ES2339843T3 - Proteina receptora de hematopoyetina novedosa, nr10. - Google Patents

Abstract

ADN aislado seleccionado del grupo que consiste en: (a) ADN que codifica para una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 2, 4 y 17; (b) ADN que comprende la región codificante de la secuencia de nucleótidos de cualquiera de SEQ ID NO: 1, 3 y 16; (c) ADN que codifica para una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 2, 4 y 17; en la que de uno o dos a 30 aminoácidos se modifican mediante deleción, adición y/o substitución por otro aminoácido, en el que dicha proteína es funcionalmente equivalente a la proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 2, 4 y 17 como receptor de factor hematopoyético en forma soluble o unida a la membrana; (d) ADN que codifica para una proteína que tiene una identidad del 70% o superior con la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 2, 4 y 17, en el que dicha proteína es funcionalmente equivalente a la proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 2, 4 y 17 como receptor de factor hematopoyético en forma soluble o unida a la membrana; y (e) ADN que codifica para una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 2, 4 y 17 de la cual se elimina la secuencia señal, en la que la secuencia señal es desde la 1ª Met hasta la 32ª Ala.

Description

Proteína receptora de hematopoyetina novedosa, NR10.

Campo técnico

La presente invención se refiere a proteínas receptoras de hematopoyetina novedosas, y a genes que las codifican, así como a métodos para producir y usar las mismas.

Antecedentes de la técnica

Se conoce un gran número de citocinas como factores humorales que están implicados en la proliferación/ diferenciación de diversas células y la activación de funciones de células maduras diferenciadas así como la muerte celular. Existen receptores específicos para estas citocinas, que se clasifican en varias familias basándose en sus similitudes estructurales (Hilton D.J., en "Guidebook to Cytokines and Their Receptors" editado por Nicola N.A. (una publicación de Sambrook & Tooze en Oxford University Press), págs. 8-16 (1994)).

Por otro lado, en comparación con las similitudes de sus receptores, la homología de la estructura primaria entre las citocinas es bastante baja. No se ha observado homología de aminoácidos significativa, incluso entre miembros de citocinas que pertenecen a la misma familia de receptores. Esto explica la especificidad funcional de las respectivas citocinas, así como las similitudes entre las reacciones celulares inducidas por cada citocina.

Ejemplos representativos de las familias de receptores mencionadas anteriormente son la familia de receptores de tirosina cinasa, la familia de receptores de hematopoyetina, la familia de receptores del factor de necrosis tumoral (TNF) y la familia de receptores del factor de crecimiento transformante \beta (TGF \beta). Se ha notificado que diferentes rutas de transducción de señales están implicadas en cada una de estas familias. Entre estas familias de receptores, muchos receptores de la familia de receptores de hematopoyetina, en particular, se expresan en células sanguíneas o inmunocitos, y sus ligandos, las citocinas, se denominan con frecuencia factores hematopoyéticos o interleucinas. Algunos de estos factores hematopoyéticos o interleucinas existen en la sangre y se cree que están implicados en la regulación humoral sistémica de funciones hematopoyéticas o inmunitarias.

Esto contrasta con la creencia de que citocinas que pertenecen a otras familias están implicadas con frecuencia solamente en regulaciones tópicas. Algunas de estas hematopoyetinas pueden considerarse como factores similares a hormona, y hormonas peptídicas representativas, tales como receptores de leptina, prolactina u hormona del crecimiento, también pertenecen a la familia de receptores de hematopoyetina. Debido a estas características reguladoras sistémicas similares a hormona, se anticipa que la administración de estas hematopoyetinas puede aplicarse al tratamiento de diversas enfermedades.

Entre el gran número de citocinas, aquellas que actualmente están aplicándose clínicamente incluyen eritropoyetina, G-CSF, GM-CSF e IL-2. En combinación con IL-11, LIF e IL-12 que actualmente se están considerando para ensayos clínicos, y las hormonas peptídicas mencionadas anteriormente, tales como la hormona del crecimiento y la prolactina, puede preverse que buscando citocinas novedosas que se unen a los receptores de hematopoyetina entre las diversas familias de receptores mencionadas anteriormente, es posible encontrar una citocina que pueda aplicarse clínicamente con una mayor eficacia.

Tal como se mencionó anteriormente, los receptores de citocinas comparten similitudes estructurales entre los miembros de la familia. Usando estas similitudes, muchas investigaciones se dirigen a encontrar receptores novedosos. En particular, ya se han clonado muchos receptores de la familia de receptores de tirosina cinasa, usando su secuencia altamente conservada en el sitio catalítico (Matthews W. et al., Cell, 65 (7): págs. 1143-52 (1991)). En comparación, los receptores de hematopoyetina no tienen un dominio de actividad enzimática similar a tirosina cinasa en sus regiones citoplasmáticas, y se conoce que sus transducciones de señales están mediadas mediante asociaciones con otras proteínas de tirosina cinasa que existen libremente en el citoplasma.

Aunque los sitios en los receptores que se unen con estas tirosina cinasas citoplasmáticas (cinasas JAK) se conservan entre los miembros de la familia, la homología no es muy alta (Murakami. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 11349-11353 (1991)). En realidad, la secuencia que mejor caracteriza estos receptores de hematopoyetina existe en la región extracelular. En particular, un motivo de cinco aminoácidos, Trp-Ser-Xaa-Trp-Ser (en el que "Xaa" es un aminoácido arbitrario), se conserva en casi todos los receptores de hematopoyetina. Por tanto, pueden obtenerse receptores novedosos buscando miembros de la familia novedosos usando esta secuencia.

En realidad, estos enfoques ya han conducido a la identificación del receptor de IL-11 (Robb, L. et al., J. Biol. Chem., 271 (23): 13754-13761 (1996)), el receptor de leptina (Gainsford T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93 (25): págs. 14564-8 (1996)) y el receptor de IL-13 (Hilton D. J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93 (1): págs. 497-501 (1996)).

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Además, pudieron identificarse dos secuencias de EST:

BASE DE DATOS EMBL [en línea] 8 de septiembre de 1998 (08-09-1998), "qa50c06.x1 Soares_NhHMPu_S1 Clon de ADNc de Homo sapiens IMAGE: 1690186 3', secuencia de ARNm". XP002311247 recuperado del número de registro de EBI EM_PRO: AI123586 Número de registro de la base de datos AI123586.

BASE DE DATOS EMBL [en línea] 4 de mayo de 1996 (04-05-1996), "zb93e11.s1 Soares_parathyroid_tumor_NbHPA clon de ADNc de Homo sapiens IMAGE: 320396 3', secuencia de ARNm". XP002311248 recuperado del número de registro de EBI EM_PRO: W16834 Número de registro de la base de datos W16834.

El documento EP 0411946 da a conocer la proteína gp130 humana, idéntica en un 29% a SEQ ID NO: 2.

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Descripción de la invención

La presente invención proporciona proteínas receptoras de hematopoyetina novedosas codificadas por un ADN aislado seleccionado del grupo que consiste en:

(a)

un ADN que codifica para una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 2, 4 y 17;

(b)

un ADN que comprende la región codificante de la secuencia de nucleótidos de cualquiera de SEQ ID NO: 1, 3 y 16;

(c)

un ADN que codifica para una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 2, 4 y 17; en la que de uno o dos a 30 aminoácidos se modifican mediante deleción, adición y/o substitución por otro aminoácido, en el que dicha proteína es funcionalmente equivalente a la proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 2, 4 y 17 como receptor de factor hematopoyético en forma soluble o unida a la membrana;

(d)

un ADN que codifica para una proteína que tiene una identidad del 70% o superior con la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 2, 4 y 17, en el que dicha proteína es funcionalmente equivalente a la proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 2, 4 y 17 como receptor de factor hematopoyético en forma soluble o unida a la membrana; y

(e)

un ADN que codifica para una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 2, 4 y 17 de la cual se elimina la secuencia señal, en la que la secuencia señal es desde la 1ª Met hasta la 32ª Ala.

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La presente invención también proporciona un vector dentro del que se ha insertado el ADN. La presente invención también proporciona métodos para seleccionar compuestos que se unen a la proteína de la presente invención.

Inicialmente, los inventores intentaron encontrar un receptor novedoso usando oligonucleótidos que codificaban para el motivo Trp-Ser-Xaa-Trp-Ser (motivo WS) como la sonda mediante hibridación en placas, método de RT-PCR, etcétera. Sin embargo, era sumamente difícil seleccionar estrictamente sólo aquellos a los que los 15 nucléotidos que codificaba para el motivo se hibridaban completamente en las condiciones de hibridación habituales, porque el oligonucleótido tggag(t/c)nnntggag(t/c) (en el que "n" es un nucleótido arbitrario) que codificaba para el motivo era corto, teniendo tan sólo 15 nucleótidos, y tenía un alto contenido en g/c. Adicionalmente, secuencias similares están contenidas en ADNc que codifica para proteínas diferentes de receptores de hematopoyetina, comenzando con diversos colágenos que se cree que se distribuyen ampliamente y también tienen altas cantidades de expresión, lo que hace que la selección mediante RT-PCR e hibridación en placas mencionadas anteriormente sea extremadamente ineficaz.

Para resolver estos problemas, los inventores buscaron motivos adicionales, diferentes del sitio del motivo WS mencionado anteriormente, que se conservan en la familia de receptores de hematopoyetina. Como resultado, se encontró que un residuo, o bien tirosina o bien histidina, ubicado de 13 a 27 aminoácidos en el sentido 5' del motivo WS en el dominio extracelular se conservaba altamente en la familia de receptores. Además, una búsqueda adicional de secuencias consenso que se encuentran frecuentemente en los 6 aminoácidos desde la Tyr/His anterior hacia el extremo C-terminal condujo a la identificación de la siguiente secuencia consenso (Tyr/His)-Xaa-(hidrófobo/Ala)-(Gln/Arg)-hidrófobo-Arg (a continuación en el presente documento, se abrevia como motivo YR). Sin embargo, este motivo YR no es exactamente una secuencia consenso perfecta, y la combinación de la secuencia de nucleótidos que codifica para el motivo es muy complicada. Por tanto, es prácticamente imposible sintetizar y proporcionar oligonucleótidos que codifiquen para todas las secuencias de aminoácidos como sondas para hibridación, que es un método práctico para la selección, o como cebadores dirigidos para RT-PCR.

Por consiguiente, los inventores buscaron otros enfoques para buscar de manera práctica miembros novedosos de la familia de receptores de hematopoyetina usando los dos motivos anteriores como sondas, y determinaron que sería apropiado realizar una búsqueda en bases de datos informática usando secuencias de aminoácidos parciales de receptores de hematopoyetina conocidos, incluyendo ambos motivos como la consulta. Los inventores repitieron búsquedas de TBlastN en las bases de datos de htgs y gss en GenBank, usando secuencias de aminoácidos parciales de múltiples receptores de hematopoyetina conocidos como la consulta. Como resultado, se obtuvieron en todos los casos muchos clones falsos positivos. Sin embargo, comparando después la secuencia de aminoácidos deducida de la secuencia de nucleótidos próxima a la sonda de los clones anteriores con la secuencia de receptores de hematopoyetina conocidos, los inventores pudieron seleccionar genes que codificaban para miembros de la familia de receptores. A partir de estos resultados, los inventores identificaron un único clon que contenía una secuencia genómica humana que se sospechaba que codificaba para un receptor de hematopoyetina novedoso y lo denominaron NR10.

Se usó la secuencia de nucleótidos anterior para diseñar cebadores de oligonucleótidos específicos. Se usaron los cebadores para realizar 5'- y 3'-RACE usando bibliotecas de ADNc de hepatocitos fetales humanos y placenta humana como el molde. Como resultado, se aisló un ADNc de longitud completa, NR10.1, que codificaba para un receptor transmembrana de 652 aminoácidos, y se determinó la secuencia de nucleótidos completa. Al mismo tiempo, un clon de ADNc, NR10.2, que se suponía que era una variante de corte y empalme de NR10, también se aisló satisfactoriamente a partir del producto de 3'-RACE. Basándose en la secuencia de nucleótidos determinada, se sugirió que NR10.2 codificaba para una proteína similar al receptor soluble de 252 aminoácidos. Se reveló que los residuos de cisteína, el motivo rico en prolina y el motivo WSXWS en el dominio extracelular que se conservaba entre los miembros de la familia de receptores, el motivo box1 en el dominio intracelular que está implicado en la transducción de señal, etcétera se conservaron bien en la estructura primaria de NR10.1. Por tanto, se consideró que NR10.1 codificaba para un receptor de hematopoyetina típico.

Posteriormente, se realizó la RT-PCR usando ARNm preparado a partir de conjuntos de cebadores y órganos humanos diversos específicos para NR10.1 y NR10.2, respectivamente, para buscar tejidos que expresaran los genes respectivos y examinar su patrón de expresión y distribución en los tejidos humanos. Se sometieron los productos de la RT-PCR a transferencia de tipo Southern usando fragmentos de ADNc específicos para NR10.1 y NR10.2, respectivamente, con el fin de descartar la posibilidad de amplificación no específica y cuantificar la cantidad de los productos. Los resultados indicaban que el gen NR10.2 se expresa de manera constitutiva en todos los tejidos examinados a un nivel constante. Por el contrario, se detectó la expresión de NR10.1 en tejidos y órganos limitados: en particular, se detectó una fuerte expresión en corazón, placenta, testículos, timo y leucocitos periféricos de adulto, y se detectó una débil expresión en bazo, médula ósea, próstata, ovario, páncreas y pulmón.

Los inventores también realizaron la clonación por PCR para aislar el marco de lectura abierto (ORF) de longitud completa de NR10.1, y por causalidad, aislaron otro clon de ADNc, denominado NR10.3, que contenía una secuencia de nucleótidos en la que un solo nucleótido falta de la secuencia de NR10.1 y que codificaba para una proteína receptora de tipo transmembrana de 662 aminoácidos. Se consideró que NR10.3 poseía funciones similares a NR10.1 a partir de las estructuras estrechamente relacionadas.

Basándose en las características anteriores, se supone que NR10 es una molécula de receptor de hematopoyetina novedosa relacionada con la regulación del sistema inmunitario o la hematopoyesis in vivo. El gen que codifica para NR10 será extremadamente útil para seleccionar factores hematopoyéticos novedosos que pueden unirse funcionalmente a la proteína receptora.

Por consiguiente, esta invención se refiere a receptores de hematopoyetina novedosos y a genes que codifican para los receptores, así como a un método para producir y usar los mismos tal como se dio a conocer anteriormente.

Se describe además un ADN que se hibrida en condiciones rigurosas con un ADN que consiste en la secuencia de nucleótidos de cualquiera de SEQ ID NO: 1, 3 y 16, y que codifica para una proteína que es funcionalmente equivalente a la proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 2, 4 y 17, y

un ADN que codifica para un péptido parcial de una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 2,4 y 17.

Se proporciona

(3) un vector dentro del que se inserta el ADN de la invención,

(4) una proteína o un péptido que se codifica por dicho ADN.

(5) un método para seleccionar un compuesto que se une a la proteína de (4), que comprende las etapas de:

(a)

poner en contacto una muestra con la proteína de (4) o péptido parcial de la misma;

(b)

detectar la actividad de unión de la muestra con la proteína de (4) o péptido parcial de la misma; y

(c)

seleccionar el compuesto que se une a la proteína de (4) o péptido parcial de la misma;

(6) un anticuerpo que se une a la proteína de (4);

(7) un método para detectar o medir la proteína de (4), que comprende las etapas de: exponer el anticuerpo de (6) a una muestra que se espera que contenga la proteína de (4); y detectar o medir la producción del inmunocomplejo entre dicho anticuerpo y dicha proteína.

Se describe un polinucleótido complementario o bien a un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de cualquiera de SEQ ID NO: 1, 3 y 16 o bien a su cadena complementaria, en el que el polinucleótido comprende al menos 15 nucleótidos.

Esta invención proporciona un receptor de hematopoyetina novedoso NR10. Según el resultado de la búsqueda en bases de datos en GenBank, el análisis de 5'- y 3'-RACE, los inventores finalmente tuvieron éxito en la identificación y el aislamiento de un gen de receptor de hematopoyetina novedoso NR10. Se encontró que al menos dos variantes de corte y empalme se transcriben a partir de NR10. Una de estas variantes, el clon de ADNc NR10.1, codifica para una proteína receptora transmembrana, y la otra, NR10.2, codifica para una proteína similar al receptor soluble de 252 aminoácidos. Además, los inventores realizaron la clonación por PCR con el fin de aislar el ORF de longitud completa del ADNc de NR10.1, y por casualidad, tuvieron éxito en aislar otro clon de ADNc, denominado NR10.3, que contenía un ORF de longitud completa que codificaba para una proteína receptora de tipo transmembrana de 662 aminoácidos.

La secuencia de nucleótidos del ADNc de NR10.1 y la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada por el ADNc se muestran en SEQ ID NO: 1 y 2, respectivamente. La secuencia de nucleótidos del ADNc de NR10.2 y la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada por el ADNc se muestran en SEQ ID NO: 3 y 4, respectivamente. La secuencia de nucleótidos del ADNc de NR10.3 y la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada por el ADNc se muestran en SEQ ID NO: 16 y 17, respectivamente.

El clon del ADNc NR10.3 tiene una deleción de un solo nucleótido en la agrupación de adenina, ubicada proximal al codón de terminación, en comparación con el clon NR10.1, lo que da como resultado un desplazamiento del marco desde esa posición que conduce a un marco de lectura abierto diferente. Por tanto, la diferencia entre los dos clones no se provoca porque sean productos de transcripción de variantes de corte y empalme. Excepto por la deleción de un nucleótido, los clones del ADNc NR10.1 y NR10.3 comparten una secuencia idéntica. Mientras tanto, sus dominios extracelulares se codifican por una secuencia completamente idéntica y, por tanto, tienen una estructura terciaria idéntica, y de ese modo, se considera que reconocen el mismo ligando específico. Además, sus dominios intracelulares comparten el motivo Box1 (secuencia Pro-Xaa-Pro tras varios residuos básicos y múltiples residuos hidrófobos) ubicado inmediatamente después del dominio transmembrana, y se supone que se unen a la cinasa JAK. Por tanto, se prevé que las proteínas codificadas por los dos clones son funcionalmente equivalentes.

El análisis por RT-PCR usando el ARNm de diversos órganos humanos reveló que el gen NR10.2 se expresa de manera constitutiva en todos los tejidos examinados a un nivel constante. Por el contrario, se detectó la expresión del gen NR10.1 en órganos y tejidos limitados: en particular, fuerte expresión en corazón, placenta, testículos, timo y leucocitos periféricos de adulto, y débil expresión en bazo, médula ósea, próstata, ovario, páncreas y pulmón. Por tanto, se supone que NR10.1 codifica para un receptor de factor hematopoyético novedoso.

