PT1576112E

PT1576112E - Multímeros de receptor de citocina zcytor17

Info

Publication number: PT1576112E
Application number: PT03761891T
Authority: PT
Inventors: Francis J Grant; Theodore E Whitmore; Scott R Presnell; Jane A Gross; Stacey R Dillon; Julia E Novak; Joseph L Kuijper; Cindy A Sprecher; Zeren Gao; Maria M Dasovich; Angela K Hammond
Original assignee: Zymogenetics Inc
Priority date: 2002-01-18
Filing date: 2003-01-21
Publication date: 2012-05-25
Also published as: US7494804B2; US20110318354A1; US20090274694A1; IL226637A; US20170204190A1; EP2338910B1; US20170369580A1; AU2003280410A1; WO2004003140A2; CY1112787T1; US20070048222A1; ES2546797T3; IL226637A0; US20140141485A1; US20070049530A1; EP2338910A1; ATE547430T1; US9212213B2; US20100266597A1; US20120264168A1

Description

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DESCRIÇÃO "MULTÍMEROS DE RECEPTOR DE CITOCINA ZCYTOR17"

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A proliferação e a diferenciação de células de organismos multicelulares são controladas por hormonas e factores de crescimento polipeptidicos. Estas moléculas distribuiveis permitem que as células se comuniquem umas com as outras e actuem em harmonia para formar células, tecidos e órgãos, e para reparar tecido danificado. Exemplos de hormonas e factores de crescimento incluem as hormonas esteróides (por exemplo, estrogénio, testosterona), hormona paratiróide, hormona estimulante de foliculo, as interleucinas, factor de crescimento derivado de plaqueta (PDGF), factor de crescimento epidérmico (EGF), factor estimulante de colónia de granulócito-macrófago (GM-CSF), eritropoietina (EPO) e calcitonina.

As hormonas e os factores de crescimento influenciam o metabolismo celular por meio da ligação a receptores. Os receptores podem ser proteínas de membrana integral que são ligados a vias de sinalização dentro da célula, tais como sistemas de segundo mensageiro. Outras classes de receptores são moléculas solúveis, tais como os factores de transcrição.

As citocinas geralmente estimulam a proliferação ou a diferenciação de células da linha hematopoiética ou participam nos mecanismos de resposta imune e inflamatória do corpo. Exemplos de citocinas que afectam a hematopoiese são eritropoietina (EPO), que estimula o desenvolvimento de células sanguíneas vermelhas; trombopoietina (TPO), que estimula o desenvolvimento de células da linha de megacariócito; e factor estimulante de colónia de granulócito (G-CSF), que estimula o desenvolvimento de neutrófilos. Estas citocinas são úteis em restaurar niveis 2 normais de células sanguíneas em pacientes que sofrem de anemia, trombocitopenia, e neutropenia ou que recebem quimioterapêutica contra cancro.

As interleucinas são uma família de citocinas que mediam respostas imunológicas, incluindo inflamação. As interleucinas mediam uma variedade de patologias inflamatórias. Central a uma resposta imune estão as células T, que produzem muitas citocinas e imunidade adaptativa a antigénios. As citocinas produzidas por células T foram classificadas como tipo 1 e tipo 2 (Kelso, A. Immun. Cell Biol. 76:300-317, 1998). As citocinas de tipo 1 incluem IL-2, IFN-γ, LT-α, e estão envolvidas em resposta inflamatórias, imunidade virai, imunidade contra parasita intracelular e rejeição a aloenxerto. As citocinas de tipo 2 incluem IL-4, IL-5, IL-β, IL-10 e IL-13, e estão envolvidas em respostas humorais, imunidade contra helmintos e resposta alérgica. Citocinas compartidas entre o Tipo 1 e 2 incluem IL-3, GM-CSF e TNF-α. Existem algumas evidências que sugerem que populações célula T que produzem Tipo 1 e Tipo 2 preferencialmente migram em diferentes tipos de tecido inflamado. Células T maduras podem ser activadas, isto é, por um antigénio ou outro estímulo, para produzir, por exemplo, citocinas, as moléculas de sinalização bioquímica, ou receptores que influenciam adicionalmente o destino da população de célula T.

As células B podem ser activadas via receptores em sua superfície celular, incluindo o receptor de célula B e outras moléculas acessórias para realizar funções celulares acessórias, tais como a produção de citocinas.

Monócitos/macrófagos e células T podem ser activados por receptores em sua superfície celular e desempenham um papel central na resposta imune pela apresentação de antigénio a linfócitos e também actuam como células acessórias a linfócitos pela segregação de numerosas 3 citocinas.

As células assassinas naturais (NK) têm uma célula progenitora comum com as células T e as células B, e desempenham um papel em vigilância imune. As células NK, que compreendem até 15% de linfócitos sanguíneos, não expressam receptores de antígeno, e portanto, não usam reconhecimento de MHC como requisito para ligação a uma célula alvo. As células NK estão envolvidas no reconhecimento e morte de certas células de tumor e células infectadas por vírus. In vivo, acredita-se as células NK necessitam de activação, no entanto, in vitro, as células NK têm mostrado que destroem alguns tipos de células de tumor sem activação.

As actividades in vivo demonstradas destas citocinas ilustram o enorme potencial clínico de, e a necessidade de, outras citocinas, agonistas de citocina, e antagonistas de citocina ou parceiros de ligação. 0 documento WO 02/00721 descreve o receptor de citocina Zcytorl7. A presente invenção trata destas necessidade proporcionando um novo receptor de citocina multimérico hematopoiético, bem como composições e métodos relacionados. A presente invenção proporciona tais polipéptidos para estes e outro usos que deveriam ser aparentes a aqueles peritos na especialidade a partir dos ensinamentos no presente documento.

Com relação a isso, a invenção proporciona um receptor de citocina multimérico ou heterodimérico isolado que compreende: um primeiro polipéptido que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90 por cento de identidade de sequência com os resíduos 20-227 da SEQ ID NO: 111; e um segundo polipéptido que compreende os resíduos 28-429 da SEQ ID NO: 7; em que o receptor de citocina multimérico ou heterodimérico liga um ligando que 4 compreende os resíduos 27-164 da SEQ ID NO: 2. A invenção também proporciona um polinucleótido isolado que compreende um primeiro polinucleótido que codifica um primeiro polipéptido que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90 por cento de identidade de sequência com os resíduos 20-227 da SEQ ID NO: 111, e um segundo polinucleótido que codifica um segundo polipéptido que compreende os resíduos 28-429 da SEQ ID NO: 7; em que o primeiro e segundo polipéptidos formam um receptor de citocina multimérico ou heterodimérico que liga um ligando que compreende os resíduos 27-164 da SEQ ID NO: 2.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 é uma ilustração de um alinhamento múltiplo de zcytorl71ig humano (SEQ ID NO: 2) (zcytorl71ig), e zcytorl71ig de ratinho (SEQ ID NO: 11) (mzcytorl71ig), IL-3 de ratinho (mIL-3) (SEQ ID NO: 100), e IL-3 humana (hIL-3) (SEQ ID NO: 102). A Figura 2 é uma ilustração de um alinhamento múltiplo de zcytorl71ig humano (SEQ ID NO: 2) (zcytorl71ig) , e zcytorl71ig de ratinho (SEQ ID NO: 11) (mzcytorl71ig). A Figura 3 é um gráfico de hidrofilicidade Hopp/Woods de zcytorl71ig humano (SEQ ID NO: 2). A Figura 4 é um alinhamento múltiplo de sequências de polinucleótido de zcytorl7 SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 111, e SEQ ID NO: 115.

A Figura 5 é um alinhamento de zcytorl7 humano (ZCYTOR) (SEQ ID NO: 5) e zcytorl7 de ratinho (M17R-0) (SEQ ID NO: 117). Entre as duas sequências, residuos idênticos (:), Resíduos conservados (.) e lacunas (-) são indicados. SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona um receptor de citocina multimérico ou heterodimérico isolado que compreende pelo menos um polipéptido que tem pelo menos 90 por cento de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 111 5 ou SEQ ID NO: 109; e em que o receptor de citocina multimérico ou heterodimérico liga um ligando que compreende SEQ ID NO: 2. Opcionalmente, o receptor de citocina multimérico ou heterodimérico isolado pode compreender ainda um domínio de ligação a citocina de um receptor de citocina de classe I. O domínio de ligação a citocina do receptor de citocina de classe I pode compreender do resíduo de aminoácido 28 ao resíduo de aminoácido 429 da SEQ ID NO: 7, do resíduo de aminoácido 28 ao resíduo de aminoácido 739 da SEQ ID NO: 7, do resíduo de aminoácido 1 ao resíduo de aminoácido 429 da SEQ ID NO: 7, do resíduo de aminoácido 1 ao resíduo de aminoácido 739 da SEQ ID NO: 7, do resíduo de aminoácido 1 ao resíduo de aminoácido 761 da SEQ ID NO: 7, do resíduo de aminoácido 28 ao resíduo de aminoácido 761 da SEQ ID NO: 7, do resíduo de aminoácido 28 ao resíduo de aminoácido 979 da SEQ ID NO: 7, ou do resíduo de aminoácido 1 ao resíduo de aminoácido 979 da SEQ ID NO: 7. O receptor de citocina multimérico ou heterodimérico isolado pode antagonizar uma actividade da SEQ ID NO: 2. 0 receptor de citocina multimérico ou heterodimérico isolado pode inibir a proliferação de células hematopoiéticas, inibir a proliferação de células imunes, inibir a proliferação de células inflamatórias, inibir uma resposta imune, inibir uma resposta inflamatória, ou inibir a proliferação de células tumorais de origem epitelial. O receptor de citocina multimérico ou heterodimérico isolado pode ser solúvel. O receptor de citocina multimérico ou heterodimérico isolado pode compreender ainda uma etiqueta de afinidade, tal como, por exemplo, polihistidina, proteína A, glutationa S transferase, Glu-Glu, substância P, Flag™ péptido, péptido de ligação a estreptavidina, e polipéptido Fc de imunoglobulina, ou molécula citotóxica, tal como, por exemplo, uma toxina ou radionuclídeo. O receptor de citocina multimérico ou heterodimérico isolado em que o 6 polipéptido que tem pelo menos 90 por cento de identidade com a SEQ ID NO: 111 pode compreender do residuo de aminoácido 20 ao residuo de aminoácido 227 da SEQ ID NO: 111, do residuo de aminoácido 20 ao residuo de aminoácido 519 da SEQ ID NO: 111, do residuo de aminoácido 20 ao residuo de aminoácido 543 da SEQ ID NO: 111, do residuo de aminoácido 20 ao residuo de aminoácido 732 da SEQ ID NO: 111, do residuo de aminoácido 1 ao residuo de aminoácido 227, do residuo de aminoácido 1 ao residuo de aminoácido 519, do residuo de aminoácido 1 ao residuo de aminoácido 543, ou do residuo de aminoácido 1 ao residuo de aminoácido 732. O receptor de citocina multimérico ou heterodimérico isolado em que o polipéptido que tem pelo menos 90 por cento de identidade com a SEQ ID NO: 109 pode compreender do residuo de aminoácido 1 ao residuo de aminoácido 649 da SEQ ID NO: 109, ou do residuo de aminoácido 20 ao residuo de aminoácido 649 da SEQ ID NO: 109. A presente invenção também proporciona um receptor de citocina multimérico ou heterodimérico isolado que compreende pelo menos um polipéptido que compreende do residuo de aminoácido 20 ao residuo de aminoácido 227 da SEQ ID NO: 111. O pelo menos um polipéptido pode compreender do residuo de aminoácido 1 ao residuo de aminoácido 227 da SEQ ID NO: 111, do residuo de aminoácido 20 ao residuo de aminoácido 519 da SEQ ID NO: 111, do residuo de aminoácido 1 ao residuo de aminoácido 519 da SEQ ID NO: 111, do residuo de aminoácido 1 ao residuo de aminoácido 543 da SEQ ID NO: 111, do residuo de aminoácido 20 ao residuo de aminoácido 543 da SEQ ID NO: 111, do residuo de aminoácido 1 ao residuo de aminoácido 732 da SEQ ID NO: 111, ou do residuo de aminoácido 20 ao residuo de aminoácido 732 da SEQ ID NO: 111. O receptor de citocina multimérico ou heterodimérico isolado pode compreender ainda um dominio de ligação a citocina de um receptor de citocina de classe I, por exemplo, do residuo de aminoácido 7 28 ao resíduo de aminoácido 429 da SEQ ID NO: 7, do resíduo de aminoácido 1 ao resíduo de aminoácido 429 da SEQ ID NO: 7, do resíduo de aminoácido 28 ao resíduo de aminoácido 739 da SEQ ID NO: 7, do resíduo de aminoácido 1 ao resíduo de aminoácido 739 da SEQ ID NO: 7, do resíduo de aminoácido 28 ao resíduo de aminoácido 761 da SEQ ID NO: 7, do resíduo de aminoácido 1 ao resíduo de aminoácido 761 da SEQ ID NO: 7, do resíduo de aminoácido 28 ao resíduo de aminoácido 979 da SEQ ID NO: 7, ou do resíduo de aminoácido 1 ao resíduo de aminoácido 979 da SEQ ID NO: 7. 0 receptor de citocina multimérico ou heterodimérico isolado pode antagonizar uma actividade de um ligando que compreende a SEQ ID NO: 2. 0 receptor de citocina multimérico ou heterodimérico isolado pode inibir a proliferação de células hematopoiéticas, inibir a proliferação de células imunes, inibir a proliferação de células inflamatórias, inibir uma resposta imune, v uma resposta inflamatória, ou inibir a proliferação de células tumorais de origem epitelial. Opcionalmente, o receptor de citocina multimérico ou heterodimérico isolado pode ser é solúvel. 0 receptor de citocina multimérico ou heterodimérico isolado pode compreender ainda uma etiqueta de afinidade, tal como, por exemplo, polihistidina, proteína A, glutationa S transferase, Glu-Glu, substância P, Flag™ péptido, péptido de ligação a estreptavidina, e polipéptido Fc de imunoglobulina, ou molécula citotóxica, tal como, por exemplo, uma toxina ou radionuclídeo. A presente invenção também proporciona um receptor de citocina multimérico ou heterodimérico solúvel que compreende do resíduo de aminoácido 20 ao resíduo de aminoácido 227 da SEQ ID NO: 111 e do resíduo de aminoácido 28 ao resíduo de aminoácido 429 da SEQ ID NO: 7. A presente invenção também proporciona um polinucleótido isolado que codifica um polipéptido do receptor de citocina que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90 por cento de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 111 ou SEQ ID NO: 109, em que o polipéptido do receptor de citocina forma um receptor de citocina multimérico ou heterodimérico, e em que o receptor de citocina multimérico ou heterodimérico liga um ligando que compreende a SEQ ID NO: 2. 0 receptor de citocina multimérico ou heterodimérico pode compreender ainda um domínio de ligação a citocina de um receptor de citocina de classe I, tal como, por exemplo, do resíduo de aminoácido 28 ao resíduo de aminoácido 429 da SEQ ID NO: 7, do resíduo de aminoácido 28 ao resíduo de aminoácido 739 da SEQ ID NO: 7, do resíduo de aminoácido 1 ao resíduo de aminoácido 429 da SEQ ID NO: 7, do resíduo de aminoácido 1 ao resíduo de aminoácido 739 da SEQ ID NO: 7, do resíduo de aminoácido 1 ao resíduo de aminoácido 761 da SEQ ID NO: 7, do resíduo de aminoácido 28 ao resíduo de aminoácido 761 da SEQ ID NO: 7, do resíduo de aminoácido 28 ao resíduo de aminoácido 979 da SEQ ID NO: 7, ou do resíduo de aminoácido 1 ao resíduo de aminoácido 979 da SEQ ID NO: 7. O receptor de citocina multimérico ou heterodimérico pode antagonizar uma actividade da SEQ ID NO: 2. O receptor de citocina multimérico ou heterodimérico pode inibir a proliferação de células hematopoiéticas, inibir a proliferação de células imunes, inibir a proliferação de células inflamatórias, inibir uma resposta imune, inibir uma resposta inflamatória, ou inibir a proliferação de células tumorais de origem epitelial. Opcionalmente, o receptor de citocina multimérico ou heterodimérico pode ser solúvel. O receptor de citocina multimérico ou heterodimérico pode compreender ainda uma etiqueta de afinidade, tal como, por exemplo, polihistidina, proteína A, glutationa S transferase, Glu-Glu, substância P, Flag™ péptido, péptido de ligação a estreptavidina, e polipéptido Fc de imunoglobulina, ou molécula citotóxica, tal como, por exemplo, uma toxina ou radionuclídeo. O polipéptido do receptor de citocina 9 codificado que tem pelo menos 90 por cento de identidade com a SEQ ID NO: 111 pode compreender do resíduo de aminoácido 20 ao resíduo de aminoácido 227 da SEQ ID NO: 111, do resíduo de aminoácido 20 ao resíduo de aminoácido 519 da SEQ ID NO: 111, do resíduo de aminoácido 20 ao resíduo de aminoácido 543 da SEQ ID NO: 111, do resíduo de aminoácido 20 ao resíduo de aminoácido 732 da SEQ ID NO: 111, do resíduo de aminoácido 1 ao resíduo de aminoácido 227 da SEQ ID NO: 111, do resíduo de aminoácido 1 ao resíduo de aminoácido 519 da SEQ ID NO: 111, do resíduo de aminoácido 1 ao resíduo de aminoácido 543 da SEQ ID NO: 111, ou do resíduo de aminoácido 1 ao resíduo de aminoácido 732 da SEQ ID NO: 111. O polipéptido do receptor de citocina codificado que tem pelo menos 90 por cento de identidade com a SEQ ID NO: 109 pode compreender do resíduo de aminoácido 1 ao resíduo de aminoácido 649 da SEQ ID NO: 109, ou do resíduo de aminoácido 20 ao resíduo de aminoácido 649 da SEQ ID NO: 109. A presente invenção também proporciona um polinucleótido isolado que codifica um polipéptido do receptor de citocina que compreende do resíduo de aminoácido 20 ao resíduo de aminoácido 227 da SEQ ID NO: 111, em que o polipéptido do receptor de citocina forma um receptor de citocina multimérico ou heterodimérico. O polipéptido do receptor de citocina pode compreender do resíduo de aminoácido 1 ao resíduo de aminoácido 227 da SEQ ID NO: 111, do resíduo de aminoácido 20 ao resíduo de aminoácido 519 da SEQ ID NO: 111, do resíduo de aminoácido 1 ao resíduo de aminoácido 519 da SEQ ID NO: 111, do resíduo de aminoácido 1 ao resíduo de aminoácido 543 da SEQ ID NO: 111, do resíduo de aminoácido 20 ao resíduo de aminoácido 543 da SEQ ID NO: 111, do resíduo de aminoácido 1 ao resíduo de aminoácido 732 da SEQ ID NO: 111, ou do resíduo de aminoácido 20 ao resíduo de aminoácido 732 da SEQ ID NO: 111. O receptor de citocina multimérico ou 10 heterodimérico pode compreender ainda um domínio de ligação a citocina de um receptor de citocina de classe I, tal como, por exemplo, do resíduo de aminoácido 28 ao resíduo de aminoácido 429 da SEQ ID NO: 7, do resíduo de aminoácido 1 ao resíduo de aminoácido 429 da SEQ ID NO: 7, do resíduo de aminoácido 28 ao resíduo de aminoácido 739 da SEQ ID NO: 7, do resíduo de aminoácido 1 ao resíduo de aminoácido 739 da SEQ ID NO: 7, do resíduo de aminoácido 28 ao resíduo de aminoácido 761 da SEQ ID NO: 7, do resíduo de aminoácido 1 ao resíduo de aminoácido 761 da SEQ ID NO: 7, do resíduo de aminoácido 28 ao resíduo de aminoácido 979 da SEQ ID NO: 7, ou do resíduo de aminoácido 1 ao resíduo de aminoácido 979 da SEQ ID NO: 7. O receptor de citocina multimérico ou heterodimérico pode antagonizar uma actividade de um ligando que compreende a SEQ ID NO: 2. O receptor de citocina multimérico ou heterodimérico pode inibir a proliferação de células hematopoiéticas, inibir a proliferação de células imunes, inibir a proliferação de células inflamatórias, inibir uma resposta imune, inibir uma resposta inflamatória, ou inibir a proliferação de células tumorais de origem epitelial. Opcionalmente, o receptor de citocina multimérico ou heterodimérico pode ser solúvel. O receptor de citocina multimérico ou heterodimérico pode compreender ainda uma etiqueta de afinidade ou molécula citotóxica como descrita no presente documento. A presente invenção também proporciona um vector de expressão que compreende os seguintes elementos ligados operativamente: um promotor de transcrição; um segmento de ADN que codifica um polipéptido do receptor de citocina que tem pelo menos 90 por cento de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 111; e um terminador de transcrição; em que o polipéptido do receptor de citocina forma um receptor de citocina multimérico ou heterodimérico, e em que o receptor de citocina multimérico ou heterodimérico liga um ligando 11 que compreende a SEQ ID NO: 2.

Alternativamente, a presente invenção também proporciona um vector de expressão que compreende os seguintes elementos ligados operativamente: a) um primeiro promotor de transcrição; um primeiro segmento de ADN que codifica um polipéptido do receptor de citocina que tem pelo menos 90 por cento de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 111; e um primeiro terminador de transcrição; e b) um segundo promotor de transcrição; um segundo segmento de ADN que codifica um domínio de ligação a citocina de um receptor de citocina de classe I; e um segundo terminador de transcrição; em que o polipéptido do receptor de citocina e o receptor de citocina de classe I formam um receptor de citocina multimérico ou heterodimérico; e em que o receptor de citocina multimérico ou heterodimérico liga a um ligando que compreende a SEQ ID NO: 2.

Alternativamente, a presente invenção também proporciona um vector de expressão que compreende os seguintes elementos ligados operativamente: a) um primeiro promotor de transcrição; um primeiro segmento de ADN que codifica um polipéptido que tem pelo menos 90 por cento de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 111; e um primeiro terminador de transcrição; e b) um segundo promotor de transcrição; um segundo segmento de ADN que codifica pelo menos uma porção de um receptor de citocina de classe I; e um segundo terminador de transcrição; em que o polipéptido e o receptor de citocina de classe I formam um receptor de citocina multimérico; e em que the receptor de citocina multimérico liga a pelo menos uma porção da SEQ ID NO: 2.

Os vectores de expressão da presente invenção podem incluir ainda uma sequência de sinal secretora ligada ao primeiro e segundo segmentos de ADN. O receptor de citocina multimérico ou heterodimérico pode ser solúvel, ligado a membrana, ou unido a um suporte sólido. O receptor de citocina multimérico ou heterodimérico pode antagonizar uma 12 actividade de um ligando que compreende a SEQ ID NO: 2. O receptor de citocina multimérico ou heterodimérico pode inibir a proliferação de células hematopoiéticas, inibir a proliferação de células imunes, inibir a proliferação de células inflamatórias, inibir uma resposta imune, inibir uma resposta inflamatória, ou inibir a proliferação de células tumorais de origem epitelial. Opcionalmente, o receptor de citocina multimérico ou heterodimérico pode ser solúvel. 0 receptor de citocina multimérico ou heterodimérico pode compreender ainda uma etiqueta de afinidade ou molécula citotóxica como descrita no presente documento. A presente invenção também proporciona uma célula cultivada incluindo um vector de expressão como descrito no presente documento, em que a célula expressa o polipéptido ou polipéptidos codificado por o segmento de ADN ou segmentos. A célula pode segregar o receptor de citocina multimérico ou heterodimérico. 0 receptor de citocina multimérico pode ligar e/ou antagonizar uma actividade da SEQ ID NO: 2 como descrita adicionalmente no presente documento. A presente invenção também proporciona uma célula cultivada que inclui um primeiro vector de expressão que compreende: a) um promotor de transcrição; b) um segmento de ADN que codifica um polipéptido do receptor de citocina que tem pelo menos 90 por cento de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 111; e c) um terminador de transcrição; e um segundo vector de expressão que compreende: a) um promotor de transcrição; b) um segmento de ADN que codifica um domínio de ligação a citocina de um receptor de citocina de classe I; e c) um terminador de transcrição; em que o polipéptido do receptor de citocina e o receptor de citocina de classe I formam um receptor de citocina multimérico ou heterodimérico, e em que o receptor de citocina multimérico ou heterodimérico liga a um ligando 13 que compreende a SEQ ID NO: 2. O primeiro e segundo vectores de expressão pode incluir uma sequência de sinal secretora ligada operativamente ao primeiro e segundo segmentos de ADN. A célula cultivada pode compreender ainda um terceiro vector de expressão que inclui a) um promotor de transcrição; b) um segmento de ADN que codifica um dominio de ligação a citocina de um segundo receptor de citocina de classe I; e c) um terminador de transcrição; em que o polipéptido do receptor de citocina, o primeiro receptor de citocina de classe I, e o segundo receptor de citocina de classe I formam um receptor de citocina multimérico. 0 dominio de ligação a citocina de um receptor de citocina de classe I pode ser da SEQ ID NO: 7 e/ou SEQ ID NO: 9. Opcionalmente, o receptor de citocina multimérico ou heterodimérico pode ser solúvel. 0 receptor de citocina multimérico ou heterodimérico podem incluir ainda uma etiqueta de afinidade como descrita no presente documento. 0 receptor de citocina multimérico ou heterodimérico pode ligar a pelo menos uma porção da SEQ ID NO: 2 e/ou antagonize uma actividade da SEQ ID NO: 2 como descrita no presente documento. A presente invenção também proporciona um método de produção de um anticorpo contra um receptor de citocina multimérico ou heterodimérico que compreende do resíduo de aminoácido 20 ao resíduo de aminoácido 227 da SEQ ID NO: 111 e um domínio de ligação a citocina de um receptor de citocina de classe I. O método inclui inocular um animal com o receptor de citocina multimérico ou heterodimérico, em que o receptor de citocina multimérico ou heterodimérico provoca uma resposta imune no animal para produzir um anticorpo que especificamente liga o receptor de citocina multimérico ou heterodimérico; e isolar o anticorpo do animal. O anticorpo pode opcionalmente ser um anticorpo monoclonal. O anticorpo pode opcionalmente ser um anticorpo de neutralização. O anticorpo pode especificamente ligar a 14 um receptor de citocina multimérico ou heterodimérico como descrita no presente documento. A presente invenção também proporciona uma composição que inclui uma quantidade eficaz de um receptor de citocina multimérico ou heterodimérico solúvel que compreende do resíduo de aminoácido 20 ao resíduo de aminoácido 227 da SEQ ID NO: 111 e um domínio de ligação a citocina de um receptor de citocina de classe I; e um veículo farmaceuticamente aceitável. O domínio de ligação do receptor de citocina de classe I pode incluir do resíduo de aminoácido 28 ao resíduo de aminoácido 429 da SEQ ID NO: 7. O receptor de citocina multimérico ou heterodimérico solúvel pode ligar a um ligando que compreende a SEQ ID NO: 2. O receptor de citocina multimérico ou heterodimérico solúvel pode incluir ainda uma etiqueta de afinidade ou molécula citotóxica como descrita no presente documento. A composição pode antagonizar uma actividade de um ligando que compreende a SEQ ID NO: 2. A composição pode inibir a proliferação de células hematopoiéticas, inibir a proliferação de células imunes, inibir a proliferação de células inflamatórias, inibir uma resposta imune, inibir uma resposta inflamatória, ou inibir a proliferação de células tumorais de origem epitelial A presente invenção também proporciona um método de produção de um receptor de citocina multimérico ou heterodimérico que compreende cultivar uma célula como descrita no presente documento, e isolar o receptor de citocina multimérico ou heterodimérico produzido pela célula. A presente invenção também proporciona uma composição de inibição de célula imune que inclui uma quantidade eficaz de um receptor de citocina multimérico ou heterodimérico solúvel que compreende do resíduo de aminoácido 20 ao resíduo de aminoácido 227 da SEQ ID NO: 111 e um domínio de ligação a citocina de um receptor de 15 citocina de classe I; e um veículo farmaceuticamente aceitável; em que o receptor de citocina multimérico ou heterodimérico solúvel inibe a proliferação de células imunes. A presente invenção também proporciona uma composição de inibição de resposta imune que inclui uma quantidade eficaz de um receptor de citocina multimérico ou heterodimérico solúvel que compreende do resíduo de aminoácido 20 ao resíduo de aminoácido 227 da SEQ ID NO: 111 e um domínio de liqação a citocina de um receptor de citocina de classe I; e um veículo farmaceuticamente aceitável; em que o receptor de citocina multimérico ou heterodimérico solúvel inibe uma resposta imune. A presente invenção também proporciona uma composição de inibição de célula inflamatória que inclui uma quantidade eficaz de um receptor de citocina multimérico ou heterodimérico solúvel que compreende do resíduo de aminoácido 20 ao resíduo de aminoácido 227 da SEQ ID NO: 111 e um domínio de liqação a citocina de um receptor de citocina de classe I; e um veículo farmaceuticamente aceitável; em que o receptor de citocina multimérico ou heterodimérico solúvel inibe a proliferação de células inflamatórias. A presente invenção também proporciona uma composição de inibição de resposta inflamatória que inclui uma quantidade eficaz de um receptor de citocina multimérico ou heterodimérico solúvel que compreende do resíduo de aminoácido 20 ao resíduo de aminoácido 227 da SEQ ID NO: 111 e um domínio de ligação a citocina de um receptor de citocina de classe I; e um veículo farmaceuticamente aceitável; em que o receptor de citocina multimérico ou heterodimérico solúvel inibe uma resposta inflamatória. A presente invenção também proporciona um método de inibição de uma resposta imune num mamífero exposto a um antigénio ou patogénio. O método inclui (a) determinar 16 directamente ou indirectamente o nível de antigénio ou patogénio presente no mamífero; (b) administrar uma composição gue compreende um receptor de citocina multimérico ou heterodimérico solúvel num veículo farmaceuticamente aceitável; (c) determinar directamente ou indirectamente o nível de antigénio ou patogénio no mamífero; e (d) comparar o nível do antigénio ou patogénio na etapa (a) ao nível do antigénio ou patogénio na etapa (c) , em que uma mudança no nível é indicativo de inibição de uma resposta imune. 0 método pode compreender ainda (e) re-administrar uma composição que compreende um receptor de citocina multimérico num veículo farmaceuticamente aceitável; (f) determinar directamente ou indirectamente o nível de antigénio ou patogénio no mamífero; e (g) comparar o número do nível do antigénio ou patogénio na etapa (a) ao antigénio nível na etapa (f), em que uma mudança no nível é indicativo de inibição de uma resposta imune. A presente invenção também proporciona um método para reduzir células hematopoiéticas e/ou células progenitoras hematopoiéticas num mamífero. 0 método inclui cultivar medula óssea ou células de sangue periférico com uma composição que compreende uma quantidade eficaz de um receptor de citocina multimérico ou heterodimérico solúvel para produzir uma diminuição no número de células linfóides na medula óssea ou células de sangue periférico em comparação com medula óssea ou células de sangue periférico cultivadas na ausência do receptor de citocina multimérico. As células hematopoiéticas e células progenitoras hematopoiéticas podem ser linfóides, que pode ser células monocíticas, macrófagos, ou células T. A presente invenção também proporciona um método de detecção da presença de um receptor de citocina multimérico ou heterodimérico numa amostra biológica. 0 método inclui colocar em contacto a amostra biológica com um anticorpo, ou um fragmento de anticorpo, como descrito no presente 17 documento, em que a colocação em contacto é realizada sob condições que permitem que a ligação do anticorpo ou fragmento de anticorpo à amostra biológica; e detectar qualquer do anticorpo ligado ou fragmento de anticorpo ligado. A presente invenção também proporciona um método de um método de destruir células de cancro. 0 método inclui obter ex vivo um tecido ou amostra biológica que contém células de cancro de um paciente, ou identificar células de cancro in vivo; produzir um receptor de citocina multimérico ou heterodimérico por meio de um método como descrita no presente documento; formular o receptor de citocina multimérico ou heterodimérico num veiculo farmaceuticamente aceitável; e administrar ao paciente ou expor as células de cancro à formulação de receptor de citocina multimérico ou heterodimérico; em que o receptor de citocina multimérico ou heterodimérico destrói as células. 0 receptor de citocina multimérico ou heterodimérico pode ser ainda conjugado a uma toxina. A presente invenção também proporciona um anticorpo que especificamente liga a um receptor de citocina multimérico ou heterodimérico como descrito no presente documento. 0 anticorpo pode ser um anticorpo policlonal, um anticorpo monoclonal murino, um anticorpo humanizado derivado de um anticorpo monoclonal murino, um fragmento de anticorpo, um anticorpo de neutralização, ou um anticorpo monoclonal humano. 0 anticorpo ou fragmento de anticorpo pode especificamente ligar a um receptor de citocina multimérico ou heterodimérico da presente invenção que pode compreender um polipéptido do receptor de citocina que compreende do resíduo de aminoácido 20 ao resíduo de aminoácido 227 da SEQ ID NO: 111 e um domínio de ligação a citocina de um receptor de citocina de classe I. O anticorpo pode incluir ainda um radionuclídeo, enzima, substrato, cofactor, marcador fluorescente, marcador 18 quimioluminescente, etiqueta de péptido, partícula magnética, fármaco, ou toxina. A presente invenção também proporciona um método para inibir proliferação ou diferenciação induzida por zcytorl71ig de células hematopoiéticas e células progenitoras hematopoiéticas. 0 método inclui cultivar medula óssea ou células de sangue periférico com uma composição que compreende uma quantidade de um receptor de citocina multimérico ou heterodimérico solúvel que compreende um polipéptido do receptor de citocina que compreende do resíduo de aminoácido 20 ao resíduo de aminoácido 227 da SEQ ID NO: 111 e um domínio de ligação a citocina de um receptor de citocina de classe I suficiente para reduzir a proliferação ou diferenciação das células hematopoiéticas na medula óssea ou células de sangue periférico em comparação com medula óssea ou células de sangue periférico cultivadas na ausência do receptor de citocina multimérico ou heterodimérico solúvel. As células hematopoiéticas e células progenitoras hematopoiéticas podem ser células linfóides, tais como macrófagos ou células T. A presente invenção também proporciona um método de redução de inflamação induzida por zcytorl71ig. O método inclui administrar a um mamífero com inflamação uma quantidade de uma composição que compreende do resíduo de aminoácido 20 ao resíduo de aminoácido 227 da SEQ ID NO: 111 e um domínio de ligação a citocina de um receptor de citocina de classe I suficiente para reduzir a inflamação. A presente invenção também proporciona um método de supressão de uma resposta inflamatória num mamífero com inflamação. 0 método inclui (1) determinar um nível de uma molécula inflamatória; (2) administrar uma composição que compreende do resíduo de aminoácido 20 ao resíduo de aminoácido 227 da SEQ ID NO: 111 e um domínio de ligação a citocina de um receptor de citocina de classe I num veículo 19 farmaceuticamente aceitável; (3) determinar um nivel após a administração da molécula inflamatória; (4) comparar o nivel da molécula inflamatória na etapa (1) com o nivel da molécula inflamatória na etapa (3), em que uma falta de crescimento ou uma diminuição o nivel de molécula inflamatória é indicativo de supressão de uma resposta inflamatória. A presente invenção também proporciona um método para inibir proliferação ou diferenciação induzida por zcytorl71ig de células hematopoiéticas e células progenitoras hematopoiéticas. 0 método inclui cultivar medula óssea ou células de sangue periférico com uma composição que compreende do resíduo de aminoácido 20 ao resíduo de aminoácido 227 da SEQ ID NO: 111 e um dominio de ligação a citocina de um receptor de citocina de classe I num veículo farmaceuticamente aceitável suficiente para reduzir a proliferação ou diferenciação das células hematopoiéticas na medula óssea ou células de sangue periférico em comparação com medula óssea ou células de sangue periférico cultivadas na ausência de receptor de citocina multimérico ou heterodimérico solúvel. As células hematopoiéticas e células progenitoras hematopoiéticas podem ser células linfóides, tal como macrófagos ou células T. A presente invenção também proporciona um método de redução de inflamação induzida por zcytorl71ig. O método inclui administrar a um mamífero com inflamação uma quantidade de uma composição que compreende do resíduo de aminoácido 20 ao resíduo de aminoácido 227 da SEQ ID NO: 111 e um domínio de ligação a citocina de um receptor de citocina de classe I num veículo farmaceuticamente aceitável suficiente para reduzir a inflamação. A presente invenção também proporciona um método de supressão de uma resposta inflamatória num mamífero com inflamação. O método inclui (1) determinar um nível de uma 20 molécula inflamatória; (2) administrar uma composição que compreende um receptor de citocina multimérico ou heterodimérico que compreende do resíduo de aminoácido 20 ao resíduo de aminoácido 227 da SEQ ID NO: 111 num veículo farmaceuticamente aceitável; (3) determinar um nível após a administração da molécula inflamatória; (4) comparar o nível da molécula inflamatória na etapa (1) com o nível da molécula inflamatória na etapa (3) , em que uma falta de crescimento ou uma diminuição no nível de molécula inflamatória é indicativo de supressão de uma resposta inflamatória. A presente invenção também proporciona um método de tratamento de um mamífero afligido com uma doença inflamatória em que zcytorl71ig desempenha um papel. O método inclui administrar um antagonista de zcytorl71ig ao mamífero tal que a inflamação é reduzida, em que o antagonista é um receptor de citocina multimérico ou heterodimérico solúvel que compreende do resíduo de aminoácido 20 ao resíduo de aminoácido 227 da SEQ ID NO: 111 e um domínio de ligação a citocina de um receptor de citocina de classe I num veículo farmaceuticamente aceitável. A doença inflamatória pode ser uma doença inflamatória crónica, tal como, por exemplo, doença inflamatória do intestino, colite ulcerativa, doença de Crohn, dermatite atópica, eczema, ou psoríase. A doença inflamatória pode ser uma doença inflamatória aguda, tal como, por exemplo, endotoxemia, septicemia, síndrome do choque tóxico, ou doença infecciosa. Opcionalmente, o receptor de citocina multimérico ou heterodimérico solúvel pode compreender ainda um radionuclídeo, enzima, substrato, cofactor, marcador fluorescente, marcador quimioluminescente, etiqueta de péptido, partícula magnética, fármaco, ou toxina. A presente invenção também proporciona um método para detectar inflamação num paciente. O método inclui obter um 21 tecido ou amostra biológica de um paciente; incubar o tecido ou amostra biológica com um receptor de citocina multimérico ou heterodimérico solúvel que compreende do residuo de aminoácido 20 ao residuo de aminoácido 227 da SEQ ID NO: 111 e um domínio de ligação a citocina de um receptor de citocina de classe I sob condições em que o receptor de citocina multimérico ou heterodimérico solúvel liga a seu polipéptido complementar no tecido ou amostra biológica; visualizar o receptor de citocina multimérico ou heterodimérico solúvel ligado no tecido ou amostra biológica; e comparar níveis de receptor de citocina multimérico ou heterodimérico solúvel ligado no tecido ou amostra biológica do paciente a um tecido ou amostra biológica normal de controlo, em que um aumento no nível de receptor de citocina multimérico ou heterodimérico solúvel ligado ao paciente tecido ou amostra biológica com relação ao tecido ou amostra biológica normal de controlo é indicativo de inflamação no paciente. A presente invenção também proporciona um método para detectar um ligando de receptor de citocina múltiplo a partir de uma amostra de teste. O método inclui colocar em contacto a amostra de teste com um receptor de citocina multimérico ou heterodimérico que compreende um polipéptido do receptor de citocina que compreende do resíduo de aminoácido 20 ao resíduo de aminoácido 227 da SEQ ID NO: 111 e um domínio de ligação a citocina de um receptor de citocina de classe I; e detectar a ligação do receptor de citocina multimérico ou heterodimérico ao ligando na amostra de teste. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Definições

Antes de expor a invenção em detalhe, pode ser proveitoso para o entendimento da mesma definir os seguintes termos: A menos que de outra forma especificado, "um", "uma", 22 "o", e "pelo menos um" são usados de forma intercambiável e significam um ou mais de um. 0 termo "etiqueta de afinidade" é utilizado no presente documento para denotar um segmento de polipéptido que pode ser unido a um segundo polipéptido para proporcionar purificação ou detecção do segundo polipéptido ou proporcionar locais para união do segundo polipéptido a um substrato. Em principal, qualquer péptido ou proteína para que um anticorpo ou outro agente de ligação específico está disponível pode ser utilizado como uma etiqueta de afinidade. Etiquetas de afinidade incluem um trato de polihistidina, proteína A (Nilsson et al., EMBO J. 4:1075, 1985; Nilsson et al.r Methods Enzymol. 198:3, 1991), glutationa S transferase (Smith e Johnson, Gene 67:31, 1988), etiqueta de afinidade Glu-Glu (Grussenmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:7952-4,1985), substância P, péptido Flag™ (Hopp et al., Biotechnology 6:1204-10, 1988), péptido de ligação a estreptavidina, ou outro epítopo antigénico ou domínio de ligação. Veja-se, em geral, Ford et al., Protein Expression and Purification 2: 95-107, 1991. Etiquetas de afinidade que codificam ADN estão disponíveis de fornecedores comerciais (por exemplo, Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). O termo "variante alélica" é utilizado no presente documento para denotar qualquer de duas ou mais formas alternativas de um gene que ocupa o mesmo locus cromossómico. A variação alélica surge de forma natural através de mutação, e pode ter como resultado polimorfismo fenotípico dentro de populações. Mutações génicas podem ser silenciosas (sem mudança no polipéptido codificado) ou pode codificar polipéptidos que têm sequência de aminoácido alterada. O termo variante alélica também é utilizado no presente documento para denotar uma proteína codificada por uma variante alélica de um gene. O termos "amino-terminal" e "carboxil-terminal" são 23 utilizados no presente documento para denotar posições dentro dos polipéptidos. Onde o contexto permite, estes termos são utilizados com referência a uma particular sequência ou porção de um polipéptido para denotar proximidade ou posição relativa. Por exemplo, uma certa sequência posicionada carboxil-terminal com relação a uma sequência de referência dentro de um polipéptido é localizada proximal à terminação carboxilo da sequência de referência, mas não está necessariamente na terminação carboxilo do polipéptido completo. 0 termo "par complemento/anti-complemento" denota fracções não idênticas que formam um par estável associado de forma não covalente sob condições apropriadas. Por exemplo, biotina e avidina (ou estreptavidina) são membros prototípicos de um par complemento/anti-complemento. Outros pares complemento/anti-complemento exemplares incluem pares receptor/ligando, pares anticorpo/antigénio (ou hapteno ou epitopo), pares de polinucleótido sense/antisense, e similares. Onde a dissociação subsequente do par complemento/anti-complemento é desejável, o par complemento/anti-complemento preferentemente tem uma afinidade de ligação de <109 M_1. . 0 termo "complementos de uma molécula de polinucleótido" denota uma molécula de polinucleótido que tem uma sequência de bases complementares e orientação reversa em comparação com uma sequência de referência. Por exemplo, a sequência 5' ATGCACGGG 3' é complementar a 5' CCCGTGCAT 3'. 0 termo "contig" denota um polinucleótido que tem um trecho contíguo de sequência idêntica ou complementar a outro polinucleótido. Diz-se que as sequências contíguas "sobrepõe" um dado trecho de sequência de polinucleótido em sua totalidade ou ao longo de um trecho parcial do polinucleótido. Por exemplo, contigs representativos da sequência de polinucleótido 5'-ATGGCTTAGCTT-3' são 5'- TAGCTTgagtct-3' e 3'-gtcgacTACCGA-5'. 0 termo "sequência de nucleótidos degenerada" denota uma sequência de nucleótidos que inclui um ou mais codões degenerados (em comparação com uma molécula de polinucleótido de referência que codifica um polipéptido). Codões degenerados contêm tripletes diferentes de nucleótidos, mas codificam o mesmo resíduo de aminoácido (isto é, tripletes GAU e GAC cada codificam Asp). 0 termo "vector de expressão" é utilizado para denotar uma molécula de ADN, linear ou circular, que compreende um segmento que codifica um polipéptido de interesse ligado operativamente a segmentos adicionais que possibilitam sua transcrição. Tais segmentos adicionais incluem sequências promotoras e de terminação, e podem também incluir uma ou mais origens de replicação, um ou mais marcadores seleccionáveis, um potenciador, um sinal de poliadenilação, etc. Vectores de expressão são geralmente derivados de ADN de plasmídeo ou virai, ou pode conter elementos de ambos. 0 termo "isolado", quando é aplicado a um polinucleótido, denota que o polinucleótido foi retirado de seu ambiente genético natural e é assim livre de outras sequências codificantes estranhas ou não desejadas, e está numa forma adequada para utilização dentro sistemas de produção de proteínas modificadas por engenharia genética. Tais moléculas isoladas são aquelas que são separadas de seu ambiente natural e incluem ADNc e clones genómicos. Moléculas isoladas de ADN da presente invenção são livres de outros genes com que estão ordinariamente associados, mas podem incluir regiões não traduzidas que ocorrem de forma natural 5' e 3' tal como promotores e terminadores. A identificação de regiões associadas será evidente a um perito comum na especialidade (veja-se, por exemplo, Dynan e Tijan, Nature 316:774-78, 1985).

Um polipéptido ou proteína "isolado" é um polipéptido ou proteína que se encontra numa condição diferente de seu 25 ambiente nativo, tal como fora do tecido animal e sangue. Numa forma preferida, o polipéptido isolado é substancialmente livre de outros polipéptidos, particularmente outros polipéptidos de origem animal. É preferido proporcionar os polipéptidos numa forma altamente purificada, isto é, superior a 95% pura, mais preferentemente superior a 99% pura. Quando é utilizado neste contexto, o termo "isolado" não exclui a presença do mesmo polipéptido em formas físicas alternativas, tais como dímeros ou alternativamente formas glicosiladas ou derivatizadas. 0 termo "neoplásico", quando se refere a células, indica células que estão a sofrer proliferação nova e anormal, particularmente num tecido onde na proliferação é descontrolada e progressiva, resultando num neoplasma. As células neoplásicas podem ser malignas, isto é, invasivas e metastáticas, ou benignas. 0 termo "ligado operativamente", quando se refere a segmentos de ADN, indica que os segmentos são dispostos de modo que funcionam em harmonia para seus propósitos pretendidos, por exemplo, a transcrição inicia no promotor e prossegue através do segmento de codificação até o terminador. 0 termo "ortólogo" denota um polipéptido ou proteína obtida de uma espécie que é a contraparte funcional de um polipéptido ou proteína de uma espécie diferente. Diferenças de sequência entre ortólogos são o resultado de especiação. "Parálogos" são proteínas distintas, mas estruturalmente relacionadas feitas por um organismo. Acredita-se que os parálogos surjam através da duplicação do gene. Por exemplo, a-globina, β-globina, e mioglobina são parálogos entre si.

Um "polinucleótido" é um polímero de cadeia simples ou dupla de bases de desoxirribonucleótido ou ribonucleótido 26 lidos desde a extremidade 5' até a extremidade 3'. Os polinucleótidos incluem ARN e ADN, e podem ser isolados de fontes naturais, sintetizados in vitro, ou preparados a partir de uma combinação de moléculas naturais e sintéticas. Os tamanhos de polinucleótidos são expressos como pares de bases (abreviados "pb"), nucleótidos ("nt"), ou quilobases ("kb") . Onde o contexto permita, os dois últimos termos podem descrever polinucleótidos que são de cadeia simples ou de cadeia dupla. Quando o termo é aplicado a moléculas de cadeia dupla é utilizado para denotar o comprimento completo e será entendido que seja equivalente ao termo "pares de bases". Será reconhecido pelos peritos na especialidade que as duas cadeias de um polinucleótido de cadeia dupla podem diferir ligeiramente em comprimento e que as extremidades das mesmas podem ser dispostas alternadamente como um resultado da clivagem enzimática; assim todos os nucleótidos dentro de uma molécula de polinucleótido de cadeia dupla podem não estar emparelhados.

Um "polipéptido" é um polímero de resíduos de aminoácido unidos por ligações peptídicas, tanto se for produzido de forma natural ou sinteticamente. Polipéptidos de menos de aproximadamente 10 resíduos de aminoácido são comummente denominados como "péptidos". O termo "promotor" é utilizado no presente documento pelo seu significado conhecido na especialidade para denotar uma porção de um gene que contém sequências de ADN que tratam da ligação de ARN polimerase e iniciação da transcrição. As sequências promotoras são comummente, mas não sempre, encontradas nas regiões não codificantes 5' dos genes.

Uma "proteína" é uma macromolécula que compreende uma ou mais cadeias de polipéptidos. Uma proteína pode também compreender componentes não peptídicos, tais como grupos de hidratos de carbono. Hidratos de carbono e outros 27 substituintes não peptídicos podem ser adicionados a uma proteína pela célula na qual a proteína é produzida, e variará com o tipo de célula. As proteínas são definidas no presente documento em termos das suas estruturas principais de aminoácido; substituintes tais como grupos de hidratos de carbono não são geralmente especificados, mas podem estar presentes mesmo assim. 0 termo "receptor" denota uma proteína associada à célula que se liga a uma molécula bioactiva (isto é, um ligando) e media o efeito do ligando sobre a célula. Receptores ligados à membrana são caracterizados por uma estrutura multi-peptídica que compreende um domínio de ligação a ligando extracelular e um domínio efector intracelular que está tipicamente envolvido na transdução de sinal. Ligação de ligando a receptor tem como resultado uma mudança conformacional no receptor que produz uma interacção entre o domínio efector e outra(s) molécula(s) na célula. Esta interacção por sua vez leva a uma alteração no metabolismo da célula. Eventos metabólicos que são ligados a interacções receptor-ligando incluem transcrição de gene, fosforilação, desfosforilação, aumentos na produção de AMP cíclico, mobilização de cálcio celular, mobilização de lípidos de membrana, adesão celular, hidrólise de lípidos de inositol e hidrólise de fosfolípidos. Em geral, os receptores podem ser receptor ligado à membrana, citossólico ou nuclear; monomérico (por exemplo, receptor da hormona de estimulação da tireoide, receptor beta-adrenérgico) ou multimérico (por exemplo, receptor do PDGF, receptor da hormona do crescimento, receptor da IL-3, receptor do GM-CSF, receptor do G-CSF, receptor da eritropoietina e receptor da IL-6). 0 termo "sequência sinal de secreção" denota uma sequência de ADN que codifica um polipéptido (um "péptido de secreção") que, como um componente de um polipéptido maior, direcciona o polipéptido maior através de uma via de 28 secreção de uma célula na qual é sintetizado. 0 polipéptido maior é comummente clivado para remover o péptido de secreção durante o trânsito através da via de secreção.

Um "receptor solúvel" é um polipéptido receptor que não é ligado a uma membrana celular. Receptores solúveis são o mais comummente polipéptidos receptores de ligação a ligando que não possuem domínios transmembrana e citoplasmático. Receptores solúveis podem compreender resíduos de aminoácido adicionais, tal como etiquetas de afinidade que proporcionam a purificação do polipéptido ou proporcionam locais para união do polipéptido a um substrato, ou sequências de região constante de imunoglobulina. Muitos receptores de superfície celular têm contrapartes de ocorrência natural, solúveis que são produzidos por proteólise. Diz-se que os polipéptidos receptores solúveis são substancialmente livres de segmentos de polipéptido transmembrana e intracelular quando não possuem suficientes porções destes segmentos para proporcionar ancoramento de membrana ou transdução de sinal, respectivamente. 0 termo "variante splice" é utilizado no presente documento para denotar formas alternativas de ARN transcritas de um gene. Variação splice surge de forma natural através da utilização de locais de splicing alternativo dentro de uma molécula de ARN transcrita, ou menos comummente entre moléculas de ARN separadamente transcritas, e pode ter como resultado diversos ARNm transcritos do mesmo gene. Variantes splice podem codificar polipéptidos que têm sequência de aminoácidos alterada. 0 termo variante splice é também usado no presente documento para denotar uma proteína codificado por um variante splice de um ARNm transcrito a partir de um gene.

Pesos moleculares e comprimentos de polímeros determinados por meio de métodos analíticos imprecisos (por exemplo, electroforese em gel) serão entendidos como sendo 29 valores aproximados. Quando tal valor é expresso como "aproximadamente" X ou "de maneira aproximada" X, o valor indicado de X será entendido que seja exacto a ±10%. A presente invenção baseia-se em parte na descoberta de um novo receptor de citocina multimérico proteína que tem a estrutura de um receptor de citocina de classe I, referido no presente documento como "receptor de citocina multimérico", ou "receptor de citocina multimérico zcytorl7". O receptor de citocina multimérico inclui pelo menos uma porção de uma subunidade de receptor zcytorl7, revelado no pedido de patente U.S. de propriedade comum N° de Série 09/892.949. Outro polipéptido de subunidade de receptor que pode ser incluído no receptor de citocina multimérico da presente invenção inclui pelo menos uma porção de pelo menos um polipéptido de um receptor de citocina de classe I, tal como OSMRbeta e/ou WSX-1. Por exemplo, a sequência deduzida de aminoácidos indicou que zcytorl7 pertence à subfamília de receptor que inclui gpl30, LIF, IL-12, receptor beta da oncostatinaM (OSMRbeta) (SEQ ID NO: 7), receptores WSX-1 (SEQ ID NO: 9) (Sprecher, CA et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 246:81-90 (1998); e Patente U.S. n° 5.925.735), DCRS2 (Publicação da WIPO No. WO 00/73451), a subunidade β do receptor de IL-2 e o receptor comum β (isto é, IL-3, IL-5, e subunidades de receptor GM-CSF). Um exemplo adicional de polipéptidos de subunidade de receptor de citocina de classe I que podem ser incluídos no receptor de citocina multimérico são os receptores para IL-2, IL-4, IL-7, Lif, IL-12, IL-15, EPO, TPO, GM-CSF e G-CSF (Cosman, Cyokine, 5(2):95-106 (1993)).

Subunidades de receptor de citocina são caracterizadas por uma estrutura de multi-domínio que compreende um domínio extracelular, um domínio transmembrana que ancora o polipéptido na membrana celular, e um domínio intracelular. O domínio extracelular pode ser um domínio de ligação a ligando, e o domínio intracelular 30 pode ser um domínio efector envolvido em transdução de sinal, embora funções de ligação a ligando e efectoras podem residir em subunidades separadas de um receptor multimérico. O próprio domínio de ligação a ligando pode ser uma estrutura de multi-dominio. Receptores multiméricos incluem homodímeros (por exemplo, isoformas oíoí e ββ de receptor PDGF, receptor de eritropoietina, MPL, e receptor de G-CSF) , heterodímeros cujos subunidades cada uma tem domínios de ligação a ligando e efector (por exemplo, isoforma αβ de receptor de PDGF), e multímeros que tem subunidades de componente com funções diferentes (por exemplo, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, e receptores de GM-CSF). Algumas subunidades de receptor são comuns a uma pluralidade de receptores. Por exemplo, a subunidade AIC2B, que não pode ligar ligando por si próprio, mas inclui um domínio de transdução de sinal intracelular, é um componente de IL-3 e receptores de GM-CSF. Muitos receptores de citocina podem ser colocados em uma de quatro famílias relacionadas com base na estrutura e função. Receptores hematopoiéticos, por exemplo, são caracterizados pela presença de um domínio que contém resíduos de cisteína conservados e o motivo WSXWS (SEQ ID NO: 3). A estrutura do receptor de citocina foi revisto por Urdal, Ann. Reports Med. Chem. 26: 221-228, 1991 e Cosman, Cytokine 5:95-106, 1993. Sob pressão selectiva para organismos para adquirir novas funções biológicas, novos membros da família de receptor provavelmente surgirão a partir da duplicação de genes de receptor existentes que levam à existência de famílias multi-gênicas. Membros da família assim contêm vestígios do gene ancestral, e estas características particulares pode ser exploradas no isolamento e identificação de membros da família adicionais. Assim, a superfamília de receptor de citocina é subdividida em diversas famílias, por exemplo, a família da imunoglobulina (incluindo CSF-1, MGF, IL-1, e receptores de PDGF); a 31 família da hematopoietina (incluindo subunidade β do receptor de IL-2, subunidade α do receptor de GM-CSF, subunidade β do receptor de GM-CSF; e receptores de G-CSF, EPO, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, e IL-9); família de receptor de TNF (incluindo receptores de TNF (p80) TNF (p60), CD27, CD30, CD40, Fas, e receptor de NGF) . A análise da sequência zcytorl7 sugere que é um membro da mesma subfamília de receptor como the gpl30, LIF, IL-12, WSX-1, subunidade β do receptor de IL-2, receptores de IL-3, IL-4, e IL-6. Certos receptores nesta subfamília (por exemplo, G- CSF) associam para formar homodímeros que transduzem um sinal. Outros membros da subfamília (por exemplo, gpl30, IL-6, IL-11, e receptores de LIF) combinam com uma segunda subunidade (denominada uma subunidade β) para ligar ligando e transduzir um sinal. Subunidades β específicas associam a uma pluralidade de subunidades específicas de receptor de citocina. Por exemplo, a subunidade β gpl30 (Hibi et al., Cell 63:1149-1157, 1990) associa a subunidades de receptor específicas para IL-6, IL-11, e LIF (Gearing et al., EMBO J. 10 :2839-2848, 1991; Gearing et al., Patente U.S. n° 5.284.755). Oncostatina M liga a um heterodímero de receptor de LIF e gpl30. CNTF liga a receptores triméricos que compreendem receptor de CNTF, receptor de LIF, e subunidades de gpl30.

Um receptor de citocina multimérico da presente invenção pode ser um heterodímero, trímero, tetrâmero, pentâmero, e similares, que compreende pelo menos uma porção de zcytorl7 e pelo menos uma porção de um receptor de citocina de classe I. Além disso, um receptor de citocina multimérico pode ser solúvel, ligado a membrana, ou unido a um suporte sólido. A análise da distribuição em tecido do ARNm do receptor de zcytorl7 revelou a expressão em subconjuntos de célula T CD4+ e CD8+ activados, monócitos CD14+, e expressão mais fraca em células B CD19+. Além disso, o ARNm estava presente em linhagens de células 32 monocíticas THP-ltanto activadas como em repouso (ATCC No. TIB-202), U937 (ATCC No. CRL-1593,2) e HL60 (ATCC No. CCL-240) .

Sequências de nucleótido de ADN que codificam zcytorl7 representativo são descritas na SEQ ID NO: 110 (desde o nucleótido 171 até o 2366), com sua sequência de 732 aminoácidos deduzida descrita na SEQ ID NO: 111; SEQ ID NO: 108 (desde o nucleótido 162 até o 2108), com sua sequência de 649 aminoácidos deduzida descrita na SEQ ID NO: 109; e na SEQ ID NO: 4 (desde o nucleótido 497 até 2482), com sua sequência de 662 aminoácidos deduzida descrita na SEQ ID NO: 5. Em sua totalidade, o polipéptido de zcytor 17 (SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 109 ou SEQ ID NO: 5) representa um segmento de polipéptido de comprimento completo (do resíduo 1 (Met) ao resíduo 732 (Vai) da SEQ ID NO: 111; do resíduo 1 (Met) ao resíduo 649 (Ile) da SEQ ID NO: 109; do resíduo 1 (Met) ao resíduo 662 (Ile) da SEQ ID NO: 5). Os domínios e características estruturais dos polipéptidos de zcytorl7 são descritos adicionalmente a seguir. A análise do polipéptido de zcytorl7 codificado pela sequência de ADN da SEQ ID NO: 110 revelou uma grelha de leitura aberta que codifica 732 aminoácidos (SEQ ID NO: 111) que compreende um péptido sinal de secreção predito de 19 resíduos de aminoácido (do resíduo 1 (Met) ao resíduo 19 (Ala) da SEQ ID NO: 111), e um polipéptido maduro de 713 aminoácidos (do resíduo 20 (Ala) ao resíduo 732 (Vai) da SEQ ID NO: 111). A análise do polipéptido de zcytorl7 codificado pela sequência de ADN da SEQ ID NO: 108 revelou uma grelha de leitura aberta que codifica 649 aminoácidos (SEQ ID NO: 109) que compreende um péptido sinal de secreção predito de 19 resíduos de aminoácido (do resíduo 1 (Met) ao resíduo 19 (Ala) da SEQ ID NO: 109), e um polipéptido maduro de 630 aminoácidos (do resíduo 20 (Ala) ao resíduo 649 (Ile) da SEQ ID NO: 109) . A análise do 33 polipéptido de zcytorl7 codificado pela sequência de ADN da SEQ ID NO: 4 revelou uma grelha de leitura aberta que codifica 662 aminoácidos (SEQ ID NO: 5) que compreende um péptido sinal de secreção predito de 32 resíduos de aminoácido (do resíduo 1 (Met) ao resíduo 32 (Ala) da SEQ ID NO: 5), e um polipéptido maduro de 630 aminoácidos (do resíduo 33 (Ala) ao resíduo 662 (Ile) da SEQ ID NO: 5) . Além do motivo WSXWS (SEQ ID NO: 3) (que corresponde aos resíduos 211 a 215 da SEQ ID NO: 111 e SEQ ID NO: 109; e ao resíduos 224 a 228 da SEQ ID NO: 5), o receptor compreende um domínio extracelular (dos resíduos 20 (Ala) a 519 (Glu) da SEQ ID NO: 111 e SEQ ID NO: 109; dos resíduos 33 (Ala) a 532 (Glu) da SEQ ID NO: 5) que inclui um domínio de ligação a citocina de aproximadamente 200 resíduos de aminoácido (dos resíduos 20 (Ala) a 227 (Pro) da SEQ ID NO: 111 e SEQ ID NO: 109; dos resíduos 33 (Ala) a 240 (Pro) da SEQ ID NO: 5); um ligante de domínio (dos resíduos 122 (Thr) a 125 (Pro) da SEQ ID NO: 111 e SEQ ID NO: 109; dos resíduos 135 (Thr) a 138 (Pro) da SEQ ID NO: 111); uma penúltima região de cadeia (dos resíduos 194 (Phe) a 202 (Arg) da SEQ ID NO: 111 e SEQ ID NO: 109; dos resíduos 207 (Phe) a 215 (Arg) da SEQ ID NO: 5); um domínio de fibronectina tipo III (dos resíduos 228 (Cys) a 519 (Glu) da SEQ ID NO: 111 e SEQ ID NO: 109; dos resíduos 241 (Cys) a 532 (Glu) da SEQ ID NO: 5); um domínio transmembrana (dos resíduos 520 (Ile) a 543 (Leu) da SEQ ID NO: 111 e SEQ ID NO: 109; dos resíduos 533 (Ile) a 556 (Leu) da SEQ ID NO: 5); domínio de sinalização intracelular completa (dos resíduos 544 (Lys) a 732 (Vai) da SEQ ID NO: 111; dos resíduos 544 (Lys) a 649 (Ile) da SEQ ID NO: 109; e dos resíduos 557 (Lys) a 662 (Ile) da SEQ ID NO: 5) que contém um local de sinalização "Box I" (dos resíduos 554 (Trp) ao 560 (Pro) da SEQ ID NO: 111 e SEQ ID NO: 109; dos resíduos 567 (Trp) ao 573 (Pro) da SEQ ID NO: 5), e um local de sinalização "Box II" (resíduos 617 (Gin) to 620 (Phe) da SEQ ID NO: 111 e SEQ ID NO: 109; dos 34 resíduos 630 (Gin) ao 633 (Phe) da SEQ ID NO: 5). Aqueles peritos na especialidade reconhecerão que estes limites de domínio são aproximados, e são com base em alinhamentos com proteínas e predições de dobramento de proteína conhecidos. Além destes domínios, características de receptor conservadas no receptor codificado incluem (como é mostrado na SEQ ID NO: 111 e SEQ ID NO: 109) um resíduo Cys conservado na posição 30 (posição 43 como é mostrado na SEQ ID NO: 5), motivo CXW (em que X é qualquer aminoácido) nas posições 40-42 (posições 53-55 como é mostrado na SEQ ID NO: 5), resíduo Trp na posição 170 (posição 183 como é mostrado na SEQ ID NO: 5), e um resíduo Arg conservado na posição 202 (posição 215 como é mostrado na SEQ ID NO: 5). Os polinucleótidos correspondentes que codificam as regiões de polipéptido de zcytorl7, domínios, motivos, resíduos e sequências descritas anteriormente são como é mostrado na SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 108, e SEQ ID NO: 4.

Além disso, formas truncadas do polipéptido de zcytorl7 parecem que são naturalmente expressas. Ambas as formas codificam receptores solúveis de zcytorl7. Um polinucleótido que codifica uma "forma longa" do receptor solúvel de zcytorl7, truncada dentro do domínio de fibronectina tipo III, é mostrado na SEQ ID NO: 112 e o polipéptido correspondente é mostrado na SEQ ID NO: 113. Esta forma truncada codifica os resíduos 1 (Met) a 324 (Lys) da SEQ ID NO: 111 e SEQ ID NO: 109), e assim compreende uma sequência de sinal intacta, motivo WSXWS (SEQ ID NO: 3), ligante, domínio de ligação a citocina, penúltima cadeia, e conservado, Cys, motivo CXW, resíduos Trp e Arg como descrito anteriormente. Um polinucleótido que codifica uma "forma curta" do receptor solúvel de zcytorl7, truncada na extremidade do domínio de ligação a citocina é mostrado na SEQ ID NO: 114 e o polipéptido correspondente é mostrado na SEQ ID NO: 115. Esta forma truncada codifica um polipéptido de 239 resíduos que é 35 idêntico aos resíduos 1 (Met) a 225 (Glu) da SEQ ID NO: 111 e SEQ ID NO: 109 e então diverge, e assim compreende uma sequência de sinal intacta, motivo WSXWS (SEQ ID NO: 3), ligante, domínio de ligação a citocina, penúltima cadeia, e conservado, Cys, motivo CXW, resíduos Trp e Arg como descrito anteriormente. Um alinhamento múltiplo das formas truncada em comparação com as formas de comprimento completo de zcytorl7 é mostrado na Figura 1.

Além disso, o ADNc de zcytorl7 das SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 112, e SEQ ID NO: 114 codificam polipéptidos que podem utilizar um metionina de iniciação alternativa (no nucleótido 75 da SEQ ID NO: 110, no nucleótido 66 da SEQ ID NO: 108, no nucleótido 66 da SEQ ID NO: 112, e no nucleótido 66 da SEQ ID NO: 114) que codificaria um polipéptido na mesma grelha de leitura aberta (ORF) como os polipéptidos de zcytorl7 das SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 113, e SEQ ID NO: 115. A utilização da metionina de iniciação alternativa adicionaria 32 aminoácidos (mostrados na SEQ ID NO: 48) dentro da grelha com relação ao N terminal da SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 113, e SEQ ID NO: 111. Além disso, nucleótido 536 da SEQ ID NO: 4 pode servir como uma metionina de iniciação alternativa, assim gerando a mesma terminação N (começando em aminoácido 14 (Met) da SEQ ID NO: 5) e sequência de polipéptido sinal, como SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 113, e SEQ ID NO: 115. Além disso, o segundo Met no aminoácido número 2 nas sequências SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 113, e SEQ ID NO: 115 (de maneira similar ai;o aminoácido número 15 (Met) na SEQ ID NO: 5) pode também servir como um metionina de partida alternativa for os polipéptidos.

Sequências de nucleótido de ADN que codifica OSMRbeta representativo são descritas na SEQ ID NO: 6 (desde o nucleótido 368 até o 3304), com sua sequência de 979 aminoácidos deduzida descrita na SEQ ID NO: 7. Em sua 36 totalidade, o polipéptido OSMRbeta (SEQ ID NO: 7) representa um segmento de polipéptido de comprimento completo (do residuo 1 (Met) ao residuo 979 (Cys) da SEQ ID NO: 7. Os domínios e características estruturais dos polipéptidos OSMRbeta são descritos adicionalmente a seguir.

Análise do polipéptido OSMRbeta codificado pela sequência de ADN da SEQ ID NO: 6 revelou uma grelha de leitura aberta que codifica 979 aminoácidos (SEQ ID NO: 7) que compreende um péptido sinal de secreção predito de 27 resíduos de aminoácido (do resíduo 1 (Met) ao resíduo 27 (Ala) da SEQ ID NO: 7), e um polipéptido maduro de 952 aminoácidos (do resíduo 28 (Glu) ao resíduo 979 (Cys) da SEQ ID NO: 7. Além dos dois motivos WSXWS (SEQ ID NO: 3) (que correspondem aos resíduos 129 a 133 e resíduos 415 a 419 da SEQ ID NO: 7), o receptor compreende um domínio extracelular (dos resíduos 28 (Glu) a 739 (Ser) da SEQ ID NO: 7); que inclui um domínio de ligação a citocina de aproximadamente 400 resíduos de aminoácido (dos resíduos 28 (Glu) a 429 (Ala) da SEQ ID NO: 7, que inclui dois domínios de ligante (dos resíduos 31 (Pro) a 34 (Pro) e resíduos 343 (Asn) a 347 (Thr) ) , três regiões de ligação de citocina (dos resíduos 35 (Vai) a 137 (Glu) , dos resíduos 240 (Pro) a 342 (Glu) , e dos resíduos 348 (Asn) a 429 (Ala) , um domínio de imunoglobulina (dos resíduos 138 (Vai) a 239 (Glu), duas regiões de penúltima cadeia (resíduos 106 (His) to 115 (Lys) e resíduos 398 (Thr) a 405 (Arg) da SEQ ID NO: 7), e um domínio de fibronectina tipo III (dos resíduos 430 (Pro) a 739 (Ser) da SEQ ID NO: 7); um domínio transmembrana (dos resíduos 740 (Met) a 761 (Leu) da SEQ ID NO: 7) ; domínio de sinalização intracelular completa (dos resíduos 762 (Lys) a 979 (Cys) da SEQ ID NO: 7) que contém um local de sinalização "Box I" (dos resíduos 771 (Tyr) a 777 (Pro) da SEQ ID NO: 7), e um local de sinalização "Box II" (dos resíduos 829 (Glu) a 832 (Leu) da SEQ ID NO: 7) . 37

Aqueles peritos na especialidade reconhecerão que estes limites de domínio são aproximados, e são com base em alinhamentos com proteínas e predições de dobramento de proteína conhecidas. Além destes domínios, características de receptor conservadas no receptor codificado incluem (como é mostrado na SEQ ID NO: 7) resíduos de Trp conservado noas posições 52 e 353, um resíduo Cys conservado na posição 288, motivo CXW (em que X é qualquer aminoácido) nas posições 294-296, e um resíduo Arg conservado anat posição 405. Os polinucleótidos correspondentes que codificam as regiões de polipéptido OS-MRbeta, domínios, motivos, resíduos e sequências descritas anteriormente são como é mostrado na SEQ ID NO: 6. A presença de regiões transmembrana, e motivos conservados e baixa variância geralmente correlaciona com ou define importantes regiões estruturais em proteínas. Regiões de baixa variância (por exemplo, agrupamentos hidrofóbicos) estão geralmente presentes em regiões de importância estrutural (Sheppard, P. et al., supra.). Tais regiões de baixa variância com frequência contêm aminoácidos raros ou infrequentes, tal como Triptofano. As regiões que flanqueiam e entre tais motivos conservados e de baixa variância podem ser mais variáveis, mas são com frequência funcionalmente significativos porque podem relacionar a ou definir estruturas e actividades importantes tal como domínios de ligação, actividade biológica e enzimática, transdução de sinal, interacção célula-célula, domínios de localização de tecido e similares.

As regiões de resíduos conservados de aminoácido em zcytorl7, descritas anteriormente, podem ser usadas como ferramentas para identificar novos membros da família. Por exemplo, transcrição reversa-reacção em cadeia da polimerase (RT-PCR) pode ser usada para amplificar sequências que codificam as regiões conservadas de ARN 38 obtidas a partir uma variedade de fontes de tecido ou linhagens de células. Em particular, iniciadores altamente degenerados desenhados a partir de as sequências de zcytorl7 são úteis para este propósito. 0 desenho e utilização de tais iniciadores degenerados podem ser facilmente realizados por um perito na especialidade. A presente invenção também contempla um receptor multimérico de zcytorl7, como detalhado no presente documento, que é capaz de sinalização intracelular. Tais receptores podem incluir pelo menos uma porção de pelo menos um domínio extracelular de um receptor de zcytorl7, e um domínio intracelular de um receptor de zcytorl7 ou outro receptor de citocina de classe I. Além do domínio extracelular de zcytorl7, o receptor de citocina multimérico pode também incluir o domínio extracelular de pelo menos uma porção de receptor de citocina de classe I, por exemplo, os domínios de ligação a ligando de receptor de OSMRbeta e/ou receptor de WSX-1. Alternativamente, o receptor de citocina multimérico pode incluir o domínio extracelular de outro receptor, tal como outro receptor de citocina de classe I, e o domínio intracelular de zcytorl7 para efectuar a sinalização intracelular. A presente invenção ainda contempla um receptor de citocina multimérico que é solúvel. Por exemplo, um receptor de citocina multimérico pode ser, por exemplo, um heterodímero que inclui, por exemplo, uma porção do domínio extracelular de zcytorl7 e uma porção do domínio extracelular de um receptor de citocina de classe I, tal como OSMRbeta (SEQ ID NO: 7) e/ou WSX-1 (SEQ ID NO: 9) . Adicionalmente, um receptor solúvel de citocina multimérico pode também incluir uma etiqueta de afinidade, tal como um polipéptido Fc de imunoglobulina. 0 receptor solúvel de citocina multimérico pode ser expresso como uma fusão com um região constante de cadeia pesada de imunoglobulina, tal como um fragmento Fc, que contém dois domínios de região 39 constante e não possui a região variável. Tais fusões são tipicamente segregadas como moléculas multiméricas em que as porções Fc são ligadas por dissulfureto entre si e dois polipéptidos não Ig são ordenados em proximidade imediata entre si. Fusões deste tipo podem ser usadas, por exemplo, para dimerização, aumentando a estabilidade e a semivida in vivo, para purificar por afinidade ligando, como ferramenta de ensaio in vitro ou antagonista.

Através de processos de clonagem, e ensaios de proliferação descrita em detalhe no presente documento, um receptor de citocina multimérico da presente invenção foi mostrado que se liga a um novo polipéptido de ligando (zcytorl71ig) (SEQ ID NO: 2), revelado no pedido de patente U.S. de propriedade comum N° de Série 60/350.325 e pedido de patente U.S. de propriedade comum N° de Série 60/375.323, com alta especificidade. Zcytorl71ig foi isolado de uma biblioteca de ADNc gerada a partir de células de sangue periférico humanas activadas (hPBCs), que foram seleccionadas para CD3. CD3 é um marcador de superfície celular único para células de origem linfóide, particularmente células T.

Um clone zcytorl71ig positivo foi isolado, e a análise de sequência revelou que a sequência de polinucleótido contida dentro do ADN de plasmideo era nova. A sequência de sinal secretora é compreendida dos resíduos de aminoácido 1 (Met) a 23 (Ala), e o polipéptido maduro é compreendido dos resíduos de aminoácido 24 (Ser) a 164 (Thr) (como é mostrado na SEQ ID NO: 2). Além disso, análise de sequenciamento N Terminal de zcytorl71ig purificado a partir de células 293T mostraram um terminação N no resíduo 27 (Leu) como é mostrado na SEQ ID NO: 2, com o polipéptido maduro compreendido dos resíduos de aminoácido 27 (Leu) a 164 (Thr) (como é mostrado na SEQ ID NO: 2) .

Em geral, as citocinas são preditas que têm um 40 estrutura de quatro alfa hélices, com as hélices A, C e D sendo as mais importante em interacções ligando-receptor, e são mais altamente conservada entre os membros da família. Com referência à sequência de aminoácidos de zcytorl71ig humano mostrada na SEQ ID NO: 2, o alinhamento de zcytorl71ig humano, IL-3 humana, e sequências de aminoácidos citocina humana é predito que a hélice A de zcytorl71ig é definida por resíduos de aminoácido 38-52; a hélice B por resíduos de aminoácido 83-98; a hélice C por resíduos de aminoácido 104-117; e a hélice D por resíduos de aminoácido 137-152; como é mostrado na SEQ ID NO: 2. A análise estrutural sugere que a volta A/B é longa, a volta B/C é curta e a volta C/D é longa. Esta estrutura de voltas resulta numa organização de hélice up-up-down-down. Com base em estrutura de feixe de 4 hélices, os resíduos de cisteína dentro zcytorl71ig que são conservados correspondem a resíduos de aminoácido 72, 133, e 147 da SEQ ID NO: 2; e 74, 137, e 151 da SEQ ID NO: 11 descritas no presente documento. Colocação de cisteína consistente é confirmação adicional da estrutura de feixe de quatro hélices. Também altamente conservado no zcytorl71ig é o resíduo Glu como é mostrado na SEQ ID NO: 2 no resíduo 43.

Além disso, a sequência de aminoácidos predita de murina zcytorl71ig mostra 31% de identidade para a proteína humana predita com relação ao comprimento total de the sequências (SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 11) . Com base em comparação entre a sequências de resíduos conservados de zcytorl71ig humano e murino foram encontrados nas regiões preditas para codificar alfa hélices C e D. Os polinucleótidos correspondentes que codificam o polipéptido humano de regiões, domínios, motivos, resíduos e sequências de zcytorl71ig descritos no presente documento são como é mostrado na SEQ ID NO: 1.

Enquanto a hélice D é conservada relativamente entre zcytorl71ig humano e murino, a hélice C é a mais 41 conservada. Enquanto ambas as espécies têm aminoácidos ácidos predominantes nesta região, as diferenças podem representar especificidade de espécies na interacção entre zcytorl71ig e o seu receptor, zcytorl7 que compreende receptores monomérico, heterodimérico (por exemplo, zcytorl7/OS-NMbeta, WSX-l/OSMRbeta, zcytorl7/WSX-l) ou multimérico (por exemplo, zcytorl7/OSNMbetaIWSX-l). A volta A/B e a hélice B de zcytorl71ig são marginalmente conservadas, e a hélice C através da volta C/D na hélice D é a mais conservada entre as espécies; a conservação através desta região sugere que é significativa funcionalmente. As hélices D de zcytorl71ig humano e murino são também conservadas. Os antagonistas de receptor de zcytorl7 podem ser desenhados através de mutações dentro da hélice D de zcytorl71ig. Estes podem incluir truncamento da proteína a partir do resíduo Thrl56 (SEQ ID NO: 2), ou conservação de resíduos que conferem a ligação do ligando ao receptor, mas diminuem a actividade de sinalização.

As citocinas de quatro feixes helicoidais são também agrupadas pelo comprimento das suas hélices de componente. As citocinas de forma de "hélice longa" consistem geralmente em hélices de entre 24-30 resíduos, e incluem IL-6, factor neutrotrófico ciliar (CNTF), factor de inibição da leucemia (LIF) e hormona de crescimento humano (hGH). As citocinas de forma de "hélice curta" consistem geralmente em hélices de entre 18-21 resíduos e incluem IL-2, IL-4 e GM-CSF. Acredita-se que zcytozl71ig seja um novo membro do grupo das citocinas de forma de hélice curta. Estudos utilizando CNTF e IL-β demonstraram que uma hélice de CNTF pode ser permutada para a hélice equivalente em IL-6, que conferem propriedades de ligação de CTNF à quimera. Assim, parece que os domínios funcionais de citocinas de quatro hélices são determinados com base na homologia estrutural, independente da identidade de sequência, e podem manter integridade funcional numa quimera (Kallen et 42 al., J. Biol. Chem. 274:11859-11867, 1999). Portanto, os domínios helicoidais de zcytorl71ig podem ser úteis para preparar moléculas de fusão quimérica, particularmente com outras citocinas de forma de hélice curta para determinar e modular a especificidade de ligação a receptor. A presente invenção também prevê proteínas de fusão modificadas por engenharia com hélice A e/ou hélice D, e proteínas de fusão que combinam domínios de volta e helicoidais de outras citocinas de forma curta tais como IL-2, IL-4, IL-15, Lif, IL-12, IL-3 e GM-CSF. A sequência de polinucleótido para IL-2 humana é mostrada na SEQ ID NO: 176 e a sequência de aminoácido correspondente é mostrada na SEQ ID NO: 177. A sequência sinal de secreção está compreendida de resíduos de aminoácido 1 (Met) a 20 (Ser) da SEQ ID NO: 177; dos nucleótidos 48 a 107 da SEQ ID NO: 176. O polipéptido maduro está compreendido de resíduos de aminoácido 21 (Ala) a 156 (Thr) da SEQ ID NO: 177; nucleótidos 108 a 515 da SEQ ID NO: 176. A hélice A de IL-2 humana está compreendida de resíduos de aminoácido 27 (Thr) a 48 (Leu) da SEQ ID NO: 177; dos nucleótidos 126 a 191 da SEQ ID NO: 176. A hélice B de IL-2 humana compreende Hélice BI e a hélice B2. A hélice BI de IL-2 humana está compreendida de resíduos de aminoácido 73 (Ala) a 80 (Gin) da SEQ ID NO: 177; nucleótidos 264 a 287 da SEQ ID NO: 176. A hélice B2 de IL-2 humana está compreendida de resíduos de aminoácido 83 (Glu) a 92 (Vai) da SEQ ID NO: 177, dos nucleótidos 294 a 323 da SEQ ID NO: 176. Assim, a Hélice B (que compreende as Hélices BI e B2) de IL-2 é representada pela sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 183 (sequência de nucleótidos da SEQ ID NO: 182) em que os resíduos de aminoácido 9 e 10 podem ser qualquer aminoácido. A SEQ ID NO: 183 é idêntica a aminoácidos 73 (Ala) a 92 (Vai) da SEQ ID NO: 177 em que os aminoácidos 81 e 82 são qualquer aminoácido. Numa forma preferida, a Hélice B de IL-2 compreende os aminoácidos 73 43 (Ala) a 92 (Vai) da SEQ ID NO: 177; nucleótidos 264 a 323 da SEQ ID NO: 176. A hélice C de IL-2 humana está compreendida de resíduos de aminoácido 102 (His) a 116 (Vai) da SEQ ID NO: 177, dos nucleótidos 351 a 395 da SEQ ID NO: 176. A hélice D de IL-2 humana está compreendida de resíduos de aminoácido 134 (Thr) a 149 (Gin) da SEQ ID NO: 177; nucleótidos 447 a 494 da SEQ ID NO: 176. A sequência de polinucleótido para IL-4 humana é mostrada na SEQ ID NO: 178 e a sequência de aminoácido correspondente é mostrada na SEQ ID NO: 179. A sequência sinal de secreção está compreendida de resíduos de aminoácido 1 (Met) a 24 (Gly) da SEQ ID NO: 179; de nucleótidos 64 a 135 da SEQ ID NO: 178. O polipéptido maduro está compreendido de resíduos de aminoácido 25 (His) a 153 (Ser) da SEQ ID NO: 179; dos nucleótidos 136 a 522 da SEQ ID NO: 178. A hélice A de IL-4 humana está compreendida de resíduos de aminoácido 30 (Thr) a 42 (Thr) da SEQ ID NO: 179; dos nucleótidos 151 a 189 da SEQ ID NO: 178. A hélice B de IL-4 humana está compreendida de resíduos de aminoácido 65 (Glu) a 83 (His) da SEQ ID NO: 179; dos nucleótidos 256 a 312 da SEQ ID NO: 178. A hélice C de IL-4 humana está compreendida de resíduos de aminoácido 94 (Ala) a 118 (Ala) da SEQ ID NO: 179; dos nucleótidos 343 a 417 da SEQ ID NO: 178. A hélice D de IL-4 humana está compreendida de resíduos de aminoácido 133 (Leu) a 151 (Cys) da SEQ ID NO: 179; dos nucleótidos 460 a 516 da SEQ ID NO: 178. A sequência de polinucleótido para GM-CSF humano é mostrada na SEQ ID NO: 180 e a sequência de aminoácido correspondente é mostrada na SEQ ID NO: 181. A sequência sinal de secreção está compreendida de resíduos de aminoácido 1 (Met) a 17 (Ser) da SEQ ID NO: 181; dos nucleótidos 9 a 59 da SEQ ID NO: 180. O polipéptido maduro está compreendido de resíduos de aminoácido 18 (Ala) a 144 (Glu) da SEQ ID NO: 181; dos nucleótidos 60 a 440 da SEQ ID NO: 180. A hélice A de GM-CSF humano está compreendida de 44 resíduos de aminoácido 30 (Trp) a 44 (Asn) da SEQ ID NO: 181; dos nucleótidos 96 a 140 da SEQ ID NO: 180. A hélice B de GM-CSF humano está compreendida de resíduos de aminoácido 72 (Leu) a 81 (Gin) da SEQ ID NO: 181; dos nucleótidos 222 a 251 da SEQ ID NO: 180. A hélice C de GM-CSF humano está compreendida de resíduos de aminoácido 85 (Gly) a 103 (Gin) da SEQ ID NO: 181; dos nucleótidos 261 a 317 da SEQ ID NO: 180. A hélice D de GM-CSF humano está compreendida de resíduos de aminoácido 120 (Phe) a 131 (Leu) da SEQ ID NO: 181; dos nucleótidos 366 a 401 da SEQ ID NO: 180.

Os resíduos de aminoácido que compreendem as hélices A, B, C, e D, para zcytorl71ig humano, IL-3, IL-2, IL-4, e GM- CSF são mostradas no Quadro 1.

Quadro 1 Hélice A Hélice B Hélice C Hélice D zcytorl71ig 38-52 83-98 104-117 137-152 de SEQ ID NO: 2 IL-3 35-45 73-86 91-103 123-141 de SEQ ID NO: 102 IL-2 27-48 73-92 102-116 134-149 de SEQ ID NO: 177; ou Hélice B como é descrito na SEQ ID NO: 183 IL-4 30-42 65-83 94-118 120-131 de SEQ ID NO: 179 GM-CSF 30-44 72-81 85-103 133- 51 de SEQ ID NO: 181 A presente invenção proporciona moléculas de polinucleótido, incluindo moléculas ADN e ARN que codificam os polipéptidos de zcytorl7 revelados no presente documento que podem ser incluídos no receptor de citocina multimérico. Aqueles peritos na especialidade reconhecerão que, em vista de degeneração do código genético, uma variação considerável da sequência é possível entre estas moléculas de polinucleótido. As SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 121 e SEQ ID NO: 122 são sequências degeneradas de ADN que 45 abrangem todos os ADN codificam o polipéptido de zcytorl7 das SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 109 e SEQ ID NO: 5, respectivamente, e fragmentos dos mesmos. Aqueles peritos na especialidade reconhecerão que as sequências degeneradas da SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 121 e SEQ ID NO: 122 também proporcionam todas as sequências de ARN que codificam as SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 109 e SEQ ID NO: 5 substituindo U for T. Assim, polinucleótidos que codificam polipéptido de zcytorl7 que compreendem do nucleótido 1 a nucleótido 2196 da SEQ ID NO: 120, do nucleótido 1 ao nucleótido 1947 da SEQ ID NO: 121, e do nucleótido 1 ao nucleótido 1986 da SEQ ID NO: 122 e seus ARN equivalentes são contemplados pela presente invenção. O Quadro 2 indica os códigos de uma letra utilizados dentro das SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 121 e SEQ ID NO: 122 para denotar posições de nucleótido degeneradas. "Resoluções" são os nucleótidos denotados por uma letra de código. "Complemento" indica o código para o(s) nucleótido(s) complementar(es). Por exemplo, o código Y denota C ou T, e o seu complemento R denota A ou G, com A sendo complementar a T, e G sendo complementar a C.

Quadro 2

Nucleótido Resolução Complemento Resolução

A A T T C C G G G G C C T T A A R A| G Y C | T Y C| T R A | G M A | C K G | T K G | T M A | C S C | G S C | G w A | T W A | T H A| C | T D A | G | T B C | G | T V A| C | C V A| C | G B C | G | T D A | G | T H A| C | T 46

Ν Α | C | G | Τ N A | C | G | T T Os codões degenerados utilizados nas SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 121 e SEQ ID NO: 122, que abrangem todos os codões possíveis para um dado aminoácido, são indicados no

Quadro 3.

Quadro 3

Aminoácido Código de uma Letra_Codões_Codão Degenerado

Cys c TGC TGT TGY Ser s AGC AGT TCA TCC TCG TCT WSN Thr T ACA ACC ACG ACT ACN Pro P CCA CCC CCG CCT CCN Ala A GCA GCC GCG GCT GCN Gly G GGA GGC GGG GGT GGN Asn N AAC AAT AAY Asp D GAC GAT GAY Glu E GAA GAG GAR Gin Q CAA CAG CAR His H CAC CAT CAY Arg R AGA AGG CGA CGC CGG CGT MGN Lys K AAA AAG AAR Met M ATG ATG Ile I ATA ATC ATT ATH Leu L CTA CTC CTG CTT TTA TTG YTN Vai V GTA GTC GTG GTT GTN Phe F TTC TTT TTY Tyr Y TAC TAT TAY Trp W TGG TGG Ter • TAA TAG TGA TRR Asn|Asp B RAY Glu|Gin Z SAR Qualquer X NNN Um perito na especialidade apreciará que alguma ambiguidade é introduzida na determinação de um codão degenerado, representativo de todos os codões possíveis que codificam cada aminoácido. Por exemplo, o codão degenerado para serina (WSN) pode, em algumas circunstâncias, codificar arginina (AGR), e o codão degenerado para arginina (MGN) pode, em algumas circunstâncias, codificar serina (AGY). Uma relação similar existe entre codões gue codificam fenilalanina e leucina. Assim, alguns polinucleótidos abrangidos pela sequência degenerada podem codificar sequências de aminoácido variantes, mas um perito na especialidade pode facilmente identificar tais sequências variantes por referência às sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 109 e SEQ ID NO: 5; ou SEQ ID NO: 117 e SEQ ID NO: 119. As sequências variantes podem ser prontamente testadas para funcionalidade como é descrito no presente documento.

Um perito na especialidade apreciará também que espécies diferentes podem exibir "utilização de codão preferencial". Em geral, veja-se, Grantham, et al., Nuc. Acids Res. 8:1893-912, 1980; Haas, et al. Curr. Biol. 6:315-24, 1996; Wain-Hobson, et al., Gene 13:355-64, 1981; Grosjean and Fiers, Gene 18:199-209, 1982; Holm, Nuc. Acids Res. 14:3075-87, 1986; Ikemura, J. Mol. Biol. 158:573-97, 1982. Como é utilizado no presente documento, o termo "utilização de codão preferencial" ou "codões preferenciais" é um termo da especialidade que se refere a codões de tradução de proteínas que são utilizados com mais frequência em células de uma certa espécie, favorecendo assim um ou alguns representativos dos codões possíveis que codificam cada aminoácido (Veja-se Quadro 3) . Por exemplo, o aminoácido Treonina (Thr) pode ser codificado por ACA, ACC, ACG, ou ACT, mas em células de mamíferos ACC é o codão utilizado mais comummente; em outras espécies, por exemplo, células de insectos, levedura, vírus ou bactérias, codões Thr diferentes podem ser preferenciais. Codões preferenciais para uma espécie particular podem ser introduzidos nos polinucleótidos da presente invenção por uma variedade de métodos conhecidos na técnica. A 48 introdução de sequências de codão preferenciais em ADN recombinante pode, por exemplo, aumentar a produção da proteína tornando a tradução da proteína mais eficaz dentro de uma espécie ou tipo de células particular. Portanto, as sequências de codão degeneradas reveladas nas SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 121 e SEQ ID NO: 122 servem como moldes para optimizar a expressão de polinucleótidos de zcytorl7 em várias espécies ou tipos de células comummente utilizados na especialidade e revelados no presente documento. As sequências que contêm codões preferenciais podem ser testadas e optimizadas para a expressão em várias espécies, e testadas para funcionalidade como é revelado no presente documento.

Como foi notado anteriormente, os polinucleótidos isolados descritos no presente documento incluem ADN e ARN. Os métodos para preparar ADN e ARN são bem conhecidos na técnica. Em geral, ARN é isolado de um tecido ou célula que produz quantidades grandes de ARN de zcytorl71ig. Tais tecidos e células são identificadas por meio de Northern blotting (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:5201, 1980), e incluem PBLs, baço, timo, medula óssea, próstata, e técidos linfáticos, linhagens de células de eritro-leucemia humana, linhagens de células de leucemia monocítica aguda, outra linhagens de células linfóides de hematopoiéticas, e similares. O ARN total pode ser preparado usando extraeção de isotiocianato de guanidínio seguido por isolamento por meio de centrifugação num gradiente de CsCl (Chirgwin et al., Biochemistry 18:52-94, 1979). ARN poli (a)+ é preparado a partir de ARN total utilizando o método de Aviv e Leder (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 69:1408-12, 1972). ADN complementar (ADNc) é preparado a partir de ARN poli(a)+ utilizando métodos conhecidos. Na alternativa, ADN genómico pode ser isolado. Polinucleótidos que codificam polipéptidos de zcytorl71ig são então identificados e isolado por meio de, por exemplo, 49 hibridação ou ou reacção em cadeia da polimerase (PCR) (Mullis, Patente U.S. n° 4.683.202).

Um clone de comprimento completo que codifica zcytorl7 pode ser obtido por meio de procedimentos de clonagem convencionais. Clones ADN complementar (ADNc) são preferidos, embora para algumas aplicações (por exemplo, a expressão em animais transgénicos) pode ser preferível utilizar um clone genómico, ou modificar um clone de ADNc para incluir pelo menos um intrão genómico. Os métodos para preparar ADNc e clones genómicos são bem conhecidos e dentro do nível de um perito ordinário na especialidade, e incluem a utilização da sequência revelada no presente documento, ou partes da mesma, para sondar ou iniciação de uma biblioteca. Bibliotecas de expressão podem ser sondadas com anticorpos contra fragmentos de zcytorl7, receptores de fragmentos, ou outros parceiros de ligação específica.

Os polinucleótidos da presente invenção podem também ser sintetizados usando máquinas síntese ADN. Actualmente o método de escolha é o método da fosforamidita. Se ADN de cadeia dupla quimicamente sintetizado é requerido para uma aplicação tal como a síntese de um gene ou um fragmento de gene, então cada cadeia complementar é feito separadamente. A produção de polinucleótidos curtos (de 60 a 80 pb) é tecnicamente fácil e pode ser cumprida pela sintetização das cadeias complementares e então recozendo as mesmas. No entanto, para produzir polinucleótidos mais longos (>300 pb) , estratégias especiais são usualmente utilizadas, porque a eficiência de acoplamento de cada ciclo durante síntese química de ADN é raramente 100%. Para superar este problema, genes sintéticos (de cadeia dupla) são montados em forma modular a partir de fragmentos de cadeia simples que são desde 20 até 100 nucleótidos em comprimento.

