CN101843895A - 新的细胞因子zcytor17配体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及zcytor171ig多核苷酸、多肽及抗-zcytor17抗体分子。所述zcytor171g是新的细胞因子。该多肽可用于刺激免疫系统，以及造血细胞的体外和体内增殖和/和发育的方法中。本发明也包括制备该蛋白的方法、其应用及其抗体。

Description

新的细胞因子ZCYTOR17配体
相关申请的引用
本申请涉及2002年12月19日递交的美国临时申请系列号No.60/435,315、2002年4月25日递交的美国临时申请系列号No.60/375,323以及2002年1月18日递交的美国临时申请系列号60/350,325。根据条款35 U.S.C.§119(e)(1)，本申请要求所述临时申请的利益。
发明背景
多细胞生物体细胞的增殖和分化受激素和多肽生长因子的调控。这些可扩散分子允许细胞彼此之间相互通讯，并协同作用形成细胞、组织和器官，并修复受损组织。激素和生长因子的实例包括类固醇激素(例如雌激素，睾丸激素)、甲状旁腺激素、促卵激素、白介素、血小板衍生生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、促红细胞生成素(EPO)和降血钙素。
激素和生长因子通过结合受体影响细胞代谢。受体可以是膜整合蛋白，与细胞内的信号传导路径相关联，例如第二信使系统。其它类的受体是可溶性分子，例如转录因子。
细胞因子通常刺激造血谱系细胞的增殖或分化，或者参与身体的免疫和炎症反应机制。影响造血的细胞因子的实例有促红细胞生成素(EPO)，其刺激红血球的发育；促血小板生成素(TPO)，其刺激巨核细胞世系细胞的发育；以及粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，其刺激嗜中性粒细胞的发育。这些细胞因子在患有贫血症、血小板减少症和嗜中性白血球减少症或者接受癌症化疗的患者中可用于恢复正常血球水平。
白介素是介导免疫应答(包括炎症)的细胞因子家族。白介素介导许多炎症病理。对于免疫应答主要的是T细胞，它产生许多细胞因子和针对抗原的适应性免疫。T细胞产生的细胞因子被分为1型和2型(Kelso，A.Immun.Cell Biol.76：300-317，1998)。1型细胞因子包括IL-2、IFN-γ、LT-α，并参与炎症反应、病毒免疫性、胞内寄生物免疫力和同种异体移植排斥。2型细胞因子包括IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL-13，并参与体液应答、蠕虫免疫力及变态反应。1型和2型共有的细胞因子包括IL-3、GM-CSF和TNF-α。有些证据提示1型和2型生产T细胞群优先迁往不同类型的炎症组织中。
成熟T细胞能够被例如抗原或其它刺激物激活，产生例如进一步影响T细胞群命运的细胞因子、生物化学信号传导分子或受体。
B细胞能够被其细胞表面的受体(包括B细胞受体和其它辅助分子)激活，行使辅佐细胞功能，例如产生细胞因子。
单核细胞/巨噬细胞及T细胞能够被其细胞表面的受体激活，并通过向淋巴细胞提呈抗原而在免疫应答中起着中心作用，并且也作为淋巴细胞的辅佐细胞发挥作用，分泌数目众多的细胞因子。
天然杀伤(NK)细胞与T细胞和B细胞具有共同的先祖细胞，并在免疫监视中发挥作用。NK细胞构成高达15％的血淋巴细胞，并且不表达抗原受体，因而不以MHC识别作为与靶细胞结合的必要条件。NK细胞参与识别并杀死某些肿瘤细胞和病毒感染的细胞。在体内，认为NK细胞需要激活，不过，在体外，已证明NK细胞无需激活而杀死某些类型的肿瘤细胞。
已证明了的细胞因子家族的体内活性表明了其它细胞因子、细胞因子激动剂及细胞因子拮抗剂的众多临床潜能及需求。本发明满足这些需求，提供了新的刺激造血细胞谱系细胞的细胞因子，以及相关组合物和方法。
本发明提供了用于这些用途及由于本文的教导对本领域技术人员将显而易见的其它用途的此类多肽。
附图的简短说明
图1图解了人zcytor17lig(SEQ ID NO：2)(zcytor17lig)、小鼠zcytor17lig(SEQ ID NO：11)(mzcytor17lig)、小鼠IL-3(mIL-3)(SEQ ID NO：100)及人IL-3(hIL-3)(SEQ ID NO：102)的多重比对。
图2图解了人zcytor17lig(SEQ ID NO：2)(zcytor17lig)及小鼠zcytor17lig(SEQ ID NO：11)(mzcytor17lig)的多重比对。
图3是人zcytor17lig(SEQ ID NO：2)的Hopp/Woods亲水图。
发明详述
在详细阐明本发明之前，定义如下术语可能有助于对其的理解：
术语“亲和标签”在本文用来指能够连附于第二多肽以供第二多肽的纯化或检测，或者为第二多肽与底物的连接提供位点的多肽区段。原则上，任何可获得其抗体或其它特异性结合剂的肽或蛋白都可用作为亲和标签。亲和标签包括多组氨酸段、蛋白A(Nilsson等，EMBO J.4：1075，1985；Nilsson等，Methods Enzymol.198：3，1991)、谷光甘肽S转移酶(Smith和Johnson，Gene 67：31，1988)、Glu-Glu亲和标签(Grussenmeyer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：7952-4，1985)、物质P、FlagTM肽(Hopp等，Biotechnology 6：1204-10，1988)、链霉抗生物素蛋白结合肽或者其它抗原表位或结合结构域。一般参见Ford等，Protein Expression and Purification 2：95-107，1991。编码亲和标签的DNA可从商业供应商获得(如Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)。
术语“等位变体”在本文用来指占据同一染色体座位的基因的任何两个或多个备选形式。等位基因变异通过突变自然发生，并且可导致种群内表型多态性。基因突变可以是沉默的(编码的多肽无变化)或者可能编码具有改变的氨基酸序列的多肽。术语等位变体也用于指基因的等位变体编码的蛋白值。
术语“氨基端”及“羧基端”在文中用于指多肽内的位置。当上下文允许时，这些术语参照多肽的特定序列或部分使用，用于指邻近或相对位置。例如，位于多肽内参照序列羧基端的某一序列处于该参照序列羧基端附近，但不一定处于所述完整多肽的羧基端。
术语“互补物/反互补物对”是指在合适条件下形成非共价结合的稳定配对的不相同成分。例如，生物素和抗生物素蛋白(或链霉抗生物素蛋白)是互补物/反互补物对的原型成员。其它例示性的互补物/反互补物对包括受体/配体对、抗体/抗原(或半抗原或表位)对、正义/反义多核苷酸对等。当期望该互补物/反互补物对随后解离时，该互补物/反互补物对优选具有＜109M-1的结合亲和力。
术语“多核苷酸分子的互补物”是指与参照序列相比，具有互补碱基序列且反向的多核苷酸分子。例如，序列5′ATGCACGGG 3′与5′CCCGTGCAT 3′互补。
术语“毗连序列(contig)”是指具有邻接的一段与另一多核苷酸相同或互补的序列的多核苷酸。邻接序列被表述为与给定的一段多核苷酸序列在其全长上或沿该多核苷酸的部分区段上“重叠”。例如，多核苷酸序列5′-ATGGCTTAGCTT-3′的代表性毗连序列(contig)是5′-TAGCTTgagtct-3′和3′-gtcgacTACCGA-5′。
术语“简并核苷酸序列”是指(与编码多肽的参照多核苷酸分子相比)包括一个或多个简并密码子的核苷酸序列。简并密码子含不同的核苷酸三联体，但编码同一氨基酸残基(即GAU和GAC三联体各自编码Asp)。
术语“表达载体”用于指线性或环状的DNA分子，其包括编码目的多肽的片段，可操作地连接于供其转录的附加片段。此类附加片段包括启动子和终止子序列，并且也可以包括一个或多个复制起点、一个或多个可选择标记、增强子、多聚腺苷酰化信号等。表达载体通常衍生自质粒或病毒载体，或者可能含有两者的元件。
当用于多核苷酸时，术语“分离的”是指该多核苷酸已自其天然遗传环境中取出，因而不含其它外源或不想要的编码序列，并且是适于在遗传改造的蛋白生产系统中应用的形式。此类分离的分子是那些从其天然环境中分离的，并且包括cDNA和基因组克隆。本发明分离的DNA分子不含它们通常与之相关的其它基因，但可以包括天然存在的5′和3′非翻译区，例如启动子和终止子。相关区域的鉴定对本领域普通技术人员来说将是显而易见的(例如参见Dynan和Tijan，Nature 316：774-78，1985)。
“分离的”多肽或蛋白是见于除其天然环境以外的条件下的多肽或蛋白，例如离开了血液和动物组织。在优选的形式中，分离的多肽实质上不含其它多肽，尤其是动物来源的其它多肽。优选以高度纯的形式提供多肽，即大于95％纯，更优选大于99％纯。当用于本上下文时，术语“分离的”不排除以备选的物理形式存在的同一多肽，例如二聚体或备选糖基化或衍生化形式。
术语“瘤的”在言及细胞时，表示经历新的和异常的增殖的细胞，尤其是在如下组织中，其中增殖是非控制性的和渐进性的，导致肿瘤。瘤细胞可以是恶性的，即侵袭性和转移性的，或者是良性的。
术语“可操作地连接”在言及DNA片段时，表示如此安置这些片段，从而使其为了其计划的目的而协调发挥功能，例如，转录自启动子起始，并通过编码片段，前进到终止子。
术语“直向同源物(ortholog)”是指从一个物种获得的多肽或蛋白，它是来自不同物种的多肽或蛋白的功能对应物。直向同源物间的序列差异是物种形成的结果。
“共生同源物(Paralogs)”是由生物体产生的不同但结构相关的蛋白。共生同源物被认为是通过基因重复产生的。例如，α-球蛋白、β-球蛋白和肌红蛋白是彼此的共生同源物。
“多核苷酸”是从5′到3′端阅读的单链或双链的脱氧核糖核苷或核糖核苷碱基的聚合物。多核苷酸包括RNA和DNA，并且可自天然来源分离、体外合成、或由天然及合成分子的组合制备。多核苷酸的大小表达为碱基对(缩写为″bp″)、核苷酸(″nt″)或千碱基对(″kb″)。在上下文允许时，后两种术语可描述单链或双链的多核苷酸。当该术语用于双链分子时，它用来指整体长度，并将理解为等同于术语“碱基对”。本领域技术人员将意识到双链多核苷酸的两条链可能在长度上稍有差异，且其末端可能因酶促切割的缘故而参差不齐；因而可能双链多核苷酸分子内并非所有的核苷酸都配对。
“多肽”是天然或合成产生的，通过肽键连接的氨基酸残基聚合物。少于大约10个氨基酸残基的多肽通常称之为“肽”。
术语“启动子”以本领域所熟知的含义在文中应用，是指含有供RNA聚合酶结合及转录起始的DNA序列的基因的一部分。启动子序列通常，但并不总是见于基因的5′非编码区。
“蛋白”是包括一个或多个多肽链的大分子。蛋白也可以包括非肽组分，例如碳水化合物基团。碳水化合物及其它非肽取代基可通过产生蛋白的细胞添加到蛋白上，并将随着细胞类型而变。蛋白在文中以其氨基酸主链结构进行定义；取代基如碳水化合物基团一般不说明，但依然可以存在。
术语“受体”是指与生物活性分子(即配体)结合并介导该配体对细胞的效应的细胞结合蛋白。膜结合受体以多个肽的结构为特征，包括胞外配体结合结构域和典型地参与信号转导的胞内效应结构域。配体与受体的结合致使受体的构象改变，导致效应结构域和细胞中其它分子之间的互作。这种互作又导致细胞代谢的改变。与受体-配体互作有关联的代谢事件包括基因转录、磷酸化、脱磷酸化、环状AMP产量的提高、细胞钙动员、膜脂动员、细胞粘附、肌醇酯的水解及磷脂的水解。一般而言，受体可以是膜结合的、胞浆或核中的；单体(例如，促甲状腺激素受体，β-肾上腺素受体)或多聚体(例如，PDGF受体，生长激素受体，IL-3受体，GM-CSF受体，G-CSF受体，促红细胞生成素受体和IL-6受体)。
术语“分泌信号序列”是指编码多肽(“分泌肽”)的DNA序列，所述多肽作为较大多肽的组分，指导该较大多肽穿过合成它的细胞的分泌路径。所述较大多肽通常在穿过分泌路径的运输期间被切割以除去分泌肽。
术语“剪接变体”在文中用于指自基因转录的RNA的替代形式。剪接变型通过使用转录的RNA分子内的，或者不太常见的分别转录的RNA分子之间的替代性剪接位点而天然发生，并可能导致数种mRNA由同一个基因转录。剪接变体可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。术语剪接变体在文中也用来指由基因转录的mRNA的剪接变体编码的蛋白。
由不精确分析法(如凝胶电泳)测定的聚合物的分子量和长度应理解为近似值。当此种数值表达为“大约”X或“大致”X时，应理解所述的X值为准确到±10％。
文中引用的所有参考文献特此全文并入作为参考。
本发明部分地是基于编码具有四螺旋束细胞因子结构的蛋白的新DNA序列的发现。通过本文详细描述的克隆过程及增殖测定，鉴定了编码新的配体多肽的多核苷酸序列，它是对受体zcytor17(SEQ ID NO：5)以及包括制瘤素M受体beta(OSMRbeta)(SEQ ID NO：7)和WSX-1(SEQID NO：9)的至少一个附加亚基具有高度特异性的配体。该多肽配体被命名为zcytor17lig，分离于从选择有CD3的激活人外周血细胞(hPBC)产生的cDNA文库。CD3是淋巴起源的细胞尤其是T细胞特有的细胞表面标志。
在下面的实施例中，利用在不存在其它生长因子时依赖于OSMRbeta和zcytor17受体相关路径、或依赖于OSMRbeta和WSX-1以及zcytor17受体相关路径存活和生长的细胞系筛选编码zcytor17lig的cDNA的来源。优选的用于转染和表达zcytor17受体的生长因子依赖性细胞系为BaF3(Palacios和Steinmetz，Cell 41：727-734，1985；Mathey-Prevot等，Mol.Cell.Biol.6：4133-4135，1986)。不过，其它生长因子依赖性细胞系例如FDC-P1(Hapel等，Blood 64：786-790，1984)和M07e(Kiss等，Leukemia 7：235-240，1993)也适用于此目的。
OSMR、WSX-1及zcytor17受体的氨基酸序列显示编码的受体属于I类细胞因子受体亚家族，该亚家族包括但不限于IL-2、IL-4、IL-7、Lif、IL-12、IL-15、EPO、TPO、GM-CSF和G-CSF的受体(综述参见Cosman，″The Hematopoietin Receptor Superfamily″in Cytokine 5(2)：95-106，1993)。zcytor17受体在共同拥有的PCT专利申请No.US01/20484(WIPO公开号No.WO 02/00721)中有充分描述，而WSX-1在美国专利No.5,925,735中有充分描述。zcytor17受体mRNA组织分布的分析揭示了在激活的CD4+和CD8+ T细胞亚型、CD14+单核细胞中的表达，以及在CD19+B细胞中的弱表达。而且，mRNA在静息或激活的细胞系THP-1(ATCC No.TIB-202)、U937(ATCC No.CRL-1593.2)和HL60(ATCC No.CCL-240)中都存在。
WSX-1的表达在胸腺、脾、PBL及淋巴结中最强，并在激活的T细胞中观察到增强的表达。OSMRbeta的组织分布被描述为非常广泛。这三个受体的组织分布提示推测的Zcytor17lig的靶是造血谱系细胞，尤其是T细胞、单核细胞/巨噬细胞和淋巴样先祖细胞及淋巴样细胞。作用于淋巴样细胞的其它已知的四螺旋束细胞因子包括IL-2、IL-4、IL-7及IL-15。四螺旋束细胞因子的综述参见Nicola等，Advances in Protein Chemistry 52：1-65，1999以及Kelso，A.，Immunol.Cell Biol.76：300-317，1998。
来自CD3+选择的、PMA/离子霉素刺激的人外周血细胞的条件培养基(CM)支持否则将依赖于IL-3的、表达zcytor17受体、OSMRbeta及WSX-1受体的BaF3细胞的生长。来自并非：1)PMA/离子霉素刺激的；或并非：2)CD3选择的(有或无PMA/离子霉素刺激)细胞的条件培养基不支持表达zcytor17、OSMRbeta及WSX-1的(BaF3/zcytor17/WSX-1/OSMRbeta)受体表达细胞Baf3细胞的生长。对照实验证明这种增殖活性不归因于其它已知的生子因子，并且此类条件培养基刺激zcytor17/WSX-1/OSMRbeta受体表达细胞增殖的能力能够被可溶形式的zcytor17受体中和。
来自用PMA/离子霉素激活的CD3+选择的细胞的条件培养基也支持表达zcytor17受体和OSMRbeta受体(zcytor17/OSMRbeta)的Baf3细胞的生长，而只表达zcytor17受体和WSX-1受体(zcytor17/WSX-1)或者只含OSMRbeta受体的BaF3细胞不被该条件培养基刺激。
暴露于来自CD3+选择的、PMA/离子霉素刺激的人外周血细胞的CM的zcytor17/WSX-1/OSMRbeta受体表达BaF3细胞的增殖通过对培养物的视觉检查和/或增殖测定法鉴定。许多合适的增殖测定是本领域公知的，并且包括染料还原的测定法，染料例如AlamarBlueTM(AccuMedInternational，Inc.Westlake，Ohio)，3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑鎓溴化物(Mosman，J.Immunol.Meth.65：55-63，1983)；3，(4，5二甲基噻唑-2-基)-5-3-羧甲氧苯基-2H-四唑鎓；2，3-双(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-5-[(苯基氨基)羰基]-2H-四唑鎓氢氧化物以及氰基二甲苯基-四唑鎓氯化物(商业上可获自于Polysciences，Inc.，Warrington，PA)；有丝分裂发生测定法，例如测量3H-胸腺嘧啶脱氧核苷的掺入；利用例如萘黑或锥虫蓝的染料排除测定法；利用二乙酰荧光素的染料摄取法以及铬释放法。一般参见Freshney，Culture of Animal Cells：A Manual of Basic Technique，第3版，Wiley-Liss，1994，特此并入作为参考。
自CD3+选择的、PMA及离子霉素刺激的原代人外周血细胞制备cDNA文库。将该CD3+选择的、PMA及离子霉素刺激的人外周血细胞cDNA文库分成含多个cDNA分子的库，并转染宿主细胞系如BHK 570细胞(ATCC保藏号No.10314)。在不含外源生长因子(如5％ FBS)的培养基中培养转染的宿主细胞，并收集条件培养基。测定条件培养基刺激转染了zcytor17、WSX-1和OSMRbeta受体的BaF3细胞增殖的能力。鉴定产生能刺激BaF3/zcytor17/WSX-1/OSMRbeta受体细胞的条件培养基的cDNA库。用该库的质粒cDNA电转化大肠杆菌(E.coli)。自单个克隆分离cDNA并单独转染到BHK 570细胞中。阳性克隆通过BaF3/zcytor17/WSX-1/OSMRbeta受体增殖测定的阳性结果鉴定，且该活性通过利用可溶性zcytor17受体的增殖中和证实。
分离阳性克隆，且序列分析揭示质粒DNA内所含的多核苷酸序列是新的。分泌信号序列由氨基酸残基1(Met)到23(Ala)组成，而成熟多肽由氨基酸残基24(Ser)到164(Thr)组成(如SEQ ID NO：2所示)。对来自293T细胞的纯化zcytor17lig的进一步N-末端序列分析显示了位于如SEQ ID NO：2中所示的残基27(Leu)的N-末端，而成熟多肽由氨基酸残基27(Leu)到164(Thr)组成(如SEQ ID NO：2所示)。
一般地，推测细胞因子具有四个α螺旋结构，其中螺旋A、C和D在配体-受体互作中最为重要，并且在该家族成员中更为高度保守。参照如SEQ ID NO：2中所示的人类zcytor17lig氨基酸序列、人zcytor17lig、人IL-3以及人类细胞因子氨基酸序列的比对，推测zcytor17lig螺旋A被定义为氨基酸残基38-52；螺旋B为氨基酸残基83-98；螺旋C为氨基酸残基104-117；而螺旋D为氨基酸残疾137-152，如SEQ ID NO：2所示。结构分析提示A/B环长，B/C环短而C/D环长。该环结构导致上-上-下-下的螺旋组织。根据4-螺旋束结构，zcytor17lig内保守的半胱氨酸残基对应于SEQ ID NO：2的氨基酸残基72、133和147以及本文描述的SEQ ID NO：11的氨基酸残基74、137和151。一致的半胱氨酸排布进一步确认了四螺旋束结构。zcytor17lig中同样高度保守的是如SEQ ID NO：2中残基43所示的Glu残基。
而且，推测的鼠zcytor17lig的氨基酸序列与推测的人蛋白在序列全长上表现出31％的同一性(SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：11)。根据人和鼠zcytor17lig序列之间的比较，于推测编码α螺旋C和D的区域发现保守残基。编码本文所述人zcytor17lig多肽区域、结构域、基序、残基及序列的相应多核苷酸示于SEQ ID NO：1。
虽然螺旋D在人和鼠zcytor17lig之间相对保守，但螺旋C最为保守。虽然两物种在该区具有占主导地位的酸性氨基酸，但差异可能解释了zcytor17lig与其受体、包括zcytor17的单体、杂二聚体(例如，zcytor17/OSMRbeta，WSX-1/OSMRbeta，zcytor17/WSX-1)或多聚体(如zcytor17/OSMRbeta/WSX-1)受体之间互作的种特异性。zcytor17lig的环A/B和螺旋B不太保守，而螺旋C经环C/D到螺旋D在物种之间最为保守；经这些区域的保守提示它在功能上的重要性。人和鼠zytor17lig的D螺旋也是保守的。可通过zytor17lig螺旋D内的突变设计Zcytor17受体的拮抗剂。这些可包括蛋白自残基Thr156(SEQ ID NO：2)的截短，或者保留使得配体与受体结合的残基，但消除信号传导活性。
四螺旋束细胞因子也以其组成螺旋的长度分类。“长螺旋”型细胞因子一般由24-30个残基之间的螺旋构成，并且包括IL-6、睫状神经营养因子(CNTF)、白血病抑制因子(LIF)和人生长激素(hGH)。“短螺旋”型细胞因子一般由18-21个残基之间的螺旋构成，并且包括IL-2、IL-4和GM-CSF。Zcytor17lig被认为是短螺旋型细胞因子类的新成员。利用CNTF和IL-6的研究证明CNTF螺旋可互换为IL-6中的等效螺旋，赋予嵌合体以CTNF结合特性。因而，似乎四螺旋细胞因子的功能结构域是以结构同源性为基础确定的，与序列同一性无关，并且可在嵌合体中维持功能的完整性(Kallen等，J.Biol.Chem.274：11859-11867，1999)。因此，zcytor17lig的螺旋结构域将可用于制备嵌合体融合分子，尤其是与其它短螺旋型细胞因子，以确定和调整受体结合特异性。特别关注的是由螺旋A和/或螺旋D改造的融合蛋白，以及组合了其它短型细胞因子例如IL-2、IL-4、IL-15、Lif、IL-12、IL-3和GM-CSF的螺旋和环结构域的融合蛋白。
人IL-2多核苷酸序列示于SEQ ID NO：161，而相应的氨基酸序列示于SEQ ID NO：162。分泌信号序列由SEQ ID NO：162的氨基酸残基1(Met)到20(Ser)、SEQ ID NO：161的核苷酸48到107组成。成熟多肽由SEQ ID NO：162的氨基酸残基21(Ala)到156(Thr)、SEQ ID NO：161的核苷酸108到515组成。人IL-2的螺旋A由SEQ ID NO：162的氨基酸残基27(Thr)到48(Leu)、SEQ ID NO：161的核苷酸126到191组成。人IL-2的螺旋B包括螺旋B1和螺旋B2。人IL-2的螺旋B1由SEQ ID NO：162的氨基酸残基73(Ala)到80(Gln)、SEQ ID NO：161的核苷酸264到287组成。人IL-2的螺旋B2由SEQ ID NO：162的氨基酸残基83(Glu)到92(Val)、SEQ ID NO：161的核苷酸294到323组成。因而，IL-2螺旋B(包括螺旋B1和B2)由SEQ ID NO：168的氨基酸序列(核苷酸序列SEQ ID NO：167)代表，其中氨基酸残基9和10可以是任何氨基酸。SEQ ID NO：168与SEQ ID NO：162的氨基酸73(Ala)到92(Val)相同，在SEQ ID NO：162中氨基酸81和82是任何氨基酸。在优选的形式中，IL-2螺旋B由SEQ ID NO：162的氨基酸73(Ala)到92(Val)、SEQ ID NO：161的核苷酸264到323组成。人IL-2的螺旋C由SEQ ID NO：162的氨基酸残基102(His)到116(Val)、SEQ IDNO：161的核苷酸351到395组成。人IL-2的螺旋D由SEQ ID NO：162的氨基酸残基134(Thr)到149(Gln)、SEQ ID NO：161的核苷酸447到494组成。
人IL-4多核苷酸序列示于SEQ ID NO：163，而相应的氨基酸序列示于SEQ ID NO：164。分泌信号序列由SEQ ID NO：164的氨基酸残基1(Met)到24(Gly)、SEQ ID NO：163的核苷酸64到135组成。成熟多肽由SEQ ID NO：164的氨基酸残基25(His)到153(Ser)、SEQ IDNO：163的核苷酸136到522组成。人IL-4的螺旋A由SEQ ID NO：164的氨基酸残基30(Thr)到42(Thr)、SEQ ID NO：163的核苷酸151到189组成。人IL-4的螺旋B由SEQ ID NO：164的氨基酸残基65(Glu)到83(His)、SEQ ID NO：163的核苷酸256到312组成。人IL-4的螺旋C由SEQ ID NO：164的氨基酸残基94(Ala)到118(Ala)、SEQ ID NO：163的核苷酸343到417组成。人IL-4的螺旋D由SEQ ID NO：164的氨基酸残基133(Leu)到151(Cys)、SEQ ID NO：163的核苷酸460到516组成。
人GM-CSF多核苷酸序列示于SEQ ID NO：165，而相应的氨基酸序列示于SEQ ID NO：166。分泌信号序列由SEQ ID NO：166的氨基酸残基1(Met)到17(Ser)、SEQ ID NO：165的核苷酸9到59组成。成熟多肽由SEQ ID NO：166的氨基酸残基18(Ala)到144(Glu)、SEQ ID NO：165的核苷酸60到440组成。人GM-CSF螺旋A由SEQ ID NO：166的氨基酸残基30(Trp)到44(Asn)、SEQ ID NO：165的核苷酸96到140组成。人GM-CSF螺旋B由SEQ ID NO：166的氨基酸残基72(Leu)到81(Gln)、SEQ ID NO：165的核苷酸222到251组成。人GM-CSF螺旋C由SEQ ID NO：166的氨基酸残基85(Gly)到103(Gln)、SEQ ID NO：165的核苷酸261到317组成。人GM-CSF螺旋D由SEQ ID NO：166的氨基酸残基120(Phe)到131(Leu)、SEQ ID NO：165的核苷酸366到401组成。
人类zcytor17lig、IL-3、IL-2、IL-4和GM-CSF中包括螺旋A、B、C和D的氨基酸残基示于表1中。
表1
  螺旋A   螺旋B   螺旋C   螺旋D
  zcytor17lig   38-52   83-98   104-117   137-152   如SEQ ID NO：2所示
  IL-3   35-45   73-86   91-103   123-141   如SEQ ID NO：102所示
  IL-2   27-48   73-92   102-116   134-149   如SEQ ID NO：162所示；或螺旋B如SEQ IDNO：168中所描述
  IL-4   30-42   65-83   94-118   133-151   如SEQ ID NO：164所示
  GM-CSF   30-44   72-81   85-103   120-131   如SEQ ID NO：166所示
本发明提供了编码本文公开的zcytor17lig多肽的多核苷酸分子，包括DNA和RNA分子。本领域技术人员将容易地认识到，考虑到遗传密码的简并性，在这些多核苷酸分子中相当多的序列变异是有可能的。SEQID NO：3是涵盖了编码SEQ ID NO：2的zcytor17lig多肽及其片段的所有DNA的简并DNA序列。本领域技术人员将会认可SEQ ID NO：3的简并序列通过将U取代为T也提供了编码SEQ ID NO：2的所有RNA序列。因而，本发明考虑包括SEQ ID NO：3的核苷酸1或70到核苷酸492的zcytor17lig多肽编码多核苷酸及其RNA等同体。表2列举了SEQID NO：3中所用的表示简并核苷酸位置的单字母代码。“解析(resolution)”是代码字母表示的核苷酸。“互补物”表示互补核苷酸的代码。例如，代码Y表示C或T，而其互补物R表示A或G，其中A互补于T，而G互补于C。
表2
Figure G2009102637047D00141
SEQ ID NO：3中所用的简并密码子，涵盖了给定氨基酸的所有可能的密码子，示于表3中。
表3
Figure G2009102637047D00151
本领域普通技术人员将会理解，在决定代表编码各氨基酸的所有可能的密码子的简并密码子时引入了某些不确定性。例如，丝氨酸的简并密码子(WSN)在某些情况下能够编码精氨酸(AGR)，而精氨酸的简并密码子(MGN)在某些情况下能够编码丝氨酸(AGY)。类似的关系存在于编码苯丙氨酸和亮氨酸的密码子之间。因而，简并序列所涵盖的某些多核苷酸可能编码变体氨基酸序列，但本领域普通技术人员参照SEQ ID NO：2的氨基酸序列能够容易地识别此类变体序列。变体序列如本文所描述的那样可被容易地测试功能。
本领域普通技术人员也将会理解不同物种会表现出“偏好密码子使用”。一般参见Grantham等，Nuc.Acids Res.8：1893-912，1980；Haas等，Curr.Biol.6：315-24，1996；Wain-Hobson等，Gene 13：355-64，1981；Grosjean和Fiers，Gene 18：199-209，1982；Holm，Nuc.Acids Res.14：3075-87，1986；Ikemura，J.Mol.Biol.158：573-97，1982。如本文所用，术语“偏好密码子使用”或“偏好密码子”为本领域术语，是指某一物种的细胞中最频繁使用的蛋白翻译密码子，从而偏好编码各氨基酸的可能密码子中的一个或数个代表(见表3)。例如，氨基酸苏氨酸(Thr)可由ACA、ACC、ACG或ACT编码，但在哺乳动物细胞中，ACC是最常用的密码子；在其它物种例如昆虫细胞、酵母、病毒或细菌中，可能偏好不同的Thr密码子。可通过本领域公知的许多方法将特定物种的偏好密码子引入到本发明的多核苷酸中。将偏好密码子序列引入到重组DNA中能够，例如，通过使得蛋白质翻译在特定细胞类型或物种内更为有效而提高蛋白产量。因此，SEQ ID NO：3中公开的简并密码子序列起着模板的作用，以优化多核苷酸在本领域常用的以及本文公开的多种细胞类型和物种中的表达。可以测试并优化含偏好密码子的序列在各物种中的表达，并如本文所述测试其功能。
如早先所指出的，本发明分离的多核苷酸包括DNA和RNA。制备DNA和RNA的方法是本领域所熟知的。一般而言，自产生大量zcytor17ligRNA的组织或细胞中分离RNA。此类组织和细胞通过RNA印迹法(Thomas，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：5201，1980)，或者通过从多种细胞类型中筛选具有作用于靶细胞或组织之活性的条件培养基鉴定。一旦鉴定了活性或RNA产生细胞或组织，可利用异硫氰酸胍抽提继之以CsCl梯度离心分离制备总RNA(Chirgwin等，Biochemistry 18：52-94，1979)。利用Aviv和Leder的方法自从总RNA制备Poly(A)+RNA(Proc. Natl.Acad.Sci.USA 69：1408-12，1972)。利用公知方法自poly(A)+RNA制备互补DNA(cDNA)。在备选方法中，可以分离基因组DNA。然后通过例如杂交或PCR鉴定和分离编码zcytor17lig多肽的多核苷酸。
编码zcytor17lig的全长克隆可通过常规的克隆操作获得。优选互补DNA(cDNA)克隆，尽管对于某些应用(例如转基因动物中的表达)，可能优选使用基因组克隆，或修饰cDNA克隆以便包括至少一个基因组内含子。制备cDNA和基因组克隆的方法是众所周知的，并在本领域普通技术人员的水平之内，并且包括利用本文公开的序列或其部分探测文库或作为其引物。表达文库可用zcytor17lig抗体片段、包括zcytor17的可溶性受体或其它特异性结合伴侣探测。
本文公开的Zcytor17lig多核苷酸序列也可用作为探针或引物克隆zcytorl71ig基因的5′非编码区。由观察到的有关zcytor17lig的组织特异性表达来看，该基因区预期会提供造血和淋巴特异性表达。zcytor17lig基因的启动子元件因而可用来指导异源基因在例如转基因动物或由基因疗法治疗的患者中组织特异性表达。克隆5′侧翼序列也如美国专利No.5,641,670所述通过“基因激活”促进zcytor17lig蛋白的产生。简要地，通过在zcytor17lig基因座中引入至少包括靶向序列、调控序列、外显子及未配对的剪接供体部位的DNA构建体，可改变细胞中内源zcytor17lig基因的表达。所述靶向序列是允许构建体与内源zcytor17lig基因座同源重组的zcytor17lig 5′非编码序列，藉此构建体内的序列可操作地连接于内源zcytor17lig编码序列。以这种方式，内源zcytor17lig启动子可被其它调控序列替代或补充，以提供增强的、组织特异性的或以其它方式调控的表达。
本发明进一步提供了来自其它物种的对应的多肽和多核苷酸(直向同源物)。这些物种包括但不限于哺乳动物、禽类、两栖动物、爬行动物、鱼、昆虫及其它脊椎动物和无脊椎动物物种。具有特别意义的是来自其它哺乳动物物种的zcytor17lig多肽，例如鼠、猪、绵羊、牛、犬、猫、马及其它灵长类的多肽。人类zcytor17lig的直向同源物可利用本发明提供的信息和组合物结合常规克隆技术克隆。例如，cDNA可如本文所述利用从表达zcytor17lig的组织或细胞类型获得的mRNA克隆。合适的mRNA来源可通过由本文公开的序列设计的探针探测RNA印迹鉴定。然后由阳性组织或细胞系的mRNA制备文库。然后可通过许多方法分离zcytor17lig编码cDNA，例如用完整或部分人类cDNA或基于所公开的序列的一组或多组简并探针探测。CDNA也可以使用由本文公开的代表性人类zcytor17lig序列设计的引物，利用聚合酶链式反应或者说PCR克隆(Mullis，美国专利No.4,683,202)。在另一方法中，cDNA文库可用于转化或转染宿主细胞，且目的cDNA的表达可用zcytor17lig多肽抗体、结合研究或活性测定鉴定。相似技术也可应用于基因组克隆的分离。
已经鉴定了zcytor17lig小鼠直向同源物的多核苷酸序列并示于SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：90，且相应的氨基酸序列示于SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：91。编码SEQ ID NO：11多肽的简并多核苷酸序列示于SEQ ID NO：12。对于所述zcytor17lig小鼠细胞因子的氨基酸序列，推测螺旋A由氨基酸残基38-52限定；螺旋B由氨基酸残基85-98限定；螺旋C由氨基酸残基104-118限定；而螺旋D由氨基酸残基141-157限定；如SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：91所示。在zcytor17lig全长氨基酸序列(SEQID NO：2和SEQ ID NO：11)上，小鼠和人类序列之间具有31％的同一性。小鼠zcytor17lig的成熟序列推测起始于Met1，如SEQID NO：11所示，在人类序列中其对应于Met1，如SEQ ID NO：2所示。组织分析揭示小鼠zcytor17lig的表达见于睾丸、脑、CD90+细胞、前列腺细胞、唾腺和皮肤。纯化的293T细胞zcytor17lig的进一步N-末端序列分析显示了N-末端位于残基31(Ala)，如SEQ ID NO：11和SEQID NO：91所示，其中成熟多肽由氨基酸残基31(Ala)到163(Cys)组成(如SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：91所示)。
本领域技术人员将会认可SEQ ID NO：1中公开的序列代表了人类zcytor17lig的单个等位基因，并且预期会发生等位基因变异和替代的剪接。该序列的等位变体可根据标准操作通过探测来自不同个体的cDNA或基因组文库克隆。SEQ ID NO：1中所示DNA序列的等位变体，包括那些含有沉默突变的以及那些突变导致氨基酸序列改变的等位变体，落在本发明的范围之内，作为SEQ ID NO：2等位变体的蛋白质也一样。由不同剪接的mRNA产生的cDNA，保留了zcytor17lig多肽的特性的，包括在本发明的范围之内，由此类cDNA和mRNA编码的多肽也一样。这些序列的等位变体和剪接变体可根据本领域公知的标准操作通过从不同的个体或组织中探测cDNA或基因组文库克隆。
本发明也提供了可用于诊断应用的试剂。例如，zcytorl71ig基因、包括zcytorl71ig DNA或RNA或其亚序列的探针，可用来测定zcytorl71ig基因是否存在于人类染色体例如染色体12上，或者是否发生了基因突变。Zcytorl71ig位于染色体12的12q24.31区(实施例13)。zcytor17lig基因座上可检测的染色体畸变包括，但不限于非整倍性、基因拷贝数改变、杂合性损失(LOH)、易位、插入、缺失、限制性位点改变以及重排。此类畸变可利用本发明的多核苷酸通过使用分子遗传技术，例如限制性片段长度多态性(RFLP)分析、使用PCR技术的短串连重复(STR)分析及本领域公知的其它遗传连锁分析技术(Sambrook等，同前.；Ausubel等，同前.；Marian，Chest 108：255-65，1995)来检测。
基因位置的确切情报可用于多种目的，包括：1)确定序列是否是现有毗连序列的一部分，并获得附加的多种形式的周围基因序列，例如YAC、BAC或cDNA克隆；2)为表现出与相同染色体区连锁的遗传病提供可能的候选基因；和3)模型生物的交叉引证，例如小鼠，这将有助于确定特定基因可能具有何种功能。
本领域技术人员将会认识到12q24区频繁地参与整体的基因组重排，包括与多种癌症相关的易位、缺失、倒置及重复。位于互联网上的关于马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院的癌症基因组剖析项目中的癌症染色体畸变的Mitelman数据库列举了199例涉及12q24基因组重排的癌症。其中，多数是连同其它重排的复杂核型的一部分；不过，在有些病例中，涉及12q24的重排是仅有的基因组改变。考虑到zcytor17lig受体在淋巴和髓样谱系细胞上的表达，尤其重要的是注意文献中报道过4例髓性白血病，其中易位(2例：Yamagata等，Cancer Genet Cytogenet 97：90-93，1997；Dunphy和Batanian，Cancer Genet Cytogenet 114：51-57，1999)或者重复(2例：Bonomi等，Cancer Genet Cytogenet 108：75-78，1999)是唯一的基因组改变。这提示位于12q24内的基因或多个基因可能直接地参与了这些患者细胞的恶性转化。zcytorl71ig不合适的过量表达可能介由自分泌或旁分泌机制，通过促进受体携带细胞的异常增殖促成了恶性转化。因此，Zcytorl71ig活性的抑制可能抑制这些细胞的生长。或者，导致zcytorl71ig基因失活的基因组重排可能通过消除zcytor17lig的免疫调节功能促进恶性转化和/或转移。的确，抑制前列腺癌转移的一个基因被绘图到12q24-qter上(Ichikawa等，Asian J Androl 2：167-171，2000)。如果zcytor17lig是该区负责抑制转移的基因，则zcytor17lig本身可能在癌症治疗中具有治疗价值。
诊断能够帮助医师确定疾病类型及合适的相关治疗，或者遗传咨询的援助。这样，本发明的抗-zcytor17lig抗体、多核苷酸及多肽可用于检测zcytor17lig多肽、mRNA或抗-zcytor17lig抗体，从而作为标记起作用，并如本文所述，利用本领域公知的或者本文描述的方法，直接地用于检测遗传病或癌症。此外，zcytor17lig多核苷酸探针可用于检测与人类疾病相关染色体12q24.3缺失和易位有关的异常或基因型，或者与肿瘤恶性发展有关的其它易位，或者预期参与恶性肿瘤或其它癌症中染色体重排的其它12q24.3突变。类似地，zcytor17lig多核苷酸探针可用于检测与人类疾病或自然流产相关染色体12三体性和染色体丢失有关的异常或基因型。从而，zcytor17lig多核苷酸探针可用于检测与这些缺陷相关的异常或基因型。
本领域技术人员将会认可zcytor17lig多核苷酸探针对于诊断与杂合性丢失(LOH)、染色体盈余(例如三体性)、易位、DNA扩增等相关的整体染色体异常尤其有用。已知zcytor17lig基因所定位的染色体基因座12q24.3内的易位与人类疾病相关。例如，12q24缺失和易位、重复和三体性与上文所讨论的与癌症相关。从而，如上文所述，既然zcytor17lig基因绘图至该关键区域，本发明的zcytor17lig多核苷酸探针可用于检测与12q24易位、缺失和三体性等相关的异常或基因型。
如上文所述，zcytor17lig基因本身的缺陷可能导致遗传性的人类疾病状态。本发明的分子，例如本发明的多肽、拮抗剂、激动剂、多核苷酸及抗体将有助于与zcytor17lig遗传缺陷相关的检测、诊断预防及治疗。另外，zcytor17lig多核苷酸探针可用于检测在zcytor17lig染色体基因座上有病或无病个体之间的等位基因差异。这样，zcytor17lig序列可用作为法医DNA作图的诊断学。
一般而言，遗传连锁分析中所用的检测患者遗传异常或畸变的诊断方法是本领域公知的。分析探针通常长度至少为20nt，尽管稍微更短的探针能够使用(如14-17nt)。PCR引物长度至少为5nt，优选为15或更长，更优选20-30nt。对于基因或染色体DNA的整体分析，zcytor17lig多核苷酸探针可能包括一整个的外显子或更多。通过将zcytor17lig序列(SEQ ID NO：1)与小鼠的zcytor17lig基因组DNA(SEQID NO：76)进行比较，本领域技术人员很容易确定外显子。一般而言，遗传连锁分析中所用的检测患者遗传异常或畸变的诊断方法是本领域公知的。多数诊断方法包括步骤：(a)从潜在患病患者、患病患者或潜在的隐性疾病等位基因无病携带者获得遗传样品；(b)通过在例如RFLP分析中将该遗传样品与zcytor17lig多核苷酸探针温育(其中所述多核苷酸将与互补多核苷酸序列杂交)，或者通过在PCR反应中在适当的PCR反应条件下将该遗传样品与正义和反义引物温育，产生第一反应产物；(iii)通过凝胶电泳和/或其它公知的方法显现所述第一反应产物，例如用zcytor17lig多核苷酸探针显现所述第一反应产物，其中该多核苷酸将与第一反应的互补多核苷酸序列杂交；和(iv)将显现的第一反应产物与来自野生型患者或者正常或对照个体的遗传样品的第二对照反应产物进行比较。第一反应产物和对照反应产物的差异指示患病或潜在患病患者的遗传异常、或无病患者杂合隐性携带者表型的存在，或来自患病患者肿瘤的遗传缺陷的存在、或者胎儿或植入前胚胎中遗传异常的存在。例如，限制性片段模式、PCR产物长度、zcytor17lig基因座上重复序列的长度等的差异，指示与正常野生型对照相比的遗传异常、遗传畸变或者等位基因差异。对照可来自未患病的家族成员或无关的个体，取决于测试和样品的可获得性。本发明中所用的遗传样品包括从患者任何组织或其它生物学样品中分离的基因组DNA、mRNA及cDNA，所述样品包括但不限于血液、唾液、精液、胚胎细胞、羊水等。所述多核苷酸探针或引物可以是RNA或DNA，并且将包括SEQ ID NO：1的一部分、SEQ ID NO：1的互补物、或其RNA等同体。此类显示与人类疾病表型的遗传连锁分析的方法是本领域众所周知的。有关诊断学中以PCR为基础的方法一般参见Mathew(编辑)，Protocols in HumanMolecular Genetics(Humana Press，Inc.1991)，White(编辑)，PCRProtocols：Current Methods and Applications(Humana Press，Inc.1993)，Cotter(编辑)，Molecular Diagnosis of Cancer(Humana Press，Inc.1996)，Hanausek和Walaszek(编辑)，Tumor Marker Protocols(Humana Press，Inc.1998)，Lo(编辑)，Clinical Applications ofPCR(Humana Press，Inc.1998)以及Meltzer(编辑)，PCR inBioanalysis(Humana Press，Inc.1998)。
zcytorl71ig基因座相关突变可通过使用直接突变分析的标准方法利用本发明的核酸分子检测，例如限制性片段多态性分析、使用PCR技术的短串连重复分析、扩增不应突变系统分析、单链构象多态性检测、RNase切割法、变性梯度凝胶电泳、荧光辅助错配分析及本领域公知的其它遗传分析技术(例如参见，Mathew(编辑)，Protocols in HumanMolecular Genetics(Humana Press，Inc.1991)，Marian，Chest 108：255(1995)，Coleman和Tsongalis，Molecular Diagnostics(HumanPress，Inc.1996)，Elles(编辑)Molecular Diagnosis of GeneticDiseases(Humana Press，Inc.1996)，Landegren(编辑)，LaboratoryProtocols for Mutation Detection(Oxford University Press 1996)，Birren等(编辑)，Genome Analysis，Vol.2：Detecting Genes(ColdSpring Harbor Laboratory Press 1998)，Dracopoli等(编辑)，CurrentProtocols in Human Genetics(John Wiley & Sons 1998)以及Richards和Ward，″Molecular Diagnostic Testing，″在Principles ofMolecular Medicine，83-88页(Humana Press，Inc.1998)。zcytorl71ig基因突变的直接分析可利用受试者的基因组DNA实施。扩增例如由外周血淋巴细胞获得的基因组DNA的方法是本领域技术人员众所周知的(例如参见Dracopoli等(编辑)，Current Protocols in HumanGenetics，7.1.6到7.1.7页(John Wiley & Sons 1998))。
小鼠zcytorl71ig基因中内含子的位置通过鉴定基因组克隆，接着通过分析内含子/外显子接点确定。小鼠基因组DNA示于SEQ ID NO：76中。参照SEQ ID NO：76，由内含子分开的3个编码外显子是明显的：第一个编码外显子位于SEQ ID NO：76的核酸编号1104-1119之间，第二个外显子在SEQ ID NO：76的核酸编号1300-1451之间，而第三个外显子在SEQ ID NO：76的核酸编号2411-2998之间。
在本发明的实施方案中，分离的zcytorl71ig编码核酸分子在严谨条件下能够与具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列的核酸分子、与具有SEQID NO：1中核苷酸28到519的核苷酸序列的核酸分子或与具有互补于SEQ ID NO：1的核苷酸序列的核酸分子杂交。一般而言，严谨条件选择为比特定序列在限定的离子强度和pH下的热熔点(Tm)低大约5℃。Tm是50％靶序列与完全匹配的探针杂交的温度(在限定的离子强度和pH下)。
如果核苷酸序列具有某些程度的互补性，则一对核酸分子例如DNA-DNA、RNA-RNA和DNA-RNA能够杂交。杂交体能够耐受双链螺旋中的错配碱基对，但杂交体的稳定性受错配度的影响。每有1-1.5％的碱基对错配，错配杂交体的Tm下降1℃。改变杂交条件的严谨性，能够控制存在于杂交体中的错配度。严谨度随着杂交温度的上升和杂交缓冲液离子强度的下降而增加。
使这些条件适用于特定的多核苷酸杂交体完全是本领域技术人员能力之内的。特定靶序列的Tm是50％靶序列与完全匹配的探针序列杂交的温度(在限定条件下)。那些影响的Tm条件包括：多核苷酸探针的大小和碱基对含量、杂交液的离子强度以及杂交液中去稳定剂的存在。许多计算Tm的公式是本领域公知的，并且是DNA、RNA和DNA-RNA杂交体以及长度不等的多核苷酸探针序列特异性的(例如，参见Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，(冷泉港出版社1989)；Ausubel等(编辑)，Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley and Sons，Inc.1987)；Berger和Kimmel(编辑)，Guideto Molecular Cloning Techniques，(Academic Press，Inc.1987)；以及Wetmur，Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.26：227(1990))。序列分析软件例如OLIGO 6.0(LSR；Long Lake，MN)和Primer Premier4.0(Premier Biosoft International；Palo Alto，CA)以及互联网上的网址，是分析给定序列以及根据用户限定的标准计算Tm的有用工具。此类程序也能在限定条件下分析给定序列并鉴定合适的探针序列。典型地，大于50个碱基对的较长多核苷酸序列的杂交，在低于计算的Tm大约20-25℃的温度下进行。对于小于50个碱基对的较小探针，杂交典型地在Tm或低于计算的Tm5-10℃下进行。这允许的DNA-DNA和DNA-RNA杂交体的最大杂交率。
杂交后，可在严谨条件下或在高度严谨条件下洗涤核酸分子以除去未杂交的核酸分子。典型的严谨洗涤条件包括在含有0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)的0.5×-2×SSC液中于55-65℃洗涤。也就是说，编码变体zcytorl71ig多肽的核酸分子在严谨洗涤条件下与具有SEQ ID NO：1(或其互补物)的核苷酸序列的核酸分子杂交，其中洗涤严谨度等同于55-65℃下的0.5×-2×SSC和0.1％SDS，包括55℃下的0.5×SSC和0.1％SDS，或65℃下的2×SSC和0.1％SDS。本领域技术人员通过例如用SSPE取代洗涤液中的SSC，能够容易地设计等同条件。
典型的高度严谨洗涤条件包括在0.1×-0.2×SSC和0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)的溶液中于50-65℃洗涤。换言之，编码变体zcytorl71ig多肽的核酸分子在高度严谨洗涤条件下与具有SEQ ID NO：1(或其互补物)的核苷酸序列的核酸分子杂交，其中洗涤严谨度等同于50-65℃下的0.1×-0.2×SSC和0.1％SDS，包括50℃下的0.1×SSC和0.1％SDS，或65℃下的0.2×SSC和0.1％SDS。
本发明也提供了与SEQ ID NO：2的多肽或其直向同源物具有实质上相似的序列同一性的分离的zcytorl71ig多肽。术语“实质上相似的序列同一性”在本文用于指包括与SEQ ID NO：2所示的序列或其直向同源物至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或大于99％序列同一性的多肽。本发明也包括这样的多肽，其包括与SEQ ID NO：2氨基酸残基1到162或33到162的序列具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或大于99％序列同一性的氨基酸序列。本发明进一步包括编码此类多肽的核酸分子。确定百分比同一性的方法在下文描述。
本发明也考虑能够由两个标准鉴定的变体zcytorl71ig核酸分子：测定编码的多肽与SEQ ID NO：2的氨基酸序列之间的相似性和/或如上文所述的杂交测定。这样的zcytorl71ig变体包括核酸分子：(1)其在严谨洗涤条件下与具有SEQ ID NO：1(或其互补物)的核苷酸序列的核酸分子杂交，其中洗涤严谨度等同于55-65℃下的0.5×-2×SSC和0.1％SDS；或(2)其编码与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或大于99％序列同一性的多肽。或者，zcytorl71ig变体可描述为核酸分子：(1)其在高度严谨洗涤条件下与具有SEQ ID NO：1(或其互补物)的核苷酸序列的核酸分子杂交，其中洗涤严谨度等同于50-65℃下的0.1×-0.2×SSC和0.1％SDS；和(2)其编码与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或大于99％序列同一性的多肽。
百分比序列同一性通过常规方法确定。例如参见Altschul等，Bull. Math.Bio. 48：603(1986)以及Henikoff和Henikoff，Proc.Natl. Acad.Sci.USA 89：10915(1992)。简要地，将两个氨基酸序列比对，以利用缺口开放罚分10、缺口延伸罚分1、以及如表4(氨基酸以标准单字母代码表示)所示的Henikoff和Henikoff(同前)″BLOSUM62″计分矩阵优化比对分值。
Figure G2009102637047D00261
本领域技术人员理解，存在许多已建立的算法可用于两氨基酸序列的比对。Pearson和Lipman的″FASTA″相似性搜索算法是用以调查本文公开的氨基酸序列与推断的变体zcytorl71ig所享有的同一性水平的合适的蛋白比对方法。FASTA算法由Pearson和Lipman，Proc.Nat′l Acad. Sci.USA 85：2444(1988)以及Pearson，Meth.Enzvmol. 183：63(1990)描述。
简要地，FASTA首先通过鉴定查询序列(如SEQ ID NO：2)与测试序列共享的具有最高同一性(如果ktup变量为1)或同一性对(如果ktup＝2)密度的区域表征序列相似性，而不考虑保守性氨基酸的取代、插入或缺失。然后利用氨基酸替代矩阵通过比较所有成对氨基酸的相似性，对具有最高同一性密度的10个区域重新计分，并“修剪”该区域两端，使之仅包括促成最高分值的那些残基。如果存在数个分值大于“截止”值(根据序列长度和ktup值由预定公式计算)的区域，则检查修剪的初始区域，以确定是否可以加上该区域，以形成带缺口的近似比对。最后，利用改良的Needleman-Wunsch-Sellers算法(Needleman和Wunsch，J. Mol.Biol. 48：444(1970)；Sellers，SIAM J.Appl.Math. 26：787(1974))将两氨基酸序列的最高得分区域比对，该算法考虑氨基酸插入和缺失。优选的FASTA分析参数为：ktup＝1，缺口开放罚分＝10，缺口延伸罚分＝1并且替代矩阵＝BLOSUM62。可通过修饰计分矩阵文件(″SMATRIX″)将这些参数引入到FASTA程序中，如Pearson，Meth. Enzymol. 183：63(1990)附录2中所阐释的那样。
FASTA利用如上文所述的比率也可用于确定核酸分子的序列同一性。对于核苷酸序列比较，ktup值可在1到6的范围内变化，优选从3到6，最优选为3，而其它参数为缺省设置。
变体zcytorl71ig多肽或具有实质上相似的序列同一性的多肽以具有一个或多个氨基酸替代、缺失或添加为特征。这些变化优选在性质上是较小的，也就是保守氨基酸替代(如下文表5所示)及不显著影响所述多肽的折叠或活性的其它替代；小段的缺失，典型地为1到大约30个氨基酸；以及氨基或羧基端延伸，例如氨基端甲硫氨酸残基、不超过大约20-25个残基的小接头肽、或亲和标签。本发明从而包括从大约108到216个氨基酸残基的多肽，其包含与SEQ ID NO：2相应区域具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或大于99％同一性的序列。包括亲和标签的多肽在zcytorl71ig多肽和亲和标签之间可进一步包括蛋白水解切割位点。优选的此类位点包括凝血酶切割位点和Xa因子切割位点。
表5
保守氨基酸取代
碱性：  精氨酸
        赖氨酸
        组氨酸
酸性L： 谷氨酸
        天门冬氨酸
极性：  谷氨酰胺
        天门冬酰胺
疏水的：亮氨酸
        异亮氨酸
        缬氨酸
芳族：  苯丙氨酸
        色氨酸
        酪氨酸
小的：  甘氨酸
        丙氨酸
        丝氨酸
        苏氨酸
        甲硫氨酸
构成对于维持结构完整关键的区域或结构域的氨基酸残基的确定是可以测定的。在这些区域内，人们能够确定或多或少耐受改变并维持分子的总体三级结构的特定残基。分析序列结构的方法包括但不限于比对具有高氨基酸或核苷酸同一性的多个序列、二级结构倾向、双元模式(binary patterns)、互补包装及隐藏的极性相互作用(Barton，Current Opin.Struct.Biol. 5：372-376，1995以及Cordes等，Current Opin.Struct.Biol. 6：3-10，1996)。一般而言，在设计分子修饰或鉴定特定片段时，确定结构将伴随着修饰分子的活性评价。
在zcytorl71ig多肽内进行氨基酸序列的改变，以最小化对生物学活性所必需高级结构的破坏。例如，当zcytorl71ig多肽包括一个或多个螺旋时，进行氨基酸残基的改变，从而不破坏螺旋几何学以及该分子中构象改变会削减某些关键功能(例如，该分子与其结合伴侣的结合)的其它元件，例如SEQ ID NO：2的A和D螺旋、残基43(Glu)、44(Glu)及136(Phe)。氨基酸序列改变的影响可通过例如上文所公开的计算机模型预测，或者通过分析结晶结构确定(例如参见Lapthorn等，Nat. Struct.Biol. 2：266-268，1995)。本领域熟知的其它技术将变体蛋白的折叠与标准分子(如天然蛋白)进行比较。例如，可进行变体和标准分子半胱氨酸模式的比较。质谱分析和利用还原及烷基化的化学修饰提供了测定以二硫键结合的以及无此结合的半胱氨酸残基的方法(Bean等，Anal.Biochem. 201：216-226，1992；Gray，Protein Sci. 2：1732-1748，1993；以及Patterson  等，Anal.Chem. 66：3727-3732，1994)。通常认为如果修饰分子不具有与标准分子相同的半胱氨酸模式，折叠将会受到影响。另一种众所周知且认可的测量折叠的方法是圆二色法(CD)。测量和比较由修饰分子和标准分子产生的CD谱是常规的(Johnson，Proteins 7：205-214，1990)。结晶学是另一种众所周知的分析折叠和结构的方法。核磁共振(NMR)、消化肽作图和表位作图也是公知的用于分析蛋白和多肽之间折叠和结构上的相似性的方法(Schaanan等，Science 257：961-964，1992)。
可产生如SEQ ID NO：2所示的zcytor17lig蛋白质序列的Hopp/Woods亲水分布图(Hopp等，Proc.Natl.Acad.Sci. 78：3824-3828，1981；Hopp，J.Immun.Meth. 88：1-18，1986以及Triquier等，Protein Engineering 11：153-169，1998)。该分布图是建立在滑行的6残基窗口上的。隐藏的G、S和T残基以及暴露的H、Y和W残基被忽略。例如，在人类zcytorl71ig中，亲水区包括SEQ ID NO：2的氨基酸残基54-59、SEQ ID NO：2的氨基酸残基129-134、SEQ ID NO：2的氨基酸残基53-58、SEQ ID NO：2的氨基酸残基35-40以及SEQ IDNO：2的氨基酸残基33-38。例如，在鼠zcytor17lig中，亲水区包括SEQ ID NO：11的氨基酸残基34-39、SEQ ID NO：11的氨基酸残基46-51、SEQ ID NO：11的氨基酸残基131-136、SEQ ID NO：11的氨基酸残基158-163以及SEQ ID NO：11的氨基酸残基157-162。
本领域技术人员将会意识到在设计zcytor17lig多肽的氨基酸序列修饰时，将会考虑到亲水性和疏水性，从而不破坏总体结构和生物学特征。特别有意义的替代是从由Val、Leu和Ile组成的组中或从由Met、Gly、Ser、Ala、Tyr和Trp组成的组中选择的疏水残基。例如，耐受替代的残基可以包括如SEQ ID NO：2中所示的Val、Leu和Ile，或者由Met、Gly、Ser、Ala、Tyr和Trp组成的组。位于SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：11中的保守半胱氨酸残基将相对不耐受替代。
必需氨基酸的身份也可以由IL-3、Lif、IL12、IL-15、IL-2、IL-4及GM-CSF与zcytor17lig之间的序列相似性分析推断。使用例如早先所述的″FASTA″分析方法，鉴定蛋白家族内高度相似性的区域，并用于分析氨基酸序列的保守区域。基于结构鉴定变体zcytor17lig多核苷酸的替代途径是确定编码潜在的变体zcytor17lig的基因的核酸分子能否和具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列的核酸分子杂交，如上文所讨论的那样。
鉴定本发明的多肽中的必需氨基酸的其它方法是本领域公知的操作，例如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells，Science 244：1081(1989)，Bass等，Proc.Natl Acad.Sci.USA 88：4498(1991)，Coombs和Corey，″Site-Directed Mutagenesis and ProteinEngineering，″in Proteins：Analysis and Design，Angeletti(编辑)，pages 259-311(Academic Press，Inc.1998))。在后一种技术中，在分子的每一个残基处引入单丙氨酸突变，并如下文所公开的那样测试所得突变分子的生物学或生物化学活性，以鉴定对该分子活性关键的氨基酸残基。参见Hilton等，J.Biol.Chem. 271：4699(1996).
