PT1188830E - Nova proteína nr10 receptora da hemopoietina - Google Patents

Description

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Descrição "Nova proteína NR10 receptora da hemopoietina"

Campo da Invenção A presente invenção diz respeito a novas proteínas receptoras da hemopoietina, e genes que as codificam, assim como a métodos para as produzir e utilizar.

Antecedentes da Invenção É conhecido um grande número de citocinas como factores humorais que estão envolvidos na proliferação/diferenciação de várias células e na activação de funções de células maduras diferenciadas, assim como na morte celular. Existem receptores específicos para estas citocinas que estão categorizados em várias famílias baseados nas suas semelhanças estruturais (Hilton D. J. em "Guidebook to Cytokines and Their Receptors" editado por Nicola N. A. (uma publicação da Sambrook & Tooze na Oxford University Press), p. 8-16 (1994)).

Por outro lado, quando se compara as semelhanças dos seus receptores, a homologia da estrutura primária entre as citocinas é muito baixa. Não foi observada nenhuma homologia significativa de aminoácidos, mesmo entre membros de citocinas que pertencem à mesma família de receptores. Isto explica a especificidade funcional das citocinas respectivas, assim como as semelhanças entre as reacções celulares induzidas por cada citocina.

Exemplos representativos das famílias de receptores mencionadas acima são a família de receptores da tirosina quinase a família do receptor da hemopoietina, a família dos receptores do factor da necrose tumoral (TNF), e a 2 família de receptores do factor de crescimento β transformante (TGFP). Foi reportado estarem envolvidas diferentes vias de transdução do sinal em cada uma destas famílias.

Entre estas famílias de receptores, muitos dos receptores da família de receptores da hemopoietina em particular são expressos em células sanguíneas ou imunócitos, e os seus ligandos, citocinas, são freguentemente designadas como factores hematopoiéticos ou interleucinas. Alguns destes factores ou interleucinas existem no sangue e pensa-se estarem envolvidos na regulação sistemática humoral de funções hematopoiéticas ou imunitárias.

Isto contrasta com o pensamento gue as citocinas que pertencem a outras famílias estão muitas vezes envolvidas em regulações apenas tópicas. Algumas destas hemopoietinas podem ser tomadas como factores semelhantes a hormonas e hormonas representativas de péptidos, tal como a hormona de crescimento, prolactina, ou receptores de leptina que também pertencem à família de receptores de hemopoietina. Devido a estas características reguladoras sistemáticas semelhantes a hormonas prevê-se que a administração destas hemopoietinas possa ser aplicada ao tratamento de várias doenças.

Entre o grande número de citocinas aquelas que são actualmente aplicadas clinicamente incluem eritropoietina G-CSF, GM-CSF, e IL-2. Combinadas com IL-11, LIF, e IL-12 que são actualmente consideradas para ensaios clínicos, e as hormonas peptídicas acima mencionadas, tal como a hormona de crescimento e a prolactina, pode-se presumir que investigando novas citocinas que se ligam a receptores de hemopoietina entre as várias famílias de receptores acima mencionadas, é possível encontrar uma citocina que possa ser aplicada clinicamente com uma eficiência mais elevada. 3

Como acima mencionado, os receptores de citocinas partilham semelhanças estruturais entre os membros da familia. Utilizando estas semelhanças muitas investigações são dirigidas para encontrar novos receptores. Em particular, muitos receptores da familia de receptores da tirosina quinase já foram clonados, utilizando esta sequência altamente conservada no local catalítico (Matthews W. et al., Cell, 65(7): pll43-52 (1991)). Em comparação, os receptores da hemopoietina não possuem um dominio de actividade enzimática semelhante à tirosina quinase nas suas regiões citoplasmáticas, e as suas transduções de sinal são conhecidas por serem mediadas através de associações com outras proteínas da tirosina quinase que existem livremente no citoplasma.

Apesar dos locais dos receptores que se ligam a estas tirosinas quinases citoplasmáticas (JAK quinases) serem conservados entre membros da familia, a homologia não é muito elevada (Murakami M. et al. Proc. Natl. Acad. Sei. EUA, 88:11349-11353 (1991)). Actualmente a sequência que melhor caracteriza estes receptores de hemopoietina existe na região extracelular. Em particular, um motivo de cinco aminoácidos, Trp-Ser-Xaa-Trp-Ser (em que "Xaa" é um aminoácido arbitrário) é conservado em quase todos os receptores de hemopoietina. Por isso, podem ser obtidos novos receptores investigando novos membros da familia utilizando esta sequência. De facto; estas estratégias já conduziram à identificação do receptor de IL-11 (Robb, L. et al., J. Biol. Chem., 271(23):13754-13761)), o receptor da leptina (Gainsford T. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. EUA, 93 (25): pl4564-8 (1996)) , e o receptor IL-13 (Hilton D. J. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. EUA, 93(1): p497-501 (1996)).

Foram ainda identificadas duas sequências EST: 4 DATABASE EMBL [Online] 8 de Setembro de 1998 (1998-09-08), "qa50c06.xl Soares_NhHMPu_Sl Homo sapiens cbNA imagem do clone: 1690186 3', sequência de ARNm. "XP002311247 recuperado a partir do n° de acesso EM_PRO: AI123586 N° de acesso da base de dados AL123586 DATABASE EMBL [Online] 4 de Maio de 1996 (1996-05-04), "zb93ell.slSoares_parathyroid_tumor_NbHPA Homo sapiens cDNA imagem do clone: 320396 3', sequência de ARNm. "XP002311247 recuperado a partir do n° de acesso EM_PRO: W16834 N° de acesso da base de dados W16834. A EP0411946 revela a proteína humana gpl30 que é 29% idêntica à SEQ ID N° 2.

Descrição Detalhada da Invenção A presente invenção disponibiliza novas proteínas receptoras da hemopoietina codificadas por um ADN isolado seleccionado a partir do grupo constituído por: (a) um ADN que codifica para uma proteína constituída pela sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID Nos 2, 4 e 17; (b) um ADN que compreende a região de codificação da sequência nucleotidica de qualquer uma das SEQ ID N°s: 1,3,e,16; (c) um ADN que codifica para uma proteína constituída pela sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID Nos 2, 4 e 17; em que um ou dois dos 30 aminoácido(s) são modificados por supressão, adição e/ou substituição por outro aminoácido em que a dita proteína é funcionalmente equivalente à proteína constituída pela sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID N°s: 2,4 e 17 na forma 5 ligada à membrana, ou na forma de receptor do factor hematopoiético solúvel; (d) ADN que codifica para uma proteína que possui uma identidade de sequência de 70%, ou mais elevada com a sequência de aminoácidos das SEQ ID N°s: 2,4, e 17, em que a dita proteína é funcionalmente equivalente à proteína constituída pela sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ IS N°s: 2,4 e 17 como receptor ligado à membrana ou receptor da forma solúvel do factor hematopiético; e (e) Um ADN que codifica para uma proteína constituída pela sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID N°s 2,4, e 17 a partir do qual a sequência de sinalização é removida, em que a sequência de sinalização vai desde a primeira Met até à 32a Ala. A presente invenção também disponibiliza um vector no qual o ADN tem de ser inserido. A presente invenção também disponibiliza métodos para pesquisar compostos que se ligam à proteína da presente invenção.

Inicialmente os inventores tentaram encontrar um novo receptor utilizando oligonucleótidos que codificam para o motivo Trp-Ser-Xaa-Trp-Ser (motivo WS) como sonda, através de hibridização em placa, método RT-PCR, e etc. Contudo, foi extremamente difícil de seleccionar estritamente apenas aqueles com os quais os 15 nucleótidos que codificam o motivo se iriam hibridizar completamente nas condições de hibridização habituais, porque o oligonucleótido tggag(t/c)nnntggag(t/c) (em que "n" é um nucleótido arbitrário) que codifica para o motivo é curto, possuindo apenas 15 nucleótidos, e tinha um teor g/c elevado. Além disso, estão contidas sequências semelhantes nas proteínas 6 que codificam para ADNc diferentes dos receptores de hemopoietina começando com vários colagénios que se pensa estarem largamente distribuídos e que também possuem elevadas quantidades de expressão, o que torna a pesquisa através de hibridização em placa e RT-PCR acima referidas extremamente ineficiente.

Para resolver estes problemas os investigadores pesquisaram motivos adicionais diferentes do local WS acima mencionado que são conservados na família dos receptores da hemopoietina. Consequentemente, foi encontrado um resíduo de tirosina, ou histidina, localizado 13 a 27 aminoácidos a montante do motivo WS no domínio extracelular que é altamente conservado na família de receptores. Além disso, pesquisas adicionais para sequências consenso que são frequentemente encontradas nos 6 aminoácidos desde a Tyr/His acima até ao terminal C conduziu à identificação da sequência consenso seguinte: (Tyr/His)-Xaa-(Hidrofóbico/Ala)-(Gln/Arg)-Hidrofóbico-Arg (abreviado aqui como o motivo YR) . Contudo este motivo YR não exactamente uma sequência consenso perfeita, e a combinação da sequência nucleotidica que codifica para o motivo é muito complicada. Por isso, é praticamente impossível sintetizar e disponibilizar oligonucleótidos que codificam para todas as sequências de aminoácidos como sondas para a hibridização que é um método prático de pesquisa, ou como iniciadores dirigidos para RT-PCR.

Neste contexto, os inventores procuraram outras estratégias para pesquisar de forma prática novos membros da família de receptores de hemopoietina utilizando os dois motivos acima como sondas e verificaram que seria adequado construir uma base de dados no computador utilizando sequências de aminoácidos parciais de receptores de hemopoietina conhecidos, incluindo ambos os motivos como pesquisa. Os inventores repetiram as pesquisas TBlastN na 7 base de dados gss e htgs no GenBank utilizando como pesquisa sequências parciais dos aminoácidos de receptores de hemopoietina múltiplos conhecidos. Como consequência, muitos clones falsos positivos foram obtidos em todos os casos. Contudo, comparando a sequência de aminoácidos deduzida a partir da sequência nucleótidica proximal da sonda dos clones acima com a sequência dos receptores da hemopoietina conhecidos os inventores foram capazes de seleccionar genes que codificam para membros da família de receptores. A partir destes resultados, os inventores identificaram um único clone contendo uma sequência genómica humana que se suspeitou codificar para um novo receptor de hemopoietina e designaram-no por NR10. A sequência nucleótidica acima foi utilizada para desenhar iniciadores oligonucleotidicos específicos. Os iniciadores foram utilizados para efectuar 5'- e 3'-RACE utilizando bibliotecas de ADNc de hepatócitos fetais humanos e placenta humana como molde. Como consequência, foi isolado um ADNc de comprimento completo, NR10.1, que codifica para um receptor transmembranar de 652 aminoácidos e foi determinada a sequência nucleótidica completa. Ao mesmo tempo, o clone de ADNc, NR10.2 que se presume ser uma variante de união (expressão inglesa "splice") do NR10 foi também isolado com êxito a partir do produto 3'-RACE. Com base na sequência nucleótidica determinada sugeriu-se que o NR10.2 codifica para uma proteína solúvel semelhante ao receptor de 252 aminoácidos. Verificou-se que os resíduos de cisteína, motivo rico em prolina, e motivo WSXWS no domínio extracelular que é conservado entre os membros da família de receptores, o motivo boxl no domínio extracelular que está implicado na transdução do sinal etc. se encontravam bem conservados na estrutura primária de NR10.1. Por isso, o NR10.1 foi considerado codificar para um receptor típico de hemopoietina. 8

Consequentemente, foi efectuada uma RT-PCR utilizando ARNm preparado a partir de vários orgãos humanos e conjuntos de iniciadores especificos para NR10.1 e NR10.2, respectivamente para pesquisar tecidos que expressam os genes respectivos e para examinar a sua distribuição e padrão de expressão em tecidos humanos. Os produtos RT-PCR foram sujeitos a transferência de Southern utilizando os fragmentos de ADNc especificos de NR10.1 e NR10.2, respectivamente, de modo a eliminar a possibilidade de amplificação não especifica e para quantificar a quantidade de produtos. Os resultados indicaram que o gene NR10.2 é expresso constitutivamente em todos os tecidos examinados a um nivel constante. Em contraste, a expressão de NR10.1 foi detectada em determinados orgãos e tecidos: em particular, foi detectada uma forte expressão no coração adulto, placenta, testículos, timo e leucócitos periféricos, e foi detectada uma expressão fraca no baço, medula óssea, próstata, ovário, pâncreas e pulmão.

Os inventores também efectuaram clonagem de PCR para isolar a grelha de leitura aberta de comprimento completo (ORF) de NR10.1, e por acaso, isolaram outro clone de ADNc, denominado NR10.3, contendo uma sequência nucleotidica em que falta um único nucleotido da sequência de NR10.1 e codifica para uma proteina do tipo transmembranar de 662 aminoácidos. Foi considerado que NR10.3 possui funções semelhantes a NR10.1 a partir das estruturas muito semelhantes.

Com base nas caracteristicas acima presume-se que NR10 é uma nova molécula receptora de hemopoietina relacionada com a regulação do sistema imunitários ou hematopoiese in vivo. 0 gene que codifica para NR10 vai ser extremamente útil na pesquisa de novos factores hematopoiéticos que podem ligar-se funcionalmente à proteina receptora. 9

Consequentemente, esta invenção diz respeito a novos receptores de hemopoietina e genes que codificam para os receptores, assim como a um método para produzir e utilizar o mesmo como referido acima. É ainda descrito um ADN que se hibridiza em condições severas com um ADN constituido pela sequência nucleotidica de qualquer uma das SEQ ID N°s 1, 3 e 16 e que codifica para uma proteína que é funcionalmente equivalente à proteína constituída pela sequência de aminoácidos de qualquer das SEQ ID N°s 2,4, e 17, e um ADN que codifica para um péptido parcial de uma proteína constituída por qualquer uma das SEQ ID N°s 2, 4 e 17: é disponibilizado (3) um vector em que o ADN da invenção é inserido, (4) uma proteína ou péptido que é codificada pelo dito ADN. (5) método de pesquisa de um composto que se liga a uma proteína de (4), compreendendo os passos de: (a) fazer contactar uma amostra com a proteína de (4) ou com um seu péptido parcial; (b) suprimir a actividade de ligação da mesma amostra com a proteína de (4) ou um seu péptido parcial; e (c) seleccionar o composto que se liga à proteína (4) ou a um seu péptido parcial; (6) um anticorpo que se liga à proteína de (4); (7) um método para detectar ou medir a proteína (4) , compreendendo os passos de : expor o anticorpo (6) a uma amostra que se espera conter a proteína de (4), e detectar ou medir a produção do complexo imunitário entre o dito anticorpo e a dita proteína. É descrito um polinucleótido complementar a um ADN que compreende a sequência nucleotidica de qualquer uma das SEQ ID N°s: 1,3, e 16, ou a sua cadeia complementar em que o polinucleótido compreende pelo menos 15 nucleótidos. 10

Esta invenção disponibiliza um novo receptor de hemopoietina NR10. De acordo com o resultado da pesquisa à base de dados no GenBank, análise 5'- e 3' RACE, os inventores acabaram por conseguir identificar e isolar um novo gene receptor da hemopoietina NR10. Verificou-se que pelo menos duas variantes de união são transcritas a partir de NR10. Uma destas variantes, o clone NR10.1 de ADNc codifica para uma proteina receptora transmembranar, e o outro, NR10.2, codifica para uma proteina solúvel semelhante a um receptor de 252 aminoácidos. Além disso os inventores efectuaram clonagem de PCR de modo a isolar o ORF de cadeia completa do ADNc de NR10.1, e por acaso conseguiram isolar outro clone de ADNc, designado NR10.3 contendo um ORF de comprimento completo que codifica para uma proteina receptora do tipo transmembranar de 662 aminoácidos. A sequência nucleótidica do NR10.1 do ADNc e a sequência de aminoácidos da proteina codificada pelo ADNc são indicadas nas SEQ ID N°s: 1 e 2, respectivamente. A sequência nucleótidica do NR10.2 do ADNc e a sequência de aminoácidos da proteina codificada pelo ADNc são indicadas nas SEQ ID N°s: 3 e 4, respectivamente. A sequência nucleótidica do NR10.3 do ADNc e a sequência de aminoácidos da proteina codificada pelo ADNc são indicadas nas SEQ ID N°s: 16 e 17, respectivamente. 0 clone NR10.3 de ADNc possui uma supressão nucleótidica única no agrupamento de adenina, localizado próximo do codão de paragem, quando comparado com o clone NR10.1, que resulta num desvio da grelha daquela posição conduzindo a uma grelha de leitura aberta diferente. Assim, a diferença entre os dois clones não é provocada por serem produtos de transcrição de variantes de união. Com excepção da supressão de um nucleótido, os clones de ADNc NR10.1 e NR10.3 partilham uma sequência idêntica. Entretanto os seus 11 domínios extracelulares são codificados por uma sequência completamente idêntica e assim possuem uma estrutura terciária idêntica, e por isso considera-se que reconhecem o mesmo ligando específico. Além disso, os seus domínios intracelulares partilham o motivo Boxl (sequência Pro-Xaa-Pro a seguir a vários resíduos básicos e resíduos hidrofóbicos múltiplos) localizados imediatamente depois do domínio transmembranar, e presume-se que se liguem à JAK quinase. Por isso prevê-se que as proteínas codificadas pelos dois clones sejam funcionalmente equivalentes. A análise de RT-PCR utilizando ARNm de vários orgãos humanos revelou que o gene NR10.2 é expresso constitutivamente em todos os tecidos examinados a um nível constante. Em contraste, foi detectada a expressão do gene NR10.1 em determinados tecidos e orgãos: em particular, uma expressão forte no coração adulto, placenta, testículos, timo e leucócitos periféricos, e expressão fraca no baço, medula óssea, próstata, ovário, pâncreas e pulmão. Assim, presume-se que o NR10.1 codifique para um novo receptor hematopoiético.

As proteínas NR10 acima podem ser úteis para uma aplicação médica. Uma vez que o NR10 é expresso no timo, leucócitos periféricos, e baço poderia ser um receptor para um factor hematopoiético desconhecido. Por isso, as proteínas NR10 são um instrumento útil na identificação do factor hematopoiético desconhecido. Podem também ser utilizados para pesquisar uma biblioteca de péptidos, ou de compostos químicos sintéticos para isolar ou identificar agonistas ou antagonistas que se podem ligar funcionalmente à molécula de NR10. Contudo é esperada uma aplicação clínica de novas moléculas que se ligam à molécula NR10 e a anticorpos específicos que podem limitar a função da molécula NR10 para regular a resposta imunitária ou 12 hematopoiese in vivo, pesquisando tais moléculas e anticorpos.

