeriserer med komplekset, vil påvirkes, på tilsvarende måte som for responsen på IL6/IL6R-komplekser (Hirota, H. et al., Proe. Nati. Acad. Sei., 92:4862-4866,1995; Hirano, T., i Thomason, A. (red.), "The Cytokine Handbook", 3. utgave, s. 208-209). Løselige reseptor-cytokin-komplekser for IL 12 og CNTF viser tilsvarende aktiviteter.
Zcytorl 71ig kan også anvendes i diagnostiske systemer for bestemmelse av nivået av en ligand i sirkulasjonen og for påvisning av en inflammatorisk respons i akutt fase. I en beslektet utførelse kan antistoffer eller andre midler som spesifikt bindes til zcytorl71ig, anvendes for å påvise zcytorl71ig-polypeptider i sirkulasjonen. Omvendt kan zcytorl71ig selv anvendes for å påvise sirkulerende eller lokalt virkende reseptorpolypeptider. Forhøyet eller redusert nivå av ligand eller reseptorpolypeptider kan indikere patologiske tilstander, innbefattet inflammasjon eller kreft. Videre kan påvisning av proteiner i akutt fase eller molekyler som zcytorl 71ig indikere en kronisk inflammatorisk tilstand i visse sykdomstilstander (f.eks. reumatoid artritt). Påvisning av slike tilstander bidrar til å lette diagnose av sykdommen, så vel som til å hjelpe den behandlende lege i valg av korrekt behandlingsform.
Polypeptidene og proteinene ifølge foreliggende oppfinnelse kan også anvendes ex vivo, f.eks. ved autolog benmargsdyrkning. Kort beskrevet fjernes benmarg fra en pasient før kjemoterapi eller organtransplantasjon og behandles med zcytorl71ig, om ønskelig i kombinasjon med ett eller flere andre cytokiner. Den behandlede benmarg tilbakeføres så til pasienten etter kjemoterapien for å øke hastigheten for benmargs-gjenvinning eller, etter transplantasjon, for å undertrykke "graft versus host"-sykdom. I tillegg kan proteinene ifølge foreliggende oppfinnelse også anvendes for ex v/vo-ekspansjon av monocytter/makrofager fra benmarg eller forløperceller fra perifert blod (PBPC). Før behandlingen kan benmargen stimuleres med stamcellefaktor (SCF) for å frigjøre tidlige forløperceller til den perifere sirkulasjon. Disse forløpercellene kan oppsamles og oppkonsentreres fra perifert blod og så behandles i kultur med zcytorl71ig, om ønskelig i kombinasjon med ett eller flere andre cytokiner, innbefattet SCF, IL-2, IL-4, IL-7, Lif, IL-3, IL-12, IL-21 eller IL-15, for differensiering og proliferasjon til lymfoide kulturer med høy tetthet, som så kan tilbakeføres til pasienten etter kjemoterapi eller transplantasjon.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en fremgangsmåte for ekspansjon av hematopoietiske celler og forløpere for hematopoietiske celler som omfatter dyrkning av benmarg eller celler fra perifert blod med et preparat som omfatter en mengde av zcytorl 71ig som er tilstrekkelig til å gi et økt antall lymfoidceller i benmargen eller blant cellene fra perifert blod, sammenlignet med benmarg eller celler fra perifert blod dyrket i fravær av zcytorl71ig. I andre utførelser er de hematopoietiske cellene og de hematopoietiske forløpercellene lymfoide celler. I en annen utførelse er de lymfoide cellene NK-celler eller cytotoksiske T-celler. Videre kan preparatet også omfatte minst ett annet cytokin utvalgt fra gruppen bestående av IL-2, IL-15, IL-4, Lif, IL-3, IL-12, IL-21, GM-CSF, Flt3-ligand og stamcellefaktor.
Alternativt kan zcytorl 71ig aktivere immunsystemet, noe som vil være viktig for å forsterke immuniteten mot infeksiøse sykdommer, for behandling av immunkompromitterte pasienter, f.eks. HIV-pasienter eller kreftpasienter, eller for å forbedre vaksiner. Nærmere bestemt vil zcytorl71ig-stimulering eller ekspansjon av monocytter/makrofager, T-celler, B-celler, NK-celler eller deres forløpere være av terapeutisk verdi ved behandling av virusinfeksjoner og som en antineoplastisk faktor. På tilsvarende måte vil zcytorl71ig-stimulering av immunresponsen mot virale og ikke-virale, patogene agens (innbefattet bakterier, protozoer og sopp) være av terapeutisk verdi ved behandling av slike infeksjoner ved at veksten av slike infeksiøse agens inhiberes. En direkte eller indirekte bestemmelse av nivået av et patogen eller antigen, f.eks. en tumorcelle, som foreligger i kroppen, kan oppnås ved en rekke fremgangsmåter som er kjent inne faget og som beskrives heri.
Foreliggende oppfinnelse omfatter en fremgangsmåte for stimulering av en immunrespons i et pattedyr som er eksponert for et antigen eller et patogen, som omfatter trinnene: (1) direkte eller indirekte bestemmelse av nivået som foreligger av antigen eller patogen i pattedyret; (2) tilførsel av et preparat som omfatter zcytorl71ig-polypeptid i et aksepterbart farmasøytisk bærestoff; (3) direkte eller indirekte bestemmelse av nivået av antigen eller patogen i pattedyret; og (4) sammenligning av nivået av antigenet eller patogenet i trinn (1) med nivået av antigen eller patogen i trinn (3), hvori et endret nivået indikerer stimulering av en immunrespons. I en annen utførelse tilføres zcytorl 71ig-preparatet på nytt. I andre utførelser er antigenet en B-celletumor, et virus, en parasitt eller en bakterie.
I en annen utførelse tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en fremgangs-måte for stimulering av en immunrespons i et pattedyr som er eksponert for et antigen eller et patogen, som omfatter: (1) bestemmelse av nivået av et antigen- eller patogen-spesifikt antistoff; (2) tilførsel av et preparat som omfatter zcytorl 71ig-polypeptid i et aksepterbart farmasøytisk bærestoff; (3) bestemmelse av nivået av antigen- eller patogenspesiflkt antistoff etter tilførselen; (4) sammenligning av antistoffhivået i trinn (1) med antistoffhivået i trinn (3), hvori en økning av antistoffhivået indikerer stimulering av en immunrespons.
Polynukleotider som koder for zcytorl 71ig-polypeptider, er anvendbare i forbindelse med genterapi hvor det ønskes å forhøye eller inhibere zcytorl 71ig-aktiviteten. Dersom et pattedyr har et mutert eller fraværende zcytorl 71ig-gen, kan zcytorl 71ig-genet innføres i cellene til pattedyret. Ved én utførelse innføres et gen som koder for et zcytorl 71ig-polypeptid in vivo i en virusvektor. Slike vektorer omfatter et svekket eller defekt DNA-virus, f.eks. herpes simplex-virus (HSV), papillomvirus, Epstein-Barr-virus (EBV), adenovirus, adenoassosiert virus (AAV) og lignende. Defekte virus som fullstendig eller nesten fullstendig mangler virale gener, foretrekkes. Et defekt virus er ikke infeksiøst etter innføring i en celle. Anvendelse av defekte virusvektorer tillater tilførsel til celler i et spesifikt, lokalisert område uten at man må ta i betraktning at vektoren kan infisere andre celler. Eksempler på spesielle vektorer omfatter en defekt herpes simplex-virus l(HSVl)-vektor (Kaplitt et al., Molec. Cell. Neurosci., 2:320-30, 1991); en svekket adenovirusvektor, f.eks. vektoren som beskrives av Stratford-Perricaudet et al., J. Clin. Invest, 90:626-30,1992; og en defekt adenoassosiert virusvektor (Samulski et al., J. Virol., 67:3096-101,1987; Samulski et al., J. Virol., 65:3822-8,1989).
Et zcytorl 71ig-gen kan innføres i en retroviral vektor, f.eks. som beskrevet av Anderson et al., US patentskrift nr. 5 399 346; Mann et al., Cell, 55:153,1983; Temin et al., US patentskrift nr. 4 650 764; Temin et al., US patentskrift nr. 4 980 289; Markowitz et al., J. Virol., 62:1120,1988; Temin et al., US patentskrift nr. 5 124 263; internasjonal patentpublikasjon WO 95/07358, publisert 16. mars 1995 av Dougherty et al.; og Kuo et al., Blood, 52:845, 1993. Alternativt kan vektoren innføres ved lipofeksjon in vivo ved anvendelse av liposomer. Syntetiske kationiske lipider kan anvendes for fremstilling av liposomer for transfeksjon in vivo av et gen som koder for en markør (Felgner et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 54:7413-7,1987; Mackey et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 55:8027-31,1988). Anvendelse av lipofeksjon for innføring av eksogene gener i spesifikke organer in vivo har visse praktiske fordeler. Molekylær målstyring av liposomer til spesifikke celler representerer ett gunstig område. Nærmere bestemt representerer styring av transfeksjonen til gitte celler én slik fordel. For eksempel vil styring av transfeksjonen til gitte celletyper være spesielt fordelaktig i et vev med cellulær heterogenitet, f.eks. immunsystemet, bukspyttkjertelen, leveren, nyrene og hjernen. Lipider kan kobles kjemisk til andre molekyler for målstyringsformål. Målstyrende peptider (f.eks. hormoner eller neurotransmittere), proteiner, slik som antistoffer, eller ikke-peptidmolekyler kan kobles kjemisk til liposomer.
Det er mulig å fjerne målcellene fra kroppen og innføre vektoren som et nakent DNA-plasmid, og så reimplantere de transformerte cellene i kroppen. Nakne DNA-vektorer for genterapi kan innføres i de ønskede vertsceller ved fremgangsmåter som er kjent innen faget, f.eks. transfeksjon, elektroporering, mikroinjeksjon, transduksjon, cellefusjon, DEAE-dekstran, kalsiumfosfatutfelling, anvendelse av en genpistol eller anvendelse av en DNA-vektor-transportør. Se f.eks. Wu et al., J. Biol. Chem., 267:963-7,1992; Wu et al., J. Biol. Chem., 265:14621-4,1988.
"Antisense"-metodologi kan anvendes for inhibering av zcytorl 71ig-gen-transkripsjonen, f.eks. for inhibering av celleproliferasjon in vivo. Polynukleotider som er komplementære til et segment i et zcytorl71ig-kodende polynukleotid (f.eks. et polynukleotid som beskrevet i SEQ ID NO: 1), er utformet slik at de bindes til zcytorl 71ig-kodende mRNA og inhiberer translasjonen av dette mRNA. Slike "antisense"-polynukleotider anvendes for å inhibere ekspresjonen av zcytorl 71ig-polypeptidkodende gener i cellekultur eller i et individ.
Mus som er modifisert slik at de uttrykket zcytorl 71ig-genet, betegnet "transgene mus", og mus som viser fullstendig fravær av zcytorl 71ig-genfunksjonen, betegnet "knockout-mus", kan også frembringes (Snouwaert et al., Science, 257:1083,1992; Lowell et al., Nature, 366:740-42,1993; Capecchi, M.R., Science, 244:1288-1292,1989; Palmiter, R.D. et al., Annu Rev Genet., 20:465-499,1986). For eksempel kan transgene mus som overuttrykker zcytorl 71ig, enten i hele kroppen eller under en vevsspesifikk eller vevsbegrenset promoter, anvendes for å fastslå hvorvidt overekspresjon gir en fenotype. For eksempel kan overekspresjon av et villtype-zcytorl 7lig-polypeptid, -polypeptidfragment eller en mutant derav endre normale cellulære prosesser, noe som fører til en fenotype som vil identifisere et vev hvori zcytorl71ig-ekspresjon er funksjonelt relevant, og kan angi et terapeutisk mål for zcytorl 71ig, dens agonister eller antagonister. For eksempel er en foretrukket transgen mus som skal frembringes, en mus som overuttrykker zcytorl 71ig (aminosyrerestene 23-164 i SEQ ID NO: 2 eller 24-163 i SEQ ID NO: 11). Videre kan slik overekspresjon føre til en fenotype som viser likhet med sykdommer hos mennesket. På tilsvarende måte kan zcytorl71ig-"knockout"-mus anvendes for å fastslå hvorvidt zcytorl71ig er absolutt påkrevd in vivo. Fenotypen til "knockout"-mus vil predikere in vivo-virkningene som en zcytorl 71ig-antagonist, f.eks. antagonistene beskrevet heri, kan ha. Zcytor-171ig-cDNA fra mus eller menneske, som beskrevet heri, kan anvendes for fremstilling av "knockout"-mus. Disse musene kan anvendes for å studere zcytorl 71ig-genet og proteinet det koder for i et in v/vø-system, og kan anvendes som in vzvo-modeller for tilsvarende humane sykdommer. Videre kan ekspresjon i transgene mus av "antisense"-zcytorl71ig-polynukleotider eller ribozymer rettet mot zcytorl 71ig, og som beskrives heri, anvendes på tilsvarende måte som de transgene musene beskrevet ovenfor. Undersøkelser kan også utføres ved tilførsel av renset zcytorl 71ig-protein.
Eksperimentelt bevismateriale tyder på en rolle for zcytorl 71ig i utvikling av sykdommer som omfatter hud eller epitel på indre overflater, f.eks. i tykktarm, tynntarm, bukspyttkjertel, lunge, prostata, uterus og lignende. For det første uttrykkes, som beskrevet heri, zcytorl 7-reseptorer, innbefattet både OSM-reseptor beta og zcytorl 7, i flere celletyper som er lokalisert i epiteloverflater, innbefattet cellelinjer avledet fra lungeepitel, lungefibroblaster, prostata, colon, bryst, leverepitel, ben og hudepitel, benfibroblaster og lignende. Videre responderte, som beskrevet heri, eksempler på alle disse celletypene på zcytorl 71ig-aktivering av en STAT-rapportørkonstruksjon. I tillegg responderte flere cellelinjer på zcytorl 71ig-stimulering ved å danne IL-6, IL-8 og MCP-1 (en kjemotaktisk faktor) i forhøyet nivå, som beskrevet heri. Totalt sett tyder disse resultatene på en rolle for zcytorl71ig i sykdommer som omfatter epitel, f.eks. atopisk dermatitt, dermatitt, psoriasis, psoriatisk artritt, eksem, gingivitt, peridontal sykdom, inflammatorisk tarmsykdom (IBD) (f.eks. ulcerøs kolitt, Crohns sykdom), reproduksjons-forstyrrelser, f.eks. cervixdysplasi, cervixkreft, andre hudsykdommer som kreft, sarkomer, karsinomer, melanomer osv., det vil si ikke bare inflammatoriske sykdommer, siden immunsystemet deltar i aktivering og helbredelse av kreft, sykdommer som omfatter barrierefeil-funksjoner, f.eks. "graft versus host"-sykdom (GVHD) og irritabel tarm-syndrom (IBS), og sykdommer som omfatter lungeepitel, f.eks. astma, emfysem og lignende. I tillegg tyder frigivelse av cytokinene IL-6, IL-8 og MCP-1 av celler som eksponeres for zcytorl 71ig på at zcytorl 71ig deltar i inflammasjon. Regulering av zcytorl71ig kan derfor være nyttig ved behandling av autoimmune sykdommer, inflammatoriske sykdommer eller kreftsykdommer forbundet med vevene som uttrykker reseptoren. Disse sykdommene omfatter f.eks. prostatitt, hepatitt, osteoartritt og lignende. Zcytorl 71ig kan på positiv eller negativ måte, direkte eller indirekte, regulere disse sykdommene. Tilførsel av zcytorl 71ig kan derfor anvendes for behandling av sykdommer som beskrevet heri, direkte eller med molekyler som inhiberer zcytorl 71ig-aktivitet, innbefattet f.eks. både monoklonale antistoffer mot zcytorl 71ig, monoklonale antistoffer mot zcytorl7 eller monoklonale antistoffer som gjenkjenner zcytorl 71ig- og OSM-reseptor beta-komplekset.
Det finnes også resultater som antyder at zcytorl 71ig kan være involvert i reguleringen av TH2-T-celleformidlede sykdommer. For det første produseres zcytorl 71ig av TH2-undergruppen av aktiverte T-celler. TH2-celler uttrykker mer zcytorl71ig enn TH1-celler. I tillegg ble minst to lungeepitelcellelinjer (SK-LU-1, A549) stimulert til økt nivå av IL-13-reseptor alfa-2-mRNA som respons på zcytorl 7-ligandstimulering, som beskrevet heri. Det er en assosiasjon mellom IL-13-reseptor alfa2-kjeden og tumorigenisiteten av humane bryst- og bukspyttkjerteltumorer. Dette antyder at zcytorl 71ig kan spille en rolle i regulering av tumorigenisiteten til disse krefttypene, så vel som andre krefttyper. Tilførsel av en zcytorl 71ig-antagonist eller direkte anvendelse av zcytorl 71ig kan derfor være nyttig ved behandling av disse krefttypene, godartede eller ondartede, og i forskjellige grader (grad I til grad IV) og stadier (f.eks. stadieplasseringsfremgangsmåtene TNM og AJC) av tumorutvikling hos pattedyr, fortrinnsvis mennesker.
Det er vel kjent innen faget at IL-13 er involvert i dannelsen av aktiverte TH2-celler og i TH2-formidlede sykdommer som astma, atopisk dermatitt og lignende. Zcytorl71ig og zcytorl71ig-antagonister kan være anvendbare ved behandling av sykdommer som omfatter TH2-T-celler. Dette vil omfatte sykdommer som f.eks. atopisk dermatitt og astma, så vel som andre sykdommer som forverres av aktiverte TH2-celler. Deltakelse av zcytorl71ig i sykdommer som f.eks. atopisk dermatitt understøttes også av fenotypen til de transgene musene som overutrykker zcytorl71ig og utvikler symptomer på atopisk dermatitt, som beskrevet heri.
Trass i den preferensielle ekspresjon av zcytorl71ig av TH2-celler er det fortsatt en viss ekspresjon av zcytorl71ig i TH1-celler og i CD8<+->T-celler. Zcytorl71ig eller dens antagonis ter kan derfor være anvendbare for behandling av sykdommer som omfatter immunmodulering av aktiverte T-celler, f.eks. virusinfeksjon, kreft, transplantatrejeksjon og lignende.
Zcytorl71ig kan også være involvert i utvikling av kreft. Det er ekspresjon av zcytorl 7- og OSM-reseptor beta-reseptorer i humane benfibroblast-osteosarkomer, humane hud-fibroblastmelanomer, colonepitelkarsinom, adenokarsinom, brystepiteladenokarsinom, prostataepiteladenosarkom og lungeepiteladenokarsinom og karsinom. Det kan derfor være nyttig å behandle tumorer med opphav i epitel med enten zcytorl 71ig, fragmenter derav eller zcytorl 71ig-antagonister som omfatter karsinom, adenokarsinom og melanom. Ikke desto mindre kan zcytorl 71ig eller en zcytorl71ig-antagonist anvendes for behandling av en kreftform eller for å redusere ett eller flere symptomer på kreft i en kreftform som omfatter skvamocellekarsinom eller epidermoid-karsinom, basalcellekarsinom, adenokarsinom, papillært karsinom, cystadeno-karsinom, bronkogent karsinom, bronkialt adenom, melanom, nyrecellekarsinom, hepato-cellulært karsinom, overgangsepitelcellekarsinom, choriokarsinom, seminom, embryonalt karsinom og ondartet blandet tumor med opphav i spyttkjertel, Wilms tumor, umodent teratom, teratokarsinom og andre tumorer som omfatter i det minste noen celler med opphav i epitel.
Generelt vil dosen av tilført zcytorl 71ig-polypeptid (eller zcytorl 7-analog eller - fusjonsprotein) variere, avhengig av faktorer som pasientens alder, vekt, høyde, kjønn, generelle medisinske tilstand og tidligere medisinske historie. Det er typisk ønskelig å tilføre mottakeren en dose av zcytorl 71ig-polypeptid som ligger i området fra ca. 1 pg/kg til 10 mg/kg (mengde middel/pasientens kroppsvekt), selv om en lavere eller høyere dose også kan tilføres, avhengig av omstendighetene. En fagperson kan lett bestemme slike doser og justeringer av dem ved anvendelse av fremgangsmåter som er kjent innen faget.
Tilførsel av zcytorl71ig-polypeptid til et individ kan være topisk, ved inhalasjon, intravenøs, intraarteriell, intraperitoneal, intramuskulær, subkutan, intrapleural, intratekal, ved perfusjon gjennom et regionalt kateter eller ved direkte intralesjonal injeksjon. Når terapeutiske proteiner tilføres ved injeksjon, kan tilførselen skje ved kontinuerlig infusjon eller ved en enkelt eller flere bolusinjeksjoner.
Ytterligere tilførselsveier omfatter oral, via slimhinnemembraner, pulmonal og transkutan. Oral tilførsel er egnet for polyestermikrokuler, zeinmikrokuler, proteinoide mikrokuler, polycyanakrylatmikrokuler og lipidbaserte systemer (se f.eks. DiBase og Morrel, "Oral Delivery of Microencapsulated Proteins", i Protein Delivery: Physical Systems, Sanders og Hendren (red.), s. 255-288 (Plenum Press, 1997)). Muligheten for intranasal tilførsel eksempli-fiseres ved en slik måte å tilføre insulin på (se f.eks. Hinchcliffe og Illum, Adv. Drug Deliv. Rev., 35:199 (1999)). Tørre eller flytende partikler som omfatter zcytorl 71ig, kan fremstilles og inhaleres ved hjelp av dispersjonssystemer for tørt pulver, flytende aerosol-generatorer eller nebulisatorer (se f.eks. Pettit og Gombotz, TIBTECH, 76:343 (1998); Patton et al., Adv. Drug Deliv. Rev., 35:235 (1999)). Denne tilnærming illustreres ved diabetes-behandlingssystemet AERX, som er en håndholdt elektronisk inhalator som tilfører insulin i aerosolform til lungene. Undersøkelser har vist at proteiner så store som 48 000 kDa er blitt tilført gjennom huden i terapeutiske konsentrasjoner ved hjelp av ultralyd med lav frekvens, noe som illustrerer muligheten for transkutan tilførsel (Mitragotri et al., Science, 269:850 (1995)). Transdermal tilførsel ved anvendelse av elektroporering byr på et annet middel for tilførsel av et molekyl med zcytorl71ig-bindingsaktivitet (Potts et al., Pharm. Biotechnol., 70:213 (1997)).
Et farmasøytisk preparat som omfatter et protein, polypeptid eller peptid med zcytorl 71ig-bindingsaktivitet, kan utformes ifølge kjente fremgangsmåter for fremstilling av farmasøytisk anvendbare preparater, hvorved de terapeutiske proteiner kombineres med et farmasøytisk aksepterbart bærestoff i en blanding. Et preparat sies å være et "farmasøytisk aksepterbart bærestoff dersom tilførsel av det kan tolereres av pasienten. Sterilt, fosfatbufret saltvann er ett eksempel på et farmasøytisk aksepterbart bærestoff. Andre egnede bærestoffer er vel kjent blant fagfolk. Se f.eks. Gennaro (red.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 19. utgave (Mack Publishing Company, 1995).
For behandlingsformål tilføres molekyler med zcytorl 71ig-bindingsaktivitet og et farmasøytisk aksepterbart bærestoff til en pasient i en terapeutisk effektiv mengde. En kombinasjon av et protein, polypeptid eller peptid med zcytorl 71ig-bindingsaktivitet og et farmasøytisk aksepterbart bærestoff sies å tilføres i en "terapeutisk effektiv mengde" dersom den tilførte mengde er fysiologisk signifikant. Et middel er fysiologisk signifikant dersom dets nærvær fører til en påvisbar endring i pasientens fysiologi. For eksempel er et middel som anvendes for behandling av inflammasjon, fysiologisk signifikant dersom dets nærvær lindrer i det minste en del av den inflammatoriske respons.
Et farmasøytisk preparat som omfatter zcytorl 71ig (eller zcytorl 71ig-analog eller - fusjonsprotein), kan foreligge i flytende form, som en aerosol eller i fast form. Flytende former illustreres ved injiserbare løsninger, aerosoler, smådråper, topologiske løsninger og orale suspensjoner. Eksempler på faste former omfatter kapsler, tabletter og former for kontrollert frigivelse. Denne siste form illustreres ved miniosmotiske pumper og implantater (Bremer et al., Pharm. Biotechnol., 70:239 (1997); Ranade, "Implants in Drug Delivery", i Drug Delivery Systems, Ranade og Hollinger (red.), s. 95-123 (CRC Press 1995); Bremer et al., "Protein Delivery with Infusion Pumps", i Protein Delivery: Physical Systems, Sanders og Hendren (red.), s. 239-254 (Plenum Press, 1997); Yewey et al., "Delivery of Proteins from a Controlled Release Injectable Implant", i Protein Delivery: Physical Systems, Sanders og Hendren (red.), s. 93-117 (Plenum Press, 1997)). Andre faste former omfatter kremer, salver, andre topologiske preparater og lignende.
Liposomer byr på et middel for tilførsel av terapeutiske polypeptider til et individ intravenøst, intrapeirtonealt, intratekalt, intramuskulært, subkutant eller ved oral tilførsel, inhalasjon eller intranasal tilførsel. Liposomer er mikroskopiske vesikler som består av ett eller flere lipiddobbeltlag som omgir vandige rom (se generelt Bakker-Woudenberg et al., Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis., 72 (suppl. 1):S61 (1993); Kim, Drugs, 46:618 (1993); og Ranade, "Site-Specific Drug Delivery Using Liposomes as Carriers", i Drug Delivery Systems, Ranade og Hollinger (red.), s. 3-24 (CRC Press, 1995)). Liposomer har en lignende sammensetning som cellulære membraner, og som en følge av dette kan liposomer tilføres trygt og er biodegraderbare. Avhengig av fremstillingsfremgangsmåten kan liposomer være unilamellære eller multi-lamellære, og liposomer kan variere i størrelse med diametere i området fra 0,02 um til mer enn 10 um. En rekke midler kan innkapsles i liposomer: hydrofobe midler fordeles i dobbeltlagene, og hydrofile midler fordeles i det indre, vandige rom (se f.eks. Machy et al., Liposomes In Cell Biology And Pharmacology (John Libbey, 1987); og Ostro et al., American J. Hosp. Pharm., 46:1576 (1989)). Det er videre mulig å kontrollere den terapeutiske tilgjengelighet av det innkapslede middel ved å variere liposomstørrelsen, antall dobbeltlag, lipidsammensetningen samt liposomenes ladning og overflateegenskaper.
Liposomer kan adsorberes til nær sagt alle celletyper og så langsomt frigi det innkapslede middel. Alternativt kan et absorbert liposom endocyteres av fagocyttiske celler. Endocytose følges av intralysosomal degradering av liposomale lipider og frigivelse av de innkapslede midler (Scherphof et al., Ann. N.Y. Acad. Sei., 446:368 (1985)). Etter intravenøs tilførsel tas små liposomer (0,1-1,0 um) typisk opp av celler i retikuloendotelsystemet, hovedsakelig lokalisert til lever og milt, mens liposomer som er større enn 3,0 um, deponeres i lungen. Dette preferensielle opptak av mindre liposomer i cellene i retikuloendotelsystemet er blitt benyttet for tilførsel av kjemoterapeutiske midler til makrofager og til levertumorer.
Retikuloendotelsystemet kan omgås ved flere fremgangsmåter, innbefattet metting med store doser av liposompartikler eller selektiv makrofaginaktivering ved hjelp av farmakologiske midler (Claassen et al., Biochim. Biophys. Acta, 502:428 (1984)). I tillegg er innføring av glykolipid- eller polyetylenglykolderivatiserte fosfolipider i liposommembraner blitt vist å føre til signifikant redusert opptak av retikuloendotelsystemet (Allen et al., Biochim. Biophys. Acta, 1068:\ 33 (1991); Allen et al., Biochim. Biophys. Acta, 1150:9 (1993)).
Liposomer kan også fremstilles slik at de målstyres mot spesielle celler eller organer ved at fosfolipidsammensetningen varieres, eller ved å innsette reseptorer eller ligander i liposomene. For eksempel er liposomer fremstilt med et høyt innhold av et ikke-ionisk, overflateaktivt middel blitt anvendt for målstyring til lever (Hayakawa et al., japansk patentskrift 04-244018; Kato et al., Biol. Pharm. Bull., 76:960 (1993)). Disse utformingene ble fremstilt ved å sammenblande fosfatidylcholin fra soyabønne, a-tokoferol og etoksylert, hydrogenert lakserolje (HCO-60) i metanol, konsentrere blandingen under vakuum og så rekonstituere blandingen med vann. En liposomal utforming av dipalmitoylfosfatidylcholin (DPPC) med en soyabønneavledet sterylglykosidblanding (SG) og kolesterol (Ch) er også blitt vist å målstyres til lever (Shimizu et al., Biol. Pharm. Bull., 20:881 (1997)).
Alternativt kan forskjellige målstyrende ligander bindes til liposomets overflate, f.eks. antistoffer, antistofrfagmenter, karbohydrater, vitaminer og transportproteiner. Liposomer kan f.eks. modifiseres med galaktosyllipidderivater av forgrenet type for målstyring til asialoglykoprotein(galaktose)reseptorer, som utelukkende uttrykkes på overflaten av leverceller (Kato og Sugiyama, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst., 74:287 (1997); Murahashi et al., Biol. Pharm. Bull., 20:259 (1997)). På tilsvarende måte har Wu et al., Hepatology, 27:772 (1998), vist at merking av liposomer med asialofetuin førte til forkortet halveringstid for liposomene i plasma og et svært forsterket opptak av asialofetuinmerket liposom i hepatocytter. På den annen side kan hepatisk akkumulering av liposomer som omfatter galaktosyllipidderivater av forgrenet type, inhiberes ved forutgående injeksjon av asialofetuin (Murahashi et al., Biol. Pharm. Bull., 20:259
(1997)). Liposomer som inneholder polyakonitylert humant serumalbumin, byr på en annen tilnærming for målstyring av liposomer til leverceller (Kamps et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 94:11681 (1997)). Videre beskriver Geho et al., US patentskrift nr. 4 603 044 et hepatocyttrettet liposomvesikkeltilførselssystem som har spesifisitet for levergallereseptorer forbundet med de spesialiserte metabolske cellene i lever.
I en mer generell tilnærming til målstyring til vev formerkes målcellene med biotinylerte antistoffer som er spesifikke for en ligand som uttrykkes av målcellen (Harasym et al., Adv. Drug Deliv. Rev., 32:99 (1998)). Etter fjerning av fritt antistoff fra plasma tilføres streptavidinkonjugerte liposomer. I en annen tilnærming kobles målstyrende antistoffer direkte til liposomer (Harasym et al, Adv. Drug Deliv. Rev., 52:99 (1998)).
Polypeptider med zcytorl71ig-bindingsaktivitet kan innkapsles i liposomer ved anvendelse av standardteknikker for proteinmikroinnkapsling (se f.eks. Anderson et al., Infect. Immun., 57:1099 (1981), Anderson et al., Cancer Res., 50:1853 (1990); Cohen et al., Biochim. Biophys. Acta, 7065:95 (1991); Alving et al., "Preparation and Use of Liposomes in Immuno-logical Studies", i Liposome Technology, 2. utgave, bind III, Gregoriadis (red.), s. 317 (CRC Press, 1993); Wassef et al., Meth. Enzymol., 749:124 (1987)). Som bemerket ovenfor, kan terapeutisk anvendbare liposomer inneholde en rekke bestanddeler. Liposomer kan f.eks. omfatte lipidderivater av poly(etylenglykol) (Allen et al., Biochim. Biophys. Acta, 1150:9 (1993)).
Degraderbare polymermikrokuler er blitt utformet for å opprettholde et høyt systemisk nivå av terapeutiske proteiner. Mikrokuler fremstilles fra degraderbare polymerer som poly(laktid-koglykolid) (PLG), polyanhydrider, poly(ortoestere), ikke-biodegraderbare etylvinylacetatpolymerer hvori proteiner innfanges i polymeren (Gombotz og Pettit, Bioconjugate Chem., 6:332 (1995); Ranade, "Role of Polymers in Drug Delivery", i Drug Delivery Systems, Ranade og Hollinger (red.), s. 51-93 (CRC Press, 1995); Roskos og Maskiewicz, "Degradable Controlled Release Systems Useful for Protein Delivery", i Protein Delivery: Physical Systems, Sanders og Hendren (red.), s. 45-92 (Plenum Press, 1997); Bartus et al., Science, 257:1161 (1998); Putney og Burke, Nature Biotechnology, 76:153 (1998); Putney, Curr. Opin. Chem. Biol., 2:548 (1998)). Polyetylenglykol(PEG)-belagte nanokuler kan også fungere som bærere for intravenøs tilførsel av terapeutiske proteiner (se f.eks. Gref et al., Pharm. Biotechnol., 70:167 (1997)).
Foreliggende oppfinnelse omfatter også kjemisk modifiserte polypeptid med zcytorl71ig-aktivitet, f.eks. et zcytorl71ig-polypeptid, zcytorl71ig-agonister og zcytorl71ig-antagonister, f.eks. anti-zcytorl 71ig-antistoffer, hvor et polypeptid er koblet til en polymer, som diskutert ovenfor.
Andre doseringsformer kan utformes av fagfolk, f.eks. som vist av Ansel og Popovich, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 5. utgave (Lea & Febiger, 1990), Gennaro (red.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 19. utgave (Mack Publishing Company, 1995), og Ranade og Hollinger, Drug Delivery Systems (CRC Press, 1996).
Som en illustrasjon kan farmasøytiske preparater leveres som et sett som omfatter en beholder som omfatter et zcytorl 71ig-polypeptid eller en zcytorl 71ig-antagonist (f.eks. et antistoff eller antistoffragment som bindes til et zcytorl 71ig-polypeptid). Terapeutiske polypeptider kan tilveiebringes i form av en injiserbar løsning for en enkelt eller flere doser, eller som et sterilt pulver som skal rekonstitueres før injeksjon. Alternativt kan et slikt sett omfatte en innretning for dispersjon av tørre pulvere, en flytende aerosolgenerator eller en nebulisator for tilførsel av et terapeutisk polypeptid. Et slikt sett kan videre omfatte skriftlig informasjon vedrørende indikasjoner og bruk av det farmasøytiske preparat. Slik innformasjon kan videre omfatte en erklæring om at zcytorl 71ig-preparatet er kontraindisert for pasienter med kjent hypersensitivitet overfor zcytorl 71ig.
Foreliggende oppfinnelse gjelder et isolert polypeptid kjennetegnet ved at den omfatter en sekvens av aminosyrerester som har minst 95 % sekvenslikhet med aminosyrerestene 27-164 ifølge SEQ ID NO: 2, hvori polypeptidet binder zcytorl7-polypeptidet som vist i SEQ ID NO: 5 eller induserer inflammasjon.
Foreliggende oppfinnelse gjelder et isolert polynukleotidmolekyl kjennetegnet ved at det omfatter en sekvens av nukleotider som koder for polypeptidet som beskrives ovenfor.
Foreliggende oppfinnelse gjelder en ekspresjonsvektor kjennetegnet ved at den omfatter følgende operativt sammenkoblede elementer: (a) en transkripsjonspromoter; (b) et DNA-segment som koder for polypeptidet ifølge krav 1 eller 2; og (c) en transkripsjonsterminator.
Foreliggende oppfinnelse gjelder en dyrket celle kjennetegnet ved at den omfatter ekspresjonsvektoren som beskrives ovenfor.
Oppfinnelse angir også en fremgangsmåte for fremstilling av et protein som omfatter dyrkning av en celle, som beskrevet ovenfor, under betingelser hvori DNA-segmentet uttrykkes, og gjenvinning av proteinet som kodes av DNA-segmentet.
Oppfinnelse angir videre et antistoff eller antistoffragment som spesifikt bindes til polypeptidet ifølge krav 1 eller 2.1 en annen utførelse omfatter antistoffet som beskrevet ovenfor, en radioaktiv isotop, et enzym, et substrat, en kofaktor, en fluorescensmarkør, en kjemi-luminescensmarkør, en peptidmerkelapp, en magnetisk partikkel, et medikament eller et toksin. I én utførelse er antistoffet som beskrevet ovenfor,
Oppfinnelsen illustreres videre ved hjelp av de påfølgende eksempler.
Eksempler
Eksempel 1
Konstruksjon av MPL- zcvtorl7- polvpeptidkimære: det ekstracellulære domenet ogtransmembrandomenet fra MPL fusjonert til det intracellulære signaldomenet fra zcytorl 7
Det 5' ekstracellulære domenet i MPL-reseptoren fra mus ble isolert fra et plasmid som inneholder muse-MPL-reseptoren (plasmid PHZ1/MPL) ved kutting med EcoRI og BamHI for erholdelse av et fragment på 1164 bp. Reaksjonsblandingen ble fraksjonert i en 1 % agarosegel, og fragmentet ble isolert ved anvendelse av
gelekstraksjonssettet "QIAquick" (Qiagen) ifølge produsentens instruksjoner. Resten av det ekstracellulære MPL-domenet og transmembrandomenet ble fremstilt ved anvendelse av PCR med primerne ZC6673 (SEQ ID NO: 13) og ZC29082 (SEQ ID NO: 14). Reaksjonsbetingelsene var som følger: 15 sykluser bestående av 94 °C i 1 minutt, 55 °C i 1 minutt og 72 °C i 2 minutter, fulgt av 72 °C i 7 minutter og så inkubering ved 4 °C. PCR-produktet ble fraksjonert i en 1 % agarosegel, og MPL-reseptorfragmentet på ca. 400 kb ble isolert ved anvendelse av gelekstraksjonssettet "QIAquick" (Qiagen) ifølge produsentens instruksjoner.
Det intracellulære domenet i human zcytorl 7 ble isolert fra et plasmid som inneholdt zcytorl 7-reseptor-cDNA (nr. 23/pCAP) ved anvendelse av PCR med primerne ZC29083 (SEQ ID NO: 15) og ZC29145 (SEQ ID NO: 16). Polynukleotidsekvensen som tilsvarer den kodende sekvens for zcytorl 7-reseptoren, er vist i SEQ ID NO: 5. Reaksjonsbetingelsene var som ovenfor. PCR-produktet ble fraksjonert i en 1 % agarosegel, og zcytorl 7-fragmentet på ca. 320 bp ble isolert ved anvendelse av gelekstraksjonssettet "QIAquick" ifølge produsentens instruksjoner.
De to isolerte PCR-fragmentene beskrevet ovenfor ble sammenblandet i et volumetrisk forhold på 1:1 og anvendt i en PCR-reaksjon hvor primerne ZC6673 (SEQ ID NO: 13) og ZC29145 (SEQ ID NO: 16) ble anvendt for dannelse av hele MPL-zcytorl 7-kimæren, bortsett fra 5-MPL-delen. Reaksjonsbetingelsene var som følger: 15 sykluser bestående av 94 °C i 1 minutt, 55 °C i 1 minutt og 72 °C i 2 minutter, fulgt av 72 °C i 7 minutter og så inkubering ved 4 °C. Hele PCR-produktet ble fraksjonert i en 1 % agarosegel, og MPL-zcytorl 7-kimærfragmentet på ca. 700 kb ble isolert ved anvendelse av gelekstraksjonssettet "QIAquick"
(Qiagen) ifølge produsentens instruksjoner. Det MPL-zcytorl7- kimærfragmentet ble kuttet med BamHI (BRL) og Xbal (Boehringer Mannheim) ifølge produsentens instruksjoner. Reaksjonsblandingen ble fraksjonert i en 1 % agarosegel, og den kuttede MPL-zcytorl7-kimære ble isolert ved anvendelse av gelekstraksjonssettet "QIAquick" (Qiagen) ifølge produsentens instruksjoner. Den resulterende kuttede MPL-zcytorl 7-kimære pluss EcoRI/BamHI-fragmentet fra 5' MPL beskrevet ovenfor ble innsatt i en ekspresjonsvektor for dannelse av den fullstendige kimæriske MPL-zcytorl 7-reseptor, som beskrevet nedenfor.
Mottakerekspresjonsvektoren pZP-7 ble kuttet med EcoRI (BRL) og Xbal (BRL) ifølge produsentens instruksjoner og gelrenset, som beskrevet ovenfor. Dette vektorfragmentet ble blandet med EcoRI- og Xbal-kuttet MPL-zcytorl 7-PCR-kimæren isolert ovenfor og EcoRI-og BamHI-5-MPL-fragmentet isolert ovenfor i en ligeringsreaksjon. Ligeringen ble utført ved anvendelse av T4-ligase (Epicentre Technologies) ved romtemperatur i 1 time ifølge produsentens instruksjoner. Et uttak av ligeringsreaksjonen ble elektroporert inn i de elektrokompetente E. co/z-cellene DH10B-*'ElectroMAX" (25 uF, 200 Q, 1,8 V). Transformantene ble utsådd på LB+-ampicillinskåler, og enkeltkolonier ble analysert ved minipreparering av plasmid (Qiagen) og kutting med EcoRI for å analysere for MPL-zcytorl 7-kimæren. EcoRI-kutting av korrekte kloner gir et fragment på ca. 2 kb. Bekreftelse av MPL-zcytorl 7-kimærsekvensen ble gjort ved sekvensanalyse. Innskuddet var på ca. 3,1 kb og var fullengde.
Eksempel 2
MPL- zcvtorl7- kimærebasert proliferasjon i BaF3- analvse ved anvendelse av Alamar Blue
A. Konstruksjon av BaF3- celler som uttrykker MPL- zcvtorl7- kimære
BaF3, en interleukin-3-avhengig (IL-3) prelymfoid cellelinje avledet fra benmarg fra mus (Palacios og Steinmetz, Cell, 47:727-734,1985; Mathey-Prevot et al, Mol. Cell. Biol., 6:4133-4135,1986), ble dyrket i komplett medium (RPMI-medium, JRH Bioscience Inc., Lenexa, KS) tilsatt 10 % varmeinaktivert føtalt kalveserum, 1-2 ng/ml muse-IL-3 (mIL-3)
(R&D, Minneapolis, MN), 2 mM "L-glutaMax-1" (Gibco BRL), 1 mM natriumpyruvat (Gibco BRL) og PSN-antibiotika (Gibco BRL)). Før elektroporeringen ble pZP-5N/MPL-zcytorl7-plasmid-DNA (eksempel 1) fremstilt og renset ved anvendelse av et Qiagen Maxi Prep-sett (Qiagen) ifølge produsentens instruksjoner. BaF3-celler for elektroporering ble vasket to ganger med RPMI-medium og så resuspendert i RPMI-medium ved en celletetthet på IO<7>celler/ml. 1 ml resuspenderte BaF3-celler ble sammenblandet med 30 ug pZP-7/MPL-zcytorl7-plasmid-DNA og overført til separate elektroporeringskamre for engangsbruk (Gibco BRL). Ved romtemperatur ble cellene gitt fem sjokk på 0,1 millisekunder ved 800 volt, fulgt av fem sjokk på 2 millisekunder ved 600 volt, tilført med et elektroporeringsapparat (Cyto-Pulse). Alternativt ble cellene elektroporert med to serielle pulser (800 uFad/300 V; fulgt av 1180 uFad/300 V), levert av et Cell-Porator-elektroporeringsapparat (Gibco BRL). De elektroporerte cellene ble overført til 50 ml komplett medium og plassert i en inkubator i 15-24 timer (37 °C, 5 % CO2). Så ble seleksjonsmidlet "Geneticin (Gibco) (1 mg/ml G418) tilsatt til cellene i en T-162-flaske for isolering av den G418-resistente porsjon. Uttak av de transfekterte BaF3-celler, i det påfølgende heri betegnet BaF3/MPL-zcytorl7-celler, ble analysert for signaliseringsevne, som beskrevet nedenfor.
B. Analyse av signaliseringsevnen til BaF3/ MPL- zcvtorl7- cellene ved anvendelse av en Alamar Blue- proliferasionsanalvse
BaF3/MPL-zcytorl7-celler ble nedsentrifugert og vasket i det komplette medium som er beskrevet ovenfor, men uten mIL-3 (i det påfølgende betegnet "mIL-3-fritt medium"). Cellene ble nedsentrifugert og vasket tre ganger for å sikre fjerning av mIL-3. Cellene ble så talt i et hemacytometer. Cellene ble utsådd i 96-brønners format med 5000 celler pr. brønn i et volum på 100 ul pr. brønn ved anvendelse av mIL-3-fritt medium.
Proliferasjonen av BaF3/MPL-zcytorl7-cellene ble anslått ved anvendelse av musetrombopoietin (mTPO) fortynnet med mIL-3-fritt medium til konsentrasjoner på 200 ng/ml, 100 ng/ml, 50 ng/ml, 25 ng/ml, 12,5 ng/ml, 6,25 ng/ml, 3,1 ng/ml og 1,5 ng/ml. 100 ul fortynnet mTPO ble tilsatt til BaF3/MPL-zcytorl7-cellene. Det totale analysevolum var 200 ul. Negative kontroller ble analysert i parallell ved anvendelse av mIL-3-fritt medium alene, uten tilsetning av mTPO. Analyseplatene ble inkubert ved 37 °C, 5 % CO2i 3 dager, hvoretter Alamar Blue (Accumed, Chicago, IL) ble tilsatt med 20 ul/brønn. Alamar Blue gir en fluorometrisk avlesning basert på cellenes metabolske aktivitet, og er således et direkte mål på celleproliferasjon sammenlignet med en negativ kontroll. Platene ble igjen inkubert ved 37 °C, 5 % CO2i 24 timer. Platene ble avlest i en "Fmax"-plateleser (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) ved anvendelse av programvaren "SoftMax" Pro ved bølgelengdene 544 nm (eksitasjon) og 590 nm (emisjon), eller i en Wallac Victor 2-plateleser (PerkinElmer Life Sciences, Boston, MA).
Resultatene bekreftet signaliseringsevnen til den intracellulære del av zcytorl 7-reseptoren, siden trombopoietin induserte en proliferasjon som var ca. 9-13 ganger høyere enn bakgrunnsnivået ved mTPO-konsentrasjoner på 50 ng/ml og høyere.
Eksempel 3
Konstruksjon av en ekspresjonsvektor som uttrykker fullengde- zcvtorl7: pZp7pX/ zcytorl7
A. Kloning av fullengde- zcvtorl7- cDNA for ekspresjon
For erholdelse av fullengde-zcytorl7-cDNA ble 5'- og 3'-PCR-produkter isolert og sammenkoblet ved anvendelse av et internt Pstl-sete. PCR-primerne ble utformet ved anvendelse av nukleotidsekvensen i SEQ ID NO: 4 og omfattet BamHI- og Xhol-restriksjonsseter for kloningsformål.
Et 5-PCR-produkt ble frembrakt ved anvendelse av et WI-38-cDNA-bibliotek som templat og oligonukleotidene ZC29359 (SEQ ID NO: 18) og ZC27899 (SEQ ID NO: 19) som primere. WI-38 er et hjemmelagd cDNA-bibliotek dannet fra en human, embryonal lungecellelinje (ATCC CRL-2221). Denne 5'-PCR-reaksjonen ble utført som følger: 30 sykluser bestående av 94 °C i 1 minutt, 65 °C i 1 minutt og 72 °C i 2 minutter, så 72 °C i 7 minutter og inkubering ved 10 °C. PCR-reaksjonen benyttet ca. 3 ug plasmid fremstilt fra cDNA-biblioteket, 20 pmol av hvert oligonukleotid og 5 enheter PWO-DNA-polymerase (Roche). Cirka 90 % av PCR-produktet ble utfelt med etanol, kuttet med BamHI og Pstl og gelrenset i en 1,0 % agarosegel. Båndet på ca. 600 bp ble kuttet ut og benyttet for ligering til kloningsvektoren pUC18 kuttet med BamHI og Pstl. De resulterende transformantene ble sekvensert for å bekrefte zcytorl 7-cDNA-sekvensen. For én av transformantene ble plasmid-DNA fremstilt og kuttet med BamHI og Pstl. Det resulterende bånd på ca. 600 bp ble gelrenset og benyttet i ligeringen beskrevet ovenfor for dannelse av fullengde-cDNA.
Et 3'-PCR-produkt ble fremstilt ved anvendelse av et hjemmelagd cDNA-bibliotek fra human testis som templat og oligonukleotidene ZC27895 (SEQ ID NO: 20) og ZC29122 (SEQ ID NO: 21) som primere. Denne 3'-PCR-reaksjonen ble utført som følger: 30 sykluser bestående av 94 °C i 45 sekunder, 65 °C i 45 sekunder og 72 °C i 2 minutter, så 72 °C i 7 minutter og inkubering ved 10 °C. Hele 3'-PCR-reaksjonen ble gelrenset i en 1,0 % agarosegel, og hovedbåndet på 1500 bp ble kuttet ut. Dette båndet ble klonet inn i vektoren PCR Blunt II TOPO ved anvendelse av settet Zeroblunt TOPO (Invitrogen). De resulterende transformantene ble sekvensert for å bekrefte zcytorl 7-cDNA-sekvensen. For én av transformantene ble plasmid-DNA fremstilt og kuttet med Pstl og Xhol. Det resulterende bånd på ca. 1500 bp ble gelrenset. En treveis ligering ble utført med det 5' BamHI- til Pstl-fragment beskrevet ovenfor, det 3' Pstl-til Xhol-fragment og ekspresjonsvektoren pZp7pX kuttet med BamHI og Xhol. Dette ga et pZp7pX-plasmid som inneholdt fullengde-cDNA for zcytorl 7 (SEQ ID NO: 4), og som ble betegnet pZp7p/zcytorl7. Fullengde-zcytorl7-cDNA i pZp7p/zcytorl7 har en taus mutasjon som endrer T til G i posisjon 1888 i SEQ ID NO: 4 (som koder for en Gly-rest i posisjon 464 i SEQ ID NO: 5). Siden denne mutasjonen var taus, koder zcytorl7-cDNA i pZp7p/zcytorl 7 for polypeptidet som er vist i SEQ ID NO: 5. Plasmid pZp7pX er en pattedyrekspresjonsvektor som inneholder en ekspresjonskassett med CMV-promoteren, intron A, flere restriksjonsseter for innsetting av kodende sekvenser og en terminator fra humant veksthormon. Plasmidet har også et replikasjonsorigo fra E. coli, en pattedyrseleksjonsmarkørekspresjonsenhet med en SV40-promoter, -enhancer og -replikasjonsorigo, et puromycinresistensgen og SV40-terminatoren.
B. Konstruksjon av ekspresjonsvektor som uttrykker fullengde- WSX- 1
Hele WSX-1-reseptoren (SEQ ID NO: 9) ble isolert fra et plasmid som inneholdt WSX-1-reseptor-cDNA (SEQ ID NO: 8) (US patentskrift nr. 5 925 735). hWSX-l/p-Bluescript SK(+)-plasmid-DNA (Stratagene, La Jolla, CA) ble kuttet med EcoRI og Xhol for dannelse av et fragment på 1075 bp, og også kuttet med Xhol og Xbal for dannelse av et fragment på 900 bp. Begge reaksjonsløsninger ble fraksjonert i en 1 % agarosegel, og de kuttede WSX-1-fragmentene ble isolert.
Mottakerekspresjonsvektoren pZP7Z ble kuttet med EcoRI og Xbal og gelrenset, som beskrevet ovenfor. Vektorfragmentet ble blandet med de to kuttede zcytorl 7-fragmentene isolert ovenfor i en ligeringsreaksjon ved anvendelse av T4-ligase (BRL). Ligeringsreaksjonen ble inkubert ved romtemperatur over natten. Et uttak av ligeringsreaksjonen ble elektroporert inn i de elektrokompetente E. co/z-cellene DH10B-"ElectroMAX" (25 uF, 200 Q, 2,3 V). Seks kolonier ble dyrket i kultur, og minipreparater av DNA ble fremstilt og kuttet for å bekrefte korrekt fullengde-WSX-1-innskudd på 2,0 kb. Det resulterende plasmid er pZPZ7Z/WSX-l.
Eksempel 4
Zcytorl 7- basert proliferasjon i BaF3- analvse ved anvendelse av Alamar Blue
A. Konstruksjon av BaF3- celler som uttrykker zcytorl 7- reseptor. WSX- 1- reseptor og
OSMR
BaF3-celler som uttrykte fullengde-zcytorl 7-reseptoren, ble fremstilt ifølge eksempel 2A ovenfor ved anvendelse av 30 ug av zcytorl 7-ekspresjonsvektoren som beskrives i eksempel 3 A. Ett unntak var at 2 ug/ml puromycin (ClonTech) ble tilsatt til de transfekterte cellene i en T-162-flaske i stedet for geneticin for isolering av den puromycinresistente celleandel. BaF3-cellene som uttrykte zcytorl7-reseptor-mRNA, ble betegnet BaF3/zcytorl7. For erholdelse av kloner ble BaF3/zcytorl7-celler talt i et hemacytometer og utsådd med 1 celle/brønn, 0,5 celle/brønn, 0,1 celle/brønn og 0,01 celle/brønn i 96-brønners plater. Femten kloner ble oppskalert til T75-flasker, og fem kloner ble analysert for zcytorl 7-ekspresjon. Total-RNA ble isolert fra nedsentrifugerte celler ved anvendelse av "S.N.A.P." total RNA Isolation Kit (InVitrogen). Førstetråds-cDNA ble syntetisert ved anvendelse av settet "proSTAR" First Strand RT-PCR, og så ble PCR med de zcytorl7-spesifikke primere ZC29180 (SEQ ID NO: 22) og ZC29122 (SEQ ID NO: 23) utført for analyse av klonene for ekspresjon av zcytorl 7. Én klon, BaF3/zcytorl7#15, ble utvalgt for ekspansjon og transfeksjon med WSX-1-ekspresjonsvektoren.