本发明也包括zcytor17lig多肽的功能片段以及编码此类功能片段的核酸分子。本文所定义的“功能”zcytor17lig或其片段以其增殖或分化活性、以其诱导或抑制特化细胞功能的能力或以其与抗-zcytor17lig抗体或zcytor17受体抗体或zcytor17、WSX-1或OSMRbeta受体或这些受体的杂二聚体(例如，zcytor17/WSX-1或zcytor17/OSMRbeta)或多聚体(如zcytor17/WSX-1/OSMRbeta)(可溶的或者固定的)特异性结合的能力为特征。如本文早先所述，zcytor17lig以四螺旋束结构为特征，包括螺旋A(氨基酸残基38-52)、螺旋B(氨基酸残基83-98)、螺旋C(氨基酸残基104-117)和螺旋D(氨基酸残基137-152)，如SEQ ID NO：2所示。从而，本发明进一步提供了的融合蛋白，其包括：(a)包括上文所述的一个或多个螺旋的多肽分子；和(b)包括一个或多个这些螺旋的功能片段。该融合蛋白的另一个多肽部分可由另一个四螺旋束细胞因子例如IL-15、IL-2、IL-4和GM-CSF或者非天然和/或无关的帮助融合蛋白分泌的分泌信号肽构成。
从而本发明提供融合蛋白，其包括至少4个多肽，其中多肽自N-端到C-端的次序为：第一多肽，包括选自下组的氨基酸残基序列：(a)SEQ ID NO：162的IL-2螺旋A氨基酸残基27-48；(b)SEQ ID NO：102的IL-3螺旋A氨基酸残基35-45；(c)SEQ ID NO：164的IL-4螺旋A氨基酸残基30-42；(d)SEQ ID NO：166的GM-CSF螺旋A氨基酸残基30-44；以及(e)SEQ ID NO：2氨基酸残基38-52；第一间隔臂，具有6-27个氨基酸残基；和第二多肽，包括选自下组的氨基酸残基序列：(a)SEQ ID NO：168的IL-2螺旋B氨基酸残基；(b)SEQ ID NO：164的IL-4螺旋B氨基酸残基65-83；(c)SEQ ID NO：102的IL-3螺旋B氨基酸残基73-86；(d)SEQ ID NO：166的GM-CSF螺旋B氨基酸残基72-81；以及(e)SEQ ID NO：2氨基酸残基83-98；第二间隔臂，具有5-11个氨基酸残基；第三多肽，包括选自下组的氨基酸残基序列：(a)SEQ IDNO：162的IL-2螺旋C残基102-116；(b)SEQ ID NO：164的IL-4螺旋C残基94-118；(c)SEQ ID NO：102的IL-3螺旋C残基91-103；(d)SEQ ID NO：166的GM-CSF螺旋C残基85-103；以及(e)SEQ ID NO：2氨基酸残基104-117；第三间隔臂，具有3-29个氨基酸残基；以及第四多肽，包括选自下组的氨基酸残基：(a)SEQ ID NO：162的IL-2螺旋D氨基酸残基134-149；(b)SEQ ID NO：102的IL-3螺旋D氨基酸残基123-141；(c)SEQ ID NO：164的IL-4螺旋D氨基酸残基133-151；(d)SEQ ID NO：166的GM-CSF螺旋D氨基酸残基120-131；以及(e)SEQID NO：2氨基酸残基137-152，其中4个多肽中至少一个来自zcytor17lig。在其它实施方案中，间隔臂肽将选自zcytor17lig以及IL-3的A/B、B/C和C/D环，如表1所示。
可实施常规的核酸分子缺失分析，以获得编码zcytor17lig多肽的核酸分子的功能片段。作为举例说明，具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列或其片段的DNA分子可用Bal31核酸酶消化，以获得系列嵌套缺失。然后将这些DNA片段以正确的读框插入到表达载体中，分离表达的多肽并测试zcytor17lig活性或者结合抗-zcytor17lig抗体或zcytor17受体的能力。核酸外切酶的一个替代途径是使用寡核苷酸定向诱变以引入缺失或终止密码子，以规定期望zcytor17lig片段的产生。或者，可利用聚合酶链式反应合成zcytor17lig基因的特定片段。
鉴定功能域的标准方法是本领域技术人员众所周知的。例如，有关干扰素任一端或两端截短的研究由Horisberger和Di Marco，Pharmac. Ther. 66：507(1995)综述。而且，用于蛋白功能分析的标准技术由例如Treuter等，Molec.Gen.Genet. 240：113(1993)；Content等，″Expression and preliminary deletion analysis of the 42 kDa 2-SAsynthetase induced by human interferon，″in Biological Interferon Systems，Proceedings-of ISIR-TNO Meeting on Interferon Systems，Cantell(编辑)，pages 65-72(Nijhoff 1987)；Herschman，″The EGF Receptor，″in Control of Animal Cell Proliferation 1，Boynton等(编辑)pages 169-199(Academic Press 1985)；Coumailleau等，J.Biol.Chem. 270：29270(1995)；Fukunaga等，J. Biol.Chem. 270：25291(1995)；Yamaguchi等，Biochem.Pharmacol. 50：1295(1995)；以及Meisel等，Plant Molec.Biol. 30：1(1996)描述。
可利用公知的诱变和筛选方法进行多氨基酸替代并测试，例如由Reidhaar-Olson和Sauer(Science 241：53(1988))或者Bowie和Sauer(Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 86：2152(1989))所公开的那些。简要地，这些作者公开了同时随机化多肽的两个或多个位置，选择功能多肽，然后对诱变多肽测序以确定各位置上允许取代的范围。其它可用的方法包括噬菌体展示(例如，Lowman等，Biochem. 30：10832(1991)，Ladner等，美国专利No.5,223,409，Huse，国际公开号WO 92/06204)以及区域定向诱变(Derbyshire等，Gene 46：145(1986)以及Ner等，DNA 7：127，(1988))。
公开的zcytor17lig核苷酸和多肽序列的变体也可以通过如由Stemmer，Nature 370：389(1994)，Stemmer，Proc.Natl Acad.Sci. USA 91：10747(1994)以及国际公开号WO 97/20078公开的DNA改组产生。简要地，变体DNA分子通过随机片段化亲本DNA，接着利用PCR重组装由体外同源重组产生，导致随机引入的点突变。该技术可利用亲本DNA分子家族，例如等位变体或来自不同物种的DNA分子来改良，以向该过程引入附加的变异。期望活性的选择或筛选，继之以附加的重复诱变以及测定，通过选择期望突变而同时除去有害变化，提供了序列的迅速“进化”。
本文公开的诱变方法可联合高通量自动化筛选方法以检测宿主细胞中克隆的诱变多肽的活性。诱变的编码如本文所述的生物活性多肽、或与本文所述抗-zcytor17lig抗体或可溶性zcytor17受体、或可溶性WSX-1或可溶性OSMR或者这些可溶性受体的杂二聚体或多聚体结合的多肽的DNA分子可从宿主细胞中回收，并利用现代设备迅速测序。这些方法允许快速确定单个氨基酸残基在目的多肽中的重要性，并且能够应用于未知结构的多肽。
另外，本发明的蛋白(或其多肽片段)可连接于其它生物活性分子，尤其是其它细胞因子，以提供多功能分子。例如，来自zcytor17lig的一个或多个螺旋可连接于其它细胞因子以促进其生物学特性或生产效率。
本发明从而提供了系列新的杂交分子，其中包括zcytor17lig一个或多个螺旋的片段融合于另一个多肽。融合优选通过在DNA水平剪接实现，以允许嵌合分子在重组生产系统中表达。然活对所得的分子测定诸如提高的溶解性、提高的稳定性、延长的清除半衰期、提高的表达和分泌水平以及药代动力学等性质。此类杂交分子在组成蛋白或多肽之间可进一步包括额外的氨基酸残基(如多肽接头)。
非天然存在的氨基酸包括(并非限制性地)反-3-甲基脯氨酸、2，4-亚甲基脯氨酸、顺-4-羟脯氨酸、反-4-羟脯氨酸、N-甲基甘氨酸、别苏氨酸、甲基苏氨酸、羟乙基半胱氨酸、羟乙基高半胱氨酸、硝基谷氨酰胺、高谷氨酰胺、2-哌啶酸、噻唑烷羧酸、脱氢脯氨酸、3-甲基脯氨酸和4-甲基脯氨酸、3，3-二甲基脯氨酸、叔-亮氨酸、正缬氨酸、2-氮杂苯丙氨酸、3-氮杂苯丙氨酸、4-氮杂苯丙氨酸以及4-氟苯丙氨酸。本领域公知许多方法将非天然存在的氨基酸残基掺入到蛋白质中。例如，可使用其中无义突变被化学上氨酰化的抑制型tRNA抑制的体外系统。合成氨基酸及氨酰化tRNA的方法是本领域公知的。含无义突变的质粒的转录和翻译典型地在包括大肠杆菌S30提取物和商业上可获得的酶及其它试剂的无细胞系统中进行。蛋白质通过层析纯化。例如，参见Robertson等，J.Am.Chem.Soc. 113：2722(1991)，Ellman等，Methods Enzymol. 202：301(1991)，Chung等，Science 259：806(1993)，以及Chung等，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 90：10145(1993)。
在第二种方法中，翻译在爪蟾卵母细胞中通过微注射突变的mRNA和化学上修饰的氨酰化抑制型tRNA进行(Turcatti等，J.Biol.Chem. 271：19991(1996))。在第三种方法中，大肠杆菌细胞在不存在待取代的天然氨基酸(如苯丙氨酸)、而存在期望的非天然存在的氨基酸(例如，2-氮杂苯丙氨酸、3-氮杂苯丙氨酸、4-氮杂苯丙氨酸或4-氟苯丙氨酸)时进行。非天然存在的氨基酸被掺入到蛋白中以取代其天然对应物。参见Koide等，Biochem. 33：7470(1994)。天然存在的氨基酸残基可通过体外化学修饰转换为非天然存在的物质。化学修饰可联合定点诱变以进一步扩大取代范围(Wynn和Richards，Protein Sci. 2：395(1993)。稳定zcytor17lig以延长该分子的半衰期可能是有利的，尤其是以活性状态延长其代谢持久性。为获得延长的半衰期，zcytor17lig分子可利用本文描述的方法化学修饰。PEG化是一种常用的方法，它已被证明可提高血浆半衰期、提高溶解性并降低抗原性和免疫原性(Nucci等，Advanced Drug Delivery Reviews 6：133-155，1991以及Lu等，Int. J.Peptide Protein Res. 43：127-138，1994)。
有限数目的非保守性氨基酸、不由遗传密码子编码的氨基酸、非天然存在的氨基酸以及非天然氨基酸可取代zcytor17lig的氨基酸残基。
本发明也提供了包括本文描述的zcytor17lig多肽的表位携带部分的多肽片段或肽。此类片段或肽可能包括“免疫原性表位”，它是在整个蛋白用作为免疫原时引发抗体应答的蛋白部分。携带免疫原表位的肽可利用标准方法鉴定(例如参见Geysen等，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 81：3998(1983))。
与此相对照，多肽片段或肽可能包括“抗原性表位”，它是抗体能够特异性结合的蛋白分子区域。某些表位包括线性或邻近的氨基酸区段，而且此种表位的抗原性不被变性剂破坏。本领域公知模拟蛋白表位的相对短的合成肽可用于刺激产生针对该蛋白的抗体(例如参见Sutcliffe等，Science 219：660(1983))。因此，本发明携带抗原表位的肽和多肽可用于产生与本文描述的多肽结合的抗体(例如中和抗体)。Hopp/Woods亲水分布图可用于确定最具抗原潜力的区域(Hopp等，1981，同前，以及Hopp，1986，同前)。例如，在人类zcytor17lig中，亲水区包括SEQ ID NO：2的氨基酸残基54-59、SEQ ID NO：2的氨基酸残基129-134、SEQ ID NO：2的氨基酸残基53-58、SEQ ID NO：2的氨基酸残基35-40以及SEQ ID NO：2的氨基酸残基33-38。例如，在鼠zcytor17lig中，亲水区包括SEQ ID NO：11的氨基酸残基34-39、SEQ ID NO：11的氨基酸残基46-51、SEQ ID NO：11的氨基酸残基131-136、SEQ ID NO：11的氨基酸残基158-163以及SEQ ID NO：11的氨基酸残基157-162。
携带抗原表位的肽和多肽优选含有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：11的至少4个到10个氨基酸、至少10个到14个氨基酸、或者大约14个到大约30个氨基酸。此类携带表位的肽和多肽可如本文所述通过片段化zcytor17lig多肽或通过化学肽合成制备。而且，表位可通过随机肽文库的噬菌体展示选择(例如，参见Lane和Stephen，Curr.Opin. Immunol. 5：268(1993)；以及Cortese等，Curr.Opin.Biotechnol. 7：616(1996))。例如，用于鉴定表位和从包括表位的小肽产生抗体的标准方法由Mole，″Epitope Mapping，″in Methods in Molecular Biology，Vol.10，Manson(编辑)，pages 105-116(The Humana Press，Inc.1992)；Price，″Production and Characterization of SyntheticPeptide-Derived Antibodies，″in Monoclonal Antibodies： Production，Engineering，and Clinical Application，Ritter和Ladyman(编辑)，pages 60-84(Cambridge University Press 1995)以及Coligan等(编辑)，Current Protocols in Immunology，9.3.1-9.3.5页和9.4.1-9.4.11页(John Wiley & Sons 1997)描述。
不论变体zcytor17lig多核苷酸的特定核苷酸序列如何，该多核苷酸编码的多肽以其增殖或分化活性、其诱导或抑制特化细胞功能的能力、或特异性结合抗-zcytor17lig抗体或zcytor17受体的能力为特征。更具体地，变体zcytor17lig多核苷酸将编码表现出至少50％，并且优选地至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％，、至少99％或大于99％SEQ ID NO：2所示多肽的活性的多肽。
对于任何zcytor17lig多肽，包括变体和融合蛋白，本领域普通技术人员利用上文表1和2所示的信息能够容易地产生完全简并的编码该变体的多核苷酸序列。
本发明进一步提供了许多其它多肽融合物(以及包括一个或多个多肽融合物的相关多聚体蛋白)。例如，zcytor17lig多肽可作为与美国专利No.5,155,027和5,567,584中公开的二聚化蛋白的融合物制备。就这方面而言的优选的二聚化蛋白包括免疫球蛋白恒定区结构域。免疫球蛋白-zcytor17lig多肽融合物可在遗传工程改造的细胞中表达(以产生各种多聚化的zcytor17lig类似物)。可将辅助结构域融合于zcytor17lig多肽，使之靶向到特定细胞、组织或大分子。例如，通过将zcytor17lig多肽融合于与靶细胞表面的受体特异性结合的配体，可将zcytor17lig多肽或蛋白靶向到预定的细胞类型中。以这种方式，可为治疗或诊断的目的而靶向多肽和蛋白。zcytor17lig多肽可与两个或多个成分融合，例如用以纯化的亲和标签和靶向结构域。多肽融合物也可以包括一个或多个切割位点，尤其是在结构域之间。参见Tuan等，Connective Tissue Research 34：1-9，1996。
利用本文讨论的方法，本领域普通技术人员能够鉴定和/或制备许多与SEQ ID NO：2残基1-164或24-164具有实质上相似的序列同一性的多肽，或其功能片段及融合物，例如螺旋A-D(SEQ ID NO：2残基38-152)，其中此类多肽或片段或融合物保留野生型蛋白的性质，例如刺激增殖、分化、诱导特化细胞功能或结合zcytor17受体或zcytor17lig抗体的能力。
本发明的zcytor17lig多肽，包括全长多肽、功能片段及融合多肽，可按照常规技术在遗传工程化的宿主细胞中产生。合适的宿主细胞是那些可用外源DNA转化或转染且在培养中生长的细胞类型，并且包括细菌、真菌细胞以及培养的高级真核细胞。优选真核细胞，尤其是培养的多细胞生物体细胞。用以操纵克隆的DNA分子和将外源DNA分子引入到多种宿主细胞的方法由Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY，1989，以及Ausubel等编辑，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，Inc.，NY，1987公开。
一般而言，编码zcytor17lig多肽的DNA序列能够在表达载体内可操作地连接于其表达所必需的其它遗传元件，通常包括转录启动子和终止子。载体通常也将包括一个或多个选择标记以及一个或多个复制起点，尽管本领域技术人员将会意识到在某些系统中，选择标记可能由不同的载体提供，而且外源DNA的复制可能通过整合到宿主细胞染色体中提供。启动子、终止子、选择标记、载体及其它元件的选择是本领域普通技术人员水平之内的常规设计的问题。许多此类元件在文献中有描述，并且可通过商业供应商获得。
为指导zcytor17lig多肽进入宿主细胞的分泌途径，在表达载体中提供分泌信号序列(也称之为前导序列、前原序列和前序列)。分泌信号序列可以是zcytor17lig的，或者来自于另一个分泌蛋白(如t-PA)或从头合成的。分泌信号序列可操作地连接于zcytor17lig DNA序列，即这两个序列以正确的读框连接和安置，以指导新合成的多肽进入宿主细胞的分泌路径。分泌信号序列通常位于编码目的多肽的DNA序列的5′端，尽管某些分泌信号序列可能位于目的DNA序列的别处(例如，参见Welch等，美国专利No.5,037,743；Holland等，美国专利No.5,143,830)。
或者，本发明多肽中所含的分泌信号序列用于指导其它多肽进入分泌路径。本发明提供了了此类融合多肽。可制备信号融合多肽，其中来自于SEQ ID NO：2氨基酸残基1-23或SEQ ID NO：11残基1-23的的分泌信号序列利用本领域公知的和本文公开的方法可操作地连接于编码另一多肽的DNA序列。本发明的融合多肽中所含的分泌信号序列优选在氨基末端融合于另外的肽，以指导该另外的肽进入分泌路径。此类构建体具有本领域公知的许多应用。例如，这些新的分泌信号序列融合构建体可指导正常非分泌的蛋白的活性成分分泌。此类融合可在体内或在体外应用，以指导肽通过分泌路径。
培养的哺乳动物细胞是本发明合适的宿主。将外源DNA引入哺乳动物宿主细胞的方法包括磷酸钙介导的转染(Wigler等，Cell 14：725，1978；Corsaro和Pearson，Somatic Cell Genetics 7：603，1981：Graham和Vander Eb，Virology 52：456，1973)、电穿孔(Neumann等，EMBO J. 1：841-5，1982)、DEAE-葡聚糖介导的转染(Ausubel等，同前)和脂质体介导的转染(Hawley-Nelson等，Focus 15：73，1993；Ciccarone等，Focus 15：80，1993以及病毒载体(Miller和Rosman，BioTechniques 7：980-90，1989；Wang和Finer，Nature Med. 2：714-6，1996)。例如，重组多肽在培养的哺乳动物细胞中的生产由Levinson等，美国专利No.4,713,339；Hagen等，美国专利No.4,784,950；Palmiter等，美国专利No.4,579,821；以及Ringold，美国专利No.4,656,134公开。合适的培养的哺乳动物细胞包括COS-1(ATCC No.CRL 1650)、COS-7(ATCC No.CRL 1651)、BHK(ATCC No.CRL1632)、BHK 570(ATCC No.CRL 10314)、293(ATCC No.CRL 1573；Graham等，J.Gen.Virol. 36：59-72，1977)以及中国仓鼠卵巢(如CHO-K1；ATCC No.CCL 61)细胞系。另外的合适的细胞系是本领域公知的，并且可从公共保藏中心例如美国模式培养物保藏中心，Manassas，VA获得。一般而言，优选强转录启动子，例如来自SV-40或巨细胞病毒的启动子。例如参见美国专利No.4,956,288。其它合适的启动子包括来自金属硫蛋白基因的那些(美国专利No.4,579,821和4,601,978)和腺病毒主要晚期启动子。
药物选择通常被用来选择其中插入了外源DNA的培养的哺乳动物细胞。此类细胞通常被称之为“转染株”。在选择剂存在下培养的且能够将目的基因传给其子代的细胞被称之为“稳定转染株”。优选的选择标记是编码抗生素新霉素抗性的基因。选择在新霉素型药物例如G-418等存在下进行。选择系统也可用于提高目的基因的表达水平，一种称之为“扩增”的过程。扩增通过在存在低水平选择剂时培养转染株，然后提高选择剂的量以选择生产高水平引入基因的产物的细胞来实施。优选的扩增选择标记是二氢叶酸还原酶，其赋予氨甲蝶呤抗性。也可以利用其它药物抗性基因(例如潮霉素抗性、多药物抗性、嘌呤霉素乙酰基转移酶)。引入改变的表型的备选标记(例如绿色荧光蛋白，或者细胞表面蛋白例如CD4、CD8、MHC I类分子、胎盘碱性磷酸酶)可用于通过诸如FACS分选或磁珠分离技术等方法从未转染的细胞中分选出转染细胞。
其它高等真核细胞也可用作宿主，包括植物细胞、昆虫细胞和禽类细胞。发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)作为载体用以在植物细胞中表达基因的用途由Sinkar等，J.Biosci.(Bangalore) 11：47-58，1987综述。转化昆虫细胞并在其中生产外源多肽由Guarino等，美国专利No.5,162,222和WIPO公开号WO 94/06463公开。昆虫细胞可被重组杆状病毒感染，通常来源于苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)(AcNPV)。参见King，L.A.和Possee，R.D.，The Baculovirus Expression System：A Laboratory Guide，London，Chapman & Hall；O′Reilly，D.R.等，Baculovirus Expression Vectors：A Laboratory Manual，NewYork，Oxford University Press.，1994；以及Richardson，C.D.编辑，Baculovirus Expression Protocols.Methods in Molecular Biology，Totowa，NJ，Humana Press，1995。制备重组杆状病毒的第二种方法使用由Luckow(Luckow，V.A，等，J Virol 67：4566-79，1993)描述的以转座子为基础的系统。该系统在Bac-to-Bac试剂盒(LifeTechnologies，Rockville，MD)中销售。该系统使用转移载体pFastBaclTM(Life Technologies)，其含Tn7转座子，以将编码zcytor17lig多肽的DNA转移到作为称之为“杆粒(bacmid)”的大质粒维持在大肠杆菌中的杆状病毒基因组中。所述pFastBaclTM转移载体使用AcNPV多角体蛋白启动子驱动目的基因(在这里为zcytor17lig)的表达。不过，pFastBaclTM可在相当程度上加以修饰。可除去多角体蛋白启动子并用杆状病毒碱性蛋白启动子代替(也称之为Pcor、p6.9或MP启动子)，它在杆状病毒感染中较早表达，并且已证明对表达分泌蛋白有利。参见Hill-Perkins，M.S.和Possee，R.D.，J.Gen.Virol. 71：971-6，1990；Bonning，B.C.等，J.Gen.Virol. 75：1551-6，1994；以及Chazenbalk，G.D.和Rapoport，B.，J.Biol.Chem. 270：1543-9，1995。在此类转移载体构建体中，可使用短或长形式的碱性蛋白启动子。而且，可构建转移载体，用来自于昆虫蛋白的分泌信号序列替换天然zcytor17lig的分泌信号序列。例如，来自蜕皮类固醇葡萄糖基转移酶(EGT)、蜜蜂蜂毒肽(Invitrogen，Carlsbad，CA)或杆状病毒gp67(PharMingen，San Diego，CA)的分泌信号序列可用于在构建体中代替天然的zcytor17lig分泌信号序列。另外，转移载体可包括在表达的zcytor17lig多肽的C-端或N-端以正确的读框与编码表位标签的DNA融合，例如，Glu-Glu表位标签(Grussenmeyer，T.等，Proc. Natl.Acad.Sci. 82：7952-4，1985)。利用本领域常见的技术，将含zcytor17lig的转移载体转化到大肠杆菌中，并筛选指示重组杆状病毒的含中断的lacZ基因的杆粒。使用常规技术分离含重组杆状病毒基因组的杆粒DNA，并用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞如Sf9细胞。随后产生表达zcytor17lig的重组病毒。重组病毒原种由本领域常用的方法制备。
利用重组病毒转染宿主细胞，典型地是来自于秋粘虫草地贪夜蛾的细胞系。一般参见Glick和Pasternak，Molecular Biotechnology： Principles and Applications of Recombinant DNA，ASM Press，Washington，D.C.，1994。另一种合适的细胞系是来自于粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)的High FiveOTM细胞系(Invitrogen)(美国专利No.5,300,435)。
真菌细胞，包括酵母细胞，也可用于本发明之中。这方面尤为关注的酵母物种包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)和甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)。例如，用外源DNA转化酿酒酵母细胞和由其产生重组多肽的方法由Kawasaki，美国专利No.4,599,311；Kawasaki等，美国专利No.4,931,373；Brake，美国专利No.4,870,008；Welch等，美国专利No.5,037,743；以及Murray等，美国专利No.4,845,075公开。转化的细胞通过由选择标记决定的表型选择，通常是药物抗性和在缺乏特定营养素(如亮氨酸)时生长的能力。酿酒酵母中优选的载体系统是由Kawasaki等(美国专利No.4,931,373)公开的POT1载体系统，它允许在含葡萄糖的培养基中选择转化的细胞。用于酵母的合适的启动子和终止子包括来自糖酵解基因(例如，参见Kawasaki，美国专利No.4,599,311；Kingsman等，美国专利No.4,615,974以及Bitter，美国专利No.4,977,092)以及醇脱氢酶基因的那些。也参见美国专利No.4,990,446；5,063,154；5,139,936和4,661,454。其它酵母转化系统，包括多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)、玉米黑粉菌(Ustilago maydis)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、Pichia guillermondii和麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)是本领域公知的。例如，参见Gleeson等，J.Gen.Microbiol. 132：3459-65，1986以及Cregg，美国专利No.4,882,279。曲霉属(Aspergillus)细胞可根据McKnight等，美国专利No.4,935,349的方法使用。转化产黄头孢(Acremoniumchrysogenum)的方法由Sumino等，美国专利No.5,162,228公开。转化链孢菌属(Neurospora)的方法由Lambowitz，美国专利No.4,486,533公开。
利用甲醇毕赤酵母作为宿主生产重组蛋白在WIPO公开号WO97/17450、WO 97/17451、WO 98/02536和WO 98/02565中公开。用于转化甲醇毕赤酵母的DNA分子通常作为双链、环状质粒制备，它优选在转化前线性化。对于甲醇毕赤酵母中多肽的生产，优选质粒中的启动子和终止子是甲醇毕赤酵母基因的，例如甲醇毕赤酵母醇利用基因(AUG1或AUG2)。其它有用的启动子包括二羟基丙酮合酶(DHAS)、甲酸脱氢酶(FMD)以及过氧化氢酶(CAT)基因的那些启动子。为促进DNA整合到宿主染色体中，优选使完整的质粒表达片段两端都侧接宿主DNA序列。优选的用于甲醇毕赤酵母的选择标记是甲醇毕赤酵母ADE2基因，它编码磷酸核糖基-5-氨基咪唑羧化酶(AIRC；EC 4.1.1.21)，后者使得ade2宿主细胞在不存在腺嘌呤时生长。对于期望将甲醇的应用降至最低程度的大规模工业化过程，优选使用其中两个甲醇利用基因(AUG1和AUG2)都被缺失的宿主细胞。为产生分泌蛋白，优选液泡蛋白酶基因(PEP4和PRB1)缺失的宿主细胞。利用电穿孔帮助将含编码目的多肽的质粒引入到甲醇毕赤酵母细胞中。优选使用具有从2.5到4.5kV/cm、优选大约3.75kV/cm场强的指数衰变脉冲电场以及从1到40毫秒、最优选大约20毫秒的时间常数(Ω)通过电穿孔转化甲醇毕赤酵母细胞。。
原核宿主细胞，包括细菌大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)、芽孢杆菌属(Bacillus)及其它属的菌株也是本发明可用的宿主细胞。转化这些宿主并表达其中克隆的外源DNA序列的技术是本领域众所周知的(例如参见Sambrook等，同前)。当在细菌如大肠杆菌中表达zcytor17lig多肽时，该多肽可典型地作为不溶颗粒保留在胞质中，或者可通过细菌分泌序列定向于周质间隙。在前一种情况下，裂解细胞，并回收颗粒和利用例如异硫氰酸胍或尿素变性。然后可以通过稀释变性剂再折叠和二聚化变性的多肽，例如对尿素及还原和氧化的谷光甘肽的组合溶液透析，接着对缓冲盐溶液透析。在后一种情况下，可通过破坏细胞(例如通过超声波破碎或渗透压刺激)，释放周质间隙的内含物并回收蛋白，以可溶和有功能形式自周质间隙回收多肽，从而避免变性和再折叠的需要。
转化或转染的宿主细胞根据常规操作在含营养素和所选宿主细胞生长所需的其它成分的培养基中培养。许多合适的培养基，包括成分确定的培养基和合成培养基，是本领域公知的，并且一般包括碳源、氮源、必需氨基酸、维生素和矿物质。根据需要，培养基也可以含有诸如生长因子或血清等组分。生长培养基一般将通过例如药物选择或由表达载体上携带的或者共转染到宿主细胞中的选择标记补偿的必需营养素缺陷选择含外源添加的DNA的细胞。甲醇毕赤酵母细胞在包括足够碳源、氮源和痕量营养素的培养基中于大约25℃到35℃的温度下培养。通过常规方法，例如小烧瓶振荡或发酵罐鼓泡为液体培养物提供充足的通气。优选的甲醇毕赤酵母培养基是YEPD(2％D-葡萄糖，2％BactoTM蛋白胨(Difco Laboratories，Detroit，MI)，1％BactoTM酵母膏(DifcoLaboratories)，0.004％腺嘌呤和0.006％L-亮氨酸)。
优选将本发明的多肽纯化至≥80％纯，更优选≥90％纯，甚至更优选≥95％纯，并且尤其优选是药物纯的状态，即就大分子，尤其是其它污染蛋白和核酸而言大于99.9纯，并且不含传染原和致热原。优选地，纯化的多肽基本上不含其它多肽，尤其是动物来源的其它多肽。
表达的重组zcytor17lig多肽(或嵌合zcytor17lig多肽)可利用分级分离和/或常规的纯化方法和介质纯化。硫酸铵沉淀及酸或高离液性(chaotrope)提取可用于样品的分级分离。例示性的纯化步骤可以包括羟磷灰石、大小排阻、FPLC以及反相高效液相层析。合适的层析介质包括衍生葡聚糖、琼脂糖、纤维素、聚丙烯酰胺、特制硅胶等。优选PEI、DEAE、QAE和Q衍生物。例示性的层析介质包括由苯基、丁基或辛基衍生的那些介质，例如苯基-Sepharose FF(Pharmacia)、Toyopearl丁基650(Toso Haas，Montgomeryville，PA)、辛基-Sepharose(Pharmacia)等；或聚丙烯酸树脂，例如Amberchrom CG 71(Toso Haas)等。合适的固体支持物包括在其所用的条件下不可溶的玻璃珠、硅胶为基础的树脂、纤维素树脂、琼脂糖珠、交联琼脂糖珠、聚苯乙烯珠、交联聚丙烯酰胺树脂等。这些支持物可用经氨基、羧基、巯基、羟基和/或碳水化合物部分允许蛋白连接的反应基团修饰。偶联化学的实例包括溴化氰活化法、N-羟基琥珀酰亚胺活化法、环氧化物活化法、巯基活化法、酰肼活化法以及用于碳化二亚胺偶联化学的羧基和氨基衍生物。这些及其它固体介质是本领域众所周知且广为应用的，并且可从商业供货商获得。将受体多肽结合到支持物介质上的方法是本领域熟知的。特定方法的选择是常规设计的问题，并且部分是由所选支持物的性质决定的。例如参见Affinity Chromatography：Principles & Methods，Pharmacia LKBBiotechnology，Uppsala，瑞典，1988。
本发明的多肽可通过使用其物理或生物化学性质分离。例如，固定化金属离子吸附(IMAC)层析可用于纯化富含组氨酸的蛋白，包括包括多聚组氨酸标签的那些蛋白。简要地，首先用二价金属离子使凝胶带电以形成螯合物(Sulkowski，Trends in Biochem. 3：1-7，1985)。富含组氨酸的蛋白将取决于所用的金属离子以不同的亲和力吸附到该基质上，并通过竞争性洗脱，降低pH，或使用强螯合剂洗脱。其它纯化方法包括通过凝集素亲和层析和离子交换层析(Methods inEnzymol.，Vol.182，″Guide to Protein Purification ″，M.Deutscher(编辑)，Acad.Press，San Diego，1990，pp.529-39)并使用可溶性zcytor17受体纯化糖基化的蛋白。在本发明另外的实施方案中，可构建目的多肽与亲和标签(例如麦芽糖结合蛋白，一种免疫球蛋白结构域)的融合物以促进纯化。
而且，使用本领域描述的方法，利用本发明的zcytor17lig的区段或结构域联合其它人类细胞因子家族蛋白(例如白介素或GM-CSF)或异源蛋白的区段或结构域，构建了多肽融合物或杂交zcytor17lig蛋白(Sambrook等，同前，Altschul等，同前，Picard，Cur.Opin. Biology，5：511-5，1994及其中的参考文献)。这些方法允许确定目的多肽中较大结构域或区段的生物学重要性。此类杂交体可能改变反应动力学、结合、限制或扩大底物特异性，或者改变多肽的组织和细胞定位，并且可应用于未知结构的多肽。
融合蛋白可由本领域技术人员公知的方法通过制备融合蛋白的各组分并化学连接之而制备。备选地，可利用已知技术产生正确读框的编码融合蛋白两组分的多核苷酸，并通过本文所述的方法表达。例如，赋予生物学功能的螺旋部分或全部可在本发明的zcytor17lig与来自另一家族成员例如IL-15、IL-2、IL-4或GM-CSF的功能等同螺旋之间交换。此类组分包括但不限于，四螺旋束细胞因子的分泌信号序列；螺旋A、B、C、D；环A/B、B/C、C/D。此类融合蛋白预期将具有与本发明的多肽或其它已知的四螺旋束细胞因子家族蛋白相同或相似的生物学功能特征，取决于所构建的融合物。而且，此类融合蛋白可能表现出如本文所公开的其它性质。
可利用标准分子生物学和克隆技术交换zcytor17lig多肽和它们与之融合的那些多肽之间等同的结构域。一般地，编码目的结构域的DNA区段，例如zcytor17lig螺旋A到D或本文所述的其它结构域，以正确的读框可操作地连接于至少一个编码附加多肽(例如来自另一细胞因子如IL-2等的结构域或区域)的其它DNA区段，并插入到合适的表达载体中，如本文所述。一般地，制备DNA构建体，从而编码多肽相应区域的数个DNA区段以正确的读框可操作地连接，以制备编码完整融合蛋白或其功能部分的单个构建物。例如，DNA构建体将编码自N-端到C-端包括信号多肽、接下来是成熟四螺旋束细胞因子融合蛋白(含有螺旋A，接下来螺旋B，接下来是螺旋C，接下来是螺旋D)的融合蛋白。此类融合蛋白可表达、分离并如本文所述测定活性。
Zcytor17lig多肽或其片段也可以通过化学合成制备。zcytor17lig多肽可以是单体或多聚体；糖基化的或非糖基化的；PEG化的或非PEG化的；并且可能或可能不包括初始的甲硫氨酸氨基酸残基。例如，可通过固相肽合成制备多肽，例如象所Merrifield，J.Am.Chem.Soc. 85：2149，1963所描述的那样。
本发明的分子的活性可利用许多测量表达zcytor17受体的细胞的增殖和/或与这种细胞的结合的测定法测量。尤其关注的是zcytor17lig-依赖性细胞的变化。可工程化为zcytor17lig-依赖性细胞的合适的细胞系包括IL-3-依赖性BaF3细胞系(Palacios和Steinmetz，Cell 41：727-734，1985；Mathey-Prevot等，Mol.Cell. Biol. 6：4133-4135，1986)、FDC-P1(Hapel等，Blood 64：786-790，1984)及MO7e(Kiss等，Leukemia 7：235-240，1993)。生长因子-依赖性细胞系可根据发表的方法建立(例如Greenberger等，Leukemia Res. 8：363-375，1984；Dexter等，Baum等编辑的Experimental Hematology Today，8th Ann.Mtg.Int.Soc.Exp.Hemato.1979，145-156，1980)。
本发明的蛋白可用于刺激参与血液生成和免疫功能稳态的细胞的增殖、活化、分化和/或特化细胞功能的诱导或抑制。特别是，zcytor17lig多肽可用于刺激造血谱系细胞的增殖、活化、分化、造血谱系细胞的特化细胞功能的诱导或抑制，所述细胞包括但不限于T细胞、B细胞、单核细胞/巨噬细胞、NK细胞、嗜中性粒细胞、内皮细胞、成纤维细胞、嗜曙红细胞、软骨细胞、肥大细胞、朗格罕氏细胞、单核细胞及巨噬细胞以及上皮细胞。上皮细胞包括，例如，成釉质细胞、主细胞、色素细胞、肠嗜铬细胞、肠嗜铬样细胞、杯形细胞、颗粒细胞、角化细胞、树突细胞、迷路支持细胞、黑素细胞、梅克尔细胞(merkelcells)、帕内特细胞(paneth cells)、壁细胞、足细胞等。造血细胞的增殖和/或分化可在体外利用培养的细胞或在体内通过向合适的动物模型给药本发明的分子测量。测量细胞增殖或分化的测定法是本领域众所周知的。例如，测量增殖的测定法包括诸如对中性红染料的化学敏感性(Cavanaugh等，Investigational New Drugs 8：347-354，1990，特此并入作为参考)、掺入放射性标记的核苷酸(Cook等，Analytical Biochem. 179：1-7，1989，特此并入作为参考)、在增殖细胞的DNA中掺入5-溴-2′-脱氧尿嘧啶(BrdU)(Porstmann等，J.Immunol.Methods 82：169-179，1985，特此并入作为参考)以及使用四唑鎓盐(Mosmann，J.Immunol.Methods 65：55-63，1983；Alley等，Cancer Res. 48：589-601，1988；Marshal等，Growth Reg. 5：69-84，1995；以及Scudiero等，Cancer Res. 48：4827-4833，1988；均特此并入作为参考)等测定法。测量分化的测定法包括，例如，测量与组织阶段特异性表达相关的细胞表面标志、酶活性、功能活性或形态学变化(Watt，FASEB， 5：281-284，1991；Francis，Differentiation 57：63-75，1994；Raes，Adv. Anim.Cell Biol.Technol.Bioprocesses，161-171，1989；均特此并入作为参考)。
本发明的分子可在体内利用病毒递送系统测定。用于此目的的例示性的病毒包括腺病毒、疱疹病毒、逆转录病毒、痘苗病毒以及腺相关病毒(AAV)。双链DNA病毒腺病毒，目前是研究得最好的用于递送异源核酸的基因转移载体(综述见T.C.Becker等，Meth.Cell Biol. 43：161-89，1994；以及J.T.Douglas和D.T.Curiel，Science & Medicine 4：44-53，1997)。
作为配体，zcytor17lig多肽的活性可通过硅基生物传感器生理功能微测定仪(microphysiometer)测量，该仪器测量与受体结合相关的胞外酸化率或质子排泄以及随后的生理细胞应答。例示性的装置是由Molecular Devices，Sunnyvale，CA制造的CytosensorTM生理功能微测定仪。多种细胞应答，例如细胞增殖、离子运输、能力产生、炎症应答、调控及受体活化等，可由该方法测量。例如，参见McConnell，H.M.等，Science 257：1906-1912，1992；Pitchford，S.等，Meth.Enzymol. 228：84-108，1997；Arimilli，S.等，J.Immunol.Meth. 212：49-59，1998；Van Liefde，I.等，Eur.J.Pharmacol. 346：87-95，1998。
而且，zcytor17lig可用于鉴定响应zcytor17lig刺激路径的细胞、组织或细胞系。上文所述的生理功能微测定仪可用于迅速鉴定配体响应细胞，例如响应本发明的zcytor17lig的细胞。细胞可在存在或不存在zcytor17lig多肽时培养。在存在zcytor17lig时引发胞外酸化可测的变化的那些细胞对zcytor17lig有响应。此类细胞或细胞系如上文所述可用于鉴定zcytor17lig多肽的拮抗剂和激动剂。
考虑到zcytor17受体的组织分布，激动剂(包括天然zcytor17lig/底物/辅因子/等)和/或拮抗剂在体外和体内应用中都具有巨大的潜力。鉴定为zcytor17lig激动剂的化合物可用于扩增、增殖、活化、分化参与造血和免疫功能稳态的细胞和/或诱导或抑制其特化细胞功能。例如，zcytor17lig和激动剂化合物可用作成分确定的细胞培养基的组分，并且可单独或与其它细胞因子和激素联合使用以取代细胞培养中常用的血清。激动剂因而可用于特异性地促进培养中的T细胞、B细胞、单核细胞/巨噬细胞、NK细胞、细胞毒性淋巴细胞及其它淋巴和髓样谱系细胞的生长和/或发育。
拮抗剂也可用作描述配体-受体相互作用的位点的特征的研究试剂。拮抗剂可用于抑制参与调控造血的细胞的扩增、增殖、活化和/或分化。zcytor17lig活性的抑制剂(zcytor17lig拮抗剂)包括抗-zcytor17lig抗体和可溶性zcytor17lig受体，以及其它肽和非肽制剂(包括核酶)。
Zcytor17lig也可用于鉴定其活性的抑制剂(拮抗剂)。在本文公开的测定法中添加测试化合物以鉴定抑制zcytor17lig活性的化合物。除了本文公开的那些测定法之外，可在设计测量受体结合、zcytor17lig-依赖性细胞应答的刺激/抑制或zcytor17受体表达细胞的增殖的多种测定法中测试样品对zcytor17lig活性的抑制。
zcytor17lig多肽可作为与免疫球蛋白重链恒定区的融合物表达，所述重链恒定区典型的是Fc片段，其含有两个恒定区结构域且缺少可变区。制备此类融合物的方法公开在美国专利No.5,155,027和5,567,584中。此类融合物典型地作为多聚体分子分泌，其中Fc部分彼此以二硫键键合，并且两个非免疫球蛋白多肽彼此紧邻排列。此类融合物可用于例如二聚化、提高稳定性和体内半衰期、亲和纯化配体、作为体外测定工具或拮抗剂。为用于测定，嵌合物通过Fc区结合于支持物，并以ELISA形式应用。
zcytor17lig结合多肽也可用于配体的纯化。所述多肽被固定在固相支持物上，例如琼脂糖珠、交联琼脂糖、玻璃、纤维素树脂以硅胶为基础的树脂、聚苯乙烯、交联聚丙烯酰胺或在使用条件下稳定的类似材料。将多肽连接于固相支持物的方法是本领域公知的，并且包括胺化学、溴化氰活化法、N-羟基琥珀酰亚胺活化法、环氧化物活化法、巯基活化法以及酰肼活化法。所得的介质通常配制为柱形式，并使含配体的液体流过柱子一次或多次，以使配体与受体多肽结合。然后利用盐浓度、高离液剂(chaotropic agents)(盐酸胍)或pH的改变破坏配体-受体的结合洗脱配体。
可有利地使用的这样的测定系统，其使用配体结合性受体(或抗体、互补物/反互补物对中的一员)或其结合片段，以及商业上可获得的生物传感器设备(BIAcore，Pharmacia Biosensor，Piscataway，NJ)。将所述受体、抗体、互补物/反互补物对成员或片段固定到受体芯片的表面。该设备的使用由Karlsson，J.Immunol.Methods 145：229-40，1991以及Cunningham and Wells，J.Mol.Biol. 234：554-63，1993公开。受体、抗体、成员或片段利用胺或巯基化学共价键连接于在流动池中连附有金膜葡聚糖纤维。测试样品流过该池。如果样品中存在配体、表位或互补物/反互补物对中相对的成员，它将分别与固定的受体、抗体或成员结合，导致介质折射率的变化，这作为金膜表面等离子体共振的变化而检测。该系统允许测定on-和off-rates，从中可计算结合亲和力，并评估结合的化学计量学。或者，配体/受体结合可利用SELDI(TM)技术(Ciphergen，Inc.，Palo Alto，CA)分析。
配体结合性受体多肽也可以用作本领域公知的其它测定中。此类系统包括用以测定结合亲和力的Scatchard分析(见Scatchard，Ann.NYAcad.Sci. 51：660-72，1949)以及量热学测定(Cunningham等，Science 253：545-48，1991；Cunningham等，Science 245：821-25，1991)。
Zcytor17lig多肽也可用于制备与zcytor17lig表位、肽或多肽结合的抗体。zcytor17lig多肽或其片段作为抗原(免疫原)接种动物并引发免疫应答。此类抗体可用于封闭促炎zcytor17lig的生物学作用，并可在本文所述的多种疾病中用作为抗炎症疗法。本领域技术人员将会意识到携带抗原表位的多肽含有zcytor17lig多肽(如SEQ ID NO：2)的至少6个、优选至少9个、并且更优选至少15到大约30个连续氨基酸残基的序列。包括zcytor17lig多肽较大部分，即从30到100个残基直至全长氨基酸序列的多肽包括在内。如本文所述，抗原或免疫原表位也可以包括粘附的标签、佐剂、赋形剂和载体。合适的抗原包括由SEQID No：2氨基酸编号24到氨基酸编号164编码的zcytor17lig多肽，或其连续的9到141个氨基酸的片段。如本文所述，其它合适的抗原包括全长和成熟的zcytor17lig、zcytor17lig四螺旋束结构的螺旋A-D以及个别或多个螺旋A、B、C和D。如本文所述，优选的用作为抗原的肽是亲水肽，例如由本领域技术人员从疏水图中推测的那些，例如，SEQID NO：2的氨基酸残基114-119、101-105、126-131、113-118和158-162，以及SEQ ID NO：11的氨基酸残基34-39、46-51、131-136、158-163和157-162。而且，例如利用DNASTAR Protean程序(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)由Jameson-Wolf图推测的zcytor17lig抗原表位作为优选抗原，并且可容易地由本领域技术人员确定。
来自用这些抗原接种动物产生的免疫应答的抗体可以如本文所述分离并纯化。制备和分离多克隆和单克隆抗体的方法是本领域熟知的。例如，参见Current Protocols in Immunology，Cooligan等(编辑)，National Institutes of Health，John Wiley and Sons，Inc.，1995；Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor，NY，1989；以及Hurrell，J.G.R.编辑，Monoclonal Hvbridoma Antibodies：Techniques and Applications，CRC Press，Inc.，Boca Raton，FL，1982。
对本领域普通技术人员显而易见的是，多克隆抗体可由zcytor17lig多肽或其片段接种许多温血动物例如马、牛、山羊、绵羊、狗、鸡、兔子、小鼠和大鼠产生。zcytor17lig多肽的免疫原性可通过使用佐剂，例如明矾(氢氧化铝)或弗氏完全或不完全佐剂提高。可用于免疫的多肽也包括融合多肽，例如zcytor17lig或其部分与免疫球蛋白多肽或与麦芽糖结合蛋白的融合物。多肽免疫原可以是全长分子或其部分。如果多肽部分是“半抗原样的”，此部分可有利地结合或连接大分子载体(例如匙孔血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或破伤风类毒素)用以免疫。
如本文所用，术语“抗体”包括多克隆抗体、亲和纯化的多克隆抗体、单克隆抗体以及抗原结合片段，例如F(ab′)2和Fab蛋白水解片段。遗传改造的完整抗体或片段例如嵌合抗体、Fv片段、单链抗体等，以及合成的抗原结合肽和多肽，也包括在内。非人抗体可通过将非人CDR移植到人框架和恒定区或者通过掺入整个非人可变结构域(任选地通过取代暴露残基以人样表面“遮蔽”它们，其结果是“装饰的”抗体)而人源化。在一些情况下，人源化抗体在人可变区框架结构域内可包含非人残基，以增强适当的结合特征。通过人源化抗体，生物学半衰期可以提高，并且降低了向人给药时潜在的不利免疫反应。而且，人类抗体可在被改造含有人类免疫球蛋白基因的转基因非人动物中产生，如WIPO公开号WO 98/24893中所披露的那样。优选这些动物中的内源免疫球蛋白基因被失活或消除，例如通过同源重组而实现。
认为抗体是特异性结合的，如果：1)它们表现出阀值水平的结合活性，且2)它们不显著地与相关多肽分子交叉反应。如果本文的抗-zcytor17lig抗体与zcytor17lig多肽、肽或表位结合的亲和力比与对照(非zcytor17lig)多肽的结合亲和力大至少10倍，则测定阀值水平的结合。优选抗体表现出106M-1或更高、优选107M-1或更高，更优选108M-1或更高，并且最优选109M-1或更高的结合亲和力(Ka)。例如，抗体的结合亲和力可由本领域普通技术人员通过Scatchard分析(Scatchard，G.，Ann.NY Acad.Sci. 51：660-672，1949)容易地确定。
抗-zcytor17lig抗体是否不显著与相关多肽分子交叉反应是由，例如通过标准蛋白质印迹分析检测zcytor17lig多肽而非已知的相关多肽的抗体显示的(Ausubel等，同前)。已知的相关多肽的实例是在现有技术中公开的那些，例如已知的直向同源物，和共生同源物以及相似的蛋白家族的已知成员。筛选也可以利用非人zcytor17lig以及zcytor17lig突变多肽进行。而且，抗体可对已知的相关多肽进行“筛除”，以分离特异性结合zcytor17lig多肽的群。例如，将用zcytor17lig引发的抗体吸附到粘附于不溶基质的相关多肽上；在合适的缓冲条件下，zcytor17lig特异性抗体将穿过基质流出。筛选允许分离与密切相关多肽非交叉反应的多克隆和单克隆抗体(Antibodies：A Laboratory Manual，Harlow和Lane(编辑)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1988；Current Protocols in Immunology，Cooligan等(编辑)，National Institutes of Health，John Wiley and Sons，Inc.，1995)。特异性抗体的筛选和分离是本领域熟知的。参见Fundamental Immunology，Paul(编辑)，Raven Press，1993；Getzoff等，Adv.inImmunol.43：1-98，1988；Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，Goding，J.W.(编辑)，Academic PressLtd.，1996；Benjamin等，Ann.Rev.Immunol. 2：67-101，1984。特异性结合的抗-zcytor17lig抗体可由本领域的许多方法检测，并如下文所述。
许多本领域技术人员公知的测定法可用于检测与zcytor17lig蛋白或多肽结合的抗体。例示性的测定法在Antibodies：A Laboratory Manual，Harlow和Lane(编辑)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1988中有详细描述。此类测定代表性的实例包括：并行免疫电泳、放射性免疫测定、放射免疫沉淀、酶联免疫吸附测定(ELISA)、斑点印迹或蛋白质印迹测定、抑制或竞争性测定以及夹心测定。另外，可筛选抗体与野生型相对于与突变zcytor17lig蛋白或多肽的结合。
zcytor17lig的抗体可用于标记表达zcytor17lig的细胞；用于通过亲和纯化分离zcytor17lig；用于诊断测定以确定zcytor17lig多肽的循环水平；用于检测或定量作为潜在的病理或疾病标志的可溶性zcytor17lig；用于使用FACS的分析方法；用于筛选表达文库；用于产生抗独特型抗体；以及作为中和抗体或作为拮抗剂在体外和体内封闭zcytor17lig的活性。合适的定向标签或标记包括放射性核素、酶、底物、辅因子、抑制剂、荧光标记、化学发光标记、磁性颗粒等；间接标签或标记可以以利用生物素-亲和素或其它互补物/反互补物对作为中间体为特征。本文的抗体也可以直接或间接地缀合于药物、毒素、放射性核素等，并且这些缀合物可用于体内诊断或治疗性应用。而且，zcytor17lig抗体或其片段可用于在体外在测定(例如蛋白质印迹或本领域公知的其它测定)中检测变性的zcytor17lig或其片段。
合适的可检测分子可直接或间接地连接于多肽或抗体，并且包括放射性核素、酶、底物、辅因子、抑制剂、荧光标记、化学发光标记、磁性颗粒等。合适的细胞毒性分子可直接或间接地连接于多肽或抗体，并且包括细菌或植物毒素(例如，白喉毒素、皂草素、假单胞菌内毒素、蓖麻毒素、相思豆毒素等)，以及治疗性放射性核素，例如碘-131、铼-188或钇-90(或者直接地连接于多肽或抗体，或者间接地通过例如螯合成分连接)。多肽或抗体也可以缀合于细胞毒性药物，例如阿霉素。对于可检测或细胞毒性分子的间接连接，可检测或细胞毒性分子可与互补物/反互补物对中的一员缀合，其中另一成员结合于多肽或抗体部分。对于这些目的，生物素/链霉抗生物素蛋白是例示性的互补物/反互补物对。
结合性多肽也可作为zcytor17lig“拮抗剂”起作用以在体外和体内封闭zcytor17lig的结合和信号传导。这些抗-zcytor17lig结合多肽将可用于抑制zcytor17lig活性或蛋白结合。
多肽-毒素融合蛋白或抗体-毒素融合蛋白可用于定向的细胞或组织抑制或消除(例如，治疗癌细胞或组织)。备选地，如果多肽具有多功能结构域(即活化结构域或受体结合结构域，外加靶向结构域)，则仅包括靶向结构域的融合蛋白可适于指导可检测的分子、细胞毒性分子或互补分子进入目的细胞或组织类型。在仅有结构域的融合蛋白包括互补分子的情况下，反互补分子可缀合于可检测的或细胞毒性分子。此类结构域-互补分子融合蛋白因而代表了一类靶向载体或介质，用于一般性反互补可检测/细胞毒性分子缀合物的细胞/组织特异性递送。
在另一个实施方案中，zcytor17lig细胞因子融合蛋白或抗体-细胞因子融合蛋白可用于体内杀伤靶组织(例如白血病、淋巴瘤、肺癌、结肠癌、黑素瘤、胰腺癌、卵巢癌、皮肤癌、血癌及骨髓癌或其中表达zcytor17lig受体的其它癌症)(一般参见Hornick等，Blood 89：4437-47，1997)。所述的融合蛋白能够将细胞因子靶向到期望的作用部位，由此提供了细胞因子升高的局部浓度。合适的zcytor17lig多肽或抗-zcytor17lig抗体靶向不期望的细胞或组织(如肿瘤或白血病)，并且融合的细胞因子通过效应细胞介导提高的靶细胞裂解。例如，用于此目的的合适的细胞因子包括白介素2及粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
又在另一个实施方案中，如果zcytor17lig多肽或抗-zcytor17lig抗体靶向血管细胞或组织，此多肽或抗体可偶联于放射性核素，并且尤其是β-发射放射性核素，以减少再狭窄。此类治疗途径对给予放射活性治疗的临床医师构成较小的危险因素。例如，与接受安慰剂条带的对照组相比，置于患者支架血管内直至递送完所需的辐射剂量的铱-192饱和条带，表现出降低的血管组织生长和增大的腔径。此外，治疗组中血管再形成和支架血栓形成显著更低。对于如本文所述的含放射性核素的生物活性缀合物推测具有相似的结果。
本文所述的生物活性多肽或抗体缀合物可静脉内、动脉内或导管内递送，或者可局部引入到预期的作用部位。
而且，炎症是生物体防御入侵因子的保护性反应。炎症是涉及许多细胞和体液调节剂(mediators)的级联事件。一方面，炎症反应的抑制可导致宿主免疫受损；但是，如果不加以限制，炎症可导致严重的综合症包括慢性炎性病(例如，类风湿性关节炎、多发性硬化症、炎症肠疾病等)、脓毒性休克以及多器官衰竭。重要的是，这些多样化的疾病状态具有共同的炎症调节剂。以炎症为特征的疾病总和对人类发病率和死亡率具有巨大的冲击。因此显然抗-炎症抗体和结合多肽，例如本文所述的抗-zcytor17lig抗体和结合多肽，对庞大数目的从哮喘和过敏到自身免疫病和脓毒性休克的人类和动物疾病可能具有决定性的治疗潜能。这样，本文所述的抗-炎症zcytor17lig抗体和结合多肽的用处在治疗上可用作为本文所述的zcytor17lig拮抗剂，尤其是在诸如关节炎、内毒素血症、炎症肠疾病、银屑病、相关病等疾病中。
1.关节炎
关节炎，包括骨关节炎、类风湿性关节炎、因损伤引起的关节炎症关节等，是常见的炎症病情，它将得益于抗炎症抗体和结合多肽例如本发明的抗-zcytor17lig抗体和结合多肽。例如，类风湿性关节炎(RA)是影响整个身体的全身性疾病，并且是最常见的关节炎形式之一。它以关节内衬膜的炎症为特征，导致疼痛、僵硬、温热、潮红及肿胀。炎症细胞释放可消化骨和软骨的酶。作为类风湿性关节炎的结果，炎症关节内衬滑膜可入侵并破坏软骨，导致关节恶化和重度疼痛及其它生理效应。有关的关节可丧失形状和排列，导致疼痛和运动丧失。
类风湿性关节炎(RA)是免疫介导的疾病，尤其以炎症和随后的组织损伤为特征，导致重度残疾和增加的死亡率。在类风湿性关节局部产生多种细胞因子。众多的研究已证明两个原型促炎症细胞因子IL-1和TNF-α在参与滑膜炎症和渐进性关节破坏的机制中起着重要作用。的确，在RA患者中给药TNF-α和IL-1导致了显著的临床和生物学炎症体征的改善以及骨浸蚀和软骨破坏的放射线学迹象的降低。然而，尽管存在这些鼓舞人心的结果，仍有显著百分比的患者不对这些制剂产生应答，提示其它调节剂也参与关节炎的病理生理学(Gabay，Expert.Opin.Biol. Ther. 2(2)：135-149，2002)。这些调节剂之一可能是zcytor17lig，因而结合或抑制zcytor17lig的分子，例如抗zcytor17lig抗体或结合伴侣，可作为有价值的治疗剂减轻类风湿性关节炎及其它关节炎疾病的炎症。
本领域已知有数种类风湿性关节炎的动物模型。例如，在胶原诱导的关节炎(CIA)模型中，小鼠患有非常类似于人类类风湿性关节炎的慢性炎症关节炎。由于CIA与RA共有相似的免疫学和病理学特点，这使之成为筛选潜在的抗炎症化合物的理想模型。CIA模型是公知的有赖于免疫应答和炎症反应才发生的小鼠模型。免疫应答包括B细胞和CD4+T细胞在对作为抗原给予的胶原应答时的相互作用，并导致产生抗胶原抗体。炎症期是由炎症调节剂的组织应答导致的，作为这些抗体中的某些与小鼠天然胶原交叉反应并激活补体级联反应的结果。使用CIA模型的有利之处在于基础的致病机制是已知的。已经鉴定了II型胶原上相关的T细胞和B细胞表位，并且已经确定了与免疫介导的关节炎相关的多种免疫学(如延迟型过敏反应和抗-胶原抗体)和炎症(如细胞因子、趋化因子和基质降解酶)参数，因而可用于评估测试化合物在CIA模型中的功效(Wooley，Curr.Opin.Rheum. 3：407-20，1999；Williams等，Immunol. 89：9784-788，1992；Myers等，Life Sci. 61：1861-78，1997；以及Wang等，Immunol.92：8955-959，1995)。
向这些CIA模型小鼠给药可溶性含zcytor17的多肽(包括本文所述的杂二聚体和多聚体受体)，例如zcytor17-Fc4或其它zcytor17可溶性和融合蛋白，用以评价zcytor17缓解症状和改变病程的作用。作为调整免疫和炎症反应的分子，zcytor17lig可诱导产生牵涉类风湿性关节炎致病的SAA，zcytor17lig拮抗剂可在体外和体内降低SAA活性，系统或局部给药zcytor17lig拮抗剂例如抗-zcytor17lig抗体或结合伴侣、包括zcytor17的多肽(包括本文所述的杂二聚体和多聚体受体)，例如zcytor17-Fc4或其它zcytor17可溶性和融合蛋白可潜在地抑制RA中的炎症反应。其它潜在的治疗剂包括zcytor17多肽、可溶性杂二聚体和多聚体受体多肽、或本文所述的抗zcytor17lig抗体或结合伴侣等。
2.内毒素血症
内毒素血症通常是由传染性因子例如细菌及其它传染性因子、败血症、中毒性休克综合症或在遭遇机会性感染的免疫受损患者中等引起的严重病情。抗-炎症抗体和结合多肽例如本发明的抗-zcytor17lig抗体和结合多肽治疗上的用处可有助于预防和治疗人类和动物的内毒素血症。其它潜在的治疗剂包括zcytor17多肽、可溶性杂二聚体和多聚体受体多肽、或本发明的抗zcytor17lig抗体或结合伴侣等，可作为有价值的治疗剂减轻内毒素血症的炎症和病理效应。
脂多糖(LPS)诱导的内毒素血症调用了在传染病中产生病理效应的许多促炎调理分子，并且LPS诱导的啮齿类动物内毒素血症是广为应用和认可的用于研究潜在的促炎或免疫调节剂的药理学效应的模型。LPS由革兰氏阴性细菌产生，是脓毒性休克发病中的主要致病因子(Glausner等，Lancet 338：732，1991)。休克样状态的确可通过向动物单次注射LPS而在实验上诱导。应答LPS的细胞产生的分子可直接或间接地靶向病原体。尽管这些生物学应答保护宿主抵抗入侵的病原体，它们也可能导致危害。从而，作为严重革兰氏阴性细菌感染的结果发生的先天免疫的大量刺激，导致过度产生细胞因子及其它分子，并形成致命综合症脓毒性休克综合症，它以发烧、低血压、弥散性血管内凝血以及多器官衰竭为特征(Dumitru等Cell 103：1071-1083，2000)。
LPS的这些毒性效应大多与导致多炎性调理分子释放的巨噬细胞活化有关。在这些调理分子中，TNF似乎起着关键性的作用，如通过给药中和抗-TNF抗体预防LPS毒性所显示的(Beutler等，Science 229：869，1985)。已充分确定向C57BI/6小鼠注射1ug大肠杆菌LPS在注射后大约2小时将导致循环的IL-6、TNF-α、IL-1和急性期蛋白(例如SAA)的显著增加。LPS的毒性似乎通过这些细胞因子介导，因为作为针对这些介导分子的被动免疫可导致降低的死亡率(Beutler等，Science 229：869，1985)。用于预防和/或治疗症脓毒性休克的潜在的免疫干预策略包括抗-TNF mAb、IL-1受体拮抗剂、LIF、IL-10和G-CSF。由于LPS诱导产生促炎因子，很可能促成了内毒素血症的病理，通过拮抗zcytor17lig多肽中和zcytor17lig活性、SAA或其它促炎因子可用于减轻内毒素血症例如内毒素休克中所看到的症状。其它潜在的治疗剂包括zcytor17多肽、可溶性杂二聚体和多聚体受体多肽、或本发明的抗-zcytor17lig抗体或结合伴侣等。
3 炎性肠病IBD
在美国大约500,000人患有炎性肠病(IBD)，其可影响结肠及直肠(溃疡性结肠炎)或两者、小肠及大肠(Crohn’s病)。这些疾病的发病机制不明，但是它们参与感染组织的慢性炎症。潜在的治疗剂包括zcytor17多肽、可溶性杂二聚体和多聚体受体多肽、或本发明的抗-zcytor17lig抗体或结合伴侣等，可作为有价值的治疗剂以减轻IBD和相关疾病中的炎症和病理效应。
溃疡性结肠炎(UC)是大肠(通常称之为结肠)的炎性病，以结肠最里面的内衬粘膜的炎症和溃疡为特征。这种炎症导致结肠频繁排空，导致腹泻。症状包括腹泻及伴随的腹部绞痛、发烧和体重丧失。尽管确切的UC致因未知，最近的研究表明身体的天然防御针对身体认做外源的身体内的蛋白运转(“自身免疫反应”)。活学因为它们类似于肠中的细菌蛋白，这些蛋白可能发起或刺激炎症过程，开始破坏结肠的内衬。随着结肠内衬的破坏，溃疡形成释放黏液、脓汁及血液。该病通常起始于直肠区，并且可能最终扩展到遍布整个大肠。复发的炎症事件导致具有疤痕组织的肠和直肠壁加厚。严重疾病可能发生结肠组织死亡或败血症。溃疡性结肠炎的症状可能在严重度方面变化，并且它们的发作可能是逐渐的或者突然的。发作可由许多因子激起，包括呼吸道感染或压力。
尽管目前尚无UC的痊愈，治疗集中于抑制结肠内衬中的异常炎症过程。包括皮质类固醇免疫抑制剂(如咪唑硫嘌呤、巯基嘌呤及氨甲蝶呤)和氨基水杨酸的治疗可用于治疗该病。不过，免疫抑制剂例如皮质类固醇和咪唑硫嘌呤的长期使用可导致严重的副作用，包括骨骼减薄、白内障、感染以及肝和骨髓效应。在当前疗法不成功的患者中，外科手术是一个选择。手术涉及整个结肠和直肠的切除。
有若干动物模型可部分模拟慢性溃疡性结肠炎。最广泛应用的模型是2，4，6-三硝基苯磺酸/乙醇(TNBS)诱导的大肠炎模型，它包括结肠慢性炎症和溃疡。当通过直肠内滴注将TNBS引入到易感小鼠的结肠中时，它在结肠粘膜中诱导T细胞介导的免疫应答，这种情况下导致大量的粘膜炎症，以遍布整个大肠壁的T细胞和巨噬细胞致密浸润为特征。而且，组织病理学像伴随着累积性体重丧失(消瘦)、出血性腹泻、直肠脱垂和大肠壁增厚的临床表现(Neurath等Intern.Rev.Immunol.19：51-62，2000)。
另一种大肠炎模型使用葡聚糖硫酸钠(DSS)，它诱导急性大肠炎，表现为出血性腹泻、体重丧失、结肠缩短和伴有中性粒细胞浸润的粘膜溃疡。DSS-诱导的大肠炎组织学上以炎症细胞浸润到固有层中、伴有淋巴样组织增生、病灶性隐窝损伤和上皮细胞溃疡为特征。认为这些变化是由于DSS对上皮的毒性效应并且通过固有层细胞的胞吞作用以及TNF-α和IFN-γ的产生形成的。尽管它常用，就DSS机制而言，有关与人类疾病的相关性的若干问题仍未解决。DSS被认为是T细胞非依赖性模型，因为它在T细胞缺陷动物如SCID小鼠中观察到。
向这些TNBS或DSS模型给药抗-zcytor17lig抗体或结合伴侣、可溶性含zcytor17的多肽(包括杂二聚体和多聚体受体)，例如zcytor17-Fc4或其它zcytor17可溶性和融合蛋白，可用于评价拮抗剂缓解症状和改变胃肠病病程的作用。Zcytor17lig可能在大肠炎的炎症应答中起作用，并且通过给药zcytor17lig拮抗剂中和zcytor17lig活性是潜在的IBD治疗途径。其它潜在的治疗剂包括本发明的zcytor17多肽、可溶性杂二聚体和多聚体受体多肽、或抗-zcytor17lig抗体或结合伴侣等。
4.银屑病
银屑病是影响大约七百万美国人的慢性皮肤病。银屑病在新皮肤细胞异常生长时发生，在老皮未能足够快脱落处导致皮肤发炎、肿胀和癣斑。斑癣是最常见的形式，以顶部覆以银白色癣的皮肤炎性斑(“病变”)为特征。银屑病可能限于少数斑，或者中度地涉及延展的皮肤区，最常见于头皮、膝、肘和躯干。尽管其高度可见，银屑病不是传染病。该病的发病涉及感染组织的慢性炎症。本发明的Zcytor17多肽、可溶性杂二聚体和多聚体受体多肽、或抗-zcytor17lig抗体或结合伴侣等，可作为有价值的治疗剂减轻银屑病、其它炎性皮肤病、皮肤和粘膜过敏及相关疾病的炎症和病理效应。
银屑病是T细胞介导的皮肤炎症紊乱，它可导致相当大的不适。它是一种无法痊愈的疾病，应侵袭所有年龄的人。银屑病侵袭大约两个百分点的欧洲和北美人。尽管患有轻微银屑病的个体通常可用局部制剂控制其疾病，但世界上多于一百万的患者需要紫外线或全身免疫抑制治疗。不幸的是，紫外线辐照的不便和风险以及许多疗法的毒性限制了它们的长期应用。而且，患者通常具有银屑病复发，而且在某些情况下停止免疫抑制治疗不久就复发。
分化是渐进性和动态的过程，起始于多能干细胞并止于终端分化的细胞。可产生不局限于某一世系的多能干细胞表达一组分化标志，当局限于某一细胞谱系时这些标志就会丢失。先祖细胞表达一组分化标志，随着细胞沿细胞谱系成熟路径前进，它们可能或可能不继续表达。由成熟细胞专一表达的分化标志通常是功能性质，例如细胞产物、产生细胞产物的酶、还有受体。细胞群分化阶段通过鉴定存在于细胞群中的标志监测。
有证据表明刺激特定细胞类型沿终端分化或去分化路径的因子影响起源于共同前体或干细胞的整个细胞群。从而，本发明包括刺激或抑制淋巴样细胞、造血细胞和上皮细胞的增殖。
Zcytor17lig是从已知具有重要的免疫学功能且含有在免疫系统中起作用的细胞的组织中分离的。Zcytor17lig表达在CD3+选择的激活的外周血细胞中，并且已证明zcytor17lig的表达在T细胞激活后增加。而且，本文实施例部分描述的实验结果表明本发明的多肽能够对单核细胞/巨噬细胞、T细胞、B细胞、NK细胞和/或分化状态的单核细胞/巨噬细胞、T细胞、B细胞、NK细胞或这些细胞的先祖细胞的生长/扩增起作用。刺激造血先祖细胞增殖且激活成熟细胞的因子一般是公知的，不过，增殖和激活也可以需要另外的生长因子。例如，已经证明IL-7和SteelFactor(c-kit配体)是NK先祖细胞集落形成所必需的。IL-15+IL-2与IL-7和Steel因子联合更为有效(Mrózek等，Blood 87：2632-2640，1996)。不过，未经鉴定的细胞因子可能对于特定亚型的NK细胞和/或NK先祖细胞的增殖是必要的(Robertson等，Blood 76：2451-2438，1990)。类似地，zcytor17lig可能单独作用或与其它细胞因子协同或增效促进单核细胞/巨噬细胞、T细胞、B细胞或NK细胞的生长、增殖扩增和修饰。
测量分化的测定法包括，例如，测量与组织的阶段特异性表达相关的细胞标志、酶活性、功能活性或形态学改变(Watt，FASEB，5：281-284，1991；Francis，Differentiation 57：63-75，1994；Raes，Adv.Anim. Cell Biol.Technol.Bioprocesses，161-171，1989；均特此并入作为参考)。备选地，zcytor17lig多肽本身可作为与组织的阶段特异性表达相关的附加的细胞表面或分泌标志。这样，zcytor17lig多肽的直接测量或其随着分化在组织中表达的丧失，可作为组织分化的标志。
类似地，zcytor17lig多肽的直接测量或其在组织中表达的丧失，可随着组织或细胞经历肿瘤发展而在组织或细胞中予以测定。与正常组织相比的细胞入侵和运动的提高，或者在癌症前期或癌变情况下zcytor17lig表达的增加或减少，可作为肿瘤发展中转化、入侵和转移的诊断。这样，肿瘤发展或转移阶段的知识将有助于医师针对给定的个体癌患者选择最合适的疗法，或治疗的攻击性。测量表达(mRNA或蛋白)增加或减少的方法是本领域众所周知的，并在文中描述，并且可应用于zcytor17lig的表达。例如，调节细胞运动力的多肽的出现或消失可用于前列腺癌的辅助诊断和预后(Banyard，J.和Zetter，B.R.，Cancer and Metast.Rev. 17：449-458，1999)。作为细胞运动力的效应分子，zcytor17lig表达的增加或减少可作为淋巴、上皮、造血及其它癌症的诊断。
而且，zcytor17lig对肿瘤进展和转移的活性和功效可在体内测量。已建立了若干同系小鼠模型以研究多肽、化合物或其它治疗对肿瘤发展的影响。在这些方法中，将在培养物中传代的肿瘤细胞移植到与肿瘤供体相同株系的小鼠中。细胞将在受体小鼠中形成具有相似特征的肿瘤，并且转移也将在某些模型中发生。除其它的以外，用于我们的研究的合适的肿瘤模型包括Lewis肺癌(ATCC No.CRL-1642)和B16黑素瘤(ATCCNo.CRL-6323)。这都是常用的与C57BL6/J小鼠同系的肿瘤细胞系，其在体外容易培养和操纵。由这些细胞系中任一种移植所得的肿瘤能够转移到C57BL6/J小鼠肺中。Lewis肺癌模型最近已用于小鼠以鉴定血管生成的抑制剂(O′Reilly MS等Cell 79：315-328，1994)。C57BL6/J小鼠通过每日注射重组蛋白、激动剂或拮抗剂或者一次性注射重组腺病毒用实验制剂处理。在处理3天后，将105到106细胞移植到背部皮肤下。备选的，细胞本身可在移植前用例如表达zcytor17lig的重组腺病毒感染，从而蛋白在肿瘤部位或在胞内而非全身合成。小鼠正常地在5天内形成可见肿瘤。令肿瘤生长为期达3周的的时期，期间它们在对照处理组中可能达到1500到1800mm3的大小。在整个实验中仔细监测肿瘤大小和体重。在处死时，取出肿瘤，并与肺和肝一起称重。已证明肺重量和转移性肿瘤负载很相关。作为附加的测量，计数肺表面的转移。利用本领域公知的和本文描述的方法，制备切除的肿瘤、肺和肝，用于组织病理学检查、免疫组织化学以及原位杂交。从而可以评估表达的讨论多肽如zcytor17lig对肿瘤募集血管和经历转移的能力的影响。另外，除了利用腺病毒，植入的细胞可由zcytor17lig瞬时转染。利用稳定zcytor17lig转染株以及利用可诱导启动子在体内激活zcytor17lig表达是本领域公知的，并且可用在该系统中以评估zcytor17lig诱导的转移。而且，纯化的zcytor17lig或zcytor17lig条件培养基可直接注射到该小鼠模型中，从而可用于该系统。一般参考文献参见O′Reilly MS等Cell 79：315-328，1994；以及Rusciano D等Murine Models of LiverMetastasis.Invasion Metastasis 14：349-361，1995。
Zcytor17lig或其抗体将可用于治疗肿瘤发生，从而将可用于癌症治疗。Zcytor17lig表达在激活的T细胞、单核细胞和巨噬细胞中，并且与白血病中常常易位的人类染色体区连锁。而且，表明zcytor17lig通过细胞因子受体zcytor17起作用，后者也表达在激活的T细胞、单核细胞和巨噬细胞中。zcytor17lig对激活的T细胞、单核细胞和巨噬细胞中的过度刺激可导致人类疾病状态，例如象免疫细胞癌及其它癌症。这样，鉴定zcytor17lig表达、多肽(例如通过抗-zcytor17lig抗体、zcytor17可溶性受体(例如zcytor17受体、杂二聚体(例如zcytor17/OSMRbeta、zcytor17/WSX-1)、多聚体(如zcytor17/OSMRbeta/WSX-1))、或者其它zcytor17lig结合伴侣)可起诊断的作用，并且可作为zcytor17lig增殖活性的拮抗剂。该配体可联合其它早已应用的制剂给药，包括常规的化学治疗剂以及免疫调节剂例如干扰素α。α/β干扰素已证明可有效地治疗某些白血病和动物疾病模型，并且干扰素-α和zcytor17lig的生长抑制功效可能是加性的。
NK细胞被认为在消除转移肿瘤细胞中起着主要作用，而且具有转移和实体肿瘤的患者具有降低的NK细胞活性水平(Whiteside等，Curr. Top.Microbiol.Immunol. 230：221-244，1998)。刺激NK细胞的制剂将可用于肿瘤的消除。
本发明提供了降低赘生性单核细胞/巨噬细胞增殖的方法，包括向具有单核细胞/巨噬细胞赘生物的哺乳动物给药足以降低赘生单核细胞/巨噬细胞增殖的量的zcytor17lig或抗-zcytor17lig组合物。在其它实施方案中，组合物可包括至少一种其它细胞因子。第二细胞因子可选自IL-2、IL-3、IL-12、IL-21、IL-22、IL-15、IL-4、GM-CSF、Flt3配体或干细胞因子。
本发明提供了抑制单核细胞/巨噬细胞激活或分化的方法。单核细胞是不完全分化的细胞，其迁移到多种组织，并在其中成熟和变成巨噬细胞。巨噬细胞通过将抗原提呈给淋巴细胞在免疫系统中起着中心作用，并通过分泌众多细胞因子作为淋巴细胞的辅佐细胞起着支持作用。巨噬细胞可内在化胞外分子，而且激活后具有增强的杀伤胞内微生物和肿瘤细胞的能力。激活的巨噬细胞也参与刺激急性或局部炎症。
在另一个方面，本发明提供了降低赘生性B或T细胞增殖的方法，包向具有B或T细胞赘生物的哺乳动物给药足以降低赘生单核细胞/巨噬细胞增殖的量的zcytor17lig拮抗剂组合物。在其它实施方案中，组合物可包括至少一种其它细胞因子，其中所述细胞因子可选自IL-2、IL-3、IL-12、IL-21、IL-22、IL-15、IL-4、GM-CSF、Flt3配体或干细胞因子。而且，Zcytor17lig拮抗剂可以是配体/毒素融合蛋白。
zcytor17lig-皂草素融合毒素可用于抵抗类似系列的白血病和淋巴瘤，扩展了可用zcytor17lig治疗的白血病范围。例如，此类白血病可以是过表达zcytor17受体(例如zcytor17受体、杂二聚体例如zcytor17/OSMRbeta，zcytor17/WSX-1)、多聚体(e.g.，zcytor17/OSMRbeta/WSX))的那些。融合毒素介导的zcytor17受体、zcytor17受体杂二聚体或多聚体(例如zcytor19/OSMRbeta，zcytor17/WSX-1或zcytor19/WSX-1/OSMR)的激活，提供了抑制靶细胞生长的两种独立的方法，第一种与单独用配体所观察到的功效相同，而第二种归因于通过受体内在化递送毒素。局限于淋巴和单核细胞的zcytor17受体表达模式提示该配体-皂草素缀合物可为患者耐受。
当恶性肿瘤治疗包括同种异体骨髓或干细胞移植时，zcytor17lig在增强移植物抗肿瘤效应中很有价值。Zcytor17lig可刺激溶解细胞的NK细胞由骨髓先祖细胞产生，并在抗原受体激活后刺激单核细胞和巨噬细胞增殖。因此，当患者接受同种异体骨髓移植时，zcytor17lig将增强抗肿瘤应答的产生，伴有或不伴有供体淋巴细胞的注入。
给定细胞因子的受体的组织分布提供了该细胞因子潜在的作用位点的强有力的指征。zcytor17的表达见于单核细胞和B细胞，在CD3+、CD4+和CD8+T细胞激活后具有显著提高的表达。另外，两个单核细胞序THP-1(Tsuchiya等，Int.J.Cancer 26：171-176，1980)和U937(Sundstrom等，Int.J.Cancer 17：565-577，1976)，也是zcytor17表达阳性的。
WSX-1受体的Northern分析在所有检测组织中揭示有转录本，人类脾脏、胸腺、淋巴结、骨髓和外周血白细胞中表达水平升高。并且，WSX-1的表达水平在激活T细胞后上升。
OSMR的表达据报道非常广泛(Mosley等，JBC 271：32635-32643，1996)。zcytor17、WSX-1及OSM受体的这种分布支持了zcytor17lig在免疫应答中的作用，特别是激活后扩增T细胞中的作用，或者在免疫系统单核细胞/巨噬细胞武器中的作用。
从而，本发明特定的实施方案指向可溶性zcytor17/WSX-1/OSMR和zcytor17/OSMR杂二聚体作为拮抗剂在炎性和免疫疾病或病症诸如胰腺炎、I型糖尿病(IDDM)、胰腺癌、胰腺炎、毒性弥漫性甲状腺肿、炎性肠病(IBD)、局限性回肠炎、结肠及肠癌、憩室病、自身免疫病、脓毒症、器官或骨髓移植；因外伤、手术或感染而起的炎症；淀粉样变性病；脾肿大；移植物对抗宿主病中以及在抑制炎症、免疫抑制、降低造血细胞、免疫细胞、炎症细胞或淋巴细胞、巨噬细胞、T细胞(包括Th1和Th2细胞、CD4+和CD8+细胞)的增殖；抑制针对病原或抗原的免疫应答中的应用。而且激活的免疫细胞例如激活的CD4+和CD19+细胞中zcytor17表达的存在说明zcytor17受体可能参与机体对抗外来入侵者(例如微生物和细胞碎片)的免疫防御反应，并可在炎症和癌症形成期间的免疫应答中起作用。这样，本发明促进或拮抗zcytor17受体功能的抗体和结合伴侣例如zcytor17lig可用于修饰免疫应答和炎症。
zcytor17lig结构和组织表达提示了在早期造血或胸腺细胞发育以及免疫应答调节或炎症中的作用。这些过程包括响应一种或多种细胞因子与其同源受体的结合刺激细胞增殖和分化。考虑到观察到的zcytor17lig的这种组织分布，激动剂(包括天然受体)和拮抗剂在体外和体内应用中都具有巨大潜能。鉴定为zcytor17lig激动剂的化合物在体外和体内可用于刺激靶细胞的增殖和发育。例如，激动剂化合物zcytor17lig或抗-zcytor17lig抗体，可用作为成分确定的细胞培养基组分，并且可单独使用或者联合其它细胞因子和激素以取代细胞培养中常用的血清。激动剂从而可用于特异性地促进培养物中的单核细胞、T细胞、B细胞及其它淋巴样和髓样谱系细胞、以及造血细胞的生长和/或发育或激活。
Zcytor17lig可用于刺激细胞介导的免疫以及用于刺激淋巴细胞增殖，例如治疗涉及免疫抑制的传染病，包括某些病毒感染。另外的用途包括肿瘤抑制，其中恶性转化产生抗原性的肿瘤细胞。zcytor17lig可用于诱导细胞毒性，它可通过激活效应细胞例如T细胞、NK(天然杀伤)细胞或LAK(淋巴激活的杀伤)细胞介导，或通过细胞凋亡途径直接诱导。Zcytor17lig也可通过提高感染的细胞类型的水平用于治疗白血球减少症，以及在骨髓移植后用于促进T细胞组分的再生；或者用于促进单核细胞增殖或激活，以及用于诊断及本文所述的其它应用。
Zcytor17lig可用于抑制免疫系统，例如治疗自身免疫病，类风湿性关节炎、多发性硬化症、糖尿病、炎症肠疾病、局限性回肠炎等。免疫抑制通过抑制感染细胞类型的增殖，也可用于降低组织或器官移植物及植入物的排斥，并用于治疗T细胞、B细胞或单核细胞特异性白血病或淋巴瘤及其它癌症。而且zcytor17lig可用于检测单核细胞、巨噬细胞和激活的T细胞，并辅助此类自身免疫病的诊断，尤其是其中单核细胞升高或激活的疾病状态。
Zcytor17lig多肽、肽、抗体等也可用在检测zcytor17lig循环水平的诊断系统中。在相关的实施方案中，与zcytor17lig多肽特异性结合的抗体或其它制剂可用于检测循环的zcytor17lig多肽。升高的或降低的配体多肽水平可指示病理状况，包括癌症。Zcytor17lig多肽可促成病理过程，并且是潜在疾病的间接标志。
并且，在某些疾病状态下zcytor17lig可用于检测或靶向其受体。例如，人类血清中升高水平的可溶性IL-2受体与多种炎症和赘生病况相关，例如心肌梗塞、哮喘、重症肌无力、类风湿性关节炎、急性T细胞白血病、B细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、结肠癌、乳腺癌及卵巢癌(Heaney等，Blood 87：847-857，1996)。类似地，zcytor17受体在激活的单核细胞中升高，因此zcytor17受体和/或其可溶性受体可能与相关炎症和赘生病况相关，或作为其标志。zcytor17lig，包括细胞毒性偶联物，因此可用于检测或靶向此类组织和疾病状态。
本发明的分子在免疫系统的单核细胞/巨噬细胞武器中具有特别用途。可评估此种活性的方法是已知的。例如，干扰素伽马(IFNγ)是单核吞噬细胞强有力的活化剂。例如，THP-1细胞(ATCC No.TIB-202)用干扰素伽马激活后，zcytor17表达的增加提示该受体参与单核细胞的激活。单核细胞是不完全分化的细胞，其迁移到多种组织，并在其中成熟和变成巨噬细胞。巨噬细胞通过将抗原提呈给淋巴细胞在免疫系统中起着重要作用，并通过分泌众多细胞因子作为淋巴细胞的辅佐细胞起着支持作用。巨噬细胞可内在化胞外分子，而且激活后具有增强的杀伤胞内微生物和肿瘤细胞的能力。激活的巨噬细胞也参与刺激急性或局部炎症。而且，已证明单核细胞-巨噬细胞的功能在多种疾病状态下是异常的。例如参见Johnston，RB，New Eng.J.Med. 318：747-752，1998。
本领域技术人员将会意识到zcytor17受体激动剂例如zcytor17是有用的。例如，在具有感染体质的人群中报道了单核细胞降低的迁移，例如新生婴儿、接受皮质类固醇或其它免疫抑制治疗的患者以及具有糖尿病、烧伤或AIDS的患者。zcytor17激动剂例如zcytor17可导致单核细胞迁移能力提高，并有可能预防这些人群的感染。具有慢性肉芽肿性疾病的患者单核吞噬细胞的吞噬杀伤也存在极度的缺陷。这导致形成皮下脓肿，以及肝、肺、皮和淋巴结中的脓肿。zcytor17受体激动剂例如zcytor17lig，可矫正或改善这种吞噬缺陷。另外，已在癌症和维-奥综合症(Wiskott-Aldrich syndrome)(湿疹、血小板减少症和复发的感染)患者中报道缺陷型单核细胞细胞毒性。通过zcytor17受体激动剂例如zcytor17lig激活单核细胞，可有助于这些病况的治疗。单核细胞-巨噬细胞系统显著地参与数种脂质贮积疾病(神经鞘脂沉积症)例如戈谢病(Gaucher′s disease)。感染抵抗力可由于巨噬细胞功能缺陷而削弱，它可通过zcytor17受体激动剂例如zcytor17lig治疗。
而且，本领域技术人员将会意识到zcytor17lig拮抗剂是有用的。例如，在动脉粥样硬化症病变中，首要的异常之一是单核细胞/巨噬细胞定位于内皮细胞上。这些病变可通过使用zcytor17lig拮抗剂预防。抗-zcytor17lig抗体(例如zcytor17lig中和抗体)、zcytor17可溶性抗体、杂二聚体和多聚体以及zcytor17lig结合伴侣也可用作为zcytor17lig拮抗剂。而且，单核母细胞白血病与多种反映出巨噬细胞生物学产物释放的临床异常相关，实例包括血清和尿液中高水平的溶酶体以及高烧。而且，此类白血病表现出单核细胞的异常增加。这些效应可能能够由例如本文所述的zcytor17lig拮抗剂预防。而且，抗-zcytor17lig可缀合于诸如毒素成分和细胞因子等分子，如本文所述，以指导杀伤白血病单核细胞。
利用本领域公知和本文所述的方法，技术人员能够容易地评估zcytor17lig激动剂和拮抗剂在本文公开的疾病状态、炎症、免疫(如自身免疫)、癌症或感染以及涉及单核细胞的其它疾病状态下的活性。另外，由于zcytor17lig以T细胞、巨噬细胞和单核细胞特异性的方式表达，并且这些疾病涉及单核细胞的异常，例如细胞增殖、功能、分布和激活，本发明的多核苷酸、多肽和抗体可作为诊断剂检测此类单核细胞异常，并指示疾病的存在。此类方法包括从患者采取生物学样品，例如血液、唾液或生检，并将其与正常对照样品进行比较。组织学、细胞学、流式细胞仪、生物化学及其它方法可用于测定与正常对照相比的患者样品中zcytor17lig或表达zcytor17lig的细胞即单核细胞的相对水平或分布。与对照相比的zcytor17lig表达水平的变化(增加或减少)或单核细胞数目或分布的变化(例如，单核细胞在它们正常不存在的组织中的增加或浸润)将可指示疾病。此类诊断方法也可以包括使用连接于本发明的多核苷酸、多肽或抗体的放射、荧光和比色标签。此类方法是本领域众所周知的，并在文中公开。
具有zcytor17lig活性的氨基酸序列通过结合zcytor17受体，从而防止zcytor17lig与内源zcytor17lig受体结合，可用于调节免疫系统。Zcytor17lig拮抗剂例如抗-zcytor17lig抗体，通过抑制zcytor17lig与内源zcytor17lig受体结合，也可用于调节免疫系统。从而，本发明包括将具有zcytor17lig活性的蛋白、多肽和肽(例如zcytor17lig多肽、zcytor17lig类似物(如抗-zcytor17lig抗-独特型抗体)以及zcytor17lig融合蛋白)用于缺少足够量的该多肽的受试者，或者产生过量包含zcytor17的受体的受试者。Zcytor17拮抗剂(如抗-Zcytor17抗体)也可用于治疗产生过量zcytor17或含zcytor17的受体的受试者。合适的受试者包括哺乳动物例如人。
已证明Zcytor17lig在激活的单核细胞中表达，并且可能参与调节炎症。这样，可测定本发明的多肽并利用其修饰炎症的能力，或者作为炎症标记使用。确定zcytor17lig促炎和抗炎性质的方法是本领域公知的，并在文中讨论。而且，它可能参与上调急性期反应物例如血清淀粉样蛋白A(amyloid A)(SAA)、α1-抗胰凝乳蛋白酶和结合珠蛋白的产生，并且zcytor17受体配体的表达可在体内注射参与炎症反应的脂多糖(LPS)后增加(Dumoutier，L.等，Proc.Nat’l.Acad.Sci. 97：10144-10149，2000)。急性期蛋白例如SAA的产生，被认为是短期生存机制，其中炎症是有益的；不然而，急性期蛋白维持较长时期则促成慢性炎症并且对人类健康是有害的。综述参见Uhlar，CM和Whitehead，AS，Eur.J.Biochem. 265：501-523，1999，以及Baumann H.和Gauldie，J.Immunology Today 15：74-80，1994。而且，急性期蛋白SAA牵涉多种慢性炎性病的发病，牵涉动脉硬化症和类风湿性关节炎，并且是淀粉样变性病中沉积的淀粉样蛋白A蛋白的前体(Uhlar，CM和Whitehead，同前)。因而，当配体例如zcytor17lig作为促炎分子起作用并诱导产生SAA时，拮抗剂将可用于治疗与该配体诱导的急性期应答蛋白相关的炎性病及其它疾病。此类拮抗剂由本发明提供。例如，减轻炎症的方法包括向具有炎症的哺乳动物给药足以减轻炎症的量的zcytor17lig多肽或抗-zcytor17lig抗体(如中和抗体)组合物。而且，在具有炎症的哺乳动物中抑制炎症反应的方法可包括：(1)测定血清淀粉样蛋白A蛋白的水平；(2)给药处于可接受的药学载体中的如本文所述的包括zcytor17lig多肽或抗-zcytor17lig抗体的组合物；(3)测定血清淀粉样蛋白A蛋白给药后的水平；(4)将步骤(1)中的血清淀粉样蛋白A蛋白水平与步骤(3)中的血清淀粉样蛋白A蛋白的水平进行比较，其中血清淀粉样蛋白A蛋白水平没有上升或下降则指示抑制了炎症反应。
与本发明的zcytor17lig结合的受体包括至少一个zcytor17受体亚基。包括在杂二聚体可溶性受体中的第二受体多肽属于包括I类细胞因子受体亚基(并且更具体地是OSMRbeta和WSX-1的)受体亚家族。根据本发明，除了单体或同型二聚体zcytor17受体多肽，杂二聚体可溶性zcytor17受体，例如包括可溶性zcytor17受体+可溶性I类受体杂二聚体组分例如OSMRbeta或WSX-1的实施方案，可作为zcytor17lig拮抗剂起作用。其它实施方案包括含zcytor17的可溶性多聚体受体，例如zcytor17受体+可溶性I类受体多聚体组分，例如OSMRbeta和WSX-1。
如同zcytor17lig，与其zcytor17受体cDNA相应的mRNA的组织分布分析显示mRNA水平在单核细胞和前列腺细胞中最高，并且在激活的单核细胞以及激活的CD4+、激活的CD8+和激活的CD3+细胞中升高。因此，zcytor17受体也牵涉诱导炎症和免疫应答。从而，本发明的特定实施方案指向于zcytor17lig-抗体和zcytor17lig以及可溶性zcytor17受体杂二聚体作为拮抗剂在炎症和免疫疾病或病症诸如胰腺炎、I型糖尿病(IDDM)、胰腺癌、胰腺炎、毒性弥漫性甲状腺肿、炎性肠病(IBD)、局限性回肠炎、结肠及肠癌、憩室病、自身免疫病、脓毒症、器官或骨髓移植；因外伤、手术或感染而起的炎症；淀粉样变性病；脾肿大；移植物对抗宿主病下以及在抑制炎症、免疫抑制、降低造血、免疫、炎症或淋巴细胞、巨噬细胞、T细胞(包括Th1和Th2细胞、CD4+和CD8+细胞)的增殖、抑制针对病原体或抗原的免疫应答中的应用。而且激活的免疫细胞例如激活的CD3+、单核细胞、CD4+和CD19+细胞中zcytor17受体及zcytor17lig表达的存在说明zcytor17受体可能参与机体对抗外来入侵者(例如微生物和细胞碎片)的免疫防御反应，并可在炎症和癌症形成期间的免疫应答中起作用。这样，本发明促进或拮抗zcytor17受体功能的zcytor17lig和抗zcytor17lig抗体可用于修饰免疫应答和炎症。
而且，与zcytor17受体多肽结合的zcytor17lig多肽及其抗体可用于：
1)在急性炎症，因外伤、手术或感染而起的炎症，脓毒症或感染，以及慢性炎性病例如哮喘、炎性肠炎(IBD)、慢性大肠炎、脾肿大、类风湿性关节炎、复发性的急性炎症事件(如肺结核)的治疗中以及淀粉样变性病和动脉粥样硬化症、Castleman’s Disease、哮喘及与急性期应答的诱导相关的其它疾病的治疗中拮抗或封闭通过含zcytor17的受体的信号传导。
2)在自身免疫病例如IDDM、多发性硬化症(MS)、系统性红斑狼疮(SLE)、重症肌无力、类风湿性关节炎以及IBD的治疗中拮抗或封闭通过zcytor17受体的信号传导，以预防或抑制免疫细胞(例如淋巴细胞、单核细胞、白细胞)中通过zcytor17受体的信号传导(Hughes C等，J. Immunol 153：3319-3325，1994)。备选地，抗体例如zcytor17lig单克隆抗体(MAb)也可作为拮抗剂损耗不期望的免疫细胞以治疗自身免疫病。哮喘、过敏及其它特应性疾病可用针对例如抗-zcytor17lig抗体、可溶性zcytor17受体可溶性受体或zcytor17/CRF2-4杂二聚体的Mab治疗，以抑制免疫应答或损耗侵入的细胞。利用本发明的多肽和抗体封闭或抑制通过zcytor17的信号传导，也可有益于胰腺、肾脏、垂体和神经元细胞的疾病。IDDM、NIDDM、胰腺炎及胰腺癌可能受益。Zcytor17可作为癌症单抗治疗的靶，其中拮抗性的Mab抑制肿瘤生长并靶向免疫介导的杀伤(Holliger P，和Hoogenboom，H：Nature Biotech. 16：1015-1016，1998)。可溶性zcytor17受体单体、同型二聚体、杂二聚体和多聚体也可用于治疗肾病例如肾小球硬化症、膜神经病、淀粉样变性病(其也侵袭肾等组织)、肾动脉硬化症、血管球性肾炎、多种起源的血管球性肾炎、肾纤维增生病以及与SLE、IDDM、II型糖尿病(NIDDM)、肾肿瘤及其它疾病相关的肾机能障碍。
3)在自身免疫病例如IDDM、MS、SLE、重症肌无力、类风湿性关节炎以及IBD的治疗中促进或起始通过zcytor17受体的信号传导。zcytor17lig可能信号传导给淋巴细胞或其它免疫细胞，使之分化、改变增殖、或改变细胞因子或改善自身免疫病的细胞表面蛋白的产生。具体地，将T辅助细胞应答调节为替代的细胞因子分泌模式可偏离自身免疫病以改善疾病(Smith JA等，J.Immunol. 160：4841-4849，1998)。类似地，zcytor17lig可用于信号传导、减少和偏离参与哮喘、过敏和特应性疾病的免疫细胞。通过zcytor17受体的信号传导也可有益于胰腺、肾脏、垂体和神经元细胞的疾病。IDDM、NIDDM、胰腺炎及胰腺癌可能受益。Zcytor17可作为胰腺癌单抗治疗的靶，其中信号传导的Mab抑制肿瘤生长并靶向免疫介导的杀伤(Tutt，AL等，J Immunol.161：3175-3185，1998)。类似地，T细胞特异性白血病、淋巴瘤、浆细胞恶性增生(例如多发性骨髓瘤)以及癌可由针对本发明含zcytor17的可溶性受体的单克隆抗体(如中和抗体)治疗。
本文所述的抗-zcytor17lig抗体、可溶性zcytor17受体单体、同型二聚体、杂二聚体和多聚体多肽可在如上所述的自身免疫病、特应性疾病、NIDDM、胰腺炎以及肾机能障碍的治疗中用于中和/封闭zcytor17受体的配体活性。可溶形式的zcytor17受体可用于促进T细胞介导的抗体应答和/或促进淋巴细胞或其它免疫细胞产生IL-4或其它细胞因子。
抗-zcytor17lig抗体及含zcytor17的可溶性受体可用作为zcytor17lig的拮抗剂。此类拮抗效应可通过直接中和或结合其天然配体实现。除了拮抗用途，可溶性受体可结合zcytor17lig并起着载体或载体蛋白的作用，以将zcytor17lig运输到不同的组织、器官和体内的细胞中。这样，可溶性受体可融合或偶联于分子、多肽或化学成分，指导可溶性受体-配体复合物进入特定部位，例如组织、特定免疫细胞、单核细胞或肿瘤。例如，在急性感染或某些癌症中，可能因诱导炎症和局部急性期应答蛋白而得益。因而，本文所述的可溶性受体或抗体可用于特异性地指导促炎zcytor17lig配体的作用。参见Cosman，D.Cytokine 5：95-106，1993；以及Fernandez-Botran，R.Exp.Opin. Invest.Drugs 9：497-513，2000。