Uma maneira alternativa para preparar um gene de comprimento completo é sintetizar um conjunto especificado de oligonucleótidos sobrepostos (de 40 a 100 nucleótidos). 50

Após as regiões complementares sobrepostas curtas 3' e 5' (de 6 a 10 nucleótidos) serem recozidas, grandes lacunas ainda permanecem, mas as regiões curtas de bases pareadas são tanto longas o suficiente como estáveis o suficiente para manter a estrutura junta. As lacunas são preenchidas e o duplex de ADN é completado via síntese enzimática de ADN por meio de ADNpolimerase I de E. coli. Após a síntese enzimática ser completada os cortes são selados com T4 ADN ligase. De construções de cadeia dupla são sequencialmente ligadas entre si para formar a sequência de gene completa que é verificada por meio de análise de sequência de ADN. Veja-se Glick and Pasternak, Molecular Biotechnology, Principies & Aplications of Recombinant DNA, (ASM Press, Washington, D.C. 1994); Itakura et al., Annu. Rev. Biochem. 53: 323-56, 1984 e Climie et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:633-7, 1990. Além disso, outras sequências são geralmente adicionadas que contêm sinais para iniciação e terminação apropriada de transcrição e tradução. A presente memória descritiva descreve reagentes que serão úteis em aplicações de diagnóstico. Por exemplo, o gene de zcytorl71ig, uma sonda que compreende ADN ou ARN de zcytorl71ig ou uma subsequência dos mesmos, pode ser utilizado para determinar se o gene de zcytorl71ig está presente num cromossoma humano, tal como cromossoma 12, ou se uma mutação de gene ocorreu. Zcytorl71ig está localizado na região 12q24.31 do cromossoma 12 (Exemplo 13) . Aberrações cromossómicas detectáveis no locus de gene de zcytorl71ig incluem, mas não são limitadas a, aneuploidia, mudanças no número de cópias do gene, perda de heterozigosidade (LOH), translocações, inserções, deleções, mudanças e rearranjos de local de restrição. Tais aberrações podem ser detectadas utilizando polinucleótidos da presente invenção utilizando técnicas de genética molecular, tais como análise de polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição (RFLP), análise de repetição 51 curta em tandem (STR) utilizando técnicas de PCR, e outras técnicas de análise de ligação genética conhecidas na especialidade (Sambrook et al., ibid.; Ausubel et al., ibid.; Marian, Chest 108:255-65, 1995). O conhecimento exacto de uma posição de gene pode ser útil para um número de propósitos, incluindo: 1) determinar se uma sequência é parte de um contig existente e obter sequências genéticas circunvizinhas adicionais em várias formas, tais como YAC, BAC ou clones de ADNc; 2) proporcionar um possível gene candidato para uma doença transmissível por hereditariedade que mostra ligação à mesma região cromossómica; e 3) organismos modelo de referência cruzada, tais como ratinho, que podem ajudar na determinação de qual função um gene particular poderia ter.

Um perito na especialidade reconheceria que a região 12q24 está envolvida com frequência em rearranjos genómicos grosseiros, incluindo translocações, deleções, inversões, e duplicações, que são associadas a vários cancros. O banco de dados de Mitelman de Aberrações Cromossómicas em Cancro, no Câncer Genome Anatomy Project, National Insitutes of Health, Betesda, Md localizado na Internet lista 199 casos de cancros com rearranjos genómicos que envolvem 12q24. Destes, a maioria é parte de cariótipos complexos com outros rearranjos; no entanto, em alguns casos o rearranjo que envolve 12q24 é a única alteração genómica. Dada a expressão do receptor para zcytorl71ig em células de linhas linfóide e mielóide, é particularmente significativo notar que existem pelo menos 4 casos de leucemia mielóide relatados na literatura em que translocação (2 casos: Yamagata et al, Câncer Genet Cytogenet 97:90-93, 1997; Dunphy e Batanian, Câncer Genet Cytogenet 114:51-57, 1999) ou duplicação (2 casos: Bonomi et al, Câncer Genet Cytogenet 108:75-78, 1999) são a única alteração genómica. Isto sugere que um gene ou genes que se situam dentro de 12q24 poderiam estar directamente envolvidos na 52 transformação maligna destas células dos pacientes. Sobre-expressão inapropriada de zcytorl71ig poderia contribuir a transformação maligna pela promoção da proliferação aberrante de células que possuem receptor, através de mecanismos autócrinos ou parácrinos. A inibição da actividade de zcytorl71ig poderia inibir assim o crescimento de tais células. Como alternativa, um rearranjo genómico que tem como resultado a inactivação do gene de zcytorl71ig podem promover transformação maligna e/ou a metástase por meio da remoção das funções imunoreguladoras de zcytorl71ig. De facto, um gene supressor da metástase em cancro de próstata foi mapeado a 12q24-qter (Ichikawa et al, Asian J Androl 2:167-171, 2000). Se zcytorl71ig for o gene dentro desta região responsável pela supressão da metástase, então zcytorl71ig por si mesmo pode ter valor terapêutico no tratamento de cancro.

Um diagnóstico poderia assistir aos médicos na determinação do tipo de doença e terapêutica associada apropriada, ou assistência no aconselhamento genético. Como tal, os inventivos anticorpos anti-zcytorl71ig, polinucleótidos, e polipéptidos podem ser utilizados para a detecção de polipéptido de zcytorl71ig, ARNm ou anticorpos anti-zcytorl71ig, servindo assim como marcadores e sendo utilizados directamente para detectar ou doenças genéticas ou cancros, como é descrito no presente documento, utilizando métodos conhecidos na técnica e descritos no presente documento. Além disso, as sondas de polinucleótido de zcytorl71ig podem ser utilizadas para detectar anormalidades ou genótipos associados ao cromossoma deleções e translocações de 12q24.3 associadas a doenças humanas, ou outras translocações envolvidas com progressão maligna de tumores ou outras mutações de 12q24.3, que são esperadas que estejam envolvidas em rearranjos de cromossoma em malignidade; ou em outros cancros. De maneira similar, as sondas de polinucleótido de zcytorl71ig podem 53 ser utilizadas para detectar anormalidades ou genótipos associados a trissomia do cromossoma 12 e perda de cromossoma associada a doenças humanas ou aborto espontâneo. Assim, as sondas de polinucleótido de zcytorl71ig podem ser utilizadas para detectar anormalidades ou genótipos associados a estes defeitos.

Um perito na especialidade reconheceria gue as sondas de polinucleótido de zcytorl71ig são particularmente úteis para o diagnóstico de anormalidades cromossómicas grosseiras associadas a perda de heterogeneidade (LOH), ganho de cromossoma (por exemplo, trissomia), translocação, amplificação de ADN, e similares. Translocações dentro do locus cromossómico 12g24.3 em gue o gene de zcytorl71ig está localizado são conhecidas por estarem associadas a doença humana. Por exemplo, deleções e translocações de 12q24, duplicações e trissomia são associadas a cancros como foi discutido acima. Assim, uma vez que o gene de zcytorl71ig mapeia esta região critica, as sondas de polinucleótido de zcytorl71ig da presente invenção podem ser utilizadas para detectar anormalidades ou genótipos associados a translocação, deleção e trissomia de 12q24, e similares, descritos acima.

Como foi discutido acima, defeitos no gene de zcytorl71ig por si mesmo podem ter como resultado um estado de doença humana transmissível por hereditariedade. As moléculas da presente invenção, tais como os polipéptidos, antagonistas, agonistas, polinucleótidos e anticorpos da presente invenção ajudariam na detecção, diagnóstico, prevenção, e tratamento associados a um defeito de gene de zcytorl71ig. Além disso, as sondas de polinucleótido de zcytorl71ig podem ser utilizadas para detectar diferenças alélicas entre indivíduos doentes ou não doentes no locus cromossómico de zcytorl71ig. Como tal, as sequências de zcytorl71ig podem ser utilizadas como diagnóstico na definição de perfil de ADN forense. 54

No geral, os métodos de diagnóstico utilizados na análise de ligação genética, para detectar uma anormalidade genética ou aberração num paciente são conhecidas na técnica. Sondas analíticas serão geralmente pelo menos 20 nt de comprimento, embora sondas um pouco mais curtas possam ser utilizadas (por exemplo, 14-17 nt). Iniciadores de PCR são pelo menos 5 nt de comprimento, preferentemente 15 ou mais, mais preferentemente 20-30 nt. Para a análise bruta de genes, ou ADN cromossómico, uma sonda de polinucleótido de zcytorl71ig pode compreender um exão inteiro ou mais. Exões são prontamente determinados por um perito na especialidade por meio da comparação de sequências de zcytorl71ig (SEQ ID NO: 1) com o ADN genómico para zcytorl71ig de ratinho (SEQ ID NO: 76) . Em geral, os métodos de diagnóstico utilizados na análise de ligação genética para detectar uma anormalidade genética ou aberração num paciente são conhecidas na técnica. A maioria dos métodos de diagnóstico compreende as etapas de (a) obter uma amostra genética de um paciente potencialmente doente, paciente doente ou portador não doente potencial de um alelo de doença recessivo; (b) produzir um primeiro produto de reacção por meio da incubação da amostra genética com uma sonda de polinucleótido de zcytorl71ig em que o polinucleótido hibridará a sequência de polinucleótido complementar, tal como em análise RFLP ou por meio da incubação da amostra genética com iniciadores sense e antisense numa reacção de PCR sob condições de reacção de PCR apropriadas; (iii) visualizar o primeiro produto de reacção por electroforese em gel e/ou outros métodos conhecidos tais como visualizar o primeiro produto de reacção com uma sonda de polinucleótido de zcytorl71ig em que o polinucleótido hibridará à sequência de polinucleótido complementar da primeira reacção; e (iv) comparar o primeiro produto de reacção visualizado a um segundo produto de reacção de controlo de uma amostra 55 genética do paciente do tipo selvagem, ou um indivíduo normal ou de controlo. Uma diferença entre o primeiro produto de reacção e o produto de reacção de controlo é indicativo de uma anormalidade genética no paciente doente ou paciente potencialmente doente, ou a presença de um fenótipo portador heterozigoto recessivo para um paciente não doente, ou a presença de um defeito genético num tumor de um paciente doente, ou a presença de uma anormalidade genética num feto ou embrião de pré-implantação. Por exemplo, uma diferença em padrão de fragmento de restrição, comprimento de produtos de PCR, comprimento de sequências repetitivas no locus de gene de zcytorl71igtic, e similares, são indicativos de uma anormalidade genética, aberração genética, ou diferença alélica em comparação com o controlo do tipo selvagem normal. Os controlos podem ser de membros de família não afectados, ou indivíduos não relacionados, dependendo do teste e disponibilidade de amostras. As amostras genéticas para utilização dentro da presente invenção incluem ADN genómico, ARNm, e ADNc isolado de qualquer tecido ou outra amostra biológica de um paciente, que inclui, mas não é limitada a, sangue, saliva, sémen, células embrionárias, fluido amniótico, e similares. A sonda de polinucleótido ou iniciador pode ser ARN ou ADN, e compreenderá uma porção da SEQ ID NO: 1, o complemento da SEQ ID NO: 1, ou um equivalente de ARN do mesmo, tais métodos para mostrar a análise de ligação genética a fenótipos de doença humana são bem conhecidos na técnica. Para a referência a métodos à base de PCR em diagnósticos veja-se geralmente, Mathew (ed.), Protocols in Human Molecular Genetics (Humana Press, Inc. 1991), White (ed.), PCR Protocols: Current Methods e Applications (Humana Press, Inc. 1993), Cotter (ed.), Molecular Diagnosis of Câncer (Humana Press, Inc. 1996), Hanausek e Walaszek (eds.), Tumor Marker Protocols (Humana Press, Inc. 1998), Lo (ed.), Clinicai Applications of PCR (Humana Press, Inc. 56 1998), e Meltzer (ed.), PCR in Bioanalysis (Humana Press, Inc. 1998) .

Mutações associadas ao locus de zcytorl71ig podem ser detectadas utilizando moléculas de ácido nucleico utilizando métodos padrão para a análise de mutação directa, tais como análise de polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição, análise de repetição curta em tandem utilizando técnicas de PCR, análise de sistema de mutação refractária a amplificação, detecção de polimorfismo de conformação de cadeia simples, métodos de clivagem de ARNase, electroforese em gel em gradiente desnaturante, análise de desemparelhamento assistida por fluorescência, e outras técnicas de análise genética conhecidas na especialidade (veja-se, por exemplo, Mathew (ed.), Protocols in Human Molecular Genetics (Humana Press, Inc. 1991), Marian, Chest 108:255 (1995), Coleman e

Tsongalis, Molecular Diagnostics (Humana Press, Inc. 1996), Elles (ed.) Molecular Diagnosis of Genetic Diseases (Humana Press, Inc. 1996), Landegren (ed.), Laboratory Protocols for Mutation Detection (Oxford University Press 1996), Birren et al. (eds.), Genome Analysis, Vol. 2: Detecting

Genes (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1998), Dracopoli et al. (eds.), Current Protocolos in Human Genetics (John Wiley & Sons 1998), e Richards e Ward, "Molecular Diagnostic Testing", em Principies of Molecular Medicine, páginas 83-88 (Humana Press, Inc. 1998). A análise directa de um gene de zcytorl71ig para uma mutação pode ser realizada utilizando um ADN genómico do indivíduo. Os métodos para amplificar ADN genómico, obtido, por exemplo, de linfócitos de sangue periférico, são bem conhecidos aos peritos na especialidade (veja-se, por exemplo, Dracopoli et al. (eds.), Current Protocols in Human Genetics, nas páginas 7.1.6 a 7.1.7 (John Wiley & Sons 1998)). A presente invenção proporciona ainda counterpart polipéptidos e polinucleótidos equivalentes de outras 57 espécies (ortólogos). Estas espécies incluem, mas não são limitadas a, espécies de mamíferos, aves, anfíbios, répteis, peixes, insecto e outros vertebrados e invertebrados. De particular interesse são polipéptidos de zcytorl71ig de outras espécies de mamíferos, incluindo, por exemplo, polipéptidos murinos, porcinos, ovinos, bovinos, caninos, felinos, equinos, e outros polipéptidos de primata. Ortólogos de zcytorl71ig humano podem ser clonados utilizando informação e composições proporcionadas pela presente invenção em combinação com técnicas de clonagem convencionais. Por exemplo, um ADNc pode ser clonado utilizando ARNm obtido de um tipo de célula ou tecido que expressa zcytorl71ig como é revelado no presente documento. Fontes adequadas de ARNm podem ser identificadas pela sondagem de Northern blots com sondas desenhadas a partir das sequências reveladas no presente documento. Uma biblioteca é então preparada a partir de ARNm de um tecido ou linha de células positiva. Um ADNc que codifica zcytorl71ig pode então ser isolado por uma variedade de métodos, tais como pela sondagem com um ADNc humano completo ou parcial ou com um ou mais conjuntos de sondas degeneradas com base nas sequências reveladas. Um ADNc pode também ser clonado utilizando a reacção em cadeia da polimerase, ou PCR (Mullis, supra), utilizando iniciadores desenhados a partir da sequência de zcytorl71ig humano representativa revelada no presente documento. Dentro de um método adicional, a biblioteca de ADNc pode ser utilizada para transformar ou transfectar células hospedeiras, e expressão do ADNc de interesse pode ser detectada com um anticorpo contra o polipéptido de zcytorl71ig, estudos de ligação ou ensaios de actividade. Técnicas similares podem também ser aplicadas ao isolamento de clones genómicos.

Uma sequência de polinucleótido f para o ratinho ortólogo de zcytorl71ig foi identificada e é mostrada na SEQ ID NO: 116 e a sequência de aminoácido correspondente é 58 mostrada na SEQ ID NO: 117. A análise do polipéptido de zcytorl7 de ratinho codificado pela sequência de ADN da SEQ ID NO: 116 revelou uma grelha de leitura aberta que codifica 662 aminoácidos (SEQ ID NO: 117) que compreende um péptido sinal de secreção predito de 45 resíduos de aminoácido (do resíduo 1 (Met) ao resíduo 45 (Ala) da SEQ ID NO: 117), e um polipéptido maduro de 617 aminoácidos (do resíduo 46 (Vai) ao resíduo 662 (Cys) da SEQ ID NO: 117) . Além disso, um resíduo Met adicional, Met (28) pode ser usado como uma metionina de iniciação; que compreende um segundo péptido sinal de secreção predito de 18 resíduos de aminoácido (do resíduo 28 (Met) ao resíduo 45 (Ala) da SEQ ID NO: 117), e o mesmo polipéptido maduro de 617 aminoácidos (do resíduo 46 (Vai) ao resíduo 662 (Cys) da SEQ ID NO: 117. Além do motivo WSXWS (SEQ ID NO: 3) que corresponde a resíduos 224-228 da SEQ ID NO: 117, o receptor compreende um domínio extracelular dos resíduos 46 (Vai) a 533 (Glu) da SEQ ID NO: 117) que inclui um domínio de ligação a citocina de aproximadamente 200 resíduos de aminoácido (dos resíduos 46 (Vai) a 240 (Pro) da SEQ ID NO: 117) e um domínio de fibronectina III (resíduos 241 (His) to 533 (Glu) da SEQ ID NO: 117); um motivo CXW (dos resíduos 66 (Cys) a 68 (Trp) da SEQ ID NO: 117); um ligante de domínio (dos resíduos 142 (Thr) a 145 (Pro) da SEQ ID NO: 117); uma penúltima região de cadeia (dos resíduos 207 (Phe) a 215 (Arg) da SEQ ID NO: 117); um domínio transmembrana (dos resíduos 534 (Ile) a 550 (Ile) da SEQ ID NO: 117) ; domínio de sinalização intracelular completa (dos resíduos 551 (Lys) a 662 (Cys) da SEQ ID NO: 117) que contém um local de sinalização "Box I" (dos resíduos 568 (Cys) a 574 (Pro) da SEQ ID NO: 117), e um local de sinalização "Box IT' (dos resíduos 628 (Glu) a 631 (leu) da SEQ ID NO: 117). Resíduos conservados comuns a classe I receptores de citocina, Estão nos resíduos 56 (Cys), 187 (Trp), e 215 (Arg). Uma comparação das sequências de 59 aminoácidos humana e de ratinho revela que tanto os polipéptidos humanos e ortólogos contêm caracteristicas estruturais correspondentes descritas anteriormente (e, veja-se, Figura 2). a sequência madura para o zcytorl7 de ratinho começa em Val46 (como é mostrado na SEQ ID NO: 117), que corresponde a Ala33 (como é mostrado na SEQ ID NO: 5) na sequência humana. Existe cerca de 61% de identidade entre as sequências de ratinho e humana com relação a sequência de aminoácidos completa que corresponde a SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 117. A percentagem anterior de identidade foi determinada usando um programa FASTA com ktup = 1, penalidade de abertura de lacuna = 12, penalidade de extensão de lacuna = 2, e matriz de substituição = BLOSUM62, com outros parâmetros ajustados como pré-definidos. Os polinucleótidos correspondentes que codificam as regiões, domínios, motivos, resíduos e sequências de polipéptido de zcytorl7 de ratinho descritas anteriormente são como mostrados na SEQ ID NO: 11 6.

Além disso, uma forma solúvel truncada do receptor de polipéptido de zcytorl7 de ratinho parece ser naturalmente expresso. Uma sequência de polinucleótido para uma forma solúvel truncada do receptor de zcytorl7 de ratinho foi identificada e é mostrada na SEQ ID NO: 118 e a correspondente sequência de aminoácidos mostradas na SEQ ID NO: 119. A análise do polipéptido de zcytorl7 de ratinho solúvel truncado codificado pela sequência de ADN da SEQ ID NO: 118 revelou uma grelha de leitura aberta que codifica 547 aminoácidos (SEQ ID NO: 119) que compreendem um péptido sinal de secreção predito de 45 resíduos de aminoácido (do resíduo 1 (Met) ao resíduo 45 (Ala) da SEQ ID NO: 119), e um polipéptido maduro de 502 aminoácidos (do resíduo 46 (Vai) ao resíduo 547 (Vai) da SEQ ID NO: 119) . Além disso, um resíduo Met adicional, Met (28) pode ser usado como uma metionina de iniciação; que compreende um segundo péptido sinal de secreção predito de 18 resíduos de aminoácido (do 60 resíduo 28 (Met) ao resíduo 45 (Ala) da SEQ ID NO: 119), e o mesmo polipéptido maduro de 502 aminoácidos (do resíduo 46 (Vai) ao resíduo 547 (Vai) da SEQ ID NO: 119. Além do motivo WSXWS (SEQ ID NO: 3) que corresponde a resíduos 224-228 da SEQ ID NO: 119, o receptor compreende um domínio extracelular dos resíduos 46 (Vai) a 533 (Trp) da SEQ ID NO: 119) que inclui um domínio de ligação a citocina de aproximadamente 200 resíduos de aminoácido (dos resíduos 46 (Vai) a 240 (Pro) da SEQ ID NO: 119) e um domínio de fibronectina III (dos resíduos 241 (His) a 533 (Trp) da SEQ ID NO: 119); um motivo CXW (dos resíduos 66 (Cys) a 68 (Trp) da SEQ ID NO: 119); um ligante de domínio (dos resíduos 142 (Thr) a 145 (Pro) da SEQ ID NO: 119); uma penúltima região de cadeia (dos resíduos 207 (Phe) a 215 (Arg) da SEQ ID NO: 119); e um região de cauda C-terminal (dos resíduos 534 (Leu) ao 547 (Vai). Resíduos conservados comuns a receptores de citocina de classe I, estão nos resíduos 56 (Cys), 187 (Trp), e 215 (Arg). Uma comparação dos sequências de aminoácidos humano e ratinho, incluindo o zcytorl7 de ratinho solúvel truncado, revela que tato os polipéptidos humanos como ortólogos contêm características estruturais correspondentes descritas anteriormente (e, veja-se, Figura 2). Os polinucleótidos correspondentes que codificam o regiões, domínios, motivos, resíduos e sequências de polipéptido de zcytorl7 de ratinho solúvel truncado descritas anteriormente são como mostrado na SEQ ID NO: 118.

Aqueles peritos na especialidade reconhecerão que as sequências revelado na SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 108 e SEQ ID NO: 4 representam alelos de zcytorl7 humano e essa variação alélica e splicing alternativo são esperados que ocorram. Variantes alélicos desta sequência podem ser clonados por meio de sondagem bibliotecas ADNc ou genómico de diferentes inidvíduos de acordo com procedimentos padrão. Variantes alélicos da sequência de ADN mostrada nas 61 SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 108 ou SEQ ID NO: 4, incluindo aqueles que contêm mutações silenciosas e aqueles em que as mutações resultam em mudanças de sequência de aminoácidos, estão dentro do âmbito da presente invenção, como são proteínas que são variantes alélicos da SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 117 ou SEQ ID NO: 119. ADNc gerados a partir de alternativamente ARNm spliced, que retêm as propriedades do polipéptido de zcytorl7 são incluídos dentro do âmbito da presente invenção, como são polipéptidos codificados por tais ADNc e ARNm. Variantes alélicos e variantes de splice destas sequências podem ser clonados por meio de sondagem ADNc ou bibliotecas genómicas a partir de diferentes indivíduos ou tecidos de acordo com procedimentos padrão conhecidos na técnica. Por exemplo, a forma curta e forma longa de receptores solúveis de zcytorl7 descritos anteriormente, e na SEQ ID NO: 112 e SEQ ID NO: 113 ou SEQ ID NO: 114 e SEQ ID NO: 115 podem ser considerados variantes alélicos ou de splice de zcytorl7. A presente invenção também proporciona polipéptidos de zcytorl7 isolados que são substancialmente similares aos polipéptidos da SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 109 ou SEQ ID NO: 5 e seus ortólogos, por exemplo, SEQ ID NO: 117 e SEQ ID NO: 119. O termo "substancialmente similar" é usado no presente documento para denotar polipéptidos que tem pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou superior a 99% de identidade de sequência com as sequências mostradas na SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 109 ou SEQ ID NO: 5 ou seus ortólogos, por exemplo, SEQ ID NO: 117 e SEQ ID NO: 119. Tais polipéptidos mais preferentemente serão pelo menos 90% idênticos, e o mais preferentemente 95% ou mais idênticos às SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 109 e SEQ ID NO: 5 ou seus ortólogos.) A percentagem de identidade de sequência é 62 determinada por meio de métodos convencionais. Veja-se, por exemplo, Altschul et al., Buli. Math. Bio. 48: 603-616, 1986 e Henikoff e Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 10915-10919, 1992. De maneira breve, duas sequências de aminoácidos são alinhadas para optimizar as pontuações de alinhamento usando uma penalidade de abertura de lacuna de 10, uma penalidade de extensão de lacuna de 1, e o "blosum 62" matriz de pontuação de Henikoff e Henikoff (ibid.) como é mostrado no Quadro 4 (aminoácidos são indicados pelos códigos de uma letra padrão). A percentagem de identidade é então calculada como: Número total de correspondências idênticas [comprimento da sequência mais longa mais o número dos espaços introduzidos na sequência com a finalidade de alinhar as duas sequências]

Quadro 4 A R N D c Q E G H I L K M F P s T A 4 R -1 5 N -2 0 6 D -2 -2 1 6 C 0 -3 1 6 Q 1 0 0 -3 5 E 0 0 2 -4 2 5 G 0 -2 0 -1 -3 -2 -2 6 H -2 0 1 -1 -3 0 0 -2 8 I -3 -3 -3 -1 -3 -3 -4 -3 4 L -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4 -3 2 4 K 2 0 -1 -3 1 1 -2 -1 -3 -2 5 M -1 -2 -3 -1 0 -2 -3 -2 1 2 -1 5 F -2 -3 -3 -3 -2 -3 -3 -3 -1 0 0 -3 0 6 P -2 -2 -1 -3 -1 -1 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -4 7 S 1 -1 1 0 -1 0 0 0 -1 -2 -2 0 -1 -2 4 T 0 -1 0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1 1 63 A R N D c Q E G H I L K M F P s T W Y V W -3 -3 -4 -4 -2 -2 -3 -2 -2 -3 -2 -3 -1 1 -4 -3 -2 11 Y -2 -2 -2 -3 -2 -1 -2 -3 2 -1 -1 -2 -1 3 -3 -2 -2 2 7 V 0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3 3 1 -2 1 -1 -2 -2 0 -3 -1 A identidade de sequência de moléculas de polinucleótido é determinada por meio de métodos similares usando uma razão como revelada anteriormente.

Os peritos na especialidade apreciam que existem muitos algoritmos estabelecidos disponíveis para alinhar duas sequências de aminoácido. 0 algoritmo de pesquisa de similaridade "FASTA" de Pearson e Lipman é um método de alinhamento de proteínas adequado para examinar o nível de identidade partilhada por uma sequência de aminoácido revelada no presente documento e a sequência de aminoácido de um zcytorl7 variante putativo. 0 algoritmo FASTA é descrito por Pearson e Lipman, Proc. Nat'1 Acad. Sei. USA 85: 2444 (1988), e por Pearson, Meth. Enzymol. 183:63 (1990).

De maneira breve, FASTA primeiro caracteriza similaridade de sequências por meio da identificação de regiões partilhadas pela sequência de consulta (por exemplo, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 117 e SEQ ID NO: 119) e e uma sequência de teste que têm a densidade mais alta de identidades (se a variável ktup for 1) ou pares de identidades (se ktup = 2), sem considerar substituições, inserções, ou deleções de aminoácido conservativas. As dez regiões com a densidade mais alta de identidades são então repontuadas por meio da comparação da similaridade de todos os aminoácidos emparelhados utilizando uma matriz de substituição de aminoácido, e as extremidades das regiões são "recortadas" para incluir somente aqueles resíduos que contribuem à pontuação mais alta. Se existirem diversas regiões com pontuações superiores ao valor de "corte" (calculados por uma fórmula predeterminada com base no comprimento da sequência e o valor de ktup), então as regiões iniciais recortadas são examinadas para determinar se as regiões podem ser unidas para formar um alinhamento aproximado com espaços. Finalmente, as regiões de pontuação mais altas das duas sequências de aminoácido são alinhadas utilizando uma modificação do algoritmo de Needleman-Wunsch-Sellers (Needleman e Wunsch, J. Mol. Biol. 48:444 (1970); Sellers, SIAM J. Appl. Math. 26:787 (1974)), que tem em consideração inserções e deleções de aminoácido. Os parâmetros preferidos para a análise FASTA são: ktup = 1, penalidade de abertura de espaço = 10, penalidade de extensão de espaço = 1, e matriz de substituição = BLOSUM62. Estes parâmetros podem ser introduzidos num programa FASTA por meio da modificação do arquivo de matriz de pontuação ("SMATRIX"), como foi explicado no Apêndice 2 de Pearson, Meth. Enzymol. 183: 63 (1990). FASTA pode também ser utilizado para determinar a identidade de sequência de moléculas de ácido nucleico utilizando uma razão como foi revelado acima. Para comparações de sequência de nucleótidos, o valor de ktup pode variar entre um a seis, preferentemente desde três até seis, mais preferentemente três, com outros parâmetros ajustados como padrão. a O quadro de BLOSUM62 (Quadro 4) é uma matriz de substituição de aminoácidos derivada de cerca de 2.000 alinhamentos múltiplos locais de segmentos de sequência de proteina, que representam regiões altamente conservadas de mais de 500 grupos de proteínas relacionadas (Henikoff e Henikoff, Proc. Nat'1 Acad. Sei. USA 89:10915 (1992)). Consequentemente, as frequências substituição de BLOSUM62 podem ser usadas para definir substituições de aminoácido conservativas que podem ser introduzidas nas sequências de aminoácidos da presente invenção. Embora seja possível desenhar substituições de aminoácido com base somente em propriedades químicas (como discutido a seguir), 65 linguagem "substituição de aminoácido conservativa" preferentemente refere-se a uma substituição representada por um valor de BLOSUM62 superior a -1. Por exemplo, uma substituição de aminoácido é conservativa se a substituição é caracterizado por um valor de BLOSUM62 de 0, 1, 2, ou 3. De acordo com este sistema, substituições de aminoácido conservativas preferidas são caracterizadas por um valor de BLOSUM62 de pelo menos 1 (por exemplo, 1, 2 ou 3), enquanto substituições de aminoácido conservativas mais preferidas são caracterizadas por um valor de BLOSUM62 de pelo menos 2 (por exemplo, 2 ou 3).

Polipéptidos variantes de zcytorl7 ou polipéptidos substancialmente homçologos de zcytorl7 são caracterizados como que tem uma ou mais substituições, deleções ou adições de aminoácido. Estas mudanças são preferentemente de uma natureza menor, isto é, substituições de aminoácido conservativas (veja-se Quadro 5) e outras substituições que não afectam significativamente a dobragem ou actividade do polipéptido; deleções pequenas, tipicamente de um a aproximadamente 30 aminoácidos; e pequenas extensões amino-ou carboxil-terminal, tais como um resíduo de metionina amino-terminal, um péptido ligante pequeno de até aproximadamente 20-25 resíduos, ou uma etiqueta de afinidade. A presente invenção assim inclui polipéptidos que compreendem uma sequência que é pelo menos 80%, preferentemente pelo menos 90%, e mais preferentemente 95% ou mais idêntica à região correspondente da SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 117 ou SEQ ID NO: 119 excluindo as etiquetas, extensão, sequências de ligante e similares. Os polipéptidos que compreendem etiquetas de afinidade podem compreender ainda um local de clivagem proteolítica entre o polipéptido de zcytorl7 e a etiqueta de afinidade. Locais adequados incluem local de clivagem trombina e local de clivagem de factor Xa. 66

Quadro 5

Substituições de aminoácido conservativas Básico: arginina lisina histidina Ácido: ácido glutâmico ácido aspártico Polar: glutamina asparagina Hidrofóbico: leucina isoleucina valina Aromático: fenilalanina triptofano tirosina Pequeno: glicina alanina serina treonina metionina A presente invenção proporciona um receptor de citocina multimérico isolado que compreende um polipéptido que tem pelo menos 90 por cento de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 109, ou SEQ ID NO: 5; e pelo menos uma porção de pelo menos um receptor de citocina de classe I, em que o receptor de citocina multimérico liga a pelo menos uma porção da SEQ ID NO: 2. O polipéptido que tem pelo menos 90 por cento de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 111 pode incluir, por exemplo, do resíduo de aminoácido 20 ao resíduo de aminoácido 227 da SEQ ID NO: 111, do resíduo de aminoácido 20 ao resíduo de aminoácido 227 da SEQ ID NO: 519, do resíduo de aminoácido 20 ao resíduo de aminoácido 543 da SEQ ID NO: 111, do resíduo de aminoácido 544 ao resíduo de aminoácido 732 da SEQ ID NO: 111, do resíduo de aminoácido 544 ao resíduo de aminoácido 67 649 da SEQ ID NO: 109, do resíduo de aminoácido 20 ao resíduo de aminoácido 732 da SEQ ID NO: 111, do residuo de aminoácido 20 ao resíduo de aminoácido 649 da SEQ ID NO: 109, e combinações dos mesmos. A pelo menos uma porção de pelo menos um receptor de citocina de classe I inclui, por exemplo, OSMRbeta (SEQ ID NO: 7) e/ou WSX-1 (SEQ ID NO: 9). Por exemplo, a pelo menos uma porção de pelo menos um receptor de citocina de classe I que compreende pelo menos uma porção da SEQ ID NO: 7 pode compreender do residuo de aminoácido 28 ao resíduo de aminoácido 429 da SEQ ID NO: 7, do residuo de aminoácido 35 ao resíduo de aminoácido 137 da SEQ ID NO: 7, do residuo de aminoácido 240 ao resíduo de aminoácido 342 da SEQ ID NO: 7, do resíduo de aminoácido 348 ao residuo de aminoácido 429 da SEQ ID NO: 7, do resíduo de aminoácido 28 ao resíduo de aminoácido 739 da SEQ ID NO: 7, do resíduo de aminoácido 28 ao residuo de aminoácido 761 da SEQ ID NO: 7, do resíduo de aminoácido 762 ao resíduo de aminoácido 979 da SEQ ID NO: 7, e/ou combinações dos mesmos. O receptor de citocina multimérico pode ser um heterodímero, trímero, tetrâmero, pentâmero, ou similares. Além disso, o receptor de citocina multimérico pode ser solúvel, imobilizado em um suporte sólido, ou ligado a membrana. Opcionalmente, o receptor de citocina multimérico pode antagonizar uma actividade da SEQ ID NO: 2, tal como inibir ou reduzir a proliferação de células hematopoiéticas, imunes, e/ou inflamatórias, ou inibir ou reduzir o potenciamento do processo hematopoiético, imune, e/ou inflamatório, ou inibir ou reduzir a diferenciação de células hematopoiéticas, por exemplo células linfóides tal como células monociticas, macrófagos e/ou células T. O receptor de citocina multimérico da presente invenção pode também compreender uma etiqueta de afinidade seleccionada a partir do grupo de polihistidina, proteína A, glutationa S transferase, Glu-Glu, substância P, Flag™ péptido, péptido de ligação a estreptavidina, e um polipéptido Fc de 68 imunoglobulina. A presente invenção também proporciona um complexo de ligando/receptor gue compreende um polipéptido gue inclui pelo menos uma porção da SEQ ID NO: 2; e um receptor solúvel de citocina multimérico gue compreende pelo menos uma porção de pelo menos um polipéptido seleccionado a partir do grupo da SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 7, e SEQ ID NO: 9, em que o polipéptido é unido ao receptor solúvel de citocina multimérico. 0 receptor solúvel de citocina multimérico pode compreender o domínio extracelular e/ou domínio transmembrana de zcytorl7 (SEQ ID NO: 111), OSMRbeta (SEQ ID NO: 7), e/ou WSX-1 (SEQ ID NO: 9). Por exemplo, o receptor solúvel de citocina multimérico pode compreender do resíduo de aminoácido 20 ao 227 to SEQ ID NO: 111, do resíduo de aminoácido 20 ao 519 to SEQ ID NO: 111, do resíduo de aminoácido 20 ao 543 a SEQ ID NO: 111, do resíduo de aminoácido 28 ao 739 a SEQ ID NO: 7, do resíduo de aminoácido 28 ao 429 a SEQ ID NO: 7, do resíduo de aminoácido 35 ao 137 a SEQ ID NO: 7, do resíduo de aminoácido 240 ao 342 a SEQ ID NO: 7, do resíduo de aminoácido 348 ao 429 a SEQ ID NO: 7, ou combinações dos mesmos. O receptor solúvel de citocina multimérico pode ser um heterodímero, trímero, tetrâmero, pentâmero, ou similares. O receptor de citocina multimérico da presente invenção pode também compreender uma etiqueta de afinidade como descrita no presente documento. O polipéptido de the complexo de ligando/receptor pode compreender resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 2 seleccionados a partir do grupo de 38 a 152, 27 a 164, 24 a 164, 1 a 164, 38 a 52, 83 a 98, 104 a 117, 137 a 152, e combinações dos mesmos. O complexo de ligando/receptor da presente pode também compreender uma proteína de fusão. A proteína de fusão pode compreender pelo menos quatro polipéptidos, em que a ordem de polipéptidos desde a terminação N até terminação C são um primeiro polipéptido que compreende os 69 resíduos de aminoácido 38-52 da SEQ ID NO: 2; um primeiro espaçador de 6-27 resíduos de aminoácido; um segundo polipéptido que compreende os resíduos de aminoácido seleccionados a partir do grupo de (a) resíduos da hélice B de IL-2 da SEQ ID NO: 183; (b) resíduos da hélice B de IL-4 65-83 da SEQ ID NO: 179; (c) resíduos da hélice B de IL-3

73-86 da SEQ ID NO: 102; (d) resíduos da hélice B de GM-CSF 72-81 da SEQ ID NO: 181; e (e) resíduos de aminoácido 83-98 da SEQ ID NO: 2; um segundo espaçador de 5-11 resíduos de aminoácido; um terceiro polipéptido que compreende os resíduos de aminoácido seleccionados a partir do grupo de (a) resíduos da hélice C de IL-2 102-116 de SEQ ID NO: 177; (b) resíduos da hélice C de IL-4 94-118 da SEQ ID NO: 179; (c) resíduos da hélice C de IL-3 91-103 da SEQ ID NO: 102;

(d) resíduos da hélice C de GM-CSF 85-103 da SEQ ID NO: 181; e (e) resíduos de aminoácido 104-117 da SEQ ID NO: 2; um terceiro espaçador de 3-29 resíduos de aminoácido; e um quarto polipéptido que compreende os resíduos de aminoácido seleccionados a partir do grupo de (a) resíduos da hélice D de IL-2 134-149 da SEQ ID NO: 177; (b) resíduos da hélice D de IL-3 123-141 da SEQ ID NO: 102; (c) resíduos da hélice D de IL-4 133-151 da SEQ ID NO: 179; (d) resíduos da hélice D de GM-CSF 120- 131 da SEQ ID NO: 181 ; e (e) resíduos de aminoácido 137- -152 da SEQ ID NO : 2 ; e um receptor de citocina multimérico que compreende pelo menos uma porção de pelo menos um polipéptido seleccionado a partir do grupo da SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 7, e SEQ ID NO: 9; em que a proteína de fusão é unida ao receptor de citocina multimérico.

Alternativamente, a proteína de fusão pode compreender pelo menos quatro polipéptidos, em que a ordem de polipéptidos desde a terminação N até a terminação C são um primeiro polipéptido que compreende os resíduos de aminoácido seleccionados a partir de um grupo de (a) resíduos da hélice A de IL-2 27-48 da SEQ ID NO: 177; (b) 70

Iresíduos da hélice A de IL-4 30-42 da SEQ ID NO: 179; (c) resíduos da hélice A de IL-3 35-45 da SEQ id NO: 102; (d) resíduos da hélice A de GM-CSF 30-44 da SEQ ID NO: 181; e (e) resíduos de aminoácidos 38-52 da SEQ ID NO: 2; um primeiro espaçador de 6-27 resíduos de aminoácido; um segundo polipéptido que compreende os resíduos de aminoácido seleccionados a partir do grupo de (a) resíduos da hélice B de IL-2 da SEQ ID NO: 183; (b) ; resíduos da hélice B de IL-4 65-83 da SEQ ID NO: 179; (c) resíduos da hélice B de IL-3 73-86 da SEQ ID NO: 102; (d) resíduos da

hélice B de GM-CSF 72-81 da SEQ ID NO: 181; e (e) resíduos de aminoácido 83-98 da SEQ ID NO: 2; um segundo espaçador de 5-11 resíduos de aminoácido; um terceiro polipéptido que compreende os resíduos de aminoácido seleccionados a partir do grupo de (a) resíduos da hélice C de IL-2 102-116 da SEQ ID NO: 177; (b) resíduos da hélice C de IL-4 94-118 da SEQ

ID NO: 179; (c) resíduos da hélice C de IL-3 91-103 da SEQ ID NO: 102; (d) resíduos da hélice C de GM-CSF 85-103 da SEQ ID NO: 181; e (e) resíduos de aminoácido 104-117 da SEQ ID NO: 2; um terceiro espaçador de 3-29 resíduos de aminoácido; e um quarto polipéptido que compreende os resíduos de aminoácido de 137-152 da SEQ ID NO: 2; e um receptor de citocina multimérico que compreende pelo menos uma porção de pelo menos um polipéptido seleccionado a partir do grupo da SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 7, e SEQ ID NO: 9; em que a proteína de fusão é unida ao receptor de citocina multimérico. Um receptor de citocina multimérico pode compreender pelo menos um dos seguintes polipéptidos da SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, ou os domínios extracelulares thereof. O complexo de ligando/receptor pode ser solúvel e pode adicionalmente incluem uma etiqueta de afinidade como descrita no presente documento. A presente invenção também proporciona um polinucleótido isolado e purificado que codifica um 71 polipéptido que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90 por cento de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 109, ou SEQ ID NO: 5, em que o polipéptido e pelo menos uma porção de pelo menos um receptor de citocina de classe I formam um receptor de citocina multimérico, e em que o receptor de citocina multimérico liga a pelo menos uma porção da SEQ ID NO: 2. A presente invenção também proporciona um polinucleótido isolado e purificado que codifica um polipéptido que compreende pelo menos uma porção de pelo menos um da SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 109, ou SEQ ID NO: 5, em que o polipéptido e pelo menos uma porção de um receptor de citocina de classe I formam um receptor de citocina multimérico, e em que o receptor de citocina multimérico liga a pelo menos uma porção da SEQ ID NO: 2. O polinucleótido pode codificar um polipéptido que está incluído num receptor solúvel de citocina multimérico e que pode também incluir uma etiqueta de afinidade como descrita no presente documento. O polipéptido pode compreender, por exemplo, do resíduo de aminoácido 20 ao 227 da SEQ ID NO: 111, do resíduo de aminoácido 20 ao 519 da SEQ ID NO: 111, do resíduo de aminoácido 20 ao 543 da SEQ ID NO: 111, e/ou combinações dos mesmos. Além disso, a pelo menos uma porção de pelo menos um receptor de citocina de classe I pode compreender, por exemplo, do resíduo de aminoácido 28 ao 739 da SEQ ID NO: 7, do resíduo de aminoácido 28 ao 429 da SEQ ID NO: 7, do resíduo de aminoácido 35 ao 137 da SEQ ID NO: 7, do resíduo de aminoácido 240 ao 342 da SEQ ID NO: 7, do resíduo de aminoácido 348 ao 429 da SEQ ID NO: 7, e/ou combinações dos mesmos. O receptor solúvel de citocina multimérico pode ser um heterodímero, trímero, tetrâmero, pentâmero, ou similares. A pelo menos uma porção da SEQ ID NO: 2 pode incluir, por exemplo resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 2 seleccionada a partir do grupo de 38 a 152, 27 a 164, 24 a 164, 1 a 164, 38 a 52, 83 a 98, 104 a 117, 137 72 a 152, e combinações dos mesmos. Opcionalmente, o receptor de citocina multimérico pode antagonizar uma actividade da SEQ ID NO: 2 como descrita no presente documento. A presente invenção proporciona ainda uma variedade de outras fusões de polipéptido e proteínas multiméricas relacionadas que compreendem uma ou mais fusões de polipéptido. Por exemplo, um polipéptido de zcytorl7 pode ser preparado como uma fusão a uma proteína dimerizante como revelado em Patentes U.S. n° 5.155.027 e 5.567.584. As proteínas dimerizantes preferidas com relação a isso incluem domínios de região constante de imunoglobulina. Fusões de imunoglobulina-polipéptido de zcytorl7 podem ser expressas em células modificadas por engenharia genética para produzir uma variedade de análogos multiméricos de zcytorl7. Domínios auxiliares podem ser fusionados a polipéptidos de zcytorl7 para direccionar os mesmos para células específicas, tecidos, ou macromoléculas (por exemplo, colagénio). Um polipéptido de zcytorl7 pode ser fusionado a duas ou mais fracções, tal como uma etiqueta de afinidade para purificação e um domínio de direccionamento. Fusões de polipéptido podem também compreender um ou mais locais de clivagem, particularmente entre domínios. Veja-se, Tuan et ai., Connective tissue Research 34:1-9, 1996. Por exemplo, um ou mais domínios do receptor de zcytorl7 solúvel pode ser unido a um receptor solúvel de citocina, tal como OSMRbeta e/ou WSX-1, que pode potências suas propriedades biológicas ou eficiência de produção. Adicionalmente, o receptor solúvel de citocina multimérico pode incluir ainda uma etiqueta de afinidade. Uma etiqueta de afinidade pode ser, por exemplo, uma etiqueta seleccionada a partir do grupo de polihistidina, proteína A, glutationa S transferase, Glu-Glu, substância P, Flag™ péptido, péptido de ligação a estreptavidina, e um polipéptido Fc de imunoglobulina.

As proteínas da presente invenção podem também 73 compreender resíduos de aminoácido que não ocorrem naturalmente. Aminoácidos que não ocorrem naturalmente incluem, sem limitação, trans-3-metilprolina, 2,4-metanoprolina, cis-4-hidroxiprolina, trans-4-hidroxiprolina, N-metilglicina, alo-treonina, metiltreonina, hidroxietilcisteína, hidroxietilhomocisteína, nitroglutamina, homoglutamina, ácido pipecólico, ácido tiazolidina carboxílico, dehidroprolina, 3- e 4-metilprolina, 3,3-dimetilprolina, terc-leucina, norvalina, 2-azafenilalanina, 3-azafenilalanina, 4-azafenilalanina, e 4-fluorofenilalanina. Diversos métodos são conhecidos na técnica para incorporar resíduos de aminoácido que não ocorrem naturalmente em proteínas. Por exemplo, um sistema in vitro pode ser utilizado em que mutações nonsense são suprimidas usando ARNt supressores quimicamente aminoacilados. Métodos para sintetizar aminoácidos e aminoacilar ARNt são conhecidos na técnica. A transcrição e a tradução de plasmídeos que contêm mutações nonsense são levadas a cabo num sistema livre de células que compreende um extracto S30 de E. coli e enzimas comercialmente disponíveis e outros reagentes. Proteínas são purificadas por meio de cromatografia. Veja-se, por exemplo, Robertson et al., J. Am. Chem. Soc. 113:2722, 1991; Ellman et al., Methods Enzymol. 202 :301, 1991; Chung et al., Science 259:806-9, 1993; e Chung et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:10145-9, 1993). Num segundo método, tradução é levada a cabo em oócitos de Xenopus por meio de microinjecção de ARNm mutado e ARNt supressor quimicamente aminoacilado (Turcatti et al., J. Riol. Chem. 271:19991-8, 1996). Dentro de um terceiro método, células de E. coli são cultivadas na ausência de um aminoácido natural é que para ser recolocado (por exemplo, fenilalanina) e na presença do(s) aminoácido(s) que não ocorrem naturalmente desejados (por exemplo, 2-azafenilalanina, 3-azafenilalanina, 4-azafenilalanina, ou 74 4-fluorofenilalanina). 0 aminoácido que não ocorre naturalmente é incorporado na proteína em lugar de seu equivalente natural. Veja-se, Koide et al., Biochem. 33:7470-7476, 1994. Resíduos de aminoácido que ocorrem de forma natural podem ser convertidos a espécies que não ocorrem de forma natural por modificação química in vitro. A modificação química pode ser combinada com mutagénese dirigida ao local para expandir adicionalmente o intervalo de substituições (Wynn e Richards, Protein Sei. 2:395 (1993)

Um número limitado de aminoácidos não conservativos, aminoácidos que não são codificados pelo código genético, aminoácidos que não ocorrem naturalmente, e aminoácidos não naturais podem ser substituídos por resíduos de aminoácido de zcytorl7.

Aminoácidos essenciais nos polipéptidos da presente invenção podem ser identificados de acordo com procedimentos conhecidos na técnica, tal como mutagénese dirigida ao local ou mutagénese de exame de alanina (Cunningham e Wells, Science 244: 1081-5, 1989; Bass et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:4498-502, 1991). Na última técnica, mutações de alanina únicas são introduzidas em cada resíduo na molécula, e as moléculas mutantes resultantes são testadas para actividade biológica ou bioquímica como é revelado a seguir para identificar resíduos de aminoácido que são críticos à actividade da molécula. Veja-se também, Hilton et al., J. Biol. Chem. 271:4699 (1996). Locais de ligando-receptor, proteína-proteína ou outra interaeção biológica pode também ser determinado por meio de análise de estrutura física, como determinadas por meio de tais técnicas como ressonância magnética nuclear, cristalografia, difraeção de electrões ou marcação de fotoafinidade, em conjunto com mutação de aminoácidos de local de contacto putativo. Veja-se, por exemplo, de Vos et al., Science 255:306-312, 1992; Smith et 75 al., J. Mol. Biol. 224:899-904, 1992; Wlodaver et al., FEBS Lett. 309:59-64, 1992. As identidades de aminoácidos essenciais podem também ser deduzidas a partir da análise de homologias com receptores relacionados.

Determinação de resíduos de aminoácido que estão dentro regiões ou domínios que são críticos à manutenção da integridade estrutural pode ser realizada. Dentro destas regiões alguém pode determinar resíduos específicos que serão mais ou menos tolerantes à mudança e manutenção da estrutura terciária global da molécula. Os métodos para analisar a estrutura de sequência incluem, mas não são limitados a, alinhamento de sequências múltiplas com identidade de aminoácido ou nucleótido e análise por computador usando software disponível (por exemplo, the Insight II® ferramentas de modelagem de homologia e visualização; MSI, San Diego, CA), propensões de estrutura secundária, padrões binários, empacotamento complementar e interacções polares enterradas (Barton, Current Opin. Struct. Biol. 5:372-376, 1995 e Cordes et al., Current Opin. Struct. Biol. 6:3-10, 1996). Em geral, ao desenhar modificações a moléculas ou identificar fragmentos específicos, a determinação de estrutura será acompanhada pela avaliação da actividade de moléculas modificadas.

As mudanças da sequência de aminoácido são feitas em polipéptidos de zcytorl7 de modo a minimizar disrupção da estrutura de ordem mais alta essencial à actividade biológica. Por exemplo, quando o polipéptido de zcytorl7 compreende uma ou mais hélices, mudanças em resíduos de aminoácido serão feitas de modo a não quebrar a geometria da hélice e outros componentes da molécula onde mudanças na conformação abatem alguma função crítica, por exemplo, ligação da molécula aos seus parceiros de ligação. Os efeitos das mudanças de sequência de aminoácido podem ser preditos por meio de, por exemplo, modelagem por computador como foi revelado acima ou determinados por análise da 76 estrutura cristalina (veja-se, por exemplo, Lapthorn et ai., Nat. Struct. Biol. 2:266-268, 1995). Outras técnicas que são bem conhecidas na especialidade comparam a dobragem de uma proteína variante a uma molécula padrão (por exemplo, a proteína nativa). Por exemplo, a comparação da cisteína padrão numa variante e moléculas padrão pode ser feita. Espectrometria de massa e modificação química utilizando redução e alquilação proporcionam métodos para determinar resíduos de cisteína que são associados a pontes dissulfureto ou são livres de tais associações (Bean et al., Anal. Biochem. 201:216-226, 1992; Gray, Protein Sei. 2:1732-1748, 1993; e Patterson et al., Anal. Chem. 66:3727-3732, 1994). Acredita-se geralmente que se uma molécula modificada não tem o mesmo padrão de ponte de dissulfureto que a molécula padrão, a dobragem seria afectada. Outro método bem conhecido e aceitado para medir a dobragem é dicroísmo circular (DC). A medição e comparação dos espectros de DC gerados por uma molécula modificada e molécula padrão é rotina (Johnson, Proteins 7:205-214, 1990). A cristalografia é outro método bem conhecido para analisar a dobragem e estrutura. A ressonância magnética nuclear (RMN), mapeamento de péptido e mapeamento de epítopo digestivo são também métodos conhecidos para analisar a dobragem e similaridades de maneira estrutural entre proteínas e polipéptidos (Schaanan et ai., Science 257 : 961-964, 1992) .

Um perfil de hidrofilicidade de Hopp/Woods da sequência de proteína de zcytorl7 como é mostrado na SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 57 e SEQ ID NO: 93 pode ser gerado (Hopp et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. 78:3824-3828, 1981; Hopp, J. Immun. Met. 88 : 1-18, 1986 e Triquier et ai., Proteína Engineering 11:153-169, 1998). Veja-se, Figura 1. O perfil está baseado numa janela deslizante de seis resíduos. Resíduos G, S, e T enterrados e resíduos Η, Y, e W expostos foram ignorados. Por exemplo, 77 em zcytor17, regiões hidrofílicas incluem resíduos de aminoácido 43 a 48 da SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 46 (do resíduos 56 a 61 da SEQ ID NO: 54), dos resíduos de aminoácido 157 a 162 da SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 46 (dos resíduos 170a 175 da SEQ ID NO: 54), dos resíduos de aminoácido 158 a 163 da SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 46 (dos resíduos 171 a 176 da SEQ ID NO: 54), dos resíduos de aminoácido 221 a 226 da SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 46 (dos resíduos 234 a 239 da SEQ ID NO: 54), e dos resíduos de aminoácido 426 a 431 da SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 46 (dos resíduos 439 a 444 da SEQ ID NO: 54).

Os peritos na especialidade reconhecerão que hidrofilicidade ou hidrofobicidade serão levados em consideração ao desenhar modificações na sequência de aminoácido de um polipéptido de zcytorl7, de modo a não quebrar o perfil biológico e estrutural global. De particular interesse para recolocação são resíduos hidrofóbicos seleccionados a partir do grupo que consiste em Vai, Leu e Ile ou o grupo que consiste em Met, Gly, Ser, Ala, Tyr e Trp. Por exemplo, resíduos tolerantes de substituição poderiam incluir tais resíduos como é mostrado na SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 57 e SEQ ID NO: 93. No entanto, os resíduos de cisteína seriam relativamente intolerantes a substituição.

As identidades de aminoácidos essenciais podem também ser inferidas a partir da análise da similaridade de sequências entre membros da família do receptor de citocina de classe I com zcytorl7. Utilizando métodos tais como análise "FASTA" descritos anteriormente, as regiões de alta similaridade são identificadas dentro de uma família de proteínas e utilizadas para analisar a sequência de aminoácido para regiões conservadas. Uma abordagem alternativa para identificar um polinucleótido de zcytorl7 variante com base na estrutura é para determinar se uma molécula de ácido nucleico que codifica um potencial 78 polinucleótido de zcytorl7 variante pode pode hibridar a uma molécula de ácido nucleico que tem a sequência de nucleótidos da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 45 ou SEQ ID NO: 53, como discutido anteriormente.

Outros métodos de identificar aminoácidos essenciais nos polipéptidos da presente invenção são procedimentos conhecidos na técnica, tal como mutagénese dirigida ao local ou mutagénese de exame de alanina (Cunningham e Wells, Science 244: 1081 (1989), Bass et al., Proc. Natl Acad. Sei. USA 88:4498 (1991), Coombs e Corey, "Local-

Directed Mutagenesis and Protein Engineering", em Proteins: Analysis and Design, Angeletti (ed.), páginas 259-311 (Academic Press, Inc. 1998)). Na última técnica, mutações de alanina únicas são introduzidas em cada residuo na molécula, e as moléculas mutantes resultantes são testadas para actividade biológica ou bioquímica como é revelado a seguir para identificar resíduos de aminoácido que são críticos à actividade da molécula. Veja-se também, Hilton et al., J. Biol. Chem. 271:4699 (1996). A presente invenção também inclui um receptor de citocina multimérico que inclui fragmentos funcionais de polipéptidos de zcytorl7 e moléculas de ácido nucleico que codificam tais fragmentos funcionais. Um zcytorl7 "funcional" ou fragmento do mesmo definido no presente documento é caracterizado por sua capacidade de mediar actividade proliferativa ou diferenciação, por sua capacidade para induzir ou inibir funções celulares especializadas, ou por sua capacidade de ligar especificamente a um anticorpo anti-zcytor17 ou ligando zcytorl7 (solúvel ou imobilizado). Além disso, fragmentos funcionais também incluem o péptido sinal, domínio de sinalização intracelular, e similares. Como anteriormente descrito no presente documento, zcytorl7 é caracterizado por uma estrutura de receptor de citocina de classe I. Assim, a presente invenção proporciona ainda proteínas de 79 fusão que abrangem: (a) moléculas de polipéptido que compreende um domínio extracelular, domínio de ligação a citocina, ou domínio intracelular descrito no presente documento; e (b) fragmentos funcionais que compreendem um ou mais destes domínios. A outra porção de polipéptido da proteína de fusão pode compreender pelo menos uma porção de um ou mais de outro receptor de citocina de classe I, por exemplo, gpl30, LIF, IL-12, WSX-1, subunidade β do receptor de IL-2 e o receptor comum β (isto é, subunidades β dos receptores de IL3, IL-5, e GM-CSF), ou por um péptido sinal não nativo e/ou um de secreção não relacionado que facilita a secreção da proteína de fusão.

Análises de deleção de rotina de moléculas de ácido nucleico podem ser realizadas para obter fragmentos funcionais de uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipéptido de zcytorl7. Como uma ilustração, Moléculas de ADN que tem a sequência de nucleótido da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 45 ou SEQ ID NO: 53 ou fragmentos dos mesmos, pode ser digerido com Bal31 nuclease para obter uma série de deleções aninhadas. Estes Fragmentos de ADN são então inseridos em vectores de expressão em grelha de leitura apropriada, e os polipéptidos expressos são isolados e testados para actividade de zcytorl7, ou para a capacidade para ligar anticorpos anti-zcytor17 ou ligando de zcytorl7. Uma alternativa a digestão de exonuclease é utilizar mutagénese dirigida a oligonucleótido para introduzir deleções ou codões de terminação para especificar a produção de um fragmento de zcytorl7 desejado. Alternativamente, fragmentos particulares de um polinucleótido de zcytorl7 podem ser sintetizados usando a reacção em cadeia da polimerase. Métodos padrão para identificar domínios funcionais são bem conhecidos aos peritos na especialidade. Por exemplo, estudos sobre o truncamento num ou ambos os terminais de interferões foram sumarizados por Horisberger 80 e Di Marco, Pharmac. Ther. 66:507 (1995). Além disso, técnicas padrão para a análise funcional de proteínas são descritas por, por exemplo, Treuter et ai., Molec. Gen. Genet. 240:113 (1993); Content et al., "Expression and preliminary delection analysis of the 42 kDa 2-5A synthetase induced by human interferon", em Biological Interferon Systems, Proceedings of ISIR-TNO Meeting on Interferon Systems, Cantell (ed.), páginas 65-72 (Nijhoff 1987); Herschman, "the EGF Receptor", em Control of Animal Cell Proliferation 1, Boynton et al., (eds.) páginas 169-199 (Academic Press 1985); Coumailleau et al., J. Biol. Chem. 270:29270 (1995); Fukunaga et al., J. Biol. Chem. 270:25291 (1995); Yamaguchi et al., Biochem. Pharmacol. 50:1295 (1995); e Meisel et al., Plant Molec, Biol. 30:1 (1996) .

Substituições de aminoácido múltiplas podem ser feitas e testadas utilizando métodos conhecidos de mutagénese e rastreio, tais como agueles revelados por Reidhaar-Olson e Sauer Science 241:53 (1988)) ou Bowie e Sauer (Proc. Nat'l Acad. Sei. USA 86:2152 (1989)). De maneira breve, estes autores revelam métodos para aleatorizar simultaneamente duas ou mais posições num polipéptido, seleccionar para polipéptido funcional, e então sequenciar os polipéptidos mutagenizados para determinar o espectro de substituições permissíveis em cada posição. Outros métodos que podem ser utilizados incluem apresentação em fago (por exemplo, Lowman et al., Biochem. 30:10832 (1991), Ladner et al., Patente US N° 5.223.409, Huse, Publicação internacional N° WO 92/06204), e mutagénese direccionada a região (Derbyshire et ai., Gene 46:145 (1986), e Ner et al., ADN 7:127, (1988)).

Variantes das sequências de polipéptido e nucleótido de zcytorl71ig reveladas podem também ser geradas através de rearranjo de ADN como foi revelado por Stemmer, Nature 370:389 (1994), Stemmer, Proc. Natl Acad. Sei. USA 91:10747 81 (1994), e Publicação do WIPO N° WO 97/20078. De maneira breve, moléculas de ADN variantes são geradas por recombinação homóloga in vitro por meio de fragmentação aleatória de um ADN parental seguido por remontagem utilizando PCR, tendo como resultado mutações ponto aleatoriamente introduzidas. Esta técnica pode ser modificada utilizando uma familia de moléculas de ADN parentais, tais como variantes alélicas ou moléculas de ADN de espécies diferentes, para introduzir variabilidade adicional no processo. Selecção ou rastreio para a actividade desejada, seguido por iterações adicionais de mutagénese e ensaio trata de "evolução" rápida das sequências por meio da selecção de mutações desejáveis ao mesmo tempo que selecciona simultaneamente contra mudanças prejudiciais.

Os métodos de mutagénese como são revelados no presente documento podem ser combinados com métodos de rastreio automatizados e de alto rendimento para detectar a actividade de polipéptidos de zcytorl7 receptores mutagenizados, clonados em células hospedeiras. Ensaios preferidos com relação a isso incluem ensaios de proliferação celular e ensaios de ligação a ligando com base em biossensor, que são descritos a seguir. As moléculas de ADN mutagenizadas que codificam receptores activos ou porções dos mesmos (por exemplo, fragmentos de ligação a ligando, domínios de sinalização, e similares) podem ser recuperadas das células hospedeiras e rapidamente sequenciadas utilizando equipamento modem. Estes métodos permitem a rápida determinação da importância de resíduos de aminoácido individuais num polipéptido de interesse, e podem ser aplicados a polipéptidos de estrutura desconhecida. A presente invenção também proporciona um novo receptor de citocina multimérico em que um segmento que compreende pelo menos uma porção de um ou mais dos domínios 82 de zcytorl7, por exemplo, secretor, extracelular, transmembrana, e intracelular, é fusionado a outro polipéptido, por exemplo, um domínio extracelular de um receptor de citocina de classe I, tal como OSMRbeta e/ou WSX-1. A fusão é preferentemente feita por meio de splicing ao nível de ADN para possibilitar a expressão de moléculas quiméricas em sistemas de produção recombinantes. As moléculas resultantes são então ensaiadas para tais propriedades como solubilidade melhorada, estabilidade melhorada, semivida de depuração prolongada, níveis de expressão e secreção melhorados, e farmacodinâmica. Tal receptor de citocina multimérico pode compreender ainda resíduos de aminoácido adicionais (por exemplo, um ligante de polipéptido) entre as proteínas ou polipéptidos componentes. Um ligante de domínio pode compreender uma sequência de aminoácidos desde cerca de 3 até cerca de 20 aminoácidos de comprimento, desde cerca de 5 até 15 cerca de aminoácidos de comprimento, desde cerca de 8 até cerca de 12 aminoácidos de comprimento, e cerca de 10 aminoácidos de comprimento. Uma função de um ligante é separar as regiões de proteína activa para promover sua bioactividade independente e permitir que cada região assuma sua conformação bioactiva independente de interferência de sua estrutura de vizinhança.

Usando os métodos discutido no presente documento, um perito na especialidade pode identificar e/ou preparar uma variedade de fragmentos ou variantes do polipéptido da SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 117 e SEQ ID NO: 119 que retêm a transdução de sinal ou actividade de ligação a ligando. Por exemplo, um pode fazer um "receptor solúvel" de zcytorl7 preparando uma variedade de polipéptidos que são substancialmente homólogos ao domínio de ligação a citocina (dos resíduos 20 (Ala) a 227 (Pro) da SEQ ID NO: 111 e SEQ ID NO: 109; dos resíduos 33 (Ala) a 240 (Pro) da SEQ ID NO: 5), o domínio extracelular 83 (dos resíduos 20 (Ala) a 519 (Glu) da SEQ ID NO: 111 e SEQ ID NO: 109; dos resíduos 33 (Ala) a 532 (Glu) da SEQ ID NO: 5), ou variantes alélicos ou espécies ortólogos dos mesmos (por exemplo, veja-se SEQ ID NO: 117 e SEQ ID NO: 119 e fragmentos funcionais das mesmas como descrito no presente documento)) e retêm actividade de ligação a ligando da proteína de zcytorl7 de tipo selvagem. Além disso, receptores de zcytorl7 solúveis variantes tais como aqueles mostrados na SEQ ID NO: 113 e SEQ ID NO: 115 podem ser isolados. Tais polipéptidos podem incluir aminoácidos adicionais frdeom, por exemplo, parte ou a totalidade dos domínios transmembrana e intracelular. Tal polipéptidos pode também incluir segmentos adicionais de polipéptido como geralmente revelado no presente documento tal como marcadores, etiquetas de afinidade, e similares.

Para qualquer polipéptido de zcytorl7, incluindo variantes, receptores solúveis, e polipéptidos de fusão ou proteínas, um perito na especialidade pode facilmente gerar um sequência de polinucleótido completamente degenerada que codifica essa variante usando a informação expostas nos Quadros 1 e 2 anteriores.

Os receptores de citocina multiméricos de zcytorl7 da presente invenção, incluindo polipéptidos de comprimento completo, fragmentos biologicamente activos, e polipéptidos de fusão, podem ser produzidos em células hospedeiras modificadas por engenharia genética de acordo com técnicas convencionais. As células hospedeiras adequadas são aqueles tipos de células que podem ser transformadas ou transfectadas com ADN exógeno e crescidas em cultura, e incluem bactérias, células fúngicas, e células eucarióticas superiores cultivadas. As células eucarióticas, particularmente células cultivadas de organismos multicelulares, são preferidas. Técnicas para manipular moléculas de ADN clonadas e introdução de ADN exógeno numa variedade de células hospedeiras são reveladas por Sambrook 84 et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, e Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley e Sons, Inc., NY, 1987. A presente invenção também proporciona um vector de expressão que compreende uma molécula de ADN isolada e purificada incluindo os seguintes elementos ligados operativamente: um primeiro promotor de transcrição, um primeiro segmento de ADN que codifica um polipéptido que tem pelo menos 90 por cento de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 111, e um primeiro terminador de transcrição; e um segundo promotor de transcrição, um segundo segmento de ADN que codifica pelo menos uma porção de um receptor de citocina de classe I, e um segundo terminador de transcrição; em que o polipéptido e o receptor de citocina de classe I formam um receptor de citocina multimérico; e em que o receptor de citocina multimérico liga a pelo menos uma porção da SEQ ID NO: 2. A molécula de ADN pode compreender ainda uma sequência de sinal secretora ligada operativamente ao primeiro e segundo segmentos de ADN. O receptor de citocina multimérico pode ser solúvel e/ou pode compreender ainda uma etiqueta de afinidade como descrita no presente documento. Além disso, o receptor de citocina multimérico pode antagonizar uma actividade da SEQ ID NO: 2 como descrita no presente documento. A pelo menos uma porção de um receptor de citocina de classe I pode compreender porções da SEQ ID NO: 7 e/ou SEQ ID NO: 9, tal como, por exemplo, do resíduo de aminoácido 28 ao resíduo de aminoácido 429 da SEQ ID NO: 7, do resíduo de aminoácido 35 ao resíduo de aminoácido 137 da SEQ ID NO: 7, do resíduo de aminoácido 240 ao resíduo de aminoácido 342 da SEQ ID NO: 7, do resíduo de aminoácido 348 ao resíduo de aminoácido 429 da SEQ ID NO: 7, do resíduo de aminoácido 28 ao resíduo de aminoácido 739 da SEQ ID NO: 7, do resíduo de aminoácido 28 ao resíduo de aminoácido 761 da SEQ ID NO: 7, 85 do resíduo de aminoácido 762 ao resíduo de aminoácido 979 da SEQ ID NO: 7, ou combinações dos mesmos. A presente invenção também proporciona uma célula cultivada que contém o vector de expressão descrito anteriormente.

Em geral, uma sequência de ADN, por exemplo, que codifica um polipéptido de zcytorl7 pode ser ligada operativamente a outros elementos genéticos requeridos para a sua expressão, incluindo geralmente um promotor e terminador de transcrição, dentro de um vector de expressão. 0 vector conterá também comummente um ou mais marcadores seleccionáveis e uma ou mais origens de replicação, embora os peritos na especialidade reconhecessem que dentro de certos sistemas, marcadores seleccionáveis podem ser proporcionados em vectores separados, e replicação do ADN exógeno pode ser proporcionada pela integração no genoma da célula hospedeira. A selecção de promotores, terminadores, marcadores seleccionáveis, os vectores e outros elementos é um assunto de desenho de rotina dentro do nível de um perito ordinário na especialidade. Muitos de tais elementos são descritos na literatura e estão disponíveis através de fornecedores comerciais.

Para direccionar, por exemplo, um polipéptido de zcytorl7 na via de secreção de uma célula hospedeira, uma sequência sinal de secreção (também conhecida como uma sequência líder, sequência prepro ou sequência pre) é proporcionada no vector de expressão. A sequência sinal de secreção pode ser essa de zcytorl7, ou pode ser derivado de outro segregadas proteína (por exemplo, t-PA) ou sintetizados de novo. A sequência de sinal secretora é ligada operativamente à sequência de ADN de zcytorl7, isto é, as duas sequências são unidas na grelha de leitura correcta e posicionadas para direccionar o polipéptido sintetizado recentemente na via de secreção da célula hospedeira. As sequências sinal de secreção são comummente 86 posicionadas 5' à sequência de ADN que codifica o polipéptido de interesse, embora certas sequências sinal de secreção possam ser posicionadas em qualquer luqar na sequência de ADN de interesse (veja-se, por exemplo, Welch et al., Patente US N° 5.037.743; Holland et al., Patente US N° 5.143.830).

Alternativamente, a sequência de sinal secretora contida nos polipéptidos da presente invenção é usada para direccionar outros polipéptidos na via de secreção. A presente invenção trata de tais polipéptidos de fusão. Um polipéptido de fusão sinal pode ser feito em que uma sequência de sinal secretora derivada do aminoácido 1 (Met) ao aminoácido 19 (Ala) da SEQ ID NO: 111 e SEQ ID NO: 109, ou em que uma sequência de sinal secretora derivada do aminoácido 1 (Met) ao aminoácido 32 (Ala) da SEQ ID NO: 5, ou do aminoácido 1 (Met) ao aminoácido 45 (Ala) da SEQ ID NO: 117 ou SEQ ID NO: 119), ou do aminoácido 28 (Met) ao residuo 45 (Ala) da SEQ ID NO: 117 ou SEQ ID NO: 119), é ligada operativamente a outro polipéptido usando métodos conhecidos na técnica e revelados no presente documento. A sequência de sinal secretora contida nos polipéptidos de fusão da presente invenção é preferentemente A sequência sinal de secreção contida nos polipéptidos de fusão da presente invenção é preferentemente fusionada amino-terminalmente a um péptido adicional para direccionar o péptido adicional na via de secreção. Tais construções têm numerosas aplicações conhecidas na técnica. Por exemplo, estas novas construções de fusão de sequência sinal de secreção podem direccionar a secreção de um componente activo de uma proteína normalmente não segregada. Tais fusões podem ser utilizadas in vivo ou in vitro para direccionar péptidos através da via de secreção. A presente invenção também proporciona uma célula cultivada que compreende um primeiro vector de expressão que compreende uma molécula de ADN que contém os seguintes 87 elementos ligados operativamente: um promotor de transcrição, um segmento de ADN que codifica um polipéptido que tem pelo menos 90 por cento de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 111, e um terminador de transcrição; e um segundo vector de expressão que compreende um promotor de transcrição, um segmento de ADN que codifica pelo menos uma porção de um receptor de citocina de classe I, e um terminador de transcrição; em que o polipéptido e o receptor de citocina de classe I formam um receptor de citocina multimérico. O primeiro e segundo vectores de expressão podem compreender ainda uma sequência de sinal secretora ligada operativamente ao primeiro e segundo segmentos de ADN. O receptor de citocina multimérico pode ser solúvel, pode ser um heterodimero, e/ou pode compreender ainda uma etiqueta de afinidade como descrita no presente documento. Além disso, o receptor de citocina multimérico pode antagonizar uma actividade da SEQ ID NO: 2 como descrita no presente documento. A pelo menos uma porção de um receptor de citocina de classe I pode compreender porções da SEQ ID NO: 7 e/ou SEQ ID NO: 9, tal como, por exemplo, do resíduo de aminoácido 28 ao resíduo de aminoácido 429 da SEQ ID NO: 7, do resíduo de aminoácido 35 ao resíduo de aminoácido 137 da SEQ ID NO: 7, do resíduo de aminoácido 240 ao resíduo de aminoácido 342 da SEQ ID NO: 7, do resíduo de aminoácido 348 ao resíduo de aminoácido 429 da SEQ ID NO: 7, do resíduo de aminoácido 28 ao resíduo de aminoácido 739 da SEQ ID NO: 7, do resíduo de aminoácido 28 ao resíduo de aminoácido 761 da SEQ ID NO: 7, do resíduo de aminoácido 762 ao resíduo de aminoácido 979 da SEQ ID NO: 7, ou combinações dos mesmos. Células de mamíferos cultivadas são hospedeiros adequados dentro da presente invenção. Os métodos para introduzir ADN exógeno em células de mamíferos hospedeiras incluem transfecção mediada por fosfato de cálcio (Wigler et al., Cell 14:725, 1978; Corsaro e Pearson, Somatic Cell 88

Genetics 7:603, 1981: Graham e Van der Eb, Virology 52:456, 1973), electroporação (Neumann et ai., EMBO J. 1:841-5, 1982), transfecção mediada por DEAE-dextrano (Ausubel et al., ibid.), e transfecção mediada por lipossoma (Haw-ley-Nelson et al., Focus 15:73, 1993; Ciccarone et ai., Focus 15:80, 1993, e vectores virais (Miller e Rosman, Bio-Técnicas 7:980-90, 1989; Wang e Finer, Nature Med. 2:714-6, 1996). A produção de polipéptidos recombinantes em células de mamíferos cultivadas é revelada, por exemplo, por Levinson et al., Patente US N° 4.713.339; Hagen et al., Patente US N° 4.784.950; Palmiter et al., Patente US N° 4.579.821; e Ringold, Patente US N° 4.656.134. As células de mamíferos cultivadas adeguadas incluem as linhas de células COS-1 (N° de ATCC CRL 1650), COS-7 (N° de ATCC CRL 1651), BHK (N° de ATCC CRL 1632), BHK 570 (N° de ATCC CRL 10314), 293 (N° de ATCC CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977) e ovário de hamster chinês (por exemplo, CHO-K1; N° de ATCC CCL 61) . As linhas de células adequadas adicionais são conhecidas na técnica e disponíveis de centros depositários públicos tais como a Colecção Americana de Culturas Celulares, Rockville, Mariland. Em geral, promotores de transcrição fortes são preferidos, tais como promotores de SV-40 ou citomegalovírus. Veja-se, por exemplo, a Patente US N° 4.956.288. Outros promotores adequados incluem aqueles de genes de metalotioneína (Patentes US N° 4.579.821 e 4.601.978) e o promotor tardio principal de adenovírus. A selecção de fármaco é utilizada geralmente para seleccionar células de mamíferos cultivadas em que ADN estranho foi inserido. Tais células são comummente denominadas como "transfectantes". As células que foram cultivadas na presença do agente selectivo e são capazes de passar o gene de interesse à sua progénie são denominadas como "transfectantes estáveis". Um marcador seleccionável preferido é um gene que codifica resistência ao antibiótico 89 neomicina. A selecção é levada a cabo na presença de um fármaco do tipo neomicina, tal como G-418 ou similares. Os sistemas de selecção podem também ser utilizados para aumentar o nivel de expressão do gene de interesse, um processo denominado como "amplificação". A amplificação é levada a cabo pela cultura de transfectantes na presença de um nivel baixo do agente selectivo e aumentando então a quantidade de agente selectivo para seleccionar células que produzem níveis altos dos produtos dos genes introduzidos. Um marcador seleccionável amplificável preferido é dihidrofolato reductase, que confere resistência a metotrexato. Outros genes de resistência a fármaco (por exemplo, resistência a higromicina, resistência a múltiplos fármacos, puromicina acetiltransferase) podem também ser utilizados. Marcadores alternativos que introduzem um fenótipo alterado, tal como proteína fluorescente verde, ou proteínas de superfície celular tais como CD4, CD8, MHC de Classe I, fosfatase alcalina placentária podem ser utilizados para separar células transfectadas de células não transfectadas por tais meios como tecnologia de separação FACS ou pérola magnética.

Outras células eucarióticas superiores podem também ser utilizadas como hospedeiros, incluindo células vegetais, células de insectos e células de aves. A utilização de Agrobacterium rhizogenes como um vector para expressar genes em células vegetais foi revisto por Sinkar et ai., J. Biosci. (Bangalore) 11:47-58, 1987. A transformação de células de insectos e produção de polipéptidos estranhos nas mesmas é revelada por Guarino et al., Patente US N° 5.162.222 e publicação WIPO N° WO 94/06463. As células de insectos podem ser infectadas com baculovírus recombinante, comummente derivado de vírus da poliedrose nuclear de Autographa californica (Ac-NPV). Veja-se, King, L.A. e Possee. R.D., The Baculovírus Expression System: A Laboratory Guide, London, Chapman & 90

Hall; OReilly, D.R. et al.; Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, Nova Iorque, Oxford University Press., 1994; e Richardson, C.D., Ed., Baculovirus Expression Protocols. Methods in Molecular Biology, Totowa, NJ, Humana Press, 1995. O segundo método de preparação baculovirus recombinante utiliza um sistema à base de transposon descrito por Luckow (Luckow, V.A, et al., J Virol 67:4566-79, 1993). Este sistema é vendido no kit Bac-to-Bac™ (Life Technologies, Rockville, MD). Este sistema utiliza um vector de transferência, pFastBacl™ (Life Technologies) que contém um transposon Tn7 para mover o ADN que codifica o polipéptido de zcytorl7 num genoma de baculovirus mantido em E. coli como um grande plasmideo chamado um "bacmídeo". Veja-se, Hill-Perkins, M.S. e Possee, R.D., J Gen Virol 71: 971-6, 1990; Bonning, B.C. et al., J Gen Virol 75:1551-6, 1994; e, Chazenbalqu, G.D., e Rapoport, B., J Biol Chem 270:1543-9, 1995. Além disso, os vectores de transferência podem incluir uma fusão dentro da grelha com ADN que codifica uma etiqueta de epítopo na terminação C ou N do polipéptido de zcytorl71ig expresso, por exemplo, uma etiqueta de epítopo Glu-Glu (Grussenmeyer, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 82:7952-4, 1985). Usando uma técnica conhecida na técnica, u um vector de transferência que contém zcytorl71ig é transformado em E. Coli, e rastreado para baemídeos que contêm um gene lacZ interrompido indicativo baculovirus de recombinante. O ADN de bacmídeo que contém o genoma de baculovirus recombinante é isolado, utilizando técnicas comuns, e utilizado para transfectar células de Spodoptera frugiperda, por exemplo, células Sf9. O vírus recombinante que expressa zcytorl71ig é produzido subsequentemente. Reservas virais recombinantes são feitas por meio de métodos comummente utilizados na técnica. O vírus recombinante é utilizado para infectar células hospedeiras, tipicamente uma linha celular derivada do lagarta-do-cartucho-do-milho, Spodoptera frugiperda. Veja- 91 se, em geral, Glick e Pasternak, Molecular Biotechnology: Principies and Applications of Recombinant DNA, ASM Press, Washington, D.C., 1994. Outra linha celular adeguada é a linha celular High FiveO™ (Invitrogen) derivada de Trichoplusia ni (Patente US N° 5.300.435). Meios livres de soro comercialmente disponíveis são usados para crescer e manter as células. Meios adeguados são Sf900 II™ (Life Technologies) ou ESF 921™ (Expression Systems) para as células Sf9; e Ex-cellO405™ (JRH Biosciences, Lenexa, KS) ou Express FiveO™ (Life Technologies) para as células T. ni. Procedimentos usados são geralmente descritos em manuais de laboratório disponíveis (King, L. A. e Possee, R.D., ibid.; 0'Reilly, D.R. et al.r ibid.; Richardson, C. D., ibid.). A purificação subseguente do polipéptido de zcytorl7 a partir do sobrenadante pode ser conseguida usando métodos descritos no presente documento.

Também podem ser utilizados células fúngicas, incluindo células de levedura dentro da presente invenção. As espécies de levedura com um interesse particular a este respeito incluem Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris e Pichia methanolica. Revelam-se métodos para transformar células de S. cerevisiae com ADN exógeno e produzir polipéptidos recombinantes a partir das mesmas, por exemplo por Kawasaki, Patente US N° 4.599.311; Kawasaki et al., Patente US N° 4.931.373; Brake, Patente US N° 4.870 .008; Welch et al., Patente US N° 5.037.743; e Murmy et al., Patente US N° 4.845.075. As células transformadas são seleccionadas pelo fenótipo determinado pelo marcador seleccionável, comummente resistência a fármacos ou a capacidade de crescer na ausência de um nutriente particular (por exemplo, leucina). Um sistema de vector preferido para utilização em Saccharomyces cerevisiae é o sistema de vector POTl revelado por Kawasaki et al. (Patente US N° 4.931.373), que permite seleccionar as células transformadas por crescimento em meio que contém 92 glicose. Os promotores e terminadores adequados para utilização em levedura incluem os de genes de enzimas glicolíticas (veja-se, por exemplo, Kawasaki, Patente US N° 4.599.311; Kingsman et ai., Patente US N° 4.615.974; e Bitter, Patente US N° 4.977.092) e genes de álcool desidrogenase. Vejam-se também as Patentes US N° 4.990.446; 5.063.154; 5.139.936 e 4.661.454. Na técnica conhecem-se sistemas de transformação para outras leveduras, incluindo Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia guillermondii e Candida maltosa. Veja-se, por exemplo, Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132: 3459-65, 1986 e Cregg, Patente US N° 4.882.279. Podem utilizar-se células de Aspergillus de acordo com os métodos de McKnight et al., Patente US N° 4.935.349. Revelam-se métodos para transformar Acremonitum chrysogenum por Sumino et al., Patente US N° 5.162.228. Revelam-se métodos para transformar Neurospora por Lambowitz, Patente US N° 4.486.533. A utilização de Pichia methanolica como hospedeiro para a produção de proteínas recombinantes é revelada nas Publicações WIPO N° WO 97/17450, WO 97/17451, WO 98/02536 e WO 98/02565. As moléculas de ADN para utilização na transformação de P. methanolica comummente serão preparadas como plasmídeos circulares, de cadeia dupla, que são alinhadas preferentemente antes da transformação. Para a produção de polipéptidos em P. methanolica, prefere-se que o promotor e terminador no plasmídeo sejam esses de um gene de P. methanolica, tal como um gene de utilização de álcool de P. methanolica (AUG1 ou AUG2) . Outros promotores úteis incluem esses da dihidroxiacetona sintase (DHAS), formiato desidrogenase (FMD), e catalase (CAT). Para facilitar a integração do ADN no cromossoma do hospedeiro, prefere-se ter o segmento de expressão inteiro do plasmideo flanqueado 93 nas duas extremidades por sequências de ADN do hospedeiro. Um marcador de selecção preferido para utilização em Pichia methanolica é um gene ADE2 de P. methanolica, que codifica a fosforribosil-5-aminoimidazol carboxilase (AIRC; EC 4.1. 1.21), que permite que as células hospedeiras ade2 cresçam na ausência de adenina. Para os processos industriais em larga escala em que é desejável minimizar a utilização de metanol, prefere-se utilizar células hospedeiras de proteínas segregadas, preferem-se células hospedeiras deficientes em genes de proteases vacuolares (PEP4 e PRB1) . Utiliza-se electroporação para facilitar a introdução de um plasmídeo que contém ADN que codifica um polipéptido de interesse em células de P. methanolica. Prefere-se transformar as células de P. methanolica por electroporação utilizando um campo eléctrico de pulsos, que se reduz exponencialmente, que tem uma intensidade de campo de 2,5 a 4,5 kV/cm, preferentemente de aproximadamente 3,75 kV/cm e uma constante de tempo (t) de 1 a 40 milissegundos, mais preferentemente de aproximadamente 20 milissegundos. São também células hospedeiras úteis, células hospedeiras procariotas, incluindo estirpes da bactéria Escherichia coli, Bacillus e outros géneros dentro da presente invenção. Neste campo são bem conhecidas técnicas para transformar estes hospedeiros e expressar sequências de ADN estranhas clonadas no seu interior (veja-se, por exemplo, Sambrook et al., ibid.) . Quando é expresso um polipéptido zcytorl71ig em bactérias tais como E. coli, o polipéptido pode ficar retido no citoplasma, tipicamente como grânulos insolúveis, ou pode dirigir-se ao espaço periplasmático por uma sequência de secreção bacteriana. No primeiro caso, as células são lisadas, e os grânulos são recuperados e desnaturados utilizando, por exemplo, isotiocianato de guanidina ou ureia. O polipéptido desnaturado depois pode ser redobrado e dimerizado por meio da diluição do desnaturante, tal como por diálise contra 94 uma solução de ureia e e uma combinação de glutatião reduzido e oxidado, seguido de diálise contra uma solução salina tamponada. No último caso, o polipéptido pode ser recuperado do espaço periplasmático numa forma solúvel e funcional rompendo as células (por exemplo, por sonicação ou choque osmótico) para libertar o conteúdo do espaço periplasmático e recuperar a proteína, evitando desta maneira a necessidade de desnaturação e redobragem.

As células hospedeiras transformadas ou transfectadas são cultivadas de acordo com os procedimentos convencionais num meio de cultura que contém nutrientes e outros componentes necessários para o crescimento das células hospedeiras escolhidas. Na técnica conhece-se uma variedade de meios adequados, incluindo meios definidos e meios complexos, e geralmente incluem uma fonte de carbono, uma fonte de azoto, aminoácidos essenciais, vitaminas e minerais. Os meios também podem conter componentes tais como factores de crescimento ou soro, quando for necessário. 0 meio de crescimento geralmente seleccionará as células que contêm o ADN adicionado exogenamente, por exemplo, por selecção com fármacos ou deficiência num nutriente essencial que é complementado pelo marcador de selecção que possui o vector de expressão ou co-transfectado na célula hospedeira. As células de P. methanolica são cultivadas num meio que compreende fontes de carbono adequadas, azoto e nutrientes de oligoelementos a uma temperatura de aproximadamente 25 °C a 35 °C. As culturas líquidas são proporcionadas com suficiente aeração por meios convencionais, tais como agitação de pequenos balões ou pulverização de fermentadores. Um meio de cultura preferido para P. methanolica é YEPD (2% de D-glicose, 2% de Bacto™ Peptona (Difco Laboratories, Detroit, MI), 1% de extracto de levedura Bacto™ (Difco Laboratories), 0,004% de adenina e 0,006% de L-leucina). um

Dentro de um aspecto da presente invenção, 95 receptor de zcytorl7 de citocina multimérico (incluindo domínios transmembrana e intracelular) é produzido por uma célula cultivada, e a célula é usada para rastrear por ligandos para o receptor, incluindo o ligando natural (SEQ ID NO: 2), bem como agonistas e antagonistas do ligando natural. Para resumir esta abordagem, um ADNc ou gene que codifica o receptor é combinado com outros elementos genéticos requeridos para sua expressão (por exemplo, um promotor de transcrição), e o vector de expressão resultante é inserido em uma célula hospedeira. Células que expressam o ADN e produzem receptor funcional são seleccionadas e usadas dentro de uma variedade de sistemas de rastreio. Células de mamífero adequadas para uso na expressão dos novos receptores da presente invenção e transdução um sinal mediado por receptor incluem células que expressa uma subunidade β, tal como gpl30, e células que co-expressam receptor de gpl30 e LIF (Gearing et al., EMBO J. 10:2839-2848, 1991; Gearing et al., Patente U.S. n° 5.284.755). Com relação a isso é geralmente preferido utilizar uma célula é que responsiva a outras citocinas que ligam a receptores na mesma subfamília, tal como IL-6 ou LIF, porque tais células conterão a(s) via(s) transdução de sinal necessárias. Células preferidas deste tipo incluem células BaF3 (Palacios e Steinmetz, Cell 41: 727-734, 1985; Mathey-Prevot et al., Mol. Cell. Biol. 6: 4133-4135, 1986), a linha celular TF-1 humana (ATCC número CRL-2003) e a linha celular DA-1 (Branch et al., Blood 69: 1782, 1987; Broudy et al., Blood 75:1622-1626, 1990). Na alternativa, células hospedeiras adequadas podem ser modificadas por engenharia para produzir uma subunidade β ou outro componente celular necessários para resposta celular desejada. Por exemplo, a linha celular murina BaF3 (Palacios e Steinmetz, Célula 41:727-734, 1985; Mathey-Prevot et al., Mol. Cell. Biol. 6: 4133-4135, 1986), uma linha celular rim de hamster bebé 96 (ΒΗΚ), ou a linha celular CTLL-2 (ATCC TIB-214) pode ser transfectada para expressar a subunidade gpl30 de ratinho, ou receptor de gpl30 e LIF de ratinho, além de zcytorl7. É geralmente preferido utilizar uma célula hospedeira e receptor (es) da mesma espécie, no entanto esta abordagem permite que linhagens de células sejam modificadas por engenharia para expressar múltiplas subunidades de receptor de qualquer espécie, deste modo superando limitações potenciais que surgem de especificidade de espécie. Em alternativa, homólogos de espécie do ADNc de receptor humanos podem ser clonados e usados dentro linhagens de células da mesma espécie, tal como um ADNc de ratinho na celular linha BaF3. Linhas de células que são dependentes de um factor de crescimento hematopoiético, tal como IL-3, pode assim ser modificada por engenharia para se tornar dependente de um ligando de zcytorl7 ou anticorpo anti-zcytor17. Células que expressam zcytorl7 funcional são usadas dentro de ensaios de rastreio. Uma variedade de ensaios adequados são conhecidos na técnica. Estes ensaios são com base na detecção de uma resposta biológica na célula alvo. Tal ensaio é um ensaio de proliferação celular. Células são cultivadas na presença ou ausência de um composto de teste, e a proliferação celular é detectada por, por exemplo, medição da incorporação de timidina tritiada ou por ensaio colorimétrico com base na redução ou quebra metabólica de Alymar Blue™ (AccuMed, Chicago, IL) ou brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenilo tetrazolio (MTT) (Mosman, J. Immunol. Met. 65:55-63, 1983) . Um formato de ensaio alternativo usa células que são adicionalmente modificadas por engenharia para expressar um gene repórter. 0 gene repórter é ligado a um elemento promotor que é responsivo à via ligada a receptor, e o ensaio detecta a activação de transcrição do gene repórter. Um elemento promotor preferido com relação a isso é um elemento de resposta a 97 soro, STAT ou SRE (veja-se, por exemplo, Shaw et al., Cell 56:563-572, 1989). Tal gene repórter preferido é um gene de luciferase (de Wet et al., Mol. Cell. Biol. 7: 725, 1987). Expressão do gene de luciferase é detectada por meio de luminescência usando métodos conhecidos na técnica (por exemplo, Baumgartner et al., J. Biol. Chem. 269:19094-29101, 1994; Schenborn e Goiffin, Promega Notes 41:11, 1993) . Kits de ensaio de luciferase são comercialmente disponíveis de, por exemplo, Promega Corp., Madison, WI. Linhas de células alvo deste tipo pode ser usados para rastrear bibliotecas de produtos químicos, meios de cultura condicionados por células, caldos fúngicos, amostras de solo, amostras de água, e similares. Por exemplo, um banco de amostras de meio condicionado de célula ou tecido pode ser ensaiado numa célula alvo para identificar células que produzem ligando. Células positivas são então usadas para produzir uma biblioteca de ADNc num vector de expressão de célula de mamífero, que é dividido em agrupamentos, transfectados em células hospedeiras, e expresso. Amostras de meios das células transfectadas são então ensaiadas, com subsequente divisão de agrupamentos, retransfecção, subcultivo, e re-ensaio de células positivas para isolar uma linha celular clonal que expressa o ligando. Amostras de meios condicionados por rim, fígado, baço, timo, outros tecidos linfóides, ou células T são preferidas fontes de ligando para uso em procedimentos de rastreio. A presente invenção também proporciona um método de produção de um receptor de citocina multimérico. O método inclui cultivar uma célula como descrita no presente documento, e isolar o receptor de citocina multimérico produzido pela célula. A presente invenção também proporciona um método para detectar um ligando de receptor de citocina múltiplo numa amostra de teste. O método inclui colocar em contacto a amostra de teste com um receptor de citocina multimérico 98 que compreende um polipéptido que compreende do resíduo de aminoácido 20 ao resíduo de aminoácido 227 da SEQ ID NO: 111 ou SEQ ID NO: 109 (do resíduo de aminoácido 33 ao resíduo de aminoácido 240 da SEQ ID NO: 5), e pelo menos uma porção de pelo menos um receptor de citocina de classe I; e detectar a ligação do receptor de citocina multimérico ao ligando na amostra de teste. A pelo menos uma porção de pelo menos um receptor de citocina de classe I pode incluir, por exemplo, uma porção da SEQ ID NO: 9 e/ou uma porção da SEQ ID NO: 7, tal como, por exemplo, do resíduo de aminoácido 28 ao resíduo de aminoácido 429 da SEQ ID NO: 7, do resíduo de aminoácido 35 ao resíduo de aminoácido 137 da SEQ ID NO: 7, do resíduo de aminoácido 240 ao resíduo de aminoácido 342 da SEQ ID NO: 7, do resíduo de aminoácido 348 ao resíduo de aminoácido 429 da SEQ ID NO: 7, do resíduo de aminoácido 28 ao resíduo de aminoácido 739 da SEQ ID NO: 7, e/ou combinações dos mesmos.

Um ligando natural para um receptor de zcytorl7 de citocina multimérico da presente invenção pode também ser identificado por meio de mutagénese de uma linha celular dependente de citocina que expressam zcytorl7 e cultivar a mesma sob condições que seleccionam crescimento autócrino. Veja-se publicação do WIPO WO 95/21930. Dentro de um procedimento típico, células que expressam zcytorl7 são mutagenizadas, tal como com EMS. As células são então permitidas que se recuperem na presença da citocina requerida, então transferidas a um meio de cultura que não possui a citocina. As células que sobrevivem são rastreadas para a produção de um ligando para receptor de zcytorl7 de citocina multimérico, tal como pela adição de polipéptido de receptor solúvel que compreende o domínio de ligação a citocina de zcytorl7 e pelo menos uma porção de um receptor de citocina de classe I, tal como o domínio de ligação a citocina de OSMRbeta (SEQ ID NO: 7) e/ou WSX-1 (SEQ ID NO: 9), como descrita no presente documento ao meio de cultura 99 para competir contra o ligando ou por meio de ensaio de meios condicionados em células de tipo selvagem em comparação com células transfectadas que expressam o receptor de zcytorl7 de citocina multimérico. Linhas de células preferidas para uso dentro deste método incluem células que são transfectadas para expressar gpl30 ou gpl30 em combinação com receptor LIF. Tais linhas de células hospedeiras incluem células CTLL-2 transfectadass (Gillis e Smith, Nature 268:154-156, 1977) e células BaF3 transfectadas.