Las proteínas NR10 anteriores pueden ser útiles para su aplicación médica. Dado que NR10.1 se expresa en timo, leucocitos periféricos y bazo, puede ser un receptor para un factor hematopoyético desconocido. Por tanto, las proteínas NR10 son una herramienta útil en la identificación del factor hematopoyético desconocido. También puede usarse para examinar una biblioteca de péptidos o compuestos químicos sintéticos con el fin de aislar o identificar agonistas o antagonistas que pueden unirse funcionalmente a la molécula de NR10. Además, se espera la aplicación clínica de moléculas novedosas que se unan a la molécula de NR10 y anticuerpos específicos que puedan limitar la función de la molécula de NR10 para regular la respuesta inmunitaria o hematopoyesis in vivo, buscando tales moléculas y anticuerpos.

Se espera que NR10 se exprese en una población limitada de células en los tejidos hematopoyéticos, y por tanto, los anticuerpos anti-NR10 son útiles para el aislamiento de tales poblaciones celulares. Las poblaciones celulares aisladas pueden usarse en el trasplante de células. Además, se espera que el anticuerpo anti-NR10 pueda usarse para el diagnóstico o el tratamiento de enfermedades, tales como leucemia.

Por otro lado, las proteínas solubles que comprenden el dominio extracelular de la proteína NR10 y la variante de corte y empalme de NR10, NR10.2, pueden usarse como un receptor de tipo señuelo para inhibir el ligando de NR10. Pueden ser útiles para el tratamiento de enfermedades en las que esté implicada NR10, tales como leucemia.

Esta invención incluye proteínas que son funcionalmente equivalentes a la proteína NR10. Por ejemplo, se incluyen homólogos de la proteína NR10 humana en otras especies y mutantes de la proteína NR10 humana. En el presente documento, el término "funcionalmente equivalente" se refiere a proteínas que tienen una actividad biológica equivalente en comparación con la de una proteína NR10. Tal actividad biológica puede incluir la actividad de la proteína como receptor de factor hematopoyético en forma soluble o unida a la membrana.

Un experto en la técnica conoce bien los métodos de introducción de mutaciones para preparar proteínas que sean funcionalmente equivalentes a otra proteína. Por ejemplo, puede usarse mutagénesis dirigida a un sitio (Hashimoto-Goto, T. et al. Gene 152: 271-275 (1995); Zoller, M.J., y Smith M. Methods Enzymol. 100: 468-500 (1983); Kramer, W. et al. Nucleic Acids Res. 12: 9441-9456 (1984); Kramer W, y Fritz HJ Methods. Enzymol. 154: 350-367 (1987); Kunkel, TA Proc Natl Acad Sci EE.UU. 82: 488-492 (1985); Kunkel Methods Enzymol. 85: 2763-2766 (1988)) y similares con el fin de introducir una mutación apropiada en la secuencia de aminoácidos de la proteína NR10 humana y preparar una proteína que es funcionalmente equivalente a la proteína. Las mutaciones de aminoácidos también pueden producirse en la naturaleza. Esta invención incluye proteínas que tienen la secuencia de aminoácidos de la proteína NR10 humana en las que se mutan uno o más residuos de aminoácido, y en la que las proteínas son funcionalmente equivalentes a la proteína NR10 humana.

Como proteína funcionalmente equivalentes a la proteína NR10 de la invención, pueden mencionarse específicamente las siguientes: una en la que uno o dos o más, preferiblemente, de dos a 30, más preferiblemente, de dos a diez aminoácidos se delecionan en una cualquiera de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 17; una en la que uno o dos o más, preferiblemente, de dos a 30, más preferiblemente, de dos a diez aminoácidos se han añadido en una cualquiera de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 17; o una en la que uno o dos o más, preferiblemente, de dos a 30, más preferiblemente, de dos a diez aminoácidos se han sustituido por otros aminoácidos en una cualquiera de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 17.

En cuanto al residuo de aminoácido que va a mutarse, es preferible que se mute en un aminoácido diferente que permita que se conserven las propiedades de la cadena lateral del aminoácido. Ejemplos de las propiedades de las cadenas laterales del aminoácido son los siguientes: aminoácidos hidrófobos (A, I, L, M, F, P, W, Y, V), aminoácidos hidrófilos (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T) y aminoácidos que comprenden las siguientes cadenas laterales: una cadena lateral alifática (G, A, V, L, I, P); una cadena lateral que contiene grupo hidroxilo (S, T, Y); una cadena lateral que contiene átomo de azufre (C, M); una cadena lateral que contiene amida y ácido carboxílico (D, N, E, Q); una cadena lateral que contiene una base (R, K, H); y una cadena lateral que contiene un grupo aromático (H, F, Y, W) (las letras entre paréntesis indican los códigos de una letra de los aminoácidos).

Se conoce que una proteína puede tener una secuencia de aminoácidos de la que se modifica mediante deleción, adición y/o substitución por otros aminoácidos de uno o más residuos de aminoácido, y aún así conservar su actividad biológica (Mark, D. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 5662-5666 (1984); Zoller, M. J. y Smith, M., Nucleic Acids Research 10: 6487-6500 (1982); Wang, A. et al., Science 224: 1431-1433 (1984); Dalbadie-McFarland, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 6409-6413 (1982)).

Una proteína de fusión que contiene la proteína NR10 humana es un ejemplo de una proteína en la que se han añadido uno o más residuos de aminoácido a la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 2, 4 ó 17) de la proteína NR10 humana. Una proteína de fusión se prepara fusionando la proteína NR10 humana de la presente invención con otro(s) péptido(s) o proteína(s) y se incluye en la presente invención. Una proteína de fusión puede prepararse ligando un ADN que codifica para la proteína NR10 humana de la presente invención con un ADN que codifica para otro(s) péptido(s) o proteína(s) en el marco, introduciendo el ADN ligado en un vector de expresión y expresando el gen de fusión en un huésped. Pueden usarse métodos conocidos por un experto en la técnica para preparar un gen de fusión de este tipo. No existe ninguna limitación en cuanto al/a los otro(s) péptido(s) o proteína(s) que se fusiona(n) a la proteína de esta invención.

Otro(s) péptido(s) que va(n) a fusionarse con una proteína de la presente invención son péptidos conocidos, por ejemplo, FLAG (Hopp, T.P. et al., Biotechnology 6: 1204-1210 (1998)), 6x His que constituye seis residuos de histidina (His), 10x His, aglutinina de influenza (HA), fragmento de c-myc humano, fragmento de VSV-GP, fragmento de p18HIV, etiqueta de T7, etiqueta de VHS, etiqueta de E, fragmento de antígeno SV40T, etiqueta de lck, fragmento de \alpha-tubulina, etiqueta de B, fragmento de proteína C, etcétera. Otros ejemplos de péptidos que van a fusionarse con la proteína de la presente invención son la glutatión-S-transferasa (GST), aglutinina de influenza (HA), región constante de inmunoglobulina, \beta-galactosidasa, proteína de unión a maltosa (MBP), etc.

Las proteínas de fusión pueden prepararse fusionando ADN disponible comercialmente que codifica para estos péptidos o proteínas con ADN que codifica para una proteína de la presente invención y expresando el ADN fusionado preparado.

Un experto en la técnica conoce bien la técnica de hibridación (Sambrook, J et al., Molecular Cloning 2ª ed. 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. press, (1989)) como método alternativo para preparar una proteína funcionalmente equivalente a una determinada proteína. Más específicamente, un experto en la técnica puede utilizar el procedimiento general para obtener una proteína funcionalmente equivalente a una proteína NR10 humana aislando ADN que tiene una alta homología con la totalidad o parte del ADN (SEQ ID NO: 1, 3 ó 16) que codifica para la proteína NR10 humana. Por tanto, la presente invención incluye tales proteínas, que se codifican por los ADN que se hibridan con un ADN que consiste en un ADN que codifica para la proteína NR10 humana o parte de la misma y que son funcionalmente equivalentes a una proteína NR10 humana. Por ejemplo, se incluyen los homólogos de NR10 humana en otros mamíferos (tales como aquellos de mono, ratón, conejo y bovino). Con el fin de aislar un ADNc con alta homología con respecto a un ADN que codifica para una proteína NR10 humana a partir de animales, es preferible usar tejidos tales como corazón, placenta y testículos.

Un experto en la técnica puede seleccionar adecuadamente las condiciones de hibridación rigurosas para aislar ADN que codifica para proteínas funcionalmente equivalentes de la proteína NR10 humana, y por ejemplo, pueden proporcionarse condiciones de baja rigurosidad. Las condiciones de baja rigurosidad son, por ejemplo, 42ºC, 2x SSC y SDS al 1%, y preferiblemente, 50ºC, 2x SSC y SDS al 1%. Las condiciones altamente rigurosas son más preferibles e incluyen, por ejemplo, 65ºC, 2x SSC y SDS al 1%. En estas condiciones, cuanto mayor es la temperatura, mayor será la homología del ADN obtenido. Si embargo, varios factores diferentes de la temperatura, tales como la concentración de sales, pueden influir en la rigurosidad de la hibridación y un experto en la técnica puede seleccionar adecuadamente los factores para conseguir una rigurosidad similar.

En lugar de la hibridación, puede utilizarse el método de amplificación de genes, por ejemplo, el método de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), para aislar el ADN objeto usando cebadores sintetizados basándose en la información de secuencia del ADN que codifica para la proteína NR10 humana (SEQ ID NO: 1, 3 y 16).

Las proteínas que son funcionalmente equivalentes a la proteína NR10 humana, codificadas por ADN aislado mediante la técnica de hibridación anterior o mediante la técnica de amplificación de genes, normalmente tienen una alta homología con respecto a la secuencia de aminoácidos de la proteína NR10 humana. Las proteínas de la presente invención también incluyen proteínas que son funcionalmente equivalentes a la proteína NR10 humana, que también tienen una alta homología con la proteína que comprende una cualquiera de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 4 ó 17. Alta homología se define normalmente como una homología del 70% o superior, favorablemente del 80% o superior, más favorablemente del 90% o superior, y lo más favorablemente del 95% o superior. La homología de una proteína puede determinarse mediante el algoritmo en "Wilbur, W.J. y Lipman, D.J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 726-730 (1983)".

La secuencia de aminoácidos, el peso molecular, el punto isoeléctrico, la presencia o ausencia de la cadena de azúcar y la forma de una proteína de la presente invención pueden diferir según las células productoras, el huésped o el método de purificación descrito a continuación. Sin embargo, siempre que la proteína obtenida tenga una función equivalente a una proteína de la presente invención (SEQ ID NO: 2, 4 y 17), se incluye en la presente invención. Por ejemplo, si una proteína de la presente invención se expresa en células procariotas, tales como E. coli, se añade un residuo de metionina al extremo N-terminal de la secuencia de aminoácidos de la proteína expresada. Si una proteína de la presente invención se expresa en células eucariotas, tales como células de mamífero, se elimina la secuencia señal N-terminal. Tales proteínas también se incluyen en las proteínas de la presente invención.

Por ejemplo, como resultado del análisis de la proteína de la invención basándose en el método en "Von Heijne, G., Nucleic Acids Research, 14: 4683-4690 (1986)", se suponía que la secuencia señal es desde la 1ª Met hasta la 32ª Ala en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 4 y 17. Por tanto, la presente invención abarca una proteína que comprende la secuencia desde la 33ª Ala hasta el 652º Asp en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. De manera similar, la presente invención abarca una proteína que comprende la secuencia desde la 33ª Ala hasta la 252ª Val en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. De manera similar, la presente invención abarca una proteína que comprende la secuencia desde la 33ª Ala hasta la 662ª Ile en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17.

Una proteína de la presente invención puede prepararse mediante métodos conocidos para un experto en la técnica, como proteína recombinante, y también como proteína natural. Una proteína recombinante puede prepararse insertando un ADN que codifica para una proteína de la presente invención (por ejemplo, el ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, 3 ó 16) en un vector de expresión adecuado, introduciendo el vector en una célula huésped adecuada y recogiendo la proteína a partir del transformante resultante. Tras obtener el extracto, puede purificarse la proteína recombinante y prepararse sometiendo a cromatografía, tal como cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de fase inversa, filtración en gel, etcétera, o cromatografía de afinidad, a la que se inmovilizan anticuerpos contra la proteína de la invención, o combinando una o más de estas columnas.

Además, cuando una proteína de la presente invención se expresa dentro de células huésped (por ejemplo, células animales y E. coli), como proteína de fusión con proteína glutatión-S-transferasa o como proteína recombinante complementada con múltiples histidinas, puede purificarse la proteína recombinante expresada usando una columna de glutatión o una columna de níquel.

Tras purificar la proteína de fusión, también es posible excluir regiones diferentes de la proteína objetivo cortando con trombina, factor Xa, etcétera, según se requiera.

Una proteína natural puede aislarse mediante métodos conocidos para un experto en la técnica. Por ejemplo, extractos de tejido o células que expresan una proteína de la invención pueden hacerse reaccionar con una columna de afinidad descrita a continuación, a la cual se fijan anticuerpos que se unen a la proteína NR10, para aislar la proteína natural. Pueden usarse anticuerpos monoclonales o policlonales.

Esta invención también incluye péptidos parciales de las proteínas de la invención. El péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos específica para una proteína de la invención se compone de al menos 7 aminoácidos, favorablemente más de 8 aminoácidos, y más favorablemente más de 9 aminoácidos. Los péptidos parciales pueden ser útiles para preparar anticuerpos contra una proteína de la invención, o seleccionar compuestos que se unen a una proteína de la presente invención, o seleccionar activadores o inhibidores de una proteína de la presente invención. Alternativamente, puede usarse como antagonista para el ligando de una proteína de la invención. Un péptido parcial de la presente invención es, por ejemplo, un péptido parcial que tiene el centro activo de la proteína que consiste en una cualquiera de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 4 ó 17. Además, los péptidos parciales pueden contener una o más regiones de las regiones hidrófilas o las regiones hidrófobas que se suponen mediante el análisis del perfil de hidrofobicidad. Estos péptidos parciales pueden contener la totalidad o una parte de una región hidrófila, o pueden contener la totalidad o una parte de una región hidrófoba. Además, por ejemplo, las proteínas solubles y las proteínas que comprenden regiones extracelulares de una proteína de la invención también están abarcadas en la presente invención.

Los péptidos parciales de la invención pueden producirse mediante técnicas de ingeniería genética, métodos de síntesis de péptidos bien conocidos, o cortando una proteína de la invención con una peptidasa adecuada. El método de síntesis en fase sólida y el método de síntesis en fase líquida pueden usarse como métodos de síntesis de péptidos.

Otro objetivo de esta invención es proporcionar ADN que codifica para una proteína de la invención. El ADN puede ser útil para producir las proteínas anteriores de la invención in vivo e in vitro. Además, por ejemplo, también es posible usar el ADN para su aplicación a la terapia génica y similares de enfermedades que surgen de anomalías del gen que codifica para la proteína de la presente invención. Puede proporcionarse el ADN en cualquier forma siempre que codifique para una proteína de la invención. Por tanto, el ADN puede ser un ADNc sintetizado a partir de ARNm, ADN genómico o ADN sintetizado químicamente. Además, puede incluirse un ADN que comprende cualquier secuencia de nucleótidos basada en la degenerescencia del código genético, siempre que codifique para una proteína de la presente invención.

El ADN de la invención puede prepararse mediante cualquier método conocido para un experto en la técnica. Por ejemplo, el ADN puede prepararse construyendo una biblioteca de ADNc a partir de células que expresan la proteína, y realizando una hibridación usando una secuencia parcial del ADN de la invención (SEQ ID NO: 1 ó 3, por ejemplo) como sonda. Una biblioteca de ADNc puede construirse según el método descrito en la bibliografía (Sambrook J. et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)), o puede usarse una biblioteca de ADN comercial. Alternativamente, el ADN puede prepararse obteniendo ARN a partir de una célula que expresa una proteína de la presente invención, sintetizando oligo-ADN basándose en la secuencia del ADN presente (SEQ ID NO: 1, 3 ó 16, por ejemplo), realizando PCR usando el ADN sintetizado como cebador, y amplificando el ADNc que codifica para una proteína de la presente invención.

Determinando la secuencia de nucleótidos del ADNc obtenido, puede determinarse la región de traducción codificada por el ADNc, y puede obtenerse la secuencia de aminoácidos de la proteína de la presente invención. Además, puede aislarse ADN genómico examinando bibliotecas de ADN genómico usando el ADNc obtenido como sonda.

Específicamente, esto puede realizarse tal como sigue: en primer lugar, se aísla ARNm a partir de células, tejidos y órganos (por ejemplo, ovario, testículo, placenta, etc.) que expresan una proteína de la invención. Para aislar el ARNm, en primer lugar, se prepara el ARN total usando métodos bien conocidos, por ejemplo, método de ultracentrifugación de guanidina (Chirgwin, J.M. et al., Biochemistry 18: 5294-5299 (1979)), el método de AGPC (Chomczynski, P. y Sacchi, N., Anal. Biochem. 162: 156-159 (1987)), etcétera, y se purifica el ARNm a partir del ARNm total usando el kit de purificación de ARNm (Pharmacia), etc. Alternativamente, puede prepararse directamente ARNm usando el kit de purificación de ARNm QuickPrep^{TM} (Pharmacia).

Se sintetiza ADNc usando transcriptasa inversa a partir del ARNm obtenido. Puede sintetizarse el ADNc usando el kit de síntesis de ADNc de primera cadena de transcriptasa inversa de AMV (SEIKAGAKU CORPORATION), etc. Adicionalmente, también puede realizarse la síntesis y la amplificación del ADNc usando el cebador y similares descrito en el presente documento siguiendo el método de 5'-RACE (Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. Acad: Sci. USA 85: 8998-9002 (1988); Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. 17: 2919-2932 (1989)) utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y el kit de RACE FINDER^{TM} de amplificación en 5' (Clontech).

El fragmento de ADN objetivo se prepara a partir del producto de PCR obtenido y se liga con el ADN del vector. Por tanto, se crea un vector de recombinación, se introduce en E. coli, etcétera, y se seleccionan las colonias para preparar el vector de recombinación deseado. La secuencia de nucleótidos del ADN objetivo puede verificarse mediante métodos conocidos, por ejemplo, el método de terminación de cadena de nucleótidos didesoxi.

Con respecto al ADN de la invención, puede diseñarse una secuencia con mayor eficacia de expresión considerando la frecuencia de uso de codón en el huésped usado para la expresión (Grantham, R. et al., Nucleic Acids Research 9: r43-74 (1981)). El ADN de la invención también puede modificarse usando kits disponibles comercialmente y métodos conocidos. Se facilitan modificaciones como, por ejemplo, digestión por enzimas de restricción, inserción de oligonucleótidos sintéticos y fragmentos de ADN adecuados, adición de ligadores, inserción de un codón de iniciación (ATG) y/o un codón de terminación (TAA, TGA o TAG), etcétera.

Específicamente, el ADN de la invención incluye ADN que consiste en la secuencia de nucleótidos desde la 523ª "A" hasta la 2478ª "C" de SEQ ID NO: 1, desde la 523ª "A" hasta la 1278ª "G" de SEQ ID NO: 3, o desde la 11ª "A" hasta la 1996ª "A" de SEQ ID NO: 16.