而且，可溶性受体通过稳定配体免于降解或清除或通过将配体靶向体内的作用部位，可用于稳定zcytor17lig，以提高配体的生物利用度、治疗寿命和/或功效。例如天然存在的IL-6/可溶性IL-6R复合物稳定IL-6，并通过gp130受体传导信号。参见Cosman，D.同前，以及Fernandez-Botran，R.同前。而且，Zcytor17可与同源配体例如其配体组合以构成配体/可溶性受体复合物。此类复合物可用于刺激提呈成对受体亚基的细胞应答。zcytor17受体/zcytor17lig复合物的细胞特异性可能与单独给药配体所见到的不同。此外，所述复合物可能具有截然不同的药物动力学性质例如作用半衰期、剂量/应答以及器官或组织特异性。Zcytor17/配体复合物因而可能具有增强免疫应答、或刺激系膜细胞、或刺激肝细胞的激动剂活性。或者，类似于针对IL6/IL6R复合物的应答，只有表达信号传导亚基的组织受带复合物的杂二聚体影响(Hirota H.等，Proc.Nat’l.Acad.Sci. 92：4862-4866，1995；Hirano，T.in Thomason，A.(Ed.)″The Cytokine Handbook″，3rd Ed.，p.208-209)。IL12和CNTF的可溶性受体/细胞因子复合物表现出相似活性。
Zcytor17lig也可用在诊断系统中，用于检测循环的配体水平，以及检测急性期炎症反应。在相关的实施方案中，与zcytor17lig特异性结合的抗体或其它制剂可用于检测循环的zcytor17lig多肽；反过来，zcytor17lig本身可用于检测循环的或局部起作用的受体多肽。升高或降水平低的配体或受体多肽可指示病理状况，包括炎症或癌症。而且，在某些疾病状态(例如类风湿性关节炎)中，检测急性期蛋白或分子例如Zcytor17lig可指示慢性炎症病况。检测此类病情可辅助疾病诊断，并帮助医师选择合适的疗法。
本发明的多肽和蛋白也可离体应用，例如在自体骨髓培养中。简要地，在化疗或器官移植前，从患者取出骨髓，并用zcytor17lig处理，任选地联合一种或多种其它细胞因子。然后在化疗后将处理的骨髓返回至患者，以加速骨髓的恢复，或在移植后返回以抑制移植物对抗宿主疾病。另外，本发明的蛋白也可用于单核细胞/巨噬细胞骨髓或外周血先祖(PBPC)细胞的离体扩增。在治疗前，可用干细胞因子(SCF)刺激骨髓，以使早期先祖细胞释放到外周循环中。可从外周血中收集这些先祖细胞并浓缩，然后在培养中用zcytor17lig处理，任选地联合一种或多种其它细胞因子，包括但不限于SCF、IL-2、IL-4、IL-7、Lif、IL-3、IL-12、IL-21或IL-15，使之分化并增殖为高密的的淋巴样培养物，其然后可在化疗或抑制后返回至患者。
本发明提供了扩增造血细胞和造血细胞先祖细胞的方法，包括与不存在zcytor17lig时培养的骨髓或外周血细胞相比，用包括足以引起骨髓或外周血细胞中淋巴样细胞数目增加的zcytor17lig量的组合物培养骨髓或外周血细胞。在其它实施方案中，造血细胞和造血先祖细胞是淋巴样细胞。在另一个实施方案中，淋巴样细胞为NK细胞或细胞毒性T细胞。此外，所述组合物也可以包括选自包括IL-2、IL-15、IL-4、Lif、IL-3、IL-12、IL-21、GM-CSF、Flt3配体和干细胞因子的组的至少一种其它细胞因子。
或者，zcytor17lig可激活免疫系统，这将对加强针对传染病的免疫力，治疗免疫受损的患者例如HIV+患者、癌症患者，或改进疫苗很重要。特别是，zcytor17lig对单核细胞/巨噬细胞、T细胞、B细胞、NK细胞或其先祖细胞的刺激或扩增，将为病毒感染治疗以及作为抗赘生物因子提供治疗价值。类似地，zcytor17lig对抵抗病毒和非病毒病原因子(包括细菌、原生动物和真菌)的免疫应答的刺激通过抑制此类传染因子的生长将为此类传染病治疗提供治疗价值。直接或间接地测定存在于体内的病原或抗原例如肿瘤细胞的水平，可通过本领域公知的和本文所述的许多方法实现。
本发明包括在暴露于抗原或病原体的哺乳动物中刺激免疫应答的方法，包括步骤：(1)直接或间接地确定所述哺乳动物中存在的抗原或病原体的水平；(2)给药处于可接受的药学载体中的包括zcytor17lig多肽的组合物；(3)直接或间接地确定所述哺乳动物的抗原或病原体水平；和(4)将步骤1中的抗原或病原体水平与步骤3中的抗原或病原体水平进行比较，其中所述水平的变化表示刺激了免疫应答。在另一个实施方案中，重复给药所述zcytor17lig组合物。在其它实施方案中，抗原是B细胞肿瘤、病毒、寄生虫或细菌。
在另一个方面，本发明提供了在暴露于抗原或病原体的哺乳动物中刺激免疫应答的方法，包括：(1)确定抗原特异性抗体或病原体特异性抗体的水平；(2)给药处于可接受的药学载体中的包括zcytor17lig多肽的组合物；(3)确定给药后抗原特异性抗体或病原体特异性抗体的水平；(4)将步骤(1)中的抗体水平与步骤(3)中的抗体水平进行比较，其中所述抗体水平的提高表示刺激了免疫应答。
编码zcytor17lig多肽的多核苷酸可用在期望提高或抑制zcytor17lig活性的基因治疗应用中。如果哺乳动物具有突变或缺失的zcytor17lig基因，可将zcytor17lig基因引入到该哺乳动物的细胞中。在一个实施方案中，在病毒载体中将编码zcytor17lig多肽的基因引入体内。此类载体包括减毒或缺陷的DNA病毒，例如但不限于缺陷型DNA病毒，例如但不限于单纯疱疹病毒(HSV)、乳头瘤病毒、EB病毒(EpsteinBarr virus，EBV)、腺病毒、腺相关病毒(AAV)等。缺陷型病毒在引入到细胞中后不是传染性的。利用缺陷型病毒载体允许在特定的局部区域给药细胞，无需考虑载体可感染其它细胞。特定载体的实例包括但不限于。缺陷型单纯疱疹病毒1(HSV1)载体(Kaplitt等，Molec.Cell. Neurosci. 2：320-30，1991)，减毒腺病毒载体，例如由Stratford-Perricaudet等，J.Clin.Invest. 90：626-30，1992描述的载体，以及缺陷型腺相关病毒载体(Samulski等，J.Virol. 61：3096-101，1987；Samulski等，J.Virol. 63：3822-8，1989)。
可将zcytor17lig基因在逆转录病毒载体中引入，例如如在Anderson等，美国专利No.5,399,346；Mann等Cell 33：153，1983；Temin等，美国专利No.4,650,764；Temin等，美国专利No.4,980,289；Markowitz等，J.Virol. 62：1120，1988；Temin等，美国专利No.5,124,263；国际专利公开号WO 95/07358，由Dougherty等公开于1995年3月16日；以及Kuo等，Blood 82：845，1993中所述的。或者，可利用脂质体通过体内脂转染引入载体。合成的阳离子脂质可用于制备脂质体，用于编码标记的基因的体内转染(Felgner等，Proc.Natl.Acad. Sci.USA 84：7413-7，1987；Mackey等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：8027-31，1988)。在体内利用脂转染将外源基因引入到特定器官中具有某些实用的优势。脂质体分子靶向特定细胞代表了一个领域的益处。更特别的，将转染定向于特定细胞代表一个领域的益处。例如，将转染定向于特定细胞类型在具有细胞异质性的组织，例如免疫系统、胰腺、肝、肾和脑中将尤为有利。脂质可化学偶联于其它分子用于靶向的目的。靶向肽(例如激素或神经递质)、蛋白例如抗体或非肽分子可化学偶联于脂质体。
也可以自体内取出靶细胞；将载体作为裸DNA质粒引入；然后将转化的细胞重移植到体内。用于基因治疗的裸DNA载体可通过本领域公知的方法引入到期望的宿主细胞中，例如转染、电穿孔、微注射、转导、细胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸钙沉淀、使用基因枪或使用DNA载体输送装置。例如参见Wu等，J.Biol.Chem. 267：963-7，1992；Wu等，J. Biol.Chem. 263：14621-4，1988。
反义方法学可用于抑制zcytor17lig基因转录，例如在体内抑制细胞增殖。互补于zcytor17lig编码多核苷酸(例如如SEQ ID NO：1所示的多核苷酸)片段的多核苷酸被设计与zcytor17lig编码mRNA结合，并抑制此mRNA的翻译。此类反义多核苷酸被用于抑制细胞培养物或受试者中zcytor17lig多肽编码基因的表达。
也可以产生称之为“转基因小鼠”的被改造表达zcytor17lig基因的小鼠，和称之为“敲除小鼠”的表现出zcytor17lig基因功能完全缺失的小鼠(Snouwaert等，Science 257：1083，1992；Lowell等，Nature 366：740-42，1993；Capecchi，M.R.，Science 244：1288-1292，1989；Palmiter，R.D.的等Annu Rev Genet. 20：465-499，1986)。例如，过表达zcytor17lig的转基因小鼠(普遍的或者处于组织特异性或组织局限性启动子控制下的)可用于查询过表达是否产生表型。例如，过表达野生型zcytor17lig多肽、多肽片段或其突变体可改变正常细胞过程，产生识别其中zcytor17lig表达在功能上相关的组织的表型，并且可指示zcytor17lig、及激动剂或拮抗剂的治疗靶。例如，优选的待改造转基因小鼠是过表达zcytor17lig(SEQ ID NO：2的氨基酸残基23-164或SEQ ID NO：11的24-163)的小鼠。而且，此类过表达可能产生与人类疾病表现出相似性的表型。类似地，敲除zcytor17lig小鼠可用于确定zcytor17lig在体内何处绝对必要。敲除小鼠的表型可预测zcytor17lig拮抗剂例如本文所述的那些可能具有的体内效应。本文所述的人类或小鼠zcytor17lig cDNA可用于产生敲除小鼠。这些小鼠可在体内系统中用于研究zcytor17lig基因和由其编码的蛋白，并且可用作为相应人类疾病的体内模型。而且，本文所述的转基因小鼠表达的zcytor17lig反义多核苷酸或指向zcytor17lig的核酶，可类似地用于上文所述的转基因小鼠。也可以通过给药纯化的zcytor17lig蛋白进行研究。
实验证据提示了zcytor17lig在涉及皮肤或内表面上皮细胞，例如大肠、小肠、胰腺、肺、前列腺、子宫等的疾病进展中的作用。首先，如本文所述，zcytor17受体，包括OSM受体β和zcytor17，在位于上皮表面的包括来源于肺上皮、肺成纤维细胞、前列腺、结肠、乳腺、肝上皮、骨和皮肤上皮、骨成纤维细胞等的细胞系的多种细胞类型中表达。而且，如本文所述，来自这些细胞类型的实例也响应zcytor17lig对STAT报告构建体的激活。另外，如本文所述，多种细胞系响应zcytor17lig刺激，产生提高水平的IL-6、IL-8、MCP-1(趋化因子)。整体而言，这些数据提示了zcytor17lig在涉及上皮的疾病中的作用，例如特应性皮炎、皮炎、银屑病、牛皮癣关节炎、湿疹、牙龈炎、牙周病、炎性肠炎(IBD)(例如溃疡性结肠炎、局限性回肠炎)、生殖疾病，例如象子宫颈异常增生、子宫颈癌、其它皮肤病像癌症：肉瘤、癌瘤、黑素瘤等，也就是说不仅仅是炎性病(因为免疫系统参与癌症激活/治疗)，涉及屏障机能障碍，例如象移植物抗宿主病(GVHD)以及过敏性肠疾病(IBD)、以及涉及肺上皮的疾病，例如哮喘、肺气肿等疾病。另外，暴露于zcytor17lig的细胞释放细胞因子IL-6、IL-8和MCP-1提示zcytor17lig参与炎症。因此，调节zcytor17lig可用于治疗与表达受体的组织相关的自身免疫病、炎症或癌变疾病。这些疾病包括，例如前列腺炎、肝炎、骨关节炎等。Zcytor17lig可能正面或负面直接或间接地调控这些疾病。因此，可给药zcytor17lig直接用于或与抑制zcytor17lig活性的分子，包括例如zcytor17lig的单克隆抗体或zcytor17的单克隆抗体或者识别zcytor17和OSM受体β复合物的单克隆抗体一起用于治疗如本文所述的疾病。
数据也提示zcytor17lig可能参与调控TH2T细胞介导的疾病。首先，zcytor17lig是由激活的T细胞的TH2亚型制备的。TH2细胞与TH1细胞相比表达更多的zcytor17lig。另外，如本文所述，响应zcyto17配体刺激，至少两种肺上皮细胞系(SK-LU-1，A549)被刺激以提高IL13受体α-2 mRNA。IL-13受体α2链与人类乳腺和胰腺肿瘤的肿瘤发生相关。这提示zcytor17lig可能在调控这些类型的癌症以及其它癌症的肿瘤发生中起作用。因此，在哺乳动物尤其是人类中给药zcytor17lig拮抗剂或直接利用zcytor17lig可用于治疗良性或恶性的，和处于肿瘤发育的多种级别(I-IV级)和时期(如TNM或AJC分期法)的这些类型的癌症。
本领域众所周知IL13参与产生激活的TH2细胞并参与TH2介导的疾病，例如哮喘、特异性皮炎等。Zcytor17lig或zcytor17lig拮抗剂可用于治疗涉及TH2 T细胞的疾病。这将包括诸如象特异性皮炎、哮喘、以及由激活的TH2细胞恶化的其它疾病等疾病。zcytor17lig对疾病的参与，例如象特异性皮炎，也通过如本文所述的过表达zcytor17lig并形成特异性皮炎症状的转基因小鼠的表型得到了支持。
尽管zcytor17lig优先由TH2细胞表达，TH1细胞中和CD8+T细胞中仍有些许zcytor17lig表达。因此，zcytor17lig或其拮抗剂可用于治疗涉及激活的T细胞免疫调节的疾病，包括例如病毒感染、癌症、移植排斥等。
Zcytor17lig也参与癌症的形成。在人类骨成纤维细胞骨肉瘤、人类皮肤成纤维细胞黑素瘤、结肠上皮细胞癌、腺癌、乳腺上皮细胞腺癌、前列腺上皮细胞腺癌以及肺上皮细胞腺癌和癌中存在zcytor17和OSM受体β受体的表达。因此，用zcytor17lig、其片段或zcytor17lig拮抗剂治疗上皮起源的肿瘤是有益的，这包括但不限于癌(carcinoma)、腺癌和黑素瘤。尽管如此，zcytor17lig或zcytor17lig拮抗剂可用于治疗癌症或减轻癌症的一种或多种症状，所述癌症包括但不限于鳞状细胞或表皮样癌、基底细胞癌、腺癌、乳头状癌囊腺癌、支气管癌、支气管腺瘤、黑素瘤、肾细胞癌、肝细胞癌、移行细胞癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、唾液腺起源的恶性混合瘤、维尔姆斯氏瘤、未成熟畸胎瘤、畸胎癌、及包括至少某些上皮来源的细胞的其它肿瘤。
一般地，zcytor17lig多肽(或zcytor17类似物或融合蛋白)的给药剂量将根据诸如患者的年龄、体重、身高、性别、普通体检情况以及以前的病史等因素变化。典型地，期望为受体提供从大约1pg/kg到10mg/kg(制剂量/患者体重)范围内剂量的zcytor17lig多肽，尽管根据情境要求也可以给药更低或更高的剂量。本领域技术人员利用本领域公知的方法可容易地确定此剂量及其调整。
向受试者给药zcytor17lig多肽可以是局部、吸入、静脉内、动脉内、腹膜内、肌内、皮下、胸膜内、鞘内、通过局部导管灌注、或通过直接病变内注射。当通过注射给药治疗剂时，给药可以通过连续输注或通过单个或多个药丸。
另外的给药路径包括口服、粘膜、肺部及经皮途径。口服递送适于聚酯微球、玉米蛋白微球、类蛋白微球、聚氰基丙烯酸酯微球及基于脂质的系统(例如，参见DiBase和Morrel，“Oral Delivery ofMicroencapsulated Proteins，”in Protein Delivery：PhysicalSystems，Sanders和Hendren(编辑)，pages 255-288(Plenum Press1997))。鼻内递送的可行性通过胰岛素给药模式得到例证(例如参见Hinchcliffe和Illum，Adv.Drug Deliv.Rev. 35：199(1999))。可制备含Zcytor17lig的干燥或液体颗粒并借助于干粉配量器、液体气雾剂发生器或喷雾器吸入(例如Pettit和Gombotz，TIBTECH 16：343(1998)；Patton等，Adv.Drug Deliv.Rev. 35：235(1999))。该方法以AERX糖尿病管理系统为例说明，它是手持电子吸入器，将气雾剂化的胰岛素递送到肺部。研究证明大至48,000kDa的蛋白可借助于低频超声以治疗浓度经皮递送，这说明了经皮给药的可行性(Mitragotri等，Science 269：850(1995))。使用电穿孔的透皮递送提供了另一种方式给药具有Zcytor17lig结合活性的分子(Potts等，Pharm. Biotechnol. 10：213(1997))。
包含具有Zcytor17lig结合活性的蛋白、多肽或肽的药物组合物可根据已知的制备药学上有用的组合物的方法配制，藉此治疗蛋白与药学上可接受的载体在混合物中组合。如果其给药可被受体患者耐受，则该组合物被表述为“药学上可接受的载体”。无菌磷酸缓冲盐是药学上可接受的载体的一个实例。其它合适的载体是本领域人员熟知的。例如，参见Gennaro(编辑)，Remington′s Pharmaceutical Sciences，19thEdition(Mack Publishing Company 1995)。
为治疗目的，向患者给药治疗有效量的具有Zcytor17lig结合活性的分子和药学上可接受的载体。如果给药的量有生理学意义，则具有Zcytor17lig结合活性的蛋白、多肽或肽与药学上可接受的载体的组合被表述为以“治疗有效量”给药。如果制剂的存在导致受体患者生理学上可检测的变化，则它有生理学意义。例如，如果治疗炎症的制剂减轻至少部分炎症反应，则它有生理学意义。
含Zcytor17lig(或Zcytor17lig类似物或融合蛋白)的药物组合物可以以液体形式、以气雾剂或以固体形式供应。液体形式，以注射液、气雾剂、小滴、局部解剖液(topological solutions)和口服悬液为例说明。例示性的固体形式包括胶囊、片剂和控释形式。后一种形式以微渗透泵和插入管为例说明(Bremer等，Pharm.Biotechnol.10：239(1997)；Ranade，“Implants in Drug Delivery，”in Drug DeliverySystems，Ranade和Hollinger(编辑)，pages 95-123(CRC Press 1995)；Bremer等，“Protein Delivery with Infusion Pumps，”in ProteinDelivery：Physical Systems，Sanders和Hendren(编辑)，pages239-254(Plenum Press 1997)；Yewey等，“Delivery of Proteins froma Controlled Release Injectable Implant，”in Protein Delivery：Physical Systems，Sanders和Hendren(编辑)，pages 93-117(PlenumPress 1997))。其它固体形式包括霜剂、膏剂、其它局部解剖敷用品等。
脂质体提供了一种静脉内、腹膜内、鞘内、肌内、皮下或通过口服给药、吸入、或鼻内给药向受试者递送治疗多肽的方法。脂质体是由一个或多个脂双层包围的水性区室组成的细微囊泡(一般参见Bakker-Woudenberg等，Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis.12(Suppl.1)：S61(1993)，Kim，Drugs 46：618(1993)，以及Ranade，“Site-Specific Drug Delivery Using Liposomes as Carriers，”inDrug Delivery Systems，Ranade和Hollinger(编辑)，pages 3-24(CRCPress 1995))。脂质体在组成上类似于细胞膜，结果脂质体可安全给药并且是生物可降解的。根据制备方法，脂质体可以是单层或多层的，并且脂质体大小可在从0.02μm大大于10μm的直径范围内变化。多种制剂可包囊在脂质体中：疏水制剂在双层中分区，而亲水制剂在内层水相空间内分区(例如，参见Machy等，Liposomes In Cell Biology AndPharmacology(John Libbey 1987)，以及Ostro等，American J.Hosp.Pharm.46：1576(1989))。而且，有可能通过改变脂质体大小、双层数目、脂质组成、以及脂质体的电荷和表面特征控制胶囊内的制剂的治疗有效性。
脂质体可吸附于几乎任何类型的细胞，然后缓慢释放胶囊内的制剂。或者，吸附的脂质体可能被吞噬细胞内吞。内吞作用继之以脂质体脂质的溶酶体内降解，并释放胶囊内的制剂(Scherphof等.，Ann.N.Y.Acad.Sci.446：368(1985))。静脉内给药后，小脂质体(0.1到1.0μm)典型地被网状内皮系统的细胞摄取，主要地定位于肝和脾中，而大于3.0μm的脂质体贮积在肺中。网状内皮系统的细胞对较小脂质体的这种优先摄取已被用来向巨噬细胞和肝肿瘤递送化疗剂。
网状内皮系统可通过多种方法环绕，包括用大剂量脂质体颗粒饱和或者通过药理学方法的选择性巨噬细胞激活(Claassen等，Biochim.Biophys.Acta 802：428(1984))。另外，已证明将糖脂类或聚乙二醇衍生的磷脂掺入到脂质体膜中可导致网状内皮系统摄取的显著降低(Allen等，Biochim.Biophys.Acta 1068：133(1991)；Allen等，Biochim.Biophys.Acta 1150：9(1993))。
也可以通过改变磷脂组成或通过在脂质体中插入受体或配体制备靶向特定细胞或器官的脂质体。例如，用高含量非离子表面活性剂制备的脂质体已用于靶向肝(Hayakawa等，日本专利04-244,018；Kato等，Biol.Pharm.Bull.16：960(1993))。这些药剂通过将大豆卵磷脂、α-生育酚以及乙氧化的氢化蓖麻油(HCO-60)在甲醇中混合、真空浓缩混合物，然后用水重建混合物制备。二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)与大豆来源的固醇糖苷混合物(SG)和胆固醇(Ch)的脂质体配方已证明靶向肝(Shimizu等.，Biol.Pharm.Bull.20：881(1997))。
或者，可将多种靶向配体连接到脂质体表面，例如抗体、抗体片段、碳水化合物、维生素和转运蛋白。例如，脂质体可用分枝型半乳糖基脂质衍生物修饰以靶向脱唾液酸糖蛋白(半乳糖)受体，该受体在肝细胞表面专一性表达(Kato和Sugiyama，Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst. 14：287(1997)；Murahashi等，Biol.Pharm.Bull.20：259(1997))。类似的，Wu等，Hepatology 27：772(1998)已证明用脱唾液酸胎球蛋白(asialofetuin)标记脂质体导致缩短的脂质体血浆半衰期，并且极大地增强肝细胞对脱唾液酸胎球蛋白标记的脂质体的摄取。在另一方面，含分枝型半乳糖基脂质衍生物的脂质体的肝累积可通过预注射脱唾液酸胎球蛋白抑制(Murahashi等，Biol.Pharm.Bull.20：259(1997))。聚乌头酸化(Polyaconitylated)的人类血清白蛋白脂质体提供了将脂质体靶向肝细胞的另美国专利No.4,603,044，描述了肝细胞定向的脂质体囊泡递送系统，它对与肝特化的代谢细胞相关的肝胆受体具有特异性。
在更普通的组织靶向方法中，靶细胞用生物素标记的靶细胞表达配体特异性的抗体预标记(Harasym等，Adv.Drug Deliv.Rev.32：99(1998))。在血浆清除游离抗体后，给药链霉抗生物素蛋白-偶联的脂质体。在另一种方法中，靶向抗体直接地连接于脂质体(Harasym等，Adv. Drug Deliv.Rev.32：99(1998))。
具有Zcytor17lig结合活性的多肽可利用蛋白微胶囊标准技术包囊在脂质体中(例如，参见Anderson等.，Infect.Immun. 31：1099(1981)，Anderson等，Cancer Res.50：1853(1990)，以及Cohen等，Biochim. Biophys.Acta 1063：95(1991)，Alving等“Preparation and Use ofLiposomes in Immunological Studies，”in Liposome Technology，2ndEdition，Vol.III，Gregoriadis(编辑)，page 317(CRC Press 1993)，Wassef等，Meth.Enzymol.149：124(1987))。如上文所指出的，治疗上可用的脂质体可包含多种组分。例如，脂质体可包括聚(乙二醇)的脂质衍生物(Allen等，Biochim.Biophys.Acta 1150：9(1993))。
已经设计可降解聚合物微球以维持高系统水平的治疗蛋白。从可降解聚合物例如聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLG)、聚酐、聚(邻酯)，非生物可降解乙酯乙烯乙酸盐制备微球，其中蛋白被包载在聚合物中(Gombotz和Pettit，Bioconjugate Chem. 6：332(1995)；Ranade，“Role ofPolymers in Drug Delivery，”in Drug Delivery Systems，Ranade和Hollinger(编辑)，pages 51-93(CRC Press 1995)；Roskos和Maskiewicz，“Degradable Controlled Release Systems Useful forProtein Delivery，”in Protein Delivery：Physical Systems，Sanders和Hendren(编辑)，pages 45-92(Plenum Press 1997)；Bartus等，Science 281：1161(1998)；Putney和Burke，Nature Biotechnology 16：153(1998)；Putney，Curr.Opin.Chem.Biol.2：548(1998))。聚乙二醇(PEG)-涂敷的纳米球也可以提供静脉内给药治疗蛋白的载体(例如参见Gref等，Pharm.Biotechnol.10：167(1997))。
本发明也考虑化学修饰具有zcytor17lig活性的多肽，例如zcytor17lig多肽、zcytor17lig激动剂和Zcytor17lig拮抗剂，例如抗-Zcytor17lig抗体，其中多肽连接于聚合物，如上文所讨论的那样。
其它剂量形式可由本领域技术人员设计，例如由Ansel和Popovich，Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems，5th Edition(Lea & Febiger 1990)，Gennaro(编辑)，Remington′s PharmaceuticalSciences，19th Edition(Mack Publishing Company 1995)以及由Ranade和Hollinger，Drug Delivery Systems(CRC Press 1996)所显示的那样。
作为举例说明，药物组合物可作为包括含zcytor17lig多肽或zcytor17lig拮抗剂(例如与zcytor17lig多肽结合的抗体或抗体片段)的容器的试剂盒提供。治疗多肽可以单个或多个剂量的可注射溶液的形式、或作为在注射前重配的无菌粉末提供。备选地，此试剂盒可包括干粉配量器、液体气雾剂发生器或喷雾器用以给药治疗多肽。此试剂盒可进一步包含有关药物组合物说明和用法的书面信息。而且，此类信息可包括Zcytor17lig组合物禁忌用于已知对Zcytor17lig过敏的患者的声明。
在一个方面，本发明提供了分离的多肽，其包含与选自下组的氨基酸残基序列具有至少90％同一性的氨基酸残基序列：(a)如SEQ ID NO：2残基38(Val)到152(Leu)所示的多肽；(b)如SEQ ID NO：2残基27(Leu)到164(Thr)所示的多肽；(c)如SEQ ID NO：2残基24(Thr)到164(Thr)所示的多肽；以及(d)如SEQ ID NO：2残基1(Met)到164(Thr)所示的多肽。在一个实施方案中，分离的多肽如上所述，其中氨基酸残基73、133和147是半胱氨酸。在另一个实施方案中，分离的多肽如上所述，其中多肽与如SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：71所示的zcytor17受体结合。在另一个实施方案中，分离的多肽包括SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：11的至少14个连续的氨基酸残基。在另一个实施方案中，分离的多肽如上所述，其中氨基酸残基选自下组：(a)SEQ IDNO：2的氨基酸残基38-52；(b)SEQ ID NO：2的氨基酸残基83-98；(c)SEQ ID NO：2的氨基酸残基104-117；以及(d)SEQ ID NO：2的氨基酸残基137-152。
在第二个方面，本发明提供了融合蛋白，其包括至少4个多肽，其中多肽自N-端到C-端的次序为：第一多肽，包括来自SEQ ID NO：2中氨基酸残基38-52的序列；第一间隔臂，具有6-27个氨基酸残基；第二多肽，包括选自下组的氨基酸残基序列：(a)SEQ ID NO：168的IL-2螺旋B氨基酸残基；(b)SEQ ID NO：164的IL-4螺旋B残基65-83；(c)SEQ ID NO：102的IL-3螺旋B残基73-86；(d)SEQ ID NO：166的GM-CSF螺旋B残基72-81；以及(e)SEQ ID NO：2氨基酸残基83-98；第二间隔臂，具有5-11个氨基酸残基；第三多肽，包括选自下组的氨基酸残基序列：(a)SEQ ID NO：162的IL-2螺旋C残基102-116；(b)SEQ ID NO：164的IL-4螺旋C残基94-118；(c)SEQ ID NO：102的IL-3螺旋C残基91-103；(d)SEQ ID NO：166的GM-CSF螺旋C残基85-103；以及(e)SEQ ID NO：2氨基酸残基104-117；第三间隔臂，具有3-29个氨基酸残基；以及第四多肽，包括选自下组的氨基酸残基序列：(a)SEQ ID NO：162的IL-2螺旋D残基134-149；(b)SEQ ID NO：102的IL-3螺旋D残基123-141；(c)SEQ ID NO：164的IL-4螺旋D残基133-151；(d)SEQ ID NO：166的GM-CSF螺旋D残基120-131；以及(e)SEQ ID NO：2氨基酸残基137-152。
在第三个方面，本发明提供了融合蛋白，其包括至少4个多肽，其中多肽自N-端到C-端的次序为：第一多肽，包括选自下组的氨基酸残基序列：(a)SEQ ID NO：162的IL-2螺旋A残基27-48；(b)SEQ ID NO：164的IL-4螺旋A残基30-42；(c)SEQ ID NO：102的IL-3螺旋A残基35-45；(d)SEQ ID NO：166的GM-CSF螺旋A残基30-44；及(e)SEQ ID NO：2氨基酸残基38-52；第一间隔臂，具有6-27个氨基酸残基；第二多肽，包括选自下组的氨基酸残基序列：(a)SEQ ID NO：168的IL-2螺旋B残基；(b)SEQ ID NO：164的IL-4螺旋B残基65-83；(c)SEQ ID NO：102的IL-3螺旋B残基73-86；(d)SEQ ID NO：166的GM-CSF螺旋B残基72-81；以及(e)SEQ ID NO：2氨基酸残基83-98；第二间隔臂，具有5-11个氨基酸残基；第三多肽，包括选自下组的氨基酸残基序列：(a)SEQ ID NO：162的IL-2螺旋C残基102-116；(b)SEQ ID NO：164的IL-4螺旋C残基94-118；(c)SEQ ID NO：102的IL-3螺旋C残基91-103；(d)SEQ ID NO：166的GM-CSF螺旋C残基85-103；以及(e)SEQ ID NO：2氨基酸残基104-117；第三间隔臂，具有3-29个氨基酸残基；以及第四多肽，包括SEQ ID NO：2中氨基酸残基137-152的序列。在另一个实施方案中，融合蛋白如上所述，其中第四多肽包括SEQ ID NO：2的氨基酸残基137-152。
在另一个方面，本发明提供了分离的多核苷酸分子，其包括编码上文所公开的多肽的核苷酸序列。在一个实施方案中，分离的多核苷酸分子如上所述，其中核苷酸选自下组：(a)如SEQ ID NO：1核苷酸139到核苷酸483所示的多核苷酸；(b)如SEQ ID NO：1核苷酸106到核苷酸519所示的多核苷酸；(c)如SEQ ID NO：1核苷酸97到核苷酸519所示的多核苷酸；以及(d)如SEQ ID NO：1核苷酸28到核苷酸519所示的多核苷酸。
在另一个方面，本发明提供了分离的多核苷酸分子，其包括编码本文公开的多肽的核苷酸序列。
在另一个方面，本发明提供了表达载体，包括如下可操作连接的元件：(a)转录启动子；(b)DNA片段，编码包括选自下组的氨基酸序列的多肽：(i)SEQ ID NO：2氨基酸残基38-52；(ii)SEQ ID NO：2氨基酸残基83-98；(iii)SEQ ID NO：2氨基酸残基104-117；(iv)SEQID NO：2氨基酸残基137-152；和(v)它们的组合；以及(c)转录终止子。
在另一个方面，本发明提供了表达载体，包括如下可操作连接的元件：a)转录启动子；(b)DNA片段，编码包括与如SEQ ID NO：2中所示的残基38(Val)到152(Leu)具有至少90％同一性的氨基酸残基序列的多肽；以及(c)转录终止子。在一个实施方案中，表达载体如上所述，包括如下可操作连接的元件：(a)转录启动子；(b)DNA片段，编码包括SEQ ID NO：2残基38(Val)到152(Leu)的氨基酸残基的多肽；以及(c)转录终止子。
在另一个方面，本发明提供了培养的细胞，其包括如上所述的表达载体。
在另一个方面，本发明提供了制备蛋白的方法，包括：在表达所述DNA片段的条件下培养如上所述的细胞；并回收由所述DNA片段编码的蛋白。
在另一个方面，本发明提供了制备zcytor17lig多肽抗体的方法，包括：向动物接种选自下组的多肽：(a)由9到141个氨基酸残基组成的多肽，其中多肽与SEQ ID NO：2中氨基酸编号24(Ser)到氨基酸编号164(Thr)的连续氨基酸残基序列相同；如上所述的多肽；(c)包括SEQ ID NO：2中氨基酸编号38-52的氨基酸序列的多肽；(d)包括SEQID NO：2中氨基酸编号83-98的氨基酸序列的多肽；(e)包括SEQ ID NO：2中氨基酸编号104-117的氨基酸序列的多肽；(f)包括SEQ ID NO：2中氨基酸编号137-152的氨基酸序列的多肽；(g)包括SEQ ID NO：2中氨基酸编号38-152的氨基酸序列的多肽；(h)包括SEQ ID NO：2中氨基酸编号24-164的氨基酸序列的多肽；(c)包括SEQ ID NO：11中氨基酸编号38-52的氨基酸序列的多肽；(d)包括SEQ ID NO：11中氨基酸编号85-98的氨基酸序列的多肽；(e)包括SEQ ID NO：11中氨基酸编号104-118的氨基酸序列的多肽；(f)包括SEQ ID NO：11中氨基酸编号141-157的氨基酸序列的多肽；(g)包括SEQ ID NO：11中氨基酸编号38-157的氨基酸序列的多肽；(h)包括SEQ ID NO：11中氨基酸编号24-163的氨基酸序列的多肽；(i)包括SEQ ID NO：2或SEQ IDNO 11中符合Hopp/Woods亲水性分布图(Hopp/woods hydrophilicityprofile)的抗原表位的多肽，其中所述分布图以滑行的6-残基窗口为基础。忽略隐藏的G、S和T残基以及暴露的H、Y和W残基；且其中所述多肽引发动物免疫应答产生抗体；并从动物中分离抗体。
在另一个方面，本发明提供了由如上所述的方法产生的抗体(如中和抗体)，其中抗体与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：11的多肽结合。在一个实施方案中，如上所述的抗体与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：11所示的多肽特异性结合。
在另一个方面，本发明提供了在暴露于抗原或病原体的哺乳动物中刺激免疫应答的方法，包括步骤：(1)直接或间接地确定所述哺乳动物中存在的抗原或病原体的水平；(2)给药处于可接受的药学载体中的包括zcytor17lig多肽的组合物；(3)直接或间接地确定所述哺乳动物的抗原或病原体水平；和(4)将步骤1中的抗原或病原体水平与步骤3中的抗原或病原体水平进行比较，其中所述水平的变化表示刺激了免疫应答。在一个实施方案中，上文所述的刺激哺乳动物免疫应答的方法进一步包括：(5)再次给药处于可接受的药学载体中的包括zcytor17lig多肽的组合物；(6)直接或间接地确定所述哺乳动物的抗原或病原体水平；和(7)将步骤1中比较的抗原或病原体水平的数目与步骤6中的抗原水平进行比较，其中所述水平的变化表示刺激了免疫应答。
在另一个方面，本发明提供了扩增造血细胞和造血细胞先祖细胞的方法，包括与不存在zcytor17lig时培养的骨髓或外周血细胞相比，用包括足以引起骨髓或外周血细胞中淋巴样细胞数目增加的zcytor17lig量的组合物培养骨髓或外周血细胞。在一个实施方案中，扩增造血细胞和造血细胞先祖细胞的方法如上所述，其中造血细胞和造血先祖细胞是淋巴样细胞。在另一个实施方案中，扩增造血细胞和造血细胞先祖细胞的方法如上所述，其中淋巴样细胞是单核细胞、巨噬细胞或T细胞。
在另一个方面，本发明提供了在暴露于抗原或病原体的哺乳动物中刺激免疫应答的方法，包括步骤：(1)确定抗原特异性抗体或病原体特异性抗体的水平；(2)给药处于可接受的药学载体中的包括zcytor17lig多肽的组合物；(3)确定给药后抗原特异性抗体或病原体特异性抗体的水平；(4)将步骤(1)中的抗体水平与步骤(3)中的抗体水平进行比较，其中所述抗体水平的提高表示刺激了免疫应答。
在另一个方面，本发明提供了检测生物学样品中zcytor17lig RNA存在的方法，包括步骤：(a)在杂交条件下使zcytor17lig核酸探针与(i)自生物学样品中分离的测试RNA分子或者(ii)自该分离的RNA分子合成的核酸分子接触，其中探针具有包括上文所述核酸分子的部分核苷酸序列或其互补物的核苷酸序列，和(b)检测核酸探针与测试RNA分子或合成核酸分子间杂交体的形成，其中杂交体的存在指示生物学样品中zcytor17lig RNA的存在。
在另一个方面，本发明提供了检测生物学样品中zcytor17lig存在的方法，包括步骤：(a)使生物学样品与如上所述的抗体或抗体片段接触，其中接触是在允许抗体或抗体片段与生物学样品结合的条件下实施的，和(b)检测任何结合的抗体或结合的抗体片段。
在另一个方面，本发明提供了杀死癌细胞的方法，包括：自患者离体获取含癌细胞的组织或生物学样品，或者在体内鉴定癌细胞；通过如上所述的方法产生多肽；以药学上可接受的载体配制所述多肽；并向患者给药或者将癌细胞暴露于所述多肽；其中所述多肽杀死细胞。在一个实施方案中，杀死癌细胞的方法如上所述，其中多肽进一步缀合到毒素上。在一个实施方案中，抗体如上所述，其中抗体选自组：(a)多克隆抗体，(b)鼠单克隆抗体，(c)衍生自(b)的人源化抗体，(d)抗体片段，和(e)人类单克隆抗体。
在另一个方面，本发明提供了抗体或抗体片段，其特异性地与包括选自下组的氨基酸残基的序列的多肽结合：(a)如SEQ ID NO：2残基38(Val)到152(Leu)所示的多肽；(b)如SEQ ID NO：2残基27(Leu)到164(Thr)所示的多肽；(c)如SEQ ID NO：2残基24(Thr)到164(Thr)所示的多肽；和(d)如SEQ ID NO：2残基1(Met)到164(Thr)所示的多肽。在另一个实施方案中，抗体如上所述，其中抗体进一步包括放射性核素、酶、底物、辅因子、荧光标记、化学发光标记、肽标签、磁性颗粒、药物或毒素。
在另一个方面，本发明提供了抑制由zcytor17lig诱导的造血细胞和造血细胞先祖细胞增殖或分化的方法，包括与不存在可溶性细胞因子受体时培养的骨髓或外周血细胞相比，用包括足以降低骨髓或外周血细胞中的造血细胞增殖或分化量的如上所述的抗体的组合物培养骨髓或外周血细胞。在一个实施方案中，抑制由zcytor17lig诱导的造血细胞和造血细胞先祖细胞增殖或分化的方法如上所述，其中造血细胞和造血先祖细胞是淋巴样细胞。在另一个实施方案中，抑制由zcytor17lig诱导的造血细胞和造血细胞先祖细胞增殖或分化的方法如上所述，其中淋巴样细胞是巨噬细胞或T细胞。
在另一个方面，本发明提供了减轻由zcytor17lig诱导的炎症的方法，包括向具有炎症的哺乳动物给药足以减轻炎症量的如本文所述的抗体组合物。
在另一个方面，本发明提供了在具有炎症的哺乳动物中抑制炎症反应的方法，包括：(1)确定炎症分子的水平；(2)给药处于可接受的药学载体中的包括如本文公开的抗体的组合物；(3)确定炎症分子给药后的水平；(4)将步骤(1)中的炎症分子水平与步骤(3)中炎症分子的水平进行比较，其中炎症分子水平无升高或者下降表示抑制了炎症反应。在一个实施方案中，抗体如上所述，其中抗体进一步包括放射性核素、酶、底物、辅因子、荧光标记、化学发光标记、肽标签、磁性颗粒、药物或毒素。
在另一个方面，本发明提供了抑制由zcytor17lig诱导的造血细胞和造血细胞先祖细胞增殖或分化的方法，包括与不存在可溶性细胞因子受体时培养的骨髓或外周血细胞相比，用包括足以降低骨髓或外周血细胞中的造血细胞增殖或分化量的如本文所公开的抗体的组合物培养骨髓或外周血细胞。在一个实施方案中，抑制由zcytor17lig诱导的造血细胞和造血细胞先祖细胞增殖或分化的方法如上所述，其中造血细胞和造血先祖细胞是淋巴样细胞。在另一个实施方案中，抑制由zcytor17lig诱导的造血细胞和造血细胞先祖细胞增殖或分化的方法如上所述，其中淋巴样细胞是巨噬细胞或T细胞。
在另一个方面，本发明提供了减轻由zcytor17lig诱导的炎症的方法，包括向具有炎症的哺乳动物给药足以减轻炎症量的如本文所公开的抗体组合物。
在另一个方面，本发明提供了在具有炎症的哺乳动物中抑制炎症反应的方法，包括：(1)确定炎症分子的水平；(2)给药处于可接受的药学载体中的包括如本文所公开的抗体的组合物；(3)确定炎症分子给药后的水平；(4)将步骤(1)中的炎症分子水平与步骤(3)中炎症分子的水平进行比较，其中炎症分子水平无升高或者下降表示抑制了炎症反应。
在另一个方面，本发明提供了治疗患有zcytor17lig发挥作用的炎性疾病的哺乳动物的方法，包括：向哺乳动物给药zcytor17lig拮抗剂，从而减轻炎症，其中拮抗剂选自与zcytor17lig(SEQ ID NO：2)多肽或多肽片段特异性结合的抗体或结合多肽。在一个实施方案中，治疗患有炎性疾病的哺乳动物的方法如上所述，其中疾病为慢性炎性疾病。在另一个实施方案中，治疗患有炎性病的哺乳动物的方法如上所述，其中疾病为选自下组的慢性炎症病：炎性肠病；溃疡性结肠炎；局限性回肠炎；特应性皮炎；湿疹；和银屑病。在另一个实施方案中，治疗患有炎性病的哺乳动物的方法如上所述，其中疾病为急性炎性病。在另一个实施方案中，治疗患有炎性病的哺乳动物的方法如上所述，其中疾病为选自下组的急性炎症病：内毒素血症；败血病；中毒性休克综合症；和传染病。在另一个实施方案中，治疗患有炎性病的哺乳动物的方法如上所述，其中抗体进一步包括放射性核素、酶、底物、辅因子、荧光标记、化学发光标记、肽标签、磁性颗粒、药物或毒素。
在另一个方面，本发明提供了检测患者炎症的方法，包括：自患者获取组织或生物学样品；将该组织或生物学样品与如本文所公开的抗体在抗体与组织或生物学样品中它的互补多肽结合的条件下进行温育；显现结合到组织或生物学样品中的抗体；并将结合到患者组织或生物学样品中的抗体水平与结合到正常对照组织或生物学样品的抗体水平进行比较，其中结合到患者组织或生物学样品的抗体水平相对于正常组织或生物学样品的增加指示患者的炎症。
在另一个方面，本发明提供了检测患者炎症的方法，包括：自患者获取组织或生物学样品；对包括SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：1互补物中至少14个连续核苷酸的多核苷酸进行标记；将组织或生物学样品与之在多核苷酸与互补多核苷酸序列杂交的条件下进行温育；显现组织或生物学样品中的标记多核苷酸；并将患者组织或生物学样品中标记多核苷酸杂交的水平与正常对照组织或生物学样品中的杂交水平进行比较，其中患者组织或生物学样品中标记多核苷酸杂交相对于正常组织或生物学样品中杂交的提高指示患者的炎症。
本发明进一步通过下列非限制性实施例进行说明。
实施例
实施例1
MPL-zcytor17多肽嵌合体的构建：
将MPL的胞外及TM结构域融合于zcytor17的胞内信号传导结构域
鼠MPL受体的5′胞外结构域从含该鼠MPL受体的质粒(PHZ1/MPL质粒)中以EcoRI和BamHI消化分离，产生1164bp的片段。消化液在1％的琼脂糖凝胶上跑样，并按制造商的说明利用Qiaquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)分离所述片段。MPL胞外结构域及跨膜结构域的其余部分利用PCR由引物ZC6，673(SEQ ID NO：13)和ZC29，082(SEQ ID NO：14)产生。反应条件如下：94℃ 1分，55℃ 1分，72℃ 2分，15个循环；跟着72℃ 7分；然后4℃浸泡。PCR产物在1％的琼脂糖凝胶上跑样，并按制造商的说明利用QiaquickTM凝胶提取试剂盒(Qiagen)分离大约400bp的MPL受体片段。
人类zcytor17的胞内结构域利用PCR由引物ZC29，083(SEQ ID NO：15)和ZC29，145(SEQ ID NO：16)从含zcytor17受体cDNA的质粒(#23/pCAP)中分离。与zcytor17受体编码序列相应的多核苷酸序列示于SEQ ID NO：5。反应条件同上。PCR产物在1％的琼脂糖凝胶上跑样，并按制造商的说明利用Qiaquick凝胶提取试剂盒分离大约320bp的zcytor17片段。
将上文所述分离的各PCR片段按1∶1的体积比混合，并用在使用ZC6673(SEQ ID NO：13)和ZC29145(SEQ ID NO：16)的PCR反应中，以产生差5′MPL部分的MPL-zcytor17嵌合体。反应条件如下：94℃ 1分，55℃ 1分，72℃ 2分，15个循环；跟着72℃ 7分；然后4℃浸泡。将全部的PCR产物在1％的琼脂糖凝胶上跑样，并按制造商的说明利用Qiaquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)分离大约700bp的MPL-zcytor17嵌合体片段。所述MPL-zcytor17嵌合体片段按制造商的说明以BamHI(BRL)和XbaI(Boerhinger Mannheim)消化。将全部的消化液在1％的琼脂糖凝胶上跑样，并按制造商的说明利用QiaquickTM凝胶提取试剂盒(Qiagen)分离切割的MPL-zcytor17嵌合体。将所得的切割的MPL-zcytor17嵌合体连同上文所述的5′MPL EcoRI/BamHI片段插入到表达载体中以产生全长的MPL-zcytor17嵌合受体，如下文所述。
接纳表达载体pZP-7按制造商的说明以EcoRI(BRL)和Xba1(BRL)消化，并如上文所述进行凝胶纯化。将该载体片段与上文分离的EcoRI和XbaI切割的MPL-zcytor17PCR嵌合体以及上文分离的EcoRI和BamHI5′MPL片段在连接反应中组合到一起。连接按制造商的说明利用T1连接酶(Epicentre Technologies)于室温下进行1小时。将连接样品电穿孔到DH10B ElectroMAXTM电感受态大肠杆菌细胞中(25μF，200Ω，1.8V)。将转化子涂布到LB+氨苄青霉素板子上，且用miniprep(Qiagen)筛选单个菌落，并以EcoRI消化检验所述MPL-zcytor17嵌合体。正确克隆的EcoRI消化产生大约2kb的片段。通过序列分析进行该MPL-zcytor17嵌合体序列的确认。插入物大约3.1kb并且是全长的。
实施例2
利用Alamar Blue的BAF3测定中以MPL-zcytor17嵌合体为基础的增殖
A.表达MPL-zcytor17嵌合体的BaF3细胞的构建
BaF3，来自鼠骨髓的白介素-3(IL-3)依赖性前-淋巴细胞系(Palacios和Steinmetz，Cell 41：727-734，1985；Mathey-Prevot等，Mol.Cell.Biol. 6：4133-4135，1986)，维持在完全培养基(RPMI培养基，JRH Bioscience Inc.，Lenexa，KS)上，补充有10％热失活的胎牛血清、1-2ng/ml鼠IL-3(mIL-3)(R&D，Minneapolis，MN)、2mM L-glutaMax-1TM(Gibco BRL)、1mM丙酮酸钠(Gibco BRL)及PSN抗生素(GIBCO BRL))。电穿孔前，制备pZP-7/MPL-zcytor17质粒DNA(实施例1)并按制造商的说明利用Qiagen Maxi Prep试剂盒(Qiagen)纯化。用于电穿孔的BaF3细胞在RPMI培养基中洗涤两次，然后以107细胞/ml的细胞密度重悬于RPMI培养基中。将1ml重悬的BaF3细胞与30μg pZP-7/MPL-zcytor17质粒DNA混合，并转移到另外的可弃型电穿孔腔中(GIBCO BRL)。室温下对细胞给予由电穿孔仪(Cyto-Pulse)施与的800伏5×.1毫秒的电击，接着是600伏5×2毫秒的电击。备选地，细胞用由Cell-Porator(GibcoBRL)电穿孔仪施与的两个序列脉冲(800μFAD/300V；继之以1180μFAD/300V)进行电穿孔。将电穿孔的细胞转移到50ml完全培养基中，并于培养箱中放置15-24小时(37℃，5％CO2)。然后对T-162烧瓶中的细胞增加遗传霉素TM(Gibco)选择(1mg/ml G418)以分离G418-抗性库。转染的BaF3细胞库，以下称之为BaF3/MPL-zcytor17细胞，如下文所述进行信号传导能力的测定。
B.利用Alamar Blue增殖测定法测试BaF3/MPL-zcytor17细胞的 信号传导能力
离心沉淀BaF3/MPL-zcytor17细胞，并在上文所述但不含mIL-3的完全培养基(以下称之为“无mIL-3培养基”)中洗涤。细胞离心并洗涤3次，以确保去除mIL-3。然后在血球计数器中计数细胞。利用无mIL-3培养基，将100μl体积的细胞以每孔5000个细胞接种到96-孔型的板中。
利用鼠血小板生成素(mTPO)，以无mIL-3培养基稀释至200ng/ml、100ng/ml、50ng/ml、25ng/ml、12.5ng/ml、6.25ng/ml、3.1ng/ml、1.5ng/ml的浓度，评估BaF3/MPL-zcytor17细胞的增殖。向所述BaF3/MPL-zcytor17细胞中添加100μl稀释的mTPO。总测定体积为200μl。仅利用无mIL-3培养基，不添加mTPO，平行进行阴性对照。测定板于37℃、5％ CO2中温育3天，此时以20μl/孔添加Alamar Blue(Accumed，Chicago，IL)。Alamar Blue基于细胞的代谢活性给出荧光读数，因而对照着阴性对照直接测量细胞增殖。板再次于37℃、5％ CO2中温育24小时。在FmaxTM板阅读器上(Molecular Devices Sunnyvale，CA)利用SoftMaxTM Pro程序以544(激发)和590(发射)的波长对板进行读数，或者用Wallac Victor 2板阅读器(PerkinElmer Life Sciences，Bost on，MA)读数。
结果证实了zcytor17受体胞内部分的信号传导能力，因为血小板生成素诱导的增殖，在mTPO浓度为50ng/ml及更高时，超过本底的约9-13倍。
实施例3
表达全长zcytor17：pZp7pX/zcytor17的表达载体的构建：
A.克隆全长zcytor17 cDNA用以表达：
为获得全长zcytor17 cDNA，分离5′和3′PCR产物，并用内部的PstI位点进行连接。PCR引物利用核苷酸序列SEQ ID NO：4设计，并且包括用于克隆目的的BamHI和Xho I限制性位点。
5′PCR产物利用WI-38cDNA文库作为模板以及寡核苷酸ZC29，359(SEO ID NO：18)和ZC27，899(SEQ ID NO：19)作为引物产生。WI-38是由人类胎肺细胞系(ATCC CRL-2221)产生的自制cDNA文库。5′PCR反应如下进行：94℃ 1分，65℃ 1分，72℃ 2分，30个循环；然后72℃ 7分；10℃浸泡。该PCR反应使用大约3μg由cDNA文库制备的质粒、20pmole的各寡核苷酸以及5单位的PWO DNA聚合酶(Roche)。大约90％的5′PCR产物用乙醇沉淀，以BamHI和PstI消化，并在1.0％的琼脂糖凝胶上进行凝胶纯化。切下大约600bp的条带，并连接到以BamHI和PstI消化的克隆载体pUC18上。对所得的转化子进行测序以确认所述zcytor17 cDNA序列。对于这些转化子中的一个，制备质粒DNA并以BamHI和PstI消化。凝胶纯化所得的大约600bp的条带，并用于下文的连接，以形成全长cDNA。
3′PCR产物利用人类睾丸自制cDNA文库作为模板以及寡核苷酸ZC27，895(SEQ ID NO：20)和ZC29，122(SEQ ID NO：21)作为引物产生。3′PCR反应如下进行：94℃ 45秒，65℃ 45秒，72℃ 2分，30个循环；然后72℃ 7分；10℃浸泡。全部3′PCR反应物在1.0％的琼脂糖凝胶上进行凝胶纯化，并切下1500bp的主带。利用Zeroblunt TOPO试剂盒(Invitrogen)将该条带克隆到PCR Blunt II TOPO载体中。对所得转化子测序以确认zcytor17 cDNA序列。对于这些转化子中的一个，制备质粒DNA并以PstI和XhoI消化。凝胶纯化所得的大约1500bp的条带。由上文的5′BamHI到Pst I片段、3′PstI到XhoI片段以及BamHI和XhoI消化的表达载体pZp7pX进行三方连接。这产生含zcytor17全长cDNA(SEQ ID NO：4)的pZp7pX质粒，命名为pZp7p/zcytor17。pZp7p/zcytor17中的全长zcytor17 cDNA具有沉默突变，它将SEQ ID NO：4中1888位的T改变为G(编码SEQ ID NO：5残基464上的Gly)。由于该突变是沉默的，pZp7p/zcytor17中的zcytor17cDNA编码如SEQ IDNO：5所示的多肽。质粒pZp7pX是含表达盒的哺乳动物表达载体，具有CMV启动子、内含子A、用以插入编码序列的多限制性位点以及人类生长激素终止子。该质粒也具有大肠杆菌的复制起点，以及具有SV40启动子、增强子和复制起点、嘌呤霉素抗性基因及SV40终止子的哺乳动物选择性标记表达单元。
B.表达全长WSX-1的表达载体的构建
完整的WSX-1受体(SEQ ID NO：9)从含WSX-1受体cDNA(SEQ ID NO：8)(美国专利No.5,925,735)的质粒中分离。hWSX-1/pBluescript SK(+)质粒DNA(Stratagene，La Jolla，CA)用EcoRI和XhoI消化产生1075bp的片段，并且也用Xhol和XbaI消化产生900bp的片段。两种消化物都在1％琼脂糖凝胶上跑样，并分离切割的WSX-1片段。
接纳表达载体pZp7Z用EcoRI和XbaI消化，并如上所述进行凝胶纯化。该载体片段与上文分离的两个切割的zcytor17片段在连接反应中利用T1连接酶组合(BRL)。连接于室温温育过夜。将连接样品电穿孔到DH10B ElectroMAXTM电感受态大肠杆菌细胞中(25μF，200Ω，2.3V)。有6个菌落在培养物中生长，并小量制备DNA，且消化确认正确的2.0kbWSX-1全长插入物。所得的质粒是pZPZ7Z/WSX-1。
实施例4
利用Alamar Blue的BAF3测定中以Zcytor17为基础的增殖
A.表达zcytor17受体、WSX-1受体和OSMR的BaF3细胞的构建
表达全长zcytor17受体的BaF3细胞利用30μg实施例3A中描述的zcytor17表达载体，按照上文实施例2A构建。一个例外是作为遗传霉素选择的替代，向T-162烧瓶中的转染细胞添加2μg/ml嘌呤霉素(ClonTech)以分离嘌呤霉素抗性库。表达所述zcytor17受体mRNA的BaF3细胞被命名为BaF3/zcytor17。为获得克隆，在血球计数器中计数Baf3/zcytor17细胞，并以1个细胞/孔、0.5个细胞/孔、0.1个细胞/孔以及0.01个细胞/孔接种在96-孔板中。将15个克隆在T75烧瓶中放大，并测定5个克隆的zcytor17表达。总RNA利用S.N.A.P.TM总RNA分离试剂盒(InVitrogen)从细胞沉淀中分离。第一链cDNA利用proSTARTM第一链RT-PCR试剂盒合成，然后利用zcytor17特异性引物ZC29，180(SEQ ID NO：22)和ZC29，122(SEQ ID NO：23)进行PCR，以筛选表达zcytor17的克隆。选择一个克隆BaF3/zcytor17#15扩增，并用WSX-1表达载体转染。
表达zcytor17和全长WSX-1的BaF3细胞按照上文实施例2A构建，利用30μg WSX-1表达载体WSX-1/pZp7Z(实施例3B)电穿孔BaF3/zcytor17#15细胞。一个例外是作为遗传霉素选择的替代，向T-162烧瓶中的转染细胞添加200μg/m Zeocin(InVitrogen)以分离Zeocin抗性库。表达zcytor17和WSX-1的BaF3细被命名为BaF3/zcytor17/hWSX-1。为获得克隆，将Baf3/zcytor17/hWSX-1细胞库以有限稀释法接种于96孔板中。扩增所得的克隆并利用S.N.A.P.TM总RNA分离试剂盒(InVitrogen)分离总RNA。第一链cDNA利用proSTARTM第一链RT-PCR试剂盒合成，然后利用WSX-1特异性引物ZC9791(SEQ IDNO：24)和ZC9793(SEQ ID NO：25)的PCR筛选表达WSX-1的克隆。选择一个克隆BaF3/zcytor17/hWSX-1#5进一步扩增，并用OSMRbeta表达载体转染。
表达zcytor17、WSX-1和全长OSMRbeta的BaF3细胞按照上文实施例2A构建，利用30μg如实施例29中所述的OSMRbeta表达载体OSMR/pZp7NX电穿孔BaF3/zcytor17/hWSX-1#5细胞。表达zcytor17、WSX-1和OSMRbeta mRNA的BaF3细胞被命名为BaF3/zcytor17/WSX-1/OSMR。为获得克隆，BaF3/zcytor17/WSX-1/OSMRbeta细胞库以有限稀释法接种于96孔板中。扩增单个克隆并利用S.N.A.P.TM总RNA分离试剂盒(InVitrogen)分离总RNA。第一链cDNA利用proSTARTM第一链RT-PCR试剂盒合成，然后利用OSMRbeta特异性引物ZC40109(SEQ ID NO：26)和ZC40112(SEQ ID NO：27)的PCR筛选表达zcytor17、WSX-1和OSMR的克隆。选择一个克隆BaF3/zcytor17/WSX-1/OSMR #5，并利用这些细胞筛选zcytor17lig，如下文实施例5和6所述。
B.表达zcytor17受体和OSMR的BaF3细胞的构建
表达全长zcytor17受体的BaF3细胞利用30μg实施例3A中描述的zcytor17表达载体，按照上文实施例2A构建。一个例外是作为遗传霉素选择的替代，向T-162烧瓶中的转染细胞添加2μg/ml嘌呤霉素(ClonTech)以分离嘌呤霉素抗性库。表达所述zcytor17受体mRNA的BaF3细胞被命名为BaF3/zcytor17。为获得克隆，将Baf3/zcytor17细胞库以有限稀释法接种于96-孔板中。在培养中扩增这些克隆，并利用S.N.A.P.TM总RNA分离试剂盒(InVitrogen)分离总RNA。第一链cDNA利用proSTARTM第一链RT-PCR试剂盒合成，然后利用PCR筛选表达zcytor17的克隆。选择一个克隆BaF3/zcytor17 #15扩增，并用OSMRbeta表达载体转染。
表达zcytor17和全长OSMRbeta的BaF3细胞按照上文实施例2A构建，利用30μg OSMRbeta表达载体OSMR/pZp7NX(实施例29)电穿孔BaF3/zcytor17#15细胞。表达zcytor17和OSMRbeta mRNA的BaF3细胞被命名为BaF3/zcytor17/OSMR。利用这些细胞筛选如下文实施例5所描述的zcytor17lig。
实施例5
利用Alamar Blue增殖测定法
使用BaF3/Zcytor17/WSX-1/OSMRbeta细胞筛选zcytor17lig
A.激活CCRF-CEM和CCRF-HSB2细胞以测试zcytor17lig的存在
CCRF-CEM和CCRF-HSB2细胞由ATCC获得，并如下文所述在培养中刺激产生条件培养基以测试zcytor17lig活性的存在。悬浮细胞以2×105细胞/ml或5×105细胞/ml种植在培养基RPMI-1640中，补充有10％FBS、2mM L-谷氨酰胺(GibcoBRL)、1×PSN(GibcoBRL)，并用10ng/ml佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA)(Calbiochem，San Diego，CA)和0.5μg/ml离子霉素TM(Calbiochem)激活24或48小时。利用刺激细胞的上清如下文所述测定BaF3/zcytor17/WSX-1/OSMRbeta细胞或BaF3/zcytor17/OSMRbeta细胞的增殖。
B.利用Alamar Blue增殖测定法使用BaF3/Zcytor17/WSX-1/OSMRbeta细胞或BaF3/zcytor17/OSMRbeta细胞筛选zcytor17lig
离心沉淀BaF3/zcytor17/WSX-1/OSMRbeta细胞或BaF3/zcytor17/OSMRbeta细胞并在无mIL-3培养基中洗涤3次。离心细胞并洗涤三次以确保除去mIL-3。然后在血球计数器中计数细胞。细胞在96-孔型板中按每板5000个细胞利用无mIL-3培养基以每孔100μl的体积接种。
BaF3/zcytor17/WSX-1/OSMRbeta细胞或BaF3/zcytor17/OSMRbeta细胞的增殖利用来自激活的CCRFCEM和CCRF-HSB2细胞的条件培养基(见实施例5A)评估。将条件培养基在无mIL-3培养基中稀释到50％、25％、12.5％、6.25％、3.125％、1.5％、0.75％及0.375％的浓度。向BaF3/zcytor17/WSX-1/OSMRbeta细胞或BaF3/zcytor17/OSMRbeta细胞中添加100μl稀释的条件培养基。总测定体积为200μl。测定板于37℃，5％CO2中温育3-5天，此时以20μl/孔添加Alamar Blue(Accumed，Chicago，IL)。板再次于37℃，5％ CO2中温育24小时。板如上文所述在FmaxTM板阅读器(Molecular devices)中读数(实施例2)。
结果证实了BaF3/zcytor17/WSX-1/OSMRbeta细胞或BaF3/zcytor17/OSMRbeta细胞对存在于激活的CCRF-CEM和CCRF-HSB2条件培养基中的因子的增殖应答。测量到的这种应答在25％浓度时大约超过本底的10倍。未转染的BaF3细胞并不响应该因子而增殖，由zcytor17和WSX-1转染的BaF3细胞(BaF3/zcytor17/WXS-1细胞)也不增殖，表明该因子是Zcytor17/OSMRbeta或zcytor17/OSMRbeta/WSX-1受体特异性的。而且，可溶性zcytor17受体降低zcytor17lig在BaF3/zcytor17/WSX-1/OSMRbeta细胞中的这种增殖活性(见实施例11)。在BaF3/zcytor17/OSMRbeta细胞中预期有相似的结果。
C.用于分离zcytor17lig的人类原代材料
从6个供体每人各抽取100ml血液。血液用含肝素10×10ml真空管抽取。汇集6个供体的血液(600ml)，在PBS中以1∶1稀释，并用Ficoll-
Figure G2009102637047D01001
PLUS(Pharmacia Biotech)分离。分离的原代人类细胞产率在ficoll梯度分离后为1.2×109细胞。
将细胞悬浮于9.6ml MACS缓冲液中(PBS，0.5％ EDTA，2mM EDTA)。取1.6ml细胞悬液并加入0.4ml CD3微珠(Miltenyi Biotec，Auburn，CA)。混合物于4℃温育15分钟。用30ml MACS缓冲液洗涤这些标记了CD3珠子的细胞，然后重悬于2ml MACS缓冲液中。
根据制造商的说明制备VS+柱(Miltenyi)。然后将该VS+柱置于VarioMACSTM磁场(Miltenyi)中。用5ml MACS缓冲液平衡柱子。然后向该柱施加分离的原代人类细胞。使CD3阴性细胞穿过。用9ml(3×3ml)MACS缓冲液洗柱。然后从磁场中取出柱子，并放置在一15ml falcon管上。通过向柱子添加5ml MACS缓冲液洗脱CD3+细胞，并利用制造商提供的柱塞冲洗掉结合的细胞。上述细胞和CD3磁珠温育、洗涤及VS-柱子的步骤(通过洗脱温育)再重复5次。从6个柱分离物中汇集所得的CD3+级分。CD3+选择的人类细胞产率为3×108个总细胞。
对汇集的CD3+选择的人类细胞取样染色，并在荧光抗体细胞分选仪(FACS)上分选以评估其纯度。人类CD3+选择的细胞为91％ CD3+细胞。
人类CD3+选择的细胞通过在RPMI+5％ FBS+PMA 10ng/ml及离子霉素0.5μg/ml(Calbiochem)中于37℃温育13小时激活。如下文所述测试这些激活的CD3+选择的人类细胞上清的zcytor17lig活性。而且，如下文实施例6中所述利用激活的CD3+选择的人类细胞制备cDNA文库。
D.利用BaF3/Zcytor17/WSX-1/OSMRbeta细胞和Alamar Blue增殖测定法测试激活的CD3+选择的人类细胞上清的zcvtor17lig
离心沉淀BaF3/zcytor17/WSX-1/OSMRbeta细胞或BaF3/zcytor17/OSMRbeta细胞并在无mIL-3培养基中洗涤3次。旋转细胞并洗涤三次以确保除去mIL-3。然后在血球计数器中计数细胞。细胞在96-孔型板中按每板5000个细胞利用无mIL-3培养基以每孔100μl的体积接种。
BaF3/zcytor17/WSX-1/OSMRbeta细胞或BaF3/zcytor17/OSMRbeta细胞的增殖利用来自激活的CD3+选择的人类细胞(见实施例5C)条件培养基评估，所述培养基在无mIL-3培养基中稀释至25％、12.5％、6.25％、3.125％、1.5％、0.75％、0.375％及0.187％的浓度。向BaF3/zcytor17/WSX-1/OSMRbeta细胞或BaF3/zcytor17/OSMRbeta细胞中添加100μl稀释的条件培养基。总测定体积为200μl。测定板如实施例5B中所述温育并测定。
结果证实了BaF3/zcytor17/WSX-1/OSMRbeta细胞或BaF3/zcytor17/OSMRbeta细胞对存在于激活的CD3+选择的人类细胞条件培养基中的因子的增殖应答。测量到的这种应答在25％浓度时大约超过本底的15倍。未转染的BaF3细胞并不响应该因子而增殖，由zcytor17和WSX-1转染的BaF3细胞(BaF3/zcytor17/WXS-1细胞)也不增殖，表明该因子是Zcytor17/OSMRbeta或zcytor17/OSMRbeta/WSX-1受体特异性的。
实施例6
从人类CD3+选择的细胞文库中克隆人类zcytor17lig
原代人类激活的CD3+选择的细胞cDNA文库的筛选揭示了作为四螺旋束细胞因子家族新成员的分离的cDNA。该cDNA编码zcytor17lig。该cDNA是利用zcytor17/WSX-1/OSM受体通过筛选zcytor17lig活性鉴定到的。
A.用于CD3+选择文库构建的载体
用于CD3+选择文库构建的载体为pZP7NX。pZP7NX载体如下构建：通过NcoI和PstI限制性酶(Boehringer Mannheim)的DNA消化除去载体pZP7中DHFR选择标记的编码区。消化的DNA在1％琼脂糖凝胶上跑样，切下并按制造商的说明利用Qiagen凝胶提取试剂盒(Qiagen)进行凝胶纯化。通过PCR法利用引物ZC13，946(SEQ ID NO：28)和ZC13，945(SEQ ID NO：29)以及pZeoSV2(+)作为模板，扩增代表Zeocin选择标记编码区的DNA片段。引物ZC13，946(SEQ ID NO：28)中有额外的PstI和BclI限制性位点，而引物ZC13，945(SEQ ID NO：29)中有额外的NcoI和SfuI位点。PCR片段用PstI和NcoI限制性酶切下，并克隆到以相同的两个酶切割且随后凝胶纯化制备的pZP7载体中。该载体被命名为pZP7Z。然后用BclI和SfuI限制性酶通过DNA消化载体pZP7Z除去Zeocin编码区。消化的DNA在1％琼脂糖凝胶上跑样，切下并凝胶纯化，然后与由相同的限制性酶(BclI和SfuI)自pZem228载体(保藏在美国模式培养物保藏中心(ATCC)，Manassas，VA；ATCC保藏号No.69446)切下的新霉素编码区DNA片段连接。
这个新载体被命名为pZP7N，其中DHFR选择标记编码区被替换为来自载体pZem228的新霉素选择标记编码区。在pZP7N中加入包括XhoI位点的填充片段以产生适于cDNA高效定向克隆的载体；这个新载体被称之为pZP7NX。为制备cDNA载体，20μg pZP7NX用20单位EcoR1(LifeTechnologies Gaithersberg，MD)和20单位Xho1(BoehringerMannheimIndianapolis，IN)于37℃消化5小时，然后68℃处理15分钟。消化物接着在0.8％低溶点琼脂糖1×TAE凝胶上跑样，以将载体和填充片段分离。切下载体带并根据制造商的建议用“β-琼脂酶”(NewEngland Biolabs，Beverly，MA)消化。乙醇沉淀后，将消化的载体重悬于水中至45ng/ml，以备下文所述与CD3+选择的cDNA文库连接之用。
B.制备原代人类激活的CD3+选择细胞的cDNA文库
在37℃培养13小时(实施例5C)之后，通过离心分离到大约1.5×108离子霉素/PMA刺激的原代人类CD3+选择的细胞。利用Qiagen公司(Valencia，CA)的″RNeasy Midi″试剂盒从细胞沉淀中分离总RNA。利用CPG公司(Lincoln Park，NJ)的″MPG mRNA纯化试剂盒″从225μg总RNA中分离mRNA。分离到3.4μg mRNA并利用如下操作转化为双链cDNA。
刺激的人类CD3+选择的细胞的第一链cDNA如下合成。混合9μl浓度为0.34μg/l的寡聚d(T)-选择的poly(A)CD3+RNA和1.0μl 1μg/μl含XhoI限制性位点的第一链引物ZC18，698(SEQ ID NO：30)，在65℃加热4分钟，并冰上冷却。第一链cDNA的合成通过向RNA-引物混合物中添加9μl第一链缓冲液(5×缓冲液；(LifeTechnologies)、4μl 100mM的二硫苏糖醇以及2μl含dATP、dGTP、dTTP和5-甲基-dCTP(Pharmacia Biotech Inc.)各10mM的脱氧核苷三磷酸溶液起始。反应混合物于45℃温育4分钟，紧接着添加8μl 200U/μl的
Figure G2009102637047D01041
RNase H-逆转录酶(Life technologies)。反应于45℃温育45分钟，紧接着是每2分钟1℃的变温温育，直至50℃，其中反应保持10分钟。为使任何二级结构变性并允许cDNA额外延伸，反应物随之在70℃加热2分钟，然后降至55℃4分钟，之后加入2μl
Figure G2009102637047D01042
RT并再温育15分钟，紧接着以1分钟/1℃变温升至70℃。通过在存在2μg糖原载体、2.0M醋酸铵和2.5倍体积的乙醇时的两次沉淀，紧接着用100μl 70％乙醇洗涤，从cDNA中除去未掺入的核苷酸。将cDNA重悬于98μl水中备用于第二链的合成。
在促进第一链引发第二链合成导致DNA发夹形成的条件下，对第一链cDNA进行第二链合成。第二链反应含98μl第一链cDNA、30μl 5×聚合酶I缓冲液(100mM Tris：HCl，pH 7.5，500mM KCl，25mM MgCl2，50mM(NH4)2SO4)、2μl 100mM的二硫苏糖醇、6μl含10mM各脱氧核苷三磷酸的溶液、5μl 5mM b-NAD、1μl 3U/μl的大肠杆菌DNA连接酶(New England Biolabs Inc.)和4μl 10U/μl的大肠杆菌DNA聚合酶I(New England Biolabs Inc.)。反应物在室温下组装，并于室温下温育2分钟，紧接着添加4μl 3.8U/μl的RNase H(LifeTechnologies)。反应物于15℃温育2小时，紧接着室温下温育15分钟。向反应物中添加10μl 1M TRIS pH7.4，并用苯酚/氯仿抽提两次、用氯仿抽提一次，然后用50μl TE(10mM TRIS pH 7.4，1mM EDTA)回抽有机相，与其余水相汇集，并在0.3M醋酸钠存在下进行乙醇沉淀。沉淀用100μl 70％乙醇洗涤、风干并重悬于40μl水中。
发夹结构的单链DNA由用绿豆核酸酶切割。反应混合物含40μl第二链cDNA、5μl 10×绿豆核酸酶缓冲液(Life technologies)、5μl在1×绿豆核酸酶缓冲液中稀释至1U/μl的绿豆核酸酶(PharmaciaBiotech Corp.)。反应于37℃温育45分钟。反应通过添加10μl 1M的Tris：HCl，pH 7.4终止，紧接着如上文所述相继以苯酚/氯仿和氯仿抽提。抽提后，cDNA在0.3M醋酸钠存在下进行乙醇沉淀。沉淀用100μl 70％乙醇洗涤、风干并重悬于38μl水中。
重悬的cDNA用T4 DNA聚合酶钝端化。重悬于38μl水中的cDNA与12μl 5×T4 DNA聚合酶缓冲液(250mM Tris：HCl，pH 8.0，250mMKCl，25mM MgCl2)、2μl 0.1M的二硫苏糖醇、6μl含10mM各脱氧核苷三磷酸的溶液以及2μl 1U/1μl的T4 DNA聚合酶(BoehringerMannheim Corp.)混合。于15℃温育45分钟后，反应通过添加30μl TE终止，紧接着相继以苯酚/氯仿和氯仿抽提并如上文所述用20μl TE回抽。DNA在2μl Pellet PaintTM(Novagen)载体和0.3M醋酸钠存在下进行乙醇沉淀并重悬于11μl水中。
将Eco RI接头连接到上述cDNA的5′端，以使之能够克隆到表达载体中。将11μl cDNA和4μl 65pmole/μl的Eco RI半磷酸化的接头(Pharmacia Biotech Corp)与5μl 5×连接酶缓冲液(LifeTechnologies)、2μl 10mM ATP及3μl 1U/μl的T4 DNA连接酶(LifeTechnologies)、1μl 10×连接缓冲液(Promega Corp)、9μl水混合。1×缓冲液的额外稀释是为了防止团粒paint沉淀。反应在水浴温度从10℃到22℃ 9小时的变温过程中温育9小时，紧接着在25℃温育45分钟。反应通过在68℃温育15分钟终止。
为促使cDNA定向克隆到表达载体中，该cDNA以XhoI消化，产生具有5′Eco RI粘端和3′XhoI粘端的cDNA。位于cDNA 3′端的XhoI限制性位点是早先利用ZC18698(SEQ ID NO：30)引物引入的。限制性酶消化在含35μl上述连接混合物、6μl 10×H缓冲液(BoehringerMannheim Corp.)、1μl 2mg/ml BSA(Biolabs Corp.)、17μl水和1.0μl 40U/μl XhoI(Boehringer Mannheim)的反应混合物中进行。消化于37℃进行1小时。反应通过在68℃温育15分钟终止，紧接着乙醇沉淀、如上所述洗涤干燥并重悬于30μl水中。
重悬的cDNA于65℃加热5分钟并置于冰上冷却，加入4μl 5×凝胶上样染料(Research Genetics Corp.)，将所述cDNA上样到0.8％的低溶点琼脂糖1×TAE凝胶(SEA PLAQUE GTGTM低溶点琼脂糖；FMC Corp.)中并电泳。从胶上切下杂质接头和长度0.6Kb以下的cDNA。反转电极，添加融化的琼脂糖填补孔，更换缓冲液，并电泳直至cDNA集中到泳道原点附近。切下含集中cDNA的凝胶区，并置于微离心管中，并且通过在65℃加热15分钟使琼脂糖融化。在将样品平衡到45℃之后，加入2μl1U/μl β-琼脂酶I(Biolabs，Inc.)，然后使混合物在45℃温育90分钟以消化琼脂糖。温育后，向样品添加1/10体积的3M NaAc，并将混合物于冰上温育15分钟。室温下将样品于14,000×g离心15分钟以除去未消化的琼脂糖，乙醇沉淀cDNA，70％乙醇洗涤，风干并重悬于40μl水中。
为确定cDNA与载体的最佳比率，组装若干连接并电穿孔。简要地，将2μl 5×T4连接酶缓冲液(Life Technologies)、1μl 10mM ATP、1μl EcoR1-Xho1消化的pZP7NX、1μl稀释至0.25U/μl的T4 DNA连接酶(Life Technologies)、加水至10μl与0.5、1、2或3μl cDNA在4个不同的连接中混合，在22℃温育4小时、68℃温育20分钟，醋酸钠-乙醇沉淀、洗涤、干燥并重悬至10μl。利用0.1cm管(Biorad)和设置为2.5KV，251F，200ohms的Genepulser，pulse controllerTM(Biorad)，将单独的1μl各连接物电穿孔至40μl DHI0b ElectroMaxTM电感受态细菌(Life Technologies)中。将这些细胞立即重悬于1mlSOC培养液(Manniatis等，同前)中，接着用500μl 50％的甘油-SOC作为保存剂。将这些“甘油贮液”以若干小份于-70℃冷冻。每种融化一小份并在补充有100μg/ml氨苄青霉素的LB-琼脂板上连续涂板。菌落数目显示CD3+cDNA与pZP7NX载体的最佳比率为1μl比45ng；这样的连接产生四百五十万的原代克隆。
为用以BaF3为基础的增值测定法(实施例5)筛选文库的目的，将上述甘油贮液在深孔微滴定板中稀释至各库100或250个克隆的液体培养物，于37℃振荡培养24小时，并根据制造商的说明利用Qiagen试剂盒分离质粒。随之将此DNA转染到BHK细胞中，培养基调整72小时，收集并贮存于-80℃，随后放置在5K BaF3/zcytor17/WSX-1/OSMRbeta细胞或BaF3/zcytor17/OSMRbeta细胞中72小时，之后利用″Alamar blue″荧光测定法(实施例5B和实施例2B)评估增殖。
实施例7
人类zcytor17lig的表达克隆
以每800μl 250个细胞的浓度向Super Broth IITM(BectonDickinson，Cockeysville，MD)+0.1mg/ml氨苄青霉素(amp)中添加激活的人类CD3+选择细胞文库的甘油贮液(实施例6)。使该大肠杆菌在室温下平衡24小时。在接种时，将400μl在LB+amp板上涂板，以确定接种的实际滴度。24小时后计数平板，然后调整SuperBrothIITM+大肠杆菌的终浓度，从而终浓度为每1.2ml 250个细胞。3次接种2 1总计6 1。然后将培养基接种到96-孔深孔板块(Qiagen)中。涂板在8-通道Q-Fill2TM加样器(Genetix，Christchurch，Dorset，UK)中进行。大肠杆菌在New Brunswick Scientific Innova 4900多层环境振荡器上以250转/分于37℃振荡过夜培养。利用Beckman GS-6KR离心机将大肠杆菌以3000rpm从溶液中旋出。将这些大肠杆菌沉淀于-20℃冷冻，或在小量制备质粒DNA前新鲜使用。各沉淀含大约250个来自人类CD3+选择的细胞文库的cDNA克隆。
然后利用QIAprepTM 96 Turbo Miniprep试剂盒(Qiagen)对这些250个cDNA克隆落库进行小量制备。质粒DNA利用125μl TE(10mM TrispH 8，1mM EDTA)洗脱。然后利用该质粒DNA转染BHK细胞。
BHK转染
BHK细胞按每孔12,000个细胞的密度以每孔100μl的体积在96-孔组织培养板中接种。培养基为DMEM(GibcoBRL)、5％热失活的胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺(GibcoBRL)、1×PSN(GibcoBRL)、1mM丙酮酸钠(GibcoBRL)。
第二天，BHK细胞用100μl SFA洗涤一次。SFA是无血清培养基，为DMEM/F12或DMEM(Gibco/BRL)、2mM GlutaMaxTM(Gibco/BRL)、1mM丙酮酸钠、10μg/ml转铁蛋白、5μg/ml胰岛素、10μg/ml胎球蛋白、2μg/ml硒、25mM HEPES(Gibco/BRL)、100μM非必需氨基酸(Gibco/BRL)。
DNA/LipofectamineTM混合物制备如下：将2.2μl LipofectamineTM试剂(Gibco/BRL)与102.8μl SFA在室温下组合，然后向LipofectamineTM/SFA中添加大约5μl质粒DNA(200ng/μl)形成DNA/LipofectamineTM混合物，它于室温下温育30分钟。从BHK细胞中除去SFA，并使细胞与50μl DNA/LipofectamineTM混合物在37℃5％CO2中温育5小时。向BHK细胞的两孔中各加50μl DNA/LipofectamineTM混合物，这样转染是一式双份进行的。
在BHK细胞与DNA/LipofectamineTM混合物温育5小时后，除去DNA/LipofectamineTM混合物并添加100μl培养基。细胞过夜温育，除去培养基并用100μl培养基替换。在培养细胞48-72小时之后，取出条件培养基，于-80℃冷冻至少20分钟，融化，然后取50μl在实施例5所描述的Baf3增殖测定中测定，以鉴定具有配体活性的250个克隆库。
在单个测定中筛选20个96-孔板。这代表大约250个cDNA/孔或总计480,000个cDNA。其中，大约60个孔的条件培养基(每孔代表大约250个cDNA)在增殖测定中测试为阳性。选择这些阳性库中的一个裂解并分离编码zcytor17lig的单个cDNA。其为62A12库。
对于62A12库，用1μl DNA通过电穿孔转化ElectroMaxTM DH10B细胞(Gibco/BRL)。将转化子涂板于LB+amp(100μg/ml)平板以提供单菌落。从电穿孔的库中选择672个单菌落，用牙签挑至7个每孔含1.2ml SuperBrothIITM的96-孔板中。将这些平板编号为#62.1到#62.7。将其过夜培养，并如上小量制备质粒DNA。对于全部的7个板，将来自裂解板的质粒DNA转染到BHK细胞中，并如上通过增殖测定，除了转染不是双份进行的之外。
从总计672个克隆中通过活性鉴定到两个阳性克隆62.6C7和62.6E9。对从克隆62.6E 9小量制备的质粒DNA测序，并取得了试验性的鉴定，但从该阳性克隆中获得了混合序列。为进一步分离zcytor17ligcDNA为单克隆，利用1μl 62.6E9库的DNA电穿孔DH10B细胞，并将转化子涂板到LB+amp(100μg/ml)平板上以提供单菌落。对从数个菌落小量制备的质粒DNA测序以提供确切的DNA序列。zcytor17lig的多核苷酸序列式全长的(SEQ ID NO：1)，且显示了其相应的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。
实施例8
表达Zcytor17可溶性受体：zcytor17CEE、zcytor17CFLG、 zcytor17CHIS和zcytor17-Fc4的哺乳动物表达载体的构建
A.含zcytor17CEE、zcytor17CFLG和zcytor17CHIS的zcytor17 哺乳动物表达载体的构建
制备表达载体pZp9zcytor17CEE，用以表达zcytor17多肽的可溶性胞外结构域，其中的构建体被设计表达包含推测的起始甲硫氨酸和邻近于推测的跨膜结构域截短的、并具有C-末端Glu-Glu标签的zcytor17多肽(SEQ ID NO：32)。
利用ZC29，451(SEQ ID NO：33)和ZC29，124(SEQ ID NO：34)作为添加EcoRI和BamHI限制性位点的PCR引物产生大约1500bp的PCR产物。利用人类HPVS自制cDNA文库作为模板，且如下进行PCR扩增：94℃ 1分，65℃ 1分，72℃ 1.5分，30个循环；跟着72℃ 7分；10℃浸泡。乙醇沉淀所述PCR反应物，并用EcoRI和BamHI限制性酶消化。消化的PCR产物在1.0％琼脂糖凝胶上进行凝胶纯化，并切下大约1500bp的条带。该带接着利用相同的引物进行如下循环的再扩增：94℃ 1分，65℃ 1分，72℃ 3分，30个循环；跟着72℃ 7分；10℃浸泡。乙醇沉淀所述PCR反应物，并用EcoRI和BamHI限制性酶消化。消化的PCR产物在1.0％琼脂糖凝胶上进行凝胶纯化，并切下大约1500bp的条带。将切下的DNA亚克隆到已由EcoRI和BamHI切割的质粒CEEpZp9中，产生质粒具有GLU-GLU C-末端标记的可溶性zcytor17受体的质粒zcytor17CEEpZp9。zcytor17CEEpZp9中的zcytor17CEE cDNA胞外结构域具有沉默突变，其将SEQ ID NO：4中1705位的T改变为C(编码SEQID NO：5中403位残基的Pro残基)。由于该突变是沉默的，zcytor17CEEpZp9中的zcytor17 cDNA编码如SEQ ID NO：5中所示的多肽。而且，由于所用的构建体，在可溶性zcytor17胞外结构域的C-末端并且是C-末端Glu-Glu标签之前插入了Gly-Ser残基对(SEQ ID NO：32)。这样，zcytor17胞外结构域C-末端的标签是如(SEQ ID NO：17)所示Glu-Glu标签。质粒CEEpZp9是哺乳动物表达载体，其包含表达盒，所述表达盒具有小鼠金属硫蛋白-1启动子、用以插入编码序列的多限制性位点以及人类生长激素终止子。所述质粒也具有大肠杆菌复制起点，以及具有SV40启动子、增强子和复制起点、DHFR基因及SV40终止子的哺乳动物选择性标记表达单元。利用标准分子生物学技术，根据制造商的说明将zcytor17CEEpZp9电穿孔到DH10B感受态细胞(GIBCO BRL，Gaithersburg，MD)中，并在含100μg/ml氨苄青霉素的LB平板上涂板，且过夜温育。菌落通过限制性分析或由单个菌落制备的DNA的PCR筛选。阳性克隆的插入序列通过序列分析验证。利用
Figure G2009102637047D01101
Maxi prep试剂盒(Qiagen)根据制造商的说明进行大规模的质粒制备。
利用相同的操作制备具有C-末端His标签(由连续6个His组成)的zcytor17可溶性受体；以及具有C-末端
Figure G2009102637047D01102
标签(SEQID NO：36)的zcytor17CFLAG。为构建这些构建体，前述载体具有取代glu-glu标签的HIS或
Figure G2009102637047D01103
标签(例如SEQ ID NO：17；SEQ ID NO：32或SEQ IDNO：35)。
B.可溶性人类zcytor17受体：zcytor17-Fc4的哺乳动物表达构 建
制备表达载体pEZE-2hzcytor17/Fc4以便在PF CHO细胞中表达C-末端Fc4标记的可溶形式的hzcytor17(人类zcytor17-Fc4)。PF CHO细胞是适于在无蛋白培养基(ExCell 325PF培养基；JRH Biosciences)中生长的自制CHO细胞系。该自制CHO细胞系最初来源于CHO DG44细胞(G.Urlaub，J.Mitchell，E.Kas，L.A.Chasin，V.L.Funanage，T.T.Myoda和J.L.Hamlin，″The Effect Of Gamma Rays at theDihydrofolate Reductase Locus：Deletions and Inversions，″Somatic  Cell and Molec.Genet.，12：555-566(1986)。包括zcytor17受体胞外结构域的多核苷酸序列的zcytor17 cDNA片段以正确的读框融合于Fc4多核苷酸序列(SEQ ID NO：37)，产生zcytor17-Fc4融合物(SEQ ID NO：38和SEQID NO：39)。pEZE-2载体为哺乳动物表达载体，其含有Fc4多核苷酸序列和克隆位点，允许利用标准分子生物学技术快速构建C-末端Fc4融合物。
通过PCR产生1566个碱基对的片段，含人类zcytor17的胞外结构域，以及Fc4的头两个氨基酸(Glu和Pro)，5′和3′端分别编码FseI和BglII位点。该PCR片段是利用引物ZC29，157(SEQ ID NO：40)和ZC29，150(SEQ I D NO：41)通过从含人类zcytor17胞外结构域的质粒(pZp9zcytor17CEE)(实施例8A)扩增产生的。PCR反应条件如下：94℃ 1分，60℃ 1分及72℃ 2分，25个循环；72℃ 10分，1个循环；跟着4℃浸泡。片段用FseI和BglII限制性内切酶消化，随后通过1％凝胶电泳纯化，条带纯化使用QiaQuick凝胶提取试剂盒(Qiagen)。所得的纯化的DNA室温下5小时连接到事先用FseI和BglII消化的、在FseI和BglII位点3′端含Fc4的pEZE-2载体中。
根据制造商的说明将2μl连接混合物电穿孔到37μl DH10B电感受态大肠杆菌(Gibco)中。转化的细胞在400μl LB培养基中稀释，并涂布到含100μg/ml氨苄青霉素的LB板上。克隆通过限制性消化分析，并将阳性克隆送交DNA测序以确认融合构建体的DNA序列。将1μl阳性克转化到37μl DH10B电感受态大肠杆菌中并在LB/amp板上划线。从该划线平板上挑取单菌落起始250ml的LB/amp培养，其接着于37℃以250rpm震荡过夜培养。由该培养物使用Qiagen plasmid Maxi试剂盒(Qiagen)产生750μg纯化的DNA。
实施例9
Zcytor17可溶性受体多肽的转染和表达
将BHK 570细胞(ATCC No.CRL-10314)、DG-44 CHO或其它哺乳动物细胞以大约1.2×106细胞/孔(6-孔板)在800μl适当的无血清(SF)培养基(例如DMEM，Gibco/BRL高葡糖)(Gibco BRL，Gaithersburg，MD)中接种。细胞根据制造商的说明利用LipofectinTM(Gibco BRL)由含zcytor17CEE、zcytor17CFLG，、zcytor17CHIS或zcytor17-Fc4的表达质粒(实施例8)在无血清(SF)培养基中转染。分离表达可溶性受体的单克隆，筛选并在细胞培养基中培养长大，并利用标准技术纯化。
A.可溶性人类zcytor17CEE受体的哺乳动物表达
BHK 570细胞(ATCC NO：CRL-10314)接种于T-75组织培养瓶中，并使之于37℃，5％CO2中在DMEM/FBS培养基(DMEM，Gibco/BRL高糖，(Gibco BRL，Gaithersburg，MD)、5％胎牛血清、1mM L-谷氨酰胺(JRHBiosciences，Lenea，KS)、1mM丙酮酸钠(Gibco BRL))中长至大约50到70％的融合。然后细胞利用LipofectinTM(Gibco BRL)由含zcytor17CEE(实施例8A)的质粒在无血清(SF)培养基配方(DMEM，10mg/ml转铁蛋白、5mg/ml胰岛素、2mg/ml胎球蛋白、1％ L-谷氨酰胺和1％丙酮酸钠)中转染。将10μg质粒DNA pZp9zcytor17CEE(实施例8A)在15ml试管中由SF培养基稀释至终体积总计500μl。将50μlLipofectamine与450μl SF培养基混合。向DNA混合物中添加所述Lipofectamine混合物，并使之在室温下温育大约30分钟。向DNA：Lipofectamine混合物中添加4ml SF培养基。细胞用5ml SF培养基冲洗一次，吸去并添加DNA：Lipofectamine混合物。细胞于37℃温育5小时，然后添加5ml DMEM/10％FBS培养基。烧瓶于37℃过夜温育，之后将细胞按1∶2、1∶10及1∶50拆分到150mm平板中的选择培养基(上文的DMEM/FBS培养基，添加有1μM氨甲蝶呤或10μM氨甲蝶呤(SigmaChemical Co.，St.Louis，Mo.)上。转染后大约10天，以胰蛋白酶消化一150mm板的1μM氨甲蝶呤抗性菌落，收集细胞，并将一半的细胞重涂于10μM氨甲蝶呤中；以进一步扩大zcytor17CEE蛋白的表达。利用SDS-PAGE和蛋白质分析测试来自该扩增细胞库的条件培养基样品的表达水平。
B.可溶性人类zcytor17-Fc4受体的哺乳动物表达
由FspI(在载体内切割一次并且不干扰表达必需基因的限制性酶)通过限制性消化使5份重复的200μg pEZE-2hzcytor17Fc4质粒DNA(实施例8B)线性化。向各重复实验中添加200μg CHO细胞基因组DNA作为载体DNA，然后通过添加0.1体积的3M醋酸钠pH 5.2和2.2体积的乙醇沉淀DNA，接着冰浴15分钟并于4℃微量离心。所得的DNA沉淀由70％乙醇洗涤、风干，再重悬于100μl无蛋白(PF)CHO非选择性生长培养基(21g/L PF CHO Ex Cell 325/200mM L-谷氨酰胺(Gibco)/100mM丙酮酸钠(Gibco)/1×HT补充液(Gibco))中。向600μl PF CHO非选择性生长培养基中的DNA添加一千万PF CHO 61代细胞，然后在GenePulser II电穿孔系统(BioRad)中利用950μF的电容和300Kv使用0.4cm间隙的Gene Pulser(BioRad)电穿孔管进行电穿孔。收集所有5份重复的电穿孔细胞，并直接在-HT培养基(21g/L PF CHO Ex Cell 325/200mM L-谷氨酰胺(Gibco)/100mM丙酮酸钠(Gibco))中进行选择。细胞在-HT培养基选择15天，之后以4×105ml在50nm MTX选择中传代。8天后，细胞以3.5×105细胞/ml种植到200mM MTX选择中。1周后，细胞以4×105细胞/ml种植到1μM MTX选择中。在1μM MTX中两周后，细胞以1×106细胞/ml种植到50ml中以产生条件培养基。用针对人类免疫球蛋白产生的抗体通过探测蛋白质印迹分析所得的72小时条件培养基。细胞产生大约1mg/L的hzcytor17/Fc4蛋白。
C.可溶性人类zcytor17-Fc4受体较大规模的哺乳动物表达
由FspI(在pEZE-2载体内切割一次并且不干扰表达必需基因的限制性酶)通过限制性消化200μg pEZE-2hzcytor17Fc4质粒DNA(实施例8B)使之线性化。添加200μg CHO细胞基因组DNA(自制)作为载体DNA，然后通过添加0.1体积的3M醋酸钠pH 5.2和2.5体积的乙醇沉淀DNA，接着室温下微量离心。制备并转化5份重复实验的DNA沉淀。所得的DNA沉淀在70％乙醇中洗涤，并风干，再重悬于100μl PF CHO非选择性生长培养基(21g/L PF CHO Ex Cell 325/200mM L-谷氨酰胺(Gibco)/100mM丙酮酸钠(Gibco)/1×HT补充液(Gibco))中。向600μlPF CHO非选择性生长培养基中的DNA添加一千万PF CHO细胞，然后在Gene Pulser II电穿孔系统(BioRad)中利用950μF的电容和300优使用0.4cm间隙的Gene Pulser(BioRad)电穿孔管进行电穿孔。收集电穿孔的细胞，并直接在-HT培养基(21g/L PF CHO Ex Cell 325/200mML-谷氨酰胺(Gibco)/100mM丙酮酸钠(Gibco)中进行选择。细胞在-HT培养基选择14天，之后以4×105ml在50nm MTX选择中传代。细胞被放大到200nm MTX、然后是1μM MTX。将所述-HT、50nm及1μM库以1×106细胞/ml种植48小时，用针对人类免疫球蛋白产生的抗体通过探测蛋白质印迹分析所得的条件培养基。
实施例10
从BHK570和CHO细胞中纯化zcytor17可溶性受体
A.可溶性人类zcytor17-Fc4受体的瞬时哺乳动物表达和纯化
如本文所述和制造商的说明，利用Lipofectamine(Gibco BRL)将pEZE-2hzcytor17Fc4质粒DNA(实施例8B)引入到40个最大板的BHK细胞中。使细胞过夜复苏，然后冲洗并重新供给无血清培养基(SL7V4，自制)。72小时后，收集培养基并过滤，并向细胞重新供给无血清培养基。72小时后，再次收集培养基并过滤。
将来自瞬时转染的BHK细胞的无血清条件培养基(2×1.5L批次)置于20mM Tris，pH 7.5，0.5M NaCl中泵至1.5ml的蛋白质A-琼脂糖柱上。由该缓冲液充分洗柱，然后用1ml 0.2M甘氨酸，pH 2.5，0.5M NaCl洗脱结合的蛋白。将洗脱的蛋白收集到0.1ml 2M Tris，pH8.5中。收集小份进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，且大量的zcytor17-Fc在PBS中透析过夜。将可溶性受体无菌过滤并以小份置于-80℃。
B.zcytor17-Fc4的纯化
重组羧基末端Fc4标记的zcytor17(实施例8和实施例9)由转染的CHO细胞产生。CHO转染是利用本领域公知的方法实施的。收集大约5L条件培养基并利用Nalgene 0.2μm过滤器无菌过滤。