Além disso, um método de captura de secreção que utiliza receptor de citocina multimérico solúvel zcytorl7 pode ser usado para isolar um ligando de zcytorl7, tal como SEQ ID NO: 2 (Aldrich, et al, Cell 87: 1161-1169, 1996). Uma biblioteca de expressão de ADNc preparada a partir uma fonte conhecida ou suspeita é transfectada em células COS-7. A biblioteca de vector de ADNc geralmente tem uma origem SV40 para amplificação em células COS-7, e um promotor CMV para alta expressão. As células COS-7 transfectadas são crescidas numa monocamada e então fixas e permeabilizadas. Receptor de citocina multimérico solúvel zcytorl7 etiquetado ou marcado com biotina, descrito no presente documento, é então colocado em contacto com a camada de célula e permitido que se ligue as células na monocamada que expressam uma molécula anti-complementar, isto é, um ligando de zcytorl7. Uma célula que expressa um ligando assim será ligado com moléculas de receptor. Um anticorpo anti-etiqueta (anti-Ig para fusões de Ig, M2 ou anti-FLAG para fusões etiquetadas com FLAG, estreptavidina, etiqueta anti-Glu-Glu, e similares) que é conjugado com peroxidase de rábano (HRP) é usado para visualizar estas células a que o receptor de citocina multimérico solúvel zcytorl7 etiquetado ou marcado com biotina se ligou. A HRP catalisa deposição de um reagente de tiramida, por exemplo, tiramida-FITC. Um kit comercialmente disponível pode ser 100 usado para esta detecção (por exemplo, Kit Renaissance TSA-Direct™; NEN Life Science Products, Boston, MA) . Células que expressam ligando de receptor de citocina multimérico zcytorl7 serão identificados sob microscopia de fluorescência como células verdes e colhidos para subsequente clonagem do ligando usando procedimentos para resgate de plasmideo como observado em Aldrich, et al, supra., seguido por ciclos subsequente de ensaio de captura de secreção, ou rastreio convencional de agrupamentos de biblioteca de ADNc, até que clones individuais são identificados.

Como um complexo de receptor multimérico, a actividade de polipéptido de zcytorl7 pode medir-se por um microfisiômetro biossensor à base de silício que mede a velocidade de acidificação extracelular ou a excreção de protões associada à ligação ao receptor e as posteriores respostas celulares fisiológicas. Um dispositivo exemplar é o Microfisiômetro Cytosensor™ fabricado por Molecular Devices, Sunnyvale, CA. Pode medir-se uma variedade de respostas celulares, tais como a proliferação celular, o transporte iónico, a produção de energia, respostas inflamatórias, actividade reguladora e de receptores e similares por este método. Veja-se, por exemplo, McConnell, H.M. et al., Science 257:1906-1912, 1992; Pitchford, S. et al., Met. Enzymol. 228:84-108, 1997; Arimilli, S. et al., J. Immunol. Met. 212:49-59, 1998; Van Liefde, I. Et al., Eur. J. Pharmacol. 346:87-95, 1998. O microfisiômetro pode ser usado para ensaiar células eucariótica, procariótica, aderente ou não aderente. Pela medição de mudanças de acidificação extracelular em meio celular ao longo do tempo, o microfisiômetro directamente mede respostas celulares a vários estímulos, incluindo agonistas, ligandos, ou antagonistas do polipéptido de zcytorl7. Preferentemente, o microfisiômetro é usado para medir respostas de uma célula eucariótica que expressam Zcytorl7, 101 em comparação com um célula eucariótica de controlo que não expressa polipéptido de zcytorl7. Células eucarióticas que expressam Zcytorl7 compreendem células em que zcytorl7 foi transfectado ou infectado via vector adenovirus, e similares, como descrito no presente documento, criando uma célula é que responsiva a estímulos que modulam zcytorl7, ou são células que expressam naturalmente zcytorl7, tal como células que expressam zcytorl7 derivadas de tecido linfóide, de baço, de timo ou PBLs. Diferenças, medidas por um aumento ou diminuição em acidificação extracelular, na resposta de células que expressam zcytorl7, com relação a um controlo, são uma medida directa de respostas celulares moduladas por zcytorl7. Além disso, tal respostas moduladas por zcytorl7 podem ser ensaiadas sob uma variedade de estímulos. Também, usando o microfisiômetro, é proporcionado um método de identificar agonistas e antagonistas de receptor de zcytorl7 de citocina multimérico, que compreende proporcionar células que expressam um receptor de zcytorl7 de citocina multimérico, cultivar uma primeira porção das células na ausência de um composto de teste, cultivar uma segunda porção das células na presença de um composto de teste, e detectar um aumento ou uma diminuição numa resposta celular da segunda porção das células em comparação com a primeira porção das células. Antagonistas e agonistas, incluindo o ligando natural para receptor de zcytorl7 de citocina multimérico, pode ser rapidamente identificado usando este método.

Um receptor de zcytorl7 de citocina multimérico pode ser expresso como uma fusão com uma região constante de cadeia pesada de imunoglobulina, tipicamente um fragmento de Fc, que contém dois domínios de região constante e não possui a região variável. Métodos para preparar tais fusões são revelados nas Patentes U.S. n° 5.155.027 e 5.567.584. Tais fusões são tipicamente segregadas como moléculas multiméricas em que as porções Fc são ligadas por 102 dissulfureto entre si e dois polipéptidos não Ig são ordenados em proximidade imediata um do outro. Fusões deste tipo podem ser usadas, por exemplo, para dimerização, aumentar a estabilidade e semivida in vivo, para purificar por afinidade o ligando, como ferramenta in vitro de ensaio ou antagonista. Para uso em ensaios, as quimeras são ligada a um suporte via a região Fc e usadas num formato ELISA.

Ensaios adicionais proporcionados pela presente invenção incluem a utilização de polipéptidos receptores híbridos. Estes polipéptidos híbridos estão em duas classes gerais. Dentro da primeira classe, o domínio intracelular de zcytorl7, que compreende aproximadamente dos resíduos 544 (Lys) a 732 (Vai) da SEQ ID NO: 111, dos resíduos 544 (Lys) a 649 (Ile) da SEQ ID NO: 109, ou dos resíduos 557 (Lys) a 662 (Ile) da SEQ ID NO: 5, ou dos resíduos 551 (Lys) a 662 (Cys) da SEQ ID NO: 117 é unido ao domínio de ligação a ligando de um segundo receptor. É preferido que o segundo receptor ser um receptor de citocina hematopoiético, tal como, por exemplo, receptor mpl (Souyri et ai., Célula 63:1137-1147, 1990). O receptor híbrido compreenderá ainda um domínio transmembrana, que pode ser derivado de receptor. Uma construção de ADN que codifica o receptor híbrido é então inserida numa célula hospedeira. Células que expressam o receptor híbrido são cultivadas na presença de um ligando para o domínio de ligação e ensaiadas para uma resposta. Este sistema proporciona um meio para analisar transdução de sinal mediada por zcytorl7 enquanto usar ligandos facilmente disponíveis. Este sistema pode também ser usado para determinar se linhas de células particulares são capazes de responder a sinais transduzidos por zcytorl7. Uma segunda classe de polipéptidos receptores híbridos compreende o domínio extracelular (ligação a ligando) (aproximadamente dos resíduos 20 (Ala) a 519 (Glu) da SEQ ID NO: 111 e SEQ ID NO: 109; aproximadamente dos resíduos 33 (Ala) a 532 (Glu) da SEQ ID NO: 5) ou domínio 103 de ligação a citocina de zcytorl7 (aproximadamente dos resíduos 20 (Ala) a 227 (Pro) da SEQ ID NO: 111 e SEQ ID NO: 109; ou aproximadamente dos resíduos 33 (Ala) a 240 (Pro) da SEQ ID NO: 5; aproximadamente dos resíduos 46 (Vai) a 533 (Glu) da SEQ ID NO: 117; ou aproximadamente dos resíduos 46 (Vai) a 533 (Trp) da SEQ ID NO: 119) com um domínio citoplasmático de um segundo receptor, preferentemente um receptor de citocina, e um domínio transmembrana. O domínio transmembrana pode ser derivado de receptor. Receptores híbridos desta segunda classe são expressos em células conhecidas por serem capazes de responder a sinais transduzidos pelo segundo receptor. Juntas, estas duas classes de receptores híbridos permitem a utilização de um amplo espectro de tipos de célula dentro de sistemas de ensaio com base em receptor. A expressão de WSX-1 é mais forte no timo, baço, PBL, e gânglio linfático, bem como expressão aumentada observada para células T activadas. A distribuição de tecido para OSMRbeta é descrita como muito ampla. A distribuição de tecido destes três receptores sugere que um alvo para o Zcytorl71ig predito é células de linhagem hematopoiética, em particular células T, monócitos/macrófagos e células progenitoras linfóides e células linfóides. Outras citocinas de quatro feixes helicoidais conhecidas que actuam sobre as células linfóides incluem IL-2, IL-4, IL-7, e IL-15. Para uma revisão de citocinas de quatro feixes helicoidais, veja-se, Nicola et al., Advances in Protein Chemistry 52:1-65, 1999 e Kelso, A., Immunol. Cell Biol. 76:300-317, 1998.

Meios condicionados (CM) de células de sangue periférico humano seleccionadas por CD3+, estimuladas por Ionomicina/PMA suportaram o crescimento de células BaF3 que expressaram o receptor de zcytorl7, OSMRbeta e receptor de WSX-1 e eram dependentes de outro modo de IL-3. Meios condicionados de células que não eram: 1) estimuladas por 104 PMA/Ionomicina; ou não eram: 2) seleccionadas por CD3 (com ou sem estimulação por PMA/Ionomicina) não suportaram o crescimento de células Baf3 que expressam zcytorl7, OSMRbeta e células que expressam receptor de WSX-1 (BaF3/zcytorl7/WSX-l/OSMRbeta). Experiências de controlo demonstraram que esta actividade proliferativa não foi atribuível a outros factores de crescimento conhecidos, e que a habilidade de tais meios condicionados estimulam a proliferação de células que expressam receptor de zcytorl7/WSX-l/OSMRbeta poderia ser neutralizada por uma forma solúvel do receptor de zcytorl7.

Os meios condicionados de células seleccionadas por CD3+ activadas com PMA/Ionomicina também suportaram o crescimento de células BaF3 que expressaram o receptor de zcytorl7 e receptor de OSMRbeta (zcytorl7/OSMRbeta), enquanto células BaF3 que expressam somente receptor de zcytorl7 e receptor de WSX-1 (zcytorl7/WSX-l) , ou que contêm somente o receptor de OSMRbeta, não foram estimuladas por este meio condicionado. A proliferação de células BaF3 que expressam receptor de zcytorl7ÍWSX-1/OSMRbeta expostas a CM de células de sangue periférico humano seleccionadas por CD3+, estimuladas por Ionomicina/PMA foi identificada por inspecção visual das culturas e/ou por ensaio de proliferação. Muitos ensaios de proliferação adequados são conhecidos na técnica, e incluem ensaios para a redução de um corante tal como AlamarBlue™ (AccuMed International, Inc. Westlake, Ohio), brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazólio (Mosman, J. Immunol. Met. 65: 55-63, 1983); 3,(4,5 dimetil tiazol-2il)-5-3- carboximetoxifenil-2H-tetrazólio; hidróxido de 2,3-bis(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-5-[(fenilamino)carbonil]-2H-tetrazólio; e cloreto de cianoditolil-tetrazólio (que estão disponíveis comercialmente de Polisciences, Inc., Warrington, PA) ; ensaios de mitogénese, tais como medição 105 de incorporação de 3H-timidina; ensaios de exclusão de corante utilizando, por exemplo, negro de naftaleno ou azul de tripano; absorção de corante utilizando fluoresceina de diacetilo; e libertação de cromo. Veja-se, em geral, Freshney, Culture of Animal Cells: A Manual of Básico Technique, 3a ed., Wiley-Liss, 1994, que é incorporado no presente documento por referência.

Uma biblioteca de ADNc foi preparada a partir de células primárias de sangue periférico humano seleccionadas por CD3+, estimuladas por Ionomicina e PMA. A biblioteca de ADNc de células de sangue periférico humano seleccionadas por CD3+, estimuladas por Ionomicina e PMA foi dividida em grupos que contêm múltiplas moléculas de ADNc e foi transfectada numa linha de células hospedeiras, por exemplo, células BHK 570 (N° de Acesso do ATCC 10314). As células hospedeiras transfectadas foram cultivadas num meio que não contém factores de crescimento exógenos (por exemplo, 5% de FBS) e o meio condicionado foi colhido. Os meios condicionados foram ensaiados para a habilidade de estimulação da proliferação de células BaF3 transfectadas com os receptores de zcytorl7, WSX-1, e OSMRbeta. Os grupos de ADNc produtores de meio condicionado que estimulou células de receptor de BaF3/zcytorl7/WSX-l/OSMRbeta foram identificados. Este ADNc de plasmídeo agrupado foi electroporado em E. coli. 0 ADNc foi isolado a partir de colónias únicas e transfectadas individualmente em células BHK570. Clones positivos foram identificados por um resultado positivo no ensaio de proliferação de receptor de BaF3/zcytorl7/WSX-l/OSMRbeta, e a actividade foi confirmada pela neutralização de proliferação utilizando o receptor de zcytorl7 solúvel.

Em vista da distribuição tissular observada para agonistas do receptor de zcytorl7 (incluindo o zcytorl71ig natural/substrato/cofactor/etc. ) e/ou seus antagonistas têm um potencial enorme em aplicações tanto in vitro como in 106 vivo. Os compostos identificados como agonistas de zcytorl71ig são úteis para a expansão, proliferação, activação, diferenciação e/ou indução ou inibição de funções celulares especializadas de células envolvidas na homeostase da hematopoiese e a função imune. Por exemplo, zcytorl71ig e os compostos agonistas são úteis como componentes de meios de cultura celular definidos, e podem utilizar-se em separado ou em combinação com outras citocinas e hormonas para substituir o soro que comummente é utilizado na cultura celular. Desta maneira, os agonistas são úteis para promover especificamente o crescimento e/ou desenvolvimento de linfócitos T, linfócitos B, monócitos/macrófagos, células NK, linfócitos citotóxicos e outras células da linhagem linfóide e mielóide em cultura.

Os antagonistas também são úteis como reagentes de investigação para caracterizar locais de interacção ligando-receptor. Os antagonistas são úteis para inibir a expansão, proliferação, activação e/ou diferenciação de células envolvidas na regulação da hematopoiese. Os inibidores da actividade de zcytorl71ig (antagonistas de zcytorl71ig) incluem anticorpos anti-zcytorl71ig e receptores de zcytorl71ig solúveis, assim como outros agentes peptídicos e não peptídicos (incluindo ribozimas).

Uma proteína de ligação a zcytorl71ig, tal como um receptor de citocina multimérico da presente invenção, pode também ser usado para purificação de ligando. O receptor de citocina multimérico é imobilizado num suporte sólido, tal como pérolas de agarose, agarose reticulada, vidro, resinas celulósicas, resinas baseadas em sílica, poliestireno, poliacrilamida reticulada ou materiais similares que são estáveis nas condições de utilização. Na técnica conhecem-se métodos para ligar polipéptidos a suportes sólidos e incluem química de amina, activação com brometo de cianogénio, activação com N-hidroxisuccinimida, activação com epóxido, activação com sulfidrilo, e activação com 107 hidrazina. O meio resultante será configurado geralmente em forma de uma coluna, e os fluidos gue contêm ligandos passam através da coluna uma ou mais vezes para permitir que o ligando se ligue ao polipéptido receptor. O ligando é eluído depois utilizando mudanças na concentração de sal, agentes caotrópicos (guanidina HC1) ou o pH para alterar a ligação ligando-receptor.

Vantajosamente pode utilizar-se um sistema de ensaio que utiliza um receptor de ligação a ligando (ou um anticorpo, um membro de um par complemento/anticomplemento) ou um fragmento de ligação do mesmo, e um instrumento biossensor disponível comercialmente (BIAcore, Pharmacia Biossensor, Piscataway, NJ) . Dito receptor, anticorpo, membro de par complemento/anticomplemento ou fragmento é imobilizado na superfície de uma microplaca receptora. É revelada a utilização deste instrumento por Karlsson, J. Immunol. Methods 145: 229-40, 1991 e Cunningham e Wells, J. Mol. Biol. 234: 554-63, 1993. Um receptor, anticorpo, membro ou fragmento liga-se covalentemente, utilizando química de amina ou sulfidrilo, a fibras de dextrano que estão ligadas a um filme de ouro dentro da célula de fluxo. Passa-se uma amostra de ensaio através da célula. Se na amostra está presente um ligando, um epítopo ou membro oposto do par complemento/anticomplemento, será ligado ao receptor, anticorpo ou membro imobilizado, respectivamente, provocando uma mudança no índice de refracção do meio, que se detecta como uma mudança na ressonância de plasmão superficial do filme de ouro. Este sistema permite a determinação de velocidades de associação e dissociação, a partir das quais pode ser calculada a afinidade de ligação, e a avaliação da estequiometria de ligação. Como alternativa, a ligação ligando/receptor pode analizar-se utilizando a tecnologia SELDI(TM) (Ciphergen, Inc., Paio Alto, CA).

Também podem ser utilizados polipéptidos receptores 108 de ligação a ligando dentro de outros sistemas de ensaio bem conhecidos na técnica. Ditos sistemas incluem a análise de Scatchard para a determinação da afinidade de ligação (veja-se Scatchard, Ann. NY Acad. Sei. 51: 660-72, 1949) e ensaios calorimétricos (Cunningham et ai., Science 253:545-48, 1991; Cunningham et al., Science 245: 821-25, 1991). A presente invenção também proporciona um anticorpo que especificamente liga a um polipéptido ou pelo menos na porção de um receptor de citocina multimérico como descrita no presente documento.

Também podem ser utilizados polipéptidos zcytorl71ig para preparar anticorpos que se ligam a epítopos, péptidos ou polipéptidos zcytorl71ig. 0 polipéptido zcytorl71ig ou fragmento do mesmo serve como antigénio (imunogénio) para inocular num animal e induzir uma resposta imune. Ditos anticorpos podem utilizar-se para bloquear a acção biológica de zcytorl71ig pró-inflamatório e são úteis como agentes terapêuticos anti-inflamatórias numa variedade de doenças como é descrito no presente documento. Um perito na especialidade reconhecerá que os polipéptidos que possuem epítopos antigénicos contêm uma sequência de pelo menos 6, preferentemente pelo menos 9 e mais preferentemente de pelo menos 15 a aproximadamente 30 resíduos de aminoácido contíguos de um(ns) polipéptido(s) do receptor de citocina multimérico, tal como zcytorl7 (SEQ ID NO: 111), OSMRbeta (SEQ ID NO: 7), e/ou WSX-1 (SEQ ID NO: 9). Polipéptidos que compreende um porção maior de um receptor de citocina multimérico, isto é, desde 30 até 100 resíduos até o comprimento total da sequência de aminoácidos são incluídos. Antigénios ou epítopos imunogénicos também podem incluir marcadores ligados, adjuvantes, veículos e excipientes, como é descrito no presente documento.

Podem ser isolados anticorpos de uma resposta imune gerada por inoculação de um animal com estes antigénios como é descrito no presente documento. Os métodos para 109 preparar e isolar anticorpos policlonais e monoclonais são bem conhecidos na técnica. Veja-se, por exemplo, Cooligan, et al. (eds.), National Institutes of Health, John Wiley e Sons, Inc., 1995; Sambrook et al. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edição, Cold Spring Harbor, NY, 1989; e Hurrell, J. G. R., Ed., Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, 1982.

Como será evidente para um perito na especialidade, podem gerar-se anticorpos policlonais por inoculação de uma variedade de animais de sangue quente tais como cavalos, vacas, cabras, ovelhas, cães, galinhas, coelhos, ratinhos e ratos com um polipéptido zcytorl71ig ou um fragmento do mesmo. A imunogenicidade de um receptor de citocina multimérico pode ser aumentada por meio da utilização de um adjuvante, tal como alúmen (hidróxido de alumínio) ou adjuvante completo ou incompleto de Freund. Receptores de citocina multiméricos úteis for imunização também incluem polipéptidos de fusão, tal como fusões de zcytorl7, OSMRbeta, e/ou WSX-1, ou uma porção dos mesmos com um polipéptido de imunoglobulina ou com proteína de ligação a maltose. O imunogénio polipeptídico pode ser uma molécula de comprimento completo ou uma parte da mesma. Se a parte de polipéptido for de "tipo hapteno", dita parte pode ligar-se vantajosamente ou associar-se a um suporte macromolecular (tal como hemocianina de lapa californiana (KLH), albumina de soro bovino (BSA) ou toxóide tetânico) para imunização.

Como é utilizado no presente documento, o termo "anticorpos" inclui anticorpos policlonais, anticorpos policlonais purificados por afinidade, anticorpos monoclonais e fragmentos de ligação a antigénio, tais como fragmentos proteolíticos F(ab')2 e Fab. Também se incluem anticorpos intactos modificados por engenharia genética ou fragmentos, tais como anticorpos quiméricos, fragmentos Fv, 110 anticorpos de cadeia simples e similares, assim como péptidos e polipéptidos de ligação a antigénio sintéticos. Os anticorpos não humanos podem ser humanizados por enxerto de CDR não humanas em regiões framework e constantes humanas, ou por incorporação dos domínios variáveis não humanos inteiros (opcionalmente "cobrindo" os mesmos com uma superfície de tipo humano por substituição de resíduos expostos, sendo o resultado um anticorpo "revestido"). Em alguns casos, os anticorpos humanizados podem conservar resíduos não humanos dentro dos domínios framework da região variável humana para aumentar as características de ligação apropriadas. Por meio da humanização de anticorpos, pode ser aumentada a semivida biológica e o potencial de reacções imunes adversas após a administração a seres humanos é reduzido. Além disso, podem ser produzidos anticorpos humanos em animais transgénicos não humanos que foram modificados por engenharia genética para conter genes de imunoglobulina humana como é revelado na publicação WIPO N° WO 98/24893. Prefere-se que os genes de imunoglobulina endógenos nestes animais sejam inactivados ou eliminados, tal como por recombinação homóloga.

Os anticorpos são considerados de ligação específica se: 1) apresentam um nível limite de actividade de ligação e 2) não apresentam reacção cruzada significativa com moléculas polipeptídicas relacionadas. Determina-se um nível limite de ligação se os anticorpos anti-zcytorl71ig do presente documento se ligarem a um polipéptido, péptido ou epítopo de zcytorl71ig com uma afinidade de pelo menos 10 vezes maior que a afinidade de ligação à proteína de controlo (não receptor de citocina multimérico). Prefere-se que os anticorpos apresentem uma afinidade de ligação (Ka) de 106 M 1 ou maior, preferentemente 107 M_1 ou maior, mais preferentemente ΙΟ8 M_1 ou maior e ainda mais preferentemente 109 M_1 ou maior. A afinidade de ligação de um anticorpo pode ser determinada facilmente por um perito 111 na especialidade, por exemplo, por análise de Scatchard (Scatchard, G., Ann. NY Acad. Sei. 51: 660-672, 1949).

Se os anticorpos anti-receptor de citocina multimérico não apresentam reacção cruzada significativa com moléculas polipeptidicas relacionadas é mostrado, por exemplo, pelo anticorpo que detecta receptor de zcytorl7 de citocina multimérico, mas não polipéptidos relacionados conhecidos utilizando uma análise de transferência de Western (Ausubel et al., ibid.) . São exemplos de polipéptidos relacionados conhecidos os revelados na técnica anterior, tais como ortólogos conhecidos, e parálogos, e membros conhecidos similares de uma família de proteínas. O rastreio também pode ser realizado utilizando receptor de citocina multimérico não humano, e polipéptidos mutantes de receptor de citocina multimérico. Além disso, anticorpos podem ser "rastreados contra" polipéptidos relacionados conhecidos, para isolar uma população que se liga especificamente ao receptor de citocina multimérico. Por exemplo, absorvem-se anticorpos induzidos contra receptor de citocina multimérico em polipéptidos relacionados aderidos a uma matriz insolúvel; os anticorpos específicos para receptor de citocina multimérico fluirão através da matriz nas condições tamponantes apropriadas. O rastreio permite o isolamento de anticorpos policlonais e monoclonais que não apresentam reacção cruzada com polipéptidos muito relacionados conhecidos (Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow e Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988; Current Protocols in Immunology, Cooligan, et al. (eds.), National Institutes of Health,

Ann.

Rev.

John Wiley e Sons, Inc., 1995). O rastreio e isolamento de anticorpos específicos são bem conhecidos na técnica. Veja-se, Fundamental Immunology, Paul (eds.), Raven Press, 1993; Getzoff et al., Adv. in Immunol. 43: 1-98, 1988; Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, Goding, J.W. (eds.), Academic Press Ltd., 1996; Benjamin et al., 112

Immunol. 2: 67-101, 1984. Especificamente, pode detectar-se a ligação de anticorpos anti-zyctorl71ig por vários métodos da técnica, e revela-se a seguir.

Pode utilizar-se uma variedade de ensaios conhecidos pelos peritos na especialidade para detectar anticorpos que se ligam a receptor de citocina proteínas multiméricas ou polipéptidos. Descrevem-se ensaios exemplares em detalhe em Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow e Lane (Eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988. Os exemplos representativos de ditos ensaios incluem: imunoelectroforese concorrente, radioimunoensaio, radioimunoprecipitação, ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA), ensaio de transferência pontual (dot blot) ou transferência de Western, inibição ou ensaio competitivo e ensaio de tipo sanduíche. Além disso, os anticorpos podem ser rastreados com respeito à ligação a proteína ou polipéptido receptor de citocina multimérico de tipo selvagem versus mutante.

Dentro de outro aspecto a presente invenção proporciona um anticorpo produzido pelo método como revelado anteriormente, em que o anticorpo se liga a pelo menos uma porção de um receptor de citocina multimérico que compreende pelo menos uma porção da SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 109, ou SEQ ID NO: 5. Em uma forma de realização, o anticorpo revelado anteriormente especificamente se liga a um polipéptido mostrado na SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 109, ou SEQ ID NO: 5. Em outra forma de realização, o anticorpo pode ser um anticorpo monoclonal ou um anticorpo policlonal.

Anticorpos to receptor de citocina multimérico podem utilizar-se para marcar células que expressam receptor de citocina multimérico; para isolar receptor de citocina multimérico por meio de purificação por afinidade; para ensaios de diagnóstico para determinar os níveis circulantes de receptor de citocina multimérico; para 113 detectar ou quantificar receptor solúvel de citocina multimérico como um marcador como um marcador da patologia ou doença subjacente; em métodos analíticos que utilizam FACS; para rastrear bibliotecas de expressão; para gerar anticorpos anti-idiotipicos; e como anticorpos neutralizadores ou como antagonistas para bloquear a actividade de zcytorl71ig in vitro e in vivo. As etiquetas ou marcadores directos adequados incluem radionuclideos, enzimas, substratos, cofactores, inibidores, marcadores fluorescentes, marcadores quimioluminescentes, partículas magnéticas e similares; as etiquetas ou marcadores indirectos podem apresentar a utilização de biotina-avidina ou outros pares complemento/anticomplemento como intermediários. Os anticorpos do presente documento também podem ser conjugados directamente ou indirectamente com fármacos, toxinas, radionuclideos e similares, e estes conjugados podem utilizar-se para aplicações de diagnóstico ou terapêuticas in vivo. Além disso, podem utilizar-se anticorpos contra receptor de citocina multimérico ou fragmentos do mesmo in vitro para detectar receptor de citocina multimérico desnaturado ou fragmentos do mesmo em ensaios, por exemplo, Western Blots ou outros ensaios conhecidos na técnica.

As moléculas detectáveis adequadas podem ligar-se directamente ou indirectamente ao receptor de citocina multimérico ou anticorpo, e incluem radionuclideos, enzimas, substratos, cofactores, inibidores, marcadores fluorescentes, marcadores quimioluminescentes, partículas magnéticas e similares. As moléculas citotóxicas adequadas podem ligar-se directamente ou indirectamente ao polipéptido ou anticorpo, e incluem toxinas bacterianas ou vegetais (por exemplo, toxina diftérica, saporina, exotoxina de Pseudomonas, ricina, abrina e similares), assim como radionuclideos terapêuticos, tais como iodo-131, rénio-188 ou ítrio-90 (ligados directamente ao polipéptido 114 ou anticorpo, ou ligados indirectamente por meio de um resíduo quelante, por exemplo). Os polipéptidos ou anticorpos também podem ser conjugados com fármacos citotóxicos tais como adriamicina. Para a ligação indirecta de uma molécula detectável ou citotóxica, a molécula detectável ou citotóxica pode ser conjugada com um membro de uma parte complementar/anticomplementar, estando o outro membro ligado à parte de polipéptido ou anticorpo. Para estes propósitos, um par complementar/anticomplementar exemplar é biotina/estreptavidina.

Um receptor solúvel de citocina multimérico também podem actuar como "antagonistas" de zcytorl71ig para bloquear a ligação de zcytorl71ig e a transdução de sinais in vitro e in vivo. Estes polipéptidos de ligação anti-zcytorl71ig seriam úteis para inibir a actividade de zcytorl71ig ou a ligação de proteínas.

Podem utilizar-se proteínas de fusão polipéptido-toxina ou proteínas de fusão anticorpo-toxina para uma inibição ou ablação celular ou tissular dirigida (por exemplo, para tratar células ou tecidos cancerosos). Como alternativa, se o polipéptido tem múltiplos domínios funcionais (isto é, um domínio de activação ou um domínio de ligação ao receptor, mais um domínio de direcção), pode ser adequada uma proteína de fusão que inclua somente o domínio de direcção para dirigir uma molécula detectável, uma molécula citotóxica ou uma molécula complementar a um tipo celular ou tissular de interesse. Nos casos em que a proteína de fusão somente com domínio inclui uma molécula complementar, a molécula anticomplementar pode ser conjugada com uma molécula detectável ou citotóxica. Ditas proteínas de fusão de domínio-molécula complementar desta forma representam um veículo de direccionamento como alvo genérico para distribuição específica de célula/tecido de conjugados genéricos de molécula citotóxica/anti-complementar-detectável. 115

Além disso, a inflamação é uma resposta protectora por um organismo para esquivar um agente invasor. A inflamação é um evento em cascata que implica muitos mediadores celulares e humorais. Por um lado, a supressão das respostas inflamatórias pode deixar a um hospedeiro imunocomprometido; no entanto, se for deixado sem comprovar, a inflamação pode ocasionar complicações graves incluindo doenças inflamatórias crónicas (por exemplo, artrite reumatóide, esclerose múltipla, doença inflamatória do intestino e similares), choque séptico e falência multiorgánica. De forma importante, estas diversas patologias partilham mediadores inflamatórios comuns. As doenças colectivas que se caracterizam por inflamação têm um grande impacto sobre a morbidade e mortalidade humana. Portanto, está claro que os polipéptidos de ligação e anticorpos anti-inflamatórios, tais como os polipéptidos de ligação e anticorpos anti-zcytorl71ig descritos no presente documento, poderiam ter um potencial terapêutico crucial para um amplo número de doenças humanas e animais, desde asma e alergia até autoimunidade e choque séptico. Como tal, a utilização de anticorpos anti-zcytorl71ig anti-inf lamatórios e polipéptidos de ligação descritos no presente documento podem ser utilizados terapeuticamente como antagonistas de zcytorl71ig descritos no presente documento, particularmente em doenças tais como artrite, endotoxemia, doença inflamatória do intestino, psoríase, doenças relacionadas e similares. 1. Artrite A artrite, incluindo a osteoartrite, artrite reumatóide, articulações artríticas como resultado de uma lesão e similares, são afecções inflamatórias comuns que se beneficiariam da utilização terapêutica de anticorpos anti-inf lamatórios e polipéptidos de ligação, tais como anticorpos anti-zcytorl71ig e polipéptidos de ligação da presente invenção. Por exemplo, a artrite reumatóide (AR) é 116 uma doença sistémica que afecta ao corpo inteiro e é uma das formas mais comuns de artrite. Caracteriza-se pela inflamação da membrana que reveste a articulação, que produz dor, riqidez, calor, vermelhidão e inchaço. As células inflamatórias libertam enzimas que podem digerir o osso e a cartilagem. Como resultado da artrite reumatóide, o revestimento da articulação inflamada, o sinóvio, pode invadir e danificar o osso e a cartilagem levando a um deterioramento da articulação e dor severa entre outros efeitos fisiológicos. A articulação envolvida pode perder a sua forma e alinhamento, tendo como resultado dor e perda de movimento. A artrite reumatóide (AR) é uma doença imune particularmente caracterizada por inflamação e posterior lesão tissular que leva a uma incapacitação severa e a um aumento da mortalidade. Nas articulações reumatóides são produzidas localmente uma variedade de citocinas. Numerosos estudos demostraram que a IL-1 e o TNF-alfa, duas citocinas pró-inflamatórias prototípicas, desempenham um papel importante nos mecanismos envolvidos na inflamação sinovial e na destruição progressiva da articulação. De facto, a administração de inibidores de TNF-alfa e IL-1 em pacientes com AR tem levado a uma melhora espectacular dos sinais clínicos e biológicos de inflamação e a uma redução dos sinais radiológicos de erosão de osso e destruição de cartilagem. No entanto, apesar destes resultados alentadores, uma percentagem significativa dos pacientes não respondem a estes agentes, o que sugere que na fisiopatologia da artrite também estão envolvidos outros mediadores (Gabay, Expert. Opin. Biol. Ther. 2(2): 135-149, 2002) . Um destes mediadores poderia ser zcytorl71ig, e portanto, uma molécula que se liga ou iniba zcytorl71ig, tal como anticorpos ou parceiros de ligação a zcytorl71ig, poderia servir como um agente terapêutico valioso para reduzir a inflamação na artrite reumatóide e outras doenças 117 artríticas .

Existem vários modelos animais para a artrite reumatóide conhecidos na técnica. Por exemplo, no modelo de artrite induzida por colagénio (AIC), os ratinhos desenvolvem artrite inflamatória crónica que se parece muito à artrite reumatóide humana. Uma vez que a AIC partilha características imunológicas e patológicas similares com a AR, isto faz com que seja um modelo ideal para seleccionar compostos potenciais anti-inflamatórios humanos. 0 modelo de AIC é um modelo bem conhecido em ratinhos que depende tanto da resposta imune como da resposta inflamatória, para ser produzido. A resposta imune compreende a interacção de linfócitos B e linfócitos T CD4+ em resposta ao colagénio, que se proporciona como antigénio, e conduz à produção de anticorpos anti-colagénio. A fase inflamatória é o resultado das respostas tissulares de mediadores da inflamação, como consequência da reacção cruzada de alguns destes anticorpos com o colagénio nativo do ratinho e a activação da cascata do complemento. Uma vantagem da utilização do modelo de AIC é que os mecanismos básicos da patogénese são conhecidos. Identificaram-se os epítopos relevantes dos linfócitos T e os linfócitos B no colagénio de tipo II, e determinaram-se diversos parâmetros imunológicos (por exemplo, hipersensibilidade de tipo retardado e anticorpo anti-colagénio) e inflamatórios, (por exemplo citocinas, quimiocinas e enzimas de degradação da matriz) relacionados com a artrite mediada pelo sistema imune, e portanto podem utilizar-se para avaliar a eficácia do composto de ensaio no modelo de AIC (Wooley, Curr. Opin. Rheum. 3:407-20, 1999; Williams et ai., Immunol. 89:9784-788, 1992; Myers et ai., Life Sei. 61 : 1861-78, 1997; e Wang et ai., Immunol. 92:8955-959, 1995). A administração de polipéptidos que compreendem zcytorl7 solúvel (incluindo receptores heterodiméricos e 118 multiméricos descritos no presente documento) , tais como zcytorl7-Fc4 ou outras proteínas de fusão e solúveis de zcytorl7 a estes ratinhos do modelo AIC foram utilizados para avaliar a utilização de zcytorl7 para melhorar os sintomas e alterar o curso da doença. Como molécula que modula a resposta imune e inflamatória, zcytorl71ig pode induzir a produção de SAA, que está envolvido na patogénese da artrite reumatóide, os antagonistas de zcytorl71ig podem reduzir a actividade de SAA ín vitro e ín vivo, a administração sistémica ou local de antagonistas de zcytorl71ig tais como anticorpos anti-zcytorl71ig ou parceiros de ligação, polipéptidos que compreendem zcytorl7 (incluindo receptores heterodiméricos e multiméricos descritos no presente documento), tais como zcytorl7-Fc4 ou outras proteínas solúveis e de fusão de zcytorl7 podem suprimir potencialmente a resposta inflamatória da AR. Outros agentes terapêuticos potenciais incluem polipéptidos zcytorl7, polipéptidos receptores heterodiméricos e multiméricos solúveis, ou anticorpos anti-zcytorl71ig ou parceiros de ligação da presente invenção, e similares. 2. Endotoxemia A endotoxemia é uma afecção grave que é produzida comummente por agentes infecciosos tais como bactérias e outros agentes de doenças infecciosas, septicemia, síndrome de choque tóxico ou em pacientes imunocomprometidos submetidos a infecções oportunistas, e similares. A administração de anticorpos anti-inflamatórios e polipéptidos de ligação terapeuticamente úteis, tais como anticorpos anti-zcytorl71ig e polipéptidos de ligação da presente invenção, poderia ajudar a prevenir e tratar a endotoxemia em seres humanos e animais. Outros agentes terapêuticos potenciais incluem polipéptidos zcytorl7, polipéptidos receptores heterodiméricos e multiméricos solúveis, ou os anticorpos anti-zcytorl71ig ou parceiros de ligação da presente invenção, e similares, poderiam servir 119 como um agente terapêutico valioso para reduzir a inflamação e os efeitos patológicos da endotoxemia. A endotoxemia induzida por lipopolissacárido (LPS) incorpora muitos dos mediadores pró-inflamatórios que produzem efeitos patológicos nas doenças infecciosas e a endotoxemia induzida por LPS em roedores é um modelo amplamente utilizado e aceitável para estudar os efeitos farmacológicos de possíveis agentes pró-inflamatórios ou imunomoduladores. 0 LPS produzido em bactérias gram negativas, é um importante agente causante da patogénese do choque séptico (Glausner et al., Lancet 338:732, 1991). De facto, pode induzir-se experimentalmente um estado similar ao choque por uma única injecção de LPS em animais. As moléculas produzidas por células que respondem a LPS podem dirigir-se a patogénios directamente ou indirectamente. Embora estas respostas biológicas protejam o hospedeiro contra os patogénios invasores, também podem produzir danos. Desta maneira, uma estimulação massiva da imunidade inata, que se produz como resultado de uma infecção bacteriana gram negativa severa, conduz a um excesso de produção de citocinas e outras moléculas, e ao desenvolvimento de um síndrome fatal, síndrome de choque séptico, que se caracteriza por febre, hipotensão, coagulação intravascular disseminada e falência multiorgánica (Durnitru et al. Cell 103: 1071-1083,2000).

Estes efeitos tóxicos do LPS estão relacionados principalmente com a activação de macrófagos que leva à libertação de múltiplos mediadores inflamatórios. Entre estes mediadores, o TNF parece desempenhar um papel crucial, como é indicado pela prevenção da toxicidade do LPS por meio da administração de anticorpos neutralizadores anti-TNF (Beutler et ai., Science 229:869, 1985). Está bem estabelecido que a injecção de 1 μg de LPS de E. coli num ratinho C57B1/6 dará como resultado um aumento significativo dos níveis circulantes de IL-6, TNF-alfa, IL- 120 1 e proteínas de fase aguda (por exemplo, SAA) aproximadamente 2 horas depois da injecção. A toxicidade do LPS parece estar mediada por estas citocinas uma vez que a imunização passiva contra estes mediadores pode produzir uma redução da mortalidade (Beutler et ai., Science 229:869, 1985). As estratégias de imunintervenção potenciais para a prevenção e/ou tratamento do choque séptico incluem mAb anti-TNF, antagonista do receptor de IL-1, LIF, IL-10 e G-CSF. Como o LPS induz a produção de factores pró-inflamatórios que possivelmente contribuem à patologia da endotoxemia, a neutralização da actividade de zcytorl71ig, SAA ou outros factores pró-inflamatórios antagonizando o polipéptido zcytorl71ig pode ser utilizado para reduzir os sintomas da endotoxemia, tais como os observados no choque endotóxico. Outros agentes terapêuticos potenciais incluem polipéptidos zcytorl7, polipéptidos receptores heterodiméricos e multiméricos solúveis, ou anticorpos anti-zcytorl71ig ou parceiros de ligação da presente invenção, e similares.

3 Doença inflamatória do intestino. DII

Nos Estados Unidos, aproximadamente 500.000 pessoas sofrem de Doença Inflamatória do Intestino (DII) que pode afectar o cólon e o recto (colite ulcerativa) ou tanto ao intestino delgado como ao intestino grosso (doença de Crohn). A patogénese destas doenças está pouco clara, mas envolvem uma inflamação crónica dos tecidos afectados. Os agentes terapêuticos potenciais incluem polipéptidos zcytorl7, polipéptidos receptores heterodiméricos e multiméricos solúveis, ou os anticorpos anti-zcytor171ig ou parceiros de ligação da presente invenção, e similares, poderiam servir como agentes terapêuticos valiosos para reduzir a inflamação e os efeitos patológicos da DII e doenças relacionadas. A colite ulcerativa (CU) é uma doença inflamatória do intestino grosso, denominado comummente cólon, 121 caracterizada por inflamação e ulceração da mucosa ou o revestimento mais interno do cólon. Esta inflamação faz com que o cólon se esvazie com frequência, tendo como resultado diarreia. Os sintomas incluem evacuações soltas e cãibras abdominais associadas, febre e perda de peso. Embora não seja conhecida a causa exacta da CU, as investigações recentes sugerem que as defesas naturais do corpo estão a actuar contra proteínas do corpo que o corpo considera estranhas (uma "reacção autoimune"). Talvez porque se pareçam a proteínas bacterianas do intestino, estas proteínas podem induzir ou estimular o processo inflamatório que começa a destruir o revestimento do cólon. Quando se destrói o revestimento do cólon, as úlceras libertam muco, pus e sangue. A doença normalmente começa na área rectal e finalmente pode estender-se ao longo de todo o intestino grosso. Os episódios repetidos de inflamação levam a um espessamento da parede do intestino e recto com tecido cicatrizado. Pode ser produzida a morte do tecido do cólon ou sepsia com a doença severa. Os sintomas de colite ulcerativa podem variar em gravidade e o seu princípio pode ser gradual ou súbito. Os ataques podem ser provocados por muitos factores, incluindo infecções respiratórias ou estres.

Embora actualmente não haja cura disponível para a CU, os tratamentos centram-se em suprimir o processo inflamatório anormal no revestimento do cólon. Dispõe-se de tratamentos que incluem corticosteróides imunosupressores (por exemplo azatioprina, mercaptopurina e metotrexato) e aminosalicilatos para tratar a doença. No entanto, a utilização a longo prazo de imunosupressores tais como corticosteróides e azatioprina pode produzir efeitos secundários graves incluindo um adelgaçamento dos ossos, cataratas, infecção e efeitos no fígado e a medula óssea. Nos pacientes em que as terapêuticas actuais não são satisfatórias, uma opção é a cirurgia. A cirurgia implica a 122 eliminação do cólon inteiro e do recto.

Existem vários modelos animais que podem imitar parcialmente a colite ulcerativa crónica. 0 modelo utilizado mais amplamente é o modelo de colite induzida por ácido 2,4,6-trinitrobensulfinico/etanol (TNBS), que induz a inflamação crónica e a ulceração no cólon. Quando introduz-se TNBS no cólon de ratinhos susceptiveis por instilação intrarectal, induz uma resposta imune mediada por linfócitos T na mucosa colónica, levando neste caso a uma inflamação massiva da mucosa caracterizada por infiltração densa de linfócitos T e macrófagos através de toda a parede do intestino grosso. Além disso, este quadro histopatológico é acompanhado pelo quadro clinico de perda de peso progressiva (desgaste) , diarreia sanguinolenta, prolapso rectal e um espessamento da parede do intestino grosso (Neurath et al. Intern. Rev. Immunol. 19:51- 62,2000).

Outro modelo de colite utiliza dextrano sulfato de sódio (DSS), que induz uma colite aguda manifestada por diarreia sanguinolenta, perda de peso, encurtamento do cólon e ulceração da mucosa com infiltração de neutrófilos. A colite induzida por DSS caracteriza-se histologicamente por infiltração de células inflamatórias na lâmina própria com hiperplasia linfóide, lesões nas criptas focais e ulceração epitelial. Acredita-se que estas mudanças se desenvolvam devido a um efeito tóxico do DSS sobre o epitélio e por fagocitose das células da lâmina própria e a produção de TNF-alfa e IFN-gama. Apesar de utilização comum, continuam sem resolver vários assuntos relacionados com os mecanismos do DSS sobre a relevância nas doenças humanas. O DSS é considerado um modelo independente de linfócitos T porque se observa em animais deficientes em linfócitos T tais como ratinhos SCID. A administração de anticorpos anti-zcytorl71ig ou parceiros de ligação, polipéptidos que compreendem zcytorl7 123 solúvel (incluindo receptores heterodiméricos e multiméricos) tais como zcytorl7-Fc4 ou outras proteínas de fusão e solúveis de zcytorl7 a estes modelos de TNBS ou DSS pode utilizar-se para avaliar a utilização de antagonistas de zcytorl71ig para melhorar os sintomas e alterar o curso da doença gastrointestinal. 0 zcytorl71ig pode desempenhar um papel na resposta inflamatória em colite, e a neutralização da actividade de zcytorl71ig por meio da administração de antagonistas de zcytorl71ig é uma possível abordagem terapêutica para a DII. Outros agentes terapêuticos potenciais incluem polipéptidos zcytorl7, polipéptidos receptores heterodiméricos e multiméricos solúveis ou anticorpos anti-zcytorl71ig ou parceiros de ligação da presente invenção, e similares. 4. Psoríase A psoríase é uma afecção cutânea crónica que afecta a mais de sete milhões de americanos. A psoríase ocorre quando novas células cutâneas crescem de forma anormal tendo como resultado emplastros inflamados, inchados e escamosos de pele em que a pele velha não se desprende o suficientemente rápido. A psoríase em placas, a forma mais comum, caracteriza-se por emplastros inflamados de pele ("lesões") cobertos com escamas brancas prateadas. A psoríase pode ser limitada a umas poucas placas ou implicar áreas moderadas a extensas da pele, aparecendo a maioria das vezes sobre o couro cabeludo, joelhos, cotovelos e tronco. Embora seja muito visível, a psoríase não é uma doença contagiosa. A patogénese da doença implica inflamação crónica dos tecidos afectados. Os polipéptidos zcytorl7, os polipéptidos receptores heterodiméricos e multiméricos solúveis ou os anticorpos anti-zcytorl71ig ou parceiros de ligação da presente invenção, e similares, poderiam servir como agentes terapêuticos valiosos para reduzir a inflamação e os efeitos patológicos na psoríase, outras doenças cutâneas inflamatórias, alergias da pele e a 124 mucosa, e doenças relacionadas. A psoríase é um distúrbio inflamatório mediado por linfócitos T da pele que pode produzir desconfortos consideráveis. É uma doença para a qual não existe cura e afecta a personas de todas as idades. A psoriase afecta aproximadamente a dois por cento da população de Europa e América do Norte. Embora os indivíduos com psoriase leve com frequência possam controlar sua doença com agentes tópicos, mais de um milhão de pacientes em todo o mundo requerem uma terapêutica imunosupressora com ultravioleta ou sistémica. Infelizmente, a inconveniência e riscos da radiação ultravioleta e as toxicidades de muitas terapêuticas limitam a sua utilização a longo prazo. Além disso, os pacientes normalmente têm recorrência de psoriase, e em alguns casos um rebote, pouco depois de interromper a terapêutica imunosupressora. A diferenciação é um processo progressivo e dinâmico, que começa com as células estaminais pluripotentes e termina com as células diferenciadas terminalmente. As células estaminais pluripotentes que podem ser regeneradas sem o comprometimento de uma linhagem expressam uma série de marcadores de diferenciação que se perdem quando é feito o comprometimento de uma linhagem celular. As células progenitoras expressam uma série de marcadores de diferenciação que podem ou não continuar a se expressar de acordo com progresso das células à via da linhagem celular em direcção à maduração. Os marcadores de diferenciação que se expressam exclusivamente pelas células maduras normalmente são propriedades funcionais tais como produtos celulares, enzimas para produzir produtos celulares e receptores. 0 estágio de diferenciação de uma população celular é monitorizado pela identificação de marcadores presentes na população celular.

Existem indicios que sugerem que factores que estimulam tipos celulares específicos de uma via para a 125 diferenciação ou desdiferenciação terminal afetam à população celular inteira que procede de um precursor ou célula estaminal comum.

Um receptor de citocina multimérico da presente invenção pode ser útil para estimular a proliferação, proliferação, activação, diferenciação e/ou indução ou inibição da função celular especializada de células da homeostase envolvida na hematopoiese e função imune. Em particular, receptores de citocina multiméricos como descritos no presente documento são úteis para estimular a proliferação, activação, diferenciação, indução, ou inibição de funções celulares especializadas de células das linhagens hematopoiéticas, incluindo, mas sem limitação, linfócitos T, linfócitos B, monócitos/macrófagos, células NK, neutrófilos, células endoteliais, fibroblastos, eosinófilos, condrócitos, mastócitos, células de langerhan, monócitos e macrófagos, assim como células epiteliais. As células epiteliais incluem, por exemplo, ameloblastos, células principais, cromatóforos, células enterocromafins, células de tipo enterocromafim, células caliciformes, células da granulosa, queratinócitos, células dendriticas, células labirínticas de suporte, melanócitos, células de Merkel, células de Paneth, células parietais, células de Sertoli e similares. A presente invenção também proporciona um método para reduzir células hematopoiéticas e células progenitoras hematopoiéticas de um mamífero. 0 método inclui cultivar medula óssea ou células de sangue periférico com uma composição que compreende uma quantidade eficaz de um receptor solúvel de citocina multimérico para produzir uma diminuição no número de células linfóides na medula óssea ou células de sangue periférico em comparação com medula óssea ou células de sangue periférico cultivadas na ausência do receptor de citocina multimérico. As células hematopoiéticas e células progenitoras hematopoiéticas 126 podem ser células linfóides, tal como células monocíticas, macrófagos, ou células T. A presente invenção também proporciona um método de inibição de uma resposta imune num mamifero exposto a um antigénio ou patogénio. 0 método inclui (a) determinar directamente ou indirectamente o nível de antigénio ou patogénio presente no mamífero; (b) administrar uma composição que compreende um receptor solúvel de citocina multimérico num veículo farmacêutico aceitável; (c) determinação de directamente ou indirectamente o nível de antigénio ou patogénio no mamífero; e (d) comparar o nível do antigénio ou patogénio na etapa (a) com o nível do antigénio ou patogénio na etapa (c) , em que uma mudança no nível é indicativo de inibição de uma resposta imune. 0 método pode incluir ainda (e) re-administrar uma composição que compreende um receptor de citocina multimérico num veículo farmacêutico aceitável; (f) determinar directamente ou indirectamente o nível de antigénio ou patogénio no mamífero; e (g) comparar o número do nível do antigénio ou patogénio na etapa (a) com o antigénio nível na etapa (f), em que uma mudança no nível é indicativo de inibição de uma resposta imune.

Alternativamente, o método pode incluir (a) determinar um nível de um anticorpo específico de antigénio ou patogénio; (b) administrar uma composição que compreende um receptor solúvel de citocina multimérico num veículo farmacêutico aceitável; (c) determinação de um nível após a administração de anticorpo específico de antigénio ou patogénio; (d) comparar o nível de anticorpo na etapa (a) com o nível de anticorpo na etapa (c), em que uma diminuição em anticorpo nível é indicativo de inibição de uma resposta imune. 0 zcytorl71ig foi isolado a partir de um tecido que se sabe que tem uma função imunológica importante e que contém células que desempenham um papel no sistema imune. 0 127 zcytorl71ig é expresso em células de sangue periférico activadas, seleccionadas por CD3+ e mostra-se gue a expressão de zcytorl71ig aumenta depois da activação de linfócitos T. Além disso, os resultados de experiências descritas na secção de Exemplos do presente documento sugere que os polipéptidos da presente invenção podem ter um efeito sobre o crescimento/expansão de monócitos/macrófagos, linfócitos T, linfócitos B, células NK e/ou o estado diferenciado de monócitos/macrófagos, linfócitos T, linfócitos B, células NK ou os progenitores destas células. Geralmente conhecem-se factores que estimulam a proliferação de progenitores hematopoiéticos e activam as células maduras, no entanto, a proliferação e activação também pode requerer factores de crescimento adicionais. Por exemplo, mostra-se que se requeriam IL-7 e o Factor de Steel (ligando de c-kit) para a formação de colónias de progenitores de NK. A IL-15 + IL-2 em combinação com IL-7 e Factor de Steel era mais eficaz (Mrozek et al., Blood 87:2632-2640, 1996). No entanto, podem ser necessárias citocinas não identificadas para a proliferação de uma subsérie especifica de células NK e/ou progenitores de NK (Robertson et al., Blood 76:2451-2438, 1990). De forma similar, zcytorl71ig pode actuar em separado ou em coordenação ou sinergia com outras citocinas para aumentar o crescimento, proliferação, expansão e modificação da diferenciação de monócitos/macrófagos, linfócitos T, linfócitos B ou células NK.

Os ensaios que medem a diferenciação incluem, por exemplo, a medição de marcadores celulares associados à expressão especifica de etapa de um tecido, actividade enzimática, actividade funcional ou mudanças morfológicas (Watt, FASEB, 5:281-284, 1991; Francis, Differentiation 57:63-75, 1994; Raes, Adv. Anim. Cell Biol. Technol. Bioprocesses, 161-171, 1989). Como alternativa, o próprio polipéptido zcytorl71ig pode servir como um marcador 128 secretado ou da superfície celular adicional associado à expressão específica de etapa de um tecido. Como tal, a medição directa do polipéptido zcytorl71ig ou a sua perda de expressão num tecido à medida que se diferencia, pode servir como marcador de diferenciação de tecidos.

De forma similar, a medição directa do polipéptido zcytorl71ig, ou sua perda de expressão num tecido pode ser determinada num tecido ou em células à medida que passam por progressão tumoral. Os aumentos na invasividade e motilidade das células, ou o aumento ou perda de expressão de zcytorl71ig num estado pré-canceroso ou canceroso, em comparação com o tecido normal, podem servir como diagnóstico para a transformação, invasão e metástase na progressão tumoral. Como tal, o conhecimento do estado de progressão ou metástase de um tumor ajudará ao médico a escolher a terapêutica mais apropriada, ou a agressividade do tratamento, para um paciente com um dado cancro individual. Os métodos para medir o aumento e perda de expressão (de um ARNm ou proteína) são bem conhecidos na técnica e descrevem-se no presente documento e podem aplicar-se à expressão de zcytorl71ig. Por exemplo, o aparecimento ou desaparecimento de polipéptidos que regulam a motilidade celular pode ser utilizado para auxiliar o diagnóstico e pronóstico do cancro de próstata (Banyard, J. e Zetter, B.R., Câncer and Metast. Rev. 17:449-458, 1999). Como um efector da motilidade celular, o aumento ou perda de expressão de zcytorl71ig pode servir como diagnóstico para o cancro linfóide, de linfócitos B, epitelial, células hematopoiéticas e outros cancros.

Além disso, a actividade e o efeito de zcytorl71ig sobre a expressão tumoral e a metástase podem ser medidos in vivo. Criaram-se vários modelos de ratinho singénico para estudar a influência de polipéptidos, compostos ou outros tratamentos sobre a progressão tumoral. Nestes modelos, implantam-se células tumorais submetidas a 129 passagens em cultura em ratinhos da mesma estirpe que o dador do tumor. As células desenvolverão tumores com caracteristicas similares nos ratinhos receptores, e também será produzida a metástase em alguns dos modelos. Os modelos tumorais apropriados para os estudos dos presentes inventores incluem o carcinoma de pulmão de Lewis (ATCC N° CRL-1642) e o Melanoma B16 (ATCC N° CRL-6323), entre outros. Estes são duas linhas tumorais utilizadas comummente, singénicas para o ratinho C57BL6/J, que são cultivadas e manipuladas facilmente in vitro. Os tumores resultantes da implantação de quaisquer destas linhas celulares podem produzir metástase no pulmão em ratinhos C57BL6/J. 0 modelo de carcinoma de pulmão de Lewis foi utilizado recentemente em ratinhos para identificar um inibidor da angiogénese (0'Reilly MS, et al. Cell 79: 315-328, 1994). Tratam-se ratinhos C57BL6/J com um agente experimental por meio de uma injecção diária de proteína recombinante, agonista ou antagonista ou uma injecção diária de adenovirus recombinante. Três dias depois deste tratamento, implantam-se de 105 a 106 células embaixo da pele dorsal. Como alternativa, as próprias células podem ser infectadas com adenovirus recombinante, tal como um que expresse zcytorl71ig, antes da implantação de forma que a proteína seja sintetizada no local do tumor ou intracelularmente, ao invés de sistemicamente. Os ratinhos normalmente desenvolvem tumores visíveis em 5 dias. Os tumores são deixados a crescer durante um período de até 3 semanas, durante o qual podem alcançar um tamanho de 1500 -1800 m3 no grupo tratado de controlo. O tamanho do tumor e o peso corporal são monitorizados cuidadosamente ao longo de toda a experiência. No momento do sacrifício, retira-se o tumor e pesa-se junto com os pulmões e o fígado. Mostra-se que o peso do pulmão se correlaciona bem com a carga tumoral metastática. Como medida adicional, contam-se as metástases da superfície do pulmão. O tumor ressecado, os 130 pulmões e o fígado são preparados para o exame histopatológico, imunohistoquímica e hibridação in situ, utilizando métodos conhecidos na técnica e descritos no presente documento. A influência do polipéptido expresso em questão, por exemplo, zcytorl71ig, sobre a capacidade do tumor de adquirir o sistema vascular e passar por metástase pode ensaiar-se desta maneira. Além disso, aparte de utilizar adenovírus, as células implantadas podem ser transfectadas de forma transitória com zcytorl71ig. A utilização de transfectantes de zcytorl71ig estáveis assim como a utilização de promotores induzíveis para activar a expressão de zcytorl71ig in vivo são conhecidas na técnica e podem utilizar-se neste sistema para avaliar a indução de metástase por zcytorl71ig. Além disso, pode injectar-se directamente zcytorl71ig purificado ou meio acondicionado de zcytorl71ig neste modelo de ratinho, e portanto utilizar-se neste sistema. Como referência geral, veja-se 0'Reilly MS, et al. Cell 79:315-328, 1994; e Rusciano D, et al. Murine Models of Liver Metastasis. Invasion Metastase 14:349-361,1995.

Um receptor solúvel de citocina multimérico da presente invenção ou anticorpos contra o mesmo podem ser úteis no tratamento de tumorgénese, e portanto seriam úteis no tratamento de cancro. O zcytorl71ig é expresso em linfócitos T activados, monócitos e macrófagos, e está associado a uma região de cromossoma humano em que são comuns as translocações em leucemias. Além disso, mostra-se que zcytorl71ig actua por meio de um receptor de citocinas, zcytorl7, que também é expresso em linfócitos T activados, monócitos e macrófagos. Durante a estimulação de linfócitos T activados, monócitos e macrófagos por zcytorl71ig se poderia produzir um estado patológico humano tal como, por exemplo, um cancro de células imuness ou outros cancros. Como tal, a identificação da expressão de zcytorl71ig, polipéptidos (por exemplo, por anticorpos anti-zcytor171ig, 131 receptores de citocina multiméricos zcytorl7 solúveis (por exemplo, receptor de zcytorl7, heterodímeros (por exemplo, zcytor17/OSMRbeta, zcytor17/WSX-l), multímeros (por exemplo, zcytor17/OSMRbeta/WSX-l)), ou outros parceiros de ligação de zcytorl71ig) pode servir como diagnóstico e pode servir como antagonistas da actividade proliferativa de zcytorl71ig. 0 ligando poderia ser administrado em combinação com outros agentes que já são utilizados, incluindo agentes quimioterapêuticos convencionais assim como moduladores imunes tais como interferão alfa. Mostra-se que os interferões alfa/beta são eficazes para tratar algumas leucemias e modelos de doenças animais, e os efeitos inibidores do crescimento do interferão alfa e zcytorl71ig podem ser aditivos.

Acredita-se que as células NK desempenham um papel importante na eliminação de células tumorais metastáticas e os pacientes com metástase e tumores sólidos tiveram níveis reduzidos de actividade de células NK (Whiteside et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 230:221-244, 1998). Um agente que estimula as células NK seria útil na eliminação de tumores. A presente invenção proporciona um método de redução de monócitos/macrófagos neoplásicos que compreende administrar a um mamífero com um neoplasma de monócitos/macrófagos uma quantidade de uma composição incluindo um receptor solúvel de citocina multimérico ou anticorpo contra o mesmo suficiente para reduzir a proliferação dos monócitos/macrófagos neoplásicos. A presente invenção proporciona um método para inibir activação ou diferenciação de monócitos/macrófagos. Os monócitos são células diferenciadas incompletamente que migram a diversos tecidos em que maduram e se convertem em macrófagos. Os macrófagos desempenham um papel fundamental na resposta imune ao apresentar o antigénio aos linfócitos e desempenham um papel de apoio como células auxiliares aos 132 linfócitos ao secretar numerosas citocinas. Os macrófagos podem internalizar moléculas extracelulares e após a activação têm uma maior capacidade de destruir microrganismos intracelulares e células tumorais. Os macrófagos activados também estão envolvidos na estimulação da inflamação aguda ou local.

Em outro aspecto, a presente invenção proporciona um método de redução da proliferação de linfócitos B ou T neoplásicos que compreende administrar a um mamífero com um neoplasma de linfócitos B ou T uma quantidade de uma composição incluindo um receptor solúvel de citocina multimérico suficiente para reduzir a proliferação dos monócitos/macrófagos neoplásicos. Além disso, o antagonista de zcytorl71ig pode ser um ligando/toxina proteína de fusão.

Uma toxina de fusão de receptor de zcytorl7 de citocina multimérico -saporina pode ser utilizada contra uma série similar de leucemias e linfomas, ampliando a série de leucemias que pode ser tratada com zcytorl71ig. Por exemplo, ditas leucemias podem ser aquelas que sobre-expressam receptores de zcytorl7 (por exemplo, receptor de zcytorl7, heterodímeros (por exemplo zcytorl7/0SMRbeta, zcytorl7/WSX-l), multímeros (por exemplo zcytorl7/0SMPbeta/WSX)). A activação mediada por toxinas de fusão do receptor de zcytorl7, heterodímeros ou multímeros do receptor de zcytorl7 (por exemplo, zcytorl9/0SMRbeta, zcytorl7/WSX-l ou zcytorl9/WSX-l/0SMR) proporciona dois meios independentes para inibir o crescimento das células alvo, sendo o primeiro idêntico aos efeitos observados pelo ligando somente, e sendo o segundo devido à libertação da toxina por meio da internalização do receptor. 0 padrão de expressão restringido a linfóides e monócitos do receptor de zcytorl7 sugere que o conjugado de ligando-saporina pode ser tolerado pelos pacientes. A distribuição tissular de receptores para dada uma 133 citocina oferece uma forte indicação dos locais potenciais de acção dessa citocina. Observou-se a expressão de zcytorl71ig em monócitos e linfócitos B, com um aumento espectacular da expressão após a activação para linfócitos T CD3+, CD4+ e CD8+. Além disso, duas linhas celulares monociticas, THP-1 (Tsuchiya et al., Int. J. Câncer 26:171-176, 1980) e U937 (Sundstrom et al., Int. J. Câncer 17:565-577, 1976) também foram positivas para a expressão de zcytor17. A análise de Northern do receptor WSX-1 revelou transcritos em todos os tecidos examinados, com maiores níveis de expressão em baço, timo, gânglio linfático, medula óssea e leucócitos de sangue periférico humanos. Além disso, os níveis de expressão de WSX-1 aumentaram após a activação de linfócitos T.

Relatou-se que a expressão de OSMR é muito ampla (Mosley et al, JBC 271:32635-32643, 1996). Esta distribuição de receptores zcytorl7, WSX-1 e OSM confirma um papel para zcytorl71ig em respostas imunes, especialmente a expansão de linfócitos T após a activação ou um papel no braço de monócitos/macrófagos do sistema imune.

Assim, formas de realização particulares da presente invenção são dirigidas à utilização de zcytorl7/WSX-l/OSMR solúvel, e heterodímeros de zcytorl7/OSMR como antagonistas em doenças ou afecções inflamatórias e imunes tais como pancreatite, diabetes de tipo I (IDDM), cancro pancreático, pancreatite, doença de Graves, doença inflamatória do intestino (IEE), doença de Crohn, cancro de cólon e intestinal, diverticulose, doença autoimune, septicemia, transplante de órgãos ou de medula óssea; inflamação devido a traumatismo, cirurgia ou infecção; amiloidose; esplenomegalia; doença de enxerto contra hospedeiro; e quando a inibição da inflamação, supressão imune, redução da proliferação de células hematopoiéticas, imunes, 134 inflamatórias ou linfóides, macrófagos, linfócitos T (incluindo células Thl e Th2, células CD4+ e CD8+), supressão de resposta imune a um patogénio ou antigénio. Além disso, a presença de expressão de zcytorl7 em células imuness activadas tais como células CD4+ e CD19+ activadas mostrou que o receptor de zcytorl7 pode estar envolvido em reacções defensivas imunes corporais contra invasores estranhos tais como microrganismos e detritos celulares, e poderia desempenhar um papel em respostas imunes durante a inflamação e a formação de cancros. Como tais, os anticorpos da presente invenção que são agonistas ou antagonistas para a função do receptor de zcytorl7, tais como zcytorl71ig, podem ser de utilidade para modificar respostas imunes e inflamação. A estrutura e a expressão tissular de zcytorl71ig sugerem um papel no desenvolvimento hematopoiético ou de timócitos precoce e na regulação da resposta imune ou inflamação. Estes processos envolvem a estimulação da proliferação celular e a diferenciação em resposta à ligação de uma ou mais citocinas aos seus receptores cognatos. Em vista da distribuição tissular observada para este zcytorl71ig, os agonistas (incluindo o receptor ou receptores naturais) e os antagonistas têm um enorme potencial em aplicações tanto in vitro como in vivo. Os compostos identificados como agonistas de zcytorl71ig são úteis para estimular a proliferação e o desenvolvimento de células alvo in vitro e in vivo. Por exemplo, os compostos agonistas, zcytorl71ig, ou anticorpos anti- zcytorl71ig são úteis como componentes de um meio de cultura celular definido, e podem utilizar-se em separado ou em combinação com outras citocinas e hormonas para substituir o soro que é utilizado comummente nas culturas celulares. Desta maneira, os agonistas são úteis para promover especificamente o crescimento e/ou desenvolvimento ou activação de monócitos, linfócitos T, linfócitos B e outras 135 células dos linhagens linfóide e mielóide, e células hematopoiéticas em cultura.

As moléculas da presente invenção têm particular utilidade particular no braço de monócitos/macrófagos do sistema imune. Conhecem-se métodos gue podem avaliar dita actividade. Por exemplo, o interferão gama (IFNy) é um potente activador de fagócitos mononucleares. Por exemplo, um aumento na expressão de zcytorl7 após a activação de células THP-1 (N° do ATCC TIB-202) com interferão gama poderia sugerir que este receptor está envolvido na activação de monócitos. Os monócitos são células incompletamente diferenciadas que migram a diversos tecidos em que maduram e se convertem em macrófagos. Os macrófagos desempenham um papel fundamental na resposta imune ao apresentar o antigénio aos linfócitos e desempenham um papel de apoio como células auxiliares aos linfócitos ao secretar numerosas citocinas. Os macrófagos podem internalizar moléculas extracelulares e após a activação têm uma maior capacidade de destruir microrganismos intracelulares e células tumorais. Os macrófagos activados também estão envolvidos na estimulação da inflamação aguda ou local. Além disso, mostra-se que a função de monócitos-macrófagos é anormal numa variedade de estados patológicos. Por exemplo, veja-se Johnston, RB, New Eng. J. Med. 318:747-752, 1998.

Um perito na especialidade reconhecerá que são úteis os agonistas de receptor de zcytorl7 de citocina multimérico, tal como zcytorl71ig. Por exemplo, relatou-se uma migração reduzida de monócitos em populações com uma predisposição a infecções, tais como bebés recém-nascidos, pacientes que recebem corticosteróides ou outra terapêutica imunosupressora, e pacientes com diabetes mellitus, queimaduras ou SIDA. Agonistas para receptor de citocina multimérico zcytorl7, tal como zcytorl71ig, poderiam produzir um aumento na capacidade dos monócitos de migrar e 136 possivelmente prevenir a infecção nestas populações. Também existe um profundo defeito de destruição fagocitica pelos fagócitos mononucleares de pacientes com doença granulomatosa crónica. Isto tem como resultado a formação de abscessos subcutâneos, assim como abscessos no fígado, pulmões, baço e gânglios linfáticos. Um agonista de receptor de citocina multimérico zcytorl7, tal como zcytorl71ig, poderia corrigir ou melhorar este defeito fagocítico. Além disso, relatou-se uma citotoxicidade defeituosa de monócitos em pacientes com cancro e sindrome de Wiskott-Aldrich (eczema, trombocitopenia e infecções recorrentes). A activação de monócitos por agonistas de receptor de citocina multimérico zcytorl7, tal como zcytorl71ig, poderia ajudar no tratamento destas afecções. 0 sistema de monócitos-macrófagos está envolvido de forma proeminente em várias doenças de armazenamento de lípidos (esfingolipidoses) tais como a doença de Gaucher. A resistência à infecção pode ser afectada por um defeito na função dos macrófagos, que poderia tratar-se por agonistas do receptor de zcytorl7 de citocina multimérico tal como zcytorl71ig.

Além disso, um perito na especialidade reconhecerá que são úteis os antagonistas de um receptor de zcytorl7 de citocina multimérico. Por exemplo, em lesões ateroscleróticas, uma das primeiras anormalidades é a localização de monócitos/macrófagos em células endoteliais. Estas lesões poderiam ser prevenidas por meio da utilização de antagonistas de zcytorl71ig. Receptores de citocina multiméricos solúveis, Zcytorl7 tal como, por exemplo, heterodímeros e trímeros, podem também ser usados como antagonistas ao zcytorl71ig. Além disso, a leucemia monoblástica está associada a uma variedade de anormalidades clínicas que reflectem a libertação dos produtos biológicos dos macrófagos, os exemplos incluem altos níveis de lisozima no soro e urina e febres elevadas. 137

Além disso, ditas leucemias apresentam um aumento anormal de células monociticas. Estes efeitos possivelmente poderiam ser prevenidos por antagonistas para zcytorl71ig, tais como os descritos no presente documento.

Utilizando métodos conhecidos na técnica e revelados no presente documento, um perito poderia avaliar facilmente a actividade de um receptor de zcytorl7 de citocina multimérico nos estados patológicos revelados no presente documento, inflamação, cancro, ou infecção bem como outros estados patológicos que envolvem células monociticas. Além disso, como zcytorl71ig é expresso de uma maneira especifica de linfócitos T, macrófagos e monócitos, e estas doenças envolvem anormalidades em células monociticas, tais como proliferação, função, localização e activação celular, os polinucleótidos, polipéptidos, e anticorpos da presente invenção podem ser usados como diagnósticos para detectar ditas anormalidades de células monociticas, e indicar a presença de doença. Ditos métodos envolvem colher uma amostra biológica de um paciente, tal como sangue, saliva ou biopsia, e a comparação da mesma com uma amostra de controlo normal. Podem utilizar-se métodos histológicos, citológicos, citometria de fluxo, métodos bioquímicos e outros métodos para determinar os níveis relativos ou a localização de zcytorl71ig, ou células que expressam zcytorl71ig, isto é, monócitos, na amostra do paciente em comparação com o controlo normal. Uma mudança no nível (aumento ou redução) da expressão de zcytorl71ig, ou uma mudança no número de localização de monócitos (por exemplo, aumento ou infiltração de células monociticas em tecidos em que normalmente não estão presentes) em comparação com um controlo indicaria doença. Ditos métodos de diagnóstico também podem incluir a utilização de marcadores radiométricos, fluorescentes e colorimétricos associados aos polinucleótidos, polipéptidos ou anticorpos da presente invenção. Tais métodos são bem conhecidos na técnica e 138 revelados no presente documento.

Podem utilizar-se sequências de aminoácidos que têm actividade de zcytorl71iq para modular o sistema imune por liqação ao receptor de zcytorl7, e portanto, prevenir a liqação de zcytorl71iq com o receptor de zcytorl71ig endógeno. Também podem ser utilizados antagonistas de zcytorl71ig, tal como um receptor de zcytorl7 de citocina multimérico, para modular o sistema imune por inibição da ligação de zcytorl71ig com o receptor de zcytorl71ig endógeno. Por conseguinte, a presente invenção inclui a utilização de um receptor de citocina multimérico que pode ser também usado para tratar um sujeito que produz um excesso de zcytorl71ig ou Zcytorl7 que compreende receptor(es). Sujeitos adequados incluem mamíferos, tal como seres humanos ou animais veterinários.

Mostra-se que zcytorl71ig é expresso em células mononucleares activadas, e pode estar envolvido na regulação da inflamação. Como tal, os polipéptidos descritos no presente documento podem ser ensaiados e utilizados por sua capacidade de modificar a inflamação ou podem ser utilizados como um marcador de inflamação. Na técnica conhecem-se métodos para determinar qualidades pró-inflamatórias e anti-inflamatórias de zcytorl71ig e analisam-se no presente documento. Além disso, pode estar envolvido na regulação positiva da produção de reagentes de fase aguda, tais como amilóide A de soro (SAA), al-antiquimotripsina e haptoglobina, e a expressão de ligando do receptor de zcytorl7 pode estar aumentada após a injecção de lipopolissacárido (LPS) in vivo que está envolvido na resposta inflamatória (Dumoutier, L. et al. , Proc. Nat'l. Acad. Sei. 97:10144-10149, 2000). A produção de proteínas de fase aguda, tais como SAA, é considerada um mecanismo de sobrevivência a curto prazo em que a inflamação é benéfica; no entanto, a manutenção de proteínas de fase aguda durante períodos mais prolongados 139 contribui à inflamação crónica e pode ser prejudicial para a saúde humana. Como revisão, veja-se Uhlar, CM e Whitehead, AS, Eur. J. Biochem. 265:501-523, 1999, e Baumann H. and Gauldie, J. Immunology Today 15:74-80, 1994. Além disso, a proteína SAA de fase aguda está envolvida na patogénese de várias doenças inflamatórias crónicas, está envolvida na aterosclerose e artrite reumatóide, e é o precursor da proteína A amilóide depositada na amiloidose (Uhlar, CM e Whitehead, supra.). Desta maneira, quando há um ligando tal como zcytorl71ig que actua como molécula pró-inflamatória e induz a produção de SAA, os antagonistas seriam úteis para tratar a doença inflamatória e outras doenças associadas a proteínas de resposta de fase aguda induzidas pelo ligando. Ditos antagonistas são definidos nas reivindicações. Por exemplo, a invenção permite reduzir a inflamação num mamífero com inflamação utilizando uma quantidade de anticorpo anti-zcytorl71ig (por exemplo, anticorpo neutralizador) como é definido nas reivindicações que é suficiente para reduzir a inflamação. Além disso, a memória descritiva descreve a supressão de uma resposta inflamatória num mamífero com inflamação por meio de: (1) a determinação de um nível de proteína amilóide A em soro; (2) a administração de uma composição que compreende um polipéptido zcytorl71ig ou anticorpo anti-zcytorl71ig como é descrito no presente documento num veículo farmaceuticamente aceitável; (3) a determinação do nível posterior à administração de proteína amilóide A em soro; (4) a comparação do nível de proteína A amilóide em soro na etapa (1) com o nível de proteína A amilóide em soro da etapa (3), em que a ausência de um aumento ou uma redução no nível em soro de proteína A amilóide é indicativa de supressão de uma resposta inflamatória.

Do mesmo modo que zcytorl71ig, a análise da distribuição tissular do ARNm que corresponde ao ADNc do receptor de zcytorl7 mostrou que o nível de ARNm era máximo 140 em monócitos e células de próstata, e está elevado em monócitos activados, e células CD4+ activadas, CD8+ activadas e CD3+ activadas. Portanto, o receptor de zcytorl7 também está envolvido na indução de respostas inflamatórias e imunes. Desta maneira, certas formas de realização particulares da presente invenção dirigem-se a utilização de anticorpos contra zcytorl71ig, e zcytorl71ig, bem como heterodímeros de receptor solúvel de zcytorl7 como antagonistas em doenças inflamatórias ou auto-imune, ou afecções tais como pancreatite, diabetes tipo I (IDDM), cancro pacreático, pancreatite, doença de Grave, doença inflamatória do intestino (DII), doença de Crohn, cancro intestinal e de colon, diverticulose, doença autoimune, septicemia, transplante de órgãos ou de medula óssea; inflamação devido a traumatismo, cirurgia ou infecção; amiloidose; esplenomegalia; doença de enxerto contra hospedeiro; e quando a inibição da inflamação, supressão imune, redução da proliferação de células hematopoiéticas, imunes, inflamatórias ou linfóides, macrófagos, linfócitos T (incluindo células Thl e Th2, células CD4+ e CD8+), supressão da resposta imune a um patogénio ou antigénio. Além disso, a presença de receptor de zcytorl7 e expressão de zcytorl71ig em células imuness activadas tais como células CD3+ activadas, monócitos, células CD4+ e CD19+ mostrou que o receptor de zcytorl7 pode estar envolvido nas reacções defensivas imunes do corpo contra invasores estranhos: tais como microrganismos e detritos celulares, e poderia desempenhar um papel em respostas imunes durante a inflamação e a formação de cancros. Como tais, zcytorl71ig e os anticorpos de zcytorl71ig da presente invenção que são agonistas ou antagonistas da função do receptor de zcytorl7 podem utilizar-se para modificar a resposta imune e a inflamação.

Além disso, polipéptido de zcytorl71igs que se liga a receptores de citocina multiméricos de zcytorl7 e 141 anticorpos contra os mesmos são úteis para: 1) A Antagonizar ou bloquear a sinalização através de um receptor de zcytorl7 de citocina multimérico no tratamento da inflamação aguda, inflamação como resultado de traumatismo, lesão tissular, cirurgia, septicemia ou infecção, e doenças inflamatórias crónicas tais como asma, doença inflamatória do intestino (DII), colite crónica, esplenomegalia, artrite reumatóide, episódios inflamatórios agudos recorrentes (por exemplo, tuberculose) e tratamento de amiloidose e aterosclerose, doença de Castleman, asma e outras doenças associadas à indução de resposta de fase aguda. 2) Antagonizar ou bloquear a sinalização através do receptor de zcytorl7 de citocina multimérico no tratamento de doenças auto-imune tal como IDDM, esclerose múltipla (MS), Lúpus eritematoso sistémico (SLE), miastenia grave, artrite reumatóide, e DII para prevenir ou inibir a sinalização em células imuness (por exemplo linfócitos, monócitos, leucócitos) por meio do receptor de zcytorl7 (Hughes C et al., J. Immunol 153: 3319-3325, 1994). A asma, a alergia e outras doenças atópicas podem ser tratadas com um MAb contra, por exemplo, receptores solúveis de citocina multiméricos de zcytorl7 ou heterodimeros zcytor17/CRF2-4, para inibir a resposta imune ou reduzir as células ofensivas. 0 bloqueio ou inibição da sinalização através de receptor de zcytorl7 de citocina multimérico, utilizando os polipéptidos e anticorpos da presente invenção também podem ser benéficos para doenças do pâncreas, rim, hipófise e células neuronais. Podem beneficiar-se a IDDM (diabetes mellitus dependente de insulina), NIDDM (diabetes mellitus não dependente de insulina), pancreatite e carcinoma pancreático. Receptor de zcytor!7 de citocina 142 multimérico pode servir como um alvo para terapêutica de cancro com MAb onde um MAb antagonizante inibe crescimento do cancro e e se dirige a destruição mediada pelo sistema imune. (Holliger P, e Hoogenboom, H: Nature Biotech. 16: 1015-1016, 1998). Mabs contra contra monómeros, homodímeros, heterodímeros e multimeros de receptor de zcytorl7 solúvel também podem ser úteis para tratar nefropatias tais como glomeruloesclerose, neuropatia membranosa, amiloidose (que também afecta ao rim entre outros tecidos), arteriosclerose renal, glomerulonefrite de diversas origens, doenças fibroproliferativas do rim, assim como disfunção renal associada a LES, IDDM (diabetes mellitus dependente de insulina), diabetes de tipo II (NIDDM), tumores renais e outras doenças.

3) Agonizar ou iniciar a sinalização através do receptor de zcytorl7 de citocina multimérico no tratamento de doenças auto-imunes tal como IDDM, MS, SLE, miastenia grave, artrite reumatoide, e DII. Zcytorl71ig pode sinalizar aos linfócitos ou outras células imuness para que se diferenciem, alterem a proliferação ou mudem a produção de citocinas ou proteínas da superfície celular que melhorem a autoimunidade. Especificamente, a modulação de uma resposta de linfócitos T auxiliares a um padrão alternativo de secreção de citocinas pode desviar uma resposta autoimune para melhorar a doença (Smith JA et al., J. Immunol. 160:4841-4849, 1998). De forma similar, zcytorl71ig pode ser utilizado para sinalizar, reduzir e desviar células imunes envolvidas na asma, alergia e doenças atópicas. A sinalização através do receptor de zcytorl7 de citocina multimérico também pode ser benéfico para doenças do pâncreas, rim, pituitária e células neuronais. Podem beneficiar-se a IDDM, NIDDM, pancreatite e carcinoma pancreático. O 143 zcytorl7 pode servir como alvo para a terapêutica com MAb de cancro pancreático quando a sinalização de um MAb inibe o crescimento do cancro e se dirige à destruição mediada pelo sistema imune (Tutt, AL et al., J Immunol. 161: 3175-3185, 1998). De forma similar, podem ser tratados com anticorpos monoclonais (por exemplo, anticorpos neutralizadores) contra receptores solúveis que compreendem zcytorl7 da presente invenção leucemias específicas de linfócitos T, linfomas, discrasia de células plasmáticas (por exemplo, mieloma múltiplo) e carcinomas.

Os receptores solúveis de citocina multiméricos de zcytorl7 como descritos no presente documento podem ser utilizados para neutralizar/bloquear a actividade do ligando do receptor de zcytorl7 no tratamento de doenças auto-imunes, doença atópica, NIDDM, pancreatite e disfunção renal como foi descrito anteriormente. Pode utilizar-se uma forma solúvel do receptor de zcytorl7 de citocina multimérico pode ser usada uma resposta imune mediada por linfócitos T e/ou promover a produção de IL-4 ou outras citocinas por linfócitos ou outras células imuness.

Um receptor solúvel de zcytorl7 de citocina multimérico úteis como antagonistas de zcytorl71ig. Ditos efeitos antagonistas podem ser conseguidos por neutralização directa ou ligação do seu ligando natural. Além das utilizações antagonísticas, os receptores solúveis podem ligar-se a zcytorl71ig e actuar como proteínas veículo ou portadoras, para transportar zcytorl71ig a diferentes tecidos, órgãos e células dentro do corpo. Como tais, os receptores solúveis podem fusionar-se ou acoplar-se a moléculas, polipéptidos ou resíduos químicos que dirigem o complexo receptor solúvel-ligando a um local específico, tal como um tecido, célula imune especifica, monócitos ou tumor. Por exemplo, na infecção aguda ou alguns cancros, podem ser obtidos benefícios pela indução 144 de inflamação e proteínas de resposta local de fase aguda. Desta maneira, os receptores solúveis descritos no presente documento ou anticorpos da presente invenção podem ser utilizados para dirigir especificamente a acção de um ligando zcytorl71ig pró-inflamatório. Veja-se Cosman, D. Cytokine 5: 95-106,1993; e Femandez-Botran, R. Exp. Opin. Invest. Drugs 9:497-513, 2000.

Além disso, os receptores solúveis podem ser utilizados para estabilizar o zcytorl71ig, para aumentar a biodisponibilidade, longevidade terapêutica e/ou eficácia do Ligando por meio da estabilização do Ligando contra a degradação ou eliminação, ou por meio do direccionamento do ligando a um local de acção dentro do corpo. Por exemplo, o complexo IL-6/IL6-R solúvel de ocorrência natural estabiliza a IL-6 e pode sinalizar através do receptor gpl30. Veja-se Cosman, D. supra., e Fernandez-Botran, R. supra. Além disso, zcytorl71ig pode ser combinado com um ligando cognato tal como o seu ligando para compreender um complexo ligando/receptor solúvel. Ditos complexos podem ser utilizados para estimular respostas de células que apresentam uma subunidade de receptor de companhia. A especificidade celular dos complexos de receptor de zcytorl7 de citocina multimérico /zcytorl71ig pode diferir da observada do ligando administrado sozinho. Além disso, os complexos podem ter propriedades farmacocinéticas distintas tais como um efeito sobre a semivida, dose/resposta e especificidade de órgão ou tecido. Complexos de receptor de zcytorl7 de citocina multimérico/ligando assim podem ter actividade agonista para aumentar uma resposta imune ou estimular às células mesangiais ou estimular às células hepáticas. Como alternativa, somente os tecidos que expressam uma subunidade de sinalização que forma heterodímero com o complexo podem ser afectados de forma análoga à resposta aos complexos IL6/IL6R (Hirota H. et ai., Proc. Nat'1. 145

Acad. Sei. 92:4862-4866, 1995; Hirano, T. em Thomason, A. (Ed.) "The Cytokine Hanbook", 3a Ed., p. 208-209) . Os complexos receptor solúvel/citocina para IL12 e CNTF apresentam actividades similares. O zcytorl71ig também pode ser utilizado dentro de sistemas de diagnóstico para a detecção de níveis circulantes de ligando, e na detecção de uma resposta inflamatória de fase aguda. Dentro de uma forma de realização relacionada, podem utilizar-se anticorpos ou outros agentes que se ligam especificamente a zcytorl71ig para detectar polipéptidos zcytorl71ig circulantes; pelo contrário, o próprio zcytorl71ig pode ser utilizado para detectar polipéptidos do receptor circulantes ou de acção local. Os níveis elevados ou reduzidos de polipéptidos de ligando ou receptor podem ser indicativos de estados patológicos, incluindo inflamação ou cancro. Além disso, a detecção de proteínas ou moléculas de fase aguda tais como zcytorl71ig pode ser indicativa de um estado inflamatório crónico em certos estados patológicos (por exemplo, artrite reumatóide). A detecção de ditas afecções serve para ajudar ao diagnóstico da doença além de ajudar ao médico a escolher uma terapêutica apropriada.

Os polinucleótidos que codificam um receptor de zcytorl7 de citocina multimérico são úteis dentro de aplicações de terapêutica génica nas quais se deseja aumentar ou inibir a actividade de zcytorl71ig. Se um mamífero tiver um gene de zcytorl71ig mutado ou ausente, o gene de zcytorl71ig pode ser introduzido nas células do mamífero. Numa forma de realização, introduz-se um gene que codifica um polipéptido zcytorl71ig in vivo num vector virai. Ditos vectores incluem um vírus de ADN atenuado ou defeituoso tal como, mas sem limitação, o vírus do herpes simples (VHS), papilomavírus, vírus de Epstein Barr (VEB), adenovírus, vírus adeno-associado (VAA) e similares. Preferem-se vírus defeituosos, que não possuem totalmente 146 ou quase totalmente genes virais. Um vírus defeituoso não é infeccioso depois de ser introduzido numa célula. A utilização de vectores virais defeituosos permite a administração às células numa área localizada específica, sem preocupação de que o vector possa infectar outras células. Os exemplos de vectores particulares incluem, mas sem limitação, vector de vírus do herpes simples 1 defeituoso (VHS1) (Kaplitt et ai., Molec. Cell. Neurosci. 2:320-30, 1991); um vector adenoviral atenuado, tal como o vector descrito por Stratford-Perricaudet et al., J. Clin. Invest. 90:626-30, 1992; e um vector de vírus adeno-associado defeituoso (Samulski et ai., J. Virol. 61:3096-101,1987; Samulski et ai., J. Virol. 63:3822-8, 1989).

Um gene de zcytorl7 da presente invenção pode ser introduzido num vector retroviral, por exemplo, como é descrito em Anderson et ai., Patente US N° 5.399.346; Mann et al. Cell 33:153, 1983; Temin et al., Patente US N° 4.650.764; Temin et al., Patente US N° 4.980.289; Markowitz et al., J. Virol. 62:1120, 1988; Ternin et al., Patente US N° 5.124.263; Publicação de Patente Internacional N° WO 95/07358, publicada 16 de Março de 1995 por Dougherty et al. ; e Kuo et al., Blood 82:845, 1993. Como alternativa, o vector pode ser introduzido por lipofecção in vivo utilizando lipossomas. Podem utilizar-se lípidos catiónicos sintéticos para preparar lipossomas, para a transfecção in vivo de um gene que codifica um marcador (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:7413-7, 1987; Mackey et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:8027-31, 1988). A utilização de lipofecção para introduzir genes exógenos em órgãos específicos in vivo tem certas vantagens práticas. O direcionamento molecular de lipossomas a células específicas representa uma área de efeitos benéficos. Mais particularmente, o direccionamento da transfecção a células particulares representa uma área de efeitos benéficos. Por exemplo, o direcionamento da transfecção a tipos celulares 147 particulares seria particularmente vantajoso num tecido com heterogeneidade celular, tal como o sistema imune, pâncreas, figado, rim e cérebro. Os lipidos podem acoplar-se quimicamente a outras moléculas para o direcionamento. Os péptidos dirigidos (por exemplo hormonas ou neurotransmissores), proteínas tais como anticorpos ou moléculas não peptídicas podem ser acopladas a lipossomas quimicamente. É possível retirar as células alvo do corpo para introduzir o vector como um plasmídeo de ADN nu; e depois reimplantar as células transformadas no corpo. Os vectores de ADN nu para terapêutica génica podem ser introduzidos nas células hospedeiras desejadas por métodos conhecidos na técnica, por exemplo, transfecção, electroporação, microinjecção, transdução, fusão celular, DEAE dextrano, precipitação com fosfato de cálcio, utilização de uma bombardeamento de partículas ou utilização de um transportador de vectores de ADN. Veja-se, por exemplo, Wu et aI.,J. Biol. Chem, 267:963-7, 1992; Wu et al., J. Biol. Chem. 263:14621-4, 1988.

Pode utilizar-se a metodologia antisense para inibir a transcrição do gene de zcytorl71ig, tal como para inibir a proliferação celular in vivo. Desenham-se polinucleótidos que são complementares a um segmento de um polinucleótido que codifica zcytorl71ig (por exemplo, um polinucleótido como é exposto nas SEQ ID NO: 110. SEQ ID NO: 108, ou SEQ ID NO: 4) para ligar-se ao ARNm que codifica zcytorl71ig e inibir a tradução de dito ARNm. Ditos polinucleótidos antisense são utilizados para inibir a expressão de genes que codificam o polipéptido zcytorl71ig numa cultura celular ou num indivíduo.

Também podem ser gerados ratinhos modificados por engenharia genética que expressam o gene de zcytorl71ig, denominados "ratinhos transgénicos" e ratinhos que apresentam uma ausência completa de função do gene 148 zcytorl71ig, denominados "ratinhos knock out" (Snouwaert et al., Science 257:1083, 1992; Lowell et ai., Nature 366:740-42, 1993; Capecchi, M.R., Science 244: 1288-1292, 1989; Palmiter, R.D. et al. Annu Rev Genet. 20: 465-499, 1986) . Por exemplo, podem utilizar-se ratinhos transgénicos que sobre-expressam zcytorl71ig, de forma ubíqua ou sob um promotor específico de tecido ou restringido a um tecido para perguntar se a sobre-expressão produz um fenótipo. Por exemplo, a sobre-expressão de um polipéptido zcytorl71ig de tipo selvagem, fragmento do polipéptido ou um mutante do mesmo pode alterar processos celulares normais, tendo como resultado um fenótipo que identifica um tecido em que a expressão de zcytorl71ig é funcionalmente relevante e pode indicar um alvo terapêutico para o zcytorl71ig, seus agonistas ou antagonistas. Por exemplo, um ratinho transgénico preferido para modificar-se por engenharia genética é um que sobre-expressa o zcytorl71ig (resíduos de aminoácido 23-164 da SEQ ID NO: 2; ou 24-163 da SEQ ID NO: 11). Além disso, dita sobre-expressão pode ter como resultado um fenótipo que amostra similaridade com doenças humanas. De forma similar, podem utilizar-se ratinhos knockout para zcytorl71ig para determinar se zcytorl71ig é absolutamente necessário in vivo. O fenótipo de ratinhos knockout é preditivo dos efeitos in vivo que pode ter um antagonista de zcytorl71ig, tal como um receptor solúvel de zcytorl7 de citocina multimérico. O ADNc de zcytorl71ig humano ou de ratinho descrito no presente documento pode utilizar-se para gerar ratinhos knockout. Estes ratinhos podem ser utilizados para estudar o gene de zcytorl71ig e a proteína codificada pelo mesmo num sistema in vivo, e podem ser utilizados como modelos in vivo para as doenças humanas correspondentes. Além disso, pode utilizar-se a expressão em ratinhos transgénicos de polinucleótidos antisenso de zcytorl71ig ou ribozimas dirigidas contra zcytorl71ig, descrita no presente documento, de forma análoga aos 149 ratinhos transgénicos descritos anteriormente. Também podem ser realizados estudos por meio da administração de proteína zcytorl71ig purificada. A presente invenção também proporciona uma composição que inclui uma quantidade eficaz de um receptor solúvel de citocina multimérico que compreende um polipéptido que compreende do resíduo de aminoácido 20 ao resíduo de aminoácido 543 da SEQ ID NO: 111 e pelo menos uma porção de pelo menos um receptor de citocina de classe I; e um veículo farmaceuticamente aceitável. O polipéptido pode ser compreendido de vários fragmentos ou porções do domínio extracelular da SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 109, e/ou SEQ ID NO: 5, tal como por exemplo, do resíduo de aminoácido 20 ao resíduo de aminoácido 227 da SEQ ID NO: 111 e do resíduo de aminoácido 20 ao resíduo de aminoácido 519 da SEQ ID NO: 111. A pelo menos uma porção de pelo menos um receptor de citocina de classe I pode incluir, por exemplo, uma porção da SEQ ID NO: 9 e/ou uma porção da SEQ ID NO: 7, tal como, por exemplo, do resíduo de aminoácido 28 ao resíduo de aminoácido 429 da SEQ ID NO: 7, do resíduo de aminoácido 35 ao resíduo de aminoácido 137 da SEQ ID NO: 7, do resíduo de aminoácido 240 ao resíduo de aminoácido 342 da SEQ ID NO: 7, do resíduo de aminoácido 348 ao resíduo de aminoácido 429 da SEQ ID NO: 7, do resíduo de aminoácido 28 ao resíduo de aminoácido 739 da SEQ ID NO: 7, e/ou combinações dos mesmos. O receptor de citocina multimérico pode incluir ainda uma etiqueta de afinidade como descrita no presente documento. A presente invenção também proporciona uma composição de inibição de célula imune que inclui uma quantidade eficaz de um receptor solúvel de citocina multimérico que compreende um polipéptido que compreende do resíduo de aminoácido 20 ao resíduo de aminoácido 227 da SEQ ID NO: 111 e pelo menos uma porção de pelo menos um receptor de citocina de classe I; e um veículo farmaceuticamente 150 aceitável, em que o receptor solúvel de citocina multimérico inibe a proliferação de células imunes. A presente invenção também proporciona uma composição de inibição de célula inflamatória que inclui uma quantidade eficaz de um receptor solúvel de citocina multimérico que compreende um polipéptido que compreende do resíduo de aminoácido 20 ao resíduo de aminoácido 227 da SEQ ID NO: 111 e pelo menos uma porção de pelo menos um receptor de citocina de classe I; e um veículo farmaceuticamente aceitável, em que o receptor solúvel de citocina multimérico inibe a proliferação de células inflamatórias.