Espera-se que NR10 seja expressa numa população restrita de células nos tecidos hematopoiéticos, e assim, os anticorpos anti-NRIO são úteis para o isolamento de tais populações de células. As populações de células isoladas podem ser utilizadas no transplante de células. Além disso, espera-se que o anticorpo anti-NRIO seja utilizado para o diagnóstico ou tratamento de doenças, tais como a leucemia.

Por outro lado, as proteínas solúveis que compreendem o dominio extracelular da proteína NR10 e a variante de união de NR10, NR10.2 podem ser utilizadas como um receptor do tipo armadilha para inibir o ligando NR10. Podem ser úteis para o tratamento de doenças em que o NR10 esteja implicado, tal como a leucemia.

Esta invenção inclui proteínas que são funcionalmente equivalentes à proteína NR10. Por exemplo, estão incluídos homólogos da proteína humana NR10 noutras espécies e mutantes da proteína NR10 humana. Aqui o termo "funcionalmente equivalente" diz respeito a proteínas que possuem uma actividade biológica equivalente, quando comparada com a da proteína NR10. Tal actividade biológica pode incluir a actividade da proteína como um receptor do factor hematopoiético na forma ligada à membrana, ou na forma solúvel. Métodos de introdução de mutações para preparar proteínas que são funcionalmente equivalentes a uma outra proteína são bem conhecidos de um perito no estado da técnica. Por exemplo, pode-se utilizar mutagénese dirigida para um local (Hashimoto-Goto, T. et al. Gene 152:271-275 (1995): Zoller, M.J., e Smith M. Methods Enzymol. 100: 468-500 (1983); Kramer, W. et al Nucleic Acids Res. 12: 9441-9456 (1984); KramerW, e Fritz HJ Methods. Enzymol. 154: 350-367 (1987); Kunkel, TA Proc Natl Acad Sei EUA. 82:488- 13 492 (1985); Kunkel Methods Enzymol. 85: 2763-2766 (1988)) e outros para introduzir uma mutação adequada na sequência de aminoácidos da proteína humana NR10 e preparar uma proteína que é funcionalmente equivalente à proteína. As mutações de aminoácidos podem também ocorrer na natureza. Esta invenção inclui proteínas que possuem a sequência de aminoácidos da proteína NR10 humana em que um ou vários resíduos de aminoácidos estão mutados e em que as proteínas são funcionalmente equivalentes à proteína humana NR10.

Como proteína funcionalmente equivalente à proteína NR10 da invenção podem ser especificamente mencionadas as seguintes: uma em que um ou vários ou mais, preferencialmente dois a 30, mais preferencialmente, dois a 10 aminoácidos são suprimidos em qualquer uma das sequências de aminoácidos da SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 4, ou SEQ ID N° 17; uma em que uma ou duas ou mais, preferencialmente dois a 30, mais preferencialmente dois a 10 aminoácidos foram adicionados em qualquer uma das das sequências de aminoácidos SEQ ID N°2, SEQ ID N°4 ou SEQ ID N°17; ou uma em que um ou dois ou mais, preferencialmente, dois a 30, mais preferencialmente, dois a 10 aminoácidos foram substituídos com outros aminoácidos em qualquer uma das sequências de aminoácidos da SEQ ID N° 2, SEQ ID N°4, ou SEQ ID N°17 .

Quanto ao resíduo de aminoácido a ser mutado é preferível que seja mutado num aminoácido diferente que permita que as propriedades da cadeia lateral do aminoácido sejam conservadas. Exemplos de propriedades das cadeias laterais dos aminoácidos são as seguintes: aminoácidos hidrofóbicos (A, I, L, M, F, P, W, Y, V) , aminoácidos hidrofílicos (R, D, N, C, E, Q, G, Η, K, S, T) , e aminoácidos que compreendem as cadeias laterais seguintes: uma cadeia lateral alifática (G, A, V, L, I, P) ; um grupo hidróxilo contendo as cadeias laterais (S, T, Y); um átomo 14 de enxofre contendo a cadeia lateral (C, M) ; um ácido carboxilico e amida contendo a cadeia lateral (D, N, E, Q); uma base contendo a cadeia lateral (R, K, H) ; e uma cadeia lateral contendo um grupo aromático (H, F, Y, W) (as letras entre parêntesis indicam códigos de uma letra de aminoácidos). É conhecido que uma proteína pode ter uma sequência de aminoácidos que é modificada por supressão, adição, e/ou substituição por outros aminoácidos de um ou vários resíduos de aminoácidos, mas que retém ainda a sua actividade biológica (Mark. D. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 81:5662-5666 (1984); Zoller, M. J. & Smith, M.,

Nucleic Acids Research 10: 6487-6500 (1982); Wang, A. et al., Science 224: 1431-1433 (1984); Dalbadie-McFarland, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. EUA79:6409-6413 (1982)).

Uma proteína de fusão contendo uma proteína humana NR10 é um exemplo de uma proteína em que um ou vários resíduos de aminoácidos foram adicionados à sequência de aminoácidos (SEQ ID N° 2, 4 ou 17) da proteína NR10 humana. É feita uma proteína de fusão fundindo a proteína NR10 humana da presente invenção com outro (s) péptido(s) ou proteína(s) e está(ão) incluído(s) na presente invenção. Pode ser preparada uma proteína de fusão ligando um ADN que codifica para uma proteína NR10 humana da presente invenção com um ADN que codifica para outro(s) péptido(s) ou proteína(s) na grelha, introduzindo o ADN ligado num vector de expressão, e expressando o gene de fusão num hospedeiro. Podem ser utilizados processos conhecidos do perito no estado da técnica para preparar um tal gene de fusão. Não existe nenhuma restrição quanto ao (s) outro (s) péptido(s) ou proteína (s) que está(ão) fundidos com a proteína desta invenção.

Outros péptidos para serem fundidos com uma proteína da presente invenção são péptidos conhecidos, por exemplo 15 FLAG (Ηορρ, T. Ρ. et al., Biotechnology 6: 1204-1210 (1988)), 6χ His constituindo 6 resíduos de histidinas (His), lOx His, aglutinina da gripe (HA), fragmento c-myc humano, fragmento VSV-GP. Fragmento pl8HIV, T7-tag, HSV-tag, E-tag, fragmento de antigénio SV40T, Ick tag; fragmento de α-tubulina, B-tag, fragmento de proteína C etc. Outros exemplos de péptidos a serem fundidos com a proteína da presente invenção são a glutationa-S-transferase (GST), aglutinina da gripe (HA), região constante da imunoglobulina, β-galactosidase, proteína que se liga à maltose (MPB), etc.

Podem ser preparadas proteínas de fusão fundindo ADN comercialmente disponível que codifica para estes péptidos ou proteínas com ADN que codificam para uma proteína da presente invenção e expressando o ADN fundido preparado. A técnica de hibridização (Sambrook, J. et al.,

Molecular Cloning 2a ed. 9,47-9,58, Cold Spring Harbor Lab. Press, (1989)) é bem conhecido do perito no estado da técnica como processo alternativo para preparar uma proteína funcionalmente equivalente a uma determinada proteína. Mais especificamente, um perito no estado da técnica pode utilizar o processo geral para obter uma funcionalidade de proteína equivalente a uma proteína NR10 humana isolando ADN que possui uma homologia elevada com todo ou parte do ADN (SEQ ID N° 1,3 ou 16) que codifica para a proteína humana NR10. Assim, a presente invenção inclui as proteínas que são codificadas por ADNs que hibridizam com um ADN constituído por um ADN que codifica para uma proteína humana NR10 ou para uma sua parte e que são funcionalmente equivalentes à proteína humana NR10. Por exemplo, estão incluídos homólogos de NR10 humana noutros mamíferos (tais como os do macaco, ratinho, coelho e bovino) . Para isolar a partir de animais um ADNc com uma homologia elevada em relação a um ADN que codifica para uma 16 proteína humana NR10 é preferível utilizar tecidos, tais como o coração, a placenta, e testículos.

Podem ser seleccionadas de forma adequada por um perito no estado da técnica condições de hibridização severas para isolar ADN que codifica para proteínas funcionalmente equivalentes à proteína NR10 humana, e por exemplo, podem ser fornecidas condições de baixa severidade. Baixas condições de severidade são por exemplo 42°C, 2xSSC, e 0,1% de SDS, e preferencialmente, 50°C, 2 xSSC, e 0,1% de SDS. São preferíveis condições de elevada severidade e incluem, por exemplo 65°C, 2xSSC, e 0,1% SDS. Nestas condições, quanto mais elevada for a temperatura maior é a homoloqia com o ADN obtido. Contudo, outros factores sem ser a temperatura, tal como a concentração salina pode influenciar a severidade da hibridização e um perito no estado da técnica pode seleccionar de forma adequada os factores para conseguir uma severidade semelhante.

Em vez da hibridização o método de amplificação do gene, por exemplo, a reacção em cadeia da polimerase (PCR) pode ser utilizado para isolar o ADN alvo utilizando iniciadores sintetizados baseados na informação da sequência do ADN que codifica para a proteína humana NR10 (SEQ ID N° 1, 3 e 16).

As proteínas que são funcionalmente equivalentes à proteína NR10 humana codificada pelo ADN isolado através da técnica de hibridização acima, ou pela técnica de amplificação do gene, possuem normalmente uma elevada homologia em relação à sequência de aminoácidos da proteína NR10 humana. As proteínas da presente invenção incluem também proteínas que são funcionalmente equivalentes à proteína humana NR10 que também possui uma homologia elevada com a proteína compreendendo qualquer uma das sequências de aminoácidos da SEQ ID N°2, 4, ou 17. 4, 17

Homologia elevada é normalmente definida como uma homologia de 70% ou mais elevada, favoravelmente 80% ou mais elevada, mais favoravelmente 90% ou mais elevada, e ainda mais favoravelmente 95% ou mais elevada. A homologia de uma proteina pode ser determinada pelo algoritmo em "Wilbur, W. J. e Lipman, D. J. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80:726-730 (1983)". A sequência de aminoácidos, peso molecular, ponto isoeléctrico a presença, ou ausência da cadeia de açúcar, e a forma de uma proteina da presente invenção pode ser diferente de acordo com as células produtoras, hospedeiro, ou método de purificação descrito abaixa. Contudo, desde que a proteina obtida possua uma função equivalente à da proteina da presente invenção (SEQ ID N° 2, 4 e 17) está incluída na presente invenção. Por exemplo, se uma proteína da presente invenção for expressa em células procarióticas, tais como E. coli é adicionado um resíduo de metionina no terminal N da sequência de aminoácidos da proteína expressa. Se uma proteína da presente invenção for expressa em células eucarióticas, tais como células de mamíferos é removida a sequência de sinalização N-terminal. Tais proteínas também incluem as proteínas da presente invenção.

Por exemplo, como resultado da análise da proteína da invenção baseada no método de "Von Heijne, G., Nucleic Acids Research, 14: 4683-4690 (1986)" presumiu-se que a sequência de sinalização vai desde a Ia Met à 32a Ala na sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 2,4 e 17. Por isso, a presente invenção compreende uma proteína compreendendo a sequência da 33a Ala a 652aa Asp na sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 2. De forma semelhante a presente invenção abrange uma proteína que compreende a sequência da 33a Ala à 252a Vai na sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 4. De forma semelhante a presente invenção abrange uma 18 proteína compreendendo a sequência da 33a Ala à 662a Ile na sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 17.

Uma proteína da presente invenção pode ser preparada através de métodos conhecidos do perito no estado da técnica como uma proteína recombinante e também como uma proteína natural. Uma proteína recombinante pode ser preparada inserindo um ADN que codifica para uma proteína da presente invenção (por exemplo, ADN que compreende a sequência nucleotidica da SEQ ID N°l, 3 ou 16) num vector de expressão adequado, introduzindo o vector numa célula hospedeira adequada e recolhendo a proteína a partir do transformante resultante. Após obtenção do extracto a proteína recombinante pode ser purificada e preparada submetendo-a a cromatografia, tal como a cromatografia de permuta iónica, cromatografia de fase reversa, filtração em gel, e outra, ou cromatografia de afinidade na qual os anticorpos contra a proteína da invenção se encontram imobilizados, ou combinando uma ou várias destas colunas.

Além disso, quando uma proteína da presente invenção é expressa nas células hospedeiras (por exemplo em células animais e E. coli) como uma proteína de fusão com a proteína da glutationa-S-transferase, ou como uma proteína recombinante suplementada com histidinas múltiplas, a proteína recombinante expressa pode ser purificada utilizando uma coluna de glutationa, ou uma coluna de níquel.

Após purificação da proteína de fusão é também possível excluir regiões diferentes da da proteína objectivo cortando com trombina, factor-Xa, e outros de acordo com o necessário.

Uma proteína natural pode ser isolada através de métodos conhecidos do perito no estado da técnica. Por exemplo, extractos de tecidos ou células que expressam uma proteína da invenção podem ser feitos reagir com uma coluna 19 de afinidade descrita abaixo à qual os anticorpos que se ligam à proteina NR10 se encontram ligados para isolar a proteina natural. Podem ser utilizados anticorpos policlonais ou monoclonais.

Esta invenção também inclui péptidos parciais das proteínas da invenção. Os péptidos constituídos pela sequência de aminoácidos específicos de uma proteína da invenção são compostos pelo menos por 7 aminoácidos favoravelmente mais do que 8 aminoácidos, e mais favoravelmente mais do que 9 aminoácidos. Os péptidos parciais podem ser utilizados para preparar anticorpos contra uma proteina da invenção, ou pesquisando a ligação de compostos em relação a uma proteina da presente invenção, ou pesquisando activadores ou inibidores de uma proteina da presente invenção. Alternativamente pode ser utilizado como um antagonista para o ligando de uma proteina da invenção. Um péptido parcial da presente invenção é por exemplo, um péptido parcial que possui o centro activo da proteina constituído por qualquer uma das sequências de aminoácidos da SEQ ID N° 2,4, ou 17. Além disso, os péptidos parciais podem conter uma ou várias regiões das regiões hidrofílicas ou hidrofóbicas deduzidas através de análise gráfica de hidrofobicidade. Estes péptidos parciais podem conter a região hidrofílica completa, ou uma parte, ou pode conter uma região hidrofóbica completa, ou uma parte. Além disso, por exemplo, proteínas solúveis e proteínas compreendendo regiões extracelulares de uma proteína da invenção são também abrangidas pela presente invenção.

Os péptidos parciais da invenção podem ser produzidos através de técnicas de engenharia genética, através de métodos bem conhecidos de síntese de péptidos, ou por excisão de uma proteína da invenção com uma peptidase adequada. 0 processo de síntese de fase sólida e o processo 20 de síntese de fase líquida podem ser utilizados como processo de síntese de péptidos.

Outro objectivo desta invenção é disponibilizar ADN que codifica para uma proteína da invenção. 0 ADN pode ser útil para produzir as proteínas acima da invenção in vivo e in vitro. Além disso, por exemplo é também possível utilizar o ADN para aplicação em terapia génica e doenças que resultam de anormalidades do gene que codifica para a proteína da presente invenção. 0 ADN pode ser fornecido de qualquer forma desde que codifique para uma proteína da invenção. Assim, o ADN pode ser um ADNc sintetizado a partir do ARNm, ADN genómico, ou ADN sintetizado quimicamente. Além disso, o ADN compreendendo qualquer sequência nucleótidica baseada na degenerescência do código genético pode ser incluída desde que codifique para uma proteína da presente invenção. 0 ADN da invenção pode ser preparado por qualquer método conhecido por um perito no estado da técnica. Por exemplo, o ADN pode ser preparado construindo uma biblioteca de ADNc a partir de células que expressam a proteína e efectuando a hibridização utilizando uma sequência parcial do ADN da invenção (SEQ ID N° 1 ou 3, por exemplo) como sonda. Uma biblioteca de ADNc pode ser construída de acordo com o método descrito na literatura (Sambrook J. et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)), ou pode ser utilizada uma biblioteca de ADN comercial. Alternativamente, o ADN pode ser preparado obtendo ARN a partir de uma célula que expressa uma proteína da presente invenção, sintetizando oligo ADN baseado na sequência do presente ADN (SEQ ID N° 1, 3, ou 16, por exemplo) efectuando PCR utilizando o ADN sintetizado como iniciador e amplificando o ADNc que codifica para uma proteína da presente invenção. 21

Determinando a sequência nucleótidica do ADNc obtido, a região de translação codificada pelo ADNc pode ser determinada, e a sequência de aminoácidos da proteina da presente invenção pode ser obtida. Além disso, o ADN genómico pode ser isolado pesquisando bibliotecas genómicas de ADN utilizando ADN como sonda.

Especificamente isto pode ser efectuado como se segue: Primeiro o ARNm é isolado a partir de células, tecidos e orgãos (por exemplo, do ovário, testículos, placenta, etc.) que expressam uma proteína da invenção. Para isolar o ARNm, primeiro, o ARN completo é preparado utilizando métodos bem conhecidos, por exemplo método da ultracentrifugação com guanidina (Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry 18: 5294-5299 (1979)), o método AGPC (Chomczynski, P. e Sacchi, N., Anal. Biochem. 162: 156-159 (1987)) e outros, e ARNm a partir de ARNm completo é purificado utilizando o Kit de purificação de ARNm (Pharmacia) etc. Alternativamente, o ARNm pode ser preparado directamente utilizando o kit de purificação QuickPrep™ de ARNm (Pharmacia). 0 ADNc é sintetizado utilizando transcriptase reversa a partir do ARNm obtido. 0 ADNc pode ser sintetizado utilizando o kit de síntese da primeira cadeia de ADNc da AMV transcriptase reversa (SEIKAGAKU CORPORATION), etc. Além disso, a síntese de ADNc e amplificação pode também ser efectuada utilizando o iniciador e outros aqui descritos seguindo o método 5'-RACE (Frohman, M.A. et al., Proc. Natl. Acad: Sei. USA 85: 8998-9002 (1988); Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids. Res. 17:2919-2932 (1989)) utilizando a reacção em cadeia da polimerase (PCR) e o Kit 5'-Ampli FINDER™ race (Clontech) . O fragmento de ADN objectivo é preparado a partir do produto PCR obtido e ligado com o ADN do vector. Assim, é criado um vector recombinante, introduzido em E. coli e outros, e as colónias são seleccionadas para preparar o 22 vector recombinante desejado. A sequência nucleotidica do ADN objectivo pode ser verificada através de métodos conhecidos, por exemplo, o método didesoxi de terminação da cadeia nucleotidica.