Se describe un ADN que se hibrida en condiciones rigurosas con el ADN que consiste en uno cualquiera de los nucleótidos, en el que el ADN codifica para una proteína funcionalmente equivalente a una proteína mencionada anteriormente de la presente invención.

\newpage

Un experto en la técnica puede seleccionar adecuadamente las condiciones rigurosas, y por ejemplo, pueden proporcionarse condiciones de baja rigurosidad. Las condiciones de baja rigurosidad son, por ejemplo, 42ºC, 2x SSC y SDS al 1%, y preferiblemente 50ºC, 2x SSC y SDS al 1%. Son más preferibles las condiciones altamente rigurosas que son, por ejemplo, 65ºC, 2x SSC y SDS al 1%. En estas condiciones, cuanto mayor es la temperatura, mayor será la homología del ADN obtenido. El ADN anterior que se hibrida con el ADN con las secuencias de SEQ ID NO: 1,3 y 16, es preferiblemente un ADN natural tal como ADNc y ADN cromosómico.

Además, la presente invención proporciona un vector que contiene un ADN de la invención como inserto. El vector puede ser útil para mantener el ADN en las células huésped o producir la proteína de la invención.

Si la célula huésped es E. coli. (tal como JM109, DH5\alpha, HB101 y XL1Blue), puede usarse cualquier vector siempre que contenga el "ori" ("origen de replicación") para su amplificación en E. coli que permite la preparación a gran escala, y un marcador de selección para transformantes (por ejemplo, un gen de resistencia a fármaco que permite la selección mediante un fármaco tal como ampicilina, tetraciclina, kanamicina y cloranfenicol). Por ejemplo, pueden usarse series de los vectores M13 y vectores pUC, pBR322, pBluescript, pCR-Script, etcétera. Con el fin de subclonación o corte de un ADNc, también pueden usarse pGEM-T, pDIRECT, pT7, etcétera. Para producir la proteína de la invención, un vector de expresión es especialmente útil. Por ejemplo, si la proteína va a expresarse en E. coli, el vector de expresión debe tener características tales como las anteriores para amplificarse en E. coli, y un promotor para una expresión eficaz, tal como el promotor lacZ (Ward et al., Nature 341: 544-546 (1989); FASEB J. 6: 2422-2427 (1992)), el promotor araB (Better et al., Science 240: 1041-1043) (1988) o el promotor T7. Tales vectores incluyen pGEX-5X-1 (Pharmacia), vectores en el sistema QIAexpress^{TM} (QIAGEN), pEGFP, pET (BL21 que expresa la ARN polimerasa de T7 se usa favorablemente como el huésped), etcétera excepto aquellos mencionados anteriormente.

El vector puede contener una secuencia señal para la secreción de polipéptido. Puede usarse la secuencia señal pelB (Lei S. P. et al., J. Bacteriol. 169: 4379 (1987)) para producir la proteína en el periplasma de E. coli. Pueden introducirse vectores en las células huésped, por ejemplo, mediante el método de cloruro de calcio o la electropora-
ción.

Por ejemplo, el vector de expresión para preparar la proteína de la invención puede ser un vector de expresión derivado de mamífero (por ejemplo, pcDNA3 (Invitrogen), pEGF-BOS (Nucleic Acids. Res., 18 (17): pág. 5322 (1990)), pEF y pCDM8), un vector de expresión derivado de célula de insecto (por ejemplo, "sistema de expresión de baculovirus Bac-to-Bac^{TM}" (GIBCO BRL), pBacPAK8), un vector de expresión derivado de planta (por ejemplo, pMH1 y pMH2), un vector de expresión derivado de virus de animal (por ejemplo, pHSV, pMV y pAdexLcw), un vector de expresión derivado de retrovirus (por ejemplo, pZIpneo), un vector de expresión derivado de levadura (por ejemplo, "Kit de expresión de Pichia" (Invitrogen), pNV11 y SP-Q01), o un vector de expresión derivado de Bacillus subtilis (por ejemplo, pPL608 y pKTH50), diferente de E. coli.

Para la expresión en células animales, tales como células CHO, COS y NIH3T3, el vector de expresión debe tener un promotor tal como promotor de SV40 (Mulligan et al., Nature 277: 108 (1979)), promotor de MMLV-LTR, promotor de EF1\alpha (Mizushima et al., Nucleic Acids Res. 18: 5322 (1990)), y promotor de CMV. Más específicamente, el vector puede contener un marcador para la selección de células transfectadas (por ejemplo, un gen de resistencia a fármaco para la selección mediante un fármaco tal como neomicina y G418). Tales vectores incluyen pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV, pOP13, etcétera.

Además, con el fin de conseguir una expresión génica estable y una amplificación del número de copias de los genes en la célula, pueden usarse células CHO deficientes en la ruta metabólica para la síntesis de nucleótidos. Se transfecta la célula CHO con un vector de expresión que contiene el gen DHFR que complementa la deficiencia (tal como pCHOI), puede amplificarse el vector mediante tratamiento con metotrexato (MTX). Para la expresión génica transitoria, pueden usarse células COS que contienen un gen que expresa el antígeno SV40-T en su cromosoma para transformar con un vector que contiene el origen de replicación de SV40 (tal como pCD). Ejemplos de orígenes de replicación que van a usarse en la presente invención incluyen los derivados de poliomavirus, adenovirus, virus del papiloma bovino (VPB), etcétera. Además, para amplificar las copias de los genes en las líneas de células huésped, el vector de expresión puede incluir un gen de aminoglucósido transferasa (APH), un gen de timidina cinasa (TK), un gen de xantina guanina fosforribosil transferasa de E. coli (Ecogpt), un gen de dihidrofolato reductasa (dhfr), etcétera, como marcador selectivo.

La expresión in vivo del ADN de la invención puede realizarse construyendo el ADN en un vector apropiado y transfectando el constructo en el organismo usando retrovirus, liposoma, liposoma catiónico, adenovirus, etcétera. Puede ser posible usar un constructo de este tipo en terapia génica para enfermedades que surgen de mutaciones en el gen NR10. Ejemplos de vectores usados para este fin incluyen un vector de adenovirus (tal como pAdexlcw) y un vector de retrovirus (tal como pZIPneo). Pueden realizarse manipulaciones generales, tales como inserción del ADN en el vector, usando métodos convencionales (Molecular Cloning, 5.61-5.63). El vector puede administrarse al paciente mediante métodos in vivo o ex vivo.

Otro objeto de esta invención es proporcionar un transformante que contiene el ADN de la invención de manera expresable. La célula huésped para insertar el vector de la presente invención no se limita en modo alguno, y puede usarse E. coli, una variedad de células animales, etcétera. El transformante puede usarse como sistema productor para preparar o expresar una proteína de la invención. Se conocen sistemas de producción in vivo e in vitro como sistemas de producción para producir proteínas. Pueden usarse sistemas de producción que usan células eucariotas y células procariotas como los sistemas de producción in vitro.

Cuando se usan células eucariotas, los sistemas de producción que usan, por ejemplo, células animales, células vegetales y células fúngicas, están disponibles como huéspedes. Ejemplos de células animales usadas incluyen células de mamífero tales como CHO (J. Exp. Med., 108: 945 (1995)), COS, 3T3, mieloma, de riñón de cría de hámster (BHK), HeLa, Vero, células de anfibio tales como ovocitos de Xenopus (Valle, et al., Nature 291: 338-340 (1981)), células de insecto tales como sf9, sf21 o Tn5. Como células CHO, pueden usarse adecuadamente de manera especial células CHO deficientes en gen DHFR, dhfr-CHO (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220 (1980)), y CHO K-1 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 60: 1275 (1968)). Para una preparación a gran escala en células animales, pueden usarse favorablemente células CHO. El vector puede transfectarse en células huésped usando una variedad de métodos, tales como los que usan fosfato de calcio, DEAE-dextrano o liposoma catiónico DOTAP (Boeringer Mannheim), así como electroporación, lipofección, etcétera.

Las células derivadas de Nicotiana tabacum se conocen bien como sistemas de producción de proteína en células vegetales, y éstas pueden cultivarse como callo. Como células fúngicas, se conocen levaduras tales como el género Saccharomyces, por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae; bacterias filamentosas, tales como el género Aspergillus, por ejemplo Aspergillus niger.

Las células bacterianas pueden usarse como sistemas de producción procarióticos. Como células bacterianas, se conocen E. coli, por ejemplo, JM109, DH5\alpha, HB101, etcétera, así como otras como Bacillus subtilis.

Las proteínas pueden obtenerse transformando estas células con el ADN objetivo, y cultivando las células transformadas in vitro según métodos conocidos. Por ejemplo, pueden usarse DMEM, MEM, RPMI1640 e IMDM como medios de cultivo de células animales. Ocasionalmente, pueden añadirse suero de ternero fetal (FCS) y tales complementos de suero en los medios anteriores; alternativamente, puede usarse un medio de cultivo libre de suero. El pH es preferiblemente de desde aproximadamente 6 hasta 8. El cultivo se realiza habitualmente a de aproximadamente 30ºC a 40ºC, durante de aproximadamente 15 a 200 h, y los cambios de medio, la aireación y la agitación se realizan según sea necesario.

Por otro lado, por ejemplo, los sistemas de producción que usan animales y plantas pueden facilitarse como sistemas de producción de proteína in vivo. Se introduce el ADN objetivo en la planta o el animal, y se produce la proteína dentro de la planta o el animal, y después, se recupera la proteína. El término "huésped" tal como se usa en la presente invención abarca tales animales y plantas también.

Cuando se usan animales, pueden usarse sistemas de producción de insecto y mamífero. Como mamíferos, pueden usarse cabras, cerdos, ovejas, ratones y bovinos (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications (1993)). También pueden usarse animales transgénicos cuando se usan mamíferos.

Por ejemplo, se prepara el ADN objetivo como gen de fusión con un gen que codifica para una proteína producida intrínsicamente en la leche, tal como \beta-caseína de cabra. A continuación, se inyecta el fragmento de ADN que contiene el gen de fusión en un embrión de cabra, y se implanta este embrión en una cabra hembra. La proteína objetivo puede extraerse de la leche de las cabras transgénicas producidas a partir de la cabra que recibió el embrión, y descendientes de las mismas. Para aumentar la cantidad de leche que contiene la proteína producida de la cabra transgénica, puede(n) administrarse una(s) hormona/hormonas adecuada(s) a las cabras transgénicas (Ebert, K.M. et al., Bio/Technology 12: 699-702 (1994)).

Pueden usarse gusanos de seda como insectos. Cuando se usan gusanos de seda, se infectan con baculovirus a los que se ha insertado el ADN que codifica para la proteína objetivo, y la proteína deseada puede obtenerse de los fluidos corporales del gusano de seda (Susumu, M. et al., Nature 315: 592-594 (1985)).

Cuando se usan plantas, por ejemplo, puede usarse tabaco. En el caso del tabaco, se inserta el ADN que codifica para la proteína objetivo en un vector de expresión vegetal, por ejemplo, pMON 530, y se introduce este vector en una bacteria tal como Agrobacterium tumefaciens. Se infecta esta bacteria al tabaco, por ejemplo, Nicotiana tabacum, y puede obtenerse el polipéptido deseado a partir de las hojas del tabaco (Julian, K. -C. Ma et al., Eur. J. Immunol. 24: 131-138 (1994)).

La proteína así obtenida de la invención se aísla a partir del interior o el exterior (medio, etc.) de la célula huésped, y puede purificarse como proteína homogénea sustancialmente pura. Puede realizarse la separación y purificación de la proteína usando métodos de separación y purificación convencionales usados para purificar proteínas y no se limitan a ningún método específico. Por ejemplo, pueden seleccionarse adecuadamente columna de cromatografía, filtración, ultrafiltración, precipitación con sales, precipitación con disolvente, extracción con disolvente, destilación, inmunoprecipitación, electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS, isoelectroenfoque, diálisis, recristalización, etcétera, o combinarse para separar/purificar la proteína.

Por ejemplo, pueden mostrarse a modo de ejemplo de cromatografías, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía hidrófoba, filtración en gel, cromatografía de fase inversa, cromatografía de adsorción, etcétera (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed. Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996)). Estas cromatografías pueden realizarse mediante cromatografía líquida, tal como HPLC, FPLC y similares. La presente invención abarca proteínas altamente purificadas usando tales métodos de purificación.

Pueden modificarse arbitrariamente las proteínas, o pueden cortarse parcialmente los péptidos tratando las proteínas con enzimas de modificación apropiadas antes o después de la purificación. Se usan como enzimas de modificación de proteína, tripsina, quimiotripsina, lisil endopeptidasa, proteína cinasa, glucosidasa, etcétera.

La presente invención también proporciona anticuerpos que se unen a la proteína de la invención. No existe ninguna limitación particular en cuanto a la forma del anticuerpo de la presente invención y la presente invención incluye anticuerpos policlonales así como anticuerpos monoclonales. También se incluyen el antisuero obtenido inmunizando animales tales como conejos con una proteína de la presente invención, así como anticuerpos monoclonales y policlonales de todas las clases, anticuerpos humanos y anticuerpos humanizados preparados mediante ingeniería genética.

Una proteína de la invención que se usa como antígeno de sensibilización para obtener anticuerpos no se limita por la especie animal de la que se deriva, pero es preferiblemente una proteína derivada de mamíferos, por ejemplo, seres humanos, ratones o ratas, de manera especialmente preferible de seres humanos. Las proteínas de origen humano pueden obtenerse usando la secuencia de nucleótidos o la secuencia de aminoácidos dadas a conocer en el presente documento.

En el presente documento, puede usarse una proteína intacta o su péptido parcial como el antígeno para inmunización. Como péptidos parciales de las proteínas, por ejemplo, pueden proporcionarse el fragmento amino (N) terminal de la proteína, y el fragmento carboxi (C) terminal. "Anticuerpo" tal como se usa en el presente documento significa un anticuerpo que reacciona específicamente con la longitud completa o fragmentos de la proteína.

Un gen que codifica para una proteína de la invención o un fragmento de la misma se inserta en un vector de expresión bien conocido, y transformando las células huésped con el vector descrito en el presente documento, se obtiene la proteína objetivo o un fragmento de la misma del interior o exterior de la célula huésped usando métodos bien conocidos, y puede usarse esta proteína como el antígeno de sensibilización. Además, también pueden usarse células que expresan la proteína, lisados celulares o proteína sintetizada químicamente de la invención como antígeno de sensibilización.

No se limitan los mamíferos que se inmunizan por el antígeno de sensibilización, pero es preferible seleccionar animales considerando la adaptabilidad con las células originales usadas en la fusión celular. Generalmente, se usan animales que pertenecen a la familia rodentia, lagomorpha y primate.

Ejemplos de animales que pertenecen a la familia rodentia que pueden usarse incluyen ratones, ratas, hámsters, etcétera. Ejemplos de animales que pertenecen a la familia lagomorpha que pueden usarse incluyen, por ejemplo, conejos. Ejemplos de primates que pueden usarse incluyen monos. Ejemplos de monos que van a usarse incluyen el infraorden catarrhini (monos del viejo mundo), por ejemplo, macacos, monos rhesus, babuinos sagrados, chimpancés, etcétera.

Pueden usarse métodos bien conocidos para inmunizar animales con el antígeno de sensibilización. Por ejemplo, se inyecta generalmente por vía intraperitoneal o por vía subcutánea el antígeno de sensibilización en mamíferos. Específicamente, se diluye adecuadamente el antígeno de sensibilización y se suspende en solución salina fisiológica o solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se mezcla con una cantidad adecuada de adyuvante general si se desea, por ejemplo, con el adyuvante completo de Freund. Entonces, se emulsiona la disolución y se inyecta en el mamífero. Después, el antígeno de sensibilización mezclado adecuadamente con adyuvante incompleto de Freund se administra preferiblemente varias veces cada de 4 a 21 días. También puede usarse un vehículo adecuado cuando se inmuniza un animal con el antígeno de sensibilización. Tras la inmunización, se detecta la elevación en el nivel de anticuerpo sérico mediante métodos habituales.

Pueden obtenerse anticuerpos policlonales contra una proteína de la invención tal como sigue. Tras verificar que se ha alcanzado un nivel de anticuerpo sérico deseado, se extrae sangre del mamífero sensibilizado con el antígeno. Se aísla el suero a partir de esta sangre usando métodos bien conocidos. Puede usarse el suero que contiene el anticuerpo policlonal como el anticuerpo policlonal, o según la necesidad, puede aislarse adicionalmente la fracción que contiene el anticuerpo policlonal a partir del suero. Por ejemplo, puede prepararse una fracción de anticuerpos que reconocen específicamente la proteína de la invención usando una columna de afinidad a la que se acopla la proteína. Entonces, puede purificarse adicionalmente la fracción usando una columna de proteína A o proteína G con el fin de preparar inmunoglobulina G o inmunoglobulina M.

Para obtener anticuerpos monoclonales, tras verificar que se ha alcanzado el nivel de anticuerpo sérico deseado en el mamífero sensibilizado con el antígeno descrito anteriormente, se extraen inmunocitos del mamífero y se usan para la fusión celular. Con este fin, pueden mencionarse los esplenocitos como inmunocitos preferibles. Como células originales fusionadas con los inmunocitos anteriores, se usan preferiblemente células de mieloma de mamífero. Más preferiblemente, se usan como célula original, células de mieloma que han adquirido la característica, que pueden usarse para distinguir células de fusión mediante agentes.

La fusión celular entre las células de mieloma y los inmunocitos anteriores puede llevarse a cabo según métodos conocidos, por ejemplo, el método de Milstein et al. (Galfre, G. y Milstein, C., Methods Enzymol. 73: 3-46 (1981)).

El hibridoma obtenido a partir de la fusión celular se selecciona cultivando las células en un medio de cultivo selectivo convencional, por ejemplo, medio de cultivo HAT (medio de cultivo que contiene hipoxantina, aminopterina, timidina). El cultivo en este medio HAT se continúa durante un período suficiente para que mueran células (células no de fusión) diferentes del hibridoma objetivo, habitualmente desde unos pocos días hasta unas pocas semanas. A continuación, se lleva a cabo el método de dilución limitante habitual, y se selecciona y clona el hibridoma que produce el anticuerpo objetivo.

Aparte del método anterior para obtener hibridomas, inmunizando un animal diferente de seres humanos con el antígeno, puede obtenerse un hibridoma que produce los anticuerpos humanos objetivo que tienen la actividad de unirse a las proteínas, mediante el método de sensibilizar linfocitos humanos, por ejemplo, linfocitos humanos infectados con el virus EB, con proteínas, células que expresan proteínas o lisados de las mismas in vitro, fusionar los linfocitos sensibilizados con células de mieloma derivadas de ser humano, por ejemplo U266, que tienen una capacidad de división celular permanente (solicitud de patente japonesa publicada sin examinar (JP-A) N.º Sho 63-17688).