BaF3-celler som uttrykte zcytorl 7 og fullengde-WSX-1, ble konstruert ifølge eksempel 2A ovenfor ved anvendelse av 30 \ xg av WSX-1-ekspresjonsvektoren WSX-l/pZp7Z (eksempel 3B) for elektroporering av BaF3/zcytorl7#15-cellene. Ett unntak er at 200 ug/ml zeocin (InVitrogen) ble tilsatt til de transfekterte cellene i en T-162-flaske i stedet for geneticin for isolering av den zeocinresistente celleandel. BaF3-cellene som uttrykte zcytorl 7 og WSX-1, ble betegnet BaF3/zcytorl7/hWSX-l. For erholdelse av kloner ble uttak av BaF3/zcytorl7/hWSX-l-cellene utsådd i begrensende fortynning i 96-brønners plater. De resulterende klonene ble ekspandert, og total-RNA ble isolert ved anvendelse av "S.N.A.P." total RNA Isolation Kit (InVitrogen). Førstetråds-cDNA ble syntetisert ved anvendelse av settet "proSTAR" First Strand RT-PCR, og så ble PCR med de WSX-1-spesifikke primere ZC9791 (SEQ ID NO: 24) og ZC9793 (SEQ ID NO: 25) anvendt for analyse av klonene for ekspresjon av WSX-1. Én klon, BaF3/zcytorl7/hWSX-l#5, ble utvalgt for videre ekspansjon og transfeksjon med OSMRbeta-ekspresjonsvektoren.
BaF3-celler som uttrykte zcytorl 7, WSX-1 og fullengde-OSMRbeta, ble konstruert ifølge eksempel 2A ovenfor ved anvendelse av 30 ug av OSMRbeta-ekspresjonsvektoren OSMR/pZp7NX, som beskrevet i eksempel 29, for elektroporering av BaF3/zcytor-17/hWSX-l#15-cellene. BaF3-cellene som uttrykte zcytorl7-, WSX-1- og OSMRbeta-mRNA, ble betegnet BaF3/zcytorl 7/WSX-l/OSMR. For erholdelse av kloner ble uttak av BaF3/zcytorl7/WSX-l/OSMRbeta-celler utsådd i begrensende fortynning i 96-brønners plater. Enkeltkloner ble ekspandert, og total-RNA ble isolert ved anvendelse av "S.N.A.P." total RNA Isolation Kit (InVitrogen). Førstetråds-cDNA ble syntetisert ved anvendelse av settet "proSTAR" First Strand RT-PCR, og så ble PCR med de OSMRbeta-spesifikke primere ZC40109 (SEQ ID NO: 26) og ZC40112 (SEQ ID NO: 27) anvendt for analyse av klonene for ekspresjon av zcytorl7, WSX-1 og OSMR. Én klon, BaF3/zcytorl7/WSX-l/OSMR#5, ble utvalgt, og disse cellene ble anvendt for søk etter zcytorl71ig, som beskrevet nedenfor i eksemplene 5 og 6.
B. Konstruksjon av BaF3- celler som uttrykker zcytorl 7- reseptor og OSMR
BaF3-celler som uttrykte fullengde-zcytorl 7-reseptor, ble fremstilt ifølge eksempel 2A ovenfor ved anvendelse av 30 ug av zcytorl 7-ekspresjonsvektoren som beskrives i eksempel 3 A. Ett unntak var at 2 ug/ml puromycin (ClonTech) ble tilsatt til de transfekterte cellene i en T-162-flaske i stedet for geneticin for isolering av den puromycinresistente celleandel. BaF3-cellene som uttrykte zcytorl 7-reseptor-mRNA, ble betegnet BaF3/zcytorl7. For erholdelse av kloner ble uttak av BaF3/zcytorl7-celler utsådd i begrensende fortynning i 96-brønners plater. Disse klonene ble ekspandert i kultur, og total-RNA ble isolert ved anvendelse av "S.N.A.P." total RNA Isolation Kit (InVitrogen). Førstetråds-cDNA ble syntetisert ved anvendelse av settet "proSTAR" First Strand RT-PCR, og så ble PCR anvendt for analyse av klonene for ekspresjon av zcytorl 7. Én klon, BaF3/zcytorl7#15, ble utvalgt for ekspansjon og transfeksjon med OSMRbeta-ekspresjonsvektoren.
BaF3-celler som uttrykte zcytorl7 og fullengde-OSMRbeta, ble fremsetilt ifølge eksempel 2A ovenfor ved anvendelse av 30 ug av OSMRbeta-ekspresjonsvektoren OSMR/pZp7NX (eksempel 29) for elektroporering av BaF3/zcytorl7#15-cellene. BaF3-cellene som uttrykte zcytorl 7- og OSMRbeta-mRNA, ble betegnet BaF3/zcytorl7/OSMR. Disse cellene ble anvendt for søk etter zcytorl 7, som beskrevet nedenfor i eksempel 5.
Eksempel 5
Søk etter zcytorl71ig ved anvendelse av BaF3/ zcytorl7/ WSX- l/ OSMRbeta- celler ved anvendelse av en Alamar Blue- proliferasjonsanalyse
A. Aktivering av CCRF- CEM- og CCRF- HSB2- celler for analyse av nærvær av zcytorl 71ig
CCRF-CEM- og CCRF-HSB2-celler ble erholdt fra ATCC og stimulert i kultur for fremstilling av kondisjonert medium for analyse av nærvær av zcytorl 71ig-aktivitet, som
beskrevet nedenfor. Suspensjonscellene ble utsådd ved 2 x 10<5>celler/ml eller 5 x 10<5>celler/ml i RPMI-1640-medium tilsatt 10 % FBS, 2 mM L-glutamin (Gibco BRL) og 1 x PSN (Gibco BRL) og aktivert med 10 ng/ml forbol-12-myristat-13-acetat (PMA) (Calbiochem, San Diego, CA) og 0,5 ug/ml ionomycin (Calbiochem) i 24 eller 48 timer. Supernatanten fra de stimulerte cellene
ble anvendt for analyse av proliferasjonen av BaF3/zcytorl7/WSX-l/OSMRbeta-celler eller BaF3/zcytorl 7/OSMRbeta-celler, som beskrevet nedenfor.
B. Søk etter zcvtorl71ig ved anvendelse av BaF3/ zcvtorl7/ WSX- l/ OSMRbeta- celler eller BaF3/ zcvtorl7/ OSMRbeta- celler ved anvendelse av en Alamar Blue- proliferasionsanalvse
BaF3/zcytorl7/WSX-l/OSMRbeta-celler eller BaF3/zcytorl7/OSMRbeta-celler ble nedsentrifugert og vasket i mIL-3-fritt medium. Cellene ble nedsentrifugert og vasket tre ganger for å sikre fjerningen av mIL-3. Cellene ble så talt i et hemacytometer. Cellene ble utsådd i 96-brønners format med 5000 celler pr. brønn i et volum på 100 ul pr. brønn ved anvendelse av mIL-3-fritt medium.
Proliferasjonen av BaF3/zcytorl7/WSX-l/OSMRbeta-cellene eller BaF3/zcytorl7/OSMRbeta-cellene ble anslått ved anvendelse av kondisjonert medium fra aktiverte CCRF-CEM- og CCRF-HSB-celler (se eksempel 5A). Kondisjonert medium ble fortynnet med mIL-3-fritt medium til konsentrasjoner på 50 %, 25 %, 12,5 %, 6,25 %, 3,125 %, 1.5 %, 0,75 % og 0,375 %. 100 ul fortynnet kondisjonert medium ble tilsatt til BaF3/zcytorl7/WSX-l/OSMRbeta-cellene eller BaF3/zcytorl7/OSMRbeta-cellene. Det totale analysevolum var 200 ul. Analyseplatene ble inkubert ved 37 °C, 5 % CO2i 3-5 dager, hvoretter Alamar Blue (Accumed, Chicago, IL) ble tilsatt med 20 ul/brønn. Platene ble igjen inkubert ved 37 °C, 5 % CO2i 24 timer. Platene ble avlest i en "Fmax"-plateleser (Molecular Devices), som beskrevet ovenfor (eksempel 2).
Resultatene bekreftet den proliferative respons av BaF3/zcytorl7/WSX-1/OSMRbeta-cellene eller BaF3/zcytorl7/OSMRbeta-cellene på en faktor som forelå i det kondisjonerte medium fra aktiverte CCRF-CEM- og CCRF-HSB-celler. Den målte respons lå ca. 10 ganger over bakgrunnsnivået ved 25 % konsentrasjon. Ikke-transfekterte BaF3-celler prolifererte ikke som respons på denne faktoren, heller ikke BaF3-celler transfektert med zcytorl7 og WSX-1 (BaF3/zcytorl 7/WSX-l -celler), noe som viste at denne faktoren var spesifikk for zcytorl 7/OSMRbeta- eller zcytorl 7/OSMRbeta/WSX-l-reseptorer. Videre reduserte løselig zcytorl 7-reseptor denne proliferative aktivitet av zcytorl 71ig i BaF3/zcytor-17/WSX-l/OSMRbeta-cellene (se eksempel 11). Tilsvarende resultater forventes i BaF3/zcytor 17/OSMRbeta-celler.
C. Anvendelse av en human primærkilde for isolering av zcvtorl71ig
100 ml blod ble tappet fra seks donorer. Blodet ble tappet ved anvendelse av 10 x 10 ml "vacutainer"-rør inneholdende heparin. Blod fra seks donorer ble slått sammen (600 ml), fortynnet 1:1 i PBS og separert ved anvendelse av "Ficoll-Paque" PLUS (Pharmacia Biotech). Utbyttet av isolerte primære humanceller etter separasjon i Ficoll-gradienten var 1,2 x IO<9>celler.
Cellene ble suspendert i 9,6 ml MACS-buffer (PBS, 0,5 % EDTA, 2 mM EDTA). 1.6 ml cellesuspensjon ble tatt ut, og 0,4 ml CD3-mikrokuler (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) ble tilsatt. Blandingen ble inkubert i 15 minutter ved 4 °C. Cellene merket med CD3-kuler ble vasket med 30 ml MACS-buffer og så resuspendert i 2 ml MACS-buffer.
En VS+-kolonne (Miltenyi) ble fremstilt ifølge produsentens instruksjoner. VS+-kolonnen ble så plassert i et "VarioMACS "-magnetfelt (Miltenyi). Kolonnen ble ekvilibrert med 5 ml MACS-buffer. De isolerte primære humancellene ble så påsatt kolonnen. De CD3-negative cellene fikk passere gjennom kolonnen. Kolonnen ble vasket med 9 ml (3 x 3 ml) MACS-buffer. Kolonnen ble så fjernet fra magneten og plassert over et 15 ml falcon-rør. CD3<+->celler ble eluert ved tilsetning av 5 ml MACS-buffer til kolonnen, og bundne celler ble vasket ut ved anvendelse av stempelet som leveres av produsenten. Inkubering av cellene med magnetiske CD3-kuler, vask og VS+-kolonnetrinnene (fra inkubering til eluering) beskrevet ovenfor ble gjentatt ytterligere fem ganger. De resulterende CD3<+->fraksjonene fra de seks kolonneseparasjonene ble slått sammen. Utbyttet av CD3 -selekterte humane cellene var i alt 3 x 10 celler.
Et uttak av de sammenslåtte CD3<+->selekterte humane celler ble farget og sortert i et fluorescerende antistoff i en cellesorterer (FACS) for å anslå renheten. De humane CD3<+->selekterte cellene var 91 % CD3<+->celler.
De humane CD3<+->selekterte cellene ble aktivert ved inkubering i RPMI + 5 % FBS + PMA, 10 ng/ml, og ionomycin, 0,5 |xg/ml (Calbiochem) i 13 timer ved 37 °C. Supernatanten fra disse aktiverte CD3<+->selekterte humane cellene ble analysert for zcytorl 71ig-aktivitet, som beskrevet nedenfor. Videre ble de aktiverte CD3<+->selekterte humane cellene anvendt for fremstilling av et cDNA-bibliotek, som beskrevet i eksempel 6 nedenfor.
D. Analyse av supernatant fra aktiverte CD3+- selekterte humane celler for zc<y>torl71i<g>ved anvendelse av BaF3/ zcvtorl7/ WSX- l/ OSMRbeta- celler og en Alamar Blue-proliferasi onsanalvse
BaF3/zcytorl7/WSX-l/OSMRbeta-celler eller BaF3/zcytorl 7/OSMRbeta-celler ble nedsentrifugert og vasket i mIL-3-fritt medium. Cellene ble nedsentrifugert og vasket tre ganger for å sikre fjerning av mIL-3. Cellene ble så talt i et hemacytometer. Cellene ble utsådd i 96-brønners format med 5000 celler pr. brønn i et volum på 100 ul pr. brønn ved anvendelse av mIL-3-fritt medium.
Proliferasjon av BaF3/zcytorl7/WSX-l/OSMRbeta-cellene eller BaF3/zcytor-17/OSMRbeta-cellene ble anslått ved anvendelse av kondisjonert medium fra aktiverte CD3<+->selekterte humane celler (se eksempel 5C), fortynnet med mIL-3-fritt medium til konsentrasjoner på 25 %, 12,5 %, 6,25 %, 3,125 %, 1,5 %, 0,75 %, 0,375 % og 0,187 %. 100 ul av det fortynnede kondisjonerte medium ble tilsatt til BaF3/zcytorl7/WSX-l/OSMRbeta-cellene eller BaF3/zcytorl7/OSMRbeta-cellene. Det totale analysevolum var 200 ul. Analyseplatene ble inkubert og analysert som beskrevet i eksempel 5B.
Resultatene bekreftet den proliferative respons av BaF3/zcytorl7/WSX-1/OSMRbeta-cellene eller BaF3/zcytorl7/OSMRbeta-cellene på en faktor som forelå i kondisjonert medium fra de aktiverte CD3<+->selekterte humane cellene. Den målte respons var ca. 15 ganger over bakgrunnsnivået ved en konsentrasjon på 25 %. De ikke-transfekterte BaF3-cellene prolifererte ikke som respons på denne faktoren, og heller ikke BaF3-celler transfektert med zcytorl 7 og WSX-1 (BaF3/zcytorl 7/WSX-l-celler), noe som viste at faktoren var spesifikk for zcytorl 7/OSMRbeta- eller zcytorl 7/OSMRbeta/WSX-l-reseptorer. Videre blokkerte løselig zcytorl 7-reseptor denne proliferative aktivitet i BaF3/zcytorl7-cellene (se eksempel 11).
Eksempel 6
Kloning av human zc<y>torl71ig fra et humant CD3+- selektert cellebibliotek
Gjennomsøking av et cDNA-bibliotek fra primære humane aktiverte, CD3<+->selekterte celler avslørte et isolert cDNA som er et nytt medlem av fireheliksbuntcytokin-familien. Dette cDNA kodet for zcytorl 71ig. Dette cDNA ble identifisert ved analyse for zcytorl71ig-aktivitet ved anvendelse av zcytorl7/WSX-l/OSM-reseptorene.
A. Vektoren for konstruksjon av et CD3+- selektert bibliotek
Vektoren for konstruksjon av det CD3<+->selekterte bibliotek var pZP7NX. pZP7NX-vektoren ble konstruert som følger. Det kodende området i DHFR-seleksjonsmarkøren i vektoren pZP7 ble fjernet ved kutting av DNA med restriksjonsenzymene Ncol og Pstl (Boehringer Mannheim). Det kuttede DNA ble fraksjonert i en 1 % agarosegel, og båndene ble kuttet ut og gelrenset ved anvendelse av gelekstraksjonssettet "Qiagen" (Qiagen) ifølge produsentens instruksjoner. Et DNA-fragment som representerte det kodende området fra seleksjons-markøren zeocin, ble amplifisert ved PCR-fremgangsmåten med primerne ZC13946 (SEQ ID NO: 28) og ZC13945 (SEQ ID NO: 29) og pZeoSV2(+) som templat. Det er ekstra Pstl- og Bcll-restriksjonsseter i primer ZC13946 (SEQ ID NO: 28), og ekstra Ncol- og Sful-seter i primer ZC13945 (SEQ ID NO: 26). PCR-fragmentet ble kuttet med restriksjonsenzymene Pstl og Ncol og klonet inn i pZP7-vektoren etter klargjøring av denne ved kutting med de samme to enzymer og påfølgende gelrensing. Denne vektoren ble betegnet pZP7Z. Så ble det zeocinkodende området fjernet ved DNA-kutting av pZP7Z-vektoren med restriksjonsenzymene Bell og Sful. Det kuttede DNA ble fraksjonert i en 1 % agarosegel, kuttet ut og gelrenset, og så ligert til et DNA fragment med det neomycinkodende området utkuttet fra vektoren pZem228 (deponert hos American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA; ATCC-deponeringsnummer 69446) med de samme restriksjonsenzymene (Bell og SM).
Denne nye vektoren ble betegnet pZP7N, og i denne var det kodende området for seleksjonsmarkøren DHFR erstattet med det kodende området for en neomycinseleksjonsmarkør fra vektoren pZem228. Et oppfyllingsfragment som omfattet et Xhol-sete, ble innført i pZP7N for erholdelse av en vektor som var egnet for retningsstyrt kloning av cDNA med høy effektivitet; denne nye vektoren ble betegnet pZP7NX. For å forberede vektoren for mottak av cDNA ble 20 ug pZP7NX kuttet med 20 enheter EcoRI (Life Technologies, Gaithersburg, MD) og 20 enheter Xhol (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) i 5 timer ved 37 °C, og så ved 68 °C i 15 minutter. Reaksjonsblandingen ble så fraksjonert i en 0,8 % agarosegel med lavt smeltepunkt i 1 x TAE for å separere oppfyllingsefragmentet fra vektoren. Vektorbåndet ble kuttet ut og behandlet med "beta-Agarase" (New England Biolabs, Beverly, MA) ifølge produsentens anbefalinger. Etter etanolutfelling ble den kuttede vektor resuspendert i vann til 45 ng/ml, klar for innligering av det CD3<+->selekterte cDNA-bibliotek som beskrives nedenfor.
B. Fremstilling av cDNA- bibliotek fra primære humane aktiverte. CD3+- selekterte celler
Cirka 1,5 x 10 8 primære humane CD3 4*-selekterte celler stimulert med ionomycin/PMA ble isolert ved sentrifugering etter dyrkning ved 37 °C i 13 timer (eksempel 5C). Total-RNA ble isolert fra de nedsentrifugerte cellene ved anvendelse av settet "RNeasy Midi" fra Qiagen, Inc. (Valencia, CA). mRNA ble isolert fra 225 ug total-RNA ved anvendelse av "MPG-mRNA"-rensesett fra CPG Inc. (Lincoln Park, NJ). 3,4 ug mRNA ble isolert og overført til dobbelttrådet cDNA ved anvendelse av følgende fremgangsmåte.
Førstetråds-cDNA fra stimulerte humane CD3<+->selekterte celler ble syntetisert
som følger. 9 ul oligo-d(T)-selektert poly(A)-CD3<+->RNA i en konsentrasjon på 0,34 ug/ul og 1,0 ul av en løsning med 1 ug/ul av førstetrådsprimeren ZC18698 (SEQ ID NO: 30), som inneholdt et Xhol-restriksjonssete, ble sammenblandet og oppvarmet til 65 °C i 4 minutter og avkjølt på is. Førstetråds-cDNA-syntese ble startet ved tilsetning av 9 ul førstetrådsbuffer (5 x "SUPERSCRIPT"-buffer, Life Technologies), 4 (al 100 mM ditiotreitol og 2 ul av en deoksynukleotidtrifosfatløsning som inneholdt 10 mM av hver av dATP, dGTP, dTTP og 5-metyl-dCTP (Pharmacia Biotech Inc.) til RNA-primerblandingen. Reaksjonsblandingen ble inkubert ved 45 °C i 4 minutter, fulgt av tilsetning av 8 ul 200 U/ul "SuperscriptU", RNase H-reverstranskriptase (Life Technologies). Reaksjonsblandingen ble inkubert ved 45 °C i 45 minutter, fulgt av en temperaturøkning på 1 °C for hvert 2. minutt til 50 °C, hvor reaksjonsblandingen ble holdt i 10 minutter. For denaturering av eventuelle sekundærstrukturer og for ytterligere forlengelse av cDNA ble reaksjonsblandingen så oppvarmet til 70 °C i 2 minutter og så avkjølt til 55 °C i 4 minutter, hvoretter 2 ul "SuperscriptU" RT ble tilsatt og blandingen inkubert i ytterligere 15 minutter, fulgt av en økning på 1 °C/minutt opp til 70 °C. Ikke-inkorporerte nukleotider ble fjernet fra cDNA ved to gangers utfelling i nærvær av 2 |ag glykogenbærer, 2,0 M ammoniumacetat og 2,5 volumer etanol, fulgt av vask med 100 ul 70 % etanol. cDNA ble resuspendert i 98 ul vann for anvendelse i andretrådssyntesen.
Andretrådssyntesen ble utført på førstetråds-cDNA under betingelser som fremmet priming av førstetråden for andretrådssyntese ved dannelse av en DNA-hårnål. Andre-trådsreaksjonen inneholdt 98 ul førstetråds-cDNA, 30 ul 5 x polymerase I-buffer (100 mM Tris-HC1, pH 7,5, 500 mM KC1,25 mM MgCl2, 50 mM (NFLO2SO4), 2 ul 100 mM ditiotreitol, 6 ul av en løsning som inneholdt 10 mM av hvert deoksynukleotidtrifosfat, 5 ul 5 mM b-NAD, 1 ul 3 U/ul E. co//'-DNA-ligase (New England Biolabs Inc.) og 4 ul 10 U/ul E. co/f-DNA-polymerase I (New England Biolabs Inc.). Reaksjonsblandingen ble sammenblandet ved romtemperatur og inkubert ved romtemperatur i 2 minutter, fulgt av tilsetning av 4 (al 3,8 U/ul RNase H (Life Technologies). Reaksjonsblandingen ble inkubert ved 15 °C i 2 timer, fulgt av inkubering i 15 minutter ved romtemperatur. 10 (il 1 M Tris, pH 7,4, ble tilsatt til reaksjonsblandingen, som så ble ekstrahert to ganger med fenol/kloroform og én gang med kloroform, de organiske faser ble så ekstrahert med 50 ul TE (10 mM Tris, pH 7,4,1 mM EDTA), som ble slått sammen med den første vannfasen, hvoretter DNA ble utfelt med etanol i nærvær av 0,3 M natriumacetat. Nedsentrifugert materiale ble vasket med 100 ul 70 % etanol, lufttørket og resuspendert i 40 ul vann.
Det enkelttrådede DNA i hårnålsstrukturen ble kuttet ved anvendelse av nuklease fra "mung bean". Reaksjonsblandingen inneholdt 40 ul andretråds-cDNA, 5 ul 10 x "mung bean"-nukleasebuffer (Life Technologies) og 5 ul "mung bean"-nuklease (Pharmacia Biotech Corp.) fortynnet til 1 U/ul i 1 x "mung bean"-nukleasebuffer. Reaksjonsblandingen ble inkubert ved 37 °C i 45 minutter. Reaksjonen ble stanset ved tilsetning av 10 ul 1 M Tris-HCl, pH 7,4, fulgt av ekstraksjon med fenol/kloroform og kloroform, som beskrevet ovenfor. Etter ekstraksj onene ble cDNA utfelt med etanol i nærvær av 0,3 M natriumacetat. Nedsentrifugert materiale ble vasket med 100 ul 70 % etanol, lufttørket og resuspendert i 38 ul vann.
Det resuspenderte cDNA ble gjort buttendet med T4-DNA-polymerase. cDNA resuspendert i 38 ul vann ble blandet med 12 (al 5 x T4-DNA-polymerasebuffer (250 mM Tris-HCl, pH 8,0, 250 mM KC1,25 mM MgCl2), 2 ul 0,1 M ditiotreitol, 6 (il av en løsning som inneholdt 10 mM av hvert deoksynukleotidtrifosfat og 2 ul 1 U/ul T4-DNA-polymerase (Boehringer Mannheim Corp.). Etter inkubering i 45 minutter ved 15 °C ble reaksjonen stanset ved tilsetning av 30 |il TE, fulgt av ekstraksjon med fenol/kloroform og kloroform og tilbakeekstraksjon med 20 (il TE, som beskrevet ovenfor. DNA ble utfelt med etanol i nærvær av 2 ul "Pellet Paint"
(Novagen) som bærer og 0,3 M natriumacetat, og ble resuspendert i 11 ul vann.
EcoRI-adaptere ble ligert til 5'-endene i cDNA beskrevet ovenfor for å tillate kloning inn i en ekspresjonsvektor. 11 (il cDNA og 4 ul av en 65 pmol/ul løsning av hemifosforylert EcoRI-adapter (Pharmacia Biotech Corp.) ble sammenblandet med 5 (il 5 x ligasebuffer (Life Technologies), 2 jj.1 10 mM ATP og 3 (il 1 U/ul T4-DNA-ligase (Life Technologies), 1 |il 10 x ligeringsbuffer (Promega Corp.) og 9 (il vann. Den ekstra fortynningen med 1 x buffer var for å forhindre utfelling av "Pellet Paint". Reaksjonsblandingen ble inkubert i 9 timer i et vannbad hvor temperaturen økte fra 10 °C til 22 °C over et tidsrom på 9 timer, fulgt av 45 minutter ved 25 °C. Reaksjonen ble stanset ved inkubering ved 68 °C i 15 minutter.
For å lette retningsstyrt kloning av cDNA inn i en ekspresjonsvektor ble cDNA kuttet med Xhol, noe som ga et cDNA med en klebrig 5'-EcoRI-ende og en klebrig 3'-XhoI-ende. Xhol-restriksjonssetet i 3-enden av cDNA var blitt innført tidligere ved anvendelse av primeren ZC18698 (SEQ ID NO: 30). Restriksjonsenzymkuttingen ble utført i en reaksjonsblanding som inneholdt 35 (il av ligeringsblandingen beskrevet ovenfor, 6 ul 10 x H-buffer (Boehringer Mannheim Corp.), 1 (il 2 mg/ml BSA (Biolabs Corp.), 17 (il vann og 1,0 (il 40 U/ul Xhol (Boehringer Mannheim). Kuttingen ble utført ved 37 °C i 1 time. Reaksjonen ble stanset ved inkubering ved 68 °C i 15 minutter, fulgt av etanolutfelling, vask og tørking, som beskrevet ovenfor, og resuspendering i 30 (il vann.
Det resuspenderte cDNA ble oppvarmet til 65 °C i 5 minutter og avkjølt på is, 4 (il 5 x gelladningsfargeløsning (Research Genetics Corp.) ble tilsatt, og cDNA ble satt på en 0,8 % agarosegel med lavt smeltepunkt ("SEA PLAQUE GTG"-agarose med lavt smeltepunkt, FMC Corp.) i 1 x TAE og fraksjonert ved elektroforese. Kontaminerende adaptere og cDNA med størrelse under 0,6 kb ble kuttet ut fra gelen. Elektrodene ble reversert, smeltet agarose ble tilsatt for igjenfylling av brønnene, bufferen ble byttet, og cDNA ble fraksjonert ved elektroforese inntil var konsentrert nær startpunktet i gelen. Området i gelen som inneholdt konsentrert cDNA, ble kuttet ut og plassert i et mikrosentrifugerør, og agarosen ble smeltet ved oppvarming til 65 °C i 15 minutter. Etter ekvilibrering av prøven til 45 °C ble 2 ul 1 U/ul beta-agarase I (Biolabs, Inc.) tilsatt, og blandingen ble inkubert i 90 minutter ved 45 °C for oppkutting av agarosen. Etter inkuberingen ble 1/10 volum 3 M Na-acetat tilsatt til prøven, og blandingen ble inkubert på is i 15 minutter. Prøven ble sentrifugert ved 14 000 x g i 15 minutter ved romtemperatur for fjerning av uspaltet agarose, og cDNA ble utfelt med etanol, vasket med 70 % etanol, lufttørket og resuspendert i 40 ul vann.
For å bestemme det optimale forhold mellom cDNA og vektor ble flere ligeringsblandinger satt sammen og elektroporert. Kort beskrevet ble 2 ul 5 x T4-ligasebuffer (Life Technologies), 1 ul 10 mM ATP, 1 ul pZP7NX kuttet med EcoRI-XhoI, 1 ul T4-DNA-ligase, fortynnet til 0,25 |ig/ul (Life Technologies), vann til et totalvolum på 10 ul og 0,5,1,2 eller 3 ul cDNA sammenblandet i fire separate ligeringsblandinger, inkubert ved 22 °C i 4 timer og ved 68 °C i 20 minutter, utfelt med natriumacetat og etanol, vasket, tørket og resuspendert i 10 ul. 1 ul av hver ligeringsreaksjon ble elektroporert inn i 40 ul DHIOb "ElectroMax"-elektrokompetente bakterier (Life Technologies) ved anvendelse av en 0,1 cm kyvette (Biorad) og et elektroporeringsinstrument av type "Genepulser pulse controller" (Biorad) justert til 2,5 kV, 251 F, 200 ohm. Disse cellene ble umiddelbart resuspendert i 1 ml SOC-medium (Manniatis et al., supra), fulgt av 500 ul 50 % glyserol-SOC som konserveringsmiddel. Disse "glyserollagersuspensjonene" ble nedfrosset i flere porsjoner ved -70 °C. Et uttak fra hver ble opptint og utsådd ved seriefortynning på LB-agarskåler tilsatt 100 |ag/ml ampicillin. Koloni-tallene viste at det optimale forhold mellom CD3<+->cDNA og pZP7NX-vektor var 1 ul til 45 ng; en slik ligeringsreaksjon ga 4,5 millioner primærkloner.
For gjennomsøking av biblioteket ved anvendelse av en BaF3-basert proliferasjonsanalyse (eksempel 5) ble glyserollagersuspensjonene ovenfor fortynnet i flytende kulturer med 100 eller 250 kloner pr. porsjon i mikrotiterplater med dyp brønn og dyrket i 24 timer ved 37 °C under omristing, hvoretter plasmid ble isolert ved anvendelse av et Qiagen-sett ifølge produsentens instruksjoner. Dette DNA ble så transfektert inn i BHK-celler, og mediet ble kondisjonert i 72 timer, høstet og lagret ved -80 °C, og så plassert over 5 K BaF3/zcytorl7/WSX-l/OSMRbeta-celler eller BaF3/zcytorl7/OSMRbeta-celler i 72 timer, hvoretter proliferasjonen ble anslått ved anvendelse av en "Alamar blue"-fluorescensanalyse (eksempel 5B og eksempel 2B).
Eksempel 7
Ekspresjonskloning av human zcytorl 71ig
Glyserollagersuspensjonene fra det aktiverte humane CD3<+->selekterte cellebibliotek (eksempel 6) ble tilsatt til "SuperBroth II" (Becton Dickinson, Cockeysville, MD) + 0,1 mg/ml ampicillin (amp) i en konsentrasjon på 250 celler pr. 800 ul. E. Cø/i-cellene ble ekvilibrert i 24 timer ved romtemperatur. På inokulasjonstidspunktet ble 400 ul plassert på LB + amp-skåler for å bestemme faktisk inokuleringstiter. Etter 24 timer ble koloniene på platene talt, hvoretter den endelige konsentrasjon av E coli i "SuperBroth II" ble justert slik at den var 250 celler pr. 1,2 ml. Tre ganger 21 ble inokulert for et totalvolum på 61. Kulturene ble så overført til 96-brønners blokker med dyp brønn (Qiagen). Overføringen ble utført med en 8-kanalers "Q-Fill2"-dispenser (Genetix, Christchurch, Dorset, UK). E. coli ble dyrket over natten ved 37 °C under omristing ved 250 rotasjoner/minutt i en New Brunswick Scientific Innova 4900- risteinkubator med flere etasjer. E. coli ble nedsentrifugert ved 3000 rpm ved anvendelse av en Beckman GS-6KR-sentrifuge. Nedsentrifugerte E. cø/z-celler ble nedfrosset ved -20 °C før fremstilling av minipreparater av plasmid-DNA eller benyttet umiddelbart. Hver porsjon med nedsentrifugerte celler inneholdt ca. 250 cDNA-kloner fra det humane CD3<+->selekterte cellebibliotek.
Det ble så fremstilt minipreparater av plasmid fra disse porsjonene med 250 cDNA-kloner ved anvendelse av "QIAprep"-96 Turbo Miniprep-sett (Qiagen). Plasmid-DNA ble eluert ved anvendelse av 125 ul TE (10 mM Tris, pH 8,1 mM EDTA). Dette plasmid-DNA ble så anvendt for transfeksjon av BHK-celler.
BHK- transfeksion
BHK-celler ble utsådd i 96-brønners vevsdyrkningsplater ved en tetthet på 12 000 celler pr. brønn i et volum på 100 ul pr. brønn. Dyrkningsmediet var DMEM (Gibco BRL), 5 % varmeinaktivert, føtalt storfeserum, 2 mM L-glutamin (Gibco BRL), 1 x PSN (Gibco BRL), 1 mM Na-pyruvat (Gibco BRL).
Neste dag ble BHK-cellene vasket én gang med 100 ul SFA. SFA er serumfritt medium bestående av DMEM/F12 (Gibco BRL), 2 mM L-"GlutaMax" (Gibco BRL), 1 mM Na-pyruvat, 10 jig/ml transferrin, 5 ug/ml insulin, 10 ug/ml fetuin, 2 ug/ml selen, 25 mM HEPES (Gibco BRL), 100 uM ikke-essensielle aminosyrer (Gibco BRL).
En DNA-/"Lipofectamin"-blanding ble fremstilt som følger: 2,2 ul "Lipofectamin"-reagens (Gibco BRL) ble blandet med 102,8 ul SFA ved romtemperatur, så ble ca. 5 ul plasmid-DNA (200 ng/ul) tilsatt til "Lipofectamin"/SFA for dannelse av DNA-/"Lipofectamin"-blandingen, som ble inkubert ved romtemperatur i 30 minutter. SFA ble fjernet fra BHK-cellene, og cellene ble inkubert med 50 ul av DNA-/"Lipofectamin"-blandingen i 5 timer ved 37 °C med 5 % C02. 50 ul av DNA-/"Lipofectamin"-blandingen ble tilsatt til hver av to brønner med BHK-celler, slik at transfeksj onene ble utført i duplikat.
Etter inkubering av BHK-cellene med DNA-/"Lipofectamin"-blanding i 5 timer
ble DNA-/"Lipofectamin"-blandingen fjernet, og 100 ul dyrkningsmedium ble tilsatt. Cellene ble inkubert over natten, hvoretter mediet ble fjernet og erstattet med 100 ul dyrkningsmedium. Etter dyrkning av cellene i 48-72 timer ble det kondisjonerte medium fjernet, nedfrosset ved -80 °C i minst 20 minutter og opptint, og et uttak på 50 ul ble analysert i BaF3-proliferasjonsanalysen som beskrives i eksempel 5 for påvisning av porsjoner av 250 kloner med ligandaktivitet.
Tjue 96-brønners plater ble analysert i en enkelt analyse. Dette representerte ca. 250 cDNA/brønn eller i alt 480 000 cDNA. Av disse ga kondisjonert medium fra ca. 60 brønner (som representerer 250 cDNA pr. brønn) positiv reaksjon i proliferasjonsanalysen. Én av disse positive porsjonene ble utvalgt for fraksjonering og isolering av ett enkelt cDNA som kodet for zcytorl71ig. Dette var porsjon 62A12.
For porsjon 62A12 ble 1 ul DNA anvendt for transformasjon av "ElectroMax"-DHlOB-celler (Gibco BRL) ved elektroporering. Transformantene ble utsådd på skåler med LB + amp (100 ng/ml) for erholdelse av enkeltkolonier. Fra den elektroporerte porsjonen ble 672 enkelt enkeltkolonier overført med tannpirkere til sju 96-brønners plater som inneholdt 1,2 ml "SuperBroth II" pr. brønn. Disse platene ble gitt numrene 62.1 til 62.7. Platene ble inkubert over natten, og minipreparater av plasmid-DNA ble fremstilt som ovenfor. For alle sju platene ble plasmid-DNA transfektert inn i BHK-celler og analysert ved proliferasjon som ovenfor, bortsett fra at transfeksjonene ikke ble gjort i duplikat.
To positive kloner, 62.6C7 og 62.6E9, ble påvist ved aktivitet fra i alt 672 kloner. Plasmid-DNA-minipreparat fra klon 62.6E9 ble sekvensert og en foreløpig identifisering erholdt, men en blandingssekvens ble erholdt fra denne positive klonen. For videre isolering av zcytorl 71ig-cDNA som en enkelt klon ble 1 ul DNA fra porsjon 62.6E9 anvendt for elektroporering av DHlOB-celler, og transformantene ble utsådd på skåler av LB + amp (100 ng/ml) for erholdelse av enkeltkolonier. Plasmid-DNA-minipreparater fra flere kolonier ble sekvensert for erholdelse av den nøyaktige DNA-sekvens. Polynukleotidsekvensen zcytorl 71ig var fullengde (SEQ ID NO: 1), og den tilsvarende aminosyresekvens er vist (SEQ ID NO: 2).
Eksempel 8
Konstruksjon av<p>attedvrekspresjonsvektorer som uttrykker de løselige zcytorl 7- reseptorene zcvtorl7- CEE. zcvtorl7- CFLG. zcvtor! 7- CHIS oe zcvtor! 7- Fc4
A. Konstruksjon av zcytorl 7- pattedvrekspresjonsvektor inneholdende zcytorl 7- CEE,
zcytorl 7- CFLG oe zcvtor! 7- CHIS
En ekspresjonsvektor ble fremstilt for ekspresjon av det løselige, ekstracellulære domenet i zcytorl 7-polypeptidet, pZp9-zcytorl7-CEE, hvor konstruksjonen ble utformet for ekspresjon av et zcytorl 7-polypeptid som omfattet det antatte innledende metionin og som var avkortet nær det antatte transmembrandomenet, og med en C-terminal Glu-Glu-merkelapp (SEQ ID NO: 32).
Et PCR-produkt på ca. 1500 bp ble fremstilt ved anvendelse av ZC29451 (SEQ ID NO: 33) og ZC29124 (SEQ ID NO: 34) som PCR-primere for innføring av et EcoRI- og BamHI-restriksjonssete. Et hjemmelagd cDNA-bibliotek fra humane HPVS ble anvendt som templat, og PCR-amplifikasjonen ble utført som følger: 30 sykluser bestående av 94 °C i 1 minutt, 65 °C i 1 minutt og 72 °C i 1,5 minutter, fulgt av 72 °C i 7 minutter og inkubering ved 10 °C. PCR-produktet ble utfelt med etanol og kuttet med restriksjonsenzymene EcoRI og BamHI. Det kuttede PCR-produkt ble gelrenset i en 1,0 % agarosegel, og båndet på ca. 1500 bp ble kuttet ut. Dette båndet ble så amplifisert på nytt med de samme primere og følgende temperatursyklus: 30 sykluser bestående av 94 °C i 1 minutt, 65 °C i 1 minutt og 72 °C i 3 minutter, fulgt av 72 °C i 7 minutter og inkubering ved 10 °C. PCR-produktet ble utfelt med etanol og kuttet med restriksjonsenzymene EcoRI og BamHI. Det kuttede PCR-produkt ble gelrenset i en 1,0 % agarosegel, og båndet på ca. 1500 bp ble kuttet ut. Det utkuttede DNA ble subklonet i plasmid CEEpZp9, som var kuttet med EcoRI og BamHI for dannelse av et plasmid med løselig reseptor for zcytorl 7, zcytorl 7CEEpZp9 merket i C-enden med GLU-GLU. Det ekstracellulære domenet i zcytorl7CEE-cDNA i zcytorl7CEEpZp9 har en taus mutasjon som endrer T til C i posisjon 1705 i SEQ ID NO: 4 (som koder for en Pro-rest i posisjon 403 i SEQ ID NO: 5). Siden denne mutasjonen var taus, koder zcytorl 7-cDNA i zcytorl 7CEEpZp9 for polypeptidet som vises i SEQ ID NO: 5. Grunnet den benyttede konstruksjon ble videre et Gly-Ser-aminosyrerestpar innsatt C-terminalt for enden av det løselige ekstracellulære domenet i zcytorl 7 og foran den C-terminale Glu-Glu-merkelapp (SEQ ID NO: 32). Merkelappen i C-enden av det ekstracellulære domenet fra zcytorl7 var således en Glu-Glu-merkelapp, som vist i SEQ ID NO: 17. Plasmid CEEpZp9 er en pattedyrekspresjonsvektor som inneholder en ekspresjonskassett med metallotionein-l-promoteren fra mus, flere restriksjonsseter for innsetting av kodende sekvenser og en terminator fra humant veksthormon. Plasmidet har også et E. cø/z-replikasjonsorigo, en pattedyrseleksjonsmarkørekspresjonsenhet med en SV40-promoter, -enhancer og - replikasjonsorigo, et DHFR-gen og SV40-terminatoren. Ved anvendelse av standard molekylærbiologiske teknikker ble zcytorl 7CEEpZp9 elektroporert inn i kompetente DH10B-celler (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) ifølge produsentens retningslinjer og utsådd på LB-skåler inneholdende 100 ug/ml ampicillin og inkubert over natten. Koloniene ble analysert ved restriksjonsanalyse eller ved PCR på DNA fremstilt fra enkeltkolonier. Innskuddssekvensen i positive kloner ble bekreftet ved sekvensanalyse. Et plasmidpreparat i stor skala ble utført ved anvendelse av "QIAGEN" Maxi Prep-sett (Qiagen) ifølge produsentens instruksjoner.
Den samme fremgangsmåte ble anvendt for fremstilling av løselige zcytorl 7-reseptorer med en C-terminal His-merkelapp bestående av seks His-rester etter hverandre, og en C-terminal "FLAG"-merkelapp (SEQ ID NO: 36), zcytorl 7-CFLAG. For fremstilling av disse konstruksjonene har den ovenfor nevnte vektor enten en HIS-merkelapp eller en "FLAG"-merkelapp i stedet for Glu-Glu-merkelappen (se f.eks. SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 32 eller SEQ ID NO: 35).
B. Pattedvrekspresjonskonstruksjon for løselig human zcvtorl7- reseptor: zcvtorl7-Fc4
En ekspresjonsvektor, pEZE-2-hzcytorl7/Fc4, ble forberedt for ekspresjon av en C-terminalt Fc4-merket, løselig versjon av hzcytorl7 (human zcytorl 7-Fc4) i PF CHO-celler. PF CHO-celler er en CHO-cellelinje som er tilpasset vekst i proteinfritt medium (Ex Cell 325 PF medium, JRH Biosciences) i vårt laboratorium. Denne CHO-cellelinjen er opprinnelig avledet fra CHO-DG44-celler (G. Urlaub, J. Mitchell, E. Kas, L.A. Chasin, V.L. Funanage, T.T. Myoda og J.L. Hamlin, "The Effect of Gamma Rays at the Dihydrofolate Reductase Locus: Deletion and Inversions", Somatic Cell and Molec. Genet., 72:555-566 (1986). Et fragment av zcytorl 7-cDNA som omfatter polynukleotidsekvensen for det ekstracellulære domenet i zcytorl 7-reseptoren, ble fusjonert med opprettholdt leseramme til Fc4-polynukleotidsekvensen (SEQ ID NO: 37) for dannelse av en zcytorl7-Fc4-fusjon (SEQ ID NO: 38 og SEQ ID NO: 39). Vektoren pEZE-2 er en pattedyrekspresjonsvektor som inneholder Fc4-polynukleotidsekvensen og et kloningssete som tillater hurtig konstruksjon av C-teminale Fc4-fusjoner ved anvendelse av standard molekylærbiologiske teknikker.
Et fragment på 1566 basepar inneholdende det ekstracellulære domenet fra human zcytorl 7 og de første to aminosyrene i Fc4 (Glu og Pro) med et Fsel-sete og et BgHI-sete i 5'-henholdsvis 3'-ende ble fremstilt ved PCR. Dette PCR-fragmentet ble fremstilt ved anvendelse av primerne ZC29157 (SEQ ID NO: 40) og ZC29150 (SEQ ID NO: 41) for amplifisering fra et plasmid som inneholdt det ekstracellulære domenet fra human zcytorl 7 (pZp9zcytorl7CEE)
(eksempel 8A). PCR-reaksjonsbetingelsene var som følger: 25 sykluser bestående av 94 °C i 1 minutt, 60 °C i 1 minutt og 72 °C i 2 minutter, 1 syklus bestående av 72 °C i 10 minutter, fulgt av inkubering ved 4 °C. Fragmentet ble kuttet med restriksjonsendonukleasene Fsel og Bglll og deretter renset ved elektroforese i en 1 % agarosegel og rensing av båndet ved anvendelse av gelekstraksjonssettet "QIAquick" (Qiagen). Det resulterende rensede DNA ble ligert i 5 timer ved romtemperatur inn i en pEZE-2-vektor som på forhånd var kuttet med Fsel og Bglll, som inneholdt Fc4 3' for Fsel- og Bglll-setene. 2 ul av ligeringsblandingen ble elektroporert inn i 37 ul elektrokompetente E. co/z-celler, stamme DH10B (Gibco) ifølge produsentens retningslinjer. De transformerte cellene ble fortynnet med 400 ul LB-medium og utsådd på LB-skåler inneholdende 100 ug/ml ampicillin. Klonene ble analysert ved restriksjonskutting, og positive kloner ble sendt for DNA-sekvensering for å bekrefte sekvensen til fusjonskonstruksjonen. 1 ul av en positiv klon ble transformert inn i 37 (al elektrokompetente E. co/z-celler, stamme DH10B, og utsådd på en LB/amp-skål. En enkeltkoloni ble plukket fra skålen for start av en 250 ml LB/amp-kultur, som så ble dyrket over natten ved 37 °C ved omristing ved 250 rpm. Denne kulturen ble anvendt for fremstilling av 750 ug renset DNA ved anvendelse av Qiagen-plasmid-Maxi-sett (Qiagen).
Eksempel 9
Transfeksjon og ekspresjon av løseli<g>e zcvtorl7- reseptorpolypeptider
BHK-570-celler (ATCC nr. CRL-10314), DG-44-CHO eller andre pattedyrceller utsås med ca. 1,2 x IO6 celler/brønn (6-brønners plate) i 800 ul av et egnet serumfritt (SF) medium (f.eks. DMEM, Gibco BRL, High Glucose) (Gibco BRL, Gaithersburg, MD). Cellene transfekteres med ekspresjonsplasmider som inneholder zcytorl7-CEE, zcytorl 7-CFLG, zcytorl 7CHIS eller zcytorl 7-Fc4 (eksempel 8), ved anvendelse av "Lipofectin" (Gibco BRL) i serumfritt (SF) medium ifølge produsentens instruksjoner. Enkeltkloner som uttrykker de løselige reseptorene, isoleres, analyseres og dyrkes i celledyrkningsmedium og renses ved anvendelse av standardteknikker.
A. Ekspresjon i patted<y>rceller av løselig human zcytorl 7CEE- reseptor
BHK-570-celler (ATCC nr. CRL-10314) ble utsådd i T-75-vevsdyrkningsflasker og fikk vokse til ca. 50-70 % konfluens ved 37 °C, 5 % C02i DMEM/FBS-medium (DMEM, Gibco BRL, High Glucose (Gibco BRL, Gaithersburg, MD), 5 % føtalt bovint serum, 1 mM L-glutamin (JRH Biosciences, Lenea, KS), 1 mM natriumpyruvat (Gibco BRL)). Cellene ble transfektert med plasmidet som inneholdt zcytorl 7CEE (eksempel 8A), ved anvendelse av "Lipofectamin" (Gibco BRL) i serumfritt (SF) medium (DMEM, 10 mg/ml transferrin, 5 mg/ml insulin, 2 mg/ml fetuin, 1 % L-glutamin og 1 % natriumpyruvat). 10 ug pZp9zcytorl7CEE-plasmid-DNA (eksempel 8A) ble fortynnet i et 15 ml rør til et endelig volum på 500 ul SF-medium. 50 ul "Lipofectamin" ble blandet med 450 ul SF-medium. "Lipofectamin"-blandingen ble tilsatt til DNA-blandingen og inkubert i ca. 30 minutter ved romtemperatur. 4 ml SF-medium ble tilsatt til DNA:"Lipofectamin"-blandingen. Cellene ble vasket én gang med 5 ml SF-medium, mediet ble avsugd, og DNA:"Lipofectamin"-blandingen ble tilsatt. Cellene ble inkubert ved 37 °C i 5 timer, hvoretter 5 ml DMEM/10 % FBS-medium ble tilsatt. Flasken ble inkubert ved 37 °C over natten, hvoretter cellene ble oppsplittet i seleksjonsmediet (DMEM/FBS-medium som ovenfor) med tilsetning av 1 uM metotreksat eller 10 uM metotreksat (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)) i 150 mm skåler ved 1:2,1:10 og 1:50. Cirka 10 dager etter transfeksjonen ble én 150 mm skål med kolonier resistente overfor 1 uM metotreksat trypsinbehandlet, cellene ble slått sammen, og halvparten av cellene ble utsådd i 10 uM metotreksat for ytterligere amplifisering av ekspresjonen av zcytorl 7CEE-protein. Kondisjonert medium fra denne porsjonen med amplifiserte celler ble analysert for ekspresjonsnivået ved anvendelse av SDS-PAGE og Western-analyse.
B. Pattedvrekspresjon av løselig human zcytorl7- Fc4- reseptor
Fem replikater av 200 ug pEZE-2hzcytorl7/Fc4-plasmid-DNA (eksempel 8B) ble linearisert ved restriksjonskutting med Fspl, et restriksjonsenzym som kutter én gang i vektoren og som ikke forstyrrer gener som er nødvendige for ekspresjon. 200 ug genomisk CHO-celle-DNA ble tilsatt til hvert replikat som bærer-DNA, hvoretter DNA ble utfelt ved tilsetning av 0,1 volum 3 M natriumacetat, pH 5,2, og 2,2 volumer etanol, fulgt av inkubering i 15 minutter på is og sentrifugering ved 4 °C. Det nedsentrifugerte DNA ble vasket med 70 % etanol og lufttørket før resuspendering i 100 proteinfritt (PF) ikke-seleksjons-CHO-medium (21 g/l PF CHO Ex Cell 325/200 mM L-glutamin (GibcoVl 00 mM natriumpyruvat (GibcoVl x HT-supplement (Gibco). 10 millioner PF CHO-celler fra passasje 61 ble tilsatt til dette DNA i 600 ul PF CHO-ikke-seleksjonsmedium og elektroporert i et Gene Pulser II-elektroporeringssystem (BioRad) ved anvendelse av en kapasitet på 950 uF og 300 Kv ved anvendelse av en Gene Pulser (BioRad) elektroporeringskyvette med elektrodeavstand 0,4 cm. De fem replikatene av elektroporerte celler ble slått sammen og direkte selektert i -HT-medium (21 g/l PF CHO Ex Cell 325/200 mM L-glutamin (Gibco)/100 mM natriumpyruvat (Gibco). Cellene ble selektert i 15 dager i -HT-medium før overføring med 4 x 10<5>celler/ml i 50 nM MTX-seleksjonsmedium. Åtte dager senere ble cellene utsådd ved 3,5 x 10<5>celler/ml i 200 mM MTX-seleksjonsmedium. Etter 1 uke ble cellene utsådd med 4 x 10<5>celler/ml i 1 uM MTX-seleksjonsmedium. Etter 2 uker ved 1 uM MTX ble cellene utsådd med 1 x IO<6>celler/ml i 50 ml for fremstilling av kondisjonert medium. Etter kondisjonering i 72 timer ble det resulterende medium analysert ved å probe Western-blott med et antistoff frembrakt mot humant lg. Cellene dannet hzcytorl7/Fc4-protein i en mengde på ca. 1 mg/l.
C. Pattedvrekspresjon i større skala av løselig human zcytorl7- Fc4- reseptor
200 ug pEZE-2hzcytorl7/Fc4-plasmid-DNA (eksempel 8B) ble linearisert ved restriksjonskutting med Fspl, et restriksjonsenzym som kutter én gang i vektoren og som ikke forstyrrer gener som er nødvendige for ekspresjon. 200 ug genomisk CHO-celle-DNA (hjemmelagd) ble tilsatt som bærer-DNA, hvoretter DNA ble utfelt ved tilsetning av 0,1 volum 3 M natriumacetat, pH 5,2, og 2,5 volumer etanol, fulgt av sentrifugering ved romtemperatur. Fem replikater med nedsentrifugert DNA ble fremstilt og brukt for transformasjon. Det nedsentrifugert DNA ble vasket med 70 % etanol og lufttørket før resuspendering i 100 PF CHO-ikke-seleksjonsmedium (21 g/l PF CHO Ex Cell 325/200 mM L-glutamin (GibcoVlOO mM natriumpyruvat (GibcoVl x HT-supplement (Gibco). 10 millioner PF CHO-celler ble tilsatt til dette DNA i 600 ul PF CHO-ikke-seleksjonsmedium og så elektroporert i et Gene Pulser II-elektropoTeringssystem (BioRad) ved anvendelse av en kapasitet på 950 uF og 300 volt ved anvendelse av en Gene Pulser (BioRad) elektroporeringskyvette med elektrodeavstand 0,4 cm. De elektroporerte cellene ble slått sammen og direkte selektert i -HT-medium (21 g/l PF CHO Ex Cell 325/200 mM L-glutamin (GibcoVlOO mM natriumpyruvat (Gibco). Cellene ble selektert i 14 dager i -HT-medium før de ble overført med 5 x 10<5>celler/ml i 50 nM MTX-seleksjonsmedium. Cellene ble amplifisert til 200 nM MTX og så til 1 uM MTX. -HT-porsjone, 50 nM-porsjonen og 1 uM-porsjonen ble utsådd ved 1 x IO<6>celler/ml i 48 timer, og det resulterende kondisjonerte medium ble analysert ved å probe Western-blott med et antistoff frembrakt mot humant lg.
Eksempel 10
Rensing av løselige zcvtorl7- reseptorer fra BHK- 570- og CHO- celler
A. Forbigående pattedvrekspresion og rensing av løselig human zcytorl 7- Fc4-reseptor
pEZE-2hzcytorl7/Fc4-plasmid-DNA (eksempel 8B) ble innført i 40 maxi-skåler med BHK-celler ved anvendelse av "Lipofectamin" (Gibco BRL), som beskrevet heri, og etter produsentens retningslinjer. Cellene fikk komme seg over natten og ble så vasket og tilsatt serumfritt medium (SL74, hjemmelagd). Etter 72 timer ble mediet oppsamlet og filtrert, og cellene ble tilsatt serumfritt medium. Etter 72 timer ble mediet igjen oppsamlet og filtrert.
Det serumfrie kondisjonerte medium (to porsjoner på 1,5 1 hver) fra forbigående
transfekterte BHK-celler ble pumpet over en 1,5 ml protein A-agarosekolonne i 20 mM Tris, pH 7,5, og 0,5 M NaCl. Kolonnen ble vasket grundig med denne bufferen, hvoretter bundet protein ble eluert med 1 ml 0,2 M glysin, pH 2,5,0,5 M NaCl. Det eluerte protein ble oppsamlet i 0,1 ml 2 M Tris, pH 8,5. Uttak ble analysert ved SDS-polyakrylamidgelelektroforese, mens resten av zcytorl 7-Fc ble dialysert over natten mot PBS. Den løselige reseptoren ble sterilfiltrert og lagret i porsjoner ved -80 °C.
B. Rensing av zcytorl 7- Fc4
Rekombinant, karboksyterminalt, Fc4-merket zcytorl 7 (eksempel 8 og eksempel 9) ble fremstilt fra transfekterte CHO-celler. CHO-transfeksjonen ble utført ved anvendelse av fremgangsmåter som er kjent innen faget. Cirka 5 1 kondisjonert medium ble høstet og sterilfiltrert ved anvendelse av Nalgene 0,2 um filtre.
Protein ble renset fra det filtrerte medium ved en kombinasjon av Poros 50 protein A-affinitetskromatografi (PerSeptive BioSystems, 1-5559-01, Framingham, MA) og Superdex 200 geleksklusjonskromatografi (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Dyrkningsmediet ble direkte påsatt en 10 x 70 mm (5,5 ml kolonnevolum) protein A-affinitetskolonne ved en gjennomstrømningshastighet på ca. 3-10 ml/minutt. Etter vask av kolonnen med 10 kolonnevolumer PBS ble bundet protein eluert med fem kolonnevolumer 0,1 M glysin, pH 3,0, ved en gjennomstrømningshastighet på 10 ml/minutt. Fraksjoner på 2 ml ble oppsamlet i rør som inneholdt 100 ul 2,0 M Tris, pH 8,0, for nøytralisering av eluert protein. Prøver fra affinitets-kolonnen ble analysert ved SDS-PAGE med coomassiefarging og Western-blotting for nærvær av zcytorl7-Fc4 ved anvendelse av humant Ig-HRP. Zcytorl7-Fc4-holdige fraksjoner ble slått sammen og konsentrert til 1-2 ml ved anvendelse av en Biomax 30-konsentrator (Millipore) og påsatt en 20 x 580 mm Superdex 200 gelfiltreringskolonne. Fraksjonene som inneholdt renset zcytorl7-Fc4, ble slått sammen, filtrert gjennom et 0,2 um filter, fordelt i porsjoner på 100 ul og nedfrosset ved -80 °C. Konsentrasjonen av det ferdig rensede protein ble bestemt ved BCA-analyse (Pierce, Rockford, IL).
C. SDS- PAGE- oe Western- blotting- analvse av zcvtor! 7/ Fc4