As provas experimentais sugerem um papel de zcytorl71ig na progressão de doenças que envolvem a pele ou epitélio de superfícies internas, tais como, por exemplo, intestino grosso, intestino delgado, pâncreas, pulmão, próstata, útero e similares. Em primeiro lugar, como é revelado no presente documento, os receptores de zcytorl7, incluindo tanto o receptor OSM beta como zcytorl7, são expressos em vários tipos celulares localizados em superfícies epiteliais que incluem linhas celulares derivadas de epitélio pulmonar, fibroblastos pulmonares, próstata, cólon, mama, epitélio hepático, osso e epitélio cutâneo, fibroblastos ósseos e similares. Além disso, como é revelado no presente documento, os exemplos de cada um destes tipos celulares respondiam à activação por zcytorl71ig de uma construção indicadora STAT. Além disso, várias linhas celulares respondiam à estimulação por zcytorl71ig por meio da produção de maiores níveis de IL-6, IL-8, MCP-1 (um factor quimiotáctico) como é descrito no presente documento. Em conjunto, estes dados sugerem um papel para zcytorl71ig em doenças que envolvem o epitélio, tais como, por exemplo, dermatite atópica; dermatite; psoríase; artrite psoriásica, eczema, gengivite, doença periodontal; doenças inflamatórias do intestino (DII) (por 151 exemplo, colite ulcerativa, doença de Crohn); distúrbios reprodutivos, tais como, por exemplo, displasia cervical, cancro cervical, outras doenças cutâneas tais como cancros: sarcomas, carcinomas, melanomas, etc., isto é, não somente doenças inflamatórias, uma vez que o sistema imune está envolvido na activação/cura de cancros; doenças que envolvem disfunção de barreiras, tais como, por exemplo, doença de enxerto contra hospedeiro (GVHD) e sindrome do intestino irritável (SII); e doenças que envolvem o epitélio pulmonar, tais como asma, enfisema e similares. Além disso, a libertação de citocinas IL-6, IL-8 e MPC-1 por células expostas a zcytorl71iq sugere que zcytorl71ig está envolvido na inflamação. Portanto, a regulação de zcytorl71ig pode ser útil no tratamento de doenças auto-imunes, inflamatórias ou cancerosas associadas aos tecidos que expressam o receptor. Estas doenças incluem, por exemplo, prostatite, hepatite, osteoartrite e similares. 0 zcytorl71ig pode regular positivamente ou negativamente, directamente ou indirectamente estas doenças. Portanto, a administração de zcytorl71ig pode ser utilizada para tratar doenças como essas descritas no presente documento directamente ou com moléculas que inibem a actividade de zcytorl71ig que incluem, por exemplo, anticorpos monoclonais contra zcytorl71ig ou anticorpos monoclonais contra zcytorl71ig, ou anticorpos monoclonais que reconhecem o complexo de receptor de zcytorl7 e OSM beta.

Os dados também sugerem que zcytorl71ig pode estar envolvido na regulação de doenças mediadas por linfócitos T TH2. Em primeiro lugar, zcytorl71ig é feito pela subsérie TH2 de linfócitos T activados. As células TH2 expressam mais zcytorl71ig que as células TH1. Além disso, estimularam-se pelo menos duas linhas de células epiteliais pulmonares (SK-LU-1, A549) para aumentar o ARNm do receptor de IL13 alfa-2 em resposta à estimulação por ligando de zcytorl7 como é descrito no presente documento. Existe uma 152 associação da cadeia alfa2 do receptor de IL-13 e a tumorigenicidade de tumores pancreáticos e de mama humanos. Isto sugere que zcytorl71ig pode desempenhar um papel na regulação da tumorigenicidade destes tipos de cancros, assim como de outros cancros. Portanto, a administração de um antagonista de zcytorl71ig ou a utilização directa de zcytorl71ig pode ser útil no tratamento destes tipos de cancros, benignos ou malignos e em diversos graus (graus I-IV) e estágios (por exemplo, métodos de classificação de estágios TNM ou AJC) do desenvolvimento tumoral, em mamíferos, preferentemente seres humanos.

Sabe-se bem na técnica que a IL13 está envolvida na geração de células TH2 activadas e em doenças mediadas por TH2, tais como asma, dermatite atópica e similares. 0 zcytorl71ig ou os antagonistas de zcytorl71ig podem ser úteis no tratamento de doenças nas quais estão envolvidos os linfócitos T TH2. Isto incluiria doenças tais como, por exemplo, dermatite atópica, asma, assim como outras doenças que se exacerbam por células TH2 activadas. A implicação de zcytorl71ig em doenças, tais como, por exemplo, dermatite atópica, também se confirma pelo fenótipo dos ratinhos transgénicos que sobre-expressam zcytorl71ig e desenvolvem sintomas de dermatite atópica como é descrito no presente documento.

Apesar da expressão preferente de zcytorl71ig pelas células TH2, existe ainda alguma expressão de zcytorl71ig nas células TH1 e nos linfócitos T CD8+. Portanto, zcytorl71ig ou seus antagonistas podem ser úteis no tratamento de doenças que envolvem a modulação imune de linfócitos T activos que incluem, por exemplo, infecção virai, cancros, rejeição de enxertos e similares.

Zyctorl71ig também pode estar envolvido no desenvolvimento de cancros. Há a expressão do receptor de zcytorl7 e de receptores OSM beta em osteossarcomas de fibroblastos ósseos humanos, melanoma de fibroblastos 153 cutâneos humanos, carcinoma epitelial de cólon, adenocarcinoma, adenocarcinoma epitelial de mama, adenossarcoma epitelial de próstata e adenocarcinoma e carcinoma epitelial de pulmão. Portanto, pode ser útil tratar tumores de origem epitelial com zcytorl71ig, fragmentos do mesmo ou antagonistas de zcytorl71ig que incluem, mas sem limitação, carcinoma, adenocarcinoma e melanoma. Independentemente, zcytorl71ig ou um antagonista de zcytorl71ig pode ser utilizado para tratar um cancro ou reduzir um ou mais sintomas de um cancro, desde um cancro que inclui, mas sem limitação, carcinoma de células escamosas ou epidermóide, carcinoma de células basais, adenocarcinoma, carcinoma papilar, cistadenocarcinoma, carcinoma broncogénico, adenoma bronquial, melanoma, carcinoma de células renais, carcinoma hepatocelular, carcinoma de células transicionais, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionário, tumor misto maligno de origem de glândulas salivares, tumor de Wilms, teratoma imaturo, teratocarcinoma e outros tumores que compreendem pelo menos algumas células de origem epitelial.

Geralmente, a dose de polipéptido zcytorl71ig administrado (ou análogo ou proteína de fusão de zcytorl7) variará dependendo de factores tais como a idade do paciente, o peso, a altura, o sexo, o estado médico geral e a história médica anterior. Tipicamente, é desejável proporcionar ao receptor uma dosagem de polipéptido zcytorl71ig que esteja no intervalo desde aproximadamente 1 pg/kg até 10 mg/kg (quantidade de agente/peso corporal do paciente), embora também possa ser administrada uma dosagem menor ou maior quando ditem as circunstâncias. Um perito na especialidade pode determinar facilmente ditas dosagens, e os ajustes das mesmas, utilizando métodos conhecidos na técnica. A administração de um polipéptido Zyctorl71ig a um indivíduo pode ser tópica, por meio de um inalador, 154 intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal, intramuscular, subcutânea, intrapleural, intratecal, por perfusão através de um cateter regional ou por injecção intralesional directa. Quando se administram proteínas terapêuticas por injecção, a administração pode ser realizada por infusão contínua ou por meio de um único ou múltiplos bólus.

As vias de administração adicionais incluem a via oral, na membrana mucosa, pulmonar e transcutânea. A administração oral é adequada para microesferas de poliéster, microesferas de zeína, microesferas de proteinóide, microesferas de policianoacrilato, e sistemas à base de lípidos (veja-se, por exemplo, DiBase e Morrei, "Oral Delivery of Microencapsulated Proteins," em Protein Delivery: Physical Systems, Sanders e Hendren (eds.), páginas 255-288 (Plenum Press 1997)). A viabilidade de uma administração intranasal é exemplificada por um modo parecido de administração de insulina (veja-se, por exemplo, Hinchcliffe e Illum, Adv. Drug Deliv. Rev. 35: 199 (1999)). Podem ser preparadas partículas secas ou líquidas que compreendem agonista ou antagonista de receptor multimérico de Zcytorl7 e inaladas com a ajuda de dispensadores de pó seco, geradores de aerossol líquido ou nebulizadores (por exemplo, Pettit e Gombotz, TIBTECH 16: 343 (1998); Patton et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 35: 235 (1999)). Esta abordagem é ilustrada pelo sistema de tratamento de diabetes AERX, que é um inalador electrónico portátil que liberta insulina em aerossol nos pulmões. Certos estudos mostraram que foram administradas proteínas de até 48.000 kDa através da pele a concentrações terapêuticas com ajuda de ultra-som de baixa frequência, o que ilustra a viabilidade da administração transcutânea (Mitragotri et al. , Science 269: 850 (1995)). A administração transdérmica utilizando electroporação proporciona outro meio para administrar uma molécula que 155 tem actividade de ligação a Zcytorl71ig (Potts et ai., Pharm. Biotechnol. 10: 213 (1997)).

Uma composição farmacêutica que compreende uma proteína, polipéptido ou péptido que tem actividade de ligação a Zcytorl71ig pode ser formulada de acordo com os métodos conhecidos para preparar composições f armaceut icamente úteis, por meio da qual as proteínas terapêuticas são combinadas numa mistura com um veículo farmaceuticamente aceitável. Diz-se que uma composição é um "veículo farmaceuticamente aceitável" se a sua administração pode ser tolerada por um paciente receptor. A solução salina tamponada com fosfato estéril é um exemplo de um veículo farmaceuticamente aceitável. Outros veículos adequados são bem conhecidos pelos peritos na especialidade. Veja-se, por exemplo, Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 19a Edição (Mack Publishing Company 1995).

Para propósitos de terapêutica, moléculas que têm actividade de ligação a receptor multimérico de Zcytorl7 e um veículo farmaceuticamente aceitável são administradas a um paciente numa quantidade terapeuticamente eficaz. Diz-se que uma combinação de uma proteína, polipéptido, ou péptido que tem actividade de ligação a receptor multimérico de Zcytorl7 e um veículo farmaceuticamente aceitável é administrada numa "quantidade terapeuticamente eficaz" se a quantidade administrada for fisiologicamente significativa. Um agente é fisiologicamente significativo se a sua presença produzir uma mudança detectável na fisiologia de um paciente receptor. Por exemplo, um agente utilizado para tratar a inflamação é fisiologicamente significativo se a sua presença aliviar pelo menos uma parte da resposta inflamatória.

Uma composição farmacêutica que compreende Zcytorl71ig (ou análogo ou proteína de fusão de Zcytorl71ig) pode ser preparada em forma líquida, num 156 aerossol ou em forma sólida. As formas líquidas são ilustradas por soluções injectáveis, aerossóis, pequenas gotas, soluções topológicas e suspensões orais. Os exemplos de formas sólidas incluem cápsulas, comprimidos e formas de libertação controlada. Esta última forma é ilustrada por bombas mini-osmóticas e implantes (Bremer et al., Pharm. Biotechnol. 10: 239 (1997); Ranade, "Implants in Drug Delivery" em Drug Delivery Systems, Ranade e Hollinger (eds.), páginas 95-123 (CRC Press 1995); Bremer et al., "Protein Delivery with Infusion Pumps," em Protein Delivery: Physical Systems, Sanders e Hendren (eds.), páginas 239-254 (plenum Press 1997); Yewey et al., "Delivery of Proteins from a Controlled Release Injectable Implant," em Proteins Delivery: Physical Systems, Sanders e Hendren (eds.), páginas 93-117 (Plenum Press 1997)). Outras formas incluem cremes, pastas, outras aplicações topológicas e similares.

Os lipossomas proporcionam um meio para administrar polipéptidos terapêuticos a um indivíduo por via intravenosa, intraperitoneal, intratecal, intramuscular, subcutânea ou por meio de administração oral, inalação ou administração intranasal. Os lipossomas são vesículas microscópicas que consistem numa ou mais bicamadas lipídicas que rodeiam compartimentos aquosos (veja-se, em geral, Bakker-Woudenberg et al., Eur. J. Clin. Microbiol. Infect, Dis. 12 (Supli. 1):S61 (1993), Kim, Drugs 46: 618 (1993), e Ranade, "Site-Specific Drug Delivery Using Liposomes as Carriers," em Drug Delivery Systems, Ranade e Hollinger (eds.), páginas 3-24 (CRC Press 1995)). Os lipossomas são similares em composição às membranas celulares e como resultado, os lipossomas podem ser administrados de forma segura e são biodegradáveis. Dependendo do método de preparação, os lipossomas podem ser unilamelares ou multilamelares, e os lipossomas podem variar em tamanho com diâmetros que variam de 0,02 μιη a 157 mais de 10 μιη. Nos lipossomas pode ser encapsulada uma variedade de agentes: agentes hidrofóbicos repartidos nas bicamadas e agentes hidrofílicos repartidos dentro do espaço ou espaços aquosos internos. (Veja-se, por exemplo, Machy et ai., Liposomes In Cell Biology And Pharmacology (John Libbey 1987), e Ostro et al.r American J. Hosp. Pharm 46: 1576 (1989)). Além disso, é possível controlar a disponibilidade terapêutica do agente encapsulado variando o tamanho do lipossoma, o número de bicamadas, a composição de lípidos, assim como a carga e as caracteristicas superficiais dos lipossomas.

Os lipossomas podem adsorver a praticamente qualquer tipo de célula e depois libertar lentamente o agente encapsulado. Como alternativa, um lipossoma absorvido pode ser introduzido por endocitose em células que são fagocíticas. A endocitose é seguida pela degradação intralisossómica dos lípidos lipossomais e a libertação dos agentes encapsulados (Scherphorf et al., Ann. N.E. Acad. Sei. 446: 368 (1985)). Depois da administração intravenosa, os lipossomas pequenos (de 0,1 a 1,0 μιη) são captados tipicamente pelas células do sistema reticulo-endotelial, localizadas principalmente no fígado e baço, enquanto que os lipossomas maiores de 3,0 μιη se depositam no pulmão. Esta captação preferente dos lipossomas mais pequenos pelas células do sistema retículo endotelial foi utilizada para administrar agentes quimioterapêuticos a macrófagos e a tumores do fígado. O sistema reticulo-endotelial pode ser evitado por vários métodos que incluem a saturação com grandes doses de partículas de lipossoma, ou inactivação selectiva de macrófagos por meios farmacológicos (Claassen et al., Biochim. Biophys. Acta 802:429 (1984)). Além disso, mostra-se que a incorporação de fosfolípidos derivatizados com glicolípidos ou polietilenoglicol nas membranas do lipossoma tem como resultado uma captação 158 significativamente reduzida pelo sistema reticulo-endotelial (Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1068:133 (1991); Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1150:9 (1993) ) .

Também podem ser preparados lipossomas para dirigir-se a células ou órgãos particulares por meio da variação da composição de fosfolípidos ou inserção de receptores ou ligandos nos lipossomas. Por exemplo, utilizaram-se lipossomas preparados com um alto conteúdo de tensioactivo não iónico para dirigir ao fígado (Hayakawa et al., Patente japonesa 04-244.018; Kato et al., Biol. Pharm. Buli. 16: 960 (1993)). Estas formulações foram preparadas por meio da mistura de fosfatidilcolina de soja, α-tocoferol e óleo de rícino hidrogenado etoxilado (HCO-60) em metanol, concentração da mistura a vácuo e depois reconstituição da mistura com água. Também se mostra gue uma formulação lipossomal de dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) com uma mistura de esteril-glucósido (SG) derivado de soja e colesterol (Ch) se dirige ao fígado (Shimizu et al., Biol. Pharm. Buli. 20: 881 (1997)).

Como alternativa, diversos ligandos de direcção podem ligar-se à superfície do lipossoma, tais como anticorpos, fragmentos de anticorpo, hidrato de carbonos, vitaminas e proteínas de transporte. Por exemplo, os lipossomas podem modificar-se com derivados de galactosil lípidos de tipo ramificado para dirigir-se a receptores de asialoglicoproteína (galactose), gue se expressam exclusivamente na superfície de células hepáticas (Kato e

Sugiyama , Crit. Rev. Ther. Drue Carrier Syst. 14 : 287 (1997); Murahashi et al., Biol. Pharm. Buli. O CM 259 (1997)). De forma similar, Wu et al., Hepatology Cs] 772 (1998) mostraram gue a marcaçao de lipossomas com asialofetuína levou a uma menor semivida em plasma de lipossoma e a uma captação muito aumentada do lipossoma marcado com asialofetuína pelos hepatócitos. Por outro 159 lado, a acumulação hepática de lipossomas que compreendem derivados de galactosil lípidos de tipo ramificado pode ser inibida por meio de uma pré-injecção de asialofetuina (Murahashi et al., Biol. Pharm. Buli. 20: 259 (1997)). Os lipossomas de albumina de soro humano poliaconitilados proporcionam outra abordagem para dirigir lipossomas às células hepáticas (Kamps et al., Proc. Nat'1 Acad. Sei. USA 94: 11681 (1997)). Além disso, Geho, et al. Patente US N° 4.603.044, descrevem um sistema de libertação de vesículas de lipossomas dirigidas a hepatócitos, que tem especificidade por receptores hepatobiliares associados às células metabólicas especializadas do fígado.

Numa abordagem mais geral ao direccionamento de tecidos, as células alvo são pré-marcadas com anticorpos biotinilados específicos por um ligando expresso pela célula alvo (Harasym et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 32: 99 (1998)). Depois da eliminação em plasma do anticorpo livre, são administrados lipossomas conjugados com estreptavidina. Em outra abordagem, os anticorpos de direccionamento ligam-se directamente aos lipossomas (Harasym et ai., Adv. Drug Deliv. Rev. 32: 99 (1998)).

Os polipéptidos que têm actividade de ligação a receptor multimérico de Zcytorl7 podem ser encapsulados dentro de lipossomas utilizando técnicas convencionais de microencapsulação de proteínas (veja-se, por exemplo, Anderson et ai., Infect. Immun. 31: 1099 (1981), Anderson et ai., Câncer Res. 50: 1853 (1990), e Cohen et ai., Biochim. Biophys. Acta 1063: 95 (1991), Alving et al. "Preparation and Use of Liposomes in Immunological Studies," em Liposome Technology, 2a Edição, Vol. III, Gregoriadis (ed.), página 317 (CRC Press 1993), Wassef et al., Meth. Enzymol. 149: 124 (1987)). Como foi indicado anteriormente, os lipossomas terapeuticamente úteis podem conter uma variedade de componentes. Por exemplo, os lipossomas podem compreender derivados de lípidos de 160 poli(etilenoglicol) (Allen et ai., Biochim. Biophys. Acta 1150: 9 (1993) ) .

Desenharam-se microesferas de polímeros degradáveis para manter altos níveis sistémicos de proteínas terapêuticas. As microesferas são preparadas a partir de polímeros degradáveis tais como poli(lactida-co-glicolida) (PLG) , polianidridos, poli (orto ésteres), polímeros de acetato de etilvinilo não biodegradáveis, em que as proteínas ficam presas no polímero (Gombotz e Pettit, Bioconjugate Chem. 6: 332 (1995); Ranade, "Role of Polymers in Drug Delivery," em Drug Delivery Systems, Ranade e Hollinger (eds.), páginas 51-93 (CRC Press 1995); Roskos e Maskiewicz, "Degradable Controlled Release Systems Useful for Protein Delivery," em Protein Delivery: Physical Systems, Sanders e Hendren (eds.), páginas 45-92 (Plenum Press 1997); Bartus et ai., Science 281: 1161 (1998); Putney e Burke, Nature Biotechnology 16: 153 (1998); Putney, Curr. Opin. Chem. Biol. 2: 548 (1998)). As nanoesferas revestidas com polietilenoglicol (PEG) também podem proporcionar veículos para a administração intravenosa de proteínas terapêuticas (veja-se, por exemplo, Gref et ai., Pharm. Biotechnol. 10: 167 (1997)). A presente invenção também contempla polipéptidos modificados quimicamente que têm actividade de ligação de receptor multimérico de Zcytorl7 tal como receptores solúveis multiméricos ou heterodiméricos de receptor multimérico de zcytorl7, e antagonistas de receptor multimérico de Zcytorl7, por exemplo, anticorpos anti-receptor multimérico de zcytorl7 ou polipéptidos de ligação, que um polipéptido é ligado com um polímero, como discutido anteriormente.

Os peritos na especialidade podem idealizar outras formas de dosagem como é mostrado, por exemplo, por Ansel e Popovich, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 5a Edição (Lea & Febiger 1990), Gennaro (ed.), 161

Remington's Pharmaceutical Sciences, 19a Edição (Mack Publishing Company 1995), e por Ranade e Hollinger, Drug Delivery Systems (CRC Press 1996).

Como ilustração, as composições farmacêuticas podem ser fornecidas como um kit que compreende um recipiente que compreende um polipéptido um polipéptido com um domínio extracelular de receptor multimérico de Zcytorl7, por exemplo, receptores solúveis multiméricos ou heterodiméricos de receptor multimérico de zcytorl7, ou um antagonista de receptor multimérico de Zcytorl7 (por exemplo, um anticorpo de neutralização ou fragmento de anticorpo que se liga a um polipéptido receptor multimérico de Zcytorl7). Os polipéptidos terapêuticos podem ser proporcionados em forma de uma solução injectável para uma única ou múltiplas doses, ou como um pó estéril que será reconstituído antes da injecção. Como alternativa, dito kit pode incluir um dispensador de pó seco, gerador de aerossol líquido, ou nebulizador para a administração de um polipéptido terapêutico. Dito kit pode compreender além disso informação escrita sobre as indicações e utilização da composição farmacêutica. Além disso, dita informação pode incluir uma informação de que a composição de Zcytorl71ig está contra-indicada em pacientes com hipersensibilidade conhecida a receptor multimérico de Zcytor17. EXEMPLOS Exemplo 1

Construção de Quimera de polipéptido de MPL-zcytorl7: MPL Extracelular e Domínio TM fundido ao Domínio de sinalização Intracelular zcytorl7 0 domínio extracelular 5' do receptor de MPL murino foi isolado a partir de um plasmídeo que contém o receptor de MPL murino (plasmídeo PHZ1/MPL) por meio de digestão com EcoRI e BamHI gerando um fragmento de 1164 pb. A digestão foi executada num gel de agarose a 1% e o fragmento foi 162 isolado utilizando o kit de extracção por gel Qiaquick (Qiagen) como pelas instruções do fabricante. 0 resto do dominio extracelular de MPL e dominio transmembrana foram gerados utilizando PCR com iniciadores ZC6,673 (SEQ ID NO: 13) e ZC29, 082 (SEQ ID NO: 14) . As condições de reacção foram como segue: 15 ciclos a 94 °C durante 1 min., 55 °C durante 1 min., 72 °C durante 2 min.; seguido por 72 °C durante 7 min.; depois um imersão a 4 °C. 0 produto de PCR foi corrido num gel de agarose a 1% e o fragmento de receptor MPL de aproximadamente 400 pb foi isolado utilizando kit de extracção por gel Qiaquick™ (Qiagen) como pelas instruções do fabricante. O dominio intracelular de zcytorl7 humano foi isolado de um plasmideo que contém ADNc de receptor zcytorl7 (#23/pCAP) utilizando PCR com iniciadores ZC29,083 (SEQ ID NO: 15) e ZC29,145 (SEQ ID NO: 16). A sequência de polinucleótido que corresponde à sequência codificante de receptor zcytorl7 é mostrada em SEQ ID NO: 5. As condições de reacção foram como para anteriormente. O produto de PCR foi corrido num gel de agarose a 1% e o fragmento de zcytorl7 de aproximadamente 320 pb foi isolado utilizando kit de extracção por gel Qiaquick como pelas instruções do fabricante.

Cada um dos fragmentos de PCR isolados descritos anteriormente foi misturado a uma razão volumétrica de 1:1 e utilizado numa reacção de PCR utilizando ZC6673 (SEQ ID NO: 13) e ZC29145 (SEQ ID NO: 16) para criar tudo, menos a porção 5' de MPL da quimera de MPL-zcytorl7. As condições de reacção foram como segue: 15 ciclos a 94 °C durante 1 min., 55 "C durante 1 min., 72 "C durante 2 min.; seguido por 72 °C durante 7 min.; depois um imersão a 4 °C. Todo o produto de PCR foi corrido num gel de agarose a 1% e o fragmento de quimera de MPL-zcytorl7 de aproximadamente 700 pb foi isolado utilizando kit de extracção por gel Qiaquick (Qiagen) como pelas instruções do fabricante. O Fragmento 163 de quimera MPL-zcytorl7 foi digerido com BamHI (BRL) e Xbal (Boerhinger Mannheim) como pelas instruções do fabricante. Todo o material digerido foi corrido num gel de agarose a 1% e a quimera MPL-zcytorl7 clivada foi isolada utilizando kit de extracção por gel Qiaquick™ (Qiagen) como pelas instruções do fabricante. A quimera MPL-zcytorl7 clivada mais fragmento 5' de EcoRI/BamHI de MPL descritos anteriormente foram inseridos num vector de expressão para gerar o receptor quimérico de MPL-zcytor17 compelto como foi descrito a seguir. 0 vector de expressão recipiente pZP-7 foi digerido com EcoRI (BRL) e Xbal (BRL) como pelas instruções do fabricante, e purificado por gel como foi descrito anteriormente. Este fragmento de vector foi combinado com a quimera de PCR MPL-zcytorl7 clivado com EcoRI e Xbal isolada anteriormente e o fragmento 5' de MPL de EcoRI e BamHI isolado anterior numa reacção de ligação. A ligação foi executada utilizando T4 Ligase (Epicentre Technologies), a temperatura ambiente durante 1 hora como pelas instruções do fabricante. Uma amostra da ligação foi electroporada em células de E. coli electrocompetentes DH10B ElectroMAX™ (25 mF, 200 Ω, 1,8 V). Transf ormantes foram inoculados em placa em placas de LB + Ampicilina e as colónias isoladas foram rastreadas por meio de miniprep (Qiagen) e digestão com EcoRI para verificar para a quimera MPL-zcytor17. A digestão com EcoRI de clones correctos rendeu aproximadamente um fragmento de 2 kb. A confirmação da sequência de quimera MPL-zcytorl7 foi feita por análises de sequência O inserto era de aproximadamente 3,1 kb, e era comprimento completo.

Exemplo 2

Proliferação com base em Quimera MPL-zcytorl7 ensaio de BAF3 Utilizando Alamar Blue A. Construção de Células BaF3 que expressam quimera MPL-zcytor 1 7 164

BaF3, uma linha de célula pré-linfóide dependente de interleucina-3 derivado de medula óssea murina (Palacios e Steinmetz, Cell 41: 727-734, 1985; Mathey-Prevot et al.,

Mol. Cell. Biol. 6:4133-4135, 1986). foi mantida em meios

completos (Meio RPMI, JRH Bioscience Inc., Lenexa, KS) suplementado com 10% de soro fetal de bezerro inactivado por calor, 1-2 ng/ml de IL-3 murina (mIL-3) (R & D, Minneapolis, MN) , 2 mM de L-glutaMax-1™ (Gibco BRL) , 1 mM de Piruvato de sódio (Gibco BRL), e antibiótico PSN (GIBCO BRL) ) . Antes da electroporação, ADN de plasmídeo de pZP-7/MPL-zcytorl7 (Exemplo 1) foi preparado e purificado utilizando um kit Qiagen Maxi Prep (Qiagen) como pelas instruções do fabricante. Células BaF3 para electroporação foram lavadas duas vezes em Meios RPMI e depois ressuspensas em Meios RPMI a uma densidade celular de 107 células/ml. Um ml de células BaF3 ressuspensas foi misturado com 3 0 mg do ADN de plasmídeo de pZP-7/MPL-zcytorl7 e transferido a câmaras de electroporação descartáveis separadas (GIBCO BRL). A temperatura ambiente, foram dados às células 5 x choques de 1 mseg a 800 volts seguido por 5 x choques de 2 ms a 600 volts distribuídos por um aparelho de electroporação (Cyto-Pulse) . Alternativamente, células foram electroporadas com dois pulsos em série (800 pFAD/300 V; seguido por 1180 pFAD/300 V) distribuídos por um aparelho de electroporação Cell-Porator (GibcoBRL). As células electroporadas foram transferidas a 50 ml de meios completos e colocadas numa incubadora durante 15-24 horas (37 °C, 5% de C02) . Depois solução de Geneticin™ (Gibco) (1 mg/ml G418) foi adicionada às células num balão T-162 para isolar o agrupamento resistente a G-418. Agrupamentos das células BaF3 transfectadas, a seguir no presente documento denominados células BaF3/MPL-zcytorl7, foram ensaiadas para capacidade de sinalização como é descrito a seguir. B. Testando a capacidade de sinalização das células 165

BaF3/MPL-zcytor17 utilizando um Ensaio de proliferação Alamar Blue Células BaF3/MPL-zcytor17 foram precipitadas por centrifugação e lavadas nos meios completos, descritos anteriormente, mas sem mIL-3 (a seguir no presente documento denominado como "meios livres de mIL-3"). As células foram centrifugadas e lavadas 3 vezes para garantir a retirada do mIL-3. As células foram depois contadas num hematocitómetro. As células foram inoculadas em placa num formato de 96 poços a 5000 células por poço num volume de 100 ml por poço utilizando os meios livres de mIL-3. A proliferação das células BaF3/MPL-zcytor17 foi avaliada utilizando trombopoietina murina (mTPO) diluída com meios livres de mIL-3 a concentrações de 200 ng/ml, 100 ng/ml, 50 ng/ml, 25 ng/ml, 12,5 ng/ml, 6,25 ng/ml, 3,1 ng/ml, 1,5 ng/ml. Cem microlitros da mTPO diluído foram adicionados às células BaF3/MPL-zcytorl7. 0 volume de ensaio total foi 200 μΐ. Controlos negativos foram executados em paralelo utilizando meios livres de mIL-3 somente, sem a adição de mTPO. As placas de ensaio foram incubadas a 37 °C, 5% de CO2 durante 3 dias em cujo tempo Alamar Blue (Accumed, Chicago, IL) foi adicionado a 20 ml/poço. Alamar Blue dá uma leitura fluorométrica com base na actividade de células de células, e é assim uma medida de directa proliferação celular em comparação com um controlo negativo. Placas foram incubadas de novo a 37 °C, 5% de C02 durante 24 horas. Placas foram lidas no leitor de placa Fmax™ (Molecular Devices Sunnyvale, CA) utilizando o programa SoftMax™ Pro, a comprimentos de onda de 544 (Excitação) e 590 (Emissão), ou um leitor de placa Wallac Victor 2 (Perkin Elmer Life Sciences, Boston, MA).

Os resultados confirmaram a capacidade de sinalização da porção intracelular do receptor zcytorl7, como a proliferação induzida por trombopoietina a aproximadamente 9-13 vezes sobre um fundo a concentrações de mTPO de 50 166 ng/ml e superior.

Exemplo 3

Construção de Vector de expressão que expressa zcytorl7: pZp7pX/zcytor!7 de comprimento completo A. Clonagem de ADNc de zcytorl7 de comprimento completo para expressão:

Para obter um ADNc zcytorl7 comprimento completo, produtos de PCR 5' e 3' foram isolados e unidos utilizando um local PstI interno. Os iniciadores de PCR foram desenhados utilizando a sequência de nucleótidos SEQ ID NO: 4 e incluem locais de restrição BamHI e Xho I para propósitos de clonagem.

Um produto de PCR 5' foi gerado utilizando uma biblioteca de ADNc WI-38 como um molde e oligonucleótidos ZC29,359 (SEQ ID NO: 18) e ZC27, 899 (SEQ ID NO: 19) como

iniciadores. WI-38 é uma biblioteca de ADNc interna gerada a partir de uma linha de células embrionárias de pulmão humanas (ATCC CRL-2221). Esta reacção de PCR 5' foi executada como segue: 30 ciclos a 94 °C durante 1 minuto, 65 °C durante 1 minuto, 72 °C durante 2 minutos, depois 72 °C durante 7 minutos; imersão a 10 °C. A reacção de PCR utilizou aproximadamente 3 mg de plasmideos preparados a partir da biblioteca de ADNc, 20 pmoles de cada oligonucleótido, e cinco unidades de PWO ADN polimerase (Roche) . Aproximadamente 90% do produto de PCR 5' foi precipitado com etanol, digerido com BamHI e PstI e purificado em gel num gel de agarose a 1,0%. A banda de aproximadamente 600 pb foi cortada e utilizada para ligação ao vector de clonagem pUC18 digerido com BamHI e PstI. Os transformantes resultantes foram sequenciados para confirmar a sequência de ADNc de zcytorl7. Para um destes transformantes, o ADN de plasmídeo foi preparado e digerido com BamHI e PstI. A banda de aproximadamente 600 pb resultante foi purificada por gel e utilizada para uma ligação abaixo para formar um ADNc de comprimento completo. 167

Um produto de PCR 3' foi gerado usando biblioteca de ADNc interna de testículos humanos como um molde e oligonucleótidos ZC27,895 (SEQ ID NO: 20) e ZC29,122 (SEQ ID NO: 21) como iniciadores. Esta reacção de PCR 3' foi executada como segue: 30 ciclos a 94° C durante 45 segundos, 65 °C durante 45 segundos, 72 °C durante 2 minutos, depois 72 °C durante 7 minutos; imersão a 10 °C. Toda a reacção de PCR 3' foi purificada por gel num gel de agarose a 1,0% e a banda principal de 1500 pb foi cortada. Esta banda foi clonada no vector PCRBluntlITOPO utilizando o kit Zeroblunt TOPO (Invitrogen). Os transformantes resultantes foram sequenciados para confirmar a sequência de ADNc de zcytorl7. Para um destes transf ormantes, o ADN de plasmídeo foi preparado e digerido com PstI e Xhol. A banda resultante de aproximadamente 1500 pb foi purificada por gel. Uma ligação de três partes foi realizada com o fragmento 5' BamHI a Pst I anterior, o fragmento 3' PstI a Xhol, e o vector de expressão pZp7pX digerido com BamHI e Xhol. Isto gerou um plasmídeo pZp7pX que contém um ADNc de comprimento completo para zcytorl7 (SEQ ID NO: 4), designado pZp7p/zcytorl7. O ADNc de zcytorl7 de comprimento completo em pZp7p/zcytorl7 tem uma mutação silenciosa que muda o T para G na posição 1888 da SEQ ID NO: 4 (que codifica um resíduo Gly no resíduo 464 da SEQ ID NO: 5) . Como esta mutação foi silenciosa, o ADNc de zcytorl7 em pZp7p/zcytorl7 codifica o polipéptido como mostrado na SEQ ID NO: 5. Plasmídeo pZp7pX é um vector de expressão de mamífero que contém uma cassete de expressão que tem o promotor CMV, intrão A. múltiplos locais de restrição para a inserção de sequências codificantes, e um terminador de hormona de crescimento humano. O plasmídeo também tem uma origem de replicação de E. coli, uma unidade de expressão seleccionável de mamífero que tem um promotor SV40, potenciador e origem de replicação, um gene de resistência a puromicina e o terminador SV40. 168 B. Construção de Vector de expressão que expressa WSX-1 de comprimento completo

Todo o receptor WSX-1 (SEQ ID NO: 9) foi isolado a partir de um plasmídeo que contém o ADNc de receptor de WSX-1 (SEQ ID NO: 8) (Patente U.S. n° 5.925.735). hWSX-1/pBluescript SK(+) ADN de plasmídeo (Stratagene, La Jolla, CA) foi digerido com EcoRI e Xhol para gerar um fragmento de 1075 pb, e também digerido com Xhol e Xbal para gerar um fragmento de 900 pb. Ambos os materiais digeridos foram corridos num gel de agarose a 1% e os fragmentos de WSX-1 clivados foram isolados. O vector de expressão recipiente pZp7Z foi digerido com EcoRI e Xbal e purificado por gel como foi descrito anteriormente. Este fragmento de vector foi combinado com os dois fragmentos de zcytorl7 clivados isolados anteriormente numa reacção de ligação utilizando T4 Ligase (BRL). A ligação foi incubada a temperatura ambiente durante a noite. Uma amostra da ligação foi electroporada em células de E. coli electrocompetentes DH10B electroMAX™ (25 mF, 200 Ω, 2,3 V). Seis colónias foram crescidas em cultura e ADN miniprep foi preparado e digerido para confirmar o correcto WSX-1 comprimento completo inserto de 2,0 kb. O plasmídeo resultante é pZPZ7Z/WSX-l.

Exemplo 4

Proliferação com base em Zcytorl7 em Ensaio de BAF3 utilizando Alamar Blue

A. Construção de Células BAF3 que expressam receptor de zcytorl?, receptor de WSX-1 e OSMR Células BaF3 que expressam o receptor de zcytorl7 de comprimento completo foram construídas como no Exemplo 2A anterior, utilizando 30 mg do vector de expressão de zcytorl7, descritos no Exemplo 3A. Uma excepção é que em liugar de selecção de Geneticina, 2 mg/ml de Puromicina (ClonTech) foram adicionados às células transfectadas num balão T-162 para isolar o agrupamento resistente a 169 puromicina. As células BaF3 que expressam o ARNm de receptor zcytorl7 foram designadas como BaF3/zcytorl7. Para obter clones, as células Baf3/zcytor17 foram contadas num hemocitómetro e inoculadas em placa a 1 célula/poço, 0,5 célula/poço, 0,1 célula/poço, e 0,01 célula/ poço em placas de 96 poços. Quinze clones foram aumentados em escapa em balões T75, e cinco clones foram ensaiados para expressão de zcytorl7. O ARN Total foi isolado de precipitados de células utilizando um Kit de Isolamento de ARN total S.N.A.P.™ (InVitrogen). ADNc de primeira cadeia foi sintetizado utilizando o kit RT-PCR de primeira cadeia proSTAR™, e depois PCR com iniciadores específicos de zcytorl7 ZC29, 180 (SEQ ID NO: 22) e ZC29, 122 (SEQ ID NO: 23) foi realizado para rastrear os clones para expressão de zcytorl7. Um clone, BaF3/zcytorl7#15 foi escolhido para expandir e transfectar com o vector de expressão WSX-1. Células BaF3 que expressam zcytorl7 e WSX-1 de comprimento completo foram construídas como por Exemplo 2A anterior, utilizando 30 pg do vector de expressão de WSX-1 WSX-l/pZp7Z (Exemplo 3B) para electroporar as células BaF3/zcytorl7#15. Uma excepção é que em lugar de selecção com Geneticina, 200 mg/ml de Zeocina (InVitrogen) foram adicionados às células transfectadas num balão T-162 para isolar o agrupamento resistente a zeocina. As células BaF3 que expressam zcytorl7 e WSX-1 foram designadas BaF3/zcytor17/hWSX-l. Para obter clones, agrupamentos de células Baf3/zcytor17/hWSX-l foram inoculadas em placa a diluição limitante em placas de 96 poços. Os clones resultantes foram expandidos e ARN total foi isolado utilizando um Kit de Isolamento de ARN total S.N.A.P.™ (InVitrogen). ADNc de primeira cadeia foi sintetizado utilizando o kit de RT-PCR de primeira cadeia proSTAR™, e depois PCR com iniciadores específicos de WSX-1 ZC9791 (SEQ ID NO: 24) e ZC9793 (SEQ ID NO: 25) foi utilizado para rastrear os clones para a expressão de WSX-1. Um clone, 170

BaF3/zcytorl7/hWSX-l#5 foi escolhido para expandir ainda e transfectar com o vector de expressão OS-MRbeta. Células BaF3 que expressam zcytorl7, WSX-1 e OSMRbeta de comprimento completo foram construídas como pelo Exemplo 2A anterior, utilizando 30 ug do vector de expressão de OSMRbeta OSMR/pZp7NX como é descrito no Exemplo 29 para electroporar as células BaF3/zcytorl7/hWSX-l#5. As células BaF3 que expressam ARNm de zcytorl7, WSX-1, e OSMRbeta foram designadas BaF3/zcytorl7/WSX-l/OSMR. Para obter clones, agrupamentos de células BaF3/zcytorl7/WSX-1/OSMRbeta foram inoculadas em placa a diluição limitante em placas de 96 poços. Clones individuais foram expandidos e o ARN total foi isolado utilizando um Kit de Isolamento de ARN total S.N.A.P.™ (InVitrogen). ADNc de primeira cadeia foi sintetizado utilizando o kit de RT-PCR de primeira cadeia proSTAR™, e depois PCR com iniciadores específicos de OSMRbeta ZC40109 (SEQ ID NO: 26) e ZC40112 (SEQ ID NO: 27) foi utilizado para rastrear os clones para a expressão de zcytorl7, WSX-1, e OSMR. Um clone, BaF3/zcytorl7/WSX-l/OSMR#5 foi seleccionado e estas células foram utilizadas para rastrear para zcytorl71ig como é descrito a seguir no Exemplos 5 e 6.

B. Construção de Células BAF3 Que expressam receptor de zcytorl7 e OSMR Células BaF3 que expressam o receptor de zcytorl7 de comprimento completo foram construídas como para o Exemplo 2A anterior, utilizando, 30 pg do vector de expressão zcytorl7, descritos no Exemplo 3A. Uma excepção é que em lugar de celecção com Geneticina, 2 ug/ml de Puromicina (ClonTech) foram adicionados às células transfectadas num balão 1-162 para isolar o agrupamento resistente a puromicina. As células BaF3 que expressam o ARNm de receptor de zcytorl7 foram designadas como BaF3/zcytor17. Para obter clones, agrupamentos de células Baf3/zcytorl7 foram inoculadas em placa a diluição limitante em placas de 171 96 poços. Estes clones foram expandidos em cultura e o ARN total foi isolado utilizando um Kit de Isolamento de ARN total S.N.A.P.™ (Invitrogen). ADNc de primeira cadeia foi sintetizado utilizando o kit de RT-PCR de primeira cadeia proSTAR™, e depois PCR foi utilizado para rastrear os clones para a expressão de zcytorl7. Um clone, BaF3/zcytorl7 #15 foi escolhido para expandir e transfectar com o vector de expressão OSMRbeta. Células BaF3 que expressam zcytorl7 e OSMRbeta de comprimento completo foram construídas como pelo Exemplo 2A anterior, utilizando 30 ug de the OSMRbeta vector de expressão OSMR/pZp7NX (Exemplo 29) para electroporar as células BaF3/zcytorl7#15. As células BaF3 que expressam zcytorl7 e ARNm OSMRbeta foram designados BaF3/zcytorl7/OSMR. Estas células foram utilizadas para rastrear para zcytorl71ig como é descrito a seguir no Exemplo 5.

Exemplo 5

Rastreio para zcytorl71ig utilizando células

BaF3/Zcytorl7/WSX-1/OSMRbeta utilizando um

Ensaio de proliferação Alamar Blue A. Activação de CCRF-CEM e células CCRF-HSB2 para testar para presença de zcytorl71ig

As células CCRF-CEM e CCRF-HSB2 foram obtidas a partir de ATCC e estimuladas em cultura para produzir meios condicionados para testar para a presença de actividade de zcytorl71ig como é descrito a seguir. As células em suspensão foram semeadas a 2 x 105 células/ml ou 5 x 105 células/ml em meios RPMI-1640 suplementados com 10% de FBS, 2 mM de L-glutamina (GibcoBRL), IX PSN (GibcoBRL), e activadas com 10 ng/ml de Forbol-12-miristato-13-acetato (PMA) (Calbiochern, San Diego, CA) e 0,5 ug/ml de Ionomycin™ (Calbiochern) durante 24 ou 48 h. O sobrenadante das células estimuladas foi utilizado para ensaiar proliferação das células BaF3/zcytorl7/WSX-I/OSMRbeta ou 172 células BaF3/zcytorl7/OSMRbeta como é descrito a seguir. B. Rastreio para zcytorl71ig utilizando células BaF3/Zcytorl7/WSX-l/OSMRbeta ou células BaF3/zcytorl7/OSMRbeta utilizando um Ensaio de proliferação Alamar Blue

As células BaF3/zcytorl7/WSX-l/OSMRbeta ou células BaF3/zcytor17/OSMRbeta foram precipitadas por centrifugação e lavadas em meios livres de mIL-3. As células foram centrifugadas e lavadas 3 vezes para garantir a retirada do mIL-3. As células foram depois contadas num hematocitómetro. As células foram inoculadas em placa num formato de 96 poços a 5000 células por poço num volume de 100 ml por poço utilizando os meios livres de mIL-3. A proliferação das células BaF3/zcytorl7/WSX-1/OSMRbeta ou células BaF3/zcytorl7/OSMRbeta foi avaliada utilizando meios condicionados das activadas células CCRFCEM e CCRF-HSB2 (veja-se o Exemplo 5A) . Meios condicionados foram diluídos com meios livres de mIL-3 a concentrações de 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,125%, 1,5%, 0,75%, e 0,375%. Cem microlitros dos meios condicionados diluídos foram adicionados às células BaF3/zcytor17/WSX-1/OSMRbeta ou células BaF3/zcytor17/OSMRbeta. O volume de ensaio total foi 200 ml. As placas de ensaio foram incubadas a 37 °C, 5% de CO2 durante 3-5 dias em cujo tempo Alamar Blue (Accumed, Chicago, IL) foi adicionado a 20 μΐ/poço. As placas foram incubadas de novo a 37 °C, 5% de C02 durante 24 horas. As placas foram lidas no leitor de placa Fmax™ (Molecular Devices) como foi descrito anteriormente (Exemplo 2) .

Os resultados confirmaram a resposta proliferativa das células BaF3/zcytorl7/WSX-l/OSMRbeta ou células BaF3/zcyorl7/OSMRbeta a um factor presente nos meios condicionados CCRF-CEM e CCRF-HSB2 activados. A resposta, como foi medido, foi aproximadamente 10 vezes sobre um fundo à concentração de 25%. As células BaF3 não 173 transfectadas não proliferam em resposta a este factor, nem as células BaF3 transfectadas com zcytorl7 e WSX-1 (células BaF3/zcytorl7/WXS-l), mostrando que este factor foi especifico para receptores Zcytorl7/0SMRbeta ou zcytorl7/0SMRbeta/WSX-l. Além disso, receptor de zcytorl7 solúvel diminuiu sua actividade proliferativa de zcytorl71ig nas células BaF3/zcytorl7/WSX-I/OSMRbeta (veja-se o Exemplo 11). Resultados similares são esperados em células BaF3/zcytorl7/OSMRbeta. C. Fonte primária humana utilizada para isolar zcytorl71ig

Colheitas de sangue de cem mililitros foram tomadas de cada um de seis dadores. 0 sangue foi colhido utilizando 10 X tubos vacutainer de 10 ml que contém heparina. O sangue foi agrupado de seis dadores (600 ml), diluido 1:1 em PBS, e separado utilizando um Ficoll-Plaque® PLUS (Pharmacia Biotech). O rendimento de células humanas primárias isoladas após a separação no gradiente de ficoll foi de 1,2 X 109 células.

As células foram suspensas em 9,6 ml de tampão MACS (PBS, 0,5% de EDTA, 2 mM de EDTA). 1,6 ml de suspensão de células foram retirados e 0,4 ml de micropérolas CD3 (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) adicionados. A mistura foi incubada durante 15 min a 4 °C. Estas células marcadas com pérolas CD3 foram lavadas com 30 ml de tampão MACS, e depois ressuspensas em 2 ml de tampão MACS.

Uma coluna VS+ (Miltenyi) foi preparada de acordo com as instruções do fabricante. A coluna VS+ foi depois colocada num campo magnético VarioMACS™ (Miltenyi). A coluna foi equilibrada com 5 ml de tampão MACS. As células humanas primária isoladas foram depois aplicadas à coluna. As células CD3 negativas foram deixadas que passassem através. A coluna foi enxaguada com 9 ml (3X3 ml) de tampão MACS. A coluna foi depois retirada do imã e colocada sobre um tube falcon de 15 ml. As células CD3+ foram eluidas pela adição de 5 ml de tampão MACS à coluna e 174 células ligadas retiradas com jacto utilizando o êmbolo proporcionado pelo fabricante. A incubação das células com as pérolas magnéticas de CD3, lavagens, e etapas em coluna VS+ (incubação através de eluição) anteriores foram repetidas mais cinco vezes. As fracções CD3+ resultantes das seis separações em coluna foram agrupadas. 0 rendimento de Células humanas seleccionadas CD3+ foram 3 X 108 células totais.

Uma amostra das células humanas seleccionadas CD3+ agrupadas foi retirada para coloração e separação num separação de células e anticorpo por fluorescência (FACS) para avaliar sua pureza. As células CD3+ humanas seleccionadas foram 91% de células CD3+.

As células CD3+ humanas seleccionadas foram activadas por incubação em RPMI + 5% de FBS + PMA 10 ng/ml e ionomicina 0,5 μρ/ιηΐ (Calbiochem) durante 13 horas a 37 °C. 0 sobrenadante destas células humanas seleccionadas CD3+ activadas foi testado para actividade de zcytorl71ig como é descrito a seguir. Além disso, as células humanas seleccionadas CD3+ activadas foram utilizadas para preparar uma biblioteca de ADNc, como é descrito no Exemplo 6, a seguir. D. Teste do sobrenadante a partir de células humanas seleccionadas CD3+ activadas para zcytorl71ig utilizando células BaF3/Zcytorl7/WSX-l/OS-MRbeta e um ensaio de proliferação Alamar Blue

As células BaF3/zcytorl7/WSX-l/OSMRbeta ou BaF3/zcytorl7/OSMRbeta foram precipitadas por centrifugação e lavadas em meios livres de mIL-3. As células foram centrifugadas e lavadas 3 vezes para garantir a retirada da mIL-3. As células foram depois contadas num hematocitómetro. As células foram inoculadas em placa num formato de 96 poços a 5000 células por poço num volume de 100 ml por poço utilizando os meios livres de mIL-3. A proliferação das células BaF3/zcytorl7/WSX-l/OSMbeta 175 ou células BaF3/zcytor17/OSMRbeta foram avaliadas utilizando meios condicionados a partir de células humanas seleccionadas CD3+ activadas (veja-se Exemplo 5C) diluída com meios livres de mIL-3 a concentrações de 25%, 12,5%, 6,25%, 3,125%, 1,5%, 0,75%, 0,375% e 0,187%. Cem microlitros dos meios condicionados diluídos foram adicionados às células BaF3/zcytorl7/WSX-l/OSMRbeta ou células BaF3/zcytorl7/OSMRbeta. O volume de ensaio total foi 200 ml. As placas de ensaio foram incubadas e ensaiadas como foi descrito no Exemplo 5B.

Os resultados confirmaram a resposta proliferativa das células BaF3/zcytor17/WSX-l/OSMRbeta ou células

BaF3/zcytor17/OSMRbeta a um factor presente nos meios condicionados de células humanas seleccionadas CD3+ activadas. A resposta, como foi medida, foi aproximadamente 15 vezes sobre o fundo à concentração de 25%. As células BaF3 não transfectadas não proliferam em resposta a este factor, nem a células BaF3 transfectadas com zcytorl7 e WSX-1 (células BaF3/zcytorl7/WXS-l) , mostrando que este factor foi específico para receptores Zcytorl7/OSMRbeta ou zcytorl7/OSMRbe-ta/WSX-l.

Exemplo 6

Clonagem de zcytorl71ig humano a partir de uma biblioteca de células humanas seleccionadas CD3+ O rastreio de uma biblioteca de ADNc de células humanas seleccionadas CD3+ activadas primárias revelou um ADN isolado é que um novo membro da família de citocina de feixe de quatro hélices. Este ADNc codificou o zcytorl71ig. O ADNc foi identificado pelo rastreio para actividade do zcytorl71ig utilizando os receptores zcytorl7/WSX-l/OSM. A. O vector para construção de biblioteca seleccionada de CD 3+ O vector para construção de biblioteca seleccionada de CD3+ foi pZP7NX. O vector pZP7NX foi construído como segue: A região codificante para o marcador selectivo DHFR no 176 vector pZP7 foi retirada por meio de digestão de ADN com enzimas de restrição Ncol e PstI (Boehringer Mannheim). 0 ADN digerido foi corrido em gel de agarose a 1%, cortado e purificado por gel utilizando o Kit de extracção por gel Qiagen (Qiagen) como pelas instruções do fabricante. Um fragmento de ADN que presenta a região codificante de Marcador selectivo de Zeocina foi amplificado por meio de método de PCR com iniciadores ZC13,946 (SEQ ID NO: 28) e C13,945 (SEQ ID NO: 29), e pZeoSV2(+) como um molde. Existem locais de restrição PstI e Bell adicionais no iniciador ZC13,946 (SEQ ID NO: 28), e locais em iniciador Ncol e Sful adicionais em ZC13, 945 (SEQ ID NO: 29). 0 fragmento de PCR foi cortado com enzimas de restrição PstI e Ncol e clonado em vector pZP7 preparado por meio de clivagem com as mesmas duas enzimas e subsequente purificação em gel. Este vector foi denominado pZP7Z. Depois a região codificante de Zeocina foi retirada por meio de digestão de ADN de vector pZP7Z com enzimas de restrição Bell e Sful. 0 ADN digerido foi corrido em gel de agarose a 1%, cortado e purificado por gel, e depois ligado com um fragmento de ADN de região codificante de neomicina cortado do vector pZem228 (depositado na Colecção Americana de Culturas Celulares (ATCC), Manassas, VA; n° de depósito ATCC 69446) com as mesmas enzimas de restrição (Bell e Sful) .

Este novo vector foi denominado pZP7N, em que a região codificante para marcador selectivo DHFR foi recolocada pela região codificante para um marcador selectivo de Neomicina do vector pZem228. Um fragmento de preenchimento que inclui um local Xhol foi adicionado a pZP7N para criar um vector adequado para clonagem direccional de alta eficiência de ADNc; este novo vector foi denominado pZP7NX. Para preparar o vector para ADNc, 20 pg de pZP7NX foi digerido com 20 unidades de EcoRl (Life Technologies Gaithersberg, MD) e 20 unidades de Xhol (Boehringer 177

Mannheim Indianapolis, EM) durante 5 horas a 37 °C, depois 68 °C durante 15 minutos. 0 material digerido foi depois corrido em gel de agarose a 0,8% de baixo ponto de fusão IXTAE para separar o preenchimento do vector. A banda de vector foi cortada e digerida com "beta-Agarase" (New England Biolabs, Beverly, MA) seguindo as recomendações do fabricante. Após a precipitação por etanol o vector digerido foi ressuspenso em água a 45 ng/ml em preparação para ligação de biblioteca de ADNc seleccionada CD3+ descrita a seguir. B. Preparação de biblioteca de células humanas seleccionadas CD3+ activadas primárias de ADNc

Aproximadamente 1,5 X 108 células CD3+ humanas seleccionadas primárias estimuladas em ionomicina/PMA foram isoladas por meio de centrifugação após cultivar a 37 °C durante 13 horas (Exemplo 5C) . ARN total foi isolado do sedimento de células utilizando o kit "RNeasy Midi" de Qiagen, Inc. (Valência, CA). O ARNm foi isolado de 225 microgramas de ARN total utilizando o "kit de purificação de ARNm MPG" de CPG Inc. (Lincoln Park, NJ) . 3,4 microgramas de ARNm foram isolados e convertidos a ADNc de cadeia dupla utilizando o seguinte procedimento. ADNc de primeira cadeia de células CD3+ humanas seleccionadas estimuladas foi sintetizado como segue. Nove μΐ de Oligo d (T)-seleccionado poli(A) CD3+ ARN numa concentração de 0,34 pg/μΐ e 1,0 μΐ de 1 pg/μΐ iniciador de primeira cadeia ZC18,698 (SEQ ID NO: 30) que contém um local de restrição Xhol foram misturados e aquecidos a 65 °C durante 4 minutos e arrefecidos por meio de resfriamento sobre gelo. A síntese de ADNc de primeira cadeia foi iniciada pela adição de 9 ml de tampão de primeira cadeia (5 x tampão SUPERSCRIPT®; (Life Technologies), 4 μΐ de 100 mM de ditiotreitol e 2 μΐ de uma solução de desoxinucleótido trifosfato que contém 10 mM cada de dATP, dGTP, dTTP e 5-metil-dCTP (Pharmacia Biotech Inc.) à 178 mistura de ARN-iniciador. A mistura de reacção foi incubada a 45 °C durante 4 minutos seguido pela adição de 8 μΐ de 200 U/μΙ SuperscriptII®, RNase H- reversa transcriptase (Life technologies). A reacção foi incubada a 45 °C durante 45 minutos seguido por uma incubação aumentando 1 °C a cada 2 minutos até 50 °C onde a reacção foi mantida durante 10 minutos. Para desnaturar qualquer estrutura secundária e permitir a extensão adicional do ADNc a reacção foi depois aquecida até 70° C durante 2 minutos depois a temperatura diminuiu até 55° C durante 4 minutos após o qual 2 μΐ de SuperscriptII®. RT foram adicionados e incubados 15 minutos adicionais seguido por um aumento até 70 °C de 1 minuto/1 °C. Os nucleótidos não incorporados foram retirados do ADNc precipitando duas vezes na presença de 2 μρ de portador de glicogénio, 2,0 M acetato de amónio e 2,5 volumes de etanol, seguido por uma lavagem com 100 μΐ de etanol a 70%. 0 ADNc foi ressuspenso em 98 μΐ de água para utilização em sintese da segunda cadeia. A sintese da segunda cadeia foi realizada no ADNc de primeira cadeia sob condições que promoveram iniciação de primeira cadeia da sintese da segunda cadeia resultando em formação de grampo de cabelo de ADN. A reacção de segunda cadeia continha 98 μΐ do ADNc de primeira cadeia, 30 μΐ de 5 x tampão de polimerase I (100 mM de Tris: HC1, pH 7,5, 500 mM de KC1, 25 mM de MgCl2, 50 mM de (NH4)2S04), 2 ml de 100 mM ditiotreitol, 6 ml de uma solução que contém 10 mM de cada desoxinucleótido trifosfato, 5 μΐ de 5 mM b-NAD, 1 μΐ de 3 U/μΙ de ADN ligase de E. coli (New England Biolabs Inc.) e 4 μΐ de 10 U/μΙ ADN polimerase 1 de E. coli (New England Biolabs Inc.). A reacção foi montada a temperatura ambiente e foi incubada a temperatura ambiente durante 2 minutos seguidos pela adição de 4 μΐ de 3,8 U/μΙ de RNase H (Life Technologies). A reacção foi incubada a 15° C durante duas horas seguido por um 15 minutos de incubação a temperatura ambiente. Dez microlitros de 1 M de TRIS pH 7,4 179 foram adicionados à reacção e extraídos duas vezes com fenol/clorofórmio e uma vez com clorofórmio, as fases orgânicas foram depois extraídos de novo com 50 μΐ de TE (10 mM de TRIS pH 7,4, 1 mM de EDTA), agrupado com a outra aquosa e precipitadas com etanol na presença de 0,3 M acetato de sódio. O sedimento foi lavado com 100 μΐ de etanol 70% seco ao ar e ressuspenso em 40 μΐ de água. O ADN de cadeia simples da estrutura de grampo de cabelo foi clivado utilizando nuclease de feijão mungo. A mistura de reacção continha 40 μΐ de ADNc de segunda cadeia, 5 μΐ de 10 x tampão de nuclease de feijão mungo (Life technologies) , 5 μΐ de nuclease de feijão mungo (Pharmacia Biotech Corp.) diluída a 1 U/μΙ em 1 X tampão de nuclease de feijão mungo. A reacção foi incubada a 37 °C durante 45 minutos. A reacção foi terminada pela adição de 10 μΐ de 1 M de Tris: HC1, pH 7,4 seguido por extracçoes sequenciais de fenol/clorofórmio e clorofórmio como descritos anteriormente. Em seguida às extracçoes, o ADNc foi precipitado com etanol na presença de 0,3 M de acetato de sódio. O sedimento foi lavado com 100 ml de etanol a 70% seco ao ar e ressuspenso em 38 μΐ de água.

As extremidades do ADNc ressuspenso foram tornadas rombas com T4 ADN polimerase. O ADNc, que foi ressuspenso em 38 μΐ de água, foi misturado com 12 μΐ 5 x tampão de T4 ADN polimerase (250 mM de Tris:HCl, pH 8,0, 250 mM de KC1, 25 mM de MgCl2) , 2 μΐ de 0,1 M ditiotreitol, 6 ml de uma solução que contém 10 mM de cada desoxinucleótido trifosfato e 2 ml de 1 U/μΙ T4 ADN polimerase (Boehringer Mannheim Corp.). Após uma incubação de 45 minutos a 15 °C, a reacção foi terminada pela adição de 30 μΐ de TE seguido por extracçoes sequenciais de fenol/clorofórmio e clorofórmio e extraídos de novo com 20 μΐ de TE como foi descrito anteriormente. O ADN foi precipitado com etanol na presença de 2 μΐ de portador de Pellet Paint™ (Novagen) e 0,3 M de acetato de sódio e foi ressuspenso 11 μΐ de água. 180

Adaptadores de EcoRI foram ligados sobre as extremidades 5' do ADNc descrito anteriormente para permitir clonagem num vector de expressão. 11 μΐ de ADNc e 4 μΐ de 65 pmol/μΐ de adaptador Eco RI hemif osf orilado (Pharmacia Biotech Corp) foram misturados com 5 μΐ 5 x de tampão de ligase (Life Technologies), 2 μΐ de 10 mM de ATP e 3 μΐ de ΐυ/μΐ de T4 DNA ligase(Life Technologies), 1 μΐ 10 x de tampão de ligação (Promega Corp), 9 ml de água. A diluição extra com 1 X tampão foi para evitar que o Pellet Paint de precipitar. A reacção foi incubada 9 horas num banho de água a temperatura crescente desde 10 °C até 22 °C ao longo de 9 horas, seguido por 45 minutos a 25 °C. A reacção foi terminada por meio de incubação a 68 °C durante 15 minutos.

Para facilitar a clonagem direccional do ADNc num vector de expressão, o ADNc foi digerido com Xho I, resultando num ADNc que tem uma extremidade coesiva 5' Eco RI e uma extremidade coesiva 3' XhoI. O local de restrição XhoI na extremidade 3' do ADNc foi introduzido previamente utilizando o iniciador ZC18698 (SEQ ID NO: 31). A digestão com enzima de restrição foi levada a cabo numa mistura de reacção que contém 35 μΐ da mistura de ligação descrita anteriormente, 6 μΐ de 10 x tampão H (Boehringer Mannheim Corp.), 1 μΐ de 2 mg/ml BSA (Biolabs Corp.), 17 μΐ de água e 1,0 μΐ de 40 U/μΙ Xhol (Boehringer Mannheim). A digestão foi levada a cabo a 37 °C durante 1 hora. A reacção foi terminada por meio de incubação a 68 °C durante 15 minutos seguido por precipitação por etanol, lavagem e secagem como foi descrito anteriormente e ressuspensão em 30 μΐ de água. O ADNc ressuspenso foi aquecido até 65° C durante 5 minutos e arrefecido sobre gelo, 4 μΐ de 5 X corante de carga de gel (Research Genetics Corp.) foram adicionados, o ADNc foi carregado sobre um gel de agarose de baixo ponto de fusão a 0,8% IX TAE (SEA PLAQUE GTG™ agarose de baixo ponto de fusão; FMC Corp.) e submetido a electroforese. Os 181 adaptadores contaminantes e o ADNc inferior a 0,6 Kb em comprimento foram cortados do gel. Os eléctrodos foram revertidos, agarose fundida foi adicionada para encher os poços, o tampão foi trocado e o ADNc foi submetido a electroforese até que se concentrou próximo a origem da pista. A área do gel que contém o ADN concentrado foi cortada e colocada num tubo micrófugo, e a agarose foi fundida por meio de aquecimento até 65 °C durante 15 minutos. Em seguida a equilibração da amostra até 45 °C,

foram adicionados 2 μΐ de 1 U/μΙ de Beta-agarase I (Biolabs, Inc.), e a mistura foi incubada durante 90 min a 45 "C para digerir a agarose. Após incubação, 1 décimo volume de 3 M de acetato de Na foi adicionado à amostra, e a mistura foi incubada sobre gelo durante 15 minutos. A amostra foi centrifugada a 14.000 x g durante 15 minutos a temperatura ambiente para retirar agarose não digerida, o ADNc foi precipitado com etanol, lavado em 70% de etanol, seco ao ar e ressuspenso em 40 μΐ de água.

Para determinar a razão óptima de ADNc para vector várias ligações foram montadas e electroporadas. De maneira breve, 2 μΐ de 5X tampão de T4 ligase (Life Technologies), 1 μΐ de 10 mM de ATP, 1 μΐ de pZP7NX digerido com EcoRI-Xhol, 1 μΐ de T4 ADN ligase diluída até 0,25 u/ml (Life Technologies) água até 10 μΐ e 0,5, 1, 2 ou 3 μΐ de ADNc foram misturados em 4 ligações separadas, incubados a 22 °C durante 4 horas, 68 °C durante 20 minutos, precipitados com acetato de sódio e etanol, lavados, secos e ressuspensos em 10 ml. Um único microlitro de cada ligação foi electroporado em 40 μΐ de bactérias electrocompetentes DHIOb ElectroMax™ (Life Technologies) utilizando uma cuveta de 0,1 cm (Biorad) e um Genepulser, pulse controller™ (Biorad) ajustado a 2,5 KV, 251 F, 200 ohms. Estas células foram imediatamente ressuspensas em 1 ml. Caldo SOC (Manniatis et ai, supra.) seguido por 500 μΐ de 50% de glicerol-SOC como um conservante. Estas "reservas de 182 glicerol" foram congelados em várias alíquotas a -70 °C.

Uma alíquota de cada um foi descongelada e inoculados em placa em série em placas de LB-agar suplementada com ampicilina a 100 pg/ml. Os números de colónias indicaram que a razão óptima de ADN CD3+ para vector pZP7NX foi de 1 μΐ para 45 ng; tal ligação proporcionou 4,5 milhões de clones primários.

Para o propósito de rastrear a biblioteca utilizando um ensaio de proliferação com base em BaF3 (Exemplo 5) reservas de glicerol de anteriormente foram diluidos em culturas liquidas de 100 ou 250 clones por agrupamento em placas de microtitulação de poço profundo, crescidas 24 horas a 37 °C com agitação e o plasmídeo foi isolado utilizando um kit Qiagen seguindo as instruções do fabricante. Tal ADN foi subsequentemente transfectado em células BHK, meios condicionados durante 72 horas, colhidos e armazenado a -80 °C, e subsequentemente colocada em células 5K BaF3/zcytorl7/WSX-l/OSMRbeta ou células BaF3/zcytor17/OSMRbeta durante 72 horas após o qual a proliferação foi avaliada utilizando um ensaio de fluorescência "Alamar blue" (Exemplo 5B e Exemplo 2B). Exemplo 7

Clonagem de expressão de zcytorl71ig humano

As reservas de glicerol da biblioteca de células humanas seleccionadas CD3+ activadas (Exemplo 6) foram adicionadas a Super Broth II™ (Becton Dickinson, Cockeysville, MD) + 0,1 mg/ml de ampicilina (amp) numa concentração de 250 células por 800 microlitros. As E. coli foram deixadas que equilibrassem durante 24 horas a temperatura ambiente. No momento da inoculação, 400 microlitros foram inoculados em placa em placas com LB + amp para determinar a titulação real da inoculação. Após 24 horas as placas foram contadas e depois a concentração final do SuperBrothlI™ + E. coli foi ajustado de modo que a concentração final era de 250 células por 1,2 ml. Três 183 vezes 2 litros foram inoculados para um total de 6 litros. Os meios foram depois inoculados em placa em blocos de 96 poços profundos (Qiagen) . A inoculação em placa foi feita no dispensador de 8 canais Q-FÍ112™ (Genetix, Christclturch, Dorset, UK) . As E. coli foram crescidas durante a noite a 37 °C com agitação a 250 rotações/min num agitador de ambiente de microtitulação New Brunswick Scientific Innova 4900. As E. coli foram separadas por centrifugação da solução a 3000 rpm, utilizando uma centrífuga Beckman GS-6KR. Estes sedimentos de E. coli foram congelados a -20 °C ou utilizados frescos antes de realizar a minipreparação do ADN de plasmídeo. Cada sedimento contém aproximadamente 250 clones de ADNc da biblioteca de células humanas seleccionadas CD3+.

Estes agrupamentos de 250 clones de ADNc foram depois submetidos a miniprep utilizando kit QIAprep™ 96 Turbo Miniprep (Qiagen). 0 ADN de plasmídeo foi eluído utilizando 125 ml de TE (10 mM Tris pH 8, 1 mM EDTA) . Este ADN de plasmídeo foi depois utilizado para transfectar células BHK.

Transfecção de BHK

As células BHK foram inoculadas em placa em placas de cultura de tecido de 96 poços a uma densidade de 12.000 células por poço num volume de 100 μΐ por poço. O meio de cultura foi DMEM (GibcoBRL), 5% de soro bovino fetal inactivado por calor, 2 mM de L-glutamina (Gibco-BRL), IX de PSN (GibcoBRL). 1 mM de piruvato de sódio (GibcoBRL).

No dia seguinte, as células BHK foram lavadas uma vez com 100 ml SFA. SFA é meio livre de soro que é DMEM/F12 ou DMEM (Gibco/BRL) , 2 mM de GlutaMax™ (GibcoIBRL) , 1 mM de piruvato de sódio, 10 pg/ml de transferrina, 5 pg/ml de insulina, 10 pg/ml de fetuína, 2 mg/ml de selénio, 25 mM de HEPES (Gibco/BRL), 100 mM de aminoácidos não essenciais (Gibco/BRL).

Uma mistura de ADN/Lipofectamine™ foi preparada como 184 se segue: 2,2 μΐ de reagente Lipofectamine™ (GibcolBRL) foi combinado com 102,8 μΐ de SFA a temperatura ambiente; aproximadamente 5 μΐ do ADN de plasmídeo (200 ng/μΐ) foram depois adicionados ao Lipofectamine™/SFA para formar a mistura de ADN/Lipofectamine™, que foi incubada a temperatura ambiente durante 30 minutos. 0 SFA foi retirado das Células BHK e as células foram incubadas com 50 μΐ da mistura de ADN/lipofectamine™ durante 5 horas a 37 °C com 5% de CO2. Cinquenta μΐ da mistura de ADN/Lipofectamine™ foram adicionados a cada um de dois poços das Células BHK, de modo que as transfecções foram feitas em duplicata.

Após as células BHK terem sido incubadas com mistura de ADN/lipofectamine™ durante 5 horas, mistura de ADN/lipof ectamine™ foi retirada e 100 ml de meios de cultura foram adicionados. As células foram incubadas durante a noite, os meios foram retirados e recolocados com 100 μΐ de meios de cultura. Após cultivar células durante 48-72 horas, os meios condicionados foram retirados, congelados a -80 °C durante um mínimo de 20 minutos, descongelados, e depois 50 μΐ foram ensaiados no Ensaio de proliferação de BAF3, descritos no Exemplo 5, para identificar agrupamentos de 250 clones com actividade de ligando.

Vinte placas de 96 poços foram rastreadas num ensaio único. Isto representou aproximadamente 250 ADNc/poço ou 480.000 ADNc total. Destes, meios condicionados de aproximadamente 60 poços (representando 250 ADNc por poço) testados positivos no ensaio de proliferação. Um destes agrupamentos positivos foi escolhido para quebrar e isolar um ADNc individual que poderia codificar o zcytorl71ig. Este foi o agrupamento 62A12.

Para o agrupamento 62A12, 1 μΐ de ADN foi utilizado para transformar células ElectroMax™ DH10B (Gibco/BRL) por electroporação. Os transformantes foram inoculados em placa em placas de LB + amp (100 mg/ml) para dar colónias 185 isoladas. Do agrupamento electroporado, 672 colónias individuais foram seleccionadas por palito de dente em sete placas de 96 poços que contêm 1,2 ml de SuperBrothlI™ por poço. Estas placas foram numeradas do n° 62,1 a n° 62,7. Estas foram cultivadas durante a noite e o ADN de plasmídeo foi submetido a miniprep como anteriormente. Para todas as sete placas, o ADN de plasmideo das placas de quebra foi transfectado em células BHK e ensaiadas por proliferação como anteriormente, excepto que as transfecções não foram feitas em duplicata.

Dois clones positivos 62.6C7 e 62.6E9 foram identificados por actividade de um total de 672 clones. ADN de plasmideo submetido a miniprep do clone 62.6E9 foi sequenciado e uma tentativa de identificação foi obtida, mas uma sequência mista foi obtida destes clones positivos. Para isolar adicionalmente o ADNc de zcytorl71ig a um clone individual, 1 μΐ de ADN do agrupamento 62.6E9 foi utilizado para electroporar células DH10B e os transformantes inoculados em placa em placas de LB + amp (100 μg/ml) para dar colónias isoladas. ADN de plasmídeo submetido a miniprep de várias colónias foi sequenciado para dar a sequência de ADN exacta. A sequência de polinucleótido de zcytorl71ig era de comprimento completo (SEQ ID NO: 1) e sua sequência de aminoácido correspondente é mostrada (SEQ ID NO: 2) .

Exemplo 8

Construção de Vectores de Expressão de Mamífero Que expressam Receptores solúveis de zcytor 17: zcytorllCEE, zcytorl7CFLG, zcytorl7CHIS e zcytorl7-Fc4

A. Construção de Vector de expressão de mamífero de zcytorl7 que contém zcytorl7CEE, zcytorl7CFLG e zcytor17 CHIS

Um vector de expressão foi preparado para a expressão do domínio extracelular solúvel do polipéptido zcytorl7, pZp9 zcytor17CEE, onde a construção foi projectada para 186 expressar um polipéptido de zcytorl7 compreendido da metionina de iniciação predita e adjacente truncado ao domínio transmembrana predito, e com uma etiqueta Glu-Glu C-terminal. (SEQ ID N4:32).

Um produto de PCR de aproximadamente 1500 pb foi gerado utilizando ZC29,451 (SEQ ID NO: 33) e ZC29,124 (SEQ ID NO: 34) como iniciadores de PCR para adicionais locais de restrição EcoRI e BamHI. Uma biblioteca interna de ADNc HPVS humano foi utilizada como um molde e amplificação por PCR foi realizada como se segue: 30 ciclos a 94 °C durante 1 minuto, 65 °C durante 1 minuto, 72 °C durante 1,5 minutos; depois 72 °C durante 7 minutos; imersão a 10 °C. A reacção de PCR foi precipitada com etanol e digerida com enzimas de restrição EcoRI e BamHI. O produto de PCR digerido foi purificado por gel num gel de agarose a 1,0% e a banda de aproximadamente 1500 pb foi cortada. Esta banda foi depois re-amplifiçada utilizando iniciadores idênticos com a seguinte ciclagem: 30 ciclos a 944 °C durante 1 minuto, 65 °C durante 1 minuto, 72 °C durante 3 minutos, depois 72 °C durante 7 minutos; imersão a 10 °C. A reacção de PCR foi precipitada com etanol e digerida com enzimas de restrição EcoRI e BamHI. O produto de PCR digerido foi purificado por gel num gel de agarose a 1,0% e a banda de aproximadamente 1500 pb foi cortada. O ADN cortado foi subclonado em plasmídeo CEEpZp9 que foi cortado com EcoRI e BamHI, para gerar plasmídeo com um receptor solúvel etiquetado no C terminal com GLU-GLU para zcytorl7, zcytorl7CEEpZp9. O domínio extracelular no ADNc de zcytorl7CEE em zcytorl7CEEpZp9 tem uma mutação silenciosa que muda o T para C na posição 1705 da SEQ ID NO: 4 (que codifica um resíduo Pro no resíduo 403 da SEQ ID NO: 5), Como esta mutação foi silenciosa, o ADNc de zcytorl7 em zcytorl7CEEpZp9 codifica o polipéptido como mostrado na SEQ ID NO: 5. Além disso, devido a construção utilizada, um par de resíduos Gly-Ser foi inserido C-terminal na extremidade 187 do domínio extracelular solúvel de zcytorl7 e antes da Etiqueta C-terminal de Glu-Glu (SEQ ID NO: 32). Como tal, a etiqueta na terminação C do domínio extracelular de zcytorl7, foi uma etiqueta Glu-Glu como mostrado na (SEQ ID NO: 17) . Plasmídeo CEEpZp9 é um vector de expressão de mamífero que contém uma cassete de expressão que tem o promotor de metalotioneína-1 de ratinho, múltiplos locais de restrição para inserção de sequências codificantes, e um terminador de hormona de crescimento humano. 0 plasmídeo também tem uma origem de replicação de E. coli, uma unidade de expressão de marcador detectável de mamífero que tem um promotor de SV40, potenciador e origem de replicação, um gene DHFR e o terminador de SV40. Utilizando técnicas de biologia molecular padrão zcytorl7CEEpZp9 foi electroporada em células DH10B competentes (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD) de acordo com a orientação do fabricante e inoculada em placa em placas de LB que contém 100 pg/ml de ampicilina, e incubada durante a noite. Colónias foram rastreadas por análise de restrição, ou PCR de ADN preparado a partir de colónias individuais. A sequência de inserto de clones positivos foi verificada por meio de análise de sequência. Uma preparação de plasmídeo em larga escala foi feita utilizando um kit QIAGEN® Maxi prep (Qiagen) de acordo com instruções do fabricante. O mesmo processo foi utilizado para preparar os receptores solúveis zcytorl7 com uma etiqueta de His C-terminal, composta de 6 resíduos de His numa fila; e uma etiqueta C-terminal FLAG® (SEQ ID NO: 36), zcytorl7CFLAG. Para construir estas construções, o vector mencionado anteriormente tem a etiqueta de HIS ou a etiqueta FLAG® em lugar da etiqueta glu-glu (por exemplo, SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 32 ou SEQ ID NO: 35). B. Construção de expressão de mamífero de Receptor zcytorU humano solúvel: zcytorl7-Fc4

Um vector de expressão, pEZE-2 hzcytor!7/Fc4, foi 188 preparado para expressar um versão solúvel marcada com Fc4 na porção C-terminal de hzcytorl7 (zcytorl7 humano-Fc4) em células PF CHO. As células PF CHO são uma linha de célula CHO interna adaptadas para crescimento em meio livre de proteína (meio ExCell 325 PF; JRH Biosciences). A linha de célula CHO interna foi originalmente derivada de células CHO DG44 (G. Urlaub, J. Mitchell, E. Kas, L.A. Chasin, V.L. Funanage, T.T. Myoda e J.L. Hamlin, "The Effect of Gamma Rays at the Dihidrofolate Reductase Locus: Deletions and Inversions," Somatic Cell and Molec. Genet., 12: 555-566 (1986) . Um fragmento de ADNc de zcytorl7 que inclui a sequência de polinucleótido do domínio extracelular do receptor zcytorl7 foi fundido in frame à sequência de polinucleótido de Fc4 (SEQ ID NO: 37) para gerar uma fusão de zcytor 17-Fc4 (SEQ ID NO: 38 e SEQ ID NO: 39) . 0 vector pEZE-2 é um vector de expressão de mamífero que contém a sequência de polinucleótido Fc4 e um local clonagem que permite a rápida construção de fusões de Fc4 C-terminal utilizando técnicas de biologia molecular padrão.

Um fragmento do par de base 1566 foi gerado por meio de PCR, que contém o domínio extracelular de zcytorl7 humano e os primeiros dois aminoácidos de Fc4 (Glu e Pro) com locais Fsel e BglII codificado nas extremidades 5' e 3', respectivamente. Este fragmento de PCR foi gerado utilizando iniciadores ZC29,157 (SEQ ID NO: 40) e ZC29,150 (SEQ ID NO: 41) por meio de amplificação a partir de um plasmídeo que contém o domínio extracelular de zcytorl7 humano (pZp9zcytorl7CEE) (Exemplo 8A) . As condições de reacção de PCR foram como se segue: 25 ciclos a 94 °C durante 1 minuto, 60 °C durante 1 minuto, e 72 °C durante 2 minutos; 1 ciclo a 72 °C durante 10 minutos; seguido por uma imersão a 4 °C. O fragmento foi digerido com endonuleases de restrição Fsel e BglII e subsequentemente purificado por electroforese em gel a 1% e purificação da banda utilizando kit de extracção por gel QiaQuick 189 (Qiagen). 0 ADN purificado resultante foi ligado durante 5 horas a temperatura ambiente num vector pEZE-2 previamente digerido com Fsel e BglII que contém Fc4 3' dos locais Fsel e BglII.

Dois μΐ da mistura de ligação foi electroporada em 37 μΐ de E. coli DH10B electrocompetente (Gibco) de acordo com as orientações do fabricante. As células transformadas foram diluidas em 400 ml de meios LB e inoculadas em placa em placas de LB que contém 100 mg/ml de ampicilina. Os clones foram analisados por material digerido de restrição e os clones positivos foram enviados para sequenciamento de ADN para confirmar a sequência da construção de fusão. Um microlitro de um clone positivo foi transformado em 37 μΐ de E. coli DH10B electrocompetente e riscado numa placa de LB/amp. Uma colónia individual foi colhida desta placa riscada para começar uma cultura de 250 ml de LB/amp que foi depois crescida durante a noite a 37 °C com agitação a 250 rpm. Esta cultura foi utilizada para gerar 750 mg de ADN purificado utilizando um kit Qiagen plasmid Maxi (Qiagen).

Exemplo 9

Transfecção E Expressão De Polipéptidos de Receptor de Zcytorl7 Solúvel

As células BHK 570 (N° de ATCC CRL-10314), DG-44 CHO, ou outras células de mamifero são inoculados em placa a aproximadamente 1,2 X 106 células/poço (placa de 6 poços) em 800 μΐ de meios livres de soros apropriados (SF) (por exemplo, DMEM, GibcolBRL High Glucose) (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) . As células são transfectadas com plasmideos de expressão que contém zcytorl7CEE, zcytorl7CFLG, zcytorl7CHIS ou zcytorl7-Fc4 (Exemplo 8), utilizando Lipofectin™ (Gibco BRL), em meios livres de soro (SF) de acordo com instrução do fabricante. Clones individuais que expressam os receptores solúveis são isolados, seleccionados e crescidos em meios de cultura de 190 célula, e purificados utilizando técnicas padrão. A. Expressão em mamífero de receptor zcytorl7CEE humano solúvel

As células 570 BHK (N° de ATCC: CRL-10314) foram inoculadas em placa em balões de cultura de tecido T-75 e deixados que crescessem até aproximadamente 50 a 70% de confluência a 37 °C, 5% de C02, em meios DMEMIFBS (DMEM,

Gibco/BRL High Glucose, (Gibco BRL, Gaithersburg, MD), 5% de soro bovino fetal, 1 mM de L-glutamina (JRH Biosciences, Lenea, KS), 1 mM de piruvato de sódio (Gibco BRL)) . As células foram depois transfectadas com o plasmídeo que contém zcytorl7CEE (Exemplo 8A) utilizando Lipofectamine™ (Gibco BRL), em formulação de meios livres de soro (SF) (DMEM, 10 mg/ml de transferrina, 5 mg/ml de insulina, 2 mg/ml de fetuina; 1% de L-glutamina e 1% piruvato de sódio). Dez microgramas do ADN de plasmídeo pZp9zcytorl7CEE (Exemplo 8A) foram diluídos num tubo de 15ml a um volume total final de 500 μΐ com meios SF. Cinquenta microlitros de Lipofectamine foram misturados com 450 μΐ de meio SF. A mistura de Lipofectamine foi adicionada à mistura de ADN e permitida que incubasse durante aproximadamente 30 minutos a temperatura ambiente. Quatro ml de meio SF foram adicionados à mistura de ADN:Lipofectamine. As células foram enxaguadas uma vez com 5 ml de meio SF, aspiradas, e a mistura de ADN:Lipofectamine foi adicionada. As células foram incubadas a 37 °C durante cinco horas, e depois 5 ml de meios DMEM/10% de FBS foram adicionados. O balão foi incubado a 37 °C durante a noite após cujo tempo as células foram divididas entre os meios de selecção (meios DMEM/FBS de acima com a adição de 1 μΜ de metotrexato ou 10 μΜ

Metotrexato (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) em placas de 150 mm a 1:2, 1:10, e 1:50. Aproximadamente 10 dias após a transfecção, uma placa de 150 mm de colónias resistentes a 1 μΜ de metotrexato foi tripsinizada, as células foram agrupadas, e metade das células foram reinoculadas em placa 191 em 10 μΜ de metotrexato; para amplificar adicionalmente a expressão da proteína zcytorl7CEE. Uma amostra meios condicionados deste agrupamento de células amplificadas foi testada para a níveis de expressão utilizando SDS-PAGE e análise de Western. B. Expressão em mamífero de receptor zcytorl7-Fc4 humano solúvel

Cinco replicatas de 200 pg de ADN de plasmídeo pEZE-2hzcytorl7Fc4 (Exemplo 8) foram linearizados por meio de digestão de restrição com FspI, uma enzima de restrição que corta uma vez dentro do vector e não interrompe os genes necessários para a expressão. 200 pg de ADN genómico de células CHO foi adicionado a cada replicata como ADN portador e depois o ADN foi precipitado pela adição de 0,1 volumes de 3 M de Acetato de sódio pH 5,2 e 2,2 volumes de etanol seguido por um incubação em gelo de 15 minutos e microcentrifugação a 4 °C. O ADN resultante precipitado foi lavado em etanol a 70% e seco ao ar antes de ser ressuspenso em 100 pl de meios de crescimento não selectivo de CHO livre de proteína (PF) (21 g/L de PF CHO Ex Cell 325 /200 mM de L-glutamina (Gibco)/100 mM de piruvato de sódio (Gibco)/lx de suplemento HT (Gibco). Dez milhões de células de 61 passagens PF CHO foram adicionados ao ADN em 600 pl de Meios de crescimento não selectivo PF CHO e depois foram electroporadas num sistema de electroporação Gene Pulser II (BioRad) utilizando 950 pF de capacitância e 300 Kv utilizando uma cuveta de electroporação Gene Pulser de 0,4 cm de lacuna (BioRad) . Todas as 5 replicatas das células electroporadas foram agrupadas e directamente seleccionadas em meios -HT (21 g/L PF CHO Ex Cell 325/ 200 mM de L-glutamina (Gibco)/100 mM de piruvato de sódio (Gibco). As células foram seleccionadas durante 1,5 dias em meios -HT antes de ser passadas a 4 x 105 ml el selecção de 50 nm MTX. Oito dias mais tarde as células foram semeadas a 3,5 X 105 células/ml em selecção de 200 mM MTX. Após um semana, 192 células foram semeadas a 4 X 105 células/ml em 1 μιη MTX selecção. Após duas semanas a 1 μΜ MTX, células foram semeadas a 1 X 106 células/ml em 50 ml para gerar meio condicionado. Os meios condicionados de 72 horas resultantes foram analisados por meio da sondagem de western blots com um anticorpo gerado contra Ig humana. As células produziram proteína hzcytor17/Fc4 a aproximadamente 1 mg/L. C. Expressão em maior escala em mamífero de receptor zcytorl7-Fc4 humano solúvel

Duzentos pg de ADN de plasmídeo de pEZE-2hzcytor17Fc4 (Exemplo 8) foram linearizados por meio de digestão de restrição com FspI, uma enzima de restrição que corta uma vez dentro do vector pEZE-2 e não interrompe os genes necessários para a expressão. Duzentos microgramas de ADN genómico de CHO (preparados no laboratório) foram adicionados como ADN portador e depois o ADN foi precipitado pela adição de 0,1 volumes de 3 M de Acetato de sódio pH 5,2 e 2,5 volumes de etanol seguido por microcentrifugação a temperatura ambiente. Cinco replicatas de sedimento de ADN foram preparados e transformados. O sedimento de ARN resultante foi lavado em etanol a 70% e seco ao ar antes de ser ressuspenso em 100 μΐ de meios de crescimento não selectivo PF CHO (21 g/L PF CHO Ex Cell 325 /200 mM de L-glutamina (Gibco)/100 mM de piruvato de sódio (Gibco)/lx de complemento HT (Gibco). Dez milhões de células CHO PF foram adicionadas ao ADN em 600 μΐ de meios de crescimento não selectivos PF CHO e depois foram electroporadas num sistema de electroporação Gene Pulser II (BioRad) utilizando 950 pF de capacitância e 300 volts utilizando uma cuveta de electroporação Gene Pulser de 0,4 cm de lacuna (BioRad). As células electroporadas foram agrupadas e postas directamente em selecção em meios -HT (21 g/L PF CHO Ex Cell 325/ 200 mM de L-glutamina (Gibco)/100 mM de piruvato de sódio (Gibco). As células 193 foram seleccionadas durante 14 dias em meios -HT antes de ser passadas a 4 x 105/ml em selecção de 50 nm MTX. As células foram amplificadas a 200 nM MTX e depois a luM MTX. Os agrupamentos -HT, 50nM, e luM foram semeados a 1 x 106 c/ml durante 48 horas, e os meios condicionados resultantes foram analisados por meio da sondagem de western blots com um anticorpo gerado contra Ig humana.

Exemplo 10

Purificação de receptores de zcytorl7 solúveis de células BHK 570 e CHO A. Expressão transitória em mamífero e purificação de receptor zcytorl7-Fc4 humano solúvel ADN de plasmideos pEZE-2hzcytorl7Fc4 (Exemplo 11B) foi introduzido em 40 maxi placas de células BHK utilizando Lipofectamine (Gibco BRL) como foi descrito no presente documento e nas instruções do fabricante. As células foram permitidas que se recuperassem durante a noite, depois foram enxaguadas e realimentadas com meio livre de soro (SL7V4, preparado no laboratório) . Após 72 horas, os meios foram colhidos e filtrados, e as células foram realimentadas com meio livre de soro. Após 72 horas, os meios foram colhidos e filtrados de novo.

Os meios condicionados livres de soro (2 x 1,5 L lotes) de células BHK transfectadas de forma transitória foi bombeado numa coluna Proteína A-agarose de 1,5 ml em 20 mM de Tris, pH 7,5, 0,5 M de NaCl. A coluna foi lavada extensivamente com este tampão e depois a proteína ligada foi eluída com 1 ml de 0,2 M de glicina, pH 2,5, 0,5 M de NaCl. A proteína eluída foi colhida em 0,1 ml de 2 M de Tris, pH 8,5.

As alíquotas foram colhidas para electroforese em gel de SDS- poliacrilamida e o zcytorl7-Fc bruto foi submetido a diálise durante a noite contra PBS. O receptor solúvel foi filtrado de forma estéril e colocado em alíquotas a -80 °C. 194 B. Purificação de zcytor!7-Fc4

Zcytorl7 marcado com Fc4 carboxilo terminal recombinante (Exemplo 8 e Exemplo 9) foi produzido a partir de células CHO transfectadas. A transfecção de CHO foi realizada utilizando métodos conhecidos no estado da técnica. Aproximadamente cinco litros de meios condicionados foram colhidos e filtrados de forma estéril utilizando filtros Nalgene de 0,2 mm. A proteína foi purificada a partir dos meios filtrados por uma combinação de cromatografia de afinidade Poros 50 proteína A (PerSeptive Biosystems, 1-5559-01, Framingham, MA) e coluna de cromatografia de exclusão em gel Superdex 200 (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). O meio de cultura foi directamente carregado sobre uma coluna de afinidade de 10 x 70 mm (5,5 ml de volume de leito) de proteína A a um fluxo de aproximadamente 3-10 ml/minuto. Em seguida de lavagem da coluna por dez volumes de coluna de PBS, a proteína ligada foi eluída por cinco volumes de coluna de 0,1 M de glicina, pH 3,0 a 10 ml/minuto) . As fracções de 2 ml foram colhidas cada uma em tubos que contêm 100 μΐ de 2,0 M de Tris, pH 8,0, com a finalidade de neutralizar as proteínas eluídas. Amostras da coluna de afinidade foram analisadas por meio de SDS-PAGE com coloração com comassie e Western blotting para a presença de zcytorl7-Fc4 utilizando Ig-HRP humana. Fracções que contêm Zcytorl7-Fc4 foram agrupadas e concentradas a 1-2 ml utilizando concentrador Biomax-30 (Millipore), e carregado sobre uma coluna de filtração em gel de 20 x 580 mm de Superdex 200. As fracções que contém zcytorl7-Fc4 purificado foram agrupadas, filtradas através de filtro de 0,2 mm, divididas em alíquotas de 100 μΐ cada uma, e congeladas a -80 °C. A concentração da proteína purificada final foi determinada por meio de ensaio BCA (Pierce, Rockford, IL) . C. Análise de SDS-PAGE e Western blotting de zcytorl7/Fc4 195

Zcytorl7-Fc4 recombinante foi analisado por meio de SDS-PAGE (Nupage 4-12%, Invitrogen, Carlsbad, CA) com método de coloração com comassie e Western blotting utilizando Ig-HRP humana. Os meios condicionados ou a proteína purificada foi submetida a electroforese utilizando uma minicélula nvitrogen Novex's Xcell II, e transferido a nitrocelulose (0,2 mm; Invitrogen, Carlsbad, CA) a temperatura ambiente utilizando módulo Novex's Xcell II blot com agitação de acordo com orientações proporcionadas no manual do instrumento. A transferência foi executada a 500 mA durante uma hora num tampão que contém 25 mM de base Tris, 200 mM de glicina, e 20% de metanol Os filtros foram depois bloqueados com 10% de leite magro em pó em PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente. A nitrocelulose foi rapidamente enxaguada, depois o anticorpo Ig-HRP humano (1:2000) foi adicionado em PBS que contém 2,5% de leite magro em pó. As manchas de transferência foram incubadas durante duas horas a temperatura ambiente, ou durante a noite a 4 °C, com agitação suave. Em seguida a incubação, as manchas de transferência foram lavadas três vezes durante 10 minutos cada em PBS, depois rapidamente enxaguada em H20. As manchas de transferência foram desenvolvidas utilizando reagentes de substrato quimioluminescente disponíveis comercialmente (Super-Signal® ULTRA reagentes 1 e 2 misturados 1:1; reagentes obtidos de Pierce, Rockford, IL), e o sinal foi capturado utilizando o software Lumi Analyst 3.0 de Lumi-Imager (Boehringer Mannheim GmbH, Alemanha) para tempos de exposição que variam desde 10 segundos até 5 minutos ou conforme seja necessário. 0 zcytorl7-Fc4purifiçado apareceu como uma banda individual com a coloração com coomassie ou prata a aproximadamente 220 kDa sob condições não redutoras, e a aproximadamente 120 kDa sob condições redutoras, que sugerem a forma dimérica de zcytorl7-Fc4 sob condições não 196 redutoras como esperado.