Pueden purificarse los anticuerpos monoclonales obtenidos, por ejemplo, mediante precipitación con sulfato de amonio, columna de proteína G o proteína A, cromatografía de intercambio iónico con DEAE, una columna de afinidad a la que se acopla la proteína de la presente invención, etcétera. El anticuerpo puede ser útil para la purificación o la detección de una proteína de la invención. También puede ser un candidato para un agonista o antagonista de la proteína. Además, es posible usarlo para el tratamiento con anticuerpos de enfermedades en las que está implicada la proteína. Para la administración in vivo (en tal tratamiento con anticuerpos), pueden usarse favorablemente anticuerpos humanos o anticuerpos humanizados debido a su antigenicidad reducida.

Por ejemplo, puede obtenerse un anticuerpo humano contra una proteína usando hibridomas preparados fusionando células de mieloma con células productoras de anticuerpos obtenidas inmunizando un animal transgénico que comprende un repertorio de genes de anticuerpos humanos con un antígeno tal como una proteína, células que expresan proteínas o un lisado celular de las mismas (documentos WO92/03918, WO93/2227, WO94/02602, WO94/25585, WO96/33735 y WO96/34096).

Aparte de producir anticuerpos usando un hibridoma, también pueden usarse inmunocitos productores de anticuerpos, tales como linfocitos sensibilizados que se inmortalizan mediante oncogenes.

También pueden obtenerse tales anticuerpos monoclonales como anticuerpos recombinantes producidos usando la técnica de ingeniería genética (por ejemplo, Borrebaeck, C.A.K. y Larrick, J.W., THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, publicado en el Reino Unido por MACMILLAN PUBLISHERS LTD, (1990)). Los anticuerpos recombinantes se producen clonando el ADN codificante a partir de inmunocitos, tales como hibridoma o linfocitos sensibilizados productores de anticuerpos, incorporando éste en un vector adecuado, e introduciendo este vector en un huésped para producir el anticuerpo. La presente invención también abarca tales anticuerpos recombinantes.

Además, el anticuerpo de la presente invención puede ser un fragmento de anticuerpo o un anticuerpo modificado, siempre que se una a una proteína de la invención. Por ejemplo, pueden proporcionarse como fragmentos de anticuerpo, Fab, F(ab')_{2}, Fv, o Fv de monocatenario en el que se unen adecuadamente el Fv de cadena H y el Fv de cadena L mediante un ligador (scFv, Huston, J.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883 (1988)). Específicamente, se producen fragmentos de anticuerpos tratando anticuerpos con enzimas, por ejemplo, papaína, pepsina, etcétera, o construyendo un gen que codifica para un fragmento de anticuerpo, introduciendo éste en un vector de expresión y expresando este vector en células huésped adecuadas (por ejemplo, Co, M. S. et al., J. Immunol. 152: 2968-2976 (1994); Better, M. y Horwitz, A.H., Methods Enzymol. 178: 476-496 (1989); Pluckthun, A. y Skerra, A., Methods Enzymol., 178: 497-515 (1989); Lamoyi, E., Methods Enzymol. 121: 652-663 (1986); Rousseaux, J. et al., Methods Enzymol. 121: 663-669 (1986); Bird, R. E. y Walker, B. W., Trends Biotechnol. 9: 132-137 (1991)).

Como anticuerpos modificados, pueden usarse anticuerpos unidos a diversas moléculas tales como polietilenglicol (PEG). El anticuerpo de la presente invención también abarca tales anticuerpos modificados. Para obtener un anticuerpo modificado de este tipo, se realizan modificaciones químicas al anticuerpo obtenido. Estos métodos ya están establecidos en el campo.

El anticuerpo de la invención puede obtenerse como anticuerpo quimérico, que comprende una región variable derivada de anticuerpo no humano y una región constante derivada de anticuerpo humano, o como anticuerpo humanizado que comprende una región determinante de complementariedad (CDR) derivada de anticuerpo no humano, una región de entramado (FR) derivada de anticuerpo humano y una región constante derivada de anticuerpo humano usando métodos convencionales.

Los anticuerpos así obtenidos pueden purificarse hasta la uniformidad. Los métodos de separación y purificación usados en la presente invención para separar y purificar el anticuerpo pueden ser cualquier método habitualmente usado para proteínas. Por ejemplo, puede seleccionarse apropiadamente cromatografía en columna, tal como cromatografía de afinidad, filtro, ultrafiltración, precipitación con sales, diálisis, electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS, electroforesis de punto isoeléctrico, etcétera, y combinarse para aislar y purificar los anticuerpos (Antibodies: a laboratory manual. Ed Harlow y David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988). La concentración de anticuerpo del anticuerpo mencionado anteriormente puede someterse a ensayo midiendo la absorbancia o mediante ensayo de inmunoabsorción unido a enzimas (ELISA), etc.

Puede usarse la columna de proteína A o proteína G para la cromatografía de afinidad. La columna de proteína A puede ser, por ejemplo, Hyper D^{TM}, POROS^{TM}, Sepharose F.F®. (Pharmacia), etcétera.

También puede usarse otra cromatografía, tal como cromatografía de intercambio iónico, cromatografía hidrófoba, filtración en gel, cromatografía de fase inversa y cromatografía de adsorción (Strategies for Protein Purification and Characterization: A laboratory Course Manual. Ed. por Marshak D.R. et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996)). Éstas pueden realizarse en cromatografía líquida tal como HPLC o FPLC.

Ejemplos de métodos que someten a ensayo la actividad de unión a antígeno de los anticuerpos de la invención incluyen, por ejemplo, medición de absorbancia, ensayo de inmunoabsorción unido a enzimas (ELISA), inmunoensayo enzimático (EIA), radioinmunoanálisis (RIA) o método de anticuerpos fluorescentes. Por ejemplo, cuando se usa ELISA, puede añadirse una proteína de la invención a una placa recubierta con los anticuerpos de la invención, y a continuación, se añade la muestra de anticuerpo objetivo, por ejemplo, sobrenadantes de cultivo de células productoras de anticuerpos, o anticuerpos purificados. Entonces, se añade el anticuerpo secundario que reconoce el anticuerpo, que está marcado con fosfatasa alcalina y enzimas de ese tipo, se incuba la placa y se lava, y se mide la absorbancia para evaluar la actividad de unión a antígeno tras añadir un sustrato de la enzima tal como p-nitrofenilfosfato. Como proteína, puede usarse un fragmento de proteína, por ejemplo, un fragmento que comprende un extremo C-terminal, o un fragmento que comprende un extremo N-terminal. Para evaluar la actividad del anticuerpo de la invención, puede usarse BIAcore^{TM} (Pharmacia).

Usando estos métodos, se ponen en contacto el anticuerpo de la invención y una muestra que se supone que contiene una proteína de la invención, y se detecta o somete a ensayo la proteína de la invención detectando o sometiendo a ensayo el inmunocomplejo de la proteína y anticuerpo anteriormente mencionados.

Un método para detectar o someter a ensayo una proteína de la invención es útil en diversos experimentos usando proteínas ya que puede detectar o someter a ensayo específicamente las proteínas.

Se describe además un polinucleótido de al menos 15 nucleótidos que es complementario al ADN que codifica para la proteína NR10 humana (SEQ ID NO: 1, 3 ó 16) o su cadena complementaria.

En el presente documento, el término "cadena complementaria" se define como una cadena de un ADN de bicatenario compuesto por pares de bases de A:T y G:C para la otra cadena. Además, "complementario" se define no sólo como aquellas que corresponden completamente dentro de una región continuada de al menos 15 nucleótidos, sino también que tienen una homología de al menos el 70%, favorablemente el 80% o superior, más favorablemente el 90% o superior, y lo más favorablemente el 95% o superior dentro de esa región. La homología puede determinarse usando el algoritmo descrito en el presente documento.

Se hace referencia en el presente documento a las sondas o los cebadores para la detección o la amplificación del ADN que codifica para una proteína de la invención, o un nucleótido o un derivado de nucleótido para la supresión de la expresión de la proteína (tal como oligonucleótido antisentido y ribozima). También pueden usarse tales polinucleótidos para preparar chips de ADN.

Un oligonucleótido antisentido que hibrida con una parte de la secuencia de nucleótidos de cualquiera de SEQ ID NO: 1, 3 y 16 también se incluye en los oligonucleótidos antisentido descritos en la memoria descriptiva. Este oligonucleótido antisentido puede ser uno contra al menos 15 nucleótidos continuos en una cualquiera de las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, 3 y 16, o puede ser el oligonucleótido antisentido contra al menos 15 nucleótidos continuos que contienen un codón de iniciación de la traducción.

Los derivados o los productos modificados de oligonucleótidos antisentido pueden usarse como oligonucleótidos antisentido. Ejemplos de tales productos modificados son modificaciones de alquilfosfonato inferior tales como de tipo metilfosfonato o de tipo etilfosfonato; fosfotioato, productos modificados de fosfoamidato, etcétera.

La expresión "oligonucleótido(s) antisentido" tal como se usa en el presente documento significa, no sólo aquellos en los que los nucleótidos correspondientes a aquellos que constituyen una región especificada de un ADN o un ARNm son totalmente complementarios, sino también aquellos que tienen una correspondencia errónea de uno o más nucleótidos, siempre que el ADN o el ARNm y el oligonucleótido puedan hibridarse de manera selectiva y estable con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, 3 ó 16.

El derivado de oligonucleótido antisentido descrito puede actuar sobre células que producen una proteína de la invención uniéndose al ADN o al ARNm que codifica para la proteína para inhibir su transcripción o traducción, y promover la degradación del ARNm, y puede tener un efecto de supresión de la función de la proteína de la invención suprimiendo la expresión de la proteína.

El derivado de oligonucleótido antisentido puede prepararse en una preparación externa tal como un linimento y un emplasto mezclando con un material de base adecuado, que es inactivo para los derivados.

Además, según se necesite, los derivados pueden formularse en comprimidos, polvos, gránulos, cápsulas, cápsulas de liposoma, inyecciones, disoluciones, gotas nasales y agentes liofilizados añadiendo excipientes, agentes isotónicos, solubilizantes, estabilizantes, conservantes, analgésicos, etc. Éstos pueden prepararse usando métodos convencionales.

El derivado de oligonucleótido antisentido puede administrarse al paciente aplicando directamente en el sitio afectado, inyectando en el vaso sanguíneo, etcétera, de manera que alcanzará el sitio afectado. También puede usarse un material que aumenta el antisentido para aumentar la durabilidad y la permeabilidad de la membrana. Ejemplos son liposoma, poli-L-lisina, lípido, colesterol, lipofectina o derivados de los mismos.

La dosificación del derivado de oligonucleótido antisentido se ajusta adecuadamente según el estado del paciente y se usa en cantidades deseadas. Por ejemplo, puede administrarse un intervalo de dosis de 0,1 a 100 mg/kg, por ejemplo de 0,1 a 50 mg/kg.

El derivado de oligonucleótido antisentido podría ser útil en inhibir la expresión de la proteína de la invención, y por tanto, podría ser útil en suprimir la actividad biológica de la proteína de la invención. También, podrían ser útiles inhibidores de expresión que comprenden el derivado de oligonucleótido antisentido descrito anteriormente, debido a su capacidad para suprimir la actividad biológica de la proteína de la invención.

Las proteínas de esta invención son útiles para seleccionar compuestos que se unen a la proteína. Es decir, se usan las proteínas en el método de selección para compuestos que se unen a las proteínas de esta invención, en el que el método comprende poner en contacto proteínas de esta invención con una muestra de prueba que se espera que contenga un compuesto que se una a las proteínas y seleccionar un compuesto con la actividad para unirse a las proteínas de esta invención.

Las proteínas de esta invención usadas en la selección pueden ser cualquiera de péptidos parciales, naturales o recombinantes. Además, pueden ser una proteína purificada, péptidos parciales de la misma, o en forma de proteínas expresadas en fracciones de membrana o superficie celular. No se limitan las muestras que van a someterse a prueba, pero pueden ser extractos celulares, sobrenadantes de cultivo, productos fermentados de microorganismos, extractos de organismos marinos, extractos vegetales, proteínas purificadas o parcialmente purificadas, péptidos, compuestos no peptídicos, compuestos de bajo peso molecular sintéticos o compuestos naturales. La proteína de la invención puede exponerse a la muestra como proteína purificada o proteína soluble, en forma unida a un soporte, como proteína de fusión con otra proteína, en forma expresada sobre la superficie de la membrana celular o como fracciones de membrana.

Una proteína de la invención puede usarse para examinar para seleccionar proteínas que se unen a la proteína (tales como ligandos) usando una variedad de métodos conocidos para una experto en la técnica. Pueden llevarse a cabo estas selecciones, por ejemplo, mediante el método de inmunoprecipitación. Específicamente, puede llevarse a cabo el método tal como sigue. Se expresa el gen que codifica para la proteína de esta invención insertando el gen en un vector para expresión de gen foráneo como pSV2neo, pcDNA I, pCD8, etcétera, y expresando el gen en células animales, etc. Puede emplearse cualquier promotor generalmente usado para la expresión, incluyendo el promotor precoz de SV40 (Rigby In Williamson (ed.), Genetic Engineering, Vol. 3. Academic Press, Londres, págs. 83-141 (1982)), promotor EF-1 \alpha (Kim, et al. Gene 91: 217-223 (1990)), promotor CAG (Niwa, et al. Gene 108: 193-200 (1991)), promotor LTR de RSV (Cullen, Methods in Enzymology 152: 684-704 (1987)), promotor SR \alpha (Takebe et al., Mol. Cell. Biol. 8: 466 (1988)), promotor precoz inmediato de CMV (Seed y Aruffo Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3365-3369 (1987)), promotor tardío de SV40 (Gheysen y Fiers J. Mol. Appl. Genet. 1: 385-394 (1982)), promotor tardío de adenovirus (Kaufman et al., Mol. Cell. Biol. 9: 946 (1989)), promotor TK de VHS, etc. Puede realizarse la transferencia de un gen foráneo en células animales para su expresión mediante cualquiera de los siguientes métodos, que incluyen el método de electroporación (Chu, G. et al., Nucl. Acid Res. 15: 1311-1326 (1987)), el método de fosfato de calcio (Chen, C. y Okayama, H. Mol. Cell. Biol. 7: 2745-2752 (1987)), el método de DEAE - dextrano (Lopata, M. A. et al. Nucl. Acids Res. 12: 5707-5717 (1984); Sussman, D. J. y Milman, G. Mol. Cell. Biol. 4: 1642-1643 (1985)), el método de lipofectina (Derijard, B. Cell. 7: 1025-1037 (1994); Lamb, B. T. et al. Nature Genetics 5: 22-30 (1993)), Rabindran, S. K. et al. Science 259: 230-234 (1993)), etc.

Una proteína de la presente invención puede expresarse como una proteína de fusión que tiene el sitio de reconocimiento para un anticuerpo monoclonal, introduciendo un sitio de reconocimiento (epítopo) para un anticuerpo monoclonal, del que se ha establecido la especificidad, en el extremo N- o C-terminal de la proteína de esta invención. Con este fin, puede utilizarse un sistema epítopo-anticuerpo comercial (Jikken Igaku (Experimental Medicine) 13: 85-90 (1995)). Hay vectores disponibles comercialmente que pueden expresar proteínas de fusión con \beta-galactosidasa, proteína de unión a maltosa, glutatión-S-transferasa, proteína verde fluorescente (GFP), etcétera, por medio del sitio de clonación múltiple.

Para minimizar la alteración de las propiedades de la proteína de esta invención debido a la formación en una proteína de fusión, se ha notificado un método para preparar una proteína de fusión introduciendo solamente una parte de epítopo pequeña que comprende de varios a 10 residuos de aminoácido. Por ejemplo, pueden utilizarse los epítopos de polihistidina (etiqueta de His), hemaglutinina de influenza (HA), c-myc humano, FLAG, glucoproteína del virus de la estomatitis vesicular (VSV-GP), proteína del gen 10 de T7 (etiqueta de T7), glucoproteína del virus del herpes simple humano (etiqueta de VHS), etiqueta de E (epítopo en el fago monoclonal), etcétera, y anticuerpos monoclonales para reconocer estos epítopos, como el sistema epítopo-anticuerpo para seleccionar proteínas que se unen a la proteína de esta invención (Jikken Igaku (Experimental Medicine) 13, 85-90 (1995)).

En la inmunoprecipitación, se forman inmunocomplejos añadiendo estos anticuerpos al lisado celular preparado usando tensioactivos adecuados. Este inmunocomplejo consiste en una proteína de esta invención, una proteína que puede unirse a la proteína, y un anticuerpo. También puede realizarse la inmunoprecipitación usando un anticuerpo frente a una proteína de esta invención además de anticuerpos frente a los epítopos descritos anteriormente. Puede prepararse un anticuerpo frente a una proteína de esta invención insertando un gen que codifica para una proteína de esta invención en un vector de expresión apropiado para E. coli para expresarlo en la bacteria, purificando la proteína así expresada e inmunizando conejos, ratones, ratas, cabras, pollos, etcétera, con la proteína purificada. También puede preparase el anticuerpo inmunizando los animales descritos anteriormente con péptidos parciales de la proteína de esta invención.

Pueden precipitarse los inmunocomplejos usando, por ejemplo, Sepharose de proteína A y Sepharose de proteína G en caso de que el anticuerpo sea un anticuerpo IgG murino. Además, en el caso de que la proteína de esta invención se prepare como proteína de fusión con el epítopo, por ejemplo, de GST, etcétera, puede formarse el inmunocomplejo usando una sustancia que se une específicamente a estos epítopos, tal como glutatión-Sepharose 4B, etcétera, dando el mismo resultado como en el caso en el que se usa el anticuerpo frente la proteína de esta invención.

La inmunoprecipitación, en general, puede llevarse a cabo según o siguiendo el método descrito en la bibliografía (Harlow, E. y Lane, D.: Antibodies, págs. 511-552, publicaciones de Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York (1988)).

Se usa generalmente SDS-PAGE para el análisis de proteínas inmunoprecipitadas, y pueden analizarse las proteínas unidas basándose en los pesos moleculares de las proteínas usando un gel de una concentración apropiada. En este caso, aunque las proteínas unidas a una proteína de esta invención, en general, son apenas detectables mediante el método de tinción de proteína habitual, tal como tinción de Coomassie y tinción con plata, puede mejorarse la sensibilidad de detección cultivando células en un medio que contiene ^{35}S-metionina y ^{35}S-cisteína marcadas con radioisótopo para marcar proteínas en el interior de las células, y detectando las proteínas marcadas. Una vez que se determina el peso molecular de la proteína, puede purificarse directamente la proteína deseada desde gel de poliacrilamida-SDS y secuenciarse.