Rekombinant zcytorl 7-Fc4 ble analysert ved SDS-PAGE (NuPage 4-12 %, Invitrogen, Carlsbad, CA) med coomassiefarging og Western-blotting med humant Ig-HRP. Enten kondisjonert medium eller renset protein ble fraksjonert ved elektroforese i en Invitrogen Novex Xcell II-minicelle og overført til nitrocellulose (0,2 mm, Invitrogen, Carlsbad, CA) ved romtemperatur ved anvendelse av Novex Xcell Il-blottemodul med omrøring ifølge retningslinjene som gis i instrumenthåndboken. Overføringen ble utført ved 500 mA i 1 time i en buffer som inneholdt 25 mM Tris-base, 200 mM glysin og 20 % metanol. Filtrene ble så blokkert med 10 % fettfri tørrmelk i PBS i 10 minutter ved romtemperatur. Nitrocellulosearket ble raskt vasket, hvoretter humant Ig-HRP-antistoff (1:2000) ble tilsatt i PBS tilsatt 2,5 % fettfri tørrmelk. Blottene ble inkubert i 2 timer ved romtemperatur eller over natten ved 4 °C under forsiktig omristing. Etter inkubasjonen ble blottene vasket tre ganger, hver gang i 10 minutter, i PBS og så hurtig vasket i H2O. Blottene ble fremkalt ved anvendelse av kommersielt tilgjengelige kjemiluminescenssubstratreagenser ("SuperSignal" ULTRA-reagenser 1 og 2 blandet 1:1, reagenser erholdt fra Pierce, Rockford, IL), og signalet ble oppfanget ved anvendelse av Lumi-Imager's programvare Lumi Analyst 3.0 (Boehringer Mannheim, GmbH, Tyskland) med ekspo-neringstider i området fra 10 sekunder til 5 minutter, eller etter behov.
Renset zcytorl 7-Fc4 opptrådte både ved coomassiefarging og sølvfarging som ett enkelt bånd ved ca. 220 kDa under ikke-reduserende betingelser og ved ca. 120 kDa under reduserende betingelser, noe som antyder en dimer form av zcytorl 7-Fc4 under ikke-reduserende betingelser, som forventet.
Eksempel 11
Anvendelse av den løselig zcytorl 7- reseptor zcytorl 7- Fc4 i kompetitive inhiberingsanalyser
BaF3/zcytorl7/WSX-l/OSMRbeta-celler og BaF3/zcytorl7/OSMRbeta-celler ble nedsentrifugert og vasket i mIL-3-fritt medium. Cellene ble nedsentrifugert og vasket tre ganger for å sikre fjerning av mIL-3. Cellene ble så talt i et hemacytometer. Cellene ble utsådd i 96-brønners format med 5000 celler pr. brønn i et volum på 100 ul pr. brønn ved anvendelse av mIL-3-fritt medium.
Kondisjonert medium fra både CCRF-CEM- og CCRF-HSB2-celleaktivering og de humane CD3<+->selekterte cellene beskrevet i eksempel 5 ble tilsatt i separate eksperimenter ved konsentrasjoner på 25 %, 12,5 %, 6,25 %, 3,125 %, 1,5 %, 0,75 %, 0,375 % og 0,187 %, med eller uten løselige zcytorl7-reseptorer (zcytorl7-Fc4, se eksempel 9 og eksempel 10) ved 1-10 jig/ml. Det totale analysevolum var 200 ul.
Analyseplatene ble inkubert ved 37 °C, 5 % CO2, i 3-5 dager, hvoretter Alamar Blue (Accumed) ble tilsatt med 20 ul/brønn. Platene ble igjen inkubert ved 37 °C, 5 % C02, i 16-24 timer. Platene ble avlest i en "Fmax"-plateleser (Molecular Devices), som beskrevet i eksempel 2. Resultatene viste delvis inhibering av celleveksten med løselig zcytorl 7-Fc4- reseptor ved 10 ng/ml, noe som bekrefter at faktoren i alle prøver var spesifikk for zcytorl7-reseptoren.
Titreringskurver, hvor den løselige reseptor eller løselige reseptorheterodimerer ble fortynnet, omfattende zcytorl 7/OSMR og zcytorl 7/WSX-l, ble også benyttet i den ovenfor beskrevne analysen for å fastslå hvorvidt zcytorl 7-reseptorer er i stand til fullstendig å inhibere veksten, f.eks. ved lave eller fysiologiske konsentrasjoner.
Tilsvarende kompetitive inhiberingsanalyser ble utført ved anvendelse av renset human zcytorl71ig (eksempel 35) og løselige reseptorer i luciferaseanalyser (eksempel 20). Resultatene viser at både homodimer zcytorl 7 og heterodimer zcytorl 7/OSMR kan inhibere aktiviteten av zcytorl 71ig.
Eksempel 12
Sekresi onsinnfangingsanalyse
En sekresjonsinnfangingsanalyse ble anvendt for å analysere bindingen mellom zcytorl 71ig og reseptorer som omfatter zcytorl 7-reseptoren, f.eks. zcytorl 7-reseptoren eller reseptorheterodimerer som omfatter zcytorl7/OSMR og zcytorl 7/WSX-l. Zcytorl 71ig-plasmid-DNA ble transfektert inn i COS-celler og anvendt for å anslå binding av zcytorl 71ig til reseptorer som omfatter zcytorl 7-reseptoren ved sekresjonsinnfanging, som beskrevet nedenfor.
A. COS- celletransfeksjoner
COS-celletransfeksjonen ble utført som følger: 800 ng zcytorl 71ig-cDNA og 4 ul "Lipofectamin" ble sammenblandet i 80 ul serumfritt DMEM-medium (55 mg natriumpyruvat, 146 mg L-glutamin, 5 mg transferrin, 2,5 mg insulin, 1 ng selen og 5 mg fetuin i 500 ml DMEM), og inkubert ved romtemperatur i 30 minutter. Deretter ble 320 ni serumfritt DMEM-medium tilsatt. Denne blandingen på 500 ni ble tilsatt til 2 x 10<5>COS-celler/brønn utsådd i 12-brønners vevsdyrkningsplater og inkubert i 5 timer ved 37 °C. Deretter ble 500 ni 20 % FBS-DMEM-medium (100 ml FBS, 55 mg natriumpyruvat og 146 mg L-glutamin i 500 ml DMEM) tilsatt, og cellene ble inkubert over natten.
B. Sekresj onsinnfangingsanalyse
Sekresjonsinnfangingen ble utført som følger: Medium ble vasket av cellene med PBS, hvoretter cellene ble fiksert i 15 minutter med 1,8 % formaldehyd i PBS. Cellene ble så vasket med PBS/0,1 % BSA og permeabilisert med 0,1 % Triton-X i PBS i 15 minutter, og så igjen vasket med PBS/0,1 % BSA. Cellene ble blokkert i 1 time med PBS/0,1 % BSA. Avhengig av hvilken løselig reseptor som ble anvendt, ble cellene inkubert i 1 time i TNB med: (A) 1-3 ng/ml av den løselige zcytorl 7-reseptor zcytorl 7-Fc4-fusjonsprotein (eksempel 10); eller (B) 1-3 \ xg/ ml zcytorl 7/OSMRbeta løselig reseptorprotein. Cellene ble så vasket med TNT. Avhengig av hvilken løselig reseptor som ble anvendt (f.eks. hvorvidt den er merket med en Fc4-merkelapp (SEQ ID NO: 37), en C-terminal FLAG-merkelapp (SEQ ID NO: 26) eller en CEE- merkelapp (SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 35)), ble cellene inkubert i nok 1 time med: (A): 1:200 fortynnet antihumant Ig-HRP (Fc-spesifikt) fra geit; (B) 1:1000 fortynnet M2-HRP; (C) 1:1000 fortynnet anti-GluGlu-antistoff-HRP; eller (D) 1:300 fortynnet streptavidin-HRP (NEN-sett) i f.eks. TNB. Igjen ble cellene vasket med TNT.
For å påvise positiv binding ble fluoresceintyramidreagens fortynnet 1:50 i fortynningsbuffer (NEN-sett), inkubert i 4-6 minutter og vasket med TNT. Cellene ble konservert med Vectashield Mounting Media (Vector Labs Burlingame, CA) fortynnet 1:5 i TNT. Cellene ble synliggjort ved anvendelse av et FITC-filter i et fluorescensmikroskop. Resultatene fra denne analysen viste at human zcytorl 7 ikke bindes til noen av de løselige reseptorene. Disse resultatene antyder at strukturen av zcytorl 7 var følsom for fikseringstrinnet i denne fremgangsmåten, siden liganden tydelig var i stand til å bindes til celleoverflatereseptorer (se f.eks. "flow"-cytometriresultatene som presenteres nedenfor i eksempel 39).
Eksempel 13
Kromosoma! lokalisering og plassering av gensekvensen for zc<y>torl71ig
Zcytorl 71ig-gensekvensen ble kartlagt til humant kromosom 12 ved anvendelse av den kommersielt tilgjengelige versjonen av "Stanford G3 Radiation Hybrid Mapping Panel"
(Research Genetics, Inc., Huntsville, AL). "Stanford G3 RH Panel" inneholder DNA fra 83 strålingshybridkloner fra hele det humane genom, pluss to kontroll-DNA (RM-donoren og A3-mottakeren). En offentlig tilgjengelig WWW-server som er plassert på Internett ved www.stanford.edu tillater kromosomal lokalisering av markører og gener.
For kartlegging av zcytorl7-lig-gensekvensen med "Stanford G3 RH Panel" ble reaksjoner på 20 ul satt opp i en 96-brønners PCR-tilpasset mikrotiterplate (Stratagene, La Jolla, CA) og anvendt i den programmerbare varmeblokken "RoboCycler Gradient 96" (Stratagene). Hver av de 95 PCR-reaksjonene bestod av 2 ul 10 x PCR-reaksjonsbuffer (Qiagen, Inc., Valencia, CA), 1,6 ul dNTP-blanding (2,5 mM av hver, Perkin-Elmer, Foster City, CA), 1 ul "sense"-primer, ZC41458 (SEQ ID NO: 42), 1 ul "antisense"-primer, ZC41457 (SEQ ID NO: 43), 2 (al "RediLoad" (Research Genetics, Inc., Huntsville, AL), 0,1 ul Qiagen HotStarTaq-DNA-polymerase (5 enheter), 25 ng DNA fra en enkelt hybridklon eller kontroll og destillert vann til et totalvolum på 20 (al. En lik mengde mineralolje ble lagt over reaksjonene, og platen ble forseglet. PCR-syklusbetingelsene var som følger: en innledende syklus bestående av 15 minutters denaturering ved 95 °C, 35 sykluser bestående av 45 sekunders denaturering ved 95 °C, 1 minutts hybridisering ved 53 °C og 1 minutt 15 sekunders primerforlengelse ved 72 °C, fulgt av en avsluttende syklus bestående av primerforlengelse ved 72 °C i 7 minutter. Reaksjonsblandingene ble fraksjonert ved elektroforese i en 2 % agarosegel (EM Science, Gibbstown, NJ), og båndene ble synliggjort ved farging med etidiumbromid.
Resultatene viste kobling mellom zcytorl 71ig-gensekvensen og kromosom 12-markøren SHGC-83339 med en LOD-poengsum > 11 og i en avstand på 17 cR_10000 fra markøren. Denne markøren plasserer zcytorl 71ig-genet i det kromosomale området 12q24.31.
Eksempel 14
Påvisning og kloning av zcytorl 71ig fra mus
A. Påvisning av fullen<g>de zc<y>torl71ig fra mus
Ved anvendelse av den humane zcytorl71ig-peptidsekvens (SEQ ID NO: 2) for søk i en hjemmelagd DNA-base ble et muse-cDNA, Genbank-aksesjonsbetegnelse AK005939, påvist som en mulig delsekvens av zcytorl 71ig fra mus. AK005939-cDNA-sekvensen ble anvendt for søk i en database som inneholdt musegenomfragmenter. Et genomisk contig for zcytorl 71ig fra mus ble bygd opp (SEQ ID NO: 76). Analyse av det kodende potensialet for dette genomiske fragment med programmet Genscan viste en sannsynlig cDNA-sekvens med samme genstruktur som human zcytorl 71ig. En muse-cDNA-sekvens er gitt i SEQ ID NO: 10, og den tilsvarende polypeptidsekvens er vist i SEQ ID NO: 11.
B. Kloning av zcytorl 71ig fra mus fra et musetestis- cDNA- bibliotek ved PCR
Basert på den genomiske sekvens (SEQ ID NO: 76) ble to PCR-primere utformet og anvendt for påvisning av en cDNA-kilde for zcytorl71ig fra mus ved PCR. Disse primerne,
ZC41498 (SEQ ID NO: 86) og ZC41496 (SEQ ID NO: 87) ble tilpasset det antatte 5'- og 3'-ikke-translaterte området i musesekvensene (SEQ ID NO: 76 og SEQ ID NO: 10). Flere cDNA-kilder ble analysert ved PCR, innbefattet Marathon-ready-cDNA (Clontech) og uttak fra hjemmelagde cDNA-biblioteker. Produktene ble synliggjort i 1 % agarosegeler. Bånd med forventet størrelse ble observert i reaksjoner som benyttet et cDNA-bibliotek fra musetestis som templat. Disse PCR-reaksj onene ble med hell utført i volumer på ca. 50 ul, med eller uten 10 % DMSO ved anvendelse av pfu-turbopolymerase (Stratagene) ifølge produsentens anbefalinger, med ytterligere benyttelse av en voksbasert varmstart som benyttet Hot Start 50s (Molecular Bioproducts, Inc., San Diego, CA). PCR ble utført med en enkelt syklus bestående av 94 °C i 4 minutter, fulgt av 40 sykluser bestående av 94 °C i 30 sekunder, 48 °C i 30 sekunder og 72 °C i 50 sekunder, med ytterligere en avsluttende primerforlengelse ved 72 °C i 7 minutter. De to PCR-reaksj onene ble slått sammen og renset ved anvendelse av agarose med lavt smeltepunkt og det agarosespaltende enzym gelase (Epicenter, Inc., Madison, WI) ifølge produsentens anbefalinger.
Bestemmelse av DNA-sekvensen til disse PCR-produktene ga en muse-zcytorl 7-cDNA-sekvens (SEQ ID NO: 90) som omfattet en ORF identisk med SEQ ID NO: 10, noe som bekreftet at SEQ ID NO: 10 koder for zcytorl7-polypeptidet fra mus. PCR-primerne ZC41583 (SEQ ID NO: 88) og ZC41584 (SEQ ID NO: 89) ble så anvendt for innføring av restriksjonsseter for Fsel og Ascl og en partiell Kozak-sekvens i den åpne leseramme for mzcytorl71ig og termineringskodonet (SEQ ID NO: 92). En programmerbar varmeblokk av type Robocycler 40 (Stratagene) ble anvendt for å oppnå en gradient av hybridiseringstemperaturer og for sykluser som følger. Pfu-turbopolymerase (Stratagene) ble benyttet som beskrevet ovenfor, men kun i 10 % DMSO. Syklusene ble utført med en enkelt syklus bestående av 94 °C i 4 minutter, fulgt av 20 sykluser bestående av 94 °C i 30 sekunder, en gradient fra 65 til 51 °C i 30 sekunder og 72 °C i 1 minutt, og en enkelt primerforlengelse ved 72 °C i 7 minutter. Templatet for denne andre temperatursyklusreaksjonen var 1 ul av det opprinnelige gelrensede mcytorl 71ig-PCR-produkt beskrevet ovenfor. Det resulterende PCR-produkt fra de tre laveste temperaturreaksjonene ble slått sammen og gelrenset ved anvendelse av gelase-fremgangsmåten (Epicenter) som er beskrevet ovenfor. Dette rensede mzcytorl71ig ble kuttet med Fsel og Ascl og ligert inn i en pZP7X-vektor som var modifisert til å ha Fsel- og Ascl-seter i kloningssetet. Plasmid pZP7X er en pattedyrekspresjonsvektor som inneholder en ekspresjonskassett med metallotionein-l(MT-l)-promoteren fra mus, flere restriksjonsseter for innsetting av kodende sekvenser og en terminator fra humant veksthormon. Plasmidet har også et E. cø/?'-replikasjonsorigo, en pattedyrseleksjonsmarkørekspresjonsenhet med en SV40-promoter, -enhancer og - replikasjonsorigo, et DHFR-gen og SV40-terminatoren. Den klonede muse-cDNA-sekvens er gitt i SEQ ID NO: 90, og den tilsvarende polypeptidsekvens er vist i SEQ ID NO: 91 (som er identisk med SEQ ID NO: 11).
Eksempel 15
Isolering av muse- zcvtorl71ig- cDNA- klon fra et aktivert musemiltbibliotek
A. Primær musekilde anvendt for isolering av muse- zcvtorl71ig
Milter fra Balb/c-mus oppsamles og knuses mellom objektglass med avrundede ender for fremstilling av en cellesuspensjon. Utbyttet av primære museceller forventes å være ca. 6,4 x 10 Q celler før seleksjonen som beskrives nedenfor.
Miltcellene suspenderes i 9,6 ml MACS-buffer (PBS, 0,5 % EDTA, 2 mM EDTA). 1,6 ml cellesuspensjon tas ut, og 0,4 ml CD90-mikrokuler (Thy 1.2) (Miltenyi Biotec) tilsettes. Blandingen inkuberes i 15 minutter ved 4 °C. Disse cellene merket med CD90-kuler vaskes med 30 ml MACS-buffer og resuspenderes så i 2 ml MACS-buffer.
En VS+-kolonne (Miltenyi) fremstilles ifølge produsentens instruksjoner. VS+-kolonnen plasseres så i et "VarioMACS"-magnetfelt (Miltenyi). Kolonnen ekvilibreres med 5 ml MACS-buffer. De isolerte primære musecellene påsettes så kolonnen. De CD90-negative cellene får passere gjennom kolonnen. Kolonnen vaskes med 9 ml (3 x 3 ml) MACS-buffer. Kolonnen fjernes så fra magneten og plasseres over et 15 ml falcon-rør. CD90<+->celler elueres ved tilsetning av 5 ml MACS-buffer til kolonnen, hvoretter bundne celler vaskes ut ved anvendelse av stempelet levert av produsenten. Inkubering av cellene med CD90-magnetkuler, vasketrinnene og VS+-kolonnetrinnene (fra inkubering til eluering) ovenfor gjentas én gang til. De resulterende CD90+-fraksj onene fra de to kolonneseparasj onene slås sammen. Utbyttet av CD90<+->selekterte musemiltceller forventes å være ca. 1 x 10<8>celler totalt.
Et uttak av de sammenslåtte CD90<+->selekterte musecellene farges og sorteres i en fluorescensbasert antistoffcellesorterer (FACS) for å anslå cellenes renhet. Et PE-konjugert antimuse-CD3e-antistoff fra hamster (PharMingen) anvendes for farging og sortering av de CD90<+->selekterte cellene. De CD90<+->selekterte musecellene bør omfatte ca. 93 % CD3<+->celler, noe som tyder på at cellene er 93 % T-celler.
De CD90<+->selekterte musecellene aktiveres ved å inkubere 3 x IO6 celler/ml i RPMI + 5 % FBS + 10 ng/ml PMA og 0,5 ug/ml ionomycin (Calbiochem) over natten ved 37 °C. Supernatanten fra disse aktiverte CD90<+->selekterte musecellene analyseres for zcytorl 71ig-aktivitet, som beskrevet nedenfor. Videre anvendes de aktiverte CD90<+->selekterte musecellene for fremstilling av et cDNA-bibliotek, som beskrevet i eksempel 16 nedenfor.
Eksempel 16
Kloning av muse- zcvtorl71ig fra et bibliotek fra CD90+- selekterte museceller
Gjennomsøking av et cDNA-bibliotek fra primære aktiverte CD90<+->selekterte museceller kan føre til oppdagelse av et isolert cDNA, som er et nytt medlem av fireheliksbunt-cytokinfamilien, som vil kode for museortologen til human zcytorl 71ig. Dette cDNA påvises ved hybridiseringssøk.
A. Vektoren for konstruksjon av CD90+- selektert bibliotek
Vektoren pZPTN anvendes for konstruksjon av det CD3<+->selekterte bibliotek (se eksempel 6A).
B. Fremstilling av cDNA- bibliotek fra primære aktiverte CD90+- selekterte museceller
Omtrent 1,5 x 10 primære CD90 -selekterte museceller stimulert med ionomycin/PMA (eksempel 15) isoleres ved sentrifugering. Total-RNA isoleres fra de nedsentrifugerte cellene og overføres til dobbelttrådet cDNA, som beskrevet i eksempel 6B. Dette DNA transfekteres så inn i BHK-celler, som beskrevet i eksempel 6B, og proliferasjonen anslås ved anvendelse av en "Alamar blue"-fluorescensanalyse (eksempel 2B).
For gjennomsøking av biblioteket ved sekresjonsinnfangingskloning er det nødvendig med en kompleks, amplifisert form av biblioteket for transfeksjon av COS-7-celler. 4,8 millioner kloner utsås på 110 15 cm LB-agarskåler tilsatt 100fig/ml ampicillin og 10 \ xg/ m\ meticillin. Etter inkubering av skålene over natten ved 37 °C høstes bakteriene ved avskraping og nedsentrifugering. Plasmid-DNA ekstraheres fra de nedsentrifugerte bakteriene ved anvendelse av et "Nucleobond-giga"-sett (Clonetech) ifølge produsentens instruksjoner. Dette plasmid anvendes så for transfeksjon av COS-7-celler på objektglass og analyseres ved anvendelse av sekresjonsinnfangingsteknikken beskrevet nedenfor (eksempel 17).
C. Gjennomsøking av det aktiverte muse- cDNA- bibliotek
Omtrent 5 x 10<5>kloner utsås på 10 LB/Amp-Maxi-skåler. Koloniene overføres til filtre, denatureres, nøytraliseres og kryssbindes ved anvendelse av standardfremgangsmåten (Sambrook, J. et al., supra). 50 ng av 5'-RACE-PCR-fragmentet på 300 bp (eksempel 14) merkes med P ved anvendelse av innmerkingssettet Prime-Itr RmT (Stratagene), som er basert på tilfeldige primere. De ti filtrene hybridiseres med denne merkede proben ved 65 °C over natten ved anvendelse av "Expresshyb"-hybridiseringsløsningen (Clontech). Filtrene vaskes så, først tre ganger ved 60 °C i 1 time med 0,2 x SSC (30 mM NaCl, 3 mM natriumsitrat, pH 7,0), 0,1 % SDS og deretter ved 65 °C i 1 time. Filtrene eksponeres for røntgenfilm ved -80 °C over natten, og røntgenfilmen fremkalles. Agarplugger som inneholder de positive koloniene tas ut, og klonene utsås på 10 cm LB/Amp-skåler. Koloniene overføres så til filtre og hybridiseres igjen ved anvendelse av samme fremgangsmåte som beskrevet ovenfor. Enkeltvise DNA-kloner isoleres og sekvenseres ved anvendelse av standardfremgangsmåter for identifisering av muse-cDNA.
Eksempel 17
Muse- zcvtorl71ig bindes ikke til human løselig zcytorl 7- reseptor i sekresjonsinnfangingsanal<y>se
DNA fra museklonen mzcytorl 71ig/pZP7 ble transfektert inn i COS-celler, og binding av zcytorl 7-holdige, løselige reseptorer (den humane løselige zcytorl 7-reseptor zcytorl 7-Fc4 (eksempel 10) eller de løselige reseptorheterodimerene zcytorl 7/WSX-l eller BaF3/zcytorl 7/OSMRbeta) til de transfekterte COS-cellene ble analysert ved en sekresj onsinnfangingsanalyse (eksempel 12). Analysen bekreftet at zcytorl 71ig fra mus ikke bindes til human løselig zcytorl 7-reseptor.
COS-celletransfeksjonen ble utført som i eksempel 12 ved anvendelse av ca, 0,7 ug muse-zcytorl71ig-cDNA (eksempel 16) i 3 ul.
Sekresjonsinnfangingen ble utført som i eksempel 12 ved anvendelse av f.eks. 1 ng/ml løselig zcytorl 7-Fc4-fusjonsproteinreseptor (eksempel 10) (eller zcytorl 7-holdige, løselige reseptorheterodimerer som beskrevet heri) i TNB, og 1:200 fortynnet antihumant Ig-HRP (Fc-spesifikt) fra geit i TNB som det påvisbare antistoff. Positiv binding av den løselige humane zcytorl 7-reseptor til de fikserte cellene kunne ikke påvises med fluoresceintyramid-reagenset som i eksempel 12. Cellene ble konservert og synliggjort ifølge eksempel 12.
Resultatene viste at zcytorl71ig fra mus ikke bindes til human løselig zcytorl7-reseptor (eller zcytorl 7-holdige, løselige reseptorheterodimerer som beskrevet heri).
Eksempel 18
Ekspresjon av muse- zcvtorl71ig i pattedyrceller
Pattedyrekspresjon av muse- zcvtorl 71ig
BHK-570-celler (ATCC nr. CRL-10314) ble utsådd i 10 cm vevsdyrkningsskåler og dyrket til ca. 20 % konfluens over natten ved 37 °C, 5 % C02, i DMEM/FBS-medium (DMEM, Gibco BRL, High Glucose media; Gibco BRL, Gaithersburg, MD), 5 % føtalt, bovint serum (Hyclone, Logan, UT), 1 mM L-glutamin (JRH Biosciences, Lenexa, KS), 1 mM natriumpyruvat (Gibco BRL). Cellene ble så transfektert med plasmidet mzcytorl71ig/pZP7X
(eksempel 14) ved anvendelse av settet Lipofectamin (Gibco BRL) for stabil transfeksjon av pattedyrceller ifølge produsentens instruksjoner.
Én dag etter transfeksjonen ble cellene splittet 1:10 og 1:20 i seleksjonsmedium (DMEM/FBS-medium tilsatt 1 uM metotreksat (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)) i 150 mm skåler. Mediet på cellene ble erstattet med friskt seleksjonsmedium på dag 5 etter transfeksjonen. Omtrent 10 dager etter transfeksjonen ble metotreksatresistente kolonier behandlet med trypsin, og cellene ble slått sammen og utsådd i dyrkningsflasker i stor skala. Etter at cellene hadde vokst til ca. 90 % konfluens, ble de vasket tre ganger med PBS og dyrket med serumfritt ESTEP2-medium (DMEM (Gibco BRL), 0,11 g/l Na-pyruvat, 3,7 g/l NaHC03,2,5 mg/l insulin, 5 mg/l transferrin, pH 7,0) for erholdelse av kondisjonert medium. Det kondisjonerte medium ble oppsamlet 3 dager senere og anvendt i enBaF3-proliferasjonsanalyse ved anvendelse av Alamar Blue, beskrevet i eksempel 19 nedenfor.
Eksempel 19
Muse- zcvtorl71ig aktiverer ikke human zcytorl 7- reseptor i BaF3- analvse ved anvendelse av Alamar Blue
Proliferasjon av BaF3/zcytorl7-, BaF3/zcytorl 7/OSMRbeta- og BaF3/zcytorl 7/WSX-l -celler (eksemplene 4 og 5B) ble anslått ved anvendelse av serumfritt, kondisjonert medium fra BHK-celler som uttrykker muse-zcytorl71ig (eksempel 18).
BaF3/zcytorl7-, BaF3/zcytorl7/OSMRbeta- og BaF3/zcytorl 7/WSX-l-celler ble nedsentrifugert, vasket og utsådd i mIL-3-fritt medium som beskrevet i eksempel 5B. Kondisjonert medium fra BHK-celler som uttrykker muse-zcytorl71ig (eksempel 18), ble fortynnet med mIL-3-fritt medium til konsentrasjoner på 50 %, 25 %, 12,5 %, 6,25 %, 3,125 %, 1,5 %, 0,75 % og 0,375 %. Proliferasjonsanalysen ble utført som i eksempel 5B. Resultatene bekreftet denne analysen var negative, noe som viser at muse-zcytorl71ig ikke aktiverer humane zcytorl 7-, zcytorl 7/OSMRbeta- eller zcytorl II WSX-1-reseptorkomplekser.
Eksempel 20
Human zcytorl 71ig aktiverer human zcytorl 7/ OSMRbeta- reseptor i luciferaseanalyse
A. Konstruksjon av cellelinjen BaF3/ KZ134/ zcvtorl7
Plasmid KZ 134 ble konstruert med de komplementære oligonukleotidene ZC12749 (SEQ ID NO: 44) og ZC12748 (SEQ ID NO: 45), som inneholder STAT-transkripsjonsfaktorbindende elementer fra fire gener, innbefattet et modifisert c-fos-Sis-induserbart element (m67SIE eller hSIE) (Sadowski, H. et al., Science, 267:1739-1744,1993), p21-SIEl frap21-WAFI-genet (Chin, Y. et al., Science, 272:719-722,1996), brystkjertel-responselementet fra P-kaseingenet (Schmitt-Ney, M. et al., Mol. Cell. Biol., 77:3745-3755, 1991) og et STAT-induserbart element fra Fcg-RI-genet (Seidel, H. et al., Proe. Nati. Acad. Sei., 92:3041-3045, 1995). Disse oligonukleotidene inneholder Asp718-XhoI-kompatible ender og ble ved anvendelse av standardfremgangsmåter ligert inn i en vektor med rapportøren ildflue-luciferase og med en c-fos-promoter (Poulsen, L.K. et al, J. Biol. Chem., 273:6229-6232,1998), kuttet med de samme enzymene og inneholdende en neomycinseleksjonsmarkør. Plasmid KZ134 ble anvendt for stabil transfeksjon av BaF3-celler ved anvendelse av standardfremgangsmåter for transfeksjon og seleksjon, for fremstilling av cellelinjen BaF3/KZ134.
En stabil BaF3/KZ134-indikatorcellelinje som uttrykte fullengde zcytorl 7-reseptor eller zcytorl 7/0SMRbeta-reseptor, ble konstruert som i eksempel 4. Klonene ble fortynnet, utsådd og selektert ved anvendelse av standardteknikker. Klonene ble analysert ved mciferaseanalyse (se eksempel 20B nedenfor) ved anvendelse av humant zcytorl 71ig-kondisjonert medium eller renset zcytorl71ig-protein (se eksempel 35 nedenfor) som induser. Klonene med den høyeste luciferaserespons (via STAT-luciferase) og den laveste bakgrunn ble utvalgt. Stabilt transfekterte cellelinjer ble selektert. Cellelinjene ble betegnet BaF3/KZ-134/zcytorl7 og BaF3/KZ134/zcytorl 7/OSMRbeta, avhengig av reseptorene som var transfektert inn i cellelinjen.
På tilsvarende måte ble det også fremstilt BHK-cellelinjer ved anvendelse av fremgangsmåten som beskrives heri, og disse ble anvendt i luciferaseanalysene som beskrives heri. Cellelinjene ble betegnet BHK/KZ134/zcytorl7 og BHK/KZ134/zcytorl 7/OSMRbeta, avhengig av hvilke reseptorer som var transfektert inn i cellelinjen.
B. Human zcytorl 71ig aktiverer human zcytorl 7- reseptor i
BaF3/ KZ134/ zcvtorl 7/ OSMRbeta- eller BHK/ KZ134/ zcvtorl7/ OSMRbeta-luciferaseanalvse
BaF3/KZ 134/zcytorl 7/OSMRbeta- og BaF3/KZl 34/zcytor 17/OSMRbeta-celler ble nedsentrifugert og vasket med mIL-3-fritt medium. Cellene ble nedsentrifugert og vasket tre ganger for å sikre fjerning av mIL-3. Cellene ble så talt i et hemacytometer. Cellene ble utsådd i 96-brønners format med ca. 30 000 celler pr. brønn i et volum på 100 ul pr. brønn ved anvendelse av mIL-3-fritt medium. Den samme fremgangsmåten ble benyttet for ikke-transfekterte BaF3/KZ134-celler for anvendelse som kontroll i den påfølgende analyse. BHK/KZ134/zcytorl 7- eller BHK/KZ134/zcytorl 7/OSMRbeta-cellene ble utsådd i 96-brønners format med 15000 celler pr. brønn i 100 ul medium. Utgangscellene BHK/KZ134 ble benyttet som kontroll.
STAT-aktivering av BaF3/KZl 34/zcytorl 7-, BaF3/KZl 34/zcytorl 7/OSMRbeta-, BHK/KZ134/zcytorl 7- eller BHK/KZ134/zcytorl7/OSMRbeta-cellene ble anslått ved anvendelse av (1) kondisjonert medium fra BHK-570-celler transfektert med human zcytorl 71ig (eksempel 7), (2) kondisjonert medium fra BHK-570-celler transfektert med muse-zcytorl 71ig (eksempel 18), (3) renset human zcytorl7-lig (eksempel 35) eller (4) mIL-3-fritt medium for måling av kontrollresponsen med medium alene. Kondisjonert medium ble fortynnet med mlL-3-fritt RPMI-medium til konsentrasjoner på 50 %, 25 %, 12,5 %, 6,25 %, 3,125 %, 1,5 %, 0,75 % og 0,375 %. Renset human zcytorl7-lig ble fortynnet til konsentrasjoner på 1200, 600, 300, 150, 75, 37,5,18,75 eller 9,4 pM. 100 ul av det fortynnede kondisjonerte medium eller det fortynnede protein ble tilsatt til BaF3/KZl 34/zcytorl 7-, BaF3/KZl 34/zcytorl 7/OSMRbeta-, BHK/KZ134/zcytorl7- eller BHK/KZ134/zcytorl7/OSMRbeta-cellene. Analysen som benyttet kondisjonert medium, ble utført i parallell på ikke-transfekterte BaF3/KZl 34- eller BHK/KZ134-celler som kontroll. Det totale analysevolum var 200 ul. Analyseplatene ble inkubert ved 37 °C, 5 % C02, i 24 timer, hvoretter BaF3-cellene ble nedsentrifugert ved 2000 rpm i 10 minutter, mediet avsugd og 25 ul lyseringsbuffer (Promega) tilsatt. For BHK-cellelinjene var sentri-fugeringstrinnet ikke nødvendig, siden disse cellene er adherente. Etter 10 minutter ved romtemperatur ble platene målt for aktivering av STAT-rapportørkonstruksjonen ved avlesning i et luminometer (Labsystems Luminoskan, modell RS), som tilsatte 40 ul luciferaseanalysesubstrat (Promega) og integrerte lysutsendelsen over 5 sekunder.
Resultatene fra denne analysen bekreftet at STAT-rapportørresponsen til BaF3/KZ134/zcytorl7/OSMRbeta- og BHK/KZ134/zcytorl 7/OSMRbeta-cellene på human zcytorl71ig, sammenlignet med enten BaF3/KZl34/zcytorl7-cellene, BHK/KZ134/zcytorl 7-cellene eller de ikke-transfekterte BaF3/KZ134- eller BHK/KZ134-cellene, ble formidlet via zcytorl 7/OSMRbeta-reseptorene. Resultatene viste også at muse-zcytorl71ig ikke aktiverer STAT-rapportøranalysen via det humane reseptorkompleks.
Eksempel 21
Muse- zcvtorl71ig er aktiv i analyse av musebenmarg
A. Isolering av ikke- adherente benmar<g>sceller med lav tetthet
Et ferskt musefemuraspirat (benmarg) erholdes fra 6-10 uker gamle Balb/c- eller C57BL/6-hannmus. Benmargen vaskes så med RPMI + 10 % FBS (JRH, Lenexa KS; Hyclone, Logan, UT) og suspenderes i RPMI + 10 % FBS som en cellesuspensjon fra total benmarg. Benmargscellesuspensjonen fraksjoneres så i en tetthetsgradient (Nycoprep, 1.077, dyr; Gibco BRL) for anrikning av celler med lav tetthet, hovedsakelig mononukleære celler, som følger: Benmargscellesuspensjonen (ca. 8 ml) pipetteres forsiktig på toppen av ca. 5 ml Nycoprep-gradientløsning i et 15 ml konisk rør og sentrifugeres så ved 600 x g i 20 minutter. Intersjikt-laget, som inneholder de mononukleære cellene med lav tetthet, fjernes så, vaskes med overskudd av RPMI + 10 % FBS og nedsentrifugeres ved 400 x g i 5-10 minutter. De nedsentrifugerte cellene resuspenderes i RPMI + 10 % FBS, utsås i en T-75-flaske med ca. 10<6>celler/ml og inkuberes ved 37 °C, 5 % C02, i ca. 2 timer. De resulterende suspensjonscellene er ikke-adherente benmargsceller med lav tetthet (NA-LD-benmargsceller).
B. 96- brønners analyse
NA-LD-musebenmargsceller utsås med 25 000 til 45 000 celler/brønn i 96-brønners vevsdyrkningsplater i RPMI + 10 % FBS + 1 ng/ml stamcellefaktor fra mus (mSCF)
(R&D Systems, Minneapolis, MN), pluss 5 % kondisjonert medium fra en av følgende: (1)
BHK-570-celler som uttrykker muse-zcytorl71ig (eksempel 18), (2) BHK-570-celler som uttrykker human zcytorl71ig (eksempel 7), eller (3) BHK-570-kontrollceller som inneholder vektor og ikke uttrykker noen av ligandene. Disse cellene behandles så med et utvalg av cytokiner for analyse av ekspansjon eller differensiering av hematopoietiske celler fra benmargen. For analysen behandles de utsådde NA-LD-musebenmargscellene med humant interleukin-15 (hIL-15) (R&D Systems) eller et cytokin fra et sett med andre cytokiner (R&D Systems). Seriefortynninger av hIL-15 eller de andre cytokinene analyseres med to gangers seriefortynning fra ca. 50 ng/ml ned til ca. 0,5 ng/ml. Etter 8-12 dager analyseres 96-brønners-prøvene for celleproliferasjon ved Alamar Blue-analysen, som beskrevet i eksempel 5B.
C. Resultater fra 96- brønners NA- LD- musebenmargsanalvse
Kondisjonert medium fra både BHK-celler som uttrykker muse-zcytorl 71ig og celler som uttrykker human zcytorl 71ig, kan
fremme ekspansjon av en populasjon av hematopoietiske celler i NA-LD-musebenmarg, enten alene eller i synergi med andre cytokiner, i motsetning til BHK-kondisjonert kontrollmedium. Populasjonen av hematopoietiske celler som ekspanderes med muse-zcytorl71ig med eller uten andre cytokiner og de hematopoietiske cellene som ekspanderes av human zcytorl 71ig med eller uten andre cytokiner, oppformeres videre i kultur. De hematopoietiske cellene farges med et fykoerytrinmerket anti-Pan-NK-celleantistoff (PharMingen) og analyseres ved "flow"-cytometri, noe som viste at de ekspanderte cellene ga positiv farge med denne markør for naturlige dreperceller (NK-celler). På tilsvarende måte kan andre spesifikke markører for hematopoietiske celler anvendes for å bestemme ekspansjon av f.eks. CD4<+->eller CD8<+->T-celler, andre T-cellepopulasjoner, B-celler og andre immunceller.
Den samme 96-brønners analyse utføres ved anvendelse av ferske celler fra human benmarg erholdt fra Poeitic Technologies, Gaithersburg, MD. Igjen viser et positivt resultat at zcytorl 71ig fra mus og menneske, alene eller i synergi med andre cytokiner, kan ekspandere en hematopoietisk cellepopulasjon som farges positivt med spesifikke cellemarkører, som beskrevet ovenfor.
Eksempel 22
Konstruksjoner for fremstilling av zcytorl 71ig- transgene mus
A. Konstruksjon for ekspresjon av human zcytorl 71ig fra MT- l- promoteren
Oligonukleotider ble utformet for frembringelse av et PCR-fragment som inneholdt en Kozak-konsensussekvens og det kodende området for human zcytorl 71ig. Disse oligonukleotidene ble utformet med et Fsel-sete i 5'-enden og et Ascl-sete i 3'-enden for å lette kloning inn i (a) pMT12-8, en standard transgen vektor, eller (b) pKF051, en lymfoidspesifikk transgen vektor (eksempel 22B).
PCR-reaksj oner utføres med ca. 200 ng human zcytorl 71ig-templat (SEQ ID NO: 1) og oligonukleotider utformet for amplifisering av fullengde zcytorl 71ig eller den aktive del av zcytorl 71ig. PCR-reaksjonsbetingelsene fastsettes ved anvendelse av teknikker som er kjent innen faget. PCR-produktene fraksjoneres ved agarosegelelektroforese og renses ved anvendelse av gelekstraksjonssettet "QIAquick" (Qiagen). Det isolerte DNA-fragment med korrekt størrelse kuttes med Fsel og Ascl (Boehringer Mannheim), utfelles med etanol og ligeres inn i pMT12-8 som på forhånd er kuttet med Fsel og Ascl. Plasmid pMT12-8, som er utformet for ekspresjon av et gen av interesse i lever og andre vev i transgene mus, inneholder en ekspresjonskassett som er flankert av 10 kb MT-1 5'-DNA og 7 kb MT-1 3'-DNA. Ekspresjonskassetten omfatter MT-1-promoteren, intron II fra rotteinsulin, en polylinker for innsetting av den ønskede klon, og poly-A-sekvensen fra humant veksthormon (hGH).
Cirka 1 ul av hver ligeringsreaksjon elektroporeres inn i kompetente DH10B-"ElectroMax"-celler (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) ifølge produsentens retningslinjer, og cellene utsås på LB-skåler inneholdende 100 ug/ml ampicillin og inkuberes over natten. Kolonier plukkes og dyrkes i LB-medium tilsatt 100 |j,g/ml ampicillin. Minipreparater av plasmid-DNA fremstilles fra de utplukkede klonene og analyseres for humant zcytorl71ig-innskudd ved restriksjonskutting med EcoRI alene eller en kombinasjon av Fsel og Ascl, og påfølgende agarosegelelektroforese. Maksipreparater fremstilles av korrekt pMT-human zcytorl71ig. Et Sall-fragment som sammen med 5'- og 3'-flankerende sekvenser inneholder MT-1-promoteren, intron II fra rotteinsulin, humant zcytorl71ig-cDNA og poly-A-sekvensen fra hGH fremstilles for anvendelse for mikroinjeksjon inn i befruktede museoocytter. Mikro-injeksjonen og fremstilling av transgene mus utføres som beskrevet av Hogan, B. et al., Manipulating the Mouse Embryo, 2. utgave, Cold Spring Harbor Laboratory press, NY, 1994.
B. Konstruksjon for ekspresjon av human zcytorl 71ig fra den lymfoidspesifikke EuLCK- promoter
Oligonukleotider utformes for fremstilling av et PCR-fragment som inneholder en Kozak-konsensussekvens og det kodende området for human zcytorl 71ig. Disse oligonukleotidene utformes med et Fsel-sete i 5'-enden og et Ascl-sete i 3-enden for å lette kloning inn i pKF051, en lymfoidspesifikk transgen vektor. PCR-reaksj onene utføres med ca. 200 ng human zcytorl71ig-templat (SEQ ID NO: 1) og oligonukleotider utformet for amplifisering av fullengde-zcytorl71ig eller den aktive del av zcytorl 71ig. En PCR-reaksjon utføres ved anvendelse av fremgangsmåter som er kjent innen faget. Det isolerte DNA-fragment med korrekt størrelse kuttes med Fsel og Ascl (Boehringer Mannheim), utfelles med etanol og ligeres inn i pKF051 som på forhånd er kuttet med Fsel og Ascl. Den transgene vektor pKF051 er avledet fra pl026X (Iritani, B.M. et al., EMBO J., 76:7019-31,1997) og inneholder den T-cellespesifikke proksimale lck-promoter, den B/T-cellespesifikke enhancer fra immunglobulin |i-tungkjede, en polylinker for innsetting av den ønskede klon og et mutert hGH-gen som koder for et inaktivt veksthormonprotein (som tilveiebringer 3'-introner og et polyadenyleringssignal).
Cirka 1 ul av hver ligeringsreaksjon elektroporeres inn i bakterieceller, cellene utsås, kloner plukkes og analyseres for human zcytorl 71ig-innskudd ved restriksjonskutting, som beskrevet ovenfor. En korrekt klon av pKF051-zcytorl71ig bekreftet ved sekvensering, og et maksipreparat fremstilles fra av klonen. Et Notl-fragment som inneholder den proksimale lck-promoter, immunglobulin u-enhanceren (EuLCK), zcytorl 7lig-cDNA og det muterte hGH-gen, fremstilles for anvendelse for mikroinjeksjon inn i befruktede museoocytter.
C. Konstruksjon for ekspresjon av muse- zcvtorl71ie fra EFlalfa- promoteren
Primerne ZC41498 (SEQ ID NO: 86) og ZC41496 (SEQ ID NO: 87) ble anvendt for PCR med et cDNA-bibliotek fra musetestis som templat. Disse PCR-reaksj onene ble med hell utført i volumer på ca. 50 ul, med eller uten 10 % DMSO ved anvendelse av pfu-turbopolymerase (Stratagene) ifølge produsentens anbefalinger, med ytterligere benyttelse av en voksbasert varmstart som benyttet Hot Start 50s (Molecular Bioproducts, Inc., San Diego, CA). PCR ble utført med en enkelt syklus bestående av 94 °C i 4 minutter, fulgt av 40 sykluser bestående av 94 °C i 30 sekunder, 48 °C i 30 sekunder og 72 °C i 50 sekunder, med ytterligere en avsluttende primerforlengelse ved 72 °C i 7 minutter. De to PCR-reaksj onene ble slått sammen og renset ved anvendelse av agarose med lavt smeltepunkt og det agarosespaltende enzym gelase (Epicenter, Inc., Madison, WI) ifølge produsentens anbefalinger.
Sekvensering av PCR-produktene viste en muse-zcytorl 7-cDNA-sekvens (SEQ ID NO: 90) som omfattet en ORF identisk med SEQ ID NO: 10, noe som bekreftet at SEQ ID
NO: 10 koder for zcytorl 7-polypeptidet fra mus. PCR-primerne ZC41583 (SEQ ID NO: 88) og ZC41584 (SEQ ID NO: 89) ble så anvendt for innføring av restriksjonsseter for Fsel og Ascl og en partiell Kozak-sekvens i den åpne leseramme for mzcytorl 71ig og et termineringskodon (SEQ ID NO: 92). En programmerbar varmeblokk av type Robocycler 40 (Stratagene) ble anvendt for å oppnå en gradient av hybridiseringstemperaturer og for sykluser som følger. Pfu-turbopolymerase (Stratagene) ble benyttet som beskrevet ovenfor, men kun i 10 % DMSO. Syklusene ble utført med en enkelt syklus bestående av 94 °C i 4 minutter, fulgt av 20 sykluser bestående av 94 °C i 30 sekunder, en gradient fra 65 til 51 °C i 30 sekunder og 72 °C i 1 minutt, fulgt av en enkelt primerforlengelse ved 72 °C i 7 minutter. Templatet for denne andre temperatursyklusreaksjonen var 1 ul av det opprinnelige gelrensede mcytorl71ig-PCR-produkt beskrevet ovenfor. Det resulterende PCR-produkt fra de tre laveste temperaturreaksjonene ble slått sammen og gelrenset ved anvendelse av gelase-fremgangsmåten (Epicenter) som er beskrevet ovenfor. Dette rensede fragment ble så kuttet med Fsel og Ascl og ligert inn i en pZP7X-vektor som var modifisert til å ha Fsel- og Ascl-seter i kloningssetet. Konstruksjonen ble sendt for sekvensering for å bekrefte korrekt sekvens. Den klonede muse-cDNA-sekvens er representert i SEQ ID NO: 90, og den tilsvarende polypeptidsekvens er vist i SEQ ID NO: 91 (som er identisk med SEQ ID NO: 11).
Det isolerte DNA-fragment med korrekt størrelse, kuttet med Fsel og Ascl (Boehringer Mannheim), ble subklonet inn i et plasmid som inneholdt EFlalfa-promoteren, på forhånd kuttet med Fsel og Ascl. Maksipreparater av den korrekte vektor EFlalfa-muse-zcytorl71ig ble fremstilt. Ekspresjonskassetten inneholder EFlalfa-promoteren (med et delert Fsel-sete), EFlalfa-intronet, det IRES-lignende SUR-setet for å lette ekspresjonen, en polylinker flankert av rotteinsulin II-seter i 5'-enden som innfører et Fsel-sete, et Pmel-sete og et Ascl-sete for innsetting av den ønskede klon, og poly A-sekvensen fra humant veksthormon (hGH). Et Notl-fragment på 7,5 kb som inneholdt EFlalfa-promoteren, ekspresjonskassetten og muse-zcytorl 7lig, ble fremstilt for anvendelse for mikroinjeksjon i befruktede museoocytter. Plasmid EF 1 alfa ble erholdt fra Louis-Marie i the Laboratoire de Differenciation Cellulaire, som beskrevet av Taboit-Dameron et al., 1999, Transgenic Research, 5:223-235.
D. Konstruksjon for ekspresjon av muse- zcvtorl71ig fra den lvmfoidspesifikke EuLCK- promoter
Oligonukleotider ble utformet for fremstilling av et PCR-fragment som inneholdt en Kozak-konsensussekvens og det kodende området for muse-zcytorl71ig. Disse oligonukleotidene ble utformet med et Fsel-sete i 5'-enden og et Ascl-sete i 3'-enden for å lette kloning inn i pKF051 (se eksempel 22B ovenfor).
Det isolerte zcytorl71ig-DNA med korrekt størrelse som ble anvendt i EFlalfa-konstruksjonene, kuttet med Fsel og Ascl (Boehringer Mannheim), ble subklonet inn i plasmid pKF051, en lymfoidspesifikk transgen vektor. Den transgene vektor pKF051 er avledet fra pl026X (Iritani, B.M. et al., EMBO J., 76:7019-31,1997) og inneholder den T-cellespesifikke proksimale lck-promoter, den B/T-cellespesifikke enhancer fra immunglobulin (i-tungkjede, en polylinker for innsetting av den ønskede klon og et mutert hGH-gen som koder for et inaktivt veksthormonprotein (som tilveiebringer 3'-introner og et polyadenyleringssignal).
Et Notl-fragment på 6,5 kb som inneholder den proksimale lck-promoter og immunglobulin u-enhanceren (EuLCK), muse-zcytorl 71ig-cDNA og det muterte hGH-gen, ble fremstilt for anvendelse for mikroinjeksjon inn i befruktede museoocytter (eksempel 41).
Eksempel 23
Konstruksjon av pattedvrekspresionsvektorer som uttrykker zcvtorl71ig- CEE
A. Konstruksjon av zcytorl 71ie- CEE/ pZMP21
Et ekspresjonsplasmid som inneholder hele eller en del av et polynukleotid som kodet for human zcytorl 71ig, ble konstruert ved homolog rekombinasjon. Plasmidet ble betegnet zcytorl 71ig-CEE/pZMP21.
Konstruksjonen av zcytorl71ig-CEE/pZMP21 ble oppnådd ved fremstilling av et zcytorl 71ig-CEE-fragment (SEQ ID NO: 95) (den tilsvarende aminosyresekvens er vist i SEQ ID NO: 96) ved anvendelse av PCR-amplifisering. DNA-templatet som ble anvendt for fremstillingen av zcytorl 71ig-CEE-fragmentet, var zcytorl71ig/pZP7nx. Primerne som ble anvendt for fremstilling av zcytorl71ig-CEE-fragmentet, var: (1) ZC41607 (SEQ ID NO: 97)
("sense"-sekvens), som fra 5'- til 3'-ende omfatter 28 bp av den flankerende vektorsekvens (5' for innskuddet) og 21 bp som tilsvarer 5'-sekvensen av zcytorl71ig; og (2) ZC41605 (SEQ ID NO: 98) ("antisense"-sekvens), som fra 5'- til 3'-ende omfatter 37 bp av den flankerende vektorsekvens (3<1>for innskuddet), 3 bp med et stoppkodon, 21 bp som koder for en C-terminal CEE-merkelapp og 21 bp som tilsvarer 3'-enden av zcytorl 71ig-sekvensen. Fragmentet som dannes i den ovenfor beskrevne PCR-amplifisering, er en kopi av templatet zcytorl71ig med addisjon av en C-terminal EE-merkelapp, noe som gir som sluttprodukt zcytorl71ig-CEE.
PCR-reaksj onene ble utført som følger. Følgende bestanddeler ble sammenblandet til et sluttvolum på 100 ul: 10 ul 10 x Taq-polymerasereaksjonsbuffer med 15 mm MgCl (Gibco), 1 ul Taq-DNA-polymerase (5 enheter/ul, Gibco), 3 ul 10 mM dNTP, 78 ul dE^O, 3 (il av en 20 pmol/ul lagerløsning av primer ZC41607 (SEQ ID NO: 97), 3 (il av en 20 pmol/ul lagerløsning av primer ZC41605 (SEQ ID NO: 98) og 2 ul av en 0,13 ug/ul lagerløsning av zcytorl71ig-templat-DNA. 50 ul mineralolje ble tilsatt til blandingen. Reaksjonsblandingen ble oppvarmet til 94 °C i 5 minutter, fulgt av 35 sykluser bestående av 94 °C i 1 minutt, 55 °C i 2 minutter og 72 °C i 3 minutter, fulgt av en 10 minutters primerforlengelse ved 72 °C og inkubering ved 4 °C inntil reaksjonsblandingen ble oppsamlet.
Plasmid pZMP21 ble kuttet ut med restriksjonsenzymet Bglll, renset med et QIAquick PCR-rensesett (Qiagen) ved anvendelse av en mikrosentirfugebasert fremgangsmåte og anvendt for rekombinasjon med PCR-fragmentet. Plasmid pZMP21 ble fremstilt fra pZMP20, som ble fremstilt frapZP9 (deponert hos American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, og gitt betegnelsen nr. 98668) med genetiske gjærelementer tatt frapRS316 (deponert hos American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, og gitt betegnelsen nr. 77145), et IRES-element fra poliovirus og det ekstracellulære domenet fra CD8, avkortet ved den karboksylterminale ende av transmembrandomenet. PZMP21 er en pattedyrekspresjonsvektor som inneholder en ekspresjonskassett som omfatter MPSV-promoteren, intronet fra immunglobulinsignalpeptid, flere restriksjonsseter for innsetting av kodende sekvenser, et stoppkodon og en terminator fra humant veksthormon. Plasmidet har også et E. co//-replikasjonsorigo, en ekspresjonsenhet for en pattedyrseleksjonsmarkør med en SV40-promoter, -enhancer og -replikasjonsorigo, et DHFR-gen, SV40-terminatoren så vel som URA3- og CEN-ARS-sekvensene som er nødvendige for seleksjon og replikasjon i S. cerevisiae.
50 ul kompetente gjærceller ( S. cerevisiae) ble sammenblandet med 100 ng kuttet plasmid og 5 ul av den tidligere beskrevne PCR-blanding og overført til en 0,2 cm elektroporeringskyvette. Blandingen av gjær og DNA ble gitt en elektrisk puls ved 0,75 kV (5 kV/cm) uendelig ohm, 25 uF. Hver kyvette ble tilsatt 600 ul 1,2 M sorbitol, og gjærcellene ble utsådd i én porsjon på 100 ul og én porsjon på 300 ul på to URA-D-skåler og inkubert ved 30 °C. Etter ca. 72 timer ble URA<+->gjærtransformantene fra en enkelt skål resuspendert i 1 ml H2O og sentrifugert i kort tid for nedsentrifugering av gjærcellene. De nedsentrifugerte cellene ble resuspendert i 500 ul lyseringsbuffer (2 % Triton X-100,1 % SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 8,0,1 mM EDTA). 500 ul lyseringsblanding ble overført til et Eppendorf-rør inneholdende 300 ul syrevaskede glasskuler med diameter 600 um og 300 ul fenol-kloroform, vorteksbehandlet med 1 minutts mellomrom to eller tre ganger og så sentrifugert i 5 minutter i en Eppendorf-sentrifuge ved maksimal hastighet. 300 ul av vannfasen ble overført til et nytt rør, og DNA ble utfelt med 600 ul 100 % etanol (EtOH), fulgt av sentrifugering i 10 minutter ved 4 °C. Nedsentrifugert DNA ble så vasket med 500 ul 70 % EtOH, fulgt av sentrifugering i 1 minutt ved 4 °C. Nedsentrifugert DNA ble resuspendert i 30 ml H2O.