通过联合Poros 50蛋白质A亲和层析(PerSeptive Biosystems，1-5559-01，Framingham，MA)和Superdex 200凝胶排阻层析柱(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)从过滤的培养基中纯化蛋白。以大约3-10ml/分的流速直接将培养基加样到10×70mm(5.5-ml床体积)蛋白质A亲和柱上。在用10倍柱体积的PBS洗柱后，通过5倍柱体积的0.1M甘氨酸，pH 3.0以10ml/分洗脱结合的蛋白。在含100μl 2.0M Tris，pH 8.0的试管中各收集2ml的级分，以中和洗脱的蛋白。来自亲和柱的样品通过考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE和利用人类Ig-HRP的蛋白质印迹分析zcytor17-Fc4的存在。收集含Zcytor17-Fc4的级分并利用Biomax-30浓缩器(Millipore)浓缩为1-2ml，加样到20×580mm的Superdex 200凝胶过滤柱上。收集含纯化的zcytor17-Fc4的级分，通过0.2μm过滤器过滤，分成每管100μl的小份，并于-80℃冷冻。纯化蛋白的终浓度通过BCA测定法(Pierce，Rockford，IL)确定。
C.zcytor17/Fc4的SDS-PAGE和蛋白质印迹分析
重组zcytor17-Fc4通过利用考马斯亮蓝染色法的SDS-PAGE(Nupage 4-12％，Invitrogen，Carlsbad，CA)以及利用人类Ig-HRP的蛋白质印迹分析。条件培养基或纯化蛋白都由Invitrogen Novex′sXcell II小室电泳，并根据仪器手册中提供的说明，在室温下利用Novex′s Xcell II印迹模具搅动着将其转移到硝化纤维素膜(0.2mm；Invitrogen，Carlsbad，CA)上。转移于500mA下在含25mM Tris碱、200mM甘氨酸和20％甲醇的缓冲液中操作1小时。然后滤膜用PBS中的10％脱脂奶粉室温下封闭10分钟。快速漂洗硝化纤维素膜，然后在含2.5％脱脂奶粉的PBS中加入人类Ig-HRP抗体(1∶2000)。印迹室温下温育2小时，或者4℃轻摇过夜。温育后，印迹在PBS中洗涤三次，每次10分钟，然后迅速在H2O中漂洗。印迹用商业上可获得的化学发光底物试剂(
Figure G2009102637047D01151
ULTRA试剂1和2以1∶1混合；试剂获自Pierce，Rockford，IL)显影，并利用Lumi-Imager′s Lumi分析者3.0软件(Boehringer Mannheim GmbH，Germany)捕获从10秒到5分钟或根据需要的暴露时间范围内的信号。
纯化的zcytor17-Fc4以单条带出现，在非还原条件下考马斯亮蓝或银染约220kDa，而在还原条件下约120kDa，表明了所预期的zcytor17-Fc4在非还原条件下的二聚体形式。
实施例11
在竞争性抑制测定中利用zcytor17可溶性受体zcytor17-Fc4可 溶性受体的测定
离心沉淀BaF3/zcytor17/WSX-1/OSMRbeta细胞和BaF3/zcytor17/OSMRbeta细胞并在无mIL-3培养基中洗涤。细胞离心并洗涤3次以确保除去mIL-3。然后在血球计数器中计数细胞。细胞利用无mIL-3培养基以每孔100μl的体积按每孔5000个细胞接种于96孔型板中。
来自实施例5中所述的CCRF-CEM和CCRF-HSB2细胞激活以及人类CD3+选择细胞的条件培养基在不同的实验中以25％、12.5％、6.25％、3.125％、1.5％、0.75％、0.375％和0.187％的浓度添加，加或不加1-10μg/ml的zcytor17可溶性受体(Zcytor17-Fc4；见实施例9和实施例10)。总测定体积为200μl。
测定板于37℃、5％CO2中温育3-5天，此时以20μl/孔添加AlamarBlue(Accumed)。板再次于37℃、5％CO2中温育16-24小时。在FmaxTM板阅读器上(Molecular Devices)如实施例2所述对板进行读数。结果显示了10μg/ml zcytor17-Fc4可溶性受体对细胞生长的部分抑制，证实了各样品中的因子是zcytor17受体特异性的。
也利用上述测定法进行了稀释可溶性受体或包括zcytor17/OSMR和zcytor17/WSX-1的可溶性受体杂二聚体的滴定曲线，以确定zcytor17受体在例如低浓度和生理浓度时是否能够完全抑制生长。
也在萤光素酶测定中利用纯化的人类zcytor17lig(实施例35)和可溶性受体进行了相似的竞争性抑制测定(实施例20)。结果证明同型二聚体zcytor17和杂二聚体zcytor17/OSMR都能够抑制zcytor17lig的活性。
实施例12
分泌陷阱测定
利用分泌陷阱测定法测试zcytor17lig对包含zcytor17受体的受体(例如zcytor17受体或包括zcytor17/OSMR和zcytor17/WSX-1的受体杂二聚体)的结合。将Zcytor17lig质粒DNA转染到COS细胞中，并如下所述通过分泌陷阱用以评估zcytor17lig对包含zcytor17受体的受体的结合。
A.COS细胞转染
COS细胞转染如下进行：800ng zcytor17lig cDNA和4μlLipofectamineTM在80μl无血清DMEM培养基(500ml DMEM中55mg丙酮酸钠，146mg L-谷氨酰胺，5mg转铁蛋白，2.5mg胰岛素，1μg硒和5mg胎球蛋白)中混合，并在室温下温育30分钟。然后添加320μl无血清DMEM培养基。将该500μl混合物添加到加有2×105COS细胞/孔的12-孔组织培养板上，并于37℃温育5小时。然后加入500μl 20％FBS DMEM培养基(500ml DMEM中100ml FBS，55mg丙酮酸钠和146mgL-谷氨酰胺)，并且细胞温育过夜。
B.分泌陷阱测定
分泌陷阱(secretion trap)如下实施：用PBS将培养基从细胞中冲洗掉，然后细胞用PBS中的1.8％甲醛固定15分钟。然后细胞用PBS/0.1％BSA洗涤并用PBS中的0.1％Triton-X通透15分钟，并再次用PBS/0.1％BSA洗涤。细胞用PBS/0.1％BSA封闭1小时。根据所用的可溶性受体是哪一个，细胞在TNB中和如下成分温育1小时：(A)1-3μg/ml zcytor17可溶性受体zcytor17-Fc4融合蛋白(实施例10)；或(B)1-3μg/ml zcytor17/OSMRbeta可溶性受体蛋白。然后细胞用TNT洗涤。根据所用的可溶性受体是哪一个(例如，如果用Fc4标签(SEQ IDN0：37)、C-末端FLAG标签(SEQ ID NO：26)或CEE标签(SEQ ID NO：32；SEQ ID NO：35)标记)，细胞和例如以下成分再温育1小时：在TNB中(A)1∶200稀释的山羊-抗-人Ig-HRP(Fc特异性)；(B)1∶1000稀释的M2-HRP；(C)1∶1000稀释的抗-GluGlu抗体-HRP；或(D)1∶300稀释的链霉抗生物素蛋白-HRP(NEN试剂盒)。细胞再次用TNT洗涤。
为检测阳性结合，荧光素tyramide试剂在稀释缓冲液中稀释(NEN试剂盒)并温育4-6分钟，并用TNT洗涤。用在TNT中以1∶5稀释的Vectashield Mounting培养基(Vector Labs Burlingame，CA)保存细胞。利用FITC滤光器在荧光显微镜上观看细胞。该测定的结果显示人类zcytor17lig不与任何可溶性受体结合。这些数据提示zcytor17lig的结构对该方案中的固定步骤敏感，因为它显然能够与细胞表面的受体结合(例如参见下文实施例39中提供的流式细胞仪数据)。
实施例13
zcytor17lig基因序列的染色体分配和定位
利用商业上可获得的“斯坦福G3放射性杂交绘图工具”(ResearchGenetics，Inc.，Huntsville，AL)版本，将zcytor17lig基因序列绘图到人类染色体12上。“斯坦福G3 RH工具”含有来自人类全基因组83个放射性杂交克隆中的各DNA，加上两个对照DNA(RM供体和A3受体)。位于互联网www.stanford.edu上的公众可用的WWW服务器允许进行标志和基因的染色体定位。
为由“斯坦福G3 RH工具”绘制zcytor17lig的基因序列，在适于PCR的96-孔微量滴定板(Stratagene，La Jolla，CA)中设置20μl反应物，并用在“RoboCycler Gradient 96”热循环仪(Stratagene)中。95个PCR反应中各包括2μl 10×PCR反应缓冲液(Qiagen，Inc.，Valencia，CA)、1.6μl dNTP混合物(各2.5mM，PERKIN-ELMER，FosterCity，CA)、1μl正义引物ZC41，458(SEQ ID NO：42)、1μl反义引物ZC41，457(SEQ ID NO：43)、2μl″RediLoad″(Research Genetics，Inc.，Huntsville，AL)、0.1μl Qiagen HotStarTaq DNA聚合酶(5单位/μl)、来自单个杂交克隆或对照的25ng DNA，以及蒸馏水，总为体积20μl。反应物覆以等量的矿物油并密封。PCR循环仪的条件如下：初始1个循环的15分钟95℃变性，35个循环的45秒95℃变性、1分钟53℃退火以及1分15秒72℃延伸，接着是终了1个循环的7分钟72℃延伸。反应物通过电泳在2％琼脂糖凝胶(EM Science，Gibbstown，NJ)上分离并通过溴乙锭染色观察。
结果显示了zcytor17lig基因序列与染色体12标志SHGC-83339的连锁，LOD分值＞11，并距该标志17cR_10000。该标志将zcytor17lig基因定位在12q24.31染色体区。
实施例14
鼠zcytor17lig的鉴定和克隆
A.全长鼠zcytor17lig的鉴定
利用人类zcytor17lig多肽序列(SEQ ID NO：2)查询自制DNA数据库，将Genbank登录号No.AK00593的鼠cDNA鉴定为潜在的鼠zcytor17lig的部分序列。利用所述AK005939 cDNA序列查询含鼠基因组片段的数据库。组装了鼠zcytor17lig的基因组毗连序列(SEQ ID NO：76)。以程序Genscan对该基因组片段编码潜力的预测揭示了可能的cDNA序列，其与人类zcytor17lig具有相同的基因结构。鼠cDNA序列显示于SEQ ID NO：10，并且其相应的多肽序列示于SEQ ID NO：11。
B.通过PCR从小鼠睾丸cDNA文库中克隆小鼠zcytor17lig
根据基因组序列(SEQ ID NO：76)，设计了两个PCR引物并通过PCR用于鉴定小鼠zcytor17lig的cDNA来源。这些引物ZC41498(SEQ ID NO：86)和ZC41496(SEQ ID NO：87)根据小鼠序列(SEQ ID NO：76和SEQ IDNO：10)推断的5′和3′非翻译区设计。通过PCR筛选到数个cDNA来源，包括Marathon-ready cDNA(Clontech)，和小份本地制备的cDNA文库。产物在1％琼脂糖凝胶上观察。在使用小鼠睾丸cDNA文库模板的反应中观察到预期大小的条带。根据制造商的建议，使用pfu turbo聚合酶(Stratagene)，PCR反应在有或无10％DMSO的大约50μl体积中可成功进行；并附加应用使用50s热启动的蜡热启动(MolecularBioproducts，Inc.San Diego，CA)。PCR热循环以单个循环的94℃ 4分钟；接着40个循环的94℃：30秒、48℃：30秒、72℃：50秒；附加终了的72℃延伸7分钟实施。收集两个PCR反应物，并根据制造商的建议利用低溶点琼脂糖和Gelase琼脂糖消化酶(Epicenter，Inc.Madison，WI)纯化。
这些PCR产物的DNA序列测定揭示了鼠zcytor17 cDNA序列(SEQ IDNO：90)，其包括与SEQ ID NO：10相同的ORF，证实SEQ ID NO：10编码小鼠zcytor17多肽。然后利用PCR引物ZC41583(SEQ ID NO：88)和ZC41584(SEQ ID NO：89)向mcytor17lig开放读框和终止密码子(SEQID NO：92)添加FseI和AscI限制性位点和部分Kozak序列。利用Robocycler 40热循环仪(Stratagene)进行退火温度的温度梯度，并如下循环。Pfu turbo聚合酶(Stratagene)如上所述应用，但仅在10％DMSO中。循环以单个循环的94℃ 4分钟；接着20个循环的94℃：30秒、65℃到51℃的梯度：30秒、72℃：1分钟；以及单次的72℃延伸7分钟。该第二热循环反应的模板是1μl上文最初凝胶纯化的mcytor17lig PCR产物。收集所得的来自三个最低温度反应的PCR产物，并利用上文所述的Gelase(Epicenter)法进行凝胶纯化。该纯化的mzcytor17lig以FseI和AscI消化并连接到经修饰在其克隆位点具有FseI和AscI位点的pZP7X载体中。质粒pZP7X为含表达盒的哺乳动物表达载体，所述表达盒具有小鼠金属硫蛋白-1(MT-1)启动子、用以插入编码序列的多限制性位点以及人类生长激素终止子。该质粒也具有大肠杆菌复制起点，以及具有SV40启动子、增强子和复制起点、DHFR基因及SV40终止子的哺乳动物选择性标记表达单元。克隆的鼠cDNA序列表示在SEQ ID NO：90中，并且相应的多肽序列显示在SEQ ID NO：91(其与SEQ ID NO：11相同)中。
实施例15
从激活的小鼠脾文库中分离小鼠zcytor17lig cDNA克隆
A.用于分离小鼠zcytor17lig的鼠原代材料
收集来自Balb/C小鼠的小鼠脾脏，在载玻片磨砂端之间捣碎以产生细胞悬液。分离的原代小鼠细胞产率在下文所述的选择前预期为大约6.4×108细胞。
将脾细胞悬浮于9.6ml MACS缓冲液(PBS，0.5％EDTA，2mM EDTA)中。取1.6ml细胞悬液并加入0.4ml CD90(Thy1.2)微珠(MiltenyiBiotec)。混合物于4℃温育15分钟。这些标记了CD90珠子的细胞用30ml MACS缓冲液洗涤，然后重悬于2ml MACS缓冲液中。
根据制造商的说明制备VS+柱(Miltenyi)。然后将该VS+柱置于VarioMACSTM磁场(Miltenyi)中。用5ml MACS缓冲液平衡柱子。然后向该柱施加分离的原代小鼠细胞。使CD90阴性细胞穿过。用9ml(3×3ml)MACS缓冲液洗柱。然后从磁场中取出柱子，并放置在一15ml falcon管上。通过向柱子添加5ml MACS缓冲液洗脱CD90+细胞，并利用制造商提供的柱塞冲洗掉结合的细胞。上述细胞和CD90磁珠温育、洗涤及VS-柱子的步骤(通过洗脱温育)再重复1次。从2个柱分离物中汇集所得的CD90+级分。CD90+选择的小鼠脾细胞产率预期为大约1×108个总细胞。
对汇集的CD90+选择的小鼠细胞取样染色，并在荧光抗体细胞分选仪(FACS)上分选以评估其纯度。利用PE-偶联的仓鼠抗-小鼠CD3E抗体(PharMingen)对所述CD90+细胞进行染色和分选。小鼠CD90+选择的细胞应当为93％CD3+细胞，提示细胞93％为T细胞。
鼠CD90+选择的细胞通过在RPMI+5％FBS+PMA 10ng/ml及离子霉素0.5μg/ml(Calbiochem)中于37℃过夜温育3×106细胞/ml激活。如下文所述测试这些激活的CD90+选择的小鼠细胞上清的zcytor17lig活性。而且，如下文实施例16中所述利用激活的CD90+选择的小鼠细胞制备cDNA文库。
实施例16
从小鼠CD90+选择的细胞文库中克隆小鼠zcytor17lig
筛选原代小鼠激活的CD90+选择的细胞cDNA文库能够揭示作为四螺旋束细胞因子家族新成员的分离的cDNA，其将编码人类zcytor17lig的小鼠直向同源物。该cDNA是通过杂交筛选鉴定到的。
A.用于CD90+选择文库构建的载体
载体pZP7NX用于CD3+选择文库的构建(见实施例6A)。
B.制备原代小鼠激活的CD90+选择细胞的cDNA文库
通过离心分离到大约1.5×108在离子霉素/PMA中刺激的原代小鼠CD90+选择的细胞(实施例15)。从细胞沉淀中分离总RNA，并如实施例6B所述转变为双链cDNA。随后将该DNA转染到BHK细胞中，如实施例6B所述，并利用″Alamar blue″荧光测定法评估增殖(实施例2B)。
为通过分泌陷阱克隆筛选文库的目的，需要用复杂扩增形式的文库转染COS-7细胞。将四百八十万克隆涂板到补充有100μg/ml氨苄青霉素、10μg/ml二甲氧基苯青霉素的110个15cm LB琼脂板上。板在37℃过夜培养后，刮板收集细菌并沉淀。利用Nucleobond-gigaTM(Clonetech)根据制造商的说明从沉淀的细菌中提取质粒DNA。然后利用该质粒转染载玻片上的COS-7细胞，并利用下文所述的分泌陷阱技术筛选(实施例17)。
C.筛选激活的小鼠cDNA文库
将大约5×105克隆涂板于10个LB/Amp Maxi平板上。转移菌落、变性、中和并利用标准操作交联(Sambrook，J.等，同前)。50ng 300bp的5′RACE PCR片段(实施例14)利用Prime-Itr RmT随即引物标记试剂盒(Stratagene)由32p标记。然后利用ExpressHybTM杂交液(Clontech)使10个滤膜与该标记探针于65℃过夜杂交。然后滤膜相继3次用0.2×SSC(30mM NaCl，3mM柠檬酸钠，pH 7.0)，0.1％SDS于60℃洗涤1小时；然后于65℃洗涤1小时。将滤膜置于-80℃过夜，并使X-射线胶片显影。取下含阳性菌落的琼脂塞，并将菌落涂板于10-cm LB/Amp板上。然后滤膜转移菌落并再次按照上述相同的操作杂交。分离单个DNA克隆并利用标准方法测序，以鉴定小鼠cDNA。
实施例17
在分泌陷阱测定中小鼠zcytor17lig不与人类zcytor17可溶性受 体结合
将来自小鼠克隆mzcytor17lig/pZP7的DNA转染到COS细胞中，并通过分泌陷阱测定法(实施例12)测试包含zcytor17的可溶性受体(人类zcytor17可溶性受体zcytor17-Fc4(实施例10)或可溶性受体杂二聚体(zcytor17/WSX-1或BaF3/zcytor17/OSMRbeta))与转染的COS细胞的结合。测定证实小鼠zcytor17lig不与人类可溶性受体zcytor17结合。
COS细胞转染按照实施例12利用3μl大约0.7μg小鼠zcytor17lig cDNA(实施例16)进行。
分泌陷阱按实施例12利用如TNB中的1μg/ml zcytor17可溶性受体Fc4融合蛋白(实施例10)(或如本文所述的包含zcytor17的可溶性受体杂二聚体)以及用于可检测抗体的TNB中1∶200稀释的羊-抗-人Ig-HRP(Fc特异性)实施。用如实施例12中的荧光素tyramide试剂未检测到可溶性人类zcytor17受体与制备的固定细胞的阳性结合。细胞根据实施例12保存和观察。
结果显示小鼠zcytor17lig不与人类zcytor17可溶性受体(或如本文所述的包含zcytor17的可溶性受体杂二聚体)结合。
实施例18
小鼠zcytor17lig在哺乳动物细胞中的表达
小鼠zcytor17lig的哺乳动物表达
将BHK 570细胞(ATCC No：CRL-10314)接种于10cm组织培养皿中，并使之于37℃，5％CO2中在DMEM/FBS培养基(DMEM，Gibco/BRL高糖培养基；Gibco BRL，Gaithersburg，MD)、5％胎牛血清(Hyclone，Logan，UT)、1mM L-谷氨酰胺(JRH Biosciences，Lenea，KS)、1mM丙酮酸钠(Gibco BRL))中长至大约20％的汇合。然后细胞利用哺乳动物稳定的Lipofectamine(GibcoBRL)转染试剂盒根据制造商的说明由质粒mzcytor17lig/pZP7X(实施例14)转染。
转染后一天，将细胞按1∶10和1∶20拆分到150mm平板中的选择培养基(添加1μM氨甲蝶呤(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO的DMEM/FBS培养基)上。转染后5天将细胞培养基用新鲜的选择培养基替换。转染后大约10天，以胰蛋白酶消化氨甲蝶呤抗性菌落，收集细胞，并接种到大规模培养烧瓶中。一旦细胞生长至大约90％的汇合，则用PBS冲洗3次，并用无血清ESTEP2培养基(DMEM(Gibco BRL)，0.11g/l丙酮酸钠，3.7g/l NaHCO3，2.5mg/l胰岛素，5mg/l转铁蛋白，pH7.0)条件培养基培养。3天后收集条件培养基，并利用Alamar Blue如下文实施例19所述投入BaF3增殖测定中。
实施例19
在使用Alamar Blue的BaF3测定中小鼠zcytor17lig不激活人类 zcytor17受体
利用来自表达小鼠zcytor17lig的BHK细胞的无血清条件培养基(实施例18)评估BaF3/zcytor17、BaF3/zcytor17/OSMRbeta和BaF3/zcytor17/WSX-1细胞(实施例4和5B)的增殖。
离心沉淀BaF3/Zcytor17、BaF3/zcytor17/OSMRbeta和BaF3/zzytor17/WSX-1细胞，洗涤并如实施例5B所述接种于无mIL-3培养基中。来自表达小鼠zcytor17lig的BHK细胞的条件培养基(实施例18)由无mIL-3培养基稀释至50％、25％、12.5％、6.25％、3.125％、1.5％、0.75％和0.375％的浓度。增殖测定按照实施例5B实施。该测定的结果是阴性的，表明小鼠zcytor17lig不激活人类zcytor17、zcytor17/OSMRbeta或zcytor17/WSX-1受体复合物。
实施例20
在萤光素酶测定中人类zcytor17lig激活人类zcytor17/OSMRbeta受 体
A.BaF3/KZ134/zcytor17细胞系的构建
KZ134质粒利用互补寡核苷酸ZC12，749(SEQ ID NO：44)和ZC12，748(SEQ ID NO：45)构建，所述寡核苷酸含有4个基因的STAT转录因子结合元件，包括修饰的c-fos Sis诱导元件(m67SIE或hSIE)(Sadowski，H.等，Science 261：1739-1744，1993)、来自p21WAF1基因的p21SE1(Chin，Y.等，Science 272：719-722，1996)、β-酪蛋白基因的乳腺应答元件(Schmitt-Ney，M.等，Mol.Cell.Biol. 11：3745-3755，1991)以及Fcg RI基因的STAT诱导元件(Seidel，H.等，Proc.Natl.Acad.Sci. 92：3041-3045，1995)。这些寡核苷酸含有Asp718-XhoI匹配端，并利用标准方法连接到以相同酶消化的具有c-fos启动子并含有新霉素选择标记的萤火虫萤光素酶报告载体(Poulsen，L.K.等，J.Biol.Chem. 273：6229-6232，1998)中。利用该KZ134质粒稳定转染BaF3细胞，使用标准转染和选择方法制备BaF3/KZ134细胞系。
按照实施例4构建表达全长zcytor17受体或zcytor17/OSMRbeta受体的稳定的BaF3/KZ134指示细胞系。稀释克隆，涂板并利用标准技术选择。克隆利用人类zcytor17lig条件培养基或纯化的zcytor17lig蛋白(见下文实施例35)作为诱导剂通过萤光素酶测定法(见下文实施例20B)筛选。选择具有最高萤光素酶应答(通过STAT萤光素酶)和最低本底的克隆。选择稳定转染体细胞系。该细胞系被称之为BaF3/KZ134/zcytor17或BaF3/KZ134/zcytor17/OSMRbeta，取决于转染到细胞系中的受体。
类似的，也利用本文所述的方法构建BHK细胞系，并用于本文所述的萤光素酶测定中。该细胞系被称之为BHK/KZ134/zcytor17或BHK/KZ134/zcytor17/OSMRbeta，取决于转染到细胞系中的受体。
B.在      BaF3/KZ134/zcytor17/OSNMbeta    或 BHK/KZ134/zcytor17/OSMRbeta萤光素酶测定中人类zcytor17lig激活 人类zcytor17受体
离心沉淀BaF3/KZ134/zcytor17和BaF3/KZ134/zcytor17/OSMRbeta细胞，并在无mIL-3培养基中洗涤。细胞离心并洗涤3次以确保除去mIL-3。然后在血球计数器中计数细胞。细胞利用无mIL-3培养基以每孔100μl的体积按每孔大约30,000个细胞接种于96孔型板中。对在随后的测定中用作为对照的未转染的BaF3/KZ134细胞使用相同的操作。将BHK/KZ134/zcytor17或BHK/KZ134/zcytor17/OSMRbeta细胞以每孔15,000个细胞接种于96孔型板的100μl培养基中。利用亲本BHK/KZ134细胞作为对照。
BaF3/KZ134/Zcytor17、BaF3/KZ134/zcytor17/OSMRbeta、BHK/KZ134/zcytor17或BHK/KZ134/zcytor17/OSMRbeta细胞的STAT激活利用以下物质评估：(1)来自转染了人类zcytor17lig的BHK570细胞的条件培养基(实施例7)，(2)来自转染了小鼠zcytor17lig的BHK570细胞的条件培养基(实施例18)，(3)纯化的人类zcytor17lig(实施例35)，或(4)无mIL-3培养基以测量仅有培养基的对照应答。条件培养基用RPMI无mIL-3培养基稀释至50％、25％、12.5％、6.25％、3.125％、1.5％、0.75％和0.375％的浓度。纯化的人类zcytor17lig被稀释至1200、600、300、150、75、37.5、18.75或9.4pM的浓度。将100μl稀释的条件培养基或蛋白添加到BaF3/KZ134/Zcytor17、BaF3/KZ134/zcytor17/OSMRbeta、BHK/KZ134/zcytor17或BHK/KZ134/zcytor17/OSMRbeta细胞中。对未转染的BaF3/KZ134或BHK/KZ134细胞平行进行使用条件培养基的测定作为对照。总测定体积为200μl。测定板于37℃、5％CO2中温育24小时，此时通过2000rpm10分钟离心沉淀BaF3细胞，并吸出培养基，加入25μl裂解缓冲液(Promega)。对于BHK细胞系，离心步骤并非必要的，因为细胞是粘附的。室温下放置10分钟后，通过在光度计(Labsystems Luminoskan，型号RS)中读数测量板中STAT报告基因构建体的激活，所述光度计以5秒的集成加入40μl萤光素酶测定底物(Promega)
该测定结果证实，当将BaF3/KZ134/zcytor17/OSMRbeta和BHK/KZ134/zcytor17/OSMRbeta细胞对人类zcytor17lig的STAT报告基因应答与BaF3/KZ134/zcytor17细胞、BHK/KZ134/zcytor17细胞或未转染的BaF3/KZ134或BHK/KZ134对照细胞进行比较时，显示应答是通过zcytor17/OSMRbeta受体介导的。该结果也证明小鼠zcytor17lig不通过人类受体复合物激活STAT报告基因测定。
实施例21
小鼠zcytor17lig在小鼠骨髓测定中是有活性的
A.非粘附性低密度骨髓细胞的分离：
新鲜小鼠股骨吸出物(骨髓)从6-10周龄的雄性Balb/C或C57BL/6小鼠中获取。然后骨髓用RPMI+10％FBS(JRH，Lenexa KS；Hyclone，Logan UT)洗涤，并悬浮于RPMI+10％FBS中作为全骨髓细胞悬液。然后如下对全骨髓细胞悬液进行密度梯度离心(Nycoprep，1.077，Animal；Gibco BRL)，以富集低密度的主要是单核的细胞：小心地将全骨髓细胞悬液(约8ml)吸取到15ml圆锥管中约5ml Nycoprep梯度溶液的上方，然后以600×g离心20分钟。然后取出含低密度单核细胞的界面层，用过量RPMI+10％FBS洗涤，并通过400×g离心5-10分钟沉淀。将该沉淀重悬于RPMI+10％FBS中，并以大约106细胞/ml接种于T-75烧瓶中，并于37℃、5％CO2中温育大约2小时。所得悬液中的细胞即非粘附性低密度(NA LD)骨髓细胞。
B.96-孔测定
将NA LD小鼠骨髓细胞以25,000到45,000个细胞/孔铺板到96孔组织培养板的RPMI+10％FBS+Ing/mL小鼠干细胞因子(mSCF)(R & DSystems，Minneapolis，MN)中，添加来自下列之一的5％条件培养基：(1)表达小鼠zcytor17lig的BHK 570细胞(实施例18)，(2)表达人类zcytor17lig的BHK 570细胞(实施例7)，或(3)含载体且不表达任何一种配体的对照BHK 570细胞。然后对这些细胞进行多种细胞因子处理，以测试造血细胞自骨髓的扩增或分化。为测试，将铺板的NA LD小鼠骨髓细胞置于人类白介素-15(hIL-15)(R & D Systems)或一组其它细胞因子之一(R & D Systems)中。测试了系列稀释度的hI1-15或其它细胞因子，从大约50ng/ml降至大约0.5ng/ml浓度的2-倍系列稀释度。8到12天后，如实施例5B所述通过Alamar blue测定法计分96-孔测定的细胞增殖。
C.96-孔NA LD小鼠骨髓测定的结果
与对照BHK条件培养基相比，来自表达小鼠和人类zcytor17lig的BHK细胞的条件培养基能够单独或者与其它细胞因子协同促进NA LD小鼠骨髓中造血细胞群的扩增。有或无其它细胞因子时小鼠zcytor17lig扩增的造血细胞群，以及那些有或无其它细胞因子时人类zcytor17lig扩增的造血细胞群，进一步在细胞培养物中进行繁殖。这些造血细胞用藻红蛋白标记的抗-泛NK细胞抗体(PharMingen)染色，并进行流式细胞仪分析，这显示扩增的细胞被该天然杀伤(NK)细胞标志阳性染色。类似的，可利用其它特异性造血细胞标志测定例如CD4+或CD8+T细胞、其它T细胞群、B细胞及其它免疫细胞标志的扩增。
利用从Poietic Technologies，Gaithersburg，MD购买的新鲜人类骨髓细胞进行相同的96-孔测定。再次地，阳性结果显示zcytor17lig单独或者与其它细胞因子协同地，小鼠及人类zcytor17lig能够扩增如上文所讨论的特异性细胞标志阳性染色的造血细胞群。
实施例22
用于产生zcytor17lig转基因小鼠的构建体
A.用以从MT-1启动子表达人类zcytor17lig的构建体
设计寡核苷酸产生含保守Kozak序列和人类zcytor17lig编码区的PCR片段。这些寡核苷酸被设计在5′端具有FseI位点且在3′端具有AscI位点，以帮助克隆到(a)标准转基因载体pMT12-8或(b)淋巴特异性转基因载体pKF051(实施例22B)中。
PCR反应用大约200ng人类zcytor17lig模板(SEQ ID NO：1)和设计用于扩增zcytor17lig全长或活性部分的寡核苷酸进行。PCR反应条件利用本领域公知的方法确定。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳分离，并利用QiaQuick(Qiagen)凝胶提取试剂盒纯化。分离的正确大小的DNA片段用FseI和AscI(Boerhinger-Mannheim)消化，乙醇沉淀并连接到事先由FseI和AscI消化的pMT12-8中。pMT12-8质粒被设计用以在转基因小鼠的肝及其它组织中表达目的基因，其含有侧接10kb MT-1 5′DNA和7 kb MT-1 3′DNA的表达盒。表达盒包括MT-1启动子、大鼠胰岛素II内含子、用以插入目的克隆的多聚接头以及人类生长激素(hGH)poly A序列。
根据制造商的说明将大约1μl各连接反应物电穿孔到DH10BElectroMaxTM感受态细胞(GIBCO BRL，Gaithersburg，MD)中，并涂板到含100μg/ml氨苄青霉素的LB平板上，温育过夜。挑取菌落并在含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基上生长。由挑取的菌落小量制备DNA，并通过以EcoRI单独消化或FseI和AscI联合消化以及随后的琼脂糖凝胶电泳筛选人类zcytor17lig插入物。进行正确pMT-人类zcytor17lig的大量制备。制备含5′和3′侧翼序列、MT-1启动子、大鼠胰岛素II内含子、人类zcytor17lig cDNA及hGH poly A序列的SalI片段，用以微注射到受精的鼠卵母细胞中。微注射以及转基因小鼠的生产如Hogan，B.等Manipulating the Mouse Embryo，第二版，冷泉港实验室出版社，纽约，1994中所述进行。
B.用以从淋巴特异性EμLCK启动子表达人类zcytor17lig的构建体
设计寡核苷酸产生含保守Kozak序列和人类zcytor17lig编码区的PCR片段。这些寡核苷酸被设计在5′端具有FseI位点且在3′端具有AscI位点，以帮助克隆到淋巴特异性转基因载体pKF051中。
PCR反应用大约200ng人类zcytor17lig模板(SEQ ID NO：1)和设计用于扩增zcytor17lig全长或活性部分的寡核苷酸进行。PCR反应利用本领域公知的方法实施。分离的正确大小的DNA片段用FseI和AscI(Boerhinger-Mannheim)消化，乙醇沉淀并连接到事先由FseI和AscI消化的pKF051中。pKF051转基因载体来源于p1026X(Iritani，B.M.等，EMBO J. 16：7019-31，1997)，并含有T细胞特异性lck近位启动子、B/T细胞特异性免疫球蛋白μ重链增强子、用以插入目的克隆的多聚接头以及突变的编码失活的生长激素蛋白的hGH基因(提供3′内含子和多聚腺苷酰化信号)。
将大约1μl各连接反应物电穿孔、涂板、挑取克隆并如上所述通过限制性消化筛选人类zcytor17lig插入物。正确的pKF051-zcytor17lig克隆通过测序验证，并进行该克隆的大量制备。制备含lck近位启动子和免疫球蛋白μ增强子(EμLCK)、zcytor17ligcDNA及突变的hGH基因的NotI片段，用以微注射到受精的小鼠卵母细胞中。
C.用以从EF1α启动子表达小鼠zcytor17lig的构建体
利用引物ZC41，498(SEQ ID NO：86)和ZC41，496(SEQ ID NO：87)对小鼠睾丸cDNA文库模板进行PCR。根据制造商的建议，使用pfu turbo聚合酶(Stratagene)，PCR反应在有或无10％DMSO的大约50μl体积中可成功进行；并附加应用使用50s热启动的蜡热启动(MolecularBioproducts，Inc.San Diego，CA)。PCR热循环以单个循环的94℃ 4分钟；接着40个循环的94℃：30秒、48℃：30秒、72℃：50秒；附加终了的72℃延伸7分钟实施。收集两个PCR反应物，并根据制造商的建议利用低溶点琼脂糖和Gelase琼脂糖消化酶(Epicenter，Inc.Madison，WI)纯化。
DNA测序的PCR产物揭示了鼠zcytor17 cDNA序列(SEQ ID NO：90)，其包括与SEQ ID NO：10相同的ORF，证实SEQ ID NO：10编码小鼠zcytor17lig多肽。然后利用PCR引物ZC41583(SEQ ID NO：88)和ZC41584(SEQ ID NO：89)向mcytor17lig开放读框和终止密码子(SEQ IDNO：92)添加FseI和AscI限制性位点和部分Kozak序列。利用Robocycler 40热循环仪(Stratagene)进行退火温度的温度梯度，并如下循环。Pfu turbo聚合酶(Stratagene)如上所述应用，但仅在10％DMSO中。循环以单个循环的94℃ 4分钟；接着20个循环的94℃：30秒、65℃到51℃的梯度：30秒、72℃：1分钟；以及单次的72℃延伸7分钟。该第二热循环反应的模板是1μl上文最初凝胶纯化的mcytor17lig PCR产物。收集所得的来自三个最低温度反应的PCR产物，并利用上文所述的琼脂酶(Epicenter)法进行凝胶纯化。纯化片段以FseI和AscI消化并连接到经修饰在其克隆位点具有FseI和AscI位点的pZP7X载体中。这被送交测序以确认正确的序列。克隆的鼠cDNA序列表示在SEQ ID NO：90中，并且相应的多肽序列显示在SEQ ID NO：91(其与SEQ ID NO：11相同)中。
分离的正确大小的DNA片段用FseI和AscI(Boerhinger-Mannheim)消化，并亚克隆到事先由FseI和AscI消化的含EF1α启动子的质粒中。进行正确EF1α小鼠zcytor17lig的大量制备。所述表达盒含EF1α启动子(具有缺失的FseI位点)、EF1α内含子、SUR IRES样位点以易化表达、5′端侧接大鼠胰岛素II位点的多聚接头(其添加用以插入目的克隆的FseI PmeI AscI位点)以及人类生长激素(hGH)poly A序列。制备含EF1α启动子表达盒及小鼠zcytor17lig的7.5kb NotI片段，用以微注射到受精的鼠卵母细胞中。EF1α质粒由Laboratoire deDifferenciation Cellulaire的Louis-Marie处获得，如在Taboit-Dameron等，1999，Transgenic Research 8：223-235中所述。
D.用以从淋巴特异性EμLCK启动子表达小鼠zcytor17lig的构建体
设计寡核苷酸产生含保守Kozak序列和小鼠zcytor17lig编码区的PCR片段。这些寡核苷酸被设计在5′端具有FseI位点且在3′端具有AscI位点，以帮助克隆到pKF051中(见上文实施例22B)。
分离的正确大小的EF1α构建体中所用的zcytor17lig DNA片段用FseI和AscI(Boerhinger-Mannheim)消化，并亚克隆到含pKF051的淋巴特异性转基因载体质粒中。所述pKF051转基因载体来源于p1026X(Iritani，B.M.，等，EMBO J.16：7019-31，1997)，并含有T细胞特异性lck近位启动子、B/T细胞特异性免疫球蛋白μ重链增强子、用以插入目的克隆的多聚接头以及突变的编码失活的生长激素蛋白的hGH基因(提供3′内含子和多聚腺苷酰化信号)。制备含lck近位启动子和免疫球蛋白μ增强子(EμLCK)、小鼠zcytor17lig cDNA及突变的hGH基因的6.5kb NotI片段，用以微注射到受精的鼠卵母细胞中(实施例41)。
实施例23
表达zcytor17lig-CEE的哺乳动物表达载体的构建
A.zCytor17Lig-CEE/pZMP21的构建
通过同源重组构建含有编码人类zCytor17lig的全部或部分多核苷酸的表达质粒。该质粒被称之为zCytor17Lig-CEE/pZMP21。
zCytor17Lig-CEE/pZMP21的构建通过利用PCR扩增产生zCytor17Lig-CEE片段(SEQ ID NO：95)(其相应的氨基酸序列显示在SEQID NO：96中)完成。用于产生zCytor17Lig-CEE片段的DNA模板是zCytor17Lig/pZP7nx。用于产生zCytor17Lig-CEE片段的引物是：(1)ZC41607(SEQ ID NO：97)(正义序列)，其包括自5′到3′端的：28bp的载体侧翼序列(插入物5′端)和对应于zCytor17Lig 5′序列的21bp；及(2)ZC41605(SEQ ID NO：98)(反义序列)，其包括自5′到3′端的：37bp的载体侧翼序列(插入物3′端)、3bp的终止密码子、编码C-末端EE标签的21bp以及对应于zCytor17Lig序列3′端的21bp。由上述PCR扩增得到的片段是添加了C-末端EE标签的一拷贝模板zCytor17Lig，产生终产物zCytor17Lig-CEE。
PCR反应如下进行：对于100μl终体积添加：10μl具有15mM MgCl(Gibco)的10×Taq聚合酶反应缓冲液、1μl Taq DNA聚合酶(5单位/μl，Gibco)、3μl 10mM dNTP、78μl dH2O、3μl 20pmol/μl的引物ZC41607(SEQ ID NO：97)贮液、3μl 20pmol/μl的引物ZC41605(SEQ ID NO：98)贮液以及2μl 0.13μg/μl的zCytor17lig模板DNA贮液。向混合物中添加体积等于50μl的矿物油。反应于94℃加热5分钟，跟着是35个循环的94℃ 1分；55℃ 2分；72℃ 3分；接着于72℃进行10分钟延伸并维持于4℃直至收集反应物。
质粒pZMP21用BglII酶限制性消化，用QiaQuick PCR纯化试剂盒(Qiagen)使用微量离心方案纯化，并用来与PCR片段重组。质粒pZMP21由pZMP20构建，后者由pZP9(保藏于美国模式培养物保藏中心，10801University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209，并指定为No.98668)构建，具有取自pRS316(保藏于美国模式培养物保藏中心，10801University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209，并指定为No.77145)的酵母遗传元件、来自脊髓灰质炎病毒的IRES元件以及CD8的胞外结构域，其在跨膜结构域的羧基末端被截短。PZMP21是含表达盒的哺乳动物表达载体，所述表达盒具有MPSV启动子、免疫球蛋白信号肽内含子、用以插入编码序列的多限制性位点、终止密码子和人类生长激素终止子。该质粒也具有大肠杆菌复制起点，以及具有SV40启动子、增强子和复制起点、DHFR基因及SV40终止子的哺乳动物选择性标记表达单元，以及在酿酒酵母(S.cerevisiae)中选择和复制所必需的URA3和CEN-ARS序列。
50μl感受态酵母细胞(酿酒酵母)独立地与100ng的切割质粒、5μl前述PCR混合物组合，并转移到0.2cm的电穿孔管中。酵母/DNA混合物于0.75kV(5kV/cm)、无穷大欧姆、25μF处电脉冲。各管添加600μl 1.2M山梨糖醇，并将酵母以一个100μl的小份和一个300μl的小份铺板到两个URA-D板上并于30℃温育。大约72小时后，将来自单个板的Ura+酵母转化株重悬于1ml H2O中，并简单旋转以沉淀酵母细胞。将细胞沉淀重悬于500μl裂解缓冲液(2％Triton X-100，1％SDS，100mM NaCl，10mM Tris，pH 8.0，1mM EDTA)中。将该500μl裂解混合物添加到含300μl酸洗600μm玻璃珠和300μl酚-氯仿的Eppendorf管中，以1分钟的间隔振荡2或3次，接着在Eppendorf离心机中以最大速度旋转5分钟。将300μl水相转移到新鲜管中，并用600μl 100％乙醇(EtOH)沉淀DNA，接着于4℃离心10分钟。然后用500μl 70％EtOH洗涤DNA沉淀，接着于4℃离心1分钟。将DNA沉淀重悬于30μl H2O中。
电感受态大肠杆菌细胞(MC1061)的转化用5μl酵母DNA制备物和50μl MC1061细胞进行。细胞在2.0kV，25μF和400欧姆(Ω)处电脉冲。电穿孔后，加入600μl SOC(2％Bacto胰蛋白胨(Difco，Detroit，MI)，0.5％酵母膏(Difco)，10mM NaCl，2.5mM KCl，10mM MgCl2，10mMMgSO4，20mM葡萄糖)。将电穿孔的大肠杆菌以200μl和50μl的小份涂板于两个LB AMP板(LB培养基(Lennox)，1.8％Bacto琼脂(Difco)，100mg/L氨苄青霉素)上。倒置板于37℃温育24小时。随机选择3个氨苄青霉素抗性菌落并送交插入物序列分析。利用Qiagen Maxi试剂盒(Qiagen)根据制造商的说明从测序确认的克隆中分离大规模质粒DNA。
B.人类zcytor17lig的哺乳动物表达
全长zCytor17Lig蛋白在转染了zCytor17Lig-CEE/pZMP21的BHK细胞(实施例23A)中生产。将BHK 570细胞(ATCC CRL-10314)铺板于T75组织培养瓶中，并使之在生长培养基(SL7V4，5％FBS，1％青霉素/链霉素)中于37℃，5％CO2中生长至大约50到70％的汇合。然后细胞通过脂质体介导的转染(利用LipofectamineTM；Life Technologies)在无血清(SF)培养基(SL7V4)中用zCytor17Lig-CEE/pZMP21转染。用SF培养基将质粒(16μg)稀释到1.5ml管中，终体积总计640μl。将35μl脂混合物与605μl SF培养基混合，并使所得的混合物在室温下温育大约15分钟。然后向DNA：脂混合物中添加5ml SF培养基。细胞用10ml PBS冲洗一次，倾去PBS，并加入DNA：脂混合物。细胞于37℃温育5小时，然后向各板中加入15ml培养基(SL7V4，5％FBS，1％青霉素/链霉素)。板于37℃温育过夜，并且第二天所述DNA：脂培养基混合物用选择培养(SL7V4，5％FBS，1％青霉素/链霉素，1μM氨甲蝶呤)替换。转染后大约10天，用胰蛋白酶消化来自T75转染瓶中的氨甲蝶呤抗性集落，收集细胞并铺板于T-162瓶中转移到大规模培养中。
实施例24
zcytor17可溶性受体在大肠杆菌中的表达
A.表达huzcytor17/MBP-6H融合多肽的表达载体pCMH01的构建
含在C-末端融合于麦芽糖结合蛋白(MBP)的编码zcytor17可溶性受体的多核苷酸的表达质粒通过同源重组构建。所述融合多肽含融合于本文所述任何zcytor17可溶性受体的大约388个氨基酸BMP部分的N-末端。zcytor17 cDNA片段(SEQ ID NO：4)利用PCR如本文所述分离。两个引物被用于在标准PCR反应中产生该zcytor17片段：(1)一个含有大约40bp的载体侧翼序列和与zcytor17氨基端相应的大约25bp，以及(2)另一个含有大约40bp与侧接载体序列相应的3′端和与zcytor17羧基端相应的大约25bp。100μl PCR反应物中的2μl在1.0％琼脂糖凝胶上用1×TBE缓冲液跑样用以分析，并观察到接近预期的片段。其余的PCR反应物与第二PCR管组合，并用400μl无水酒精沉淀。利用沉淀的DNA重组到SmaI切割的接纳载体pTAP170中，以产生编码MBP-zcytor17融合物的构建体，如下文所述。
质粒pTAP170来源于质粒pRS316和pMAL-c2。质粒pRS316是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)穿梭载体(Hieter P.和Sikorski，R.，Genetics 122：19-27，1989)。pMAL-C2(NEB)是大肠杆菌表达质粒。它携带驱动Ma1E(编码MBP的基因)的tac启动子，接着是His标签，凝血酶切割位点，克隆位点以及rrnB终止子。载体pTAP170利用酵母同源重组构建。100ng EcoR1切割的pMAL-c2与1μg Pvul切割的pRS316、1μg接头以及1μg Sca1/EcoR1切割的pRS316重组。所述接头由在PCR反应中组合在一起的寡核苷酸zc19，372(SEQ ID NO：157)(100pmole)：zc19，351(SEQ ID NO：158)(1pmole)：zc19，352(SEQID NO：159)(1pmole)以及zc19，371(SEQ ID NO：160)(100pmole)组成。条件如下：10个循环的94℃ 30秒，50℃ 30秒以及72℃ 30秒；接着4℃浸泡。PCR产物通过100％乙醇沉淀浓缩。
将100μl酵母细胞(酿酒酵母)与10μl含大约1μg人类zcytor17插入物和100ng SmaI消化的pTAP170载体的混合物组合，并转移到0.2cm的电穿孔管中。所述酵母/DNA混合物在0.75kV(5kV/cm)，无限大欧姆，25μF处电脉冲。向各管添加600μl 1.2M的山梨糖醇。然后将酵母以两个300μl的小份涂板于两个-URA D板上并于30℃温育。
大约48小时后，从单个平板挑取Ura+酵母转化株，分离DNA，并转化到电感受态大肠杆菌细胞(例如MC1061，Casadaban等，J.Mol. Biol. 138，179-207)中，并利用标准操作涂板于MM/CA+KAN 25μg/L板(Pryor和Leiting，Protein Expression and Purification 10：309-319，1997)上。细胞在具25μg/ml卡那霉素的MM/CA中于37℃振荡生长2小时。1ml培养物用1mM IPTG诱导。2到4小时后，将250μl各培养物与250μl酸洗玻璃珠以及具有5％ME和染料的250μl Thorner缓冲液(8M尿素，100mM Tris pH7.0，10％甘油，2mM EDTA，5％SDS)混合。将样品振荡1分钟，并加热至65℃ 10分钟。将20μl加样到4％-12％PAGE凝胶(NOVEX)上的每个泳道中。凝胶在1×MES缓冲液中跑样。阳性克隆被命名为pCMH01，并对其进行序列分析。
利用1μl测序DNA转化菌株BL21。细胞在2.0kV，25μF和400欧姆处电脉冲。电穿孔后，加入具有25μg/L卡那霉素的0.6ml MM/CA。细胞在MM/CA中生长并如上所述由ITPG诱导。培养阳性克隆，利用标准技术用于huzcytor17/MBP-6H融合蛋白的蛋白纯化。
B.从大肠杆菌发酵液中纯化huzcytor17/MBP-6H可溶性受体
除非另行指出，所有操作于4℃进行。利用如下操作纯化重组huzcytor17/MBP-6H可溶性受体多肽。利用标准分子生物学方法构建含pCMH01构建体且表达huzcytor17/MBP-6H可溶性受体多肽的大肠杆菌细胞，并培养在SuperBroth II(12g/L酪蛋白，24g/L酵母膏，11.4g/L磷酸二钾盐，1.7g/L磷酸单钾盐；Becton Dickenson，Cockeysville，MD)。收集所得细胞并于0.5％甘油中冷冻。20g冷冻细胞被用于蛋白纯化。
将融化的细胞重悬于500mL淀粉平衡缓冲液(20mM Tris，100mMNaCl，pH 8.0)中。利用弗氏压碎器破坏系统(Constant Systems Ltd.，Warwick，UK)于-7℃到-10℃的温度设置以及30K PSI裂解细胞。在经弗氏循环前后通过A600读数检验重悬细胞的破损度。裂解的细胞悬液以10,000G 30分钟沉淀。从碎片沉淀中收集上清用于蛋白纯化。
将25ml直链淀粉树脂(New England Biolabs，Beverly，MA)倾倒在Bio-Rad，2.5cm D×10cm H玻璃柱上。填充柱子并以10倍柱体积(CV)的淀粉平衡缓冲液通过重力平衡。将收集的细胞上清分批加样到直链淀粉树脂上，摇动过夜。使上样的树脂返回到玻璃柱中，用10CV的淀粉平衡缓冲液洗涤，并用约2CV的淀粉洗脱缓冲液(淀粉平衡缓冲液，10mM麦芽糖，Fluka Biochemical，瑞士)通过重力洗脱。在洗脱特性内收集10个5ml的级分，并测定280和320nM的吸光度。直链淀粉树脂用1CV的蒸馏水、5CV的0.1％(w/v)SDS(Sigma)、5CV的蒸馏水、5CV的淀粉平衡缓冲液以及最终1CV的淀粉贮存缓冲液(淀粉平衡缓冲液，0.02％(w/v)叠氮化钠)再生。再生的树脂4℃贮存。
收集目的洗脱谱级分，并在10K透析室(Slide-A-Lyzer，PierceImmunochemical)中对更换4次的4L PBS pH 7.4(Sigma)在为期8小时的时间内透析。透析后，收集的物质代表了纯化的huzcytor17/MBP-6H多肽。将纯化的huzcytor17/MBP-6H多肽过滤灭菌，并通过SDS-PAGE考马斯亮蓝染色进行适当的分子量产物的分析。huzcytor17/MBP-6H多肽的浓度通过BCA分析确定为0.76mg/ml。
纯化的huzcytor17/MBP-6H多肽经适当配制用以免疫兔子，并送交R & R Research and Development(Stanwood，WA)用于多克隆抗体生产(下文实施例25)。
实施例25
人类zcytor17可溶性受体的多克隆抗体
A.制备和纯化
多克隆抗体通过用纯化的重组蛋白huzcytor17/MBP-6H(实施例24)免疫2只雌性新西兰白兔制备。兔子分别给予初始的腹膜内注射(IP)200μg辅以完全弗氏佐剂的纯化蛋白，接着每三周加强IP注射100μg辅以不完全弗氏佐剂的蛋白。给予第二次加强注射(总计3次注射)后7到10天，对动物放血，并收集血清。然后动物每三周加强并放血。
huzcytor17/MBP-6H特异性兔血清利用CNBr-SEPHAROSE 4B蛋白柱(Pharmacia LKB)进行抗-MBP抗体的预吸附，该柱以每克CNBr-SEPHAROSE使用10mg非特异性纯化的重组MBP-融合蛋白制备。huzcytor17/MBP-6H-特异性多克隆抗体从预吸附的兔血清中利用CNBr-SEPHAROSE 4B蛋白柱进行(Pharmacia LKB)亲和纯化，该柱使用10mg特异性抗原纯化的重组蛋白huzcytor17/MBP-6H制备。纯化后，多克隆抗体用更换4次的20倍于抗体体积的PBS在为期至少8小时的时间内透析。利用500ng/ml纯化的重组蛋白huzcytor17/MBP-6H作为抗体靶通过ELISA描述Huzcytor17-特异性抗体的特征。兔抗-huzcytor17/MBP-6H亲和纯化的抗体对其特异性纯化的重组抗原huzcytor17/MBP-6H的检测下限(LLD)为500pg/ml。
B.兔抗-人ZcytoR17 MBP-6H抗体的SDS-PAGE和蛋白质印迹分析
兔抗-人ZcytoR17 MBP-6H抗体由考马斯亮蓝染色法的SDS-PAGE(NuPage 4-12％，Invitrogen，Carlsbad，CA)以及使用羊抗-兔IgG-HRP的蛋白质印迹测试。纯化蛋白(200-25ng)或含zcytor17的条件培养基都利用Invitrogen Novex′s Xcell II Mini-cell电泳，并根据仪器手册中提供的说明，在室温下利用Novex′s Xcell II印迹模具搅动着将其转移到硝化纤维素膜(0.2mm；Invitrogen，Carlsbad，CA)上。转移于300mA下在含25mM Tris碱、200mM甘氨酸和20％甲醇的缓冲液中操作1小时。然后滤膜用Western A缓冲液(自制，50mM Tris，pH 7.4，5mM EDTA，pH 8.0，0.05％ Igepal CA-630，150mM NaCl以及0.25％白明胶)于4℃轻摇过夜封闭。快速漂洗硝化纤维素膜，然后在WesternA缓冲液中加入兔抗-人zcytoR17 MBP-6H(1∶1000)。印迹室温下轻摇温育1.5小时。印迹在Western A中洗涤三次，每次5分钟，然后在Western A缓冲液中加入羊抗-兔IgG HRP抗体(1∶1000)。印迹室温下轻摇温育1.25小时。印迹在Western A中洗涤三次，每次5分钟，然后迅速在H2O中漂洗。印迹用商业上可获得的化学发光底物试剂(ECLWestern印迹检测试剂1和2以1∶1混合；试剂获自AmershamPharmacia Biotech，Buckinghamshire，英国)显影，并使印迹暴露于X-射线胶片长达15分钟。
兔抗-人zcytoR17 MBP-6H能够检测存在于条件培养基中的人类zcytor17以及zcytoR17纯化蛋白在还原条件下作为120kDa的条带。
实施例26
使用PCR确定小鼠zcytor17在组织面板的组织分布
利用PCR对来自鼠组织的cDNA面板筛选小鼠zcytor17的表达。该面板是自制的，并含有94个marathon cDNA，并且来自多种正常和癌变鼠组织及细胞系的cDNA样品显示在下文表6中。cDNA来自自制文库，或者marathon cDNA来自自制RNA制备物、Clontech RNA或InvitrogenRNA。小鼠marathon cDNA利用marathon-ReadyTM试剂盒(Clontech，PaloAlt o，CA)制备，并用小鼠转铁蛋白受体引物ZC10，651(SEQ ID NO：46)和ZC10，565(SEQ ID NO：47)测试质量，然后根据转铁蛋白条带的强度稀释。为确保面板中扩增的文库样品的质量，进行质量控制(QC)的3种测试：(1)为评估用于文库的RNA质量，通过个体cDNA文库载体序列特异性的载体寡核苷酸的PCR测试自制cDNA的平均插入物大小；(2)面板样品中cDNA浓度的标准化，是使用5′载体寡核苷酸：ZC14，063(SEQID NO：48)和3′α微管蛋白特异性寡核苷酸引物ZC17，574(SEQ ID NO：49)或3′G3PDH特异性寡核苷酸引物ZC17，600(SEQ ID NO：50)利用标准PCR方法扩增全长α微管蛋白或G3PDH cDNA实现的；以及(3)将样品送交测序以检验可能的核糖体或染色体DNA污染。面板设置在96-孔型板中，包括小鼠基因组DNA(Clontech，Palo Alto，CA)阳性对照样品。各孔含大约0.2-100pg/μl cDNA。PCR利用寡核苷酸ZC38，065(SEQID NO：51)和ZC38，068(SEQ ID NO：52)、TaKaRa Ex TaqTM(TAKARA ShuzoCo LTD，Biomedicals Group，Japan)以及Rediload染料(ResearchGenetics，Inc.，Huntsville，AL)建立。扩增如下进行：1个循环的94℃ 5分；5个循环的94℃ 30秒，68℃30秒；35个循环的94℃ 30秒，56℃ 30秒以及72℃ 30秒，接着1个循环的72℃ 5分钟。使用4％琼脂糖凝胶对大约10μl PCR反应产物进行标准琼脂糖凝胶电泳。在脑、CD90+细胞、树突细胞、胚胎、MEWt#2、Tuvak-前列腺细胞系、唾腺、皮肤及睾丸中观察到正确推断的DNA片段大小。
切下皮肤和睾丸的DNA片段并利用凝胶提取试剂盒(Qiagen，Chatsworth，CA)根据制造商的说明纯化。片段经测序确认以证明它们的确是小鼠zcytor17。
表6
  组织/细胞系  #样品   组织/细胞系  #样品
  229   1
  7F2   1
  扩增的脂肪细胞   1
  aTC1.9   1
  脑   4
  CCC4   1
  扩增的CD90+   1
  OC10B   1
  组织/细胞系  #样品   组织/细胞系  #样品
  树突细胞   1
  胚胎   1
  心脏   2
  肾脏   3
  肝   2
  肺   2
  MEWt#2   1
  P388D1   1
  胰腺   1
  胎盘   2
  Jakotay-前列腺细胞系   1
  Nelix-前列腺细胞系   1
  Paris-前列腺细胞系   1
  Torres-前列腺细胞系   1
  Tuvak-前列腺细胞系   1
  唾腺   2
  骨骼肌   1
  皮肤   2
  小肠   1
  组织/细胞系  #样品   组织/细胞系  #样品
  平滑肌   2
  脾   2
  胃   1
  睾丸   3
  胸腺   1
实施例27
使用实时定量RT/PCR的人类Zcytor17在各种组织中的表达
A.用于人类Zcytor17、OSMRbeta和Zcytor17lig常规及定量 RT-PCR的引物和探针
实时定量RT-PCR使用先前已有描述的ABI PRISM 7900序列检测系统(PE Applied Biosystems，Inc.，Foster City，CA)(参见Heid，C.A.等，Genome Research 6：986-994，1996；Gibson，U.E.M.等，Genome Research 6：995-1001，1996；Sundaresan，S.等，Endocrinology 139：4756-4764，1998)。该方法合并使用了含报告和淬灭荧光两种染料的基因特异性探针。当探针完整时，由于临近于淬灭染料，报告染料的发射为负。在使用另外的基因特异性正向和反向引物进行PCR延伸期间，探针由Taq聚合酶的5′核酸酶活性切割，这使得报告染料自探针释放，导致荧光发射的增加。
用于人类Zcytor17、OSMRbeta和Zcytor17lig表达实时定量RT-PCR分析的引物和探针使用引物设计软件引物快车(Primer ExpressTM)(PEApplied Biosystems，Foster City，CA)设计。设计人类Zcytor17引物跨越内含子-外显子接点，以消除可能的基因组DNA的扩增。正向引物ZC37，877(SEQ ID NO：53)和反向引物ZC37，876(SEQ ID NO：54)以200nM的浓度用于PCR反应合成73bp的产物。相应的Zcytor17
Figure G2009102637047D01421
探针命名为ZC37，776(SEQ ID NO：55)，由PE AppliedBiosystems合成并标记，并以200nM的浓度用于各PCR反应。ZC37，776(SEQ ID NO：55)探针在5′端用报告荧光染料(6-羧基-荧光素)(FAM)(PE Applied Biosystems)标记，而3′端用荧光淬灭染料(6-羧基-四甲基-罗丹明)(TAMRA)(Epoch Biosciences，Bothell，WA)标记。
设计人类OSMRbeta引物跨越内含子-外显子接点，以消除可能的基因组DNA的扩增。正向引物ZC43，891(SEQ ID NO：122)和反向引物ZC43，900(SEQ ID NO：123)以200nM的浓度用于PCR反应(下文)。相应的OSMRbeta探针命名为ZC43，896(SEQ ID NO：124)，由PE Applied Biosystems合成并标记，并以200nM的浓度用于各PCR反应。ZC43，896(SEQ ID NO：124)探针在5′端用报告荧光染料(6-羧基-荧光素)(FAM)(PE Applied Biosystems)标记，而3′端用非荧光淬灭染料(ECLIPSE)(Epoch Biosciences)标记。
设计人类Zcytor17lig引物跨越内含子-外显子接点，以消除可能的基因组DNA的扩增。正向引物ZC43，280(SEQ ID NO：125)和反向引物ZC43，281(SEQ ID NO：126)以大约200nM的浓度用于PCR反应(下文)。相应的Zcytor17lig
Figure G2009102637047D01423
探针命名为ZC43，275(SEQ ID NO：127)，由PE Applied Biosystems合成并标记，并以200nM的浓度用于各PCR反应。ZC43，275(SEQ ID NO：127)探针在5′端用报告荧光染料(6-羧基-荧光素)(FAM)(PE Applied Biosystems)标记，而3′端用非荧光淬灭染料(ECLIPSE)(Epoch Biosciences)标记。
作为对照测试被测试的RNA样品完整性和质量，利用由PE AppliedBiosystems定购的(rRNA试剂盒)或者自行设计的(GUS)引物和探针集合对所有的RNA样品筛选rRNA或GUS。rRNA试剂盒含正向引物(SEQ IDNO：56)、rRNA反向引物(SEQ ID NO：57)以及rRNA
Figure G2009102637047D01431
探针(SEQID NO：58)。rRNA探针在5′端用报告荧光染料VIC(PE AppliedBiosystems)标记，而3′端用荧光淬灭染料TAMRA(PE AppliedBiosystems)标记。GUS引物和探针自制产生，并分别以200nM和100nM的浓度用于各PCR反应。正向引物为ZC40，574(SEQ ID NO：128)而反向引物为ZC40，575(SEQ ID NO：129)。GUS探针ZC43，017(SEQ ID NO：130)在5′端用报告荧光染料(Yakima-Yellow)(Epoch Biosciences)标记，而3′端用非荧光淬灭染料(ECLIPSE)(Epoch Biosciences)标记。rRNA和GUS结果也起内源性对照的作用，并允许标准化测试样品中观察到的Zcytor17 mRNA表达结果。
对于常规的非定量RT-PCR，利用引物设计软件引物快车(PrimerExpressTM)(PE Applied Biosystems，Foster City，CA)设计引物。人类zcytor17引物产生大约1000碱基对的产物并且如下：正向引物ZC28，917(SEQ ID NO：83)和反向引物ZC28，480(SEQ ID NO：131)。人类OSMRbeta引物产生202碱基对的产物并且如下：正向引物ZC41，653(SEQ ID NO：132)和反向引物ZC41，655(SEQ ID NO：133)。人类Zcytor17lig引物产生305碱基对的产物并且如下：正向引物ZC41，703(SEQ ID NO：134)和反向引物ZC41，704(SEQ ID NO：135)。
B.用于小鼠Zcytor17、OSMRbeta和Zcytor17lig常规及定量RT-PCR的引物和探针
用于鼠Zcytor17、OSMRbeta和Zcytor17lig表达实时定量RT-PCR分析的引物和探针使用引物设计软件引物快车(Primer ExpressTM)(PEApplied Biosystems，Foster City，CA)设计。设计鼠Zcytor17引物跨越内含子-外显子接点，以消除可能的基因组DNA的扩增。正向引物ZC43，272(SEQ ID NO：136)和反向引物ZC43，273(SEQ ID NO：137)以300nM的浓度用于PCR反应(下文)。相应的Zcytor17
Figure G2009102637047D01432
探针命名为ZC43，478(SEQ ID NO：138)，由PE Applied Biosystems合成并标记。ZC43，478(SEQ ID NO：138)探针在5′端用报告荧光染料(6-羧基-荧光素)(FAM)(PE Applied Biosystems)标记，而3′端用荧光淬灭染料(6-羧基-四甲基-罗丹明)(TAMRA)(EpochBiosciences，Bothell，WA)标记。ZC43，478(SEQ ID NO：138)探针以100nM的浓度用于PCR反应。
设计鼠Zcytor17lig引物跨越内含子-外显子接点，以消除可能的基因组DNA的扩增。正向引物ZC43，278(SEQ ID NO：139)和反向引物ZC43，279(SEQ ID NO：140)以500nM的浓度用于PCR反应。相应的Zcytor17lig
Figure G2009102637047D01441
探针命名为ZC43，276(SEQ ID NO：141)，由PEApplied Biosystems合成并标记。ZC43，478(SEQ ID NO：138)探针在5′端用报告荧光染料(6-羧基-荧光素)(FAM)(PE Applied Biosystems)标记，而3′端用非荧光淬灭染料(ECLIPSE)(Epoch Biosciences)标记。ZC43，276(SEQ ID NO：141)探针以200nM的浓度用于PCR反应(下文)。
设计鼠OSMRbeta引物跨越内含子-外显子接点，以消除可能的基因组DNA的扩增。正向引物ZC43，045(SEQ ID NO：142)和反向引物ZC43，046(SEQ ID NO：143)以300nM的浓度用于PCR反应。相应的OSMRbeta
Figure G2009102637047D01442
探针命名为ZC43，141(SEQ ID NO：144)，由EpochBiosciences合成并标记。ZC43，141(SEQ ID NO：144)探针在5′端用报告荧光染料(6-羧基-荧光素)(FAM)(PE Applied Biosystems)标记，而3′端用非荧光淬灭染料(ECLIPSE)(Epoch Biosciences)标记。ZC43,141(SEQ ID NO：144)探针以100nM的浓度用于PCR反应(下文)。
作为对照测试被测试的RNA样品完整性和质量，利用由引物设计程序引物快车(Primer ExpressTM)(PE Applied Biosystems，Foster City，CA)设计的引物和探针对所有的RNA样品筛选鼠GUS或转铁蛋白受体。鼠GUS引物如下：正向引物ZC43，004(SEQ ID NO：145)、反向引物ZC43，005(SEQ ID NO：146)以及探针ZC43，018(SEQ ID NO：147)。鼠GUS探针ZC43，018(SEQ ID NO：147)在5′端用报告荧光染料Yakima-Yellow(Epoch Biosciences)标记，而3′端用非荧光淬灭染料ECLIPSE(Epoch Biosciences)标记。鼠GUS引物以300nM用于PCR反应，而探针ZC43，018(SEQ ID NO：147)以100nM应用。在某些情况下，利用鼠转铁蛋白受体替代GUS作为内源性对照。转铁蛋白受体正向引物ZC40，269(SEQ ID NO：148)和反向引物ZC40，268(SEQ ID NO：149)以300nM应用。转铁蛋白受体探针ZC40，298(SEQ ID NO：150)以100nM用于PCR，并且在5′端用报告荧光染料VIC(PE Applied Biosystems)标记，而3′端用荧光淬灭染料(TAMRA)(PE Applied Biosystems)标记。鼠GUS和转铁蛋白受体结果也起内源性对照的作用，并允许标准化测试样品中观察到的Zcytor17、OSMRbeta和Zcytor17lig mRNA表达结果。
对于常规的半定量RT-PCR，利用引物设计软件引物快车(PrimerExpressTM)(PE Applied Biosystems，Foster City，CA)设计引物。鼠zcytor17引物产生276碱基对的产物并且如下：正向引物ZC43，140(SEQ ID NO：151)和反向引物ZC43，139(SEQ ID NO：152)。鼠OSMRbeta引物产生575碱基对的产物并且如下：正向引物ZC41，608(SEQ ID NO：153)和反向引物ZC41，609(SEQ ID NO：154)。鼠Zcytor17lig引物产生657碱基对的产物并且如下：正向引物ZC41，502(SEQ ID NO：155)和反向引物ZC41，500(SEQ ID NO：156)。
C.实时定量RT-PCR和常规半定量RT-PCR的方案
Zcytor17、OSMRbeta和Zcytor17lig mRNA的相对水平利用一步RT-PCR法(PE Applied Biosystems)通过分析总RNA样品确定。通过标准方法分离来自Zcytor17转染的以及OSMRbeta转染的BAF细胞(人类)或BHK细胞(鼠)的总RNA，并用以产生定量Zcytor17和OSMRbeta的标准曲线。所述曲线包括100-0.01ng/μl范围内10倍系列稀释，其中各标准曲线点重复三份分析。类似的，对于Zcytor17lig，利用激活的CD4+T细胞RNA(早先证明产生Zcytor17lig)产生在相同的100-0.01ng/μl范围内的标准曲线。来自人类或鼠细胞的总RNA重复三份分析人或鼠Zcytor17、OSMRbeta和Zcytor17lig转录本水平以及以下内源性对照基因之一：rRNA、GUS或转铁蛋白受体。在10μl的总体积中，对各RNA样品进行一步RT-PCR反应，包含：处于预配制的含内部对照染料(ROX)(羧基-x-罗丹明)和Thermo-
Figure G2009102637047D01451
DNA聚合酶(Abgene，Surrey，UK)的2×主混合物中的大约50-100ng总RNA；合适的目的基因引物(见本实施例A和B部分)；合适的探针(浓度参见A和B部分)；逆转录酶(50U/μl)(PE Applied Biosystems)以及适当体积的不含RNase的水。PCR热循环条件如下：初始的反转录(RT)步骤：1个循环的48℃ 30分钟；接着是Thermo-
Figure G2009102637047D01462
酶活化步骤：1个循环的95℃ 10分钟；接着是40个循环的扩增：95℃ 15秒和60℃ 1分钟。相对的Zcytor17、OSMRbeta和Zcytor17lig RNA水平利用制造商PEBiosystems(User Bulletin#2：ABI Prism 7700 Sequence DetectionSystem，Relative Quantitation of Gene Expression，December11，1997)所描述的标准曲线法确定。rRNA、GUS或转铁蛋白受体的测量被用来标准化目的基因的水平。
半定量RT-PCR反应利用′Superscript One-Step RT-PCR Systemwith Platinum Taq′(Invitrogen，Carlsbad，CA)。每个25μl的反应包括以下：12.5μl 2×反应缓冲液、0.5μl(20pmol/μl)正向引物、0.5μl(20pmol/μl)反向引物、0.4μl RT/Taq聚合酶混合物、5.0μlRediload凝胶上样缓冲液(Invitrogen)、5.1μl不含RNase的水以及1.0μl总RNA(100ng/μl)。扩增如下进行：1个循环的45℃ 30分钟，接着是35-38个循环的94℃ 20秒；变化的退火温度(见下文表7)20秒；72℃ 45秒；然后以72℃ 5分钟的终了延伸结束。使用2％琼脂糖凝胶对8-10μl PCR反应产物进行标准琼脂糖凝胶电泳。
表7
  鼠Zcytor17   58℃退火温度
  鼠OSMRbeta   60℃退火温度
  鼠Zcytor17lig   52℃退火温度
  人Zcytor17   55℃退火温度
  人OSMRbeta   59℃退火温度
  人Zcytor17lig   59℃退火温度
D.从人和鼠PBMC亚群和细胞系中分离RNA
从若干不计名供体抽血，并利用标准Ficoll梯度方法学分离外周血单个核细胞(PBMC)。然后利用单核细胞分离试剂盒和磁细胞分离系统(Miltenyi Biotec，Auburn，CA)分离单核细胞。然后将单核细胞涂板于超低粘附24-孔板的无内毒素培养基中。它们要么未刺激，要么用重组人IFNg(R & D Systems Inc.)以10ng/ml处理。在24和48小时收集细胞。以相似的方式，利用来自Miltenyi Biotec的抗-CD4和抗-CD8磁珠从PBMC中分离CD4+和CD8+T细胞。细胞然后在包被有0.5μg/ml抗-CD3抗体的组织培养板中在含5μg/ml抗-CD28抗体的培养基中激活4或16小时。也利用Miltenyi的抗-CD56包被的磁珠从PBMC中分离了NK细胞。某些NK细胞在零时间点收集RNA，而其它的则涂板于含乙酸肉豆蔻酸佛波醇(PMA)(5ng/ml)和离子霉素(0.5μg/ml)的培养基中24小时。另外，在其静息或活化状态收集多种人类单核细胞样细胞系U937、THP-1及HL-60。U937细胞用PMA(10ng/ml)激活过夜。HL-60用PMA(10ng/ml)激活过夜或用IFNg(10ng/ml)激活72或96小时，以驱使它们走单核细胞路径。THP-1细胞用LPS(10ng/ml)和IFNg(10ng/ml)联合激活过夜。利用RNeasy MidiprepTM试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)按制造商的说明从所有原代细胞中制备RNA。利用DNA-FreeTM试剂盒(Ambion，Inc.，Austin，TX)除去携带污染的DNA。RNA浓度利用标准分光光度法测定而RNA质量利用Bioanalyzer 2100(Agilent Technologies，Palo Alto，CA)测定。
鼠T细胞RNA利用本领域熟知的许多方法收集。原代脾CD4+和CD8+T细胞利用抗体包被的磁珠和来自Miltenyi Biotec的磁细胞分离系统从C57BI/6小鼠脾脏中分离。CD4+和CD8+T细胞然后通过在包被有抗-CD3抗体(500ng/ml)的24-孔板中在含5μg/ml抗-CD28抗体的培养基中培养细胞激活。在0、4和16小时收集细胞RNA。类似的，分离CD4+T细胞并利用如下方案使之朝Th1或Th2表型倾斜。由于C57BI/6 T细胞已经倾斜于Th1方向，所需的仅仅是用0.5μg/ml PMA和10ng/ml离子霉素激活6小时。′Th2′倾斜通过将初生CD4+T细胞和2.5μg/ml抗-CD28、10ng/ml mIL-2(R & D Systems Inc.)及25ng/ml mIL-4(R &D Systems)铺板于包被有0.5μg/ml抗-CD3的板中获得。培养2天后，将细胞重悬于含10ng/ml mIL-2(R & D Systems)和25ng/ml mIL-4的培养基中。细胞再培养3天，然后用PMA和离子霉素激活6小时。
另外一组Th1和Th2倾斜的T细胞用T细胞受体转基因DO11.10T细胞系得到。将所有细胞涂板于抗-CD3和抗-CD28包被的板中。′Th1′细胞涂板于含mIL-12(1ng/ml)和抗-IL-4(10μg/ml)的培养基中。′Th2′细胞涂板于含mIL-4(10ng/ml)和抗-IFNg(10μg/ml)的培养基中。24小时后，向所有培养物给予mlL-2(10ng/ml)。再过两天后，更换细胞培养基，并添加含前述细胞因子的新培养基，并且细胞培养另外4天，之后收集。
所有的鼠T细胞RNA利用RNeasy MidiprepTM试剂盒(Qiagen)制备，并利用来自Ambion的DNA-freeTM试剂盒除去污染DNA。
E.从胰腺炎和过敏性肠疾病的鼠模型中分离RNA
为诱发类似于人类过敏性肠疾病(IBD)的情况，使用杂种小鼠株系C57BI6/129S6F1。将小鼠分成4组，平均每组6只小鼠。组1不给葡聚糖硫酸钠(DSS)，并于14天处死。组2在处死前接受2％DSS两天。组3在处死前接受2％DSS七天。组4接受2％DSS七天，然后使之恢复七天，并于14天处死。在处死当天，取出远结肠区，并置于RNAlaterTM(Ambion)中。结肠区利用标准技术匀浆，并利用RNeasyMidiprepTM试剂盒(Qiagen)分离RNA。污染DNA按制造商的说明通过DNA-freeTM(Ambion)处理除去。
在不同的研究中，通过雨蛙肽注射在雄性CD-1小鼠中诱发急性胰腺炎。将小鼠分成3组(n＝8只鼠/组)。组1的动物用介质(盐水)给予7次腹膜内注射(每小时注射1次)，然后在首次注射后12和24小时处死。组2和3以6小时50μg/kg/小时的剂量用雨蛙肽(Sigma)(Catalog#C-9026)给予7次腹膜内注射(每小时注射1次)。组2在首次注射后12小时处死，而组3在首次注射后24小时处死。处死时取出胰腺并迅速冷冻用于RNA分离。组织匀浆，并利用RNeasyMidipreTM试剂盒分离RNA。
又在另一个研究中，产生鼠Zcytor17lig转基因小鼠并观察表型变化(见实施例41)。在许多转基因小鼠中观察到竖毛和脱毛。处死4只转基因小鼠，并从正常和无毛区取皮肤样品，迅速冷冻并用于稍后的RNA分离。同样收集两个非转基因对照小鼠的皮肤切片。将皮肤样品匀浆，然后用蛋白酶K(Qiagen)(Catalog#19133)于60℃消化20分钟。然后利用RNeasy MidiprepTM试剂盒根据制造商的说明分离RNA。利用来自Ambion的DNA-freeTM试剂盒除去携带污染的DNA。
F.人类Zcytor17、OSMRbeta和Zcytor17lig定量和半定量RT-PCR 的结果
通过定量RT-PCR在四组处于静息态或以IFNg激活24或48小时的原代人类单核细胞中检测Zcytor17和OSMRbeta的表达。Zcytor17表达在未刺激的细胞中检测不到，但是用IFNg激活24小时后显著上升，并且在激活48小时后最高。在所有情况下，OSMRbeta检测不到。这些样品中未测Zcytor17lig。
在原代T细胞中，Zcytor17在静息的CD4+和CD8+亚型中都检测不到。不过，在4小时激活后，Zcytor17的表达在两个亚型中都上升，然后在16小时的时间点降至稍稍更低的水平。OSMRbeta在这些样品中检测不到。Zcytor17lig的表达利用半定量RT-PCR检测。在未刺激的CD4+和CD8+T细胞中未检测到表达。不过，在4小时激活后，检测到高水平的Zcytor17lig。该水平在16小时时间点多少有些下跌。
Zcytor17的表达未在NK细胞中检测。OSMRb在这些样品中检测不到。Zcytor17lig的表达在静息NK细胞中检测不到，然而激活的NK细胞产生微弱的信号，提示这些细胞在某些条件下可能产生Zcytor17lig。
在人类单核细胞样细胞系U937、THP-1和HL-60中，除了在激活的THP-1样品中检测到微弱信号之外，OSMRbeta的表达在所有静息和激活的样品中都检测不到。Zcytor17的表达在U937和THP-1静息细胞系中都很高，并且在激活后表现出强烈的上调。在U937中的表达是任何细胞类型中最高的。在HL-60中，Zcytor17在未刺激细胞中以中度水平表达，并在PMA刺激后下降。不过，当用IFNg刺激72和96小时后，HL-60中Zcytor17的表达显著上调。所有人类表达数据总结于下文表8。
表8
  原代人类单核细胞   激活状态   Zcytor17   OSMRbeta   Zcytor17lig
  人类单核细胞人类单核细胞人类单核细胞人类CD4+人类CD4+人类CD4+人类CD8+人类CD8+人类CD8+人类NK细胞人类NK细胞   未刺激IFNg激活24小时IFNg激活48小时未刺激激活4小时激活16小时未刺激激活4小时激活16小时未刺激激活24小时   -+++-+++-+++   ----------- -+++-+++-+
  原代人类单核细胞   激活状态   Zcytor17   OSMRbeta   Zcytor17lig
  U937U937THP-1THP-1HL-60HL-60HL-60HL-60   未刺激激活16小时未刺激激活16小时未刺激PMA激活16小时IFNg激活72小时IFNg激活96小时   +++++++++++++++++++   ---+----   --------
G.鼠Zcytor17、OSMRbeta和Zcytor17lig定量和半定量RT-PCR 的结果
在多种鼠T细胞群中检测了鼠Zcytor17、OSMRbeta和Zcytor17lig的表达水平，并且结果总结于下文表9。鼠Zcytor17的表达通过半定量RT-PCR测试，并且表明在静息和激活的原代CD4+T细胞中都处于低水平。在静息CD8+T细胞中检测到Zcytor17的表达，之后随着抗-CD3和抗-CD28抗体的激活在4小时和16小时的时间点上似乎都下跌。OSMRbeta的表达通过定量RT-PCR测量，并且表明表达于静息和激活的CD4+和CD8+T细胞中。在CD4+和CD8+T细胞中OSMRbeta的表达在4小时激活后上升，然后到16小时都返回到未刺激的水平。Zcytor17lig通过定量RT-PCR检测，并且表明在未刺激的CD4+T细胞中以极低的水平表达。不过，在4小时激活后，Zcytor17lig的表达显著上调，然后到16小时时间点时稍有下跌。在CD8+T细胞中，在未刺激的细胞中未检测到Zcytor17lig。在4小时时间点有些许Zcytor17lig表达，但是到16小时，表达水平跌回到检测水平以下。
在DO11.10T细胞中，在初生和Th2倾斜的细胞中而非Th1倾斜的细胞中检测到Zcytor17的表达。OSMRbeta在初生DO11.10T细胞中以低水平表达。OSMRbeta的表达水平在Th1倾斜的细胞中显著上升，并且在Th2倾斜的细胞中表达中度上升。Zcytor17lig在这些细胞中的表达证明主要是Th2倾斜的亚型。在Th1亚型中检测到低水平的表达，而在初生细胞中未检测到表达。这些结果总结于下文表9。
在朝Th1或Th2方向倾斜的原代CD4+T细胞中，未调查Zcyto17。在所有3个样品中检测到OSMRbeta的表达，最高水平见于Th2样品。与DO11.10的结果相似，在Th2倾斜亚型中检测到高水平的Zcytor17lig表达，在Th1亚型中检测到小量表达，而未刺激细胞中的水平检测不到。这些结果总结于下文表9。
表9
  鼠T细胞   Zcytor17   OSMRbeta   Zcytor17lig
  CD4+T细胞 未刺激CD4+T细胞 激活4小时CD4+T细胞 激活16小时CD8+T细胞 未刺激CD8+T细胞 激活4小时CD8+T细胞 激活16小时   +++++/--   ++++++++   +/-+++-+-
  DO11.10新生DO11.10Th1DO11.10Th2   +-+   ++++++   -+++
  CD4+T细胞 未刺激CD4+T细胞 倾斜于Th1CD4+T细胞 倾斜于Th2   +++++++   -++++
在Zcytor17lig转基因皮肤样品中，利用定量RT-PCR测定Zcytor17、OSMRbeta和Zcytor17lig的表达水平。Zcytor17表明以大约相等的水平存在于所有样品中。在非转基因对照动物中比转基因样品中具有显著更高水平的OSMRbeta表达。Zcytor17lig的表达在非转基因对照动物中检测不到，在转基因动物中具有中度至高水平的表达。结果总结于下文表10。
表10
 鼠Zcytor17lig转基因皮肤   皮肤表型   Zcytor17   OSMRbeta   Zcytor17lig
  野生型小鼠野生型小鼠转基因#1转基因#1转基因#2转基因#2转基因#3转基因#3转基因#4转基因#4   正常正常正常脱毛正常脱毛正常脱毛正常脱毛   ++++++++++   ++++++++++++++   --++++++++++++
在不同的实验中，通过定量RT-PCR测量遭受急性胰腺炎的小鼠胰腺中Zcytor17、OSMRbeta和Zcytor17lig的表达水平。Zcytor17的表达在所有样品中检测不到。观察到OSMRbeta的表达在正常对照样品中处于低水平(组1)，但在12小时时间点上表现出强烈的上调(组2)，而且在24小时时间点上处于稍稍更低的水平(组3)。Zcytor17lig的表达在对照动物中检测不到，但在两个雨蛙肽注射组中都表现出高水平。数据总结于下文表11。
表11
  胰腺炎模型   描述   Zcytor17   OSMRbeta   Zcytor17lig
  组1组2组3   正常对照注射后12小时注射后24小时   ---   ++++++   -++++
在另一个实验中，调查遭受DSS处理的小鼠远端结肠中Zcytor17和OSMRbeta的表达水平。在该鼠炎性肠疾病模型中，两基因的表达水平都通过定量RT-PCR测定，并总结于下文表12中。Zcytor17的表达水平随着疾病严重度而提高，在组1正常动物中具有低水平表达，而在组2和3中观察到提高的量。在组4的动物中，Zcytor17的水平返回到更为正常的水平。与Zcytor17的表达不同，OSMRbeta的水平在对照动物中最高，而在所有3个DSS处理组中水平实际上下降。
表12
  IBD模型   描述  SAC天数   Zcytor17   OSMRbeta
  组1组2组3组4   正常对照DSS-处理2天DSS-处理7天DSS-处理7天   142714   +++++++   +++++
实施例28
基于多组织第一链cDNA的RT-PCR分析的人类Zcytor17lig的组织分布 表达
利用商业上可获得的标准化多组织第一链cDNA面板(OriGeneTechnologies，Inc.Rockville，MD；BD Biosciences Clontech，PaloAlto，CA)调查zcytor17lig的基因表达。这些包括OriGene″人类组织快速扫描TM面板″(Cat.#CHSCA-101，含22种不同的组织、骨髓以及血浆血液白细胞)以及BD Biosciences Clontech″人类血液级分MTCTM面板″(Cat.#K1428-1，含9种不同的血液级分)。
PCR反应利用zcytor17lig特异性寡核苷酸引物ZC41，458(SEQ IDNO：60)和ZC41，457(SEQ ID NO：61)(产生139bp的产物)、以及ZC41，459(SEQ ID NO：62)和ZC41，460(SEQ ID NO：63)(其产生92bp的产物)、Qiagen HotStarTaq DNA聚合酶和缓冲液(Qiagen，Inc.，Valencia，CA)、dH2O以及RediLoadTM染料(Research Genetics，Inc.，Huntville，AL)建立。PCR循环仪条件如下：初始1个循环的95℃变性1分钟，35个循环的95℃变性45秒，53℃或56℃退火1分钟，以及72℃延伸1分15秒；接着是最终1个循环的72℃延伸7分钟。反应物通过在2％琼脂糖凝胶(EM Science，Gibbstown，NJ)上电泳分离，并通过溴乙锭染色观察。
利用OriGene″人类组织快速扫描TM面板″在下列成人组织中观察到正确大小的DNA片段：睾丸、血浆血白细胞(PBL)以及骨髓。
利用BD Biosciences Clontech″人类血液级分MTCTM面板″在下列人类血液级分中观察到正确大小的DNA片段：激活的单核细胞(B细胞和T细胞以及单核细胞)、激活的CD8+细胞(T-抑制细胞/细胞毒性)、激活的CD4+细胞(T-辅助细胞/诱导物)，并且微弱地在静息CD8+细胞中观察到。
实施例29
人类制瘤素M受体的克隆
制瘤素Mβ受体(OSMRbeta)为与IL12R-B2具有结构相似性的I型细胞因子受体。ZcytoR17与IL12R-B1具有结构相似性。对OSMRbeta和zcytor17进行测试，以观察它们能否在细胞因子信号传导复合体中作为亚基相互作用，以及它们能否一起作为zcytor17lig的信号传导受体或可溶性受体拮抗剂发挥作用。
为分离OSM-Rbeta，设计寡核苷酸PCR引物ZC39982(SEQ ID NO：64)和ZC39983(SEQ ID NO：65)以扩增人类制瘤素MβcDNA序列(SEQ ID NO：6)(Genbank登录号No.U60805；Mosley B，JBC 271卷，50期，1996年12月20日发行，32635-32643页)的全长编码区。
使用耐用的聚合酶Advantage II(Clonetech，PaloAlto，CA)对cDNA文库模板阵列进行PCR反应，以便鉴定cDNA的来源。所用的模板DNA来自扩增的cDNA质粒文库，各含5百万独立的cDNA克隆。反应按制造商的说明组配，使用400fmol/μl各寡核苷酸以及2-20ng/μl纯化的质粒文库DNA作为模板。CDNA文库来源于下列人类组织和细胞系：胎脑、前列腺平滑肌、骨髓、RPMI1588、甲状腺、WI-38、睾丸、刺激的外周血单个核细胞、刺激的CD3+细胞、THP-1、激活的扁桃腺、HACAT以及胎肝。反应在热循环仪机器上利用如下条件进行：30个循环的95℃ 20秒，68℃ 3分钟。在30个循环结束后，进行另外的68℃ 8分钟的单独延伸循环。PCR产物通过在溴乙锭存在下的TAE琼脂糖凝胶电泳接着UV照明观察。发现最丰富的产物来自于前列腺平滑肌cDNA文库。利用不太耐用但更高保真度的热稳定DNA聚合酶″turboPFu″(Stratagene，La Jolla，CA)重复使用前列腺平滑肌模板以及寡核苷酸ZC39982(SEQ ID NO：64)和ZC39983(SEQ ID NO：65)的PCR反应。用如下条件进行30个扩增循环：94℃变性30秒，63℃退火45秒，72℃延伸3.5分钟。单带产物在0.8％TAE琼脂糖凝胶上进行凝胶纯化。
然后利用被设计包括限制性酶识别位点的引物ZC39980(SEQ ID NO：66)和ZC39981(SEQ ID NO：67)再次扩增此DNA，以允许该cDNA克隆到哺乳动物表达载体中。
PCR反应利用“TurboPfu”和纯化的PCR产物进行15个循环：95℃ 1分，64℃ 1分20秒，72℃ 4.5分。PCR反应物接着由EcoR1和Xho1(Invitrogen，Carlsbad，CA)消化，并如上所述凝胶纯化。用EcoR1和Xho1消化制备哺乳动物表达载体pZ7NX，然后将PCR产物连接到所述载体上，并电转化到大肠杆菌DH10b细胞中。分离并测序几个细菌菌落。一个克隆除了单个非保守性突变以外是正确的。为改变该碱基以便与预期的序列一致，在利用pZP7Nx-h由“Turbopfu”进行的PCR反应中使用了跨越突变和邻近的Pst1限制性位点的寡核苷酸。早先测序的制瘤素M R质粒作为模板。PCR扩增的DNA用Pst1和Xho1消化，并克隆回pZP7Nx-h制瘤素M R质粒中，以替代含有所述令人讨厌的突变的Pst1/Xho1片段。对这个新质粒在新近扩增的Pst1到Xho1区进行序列分析，以确认所述矫正并确保扩增过程中未产生其它错误。该分析确认了序列在编码区与预期序列一致。所述序列示于SEQ ID NO：6，而相应的氨基酸序列示于SEQ ID NO：7。
实施例30
用于产生人类Zcytor17/制瘤素M受体(OSMRbeta)杂二聚体的构建体
用于构建、表达和纯化此类可溶性杂二聚体受体的系统是本领域公知的，并已被改造以适合所述受体对人类制瘤素M受体(OSMRbeta)和人类zcytor17。对于该构建体，OSMRbeta可溶性受体的多核苷酸示于SEQID NO：68，相应的多肽示于SEQ ID NO：69；而人类zcytor17可溶性受体的多核苷酸示于SEQ ID NO：70，相应的多肽示于SEQ ID NO：71。
为构建表达分泌的可溶hzcytor17/人类OSMRbeta杂二聚体的细胞系，制备构建体从而所得的杂二聚体可溶性受体包括人类OSMRbeta胞外结构域，融合于C-末端具有Glu-Glu标签(SEQ ID NO：35)的IgG γ1(Fc4)重链(SEQ ID NO：37)；而zcytoR17的胞外结构域融合于C-末端具有His标签(SEQ ID NO：72)的Fc4(SEQ ID NO：37)。对于所述杂二聚体的hzcytor17和人类OSMRbeta两个臂，在受体的胞外部分和Fc4的N-末端之间都设计了12个氨基酸的Gly-Ser间隔臂(SEQ ID NO：73)。
A.人类可溶性OSMRbeta/Fc4-CEE的构建
为构建所述杂二聚体的人类可溶性OSMRbeta/Fc4-CEE部分，由寡核苷酸ZC14063(SEQ ID NO：48)和ZC41557(SEQ ID NO：74)利用PCR在如下的PCR反应条件下分离人类OSMRbeta的胞外部分：30个循环的95℃ 60秒，57℃ 30秒和72℃ 100秒；以及72℃ 7分钟。PCR产物利用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化，以EcoR1和BglII(Boerhinger-Mannheim)消化，通过凝胶电泳分离，并使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)纯化。
将表达盒、质粒主链和嵌合物的Fc4-GluGlu标签部分容纳到事先自制的质粒载体中。该质粒载体用EcoR1和BamH1(Boerhinger-Mannheim)消化，通过凝胶电泳分离，并使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)纯化。利用T4 DNA连接酶(Life Technologies，Bethesda，MD)使用标准连接法将消化且纯化的含人类OSMRbeta和Fc4-cEE的质粒片段连接到一起。对所得连接物的小量制备物筛选正确大小(772bp)的可溶性OSMRbeta EcoRI/Sma1插入物，并对阳性小量制备物测序以确认PCR反应的准确性。这个新质粒构建体被称之为pZP9-ONCOMR-Fc4CEE。
B.人类可溶性Zcytor17/Fc4-CHIS的构建
为构建所述杂二聚体的hzcytor17/Fc4-CHIS部分，通过消化事先包含Zcytor17-Fc4可溶性受体的质粒分离人类zcytor17的胞外部分。质粒首先用Sall(New England Biolabs，Beverly，MA)消化，之后反应物连续用酚氯仿抽提并乙醇沉淀。然后用T4 DNA聚合酶(Boerhinger-Mannheim)处理消化的DNA，以填充因Sall消化产生的5’突出，使该DNA末端钝端化，之后反应物连续用酚氯仿抽提并乙醇沉淀。然后进一步用BglII消化钝端化的DNA以在3’端切割，通过凝胶电泳分离，并使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)按制造商的说明纯化。将所得的含编码zcytoR17胞外结构域的序列的DNA片段连接到如下制备的含Fc4-CHIS标签的哺乳动物表达载体中。
将表达盒、质粒主链和嵌合物的Fc4-CHIS标签部分容纳到事先自制的质粒载体中。该质粒载体用EcoR1(Boerhinger-Mannheim)消化，之后反应物连续用酚氯仿抽提并乙醇沉淀。然后用T4 DNA聚合酶(Boerhinger-Mannheim)处理消化的DNA，以填充因EcoR1消化产生的5’突出，使该DNA末端钝端化，之后反应物连续用酚氯仿抽提并乙醇沉淀。然后进一步用BamH1(Boerhinger-Mannheim)消化钝端化的DNA以在3’端切割，通过凝胶电泳分离，并使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)纯化。利用T4 DNA连接酶(Life Technologies，Bethesda，MD)使用标准连接法将消化且纯化的含人类zcytor17和Fc4-CHIS的质粒片段连接到一起。
使用zcytor17特异性有义引物ZC29180(SEQ ID NO：22)和Fc4特异性反义引物ZC29232(SEQ ID NO：75)由如下PCR反应条件通过PCR对所得连接物的小量制备物进行筛选：30个循环的94℃ 60秒，68℃150秒；以及72℃ 7分钟。预期的848bp的产物大小证实了称之为pZEM228 hzcytor17/Fc4HIS的质粒的正确组装。