Además, la selección de proteínas que se unen a una proteína de la presente invención también puede realizarse usando el método de transferencia de tipo West-western (Skolnik, E. Y. et al., Cell 65: 83-90 (1991)). Específicamente, se aísla ADNc a partir de células, tejidos y órganos (por ejemplo, tejido, célula o célula cultivada de corazón, placenta, testículo, timo, leucocito periférico, etc.) en los que se espera que se exprese la proteína que se une a la proteína de esta invención, y se transfiere a un vector de fago (por ejemplo, \lambdagt11, ZAPII, etc.), para preparar un biblioteca de ADNc, que se expresa entonces en placas recubiertas con un medio de crecimiento. Se fija la proteína así expresada en un filtro, que se hace reaccionar después con la proteína purificada, marcada de esta invención, y pueden detectarse por el marcaje placas que expresan proteínas unidas a la proteína de esta invención. Métodos para marcar una proteína de esta invención incluyen métodos que utilizan la actividad de unión de biotina y avidina, métodos que utilizan anticuerpos que se unen específicamente a la proteína de esta invención, o péptidos o polipéptidos (por ejemplo, GST, etc.) fusionados con la proteína de esta invención, métodos que utilizan los radioisótopos, métodos que utilizan fluorescencia, etc.

Además, se muestra a modo de ejemplo otro método de selección mediante un método que utiliza el sistema de 2 híbridos usando células (Fields, S., y Sternglanz, R., Trends. Genet. 10: 286-292 (1994); Dalton S, y Treisman R, "Characterization of SAP-1, a protein recruited by serum response factor to the c-fos serum response element". Cell 68: 597-612 (1992), "MATCHMARKER Two-Hybrid System", "Mammalian MATCHMARKER Two-Hybrid Assay Kit", "MATCHMARKER One-Hybrid System" (Clonetech); "HybriZAP Two-Hybrid Vector system" (Stratagene)). En el sistema de dos híbridos, puede fusionarse una proteína de la invención con el dominio de unión a ADN de SRF o GAL4, y expresarse en levadura. Se construye una biblioteca de ADNc a partir de células que se prevé que expresan proteínas que se unen a la proteína de la presente invención, en la que se construye la biblioteca de ADNc de tal modo que las proteínas se expresan como proteínas de fusión con regiones de activación de la transcripción de VP16. Se transfecta la biblioteca de ADNc en la levadura anterior, y entonces se detectan los clones positivos para aislar el ADNc derivado de la biblioteca (la expresión de una proteína que se une a la proteína de la invención en levadura conduce a la unión de las dos proteínas, y da como resultado en la activación del gen indicador, lo que permite detectar clones positivos). Puede obtenerse la proteína codificada por el ADNc aislado introduciendo el ADNc en E. coli y expresándolo en la misma. Por tanto, es posible preparar proteínas que se unen a una proteína de la invención y genes que codifican para las mismas. El gen indicador usado en el sistema de dos híbridos puede ser tal como HIS3, Ade2, LacZ, CAT, luciferasa o PAI-I (inhibidor del activador del plasminógeno tipo I), pero no se limita a los
mismos.

La selección de compuestos, que se unen a una proteína de esta invención, también puede llevarse a cabo usando cromatografía de afinidad. Por ejemplo, se inmoviliza la proteína de esta invención sobre un soporte en la columna de cromatografía de afinidad, a la que se aplica una muestra de prueba, que se espera que exprese una proteína que se une a la proteína de esta invención. Las muestras pueden ser extractos celulares, lisados celulares u otros. Tras aplicar la muestra de prueba, se lava la columna, y puede obtenerse la proteína que se une a la proteína de la invención.

Puede analizarse la proteína obtenida para su secuencia de aminoácidos para sintetizar sondas de oligonucleótido, que pueden usarse para examinar una biblioteca de ADNc para obtener un ADN que codifica para la proteína.

Puede usarse un biosensor que utiliza resonancia de plasmón de superficie para detectar o medir el compuesto unido. Tal sensor (como BIAcore (Pharmacia)) puede permitir observar la interacción en tiempo real usando una pequeña cantidad de proteína sin la necesidad de marcaje. Por tanto, es posible evaluar la interacción entre la proteína de la invención y muestras usando un biosensor tal como BIAcore.

Además, los compuestos que se unen a una proteína de la invención (incluyendo agonistas y antagonistas), compuestos que no siempre son proteínas, pueden aislarse usando una variedad de métodos conocidos para un experto en la técnica. Por ejemplo, puede fijarse y exponerse la proteína de la invención a compuestos sintéticos, un banco de compuestos naturales o una biblioteca de péptidos de fago aleatoria para seleccionar una molécula que se une a la proteína. Alternativamente, puede realizarse una selección de alto rendimiento usando química combinatoria (Wrighton NC, Farrel FX, Chang R, Kashyap AK, Barbone FP, Mulcahy LS, Johnson DL, Barrett RW, Jolliffe LK, Dower WJ., "Small peptides as potent mimetics of the protein hormone erythropoietin". Science (ESTADOS UNIDOS) 273: 458-464 (26 de Julio de 1996); Verdine G.L., "The combinatorial chemistry of nature". Nature (INGLATERRA) 384: 11-13 (7 de noviembre de 1996); Hogan JC Jr., "Directed combinatorial chemistry". Nature (INGLATERRA) 384: 17-9 (7 de noviembre de 1996)).

Puede realizarse la selección de un ligando que se une a una proteína de la invención tal como sigue. Se fusiona el dominio extracelular de la proteína de la invención con el dominio intracelular incluyendo el dominio transmembrana de una proteína receptora de hematopoyetina que tiene una capacidad de transducción de señal conocida para preparar un receptor quimérico. Puede expresarse el receptor quimérico sobre la superficie celular de una línea celular apropiada, favorablemente una línea celular que puede crecer solamente en presencia de un factor de crecimiento apropiado (línea celular dependiente de factor de crecimiento). Entonces, puede cultivarse la línea celular en medio complementado con un material de muestra en el que puede expresarse una variedad de factores de crecimiento, citocinas o factores hematopoyéticos. Según este método, la línea celular dependiente de factor de crecimiento solamente puede proliferar y sobrevivir cuando la muestra contiene un ligando apropiado que se une específicamente al dominio extracelular de la proteína de la invención. Puede usarse el receptor de hematopoyetina conocido, tal como receptor de trombopoyetina, receptor de eritropoyetina, receptor de G-SCF y gp130. La pareja para construir un receptor quimérico para el sistema de selección de la presente invención no se limita a los receptores anteriores siempre que su dominio intracelular proporcione una estructura necesaria para la actividad de transducción de señal. La línea celular dependiente de factor de crecimiento puede ser una línea celular dependiente de IL-3 tal como BaF3 o FDC-P1.

En un caso poco frecuente, el ligando que se une específicamente a una proteína de la invención puede no ser una proteína soluble sino una proteína unida a la membrana. En este caso, la selección puede realizarse usando una proteína que comprende solamente el dominio extracelular de la proteína de la invención, o una proteína de fusión en la que el dominio extracelular está unido a una parte de otras proteínas solubles. Tales proteínas se marcan antes de que se usen para medir la unión con las células que se espera que expresen el ligando. La primera proteína que comprende solamente el dominio extracelular puede ser una proteína receptora soluble construida artificialmente mediante la introducción de un codón de terminación en la región N-terminal del dominio transmembrana, o una proteína soluble tal como NR10.2. La segunda proteína de fusión puede ser una proteína en la que la región Fc de la inmunoglobulina G, o el péptido FLAG, está unido al extremo C-terminal del dominio extracelular. Estas proteínas solubles marcadas también pueden ser útiles para la detección mediante el método de tipo west-western.

Una proteína quimérica del dominio extracelular de una proteína de la invención y la región Fc de un anticuerpo (tal como IgG humana) puede purificarse usando una columna de proteína A. Tal proteína quimérica similar a anticuerpo conserva la capacidad de unión a ligando. Por tanto, la proteína puede marcarse apropiadamente con un isótopo, etcétera, y usarse para la selección de un ligando (Suda T. et al., Cell 175: 1169-1178 (1993)). Algunas citocinas tales como moléculas de la familia del TNF existen principalmente en una forma unida a la membrana, de modo que tales ligandos pueden aislarse exponiendo la proteína quimérica similar a anticuerpo a una variedad de células y seleccionando las células por la capacidad de unión a la proteína. Alternativamente, pueden aislarse ligandos según el mismo método usando células a las que se introduce una biblioteca de ADNc. Además, la proteína quimérica similar a anticuerpo también puede usarse como antagonista.

Los compuestos obtenidos mediante la selección anterior pueden ser un candidato para fármacos que activan o inhiben la actividad de una proteína de la invención. Puede ser posible usar tales compuestos para el tratamiento de enfermedades que surgen de la expresión anómala o trastorno funcional de una proteína de la presente invención. El compuesto obtenido usando el método de selección de la invención puede incluir compuestos resultantes de la modificación del compuesto que tienen la actividad para unirse a la proteína de la invención mediante la adición, deleción y/o sustitución de una parte de la estructura.

Cuando se usa el compuesto aislado o una proteína de la presente invención (tipo señuelo (forma soluble)) como producto farmacéutico para seres humanos y otros mamíferos, por ejemplo, ratones, ratas, cobayas, conejos, pollos, gatos, perros, ovejas, cerdos, ganado vacuno, monos, babuinos sagrados, chimpancés, el compuesto aislado puede administrarse directamente o puede formularse en una forma farmacéutica usando métodos de preparación farmacéuticos conocidos. Por ejemplo, según la necesidad, los fármacos pueden administrarse por vía oral, como comprimidos recubiertos de azúcar, cápsulas, elíxires y microcápsulas, o por vía parenteral, en forma de inyecciones de disoluciones estériles, suspensiones con agua o cualquier otro líquido farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, los compuestos pueden mezclarse con medio o vehículos farmacológicamente aceptables, específicamente, agua esterilizada, solución salina fisiológica, aceite vegetal, emulsionantes, disolventes, tensioactivos, estabilizantes, agentes aromatizantes, excipientes, vehículos, conservantes y aglutinantes, en una forma de dosis unitaria requerida para la aplicación de fármacos generalmente aceptada. La cantidad de principios activos en estas preparaciones hacen una dosificación adecuada que puede adquirirse dentro del intervalo indicado.

Los ejemplos de aditivos que pueden mezclarse con los comprimidos y las cápsulas son aglutinantes tales como gelatina, almidón de maíz, goma tragacanto y goma arábiga; excipientes tales como celulosa cristalina; agentes de hinchamiento tales como almidón de maíz, gelatina y ácido algínico; lubricantes tales como estearato de magnesio, edulcorantes tales como sacarosa, lactosa o sacarina; agentes aromatizantes tales como menta, aceite de Gaultheria adenothrix y cereza. Cuando la forma farmacéutica unitaria es una cápsula, también puede incluirse un vehículo líquido, tal como aceite, en los componentes anteriores. Los materiales compuestos estériles para inyecciones pueden formularse siguiendo aplicaciones de fármacos normales usando vehículos tales como agua destilada usada para las inyecciones.

Por ejemplo, pueden usarse solución salina fisiológica, glucosa y otros líquidos isotónicos incluyendo adyuvantes, tales como D-sorbitol, D-manosa, D-manitol y cloruro de sodio, como disoluciones acuosas para las inyecciones. Éstas pueden usarse conjuntamente con solubilizantes adecuados, tales como alcohol, específicamente etanol, polialcoholes tales como propilenglicol y polietilenglicol, tensioactivos no iónicos, tales como Polysorbate 80 (TM) y HCO-50.

Puede usarse aceite de sésamo o aceite de semilla de soja como líquido oleaginoso y puede usarse junto con benzoato de bencilo o alcohol bencílico como solubilizantes; puede formularse con un tampón tal como tampón fosfato y tampón acetato de sodio; un analgésico tal como clorhidrato de procaína; un estabilizante tal como alcohol bencílico, fenol; y un antioxidante. La inyección preparada se llena generalmente en una ampolla adecuada.

Pueden usarse métodos bien conocidos para un experto en la técnica para administrar el compuesto farmacéutico a los pacientes, por ejemplo, como inyecciones percutáneas, intravenosas, intraarteriales y también como administraciones orales, intramusculares, transbronquiales o intranasales. La dosificación y el método de administración varían según el peso corporal y la edad del paciente, el método de administración, etcétera, pero un experto en la técnica puede seleccionarlos adecuadamente. Si dicho compuesto puede codificarse por un ADN, dicho ADN puede insertarse en un vector para terapia génica para realizar la terapia. La dosificación y el método de administración varían según el peso corporal, la edad, los síntomas de un paciente, etcétera, pero un experto en la técnica puede seleccionarlos adecuadamente.

Por ejemplo, la dosis de la proteína (tipo señuelo (forma soluble)) puede variar dependiendo del paciente, el órgano diana, el tipo de enfermedad y el método de administración. Sin embargo, puede inyectarse a un adulto normal (peso corporal, 60 kg) a una dosis de 100 \mug a 10-20 mg al día.

Por ejemplo, aunque existen algunas diferencias según los síntomas, la dosis de un compuesto que se une con la proteína de la presente invención, o un compuesto que inhibe la actividad de la proteína de esta invención puede ser de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 100 mg al día, por ejemplo de aproximadamente 1,0 mg a aproximadamente 50 mg al día, o de aproximadamente 1,0 mg a aproximadamente 20 mg al día, cuando se administra por vía oral a un adulto normal (peso 60 kg).

Cuando la proteína se administra por vía parenteral en forma de una inyección a un adulto normal (peso 60 kg), aunque existen algunas diferencias según el paciente, el órgano diana, los síntomas y el método de administración, es conveniente inyectar por vía intravenosa una dosis de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 30 mg al día, por ejemplo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 20 mg al día, o de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10 mg al día. Además, en el caso de otros animales, es posible administrar una cantidad convertida a 60 kg de peso corporal o área superficial.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra la secuencia de nucleótidos de AQ022781 identificada en la base de datos gss. La secuencia de aminoácidos deducida se muestra debajo de la secuencia de exón prevista. Aparecen en un recuadro el motivo YR y el motivo WS que se usaron como diana. También aparecen en un recuadro dos "n" en la secuencia de nucleótidos.

La figura 2 muestra secuencias de aminoácidos parciales de NR10 encontradas en la secuencia de AQ022781, y aquellas de receptores de hematopoyetina conocidos que tienen homología con las mismas. Aparecen en un recuadro sombreado los residuos idénticos, y aparecen sombreados los residuos similares. Aparecen subrayados los espacios de huecos. Los receptores de hematopoyetina conocidos son, desde arriba, gp130 humano (número de registro de GenBank NM002184.1; IL6ST), receptor de LIF humano (número de registro de GenBank NM002310.1; LIFR), subunidad \beta del receptor de oncostatina M humano (número de registro de GenBank NM003999.1; OSMR), subunidad \beta2 del receptor de IL-12 humano (número de registro de GenBank NM001559.1; IL12RB2) y NR6 humano (número de registro de GenBank AC003112).

La figura 3 muestra la secuencia de nucleótidos del ADNc de NR10.1 de longitud completa que se obtuvo combinando los productos de 5'- y 3'-RACE. También se muestra la secuencia de aminoácidos deducida que codifica para NR10.1. Aparece subrayada la secuencia de aminoácidos que se prevé que es la secuencia señal de secreción. Aparece sombreado el dominio transmembrana previsto. Aparecen en un recuadro el motivo WS y los residuos de cisteína conservados.

La figura 4 es una continuación de la figura 3.

La figura 5 es una continuación de la figura 4.

La figura 6 muestra la secuencia de nucleótidos del ADNc de NR10.2 de longitud completa que se obtuvo combinando los productos de 5'- y 3'-RACE. También se muestra la secuencia de aminoácidos deducida que codifica para NR10.2. Aparece subrayada la secuencia señal de secreción prevista. Aparecen en un recuadro el motivo WS y los residuos de cisteína conservados.

La figura 7 es una continuación de la figura 6.

La figura 8 muestra fotografías que demuestran el resultado del análisis por RT-PCR del patrón de expresión del gen NR10.1 en órganos humanos.

La figura 9 muestra fotografías que demuestran el resultado del análisis por RT-PCR del patrón de expresión del gen NR10.2 en órganos humanos.

La figura 10 muestra una fotografía que demuestra el resultado de la cuantificación de la expresión del gen NR10.1 en órganos humanos mediante transferencia de tipo Southern.

La figura 11 muestra una fotografía que demuestra el resultado de la cuantificación de la expresión del gen NR10.2 en órganos humanos mediante transferencia de tipo Southern.

La figura 12 es una ilustración esquemática de la estructura de la proteína que va a expresarse del constructo de vector de expresión.

La figura 13 muestra la secuencia de nucleótidos del ADNc de NR10.3 de longitud completa. También se muestra la secuencia de aminoácidos deducida que codifica para NR10.3. Aparece subrayada la secuencia señal de secreción prevista. Aparece coloreada la secuencia de aminoácidos que se prevé que es el dominio transmembrana. Aparecen en un recuadro el motivo WS y los residuos de cisteína conservados.

La figura 14 es una continuación de la figura 13.

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Mejor modo para llevar a cabo la invención

Esta invención se explicará en detalle a continuación con referencia a los ejemplos.

Ejemplo 1 Aislamiento de los genes NR10.1 y NR10.2 (1) Búsqueda con BLAST

Los inventores tenían como objetivo encontrar otro motivo conservado entre la familia de receptores de hematopoyetina, además del motivo Trp-Ser-Xaa-Trp-Ser (motivo WS), con el fin de diseñar una sonda de oligonucleótido que incluyera ambos motivos juntos. Los inventores examinaron la secuencia de otras regiones para detectar otro motivo. Como resultado, se encontró un residuo de tirosina o histidina en el dominio extracelular de las proteínas de la familia, ubicado de 13 a 27 aminoácidos en el sentido de 5' del motivo WS, que se conserva con una alta frecuencia. Además, se examinó los seis residuos de aminoácido ubicados en el extremo C-terminal desde el residuo de Tyr/His para una secuencia consenso que aparece con una alta frecuencia, y se encontró la siguiente secuencia de aminoácidos: (Tyr/His)-Xaa-(hidrófobo/Ala)-(Gln/Arg)-hidrófobo-Arg (denominado el motivo YR en lo siguiente). Sin embargo, el motivo YR no se considera como una secuencia consenso perfecta, y además la combinación de las secuencias de nucleótidos que pueden codificar para el motivo es realmente complicada. Por tanto, parecía muy difícil sintetizar todas las secuencias de nucleótidos que codificaban para la secuencia de aminoácidos y proporcionarlas como la sonda para la hibridación, un método práctico de selección, o como el cebador para la RT-PCR.

Por consiguiente, los inventores examinaron en busca de un método específico de selección para un receptor de hematopoyetina novedoso usando los motivos anteriores como la sonda. Como resultado, se consideró razonable realizar una búsqueda informática en bases de datos usando una consulta compuesta por una secuencia de aminoácidos parcial de receptores de hematopoyetina conocidos, un fragmento que incluía ambos motivos.