Transformasjon av elektrokompetente E. co//-celler (MC 1061) ble utført med 1 ml av gjær-DNA-preparatet og 50 ul MC 1061-celler. Cellene ble gitt en elektrisk puls ved 2,0 kV, 25 uF og 400 ohm (Q). Etter elektroporeringen ble 600 ul SOC (2 % Bacto-Trypton (Difco, Detroit, MI), 0,5 % gjærekstrakt (Difco), 10 mM NaCl, 2,5 mM KC1,10 mM MgCl2,10 mM MgS04, 20 mM glukose) tilsatt. De elektroporerte E. co/z-cellene ble utsådd i én porsjon på 200 ul og én porsjon på 50 ul på to LB/AMP-skåler (LB-medium (Lennox), 1,8 % Bacto-agar (Difco), 100 mg/ml ampicillin). Platene ble inkubert opp ned i ca. 24 timer ved 37 °C. Tre ampicillinresistente kolonier ble tilfeldig utvalgt, og innskuddet ble sekvensert. Plasmid-DNA ble isolert i stor skala fra én klon med bekreftet sekvens ved anvendelse av Qiagen Maxi-sett (Qiagen) ifølge produsentens instruksjoner.
B. Ekspresjon i pattedyrceller av human zcvtorl 71ie
Fullengde-zcytorl71ig-protein ble fremstilt i BHK-celler transfektert med zcytorl 71ig-CEE/pZMP21 (eksempel 23A). BHK-570-celler (ATCC CRL-10314) ble utsådd i T75- vevsdyrkningsflasker og dyrket til ca. 50-70 % konfluens ved 37 °C, 5 % CO2, i dyrkningsmedium (SL7V4, 5 % FBS, 1 % pen/strep). Cellene ble så transfektert med zcytorl 71ig-CEE/- pZMP21 ved liposomformidlet transfeksjon (ved anvendelse av "Lipofectamin", Life Technologies) i serumfritt (SF) medium (SL7V4). Plasmidet (16 ug) ble fortynnet i 1,5 ml rør til et endelig volum på 640 ul med SF-medium. 35 ul av lipidblandingen ble blandet med 605 (il SF-medium, og den resulterende blanding ble inkubert i ca. 15 minutter ved romtemperatur. 5 ml SF-medium ble så tilsatt til DNA:lipidblandingen. Cellene ble vasket én gang med 10 ml PBS, PBS ble fjernet ved dekantering, og DNA:lipidblandingen ble tilsatt. Cellene ble inkubert ved 37 °C i 5 timer, hvoretter 15 ml medium (SL7V4, 5 % FBS, 1 % pen/strep) ble tilsatt til hver skål. Skålene ble inkubert ved 37 °C over natten, og DNA:lipidblandingen ble erstattet med seleksjonsmedium (SL7V4, 5 % FBS, 1 % pen/strep, 1 uM metotreksat) neste dag. Cirka 10 dager etter transfeksjonen ble metotreksatresistente kolonier fra T75-transfeksjonsflasken trypsinbehandlet, og cellene ble slått sammen og utsådd i en T-162-flaske og overført til dyrkning i stor skala.
Eksempel 24
Ekspresjon av løseli<g>zcvtorl 7- reseptor i E . coli
A. Konstruksjon av ekspresjonsvektoren pCMHOl som uttrykker huzcvtorl7/ MBP-6H- fusi onspol vpeptid
Et ekspresjonsplasmid som inneholdt et polynukleotid som kodet for en løselig zcytorl 7-reseptor C-terminalt fusjonert til maltosebindende protein (MBP), ble konstruert ved homolog rekombinasjon. Fusjonspolypeptidet inneholder en N-terminal MBP-del på ca. 388 aminosyrer fusjonert til en av de løselige zcytorl 71ig-reseptorene som beskrives heri. Et fragment av humant zcytorl7-cDNA (SEQ ID NO: 4) ble isolert ved anvendelse av PCR, som beskrevet heri. To primere ble anvendt for fremstilling av zcytorl 7-fragmentet i en standard PCR-reaksj on: (1) en primer som inneholdt ca. 40 bp av den flankerende vektorsekvens og ca. 25 bp tilsvarende aminoenden av zcytorl7, og (2) en annen primer inneholdende ca. 40 bp av 3'-enden tilsvarende den flankerende vektorsekvens og ca. 25 bp tilsvarende karboksylenden av zcytorl 7. 2 ul av PCR-reaksjonen på 100 ul ble fraksjonert i en 1,0 % agarosegel med 1 x TBE-buffer for analyse, og et fragment med tilnærmet forventet størrelse ble observert. Resten av PCR-reaksj onsblandingen ble blandet med det andre PCR-røret, og DNA ble utfelt med 400 ul absolutt etanol. Utfelt DNA ble anvendt for rekombinasjon inn i den Smal-kuttede mottaker-vektoren pTAP170 for fremstilling av konstruksjonen som koder for MBP-zcytorl7-fusjonen, som beskrevet nedenfor.
Plasmid pTAP170 ble avledet fra plasmidene pRS316 og pMAL-c2. Plasmid pRS316 er en Saccharomyces cerevwiae-skyttelvektor (Hieter P. og Sikorski, R., Genetics, 722:19-27,1989). pMAL-C2 (NEB) er et E. cø//-ekspresjonsplasmid. Plasmidet bærer tac-promoteren som styrer MalE (genet som koder for MBP), fulgt av en His-merkelapp, et trombinkløyvingssete, et kloningssete og rraB-terminatoren. Vektoren pTAP170 ble konstruert ved anvendelse av homolog rekombinasjon i gjær. 100 ng EcoRI-kuttet pMAL-c2 ble rekombinert med 1 ug Pvul-kuttet pRS316,1 ug linker og 1 ug Scal/EcoRI-kuttet pRS316. Linkeren bestod av oligonukleotidene zcl9372 (SEQ ID NO: 157) (100 pmol), zcl9351 (SEQ ID NO: 158) (1 pmol), zcl9352 (SEQ ID NO: 159) (1 pmol) ogzcl9371 (SEQ ID NO: 160)
(100 pmol) sammenblandet i en PCR-reaksjon. Betingelsene var som følger: 10 sykluser bestående av 94 °C i 30 sekunder, 50 °C i 30 sekunder og 72 °C i 30 sekunder, fulgt av inkubering ved 4 °C. PCR-produktene ble oppkonsentrert ved utfelling med 100 % etanol.
100 (xl kompetente gjærceller ( S. cerevisiae) ble blandet med 10 ul av en blanding som inneholdt ca. 1 ug human zcytorl 7-innskudd og 100 ng Smal-kuttet pTAP170-vektor, og overført til en 0,2 cm elektroporeringskyvette. Blandingen av gjær og DNA ble gitt en elektrisk puls ved 0,75 kV (5 kV/cm), uendelig ohm, 25 uF. Til hver kyvette ble det tilsatt 600 ul 1,2 M sorbitol. Gjærcellene ble så utsådd i to porsjoner på 300 ul på to URA-D-skåler og inkubert ved 30 °C.
Etter ca. 48 timer ble Ura<+->gjærtransformantene fra en enkelt skål plukket, og DNA ble isolert og transformert inn i elektrokompetente E co/i-celler (f.eks. MC1061, Casadaban et al., J. Mol. Biol., 138,179-207) og utsådd på MM/CA + KAN 25 ug/l-skåler (Pryor og Leiting, Protein Expression and Purification, 70:309-319,1997) ved anvendelse av standardfremgangsmåter. Cellene ble dyrket i MM/CA med 25 ug/ml kanamycin i 2 timer under omristing ved 37 °C. 1 ml av kulturen ble indusert med 1 mM IPTG. 2-4 timer senere ble 250 ul av hver kultur blandet med 250 ul syrevaskede glasskuler og 250 ul Thorner-buffer med 5 % pME og fargestoff (8 M urea, 100 mM Tris, pH 7,0,10 % glyserol, 2 mM EDTA, 5 % SDS). Prøvene ble vorteksbehandlet i 1 minutt og oppvarmet til 65 °C i 10 minutter. 20 ul ble satt i hvert spor i en 4-12 % PAGE-gel (NOVEX). Elektroforesen ble kjørt i 1 x MES-buffer. De positive klonene ble betegnet pCMHOl og ble sekvensert. 1 ul sekvensert DNA ble anvendt for transformasjon av stamme BL21. Cellene ble gitt en elektrisk puls ved 2,0 kV, 25 uF og 400 ohm. Etter elektroporeringen ble cellene tilsatt 0,6 ml MM/CA med 25 ug/l kanamycin. Cellene ble dyrket i MM/CA og indusert med IPTG, som beskrevet ovenfor. De positive klonene ble dyrket opp for rensing av huzcytorl7/MBP-6H-fusjonsproteinet ved anvendelse av standardteknikker.
B. Rensing av løselig huzcvtorl7/ MBP- 6H- reseptor fra E co//- fermentering
Dersom ikke annet er angitt, ble alle operasjoner utført ved 4 °C. Følgende fremgangsmåte ble anvendt for rensing av rekombinant, løselig huzcytorl7/MBP-6H-reseptorpolypeptid. E cø/z-celler som inneholdt pCMHOl-konstruksjonen og som uttrykte løselig huzcytorl7/MBP-6H-reseptorpolypeptid, ble fremstilt ved anvendelse av standard molekylærbiologiske fremgangsmåter og dyrket i "SuperBroth II" (12 g/l kasein, 24 g/l gjærekstrakt, 11,4 g/l dikaliumfosfat, 1,7 g/l monokaliumfosfat; Becton Dickinson, Cockeysville, MD). De resulterende cellene ble høstet og nedfrosset i 0,5 % glyserol. 20 g av de frosne cellene ble anvendt for proteinrensing.
De opptinte cellene ble resuspendert i 500 ml amyloseekvilibreringsbuffer (20 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8,0). Et French Press-celleoppbrytningssystem (Constant Systems Ltd., Warwick, UK) med temperaturen justert til -7 til -10 °C og et trykk på 207 mPa ble anvendt for lysering av cellene. De resuspenderte cellene ble kontrollert for oppbrytning ved måling av A^ oo før og etter passasje gjennom French Press. Den lyserte cellesuspensjon ble sentrifugert ved 10 000 x G i 30 minutter. Supernatanten ble fjernet fra de nedsentrifugerte cellerestene for rensing av protein. 25 ml amyloseresin (New England Biolabs, Beverly, MA) ble helt i en Bio-Rad med 2,5 cm diameter x 10 cm høyde glasskolonne. Kolonnen ble pakket og ekvilibrert med 10 kolonnevolumer (CV) amyloseekvilibreringsbuffer. Den høstede cellesupernatant ble blandet med amyloseresin over natten under vipping. Resin med bundet materiale ble ført tilbake til glasskolonnen, vasket med 10 CV amyloseekvilibreringsbuffer og eluert med ca. 2 CV amyloseelueringsbuffer (amyloseekvilibreringsbuffer, 10 mM maltose, Fluka Biochemical, Sveis). Ti fraksjoner på 5 ml ble oppsamlet over elueringsprofilen og analysert for absorbans ved 280 og 320 nm. Amyloseresinet ble regenerert med 1 CV destillert H20, 5 CV 0,1 % (vekt/volum) SDS (Sigma), 5 CV destillert H20,5 CV amyloseekvilibreringsbuffer og endelig 1 CV amyloselagringsbuffer (amyloseekvilibreringsbuffer, 0,02 % (vekt/volum) natriumazid). Det regenererte resin ble lagret ved 4 °C.
Eluerte fraksjoner av interesse ble slått sammen og dialysert i et 1 OK dialyse-kammer (Slide-A-Lyzer, Pierce Immunochemical) mot 4x41 PBS, pH 7,4 (Sigma), over et tidsrom på 8 timer. Etter dialysen representerte det høstede materialet det rensede huzcytorl7/MBP-6H-polypeptid. Det rensede huzcytorl7/MBP-6H-polypeptid ble sterilisert ved filtrering og analysert ved SDS-PAGE med coomassiefarging for et produkt med passende molekylvekt. Konsentrasjonen av huzcytorl7/MBP-6H-polypeptidet ble ved BCA-analyse bestemt til 0,76 mg/ml.
Renset huzcytorl7/MBP-6H-polypeptid ble utformet på egnet vis for immunisering av kaniner og sendt til R & R Research and Development (Stanwood, WA) for fremstilling av polyklonalt antistoff (eksempel 25 nedenfor).
Eksempel 25
Polyklonalt antistoff mot human løselig zcytorl 71ig- reseptor
A. Fremstilling og rensing
Polyklonale antistoffer ble fremstilt ved immunisering av to hvite New Zealand-hunnkaniner med det rensede rekombinante protein huzcytorl7/MBP-6H (eksempel 24). Kaninene ble gitt en innledende intraperitoneal (IP) injeksjon med 200 ug renset protein i komplett Freunds adjuvans, fulgt av IP forsterkerinjeksjoner av 100 ug protein i ukomplett Freunds adjuvans hver 3. uke. 7-10 dager etter tilførsel av den andre forsterkerinjeksjonen (i alt tre injeksjoner) ble blod tappet fra dyrene og serum oppsamlet. Dyrene ble så gitt forsterkerinjeksjoner og tappet for blod hver 3. uke.
Det huzcytorl7/MBP-6H-spesifikke kaninserum ble preadsorbert på anti-MBP-antistoffer ved anvendelse av en CNBr-SEPHAROSE-4B-proteinkolonne (Pharmacia LKB) som var blitt fremstilt ved anvendelse av 10 mg uspesifikt renset, rekombinant MBP-fusjonsprotein pr. gram CNBr-SEPHAROSE. De huzcytorl7/MBP-6H-spesifikke polyklonale antistoffene ble affinitetsrenset fra det preadsorberte kaninserum ved anvendelse av en CNBr-SEPHAROSE-4B-proteinkolonne (Pharmacia LKB) som var blitt fremstilt ved anvendelse av 10 mg av det spesifikke antigenrensede, rekombinante huzcytorl7/MBP-6H-protein. Etter rensingen ble de polyklonale antistoffene dialysert mot 4 x 20 ganger antistoffvolumet av PBS over et tidsrom på minst 8 timer. Huzcytorl7-spesifikke antistoffer blekarakterisert vedELISA og anvendelse av 500 ng/ml av det rensede rekombinante protein huzcytorl7/MBP-6H som antistoffmål. Den nedre deteksjonsgrense (LLD) for det affinitetsrensede anti-huzcytorl7/MBP-6H-antistoff fra kanin var 50 pg/ml mot det spesifikke rensede, rekombinante antigen huzcytorl7/MBP-6H.
B. SDS- PAGE og Western- blotting- analvse av antihuman zcytorl 7- MBP- 6H-antistoff fra kanin
Antihumant zcytorl 7-MBP-6H-antistoff fra kanin ble analysert ved SDS-PAGE (NuPage 4-12 %, Invitrogen, Carlsbad, CA) med coomassiefarging og Western-blotting ved anvendelse av antikanin-IgG-HRP fra geit. Enten renset protein (200-25 ng) eller kondisjonert medium som inneholdt zcytorl7, ble fraksjonert ved elektroforese ved anvendelse av en Invitrogen Novex Xcell II-minicelle og overført til nitrocellulose (0,2 mm, Invitrogen, Carlsbad, CA) ved romtemperatur ved anvendelse av Novex Xcell-blottemodul under omrøring ifølge retningslinjene som gis i instrumenthåndboken. Overføringen ble utført ved 300 mA i 1 time i en buffer som inneholdt 25 mM Tris-base, 200 mM glysin og 20 % metanol. Filteret ble så blokkert med Western A-buffer (hjemmelagd, 50 mM Tris, pH 7,4, 5 mM EDTA, pH 8,0, 0,05 % Igepal CA-630,150 mM NaCl og 0,25 % gelatin) over natten under forsiktig vipping ved 4 °C. Nitrocellulosen ble raskt vasket, hvoretter antihuman zcytorl 7-MBP-6H (1:1000) ble tilsatt i Western A-buffer. Blottet ble inkubert i 1,5 timer ved romtemperatur under forsiktig vipping. Blottet ble vasket tre ganger, hver gang i 5 minutter, med Western A, hvoretter antikanin-IgG-HRP-antistoff fra geit (1:1000) ble tilsatt i Western A-buffer. Blottet ble inkubert i 1,5 timer ved romtemperatur under forsiktig vipping. Blottet ble vasket tre ganger, hver gang i 5 minutter, med Western A og så raskt vasket med H2O. Blottet ble fremkalt ved anvendelse av kommersielt tilgjengelige kjemiluminescenssubstratreagenser (ECL Western-blottingdeteksjonsreagenser 1 og 2 blandet 1:1, reagenser erholdt fra Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, England), og blottet ble eksponert for røntgenfilm i opptil 15 minutter.
Antihuman zcytorl 7-MBP-6H fra kanin kunne påvise human zcytorl 7 i kondisjonert medium, så vel som renset zcytorl7-protein som et bånd ved 120 kDa under reduserende betingelser.
Eksempel 26
Vevsfordelingen av zc<y>torl7 fra mus i vevspaneler ved anvendelse av PCR
Et sett med cDNA fra musevev ble analysert for muse-zcytorl7-ekspresjon ved anvendelse av PCR. Settet var hjemmelagd og inneholdt 94 Marathon-cDNA og cDNA-prøver fra forskjellige normale og kreftholdige musevev og cellelinjer, som vist i tabell 6 nedenfor. Disse cDNA kom fra hjemmelagde biblioteker eller Marathon-cDNA fra hjemmelagde RNA-preparater, Clontech-RNA eller Invitrogen-RNA. Muse-Marathon-cDNA ble fremstilt ved anvendelse av settet "Marathon-Ready" (Clontech, Palo Alto, CA) og QC-analysert med musetransferrinreseptorprimerne ZC 10651 (SEQ ID NO: 46) og ZC 10565 (SEQ ID NO: 47) og så fortynnet, basert på intensiteten av transferrinbåndet. For å sikre kvaliteten av de amplifiserte bibliotekprøvene i settet ble tre analyser for kvalitetskontroll (QC) utført: (1) for å anslå kvaliteten av RNA anvendt for bibliotekene ble de hjemmelagde cDNA analysert for gjennomsnittlig innskuddsstørrelse ved PCR med vektoroligonukleotider som var spesifikke for vektorsekvensene i et gitt cDNA-bibliotek; (2) standardisering av konsentrasjonen av cDNA i settprøvene ble oppnådd ved anvendelse av standard PCR-fremgangsmåter for amplifisering av fullengde-alfa-tubulin- eller G3PDH-cDNA ved anvendelse av et 5' vektoroligonukleotid: ZC14063 (SEQ ID NO: 48) og en 3' alfa-tubulinspesifikk oligonukleotidprimer ZC17574 (SEQ ID NO: 49) eller en 3' G3PDH-spesifikk oligonukleotidprimer ZC17600 (SEQ ID NO: 50); og (3) en prøve ble sendt for sekvensering for å analysere for mulig kontaminering med ribosomalt eller mitokondrielt DNA. Settet ble satt opp i 96-brønners format som omfattet en positiv kontrollprøve bestående av genomisk muse-DNA (Clontech, Palo Alto, CA). Hver brønn inneholdt ca. 0,2-100 pg/ul cDNA. PCR ble utført med oligonukleotidene ZC38065 (SEQ ID NO: 51) og ZC38068 (SEQ ID NO: 52), "TaKaRa Ex Taq" (TAKARA Shuzo Co. Ltd., Biomedicals Group, Japan), og fargestoffet Rediload (Research Genetics, Inc., Huntsville, AL). Amplifiseringen ble utført som følger: 1 syklus bestående av 94 °C i 5 minutter, 5 sykluser bestående av 94 °C i 30 sekunder og 68 °C i 30 sekunder, 35 sykluser bestående av 94 °C i 30 sekunder, 56 °C i 30 sekunder og 72 °C i 30 sekunder, fulgt av 1 syklus bestående av 72 °C i 5 minutter. Cirka 10 (il av PCR-reaksjonsproduktet ble fraksjonert ved standard agarosegelelektroforese ved anvendelse av en 4 % agarosegel. Et DNA-fragment med korrekt utledet størrelse ble observert i hjerne, CD90<+->celler, dendrittceller, embryoceller, MEWt#2-celler, Tuvak-prostatacellelinjen, spyttkjertel, hud og testis.
DNA-fragmentet fra hud og testis ble kuttet ut og renset ved anvendelse av et gelekstraksjonssett (Qiagen, Chatsworth, CA) ifølge produsentens instruksjoner. Fragmentene ble bekreftet ved sekvensering for å vise at de faktisk var muse-zcytorl 7.
Eksempel 27
Ekspresjon av human zcytorl 7 i forskjellige vev ved anvendelse av sanntids- kvantitativ RT/ PCR
A. Primere og prober for human zc<y>torl7. OSMRbeta og zcytorl 71ig for konvensjonell og kvantitativ RT- PCR
Sanntids-kvantitativ RT-PCR ved anvendelse av ABIPRISM 7900-sekvensdeteksjonssystemet (PE Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) er blitt beskrevet tidligere (se Heid, CA. et al., Genome Research, 6:986-994,1996; Gibson, U.E.M. et al., Genome Research, 6:995-1001,1996; Sundaresan, S. et al, Endocrinology, 739:4756-4764, 1998). Denne fremgangsmåten benytter en genspesifikk probe som inneholder både fluorescerende rapportørfargestoff og fluorescerende lysslukkende fargestoff. Så lenge som proben er intakt, motvirkes lysutsendelsen fra rapportørfargestoffet på grunn av at lysblokkeringsfargestoffet befinner seg like ved. Under PCR-forlengelsen ved anvendelse av ytterligere genspesifikke foroverprimere og reversprimere kuttes proben av Taq-polymerasens 5'-nukleaseaktivitet, noe som frigjør rapportørfargestoffet fra proben og fører til forhøyet fluor-escens.
Primerne og probene som anvendes til sanntids-kvantitative RT-PCR-analyser av human zcytorl7-, OSMRbeta- og zcytorl71ig-ekspresjon, ble utformet ved anvendelse av primerutformingsprogramvaren "Primer Express" (PE Applied Biosystems, Foster City, CA). Primere for human zcytorl 7 ble utformet slik at de lå på hver sin side av en intron-eksonovergang for å forhindre mulig amplifisering av genomisk DNA. Foroverprimeren ZC37877 (SEQ ID NO: 53) og reversprimeren ZC37876 (SEQ ID NO: 54) ble anvendt i en PCR-reaksjon i en konsentrasjon på 200 nM for syntese av et produkt på 73 bp. Den tilsvarende zcytorl 7-"Taq-Man"-probe, betegnet ZC37776 (SEQ ID NO: 55), ble syntetisert og merket av PE Applied Biosystems og anvendt i PCR-reaksj onene i en konsentrasjon på 200 nM. Proben ZC37776 (SEQ ID NO: 55) var merket i 5'-enden med et fluorescerende rapportørfargestoff (6-karboksy-fluorescein) (FAM) (PE Applied Biosystems), og i 3'-enden med et fluorescensblokkerende fargestoff (6-karboksytetrametylrhodamin) (TAMRA) (Epoch Biosciences, Bothell, WA).
Primere for human OSMRbeta ble utformet slik at de lå på hver sin side av en intron-eksonovergang for å forhindre mulig amplifisering av genomisk DNA. Foroverprimeren ZC43891 (SEQ ID NO: 122) og reversprimeren ZC43900 (SEQ ID NO: 123) ble anvendt i en PCR-reaksjon (se nedenfor) i en konsentrasjon på 200 nM. Den tilsvarende OSMRbeta-"Taq-Man"-probe, betegnet ZC43896 (SEQ ID NO: 124), ble syntetisert og merket av PE Applied Biosystems og anvendt i PCR-reaksj onene i en konsentrasjon på 200 nM. Proben ZC43896 (SEQ ID NO: 124) var merket i 5'-enden med et fluorescerende rapportørfargestoff (6-karboksy-fluorescein) (FAM) (PE Applied Biosystems), og i 3'-enden med et ikke-fluorescerende, lysblokkerende fargestoff (ECLIPSE) (Epoch Biosciences).
Primere for human zcytorl 71ig ble utformet slik at de lå på hver sin side av en intron-eksonovergang for å forhindre mulig amplifisering av genomisk DNA. Foroverprimeren
ZC43280 (SEQ ID NO: 125) og reversprimeren ZC43281 (SEQ ID NO: 126) ble anvendt i en PCR-reaksjon (se nedenfor) i en konsentrasjon på ca. 200 nM. Den tilsvarende zcytorl 71ig-"Taq-Man"-probe, betegnet ZC43275 (SEQ ID NO: 127), ble syntetisert og merket av PE Applied Biosystems og anvendt i PCR-reaksj onene i en konsentrasjon på 200 nM. Proben ZC43275 (SEQ ID NO: 127) var merket i 5'-enden med et fluorescerende rapportørfargestoff (6-karboksy-fluorescein) (F AM) (PE Applied Biosystems), og i 3-enden med et ikke-fluorescerende, lysblokkerende fargestoff (ECLIPSE) (Epoch Biosciences).
Som en kontroll for å analysere integritet og kvalitet av de analyserte RNA-prøvene ble alle rRNA-prøver analysert for enten tRNA eller GUS ved anvendelse av et primer-og probesett som enten var bestilt fra PE Applied Biosystems (rRNA-sett) eller utformet i laboratoriet (GUS). rRNA-settet inneholdt foroverprimeren (SEQ ID NO: 56), revers-rRNA-primeren (SEQ ID NO: 57) og rRNA-"TaqMan"-proben (SEQ ID NO: 58). rRNA-proben var merket i 5'-enden med et fluorescerende rapportørfargestoff, VIC (PE Applied Biosystems), og i 3'-enden med det fluorescerende, lysblokkerende fargestoff TAMRA (PE Applied Biosystems). GUS-primerne og -proben ble fremstilt i laboratoriet og anvendt i PCR-reaksj onene i konsentrasjoner på 200 nM henholdsvis 100 nM. Foroverprimeren var ZC40574 (SEQ ID NO: 128) og reversprimeren var ZC40575 (SEQ ID NO: 129). GUS-proben ZC43017 (SEQ ID NO: 130) var merket i 5'-enden med et fluorescerende rapportørfargestoff (Yakima-Yellow) (Epoch Biosciences), og i 3'-enden med et ikke-fluorescerende, lysblokkerende fargestoff (ECLIPSE)
(Epoch Biosciences). Resultatene for rRNA og GUS fungerer også som endogen kontroll og tillater normalisering av zcytorl7-mRNA-ekspresjonsresultatene som observeres i analyse-prøvene.
For konvensjonell, ikke-kvantitativ RT-PCR ble primere utformet ved anvendelse av primerutformingsprogramvaren "Primer Express" (PE Applied Biosystems, Foster City, CA). Primerne for human zcytorl 7 danner et produkt på ca. 1000 basepar og er som følger: foroverprimeren ZC28917 (SEQ ID NO: 83) og reversprimeren ZC28480 (SEQ ID NO: 131). Primerne for human OSMRbeta danner et produkt på 202 basepar og er som følger: foroverprimeren ZC41653 (SEQ ID NO: 132) og reversprimeren ZC41655 (SEQ ID NO: 133). Primerne for human zcytorl 71ig gir et produkt på 305 basepar og er som følger: foroverprimeren ZC41703 (SEQ ID NO: 134) og reversprimeren ZC41704 (SEQ ID NO: 135).
B. Primere og prober for zc<y>torl7. OSMRbeta oe zcvtorl71ig fra mus for konvensjonell og kvantitativ RT- PCR
Primerne og probene som ble anvendt til sanntids-kvantitative RT-PCR-analyser av ekspresjonen av zcytorl7, OSMRbeta og zcytorl71ig fra mus, ble utformet ved anvendelse av primerutformingsprogramvaren "Primer Express" (PE Applied Biosystems, Foster City, CA). Primere for muse-zcytorl 7 ble utformet slik at de lå på hver sin side av en intron-eksonovergang for å forhindre mulig amplifisering av genomisk DNA. Foroverprimeren ZC43272 (SEQ ID NO: 136) og reversprimeren ZC43273 (SEQ ID NO: 137) ble anvendt i PCR-reaksj onene (nedenfor) i en konsentrasjon på 300 nM. Den tilsvarende zcytorl 7-"TaqMan"-probe, betegnet ZC43478 (SEQ ID NO: 138), ble syntetisert og merket av PE Applied Biosystems. Proben ZC43478 (SEQ ID NO: 138) var merket i 5'-enden med et fluorescerende rapportørfargestoff (6-karboksy-fluorescein) (FAM) (PE Applied Biosystems), og i 3'-enden med et fluorescensblokkerende fargestoff (6-karboksytetrametylrhodamin) (TAMRA) (PE Applied Biosystems). Proben ZC43478 (SEQ ID NO: 138) ble anvendt i PCR-reaksj onen i en konsentrasjon på 100 nM.
Primere for muse-zcytorl 71ig ble utformet slik at de lå på hver sin side av en intron-eksonovergang for å forhindre mulig amplifisering av genomisk DNA. Foroverprimeren ZC43278 (SEQ ID NO: 139) og reversprimeren ZC43279 (SEQ ID NO: 140) ble anvendt i PCR-reaksjonene i en konsentrasjon på 500 nM. Den tilsvarende zcytorl 71ig-"TaqMan"-probe, betegnet ZC43276 (SEQ ID NO: 141), ble syntetisert og merket av PE Applied Biosystems. Proben ZC43478 (SEQ ID NO: 138) var merket i 5'-enden med et fluorescerende rapportør-fargestoff (6-karboksyfluorescein) (F AM) (PE Applied Biosystems), og i 3-enden med et ikke-fluorescerende, lysblokkerende fargestoff (ECLIPSE) (Epoch Biosciences). Proben ZC43276 (SEQ ID NO: 141) ble anvendt i PCR-reaksj onene (se nedenfor) i en konsentrasjon på 200 nM.
Primere for muse-OSMRbeta ble utformet slik at de lå på hver sin side av en intron-eksonovergang for å forhindre mulig amplifisering av genomisk DNA. Foroverprimeren ZC43045 (SEQ ID NO: 142) og reversprimeren ZC43046 (SEQ ID NO: 143) ble anvendt i PCR-reaksjonene i en konsentrasjon på 300 nM. Den tilsvarende OSMRbeta-"TaqMan"-probe, betegnet ZC43141 (SEQ ID NO: 144), ble syntetisert og merket av Epoch Biosciences. Proben ZC43141 (SEQ ID NO: 144) var merket i 5'-enden med et fluorescerende rapportørfargestoff (6-karboksyfluorescein) (F AM) (PE Applied Biosystems), og i 3-enden med et ikke-fluorescerende, lysblokkerende fargestoff (ECLIPSE) (Epoch Biosciences). Proben ZC43141 (SEQ ID NO: 144) ble anvendt i PCR-reaksj onene (se nedenfor) i en konsentrasjon på 100 nM.
Som en kontroll for å analysere integritet og kvalitet av de analyserte RNA-prøvene ble alle rRNA-prøver analysert for enten muse-GUS eller transferrinreseptor ved anvendelse av primere og prober utformet ved anvendelse av primerutformingsprogramvaren "Primer Express" (PE Applied Biosystems, Foster City, CA). Muse-GUS-primerne er som følger: foroverprimeren ZC43004 (SEQ ID NO: 145), reversprimeren ZC43005 (SEQ ID NO: 146) og "TaqMan"-proben ZC43018 (SEQ ID NO: 147). Muse-GUS-proben ZC43018 (SEQ ID NO: 147) var merket i 5'-enden med et fluorescerende rapportørfargestoff, Yakima-Yellow (Epoch Biosciences), og i 3'-enden med det ikke-fluorescerende, lysblokkerende fargestoff ECLIPSE (Epoch Biosciences). Muse-GUS-primerne ble anvendt i PCR-reaksj onene i en konsentrasjon på 300 nM, og proben ZC43018 (SEQ ID NO: 147) ble anvendt ved 100 nM. I noen tilfeller ble musetransferrinreseptoren anvendt i stedet for GUS som endogen kontroll. Foroverprimeren for transferrinreseptoren ZC40269 (SEQ ID NO: 148) og reversprimeren ZC40269 (SEQ ID NO: 149) ble anvendt i en konsentrasjon på 300 nM. Transferrinreseptor-proben ZC40298 (SEQ ID NO: 150) ble anvendt i PCR i en konsentrasjon på 100 nM og var merket i 5-enden med det fluorescerende rapportørfargestoff VIC (PE Applied Biosystems), og i 3'-enden med et fluorescerende, lysblokkerende fargestoff (TAMRA) (PE Applied Biosystems). Resultatene for muse-GUS og transferrinreseptoren fungerer også som endogen kontroll og tillater normalisering av zcytorl 7-, OSMRbeta- og zcytorl 71iglig-mRNA-ekspresjonsresultatene som observeres i analyseprøvene.
For konvensjonell, semi-kvantitativ RT-PCR ble primere utformet ved anvendelse av primerutformingsprogramvaren "Primer Express" (PE Applied Biosystems). Primerne for muse-zcytorl 7 gir et produkt på 276 basepar og er som følger: foroverprimeren ZC43140 (SEQ ID NO: 151) og reversprimeren ZC43139 (SEQ ID NO: 152). Primerne for muse-OSMRbeta gir et produkt på 575 basepar og er som følger: foroverprimeren ZC41608 (SEQ ID NO: 153) og reversprimeren ZC41609 (SEQ ID NO: 154). Primerne for muse-zcytorl71ig gir et produkt på 657 bp og er som følger: foroverprimeren ZC41502 (SEQ ID NO: 155) og reversprimeren ZC41500 (SEQ ID NO: 156).
C. Fremgangsmåter for sanntids- kvantitativ RT- PCR og konvensjonell, semikvantitativ RT- PCR
Det relative nivå av zcytorl7-, OSMRbeta- og zcytorl 71ig-mRNA ble bestemt ved å analysere prøver av total-RNA ved anvendelse av ettrinns-RT-PCR-fremgangsmåten (PE Applied Biosystems). Total-RNA fra zcytorl7- og OSMRbeta-transfekterte BAF-celler (menneske) eller BHK-celler (mus) ble isolert ved standardfremgangsmåter og anvendt for fremstilling av en standardkurve som ble benyttet for kvantifisering av zcytorl 7- og OSMRbeta. Kurven bestod av 10 gangers seriefortynninger i området fra 100 til 0,01 ng/ul, hvor hvert punkt på standardkurven ble analysert i triplikat. For zcytorl 71ig ble på tilsvarende måte RNA fra aktiverte CD4<+->T-celler (som tidligere er vist å danne zcytorl 71ig) anvendt for fremstilling av en standardkurve i det samme området fra 100 til 0,01 ng/ul. Total-RNA fra humane celler eller museceller ble analysert i triplikat for transkripsjonsnivået av zcytorl 7, OSMRbeta og zcytorl 71ig fra enten menneske eller mus og for ett av følgende endogene kontrollgener: rRNA, GUS eller transferrinreseptor. I et totalvolum på 10 ul ble hver RNA-prøve behandlet ved en ettrinns-RT-PCR-reaksjon som inneholdt: ca. 50-100 ng total-RNA i en ferdigblandet 2 x hovedblanding som inneholdt et internt kontrollfargestoff (ROX) (karboksy-x-rhodamin) og
"Thermo-Start"-DNA-polymerase (Abgene, Surrey, Storbritannia); egnede primere for genet av interesse (se delene A og B i det foreliggende eksempel); den tilhørende probe (se delene A og B for konsentrasjoner); "Superscripf-reverstranskriptase (50 U/ul) (PE Applied Biosystems); og et egnet volum av RNase-fritt vann. PCR-betingelsene var som følger: et innledende revers-transkripsjons(RT)trinn med én syklus bestående av 48 °C i 30 minutter, fulgt av et "Thermo-Start"-enzymaktiveringstrinn med én syklus bestående av 95 °C i 10 minutter, fulgt av 40 amplifiseringssykluser bestående av 95 °C i 15 sekunder og 60 °C i 1 minutt. Det relative nivå av zcytorl 7-, OSMRbeta- og zcytorl 71ig-RNA ble bestemt ved anvendelse av standardkurve-fremgangsmåten beskrevet av produsenten, PE Biosystems (User Bulletin #2: ABI Prism 7700 Sequence Detection System, Relative Quantitation of Gene Expression, 11. desember 1997).
Målingene for rRNA, GUS eller transferrinreseptor ble anvendt for å normalisere nivået for genet av interesse.
De semikvantitative RT-PCR-reaksjonene benyttet "Superscript One-Step RT-PCR System with Platinum Taq" (Invitrogen, Carlsbad, CA). Hver reaksjon på 25 ul inneholdt følgende: 12,5 ul 2 x reaksjonsbuffer, 0,5 |il (20 pmol/(il) foroverprimer, 0,5 ul (20 pmol/|il) reversprimer, 0,4 ul RT/Taq-polymeraseblanding, 5 ul "Rediload"-gelladningsbuffer (Invitrogen), 5,1 ul RNase-fritt vann og 1,0 ul total-RNA (100 ng/ul). Amplifikasjonen ble utført som følger: én syklus bestående av 45 °C i 30 minutter, fulgt av 35-38 sykluser bestående av 94 °C i 20 sekunder, varierende hybridiseringstemperatur (se tabell 7 nedenfor) i 20 sekunder og 72 °C i 45 sekunder, og så avsluttet med et forlengelsestrinn bestående av 72 °C i 5 minutter. 8-10 ul av PCR-reaksjonsproduktet ble fraksjonert ved standard agarosegelelektroforese i en 2 % agarosegel.
D. Isolering av RNA fra undergrupper av PBMC fra menneske og mus og fra cellelinjer
Blod ble tappet fra flere anonyme donorer, og mononukleære celler fra perifert blod (BBMC) ble isolert ved anvendelse av standard Ficoll-grandientmetodologi. Monocyttene ble så isolert ved anvendelse av Monocyte Isolation Kit og Magnetic Cell Separation System (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Monocyttene ble så utsådd i 24-brønners plater med ultralav adherens i endotoksinfritt medium. De ble enten ikke stimulert eller behandlet med rekombinant, humant IFNg (R&D Systems, Inc.) ved 10 ng/ml. Celler ble oppsamlet etter 24 og 48 timer. På tilsvarende måte ble CD4<+->og CD8<+->T-celler isolert fra PBMC ved anvendelse av anti-CD4-eller anti-CD8-magnetkuler fra Miltenyi Biotec. Cellene ble så aktivert i 4 eller 16 timer i vevsdyrkningsskåler belagt med 0,5 ug/ml anti-CD3-antistoff i medium som inneholdt 5 ng/ml anti-CD28-antistoff. NK-celler ble også isolert fra PBMC ved anvendelse av Miltenyis anti-CD56-belagte magnetiske kuler. Noen av NK-cellene ble oppsamlet ved tid null for RNA, mens resten ble utsådd i medium som inneholdt forbolmyristatacetat (PMA) (5 ng/ml) og ionomycin (0,5Hg/ml) i 24 timer. I tillegg ble flere humane monocyttlignende cellelinjer, U937, THP-1 og HL-60, oppdyrket i enten hvilende eller aktivert tilstand. U937-celler ble aktivert over natten med PMA (10 ng/ml). HL-60 ble aktivert over natten med PMA (10 ng/ml) eller i 72 og 96 timer med IFNg (10 ng/ml) for å styre dem ned en monocyttdifferensieringsvei. THP-l-cellene ble aktivert over natten med en kombinasjon av LPS (10 ng/ml) og IFNg (10 mg/ml). RNA ble fremstilt fra alle primærceller ved anvendelse av "RNeasy Midiprep"-sett (Qiagen, Valencia, CA) ifølge produsentens instruksjoner. Rester av DNA ble fjernet ved anvendelse av settet "DNA-Free"
(Ambion, Inc., Austin, TX). RNA-konsentrasjonen ble bestemt ved anvendelse av standard spektrofotometri, og RNA-kvaliteten ble bestemt ved anvendelse av Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA).
Muse-T-celle-RNA ble oppsamlet ved anvendelse av en rekke fremgangsmåter som er vel kjent innen faget. Primære CD4<+->og CD8<+->T-celler ble isolert fra milt fra C57B1/6-mus ved anvendelse av antistoffbelagte, magnetiske kuler og Magnetic Cell Separation System fra Miltenyi Biotec. CD4<+->og CD8<+->T-cellene ble så aktivert ved å dyrke cellene i 24-brønners plater belagt med anti-CD3-antistoff (500 ng/ml) i medium som inneholdt anti-CD28-antistoff i en konsentrasjon på 5 ug/ml. Cellene ble høstet for isolering av RNA etter 0,4 og 16 timer. På tilsvarende måte ble CD4<+->T-celler isolert og så dirigert mot en Thl- eller Th2-fenotype ved anvendelse av følgende fremgangsmåte. Siden C57Bl/6-T-celler allerede er forskjøvet i Thl-retning, var alt som var nødvendig å aktivere cellene i 6 timer med 0,5 ug/ml PMA og 10 ng/ml ionomycin. Forskyvningen mot "Th2" ble oppnådd ved å utså naive CD4<+->T-celler med 2,5 ng/ml anti-CD28,10 ng/ml mIL-2 (R&D Systems, Inc.) og 25 ng/ml mIL-4 (R&D Systems) i skåler belagt med 0,5 |ig/ml anti-CD3. Etter 2 dager i kultur ble cellene resuspendert i medium som inneholdt 10 ng/ml mIL-2 (R&D Systems) og 25 ng/ml mIL-4. Cellene ble dyrket i ytterligere 3 dager og så aktivert med PMA og ionomycin i 6 timer.
Ytterligere et sett med T-celler forskjøvet mot Thl eller Th2 ble fremstilt ved anvendelse av den T-cellereseptortransgene cellelinje DOl 1.10. Alle cellene ble utsådd i skåler belagt med anti-CD3 og anti-CD28. "Thl "-cellene ble utsådd i medium som inneholdt mIL-12 (1 ng/ml) og anti-IL-4 (10 ng/ml). "Th2"-cellene ble utsådd i medium som inneholdt mIL-4 (10 ng/ml) og anti-IFNg (10 ng/ml). Etter 24 timer ble alle kulturer gitt mIL-2 (10 ng/ml). Etter ytterligere 2 dager ble mediet på cellene byttet, nytt medium som inneholdt de ovenfor nevnte cytokiner, ble tilsatt, og cellene ble dyrket i ytterligere 4 dager før høsting.
Alt muse-T-celle-RNA ble fremstilt ved anvendelse av "RNeasy Midiprep"-sett (Qiagen), og kontaminerende DNA ble fjernet ved anvendelse av settet "DNA-Free" fra Ambion.
E. Isolering av RNA fra musemodeller for pankreatitt og irritabel tarmsykdom
For induksjon av en tilstand som ligner på irritabel tarmsykdom (IBD) hos mennesket, ble hybridmusestammen C57B16/129S6F1 anvendt. Musene ble inndelt i fire
grupper med gjennomsnittlig seks mus pr. gruppe. Gruppe 1 ble ikke gitt dekstransulfatnatrium (DSS) og ble avlivet på dag 14. Gruppe 2 ble gitt 2 % DSS i 2 dager før avlivning. Gruppe 3 ble gitt 2 % DSS i 7 dager før avlivning. Gruppe 4 ble gitt 2 % DSS i 7 dager, fikk så komme seg i 7 dager og ble avlivet på dag 14. På avlivningsdagen ble biter av den distale colon tatt ut og plassert i "RNAlater" (Ambion). Colonbitene ble homogenisert ved anvendelse av
standardteknikker, og RNA ble isolert ved anvendelse av "RNeasy Midiprep"-sett (Qiagen). Kontaminerende DNA ble fjernet ved "DNA-Free"-behandling (Ambion) ifølge produsentens instruksjoner.
I en annen undersøkelse ble akutt pankreatitt indusert i CD-l-hannmus ved injeksjon av cerulein. Musene ble inndelt i tre grupper (n = 8 mus/gruppe). Dyrene i gruppe 1 ble gitt sju intraperitoneale injeksjoner (én injeksjon pr. time) med bærestoff (saltvann) og så avlivet 12 og 24 timer etter første injeksjon. Gruppene 2 og 3 ble gitt sju intraperitoneale injeksjoner av cerulein (Sigma) (katalog nr. C-9026) i en dose på 50 |ig/kg/time i 6 timer (én injeksjon i timen). Gruppe 2 ble avlivet 12 timer etter første injeksjon og gruppe 3 24 timer etter første injeksjon. Bukspyttkjertelen ble tatt ut på avlivningstidspunktet og hurtig nedfrosset for RNA-isolering. Vevene ble homogenisert og RNA ble isolert ved anvendelse av Qiagen "RNeasy Midiprep"-sett.
I nok en undersøkelse ble zcytorl 71ig-transgene mus fremstilt og observert for fenotypiske endringer (se eksempel 41). Piloereksjon og hårtap ble observert hos mange av de transgene musene. Fire transgene mus ble avlivet, og hudprøver fra både normale og hårløse områder ble fjernet og hurtig nedfrosset for senere isolering av RNA. Hudbiter fra to ikke-transgene kontrollmus ble også oppsamlet. Hudprøvene ble homogenisert og så behandlet med proteinase K (Qiagen) (katalog nr. 19133) i 20 minutter ved 60 °C. RNA ble så isolert ved anvendelse av Qiagen "RNeasy Midiprep"-sett ifølge produsentens instruksjoner. Rester av DNA ble fjernet ved anvendelse av settet "DNA-Free" fra Ambion.
F. Resultater fra kvantitativ og semikvantitativ RT- PCR for human zcytorl 7.
OSMRbeta oe zc<y>torl71ig
Ekspresjonen av zcytorl 7 og OSMRbeta ble undersøkt ved kvantitativ RT-PCR i fire sett av primære humane monocytter som enten var i hviletil stand eller aktivert med IFNg i 24 eller 48 timer. Zcytorl7-ekspresjonen lå under deteksjonsnivået i de ikke-stimulerte cellene, men økte dramatisk etter 24 timers aktivering med IFNg og var høyest etter 48 timers aktivering. I alle tilfeller var nivået av OSMRbeta under deteksjonsgrensen. Zcytorl 71ig ble ikke analysert i disse prøvene.
I de primære T-cellene var zcytorl 7-nivået under deteksjonsgrensen, både i hvilende CD4<+->celler og hvilende CD8<+->celler. Etter 4 timers aktivering gikk imidlertid ekspresjonen av zcytorl 7 opp i begge gruppene og avtok så til et noe lavere nivå etter 16 timer. Nivået av OSMRbeta var under deteksjonsgrensen i disse prøvene. Zcytorl 71ig-ekspresjonen ble undersøkt ved anvendelse av semikvantitativ RT-PCR. Ingen ekspresjon ble påvist i de ikke-stimulerte CD4<+->og CD8<+->T-cellene. Etter 4 timers aktivering ble imidlertid zcytorl 71ig påvist i høyt nivå. Dette nivået avtok noe i 16-timersprøven.
Ekspresjonen av zcytorl 7 ble ikke undersøkt i NK-celler. OSMRb lå under påvisningsgrensen i disse prøvene. Ekspresjonen av zcytorl71ig var under deteksjonsgrensen i de hvilende NK-cellene, et svakt signal ble imidlertid oppnådd i de aktiverte NK-cellene, noe som antyder at disse cellene kan lage zcytorl 71ig under visse betingelser.
I de humane, monocyttlignende cellelinjene U937, THP-1 og HL-60 var OSMRbeta-ekspresjonen under deteksjonsgrensen i alle hvilende og aktiverte prøver, bortsett fra for aktiverte THP-1-prøver, hvor et svakt signal ble påvist. Zcytorl 7-ekspresjonen var høy, både i hvilende U937-celler og hvilende THP-1-celler, og viste en kraftig oppregulering etter aktivering. Av alle celletyper var ekspresjonen i U937-celler den høyeste. I HL-60 celler ble zcytorl 7 uttrykt i moderat nivå i de ikke-stimulerte cellene og avtok etter stimulering med PMA. Ekspresjonen av zcytorl 7 ble imidlertid dramatisk oppregulert i HL-60-celler ved stimulering med IFNg i 72 og 96 timer. Alle de humane ekspresjonsresultatene oppsummeres i tabell 8 nedenfor.
G. Resultater fra kvantitativ og semikvantitativ RT- PCR for zcytorl 7. OSMRbeta og zcytorl 71ig fra mus
Ekspresjonsnivået for zcytorl 7, OSMRbeta og zcytorl 71ig fra mus ble undersøkt i flere muse-T-cellepopulasjoner, og resultatene oppsummeres i tabell 9 nedenfor. Muse-zcytorl 7- ekspresjonen ble analysert ved semikvantitativ RT-PCR og vist å ha et lavt nivå i både hvilende og aktiverte primære CD4<+->T-celler. Ekspresjon av zcytorl7 ble påvist i hvilende CD8<+->T-celler og så ut til å avta etter aktivering med anti-CD3- og anti-CD28-antistoff, både etter 4 og 16 timer. OSMRbeta-ekspresjonen ble målt ved kvantitativ RT-PCR, og dette mRNA ble vist å uttrykkes i hvilende og aktiverte CD4<+->og CD8<+->T-celler. Ekspresjonen av OSMRbeta gikk opp etter 4 timers aktivering og vendte så tilbake til det ikke-stimulerte nivå etter 16 timer, både i CD4<+->og CD8<+->T-celler. Zcytorl71ig ble påvist ved kvantitativ RT-PCR og ble vist å uttrykkes i svært lavt nivå i ikke-stimulerte CD4<+->T-celler. Etter 4 timers aktivering var imidlertid ekspresjonen av zcytorl 71ig dramatisk oppregulert, og avtok så noe etter 16 timer. ICD8<+->T-celler kunne intet zcytorl71ig påvises i de ikke-stimulerte cellene. Det forelå en viss ekspresjon av zcytorl71ig etter 4 timer, men etter 16 timer hadde ekspresjonsnivået igjen falt under påvisningsgrensen.
I DOl 1.10-T-cellene ble zcytorl 7-ekspresj on påvist i de naive cellene og i cellene som var forskjøvet mot Th2, men ikke i cellene forskjøvet mot Thl. OSMRbeta-ekspresjonen hadde lavt nivå i de naive DOll.lO-cellene. Det var en dramatisk økning i ekspresjonsnivået for OSMRbeta i cellene forskjøvet mot Thl og en moderat økning i ekspresjonen i cellene forskjøvet mot Th2. Zcytorl 71ig-ekspresjonen i disse cellene ble vist å hovedsakelig foreligge i undergruppen forskjøvet mot Th2. Et lavt nivå ble påvist i Thl-undergruppen, og ingen ekspresjon ble påvist i de naive cellene. Disse resultatene er oppsummert i tabell 9 nedenfor.
I de primære CD4<+->T-cellene som var forskjøvet i enten Thl- eller Th2-retning, ble zcytorl7 ikke undersøkt. OSMRbeta-ekspresjon ble påvist i alle de tre prøvene, med høyest nivå funnet i Th2-prøven. På tilsvarende måte som for resultatene fra DOl 1.10 ble zcytorl71ig-ekspresjon påvist i høyt nivå i undergruppen forskjøvet mot Th2, mens en liten mengde ble påvist i Thl-undergruppen, og nivået var under påvisningsgrensen i de ikke-stimulerte cellene. Disse resultatene er oppsummert i tabell 9 nedenfor.
I de zcytorl 71ig-transgene hudprøvene ble ekspresjonsnivået for zcytorl 7, OSMRbeta og zcytorl 71ig bestemt ved anvendelse av kvantitativ RT-PCR. Zcytorl 7 ble vist å foreligge i alle prøver i grovt sett samme nivå. Det var et dramatisk høyere nivå av OSMRbeta-ekspresjon i de ikke-transgene kontrolldyrene enn i de transgene prøvene. Zcytorl 71ig-ekspresjonen var under deteksjonsgrensen i de ikke-transgene kontrolldyrene, med moderat til høyt ekspresjonsnivå i de transgene dyrene. Resultatene er oppsummert i tabell 10 nedenfor.
I et annet forsøk ble ekspresjonsnivået for zcytorl 7, OSMRbeta og zcytorl 71ig målt ved kvantitativ RT-PCR i bukspyttkjertel fra mus utsatt for akutt pankreatitt. Zcytorl7-ekspresjonen lå under deteksjonsgrensen i alle prøver. OSMRbeta-ekspresjon ble observert i lavt nivå i de normale kontrollprøvene (gruppe 1), men viste en kraftig oppregulering i 12-timersgruppen (gruppe 2) og et noe lavere nivå i 24-timersgruppen (gruppe 3). Zcytorl71ig-ekspresjonen lå under deteksjonsgrensen i kontrolldyrene, men viste høyt nivå i begge de ceruleininjiserte gruppene. Resultatene er oppsummert i tabell 11 nedenfor.
I et annet eksperiment ble ekspresjonsnivået for zcytorl 7 og OSMRbeta undersøkt i distal colon fra mus behandlet med DSS. I denne musemodellen for inflammatorisk tarmsykdom ble ekspresjonsnivået for begge gener bestemt ved kvantitativ RT-PCR og er oppsummert i tabell 12 nedenfor. Zcytorl 7-ekspresjonsnivået økte med omfanget av sykdommen, med lavt ekspresjonsnivå i de normale dyrene i gruppe 1 og økende mengder observert i grupper 2 og 3.1 gruppe 4-dyrene hadde zcytorl7-nivået vendt tilbake til et mer normalt nivå. I motsetning til zcytorl 7-ekspresj onen var nivået av OSMRbeta høyest i kontrolldyrene, og nivået avtok faktisk i alle de tre DSS-behandlede gruppene.
Eksempel 28
Vevsfordelingen av human zcytorl71ig- ekspresjon basert på RT- PCR- analvse av førstetråds-cDNA fra flere vev
Genekspresjonen av zcytorl 71ig ble undersøkt ved anvendelse av kommersielt tilgjengelige, normaliserte førstetråds-cDNA-sett fra flere vev (OriGene Technologies, Inc., Rockville, MD; BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA). Disse omfattet OriGene "Human Tissue Rapid-Scan Panel" (kat. nr. CHSCA-101), som inneholder 22 forskjellige vev og leukocytter fra benmarg og plasma) og BD Biosciences Clontech "Human Blood Fractions MTC Panel" (kat. nr. K1428-1, som inneholder ni forskjellige blodfraksjoner).
PCR-reaksj oner ble satt opp ved anvendelse av de zcytorl 71ig-spesifikke oligonukleotidprimerne ZC41458 (SEQ ID NO: 60) og ZC41457 (SEQ ID NO: 61), som gir et produkt på 139 bp, og ZC41459 (SEQ ID NO: 62) og ZC41460 (SEQ ID NO: 63), som gir et
produkt på 92 bp, Qiagen HotStarTaq-DNA-polymerase og buffer (Qiagen, Inc., Valencia, CA), dH20 og fargestoffet Rediload (Research Genetics, Inc., Huntsville, AL). PCR-betingelsene var som følger: en innledende syklus bestående av 15 minutters denaturering ved 95 °C, 35 sykluser bestående av 45 sekunders denaturering ved 95 °C, 1 minutts hybridisering ved 53 °C eller 56 °C og 1 minutt 15 sekunders primerforlengelse ved 72 °C, fulgt av en avsluttende forlengelses-reaksjon bestående av 7 minutter ved 72 °C. Reaksjonsproduktene ble fraksjonert ved elektroforese i en 2 % agarosegel (EM Science, Gibbstown, NJ) og synliggjort ved farging med etidiumbromid.
Et DNA-fragment med korrekt størrelse ble observert i følgende humane voksne vev ved anvendelse av OriGene "Human Tissue Rapid-Scan Panel": testis, plasmablod-leukocytter (PBL) og benmarg.
Et DNA-fragment med korrekt størrelse ble observert i følgende humane blodfraksjoner ved anvendelse av BD Biosciences Clontech "Human Blood Fractions MTC Panel": aktiverte mononukleære celler (B-celler, T-celler og monocytter), aktiverte CD8<+->celler (T-suppressorceller/cytotoksiske celler), aktiverte CD4<+->celler (T-hjelperceller/induserceller) og et svakt produkt fra hvilende aktiverte CD8<+->celler.
Eksempel 29
Kloning av den humane onkostatin M- reseptor
Onkostatin M-betareseptoren (OSMRbeta) er en cytokinreseptor av type I med strukturell likhet med IL12R-B2. Zcytorl7 har strukturell likhet med IL12R-B1. OSMRbeta og zcytorl 7 ble analysert for å undersøke hvorvidt de kunne interagere som subenheter i et cytokinsignalkompleks, og hvorvidt de sammen kunne fungere som en signaliserende reseptor eller løselig reseptorantagonist for zcytorl 71ig.
For isolering av OSMRbeta ble oligonukleotid-PCR-primerne ZC39982 (SEQ ID NO: 64) og ZC39983 (SEQ ID NO: 65) utformet for amplifisering av det fullengdekodende området fra den humane onkostatin M-beta-cDNA-sekvens (SEQ ID NO: 6) (Genbank-aksesjonsbetegnelse nr. U60805; Mosley, B., JBC, volum 271, bind 50, nummeret fra 20. desember 1996, s. 32635-32643.