No que diz respeito ao ADN da invenção, a sequência com uma eficiência de expressão mais elevada pode ser desenhada considerando a frequência de utilização do codão no hospedeiro utilizado para a expressão (Grantham, R. et al., Nucleic Acids Research 9: r43-74 (1981)). 0 ADN da invenção pode também ser modificado utilizando kits disponíveis comercialmente e métodos conhecidos. São fornecidas modificações tais como por exemplo digestão por enzimas de restrição, inserção de oligonucleótidos sintéticos e fragmentos de ADN adequados, adição de agentes de ligação, inserção de um codão de iniciação (ATG) e/ou codão de paragem (TAA, TGA ou TAG), e outros.

Especificamente o ADN da invenção inclui ADN constituído pela sequência nucleotidica desde a 523a "A" à 22478th "C" da SEQ ID N° 1, 523a "A" à 1278a "G" da SEQ ID N° 3, ou 11a "A" a 1996a "A" da SEQ ID N° 16. É descrito um ADN que se hibridiza em condições severas com o ADN constituído por qualquer um dos nucleótidos, em que o ADN codifica para uma proteína funcionalmente equivalente a uma proteína acima mencionada da presente invenção.

Condições severas podem ser seleccionadas de forma adequada por um perito no estado da técnica, e por exemplo condições de baixa severidade podem ser fornecidas. Condições de baixa severidade são por exemplo 42°C, 2xSSC, e 0,1% de SDS, e preferencialmente 50°C, 2xSSC, e 0,1% de SDS. Mais preferidas são condições de elevada severidade que são por exemplo 65°C, 2xSSC, e 0,1% de SDS. Nestas condições, quanto maior for a temperatura maior será a homologia do ADN obtido. O ADN acima que se hibridiza com o 23 ADN com as sequências da SEQ ID N° 1,3, e 16 é preferencialmente um ADN natural tal como um ADNc e ADN cromossomal.

Além disso, a presente invenção disponibiliza um vector contendo um ADN da invenção como inserção. 0 vector pode ser útil para manter o ADN em células hospedeiras ou para produzir a proteina da invenção.

Se a célula hospedeira for E. coli (tal como JM109, DH5a, HB101, e XLIBlue), qualquer vector pode ser utilizado desde que contenha "ori" para amplificação em E. coli que permite uma preparação em grande escala, e um marcador de selecção para transformantes (por exemplo, um gene de resistência que possibilita a selecção através de um fármaco, tal como a ampicilina, tetraciclina, canamicina, e cloroanfenicol). Por exemplo, podem ser utilizadas séries dos vectores M13 e vectores pUC, pBR322, pBluescript, pCR-Script, etc. Para a subclonagem ou excisão de um ADNc podem também ser utilizados pGEM-T, pDIRECT, pT7. Para produzir a proteina da invenção é especialmente útil um vector de expressão. Por exemplo, se as proteínas são para serem expressas em E. coli, o vector de expressão tem que ter caracteristicas tais como acima referido para serem amplificadas em E. coli, e um promotor para uma expressão eficiente, tal como o promotor lacZ (Ward et al., Nature 341: 544-546 (1989); FASEB J. 6: 2422-2427 (1992)), promotor araB (Better et al., Science 240: 1041-1043) (1988), ou promotor T7. Tais vectores incluem pGEX-5X-l (Pharmacia) , vectores no sistema QIAexpress™ (QIAGEN) , pEGFP, pET (BL21 que expressa a T7 ARN polimerase é utilizado favoravelmente como hospedeiro) e outros com excepção dos mencionados acima. O vector pode conter uma sequência de sinalização para a secreção de polipéptidos. A sequência de sinalização pelB (Lei S. P. et al., J. Bacteriol. 169:4379 (1987)) pode ser 24 utilizado para produzir as proteínas no periplasma de E. coli. Podem ser introduzidos vectores nas células hospedeiras, por exemplo, através do método de cloreto de cálcio ou electroporação.

Por exemplo, o vector de expressão para preparar a proteína da invenção pode ser um vector de expressão derivado de um mamífero (por ex. pcADN3 (Invitrogen), pEGF-BOS (Nucleic Acids. Res., 18(17):p5322 (1990)), pEF e pCDM8), um vector de expressão derivado de uma célula de insecto (por ex. "sistema de expressão de baculovirus Bac- para-BAC™" (GIBCO BRL) , pBacPAK8) , um vector de expressão derivado de uma planta (por ex. pMHl e pMH2), um vector de expressão derivado de um vírus de um animal (por ex., pHSV, pMV, e pAdexLcw), um vector de expressão derivado do retro-vírus (por ex., pZlpneo), um vector de expressão derivado de levedura (por ex. "Pichia Expression Kit" (In vitrogen), pNVll e SP-Q01), ou um vector de expressão derivado do Bacillus subtilis (por ex., pPL608 e pKTH50)sem ser E. coli.

Para a expressão em células de animais, tais como CHO, COS, e NIH3T3, o vector de expressão tem que ter um promotor tal como o promotor SV40 (Mulligan et al., Nature 277: 108 (1979)), promotor MMLV-LTR, promotor EFla (Mizushima et al., Nucleic Acids Res. 18:5322 (1990)), e promotor CMV. Mais especificamente, o vector pode conter um marcador para a selecção de células transfectadas (por exemplo, um gene resistente a um fármaco para a selecção através de um fármaco, tal como a neomicina e G418). Tais vectores incluem pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV, pOP13, etc.

Além disso, para se conseguir uma expressão estável do gene e amplificação do número de cópias dos genes em células, podem ser utilizadas células CHO deficientes na via metabólica para a síntese de nucleótidos. A célula de 25 CHO é transfectada com um vector de expressão contendo o gene DHFR que complementa a deficiência (tal como pCHOI), depois o vector pode ser amplificado através de tratamento com metotrexato (MTX). Para uma expressão genética transiente, podem ser utilizadas células COS contendo um gene que expressa o antigénio-SV40 T no seu cromossoma para transformar com um vector contendo a origem de replicação SV40 (tal como pCD) . Exemplos de origens de replicação a serem utilizadas na presente invenção incluem aquelas derivadas do poliomavirus, adenovirus, papilomavirus de bovino (BPV) e outros. Além disso, para amplificar as cópias dos genes em linhas de hospedeiros celulares, o vector de expressão pode incluir como marcador selectivo um gene de aminoglicósido transferase (APH), gene da timidina quinase, gene da E. coli xantina guanina fosforibosil transferase (Ecogpt), gene da dihidrofolato redutase (dhfr) e outros. A expressão in vivo do ADN da invenção pode ser efectuada construindo o ADN num vector adequado e transfectando a construção para o corpo utilizando retrovírus, lipossomas, lipossomas catiónicos, adenovirus etc. Pode ser possível utilizar uma tal construção na terapia génica para doenças que têm a sua origem nas mutações do gene NR10. Exemplos de vectores utilizados para este fim incluem um vector de adenovirus (tal como pAdexlcw) e um vector retrovíral (tal como pZLPneo). Manipulações gerais, tais como a inserção do ADN no vector pode ser efectuada utilizando métodos padrão (Molecular Cloning, 5.61-5,63). 0 vector pode ser administrado ao doente através de métodos ex vivo ou in vivo.

Outro objectivo desta invenção é disponibilizar um transf ormante que contém ADN da invenção de uma forma expressável. A célula hospedeira para inserir o vector da presente invenção não se encontra limitada de qualquer 26 forma, e E. coli, uma variedade de células animais etc. podem ser utilizadas. 0 transformante pode ser utilizado como um sistema produtor para preparar ou expressar uma proteína da invenção. Sistemas de produção in vitro ou in vivo são conhecidos como sistemas de produção para produzir proteínas. Sistemas de produção utilizando células eucarióticas e células procarióticas podem ser utilizadas como sistemas de produção in vitro.

Quando se utilizam células eucarióticas os sistemas de produção que utilizam, por exemplo, células animais, células de plantas e células fúngicas encontram-se disponíveis como hospedeiros. Exemplos de células animais utilizadas incluem células de mamíferos tais como células CHO (J. Exp. Med., 108:945 (1995)), COS, 3T3, mieloma, rim de hamster bébé (BHK), HeLa, Vero, células anfíbias tais como Xenopus oocytes (Valle, et al., Nature 291:338-340 (1981)), células de insecto tais como sf9, sf21, ou Tn5. Como células podem ser utilizadas de forma adequada especialmente DHFR célula CHO deficiente em genes, dhfr-CHO (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:4216-4220 (1980)), e CHO K-l (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 60: 1275 (1968)). Para uma preparação em grande escala em células animais podem ser utilizadas favoravelmente células CHO. O vector pode ser transfectado em células hospedeiras utilizando uma variedade de métodos, tais como aqueles que utilizam fosfato de cálcio, DEAE-dextrano, ou lipossoma catiónico DOTAP (Boeringer Mannheim), assim como electroporação, lipofecção etc. Células derivadas de Nicotiana tabacum são bem conhecidas como sistemas de produção de proteínas em células de plantas, e estas podem ser submetidas a cultura de caules. Como células fúngicas, leveduras como o género da Saccharomyces, por exemplo, Saccharomyces cerevisiae; 27 bactérias filamentosas, tais como do género Aspergillus, por exemplo Aspergillus niger.

Podem ser utilizadas células bacterianas como sistemas de produção procarióticos. Como células bacterianas são conhecidas, E. coli, por exemplo, JM109, DH5a, HB101 e semelhantes, assim como outras como o Bacillus subtilis.

Podem ser obtidas proteínas transformando estas células com o ADN objectivo e cultivando as células transformadas de acordo com processos conhecidos. Por exemplo, podem ser utilizados como meios de cultura de células animais DMEM, MEM, RPMI1640, e IMDM. Ocasionalmente podem ser adicionados soro fetal de vitela (FCS) e suplementos séricos semelhantes aos meios acima; alternativamente pode ser utilizado um meio isento de soro. 0 pH é preferencialmente de cerca de 6 a 8. A cultura é habitualmente efectuada a cerca de 30°C a 40°C, durante cerca de 15 a 200 h, e alterações do meio, arejamento e agitação são efectuadas quando necessário.

Por outro lado, por exemplo, sistemas de produção que utilizam animais e plantas podem ser fornecidos como sistemas de produção de proteina in vivo. O ADN objectivo é introduzido na planta ou animal, e a proteina é produzida na planta ou animal, e depois a proteina é recuperada. O termo "hospedeiro", quando utilizado na presente invenção abrange igualmente tais animais e plantas.

Quando se utilizam animais podem ser utilizados sistemas de produção de mamiferos e de insectos. Como mamíferos, cabras, porcos, ovelhas, ratinhos e bovinos (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications (1993)). Animais transgénicos podem também ser utilizados, quando se utilizam mamíferos.

Por exemplo, o ADN objectivo é preparado como um gene de fusão que codifica para uma proteína produzida intrinsecamente no leite, tal como a caseína de cabra β. A 28 seguir, o fragmento de ADN que contém o gene de fusão é injectado no embrião da cabra, e o seu embrião é implantado na cabra fêmea. A proteína objectivo pode ser recolhida do leite das cabras transgénicas produzidas a partir da cabra que recebeu o embrião, e dos seus descendentes. Para aumentar a quantidade de leite contendo proteína produzida a partir da cabra partir da cabra transgénica, pode ser fornecida às cabras transgénicas hormona/hormonas adequadas (Ebert, K. M. et al., Bio/Technology 12: 699-702 (1994)).

Podem ser utilizados bichos da seda como insectos. Quando se utilizam bichos da seda eles são infectados com baculovírus no qual o ADN que codifica para a proteína objectivo foi inserido, e a proteína desejada pode ser obtida a partir de fluidos corporais do bicho de seda (Susumu, M. et al., Nature 315:592-594 (1985)).

Quando se utilizam plantas, por exemplo, pode ser utilizado tabaco. No caso do tabaco o ADN que codifica para a proteína objectivo é inserido num vector de expressão da planta, por exemplo, pMON 530, e este vector é introduzido numa bactéria, tal como a Agrobacterium tumefaciens. O tabaco é infectado com esta bactéria, por exemplo Nicotiana tabacum e é capaz de se obter o polipéptido desejado a partir das folhas de tabaco (Julian, K. -C. Ma et al., Eur. J. Immunol. 24: 131-138 (1994)). A proteína da invenção assim obtida é isolada do interior ou do exterior (meio, etc.) da célula hospedeira, e pode ser purificada como uma proteína homogénea substancialmente pura. A separação e purificação da proteína pode ser efectuada utilizando separação convencional e métodos de purificação utilizados para purificar proteínas e não estão limitados a qualquer método específico. Por exemplo, uma coluna cromatográfica, filtração, ultrafiltração, precipitação com sal, precipitação com solvente, extracção com solvente, 29 destilação, imunoprecipitação, electroforese em gel de SDS-poliacrilamida, focagem isoeléctrica, diálise, recristalização, e semelhantes podem ser seleccionados de forma adequada, ou combinados para separar/purificar a proteina.

Por exemplo, cromatografia de afinidade, cromatografia de permuta iónica, cromatografia hidrofóbica, filtração por gel, cromatografia de fase reversa, cromatografia de adsorção e semelhantes podem ser exemplificadas como cormatografias (Strategies for Protein Purification e Characterization: A Laboratory Course Manual, Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor laboratory Press (1996)). Estas cromatografias podem ser efectuadas por cromatografia liquida tal como HPLC, FPLC, e outras. A presente invenção abrange proteínas altamente purificadas utilizando tais métodos de purificação.

As proteínas podem ser arbitrariamente purificadas, ou os péptidos podem ser excisados parcialmente tratando as proteínas com as enzimas de modificação adequadas antes ou depois da purificação. Tripsina, quimotripsina, lisil endopeptidase, proteína quinase, glucosidase e outras são utilizadas como enzimas de modificação proteicas. A presente invenção também disponibiliza anticorpos que se ligam à proteína da invenção. Não existe nenhuma restrição particular, quanto à forma do anticorpo da presente invenção e a presente invenção inclui anticorpos policlonais, assim como anticorpos monoclonais. 0 anti-soro obtido de animais imunizantes tais como coelhos com uma proteína da presente invenção, assim como anticorpos policlonais e monoclonais de todas as classes, anticorpos humanos e anticorpos humanizados construídos por engenharia genética também estão incluídos.

Uma proteína da invenção que é utilizada como antigénio sensibilizante para obter anticorpos não se 30 encontra limitada pelas espécies animais a partir das quais é obtida, mas é preferencialmente uma proteina derivada de mamíferos, por exemplo, seres humanos, ratinhos, ou ratos especialmente preferido de seres humanos. Podem ser obtidas proteínas de origem humana utilizando a sequência nucleótidica ou sequência de aminoácidos aqui revelada.

Aqui pode ser utilizado uma proteína intacta ou um péptido parcial como antigénio para humanização. Podem ser administrados como péptidos parciais das proteínas, por exemplo, o fragmento amino (N) terminal da proteína, e o fragmento terminal carbóxilo (C ) . Quando aqui utilizado "anticorpo" significa um anticorpo que reage especificamente com a proteína de comprimento completo ou com os seus fragmentos.

Um gene que codifica para uma proteína da invenção ou um seu fragmento é inserido num vector de expressão bem conhecido, e transformando as células hospedeiras com o vector aqui descrito é obtida a proteína objectivo ou um seu fragmento do interior ou do exterior da célula hospedeiro utilizando métodos bem conhecidos, e esta proteína pode ser utilizada como antigénio de sensibilização. Também células que expressam a proteína, lisados de células ou proteína da invenção sintetizada quimicamente podem também ser utilizadas como antigénio de sensibilização.

Os mamíferos que são imunizados pelo antigénio de sensitização não se encontram restringidos, mas é preferível seleccionar animais considerando a adaptabilidade às células progenitoras utilizadas na fusão celular. Geralmente são utilizados os animais que pertencem à família dos roedores, lagomorfos e primatas.

Exemplos de animais que pertencem aos roedores que podem ser utilizados incluem ratinhos, ratos, hamsters e outros. Exemplos de animais que pertencem a lagomorfos que 31 podem ser utilizados incluem por exemplo, coelhos. Exemplos de primatas que podem ser utilizados incluem macacos. Exemplos de macacos a serem utilizados incluem a infraordem catarrhini (macacos do velho mundo), por exemplo, macacos cinomolgus, macacos resus, babuinos sagrados, chimpanzés e outros. Métodos bem conhecidos podem ser utilizados para imunizar animais com um antigénio de sensibilização. Por exemplo, o antigénio de sensibilização é geralmente injectado intraperitonealmente ou por via subcutânea em mamíferos. Especificamente o antigénio sensibilizante é diluido de forma adequada e suspenso em soro fisiológico ou tampão fosfato salino (PBS) e misturado com uma quantidade adequada de um adjuvante geral se desejado, por exemplo com adjuvante completo de Freund. Depois a solução é emulsionada e injectada num mamífero. Depois o antigénio de sensibilização misturado de forma adequada com adjuvante incompleto de Freund é administrado preferencialmente várias vezes todos os 4 a 21 dias. Um suporte adequado pode também ser utilizado quando se imuniza um animal com o antigénio de sensibilização. Após imunização, a elevação no nível de anticorpo do soro é detectada através dos métodos habituais.

Anticorpos policlonais contra uma proteína da invenção podem ser obtidos como se segue. Depois de verificar que um nível desejado de anticorpo no soro foi atingido, é retirado sangue do mamífero sensibilizado com o antigénio. 0 soro é isolado deste sangue utilizando métodos bem conhecidos. Pode ser utilizado soro contendo o anticorpo policlonal como anticorpo policlonal, ou de acordo com as necessidades, a fracção contendo anticorpo policlonal pode ser ainda isolada a partir do soro. Por exemplo, uma fracção dos anticorpos que reconhece especificamente a proteína da invenção pode ser preparada utilizando uma 32 coluna de afinidade à qual a proteína é acoplada. Depois a fracção pode ser ainda purificada utilizando uma coluna de proteína A ou proteína G para preparar a imunoglubulina G ou imunoglobulina M.

Para obter anticorpos monoclonais após se ter verificado que o nível de anticorpo desejado no corpo é atingido no mamífero sensibilizado com o antigénio acima descrito são retirados imunócitos do mamífero e utilizados para a fusão da célula.