En primer lugar, se diseñaron las secuencias de aminoácidos que cumplían la condición necesaria de contener ambos motivos para preparar una consulta para la búsqueda en bases de datos. Aunque la familia de receptores contiene normalmente un espaciador de 7 a 10 aminoácidos entre los motivos, se fijó el espaciador en 10 aminoácidos tomando el promedio. Se esperaba que, incluso si la longitud del espaciador en los genes dianas era diferente de la misma en la consulta, el hueco se llenaría mediante un espacio de modo que no interfiriera en la búsqueda. Además, se minimizó el número de residuos indeterminados de manera que aumentara la calidad de la secuencia y mejorara la sensibilidad de detección. Por tanto, basándose en la secuencia que aparecía frecuentemente en receptores de hematopoyetina conocidos, se diseñaron provisionalmente tres patrones para el motivo YR, dos residuos en ambos extremos del espaciador, y los residuos en el centro y el extremo C-terminal del motivo WS, respectivamente, según la tabla 1.

TABLA 1

1

Combinando el motivo YR, el espaciador y el motivo WS descritos en la tabla 1 resultan 27 consultas diferentes. Se usaron las consultas para buscar la base de datos nr en GenBank usando el programa TblastN (Advanced TblastN 2.0.8). Se establecieron los parámetros de búsqueda como valor esperado = 100, descripciones = 100 y alineaciones = 100. Como resultado, muchos de los receptores de hematopoyetina conocidos se identificaron como positivos, confirmando que el método estaba funcionando correctamente. Entonces, se usaron las mismas consultas para buscar en la base de datos de EST así como en la base de datos de gss y htgs con el fin de detectar una secuencia que pudiera codificar para un receptor de hematopoyetina novedoso. Sin embargo, el resultado no produjo clones positivos que parecieran novedosos. Se consideró que la variedad limitada de las 27 consultas mencionadas anteriormente es la causa del resultado. Por consiguiente, se intentó una preparación adicional de una variedad de secuencias para la consulta, pero la combinación de la secuencia se volvió demasiada complicada para continuar la preparación manualmente. Después de todo, los inventores decidieron usar secuencias de aminoácidos parciales de receptores de hematopoyetina conocidos que se fragmentaron de manera que se incluyeran ambos de los motivos YR y WS con el fin de preparar una consulta para la búsqueda en bases de datos.

La comparación de la estructura genómica de la familia de receptores reveló que los motivos YR y WS están contenidos dentro de un solo exón en todos los receptores de hematopoyetina conocidos examinados. Esto sugiere que la continuidad y la compatibilidad de ambos motivos puede conservarse también en la secuencia genómica. Por tanto, se esperaba que el exón de un receptor de hematopoyetina conocido que codificase para ambos motivos fuera eficaz como la consulta para buscar el gen diana en la base de datos de EST, y la base de datos genómica también. En el presente documento, se usaron las secuencias de receptor de LIF humano y gp130 humano como la secuencia de receptor de hematopoyetina conocido, porque sus estructuras tienen una similitud relativamente alta entre la familia de receptores, y se espera que la similitud se comparta en el receptor diana novedoso. Aunque ya se conocían las secuencias de receptor de LIF humano y gp130 humano, los inventores usaron la secuencia de aminoácidos codificada por el ADNc que los propios inventores habían aislado usando hibridación de placas de lisis y RT-PCR con una sonda que codificaba para el motivo WS.

Basándose en la estructura genómica, se conoce que los receptores de hematopoyetina deben contener un exón que codifica para los motivos YR y WS que tiene una longitud de 50 a 70 aminoácidos. Por consiguiente, 29 aminoácidos hacia el extremo N-terminal y 30 aminoácidos hacia el extremo C-terminal desde el primer residuo de Tyr en el motivo YR, un total de 60 aminoácidos se cortaron de la secuencia de de receptor de LIF humano y gp130 humano para preparar una consulta por motivos de conveniencia. El receptor de LIF contiene dos motivos WS, y se seleccionó el segundo motivo WS (en el lado C-terminal) teniendo en cuenta la conservación del motivo YR. Se usaron las consultas anteriores para buscar en la base de datos de gss (Genomic Survey Sequence, secuencia de la encuesta sobre el genoma) y htgs en GenBank usando TblastN (Advanced TblastN 2.0.8). Se establecieron los parámetros como valor esperado = 50, descripciones = 100 y alineaciones = 100.

La longitud de la secuencia consulta seleccionada, 60 aminoácidos, no era exactamente la misma que la de la secuencia del exón real. Sin embargo, teniendo en cuenta que la longitud de este exón en genes de receptores de hematopoyetina conocidos difiere algo según cada gen, y tomando en gran consideración la conservación de los dos motivos YR y WS como el índice, se decidió que la diferencia no puede interferir con la búsqueda. Se usó la base de datos de gss y htgs porque no se habían analizado completamente estas secuencias genómicas debido a su complejidad, y por tanto, se esperaba que fuesen adecuadas para identificar genes de receptores novedosos. Dado que las consultas eran más largas que las 27 consultas artificiales previas, se establecieron los parámetros "valor esperado = 50, descripciones = 100 y alineaciones = 100" para reducir la sensibilidad de detección de manera que se evitara un aumento de clones falsos positivos que tienen homología con una región que no sean los motivos. Por tanto, se esperaba que esto permitiera la detección de genes diana suprimiendo la detección de tales clones falsos positivos que mostraban homología en secuencias que no fueran la secuencia del motivo diana.

Como resultado, la búsqueda dio como resultado muchas coincidencias de clones falsos positivos, y se descartaron aquellos clones en los que no se codificaban los dos motivos YR y WS en el mismo marco de lectura, o que contenían un codón de terminación entre los motivos. También, se descartaron aquellos clones que contenían sólo el motivo YR pero no el motivo WS, porque, tal como se mencionó anteriormente, el motivo YR no es una secuencia consenso completamente establecida. Por tanto, se consideraba predominante la conservación del motivo WS. Como resultado, se seleccionó un único clon que contenía la secuencia genómica humana (n.º de registro de GenBank AQ022781) que se esperaba que codificase para una parte de un gen de receptor de hematopoyetina novedoso, y el gen se denominó NR10.

AQ022781 es la secuencia terminal de un clon de BAC que consiste en 459 pb, depositado en la base de datos de gss. Era el único clon que también era positivo en ambas búsquedas usando secuencias de aminoácidos parciales de receptor de LIF o gp130 humano como la consulta respectivamente. Se presumía que la fiabilidad de la secuencia podía ser baja debido a la existencia de dos "n" en la mitad y la naturaleza del sistema de depósito de la secuencia de la encuesta sobre el genoma. No obstante, tal como se muestra en la figura 1, una secuencia consenso de corte y empalme puede reconocerse como la secuencia "ag" tras la secuencia rica en "c/t" en las bases 175 a 218, y era previsible que contenga un exón que comienza en "atg" tras la secuencia consenso de corte y empalme. Entonces, se usó la secuencia de exón prevista para buscar en la base de datos nr en GenBank usando BlastX (Advanced BlastX 2.0.8). Los resultados revelaron que el exón tiene homología con muchos genes de receptores de hematopoyetina conocidos tal como se muestra en la figura 2. El resultado fue: (1) AQ022781 contiene un motivo YR, secuencia [YVIALR], y que conservó un motivo WS completo, secuencia [WSDWS]; (2) que muestra homología con varios receptores de hematopoyetina conocidos, y (3) los dos residuos de Ser en el motivo WS están codificados por AG(C/T). Y por tanto, se predijo que el gen podía codificar para un gen de receptor de hematopoyetina novedoso. El codón para Ser en el motivo WS es generalmente AG(C/T) en la mayoría de receptores de hematopoyetina conocidos, pero TNC codifica para el segundo residuo de Ser en el receptor de EPO, el receptor de TPO y el receptor de IL-6 de ratón. En efecto, en la mayoría de los clones falsos positivos que contenían por casualidad una secuencia similar al motivo WS, TCN codificaba en su mayoría para la segunda Ser. Por tanto, podía usarse el residuo de Ser codificado por el codón AG(C/T) como marcador para la selección de clones positivos. Por consiguiente, se diseñaron cebadores de oligonucleótidos específicos a partir de la secuencia de exón prevista en AQ022781, y se usaron para el método de 3'-RACE y 5'-RACE como a continuación.

(2) Diseño de cebadores de oligonucleótidos

Tal como se describió en (1), se predijeron los sitos de exón en las secuencias AQ022781, y se usaron estas secuencias para diseñar los siguientes cebadores de oligonucleótidos específicos para NR10. Se sintetizaron tres cebadores sentido (NR10-S1, NR10-S2 y NR10-S3; orientados en el sentido de 3') y tres cebadores antisentido (NR10-A1, NR10-A2 y NR10-A3; orientados en el sentido de 5') usando el sintetizador de ADN/ARN ABI 394 en condiciones para unir un grupo tritilo al extremo terminal 5'. Entonces, se purificaron los productos usando una columna OPC (ABI n.º 400771) para obtener cebadores de longitud completa.

NR10-S1: 5'-ATG GAA GTC AAC TTC GCT AAG AAC CGT AAG-3'

(SEQ ID NO: 5)

NR10-S2: 5'-CCA AAC GTA CAA CCT CAC GGG GCT GCA ACC-3'

(SEQ ID NO: 6)

NR10-S3: 5'-GTC ATA GCT CTG CGA TGT GCG GTC AAG GAG-3'

(SEQ ID NO: 7)

NR10-A1: 5'-agt agc ttg cgT TCT TCC TCA GCT ATT CCC-3'

(SEQ ID NO: 8)

NR10-A2: 5'-CTT TGA CTC CTT GAC CGC ACA TCG CAG AGC-3'

(SEQ ID NO: 9)

NR10-A3: 5'-GGT TGC AGC CCC GTG AGG TTG TAC GTT TGG-3'

(SEQ ID NO: 10)

La "n" en la posición 376 en la secuencia AQ022781 (figura 1) se asignó que era la base "c" para designar las secuencias de los cebadores anteriores, y por tanto, se designó como "g" la base correspondiente en la posición 11 en la secuencia del cebador NR10-A1. Según el análisis de la secuencia consenso para el corte y empalme del exón mínimo en la secuencia AQ022781 se predijo que comenzaba desde la base "a" en la posición 211 hasta la base "c" en la posición 399, empezando el intrón desde la siguiente secuencia "gt". Sin embargo, el análisis de los productos de 3'-RACE, tal como se describe más adelante, reveló que el intrón comienza desde la base "n" en la posición 376 o desde la base "g" en la posición 377. Por tanto, como resultado, las 11 bases mostradas en letras minúsculas de la secuencia del cebador NR10-A1 anterior no pueden unirse correctamente durante la PCR, mientras que la secuencia correspondiente no se transcribe en ARNm. Sin embargo, las reacciones de PCR avanzaron correctamente, probablemente porque las otras 19 bases, las secuencias del extremo terminal 3', pudieron hibridarse específicamente.

(3) Clonación del ADNc del extremo C-terminal mediante el método de 3'-RACE

Con el fin de aislar el ADNc de longitud completa de NR10, se realizó una 3'-RACE-PCR usando los cebadores NR10-S1 y NR10-S2 descritos en (2) para la PCR primaria y secundaria, respectivamente. Se realizó el experimento de PCR usando una biblioteca de ADNc Marathon-Ready de hígado fetal humano (Clontech n.º 7403-1) como el molde, y la mezcla de ADNc polimerasa Advantage (Clontech n.º 8417-1) en un termociclador (Gene Amp PCR System 2400 de Perkin Elmer). En las siguientes condiciones, como resultado, se obtuvieron productos de PCR que mostraban dos tamaños diferentes por corte y empalme alternativos.

Las condiciones de la PCR primaria fueron las siguientes: un único ciclo de "94ºC durante 4 min.", 5 ciclos de "94ºC durante 20 s y 72ºC durante 100 s", 5 ciclos de "94ºC durante 20 s y 70ºC durante 100 s", 28 ciclos de "94ºC durante 20 s y 68ºC durante 100 s", un único ciclo de 72ºC durante 3 min., y terminación a 4ºC.

Las condiciones de la PCR secundaria fueron las siguientes: un único ciclo de "94ºC durante 4 min.", 5 ciclos de "94ºC durante 20 s y 70ºC durante 100 s", 25 ciclos de "94ºC durante 20 s y 68ºC durante 100 s", un único ciclo de 72ºC durante 3 min., y terminación a 4ºC.

Se obtuvieron dos productos de amplificación mediante la PCR y se subclonaron ambos en el vector pGEM-T Easy (Promega n.º A1360), y se determinaron las secuencias de nucleótidos. Se realizó la transformación del producto de PCR en el vector pGEM-T Easy usando ADN ligasa de T4 (Promega n.º A1360) en una reacción de 12 h a 4ºC. Se obtuvieron productos recombinantes de los productos de PCR y el vector pGEM-T mediante la transformación de la cepa DH5\alpha de E. coli (TOYOBO n.º DNA-903). Se seleccionaron los productos recombinantes usando Insert Check Ready Blue (TOYOBO n.º PIK-201). Se determinaron las secuencias de nucleótidos usando el kit de reacción BigDye Terminator Cycle Sequencing SF Ready (ABI/Perkin Elmer nº. 4303150) y analizando con el secuenciador de ADN ABI PRISM 377. Se determinaron las secuencias de nucleótidos del fragmento de inserción completo de seis clones independientes. Como resultado, se dividieron en dos grupos, cada uno compuesto por 3 clones, basándose en la diferencia de longitud y secuencia de los pares de bases. Se confirmó que la diferencia del producto resultaba del corte y empalme alternativos, y las dos secuencias obtenidas son secuencias de nucleótidos parciales de NR10. El clon de ADNc que posiblemente codificaba para el ORF largo incluyendo la región transmembrana se denominó NR10.1, y el otro que posiblemente codificaba para un ORF corto sin la región transmembrana se denominó NR10.2.

(4) Clonación del ADNc N-terminal mediante 5'-RACE

Con el fin de aislar el ADNc de longitud completa de NR10, se realizó una 5'-RACE-PCR usando los cebadores NR10-A1 y NR10-A2 del ejemplo 2 para la PCR primaria y secundaria, respectivamente. Como en 3'-RACE, se realizó el experimento de PCR usando la biblioteca de ADNc Marathon-Ready de hígado fetal humano como el molde, y la mezcla de ADNc polimerasa Advantage en un termociclador (Gene Amp PCR System 2400 de Perkin Elmer). En las mismas condiciones descritas en (3), se obtuvieron productos de PCR de tres tamaños diferentes. Se subclonaron los tres productos en el vector pGEM-T Easy tal como se describió anteriormente para determinar la secuencia de nucleótidos. Se realizó la transformación de los productos de PCR en el vector pGEM-T Easy usando ADN ligasa de T4 en una reacción durante 12 h a 4ºC. Se obtuvieron los productos recombinantes de los productos de PCR y el vector pGEM-T mediante la transformación de la cepa DH5\alpha de E. coli y se realizó la selección de los productos recombinantes usando Insert Check Ready Blue tal como se describió anteriormente. También se determinaron las secuencias de nucleótidos tal como anteriormente usando el kit de reacción BigDye Terminator Cycle Sequencing SF Ready y el secuenciador de ADN ABI PRISM 377 para el análisis. Los resultados revelaron que los tres productos de 5'-RACE obtenidos con diferentes tamaños se derivaron del mismo transcrito de ARNm. La diferencia de tamaño se debió a una reacción de extensión incompleta en el 5'-RACE y se negó la posibilidad de que fuesen derivados de corte y empalme alternativos. Aunque, ni siquiera el clon de ADNc con el producto de extensión más largo entre los tres productos de 5'-RACE contenía el extremo terminal 5' de la secuencia de longitud completa. Además, otro intento usando los cebadores NR10-A2 y NR10-A3 de (2) para la PCR primaria y secundaria, respectivamente, terminó con un resultado similar. Por consiguiente, con el fin de realizar otra reacción de elongación mediante 5'-RACE, se diseñaron nuevos cebadores de oligonucleótidos próximos al extremo N-terminal de la secuencia de nucleótidos obtenida. Se prepararon según el ejemplo 2, dos cebadores antisentido, NR10-A4 y NR10-A5 (orientación en el sentido de 5') como a continuación.

NR10-A4: 5'-ATC AGA TGA AAC AGG CGC CAA CTC AGG-3'

(SEQ ID NO: 11)

NR10-A5: 5'-TGG TTT CAC ACG GAA AAT CTT AGG TGG-3'

(SEQ ID NO: 12)

Tal como se describió anteriormente, se realizó una 5'-RACE-PCR usando la biblioteca de ADNc Marathon-Ready de hígado fetal humano como el molde, y el cebador NR10-A4 y NR10-A5 para la PCR primaria y secundaria, respectivamente. Las condiciones para la PCR, el método de subclonación y el método para determinar la secuencia de nucleótidos fueron tal como se describieron en (3). Sin embargo, los resultados de la determinación de la secuencia revelaron que se obtuvieron de nuevo sólo productos de elongación incompletos, en los que la reacción de extensión se detuvo en el mismo sitio que mediante la 5'-RACE-PCR usando los cebadores NR10-A1, NR10-A2 y NR10-A3 anteriores. Era posible que el ARNm de NR10 adopte una conformación terciaria en esa posición de modo que bloquea la síntesis de la cadena de ADNc primaria. También existe la posibilidad de que la secuencia de nucleótidos de la región en el sentido de 5' desde esa posición pudiera tener un alto contenido en G/C, lo que podría bloquear la reacción de PCR. De cualquier modo, podría ser el caso de que la calidad de la biblioteca usada para preparar la biblioteca de ADNc pudiera haber sido baja. Por consiguiente, se sustituyó el molde para la PCR por la biblioteca de ADNc Marathon-Ready de placenta humana (Clontech n.º 7411-1) tal como se describe a continuación. Se eligió este material derivado de placenta humana de acuerdo con el resultado de la distribución tisular del gen NR10 mediante el análisis por RT-PCR descrito más adelante.

(5) Clonación del ADNc N-terminal a través de extensión continua mediante 5'-RACE

Para aislar la secuencia N-terminal de un clon de ADNc correspondiente al NR10 de longitud completa, se realizó una 5'-RACE-PCR usando los cebadores NR10-A4 y NR10-A5 de (4) para la PCR primaria y secundaria, respectivamente. Se usó la biblioteca de ADNc Marathon-Ready de placenta humana como el molde debido a los motivos mencionados anteriormente. Se usó la mezcla de ADNc polimerasa Advantage en el experimento de PCR. Se llevó a cabo la 5'-RACE-PCR usando el termociclador Gene Amp PCR System 2400 de Perkin Elmer en las siguientes condiciones para obtener un producto de PCR de tamaño único.

Las condiciones para la PCR primaria fueron las siguientes: un único ciclo de "94ºC durante 4 min.", 5 ciclos de "94ºC durante 20 s y 72ºC durante 2 min.", 5 ciclos de "94ºC durante 20 s y 70ºC durante 2 min.", 28 ciclos de "94ºC durante 20 s y 68ºC durante 90 s", un único ciclo de 72ºC durante 3 min., y terminación a 4ºC.

Las condiciones para la PCR secundaria fueron las siguientes: un único ciclo de "94ºC durante 4 min.", 5 ciclos de "94ºC durante 20 s y 70ºC durante 90 s", 25 ciclos de "94ºC durante 20 s y 68ºC durante 90 s", un único ciclo de 72ºC durante 3 min., y terminación a 4ºC.