PCR-reaksj onene ble kjørt på et sett av cDNA-bibliotektemplater ved anvendelse av en robust polymerase, Advantage II (Clontech, Palo Alto, CA) for påvisning av en kilde for cDNA. Det benyttede templat-DNA var fra amplifiserte cDNA-plasmidbiblioteker som hvert inneholdt 5 millioner uavhengige cDNA-kloner. Reaksjonsblandingene ble oppbygd ifølge produsentens instruksjoner ved anvendelse av 400 fmol/ul av hvert oligonukleotid og 2-20 ng/ul renset plasmidbibliotek-DNA som templat. cDNA-bibliotekene var avledet fra følgende humane vev og cellelinjer: føtal hjerne, glatt muskel fra prostata, benmarg, RPMI-11588, skjoldkjertel, WI-38, testis, stimulerte mononukleære celler fra perifert blod, stimulerte CD3<+->celler, THP-1, aktivert tonsill, HACAT og føtal lever. Reaksjonene ble utført i en programmerbar varmeblokk ved anvendelse av følgende betingelser: 30 sykluser bestående av 95 °C i 20 sekunder og 68 °C i 3 minutter. Etter at de 30 syklusene var fullført, ble en ekstra primerforlengelse bestående av 8 minutter ved 68 °C utført. PCR-produktene ble synliggjort ved agarosegelelektroforese i TAE i nærvær av etidiumbromid, fulgt av belysning med UV-lys. Det kraftigste produktet ble funnet med et cDNA-bibliotek fra glatt muskel fra prostata. PCR-reaksj onen som benyttet templat fra glatt muskel fra prostata og oligonukleotidene ZC39982 (SEQ ID NO: 64) og ZC39983 (SEQ ID NO: 65) ble gjentatt ved anvendelse av en mindre robust, varmestabil DNA-polymerase, "turboPFu" (Stratagene, La Jolla, CA) med høyere fidelitet. 30 amplifiseringssykluser ble utført med følgende betingelser: denaturering ved 94 °C i 30 sekunder, hybridisering ved 63 °C i 45 sekunder og primerforlengelse ved 72 °C i 3,5 minutter. Et produkt bestående av ett enkelt bånd ble gelrenset i en 0,8 % agarosegel i TAE.
Dette DNA ble så amplifisert på nytt ved anvendelse av primerne ZC39980 (SEQ ID NO: 66) og ZC39981 (SEQ ID NO: 67), som var utformet slik at de omfattet restriksjonsenzymgjenkjennings-sekvenser for å tillate kloning av dette cDNA inn i en pattedyrekspresj onsvektor.
PCR-reaksj onen ble utført ved anvendelse av "turboPFu" og det rensede PCR-produkt i 15 sykluser bestående av 95 °C i 1 minutt, 64 °C i 1 minutt 20 sekunder og 72 °C i 4,5 minutter. Produktet ble så kuttet med EcoRI og Xhol (Invitrogen, Carlsbad, CA) og gelrenset som beskrevet ovenfor. En pattedyrekspresj onsvektor, pZ7Nx, ble forberedt ved kutting med EcoRI og Xhol, og PCR-produktet ble ligert inn i denne vektor og elektroporert inn i E. coli-DHlOb-celler. Flere bakteriekolonier ble isolert og sekvensert. Én klon var korrekt, bortsett fra en enkelt ikke-konservativ mutasjon. For å endre denne basen for erholdelse av den forventede sekvens ble et oligonukleotid som omfattet mutasjonen og et Pstl-restriksjonssete i nabostilling anvendt i en PCR-reaksjon med "turboPFu", og det tidligere sekvenserte pZP7Nx-h-onkostatin M-R-plasmid som templat. Det PCR-amplifiserte DNA ble kuttet med Pstl og Xhol og klonet tilbake i pZP7Nx-h-onkostatin M-R-plasmidet i stedet for Pstl/XhoI-fragmentet som inneholdt den uønskede mutasjon. Dette nye plasmid ble sekvensert over det nyamplifiserte Pstl- til Xhol-området for å bekrefte korreksjonen og for å sikre at ingen nye feil hadde oppstått i amplifiseringsprosessen. Denne analysen bekreftet en sekvens som stemte med den forventede sekvens over det kodende området. Sekvensen er vist i SEQ ID NO: 6, og den tilsvarende aminosyresekvens er vist i SEQ ID NO: 7.
Eksempel 30
Konstruksjoner for fremstilling av en human zcytorl7/ onkostatin M- reseptorCOSMRbeta')-heterodimer
Et system for konstruksjon, ekspresjon og rensing av slike løselige heterodimere reseptorer er kjent innen faget og er blitt tilpasset reseptorparet human onkostatin M-reseptor (OSMRbeta) og human zcytorl7. For denne konstruksjonen er polynukleotidet for den løselige reseptor for OSMRbeta vist i SEQ ID NO: 68 og det tilsvarende polypeptid i SEQ ID NO: 69, og polynukleotidet for den løselige reseptor for human zcytorl7 er vist i SEQ ID NO: 70 og det tilsvarende polypeptid i SEQ ID NO: 71.
For konstruksjon av en cellelinje som uttrykker den utskilte, løselige hzcytorl7/human OSMRbeta-heterodimer ble en konstruksjon fremstilt på en slik måte at den resulterende heterodimere, løselige reseptor omfatter det ekstracellulære domenet fra human OSMRbeta fusjonert til tungkjeden fra IgG-gammal (Fc4) (SEQ ID NO: 37) med en Glu-Glu-merkelapp (SEQ ID NO: 35) i C-enden, mens det ekstracellulære domenet fra zcytorl 7 var fusjonert til Fc4 (SEQ ID NO: 37) med en His-merkelapp (SEQ ID NO: 72) i C-enden. For både hzcytorl7-armen og den humane OSMRbeta-arm av heterodimeren ble en Gly-Ser-avstandsgiver bestående av 12 aminosyrer (SEQ ID NO: 73) innført mellom reseptorens ekstracellulære område og N-enden av Fc4.
A. Konstruksjon av human løselig OSMRbeta/ Fc4- CEE
For konstruksjon av den humane løselige OSMRbeta/Fc4-CEE-del av heterodimeren ble den ekstracellulære del av human OSMRbeta isolert ved anvendelse av PCR med oligonukleotidene ZC14063 (SEQ ID NO: 48) og ZC41557 (SEQ ID NO: 74) under PCR-reaksj onsbetingelser som følger: 30 sykluser bestående av 95 °C i 60 sekunder, 57 °C i 30 sekunder og 72 °C i 100 sekunder, og 72 °C i 7 minutter. PCR-produktene ble renset ved anvendelse av gelekstraksjonssettet "QIAquick" (Qiagen), kuttet med EcoRI og Bglll (Boehringer Mannheim), fraksjonert ved gelelektroforese og renset ved å anvende et QIAquick-gelekstraksjonssett (Qiagen).
Ekspresjonskassetten, plasmidryggraden og Fc4-GluGlu-merkelappdelen i kimæren inngikk i en plasmidvektor som tidligere var fremstilt i laboratoriet. Plasmidvektoren ble kuttet med EcoRI og BamHI (Boehringer Mannheim), separert ved gelelektroforese og renset ved anvendelse av et QIAquick-gelekstraksjonssett (Qiagen). De kuttede og rensede fragmentene av human OSMRbeta- og Fc4-CEE-holdig plasmid ble ligert sammen ved anvendelse av T4-DNA-ligase (Life Technologies, Bethesda, MD) ved anvendelse av standard ligerings-fremgangsmåter. Minipreparater av det resulterende produkt ble analysert for et EcoRI/Smal-innskudd med korrekt størrelse (772 bp) for løselig OSMRbeta, og positive minipreparater ble sekvensert for å bekrefte at PCR-reaksj onen hadde foregått på nøyaktig vis. Denne nye plasmid-konstruksjonen betegnes pZP9-ONCOMR-Fc4CEE.
B. Konstruksjon av human løselig zcvtorl7/ Fc4- CHIS
For konstruksjon av zcytorl 7Fc4-CHIS-delen av heterodimeren ble den ekstracellulære del av human zcytorl 7 isolert ved kutting av et plasmid som allerede inneholdt løselig zcytorl 7-Fc4-reseptor. Plasmidet ble først kuttet med Sali (New England Biolabs, Beverly, MA), hvoretter reaksjonsblandingen ble ekstrahert med fenol-kloroform og utfelt med etanol. Det kuttede DNA ble så behandlet med T4-DNA-polymerase (Boehringer Mannheim) for innfylling av 5'-overhengene dannet ved kuttingen med Sali, noe som gjorde DNA-endene butte, hvoretter reaksjonsblandingen ble ekstrahert med fenol-kloroform og utfelt med etanol. Det buttendede DNA ble så kuttet med Bglll for kutting i 3'-enden, fraksjonert ved gelelektroforese og renset ved anvendelse av et QIAquick-gelekstraksjonssett (Qiagen) ifølge produsentens instruksjoner. Det resulterende DNA-fragment, som inneholdt sekvensen som koder for det ekstracellulære domenet i zcytorl 7, ble ligert inn i en Fc4-CHIS-merkelappholdig pattedyrekspresjonsvektor fremstilt som følger.
Ekspresjonskassetten, plasmidryggraden og Fc4-CHIS-merkelappdelen i kimæren inngikk i en plasmidvektor som tidligere var fremstilt i laboratoriet. Denne plasmidvektoren ble kuttet med EcoRI (Boehringer Mannheim), hvoretter reaksjonsblandingen ble ekstrahert med fenol-kloroform og utfelt med etanol. Det kuttede DNA ble så behandlet med T4-DNA-polymerase (Boehringer Mannheim) for innfylling av 5'-overhengene dannet ved kuttingen med EcoRI, noe som gjorde DNA-endene butte, hvoretter reaksjonsblandingen ble ekstrahert med fenol-kloroform og utfelt med etanol. Det buttendede DNA ble så kuttet med BamHI (Boehringer Mannheim) for kutting i 3'-enden, fraksjonert ved gelelektroforese og renset ved anvendelse av et QIAquick-gelekstraksjonssett (Qiagen). De kuttede og rensede fragmentene av plasmid inneholdende human zcytorl 7 og Fc4-CHIS ble ligert sammen ved anvendelse av T4-DNA-ligase (Life Technologies, Bethesda, MD) ved anvendelse av standard ligeringsfremgangs-måter.
Minipreparater av det resulterende plasmid ble analysert ved PCR og anvendelse av den zcytorl 7-spesifikke "sense"-primer ZC29180 (SEQ ID NO: 22) og den Fc4-spesifikke "antisense"-primer ZC29232 (SEQ ID NO: 75) med følgende PCR-reaksjonsbetingelser: 30 sykluser bestående av 94 °C i 60 sekunder, 68 °C i 150 sekunder og 72 °C i 7 minutter. En forventet produktstørrelse på 848 bp bekreftet korrekt oppbygging av plasmidet, som ble betegnet pZEM228hzcytorl7/Fc4HIS.
En andre zcytorl 7-Fc4-konstruksjon ble fremstilt for anvendelse for fremstilling av homodimerprotein fra COS-celler. Kort beskrevet ble det kodende området for fullengde-fusjonsprotein isolert ved kutting av et plasmid som allerede inneholdt løselig zcytorl 7-Fc4-reseptor med Sali (Boehringer Mannheim). Reaksjonsblandingen ble ekstrahert med fenol-kloroform og utfelt med etanol. Det kuttede DNA ble så behandlet med T4-DNA-polymerase (Boehringer Mannheim) for innfylling av 5'-overhengene dannet ved kuttingen med EcoRI, noe som gjorde DNA-endene butte, hvoretter reaksjonsblandingen ble ekstrahert med fenol-kloroform og utfelt med etanol. Det buttendede DNA ble så kuttet med Noti (Boehringer Mannheim) for kutting i 3'-enden, fraksjonert ved gelelektroforese og renset ved anvendelse av et QIAquick-gelekstraksjonssett (Qiagen). En pattedyrekspresjonsvektor som inneholdt en CMV-styrt ekspresjonskassett, ble kuttet for dannelse av kompatible ender, og de to fragmentene ble ligert sammen. Minipreparater av det resulterende produkt ble analysert ved PCR og anvendelse av den vektorspesifikke "sense"-primer ZC14063 (SEQ ID NO: 48) og den zcytorl7-spesifikke "antisense"-primer ZC27899 (SEQ ID NO: 19) med følgende PCR-reaksj onsbeting-elser: 30 sykluser bestående av 94 °C i 30 sekunder, 64 °C i 30 sekunder og 70 °C i 90 sekunder, fulgt av 72 °C i 7 minutter. En forventet produktstørrelse på ca. 1000 bp bekreftet korrekt oppbygging av plasmidet, som ble betegnet pZP7NX-hzcytorl7-Fc4. Dette plasmid ble så transfektert inn i COS-celler ved anvendelse av "Lipofectamin" (Gibco BRL) ifølge produsentens instruksjoner. Cellene ble kondisjonert i 60 timer i DMEM + 5 % FBS (Gibco BRL), hvoretter proteinet ble renset over en protein G-Sepharose 4B-kromatografikolonne og gjort tilgjengelig for in v/Yro-bioanalyser, f.eks. analysene som beskrives heri.
C. Fremstilling av en human zcvtorl7/ onkostatin M- reseptor (" OSMRbeta)
Cirka 16 ng av hver av pZP9-ONCOMR-Fc4CEE og pZEM228hzcytorl7/Fc4HIS ble kotransfektert inn i BHK-570-celler (ATCC nr. CRL 1034) ved anvendelse av "Lipofectamin" (Gibco BRL) ifølge produsentens instruksjoner. De transfekterte cellene ble selektert i 10 dager i DMEM + 5 % FBS (Gibco BRL) tilsatt 0,5 mg/ml G418 (Gibco BRL) og 250 nM metotreksat (MTX) (Sigma, St. Louis, MO) i 10 dager.
Den resulterende fraksjon med dobbeltselekterte celler ble anvendt for fremstilling av det heterodimere protein. Tre cellefabrikker (Nunc, Danmark) fra denne fraksjonen ble anvendt for fremstilling av 101 serumfritt, kondisjonert medium. Dette kondisjonerte medium ble sendt gjennom en 1 ml protein A-kolonne og eluert i (10) fraksjoner på 750 ul. Fire av disse fraksjonene som ble funnet å ha den høyeste konsentrasjon, ble slått sammen og dialysert (dialysegrenseverdi 10 kDa) mot PBS. Det ønskede heterodimere, løselige zcytorl7/0SMRbeta-proteinkompleks ble isolert fra de andre bestanddeler i mediet ved å sende porsjonen gjennom en nikkelkolonne og vaske kolonnen med forskjellige konsentrasjoner av imidazol. Det løselige zcytorl 7/OSMRbeta-protein ble eluert ved intermediære imidazolkonsentrasjoner, mens zcytorl 7/Fc4His-homodimer ble eluert ved høyere konsentrasjoner av imidazol.
Eksempel 31
Vevsfordelin<g>en av human zcytorl 7 i sett med vev ved anvendelse av Northern- blott og PCR
A. Vevsfordelingen av human zcytorl 7 ved anvendelse av Northern- blott
"Human Multiple Tissue Northern Blots (Human 12-lane MTN Blot I and II", og "Human Immune System MTN Blot II; Human Endocrine MTN, human Fetal MTN Blot II, human Multiple Tissue Array)" (Clontech) samt hjemmelagde blott som inneholdt forskjellige vev, ble analysert for å bestemme vevsfordelingen av human zcytorl 7-ekspresj on. De
hjemmelagde blottene omfattet mRNA fra følgende vev og cellelinjer: SK-Hep-1-celler, THP1-celler, binyrekjertel (Clontech), nyre (Clontech), lever (Clontech og Invitrogen), ryggmarg (Clontech), testis (Clontech), humane CD4<+->T-celler, humane CD8<+->T-celler, humane CD19<+->T-celler, human blandet lymfocyttreaksjon (MLR), THP1-cellelinjen (ATCC nr. TIB-202), U937-cellelinjen, muselymfoblastcellelinjen p388Dl (ATCC nr. CCL-46), med eller uten stimulering med ionomycin og den humane embryonale lungecellelinje WI-38 (ATCC nr. CRL-2221), med eller uten stimulering med ionomycin.
En PCR-avledet probe for zcytorl7 (SEQ ID NO: 4) på ca. 500 bp ble amplifisert ved anvendelse av oligonukleotidene FC28575 (SEQ ID NO: 77) og ZC27899 (SEQ ID NO: 19) som primere. PCR-ampliifseringen ble utført som følger: 30 sykluser bestående av 94 °C i 1 minutt, 65 °C i 1 minutt og 72 °C i 1 minutt, fulgt av inkubering ved 72 °C i 7 minutter. PCR-produktet ble synliggjort ved agarosegelelektroforese, og PCR-produktet på ca. 500 bp ble gelrenset som beskrevet heri. Proben ble radioaktivt merket ved anvendelse av "PRIME IT II" Random Primer Labeling-sett (Stratagene) ifølge produsentens instruksjoner. Proben ble renset ved anvendelse av en "NUCTRAP"-stempelkolonne (Stratagene). "EXPRESSHYB"-løsning (Clontech) ble anvendt for prehybridisering og som hybridiseringsløsning for Northern-blottene. Prehybridiseringen ble utført ved 68 °C i 2 timer. Hybridiseringen fant sted over natten ved 68 °C med ca. 1,5 x IO<6>cpm/ml merket probe. Blottene ble vasket tre ganger ved romtemperatur i 2 x SSC, 0,05 % SDS, fulgt av én gangs vask i 10 minutter i 2 x SSC, 0,1 % SDS ved 50 °C. Flere svake bånd kunne observeres etter flere dagers eksponering. Et transkript på ca. 9 kb ble sett i luftrør, skjelettmuskel og brissel, et transkript på ca. 2 kb ble observert i PBL, HPV, U937-celler og THP-1-celler, og et transkript på ca. 1,2 kb ble observert i placenta, benmarg og skjoldkjertel, samt HPV og U937-celler. I alle vev opplistet ovenfor var signalintensiteten svak. Det så ut til å være lite ekspresjon i de fleste normale vev, noe som antyder at zcytorl 7-ekspresj on kan være
avhengig av aktivering av cellen eller vevene som reseptoren uttrykkes i.
B. Vevsfordeling i sett av vev ved anvendelse av PCR
Et sett av cDNA fra humane vev ble analysert for zcytorl7-ekspresjon ved anvendelse av PCR. Settet var fremstilt i laboratoriet og inneholdt 94 Marathon-cDNA og cDNA-prøver fra forskjellige normale og kreftholdige humane vev og cellelinjer, som vist i tabell 13 nedenfor. Disse cDNA kom fra hjemmelagde biblioteker eller Marathon-cDNA fra hjemmelagde RNA-preparater, Clontech-RNA eller Invitrogen-RNA. Marathon-cDNA ble fremstilt ved anvendelse av settet "Marathon-Ready (Clontech, Palo Alto, CA) og QC-analysert med klatrinprimerne ZC21195 (SEQ ID NO: 78) og ZC21196 (SEQ ID NO: 79) og så fortynnet, basert på intensiteten av klatrinbåndet. For å sikre kvaliteten av prøvene i settet ble tre analyser for kvalitetskontroll (QC) utført: (1) for å anslå kvaliteten av RNA anvendt for bibliotekene ble de hjemmelagde cDNA analysert for gjennomsnittlig innskuddsstørrelse ved PCR med vektoroligonukleotider som var spesifikke for vektorsekvensene i et gitt cDNA-bibliotek; (2) standardisering av konsentrasjonen av cDNA i prøvene i settet ble oppnådd ved anvendelse av standard PCR-fremgangsmåter for amplifisering av fullengde-alfa-tubulin- eller G3PDH-cDNA ved anvendelse av et 5<*->vektoroligonukleotid, ZC14063 (SEQ ID NO: 48) og 3<*->alfa-tubulinspesifikk oligonukleotidprimer ZC17574 (SEQ ID NO: 49) eller 3'-G3PDH-spesifikk oligonukleotidprimer ZC 17600 (SEQ ID NO: 50); og (3) en prøve ble sendt for sekvensering for å undersøke mulig kontaminering med ribosomalt DNA eller mitokondrielt DNA. Settet ble satt opp i 96-brønners format som omfattet et humant genomisk DNA (Clontech, Palo Alto, CA) som positiv kontrollprøve. Hver brønn inneholdt ca. 0,2-100 pg/ul cDNA. PCR-reaksj onene ble satt opp ved anvendelse av oligonukleotidene ZC26358 (SEQ ID NO: 80) og ZC26359 (SEQ ID NO: 81), TaKaRa "Ex Taq" (TAKARA Shuzo Co., LTD, Biomedicals Group, Japan), og farge-oppløsningen Rediload (Research Genetics, Inc., Huntsville, AL). Amplifiseringen ble utført som følger: 1 syklus bestående av 94 °C i 2 minutter, 35 sykluser bestående av 94 °C i 30 sekunder, 66,3 °C i 30 sekunder og 72 °C i 30 sekunder, fulgt av 1 syklus med primerforlengelse ved 72 °C i 5 minutter. Cirka 10 ul av PCR-reaksjonsproduktet ble fraksjonert ved standard agarosegelelektroforese i en 4 % agarosegel. Den forventede DNA-fragmentstørrelse ble observert i reaksjonene fra lymfeknute, prostata, skjoldkjertel, HPV (prostataepitel), HPVS (selektert prostataepitel), lungetumor og uterustumor, samt i reaksjonen med genomisk DNA.
DNA-fragmentet fra prostatavev (to prøver), HPV (prostataepitel), HPVS (utvalgt prostataepitel) og genomisk DNA ble kuttet ut og renset ved anvendelse av et gelekstraksjonssett (Qiagen, Chatsworth, CA) ifølge produsentens instruksjoner. Fragmentene ble bekreftet ved sekvensering for å vise at de faktisk var zcytorl7.
C. Ekspresionsanalvse for zcvtorU ved PCR og Northern- blotting
Annotering av celletyper og vekstbetingelser som påvirker ekspresjonen av reseptoren er et nyttig middel for å utlede reseptorens funksjon og forutsi en kilde for liganden. For dette formål ble et bredt utvalg av vev og celletyper undersøkt ved PCR. Den varmestabile polymerasen "Advantage II" (Clontech, La Jolla, CA) ble anvendt med oligonukleotidprimerne ZC29180 (SEQ ID NO: 22) og ZC29179 (SEQ ID NO: 82) 1 og 1-10 ng av de forskjellige
cDNA-templatene som er opplistet nedenfor for 30 amplifiseringssykluser bestående av 94 °C i 30 sekunder, 66 °C i 20 sekunder og 68 °C i 1 minutt 30 sekunder. Etter dette ble 20 % av hver reaksjonsblanding fraksjonert i 0,8 % agarosegeler med TAE og etidiumbromid og synliggjort med UV-lys. Prøvene ble så gitt poeng, basert på båndintensiteten. Se tabell 14 nedenfor.
Av de kraftige positive PCR-signalene var to fra de humane monocyttcellelinjene U937ogTHPl.
Disse to cellelinjene ble sammen med en prostataepitellinje utvalgt for videre analyse ved Northern-blotting. Tidligere forsøk på å synliggjøre et transkript ved Northern-analyse ved anvendelse av mRNA fra forskjellige vev ga svake og diffuse signaler i et overraskende stort størrelsesområde fra 7 til 10 kb, noe som gjorde det vanskelig å tolke disse resultatene. En denaturerende formaldehyd/MOPS/0,8 % agarosegel ble fremstilt (RNA Methodologies, Farrell, RE Academic Press), og 2 ug poly A<+->mRNA ble fraksjonert for hver prøve ved siden av en RNA-stige (Life Technologies, Bethesda, MD). Gelen ble så overført til Hybond-nylon (Amersham, Buckinghamshire, UK), UV-kryssbundet og hybridisert i ExpressHyb-løsning (Clontech, LaJolla, CA) ved 68 °C over natten ved anvendelse av en probe mot human zcytorl7, fremstilt ved PCR med oligonukleotidene ZC28575 (SEQ ID NO: 77) og ZC27899 (SEQ ID NO: 19) og merket med et Megaprime 32p<->sett (Amersham). Northern-blottet ble så vasket med 0,2 x SSC + 0,1 % SDS ved 65 °C i 15 minutter og eksponert for røntgenfilm i 7 dager med intensiveringsfolie. Et fremtredende bånd på 8 kb ble observert i sporene for prostataepitel og U937, mens et svakere bånd forelå i THP1-sporet.
For optimalisering av cDNA som ble anvendt som hybridiseirngsprobe, ble fire forskjellige områder fra human fullengde-zcytorl7-sekvens amplifisert ved PCR, merket og hybridisert som beskrevet ovenfor til Southern-blott inneholdende genomisk DNA og DNA fra amplifisert cDNA-bibliotek. De fire probene, som heri betegnes prober A-D, ble amplifisert ved anvendelse av følgende primerpar: (A) ZC28575 (SEQ ID NO: 77), ZC27899 (SEQ ID NO: 19); (B) ZC27895 (SEQ ID NO: 20), ZC28917 (SEQ ID NO: 83); (C) ZC28916 (SEQ ID NO: 84), ZC28918 (SEQ ID NO: 85); og (D) ZC28916 (SEQ ID NO: 84), ZC29122 (SEQ ID NO: 21). Humant genomisk DNA ble sammen med amplifiserte cDNA-biblioteker som var vist å inneholde zcytorl 7 ved PCR, kuttet med EcoRI og Xhol for frigjøring av innskuddene og fraksjonert 1 TAE/0,8 % agarosegeler i duplikat, denaturert med 0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl, blottet til Hybond, UV-kryssbundet og hybridisert med en av probene ovenfor. Probe B ble vist å gi minst uspesifikk binding og kraftigst signal. Probe B ble således anvendt for alle påfølgende hybridi-seringer.
Siden THP1 -cellene er en utmerket modell for sirkulerende monocytter og uttrykte zcytorl 7 i lavt nivå, behandlet vi dem med en rekke forbindelser i et forsøk på å forhøye ekspresjonen av zcytorl 7. Cellene ble dyrket til en tetthet på 2 x 10<5>celler/ml, vasket og resuspendert i forskjellige stimuleringsmedier, dyrket i 4 eller 30 timer og høstet for fremstilling av RNA. Hvert medium ble tilsatt et av følgende medikamenter eller cytokinpar: LPS, 2 pg/ml (Sigma Chemicals, St. Louis, MO), hTNFa, 2 ng/ml (R&D Systems, Minneapolis, MN), hGM-CSF, 2 ng/ml (R&D Systems, Minneapolis, MN), hlFNy, 50 ng/ml (R&D Systems, Minneapolis, MN), hMCSF, 1 ng/ml (R&D Systems, Minneapolis, MN), hIL6,1 ng/ml (R&D Systems, Minneapolis, MN), hILl (5,2 ng/ml (R&D Systems, Minneapolis, MN), hlFNy, 50 ng/ml + hIL4, 0,5 ng/ml (R&D Systems, Minneapolis, MN), hlFNy, 50 ng/ml + hILlO, 1 ng/ml (R&D Systems, Minneapolis, MN), PMA, 10 ng/ml (Calbiochem, SanDiego, CA) og en ubehandlet kontroll. Etter fullført dyrkning ble total-RNA fremstilt ved anvendelse av et RNAeasy Midi-sett (Qiagen, Valencia, CA). Poly A<+->RNA ble isolert fra total-RNA ved anvendelse av et MPG-sett (CPG, Lincoln Park, NJ). 2 ug poly A<+->RNA fra hver dyrkning ble fraksjonert i formaldehyd/MOPS/- agarosegeler, overført til nylon og UV-kryssbundet som beskrevet ovenfor. Disse Northern-blottene ble så hybridisert som ovenfor til probe B ved 68 °C over natten, vasket ved høy stringens med 0,2 x SSC, 0,1 % SDS ved 65 °C, eksponert for røntgenfilm over natten og så eksponert for fosforfolier for kvantifisering av signalet. Et dominerende mRNA på 8 kb, så vel som et relativt svakere bånd på 2,8 kb, ble observert i alle spor. 20 gangers økning av mengden zcytorl7-mRNA ble observert i RNA fra celler behandlet med hlFNy i 30 timer, denne virkningen ble noe dempet med samtidig behandling med IL4. En mindre økning på tre ganger i mRNA-nivået ble observert for RNA fra celler behandlet med LPS, TNFcc og GM-CSF, mens MCSF, IL6 og ILip hadde ingen virkning på zcytorl7-mRNA-nivået. Disse resultatene antyder en rolle for zcytorl 7-reseptoren og dens ligand i monocytWrnakrofagbiologi og, implisitt, i en rekke sykdomsprosesser som disse cellene deltar i.
Eksempel 32
Vevsfordeling av human zcytorl 71ig i sett av vev ved anvendelse av Northern- blotting og PCR
Et fragment for cDNA for human zcytorl 71ig ble erholdt ved anvendelse av PCR med de genspesifikke primerne: "Sense"-primer ZC41438 (SEQ ID NO: 93) og "antisense"-primer ZC41437 (SEQ ID NO: 94) og cDNA for human zcytorl71ig (SEQ ID NO: 90) som templat. Dette fragment ble renset ved anvendelse av standard fremgangsmåter og ca. 25 ng merket med<32>P-alfa-dCTP ved anvendelse av tilfeldig priming-merkingssettet Prime-It RmT (Stratagene), og hybridisert i Ultrahyb (Ambion) og anvendt for eksponering av Biomax-filmer/intensiveringsfolier ifølge produsentens anbefalinger i hvert tilfelle. Nye, ubrukte blott, innbefattet Clontech-blottene humant 12-spors MTN-blott, MTN II-blott fra human hjerne og MTN-blott IV fra human hjerne, MTN II-blott fra humant immunsystem og human MTE-matrise II fra Clontech ble hybridisert over natten ved 42 °C ifølge Ambions ultrahyb-fremgangsmåte. Uspesifikk radioaktivitet ble vasket bort ved anvendelse av 1 SSC/0,5 % SDS ved 55 °C. De positive blottene omfattet det humane 12-spors MTN-blott (Clontech). Av de 12 undersøkte vevene var kun placenta positiv for et transkript på ca. 1,2 KB transkript.
Eksempel 33
Konstruksjon av pattedvrekspresionsvektorer som uttrykker human zcvtorl71ig- CEE
A. Konstruksjon av zcvtorl71ig- CEE/ pZMP21
Et ekspresjonsplasmid som inneholdt hele eller en del av et polynukleotid som kodet for zcytorl71ig-CEE (SEQ ID NO: 95) ble konstruert ved homolog rekombinasjon. Plasmidet ble betegnet zcytorl 71ig-CEE/pZMP21.
Konstruksjonen av zcytorl 71ig-CEE/pZMP21 ble oppnådd ved fremstilling av et zcytorl 71ig-CEE-fragment ved anvendelse av PCR-amplifisering. DNA-templatet som ble anvendt for fremstilling av zcytorl 7Lig-CEE-fragmentet, var zcytorl 71ig/pZP7nx. Primerne som ble anvendt for fremstilling av zcytorl 71ig-CEE-fragmentet, var: (1) ZC41607 (SEQ ID NO: 97)
("sense"-sekvens), som fra 5'- til 3'-ende omfattet: 28 bp av flankerende vektorsekvens (5<1>for innskuddet) og 21 bp som tilsvarte 5'-sekvensen av zcytorl 7lig; og (2) ZC41605 (SEQ ID NO: 98) ("antisense"-sekvens), som fra 5'- til 3'-ende omfattet: 37 bp av flankerende vektorsekvens (3' for innskuddet), 3 bp av et stoppkodon, 21 bp som kodet for en C-terminal EE-merkelapp og 21 bp som tilsvarte 3'-enden av zcytorl71ig-sekvensen. Fragmentet som ble dannet ved PCR-amplifiseringen ovenfor, var en kopi av templatet zcytorl 71ig med innføring av en C-terminal EE-merkelapp, noe som ga sluttproduktet zcytorl 71ig-CEE.
PCR-reaksj onene ble utført som følger: Til et sluttvolum på 100 ul ble følgende komponenter sammenblandet: 10 ul 10 x Taq-polymerasereaksjonsbuffer med 15 mM MgCl (Gibco), 1 ul Taq-DNA-polymerase (5 enheter/ul, Gibco), 3 ul 10 mM dNTP, 78 ul dH20, 3 fil av en 20 pmol/ul lagerløsning av primer ZC41607 (SEQ ID NO: 97), 3 ul av en 20 pmol/ul lagerløsning av primer ZC41605 (SEQ ID NO: 98) og 2 ul av en 0,13 |ig/ul lagerløsning av zcytorl 71ig-templat-DNA. 50 ul mineralolje ble tilsatt til blandingen. Reaksjonsblandingen ble oppvarmet til 94 °C i 5 minutter, fulgt av 35 sykluser bestående av 94 °C i 1 minutt, 55 °C i 2 minutter og 72 °C i 3 minutter, fulgt av en 10 minutters primerforlengelse ved 72 °C og inkubering ved 4 °C inntil reaksjonsblandingen ble oppsamlet.
Plasmid pZMP21 ble restriksjonskuttet med enzymet Bglll, renset med "QiAQuick PCR Purification Kit" (Qiagen) ved anvendelse av en mikrosentirfugebasert fremgangsmåte og anvendt for rekombinasjon med PCR-fragmentet. Plasmid pZMP21 ble fremstilt fra pZMP20, som i sin tur var fremstilt fra pZP9 (deponert hos American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 201102209 og betegnet nr. 98668) med genetiske gjærelementer fra pRS316 (deponert hos American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209 og betegnet nr. 77145), et IRES-element fra poliovirus og det ekstracellulære domenet fra CD8, avkortet ved karboksylterminale ende av transmembrandomenet. PZMP21 er en pattedyrekspresj onsvektor som inneholdt en ekspresjonskassett med MPSV-promoteren, signalpeptid og intron fra immunglobulin, flere restriksjonsseter for innsetting av kodende sekvenser, et stoppkodon og en terminator fra humant veksthormon. Plasmidet har også et E. co/i-replikasjonsorigo, en ekspresjonsenhet for en pattedyrseleksjons-markør med en SV40-promoter, -enhancer og -replikasjonsorigo, et DHFR-gen, SV40-terminatoren samt URA3- og CEN-ARS-sekvensene som er nødvendige for seleksjon og replikasjon i S. cerevisiae.
50 ul kompetente gjærceller ( S. cerevisiae) ble blandet med 100 ng kuttet plasmid og 5 ul av den tidligere beskrevne PCR-blanding og overført til en 0,2 cm elektroporeringskyvette. Blandingen av gjær og DNA ble gitt en elektrisk puls ved 0,75 kV (5 kV/cm), oo ohm, 25 uF. Hver kyvette ble tilsatt 600 ul 1,2 M sorbitol, og gjærcellene ble utsådd i én porsjon på
100 ul og én porsjon på 300 fal på to URA-D-skåler og inkubert ved 30 °C. Etter ca. 72 timer ble Ura<+->gjærtransformantene fra en enkelt skål resuspendert i 1 ml H2O og sentrifugert i kort tid for nedsentrifugering av gjærcellene. Nedsentrifugerte celler ble resuspendert i 500 ul lyseringsbuffer (2 % Triton X-100, 1 % SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA). 500 ul lyseringsblanding ble overført til et Eppendorf-rør som inneholdt 30\ x\ syrevaskede glasskuler med 600 um diameter og 300 ul fenol-kloroform og vorteksbehandlet med 1 minutts mellomrom to eller tre ganger, og så sentrifugert i 5 minutter i en Eppendorf-sentrifuge ved maksimal hastighet. 300 ul av vannfasen ble overført til et nytt rør, og DNA ble utfelt med 600 ul 100 % etanol (EtOH), fulgt av sentrifugering i 10 minutter ved 4 °C. Nedsentrifugert DNA ble så vasket med 500 ul 70 % EtOH, fulgt av sentrifugering i 1 minutt ved 4 °C. Nedsentrifugert DNA ble resuspendert i 30 ml H2O.
Transformasjon av elektrokompetente E. cø//'-celler (MC 1061) ble utført med 5 ul av gjær-DNA-preparatet og 50 ul MC 1061-celler. Cellene ble gitt en elektrisk puls ved 2,0 kV, 25 uF og 400 ohm (Q). Etter elektroporeringen ble 600 ul SOC (2 % Bacto-Trypton (Difco, Detroit, MI), 0,5 % gjærekstrakt (Difco), 10 mM NaCl, 2,5 mM KC1,10 mM MgCl2,10 mM MgS04,20 mM glukose) tilsatt. De elektroporerte E. co/i-cellene ble utsådd i én porsjon på 200 ul og én porsjon på 50 (il på to LB/AMP-skåler (LB-medium (Lennox), 1,8 % Bacto-agar (Difco), 100 mg/ml ampicillin). Platene ble inkubert opp ned i ca. 24 timer ved 37 °C. Tre ampicillinresistente kolonier ble tilfeldig utvalgt, og innskuddet ble sekvensert. Plasmid-DNA ble isolert i stor skala fra én klon med bekreftet sekvens ved anvendelse av Qiagen Maxi-sett (Qiagen) ifølge produsentens instruksjoner.
B. Konstruksjon av muse- zcvtorl71ig(' m')- CEE/ pZMP21
Et ekspresjonsplasmid som inneholdt hele polynukleotidet som koder for muse-zcytorl 71ig-CEE (SEQ ID NO: 104 og SEQ ID NO: 105), ble også konstruert ved homolog rekombinasjon ved anvendelse av fremgangsmåten beskrevet i eksempel 33A ovenfor. De benyttede primere var: (1) ZC41643 (SEQ ID NO: 106) (forover, 5' til 3' "sense") med et 28 bp overlapp med vektoren 5' for innsettingspunktet, og 21 bp tilsvarende 5'-enden av zcytorl 7-lig(m); og (2) ZC41641 (SEQ ID NO: 107) (revers, 5' til 3' "antisense") med et vektoroverlapp på 37 bp 3' for innsettingspunktet, et stoppkodon på 3 bp, 21 bp som koder for en C-terminal EE-merkelapp på 21 bp, og 24 bp tilsvarende 3'-enden av zcytorl71ig(m)-CEE. Plasmidet ble betegnet zcytorl 71ig(m)-CEE/pZMP21. Polynukleotidsekvensen for zcytorl 71ig(m)-CEO er vist i SEQ ID NO: 104, og den tilsvarende polypeptidsekvens er vist i SEQ ID NO: 105.
Eksempel 34
Transfeksjon og ekspresjon av cytorl71ig- CEE- polvpeptider
A. Ekspresjon av human zcvtorl71ig- CEE/ pZMP21 i 293T- celler
ZCytorl71ig-CEE ble forbigående uttrykt i 293T-celler (Stanford University School of Medicine, Stanford, CA, ATCC (SD-3515)) for fremstilling av renset protein. Dagen før transfeksjonen ble 293T-celler utsådd med 6,5 x IO4 celler/cm<2>i 30 T162-dyrkningsflasker med et totalvolum på 30 ml dyrkningsmedium (SL7V4 + 5 % FBS + 1 % Pen/Strep) pr. flaske. Cellene ble inkubert i 24 timer ved 37 °C.
En DNA/liposomblanding ble fremstilt som følger: To 50 ml koniske rør ble fylt med 25 ml transfeksjonsmedium (SL7V4 + 1 % Pen/Strep), og 1,13 mg zcytorl 71ig-CEE/pZMP21 (eksempel 33) ble tilsatt til hvert rør. Et separat sett bestående av to 50 ml koniske rør ble fylt med 22 ml transfeksjonsmedium (se ovenfor), og 3 ml liposomer ("Lipofectamin", Gibco) ble tilsatt til hvert rør. For hvert sett med rør ble ett rør DNA tilsatt til ett rør med liposomer, og DNA/liposomblandingen ble inkubert i 30 minutter. De to 50 ml koniske rørene som inneholdt DNA/liposomblandinger, ble slått sammen (ca. 100 ml), og 300 ml transfeksjonsmedium ble tilsatt.
Mediet ble dekantert fra de 30 flaskene med 293T-celler, cellene ble vasket 1 x med ca. 15 ml PBS, og 12,5 ml fortynnet DNA/liposom blanding ble tilsatt til hver flaske. Flaskene ble inkubert i 3 timer ved 37 °C. Etter inkuberingen ble 25 ml dyrkningsmedium (se ovenfor) tilsatt til hver T162-flaske. Transfeksjonsmediet ble høstet etter ca. 96 timer og ble anvendt for proteinrensing (eksempel 35).
B. Ekspresjon av human zcytorl71ig- CEE/ pZMP21 i BHK- celler
Fullengde-zcytorl71ig-protein ble fremstilt i BHK-celler transfektert med zcytorl 71ig-CEE/pZMP21 (se eksempel 33 ovenfor). BHK-570-celler (ATCC CRL-10314) ble utsådd i T75-vevsdyrkningsflasker og inkubert til ca. 50-70 % konfluens ved 37 °C, 5 % CO2, i dyrkningsmedium (SL7V4, 5 % FBS, 1 % pen/strep). Cellene ble så transfektert med zcytorl71ig-CEE/pZMP21 ved liposomformidlet transfeksjon (ved anvendelse av "Lipofectamin", Life Technologies) i serumfritt (SF) medium (SL7V4). Plasmidet (16 jxg) ble fortynnet i 1,5 ml rør til et sluttvolum på 640 ul med SF-medium. 35 ul av lipidblandingen ble blandet med 605 ul SF-medium, og den resulterende blanding ble inkubert i ca. 15 minutter ved romtemperatur. 5 ml SF-medium ble så tilsatt til DNA:lipidblandingen. Cellene ble vasket én gang med 10 ml PBS, PBS ble fjernet ved dekantering, og DNA:lipidblandingen ble tilsatt. Cellene ble inkubert ved 37 °C i 5 timer, hvoretter 15 ml medium (SL7V4, 5 % FBS, 1 % pen/strep) ble tilsatt til hver skål. Skålene ble inkubert ved 37 °C over natten, og DNA:lipid:mediumblandingen ble erstattet med seleksjonsmedium (SL7V4, 5 % FBS, 1 % pen/strep, 1 uM metotreksat) neste dag. Cirka 10 dager etter transfeksjonen ble metotreksatresistente kolonier fra T75-transfeksjonsflasken trypsinbehandlet, og cellene ble slått sammen og utsådd i en T-162-flaske og overført til dyrkning i stor skala.
C. Eks<p>resjon av muse- zcvtorl71ig- CEE( mVpZMP21 i 293T- celler
Muse-zytorl71ig(m)-CEE ble forbigående uttrykt i 293T-celler, som beskrevet i eksempel 34A, og dyrkningsmediet ble anvendt for proteinrensing (eksempel 35).
Eksempel 35
Rensing av zcvtorl71ig- CEE fra 293T- celler
Dersom ikke annet er angitt, ble alle operasjoner utført ved 4 °C. Følgende fremgangsmåte ble anvendt for rensing av zcytorl71ig fra mus og menneske med C-terminale Glu-Glu(EE)-merkelapper (SEQ ID NO: 103). Kondisjonert medium fra 293T-celler som uttrykte zcytorl 71ig-CEE (eksempel 34), ble renset. Totalkonsentrasjonen av målprotein i det kondisjonerte medium ble bestemt ved SDS-PAGE og Western-blott-analyse med anti-EE-antistoff.
En 5,5 ml kolonne med anti-EE Poros 50 A (PE BioSystems, Framingham, MA)
(fremstilt som beskrevet nedenfor) ble overført til en Waters AP-1,1 cm x 7 cm glasskolonne (Waters, Milford, MA). Kolonnen ble pakket ved gjennomstrømning og ekvilibrert i en BioCad Sprint (PE BioSystems, Framingham, MA) med fosfatbufret saltvann (PBS), pH 7,4. Det kondisjonerte medium ble justert med NaCl til 0,3 M, og pH ble justert til 7,2. Det kondisjonerte medium ble så påsatt kolonnen over natten ved en gjennomstrømningshastighet på ca. 3 ml/minutt. Kolonnen ble vasket med 10 kolonnevolumer (CV) PBS, pH 7,4, og igjen vasket med 3CV 5 x Sigma-PBS, pH 7,4. Kolonnen ble trinnvis eluert med 0,5 M acetat, 0,5 M NaCl, pH 2,5, ved en gjennomstrømningshastighet på 3 ml/minutt. Fraksjonsrørene inneholdt 1 ml Tris-base (uten pH-justering) for umiddelbar nøytralisering av eluatet. Kolonnen ble igjen vasket med 2 CV 5 x Sigma-PBS, pH 7,4, for nøytralisering av kolonnen, og så ekvilibrert med PBS (pH 7,4). Fraksjoner på 2 ml ble oppsamlet over hele elueringen, og absorbansen ved 280 og 215 nm ble målt, ubundet materiale og vaskeporsjonene ble også oppsamlet og analysert. Topp-fraksjonene eluert med 5 x PBS og med lav pH ble analysert for målproteinet ved SDS-PAGE med sølvfarging og Western-blotting med anti-EE som primærantistoff og antimuse-HRP-konjugat som sekundærantistoff. Fraksjonene av interesse eluert med lav pH ble slått sammen og oppkonsentrert fra 38 ml til 0,8 ml ved anvendelse av en sentrifugeringskonsentrator med en membran med grenseverdi 5000 Dalton (Millipore, Bedford, MA) ifølge produsentens instruksjoner.
For separasjon av zcytorl 71ig-CEE fra aggregert materiale og eventuelle kontaminerende proteiner ble de sammenslåtte, oppkonsentrerte fraksjonene fraksjonert ved størrelseseksklusjonskromatografi på en 1,6 x 60 cm (120 ml) Superdex 75-kolonne (Pharmacia, Piscataway, NJ) ekvilibrert og påsatt prøve i PBS ved en gjennomstrømningshastighet på 1,0 ml/minutt ved anvendelse av BioCad Sprint-instrumentet. Fraksjoner på 3 ml ble oppsamlet over hele kromatografiforløpet, og absorbansen ved 280 og 215 nM ble målt. Toppfraksj onene blekarakterisert vedSDS-PAGE med sølvfarging, og kun de reneste fraksjonene ble slått sammen. Dette materialet representerte renset zcytorl 71ig-CEE- protein.
På Western-blottede, Coomassie Blue-fargede og sølvfargede SDS-PAGE-geler var zcytorl 71ig-CEE ett av hovedbåndene. Proteinkonsentrasjonen av det rensede materialet ble bestemt med BCA-analyse (Pierce, Rockford, IL), og proteinet ble fordelt i porsjoner og lagret ved -80 °C ifølge standardfremgangsmåter.
For fremstilling av Poros A50-anti-EE ble et kolonnevolum på 65 ml av Poros A50 (PE Biosystems) vasket med 100 ml vann og deretter med 0,1 M trietanolamin, pH 8,2 (TEA, ICN, Aurora, Ohio), 1 M Na2S04, pH 8,8, tilsatt 0,02 % natriumazid ved anvendelse av en vakuumkolbe påsatt en filterenhet. En løsning av monoklonalt anti-EE-antistoff i en konsentrasjon på 2 mg/ml i et volum på 300 ml ble blandet med det vaskede resin i et volum på 250 ml. Etter inkubering over natten ved romtemperatur ble ubundet antistoff fjernet ved vask av resinet med 5 volumer 200 mM TEA, 1 M Na2S04, pH 8,8, tilsatt 0,02 % natriumazid, som beskrevet ovenfor. Resinet ble resuspendert i 2 volumer TEA, 1 M Na2S04, pH 8,8, tilsatt 0,02 % natriumazid og overført til en egnet beholder. 3 ml 25 mg/ml (68 mM) disuksinimidylsuberat (i DMSO levert av Pierce, Rockford, IL) ble tilsatt, og løsningen ble inkubert i 3 timer ved romtemperatur. Uspesifikke seter i resinet ble så blokkert ved inkubering i 10 minutter ved romtemperatur med 5 volumer 20 mM etanolamin (Sigma, St. Louis, MO) i 200 mM TEA, pH 8,8, ved anvendelse av vakuumkolben og filterenheten. Resinet ble vasket med PBS, pH 7,4, fulgt av 0,1 M glysin, pH 3, og så nøytralisert med 10 x PBS. Etter vask med destillert vann ble det ferdigkoblede anti-EE-Poros-A 50-resin lagret ved 4 °C i 20 % etanol.
Eksempel 36
N- terminal sekvensering av zcytorl 71ig fra menneske og mus
A. N- terminal sekvensering av zcytorl 71ig fra menneske
Standard automatisert N-terminal polypeptidsekvensering (Edman-degradering) ble utført ved anvendelse av reagenser fra Applied Biosystems. N-terminal sekvensanalyse ble utført i et "Model 494 Protein Sequencer System" (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). Dataanalysen ble utført med "Model 61 OA Data Analysis System for Protein Sequencing", versjon 2.1 (Applied Biosystems).
En prøve med renset human zcytorl71ig-CEE (eksempel 35) ble erholdt. Prøven ble påsatt et forbehandlet glassfiberfilter for N-terminal sekvensering. Glassfiberfilteret var forberedt ved behandling med "Biobrene".
N-terminal sekvensanalyse av det utskilte humane zcytorl 71ig-polypeptid bekreftet ikke det forventede kløyvingssetet for signalsekvensen, men viste at det modne protein starter ved aminosyrerest 27 (Leu) i SEQ ID NO: 2 for den humane zcytorl71ig-forløpersekvens.
B. N- terminal sekvensering av muse- zcytorl71ig
Standard automatisert N-terminal polypeptidsekvensering (Edman-degradering) ble utført ved anvendelse av reagenser fra Applied Biosystems. N-terminal sekvensanalyse ble utført i et "Model 494 Protein Sequencer System" (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). Dataanalysen ble utført med "Model 61 OA Data Analysis System for Protein Sequencing", versjon 2.1 (Applied Biosystems).
En prøve med renset muse-zcytorl71ig-CEE ble levert, innfanget på protein G-Sepharose/anti-EE-kuler (eksempel 35). Kulene ble plassert i reduserende SDS-PAGE-prøvebuffer og behandlet på et kokende vannbad før fraksjonering ved SDS-PAGE ved anvendelse av et Novex SDS-PAGE-system (4-12 % bis-Tris-MES-NuPage, Invitrogen) ifølge produsentens instruksjoner. Materialet i gelen ble elektrooverført til en Novex PVDF-membran og farget med Coomassie Blue (Sigma, St. Louis, MO) ved anvendelse av standardfremgangsmåter. Tilsvarende anti-EE-Western-blott ble fremstilt for identifisering av zcytorl 71ig-båndet for N-terminal proteinsekvensering. Muse-anti-EE-IgG-HRP-konjugert antistoff ble fremstilt i laboratoriet.
N-terminal sekvensanalyse av det utskilte muse-zcytorl71ig-polypeptid bekreftet det forventede kløyvingssetet for signalsekvensen og viste at det modne protein starter ved aminosyre 31 (Ala) ifølge SEQ ID NO: 11 og SEQ ID NO: 91 for muse-zcytorl71ig-forløpersekvensen.
Eksempel 37
Cos- cellebindingsanalyse
En bindingsanalyse ble anvendt for å analysere binding av zcytorl 71ig til reseptorer som omfatter zcytorl 7-reseptor, f.eks. zcytorl 7-reseptoren eller reseptorheterodimerer og -trimerer som omfatter zcytorl 7-reseptor (f.eks. zcytorl 7/OSMR, zcytorl 7/WSX-l eller zcytorl7/OSMR/WSX-l, eller andre klasse I-cytokinreseptorsubenheter). Zcytorl7-reseptorplasmid-DNA ble transfektert inn i COS-celler, og de transfekterte COS-cellene ble anvendt for å anslå binding av zcytorl 71ig til reseptorer som omfatter zcytorl 7-reseptor, som beskrevet nedenfor.
A. Transfeksjon av COS- celler
COS-celletransfeksjonen ble utført som følger: Sammenbland 800 ng
reseptorplasmid-DNA i følgende kombinasjoner: pzp7pX/zcytorl7 alene; pZp7Z/WSX-l alene; pZp7NX/OSMR alene; pZp7pX/zcytorl7 + pZp7NX/OSMR; pZp7pX/zcytorl 7 + pZp7Z/WSX-1; pZp7NX/OSMR + pZp7Z/WSX-l; pZp7pX/zcytorl7 + pZp7NX/OSMR + pZp7Z/WSX-l) og 4 ul "Lipofectamin" i 80 ul serumfritt DMEM-medium (55 mg natriumpyruvat, 146 mg L-glutamin, 5 mg transferrin, 2,5 mg insulin, 1 ul selen og 5 mg fetuin i 500 ml DMEM), inkuber ved romtemperatur i 30 minutter og tilsett så 320 ul serumfritt DMEM-medium. Tilsett denne blandingen på 400 ul til 2 x IO<5>COS-celler/brønn utsådd i 12-brønners vevsdyrkningsplater (fibronektinbelagte) og inkuber i 5 timer ved 37 °C. Tilsett 500 ul 20 % FBS-DMEM-medium (100 ml FBS, 55 mg natriumpyruvat og 146 mg L-glutamin i 500 ml DMEM) og inkuber over natten.
B. Bindingsanalyse
Bindingsanalysen ble utført som følger: Medium ble fjernet fra cellene med PBS + 0,1 % BSA, hvoretter cellene ble blokkert i 60 minutter med samme løsning. Cellene ble så inkubert i 1 time i PBS + 0,1 % BSA med 1,0 ug/ml renset zcytorl71ig-CEE-protein. Cellene ble så vasket med PBS + 0,1 % BSA og inkubert i nok 1 time med 1:1000 fortynnet anti-GluGlu-antistoff fra mus. Igjen ble cellene vasket med PBS + 0,1 % BSA, og så inkubert i 1 time med 1:200 fortynnet HRP-konjugert antimuseantistoff fra geit.
Positiv binding ble påvist med fluoresceintyramidreagens fortynnet 1:50 i fortynningsbuffer (fra NEN-settet), inkubert i 4-6 minutter og vasket med PBS + 0,1 % BSA. Cellene ble fiksert i 15 minutter med 1,8 % formaldehyd i PBS og så vasket med PBS + 0,1 % BSA. Cellene ble konservert med Vectashield Mounting Media (Vector Labs Burlingame, CA) fortynnet 1:5 i PBS. Cellene ble synliggjort ved anvendelse av et FITC-filter i et fluorescensmikroskop.
Positiv binding ble påvist for celler transfektert med zcytorl 7 alene, zcytorl 7 + OSMRbeta, zcytorl7 + WSX-1 og zcytorl7 + OSMRbeta + WSX-1. Ingen binding ble påvist for celler transfektert med WSX-1 + OSMRbeta, med OSMRbeta alene eller med WSX-1 alene.
Eksempel 38
Muse- zcytorl 71ig aktiverer muse- zcytorl 71ig/ OSMRbeta- reseptor i luciferaseanalyse
A. Kloning av fullengdemuse- zcytorl7 og muse- OSMRbeta for ekspresjon
Et cDNA-bibliotek fra musetestis ble gjennomsøkt for en fullengdeklon av muse-zcytorl 7. Biblioteket ble utsådd med 65 500 cfu/skål på 24 LB + Amp-skåler. Koloniene ble overført til filtre ved anvendelse av Hybond N (Amersham-Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ) på i alt ca. 1,6 millioner kolonier. Filtrene ble merket med en varm nål for orientering og så denaturert i 6 minutter i 0,5 M NaOH og 1,5 M Tris-HCl, pH 7,22. Filtrene ble så nøytralisert i 1,5 M NaCl og 0,5 M Tris-HCl, pH 7,2, i 6 minutter. DNA ble bundet til filtrene ved anvendelse av et UV-kryssbindingsinstrument ("Stratalinker", Stratagene, La Jolla, CA) ved 1200 joules. Filtrene ble så inkubert over natten ved romtemperatur for tørking.
Neste dag ble filtrene forvasket ved 65 °C i forvaskingsbuffer bestående av 0,25 x SSC, 0,25 % SDS og 1 mM EDTA. Cellerester ble fjernet manuelt ved anvendelse av "Kimwipes" (Kimberly-Clark), og løsningen ble byttet tre ganger over et tidsrom på 1 time. Filtrene ble lufttørket og lagret ved romtemperatur inntil bruk. Filtrene ble så prehybridisert i ca. 3 timer ved 63 °C i 20 ml "ExpressHyb"-hybirdiseringsløsning (Clontech, Palo Alto, CA).
Probe B (eksempel 31) ble fremstilt ved PCR fra en human zcytorl 7-templat ved anvendelse av oligonukleotidprimerne FZC27895 (SEQ ID NO: 20) og ZC28917 (SEQ ID NO: 83), og ble radioaktivt merket med<32>P ved anvendelse av et kommersielt tilgjengelig sett (Megaprime DNA Labeling System; Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) ifølge produsentens instruksjoner. Proben ble renset ved anvendelse av en "Stratagene"-stempelkolonne