Com este objectivo podem ser mencionados esplenócitos como imunócitos preferidos. São preferencialmente utilizadas como células progenitoras fundidas com os imunócitos referidos acima, células do mieloma de mamífero. Mais preferencialmente, são utilizadas como células progenitoras células do mieloma que adquiriram a característica que pode ser utilizada para distinguir células de fusão por agentes. A fusão celular entre os imunócitos referidos acima e as células do mieloma podem ser conduzidos de acordo com métodos conhecidos, por exemplo o método de Milstein et al. (Galfre, G. e Milstein, C., Methods Enzymol. 73: 3-46 (1981)) . 0 hibridoma obtido a partir da fusão celular é seleccionado cultivando as células num meio padrão de cultura selectivo, por exemplo meio de cultura HAT (Hipoxantina, aminopterina, meio de cultura contendo timidina). A cultura neste meio HAT é continuada durante um período suficiente para as células (células de não fusão) diferentes das células do hibridoma alvo morrerem, geralmente desde alguns dias até a algumas semanas. A seguir, o método de diluição limitante é efectuado e o hibridoma que produz o anticorpo objectivo é pesquisado e clonado. 33

Um método diferente do acima mencionado para produzir hibridomas imunizando um animal sem ser um ser humano com o antigénio, pode ser obtido um hibridoma que produz os anticorpos humanos alvo que possui a actividade de se ligar a proteínas, através de um método de sensibilização de linfócitos humanos, por exemplo linfócitos humanos infectados com vírus EB, com proteínas, com células que expressam proteínas ou os seus lisados in vitro, fundindo os linfócitos sensibilizados com as células do mieloma derivadas de seres humanos, por exemplo U266, possuindo uma capacidade permanente de divisão celular (pedido de patente Japonesa não examinada (JP-A) N° Sho 63-17688) . Os anticorpos monoclonais obtidos podem ser purificados através de, por exemplo, precipitação com sulfato de amónio, coluna de proteína A ou proteína G, cromatografia por permuta iónica DEAE, coluna de afinidade à qual a proteína da presente invenção é acoplada, etc. 0 anticorpo pode ser útil para a purificação ou detecção de uma proteína da invenção. Pode igualmente ser um candidato para um agonista ou antagonista da proteína. Além disso, é possível de o utilizar para o tratamento com anticorpos de doenças em que a proteína está implicada. Para a administração in vivo (neste tal tratamento com anticorpos), anticorpos humanos, ou anticorpos humanizados podem ser favoravelmente utilizados devido à sua antigenicidade reduzida.

Por exemplo, um anticorpo humano contra uma proteína pode ser obtido utilizando hibridomas construídos fundindo células de mieloma com células produtoras de anticorpos obtidas imunizando um animal transgénico compreendendo um reportório de genes de anticorpo humano com um antigénio, tal como uma proteína, células que expressam proteínas, ou um seu lisado celular (WO92/03918, W0932227, W094/02602, W094/25585, W096/33735, e WO96/34096). 34

Para além de produzir anticorpos utilizando hibridomas podem também ser utilizados imunócitos produtores de anticorpos, tais como linfócitos sensibilizados que são imortalizados por oncogenes.

Tais anticorpos monoclonais podem também ser obtidos como anticorpos recombinantes produzidos através da técnica de engenharia genética (por exemplo, Borrebaeck, C.A.K. e Larrick, J. W., THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, publicado no reino Unido por MACMILLAN PUBLISHERS LTD. (1990) ) . Anticorpos recombinantes são produzidos clonando o ADN de imunócitos, tais como o hibridoma ou anticorpos produtores de linfócitos sensibilizados incorporando isto num vector adequado, e introduzindo este vector num hospedeiro para produzir o anticorpo. A presente invenção abrange também tais anticorpos recombinantes.

Além disso, o anticorpo da presente invenção pode ser um fragmento de anticorpo ou um anticorpo modificado desde que se ligue a uma proteína da invenção. Por exemplo, Fab, F(ab')2/ Fv, ou Fv de cadeia simples em que a cadeia H Fv e a cadeia L Fv estão ligadas de forma adequada através de um agente de ligação (scFFv. Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:5879-5883 (1988)) podem ser administrados como fragmentos de anticorpos. Especificamente são produzidos fragmentos de anticorpos tratando os anticorpos com enzimas, por exemplo, papaina, pepsina e outros, ou construindo um gene que codifica para um fragmento de anticorpo introduzindo isto num vector de expressão, e expressando este vector em células hospedeiras adequadas (por exemplo, Co, M.S. et al. , J. Immunol. 152:2 968-2 97 6 (1994); Better, M. e Horwitz, A. H., Methods Enzymol. 178: 476-496 (1989); Plukthun, A. e Skerra, A., Methods Enzymol., 178: 497-515 (1989); Lamoyi, E., Methods Enzymol. 121:652-663 (1986); Rousseaux, J. et al., MethodsEnzymol. 35 121:663-669 (1986); Bird, R.E. e Walker, B.W., Trends

Biotechnol. 9: 132-137 (1991)).

Podem ser utilizados como anticorpos modificados, anticorpos ligados a várias moléculas tais como polietileno glicol (PEG). O anticorpo da presente invenção abrange também tais anticorpos modificados. Para obter um tal anticorpo modificado são efectuadas modificações químicas no anticorpo obtido. Estes métodos já estão estabelecidos no campo. 0 anticorpo da invenção pode ser obtido como um anticorpo quimérico compreendendo uma região variável não-humana derivada de anticorpo e região constante derivada de anticorpo humano, ou um anticorpo humanizado compreendendo um anticorpo não humano derivado de uma região determinante da complementaridade (CDR) , anticorpo humano derivado da região da estrutura (FR), e região constante derivada do anticorpo humano utilizando métodos convencionais.

Os anticorpos obtidos deste modo podem ser purificados até à uniformidade. Os métodos de separação e purificação utilizados na presente invenção para separar e purificar o anticorpo pode ser qualquer método geralmente utilizado para as proteínas. Por exemplo, cromatografia em coluna, tal como cromatografia de afinidade, filtro, ultrafiltração, precipitação com sal, diálise, electroforese em gel SDS de poliacrilamida, electroforese de ponto isoeléctrico etc. Pode ser seleccionado e combinado para isolar e purificar anticorpos (Antibodies: a laboratory manual. Ed Harlow e David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)). Concentração de anticorpos do anticorpo acima mencionado pode ser doseada medindo a absorvância, ou através do ensaio de imunosorção de enzima ligada (ELISA), etc.

Pode ser utilizada uma coluna de proteína A ou proteína G para cromatografia de afinidade, a coluna de 36 proteína A pode ser por exemplo Hyber D™, POROS™, Sepharose F.F®. (Pharmacia) etc.

Pode ser igualmente utilizada outra cromatografia, tal como cromatografia de permuta iónica, cromatografia hidrofóbica, filtração em gel, cromatografia de fase reversa, e cromatografia de adsorção (Strategies for Protein Purification and Characterization: A laboratory Course Manual Ed. By Marshak D.R. et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996)). Esta pode ser efectuada por cromatografia líguida tal como HPLC ou FPLC.

Exemplos de métodos que testam a actividade de ligação ao antigénio dos anticorpos da invenção incluem por exemplo a medição da absorvância, ensaio de imunosorção de enzima ligada (ELISA), imunoensaio de enzima (EIA), radio-imunoensaio (RIA), ou método de anticorpo fluorescente. Por exemplo, quando se utiliza ELISA, pode ser adicionada uma proteína da invenção a uma placa revestida com anticorpos da invenção, e a seguir é adicionada, a amostra do anticorpo alvo, por exemplo, sobrenadantes de cultura de células produtoras de anticorpos, ou anticorpos purificados. Depois anticorpos secundários que reconhecem o anticorpo que é seleccionado por fosfatase alcalina e enzimas semelhantes é adicionado, a placa é incubada e lavada, e a absorvância é medida para avaliar a actividade de ligação ao antigénio após se adicionar um substracto enzimático tal como o fosfato de p-nitrofenil. Pode ser utilizada como proteína um fragmento de proteína, por exemplo um fragmento compreendendo um terminal C, ou um fragmento compreendendo um terminal N. Para avaliar a actividade do anticorpo da invenção, pode ser utilizado BIAcore™ (Pharmacia) .

Utilizando estes métodos, são feitos contactar o anticorpo da invenção e uma amostra que se considera conter uma proteína da invenção, e a proteína da invenção é 37 detectada ou ensaiada detectando ou ensaiando o complexo imunitário do anticorpo acima mencionado e proteina.

Um método para detectar ou dosear uma proteina da invenção é útil em várias experiências que utilizam proteínas, uma vez que pode detectar especificamente ou dosear as proteinas. É ainda descrito um polinucleótido de pelo menos 15 nucleótidos que é complementar ao ADN que codifica para a proteina humana NR10 (SEQ ID N° 1, 3, ou 16) ou para a sua cadeia complementar.

Aqui o termo "cadeia complementar" é definido como uma cadeia ou uma cadeia dupla de ADN composta de pares de bases A:T e G:C da outra cadeia. Também "complementar" é também definido como aqueles que emparelham completamente numa região continua de pelo menos 15 nucleótidos, mas que também possuem uma homologia de pelo menos 70%, favoravelmente 80%, ou mais elevada, mais favoravelmente 90%, ou mais elevada, e ainda mais favoravelmente 95% ou mais elevada naquela região. A homologia pode ser determinada utilizando o algoritmo aqui descrito.

Amostras ou iniciadores para detectar ou amplificar ADN que codifica para uma proteina da invenção, ou um nucleótido ou derivado de nucleótido para a supressão da expressão da proteina (tal como um oligonucleótido antisentido e ribozima) são aqui referidos. Tais polinucleótidos podem também ser utilizados para preparar chips de ADN.

Oligonucleótido antisentido que hibridiza com uma porção da sequência nucleótidica de qualquer uma da SEQ ID N°l, 3 e 16 está também incluido nos oligonucleótidos antisentido descritos na memória descritiva. Este oligonucleótido antisentido pode ser um contra pelo menos 15 nucleótidos contínuos em qualquer uma das sequências nucleótidicas da SEQ ID N° 1,3 e 16, ou pode ser o 38 oligonucleótido antisentido contra pelo menos 15 nucleótidos contínuos contendo um codao de início de tradução.

Derivados ou produtos modificados de oligonucleótidos antisentido podem ser utilizados como oligonucleótidos antisentido. Exemplos de tais produtos modificados são modificações de fosfonatos de alquilo inferiores tais como do tipo metil-fosfonato ou do tipo etil-fosfonato; fosforotioatos; produtos modificados de fosforoamidatos e semelhantes. 0 termo "oligonucleótido(s) antisentido" quando aqui utilizado significa não apenas aqueles em que os nucleótidos correspondentes aqueles que constituem uma região específica de um ADN ou de um ARNm são completamente complementares, mas são também aqueles que possuem um erro de emparelhamento de um ou vários nucleótidos desde que o ADN ou o ARNm e o oligonucleótido se possam hibridizar selectivamente e de forma estável com a sequência nucleótidica da SEQ ID N°l, 3, ou 16. 0 derivado oligonucleótidico anti-sentido descrito pode actuar em células que produzem uma proteína da invenção através da ligação do ADN ou do ARNm que codifica para a proteína para inibir a sua transcrição ou tradução e para promover a degradação do ARNm, e pode ter um efeito de suprimir a função da proteína da invenção suprimindo a expressão da proteína. 0 derivado oligonucleótido antisentido pode ser construído numa preparação externa, tal como um linimento e um cataplasma misturando com um material de base adequado, que é inactivo em relação aos derivados.

Também quando necessário os derivados podem ser formulados em comprimidos, pós, grânulos, cápsulas, cápsulas de lipossomas, injecções, soluções gotas para o nariz e agentes de secagem por congelação adicionando 39 excipientes, agentes isotónicos, solubilizantes, estabilizantes, conservantes, analgésicos, etc. Estes podem ser preparados utilizando métodos convencionais. 0 derivado de oligonucleótido antisentido pode ser administrado ao doente aplicando directamente no local a tratar, injectando-o no vaso sanguíneo e semelhante de modo a que atinja o local de tratamento. Um material de montagem antisentido pode também ser utilizado para aumentar a durabilidade e a permeabilidade da membrana. Exemplos são lipossomas, poli-L-lisina, lipidos, colesterol, lipofectina, ou seus derivados. A dosagem do derivado oligonucleótidico antisentido pode ser ajustada de forma adequada de acordo com o estado do doente e utilizado em quantidades desejadas. Por exemplo, pode ser administrada uma gama de dosagem de 0,1 a 100 mg/kg, por ex. 0,1 a 50 mg/kg. O derivado oligonucleótidico antisentido poderia ser útil na inibição da expressão da proteina da invenção e por isso poderia ser útil na supressão da actividade biológica da proteina da invenção. Inibidores de expressão compreendendo o derivado oligonucleotidico antisentido descrito poderia também ser útil, devido à sua capacidade de suprimir a actividade biológica da proteina da invenção.

Proteínas desta invenção são úteis para pesquisar a ligação de compostos à proteina. Isto é, as proteínas são utilizadas no método de pesquisa de compostos que se ligam a proteínas desta invenção em que o método compreende fazer contactar as proteínas desta invenção com uma amostra teste que se espera que contenha um composto para se ligar às proteínas e seleccionar um composto com a actividade de se ligar às proteínas desta invenção.

As proteínas desta invenção utilizadas na pesquisa podem ser qualquer dos péptidos recombinantes, naturais ou parciais. Também podem ser uma proteína purificada, os seus 40 péptidos parciais, ou estar na forma de proteinas expressas sobre a superficie celular, ou fracções membranares. As amostras a serem testadas não estão limitadas, mas podem ser extractos de células, sobrenadantes de cultura, produtos fermentados de microrganismos, extractos de organismos marinhos, extractos de plantas, proteinas purificadas ou parcialmente purificadas, péptidos, compostos não péptidicos, compostos de baixo peso molecular sintéticos, ou compostos naturais. A proteína da invenção pode ser exposta à amostra como uma proteína purificada ou proteína solúvel numa forma ligada a um suporte, como uma proteína de fusão com outra proteína, numa forma expressa sobre a superfície de uma membrana celular, ou como fracções de membranas.

Uma proteína da invenção pode ser utilizada para pesquisar proteínas que se ligam à proteína (tal como ligandos) utilizando uma variedade de métodos conhecidos do perito no estado da técnica. Esta pesquisa pode ser efectuada, por exemplo através do método da imunoprecipitação. Em particular o método pode ser efectuado como se segue. 0 gene que codifica para a proteína desta invenção é expresso inserindo o gene num vector para a expressão de genes estranhos, tal como pSV2neo, pcADN I, pCD8, e semelhantes e expressando os genes em células animais etc. Podem ser utilizados para a expressão quaisquer promotores habitualmente usados incluindo o promotor precoce SV40 (Rigby em Williamson (ed.), Genetic Engineering, vol. 3. Academic Press, Londres, p.83-141 (1982)), promotor α EF-1 (Kim et al. Gene 91:217-223 (1990)), promotor CAG (Niwa et al. Gene 108: 193-200 (1991)), promotor RSV LTR (Cullen, Methods in Enzymology 152:684-704 (1987)), promotor SR α (Takebe et al. Mol. Cell. Biol. 8:466 (1988)), promotor precoce imediato CMV (Seed e Aruffo Proc. Natl. Acad. Sei. USA 41 84:3365-3369 (1987)), promotor tardio SV40 (Gheysen e Fiers J. Mol. Appl. Genet. 1:385-394 (1982)), promotor tardio de Adenovirus (Kaufman et al., Mol. Cell. Biol. 9:946 (1989)), promotor HSV TK, etc. Transferência de um gene estranho em células de animais para a sua expressão pode ser efectuada através de qualquer um dos métodos seguintes, incluindo o método da electroporação (Chu, G. et al. Nucl. Acid Res. 15:1311-1326 (1987)), o método do fosfato de cálcio (Chen, C. e Okayama, H. Mol. Cell. Biol. 7:2745-2752 (1987)), o método do dextrano DEAE (Lopata, Μ. A. et al. Nucl. Acids Res. 12: 5707-5717 (1984); Sussman, D. J. e Milman, G. Mol. Cell. Biol. 4: 1642-1643 (1985)), o método da lipofectina (Derijard, B. Cell. 7:1025-1037 (1994); Lamb, B.T. et al Nature Genetics 5: 22-30 (1993)), Rabindran, S. K. et al. Science 259:230-234 (1993)), etc.

Uma proteina da presente invenção pode ser expressa como uma proteína de fusão que possui o local de reconhecimento para um anticorpo monoclonal introduzindo um local de reconhecimento (epitopo) para um anticorpo monoclonal, em que a especificidade foi estabelecida no terminal N ou C da proteína desta invenção. Pode ser utilizado para este fim, um sistema comercial de epitopo-anticorpo (Jikken Igaku (Experimental Medicine) 13:85-90 (1995)). Estão comercialmente disponíveis vectores que são capazes de expressar proteínas de fusão com β-galactasidase, proteína de ligação à maltose, glutationa-S-transferase, proteína de fluorescência verde (GFP), e semelhantes através de um local de multi-clonagem.

Para minimizar a alteração das propriedades da proteína desta invenção devido à formação de uma proteína de fusão foi divulgado um método para preparar uma proteína de fusão introduzindo apenas uma pequena porção de um epitopo compreendendo vários até 10 resíduos de aminoácidos. Podem ser utilizados por exemplo, os epitopos 42 de polihistidina (His-tag), hemaglutinina da gripe (HA), c-myc humana, FLAG, glicoproteína do vírus da estomatite vesicular (VSV-GP), proteína 10 do gene T7 (T7-tag), glicoproteína do vírus simplex do herpes humano (HSV-tag), E-tag (epitopo no fago monoclonal), e semelhantes e anticorpos monoclonais para reconhecerem estes epitopos como sistema epitopo-anticorpo para pesquisar proteínas que se ligam à proteína desta invenção (Jikken Igaku (Experimental Medicine) 13, 85-90 (1995)).

Na imunoprecipitação são formados imuno complexos adicionando estes anticorpos ao lisado celular preparado utilizando agentes tensioactivos adequados. Este imuno complexo é constituído por uma proteína desta invenção, uma proteína capaz de se ligar à proteína, e um anticorpo. A imunoprecipitação pode também ser efectuada utilizando um anticorpo de uma proteína desta invenção para além de anticorpos dos epitopos descritos acima. Um anticorpo para uma proteína desta invenção pode ser preparado inserindo um gene que codifica para uma proteína desta invenção num vector de expressão adequado para E. coli para o expressar na bactéria, purificar a bactéria expressa deste modo, e imunizando coelhos, ratinhos, ratos, cabras, galinhas e outros com a proteína purificada. O anticorpo pode também ser preparado imunizando os animais acima descritos com péptidos parciais da proteína desta invenção.