Se subclonó el producto de PCR obtenido en el vector pGEM-T Easy tal como se describió en el ejemplo 3, y se determinó la secuencia de nucleótidos. Las secuencias de nucleótidos del fragmento de inserción completo de 4 clones independientes de productos transformantes revelaron que los clones contienen la secuencia N-terminal del clon de ADNc de NR10 de longitud completa. Entonces, se combinaron la secuencia de nucleótidos determinada mediante la 5'-RACE-PCR y las determinadas mediante 3'-RACE en (3) para obtener finalmente la secuencia de nucleótidos de longitud completa del ADNc de NR10.1 y NR10.2 de longitud completa. La secuencia de nucleótidos determinada para el ADNc de NR10.1 (SEQ ID NO: 1) y la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia (SEQ ID NO: 2) se muestran en las figuras 3 a 5. La secuencia de nucleótidos determinada para el ADNc de NR10.2 (SEQ ID NO: 3) y la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia (SEQ ID NO: 4) se muestran en las figuras 6 y 7.

Según la determinación de la secuencia de nucleótidos de longitud completa del ADNc de NR10, se reveló que la "n" en la posición 281 de AQ022781 (figura 1) era en realidad "t". Mientras que, no se determinó la "n" en la posición 376 puesto que el intrón comienza desde la base cerca de esta "n". Sin embargo, independientemente del nucleótido que se usara para sustituir la "n" en la posición 376, la secuencia no proporcionó una secuencia consenso para el corte y empalme (ag/gtaag, etc.). Considerando las características de la información de la base de datos de gss, se presumía que la secuencia [ag/gcaag] cerca de la "n" en la posición 376 era en realidad [ag/gtaag]. La determinación de la secuencia de nucleótidos de longitud completa de NR10.1 y NR10.2 reveló que estos dos genes están conectados a un exón diferente en el sitio de corte y empalme recóndito objeto a través de corte y empalme alternativos, y el extremo C-terminal después de eso codificaba para secuencias de aminoácidos diferentes. Su estructura primaria indica que NR10.1 puede codificar para una proteína receptora de hematopoyetina de tipo transmembrana que consiste en 652 aminoácidos, y que NR10.2 puede codificar para una proteína similar a receptor del tipo de secreción soluble que consiste en 252 aminoácidos. Las características estructurales de estos NR10 son las siguientes:

En primer lugar, se prevé que la secuencia desde la 1ª Met hasta la 32ª Ala en el dominio extracelular común de NR10.1 y NR10.2 es la secuencia señal de secreción habitual. En el presente documento, se presume que la 1ª Met es el sitio de inicio de la traducción porque allí existe un codón de terminación en el marco en la posición (-2). A continuación, existe un dominio de unión a ligando habitual, en la región desde la 43ª Cys hasta la 53ª Cys o el 55º residuo de Trp. Además, la 81ª y la 94ª Cys corresponden a la conformación de repetición de residuos de Cys bien conservada entre otra familia de receptores de hematopoyetina. Además, se conserva una región rica en Pro (motivo PP-W) que empieza en los residuos de Pro consecutivos en las posiciones 137 y 138 hasta el 157º residuo de Trp, y los residuos desde la 210ª Tyr hasta la 215ª Arg corresponden al motivo YR anterior. También se encuentra un caja de WSXWS (motivo WS) habitual en los residuos desde el 224º Trp hasta la 228ª Ser.

El marco de lectura abierto (ORF) de NR10.2 codifica para 24 aminoácidos desde la secuencia WSXWS y termina en el codón de terminación posterior. Por tanto, codifica para una proteína similar al receptor de hematopoyetina soluble sin una región transmembrana. Por otro lado, el ORF de NR10.1 contiene un dominio transmembrana habitual de 24 aminoácidos desde el 533º residuo de Ile hasta el 556º residuo de Leu tras los motivos anteriores. Además, el dominio intracelular adyacente al dominio transmembrana contiene residuos de Pro en las posiciones 571 y 573, que corresponden a la secuencia consenso de la caja 1 (motivo PXP) bien conservada entre otros receptores de hematopoyetina y se considera que está implicada en la transducción de señales. Estas características anteriores confirman que el gen NR10 codifica para una proteína receptora de hematopoyetina novedosa.

Ejemplo 2 Determinación de la distribución tisular y análisis del patrón de expresión del gen NR10 mediante RT-PCR

Se detectó el ARNm usando el método de RT-PCR para analizar la distribución de la expresión y los patrones de expresión del gen NR10.1 y NR10.2 en diferentes órganos humanos. Se sintetizaron los cebadores de oligonucleótidos con las siguientes secuencias para el análisis por RT-PCR. Se usó el cebador NR10-S0 como cebador sentido (orientación en el sentido de 3'), y se usaron los cebadores NR10.1-A0 y NR10.2-A0 como cebadores antisentido (orientación en el sentido de 5'). Se sintetizaron los cebadores y se purificaron tal como se describió en el ejemplo 2. Mientras que se diseñó NR10-S0 de manera que correspondiera a secuencias comunes de NR10.1 y NR10.2, se diseñaron NR10.1-A0 y NR10.2-A0 según secuencias específicas de NR10.1 y NR10.2, respectivamente.

hNR10-S0: 5'-GCA TTC AGG ACA GTC AAC AGT ACC AGC-3'

(SEQ ID NO: 13)

hNR10.1-A0: 5'-AGC TGG AAT CCT CAG GGT GGC CAC TGG-3'

(SEQ ID NO: 14)

hNR10.2-A0: 5'-GCC CAT CAC CAG AGT AGA CAG GAC GGG-3'

(SEQ ID NO: 15)

Los moldes usados eran el panel I de ADNc de tejido múltiple (MTC) humano (Clontech n.º K1420-1), el panel II de MTC humano (Clontech n.º K1421-1), el panel de MTC de sistema inmunitario humano (Clontech n.º K1426-1) y el panel de MTC fetal humano (Clontech n.º K1425-1). Se realizó la PCR usando la mezcla de ADNc polimerasa Advantage (Clontech n.º 8417-1) en un termociclador (Gen Amp PCR System 2400 de Perkin Elmer). Se usaron NR10-S0 y NR10.1-A0 por parejas para la detección de NR10.1. Para la detección de NR10.2, se usó el conjunto de cebadores [NR10-S0 y NR10.2-A0]. Se realizó la PCR mediante las siguientes condiciones para amplificar el gen diana: un único ciclo de "94ºC durante 4 min.", 5 ciclos de "94ºC durante 20 s y 72ºC durante 1 min.", 5 ciclos de "94ºC durante 20 s y 70ºC durante 1 min.", 25 ciclos de "94ºC durante 20 s y 68ºC durante 1 min.", un único ciclo de 72ºC durante 3 min. y terminación a 4ºC.

Tal como se muestra en la figura 9, el resultado fue que se detectó la expresión génica constitutiva de NR10.2 a un nivel casi constante en todos los ARNm derivados de tejidos y órganos humanos examinados. Por el contrario, tal como se muestra en la figura 8, se detectó la expresión del gen NR10.1 en tejidos u órganos limitados, y su nivel de expresión varió significativamente. Realizando la PCR usando cebadores de G3PDH humanos en las condiciones anteriores y detectando la expresión del gen de mantenimiento G3PDH, se confirmó que se había normalizado el número de copias de ARNm entre el ARNm molde. Se halló la expresión del gen NR10.1 en órganos tal como sigue: en adulto humano, se expresó fuertemente en corazón, placenta, testículo, timo y leucocitos periféricos, mientras que se detectó una débil expresión en bazo, médula ósea, próstata, ovario, páncreas y pulmón; en feto humano, se detectó una fuerte expresión en músculo esquelético, timo, corazón y riñón, mientras que se detectó una débil expresión en pulmón, hígado y bazo. Por otro lado, no pudo detectarse la expresión en cerebro, músculo esquelético, riñón, intestino delgado o colon en adulto humano, ni en cerebro fetal.

El tamaño del producto de amplificación por PCR fue de 480 pb y 243 pb para NR10.1 y NR10.2, respectivamente, lo que concordaba con los tamaños calculados a partir de las secuencias de nucleótidos determinadas. Por tanto, se consideraron que los productos eran productos de la reacción de amplificación de PCR específica. Esto se confirmó además mediante transferencia de tipo Southern como a continuación, y se negó la posibilidad de que fueran productos de amplificación de PCR no específica.

Debido al hecho de que se detectó principalmente una fuerte expresión del gen NR10.1 en aquellos órganos que contienen células responsables de la inmunidad y células hematopoyéticas, y considerando la distribución de la expresión génica de NR10.1, se sugirió fuertemente la posibilidad de que NR10 funciona como un receptor de hematopoyetina novedoso. Adicionalmente, el hecho de que la expresión también se distribuyó entre células del sistema genital y el sistema endocrino así como en el corazón sugirió que NR10 podría regular no sólo el sistema inmunitario y el sistema hematopoyético sino también diversas funciones fisiológicas en el organismo además.

El hecho de que la expresión de NR10.2 se detectara en todos los órganos indica la posibilidad de que las células que constituyen los órganos objeto del análisis producen una proteína de tipo secretora activa. Es posible que la expresión del gen NR10 esté regulada estrictamente en poblaciones celulares o tejidos particulares a través de la regulación transcripcional y el corte y empalme alternativos que determinan la especificidad funcional de estos tejidos y células.

Ejemplo 3 Verificación de la especificidad de los productos de PCR mediante transferencia de tipo Southern

Con el fin de verificar la especificidad de la amplificación, se sometió al producto del gen diana amplificado por RT-PCR a transferencia de tipo Southern usando fragmentos de ADNc específicos para NR10.1 y NR10.2, respectivamente, como sonda. Al mismo tiempo, se detectó cuantitativamente la cantidad del producto de RT-PCR para evaluar los niveles relativos de expresión génica entre diferentes órganos humanos. Se sometió a electroforesis el producto de RT-PCR en un gel de agarosa, se sometió a inmunotransferencia sobre una membrana de nailon cargada (Hybond N (+), Amersham n.º de cat. RPN303B), y se sometió a hibridación. Se usaron los fragmentos de ADNc de NR10.1 y NR10.2 obtenidos en el ejemplo 3 como sondas específicas para los respectivos genes. Se prepararon las sondas usando el kit Mega Prime (Amersham n.º de cat. RPN 1607), y se marcaron con el radioisótopo, [\alpha-^{32}P]-dCTP (Amersham n.º de cat. AA0005). Se realizó la hibridación usando la disolución de hibridación Express (Clontech n.º 8015-2), y tras la prehibridación a 68ºC durante 30 min., se añadió la sonda marcada desnaturalizada por calor para llevar a cabo la hibridación a 68ºC durante 120 min. Tras el lavado posterior en (1) 1x SSC/SDS al 0,1% a temperatura ambiente durante 5 min., (2) 1x SSC/SDS al 0,1% a 50ºC durante 30 min., y (3) 0,1x SSC/SDS al 0,1% a 50ºC durante 30 min., se expuso la membrana a una placa de formación de imágenes (FUJI n.º BAS-III), y se detectó la señal específica de NR10 usando el analizador de imágenes (FUJIX, BAS-2000 II).

Los resultados detectados para NR10.1 y NR10.2 se muestran en las figuras 10 y 11, respectivamente. Se verificó el producto amplificado en la RT-PCR previa como productos de amplificación específicos de los respectivos genes. Además, el resultado de la cuantificación del nivel relativo de expresión entre cada uno de los tejidos respaldó la evaluación mencionada anteriormente. Se conoce que el método de detección para la expresión del gen diana usando RT-PCR y transferencia de tipo Southern en combinación tiene una sensibilidad extremadamente alta en comparación con otros métodos para el análisis de la expresión. No obstante, no se detectó la expresión de NR10.1 en el sistema neuronal tal como cerebros fetal y de adulto, en tejidos digestivos de adulto. Además, no se detectó expresión en riñón o músculo esquelético de adulto, en los que se reconoció una fuerte expresión en el feto.

Ejemplo 4 Análisis por transferencia de tipo Northern de la expresión del gen NR10

Se realizó el análisis por transferencia de tipo Northern de la expresión del gen NR10 para examinar el patrón de expresión del gen NR10 en órganos humanos y líneas celulares tumorales humanas, y para determinar el tamaño de los transcritos de NR10. Además, se examinó la posibilidad de si existían variantes de corte y empalme diferentes de NR10.1 o NR10.2. Se usaron la transferencia de tipo Northern de tejido múltiple (MTN) humano (Clontech n.º 7760-1), la transferencia de MTN humano II (Clontech n.º 7759-1), la transferencia de MTN humano III (Clontech n.º 7767-1) y la transferencia de MTN de línea celular de cáncer humano (Clontech n.º 7757-1).

Se usaron los fragmentos de ADNc obtenidos mediante 5'-RACE en el ejemplo 1 (5) como las sondas. Se prepararon las sondas tal como se describió en el ejemplo 3, usando el kit Mega Prime, y se marcaron con [\alpha-^{32}P]-dCTP. Se realizó la hibridación usando la disolución de hibridación Express, y tras la prehibridación a 65ºC durante 30 min., se añadieron las sondas desnaturalizadas por calor para llevar a cabo la hibridación a 65ºC durante 16 h. Tras el lavado posterior en (1) 1x SSC/SDS al 0,1% a temperatura ambiente durante 5 min., (2) 1x SSC/SDS al 0,1% a 48ºC durante 30 min., y (3) 0,5x SSC/SDS al 0,1% a 48ºC durante 30 min., se expuso la membrana a una placa de formación de imágenes tal como se describió anteriormente, y se hizo el intento de detectar la señal específica de NR10 usando el analizador de imágenes.

El método, inesperadamente, no logró detectar ninguna señal en ninguno de los órganos humanos examinados. Esto pudo deberse a que la transferencia de tipo Northern tiene una sensibilidad significativamente menor que la RT-PCR y por tanto no logró detectar el ARNm con un bajo nivel de expresión.

Ejemplo 5 Selección de placas de lisis

El procedimiento anterior utilizó clonación por PCR para obtener el ADNc de longitud completa del gen NR10. Siempre existe la posibilidad de que se introduzca una mutación puntual en el producto mediante la clonación por PCR. Por tanto, con el fin de volver a confirmar la secuencia de nucleótidos del clon de ADNc anterior, se realizó la hibridación de placas de lisis usando una biblioteca de ADNc en fago lambda para volver a aislar el gen diana. Se usó la biblioteca de ADNc de placenta humana (Clontech nº. HL1144X), en la que se confirmó la expresión del gen NR10 como resultado del análisis de la expresión del gen NR10 mediante RT-PCR, para la selección de placas de lisis. Se usaron los fragmentos de ADNc obtenidos mediante 5'-RACE en (5) del ejemplo 1 como la sonda, tal como anteriormente. Se prepararon y marcaron las sondas tal como en el ejemplo 3, usando el kit Mega Prime, y se marcaron con [\alpha-^{32}P]-dCTP. Se realizó la hibridación usando la disolución de hibridación Express, y tras la prehibridación a 65ºC durante 30 min., se añadieron las sondas desnaturalizadas por calor para llevar a cabo la hibridación a 65ºC durante 16 h. Tras el lavado posterior en (1) 1x SSC/SDS al 0,1% a temperatura ambiente durante 5 min., (2) 1x SSC/SDS al 0,1% a 58ºC durante 30 min., y (3) 0,5x SSC/SDS al 0,1% a 58ºC durante 30 min., se expuso la membrana a una película de rayos X (Kodak, n.º de cat. 165-1512) para detectar placas de lisis positivas para NR10.

Como resultado, no se obtuvo ningún clon positivo. Tal como se describió en el ejemplo 4, un motivo por el qué el clon de ADNc no pudo aislarse podría ser que el número de copias expresadas del gen diana era demasiado pequeño. Para aislar el gen diana, es favorable realizar la hibridación de placas de lisis usando una biblioteca de ADNc en fago lambda derivada de músculo esquelético fetal humano, que mostró el mayor nivel de expresión del gen mediante análisis por RT-PCR.

Ejemplo 6 Selección del ligando (1) Construcción del receptor quimérico de NR10

Se construye un sistema de selección para buscar un ligando, una hematopoyetina novedosa, que puede unirse específicamente a NR10. En primer lugar, se amplificó mediante PCR la secuencia de ADNc que codifica para la región extracelular de NR10.1 (desde la 1ª Met hasta el 238º Glu o desde la 1ª Met hasta el 532º Glu), y se une en el marco este fragmento de ADN a fragmentos de ADN que codifican para la región transmembrana y la región intracelular de un receptor de hematopoyetina conocido, para preparar una secuencia de fusión que codifica para un receptor quimérico. Tal como se describió anteriormente, existen varios candidatos para la pareja, el receptor de hematopoyetina conocido, y entre ellos, se selecciona el receptor de TPO humano (MPL-P humano). Específicamente, tras amplificar la secuencia de ADN que codifica para la región intracelular que incluye la región transmembrana del receptor de TPO humano mediante PCR, se unió esta secuencia a la secuencia de ADNc que codificaba para la región extracelular de NR10.1 en el marco, y se insertó en un vector de plásmido (pEF-BOS) que puede expresarse en células de mamífero. El vector de expresión construido se denominó pEF-NR10/TPO-R. Un diagrama esquemático de la estructura del receptor quimérico NR10/TPO-R construido se muestra en la figura 12. Junto con un vector de expresión pSV2bsr (Kaken Pharmaceutical) que contenía un gen de resistencia a blasticidina S, se introdujo el vector que expresaba el receptor quimérico NR10/TPO-R en la línea celular dependiente de factor de crecimiento Ba/F3, y se forzó para la expresión. Se seleccionaron las células con gen introducido cultivando con la coexistencia de 8 \mug/ml de clorhidrato de blasticidina S (Kaken Pharmaceutical) e IL-3. Transfiriendo las células con receptor quimérico introducido obtenidas a un medio sin IL-3, cultivando añadiendo materiales que se espera que contengan un ligando diana, es posible llevar a cabo la selección que hace uso del hecho de que la supervivencia/proliferación de las célula sólo es posible cuando está presente un ligando que se une específicamente a NR10.

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(2) Preparación de la proteína de fusión soluble NR10/IgG1-Fc

Se preparó la proteína de fusión soluble NR10/IgG1-Fc para utilizarla para buscar ligandos de tipo unido a la membrana celular, o detectar ligandos solubles a través de BIAcore (Pharmacia) y transferencia de tipo West-western. Se preparó una secuencia de fusión que codificaba para la proteína de fusión soluble uniendo el fragmento de ADN que codificaba para la región extracelular de NR10.1 (desde la 1ª Met hasta el 238º Glu o desde la 1ª Met hasta el 532º Glu) preparado en (1) del ejemplo 6 con el fragmento de ADN que codificaba para la región Fc de la inmunoglobulina humana IgG1 en el marco. Un diagrama esquemático de la estructura de la proteína de fusión soluble que codifica para la NR10/IgG1-Fc construida se muestra en la figura 12. Se insertó este fragmento de gen de fusión en un vector de plásmido (pEF-BOS) que puede expresarse en células de mamífero, y el vector de expresión construido se denominó pEF-NR10/IgG1-Fc. Tras forzar la expresión de este pEF-NR10/IgG1-Fc en células de mamífero, y la selección de células con gen introducido estables, puede purificarse la proteína recombinante secretada en el sobrenadamente de cultivo mediante inmunoprecipitación usando anticuerpo anti-Fc de IgG1 humana, o mediante columnas de afinidad, etc.