("NucTrap"-kolonne, Stratagene, La Jolla, CA). Proben ble denaturert ved 100 °C i 15 minutter og overført til "ExpressHyb". Filtrene ble hybridisert i 15 ml hybridiseringsløsning som inneholdt 1,6 x IO6 cpm/ml probe ved 63 °C over natten. Filtrene ble vasket ved 55 °C i 2 x SSC, 0,1 % SDS og 1 mM EDTA og eksponert for røntgenfilm ved -80 °C i 4,5 dager. Tretten positive kolonier ble plukket fra skålene som plugger og plassert i 1 ml LB + amp i 1,7 ml rør. Rørene ble inkubert ved 4 °C over natten. Disse 13 positive klonene gjennomgikk ytterligere to renserunder. Tertiærskålene ble dyrket ved 37 °C etter overføring av kolonier til filtre, og enkeltkolonier ble utvalgt og sendt til sekvensering. Tre av disse ble vist å inneholde sekvensen til museortologen av zcytorl 7.
I tillegg ble et PCR-produkt fremstilt ved anvendelse av CTLL-2-cDNA som templat og oligonukleotidene C38239 (SEQ ID NO: 108) og ZC38245 (SEQ ID NO: 109) som primere. CTLL-2 er en cytotoksisk T-lymfocyttcellelinje fra mus (ATCC nr. TIB-214). Denne PCR-reaksj onen ble utført som følger: 1 syklus bestående av 95 °C i 1 minutt, 30 sykluser bestående av 95 °C i 15 sekunder og 68 °C i 3 minutter, fulgt av inkubering ved 68 °C i 10 minutter og lagring ved 4 °C. I PCR-reaksj onen ble det anvendt ca. 0,5 ng cDNA, 20 pmol av hvert oligonukleotid og 1 ul Advantage II-polymeraseblanding (ClonTech). Cirka 6 % av PCR-produktet ble anvendt som templat i en ny PCR-reaksjon utført som ovenfor, bortsett fra at oligonukleotidene ZC38239 (SEQ ID NO: 108) og ZC38238 (SEQ ID NO: 110) ble benyttet. Denne PCR-reaksjonen ble utført som følger: 30 sykluser bestående av 94 °C i 45 sekunder, 65 °C i 45 sekunder og 72 °C i 1 minutt, fulgt av 72 °C i 7 minutter og lagring ved 10 °C. Mesteparten av PCR-reaksjonen ble påsatt en 1,0 % agarosegel, og hovedbåndet med størrelse ca. 360 bp ble kuttet ut, DNA-fragmentet ble eluert, og DNA-sekvensering ble utført.
Sekvensen til muse-zcytorl 7-polynukleotidet er vist i SEQ ID NO: 11 og den tilsvarende aminosyresekvens i SEQ ID NO: 112.1 tillegg er en avkortet, løselig form av muse-zcytorl 7-polynukleotidet vist i SEQ ID NO: 113 og den tilsvarende aminosyresekvens i SEQ ID NO: 114.
For erholdelse av fullengdemuse-OSMRbeta-cDNA ble 5'- og 3'-PCR-produkter isolert og sammenkoblet ved anvendelse av et internt BamHI-sete. PCR-primerne ble utformet ved anvendelse av nukleotidsekvensen i SEQ ID NO: 119 og omfattet seter for restriksjonsenzymene EcoRI og Xbal for kloningsformål. Den genomiske muse-OSMRbeta-nukleinsyresekvens er vist i SEQ ID NO: 119, hvori den kodende sekvens omfatter sekvensen fra nukleotid 780 til 3692, som koder for et muse-OSMRbetapolypeptid på 970 aminosyrer, som er vist i SEQ ID NO: 120. En degenerert nukleinsyresekvens som koder for polypeptidet ifølge SEQ ID NO: 120, er vist i SEQ ID NO: 121.
Et 5'-PCR-produkt ble fremstilt ved anvendelse av et hjemmelagd cDNA-bibliotek fra 3T3-L1 (differensierte museadipocytter) som templat og oligonukleotidene ZC41764 (SEQ ID NO: 115) og ZC41598 (SEQ ID NO: 116) som primere. Denne 5'-PCR-reaksjon ble utført som følger: 30 sykluser bestående av 95 °C i 45 sekunder, 55 °C i 45 sekunder og 72 °C i 1 minutt 30 sekunder, fulgt av 72 °C i 7 minutter og lagring ved 4 °C. I PCR- reaksjonen ble det anvendt ca. 3 ug plasmid fremstilt fra cDNA-biblioteket, 20 pmol av hvert oligonukleotid og 5 enheter iVo-DNA-polymerase (Roche). Cirka 90 % av 5<*->PCR-produktet ble kuttet med EcoRI og BamHI og gelrenset i en 1,0 % agarosegel. Båndet på ca. 1446 bp ble kuttet ut og anvendt for ligering (se nedenfor).
Et 3'-PCR-produkt ble fremstilt ved anvendelse av et hjemmelagd cDNA-bibliotek fra museplacenta som templat og oligonukleotidene ZC41948 (SEQ ID NO: 117) og ZC41766 (SEQ ID NO: 118) som primere. 3'-PCR-reaksjonen ble utført som følger: 30 sykluser bestående av 95 °C i 45 sekunder, 55 °C i 45 sekunder og 72 °C i 1 minutt 30 sekunder, fulgt av 72 °C i 7 minutter og lagring ved 4 °C. I PCR-reaksjonen ble det anvendt ca. 3 ug plasmid fremstilt fra cDNA-biblioteket, 20 pmol av hvert oligonukleotid og 5 enheter /Vø-DNA-olymerase (Roche). Cirka 90 % av 3'-PCR-produktet ble kuttet med BamHI og Xbal og gelrenset i en 1,0 % agarosegel. Båndet på ca. 2200 bp ble kuttet ut og anvendt for ligering sammen med 5'-PCR-produktet (beskrevet ovenfor) til ekspresjonsvektoren pZP-5Z kuttet med EcoRI og Xbal. Treveisligeringen ble utført med 5'-EcoRI til BamHI-fragment beskrevet ovenfor, 3'-BamHI til Xbal-fragment og ekspresjonsvektoren pZP-5Z kuttet med EcoRI og Xbal. Dette ga et pZP-5Z-plasmid som inneholdt fullengde-cDNA for muse-OSMRbeta (nukleotidene 780-3692 i SEQ ID NO: 119), betegnet pZP-5Z/OSMRbeta. Fullengdemuse-OSMRbeta-cDNA i pZP5Z/OSMRbeta har to aminosyreinnsettinger sammenlignet med SEQ ID NO: 120. Det foreligger en duplikasjon av aminosyren glysin i stilling 370 og en duplikasjon av aminosyren glutaminsyre i stilling 526. Plasmid pZP-5Z er en pattedyrekspresjonsvektor som inneholder en ekspresjonskassett med CMV-promoteren, flere restriksjonsseter for innsetting av kodende sekvenser og en terminator fra humant veksthormon. Plasmidet har også et E. co/z-replikasjonsorigo og en ekspresjonsenhet for en pattedyrseleksjonsmarkør som omfatter SV40-promoter, -enhancer og -replikasjonsorigo, et zeocinresistensgen og SV40-terminatoren.
De resulterende transformanter ble sekvensert for å bekrefte muse-OSMRbeta-cDNA-sekvensen.
B. Konstruksjon av cellelinjene BaF3/ KZ134/ zcytorl7m.
BaF3/ KZ134/ zcvtorl7m/ OSMRbeta- m. BHK/ KZ134/ zcvtorl7m oe BHK/ KZ134/ zcvtorl7m/ OSMRbeta- m
De stabile cellelinjene BaF3/KZ134 og BHK/KZ134 (eksempel 20) ble transfektert med et ekspresjonsplasmid som kodet for fullengdemuse-zcytorl7, pZP7P/zcytorl7m (eksempel 38A) for frembringelse av cellelinjene BaF3/KZl34/zcytorl 7m og BHK/KZ134/zcytorl 7m. Muse-OSMRbeta-ekspresjonsplasmidet pZP-5Z/OSMRbeta-m (eksempel 38A) ble så transfektert inn i disse cellene for dannelse av cellelinjene BaF3/KZl 34/zcytorl 7m/OSMRbeta-m og BHK/KZ134/zcytorl 7m/OSMRbeta-m. Fremgangsmåtene var som beskrevet i eksempel 4, bortsett fra at Baf3/KZl 34/zcytorl7m og BHK/KZ134/zcytorl 7m i tillegg til seleksjon med geneticin ble selektert med 2 ug/ml puromycin, mens BaD/KZl 34/zcytorl 7m/OSMRbeta-m og BHK/KZ134/zcytorl 7m/OSMRbeta-m i tillegg til geneticin ble selektert med 2 |ig/ml puromycin og 200 |ig/ml zeocin.
Kloner ble fortynnet, utsådd og selektert ved anvendelse av standardteknikker. Klonene ble analysert ved en luciferaseanalyse (se eksempel 20 ovenfor) ved anvendelse av kondisjonert medium inneholdende muse-zcytorl 71ig eller renset muse-zcytorl 71ig-protein (eksempel 35) som induser. Klonene med den høyeste luciferaserespons (via STAT-luciferase) og den laveste bakgrunn ble utvalgt. Stabilt transfekterte cellelinjer ble utvalgt.
C. Muse- zcytorl 71ig aktiverer muse- zcytorl 7- reseptor i
BaF3/ KZ134/ zcvtorl7m/ OSMRbeta- m eller BHK/ KZ134/ zcvtorl7m/ OSMRbeta-m- basert luciferaseanalyse
Cellelinjene ble utsådd for luciferaseanalyser som beskrevet i eksempel 20 ovenfor. STAT-aktivering av BaF3/KZl34/zcytorl7m-, BaF3/KZ134/zcytorl7m/OSMRbeta-m-, BHK/KZ134/zcytorl 7m- eller BHK/KZ134/zcytorl 7m/OSMRbeta-m-cellene ble anslått ved anvendelse av (1) kondisjonert medium fra BHK570-celler transfektert med human zcytorl71ig (eksempel 7); (2) kondisjonert medium fra BHK570-celler transfektert med muse-zcytorl71ig (eksempel 18); (3) renset muse-zcytorl71ig og human zcytorl 71ig (eksempel 35); og (4) mIL-3-fritt medium for måling av kontrollresponsen med medium alene. Luciferaseanalysene ble utført som beskrevet i eksempel 20.
Resultatene fra denne analysen bekrefter STAT-rapportørresponsen i FBaF3/KZl 34/zcytorl 7m/OSMRbeta-m- og BHK/KZ134/zcytorl 7m/OSMRbeta-m-cellene overfor muse-zcytorl 71ig ved sammenligning med enten BaF3/KZl 34/zcytorl 7m-cellene, BHK/KZ134/zcytorl 7m-cellene eller de ikke-transfekterte BaF3/KZ134- eller BHK/KZ134-kontrollcellene og viser at responsen formidles via muse-zcytor/OSMRbeta-reseptorene. Resultatene viser også at human zcytorl 71ig ikke aktiverer STAT-rapportøranalysen via musereseptorkomplekset.
Eksempel 39
Human zcytorl 71ig- binding til zcytorl 7 og zcvtorl 7/ OSMRbeta ved " flow"- cvtometri
Biotinylering av human zcytorl 7L ble utført som følger: 100 ul zcytorl 7 i en konsentrasjon på 5,26 mg/ml ble blandet med 30 ul 10 mg/ml EZ-link Sulfo-NHS-LC-biotin (Pierce, Rockford, IL) løst i dobbeltdestillert H2O. Løsningen ble inkubert på en vippemaskin i 30 minutter ved romtemperatur. Etter biotinyleringen ble løsningen dialysert mot PBS ved anvendelse av en Slide-A-Lyzer dialysekassett.
For å analysere bindingsegenskapene til human zcytorl 71ig overfor forskjellige reseptorkombinasjoner ble både BHK- og BAF3-celler transfektert med ekspresjonsplasmider ved anvendelse av standardteknikker som er vel kjent i faget. Disse plasmidene ble transfektert inn i begge cellelinjer i følgende kombinasjoner: zcytorl7 alene, OSMRbeta alene og både zcytorl7 og OSMRbeta. Transfeksjonen ble utført som beskrevet i detalj ovenfor. Ikke- transfekterte BHK- og BAF3-celler ble anvendt som kontroller. Cellene ble farget for FACS som følger: 2E5-celler ble farget med enten 2,0 ul, 100 ng/ml, 10 ng/ml, 1,0 ng/ml, 100 pg/ml, 10 pg/ml eller 1,0 pg/ml biotinylert zcytorl 7L eller uten tilsetning i 30 minutter på is i FACS-buffer (PBS + 2 % BSA + 2 % NHS (Gemini) + 2 % NGS). Cellene ble vasket 1,5 ganger og så farget med SA-PE (Jackson Immuno Laboratories) i en fortynning på 1:250 i 30 minutter på is. Cellene ble så vasket 1,5 ganger med FACS-buffer, resuspendert i FACS-buffer og analysert ved FACS i instrumentet BD FACSCaliber ved anvendelse av programvaren CellQuest (Becton Dickinson, Mountain View, CA).
Både BHK- og BAF3-cellene viste at zcytorl 71ig ble bundet til både zcytorl 7 alene og i kombinasjon med OSMRbeta, hvor bindingen til zcytorl7/OSMRbeta-heterodimeren var noe kraftigere. Ingen binding ble observert i cellelinjene som uttrykte OSMRbeta alene. Zcytorl71ig ble bundet på en konsentrasjonsavhengig måte. Verdiene for gjennomsnittlig fluorescensintensitet (MFI) for bindingen til BHK er vist nedenfor i tabell 15.
Eksempel 40
Genekspresionsmatriseanalvse av celler behandlet med human zcytorl71ig
RNA ble isolert fra A549-celler behandlet med human zcytorl 71ig, SK-LU-1-celler behandlet med zcytorl71ig og ubehandlede kontrollceller ved anvendelse av "RNeasy Midi Kit" (Qiagen, Valencia, CA) ifølge produsentens instruksjoner.
Genekspresjonsprofilen for cellene behandlet med zcytorl71ig og de angjeldende kontrollceller, ble utført ved anvendelse av "GEArray Q series"-cDNA-ekspresjonsmatriser (SuperArray, Inc., Bethesda, MD). Q Series-cDNA-ekspresjonsmatrisene inneholdt opptil 96 cDNA-fragmenter forbundet med en spesifikk biologisk reaksjonsvei eller gener med lignende funksjoner eller strukturelle egenskaper. En sammenligning av matriser fra behandlede celler og kontrollceller tillater bestemmelse av opp- og nedregulering av spesifikke gener. Probe-merkingen, hybridiseringen og påvisningen ble utført ifølge produsentens instruksjoner. Påvisning av kjemiluminescenssignal og oppsamling av resultatene ble utført i en Lumi-Imager arbeidsstasjon (Roche, Indianapolis, IN). De resulterende billedresultatene ble analysert ved anvendelse av programvaren ImageQuant 5.2 (Amersham Biosciences, Inc., Piscataway, NJ) og GEArray Analyzer 1,2 (SuperArray Inc., Bethesda, MD).
Analyse av resultatene fra humant interleukin og reseptor Q-serien av HS-014N-matriser viste etter normalisering en ca. 4,7 gangers økning av IL13RA2-signalet i de zcytorl71ig-behandlede humane SK-LU-1-cellene og en ca. 2,2 gangers økning av IL13RA2-signalet i de zcytorl 71ig-behandlede humane A549-cellene.
Disse resultatene viser at zcytorl 71ig i signifikant grad oppregulerte IL13RA2 i SK-LU-1- og A549-cellene. Begge linjer er etablerte cellelinjer avledet fra humane lungekarsi-nomer (Blobel et al., Virchows Arch. B. Cell Pathol. Incl. Mol. Pathol., 1984,4J(4):407-29). Nærmere bestemt er A549karakterisertsom en human pulmonalepitelcellelinje (Lin et al., J. Pharm. Pharmacol., sept. 2002,54(9):1271-8; Martinez et al., Toxicol. Sei., okt. 2002,
<JP(2):409-23).
Interleukin-13 (IL13), et cytokin som utskilles av aktiverte T-lymfocytter, er blitt vist å være både nødvendig og tilstrekkelig for ekspresjon av allergisk astma og for anvendelse i eksperimentelle astmamodeller som omfatter hyperresponsivitet i luftveiene, rekruttering av eosinofile celler og overproduksjon av mukus (Wills-Karp et al., Science, 1998,252:2258-2261). Det er blitt vist at selektiv nøytralisering av ILI3 vil lindre astmafenotypen (Grunig et al., Science, 1998,252:2261-2263). Det er også blitt rapportert at IL13 deltar i oppregulering av ekspresjon av mucingenet MUC8 i humant nesepolyppepitel og dyrket neseepitel (Kimm et al., Acta Otolaryngol., sept. 2002, 722(6):638-643; Seong et al., Acta Otolaryngol., juni 2002, 122( 4):401-407). MUC8, et hovedmucinglykoprotein i luftveiene, er blitt foreslått å spille en rolle i patogenesen av mukushypersekresjon ved kronisk sinusitt med polypper (Seong et al., Acta Otolaryngol., juni 2002, 722(4):401-407).
Funksjonelt signaliserer IL 13 via et reseptorkompleks som består av inter]eukin-13-reseptorens alfa-l-kjede (IL13RA1) og IL-4-reseptor alfa (IL4RA) (Daines og Hershey, J.
Biol. Chem., 2002,22(12):10387-10393). Det er også blitt vist at interleukin-13-reseptor alfa-2 (IL13RA2) binder IL13 med høy affinitet, men alene (Daines og Hershey, J. Biol. Chem., 2002, 22(12):10387-10393). Denne reseptoren mangler imidlertid det cytoplasmatiske domenet som er nødvendig for signaloverføring og anses derfor å være en "lokke"-reseptor. Det er blitt vist at ILI 3RA2 hovedsakelig er et intracellulært molekyl som hurtig kan mobiliseres fra intracellulære lagre og uttrykkes på overflaten etter behandling av cellene med interferon (IFN)-gamma. Ekspresjon på overflaten av IL13RA2 etter IFN-gamma-behandling omfatter ikke proteinsyntese og fører til redusert ILI3-signalisering (Daines og Hershey, J. Biol. Chem., 2002,22(12):10387-10393).
Resultatene fra genekspresjonsmatriseanalysen for zcytorl 71ig viser at virkningen av zcytorl 71ig er ny relativt til virkningen av IFN-gamma ved at zcytorl 71ig-behandling av cellelinjer avledet fra lungeepitel førte til en signifikant økning av IL13RA2-genekspresjonen. Zcytorl 71ig-behandling kan således være gunstig i tilfeller hvor langtidsoppregulering av IL13RA2-ekspresjonen og nedregulering av ILI 3 er ønskelig, f.eks. ved astma, hyperaktivitet i luftveiene (AHR) og mucinregulering, innbefattet kronisk sinusitt med polypper.
Eksempel 41
Muse- zcvtorl71ig- transgene mus
For evaluering av in v/vø-virkningene av overekspresjon av zcytorl 71ig ble det fremstilt flere stamdyr for transgene mus som uttrykker museformen av genet styrt av to forskjellige promotere: den lymfocyttspesifikke promoter Eu/lck og promoteren EF la, som er aktiv i alle vev (eksempel 22). Serumproteinnivået varierer fra ca. 20 til 300 ng/ml. Eu/lck-promoteren ga mus med høyere nivå av proteinet i serum enn nivået hos EFla-zcytorl71ig-transgene mus.
De zcytorl71ig-transgene musene utviklet en hudfenotype i en alder av ca. 4-8 uker. Pelsen til de transgene musene ble "rynket", med åpenbar piloereksjon og mildt til alvorlig håravfall, vanligvis på ryggen, sidene av kroppen og rundt øynene. Denne fenotypen ble gjennomgående funnet hos mus med påvisbart nivå av zcytorl71ig-protein i serum. Blant stamdyrene ble en 100 % forekomst blant musene som uttrykte det Eu/lck-styrte gen og 50 % forekomst hos de EFla-transgene musene, bemerket, noe som korrelerte godt med det relative zcytorl 71ig-nivå som kunne påvises i serum. Den transgene huden så ut til å være pruritisk, vist ved musenes kløende atferd, noen ganger så omfattende at den induserte hudløshet og lesjoner i huden som vanligvis ble infisert (i det minste med Staphylococcus aureus). Musene ble opprinnelig merket med øremerker av metall, men i de fleste tilfeller ble merkingen fjernet med makt av musene selv. Dette førte ofte til alvorlige skader på det ytre øret. Disse skadde ørene ble ofte ikke ordentlig helbredet, noe som viste seg ved vedvarende pustler og skorpedannelse, og et væskende, ekspanderende sår ble utviklet hos mange av dyrene bak og mellom ørene. Noen av de transgene musene utviklet også skorpete sår på skulder og hals. Hudlesjoner ble observert i en undergruppe av dyrene, disse ble generelt utviklet på områder av huden hvor hårtapet allerede var fremtredende og ble ofte forverret ved musenes kløende atferd.
Sanntids-kvantitativ RT-PCR ble anvendt for påvisning av zcytorl71ig-RNA-transkripter i transgene (men ikke ikke-transgene) hudprøver, hvor den Eu/lck-transgene hud uttrykte mer zcytorl 71ig-RNA enn hud fra EF1 a-transgene mus. Genene som koder for zcytorl 7-reseptorsubenhetene zcytorl 7 og OSMRbeta, ble uttrykt i huden hos både ikke-transgene og zcytorl 71ig-transgene mus.
En undersøkelse av lymfoide vev fra en undergruppe av de Eu/lck-transgene stamdyrene ved "flow"-cytometri viste en signifikant økning av andelen aktiverte T-celler i milt og lymfeknuter fra disse musene. To av de fire musene som ble analysert, hadde svært forstørrede cervixlymfeknuter, muligens grunnet forekomsten av lesjoner på halsen. En svak økning i vekten av milten og en svak økning av sirkulerende monocytter og nøytrofile celler i blodet hos de transgene musene ble også observert. Det var ingen økning av en rekke analyserte cytokiner og heller ikke endring i nivået av serumamyloid A-nivået i sirkulasjonen hos disse musene. Virkningene på immuncellene i de transgene musene kan være en direkte eller indirekte følge av zcytorl 71ig eller sekundære virkninger fra hudlesjonene.
Histopatologiske undersøkelser ble utført på mange vev, bortsett fra hud, innbefattet lever, brissel, milt, nyre og testis, og ingen signifikante unormaliteter i disse organene ble bemerket. Analyse av den transgene huden viste imidlertid en rekke endringer som varierte innen vide grenser, avhengig av kilde og lokalisering av huden (f.eks. normal, hårløs eller med lesjoner). I mange tilfeller hadde de transgene musenes ører fortykket epidermis sammenlignet med ikke-transgene kontroller (f.eks. tilnærmet fire lag sammenlignet med to lag), og de underliggende vev inneholdt et lavt til moderat antall inflammatoriske celler som hovedsakelig var mononukleære, med enkelte nøytrofile celler. Epidermis over buken så i flere seter ut til å være noe tykkere i de transgene musene, men det var ingen åpenbar økning i antall inflammatoriske celler i den underliggende dermis eller subcutis. I den hårløse delen av hud fra disse musene forelå det utvidede hårfollikler som inneholdt noen rester, men ingen hårstammer (noe som viser at hårene falt ut med roten). I områder med lesjoner var det en alvorlig fortykkelse av epidermis (akantose), forhøyet mengde keratin på hudoverflaten (hyperkeratose), spredte ulcere av forskjellig størrelse og et signifikant antall inflammatoriske celler i dermis (hovedsakelig nøytrofile celler med et varierende antall makrofager og lymfocytter). Dermis inneholdt også flere mastceller som lå rundt lesjonene. Noen av hårstammene i områdene med lesjoner i den transgene huden forelå i den aktive tilstand (anagen), i motsetning til mange av hårstammene i "normale" områder, som var i det involuterende (katagene) til det inaktive (telogene) stadium.
Fenotypen til de zcytorl 71ig-transgene musene ligner svært på fenotypen til pasienter med atopisk dermatitt (AD) og musemodeller for AD. AD er en vanlig kronisk, inflammatorisk sykdom som særpreges ved hyperaktiverte cytokiner fra hjelper-T-celleundergruppe 2 (Th2). Zcytorl 71ig uttrykkes fortrinnsvis av Th2-celler relativt til Thl-celler, noe som gir denne sammenligningen ytterligere troverdighet. Selv om den nøyaktige sykdoms-årsak til AD er ukjent, er en rekke faktorer blitt implisert, innbefattet hyperaktive Th2-immunresponser, autoimmunitet, infeksjon, allergener og genetisk predisposisjon. Nøkkelegen-skaper ved sykdommen omfatter xerose (tørr hud), pruritus (kløe i huden), konjunktivitt, inflammatoriske hudlesjoner, infeksjon med Staphylococcus aurens, forhøyet antall eosinofile celler i blodet, forhøyet nivå av IgE og IgGl i serum og kronisk dermatitt med infiltrasjon av T- celler, mastceller, makrofager og eosinofile celler. Kolonisering eller infeksjon med S. aureus er blitt vist å forverre AD og bidra til denne hudsykdommens kroniske natur.
AD forefinnes ofte hos pasienter med astma og allergisk rhinitt og er ofte den innledende manifestering av allergisk sykdom. Cirka 20 % av populasjonen i vestlige land lider av disse allergiske sykdommene, og forekomsten av AD i utviklede land er av ukjente grunner økende. AD begynner typisk i barndommen og kan ofte vedvare gjennom ungdom til voksen alder. Dagens behandlingsmåter for AD omfatter topiske kortikosteroider, oralt tilført syklosporin A, ikke-kortikosteroide immunsupprimerende midler som takrolimus (FK506 i salveform) og interferon-gamma. Trass i de mange behandlingsformene for AD forbedres symptomene ikke hos mange pasienter, eller pasientene har uheldige reaksjoner på medikamentene, noe som krever en leting etter andre, mer effektive terapeutiske midler.
Epitelceller som uttrykker den heterodimere reseptor for zcytorl 71ig (zcytorR17 og OSMRbeta), er lokalisert i setene (f.eks. hud, tarm, lunge osv.) for inngang av allergener i kroppen og interagerer nært med dendrittceller (profesjonelle antigenpresenterende celler in situ. Dendrittcellene spiller en viktig rolle i utviklingen av allergiske sykdommer, og zcytorl 71ig kan interagere med sin reseptor i epitelceller i hud og lunge og påvirke immunresponsene i disse organene. Zcytorl 71ig og tilhørende reseptor(er) kan derfor tenkes å bidra til utviklingen av allergiske sykdommer som AD og astma. Videre tyder fenotypen til de zcytorl 71ig-transgene musene på at denne liganden spiller en rolle i sårheling, siden musene ser ut til å være ute av stand til å reparere øreskader og ofte bærer vedvarende lesjoner på rygg og side. En antagonist av zcytorl 71ig kan derfor representere et levedyktig terapeutisk middel for disse og andre indikasjoner.
Eksempel 42
Luciferaseanal<y>se av humane transformerte epitelcellelinjer ved forbigående transfeksjon med et STAT/ SRE- rapportørgen fra adenovirus
Et bredt utvalg av humane transformerte epitelcellelinjer (se tabell 16 nedenfor) ble utsådd i 96-brønners, flatbunnede skåler med 10 000 celler/brønn i vanlig dyrkningsmedium, som angitt for hver celletype. Neste dag ble cellene infisert med en adenovirusrapportør-konstruksjon, KZ136, ved en infeksjonsmultiplisitet på 5000. KZ136-rapportøren inneholder STAT-elementene i tillegg til et serumresponselement. Totalvolumet var 100 ul/brønn med DMEM, supplert med 2 mM L-glutamin (Gibco BRL), 1 mM natriumpyruvat (Gibco BRL) og 1 x insulin-transferrin-selen-supplement (Gibco BRL) (i det påfølgende betegnet serumfritt medium). Cellene ble dyrket over natten.
Neste dag ble mediet fjernet og erstattet med 100 ul induksjonsmedium. Induksjonsmediet var human zcytorl71ig fortynnet i serumfritt medium i konsentrasjoner på 100 ng/ml, 50 ng/ml, 25 ng/ml, 12,5 ng/ml, 6,25 ng/ml, 3,125 ng/ml og 1,56 ng/ml. En positiv kontroll med 20 % FBS ble anvendt for å bekrefte analysen og for å sikre at adenovirus-infeksjonen var vellykket. Cellene ble indusert i 5 timer, hvoretter mediet ble avsugd. Cellene ble så vasket i 50 (il/brønn PBS og deretter lysert med 30 (il/brønn av 1 x cellelyseringsbuffer (Promega). Etter 10 minutters inkubering ved romtemperatur ble 25 ul/brønn lysat overført til ugjennomsiktige, hvite, 96-brønners plater. Platene ble så avlest i luminometeret ved anvendelse av 5 sekunders integrasjon med 40 ul/brønn injeksjon av luciferasesubstrat (Promega).
Resultatene viste at flere epitelcellelinjer hadde evnen til å respondere på zcytorl 71ig, som vist i tabell 16 nedenfor.
Eksempel 43
Cvtokinproduksion av humane epitelcellelinjer dyrket med human zcytorl71ig
Epitelcellelinjer fra sykdomstilstander hos mennesket (A549, humant lungeepitel-karsinom; SkLul, humant lungeepiteladenokarsinom; DU145, humant prostataepitelkarsinom; PZ-HPV-7, humant prostataepitel transformert med HPV; U20S, humant benepitelosteosarkom) ble analysert for cytokinproduksjon som respons på zcytorl 71ig in vitro. Disse cellelinjene har både zcytorl 7 og OSMR-beta, påvist ved RT-PCR, og responderer på human zcytorl 71ig ved analyse med adenovirusluciferaserapportørkonstruksjonen KZ136 (eksempel 42). Cytokinproduksjonen i disse cellelinjene ble bestemt som respons på human zcytorl71ig i en serie bestående av tre eksperimenter.
A. Cvtokinproduksion ved epitelcellelinjer fra s<y>kdomstilstander hos mennesket dyrket med human zcytorl 71ig
Cellene ble utsådd ved en tetthet på 4,5 x IO<5>celler pr. brønn i en 6-brønners plate (Costar) og dyrket i de angjeldende dyrkningsmedier. Cellene ble dyrket med analysereagenser: 100 ng/ml zcytorl 71ig, 10 ng/ml, interferon-gamma (IFN-gamma) (R&D Systems, Minneapolis, MN), 10 ng/ml tumornekrosefaktor alfa (TNF-alfa) (R&D Systems, Minneapolis, MN), 10 ng/ml IL-beta (R&D Systems, Minneapolis, MN) eller 100 ug/ml lipopolysakkarid (LPS) (Sigma). Supernatanter ble høstet etter 24 og 48 timer og analysert for cytokinene GM-CSF (granulocyttmakrofagkolonistimulerende faktor) IL-lb, IL-6, IL-8, MCP-1 (makrofagkjemo-attraktantprotein 1) og TNFa. Multiplex Antibody Bead-sett fra BioSource International (Camarillo, CA) ble anvendt for måling av cytokiner i prøvene. Analysene ble avlest i et Luminex-100-instrument (Luminex, Austin, TX), og resultatene ble analysert ved anvendelse av programvaren MasterPlex (MiraiBio, Alameda, CA). Cytokinproduksjonen (pg/ml) for hver cellelinje i prøvene uttatt etter 24 timer er vist nedenfor i tabell 17.
TL-lb, pg/ml IL-6, pg/ml MCP-1, pg/ml TNFot, pg/ml
Alle de analyserte cellelinjene produserte GM-CSF og IL-8 som respons på stimulering med kontrollcytokinene IL-lb og TNFa. De fleste cellelinjene dannet IL-6 og MCP-1 som respons på stimulering med IL-lb og TNFa. Zcytorl71ig stimulerte IL-6-produksjonen i cellelinjen DU145, sammenlignet med kontrollen (193 pg/ml sammenlignet med 71 pg/ml). Zcytorl71ig stimulerte tre av fem cellelinjer til produksjon av IL-8, hvor den høyeste virkningen ble observert i A549-celler (fem ganger), og reduserte IL-8-dannelsen i U20S-celler med en faktor på 2. Det var en svak virkning på MCP-1-produksjonen for DU145- og U20S-celler ved dyrking med zcytorl 71ig.
B. Cytokinproduksjon ved normale humane epitelcellelinjer dyrket med human zcytorl 71ig
I tillegg til de humane epitelcellelinjene ble normale human bronkiale epitelceller ((NHBE, Clonetics) også analysert. Cellene ble utsådd ved en tetthet på 1 x IO<5>celler pr. brønn i en 24-brønners plate og dyrket med analysereagensene: 1000 ng/ml, 100 ng/ml og 10 ng/ml zcytorl 71ig (A760F), 10 ng/ml TNFa, 10 ng/ml OSM, 10 ng/ml IFNa, 10 ng/ml TGFb eller 10 ng/ml lymfotaktin. Supernatanter ble høstet etter 24 og 48 timer og analysert for cytokinene IL-6, IL-8, MCP-1, MIP-la, RANTES og eotaksin. Cytokinene ble analysert som beskrevet tidligere. Cytokinproduksjonen (pg/ml) for hver cellelinje i prøvene uttatt etter 48 timer er vist nedenfor i tabell 18.
IL-8, pg/ml
DU145-cellene dannet IL-6 som respons på zcytorl71ig, en gjentakelse av de tidligere resultatene i eksempel 43A. Imidlertid hadde kun A549 og U20S den samme IL-8-responsen som ble observert i eksempel 43A. SkLul- og U20S-celler dannet begge MCP-1 som respons på zcytorl 71ig. Cytokinproduksjonen ved NHBE-celler var marginal sammenlignet med kontrollene.
C. Cvtokinproduksjon ved epitelcellelinjer fra s<y>kdomstilstander hos mennesket dyrket sammen med human zcytorl71ig og IFN- gamma
Cellene ble utsådd i en tetthet på 2 x IO5 celler pr. brønn i 24-brønners plater og dyrket i nærvær av 10 ng/ml IFN-gamma +/- zcytorl 71ig ved 100 ng/ml, 10 ng/ml eller 1 ng/ml. Supernatanter ble oppsamlet etter 24 og 48 timer og analysert for IL-8 og MCP-1, som beskrevet ovenfor. Cytokinproduksjonen (pg/ml) for hver cellelinje i prøvene uttatt etter 24 timer er vist nedenfor i tabell 19.
A549-cellene dannet IL-8 som respons på zcytorl 71ig, det var imidlertid ingen virkning av å dyrke cellene med tilsatt IFN-gamma. U20S-cellene dannet 20 ganger mer MCP-1 ved dyrking med IFNg og 50 ganger mer MCP-1 ved dyrking med IFN-gamma + zcytorl 71ig.
Eksempel 44
Virkninger av zcytorl 71ig på 3H- TdR- inkorporering i prostataepitelkarsinomcellelinjen DU145
Cellene ble utsådd i 96-brønners vevsdyrkningsplater (Falcon) ved en tetthet på 25 000/brønn i MEM (Life Technologies) dyrkningsmedium tilsatt glutamin, pyruvat, ikke-essensielle aminosyrer (Life Technologies) og 10 % føtalt bovint serum (Hyclone). Ved konfluens (24 timer senere) ble cellene overført til vekststoppmedium ved å erstatte serum med 0,1 % BSA (Life Technologies). Etter 48 timers inkubering for å oppnå cellesynkronisering ble vekststoppmediet erstattet med friskt medium. Deretter ble human rekombinant zcytorl 71ig (analysereagens) tilsatt i forskjellige konsentrasjoner (fra 0,24 til 60 ng/ml) (se tabell 16) for å analysere virkningen av proteinet på den basale DNA-replikasjon. Noen brønner ble tilsatt 2,5 % FBS (Hyclone) i tillegg til zcytorl 71ig for å analysere virkningen av proteinet på et forhøyet nivå av TdR-inkorporering. 10 % FBS og 20 ng/ml blodplateavledet vekstfaktor-BB (PDGF-BB)
(R&D) ble anvendt som positiv kontroll.
18 timer etter tilsetning av zcytorl 71ig og resten av analysereagensene ble cellene pulsmerket med 250 nCi/ml [<3>H]-tymidin (NEN) i 4 timer. Etter pulsmerkingen på 4 timer ble mediet fjernet, og 100 ul trypsinløsning (Life Technologies) ble tilsatt til hver brønn for frigivelse av cellene. Radioaktiviteten som ble inkorporert i DU145, ble bestemt ved å høste cellene med en Packard Filtermate 196-cellehøster og måle inkorporert radioaktivitet ved anvendelse av en Packard TopCount NXT-scintillasjonsteller for mikroplater.
Som vist i tabell 20 nedenfor, induserte zcytorl 71ig tymidininkorporering i hvilende celler (i 0,1 % BSA) på en konsentrasjonsavhengig måte. Denne virkningen nådde et nivå som var 2,5 ganger høyere enn i BSA-kontrollen ved den høyeste benyttede konsentrasjon, 60 ng/ml. I tillegg kunne denne virkningen av zcytorl 71ig også påvises etter forhøyelse av baselinjeinkorporering ved tilsetning av 2,5 % FBS (i denne undersøkelsen et like kraftig mitogen som 10 % FBS). Disse resultatene viser derfor at zcytorl 71ig både under basale og stimulerte betingelser kan virke som mitogen faktor for DU145-karsinomcellene.
Tabell 16 viser virkningene av zcytorl 71ig på tymidininkorporeringen i DU 145-celler. Resultatene er gitt som cpm/brønn, og tallene er gjennomsnittsverdi + standardavvik for brønner i triplikat.
Eksempel 45
Ekspresjon av huzcytorl71ig i E . coli
A. Konstruksjon av ekspresjonsvektoren pRPSOl som uttrykker huzcytorl 71ig/ MBP-6H- fussonspolvpeptid
Et ekspresjonsplasmid som inneholdt et polynukleotid som kodet for huzcytorl71ig fusjonert C-terminalt til maltosebindende protein (MBP), ble fremstilt ved homolog rekombinasjon. Fusjonspolypeptidet inneholdt en N-terminal MBP-del på ca. 388 aminosyrer fusjonert til huzcytorl 71ig beskrevet heri. Et fragment av huzcytorl71ig-cDNA ble isolert ved anvendelse av PCR-fremgangsmåten som beskrives heri. To primere ble anvendt for fremstilling av zcytorl71ig-fragmentet i en standard PCR-reaksjon: (1) én primer inneholdt 40 bp av den flankerende vektorsekvens og 20 bp som tilsvarer aminoenden av huzcytorl 71ig; og (2) en annen primer inneholdt 40 bp av 3'-enden tilsvarende den flankerende vektorsekvens og 20 bp som tilsvarte karboksylenden av huzcytorl71ig. 2 ul av PCR-reaksjonen på 100 ul ble fraksjonert i en 1,0 % agarosegel med 1 x TBE-buffer for analyse, og et fragment med den forventede molekyl - vekt ble observert. Resten av PCR-reaksjonen ble blandet med det andre PCR-røret og utfelt med 400 ul absolutt etanol. Utfelt DNA ble anvendt for rekombinasjon i den Smal-kuttede mottaker-vektor pTAP98 for fremstilling av konstruksjonen som kodet for MBP-huzcytorl71ig-fusjonen, som beskrevet nedenfor.
Vektoren pTAP98 ble fremstilt ved anvendelse av homolog rekombinasjon i gjær. 100 ng EcoRI-kuttet pMAL-c2 ble blandet med 1 ug Pvul-kuttet pRS316,1 ug linker og 1 ug Scal/EcoRI-kuttet pRS316 i en PCR-reaksjon. PCR-produktene ble oppkonsentrert ved utfelling med 100 % etanol. Den kompetente gjærcelle- ( S. cerevisiae)-\ injen SF838-9Da ble blandet med 10 ul av en blanding som inneholdt ca. 1 ug av huzcytorl 71ig-PCR-produktet (se ovenfor) og 100 ng Smal-kuttet pTAP98-vektor og elektroporert ved 0,75 kV, 25 uF og uendelig ohm. Den resulterende reaksjonsblanding ble utsådd på URA-D-skåler og inkubert ved 30 °C.
Etter 48 timer ble Ura<+->gjærtransformantene fra en enkelt skål utvalgt. DNA ble isolert og transformert inn i elektrokompetente E. cø/z-celler (f.eks. MC1061, Casadaban et al., J. Mol. Biol., 138,179-207). De resulterende E. co/z-cellene ble utsådd på MM/CA + AMP
100 pg/l-skåler (Pryor og Leiting, Protein Expression and Purification, 70:309-319,1997) ved anvendelse av standardfremgangsmåter. Fire enkeltkloner ble høstet fra skålene og inokulert i MM/CA med 100 |ig/ml ampicillin i 2 timer ved 37 °C. 1 ml av hver kulturen ble indusert med 1 mM IPTG. Cirka 2-4 timer senere ble 250 ul av hver induserte kultur blandet med 250 (il syrevaskede glasskuler og 250 ul Thorner-buffer med 5 % pME og fargestoff (8 M urea, 100 mM Tris, pH 7,0,10 % glyserol, 2 mM EDTA, 5 % SDS). Prøvene ble vorteksbehandlet i 1 minutt og oppvarmet til 65 °C i 10 minutter. 20 (il av hver prøve ble satt i en brønn i en 4-12 % PAGE-gel (NOVEX). Elektroforesen ble utført i 1 x MES-buffer. De positive klonene ble betegnet pRPSOl og ble sekvensert. 1 (il sekvensert DNA ble anvendt for transformasjon av elektrokompetente E. coli-celler, stamme MC 1061. Cellene ble gitt en elektrisk puls ved 2,0 kV, 25 uF og 400 ohm. Etter elektroporeringen ble cellene tilsatt 0,6 ml SOC og dyrket på LB + Amp-skåler ved 37 °C over natten med 100 mg/l ampicillin. Fire kulturer ble indusert med IPTG og analysert for positive kloner, som beskrevet ovenfor. De positive klonene ble ekspandert for rensing av huzcytorl 71ig/MBP-6H-fusjonsprotein ved anvendelse av standardteknikker.
B. Rensing av huzcytorl 71ig/ MBP- 6H fra E . co//- fermentering
Dersom ikke annet er angitt, ble alle operasjoner utført ved 4 °C. Følgende fremgangsmåte ble anvendt for rensing av rekombinant huzcytorl71ig/MBP-6H-polypeptid.
E. co//-celler som inneholdt pRPSOl-konstruksjonen og som uttrykte huzcytorl 71ig/MBP-6H, ble fremstilt ved anvendelse av standard molekylærbiologiske fremgangsmåter og dyrket i 50,0 g/l "SuperBroth II" (12 g/l kasein, 24 g/l gjærekstrakt, 11,4 g/l dikaliumfosfat, 1,7 g/l monokaliumfosfat; Becton Dickinson, Cockeysville, MD), 5 g/l glyserol og 5 ml/l 1 M magnesiumsulfat. 20 g av celler ble høstet og nedfrosset for rensing av protein.
De opptinte cellene ble resuspendert i 500 ml amyloseekvilibreringsbuffer (20 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8,0). Et French Press-celleoppbrytningssystem (Constant Systems Ltd., Warwick, UK) med temperaturen justert til -7 til -10 °C og et trykk på 207 mPa ble anvendt for lysering av cellene. De resuspenderte cellene ble analysert for oppbrytning ved måling av A6oofør og etter passasje gjennom French Press. Den prosesserte cellesuspensjon ble sentrifugert ved 10 000 x G i 30 minutter for fjerning av cellerester, og supernatanten ble høstet for rensing av protein.
En 25 ml kolonne med amyloseresin (New England Biolabs, Beverly, MA)
(fremstilt som beskrevet nedenfor) ble helt i en Bio-Rad med 2,5 cm diameter x 10 cm høyde glasskolonne. Kolonnen ble pakket og ekvilibrert med 10 kolonnevolumer (CV) amyloseekvilibreringsbuffer. Den prosesserte cellesupernatant ble ladet på amyloseresinet i én porsjon over natten under vipping. Resinet ble tilbakeført til Bio-Rad-kolonnen og vasket med 10 CV amyloseekvilibreringsbuffer. Kolonnen ble eluert med ca. 2 CV amyloseelueringsbuffer (amyloseekvilibreringsbuffer +10 mM maltose, Fluka Biochemical, Sveis). Ti fraksjoner på 5 ml ble oppsamlet over elueringsprofilen og analysert for absorbans ved 280 og 320 nm. Amyloseresinet ble regenerert med 1 CV destillert H20,5 CV 0,1 % (vekt/volum) SDS (Sigma), 5 CV destillert H20, 5 CV amyloseekvilibreringsbuffer og endelig 1 CV amyloselagringsbuffer (amyloseekvilibreringsbuffer + 0,02 % natriumazid). Den regenererte kolonnen ble lagret ved 4°C.
Eluerte fraksjoner av interesse ble slått sammen og dialysert i et 1 OK dialyse-kammer (Slide-A-Lyzer, Pierce Immunochemical) mot 4x41 PBS, pH 7,4 (Sigma), over et tidsrom på 8 timer for fjerning av lavmolekylære kontaminanter, for bufferutbytting og avsalting. Etter dialysen representerte det høstede materialet det rensede huzcytorl 71ig/MBP-6H-polypeptid. Renset huzcytorl 7/MBP-6H-polypeptid ble filtersterilisert og analysert ved SDS-PAGE og coomassiefarging for et produkt med forventet molekylvekt. Konsentrasjonen av huzcytorl 71ig/MBP-6H-polypeptidet ble ved BCA-analyse bestemt til å være 1,28 mg/ml.
Eksempel 46
Polyklonalt antistoff mot human zcytorl 71ig
A. Fremstilling og rensing
Polyklonale antistoffer ble fremstilt ved å immunisere to hvite New Zealand-hunnkaniner med renset rekombinant hzcytorl7L/MBP-6H-protein (eksempel 45). Kaninene ble gitt en innledende intraperitoneal (IP) injeksjon med 200 ug renset protein i komplett Freunds adjuvans, fulgt av intraperitoneale forsterkerinjeksjoner med 100 ug protein i ukomplett Freunds adjuvans hver 3. uke. 7-10 dager etter tilførsel av den andre forsterkerinjeksjonen (i alt tre injeksjoner) ble blod tappet og serum oppsamlet. Dyrene ble så gitt forsterkerinjeksjoner og tappet for blod hver 3. uke.
Det hzcytorl7L/MBP-6H-spesifikke kaninserum ble preadsorbert på anti-MBP-antistoffer ved anvendelse av en CNBr-SEPHAROSE-4B-proteinkolonne (Pharmacia LKB) som var blitt fremstilt ved anvendelse av 10 mg uspesifikt renset, rekombinant MBP-fusjonsprotein pr. gram CNBr-SEPHAROSE. De hzcytorl 7L/MBP-6H-spesifikke polyklonale antistoffene ble affinitetsrenset fra det preadsorberte kaninserum ved anvendelse av en CNBr-SEPHAROSE-4B-proteinkolonne (Pharmacia LKB) som var blitt fremstilt ved anvendelse av 10 mg av det spesifikke antigenrensede, rekombinante hzcytorl 7L/MBP-6H-protein. Etter rensingen ble de polyklonale antistoffene dialysert mot 4 x 20 ganger antistoffvolumet av PBS over et tidsrom på minst 8 timer. Hzcytorl 7-ligandspesifikke antistoffer blekarakterisert vedELISA og anvendelse av 500 ng/ml av det rensede rekombinante protein hzcytorl 7L/MBP-6H eller hzcytorl 7L-CEE, fremstilt i et baculovirusekspresjonssystem, som antistoffmål. Den nedre deteksjonsgrense (LLD) for affinitetsrenset anti-hzcytorl7L/MBP-6H-antistoff fra kanin var 100 pg/ml for det spesifikke rensede, rekombinante antigen hzcytorl 7L/MBP-6H, og 500 pg/ml for renset rekombinant hzcytorl7L-CEE fremstilt i et baculovirusekspresjonssystem.
B. SDS- PAGE og Western- blotting- analyse av antihuman zcytorl71ig- MBP- 6H-antistoff fra kanin
Antihumant zcytorl 71ig-MBP-6H-antistoff fra kanin ble analysert ved SDS-PAGE (NuPage 4-12 %, Invitrogen, Carlsbad, CA) med coomassiefarging og Western-blotting ved anvendelse av antikanin-IgG-HRP fra geit. Renset zcytorl 71ig-protein fra menneske og mus (200-25 ng) ble fraksjonert ved elektroforese ved anvendelse av en Invitrogen Novex Xcell II-minicelle og overført til nitrocellulose (0,2 mm, Invitrogen, Carlsbad, CA) ved romtemperatur ved anvendelse av Novex Xcell-blottemodul under omrøring ifølge retningslinjene som gis i instrumenthåndboken. Overføringen ble utført ved 300 mA i 1 time i en buffer som inneholdt 25 mM Tris-base, 200 mM glysin og 20 % metanol. Filteret ble så blokkert med Western A-buffer (hjemmelagd, 50 mM Tris, pH 7,4, 5 mM EDTA, pH 8,0, 0,05 % Igepal CA-630,150 mM NaCl og 0,25 % gelatin) over natten under forsiktig vipping ved 4 °C. Nitrocellulosen ble raskt vasket, hvoretter antihuman zcytorl 71ig-MBP-6H (1:1000) fra kanin ble tilsatt i Western A-buffer. Blottet ble inkubert i 1,5 timer ved romtemperatur under forsiktig vipping. Blottet ble vasket tre ganger, hver gang i 5 minutter, med Western A-buffer, hvoretter antikanin-IgG-HRP-antistoff fra geit (1:5000) ble tilsatt i Western A-buffer. Blottet ble inkubert i 1 time ved romtemperatur under forsiktig vipping. Blottet ble vasket tre ganger, hver gang i 5 minutter, med Western A-buffer og så raskt vasket med H2O. Blottet ble fremkalt ved anvendelse av kommersielt tilgjengelige kjemiluminescenssubstratreagenser (ECL Western-blottingdeteksjonsreagenser 1 og 2 blandet 1:1, reagenser erholdt fra Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, England), og blottet ble eksponert for røntgenfilm i opptil 5 minutter.
Renset zcytorl 71ig fremstod som et kraftig bånd ved ca. kDa og et svakere bånd ved ca. 20 kDa under reduserende betingelser. Muse-zcytorl 71ig ble ikke påvist med antihuman zcytorl 71ig-antistoff fra kanin.
Eksempel 47
Virkninger av zcytorl 71ig på U937- monocyttadhesion til et encellelag av transformerte benmargsendotelceller ( TRBMEO
Transformerte benmargsendotelceller (TRBMEC) ble utsådd i 96-brønners vevsdyrkningsplater (Falcon) ved en tetthet på 25 000 celler/brønn i medium Ml31 (Cascade Biologics), tilsatt mikrovaskulært vekstsupplement (MVGS) (Cascade Biologics). Ved konfluens (24 timer senere) ble mediet byttet til Ml99 (Gibco-Life Technologies) tilsatt 1 % føtalt bovint Serum (Hyclone). Human rekombinant zcytorl71ig (analysereagens) ble tilsatt i forskjellige konsentrasjoner (fra 0,4 til 10 ng/ml) (se tabell 21 nedenfor) for å analysere virkningen av proteinet på immuncelleendotelcelleinteraksjoner som fører til adhesjon. Noen brønner ble tilsatt 0,3 ng/ml tumornekrosefaktor (TNF-alfa, R&D Systems), et kjent proinflammatorisk cytokin, i tillegg til zcytorl 71ig, for å analysere virkningen av proteinet på endotelceller under inflammatoriske betingelser. TNF-alfa i en konsentrasjon på 0,3 ng/ml ble anvendt alene som positiv kontroll, og den anvendte konsentrasjon representerer ca. 70 % av den maksimale TNF-alfa-virkning i dette systemet, det vil si at den ikke induserer maksimal adherens av U937-celler (en human monocyttlignende cellelinje) til endotelet. Av denne grunn kan dette oppsettet påvise både oppregulering og nedregulering av virkningene av TNF-alfa. Det basale adhesjonsnivå både med og uten TNF-alfa ble anvendt som basalnivået for å anslå virkningene av analysereagensene.
Etter inkubering over natten av endotelcellene med analysereagensene (zcytorl 71igand ± TN-alfa) ble U937-celler farget med 5 uM kalsein-AM-fluorescensmarkør (Molecular Probes) og suspendert i RPMI-1640 (uten fenolrødt) tilsatt 1 % FBS og utsådd med 100 000 celler/brønn på det vaskede TRBMEC-encellelag. Fluorescensnivået ved eksitasjons- og emisjonsbølgelengdene på 485/538nm (Molecular Devices mikroplateleser, CytoFluor-anvendelse) ble målt 30 minutter senere, før og etter tre gangers vask av brønnen med forvarmet RPMI-1640 (uten fenolrødt) for fjerning av ikke-adherente U937-celler. Fluorescensnivået før vask (total) og etter vask (adherensspesifikk) ble anvendt for bestemmelse av prosent adherens (netto adherensspesifikt nivå/netto totalnivå x 100 = % adherens).
Som vist i tabell 21 nedenfor, påvirket zcytorl 71ig ved tilsetning alene det basale adherensnivå for U937-celler til encellelaget av endotelceller i det anvendte konsentrasjons-området (mindre enn 2 x økning, p < 0,01 ved ANOVA-test). Alene ga den positive kontroll, 0,3 ng/ml TNF-alfa, en økning av adherensen av U937-celler fra et utgangspunkt på 5,8 % til 35 %
(6 ganger). I nærvær av TNF-alfa ga zcytorl 71ig en synergistisk virkning med TNF-alfa og ga en videre økning av adhesjonen av U937-celler på en konsentrasjonsavhengig måte mellom 0,4 og 10 ng/ml (p < 0,01 ved ANOVA-test). Ved 10 ng/ml forsterket zcytorl 71ig virkningen av TNF-alfa med 62 %. Disse resultatene viser at zcytorl 71ig i seg selv kan være et proinflammatorisk middel. Zcytorl 71ig kunne virke synergisk med submaksimale konsentrasjoner av TNF-alfa for økning av monocyttadherensen til endotelceller. Disse resultatene viser også at endotelceller, særlig når de er eksponert for proinflammatoriske cytokiner som TNF-alfa, er et sannsynlig
målvev for virkningen av zcytorl71ig. Følgene av virkningen av zcytorl 7-ligand på endotelceller kan være å forsterke adhesjonen av monocytter eller makrofager til et sete for proinflammatorisk aktivitet. Aktiverte monocytter og makrofager er viktige i mange inflammatoriske sykdommer. Inhibering av monocytt-/makrofagadhesjonen kan derfor utgjøre et terapeutisk grunnlag for zcytorl 7-ligandantagonister. Disse resultatene understøtter anvendelsen av zcytorl 7-ligandantagonister for behandling av lungesykdommer, vaskulære sykdommer, autoimmunitet, tumor-metastaser, sykdom som følge av allergiske reaksjoner, sårheling og hudsykdommer, innbefattet kontaktdermatitt, allergisk dermatitt eller ikke-allergisk dermatitt, psoriasis og inflammatorisk tarmsykdom. Tabell 21 viser virkningene av zcytorl71ig på adhesjonen av U937-monocytter til encellelag med TRBMEC-endotelceller. Resultatene er gitt som prosent adhesjon, og verdiene er middelverdi ± standardavvik fra brønner i triplikat.