建立第二zcytor17-Fc4构建体，用于自COS细胞产生同型二聚体蛋白。简要地，通过用Sal1(Boerhinger-Mannheim)消化事先含Zcytor17-Fc4可溶性受体的质粒分离完整融合蛋白的编码区。反应物连续用酚氯仿抽提并乙醇沉淀。然后用T4 DNA聚合酶(Boerhinger-Mannheim)处理消化的DNA，以填充因EcoR1消化产生的5’突出，使该DNA末端钝端化，之后反应物连续用酚氯仿抽提并乙醇沉淀。然后进一步用Not1(Boerhinger-Mannheim)消化钝端化的DNA以在3’端切割，通过凝胶电泳分离，并使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)纯化。消化含CMV驱动的表达盒的哺乳动物表达载体以产生匹配的末端，并将2片段连接到一起。使用载体特异性有义引物ZC14063(SEQ IDNO：48)和zcytor17特异性反义引物ZC27899(SEQ ID NO：19)由如下PCR反应条件通过PCR对所得连接物的小量制备物进行筛选：30个循环的94℃ 30秒，64℃ 30秒，70℃ 90秒；以及72℃ 7分钟。预期的大约1000bp的产物大小证实了称之为pZP7NX-hzcytor17-Fc4的质粒的正确组装。随后使用Lipofectamine(Gibco/BRL)按制造商的说明将该质粒转染到COS细胞中。细胞在DMEM+5％FBS(Gibco/BRL)中条件化60小时，之后蛋白在蛋白G-琼脂糖4B层析柱上纯化，并使之可用于体外生物测定，例如象本文所述的那些生物测定。
C.人类Zcytor17/制瘤素M受体(OSMRbeta)的产生
利用Lipofectamine(Gibco/BRL)按制造商的说明将pZP9-ONCOMR-Fc4CEE和pZEM228 hzcytor17/Fc4HIS大约各16μg共转染到BHK-570(ATCC No.CRL-10314)细胞中。转染的细胞在含0.5mg/mlG418(Gibco/BRL)的DMEM+5％FBS(Gibco/BRL)中选择10天，并在250nM氨甲蝶呤(MTX)(Sigma，St.Louis，MO)中选择10天。
利用所得的双重选择的细胞库产生杂二聚体蛋白。利用该库中的3个细胞工厂(Nunc，Denmark)产生10L无血清条件培养基。使该条件培养基穿过1ml蛋白-A柱并洗脱为(10)750μl级分。收集这些级分中发现具有最高浓度的4个并对PBS透析(10kD MW截留)。通过穿过镍柱并用多种浓度的咪唑洗柱，从其它培养基组分中分离期望的杂二聚体可溶性zcytor17/OSMRbeta蛋白复合物。可溶性zcytor17/OSMRbeta蛋白在中间浓度的咪唑下洗脱，而hzcytor17/Fc4HIS同型二聚体在较高浓度的咪唑下洗脱。
实施例31
使用RNA印迹和PCR的人类zcytor17在组织面板中的组织分布
A.使用RNA印迹的人类zcytor17组织分布
探测人类多组织RNA印迹(人类12-道MTN印迹I和II，和人类免疫系统MTN印迹II；人类内分泌MTN，人类胎儿MTN印迹II，人类多组织阵列)(Clontech)以及自制的含多种组织的印迹以确定人类zcytor17表达的组织分布。自制的印迹包括如下组织和细胞系mRNA：SK-Hep-1细胞，THP1细胞，肾上腺(Clontech)；肾(Clontech)，肝(Clontech和Invitrogen)；脊髓(Clontech)，睾丸(Clontech)，人类CD4+T细胞，人类CD8+T细胞，人类CD19+T细胞，人类混合淋巴细胞反应(MLR)，THP1细胞系(ATCC No.TIB-202)，U937细胞系，离子霉素刺激或未刺激的p388D1小鼠成淋巴细胞细胞系(ATCC No.CCL-46)；以及离子霉素刺激或未刺激的WI-38人类胚胎肺细胞系(ATCC No.CRL-2221)。
zcytor17(SE ID NO：4)大约500bp PCR来源的探针利用寡核苷酸ZC28，575(SEQ ID NO：77)和ZC27，899(SEQ ID NO：19)作为引物扩增。PCR扩增如下实施：30个循环的94℃ 1分钟，65℃ 1分钟和72℃ 1分钟；继之以1个循环的72℃ 7分钟。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳观察，并如本文所述凝胶纯化接近500bp的PCR产物。所述探针用PRIMEIT II随机引物标记试剂盒(Stratagene)根据制造商的说明进行放射性标记。所述探针用NUCTRAP推进柱(Stratagene)纯化。利用EXPRESSHYB(Clontech)液进行预杂交，并作为RNA印迹的杂交液。预杂交在68℃进行2小时。杂交和大约1.5×106cpm/ml标记的探针于68℃过夜进行。印迹室温下在2×SSC，0.05％SDS中洗涤3次，接着在2×SSC，0.1％SDS中于50℃洗涤10分钟1次。暴露数天后观察到数条弱带。在气管、骨骼肌和胸腺中观察到大约9kb的转录本；在PBL、HPV、U937和THP-1细胞中观察到大约2kb的转录本；而在胎盘、骨髓和甲状腺以及HPV和U937细胞中观察到大约1.2kb的转录本。在所有上文所列的组织中，信号强度都很微弱。在多数正常组织中似乎少有表达，提示zcytor17表达可能有赖于表达它的细胞或组织的激活。
B.使用PCR在组织面板中的组织分布
利用PCR筛选来自人类组织的cDNA面板的zcytor17表达。该面板是自制的，并且含有下文表13所示的来自多种正常及癌变人类组织和细胞系的94个marathon cDNA和cDNA样品。cDNA来自自制文库，或marathon cDNA来自自制RNA制备物、Clontech RNA或Invitrogen RNA。Marathon cDNA利用marathon-ReadyTM试剂盒(Clontech，Palo Alto，CA)制备，并用网格蛋白引物ZC21195(SEQ ID NO：78)和ZC21196(SEQ IDNO：79)测试质量，然后根据网格蛋白条带的强度稀释。为确保面板样品的质量，进行三份质检(QC)测试：(1)为评估用于文库的RNA质量，通过个体cDNA文库载体序列特异性的载体寡核苷酸的PCR测试自制cDNA的平均插入物大小；(2)面板样品中cDNA浓度的标准化，是使用5′载体寡核苷酸ZC14，063(SEQ ID NO：48)和3′α微管蛋白特异性寡核苷酸引物ZC17，574(SEQ ID NO：49)或3′G3PDH特异性寡核苷酸引物ZC17，600(SEQ ID NO：50)利用标准PCR方法扩增全长α微管蛋白或G3PDH cDNA实现的；以及(3)将样品送交测序以检验可能的核糖体或线粒体DNA污染。面板设置在96-孔型板中，包括人类基因组DNA(Clontech，Palo Alto，CA)阳性对照样品。各孔含大约0.2-100pg/μlcDNA。PCR反应利用寡核苷酸ZC26，358(SEQ ID NO：80)和ZC26，359(SEQID NO：81)、TaKaRa Ex TaqTM(TAKARA Shuzo Co LTD，Biomedicals Group，Japan)以及Rediload染料(Research Genetics，Inc.，Huntsville，AL)建立。扩增如下进行：1个循环的94℃ 2分，35个循环的94℃ 30秒，66.3℃30秒和72℃ 30秒，接着1个循环的72℃ 5分钟。使用4％琼脂糖凝胶对大约10μl PCR反应产物进行标准琼脂糖凝胶电泳。在淋巴结、前列腺、甲状腺、HPV(前列腺上皮)、HPVS(前列腺上皮，选择的)、肺瘤、子宫瘤反应物连同基因组DNA反应物中观察到正确推断的DNA片段大小。
切除前列腺组织(2份样品)、HPV(前列腺上皮)、HPVS(前列腺上皮，选择的)以及基因组的DNA片段并利用凝胶提取试剂盒(Qiagen，Chatsworth，CA)根据制造商的说明纯化。通过序列分析确认片段，以证明它们确实是zcytor17。
表13
  组织/细胞系   #样品   组织/细胞系   #样品
  肾上腺   1   骨髓   3
  膀胱   1   胎脑   3
  骨髓   1   胰岛   2
  脑   1   前列腺   3
  宫颈   1   RPMI #1788(ATCC #CCL-156)   2
  结肠   1   睾丸   4
  胎脑   1   甲状腺   2
  胎心   1   WI38(ATCC # CCL-75)   2
  胎肾   1   ARIP(ATCC # CRL-1674-大鼠)   1
  胎肝   1   HaCat-人类角化细胞   1
  胎肺   1   HPV(ATCC # CRL-2221)   1
  胎肌肉   1   肾上腺   1
  胎皮肤   1   前列腺SM   2
  组织/细胞系   #样品   组织/细胞系   #样品
  心脏   2   CD3+筛选的PBMC离子霉素+PMA刺激   1
  K562(ATCC#CCL-243)   1   HPVS(ATCC # CRL-2221)筛选的
  肾   1   心脏   1
  肝   1   垂体   1
  肺   1   胎盘   2
  淋巴结   1   唾液腺   1
  黑素瘤   1   HL60(ATCC # CCL-240)   3
  胰腺   1   血小板   1
  垂体   1   HBL-100   1
  胎盘   1   肾小球膜   1
  前列腺   1   T-细胞   1
  直肠   1   嗜中性粒细胞   1
  唾液腺   1   MPC   1
  骨骼肌   1   Hut-102(ATCC # TIB-162)   1
  小肠   1   内皮细胞   1
  脊髓   1   HepG2(ATCC # HB-8065)   1
  脾   1   成纤维细胞   1
  胃   1   E.Histo   1
  睾丸   2
  组织/细胞系   #样品   组织/细胞系   #样品
  胸腺   1
  甲状腺   1
  气管   1
  子宫   1
  食道瘤   1
  胃瘤   1
  肾瘤   1
  肝瘤   1
  肺瘤   1
  卵巢瘤   1
  直肠瘤   1
  子宫瘤   1
C.通过PCR和RNA印迹的zcytoR17的表达分析
影响受体表达的细胞类型和生长条件的诠释是阐释其功能和预测配体来源的有用工具。为此目的，通过PCR考察了广泛种类的组织和细胞类型。热稳定的聚合酶Advantage II(Clontech，La Jolla，CA)和寡核苷酸引物ZC29，180(SEQ ID NO：22)和ZC29，179(SEQ ID NO：82)以及1-10ng下文所列的多种cDNA模板一起用于30个扩增循环(94℃，30秒；66℃，20秒；68℃，1分30秒)。之后，20％的各反应物在0.8％琼脂糖、TAE/溴化乙锭凝胶上跑样并用紫外光观察。然后根据条带强度对样品计分。见下文表14。
表14
  细胞及条件  评分0-5
  Hel，以PMA刺激   0
  U937   3
  细胞及条件  评分0-5
  MCF-7   0
  HuH7   1
  人类卵泡   0
  HT-29   0
  HEPG2   0
  HepG2，以IL6刺激   0
  人类皮肤内皮细胞   0
  人类静脉内皮细胞   0
  人类CD4+   0
  BEWO   0
  人类CD19+   1
  人类PMBC，以PHA、PMA、离子霉素、IL2、IL4、TNFα刺激24小时   0
  人类PMBC，以LPS、PWM、INFγ、TNFα刺激24小时   0
  人类PMBC，所有上述条件48小时   4
  HUVEC p.2   4
  RPMI1788   0
  TF1   0
  猴子脾T细胞，以PMA、离子霉素刺激   0
  HPV转化的人类前列腺上皮细胞   5
  细胞及条件  评分0-5
  人类扁桃体，发炎的   0
  HACAT   0
  人类软骨细胞(synviacyte)   1
  人类滑液细胞   1
  THP1   5
  REH   0
在强阳性PCR信号中，两个来自人类单核细胞系U937和THP1。
选择这两个细胞系连同前列腺上皮细胞系进一步通过RNA印迹分析。以前试图利用来自多种组织的mRNA通过northern分析观察转录本，结果在令人惊讶地大的7-10kb大小范围内产生微弱和散布的信号，使得该数据难以解释。制备变性甲醛/MOPS/0.8％琼脂糖凝胶(RNAMethodologies，Farrell，RE Academic Press)，并对每个样品跑样2μg polyA+mRNA连同RNA ladder(Life Technologies，Bethesda，MD)。然后将凝胶转移到Hybond尼龙(Amersham，Buckinghamshire，UK)上，UV交联，并利用通过PCR以及寡核苷酸ZC28，575(SEQ ID NO：77)以及ZC27，899(SEQ ID NO：19)产生并用Megaprime32P试剂盒(Amersham)标记的人类zcytoR17探针在ExpressHyb液(Clontech，LaJolla，CA)中于68℃杂交过夜。RNA印迹随后用0.2×SSC+0.1％SDS于65℃洗涤15分钟，并用增感屏暴露于胶片7天。在前列腺上皮和U937泳道中都看到显著的8kb条带，而THP1泳道中存在较弱的条带。
为优化用作为杂交探针的cDNA，通过PCR扩增全长人类zcytoR17序列的4个不同区域、标记并如上所述与含基因组和扩增的cDNA文库DNA的Southern杂交。这4个文中命名为A-D的探针，是利用如下引物对扩增的：(A)ZC28，575(SEQ ID NO：77)，ZC27，899(SEQ ID NO：19)；(B)ZC27，895(SEQ ID NO：20)，ZC28，917(SEQ ID NO：83)；(C)ZC28，916(SEQ ID NO：84)，ZC28，918(SEQ ID NO：85)；和(D)ZC28，916(SEQ ID NO：84)，ZC29，122(SEQ ID NO：21)。人类基因组DNA连同通过PCR证明含zcytor17的扩增的cDNA文库用EcoR1和Xho1消化，以释放插入物并在TAE/0.8％琼脂糖凝胶上双份跑样，用0.5M NaOH、1.5M NaCl变性，转印到Hybond，UV交联，并分别与不同的探针杂交。发现探针B具有最小限度的非特异性结合和最强的信号。因而探针B用于所有随后的杂交。
考虑到THP1细胞是循环单核细胞的出色模型并且以低水平表达zcytor17，我们用多种化合物处理它们，以努力提高zcytoR17的表达。细胞以2e5/ml的密度生长，洗涤，并重悬于多种刺激培养基中，生长4或30个小时，并收集制备RNA。各培养基补充有如下药物或细胞因子对：LPS 2ug/ml(Sigma Chemicals，St.Louis，MO)、hTNFα 2ng/ml(R&DSystems，Minneapolis，MN)、hGM-CSF 2ng/ml(R&D Systems，Minneapolis，MN)、hIFNγ 50ng/ml(R&D Systems，Minneapolis，MN)、hMCSF 1ng/ml(R&D Systems，Minneapolis，MN)、hIL6 1ng/ml(R&DSystems，Minneapolis，MN)、hIL1 β 2ng/ml(R&D Systems，Minneapolis，MN)、hIFNγ 50ng/ml+hIL4 0.5ng/ml(R&D Systems，Minneapolis，MN)、hIFNγ 50ng/ml+hIL10 1ng/ml(R&D Systems，Minneapolis，MN)、PMA 10ng/ml(Calbiochem，SanDiego，CA)以及未处理的对照。在培养周期结束时，利用RNAeasy Midi-试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)制备总RNA。利用MPG试剂盒(CPG，Lincoln Park，NJ)从总RNA中选择Poly A+RNA。来自各种条件的2ug polyA+RNA在甲醛/MOPS/琼脂糖凝胶上跑样，转移到尼龙膜上，并如上所述进行UV交联。然后如上文那样使这些RNA印迹与探针B于68℃杂交过夜，在高度严谨条件下用0.2×SSC，0.1％SDS于65℃洗涤，暴露于胶片过夜，然后暴露于磷光屏进行信号定量。在所有泳道中观察到显著的8kb mRNA以及相对较弱的2.8kb条带。在来自用hIFNγ处理30小时的细胞的RNA中观察到zcytor17 mRNA 20倍的增加，该效应因IL4的同时处理而稍微弱化。在用LPS、TNFα和GM-CSF处理的细胞的RNA中观察到mRNA较小的3倍的增加，而MCSF、IL6和IL1β对zcytor17 mRNA水平没有影响。该数据提示了zcytor17受体及其配体在单核细胞巨噬细胞生物学中以及作为延伸的在这些细胞所参与的任何数目的疾病过程中的作用。
实施例32
使用RNA印迹和PCR的人类zcvtor17lig在组织面板中的组织分布
人类zcytor17lig cDNA片段利用PCR用基因特异性引物：有义引物ZC41438(SEQ ID NO：93)和反义引物ZC41437(SEQ ID NO：94)以及模板人类zcytor17lig cDNA(SEQ ID NO：90)获得。该片段利用标准方法纯化，并且大约25ng由32Pα dCTP利用Prime-It RmT随机引物标记试剂盒(Stratagene)标记，并在Ultrahyb(Ambion)中杂交，并按制造商在各种情况下的建议用于曝光Biomax胶片/增感屏。新的先前未用的来自Clontech的印迹包括Clontech人类12泳道MTN、人类大脑MTN II以及人类大脑MTN印迹IV、人类免疫系统MTN II和人类MTE阵列II，按Ambion ultrahyb法于42℃过夜杂交。非特异性放射性计数利用.1SSC/.5％SDS于55℃洗掉。阳性印迹包括人类12泳道MTN(Clontech)。所调查的12个组织中，只有胎盘是大约1.2KB的转录本阳性的。
实施例33
表达人类zcytor17lig-CEE的哺乳动物表达载体的构建
A.zCytor17Lig-CEE/pZMP21的构建
通过同源重组构建含有全部或部分编码zCytor17Lig-CEE的多核苷酸(SEQ ID NO：95)的表达质粒。该质粒被称之为zCytor17Lig-CEE/pZMP21。
zCytor17Lig-CEE/pZMP21的构建通过利用PCR扩增产生zCytor17Lig-CEE片段完成。用于产生zCytor17Lig-CEE片段的DNA模板是zCytor17Lig/pZP7nx。用于产生zCytor17Lig-CEE片段的引物是：(1)ZC41，607(SEQ ID NO：97)(有义序列)，其从5’到3’端包括：28bp的载体侧翼序列(插入物5’端)和对应于zCytor17Lig 5’序列的21bp；和(2)ZC41，605(SEQ ID NO：98)(反义序列)，其从5’到3’端包括：37bp的载体侧翼序列(插入物3’端)、3bp的终止密码子、编码C-末端EE标签的21bp以及对应于zCytor17Lig序列3’端的21bp。由上述PCR扩增得到的片段是一拷贝模板zCytor17Lig外加C-末端EE标签，产生终产物zCytor17Lig-CEE。
PCR反应如下进行：对于100μl终体积添加：10μl 10x Taq聚合酶反应缓冲液和15mM MgCl(Gibco)、1μl Taq DNA聚合酶(5单位/μl，Gibco)、3μl 10mM dNTP、78μl dH2O、3μl 20pmol/μl引物ZC41，607(SEQID NO：97)贮液、3μl 20pmol/μl引物ZC41，605(SEQ ID NO：98)贮液、以及2μl 0.13μg/μl zCytor17lig模板DNA贮液。向混合物中添加体积等于50μl的矿物油。反应加热至94℃ 5分钟，接着是35个循环的94℃ 1分；55℃ 2分；72℃ 3分；接着在72℃延伸10分，然后维持在4C直到收集反应物。
质粒pZMP21用BglII酶限制性消化，使用微离心方案由QiaQuickPCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化，并与PCR片段重组。质粒pZMP21由pZMP20构建，后者由pZP9(保藏在美国模式培养物保藏中心，10801University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209，并且命名为No.98668)构建，具有pRS316(保藏在美国模式培养物保藏中心，10801University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209，并且命名为No.77145)酵母遗传元件、脊髓灰质炎病毒IRES元件以及在跨膜结构域羧基末端截短的CD8胞外结构域。PZMP21是含表达盒的哺乳动物表达载体，所述表达盒具有MPSV启动子、免疫球蛋白信号肽内含子、用以插入编码序列的多限制性位点、终止密码子和人类生长激素终止子。该质粒也具有大肠杆菌复制起点，具有SV40启动子、增强子和复制起点、DHFR基因、SV40终止子的哺乳动物选择标记表达单元，以及在酿酒酵母中选择和复制所必需的URA3和CEN-ARS序列。
50μl感受态酵母细胞(酿酒酵母)独立地与100ng切割的质粒、5μl早先所述的PCR混合物组合，并转移到0.2cm电穿孔管中。酵母/DNA混合物在0.75kV(5kV/cm)，∞欧姆，25μF下电脉冲。各管添加600μl1.2M山梨糖醇，并将酵母以100μl的一小份和300μl的一小份涂布到两个URA-D板上，并于30℃温育。在大约72小时后，将来自单个板的Ura+酵母转化子重悬于1ml H2O中，并简短旋转以沉淀酵母细胞。细胞沉淀重悬于500μl裂解缓冲液(2％Triton X-100，1％SDS，100mM NaCl，10mM Tris，pH 8.0，1mM EDTA)中。将500μl裂解混合物添加到含300μl酸洗600μm玻璃珠和300μl酚氯仿的Eppendorf管中，以1分钟的间隔振荡2或3次，接着在Eppendorf离心机中以最大速度旋转5分钟。将300μl水相转移到新鲜管中，并用600μl 100％乙醇(EtOH)沉淀DNA，接着于4℃离心10分钟。然后用500μl 70％EtOH洗涤DNA沉淀，接着于4℃离心1分钟。将DNA沉淀重悬于30μl H2O中。
电感受态大肠杆菌细胞(MC1061)的转化是用5μl酵母DNA制备物和50μl MC1061细胞进行的。细胞在2.0kV，25μF和400欧姆(□)下电脉冲。电穿孔后，添加600μl SOC(2％Bacto‘胰蛋白胨(Difco，Detroit，MI)，0.5％酵母膏(Difco)，10mM NaCl，2.5mM KCl，10mM MgCl2，10mM MgSO4，20mM葡萄糖)。将电穿孔的大肠杆菌细胞以200μl的一小份和50μl的一小份涂布到两个LB AMP板(LB肉汤(Lennox)，1.8％Bacto琼脂(Difco)，100mg/L氨苄青霉素)上。板于37℃倒置温育24小时。随机选择3个氨苄青霉素抗性菌落并送交插入物序列分析。大规模质粒DNA利用Qiagen Maxi试剂盒(Qiagen)根据制造商的说明从测序确认的菌落中分离。
B.小鼠zCytor17Lig(m)-CEE/pZMP21的构建
含编码鼠zCytor17Lig-CEE(SEQ ID NO：104和SEQ ID NO：105)的完整多核苷酸的表达质粒也利用上文实施例33A中所述的方法通过同源重组构建。所用的引物是：(1)ZC41643(SEQ ID NO：106)(正向，5′到3′有义)，具有插入点5′端的28bp载体重叠；21bp的zcytor17lig(m)5′端；和(2)ZC41641(SEQ ID NO：107)(反向，5′到3′反义)，具有插入点3′端的37bp载体重叠；3bp终止密码子；21bp的C-末端EE标签；24bp的zCytor17Lig(m)-CEE 3′端。该质粒被称之为zcytor17lig(m)-CEE/pZMP21。zcytor17lig(m)-CEE的多核苷酸序列示于SEQ ID NO：104，而相应的多肽序列示于SEQ ID NO：105。
实施例34
zcytor17lig-CEE多肽的转染和表达
A.人类zcytor17lig-CEE/pZMP21在293T细胞中的表达
ZCytor17Lig-CEE在293T细胞(Stanford University School ofMedicine，Stanford，CA，ATCC(SD-3515))中瞬时表达，产生原始的纯化蛋白。在转染前一天，293T细胞以6.5×104细胞/cm2种植于30T162培养瓶中，每个烧瓶中有总体积30ml的培养基(SL7V4+5％FBS+1％Pen/Strep)。使细胞于37C温育24小时。
DNA/脂质体混合物如下制备：向两个50ml锥形管中填充25mL转染培养基(SL7V4+1％Pen/Strep)，并各自添加1.13mgzCytor17Lig-CEE/pZMP21(实施例33)。另外一组两个50ml锥形管中填充22ml转染培养基(上文)，并各自添加3ml脂质体(Lipofectamine，Gibco)。对于每一组试管，将一管DNA添加到一管脂质体中，并使所述DNA/脂质体混合物温育30分钟。汇集含所述DNA/脂质体混合物的两个50ml锥形管(大约100ml)，并添加300ml转染培养基。
倾出30个烧瓶的293T细胞，用大约15ml PBS洗涤1x，并将12.5ml稀释的DNA/脂质体混合物添加到各烧瓶中。烧瓶于37C温育3小时。温育期间过后，向各T162烧瓶中添加25ml培养基(上文)。大约96小时后收集转染培养基，并用于蛋白纯化(实施例35)。
B.人类zcytor17lig-CEE/pZMP21在BHK细胞中的表达
全长zCytor17Lig蛋白在由zCytor17Lig-CEE/pZMP21(见上文实施例33)转染的BHK细胞中生产。将BHK 570细胞(ATCC CRL-10314)接种于T75组织培养瓶中，并使之在37℃，5％CO2中在生长培养基(SL7V4，5％FBS，1％pen/strep)中生长至大约50到70％汇合。细胞然后通过脂质体介导的转染(使用LipofectamineTM；Life Technologies)由zCytor17Lig-CEE/pZMP21在无血清(SF)培养基(SL7V4)中转染。质粒(16μg)在1.5ml管中用SF培养基稀释到总终体积640μl。35μl脂质混合物与605μl SF培养基混合，并使所得的混合物在室温下温育大约15分钟。然后将5ml SF培养基添加到所述DNA：脂质混合物中。细胞用10ml PBS冲洗1次，倾出PBS，然后添加DNA：脂质混合物。细胞于37℃温育5小时，然后向各板添加15ml培养基(SL7V4，5％FBS，1％pen/strep)。板于37℃温育过夜，然后第二天所述DNA：脂质培养基混合物用选择培养基(SL7V4，5％FBS，1％pen/strep，1μM氨甲蝶呤)替换。转染后大约10天，来自T75转染烧瓶的氨甲蝶呤抗性集落由胰蛋白酶消化，收集细胞并接种到T-162烧瓶中，并转至大规模培养。
C.小鼠zcytor17lig-CEE(m)/pZMP21在293T细胞中的表达
小鼠zcytor17lig(m)-CEE如实施例34A所述在293T细胞中瞬时表达，并且培养基被用于蛋白纯化(实施例35)。
实施例35
从293T细胞中纯化Zcytor17lig-CEE
除非另行指出，所有操作都在4℃进行。如下操作被用于纯化含C-末端Glu-Glu(EE)标签(SEQ ID NO：103)的小鼠和人类Zcytor17lig。纯化来自表达Zcytor17lig-CEE的293T细胞(实施例34)的条件培养基。条件培养基中靶蛋白的总浓度通过SDS-PAGE和抗-EE抗体的蛋白质印迹测定。
将5.5ml柱的抗-EE Poros 50A(PE BioSystems，Framingham，MA)(如下所述制备)倒入Waters AP-1，1cmx7cm玻璃柱(Waters，Milford，MA)中。柱子流动压实并在BioCad Sprint(PE BioSystems，Framingham，MA)上用磷酸缓冲盐溶液(PBS)pH 7.4平衡。条件培养基用NaCl调整至0.3M，且pH调整至7.2。然后将条件培养基上样到柱上，以大约3ml/分的流速过夜。柱子用10倍柱体积(CV)的PBS pH 7.4洗涤，并用3CV 5×Sigma PBS pH 7.4再次洗涤。用0.5M乙酸、0.5M NaCl，pH 2.5以3ml/分分步洗脱。分级管含1ml Tris碱(无pH调整)以立即中和洗脱液。柱子用2CV 5X Sigma PBS，pH 7.4再次洗涤，以中和柱子然后在PBS(pH7.4)中平衡。在整个洗脱层析中收集各2ml级分，并监测280和215nM的吸光值；也保留并分离的流出和洗涤库。通过SDS-PAGE银染和一抗抗-EE及二抗抗-鼠HRP偶联的蛋白质印迹分析5X PBS和酸洗脱峰级分的靶蛋白。汇集目的酸洗脱级分，并用5000道尔顿分子量的截留膜旋转浓缩器(Millipore，Bedford，MA)根据制造商的说明从38ml浓缩至0.8ml。
为从聚集的物质及任何其它污染的共纯化蛋白中分离Zcytor17lig-CEE，对汇集的浓缩级分在利用BioCad Sprint以1.0ml/分的流速由PBS平衡且上样的1.6x60cm(120ml)Superdex 75(Pharmacia，Piscataway，NJ)柱子上进行分子大小排阻层析。在整个层析中收集各3ml级分，并监测280和215nM的吸光值。峰级分通过SDS-PAGE银染描述特征，并且只汇集最纯的级分。该物质代表纯化的Zcytor17lig-CEE蛋白。
在蛋白质印迹、考马斯亮蓝和银染的SDS-PAGE凝胶上，Zcytor17lig-CEE是一个主带。纯化物质的蛋白浓度通过BCA分析(Pierce，Rockford，IL)进行，并将蛋白分成小份，并根据标准操作贮存于-80℃。
为制备PorosA50抗-EE，65ml床体积的Poros A50(PE Biosystems)用100ml水洗涤，然后由含0.02％叠氮化钠的0.1M三乙醇胺，pH 8.2(TEA，ICN，Aurora，Ohio)，1M Na2SO4，pH 8.8利用真空烧瓶过滤单元洗涤。将浓度为2mg/ml体积为300ml的EE单克隆抗体溶液与体积250ml的洗涤树脂混合。室温下过夜温育后，通过用5体积如上所述的含0.02％叠氮化钠的200mM TEA，1M Na2SO4，pH 8.8洗涤树脂除去未结合的抗体。将树脂重悬于2体积含0.02％叠氮化钠的TEA，1M Na2SO4，pH 8.8中，并转移到合适的容器中。添加3ml 25mg/ml(68mM)二琥珀酰亚胺基辛二酸盐(Disuccinimidyl suberate)(处于DMSO中，由Pierce供应，Rockford，IL)，并且该溶液在室温下温育3小时。然后通过用5体积处于200mM TEA，pH 8.8中的20mM乙醇胺(Sigma，St.Louis，MO)利用真空烧瓶过滤单元在室温下温育10分钟封闭树脂上的非特异性位点。树脂用PBS，pH 7.4洗涤，然后用0.1M甘氨酸，pH 3洗涤，然后用10X PBS中和。在用蒸馏水洗涤后，最终偶联的抗-EE Poros-A 50树脂在4℃贮存于20％乙醇中。
实施例36
人类和小鼠Zcytor17lig的N-末端序列分析
A.人类Zcytor17lig的N-末端序列分析
标准自动化N-末端多肽序列分析(Edman降解)利用来自AppliedBiosystems的试剂进行。N-末端序列分析在Model 494蛋白测序仪系统(Applied Biosystems，Inc.，Foster City，CA)上进行。数据分析由Model 610A蛋白测序数据分析系统2.1a版(Applied Biosystems)进行。
提供了纯化的人类zcytor17lig-CEE样品(实施例35)。将该样品加样到制备的玻璃纤维滤器上进行N-末端序列分析。玻璃纤维滤器通过与BiobreneTM预循环制备。
分泌的人类zcytor17lig多肽的N-末端序列分析未验证推测的信号序列切割位点，但在人类zcytor17lig前体序列SEQ ID NO：2的残基27(Leu)处产生成熟起点。
B.小鼠Zcytor17lig的N-末端序列分析
标准自动化N-末端多肽序列分析(Edman降解)利用来自AppliedBiosystems的试剂进行。N-末端序列分析在Model 494蛋白测序仪系统(Applied Biosystems，Inc.，Foster City，CA)上进行。数据分析由Model 610A蛋白测序数据分析系统2.1a版(Applied Biosystems)进行。
供应纯化的小鼠zcytor17lig-CEE样品并在蛋白G琼脂糖/抗-EE珠子(实施例35)上捕获。将珠子置于还原SDS PAGE样品缓冲液中，并放在沸水浴中，之后利用Novex SDS PAGE洗脱(4-12％Bis-Tris MESNuPAGE；Invitrogen)按制造商的说明进行SDS PAGE。凝胶电转移到Novex PVDF膜(Invitrogen)，并利用标准方法进行考马斯亮蓝染色(Sigma，St.Louis，MO)。进行相应的抗-EE蛋白质印迹以鉴定zcytor17lig条带用于N-末端蛋白序列分析。所用的小鼠抗-EE IgG HRP偶联的抗体是自制的。
分泌的小鼠zcytor17lig多肽N-末端序列分析证实了推测的信号序列的切割位点，参照小鼠zcytor17lig前体序列的SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：91在31(Ala)处产生成熟起点。
实施例37
Cos细胞结合测定
利用结合测定测试zcytor17lig与包含zcytor17受体的受体的结合，例如zcytor17受体或包含zcytor17受体的受体杂二聚体和三聚体(如zcytor17/OSMR、zcytor17/WSX-1或zcytor17/OSMR/WSX-1，或其它I类细胞因子受体亚基)。将Zcytor17受体质粒DNA转染到COS细胞中，并如下所述利用转染的COS细胞评估zcytor17lig与包含zcytor17受体的受体的结合。
A.COS细胞转染
COS细胞转染如下实施：在80ul无血清DMEM培养基(500ml DMEM中55mg丙酮酸钠、146mg L-谷氨酰胺、5mg转铁蛋白、2.5mg胰岛素、1μg硒和5mg胎球蛋白)中混合如下组合的800ng受体质粒DNA：单独pZp7pX/zcytor17、单独pZp7Z/WSX-1、单独pZp7NX/OSMR、pZp7pX/zcytor17+pZp7NX/OSMR、pZp7pX/zcytor17+pZp7Z/WSX-1、pZp7NX/OSMR+pZp7Z/WSX-1、pZp7pX/zcytor17+pZp7NX/OSMR+pZp7Z/WSX-1)和4ul Lipofectamine，室温下温育30分钟，然后加入320μl无血清DMEM培养基。将400μl这种混合物添加到2×105COS细胞/孔涂板的12-孔组织培养板(纤连蛋白涂敷的)中，并于37℃温育5小时。添加500ul 20％FBS DMEM培养基(500ml DMEM中100ml FBS，55mg丙酮酸钠和146mg L-谷氨酰胺)并过夜温育。
B.结合测定
结合测定如下实施：用PBS+0.1％BSA洗掉细胞的培养基，然后细胞用相同的溶液封闭60分钟。细胞接着在PBS+0.1％BSA中与1.0μg/mlzcytor17ligCEE纯化蛋白温育1小时。细胞接着用PBS+0.1％BSA洗涤并与1∶1000稀释的鼠抗-GluGlu抗体温育另外1小时。细胞再次用PBS+0.1％BSA洗涤，然后与1∶200稀释的羊抗-鼠-HRP偶联的抗体温育1小时。
阳性结合用荧光素tyramide试剂检测，其在稀释缓冲液(NEN试剂盒)中以1∶50稀释并温育4-6分钟，并用PBS+0.1％BSA洗涤。细胞用PBS中1.8％甲醛固定15分钟，然后用PBS+0.1％BSA洗涤。细胞保存于在PBS中以1∶5稀释的Vectashield Mounting培养基(VectorLabs Burlingame，CA)中。许百在荧光显微镜中利用FITC滤器观察。
在由仅zcytor17、zcytor17+OSMRbeta、zcytor17+WSX-1和zcytor17+OSMRbeta+WSX-1转染的细胞中检测到阳性结合。对于由WSX-1+OSMRbeta、仅由OSMRbeta或仅由WSX-1转染的细胞未检测到结合。
实施例38
在萤光素酶测定中小鼠zcytor17lig激活小鼠zcytor17/OSMRbeta受体
A.克隆全长小鼠zcytor17和小鼠OSMRbeta用于表达
在小鼠睾丸cDNA文库中筛选全长小鼠zcytoR17克隆。将所述文库以65,500cfu/板涂布于24LB+Amp板上。利用Hybond N(Amersham-Pharmacia Biotech，Inc.，Piscataway，NJ)对总计大约1,600,000菌落进行滤膜揭取。滤膜用热针标记以定向，然后在0.5MNaOH和1.5M Tris-HCl，pH 7.2中变性6分钟。滤膜然后用1.5M NaCl和0.5M Tris-HCl，pH 7.2中和6分钟。利用UV交联剂(Stratagene，La Jolla，CA)以1200焦耳将DNA粘附到滤膜上。然后使滤膜在室温下过夜干燥。
第二天，滤膜于65℃在由0.25X SSC，0.25％SDS和1mM EDTA组成的预洗涤缓冲液中预洗涤。然后利用
Figure G2009102637047D01762
(Kimberly-Clark)人工除去细胞碎片，并在1小时的时期内更换溶液3次。滤膜风干并在室温下贮存备用。然后滤膜在20ml ExpressHybTM杂交液(Clontech，Palo Alto，CA)中于63℃预杂交大约3小时。
探针B(实施例31)通过PCR由人类zcytoR17模板利用寡核苷酸引物ZC27，895(SEQ ID NO：20)和ZC28，917(SEQ ID NO：83)产生，并利用商业上可获得的试剂盒(Megaprime DNA Labeling System；AmershamPharmacia Biotech，Piscataway，NJ)根据制造商的说明由32P放射性标记。探针利用StratageneTM推进柱(
Figure G2009102637047D01763
column；Stratagene，La Jolla，CA)纯化。探针在100℃变性15分钟，并加到ExpressHybTM中。滤膜在含1.6×106cpm/ml探针的15ml杂交液中于63℃杂交过夜。滤膜于55℃在2X SSC，0.1％SDS和1mM EDTA中洗涤，并在-80℃暴露于X-射线胶片41/2天。从板中作为培养基塞挑取13个阳性菌落，并置于1.7ml管的1ml LB+amp中。管置于4℃过夜。对这13个阳性菌落进行另外两轮纯化。第三板在滤膜揭取且挑取单菌落后于37℃长出，并送交序列分析。其中确定有三个含有zcytoR17的小鼠直向同源物。
此外，PCR产物利用CTLL-2 cDNA作为模板和寡核苷酸ZC38，239(SEQ ID NO：108)和ZC38，245(SEQ ID NO：109)作为引物产生。CTLL-2是小鼠细胞毒性T淋巴细胞系(ATCC No.TIB-214)。该PCR反应如下进行：1个循环的95 C1分钟，30个循环的95 C15秒，68 C3分钟，然后68 C10分钟；4C浸泡。PCR反应利用大约0.5ng cDNA、20pmole各寡核苷酸以及1μl Advantage II聚合酶混合物(ClonTech)。大约6％的PCR产物用作为同上的新PCR反应的模板，除了寡核苷酸引物是ZC38，239(SEQ ID NO：108)和ZC38，238(SEQ ID NO：110)。该PCR反应如下进行：30个循环的94 C 45秒，65 C 45秒，72 C 1分钟，然后72 C 7分钟；10 C浸泡。多数PCR反应物上样到1.0％琼脂糖凝胶中，并切下大约360bp的主带，洗脱DNA片段，并进行DNA序列分析。
小鼠zcytor17多核苷酸的序列示于SEQ ID NO：111，而相应的氨基酸序列示于SEQ ID NO：112。另外，截短可溶形式的小鼠zcytor17多核苷酸示于SEQ ID NO：113，而相应的氨基酸序列示于SEQ ID NO：114。
为获得全长小鼠OSMRbeta cDNA，分离5′和3′PCR产物并利用内在的BamHI位点连接起来。PCR引物利用核苷酸序列SEQ ID NO：119设计，并且包括用于克隆目的的EcoRI和XbaI限制性位点。基因组小鼠OSMRbeta核酸序列示于SEQ ID NO：119，其中编码序列涵盖残基780到3692，编码小鼠OSMRbeta 970个氨基酸的多肽，其示于SEQ ID NO：120。编码SEQ ID NO：120多肽的简并核酸序列示于SEQ ID NO：121。
5′PCR产物利用自制的3T3-L1(分化的小鼠脂肪细胞)cDNA文库作为模板和寡核苷酸ZC41，764(SEQ ID NO：115)和ZC41，598(SEQ IDNO：116)作为引物产生。该5’PCR反应如下进行：30个循环的95 C 45秒，55 C 45秒，72 C 1分30秒，然后72 C 7分钟；4 C浸泡。PCR反应利用大约3μg由cDNA文库制备的质粒、20pmole各寡核苷酸以及5单位Pwo DNA聚合酶(Roche)。大约90％的5’PCR产物用EcoRI和BamHI消化，并在1.0％琼脂糖凝胶上凝胶纯化。切下大约1446bp的条带用于连接(见下文)。
3′PCR产物利用小鼠胎盘自制cDNA文库作为模板和寡核苷酸ZC41，948(SEQ ID NO：117)和ZC41，766(SEQ ID NO：118)作为引物产生。该3’PCR反应如下进行：30个循环的95 C 45秒，55 C 45秒，72 C1分30秒，然后72 C 7分钟；4 C浸泡。PCR反应利用大约3μg由cDNA文库制备的质粒、20pmole各寡核苷酸以及5单位Pwo DNA聚合酶(Roche)。大约90％的3’PCR产物用BamHI和XbaI消化，并在1.0％琼脂糖凝胶上凝胶纯化。切下大约2200bp的条带用于和5’PCR产物(上文所述的)一起连接到由EcoRI和XbaI消化的表达载体pZP-5Z中。三方连接用上述5′EcoRI到BamHI片段、3′BamHI到XbaI片段和由EcoRI和XbaI消化的表达载体pZP-5Z进行。这产生含小鼠OSMRbeta(SEQ ID NO：119的核苷酸780到3692)全长cDNA的pZP-5Z质粒，命名为pZP-5Z/OSMRbeta。pZP5Z/OSMRbeta中的全长小鼠OSMRbeta cDNA具有来自SEQ ID NO：120的两个氨基酸插入物。在位置370处氨基酸甘氨酸重复，而在位置526处氨基酸谷氨酸重复。质粒pZP-5Z是含表达盒的哺乳动物表达载体，所述表达盒具有CMV启动子、用于插入编码序列的多限制性位点以及人类生长激素终止子。该质粒也具有大肠杆菌复制起点，具有SV40启动子、增强子和复制起点、zeocin抗性基因和SV40终止子的哺乳动物选择标记表达单元。
对所得的转化子测序以确认小鼠OSMRbeta cDNA序列。
B.BaF3/KZ134/zcytor17m、BaF3/KZ134/zcytor17m/OSMRbetam、 BHK/KZ134/zcytor17m以及BHK/KZ134/zcytor17m/OSMRbetam细胞系的 构建
稳定的BaF3/KZ134和BHK/KZ134细胞系(实施例20)用编码全长小鼠zcytor17、pZP-7P/zcytor17m(实施例38A)的表达质粒转染，分别产生BaF3/KZ134/zcytor17m和BHK/KZ134/zcytor17m细胞。然后将小鼠OSMRbeta表达质粒pZP-5Z/OSMRbetam(实施例38A)转染到这些细胞中，分别产生BaF3/KZ134/zcytor17m/OSMRbetam和BHK/KZ134/zcytor17m/OSMRbetam细胞系。方法描述在实施例4中，除了Baf3/KZ134/zcytor17m和BHK/KZ134/zcytor17m除用遗传霉素外还用2ug/ml嘌呤霉素选择，而Baf3/KZ134/zcytor17m/OSMRbetam和BHK/KZ134/zcytor17m/OSMRbetam除用遗传霉素外还用2ug/ml嘌呤霉素和200ug/ml zeocin选择。
克隆利用标准技术稀释、涂板和选择。克隆利用小鼠zcytor17lig条件培养基和纯化的小鼠zcytor17lig蛋白(实施例35)作为诱导物通过萤光素酶测定筛选(见上文实施例20)。选择具有最高萤光素酶反应(通过STAT萤光素酶)和最低本底的克隆。选择稳定的转染体细胞系。
C.在BaF3/KZ134/zcytor17m/OSMRbetam或BHK/KZ134/zcytor17m/ OSMRbetam萤光素酶测定中小鼠Zcytor17lig激活小鼠zcytor17受体
细胞系如上文实施例20所述涂板进行萤光素酶测定。BaF3/KZ134/Zcytor17m、BaF3/KZ134/zcytor17m/OSMRbetam、BHK/KZ134/zcytor17m或BHK/KZ134/zcytor17m/OSMRbetam细胞的STAT激活利用如下评估：(1)来自用人类zcytor17lig转染的BHK570细胞(实施例7)的条件培养基，(2)来自用小鼠zcytor17lig转染的BHK570细胞(实施例18)的条件培养基，(3)纯化的小鼠和人类zcytor17lig(实施例35)，和(4)无mIL-3培养基以测量仅有培养基的对照反应。萤光素酶测定如实施例20所述进行。
该测定的结果证实了与BaF3/KZ134/zcytor17m细胞、BHK/KZ134/zcytor17m细胞或未转染的BaF3/KZ134或BHK/KZ134对照细胞相比，BaF3/KZ134/zcytor17m/OSMRbetam和BHK/KZ134/zcytor17m/OSMRbetam细胞对小鼠zcytor17lig的STAT报告基团反应，并证明所述反应是通过小鼠zcytor17/OSMRbeta受体介导的。该结果也证明人类zcytor17lig不通过小鼠受体复合物激活所述STAT报告基团测定。
实施例39
人类zcytor17lig通过流式细胞仪与zcytor17和 zcytor17/OSMRbeta结合
人类zcytor17L的生物素标记如下进行：100μL 5.26mg/mL的zcytor17与溶于ddH2O中的30μL 10mg/mL EZ-linkSulfo-NHS-LC-biotin(Pierce，Rockford，IL)组合。溶液在振摇器中室温下温育30分钟。生物素标记后，溶液利用Slide-A-Lyzer透析盒在PBS中透析。
为测试人类zcytor17lig对不同受体组合的结合特性，BHK和BAF3细胞都用本领域熟知的标准技术由表达质粒转染。这些质粒以下列组合转染到两种细胞系中：单独zcytor17、单独OSMRbeta、以及zcytor17和OSMRbeta同时。转染如上文所详述的那样进行。未转染的BHK和BAF3细胞用作为对照。细胞如下通过FACS染色：2E5细胞用2.0μg/mL、100ng/mL、10ng/mL、1.0ng/mL、100pg/mL、10pg/mL、1.0pg/mL生物素标记的zcytor17L染色或者未染色于冰上在FACS缓冲液(PBS+2％BSA+2％NHS(Gemini)+2％NGS)中静置30分钟。细胞洗涤1.5次，然后在冰上以1∶250用SA-PE(Jackson Immuno Laboratories)染色30分钟。细胞然后用FACS缓冲液洗涤1.5次，重悬于FACS缓冲液中，并在BDFACSCaliber上利用Cell Quest软件(Becton Dickinson，Mountain View，CA)通过FACS分析。
BHK和BAF3细胞都证明zcytor17lig与单独的zcytor17或它与OSMRbeta的组合都结合，其中与zcytor17/OSMRbeta杂二聚体的结合稍稍更强。在只表达OSMRbeta的任一细胞系中均未观察到结合。zcytor17lig以浓度依赖性的方式结合。BHK结合的平均荧光强度(MFI)值示于下文表15。
表15
  zcytor17μg/mL   2.0   0.100   0.010   0.001   0.0001   0.00001   0.000001   0.0
  BHKC17+OSMRbeta   3780   2126   328   53   17   15   14   13
  BHK-C17   3032   1600   244   39   16   15   14   15
  BHK-OSMRbeta   13   X   X   X   X   X   X   0
  BHK-WT   15   14   13   X   X   X   X   13
  zcytor17μg/mL   10.0   3.33   1.11   0.37   0.12   0.04   0.00
  BAF3-C17+OSMRbeta   531   508   489   441   364   247   7
  BAF3-OSMRbeta   6   5   5   5   5   5   11
  BAF3-WT   13   13   12   12   12   12   13
  zcytor17ng/mL   100.0   10.0   1.0   0.0
  BAF3-C17   347   72   17   7
实施例40
人类Zcytor17lig处理的细胞的基因表达阵列分析
利用RNeasy Midi试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)根据制造商的说明从人类zcytor17lig处理的A549细胞、zcytor17lig处理的SK-LU-1细胞以及未处理的对照细胞分离RNA。
用zcytor17lig处理的细胞和各自的对照细胞的基因表达谱分析利用GEArray Q系列cDNA表达阵列(SuperArray Inc.，Bethesda，MD)进行。Q系列cDNA表达阵列含有多达96个与特定生物学路径相关的cDNA片段，或具有相似功能或结构特征的基因。比较来自处理和对照细胞的阵列允许确定特定基因的上调和下调。探针标记、杂交和检测根据制造商的说明进行。化学发光信号检测和数据获取在Lumi-Imager工作站(Roche，Indianapolis，IN)中进行。所得的影响数据利用ImageQuant5.2(Amersham Biosciences，Inc.，Piscataway，NJ)和GEArray分析者1.2(SuperArray Inc.，Bethesda，MD)软件分析。
来自人类白介素和受体Q系列HS-014N阵列的结果分析显示标准化后，在zcytor17lig处理的人类SK-LU-1细胞中，IL13RA2信号增加大约4.7倍，而在zcytor17lig处理的人类A549细胞中，IL13RA2信号增加大约2.2倍。
这些结果表明zcytor17lig显著上调SK-LU-1和A549细胞中的IL13RA2。这两者都是已经建立的来自人类肺癌的细胞系(Blobel等，Virchows Arch B Cell Pathol Incl Mol Pathol.，1984；45(4)：407-29)。更具体地，A549被表征为人类肺上皮细胞系(Lin等，J Pharm Pharmacol.，2002 Sep；54(9)：1271-8；Martinez等，Toxicol Sci.，2002 Oct；69(2)：409-23)。
白介素-13(IL13)，由激活的T淋巴细胞分泌的一种细胞因子，已证明是表达过敏性哮喘所必需的并且足以用作哮喘的实验模型，这包括通气道高反应性(hyper-responsiveness)、嗜曙红细胞募集以及黏液过量生产(Wills-Karp等，Science，1998；282：2258-2261)。已经表明选择性中和IL13将改善哮喘表型(Grunig等，Science，1998；282：2261-2263)。也已经报道IL13参与粘液素基因MUC8在人类鼻息肉上皮和培养的鼻上皮中表达的上调(Kimm等，Acta Otolaryngol.，2002；Sep；122(6)：638-643；Seong等，Acta Otolaryngol.，2002；Jun；122(4)：401-407)。MUC8，一种主要的通气道黏液糖蛋白，暗示着在慢性息肉窦炎的黏液过分泌的发病机理中起着作用(Seong等，Acta Otolaryngol.，2002；Jun；122(4)：401-407)。
在功能上，IL13通过由白介素-13受体α-1链(IL13RA1)和IL-4受体α(IL4RA)组成的受体复合物传导信号(Daines和Hershey，J Biol Chem.，2002；22(12)：10387-10393)。也已经证明白介素-13受体α-2(IL13RA2)仅通过自身以高亲和力结合IL13(Daines和Hershey，J Biol Chem.，2002；22(12)：10387-10393)。然而该受体缺乏信号传导所必需的胞浆结构域，因而被认为是假受体。已经证明IL13RA2主要是胞内分子，在用干扰素(IFN)-γ细胞处理后能够快速从胞内贮备动员并在表面表达。IFN-γ处理后的IL13RA2的表面表达不涉及蛋白合成并导致IL13信号传导减弱(Daines和Hershey，J Biol Chem.，2002；22(12)：10387-10393)。
zcytor17lig基因表达阵列分析的结果表明，zcytor17lig的作用相对于IFN-γ的作用是新颖的，因为zcytor17lig处理肺上皮来源的细胞系导致IL13RA2基因表达的显著增加。从而，zcytor17lig处理在期望长期上调IL13RA2表达和下调IL13的情况下能够有益，例如哮喘、通气道机能亢进(AHR)以及粘液素调控，包括慢性息肉窦炎。
实施例41
鼠zcytor17lig的转基因小鼠
为评价zcytor17lig过表达的体内效应，产生了表达鼠形式基因的多种转基因小鼠建立者，由两个不同的启动子驱动：淋巴细胞特异性启动子Eμ/lck以及普遍存在的启动子EF1α(实施例22)。血清蛋白水平在大约20-300ng/ml的范围内变化。Eμ/lck启动子产生与EF1α-zcytor17lig转基因小鼠相比具有更高水平的血清蛋白的小鼠。
zcytor17lig转基因小鼠在4-8周龄左右形成皮肤表型。转基因小鼠的毛皮变得褶皱，伴有明显的竖毛和轻微到严重的脱毛，通常是在背部、躯干侧面以及眼睛周围。这些表型一致地见于具有可检测水平的血清zcytor17lig蛋白的小鼠中。在这些建立者中，观察到表达Eμ/lck驱动基因的小鼠中是100％发生率，而EF1α-zcytor17lig转基因小鼠中的50％发生率，与其血清中检测到的zcytor17lig相对水平很好地相关。转基因皮肤似乎是痒的，这通过小鼠的抓挠行为证明，有时过度足以诱发皮肤脱落和皮肤病变，通常被感染(至少具有金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus))。小鼠最初以金属耳标签鉴别，但在多数情况下，所述耳标签被小鼠本身强行取下。这通常导致外耳的严重损伤。这些受伤的耳朵通常不能完全痊愈，这由许多动物的耳前和耳间将会形成的持久性脓疱和结痂、渗漏、扩张的创口的存在反映。有些转基因小鼠在其肩部和颈部也形成结痂创口。在一亚组动物中观察到皮肤病变，通常在脱毛早已明显的皮肤区域发展而来，并且通常被小鼠的抓挠行为加剧。
在转基因(而不是非转基因)皮肤样品中利用实时定量RT-PCR检测zcytor17lig RNA转录本，其中Eμ/lck转基因皮肤比来自EF1α-zcytor17lig转基因小鼠的皮肤表达更多的zcytor17lig RNA。编码zcytor17受体亚基zcytor17和OSM-Rbeta的基因在非转基因和zcytor17lig转基因小鼠中都表达。
通过流式细胞仪检查来自Eμ/lck-转基因建立者亚组的淋巴组织揭示了这些小鼠的脾脏和淋巴结中激活的T细胞比例的显著提高。分析的4只小鼠中有2只具有严重扩大的颈部淋巴结，很可能归因于其颈部存在的病变。观察到转基因小鼠脾脏重量的细微增加以及血液中循环的单核细胞和嗜中性粒细胞的细微增加。许多测试的细胞因子没有提高，这些小鼠中循环的血清淀粉样蛋白A的水平也没有变化。对转基因小鼠中免疫细胞的这种效应可能是zcytor17lig的直接或间接结果，或者是皮肤病变的次级效应。
对皮肤之外的许多组织进行了组织病理学检查，包括肝、胸腺、脾、肾和睾丸，而且这些器官中未看到明显的异常。不过，分析转基因皮肤的确揭示了许多变化，这极大地取决于皮肤的来源和场所而不同(如正常、无毛或病变)。在许多情况下，与非转基因对照相比，转基因小鼠的耳朵具有增厚的表皮(例如，大约4层对2层)，并且下面的组织含有低度到中度数目的炎性细胞，它们主要是单核细胞，偶有嗜中性粒细胞。转基因小鼠腹部的表皮似乎多灶性地稍微更厚，但是在下面的真皮或皮下组织中没有明显的炎性细胞的增加。在这些小鼠皮肤的无毛部分，存在放大的毛囊，含有某些碎片但没有发轴(例如，毛发连根脱落)。在病变区，存在表皮的剧烈增厚(棘皮症)、皮肤表面角蛋白增多(角化过度症)、分散的不同大小的溃疡以及真皮中显著数目的炎性细胞(主要是嗜中性粒细胞，伴有不等数目的巨噬细胞和淋巴细胞)。真皮也含有与病变邻接的众多肥大细胞。转基因皮肤病变区有些毛轴处于活化期(毛发生长初期)，与“正常”区中处于复原(毛发生长中期)到失活(毛发生长终期)期的许多毛轴形成对照。
zcytor17lig转基因小鼠的表型与特应性皮炎(AD)患者和小鼠AD模型极为相似。AD是常见的慢性炎症疾病，它以过度活化的辅佐T细胞亚型2(Th2)细胞因子为特征。Zcytor17lig优先被Th2而非Th1细胞表达，这进一步证实了这种对比。尽管AD确切的病因学尚未知晓，牵涉了多种因子，包括过度活化的Th2免疫应答、自身免疫、感染、过敏原和遗传体质。疾病的关键特征包括硬化症(皮肤干燥)、搔痒症(皮肤搔痒)、结膜炎、炎性皮肤病变、金黄色葡萄球菌感染、升高的血液嗜曙红细胞增多、升高的血清IgE和IgG1，以及伴有T细胞、肥大细胞、巨噬细胞和嗜曙红细胞浸润的慢性皮炎。金黄色葡萄球菌聚团或感染被认为恶化AD，并使得这种皮肤病长期性永久化。
AD常见于哮喘和过敏性鼻炎患者中，而且经常是过敏性疾病最初的表现。大约20％西方国家的人群患有这些过敏性疾病，并且发达国家中AD的发生由于未知原因正在上升。AD典型地起始于孩童时期，并且通常从青春期持续到成年期。目前AD的治疗包括局部皮质类固醇、口服环孢菌素A、非皮质类固醇免疫抑制剂例如tacrolimus(软膏形式的FK506)，以及干扰素-γ。尽管存在多种AD疗法，但许多患者的症状未改善，或者他们对药物具有不良反应，需要寻求其它更为有效的治疗剂。
上皮细胞，其表达zcytor17lig杂二聚体受体(zcytoR17和OSM-Rbeta)，位于过敏原进入机体的部位(例如皮肤、肠、肺等)，并在原位与树突细胞(专职抗原提呈细胞)紧密相互作用。树突细胞在过敏性疾病的发病机理中起着重要作用，并且zcytor17lig可与皮肤和肺中上皮细胞上它的受体相互作用，并影响这些器官的免疫应答。Zcytor17lig及其受体因而可能促成了过敏性疾病例如AD和哮喘的发病。此外，zcytor17lig转基因小鼠的表型提示该配体可能在创伤愈合中起作用，因为小鼠似乎不能修复其耳朵的损伤，并且常常在其背部和侧面携带持久的病变。zcytor17lig拮抗剂因而可能代表了这些及其它病征可行的治疗剂。
实施例42
通过腺病毒STAT/SRE报告基因瞬时感染对人类转化的上皮细胞系 的萤光素酶测定
将广泛种类的人类转化的上皮细胞系(见下表16)以10,000细胞/孔的密度种植于96-孔平底板中各细胞类型指定的常规生长培养基中。第二天，细胞用腺病毒报告基因构建体KZ136以5000的感染复数感染。KZ136报告基因除了血清应答元件还含STAT元件。总体积为100ul/孔，使用补充有2mM L-谷氨酰胺(GibcoBRL)、1mM丙酮酸钠(GibcoBRL)和1x胰岛素-转铁蛋白-硒补充剂(GibcoBRL)的DMEM(以下称之为无血清培养基)。细胞过夜培养。
第二天，除去培养基并替换为100μl诱导培养基。诱导培养基是在无血清培养基中稀释为100ng/ml、50ng/ml、25ng/ml、12.5ng/ml、6.25ng/ml、3.125ng/ml和1.56ng/ml的人类zcytorl7lig。利用20％FBS阳性对照对测定进行验证，以确保腺病毒侵染的成功。细胞诱导5小时，此时吸出培养基。细胞然后在50μl/孔的PBS中洗涤，随后在30μl/孔的1×细胞裂解缓冲液(Promega)中裂解。室温下诱导10分钟之后，将25μl/孔的裂解物转移到不透明白色96-孔板中。然后板在照度计中利用5秒集成、40μl/孔萤光素酶底物(Promega)注射进行读数。
结果揭示了多种上皮细胞系对zcytor17lig的应答能力，如下表16所示。
表16
Figure G2009102637047D01871
实施例43
用人类zcytor17lig培养的人类上皮细胞系的细胞因子生产
对人类病态上皮细胞系(A549，人类肺上皮细胞癌；SkLul，人类肺上皮细胞腺癌；DU145，人类前列腺上皮细胞癌；PZ-HPV-7，HPV转化的人类前列腺上皮细胞；U20S，人类骨上皮细胞骨肉瘤)在体外筛选应答zcytor17lig的细胞因子生产。这些细胞系通过RT-PCR鉴定具有zcytor17和OSMR-beta两者，并且在用腺病毒萤光素酶报告构建体KZ136(实施例42)测定时对人类zcytor17lig产生应答。这些细胞系对人类zcytor17lig应答的细胞因子生产在3个系列实验中被确定。
A.用人类zcytor17lig培养的人类病态上皮细胞系的细胞因子 生产
细胞以4.5×105细胞每孔的密度接种到6孔板(Costar)中，并在各自的生长培养基中培养。细胞用测试试剂培养：100ng/mLzcytor17lig、10ng/mL干扰素γ(IFNγ)(R&D Systems，Minneapolis，MN)、10ng/mL肿瘤坏死因子α(TNF α)(R&D Systems，Minneapolis，MN)、10ng/mL IL-1β(R&D Systems，Minneapolis，MN)或100ug/mL脂多糖(LPS)(Sigma)。在24和48小时收集上清，并测定细胞因子：GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)、IL-1b、IL-6、IL-8、MCP-1(巨噬细胞化学引诱蛋白-1)和TNFa。利用来自BioSource International(Camarillo，CA)的多元抗体珠试剂盒测量样品中的细胞因子。测定在Luminex-100仪器(Luminex，Austin，TX)上读数，并利用MasterPlex软件(MiraiBio，Alameda，CA)分析数据。24小时的样品中各细胞系的细胞因子产生(pg/mL)示于下表17。
表17
Figure G2009102637047D01891
Figure G2009102637047D01901
测试的所有细胞系应答对照细胞因子IL-1b和TNFa的刺激产生GM-CSF和IL-8。多数细胞系应答IL-1b和TNFa刺激产生IL-6和MCP-1。与对照相比，zcytor17lig刺激DU145细胞系的IL-6生产(193pg/mL对71pg/mL)。zcytor17lig刺激5种细胞系中的3种产生IL-8，在A549细胞中观察到最大效应(5倍)，并使U2OS细胞的IL-8产量下降2倍。当用zcyto17lig培养时，对DU145和U2Os细胞的MCP-1生产具有轻微的影响。
B.用人类zcytor17lig培养的正常人类上皮细胞系的细胞因子 产生
除了人类上皮细胞系，也测试了正常人类支气管上皮细胞(NHBE，clonetics)。细胞以1×105细胞每孔的密度涂布于24孔板中，并用测试试剂培养：1000ng/mL、100ng/mL及10ng/mL zcytor17lig(A760F)、10ng/mL TNFa、10ng/mL OSM、10ng/mL IFNa、10ng/mL TGFb或10ng/mLLymphotactin。在24和48小时收集上清，并测定细胞因子：IL-6、IL-8、MCP-1、MIP-1a、RANTES和Eotaxin。细胞因子如先前所述测定。48小时的样品中各细胞系的细胞因子产量(pg/mL)示于下表18。
表18
Figure G2009102637047D01921
nd＝未测
DU145细胞应答zcytor17lig产生IL-6，重复了实施例43A中以前的结果。不过，只有A549和U2OS如实施例43A中所看到的那样具有相似的IL-8应答。SkLu1和U2OS细胞都应答zcytor17lig产生MCP-1。NHBE细胞的细胞因子产量与对照相比接近。
C.用人类zcytor17lig和IFNγ共培养的人类病态上皮细胞系的 细胞因子产量
细胞以2×105细胞每孔的密度涂布于24孔板中，并用10ng/mL IFNγ+/-100ng/mL、10ng/mL或1ng/mL的zcytor17lig共培养。在24和48小时收集上清，并如上所述测定IL-8和MCP-1。24小时的样品中各细胞系的细胞因子产量(pg/mL)示于下表19。
表19
A549细胞应答zcytor17lig产生IL-8，不过添加IFNγ共培养细胞没有作用。U2OS细胞在用IFNg培养时产生多20倍的MCP-1，而在用IFNγ+zcytor17lig培养时产生多50倍的MCP-1。
实施例44
Zcytor17lig对DU145前列腺上皮癌细胞中 3 H-TdR掺入的效应
将细胞以25,000/孔的密度种植于96-孔组织群集器(tissueclusters)(Falcon)的MEM(Life Technologies)生长培养基中，此培养基补充有谷氨酰胺、丙酮酸、非必需氨基酸(Life Technologies)和10％胎牛血清(Hyclone)。汇合时(24小时后)，通过0.1％BSA(LifeTechnologies)替代血清，将细胞转至生长停滞培养基。48小时后实现细胞同步化，将生长停滞培养基替换为新鲜培养基。然后以多种浓度(从0.24到60ng/mL)添加人类重组zcytor17lig(测试试剂)(见下表16)，以测试该蛋白对基础DNA复制的效应。有些孔除zcytor17lig以外还接受2.5％FBS(Hyclone)，以测试该蛋白对提高水平的TdR掺入的效应。FBS 10％和20ng/ml血小板衍生生长因子-BB(PDGF-BB)(R&D)用作为阳性对照。
在加入zcytor17lig及其余测试试剂之后18小时，细胞用250nCi/mL[3H]-胸腺嘧啶脱氧核苷(NEN)脉冲4小时。4小时脉冲之后，弃去培养基并向各孔加入100μL胰岛素溶液(Life Technologies)以使细胞脱离。DU145掺入的放射活性通过用Packard Filtermate 196细胞收集器收集细胞并利用Packard TopCount NXT微板闪烁计数器计数掺入的标记物来测定。
正如下文表20中所看到的那样，zcytor17lig诱导胸腺嘧啶脱氧核苷以浓度依赖性的方式掺入到静息细胞(处于0.1％BSA中)中。该效应在所用的最高浓度60ng/mL时达到BSA对照的2.5倍。另外，当通过添加2.5％FBS(在该系列中是同10％FBS一样强有力的有丝分裂原)升高基线掺入时，也可检测到zcytor17lig的这种效应。这些结果因此表明在基础和刺激条件下，zcytor17lig都可作为DU145癌细胞的促有丝分裂因子。
表16显示了zcytor17lig对DU145细胞中胸腺嘧啶脱氧核苷掺入的效应。结果表达为cpm/孔，且数字是三份重复孔的均值±标准差。
表20
  0.1％BSA   2.5％FBS
  BSA对照   1139±336   4228±600
  Zcytor17lig(0.24ng/mL)   1430±136   4894±1037
  Zcytor17lig(0.74ng/mL)   1657±32   5038±810
  Zcytor17lig(2.22ng/mL)   1646±57   5162±808
  Zcytor17lig(6.67ng/mL)   2226±189   6385±1613
  Zcytor17lig(20ng/mL)   2168±108   5880±1085
  Zcytor17lig(60ng/mL)   2512±111   6165±417
  PDGF-BB(20ng/mL)   4094±202   5927±360
实施例45
huzcytor17lig在大肠杆菌中的表达
A.表达huzcytor17Lig/MBP-6H融合多肽的表达载体pRPS01的构建
含编码合于麦芽糖结合蛋白(MBP)C-末端融的huzcytor17lig的多核苷酸的表达质粒通过同源重组构建。所述融合多肽含有N-末端大约388个氨基酸的MBP部分，其融合于本文所述的huzcytor17Lig。利用PCR法如本文所述分离huzcytor17lig cDNA片段。在产生zcytor17lig片段的标准PCR反应中使用了两个引物：(1)一个含有40bp的载体侧翼序列和与huzcytor17lig氨基端相应的20bp，和(2)另一个含与侧翼载体序列相应的3’端40bp和与huzcytor17lig羧基端相应的20bp。100μl PCR反应物中的2μl在1.0％琼脂糖凝胶上用1x TBE缓冲液跑样用以分析，并观察到预期分子量的片段。剩余的PCR反应物与第二PCR管组合并用400μl无水乙醇沉淀。沉淀的DNA重组到Sma1切割的载体pTAP98中，以产生编码MBP-huzcytor17lig融合物的构建体，如下文所述。
载体pTAP98利用酵母同源重组构建。100ng EcoR1切割的pMAL-c2与1μg Pvu1切割的pRS316重组，1μg接头和1μg Sca1/EcoR1切割的pRS316在PCR反应中混合。PCR产物通过100％乙醇沉淀浓缩。感受态酵母细胞(酿酒酵母)株SF838-9Dα，与10μl含大约1μg huzcytor17lig PCR产物(上文)和100ng SmaI消化的pTAP98载体的混合物混合，并在0.75kV，25μF和∞欧姆时电穿孔。将所得的反应混合物涂布到URA-D板上并于30℃温育。
48小时后，选择单个板上的Ura+酵母转化株。分离DNA并转化到电感受态大肠杆菌细胞(如MC1061，Casadaban等J.Mol.Biol. 138，179-207)中。利用标准操作将所得的大肠杆菌细胞涂布到MM/CA+AMP100mg/L板(Pryor和Leiting，Protein Expression and Purification 10：309-319，1997)上。从板上收集4个单克隆，并于37℃接种到具有100μg/ml氨苄青霉素的MM/CA中2小时。1ml各培养物用1mM IPTG诱导。大约2-4小时后，将250μl各诱导的培养物与250μl酸洗玻璃珠以及具有5％βME和染料的250μl Thorner缓冲液(8M尿素，100mM Tris pH7.0，10％甘油，2mM EDTA，5％SDS)混合。样品涡旋1分钟，并加热到65℃ 10分钟。将20μl各样品加样到4％-12％PAGE凝胶(NOVEX)的各泳道中。凝胶在1XMES缓冲液中跑样。阳性克隆被命名为pRPS01并对其进行序列分析。
利用1μl测序的DNA转化电感受态大肠杆菌细胞株MC1061。细胞在2.0kV，25μF和400欧姆时电脉冲。电穿孔后，细胞由0.6ml SOC拯救并在具有100mg/L氨苄青霉素LB+Amp板上于37℃生长过夜。4份培养物用ITPG诱导，并如上所述作阳性筛选。扩增阳性克隆，利用标准技术进行huzcytor17lig/MBP-6H融合蛋白的蛋白纯化。
B.从大肠杆菌发酵液中纯化huzcytor17Lig/MBP-6H
除非另行指出，所有操作都在4℃进行。利用如下操作纯化重组的huzcytor17Lig/MBP-6H多肽。含pRPS01构建体且表达huzcytor17Lig/MBP-6H的大肠杆菌细胞利用标准分子生物学方法构建，并培养在50.0g/L SuperBroth II(12g/L Casien，24g/L酵母提取物，11.4g/L磷酸二钾盐，1.7g/L磷酸单钾盐；Becton Dickenson，Cockeysville，MD)，5g/L甘油和5mL/L 1M硫酸镁中。收集20g细胞并冷冻用于蛋白纯化。
将融化的细胞重悬于500mL直链淀粉平衡缓冲液(20mM Tris，100mMNaCl，pH 8.0)中。利用弗氏压碎器破坏系统(Constant Systems Ltd.，Warwick，UK)于-7℃到-10℃的温度设置以及30K PSI裂解细胞。在循环通过弗氏压碎器前后通过A600读数测定重悬细胞的破损度。加工的细胞悬液以10,000G 30分钟沉淀以除去细胞碎片，并收集上清用于蛋白纯化。
将25ml直链淀粉树脂柱(New England Biolabs，Beverly，MA)(如下文所述制备)倾倒在Bio-Rad，2.5cm D×10cm H玻璃柱中。柱子以10倍柱体积(CV)的直链淀粉平衡缓冲液通过重力压实并平衡。将处理的细胞上清分批加样到直链淀粉树脂上，摇动过夜。使树脂返回到Bio-Rad柱中，并用10 CV的直链淀粉平衡缓冲液通过重力洗涤。柱子用约2 C的直链淀粉洗脱缓冲液(直链淀粉平衡缓冲液+10mM麦芽糖，FlukaBiochemical，瑞士)通过重力洗脱。在洗脱曲线内收集10个5ml的级分，并测定280和320nM的吸光度。淀粉树脂用1 CV的蒸馏水、5 CV的0.1％(w/v)SDS(Sigma)、5 CV的蒸馏水、5 CV的淀粉平衡缓冲液以及最终1 CV的淀粉贮存缓冲液(淀粉平衡缓冲液+0.02％(w/v)叠氮化钠)再生。再生的柱4℃贮存。
合并目的洗脱级分，并在10K透析室(Slide-A-Lyzer，PierceImmunochemical)中对4x4L PBS pH 7.4(Sigma)进行为期8小时的透析，以除去低分子量污染物、实现缓冲液交换以及脱盐。透析后，收集的物质为纯化的huzcytor17/MBP-6H多肽。将纯化的huzcytor17/MBP-6H多肽过滤灭菌，并通过SDS-PAGE考马斯亮蓝染色进行适当的分子量产物的分析。huzcytor17/MBP-6H多肽的浓度通过BCA分析确定为1.28mg/ml。
实施例46
人类zcytor17lig多克隆抗体
A.制备和纯化
多克隆抗体通过用纯化的重组蛋白hzcytor17L/MBP-6H(实施例45)免疫2只雌性新西兰白兔制备。兔子分别接受200μg处于完全弗氏佐剂中的纯化蛋白的初次腹膜内(IP)注射，继之以每隔三周的100μg处于不完全弗氏佐剂中的蛋白作加强IP注射。给予第二次加强注射(总计3次注射)后7到10天，对动物放血并收集血清。动物接着每隔三周被加强免疫并放血。
利用CNBr-SEPHAROSE 4B蛋白柱(Pharmacia LKB)使hzcytor17L/MBP-6H特异性兔血清预吸附抗-MBP抗体，所述蛋白柱利用每克CNBr-SEPHAROSE 10mg非特异性纯化的重组MBP-融合蛋白制备。hzcytor17L/MBP-6H-特异性多克隆抗体利用CNBr-SEPHAROSE 4B蛋白柱(Pharmacia LKB)从预吸附的兔血清中进行亲和纯化，该蛋白柱利用10mg特异性抗原纯化的重组蛋白hzcytor17L/MBP-6H制备。纯化后，多克隆抗体用更换4次的20倍抗体体积的PBS进行至少8小时的透析。Hzcytor17-配体-特异性抗体利用500ng/ml纯化的重组蛋白hzcytor17L/MBP-6H或杆状病毒表达系统中产生的hzcytor17L-CEE作为抗体靶通过ELISA表征。兔抗-hzcytor17L/MBP-6H亲和纯化的抗体的检测下限(LLD)对其特异性纯化的重组抗原hzcytor17L/MBP-6H是100pg/ml，而对纯化的杆状病毒表达系统中产生的重组hzcytor17L-CEE是500pg/ml。
B.兔抗-人ZcytoR17lig MBP-6H抗体的SDS-PAGE和蛋白质印迹 分析
兔抗-人ZcytoR17lig MBP-6H抗体由考马斯亮蓝染色法通过SDS-PAGE(Nupage 4-12％，Invitrogen，Carlsbad，CA)以及利用羊抗-兔IgG-HRP的蛋白质印迹测试。人和小鼠zcytor17lig纯化蛋白(200-25ng)利用Invitrogen Novex’s Xcell II mini-cell电泳，并在室温下利用Novex’s Xcell印迹模具根据仪器手册中提供的说明搅拌着转移到硝化纤维素膜(0.2mm；Invitrogen，Carlsbad，CA)上。转移在含25mM Tris碱、200mM甘氨酸和20％甲醇的缓冲液中于300mA运作1小时。滤膜然后用Western A缓冲液(自制，50mM Tris，pH 7.4，5mMEDTA，pH 8.0，0.05％Igepal CA-630，150mM NaCl及0.25％明胶)于4C轻摇过夜封闭。迅速冲洗硝化纤维素膜，然后将兔抗-人zcytoR17lig MBP-6H(1∶1000)加到Western A缓冲液中。印迹室温下轻摇温育1.5小时。印迹在Western A中冲洗3次各5分钟，然后将羊抗-兔IgG HRP抗体(1∶5000)加到Western A缓冲液中。印迹室温下轻摇温育1小时。印迹在Western A中冲洗3次各5分钟，然后迅速在H2O中冲洗。印迹利用商业上可获得的化学发光底物试剂(ECL蛋白质印迹检测试剂1和2，以1∶1混合；试剂获自Amersham Pharmacia Biotech，Buckinghamshire，England)显色，并将印迹暴露于X-射线胶片长达5分钟。
纯化的人类zcytor17lig在还原条件下表现为大约30kDa的大条带和大约20kDa的小条带。小鼠zcytor17lig不能由兔抗-人zcytoR17lig抗体检测。
实施例47
Zcytor17lig对U937单核细胞粘附于转化的骨髓内皮细胞(TRBMEC)单层 的功效
将转化的骨髓内皮细胞(TRBMEC)以25,000/孔的密度种植于96-孔组织群集器(Falcon)中补充有微血管生长补充物(MVGS)(CascadeBiologics)的培养基M131(Cascade Biologics)中。汇合时(24小时后)，将细胞转至补充有1％胎牛血清(Hyclone)的M199(Gibco-LifeTechnologies)中。以多种浓度(从0.4到10ng/mL)(见下表21)添加人类重组zcytor17lig(测试试剂)，以测试该蛋白对导致粘附的免疫细胞-内皮细胞相互作用的功效。有些孔除了zcytor17lig以外，还接受0.3ng/ml肿瘤坏死因子(TNFalpha R&D Systems)，一种已知的促炎细胞因子，以测试该蛋白在炎性情况下对内皮细胞的功效。单独0.3ng/ml的TNFalpha用作为阳性对照，并且所用的浓度为该系统中最大TNFalpha效应的大约70％，也就是说，它不诱导U937细胞(一种人类单核细胞样细胞系)对内皮最大程度的粘附。鉴于此原因，这种设置可检测TNFalpha效应的上调和下调。有或无TNFalpha的基础粘附水平用作为评估测试试剂效应的基线。
内皮细胞与测试试剂(zcytor17ligand±TNFalpha)过夜温育后，U937细胞用5μMCalcein-AM荧光标记(Molecular Probes)染色，将细胞悬于补充有1％FBS的RPMI 1640(无酚红)中，并以100,000细胞/孔种于冲洗过的TRBMEC单层上。30分钟后，在用温RPMI 1640(无酚红)冲洗孔3次以除去未粘附的U937之前及之后，测量485/538nm激发/发射波长(Molecular Devices micro-plate reader，CytoFluorapplication)下的荧光水平。利用冲洗前(总)和冲洗后(粘附特异性)的荧光水平确定粘附百分比(净粘附/净总x100＝％粘附)。
如下文表21中所看到的那样，zcytor17lig在单独加入时在所用的浓度范围内影响U937细胞对内皮细胞单层的基础粘附(增加小于2倍，ANOVA试验p＜0.01)。阳性对照0.3ng/mL TNFalpha自身将U937细胞的粘附从基础的5.8％提高到35％(6倍)。在TNFalpha存在下，zcytor17lig以浓度依赖性的方式在0.4和10ng/mL之间与TNFalpha协同作用进一步促进U937的粘附(ANOVA试验p＜0.01)。在10ng/mL时，zcytor17lig使TNFalpha的效应增强62％。这些结果表明zcytor17lig本身可能是促炎因子。Zcytor17lig能够与次高浓度的TNFalpha协同提高单核细胞对内皮细胞的粘附。这些结果也说明内皮细胞，尤其是在暴露于促炎细胞因子如TNFalpha时，可能是zcytor17lig作用的靶组织。zcytor17配体对内皮细胞的影响力可能是提高单核细胞或巨噬细胞对促炎活性部位的粘附。激活的单核细胞和巨噬细胞在许多炎性疾病中是重要的。因此抑制单核细胞/巨噬细胞粘附可能提供了zcytor17配体拮抗剂的治疗原理。该数据将支持zcytor17配体拮抗剂在治疗肺病、血管病、自身免疫病、肿瘤转移、涉及过敏反应的疾病、创伤愈合和皮肤病包括接触、过敏性或非过敏性皮炎或银屑病以及炎性肠病中的用途。表21显示了zcytor17lig对U937单核细胞粘附于TRBMEC内皮单层的效应。结果表达为粘附百分比，且数字是三份重复孔的均值±标准差。
表21
  基础   0.3ng/mL TNFα
  基础   5.8±1.2   35±5.5
  zcytor17lig 0.4ng/mL   9±0.7   44.7±2.5
  zcytor17lig 1.1ng/mL   10.4±0.8   45.2±0.6
  zcytor17lig 3.3ng/mL   7.9±1.7   51.1±4
  zcytor17lig 10ng/mL   9.5±0.5   56.6±3.9
鉴于前述内容，尽管为了举例说明的目的，本文描述了本发明的具体实施方案，但应理解可以进行各种修饰而不偏离本发明的范围和精神。因而，本发明除了所附的权利要求之外，不受任何限制。
本申请还涉及如下项目中的内容：
1.分离的多肽，包含与选自下组的氨基酸残基序列具有至少90％同一性的氨基酸残基序列：
(a)如SEQ ID NO：2的残基38(Val)到152(Leu)所示的多肽；
(b)如SEQ ID NO：2的残基27(Leu)到164(Thr)所示的多肽；
(c)如SEQ ID NO：2的残基24(Thr)到164(Thr)所示的多肽；以及
(d)如SEQ ID NO：2的残基1(Met)到164(Thr)所示的多肽。
2.项目1的分离的多肽，其中氨基酸残基73、133和147为半胱氨酸。
3.项目1的分离的多肽，其中多肽与如SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：71所示的zcytor17受体结合。
4.分离的多肽，包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：11中至少14个连续的氨基酸残基。
5.项4的分离的多肽，其中氨基酸残基选自下组：
(a)SEQ ID NO：2的氨基酸残基38-52；
(b)SEQ ID NO：2的氨基酸残基83-98；
(c)SEQ ID NO：2的氨基酸残基104-117；以及
(d)SEQ ID NO：2的氨基酸残基137-152。
6.融合蛋白，包含至少4个多肽，其中多肽自N-端到C-端的次序为：
第一多肽，包含来自SEQ ID NO：2中38-52的氨基酸残基序列；
第一间隔臂，具有6-27个氨基酸残基；
第二多肽，包含选自下组的氨基酸残基序列：
(a)SEQ ID NO：168的IL-2螺旋B氨基酸残基；
(b)SEQ ID NO：164的IL-4螺旋B残基65-83；
(c)SEQ ID NO：102的IL-3螺旋B残基73-86；
(d)SEQ ID NO：166的GM-CSF螺旋B残基72-81；以及
(e)SEQ ID NO：2氨基酸残基83-98；
第二间隔臂，具有5-11个氨基酸残基；
第三多肽，包含选自下组的氨基酸残基序列：
(a)SEQ ID NO：162的IL-2螺旋C残基102-116；
(b)SEQ ID NO：164的IL-4螺旋C残基94-118；
(c)SEQ ID NO：102的IL-3螺旋C残基91-103；
(d)SEQ ID NO：166的GM-CSF螺旋C残基85-103；以及
(e)SEQ ID NO：2的氨基酸残基104-117；
第三间隔臂，具有3-29个氨基酸残基；以及
第四多肽，包含选自下组的氨基酸残基序列：
(a)SEQ ID NO：162的IL-2螺旋D残基134-149；
(b)SEQ ID NO：102的IL-3螺旋D残基123-141；
(c)SEQ ID NO：164的IL-4螺旋D残基133-151；
(d)SEQ ID NO：166的GM-CSF螺旋D残基120-131；以及
(e)SEQ ID NO：2的氨基酸残基137-152。
7.融合蛋白，包含至少4个多肽，其中多肽自N-端到C-端的次序为：
第一多肽，包含选自下组的氨基酸残基序列：
(a)SEQ ID NO：162的IL-2螺旋A残基27-48；
(b)SEQ ID NO：164的IL-4螺旋A残基30-42；
(c)SEQ ID NO：102的IL-3螺旋A残基35-45；
(d)SEQ ID NO：166的GM-CSF螺旋A残基30-44；以及
(e)SEQ ID NO：2氨基酸残基38-52；
第一间隔臂，具有6-27个氨基酸残基；
第二多肽，包含选自下组的氨基酸残基序列：
(a)SEQ ID NO：168的IL-2螺旋B残基；
(b)SEQ ID NO：164的IL-4螺旋B残基65-83；
(c)SEQ ID NO：102的IL-3螺旋B残基73-86；
(d)SEQ ID NO：166的GM-CSF螺旋B残基72-81；以及
(e)SEQ ID NO：2氨基酸残基83-98；
第二间隔臂，具有5-11个氨基酸残基；
第三多肽，包含选自下组的氨基酸残基序列：
(a)SEQ ID NO：162的IL-2螺旋C残基102-116；
(b)SEQ ID NO：164的IL-4螺旋C残基94-118；
(c)SEQ ID NO：102的IL-3螺旋C残基91-103；
(d)SEQ ID NO：166的GM-CSF螺旋C残基85-103；以及
(e)SEQ ID NO：2的氨基酸残基104-117；
第三间隔臂，具有3-29个氨基酸残基；以及
第四多肽，包含来自SEQ ID NO：2中137-152的氨基酸残基序列。
8.根据项目6的融合蛋白，其中第四多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸残基137-152。
9.分离的多核苷酸分子，包含编码项目1中多肽的核苷酸序列。
10.项目9的分离的多核苷酸分子，其中核苷酸选自下组：
(a)如SEQ ID NO：1的核苷酸的139到核苷酸483所示的多核苷酸；
(b)如SEQ ID NO：1的核苷酸的106到核苷酸519所示的多核苷酸；
(c)如SEQ ID NO：1的核苷酸的97到核苷酸519所示的多核苷酸；以及
(d)如SEQ ID NO：1的核苷酸的28到核苷酸519所示的多核苷酸。
11.分离的多核苷酸分子，包括编码项目4中多肽的核苷酸序列。
12.表达载体，包含如下可操作连接的元件：
(a)转录启动子；
(b)DNA片段，编码包含选自下组的氨基酸序列的多肽：
(a)SEQ ID NO：2的氨基酸残基38-52；
(b)SEQ ID NO：2的氨基酸残基83-98；
(c)SEQ ID NO：2的氨基酸残基104-117；以及
(d)SEQ ID NO：2的氨基酸残基137-152；以及
(c)转录终止子。
13.表达载体，包含如下可操作连接的元件：
(a)转录启动子；
(b)DNA片段，编码包含与如SEQ ID NO：2中所示的残基38(Val)到152(Leu)具有至少90％同一性的氨基酸残基序列的多肽；以及
(c)转录终止子。
14.根据项目13的表达载体，包含如下可操作连接的元件：
(a)转录启动子；
(b)DNA片段，编码包含SEQ ID NO：2的氨基酸残基38(Val)到152(Leu)的多肽；以及
(c)转录终止子。
15.培养的细胞，包含根据项目13的表达载体。
16.制备蛋白的方法，包括：
在表达所述DNA片段的条件下培养根据项目15的细胞；以及
回收由所述DNA片段编码的蛋白。
17.制备zcytor17lig多肽抗体的方法，包括：
向动物接种选自下组的多肽：
(a)由9到141个氨基酸残基组成的多肽，其中该多肽与SEQ ID NO：2中氨基酸编号24(Ala)到氨基酸编号164(Thr)的连续氨基酸残基序列相同；
(b)根据项目1的多肽；
(c)包含SEQ ID NO：2中氨基酸编号38-52的氨基酸序列的多肽；
(d)包含SEQ ID NO：2中氨基酸编号83-98的氨基酸序列的多肽；
(e)包含SEQ ID NO：2中氨基酸编号104-117的氨基酸序列的多肽；
(f)包含SEQ ID NO：2中氨基酸编号137-152的氨基酸序列的多肽；
(g)包含SEQ ID NO：2中氨基酸编号38-152的氨基酸序列的多肽；
(h)包含SEQ ID NO：2中氨基酸编号24-164的氨基酸序列的多肽；
(c)包含SEQ ID NO：11中氨基酸编号38-52的氨基酸序列的多肽；
(d)包含SEQ ID NO：11中氨基酸编号85-98的氨基酸序列的多肽；
(e)包含SEQ ID NO：11中氨基酸编号104-118的氨基酸序列的多肽；
(f)包含SEQ ID NO：11中氨基酸编号141-157的氨基酸序列的多肽；
(g)包含SEQ ID NO：11中氨基酸编号38-157的氨基酸序列的多肽；
(h)包含SEQ ID NO：11中氨基酸编号24-163的氨基酸序列的多肽；
(i)包含依据SEQ ID NO：2或SEQ ID NO 11的Hopp/Woods亲水性分布图的抗原表位的多肽，其中所述分布图以滑行的6-残基窗口为基础。忽略隐藏的G、S和T残基以及暴露的H、Y和W残基；且
所述多肽引发动物免疫应答产生抗体；并
从动物中分离抗体。
18.由项目17的方法制备的抗体，其中抗体与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：11的多肽结合。
19.抗体，其与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：11所示的多肽特异性结合。
20.在暴露于抗原或病原体的哺乳动物中刺激免疫应答的方法，包括步骤：
(1)直接或间接地确定所述哺乳动物中存在的抗原或病原体的水平；
(2)给药包含处于可接受的药学载体中的zcytor17lig多肽的组合物；
(3)直接或间接地确定所述哺乳动物的抗原或病原体水平；和
(4)将步骤1中的抗原或病原体水平与步骤3中的抗原或病原体水平进行比较，其中所述水平的变化表示刺激了免疫应答。
21.项目20的方法，进一步包括：
(5)再次给药包含处于可接受的药学载体中的zcytor17lig多肽的组合物；
(6)直接或间接地确定所述哺乳动物的抗原或病原体水平；和
(7)将步骤1中比较的抗原或病原体水平的数目与步骤6中的抗原水平进行比较，其中所述水平的变化表示刺激了免疫应答。
22.扩增造血细胞和造血细胞祖细胞的方法，包括与不存在zcytor17lig时培养的骨髓或外周血细胞相比，用包括足以引起骨髓或外周血细胞中淋巴样细胞数目增加量的zcytor17lig的组合物培养骨髓或外周血细胞。
23项目22的方法，其中造血细胞和造血祖细胞是淋巴样细胞。
24.项目23的方法，其中淋巴样细胞是单核细胞、巨噬细胞或T细胞。
25.在暴露于抗原或病原体的哺乳动物中刺激免疫应答的方法，包括步骤：
(1)确定抗原特异性抗体或病原体特异性抗体的水平；
(2)给药包含处于可接受的药学载体中的zcytor17lig多肽的组合物；
(3)确定给药后抗原特异性抗体或病原体特异性抗体的水平；
(4)将步骤(1)中的抗体水平与步骤(3)中的抗体水平进行比较，其中所述抗体水平的提高表示刺激了免疫应答。
26.检测生物学样品中zcytor17lig RNA存在的方法，包括步骤：
(a)在杂交条件下使zcytor17lig核酸探针与(i)自生物学样品中分离的测试RNA分子或者(ii)自该分离的RNA分子合成的核酸分子接触，其中探针具有包含项目10的核酸分子的部分核苷酸序列或其互补物的核苷酸序列，和
(b)检测核酸探针与测试RNA分子或合成核酸分子间杂交体的形成，
其中杂交体的存在指示生物学样品中zcytor17lig RNA的存在。
27.检测生物学样品中zcytor17lig存在的方法，包括步骤：
(a)使生物学样品与项目19的抗体或抗体片段接触，其中接触是在允许抗体或抗体片段与生物学样品结合的条件下实施的，和
(b)检测任何结合的抗体或结合的抗体片段。
28.杀死癌细胞的方法，包括：
自患者离体获取含癌细胞的组织或生物学样品，或者在体内鉴定癌细胞；
通过项目16的方法制备多肽；
以药学上可接受的载体配制所述多肽；和
向患者给药或者将癌细胞暴露于所述多肽；
其中所述多肽杀死细胞。
29.项目28的杀死癌细胞的方法，其中多肽进一步缀合到毒素上。
30.项目19的抗体，其中抗体选自组：(a)多克隆抗体，(b)鼠单克隆抗体，(c)衍生自(b)的人源化抗体，(d)抗体片段，和(e)人类单克隆抗体。
31.抗体或抗体片段，特异性地与包含选自下组的氨基酸残基序列的多肽结合：
(a)如SEQ ID NO：2的残基38(Val)到152(Leu)所示的多肽；
(b)如SEQ ID NO：2的残基27(Leu)到164(Thr)所示的多肽；
(c)如SEQ ID NO：2的残基24(Thr)到164(Thr)所示的多肽；和
(d)如SEQ ID NO：2的残基1(Met)到164(Thr)所示的多肽；
32.项目19的抗体，其中抗体进一步包含放射性核素、酶、底物、辅因子、荧光标记、化学发光标记、肽标签、磁性颗粒、药物或毒素。
33.抑制由zcytor17lig诱导的造血细胞和造血细胞祖细胞增殖或分化的方法，包括与不存在可溶性细胞因子受体时培养的骨髓或外周血细胞相比，用包含足以降低骨髓或外周血细胞中的造血细胞增殖或分化量的根据项目19的抗体的组合物培养骨髓或外周血细胞。
34.项目33的方法，其中造血细胞和造血祖细胞是淋巴样细胞。
35.项目34的方法，其中淋巴样细胞是巨噬细胞或T细胞。
36.减轻由zcytor17lig诱导的炎症的方法，包括向具有炎症的哺乳动物给药足以减轻炎症量的根据项目19的抗体的组合物。
37.在具有炎症的哺乳动物中抑制炎症反应的方法，包括：
(1)确定炎症分子的水平；
(2)给药包含处于可接受的药学载体中的根据项目19的抗体的组合物；
(3)确定给药后炎症分子的水平；
(4)将步骤(1)中的炎症分子水平与步骤(3)中炎症分子的水平进行比较，其中炎症分子水平无升高或者下降表示抑制了炎症反应。
38.项目31的抗体，其中抗体进一步包含放射性核素、酶、底物、辅因子、荧光标记、化学发光标记、肽标签、磁性颗粒、药物或毒素。
39.抑制由zcytor17lig诱导的造血细胞和造血细胞祖细胞增殖或分化的方法，包括与不存在可溶性细胞因子受体时培养的骨髓或外周血细胞相比，用包含足以降低骨髓或外周血细胞中的造血细胞增殖或分化量的根据项目31的抗体的组合物培养骨髓或外周血细胞。
40.项目39的方法，其中造血细胞和造血祖细胞是淋巴样细胞。
41.项目40的方法，其中淋巴样细胞是巨噬细胞或T细胞。
42.减轻由zcytor17lig诱导的炎症的方法，包括向具有炎症的哺乳动物给药足以减轻炎症量的根据项目31的抗体的组合物。
43.在具有炎症的哺乳动物中抑制炎症反应的方法，包括：
(1)确定炎症分子的水平；
(2)给药包含处于可接受的药学载体中的根据项目31的抗体的组合物；
(3)确定给药后炎症分子的水平；
(4)将步骤(1)中的炎症分子水平与步骤(3)中炎症分子的水平进行比较，其中炎症分子水平无升高或者下降表示抑制了炎症反应。
44.治疗患有zcytor17lig在其中发挥作用的炎性疾病的哺乳动物的方法，包括：
向哺乳动物给药zcytor17lig拮抗剂，从而减轻炎症，其中拮抗剂选自与zcytor17lig(SEQ ID NO：2)的多肽或多肽片段特异性结合的抗体或结合多肽。
45.项目44的方法，其中疾病为慢性炎性疾病。
46.项目45的方法，其中疾病为选自下组的慢性炎性疾病：
(a)炎性肠病；
(b)溃疡性结肠炎；
(c)局限性回肠炎；
(d)特应性皮炎；
(e)湿疹；和
(f)银屑病。
47.项目44的方法，其中疾病为急性炎性疾病。
48.项目47的方法，其中疾病为选自下组的急性炎性疾病：
(a)内毒素血症；
(b)败血病；
(c)中毒性休克综合症；和
(d)感染性疾病。
49.项目44的方法，其中抗体进一步包含放射性核素、酶、底物、辅因子、荧光标记、化学发光标记、肽标签、磁性颗粒、药物或毒素。
50.检测患者炎症的方法，包括：
自患者获取组织或生物学样品；
将该组织或生物学样品与项目19的抗体在抗体与组织或生物学样品中它的互补多肽结合的条件下进行温育；
显现结合到组织或生物学样品中的抗体；和
将结合到患者组织或生物学样品中的抗体水平与结合到正常对照组织或生物学样品的抗体水平进行比较，
其中结合到患者组织或生物学样品的抗体水平相对于正常组织或生物学样品的增加指示患者的炎症。
51.检测患者炎症的方法，包括：
自患者获取组织或生物学样品；
对包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：1互补物中至少14个连续核苷酸的多核苷酸进行标记；
将组织或生物学样品与之在多核苷酸与互补多核苷酸序列杂交的条件下进行温育；
显现组织或生物学样品中的标记多核苷酸；和
将患者组织或生物学样品中标记的多核苷酸杂交的水平与正常对照组织或生物学样品中的杂交水平进行比较，
其中患者组织或生物学样品中标记的多核苷酸杂交相对于正常对照组织或生物学样品中杂交的提高指示患者的炎症。
序列表
<110>ZymoGenetics.Inc.