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(3) Construcción de un sistema de expresión de NR10.2 y purificación de la proteína NR10.2 recombinante

Se preparó la proteína NR10.2 recombinante para utilizarla para buscar ligandos unidos a la membrana celular, o la detección de ligandos solubles usando BIAcore (Pharmacia) o transferencia de tipo West-western. Se sustituyó el codón de terminación de la secuencia codificante de aminoácidos del ADNc de NR10.2 mediante una mutación puntual por una secuencia de nucleótidos que codificaba para un residuo de aminoácido arbitrario, y entonces, se unió a la secuencia de nucleótidos que codificaba para el péptido FLAG en el marco. Se insertó este fragmento unido en un vector de plásmido que puede expresarse en células de mamífero, y el vector de expresión construido se denominó pEF-BOS/NR10.2 FLAG. La figura 12 muestra un diagrama esquemático de la estructura del inserto NR10.2 FLAG dentro del vector de expresión construido. Tras la expresión forzada de este pEF-BOS/NR10.2 FLAG en células de mamífero y la selección de células con gen introducido estables, puede inmunoprecipitarse la proteína recombinante secretada en el sobrenadante de cultivo usando anticuerpos anti-péptido FLAG, o puede purificarse mediante columnas de afinidad, etc.

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Ejemplo 7 Aislamiento del gen NR10.3 (1) Diseño de cebadores de oligonucleótidos

Se llevó a cabo de nuevo el aislamiento del gen NR10.1 para obtener el ADNc que comprendía una secuencia codificante de longitud completa continua. En primer lugar, se seleccionó la 5'-UTR y la 3'-UTR dentro de la secuencia de nucleótidos del ADNc de NR10.1 para diseñar cebadores sentido y antisentido (orientación en el sentido de 3' y en el sentido de 5', respectivamente) con secuencias tal como sigue. Se sintetizaron los cebadores tal como en (2) del ejemplo 1 en un sintetizador de ADN/ARN ABI 394 en condiciones en las que se unía un grupo tritilo al extremo terminal 5'. Se purificó el producto usando una columna OPC (ABI n.º 400771) para obtener cebadores de longitud completa.

NR10-5UTR (SN); 5'-CCC CTG ATA CAT GAA GCT CTC TCC CCA GCC-3'

(SEQ ID NO: 18)

NR10-3UTR (AS); 5'-CCA GTC TTC GGA GAT GGT TCT CTT GGG GCC-3'

(SEQ ID NO: 19)

(2) Clonación por PCR

Con el fin de aislar la CDS de longitud completa de NR10, se realizó la clonación por PCR usando los cebadores NR10-5UTR y NR10-3UTR como cebadores sentido y antisentido, respectivamente. Se usó la biblioteca de ADNc Marathon-Ready de placenta humana (Clontech nº. 7411-1) como el molde. Se realizó el experimento de PCR usando la mezcla de ADNc polimerasa Advantage (Clontech nº. 8417-1) en un termociclador Gene Amp PCR System 2400 de Perkin Elmer. Se realizó la PCR mediante un único ciclo de "94ºC durante 4 min.", 5 ciclos de "94ºC durante 20 s y 72ºC durante 90 s", 5 ciclos de "94ºC durante 20 s y 70ºC durante 90 s", 28 ciclos de "94ºC durante 20 s y 68ºC durante 90 s", un único ciclo de 72ºC durante 3 min., y se terminó a 4ºC. Como resultado, se obtuvo un producto de amplificación de 2119 pb.

Se subclonó el producto de PCR obtenido en el vector pGEM-T Easy (Promega n.º A1360) tal como en (3) del ejemplo 1, y se determinó la secuencia de nucleótidos. Se realizó la recombinación del producto de PCR en el vector pGEM-T Easy usando ADN ligasa de T4 (Promega n.º A1360) en una reacción de 12 h a 4ºC. Se obtuvo el producto recombinante del producto de PCR y el vector pGEM-T Easy mediante la transformación de E. coli DH5 alfa (Toyobo n.º DNA-903) y se usó Insert Check Ready Blue (TOYOBO n.º PIK-201) para la selección. Se determinó la secuencia de nucleótidos usando el kit de reacción BigDye Terminator Cycle Sequencing SF Ready (ABI/Perkin Elmer nº. 4303150) y el secuenciador de ADN ABI PRISM 377. Se determinaron las secuencias de nucleótidos de los fragmentos de inserción completos de 5 clones independientes del producto recombinante. Como resultado, se determinó la secuencia de nucleótidos de un clon de ADNc que puede codificar para la CDS de longitud completa de NR10 incluyendo la región transmembrana. Sin embargo, no se reconoció la secuencia determinada como la de NR10.1, sino que en su lugar era un clon de ADNc que podía codificar para un tipo transmembrana de la proteína receptora de 662 aminoácidos. El clon se denominó NR10.3 para distinguirlo del NR10.1.

Se depositó la E. coli que contenía este clon de ADNc en el Instituto Nacional de Biociencias y Tecnología Humana, Agencia de la Ciencia de la Industria y la Tecnología.

Institución depositaria: Instituto Nacional de Biociencias y Tecnología Humana, Agencia de Ciencia de la Industria y la Tecnología, Ministerio de Comercio Internacional e Industria.

Dirección: 1-1-3 Higashi, Tsukuba, Ibaraki 305-8566, Japón.

Fecha de depósito (fecha original): 23 de julio de 1999 (Heisei 11).

N.º de registro Seimeiken Jyouki Dai 6793 Go (FERM BP-6793).

En comparación con NR10.1, el clon de ADNc de NR10.3 tiene una deleción de un solo nucleótido en la agrupación de adenina en la proximidad del codón de terminación que conduce a un desplazamiento del marco. De ese modo, NR10.1 y NR10.3 presentan una diferencia en el marco de lectura de la secuencia de aminoácidos próxima al codón de terminación. La secuencia de nucleótidos resuelta de NR10.3 y la secuencia de aminoácidos codificada por ésta se muestran en SEQ ID NO: 16 y 17, respectivamente, así como en las figuras 13 y 14.

(3) Significado de la existencia de NR10.1 y NR10.3

Tal como se describió anteriormente, la diferencia entre NR10.1 y NR10.3 está provocada por la diferencia de un solo nucleótido en una posición cercana al codón de terminación, y no por productos de transcripción diferentes debido a mutantes de corte y empalme. Dado que los clones de ADNc de NR10.1 y NR10.3 son idénticos excepto por la deleción de un solo nucleótido, se presume que las proteínas receptoras de factores hematopoyéticos codificadas por los mismos son funcionalmente equivalentes. Sin embargo, una deleción de un solo nucleótido o mutación puntual de este tipo puede desempeñar un papel en ciertas enfermedades, o la diversidad de secuencia puede estar provocada de manera dependiente de la raza o familia.

Ejemplo 8 Ubicación cromosómica del NR10 (1) Diseño de los cebadores de oligonucleótidos

Con el fin de construir un mapa cromosómico de NR10, se sintetizó un cebador de oligonucleótido, NR10-intrón, con la siguiente secuencia. Se diseñó el cebador NR10-intrón como cebador sentido (orientación en el sentido de 3') seleccionando la secuencia de un sitio de intrón, no transcrito en el ARNm de NR10, dentro de la secuencia AQ022781 depositado en la base de datos de gss. Se sintetizó el cebador tal como se describió en (2) del ejemplo 1 usando un sintetizador de ADN/ARN ABI 394 en condiciones en las que se unía un grupo tritilo al extremo terminal 5' y se purificó en una columna de OPC (ABI n.º 400771) para obtener un producto de longitud completa.

NR10-intrón (SN): 5' CTG TGT AAG TAC CAA TTG TTC CCA GGC-3'

(SEQ ID NO: 20)

(2) Mapeo cromosómico del gen NR10

Con el fin de preparar un mapa cromosómico de NR10, se realizó el análisis por PCR usando ADN respectivo obtenido a partir del sistema de células somáticas de ser humano/ratón que tiene 24 cromosomas (Dubois B.L. y Naylor S., Genomics 16:315-319 (1993)).

Se usaron el cebador NR10-intrón de (1) del ejemplo 8 y el cebador NR10-A1 producido en (2) del ejemplo 1 como cebadores sentido y antisentido, respectivamente. Se realizó el experimento de PCR usando la mezcla de ADNc polimerasa Advantage (Clontech nº. 8417-1) en un termociclador Gene Amp PCR System 2400 de Perkin Elmer en las siguientes condiciones para PCR. Como resultado, se amplificó un producto de amplificación de 359 pb, que sugería la existencia del gen NR10 en el cromosoma 5 humano.

Se realizó la PCR mediante un único ciclo de "94ºC durante 4 min.", 5 ciclos de "94ºC durante 20 s y 70ºC durante 60 s", 28 ciclos de "94ºC durante 20 s y 68ºC durante 60 s", y un único ciclo de 72ºC durante 3 min., y se terminó a 4ºC.

Se clonó el producto de PCR obtenido en el vector pGEM-T Easy (Promega n.º A1360) tal como se describió en (3) del ejemplo 1, y se determinó la secuencia de nucleótidos usando un secuenciador de ADN ABI PRISM 337. El análisis de la secuencia de nucleótidos del fragmento de inserción completo de ocho clones recombinantes independientes confirmó que el producto de PCR tenía la secuencia de nucleótidos del fragmento de ADN genómico diana que contenía una secuencia parcial de NR10, y no un producto debido a una amplificación no específica.

El resultado anterior también confirmó que el conjunto de cebadores estaba funcionando de manera específica. Posteriormente, se determinó el locus del gen NR10 usando el panel 93 de híbridos de radiación GeneBridge 4 (Walter et al., Nature Genetics 7: 22-28 (1994)). Se realizó el análisis por PCR usando el panel 93 de híbridos de radiación GeneBridge 4 como molde y los cebadores N10-intrón y NR10-A1 en las mismas condiciones que anteriormente. Se evaluó cuantitativamente la cantidad de productos amplificados a partir de los híbridos respectivos como positiva o negativa, y se convirtió el resultado en código binario. Usando el programa en el servidor en [http://www.carbon.wi.mit.edu: 8000/cgi-bin/contig/rhmapper.pl], se comparó el resultado con códigos similares de genes marcadores de mapas génicos usados para construir mapas de región de entramado, y se determinó la ubicación en el cromosoma. Como resultado, se mapeó NR10 en el cromosoma 5 próximo al centrosoma, y se confirmó además que existe entre los marcadores WI-3071 (60-61 cM) y AFM183YB8 (67 cM).

Los genes del receptor de LIF y gp130 humano, que los inventores usaron en la búsqueda en bases de datos original, se mapearon también en regiones del cromosoma 5. Más específicamente, se mapeó el gen de gp130 humano en el cromosoma 5 q11 (67,2-69,6 cM), y se mapeó el gen del receptor de LIF en el cromosoma 5 p12-p13 (59,9-61,1 cM).

Desde el punto de la genética evolutiva, también es de gran importancia que se mapeara el gen NR10 en la región 61-67 cM en el cromosoma 5, una región entre los dos genes. Es decir, los tres genes, genes de NR10 humano, del receptor de LIF humano y gp130 humano, de la misma familia de receptores, cuyas estructuras muestran una similitud relativamente alta en la familia, se ubiquen próximos entre sí en una región sumamente limitada del mismo cromosoma 5 humano. Este hecho respalda la teoría de que tres genes de receptor diferentes se derivan de un mismo gen ancestral, y que se vieron sometidos a evolución genética durante la larga historia de la evolución biológica para conseguir diversidad no sólo en su estructura sino también en sus funciones.

Aplicabilidad industrial

La presente invención proporciona proteínas receptoras de hematopoyetina y ADN que codifica para las mismas novedosos. La presente invención también proporciona: un vector en el que se ha insertado el ADN, un producto transformante que alberga el ADN, y un método para producir proteínas recombinantes usando el producto transformante. Además, proporciona un método de selección para un compuesto o un ligando natural que se une a la proteína. Se cree que la proteína de la invención está asociada con funciones inmunológicas y hematopoyéticas. Por tanto, se espera que las proteínas de esta invención puedan aplicarse para el diagnóstico y el tratamiento de enfermedades relacionadas con la inmunidad y la hematopoyesis.

Tal como se describió anteriormente, se espera que el gen NR10 proporcione una fuente útil para obtener agonistas o factores hematopoyéticos novedosos que pueden unirse funcionalmente a la proteína receptora codificada por el gen. Se espera que se potencien la función hematopoyética o la inmunidad celular in vivo administrando tales sustancias de unión funcionales o anticuerpos específicos que pueden activar la función de la molécula de NR10 en el organismo. Por tanto, podría ser posible desarrollar un fármaco para su aplicación clínica que promueva la proliferación o la diferenciación de las células responsables de la inmunidad o las células hematopoyéticas, o que active la función de las células inmunitarias usando el gen NR10. También, podría ser posible usar tales fármacos para potenciar la inmunidad citotóxica contra tipos particulares de tumor. Es posible que NR10.1 se exprese en una población limitada de células en los tejidos hematopoyéticos. Por consiguiente, los anticuerpos anti-NR10 serían útiles para el aislamiento de tales poblaciones, que pueden usarse para tratamientos mediante el trasplante de células.

Por otro lado, puede usarse NR10.2, una variante de corte y empalme de NR10, como inhibidor para el ligando de NR10, como receptor de tipo señuelo. Además, se espera que administrando antagonistas que pueden unirse funcionalmente a la molécula de NR10, u otros inhibidores, así como anticuerpos específicos, que pueden inhibir la función molecular de NR10 en el organismo, podría ser posible suprimir la inmunidad celular o inhibir la proliferación de células hematopoyéticas in vivo. Por tanto, podría ser posible aplicar tales inhibidores al desarrollo de un fármaco para su aplicación clínica que inhiba la proliferación o la diferenciación de las células responsables de la inmunidad o células hematopoyéticas, o suprima la función inmunitaria o la inflamación. Específicamente, podría ser posible usar tales inhibidores para suprimir la aparición de enfermedades autoinmunitarias que surgen de la autoinmunidad, o el rechazo de tejidos por el sistema inmunitario del organismo vivo, el principal problema en el trasplante. Además, los inhibidores pueden usarse eficazmente para tratar tales enfermedades provocadas por la respuesta inmunitaria regulada por incremento de manera anómala. Por tanto, puede ser posible usar los inhibidores para tratar una variedad de alergias que son específicas para antígenos particulares, tales como metal y polen.

<110> CHUGAI RESEARCH INSTITUTE FOR MOLECULAR MEDICINE, INC.

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<120> PROTEÍNA RECEPTORA DE HEMATOPOYETINA NOVEDOSA, NR10

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<130> C2-105DP1PCT

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<140>

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<141>

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<150> JP1999-155797

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<151> 02-06-1999

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<150> JP1999-217797

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<151> 30-07-1999

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<160> 20

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<170> PatentIn Ver. 2.0

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<210> 1

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<211> 2969

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> CDS

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<222> (523)..(2478)

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<400> 1

2

3

4

5

6

7

8

9

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<210> 2

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<211> 652

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

10

11

12

13

14

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2440

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (523)..(1278)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

15

16

17

18

19

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 252

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

20

21

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia de cebador de oligonucleótido sintetizada artificialmente

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

22

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia de cebador de oligonucleótido sintetizada artificialmente

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

23

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

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<211> 30

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia de cebador de oligonucleótido sintetizada artificialmente

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

24

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<210> 8

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<211> 30

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia de cebador de oligonucleótido sintetizada artificialmente

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

25

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia de cebador de oligonucleótido sintetizada artificialmente

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

26

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<210> 10

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<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia de cebador de oligonucleótido sintetizada artificialmente

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

27

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia de cebador de oligonucleótido sintetizada artificialmente

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

28

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<210> 12

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<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia de cebador de oligonucleótido sintetizada artificialmente

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<400> 12

29

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<210> 13

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<211> 27

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia de cebador de oligonucleótido sintetizada artificialmente

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

30

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<210> 14

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<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia de cebador de oligonucleótido sintetizada artificialmente

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

31

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

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<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia de cebador de oligonucleótido sintetizada artificialmente

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

32

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2119

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)..(1996)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

33

34

35

36

37

38

39

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 662

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

40

41

42

43

44

45

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

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<211> 30

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia de cebador de oligonucleótido sintetizada artificialmente

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

46

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<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia de cebador de oligonucleótido sintetizada artificialmente

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

47

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia de cebador de oligonucleótido sintetizada artificialmente

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

48

Claims (6)

1. ADN aislado seleccionado del grupo que consiste en:

(a)

ADN que codifica para una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 2, 4 y 17;

(b)

ADN que comprende la región codificante de la secuencia de nucleótidos de cualquiera de SEQ ID NO: 1, 3 y 16;

(c)

ADN que codifica para una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 2, 4 y 17; en la que de uno o dos a 30 aminoácidos se modifican mediante deleción, adición y/o substitución por otro aminoácido, en el que dicha proteína es funcionalmente equivalente a la proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 2, 4 y 17 como receptor de factor hematopoyético en forma soluble o unida a la membrana;

(d)

ADN que codifica para una proteína que tiene una identidad del 70% o superior con la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 2, 4 y 17, en el que dicha proteína es funcionalmente equivalente a la proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 2, 4 y 17 como receptor de factor hematopoyético en forma soluble o unida a la membrana; y

(e)

ADN que codifica para una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 2, 4 y 17 de la cual se elimina la secuencia señal, en la que la secuencia señal es desde la 1ª Met hasta la 32ª Ala.

2. Vector dentro del cual se inserta el ADN descrito en la reivindicación 1.

3. Proteína o péptido que se codifica por el ADN descrito en la reivindicación 1.

4. Método de selección de un compuesto que se une a la proteína de la reivindicación 3, que comprende las etapas de:

(a)

poner en contacto una muestra con la proteína de la reivindicación 3 o un péptido parcial de la misma;

(b)

detectar la actividad de unión de la muestra con la proteína de la reivindicación 3 o un péptido parcial de la misma; y

(c)

seleccionar el uno o más compuestos que se unen a la proteína de la reivindicación 3 o un péptido parcial de la misma.

5. Anticuerpo que se une a la proteína de la reivindicación 3.

6. Método para detectar o medir la proteína de la reivindicación 3, que comprende las etapas de: exponer el anticuerpo de la reivindicación 5 a una muestra que se espera que contenga la proteína de la reivindicación 3; y detectar o medir la producción del inmunocomplejo entre dicho anticuerpo y dicha proteína.