Claims (15)

1. Isolert polypeptid, karakterisert vedat det omfatter en sekvens av aminosyrerester som har minst 95 % sekvenslikhet med aminosyrerestene 27-164 ifølge SEQ ID NO: 2, hvor polypeptidet binder zcytorl7-polypeptidet som vist i SEQ ID NO: 5 eller induserer inflammasjon.
2. Isolert polypeptid ifølge krav 1, hvor polypeptidet omfatter aminosyrerestene 27-164 ifølge SEQ ID NO: 2.
3. Isolert polynukleotid, karakterisert vedat det koder for polypeptidet ifølge krav 1 eller 2.
4. Ekspresjonsvektor, karakterisert vedat den omfatter følgende operativt sammenkoblede elementer: (a) en transkripsjonspromoter; (b) et DNA-segment som koder for polypeptidet ifølge krav 1 eller 2, og (c) en transkripsjonsterminator.
5. Dyrket celle, karakterisert vedat den omfatter ekspresjonsvektoren ifølge krav 4.
6. Fremgangsmåte for fremstilling av et protein, karakterisert vedat den omfatter: dyrkning av cellen ifølge krav 5 under betingelser hvori det kodede polypeptidet uttrykkes; og gjenvinning av det kodede polypeptidet.
7. Isolert antistoff eller antigenbindende fragment derav, karakterisert vedat det bindes spesifikt til polypeptidet ifølge krav 1 eller 2.
8. Isolert antistoff ifølge krav 7, hvor antistoffet er a) et polyklonalt antistoff, b) et murint monoklonalt antistoff, c) et humanisert antistoff avledet fra (b), d) et kimært antistoff, eller e) et humant, monoklonalt antistoff.
9. Isolert antigenbindende fragment ifølge krav 7, hvor det antigenbindende fragment er F(ab')2, Fab eller et enkeltkjede Fv.
10. Isolert antistoff eller antigenbindende fragment derav ifølge krav 7, hvor antistoffet eller det antigenbindende fragment derav videre omfatter en radioaktiv isotop, et enzym, et substrat, en kofaktor, en fluorescensmarkør, en kjemiluminescensmarkør, en peptidmerkelapp, en magnetisk partikkel, et medikament eller et toksin.
11. Fremgangsmåte for ekspansjon av hematopoietiske celler og hematopoietiske forløperceller, karakterisert vedat den omfatter dyrkning av celler fra benmarg eller perifert blod med et preparat som omfatter en mengde av polypeptid omfattende restene 27-164 fra SEQ ID NO: 2 som er tilstrekkelig til å gi en økning av antallet lymfoide celler i cellene fra benmarg eller perifert blod, sammenlignet med celler fra benmarg eller perifert blod dyrket i fravær av polypeptidet.
12. Fremgangsmåte ifølge krav 11, hvor de hematopoietiske cellene og de hematopoietiske forløpercellene er lymfoide celler.
13. Fremgangsmåte ifølge krav 12, hvor de lymfoide cellene er monocytter, makrofager eller T-celler.
14. Fremgangsmåte for påvisning av nærvær av zcytorl71ig-RNA i en biologisk prøve,karakterisert vedat den omfatter trinnene: (a) å sette en nukleinsyreprobe bestående av nukleotidene 106-519 fra SEQ ID NO:l, eller komplementær sekvens derav, under hybridiseringsbetingelser i forbindelse med enten (i) analyse-RNA-molekyler isolert fra den biologiske prøven, eller (ii) nukleinsyremolekyler syntetisert fra de isolerte RNA-molekylene; og (b) påvisning av dannelse av hybrider mellom nukleinsyreproben og enten analyse-RNA-molekylene eller de syntetiserte nukleinsyremolekylene, hvori nærvær av hybridene viser nærvær av zcytorl 71ig-RNA i den biologiske prøven.
15. Antistoff eller antigenbindende fragment derav ifølge krav 7, for anvendelse til behandling av: (a) inflammatorisk tarmsykdom; (b) ulcerøs kolitt; (c) Crohns sykdom; (d) atopisk dermatitt; (e) eksem; eller (f) psoriasis.
NO20043419A 2002-01-18 2004-08-17 Polypeptid som binder zcytor17-polypeptidet, dets polynukleotid, ekspresjonsvektor og dyrket celle med ekspresjonsvektoren, og fremgangsmate for fremstilling av polypeptidet, samt antistoff som bindes til polypeptidet og dets anvendelse til behandling, og fremgangsmate for ekspansjon av celler, og for pavisning av zcytor17lig-RNA i en biologisk prove. NO332266B1 (no)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US35032502P 2002-01-18 2002-01-18
US37532302P 2002-04-25 2002-04-25
US43531502P 2002-12-19 2002-12-19
PCT/US2003/001984 WO2003060090A2 (en) 2002-01-18 2003-01-21 Novel cytokine zcytor17 ligand