<120>新的细胞因子zcytor17配体
<130>02-01PC
<150>US 60/350,325
<151>2002-01-18
<150>US 60/375,323
<151>2002-04-25
<150>US 60/435,315
<151>2002-12-19
<160>168
<170>FastSEQ for Windows Version 3.0
<210>1
<211>904
<212>DNA
<213>人类
<220>
<221>CDS
<222>(28)...(519)
<400>1
ctgaagctgg ccttgctctc tctcgcc atg gcc tct cac tca ggc ccc tcg acg 54
                              Met Ala Ser His Ser Gly Pro Ser Thr
                                1               5
tct gtg ctc ttt ctg ttc tgc tgc ctg gga ggc tgg ctg gcc tcc cac   102
Ser Val Leu Phe Leu Phe Cys Cys Leu Gly Gly Trp Leu Ala Ser His
 10                  15                  20                  25
acg ttg ccc gtc cgt tta cta cga cca agt gat gat gta cag aaa ata   150
Thr Leu Pro Val Arg Leu Leu Arg Pro Ser Asp Asp Val Gln Lys Ile
                 30                  35                  40
gtc gag gaa tta cag tcc ctc tcg aag atg ctt ttg aaa gat gtg gag   198
Val Glu Glu Leu Gln Ser Leu Ser Lys Met Leu Leu Lys Asp Val Glu
             45                  50                  55
gaa gag aag ggc gtg ctc gtg tcc cag aat tac acg ctg ccg tgt ctc   246
Glu Glu Lys Gly Val Leu Val Ser Gln Asn Tyr Thr Leu Pro Cys Leu
         60                  65                  70
agc cct gac gcc cag ccg cca aac aac atc cac agc cca gcc atc cgg   294
Ser Pro Asp Ala Gln Pro Pro Asn Asn Ile His Ser Pro Ala Ile Arg
     75                  80                  85
gca tat ctc aag aca atc aga cag cta gac aac aaa tct gtt att gat   342
Ala Tyr Leu Lys Thr Ile Arg Gln Leu Asp Asn Lys Ser Val Ile Asp
 90                  95                 100                 105
gag atc ata gag cac ctc gac aaa ctc ata ttt caa gat gca cca gaa   390
Glu Ile Ile Glu His Leu Asp Lys Leu Ile Phe Gln Asp Ala Pro Glu
                110                 115                 120
aca aac att tct gtg cca aca gac acc cat gaa tgt aaa cgc ttc atc   438
Thr Asn Ile Ser Val Pro Thr Asp Thr His Glu Cys Lys Arg Phe Ile
            125                 130                 135
ctg act att tct caa cag ttt tca gag tgc atg gac ctc gca cta aaa   486
Leu Thr Ile Ser Gln Gln Phe Ser Glu Cys Met Asp Leu Ala Leu Lys
        140                 145                 150
tca ttg acc tct gga gcc caa cag gcc acc act taaggccatc tcttcctttc 539
Ser Leu Thr Ser Gly Ala Gln Gln Ala Thr Thr
    155                 160
ggattggcag gaacttaagg agccttaaaa agatgaccga cagctaagtg tgggaactct 599
gccgtgattc cttaagtaca tttttccaat gaataatctc agggacccct catatgggct 659
agtcccggga gggctgagat gtgaatttgt gaattacctt gaaaaacatt aggttattgt 719
tattagtctt ggtatttatg gaatgctttt cttctgcagg cttaagtctt acttattata 779
ccctcgtgag ggtgggaggt ggcagctatg ttaatttatt gatatttatt gtactaagag 839
ttgtcaatgc tccctggggg agccctcgga atctatttaa taaattatat tgaatttttc 899
tcata                                                             904
<210>2
<211>164
<212>PRT
<213>人类
<400>2
Met Ala Ser His Ser Gly Pro Ser Thr Ser Val Leu Phe Leu Phe Cys
 1               5                  10                  15
Cys Leu Gly Gly Trp Leu Ala Ser His Thr Leu Pro Val Arg Leu Leu
            20                  25                  30
Arg Pro Ser Asp Asp Val Gln Lys Ile Val Glu Glu Leu Gln Ser Leu
        35                  40                  45
Ser Lys Met Leu Leu Lys Asp Val Glu Glu Glu Lys Gly Val Leu Val
    50                  55                  60
Ser Gln Asn Tyr Thr Leu Pro Cys Leu Ser Pro Asp Ala Gln ProPro
65                  70                  75                  80
Asn Asn Ile His Ser Pro Ala Ile Arg Ala Tyr Leu Lys Thr Ile Arg
                85                  90                  95
Gln Leu Asp Asn Lys Ser Val Ile Asp Glu Ile Ile Glu His Leu Asp
            100                 105                 110
Lys Leu Ile Phe Gln Asp Ala Pro Glu Thr Asn Ile Ser Val Pro Thr
        115                 120                 125
Asp Thr His Glu Cys Lys Arg Phe Ile Leu Thr Ile Ser Gln Gln Phe
    130                 135                 140
Ser Glu Cys Met Asp Leu Ala Leu Lys Ser Leu Thr Ser Gly Ala Gln
145                 150                 155                 160
Gln Ala Thr Thr
<210>3
<211>492
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人类zcytor17lig简并多核苷酸SEQ ID NO：2
<221>misc_feature
<222>(1)...(492)
<223>n＝A，T，C或G
<400>3
atggcnwsnc aywsnggncc nwsnacnwsn gtnytnttyy tnttytgytg yytnggnggn 60
tggytngcnw sncayacnyt nccngtnmgn ytnytnmgnc cnwsngayga ygtncaraar 120
athgtngarg arytncarws nytnwsnaar atgytnytna argaygtnga rgargaraar 180
ggngtnytng tnwsncaraa ytayacnytn ccntgyytnw snccngaygc ncarccnccn 240
aayaayathc aywsnccngc nathmgngcn tayytnaara cnathmgnca rytngayaay 300
aarwsngtna thgaygarat hathgarcay ytngayaary tnathttyca rgaygcnccn 360
garacnaaya thwsngtncc nacngayacn caygartgya armgnttyat hytnacnath 420
wsncarcart tywsngartg yatggayytn gcnytnaarw snytnacnws nggngcncar 480
cargcnacna cn                                                     492
<210>4
<211>2903
<212>DNA
<213>人类
<220>
<221>CDS
<222>(497)...(2482)
<400>4
tgaaaagaca tgtgtgtgca gtatgaaaat tgagacagga aggcagagtg tcagcttgtt 60
ccacctcagc tgggaatgtg catcaggcaa ctcaagtttt tcaccacggc atgtgtctgt 120
gaatgtccgc aaaacattag tttcactctt gtcgccaggt tggagtacaa tggcacgatc 180
ttggctcact gcaacctctg cctcccgggt tcaagcgatt ctcctgcctc agcctcccga 240
gtagctggga ttacagttaa caataatgca atccatttcc cagcataagt gggtaagtgc 300
cactttgact tgggctgggc ttaaaagcac aagaaaagct cgcagacaat cagagtggaa 360
acactcccac atcttagtgt ggataaatta aagtccagat tgttcttcct gtcctgactt 420
gtgctgtggg aggtggagtt gcctttgatg caaatccttt gagccagcag aacatctgtg 480
gaacatcccc tgatac atg aag ctc tct ccc cag cct tca tgt gtt aac ctg  532
                  Met Lys Leu Ser Pro Gln Pro Ser Cys Val Asn Leu
                   1               5                   10
ggg atg atg tgg acc tgg gca ctg tgg atg ctc cct tca ctc tgc aaa   580
Gly Met Met Trp Thr Trp Ala Leu Trp Met Leu Pro Ser Leu Cys Lys
         15                  20                  25
ttc agc ctg gca gct ctg cca gct aag cct gag aac att tcc tgt gtc   628
Phe Ser Leu Ala Ala Leu Pro Ala Lys Pro Glu Asn Ile Ser Cys Val
     30                  35                  40
tac tac tat agg aaa aat tta acc tgc act tgg agt cca gga aag gaa   676
Tyr Tyr Tyr Arg Lys Asn Leu Thr Cys Thr Trp Ser Pro Gly Lys Glu
 45                  50                  55                  60
acc agt tat acc cag tac aca gtt aag aga act tac gct ttt gga gaa   724
Thr Ser Tyr Thr Gln Tyr Thr Val Lys Arg Thr Tyr Ala Phe Gly Glu
                 65                  70                  75
aaa cat gat aat tgt aca acc aat agt tct aca agt gaa aat cgt gct   772
Lys His Asp Asn Cys Thr Thr Asn Ser Ser Thr Ser Glu Asn Arg Ala
             80                  85                  90
tcg tgc tct ttt ttc ctt cca aga ata acg atc cca gat aat tat acc   820
Ser Cys Ser Phe Phe Leu Pro Arg Ile Thr Ile Pro Asp Asn Tyr Thr
         95                 100                 105
att gag gtg gaa gct gaa aat gga gat ggt gta att aaa tct cat atg   868
Ile Glu Val Glu Ala Glu Asn Gly Asp Gly Val Ile Lys Ser His Met
    110                 115                 120
aca tac tgg aga tta gag aac ata gcg aaa act gaa cca cct aag att   916
Thr Tyr Trp Arg Leu Glu Asn Ile Ala Lys Thr Glu Pro Pro Lys Ile
125                 130                 135                 140
ttc cgt gtg aaa cca gtt ttg ggc atc aaa cga atg att caa att gaa   964
Phe Arg Val Lys Pro Val Leu Gly Ile Lys Arg Met Ile Gln Ile Glu
                145                 150                 155
tgg ata aag cct gag ttg gcg cct gtt tca tct gat tta aaa tac aca   1012
Trp Ile Lys Pro Glu Leu Ala Pro Val Ser Ser Asp Leu Lys Tyr Thr
            160                 165                 170
ctt cga ttc agg aca gtc aac agt acc agc tgg atg gaa gtc aac ttc   1060
Leu Arg Phe Arg Thr Val Asn Ser Thr Ser Trp Met Glu Val Asn Phe
        175                 180                 185
gct aag aac cgt aag gat aaa aac caa acg tac aac ctc acg ggg ctg   1108
Ala Lys Asn Arg Lys Asp Lys Asn Gln Thr Tyr Asn Leu Thr Gly Leu
    190                 195                 200
cag cct ttt aca gaa tat gtc ata gct ctg cga tgt gcg gtc aag gag   1156
Gln Pro Phe Thr Glu Tyr Val Ile Ala Leu Arg Cys Ala Val Lys Glu
205                 210                 215                 220
tca aag ttc tgg agt gac tgg agc caa gaa aaa atg gga atg act gag   1204
Ser Lys Phe Trp Ser Asp Trp Ser Gln Glu Lys Met Gly Met Thr Glu
                225                 230                 235
gaa gaa gct cca tgt ggc ctg gaa ctg tgg aga gtc ctg aaa cca gct   1252
Glu Glu Ala Pro Cys Gly Leu Glu Leu Trp Arg Val
Figure G2009102637047D02161
Lys Pro Ala
            240                 245                 250
gag gcg gat gga aga agg cca gtg cgg ttg tta tgg aag aag gca aga   1300
Glu Ala Asp Gly Arg Arg Pro Val Arg Leu Leu Trp Lys Lys Ala Arg
        255                 260                 265
gga gcc cca gtc cta gag aaa aca ctt ggc tac aac ata tgg tac tat   1348
Gly Ala Pro Val Leu Glu Lys Thr Leu Gly Tyr Asn Ile Trp Tyr Tyr
    270                 275                 280
cca gaa agc aac act aac ctc aca gaa aca atg aac act act aac cag   1396
Pro Glu Ser Asn Thr Asn Leu Thr Glu Thr Met Asn Thr Thr Asn Gln
285                 290                 295                 300
cag ctt gaa ctg cat ctg gga ggc gag agc ttt tgg gtg tct atg att   1444
Gln Leu Glu Leu His Leu Gly Gly Glu Ser Phe Trp Val Ser Met Ile
                305                 310                 315
tct tat aat tct ctt ggg aag tct cca gtg gcc acc ctg agg att cca   1492
Ser Tyr Asn Ser Leu Gly Lys Ser Pro Val Ala Thr Leu Arg Ile Pro
            320                 32                 5330
gct att caa gaa aaa tca ttt cag tgc att gag gtc atg cag gcc tgc   1540
Ala Ile Gln Glu Lys Ser Phe Gln Cys Ile Glu Val Met Gln Ala Cys
        335                 340                 345
gtt gct gag gac cag cta gtg gtg aag tgg caa agc tct gct cta gac   1588
Val Ala Glu Asp Gln Leu Val Val Lys Trp Gln Ser Ser Ala Leu Asp
    350                 355                 360
gtg aac act tgg atg att gaa tgg ttt ccg gat gtg gac tca gag ccc   1636
Val Asn Thr Trp Met Ile Glu Trp Phe Pro Asp Val Asp Ser Glu Pro
365                 370                 375                 380
acc acc ctt tcc tgg gaa tct gtg tct cag gcc acg aac tgg acg atc   1684
Thr Thr Leu Ser Trp Glu Ser Val Ser Gln Ala Thr Asn Trp Thr Ile
                385                 390                 395
cag caa gat aaa tta aaa cct ttc tgg tgc tat aac atc tct gtg tat   1732
Gln Gln Asp Lys Leu Lys Pro Phe Trp Cys Tyr Asn Ile Ser Val Tyr
            400                 405                 410
cca atg ttg cat gac aaa gtt ggc gag cca tat tcc atc cag gct tat   1780
Pro Met Leu His Asp Lys Val Gly Glu Pro Tyr Ser Ile Gln Ala Tyr
        415                 420                 425
gcc aaa gaa ggc gtt cca tca gaa ggt cct gag acc aag gtg gag aac   1828
Ala Lys Glu Gly Val Pro Ser Glu Gly Pro Glu Thr Lys Val Glu Asn
    430                 435                 440
att ggc gtg aag acg gtc acg atc aca tgg aaa gag att ccc aag agt   1876
Ile Gly Val Lys Thr Val Thr Ile Thr Trp Lys Glu Ile Pro Lys Ser
445                 450                 455                 460
gag aga aag ggt atc atc tgc aac tac acc atc ttt tac caa gct gaa   1924
Glu Arg Lys Gly Ile Ile Cys Asn Tyr Thr Ile Phe Tyr Gln Ala Glu
                465                 470                 475
ggt gga aaa gga ttc tcc aag aca gtc aat tcc agc atc ttg cag tac   1972
Gly Gly Lys Gly Phe Ser Lys Thr Val Asn Ser Ser Ile Leu Gln Tyr
            480                 485                 490
ggc ctg gag tcc ctg aaa cga aag acc tct tac att gtt cag gtc atg   2020
Gly Leu Glu Ser Leu Lys Arg Lys Thr Ser Tyr Ile Val Gln Val Met
        495                 500                 505
gcc agc acc agt gct ggg gga acc aac ggg acc agc ata aat ttc aag   2068
Ala Ser Thr Ser Ala Gly Gly Thr Asn Gly Thr Ser Ile Asn Phe Lys
    510                 515                 520
aca ttg tca ttc agt gtc ttt gag att atc ctc ata act tct ctg att   2116
Thr Leu Ser Phe Ser Val Phe Glu Ile Ile Leu Ile Thr Ser Leu Ile
525                 530                 535                 540
ggt gga ggc ctt ctt att ctc att atc ctg aca gtg gca tat ggt ctc  2164
Gly Gly Gly Leu Leu Ile Leu Ile Ile Leu Thr Val Ala Tyr Gly Leu
                545                 550                 555
aaa aaa ccc aac aaa ttg act cat ctg tgt tgg ccc acc gtt ccc aac  2212
Lys Lys Pro Asn Lys Leu Thr His Leu Cys Trp Pro Thr Val Pro Asn
            560                 565                 570
cct gct gaa agt agt ata gcc aca tgg cat gga gat gat ttc aag gat  2260
Pro Ala Glu Ser Ser Ile Ala Thr Trp His Gly Asp Asp Phe Lys Asp
        575                 580                 585
aag cta aac ctg aag gag tct gat gac tct gtg aac aca gaa gac agg  2308
Lys Leu Asn Leu Lys Glu Ser Asp Asp Ser Val Asn Thr Glu Asp Arg
    590                 595                 600
atc tta aaa cca tgt tcc acc ccc agt gac aag ttg gtg att gac aag  2356
Ile Leu Lys Pro Cys Ser Thr Pro Ser Asp Lys Leu Val Ile Asp Lys
605                 610                 615                 620
ttg gtg gtg aac ttt ggg aat gtt ctg caa gaa att ttc aca gat gaa  2404
Leu Val Val Asn Phe Gly Asn Val Leu Gln Glu Ile Phe Thr Asp Glu
                625                 630                 635
gcc aga acg ggt cag gaa aac aat tta gga ggg gaa aag aat ggg act  2452
Ala Arg Thr Gly Gln Glu Asn Asn Leu Gly Gly Glu Lys Asn Gly Thr
            640                 645                 650
aga att ctg tct tcc tgc cca act tca ata taagtgtgga ctaaaatgcg    2502
Arg Ile Leu Ser Ser Cys Pro Thr Ser Ile
        655                 660
agaaaggtgt cctgtggtct atgcaaatta gaaaggacat gcagagtttt ccaactagga 2562
agactgaatc tgtggcccca agagaaccat ctctgaagac tgggtatgtg gtcttttcca 2622
cacatggacc acctacggat gcaatctgta atgcatgtgc atgagaagtc tgttattaag 2682
tagagtgtga aaacatggtt atggtaatag gaacagcttt taaaatgctt ttgtatttgg 2742
gcctttcata caaaaaagcc ataataccat tttcatgtaa tgctatactt ctatactatt 2802
ttcatgtaat actatacttc tatactattt tcatgtaata ctatacttct atactatttt 2862
catgtaatac tatacttcta tattaaagtt ttacccactc a                     2903
<210>5
<211>662
<212>PRT
<213>人类
<400>5
Met Lys Leu Ser Pro Gln Pro Ser Cys Val Asn Leu Gly Met Met Trp
 1               5                  10                  15
Thr Trp Ala Leu Trp Met Leu Pro Ser Leu Cys Lys Phe Ser Leu Ala
            20                  25                  30
Ala Leu Pro Ala Lys Pro Glu Asn Ile Ser Cys Val Tyr Tyr Tyr Arg
        35                  40                  45
Lys Asn Leu Thr Cys Thr Trp Ser Pro Gly Lys Glu Thr Ser Tyr Thr
    50                  55                  60
Gln Tyr Thr Val Lys Arg Thr Tyr Ala Phe Gly Glu Lys His Asp Asn
65                  70                  75                  80
Cys Thr Thr Asn Ser Ser Thr Ser Gl u Asn Arg Ala Ser Cys Ser Phe
                85                  90                  95
Phe Leu Pro Arg Ile Thr Ile Pro Asp Asn Tyr Thr Ile Glu Val Glu
            100                 105                 110
Ala Glu Asn Gly Asp Gly Val Ile Lys Ser His Met Thr Tyr Trp Arg
        115                 120                 125
Leu Glu Asn Ile Ala Lys Thr Glu Pro Pro Lys Ile Phe Arg Val Lys
    130                 135                 140
Pro Val Leu Gly Ile Lys Arg Met Ile Gln Ile Glu Trp Ile Lys Pro
145                 150                 155                 160
Gl u Leu Ala Pro Val Ser Ser Asp Leu Lys Tyr Thr Leu Arg Phe Arg
                 165                 170                 175
Thr Val Asn Ser Thr Ser Trp Met Glu Val Asn Phe Ala Lys Asn Arg
            180                 185                 190
Lys Asp Lys Asn Gln Thr Tyr Asn Leu Thr Gly Leu Gln Pro Phe Thr
        195                 200                 205
Glu Tyr Val Ile Ala Leu Arg Cys Ala Val Lys Glu Ser Lys Phe Trp
    210                 215                 220
Ser Asp Trp Ser Gln Glu Lys Met Gly Met Thr Glu Glu Glu Ala Pro
225                 230                 235                 240
Cys Gly Leu Glu Leu Trp Arg Val Leu Lys Pro Ala Glu Ala Asp Gly
                245                 250                 255
Arg Arg Pro Val Arg Leu Leu Trp Lys Lys Al a Arg Gly Al a Pro Val
            260                 265                 270
Leu Glu Lys Thr Leu Gly Tyr Asn Ile Trp Tyr Tyr Pro Glu Ser Asn
        275                 280                 285
Thr Asn Leu Thr Glu Thr Met Asn Thr Thr Asn Gln Gln Leu Glu Leu
    290                 295                 300
His Leu Gly Gly Glu Ser Phe Trp Val Ser Met Ile Ser Tyr Asn Ser
305                 310                 315                 320
Leu Gly Lys Ser Pro Val Ala Thr Leu Arg Ile Pro Ala Ile Gln Glu
                325                 330                 335
Lys Ser Phe Gln Cys Ile Glu Val Met Gln Ala Cys Val Ala Glu Asp
            340                 345                 350
Gln Leu Val Val Lys Trp Gln Ser Ser Ala Leu Asp Val Asn Thr Trp
        355                 360                 365
Met Ile Glu Trp Phe Pro Asp Val Asp Ser Glu Pro Thr Thr Leu Ser
    370                 375                 380
Trp Glu Ser Val Ser Gln Ala Thr Asn Trp Thr Ile Gln Gln Asp Lys
385                 390                 395                 400
Leu Lys Pro Phe Trp Cys Tyr Asn Ile Ser Val Tyr Pro Met Leu His
                405                 410                 415
Asp Lys Val Gly Glu Pro Tyr Ser Ile Gln Ala Tyr Ala Lys Glu Gly
            420                 425                 430
Val Pro Ser Glu Gly Pro Glu Thr Lys Val Glu Asn Ile Gly Val Lys
        435                 440                 445
Thr Val Thr Ile Thr Trp Lys Glu Ile Pro Lys Ser Glu Arg Lys Gly
    450                 455                 460
Ile Ile Cys Asn Tyr Thr Ile Phe Tyr Gln Ala Glu Gly Gly Lys Gly
465                 470                 475                 480
Phe Ser Lys Thr Val Asn Ser Ser Ile Leu Gln Tyr Gly Leu Glu Ser
                485                 490                 495
Leu Lys Arg Lys Thr Ser Tyr Ile Val Gln Val Met Ala Ser Thr Ser
            500                 505                 510
Ala Gly Gly Thr Asn Gly Thr Ser IleAsn Phe Lys Thr Leu Ser Phe
        515                 520                 525
Ser Val Phe Glu Ile Ile Leu Ile Thr Ser Leu Ile Gly Gly Gly Leu
    530                 535                 540
Leu Ile Leu Ile Ile Leu Thr Val Ala Tyr Gly Leu Lys Lys Pro Asn
545                 550                 555                 560
Lys Leu Thr His Leu Cys Trp Pro Thr Val Pro Asn Pro Ala Glu Ser
                565                 570                 575
Ser Ile Ala Thr Trp His Gly Asp Asp Phe Lys Asp Lys Leu Asn Leu
            580                 585                 590
Lys Glu Ser Asp Asp Ser Val Asn Thr Glu Asp Arg Ile Leu Lys Pro
        595                 600                 605
Cys Ser Thr Pro Ser Asp Lys Leu Val Ile Asp Lys Leu Val Val Asn
    610                 615                 620
Phe Gly Asn Val Leu Gln Glu Ile Phe Thr Asp Glu Ala Arg Thr Gly
625                 630                 635                 640
Gln Glu Asn Asn Leu Gly Gly Glu Lys Asn Gly Thr Arg Ile Leu Ser
                645                 650                 655
Ser Cys Pro Thr Ser Ile
       660
<210>6
<211>2964
<212>DNA
<213>人类
<220>
<221>CDS
<222>(13)...(2949)
<400>6
gaattcgcca cc atg gct cta ttt gca gtc ttt cag aca aca ttc ttc tta 51
               Met Ala Leu Phe Ala Val Phe Gln Thr Thr Phe Phe Leu
                1               5                  10
aca ttg ctg tcc ttg agg act tac cag agt gaa gtc ttg gct gaa cgt   99
Thr Leu Leu Ser Leu Arg Thr Tyr Gln Ser Glu Val Leu Ala Glu Arg
     15                  20                  25
tta cca ttg act cct gta tca ctt aaa gtt tcc acc aat tct acg cgt   147
Leu Pro Leu Thr Pro Val Ser Leu Lys Val Ser Thr Asn Ser Thr Arg
 30                  35                  40                  45
cag agt ttg cac tta caa tgg act gtc cac aac ctt cct tat cat cag   195
Gln Ser Leu His Leu Gln Trp Thr Val His Asn Leu Pro Tyr His Gln
                 50                  55                  60
gaa ttg aaa atg gta ttt cag atc cag atc agt agg att gaa aca tcc   243
Glu Leu Lys Met Val Phe Gln Ile Gln Ile Ser Arg Ile Glu Thr Ser
             65                  70                  75
aat gtc atc tgg gtg ggg aat tac agc acc act gtg aag tgg aac cag   291
Asn Val Ile Trp Val Gly Asn Tyr Ser Thr Thr Val Lys Trp Asn Gln
         80                  85                  90
gtt ctg cat tgg agc tgg gaa tct gag ctc cct ttg gaa tgt gcc aca   339
Val Leu His Trp Ser Trp Glu Ser Glu Leu Pro Leu Glu Cys Ala Thr
     95                 100                 105
cac ttt gta aga ata aag agt ttg gtg gac gat gcc aag ttc cct gag  387
His Phe Val Arg Ile Lys Ser Leu Val Asp Asp Ala Lys Phe Pro Glu
110                 115                 120                 125
cca aat ttc tgg agc aac tgg agt tcc tgg gag gaa gtc agt gta caa  435
Pro Asn Phe Trp Ser Asn Trp Ser Ser Trp Glu Glu Val Ser Val Gln
                130                 135                 140
gat tct act gga cag gat ata ttg ttc gtt ttc cct aaa gat aag ctg  483
Asp Ser Thr Gly Gln Asp Ile Leu Phe Val Phe Pro Lys Asp Lys Leu
            145                 150                 155
gtg gaa gaa ggc acc aat gtt acc att tgt tac gtt tct agg aac att  531
Val Glu Glu Gly Thr Asn Val Thr Ile Cys Tyr Val Ser Arg Asn Ile
        160                 165                 170
caa aat aat gta tcc tgt tat ttg gaa ggg aaa cag att cat gga gaa  579
Gln Asn Asn Val Ser Cys Tyr Leu Glu Gly Lys Gln Ile His Gly Glu
    175                 180                 185
caa ctt gat cca cat gta act gca ttc aac ttg aat agt gtg cct ttc  627
Gln Leu Asp Pro His Val Thr Ala Phe Asn Leu Asn Ser Val Pro Phe
190                 195                 200                 205
att agg aat aaa ggg aca aat atc tat tgt gag gca agt caa gga aat  675
Ite Arg Asn Lys Gly Thr Asn Ile Tyr Cys Glu Ala Ser Gln Gly Asn
                210                 215                 220
gtc agt gaa ggc atg aaa ggc atc gtt ctt ttt gtc tca aaa gta ctt  723
Val Ser Glu Gly Met Lys Gly Ile Val Leu Phe Val Ser Lys Val Leu
            225                 230                 235
gag gag ccc aag gac ttt tct tgt gaa acc gag gac ttc aag act ttg  771
Glu Glu Pro Lys Asp Phe Ser Cys Glu Thr Glu Asp Phe Lys Thr Leu
        240                 245                 250
cac tgt act tgg gat cct ggg acg gac act gcc ttg ggg tgg tct aaa  819
His Cys Thr Trp Asp Pro Gly Thr Asp Thr Ala Leu Gly Trp Ser Lys
    255                 260                 265
caa cct tcc caa agc tac act tta ttt gaa tca ttt tct ggg gaa aag  867
Gln Pro Ser Gln Ser Tyr Thr Leu Phe Glu Ser Phe Ser Gly Glu Lys
270                 275                 280                 285
aaa ctt tgt aca cac aaa aac tgg tgt aat tgg caa ata act caa gac  915
Lys Leu Cys Thr His Lys Asn Trp Cys Asn Trp Gln Ile Thr Gln Asp
                290                 295                 300
tca caa gaa acc tat aac ttc aca ctc ata gct gaa aat tac tta agg   963
Ser Gln Glu Thr Tyr Asn Phe Thr Leu Ile Ala Glu Asn Tyr Leu Arg
            305                 310                 315
aag aga agt gtc aat atc ctt ttt aac ctg act cat cga gtt tat tta   1011
Lys Arg Ser Val Asn Ile Leu Phe Asn Leu Thr His Arg Val Tyr Leu
        320                 325                 330
atg aat cct ttt agt gtc aac ttt gaa aat gta aat gcc aca aat gcc   1059
Met Asn Pro Phe Ser Val Asn Phe Glu Asn Val Asn Ala Thr Asn Ala
    335                 340                 345
atc atg acc tgg aag gtg cac tcc ata agg aat aat ttc aca tat ttg   1107
Ile Met Thr Trp Lys Val His Ser Ile Arg Asn Asn Phe Thr Tyr Leu
350                 355                 360                 365
tgt cag att gaa ctc cat ggt gaa gga aaa atg atg caa tac aat gtt   1155
Cys Gln Ile Glu Leu His Gly Glu Gly Lys Met Met Gln Tyr Asn Val
                370                 375                 380
tcc atc aag gtg aac ggt gag tac ttc tta agt gaa ctg gaa cct gcc   1203
Ser Ile Lys Val Asn Gly Glu Tyr Phe Leu Ser Glu Leu Glu Pro Ala
            385                 390                 395
aca gag tac atg gcg cga gta cgg tgt gct gat gcc agc cac ttc tgg   1251
Thr Glu Tyr Met Ala Arg Val Arg Cys Ala Asp Ala Ser His Phe Trp
        400                 405                 410
aaa tgg agt gaa tgg agt ggt cag aac ttc acc aca ctt gaa gct gct   1299
Lys Trp Ser Glu Trp Ser Gly Gln Asn Phe Thr Thr Leu Glu Ala Ala
    415                 420                 425
ccc tca gag gcc cct gat gtc tgg aga att gtg agc ttg gag cca gga   1347
Pro Ser Glu Ala Pro Asp Val Trp Arg Ile Val Ser Leu Glu Pro Gly
430                 435                 440                 445
aat cat act gtg acc tta ttc tgg aag cca tta tca aaa ctg cat gcc   1395
Asn His Thr Val Thr Leu Phe Trp Lys Pro Leu Ser Lys Leu His Ala
                450                 455                 460
aat gga aag atc ctg ttc tat aat gta gtt gta gaa aac cta gac aaa   1443
Asn Gly Lys Ile Leu Phe Tyr Asn Val Val Val Glu Asn Leu Asp Lys
            465                 470                 475
cca tcc agt tca gag ctc cat tcc att cca gca cca gcc aac agc aca   1491
Pro Ser Ser Ser Glu Leu His Ser Ile Pro Ala Pro Ala Asn Ser Thr
        480                 485                 490
aaa cta atc ctt gac agg tgt tcc tac caa atc tgc gtc ata gcc aac   1539
Lys Leu Ile Leu Asp Arg Cys Ser Tyr Gln Ile Cys Val Ile Ala Asn
    495                 500                 505
aac agt gtg ggt gct tct cct gct tct gta ata gtc atc tct gca gac   1587
Asn Ser Val Gly Ala Ser Pro Ala Ser Val Ile Val Ile Ser Ala Asp
510                 515                 520                 525
ccc gaa aac aaa gag gtt gag gaa gaa aga att gca ggc aca gag ggt   1635
Pro Glu Asn Lys Glu Val Glu Glu Glu Arg Ile Ala Gly Thr Glu Gly
                530                 535                 540
gga ttc tct ctg tct tgg aaa ccc caa cct gga gat gtt ata ggc tat   1683
Gly Phe Ser Leu Ser Trp Lys Pro Gln Pro Gly Asp Val Ile Gly Tyr
            545                 550                 555
gtt gtg gac tgg tgt gac cat acc cag gat gtg ctc ggt gat ttc cag   1731
Val Val Asp Trp Cys Asp His Thr Gln Asp Val Leu Gly Asp Phe Gln
       560                 565                 570
tgg aag aat gta ggt ccc aat acc aca agc aca gtc att agc aca gat   1779
Trp Lys Asn Val Gly Pro Asn Thr Thr Ser Thr Val Ile Ser Thr Asp
    575                 580                 585
gct ttt agg cca gga gtt cga tat gac ttc aga att tat ggg tta tct   1827
Ala Phe Arg Pro Gly Val Arg Tyr Asp Phe Arg Ile Tyr Gly Leu Ser
590                 595                 600                 605
aca aaa agg att gct tgt tta tta gag aaa aaa aca gga tac tct cag   1875
Thr Lys Arg Ile Ala Cys Leu Leu Glu Lys Lys Thr Gly Tyr Ser Gln
                610                 615                 620
gaa ctt gct cct tca gac aac cct cac gtg ctg gtg gat aca ttg aca   1923
Glu Leu Ala Pro Ser Asp Asn Pro His Val Leu Val Asp Thr Leu Thr
            625                 630                 635
tcc cac tcc ttc act ctg agt tgg aaa gat tac tct act gaa tct caa   1971
Ser His Ser Phe Thr Leu Ser Trp Lys Asp Tyr Ser Thr Glu Ser Gln
        640                 645                 650
cct ggt ttt ata caa ggg tac cat gtc tat ctg aaa tcc aag gcg agg   2019
Pro Gly Phe Ile Gln Gly Tyr His Val Tyr Leu Lys Ser Lys Ala Arg
    655                 660                 665
cag tgc cac cca cga ttt gaa aag gca gtt ctt tca gat ggt tca gaa   2067
Gln Cys His Pro Arg Phe Glu Lys Ala Val Leu Ser Asp Gly Ser Glu
670                 675                 680                 685
tgt tgc aaa tac aaa att gac aac ccg gaagaa aag gca ttg att gtg    2115
Cys Cys Lys Tyr Lys Ile Asp Asn Pro Glu Glu Lys Ala Leu Ile Val
                690                 695                 700
gac aac cta aag cca gaa tcc ttc tat gag ttt ttc atc act cca ttc   2163
Asp Asn Leu Lys Pro Glu Ser Phe Tyr Glu Phe Phe Ile Thr Pro Phe
            705                 710                 715
act agt gct ggt gaa ggc ccc agt gct acg ttc acg aag gtc acgact    2211
Thr Ser Ala Gly Glu Gly Pro Ser Ala Thr Phe Thr Lys Val Thr Thr
        720                 725                 730
ccg gat gaa cac tcc tcg atg ctg att cat atc cta ctg ccc atg gtt   2259
Pro Asp Glu His Ser Ser Met Leu Ile His Ile Leu Leu Pro Met Val
    735                 740                 745
ttc tgc gtc ttg ctc atc atg gtc atg tgc tac ttg aaa agt cag tgg   2307
Phe Cys Val Leu Leu Ile Met Val Met Cys Tyr Leu Lys Ser Gln Trp
750                 755                 760                 765
atc aag gag acc tgt tat cct gac atc cct gac cct tac aag agc agc   2355
Ile Lys Glu Thr Cys Tyr Pro Asp Ile Pro Asp Pro Tyr Lys Ser Ser
                770                 775                 780
atc ctg tca tta ata aaa ttc aag gag aac cct cac cta ata ata atg   2403
Ile Leu Ser Leu Ile Lys Phe Lys Glu Asn Pro His Leu Ile Ile Met
            785                 790                 795
aat gtc agt gac tgt atc cca gat gct att gaa gtt gta agc aag cca   2451
Asn Val Ser Asp Cys Ile Pro Asp Ala Ile Glu Val Val Ser Lys Pro
        800                 805                 810
gaa ggg aca aag ata cag ttc cta ggc act agg aag tca ctc aca gaa   2499
Glu Gly Thr Lys Ile Gln Phe Leu Gly Thr Arg Lys Ser Leu Thr Glu
    815                 820                 825
acc gag ttg act aag cct aac tac ctt tat ctc ctt cca aca gaa aag   2547
Thr Glu Leu Thr Lys Pro Asn Tyr Leu Tyr Leu Leu Pro Thr Glu Lys
830                 835                 840                 845
aat cac tct ggc cct ggc ccc tgc atc tgt ttt gag aac ttg acc tat   2595
Asn His Ser Gly Pro Gly Pro Cys Ile Cys Phe Glu Asn Leu Thr Tyr
                850                 855                 860
aac cag gca gct tct gac tct ggc tct tgt ggc cat gtt cca gta tcc   2643
Asn Gln Ala Ala Ser Asp Ser Gly Ser Cys Gly His Val Pro Val Ser
            865                 870                 875
cca aaa gcc cca agt atg ctg gga cta atg acc tca cct gaa aat gta   2691
Pro Lys Ala Pro Ser Met Leu Gly Leu Met Thr Ser Pro Glu Asn Val
        880                 885                 890
cta aag gca cta gaa aaa aac tac atg aac tcc ctg gga gaa atc cca   2739
Leu Lys Ala Leu Glu Lys Asn Tyr Met Asn Ser Leu Gly Glu Ile Pro
    895                 900                 905
gct gga gaa aca agt ttg aat tat gtg tcc cag ttg gct tca ccc atg   2787
Ala Gly Glu Thr Ser Leu Asn Tyr Val Ser Gln Leu Ala Ser Pro Met
910                 915                 920                 925
ttt gga gac aag gac agt ctc cca aca aac cca gta gag gca cca cac   2835
Phe Gly Asp Lys Asp Ser Leu Pro Thr Asn Pro Val Glu Ala Pro His
                930                 935                 940
tgt tca gag tat aaa atg caa atg gca gtc tcc ctg cgt ctt gcc ttg   2883
Cys Ser Glu Tyr Lys Met Gln Met Ala Val Ser Leu Arg Leu Ala Leu
            945                 950                 955
cct ccc ccg acc gag aat agc agc ctc tcc tca att acc ctt tta gat   2931
Pro Pro Pro Thr Glu Asn Ser Ser Leu Ser Ser Ile Thr Leu Leu Asp
        960                 965                 970
cca ggt gaa cac tac tgc taaccagcac tcgag                          2964
Pro Gly Glu His Tyr Cys
    975
<210>7
<211>979
<212>PRT
<213>人类
<400>7
Met Ala Leu Phe Ala Val Phe Gl n Thr Thr Phe Phe Leu Thr Leu Leu
 1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Thr Tyr Gln Ser Glu Val Leu Ala Glu Arg Leu Pro Leu
            20                  25                  30
Thr Pro Val Ser Leu Lys Val Ser Thr Asn Ser Thr Arg Gln Ser Leu
        35                  40                  45
His Leu Gln Trp Thr Val His Asn Leu Pro Tyr His Gln Glu Leu Lys
    50                  55                  60
Met Val Phe Gln Ile Gln Ile Ser Arg Ile Glu Thr Ser Asn Val Ile
65                  70                  75                  80
Trp Val Gly Asn Tyr Ser Thr Thr Val Lys Trp Asn Gln Val Leu His
                85                  90                  95
Trp Ser Trp Glu Ser Glu Leu Pro Leu Glu Cys Ala Thr His Phe Val
            100                 105                 110
Arg Ile Lys Ser Leu Val Asp Asp Ala Lys Phe Pro Glu Pro Asn Phe
        115                 120                 125
Trp Ser Asn Trp Ser Ser Trp Glu Glu Val Ser Val Gln Asp Ser Thr
    130                 135                 140
Gly Gln Asp Ile Leu Phe Val Phe Pro Lys Asp Lys Leu Val Glu Glu
145                 150                 155                 160
Gly Thr Asn Val Thr Ile Cys Tyr Val Ser Arg Asn Ile Gln Asn Asn
                165                 170                 175
Val Ser Cys Tyr Leu Glu Gly Lys Gln Ile His Gly Glu Gln Leu Asp
            180                 185                 190
Pro His Val Thr Ala Phe Asn Leu Asn Ser Val Pro Phe Ile Arg Asn
        195                 200                 205
Lys Gly Thr Asn Ile Tyr Cys Glu Ala Ser Gln Gly Asn Val Ser Glu
    210                 215                 220
Gly Met Lys Gly Ile Val Leu Phe Val Ser Lys Val Leu Glu Glu Pro
225                 230                 235                 240
Lys Asp Phe Ser Cys Glu Thr Glu Asp Phe Lys Thr Leu His Cys Thr
                245                 250                 255
Trp Asp Pro Gly Thr Asp Thr Ala Leu Gly Trp Ser Lys Gln Pro Ser
            260                 265                 270
Gln Ser Tyr Thr Leu Phe Glu Ser Phe Ser Gly Glu Lys Lys Leu Cys
        275                 280                 285
Thr His Lys Asn Trp Cys Asn Trp Gln Ile Thr Gln Asp Ser Gln Glu
    290                 295                 300
Thr Tyr Asn Phe Thr Leu Ile Ala Glu Asn Tyr Leu Arg Lys Arg Ser
305                 310                 315                 320
Val Asn Ile Leu Phe Asn Leu Thr His Arg Val Tyr Leu Met Asn Pro
                325                 330                 335
Phe Ser Val Asn Phe Glu Asn Val Asn Ala Thr Asn Ala Ile Met Thr
            340                 345                 350
Trp Lys Val His Ser Ile Arg Asn Asn Phe Thr Tyr Leu Cys Gln Ile
        355                 360                 365
Glu Leu His Gly Glu Gly Lys Met Met Gln Tyr Asn Val Ser Ile Lys
    370                 375                 380
Val Asn Gly Glu Tyr Phe Leu Ser Glu Leu Glu Pro Ala Thr Glu Tyr
385                 390                 395                 400
Met Ala Arg Val Arg Cys Ala Asp Ala Ser His Phe Trp Lys Trp Ser
                405                 410                 415
Glu Trp Ser Gly Gln Asn Phe Thr Thr Leu Glu Ala Ala Pro Ser Glu
            420                 425                 430
Ala Pro Asp Val Trp Arg Ile Val Ser Leu Glu Pro Gly Asn His Thr
        435                 440                 445
Val Thr Leu Phe Trp Lys Pro Leu Ser Lys Leu His Ala Asn Gly Lys
    450                 455                 460
Ile Leu Phe Tyr Asn Val Val Val Glu Asn Leu Asp Lys Pro Ser Ser
465                 470                 475                 480
Ser Glu Leu His Ser Ile Pro Ala Pro Ala Asn Ser Thr Lys Leu Ile
                485                 490                 495
Leu Asp Arg Cys Ser Tyr Gln Ile Cys Val Ile Ala Asn Asn Ser Val
            500                 505                 510
Gly Ala Ser Pro Ala Ser Val Ile Val Ile Ser Ala Asp Pro Glu Asn
        515                 520                 525
Lys Glu Val Glu Glu Glu Arg Ile Ala Gly Thr Glu Gly Gly Phe Ser
    530                 535                 540
Leu Ser Trp Lys Pro Gln Pro Gly Asp Val Ile Gly Tyr Val Val Asp
545                 550                 555                 560
Trp Cys Asp His Thr Gln Asp Val Leu Gly Asp Phe Gln Trp Lys Asn
                565                 570                 575
Val Gly Pro Asn Thr Thr Ser Thr Val Ile Ser Thr Asp Ala Phe Arg
            580                 585                 590
Pro Gly Val Arg Tyr Asp Phe Arg Ile Tyr Gly Leu Ser Thr Lys Arg
        595                 600                 605
Ile Ala Cys Leu Leu Glu Lys Lys Thr Gly Tyr Ser Gln Glu Leu Ala
    610                 615                 620
Pro Ser Asp Asn Pro His Val Leu Val Asp Thr Leu Thr Ser His Ser
625                 630                 635                 640
Phe Thr Leu Ser Trp Lys Asp Tyr Ser Thr Glu Ser Gln Pro Gly Phe
                 645                 650                 655
Ile Gln Gly Tyr His Val Tyr Leu Lys Ser Lys Ala Arg Gln Cys His
            660                 665                 670
Pro Arg Phe Glu Lys Ala Val Leu Ser Asp Gly Ser Glu Cys Cys Lys
        675                 680                 685
Tyr Lys Ile Asp Asn Pro Glu Glu Lys Ala Leu Ile Val Asp Asn Leu
    690                 695                 700
Lys Pro Glu Ser Phe Tyr Glu Phe Phe Ile Thr Pro Phe Thr Ser Ala
705                 710                 715                 720
Gly Glu Gly Pro Ser Ala Thr Phe Thr Lys Val Thr Thr Pro Asp Glu
                725                 730                 735
His Ser Ser Met Leu Ile His Ile Leu Leu Pro Met Val Phe Cys Val
            740                 745                 750
Leu Leu Ile Met Val Met Cys Tyr Leu Lys Ser Gln Trp Ile Lys Glu
        755                 760                 765
Thr Cys Tyr Pro Asp Ile Pro Asp Pro Tyr Lys Ser Ser Ile Leu Ser
    770                 775                 780
Leu Ile Lys Phe Lys Glu Asn Pro His Leu Ile Ile Met Asn Val Ser
785                 790                 795                 800
Asp Cys Ile Pro Asp Ala Ile Glu Val Val Ser Lys Pro Glu Gly Thr
                805                 810                 815
Lys Ile Gln Phe Leu Gly Thr Arg Lys Ser Leu Thr Glu Thr Glu Leu
            820                 825                 830
Thr Lys Pro Asn Tyr Leu Tyr Leu Leu Pro Thr Glu Lys Asn His Ser
        835                 840                 845
Gly Pro Gly Pro Cys Ile Cys Phe Glu Asn Leu Thr Tyr Asn Gln Ala
    850                 855                 860
Ala Ser Asp Ser Gly Ser Cys Gly His Val Pro Val Ser Pro Lys Ala
865                 870                 875                 880
Pro Ser Met Leu Gly Leu Met Thr Ser Pro Glu Asn Val Leu Lys Ala
                885                 890                 895
Leu Glu Lys Asn Tyr Met Asn Ser Leu Gly Glu Ile Pro Ala Gly Glu
            900                 905                 910
Thr Ser Leu Asn Tyr Val Ser Gln Leu Ala Ser Pro Met Phe Gly Asp
        915                 920                 925
Lys Asp Ser Leu Pro Thr Asn Pro Val Glu Ala Pro His Cys Ser Glu
    930                 935                 940
Tyr Lys Met Gln Met Ala Val Ser Leu Arg Leu Ala Leu Pro Pro Pro
945                 950                 955                 960
Thr Glu Asn Ser Ser Leu Ser Ser Ile Thr Leu Leu Asp Pro Gly Glu
                965                 970                 975
His Tyr Cys
<210>8
<211>2657
<212>DNA
<213>人类
<220>
<221>CDS
<222>(133)...(2040)
<400>8
cggaggcggc ctgccggggt ggttcggctt cccgttgccg cctcgggcgc tgtacccaga 60
gctcgaagag gagcagcgcg gccgcgcgga cccggcaagg ctgggccgga ctcggggctc 120
ccgagggacg cc atg cgg gga ggc agg ggc gcc cct ttc tgg ctg tgg ccg 171
              Met Arg Gly Gly Arg Gly Ala Pro Phe Trp Leu Trp Pro
               1               5                   10
ctg ccc aag ctg gcg ctg ctg cct ctg ttg tgg gtg ctt ttc cag cgg   219
Leu Pro Lys Leu Ala Leu Leu Pro Leu Leu Trp Val Leu Phe Gln Arg
     15                  20                  25
acg cgt ccc cag ggc agc gcc ggg cca ctg cag tgc tac gga gtt gga   267
Thr Arg Pro Gln Gly Ser Ala Gly Pro Leu Gln Cys Tyr Gly Val Gly
 30                  35                  40                  45
ccc ttg ggc gac ttg aac tgc tcg tgg gag cct ctt ggg gac ctg gga   315
Pro Leu Gly Asp Leu Asn Cys Ser Trp Glu Pro Leu Gly Asp Leu Gly
                 50                  55                  60
gcc ccc tcc gag tta cac ctc cag agc caa aag tac cgt tcc aac aaa   363
Ala Pro Ser Glu Leu His Leu Gln Ser Gln Lys Tyr Arg Ser Asn Lys
             65                  70                  75
acc cag act gtg gca gtg gca gcc gga cgg agc tgg gtg gcc att cct   411
Thr Gln Thr Val Ala Val Ala Ala Gly Arg Ser Trp Val Ala Ile Pro
         80                  85                  90
cgg gaa cag ctc acc atg tct gac aaa ctc ctt gtc tgg ggc act aag   459
Arg Glu Gln Leu Thr Met Ser Asp Lys Leu Leu Val Trp Gly Thr Lys
     95                 100                 105
gca ggc cag cct ctc tgg ccc ccc gtc ttc gtg aac cta gaa acc caa   507
Ala Gly Gln Pro Leu Trp Pro Pro Val Phe Val Asn Leu Glu Thr Gln
110                 115                 120                 125
atg aag cca aac gcc ccc cgg ctg ggc cct gac gtg gac ttt tcc gag   555
Met Lys Pro Asn Ala Pro Arg Leu Gly Pro Asp Val Asp Phe Ser Glu
                130                 135                 140
gat gac ccc ctg gag gcc act gtc cat tgg gcc cca cct aca tgg cca   603
Asp Asp Pro Leu Glu Ala Thr Val His Trp Ala Pro Pro Thr Trp Pro
            145                 150                 155
tct cat aaa gtt ctg atc tgc cag ttc cac tac cga aga tgt cag gag   651
Ser His Lys Val Leu Ile Cys Gln Phe His Tyr Arg Arg Cys Gln Glu
        160                 165                 170
gcg gcc tgg acc ctg ctg gaa ccg gag ctg aag acc ata ccc ctg acc   699
Ala Ala Trp Thr Leu Leu Glu Pro Glu Leu Lys Thr Ile Pro Leu Thr
    175                 180                 185
cct gtt gag atc caa gat ttg gag cta gcc act ggc tac aaa gtg tat   747
Pro Val Glu Ile Gln Asp Leu Glu Leu Ala Thr Gly Tyr Lys Val Tyr
190                 195                 200                 205
ggc cgc tgc cgg atg gag aaa gaa gag gat ttg tgg ggc gag tgg agc   795
Gly Arg Cys Arg Met Glu Lys Glu Glu Asp Leu Trp Gly Glu Trp Ser
                210                 215                 220
ccc att ttg tcc ttc cag aca ccg cct tct gct cca aaa gat gtg tgg   843
Pro Ile Leu Ser Phe Gln Thr Pro Pro Ser Ala Pro Lys Asp Val Trp
            225                 230                 235
gta tca ggg aac ctc tgt ggg acg cct gga gga gag gaa cct ttg ctt   891
Val Ser Gly Asn Leu Cys Gly Thr Pro Gly Gly Glu Glu Pro Leu Leu
        240                 245                 250
cta tgg aag gcc cca ggg ccc tgt gtg cag gtg agc tac aaa gtc tgg
Leu Trp Lys Ala Pro Gly Pro Cys Val Gln Val Ser Tyr Lys Val Trp
    255                 260                 265
ttc tgg gtt gga ggt cgt gag ctg agt cca gaa gga att acc tgc tgc   987
Phe Trp Val Gly Gly Arg Glu Leu Ser Pro Glu Gly Ile Thr Cys Cys
270                 275                 280                 285
tgc tcc cta att ccc agt ggg gcg gag tgg gcc agg gtg tcc gct gtc   1035
Cys Ser Leu Ile Pro Ser Gly Ala Glu Trp Ala Arg Val Ser Ala Val
                290                 295                 300
aac gcc aca agc tgg gag cct ctc acc aac ctc tct ttg gtc tgc ttg   1083
Asn Ala Thr Ser Trp Glu Pro Leu Thr Asn Leu Ser Leu Val Cys Leu
            305                 310                 315
gat tca gcc tct gcc ccc cgt agc gtg gca gtc agc agc atc gct ggg   1131
Asp Ser Ala Ser Ala Pro Arg Ser Val Ala Val Ser Ser Ile Ala Gly
        320                 325                 330
agc acg gag cta ctg gtg acc tgg caa ccg ggg cct ggg gaa cca ctg   1179
Ser Thr Glu Leu Leu Val Thr Trp Gln Pro Gly Pro Gly Glu Pro Leu
    335                 340                 345
gag cat gta gtg gac tgg gct cga gat ggg gac ccc ctg gag aaa ctc   1227
Glu His Val Val Asp Trp Ala Arg Asp Gly Asp Pro Leu Glu Lys Leu
350                 355                 360                 365
aac tgg gtc cgg ctt ccc cct ggg aac ctc agt gct ctg tta cca ggg   1275
Asn Trp Val Arg Leu Pro Pro Gly Asn Leu Ser Ala Leu Leu Pro Gly
                370                 375                 380
aat ttc act gtc ggg gtc ccc tat cga atc act gtg acc gca gtc tct   1323
Asn Phe Thr Val Gly Val Pro Tyr Arg Ile Thr Val Thr Ala Val Ser
            385                 390                 395
gct tca ggc ttg gcc tct gca tcc tcc gtc tgg ggg ttc agg gag gaa   1371
Ala Ser Gly Leu Ala Ser Ala Ser Ser Val Trp Gly Phe Arg Glu Glu
        400                 405                 410
tta gca ccc cta gtg ggg cca acg ctt tgg cga ctc caa gat gcc cct
Figure G2009102637047D02321
Leu Ala Pro Leu Val Gly Pro Thr Leu Trp Arg Leu Gln Asp Ala Pro
    415                 420                 425
cca ggg acc ccc gcc ata gcg tgg gga gag gtc cca agg cac cag ctt   1467
Pro Gly Thr Pro Ala Ile Ala Trp Gly Glu Val Pro Arg His Gln Leu
430                 435                 440                 445
cga ggc cac ctc acc cac tac acc ttg tgt gca cag agt gga acc agc   1515
Arg Gly His Leu Thr His Tyr Thr Leu Cys Ala Gln Ser Gly Thr Ser
                450                 455                 460
ccc tcc gtc tgc atg aat gtg agt ggc aac aca cag agt gtc acc ctg   1563
Pro Ser Val Cys Met Asn Val Ser Gly Asn Thr Gln Ser Val Thr Leu
            465                 470                 475
cct gac ctt cct tgg ggt ccc tgt gag ctg tgg gtg aca gca tct acc   1611
Pro Asp Leu Pro Trp Gly Pro Cys Glu Leu Trp Val Thr Ala Ser Thr
        480                 485                 490
atc gct gga cag ggc cct cct ggt ccc atc ctc cgg ctt cat cta cca   1659
Ile Ala Gly Gln Gly Pro Pro Gly Pro Ile Leu Arg Leu His Leu Pro
    495                 500                 505
gat aac acc ctg agg tgg aaa gtt ctg cca ggc atc cta ttc ttg tgg   1707
Asp Asn Thr Leu Arg Trp Lys Val Leu Pro Gly Ile Leu Phe Leu Trp
510                 515                 520                 525
ggc ttg ttc ctg ttg ggg tgt ggc ctg agc ctg gcc acc tct gga agg   1755
Gly Leu Phe Leu Leu Gly Cys Gly Leu Ser Leu Ala Thr Ser Gly Arg
                530                 535                 540
tgc tac cac cta agg cac aaa gtg ctg ccc cgc tgg gtc tgg gag aaa   1803
Cys Tyr His Leu Arg His Lys Val Leu Pro Arg Trp Val Trp Glu Lys
            545                 550                 555
gtt cct gat cct gcc aac agc agt tca ggc cag ccc cac atg gag caa   1851
Val Pro Asp Pro Ala Asn Ser Ser Ser Gly Gln Pro His Met Glu Gln
        560                 565                 570
gta cct gag gcc cag ccc ctt ggg gac ttg ccc atc ctg gaa gtg gag   1899
Val Pro Glu Ala Gln Pro Leu Gly Asp Leu Pro Ile Leu Glu Val Glu
    575                 580                 585
gag atg gag ccc ccg ccg gtt atg gag tcc tcc cag ccc gcc cag gcc   1947
Glu Met Glu Pro Pro Pro Val Met Glu Ser Ser Gln Pro Ala Gln Ala
590                 595                 600                 605
acc gcc ccg ctt gac tct ggg tat gag aag cac ttc ctg ccc aca cct   1995
Thr Ala Pro Leu Asp Ser Gly Tyr Glu Lys His Phe Leu Pro Thr Pro
                610                 615                 620
gag gag ctg ggc ctt ctg ggg ccc ccc agg cca cag gtt ctg gcc       2040
Glu Glu Leu Gly Leu Leu Gly Pro Pro Arg Pro Gln Val Leu Ala
            625                 630                 635
tgaaccacac gtctggctgg gggctgccag ccaggctaga gggatgctca tgcaggttgc 2100
accccagtcc tggattagcc ctcttgatgg atgaagacac tgaggactca gagaggctga 2160
gtcacttacc tgaggacacc cagccaggca gagctgggat tgaaggaccc ctatagagaa 2220
gggcttggcc cccatgggga agacacggat ggaaggtgga gcaaaggaaa atacatgaaa 2280
ttgagagtgg cagctgcctg ccaaaatctg ttccgctgta acagaactga atttggaccc 2340
cagcacagtg gctcacgcct gtaatcccag cactttggca ggccaaggtg gaaggatcac 2400
ttagagctag gagtttgaga ccagcctggg caatatagca agacccctca ctacaaaaat 2460
aaaacatcaa aaacaaaaac aattagctgg gcatgatggc acacacctgt agtccgagcc 2520
acttgggagg ctgaggtggg aggatcggtt gagcccagga gttcgaagct gcagggacct 2580
ctgattgcac cactgcactc caggctgggt aacagaatga gaccttatct caaaaataaa 2640
caaactaata aaaagca                                                2657
<210>9
<211>636
<212>PRT
<213>人类
<400>9
Met Arg Gly Gly Arg Gly Ala Pro Phe Trp Leu Trp Pro Leu Pro Lys
 1               5                  10                  15
Leu Ala Leu Leu Pro Leu Leu Trp Val Leu Phe Gln Arg Thr Arg Pro
            20                  25                  30
Gln Gly Ser Ala Gly Pro Leu Gln Cys Tyr Gly Val Gly Pro Leu Gly
        35                  40                  45
Asp Leu Asn Cys Ser Trp Glu Pro Leu Gly Asp Leu Gly Ala Pro Ser
    50                  55                  60
Glu Leu His Leu Gln Ser Gln Lys Tyr Arg Ser Asn Lys Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Val Ala Val Ala Ala Gly Arg Ser Trp Val Ala Ile Pro Arg Glu Gln
                85                  90                  95
Leu Thr Met Ser Asp Lys Leu Leu Val Trp Gly Thr Lys Ala Gly Gln
            100                 105                 110
Pro Leu Trp Pro Pro Val Phe Val Asn Leu Glu Thr Gln Met Lys Pro
        115                 120                 125
Asn Ala Pro Arg Leu Gly Pro Asp Val Asp Phe Ser Glu Asp Asp Pro
    130                 135                 140
Leu Glu Ala Thr Val His Trp Ala Pro Pro Thr Trp Pro Ser His Lys
145                 150                 155                 160
Val Leu Ile Cys Gln Phe His Tyr Arg Arg Cys Gln Glu Ala Ala Trp
                165                 170                 175
Thr Leu Leu Glu Pro Glu Leu Lys Thr Ile Pro Leu Thr Pro Val Glu
            180                 185                 190
Ile Gln Asp Leu Glu Leu Ala Thr Gly Tyr Lys Val Tyr Gly Arg Cys
        195                 200                 205
Arg Met Glu Lys Glu Glu Asp Leu Trp Gly Glu Trp Ser Pro Ile Leu
    210                 215                 220
Ser Phe Gln Thr Pro Pro Ser Ala Pro Lys Asp Val Trp Val Ser Gly
225                 230                 235                 240
Asn Leu Cys Gly Thr Pro Gly Gly Glu Glu Pro Leu Leu Leu Trp Lys
                245                 250                 255
Ala Pro Gly Pro Cys Val Gln Val Ser Tyr Lys Val Trp Phe Trp Val
            260                 265                 270
Gly Gly Arg Glu Leu Ser Pro Glu Gly Ile Thr Cys Cys Cys Ser Leu
        275                 280                 285
Ile Pro Ser Gly Ala Glu Trp Ala Arg Val Ser Ala Val Asn Ala Thr
    290                 295                 300
Ser Trp Glu Pro Leu Thr Asn Leu Ser Leu Val Cys Leu Asp Ser Ala
305                 310                 315                 320
Ser Ala Pro Arg Ser Val Ala Val Ser Ser Ile Ala Gly Ser Thr Glu
                325                 330                 335
Leu Leu Val Thr Trp Gln Pro Gly Pro Gly Glu Pro Leu Glu His Val
            340                 345                 350
Val Asp Trp Ala Arg Asp Gly Asp Pro Leu Glu Lys Leu Asn Trp Val
        355                 360                 365
Arg Leu Pro Pro Gly Asn Leu Ser Ala Leu Leu Pro Gly Asn Phe Thr
    370                 375                 380
Val Gly Val Pro Tyr Arg Ile Thr Val Thr Ala Val Ser Ala Ser Gly
385                 390                 395                 400
Leu Ala Ser Ala Ser Ser Val Trp Gly Phe Arg Glu Glu Leu Ala Pro
                405                 410                 415
Leu Val Gly Pro Thr Leu Trp Arg Leu Gln Asp Ala Pro Pro Gly Thr
            420                 425                 430
Pro Ala Ile Ala Trp Gly Glu Val Pro Arg His Gln Leu Arg Gly His
        435                 440                 445
Leu Thr His Tyr Thr Leu Cys Ala Gln Ser Gly Thr Ser Pro Ser Val
    450                 455                 460
Cys Met Asn Val Ser Gly Asn Thr Gln Ser Val Thr Leu Pro Asp Leu
465                 470                 475                 480
Pro Trp Gly Pro Cys Glu Leu Trp Val Thr Ala Ser Thr Ile Ala Gly
                485                 490                 495
Gln Gly Pro Pro Gly Pro Ile Leu Arg Leu His Leu Pro Asp Asn Thr
            500                 505                 510
Leu Arg Trp Lys Val Leu Pro Gly Ile Leu Phe Leu Trp Gly Leu Phe
        515                 520                 525
Leu Leu Gly Cys Gly Leu Ser Leu Ala Thr Ser Gly Arg Cys Tyr His
    530                 535                 540
Leu Arg His Lys Val Leu Pro Arg Trp Val Trp Glu Lys Val Pro Asp
545                 550                 555                 560
Pro Ala Asn Ser Ser Ser Gly Gln Pro His Met Glu Gln Val Pro Glu
                565                 570                 575
Ala Gln Pro Leu Gly Asp Leu Pro Ile Leu Glu Val Glu Glu Met Glu
            580                 585                 590
Pro Pro Pro Val Met Glu Ser Ser Gln Pro Ala Gln Ala Thr Ala Pro
        595                 600                 605
Leu Asp Ser Gly Tyr Glu Lys His Phe Leu Pro Thr Pro Glu Glu Leu
    610                 615                 620
Gly Leu Leu Gly Pro Pro Arg Pro Gln Val Leu Ala
625                 630                 635
<210>10
<211>755
<212>DNA
<213>台湾鼷鼠
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(489)
<400>10
atg atc ttc cac aca gga aca acg aag cct acc ctg gtg ctg ctt tgc   48
Met Ile Phe His Thr Gly Thr Thr Lys Pro Thr Leu Val Leu Leu Cys
 1               5                  10                  15
tgt ata gga acc tgg ctg gcc acc tgc agc ttg tcc ttc ggt gcc cca   96
Cys Ile Gly Thr Trp Leu Ala Thr Cys Ser Leu Ser Phe Gly Ala Pro
             20                  25                  30
ata tcg aag gaa gac tta aga act aca att gac ctc ttg aaa caa gag   144
Ile Ser Lys Glu Asp Leu Arg Thr Thr Ile Asp Leu Leu Lys Gln Glu
         35                  40                  45
tct cag gat ctt tat aac aac tat agc ata aag cag gca tct ggg atg   192
Ser Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Tyr Ser Ile Lys Gln Ala Ser Gly Met
     50                  55                  60
tca gca gac gaa tca ata cag ctg ccg tgt ttc agc ctg gac cgg gaa   240
Ser Ala Asp Glu Ser Ile Gln Leu Pro Cys Phe Ser Leu Asp Arg Glu
65                  70                  75                  80
gca tta acc aac atc tcg gtc atc ata gca cat ctg gag aaa gtc aaa   288
Ala Leu Thr Asn Ile Ser Val Ile Ile Ala His Leu Glu Lys Val Lys
                 85                  90                  95
gtg ttg agc gag aac aca gta gat act tct tgg gtg ata aga tgg cta   336
Val Leu Ser Glu Asn Thr Val Asp Thr Ser Trp Val Ile Arg Trp Leu
            100                 105                 110
aca aac atc agc tgt ttc aac cca ctg aat tta aac att tct gtg cct   384
Thr Asn Ile Ser Cys Phe Asn Pro Leu Asn Leu Asn Ile Ser Val Pro
        115                 120                 125
gga aat act gat gaa tcc tat gat tgt aaa gtg ttc gtg ctt acg gtt   432
Gly Asn Thr Asp Glu Ser Tyr Asp Cys Lys Val Phe Val Leu Thr Val
    130                 135                 140
tta aag cag ttc tca aac tgc atg gca gaa ctg cag gct aag gac aat   480
Leu Lys Gln Phe Ser Asn Cys Met Ala Glu Leu Gln Ala Lys Asp Asn
145                 150                 155                 160
act aca tgc tgagtgatgg gggggggggg ggtgcagtgt cctcagcagt           529
Thr Thr Cys
gcctgtcctt cgagggctga gcttgcaacc caggacttaa ctccaaaggg actgtgcggt 589
cattactagt catgttattt atgtttttat tttgtccact gaaatcttgt tctgctaccc 649
tgtagggact ggaagtggca gctatattta tttatttatg tactgagttt gttaacgctc 709
catggaggag ccttcagagt ctatttaata aattatattg acatga                755
<210>11
<211>163
<212>PRT
<213>台湾鼷鼠
<400>11
Met Ile Phe His Thr Gly Thr Thr Lys Pro Thr Leu Val Leu Leu Cys
 1               5                  10                  15
Cys Ile Gly Thr Trp Leu Ala Thr Cys Ser Leu Ser Phe Gly Ala Pro
            20                  25                  30
Ile Ser Lys Glu Asp Leu Arg Thr Thr Ile Asp Leu Leu Lys Gln Glu
        35                  40                  45
Ser Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Tyr Ser Ile Lys Gln Ala Ser Gly Met
    50                  55                  60
Ser Ala Asp Glu Ser Ile Gln Leu Pro Cys Phe Ser Leu Asp Arg Glu
65                  70                  75                  80
Ala Leu Thr Asn Ile Ser Val Ile Ile Ala His Leu Glu Lys Val Lys
                85                  90                  95
Val Leu Ser Glu Asn Thr Val Asp Thr Ser Trp Val Ile Arg Trp Leu
            100                 105                 110
Thr Asn Ile Ser Cys Phe Asn Pro Leu Asn Leu Asn Ile Ser Val Pro
        115                 120                 125
Gly Asn Thr Asp Glu Ser Tyr Asp Cys Lys Val Phe Val Leu Thr Val
    130                 135                 140
Leu Lys Gln Phe Ser Asn Cys Met Ala Glu Leu Gln Ala Lys Asp Asn
145                 150                 155                 160
Thr Thr Cys
<210>12
<211>489
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>小鼠zcytor17lig简并多核苷酸SEQ ID NO：11
<221>misc_feature
<222>(1)...(489)
<223>n＝A，T，C或G
<400>12
atgathttyc ayacnggnac nacnaarccn acnytngtny tnytntgytg yathggnacn 60
tggytngcna cntgywsnyt nwsnttyggn gcnccnathw snaargarga yytnmgnacn 120
acnathgayy tnytnaarca rgarwsncar gayytntaya ayaaytayws nathaarcar 180
gcnwsnggna tgwsngcnga ygarwsnath carytnccnt gyttywsnyt ngaymgngar 240
gcnytnacna ayathwsngt nathathgcn cayytngara argtnaargt nytnwsngar 300
aayacngtng ayacnwsntg ggtnathmgn tggytnacna ayathwsntg yttyaayccn 360
ytnaayytna ayathwsngt nccnggnaay acngaygarw sntaygaytg yaargtntty 420
gtnytnacng tnytnaarca rttywsnaay tgyatggcng arytncargc naargayaay 480
acnacntgy                                                         489
<210>13
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC6673
<400>13
gcgcaaggtg ccgttcacag c                                           21
<210>14
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC29082
<400>14
caatttgttg ggttttttta gcagcagtag gcccag                           36
<210>15
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC29083
<400>15
ctgggcctac tgctgctaaa aaaacccaac aaattg                           36
<210>16
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC29145
<400>16
gcgtctagag ggttatattg aagttgggca ggaaga                 36
<210>17
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>Gly-Ser修饰的Glu-Glu(CEE)肽标签
<400>17
Gly Ser Glu Tyr Met Pro Met Glu
 1               5
<210>18
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC29359
<400>18
gcgggatcca tgaagctctc tccccagcct tca                    33
<210>19
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC27899
<400>19
ccagaacttt gactccttga ccg                               23
<210>20
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC27895
<400>20
gaagtcaact tcgctaagaa ccg                     23
<210>21
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC29122
<400>21
ccgctcgagt tatattgaag ttgggcagga agac         34
<210>22
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC29180
<400>22
cctggagtcc ctgaaacgaa ag                      22
<210>23
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC29122
<400>23
ccgctcgagt tatattgaag ttgggcagga agac
Figure G2009102637047D02411
<210>24
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC9791
<400>24
cgttccaaca aaacccagac                    20
<210>25
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC9793
<400>25
tggcgttgac agcggacac                     19
<210>26
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC40109
<400>26
ccattccagc accagccaac                    20
<210>27
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC40112
<400>27
tacaacttca atagcatctg gg                 22
<210>28
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC13496
<400>28
ccctgcagtg atcaacatgg ccaagttgac cagtgccgtt              40
<210>29
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC13945
<400>29
gcccatggac tagtttcgaa aggtcgagtg tcagtcctgc tcctc        45
<210>30
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC18698
<400>30
tttttttctc gagacttttt tttttttttt tttt                    34
<210>31
<220>
<223>略过的序列
<400>31
000
<210>32
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>具有Gly-Ser残基对的Glu-Glu(CEE)肽标签
     pair
<400>32
Gly Ser Gly Gly Glu Tyr Met Pro Met Glu
 1               5                  10
<210>33
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC29451
<400>33
ccggaattcc cctgatacat gaagctctct ccc                33
<210>34
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC29124
<400>34
cgcggatccc tcaaagacac tgaatgacaa tgt                33
<210>35
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>无Gly-Ser残基对的Glu-Glu(CEE)肽标签
<400>35
Glu Tyr Met Pro Met Glu
 1               5
<210>36
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>C-末端FLAG肽序列
<400>36
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
 1               5
<210>37
<211>684
<212>DNA
<213>人类
<400>37
tcagacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aagccgaggg ggcaccgtca 60
gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 120
acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 180
gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 240
taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 300
aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca tcctccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 360
aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc 420
aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 480
gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 540
tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 600
gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 660
agcctctccc tgtctccggg taaa                                        684
<210>38
<211>2295
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人类zcytor17-Fc4融合多核苷酸
<221>CDS
<222>(1)...(2295)
<400>38
atg aag ctc tct ccc cag cct tca tgt gtt aac ctg ggg atg atg tgg   48
Met Lys Leu Ser Pro Gln Pro Ser Cys Val Asn Leu Gly Met Met Trp
 1               5                   10                  15
acc tgg gca ctg tgg atg ctc cct tca ctc tgc aaa ttc agc ctg gca   96
Thr Trp Ala Leu Trp Met Leu Pro Ser Leu Cys Lys Phe Ser Leu Ala
             20                  25                  30
gct ctg cca gct aag cct gag aac att tcc tgt gtc tac tac tat agg   144
Ala Leu Pro Ala Lys Pro Glu Asn Ile Ser Cys Val Tyr Tyr Tyr Arg
         35                  40                  45
aaa aat tta acc tgc act tgg agt cca gga aag gaa acc agt tat acc   192
Lys Asn Leu Thr Cys Thr Trp Ser Pro Gly Lys Glu Thr Ser Tyr Thr
     50                  55                  60
cag tac aca gtt aag aga act tac gct ttt gga gaa aaa cat gat aat   240
Gln Tyr Thr Val Lys Arg Thr Tyr Ala Phe Gly Glu Lys His Asp Asn
 65                  70                  75                  80
tgt aca acc aat agt tct aca agt gaa aat cgt gct tcg tgc tct ttt   288
Cys Thr Thr Asn Ser Ser Thr Ser Glu Asn Arg Ala Ser Cys Ser Phe
                 85                  90                  95
ttc ctt cca aga ata acg atc cca gat aat tat acc att gag gtg gaa   336
Phe Leu Pro Arg Ile Thr Ile Pro Asp Asn Tyr Thr Ile Glu Val Glu
            100                 105                 110
gct gaa aat gga gat ggt gta att aaa tct cat atg aca tac tgg aga   384
Ala Glu Asn Gly Asp Gly Val Ile Lys Ser His Met Thr Tyr Trp Arg
        115                 120                 125
tta gag aac ata gcg aaa act gaa cca cct aag att ttc cgt gtg aaa   432
Leu Glu Asn Ile Ala Lys Thr Glu Pro Pro Lys Ile Phe Arg Val Lys
    130                 135                 140
cca gtt ttg ggc atc aaa cga atg att caa att gaa tgg ata aag cct   480
Pro Val Leu Gly Ile Lys Arg Met Ile Gln Ile Glu Trp Ile Lys Pro
145                 150                 155                 160
gag ttg gcg cct gtt tca tct gat tta aaa tac aca ctt cga ttc agg   528
Glu Leu Ala Pro Val Ser Ser Asp Leu Lys Tyr Thr Leu Arg Phe Arg
                165                 170                 175
aca gtc aac agt acc agc tgg atg gaa gtc aac ttc gct aag aac cgt   576
Thr Val Asn Ser Thr Ser Trp Met Glu Val Asn Phe Ala Lys Asn Arg
            180                 185                 190
aag gat aaa aac caa acg tac aac ctc acg ggg ctg cag cct ttt aca   624
Lys Asp Lys Asn Gln Thr Tyr Asn Leu Thr Gly Leu Gln Pro Phe Thr
        195                 200                 205
gaa tat gtc ata gct ctg cga tgt gcg gtc aag gag tca aag ttc tgg   672
Glu Tyr Val Ile Ala Leu Arg Cys Ala Val Lys Glu Ser Lys Phe Trp
    210                 215                 220
agt gac tgg agc caa gaa aaa atg gga atg act gag gaa gaa gct cca   720
Ser Asp Trp Ser Gln Glu Lys Met Gly Met Thr Glu Glu Glu Ala Pro
225                 230                 235                 240
tgt ggc ctg gaa ctg tgg aga gtc ctg aaa cca gct gag gcg gat gga   768
Cys Gly Leu Glu Leu Trp Arg Val Leu Lys Pro Ala Glu Ala Asp Gly
                245                 250                 255
aga agg cca gtg cgg ttg tta tgg aag aag gca aga gga gcc cca gtc
Figure G2009102637047D02471
Arg Arg Pro Val Arg Leu Leu Trp Lys Lys Ala Arg Gly Ala Pro Val
             260                 265                 270
cta gag aaa aca ctt ggc tac aac ata tgg tac tat cca gaa agc aac   864
Leu Glu Lys Thr Leu Gly Tyr Asn Ile Trp Tyr Tyr Pro Glu Ser Asn
        275                 280                 285
act aac ctc aca gaa aca atg aac act act aac cag cag ctt gaa ctg   912
Thr Asn Leu Thr Glu Thr Met Asn Thr Thr Asn Gln Gln Leu Glu Leu
    290                 295                 300
cat ctg gga ggc gag agc ttt tgg gtg tct atg att tct tat aat tct   960
His Leu Gly Gly Glu Ser Phe Trp Val Ser Met Ile Ser Tyr Asn
Figure G2009102637047D02472
305                 310                 315
Figure G2009102637047D02473
ctt ggg aag tct cca gtg gcc acc ctg agg att cca gct att caa gaa   1008
Leu Gly Lys Ser Pro Val Ala Thr Leu Arg Ile Pro Ala Ile Gln Glu
                325                 330                 335
aaa tca ttt cag tgc att gag gtc atg cag gcc tgc gtt gct gag gac   1056
Lys Ser Phe Gln Cys Ile Glu Val Met Gln Ala Cys Val Ala Glu Asp
            340                 345                 350
cag cta gtg gtg aag tgg caa agc tct gct cta gac gtg aac act tgg   1104
Gln Leu Val Val Lys Trp Gln Ser Ser Ala Leu Asp Val Asn Thr Trp
        355                 360                 365
atg att gaa tgg ttt ccg gat gtg gac tca gag ccc acc acc ctt tcc   1152
Met Ile Glu Trp Phe Pro Asp Val Asp Ser Glu Pro Thr Thr Leu Ser
    370                 375                 380
tgg gaa tct gtg tct cag gcc acg aac tgg acg atc cag caa gat aaa   1200
Trp Glu Ser Val Ser Gln Ala Thr Asn Trp Thr Ile Gln Gln Asp Lys
385                 390                 395                 400
tta aaa ccc ttc tgg tgc tat aac atc tct gtg tat cca atg ttg cat   1248
Leu Lys Pro Phe Trp Cys Tyr Asn Ile Ser Val Tyr Pro Met Leu His
                405                 410                 415
gac aaa gtt ggc gag cca tat tcc atc cag gct tat gcc aaa gaa ggc   1296
Asp Lys Val Gly Glu Pro Tyr Ser Ile Gln Ala Tyr Ala Lys Glu Gly
            420                 425                 430
gtt cca tca gaa ggt cct gag acc aag gtg gag aac att ggc gtg aag   1344
Val Pro Ser Glu Gly Pro Glu Thr Lys Val Glu Asn Ile Gly Val Lys
        435                 440                 445
acg gtc acg atc aca tgg aaa gag att ccc aag agt gag aga aag ggt   1392
Thr Val Thr Ile Thr Trp Lys Glu Ile Pro Lys Ser Glu Arg Lys Gly
    450                 455                 460
atc atc tgc aac tac acc atc ttt tac caa gct gaa ggt gga aaa gga   1440
Ile Ile Cys Asn Tyr Thr Ile Phe Tyr Gln Ala Glu Gly Gly Lys Gly
465                 470                 475                 480
ttc tcc aag aca gtc aat tcc agc atc ttg cag tac ggc ctg gag tcc   1488
Phe Ser Lys Thr Val Asn Ser Ser Ile Leu Gln Tyr Gly Leu Glu Ser
                485                 490                 495
ctg aaa cga aag acc tct tac att gtt cag gtc atg gcc agc acc agt   1536
Leu Lys Arg Lys Thr Ser Tyr Ile Val Gln Val Met Ala Ser Thr Ser
            500                 505                 510
gct ggg gga acc aac ggg acc agc ata aat ttc aag aca ttg tca ttc   1584
Ala Gly Gly Thr Asn Gly Thr Ser Ile Asn Phe Lys Thr Leu Ser Phe
        515                 520                 525
agt gtc ttt gag gag ccc aga tct tca gac aaa act cac aca tgc cca   1632
Ser Val Phe Glu Glu Pro Arg Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
    530                 535                 540