Exemplo 11

Ensaio utilizando receptor solúvel de zcytorl7, receptor solúvel de zcytorl7-Fc4 em ensaio de inibição competitiva

As células BaF3/zcytor17/WSX-l/OSMRbeta ou células BaF3/zcyl7/OSMRbeta foram precipitadas por centrifugação e lavadas em meios livres de mIL-3. As células foram centrifugadas e lavadas 3 vezes para garantir a retirada da mIL-3. As células foram depois contadas num hematocitómetro. As células foram inoculadas em placa num formato de 96 poços a 5000 células por poço num volume de 100 μΐ por poço utilizando os meios livres de mIL-3.

Meios condicionados tanto da activação de células CCRF-CEM como CCRF-HSB2 e as células CD3+ humanas seleccionadas, descritos no Exemplo 5, foram adicionados em experiências separadas a concentrações de 25%, 12,5%, 6,25%. 3,125%, 1,5%, 0,75%, 0,375%, e 0,187%, com ou sem receptores solúveis de zcytorl7 (Zcytorl7-Fc4; Veja-se, Exemplo 9 e Exemplo 10) a 1-10 pg/ml. O volume de ensaio total foi 200 μΐ.

As placas de ensaio foram incubadas a 37 °C, 5% de CO2 durante 3-5 dias em cujo tempo Alamar Blue (Accumed) foi adicionado a 20 μΐ/poço. Placas foram incubadas de novo a 37 °C, 5% de C02 durante 16-24 horas. As placas foram lidas no leitor de placa Fmax™ (Molecular. Devices) como foi descrito no Exemplo 2. Resultados demonstraram inibição parcial de crescimento celular com receptor solúvel zcytorl7-Fc4 a 10 pg/ml, confirmando que o factor em cada amostra foi especifico para o receptor zcytorl7.

Curvas de titulação, diluindo o receptor solúvel, ou heterodimeros de receptor solúvel que compreende zcytor17/OSMR e zcytor17/WSX-l foram também executadas utilizando o ensaio indicado anteriormente para determinar se receptores zcytor17 são capazes de inibir completamente o crescimento, por exemplo, a concentrações baixas ou 197 fisiológicas .

Exemplo 12

Ensaio de captura de secreção

Um ensaio de captura de secreção é usado para testar a ligação do zcytorl71ig a receptores que compreendem receptor zcytorl7, tal como o receptor zcytorl7 ou heterodimeros e trímeros de receptores que compreendem o receptor zcytorl7 (por exemplo, zcytor17/OSMR, zcytorl7/WSX-l, ou zcytor17/0SMR/WSX-1, ou outras subunidades de receptor de citocina de Classe I). 0 ADN de Zcytorl71ig de plasmideo é transfectado em células COS, e utilizado para avaliar a ligação do zcytorl71ig a receptores que compreende receptor zcytor17 por captura de secreção como é descrito a seguir.

A. Transfecções de células COS A transfecção de células COS é realizada como se segue: foram misturados 800 ng de ADNc de zcytorl71ig e 5 μΐ de Lipofectamine™ em 92 μΐ de meio DMEM livre de soro (55 mg de piruvato de sódio, 146 mg de L-glutamina, 5 mg de transferrina, 2,5 mg de insulina, 1 μg de selénio e 5 mg de fetuina em 500 ml de DMEM), incuba-se a temperatura ambiente durante 30 minutos e em seguida foram adicionados 400 μΐ de meios DMEM livres de soro. Adicionar esta mistura de 500 μΐ em l,5xl05 células COS/poço cultivadas numa placa de cultura de tecidos de 12 poços e foram incubadas durante 5 horas a 37 °C. Adicionar 500 μΐ de meios FBS DMEM a 20% (100 ml de FBS, 55 mg de piruvato de sódio e 146 mg de L-glutamina em 500 ml de DMEM) e incubar durante a noite. B. Ensaio de Captura de Secreção A captura de secreção é realizada como se segue: o meio é enxaguado das células com PBS e depois fixo durante 15 minutos com formaldeído a 1,8% em PBS. As células depois são lavadas com TNT (0,1M Tris-HCL, 0,15M NaCl, e 0,05% Tween-20 em H20) , e permeadas com 0,1% Triton-X em PBS durante 15 minutos, e lavadas de novo com TNT. As células 198 são bloqueadas durante 1 hora com TNB (0,1M Tris-HCL, 0,15M NaCl e 0,5% de Reagente de Bloqueio (NEN Renaissance TSA-Direct Kit) em H2O) , e lavadas de novo com TNT. Se for usada a proteína de receptor biotinilada, as células são bloqueadas para incubações de 15 minutos com lavagem com Avidina e então Biotina (Vector Labs) entre as mesmas com TNT. Dependendo de qual receptor solúvel é usado, as células são incubadas durante 1 hora em TNB com: (A) 1-3 μρ/ιηΐ de receptor solúvel zcytorl7, proteína de fusão zcytorl7-Fc4 (Exemplo 10); (B) 1-3 μρ/ιηΐ de proteína receptora solúvel zcytor 17/OSMRbeta; (C) 1-3 μρ/ιηΐ zcytorl7/ proteína de receptor de WSX-1 solúvel; ou (D) 1-3 μρ/ιηΐ zcytor 17/OSMR/ proteína de receptor de WSX-1 solúvel. As células depois são lavadas com TNT. Dependendo do receptor solúvel que foi utilizado (por exemplo, se estava marcado com um marcador Fc4 (SEQ ID NO: 37), um marcador FLAG C-terminal (SEQ ID NO: 36) ou um marcador CEE (SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 35)), as células são incubadas durante outra hora com: (A) Ig de cabra ant i-humana-HRP diluída 1:200 (específica de Fc) ; (B) M2-HRP diluída 1 : 1000; (C) anticorpo anti-GluGlu-HRP diluído 1:1000; ou (D) estreptavidina-HRP diluído 1:300 (kit NEN) em TNB, por exemplo. De novo as células são lavadas com TNT.

Detecta-se a ligação positiva com reagente de fluoresceína tiramida diluído 1:50 em tampão de diluição (kit NEN) e incubado durante 4-6 minutos e lavado com TNT. As células foram conservadas com Meio de Montagem Vectashield (Vector Labs Burlingame, CA) diluído 1:5 em TNT. As células são visualizadas utilizando um filtro FITC num microscópio fluorescente.

Exemplo 13

Designação Cromossómica e Colocação da Sequência Genica para o zcytorl71ig A sequência génica de zcytorl71ig foi mapeada no cromossoma humano 12 utilizando a versão disponível 199 comercialmente do "Stanford G3 Radiation Hybrid Mapping Panei" (Research Genetics, Inc., Huntsville, AO). 0 "Stanford G3 RH Panei" contém ADN de cada um de 83 clones de híbridos de radiação do genoma humano completo, mais dois ADN de controlo (o dador de RM e o receptor de A3). Um servidor WWW (por exemplo, Standford University) permite a localização cromossómica de marcadores e genes.

Para o mapeamento da sequência génica de zcytorl71ig com o "Stanford G3 RH Panei", reacções de 20 μΐ foram preparadas numa placa de microtitulação de 96 poços compatível para PCR (Stratagene, A Jolla, CA) e foram utilizadas num termociclador "RoboCycler Gradient 96" (Stratagene). Cada uma das 95 reacções de PCR consistia em 2 μΐ de tampão de reacção de PCR 10X (Qiagen, Inc. Valência, CA), 1,6 μΐ de mistura de dNTP (2,5 mM de cada um, PERKIN-ELMER, Foster City, CA), 1 μΐ de iniciador sense, ZC41,458 (SEQ ID NO: 42), 1 μΐ de iniciador antisense, ZC41,457 (SEQ ID NO: 43), 2 μΐ de "RediLoad" (Research Genetics, Inc., Huntsville, AO), 0, 1 μΐ de HotStarTaq ADN Polimerase de Qiagen (5 unidades/μΐ) , 25 ng de ADN de um clone híbrido individual ou controlo e água destilada para um volume total de 20 μΐ. As reacções foram cobertas com uma quantidade igual de óleo mineral e foram seladas. As condições do ciclador de PCR foram como se segue: um ciclo inicial de desnaturação de 15 minutos a 95 °C, 35 ciclos de desnaturação de 45 segundos a 95 °C, 1 minuto de hibridação a 53 °C e 1 minuto e 15 segundos de extensão a 72 °C, seguido de um 1 ciclo de extensão final de 7 minutos a 72 °C. As reacções foram separadas por electrof orese num gel de agarose a 2% (EM Science, Gibbstown, NJ) e foram visualizadas por coloração com brometo de etídio.

Os resultados mostraram a ligação da sequência do gene de zcytorl71ig ao marcador do cromossoma 12 SHGC-83339 com uma pontuação LOD >11 e a uma distância de 17 cR_10 000 do 200 marcador. Este marcador situa ao gene de zcytorl71ig na região crombassómica 12q2 4,31.

Exemplo 14

Identificação e clonagem de zcytorl71ig murino A. Identificação de zcytorl71ig murino de comprimento completo

Utilizando a sequência do péptido zcytorl71ig humano (SEQ ID NO: 2) para consultar uma base de dados de ADN interna, foi identificado um ADNc murino, N° de Acesso do Genbank AK005939, como sequência parcial potencial para o zcytorl71ig murino. A sequência de ADNc de AK005939 foi utilizada para estudar uma base de dados que continha fragmentos genómicos murinos. Foi montado um contig genómico do zcytorl71ig murino (SEQ ID NO: 76). A predição do potencial codificante neste fragmento genómico com o programa Genscan revelou uma provável sequência de ADNc, com a mesma estrutura génica que o zcytorl71ig humano. Na SEQ ID NO: 10, é representada uma sequência de ADNc murina, e a sequência de polipéptido correspondente é mostrada na SEQ ID NO: 11. B. Clonagem de zcytor!71ig de ratinho a partir de uma biblioteca de ADNc de testículo de ratinho por PCR.

Co base na sequência genómica (SEQ ID NO: 76), foram projectados dois iniciadores de PCR e foram utilizados para identificar uma fonte de ADNc de zcytorl71ig de ratinho por PCR. Estes iniciadores ZC41498 (SEQ ID NO: 86) e ZC41496 (SEQ ID NO: 87) foram projectados para as supostas regiões não traduzidas 5' e 3' das sequências de ratinho (SEQ ID NO: 76 e SEQ ID NO: 10). Foram rastreadas várias fontes de ADNc por PCR, incluindo ADNc Marathon-ready (Clontech) e aliquotas de bibliotecas de ADNc fabricadas localmente. Os produtos foram visualizados em géis de agarose a 1%. Foram observadas bandas do tamanho esperado em reacções que utilizavam um molde de biblioteca de ADNc de testículo de ratinho. Estas reacções de PCR foram realizadas 201 satisfatoriamente em volumes de aproximadamente 50 μΐ com ou sem 10% de DMSO, utilizando pfu turbo polimerase (Stratagene) de acordo com as recomendações do fabricante; com uma aplicação adicional de iniciador a temperaturas elevadas de cera, utilizando inicio a temperatura elevada 50 s (molecular Bioproducts, Inc. San Diego, CA). Os ciclos térmicos de PCR foram realizados com somente um ciclo de 94 °C durante 4 minutos; seguido de 40 ciclos de 94 °C: 30 segundos, 48 °C: 30 segundos, 72 °C: 50 segundos; com uma extensão final adicional a 72 °C durante 7 minutos. As duas reacções de PCR foram agrupadas e purificadas utilizando agarose de baixo ponto de fusão e a enzima de digestão de agarose Gelase (Epicenter, Inc. Madison, WI) de acordo com as recomendações do fabricante. A determinação da sequência de ADN destes produtos de PCR revelou uma sequência de ADNc de zcytorl7 murino (SEQ ID NO: 90) que compreendia uma ORF idêntica à SEQ ID NO: 10, confirmando que a SEQ ID NO: 10 codificava o polipéptido zcytorl71ig de ratinho. Depois foram utilizados iniciadores de PCR ZC41583 (SEQ ID NO: 88) e ZC41584 (SEQ ID NO: 89), para adicionar locais de restrição Fsel e Asei e uma sequência Kozak parcial à grelha de leitura aberta de mcytorl71ig e um codão de terminação (SEQ ID NO: 92) . Foi utilizado um termociclador Robocycler 40 (Stratagene) para realizar um gradiente de temperaturas de hibridação e ciclos como se segue, Pfu turbo polimerase (Stratagene) foi aplicado como foi descrito anteriormente, mas somente em DMSO a 10%. Os ciclos foram realizados com somente um ciclo de 94 °C durante 4 min; seguido de 20 ciclos de 94 °C: 30 segundos, gradiente de 65 °C a 51 °C: 30 segundos, 72 °C: 1 minuto; e somente uma extensão de 72 °C durante 7 minutos. O molde para esta segunda reacção de termociclagem foi 1 μΐ do produto de PCR mcytorl71ig purificado em gel inicial, indicado anteriormente. O produto de PCR resultante das três reacções à menor temperatura foi agrupado e foi 202 purificado em gel utilizando o método de Gelase (Epicenter) descrito anteriormente. Este mzcytorl71ig purificado foi digerido com Fsel e Asei e foi ligado num vector pZP7X modificado para ter locais Fsel e Asei em seu local de clonagem. 0 plasmideo pZP7X é um vector de expressão de mamífero que contém uma cassete de expressão que tem o promotor da metalotioneina-1 de ratinho (MT-1), múltiplos locais de restrição para a inserção de sequências codificantes, e um terminador de hormona de crescimento humana. O plasmideo também tem uma origem de replicação de E. coli, uma unidade de expressão de marcador de selecção de mamífero que tem um promotor, potenciador e origem de replicação de SV40, um gene de DHFR e o terminador de SV40. A sequência de ADNc murina clonada é representada na SEQ ID NO: 90, e a sequência de polipéptido correspondente é mostrada na SEQ ID NO: 91 (que é idêntica à SEQ ID NO: 11). Exemplo 15

Isolamento do clone de ADNc de zcytorl71ig de ratinho a partir de uma biblioteca de baço de ratinho activada A. Fonte primária murina utilizada para isolar zcytorlHig de ratinho

Colhem-se baços de ratinho procedentes de ratinho Balb/C e são triturados entre lâminas de extremidades esmeriladas para criar uma suspensão celular. É de esperar que o rendimento de células de ratinho primárias isoladas seja de aproximadamente 6,4 X 108 células antes da selecção descrita a seguir.

As células de baço são suspensas em 9,6 ml de tampão MACS (PBS, EDTA a 0,5%, EDTA 2 mM). São retirados 1,6 ml de suspensão celular e são adicionados 0,4 ml de micropérolas CD90 (Thy 1,2) (Miltenyi Biotec). A mistura é incubada durante 15 min. a 4 °C. Estas células marcadas com pérolas CD90 são lavadas com 30 ml de tampão MACS, e depois são ressupensas em 2 ml de tampão MACS. É preparada uma coluna VS+ (Miltenyi) de acordo com as 203 instruções do fabricante. A coluna VS+ depois é colocada num campo magnético VarioMACS™ (Miltenyi). A coluna é equilibrada com 5 ml de tampão MACS. As células de ratinho primárias isoladas depois são aplicadas à coluna. As células negativas para CD90 são permitidas que passem através. A coluna é enxaguada com 9 ml (3 X 3 ml) de tampão MACS. Depois a coluna é retirada do imã e é colocada sobre um tubo Falcon de 15 ml. As células CD90+ são eluidas adicionando 5 ml de tampão MACS à coluna e as células ligadas são retiradas com jacto utilizando o êmbolo proporcionado pelo fabricante. A incubação das células com as pérolas magnéticas CD90, as lavagens e as etapas da coluna VS+ (incubação por meio de eluição) anteriores são repetidas mais uma vez. As fracções de CD90+ resultantes das 2 separações em coluna são agrupadas. É de esperar que o rendimento de células de baço de ratinho seleccionadas CD90+ seja aproximadamente 1 X 108 células em total. É retirada uma amostra das células de ratinho seleccionadas CD90+ agrupadas para a coloração e classificação num separador de células com anticorpos fluorescentes (FACS) para avaliar sua pureza. É utilizado um anticorpo de hámster anti-CD3£ de ratinho conjugado com PE (PharMingen) para a coloração e separação das células seleccionadas CD90+. As células seleccionadas CD90+ de ratinho devem ser aproximadamente 93% de células CD3 + , o que sugere que as células são 93% células T.

As células seleccionadas CD90+ murinas são activadas por incubação de 3 X 106 células/ml em RPMI + FBS a 5% + 10 ng/ml de PMA e 0,5 μρ/ιηΐ de Ionomicina (Calbiochem) durante a noite a 37 °C. O sobrenadante destas células de ratinho seleccionadas CD90+ activadas é ensaiado com respeito à actividade zcytorl71ig como é descrito a seguir. Além disso, as células de ratinho seleccionadas CD90+ activadas são utilizadas para preparar uma biblioteca de ADNc, como é descrito no Exemplo 16, mostrado a seguir. 204

Exemplο 16

Clonagem de zcytorl71ig de ratinho a partir de uma biblioteca de células seleccionadas CD90+ de ratinho O rastreio de uma biblioteca de ADNc de células seleccionadas CD90+ activadas de ratinho pode revelar ADNc isolado que é um novo membro da família de citocinas de quatro feixes helicoidais que codificariam o ortóloqo de ratinho do zcytorl71iq humano. O ADNc é identificado por rastreio de hibridação. A. O vector para a construção da biblioteca seleccionada do CD90 +

Para a construção da biblioteca seleccionada de CD3+ é utilizado o vector pZP7N (veja-se o Exemplo 6A). B. Preparação da biblioteca de ADNc de células seleccionadas CD90+ activadas de ratinho primárias.

Isolam-se por centrifugação aproximadamente 1,5 X 108 células seleccionadas CD90+ de ratinho primárias estimuladas em ionomicina/PMA (Exemplo 15). Isola-se o ARN total a partir do sedimento celular e é convertido em ADNc de cadeia dupla como é descrito no Exemplo 6B. Este ADN depois é introduzido por transfecção em células BHK, como é descrito no Exemplo 6B, e a proliferação é avaliada utilizando um ensaio de fluorescência com "Alamar Blue" (Exemplo 2B).

Com a finalidade de rastrear a biblioteca por meio de clonagem de captura de secreção, é necessária uma forma amplificada, complexa, da biblioteca para transfectar células COS-7. Cultivam-se 4,8 milhões de clones em 110 placas de LB-agar de 15 cm suplementadas com 100 μρ/πιΐ de ampicilina, 10 μρ/ιηΐ de meticilina. Depois de cultivar as placas durante a noite a 37 °C as bactérias são colhidas por raspado e são sedimentadas. É extraído ADN de plasmídeo das bactérias sedimentadas utilizando um Nucleobond-giga™ (Clonetech) seguindo as instruções do fabricante. Este plasmídeo depois é utilizado para transfectar células COS-7 205 em lâminas e é rastreado utilizando a técnica de captura de secreção descrita a seguir (Exemplo 17). C. Rastreio da biblioteca de ADNc de ratinho activada

Inoculam-se em placas aproximadamente 5 X 105 clones em 10 placas LB/Amp Maxi. As colónias são levantadas, desnaturadas, neutralizadas e entrecruzadas utilizando os procedimentos padrão (Sambrook, J. et al. supra.) . Cinquenta nanogramas do fragmento de PCR 5'-RACE de 300 pb 5' (Exemplo 14) são marcados com 32P utilizando o kit de marcação de iniciador aleatório Prime-Itr RmT (Stratagene). Os 10 filtros são hibridados com esta sonda marcada a 65 °C durante a noite utilizando solução de hibridação ExpressHyb™ (Clontech). Os filtros depois são lavados sequencialmente a 60 °C durante 1 hora três vezes com SSC 0,2x (NaCl 30 mM, citrato de sódio 3 mM, pH 7,0), SDS a 0,1%; e depois a 65 °C durante 1 hora. Os filtros são expostos a - 80 °C durante a noite e o filme de raios X é revelado. São extraídos blocos de agar que contêm as colónias positivas e os clones são cultivados em placas LB/Amp de 10 cm. As colónias depois são levantadas em filtros e são hibridadas de novo seguindo o mesmo procedimento descrito anteriormente. São isolados clones de ADN individuais e são sequenciados utilizando métodos convencionais, para identificar o ADNc de ratinho.

Exemplo 17 zcylorl71ig de ratinho não se liga ao receptor solúvel zcytorl7 humano no ensaio de captura de secreção O ADN para o clone de ratinho mzcytor 171ig/pZP7 foi introduzido por transfecção em células COS, e a ligação de receptores solúveis que compreendem zcytorl7 (receptor solúvel zcytorl7 humano zcytorl7-Fc4 (Exemplo 10), ou heterodímeros de receptor solúvel (zcytorl7/WSX-l ou BaF3/zcytorl7/OSMRbeta), às células COS transfectadas foi ensaiada por um ensaio de captura de secreção (Exemplo 12). O ensaio confirmou que zcytorl71ig de ratinho não se liga 206 ao receptor solúvel zcytorl7 humano. A transfecção de células COS foi realizada de acordo com o Exemplo 12 utilizando aproximadamente 0,7 μρ de ADNc de zcytorl71ig de ratinho (Exemplo 16) em 3 μΐ. A captura de secreção foi realizada de acordo com o Exemplo 12 utilizando, por exemplo, 1 μg/ml de proteína de fusão de receptor solúvel zcytorl7 Fc4 (Exemplo 10) (ou heterodímeros de receptor solúvel que compreendia zcytorl7 como é descrito no presente documento) em TNB, e Ig-HRP de cabra anti-humana (específica de Fc) diluída 1:200 em TNB para o anticorpo detectável. Não foi detectada ligação positiva do receptor zcytorl7 humano solúvel às células fixas preparadas com o reagente fluoresceína tiramida de acordo com o Exemplo 12. As células foram conservadas e foram visualizadas de acordo com o Exemplo 12.

Os resultados indicaram que zcytorl71ig de ratinho não se liga ao receptor solúvel zcytorl7 humano (ou heterodímeros do receptor solúvel que compreende zcytorl7 como é descrito no presente documento).

Exemplo 18

Expressão de zcyrorl71ig em células de mamífero Expressão em mamífero de zcytorl71ig de ratinho

As células BHK 570 (N° de ATCC CRL-10314) foram

inoculadas em placas em placas de cultura de tecido de 10 cm e foram deixadas que crescessem até uma confluência de aproximadamente 20% durante a noite a 37 °C, com um 5% de C02 em meio DMEM/FBS (DMEM, Gibco/BRL de Alto conteúdo de glicose; GibcoBRL, Gaithersburg, MD), soro bovino fetal a 5% (Hyclone, Logan, UT) , 1 mM de L-glutamina (JRH

Biosciences, Lenexa, KS), 1 mM de piruvato de sódio (Gibco BRL). As células depois foram transfectadas com o plasmídeo mzcytorl71ig/pZP7X (Exemplo 14) utilizando um kit de transfecção de Lipofectamine (GibcoBRL) estável de mamífero de acordo com as instruções do fabricante.

Um dia depois da transfecção, as células foram 207 divididas 1:10 e 1:20 no meio de selecção (meio de DMEM/FBS com a adição de 1 μΜ de metotrexato (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)) em placas de 150 mm. O meio das células foi substituído por meio de selecção fresco no dia 5 depois da transfecção. Aproximadamente 10 dias depois da transfecção, as colónias resistentes foram tripsinizadas a metotrexato e as células foram agrupadas e cultivadas em balões de cultura a grande escala. Uma vez que as células tinham crescido até uma confluência de aproximadamente 90%, foram enxaguadas com PBS três vezes e foram cultivadas com meio ESTEP2 livre de soro (meio condicionado DMEM (Gibco BRL), 0,11 g/1 de Piruvato de Na, 3,7 g/1 de NaHCCb, 2,5 mg/1 de insulina, 5 mg/1 de transferrina, pH 7,0) . O meio condicionado foi colhido três dias depois, e foi posto num ensaio de proliferação de BaF3 utilizando Alamar Blue descrito no Exemplo 19 apresentado a seguir.

Exemplo 19 zcytorl71ig de ratinho não activa o receptor zcytorl7 humano em ensaio de BaF3 utilizando Alamar Blue A proliferação de células BaF3/zcytorl7, BaF3/zcytorl7/OSMRbeta e BaF3/zcytorl7/WSX-l (Exemplo 4 e 5B) foi avaliada utilizando meio condicionado livre de soro de células BHK que expressavam zcytorl71ig de ratinho (Exemplo 18).

As células BaF3/Zcytorl7, BaF3/zcytorl7/OSMRbeta e BaF3/zcytorl7/WSX-l foram centrifugadas, lavadas e cultivadas em meio sem mIL-3 como é descrito no Exemplo 5B. Foi diluído meio condicionado de células BHK que expressavam zcytorl71ig de ratinho (Exemplo 18) com meio sem mIL-3 até concentrações de 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,125%, 1,5%, 0,75% e 0,375%. O ensaio de proliferação foi realizado de acordo com o Exemplo 5B. Os resultados deste ensaio foram negativos, indicando que zcytorl71ig de ratinho não activa complexos de receptor zcytorl7, zcytorl7/OSMRbeta ou zcytorl7/WSX-l humanos. 208

Exemplo 20 zcytorl71ig humano activa ao receptor zcytorl7/OSMRbeta humano no ensaio de luciferase A. Construção da linha celular BaF3/KZ134/zcytorl7 O plasmídeo KZ134 foi construído com oligonucleótidos complementares ZC12,749 (SEQ ID NO: 44) e ZC12,748 (SEQ ID NO: 45) que contêm elementos de ligação ao factor de transcrição STAT de 4 genes, que inclui um elemento induzível c-fos Sis modificado (m67SIE ou hSIE) (Sadowski, H. et al., Science 261: 1739-1744, 1993), o p21 SIE1 do gene p21 WAF1 (Chin, E, et ai., Science 272: 719-722, 1996), o elemento de resposta de glândula mamária do gene da β-caseína (Schmitt-Ney, M. et al., Mol. Cell. Biol. 11: 3745-3755, 1991), e um elemento induzível STAT do gene Fcg RI, (Seidel, H. et al., Proc. NatL Acad. Sei. 92:3041-3045, 1995). Estes oligonucleótidos contêm extremidades compatíveis com Asp718-XhoI e foram ligados, utilizando métodos convencionais, a um vector indicador de luciferase de pirilampo receptor com um promotor de c-fos (Poulsen, LK. et al., J. Biol. Chem. 273: 6229-6232, 1998) digerido com as mesmas enzimas e que continha um marcador de selecção de neomicina. O plasmídeo KZ134 foi utilizado para transfectar de forma estável células BaF3, utilizando métodos de transfecção e selecção padrão para obter a linha celular BaF3/KZ134.

Foi construída uma linha celular indicadora de BaF3/KZ134 estável, que expressava o receptor zcytorl7 de comprimento completo ou o receptor zcytorl7/OSMRbeta de acordo com o Exemplo 4. Os clones foram diluídos, cultivados em placas e seleccionados utilizando técnicas convencionais. Os clones foram rastreados pelo ensaio de luciferase (veja-se o Exemplo 20B, indicado a seguir) utilizando o meio condicionado de zcytorl71ig humano ou a proteína zcytorl71ig purificada (veja-se o Exemplo 35, indicado a seguir) como indutor. Foram seleccionados clones 209 com a maior resposta a luciferase (por meio de luciferase STAT) e o menor nivel de fundo. Foram seleccionados as linhas celulares transfectantes. As linhas celulares foram denominadas BaF3/KZ134/zcytorl7 ou BaF3/KZ134/zcytor17/OSMRbeta dependendo dos receptores introduzidos por transfecção na linha celular.

De forma similar, também foram construídas linhas celulares BHK utilizando o método descrito no presente documento, e foram utilizados em ensaios de luciferase descritos no presente documento. As linhas celulares foram denominadas BHK/KZ1344/zcytorl7 ou BHK/KZ134/zcytor17/OSMRbeta dependendo dos receptores introduzidos por transfecção na linha celular. B. Zcytorl71ig humano activa o receptor zcytorl7 humano no ensaio de luciferase BaF3/KZl34/zcytorl7/OSMRbeta ou BHK/KZ134/zcytorl7/OSMRbeta.

Foram centrifugadas células BaF3/KZ134/zcytorl7 e BaF3/KZ134/zcyorl7/OsMRbeta e foram lavadas em meio sem mIL-3. As células foram centrifugadas e foram lavadas 3 vezes para garantir a eliminação de mIL-3. Depois, as células foram contadas em hemacitómetro. As células foram cultivadas num formato de 96 poços a aproximadamente 30.000 células por poço num volume de 100 μΐ por poço utilizando o meio sem mIL-3. Foi utilizado o mesmo método para as células BaF31KZ134 não transfectadas para uso como um controlo no ensaio posterior. Foram cultivadas células BHK/KZ134/xcytorl7 ou BHK/KZ134/zcytorl7/OSMRbeta num formato de 96 poços a 15.000 células por poço em 100 μΐ de meio. Como controlo foram utilizadas células BHK/KZ134 parentais. A activação por STAT das células BaF3/KZ134/Zcytorl7, BaF3/KZ134/zcytorl7/OSMRbeta, BHK/KZ134/zcytorl7 ou BHK/KZ134/zcytorl7/OSMRbeta foi avaliado utilizando (1) meio condicionado de células BHK570 transfectadas com o zcytorl71ig humano (Exemplo 7), (2) meio condicionado de 210 células BHK570 transfectadas com zcytorl71ig de ratinho (Exemplo 18), (3) zcytorl71ig humano purificado (Exemplo 35), ou (4) meio sem mIL-3 para medir a resposta de controlo somente com meio. O meio condicionado foi diluído com meio RPMI sem mIL-3 a concentrações de 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,125%, 1,5%, 0,75% e 0,375%. O zcytorl71ig humano purificado foi diluído a uma concentração de 1200, 600, 300, 150, 75, 37,5, 18,75 ou 9,4 pM. Foram adicionados cem microlitros do meio condicionado diluído ou proteína às células BaF3/KZ134/Zcytorl7, BaF3/KZ134/zcytorl7/OSMRbeta, BHK/KZ134/zcytorl7 ou BHK/KZ134/zcytor17/OSMRbeta. O ensaio utilizando o meio condicionado foi realizado em paralelo em células de BaF3/KZ134 não transfectadas ou BHK/KZ134 como controlo. O volume total de ensaio foi de 200 μΐ. As placas de ensaio foram incubadas a 37 °C, com 5% de CO2 durante 24 horas, depois do que as células de BaF3 foram preipitadas por centrifugação a 2000 rpm durante 10 min., e o meio foi aspirado, e foram adicionados 25 μΐ de tampão de lise (Promega). Para as linhas celulares BHK, a etapa de centrifugação não foi necessária já que as células são aderentes. Depois de 10 minutos a temperatura ambiente, as placas foram medidas com respeito à activação da construção indicadora STAT lendo num luminómetro (Labsystems Luminoskan, modelo RS) que adicionou 40 μΐ de substrato de ensaio de luciferase (Promega) a um integração de cinco segundos.

Os resultados deste ensaio confirmaram que a resposta do indicador STAT das células BaF3/KZ134/zcytorl7/OSMRbeta e BHK/KZ134/zcytorl7/OSMRbeta ao zcytorl71ig humano em comparação com as células BaF3/KZ134/zcytorl7, as células BHK/KZ134/zcytorl7 ou as BaF3/KZl34 não transfectadas ou células de controlo BHK/KZ134, mostraram que a resposta estava mediada pelos receptores zcytor17/OSMRbeta. Os resultados também mostraram que o zcytorl71ig de ratinho não activa o ensaio indicador STAT por meio do complexo de 211 receptor humano.

Exemplo 21 zcytorl71ig de ratinho é activo em ensaio de medula óssea de ratinho A. Isolamento de células de medula de baixa densidade não aderentes:

Aspirado de fémur de ratinho fresco (medula) foi obtido de ratinhos Balb/C ou C57BL/6 de 6-10 semanas de idade, macho. A medula depois é lavada com RPMI + FBS a 10% (JRH, Lenexa KS; Hyclone, Logan UT) e é suspensa em RPMI + FBS a 10% como uma suspensão de células de medula inteiras. A suspensão de células de medula inteiras depois é submetida a um gradiente de densidade (Nycoprep, 1.077, Animal: Gibco BRL) para enriquecer com respeito às células de baixa densidade, principalmente mononucleares, como se segue: a suspensão de células de medula inteiras (aproximadamente 8 ml) é pipetado cuidadosamente sobre aproximadamente 5 ml de solução em gradiente Nycoprep num tubo cónico de 15 ml, e depois é centrifugado a 600 X g durante 20 minutos. Depois é retirada a camada interfacial, que contém as células mononucleares de baixa densidade, é lavada com excesso de RPMI + FBS a 10% e é precipitada por centrifugação a 400 X g durante 5-10 minutos. Este sedimento é ressuspenso em RPMI + FBS A 10% e é cultivado num balão T-75 aproximadamente 106 células/ml, e é incubada a 37 °C, com 5% de CO2 durante aproximadamente 2 horas. As células resultantes em suspensão são Células de Medula de Baixa Densidade Não Aderentes (NA LD). B. Ensaio de 96 poços São cultivadas Células de Medula de Ratinho NA LD de 25.000 a 45.000 células/poço em placas de cultura de tecido de 96 poços em RPMI + FBS a 10% + 1 ng/ml de Factor de Células estaminais de ratinho (mSCF) (R&D Systems, Minneapolis, MN) , mais 5% de meio condicionado de um do seguinte: (1) células BHK 570 que expressam zcytorl71ig de 212 ratinho (Exemplo 18), (2) células BHK 570 que expressam zcytorl71ig humano (Exemplo 7), ou (3) células BHK 570 de controlo que contêm vector e que não expressam nenhum ligando. Estas células depois são submetidas a uma diversidade de tratamentos com citocinas para ensaiar a expansão ou diferenciação de células hematopoiéticas da medula. Para o ensaio, as células de medula de ratinho NA LD cultivadas são submetidas a Interleucina-15 humana (hlL-15) (R&D Systems), ou uma de um painel de outras citocinas (R&D System). É ensaiada a diluição em série de hll-15; ou as outras citocinas, com uma diluição em série duas vezes desde uma concentração de aproximadamente 50 ng/ml a aproximadamente 0,5 ng/ml. Depois de 8 a 12 dias os ensaios de 96 poços são pontuados com respeito à proliferação celular pelo ensaio de Alamar Blue como é descrito no Exemplo 5B. C. Resultados do ensaio de Medula de Ratinho NA LD de 96 poços O meio condicionado das células BHK que expressam zcytorl71ig de ratinho e humano pode promover a expansão de uma população de células hematopoiéticas individualmente ou em sinergia com outra citocina na medula de ratinho NA LD em comparação com meio condicionado de BHK de controlo. A população de células hematopoiéticas expandidas pelo zcytorl71ig de ratinho com ou sem outras citocinas, e as células hematopoiéticas expandidas pelo zcytorl71ig humano com ou sem outras citocinas, são propagadas adicionalmente em cultura celular. Estas células hematopoiéticas são coradas com um anticorpo anti-Pan célula NK marcado com ficoeritrina (PharMingen) e são submetidas a uma análise de citometria de fluxo, que demonstrou que as células expandidas são coradas positivamente para este marcador de células assassinas naturais (NK) . De forma similar, podem ser utilizados outros marcadores específicos de células hematopoiéticas para determinar a expansão de, por exemplo, 213 células T CD4+ ou CD8+, outras populações de células T, linfócitos B e outros marcadores de células imuness. 0 mesmo ensaio de 96 poços é realizado utilizando células de medula humana fresca procedentes de mPoieticTechnologies, Gaithersburg, MD. De novo, um resultado positivo amostra que zcytorl71ig somente ou em sinergia com outras citocinas, o zcytorl71ig de ratinho e humano pode expandir uma população de células hematopoiéticas que é corada positivamente por marcadores celulares específicos como foi revelado anteriormente. Exemplo 22

Construções para gerar ratinhos transgénicos para zcytor 171ig A. Construção para expressar zcytor!7lig humano a partir do promotor de MT-1

Projectam-se oligonucleótidos para gerar um fragmento de PCR que continha uma sequência Kozak consenso e a região codificante de zcytorl71ig humana. Estes oligonucleótidos projectam-se com um local Fsel na extremidade 5' e um local Asei na extremidade 3' para facilitar a clonagem em (a) pMT12-8, o presente vector transgénico convencional ou (b) pKFOõl, um vector transgénico específico de linfóide (Exemplo 22B).

As reacções de PCR são realizadas com aproximadamente 200 ng de molde de zcytorl71ig humano (SEQ ID NO: 1) e oligonucleótidos projectados para amplificar a comprimento completo ou a parte activa do zcytorl71ig. As condições de reacção de PCR são determinadas utilizando métodos conhecidos no estado da técnica. Os produtos de PCR são separados por electroforese em gel de agarose e são purificados utilizando um kit de extracção de gel QiaQuick™ (Qiagen). O fragmento de ADN do tamanho correcto, isolado, é digerido com Fsel e Asei (Boerhinger-Mannheim) , é precipitado com etanol e é digerido em pMT12-8 previamente digerido com Fsel e Asei. O plasmídeo pMT12-8, projectado 214 para a expressão de um gene de interesse em fígado e outros tecidos em ratinhos transgénicos, contém uma cassete de expressão flanqueada por 10 kb de ADN 5'-MT-1 e 7 kb de ADN 3' MT-1 A cassete de expressão compreende o promotor de MT-1, o intrão II de insulina de rato, um poliligante para a inserção do clone desejado e a sequência poli A da hormona de crescimento humana (hGH).

Aproximadamente um microlitro de cada de reacção de ligação é introduzido por electroporação em células DH10B ElectroMax™ competentes (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD) de acordo com as instruções do fabricante e é cultivado em placas LB que contêm 100 μρ/ιηΐ de ampicilina, e são incubadas durante a noite. As colónias são colhidas e cultivadas em meio LB que contém 100 μρ/ιηΐ de ampicilina. É preparado ADN Miniprep a partir dos clones seleccionados e é rastreado com respeito ao inserto de zcytorl71ig humano por digestão de restrição com EcoRI sola, ou Fsel e Asei combinadas, e posteriormente electroforese em gel de agarose. São realizadas Maxipreps do pMT-zcytorl71ig humano correcto. É preparada um fragmento Sall que contém as sequências flanqueantes 5' e 3', o promotor de MT-1, o intrão II de insulina de rato, ADNc de zcytorl71ig humano e a sequência poli A de hGH para serem utilizados para microinjecção em ovócitos murinos fertilizados. A microinjecção e a produção de ratinhos transgénicos realizam-se como é descrito em Hogan, B. et al. Manipulating the Mouse Embryo, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1994. B. Construção para a expressão de zcytorl71ig humano a partir do promotor de ΕμΕΟΚ específico de linfóide. São projectados oligonucleótidos para gerar um fragmento de PCR que contém uma sequência Kozak consenso e a região codificante de zcytorl71ig humano. Estes oligonucleótidos são projectados com um local Fsel na extremidade 5' e um local Asei na extremidade 3' para 215 facilitar a clonagem em pKF051, um vector transgénico especifico de linfóide.

As reacções de PCR são realizadas com aproximadamente 200 ng de molde de zcytorl71ig humano (SEQ ID NO: 1) e oligonucleótidos projectados para amplificar o comprimento completo ou a parte activa de zcytorl71ig. É realizada uma reacção de PCR utilizando métodos conhecidos na técnica. O fragmento de ADN de tamanho correcto isolado é digerido com Fsel e Asei (Boerhinger-Mannheim), é precipitado com etanol e se liga a pKF051 previamente digerido com Fsel e Asei. O vector transgénico pKF051 procede de pl026X (Iritani, B.M., et al. , EMBO J. 16: 7019-31, 1997) e contém o promotor próximo lck especifico de células T, o potenciador da cadeia pesada μ de imunoglobulina especifica de linfócitos B/T, um poliligante para a inserção do clone desejado e um gene de hGH mutado que codifica uma hormona de crescimento inactiva (que proporciona intrões 3' e um sinal de poliadenilação). Aproximadamente um microlitro de cada reacção de ligação é introduzido por electroporação, é cultivado, os clones são colhidos e são rastreados com respeito ao inserto de zcytorl71ig humano por digestão de restrição como foi descrito anteriormente. Um clone correcto de pKF051 -zcytorl71ig é verificado por sequenciamento, e é realizado um Maxiprep deste clone. É preparado um fragmento Notl que contém o promotor proximal lck e o potenciador μ de imunoglobulina (Εμ]ΧΚ) , ADNc de zcytorl71ig, e o gene de hGH mutado para ser utilizado para a microinjecção em ovócitos murinos fertilizados. C. Construção para a expressão de zcytorl71ig de ratinho a partir do promotor de EF1 alfa

Foram utilizados iniciadores ZC41,498 (SEQ ID NO: 86) e ZC41,496 (SEQ ID NO: 87) para amplificar por PCR um molde de biblioteca de ADNc de testículo de ratinho. Estas reacções de PCR foram realizadas satisfatoriamente em 216 volumes de aproximadamente 50 μΐ com ou sem 10% de DMSO, utilizando pfu turbo polimerase (Stratagene) de acordo com as recomendações do fabricante; com uma aplicação adicional de um iniciador a alta temperatura de cera utilizando início a alta temperatura 50s (Molecular Bioproducts, Inc. San Diego, CA). Os ciclos térmicos de PCR foram realizados com somente um ciclo de 94 °C durante 4 min; seguido de 40 ciclos de 94 °C: 30 segundos, 48 °C: 30 segundos, 72 °C: 50 segundos; com uma extensão final adicional de 72 °C durante 7 minutos. As duas reacções de PCR foram agrupadas e foram purificadas utilizando agarose de baixo ponto de fusão e a enzima de digestão de agarose Gelase (Epicenter, Inc. Madison, WI) de acordo com as recomendações do fabricante.

Os produtos de PCR com o ADN seguenciado revelaram uma seguência de ADNc de zcytorl7 murino (SEQ ID NO: 90) gue compreendia uma ORF idêntica à SEQ ID NO: 10, confirmando gue a SEQ ID NO: 10 codificava o polipéptido zcytorl71ig de ratinho. Depois foram utilizados iniciadores de PCR, ZC41583 (SEQ ID NO: 88) e ZC41584 (SEQ ID NO: 89), para adicionar locais de restrição Fsel e AscI e uma sequência Kozak parcial à grelha de leitura aberta de mcytorl71ig e codão de terminação (SEQ ID NO: 92). Foi utilizado um termociclador Robocycler 40 (Stratagene) para realizar um gradiente de temperaturas de hibridação e ciclos como se segue. Foi aplicado Pfu turbo polimerase (Stratagene) como foi descrito anteriormente, mas somente em DMSO a 10%. Os ciclos foram realizados com somente um ciclo de 94 °C durante 4 min; seguido de 20 ciclos de 94 °C: 30 segundos, gradiente de 65 °C a 51 °C: 30 segundos, 72 °C: 1 minuto; e somente uma extensão a 72 °C durante 7 minutos. O molde para esta segunda reacção de ciclos térmicos foi 1 μΐ do produto de PCR mcytorl71ig purificado em gel inicial, indicado anteriormente. O produto de PCR resultante das três reacções à menor temperatura foi agrupado e foram purificadas em gel utilizando o método de Gelase 217 (Epicenter) descrito anteriormente. Este fragmento purificado depois foi digerido com Fsel e Asei e foi ligado ao vector pZP7X modificado para ter locais Fsel e Asei em seu local de clonagem. Isto foi enviado a sequenciamento para confirmar a sequência correcta. A sequência de ADNc murina clonada é representada na SEQ ID NO: 90, e a sequência de polipéptido correspondente é mostrada na SEQ ID NO: 91 (que é idêntica à SEQ ID NO: 11). O fragmento de ADN com o tamanho correcto, isolado, digerido com Fsel e Asei (Boerhinger-Mannheim) foi subclonado num plasmídeo que continha o promotor de EF1 alfa previamente digerido com Fsel e Asei. Foram realizadas Maxipreps de EFlalfa zcytorl71ig de ratinho correcto. A cassete de expressão contém o promotor EFl alfa (com um local Fsel deletado), o intrão de EFl alfa, um local similar a SUR IRES para facilitar a expressão, um poliligante flanqueado com locais de insulina II de rato na extremidade 5' que adiciona locais Fsel, Pmel e AscI para a inserção do clone desejado, e a sequência poli A da hormona de crescimento humana (hGH). Foi preparado um fragmento Not I de 7,5 kb que continha a cassete de expressão de promotor de EFlalfa e zcytorl71ig de ratinho para ser utilizado para microinjecção em ovócitos murinos fertilizados. O plasmídeo EFlalfa foi obtido de Louis-Marie do Laboratoire de Differentiation Cellulaire, como é descrito em Taboit-Dameron et al., 1999, Transgenic Resejarch 8: 223-235. D. Construção para a expressão de zcytorlVlig de ratinho a partir do promotor de ΕμίΟΚ específico de linfóide

Projectam-se oligonucleótidos para gerar um fragmento de PCR que continha uma sequência Kozak consenso e a região codificante de zcytorl71ig de ratinho. Estes oligonucleótidos foram projectados com um local Fsel na extremidade 5' e um local AscI na extremidade 3' para facilitar a clonagem em pKF051 (veja-se Exemplo 22B, 218 anterior). 0 fragmento de ADN de zcytorl71ig com o tamanho correcto, isolado, utilizado nas construções de EFlalfa, digerido com Fsel e Asei (Boerhinger-Mannheim) , foi subclonado num plasmideo que continha pKF051, um vector transgénico especifico de linfóide. 0 vector transgénico pKF051 procede de pl026X (Iritani, B.M., et al., EMBO J. 16:7019-31, 1997) e contém o promotor proximal lck especifico de células T, o potenciador da cadeia pesada μ de imunoglobulina especifica de linfócitos B/T, um poliligante para a inserção do clone desejado, e um gene de hGH mutado que codifica uma proteína de hormona de crescimento inactiva (proporcionando intrões 3' e uma sinal de poliadenilação). Foi preparado um fragmento Notl de 6,5 kb, que continha o promotor proximal lck e o potenciador μ de imunoglobulina (ΕμΕΟΚ) , ADNc de zcytorl71ig de ratinho, e o gene de hGH mutado para ser utilizado para a microinjecção em ovócitos murinos fertilizados (Exemplo 41) .

Exemplo 23

Construção de vectores de expressão de mamífero que expressam zcytor 171ig-CEE A. Construção de zCytorl7Lig-CEE/pZMP21

Foi construído um plasmideo de expressão que continha todo ou parte de um polinucleótido que codificava zCytorl71ig humano por meio de recombinação homóloga. O plasmideo foi denominado zCytorl7Lig-CEE/pZMP21. A construção de zCytorl7Lig-CEE/pZMP21 foi realizada gerando um fragmento zCytorl7Lig-CEE (SEQ ID NO: 95) utilizando amplificação por PCR. O molde de ADN utilizado para a produção do fragmento zCytorl7Lig-CEE foi zCytorl7Lig/pZP7nx. Os iniciadores utilizados para a produção do fragmento zCytorl7Lig-CEE foram: (1) ZC41607 (SEQ ID NO: 97) (sequência com sentido), que inclui desde a extremidade 5' até a extremidade 3': 2 8 pb da sequência 219 flanqueante do vector (5' do inserto) e 21 pb que correspondem à sequência 5' de zCytorl7Lig; e (2) ZC41605 (SEQ ID NO: 98) (sequência antisense), que inclui desde a extremidade 5' até a extremidade 3': 3 7 pb da sequência flanqueante do vector (3' do inserto), 3 pb do codão de terminação, 21 pb que codificam um marcador EE C-terminal e 21 pb que correspondem à extremidade 3' da sequência de zCytorl7Lig. O fragmento resultante da amplificação por PCR anterior é uma cópia do molde zCytorl7Lig com a adição de um marcador EE C-terminal, produzindo um produto final zCytor17Lig-CEE.

As reacções de PCR foram realizadas como se segue: A um volume final de 100 μΐ foram adicionados: 10 μΐ de Tampão de Reacção de Taq Polimerase lOx com MgCl 15 mM (Gibco), 1 μΐ de Taq ADN Polimerase (5 unidades/μΐ, Gibco), 3 μΐ de dNTP 10 mM, 78 μΐ de dH20, 3 μΐ de uma solução de reserva de 20 pmol/μΐ de iniciador ZC41607 (SEQ ID NO: 97) 3 μΐ de uma solução de reserva de 20 pmol/μΐ de iniciador ZC41605 (SEQ ID NO: 98), e 2 μΐ de uma solução de reserva de 0,13 μρ/μΐ de ADN molde de zCytorl71ig. Foi adicionado um volume igual a 50 μΐ de óleo mineral à mistura. A reacção foi aquecida até 94 °C durante 5 minutos, seguido de 35 ciclos a 94 °C durante 1 minuto; 55 °C durante 2 minutos; 72 °C durante 3 minutos; seguido de uma extensão de 10 minutos a 72 °C e mantida a 4 °C até que foi colhido a reacção. O plasmídeo pZMP21 foi digerido com enzima de restrição BglII, foi limpo com o Kit de Purificação de PCR QiaQuick (Qiagen) utilizando um protocolo de microcentrifuga, e foi utilizada para a recombinação com o fragmento de PCR. O plasmídeo pZMP21 foi construído a partir de pZMP20 que foi construído a partir de pZP9 (depositado na Colecção Americana de Culturas Celulares, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, e é designado N° 98668) com os elementos genéticos de levedura 220

tomados de pRS316 (depositado na Colecção Americana de Culturas Tipo, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, e designado N° 77145), um elemento IRES de poliovírus, e o domínio extracelular de CD8, truncado na extremidade carboxilo terminal do domínio transmembrana. PZMP21 é um vector de expressão de mamífero que contém uma cassete de expressão que tem o promotor de MPSV, um intrão de péptido sinal de imunoglobulina, múltiplos locais de restrição para a inserção de sequências codificantes, um codão de terminação e um terminador de hormona de crescimento humana. O plasmídeo também uma origem de replicação de E. coli uma unidade de expressão de um marcador de selecção de mamífero que tem um promotor, potenciador e origem de replicação de SV40, um gene de DHFR, o terminador de SV40, assim como a sequências URA3 e CEN-ARS necessárias para a selecção e replicação em S. cerevisiae.

Foram combinados 50 μΐ de células de levedura competentes (S. cerevisiae) independentemente com 100 ng de plasmídeo cortado, 5 μΐ de mistura de PCR descrita previamente, e foram transferidos a uma cuveta de electroporação de 0,2 cm. A mistura de levedura/ADN foi submetido a electropulsos a 0,75 kv (5 kV/cm), infinitos ohms, 25 μ*1. A cada cuveta foram adicionados 600 μΐ de sorbitol 1,2 M e a levedura foi cultivada numa alíquota de 100 μΐ e uma alíquota de 300 μΐ em duas placas URA-D e foi incubada a 30 °C. Depois de aproximadamente 72 horas, os transformantes de levedura Ura+ de somente uma placa foram ressuspensos num 1 ml de H2O e foram centrif ugadas brevemente para sedimentar as células de levedura. O sedimento celular foi ressupenso em 500 μΐ de tampão de lise (Triton X-100 a 2%, SDS a 1%, 100 mM de NaCl, 10 mM de Tris, pH 8,0, 1 mM de EDTA) . Os 500 μΐ da mistura de lise foram adicionados a um tubo Eppendorf que continha 300 μΐ de pérolas de vidro de 600 μιη lavadas com ácidos e 300 μΐ 221 de fenol clorofórmio, submetidos e vórtex durante intervalos de 1 minutos duas ou três vezes, seguido de uma centrifugação 5 minutos numa centrifuga Eppendorf a velocidade máxima. Trezentos microlitros da fase aquosa foram transferidos a um tubo limpo, e o ADN foi precipitado com 600 μΐ de etanol a 100% (EtOH) , seguido de centrifugação durante 10 minutos a 4 °C. O sedimento de ADN depois foi lavado com 500 μΐ de EtOH ao 70%, seguido de centrifugação durante 1 minuto a 4 °C. O sedimento de ADN foi ressupenso em 30 μΐ de H20. A transformação de células E. coli electrocompetentes (MC1061) foi realizada com 5 μΐ da preparação de ADN de levedura e 50 μΐ de células MC1061. As células foram submetidas a electropulsos a 2,0 kv, 25 μΕ e 400 ohms (Ω) . Depois da electroporação, foram adicionados 600 μΐ de SOC (Bacto Tryptone a 2% (Difco, Detroit, MI), extracto de levedura a 0,5% (Difco), 10 mM de NaCl, 2,5 mM de KC1, 10 mM de MgC12, 10 mM de MgS04, 20 mM de glicose). As células E. coli submetidas a electroporação são cultivadas numa aliquota de 200 μΐ e 50 μΐ em duas placas de LB AMP (caldo LB (Lennox), Bacto Agar a 1,8% (Difco), 100 mg/1 de Ampicilina). As placas foram incubadas em posição vertical durante aproximadamente 24 horas a 37 °C. Foram seleccionadas três colónias resistentes a ampicilina aleatoriamente e foram enviadas para análise de sequência do inserto. O ADN de plasmídeo foi isolado a grande escala a partir de um clone com a sequência confirmada utilizando o kit Qiagen Maxi (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante. B. Expressão em mamífero de zcytor 171ig humano

Proteína zCytorl7Lig de comprimento completo foi produzida em células BHK transfectadas com zCytorl7Lig-CEE/pZMP21 (Exemplo 23A) . Células BHK 570 (ATCC CRL-10314) foram inoculadas em balões de cultura de tecido T75 e foram deixadas que crescessem até uma confluência de 222 aproximadamente 50 a 70% a 37 °C, com 5% de C02, em meio de crescimento (SL7V4, FBS a 5%, pen/strep a 1%) . As células depois foram transfectadas com zCytorl7Lig-CEE/pZMP21 por transfecção mediada por lipossomas (utilizando Lipofectamine™; Life Technologies), em meio livre de soro (SF) (SL7V4) . 0 plasmídeo (16 μg) foi diluído em tubo de 1,5 ml até um volume final total de 640 μΐ com meio SF. Trinta cinco microlitros da mistura de lípido foram misturados com 60 5 μΐ de meio SF, e a mistura resultante foi deixada incubar aproximadamente 15 minutos a temperatura ambiente. Depois foram adicionados 5 mililitros de meio SF à mistura de ADN: lípido. As células foram enxaguadas uma vez com 10 ml de PBS, o PBS foi decantado, e a mistura de ADN:lípidos foi adicionada. As células são incubadas a 37 °C durante cinco horas, e depois foram adicionados 15 ml de meio (SL7V4, FBS a 5%, pen/strep a 1%) a cada placa. As placas foram incubadas a 37 °C durante a noite e a mistura de ADNtmeio de lípidos foi substituída por meio de selecção (SL7V4, FBS a 5%, pen/strep a 1%, 1 μΜ de metotrexato) no dia seguinte. Aproximadamente 10 dias depois da transfecção, colónias resistentes a metotrexato do balão de transfecção T75 foram tripsinizadas e as células foram agrupadas e foram inoculadas num balão T = 162 e foram transferidas a uma cultura a grande escala. Exemplo 24

Expressão de receptor solúvel zcytorH em E. coli A. Construção de vector de expressão pCMHOl que expressa pollpéptldo de fusão huzcytorl7/MBP-6H

Construiu-se um plasmídeo de expressão que continha um polinucleótido que codificava um receptor solúvel zcytorl7 fusionado na extremidade C a proteína de ligação a maltose (MBP) por meio de recombinação homóloga. O polipéptido de fusão contém uma parte de MBP de aproximadamente 388 aminoácidos N-terminal fusionada a qualquer dos receptores solúveis de zcytorl7 descritos no presente documento. Foi 223 isolado um fragmento de ADNc de zcytorl7 (SEQ ID NO: 4) utilizando PCR como é descrito no presente documento. Foram utilizados dois iniciadores na produção do fragmento de zcytorl7 numa reacção de PCR convencional: (1) um gue contém aproximadamente 40 pb da seguência flangueante do vector e aproximadamente 25 pb correspondentes à extremidade amino do zcytorl7, e (2) outro gue contém aproximadamente 40 pb da extremidade 3' correspondente à sequência flanqueante do vector e aproximadamente 25 pb correspondentes à extremidade carboxilo do zcytorl7. Dois μΐ da reacçao de PCR de 100 μΐ foram introduzidos num gel de agarose a 1,0% com tampão TBE 1 x para a análise, e o fragmento aproximadamente esperado foi observado. A reacção de PCR restante foi combinada com o segundo tubo de PCR e foi precipitada com 400 μΐ de etanol absoluto. O ADN precipitado foi utilizado para a recombinação no vector pTAP170 receptor cortado com Smal para produzir a construção que codificava a fusão MBP-zcytorl7 como é descrito a seguir.

Foi obtido plasmideo pTAP170 a partir dos plasmideos pRS316 e pMAL-c2. O plasmideo pRS316 é um vector transportador de Saccharomyces cerevisiae (Hieter P. e Sikorski, R., Genetics 122:19-27, 1989). pMAL-C2 (NEB) é um plasmideo de expressão de E. coli. Porta o promotor tac que dirige MalE (gene que codifica MBP) seguido de um marcador His, um local de clivagem por trombina, um local de clonagem e o terminador rmB. 0 vector pTAP170 foi construído utilizando recombinação homóloga da levedura. Foram recombinados 100 ng de pMAL-c2 cortado com EcoRl com 1 μρ de pRS316 cortado com Pvul, 1 μρ de ligante e 1 μρ de pRS316 cortado com Scal/EcoRI. O ligante consistia nos oligos zcl9,372 (SEQ ID NO: 172) (100 pmol): zcl9,351 (SEQ ID NO: 173) (1 pmol): zcl9,352 (SEQ ID NO: 174) (1 pmol), e zcl9,371 (SEQ ID NO:175) (100 pmol) combinados numa reacção de PCR. As condições foram as seguintes: 10 ciclos de 94 °C 224 durante 30 segundos, 50 °C durante 30 segundos e 72 °C durante 30 segundos; seguido de imersão a 4 °C. Os produtos de PCR foram concentrados por meio de precipitação com etanol a 100%.

Cem microlitros de células de levedura competentes (S. cerevisiae) foram combinados com 10 μΐ de uma mistura que continha aproximadamente 1 μρ do inserto de zcytorl7 humano, e 100 ng de vector pTAP170 digerido com Smal, e foram transferidos a uma cuveta de electroporação de 0,2 cm. A mistura de levedura/ADN foi submetida a electropulsos a 0,75 kV (5 kV/cm), infinitos ohms, 25 μΡ. A cada cuveta foram adicionados 600 μΐ de sorbitol 1,2 Μ. A levedura depois foi cultivada em duas alíquotas de 300 μΐ sobre duas placas de -URA D e foram incubados a 30 °C.

Depois de aproximadamente 48 horas, os transformantes de levedura Ura+ de somente uma placa foram seleccionados, foi isolado o ADN e foi utilizado para transformar células E. coli electrocompetentes (por exemplo, MC1061, Casadaban et. al. J. Mol. Biol. 138, 179-207) e são inoculados em placas com MM/CA+KAN a 25 \iq/l (Pryor e Leiting, Protein Expression and Purification 10:309-319, 1997) utilizando métodos convencionais. As células são inoculadas em MM/CA com 25 μρ/ιηΐ de Kanamicina durante duas horas, com agitação a 37 °C. Um ml da cultura foi induzido com IPTG 1 mM. De duas a quatro horas depois, os 250 μΐ de cada cultura foram misturados com 250 μΐ de pérolas de vidro lavadas com ácido e 250 μΐ de tampão Thomer com βΜΕ a 5% e corante (ureia 8 M, Tris 100 mM pH 7,0, glicerol a 10%, 2 mM de EDTA, SDS a 5%). As amostras foram submetidas a agitação com vórtex durante um minuto e foram aquecidas a 65 °C durante 10 minutos. Foram carregados 20 μΐ por pista num gel PAGE de 4% a 12% (NOVEX) . Os géis foram processados em tampão MES IX. Os clones positivos foram denominados pCMHOl e foram submetidos a análise de sequência.

Um microlitro de ADN de sequenciamento foi utilizado 225 para transformar a estirpe BL21. As células foram submetidas a electropulsos a 2,0 kV, 25 μΕ e 400 ohm. Depois da electroporação, 0,6 ml de MM/CA com 25 [ig/1 de Kanomiacina. As células foram crescidas em MM/CA e foram induzidas com ITPG como foi descrito anteriormente. Os clones positivos foram utilizados para crescer com respeito à purificação de proteína da proteína de fusão huzcytorl7/MBP-6H utilizando técnicas convencionais. B. Purificação do receptor solúvel huzcytorl7/MBP-6H por fermentação de E. coli A menos que se indique outra cosa, todas as operações foram realizadas a 4 °C. O seguinte método foi utilizado para a purificação do polipéptido receptor solúvel huzcytorl7/MBP-6H recombinante. Foram construídas células E. coli que continham a construção pCMHOl e que expressavam o polipéptido receptor solúvel buzcytorl7/MBP-6H utilizando métodos de biologia molecular convencionais e são cultivados em SuperBroth II (12 g/1 de Casien, 24 g/1 de Extracto de Levedura, 11,4 g/1 de fosfato de dipotássio, 1,7 g/1 de fosfato de monopotássio; Becton Dickenson, Cockeysville, MD). As células resultantes foram colhidas e congeladas em glicerol a 0,5%. Para a purificação de proteínas foram utilizados vinte gramas de células congeladas.

As células descongeladas foram ressuspensas em 500 ml de tampão de Equilíbrio de Amilose (Tris 20 nM, NaCl 100 mM, pH 8,0). Para lisar as células foi utilizado um sistema de ruptura de células de Prensa French (Constant Systems Ltd., Warwick, UK) com um ajuste da temperatura de -7 °C a -10 °C e 206,79 MPa. A ruptura das células resuspendidas foi verificada por leituras de A60o antes e depois dos ciclos através da Prensa French. A suspensão de células lisadas foi precipitada a 10.000 G durante 30 minutos. Foi colhido o sobrenadante do sedimento de detritos para a purificação de proteínas. 226

Vinte e cinco ml de resina de Amilose (New England Biolabs, Beverly, MA) foram deitados numa coluna de vidro Bio-Rad, de 2,5 cm de diâmetro por 10 cm de altura. A coluna foi cheia e foi equilibrada por gravidade com 10 volumes de coluna (VC) de tampão de equilíbrio de Amilose. O sobrenadante celular colhido foi carregado por lotes na resina de Amilose, durante a noite com agitação. A resina carregada foi devolvida à coluna de vidro, foi lavada com 10 VC de tampão de Equilibro de Amilose e foi eluída por gravidade com -2 VC de tampão de Eluição de Amilose (tampão de Equilíbrio de Amilose, Maltose 10 mM, Fluka Biochemical, Suíça) . Foram colhidas dez fracções de 5 ml ao longo do perfil de eluição e foram ensaiadas com respeito à absorvância a 280 e 320 nm. A resina de Amilose foi regenerada com 1 VC de H2O destilada, 5 VC de SDS a 0,1% (p/v) (Sigma), 5 VC de H2O destilada, 5 VC de tampão de

Equilíbrio de Amilose, e finalmente 1 VC de tampão de Armazenamento de Amilose (tampão de Equilíbrio de Amilose, Azida Sódica ao 0,02% (p/v)). A resina regenerada foi armazenada a 4 °C.

Agruparam-se as fracções do perfil de eluição de interesse e foram submetidas a diálise numa câmara de diálise 10 K (Slide-A-Lyzer, Pierce Immunochemical) contra 4 trocas de 4 1 de PBS pH 7,4 (Sigma) durante um período de tempo de 8 horas. Depois da diálise, o material colhido representava o polipéptido huzcytor17/MBP-6H purificado. O polipéptido huzcytor17/MBP-6H purificado foi esterilizado por filtração e foi analisado por meio de coloração com Coomasie e SDS-PAGE para um produto com o peso molecular apropriado. A concentração do polipéptido huzcytorl7/MBP-6H foi determinada por análise BCA e foi de 0,76 mg/ml. O polipéptido huzcytor17/MBP-bH purificado foi formulado de maneira apropriada para a imunização de coelhos e foi enviado a R & R Research and Development (Stanwood, WA) para a produção de anticorpos policlonais 227 (Exemplo 25, a seguir).

Exemplo 25

Anticorpo Policlonal de Receptor Solúvel zcytorl7 Humano A. Preparação e Purificação

Prepararam-se anticorpos policlonais imunizando 2 coelhos brancos New Zealand fêmea com a proteína recombinante purificada huzcytor17/MBP-6H (Exemplo 24). Cada coelho recebeu uma injecção intraperitoneal (IP) inicial de 200 μρ de proteína purificada em Adjuvante Completo de Freund seguido de injecções IP de reforço de 10 0 μg de proteína em Adjuvante Incompleto de Freund a cada três semanas. De sete a dez dias depois da administração da segunda injecção de reforço (3 injecções em total), foi extraído sangue dos animais e foi colhido o soro. Os animais depois foram submetidos a reforços e a extracções de sangue a cada três semanas. O soro de coelho específico para huzcytorl7/MBP-6H foi pré-absorvido de anticorpos anti-MBP utilizando uma coluna de proteína CNBr-SEPHAROSE 4B (Pharmacia LKB) que foi preparada utilizando 10 mg de proteína de fusão-MBP recombinante purificada não específica por grama de CNBr-SEPHAROSE. Os anticorpos policlonais específicos para huzcytorl7/MBP-bH foram purificadas por afinidade a partir do soro de coelho pré-adsorvido utilizando uma coluna de proteína CNBr-SEPHAROSE- 4B (Pharmacia LKB) que foi preparada utilizando 10 mg da proteína recombinante purificada a partir do antigénio específico huzcytor17/MBP-6H. Depois da purificação, os anticorpos policlonais foram submetidos a diálise com 4 trocas de 20 vezes o volume de anticorpo de PBS durante um período de tempo de pelo menos 8 horas. Os anticorpos específicos para Huzcytorl7 foram caracterizados por ELISA utilizando 500 ng/ml da proteína recombinante purificada huzcytorl7/MBP-6H como alvo de anticorpo. O limite inferior de detecção (LID) do anticorpo purificado por afinidade anti-huzcytor17/MBP-6H de coelho 228 foi 500 pg/ml em seu antigénio recombinante purificado especifico huzcytorl7/MBP-6H. B. Análise de SDS-PAGE e Western blotting de anticorpo de coelho Anti-ZcytoR17 MBP-6H Humano

Foi ensaiado anticorpo de coelho anti-ZcytoRl7 MBP-6H humano por SDS-PAGE (NuPage 4-12%, Invitrogen, Carlsbad, CA) com o método de coloração com coomassie e Western blotting utilizando IgG de cabra anti-coelho-HRP. A proteína purificada (200-25 ng) ou o meio condicionado que continha zcytorl7 foram submetidos a electroporação utilizando uma mini-cell Xcell II de Novex de Invitrogen e foram transferidos a nitrocelulose (0,2 mm; Invitrogen, Carlsbad, CA) a temperatura ambiente utilizando o módulo de blot Xcell de Novex com agitação de acordo com as instruções proporcionadas no manual do instrumento. A transferência foi realizada a 300 mA durante uma hora num tampão que continha base Tris 25 mM, glicina 200 mM, e metanol a 20%. O filtro depois foi bloqueado com tampão A de Western (local, Tris 50 mM, pH 7,4, EDTA 5 mM, pH 8,0, Igepal CA-630 a 0,05%, NaCl 150 mM, e gelatina a 0,25%) durante a noite com agitação suave a 4 °C. A nitrocelulose foi enxaguada rapidamente e depois foi adicionado o anticorpo de coelho anti-zcytoRl7 MBP-6H humano (1:1000) em tampão A de Western. A mancha de transferência foi incubada durante 1,5 horas a temperatura ambiente com agitação suave. A mancha de transferência foi enxaguada 3 vezes durante 5 minutos cada vez em Western A, e depois foi adicionado anticorpo de cabra anti-IgG de coelho-HRP (1 : 1000) em tampão A de Western A. A mancha de transferência foi incubada durante 1,25 horas a temperatura ambiente com agitação suave. A mancha de transferência foi enxaguada 3 vezes durante 5 minutos em Western A, e depois foi enxaguada rapidamente em H20. A mancha de transferência foi revelada utilizando reagentes de substratos quimiluminescentes disponíveis comercialmente, reagentes de 229 detecção de CLWestern blotting 1 e 2 misturados 1:1; reagentes obtidos de Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, Inglaterra) e a mancha de transferência foi exposta a um filme de raios X durante até 15 minutos. 0 anticorpo de coelho anti-zcytoRl7 MBP-6H humano foi capaz detectar o zcytorl7 humano presente em meios condicionados assim como a proteína zcytoR17 purificada como uma banda a 120 kDa em condições redutoras.

Exemplo 26

Distribuição De tecido de zcytorl7 de ratinho em Painéis de Tecidos Utilizando PCR

Um painel de ADNc de tecidos murinos foi rastreado com respeito à expressão de zcytorl7 de ratinho utilizando PCR. 0 painel foi realizado internamente e continha 94 ADNc marathon e amostras de ADNc de diversas linhas celulares e tecidos murinos normais e cancerosos como é mostrado no Quadro 6 proporcionado a seguir. Os ADNc procediam de bibliotecas internas ou ADNc marathon de preps de ARN internas, ARN Clontech ou ARN de Invitrogen. Os ADNc marathon de ratinho foram fabricados utilizando o kit marathon Ready™ (Clontech, Paio Alto, CA) e foram ensaiadas QC com iniciadores de receptor de transferrina de ratinho ZC10,651 (SEQ ID NO: 46) e ZC10,565 (SEQ ID NO: 47) e depois foram diluídos com base na intensidade da banda de transferrina. Para garantir a qualidade das amostras de biblioteca amplificadas no painel, foram realizadas três ensaios de controlo de qualidade (QC) : (1) para avaliar a qualidade do ARN utilizado para as bibliotecas, os ADNc internos foram ensaiados com respeito ao tamanho médio do inserto por PCR com oligos do vector que eram específicos para as sequências de vector para uma biblioteca de ADNc individual; (2) a padronização da concentração do ADNc nas amostras do painel foi conseguida utilizando métodos de PCR convencionais para amplificar a alfa tubulina de comprimento completo ou o ADNc de G3PDH utilizando um oligo 230 de vector 5': ZC14,063 (SEQ ID NO: 48) e um iniciador de oligo especifico de alfa tubulina 3' ZC17,574 (SEQ ID NO: 49) ou iniciador de oligo especifico de G3PDH 3' ZC17,600 (SEQ ID NO: 50); e (3) foi enviado uma amostra a sequenciamento para verificar a possível contaminação do ADN ribossómico ou mitocondrial. O painel foi estabelecido num formato de 96 poços que incluía uma amostra de controlo positiva para ADN genómico de ratinho (Clontech, Paio Alto, CA). Cada poço continha aproximadamente 0,2-100 pg/μΐ de ADNc. A PCR foi preparada utilizando oligos ZC38,065 (SEQ ID NO: 51) e ZC38,068 (SEQ ID NO: 52), TaKaRa Ex Taq™ (TAKARA Shuzo Co LTD, Biomedicals Group, Japão), e corante Rediload (Resejarch Genetics, Inc., Huntsville, AO). A amplificação foi realizada como se segue: 1 ciclo a 94 °C durante 5 minutos; 5 ciclos de 94 °C durante 30 segundos, 68 °C durante 30 segundos; 35 ciclos de 94 °C durante 30 segundos, 56 °C durante 30 segundos e 72 °C durante 30 segundos, seguido de 1 ciclo a 72 °C durante 5 minutos. Aproximadamente 10 μΐ do produto de reacção de PCR foi submetido a electroforese em gel de agarose convencional utilizando um gel de agarose a 4%. O tamanho correcto do fragmento de ADN previsto foi observado em cérebro, células CD90+, dendriticas, embriões, MEWt#2, linha celular de próstata Tuvak, glândula salivar, pele e testículo. O fragmento de ADN para pele e testículo foi cortado e purificado utilizando um Kit de Extracção de Gel (Qiagen, Chatsworth, CA) de acordo com as instruções do fabricante. Os fragmentos foram confirmados por sequenciamento para demostrar que efectivamente eram zcytorl7 de ratinho.

Quadro 6

Tecido/Linha celular N° de amostras Tecido/Linha celular N° de amostras 229 1 7F2 1 Adipócitos-Amplificados 1 231

Tecido/Linha celular N° de amostras Tecido/Linha celular N° de amostras aTC 1,9 1 Cérebro 4 CCC4 1 CD90+ Amplificado 1 OCIOB 1 Dendrítica 1 Embrião 1 Coração 2 Rim 3 Fígado 2 Pulmão 2 MEWt#2 1 P388D1 1 Pâncreas I Placenta 2 Linha celular de Próstata-Jakotay 1 Linha celular de Próstata-Nelix 1 Linha celular de Próstata-Paris 1 Linha celular de Próstata-Torres 1 Linha celular de Próstata-Tuvak 1 Glândula Salivar 2 Músculo Esquelético 1 Pele 2 Intestino Delgado 1 Músculo Liso 2 Baço 2 Estômago 1 232

Tecido/Linha celular N° de amostras Tecido/Linha celular N° de amostras Testículo 3 Timo 1

Exemplο 21

Expressão de zcytorH Humano em Diversos Tecidos Utilizando RT/PCR Quantitativa em Tempo Real A. Iniciadores e Sondas para zcytorll humano, OSMRbeta e ZcytorUlig para RT-PCR Convencional e Quantitativa

Previamente foi descrito a RT-PCR quantitativa em tempo real utilizando o Sistema de Detecção de Sequência ABI PRISM 7900 (PE Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) (Veja-se, Heid, C.A. et al., Genome Research 6:986-994, 1996; Gibson, OU.E.M. et al., Genome Research 6:995-1001, 1996; Sundaresan, S. et al., Endocrinology 139:4756-4764, 1998). Este método incorpora o uso de uma sonda especifica de gene que contém corantes fluorescentes indicadores e inactivadores. Quando a sonda está intacta, a emissão de corante indicador é anulada devido à proximidade do corante inactivador. Durante a extensão de PCR utilizando iniciadores directos e inversos específicos de genes adicionais, a sonda é cortada pela actividade nuclease 5' da Taq polimerase que liberta o corante indicador da sonda dando como resultado um aumento na emissão de fluorescência.

Os iniciadores e sondas utilizados para as análises de RT-PCR quantitativa em tempo real da expressão de Zcytorl7 humano, OSMRbeta e Zcytorl71ig foram projectados utilizando o software de projecto de iniciadores Primer Express™ (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) . Foram projectados iniciadores para Zcytorl7 humano que incluíam uma ligação intrão-exão para eliminar a possível amplificação do ADN genómico. O iniciador directo, ZC37,877 (SEQ ID NO: 53) e o iniciador reverso, ZC37, 876 (SEQ ID NO: 54) foram

utilizados numa reacção de PCR a uma concentração 200 nM 233 para sintetizar um produto de 73 pb. A sonda Zcytorl7TaqMan® correspondente, denominada ZC37,776 (SEQ ID NO: 55) foi sintetizada e marcada por PE Applied Biosystems e foi utilizada em cada reacção de PCR a uma concentração de 200 nM. A sonda ZC37, 776 (SEQ ID NO: 55) foi marcada na extremidade 5' com um corante fluorescente indicador (β-carboxi-fluoresceina) (FAM) (PE Applied Biosystems) e na extremidade 3' com um corante indicador fluorescente (β-carboxi-tetrametilrodamina) (TAMRA) (Epoch Biosciences, Bothell, WA).

Projectam-se iniciadores para OSMRbeta humana que incluíam uma ligação intrão-exão para eliminar a possível amplificação do ADN genómico. O iniciador directo, ZC43,891 (SEQ ID NO: 137) e o iniciador reverso ZC43,900 (SEQ ID NO: 138) foram utilizados numa reacção de PCR (indicada a seguir) a uma concentração 200 nM. A sonda TaqMan® de OSMRbeta correspondente, denominada ZC43,896 (SEQ ID NO: 139) foi sintetizada e marcada por PE Applied Biosystems e foi utilizada em cada reacção de PCR a uma concentração de 200 nM. A sonda ZC43,896 (SEQ ID NO: 139) foi marcada na extremidade 5' com um corante fluorescente indicador (6-carboxi-fluoresceina) (FAM) (PE Applied Biosystems) e na extremidade 3' com um corante inactivador não fluorescente (ECLIPSE) (Epoch Biosciences).

Os iniciadores para Zcytorl71ig humano foram projectados de maneira que incluíam uma ligação intrão-exão para eliminar a possível amplificação do ADN genómico. O iniciador directo, ZC43,280 (SEQ ID NO: 140) e o iniciador reverso ZC43,281 (SEQ ID NO: 141) foram utilizados numa reacção de PCR (indicada a seguir) a uma concentração aproximadamente 200 nM. A sonda TaqMan® de Zcytorl71ig correspondente, denominada ZC43,275 (SEQ ID NO: 142) foi sintetizada e marcada por PE Applied Biosystems e foi utilizada em cada reacção de PCR a uma concentração de 200 nM. A sonda ZC43,275 (SEQ ID NO: 142) foi marcada na 234 extremidade 5' com um corante fluorescente indicador (6-carboxi-fluoresceina) (FAM) (PE Applied Biosystems) e na extremidade 3' com um corante inactivador não fluorescente (ECLIPSE) (Epoch Biosciences).

Como controlo para ensaiar a integridade e qualidade das amostras de ARN ensaiadas, todas as amostras de ARN foram rastreadas com respeito ao ARNr ou GUS utilizando séries de iniciador e sonda pedidas a PE Applied Biosystems (kit de ARNr) ou projectadas internamente (GUS) . 0 kit de ARNr continha o iniciador directo (SEQ ID NO: 56), o iniciador reverso de ARNr (SEQ ID NO: 57), e a sonda TaqMan® de ARNr (SEQ ID NO: 58) . A sonda de ARNr foi marcada na extremidade 5' com um corante fluorescente indicador VIC (PE Applied Biosystems) e na extremidade 3' com o corante fluorescente inactivador TAMRA (PE Applied Biosystems). Os iniciadores e sonda de GUS foram gerados internamente e foram utilizadas em cada reacção de PCR a 200 nM e 100 nM, respectivamente. O iniciador directo foi ZC40,574 (SEQ ID NO: 143) e o iniciador reverso foi ZC40,575 (SEQ ID NO: 144). A sonda de GUS ZC43,017 (SEQ ID NO: 145) foi marcada na extremidade 5' com um corante fluorescente indicador (Yakima-Yellow) (Epoch Biosciences) e na extremidade 3' com um corante inactivador não fluorescente (ECLIPSE) (Epoch Biosciences). Os resultados do ARNr e GUS também servem como controlo endógeno e permitem a normalização dos resultados de expressão de ARNm de Zcytorl7 vistos nas amostras de ensaio.

Para a RT-PCR não quantitativa convencional, foram projectados iniciadores utilizando o software de projecto de iniciadores Primer Express™ (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) . Os iniciadores de zcytorl7 humano geram um produto de aproximadamente 1000 pares de bases e são os seguintes: iniciador directo ZC28,917 (SEQ ID NO: 83), e iniciador reverso ZC28,480 (SEQ ID NO: 146). Os iniciadores de OSMRbeta humano geram um produto de 202 pares de bases e 235 são os seguintes: iniciador directo ZC41,653 (SEQ ID NO: 147) e iniciador reverso ZC41,655 (SEQ ID NO: 148) . Os iniciadores de Zcytorl71ig humano geram um produto de 305 pares de bases e são os seguintes: iniciador directo ZC41,703 (SEQ ID NO: 149) e iniciador reverso ZC41,704 (SEQ ID NO: 150). B. Iniciadores e Sondas para Zcytorl7, OSMRbeta e Zcytorl71ig murinos para RT-PCR Convencional e Quantitativa

Os iniciadores e sondas usados para a análise de RT-PCR quantitativa de tempo real da expressão de Zcytorl7, OSMRbeta e Zcytorl71ig foram projectados usando o software de projecto de iniciadores Primer Express™ (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) . Os iniciadores para Zcytorl7 murino foram projectados de forma que incluíssem uma união intrão-exão para eliminar a possível amplificação do ADN genómico. O iniciador directo, ZC43,272 SEQ ID NO: 151) e o iniciador reverso, ZC43,273 SEQ ID NO: 152) foram usados nas reacções de PCR (indicadas a seguir) a uma concentração 300 nM. A sonda TaqMan® de Zcytorl7 correspondente, denominada ZC43,478 SEQ ID NO: 153) foi sintetizada e marcada por PE Applied Biosystems. A sonda ZC43,478 SEQ ID NO: 153) foi marcada na extremidade 5' com um corante fluorescente indicador (6-carboxi-fluoresceína) (FAM) (PE Applied Biosystems) e na extremidade 3' com um corante fluorescente inactivador (6-carboxi-tetrametilrodamina) (TAMRA) (PE Applied Biosystems). A sonda ZC43,478 SEQ ID NO: 153) foi usada nas reacções de PCR a uma concentração de 100 nM.

Os iniciadores para Zcytorl71ig murino foram projectados de maneira que incluíssem uma união intrão-exão para eliminar a possível amplificação do ADN genómico. O iniciador directo, ZC43,278 SEQ ID NO: 154) e o iniciador reverso ZC43,279 SEQ ID NO: 155) foram usados nas reacções de PCR a uma concentração 500 nM. A sonda TaqMan® de Zcytorl71ig correspondente, denominada ZC43,276 SEQ ID NO: 236 141) foi sintetizada e marcada por PE Applied Biosystems. A sonda ZC43,478 SEQ ID NO: 153) foi marcada na extremidade 5' com o corante fluorescente indicador (6-carboxi-fluoresceina) (FAM) (PE Applied Biosystems) e na extremidade 3' com um corante inactivador não fluorescente (ECLIPSE) (Epoch Biosciences). A sonda ZC4 3,276 SEQ ID NO: 156) foi usada nas reacções de PCR (indicadas a seguir) a uma concentração de 200 nM.

Os iniciadores para OSMRbeta murino foram projectados de maneira que incluíssem uma união intrão-exão para eliminar a possível amplificação do ADN genómico. O iniciador directo, ZC43,045 SEQ ID NO: 157) e o iniciador reverso, ZC43,046 SEQ ID NO: 158) foram usados nas reacções de PCR a uma concentração 300 nM. A sonda TaqMan® de OSMRbeta correspondente, denominada ZC43,141 SEQ ID NO: 159) foi sintetizada e marcada por Epoch Biosciences. A sonda ZC43,141 SEQ ID NO: 159) foi marcada na extremidade 5' com um corante fluorescente indicador (6-carboxi-fluoresceina) (FAM) (PE Applied Biosystems) e na extremidade 3' com um corante inactivador não fluorescente (ECLIPSE) (Epoch Biosciences). A sonda ZC43,141 SEQ ID NO: 159) foi usada nas reacções de PCR (indicadas a seguir) a uma concentração de 100 nM.

Como controlo para ensaiar a integridade e qualidade das amostras de ARN ensaiadas, todas as amostras de ARN foram rastreadas com respeito a GUS murino ou receptor de transferrina usando iniciadores e sondas projectadas usando o programa de projecto de iniciadores Primer Express™ (PE Applied Biosystems Inc., Foster City, CA). Os iniciadores de GUS murino são os seguintes: iniciador directo, ZC43,004 SEQ ID NO: 160), iniciador reverso: ZC43,005 SEQ ID NO: 161) e sonda TaqMan® ZC43,018 SEQ ID NO: 162). A sonda de GUS murino ZC43,018 SEQ ID NO: 162) foi marcada na extremidade 5' com um corante fluorescente indicador Yakima-Yellow (Epoch Biosciences) e na extremidade 3' com o 237 corante inactivador não fluorescente ECLIPSE (Epoch Biosciences) . Os iniciadores de GUS murino foram usados nas reacções de PCR a 300 nM e a sonda ZC43,018 SEQ ID NO: 162) foi usada a uma concentração 100 nM. Em alguns casos, foi usado receptor de transferrina murino em lugar de GUS como controlo endógeno. O iniciador directo do receptor de transferrina, ZC40,269 SEQ ID NO: 163) e o iniciador reverso ZC40,268 SEQ ID NO: 164) foram usados a uma concentração 300 nM. A sonda do receptor de transferrina ZC40,298 SEQ ID NO: 165) foi usado na PCR a uma concentração 100 nM e foi marcada na extremidade 5' com um corante fluorescente indicador VIC (PE Applied Biosystems) e na extremidade 3' com um corante inactivador fluorescente (TAMRA) (PE Applied Biosystems). Os resultados de GUS murino e receptor de transferrina também servem como controlo endógeno e permitem a normalização dos resultados de expressão do ARNm de Zcytorl7, OSMRbeta e Zcytorl71ig observados nas amostras de ensaio.

Para a RT-PCR semiquantitativa convencional, foram projectados iniciadores usando o software de projecto de iniciadores Primer Express™ (PE Applied Biosystems). Os iniciadores de Zcytorl7 murino geram um produto de 276 pares de bases e são os seguintes: iniciador directo ZC43,140 SEQ ID NO: 166), e iniciador reverso ZC43,139 SEQ ID NO: 167). Os iniciadores de OSMRbeta murino geram um produto de 575 pares de bases e são os seguintes: iniciador directo ZC41,608 SEQ ID NO: 168) e iniciador reverso ZC41,609 SEQ ID NO: 169). Os iniciadores de Zcytorl71ig murino geram um produto de 657 pb e são os seguintes: iniciador directo ZC41,502 SEQ ID NO: 170) e iniciador reverso ZC41,500 SEQ ID NO: 171). C. Protocolos para RT-PCR Quantitativa em Tempo Real e RT-PCR Semiquantitativa Convencional

Os níveis relativos de ARNm de Zcytorl7, OSMRbeta e Zcytorl71ig foram determinados analisando amostras de ARN 238

total usando o método de RT-PCR de uma etapa (PE Applied Biosystems). Foi isolado ARN total de células BHK (murinas) ou células BAF (humanas) transfectadas com Zcytorl7 e OSMRbeta por métodos convencionais e foram usados para gerar uma curva padrão usada para a quantificação de Zcytorl7 e OSMRbeta. A curva consistia em diluições em série de 10 vezes que variavam de 100 a 0,01 ng/μΐ cada ponto da curva padrão sendo analisado em triplicata. De forma similar, para Zcytorl71ig, foi usado ARN de células T CD4+ activadas (que foi demostrado previamente que fabricam Zcytorl71ig) para gerar uma curva padrão no mesmo intervalo de 100 a 0,01 ng/μΐ. O ARN total das células humanas ou murinas foi analisado em triplicata com respeito aos níveis de transcrito de Zcytorl7, OSMRbeta e Zcytorl71ig humanos ou murinos e com respeito a um dos seguintes genes de controlo endógenos: ARNr, GUS ou receptor de transferrina. Num volume total de 10 μΐ, cada amostra de ARN foi submetida a uma reacção de RT-PCR de uma etapa que continha: aproximadamente 50-100 ng de ARN total em mistura mestre 2X pré-formulada que continha um corante de controlo interno (ROX) (carboxi-x-rodamina) e ADN Polimerase Thermo-Start® (Abgene, Surrey, RU) ; iniciadores apropriados para o gene de interesse (vejam-se as partes A e B do presente exemplo); a sonda apropriada (vejam-se as partes A e B para a concentração); transcriptase reversa Superscript® (50 OU/μΙ) (PE Applied Biosystems), e um volume apropriado de água sem RNase. As condições dos ciclos térmicos de PCR foram as seguintes: uma etapa inicial de transcrição reversa (RT) de um ciclo a 48 °C durante 30 minutos; seguido de uma etapa de activação enzimática Thermo-Start® de um ciclo a 95 °C durante 10 minutos; seguido de 40 ciclos de amplificação a 95 °C durante 15 segundos e 60 °C durante 1 minuto. Os níveis relativos de ARN de Zcytorl7, OSMRbeta e Zcytorl71ig foram determinados usando o método de curva padrão como é descrito pelo fabricante, PE 239

Biosystems (User Bulletin n° 2: ABI Prism 7700 Sequence Detection System, Relative Quantitation de Gene Expression, 11 de Dezembro de 1997) As medições de ARNr, GUS ou Receptor de Transferrina foram usados para normalizar os níveis do gene de interesse.

As reacções de RT-PCR semiquantitativas usaram o "Superscript One-Step RT-PCR System with Platinum Taq" (Invitrogen, Carlsbad, CA). Cada reacção de 25 μΐ consistia no seguinte: 12,5 ml de Tampão de Reacção 2X, 0,5 μΐ (20 pmol/μΐ) de iniciador directo, 0,5 μΐ (20 pmol/μΐ) de iniciador reverso, 0,4 μΐ de mistura de RT/Taq Polimerase, 5,0 ml de Tampão de Carga de Gel Rediload (Invitrogen), 5,1 μΐ de agua sem RNase e 1, 0 μΐ de ARN total (100 ng/μΐ) . A amplificação foi realizada como se indica a seguir: um ciclo a 45 °C durante 30 minutos seguido de 35-38 ciclos de 94 °C, 20 segundos; temperatura de hibridação variável (veja-se o Quadro 7 mostrada a seguir), 20 segundos; 72 °C, 45 segundos; e depois terminando com uma extensão final a 72 °C durante 5 minutos. De oito a dez microlitros do produto de reacção de PCR foram submetidos a electroforese em gel de agarose convencional usando um gel de agarose ao 2%

Quadro 7

Zcytorl7 murino Temperatura de hibridação 58 °C OSMRbeta murino Temperatura de hibridação 60 °C Zcytor 171ig murino Temperatura de hibridação 52 °C Zcytorl7 humano Temperatura de hibridação 55 °C OSMRbeta humano Temperatura de hibridação 59 °C Zcytorl71ig humano Temperatura de hibridação 59 °C D. Isolamento de ARN a partir de Linhas Celulares e 240

Subséries de PBMC Humanas e Murinas

Foi extraído sangue de vários dadores anónimos e foram isoladas células mononucleares de sangue periférico (PBMC) usando a metodologia de gradiente de Ficoll. Depois foram isolados os monócitos usando o Kit de Isolamento de Monócitos e o Sistema Magnético de Separação de Células (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) . Os monócitos depois foram inoculados em placas de 24 poços de aderência ultrabaixa em meio sem endotoxina. Foram estimulados ou foram tratados com IFNg humano recombinante (R&D Systems Inc.) a 10 ng/ml. As células foram colhidas a 24 e 48 horas. De uma maneira similar, foram isoladas células T CD4+ e CD8+ a partir de PBMC usando as pérolas magnéticas anti-CD4 ou anti-CD8 de Miltenyi Biotic. As células depois foram activadas durante 4 ou 16 horas em placas de cultura de tecidos revestidas com 0,5 μρ/ιηΐ de anticorpos anti-CD3 em meio que continha 5 μg/ml de anticorpos anti-CD28. Também foram isoladas células NK a partir de PBMC usando pérolas magnéticas revestidas com anti-CD5 de Miltenyi. Algumas das células NK foram colhidas a tempo zero para o ARN e outras foram inoculadas em meios que continham Forbol Miristato Acetato (PMA) (5 ng/ml) e ionomicina (0,5 μg/ml) durante 24 horas. Além disso, foram colhidas várias linhas celulares parecidas a monócitos humanos, U937, THP-1 e HL-60 em estado de repouso ou activado. As células U937 foram activadas durante a noite com PMA (100 ng/ml) . As HL-60 foram activadas durante a noite com PMA (10 ng/ml) ou durante 72 e 96 horas com IFNg (10 ng/ml) para dirigir as mesmas a uma via monocítica. As células THP-1 foram activadas durante a noite com uma combinação de LPS (10

ng/ml) e IFNg (10 ng/ml) . Foi preparado ARN a partir de todas as células primárias usando o Kit RNeasy Midiprep™ (Qiagen, Valência, CA) de acordo com as instruções do fabricante. Foi retirado o ADN restante usando o kit DNA-Free™ (Ambion, Inc., Austin, TX) . A concentração de ARN 241 foi determinada usando espectrofotometria convencional e a qualidade do ARN foi determinada usando o Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Paio Alto, CA).

Foi colhido ARN de células T murinos usando uma diversidade de métodos bem conhecidos na técnica. Foram isoladas células T CD4+ e CD8+ esplénicos primários a partir dos baços de ratinhos C57B1/6 usando pérolas magnéticas revestidas de anticorpo e o Sistema Magnético de Separação de Células de Miltenyi Biotec. As células T CD4+ e CD8+ depois foram activadas cultivando as células em placas de 24 poços revestidas com anticorpos anti-CD3 (500 ng/ml) em meio que continha anticorpos anti-CD28 a 5 μρ/πιΐ. As células foram colhidas para o ARN a 0, 4 e 16 horas. De forma similar, foram isoladas células T CD4+ e depois se desviadas a um fenótipo Thl ou Th2 usando o seguinte protocolo. Como os células T C57B1/6 já estão desviadas na direcção Thl, tudo o que era necessário era activar durante 6 horas com 0,5 μρ/ιηΐ de PMA e 10 ng/ml de ionomicina. O desvio a "Th2" foi obtido cultivando células T CD4+ naive com 2,5 μg/ml de anti-CD28, 10 ng/ml de mIL-2 (R&D Systems Inc.) e 25 ng/ml de mIL-4 (R&D Systems) em placas revestidas com 0,5 μρ/ιηΐ de anti-CD3. Depois de dois dias em cultura, as células foram ressuspensas em meio que continha 10 ng/ml de mIL-2 (R&D Systems) e 25 ng/ml de mlL-4. As células foram cultivadas durante mais três dias e depois foram activadas com PMA e ionomicina durante 6 horas.