Complexos imunitários podem ser precipitados utilizando por exemplo sefarose da proteína A e sefarose da proteína G no caso em que o anticorpo é um anticorpo de IgG de murino. Além disso, no caso em que a proteína desta invenção é preparada como uma proteína de fusão com o epitopo de, por exemplo, GST e outros o imuno complexo pode ser formado utilizando uma substância que se liga especificamente a estes epitopos, tais como glutationa- 43 sefarose 4B e outros dando o mesmo resultado que no caso em que o anticorpo para a proteína desta invenção é utilizado. A imuno precipitação em geral pode ser efectuada de acordo com ou seguindo o método descrito na literatura (Harlow, E. e Lane, D.: Anticorpos p. 511-552, Cold Spring Harbor Laboratory publications, Nova Iorque (1988)). SDS-PAGE é geralmente utilizado para a análise de proteínas imunoprecipitadas, e as proteínas ligadas podem ser analisadas baseadas nos pesos moleculares de proteínas utilizando um gel de uma concentração adequada. Neste caso, apesar das proteínas ligadas a uma proteína desta invenção, em geral, serem dificilmente detectáveis através do método usual de coloração de proteinas, tais como coloração com Coomassie e coloração com prata, a sensibilidade da detecção pode ser melhorada cultivando células num meio contendo o radio isótopo marcado com metionina 35$ e 35s-cisteína para marcar as proteínas dentro das células e para detectar as proteínas marcadas. Quando o peso molecular da proteína é determinado a proteína desejada pode ser purificada directamente a partir do gel de SDS-poliacrilamida e sequenciado.

Além disso, a pesquisa de proteínas ligadas a uma proteína da presente invenção pode ser também efectuada utilizando o método de transferência de Western (Skolnik, E. Y. et al., Cell 65:83-90 (1991)). Especificamente o ADNc é isolado a partir de células, tecidos e orgãos (por exemplo, tecido, células, ou células cultivadas de coração; placenta, testículos, timo, leucócitos periféricos etc.) em que é esperado que a ligação à proteína desta invenção seja expressa e transferida para um vector fago (por exemplo, Xgtll, ZAPII etc.), para preparar uma biblioteca de ADNc que é então expressa em placas revestidas com um meio de crescimento. A proteína expressa deste modo é fixa sobre um filtro, que é então feito reagir com a proteína purificada 44 marcada desta invenção, e as placas que expressam as proteínas ligadas à proteína desta invenção podem ser detectadas pela marcação. Métodos para marcar uma proteína desta invenção incluem métodos que utilizam a actividade de ligação da biotina e avidina, métodos que utilizam anticorpos que se ligam especificamente à proteína desta invenção, ou péptidos ou polipéptidos (por exemplo GST etc.) fundidos com a proteína desta invenção, métodos que utilizam os radioisótopos, métodos que utilizam fluorescência, etc.

Além disso, um outro método de pesquisa é exemplificado através de um método que utiliza o sistema 2-híbrido utilizando células (Fields, S., e Sternglanz, R., Trends. Genet. 10: 286-292 (1994); Dalton S, e Treisman R, "Characterization of SAP-1, uma proteína recrutada pelo factor de resposta sérico ao elemento de resposta sérico c-fos. "Cell 68: 597-612 (1992), "MATCH-MARKER Two-Hybrid

System", "Mammalian MATCHMARKER Two-Hybrid Assay Kit", "MARCHMARKER One-Hybrid System" (Clontech); "HybriZAP Two-Hybrid Vector System" (Stratagene)). No sistema de 2-híbridos, uma proteína da invenção pode ser fundida com o domínio de ligação do ADN de SRF ou GAL4, e expressa em levedura. Uma biblioteca de ADNc é construída a partir de células que se prevê expressarem proteínas que se ligam à proteína da presente invenção, em que a biblioteca de ADNc é construída de tal modo que as proteínas são expressas como proteínas de fusão com regiões de activação da transcrição de VP16. A biblioteca de ADNc é transfectada para a levedura acima, e depois os clones positivos são detectados para isolar o ADNc derivado da biblioteca (Expressão de uma proteína que se liga à proteína da invenção na levedura conduz à ligação de duas proteínas, e resulta na activação do gene repórter que permite a detecção de clones positivos). A proteína codificada pelo 45 ADNc isolado pode ser obtida introduzindo o ADNc em E. coli e expressando-o ali. Assim, é possivel preparar proteínas que se ligam a uma proteína da invenção e genes que as codificam. 0 gene repórter utilizado num sistema de dois híbridos pode ser HIS3, Ade2, LacZ, CAT, luciferase, ou PAI-I (inibidor do activador plasminogénico do tipo I), mas não se encontra limitado a estes. A pesquisa de compostos que se ligam a uma proteína desta invenção também pode ser efectuada utilizando cromatografia de afinidade. Por exemplo, a proteína desta invenção é imobilizada sobre um suporte na coluna de cromatografia de afinidade à qual uma amostra teste que se espera que expresse uma proteína que se liga à proteína desta invenção é aplicada. As amostras podem ser extractos de células, lisados celulares, ou outros. Após se ter aplicado a amostra teste a coluna é lavada, e a proteína que se liga à proteína da invenção pode ser obtida. A proteína obtida pode ser analisada, quanto à sua sequência de aminoácidos para sintetizar sondas de oligonucleótidos que podem ser utilizadas para pesquisar uma biblioteca de ADNc para obter um ADN que codifica a proteína.

Um biosensor que utiliza ressonância de plasmão de superfície pode ser utilizado para detectar ou medir o composto ligado. Um tal sensor (como BIAcore da Pharmacia)) pode possibilitar observar a interacção em tempo real utilizando uma pequena quantidade de proteína sem a necessidade de marcação. Assim, é possível avaliar a interacção entre a proteína da invenção e as amostras utilizando um biosensor como BIAcore.

Além disso, compostos que se ligam a uma proteína da invenção (incluindo agonistas e antagonistas), cujos compostos não são sempre proteínas podem ser isolados utilizando uma variedade de métodos conhecidos pelo perito 46 no estado da técnica. Por exemplo, a proteína da invenção pode ser fixada e exposta a compostos sintéticos, um banco de compostos naturais, ou uma biblioteca de péptidos de fagos aleatória para pesquisar uma molécula que se liga a uma proteína. Alternativamente, pode ser efectuado rastreio de alto débito utilizando química combinatória (Wrighton NC, Farrel FX, Chang R, Kashyap AK, Barbone FP, Mulcahy LS, Johnson DL, Barrett RW, Jolliffe LK, Dower WJ., "Small peptides as potent mimetics of the protein hormone erythropoietin. "Science (UNITED STATES) 273:458-464 (Jul 26 1996); Verdine G.L., "The combinatorial chemistry of nature" Nature (ENGLAND) 384: 11-13 (Nov 7 1996); Hogan JC Jr., "Directed combinatorial chemistry." Nature (ENGLAND) 384: 17-9 (Nov 7 1996)) . A pesquisa de um ligando que se liga a uma proteína da invenção pode ser efectuada como se segue. 0 domínio extracelular da proteína da invenção é fundido com o domínio intracelular incluindo o domínio transmembranar de uma proteína de um receptor de hemopoietina que possui uma capacidade conhecida de transdução de um sinal para preparar um receptor quimérico. 0 receptor quimérico pode ser expresso sobre a superfície da célula de uma linha celular adequada, favoravelmente uma linha celular que é capaz de crescer apenas na presença de um factor de crescimento adequado (factor de crescimento dependente da linha celular). Depois a linha celular pode ser cultivada em meio suplementado com um material da amostra em que uma variedade de factores de crescimento, citocinas, ou factores hematopoiéticos podem ser expressos. De acordo com este método, a linha celular dependente do factor de crescimento pode sobreviver apenas e proliferar, quando a amostra contém um ligando apropriado que se liga especificamente ao domínio extracelular da proteína da invenção. Pode ser utilizado o receptor conhecido da 47 hemopoietina, tal como um receptor da trombopoietina, receptor da eritropoietina, receptor G-CSF, e gpl30. 0 parceiro para construir um receptor quimérico para pesquisar o sistema da presente invenção não se encontra limitado aos receptores acima desde que o seu dominio intracelular disponibilize uma estrutura necessária para a actividade do sinal de transdução. A linha celular dependente do factor de crescimento pode ser uma linha celular dependente de IL-3, tal como BaF3 ou FDC-P1.

Num caso raro, o ligando que se liga especificamente a uma proteina da invenção pode não ser uma proteina solúvel, mas uma proteina ligada à membrana. Neste caso, pode ser efectuada uma pesquisa utilizando uma proteina que compreende apenas o dominio extracelular da proteina da invenção, ou uma proteina de fusão em que o dominio extracelular se encontra ligado a uma parte de outras proteínas solúveis. Tais proteínas encontram-se marcadas antes de serem utilizadas para medir a ligação com as células que se espera que expressem o ligando. A primeira proteína compreendendo apenas o domínio extracelular pode ser uma proteína receptora solúvel construída artificialmente através da introdução de um codão de paragem na região N-terminal do domínio transmembranar, ou uma proteína solúvel tal como NR10.2. A última proteína de fusão pode ser uma proteína em que a região Fc da imunoglobulina G, ou o péptido FLAG se encontra ligado ao terminal C do domínio extracelular. Estas proteínas solúveis marcadas podem ser também úteis para detecção, através do método west-western.

Uma proteína quimérica do domínio extracelular de uma proteína da invenção e a região Fc de um anticorpo (tal como IgG humano) pode ser purificado utilizando uma coluna de proteína A. Uma tal proteína quimérica semelhante a um anticorpo retém a capacidade de ligação do ligando. Assim, 48 a proteína pode ser marcada de forma adequada com um isótopo etc., e utilizada para a pesquisa de um ligando (Suda T. et al., Cell 175:1169-1178 (1993)). Algumas citocinas tais como moléculas da família TNF existem basicamente numa forma ligada à membrana, assim tais ligandos podem ser isolados expondo a proteína quimérica semelhante a um anticorpo a uma variedade de células e seleccionando as células através da capacidade de ligação à proteína. Alternativamente, podem ser isolados ligandos de acordo com o mesmo método utilizando células nas quais uma biblioteca de ADNc é introduzida. Além disso, a proteína quimérica semelhante a um anticorpo pode também ser utilizada como antagonista.

Os compostos obtidos através do método de pesquisa acima podem ser candidatos a fármacos que activam ou inibem a actividade de uma proteína da invenção. Pode ser possível utilizar tais compostos para o tratamento de doenças que surgem da expressão anormal ou desordem funcional de uma proteína da presente invenção. 0 composto obtido através do método de pesquisa da invenção pode incluir compostos que resultam da modificação do composto que possui a actividade de se ligar à proteína da invenção adicionando, suprimindo e/ou substituindo uma parte da estrutura.

Quando se utiliza o composto isolado ou uma proteína da invenção (tipo armadilha (forma solúvel)) como um fármaco para seres humanos e outros mamíferos, por exemplo ratinhos, ratos, porquinhos da índia, coelhos, galinhas, gatos, cães, ovelhas, porcos, gado, macacos, babuínos sagrados, chimpanzés, o composto isolado pode ser administrado directamente ou pode ser formulado numa forma farmacêutica utilizando métodos conhecidos de preparação farmacêutica. Por exemplo, de acordo com a necessidade, os fármacos podem ser tomados oralmente, como comprimidos revestidos com açúcar, cápsulas, elixires e microcápsulas, 49 ou por via parenteral na forma de injecções de soluções estéreis, suspensões com água, ou qualquer liquido farmaceuticamente aceitável. Por exemplo, os compostos podem ser misturados com veiculos farmacologicamente aceitáveis ou meio, em particular água esterilizada, soro fisiológico, óleo de plantas, emulsionantes, solventes, agentes tensioactivos, estabilizantes, aromas, excipientes, veiculos, conservantes e agentes ligantes numa forma de dosagem necessária para uma implementação do fármaco aceite de forma geral. A quantidade de princípios activos nestas preparações torna uma dosagem apropriada possivel de adquirir na gama indicada.

Exemplos de aditivos que podem ser misturados com comprimidos e cápsulas são ligantes como a gelatina, amido de milho, goma de tragacanto e goma arábica; excipientes tais como a celulose cristalina; agentes de inchamento, tais como amido de milho, gelatina e ácido alginico; lubrificantes tais como estearato de magnésio; edulcorantes tais como a sacarose, lactose ou sacarina; agentes de aromatização tais como a hortelã-pimenta, óleo de Gaultheria adenothrix e cereja. Quando a forma de dosagem é uma cápsula, um veiculo liquido, tal como óleo pode ser incluido nos ingredientes acima. Compostos estéreis para injecções podem ser formulados seguindo-se implementação normal do fármaco utilizando veiculos tais como água destilada utilizada para as injecções.

Por exemplo, soro fisiológico, glucose e outros líquidos isotónicos incluindo adjuvantes como D-sorbitol, D-manose, D-manitol, e cloreto de sódio podem ser utilizados na forma de soluções aquosas para injecções. Estes podem ser utilizados conjuntamente com solubilizantes adequados, tais como álcool, em particular etanol, poliálcoois tais como propileno glicol e polietileno 50 glicol, agentes tensioactivos não iónicos, tal como Polissorbato 80 ™ e HCO-50. Óleo de sésamo ou óleo de soja podem ser utilizados como liquido oleaginoso e pode ser utilizado em conjunção com benzoato de benzilo ou álcool benzilico como solubilizante; pode ser formulado com um tampão, tal como tampão fosfato e tampão de acetato de sódio, um analgésico tal como cloridrato de procaina; um estabilizante como álcool benzilico, fenol; e um anti-oxidante. A injecção preparada é geralmente vertida para uma ampola adequada.

Processos bem conhecidos de um perito no estado da técnica podem ser utilizados para administrar o composto farmacêutico aos doentes, por exemplo através de administração intra-arterial , intravenosa, inj ecções percutâneas e também por via intranasal, transbrônquica, intramuscular ou oral. A dosagem e método de administração variam de acordo com o peso corporal e idade do doente, com o método de administração e outros, mas um perito no estado da técnica pode seleccioná-los de forma adequada. Se o dito composto for codificável por um ADN, o dito ADN pode ser inserido num vector para terapia génica para efectuar a terapia. A dosagem e processo de administração podem variar de acordo com o peso corporal, idade, sintomas de um doente etc., mas um perito no estado da técnica pode seleccioná-los de forma adequada.

Por exemplo, a dose da proteína (tipo armadilha (forma solúvel)) pode variar dependendo do doente, orgão alvo, tipo de doença e método de administração. Contudo, pode ser injectado num adulto normal (peso corporal, 60 kg) com uma dose de 100 μg a 10-20 mg por dia.

Por exemplo, apesar de haver algumas diferenças de acordo com os sintomas, a dose de um composto que se liga a uma proteína da presente invenção, ou um composto que inibe a actividade da proteína desta invenção pode ser de cerca 51 de 0,1 mg a cerca de 100 mg por dia por ex. cerca de 1,0 mg a cerca de 50 mg por dia, ou cerca de 1,0 mg a cerca de 20 mg por dia, quando administrada oralmente a um adulto padrão (peso 60 kg).

Quando a proteina é administrada por via parenteral na forma de uma injecção a um adulto padrão (peso 60 kg), apesar de existirem algumas diferenças de acordo com o doente, orgão alvo, sintomas e métodos de administração é conveniente injectar por via intravenosa uma dose de cerca de 0,01 mg a cerca de 30 mg por dia, por ex. cerca de 0,1 a cerca de 20 mg por dia, ou cerca de 0,1 a cerca de 10 mg por dia. Também no caso de outros animais é possível administrar uma quantidade convertida para 60 kg de peso corporal ou área superficial.

Breve Descrição das Figuras A Fig. 1 apresenta a sequência nucleótidica de AQ022781 na base de dados gss. A sequência de aminoácidos deduzida é apresentada debaixo da sequência de exões prevista. O motivo YR e motivo WS foram utilizados como alvo e estão dentro de um rectângulo.

Dois "n" na sequência nucleótidica estão também no centro de um rectângulo. A Fig. 2 apresenta sequência de aminoácidos parciais de NR10 encontradas na sequência de AQ022781, e daquelas de receptores conhecidos de hemopoietina que possuem homologia com eles. Resíduos idênticos encontram-se dentro de um rectângulo a sombreado, e resíduos semelhantes são sombreados. Os hiatos estão sublinhados. Receptores de hemopoietina conhecidos são de cima para baixo gpl30 humano (Genbank n° de acesso NM002184.1; IL6ST) , receptor LIF humano (Genbank n° de acesso NM002310.1; LIFR), subunidade β do receptor M da oncostatina humana (Genbank n° de acesso 52 ΝΜ003999.1; OSMR), subunidade β2 do receptor IL-12 humano (Genbank n° de acesso NM001559.1; IL12RB2), e NR6 humano (GenBank Accession N° AC003112).

Fig. 3 apresenta a sequência nucleótidica do ADNc de NR10.1 de de comprimento completo que foi obtido combinando os produtos 5'- e 3'-RACE. A sequência de aminoácidos que codifica para NR10.1 é também apresentada. A sequência de aminoácidos prevista para ser a sequência de sinal de secreção encontra-se sublinhada. 0 dominio transmembranar previsto encontra-se a sombreado. Residuos de cisterna conservados e o motivo WS encontram-se dentro de um rectângulo. A Fig. 4 é uma continuação da Fig. 3. A Fig. 5 é uma continuação da Fig. 4. A Fig. 6 apresenta a sequência nucleótidica do ADNc de NR10.2 de comprimento completo que foi obtido combinando os produtos 5'- e 3'-RACE. A sequência de aminoácidos deduzida que codifica para NR10.2 é também indicada. A sequência de sinalização da secreção prevista encontra-se sublinhada. Residuos de cisteina conservados e o motivo WS encontram-se dentro de um rectângulo. A Fig. 7 é uma continuação da Fig. 6. A Fig. 8 apresenta fotografias que demonstram o resultado da análise RT-PCR do padrão de expressão do gene NR10.1 em orgãos humanos. A Fig. 9 apresenta fotografias que demonstram o resultado da análise de RT-PCR do padrão de expressão do gene NR10.2 em orgãos humanos. A Fig. 10 apresenta uma fotografia que apresenta o resultado da quantificação da expressão do gene NR10.1 em orgãos humanos através de transferência de Southern. A Fig. 11 apresenta uma fotografia que demonstra o resultado da quantificação da expressão do gene NR10.2 nos orgãos humanos por transferência de Southern 53 A Fig. 12 é uma ilustração esquemática da estrutura da proteina a ser expressa a partir da construção do vector de expressão. A Fig 13 apresenta a sequência nucleótidica do ADNc de NR10.3 de comprimento completo. A sequência de aminoácidos deduzida que codifica para o NR10.3 é também apresentada. A sequência de sinal da secreção prevista encontra-se sublinhada. A sequência de aminoácidos prevista como sendo o dominio transmembranar é colorida. Resíduos cisteínicos conservados e o motivo WS encontram-se dentro de um rectângulo. A Fig. 14 é uma continuação da Fig. 13.

Melhor Modo para Realizar as Invenções

Esta invenção será explicada em detalhe abaixo com referência a exemplos.