ccg tgc cca gca cct gaa gcc gag ggg gca ccg tca gtc ttc ctc ttc   1680
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe
545                 550                 555                 560
ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc   1728
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
                565                 570                 575
aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc   1776
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
            580                 585                 590
aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg   1824
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
        595                 600                 605
cgg gag gag cag tac aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc   1872
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
    610                 615                 620
gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc   1920
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
625                 630                 635                 640
tcc aac aaa gcc ctc cca tcc tcc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc   1968
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
                645                 650                 655
aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg   2016
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
            660                 665                 670
gat gag ctg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc   2064
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
        675                 680                 685
ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg   2112
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
    690                 695                 700
gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc   2160
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
7057                 10                 715                 720
ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag   2208
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
                725                 730                 735
ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac   2256
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
            740                 745                 750
tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa taa               2295
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys  ＊
        755                 760
<210>39
<211>764
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人类zcytor17-Fc4融合多肽
<400>39
Met Lys Leu Ser Pro Gln Pro Ser Cys Val Asn Leu Gly Met Met Trp
 1               5                  10                  15
Thr Trp Ala Leu Trp Met Leu Pro Ser Leu Cys Lys Phe Ser Leu Ala
            20                  25                  30
Ala Leu Pro Ala Lys Pro Glu Asn Ile Ser Cys Val Tyr Tyr Tyr Arg
        35                  40                  45
Lys Asn Leu Thr Cys Thr Trp Ser Pro Gly Lys Glu Thr Ser Tyr Thr
    50                  55                  60
Gln Tyr Thr Val Lys Arg Thr Tyr Ala Phe Gly Glu Lys His Asp Asn
65                  70                  75                  80
Cys Thr Thr Asn Ser Ser Thr Ser Glu Asn Arg Ala Ser Cys Ser Phe
                85                  90                  95
Phe Leu Pro Arg Ile Thr Ile Pro Asp Asn Tyr Thr Ile Glu Val Glu
            100                 105                 110
Ala Glu Asn Gly Asp Gly Val Ile Lys Ser His Met Thr Tyr Trp Arg
        115                 120                 125
Leu Glu Asn Ile Ala Lys Thr Glu Pro Pro Lys Ile Phe Arg Val Lys
    130                 135                 140
Pro Val Leu Gly Ile Lys Arg Met Ile Gln Ile Glu Trp Ile Lys Pro
145                 150                 155                 160
Glu Leu Ala Pro Val Ser Ser Asp Leu Lys Tyr Thr Leu Arg Phe Arg
                165                 170                 175
Thr Val Asn Ser Thr Ser Trp Met Glu Val Asn Phe Ala Lys Asn Arg
            180                 185                 190
Lys Asp Lys Asn Gln Thr Tyr Asn Leu Thr Gly Leu Gln Pro Phe Thr
        195                 200                 205
Glu Tyr Val Ile Ala Leu Arg Cys Ala Val Lys Glu Ser Lys Phe Trp
    210                 215                 220
Ser Asp Trp Ser Gln Glu Lys Met Gly Met Thr Glu Glu Glu Ala Pro
225                 230                 235                 240
Cys Gly Leu Glu Leu Trp Arg Val Leu Lys Pro Ala Glu Ala Asp Gly
                245                 250                 255
Arg Arg Pro Val Arg Leu Leu Trp Lys Lys Ala Arg Gly Ala Pro Val
            260                 265                 270
Leu Glu Lys Thr Leu Gly Tyr Asn Ile Trp Tyr Tyr Pro Glu Ser Asn
        275                 280                 285
Thr Asn Leu Thr Glu Thr Met Asn Thr Thr Asn Gln Gln Leu Glu Leu
    290                 295                 300
His Leu Gly Gly Glu Ser Phe Trp Val Ser Met Ile Ser Tyr Asn Ser
305                 310                 315                 320
Leu Gly Lys Ser Pro Val Ala Thr Leu Arg Ile Pro Ala Ile Gln Glu
                325                 330                 335
Lys Ser Phe Gln Cys Ile Glu Val Met Gln Ala Cys Val Ala Glu Asp
            340                 345                 350
Gln Leu Val Val Lys Trp Gln Ser Ser Ala Leu Asp Val Asn Thr Trp
        355                 360                 365
Met Ile Glu Trp Phe Pro Asp Val Asp Ser Glu Pro Thr Thr Leu Ser
    370                 375                 380
Trp Glu Ser Val Ser Gln Ala Thr Asn Trp Thr Ile Gln Gln Asp Lys
385                 390                 395                 400
Leu Lys Pro Phe Trp Cys Tyr Asn Ile Ser Val Tyr Pro Met Leu His
                405                 410                 415
Asp Lys Val Gly Glu Pro Tyr Ser Ile Gln Ala Tyr Ala Lys Glu Gly
            420                 425                 430
Val Pro Ser Glu Gly Pro Glu Thr Lys Val Glu Asn Ile Gly Val Lys
        435                 440                 445
Thr Val Thr Ile Thr Trp Lys Glu Ile Pro Lys Ser Glu Arg Lys Gly
    450                 455                 460
Ile Ile Cys Asn Tyr Thr Ile Phe Tyr Gln Ala Glu Gly Gly Lys Gly
465                 470                 475                 480
Phe Ser Lys Thr Val Asn Ser Ser Ile Leu Gln Tyr Gly Leu Glu Ser
                485                 490                 495
Leu Lys Arg Lys Thr Ser Tyr Ile Val Gln Val Met Ala Ser Thr Ser
            500                 505                 510
Ala Gly Gly Thr Asn Gly Thr Ser Ile Asn Phe Lys Thr Leu Ser Phe
        515                 520                 525
Ser Val Phe Glu Glu Pro Arg Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
    530                 535                 540
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe
545                 550                 555                 560
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
                565                 570                 575
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
            580                 585                 590
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
        595                 600                 605
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
    610                 615                 620
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
625                 630                 635                 640
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
                645                 650                 655
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
            660                 665                 670
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
        675                 680                 685
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
    690                 695                 700
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
705                 710                 715                 720
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
Figure G2009102637047D02521
                725                 730                 735
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
            740                 745                 750
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
        755                 760
<210>40
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC29157
<400>40
ctagtatggc cggccatgaa gctctctccc cagc               34
<210>41
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC29150
<400>41
gtctgaagat ctgggctcct caaagacact gaatgacaat g       41
<210>42
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC41458
<400>42
tggacctcgc actaaaatca t                             21
<210>43
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC41457
<400>43
aatcacggca gagttcccac ac                                          22
<210>44
<211>100
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC12749
<400>44
gtaccttccc gtaaatccct ccccttcccg gaattacacc cgcgtatttc ccagaaaagg 60
aactgtagat ttctaggaat tcaatccttg gccacgcgtc                       100
<210>45
<211>100
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC12748
<400>45
tcgagacgcg tggccaagga ttgaattcct agaaatctac agttcctttt ctgggaaata 60
cgcgggtgta attccgggaa ggggagggat ttacgggaag                       100
<210>46
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC10651
<400>46
agcttttctg cagcagctct                                             20
<210>47
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC10565
<400>47
tttgcagaaa aggttgcaaa tgc                       23
<210>48
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC14063
<400>48
caccagacat aatagctgac agact                     25
<210>49
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC17574
<400>49
ggtrttgctc agcatgcaca c                         21
<210>50
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC17600
<400>50
catgtaggcc atgaggtcca ccac                      24
<210>51
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC38065
<400>51
ctttcctggg aatctgtgtc t                          21
<210>52
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC38068
<400>52
cctccagctc tggtgctg                              18
<210>53
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC37877
<400>53
caaaaaaccc aacaaattga ctca                       24
<210>54
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC37876
<400>54
catgtggcta tactactttc agcag                      25
<210>55
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>zcytor17受体
Figure G2009102637047D02571
探针
<400>55
ctgtgttggc  ccaccgttcc ca                     22
<210>56
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>rRNA正向引物
<400>56
cggctaccac atccaaggaa                         20
<210>57
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>rRNA反向引物
<400>57
gctggaatta ccgcggct                           18
<210>58
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>rRNA
Figure G2009102637047D02572
探针
<400>58
tgctggcacc agacttgccc tc                      22
<210>59
<220>
<223>略过的序列
<400>59
000
<210>60
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC41458
<400>60
tggacctcgc actaaaatca t                      21
<210>61
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC41457
<400>61
aatcacggca gagttcccac ac                     22
<210>62
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC41459
<400>62
agaagggcgt gctcgtgtc                         19
<210>63
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC41460
<400>63
ccggatggct gggctgtg                         18
<210>64
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC39982
<400>64
aatgtctgtg tagcataagg tatga                 25
<210>65
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC39983
<400>65
cctgcctacc tgaaaaccag aa                    22
<210>66
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC39980
<400>66
tttgaattcg ccaccatggc tctatttgca gtcttt     36
<210>67
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC39981
<400>67
ctgtctcgag tgctggttag cagtgttc                                    28
<210>68
<211>2217
<212>DNA
<213>人类
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(2217)
<400>68
atg gct cta ttt gca gtc ttt cag aca aca ttc ttc tta aca ttg ctg   48
Met Ala Leu Phe Ala Val Phe Gln Thr Thr Phe Phe Leu Thr Leu Leu
 1               5                   10                  15
tcc ttg agg act tac cag agt gaa gtc ttg gct gaa cgt tta cca ttg   96
Ser Leu Arg Thr Tyr Gln Ser Glu Val Leu Ala Glu Arg Leu Pro Leu
             20                  25                  30
act cct gta tca ctt aaa gtt tcc acc aat tct acg cgt cag agt ttg   144
Thr Pro Val Ser Leu Lys Val Ser Thr Asn Ser Thr Arg Gln Ser Leu
         35                  40                  45
cac tta caa tgg act gtc cac aac ctt cct tat cat cag gaa ttg aaa   192
His Leu Gln Trp Thr Val His Asn Leu Pro Tyr His Gln Glu Leu Lys
     50                  55                  60
atg gta ttt cag atc cag atc agt agg att gaa aca tcc aat gtc atc   240
Met Val Phe Gln Ile Gln Ile Ser Arg Ile Glu Thr Ser Asn Val Ile
 65                  70                  75                  80
tgg gtg ggg aat tac agc acc act gtg aag tgg aac cag gtt ctg cat   288
Trp Val Gly Asn Tyr Ser Thr Thr Val Lys Trp Asn Gln Val Leu His
                 85                  90                  95
tgg agc tgg gaa tct gag ctc cct ttg gaa tgt gcc aca cac ttt gta   336
Trp Ser Trp Glu Ser Glu Leu Pro Leu Glu Cys Ala Thr His Phe Val
            100                 105                 110
aga ata aag agt ttg gtg gac gat gcc aag ttc cct gag cca aat ttc   384
Arg Ile Lys Ser Leu Val Asp Asp Ala Lys Phe Pro Glu Pro Asn Phe
        115                 120                 125
tgg agc aac tgg agt tcc tgg gag gaa gtc agt gta caa gat tct act   432
Trp Ser Asn Trp Ser Ser Trp Glu Glu Val Ser Val Gln Asp Ser Thr
    130                 135                 140
gga cag gat ata ttg ttc gtt ttc cct aaa gat aag ctg gtg gaa gaa   480
Gly Gln Asp Ile Leu Phe Val Phe Pro Lys Asp Lys Leu Val Glu Glu
145                 150                 155                 160
ggc acc aat gtt acc att tgt tac gtt tct agg aac att caa aat aat   528
Gly Thr Asn Val Thr Ile Cys Tyr Val Ser Arg Asn Ile Gln Asn Asn
                165                 170                 175
gta tcc tgt tat ttg gaa ggg aaa cag att cat gga gaa caa ctt gat   576
Val Ser Cys Tyr Leu Glu Gly Lys Gln Ile His Gly Glu Gln Leu Asp
            180                 185                 190
cca cat gta act gca ttc aac ttg aat agt gtg cct ttc att agg aat   624
Pro His Val Thr Ala Phe Asn Leu Asn Ser Val Pro Phe Ile Arg Asn
        195                 200                 205
aaa ggg aca aat atc tat tgt gag gca agt caa gga aat gtc agt gaa   672
Lys Gly Thr Asn Ile Tyr Cys Glu Ala Ser Gln Gly Asn Val Ser Glu
    210                 215                 220
ggc atg aaa ggc atc gtt ctt ttt gtc tca aaa gta ctt gag gag ccc   720
Gly Met Lys Gly Ile Val Leu Phe Val Ser Lys Val Leu Glu Glu Pro
225                 230                 235                 240
aag gac ttt tct tgt gaa acc gag gac ttc aag act ttg cac tgt act   768
Lys Asp Phe Ser Cys Glu Thr Glu Asp Phe Lys Thr Leu His Cys Thr
                245                 250                 255
tgg gat cct ggg acg gac act gcc ttg ggg tgg tct aaa caa cct tcc   816
Trp Asp Pro Gly Thr Asp Thr Ala Leu Gly Trp Ser Lys Gln Pro Ser
            260                 265                 270
caa agc tac act tta ttt gaa tca ttt tct ggg gaa aag aaa ctt tgt   864
Gln Ser Tyr Thr Leu Phe Glu Ser Phe Ser Gly Glu Lys Lys Leu Cys
        275                 280                 285
aca cac aaa aac tgg tgt aat tgg caa ata act caa gac tca caa gaa   912
Thr His Lys Asn Trp Cys Asn Trp Gln Ile Thr Gln Asp Ser Gln Glu
    290                 295                 300
acc tat aac ttc aca ctc ata gct gaa aat tac tta agg aag aga agt   960
Thr Tyr Asn Phe Thr Leu Ile Ala Glu Asn Tyr Leu Arg Lys Arg Ser
305                 310                 315                 320
gtc aat atc ctt ttt aac ctg act cat cga gtt tat tta atg aat cct   1008
Val Asn Ile Leu Phe Asn Leu Thr His Arg Val Tyr Leu Met Asn Pro
                325                 330                 335
ttt agt gtc aac ttt gaa aat gta aat gcc aca aat gcc atc atg acc   1056
Phe Ser Val Asn Phe Glu Asn Val Asn Ala Thr Asn Ala Ile Met Thr
            340                 345                 350
tgg aag gtg cac tcc ata agg aat aat ttc aca tat ttg tgt cag att   1104
Trp Lys Val His Ser Ile Arg Asn Asn Phe Thr Tyr Leu Cys Gln Ile
        355                 360                 365
gaa ctc cat ggt gaa gga aaa atg atg caa tac aat gtt tcc atc aag   1152
Glu Leu His Gly Glu Gly Lys Met Met Gln Tyr Asn Val Ser Ile Lys
    370                 375                 380
gtg aac ggt gag tac ttc tta agt gaa ctg gaa cct gcc aca gag tac   1200
Val Asn Gly Glu Tyr Phe Leu Ser Glu Leu Glu Pro Ala Thr Glu Tyr
385                 390                 395                 400
atg gcg cga gta cgg tgt gct gat gcc agc cac ttc tgg aaa tgg agt   1248
Met Ala Arg Val Arg Cys Ala Asp Ala Ser His Phe Trp Lys Trp Ser
                405                 410                 415
gaa tgg agt ggt cag aac ttc acc aca ctt gaa gct gct ccc tca gag   1296
Glu Trp Ser Gly Gln Asn Phe Thr Thr Leu Glu Ala Ala Pro Ser Glu
            420                 425                 430
gcc cct gat gtc tgg aga att gtg agc ttg gag cca gga aat cat act   1344
Ala Pro Asp Val Trp Arg Ile Val Ser Leu Glu Pro Gly Asn His Thr
        435                 440                 445
gtg acc tta ttc tgg aag cca tta tca aaa ctg cat gcc aat gga aag   1392
Val Thr Leu Phe Trp Lys Pro Leu Ser Lys Leu His Ala Asn Gly Lys
    450                 455                 460
atc ctg ttc tat aat gta gtt gta gaa aac cta gac aaa cca tcc agt   1440
Ile Leu Phe Tyr Asn Val Val Val Glu Asn Leu Asp Lys Pro Ser Ser
465                 470                 475                 480
tca gag ctc cat tcc att cca gca cca gcc aac agc aca aaa cta atc   1488
Ser Glu Leu His Ser Ile Pro Ala Pro Ala Asn Ser Thr Lys Leu Ile
                485                 490                 495
ctt gac agg tgt tcc tac caa atc tgc gtc ata gcc aac aac agt gtg   1536
Leu Asp Arg Cys Ser Tyr Gln Ile Cys Val Ile Ala Asn Asn Ser Val
            500                 505                 510
ggt gct tct cct gct tct gta ata gtc atc tct gca gac ccc gaa aac   1584
Gly Ala Ser Pro Ala Ser Val Ile Val Ile Ser Ala Asp Pro Glu Asn
        515                 520                 525
aaa gag gtt gag gaa gaa aga att gca ggc aca gag ggt gga ttc tct   1632
Lys Glu Val Glu Glu Glu Arg Ile Ala Gly Thr Glu Gly Gly Phe Ser
    530                 535                 540
ctg tct tgg aaa ccc caa cct gga gat gtt ata ggc tat gtt gtg gac   1680
Leu Ser Trp Lys Pro Gln Pro Gly Asp Val Ile Gly Tyr Val Val Asp
545                 550                 555                 560
tgg tgt gac cat acc cag gat gtg ctc ggt gat ttc cag tgg aag aat   1728
Trp Cys Asp His Thr Gln Asp Val Leu Gly Asp Phe Gln Trp Lys Asn
                565                 570                 575
gta ggt ccc aat acc aca agc aca gtc att agc aca gat gct ttt agg   1776
Val Gly Pro Asn Thr Thr Ser Thr Val Ile Ser Thr Asp Ala Phe Arg
            580                 585                 590
cca gga gtt cga tat gac ttc aga att tat ggg tta tct aca aaa agg   1824
Pro Gly Val Arg Tyr Asp Phe Arg Ile Tyr Gly Leu Ser Thr Lys Arg
        595                 600                 605
att gct tgt tta tta gag aaa aaa aca gga tac tct cag gaa ctt gct   1872
Ile Ala Cys Leu Leu Glu Lys Lys Thr Gly Tyr Ser Gln Glu Leu Ala
    610                 615                 620
cct tca gac aac cct cac gtg ctg gtg gat aca ttg aca tcc cac tcc   1920
Pro Ser Asp Asn Pro His Val Leu Val Asp Thr Leu Thr Ser His Ser
625                 630                 635                 640
ttc act ctg agt tgg aaa gat tac tct act gaa tct caa cct ggt ttt   1968
Phe Thr Leu Ser Trp Lys Asp Tyr Ser Thr Glu Ser Gln Pro Gly Phe
                645                 650                 655
ata caa ggg tac cat gtc tat ctg aaa tcc aag gcg agg cag tgc cac   2016
Ile Gln Gly Tyr His Val Tyr Leu Lys Ser Lys Ala Arg Gln Cys His
            660                 665                 670
cca cga ttt gaa aag gca gtt ctt tca gat ggt tca gaa tgt tgc aaa   2064
Pro Arg Phe Glu Lys Ala Val Leu Ser Asp Gly Ser Glu Cys Cys Lys
        675                 680                 685
tac aaa att gac aac ccg gaa gaa aag gca ttg att gtg gac aac cta   2112
Tyr Lys Ile Asp Asn Pro Glu Glu Lys Ala Leu Ile Val Asp Asn Leu
    690                 695                 700
aag cca gaa tcc ttc tat gag ttt ttc atc act cca ttc act agt gct   2160
Lys Pro Glu Ser Phe Tyr Glu Phe Phe Ile Thr Pro Phe Thr Ser Ala
705                 710                 715                 720
ggt gaa ggc ccc agt gct acg ttc acg aag gtc acg act ccg gat gaa   2208
Gly Glu Gly Pro Ser Ala Thr Phe Thr Lys Val Thr Thr Pro Asp Glu
                725                 730                 735
cac tcc tcg                                                       2217
His Ser Ser
<210>69
<211>739
<212>PRT
<213>人类
<400>69
Met Ala Leu Phe Ala Val Phe Gln Thr Thr Phe Phe Leu Thr Leu Leu
 1               5                  10                  15
Ser Leu Arg Thr Tyr Gln Ser Glu Val Leu Ala Glu Arg Leu Pro Leu
            20                  25                  30
Thr Pro Val Ser Leu Lys Val Ser Thr Asn Ser Thr Arg Gln Ser Leu
        35                  40                  45
His Leu Gln Trp Thr Val His Asn Leu Pro Tyr His Gln Glu Leu Lys
    50                  55                  60
Met Val Phe Gln Ile Gln Ile Ser Arg Ile Glu Thr Ser Asn Val Ile
65                  70                  75                  80
Trp Val Gly Asn Tyr Ser Thr Thr Val Lys Trp Asn Gln Val Leu His
                85                  90                  95
Trp Ser Trp Glu Ser Glu Leu Pro Leu Glu Cys Ala Thr His Phe Val
            100                 105                 110
Arg Ile Lys Ser Leu Val Asp Asp Ala Lys Phe Pro Glu Pro Asn Phe
        115                 120                 125
Trp Ser Asn Trp Ser Ser Trp Glu Glu Val Ser Val Gln Asp Ser Thr
    130                 135                 140
Gly Gln Asp Ile Leu Phe Val Phe Pro Lys Asp Lys Leu Val Glu Glu
145                 150                 155                 160
Gly Thr Asn Val Thr Ile Cys Tyr Val Ser Arg Asn Ile Gln Asn Asn
                165                 170                 175
Val Ser Cys Tyr Leu Glu Gly Lys Gln Ile His Gly Glu Gln Leu Asp
            180                 185                 190
Pro His Val Thr Ala Phe Asn Leu Asn Ser Val Pro Phe Ile Arg Asn
        195                 200                 205
Lys Gly Thr Asn Ile Tyr Cys Glu Ala Ser Gln Gly Asn Val Ser Glu
    210                 215                 220
Gly Met Lys Gly Ile Val Leu Phe Val Ser Lys Val Leu Glu Glu Pro
225                 230                 235                 240
Lys Asp Phe Ser Cys Glu Thr Glu Asp Phe Lys Thr Leu His Cys Thr
                245                 250                 255
Trp Asp Pro Gly Thr Asp Thr Ala Leu Gly Trp Ser Lys Gln Pro Ser
            260                 265                 270
Gln Ser Tyr Thr Leu Phe Glu Ser Phe Ser Gly Glu Lys Lys Leu Cys
        275                 280                 285
Thr His Lys Asn Trp Cys Asn Trp Gln Ile Thr Gln Asp Ser Gln Glu
    290                 295                 300
Thr Tyr Asn Phe Thr Leu Ile Ala Glu Asn Tyr Leu Arg Lys Arg Ser
305                 310                 315                 320
Val Asn Ile Leu Phe Asn Leu Thr His Arg Val Tyr Leu Met Asn Pro
                325                 330                 335
Phe Ser Val Asn Phe Glu Asn Val Asn Ala Thr Asn Ala Ile Met Thr
            340                 345                 350
Trp Lys Val His Ser Ile Arg Asn Asn Phe Thr Tyr Leu Cys Gln Ile
        355                 360                 365
Glu Leu His Gly Glu Gly Lys Met Met Gln Tyr Asn Val Ser Ile Lys
    370                 375                 380
Val Asn Gly Glu Tyr Phe Leu Ser Glu Leu Glu Pro Ala Thr Glu Tyr
385                 390                 395                 400
Met Ala Arg Val Arg Cys Ala Asp Ala Ser His Phe Trp Lys Trp Ser
                405                 410                 415
Glu Trp Ser Gly Gln Asn Phe Thr Thr Leu Glu Ala Ala Pro Ser Glu
            420                 425                 430
Ala Pro Asp Val Trp Arg Ile Val Ser Leu Glu Pro Gly Asn His Thr
        435                 440                 445
Val Thr Leu Phe Trp Lys Pro Leu Ser Lys Leu His Ala Asn Gly Lys
    450                 455                 460
Ile Leu Phe Tyr Asn Val Val Val Glu Asn Leu Asp Lys Pro Ser Ser
465                 470                 475                 480
Ser Glu Leu His Ser Ile Pro Ala Pro Ala Asn Ser Thr Lys Leu Ile
                485                 490                 495
Leu Asp Arg Cys Ser Tyr Gln Ile Cys Val Ile Ala Asn Asn Ser Val
            500                 505                 510
Gly Ala Ser Pro Ala Ser Val Ile Val Ile Ser Ala Asp Pro Glu Asn
        515                 520                 525
Lys Glu Val Glu Glu Glu Arg Ile Ala Gly Thr Glu Gly Gly Phe Ser
    530                 535                 540
Leu Ser Trp Lys Pro Gln Pro Gly Asp Val Ile Gly Tyr Val Val Asp
545                 550                 555                 560
Trp Cys Asp His Thr Gln Asp Val Leu Gly Asp Phe Gln Trp Lys Asn
                565                 570                 575
Val Gly Pro Asn Thr Thr Ser Thr Val Ile Ser Thr Asp Ala Phe Arg
            580                 585                 590
Pro Gly Val Arg Tyr Asp Phe Arg Ile Tyr Gly Leu Ser Thr Lys Arg
        595                 600                 605
Ile Ala Cys Leu Leu Glu Lys Lys Thr Gly Tyr Ser Gln Glu Leu Ala
    610                 615                 620
Pro Ser Asp Asn Pro His Val Leu Val Asp Thr Leu Thr Ser His Ser
625                 630                 635                 640
Phe Thr Leu Ser Trp Lys Asp Tyr Ser Thr Glu Ser Gln Pro Gly Phe
                645                 650                 655
Ile Gln Gly Tyr His Val Tyr Leu Lys Ser Lys Ala Arg Gln Cys His
            660                 665                 670
Pro Arg Phe Glu Lys Ala Val Leu Ser Asp Gly Ser Glu Cys Cys Lys
        675                 680                 685
Tyr Lys Ile Asp Asn Pro Glu Glu Lys Ala Leu Ile Val Asp Asn Leu
    690                 695                 700
Lys Pro Glu Ser Phe Tyr Glu Phe Phe Ile Thr Pro Phe Thr Ser Ala
705                 710                 715                 720
Gly Glu Gly Pro Ser Ala Thr Phe Thr Lys Val Thr Thr Pro Asp Glu
                725                 730                 735
His Ser Ser
<210>70
<211>1557
<212>DNA
<213>人类
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(1557)
<400>70
atg atg tgg acc tgg gca ctg tgg atg ctc ccc tca ctc tgc aaa ttc   48
Met Met Trp Thr Trp Ala Leu Trp Met Leu Pro Ser Leu Cys Lys Phe
 1               5                   10                  15
agc ctg gca gct ctg cca gct aag cct gag aac att tcc tgt gtc tac   96
Ser Leu Ala Ala Leu Pro Ala Lys Pro Glu Asn Ile Ser Cys Val Tyr
             20                  25                  30
tac tat agg aaa aat tta acc tgc act tgg agt cca gga aag gaa acc   144
Tyr Tyr Arg Lys Asn Leu Thr Cys Thr Trp Ser Pro Gly Lys Glu Thr
         35                  40                  45
agt tat acc cag tac aca gtt aag aga act tac gct ttt gga gaa aaa   192
Ser Tyr Thr Gln Tyr Thr Val Lys Arg Thr Tyr Ala Phe Gly Glu Lys
     50                  55                  60
cat gat aat tgt aca acc aat agt tct aca agt gaa aat cgt gct
His Asp Asn Cys Thr Thr Asn Ser Ser Thr Ser Glu Asn Arg Ala Ser
 65                  70                  75                  80
tgc tct ttt ttc ctt cca aga ata acg atc cca gat aat tat acc
Figure G2009102637047D02672
Cys Ser Phe Phe Leu Pro Arg Ile Thr Ile Pro Asp Asn Tyr Thr Ile
                 85                  90                  95
gag gtg gaa gct gaa aat gga gat ggt gta att aaa tct cat atg aca   336
Glu Val Glu Ala Glu Asn Gly Asp Gly Val Ile Lys Ser His Met Thr
            100                 105                 110
tac tgg aga tta gag aac ata gcg aaa act gaa cca cct aag att ttc   384
Tyr Trp Arg Leu Glu Asn Ile Ala Lys Thr Glu Pro Pro Lys Ile Phe
        115                 120                 125
cgt gtg aaa cca gtt ttg ggc atc aaa cga atg att caa att gaa tgg   432
Arg Val Lys Pro Val Leu Gly Ile Lys Arg Met Ile Gln Ile Glu Trp
    130                 135                 140
ata aag cct gag ttg gcg cct gtt tca tct gat tta aaa tac aca ctt   480
Ile Lys Pro Glu Leu Ala Pro Val Ser Ser Asp Leu Lys Tyr Thr Leu
145                 150                 155                 160
cga ttc agg aca gtc aac agt acc agc tgg atg gaa gtc aac ttc gct   528
Arg Phe Arg Thr Val Asn Ser Thr Ser Trp Met Glu Val Asn Phe Ala
                165                 170                 175
aag aac cgt aag gat aaa aac caa acg tac aac ctc acg ggg ctg cag   576
Lys Asn Arg Lys Asp Lys Asn Gln Thr Tyr Asn Leu Thr Gly Leu Gln
            180                 185                 190
cct ttt aca gaa tat gtc ata gct ctg cga tgt gcg gtc aag gag tca   624
Pro Phe Thr Glu Tyr Val Ile Ala Leu Arg Cys Ala Val Lys Glu Ser
        195                 200                 205
aag ttc tgg agt gac tgg agc caa gaa aaa atg gga atg act gag gaa   672
Lys Phe Trp Ser Asp Trp Ser Gln Glu Lys Met Gly Met Thr Glu Glu
    210                 215                 220
gaa gct cca tgt ggc ctg gaa ctg tgg aga gtc ctg aaa cca gct gag   720
Glu Ala Pro Cys Gly Leu Glu Leu Trp Arg Val Leu Lys Pro Ala Glu
225                 230                 235                 240
gcg gat gga aga agg cca gtg cgg ttg tta tgg aag aag gca aga gga   768
Ala Asp Gly Arg Arg Pro Val Arg Leu Leu Trp Lys Lys Ala Arg Gly
                245                 250                 255
gcc cca gtc cta gag aaa aca ctt ggc tac aac ata tgg tac tat cca   816
Ala Pro Val Leu Glu Lys Thr Leu Gly Tyr Asn Ile Trp Tyr Tyr Pro
            260                 265                 270
gaa agc aac act aac ctc aca gaa aca atg aac act act aac cag cag   864
Glu Ser Asn Thr Asn Leu Thr Glu Thr Met Asn Thr Thr Asn Gln Gln
        275                 280                 285
ctt gaa ctg cat ctg gga ggc gag agc ttt tgg gtg tct atg att tct   912
Leu Glu Leu His Leu Gly Gly Glu Ser Phe Trp Val Ser Met Ile Ser
    290                 295                 300
tat aat tct ctt ggg aag tct cca gtg gcc acc ctg agg att cca gct   960
Tyr Asn Ser Leu Gly Lys Ser Pro Val Ala Thr Leu Arg Ile Pro Ala
305                 310                 315                 320
att caa gaa aaa tca ttt cag tgc att gag gtc atg cag gcc tgc gtt   1008
Ile Gln Glu Lys Ser Phe Gln Cys Ile Glu Val Met Gln Ala Cys Val
                325                 330                 335
gct gag gac cag cta gtg gtg aag tgg caa agc tct gct cta gac gtg   1056
Ala Glu Asp Gln Leu Val Val Lys Trp Gln Ser Ser Ala Leu Asp Val
            340                 345                 350
aac act tgg atg att gaa tgg ttt ccg gat gtg gac tca gag ccc acc   1104
Asn Thr Trp Met Ile Glu Trp Phe Pro Asp Val Asp Ser Glu Pro Thr
        355                 360                 365
acc ctt tcc tgg gaa tct gtg tct cag gcc acg aac tgg acg atc cag   1152
Thr Leu Ser Trp Glu Ser Val Ser Gln Ala Thr Asn Trp Thr Ile Gln
    370                 375                 380
caa gat aaa tta aaa cct ttc tgg tgc tat aac atc tct gtg tat cca   1200
Gln Asp Lys Leu Lys Pro Phe Trp Cys Tyr Asn Ile Ser Val Tyr Pro
385                 390                 395                 400
atg ttg cat gac aaa gtt ggc gag cca tat tcc atc cag gct tat gcc   1248
Met Leu His Asp Lys Val Gly Glu Pro Tyr Ser Ile Gln Ala Tyr Ala
                405                 410                 415
aaa gaa ggc gtt cca tca gaa ggt cct gag acc aag gtg gag aac att   1296
Lys Glu Gly Val Pro Ser Glu Gly Pro Glu Thr Lys Val Glu Asn Ile
            420                 425                 430
ggc gtg aag acg gtc acg atc aca tgg aaa gag att ccc aag agt gag  1344
Gly Val Lys Thr Val Thr Ile Thr Trp Lys Glu Ile Pro Lys Ser Glu
        435                 440                 445
aga aag ggt atc atc tgc aac tac acc atc ttt tac caa gct gaa ggt  1392
Arg Lys Gly Ile Ile Cys Asn Tyr Thr Ile Phe Tyr Gln Ala Glu Gly
    450                 455                 460
gga aaa gga ttc tcc aag aca gtc aat tcc agc atc ttg cag tac ggc  1440
Gly Lys Gly Phe Ser Lys Thr Val Asn Ser Ser Ile Leu Gln Tyr Gly
465                 470                 475                 480
ctg gag tcc ctg aaa cga aag acc tct tac att gtt cag gtc atg gcc  1488
Leu Glu Ser Leu Lys Arg Lys Thr Ser Tyr Ile Val Gln Val Met Ala
                485                 490                 495
agc acc agt gct ggg gga acc aac ggg acc agc ata aat ttc aag aca  1536
Ser Thr Ser Ala Gly Gly Thr Asn Gly Thr Ser Ile Asn Phe Lys Thr
            500                 505                 510
ttg tca ttc agt gtc ttt gag                                      1557
Leu Ser Phe Ser Val Phe Glu
        515
<210>71
<211>519
<212>PRT
<213>人类
<400>71
Met Met Trp Thr Trp Ala Leu Trp Met Leu Pro Ser Leu Cys Lys Phe
 1               5                  10                  15
Ser Leu Ala Ala Leu Pro Ala Lys Pro Glu Asn Ile Sen Cys Val Tyr
            20                  25                  30
Tyr Tyr Arg Lys Asn Leu Thr Cys Thr Trp Ser Pro Gly Lys Glu Thr
        35                  40                  45
Ser Tyr Thr Gln Tyr Thr Val Lys Arg Thr Tyr Ala Phe Gly Glu Lys
    50                  55                  60
His Asp Asn Cys Thr Thr Asn Ser Ser Thr Ser Glu Asn Arg Ala Ser
65                  70                  75                  80
Cys Ser Phe Phe Leu Pro Arg Ile Thr Ile Pro Asp Asn Tyr Thr Ile
                85                  90                  95
Glu Val Glu Ala Glu Asn Gly Asp Gly Val Ile Lys Ser His Met Thr
            100                 105                 110
Tyr Trp Arg Leu Glu Asn Ile Ala Lys Thr Glu Pro Pro Lys Ile Phe
        115                 120                 125
Arg Val Lys Pro Val Leu Gly Ile Lys Arg Met Ile Gln Ile Glu Trp
    130                 135                 140
Ile Lys Pro Glu Leu Ala Pro Val Ser Ser Asp Leu Lys Tyr Thr Leu
145                 150                 155                 160
Arg Phe Arg Thr Val Asn Ser Thr Ser Trp Met Glu Val Asn Phe Ala
                165                 170                 175
Lys Asn Arg Lys Asp Lys Asn Gln Thr Tyr Asn Leu Thr Gly Leu Gln
            180                 185                 190
Pro Phe Thr Glu Tyr Val Ile Ala Leu Arg Cys Ala Val Lys Glu Ser
        195                 200                 205
Lys Phe Trp Ser Asp Trp Ser Gln Glu Lys Met Gly Met Thr Glu Glu
    210                 215                 220
Glu Ala Pro Cys Gly Leu Glu Leu Trp Arg Val Leu Lys Pro Ala Glu
225                 230                 235                 240
Ala Asp Gly Arg Arg Pro Val Arg Leu Leu Trp Lys Lys Ala Arg Gly
                245                 250                 255
Ala Pro Val Leu Glu Lys Thr Leu Gly Tyr Asn Ile Trp Tyr Tyr Pro
            260                 265                 270
Glu Ser Asn Thr Asn Leu Thr Glu Thr Met Asn Thr Thr Asn Gln Gln
        275                 280                 285
Leu Glu Leu His Leu Gly Gly Glu Ser Phe Trp Val Ser Met Ile Ser
    290                 295                 300
Tyr Asn Ser Leu Gly Lys Ser Pro Val Ala Thr Leu Arg Ile Pro Ala
305                 310                 315                 320
Ile Gln Glu Lys Ser Phe Gln Cys Ile Glu Val Met Gln Ala Cys Val
                325                 330                 335
Ala Glu Asp Gln Leu Val Val Lys Trp Gln Ser Ser Ala Leu Asp Val
            340                 345                 350
Asn Thr Trp Met Ile Glu Trp Phe Pro Asp Val Asp Ser Glu Pro Thr
        355                 360                 365
Thr Leu Ser Trp Glu Ser Val Ser Gln Ala Thr Asn Trp Thr Ile Gln
    370                 375                 380
Gln Asp Lys Leu Lys Pro Phe Trp Cys Tyr Asn Ile Ser Val Tyr Pro
385                 390                 395                 400
Met Leu His Asp Lys Val Gly Glu Pro Tyr Ser Ile Gln Ala Tyr Ala
                405                 410                 415
Lys Glu Gly Val Pro Ser Glu Gly Pro Glu Thr Lys Val Glu Asn Ile
            420                 425                 430
Gly Val Lys Thr Val Thr Ile Thr Trp Lys Glu Ile Pro Lys Ser Glu
        435                 440                 445
Arg Lys Gly Ile Ile Cys Asn Tyr Thr Ile Phe Tyr Gln Ala Glu Gly
    450                 455                 460
Gly Lys Gly Phe Ser Lys Thr Val Asn Ser Ser Ile Leu Gln Tyr Gly
465                 470                 475                 480
Leu Glu Ser Leu Lys Arg Lys Thr Ser Tyr Ile Val Gln Val Met Ala
                485                 490                 495
Ser Thr Ser Ala Gly Gly Thr Asn Gly Thr Ser Ile Asn Phe Lys Thr
            500                 505                 510
Leu Ser Phe Ser Val Phe Glu
        515
<210>72
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>C-末端His肽标签
<400>72
Gly Ser Gly Gly His His His His His His
 1               5                  10
<210>73
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>12个氨基酸的Gly-Ser间隔臂
<400>73
Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Glu Pro Arg Ser
 1               5                  10
<210>74
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC41557
<400>74
ttatagatct cgaggagtgt tcatccggag t                                31
<210>75
<211>65
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC29232
<400>75
cgactgactc gagtcagtga tggtgatggt gatggccacc tgatccttta cccggagaca 60
gggag                                                             65
<210>76
<211>3196
<212>DNA
<213>台湾鼷鼠
<400>76
tgtatgtctg cacagtttgt gtatgcctgg tgcccacaga ggctcgagag tgtcagattc 60
cccccaaaac tggagttaca gttttgagcc gccccatgct tgatagcaat caaacctggg 120
tcctctgaaa gagcatccag tgcatgtaac cactgaacca tctctccaaa ccatgaacat 180
cactttaatt ttttttaata gttaaaggat attttgattc taaagatgta aaagaacgtc 240
tcacctattt tgaaatttgg taataaatgt ttcttcaaag cttaaaaaaa ttagttcagg 300
tttttttttt ttttcagtca gtgatttgct aagctgccca aactggctta gaatttgtga 360
ccctcttgtc tcagcatact gagtgttaag attacaagtg caccccctac ccagttccca 420
taattaactg atccaccccc acccccatcc caccccactc ccattgcctg ggcaagtaac 480
tcttgagccc cattctggtt ctagagtctg aagtcacaaa ggtgcaggtg agaacgcaag 540
gacaagggca ggccctggag cacagatgcc ttctccttat gccttccctg tgttcactag 600
agccatcccc ctgcctccgg aattcccaca gatggatcgc tctgtggctt cttaaaactt 660
ccctgcaggg cactgaccct cagcccctct aagtcacttc ttccccagtg attgtacttt 720
tcaatcgggc ttcaaacttt cctctcatta aatcagcaag cactttccaa gaaaagagag 780
atgctcaaga tgccttcctg tgtggtatgt gtatgcgttt gtgtgtgtgc acgcatgtgt 840
gtgcatgtga ctcaatcttc tgccttgcct tgagggtaac ctcagcattt ccttccagcc 900
ctgctttccc caggccgagc cgaggctggc aaccttttga aaatgttttc tggagaaaag 960
ctgagcaatg gttttgccat gggcgggcct ttgatctgct tcctcatgac aaccctttat 1020
atattgcctg gtggccatgg cgaacacacc aggctccaga gaccacaggc aaagcgggcc 1080
ttcctcactc tcttaccgtc gccatgatct tccacacagg taccgctggc tccacacgca 1140
gctcagcatg gcttcagctc catggctctt atcatgttag gggaaggagc cgggaatggc 1200
tgcctcaggt ggttgctgga cagaggctgt tgtaactgaa gctgggatgg gcaggggcat 1260
ctgacctatc agctccatgg tatccttctt tttctccagg aacaacgaag cctaccctgg 1320
tgctgctttg ctgtatagga acctggctgg ccacctgcag cttgtccttc ggtgccccaa 1380
tatcgaagga agacttaaga actacaattg acctcttgaa acaagagtct caggatcttt 1440
ataacaacta tgtaagtgcc cttgagattg ttttttctta accatttctt taaaatgtct 1500
tattttgcta tctaagcaca gctatccttt ctcgatataa agccagctat ggaagccaga 1560
gaggcatggg gaaacattgg aattcggttg gggtgaaatg tttccaaggg ggtaaatgca 1620
ctagcagaag aggcagaggc agactggtcc agggactgaa accttggcag cttacgaaac 1680
actacaggat gtatgctccc tgaattcttt atctcaaatc cacccggctc acagtcccta 1740
ctaaacgagc attcttgctg aaagggcatc cttagagaag ggccagcttg attcaggaat 1800
cccccaagag caatgagagc cagtttcagc agccaaagat gtcctagtgg aagcagggtg 1860
tgaggatctt cctttgggtc tccgttgact aactaggcaa ctgtctgtgt gttcttggag 1920
catcctggag ggccctctgc ctggccagag cctggcacag gtacagcaca ggacccagaa 1980
agtgtgaata cttcatttcc ttgggaccgc ttagataact tcagttgaag caagtaacag 2040
ggaaactgat ggagacacag ataacctccc tgcccctctc acttcagtca ctgagcctcc 2100
gagaacaggt tgcagatggc taggggcagc ctcagccaga taggcggagg cagactgggt 2160
agaagcatcc ttaggaacca cggccaacct gggtgggtat gccatgtctt ctagctcata 2220
agccaactag accttcgatt cctgtagaca cagagttagt gatggcccaa gcttcagaag 2280
gttgttgtac caattagata aggtctgagg caggctagac acagaggaag ccctggaaat 2340
gagctgttct gagctgtagg gttgttacaa atgtcttcct tacaatattt caaacctcct 2400
ctttctacag agcataaagc aggcatctgg gatgtcagca gacgaatcaa tacagctgcc 2460
gtgtttcagc ctggaccggg aagcattaac caacatctcg gtcatcatag cacatctgga 2520
gaaagtcaaa gtgttgagcg agaacacagt agatacttct tgggtgataa gatggctaac 2580
aaacatcagc tgtttcaacc cactgaattt aaacatttct gtgcctggaa atactgatga 2640
atcctatgat tgtaaagtgt tcgtgcttac ggttttaaag cagttctcaa actgcatggc 2700
agaactgcag gctaaggaca atactacatg ctgagtgatg gggggggggg ggtgcagtgt 2760
cctcagcagt gcctgtcctt cgagggctga gcttgcaacc caggacttaa ctccaaaggg 2820
actgtgcggt cattactagt catgttattt atgtttttat tttgtccact gaaatcttgt 2880
tctgctaccc tgtagggact ggaagtggca gctatattta tttatttatg tactgagttt 2940
gttaacgctc catggaggag ccttcagagt ctatttaata aattatattg acatgatcac 3000
ataatcagtt ttggaatttg tgatggggtt gaaatcaaag attaggaatg ttctggaaat 3060
agtttatgct accctctccc tccattagac agactcatga gcaaataatc ccagcagcat 3120
cacgtgcatg ataaacatct ttgttccagg tcataagtac aatcactgtc cttttggtat 3180
gtaggctgga aactaa                                                 3196
<210>77
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC28575
<400>77
ccaggaaagg aaaccagtta tacc                    24
<210>78
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC21195
<400>78
gaggagacca taacccccga cag                     23
<210>79
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC21196
<400>79
catagctccc accacacgat ttt                     23
<210>80
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC26358
<400>80
aaaaccaaac gtacaacctc acggg                   25
<210>81
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC26359
<400>81
gagcagccat acaccagagc agaca                25
<210>82
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC29179
<400>82
gcagggttgg gaacggtgg                       19
<210>83
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC28917
<400>83
tgcaagatgc tggaattgac                      20
<210>84
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC28916
<400>84
agtcaattcc agcatcttgc
<210>85
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC28918
<400>85
tcacagagtc atcagactcc                           20
<210>86
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC41498
<400>86
ggctccagag accacagg                             18
<210>87
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC41496
<400>87
atgactagta atgaccgcac ag                        22
<210>88
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC41583
<400>88
cgtacgggcc ggccaccatg atcttccaca caggaacaa      39
<210>89
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC41584
<400>89
tgacgaggcg cgcctcagca tgtagtattg tcctta                           36
<210>90
<211>650
<212>DNA
<213>台湾鼷鼠
<220>
<221>CDS
<222>(53)...(542)
<400>90
ggctccagag accacaggca aagcgggcct tcctcactct cttaccgtcg cc atg atc 58
                                                          Met Ile
                                                           1
ttc cac aca gga aca acg aag cct acc ctg gtg ctg ctt tgc tgt ata   106
Phe His Thr Gly Thr Thr Lys Pro Thr Leu Val Leu Leu Cys Cys Ile
         5                   10                  15
gga acc tgg ctg gcc acc tgc agc ttg tcc ttc ggt gcc cca ata tcg   154
Gly Thr Trp Leu Ala Thr Cys Ser Leu Ser Phe Gly Ala Pro Ile Ser
     20                  25                  30
aag gaa gac tta aga act aca att gac ctc ttg aaa caa gag tct cag   202
Lys Glu Asp Leu Arg Thr Thr Ile Asp Leu Leu Lys Gln Glu Ser Gln
 35                  40                  45                  50
gat ctt tat aac aac tat agc ata aag cag gca tct ggg atg tca gca   250
Asp Leu Tyr Asn Asn Tyr Ser Ile Lys Gln Ala Ser Gly Met Ser Ala
                 55                  60                  65
gac gaa tca ata cag ctg ccg tgt ttc agc ctg gac cgg gaa gca tta   298
Asp Glu Ser Ile Gln Leu Pro Cys Phe Ser Leu Asp Arg Glu Ala Leu
             70                  75                  80
acc aac atc tcg gtc atc ata gca cat ctg gag aaa gtc aaa gtg ttg   346
Thr Asn Ile Ser Val Ile Ile Ala His Leu Glu Lys Val Lys Val Leu
         85                  90                  95
agc gag aac aca gta gat act tct tgg gtg ata aga tgg cta aca aac   394
Ser Glu Asn Thr Val Asp Thr Ser Trp Val Ile Arg Trp Leu Thr Asn
    100                 105                 110
atc agc tgt ttc aac cca ctg aat tta aac att tct gtg cct gga aat   442
Ile Ser Cys Phe Asn Pro Leu Asn Leu Asn Ile Ser Val Pro Gly Asn
115                 120                 125                 130
act gat gaa tcc tat gat tgt aaa gtg ttc gtg ctt acg gtt tta aag   490
Thr Asp Glu Ser Tyr Asp Cys Lys Val Phe Val Leu Thr Val Leu Lys
                135                 140                 145
cag ttc tca aac tgc atg gca gaa ctg cag gct aag gac aat act aca   538
Gln Phe Ser Asn Cys Met Ala Glu Leu Gln Ala Lys Asp Asn Thr Thr
            150                 155                 160
tgc t gagtgatggg gggggggtgc agtgtcctca gcagtgcctg tccttcgagg      592
Cys
gctgagcttg caacccagga cttaactcca aagggactgt gcggtcatta ctagtcat   650
<210>91
<211>163
<212>PRT
<213>台湾鼷鼠
<400>91
Met Ile Phe His Thr Gly Thr Thr Lys Pro Thr Leu Val Leu Leu Cys
 1               5                  10                  15
Cys Ile Gly Thr Trp Leu Ala Thr Cys Ser Leu Ser Phe Gly Ala Pro
            20                  25                  30
Ile Ser Lys Glu Asp Leu Arg Thr Thr Ile Asp Leu Leu Lys Gln Glu
        35                  40                  45
Ser Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Tyr Ser Ile Lys Gln Ala Ser Gly Met
    50                  55                  60
Ser Ala Asp Glu Ser Ile Gln Leu Pro Cys Phe Ser Leu Asp Arg Glu
65                  70                  75                  80
Ala Leu Thr Asn Ile Ser Val Ile Ile Ala His Leu Glu Lys Val Lys
                85                  90                  95
Val Leu Ser Glu Asn Thr Val Asp Thr Ser Trp Val Ile Arg Trp Leu
            100                 105                 110
Thr Asn Ile Ser Cys Phe Asn Pro Leu Asn Leu Asn Ile Ser Val Pro
        115                 120                 125
Gly Asn Thr Asp Glu Ser Tyr Asp Cys Lys Val Phe Val Leu Thr Val
    130                 135                 140
Leu Lys Gln Phe Ser Asn Cys Met Ala Glu Leu Gln Ala Lys Asp Asn
145                 150                 155                 160
Thr Thr Cys
<210>92
<211>511
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>克隆的鼠cDNA序列(SEQ ID NO：90)w/mcytor17lig开放读框和终止密码子及FseI和AscI限制性位点和部分kozak序列
<400>92
ggccggccac catgatcttc cacacaggaa caacgaagcc taccctggtg ctgctttgct 60
gtataggaac ctggctggcc acctgcagct tgtccttcgg tgccccaata tcgaaggaag 120
acttaagaac tacaattgac ctcttgaaac aagagtctca ggatctttat aacaactata 180
gcataaagca ggcatctggg atgtcagcag acgaatcaat acagctgccg tgtttcagcc 240
tggaccggga agcattaacc aacatctcgg tcatcatagc acatctggag aaagtcaaag 300
tgttgagcga gaacacagta gatacttctt gggtgataag atggctaaca aacatcagct 360
gtttcaaccc actgaattta aacatttctg tgcctggaaa tactgatgaa tcctatgatt 420
gtaaagtgtt cgtgcttacg gttttaaagc agttctcaaa ctgcatggca gaactgcagg 480
ctaaggacaa tactacatgc tgaggcgcgc c                                511
<210>93
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC41438
<400>93
gccatggcct ctcactcagg c                                           21
<210>94
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC41437
<400>94
ccagggagca ttgacaactc ttag                                        24
<210>95
<21l>516
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人类zCytor17Lig-CEE多核苷酸
<221>CDS
<222>(1)...(516)
<400>95
atg gcc tct cac tca ggc ccc tcg acg tct gtg ctc ttt ctg ttc tgc   48
Met Ala Ser His Ser Gly Pro Ser Thr Ser Val Leu Phe Leu Phe Cys
 1               5                   10                  15
tgc ctg gga ggc tgg ctg gcc tcc cac acg ttg ccc gtc cgt tta cta   96
Cys Leu Gly Gly Trp Leu Ala Ser His Thr Leu Pro Val Arg Leu Leu
             20                  25                  30
cga cca agt gat gat gta cag aaa ata gtc gag gaa tta cag tcc ctc   144
Arg Pro Ser Asp Asp Val Gln Lys Ile Val Glu Glu Leu Gln Ser Leu
         35                  40                  45
tcg aag atg ctt ttg aaa gat gtg gag gaa gag aag ggc gtg ctc gtg   192
Ser Lys Met Leu Leu Lys Asp Val Glu Glu Glu Lys Gly Val Leu Val
     50                  55                  60
tcc cag aat tac acg ctg ccg tgt ctc agc cct gac gcc cag ccg cca
Ser Gln Asn Tyr Thr Leu Pro Cys Leu Ser Pro Asp Ala Gln Pro Pro
 65                  70                  75                  80
aac aac atc cac agc cca gcc atc cgg gca tat ctc aag aca atc aga  288
Asn Asn Ile His Ser Pro Ala Ile Arg Ala Tyr Leu Lys Thr Ile Arg
                 85                  90                  95
cag cta gac aac aaa tct gtt att gat gag atc ata gag cac ctc gac  336
Gln Leu Asp Asn Lys Ser Val Ile Asp Glu Ile Ile Glu His Leu Asp
            100                 105                 110
aaa ctc ata ttt caa gat gca cca gaa aca aac att tct gtg cca aca  384
Lys Leu Ile Phe Gln Asp Ala Pro Glu Thr Asn Ile Ser Val Pro Thr
        115                 120                 125
gac acc cat gaa tgt aaa cgc ttc atc ctg act att tct caa cag ttt  432
Asp Thr His Glu Cys Lys Arg Phe Ile Leu Thr Ile Ser Gln Gln Phe
    130                 135                 140
tca gag tgc atg gac ctc gca cta aaa tca ttg acc tct gga gcc caa  480
Ser Glu Cys Met Asp Leu Ala Leu Lys Ser Leu Thr Ser Gly Ala Gln
145                 150                 155                 160
cag gcc acc act gaa gaa tac atg ccg atg gaa taa                  516
Gln Ala Thr Thr Glu Glu Tyr Met Pro Met Glu  ＊
                165                 170
<210>96
<211>171
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人类zCytor17Lig-CEE多肽
 <400>96
Met Ala Ser His Ser Gly Pro Ser Thr Ser Val Leu Phe Leu Phe Cys
 1               5                  10                  15
Cys Leu Gly Gly Trp Leu Ala Ser His Thr Leu Pro Val Arg Leu Leu
            20                  25                  30
Arg Pro Ser Asp Asp Val Gln Lys Ile Val Glu Glu Leu Gln Ser Leu
        35                  40                  45
Ser Lys Met Leu Leu Lys Asp Val Glu Glu Glu Lys Gly Val Leu Val
    50                  55                  60
Ser Gln Asn Tyr Thr Leu Pro Cys Leu Ser Pro Asp Ala Gln Pro Pro
65                  70                  75                  80
Asn Asn Ile His Ser Pro Ala Ile Arg Ala Tyr Leu Lys Thr Ile Arg
                85                  90                  95
Gln Leu Asp Asn Lys Ser Val Ile Asp Glu Ile Ile Glu His Leu Asp
            100                 105                 110
Lys Leu Ile Phe Gln Asp Ala Pro Glu Thr Asn Ile Ser Val Pro Thr
        115                 120                 125
Asp Thr His Glu Cys Lys Arg Phe Ile Leu Thr Ile Ser Gln Gln Phe
    130                 135                 140
Ser Glu Cys Met Asp Leu Ala Leu Lys Ser Leu Thr Ser Gly Ala Gln
145                 150                 155                 160
Gln Ala Thr Thr Glu Glu Tyr Met Pro Met Glu
                165                 170
<210>97
<211>49
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZCZC41607
<400>97
tccagggaat tcatataggc cggccaccat ggcctctcac tcaggcccc              49
<210>98
<211>82
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZCZC41605
<400>98
caaccccaga gctgttttaa ggcgcgcctc tagattatta ttccatcggc atgtattctt  60
cagtggtggc ctgttgggct cc                                           82
<210>99
<211>629
<212>DNA
<213>台湾鼷鼠
<220>
<221>CDS
<222>(28)...(528)
<400>99
aaccccttgg aggaccagaa cgagaca atg gtt ctt gcc agc tct acc acc agc 54
                              Met Val Leu Ala Ser Ser Thr Thr Ser
                               1               5
atc cac acc atg ctg ctc ctg ctc ctg atg ctc ttc cac ctg gga ctc   102
Ile His Thr Met Leu Leu Leu Leu Leu Met Leu Phe His Leu Gly Leu
 10                  15                  20                  25
caa gct tca atc agt ggc cgg gat acc cac cgt tta acc aga acg ttg   150
Gln Ala Ser Ile Ser Gly Arg Asp Thr His Arg Leu Thr Arg Thr Leu
                 30                  35                  40
aat tgc agc tct att gtc aag gag att ata ggg aag ctc cca gaa cct   198
Asn Cys Ser Ser Ile Val Lys Glu Ile Ile Gly Lys Leu Pro Glu Pro
             45                  50                  55
gaa ctc aaa act gat gat gaa gga ccc tct ctg agg aat aag agc ttt   246
Glu Leu Lys Thr Asp Asp Glu Gly Pro Ser Leu Arg Asn Lys Ser Phe
         60                  65                  70
cgg aga gta aac ctg tcc aaa ttc gtg gaa agc caa gga gaa gtg gat   294
Arg Arg Val Asn Leu Ser Lys Phe Val Glu Ser Gln Gly Glu Val Asp
     75                  80                  85
cct gag gac aga tac gtt atc aag tcc aat ctt cag aaa ctt aac tgt   342
Pro Glu Asp Arg Tyr Val Ile Lys Ser Asn Leu Gln Lys Leu Asn Cys
 90                  95                 100                 105
tgc ctg cct aca tct gcg aat gac tct gcg ctg cca ggg gtc ttc att   390
Cys Leu Pro Thr Ser Ala Asn Asp Ser Ala Leu Pro Gly Val Phe Ile
                110                 115                 120
cga gat ctg gat gac ttt cgg aag aaa ctg aga ttc tac atg gtc cac   438
Arg Asp Leu Asp Asp Phe Arg Lys Lys Leu Arg Phe Tyr Met Val His
            125                 130                 135
ctt aac gat ctg gag aca gtg cta acc tct aga cca cct cag ccc gca   486
Leu Asn Asp Leu Glu Thr Val Leu Thr Ser Arg Pro Pro Gln Pro Ala
        140                 145                 150
tct ggc tcc gtc tct cct aac cgt gga acc gtg gaa tgt taa           528
Ser Gly Ser Val Ser Pro Asn Arg Gly Thr Val Glu Cys  ＊
    155                 160                 165
aacagcaggc agagcaccta aagtctgaat gttcctcatg gcccatggtc aaaaggattt 588
tacattcctt tatgccatca aatgtcttat caatttatct a                     629
<210>100
<211>166
<212>PRT
<213>台湾鼷鼠
<400>100
Met Val Leu Ala Ser Ser Thr Thr Ser Ile His Thr Met Leu Leu Leu
 1               5                  10                  15
Leu Leu Met Leu Phe His Leu Gly Leu Gln Ala Ser Ile Ser Gly Arg
            20                  25                  30
Asp Thr His Arg Leu Thr Arg Thr Leu Asn Cys Ser Ser Ile Val Lys
        35                  40                  45
Glu Ile Ile Gly Lys Leu Pro Glu Pro Glu Leu Lys Thr Asp Asp Glu
    50                  55                  60
Gly Pro Ser Leu Arg Asn Lys Ser Phe Arg Arg Val Asn Leu Ser Lys
65                  70                  75                  80
Phe Val Glu Ser Gln Gly Glu Val Asp Pro Glu Asp Arg Tyr Val Ile
                85                  90                  95
Lys Ser Asn Leu Gln Lys Leu Asn Cys Cys Leu Pro Thr Ser Ala Asn
            100                 105                 110
Asp Ser Ala Leu Pro Gly Val Phe Ile Arg Asp Leu Asp Asp Phe Arg
        115                 120                 125
Lys Lys Leu Arg Phe Tyr Met Val His Leu Asn Asp Leu Glu Thr Val
    130                 135                 140
Leu Thr Ser Arg Pro Pro Gln Pro Ala Ser Gly Ser Val Ser Pro Asn
145                 150                 155                 160
Arg Gly Thr Val Glu Cys
                165
<210>101
<211>674
<212>DNA
<213>人类
<220>
<221>CDS
<222>(10)...(464)
<400>101
gatccaaac atg agc cgc ctg ccc gtc ctg ctc ctg ctc caa ctc ctg gtc 51
          Met Ser Arg Leu Pro Val Leu Leu Leu Leu Gln Leu Leu Val
           1               5                   10
cgc ccc gga ctc caa gct ccc atg acc cag aca acg tcc ttg aag aca   99
Arg Pro Gly Leu Gln Ala Pro Met Thr Gln Thr Thr Ser Leu Lys Thr
 15                  20                  25                  30
agc tgg gtt aac tgc tct aac atg atc gat gaa att ata aca cac tta   147
Ser Trp Val Asn Cys Ser Asn Met Ile Asp Glu Ile Ile Thr His Leu
                 35                  40                  45
aag cag cca cct ttg cct ttg ctg gac ttc aac aac ctc aat ggg gaa   195
Lys Gln Pro Pro Leu Pro Leu Leu Asp Phe Asn Asn Leu Asn Gly Glu
             50                  55                  60
gac caa gac att ctg atg gaa aat aac ctt cga agg cca aac ctg gag   243
Asp Gln Asp Ile Leu Met Glu Asn Asn Leu Arg Arg Pro Asn Leu Glu
         65                  70                  75
gca ttc aac agg gct gtc aag agt tta cag aac gca tca gca att gag   291
Ala Phe Asn Arg Ala Val Lys Ser Leu Gln Asn Ala Ser Ala Ile Glu
     80                  85                  90
agc att ctt aaa aat ctc ctg cca tgt ctg ccc ctg gcc acg gcc gca   339
Ser Ile Leu Lys Asn Leu Leu Pro Cys Leu Pro Leu Ala Thr Ala Ala
 95                 100                 105                 110
ccc acg cga cat cca atc cat atc aag gac ggt gac tgg aat gaa ttc   387
Pro Thr Arg His Pro Ile His Ile Lys Asp Gly Asp Trp Asn Glu Phe
                115                 120                 125
cgg agg aaa ctg acg ttc tat ctg aaa acc ctt gag aat gcg cag gct   435
Arg Arg Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Lys Thr Leu Glu Asn Ala Gln Ala
            130                 135                 140
caa cag acg act ttg agc ctc gcg atc tt ttagtccaac gtccagctcg      484
Gln Gln Thr Thr Leu Ser Leu Ala Ile
        145                 150
ttctctgggc cttctcacca cagcgcctcg ggacatcaaa aacagcagaa cttctgaaac 544
ctctgggtca tctctcacac attccaggac cagaagcatt tcaccttttc ctgcggcatc 604
agatgaattg ttaattatct aatttctgaa atgtgcagct cccatttggc cttgtgcgt  654
tgtgttctca                                                        674
<210>102
<211>151
<212>PRT
<213>人类
<400>102
Met Ser Arg Leu Pro Val Leu Leu Leu Leu Gln Leu Leu Val Arg Pro
 1               5                  10                  15
Gly Leu Gln Ala Pro Met Thr Gln Thr Thr Ser Leu Lys Thr Ser Trp
            20                  25                  30
Val Asn Cys Ser Asn Met Ile Asp Glu Ile Ile Thr His Leu Lys Gln
        35                  40                  45
Pro Pro Leu Pro Leu Leu Asp Phe Asn Asn Leu Asn Gly Glu Asp Gln
    50                  55                  60
Asp Ile Leu Met Glu Asn Asn Leu Arg Arg Pro Asn Leu Glu Ala Phe
65                  70                  75                  80
Asn Arg Ala Val Lys Ser Leu Gln Asn Ala Ser Ala Ile Glu Ser Ile
                85                  90                  95
Leu Lys Asn Leu Leu Pro Cys Leu Pro Leu Ala Thr Ala Ala Pro Thr
            100                 105                 110
Arg His Pro Ile His Ile Lys Asp Gly Asp Trp Asn Glu Phe Arg Arg
        115                 120                 125
Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Lys Thr Leu Glu Asn Ala Gln Ala Gln Gln
    130                 135                 140
Thr Thr Leu Ser Leu Ala Ile
145                 150
<210>103
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>无Gly-Ser残基对的替代性Glu-Glu(CEE)肽标签
<400>103
Glu Glu Tyr Met Pro Met Glu
 1               5
<210>104
<211>513
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>鼠zCytor17Lig(m)-CEE多核苷酸
<221>CDS
<222>(1)...(513)
<400>104
atg atc ttc cac aca gga aca acg aag cct acc ctg gtg ctg ctt tgc   48
Met Ile Phe His Thr Gly Thr Thr Lys Pro Thr Leu Val Leu Leu Cys
 1               5                   10                  15
tgt ata gga acc tgg ctg gcc acc tgc agc ttg tcc ttc ggt gcc cca   96
Cys lle Gly Thr Trp Leu Ala Thr Cys Ser Leu Ser Phe Gly Ala Pro
             20                  25                  30
ata tcg aag gaa gac tta aga act aca att gac ctc ttg aaa caa gag   144
Ile Ser Lys Glu Asp Leu Arg Thr Thr Ile Asp Leu Leu Lys Gln Glu
         35                  40                  45
tct cag gat ctt tat aac aac tat agc ata aag cag 9ca tct ggg atg   192
Ser Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Tyr Ser Ile Lys Gln Ala Ser Gly Met
     50                  55                  60
tca gca gac 9aa tca ata cag ctg ccg tgt ttc agc ctg gac cgg gaa   240
Ser Ala Asp Glu Ser Ile Gln Leu Pro Cys Phe Ser Leu Asp Arg Glu
 65                  70                  75                  80
gca tta acc aac atc tcg gtc atc ata gca cat ctg gag aaa gtc aaa   288
Ala Leu Thr Asn Ile Ser Val Ile Ile Ala His Leu Glu Lys Val Lys
                 85                  90                  95
gtg ttg agc gag aac aca gta gat act tct tgg gtg ata aga tgg cta  336
Val Leu Ser Glu Asn Thr Val Asp Thr Ser Trp Val Ile Arg Trp Leu
            100                 105                 110
aca aac atc agc tgt ttc aac cca ctg aat tta aac att tct gtg cct  384
Thr Asn Ile Ser Cys Phe Asn Pro Leu Asn Leu Asn Ile Ser Val Pro
        115                 120                 125
gga aat act gat gaa tcc tat gat tgt aaa gtg ttc gtg ctt acg gtt  432
Gly Asn Thr Asp Glu Ser Tyr Asp Cys Lys Val Phe Val Leu Thr Val
    130                 135                 140
tta aag cag ttc tca aac tgc atg gca gaa ctg cag gct aag gac aat   480
Leu Lys Gln phe Ser Asn Cys Met Ala Glu Leu Gln Ala Lys Asp Asn
145                 150                 155                 160
act aca tgc gaa gaa tac atg ccg atg gaa tga                       513
Thr Thr Cys Glu Glu Tyr Met Pro Met Glu  ＊
                165                 170
<210>105
<211>170
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>鼠zCytor17Lig(m)-CEE多肽
<400>105
Met Ile Phe His Thr Gly Thr Thr Lys Pro Thr Leu Val Leu Leu Cys
 1               5                  10                  15
Cys Ile Gly Thr Trp Leu Ala Thr Cys Ser Leu Ser Phe Gly Ala Pro
            20                  25                  30
Ile Ser Lys Glu Asp Leu Arg Thr Thr Ile Asp Leu Leu Lys Gln Glu
        35                  40                  45
Ser Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Tyr Ser Ile Lys Gln Ala Ser Gly Met
    50                  55                  60
Ser Ala Asp Glu Ser Ile Gln Leu Pro Cys Phe Ser Leu Asp Arg Glu
65                  70                  75                  80
Ala Leu Thr Asn Ile Ser Val Ile Ile Ala His Leu Glu Lys Val Lys
                85                  90                  95
Val Leu Ser Glu Asn Thr Val Asp Thr Ser Trp Val Ile Arg Trp Leu
            100                 105                 110
Thr Asn Ile Ser Cys Phe Asn Pro Leu Asn Leu Asn Ile Ser Val Pro
        115                 120                 125
Gly Asn Thr Asp Glu Ser Tyr Asp Cys Lys Val Phe Val Leu Thr Val
    130                 135                 140
Leu Lys Gln Phe Ser Asn Cys Met Ala Glu Leu Gln Ala Lys Asp Asn
145                 150                 155                 160
Thr Thr Cys Glu Glu Tyr Met Pro Met Glu
                165                 170
<210>106
<211>49
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC41643
<400>106
tccagggaat tcatataggc cggccaccat gatcttccac acaggaaca            49
<210>107
<211>85
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC41641
<400>107
caaccccaga gctgttttaa ggcgcgcctc tagattatca ttccatcggcatgtattctt 60
cgcatgtagt attgtcctta gcctg                                      85
<210>108
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC38，239
<400>108
gccgactaag ccagagaac                     19
<210>109
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC38，245
<400>109
ctgttgacag ttctgaaccg                    20
<210>110
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC38，238
<400>110
cgcggtttcc attgtatctg                    20
<210>111
<211>2748
<212>DNA
<213>台湾鼷鼠
<220>
<221>CDS
<222>(237)...(2222)
<400>111
gatggggccc tgaatgttga tctgacagaa ttccagacca acctggtggt tattgtcctt
ttcatctggt catgctgaat atactctcaa gatgtgctgg agaaggtgct gctg
Figure G2009102637047D02912
ctctcagaga aggcagtgct ggaggcgttc ctggcccggg tctcctccta ctgttcctgg 180
tagcccagcc ttctcggggt ggaaggagaa gctggccagg tgagctctga ggaagc atg 239
                                                              Met
ctg agc agc cag aag gga tcc tgc agc cag gaa cca ggg gca gcc cac   287
Leu Ser Ser Gln Lys Gly Ser Cys Ser Gln Glu Pro Gly Ala Ala His
             5                   10                  15
gtc cag cct ctg ggt gtg aac gct gga ata atg tgg acc ttg gca ctg   335
Val Gln Pro Leu Gly Val Asn Ala Gly Ile Met Trp Thr Leu Ala Leu
         20                  25                  30
tgg gca ttc tct ttc ctc tgc aaa ttc agc ctg gca gtc ctg ccg act   383
Trp Ala Phe Ser Phe Leu Cys Lys Phe Ser Leu Ala Val Leu Pro Thr
     35                  40                  45
aag cca gag aac att tcc tgc gtc ttt tac ttc gac aga aat ctg act   431
Lys Pro Glu Asn Ile Ser Cys Val Phe Tyr Phe Asp Arg Asn Leu Thr
 50                  55                  60                  65
tgc act tgg aga cca gag aag gaa acc aat gat acc agc tac att gtg   479
Cys Thr Trp Arg Pro Glu Lys Glu Thr Asn Asp Thr Ser Tyr Ile Val
                 70                  75                  80
act ttg act tac tcc tat gga aaa agc aat tat agt gac aat gct aca   527
Thr Leu Thr Tyr Ser Tyr Gly Lys Ser Asn Tyr Ser Asp Asn Ala Thr
             85                  90                  95
gag gct tca tat tct ttt ccc cgt tcc tgt gca atg ccc cca gac atc   575
Glu Ala Ser Tyr Ser Phe Pro Arg Ser Cys Ala Met Pro Pro Asp Ile
        100                 105                 110
tgc agt gtt gaa gta caa gct caa aat gga gat ggt aaa gtt aaa tct   623
Cys Ser Val Glu Val Gln Ala Gln Asn Gly Asp Gly Lys Val Lys Ser
    115                 120                 125
gac atc aca tat tgg cat tta atc tcc ata gca aaa acc gaa cca cct   671
Asp Ile Thr Tyr Trp His Leu Ile Ser Ile Ala Lys Thr Glu Pro Pro
130                 135                 140                 145
ata att tta agt gtg aat cca att tgt aat aga atg ttc cag ata caa   719
Ile Ile Leu Ser Val Asn Pro Ile Cys Asn Arg Met Phe Gln Ile Gln
                150                 155                 160
tgg aaa ccg cgt gaa aag act cgt ggg ttt cct tta gta tgc atg ctt
Trp Lys Pro Arg Glu Lys Thr Arg Gly Phe Pro Leu Val Cys Met Leu
            165                 170                 175
cgg ttc aga act gtc aac agt agc cgc tgg acg gaa gtc aat ttt gaa   815
Arg Phe Arg Thr Val Asn Ser Ser Arg Trp Thr Glu Val Asn Phe Glu
        180                 185                 190
aac tgt aaa cag gtc tgc aac ctc aca gga ctt cag gct ttc aca gaa   863
Asn Cys Lys Gln Val Cys Asn Leu Thr Gly Leu Gln Ala Phe Thr Glu
    195                 200                 205
tat gtc ctg gct cta cga ttc agg ttc aat gac tca aga tat tgg agc   911
Tyr Val Leu Ala Leu Arg Phe Arg Phe Asn Asp Ser Arg Tyr Trp Ser
210                 215                 220                 225
aag tgg agc aaa gaa gaa acc aga gtg act atg gag gaa gtt cca cat   959
Lys Trp Ser Lys Glu Glu Thr Arg Val Thr Met Glu Glu Val Pro His
                230                 235                 240
gtc ctg gac ctg tgg aga att ctg gaa cca gca gac atg aac gga gac   1007
Val Leu Asp Leu Trp Arg Ile Leu Glu Pro Ala Asp Met Asn Gly Asp
            245                 250                 255
agg aag gtg cga ttg ctg tgg aag aag gca aga gga gcc ccc gtc ttg   1055