Foi obtido uma série adicional de células T desviados a Thl e Th2 usando a linha de células T DO11.10 transgénica para o Receptor de Células T. Todas as células foram cultivadas em placas revestidas com anti-CD3 e anti-CD28. As células "Th-1" foram cultivadas em meio que continha mIL-12 (1 ng/ml) e anti-IL-4 (10 μg/ml) . As células "Th2" foram cultivadas em meio que continha mIL-4 (10 ng/ml) e anti-IFNg (10 μg/ml). Depois de 24 horas, todas as culturas 242 receberam mIL-2 (10 ng/ml). Depois de mais dois dias, o meio das células foi trocado e foi adicionado novo meio que continha as citocinas mencionadas anteriormente e as células foram cultivadas mais 4 dias antes de ser colhidos.

Todo o ARN de células T murinos foi preparado usando o Kit RNeasy Midiprep™ (Qiagen) e o ADN contaminante foi retirado usando o kit DNA-free™ kit de Ambion. E. Isolamento de ARN a partir de Modelos Murinos de Pancreatite e Doença de Intestino Irritável

Para induzir um estado similar à Doença de Intestino Irritável (Eli) humana, foi usado a estirpe de ratinho híbrida C57B16/129S6F1. Os ratinhos foram divididos em 4 grupos com um tamanho médio de seis ratinhos por grupo. O grupo 1 não recebeu Dextran Sulfato de sódio (DSS) e foi sacrificado no dia 14. 0 grupo 2 recebeu DSS a 2% durante dois dias antes do sacrifício. 0 grupo 3 recebeu DSS a 2% durante sete dias antes do sacrifício. 0 grupo 4 recebeu DSS a 2% durante sete dias, depois foi deixado que os ratinhos se recuperassem durante sete dias e foram sacrificados no dia 14. No dia do sacrifício, foram retiradas secções de cólon distai e foram postas em RNAIater™ (Ambion) . As secções de cólon foram homogeneizadas usando técnicas convencionais e o ARN foi isolado usando o Kit RNeasy Midiprep™ (Qiagen) . O ADN contaminante foi retirado por tratamento com DNA-free™ (Ambion) de acordo com as instruções do fabricante.

Num estudo diferente, foi induzido pancreatite aguda em ratinhos CD-I macho por injecção de caeruleína. Os ratinhos foram divididos em três grupos (n = 8 ratinhos/grupo). Os animais do grupo 1 receberam sete injecções i.p. (1 injecção por hora) de veículo (solução salina) e depois foram sacrificados 12 e 24 horas depois da primeira injecção. Os grupos 2 e 3 receberam sete injecções i.p. de caeruleína (Sigma) (n° de catálogo C-9026) a uma dose de 50 μg/kg/h durante seis horas (1 injecção por 243 hora). 0 grupo 2 foi sacrificado 12 horas depois da primeira injecção e o grupo 3 foi sacrificado 24 horas depois da primeira injecção. Foram retirados os pâncreas no momento do sacrifício e foram congelados imediatamente para o isolamento do ARN. Os tecidos foram homogeneizados e o ARN foi isolado usando o Kit RNeasy Midiprep™ de Qiagen.

Em outro estudo, foram gerados ratinhos transgénicos para Zcytorl71ig murino e foram observadas as mudanças fenotípicas (veja-se o Exemplo 41). Foi observado uma piloerecção e perda de pelo em muitos dos ratinhos transgénicos. Foram sacrificados quatro ratinhos transgénicos e foram retiradas amostras de pele de áreas normais e sem pelo e foram congelados imediatamente para um isolamento posterior do ARN. Também foram colhidas secções de pele de dois ratinhos de controlo não transgénicos. As amostras de pele foram homogeneizadas e depois foram digeridas com Proteinase K (Qiagen) (n° de catálogo 19133) durante 20 minutos a 60 °C. Depois foi isolado o ARN usando o Kit RNeasy Midiprep™ de Qiagen seguindo as instruções do fabricante. O ADN excedente foi retirado usando o kit DNA-free™ de Ambion. F. Resultados de RT-PCR Quantitativa e Semiquantitativa para Zcytorl7, OSMRbeta e Zcytorl71ig Humanos A expressão de Zcytorl7 e OSMRbeta foi examinado por RT-PCR quantitativa em quatro séries de monócitos humanos primários que estavam em estado de repouso ou activados com IFNg durante 24 ou 48 horas. A expressão de Zcytorl7 estava abaixo da detecção nas células infraestimuladas, mas aumentava espectacularmente depois da activação de 24 horas com IFNg, e era máxima depois de 48 horas de activação. Em todos os casos, OSMRbeta estava abaixo da detecção. Nestas amostras não foi ensaiado Zcytorl71ig.

Nas células T primárias, Zcytorl7 estava abaixo da detecção nas subséries de CD4+ e CD8+ em repouso. Depois de uma activação de quatro horas, no entanto, a expressão de 244

Zcytorl7 aumentou nas duas subséries e depois foi reduzida a um nível ligeiramente menor no ponto de tempo de 16 horas. OSMRbeta esteve abaixo da detecção nestas amostras. A expressão de Zcytorl71ig foi examinada usando RT-PCR semiquantitativa. Não se detectou expressão nas células T CD4+ e CD8+ não estimuladas. No entanto, depois da activação de quatro horas, foram detectados altos níveis de Zcytorl71ig. Este nível foi reduzido em alguma medida no ponto de tempo de 16 horas. A expressão de Zcytorl7 não foi examinada em células NK. OSMRb estava abaixo da detecção nestas amostras. A expressão de Zcytorl71ig estava abaixo da detecção nas células NK em repouso, no entanto houve um sinal débil gerado pelas células NK activadas que sugeria que estás células podem fabricar Zcytorl71ig em certas condições.

Nas linhas celulares similares a monócitos humanos, U937, THP-1 e HL-60, a expressão de OSMRbeta estava abaixo da detecção em todas as amostras em repouso e activadas com a excepção das amostras de THP-1 activadas nas que se detectem que foi detectado um sinal débil. A expressão de Zcytorl7 foi alta nas linhas celulares em repouso U937 e THP-1 e mostrou uma forte regulação positiva depois da activação. A expressão nas células U937 foi a maior de qualquer tipo celular. Nas células HL-60, Zcytorl7 era expresso em níveis moderados nas células não estimuladas e foi reduzida depois da estimulação com PMA. No entanto, a expressão de Zcytorl7 estava regulada positivamente de forma espectacular nas células HL-60 quando eram estimuladas com IFNg durante 72 e 96 horas. Todos os dados de expressão em humanos são resumidos no Quadro 8 proporcionados a seguir. 245 Quadro 8

Monócitos Humanos Primários Estado de Activação Zcytorl7 OSMRbeta Zcytorl71 íg Monócitos Humanos Não estim. - - Monócitos Humanos Act. 24 h IFNg + - Monócitos Humanos Act. 48 h IFNg + + - CD4+ Humana Não estim. - - - CD4+ Humana Act. 4 h + + - + + CD4+ Humana Act. 16 h + - + CD8+ Humana No estim - - - CD8+ Humana Act. 4 h -H- - + + CD8+ Humana Act. 16 h + - + Células NK Humanas Não estim. - - Células NK Humanas Act. 2 4 h - + U937 Não estim. + + - - U937 Act. 16 h + + + - - THP-1 Não estim. + + - - THP-1 Act. 16 h + + + + - HL-60 Não estim. ++ - - HL-60 Act. 16 h PMA + - - HL-60 Act. 72 h IFNg + + + - - HL-60 Act 96 h IFNg +++ - - G. Resultados de RT-PCR Quantitativa e Semiquantitativa para Zcytorl7, OSMRbeta e Zcytorl71ig Murinos

Os níveis de expressão de Zcytorl7, OSMRbeta e Zcytorl71ig murinos foram examinados em várias populações de células T murinos e os resultados são resumidos no Quadro 9 proporcionada a seguir. A expressão de Zcytorl7 murino foi ensaiada por RT-PCR semiquantitativa e mostrou estar a baixos níveis em células T CD4+ primários activados e em repouso. A expressão de Zcytorl7 foi detectada em células T CD8+ em repouso e depois parecia reduzir após a activação com anticorpos anti-CD3 e anti-CD28 nos pontos de 246 tempo de 4 e 16 horas. A expressão de OSMRbeta foi medida por RT-PCR quantitativa e mostrou que expressa em células T CD4+ e CD8+ activados e em repouso. A expressão de OSMRbeta aumentou depois de uma activação de 4 horas e depois voltou aos niveis não estimulados às 16 horas nos células T CD4+ e CD8+. Foi detectada Zcytorl71ig por RT-PCR quantitativa e mostrou que se expressa a níveis muito baixos em células T CD4+ não estimulados. No entanto, depois de uma activação de 4 horas, a expressão de Zcytorl71ig foi regulada positivamente de forma espectacular e depois foi reduzida ligeiramente no ponto de tempo de 16 horas. Em células T CD8+, não foi detectada Zcytorl71ig nas células não estimuladas. Houve alguma expressão de Zcytorl71ig no ponto de tempo de 4 horas, mas às 16 horas os níveis de expressão tinham reduzido abaixo da detecção.

Nas células T DO11.10, foi detectada a expressão de Zcytorl7 nas células naive e desviadas a Th2, mas não nas células desviadas a Thl. A expressão de OSMRbeta estava a baixos níveis nas células D01 1,10 naive. Houve um aumento espectacular nos níveis de expressão de OSMRbeta nas células desviadas a Thl e um aumento moderado da expressão nas células desviadas a Th2. A expressão de Zcytorl71ig nestas células mostrou ser predominantemente pela subsérie desviada Th2. Foram detectados baixos níveis na subsérie Thl e não foi detectada expressão nas células naive. Estes resultados são resumidos no Quadro 9 proporcionado a seguir.

Nas células T CD4+ primários que foram desviados na direcção Thl ou Th2, não foi examinado Zcytorl7. Foi detectada expressão de OSMRbeta nas três amostras, sendo encontrados os maiores níveis na amostra Th2. De forma similar aos resultados de DO11.10, foi detectada expressão de Zcytorl71ig a altos níveis na subsérie desviada a Th2, sendo detectado uma pequena quantidade na subsérie Thl e os níveis estavam abaixo da detecção nas células não 247 estimuladas. Estes resultados são resumidos no Quadro 9 proporcionada a seguir.

Quadro 9 Células T Murinos Zcytorl7 OSMRbeta Zcytorl71ig Células T CD4+ Não estimulados + + + /- Células T CD4+ 4 h de Activação + + + + + Células T CD4+ 16 h de Activação + + + Células T CD8+ Não estimulados + + - Células T CD8+ 4 h de Activação + /- + + + Células T CD8+ 16 h de Activação - + - D011,10 Naive + + - DOll,10 Thl - + + + + D011,11 Th2 + + + + + Células T CD4+ Não estimulados + + - Células T CD4+ Desviados Thl + + + + Células T CD4+ Desviados Th2 + + + + +

Nas amostras de pele transgénica de Zcytorl71ig, os níveis de expressão de Zcytorl7, OSMRbeta e Zcytorl71ig foram determinados usando RT-PCR quantitativa. Foi mostrado que Zcytorl7 estava presente em todas as amostras a níveis aproximadamente equivalentes. Houve níveis espectacularmente superiores de expressão de OSMRbeta nos 248 animais de controlo não transgénicos em comparação com as amostras transgénicas. A expressão de Zcytorl71ig estava abaixo da detecção nos animais de controlo não transgénicos com níveis de expressão de moderados a elevados nos animais transgénicos. Os resultados são resumidos no Quadro 10 proporcionada a seguir.

Quadro 10

Zcytorl71ig Murino Pele Transgénica Fenótipo de pele Zcytorl7 OSMRbeta Ligando de Zcytorl7 Ratinho de Tipo Selvagem Normal + + + + - Ratinho de Tipo Selvagem Normal + + + + - Transgénico n° 1 Normal + + + Transgénico n° 1 Perda de Pelo + + + Transgénico n° 2 Normal + + + Transgénico n° 2 Perda de Pelo + + + Transgénico n° 3 Normal + + + Transgénico n° 3 Perda de Pelo + + + Transgénico n° 4 Normal + + + + + Transgénico n° 4 Perda de Pelo + + + + +

Numa experiência diferente, foram medidos os níveis de expressão de Zcytorl7, OSMRbeta e Zcytorl71ig por RT-PCR guantitativa no pâncreas de ratinhos submetidos a pancreatite aguda. A expressão de Zcytorl7 estava abaixo da detecção em todas as amostras. Foi observado expressão de OSMRbeta a baixos níveis nas amostras de controlo normais (Grupo 1), mas mostrou uma forte regulação positiva em ponto de tempo de 12 horas (Grupo 2) e níveis ligeiramente menores no ponto de tempo de 24 horas (Grupo 3). A expressão de Zcytorl71ig estava abaixo da detecção nos animais de controlo, mas mostrou altos níveis nos dois grupos injectados com caeruleína. Os dados são resumidos no Quadro 11 proporcionado a seguir. 249

Quadro 11

Modelo de Pancreatite Descrição Zcytorl7 OSMRbeta Ligando de Zcytorl7 Grupo 1 Controlo Normal - + - Grupo 2 12 h Depois Injecção da - + + + 4- + Grupo 3 24 h Depois Injecção da - + + + +

Em outra experiência, foram examinados os níveis de expressão de Zcytorl7 e OSMRbeta no cólon distai de ratinhos submetidos a tratamento com DSS. Neste modelo murino de doença inflamatória do intestino, os níveis de expressão dos dois genes foram determinados por RT-PCR quantitativa e são resumidos no Quadro 12 proporcionada a seguir. Os níveis de expressão de Zcytorl7 aumentaram com a gravidade da doença, com baixos níveis de expressão nos animais normais do Grupo 1 e quantidades crescentes nos Grupos 2 e 3. Nos animais do Grupo 4, os níveis de Zcytorl7 tinham voltado a níveis mais normais. Ao contrário da expressão de Zcytorl7, os níveis de OSMRbeta foram os máximos nos animais de controlo e os níveis realmente foram reduzidos nos três grupos tratados com DSS.

Quadro 12

250

Exemplo 28

Expressão de Distribuição De tecido de Zcytorl71ig Humano baseada na análise RT-PCR de ADNc de Primeira Cadeia de Múltiplos Tecidos A expressão génica de zcytorl71ig foi examinada usando painéis de ADNc de primeira cadeia de Múltiplos tecidos normalizados disponíveis no mercado (OriGene Technologies, Inc. Rockville, MD; BD Biosciences Clontech, Paio Alto, CA) . Estes incluíam o painel "Human Tissue Rapid-Scan™ Painel" de OriGene (n° de cat CHSCA-101, que contém 22 tecidos diferentes, médula óssea e leucócitos de sangue e plasma) e o painel "Human Blood Fractions MTC™ Panei" de BD Biosciences Clontech (n° de cat. K1428-1, que contém 9 fracções de sangue diferentes).

As reacções de PCR foram estabelecidas usando os iniciadores oligo específicos de zcytorl71ig ZC41,458 SEQ ID NO: 60) e ZC41,457 SEQ ID NO: 61), que produziram um produto de 139 pb, e ZC41,459 SEQ ID NO: 62) e ZC41,460 SEQ ID NO: 63), que produziram um produto de 92 pb, HotStarTaq ADN Polimerase de Quiagen e tampão (Qiagen, Inc., Valência, CA), dH20, e corante RediLoad™ (Research Genetics, Inc., Huntville, AO) . As condições dos ciclos de PCR foram as seguintes: 1 ciclo inicial de 15 minutos de desnaturação a 95 °C, 35 ciclos de desnaturação de 45 segundos a 95 °C, 1 minuto de hibridação a 53 °C ou 56 °C e 1 minuto e 15 segundos de extensão a 72 °C, seguido de um ciclo final de extensão de 7 minutos a 72 °C. As reacções foram separadas por electrof orese num gel de agarose a 2% (EM Science, Gibbstown, NJ) e foram visualizadas por coloração com brometo de etídio.

Foi observado um fragmento de ADN do tamanho correcto nos seguintes tecidos adultos humanos usando o painel "Human Tissue Rapid-Scan™ Painel" de OriGene: testículo, leucócitos de plasma sanguíneo (PBL) e médula óssea.

Foi observado um fragmento de AND do tamanho correcto 251 nas seguintes fracções de sangue humana usando o painel "Human Blood Fractions MTC™+ Panei" de BD Biosciences Clontech: células mononucleares activadas (linfocitos B e T e monócitos), células CD8+ activadas (T- supresor/citotóxico), células CD4+ activadas (T- auxiliar/inductor) e débilmente nas células CD8+ em repouso.

Exemplo 29

Clonagem do receptor da Oncostatina M humano 0 receptor da Oncostatina M beta (OSMRbeta) é um receptor de citocina de tipo I com similaridade estrutural a IL-12R-B2. ZcytoR17 tem similaridade estrutural com IL12R - BI. Os receptores OSMRbeta e zcytorl7 foram ensaiados para ver se podiam interagir como subunidades num complexo de sinalização de citocinas, e se conjuntamente poderiam actuar como receptor de sinalização, ou antagonista de receptor solúvel, para zcytorl71ig.

Para isolar OSMRbeta, foram projectados iniciadores de PCR oligonucleotidicos ZC39982 SEQ ID NO: 64) e ZC39983 SEQ ID NO: 65) para amplificar a região codificante de comprimento completo da seguência de ADNc da Oncostatina M beta humana SEQ ID NO: 6) (Genbank, N° de Acesso U60805; Mosley B, JBC Volume 271, Número 50, Edição de 20 de Dezembro de 1996, páginas 32635-32643).

Foram realizadas reacções de PCR numa série de moldes de biblioteca de ADNc usando uma Polimerase sólida, Advantage II (Clontech, PaloAlto, CA), para identificar uma fonte do ADNc. O ADN molde usado procedia de bibliotecas de plasmídeos de ADNc amplificadas que continham, cada uma, 5 milhões de clones de ADNc independentes. As reacções foram realizadas seguindo as instruções de fabricante usando 400 fmol/μΐ de cada oligonucleótido e 2-20 ng/μΐ de ADN de biblioteca de plasmídeo purificado como molde. As bibliotecas de ADNc procediam dos seguintes tecidos e linhas celulares humanas: cérebro fetal, músculo liso de 252 próstata, médula óssea, RPMI1588, tiróide, WI-38, testículo, células mononucleares de sangue periférico estimuladas, células CD3+ estimuladas, THP-1, amígdala activada, HACAT e fígado fetal. As reacções foram realizadas numa máquina de termociclagem usando as seguintes condições: 30 ciclos de 95 °C durante 20 segundos, 68 °C durante 3 minutos. Ao final dos 30 ciclos, foi realizada um ciclo de extensão individual adicional de 8 minutos a 68 °C. Os produtos de PCR foram visualizados por electrof orese em gel de TAE agarose em presença de brometo de etídio seguido de iluminação UV. Foi observado que o produto mais abundante procedia de uma biblioteca de ADNc de músculo liso de próstata. A reacção de PCR usando molde de músculo liso de próstata e oligonucleótidos ZC39982 SEQ ID NO: 64) e ZC39983 SEQ ID NO: 65) foi repetido usando uma ADN Polimerase termoestável menos sólida, mas de maior fidelidade "turboPFu" (Stratagene, La Jolla, CA) . Foram realizados trinta ciclos de amplificação com as seguintes condições: desnaturação a 94 °C, 30 segundos, hibridação a 63 °C 45 segundos, extensão a 72 °C 3,5 minutos. Foi purificada em gel uma só banda de produto num gel de TAE, agarose a 0,8%.

Este ADN depois foi amplificado de novo usando iniciadores ZC39980 SEQ ID NO: 66) e ZC39981 SEQ ID NO: 67) projectados para incluir sequências de reconhecimento de enzimas de restrição para permitir a clonagem de este ADNc num vector de expressão de mamífero. A reacçao de PCR foi realizada usando "TurboPfu" e 0 produto de PCR purificado durante 15 ciclos de 95 °C 1 minuto, 6 4 1—1 O o minuto 20 segundos, 72 °C 4, 5 minutos. A reacção de PCR depois foi digerida com EcoRI e Xhol (Invitrogen, Carlsbad, CA) e foi purificada em gel como foi descrito anteriormente. Foi preparado um vector de expressão de mamífero, pZ7NX por digestão com EcoRI e Xhol e o produto de PCR foi ligado a este vector e foi 253 introduzido por electroporação em células E. coli DHIOb. Foram isoladas várias colónias bacterianas e foram sequenciadas. Um clone era correcto com a excepção de uma só mutação não conservativa. Para mudar esta base para que correspondesse à sequência esperada, foi usada mutação de substituição de um oligonucleótido e um local de restrição PstI estranho numa reacção de PCR com "TurboPfu" usando o plasmideo pZP7Nx-h de Oncostatina M R previamente sequenciado como molde. 0 ADN amplificado por PCR foi digerido com PstI e Xhol e foi clonado de novo no plasmideo pZP7Nx-h de Oncostatina M R em lugar do fragmento PstI/Xhol que continha a mutação ofensiva. Este novo plasmideo foi sequenciado na região PstI a Xhol recentemente amplificada para confirmar a correcção e garantir de que não eram criados outros erros no processo de amplificação. Esta análise confirmou a sequência de que correspondia à sequência esperada na região codificante. A sequência é mostrada na SEQ ID NO: 6 e a sequência de aminoácidos correspondente se amostra na SEQ ID NO: 7.

Exemplo 30

Construções para Gerar um Heterodlmero de Zcytorl7/receptor de Oncostatina M (OSMRbeta) Humano

Na técnica conhece-se um sistema para a construção, expressão e purificação dos ditos receptores heterodiméricos solúveis e foi adaptado ao par de receptores receptor de oncostatina M humano (OSMRbeta) e zcytorl7 humano. Para esta construção, o polinucleótido para o receptor solúvel OSMRbeta é mostrado na SEQ ID NO: 68 e o polipéptido correspondente é mostrado na SEQ ID NO: 69; e o polinucleótido para o receptor solúvel zcytorl7 humano é mostrado na SEQ ID NO: 70 e o polipéptido correspondente é mostrado na SEQ ID NO: 71.

Para construir uma linha celular que expressa um heterodlmero hzcytorl7 solúvel/OSMRbeta humano segregado, foi realizada uma construção de forma que o receptor 254 solúvel heterodimérico resultante compreendesse o domínio extracelular de OSMRbeta humano fusionado à cadeia pesada da IgG gamai (Fc4) SEQ ID NO: 37) com um marcador Glu-Glu SEQ ID NO: 35) na extremidade C; enquanto que o domínio extracelular de zcytoR17 é fusionado a Fc4 SEQ ID NO: 37) com um marcador His SEQ ID NO: 72) na extremidade C. Para os dois braços de hzcytorl7 e OSMRbeta humano do heterodímero, foi obtido por engenharia genética um espaçador Gly-Ser de 12 aminoácidos SEQ ID NO: 73) entre a parte extracelular do receptor e a extremidade N de Fc4. A. Construção de OSMRbeta/Fc4-CEE solúvel humano

Para a construção da parte 0SMRbeta/Fc4-CEE solúvel humana do heterodímero, foi isolado a parte extracelular de OSMRbeta humano usando PCR com oligos ZC14063 SEQ ID NO: 48) e ZC41557 SEQ ID NO: 74) nas condições de reacção de PCR seguintes: 30 ciclos de 95 °C durante 60 seg, 57 °C durante 30 seg e 72 °C durante 100 seg; e 72 °C durante 7 min. Os produtos de PCR foram purificados usando o Kit de Purificação de PCR QIAquick (Qiagen), foram digeridos com EcoRI e BglII (Boerhinger-Mannheim), foram separadas por electroforese em gel e foram purificados usando o kit de extracção de gel QIAquick (Qiagen). A cassete de expressão, o esqueleto do plasmídeo e a parte do marcador Fc4-GluGlu da quimera estavam contidos dentro de um vector de plasmídeo interno fabricado previamente. O vector de plasmídeo foi digerida com EcoRI e BamHI (Boerhinger-Mannheim), os fragmentos foram separados por electroforese em gel e foram purificados usando o kit de extracção de gel QIAquick (Qiagen). Os fragmentos digeridos e purificados do plasmídeo que continha OSMRbeta humano e Fc4-cEE foram ligados entre si usando ADN ligase de T4 (Life Technologies. Bethesda, MD) usando métodos de ligação convencionais. Foram rastreadas minipreps do ligação resultante com respeito a uma inserção EcoRI/Smal do tamanho correcto (772 pb) para o OSMRbeta solúvel e as 255 minipreps positivas foram sequenciadas para confirmar com exactidão a reacção de PCR. Esta nova construção de plasmideo se denomina ZP9-ONCOMR-Fc4CEE. B. Construção de Zcytorl?/Fc4-CHIS solúvel humano

Para a construção da parte hzcytorl7/Fc4-CHIS do heterodímero, a parte extracelular de zcytorl7 humano foi isolado por digestão de um plasmideo que continha previamente o receptor solúvel Zcytorl7-Fc4. 0 plasmideo foi digerido em primeiro lugar com Sall (New England Biolabs, Beverly, MA), depois do qual a reacção foi extraída em série com fenol clorofórmio e foi precipitado com etanol. 0 ADN digerido depois foi tratado com ADN Polimerase de T4 (Boerhinger-Mannheim), para preencher as protuberâncias 5' criados pela digestão com Sall, deixando rombas as extremidades de ADN, depois do qual a reacção foi extraída em série com fenol clorofórmio e foi precipitada com etanol. 0 ADN de extremidades rombas depois foi digerido adicionalmente com BglII para cortar na extremidade 3', foi separado por electroforese em gel e foi purificado usando um kit de extracção de gel QIAquick (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante. 0 fragmento de ADN resultante que continha a sequência codificante do domínio extracelular de zcytoR17 foi ligado a um vector de expressão de mamífero que continha o marcador Fc4-CHIS, preparado como se indica a seguir. A cassete de expressão, o esqueleto do plasmideo e a parte do marcador Fc4-CHIS da quimera estavam contidos dentro de um vector de plasmideo interno fabricado previamente. Este vector de plasmideo foi digerido com EcoRI (Boerhinger-Mannheim) , depois do qual a reacção foi extraída em série com fenol clorofórmio e foi precipitado com etanol. 0 ADN digerido depois foi tratado com ADN Polimerase de T4 (Boerhinger-Mannheim), para preencher as protuberâncias 5' criadas pela digestão com EcoRI, deixando rombas as extremidades do ADN, depois do qual a reacção foi 256 extraída em série com fenol clorofórmio e foi precipitado com etanol. 0 ADN de extremidades rombas depois foi digerida adicionalmente com BamHI (Boerhinger-Mannheim) para cortar a extremidade 3', foi separado por electrof orese em gel e foi purificada usando um kit de extracção de gel QIAquick (Qiagen). Os fragmentos digeridos e purificados do plasmídeo que continha zcytorl7 e Fc4-CHIS foram ligados entre si usando ADN Ligase de T4 (Life Technologies, Bethesda, MD) usando métodos de ligação convencionais.

Foram rastreadas minipreps da ligação resultante por PCR usando o iniciador sense específico de zcytorl7 ZC29180 SEQ ID NO: 22) e o iniciador antisense especifico de Fc4 ZC29232 SEQ ID NO: 75) com as seguintes condições das reacções de PCR: 30 ciclos de 94 °C durante 60 seg, 68 °C durante 150 seg; e 72 °C durante 7 min. Um tamanho esperado do produto de 846 pb confirmou a montagem correcta do plasmídeo denominado pZEM228 hzcytorl7/Fc4HIS.

Foi criada uma segunda construção zcytorl7-Fc4 para utilização na geração da proteína homodimérica em células COS. Em resumo, a região codificante da proteína de fusão completa foi isolada por digestão de um plasmídeo que previamente continha receptor solúvel Zcytorl7-Fc4 com Sall (Boerhinger-Mannheim). A reacção foi extraída em série com fenol clorofórmio e foi precipitada com etanol. O ADN digerido depois foi tratado com ADN Polimerase de T4 (Boerhinger-Mannheim) para preencher as protuberâncias 5' criadas pela digestão com EcoRI, deixando rombas as extremidades do ADN, depois do qual a reacção foi extraída em série com fenol clorofórmio e foi precipitada com etanol. O ADN de extremidades rombas depois foi digerido adicionalmente com Notl (Boerhinger-Mannheim) para cortar na extremidade 3', foi separado por electroforese em gel e foi purificado usando um kit de extracção de gel QIAquick (Qiagen). Um vector de expressão de mamífero que continha 257 uma cassete de expressão dirigido por CMV foi digerido para gerar extremidades compatíveis e os dois fragmentos foram ligados entre si. Foram rastreadas minipreps da ligação resultante por PCR usando o iniciador sense específico do vector ZC14063 SEQ ID NO: 48) e o iniciador antisense específico de zcytorl7 ZC27899 SEQ ID NO: 19) com as seguintes condições de reacção de PCR: 30 ciclos de 94 °C durante 30 seg, 64 °C durante 30 seg; 70 °C durante 90 seg; e 72 °C durante 7 min. Um tamanho de produto esperado de aproximadamente 1000 pb confirmou a montagem correcta do plasmídeo denominado pZP7NX-hzcytor17-Fc4. Este plasmídeo posteriormente foi introduzido por transfecção em células COS usando Lipofectamine (Gibco/BRL) de acordo com as instruções do fabricante. As células foram condicionadas durante 60 horas em DMEM + FBS a 5% (Gibco/BRL), depois do qual a proteína foi purificada sobre uma coluna de cromatografia de proteína G-sepharose 4B e foi posta a disposição dos bioensaios in vitro, por exemplo, tais como os descritos no presente documento. C. Geração do receptor Zcytorl7 Oncostatina M (OsmRbeta) humano

Foram introduzidos por co-transfecção aproximadamente 16 μg de pZP9-ONCOMR=Fc4CEE e pZEM228 hzcytorl7/Fc4HIS em células BHK-570 (N° de ATCC CRL-10314) usando lipofectamine (GibcoBRL) de acordo com as instruções do fabricante. As células transfectadas foram seleccionadas durante 10 dias em DMEM + FBS a 5% (Gibco/BRL) que continha 0,5 mg/ml de G418 (Gibco/BRL) e metiltrexato (MTX) 250 nM (Sigma, St. Louis, MO) durante 10 dias. O agrupamento resultante de células duplamente seleccionadas foi usado para gerar a proteína heterodimérica. Foram usadas três fábricas celulares (Nunc, Dinamarca) deste agrupamento para gerar 10 1 de meio condicionado sem soro. Este meio condicionado foi passado numa coluna de 1 ml de proteína A e foi eluído em (10) 258 fracções de 750 microlitros. Foi descoberto que quatro destas fracções tinham a maior concentração e foram agrupadas e submetidas a diálise (limite de PM 10 kD) contra PBS. O complexo de proteína heterodimérico zcytor17/OSMRbeta solúvel foi isolado a partir de outros componentes do meio passando o agrupamento sobre uma coluna de níquel e lavando a coluna com diversas concentrações de imidazol. A proteína zcytor17/OSMRbeta solúvel foi eluída a concentrações intermediárias de imidazol, enquanto que o homodímero hzcytorl7/Fc4HIS eluiu a maiores concentrações de imidazol.

Exemplo 31

Distribuição De tecido de zcytorl7 Humano em Painéis de

Tecido Usando Northern blot e PCR A. Distribuição De tecido de zcytorl7 Humano Usando

Northern blot

Foram sondadas manchas de Northern blot de Múltiplos tecidos humanos (manchas de transferência I e II de MTN de pista 12 humano e mancha de transferência II de MTN de sistema imune humano; MTN de tecido endócrino humano, transferência II de MTN de tecido fetal humano, matriz de Múltiplos tecidos humanos) (Clontech) assim como manchas de transferência internas que continham diversos tecidos, para determinar a distribuição de tecido da expressão de zcytorl7 humano. As manchas de transferência preparadas internamente incluíam os seguintes ARNm de tecidos e linhas celulares: células SK-Hep-1, células THP1, Glândula suprarrenal (Clontech); Rim (Clontech), Fígado (Clontech e Invitrogen) ; Médula espinal (Clontech), Testículo (Clontech), Células T CD4+ humanos, Células T CD8+ humanos, células T CD19+ humanos, reacção mista de linfócitos humanos (MLR), linha celular THP1 (N° de ATCC TIB-202), linha celular U937, linha celular de linfoblastos de ratinho p388DI (N° de ATCC CCL-46) com ou sem estimulação por ionomicina; e linha celular de pulmão embrionário 259 humano WI-38 (N° de ATCC CRL-2221) com ou sem estimulação por ionomicina.

Foi amplificado uma sonda obtida por PCR de aproximadamente 500 pb para zcytorl7 SEQ ID NO: 4) usando oligonucleótidos ZC28,575 SEQ ID NO: 77) e ZC27, 899 SEQ ID NO: 19) como iniciadores. A amplificação por PCR foi realizada como se indica a seguir: 30 ciclos de 94 °C durante 1 minuto, 65 °C durante um minuto e 72 °C durante um minuto; seguido de um ciclo a 72 °C durante 7 minutos. O produto de PCR foi visualizado por electroforese em gel de agarose e o produto de PCR de aproximadamente 500 pb foi purificado em gel como é descrito no presente documento. A sonda foi marcada radioactivamente usando o kit de marcação de iniciador aleatório PRIME IT II™ (Stratagene) de acordo com as instruções do fabricante. A sonda foi purificada usando uma coluna de pressão NUCTRAP™ (Stratagene). Foi usada solução EXPRESSHYB™ (Clontech) para a pré-hibridação e como solução de hibridação para os Northern blot. A pré-hibridação foi realizada a 68 °C durante 2 horas. A hibridação foi realizada durante a noite a 68 °C com aproximadamente 1,5X106 cpm/ml de sonda marcada. As manchas de transferência foram lavadas três vezes a temperatura ambiente em SSC 2X, SDS a 0,05% seguido de uma lavagem durante 10 minutos em SSC 2X, SDS a 0,1% a 50 °C. Foram observadas várias bandas foram depois de uma exposição de vários dias. Foi observado um transcrito de aproximadamente 9 kb em traqueia, músculo esquelético e timo; foi observado um transcrito de aproximadamente 2 kb em células PBL, HPV, U937 e THP-1; e foi observado um transcrito de aproximadamente 1,2 kb em placenta, médula óssea e tiróide, e em células HPV e U937. Em todos os tecidos indicados anteriormente, a intensidade do sinal foi fraco. Parecia ter pouca expressão na maioria dos tecidos normais, o que sugere que a expressão de zcytorl7 pode ser dependente da activação das células ou tecidos em que se expressa. 260 B. Distribuição De tecido em painéis de tecidos usando PCR Um painel de ADNc de tecidos humanos foi rastreado com respeito à expressão de zcytorl7 usando PCR. O painel foi realizado internamente e continha 94 amostras de ADNc marathon e amostras de ADNc de diversas linhas celulares e tecidos humanos normais e cancerosos e como é mostrado a seguir no Quadro 13. Os ADNc procediam de bibliotecas internas ou de ADNc marathon procedente de preparações de ARN internas, ARN de Clontech ou ARN de Invitrogen. Os ADNc marathon foram fabricados usando o kit marathon-Ready™ (Clontech, Paio Alto, CA), foram submetidos a ensaios de CC com iniciadores de clatrina ZC21195 SEQ ID NO: 78) e ZC21196 SEQ ID NO: 79) e depois foram diluídos com base na intensidade da banda de clatrina. Para garantir a qualidade das amostras do painel, foram realizados três ensaios de controlo de qualidade (CC): (1) para avaliar a qualidade do ARN usado para as bibliotecas, os ADNc internos foram ensaiados com respeito ao tamanho médio do inserto por PCR com oligos do vector que eram específicos para as sequências de vector para uma biblioteca de ADNc individual; (2) a padronização da concentração do ADNc nas amostras do painel foi conseguida usando métodos de PCR convencionais para amplificar a alfa tubulina de comprimento completo ou ADNc de G3PDH usando um oligo de vector 5' ZC14, 063 SEQ ID NO: 48) e um iniciador oligo específico de alfa tubulina 3' ZC17,574 SEQ ID NO: 49) ou o iniciador oligo específico de G3PDH 3' ZC17,600 SEQ ID NO: 50); e (3) uma amostra foi enviada a sequenciamento para verificar a possível contaminação com ADN ribossómico ou mitocondrial. O painel foi preparado num formato de 96 poços que incluía uma amostra de controlo positivo de ADN genómico humano (Clontech, Paio Alto, CA). Cada poço continha aproximadamente 0,2-100 pg/μΐ de ADNc. As reacções de PCR foram preparadas usando oligos ZC26,358 SEQ ID NO: 80) e ZC26,359 SEQ ID NO: 81), TaKaRa Ex Taq™ (TARARA Shuzo 261

Co LTD, Biomedicals Group, Japão), e corante Rediload (Research Genetics, Inc., Huntsville, AO). A amplificação foi realizada como se indica a seguir: um ciclo a 94 °C durante 2 minutos, 35 ciclos de 94 °C durante 30 segundos, 66,3 °C durante 30 segundos e 72 °C durante 30 segundos, seguido de um ciclo a 72 °C durante 5 minutos.

Aproximadamente 10 μΐ do produto de reacção de PCR foram submetidos a electroforese em gel de agarose convencional usando um gel de agarose ao 4%. Foi observado o tamanho do fragmento de ADN previsto correcto em gânglio linfático, próstata, tiróide, HPV (epitélio de próstata), HPVS (epitélio de próstata, seleccionado) , tumor de pulmão, reacções de tumor de útero, junto com a reacção de ADN genómico.

Os fragmentos de ADN para o tecido de próstata (2 amostras), HPV (epitélio de próstata), HPVS (epitélio de próstata, seleccionado), e genómico foram cortados e purificados usando um kit de extracção em gel (Qiagen, atsworth, CA) de acordo com as instruções do fabricante. Os fragmentos foram confirmados por sequenciamento para mostrar que efectivamente era zcytorl7.

Quadro 13

Tecido/ linha celular N° de amostras Tecido/ linha celular N° de amostras Glândula suprarrenal 1 Médula óssea 3 Bexiga 1 Cérebro fetal 3 Médula óssea 1 Ilhota 2 Cérebro 1 Próstata 3 Colo do útero 1 RPMI N° 1788 (N° de ATCC CCL-156) 2 Cólon 1 Testículo 4 Cérebro fetal 1 Tiróide 2 Coração fetal 1 WI38 (N° de ATCC CCL-75) 2 262

Rim fetal 1 ARIP (N° de ATCC CRL-1674 rato) 1 Fígado fetal 1 HaCat - queratinócitos humanos 1 Pulmão fetal 1 HPV (N° de ATCC CRL-2221) 1 Músculo fetal 1 Glândula suprarrenal 1 Pele fetal 1 SM de próstata 2 Coração 2 PBMC seleccionadas CD3+ estimuladas com ionomicina + PMA 1 K562 (N° de ATCC CCL-243) 1 HPVS (N° de ATCC CRL-2221) seleccionadas 1 Rim 1 Coração 1 Fígado 1 Pituitária 1 Pulmão 1 Placenta 2 Gânglio linfático 1 Glândula salivar 1 Melanoma 1 HL60 (N° de ATCC CCL-240) 3 Pâncreas 1 Plaqueta 1 Pituitária 1 HBL-100 1 Placenta 1 Mesangial renal 1 Próstata 1 Linfócito T 1 Recto 1 Neutrófilo 1 Glândula salivar 1 MPC 1 Músculo esquelético 1 Hut-102 (N° de ATCC TIB-162) 1 Intestino delgado 1 Endotelial 1 Médula espinal 1 HepG2 (N° de ATCC HB-8065) 1 Baço 1 Fibroblasto 1 Estômago 1 E. Histo 1 Testículo 2 Timo 1 Tiróide 1 Traqueia 1 263 Útero 1 Tumor esofágico 1 Tumor gástrico 1 Tumor renal 1 Tumor hepático 1 Tumor de pulmão 1 Tumor de ovário 1 Tumor rectal 1 Tumor de útero 1 C. Análise de expressão de zcytorl7 por PCR e Northern A anotação dos tipos celulares e as condições de crescimento que afectam à expressão do receptor é um meio útil para esclarecer sua função e predizer uma fonte de ligando. Para esta finalidade, foram inspeccionadas uma ampla diversidade de tecidos e tipos celulares por PCR. Foi usada a Polimerase termoestável Advantage II™ (Clontech, La Jolla, CA) com os iniciadores oligonucleotidicos ZC29,180 SEQ ID NO: 22) e ZC29,179 SEQ ID NO: 82) e 1-10 ng dos diversos moldes de ADNc indicados a seguir para 30 ciclos de amplificação de (94 °C, 30 seg.; 66 °C, 20 seg.; 68 °C, 1 min. 30 seg.). Depois disto, foi realizada um 20% de cada reacção em géis de agarose a 0,8%, TAE/ brometo de etidio e foram visualizadas com luz UV. Depois, as amostras foram avaliadas com base na intensidade das bandas. Veja-se o Quadro 14 mostrada a seguir.

Quadro 14 Células e Condições Pontuação 0-5 Hei estimulada com PMA 0 U937 3 MCF-7 0 HuH7 1 Foliculo humano 0 HT-29 0 264 HEPG2 0 HepG2 estimulada com IL6 0 Endotélio dérmico humano 0 Endotélio venoso humano 0 CD4+ humana 0 BEWO 0 CD19+ humana 1 PBMC humana estimulada com PHA, PMA, Ionomicina, IL2, IL4, TNFa 24horas 0 PBMC humana estimulada com LPS, PWM. IFNy, TNFa, 24 horas 0 Todas as PBMC humanas das condições anteriores durante 48 horas 4 HUVEC p.2 4 RPN1788 0 TF1 0 Células T de baço de macaco estimulados com PMA, Ionomicina 0 Epitélio de próstata humana transformada com HPV 5 Amigdala humana inflamada 0 HACAT 0 Condrócito humano 1 Sinoviócito humano 1 THP1 5 REH 0

Dos fortes sinais de PCR positivas, dois procediam das linhas celulares de monócitos humanos U937 e THP1.

Estas duas linhas celulares juntamente com uma linha de epitélio de próstata foram seleccionadas para análise adicionais por Northern blot. Os intentos anteriores de visualizar um transcrito por análise de Northern usando ARNm de diversos tecidos produziram sinais fracos e difusos no intervalo de tamanho surpreendentemente grande de 7-10 kb, fazendo com que este dado seja difícil de interpretar. 265

Foi preparado um gel desnaturalizante de formaldeído/MOPS/agarose a 0,8% (RNA Methodologies, Farrell, RE Academic Press) e foram postos 2 μρ de polyA+ ARNm para cada amostra juntamente com uma escala de ARN (Life Technologies, Bethesda, MD) . O gel depois foi transferido a nylon Hybond (Amersham, Buckinghamshire, Reino Unido), foi submetido a entrecruzamento UV e foi hibridado em solução ExpressHyb (Clontech, La Jolla, CA) a 68 °C durante a noite usando uma sonda para zcytoR17 humano gerada por PCR com os oligos ZC28,575 SEQ ID NO: 77), e ZC27, 899 SEQ ID NO: 19) e foi marcada com o kit Megaprime 32P (Amersham). A mancha de Northern blot posteriormente foi lavada com SSC 4,2X + SDS a 0,1% a 65 °C durante 15 minutos e foi exposta à pelicula durante 7 dias com crivos de intensificação. Foi observado uma banda proeminente de 8 kb tanto no epitélio de próstata como nas pistas de U937 enquanto que estava presente uma banda mais débil no pista de THP1.

Para optimizar o ADNc usado como sonda de hibridação, foram amplificadas quatro regiões diferentes da sequência de zcytoR17 humano de comprimento completo por PCR, foram marcadas e hibridadas como foi descrito anteriormente com manchas de Southern blot que continham ADN da biblioteca de ADNc genómica e amplificada. As quatro sondas, denominadas no presente documento sondas A-D, foram amplificadas usando os seguintes pares de iniciadores: (A) ZC28,575 SEQ ID NO: 77), ZC2 7, 899 SEQ ID NO: 19); (B) ZC27, 895 SEQ ID NO: 20), ZC2 8,917 SEQ ID NO: 83); (C) ZC28,916 SEQ ID NO: 84), ZC28,918 SEQ ID NO: : 85); e (D) ZC28,916 SEQ ID NO: 84), ZC29, 122 SEQ ID NO: 21) . O ADN genómico humano juntamente com as bibliotecas de ADNc amplificadas demostraram conter zcytoR17 por PCR e foram digeridos com EcoRl e Xhol para libertar insertos e foram processados em géis de TAE/agarose a 0,8%, em duplicata, foras desnaturalizados com NaOH 0,5 M, NaCl 1,5 M, foram transferidos a Hybond, 266 foram submetidos a entrecruzamento UV e cada um hibridou com uma sonda distinta. Foi observado que a sonda B tinha a menor ligação não específica e o sinal mais forte. Desta maneira, a sonda B foi usada para todas as hibridações posteriores.

Dado que as células THP1 são um excelente modelo de monócitos circulantes e expressavam zcytoR17 a baixos níveis, foram tratadas com uma diversidade de compostos com a intenção de aumentar a expressão de zcytoR17. As células foram cultivadas a uma densidade de 2X105/ml, foram lavadas e foram ressuspensas em diversos meios de estimulação, foram cultivadas durante quatro ou trinta horas e foram colhidas para as preparações de ARN. Cada meio foi suplementado com um dos seguintes fármacos ou pares de citocinas: LPS 2 ug/ml (Sigma Chemicals, St. Louis, MO), hTNFa2 ng/ml (R&D Systems, Mineápolis, MN) , hGM-CSF 2 ng/ml (R&D Systems, Mineápolis, MN) , hlFNy 50 ng/ml (R&D Systems, Mineápolis, MN) , hMCSF 1 ng/ml (R&D Systems, Mineápolis, MN) , hIL6 1 ng/ml (R&D Systems, Mineápolis, MN) , ϊιϋ,ΐβ 2 ng/ml (R&D Systems, Mineápolis, MN) , hlFNy 50 ng/ml + hIL4 0,5 ng/ml (R&D Systems, Mineápolis, MN), hlFNy 50 ng/ml + hILlO 1 ng/ml (R&D Systems, Mineápolis, MN) , PMA 10 ng/ml (Calbiochem, San Diego, CA) e um controlo não tratado. Ao final do período de cultura foi preparado ARN total usando um kit RNAeasy Midi (Qiagen, Valência, CA). Foi seleccionado o ARN poli A+ a partir do ARN total usando um kit MPG (CPG, Lincoln Park, NJ). Dois ug de ARN poli A+ de cada condição foram processados em géis de formaldeído/MOPS/agarose, foram transferidos a nylon e foram submetidos a entrecruzamento UV como foi descrito anteriormente. Estas manchas de Northern blot depois foram hibridadas, como foi indicado anteriormente, com a sonda B a 68 °C durante a noite, foram lavados a alta restringência com SSC 0,2X, SDS a 0,1% a 65 °C, foram expostos a um filme durante a noite e depois foram expostos a crivos de fósforo 267 para a quantificação do sinal. Em todos as pistas foi observado um ARNm de 8 kb dominante assim como uma banda de 2,8 kb relativamente mais débil. Foi observado um aumento de 20 vezes no ARNm de zcytoRl7 no ARN das células tratadas com hlFNy durante 30 horas, e este efeito foi mutado ligeiramente com tratamento simultâneo com IL4. Foram observadas aumentos minoritários de 3 vezes no ARNm no ARN procedente de células tratadas com LPS, TNFa e GM-CSF, enquanto que o MCSF, IL6 e ΙΙ,ΐβ não tiveram nenhum efeito sobre os niveis de ARNm de zcytorl7. Estes dados tomados juntos sugerem um papel para o receptor zcytorl7 e seu ligando na biologia dos monócitos e macrófagos e, por extensão, em vários processos de doença nos que participam estas células.

Exemplo 32

Distribuição de tecido de zcytorl71ig humano em Painéis de Tecidos Usando Northern blot e PCR

Foi obtido um fragmento de ADNc de zcytorl71ig humano usando PCR com iniciadores específicos de genes: iniciador sense ZC41438 SEQ ID NO: 93) e iniciador antisense ZC41438 SEQ ID NO: 93) e ADNc de zcytorl71ig humano molde SEQ ID NO: 90). Este fragmento foi purificado usando métodos

convencionais e aproximadamente 25 ng foram marcadas com 32 P alfa dCTP usando o kit de marcação de iniciadores aleatório Prime-It RmT (Stratagene) e foram feitos hibridar em Ultrahyb, (Ambion) e foram usados para expor o filme Biomax/crivos de intensificação de acordo com as recomendações do fabricante em cada caso. Foram hibridadas manchas de transferência novas, não usadas previamente, incluindo MTN de pista 12 humano de Clontech, MTN II de cérebro humano, e a mancha de transferência IV de MTN de cérebro humano, MTN II de sistema imune humano, e a matriz II de MTE humana, de Clontech, durante a noite a 42 °C de acordo com o método Ambion ultrahyb. Foram eliminadas as quantidades radioactivas não específicas usando SSC 0,1/SDS 268 a 0,5% a 55 °C. As manchas de transferência positivas incluíam MTN de pista 12 humano (Clontech). Dos 12 tecidos examinados, somente a placenta foi positiva para um transcrito de aproximadamente 1,2 kb.

Exemplo 33

Construção de vectores de expressão de mamífero que expressam zcytorl71ig- CEE humano A. Construção de zCytorl7Lig-CEE/pZMP21

Construiu-se um plasmídeo de expressão que continha todo ou parte de um polinucleótido que codificava zcytor 17Lig-CEE SEQ ID NO: 95) por meio de recombinação homóloga. O plasmídeo foi denominado zCytorl7Lig- CEE/pZMP21. A construção de zCytor17Lig-CEE/pZMp21 foi realizada gerando um fragmento zCytor17Lig-CEE usando amplificação por PCR. O molde de ADN usado para a produção do fragmento zCytor17Lig-CEE foi zCytor17Lig/pZP7nx. Os iniciadores usados para a produção do fragmento zCytorl7Lig-CEE foram: (1) ZC4 1,607 SEQ ID NO: 97) (sequência sense) , que inclui desde a extremidade 5' à extremidade 3': 28 pb da sequência flanqueante do vector (5' do inserto) e 21 pb correspondentes à sequência 5' de zCytorl7Lig; e (2) ZC41,605 SEQ ID NO: 98) (sequência antisense), que inclui desde a extremidade 5' à extremidade 3': 37 pb da sequência flanqueante do vector (3' do inserto), 3 pb do codão de terminação, 21 pb que codificam um marcador EE C-terminal, e 21 pb que correspondem à extremidade 3' da sequência de zCytorl7Lig. O fragmento resultante da amplificação por PCR anterior é uma cópia do zCytorl7Lig molde com a adição de um marcador EE C-terminal, produzindo um produto final zCytorl7Lig-CEE.

As reacções de PCR foram realizadas como se indica a seguir: A um volume final de 100 μΐ foram adicionados: 10 μΐ de tampão de reacçao de Taq Polimerase 10X com MgCl 15 mM (Gibco), 1 μΐ de Taq ADN Polimerase (5 unidades/μΐ 269 (Gibco), 3 μΐ de dNTP 10 mM, 78 μΐ de dH20, 3 μΐ de uma solução de reserva de 20 pmol/μΐ de iniciador ZC41,607 SEQ ID NO: 97), 3 μΐ de uma solução de reserva de 20 pmol/μΐ de iniciador ZC41,605 SEQ ID NO: 98) e 2 μΐ de uma solução de reserva de 0,13 μρ/μΐ de ADN molde de zCytorl71ig. Foi adicionado um volume igual a 50 μΐ de óleo mineral à mistura. A reacção foi aguecida a 94 °C durante 5 minutos, seguido de 35 ciclos a 94 °C durante um minuto; 55 °C durante 2 minutos; 72 °C durante 3 minutos; seguido de uma extensão de 10 minutos a 72 °C e manutenção a 4 °C até que a reacção foi colhida.

O plasmideo pZMP21 foi submetido a digestão de restrição com enzima BglII, foi limpo com kit de purificação de PCR QiaQuick (Qiagen) usando um protocolo de microcentrifuga e foi usado para recombinação com o fragmento de PCR. O plasmideo pZMP21 foi construído a partir de pZMP20, que foi construído a partir de pZp9 (depositado na Colecção Americana de Culturas celulares, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, e é designado N° 98668) com os elementos genéticos de levadura de pRS316 (depositado na Colecção Americana de Culturas celulares, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, e é designado N° 77145), um elemento IRES de poliovírus e o domínio extracelular de CD8, truncado na extremidade carboxilo terminal do domínio transmembrana. PZMP21 é um vector de expressão de mamífero que contém uma cassete de expressão que tem o promotor de MPSV, intrão de péptido sinal de imunoglobulina, Múltiplos locais de restrição para a inserção de sequências codificantes, um codão de terminação e um terminador de hormona de crescimento humana. O plasmideo também tem uma origem de replicação de E. coli, uma unidade de expressão de marcador de selecção de mamífero que tem um promotor, potenciador e origem de replicação de SV40, um gene de DHFR, o terminador de SV40, assim como as sequências de URA3 e CEN-ARS 270 necessárias para a selecção e replicação em S. cerevisiae.

Foram combinados independentemente 50 μΐ de células de levedura competentes (S. cerevisiae) com 100 ng de plasmideo de corte, 5 μΐ de mistura de PCR descrita previamente, e foram transferidos a uma cuveta de electroporação de 0,2 cm. A mistura de levedura/ADN foi submetida a electropulsos a 0,75 kV (5 kV/cm) °° ohms, 25 μρ. A cada cuveta foram adicionados 600 μΐ de sorbitol 1,2 M e a levedura foi inoculada numa alíquota de 100 μΐ e uma aliquota de 300 μΐ sobre duas placas URA-D e foi incubada a 30 °C. Depois de aproximadamente 72 horas, os transf ormantes de levedura URA+ de uma só placa foram ressuspensos em 1 ml de H2O e foram centrif ugados brevemente para sedimentar as células de levedura. O sedimento celular foi ressuspenso em 500 μΐ de tampão de lise (Triton X-100 a 2%, SDS a 1%, NaCl 100 mM, Tris 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM) . Os 500 μΐ da mistura de lise foram adicionados a um tubo Eppendorf que continha 300 μΐ de pérolas de vidro de 600 μκι lavadas com ácido e 300 μΐ de fenol-clorofórmio, foram agitados com vórtice durante intervalos de 1 minuto duas ou três vezes, seguido de uma centrifugação de 5 minutos numa centrífuga de Eppendorf a velocidade máxima. Trezentos microlitros da fase aquosa foram transferidos a um tubo limpo e o ADN foi precipitado com 600 μΐ de etanol (EtOH) a 100% seguido de centrifugação durante 10 minutos a 4 °C. O sedimento de ADN depois foi lavado com 500 μΐ de EtOH a 70%, seguido de centrifugação durante 1 minuto a 4 °C. O sedimento de ADN foi ressuspenso em 30 μΐ de H20. A transformação de células E. coli electrocompetentes (MC1061) foi realizada com 5 μΐ da preparação de ADN de levedura e 50 μΐ de células MC1061. As células foram submetidas a electropulsos a 2,0 kV, 25 μΕ e 400 ohms (Ω) . Depois da electroporação, foram adicionados 600 μΐ de SOC (Bacto Tryptone a 2% (Difco, Detroit, MI), extracto de 271 levedura a 0,5% (Difco) , NaCl 10 mM, KC1 2,5 mM, MgCl2 10 mM, MgS04 10 mM, glucose 20 mM) . As células E. coli submetidas a electroporação foram cultivadas numa aliguota de 200 μΐ e 50 μΐ em duas placas de LB AMP (caldo LB (Lennox) , Bacto Agar a 1,8% (Difco), 100 mg/1 de Ampicilina) . As placas foram incubadas em posição vertical durante aproximadamente 24 horas a 37 °C. Foram seleccionadas três colónias resistentes a ampicilina aleatoriamente e foram enviadas para análise de sequência do inserto. Foi isolado ADN de plasmídeo a grande escala a partir de um clone com a sequência confirmada usando o kit Qiagen Maxi (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante. B. Construção de zCytorl7Lig(m)-CEE/pZMP21 de ratinho

Também foi construído um plasmídeo de expressão que continha o polinucleótido inteiro que codificava zCytorl7Lig-CEE murino SEQ ID NO: 104 e SEQ ID NO: 105) por meio de recombinação homologa usando o método descrito no Exemplo 33A anterior. Os iniciadores usados foram: (1) ZC41643 SEQ ID NO: 105) (directo, 5' a 3', sense) , que tinha um vector de 28 pb sobreposto na posição 5' do ponto de inserção; 21 pb da extremidade 5' de zcytorl71ig (m) e (2) ZC41641 SEQ ID NO: 107) (inverso, 5' a 3', antisense) que tinha um vector de 33 pb sobreposto na posição 3' do ponto de inserção; codão de terminação de 3 pb; 21 pb de marcador EE C-terminal; 24 pb da extremidade 3' de zCytorl7Lig(m)-CEE. O plasmídeo foi denominado zcytorl71ig(m)-CEE/pZMP21. A sequência de polinucleótido de zcytorl71ig(m)-CEE é mostrada na SEQ ID NO: 104 e a sequência polipeptídica correspondente é mostrado na SEQ ID NO: 105.

Exemplo 34

Transfecção e Expressão de Polipéptidos zcytor!7lig-CEE A. Expressão de zcytorl71ig-CEE/pZMP21 humano em células 293T 272

Foi expresso ZCytorl71ig-CEE de forma transitória em células 293T (Stanford University School of Medicine, Stanford, CA, ATCC (SD-3515)) para gerar a proteina purificada inicial. No dia anterior à transfecção, foram semeadas células 293T a 6,5 x 104 células/cm2 em 30 balões de cultura T162 com um volume total de 30 ml de meio de cultura (SL7V4 + FBS a 5% + Pen/Estrep ao 1%) por balão. As células foram deixadas incubar durante 24 horas a 37 °C.

Foi preparada uma mistura de ADN/Lipossomas como se segue: dois tubos cónicos de 50 ml foram cheios com 25 ml de meio de transfecção (SL7V4 + Pen/Estrep ao 1%) e foram adicionados 1,13 mg de zCytorl7Lig-CEE/pZMP21 (Exemplo 33) a cada um. Uma série separada de dois tubos cónicos de 50 ml foram cheios com 22 ml de meio de transfecção (anterior) e foram adicionados a cada um 3 ml de lipossomas (Lipofectamine, (Gibco)). Para cada série de tubos, foi adicionado um tubo de ADN a um tubo de lipossomas e a mistura de ADN/lipossomas foi incubada durante 30 minutos. Os dois tubos cónicos de 50 ml que continham as misturas de AND/lipossomas foram agrupados (aproximadamente 100 ml) e foram adicionados 300 ml de meio de transfecção.

Os 30 balões das células 293T foram decantados, foram lavados uma vez com aproximadamente 15 ml de PBS e foram adicionados 12,5 ml da mistura de ADN/lipossomas diluída a cada balão. Os balões foram incubados durante 3 horas a 37 °C. Depois do período de incubação, foram adicionados 25 ml de meio de cultura (anterior) a cada balão T162. O meio de transfecção foi colhido depois de aproximadamente 96 horas e foi usado para a purificação de proteínas (Exemplo 35).

B. Expressão de zcytor!71ig-CEE(m)/pZMP21 de ratinho em células 293T

Acytorl71ig(m)-CEE de ratinho foi expresso de forma transitória em células 293T como é descrito no Exemplo 34A e foi usado meio de cultura para a purificação de proteínas (Exemplo 35). 273

Exemplo 35

Purificação de Zcytorl7lig-CEE a partir de células 293T A menos que se indique outra cosa, todas as operações foram realizadas a 4 °C. Foi usado o seguinte método para purificar Zcytorl71ig humano e de ratinho que continha marcadores Glu-Glu (EE) C-terminais SEQ ID NO: 103). Foi purificado meio condicionado a partir de células 293T que expressavam Zcytorl71ig-CEE (Exemplo 34). As concentrações totais de proteína alvo do meio condicionado foram determinadas por meio de SDS-PAGE e análise de Western blotting com o anticorpo anti-EE.

Uma coluna de 5,5 ml de anti-EE Poros 50 A (PE Biosystems), (Framingham, MA) (preparada como é descrito a seguir) foi deitada numa coluna de vidro Waters AP-1, 1 cm x 7 cm (Waters, Milford MA) . A coluna foi preenchida e equilibrada num BioCad Sprint (PE BioSystems, Framingham, MA) com solução salina tamponada com fosfato (PBS) pH 7,4. O meio condicionado foi ajustado com NaCl a 0,3 Me o pH foi ajustado a 7,2. O meio condicionado depois foi carregado na coluna durante a noite com uma taxa de fluxo de aproximadamente 3 ml/minuto. A coluna foi lavada com 10 volumes de coluna (VC) de PBS pH 7,4 e de novo foi lavada com 3 VC de Sigma PBS 5X pH 7,4. Foi eluída por etapas com acetato 0,5 M, NaCl 0,5 M, pH 2,5 a 3 ml/minuto. Os tubos das fracções continham 1 ml de base Tris (sem ajuste de pH) para neutralizar a eluição imediatamente. A coluna foi lavada de novo com 2 VC com Sigma PBS 5X, pH 7,4, para neutralizar a coluna e depois foi equilibrada em PBS (pH 7,4) . Foram colhidas fracções de 2 ml durante a cromatografia de eluição completa e foi verificada a absorvância a 280 e 215 nm; também foram guardadas a reserva de eluições e a reserva de lavagem e foram analisadas. O PBS 5X e as fracções pico de eluição ácida foram analisados com respeito à proteína alvo por coloração com prata de SDS-PAGE e Western blotting com o anticorpo 274 primário anti-EE e o anticorpo secundário anti-ratinho conjugado com HRP. As fracções de eluição ácida de interesse foram agrupadas e foram concentradas de 38 ml a 0,8 ml usando um concentrador de centrifugação de membrana com um limite de peso molecular de 5.000 Dalton (Millipore, Bedford, MA) de acordo com as instruções do fabricante.

Para separar Zcytort71ig-CEE do material agregado e qualquer outra proteína de co-purificação contaminante, as fracções concentradas agrupadas foram submetidas a cromatografia de exclusão molecular numa coluna Superdex 75 (120 ml) (Pharmacia, Piscataway, NJ) de 1,6 x 60 cm equilibrada e carregada em PBS a uma taxa de fluxo de 1,0 ml/min usando um BioCad Sprint. Foram colhidas fracções de 3 ml ao longo de toda a cromatograf ia e foi verificada a absorvância a 280 e 215 nm. As fracções pico foram caracterizadas por coloração com prata de SDS-PAGE e somente foram agrupadas as fracções mais puras. Este material representava a proteína Zcytort71ig-CEE purificada.

Nos géis de SDS-PAGE submetidos a Western blotting, coloração com azul de Coomassie e coloração com prata, o Zcytort71ig-CEE era uma banda principal. A concentração de proteínas do material purificado foi realizada por análise BCA ( (Pierce, Rockford, IL) e a proteína foi dividida em alíquotas e foi armazenada a -80 °C de acordo com métodos convencionais.

Para preparar anti-EE Poros A50, foi lavado um volume de leito de 65 ml de Poros A50 (PE Biosystems) com 100 ml de água e depois trietanolamína 0,1 M, pH 8,2 (TEA, ICN, Aurora, Ohio), Na2S04 1 M, pH 8,8 que continha azida sódica ao 0,02% usando uma unidade de filtro de balão a vácuo. A solução de anticorpo monoclonal EE, a uma concentração de 2 mg/ml num volume de 300 ml, foi misturada com a resina lavada num volume de 250 ml. Depois de uma incubação durante a noite a temperatura ambiente, foi retirado o 275 anticorpo não unido lavando a resina com 5 volumes de TEA 200 mM, Na2S04 1M, pH 8,8 que continha azida sódica a 0,02% como foi descrito anteriormente. A resina foi ressuspenso em 2 volumes de TEA, Na2S04 1 M, pH 8,8 que continha azida sódica ao 0,02% e foi transferido a um recipiente adequado. Foram adicionados 3 ml de Didisuccinimidil suberato a 25 mg/ml (68 mM) (em DMSO fornecido por Pierce, Rockford, IL) e a solução foi incubada durante 3 horas a temperatura ambiente. Depois, os locais não específicos na resina foram bloqueados por incubação durante 10 min a temperatura ambiente com 5 volumes de etanolamina 20 mM (Sigma, St. Louis, MO) em TEA 200 mM , pH 8,8 usando a unidade de filtro de balão a vácuo. A resina é lavada com PBS, pH 7,4, seguido de glicina 0,1 M, pH 3 e depois foi neutralizada com PBS 10X. Depois de lavar com água destilada, a resina anti-EE Poros-A 50 acoplada a final foi armazenada a 4 °C em Etanol a 20%.

Exemplo 36

Sequenciamento N-terminal de Zcytorl71ig humano e de ratinho A. Sequenciamento N-terminal de Zcytorl71ig humano

Foi realizada um sequenciamento automático convencional do polipéptido N-terminal (degradação de Edman) usando reactivos de Applied Biosystems. A análise da sequência N-terminal foi realizada num sistema Sequenciador de Proteínas Modelo 494 (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). A análise dos dados foi realizada com o Sistema de Análise de Dados Modelo 610A para Sequenciamento de Proteínas, versão 2.1a (Applied Biosystems).

Foi fornecida uma amostra de Zcytort71ig-CEE purificada (Exemplo 35). A amostra foi carregada num filtro de fibra de vidro preparado para a sequenciamento N-terminal. O filtro de fibra de vidro foi preparado por pré-ciclagem com Biobrene™. A análise da sequência N-terminal do polipéptido 276

Zcytort71ig humano segregado não verificava o local de clivagem previsto da sequência sinal, mas resultou num inicio maduro no resíduo 27 (Leu) na SEQ ID NO: 2 da sequência precursora de zcytorl71ig humano. B. Sequenciamento N-terminal de Zcytorl71ig humano

Foi realizada o sequenciamento do polipéptido N-terminal automático convencional (degradação de Edman) usando reactivos de Applied Biosystems. A análise da sequência N-terminal foi realizada num Sistema Sequenciador de Proteínas Modelo 494 (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). A análise dos dados foi realizada com o Sistema de Análise de Dados Modelo 610A para Sequenciamento de Proteínas, 2.1a (Applied Biosystems).

Foi fornecida uma amostra de zcytorl71ig-CEE de ratinho purificada conforme foi capturada em pérolas de Proteína G Sepharose/anti-EE (Exemplo 35). As pérolas foram postas em tampão de amostra de SDS PAGE redutor e num banho de água em ebulição antes de se processado em SDS PAGE, usando um sistema SDS PAGE de Novex (Bis-Tris MES NuPAGE 4-12%; Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. 0 gel foi electrotransferido a uma membrana Novex PVDF (Invitrogen), e foi corado com azul de Coomassie (Sigma, St. Louis, MO) usando métodos convencionais. Foram realizadas transferências de Western anti-EE correspondentes para identificar a banda de Zcytorl71ig para o sequenciamento da proteína N-Terminal. 0 anticorpo de ratinho anti-IgG EE conjugado com HRP usado foi produzido internamente. A análise da sequência N-terminal do polipéptido zcytorl71ig de ratinho segregado verificou o local de clivagem previsto da sequência sinal, dando como resultado um início maduro a 31 (Ala) em referência a as SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 91 da sequência precursora de zcytorl71ig de ratinho.

Exemplo 37 277

Ensaio de ligação a células Cos

Foi usado um ensaio de ligação para ensaiar a ligação de zcytorl71ig a receptores que compreendem o receptor zcytorl7, tais como o receptor zcytorl7 ou heterodímeros e trimeros do receptor que compreendem receptor zcytorl7 (por exemplo, zcytorl7/0SMR, zcytorl7/WSX-l, ou zcytorl7/0SMR/WSX-l, ou outras subunidades receptoras de citocinas de Classe I). Foi introduzido por transfecção ADN de plasmídeo do receptor zcytorl7 em células COS e as células COS transfectadas foram usados para avaliar a união de zcytorl71ig a receptores que compreendem o receptor zcytorl7 como é descrito a seguir.

A. Transfecções de células COS A transfecção de células COS foi realizada como se segue: misturar 800 ng de ADN de plasmídeo de receptor nas seguintes combinações: pZp7pX/zcytorl7 só; pZp7Z/WSX-l só; pZp7NX/OSMR só; pZp7pX/zcytorl7 + pZp7NX/OSMR; pZp7pX/zcytorl7 + pZp7Z/WSX-l; pZp7NX/OSMR + pZp7Z/WSX-l; pZp7pX/zcytor17 + pZp7NX/OSMR + pZp7Z/WSX-l) e 4 ul de

Lipofectamine™ em 80 μΐ de meio DMEM sem soro (55 mg de piruvato de sódio, 146 mg de L-glutamina, 5 mg de Transferrina, 2,5 mg insulina, 1 μg de selénio e 5 mg de fetuina em 500 ml DMEM), incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos e depois adicionar 320 μΐ de meio DMEM sem soro. Adicionar estes 400 μΐ de mistura sobre 2 x 105 células COS/poço cultivadas em placas de cultura de tecidos de 12 poços (revestidas com fibronectina) e incubar durante 5 horas a 37 °C. Adicionar 500 ul de meio FBS DMEM a 20% (100 ml de FBS, 55 mg de piruvato de sódio e 146 mg de L-glutamina em 500 ml de DMEM) e incubar durante a noite. B. Ensaio de ligação O ensaio de ligação foi realizado como se segue: foi retirado o meio das células com PBS + BSA a 0,1% e depois as células foram bloqueadas durante 60 minutos com a mesma solução. As células depois foram incubadas durante 1 hora 278 em PBS + BSA a 0,1% com proteína purificada zcytorl71igCEE a 1,0 μρ/ιηΐ. As células depois foram lavadas com PBS + BSA a 0,1% e foram incubadas durante outra hora com anticorpo de ratinho anti-GluGlu diluído 1:1000. De novo, as células foram lavadas com PBS + BSA a 0,1%, depois foram incubadas durante 1 hora com anticorpo de cabra anti-ratinho conjugado com HRP diluído 1:200. A ligação positiva foi detectada com reagente de fluoresceína tiramida diluído 1:50 em tampão de diluição (kit NEN) e foi incubada durante 4-6 minutos, e foi lavada com PBS + BSA a 0,1%. As células foram fixas durante 15 minutos com formaldeído ao 1,8% em PBS, e depois foram lavadas com PBS + BSA a 0,1%. As células foram conservadas com meio de montagem Vectashield (Vector Labs Burlingame, CA) diluído 1:5 em PBS. As células foram visualizadas usando um filtro FTTC num microscópio fluorescente.

Foi detectada a ligação positiva para as células transfectadas com zcytorl7 só, zcytorl7 + OSMRbeta, zcytorl7 + WSX-1, e zcytorl7 + OSMRbeta + WSX-1. Não se detectou ligação para as células transfectadas com WSX-1 + OSMRbeta, com OSMRbeta só, ou com WSX-1 só.

Exemplo 38

Zcytorl71ig de ratinho activa a receptor zcytorl7/OSMRbeta de ratinho no ensaio de luciferase A. Clonagem de zcytor!7 de ratinho de comprimento completo e OSMRbeta de ratinho para a expressão

Rastreou-se uma biblioteca de ADNc de testículo de ratinho com respeito a um clone de comprimento completo de zcytoR17 de ratinho. A biblioteca foi inoculada em placa a 65.500 ufc/placa em 24 placas de LB + Amp. Prepararam-se elevações de filtro utilizando Hybond N (Amersham-Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ) sobre um total de aproximadamente 1,6 milhões de colónias. Os filtros foram marcados com uma agulha quente para a orientação e depois desnaturalizados durante 6 minutos em NaOH 0,5 M e Tris-HCl 279 1,5 Μ, ρΗ 7,2. Os filtros depois foram neutralizados em NaCl 1,5 M e Tris-HCl 0,5 M, pH 7,2 durante 6 minutos. O ADN foi fixo aos filtros utilizando um agente de entrecruzamento UV (Stratalinker®, Stratagene, La Jolla, CA) a 1200 joules. Os filtros depois foram deixados secar durante a noite a temperatura ambiente.

Ao dia seguinte, os filtros foram pré-lavados a 65 °C em tampão de pré-lavagem que consistia em SSC 0,25X, SDS a 0,25% e EDTA 1 mM. Os detritos celulares foram retirados manualmente utilizando Kimwipes® (Kimberly-Clark) e a solução foi mudada 3 vezes durante um período de 1 hora. Os filtros foram secos ao ar e armazenados a temperatura ambiente até serem necessários. Os filtros depois foram pré-hibridados durante aproximadamente 3 horas a 63 °C em 20 ml de solução de hibridação ExpressHyb™ (Clontech, Paio Alto, CA). A sonda B (Exemplo 31) foi gerada por PCR a partir de molde de zcytoR17 humano utilizando iniciadores oligonucleotídicos ZC27,895 (SEQ ID NO: 20) e ZC28,917 (SEQ ID NO: 83) e marcada radiactivamente com 32P utilizando um kit disponível comercialmente (Megaprime DNA Labeling System; Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) de acordo com as instruções do fabricante. A sonda foi purificada utilizando uma coluna de pressão Stratagene™ (coluna NucTrap®; Stratagene, La Jolla, CA) . A sonda foi desnaturada a 100 °C durante 15 min e adicionada a ExpressHyb™. Os filtros foram hibridados em 15 ml de solução de hibridação que continha 1,6 x 106 cpm/ml de sonda a 63 °C durante a noite. Os filtros foram lavados a 55 °C em SSC 2X, SDS a 0,1% e EDTA 1 mM e expostos a uma película de raios X a -80 °C durante 4 dias e meio. Colheram-se 13 positivos das placas como blocos e colocaram-se em 1 ml de LB + amp em tubos de 1,7 ml. Os tubos foram colocados a 4 °C durante a noite. Estes 13 positivos foram submetidos a duas rondas mais de 280 purificação. As placas terciárias foram cultivadas a 37 °C, depois realizaram-se elevações de filtro e colheram-se colónias individuais e enviaram-se ao sequenciamento. Determinou-se que três destas continham a sequência do ortólogo de ratinho de zcytoR17.

Além disso, gerou-se um produto de PCR utilizando ADNc de CTLL-2 como molde e oligonucleótidos ZC38,239 (SEQ ID NO: 123) e ZC38,245 (SEQ ID NO: 124) como iniciadores. CTLL-2 é uma linha celular de linfócitos T citotóxicos de ratinho (N° de ATCC TTB-214). Esta reacção de PCR realizou-se como é indicado a seguir: um ciclo a 95 °C durante 1 minuto, 30 ciclos a 95 °C durante 15 segundos, 68 °C durante 3 minutos, e depois 68 °C durante 10 minutos; imersão a 4 °C. A reacção de PCR utilizou aproximadamente 0,5 ng de ADNc, 20 pmol de cada oligonucleót ido e 1 μΐ de mistura de polimerase Advantage II (ClonTech) . Aproximadamente 6% do produto de PCR foram utilizados como molde numa nova reacção de PCR, como foi indicado anteriormente, com a excepção de que se utilizaram os oligonucleótidos ZC38,239 (SEQ ID NO: 123) e ZC38,238 (SEQ ID NO: 125). Esta reacção de PCR realizou-se como é indicado a seguir: 30 ciclos a 94 °C durante 45 segundos, 65 °C durante 45 segundos, 72 °C durante 1 minuto, e depois 72 °C durante 7 minutos; imersão a 10 °C. A maior parte da reacção de PCR foi carregada num gel de agarose a 1,0% e excisou-se a banda predominante a aproximadamente 360 pb, eluiu-se o fragmento de ADN e realizou-se o sequenciamento de ADN. A sequência do polinucleótido zcytorl7 de ratinho é mostrada na SEQ ID NO: 126 e a sequência de aminoácidos correspondente é mostrada na SEQ ID NO: 127. Além disso, é mostrada uma forma solúvel truncada do polinucleótido zcytorl7 de ratinho na SEQ ID NO: 128 e a sequência de aminoácidos correspondente é mostrada na SEQ ID NO: 129.

Para obter um ADNc de OSMRbeta de ratinho de 281 comprimento completo, isolaram-se produtos de PCR 5' e 3' e ligaram-se utilizando um local BamHI interno. Os iniciadores de PCR foram projectados utilizando a sequência de nucleótidos da SEQ ID NO: 134 e incluem locais de restrição EcoRI e Xbal para a clonagem. A sequência de ácido nucleico de OSMRbeta de ratinho genómica é mostrada na SEQ ID NO: 134, na qual a sequência codificante inclui os resíduos 780 a 3692 que codificam um polipéptido de 970 aminoácidos OSMRbeta de ratinho, que é mostrado na SEQ ID NO: 135. Na SEQ ID NO: 135 é mostrada uma sequência de ácido nucleico degenerada que codifica o polipéptido da SEQ ID NO: 136.

Gerou-se um produto de PCR 5' utilizando uma biblioteca de ADNc de 3T3-L1 (adipócito de ratinho diferenciado) interna como molde e os oligonucleótidos ZC41,764 (SEQ ID NO: 130) e ZC41,598 (SEQ ID NO: 131) como iniciadores. Esta reacção de PCR 5' realizou-se como é indicado a seguir: 30 ciclos a 95 °C durante 45 segundos, 55 °C durante 45 segundos, 72 °C durante 1 minuto e 30 segundos, e depois 72 °C durante 7 minutos; imersão a 4 °C. A reacção de PCR utilizou aproximadamente 3 μρ de plasmídeo preparado a partir da biblioteca de ADNc, 20 pmol de cada oligonucleótido e cinco unidades de ADN polimerase de Pwo (Roche) . Aproximadamente 90% do produto de PCR 5' foram dirigidos com EcoRI e BamHI e purificados num gel de agarose a 1,0%. A banda de aproximadamente 1446 pb foi excisada e utilizada para o ligamento (veja-se a seguir).

Gerou-se um produto de PCR 3' utilizando uma biblioteca de ADNc interna de placenta de ratinho como molde e os oligonucleótidos ZC41, 948 (SEQ ID NO: 132) e ZC41,766 (SEQ ID NO: 133) como iniciadores. Esta reacção de PCR 3' realizou-se como é indicado a seguir: 30 ciclos a 95 °C durante 45 segundos, 55 °C durante 45 segundos, 72 °C durante 1 minuto e 30 segundos, e depois 72 °C durante 7 minutos; imersão a 4 °C. A reacção de PCR utilizou 282 aproximadamente 3 μρ de plasmídeo preparado a partir da biblioteca de ADNc, 20 pmol de cada oligonucleótido e cinco unidades de ADN polimerase de Pwo (Roche). Aproximadamente 90% do produto de PCR 3' foram dirigidos com BamHI e Xbal e purificados num gel de agarose a 1,0%. A banda de aproximadamente 2200 pb foi excisada e utilizada para o ligamento junto com o produto de PCR 5' (descrito anteriormente) ao vector de expressão pZP-5Z digerido com EcoRI e Xbal. O ligamento de três partes realizou-se com o fragmento EcoRI a BamHI 5' anterior, o fragmento BamHI a Xbal 3' e o vector de expressão pZP-5Z digerido com EcoRI e Xbal. Isto gerou um plasmídeo pZP-5Z que continha um ADNc de comprimento completo para OSMRbeta de ratinho (nucleótidos 780 a 3692 da SEQ ID NO: 134), denominado pZP-5Z/OSMRbeta. O ADNc de OSMRbeta de ratinho de comprimento completo em pZP5Z/OSMRbeta tem duas inserções de aminoácidos da SEQ ID NO: 135. Há uma duplicação do aminoácido glicina na posição 370 e uma duplicação do aminoácido ácido Glutámico na posição 526. O plasmídeo pZP-5Z é um vector de expressão de mamífero que contém uma cassete de expressão que tem o promotor de CMV, múltiplos locais de restrição para a inserção de sequências codificantes e um terminador de hormona de crescimento humana. O plasmídeo também tem uma origem de replicação de E. coli, uma unidade de expressão de marcador de selecção de mamífero que tem um promotor, potenciador e origem de replicação de SV40, um gene de resistência a zeocina e o terminador de SV40.

Os transformantes resultantes foram sequenciados para confirmar a sequência de ADNc de OSMRbeta de ratinho. B. Construção das linhas celulares BaF3/KZl34/zcytorl7m, BaF3/KZl34/zcytorl7m/OSMRhetam, BHK/KZ134/zcytorl7m e BHK/KZ134/zcytorl7m/OSMRbetam

Transfectaram-se linhas celulares BaF3/KZ134 e BHK/KZ134 estáveis (Exemplo 20) com um plasmídeo de 283 expressão que codificava zcytorl7 de ratinho de comprimento completo, pZP-7P/zcytorl7m (Exemplo 38A), para criar células BaF3/KZ134/zcytorl7m e BHK/KZ134/zcytorl7m, respectivamente. 0 plasmideo de expressão de OSMRbeta de ratinho, pZP-5Z/0SMRbetam (Exemplo 38A), depois foi introduzido por transfecção nestas células para criar linhas celulares BaF3/KZ134/zcytorl7m/OSMRbetam e BHK/KZ134/zcytorl7m/OSMRbetam, respectivamente. Os métodos foram como foi descrito no Exemplo 4 com a excepção de que Baf3/KZ134/zcytorl7m e BHK/KZ134/zcytorl7m foram seleccionados com, além de Geneticina, 2 ug/ml de puromicina enquanto que Baf3/KZ134/zcytorl7m/OSMRbetam e BHK/KZ134/zcytorl7m/OSMRbetam foram seleccionados com, além de Geneticina, 2 ug/ml de puromicina e 200 ug/ml de zeocina.

Os clones foram diluídos, cultivados e seleccionados utilizando técnicas convencionais. Os clones foram rastreados por ensaio de luciferase (veja-se o Exemplo 20, anterior) utilizando o meio acondicionado de zcytorl71ig de ratinho ou proteína zcytorl71ig de ratinho purificada (Exemplo 35) como indutor. Seleccionaram-se clones com a máxima resposta de luciferase (por meio de luciferase STAT) e o menor nível de fundo. Seleccionaram-se linhas celulares transfectantes adequadas. C. Zcytorl71ig de ratinho activa o receptor zcytor!7 de ratinho no ensaio de luciferase de BaF3/KZl34/zcytorl7m/OSMRbetam ou BHK/KZ134/zcytorl7m/OSMRbetam

Inocularam-se em placas as linhas celulares para ensaios de luciferase como é descrito no Exemplo 20 anterior. A activação STAT das células BaF3/KZ134/Zcytor17m, BaF3/KZ13/zcytor17m/OSMRbetam, BHK/KZ134/zcytorl7m, ou BHK/KZ134/zcytorl7m/OSMRbetam foi avaliada utilizando (1) meio acondicionado de células BHK570 transfectadas com zcytorl71ig humano (Exemplo 7), 284 (2) meio acondicionado de células BHK570 transfectadas com o zcytorl71ig de ratinho (Exemplo 18), (3) zcytorl71ig de ratinho e humano purificado (Exemplo 35), e (4) meio sem mIL-3 para medir a resposta do controlo com meio somente. Os ensaios de luciferase realizaram-se como foi descrito no Exemplo 20.

Os resultados deste ensaio confirmam a resposta do indicador STAT das células BaF3/KZ134/zcytor17m/OSMRbetam e BHK/KZ134/zcytorl7m/OSMRbetam ao zcytorl71ig de ratinho em comparação com as células BaF3/KZ134/zcytorl7m, as células BHK/KZ134/zcytorl7m ou as células de controlo BHK/KZ134 ou BaF3/KZ134 não transfectadas, e mostram que a resposta está mediada pelos receptores zcytor17/OSMRbeta de ratinho. Os resultados também mostram que o zcytorl71ig humano não activa o ensaio de indicador STAT por meio do complexo do receptor de ratinho.

Exemplo 39

Ligação a ligando de zcytorl7 humano a zcytorl7 e zcytorl7/OSMRbeta por citometria de fluxo A biotinilação de zcytorl7L humano realizou-se como é indicado a seguir: foram combinados 100 μΐ de zcytorl7 a 5,26 mg/ml com 30 μΐ de EZ-link Sulfo-NHS-LC-biotina a 10 mg/ml (Pierce, Rockford, IL) dissolvido em ddH20. Esta solução foi incubada num agitador durante 30 minutos a temperatura ambiente. Depois da biotinilação, a solução foi dializada em PBS utilizando uma cassete de diálise Slide-A-Lyzer.

Para testar as propriedades de ligação do ligando de zcytorl7 humano a diferentes combinações de receptores, transfectaram-se células BHK e BAF3 com plasmídeos de expressão utilizando técnicas convencionais bem conhecidas neste campo. Estes plasmídeos foram introduzidos por transfecção nas duas linhas celulares nas seguintes combinações: zcytorl7 somente, OSMRbeta somente e tanto zcytorl7 como OSMRbeta. A transfecção realizou-se como foi 285 detalhado anteriormente. Como controlos foram utilizadas células BHK e BAF3 não transfectadas. As células foram coradas por FACS como é indicado a seguir: as células 2E5 foram coradas com: 2,0 μρ/ιηΐ, 100 ng/ml, 10 ng/ml, 1,0 ng/ml, 100 pg/ml, 10 pg/ml ou 1,0 pg/ml de zcytorl7L biotinilado ou foram deixadas sem corar durante 30 minutos em gelo em tampão FACS (PBS + BSA a 2% + NHS a 2% (Gemini) + NGS a 2%) . As células foram lavadas 1,5 vezes e depois foram coradas com SA-PE (Jackson Immuno Laboratories) a 1:250 durante 30 minutos em gelo. Depois, as células foram lavadas 1,5 vezes com tampão FACS e ressuspensas em tampão FACS e analisadas por FACS num BD FACSCaliber utilizando o software CellQuest (Becton Dickinson, Mountain View, CA).

Tanto as células BHK como as células BAF3 mostraram que zcytorl71ig se ligava a zcytorl7 em separado e em combinação com OSMRbeta, sendo a ligação ao heterodímero zcytorl7/0SMRbeta ligeiramente mais forte. Não foi observada a ligação em linhas celulares que expressavam OSMRbeta somente. O ligando de zcytorl7 ligou-se de uma maneira dependente da concentração. Os valores de intensidade fluorescente média (MFI) para a ligação a BHK são mostrados a seguir no Quadro 15.

Quadro 15 zcytorl7 μς/πιΐ 2, 0 0, 100 0, 010 0,001 0,0001 0, 00001 0,000001 o o BHK 3780 2126 328 53 17 15 14 13 C17+OSMRbeta BHK-C17 3032 1600 244 39 16 15 14 15 BHK-OSMRbeta 13 X X X X X X 0 BHK-WT 15 14 13 X X X X 13 zcytorl7 μg/ml 10,0 3,33 1, 11 0,37 0, 12 0, 04 0,00 BAF3 C17+OSMRbeta 531 508 489 441 364 247 7 BAF3-C17 6 5 5 5 5 5 11 BAF3-WT 13 13 12 12 12 12 13 286 zcytorl7 ng/ml 100,0 10,0 1,0 0, 0 BAF3-C17 347 72 17 7

Exemplο 40

Análise de Matriz de Expressão Génica de Células Tratadas com Zcytorl71ig Humano

Isolou-se ARN a partir de células A549 tratadas com zcytorl71ig humano, células SK-LU-1 tratadas com zcytorl71ig e células de controlo não tratadas utilizando um kit RNeasy Midi (Qiagen, Valência, CA) de acordo com as instruções do fabricante. 0 perfil de expressão génica das células tratadas com zcytorl71ig e das células de controlo respectivas realizou-se utilizando matrizes de expressão de ADNc da série GEArray Q (SuperArray Inc., Bethesda, MD). As matrizes de expressão de ADNc da série Q contêm até 96 fragmentos de ADNc associados a uma via biológica especifica, ou genes com funções ou características estruturais similares. A comparação de matrizes de células tratadas e de controlo permite a determinação da regulação positiva e negativa de genes específicos. A marcação de sondas, a hibridação e a detecção realizaram-se de acordo com as instruções do fabricante. A detecção do sinal quimioluminescente e a adquisição de dados foram realizadas numa estação de trabalho Lumi-Imager (Roche, Indianápolis, IN). Os dados de imagens resultantes foram analisadas utilizando ImageQuant 5.2 (Amersham Biosciences, inc., Piscataway, NJ) e o software GEArray Analyzer 1,2 (SuperArray Inc., Bethesda, MD) . 0 análise dos resultados das matrizes HS-014N série Q de Receptor e Interleucina humana, mostrou, depois da normalização, um aumento de aproximadamente 4, 7 vezes no sinal de IL13RA2 nas células SK-LU-1 humanas tratadas com 287 zcytorl71ig e um aumento de aproximadamente 2,2 vezes do sinal de IL13RA2 nas células A549 humanas tratadas com zcytorl71ig.

Estes resultados indicam que zcytorl71ig regulava positivamente de uma forma significativa IL13RA2 nas células SK-LU-1 e A549. Estas duas linhas são linhas celulares estabelecidas derivadas de carcinomas de pulmão humano (Blobel et al., Virchows Arch B Cell Pathol Incl Mol Pathol., 1984; 45(4): 407-29). Mais especificamente, A549 caracteriza-se como uma linha celular de epitélio pulmonar humano (Lin, et al., J Pharm Pharmacol., Setembro de 2002; 54 (9): 1271-8; Martínez et al., Toxicol Sei., 2002 Out; 69 (2) : 409-23) .

Demonstrou-se que a interleucina-13 (IL-13), uma citocina secretada por linfócitos T activados, é necessária e suficiente para a expressão da asma alérgica e para utilização em modelos experimentais de asma, que incluem hiperresposta das vias respiratórias, recrutamento de eosinófilos e superprodução de muco (Wills-Karp et al., Science, 1998; 282: 2258-2261). mostrou-se que a neutralização selectiva da IL13 melhorará o fenótipo da asma (Grunig et al., Science, 1998; 282: 22bl-2263). Também foi notificado que a IL13 está implicada na regulação positiva da expressão do gene de mucina MUC8 em epitélio de pólipo nasal humano e epitélio nasal cultivado (Kimm et al. , Acta Otolaryngol., 2002; Set; 122 (6): 638-643; Seong et al., Acta Otolaryngol., 2002; Jun; 122(4): 401-407). MUC8, uma glicoproteina de mucina das vias respiratórias importante, está implicada na patogénese da hipersecreção de muco na sinusite crónica com pólipos (Seong et al., Acta Otolaryngol., 2002; Jun; 122(4): 401-407).

Funcionalmente, IL13 sinaliza através de um complexo de receptor que consiste na cadeia alfa-1 do receptor de interleucina-13 (IL13RA1) e o receptor alfa de IL-4 (IL4RA) (Daines e Hershey, J Biol Chem., 2002; 22(12): 10387- 10393). Também foi mostrado que o receptor alfa-2 de interleucina-13 (IL13RA2) se liga a IL13 com alta afinidade, mas por si mesmo (Daines e Hershey, J Biol Chem., 2 0 02; 22(12): 10387- 10393) . No entanto, este receptor nao possui o domínio citoplasmático necessário para a sinalização e, portanto, é considerado um receptor engodo. Mostrou-se que IL13RA2 é predominantemente uma molécula intracelular que pode ser mobilizada rapidamente desde depósitos intracelulares e ser expressa na superfície depois do tratamento celular com interferão (IFN)-gama. A expressão na superfície de IL13RA2 depois do tratamento com IFN-gama não implica a síntese de proteínas e tem como resultado uma sinalização de IL13 diminuída (Daines e Hershey, J Biol Chem., 2002; 22(12): 10387-10393).

Os resultados do análise da matriz de expressão génica para zcytorl71ig indicam que a acção zcytorl71ig é nova com respeito à do IFN-gama, uma vez que o tratamento com zcytorl71ig de linhas celulares derivadas de epitélio pulmonar teve como resultado um aumento significativo da expressão do gene de IL13RA2. Prevê-se portanto que o tratamento com zcytorl71ig poderia ser benéfico em casos nos quais se deseja a regulação positiva a longo prazo da expressão de IL13RA2 e a regulação negativa de IL13, tais como em casos de asma, hiperact ividade das vias respiratórias (HVR) e regulação de mucina, incluindo sinusite crónica com pólipos.

Exemplo 41

Ratinho Transgénico para zcytorl71ig Murino

Para avaliar os efeitos in vivo da sobre-expressão de zcytorl71ig, geraram-se múltiplos criadores de ratinhos transgénicos que expressavam a forma murina do gene, dirigido por dois promotores diferentes: o promotor específico de linfócitos Εμ/lck, e o promotor ubíquo EFla (Exemplo 22). Os níveis séricos de proteína variam de aproximadamente 200 a 300 ng/ml. O promotor Εμ/lck gerou 289 ratinhos com maiores níveis de proteína em soro que aqueles observados nos ratinhos transgénicos com EFla-zcytorl71ig.

Os ratinhos transgénicos com zcytorl71ig desenvolveram um fenótipo de pele aproximadamente às 4-8 semanas de idade. 0 pelo dos ratinhos transgénicos "eriçava-se", mostrando uma piloerecção evidente e uma perda de pelo de leve a severa, normalmente nas suas costas, os lados do torso, e ao redor dos seus olhos. Este fenótipo encontrou-se sistematicamente em ratinhos com níveis detectáveis de proteína zcytorl71ig no seu soro. Entre os criadores, foi observado uma taxa de incidência de 100% entre os ratinhos que expressavam o gene dirigido por Εμ/lck e uma incidência de 50% nos ratinhos transgénicos EFla-zcytorl71ig, que se correlacionava bem com os níveis relativos de zcytorl71ig que se detectaram no seu soro. A pele transgénica parecia ter prurido, como é demonstrado pelo comportamento de coçadela dos ratinhos, algumas vezes tão intenso que produzia escoriação e lesões na pele que normalmente se infectavam (com pelo menos Staphylococcus aureus) . Os ratinhos foram identificados originalmente com etiquetas metálicas na orelha, mas na maioria dos casos, as etiquetas metálicas eram retiradas pela força pelos próprios ratinhos. Isto com frequência produziu lesões severas no ouvido externo. Estas orelhas feridas com frequência não se curavam apropriadamente, como é reflectido pela presença de pústulas e crostas de longa duração, e uma ferida supurante em expansão que se desenvolveu em muitos dos animais, atrás e entre as suas orelhas. Alguns dos ratinhos transgénicos também desenvolveram feridas com crostas em seus ombros e pescoço. Observaram-se lesões cutâneas numa subsérie dos animais, que geralmente apareciam em áreas da pele nas quais uma perda de pelo já era aparente, e com frequência foram exacerbadas pelo comportamento de coçadela do ratinho.

Utilizou-se RT-PCR quantitativa em Tempo Real para 290 detectar transcritos de ARN de zcytorl71ig em amostras de pele transgénicas (mas não não transgénicas), expressando a pele transgénica com Εμ/lck mais ARN de zcytorl71ig que a pele de ratinhos transgénicos EFla-zcytorl71ig. Os genes que codificavam as subunidades do receptor zcytorl7, zcytorl7 e OSM-Rbeta, foram expressos na pele de ratinhos não transgénicos e transgénicos para zcytorl71ig.