Publications (2)

Publication Number Publication Date
NO20043419L NO20043419L (no) 2004-10-18
NO332266B1 true NO332266B1 (no) 2012-08-13

Family

ID=27407940

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20043419A NO332266B1 (no) 2002-01-18 2004-08-17 Polypeptid som binder zcytor17-polypeptidet, dets polynukleotid, ekspresjonsvektor og dyrket celle med ekspresjonsvektoren, og fremgangsmate for fremstilling av polypeptidet, samt antistoff som bindes til polypeptidet og dets anvendelse til behandling, og fremgangsmate for ekspansjon av celler, og for pavisning av zcytor17lig-RNA i en biologisk prove.

Country Status (21)

Country Link
US (12) US7064186B2 (no)
EP (3) EP1961811B1 (no)
JP (1) JP4795641B2 (no)
KR (1) KR101013401B1 (no)
CN (2) CN101843895A (no)
AT (3) ATE536406T1 (no)
AU (2) AU2003225525B2 (no)
BR (1) BR0306979A (no)
CA (1) CA2473686C (no)
CY (1) CY1112833T1 (no)
DE (2) DE60333963D1 (no)
DK (3) DK2230299T3 (no)
ES (3) ES2377188T3 (no)
IL (3) IL163066A (no)
NO (1) NO332266B1 (no)
PL (1) PL211833B1 (no)
PT (1) PT2230299E (no)
RU (2) RU2490276C2 (no)
SI (1) SI2230299T1 (no)
WO (1) WO2003060090A2 (no)
ZA (1) ZA200405695B (no)

Families Citing this family (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2135953B1 (en) 1999-06-02 2014-04-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Novel hemopoietin receptor protein, Nr. 10
EP1221482B1 (en) 1999-09-27 2005-12-28 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Hemopoietin receptor protein, nr12
US20030096339A1 (en) 2000-06-26 2003-05-22 Sprecher Cindy A. Cytokine receptor zcytor17
DK2230299T3 (da) * 2002-01-18 2012-03-26 Zymogenetics Inc Hidtil ukendt cytokin ZCYTOR17-ligand
EP2840089A1 (en) * 2002-01-18 2015-02-25 ZymoGenetics, Inc. Cytokine receptor zcytor17 multimers
US9738700B2 (en) 2002-01-18 2017-08-22 Zymogenetics Inc. ZCYTOR17 heterodimeric cytokine receptor
WO2005040380A1 (ja) * 2003-10-29 2005-05-06 Bml, Inc. げっ歯類動物の免疫応答調節蛋白質
JP2007068402A (ja) * 2003-12-26 2007-03-22 Bml Inc 免疫応答調節蛋白質
CA2580084A1 (en) * 2004-11-03 2006-05-18 Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc. T cell proteins and nucleotides encoding the same
WO2006081573A2 (en) * 2005-01-28 2006-08-03 Zymogenetics, Inc. Homogeneous preparations of il-31
WO2006088955A2 (en) * 2005-02-14 2006-08-24 Zymogenetics, Inc. Methods of treating diseases which are mediated by cutaneous lymphocyte antigen positive cells
AU2012202218B2 (en) * 2005-02-14 2014-05-22 National Jewish Medical And Research Center Methods Of Treating Diseases Which Are Mediated By Cutaneous Lymphocyte Antigen Positive Cells
EP1858924A1 (en) 2005-02-14 2007-11-28 ZymoGenetics, Inc. Methods of treating skin disorders using an il-31ra antagonist
EP1869224A4 (en) * 2005-04-15 2009-11-18 Oncomethylome Sciences Inc METHYLATION MARKERS FOR THE DIAGNOSIS AND TREATMENT OF CANCERS
US20130216542A1 (en) 2005-05-06 2013-08-22 Zymogenetics, Inc. Variable region sequences of il-31 monoclonal antibodies and methods of use
ES2561628T3 (es) * 2005-05-06 2016-02-29 Zymogenetics, Inc. Anticuerpos monoclonales IL-31 y métodos de uso
US8101183B2 (en) 2005-05-06 2012-01-24 Zymogentics, Inc. Variable region sequences of IL-31 monoclonal antibodies
CA2633439A1 (en) 2006-01-10 2007-11-22 Zymogenetics, Inc. Methods of treating pain and inflammation in neuronal tissue using il-31ra and osmrb antagonists
EP4342995A3 (en) * 2006-03-31 2024-05-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for controlling blood pharmacokinetics of antibodies
MY157796A (en) 2006-06-08 2016-07-29 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Preventive or remedy for inflammatory disease
CA2660175C (en) * 2006-09-01 2015-05-12 Zymogenetics, Inc. Variable region sequences of il-31 monoclonal antibodies and methods of use
US8278056B2 (en) 2008-06-13 2012-10-02 Oncohealth Corp. Detection of early stages and late stages HPV infection
WO2008086505A2 (en) * 2007-01-10 2008-07-17 Zymogenetics, Inc. Methods of using il-31 to treat airway hyper-responsiveness and asthma
AR068563A1 (es) 2007-09-26 2009-11-18 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Region constante de anticuerpo mutante
WO2009041643A1 (ja) * 2007-09-26 2009-04-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cdrのアミノ酸置換により抗体の等電点を改変する方法
WO2009052487A2 (en) * 2007-10-18 2009-04-23 University Of South Florida Method of detecting oncogenesis of hematopoietic cells
ES2585480T3 (es) * 2007-12-05 2016-10-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anticuerpo anti-NR10 y uso del mismo
AU2008332276B2 (en) 2007-12-05 2014-02-27 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Therapeutic agent for pruritus
DK2796466T3 (en) 2007-12-07 2018-02-05 Zymogenetics Inc HUMANIZED ANTIBODY MOLECULE SPECIFIC TO IL-31
JP4954326B2 (ja) 2008-04-11 2012-06-13 中外製薬株式会社 複数分子の抗原に繰り返し結合する抗原結合分子
CA2724638C (en) 2008-05-27 2020-02-18 Dako Denmark A/S Hybridization compositions and methods comprising a polar aprotic solvent
WO2010097655A1 (en) * 2009-02-26 2010-09-02 Dako Denmark A/S Compositions and methods for rna hybridization applications
JP2010210772A (ja) 2009-03-13 2010-09-24 Dainippon Screen Mfg Co Ltd 液晶表示装置の製造方法
EP3674317A1 (en) 2009-03-19 2020-07-01 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody constant region variant
WO2010107110A1 (ja) 2009-03-19 2010-09-23 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
US8892184B2 (en) 2010-10-18 2014-11-18 Siemens Medical Solutions Usa, Inc. Systems and methods for reducing interference in a dual modality imaging system
EP4231014A3 (en) 2010-11-30 2024-03-20 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding to plurality of antigen molecules repeatedly
US8790651B2 (en) 2011-07-21 2014-07-29 Zoetis Llc Interleukin-31 monoclonal antibody
JP6185468B2 (ja) * 2011-08-12 2017-08-23 メロ バイオテクノロジー インコーポレイテッドＭｅｌｌｏ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ． 原核細胞内においてヘアピン様ｒｎａを発現させる方法及び組成物
EP2761028A1 (en) 2011-09-30 2014-08-06 Dako Denmark A/S Hybridization compositions and methods using formamide
US11118226B2 (en) 2011-10-21 2021-09-14 Agilent Technologies, Inc. Hybridization compositions and methods
US10196662B2 (en) * 2012-08-10 2019-02-05 Mello Biotechnology, Inc. Composition for producing microRNA precursors as drugs for enhancing wound healing and production method of the microRNA precursors
SG11201508829QA (en) 2013-05-30 2015-12-30 Biogen Ma Inc Oncostatin m receptor antigen binding proteins
US10464982B2 (en) 2014-04-23 2019-11-05 Emory University Compositions of GM-CSF and interleukin fusions for immune modulation and uses related thereto
EP3142692B1 (en) * 2014-05-12 2019-05-01 Technion Research & Development Foundation Limited Compositions comprising il-31 and uses thereof
BR112017022101A2 (pt) 2015-04-14 2018-07-31 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha composição farmacêutica para prevenção e/ou tratamento de dermatite atópica contendo antagonista de il-31 como ingrediente ativo
CN104826100A (zh) * 2015-04-16 2015-08-12 浙江海隆生物科技有限公司 一种猪瘟病毒重组亚单位疫苗的制备方法与应用
DE102015215840B4 (de) * 2015-08-19 2017-03-23 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Multiaperturabbildungsvorrichtung, Abbildungssystem und Verfahren zum Bereitstellen einer Multiaperturabbildungsvorrichtung
US10093731B2 (en) 2017-02-24 2018-10-09 Kindred Biosciences, Inc. Anti-IL31 antibodies for veterinary use
WO2021100794A1 (ja) 2019-11-20 2021-05-27 中外製薬株式会社 抗体含有製剤
CN111337666B (zh) * 2020-02-12 2021-04-02 山东大学 I-motif重组介导的FRET探针及其原位成像癌细胞表面蛋白质同源二聚化的应用
TWI765431B (zh) * 2020-11-25 2022-05-21 長庚大學 核酸放大系統及其方法

Family Cites Families (76)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4054646A (en) * 1973-07-30 1977-10-18 General Electric Method and apparatus for detection of antibodies and antigens
AU560472B2 (en) 1981-08-25 1987-04-09 Celltech Limited Yeast expression vectors
US4579821A (en) 1981-11-23 1986-04-01 University Patents, Inc. Control of DNA sequence transcription
US4656134A (en) 1982-01-11 1987-04-07 Board Of Trustees Of Leland Stanford Jr. University Gene amplification in eukaryotic cells
US4486533A (en) 1982-09-02 1984-12-04 St. Louis University Filamentous fungi functional replicating extrachromosomal element
US4599311A (en) 1982-08-13 1986-07-08 Kawasaki Glenn H Glycolytic promotersfor regulated protein expression: protease inhibitor
US4977092A (en) 1985-06-26 1990-12-11 Amgen Expression of exogenous polypeptides and polypeptide products including hepatitis B surface antigen in yeast cells
US4601978A (en) 1982-11-24 1986-07-22 The Regents Of The University Of California Mammalian metallothionein promoter system
US4603044A (en) 1983-01-06 1986-07-29 Technology Unlimited, Inc. Hepatocyte Directed Vesicle delivery system
US4713339A (en) 1983-01-19 1987-12-15 Genentech, Inc. Polycistronic expression vector construction
US4661454A (en) 1983-02-28 1987-04-28 Collaborative Research, Inc. GAL1 yeast promoter linked to non galactokinase gene
US5139936A (en) 1983-02-28 1992-08-18 Collaborative Research, Inc. Use of the GAL1 yeast promoter
US4650764A (en) 1983-04-12 1987-03-17 Wisconsin Alumni Research Foundation Helper cell
US4870008A (en) 1983-08-12 1989-09-26 Chiron Corporation Secretory expression in eukaryotes
US4931373A (en) 1984-05-25 1990-06-05 Zymogenetics, Inc. Stable DNA constructs for expression of α-1 antitrypsin
US4766073A (en) 1985-02-25 1988-08-23 Zymogenetics Inc. Expression of biologically active PDGF analogs in eucaryotic cells
EP0184576B1 (en) 1984-12-06 1990-06-27 Fina Research S.A. Promoters for the expression of foreign genes in yeast, plasmids comprising them, and uses thereof for the production of polypeptides
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
GR860984B (en) 1985-04-17 1986-08-18 Zymogenetics Inc Expression of factor vii and ix activities in mammalian cells
US4882279A (en) 1985-10-25 1989-11-21 Phillips Petroleum Company Site selective genomic modification of yeast of the genus pichia
US4935349A (en) 1986-01-17 1990-06-19 Zymogenetics, Inc. Expression of higher eucaryotic genes in aspergillus
GB8611832D0 (en) 1986-05-15 1986-06-25 Holland I B Polypeptide
US4980289A (en) 1987-04-27 1990-12-25 Wisconsin Alumni Research Foundation Promoter deficient retroviral vector
US5063154A (en) 1987-06-24 1991-11-05 Whitehead Institute For Biomedical Research Pheromone - inducible yeast promoter
US5567584A (en) 1988-01-22 1996-10-22 Zymogenetics, Inc. Methods of using biologically active dimerized polypeptide fusions to detect PDGF
ATE140963T1 (de) 1988-01-22 1996-08-15 Zymogenetics Inc Verfahren zur herstellung von sekretierten rezeptoranalogen
US4956288A (en) 1988-04-22 1990-09-11 Biogen, Inc. Method for producing cells containing stably integrated foreign DNA at a high copy number, the cells produced by this method, and the use of these cells to produce the polypeptides coded for by the foreign DNA
US5037743A (en) 1988-08-05 1991-08-06 Zymogenetics, Inc. BAR1 secretion signal
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5162228A (en) 1988-12-28 1992-11-10 Takeda Chemical Industries, Ltd. Gylceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene and promoter
US5124263A (en) 1989-01-12 1992-06-23 Wisconsin Alumni Research Foundation Recombination resistant retroviral helper cell and products produced thereby
US5116964A (en) 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
US5399346A (en) 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
US5162222A (en) 1989-07-07 1992-11-10 Guarino Linda A Use of baculovirus early promoters for expression of foreign genes in stably transformed insect cells or recombinant baculoviruses
IL99552A0 (en) 1990-09-28 1992-08-18 Ixsys Inc Compositions containing procaryotic cells,a kit for the preparation of vectors useful for the coexpression of two or more dna sequences and methods for the use thereof
JP3202999B2 (ja) 1991-01-31 2001-08-27 協和醗酵工業株式会社 肝移行性リポソーム製剤
US5298418A (en) 1991-09-16 1994-03-29 Boyce Thompson Institute For Plant Research, Inc. Cell line isolated from larval midgut tissue of Trichoplusia ni
US5641670A (en) 1991-11-05 1997-06-24 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and protein delivery
CA2144651A1 (en) 1992-09-14 1994-03-31 Timothy J. Miller Immortalized cells and uses therefor
WO1995007358A1 (en) 1993-07-30 1995-03-16 University Of Medicine & Dentistry Of New Jersey Efficient gene transfer into primary lymphocytes
US6117679A (en) 1994-02-17 2000-09-12 Maxygen, Inc. Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination
US5492841A (en) * 1994-02-18 1996-02-20 E. I. Du Pont De Nemours And Company Quaternary ammonium immunogenic conjugates and immunoassay reagents
US5783672A (en) 1994-05-26 1998-07-21 Immunex Corporation Receptor for oncostatin M
RU2102988C1 (ru) * 1995-02-10 1998-01-27 Зинченко Елена Вениаминовна Препарат с иммуномодулирующими свойствами
US6074849A (en) 1995-07-19 2000-06-13 Genetics Institute, Inc. Polynucleotides encoding human CTLA-8 related proteins
CA2237120C (en) 1995-11-09 2005-03-01 Zymogenetics, Inc. Compositions and methods for producing heterologous polypeptides in pichia methanolica
US6265184B1 (en) * 1995-12-20 2001-07-24 Icos Corporation Polynucleotides encoding chemokine receptor 88C
US5792850A (en) 1996-05-23 1998-08-11 Zymogenetics, Inc. Hematopoietic cytokine receptor
CN1238806A (zh) 1996-07-17 1999-12-15 津莫吉尼蒂克斯公司 甲醇毕赤酵母营养突变体的制备
AU718510B2 (en) 1996-07-17 2000-04-13 Zymogenetics Inc. Transformation of pichia methanolica
WO2002000690A2 (en) 2000-06-23 2002-01-03 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of disorders involving angiogenesis
KR20080059467A (ko) 1996-12-03 2008-06-27 아브게닉스, 인크. 복수의 ｖｈ 및 ｖｋ 부위를 함유하는 사람 면역글로불린유전자좌를 갖는 형질전환된 포유류 및 이로부터 생성된항체
GB9819420D0 (en) 1998-09-07 1998-10-28 Glaxo Group Ltd Novel receptor
WO2000068381A1 (en) * 1999-05-11 2000-11-16 Zymogenetics, Inc. Cytokine receptor mouse zcytor10
EP2135953B1 (en) 1999-06-02 2014-04-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Novel hemopoietin receptor protein, Nr. 10
AU6531101A (en) 2000-06-02 2001-12-17 Genentech Inc Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20030096339A1 (en) 2000-06-26 2003-05-22 Sprecher Cindy A. Cytokine receptor zcytor17
AU2001273032A1 (en) * 2000-06-26 2002-01-08 Zymogenetics Inc. Cytokine receptor zcytor17
AU2001273150A1 (en) 2000-07-20 2002-02-05 Genentech Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
JP2005507632A (ja) 2000-10-06 2005-03-24 イミュネックス・コーポレーション ヘマトポエチン受容体、ｈｐｒ１およびｈｐｒ２
WO2002077230A1 (fr) 2001-03-26 2002-10-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Variants d'epissage nr10
DK2230299T3 (da) 2002-01-18 2012-03-26 Zymogenetics Inc Hidtil ukendt cytokin ZCYTOR17-ligand
EP2840089A1 (en) 2002-01-18 2015-02-25 ZymoGenetics, Inc. Cytokine receptor zcytor17 multimers
DK1485477T3 (da) 2002-02-25 2009-08-10 Genentech Inc Hidtil ukendt type-1-cytokinreceptor GLM-R
US20060188409A1 (en) * 2005-01-19 2006-08-24 Irm Llc Multi-well container positioning devices, systems, computer program products, and methods
WO2006081573A2 (en) 2005-01-28 2006-08-03 Zymogenetics, Inc. Homogeneous preparations of il-31
EP1858924A1 (en) 2005-02-14 2007-11-28 ZymoGenetics, Inc. Methods of treating skin disorders using an il-31ra antagonist
WO2006088955A2 (en) 2005-02-14 2006-08-24 Zymogenetics, Inc. Methods of treating diseases which are mediated by cutaneous lymphocyte antigen positive cells
US20130216542A1 (en) 2005-05-06 2013-08-22 Zymogenetics, Inc. Variable region sequences of il-31 monoclonal antibodies and methods of use
ES2561628T3 (es) 2005-05-06 2016-02-29 Zymogenetics, Inc. Anticuerpos monoclonales IL-31 y métodos de uso
US8101183B2 (en) 2005-05-06 2012-01-24 Zymogentics, Inc. Variable region sequences of IL-31 monoclonal antibodies
CA2633439A1 (en) 2006-01-10 2007-11-22 Zymogenetics, Inc. Methods of treating pain and inflammation in neuronal tissue using il-31ra and osmrb antagonists
CA2660175C (en) 2006-09-01 2015-05-12 Zymogenetics, Inc. Variable region sequences of il-31 monoclonal antibodies and methods of use
WO2008086505A2 (en) 2007-01-10 2008-07-17 Zymogenetics, Inc. Methods of using il-31 to treat airway hyper-responsiveness and asthma
DK2796466T3 (en) 2007-12-07 2018-02-05 Zymogenetics Inc HUMANIZED ANTIBODY MOLECULE SPECIFIC TO IL-31

Also Published As

Publication number Publication date
US7507795B2 (en) 2009-03-24
US20090149635A1 (en) 2009-06-11
US8124378B2 (en) 2012-02-28
ES2351678T3 (es) 2011-02-09
BR0306979A (pt) 2004-11-23
EP2230299A1 (en) 2010-09-22
IL210455A (en) 2014-02-27
KR20040082394A (ko) 2004-09-24
AU2003225525A1 (en) 2003-07-30
EP2230299B1 (en) 2011-12-07
ES2310660T3 (es) 2009-01-16
DK2230299T3 (da) 2012-03-26
EP1476541A4 (en) 2006-01-11
US7459293B2 (en) 2008-12-02
US20060141579A1 (en) 2006-06-29
US20090192292A1 (en) 2009-07-30
PL371586A1 (en) 2005-06-27
DE60333963D1 (de) 2010-10-07
EP1476541B1 (en) 2008-07-16
US8013124B2 (en) 2011-09-06
US20030224487A1 (en) 2003-12-04
CN1643138A (zh) 2005-07-20
CA2473686A1 (en) 2003-07-24
EP1961811B1 (en) 2010-08-25
US20070077627A1 (en) 2007-04-05
AU2003225525B2 (en) 2008-07-24
CA2473686C (en) 2011-09-20
ES2377188T3 (es) 2012-03-23
US20070111266A1 (en) 2007-05-17
CY1112833T1 (el) 2016-02-10
RU2004125165A (ru) 2005-04-20
RU2490276C2 (ru) 2013-08-20
AU2008230054B2 (en) 2012-01-19
SI2230299T1 (sl) 2012-07-31
US7064186B2 (en) 2006-06-20
DK1961811T3 (da) 2010-11-08
WO2003060090A2 (en) 2003-07-24
US20150010946A1 (en) 2015-01-08
US20110196128A1 (en) 2011-08-11
ATE478944T1 (de) 2010-09-15
US8778344B2 (en) 2014-07-15
IL210454A0 (en) 2011-03-31
AU2008230054A1 (en) 2008-11-13
US20070249020A1 (en) 2007-10-25
JP4795641B2 (ja) 2011-10-19
NO20043419L (no) 2004-10-18
US20190338020A1 (en) 2019-11-07
PT2230299E (pt) 2012-03-02
DE60322188D1 (de) 2008-08-28
US7425325B2 (en) 2008-09-16
EP1476541A2 (en) 2004-11-17
IL210454A (en) 2014-02-27
ZA200405695B (en) 2005-03-30
RU2008118227A (ru) 2009-11-20
PL211833B1 (pl) 2012-06-29
ATE401390T1 (de) 2008-08-15
US7531636B2 (en) 2009-05-12
US20130156695A1 (en) 2013-06-20
US20180155418A1 (en) 2018-06-07
ATE536406T1 (de) 2011-12-15
CN100575482C (zh) 2009-12-30
KR101013401B1 (ko) 2011-02-14
DK1476541T3 (da) 2008-11-03
RU2360923C2 (ru) 2009-07-10
WO2003060090A3 (en) 2004-04-01
US9605062B2 (en) 2017-03-28
JP2005526494A (ja) 2005-09-08
IL163066A (en) 2011-08-31
EP1961811A1 (en) 2008-08-27
US7740834B2 (en) 2010-06-22
IL210455A0 (en) 2011-03-31
CN101843895A (zh) 2010-09-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20190338020A1 (en) Il-31 antibody compositions
AU2003280410B2 (en) Cytokine receptor zcytor17 multimers
AU2012202219A1 (en) Novel Cytokine Zcytor17 Ligand

Legal Events

Date Code Title Description
MM1K Lapsed by not paying the annual fees