Arg Lys Val Arg Leu Leu Trp Lys Lys Ala Arg Gly Ala Pro Val Leu
        260                 265                 270
gag aaa aca ttt ggc tac cac ata cag tac ttt gca gag aac agc act   1103
Glu Lys Thr Phe Gly Tyr His Ile Gln Tyr Phe Ala Glu Asn Ser Thr
    275                 280                 285
aac ctc aca gag ata aac aac atc acc acc cag cag tat gaa ctg ctt   1151
Asn Leu Thr Glu Ile Asn Asn Ile Thr Thr Gln Gln Tyr Glu Leu Leu
290                 295                 300                 305
ctg atg agc cag gca cac tct gtg tcc gtg act tct ttt aat tct ctt   1199
Leu Met Ser Gln Ala His Ser Val Ser Val Thr Ser Phe Asn Ser Leu
                310                 315                 320
ggc aag tcc caa gag acc atc ctg agg atc cca gat gtc cat gag aag   1247
Gly Lys Ser Gln Glu Thr Ile Leu Arg Ile Pro Asp Val His Glu Lys
            325                 330                 335
acc ttc cag tac att aag agc atg cag gcc tac ata gcc gag ccc ctg   1295
Thr Phe Gln Tyr Ile Lys Ser Met Gln Ala Tyr Ile Ala Glu Pro Leu
        340                 345                 350
ttg gtg gtg aac tgg caa agc tcc att cct gcg gtg gac act tgg ata   1343
Leu Val Val Asn Trp Gln Ser Ser Ile Pro Ala Val Asp Thr Trp Ile
    355                 360                 365
gtg gag tgg ctc cca gaa gct gcc atg tcg aag ttc cct gcc ctt tcc   1391
Val Glu Trp Leu Pro Glu Ala Ala Met Ser Lys Phe Pro Ala Leu Ser
370                 375                 380                 385
tgg gaa tct gtg tct cag gtc acg aac tgg acc atc gag caa gat aaa   1439
Trp Glu Ser Val Ser Gln Val Thr Asn Trp Thr Ile Glu Gln Asp Lys
                390                 395                 400
cta aaa cct ttc aca tgc tat aat ata tca gtg tat cca gtg ttg gga   1487
Leu Lys Pro Phe Thr Cys Tyr Asn Ile Ser Val Tyr Pro Val Leu Gly
            405                 410                 415
cac cga gtt gga gag ccg tat tca atc caa gct tat gcc aaa gaa gga   1535
His Arg Val Gly Glu Pro Tyr Ser Ile Gln Ala Tyr Ala Lys Glu Gly
        420                 425                 430
act cca tta aaa ggt cct gag acc agg gtg gag aac atc ggt ctg agg   1583
Thr Pro Leu Lys Gly Pro Glu Thr Arg Val Glu Asn Ile Gly Leu Arg
    435                 440                 445
aca gcc acg atc aca tgg aag gag att cct aag agt gct agg aat gga   1631
Thr Ala Thr Ile Thr Trp Lys Glu Ile Pro Lys Ser Ala Arg Asn Gly
450                 455                 460                 465
ttt atc aac aat tac act gta ttt tac caa gct gaa ggt gga aaa gaa   1679
Phe Ile Asn Asn Tyr Thr Val Phe Tyr Gln Ala Glu Gly Gly Lys Glu
                470                 475                 480
ctc tcc aag act gtt aac tct cat gcc ctg cag tgt gac ctg gag tct   1727
Leu Ser Lys Thr Val Asn Ser His Ala Leu Gln Cys Asp Leu Glu Ser
            485                 490                 495
ctg aca cga agg acc tct tat act gtt tgg gtc atg gcc agc acc aga   1775
Leu Thr Arg Arg Thr Ser Tyr Thr Val Trp Val Met Ala Ser Thr Arg
        500                 505                 510
gct gga ggt acc aac ggg gtg aga ata aac ttc aag aca ttg tca atc   1823
Ala Gly Gly Thr Asn Gly Val Arg Ile Asn Phe Lys Thr Leu Ser Ile
    515                 520                 525
agt gtg ttt gaa att gtc ctt cta aca tct cta gtt gga gga ggc ctt   1871
Ser Val Phe Glu Ile Val Leu Leu Thr Ser Leu Val Gly Gly Gly Leu
530                 535                 540                 545
ctt cta ctt agc atc aaa aca gtg act ttt ggc ctc aga aag cca aac   1919
Leu Leu Leu Ser Ile Lys Thr Val Thr Phe Gly Leu Arg Lys Pro Asn
                550                 555                 560
cgg ttg act ccc ctg tgt tgt cct gat gtt ccc aac cct gct gaa agt   1967
Arg Leu Thr Pro Leu Cys Cys Pro Asp Val Pro Asn Pro Ala Glu Ser
            565                 570                 575
agt tta gcc aca tgg ctc gga gat ggt ttc aag aag tca aat atg aag   2015
Ser Leu Ala Thr Trp Leu Gly Asp Gly Phe Lys Lys Ser Asn Met Lys
        580                 585                 590
gag act gga aac tct ggg aac aca gaa gac gtg gtc cta aaa cca tgt   2063
Glu Thr Gly Asn Ser Gly Asn Thr Glu Asp Val Val Leu Lys Pro Cys
    595                 600                 605
ccc gtc ccc gcg gat ctc att gac aag ctg gta gtg aac ttt gag aat   2111
Pro Val Pro Ala Asp Leu Ile Asp Lys Leu Val Val Asn Phe Glu Asn
610                 615                 620                 625
ttt ctg gaa gta gtt ttg aca gag gaa gct gga aag ggt cag gcg agc   2159
Phe Leu Glu Val Val Leu Thr Glu Glu Ala Gly Lys Gly Gln Ala Ser
                630                 635                 640
att ttg gga gga gaa gcg aat gag tat atc tta tcc cag gaa cca agc   2207
Ile Leu Gly Gly Glu Ala Asn Glu Tyr Ile Leu Ser Gln Glu Pro Ser
            645                 650                 655
tgt cct ggc cat tgc tgaagctacc ctcagggtcc aggacagctg tcttgttggc   2262
Cys Pro Gly His Cys
        660
acttgactct ggcaggaacc tgatctctac ttttcttctc cctgtctccg gacactttct 2322
ctccttcatg cagagaccag gactagagcg gattcctcat ggtttgccag gctcctcagt 2382
ccttgctcgg gctcaggatc ttcaacaatg ccctttctgg gacactccat catccactta 2442
tatttatttt ttgcaacatt gtggattgaa cccagggact tgtttatgcg cgcaacttca 2502
gtaactgtgg cagagactta ggaatggaga tctgaccctt tgcagaaggt ttctggacat 2562
ccgtccctgt gtgagcctca gacagcattg tctttacttt gaatcagctt ccaagttaat 2622
aaaagaaaaa cagagaggtg gcataacagc tcctgcttcc tgacctgctt gagttccagt 2682
tctgacttcc tttggtgatg aacagcaatg tgggaagtgt aagctgaata aaccctttcc 2742
tcccca                                                            2748
<210>112
<211>662
<212>PRT
<213>台湾鼷鼠
<400>112
Met Leu Ser Ser Gln Lys Gly Ser Cys Ser Gln Glu Pro Gly Ala Ala
 1               5                  10                  15
His Val Gln Pro Leu Gly Val Asn Ala Gly Ile Met Trp Thr Leu Ala
            20                  25                  30
Leu Trp Ala Phe Ser Phe Leu Cys Lys Phe Ser Leu Ala Val Leu Pro
        35                  40                  45
Thr Lys Pro Glu Asn Ile Ser Cys Val Phe Tyr Phe Asp Arg Asn Leu
    50                  55                  60
Thr Cys Thr Trp Arg Pro Glu Lys Glu Thr Asn Asp Thr Ser Tyr Ile
65                  70                  75                  80
Val Thr Leu Thr Tyr Ser Tyr Gly Lys Ser Asn Tyr Ser Asp Asn Ala
                 85                  90                  95
Thr Glu Ala Ser Tyr Ser Phe Pro Arg Ser Cys Ala Met Pro Pro Asp
            100                 105                 110
Ile Cys Ser Val Glu Val Gln Ala Gln Asn Gly Asp Gly Lys Val Lys
        115                 120                 125
Ser Asp Ile Thr Tyr Trp His Leu Ile Ser Ile Ala Lys Thr Glu Pro
    130                 135                 140
Pro Ile Ile Leu Ser Val Asn Pro Ile Cys Asn Arg Met Phe Gln Ile
145                 150                 155                 160
Gln Trp Lys Pro Arg Glu Lys Thr Arg Gly Phe Pro Leu Val Cys Met
                165                 170                 175
Leu Arg Phe Arg Thr Val Asn Ser Ser Arg Trp Thr Glu Val Asn Phe
            180                 185                 190
Glu Asn Cys Lys Gln Val Cys Asn Leu Thr Gly Leu Gln Ala Phe Thr
        195                 200                 205
Glu Tyr Val Leu Ala Leu Arg Phe Arg Phe Asn Asp Ser Arg Tyr Trp
    210                 215                 220
Ser Lys Trp Ser Lys Glu Glu Thr Arg Val Thr Met Glu Glu Val Pro
225                 230                 235                 240
His Val Leu Asp Leu Trp Arg Ile Leu Glu Pro Ala Asp Met Asn Gly
                245                 250                 255
Asp Arg Lys Val Arg Leu Leu Trp Lys Lys Ala Arg Gly Ala Pro Val
            260                 265                 270
Leu Glu Lys Thr Phe Gly Tyr His Ile Gln Tyr Phe Ala Glu Asn Ser
        275                 280                 285
Thr Asn Leu Thr Glu Ile Asn Asn Ile Thr Thr Gln Gln Tyr Glu Leu
    290                 295                 300
Leu Leu Met Ser Gln Ala His Ser Val Ser Val Thr Ser Phe Asn Ser
305                 310                 315                 320
Leu Gly Lys Ser Gln Glu Thr Ile Leu Arg Ile Pro Asp Val His Glu
                325                 330                 335
Lys Thr Phe Gln Tyr Ile Lys Ser Met Gln Ala Tyr Ile Ala Glu Pro
            340                 345                 350
Leu Leu Val Val Asn Trp Gln Ser Ser Ile Pro Ala Val Asp Thr Trp
        355                 360                 365
Ile Val Glu Trp Leu Pro Glu Ala Ala Met Ser Lys Phe Pro Ala Leu
    370                 375                 380
Ser Trp Glu Ser Val Ser Gln Val Thr Asn Trp Thr Ile Glu Gln Asp
385                 390                 395                 400
Lys Leu Lys Pro Phe Thr Cys Tyr Asn Ile Ser Val Tyr Pro Val Leu
                405                 410                 415
Gly His Arg Val Gly Glu Pro Tyr Ser Ile Gln Ala Tyr Ala Lys Glu
            420                 425                 430
Gly Thr Pro Leu Lys Gly Pro Glu Thr Arg Val Glu Asn Ile Gly Leu
        435                 440                 445
Arg Thr Ala Thr Ile Thr Trp Lys Glu Ile Pro Lys Ser Ala Arg Asn
    450                 455                 460
Gly Phe Ile Asn Asn Tyr Thr Val Phe Tyr Gln Ala Glu Gly Gly Lys
465                 470                 475                 480
Glu Leu Ser Lys Thr Val Asn Ser His Ala Leu Gln Cys Asp Leu Glu
                485                 490                 495
Ser Leu Thr Arg Arg Thr Ser Tyr Thr Val Trp Val Met Ala Ser Thr
            500                 505                 510
Arg Ala Gly Gly Thr Asn Gly Val Arg Ile Asn Phe Lys Thr Leu Ser
        515                 520                 525
Ile Ser Val Phe Glu Ile Val Leu Leu Thr Ser Leu Val Gly Gly Gly
    530                 535                 540
Leu Leu Leu Leu Ser Ile Lys Thr Val Thr Phe Gly Leu Arg Lys Pro
545                 550                 555                 560
Asn Arg Leu Thr Pro Leu Cys Cys Pro Asp Val Pro Asn Pro Ala Glu
                565                 570                 575
Ser Ser Leu Ala Thr Trp Leu Gly Asp Gly Phe Lys Lys Ser Asn
Figure G2009102637047D02971
            580                 585                 590
Lys Glu Thr Gly Asn Ser Gly Asn Thr Glu Asp Val Val Leu Lys Pro
        595                 600                 605
Cys Pro Val Pro Ala Asp Leu Ile Asp Lys Leu Val Val Asn Phe Glu
    610                 615                 620
Asn Phe Leu Glu Val Val Leu Thr Glu Glu Ala Gly Lys Gly Gln Ala
625                 630                 635                 640
Ser Ile Leu Gly Gly Glu Ala Asn Glu Tyr Ile Leu Ser Gln Glu Pro
                645                 650                 655
Ser Cys Pro Gly His Cys
            660
<210>113
<211>2728
<212>DNA
<213>台湾鼷鼠
<220>
<221>CDS
<222>(237)...(1877)
<400>113
gatggggccc tgaatgttga tctgacagaa ttccagacca acctggtggt tattgtcctt 60
ttcatctggt catgctgaat atactctcaa gatgtgctgg agaaggtgct gctgtccggg 120
ctctcagaga aggcagtgct ggaggcgttc ctggcccggg tctcctccta ctgttcctgg 180
tagcccagcc ttctcggggt ggaaggagaa gctggccagg tgagctctga ggaagc atg 239
                                                              Met
                                                               1
ctg agc agc cag aag gga tcc tgc agc cag gaa cca ggg gca gcc cac   287
Leu Ser Ser Gln Lys Gly Ser Cys Ser Gln Glu Pro Gly Ala Ala His
             5                   l0                  15
gtc cag cct ctg ggt gtg aac gct gga ata atg tgg acc ttg gca ctg   335
Val Gln Pro Leu Gly Val Asn Ala Gly Ile Met Trp Thr Leu Ala Leu
         20                  25                  30
tgg gca ttc tct ttc ctc tgc aaa ttc agc ctg gca gtc ctg ccg act   383
Trp Ala Phe Ser Phe Leu Cys Lys Phe Ser Leu Ala Val Leu Pro Thr
     35                  40                  45
aag cca gag aac att tcc tgc gtc ttt tac ttc gac aga aat ctg act   431
Lys Pro Glu Asn Ile Ser Cys Val Phe Tyr Phe Asp Arg Asn Leu Thr
 50                  55                  60                  65
tgc act tgg aga cca gag aag gaa acc aat gat acc agc tac att gtg   479
Cys Thr Trp Arg Pro Glu Lys Glu Thr Asn Asp Thr Ser Tyr Ile Val
                 70                  75                  80
act ttg act tac tcc tat gga aaa agc aat tat agt gac aat gct aca   527
Thr Leu Thr Tyr Ser Tyr Gly Lys Ser Asn Tyr Ser Asp Asn Ala Thr
             85                  90                  95
gag gct tca tat tct ttt ccc cgt tcc tgt gca atg ccc cca gac atc   575
Glu Ala Ser Tyr Ser Phe Pro Arg Ser Cys Ala Met Pro Pro Asp Ile
        100                 105                 110
tgc agt gtt gaa gta caa gct caa aat gga gat ggt aaa gtt aaa tct   623
Cys Ser Val Glu Val Gln Ala Gln Asn Gly Asp Gly Lys Val Lys Ser
    115                 120                 125
gac atc aca tat tgg cat tta atc tcc ata gca aaa acc gaa cca cct   671
Asp Ile Thr Tyr Trp His Leu Ile Ser Ile Ala Lys Thr Glu Pro Pro
130                 135                 140                 145
ata att tta agt gtg aat cca att tgt aat aga atg ttc cag ata caa   719
Ile Ile Leu Ser Val Asn Pro Ile Cys Asn Arg Met Phe Gln Ile Gln
                150                 155                 160
tgg aaa ccg cgt gaa aag act cgt ggg ttt cct tta gta tgc atg ctt   767
Trp Lys Pro Arg Glu Lys Thr Arg Gly Phe Pro Leu Val Cys Met Leu
            165                 170                 175
cgg ttc aga act gtc aac agt agc cgc tgg acg gaa gtc aat ttt gaa   815
Arg Phe Arg Thr Val Asn Ser Ser Arg Trp Thr Glu Val Asn Phe Glu
        180                 185                 190
aac tgt aaa cag gtc tgc aac ctc aca gga ctt cag gct ttc aca gaa   863
Asn Cys Lys Gln Val Cys Asn Leu Thr Gly Leu Gln Ala Phe Thr Glu
    195                 200                 205
tat gtc ctg gct cta cga ttc agg ttc aat gac tca aga tat tgg agc   911
Tyr Val Leu Ala Leu Arg Phe Arg Phe Asn Asp Ser Arg Tyr Trp Ser
210                 215                 220                 225
aag tgg agc aaa gaa gaa acc aga gtg act atg gag gaa gtt cca cat   959
Lys Trp Ser Lys Glu Glu Thr Arg Val Thr Met Glu Glu Val Pro His
                230                 235                 240
gtc ctg gac ctg tgg aga att ctg gaa cca gca gac atg aac gga gac   1007
Val Leu Asp Leu Trp Arg Ile Leu Glu Pro Ala Asp Met Asn Gly Asp
            245                 250                 255
agg aag gtg cga ttg ctg tgg aag aag gca aga gga gcc ccc gtc ttg   1055
Arg Lys Val Arg Leu Leu Trp Lys Lys Ala Arg Gly Ala Pro Val Leu
        260                 265                 270
gag aaa aca ttt ggc tac cac ata cag tac ttt gca gag aac agc act   1103
Glu Lys Thr Phe Gly Tyr His Ile Gln Tyr Phe Ala Glu Asn Ser Thr
    275                 280                 285
aac ctc aca gag ata aac aac atc acc acc cag cag tat gaa ctg ctt   1151
Asn Leu Thr Glu Ile Asn Asn Ile Thr Thr Gln Gln Tyr Glu Leu Leu
290                 295                 300                 305
ctg atg agc cag gca cac tct gtg tcc gtg act tct ttt aat tct ctt   1199
Leu Met Ser Gln Ala His Ser Val Ser Val Thr Ser Phe Asn Ser Leu
                310                 315                 320
ggc aag tcc caa gag acc atc ctg agg atc cca gat gtc cat gag aag   1247
Gly Lys Ser Gln Glu Thr Ile Leu Arg Ile Pro Asp Val His Glu Lys
            325                 330                 335
acc ttc cag tac att aag agc atg cag gcc tac ata gcc gag ccc ctg   1295
Thr Phe Gln Tyr Ile Lys Ser Met Gln Ala Tyr Ile Ala Glu Pro Leu
        340                 345                 350
ttg gtg gtg aac tgg caa agc tcc att cct gcg gtg gac act tgg ata   1343
Leu Val Val Asn Trp Gln Ser Ser Ile Pro Ala Val Asp Thr Trp Ile
    355                 360                 365
gtg gag tgg ctc cca gaa gct gcc atg tcg aag ttc cct gcc ctt tcc   1391
Val Glu Trp Leu Pro Glu Ala Ala Met Ser Lys Phe Pro Ala Leu Ser
370                 375                 380                 385
tgg gaa tct gtg tct cag gtc acg aac tgg acc atc gag caa gat aaa   1439
Trp Glu Ser Val Ser Gln Val Thr Asn Trp Thr Ile Glu Gln Asp Lys
                390                 395                 400
cta aaa cct ttc aca tgc tat aat ata tca gtg tat cca gtg ttg gga   1487
Leu Lys Pro Phe Thr Cys Tyr Asn Ile Ser Val Tyr Pro Val Leu Gly
            405                 410                 415
cac cga gtt gga gag ccg tat tca atc caa gct tat gcc aaa gaa gga   1535
His Arg Val Gly Glu Pro Tyr Ser Ile Gln Ala Tyr Ala Lys Glu Gly
        420                 425                 430
act cca tta aaa ggt cct gag acc agg gtg gag aac atc ggt ctg agg   1583
Thr Pro Leu Lys Gly Pro Glu Thr Arg Val Glu Asn Ile Gly Leu Arg
    435                 440                 445
aca gcc acg atc aca tgg aag gag att cct aag agt gct agg aat gga   1631
Thr Ala Thr Ile Thr Trp Lys Glu Ile Pro Lys Ser Ala Arg Asn Gly
450                 455                 460                 465
ttt atc aac aat tac act gta ttt tac caa gct gaa ggt gga aaa gaa   1679
Phe Ile Asn Asn Tyr Thr Val Phe Tyr Gln Ala Glu Gly Gly Lys Glu
                470                 475                 480
ctc tcc aag act gtt aac tct cat gcc ctg cag tgt gac ctg gag tct   1727
Leu Ser Lys Thr Val Asn Ser His Ala Leu Gln Cys Asp Leu Glu Ser
            485                 490                 495
ctg aca cga agg acc tct tat act gtt tgg gtc atg gcc agc acc aga   1775
Leu Thr Arg Arg Thr Ser Tyr Thr Val Trp Val Met Ala Ser Thr Arg
        500                 505                 510
gct gga ggt acc aac ggg gtg aga ata aac ttc aag aca ttg tca atc   1823
Ala Gly Gly Thr Asn Gly Val Arg Ile Asn Phe Lys Thr Leu Ser Ile
    515                 520                 525
agt gag tac tgg ctt cag gcc tca ttc tgg agt tta ctt cgg gtt gga   1871
Ser Glu Tyr Trp Leu Gln Ala Ser Phe Trp Ser Leu Leu Arg Val Gly
530                 535                 540                 545
aat gtt tgacaggagc aaggagagcc agcagagggc agcagagcat ggcttctcct    1927
Asn Val
gctctctctg gctcactcac ctcccaggag ttactgagga gctggcaaag ggagggctga 1987
gttagaccaa caggccattt tgatccttgc tggtaagcag ccacaaataa tcttaagatg 2047
aagcaagcaa catccacttc agcctcagcc acgtcaaagg ctgttgcctg agctcacact 2107
ggccagttcc taaatgtcag gagttgtgca atagaacctg ggaaggaaca actggttgat 2167
cagaggtcac tgacaaggga cttaatgtta ccatctgcgg tggggctttt gtttcgtttt 2227
gtttgtttgt tatgtgtatt caacttatca gcttttacgt tgaaaacatg aaaagcaaga 2287
caaatttgtt agatatcaca tataatgtga aatataatag tttaataatt gagtaggaaa 2347
gctgagggca tgtaatagac agagggaaaa gaagaggaaa gccagtctgg tctacaaagt 2407
gagttccagg acagccaggg ctacatggag aaaccctgtc tcaatcaatc aatcaatcaa 2467
tcaatcagtc aatcaatcaa aattcaagca gcattgacaa gttttgcaat aactactata 2527
aaccaaaaaa gtcatcttga tgtatctcag aagccccttg ttatttatgt tcctgaagac 2587
taaagtagac cgtggctctg agaaccatga gcaagataac acgttctgtc ctgcagccta 2647
acaatgcctt cttggtattc tttttgatac aacttctaaa ataacttttt tttaaaaaaa 2707
ataaaaatca tgttacagct a                                           2728
<210>114
<211>547
<212>PRT
<213>台湾鼷鼠
<400>114
Met Leu Ser Ser Gln Lys Gly Ser Cys Ser Gln Glu Pro Gly Ala Ala
 1               5                  10                  15
His Val Gln Pro Leu Gly Val Asn Ala Gly Ile Met Trp Thr Leu Ala
            20                  25                  30
Leu Trp Ala Phe Ser Phe Leu Cys Lys Phe Ser Leu Ala Val Leu Pro
        35                  40                  45
Thr Lys Pro Glu Asn Ile Ser Cys Val Phe Tyr Phe Asp Arg Asn Leu
    50                  55                  60
Thr Cys Thr Trp Arg Pro Glu Lys Glu Thr Asn Asp Thr Ser Tyr Ile
65                  70                  75                  80
Val Thr Leu Thr Tyr Ser Tyr Gly Lys Ser Asn Tyr Ser Asp Asn Ala
                85                  90                  95
Thr Glu Ala Ser Tyr Ser Phe Pro Arg Ser Cys Ala Met Pro Pro Asp
            100                 105                 110
Ile Cys Ser Val Glu Val Gln Ala Gln Asn Gly Asp Gly Lys Val Lys
        115                 120                 125
Ser Asp Ile Thr Tyr Trp His Leu Ile Ser Ile Ala Lys Thr Glu Pro
    130                 135                 140
Pro Ile Ile Leu Ser Val Asn Pro Ile Cys Asn Arg Met Phe Gln Ile
145                 150                 155                 160
Gln Trp Lys Pro Arg Glu Lys Thr Arg Gly Phe Pro Leu Val Cys Met
                165                 170                 175
Leu Arg Phe Arg Thr Val Asn Ser Ser Arg Trp Thr Glu Val Asn Phe
            180                 185                 190
Glu Asn Cys Lys Gln Val Cys Asn Leu Thr Gly Leu Gln Ala Phe Thr
        195                 200                 205
Glu Tyr Val Leu Ala Leu Arg Phe Arg Phe Asn Asp Ser Arg Tyr Trp
    210                 215                 220
Ser Lys Trp Ser Lys Glu Glu Thr Arg Val Thr Met Glu Glu Val Pro
225                 230                 235                 240
His Val Leu Asp Leu Trp Arg Ile Leu Glu Pro Ala Asp Met Asn Gly
                245                 250                 255
Asp Arg Lys Val Arg Leu Leu Trp Lys Lys Ala Arg Gly Ala Pro Val
            260                 265                 270
Leu Glu Lys Thr Phe Gly Tyr His Ile Gln Tyr Phe Ala Glu Asn Ser
        275                 280                 285
Thr Asn Leu Thr Glu Ile Asn Asn Ile Thr Thr Gln Gln Tyr Glu Leu
    290                 295                 300
Leu Leu Met Ser Gln Ala His Ser Val Ser Val Thr Ser Phe Asn Ser
305                 310                 315                 320
Leu Gly Lys Ser Gln Glu Thr Ile Leu Arg Ile Pro Asp Val His Glu
                325                 330                 335
Lys Thr Phe Gln Tyr Ile Lys Ser Met Gln Ala Tyr Ile Ala Glu Pro
            340                 345                 350
Leu Leu Val Val Asn Trp Gln Ser Ser Ile Pro Ala Val Asp Thr Trp
        355                 360                 365
Ile Val Glu Trp Leu Pro Glu Ala Ala Met Ser Lys Phe Pro Ala Leu
    370                 375                 380
Ser Trp Glu Ser Val Ser Gln Val Thr Asn Trp Thr Ile Glu Gln Asp
385                 390                 395                 400
Lys Leu Lys Pro Phe Thr Cys Tyr Asn Ile Ser Val Tyr Pro Val Leu
                405                 410                 415
Gly His Arg Val Gly Glu Pro Tyr Ser Ile Gln Ala Tyr Ala Lys Glu
            420                 425                 430
Gly Thr Pro Leu Lys Gly Pro Glu Thr Arg Val Glu Asn Ile Gly Leu
        435                 440                 445
Arg Thr Ala Thr Ile Thr Trp Lys Glu Ile Pro Lys Ser Ala Arg Asn
    450                 455                 460
Gly Phe Ile Asn Asn Tyr Thr Val Phe Tyr Gln Ala Glu Gly Gly Lys
465                 470                 475                 480
Glu Leu Ser Lys Thr Val Asn Ser His Ala Leu Gln Cys Asp Leu Glu
                485                 490                 495
Ser Leu Thr Arg Arg Thr Ser Tyr Thr Val Trp Val Met Ala Ser Thr
            500                 505                 510
Arg Ala Gly Gly Thr Asn Gly Val Arg Ile Asn Phe Lys Thr Leu Ser
        515                 520                 525
Ile Ser Glu Tyr Trp Leu Gln Ala Ser Phe Trp Ser Leu Leu Arg Val
    530                 535                 540
Gly Asn Val
545
<210>115
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物ZC41，764
<400>115
atcgaattca gaccaatggc tttctctgtg                     30
<210>116
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物Zc41，598
<400>116
acagtagtgt tctgactcag ttgg                           24
<210>117
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物Zc41，948
<400>117
ggtactgttc tctttgtctc g                              21
<210>118
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物ZC41，766
<400>118
atctctagat gtttactgtt caccttg                                      27
<210>119
<211>4026
<212>DNA
<213>台湾鼷鼠
<220>
<221>CDS
<222>(780)...(3692)
<400>119
ctgtggacat tttaccatgc agccataaag agaggtcaaa aatgtctttc aagtgcccgg 60
ttagtaaaga tctgatggcg ttctaaggag agaaaggaac ttggatcttc gtggacaaag 120
aattcaggtc tgtagctgaa ggaggcgtgg ccacacaggg cgtttccagg tcctgtagag 180
gaagcacagt tcatagatct ctgttctaac acgtctgtct tgctctgaac gccgaaagtc 240
aactcgatca caagtttgat ccaacagttt gacatttcag gtaattttca gacggagcgc 300
tggggttgga tctcccaagc aacacaattg gctctgtgca ggacacctgg cacggggcac 360
tgggtcgcag ctcgtcccct ctccctccag gaacaacgat gctcaaggac cagcttttcc 420
tcccaggcct ctcccacttc ccttctcacc ggtgctgccc gcccggtccc gggaaccgcg 480
cccgtcgcag ggtcccgatc gttcccccta catcccttgg gaccaggagc aaattcctgt 540
gggtcccagg agtgccaaaa gtgctcagcg agacgggaaa ttgcaacagt acttggccct 600
tcggccctcc cccggcgctt tcccgtaact cccgcccctg gacacttgtc ccgtagttga 660
ttcatagctg gggcgcgggg ccgcctccac acgcctggac agacgtccgc gcccgttccc 720
ctgtgaggcc gaggaccggc aaggctccgg agcaggtcgc caggcgggta atcagacca  779
atg gct ttc tct gtg gtc ctt cat cca gcc ttc ctc ctg gca gtg ctg   827
Met Ala Phe Ser Val Val Leu His Pro Ala Phe Leu Leu Ala Val Leu
 1               5                   10                  15
tcc ctg agg gca tcc cga agc gaa gtc ttg gag gag cct tta cca ttg   875
Ser Leu Arg Ala Ser Arg Ser Glu Val Leu Glu Glu Pro Leu Pro Leu
             20                  25                  30
act cct gag ata cat aaa gtt tct ttt caa ttg aaa ctt caa gaa gtg   923
Thr Pro Glu Ile His Lys Val Ser Phe Gln Leu Lys Leu Gln Glu Val
         35                  40                  45
aat tta gaa tgg act gtc cca gcc ctt act cat gaa gaa tta aac atg   971
Asn Leu Glu Trp Thr Val Pro Ala Leu Thr His Glu Glu Leu Asn Met
     50                  55                  60
ata ttt cag ata gag atc agt aga ctg aac ata tcc aac acc atc tgg   1019
Ile Phe Gln Ile Glu Ile Ser Arg Leu Asn Ile Ser Asn Thr Ile Trp
 65                  70                  75                  80
gtg gag aat tat agc acc act gtg aag cgt gaa gaa gct gtg cgt tgg   1067
Val Glu Asn Tyr Ser Thr Thr Val Lys Arg Glu Glu Ala Val Arg Trp
                 85                  90                  95
aac tgg acg tct gat atc cct ttg gag tgt gtc aaa cat ttc ata aga   1115
Asn Trp Thr Ser Asp Ile Pro Leu Glu Cys Val Lys His Phe Ile Arg
            100                 105                 110
atc agg gct ctg gta gat gac acc aag tcc ctt cca cag agt tcc tgg   1163
Ile Arg Ala Leu Val Asp Asp Thr Lys Ser Leu Pro Gln Ser Ser Trp
        115                 120                 125
ggc aac tgg agt tcc tgg aaa gaa gtt aat gca aag gtt tcc gtt gaa   1211
Gly Asn Trp Ser Ser Trp Lys Glu Val Asn Ala Lys Val Ser Val Glu
    130                 135                 140
cct gat aaa tca tta ata ttt cct aaa gac aaa gtg ttg gaa gaa ggc   1259
Pro Asp Lys Ser Leu Ile Phe Pro Lys Asp Lys Val Leu Glu Glu Gly
145                 150                 155                 160
tcc aat gtc acc atc tgt ctg atg tat ggg cag aat gta tat aat gta   1307
Ser Asn Val Thr Ile Cys Leu Met Tyr Gly Gln Asn Val Tyr Asn Val
                165                 170                 175
tcc tgt aag ttg caa gat gag cca atc cat gga gaa caa ctt gat tcc   1355
Ser Cys Lys Leu Gln Asp Glu Pro Ile His Gly Glu Gln Leu Asp Ser
            180                 185                 190
cac gtg tca tta tta aaa ttg aac aat gta gtt ttc ctt agt gac aca   1403
His Val Ser Leu Leu Lys Leu Asn Asn Val Val Phe Leu Ser Asp Thr
        195                 200                 205
ggg aca aac atc aat tgt caa gcc acg aag ggt cct aaa aga ata ttt   1451
Gly Thr Asn Ile Asn Cys Gln Ala Thr Lys Gly Pro Lys Arg Ile Phe
    210                 215                 220
ggt act gtt ctc ttt gtc tcg aaa gtg ctc gag gaa cct aag aat gtt   1499
Gly Thr Val Leu Phe Val Ser Lys Val Leu Glu Glu Pro Lys Asn Val
225                 230                 235                 240
tcc tgt gaa acc cga gac ttt aag act ttg gac tgt tca tgg gaa cct   1547
Ser Cys Glu Thr Arg Asp Phe Lys Thr Leu Asp Cys Ser Trp Glu Pro
                245                 250                 255
ggg gta gat acg act ttg act tgg cgt aaa caa aga ttc caa aac tac   1595
Gly Val Asp Thr Thr Leu Thr Trp Arg Lys Gln Arg Phe Gln Asn Tyr
            260                 265                 270
act tta tgt gaa tcg ttc tct aag aga tgt gag gtt tct aac tac agg   1643
Thr Leu Cys Glu Ser Phe Ser Lys Arg Cys Glu Val Ser Asn Tyr Arg
        275                 280                 285
aac tcc tat acc tgg caa atc act gaa ggc tca cag gaa atg tat aac   1691
Asn Ser Tyr Thr Trp Gln Ile Thr Glu Gly Ser Gln Glu Met Tyr Asn
    290                 295                 300
ttt act ctc aca gct gaa aac caa cta agg aaa aga agt gtc aac att   1739
Phe Thr Leu Thr Ala Glu Asn Gln Leu Arg Lys Arg Ser Val Asn Ile
305                 310                 315                 320
aat ttt aac ctg acc cat aga gtt cat cca aag gct ccg cag gac gtc   1787
Asn Phe Asn Leu Thr His Arg Val His Pro Lys Ala Pro Gln Asp Val
                325                 330                 335
acc ctt aaa att ata ggt gct aca aaa gcc aac atg act tgg aag gtt   1835
Thr Leu Lys Ile Ile Gly Ala Thr Lys Ala Asn Met Thr Trp Lys Val
            340                 345                 350
cac tcc cat gga aac aac tac aca ctt ttg tgt cag gtt aaa ctc caa   1883
His Ser His Gly Asn Asn Tyr Thr Leu Leu Cys Gln Val Lys Leu Gln
        355                 360                 365
tat gga gaa gtg att cat gag cac aat gtt tct gtc cac atg agc gca   1931
Tyr Gly Glu Val Ile His Glu His Asn Val Ser Val His Met Ser Ala
    370                 375                 380
aac tac ctc ttc agt gat ctg gat cca gac aca aag tac aag gct ttt   1979
Asn Tyr Leu Phe Ser Asp Leu Asp Pro Asp Thr Lys Tyr Lys Ala Phe
385                 390                 395                 400
gtg cgc tgt gca agt gcc aac cac ttc tgg aaa tgg agc gac tgg acc   2027
Val Arg Cys Ala Ser Ala Asn His Phe Trp Lys Trp Ser Asp Trp Thr
                405                 410                 415
caa aaa gag ttc agc aca ccc gag act gct ccc tca cag gct ctt gat   2075
Gln Lys Glu Phe Ser Thr Pro Glu Thr Ala Pro Ser Gln Ala Leu Asp
            420                 425                 430
gta tgg aga caa gtg tgg tcg gag aat gga aga cgc att gtg act tta   2123
Val Trp Arg Gln Val Trp Ser Glu Asn Gly Arg Arg Ile Val Thr Leu
        435                 440                 445
ttc tgg aag cca cta tta aaa tca cag gcc aat ggc aaa atc ata tcc   2171
Phe Trp Lys Pro Leu Leu Lys Ser Gln Ala Asn Gly Lys Ile Ile Ser
    450                 455                 460
tat aat ata gtt gta gaa aat gaa gcc aaa cca act gag tca gaa cac   2219
Tyr Asn Ile Val Val Glu Asn Glu Ala Lys Pro Thr Glu Ser Glu His
465                 470                 475                 480
tac tgt gtc tgg gca cca gcc ctc agc aca aac ctg agc ctt gac ctg   2267
Tyr Cys Val Trp Ala Pro Ala Leu Ser Thr Asn Leu Ser Leu Asp Leu
                485                 490                 495
caa cct tac aag att cgc atc aca gcc aac aac agc atg ggg gca tct   2315
Gln Pro Tyr Lys Ile Arg Ile Thr Ala Asn Asn Ser Met Gly Ala Ser
            500                 505                 510
cct gag tcc ttg atg gtc ctt tct aat gat tct gga cac gag gtc aag   2363
Pro Glu Ser Leu Met Val Leu Ser Asn Asp Ser Gly His Glu Val Lys
        515                 520                 525
gaa aag aca att aaa ggt ata aag gat gca ttc aat att tct tgg gag   2411
Glu Lys Thr Ile Lys Gly Ile Lys Asp Ala Phe Asn Ile Ser Trp Glu
    530                 535                 540
ccc gta tct gga gac acg atg ggc tat gtt gtg gac tgg tgt gca cat   2459
Pro Val Ser Gly Asp Thr Met Gly Tyr Val Val Asp Trp Cys Ala His
545                 550                 555                 560
tcc cag gac caa cgc tgt gat ttg cag tgg aag aac ctt ggt ccc aat   2507
Ser Gln Asp Gln Arg Cys Asp Leu Gln Trp Lys Asn Leu Gly Pro Asn
                565                 570                 575
acc aca agc acc acc atc acc tca gat gat ttt aaa cca ggc gtc cgt   2555
Thr Thr Ser Thr Thr Ile Thr Ser Asp Asp Phe Lys Pro Gly Val Arg
            580                 585                 590
tac aac ttc aga att ttt gaa agg tct gtg gaa cac aaa gct cgg tta   2603
Tyr Asn Phe Arg Ile Phe Glu Arg Ser Val Glu His Lys Ala Arg Leu
        595                 600                 605
gta gag aaa caa aga gga tac acc cag gaa ctg gct cct ttg gtg aat   2651
Val Glu Lys Gln Arg Gly Tyr Thr Gln Glu Leu Ala Pro Leu Val Asn
    610                 615                 620
cca aaa gtg gag att cct tac tcg acc cct aac tcc ttc gtt cta aga   2699
Pro Lys Val Glu Ile Pro Tyr Ser Thr Pro Asn Ser Phe Val Leu Arg
625                 630                 635                 640
tgg cca gat tat gac agc gac ttc cag gct ggt ttt ata aaa ggg tac   2747
Trp Pro Asp Tyr Asp Ser Asp Phe Gln Ala Gly Phe Ile Lys Gly Tyr
                645                 650                 655
ctc gtg tat gtg aaa tcc aag gag atg cag tgc aac caa ccc tgg gaa   2795
Leu Val Tyr Val Lys Ser Lys Glu Met Gln Cys Asn Gln Pro Trp Glu
            660                 665                 670
agg acc ctc ctt cca gat aat tca gtc ctc tgt aaa tac gac atc aat   2843
Arg Thr Leu Leu Pro Asp Asn Ser Val Leu Cys Lys Tyr Asp Ile Asn
        675                 680                 685
ggc tca gag aca aag aca ctc acc gtg gaa aac ctt cag cca gag tcc   2891
Gly Ser Glu Thr Lys Thr Leu Thr Val Glu Asn Leu Gln Pro Glu Ser
    690                 695                 700
ctc tat gag ttt ttc gtc act ccg tac acc agc gct ggc cca gga ccc   2939
Leu Tyr Glu Phe Phe Val Thr Pro Tyr Thr Ser Ala Gly Pro Gly Pro
705                 710                 715                 720
aat gaa acg ttc aca aag gtc aca act cca gat gca cgc tcc cac atg   2987
Asn Glu Thr Phe Thr Lys Val Thr Thr Pro Asp Ala Arg Ser His Met
                725                 730                 735
ctg ctg cag atc ata cta ccc atg acc ctc tgc gtc ttg ctc agc atc   3035
Leu Leu Gln Ile Ile Leu Pro Met Thr Leu Cys Val Leu Leu Ser Ile
            740                 745                 750
att gtc tgc tac tgg aaa agt cag tgg gtg aag gag aag tgc tac cct   3083
Ile Val Cys Tyr Trp Lys Ser Gln Trp Val Lys Glu Lys Cys Tyr Pro
        755                 760                 765
gac att ccc aat ccg tac aag agc agc att ctg tca ctc ata aaa tcc   3131
Asp Ile Pro Asn Pro Tyr Lys Ser Ser Ile Leu Ser Leu Ile Lys Ser
    770                 775                 780
aag aag aat cct cac tta ata atg aat gtc aaa gac tgc att cca gat   3179
Lys Lys Asn Pro His Leu Ile Met Asn Val Lys Asp Cys Ile Pro Asp
785                 790                 795                 800
gtc ctt gaa gtg ata aac aaa gca gaa ggc agc aag aca cag tgt gta   3227
Val Leu Glu Val Ile Asn Lys Ala Glu Gly Ser Lys Thr Gln Cys Val
                805                 810                 815
ggc tct ggg aaa ctt cac att gaa gat gta ccc act aag ccg cca atc   3275
Gly Ser Gly Lys Leu His Ile Glu Asp Val Pro Thr Lys Pro Pro Ile
            820                 825                 830
gtg cca aca gaa aag gat tcc tca ggg cct gtg ccc tgc atc ttc ttt   3323
Val Pro Thr Glu Lys Asp Ser Ser Gly Pro Val Pro Cys Ile Phe Phe
       835                 840                 845
gag aat ttt act tac gat cag tca gct ttt gac tct ggt tcc cat ggc   3371
Glu Asn Phe Thr Tyr Asp Gln Ser Ala Phe Asp Ser Gly Ser His Gly
    850                 855                 860
ctc att cca ggt ccc cta aaa gac aca gca cac caa ctt gga cta ttg   3419
Leu Ile Pro Gly Pro Leu Lys Asp Thr Ala His Gln Leu Gly Leu Leu
865                 870                 875                 880
gct cca cct aac aag ttc cag aac gta tta aaa aat gac tac atg aag   3467
Ala Pro Pro Asn Lys Phe Gln Asn Val Leu Lys Asn Asp Tyr Met Lys
                885                 890                 895
ccc ctg gtc gaa agt cca act gaa gaa act agc ttg att tat gtg tca   3515
Pro Leu Val Glu Ser Pro Thr Glu Glu Thr Ser Leu Ile Tyr Val Ser
            900                 905                 910
cag ctg gct tca ccc atg tgc gga gac aag gac acg ctt gcc aca gaa   3563
Gln Leu Ala Ser Pro Met Cys Gly Asp Lys Asp Thr Leu Ala Thr Glu
        915                 920                 925
cca ccc gtg cca gtg cat ggt tca gag tat aaa agg caa atg gta gtt   3611
Pro Pro Val Pro Val His Gly Ser Glu Tyr Lys Arg Gln Met Val Val
    930                 935                 940
ccc ggg agc ctc gca tca cct tct ctg aag gag gat aac agc ttg acc   3659
Pro Gly Ser Leu Ala Ser Pro Ser Leu Lys Glu Asp Asn Ser Leu Thr
945                 950                 955                 960
tca acg gtc ctc tta ggc caa ggt gaa cag taa acaccacgca gcacaaataa 3712
Ser Thr Val Leu Leu Gly Gln Gly Glu Gln  ＊
                965                 970
atgcactcca cacactatag gcactttggg agatgtagct gttaccatgc caacaccacg 3772
tgccctggtt ggttccaggg gtgggggttg aggggagact cattatctgc agtgctgatt 3832
tatcaacgat cactacagac caacagactt aaggaccata taatatggtg ttcaccctga 3892
aggcgttccc tagaaatggc agatccgaga gcatgctgac cttgctatta tttggtccag 3952
gctcaccctt attgcagtag cttgacatag ggtgtacacc agtcatttcg cagagcctac 4012
ctactcaaaa ctac                                                   4026
<210>120
<211>970
<212>PRT
<213>台湾鼷鼠
<400>120
Met Ala Phe Ser Val Val Leu His Pro Ala Phe Leu Leu Ala Val Leu
 1               5                  10                  15
Ser Leu Arg Ala Ser Arg Ser Glu Val Leu Glu Glu Pro Leu Pro Leu
            20                  25                  30
Thr Pro Glu Ile His Lys Val Ser Phe Gln Leu Lys Leu Gln Glu Val
        35                  40                  45
Asn Leu Glu Trp Thr Val Pro Ala Leu Thr His Glu Glu Leu Asn Met
    50                  55                  60
Ile Phe Gln Ile Glu Ile Ser Arg Leu Asn Ile Ser Asn Thr Ile Trp
65                  70                  75                  80
Val Glu Asn Tyr Ser Thr Thr Val Lys Arg Glu Glu Ala Val Arg Trp
                85                  90                  95
Asn Trp Thr Ser Asp Ile Pro Leu Glu Cys Val Lys His Phe Ile Arg
            100                 105                 110
Ile Arg Ala Leu Val Asp Asp Thr Lys Ser Leu Pro Gln Ser Ser
Figure G2009102637047D03111
        115                 120                 125
Gly Asn Trp Ser Ser Trp Lys Glu Val Asn Ala Lys Val Ser Val Glu
    130                 135                 140
Pro Asp Lys Ser Leu Ile Phe Pro Lys Asp Lys Val Leu Glu Glu Gly
145                 150                 155                 160
Ser Asn Val Thr Ile Cys Leu Met Tyr Gly Gln Asn Val Tyr Asn Val
                165                 170                 175
Ser Cys Lys Leu Gln Asp Glu Pro Ile His Gly Glu Gln Leu Asp Ser
            180                 185                 190
His Val Ser Leu Leu Lys Leu Asn Asn Val Val Phe Leu Ser Asp Thr
        195                 200                 205
Gly Thr Asn Ile Asn Cys Gln Ala Thr Lys Gly Pro Lys Arg Ile Phe
    210                 215                 220
Gly Thr Val Leu Phe Val Ser Lys Val Leu Glu Glu Pro Lys Asn Val
225                 230                 235                 240
Ser Cys Glu Thr Arg Asp Phe Lys Thr Leu Asp Cys Ser Trp Glu Pro
                245                 250                 255
Gly Val Asp Thr Thr Leu Thr Trp Arg Lys Gln Arg Phe Gln Asn Tyr
            260                 265                 270
Thr Leu Cys Glu Ser Phe Ser Lys Arg Cys Glu Va1 Ser Asn Tyr Arg
        275                 280                 285
Asn Ser Tyr Thr Trp Gln Ile Thr Glu Gly Ser Gln Glu Met Tyr Asn
    290                 295                 300
Pne Thr Leu Thr Ala Glu Asn Gln Leu Arg Lys Arg Ser Val Asn Ile
305                 310                 315                 320
Asn Phe Asn Leu Thr His Arg Val His Pro Lys Ala Pro Gln Asp Val
                325                 330                 335
Thr Leu Lys Ile Ile Gly Ala Thr Lys Ala Asn Met Thr Trp Lys Val
            340                 345                 350
His Ser His Gly Asn Asn Tyr Thr Leu Leu Cys Gln Val Lys Leu Gln
        355                 360                 365
Tyr Gly Glu Val Ile His Glu His Asn Val Ser Val His Met Ser Ala
    370                 375                 380
Asn Tyr Leu Phe Ser Asp Leu Asp Pro Asp Thr Lys Tyr Lys Ala Phe
385                 390                 395                 400
Val Arg Cys Ala Ser Ala Asn His Phe Trp Lys Trp Ser Asp Trp Thr
                405                 410                 415
Gln Lys Glu Phe Ser Thr Pro Glu Thr Ala Pro Ser Gln Ala Leu Asp
            420                 425                 430
Val Trp Arg Gln Val Trp Ser Glu Asn Gly Arg Arg Ile Val Thr Leu
       435                 440                 445
Phe Trp Lys Pro Leu Leu Lys Ser Gln Ala Asn Gly Lys Ile Ile Ser
    450                 455                 460
Tyr Asn Ile Val Val Glu Asn Glu Ala Lys Pro Thr Glu Ser Glu His
465                 470                 475                 480
Tyr Cys Val Trp Ala Pro Ala Leu Ser Thr Asn Leu Ser Leu Asp Leu
                485                 490                 495
Gln Pro Tyr Lys Ile Arg Ile Thr Ala Asn Asn Ser Met Gly Ala Ser
            500                 505                 510
Pro Glu Ser Leu Met Val Leu Ser Asn Asp Ser Gly His Glu Val Lys
        515                 520                 525
Glu Lys Thr Ile Lys Gly Ile Lys Asp Ala Phe Asn Ile Ser Trp Glu
    530                 535                 540
Pro Val Ser Gly Asp Thr Met Gly Tyr Val Val Asp Trp Cys Ala His
545                 550                 555                 560
Ser Gln Asp Gln Arg Cys Asp Leu Gln Trp Lys Asn Leu Gly Pro Asn
                565                 570                 575
Thr Thr Ser Thr Thr Ile Thr Ser Asp Asp Phe Lys Pro Gly Val Arg
            580                 585                 590
Tyr Asn Phe Arg Ile Phe Glu Arg Ser Val Glu His Lys Ala Arg Leu
        595                 600                 605
Val Glu Lys Gln Arg Gly Tyr Thr Gln Glu Leu Ala Pro Leu Val Asn
    610                 615                 620
Pro Lys Val Glu Ile Pro Tyr Ser Thr Pro Asn Ser Phe Val Leu Arg
625                 630                 635                 640
Trp Pro Asp Tyr Asp Ser Asp Phe Gln Ala Gly Phe Ile Lys Gly Tyr
                645                 650                 655
Leu Val Tyr Val Lys Ser Lys Glu Met Gln Cys Asn Gln Pro Trp Glu
            660                 665                 670
Arg Thr Leu Leu Pro Asp Asn Ser Val Leu Cys Lys Tyr Asp Ile Asn
        675                 680                 685
Gly Ser Glu Thr Lys Thr Leu Thr Val Glu Asn Leu Gln Pro Glu Ser
    690                 695                 700
Leu Tyr Glu Phe Phe Val Thr Pro Tyr Thr Ser Ala Gly Pro Gly Pro
705                 710                 715                 720
Asn Glu Thr Phe Thr Lys Val Thr Thr Pro Asp Ala Arg Ser His Met
                725                 730                 735
Leu Leu Gln Ile Ile Leu Pro Met Thr Leu Cys Val Leu Leu Ser Ile
             740                 745                 750
Ile Val Cys Tyr Trp Lys Ser Gln Trp Val Lys Glu Lys Cys Tyr Pro
        755                 760                 765
Asp Ile Pro Asn Pro Tyr Lys Ser Ser Ile Leu Ser Leu Ile Lys Ser
    770                 775                 780
Lys Lys Asn Pro His Leu Ile Met Asn Val Lys Asp Cys Ile Pro Asp
785                 790                 795                 800
Val Leu Glu Val Ile Asn Lys Ala Glu Gly Ser Lys Thr Gln Cys Val
                805                 810                 815
Gly Ser Gly Lys Leu His Ile Glu Asp Val Pro Thr Lys Pro Pro Ile
            820                 825                 830
Val Pro Thr Glu Lys Asp Ser Ser Gly Pro Val Pro Cys Ile Phe Phe
        835                 840                 845
Glu Asn Phe Thr Tyr Asp Gln Ser Ala Phe Asp Ser Gly Ser His Gly
    850                 855                 860
Leu Ile Pro Gly Pro Leu Lys Asp Thr Ala His Gln Leu Gly Leu Leu
865                 870                 875                 880
Ala Pro Pro Asn Lys Phe Gln Asn Val Leu Lys Asn Asp Tyr Met Lys
                885                 890                 895
Pro Leu Val Glu Ser Pro Thr Glu Glu Thr Ser Leu Ile Tyr Val Ser
            900                 905                 910
Gln Leu Ala Ser Pro Met Cys Gly Asp Lys Asp Thr Leu Ala Thr Glu
        915                 920                 925
Pro Pro Val Pro Val His Gly Ser Glu Tyr Lys Arg Gln Met Val Val
    930                 935                 940
Pro Gly Ser Leu Ala Ser Pro Ser Leu Lys Glu Asp Asn Ser Leu Thr
945                 950                 955                 960
Ser Thr Val Leu Leu Gly Gln Gly Glu Gln
                965                 970
<210>121
<211>2910
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码SEQ ID NO：120多肽的简并多核苷酸
<221>misc_feature
<222>(1)...(2910)
<223>N＝A，T，G，或C
<221>misc_feature
<222>(1)...(2910)
<223>n＝A，T，C或G
<400>121
atggcnttyw sngtngtnyt ncayccngcn ttyytnytng cngtnytnws nytnmgngcn 60
wsnmgnwsng argtnytnga rgarccnytn ccnytnacnc cngarathca yaargtnwsn 120
ttycarytna arytncarga rgtnaayytn gartggacng tnccngcnyt nacncaygar 180
garytnaaya tgathttyca rathgarath wsnmgnytna ayathwsnaa yacnathtgg 240
gtngaraayt aywsnacnac ngtnaarmgn gargargcng tnmgntggaa ytggacnwsn 300
gayathccny tngartgygt naarcaytty athmgnathm gngcnytngt ngaygayacn 360
aarwsnytnc cncarwsnws ntggggnaay tggwsnwsnt ggaargargt naaygcnaar 420
gtnwsngtng arccngayaa rwsnytnath ttyccnaarg ayaargtnyt ngargarggn 480
wsnaaygtna cnathtgyyt natgtayggn caraaygtnt ayaaygtnws ntgyaarytn 540
cargaygarc cnathcaygg ngarcarytn gaywsncayg tnwsnytnyt naarytnaay 600
aaygtngtnt tyytnwsnga yacnggnacn aayathaayt gycargcnac naarggnccn 660
aarmgnatht tyggnacngt nytnttygtn wsnaargtny tngargarcc naaraaygtn 720
wsntgygara cnmgngaytt yaaracnytn gaytgywsnt gggarccngg ngtngayacn 780
acnytnacnt ggmgnaarca rmgnttycar aaytayacny tntgygarws nttywsnaar 840
mgntgygarg tnwsnaayta ymgnaaywsn tayacntggc arathacnga rggnwsncar 900
garatgtaya ayttyacnyt nacngcngar aaycarytnm gnaarmgnws ngtnaayath 960
aayttyaayy tnacncaymg ngtncayccn aargcnccnc argaygtnac nytnaarath 1020
athggngcna cnaargcnaa yatgacntgg aargtncayw sncayggnaa yaaytayacn 1080
ytnytntgyc argtnaaryt ncartayggn gargtnathc aygarcayaa ygtnwsngtn 1140
cayatgwsng cnaaytayyt nttywsngay ytngayccng ayacnaarta yaargcntty 1200
gtnmgntgyg cnwsngcnaa ycayttytgg aartggwsng aytggacnca raargartty 1260
wsnacnccng aracngcncc nwsncargcn ytngaygtnt ggmgncargt ntggwsngar 1320
aayggnmgnm gnathgtnac nytnttytgg aarccnytny tnaarwsnca rgcnaayggn 1380
aarathathw sntayaayat hgtngtngar aaygargcna arccnacnga rwsngarcay 1440
taytgygtnt gggcnccngc nytnwsnacn aayytnwsny tngayytnca rccntayaar 1500
athmgnatha cngcnaayaa ywsnatgggn gcnwsnccng arwsnytnat ggtnytnwsn 1560
aaygaywsng gncaygargt naargaraar acnathaarg gnathaarga ygcnttyaay 1620
athwsntggg arccngtnws nggngayacn atgggntayg tngtngaytg gtgygcncay 1680
wsncargayc armgntgyga yytncartgg aaraayytng gnccnaayac nacnwsnacn 1740
acnathacnw sngaygaytt yaarccnggn gtnmgntaya ayttymgnat httygarmgn 1800
wsngtngarc ayaargcnmg nytngtngar aarcarmgng gntayacnca rgarytngcn 1860
ccnytngtna ayccnaargt ngarathccn taywsnacnc cnaaywsntt ygtnytnmgn 1920
tggccngayt aygaywsnga yttycargcn ggnttyatha arggntayyt ngtntaygtn 1980
aarwsnaarg aratgcartg yaaycarccn tgggarmgna cnytnytncc ngayaaywsn 2040
gtnytntgya artaygayat haayggnwsn garacnaara cnytnacngt ngaraayytn 2100
carccngarw snytntayga rttyttygtn acnccntaya cnwsngcngg nccnggnccn 2160
aaygaracnt tyacnaargt nacnacnccn gaygcnmgnw sncayatgyt nytncarath 2220
athytnccna tgacnytntg ygtnytnytn wsnathathg tntgytaytg gaarwsncar 2280
tgggtnaarg araartgyta yccngayath ccnaayccnt ayaarwsnws nathytnwsn 2340
ytnathaarw snaaraaraa yccncayytn athatgaayg tnaargaytg yathccngay 2400
gtnytngarg tnathaayaa rgcngarggn wsnaaracnc artgygtngg nwsnggnaar 2460
ytncayathg argaygtncc nacnaarccn ccnathgtnc cnacngaraa rgaywsnwsn 2520
ggnccngtnc cntgyathtt yttygaraay ttyacntayg aycarwsngc nttygaywsn 2580
ggnwsncayg gnytnathcc nggnccnytn aargayacng cncaycaryt nggnytnytn 2640
gcnccnccna ayaarttyca raaygtnytn aaraaygayt ayatgaarcc nytngtngar 2700
wsnccnacng argaracnws nytnathtay gtnwsncary tngcnwsncc natgtgyggn 2760
gayaargaya cnytngcnac ngarccnccn gtnccngtnc ayggnwsnga rtayaarmgn 2820
caratggtng tnccnggnws nytngcnwsn ccnwsnytna argargayaa ywsnytnacn 2880
wsnacngtny tnytnggnca rggngarcar                                  2910
<210>122
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物ZC43891
<400>122
gggcagtagg atatgaatca gcat                     24
<210>123
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物ZC43900
<400>123
gaaggcccca gtgctacgt                           19
<210>124
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>OSMRbeta探针ZC43896
<400>124
tcatccggag tcgtgacctt cgtg                     24
<210>125
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物ZC43280
<400>125
gagcacgccc ttctcttcct                         20
<210>126
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物ZC43281
<400>126
cgttgcccgt ccgtttacta                          20
<210>127
<211>40
<212>DNA
<213>q人工序列
<220>
<223>zcytor17lig探针ZC43275
<400>127
ctgtaattcc tcgactattt tctgtacatc atcacttggt    40
<210>128
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物ZC40574
<400>128
ctcatttgga attttgccga tt                       22
<210>129
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物ZC40575
<400>129
ccgagtgaag atcccctttt ta                     22
<210>130
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>GUS探针ZC43017
<400>130
tgaacagtca ccgacgagag tgctgg                 26
<210>131
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物ZC28480
<400>131
cgattcagga cagtcaacag tacc                   24
<210>132
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物ZC41653
<400>132
ccttcgtgaa cgtagcactg g                      21
<210>133
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物ZC41655
<400>133
ctgaaatcca aggcgaggc                     19
<210>134
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物ZC41703
<400>134
tgaagctggc cttgctctct                    20
<210>135
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物ZC41704
<400>135
gagatatgcc cggatggct                     19
<210>136
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物ZC43272
<400>136
gctggtatca ttggtttcct tctc               24
<210>137
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物ZC43273
<400>137
cattctcttt cctctgcaaa ttca                     24
<210>138
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>zcytor17探针ZC43478
<400>138
tagagaacat ttcctgcgtc ttttacttcg acag          34
<210>139
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物ZC43278
<400>139
aaacaagagt ctcaggatct ttataacaac               30
<210>140
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物ZC43279
<400>140
acggcagctg tattgattcg t                         21
<210>141
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>zcytor17lig探针ZC43276
<400>141
taaagcaggc atctgggatg tcagca                     26
<210>142
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物ZC43045
<400>142
aaacatgata tttcagatag agatcagtag act             33
<210>143
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物ZC43046
<400>143
cttatgaaat gtttgacaca ctccaa                     26
<210>144
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>OSMRbeta探针ZC43141
<400>144
ctgtgcgttg gaactggacg tctgatatc                  29
<210>145
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物ZC43004
<400>145
gaaacccgcc gcatattact t                     21
<210>146
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物ZC43005
<400>146
tggcgttgct cacaaaggt                        19
<210>147
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Murine GUS探针ZC43018
<400>147
acccacacca aagccctgga cctc                  24
<210>148
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物ZC40269
<400>148
gccagtttca cacactcctc ttt
Figure G2009102637047D03221
<210>149
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物ZC40268
<400>149
gcagctattg cactagtcat tttctt                     26
<210>150
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>运铁蛋白受体探针ZC40298
<400>150
cccaggtagc cactcatgaa tccaatcaa                  29
<210>151
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物ZC43140
<400>151
ttcttccaca gcaatcgcac                            20
<210>152
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物ZC43139
<400>152
atgcatgctt cggttcagaa c                          21
<210>153
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物ZC41608
<400>153
gcagacaatg atgctgagca agac                     24
<210>154
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物ZC41609
<400>154
caacgctgtg atttgcagtg gaag                     24
<210>155
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物ZC41502
<400>155
agcgggcctt cctcactc                            18
<210>156
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物ZC41500
<400>156
ggacaaaata aaaacataaa taac                                         24
<210>157
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>接头
<400>157
tgtcgatgaa gccctgaaag acgcgcagac taattcgagc                        40
<210>158
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>接头
<400>158
acgcgcagac taattcgagc tcccaccatc accatcacca cgcgaattcg gtaccgctgg  60
<210>159
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>接头
<400>159
actcactata gggcgaattg cccgggggat ccacgcggaaccagcggtac cgaattcgcg   60
<210>160
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>接头
<400>160
acggccagtg aattgtaata cgactcacta tagggcgaat tg                    42
<210>161
<211>825
<212>DNA
<213>人类
<220>
<221>CDS
<222>(48).(518)
<400>161
atcactctct ttaatcacta ctcacattaa cctcaactcc tgccaca atg tac agg   56
                                                    Met Tyr Arg
                                                     1
atg caa ctc ctg tct tgc att gca cta att ctt gca ctt gtc aca aac   104
Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ile Leu Ala Leu Val Thr Asn
     5                   10                  15
agt gca cct act tca agt tcg aca aag aaa aca aag aaa aca cag cta   152
Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Lys Lys Thr Gln Leu
 20                  25                  30                  35
caa ctg gag cat tta ctg ctg gat tta cag atg att ttg aat gga att   200
Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly
                 40                  45                  50
aat aat tac aag aat ccc aaa ctc acc agg atg ctc aca ttt aag ttt   248
Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe
             55                  60                  65
tac atg ccc aag aag gcc aca gaa ctg aaa cag ctt cag tgt cta gaa   296
Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys Gln Leu Gln Cys Leu Glu
         70                  75                  80
gaa gaa ctc aaa cct ctg gag gaa gtg ctg aat tta gct caa agc aaa   344
Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys
     85                  90                  95
aac ttt cac tta aga ccc agg gac tta atc agc aat atc aac gta ata  392
Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile
100                 105                 110                 115
gtt ctg gaa cta aag gga tct gaa aca aca ttc atg tgt gaa tat gca  440
Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala
                120                 125                 130
gat gag aca gca acc att gta gaa ttt ctg aac aga tgg att acc ttt  488
Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe
             135                 140                 145
tgt caa agc atc atc tca aca cta act tga taattaagtg cttcccactt    538
Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr  ＊
        150                 155
aaaacatatc aggccttcta tttatttatt taaatattta aattttatat ttattgttga 598
atgtatggtt gctacctatt gtaactatta ttcttaatct taaaactata aatatggatc 658
ttttatgatt ctttttgtaa gccctagggg ctctaaaatg gtttacctta tttatcccaa 718
aaatatttat tattatgttg aatgttaaat atagtatcta tgtagattgg ttagtaaaac 778
tatttaataa atttgataaa tataaaaaaa aaaaacaaaa aaaaaaa               825
<210>162
<211>156
<212>PRT
<213>人类
<400>162
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ile Leu Ala Leu
 1               5                  10                  15
Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Lys Lys
            20                  25                  30
Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu
        35                  40                  45
Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr
    50                  55                  60
Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys Gln Leu Gln
65                  70                  75                  80
Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala
                85                  90                  95
Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile
            100                 105                 110
Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys
        115                 120                 125
Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp
    130                 135                 140
Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
145                 150                 155
<210>163
<211>614
<212>DNA
<213>人类
<220>
<221>CDS
<222>(64)...(525)
<400>163
gatcgttagc ttctcctgat aaactaattg cctcacattg tcactgcaaa tcgacaccta 60
tta atg ggt ctc acc tcc caa ctg ctt ccc cct ctg ttc ttc ctg cta   108
    Met Gly Leu Thr Ser Gln Leu Leu Pro Pro Leu Phe Phe Leu Leu
     1               5                   10                  15
gca tgt gcc ggc aac ttt gtc cac gga cac aag tgc gat atc acc tta   156
Ala Cys Ala Gly Asn Phe Val His Gly His Lys Cys Asp Ile Thr Leu
                20                  25                  30
cag gag atc atc aaa act ttg aac agc ctc aca gag cag aag act ctg   204
Gln Glu Ile Ile Lys Thr Leu Asn Ser Leu Thr Glu Gln Lys Thr Leu
            35                  40                  45
tgc acc gag ttg acc gta aca gac atc ttt gct gcc tcc aag aac aca   252
Cys Thr Glu Leu Thr Val Thr Asp Ile Phe Ala Ala Ser Lys Asn Thr
        50                  55                  60
act gag aag gaa acc ttc tgc agg gct gcg act gtg ctc cgg cag ttc   300
Thr Glu Lys Glu Thr Phe Cys Arg Ala Ala Thr Val Leu Arg Gln Phe
    65                  70                  75
tac agc cac cat gag aag gac act cgc tgc ctg ggt gcg act gca cag   348
Tyr Ser His His Glu Lys Asp Thr Arg Cys Leu Gly Ala Thr Ala Gln
80                  85                  90                  95
cag ttc cac agg cac aag cag ctg atc cga ttc ctg aaa cgg ctc gac   396
Gln Phe His Arg His Lys Gln Leu Ile Arg Phe Leu Lys Arg Leu Asp
                100                 105                 110
agg aac ctc tgg ggc ctg gcg ggc ttg aat tcc tgt cct gtg aag gaa   444
Arg Asn Leu Trp Gly Leu Ala Gly Leu Asn Ser Cys Pro Val Lys Glu
             115                 120                 125
gcc aac cag agt acg ttg gaa aac ttc ttg gaa agg cta aag acg atc   492
Ala Asn Gln Ser Thr Leu Glu Asn Phe Leu Glu Arg Leu Lys Thr Ile
        130                 135                 140
atg aga gag aaa tat tca aag tgt tcg agc tga atattttaat ttatgagttt 545
Met Arg Glu Lys Tyr Ser Lys Cys Ser Ser  ＊
    145                 150
ttgatagctt tattttttaa gtatttatat atttataact catcataaaa taaagtatat 605
atagaatct                                                         614
<210>164
<211>153
<212>PRT
<213>人类
<400>164
Met Gly Leu Thr Ser Gln Leu Leu Pro Pro Leu Phe Phe Leu Leu Ala
 1               5                  10                  15
Cys Ala Gly Asn Phe Val His Gly His Lys Cys Asp Ile Thr Leu Gln
            20                  25                  30
Glu Ile Ile Lys Thr Leu Asn Ser Leu Thr Glu Gln Lys Thr Leu Cys
        35                  40                  45
Thr Glu Leu Thr Val Thr Asp Ile Phe Ala Ala Ser Lys Asn Thr Thr
    50                  55                  60
Glu Lys Glu Thr Phe Cys Arg Ala Ala Thr Val Leu Arg Gln Phe Tyr
65                  70                  75                  80
Ser His His Glu Lys Asp Thr Arg Cys Leu Gly Ala Thr Ala Gln Gln
                85                  90                  95
Phe His Arg His Lys Gln Leu Ile Arg Phe Leu Lys Arg Leu Asp Arg
            100                 105                 110
Asn Leu Trp Gly Leu Ala Gly Leu Asn Ser Cys Pro Val Lys Glu Ala
        115                 120                 125
Asn Gln Ser Thr Leu Glu Asn Phe Leu Glu Arg Leu Lys Thr Ile Met
    130                 135                 140
Arg Glu Lys Tyr Ser Lys Cys Ser Ser
145                 150
<210>165
<211>756
<212>DNA
<213>人类
<220>
<221>CDS
<222>(9)...(443)
<400>165
gctggagg atg tgg ctg cag agc ctg ctg ctc ttg ggc act gtg gcc tgc  50
         Met Trp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Ala Cys
          1               5                   10
agc atc tct gca ccc gcc cgc tcg ccc agc ccc agc acg cag ccc tgg   98
Ser Ile Ser Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ser Thr Gln Pro Trp
 15                  20                  25                  30
gag cat gtg aat gcc atc cag gag gcc cgg cgt ctc ctg aac ctg agt   146
Glu His Val Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg Leu Leu Asn Leu Ser
                 35                  40                  45
aga gac act gct gct gag atg aat gaa aca gta gaa gtc atc tca gaa   194
Arg Asp Thr Ala Ala Glu Met Asn Glu Thr Val Glu Val Ile Ser Glu
             50                  55                  60
atg ttt gac ctc cag gag ccg acc tgc cta cag acc cgc ctg gag ctg   242
Met Phe Asp Leu Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr Arg Leu Glu Leu
         65                  70                  75
tac aag cag ggc ctg cgg ggc agc ctc acc aag ctc aag ggc ccc ttg   290
Tyr Lys Gln Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly Pro Leu
     80                  85                  90
acc atg atg gcc agc cac tac aag cag cac tgc cct cca acc ccg gaa   338
Thr Met Met Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro Pro Thr Pro Glu
 95                 100                 105                 110
act tcc tgt gca acc cag act atc acc ttt gaa agt ttc aaa gag aac   386
Thr Ser Cys Ala Thr Gln Thr Ile Thr Phe Glu Ser Phe Lys Glu Asn
                115                 120                 125
ctg aag gac ttt ctg ctt gtc atc ccc ttt gac tgc tgg gag cca gtc   434
Leu Lys Asp Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro Val
            130                 135                 140
cag gag tga gaccggccag atgaggctgg ccaagccggg gagctgctct           483
Gln Glu  ＊
ctcatgaaac aagagctaga aactcaggat ggtcatcttg gagggaccaa ggggtgggcc 543
acagccatgg tgggagtggc ctggacctgc cctgggccac actgaccctg atacaggcat 603
ggcagaagaa tgggaatatt ttatactgac agaaatcagt aatatttata tatttatatt 663
tttaaaatat ttatttattt atttatttaa gttcatattc catatttatt caagatgttt 723
taccgtaata attattatta aaaatatgct tct                              756
<210>166
<211>144
<212>PRT
<213>人类
<400>166
Met Trp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Ala Cys Ser Ile
 1               5                  10                  15
Ser Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ser Thr Gln Pro Trp Glu His
            20                  25                  30
Val Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg Leu Leu Asn Leu Ser Arg Asp
        35                  40                  45
Thr Ala Ala Glu Met Asn Glu Thr Val Glu Val Ile Ser Glu Met Phe
    50                  55                  60
Asp Leu Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr Arg Leu Glu Leu Tyr Lys
65                  70                  75                  80
Gln Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly Pro Leu Thr Met
                85                  90                  95
Met Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Ser
            100                 105                 110
Cys Ala Thr Gln Thr Ile Thr Phe Glu Ser Phe Lys Glu Asn Leu Lys
        115                 120                 125
Asp Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro Val Gln Glu
    130                 135                 140
<210>167
<211>60
<212>DNA
<213>人类
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(60)
<221>变异
<222>(25)...(30)
<223>n＝A，G，C，或T
<221>misc_feature
<222>(1)...(60)
<223>n＝A，T，C或G
<400>167
gcc aca gaa ctg aaa cag ctt cag nnn nnn gaa gaa gaa ctc aaa cct   48
Ala Thr Glu Leu Lys Gln Leu Gln Xaa Xaa Glu Glu Glu Leu Lys Pro
 1               5                   10                  15
ctg gag gaa gtg                                                   60
Leu Glu Glu Val
             20
<210>168
<211>20
<212>PRT
<213>人类
<220>
<221>变体
<222>(9)...(10)
<223>任何氨基酸
<221>变体
<222>(1)...(20)
<223>Xaa＝任何氨基酸
<400>168
Ala Thr Glu Leu Lys Gln Leu Gln Xaa Xaa Glu Glu Glu Leu Lys Pro
 1               5                   10                 15
Leu Glu Glu Val
            20

Claims (18)

1.多肽用于制备在哺乳动物中上调IL-13RA2基因表达的药物的用途，其中所述多肽包含氨基酸残基序列，所述氨基酸残基序列选自：
(a)包含SEQ ID NO：2中所示残基38(Val)到残基152(Leu)的氨基酸序列的多肽；
(b)包含SEQ ID NO：2中所示残基27(Leu)到残基164(Thr)的氨基酸序列的多肽；
(c)包含SEQ ID NO：2中所示残基24(Ser)到残基164(Thr)的氨基酸序列的多肽；和
(d)包含SEQ ID NO：2中所示残基1(Met)到残基164(Thr)的氨基酸序列的多肽。
2.权利要求1的用途，其中IL13RA2基因表达的增加发生在肺上皮细胞中。
3.多肽用于制备在哺乳动物中下调IL-13基因表达的药物的用途，其中所述多肽包含氨基酸残基序列，所述氨基酸残基序列选自：
(a)包含SEQ ID NO：2中所示残基38(Val)到残基152(Leu)的氨基酸序列的多肽；
(b)包含SEQ ID NO：2中所示残基27(Leu)到残基164(Thr)的氨基酸序列的多肽；
(c)包含SEQ ID NO：2中所示残基24(Ser)到残基164(Thr)的氨基酸序列的多肽；和
(d)包含SEQ ID NO：2中所示残基1(Met)到残基164(Thr)的氨基酸序列的多肽。
4.权利要求3的用途，其中IL13基因表达的降低发生在肺上皮细胞中。
5.权利要求3的用途，其中IL13介导的嗜曙红细胞募集或黏液生产被降低。
6.多肽用于制备治疗哺乳动物哮喘的药物的用途，其中所述多肽包含氨基酸残基序列，所述氨基酸残基序列选自：
(a)包含SEQ ID NO：2中所示残基38(Val)到残基152(Leu)的氨基酸序列的多肽；
(b)包含SEQ ID NO：2中所示残基27(Leu)到残基164(Thr)的氨基酸序列的多肽；
(c)包含SEQ ID NO：2中所示残基24(Ser)到残基164(Thr)的氨基酸序列的多肽；和
(d)包含SEQ ID NO：2中所示残基1(Met)到残基164(Thr)的氨基酸序列的多肽。
7.权利要求6的用途，其中所述哮喘是过敏性哮喘。
8.多肽用于制备治疗哺乳动物通气道炎症的药物的用途，其中所述多肽包含氨基酸残基序列，所述氨基酸残基序列选自：
(a)包含SEQ ID NO：2中所示残基38(Val)到残基152(Leu)的氨基酸序列的多肽；
(b)包含SEQ ID NO：2中所示残基27(Leu)到残基164(Thr)的氨基酸序列的多肽；
(c)包含SEQ ID NO：2中所示残基24(Ser)到残基164(Thr)的氨基酸序列的多肽；和
(d)包含SEQ ID NO：2中所示残基1(Met)到残基164(Thr)的氨基酸序列的多肽。
9.多肽用于制备治疗哺乳动物通气道高反应性的药物的用途，其中所述多肽包含氨基酸残基序列，所述氨基酸残基序列选自：
(a)包含SEQ ID NO：2中所示残基38(Val)到残基152(Leu)的氨基酸序列的多肽；
(b)包含SEQ ID NO：2中所示残基27(Leu)到残基164(Thr)的氨基酸序列的多肽；
(c)包含SEQ ID NO：2中所示残基24(Ser)到残基164(Thr)的氨基酸序列的多肽；和
(d)包含SEQ ID NO：2中所示残基1(Met)到残基164(Thr)的氨基酸序列的多肽。
10.权利要求6-9任一项的用途，其中所述药物降低IL13表达。
11.权利要求6-9任一项的用途，其中所述药物增加IL13RA2表达。
12.权利要求6-9任一项的用途，其中所述药物降低IL13介导的嗜曙红细胞募集或黏液生产。
13.前述权利要求任一项的用途，其中所述多肽包含SEQ ID NO：2中所示残基27(Leu)到残基164(Thr)的氨基酸序列。
14.用于在哺乳动物中上调IL-13RA2基因表达的多肽，其中所述多肽包含氨基酸残基序列，所述氨基酸残基序列选自：
(a)包含SEQ ID NO：2中所示残基38(Val)到残基152(Leu)的氨基酸序列的多肽；
(b)包含SEQ ID NO：2中所示残基27(Leu)到残基164(Thr)的氨基酸序列的多肽；
(c)包含SEQ ID NO：2中所示残基24(Se r)到残基164(Thr)的氨基酸序列的多肽；和
(d)包含SEQ ID NO：2中所示残基1(Met)到残基164(Thr)的氨基酸序列的多肽。
15.用于在哺乳动物中下调IL-13基因表达的多肽，其中所述多肽包含氨基酸残基序列，所述氨基酸残基序列选自：
(a)包含SEQ ID NO：2中所示残基38(Val)到残基152(Leu)的氨基酸序列的多肽；
(b)包含SEQ ID NO：2中所示残基27(Leu)到残基164(Thr)的氨基酸序列的多肽；
(c)包含SEQ ID NO：2中所示残基24(Ser)到残基164(Thr)的氨基酸序列的多肽；和
(d)包含SEQ ID NO：2中所示残基1(Met)到残基164(Thr)的氨基酸序列的多肽。
16.用于治疗哺乳动物哮喘的多肽，其中所述多肽包含氨基酸残基序列，所述氨基酸残基序列选自：
(a)包含SEQ ID NO：2中所示残基38(Val)到残基152(Leu)的氨基酸序列的多肽；
(b)包含SEQ ID NO：2中所示残基27(Leu)到残基164(Thr)的氨基酸序列的多肽；
(c)包含SEQ ID NO：2中所示残基24(Ser)到残基164(Thr)的氨基酸序列的多肽；和
(d)包含SEQ ID NO：2中所示残基1(Met)到残基164(Thr)的氨基酸序列的多肽。
17.用于治疗哺乳动物通气道炎症的多肽，其中所述多肽包含氨基酸残基序列，所述氨基酸残基序列选自：
(a)包含SEQ ID NO：2中所示残基38(Val)到残基152(Leu)的氨基酸序列的多肽；
(b)包含SEQ ID NO：2中所示残基27(Leu)到残基164(Thr)的氨基酸序列的多肽；
(c)包含SEQ ID NO：2中所示残基24(Ser)到残基164(Thr)的氨基酸序列的多肽；和
(d)包含SEQ ID NO：2中所示残基1(Met)到残基164(Thr)的氨基酸序列的多肽。
18.用于治疗哺乳动物通气道高反应性的多肽，其中所述多肽包含氨基酸残基序列，所述氨基酸残基序列选自：
(a)包含SEQ ID NO：2中所示残基38(Val)到残基152(Leu)的氨基酸序列的多肽；
(b)包含SEQ ID NO：2中所示残基27(Leu)到残基164(Thr)的氨基酸序列的多肽；
(c)包含SEQ ID NO：2中所示残基24(Ser)到残基164(Thr)的氨基酸序列的多肽；和
(d)包含SEQ ID NO：2中所示残基1(Met)到残基164(Thr)的氨基酸序列的多肽。
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