Um exame dos tecidos linfóides de uma subsérie de criadores transgénicos com Εμ/lck por citometria de fluxo revelou um aumento significativo na proporção de linfócitos T activados no baço e gânglios linfáticos destes ratinhos. Dois dos quatro ratinhos analisados tiveram gânglios linfáticos cervicais muito aumentados, possivelmente devido à presença de lesões nos seus pescoços. Foi observado um ligeiro aumento no peso do baço e um ligeiro aumento nos monócitos e neutrófilos circulantes no sangue dos ratinhos transgénicos. Não houve aumento numa variedade de citocinas ensaiadas, nem houveram mudanças nos níveis de amilóide A em soro circulante nestes ratinhos. Os efeitos sobre as células imuness nos ratinhos transgénicos podem ser um resultado directo ou indirecto de zcytorl71ig, ou são efeitos secundários das lesões cutâneas.

Realizou-se histopatologia em muitos tecidos distintos de pele, incluindo fígado, timo, baço, rim e testículo, e não foram detectadas anormalidades significativas nestes órgãos. No entanto, a análise da pele transgénica revelou varias alterações que variavam em grande medida dependendo da fonte e localização da pele (por exemplo, normal, sem pelo ou lesionai). Em muitos casos, as orelhas dos ratinhos transgénicos tinham uma epiderme engrossada em comparação com os controlos não transgénicos (por exemplo, aproximadamente 4 camadas contra 2 camadas), e os tecidos subjacentes continham números de baixos a moderados de células inflamatórias, que eram principalmente mononucleares com neutrófilos ocasionais. A epiderme sobre 291 o abdómen parecia multifocalmente ligeiramente mais grossa nos ratinhos transgénicos, mas não houve um aumento evidente de células inflamatórias na derme subjacente ou subcutis. Nas partes de pele sem pelo destes ratinhos havia foliculos pilosos dilatados que continham alguns resíduos mas não talos pilosos (por exemplo, os pelos caíam-se pela raiz). Nas áreas lesionadas havia um engrossamento severo da epiderme (acantose), aumento de queratina na superfície da pele (hiperqueratose), úlceras espalhadas de tamanho variável e números significativos de células inflamatórias na derme (principalmente neutrófilos, com números variáveis de macrófagos e linfócitos). A derme também continha numerosos mastócitos que bordeavam as lesões. Alguns dos talos pilosos das áreas lesionadas da pele transgénica estavam em fase activa (anágena), a diferença de muitos dos talos pilosos em áreas "normais" que estavam na fase de involução (catágena) ou inactiva (telógena). 0 fenótipo do ratinho transgénico com zcytorl71ig parece-se muito ao de pacientes com dermatite atópica (DA) e de modelos de ratinho de DA. A DA é uma doença inflamatória crónica comum que se caracteriza por citocinas hiperactivadas da subsérie de linfócitos T auxiliares 2 (Th2). Zcytorl71ig é expresso preferentemente por células Th2 contra Thl, o qual dá mais credibilidade a esta comparação. Embora se desconheça a etiologia exacta da DA, estão envolvidos múltiplos factores incluindo respostas imunes Th2 hiperactivas, autoimunidade, infecção, alérgenos e predisposição genética. Os factores clave da doença incluem xerose (secura da pele), prurido (coceira da pele), conjuntivite, lesões cutâneas inflamatórias, infecção por Staphylococcus aureus, elevação de eosinofilia em sangue, elevação dos níveis séricos de IgE e IgGl e dermatite crónica com infiltração de linfócitos T, mastócitos, macrófagos e eosinófilos. Reconheceu-se que a colonização ou infecção com S. aureus exacerba a DA e perpetua a 292 cronicidade desta doença cutânea. A DA encontra-se com frequência em pacientes com asma e rinite alérgica, e frequentemente é a manifestação inicial da doença alérgica. Aproximadamente 20% da população nos paises ocidentais sofre destas doenças alérgicas, e a incidência de DA em paises desenvolvidos está aumentando por razões desconhecidas. A DA tipicamente começa na infância e com frequência pode persistir até a adolescência até a fase adulta. Os tratamentos actuais para a DA incluem corticosteróides tópicos, ciclosporina A oral, imunosupressores não corticosteróides tais como tacrolimus (FK506 em forma de pomada) e interferão gama. A pesar da variedade de tratamentos para a DA, muitos sintomas do paciente não melhoram ou têm reacções adversas às medicações, necessitando a pesquisa de outros agentes terapêuticos mais eficazes.

As células epiteliais que expressam o receptor heterodimérico para zcytorl71ig (zcytorR17 e OSM-Rbeta) estão localizadas em locais (por exemplo, pele, intestino, pulmão, etc.) de entrada do alérgeno no corpo e interagem intimamente com as células dendriticas (células apresentadoras de antigénio profissionais) in situ. As células dendriticas desempenham um papel importante na patogénese das doenças alérgicas, e é possivel que zcytorl71ig possa interagir com o seu receptor sobre células epiteliais na pele e pulmão e influir sobre respostas imunes nestes órgãos. Portanto, zcytorl71ig e seus receptores podem contribuir à patogénese de doenças alérgicas tais como AD e asma. Além disso, o fenótipo do ratinho transgénico zcytorl71ig sugere que este ligando pode desempenhar um papel na cura de feridas, uma vez que os ratinhos parecem incapazes de reparar as lesões nas suas orelhas, e com frequência têm lesões de longa duração nas suas costas e laterais. Portanto, um antagonista de zcytorl71ig poderia representar uma terapêutica viável para 293 estas e outras indicações.

Exemplo 42

Ensaio de Luciferase em Linhas de Células Epiteliais Transformadas Humanas por meio de Infecção Transitória com Gene Indicador STAT/SER Adenoviral

Semeou-se uma ampla variedade de linhas de células epiteliais transformadas humanas (veja-se o Quadro 16 mostrado a seguir) em placas de 96 poços de fundo plano a 10.000 células/poço em meio de crescimento regular como é especificado para cada tipo celular. No dia seguinte, as células foram infectadas com uma construção indicadora de adenovirus, KZ136, a uma multiplicidade de infecção de 5000. O indicador KZ136 contém os elementos STAT além de um elemento de resposta sérico. 0 volume total foi de 100 ul/poço utilizando DMEM suplementado com L-glutamina 2 mM (GibcoBRL) , Piruvato de Sódio 1 mM (GibcoBRL) e suplemento de Insulina-Transferrina-Selénio lx (GibcoBRL (denominado a seguir no presente documento meio sem soro). As células foram cultivadas durante a noite.

Ao dia seguinte retirou-se o meio e substituiu-se por 100 μΐ de meio de indução. O meio de indução era ligando de zcytorl7 humano diluído em meio sem soro a 100 ng/ml, 50 ng/ml, 25 ng/ml, 12,5 ng/ml, 6,25 ng/ml, 3,125 ng/ml e 1,56 ng/ml. Utilizou-se um controlo positivo de FBS a 20% para validar o ensaio e para assegurar que a infecção pelo adenovirus era satisfatória. As células induziram-se durante 5 horas, depois do cual se aspirou o meio. As células depois foram lavadas em 50 μΐ/poço de PBS e posteriormente lisadas em 30 μΐ/poço de tampão de lise de células IX (Promega). Depois de uma incubação de 10 minutos a temperatura ambiente, transferiram-se 25 μΐ/poço de lisado a placas brancas opacas de 96 poços. As placas depois foram lidas no Luminómetro utilizando uma integração de 5 segundos com a injecção 40 μΐ/poço de substrato de luciferase (Promega). 294

Os resultados revelaram a capacidade de múltiplas linhas de células epiteliais de responder a ligando de zcytorl7 como é mostrado no Quadro 16 apresentado a seguir.

Quadro 16

Linha Celular Espécie Tecido Morfologia Doença Indução em vezes A5 49 Humana Pulmão Epitelial Carcinoma 2x Sk-Lu-1 Humana Pulmão Epitelial Adenocarcinoma 6x WI-38 Humana Pulmão embrionário Fibroblasto Negativo MRC-5 Humana Pulmão Fibroblasto Negativo DU 145 Humana Próstata Epitelial Carcinoma lOx PZ-HPV- 7 Humana Próstata Epitelial Transformado com VHP 5 x PC-3 Humana Próstata Epitelial Adenocarcinoma Negativo U20S Humana Osso Epitelial Osteossarcoma 15, 5x SaOS2 Humana Osso Epitelial Osteossarcoma 22x MG-6 3 Humana Osso Fibroblasto Osteossarcoma Negativo 143B Humana Osso Fibroblasto Osteossarcoma 3, 5x HOS Humana Osso Fibroblasto e Epitelial 8x TRBMeC Humana Osso, Medula óssea Epitelial 2x HT144 Humana Pele Fibroblasto Melanoma 5x C32 Humana Pele Melanoma Negativo Sk-Mel- 2 Humana Pele Poligonal Melanoma 2, 7x WM-115 Humana Pele Epitelial Melanoma 2x HCT-116 Humana Cólon Epitelial Carcinoma Negativo HT-29 Humana Cólon Epitelial Carcinoma Negativo CaCo2 Humana Cólon Epitelial Adenocarcinoma 3x HBL-100 Humana Mama Epitelial 1, 5x 295

Linha Celular Espécie Tecido Morfologia Doença Indução em vezes ME-18 0 Humana Colo do Epitelial Carcinoma Negativo útero HeLa Humana Colo do Epitelial Adenocarcinoma Negativo 299 útero SK-N-SH Humana Cérebro Epitelial Neuroblastoma Negativo U138 MG Humana Cérebro Poligonal Glioblastoma Negativo HepG2 Humana Fígado Epitelial Carcinoma Negativo Fígado Humana Fígado Epitelial Negativo Chang Sk-Hep- Humana Fígado Epitelial Adenocarcinoma 4x Int 407 Humana Intestino Epitelial Negativo 3a-Sub- Humana Placenta Negativo Ε

Exemplο 43

Produção de citocinas por linhas de células epiteliais humanas cultivadas com ligando de zcytorl7 humano

Rastrearam-se linhas de células epiteliais com patologias humanas (A549, carcinoma de epitélio pulmonar humano; SkLul, adenocarcinoma de epitélio pulmonar humano; DU145, carcinoma epitelial de próstata humano; PZ-HPV-7, HPV epitelial de próstata humana transformada; U20S, osteossarcoma epitelial de osso humano) com respeito à produção de citocinas em resposta a ligando de zcytorl7 in vitro. Estas linhas celulares têm zcytorl7 e OSMR-beta, identificados por RT-PCR, e respondem a ligando de zcytorl7 humano quando se ensaiam com a construção indicadora de luciferase adenoviral KZ136 (Exemplo 42) . A produção de citocinas por estas linhas celulares foi determinada em resposta a ligando de zcytorl7 humano numa série de três experimentos. A. Produção de citocinas por linhas de células epiteliais 296 com patologias humanas cultivadas com zcytorl71ig humano

As células foram cultivadas a uma densidade de 4,5 x 105 células por poço numa placa de 6 poços (Costar) e foram cultivadas em meio de crescimento respectivo. As células foram cultivadas com reagentes de ensaio: 100 ng/ml de ligando de zcytorl7, 10 ng/ml de Interferão gama (IFN gama) (R&D Systems, Mineápolis, MN), 10 ng/ml de Factor de

Necrose Tumoral alfa (TNF alfa) (R&D Systems, Mineápolis, MN) , 10 ng/ml de IL-lbeta (R&D Systems, Mineápolis, MN) ou 100 ug/ml de Lipopolissacárido (LPS) (Sigma). Colheram-se os sobrenadantes às 24 e 48 horas e ensaiaram-se com respeito às citocinas; GM-CSF (Factor Estimulador de Colónias de Granulócitos-Macrófagos) , IL-lb, IL-6, IL-8, MCP-1 (Proteína-1 Quimioatractivo de Macrófagos) e TNFa. Utilizaram-se kits Multiplex Antibody Bead de BioSource International (Camarillo, CA) para medir as citocinas nas amostras. Os ensaios foram lidos num instrumento Luminex-100 (Luminex, Austin, TX) e os dados analisados utilizando um software MasterPlex (MiraiBio, Alameda, CA). A produção de citocinas (pg/ml) para cada linha celular nas amostras de 24 horas é mostrada a seguir no Quadro 17.

Quadro 17 GM-CSF pg/ml A549 SkLul DU145 U20S PZ-HPV—7 zcytorl7L 18, 80 10,26 16, 19 13,26 14,10 IFN-g 16, 19 13,36 11,56 16,26 11,81 IL-lb 104,60 126,44 76, 77 338,25 27,32 TNFa 106,67 33,20 58,50 107,09 33,79 LPS 1764 10,62 11, 81 25, 47 18,34 controlo 14, 81 8,56 13,26 21,67 13,96 IL-lb pg/ml 297 A5 49 SkLul DU145 U20S PZ-HPV-7 zcytorl7L 26,90 30,17 28, 77 29,07 28,00 IFN-g 29,07 35,33 21,96 26,90 26,73 IL-lb 1332,88 1256,17 979,02 1107,35 998,60 TNFa 31,11 33,28 35,33 31,24 25,66 LPS 33,28 28,77 29,07 31,11 31,24 controlo 28,77 28, 77 26,73 31,24 29,07 IL-6 pg/ml A5 49 SkLul DU145 U20S PZ-HPV-7 zcytorl7L 20,09 26,89 193,05 19,37 17,30 IFN-g 17,52 33,64 217,58 27, 02 17,63 IL-lb 175,44 5920,19 2375,29 304,08 18, 44 TNFa 354,16 1002,51 1612,17 103,58 18,33 LPS 18,06 35,65 162,18 22, 42 17,30 controlo 17,63 27, 80 71,23 19,32 17, 19 IL-8 pg/ml A5 49 SkLul DU145 U20S PZ-HPV-7 zcytorl7L 86,33 150,81 150,61 45,92 6, 81 IFN-g 24,07 72, 82 163,31 81, 78 1,35 IL-lb 1726,24 4083,12 4407,79 5308,83 124,17 TNFa 3068,68 3811,75 2539,39 3324,02 69,65 LPS 20,28 167,13 230,39 115,08 7, 95 controlo 14,92 109,78 107,27 93,44 9, 49 MCP-1 pg/ml A5 49 SkLul DU145 U20S PZ-HPV-7 zcytorl7L 8,97 187,29 26,84 105,15 7,20 IFN-g 7,30 267,99 17, 05 88,68 7, 71 IL-lb 8, 11 8039,84 88,78 3723,81 4, 70 TNFa 8,50 7100,37 153,26 3826,80 2, 80 LPS 9, 40 185,83 22,65 61,62 5,61 controlo 8, 16 167,93 13,68 47, 78 5,61 TNFa pg/ml 298 A549 SkLul DU145 U20S PZ-HPV-7 zcytorl7L 16,23 17,52 16,67 15, 80 17, 09 IFN-g 15, 80 17, 09 15, 80 16,65 15, 80 IL-lb 16,66 17, 09 15, 80 17, 95 16,23 TNFa 1639,92 1648,83 2975,07 1348,33 3554,82 LPS 16,87 15, 80 15,37 17, 09 17,52 controlo 16,23 15, 80 15, 80 17, 09 16,66

Todas as linhas celulares ensaiadas produziram GM-CSF e IL-8 em resposta à estimulação com as citocinas de controlo IL-lb e TNFa. A maioria das linhas celulares produziu IL-6 e MCP-1 em resposta à estimulação com IL-lb e TNFa. 0 ligando de zcytorl7 estimulou a produção de IL-β na linha celular DU145 em comparação com o controlo (193 pg/ml contra 71 pg/ml). 0 ligando de zcytorl7 estimulou 3 de 5 linhas celulares para produzir IL-8, sendo observado o maior efeito em células A549 (5 vezes), e reduziu a produção de IL-8 em células U20S 2 vezes. Houve um ligeiro efeito sobre a produção de MCP-1 por células DU145 e U20S quando foram cultivadas com o ligando de zcytorl7. B. Produção de citocinas por linhas de células epiteliais humanas normais cultivadas com zcytorl71ig humano

Além das linhas de células epiteliais humanas, também se ensaiaram células de epitélio bronquial humano normal (NHBE, Clonetics). As células foram cultivadas a uma densidade de 1 x 105 células por poço numa placa de 24 poços e foram cultivadas com reagentes de ensaio; 1000 ng/ml, 100 ng/ml e 10 ng/ml de ligando de zcytorl7 (A760F), 10 ng/ml de TNFa, 10 ng/ml de OSM, 10 ng/ml de IFNa, 10 ng/ml de TGFb ou 10 ng/ml de linfotactina. Colheram-se os sobrenadantes às 24 e 48 horas e ensaiaram-se com respeito às citocinas; IL-β, IL-8, MCP-1, ΜΙΡ-a, RANTES e Eotaxina. As citocinas ensaiaram-se como foi descrito previamente. A 299 produção de citocinas (pg/ml) para cada linha celular nas amostras de 48 horas é mostrada a seguir no Quadro 18.

Quadro 18 IL-6 pg/ml A5 49 DU145 SkLul U20S NHBE rl7L 1000 ng/ml 24,5 56,3 32,1 25,2 64,5 rl7L 100 ng/ml 25, 0 65, 0 31,0 25, 4 50,2 rl7L 10 ng/ml 24, 8 51,8 30,2 25,3 54,3 TNFa 272,9 355, 4 437,5 36,1 299,3 OSM 26,4 73,5 112, 4 25,6 80,4 IFNa 24,6 109,3 33,7 26,4 52,4 TGF a 24, 4 102,6 42, 7 27, 8 268,9 controlo 24,5 36,3 29,9 25,2 47,9 IL-8 pg/ml A549 DU145 SkLul U20S NHBE rl7L 1000 ng/ml 35, 0 243,3 45,6 18,6 402,0 rl7L 100 ng/ml 31,0 290,7 40, 1 21,3 296,0 rl7L 10 ng/ml 30,4 240, 4 33,4 18,9 361,8 TNFa 2809,3 2520,9 1385,2 2784,9 1486,3 OSM 37, 8 60,6 68,0 22,5 494,6 IFNa 18,9 315,3 39,5 33,1 231,6 TGF a 9,9 77,5 19,6 88,9 246,9 controlo 10,9 238,0 38,0 39,7 315, 8 MCP-1 pg/ml A5 49 DU145 SkLul U20S NHBE rl7L 1000 ng/ml nd nd 149, 1 81,0 nd rl7L 100 ng/ml nd nd 130,6 81,9 nd rl7L 10 ng/ml nd nd 111,7 49, 1 nd TNFa nd 22,1 2862,6 1104,7 nd OSM nd 17,2 448,2 85, 8 nd IFNa nd nd 131,7 10,5 nd TGF a nd 1,7 54,5 27,6 nd controlo nd nd 113,0 1,7 nd nd não detectado 300

As células DU145 produziram IL-6 em resposta a ligando de zcytorl7, repetindo os resultados anteriores no Exemplo 43A. No entanto, somente A549 e U20S tiveram respostas de IL-8 similares às observadas no Exemplo 43A. Tanto as células SkLul como as células U20S produziram MCP-1 em resposta a ligando de zcytorl7. A produção de citocinas por células NHBE foi marginal em comparação com os controlos. C. Produção de citocinas por linhas de células epiteliais com patologias humanas co-cultivadas com zcytorl71ig humano e IFN gama

As células foram cultivadas a uma densidade de 2 x 105 por poço numa placa de 24 poços e foram co-cultivadas com 10 ng/ml de IFN gama + /- ligando de zcytorl7 a 100 ng/ml, 10 ng/ml ou 1 ng/ml. Os sobrenadantes colheram-se às 24 e 48 horas e ensaiaram-se com respeito a IL-8 e MCP-1 como foi descrito anteriormente. A produção de citocinas (pg/ml) para cada linha celular nas amostras de 24 horas é mostrada a seguir no Quadro 19.

Quadro 19 IL-8 pg/ml MCP-1 pg/ml A549 10 ng/ml IFNg+100 ng/ml rl7L 10 ng/ml IFNg+10 ng/ml rl7L 10 ng/ml IFNg+1 ng/ml rl7L 10 ng/ml IFNg controlo 86,7 75, 1 63.6 35, 4 36.6 nd nd nd nd nd 10 ng/ml IFNg+100 ng/ml DU145 rl7L 102,3 nd 10 ng/ml IFNg+10 ng/ml 92,9 nd rl7L 10 ng/ml IFNg+1 ng/ml rl7L 79,9 nd 10 ng/ml IFNg 70,7 nd controlo 79,4 nd 301

SkLul 10 ng/ml IFNg+100 ng/ml rl7L 10 ng/ml IFNg+10 ng/ml rl7L 10 ng/ml IFNg+1 ng/ml rl7L 10 ng/ml IFNg controlo 152,2 194, 4 138,7 203, 0 604,9 870,7 585, 4 652,6 292,3 10 ng/ml IFNg+100 ng/ml U20S rl7L 106, 8 357, 0 10 ng/ml IFNg+10 ng/ml 198,2 347, 7 rl7L 10 ng/ml IFNg+1 ng/ml rl7L 109,9 293,3 10 ng/ml IFNg 118, 8 159, 8 controlo 146, 8 7,0

As células A549 produziram IL-8 em resposta a ligando de zcytorl7, no entanto não houve nenhum efeito da co-cultura das células com a adição de IFN gama. As células U20S produziram 20 vezes mais MCP-1 quando foram cultivadas com IFNg e 50 vezes mais MCP-1 quando foram cultivadas com IFN gama + ligando de zcytorl7.

Exemplo 44

Zcytorl71ig Afecta à Incorporação de 3H-TdR em Células de Carcinoma Epitelial de Próstata DU145

Semearam-se as células em grupos de tecidos de 96 poços (Falcon) a uma densidade de 25.000/poço em meio de crescimento MEM (Life Technologies) suplementado com glutamina, piruvato, aminoácidos não essenciais (Life Technologies) e soro bovino fetal a 10% (Hyclone). Quando se alcançou a confluência (24 horas depois), as células foram mudadas a um meio de detenção do crescimento por meio da substituição do soro por BSA a 0,1% (Life Technologies). Depois de 48 horas para conseguir a sincronização celular, o meio de detenção do crescimento foi substituído por meio novo. Depois, adicionou-se zcytorl71ig recombinante humano (reagente de ensaio) a diversas concentrações (de 0,24 a 60 302 ng/ml) (veja-se o Quadro 16 mostrado a seguir) para ensaiar o efeito da proteína sobre a replicação do ADN basal. Alguns poços receberam FBS a 2,5% (Hyclone) além de ligando de zcytorl7, para ensaiar o efeito da proteína sobre os níveis elevados da incorporação de TdR. Como controlos positivos foram utilizados FBS a 10% e 20 ng/ml de Factor-BB de Crescimento Derivado de Plaquetas (PDGF-BB) (R&D).

Dezoito horas depois da adição de ligando de zcytorl7 e o resíduo dos reagentes de ensaio, as células foram submetidas a pulsos com 250 nCi/ml de [3H]-timidina (NEN) durante 4 horas. Depois do pulso de 4 horas, descartou-se o meio e adicionaram-se 100 μΐ de solução de tripsina (Life Technologies) a cada poço para separar as células. A radiactividade incorporada por DU145 foi determinada por meio da colheita das células com um colheitador de células Packard Filtermate 196 e por meio da contagem do marcador incorporado utilizando um contador de cintilação de microplacas Packard TopCount NXT.

Como pode ser visto no Quadro 20 mostrado a seguir, zcytorl71ig induziu a incorporação de timidina nas células aquiescentes (em BSA a 0,1%) de uma maneira dependente da concentração. Este efeito alcançou 2,5 vezes o do controlo com BSA à maior concentração utilizada, 60 ng/ml. Além disso, este efeito de zcytorl71ig também foi detectável quando a incorporação basal se elevou pela adição de FBS a 2,5% (nesta série um mitogénio tão potente como FBS a 10%). Estes resultados, portanto, indicam que tanto nas condições basais como nas condições estimuladas, zcytorl71ig pode actuar como factor mitogénico para as células de carcinoma DU145. O Quadro 16 mostra os efeitos de zcytorl71ig sobre a incorporação de timidina por células DU145. Os resultados são expressos em cpm/poço e os números são a média ± desvio típico de poços por triplicado.

Quadro 20 303 BSA a FBS a 0, 1% 1,5% Zcytorl71ig (0,24 ng/ml) 1139 ± 336 4228 ± 600 Zcytorl71ig (0,24 ng/ml) 1430 ± 136 4894 ± 1037 Zcytorl71ig (0,74 ng/ml) 1657 ± 32 5038 ± 810 Zcytorl71ig (2,22 ng/ml) 1646 ± 57 5162 ± 808 Zcytorl71ig (6,67 ng/ml) 2226 ± 189 6385 ± 1613 Zcytorl71ig (20 ng/ml) 2168 ± 108 5880 ± 1085 Zcytorl71ig (60 ng/ml) 2512 ± 111 6165 ±417 PDGF-BB (20 ng/ml) 4090 ± 202 5927 ± 360

Exemplο 45

Expressão de ligando de huzcytorl7 em E. coli Ά. Construção de vector de expressão pRPSOl que expressa o polipéptido de fusão huzcytorl7Lig/MBP-6H

Construiu-se um plasmídeo de expressão que continha um polinucleótido que codificava huzcytorl71ig fusionado pela extremidade C-terminal a Proteína de Ligação a Maltose (MBP) por meio de recombinação homóloga. O polipéptido de fusão contém uma parte de MBP de aproximadamente 38 8 aminoácidos N-terminal fusionada ao huzcytorl7Lig descrito no presente documento. Foi isolado um fragmento de ADNc de huzcytorl71ig utilizando o método de PCR como foi descrito no presente documento. Utilizaram-se dois iniciadores na produção do fragmento de zcytorl71ig numa reacção de PCR 304 convencional: (1) um que contém 40 pb da sequência flanqueante do vector e 20 pb correspondentes à extremidade amino de huzcytorl71ig, e (2) outro que contém 40 pb da extremidade 3' correspondente à sequência flanqueante do vector e 20 pb correspondentes à extremidade carboxilo de huzcytorl71ig. Dois microlitros dos 100 μΐ de reacção de PCR foram processados num gel de agarose a 1,0% com tampão TBE 1 x para a análise, e foi observado o fragmento do peso molecular esperado. O resíduo da reacção de PCR foi combinado com o segundo tubo de PCR e precipitado com 400 μΐ de etanol absoluto. O ADN precipitado utilizou-se para recombinação no vector receptor pTAP98 cortado com Smal para produzir a construção que codificava a fusão MBP-huzcytorl71ig, como é descrito a seguir. O vector pTAP98 foi construído utilizando recombinação homóloga de levedura. Cem nanogramas de pMAL-c2 cortado com EcoR foram recombinados com 1 μg de pRS316 cortado com Pvul, 1 μg de ligante e 1 μg de pRS316 cortado com Scal/EcoRl numa reacção de PCR. Os produtos de PCR foram concentrados por meio de precipitação com etanol a 100%. A estirpe de células de levedura competente (S. cerevisiae) , SF838-9DCC, foi combinada com 10 μΐ de uma mistura que continha aproximadamente 1 μρ do produto de PCR huzcytorl71ig (anterior) e 100 ng do vector pTAP98 digerido com Smal, e submetida a electroporação a 0,75 kV, 25 μΕ e °° ohms. A mistura de reacção resultante foi inoculada em placa em placas URA-D e incubada a 30 °C.

Depois de 48 horas, colheram-se os transformantes de levedura Ura+ de uma única placa. Foi isolado o ADN e foi utilizado para transformar células E. coli electrocompetentes (por exemplo, MC1061, Casadaban et al. J. Mol. Biol. 138, 179-207) . As células E. coli resultantes foram cultivadas em placas MM/CA + AMP a 100 mg/1 (Pryor e Leiting, Protein Expression and Purification 10: 309-319, 1997) utilizando métodos convencionais. Colheram-se quatro 305 clones individuais a partir das placas e inocularam-se em MM/CA com 100 μρ/ιηΐ de Ampicilina durante duas horas a 37 °C. Um mililitro de cada cultura foi induzido com IPTG 1 mM. Aproximadamente 2-4 horas depois, 250 μΐ de cada cultura induzido foram misturados com 250 μΐ de pérolas de vidro lavadas com ácido e 250 μΐ de tampão Thorner com PME a 5% e colorante (ureia 8 M, Tris 100 mM pH 7,0, glicerol a 10%, EDTA 2 mM, SDS a 5%) . As amostras foram submetidas a vórtex durante um minuto e aquecidas a 65 °C durante 10 minutos. Carregaram-se vinte microlitros de cada amostra por pista num gel PAGE de 4%-12% (NOVEX) . Os géis foram processados em tampão MES IX. Os clones positivos foram denominados pROPSOl e foram submetidos a análise de sequências.

Utilizou-se um microlitro de ADN de sequenciamento para transformar a estirpe de células E. coli electrocompetentes MC1061. As células foram submetidas a electropulsos a 2,0 kV, 25 μΕ e 400 ohms. Depois da electroporação, as células foram resgatadas em 0,6 ml de SOC e foram cultivadas em placas LB+Amp a 37 °C durante a noite, com 100 mg/1 de Ampicilina. Induziram-se quatro culturas com ITPG e rastrearam-se com respeito aos positivos como foi descrito anteriormente. Os clones positivos foram expandidos para a purificação de proteínas da proteína de fusão huzcytorl71ig/MBP-6H utilizando técnicas convencionais. B. Purificação de huzcytorl7Lig/MBP-6H a partir de fermentação de E. coli A menos que se indique de outro modo, todas as operações realizaram-se a 4 °C. O seguinte método foi utilizado para purificar o polipéptido huzcytorl7Lig/MBP-6H recombinante. Construíram-se células E. coli que continham a construção pRPSOl e expressavam huzcytorl7Lig/MBP-6H utilizando métodos convencionais de biologia molecular e foram cultivadas em 50,0 g/1 de SuperBroth II (12 g/1 de 306

Caseína, 24 g/1 de Extracto de levedura, 11,4 g/1 de fosfato de dipotássio, 1,7 g/1 de fosfato de monopotássio; Becton Dickinson, Cockeysville, MD) , 5 g/1 de glicerol e 5 ml/1 de Sulfato de Magnésio 1 M. Colheram-se vinte gramas de células e congelaram-se para a purificação de proteínas.

As células descongeladas ressuspensas em 500 ml de tampão de Eguilíbrio de Amilose (Tris 20 mM, NaCl 100 mM, pH 8,0) . Para lisar as células utilizou-se um sistema de ruptura de células de Prensa French (Constant Systems Ltd., Warwick, RU) estabelecendo uma temperatura de -7 °C a -10 °C e foram utilizados 30K PSI para lisar as células. As células ressuspensas ensaiaram-se com respeito à ruptura por leituras de A60o antes e depois dos ciclos através da Prensa French. A suspensão celular processada foi sedimentada a 10.000 G durante 30 minutos para retirar os detritos celulares e o sobrenadante foi colhido para a purificação de proteínas.

Deitou-se uma coluna de 25 ml de resina de Amilose (New England Biolabs, Beverly, MA) (preparada como é descrito a seguir) numa coluna de vidro H Bio-Rad, de 2,5 cm de diâmetro x 10 cm de altura. A coluna foi preenchida e equilibrada por gravidade com 10 volumes de coluna (VC) de tampão de equilíbrio de Amilose. O sobrenadante celular processado foi carregado por lotes na resina de Amilose, durante a noite com agitação. A resina foi devolvida à coluna Bio-Rad e lavada com 10 VC de tampão de Equilíbrio de Amilose por gravidade. A coluna eluiu-se com -2 VC de tampão de Eluição de Amilose (tampão de Equilíbrio de Amilose, Maltose 10 mM, Fluka Biochemical, Suiza) por gravidade. Colheram-se dez fracções de 5 ml ao longo do perfil de eluição e ensaiaram-se com respeito à absorvência a 280 e 320 nm. A resina de Amilose foi regenerada com 1 VC de H20 destilada, 5 VC de SDS a 0,1% (p/v) (Sigma), 5 VC de H20 destilada, 5 VC de tampão de Equilíbrio de Amilose, e finalmente 1 VC de tampão de Armazenamento de Amilose 307 (tampão de Equilíbrio de Amilose + Azida de Sódio a 0,02%). A coluna regenerada foi armazenada a 4 °C.

Agruparam-se as fracções do perfil de eluição de interesse e dializaram-se numa câmara de diálise 10 K (Slide-A-Lyzer, Pierce Immunochemical) contra 4 x 4 1 de PBS pH 7,4 (Sigma) durante um período de tempo de 8 horas para retirar os contaminantes de baixo peso molecular, permuta de tampão e dessalinização. Depois da diálise, o material colhido representava o polipéptido huzcytorl7/MBP-6H purificado. O polipéptido huzcytorl7/MBP-6H purificado foi esterilizado por filtração e analisado por meio de coloração com Coomasie e SDS-PAGE para um produto com o peso molecular apropriado. A concentração do polipéptido huzcytor17/MBP-6H foi determinada por análise BCA e foi de 1,28 mg/ml.

Exemplo 46

Anticorpo Policlonal de zyctorlVlig Humano A. Preparação e Purificação

Prepararam-se anticorpos policlonais imunizando 2 coelhos brancos New Zealand fêmea com a proteína recombinante purificada huzcytor17/MBP-6H (Exemplo 45). Cada coelho recebeu uma injecção intraperitoneal (IP) inicial de 200 μρ de proteína purificada em Adjuvante Completo de Freund seguido de injecções IP de reforço de 100 μg de proteína em Adjuvante Incompleto de Freund cada três semanas. De sete a dez dias depois da administração da segunda injecção de reforço (3 injecções em total), extraiu-se sangue dos animais e colheu-se o soro. Os animais depois foram submetidos a reforços e a extracções de sangue cada três semanas. O soro de coelho específico para huzcytorl7/MBP-6H foi pré-adsorvido de anticorpos anti-MBP utilizando uma coluna de proteína CNBr-SEPHAROSE 4B (Pharmacia LKB) que foi preparada utilizando 10 mg de proteína de fusão-MBP recombinante purificada não específica por grama de CNBr- 308 SEPHAROSE. Os anticorpos policlonais específicos para huzcytor17/MBP-6H foram purificados por afinidade a partir do soro de coelho pré-adsorvido utilizando uma coluna de proteína CNBr-SEPHAROSE 4B (Pharmacia LKB) que foi preparada utilizando 10 mg da proteína recombinante purificada de antigénio específico huzcytorl7/MBP-6H. Depois da purificação, os anticorpos policlonais foram dialisados com 4 mudanças de 20 vezes o volume de anticorpo de PBS durante um período de tempo de pelo menos 8 horas. Os anticorpos específicos de ligando de hzcytorl7 foram caracterizados por ELISA utilizando 500 ng/ml das proteínas recombinantes purificadas hzcytorl7L/MBP-6H ou hzcytorl7L-CEE produzidas num sistema de expressão de baculovírus como alvos de anticorpo. O limite inferior de detecção (LID) do anticorpo de coelho anti-hzcytorl7L/MBP-6H purificado por afinidade foi 100 pg/ml sobre o seu antigénio recombinante purificado específico hzcytorl7L/MBP-6H e 500 pg/ml sobre hzcytorl7L-CEE recombinante purificado produzido num sistema de expressão de baculovírus.

B. SDS-PAGE e análise de Western blotting de anticorpo de coelho anti-ZcytoR.17lig humano MBP-6H

Ensaiou-se anticorpo de coelho anti-ZcytoRl7 MBP-6H humano por SDS-PAGE (NuPage 4-12%, Invitrogen, Carlsbad, CA) com o método de coloração com coomassie e Western blotting utilizando IgG de cabra anti-coelho-HRP. A proteína purificada (200-25 ng) zcytorl71ig de ratinho e humana foi submetida a electroporação utilizando uma mini-cell Xcell II de Novex de Invitrogen e transferida a nitrocelulose (0,2 mm; Invitrogen, Carlsbad, CA) a temperatura ambiente utilizando o módulo de transferência Xcell de Novex com agitação de acordo com as instruções proporcionadas no manual do instrumento. A transferência realizou-se a 300 mA durante uma hora num tampão que continha base Tris 25 mM, glicina 200 mM, e metanol a 20%. O filtro depois foi bloqueado com tampão A de Western 309 (interno, Tris 50 mM, pH 7,4, EDTA 5 mM, pH 8,0, Igepal CA-630 a 0,05%, NaCl 150 mM, e gelatina a 0,25%) durante a noite com agitação suave a 4 °C. A nitrocelulose foi enxaguada rapidamente e depois adicionou-se o anticorpo de coelho anti-zcytoRl7 MBP-6H humano (1:1000) em tampão A de Western. A mancha de transferência foi incubada durante 1,5 horas a temperatura ambiente com agitação suave. A mancha de transferência foi enxaguada 3 vezes durante 5 minutos cada vez em Western A, e depois adicionou-se anticorpo de cabra anti-IgG de coelho-HRP (1:5000) em tampão A de Western A. A mancha de transferência foi incubada durante 1 hora a temperatura ambiente com agitação suave. A mancha de transferência foi enxaguada 3 vezes durante 5 minutos cada vez em Western A, e depois foi enxaguada rapidamente em H20. A mancha de transferência se revelou utilizando reagentes de substratos quimioluminescentes disponíveis comercialmente (reagentes de detecção de transferência CLWestern 1 e 2 misturados 1:1; reagentes obtidos de Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, Inglaterra) e a mancha de transferência foi exposta a uma película de raios X durante até 5 minutos. O zyctorl71ig humano purificado apareceu como uma banda grande a aproximadamente 30 kDa e uma banda mais pequena a aproximadamente 20 kDa em condições reduzidas. O zcytorl71ig de ratinho não foi detectado pelo anticorpo de coelho anti-zcytorl71ig humano.

Exemplo 47

Efeitos de ZcytorUlig sobre a Adesão de Monócitos U937 a uma Monocapa de Células Endoteliais de Medula Óssea Transformada (TRBMEC)

Aceleraram-se Células Endoteliais de Medula Óssea Transformadas (TRBMEC) em grupos de tecidos de 96 poços (Falcon) a uma densidade de 25.000/poço em meio M131 (Cascade Biologics) suplementado com Suplemento de Crescimento Microvascular (MVGS) (Cascade Biologics). 310

Quando alcançaram a confluência (24 horas depois), as células foram mudadas a M199 (Gibco-Life Technologies) suplementado com Soro Bovino Fetal a 1% (Hyclone). Adicionou-se zyctorl71ig recombinante humano (reagente de ensaio) a diversas concentrações (de 0,4 a 10 ng/ml) (veja-se o Quadro 21 proporcionado a seguir) para ensaiar o efeito da proteína sobre as interacções células imuness-células endoteliais que tinham como resultado a adesão. Alguns poços receberam 0,3 ng/ml de Factor de Necrose Tumoral (TNalfa R&D Systems), uma citocina pró-inflamatória conhecida, além de zyctorl71ig, para ensaiar o efeito da proteína sobre as células endoteliais em condições inflamatórias. Como controlo positivo foi utilizado TNFalfa a 0,3 ng/ml somente e a concentração utilizada representa aproximadamente 70% do efeito máximo de TNFalfa neste sistema, isto é, não induz a aderência máxima das células U937 (uma linha celular similar a monócitos humanos) ao endotélio. Por esta razão, este sistema pode detectar tanto a regulação positiva como a regulação negativa dos efeitos do TNFalfa. Os níveis basais de adesão tanto com como sem TNFalfa foram utilizados como valor basal para avaliar o efeito dos reagentes de ensaio.

Depois de uma incubação de uma noite das células endoteliais com os reagentes de ensaio (zcytorl71igando ± TNFalfa), as células U937 coradas com marcador fluorescente Calceina-AM 5 μΜ (Molecular Probes), as células foram suspensas em RPMI 1640 (sem rojo de fenol) suplementado com FBS a 1% e foram cultivadas a 100,00 células/poço na monocapa de TRBMEC aclarada. Mediram-se os níveis de fluorescência a comprimentos de onda de excitação/emissão de 485/538 nm (leitor de microplacas Molecular Devices, aplicação CytoFluor) 30 minutos depois, antes e depois de enxaguar os poços três vezes com RPMI 1640 quente (sem vermelho de fenol), para retirar as U937 não aderentes. Utilizaram-se os níveis de fluorescência antes do enxagúe 311 (total) e depois do enxagúe (específico de aderência) para determinar a percentagem de aderência (aderente líquido/total líquido x 100 =% de aderência).

Como pode ser visto no Quadro 21 mostrado a seguir, quando se adicionava zyctorl71ig somente afectava à aderência basal das células U937 às monocapas endoteliais no intervalo de concentrações utilizado (aumentos menores de 2 vezes, p<0,01 por ensaio ANOVA) . Por si mesmo, o controlo positivo, 0,3 ng/ml de TNFalfa, aumentava a aderência das células U937 desde um nivel basal de 5,8% a 35% (6-vezes). Na presença de TNFalfa, zyctorl7 sinergizava com TNFalfa e aumentava adicionalmente a adesão a U937 de uma maneira dependente da concentração entre 0,4 e 10 ng/ml (p<0,01 por ensaio ANOVA). A 10 ng/ml, zyctorl71ig aumentava o efeito de TNFalfa num 62%. Estes resultados indicam que zyctorl71ig pode ser por si mesmo um agente pró-inflamatório. Zcytorl71ig podia sinergizar com concentrações submáximas de TNFalfa para aumentar a aderência dos monócitos às células endoteliais. Estes resultados também mostram que as células endoteliais, especialmente quando se expõem a citocinas pró-inflamatórias tais como TNFalfa, provavelmente são um tecido alvo da acção de zyctorl71ig. A consequência de zyctorl71igando sobre as células endoteliais pode ser elevada a adesão de monócitos ou macrófagos a um local de actividade pró-inflamatória. Os monócitos e macrófagos activados são importantes em muitas doenças inflamatórias. Portanto, a inibição das adesões de monócito/macrófagos pode proporcionar um fundamento terapêutico para os antagonistas de zyctorl71igando. Estes dados suportam a utilização de antagonistas de zcytorl71igando para o tratamento de doenças pulmonares, doenças vasculares, autoimunidade, metástase tumorais, doenças que envolvem reacções alérgicas, cura de feridas e doenças da pele incluindo dermatite de contacto, alérgicas ou não alérgicas 312 ou psoríase e doença inflamatória do intestino. 0 Quadro 21 amostra os efeitos de zyctorl71ig sobre a adesão de monócitos U937 a monocapas endoteliais TRBMEC. Os resultados são expressos em percentagem de adesão e os números são a média ± desvio típico de poços por triplicado.

Quadro 21

Basal 0,3 ng/ml de TNFalfa Basal 5,8 ± 1,2 35 ± 5,5 zyctorl71ig 0,4 ng/ml 9 + 0,7 44,7 ± 2,5 zyctorl71ig 1,1 ng/ml 10,4 ± 0,8 45,2 ± 0,6 zyctorl71ig 3,3 ng/ml 7,9 ± 1,7 51,1 ± 4 zyctorl71ig 10 ng/ml 9,5 ± 0,5 56,6 ± 3,9 LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> Zymogenetics <120> MULTÍMEROS DE RECEPTOR DE CITOCINA ZCYT0R17

<13 0> 02-02PC <150> US 60/435.361 <151> 19-12-2002 <150> US 60/389.108 <151> 14-06-2002 <150> US 60/350.325 <151> 18-01-2002 <160> 183 <170> FastSEQ para Windows Versão 4.0 <210> 1 313 <211> 904 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (28) , ... (519) <400> 1 ctgaagctgg ccttgctctc tctcgcc atg gcc tct cac tca ggc ccc tcg acg 54

Met Ala Ser His Ser Gly Pro Ser Thr 1 5 tct gtg ctc ttt ctg ttc tgc tgc ctg gga ggc tgg ctg gcc tcc cac 102 Ser 10 Vai Leu Phe Leu Phe 15 Cys Cys Leu Gly Gly 20 Trp Leu Ala Ser His 25 acg ttg ccc gcc cgt tta cta cga cca agt gat gat gta cag aaa ata 150 Thr Leu Pro Vai Arg 30 Leu Leu Arg Pro Ser 35 Asp Asp Val Gin Lys 40 lie gtc gag gaa tta cag tcc ctc tcg aag atg ctt ttg aaa gat gtg gag 158 Vai Glu Glu Leu 45 Gin Ser Leu Ser Lys 50 Met Leu Leu Lys Asp 55 Val Glu gaa gag aag ggc gtg ctc gtg tcc cag aat tac acg ctg ccg tgt ctc 246 Glu Glu Lys 60 Gly vai Leu Vai Ser 65 Gin Asn Tyr Thr Leu 70 Pro Cys Leu age cet gac gcc cag ccg cca aac aac ate cac age cca gcc ate cgg 294 314

Ser Pro 75 Asp Ala Gin Pro Pro 80 Asn Asn Ile His Ser 85 Pro Ala Ile Arg gca tat ctc aag aca ate aga cag cta gac aac aaa tet gtt att gat 342 Ala 90 Tyr Leu Lys Thr Ile 95 Arg Gin Leu Asp Asn 100 Lys Ser val Ile Asp 105 gag ate ata gag cac ctc gac aaa ctc ata ttt caa gat gca cca gaa 390 Glu ile Ile Glu His 110 Leu Asp Lys Leu Ile 115 Phe Gin Asp Ala Pro 120 Glu aca aac att CCC gtg cca aca gac acc cat gaa tgt aaa ege ttc ate 438 Thr Asn Ile Ser 125 Val Pro Thr Asp Thr 130 His Glu Cys Lys Arg 135 Phe Ile ctg acc att tet caa cag ttt tca gag tgc atg gac ctc gca cta aaa 486 Leu Thr Ile 140 Ser Gin Gin Phe Ser 145 Glu Cys Het Asp Leu 150 Ala Leu Lys tca Ser ctg Leu 155 acc Thr tet Ser gga Gly gee Ala caa Gin 160 cag Gin gee Ala acc Thr act Thr taaggccatc tcttcctttc 539 ggattggcag gaacttaagg agccttaaaa agatgaccga cagctaagtg tgggaactct 599 gccgtgattc cttaagtaca tttttccaat gaataatctc agggacccct catatgggct 659 agtcccggga gggctgagat gtgaatttgt gaattacctt gaaaaacatt aggttattgt 719 tattagtctt ggtatttatg gaatgctttt cttctgcagg cttaagtctt acttattata 779 ccctcgtgag ggtgggaggt ggcagctatg ttaatttatt gatatttatt gtactaagag 839 ttgtcaatgc tccctggggg agccctcgga atctatttaa taaattatat tgaatttctc 899 teaca 904

<210> 2 <211> 164 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 315

Met 1 Ala ser His Ser 5 Gly Pro Ser Thr Ser 10 Vai Leu Phe Leu Phe Cys 15 Cys Leu Gly Gly 20 Trp Leu Ala Ser His 25 Thr Leu Pro Vai Arg 30 Leu Leu Arg Pro Ser 35 Asp Asp Vai Gin Lys 40 Ile vai Glu Glu Leu 45 Gin Ser Leu Ser Lys 50 Met Leu Leu Lys Asp 55 Vai Glu Glu Glu Lys 60 Gly Vai Leu Vai Ser 65 Gin Asn Tyr Thr Leu 70 Pro Cys Leu Ser Pro 75 Asp Ala Gin Pro Pro 80 Asn Asn lie His Ser 85 Pro Ala Ile Arg Ala 90 Tyr Leu Lys Thr Ile 95 Arg Gin Leu Asp Asn 100 Lys Ser Vai Ile Asp 105 Glu Ile Ile Glu His 110 Leu Asp Lys Leu Ile 115 Phe õln Asp Ala Pro 120 Glu Thr Asn Ile Ser 125 Vai Pro Thr Asp Thr 130 His Glu Cys Lys Arg 135 Phe ile Leu Thr Ile 140 Ser Gin Gin Phe Ser 145 Gin Glu Ala Cys Thr Met Thr Asp Leu 150 Ala Leu Lys Ser Leu 155 Thr Ser Gly Ala Gin 160

<210> 3 <211> 492 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> polinucleótido degenerado zcytorl71ig humano da SEQ ID N°: 2 <221> misc_feature <222> (1)...(492) <223> n = A, T, C ou G <400> 3 atggcnwsnc aywsnggncc nwsnacnwsn gtnytnttyy tnttytgytg yytnggnggn 60 cggytngcnw sncayacnyt nccngtnmgn ytnytnmgnc cnwsngayga ygtncaraar 120 athgtngarg arytncarws nytnwsnaar atgytnytna argaygtnga rgargaraar 180 ggngcnytng tnwsncaraa ytayacnytn ccntgyycnw snccngaygc ncarccnccn 240 aayaayathc aywsnccngc nathmgngcn tayytnaara cnathmgnca rytngayaay 300 aarvsngtna thgaygarat hathgarcay ytngayaary tnathttyca rgaygcnccn 360 garacnaaya thwsngtncc nacngayacn caygartgya armgnttyat hytnacnath 420 wsncarcart tywsngartg yatggayytn gcnytnaarw snytnacnws nggngcncar 480 cargcnacna cn 492 <210> 4 316 <211> 2903 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (497) ... (2482 <40 0> 4 tgaaaagaca tgtgtgtgca gtatgaaaat tgagacagga aggcagagtg ccagcctgtt 60 ccacctcagc tgggaatgtg catcaggcaa ctcaagtttt tcaccacggc atgtgtctgt 120 gaatgcccgc aaaacatCag tttcactctt gtcgccaggt tggagtacaa tggcacgatc 180 ccggcccact gcaacctctg cctcccgggt tcaagcgatt ctcctgcctc agcctcccga 240 gtagctggga ttacagttaa caataatgca atccatttcc cagcataagt gggtaagtgc 300 cactttgact tgggctgggc ttaaaagcac aagaaaagct cgcagacaat cagagtggaa 360 acacccccac atcttagtgt ggataaatta aagtccagat tgttcttcct gtcctgactt 420 gtgctgcggg aggtggagtt gcctttgatg caaatccttt gagccagcag aacatctgtg 480 gaacatcccc tgatac atg aag ctc tct ccc cag cct tca tgt gct aac ctg 532 Met Lys Leu Ser Pro Gin Pro Ser Cys Vai Asn Leu 15 10 999 atg atg tgg acc tgg gea ctg tgg atg ctc cct tca ctc tgc aaa 580 Gly Met Met 15 Trp Thr Trp Ala Leu 20 Trp Met Leu Pro Ser 25 Leu Cys Lys ttc age ctg gea gct ctg cca gct aag cct gag aac att tcc tgt gtc 628 Phe Ser 30 Leu Ala Ala Leu Pro 35 Ala Lys Pro Glu Asn 40 Ile Ser Cys Val tac tac tat agg aaa aat tta acc tgc act tgg agt cca gga aag gaa 676 Tyr 45 Tyr Tyr Arg Lys Asn 50 Leu Thr Cys Thr Trp 55 Ser Pro Gly Lys Glu 60 acc agt tat acc cag tac aca gtt aag aga act tac gct ttt gga gaa 724 Thr Ser Tyr Thr Gin 65 Tyr Thr val Lys Arg 70 Thr Tyr Ala Phe Gly 75 Glu aaa cat gat aat tgt aca acc aat agt tct aca agt gaa aat cgt gct 772 Lys His ASP Asn 80 Cys Thr Thr Asn Ser 85 Ser Thr Ser Glu Asn 90 Arg Ala 317 tcg tgc tct ttt ttc ctt cca aga ata acg ate cca gat aat tat acc 820 Ser Cys Ser 95 Phe Phe Leu Pro Arg 100 Xle Thr Ile pro Asp 105 Asn Tyr Thr att gag gtg gaa gct gaa aat gga gat ggt gta att aaa tct cat atg 868 Xle Glu 110 Vai Glu Ala Glu Asn 115 Gly Asp Gly Val Ile 120 Lys Ser His Met aca tac tgg aga tta gag aac ata gcg aaa act gaa cca cct aag att 916 Thr 125 Tyr Trp Arg Leu Glu 130 Asn Ile Ala Lys Thr 135 Glu Pro Pro Lys Ile 140 ttc cgt gtg aaa cca gtt ttg ggc ate aaa cga atg att caa att gaa 964 Phe Arg Vai Lys Pro 145 val Leu Gly Ile Lys ISO Arg Met Ile Gin Ile 155 Glu tgg ata aag cct gag ttg gcg cct gtt tca tct gat tta aaa tac aca 1012 Trp Ile Lys Pro 160 Glu Leu Ala Pro Val 165 Ser Ser Asp Leu Lys 170 Tyr Thr ctt cga ttc agg aca gtc aac agt acc age tgg atg gaa gtc aac ttc 1060 Leu Arg Phe 175 Arg Thr Val Asn Ser 180 Thr Ser Trp Met Glu 185 Val Asn Phe gct aag aac cgt aag gat aaa aac caa acg tac aac ctc acg ggg ctg 1108 Ala Lys 190 Asn Arg Lys Asp Lys 19S Asn Gin Thr Tyr Asn 200 Leu Thr Gly Leu cag cct ttt aca gaa tat gtc ata gct ctg cga tgt gcg gtc aag gag 1156 Gin 205 Pro Phe Thr Glu Tyr 210 val Ile Ala Leu Arg 215 Cys Ala Val Lys Glu 220 tca aag ttc tgg agt gac tgg age caa gaa aaa atg gga atg act gag 1204 Ser Lys Phe Trp Ser 225 Asp Trp Ser Gin Glu 230 Lys Met Gly Met Thr 235 Glu gaa gaa gct cca tgt ggc ctg gaa ctg tgg aga gtc ctg aaa cca gct 1252 Glu Glu Ala Pro 240 Cys Gly Leu Glu Leu 245 Trp Arg Val Leu Lys 250 Pro Ala gag gcg gat gga aga agg cca gtg cgg ttg tta tgg aag aag gea aga 1300 Glu Ala Asp 255 Gly Arg Arg Pro Val 260 Arg Leu Leu Trp Lys 265 Lys Ala Arg gga gcc cca gtc cta gag aaa aca ctt ggc tac aac ata tgg tac tat 1348 Gly Ala 270 Pro val Leu Glu Lys 275 Thr Leu Gly Tyr Asn 280 Ile Trp Tyr Tyr cca gaa age aac act aac ctc aca gaa aca atg aac act act aac cag 1396 Pro 285 Glu Ser Asn Thr Asn 290 Leu Thr Glu Thr Met 295 Asn Thr Thr Asn Gin 300 cag ctt gaa ctg cat ctg gga ggc gag age ttt tgg gtg tct atg att 1444 Gin Leu Glu Leu His 305 Leu Gly Gly Glu Ser 310 Phe Trp val Ser Met 315 Ile tct tat aat tct ctt ggg aag tct cca gtg gcc acc ctg agg att cca 1492 Ser Tyr Asn Ser 320 Leu Gly Lys Ser Pro 325 Val Ala Thr Leu Arg 330 ile Pro gct att caa gaa aaa tca ttt cag tgc att gag gtc atg cag gcc tgc 1540 Ala Xle Gin Glu Lys Ser Phe Gin Cys Ile Glu Val Met Gin Ala Cys 318 335 340 345 9tt gct gag gac cag cta gtg gtg aag tgg caa age tet gct cta gac 1588 Vai Ala 350 Glu Asp Gin Leu Vai 355 Val Lys Trp Gin Ser 360 Ser Ala Leu Asp gtg aac act tgg atg att gaa tgg ttt ccg gat gtg gac tea gag ccc 1636 Vai 365 Asn Thr Trp Met Ile 370 Glu Trp Phe Pro Asp 375 Val Asp Ser Glu Pro 380 acc acc ctt tcc tgg gaa tet gtg tet cag gcc acg aac tgg acg ate 1684 Thr Thr Leu Ser Trp 385 Glu Ser Val Ser Gin 390 Ala Thr Asn Trp Thr 395 Ile cag caa gat aaa tta aaa cct ttc tgg tgc tat aac ate tet gtg tat 1732 Gin Gin Asp Lys 400 Leu Lys Pro Phe Trp 405 Cys Tyr Asn Ile Ser 410 Val Tyr cca atg ttg cat gac aaa gtt ggc gag cca tat tcc ate cag gct tat 1780 Pro Met Leu 415 His Asp Lys Vai Gly 420 Glu Pro Tyr Ser Ile 425 Gin Ala Tyr gcc aaa gaa ggc gtt cca tea gaa ggt cct gag acc aag gtg ffag aac 1828 Ala Lys 430 Glu Gly Vai Pro Ser 435 Glu Gly Pro Glu Thr 440 Lys Val Glu Asn att ggc gtg aag acg gtc acg ate aca tgg aaa gag att ccc aag agt 1876 Ile 445 Gly Vai Lys Thr Vai 450 Thr Ile Thr Trp Lys 455 Glu Ile Pro Lys Ser 460 gag aga aag ggt ate ate tgc aac tac acc ate ttt tac caa gct gaa 1924 I lê 465 — ne - _ Asn * nl_ _ Tyr /il u * 1 « ri 1 „ V>U1 «rg juyjj <~ys» »yr (Ui 470 uc rue Uill ma 475 VJ1U ggc gga aaa gga ttc tcc aag aca gtc aat tcc age ate ttg cag tac 1972 Gly Gly Lys Gly 480 Phe Ser Lys Thr Val 485 Asn Ser Ser He Leu 490 Gin Tyr ggc ccg gag tcc ctg aaa cga aag acc tet tac att gtt cag gtc atg 2020 Gly Leu Glu 495 Ser Leu Lys Arg Lys 500 Thr Ser Tyr Ile val 505 Gin Val Met gcc age acc agt gct ggg gga acc aac ggg acc age ata aat ttc aag 2068 Ala Ser 510 Thr Ser Ala Gly Gly 515 Thr Asn Gly Thr Ser 520 Ile Asn Phe Lys aca ttg tea ttc agt gtc ttt gag att ate ctc ata act tet ctg att 2116 Thr 525 Leu Ser Phe Ser Vai 530 Phe Glu Ile Ile Leu 535 Ile Thr Ser Leu Ile 540 ggt gga ggc ctt ctt att ctc att ate ctg aca gtg gea tat ggt ctc 2164 Gly Gly Gly Leu Leu 545 Ile Leu Ile Ile Leu 550 Thr Val Ala Tyr Gly 555 Leu aaa aaa ccc aac aaa ttg act cat ctg tgt tgg ccc acc gtt ccc aac 2212 Lys Lys Pro Asn 560 Lys Leu Thr His Leu 565 Cys Trp Pro Thr Val 570 Pro Asn cct gct gaa agt agt ata gcc aca tgg cat gga gat gat ttc aag gat 2260 Pro Ala Glu 575 Ser Ser Ile Ala Thr 580 Trp His Gly Asp Asp 585 Phe Lys Asp aag cta aac ctg aag gag tet gac gac tet gtg aac aca gaa gac agg 2308 319 319 Lys Leu 590 Asn Leu Lys Glu Ser 595 Asp Asp Ser Vai Asn 600 Thr Glu ASP Arg ate Cta aaa cca tgt tcc acc ccc agt gac aag ttg gtg att gac aag Ile 605 Leu Lys Pro Cys Ser 610 Thr Pro Ser Asp Lys 615 Leu Vai Ile Asp Lys 620 ttg gtg gtg aac ttt ggg aat gtt ctg caa gaa att ttc aca gat gaa Leu Vai vai Asn Phe 625 Gly Asn Vai Leu Gin 630 Glu ile Phe Thr Asp 635 Glu gee aga acg ggt cag gaa aac aat tta gga 999 gaa aag aat ggg act Ala Arg Thr Gly 640 Gin Glu Asn Asn Leu 645 Gly Gly Glu Lys Asn 650 Gly Thr aga Arg att Ile ctg Leu 655 tet Ser tcc Ser tgc Cys cca Pro act Thr 660 tea Ser ata Ile taagtgtgga ctaaaatgcg 2356 2404 2452 2502 2562 2622 2682 2742 2802 2862 2903 agaaaggtgt cctgtggtct atgcaaatta gaaaggacat gcagagtttt ccaactagga agactgaatc tgtggcccca agagaaccac ctctgaagac tgggtatgtg gtcttttcca cacatggacc acctacggat gcaatctgta atgcatgtgc atgagaagtc tgttattaag tagagtgtga aaacatggCC atggtaatag gaacagctCt taaaatgctt ttgtatttgg gcccttcata caaaaaagcc ataataccat tttcatgtaa tgctatactt ctatactatt ttcatgtaat actatacttc tatactattt tcatgtaata ctatacttct atactatttt cacgtaatac tatacttcta tattaaagtt ttacccactc a

<210> 5 <211> 662 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 320

Met 1 Lys Leu Ser Pro 5 Gin Pro Ser Cys Vai 10 Asn Leu Gly Met Met 15 Trp Thr Trp Ala Leu 20 Trp Met Leu Pro Ser 25 Leu Cys Lys Phe Ser 30 Leu Ala Ala Leu Pro 35 Ala Lys Pro Glu Asn 40 ile Ser Cys Val Tyr 45 Tyr Tyr Arg Lys Asn 50 Leu Thr Cys Thr Trp 55 Ser Pro Gly Lys Glu 60 Thr Ser Tyr Thr Gin €5 Tyr Thr Vai Lys Arg 70 Thr Tyr Ala Phe Gly 75 Glu Lys His Asp Asn 80 Cys Thr Thr Asn Ser 85 Ser Thr Ser Glu Asn 90 Arg Ala Ser Cys Ser 95 Phe Phe Leu Pro Arg 100 Ile Thr Ile Pro Asp 105 Asn Tyr Thr Ile Glu 110 Val Glu Ala Glu Asn 115 Gly Asp Gly Vai Ile 120 Lys Ser His Met Thr 125 Tyr Trp Arg Leu Glu 130 Asn Ile Ala Lys Thr 135 Glu Pro Pro Lys Ile 140 Phe Arg Val Lys Pro 145 Vai Leu Gly Ile Lys 150 Arg Met Ile Gin ile 155 Glu Trp Ile Lys Pro 160 Glu Leu Ala Pro Vai 165 Ser Ser Asp Leu Lys 170 Tyr Thr Leu Arg Phe 175 Arg Thr Vai Asn Ser 180 Thr Ser Trp Met Glu 185 Vai Asn Phe Ala Lys 190 Asn Arg Lys Asp Lys 195 Asn Gin Thr Tyr Asn 200 Leu Thr Gly Leu Gin 205 Pro Phe Thr Glu Tyr 210 Vai Ile Ala Leu Arg 215 Cys Ala Vai Lys Glu 220 Ser Lys Phe Trp Ser 225 Asp Trp Ser Gin Glu 230 Lys Met Gly Met Thr 235 Glu Glu Glu Ala Pro 240 321 cys Gly Leu Glu Leu 245 Trp Arg Val Leu Lys 2S0 Pro Ala Glu Ala Asp 255 Gly Arg Arg Pro Val 260 Arg Leu Leu Trp Lys 265 Lys Ala Arg Gly Ala 270 Pro Val Leu Glu Lys 275 Thr Leu Gly Tyr Asn 280 Ile Trp Tyr Tyr Pro 285 Glu Ser Asn Thr Asn 290 Leu Thr Glu Thr Met 29S Asn Thr Thr Asn Gin 300 Gin Leu Glu Leu His 305 Leu Gly Gly Glu Ser 310 Phe Trp Val Ser Met 315 Ile Ser Tyr Asn Ser 320 Leu Gly Lys Ser Pro 325 Val Ala Thr Leu Arg 330 Ile Pro Ala Ile Gin 335 Glu Lys Ser Phe Gin 340 Cys Ile Glu Val Met 345 Gin Ala Cys Val Ala 350 Glu Asp Gin Leu Vai 355 Val Lys Trp Gin Ser 360 Ser Ala Leu Asp Val 365 Asn Thr Trp Met Ile 370 Glu Trp Phe Pro Asp 375 Val Asp Ser Glu Pro 380 Thr Thr Leu Ser Trp 385 Glu Ser Val Ser Gin 390 Ala Thr Asn Trp Thr 395 Ile Gin Gin Asp Lys 400 Leu Lys Pro Phe Trp 405 Cys Tyr Asn Ile Ser 410 Val Tyr Pro Met Leu 415 His Asp Lys val Gly 420 Glu Pro Tyr Ser Ile 425 Gin Ala Tyr Ala Lys 430 Glu Gly vai Pro Ser 435 Glu Gly Pro Glu Thr 440 Lys Val Glu Asn lie 445 Gly Val Lys Thr Vai 450 Thr Ile Thr Trp Lys 455 Glu Ile Pro Lys Ser 460 Glu Arg Lys Gly Ile 465 lie Cys Asn Tyr Thr 470 Ile Phe Tyr Gin Ala 475 Glu Gly Gly Lys Gly 480 Phe Ser Lys Thr Val 485 Asn Ser Ser Ile Leu 490 Gin Tyr Gly Leu Glu 495 Ser Leu Lys Arg Lys 500 Thr Ser Tyr Ile Val 505 Gin Val Met Ala Ser 510 Thr Ser Ala Gly Gly 515 Thr Asn Gly Thr Ser 520 Ile Asn Phe Lys Thr 525 Leu Ser Phe Ser Vai 530 Phe Glu Ile Ile Leu 535 Ile Thr Ser Leu Ile 540 Gly Gly Gly Leu Leu 545 Ile Leu Ile Ile Leu 550 Thr Val Ala Tyr Gly 555 Leu Lys Lys Pro Asn 560 Lys Leu Thr His Leu 565 Cys Trp Pro Thr Val 570 Pro Asn Pro Ala Glu 575 Ser Ser Ile Ala Thr 580 Trp His Gly Asp Asp S85 Phe Lys Asp Lys Leu 590 Asn Leu Lys Glu ser 595 Asp Asp Ser Val Asn 600 Thr Glu Asp Arg Ile 605 Leu Lys Pro Cys Ser 610 Thr Pro Ser Asp Lys 615 Leu val Ile Asp Lys 620 Leu Val Val Asn Phe 625 Gly Asn Val Leu Gin 630 Glu Ile Phe Thr Asp 635 Glu Ala Arg Thr Gly 640 Gin Ser Glu Cys Asn Pro Asn Thr 660 Leu 645 Ser Gly Ile Gly Glu Lys Asn 650 Gly Thr Arg ile Leu 655 Ser

<210> 6 <211> 4171 <212> ADN 322 <213> Homo sapiens <22 0>

<221> CDS <222> (368)...(3304) <400> 6 323 gggccgcctc tgcacgtccg ccccggagcc cgcacccgcg ccccacgcgc cgccgaggac 60 ccggcccggc tcgtggagcc cttcgcccgc ggcgtgagta cccccgaccc gcccgtcccc 120 gctctgctcg cgccctgccg ctgcgccgcc ctcggtggct tttccgacgg gcgagccccg 180 tgctgtgcgg gaaagaatcc gacaacttcg cagcccatcc cggctggacg cgaccgggag 240 tgcagcagcc cgtteecctc ctcggtgccg cctctgccca gcgtttgctt ggctgggcta 300 ccacctgcgc tcggacggcg ctcggagggt cctcgceecc ggcctgccta cccgaaaacc 360 agaactg atg Met 1 gct Ala cta Leu ttt Phe gea Ala 5 gtc Val ttt Phe cag Gin aca Thr aca Thr 10 ttc Phe ttc Phe tta Leu aca Thr 409 ttg ctg tcc ttg agg act tac cag agt gaa gtc ttg gct gaa cgt tta 457 Leu IS Leu Ser Leu Arg Thr 20 Tyr Gin Ser Glu Val 25 Leu Ala Glu Arg Leu 30 cca ttg act cct gta tea ctt aaa 9tt tcc acc aat tct acg cgt cag 505 Pro Leu Thr Pro Val 35 Ser Leu Lys val Ser 40 Thr Asn Ser Thr Arg 45 Gin agt ttg cac tta caa tgg act gtc cac aac ctt cct tat cat cag gaa 553 Ser Leu His Leu 50 Gin Trp Thr Val His 55 Asn Leu Pro Tyr His 60 Gin Glu ttg aaa atg gta ttt cag ate cag ate agt agg att gaa aca tcc aat 601 Leu Lys Met 65 Val Phe Gin Ile Gin 70 He Ser Arg Ile Glu 75 Thr Ser Asn gtc ate tgg gtg 999 aat tac age acc act gtg aag tgg aac cag gtt 649 Val Ile 80 Trp Val Gly Asn Tyr 85 Ser Thr Thr Val Lys 90 Trp Asn Gin Val ctg cat tgg age tgg gaa tct gag ctc cct ttg gaa tgt gee aca cac 697 Leu 95 His Trp Ser Trp Glu 100 Ser Glu Leu Pro Leu 105 Glu Cys Ala Thr His 110 ttt gta aga ata aag agt ttg gtg gac gat gee aag ttc cct gag cca 745 Phe Val Arg Ile Lys 115 Ser Leu Val Asp Asp 120 Ala Lys Phe Pro Glu 125 Pro aat ttc tgg age aac tgg agt tcc tgg gag gaa gtc agt gta caa gat 793 Asn Phe Trp Ser 130 Asn Trp Ser Ser Trp 135 Glu Glu Val Ser Val 140 Gin Asp tct act gga cag gat ata ttg ttc 9tt ttc cct aaa gat aag ctg gtg 841 Ser Thr Gly 145 Gin Asp ile Leu Phe 150 Val Phe Pro Lys Asp 155 Lys Leu Val gaa gaa ggc acc aat gtt acc att tgt tac gtt tct agg aac att caa 889 Glu Glu 160 Gly Thr Asn Val Thr 165 Ile Cys Tyr Val Ser 170 Arg Asn Ile Gin aat aat gta tcc tgt tat ttg gaa 999 aaa cag att Cat gga gaa caa 937 Asn 175 Asn Val Ser Cys Tyr 180 Leu Glu Gly Lys Gin 185 Ile His Gly Glu Gin 190 ctt gat cca cat gta act gea ttc aac ttg aat agt gtg cct ttc att 985 Leu ASp Pro His Val 195 Thr Ala Phe Asn Leu 200 Asn Ser val Pro Phe 205 Ile agg aat aaa ggg aca aat ate tat tgt gag gea agt caa gga aat gtc 1033 Arg Asn Lys Gly Thr Asn Ile Tyr Cys Glu Ala Ser Gin Gly Asn Val 324 210 215 220 agt gaa 99C atg aaa ggc ate gtt ctt ttt gtc tea aaa gta ctt gag 1081 Ser Glu Gly 225 Met Lys Gly lie Val 230 Leu Phe Val Ser Lys 235 Val Leu Glu gag ccc aag gac ttt tet tgc gaa acc gag gac ttc aag act ttg cac 1129 Glu Pro 240 Lys Asp Phe Ser Cys 245 Glu Thr Glu Asp Phe 250 Lys Thr Leu His tgc aet tgg gat cct ggg acg gac act gee ttg ggg tgg tet aaa caa 1177 Cys 255 Thr Trp Asp Pro Gly 260 Thr Asp Thr Ala Leu 265 Gly Trp Ser Lys Gin 270 cct tcc caa age tac act tta ttt gaa tea ttt tet ggg gaa aag aaa 1225 Pro Ser Gin Ser Tyr 275 Thr Leu Phe Glu Ser 280 Phe Ser Gly Glu Lys 285 Lys ctt tgt aca cac aaa aac tgg tgt aat tgg caa ata act caa gac tea 1273 Leu Cys Thr His 290 Lys Asn Trp Cys Asn 295 Trp Gin Ile Thr Gin 300 Asp Ser caa gaa acc tat aac ttc aca ctc ata gct gaa aat tac tta agg aag 1321 Gin Glu Thr 305 Tyr Asn Phe Thr Leu 310 Ile Ala Glu Asn Tyr 315 Leu Arg Lys aga agt gtc aat ate ctt ttt aac ctg act cat cga gtt tat tta atg 1369 Arg Ser 320 Val Asn lie Leu Phe 325 Asn Leu Thr His Arg 330 Val Tyr Leu Met aat cct ttt agt gtc aac ttt gaa aat gta aat gee aca aat gee ate 1417 Asn 335 Pro Phe Ser Val Asn 340 Phe Glu Asn Val Asn 345 Ala Thr Asn Ala Ile 350 afcg acc tgg aag gtg cac tcc ata agg aat aat ttc aca tat ttg tgt 1465 Met Thr Trp Lys Val 355 His Ser Xle Arg Asn 360 Asn Phe Thr Tyr Leu 365 Cys cag att gaa ctc cat ggt gaa gga aaa atg atg caa tac aat gtt tcc 1513 Gin Ile Glu Leu 370 His Gly Glu Gly Lys 375 Met Met Gin Tyr Asn 380 Val Ser ate aag gcg aac ggt gag tac ttc tta agt gaa ctg gaa cct gee aca 1561 Ile Lys Val 385 Asn Gly Glu Tyr Phe 390 Leu Ser Glu Leu Glu 395 Pro Ala Thr Gag tac atg gcg cga gta cgg tgt gct gat gee age cac ttc tgg aaa 1609 Glu Tyr 400 Met Ala Arg Val Arg 405 Cys Ala Asp Ala Ser 410 His Phe Trp Lys tgg agt gaa tgg agt ggt cag aac ttc acc aca ctt gaa gct gct ccc 1657 Trp 415 Ser Glu Trp Ser Gly 420 Gin Asn Phe Thr Thr 425 Leu Glu Ala Ala Pro 430 tea gag gee cct gat gtc tgg aga att gtg age ttg gag cca gga aat 1705 Ser Glu Ala Pro Asp 435 Val Trp Arg Ile Val 440 Ser Leu Glu Pro Gly 445 Asn cat act gcg acc tta ctc cgg aag cca tta tea aaa ctg cat gee aat 1753 His Thr Val Thr 450 Leu Phe Trp Lys Pro 455 Leu Ser Lys Leu His 460 Ala Asn 99a aag ate ctg ttc tac aat gta gtt gta gaa aac cta gac aaa cca 1801 325

Gly Lys lie 465 Leu Phe Tyr Asn Val 470 Val Val Glu Asn Leu 475 Asp Lys Pro tcc agt cca gag ctc cat tcc att cca gea cca gee aac age aca aaa 1849 Ser Ser 480 Ser Glu Leu His Ser 485 ile Pro Ala Pro Ala 490 Asn Ser Thr Lys cta ate ctt gac agg tgt ccc tac caa ate tgc gtc ata gee aac aac 1897 Leu 495 Ile Leu Asp Arg Cys 500 Ser Tyr Gin ile Cys 505 Val Ile Ala Asn Asn 510 agt Gtg GGt gct tet cct gct tet gta ata gtc ate tet gea gac ccc 1945 Ser Vai Gly Ala Ser 515 Pro Ala Ser val Ile 520 Val Ile Ser Ala Asp 525 Pro gaa aac aaa gag gtt gag gaa gaa aga att gea ggc aca gag ggt gga 1993 Glu Asn Lys Glu 530 Vai Glu Glu Glu Arg 535 Ile Ala Gly Thr Glu 540 Gly Gly ttc tet ctg Cct tgg aaa ccc caa cct gga gat gtt ata ggc tat gtt 2041 Phe Ser Leu 545 Ser Trp Lys Pro Gin 550 Pro Gly Asp Val lie 555 Gly Tyr Val gtg gac tgg tgt gac cat acc cag gat gtg ctc ggt gat ttc cag tgg 2089 Vai Asp 560 Trp Cys Asp His Thr 565 Gin Asp Val Leu Gly 570 Asp Phe Gin Trp aag aac gta ggt ccc aat acc aca age aca gtc att age aca gat gct 2137 Lys 575 Asn Vai Gly Pro Asn 580 Thr Thr Ser Thr Val 585 Ile Ser Thr Asp Ala 590 tcc agg cca gga gtt cga tat gac ttc aga att tat ggg tta tet aca 2185 Pbe Arg Pro Gly Vai 595 Arg Tyr Asp Phe Arg 600 Ile Tyr Gly Leu Ser 605 Thr aaa aGG att gct tgt tta tta gag aaa aaa aca gga tac tet cag gaa 2233 Lys Arg Ile Ala 610 Cys Leu Leu Glu Lys 615 Lys Thr Gly Tyr Ser 620 Gin Glu ccc gct cct cca gac aac cct cac gtg ctg gtg gat aca ttg aca tcc 2281 Leu Ala Pro 625 Ser Asp Asn Pro His 630 Val Leu Val Asp Thr 635 Leu Thr Ser cac tcc ttc act ctg agt tgg aaa gat tac tet act gaa tet caa cct 2329 His Ser 640 Phe Thr Leu Ser Trp 645 Lys Asp Tyr Ser Thr 650 Glu Ser Gin Pro ggt ttt ata caa ggg tac cat gtc tat ctg aaa tcc aag gcg agg cag 2377 Gly 655 Phe Ile Gin Gly Tyr 660 His Val Tyr Leu Lys 665 Ser Lys Ala Arg Gin 670 Cgc cac cca cga ttt gaa aag gea gtt ctt tea gat ggt tea gaa tgt 2425 Cys His Pro Arg Phe 675 Glu Lys Ala Val Leu 680 Ser Asp Gly Ser Glu 685 Cys cgc aaa cac aaa att gac aac ccg gaa gaa aag gea ttg att gtg gac 2473 Cys Lys Tyr Lys 690 Ile Asp Asn Pro Glu 695 Glu Lys Ala Leu lie 700 Val Asp aac cta aag cca gaa tcc ttc tat gag ttt ttc ate act cca ttc act 2521 Asn Leu Lys 705 Pro Glu Ser Phe Tyr 710 Glu Phe Phe Ile Thr 71S Pro Phe Thr 326 agt Ser gct Ala 720 ggt Gly gaa Glu ggc Gly ccc Pro agt Ser 725 gct acg Ala Thr ttc Phe acg Thr aag Lys 730 gtc val acg Thr act Thr ccg Pro 2569 gat Asp 735 gaa Glu cac His tcc Ser tcg Ser atg Met 740 ctg Leu att Ile cat His ate Ile cta Leu 745 ctg Leu ccc Pro atg Met gtt Val ttc Phe 750 2617 tgc Cys gtc Vai ttg Leu ctc Leu ate Ile 755 atg Met gtc Vai atg tgc Met Cys tac Tyr 760 ttg Leu aaa Lys agt Ser cag Gin tgg Trp 765 ate Ile 2665 aag Lys gag Glu acc Thr tgt Cys 770 tat Tyr cct Pro gac Asp ate Ile cct Pro 775 gac Asp cct Pro tac Tyr aag Lys age Ser 780 age Ser ate Ile 2713 ctg Leu tca Ser tta Leu 785 ata lie aaa Lys ttc Phe aag Lys gag aac Glu Asn 790 cct Pro cac His cta Leu ata Ile 795 ata Ile atg Met aat Asn 2761 gtc Vai agt Ser 800 gac Asp tgt Cys ate Ile cca Pro gat Asp 805 gct Ala att Ile gaa Glu gtt Val gta Val 810 age Ser aag Lys cca Pro gaa Glu 2809 ggg aca Gly Thr 815 aag Lys ata Ile cag Gin ttc Phe 820 cta Leu ggc act Gly Thr agg Arg aag Lys 825 tca Ser ctc Leu aca Thr gaa Glu acc Thr 830 2857 gag Glu ttg Leu act Thr aag Lys cct Pro 83S aac Asn tac Tyr ctt Leu tat Tyr ctc Leu 840 ctt Leu cca Pro aca Thr gaa Glu aag Lys 845 aat Asn 2905 cac His tct Ser ggc Gly cct Pro 850 ggc Gly ccc Pro tgc Cys ate Ile tgt Cys 855 ttt Phe gag Glu aac Asn ttg Leu acc Thr 860 tat Tyr aac Asn 2953 cag Gin gca Ala gct Ala 865 tct Ser gac Asp tct Ser ggc Gly tct tgt Ser Cys 870 ggc Gly cat His gtt Val cca Pro 875 gta Val tcc Ser cca Pro 3001 aaa Lys gcc Ala 880 cca Pro agt Ser atg Met ctg Leu gga Gly 885 cta Leu atg Met acc Thr tca Ser cct Pro 890 gaa Glu aat Asn gta Val cta Leu 3049 aag Lys 895 gca Ala cta Leu gaa Glu aaa Lys aac Asn 900 tac Tyr atg Met aac Asn tcc Ser ctg Leu 905 gga Gly gaa Glu ate Ile cca Pro gct Ala 910 3097 gga gaa Gly Glu aca Thr agt Ser ttg Leu 915 aat Asn tat Tyr 9tg Vai tcc Ser cag Gin 920 ttg Leu gct Ala tca Ser ccc Pro atg Met 925 ttt Phe 3145 gga Gly gac Asp aag Lys gac Asp 930 age Ser ctc Leu cca Pro aca Thr aac Asn 935 cca Pro gta Val gag Glu gca Ala cca Pro 940 cac His tgt Cys 3193 tca Ser gag Glu tat Tyr 945 aaa Lys atg Met caa Gin atg Met gca Ala 950 gtc Vai tcc Ser ctg Leu cgt Arg ctt Leu 9S5 gcc Ala ttg Leu cct Pro 3241 ccc Pro ccg Pro 960 acc Thr gag Glu aat Asn age Ser age Ser 965 ctc Leu tcc Ser tca Ser att Ile acc Thr 970 ctt Leu tta Leu gat Asp cca Pro 3289 327 ggc gaa cac tac tgc taaccagcat gccgatctca taccttatgc tacacagaca 3344

Gly Glu His Tyr Cys

97S tcaagaagag cagagctggc accctgtcat caatttgcag gtctggctta tataagacca ctatggaact taacactccc cattggagca agcatgccta ccttctgctg tttgttccag gacctaagga tatgcattaa ccaccctaca gtggtcctag aagttcagtt tttactgagg tgaaggcttt aataaaggcc acaggagaca ttactgagcg tgttttataa aaaactcaca tacctcgaac ggataagaat ctatagtCca gggcgggggg catagctcta atctaatata acaattcctc tgtcaagctt actacagtga tactgtcagt tgtactCctg ctccatagac acctcagaac ataaaaagga acgtatatca ttttctttca agaactatat ataaatgacc caccagtggc cttggtcett aatcccagta 3404 ctacagcctg gctaggttaa aggccagagg 3464 agcttgcccc agagacggea ggatcatggg 3524 gctcaccttt agaacaggag acttgagctt 3S84 gactcccact cagcactgta cagggtggct 3644 aaatattccc attaacagca attattatat 3704 ttactatagc atagattgtc aaatgtaaat 3764 ggtgtttgag gccaaaacag attttagact 3824 ccgacacagt aaaatcaacc ctgtgggtgg 3884 taaaatgcgt gatgaatcaa caagattccc 3944 aagaatggga ttggcaagta acttctgact 4004 atcagtattc tgccatcatt tttgatgact 4064 cataattcca gtcacagttt teggttcctc 4124 tgttttcacg cggccgc 4171

<210> 7 <211> 979 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 328

Met 1 Ala Leu Phe Ala 5 Vai Phe Gin Thr Thr 10 Phe Phe Leu Thr Leu 15 Leu Ser Leu Arg Thr 20 Tyr Gin Ser Glu Vai 25 Leu Ala Glu Arg Leu 30 Pro Leu Thr Pro Vai 35 Ser Leu Lys Vai Ser 40 Thr Asn Ser Thr Arg 45 Gin Ser Leu His Leu 50 Gin Trp Thr Vai His 55 Asn Leu Pro Tyr His 60 Gin Glu Leu Lys Met €5 Vai Phe Gin Ile Gin 70 Ile Ser Arg Ile Glu 75 Thr Ser Asn Val Ile 80 Trp Vai Gly Asn Tyr 85 Ser Thr Thr Vai Lys 90 Trp Asn Gin Val Leu 95 His Trp Ser Trp Glu 100 Ser Glu Leu Pro Leu 105 Glu Cys Ala Thr His 110 Phe val Arg Ile Lys 115 ser Leu Vai Asp Asp 120 Ala Lys Phe Pro Glu 125 Pro Asn Phe Trp Ser 130 Asn Trp Ser Ser Trp 135 Glu Glu Val Ser Val 140 Gin Asp Ser Thr Gly 145 Gin Asp He Leu Phe 150 Vai Phe Pro Lys Asp 155 Lys Leu Val Glu Glu 160 Gly Thr Asn Vai Thr 165 Ile Cys Tyr Vai Ser 170 Arg Asn Ile Gin Asn 175 Asn Vai Ser Cys Tyr ISO Leu Glu Gly Lys Gin 18S Ile His Gly Glu Gin 190 Leu Asp Pro His Vai 195 Thr Ala Phe Asn Leu 200 Asn Ser Val Pro Phe 20S Ile Arg Asn Lys Gly 210 Thr Asn Ile Tyr Cys 215 Glu Ala Ser Gin Gly 220 Asn Val Ser Glu Gly 225 Met Lys Gly Ile Vai 230 Leu Phe Val Ser Lys 235 Val Leu Glu Glu Pro 240 Lys Asp Phe Ser Cys 245 GlU Thr Glu Asp Phe 250 Lys Thr Leu His Cys 255 Thr Trp Asp pro Gly 260 Thr Asp Thr Ala Leu 265 Gly Trp Ser Lys Gin 270 Pro Ser Gin Ser Tyr 275 Thr Leu Phe Glu Ser 280 Phe Ser Gly Glu Lys 285 Lys Leu Cys Thr His Lys Asn Trp Cys Asn Trp Gin Ile Thr Gin Asp Ser Gin Glu 329

Thr 290 Tyr Asn Phe 305 Vai Asn Ile Leu Phe Ser Vai Asn Trp Lys Vai 340 His Glu Leu 355 His Gly Vai 370 Asn Gly Glu 385 Met Ala Arg Vai Glu Trp Ser Gly Ala Pro Asp 420 Vai Vai Thr 435 Leu Phe He 450 Leu Phe Tyr 465 Ser Glu Leu His Leu Asp Arg Cys Gly Ala Ser 500 Pro Lys Glu 515 Vai Glu Lcii 530 r —--- Lys 545 Trp Cys Asp His Vai Gly Pro Asn Pro Gly Vai 580 Arg Ile Ala 595 Cys Leu Pro 610 Ser Asp Asn 625 Phe Thr Leu Ser He Gin Gly Tyr Pro Arg Phe 660 Glu Tyr Lys 675 Ile Asp Lys 690 Pro Glu Ser 705 Gly Glu Gly Pro His Ser Ser Met Leu Leu Ile 740 Met Thr Cys 755 Tyr Pro Leu 770 Ile Lys Phe 785 295 Thr Leu 310 He Ala Phe 325 Asn Leu Thr Phe Glu Asn Val Ser Ile Arg Asn 360 Glu Gly Lys 375 Met Tyr Phe 390 Leu Ser Arg 405 Cys Ala Asp Gin Asn Phe Thr Trp Arg Ile val 440 Trp Lys Pro 455 Leu Asn Val 470 Val Val Ser 485 Ile Pro Ala Ser Tyr Gin Ile Ala Ser Val Ile 520 Glu Glu Arg 535 Ile n.A a Λ9 * . ri v VIU 550 riv VJ-JT Thr 565 Gin ASP Val Thr Thr Ser Thr Tyr Asp Phe Arg 600 Leu Glu Lys 615 Lys Pro His 630 Val Leu Trp 645 Lys Asp Tyr His Val Tyr Leu Lys Ala Val Leu 680 Asn Pro Glu 695 Glu Phe Tyr 710 Glu Phe Ser 725 Ala Thr Phe Leu Ile His Ile vai Met Cys Tyr 760 Asp He Pro 775 Asp Lys Glu 790 Asn Pro 300 Glu Asn Tyr 315 Leu His Arg 330 Val Tyr Asn 345 Ala Thr Asn Asn Phe Thr Tyr Met Gin Tyr Asn 380 Glu Leu Glu 395 Pro Ala Ser 410 His Phe Thr 425 Leu Glu Ala Ser Leu Glu Pro Ser Lys Leu His 460 Glu Asn Leu 475 ASp Pro Ala 490 Asn Ser Cys 505 Val Ile Ala Val He Ser Ala Ala Gly Thr Glu 540 X A9£/ HaT t1 « Λ1.. vai 14« 555 \jijr Leu Gly 570 Asp Phe Val S85 Ile Ser Thr Ile Tyr Gly Leu Thr Gly Tyr Ser 620 Val Asp Thr 635 Leu Ser Thr 650 Glu Ser Lys 665 Ser Lys Ala Ser Asp Gly Ser Lys Ala Leu He 700 Phe Ile Thr 715 Pro Thr Lys 730 Val Thr Leu 745 Leu Pro Met Leu Lys Ser Gin Pro Tyr Lys Ser 780 His Leu Ile 795 Ile

Arg Lys Arg Ser 320 Leu Met Asn 335 Pro Ala Ile 350 Met Thr Leu 365 Cys Gin He Val Ser Ile Lys Ala Thr Glu Tyr 400 Trp Lys Trp 415 Ser Ala Pro 430 Ser Glu Gly 445 Asn His Thr Ala Asn Gly Lys Lys Pro Ser Ser 480 Thr Lys Leu 495 Ile Asn Asn S10 Ser Val Asp 525 Pro Glu Asn Gly Gly Phe Ser «vw AjfA i r« Λ λ AB^ 560 vaA ναι Gin Trp Lys 575 Asn Asp Ala 590 Phe Arg Ser 605 Thr Lys Arg Gin Glu Leu Ala Thr Ser His Ser 640 Gin Pro Gly 655 Phe Arg Gin 670 Cys His Glu 685 Cys Cys Lys Val Asp Asn Leu Phe Thr Ser Ala 720 Thr Pro Asp 735 Glu Val Phe 750 Cys Val Trp 765 Ile Lys Glu Ser Ile Leu Ser Met Asn Val Ser 800 330 330 ASp Cys Ile Pro Asp 805 Ala Ile Glu Vai Vai 810 Ser Lys Pro Glu Gly 815 Thr Lys Ile Gin Phe 820 Leu Gly Thr Arg Lys 825 Ser Leu Thr Glu Thr Glu 830 Leu Thr Lys Pro 83S Asn Tyr Leu Tyr Leu Leu 840 Pro Thr Glu Lys Asn His 845 Ser Gly Pro 850 Gly Pro Cys Ile Cys 85S Phe Glu Asn Leu Thr Tyr Asn Gin 860 Ala Ala 865 Ser Asp Ser Gly Ser Cys Gly His 870 Vai Pro Vai 875 Ser Pro Lys Ala 880 Pro Ser Met Leu Gly 885 Leu Met Thr Ser Pro 890 Glu Asn Vai Leu Lys 895 Ala Leu Glu Lys Asn 900 Tyr Met Asn Ser Leu Gly 905 Glu Ile Pro Ala Gly 910 Glu Thr Ser Leu 915 Asn Tyr Vai Ser Gin Leu 920 Ala Ser Pro Met Phe Gly 925 ASp Lys Asp 930 Ser Leu pro Thr Asn 935 Pro Vai Glu Ala Pro 940 His Cys Ser Glu Tyr 945 Lys Met Gin Met Ala Vai 950 Ser Leu Arg Leu 955 Ala Leu Pro Pro Pro 960 Thr Hls Glu Tyr Asn Cys Ser Ser 965 Leu Ser Ser Ile Thr 970 Leu Leu Asp Pro Gly 97S Glu

<210> 8 <211> 2657 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> CDS (133)...(2040) <221> <222> <40 0> 331 cggaggcggc ctgccggggt ggttcggctt cccgttgccg cctcgggcgc tgtacccaga 60 gctcgaagag gagcagcgcg gccgcgcgga cccggcaagg ctgggccgga ctcggggctc 120 ccgagggacg cc atg cgg gga ggc agg ggc gcc cct tcc tgg ctg cgg ccg 171 Met Arg Gly Gly Arg Gly Ala Pro Phe Trp Leu Trp Pro 15 10 ctg ccc aag ctg gcg ctg ctg cct ctg ttg tgg gtg ctt ttc cag cgg 219 Leu Pro 15 Lys Leu Ala Leu Leu 20 Pro Leu Leu Trp Val 25 Leu Phe Gin Arg acg cgt ccc cag ggc age gcc ggg cca ctg cag tgc tac gga gtt gga 267 Thr 30 Arg Pro Gin Gly Ser 35 Ala Gly Pro Leu Gin 40 Cys Tyr Gly Val Gly 45 ccc ttg ggc gac ttg aac tgc teg tgg gag cct ctt ggg gac ctg gga 315 Pro Leu Gly Asp Leu 50 Asn Cys Ser Trp Glu 55 Pro Leu Gly Asp Leu 60 Gly gcc ccc tcc gag tta cac ctc cag age caa aag tac cgt tcc aac aaa 363 Ala Pro Ser Glu 65 Leu His Leu Gin Ser 70 Gin Lys Tyr Arg Ser 75 Asn Lys acc cag act gtg gca gtg gca gcc gga cgg age tgg gtg gcc act cct 411 Thr Gin Thr 80 Vai Ala Val Ala Ala 85 Gly Arg Ser Trp Val 90 Ala lie Pro cgg gaa cag ctc acc atg tet gac aaa ccc ctt gtc tgg ggc act aag 459 332