[Exemplo 11 Isolamento dos genes de NR10.1 e NR10.2 (1) Pesquisa BLAST

Os inventores pretenderam encontrar outro motivo conservado entre a família de receptores da hemopoietina, para além do motivo Trp-Ser-Xaa-Trp-Ser (motivo WS), para desenhar uma sonda oligonucleótidica incluindo ambos os motivos. Os inventores examinaram a sequência de outras regiões para outro motivo. Como resultado encontraram um resíduo de tirosina ou histidina no domínio extracelular das proteínas da família, localizadas 13 a 27 aminoácidos a montante do motivo WS que é conservado a elevada frequência. Examinaram ainda os seis resíduos de aminoácidos localizados no terminal C do resíduo Tyr/His 54 para uma sequência consenso que aparece com uma frequência elevada, e encontraram a seguinte sequência de aminoácidos: (Tyr/His)-Xaa-(Hydrofóbico/Ala)-(Gln/Arg)-hidrofóbico-Arg (referido a seguir como motivo YR) . Contudo, o motivo YR não é considerado uma sequência consenso perfeita, e também a combinação de sequências nucleótidicas que podem codificar o motivo é realmente complicada. Assim, tornou-se muito dificil sintetizar todas as sequências nucleótidicas que codificam para a sequência de aminoácidos e fornecê-las como sonda para hibridização, um método prático de rastreio, ou como o iniciador para RT-PCR.

Neste contexto, os inventores examinaram um método especifico de rastreio para um novo receptor de hemopoietina utilizando os motivos acima como sonda. Como resultado verificaram ser razoável efectuar uma pesquisa de base de dados num computador utilizando uma pesquisa composta por uma sequência parcial de aminoácidos de receptores de hemopoietina conhecidos, um fragmento incluindo ambos os motivos.

Primeiro, as sequências de aminoácidos que preencheram a condição necessária de conter ambos os motivos foram desenhadas para preparar uma para uma pesquisa para rastreio de base de dados. Apesar da família de receptores conter normalmente um espaçador de 7 a 10 aminoácidos entre os motivos, o agente de espaçamento foi fixado em 10 aminoácidos em média. Esperava-se que mesmo se o comprimento do agente espaçador nos genes alvo fosse diferente do da pesquisa, o hiato seria cheio com espaço de modo a não interferir com a pesquisa. Além disso, o número de resíduos não determinados foi minimizado de modo a aumentar a qualidade da sequência e melhorar a sensibilidade da detecção. Assim, baseado na sequência que apareceu frequentemente em receptores conhecidos da hemopoietina, foram desenhados três padrões por tentativas 55 para o motivo YR, dois resíduos em ambos os terminais do agente de espaçamento, e os resíduos no centro e o terminal C do motivo WS, respectivamente como na Tabela 1.

Tabela 1

Motivo YR Agente de espaçamento de aminoácidos Motivo WS YTVQVR AR XXXXXX GT WSEWSP YTVQVR VQ XXXXXX GY WSDWSE YSLQLR CK XXXXXX GI WSPWSQ

Combinando o motivo YR, agente de espaçamento e o motivo WS descrito na Tabela 1 obtêm-se 27 pesquisas diferentes. As pesquisas utilizadas para rastrear a base de dados nr en GenBanK utilizando o programa TblastN ( Advanced TblastN 2.0.8). Os parâmetros para a pesquisa foram colocados como Valor Expectável=l00, Descrições =100, e Alinhamentos=100. Como consequência muitos dos receptores de hemopoietina conhecidos foram identificados como positivos, confirmando que o método estava a trabalhar de forma correcta. Depois as mesmas pesquisas foram utilizadas para rastrear a base de dados EST, assim como na base de dados gss e htgs para detectar uma sequência que poderia codificar para um novo receptor de hemopoietina. Contudo, o resultado não deu origem a quaisquer clones positivos que parecessem novos. Foi considerado que a variedade limitada das 27 pesquisas acima mencionadas era a causa do resultado. Neste contexto, foi tentada uma outra preparação de uma variedade de sequências para a pesquisa, mas a combinação das sequências tornou-se demasiado complicada para continuar a preparação manualmente. Finalmente, os investigadores decidiram utilizar sequências de aminoácidos parciais de receptores de hemopoietina conhecidos que foram fragmentados de modo a incluir tanto os motivos YR e WS 56 para preparar uma pesquisa para um rastreio na base de dados.

Comparação da estrutura genómica da família de receptores revelou que os motivos YR e WS estão contidos num único exão em todos os receptores de hemopoietina conhecidos examinados. Isto sugere que a continuidade e compatibilidade de ambos os motivos pode também ser retida na sequência genómica. Espera-se por isso que o exão de um receptor conhecido de hemopoietina que codifica para ambos os motivos sejam eficazes como pesquisa para rastrear o gene alvo na base de dados EST, e na base de dados genómica também. Aqui as sequências dos receptores gpl30 humano e LIF humano foram utilizadas como a sequência conhecida do receptor de hemopoietina, porque as suas estruturas possuem uma semelhança relativamente elevada entre a família de receptores e espera-se que a semelhança seja partilhada no novo receptor alvo. Enquanto que as sequências de gp 130 humano e receptor LIF humano já eram conhecidas, os inventores utilizaram a sequência de aminoácidos codificada pelo ADNc que tinha sido isolada pelos próprios inventores utilizando a técnica de hibridização em placa e RT-PCR com uma sonda que codifica para o motivo WS.

Com base na estrutura genómica sabe-se que os receptores da hemopoietina têm que conter um exão que codifica para os motivos YR e WS com um comprimento de 50 a 70 aminoácidos. Neste contexto, 29 aminoácidos até ao terminal N e 30 aminoácidos até ao terminal C desde o primeiro resíduo Tyr no motivo YR foi cortado um total de 60 aminoácidos da sequência de gp 130 humana e do receptor LIF humano para preparar uma sequência de pesquisa por questões de conveniência. 0 receptor LIF contém dois motivos WS, e o segundo (do lado do terminal C) foi seleccionado um motivo WS considerando a conservação do motivo YR. As pesquisas acima foram utilizadas para 57 pesquisar a gss (Sequência de Pesquisa Genómica -do inglês "Genomic Survey Sequence") e a base de dados htgs na GenBank utilizando TblastN (Advanced TblastN 2.0.8). Os parâmetros foram regulados para Valor Expectável=50, Descrições =100, e Alinhamentos=100. O comprimento da sequência de pesquisa seleccionada, 60 aminoácidos não foi exactamente o mesmo que o da actual sequência de exões. Contudo, entrando em linha de conta que o comprimento deste exão em genes de receptores de hemopoietina conhecidos difere um pouco de acordo com cada gene e tomando como muito importante a conservação de ambos os motivos YR e WS decidiu-se que a diferença pode não interferir com a pesquisa. As bases gss e htgs foram utilizadas, porque estas sequências genómicas não foram completamente analisadas devido à sua complexidade e assim era de esperar que fossem adequadas para identificar novos genes receptores. Uma vez que as pesquisas eram mais longas do que as anteriores 27 pesquisas artificiais, foram regulados os parâmetros Valor Expectável=50, Descrições =100, e Alinhamentos=l00 para reduzir a sensibilidade da detecção de modo a evitar o aumento de clones falsos positivos que possuem homologia em relação a uma região diferente da dos motivos. Assim, espera-se que isto permita a detecção de genes alvo suprimindo a detecção de clones falso positivos que apresentam homologia em sequências diferentes da sequência alvo do motivo.

Como resultado a investigação resultou em muitos clones falsos positivos, e aqueles clones em que tanto os motivos YR e WS não eram codificados na mesma grelha de leitura, ou que continham um codão de paragem entre os motivos foram desprezadas. Também aqueles clones contendo apenas o motivo YR, mas não o motivo WS foram eliminados, porque como mencionado acima, o motivo YR não é uma sequência de consenso completamente estabelecida. Por isso, 58 a conservação do motivo WS foi considerada predominante. Como resultado, foi seleccionado um clone único contendo a sequência genómica humana (N° de acesso do GenBank AQ022781) que se esperava codificar para uma parte de um novo gene receptor da hemopoietina, e o gene foi designado NR10. AQ022781 é a sequência terminal de um clone BAC constituído por 459 pb, depositado na base de dados gss. Foi o único clone que era também positivo em ambas os rastreios utilizando sequências de aminoácidos parciais de gp 130 humano ou receptor LIF como pesquisa respectivamente. Considerou-se que o grau de confiança da sequência poderia ser baixo devido à existência de dois "n" no meio e a natureza do sistema de deposição da Sequência de Pesquisa Genómica. No entanto, como apresentado na Figura 1, uma sequência de união consenso poderia ser reconhecida como a sequência "ag" que se segue á sequência "c/t" rica desde as bases 175a até à 218a e foi possivel de prever que continha um exão que começava de "atg" a seguir à sequência de união consenso. Depois a sequência do exão prevista foi utilizada para pesquisar na base de dados nr no GenBank utilizando BlastX (Advanced BlastX 2.0.8). Os resultados revelaram que o exão possui homologia com muitos genes receptores da hemopoietina conhecidos como indicado na Fig. 2. O resultado foi: (1)AQ022781 contém um motivo YR, sequência [YVIALR], e que retinha um motivo WS completo, sequência [WSDWS]; (2) mostrando homologia com vários receptores de hemopietina conhecidos, e (3) ambos os dois residuos Ser no motivo WS são codificados por AG(C/T). E assim, foi previsto que o gene poderia codificar um novo gene receptor da hemopoietina. O codão para a Ser no motivo WS é geralmente AG(C/T) na maior parte dos receptores de hemopoietina conhecidos, mas o segundo residuo Ser no receptor EPO, receptor TPO, e receptor de ratinho IL-β é 59 codificado por TCN. De facto, a maior parte dos clones falsos positivos contendo por acaso uma sequência semelhante a um motivo WS, a segunda Ser era na maior parte das vezes codificada por TCN. Assim, o residuo Ser codificado pelo codão AG(C/T) poderia ser utilizado como marcador para seleccionar clones positivos. Neste contexto, foram desenhados iniciadores oligonucleótidos específicos a partir da sequência de exão prevista em AQ022781, e utilizada no método 5'-RACE e 3'-RACE como abaixo. (2) Concepção de iniciadores de oligonucleótidos

Como descrito em (1), foram previstos locais de exões em sequências AQ022781 e estas sequências foram utilizadas para desenhar os seguintes iniciadores oligonucleótidos específicos para NR10. Foram sintetizados três iniciadores de sentido (NR10-S1, NR10-S2, e NR10-S3; orientados a jusante)e três iniciadores anti-sentido (NR10-A1, NR10-A2, e NR10-A3: orientados a montante) utilizando o sintetizador ABI 394 ADN/ARN em condições para ligar um grupo tritilo ao terminal 5' . Depois os produtos foram purificados utilizando uma coluna OPC (ABI#40071) para obter iniciadores de comprimento completo.

NR10-S1: 5'-ATG GAA GTC AAC TTC GCT AAG AAC CGT AAG-3' (SEQ ID N° 5) NR10-S2: 5'-CCA AAC GTA CAA CCT CAC GGG GCT GCA ACC-3' (SEQ ID N° 6) NR10-S3: 5'-GTC ATA GCT CTG CGA TGT CGC GTC AAG GAG-3' (SEQ ID N°7) NR10-A1: 5'-agt age ttg cgT TCT TCC TCA GCT ATT CCC-3' (SEQ ID N° 8) NR10-A2: 5'-CTT TGA CTC CTT GAC CGC ACA TCG CAG AGC-3' (SEQ ID N° 9) 60 NR10-A3: 5'-GGT TGC AGC CCC GTC AGG TTG TAC GTT TGG-3' (SEQ ID N°10) O "n" na posição 376 na sequência AQ022781 (Fig. 1) foi atribuído à base "c" para desenhar as sequências iniciadoras acima, e assim, a base correspondente na posição 11 da sequência do iniciador NR10-A1 foi designada "g". De acordo com a análise da sequência consenso a união do exão mínimo com a sequência AQ022781 foi prevista começar desde a base "a" na posição 211 até à base "c" na posição 399, começando o intrão na sequência "gt" seguinte. Contudo, a análise dos produtos 3'-RACE como descrito mais tarde revelou que o intrão começa desde a base "n" na posição 376 ou desde a base "g" na posição 377. Por isso, como resultado as 11 bases indicadas em minúsculas na sequência do iniciador NR10-A1 acima não se podem ligar correctamente durante a PCR, enquanto que a sequência correspondente não é transcrita em ARNm. Contudo, as reacções PCR efectuaram-se correctamente, provavelmente porque as outras 19 bases, as sequências 3'-terminal foram capazes de se emparelhar especificamente.

(3) Clonagem do terminal C de ADNc através de um método 3'-RACE

Para isolar o ADNc de comprimento completo de NR10, foi efectuada PCR 3'-RACE utilizando iniciadores NR10-S1 e NR10-S2 descritos em (2) para PCR primária e secundária, respectivamente. A experiência PCR foi efectuada utilizando como molde uma biblioteca de ADNc Marathon-Ready de fígado fetal humano (Clontech #7403-1), e mistura de ADNc polimerase Advantage (Clontech #8417-1) num ciclador térmico (Perkin Elmer gene Amp PCR System 2400). Nas condições seguintes, foram obtidos como resultado produtos 61 PCR que apresentam dois tamanhos diferentes através de uniões alternativas.

As condições para PCR primária foram as seguintes: um

ciclo único de kO 0 O durante 4 min", 5 ciclos de " 9 4 ° C durante 20 s, (D N) 0 O durante 100 s", 5 ciclos de 94 °C durante 20 s, CD o 0 O durante 100 s", 28 ciclos de kO 0 O durante 20 s, e 68°C durante 100 s", um único ciclo de 72°C durante 3 min, e terminação a 4°C.

As condições para PCR secundária foram as seguintes: um ciclo único de "94°C durante 4 min", 5 ciclos de "94°C durante 20 s, e 70°C durante 100 s", 25 ciclos de "94°C durante 20 s, e 68°C durante 100 s um único ciclo de 72°C durante 3 min, e terminação a 4°C.

Foram obtidos dois produtos de amplificação através de PCR e ambos foram subclonados no vector pGEM-TEasy (Promega #A1360), e as sequências nucleótidicas foram determinadas. A transformação do produto PCR no vector pGEM-T-Easy vector foi efectuada utilizando T4 ADN ligase (Promega #A1360) numa reacção de 12 horas a 4°C. Foram obtidos recombinantes dos produtos PCR do vector pGEM-T através da transformação da estirpe de E. coli DH5a (TOYOBO #DNA-903) . Os produtos recombinantes foram seleccionados utilizando Insert Check Ready Blue (TOYOBO #PIK-201). As sequências nucleótidicas foram determinadas utilizando o kit "BigDye terminator Cycle Sequencing SF Ready Reaction" (ABI/Perkin Elmer #4303150) e analisando-as com o sequenciador de ADN ABI PRISM377. Foram determinadas as sequências nucleótidicas do fragmento de inserção completo de seis clones independentes. A seguir foram divididas em dois grupos, cada um composto por 3 clones baseados na diferença em comprimento e sequência dos pares de bases. Foi confirmado que a diferença do produto resultou de uniões alternativas, e ambas as sequências obtidas são sequências nucleótidicas parciais de NR10. O clone de ADNc codificando possivelmente 62 o ORF longo incluindo a região transmembranar foi designado NR10.1, e outro codificando possivelmente um ORF curto sem a região transmembranar foi designado NR10.2.

(4) Clonagem do ADNc N-terminal por 5'-RACE

De modo a isolar o ADNc de comprimento completo de NR10, foi efectuada PCR 5'-RACE utilizando iniciadores NR10-A1 e NR10-A2 do exemplo 2 para PCR primária e secundária, respectivamente. Como no 3'-RACE foi efectuada uma experiência por PCR utilizando como molde uma biblioteca de ADNc Marathon Ready de figado fetal humano e mistura de ADNc polimerase Advantage num ciclador térmico (Perkin Elmer Gene Amp PCR System 2400) . Nas mesmas condições que descrito em (3) , foram obtidos produtos PCR de três tamanhos diferentes. Todos os três produtos foram subclonados no vector pGEM-T Easy como descrito acima para determinar a sequência nucleótidica. A transformação dos produtos PCR no vector pGEM-T Easy foi efectuada utilizando a T4 ADN ligase numa reacção durante 12 horas a 4°C. Os recombinantes dos produtos PCR e vector pGEM-T foram obtidos por transformação da estirpe E. coli DH5a, e selecção dos produtos recombinantes foi efectuada utilizando o Insert Check Ready Blue como descrito acima. As sequências nucleótidicas foram também determinadas como acima utilizando o kit "BigDye terminator Cycle Sequencing SF Ready Reaction" e o sequenciador de ADN ABI PRISM377 para análise. O resultado revelou que os três produtos 5'-RACE obtidos com diferentes tamanhos eram derivados do mesmo transcripto de ARNm. A diferença em tamanho foi devido a uma extensão de reacção incompleta na 5'-RACE e a possibilidade foi negada de serem derivados de uniões alternativas. No entanto, mesmo o clone de ADNc com o produto de extensão mais longo entre os três produtos 5'- 63 RACE não continham o terminal 5' da sequência de comprimento completo. Além disso, uma outra tentativa utilizando os iniciadores NR10-A2 e NR10-A3 de (2) para PCR primário e secundário, respectivamente terminaram num resultado semelhante. Neste contexto de modo a efectuar outra reacção de elongação 5'-RACE foram desenhados novos iniciadores oligonucleótidos proximais ao N-terminal da sequência nucleótidica obtida. Dois iniciadores anti-sentido NR10-A4 e NR10-A5 (orientação a montante) como abaixo foram preparadas de acordo com o Exemplo 2. NR10-A4: 5'-ATC AGA TGA AAC AGG CGC CAA CTC AGG-3' (SEQ ID N° 11) NR10-A5: 5'-TGG TTT CAC ACG GAA AAT CTT AGG TGG-3' (SEQ ID N°:12)

Como descrito acima, foi efectuado PCR 5'-RACE utilizando como molde uma biblioteca de ADNc Marathon-Ready de fígado fetal humano, e os iniciadores NR10-A4 e NR10-A5 para PCR primário e secundário, respectivamente. Condições para um método PCR de subclonagem, e para um método de determinação da sequência nucleótidica são os descritos em (3) . Contudo os resultados da determinação da sequência revelaram que foram apenas novamente obtidos produtos de elongação incompletos em que a reacção de extensão parou no mesmo local que através de 5'-RACE PCR utilizando os iniciadores acima NR10-A1, NR10-A2, e NR10-A3. Poderia ser possível que o ARNm de NR10 tivesse formado uma conformação terciária na posição em que bloqueia a síntese da cadeia primária de ADNc. Existe também a possibilidade de que a sequência nucleótidica da região a montante daquela região possa possuir um teor elevado de G/C, que poderia bloquear a reacção PCR. De qualquer modo, pode acontecer o caso de que a qualidade da biblioteca utilizada para preparar a biblioteca de ADNc possa ser baixa. Neste contexto, o molde para PCR foi substituído pela biblioteca de ADNc Marathon- 64

Ready de placenta humana (Clontech #7411-1)como descrito a seguir. Este material derivado da placenta humana foi escolhido de acordo com o resultado da distribuição do tecido do gene NR10, através da análise RT-PCR descrita mais tarde. (5)-Clonaqem do ADNc N-terminal através de extensão continua por 5"-RACE.

Para isolar a sequência N-terminal de um clone de ADNc que corresponde a NR10 de comprimento completo, foi efectuada 5'-RACE PCR utilizando iniciadores NR10-A4 e NR10-A5 de (4) para PCR primária e secundária respectivamente. Foi utilizada como molde uma biblioteca de ADNc Marathon-Ready de placenta humana devido às razões mencionadas acima. Foi utilizada na experiência PCR uma mistura de ADNc polimerase Advantaqe. Foi efectuada 5'-RACE PCR utilizando o ciclador térmico Perkin Elmer Gene Amp PCR System 2400 nas condições seguintes para obter um produto PCR de tamanho único. A condição para o PCR primário foi a seguinte um ciclo único de "94°C durante 4 min", 5 ciclos de 94°C durante 20 s, e 72°C durante 2 min, 5 ciclos de "94°C durante 20 s, e

70°C durante 2 min", 28 ciclos de " kD O O durante 2 0 s, e 68°C durante 90 s", um ciclo único de 72 °C durante 3 min, e terminação a 4°C • A condição para PCR secundário foi a seguinte: um ciclo único de "94°C durante 4 min" 5 ciclos de "94 °C durante 20 s, e ; 7 0 °C durante 90 s", . 25 ciclos de "94 °C durante 20 s, e 68°C durante 90 s", um ciclo único de 72°C durante 3 min, e terminação a 4°C. O produto PCR obtido foi subclonado no vector pGEM-T Easy como descrito no Exemplo 3, e a sequência nucleótidica foi determinada. As sequências nucleótidicas do fragmento 65 de inserção completo de 4 clones independentes de transformantes revelaram que os clones contêm a sequência N-terminal do clone de ADNc NR10 de comprimento completo. Depois a sequência nucleotidica determinada pela 5'-RACE-PCR e aquelas determinadas pela 3'-RACE em (3) foram combinadas para se obter finalmente a sequência nucleótidica de comprimento completo NR10.1 e NR10.2 de ADNc. A sequência nucleotidica determinada para NR10.1 ADNc (SEQ ID N° 1) e a sequência de aminoácidos codificada pela sequência (SEQ ID N°2) são indicadas na Fig. 3 a 5. A sequência nucleotidica determinada para NR10.2 ADNc (SEQ ID N°3) e a sequência de aminoácidos codificada pela sequência (SEQ ID N°4) são indicadas na Fig. 6 e 7.

De acordo com a determinação da sequência nucleotidica de comprimento completo de ADNc de NR10 foi revelado que "n" na posição 281 de AQ022781 (Fig. 1) era realmente "t". enquanto que "n" na posição 37 6 não foi determinada, porque o intrão se inicia desde a base à volta deste "n". No entanto, qualquer que seja o nucleótido utilizado para substituir "n" na posição 376 a sequência não deu origem a uma sequência consenso para a união (ag/gtaag etc.). Considerando as caracteristicas da informação da base de dados gss, considerou-se que a sequência [an/gcaag] à volta do "n" na posição 376 era de facto [ag/gcaag]. Determinação da sequência nucleótidica de comprimento completo de NR10.1 e NR10.2 revelou que estes dois genes estão ligados a um exão diferente no local de união obscuro alvo através de união alternativa, e o terminal C codificou subsequentemente diferentes sequências de aminoácidos. A estrutura primária indica que NR10.1 pode codificar para uma proteína receptora de hemopoietina do tipo transmembranar constituída por 652 aminoácidos, e que NR10.2 pode codificar para uma proteína semelhante a um receptor do tipo secreção constituída por 252 aminoácidos. 66

As características estruturais destes NR10 são as seguintes:

Primeiro é previsto que a sequência da primeira Met à 32a Ala no domínio extracelular comum de NR10.1 e NR10.2 é a sequência de sinal típica de secreção. Aqui a Ia Met é considerada ser o local de iniciação da tradução porque existe um codão de terminação na grelha na posição (-2) . Depois existe um domínio típico de ligação de ligandos na região desde a 43a Cys até à 53a Cys ou ao resíduo 55° Trp. Além disso, a Cys 81a e 94a corresponde à conformação de repetição do resíduo Cys bem conservado entre outras famílias de receptores de hemopoietina. Além disso, é conservada uma região rica em Pro (motivo PP-W) iniciando-se nos resíduos Pro consecutivos nas posições 137 e 138 até ao resíduo 157° Trp, e os resíduos desde a Tyr 210a até à Arg 215a corresponde ao motivo YR acima. Uma caixa típica WSXWS (motivo WS) é também encontrada nos resíduos desde a Trp 224a até à Ser 228a. A grelha de leitura aberta (ORF) de NR10.2 codifica para 24 aminoácidos desde a sequência WSXWS e termina no codão de paragem a seguir. Assim, codifica para uma proteína semelhante a um receptor de hemopoietina solúvel sem uma região transmembranar. Por outro lado, o ORF de NR10.1 contém um domínio transmembranar típico de 24 aminoácidos desde a Ile 533a até ao resíduo Leu 556° a seguir aos motivos acima. Para além disso, o domínio intracelular adjacente ao domínio transmembranar contém resíduos Pro nas posições 571 e 573, correspondente à sequência de consenso da Box-1 (motivo PXP) bem conservado entre outros receptores de hemopoietina e é considerado estar implicado na transdução de sinal. Estas características acima confirmam que o gene NR10 codifica para uma nova proteína receptora de hemopoietina. 67

[Exemplo 2] Distribuição na determinação do tecido e análise do padrão de expressão do gene de NR10 por RT-PCR

Foi detectado o ARNm utilizando o método RT-PCR para analisar a distribuição da expressão e os padrões de expressão do gene de NR10.1 e NR10.2 em orgãos humanos diferentes. Foram sintetizados os iniciadores oligonucleótidos com as sequências seguintes para a análise por RT-PCR. 0 iniciador NR10-S0 foi utilizado como um iniciador de sentido (orientação a jusante), e NR10.1-A0 e NR10.2-A0 foram utilizados como iniciadores antisentido (orientação a montante). Os iniciadores foram sintetizados e purificados como descrito no Exemplo 2. Enquanto que NR10-S0 foi desenhado de modo a corresponder às sequências comuns de NR10.1 e NR10.2, NR10.1-A0 e NR10.2-A0 foram desenhados de acordo com as sequências especificas de NR10.1 e NR10.2, respectivamente. hNRIO-SO: 5'-GCA TTC AGG ACA GTC AAC AGT ACC AGC-3' (SEQ ID N° : 13) hNRIO.l-AO: 5'-AGC TGG AAT CCT CAG GGT GGC CAC TGG-3' (SEQ ID N°:14) hNRl0.2-AO: 5'-GCC CAT CAC CAG AGT AGA CAG GAC GGG-3' (SEQ ID N°: 15)

Os moldes utilizados foram ADNc de tecido múltiplo humano Painel I (Clontech #K1420-1), MTC humano Painel II (Clontech#K1421-l) Sistema imunitário humano MTC Panei (Clontech#K1426-1), e painel humano fetal MTC (Clontech #K1425-1). Foi efectuada PCR utilizando mistura de polimerase Advantage (Clontech#K1426-1), e painel humano fetal MTC (Clontech#K1425-l). Foi efectuada PCR utilizando mistura de polimerase Advantage (Clontech#8417-l) num ciclador térmico (Perkin Elmer Gene Amp PCR System 2400). Foi utilizado o par NR10-S0 e NR10.1-A0 para a detecção de NR10.1. Para a detecção de NR10.2 foi utilizado o conjunto 68 de iniciadores [NR10-S0 e NR10.2-A0]. Foi efectuada uma PCR nas condições seguintes para amplificar o gene alvo: um

ciclo único de 0 O durante 4 min", 5 ciclos de "94 °C durante 20 s, e 72 °C durante 1 min", 5 ciclos de 94 °C durante 20 s, e 7 0 °C durante 1 min, 25 ciclos de "94 °C durante 20 s, e 68°C durante 1 min", um único ciclo de 72°C durante 3 min, e terminação a 4°C.

Como indicado na Fig. 9 o resultado foi que na expressão genética constitutiva de NR10.2 foi detectado até a um nivel quase constante em todos os orgãos humanos examinados e tecidos derivados de ARNm. Em contraste, como indicado na Fig. 8, a expressão do gene NR10.1 foi detectada em determinados orgãos e tecidos, e o seu nivel de expressão variou significativamente. Efectuando PCR utilizando iniciadores G3PDH nas condições acima e detectando a expressão do gene doméstico G3PDH foi confirmado que o número de cópias de ARNm entre o molde ARNm tinha sido normalizado. A expressão do gene NR10.1 foi encontrada em orgãos como se segue: no adulto humano foi fortemente expressa no coração, placenta, testículos, timo e leucócitos periféricos, enquanto que uma expressão fraca foi detectada no baço, medula óssea, próstata, ovários, pâncreas e pulmão; no feto humano foi detectada uma expressão forte no músculo esquelético, timo, coração, e rim, enquanto que uma expressão fraca foi detectada no pulmão, figado e baço. Por outro lado, não pôde ser detectada nenhuma expressão no cérebro, músculo esquelético, rim, intestino delgado, ou cólon no humano adulto nem no cérebro do feto. reacção de O tamanho do produto de amplificação do PCR foi de 480 pb e 423 pb para NR10.1 e NR10.2, respectivamente que foi consistente com as dimensões calculadas a partir das sequências nucleótidicas determinadas. Assim, os produtos foram considerados serem produtos da 69 amplificação específica de PCR. Isto foi ainda confirmado por transferência de Southern a seguir descrita e a possibilidade de serem produtos de amplificação de PCR não específicos foi negada.

Devido ao facto de que uma forte expressão do gene de NR10.1 ser principalmente detectado naqueles orgãos contendo células que respondem do ponto de vista imunitário e células hematopoiéticas e considerando a distribuição da expressão genética de NR10.1, a possibilidade de NR10 funcionar como um novo receptor de hemopoietina foi fortemente sugerida. Além disso, o facto da expressão se encontrar também distribuída entre células do sistema genital e do sistema endócrino, tal como no coração sugeriu que NR10 poderia regular não apenas o sistema imunitário e sistema hematopoiético, mas também diversas funções fisiológicas no corpo. 0 facto de que a expressão de NR10.2 ter sido detectada em todos os orgãos indica a possibilidade das células que constituem os orgãos em questão na análise produzirem a proteína activa do tipo secretório. É possível que a expressão do gene NR10 seja estritamente regulada em determinados tecidos ou populações de células através de uma regulação transcripcional e união alternativa que determina a especificidade funcional destes tecidos e células.

[Exemplo 31 Verificação da especificidade dos produtos PCR através de transferência de Southern

Para verificar a especificidade da amplificação, o produto génico alvo amplificado por RT-PCR do Exemplo 2 foi submetido a transferência de Southern utilizando fragmentos de ADNc específicos para NR10.1 e NR10.2, respectivamente, como sonda. Ao mesmo tempo, a quantidade de produto RT-PCR 70 foi detectada quantitativamente para avaliar os niveis relativos da expressão do gene entre os diferentes orgãos humanos. 0 produto RT-PCR foi submetido a electroforese num gel de agarose, transferido para uma membrana de nylon carregada (Hybond N ( + ) , Amersham cat#RPN303B), e sujeito a hibridização. Fragmentos de ADNc de NR10.1 e NR10.2 obtidos no Exemplo 3 foram utilizados como sondas especificas para os genes respectivos. Foram preparadas amostras utilizando o kit Mega Prime (Amersham cat#RPNl607) , e marcado com radioisótopo, [a-32p]-dCTP (Amersham cat#AA0005). A hibridização foi efectuada utilizando a solução Express Hybridization (Clontech#8015-2), e depois da pré-hibridização a 68°C durante 30 minutos, uma sonda marcada desnaturada por calor foi adicionada para efectuar uma hibridização a 68°C durante 120 min. Após uma lavagem subsequente em (1) lxSSC/0,1% SDS à temperatura ambiente durante 5 min, (2) 1 x SSC/0,1% SDS a 50°C durante 30 min, e (3) 0,lx SSC/0,1% SDS a 50°C durante 30 min, a membrana foi exposta a uma placa de imageologia (FUJI #BAS-III) e foi detectado um sinal NR10 especifico utilizando o analisador de Imagem (FUJIX, BAS-2000 II).

Os resultados detectados para NR10.1 e NR10.2 são apresentados na Fig. 10 e 11, respectivamente. O produto amplificado na RT-PCR anterior foi verificado como produtos de amplificação específicos dos genes respectivos. Além disso, o resultado da quantificação do nível de expressão relativo entre cada tecido suportou a afirmação acima mencionada. O método de detecção para a expressão do gene alvo utilizando RT-PCR e transferência de Southern em combinação é conhecida por ter uma sensibilidade extremamente elevada, quando comparada com outros métodos para análise da expressão. No entanto, a expressão de NR10.1 não foi detectada no sistema neuronal, tal como nos cérebros de adulto e do feto, nos tecidos digestivos do 71 adulto. Além disso, não foi detectada nenhuma expressão no músculo esquelético do adulto, ou rim em que uma expressão forte foi reconhecida no feto.

[Exemplo 4] Análise de transferência de Northern da expressão do gene NR10

Análise de transferência de Northern de expressão do gene NR10 foi efectuada para examinar o padrão de expressão do gene NR10 nos orgãos humanos e nas linhas celulares tumorais, e para determinar a dimensão dos transcriptos NR10. Para além disso, a possibilidade das variantes de união diferentes de NR10.1 ou NR10.2 existirem foi examinada. Foram utilizadas as transferências de Northern do tecido múltiplo humano (MTN) (Clontech #7760-1). MTN humano transferência II (Clontech #7759-1), MTN humano transferência III (Clontech #7767-1) e linha celular do cancro humana transferência MTN (Clontech #7757-1).

Os fragmentos de ADNc obtidos através de 5'-RACE no Exemplo 1 (5) foram utilizados como sondas. As sondas foram preparadas como descrito no Exemplo 3, utilizando o kit Mega Prime e marcado com [a-32p]d(CTP. A hibridização foi efectuada utilizando a solução Express Hybridization, e após pré-hibridização a 65°C durante 30 min foram adicionadas amostras desnaturadas pelo calor para efectuar hibridização a 65°C durante 16 h. Após uma lavagem subsequente em (1) lxSSC/0,1% SDS à temperatura ambiente durante 5 minutos, (2) lx SSC/01% SDS a 48°C durante 30 min, e (3) 0,5xSSC/0,l% SDS a 48°C durante 30 min, a membrana foi exposta a uma placa de imagiologia como descrito acima, e foi feita uma tentativa para detectar o sinal especifico de NR10 utilizando um analisador de imagem. O método, inesperadamente falhou a detecção de qualquer sinal em qualquer um dos orgãos humanos 72 examinados. Isto poderia ser porque a transferência de Northern possui uma sensibilidade significativamente mais baixa do que a RT-PCR e falhou assim a detecção de ARNm com um baixo nivel de expressão.

[Exemplo 51 Rastreio da placa 0 procedimento acima utilizou clonagem por PCR para obter um ADNc de comprimento completo do gene NR10. Existe sempre a possibilidade de que uma mutação pontual no produto seja introduzida por clonagem por PCR. Assim, para reconfirmar a sequência nucleotidica do clone de ADNc acima, foi efectuada uma hibridização em placa utilizando uma biblioteca de ADNc de fago lambda para reisolar o gene alvo. Uma biblioteca de placenta humana (Clontech #HL1144X) em que a expressão do gene NR10 foi confirmada como resultado da análise da expressão do gene NR10 por RT-PCR foi utilizada para rastreio da placa. Os fragmentos de ADNc obtidos por 5'-RACE no Exemplo 1(5) foram utilizados como sonda, como acima. Foram preparadas amostras e marcadas como no Exemplo 3, utilizando o kit Mega Prime, e marcado com [a-32p]dCTP. A hibridização foi efectuada utilizando uma solução Express Hybridization, e depois da pré-hibridização a 65°C durante 30 min foram adicionadas amostras desnaturadas pelo calor para efectuar a hibridização a 65°C durante 16 h. Após lavagem subsequente em (1) 1 xSSC/0,1% SDS à temperatura ambiente durante 5 min, (2) lx SSC/0,1% SDS a 58°C durante 30 min, e (3) 0,5xSSC/0,l% SDS a 58°C durante 30 min, a membrana foi exposta a um filme de raios X (Kodak, cat#l65-1512) para detectar placas NR10 positivas.

Como resultado não foi obtido nenhum clone positivo. Como descrito no Exemplo 4, uma razão para o clone de ADNc não poder ser isolado poderia ser que o número de cópia 73 expressos do gene alvo era demasiado baixo. Para isolar o gene alvo é favorável efectuar uma hibridização em placa utilizando uma biblioteca de ADNc de fago lambda derivada de músculo esquelético fetal humano que apresentou o maior nivel de expressão do gene por análise de RT-PCR.

[Exemplo 61 Rastreio de ligandos (1) Construção do receptor quimérico de NR10 É construído um sistema de rastreio para pesquisar um ligando, uma nova hemopoietina que se pode ligar especificamente a NR10. Primeiro, a sequência de ADNc que codifica para a região extracelular de NR10.1 (desde a Ia Met até à 238a Glu ou Ia Met até à 532a Glu) foi amplificada por PCR, e este fragmento de ADN encontra-se ligado na grelha aos fragmentos de ADN que codificam para a região transmembranar e para a região intracelular de um receptor de hemopoietina conhecido para preparar uma sequência de fusão que codifica para um receptor quimérico. Como descrito acima, existem vários candidatos para o parceiro, o receptor de hemopoietina conhecido e entre eles é seleccionado o receptor TPO humano (MPL-P humano). Especificamente, após amplificação da sequência de ADN que codifica para a região intracelular que inclui a região transmembranar do receptor humano TPO por PCR, esta sequência foi ligada à sequência de ADNc que codifica para a região extracelular de NR10.1 na grelha e foi inserida num vector plasmídico (pEF-BOS) expressável em células de mamíferos. 0 vector de expressão construído foi designado pEF-NRlO/TPO-R. Um diagrama esquemático da estrutura do receptor quimérico construído NRIO/TPO-R é apresentado na Fig. 12. Conjuntamente com um vector de expressão pSV2bsr (Kaken Pharmaceutical) contendo gene resistente à 74

Blastcidin S, o vector que expressa o receptor NRIO/TPO-R quimérico foi introduzido na linha celular dependente do factor de crescimento Ba/F3, e foi forçado para a expressão. As células introduzidas no gene foram seleccionadas por cultura sob a coexistência de 8 μρ/ιηΐ cloridrato de Blastcidina S (Kaken Pharmaceutical) e IL-3. Transferindo as células introduzidas no receptor quimérico obtido para um meio isento de IL-3, cultivando adicionando materiais que se espera conterem um ligando alvo é possivel efectuar uma pesquisa que torna a utilização do facto de que a sobrevivência/proliferação da célula é possivel apenas, quando um ligando que se liga especificamente a NR10 se encontra presente. (2) Preparação da proteína de fusão solúvel NRlO/lqGl-Fc

Foi preparada uma proteína de fusão solúvel NRlOlgGl-Fc para ser utilizada para pesquisar ligandos do tipo ligado à membrana, ou para detectar ligandos solúveis através BIAcore (Pharmacia) e transferência de West-western. Uma sequência de fusão que codifica para a proteína de fusão solúvel foi preparada ligando o fragmento de ADN que codifica para a região extracelular de NR10.1 (desde a Ia Met até à 238a Glu ou Ia Met até à 532 Glu) preparada no Exemplo 6(1) com o fragmento de ADN que codifica para a região Fc da imunoglobulina humana IgGl na grelha. Um diagrama esquemático da estrutura da proteína de fusão solúvel que codifica para o NRlO/IgGl-Fc construído é apresentado na Fig.12. Este fragmento do gene de fusão foi inserido num vector plasmídico (pEF-BOS) expressável em células de mamíferos e o vector de expressão construído foi designado pEF-NRIO/IgGl-Fc. Após se ter forçado a expressão deste pEF-NRIO/IgGI-Fc em células de mamíferos, e seleccionando células de genes introduzidos estáveis, a 75 proteína recombinante secretada no sobrenadante de cultura pode ser purificada por imunoprecipitação utilizando anticorpo IgGl-Fc anti-humano, ou por colunas de afinidade, etc. (3) Construção de um sistema de expressão de NR10.2 e purificação da proteína NR10.2 recombinante A proteína NR10.2 recombinante foi preparada para ser utilizada para pesquisar ligandos ligados à membrana celular, ou para a detecção de ligandos solúveis utilizando BIAcore (Pharmacia) ou transferência de Western-western. 0 codão de paragem da sequência de codificação do aminoácido NR10.2 ADNc foi substituído por mutação pontual por uma sequência nucleotidica que codifica para um resíduo de aminoácido arbitrário, e depois, foi ligada à sequência nucleotidica que codifica para o péptido FLAG na grelha. Este fragmento ligado foi inserido num vector plasmídico possível de expressar em células de mamíferos, e o vector de expressão construído foi designado pEF-BOS/NRIO.2FLAG. A Figura 12 apresenta um diagrama esquemático da estrutura da inserção NR10.2FLAG no vector de expressão construído. Após expressão forçada deste pEF-BOS/NRIO.2 FLAG em células de mamíferos e selecção de células introduzidas de genes estáveis, a proteína recombinante secretada no sobrenadante de cultura pode ser imunoprecipitada utilizando um anticorpo peptídico anti-FLAG, ou pode ser purificado por colunas de afinidade etc.

[Exemplo 71 Isolamento do gene NR10.3 (1) Desenho de iniciadores oligonucleótidos 76 0 isolamento do gene NR10.1 foi efectuado novamente para obter o ADNc compreendendo uma sequência de codificação continua. Primeiro, foi seleccionada 5'-UTR e 3'-UTR na sequência nucleotidica de NR10.1 Foi seleccionado ADNc para desenhar iniciadores de sentido e antisentido (de orientação a jusante e a montante, respectivamente) com sequências como se segue. Os iniciadores foram sintetizados como no Exemplo 1 (2) num sintetizador ABI 394 ADN/ARN nas condições em que um grupo tritilo foi ligado ao terminal 5'. 0 produto foi purificado utilizando uma coluna OPC (ABI #400771) para obter iniciadores de comprimento completo. NR10-SUTR(SN); 5'-CCC CTG ATA CAT GAA GCT CTC TCC CCA GCC-3' (SEQ ID N°18) NR10-3UTR(AS); 5'-CCA GTC TTC GGA GAT GGT TCT CTT GGG GCC-3' (SEQ ID N°19)

(2) Clonagem por PCR

Para isolar o CDS de comprimento completo de NR10, foi efectuada clonagem PCR utilizando NR10-5UTR e NR10-3UTR como iniciadores sentido e anti-sentido, respectivamente. Foi utilizada como molde uma biblioteca de ADNc Marathon-Ready de placenta humana (Clontech #7411-1). Foi efectuada uma experiência PCR utilizando a mistura de polimerase de ADNc Advantage (Clontech #8417-1) num ciclador térmico Perkin Elmer Gene Amp PCR System 2400. A PCR foi efectuada através de um único ciclo de "94°C durante 4 min", 5 ciclos de "94°C durante 20 s, e 72°C durante 90 s", 5 ciclos de "94°C durante 20 s, e 70°C durante 90 s", 28 ciclos de "94°C durante 20 s, e 68°C durante 90 s", um único ciclo de 72°C durante 3 min e foi terminada a 4°C. Como resultado foi obtido um produto de amplificação de 2119 pb. O produto PCR obtido foi subclonado no vector pGEM-T Easy (Promega #A1360) como no Exemplo 1 (3), e a sequência 77 nucleotidica foi determinada. A recombinação do produto PCR no vector pGEM-T Easy foi efectuada utilizando T4 ADN ligase (Promega #A1360) numa reacção de 12 h a 4°C. 0 recombinante do produto PCR e do vector pGEM-T Easy foi obtido por transformação de DH5alfa E. coli (Toyobo#ADN-903) e Insert Check Ready Blue (TOYOBO #PIK-201) foi utilizado para a selecção. A sequência nucleotidica foi determinada utilizando o kit "BigDye terminator Cycle Sequencing SF Ready Reaction" (ABI/Perkin Elmer #4303150) e o sequenciador de ADN ABI PRISM 377. Foram determinadas as sequência nucleótidicas dos fragmentos de inserção completos de 5 clones independentes do recombinante. Como resultado foi determinada a sequência nucleotidica de um clone de ADNc que podia codificar para o CDs de cadeia completa de NR10 incluindo a região transmembranar. Contudo, a sequência determinada não foi reconhecida como a de NR10.1, mas em vez disso foi um clone de ADNc que poderia codificar para uma proteína receptora do tipo transmembranar de 662 aminoácidos. O clone foi designado como NR10.3 de modo a distingui-lo de NR10.1. A E. coli contendo este clone de ADNc foi depositado no National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology.

Instituição depositária: National Institute of

Bioscience and Human- Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry.

Morada: 1-1-3 Higashi, Tsukuba, Ibaraki 305-8566, Japão. Data de deposição (data original): Julho 23, 1999 (Heisei 11) . N° de acesso Seimeiken Jyouki Dai 6793 Go (FERM BP-6793).

Quando comparado com NR10.1, o clone de ADNc NR10.3 possui uma única supressão nucleotidica no grupo da adenina na proximidade do codão de paragem conduzindo a um desvio 78 da grelha. Por isso, NR10.1 e NR10.3 exibiram uma diferença na grelha de leitura da sequência de aminoácidos próxima do codão de paragem. A sequência nucleótidica decidida de NR10.3 e a sequência de aminoácido por ela codificada são indicadas na SEQ ID N°16 e 17, respectivamente, assim como na Fig. 13 e 14. (3) Significância da existência de NR10.1 e NR10.3

Como descrito acima, a diferença entre NR10.1 e NR10.3 é provocada pela diferença de um único nucleótido numa posição próxima do codão de paragem e não por diferentes produtos de transcrição devido a mutantes de união. Uma vez que os clones de ADNc de NR10.1 e NR10.3 são idênticos com excepção da supressão do dito nucleótido, as proteínas receptoras do factor hematopoiético por eles codificadas são consideradas serem funcionalmente equivalentes. Contudo, uma tal supressão única do nucleótido, ou mutação pontual poderia desempenhar um papel numa determinada doença, ou a diversidade da sequência pode ser causada de forma dependente da família ou da raça.

[Exemplo 81 Localização cromossomal do NR10 (1)Desenho dos iniciadores oligonucleótidos

Para construir um mapa do cromossoma de NR10, um iniciador oligonucleótido, foi sintetizado. Foi desenhado um iniciador intrão NR-10 como um iniciador de sentido (orientação a jusante) seleccionando a sequência de um local do intrão não transcrita para o NR10 de ARNm na sequência de AQ022781 depositada na base de dados gss. 0 iniciador foi sintetizado como descrito no Exemplo 1 (2) utilizando um sintetizador de ADN/ARN, ABI 394 nas 79 condições em que um grupo tritilo é ligado ao terminal 5', e purificado sobre uma coluna OPC (ABI #400771) para obter um produto de comprimento completo. NRlO-intrão (SN): 5'-CTG TGT AAG TAC CAA TTG TTC CCA GGC-3' (SEQ ID N°:20) (2) Mapeamento do cromossoma no gene NR10

Para fazer um mapa cromossomal de NR10 foi efectuada uma análise de PCR utilizando o ADN respectivo obtido a partir do sistema celular somático humano/ratinho possuindo 24 cromossomas (Dubois B. L. e Naylor S. Genomics 16:315-319 (1993) ) . O iniciador NRlO-intrão do Exemplo 8(1) e iniciador NR10-A1 produzido no Exemplo 1 (2) foram utilizados como iniciadores de sentido e anti-sentido, respectivamente. Foi efectuada uma experiência de PCR utilizando a mistura de ADNc polimerase Advantage (Clonetech #8417-1) num ciclador térmico Perkin Elmer Gene Amp PCR System 2400 sob as seguintes condições de PCR. Como resultado foi amplificado um produto de amplificação PCR de 359 pb que sugere a existência do gene NR10 no cromossoma humano 5.

Foi efectuado PCR através de um ciclo único de "94°C durante 4 min", 5 ciclos de "9 4 ° C durante 20 s, e 7 0 °C durante 60 s", 28 ciclos de "9 4 ° C durante 20 s, e 68 °C durante 60 s", e um ciclo único de 72°C durante 3 min, e foi terminado a 4°C.

O produto PCR obtido foi clonado no vector pGEM-T Easy (Promega #A1360) como descrito no Exemplo 1(3) e a sequência nucleotidica foi determinada utilizando um sequenciador de ADN ABI PRISM377. Análise da sequência nucleotidica da inserção do fragmento completo de oito clones recombinantes independentes confirmou que o produto PCR possuia a sequência nucleotidica do fragmento de ADN 80 genómico alvo contendo uma sequência parcial de NR10, e não um produto devido a uma amplificação não especifica. 0 resultado acima também confirmou que o conjunto iniciador estava a trabalhar de uma maneira especifica. Posteriormente, o locus do gene NR10 foi determinado utilizando o hibrido de radiação GeneBridge 4 painel 93 (Walter et al., Nature Genetics 7: 22-28 (1994)). A análise PCR foi efectuada utilizando como molde o hibrido de radiação GeneBridge 4 painel 93 e o NlO-intrão e iniciadores NR10-A1 nas mesmas condições que acima. A quantidade de produtos amplificados dos respectivos hibridos foi avaliada quantitativamente como mais ou menos e o resultado foi convertido num código binário. Utilizando o programa no servidor em [http://www.carbon.wi.mit.edu:800 0/cgi- bin/contig/rhmapper.pl] o resultado foi comparado com códigos semelhantes dos genes marcadores do mapa do gene utilizado para construir mapas da estrutura, e foi determinada a localização no cromossoma. Como resultado o NR10 foi mapeado no cromossoma 5 proximal do centrossoma, e foi ainda confirmado que existe entre os marcadores WI-3071 (60-61cM) e AFM183YB8 (67cM).

Os genes humanos gpl30 e LIF que foram utilizados na pesquisa da base de dados original pelos inventores foram também mapeados em regiões do cromossoma 5. Mais especificamente, o gene de gpl30 humano foi mapeado no cromossoma 5 qll (67.2-69.6cM) , e o gene do receptor LIF humano foi mapeado no cromossoma 5 pl2-pl3 (59.9-61.1 cM) .

Do ponto de vista da genética evolucionária é também de grande importância que o gene de NR10 fosse mapeado na região 61-67 cM no cromossoma 5, uma região entre os dois genes. Isto é, os três genes, gpl30 humano, receptor LIF humano, e gene NR10 humano da mesma familia de receptores, cujas estruturas apresentam uma semelhança relativamente 81 elevada na família encontram-se localizados muito perto um do outro numa região extremamente restrita do mesmo cromossoma 5 humano. Este facto suporta a teoria de que três genes receptores diferentes são derivados do mesmo gene ancestral, e que evoluíram geneticamente durante a longa história de evolução biológica para conseguir diversidade, não apenas na sua estrutura, mas também nas funções.

Aplicabilidade Industrial A presente invenção disponibiliza novas proteínas receptoras de hemopoietina e ADN que as codifica. A presente invenção também fornece: um vector no qual foi inserido ADN, um transf ormante que alberga o ADN, e um método para produzir proteínas recombinantes utilizando o transformante. Fornece ainda um processo de rastreio de um composto ou de um ligando natural que se liga à proteína. Pensa-se que a proteína da invenção esteja associada a funções imunológicas e hematopoiéticas. Por isso espera-se que as proteínas desta invenção possam ser aplicadas para diagnóstico e tratamento de doenças relacionadas com imunidade e hematopoiese.

Como descrito acima, espera-se que o gene NR10 forneça uma fonte útil para obter novos factores hematopoiéticos ou agonistas que são capazes de se ligarem funcionalmente à proteína receptora codificada pelo gene. Espera-se que a imunidade celular ou função hematopoiética in vivo seja reforçada administrando tais substâncias de ligação funcional, ou anticorpos específicos que podem activar a função da molécula NR10 no organismo. Assim, poderia ser possível desenvolver um fármaco para uma aplicação clínica que promove a proliferação ou diferenciação de células imunitárias responsáveis, ou células hematopoiéticas, ou 82 que activam a função das células imunitárias utilizando o gene NR10. Poderá também ser possivel utilizar tais fármacos para aumentar a imunidade citotóxica contra tipos particulares de tumor. É possivel que NR10.1 seja expressa numa população restrita de células nos tecidos hematopoiéticos. Neste contexto, anticorpos anti-NRIO seriam úteis para isolar tais populações de células, que podem ser utilizadas para tratamentos de transplantação de células.

Por outro lado, NR10.2 uma variante de união de NR10 pode ser utilizada como um inibidor para o ligando de NR10 como um receptor do tipo armadilha. Além disso, espera-se que administrando antagonistas que podem ligar-se funcionalmente à molécula de NR10, ou outros inibidores, assim como anticorpos específicos que podem inibir a função molecular de NR10 no organismo, poderia ser possível suprimir a imunidade celular ou inibir a proliferação de células hematopoiéticas in vivo. Assim, poderia ser possível aplicar tais inibidores no desenvolvimento de um fármaco para aplicação clínica que inibe a proliferação ou diferenciação de células responsáveis pela imunidade ou células hematopoiéticas, ou para suprimir a função imunitária ou inflamação. Especificamente poderia ser possível utilizar tais inibidores para suprimir o início de doenças autoimunitárias que surgem da autoimunidade, ou rejeição de tecido através do sistema imunitário do corpo vivo, o problema básico na transplantação. Além disso, os inibidores podem ser eficazmente utilizados para tratar tais doenças provocadas pela resposta imunitária anormalmente regulada em excesso. Assim, pode ser possível utilizar inibidores para tratar uma variedade de alergias que são específicas de antigénios particulares, tal como metal e pólen

Listagem das Sequências <-?lO* CHCGAi RESEARCH íNSTrTUTE FOR MOLECULAR MEDiCOO, {NC.

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CTGTGTÁAGT ACCAATT6TT CCCAGGC

Lisboa, 5 de Abril de 2010.

Claims (6)

1. Lisbo Re ivindi cações 1. ADN isolado seleccionado a partir do grupo constituído por: (a) ADN que codifica para uma proteína constituída pela sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID N°s: 2, 4 e 17; (b) ADN compreendendo a região de codificação da sequência nucleótidica de qualquer uma das SEQ ID N°s: 1,3, e 16; (c) ADN que codifica para uma proteína constituída pela sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID N°s 2,4 e 17 em que um ou dois até 30 aminoácido(s) são modificados por supressão, adição e/ou substituição por outro aminoácido em que a dita proteína é funcionalmente equivalente à proteína constituída pelas sequências de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID N°s 2, 4 e 17 como receptor do factor hematopoiético na forma solúvel, ou ligada à membrana; (d) ADN que codifica para uma proteína que possui identidade de 70% ou mais com a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID N°s 2,4 e 17 em que a dita proteína é funcionalmente equivalente à proteína constituída pelas sequências de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID N°s 2, 4 e 17 como receptor do factor hematopoiético na forma solúvel, ou ligada à membrana; e (e) ADN que codifica para uma proteína constituída pela sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID N°s 2,4 e 17 a partir da qual a sequência de sinal é removida, em que a sequência de sinal vai desde a Ia Met à 32a Ala.
2. 2. Vector no qual o ADN descrito na reivindicação 1 é inserido.
3. 3. Proteína ou péptido que é codificado pelo ADN descrito na reivindicação 1.
4. 4. Processo para pesquisar um composto que se liga à proteína da reivindicação 3, compreendendo os passos de: (a) fazer contactar uma amostra com a proteína da reivindicação 3 ou de um seu péptido parcial; (b) detectar a actividade de ligação da amostra com a proteína de acordo com a reivindicação 3 ou o seu péptido parcial; e (c) seleccionar um ou vários compostos que se ligam à proteína de acordo com a reivindicação 3 ou um seu péptido parcial.
5. 5. Anticorpo que se liga à proteína de acordo com a reivindicação 3.
6. 6. Processo para detectar ou medir a proteína de acordo com a reivindicação 3 compreendendo os passos de: expor o anticorpo de acordo com a reivindicação 5 a uma amostra que se espera conter a proteína de acordo com a reivindicação 3; e detecção ou medição da produção do complexo imunitário entre o dito anticorpo e a dita proteína. Lisboa, 5 de Abril de 2010.