Arg Glu 95 Gin Leu Thr Met Ser 100 Asp Lys Leu Leu Val 105 Trp Gly Thr Lys gca ggc cag cct ctc tgg ccc ccc gtc ttc gtg aac cta gaa acc caa 507 Ala Gly 110 Gin Pro Leu Trp 115 Pro Pro Val Phe val 120 Asn Leu Glu Thr Gin 125 atg aag cca aac gcc ccc cgg ctg ggc cct gac gtg gac ttt tcc gag 555 Met Lys Pro Asn Ala 130 Pro Arg Leu Gly Pro 135 Asp val Asp Phe Ser 140 Glu gat gac ccc ctg gag gcc act gtc cat tgg gcc cca cct aca tgg cca 603 Asp Asp Pro Leu 145 Glu Ala Thr Val His 150 Trp Ala Pro Pro Thr 155 Trp Pro tct cat aaa gtt ctg ate tgc cag ttc cac tac cga aga tgt cag gag 651 Ser His Lys 160 Val Leu Ile Cys Gin 165 Phe His Tyr Arg Arg 170 Cys Gin Glu gcg gcc tgg acc ctg ctg gaa ccg gag ctg aag acc ata ccc ctg acc 699 Ala Ala 175 Trp Thr Leu Leu Glu 180 Pro Glu Leu Lys Thr 185 Xle Pro Leu Thr cct gtt gag ate caa gat ttg gag cta gcc act ggc tac aaa gtg tat 747 Pro Vai 190 Glu Xle Gin Asp 195 Leu Glu Leu Ala Thr 200 Gly Tyr Lys Val Tyr 205 ggc cgc tgc cgg atg gag aaa gaa gag gat ttg tgg ggc gag tgg age 795 Gly Arg Cys Arg Met 210 Glu Lys Glu Glu Asp 215 Leu Trp Gly Glu Trp 220 Ser ccc att ttg tcc ttc cag aca ccg cct tct gct cca aaa gat gtg tgg 843 Pro Xle Leu Ser 225 Phe Gin Thr Pro Pro 230 Ser Ala Pro Lys Asp 235 Val Trp gta tca 009 aac ctc tgt ggg acg cct gga gga gag gaa cct ttg ctt 891 Vai Ser Gly 240 Asn Leu Cys Gly Thr 245 Pro Gly Gly Glu Glu 250 Pro Leu Leu cta tgg aag gcc cca ggg ccc tgt gtg cag gtg age tac aaa gtc tgg 939 Leu Trp 255 Lys Ala Pro Gly Pro 260 Cys Val Gin val Ser 265 Tyr Lys Val Trp ttc tgg gtt gga ggt cgt gag ctg agt cca gaa gga att acc tgc tgc 987 Phe Trp 270 val Gly Gly Arg 275 Glu Leu Ser Pro Glu 280 Gly ile Thr Cys Cys 285 tgc tcc cta att ccc agt ggg gcg gag tgg gcc agg gtg tcc gct gtc 1035 Cys Ser Leu Ile Pro 290 Ser Gly Ala Glu Trp 295 Ala Arg Val Ser Ala 300 Val aac gcc aca age tgg gag cct ctc acc aac ctc tct ttg gtc tgc ttg 1083 Asn Ala Thr Ser 305 Trp Glu Pro Leu Thr 310 Asn Leu Ser Leu Val 315 Cys Leu gat tca gcc tct gcc ccc cgt age gtg gca gtc age age ate gct ggg 1131 Asp Ser Ala 320 Ser Ala Pro Arg Ser 325 Val Ala Val Ser Ser 330 Ile Ala Gly age acg gag cta ctg gtg acc tgg caa ccg ggg cct ggg gaa cca ctg 1179 Ser Thr 335 Glu Leu Leu Val Thr 340 Trp Gin Pro Gly Pro 345 Gly Glu Pro Leu 1227 333 1227 333 gag cat gta gtg gac tgg gct cga gat ggg gac ccc ctg gag aaa ctc Glu 350 His Vai Vai Asp Trp 355 Ala Arg Asp Gly Asp 360 Pro Leu Glu Lys Leu 365 aac tgg gtc cgg ctt ccc cct ggg aac etc agt gct ctg tta cca ggg Asn Trp Vai Arg Leu 370 Pro Pro Gly Asn Leu 375 Ser Ala Leu Leu Pro 380 Gly aat ttc act gtc ggg gtc ccc tat cga ate act gtg acc gea gtc tet Asn Phe Thr Vai 385 Gly Vai Pro Tyr Arg 390 Ile Thr Val Thr Ala 395 Val Ser gct tea ggc ttg gee tet gea tcc tcc gtc tgg ggg ttc agg gag gaa Ala Ser Gly 400 Leu Ala ser Ala Ser 405 Ser Val Trp Gly Phe 410 Arg Glu Glu tta gea CCC cta gtg ggg cca acg ctt cgg cga ccc caa gat gee cct Leu Ala 415 Pro Leu vai Gly Pro 420 Thr Leu Trp Arg Leu 425 Gin Asp Ala Pro cca ggg acc ccc gee ata gcg tgg gga gag gtc cca agg cac cag ctt Pro 430 Gly Thr Pro Ala He 435 Ala Trp Gly Glu Val 440 Pro Arg His Gin Leu 445 cga ggc cac ctc acc cac tac acc ttg tgt gea cag agt gga acc age Arg Gly His Leu Thr 450 His Tyr Thr Leu Cys 455 Ala Gin Ser Gly Thr 460 Ser ccc tcc gtc tgc atg aat gtg agt ggc aac aca cag agt gtc acc ctg Pro Ser Vai Cys 465 Met Asn Vai Ser Gly 470 Asn Thr Gin Ser Val 475 Thr Leu cct gac ctt cct tgg ggt ccc tgt gag ctg tgg gtg aca gea tet acc Pro Asp Leu 480 Pro Trp Gly Pro Cys 485 Glu Leu Trp Val Thr 490 Ala Ser Thr ate gct gga cag ggc cct cct ggt ccc ate ctc cgg ctt cat cta cca Ile Ala 495 Gly Gin Gly Pro Pro 500 Gly Pro Ile Leu Arg 505 Leu His Leu Pro gat aac acc ctg agg tgg aaa gtt ctg cca ggc acc cta ttc ttg tgg Asp 510 Asn Thr Leu Arg Trp 515 Lys vai Leu Pro Gly 520 Ile Leu Phe Leu Trp 525 ggc ttg ttc ctg ttg ggg tgt ggc ctg age ccg gee acc tet gga agg Gly Leu Phe Leu Leu 530 Gly Cys Gly Leu Ser 535 Leu Ala Thr Ser Gly 540 Arg tgc tac cac cta agg cac aaa gtg ctg ccc ege tgg gtc tgg gag aaa Cys Tyr His Leu 545 Arg His Lys Val Leu 550 Pro Arg Trp Val Trp 555 Glu Lys gtt cct gat cct gee aac age agt tea ggc cag ccc cac atg gag caa Vai PrO Asp 560 Pro Ala Asn Ser Ser 565 Ser Gly Gin Pro His 570 Met Glu Gin gta cct gag gee cag ccc ctt ggg gac ttg ccc ate ctg gaa gtg gag Vai Pro 575 Glu Ala Gin Pro Leu 580 Gly Asp Leu Pro Ile 585 Leu Glu Val Glu gag atg gag ccc ceg ccg gtt atg gag tcc tcc cag ccc gee cag gee Glu 590 Het Glu Pro Pro Pro 595 Vai Met Glu Ser Ser 600 Gin Pro Ala Gin Ala 605 1275 1323 1371 1419 1467 1515 1563 1611 1659 1707 1755 1803 1851 1899 194? 334 acc gcc ccg ctt gac tct sgg tat Thr Ala Pro Leu Asp 610 Ser Gly Tyr gag gag ctg ggc ctt ctg ggg ccc Glu Glu Leu Gly Leu 625 Leu Gly Pro gag aag cac ttc ctg ccc aca cct Glu Lys 615 His Phe Leu Pro Thr 620 Pro ccc agg cca cag gtt ctg gcc Pro Arg 630 Pro Gin Vai Leu 635 Ala 1995 2040 tgaaccacac accccagtcc gtcacttacc gggettggcc ttgagagtgg cagcacagtg ttagagctag aaaacaccaa acttgggagg ctgattgcac caaactaata gtctggctgg cggactagcc tgaggacacc cccatgggga cagctgcctg gctcacgcct gagtttgaga aaacaaaaac ctgaggtggg cactgcactc aaaagca gggctgccag ctcttgatgg cagccaggca agacacggat ccaaaatctg gtaatcccag ccagcctggg aattagctgg aggatcggtt caggctgggt ccaggctaga gggatgctca tgcaggttgc 2100 atgaagacac tgaggactca gagaggctga 2160 gagctgggat tgaaggaccc ctatagagaa 2220 ggaaggtgga gcaaaggaaa atacatgaaa 2280 ttccgctgta acagaaccga atttggaccc 2340 cactttggca ggccaaggtg gaaggaccac 2400 caatatagca agacccctca ctacaaaaat 2460 gcaCgatggc acacacctgt agtccgagcc 2S20 gagcccagga gttcgaagct gcagggacct 2580 aacagaatga gaccttatct caaaaataaa 2640 2657 <210> 9 <211> 636 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 335

Met 1 Arg Gly Gly Arg 5 Gly Ala Pro Phe Trp 10 Leu Trp Pro Leu Pro 15 Lys Leu Ala Leu Leu 20 Pro Leu Leu Trp Val 25 Leu Phe Gin Arg Thr 30 Arg Pro Gin Gly Ser 35 Ala Gly Pro Leu Gin 40 Cys Tyr Gly Val Gly 45 Pro Leu Gly Asp Leu 50 Asn Cys Ser Trp Glu 55 Pro Leu Gly Asp Leu 60 Gly Ala Pro Ser Glu 65 Leu His Leu Gin Ser 70 Gin Lys Tyr Arg Ser 75 Asn Lys Thr Gin Thr 80 Vai Ala Val Ala Ala 85 Gly Arg Ser Trp Val 90 Ala Ile Pro Arg Glu 95 Gin Leu Thr Met Ser 100 Asp Lys Leu Leu Val 105 Trp Gly Thr Lys Ala 110 Gly Gin Pro Leu Trp 115 Pro Pro Val Phe val 120 Asn Leu Glu Thr Gin 125 Met Lys Pro Asn Ala 130 Pro Arg Leu Gly Pro 13S Asp Val Asp Phe Ser 140 Glu Asp Asp Pro Leu 14S Glu Ala Thr val His 150 Trp Ala Pro Pro Thr 155 Trp Pro Ser His Lys 160 Vai Leu lie Cys Gin 165 Phe His Tyr Arg Arg 170 Cys Gin Glu Ala Ala 175 Trp Thr Leu Leu Glu 180 Pro Glu Leu Lys Thr 185 Ile Pro Leu Thr Pro 190 Val Glu lie Gin Asp 195 Leu Glu Leu Ala Thr 200 Gly Tyr Lys val Tyr 205 Gly Arg Cys Arg Met 210 Glu Lys Glu Glu Asp 215 Leu Trp Gly Glu Trp 220 Ser Pro Ile Leu Ser 225 Phe Gin Thr Pro Pro 230 Ser Ala Pro Lys Asp 235 Val Trp Val Ser Gly 240 Asn Leu Cys Gly Thr 245 Pro Gly Gly Glu Glu 250 Pro Leu Leu Leu Trp 255 Lys Ala Pro Gly Pro 260 Cys val Gin Val Ser 265 Tyr Lys Val Trp Phe 270 Trp Val Gly Gly Arg 275 Glu Leu Ser Pro Glu 280 Gly Ile Thr Cys Cys 285 Cys Ser Leu 336

Ile Pro Ser Gly Ala Glu Trp Ala Arg Val Ser Ala Val Asn Ala Thr 290 295 300 Ser Trp Glu Pro Leu Thr Asn Leu Ser Leu Val Cys Leu Asp Ser Ala 305 310 315 320 Ser Ala Pro Arg Ser Val Ala Val Ser Ser Ile Ala Gly Ser Thr Glu 325 330 335 l>eu Leu val Thr Trp Gin Pro Gly Pro Gly Glu Pro Leu Glu His Val 340 345 350 Vai Asp Trp Ala Arg Asp Gly Asp Pro Leu Glu Lys Leu Asn Trp Val 355 360 365 Arg Leu Pro Pro Gly Asn Leu Ser Ala Leu Leu Pro Gly Asn Phe Thr 370 375 380 Vai Gly Val Pro Tyr Arg Ile Thr Val Thr Ala Val Ser Ala Ser Gly 385 390 395 400 Leu Ala Ser Ala Ser Ser Val Trp Gly Phe Arg Glu Glu Leu Ala Pro 405 410 415 Leu Vai Gly Pro Thr Leu Trp Arg Leu Gin Asp Ala Pro Pro Gly Thr 420 425 430 Pro Ala Ile Ala Trp Gly Glu Val Pro Arg His Gin Leu Arg Gly His 435 440 445 Leu Thr His Tyr Thr Leu Cys Ala Gin Ser Gly Thr Ser Pro Ser val 450 4S5 460 Cys Met Asn Val Ser Gly Asn Thr Gin Ser Val Thr Leu Pro Asp Leu 465 470 475 480 Pro Trp Gly Pro Cys Glu Leu Trp Val Thr Ala Ser Thr Ile Ala Gly 485 490 495 Gin Gly Pro Pro Gly Pro Ile Leu Arg Leu His Leu Pro Asp Asn Thr 500 505 510 Leu Arg Trp Lys Val Leu Pro Gly Ile Leu Phe Leu Trp Gly Leu Phe 515 520 525 Leu Leu Gly Cys Gly Leu Ser Leu Ala Thr Ser Gly Arg Cys Tyr His 530 535 540 Leu Arg His Lys Val Leu Pro Arg Trp Val Trp Glu Lys Val Pro Asp 545 550 555 560 Pro Ala Asn Ser Ser Ser Gly Gin Pro His Met Glu Gin Val Pro Glu 565 570 575 Ala Gin Pro Leu Gly Asp Leu Pro Ile Leu Glu Val Glu Glu Met Glu 580 585 590 Pro Pro Pro Val Met Glu Ser Ser Gin Pro Ala Gin Ala Thr Ala Pro 595 600 605 Leu Asp Ser Gly Tyr Glu Lys His Phe Leu Pro Thr Pro Glu Glu Leu 610 615 620 Gly Leu Leu Gly Pro Pro Arg Pro Gin Val Leu Ala 625 630 635 <210> 10 <211> 755 <212> ADN <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (D . . . (489) 337 <4 Ο 0> 10 atg ate ttc cac aca gga aca acg aag cct acc ctg gtg ctg ctt tgc 48 Met 1 Ile Phe His Thr Gly 5 Thr Thr Lys Pro 10 Thr Leu Val Leu Leu 15 Cys tgt ata gga acc tgg ctg gee acc tgc age ttg tcc ttc ggt gee cca 96 cys Ile Gly Thr 20 Trp Leu Ala Thr Cys 25 Ser Leu Ser Phe Gly 30 Ala Pro ata teg aag gaa gac tta aga act aca att gac etc ttg aaa caa gag 144 Ile Ser Lys Glu Asp Leu Arg Thr Thr Ile Asp Leu Leu Lys Gin Glu 35 40 45 tet cag gat ctt tat aac aac tat age ata aag cag gea tet ggg atg 192 Ser Gin Asp Leu Tyr Asn Asn Tyr Ser Ile Lys Gin Ala Ser Gly Met 50 55 60 tea gea gac gaa tea ata cag ctg ccg tgt ttc age ctg gac cgg gaa 240 Ser Ala Asp Glu Ser Ile Gin Leu Pro Cys Phe Ser Leu Asp Arg Glu 65 70 75 80 gea tta acc aac ate teg gtc ate ata gea cat ctg gag aaa gtc aaa 288 Ala Leu Thr Asn Ile Ser Val Ile Ile Ala His Leu Glu Lys Val Lys 85 90 95 gtg ttg age gag aac aca gta gat act tet tgg gtg ata aga tgg cta 336 Val Leu Ser Glu Asn Thr Val Asp Thr Ser Trp Val lie Arg Trp Leu 100 105 110 aca aac ate age tgt ttc aac cca ctg aat tta aac att tet gtg cct 384 Thr Asn ile Ser Cys Phe Asn Pro Leu Asn Leu Asn Ile Ser val Pro 115 120 125 gga aat act gat gaa tcc tat gat tgt aaa gtg ttc gtg ctt acg gtt 432 Gly Asn Thr Asp Glu Ser Tyr Asp Cys Lys Val Phe Val Leu Thr Val 130 135 140 tta aag cag ttc tea aac tgc atg gea gaa ctg cag gct aag gac aat 480 Leu Lys Gin Phe Ser Asn Cys Met Ala Glu Leu Gin Ala Lys Asp Asn 145 150 155 160 act aca tgc tgagtgatgg gggggggggg ggtgcagtgt cctcagcagt 529 Thr Thr Cys gcctgtcctt cgagggctga gcttgcaacc : caggacttaa ctccaaaggg actgtgcggt 589 cattactagt catgttattt atgtttttat : tttgtccact gaaatcttgt tctgctaccc 649 tgtagggact ggaagtggca gctatattta tttatttatg tactgagttt gttaacgctc 709 catggaggag cetteagagt ctatttaata i aattatattg acatga 755 <210> 11 <211> 163 338

<212> PRT <213> Mus musculus <400> 11

Met 1 Ile Phe His Thr 5 Gly Thr Thr Lys Pro 10 Thr Leu Val Leu Leu 15 Cys Cys Ile Gly Thr Trp 20 Leu Ala Thr Cys 25 Ser Leu Ser Phe Gly 30 Ala Pro Ile Ser Lys 35 Glu Asp Leu Arg Thr 40 Thr Ile Asp Leu Leu 45 Lys Gin Glu Ser Gin 50 Asp Leu Tyr Asn Asn 55 Tyr Ser Ile Lys Gin 60 Ala Ser Gly Mec Ser 65 Ala Asp Glu Ser Ile 70 Gin Leu Pro Cys Phe 75 Ser Leu Asp Arg Glu 80 Ala Leu Thr Asn Ile 85 Ser Val Ile Ile Ala 90 His Leu Glu Lys Val 95 Lys Val Leu Ser Glu Asn 100 Thr Val Asp Thr 105 Ser Trp Val Ile Arg 110 Trp Leu Thr Asn Ile Ser Cys Phe Ásn Pro Leu Asn Leu Asn Ile Ser val Pro 115 Gly Asn Thr Asp Glu Ser Tyr 120 Asp Cys Lys Val phe 125 Val Leu Thr Val 130 Leu Lys Gin phe Ser Asn 135 Cys Met Ala Glu Leu 140 Gin Ala Lys Asp Asn 145 150 155 160

Thr Thr Cys

<210> 12 <211> 489 <212> ADN <213> Sequência artificial <220>

SEQ <223> polinucleótido degenerado zcytorl71ig de rato da ID N°: 11 <221> misc_feature <222> (1)...(489) <223> n = A, T, C ou G <400> 12 339 atgathttyc ayacnggnac nacnaarccn acnytngtny tnytntgytg yathggnacn 60 tggytngcna cntgywsnyc nwsnttyggn gcnccnathw snaargarga yytnmgnacn 120 acnathgayy tnytnaarca rgarwsncar gayytntaya ayaaycayws nathaarcar 180 gcnwsnggna tgwsngcnga ygarwsnath carytnccnt gyttywsnyt ngaymgngar 240 gcnytnacna ayathwsngt nathathgcn cayytngara argtnaargt nytnwsngar 300 aayacngtng ayacnwsntg ggtnathjngn tggytnacna ayathwsntg yttyaayccn 360 ytnaayytna ayathwsngt nccnggnaay acngaygarw sntãygaytg yaargtntty 420 gtnytnacng tnytnaarca rttywsnaay tgyatggcng arytncargc naargayaay 480 acnacntgy 489

<210> 13 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC6673 <400> 13 gcgcaaggtg ccgttcacag c 21

<210> 14 <211> 36 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC29082 <400> 14 caatttgttg ggttttttta gcagcagtag gcccag36

<210> 15 <211> 36 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> 340 <223> Iniciador oligonucleotidico ZC29083 <40 0> 15 ctgggcctac tgctgctaaa aaaacccaac aaattg36

<210> 16 <211> 36 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC29145 <40 0> 16 gcgtctagag ggttatattg aagttgggca ggaaga36

<210> 17 <211> 8 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> etiqueta peptidica Glu-Glu (CEE) modificada com Gly-Ser <40 0> 17

Gly Ser Glu Tyr Met Pro Met Glu 1 5

<210> 18 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> 341 <223> Iniciador oligonucleotidico ZC29359 <40 0> 18 gcgggatcca tgaagctctc tccccagcct tca 33

<210> 19 <211> 23 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC27899 <400> 19 ccagaacttt gactccttga ccg 23

<210> 20 <211> 23 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC27895 <400> 20 gaagtcaact tcgctaagaa ccg 23

<210> 21 <211> 34 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC29122 342 <400> 21 ccgctcgagt tatattgaag ttgggcagga agac 34 <210> 22 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC29180 <40 0> 22 cctggagtcc ctgaaacgaa ag 22 <210> 23 <211> 34 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC29122 <40 0> 23 ccgctcgagt tatattgaag ttgggcagga agac 34 <210> 24 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC9791 <400> 24 cgttccaaca aaacccagac 20 343

<210> 25 <211> 19 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC9793 <40 0> 25 tggcgttgac agcggacac 19 <210> 26 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC40109 <40 0> 26 ccattccagc accagccaac 20 <210> 27 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC40112 <40 0> 27 tacaacttca atagcatctg gg 22 <210> 28 344

<211> 40 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador oligonucleotídico ZC13946 <400> 28 ccctgcagtg atcaacatgg ccaagttgac cagtgccgtt 40

<210> 29 <211> 45 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador oligonucleotídico ZC13945 <400> 29 gcccatggac tagtttcgaa aggtcgagtg tcagtcctgc tcctc45

<210> 30 <211> 34 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador oligonucleotídico ZC18698 <400> 30 tttttttctc gagacttttt tttttttttt tttt 34 <210> 31 <22 0> 345 <223> Sequência passada po <40 0> 31 000 <210> 32 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223>etiqueta peptídica Glu-Glu (CEE) com o par de resíduos Gly-Ser <400> 32

Gly Ser Gly Gly Glu Tyr Met Pro Met Glu 1 5 10

<210> 33 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador oligonucleotídico ZC29451 <400> 33 ccggaattcc cctgatacat gaagctctct ccc 33

<210> 34 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência artificial 346 <22 0> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC29124 <400> 34 cgcggatccc tcaaagacac tgaatgacaa tgt 33

<210> 35 <211> 6 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> etiqueta peptidica Glu-Glu (CEE) sem o par de resíduos Gly-Ser <400> 35

Glu Tyr Met Pro Met Glu 1 5 <210> 36 <211> 8

<212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> sequência peptidica C-terminal FLAG <400> 36

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 S

<210> 37 <211> 684 <212> ADN 347 <213> Homo sapiens <400> 37 tcagacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aagccgaggg ggcaccgcca 60 gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 120 acatgcgcgg cggcggacgc gagccacgaa gaccctgagg tcaagtecaa ctggtacgtg 180 gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 240 taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 300 aagtgcaagg tccccaacaa agccctccca ccctccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 360 aaagggcagc cccgagaacc acaggcgtac accctgcccc catcccggga tgagccgacc 420 aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 480 gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 540 cccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 600 gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 660 agcctccccc tgtctccggg taaa 684

<210> 38 <211> 2295 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> polinucleótido de fusão zcytorl7-Fc4 humano

<221> CDS <222> (1)...(2295) <400> 38 348 atg aag ctc tct ccc cag cct tca tgt gtt aac ctg ggg atg atg tgg 48 Met 1 Lys Leu Ser Pro 5 Gin Pro Ser Cys Vai 10 Asn Leu Gly Met Met 15 Trp acc tgg gca ctg tgg atg ctc cct tca ctc tgc aaa ttc age ctg gca 96 Thr Trp Ala Leu 20 Trp Met Leu Pro Ser 25 Leu Cys Lys Phe Ser 30 Leu Ala gcc ctg cca gct aag cct gag aac att tec tgt gtc tac tac tat agg 144 Ala Leu Pro 35 Ala Lys Pro Glu Asn 40 ile Ser Cys Vai Tyr 45 Tyr Tyr Arg aaa aat tta acc tgc aet tgg agt cca gga aag gaa acc agt tat acc 192 Lys Asn 50 Leu Thr Cys Thr Trp 55 Ser Pro Gly Lys Glu 60 Thr Ser Tyr Thr cag tac aca gtt aag aga act tac gct ttt gga gaa aaa cat gat aat 240 Gin Tyr 65 Thr Vai Lys Arg 70 Thr Tyr Ala Phe Gly 75 Glu Lys His Asp Asn 80 tgt aca acc aat agt tct aca agt gaa aat cgt gct tcg tgc tct ttt 288 Cys Thr Thr Asn Ser β5 Ser Thr Ser Glu Asn 90 Arg Ala Ser Cys Ser 95 Phe ttc ccc cca aga ata acg ate cca gat aat tat acc att gag gtg gaa 336 Phe Leu Pro Arg 100 lie Thr Ile Pro Asp Asn 10S Tyr Thr Ile Glu 110 Vai Glu gct gaa aat gga gat ggt gta att aaa tct cat atg aca tac tgg aga 384 Ala Glu Asn 115 Gly Asp Gly Vai ile 120 Lys Ser His Met Thr 125 Tyr Trp Arg tca gag aac ata gcg aaa act gaa cca cct aag att ttc cgt gtg aaa 432 Leu Glu 130 Asn ile Ala Lys Thr 135 Glu Pro Pro Lys Ile 140 Phe Arg vai Lys cca gtt ttg ggc ate aaa cga atg att caa att gaa tgg ata aag cct 480 Pro 145 Vai Leu Gly Ile Lys 150 Arg Met ile Gin Ile 155 Glu Trp Ile Lys Pro 160 gag tcg gcg cct gct tca tct gat tta aaa tac aca ctt cga ttc agg 528 Glu Leu Ala Pro Vai 165 Ser Ser Asp Leu Lys 170 Tyr Thr Leu Arg Phe 175 Arg 349 aca gtc aac agt acc age tgg atg gaa gtc aac ttc gct aag aac cgt 576 Thr Vai Asn Ser 180 Thr Ser Trp Met Glu 185 Val Asn Phe Ala Lys 190 Asn Arg aag gat aaa aac caa acg tac aac ctc acg ggg ctg cag cct ttt aca 624 Lys Asp Lys 19S Asn Gin Thr Tyr Asn 200 Leu Thr Gly Leu Gin 205 Pro Phe Thr gaa cat gtc ata gct ctg cga tgt gcg gtc aag gag tca aag ttc tgg 672 Glu Tyr 210 Vai Ile Ala Leu Arg 215 Cys Ala Val Lys Glu 220 Ser Lys Phe Trp agt gac tgg age caa gaa aaa atg gga atg act gag gaa gaa gct cca 720 Ser 225 Asp Trp Ser Gin Glu 230 Lys Met Gly Met Thr 23S Glu Glu Glu Ala Pro 240 tgt ggc ctg gaa ctg tgg aga gtc ctg aaa cca gct gag gcg gat gga 768 Cys Gly Leu Glu Leu 24S Trp Arg Val Leu Lys 250 Pro Ala Glu Ala Asp 255 Gly aga agg cca gtg cgg ttg tta tgg aag aag gea aga gga gee cca gtc 816 Arg Arg Pro Val 260 Arg Leu Leu Trp Lys 265 Lys Ala Arg Gly Ala 270 Pro Val cta gag aaa aca ctt ggc tac aac ata tgg tac tat cca gaa age aac 864 Leu Glu Lys 275 Thr Leu Gly Tyr Asn 280 Ile Trp Tyr Tyr Pro 285 Glu Ser Asn act aac ctc aca gaa aca atg aac act act aac cag cag ctt gaa ctg 912 Thr Asn 290 Leu Thr Glu Thr Met 295 Asn Thr Thr Asn Gin 300 Gin Leu Glu Leu cat ctg gga ggc gag age ttt tgg gtg tct atg att tct tat aat tct 960 His 305 Leu Gly Gly Glu Ser 310 Phe Trp val Ser Met 315 Ile Ser Tyr Asn Ser 320 ctt ggg aag tct cca gtg gee acc ctg agg att cca gct att caa gaa 1008 Leu Gly Lys Ser Pro 325 Val Ala Thr Leu Arg 330 Ile Pro Ala Ile Gin 335 Glu aaa tca ttt cag tgc att gag gtc atg cag gee tgc gtt gct gag gac 1056 Lys Ser Phe Gin 340 Cys Ile Glu Val Met 345 Gin Ala Cys Val Ala 350 Glu Asp cag cta gtg gtg aag tgg caa age tct gct Cta gac gtg aac act tgg 1104 Gin Leu Vai 355 Val Lys Trp Gin Ser 360 Ser Ala Leu Asp Val 365 Asn Thr Trp atg act gaa tgg ttt ceg gat gtg gac tca gag ccc acc acc ctt tcc 1152 Met Ile 370 Glu Trp Phe Pro Asp 375 Val Asp Ser Glu Pro 380 Thr Thr Leu Ser tgg gaa tct gtg tçt cag gee acg aac tgg acg ate cag caa gat aaa 1200 Trp 385 Glu Ser Val Ser Gin 390 Ala Thr Asn Trp Thr 395 Ile Gin Gin Asp Lys 400 tca aaa ccc ttc tgg tgc tat aac ate tct gtg tat cca atg ttg cat 1248 Leu Lys Pro Phe Trp 405 Cys Tyr Asn lie Ser 410 Val Tyr Pro Met Leu 415 His gac aaa gtt ggc gag cca tat tcc ate cag gct tat gee aaa gaa ggc 1296 Asp Lys Vai Gly Glu Pro Tyr Ser Ile Gin Ala Tyr Ala Lys Glu Gly 350 420 425 430 gtt cca Vai Pro tea Ser 435 gaa Glu ggt Gly cct Pro gag Glu acc Thr 440 aag Lys gtg Val gag aac Glu Asn att Ile 44S 99C Gly gtg Val aag Lys 1344 acg gtc Thr Val 450 acg Thr aec Ile aca Thr tgg aaa Trp Lys 455 gag Glu att Ile ccc Pro aag Lys agt Ser 460 gag Glu aga Arg aag Lys ggt Gly 1392 ate ate Ile Ile 465 tgc Cys aac Asn tac Tyr acc Thr 470 ate Ile ttt Phe tac Tyr caa Gin gct Ala 475 gaa Glu ggt Gly gga Gly aaa Lys gga Gly 480 1440 ttc tec Fhe Ser aag Lys aca Thr gtc val 485 aat Asn tcc Ser age Ser ate Ile ttg Leu 490 cag Gin tac Tyr ggc Gly ctg Leu gag Glu 495 ccc Ser 1488 ctg aaa Leu Lys cga Arg aag Lys 500 acc Thr tcc Ser tac Tyr att Ile gtt Val 505 cag Gin gtc Val atg Met gee Ala age Ser 510 acc Thr agt Ser 1536 gct ggg Ala Gly gga Gly 515 acc Thr aac Asn ggg acc Gly Thr age Ser 520 ata Ile aat Asn ttc aag Phe Lys aca Thr 525 ttg Leu tea Ser ttc Phe 1584 age gtc Ser Val 530 ttt Phe gag Glu gag Glu ccc Pro aga Arg 535 tet Ser tea Ser gac Asp aaa Lys act Thr 540 cac His aca Thr tgc Cys cca Pro 1632 ccg tgc Pro Cys 545 cca Pro gea Ala cct Pro gaa Glu 550 gee Ala gag Glu ggg Gly gea Ala ccg Pro 555 tea Ser gtc Val ttc Phe etc Leu ttc Phe 560 1680 ccc cca Pro Pro aaa Lys ccc Pro aag Lys 565 gac Asp acc Thr etc Leu atg Met ate Ile 570 tcc Ser cgg Arg acc Thr cct Pro gag Glu 575 gtc Val 1728 aca tgc Thr Cys gtg Val gtg Val 560 gtg Val gac gtg Asp Val age Ser cac His 585 gaa Glu gac Asp cct Pro gag Glu gtc Val 590 aag Lys tcc Phe 1776 aac tgg Asn Trp tac Tyr S95 gtg Val gac Asp ggc gtg Gly Val gag Glu 600 gtg Val cat His aat Asn gee Ala aag Lys 605 aca Thr aag Lys ccg Pro 1824 cgg gag Arg Glu 610 gag Glu cag Gin tac Tyr aac Asn age Ser 615 acg Thr tac Tyr cgt Arg gtg gtc Val Val 620 age Ser gtc Val etc Leu acc Thr 1872 gtc ctg Val Leu 625 cac His cag Gin gac Asp tgg Trp 630 ctg Leu aat Asn ggc Gly aag Lys gag Glu 635 tac Tyr aag Lys tgc Cys aag Lys gtc Val 640 1920 tcc aac Ser Asn aaa Lys gee Ala etc Leu 645 cca Pro tcc Ser tcc Ser ate Ile gag Glu 650 aaa acc Lys Thr ate Ile tcc Ser aaa Lys 655 gee Ala 1968 aaa ggg Lys Gly cag Gin ccc Pro 660 cga Arg gaa Glu cca Pro cag Gin gtg Val 665 tac Tyr acc Thr ctg Leu ccc Pro cca Pro 670 tcc Ser cgg Arg 2016 gat gag ctg acc aag aac cag gtc age ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc 2064 351

Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly 675 680 685 Ctc tat ccc age gac ate gee gcg gag tgg gag age aac ggg cag ccg 2112 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro 690 695 700 gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc 2160 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser 705 710 715 720 ttc ttc ctc tac age aag ctc acc gtg gac aag age agg tgg cag cag 2208 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin 725 730 735 ggg aac gtc ttc tea tgc tcc gcg atg cat gag gct ctg cac aac cac 2256 Gly Asn Vai Phe Ser Cys Ser vai Met Hls Glu Ala Leu His Asn His 740 745 750 tac acg cag aag age ctc tcc ctg tet ccg ggt aaa taa 2295 Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys * 755 760

<210> 39 <211> 764 < 212 > PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> polipéptido de fusão zcytorl7-Fc4 humano <400> 39 352

Met 1 Lys Leu Ser Pro 5 Gin Pro Ser Cys Val 10 Asn Leu Gly Met Met 15 Trp Thr Trp Ala Leu 20 Trp Met Leu Pro Ser 25 Leu Cys Lys Phe Ser 30 Leu Ala Ala Leu Pro 35 Ala Lys Pro Glu Asn 40 Ile Ser Cys Val Tyr 45 Tyr Tyr Arg Lys Asn 50 Leu Thr Cys Thr Trp 55 Ser Pro Gly Lys Glu 60 Thr Ser Tyr Thr Gin 65 Tyr Thr Val Lys Arg 70 Thr Tyr Ala Phe Gly 75 Glu Lys His Asp Asn 80 Cys Thr Thr Asn Ser 85 Ser Thr Ser Glu Asn 90 Arg Ala Ser Cys Ser 95 Phe Phe Leu Pro Arg 100 Ile Thr Ile Pro Asp 105 Asn Tyr Thr Ile Glu 110 Val Glu Ala Glu Asn 11S Gly Asp Gly Val Ile 120 Lys Ser His Met Thr 125 Tyr Trp Arg Leu Glu 130 Asn Ile Ala Lys Thr 135 Glu Pro Pro Lys Ile 140 Phe Arg Val Lys Pro 145 Vai Leu Gly ile Lys 150 Arg Met Ile Gin Ile 155 Glu Trp Ile Lys Pro 160 Glu Leu Ala Pro Val 165 Ser Ser ASp Leu Lys 170 Tyr Thr Leu Arg Phe 175 Arg Thr Vai Asn Ser 180 Thr Ser Trp Met Glu 185 Val Asn Phe Ala Lys 190 Asn Arg Lys Asp Lys 195 Asn Gin Thr Tyr Asn 200 Leu Thr Gly Leu Gin 205 Pro Phe Thr Glu Tyr 210 Val Ile Ala Leu Arg 215 Cys Ala Val Lys Glu 220 Ser Lys Phe Trp Ser 225 Asp Trp Ser Gin Glu 230 Lys Met Gly Met Thr 235 Glu Glu Glu Ala Pro 240 353

Cys Gly Leu Glu Leu 245 Trp Arg val Leu Lys 250 Pro Ala Glu Ala Asp Gly 255 Arg Arg Pro Val 260 Arg Leu Leu Trp Lys 265 Lys Ala Arg Gly Ala 270 Pro Val Leu Glu Lys 275 Thr Leu Gly Tyr Asn 280 Ile Trp Tyr Tyr Pro 2B5 Glu Ser Asn Thr Asn 290 Leu Thr Glu Thr Met 295 Asn Thr Thr Asn Gin 300 Gin Leu Glu Leu His 305 Leu Gly Gly Glu Ser 310 Phe Trp Val Ser Met 315 ile Ser Tyr Asn Ser 320 Leu Gly- Lys Ser Pro 325 val Ala Thr Leu Arg 330 ile Pro Ala ile Gin Glu 335 Lys Ser Phe Gin 340 Cys ile Glu Val Met 345 Gin Ala Cys Val Ala 350 Glu Asp Gin Leu Vai 355 Val Lys Trp Gin Ser 360 Ser Ala Leu Asp Val 365 Asn Thr Trp Met Ile 370 Glu Trp Phe Pro Asp 375 Val Asp Ser Glu Pro 380 Thr Thr Leu Ser Trp 385 Glu Ser Val Ser Gin 390 Ala Thr Asn Trp Thr 395 Ile Gin Gin Asp Lys 400 Leu Lys Pro Phe Trp 405 Cys Tyr Asn Ile Ser 410 Val Tyr Pro Met Leu His 415 ASp Lys Vai Gly 420 Glu Pro Tyr Ser Ile 425 Gin Ala Tyr Ala Lys 430 Glu Gly Vai Pro Ser 435 Glu Gly Pro Glu Thr 440 Lys Val Glu Asn Ile 445 Gly Val Lys Thr Vai 450 Thr Ile Thr Trp Lys 455 Glu Ile Pro Lys Ser 460 Glu Arg Lys Gly lie 465 Ile Cys Asn Tyr Thr 470 Ile Phe Tyr Gin Ala 475 Glu Gly Gly Lys Gly 480 Phe Ser Lys Thr Val A QC Asn Ser Ser lie Leu Λ Ο Λ Gin Tyr Gly Leu Glu Ser jioc Leu Lys Arg Lys SOO Thr Ser Tyr Ile Val 505 Gin Val Met Ala Ser 510 Thr Ser Ala Gly Gly 515 Thr Asn Gly Thr Ser 520 Ile Asn Phe Lys Thr 525 Leu Ser Phe Ser vai 530 Phe Glu Glu Pro Arg 535 Ser Ser Asp Lys Thr 540 His Thr Cys Pro Pro 545 Cys Pro Ala Pro Glu 550 Ala Glu Gly Ala Pro 555 Ser val Phe Leu Phe 560 Pro Pro Lys Pro Lys 565 Asp Thr Leu Met Ile 570 Ser Arg Thr Pro Glu Val 575 Thr Cys Vai Val 580 Val Asp Val Ser His 585 Glu Asp Pro Glu Val S90 Lys Phe Asn Trp Tyr 595 Val Asp Gly Val Glu 600 Val His Asn Ala Lys 605 Thr Lys Pro Arg Glu 610 Glu Gin Tyr Asn Ser 615 Thr Tyr Arg Val Val 620 Ser Val Leu Thr Vai 625 Leu His Gin Asp Trp 630 Leu Asn Gly Lys Glu 635 Tyr Lys Cys Lys Val 640 Ser Asn Lys Ala Leu 645 Pro Ser Ser Ile Glu 650 Lys Thr Ile Ser Lys Ala 655 Lys Gly Gin Pro 660 Arg Glu Pro Gin val 665 Tyr Thr Leu Pro Pro 670 Ser Arg Asp Glu Leu 675 Thr Lys Asn Gin Val 680 Ser Leu Thr Cys Leu 685 Val Lys Gly Phe Tyr 690 Pro Ser Asp ile Ala 695 Val Glu Trp Glu ser 700 Asn Gly Gin Pro Glu 705 Asn Asn Tyr Lys Thr 710 Thr Pro Pro Val Leu 715 Asp Ser Asp Gly Ser 720 Phe Phe Leu Tyr Ser 725 Lys Leu Thr Val Asp 730 Lys Ser Arg Trp Gin Gin 735 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser val Met His Glu Ala Leu His Asn His 354 740 74S 750

Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 755 760 <210> 40 <211> 34 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC29157 <400> 40 ctagtatggc cggccatgaa gctctctccc cagc 34 <210> 41 <211> 41 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC29150 <400> 41 gtctgaagat ctgggctcct caaagacact gaatgacaat g 41 <210> 42 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC41458 <400> 42 355 tggacctcgc actaaaatca t 21 <210> 43 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC41457 <40 0> 43 aatcacggca gagttcccac ac 22 <210> 44 <211> 100 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC12749 <40 0> 44 gtaccttccc gtaaatcccc ccccttcccg gaattacacc cgcgtattcc ccagaaaagg 60 aactgtagat ttctaggaat tcaatccttg gccacgcgtc 100 <210> 45 <211> 100 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC12748 <400> 45 356 tcgagacgcg tggccaagga ctgaatccct agaaatctac agttccCttt ctgggaaata 60 cgcgggtgta attccgggaa ggggagggat ttacgggaag 100 <210> 46 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC10651 <400> 46 agcttttctg cagcagctct 20 <210> 47 <211> 23 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC10565 <400> 47 tttgcagaaa aggttgcaaa tgc 23 <210> 48 <211> 25 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC14063 <400> 48 357 caccagacat aatagctgac agact 25 <210> 49 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC17574 <40 0> 49 ggtrttgctc agcatgcaca c 21 <210> 50 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC17600 <40 0> 50 catgtaggcc atgaggtcca ccac 24 <210> 51 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC38065 <40 0> 51 ctttcctggg aatctgtgtc t 21 358

<210> 52 <211> 18 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> ZC38068 <223> Iniciador oligonucleotídi <400> 52 cctccagctc tggtgctg 18

<210> 53 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> ZC37877 <223> Iniciador oligonucleotídi <400> 53 caaaaaaccc aacaaattga ctca 24 <210> 54 <211> 25 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador oligonucle <40 0> 54 ZC37876 catgtggcta tactactttc agcag 25 <210> 55 <211> 22 359 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sonda TaqMan® do receptor zcytorl7 <40 0> 55 ctgtgttggc ccaccgttcc ca 22 <210> 56 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> iniciador directo de ARNr <40 0> 56 cggctaccac atccaaggaa 20 <210> 57 <211> 18 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> iniciador inverso de ARNr <40 0> 57 gctggaatta ccgcggct 18 <210> 58 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência artificial 360 <22 0> <223> sonda TaqMan® de ARNr <400> 58 tgctggcacc agacttgccc tc 22 <210> 59 <22 0> <223> Sequência passada por alto <400> 59 000

<210> 60 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> ZC41458 <223> Iniciador oligonucleotidico <400> 60 tggacctcgc actaaaatca t 21

<210> 61 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> ZC41457 <223> Iniciador oligonucleotidico <400> 61 361 aatcacggca gagttcccac ac 22

<210> 62 <211> 19 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> ZC41459 <223> Iniciador oligonucleotidic <400> 62 agaagggcgt gctcgtgtc 19

<210> 63 <211> 18 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> ZC41460 <223> Iniciador oligonucleotidic <400> 63 ccggatggct gggctgtg 18

<210> 64 <211> 25 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> ZC39982 <223> Iniciador oligonucleotidic <400> 64 aatgtctgtg tagcataagg tatga 25 362 <210> 65 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC399 83 <40 0> 65 cctgcctacc tgaaaaccag aa 22 <210> 66 <211> 36 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC399 80 <40 0> 66 tttgaattcg ccaccatggc tctatttgca gtcttt 36 <210> 67 <211> 28 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC399 81 <400> 67 ctgtctcgag tgctggttag cagtgttc 28 <210> 68 <211> 2217 363

<212> ADN <213> Homo sapiens <22 0>

<221> CDS <222> (1)...(2217) <400> 68 364 atg gct cta ttt gea gtc ttt cag aca aca ttc ttc tta aca ttg ctg 48 Ket 1 Ala Leu Phe Ala 5 Vai Phe Gin Thr Thr 10 Phe Phe Leu Thr Leu 15 Leu tcc ttg agg act tac cag agt gaa gtc ttg gct gaa cgt tta cca ttg 96 Ser Leu Arg Thr 20 Tyr Gin Ser Glu Val 25 Leu Ala Glu Arg Leu 30 Pro Leu act cct gta tea Ctt aaa gtt tcc acc aat tet acg cgt cag agt ttg 144 Thr Pro Vai 35 Ser Leu Lys Vai Ser 40 Thr Asn Ser Thr Arg 45 Gin Ser Leu cac tta caa tgg act gtc cac aac ctt cct tat cat cag gaa ttg aaa 192 His Leu 50 Gin Trp Thr Vai His 55 Asn Leu Pro Tyr His 60 Gin Glu Leu Lys a t:g gta ttt cag ate cag ate agt agg att gaa aca tcc aat gtc ate 240 Met 65 Vai Phe Gin Ile Gin 70 Ile Ser Arg Ile Glu 75 Thr Ser Asn Val Ile 80 tgg gtg ggg aat tac age acc act gtg aag tgg aac cag gtt ctg cat 288 Trp Vai Gly Asn Tyr 85 Ser Thr Thr Val Lys 90 Trp Asn Gin Val Leu 95 His tgg age tgg gaa tet gag ctc cct ttg gaa tgt gee aca cac ttt gta 336 Trp Ser Trp Glu 100 Ser Glu Leu Pro Leu 105 Glu Cys Ala Thr His 110 Phe Val aga ata aag agt ttg gtg gac gat gee aag ttc cct gag cca aat ttc 384 Arg Zle Lys 115 Ser Leu Vai Asp Asp 120 Ala Lys Phe Pro Glu 125 Pro Asn Phe tgg age aac tgg agt tcc tgg gag gaa gtc agt gta caa gat tet act 432 Trp Ser 130 Asn Trp Ser Ser Trp 135 Glu Glu Val Ser Val 140 Gin Asp Ser Thr gga cag gat ata ttg ttc gtc ttc cct aaa gat aag ctg gtg gaa gaa 480 Gly 145 Gin Asp Ile Leu Phe 150 Val Phe Pro Lys Asp 155 Lys Leu Val Glu Glu 160 ggc acc aat gtt acc att tgt tac gtt tet agg aac att caa aat aat 528 Gly Thr Asn Vai Thr 165 Ile Cys Tyr val Ser 170 Arg Asn Ile Gin Asn 175 Asn gta tcc tgt tat ttg gaa ggg aaa cag att cat gga gaa caa ctt gat 576 Vai Ser Cys Tyr 180 Leu Glu Gly Lys Gin 185 Ile His Gly Glu Gin 190 Leu Asp cca cat gta act gea ttc aac ttg aat agt gtg cct ttc att agg aat 624 Pro His Vai 195 Thr Ala Phe Asn Leu 200 Asn Ser Val Pro Phe 205 Ile Arg Asn aaa ggg aca aat ate tat tgt gag gea agt caa gga aat gtc agt gaa 672 Lys Gly 210 Thr Asn Ile Tyr Cys 215 Glu Ala Ser Gin Gly 220 Asn Val Ser Glu 365 ggc atg aaa ggc ate gtt ctt ttt gtc tea aaa gta ctt gag gag ccc 720 Gly Met 225 Lys Gly Ile vai 230 Leu Phe Val Ser Lys 235 Val Leu Glu Glu Pro 240 aag gac ttt tet tgt gaa acc gag gac ttc aag act ttg cac tgt act 768 Lys Asp Phe Ser Cys 245 Glu Thr Glu Asp Phe 250 Lys Thr Leu His Cys 255 Thr tgg gat cct ggg acg gac act gee ttg ggg tgg tet aaa caa cct tcc 816 Trp Asp Pro Gly 260 Thr Asp Thr Ala Leu 265 Gly Trp Ser Lys Gin 270 Pro Ser caa age tac act tta ttt gaa tea ttt tet ggg gaa aag aaa ctt tgt 864 Gin Ser Tyr 275 Thr Leu Phe Glu Ser 280 Phe Ser Gly Glu Lys 285 Lys Leu Cys aca cac aaa aac tgg tgt aat tgg caa ata act caa gac tea caa gaa 912 Thr His 290 Lys Asn Trp Cys Asn 295 Trp Gin Ile Thr Gin 300 Asp Ser Gin Glu acc tat aac ttc aca ctc ata gct gaa aat tac tta agg aag aga agt 960 Thr Tyr 305 Asn Phe Thr Leu 310 Ile Ala Glu Asn Tyr 315 Leu Arg Lys Arg Ser 320 gee aat ate ctt ttt aac ctg act cat cga gtt tat tta atg aat cct 1008 Vai Asn Ile Leu Phe 325 Asn Leu Thr His Arg 330 Val Tyr Leu Met Asn 335 Pro ttt agt gtc aac ttt gaa aat gta aat gee aca aat gee ate atg acc 1056 Phe Ser Vai Asn 340 Phe Glu Asn Val Asn 345 Ala Thr Asn Ala Ile 350 Met Thr tgg aag gtg cac tcc ata agg aat aat ttc aca tat ttg tgt cag att 1104 Trp Lys Vai 355 His Ser ile Arg Asn 360 Asn Phe Thr Tyr Leu 365 Cys Gin Ile gaa etc cat ggt gaa gga aaa atg atg caa tac aat gtt tcc ate aag 1152 Glu Leu 370 His Gly Glu Gly Lys 375 Met Met Gin Tyr Asn 380 Val Ser Ile Lys gtg aac ggt gag tac ttc tta agt gaa ctg gaa cct gee aca gag tac 1200 Vai Asn 385 Gly Glu Tyr Phe 390 Leu Ser Glu Leu Glu 395 Pro Ala Thr Glu Tyr 400 atg gcg cga gta cgg tgt gct gat gee age cac ttc tgg aaa tgg agt 1248 Met Ala Arg Vai Arg 405 Cys Ala Asp Ala Ser 410 His Phe Trp Lys Trp 415 Ser gaa tgg agt ggt cag aac ttc acc aca ctt gaa gct gct ccc tea gag 1296 Glu Trp Ser Gly 420 Gin Asn Phe Thr Thr 425 Leu Glu Ala Ala Pro 430 Ser Glu gee cct gat gtc tgg aga att gtg age ttg gag cca gga aat cat act 1344 Ala Pro Asp 435 Vai Trp Arg Ile Val 440 Ser Leu Glu Pro Gly 445 Asn His Thr gtg acc tta ttc tgg aag cca tta tea aaa ctg cat gee aat gga aag 1392 Vai Thr 450 Leu Phe Trp Lys Pro 455 Leu Ser Lys Leu His 460 Ala Asn Gly Lys ate ctg ttc tat aat gta gtt gta gaa aac cta gac aaa cca tcc agt 1440 Ile Leu 465 Phe Tyr Asn Vai 470 Vai Val Glu Asn Leu 475 Asp Lys Pro Ser Ser 480 366 tca gag ctc cat tcc att cca gca cca gee aac age aca aaa cta ate 1488 Ser Glu Leu His Ser 485 Ile Pro Ala Pro Ala 490 Asn Ser Thr Lys Leu 495 ile ctt gac agg tgt tcc tac caa ate tgc gtc ata gee aac aac agt gtg 1536 Leu Asp Arg Cys SOO Ser Tyr Gin Ile cys 505 Val Ile Ala Asn Asn 510 Ser val ggt gct tct cct gct tct gta ata gtc ate tct gca gac ccc gaa aac 1584 Gly Ala Ser 515 Pro Ala Ser Val lie 520 Val Ile Ser Ala Asp 525 Pro Glu Asn aaa gag gtt gag gaa gaa aga att gca ggc aca gag ggt gga ttc tct 1632 Lys Glu 530 Vai Glu Glu Glu Arg 535 Ile Ala Gly Thr Glu 540 Gly Gly Phe Ser ctg tct tgg aaa ccc caa cct gga gat gtt ata ggc tat gtt gtg gac 1680 Leu 545 Ser Trp Lys Pro Gin 550 Pro Gly Asp vai Ile 555 Gly Tyr Val val Asp S60 tgg tgt gac cat acc cag gat gtg ctc ggt gat ttc cag tgg aag aat 1728 Trp Cys Asp His Thr 565 Gin Asp Val Leu Gly 570 Asp Phe Gin Trp Lys 575 Asn gta ggt ccc aat acc aca age aca gtc att age aca gat gct ttt agg 1776 Vai Gly Pro Asn 580 Thr Thr Ser Thr Val 585 Ile Ser Thr Asp Ala 590 Phe Arg cca gga gtt cga tat gac ttc aga att tat ggg tta tct aca aaa agg 1824 Pro Gly Val 595 Arg Tyr Asp Phe Arg 600 Ile Tyr Gly Leu Ser 605 Thr Lys Arg att gct tgt tta tta gag aaa aaa aca gga tac tct cag gaa ctt gct 1872 Ile Ala 610 Cys Leu Leu Glu Lys 615 Lys Thr Gly Tyr Ser 620 Gin Glu Leu Ala cct tca gac aac cct cac gtg ctg gtg gat aca ttg aca tcc cac tcc 1920 Pro 625 Ser Asp Asn Pro His 630 Val Leu Val Asp Thr 635 Leu Thr Ser His Ser 640 ttc act ctg agt tgg aaa gat tac tct act gaa tct caa cct ggt ttt 1968 Phe Thr Leu Ser Trp 645 Lys Asp Tyr Ser Thr 650 Glu Ser Gin Pro Gly 655 Phe ata caa ggg tac cat gtc tat ctg aaa tcc aag gcg agg cag tgc cac 2016 ile Gin Gly Tyr 660 His val Tyr Leu Lys 665 Ser Lys Ala Arg Gin 670 Cys His cca cga ttt gaa aag gca gtt ctt tca gat ggt tca gaa tgt tgc aaa 2064 Pro Arg Phe 675 Glu Lys Ala Val Leu 680 Ser Asp Gly Ser Glu 685 Cys Cys Lys tac aaa att gac aac ccg gaa gaa aag gca ttg att gtg gac aac cta 2112 Tyr Lys 690 Ile Asp Asn Pro Glu 695 Glu Lys Ala Leu lie 700 Val Asp Asn Leu aag cca gaa tcc ttc tat gag ttt ttc ate act cca ttc act agt gct 2160 Lys 705 Pro Glu Ser Phe Tyr 710 Glu Phe Phe Ile Thr 715 Pro Phe Thr Ser Ala 720 ggt gaa ggc ccc agt gct acg ttc acg aag gtc acg act ccg gat gaa 2208 Gly Glu Gly Pro Ser Ala Thr Phe Thr Lys Val Thr Thr Pro Asp Glu 367 730 735 725 cac ccc tcg His Ser Ser <210> 69 <211> 739 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 69 2217 368

Met 1 Ala Leu Phe Ala 5 val Phe Gin Thr Thr 10 Phe Phe Leu Thr Leu 15 Leu Ser Leu Arg Thr 20 Tyr Gin Ser Glu Val 25 Leu Ala Glu Arg Leu 30 Pro Leu Thr Pro Vai 35 Ser Leu Lys Val Ser 40 Thr Asn Ser Thr Arg 45 Gin Ser Leu His Leu SO Gin Trp Thr Val His 55 Asn Leu Pro Tyr His 60 Gin Glu Leu Lys Met 65 Vai Phe Gin Ile Gin 70 Ile Ser Arg Ile Glu 75 Thr Ser Asn Val Ile 80 Trp Vai Gly Asn Tyr 85 Ser Thr Thr Val Lys 90 Trp Asn Gin Val Leu 95 His Trp Ser Trp Glu 100 Ser Glu Leu Pro Leu 105 Glu Cys Ala Thr His 110 Phe val Arg lie Lys 115 Ser Leu Val Asp Asp 120 Ala Lys Phe Pro Glu 125 Pro Asn Phe Trp Ser 130 Asn Trp Ser Ser Trp 135 Glu Glu Val Ser val 140 Gin Asp Ser Thr Gly 145 Gin Asp Ile Leu Phe 150 Val Phe Pro Lys Asp 155 Lys Leu Val Glu Glu 160 Gly Thr Asn Val Thr 165 Ile Cys Tyr Val Ser 170 Arg Asn Ile Gin Asn 175 Asn Vai Ser Cys Tyr 180 Leu Glu Gly Lys Gin 185 Ile His Gly Glu Gin 190 Leu Asp Pro His Vai 195 Thr Ala Phe Asn Leu 200 Asn Ser Val Pro Phe 205 Ile Arg Asn Lys Gly 210 Thr Asn Ile Tyr Cys 215 Glu Ala Ser Gin Gly 220 Asn Val Ser Glu Gly 225 Met Lys Gly Ile Val 230 Leu Phe Val Ser Lys 235 Val Leu Glu Glu Pro 240 Lys ASP Phe Ser Cys 245 Glu Thr Glu Asp Phe 250 Lys Thr Leu His Cys 255 Thr Trp Asp Pro Gly 260 Thr Asp Thr Ala Leu 265 Gly Trp Ser Lys Gin 270 Pro Ser Gin Ser Tyr 275 Thr Leu Phe Glu Ser 280 Phe Ser Gly Glu Lys 285 Lys Leu Cys Thr His 290 Lys Asn Trp Cys Asn 295 Trp Gin Ile Thr Gin 300 Asp Ser Gin Glu Thr 305 Tyr Asn Phe Thr Leu 310 Ile Ala Glu Asn Tyr 315 Leu Arg Lys Arg Ser 320 Vai Asn Xle Leu Phe 325 Asn Leu Thr His Arg 330 Val Tyr Leu Met Asn 335 Pro Phe Ser val Asn 340 Phe Glu Asn Val Asn 345 Ala Thr Asn Ala Ile 350 Met Thr Trp Lys vai 355 His Ser Ile Arg Asn 360 Asn Phe Thr Tyr Leu 365 Cys Gin ile Glu Leu 370 His Gly Glu Gly Lys 375 Met Met Gin Tyr Asn 380 Val Ser Ile Lys Vai 385 Asn Gly Glu Tyr Phe 390 Leu Ser Glu Leu Glu 395 Pro Ala Thr Glu Tyr 400 369 Het Ala Arg Vai Arg 405 Cys Ala Asp Ala Ser 410 His Phe Trp Lys Trp Ser 415 Glu Trp Ser Gly 420 Gin Asn Phe Thr Thr 425 Leu Glu Ala Ala Pro 430 Ser Glu Ala Pro Asp 435 Vai Trp Arg Ile Val 440 Ser Leu Glu Pro Gly 445 Asn His Thr Vai Thr 450 Leu Phe Trp Lys Pro 455 Leu Ser Lys Leu His 460 Ala Asn Gly Lys Ile 465 Leu phe Tyr Asn Vai 470 Val Val Glu Asn Leu 475 Asp Lys Pro Ser Ser 480 Ser Glu Leu His Ser 485 Ile Pro Ala Pro Ala 490 Asn Ser Thr Lys Leu Ile 495 Leu Asp Arg Cys 500 Ser Tyr Gin Ile Cys 505 Val He Ala Asn Asn 510 Ser Val Gly Ala Ser 515 Pro Ala Ser Val Ile 520 Val Ile Ser Ala Asp 52S Pro Glu Asn Lys Glu 530 Vai Glu Glu Glu Arg 535 Ile Ala Gly Thr Glu 540 Gly Gly Phe Ser Leu 545 Ser Trp Lys Pro Gin 550 Pro Gly Asp Val Ile 555 Gly Tyr val Val Asp 560 Trp Cys Asp His Thr 565 Gin Asp Val Leu Gly 570 Asp Phe Gin Trp Lys Asn 575 Vai Gly Pro Asn 580 Thr Thr Ser Thr Val 585 Ile Ser Thr Asp Ala 590 Phe Arg Pro Gly Vai 595 Arg Tyr Asp Phe Arg 600 Ile Tyr Gly Leu Ser 605 Thr Lys Arg ile Ala 610 Cys Leu Leu Glu Lys 615 Lys Thr Gly Tyr Ser 620 Gin Glu Leu Ala Pro 625 Ser Asp Asn Pro His 630 Val Leu Val ASp Thr 635 Leu Thr Ser His Ser 640 Phe Thr Leu Ser Trp 645 Lys Asp Tyr Ser Thr 650 Glu Ser Gin Pro Gly Phe 655 Ile Gin Gly Tyr 660 His Val Tyr Leu Lys 665 Ser Lys Ala Arg Gin 670 Cys His Pro Arg Phe 675 Glu Lys Ala Val Leu 680 Ser Asp Gly Ser Glu 685 Cys Cys Lys Tyr Lys 690 Ile Asp Asn Pro Glu 695 Glu Lys Ala Leu Ile 700 Val Asp Asn Leu Lys 705 Pro Glu Ser Phe Tyr 710 Glu Phe Phe Ile Thr 715 Pro Phe Thr Ser Ala 720 Gly His Glu Ser Gly Ser Pro Ser 725 Ala Thr Phe Thr Lys 730 Val Thr Thr Pro Asp Glu 735 <210> 70 <211> 1557 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (D . . , . (1557) (1557) 370 <400> 70 atg atg tgg acc tgg gea ctg tgg Met 1 Met Trp Thr Trp 5 Ala Leu Trp age ctg gea gct ctg cca gct aag Ser Leu Ala Ala 20 Leu Pro Ala Lys atg etc ccc tea etc tgc aaa ttc Met Leu 10 Pro Ser Leu Cys Lys 15 Phe cct gag aac att tcc tgt gtc tac Pro 25 Glu Asn Ile Ser Cys 30 Vai Tyr 371 tac cat agg aaa aat tta acc tgc act tgg agt cca gga aag gaa acc 144 Tyr Tyr Arg 35 Lys Asn Leu Thr Cys 40 Thr Trp Ser Pro Gly 45 Lys Glu Thr agt Cat acc cag tac aca gtt aag aga act tac gct ttt gga gaa aaa 192 Ser Tyr 50 Thr Gin Tyr Thr Val 55 Lys Arg Thr Tyr Ala 60 Phe Gly Glu Lys cat gat aat tgt aca acc aat agt tet aca agt gaa aat cgt gct teg 240 His 65 Asp Asn Cys Thr Thr 70 Asn Ser Ser Thr Ser 75 Glu Asn Arg Ala Ser 80 tgc cct ttt tcc ctt cca aga ata acg ate cca gat aat tat acc att 288 Cys Ser Phe Phe Leu 85 Pro Arg Ile Thr ile 90 Pro Asp Asn Tyr Thr 95 Ile gag gcg gaa gct gaa aat gga gat ggt gta att aaa tcc cat atg aca 336 Glu Val Glu Ala 100 Glu Asn Gly Asp Gly 105 Val Ile Lys Ser His 110 Met Thr cac tgg aga tta gag aac ata gcg aaa act gaa cca cct aag att ttc 384 Tyr Trp Arg LIS Leu Glu Asn Ile Ala 120 Lys Thr Glu Pro Pro 125 Lys Ile Phe 4J Oi υ gtg aaa cca gtt ttg ggc ate aaa cga atg att caa att gaa tgg 432 Arg val 130 Lys Pro Val Leu Gly 135 lie Lys Arg Met Ile 140 Gin Ile Glu Trp ata aag cct gag ttg gcg CCt gtt tea tet gat cta aaa tac aca ctt 480 Xle 145 Lys Pro Glu Leu Ala 150 Pro Val Ser Ser Asp 155 Leu Lys Tyr Thr Leu 160 cga Ctc agg aca gtc aac agt acc age tgg atg gaa gtc aac ttc gct 528 Arg Phe Arg Thr Val 165 Asn Ser Thr Ser Trp 170 Met Glu Val Asn Phe 175 Ala aag aac cgt aag gat aaa aac caa acg tac aac ctc acg ggg ctg cag 576 Lys Asn Arg Lys 180 Asp Lys Asn Gin Thr 185 tyr Asn Leu Thr Gly 190 Leu Gin cct ttt aca gaa tat gtc ata gct ctg cga tgt gcg gtc aag gag tea 624 Pro Phe Thr 195 Glu Tyr Val Ile Ala 200 Leu Arg Cys Ala Val 205 Lys Glu Ser aag ctc cgg agt gac tgg age caa gaa aaa atg gga atg act gag gaa 672 Lys Phe 210 Trp Ser Asp Trp Ser 215 Gin Glu Lys Met Gly 220 Met Thr Glu Glu gaa gct cca tgt ggc ctg gaa ctg tgg aga gtc ctg aaa cca gct 9ag 720 Glu 225 Ala Pro Cys Gly Leu 230 Glu Leu Trp Arg Val 235 Leu Lys Pro Ala Glu 240 gcg gat gga aga agg cca gtg cgg ttg tta tgg aag aag gea aga gga 768 Ala Asp Gly Arg Arg 245 Pro val Arg Leu Leu 250 Trp Lys Lys Ala Arg 255 Gly gcc cca gtc cta gag aaa aca ctt age tac aac ata tgg tac tat cca 816 Ala Pro val Leu 260 Glu Lys Thr Leu Gly 265 Tyr Asn Ile Trp Tyr 270 Tyr Pro gaa age aac act aac ctc aca gaa aca atg aac act act aac cag cag 864 Glu Ser Asn Thr Asn Leu Thr Glu Thr Met Asn Thr Thr Asn Gin Gin 372 275 280 285 etc gaa ctg cat ctg gga ggc gag age ttt tgg gtg tcc atg att tcc 912 Leu Glu 250 Leu His Leu Gly Gly 295 Glu Ser Phe Trp Val 300 Ser Met Ile Ser tat aat tet ctt ggg aag tet cca gtg gee acc ctg agg att cca gct 960 Tyr 305 Asn Ser Leu Gly Lys 310 Ser Pro Val Ala Thr 315 Leu Arg Ile Pro Ala 320 att caa gaa Ma tca ttt cag tgc att gag gtc atg cag gee tgc gtt 1008 Ile Gin Glu Lys Ser 325 Phe Gin Cys Ile Glu 330 Val Met Gin Ala Cys 335 Val gct gag gac cag cta gtg gtg aag tgg caa age tet gct cta gac gtg 1056 Ala Glu Asp Gin 340 Leu Vai Vai Lys Trp 345 Gin Ser Ser Ala Leu 350 Asp Val aae act tgg atg att gaa tgg ttt ccg gat gtg gac tca gag ccc acc 1104 Asn Thr Trp 355 Met Ile Glu Trp Phe 360 Pro Asp Val Asp Ser 365 Glu Pro Thr acc ctt tec tgg gaa tet gtg tet cag gee acg aac tgg acg ate cag 1152 Thr Leu 370 Ser Trp Glu Ser Vai 375 Ser Gin Ala Thr Asn 380 Trp Thr Ile Gin caa gat aaa tta aaa cct ttc tgg tgc tat aac ate tet gtg tat cca 1200 Gin 385 Asp Lys Leu Lys pro 390 Phe Trp Cys Tyr Asn 395 Ile Ser Val Tyr Pro 400 atg ttg cat gac aaa gtt ggc gag cca tat tcc ate cag gct tac gee 1248 Met Leu His Asp Lys 405 Vai Gly Glu Pro Tyr 410 Ser Ile Gin Ala Tyr 415 Ala aaa gaa ggc gtt cca tca gaa ggt cct gag acc aag gtg gag aac att 1296 Lys Glu Gly Vai 420 Pro Ser Glu Gly Pro 425 Glu Thr Lys Vai Glu 430 Asn Ile ggc gtg aag acg gtc acg ate aca tgg aaa gag att ccc aag agt gag 1344 Gly Vai Lys 435 Thr Vai Thr Ile Thr 440 Trp Lys Glu Ile Pro 445 Lys Ser Glu aga aag ggt ate ate tgc aac tac acc ate ttt tac caa gct gaa ggt 1392 Arg Lys 450 Gly Ile ile Cys Asn 455 Tyr Thr Ile Phe Tyr 460 Gin Ala Glu Gly gga aaa gga ttc tcc aag aca gtc aat tcc age ate ttg cag tac ggc 1440 Gly 465 Lys Gly Phe Ser Lys 470 Thr Vai Asn Ser Ser 475 Ile Leu Gin Tyr Gly 480 ctg gag tcc ctg aaa cga aag acc tet tac att gtt cag gtc atg gee 1488 Leu Glu Ser Leu Lys 485 Arg Lys Thr Ser Tyr 490 Ile Val Gin Val Met 495 Ala age acc agt gct ggg gga acc aac ggg acc age ata aat ttc aag aca 1536 Ser Thr Ser Ala SOO Gly Gly Thr Asn Gly 50S Thr Ser Ile Asn Phe 510 Lys Thr 1557 ttg tca ttc agt gtc CCt gag Leu Ser Phe Ser Vai Phe Glu 515 373

<210> 71 <211> 519 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 71 374

Met 1 Met Trp Thr Trp 5 Ala Leu Trp Met Leu 10 Pro Ser Leu Cys Lys 15 Phe Ser Leu Ala Ala 20 Leu Pro Ala Lys Pro 25 Glu Asn Ile Ser Cys 30 Val Tyr Tyr Tyr Arg 35 Lys Asn Leu Thr Cys 40 Thr Trp Ser Pro Gly 45 Lys Glu Thr Ser Tyr 50 Thr Gin Tyr Thr Val 55 Lys Arg Thr Tyr Ala 60 Phe Gly Glu Lys His 65 Asp Asn Cys Thr Thr 70 Asn Ser Ser Thr Ser 75 Glu Asn Arg Ala Ser 80 Cys Ser Phe Phe Leu 85 Pro Arg Ile Thr Ile 90 Pro Asp Asn Tyr Thr 95 Ile Glu Vai Glu Ala 100 Glu Asn Gly Asp Gly 105 Val Ile Lys Ser His 110 Met Thr Tyr Trp Arg 115 Leu Glu Asn Ile Ala 120 Lys Thr Glu Pro Pro 125 Lys ile Phe Arg Vai 130 Lys Pro Val Leu Gly 135 Ile Lys Arg Met ile 140 Gin ile Glu Trp Ile 145 Lys Pro Glu Leu Ala 150 Pro Val Ser Ser Asp 155 Leu Lys Tyr Thr Leu 160 Arg Phe Arg Thr Val 165 Asn Ser Thr Ser Trp 170 Met Glu val Asn Phe 175 Ala Lys Asn Arg Lys 180 Asp Lys Asn Gin Thr 185 Tyr Asn Leu Thr Gly 190 Leu Gin Pro Phe Thr 195 Glu Tyr Val ile Ala 200 Leu Arg Cys Ala Val 205 Lys Glu Ser Lys Phe 210 Trp Ser Asp Trp Ser 215 Gin Glu Lys Met Gly 220 Met Thr Glu Glu Λ1 .. » 1 _ Pro A. vor» Λή . - t ... .. Leu AAF •fc it. i vai 235 Ψ v . λ1 . IH1 .. V3XU 225 ma vjAy liCU 230 U1U ueu nv Μία UiU 240 Ala Asp Gly Arg Arg 245 Pro Val Arg Leu Leu 250 Trp Lys Lys Ala Arg 255 Gly Ala Pro Val Leu 260 Glu Lys Thr Leu Gly 265 Tyr Asn Ile Trp Tyr 270 Tyr Pro Glu Ser Asn 275 Thr Asn Leu Thr Glu 280 Thr Met Asn Thr Thr 285 Asn Gin Gin Leu Glu 290 Leu His Leu Gly Gly 295 Glu Ser Phe Trp Val 300 Ser Met Ile Ser Tyr 305 Asn Ser Leu Gly Lys 310 Ser Pro Val Ala Thr 315 Leu Arg Ile Pro Ala 320 lie Gin Glu Lys Ser 325 Phe Gin Cys Ile Glu 330 Val Met Gin Ala Cys 335 Val Ala Glu Asp Gin 340 Leu Vai Val Lys Trp 345 Gin Ser Ser Ala Leu 350 Asp Val Asn Thr Trp 355 Met Ile Glu Trp Phe 360 Pro Asp Val Asp Ser 365 Glu Pro Thr Thr Leu 370 Ser Trp Glu Ser Val 375 Ser Gin Ala Thr Asn 380 Trp Thr Ile Gin Gin 385 Asp Lys Leu Lys Pro 390 Phe Trp Cys Tyr Asn 395 Ile Ser val Tyr Pro 400 Met Leu His Asp Lys 405 Val Gly Glu Pro Tyr 410 Ser Ile Gin Ala Tyr 415 Ala Lys Glu Gly Val 420 Pro Ser Glu Gly Pro 425 Glu Thr Lys Val Glu 430 Asn Ile Gly val Lys 435 Thr Val Thr Ile Thr 440 Trp Lys Glu Ile Pro 445 Lys Ser Glu Arg Lys Gly Ile Ile Cys Asn Tyr Thr Ile Phe Tyr Gin Ala Glu Gly 375 375 460 Ser Ile Leu Gin Tyr Gly 475 480 Ile Vai Gin Vai Met Ala 495 Ser Ile Asn Phe Lys Thr 510 450 455

Gly Lys Gly Phe Ser Lys Thr Vai Asn Ser 465 470

Leu Glu Ser Leu Lys Arg Lys Thr Ser Tyr 485 490

Ser Thr Ser Ala Gly Gly Thr Asn Gly Thr SOO 505

Leu Ser Phe Ser Vai Phe Glu 515

<210> 72 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> etiqueta peptidica de His na extremidade C. <400> 72

Gly Ser Gly Gly His His His His His His 15 10

<210> 73 <211> 12 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> espaçador Gly-Ser de 12 aminoácidos <400> 73

Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Glu Pro Arg ser 15 10

<210> 74 <211> 31 <212> ADN <213> Sequência artificial 376 <22 0> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC41557 <400> 74 ttatagatct cgaggagtgt tcatccggag t 31

<210> 75 <211> 65 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC29232 <400> 75 cgactgactc gagtcagtga tggtgatggt gatggccacc tgatccctta cccggagaca 60 gggag 65

<210> 76 <211> 3196 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 76 377 tgtatgtctg cacagtttgt gtatgcctgg tgcccacaga ggctcgagag tgtcagattc 60 cccccaaaac cggagttaca gttctgagcc gccccatgct cgatagcaat caaacctggg 120 tcctccgaaa gagcacccag tgcatgtaac cactgaacca tctctccaaa ccatgaacac 180 cacctcaact ttttttaata gttaaaggat attttgattc taaagatgta aaagaacgtc 240 tcacceattt tgaaatttgg caacaaatgc ttcttcaaag cttaaaaaaa ttagttcagg 300 cttttttttt ctcccagcca gtgattcgct aagctgccca aactggctta gaatttgtga 360 ccctcttgtc tcagcatact gagtgttaag attacaagtg caccccctac ccagttccca 420 taattaaccg atccaccccc acccccaccc caccccactc ccattgcctg ggcaagtaac 480 tcttgagccc cattctggtt ctagagtctg aagtcacaaa ggtgcaggtg agaacgcaag 540 gacaagggca ggccctggag cacagatgcc ttctccttafc gccttccctg tgctcactag 600 agccatcccc ctgcctccgg aattcccaca gacggatcgc tccgtggctt cttaaaactt 660 ccctgcaggg cactgaccct cagcccctct aagtcacttc ccccccagtg attgtacttt 720 tcaatcgggc ttcaaacttt cctctcatta aatcagcaag cactttccaa gaaaagagag 780 atgctcaaga tgccttcctg tgtggcatgt gtatgcgttC gcgtgtgtgc acgcatgtgt 840 gtgcacgtga ctcaatcttc tgccttgcct tgagggtaac ctcagcattt ccttccagcc 900 ctgctttccc caggccgagc cgaggctggc aaccttCtga aaacgccttc tggagaaaag 960 ctgagcaatg gttttgccat gggcgggcct ttgatctgcc tcctcatgac aaccctttaC 1020 atattgcctg gtggccatgg cgaacacacc aggctccaga gaccacaggc aaagcgggcc 1080 ttcctcacte tctcaccgtc gccatgatct tccacacagg taccgccggc tccacacgca 1140 gctcagcatg gcttcagctc catggctctt atcatgttag gggaaggagc cgggaatggc 1200 tgcctcaggt ggtcgctgga cagaggctgt tgtaactgaa gccgggatgg gcaggggcat 1260 ctgacccatc agctccatgg tacccttctt tttctccagg aacaacgaag cctaccctgg 1320 tgccgctttg ctgtatagga acctggccgg ccacctgcag cttgcccttc ggtgccccaa 1380

Catcgaagga agacttaaga accacaattg acctcctgaa acaagagtct caggatcttt 1440 ataacaacca tgtaagtgcc cttgagatcg ttttttctta accacttctt taaaatgtct 1500 cattttgcta tctaagcaca gctatccttt ctcgatataa agccagccat ggaagccaga 1560 gaggcatggg gaaacattgg aattcggttg gggtgaaatg tttccaaggg ggtaaatgca 1620 ctagcagaag aggcagaggc agactggtcc agggactgaa accttggcag cttacgaaac 1680 actacaggat gtatgctccc tgaattcttt atctcaaatc cacccggctc acagtcccta 1740 ctaaacgagc actcttgctg aaagggcatc cttagagaag ggccagcttg attcaggáat 1800 cccccaagag caatgagagc cagtttcagc agccaaagat gtcctagcgg aagcagggtg 1860 cgaggatctt cctttgggtc tccgttgact aactaggcaa ctgtctgtgt gttcttggag 1920 catcctggag ggccctcegc ctggccagag cctggcacag gtacagcaca ggacccagaa 1980 agcgtgaata cttcatttcc ttgggaccgc ttagataact tcagttgaag caagtaacag 2040 ggaaactgat ggagacacag ataacctccc tgcccctctc acttcagtca ctgagcctcc 2100 gagaacaggt tgcagatggc taggggcagc ctcagccaga taggcggagg cagactgggt 2160 agaagcatcc ttaggaacca cggccaacct gggtgggtat gccatgtctt ctagctcaca 2220 agccaactag accttcgatt cctgtagaca cagagccagt gacggcccaa gctccagaag 2280 gttgttgtac caattagata aggtctgagg caggcCagac acagaggaag ccctggaaat 2340 gagctgttct gagctgtagg gttgttacaa atgtcttcct cacaatattt caaacctcct 2400 ctttctacag agcataaagc aggcatctgg gatgtcagca gacgaatcaa tacagctgcc 2460 gegtttcagc ctggaccggg aagcattaac caacatctcg gtcatcatag cacatctgga 2520 gaaagtcaaa gcgttgagcg agaacacagt agatacttct tgggtgataa gatggccaac 2580 aaacaccagc tgtttcaacc cactgaattt aaacatttct gtgcccggaa atactgatga 2640 atcctatgat tgtaaagtgt tcgtgcttac ggtttcaaag cagttctcaa actgcacggc 2700 agaactgcag gctaaggaca atactacatg etgagtgatg gggggggggg ggtgcagtgt 2760 cctcagcagc gcctgtcctt cgagggctga gcttgcaacc caggacttaa ccccaaaggg 2820 actgtgcggt cattactagt catgCtattt atgtttttat tttgtccact gaaatcttgt 2880 cccgccaccc tgtagggact ggaagcggca gctatattca tttattcatg tactgagttt 2940 gttaacgctc catggaggag ccttcagagt ctatttaata aattatattg acatgatcac 3000 ataatcagtc ttggaatttg tgatggggtc gaaatcaaag attaggaatg ttctggaaat 3060 agtttacgcc accctctccc eccatcagac agactcacga gcaaataatc ccagcagcat 3120 cacgtgeatg ataaacatct ttgttccagg tcataagtac aatcactgcc cttttggtat 3180 gcaggctgga aactaa 3196 <210> 77 <211> 24 378 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC28575 <40 0> 77 ccaggaaagg aaaccagtta tacc 24 <210> 78 <211> 23 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC21195 <40 0> 78 gaggagacca taacccccga cag 23 <210> 79 <211> 23 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC21196 <40 0> 79 catagctccc accacacgat ttt 23 <210> 80 <211> 25 <212> ADN <213> Sequência artificial 379 <22 0> <223> Iniciador oligonucleot: idico <40 0> 80 aaaaccaaac gtacaacctc acggg 25 <210> 81 <211> 25 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador oligonucleot: idico <40 0> 81 gagcagccat acaccagagc agaca 25 <210> 82 <211> 19 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador oligonucleot: idico <40 0> 82 ZC26358 ZC26359 ZC29179 gcagggttgg gaacggtgg 19

<210> 83 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> 380 <223> Iniciador oligonucleotidico ZC28917 <400> 83 tgcaagatgc tggaattgac 20

<210> 84 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC28916 <400> 84 agtcaattcc agcatcttgc 20

<210> 85 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC28918 <400> 85 tcacagagtc atcagactcc 20

<210> 86 <211> 18 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC41498 381 <400> 86 ggctccagag accacagg 18 <210> 87 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC41496 <40 0> 87 atgactagta atgaccgcac ag 22 <210> 88 <211> 39 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC41583 <40 0> 88 cgtacgggcc ggccaccatg atcttccaca caggaacaa 39 <210> 89 <211> 36 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC41584 <40 0> 89 tgacgaggcg cgcctcagca tgtagtattg tcctta36 382

<210> 90 <211> 650 <212> ADN <213> Mus musculus <22 0>

<221> CDS <222> (53)...(542) <400> 90 383 ggctccagag accacaggca aagcgggcct tcctcactct cttaccgtcg cc atg ate 58

Met Ile X ttc cac aca gga aca acg aag cet acc ctg gtg ctg ctt tgc tgt ata 106 Phe His Thr 5 Gly Thr Thr Lys Pro 10 Thr Leu Val Leu Leu 15 Cys Cys Ile gga acc tgg ctg gee acc tgc age ttg tcc ttc ggt gee cca ata teg 154 Gly Thr 20 Trp Leu Ala Thr Cys 25 Ser Leu Ser Phe Gly 30 Ala Pro Ile Ser aag gaa gac tta aga act aca att gac etc ttg aaa caa gag tet cag 202 Lys 35 Glu Asp Leu Arg Thr 40 Thr Ile Asp Leu Leu 45 Lys Gin Glu Ser Gin 50 gat ctt tat aac aac tat age ata aag cag gea tet ggg atg tea gea 250 Asp Leu Tyr Asn Asn 55 Tyr Ser Ile Lys Gin 60 Ala ser Gly Met Ser 65 Ala gac gaa tea ata cag ctg ccg tgt ttc age ctg gac cgg gaa gea tta 298 Asp Glu Ser Ile 70 Gin Leu Pro Cys Phe 75 Ser Leu Asp Arg Glu 80 Ala Leu acc aac ate teg gtc ate ata gea cat ctg gag aaa gtc aaa gtg ttg 346 Thr Asn Ile 85 Ser Wal W λ. Ile Ile Ala 90 Kis Leu Glu Lys Val 95 Lys Val Leu age gag aac aca gta gat act tet tgg gtg ata aga tgg cta aca aac 394 Ser Glu 100 Asn Thr Vai Asp Thr 105 Ser Trp Val Ile Arg 110 Trp Leu Thr Asn ate age tgt ttc aac cca ctg aat tta aac att tet gtg cct gga aat 442 Ile 115 Ser Cys Phe Asn Pro 120 Leu Asn Leu Asn Ile 125 Ser Val Pro Gly Asn 130 act gat gaa tcc tat gat tgt aaa gtg ttc gtg ctt acg gtt tta aag 490 Thr Asp Glu Ser Tyr 135 Asp Cys Lys Val Phe 140 val Leu Thr Val Leu 145 Lys cag ttc tea aac tgc atg gea gaa ctg cag gct aag gac aat act aca 538 Gin Phe Ser Asn 150 Cys Met Ala Glu Leu 155 Gin Ala Lys Asp Asn 160 Thr Thr tgc t gagtgatggg gggggggtgc agtgtcctca gcagtgcctg tcettcgagg 592

Cys gctgagcttg caacccagga cttaactcca aagggactgt gcggtcatta ctagtcat 650

<210> 91 <211> 163 <212> PRT <213> Mus musculus 384 <400> 91

Met 1 Ile Phe HÍS Thr 5 Gly Thr Thr Lys Pro 10 Thr Leu Vai Leu Leu 15 Cys Cys Ile Gly Thr 20 Trp Leu Ala Thr Cys 25 Ser Leu Ser Phe Gly 30 Ala Pro Ile Ser Lys 35 Glu Asp Leu Arg Thr 40 Thr Ile Asp Leu Leu 45 Lys Gin Glu Ser Gin 50 Asp Leu Tyr Asn Asn 55 Tyr Ser Ile Lys Gin 60 Ala Ser Gly Met Ser 65 Ala Asp Glu Ser Ile 70 Gin Leu Pro Cys Phe 75 Ser Leu Asp Arg Glu 80 Ala Leu Thr Asn Ile 85 Ser Vai Ile Ile Ala 90 His Leu Glu Lys val 95 Lys Vai Leu Ser Glu 100 Asn Thr Vai Asp Thr 105 Ser Trp Vai Ile Arg 110 Trp Leu Thr Asn Ile 115 Ser Cys Phe Asn Pro 120 Leu ASn Leu Asn ile 125 Ser Val Pro Gly Asn 130 Thr Asp Glu Ser Tyr 135 Asp Cys Lys Vai Phe 140 vai Leu Thr Val Leu 145 Thr Lys Thr Gin Cys Phe Ser Asn 150 Cys Met Ala Glu Leu 1S5 Gin Ala Lys Asp Asn 160

<210> 92 <211> 511 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> sequência de ADNc murina (SEQ ID N°: 90) y locais de restrição w/Fsel e Asei e una sequência Kozak parcial para a grella de leitura aberta y codão de terminação de mcytorl71ig <400> 92 ggccggccac catgatcttc cacacaggaa caacgaagcc taccctggtg ctgctttgct 60 gtataggaac ctggctggcc acctgcagct tgtccttcgg tgccccaata tcgaaggaag 120 acttaagaac tacaattgac ctcttgaaac aagagtctca ggatctttat aacaactata 180 gcacaaagca ggcatctggg acgtcagcag acgaaccaat acagctgccg tgtttcagcc 240 tggaccggga agcattaacc aacatctcgg tcatcatagc acatctggag aaagtcaaag 300 tgttgagcga gaacacagta gatacttcct gggtgataag acggctaaca aacatcagct 360 gtttcaaccc accgaactta aacatttctg tgcctggaaa tactgatgaa tcctatgatt 420 gtaaagtgtt cgtgctcacg gttttaaagc agtcctcaaa ctgcatggca gaactgcagg 480 ccaaggacaa cactacatgc tgaggcgcgc c 511 385

<210> 93 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC41438 <40 0> 93 gccatggcct ctcactcagg c 21 <210> 94 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC41437 <40 0> 94 ccagggagca ttgacaactc ttag 24 <210> 95 <211> 516 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> polinucleótido zCytor17Lig-CEE humano <221> CDS <222> (1)...(516) <400> 95 386 atg gcc tct cac tca ggc ccc tcg acg tct gtg ctc ttt ctg ttc tgc 48 Met Ala Ser His Ser Gly Pro Ser Thr Ser Val Leu Phe Leu Phe Cys 1 S 10 15 tgc ctg gga ggc tgg ctg gcc tcc cac acg ttg ccc gtc cgt tta cta 96 Cys Leu Gly Gly Trp Leu Ala Ser His Thr Leu Pro Val Arg Leu Leu 20 25 30 cga cca agt gat gat gta cag aaa ata gtc gag gaa tta cag tcc ctc 144 Arg Pro Ser Asp Asp Vai Gin Lys Ile Val Glu Glu Leu Gin Ser Leu 35 40 45 tcg aag atg ctt ttg aaa gat gtg gag gaa gag aag ggc gtg ctc gtg 192 Ser Lys Met Leu Leu Lys Asp Vai Glu Glu Glu Lys Gly Val Leu Val 50 55 60 tcc cag aat tac acg ctg ccg tgt ctc age cct gac gcc cag ccg cca 240 Ser Gin Asn Tyr Thr Leu Pro Cys Leu Ser Pro Asp Ala Gin Pro Pro 65 70 75 80 aac aac ate cac age cca gcc ate cgg gea tat ctc aag aca ate aga 288 Asn Asn Ile His Ser Pro Ala Ile Arg Ala Tyr Leu Lys Thr Ile Arg 85 90 95 cag cta gac aac aaa tct gtt att gac gag ate ata gag cac ctc gac 336 Gin Leu Asp Asn Lys Ser Vai Ile Asp Glu ile Ile Glu His Leu Asp 100 105 110 aaa ctc ata ttt caa gat gea cca gaa aca aac att tct gtg cca aca 384 Lys Leu Ile Phe Gin Asp Ala Pro Glu Thr Asn Ile Ser Val Pro Thr 115 120 125 gac acc cat gaa tgt aaa ege ttc ate ctg act att tct caa cag ttt 432 Asp Thr His Glu Cys Lys Arg Phe Ile Leu Thr Ile Ser Gin Gin Phe 130 135 140 tca gag tgc atg gac ctc gea cta aaa cca ctg acc tct gga gcc caa 480 Ser Glu Cys Met Asp Leu Ala Leu Lys Ser Leu Thr Ser Gly Ala Gin 145 ISO 155 160 cag gcc acc act gaa gaa tac atg ccg atg gaa taa 516 Gin Ala Thr Thr Glu Glu Tyr Met Pro Met Glu * 165 170 <210> 96 <211> 171 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> polipéptido zCytorl7Lig-CEE humano 387 <400> 96 Het Ala Ser His Ser Gly Pro Ser Thr Ser Vai Leu Phe Leu Phe Cys 1 Cys Leu Gly Gly 5 Trp Leu Ala Ser His 10 Thr Leu Pro Vai Arg 15 Leu Leu Arg pro Ser 20 Asp Asp Vai Gin Lys 25 Ile Vai Glu Glu Leu 30 Gin Ser Leu Ser Lys 35 Het Leu Leu Lys Asp 40 Vai Glu Glu Glu Lys 45 Gly Vai Leu Vai 50 Ser Gin Asn Tyr Thr Leu 55 Pro Cys Leu Ser Pro 60 Asp Ala Gin Pro Pro 65 Asn Asn Ile His Ser 70 Pro Ala Ile Arg Ala 75 Tyr Leu Lys Thr 80 Ile Arg Gin' Leu Asp Asn 85 Lys Ser Vai Ile Asp 90 Glu Ile Ile Glu His 95 Leu Asp Lys Leu Ile 100 Phe Gin Asp Ala Pro 105 Glu Thr Asn Ile Ser 110 Vai Pro Thr Asp Thr 115 His Glu Cys Lys Arg 120 Phe Ile Leu Thr Ile 125 Ser Gin Gin Phe 130 Ser Glu Cys Met Asp Leu 135 Ala Leu Lys Ser Leu 140 Thr Ser Gly Ala Gin 145 Gin Ala Thr Thr Glu 165 150 Glu Tyr Het Pro Met 170 155 Glu 160

<210> 97 <211> 49 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC41607 <400> 97 tccagggaat tcatataggc cggccaccat ggcctctcac tcaggcccc 49

<210> 98 <211> 82 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC41605 <400> 98 caaccccaga gctgttttaa ggcgcgcctc cagactatta ctccatcggc atgtattctt 60 cagtggtggc ctgttgggct cc 82

<210> 99 <211> 629 <212> ADN <213> Mus musculus <22 0>

<221> CDS <222> (28)...(528) <400> 99 389 aaccccttgg aggaccagaa cgagaca atg gtt ctt gcc age tet acc acc age 54

Met Vai Leu Ala Ser Ser Thr Thr Ser 1 5 ate cac acc atg ctg etc ctg ctc ctg atg ctc ttc cac ctg gga ctc 102 Ile His Thr Met Leu Leu Leu Leu Leu Met Leu Phe His Leu Gly Leu 10 IS 20 25 caa gct tea ate agt ggc cgg gat acc cac cgt tta acc aga acg ttg ISO Gin Ala Ser He Ser Gly Arg Asp Thr His Arg Leu Thr Arg Thr Leu 30 35 40 aat tgc age tet att gtc aag gag att ata ggg aag ctc cca gaa cct 198 Asn Cys Ser Ser Ile val Lys Glu Ile Ile Gly Lys Leu Pro Glu Pro 45 50 55 gaa etc aaa act gat gat gaa gga ccc tet ctg agg aat aag age ttt 246 Glu Leu Lys Thr Asp Asp Glu Gly Pro Ser Leu Arg Asn Lys Ser Phe 60 65 70 cgg aga gta aac ctg tcc aaa ttc gtg gaa age caa gga gaa gtg gat 294 Arg Arg Vai Asn Leu Ser Lys Phe Val Glu Ser Gin Gly Glu val Asp 75 80 85 cct gag gac aga tac gtt ate aag tcc aat ctt cag aaa ctt aac tgt 342 Pro Glu Asp Arg Tyr val Ile Lys Ser Asn Leu Gin Lys Leu Asn Cys 90 95 100 105 tgc ctg cct aca tet gcg aat gac tet gcg ctg cca ggg gtc ttc att 390 Cys Leu Pro Thr Ser Ala Asn Asp Ser Ala Leu Pro Gly Val Phe Ile 110 115 120 cga gat ctg gat gac ttt cgg aag aaa ctg aga ttc tac atg gtc cac 438 Arg Asp Leu Asp Asp Phe Arg Lys Lys Leu Arg Phe Tyr Met Val His 125 130 135 ctt aac gat ctg gag aca gtg cta acc tet aga cca cct cag CCC gea 486 Leu Asn Asp Leu Glu Thr Val Leu Thr Ser Arg Pro Pro Gin Pro Ala 140 145 150 tet ggc tcc gtc tet cct aac cgt gga acc gtg gaa tgt taa 528 Ser Gly Ser Val Ser Pro Asn Arg Gly Thr Val Glu Cys * 155 160 165 aacagcaggc agagcaccta aagtctgaat gtccctcatg gcccatggcc aaaaggattt 58S tacattcctt tatgccatca aacgtcctat caatttatct a 629

<210> 100 <211> 166 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 100 390

Met 1 Vai Leu Ala Ser 5 Ser Thr Thr Ser Ile 10 His Thr Mec Leu Leu 15 Leu Leu Leu Met Leu 20 Phe His Leu Gly Leu 25 Gin Ala Ser lie Ser 30 Gly Arg Asp Thr His 35 Arg Leu Thr Arg Thr 40 Leu Asn Cys Ser Ser 45 Ile Val Lys Glu Ile 50 Ile Gly Lys Leu Pro 55 Glu Pro Glu Leu Lys 60 Thr Asp Asp Glu Gly 65 Pro Ser Leu Arg Asn 70 Lys Ser Phe Arg Arg 75 Val Asn Leu Ser Lys 80 Phe Vai Glu Ser Gin 85 Gly Glu val Asp Pro 90 Glu Asp Arg Tyr Val 95 Ile Lys Ser Asn Leu 100 Gin Lys Leu Asn Cys 105 Cys Leu Pro Thr Ser 110 Ala Asn Asp Ser Ala 115 Leu Pro Gly Vai Phe 120 Ile Arg Asp Leu Asp 125 ASp Phe Arg Lys Lys 130 Leu Arg Phe Tyr Met 135 Val His Leu Asn Asp 140 Leu Glu Thr Val Leu 145 Arg Thr Gly Ser Thr Arg Vai Pro Glu 165 Pro 150 Cys Gin Pro Ala Ser Gly 155 Ser Val Ser Pro Asn 160 <210> 101 <211> 674 <212> ADN <213> Homo <22 0> <221> CDS <222> (10) <40 0> 101 391 gatccaaac atg age ege ctg ccc gtc ctg etc ctg etc caa etc ctg gtc 51 Met Ser Arg Leu Pro Vai Leu Leu Leu Leu Gin Leu Leu Vai 15 10 ege Arg 15 ccc Pro gga etc Gly Leu caa Gin gct Ala 20 ccc Pro atg Met acc Thr cag Gin aca Thr 25 acg Thr tcc Ser ttg Leu aag Lys aca Thr 30 99 age Ser cgg Trp gtt Vai aac Asn tgc Cys 35 tet Ser aac Asn atg Met ate Ile gat Asp 40 gaa Glu att Ile ata Ile aca Thr cac His 45 tta Leu 147 aag Lys cag Gin cca Pro cct Pro 50 ttg Leu cct Pro ttg Leu ctg Leu gac Asp 55 ttc Phe aac Asn aac Asn etc Leu aat Asn 60 ggg Gly gaa Glu 195 gac Asp caa Gin gac Asp 65 att Ile ctg Leu atg Met gaa Glu aat Asn 70 aac Asn ctt Leu cga Arg agg Arg cca Pro 75 aac Asn ctg Leu gag Glu 243 gea Ala ttc Phe aac Asn agg Arg gct Ala gtc Vai aag Lys agt Ser tta Leu cag Gin aac Asn gea Ala tea Ser gea Ala att Ile gag Glu 291 80 85 90 age Ser 95 att Ile ctt Leu aaa Lys aat Asn etc Leu 100 ctg Leu cca Pro tgt Cys ctg Leu ccc Pro 10S ctg Leu gee Ala acg Thr gee Ala gea Ala 110 339 ccc Pro acg cga Thr Arg cat His cca Pro 115 ate Ile cat His ate Ile aag Lys gac Asp 120 ggt Gly gac Asp cgg Trp aat Asn gaa Glu 125 ttc Phe 387 cgg Arg agg aaa Arg Lys ctg Leu 130 acg Thr ttc Phe tat Tyr ctg Leu aaa Lys 135 acc Thr ctt Leu gag Glu aat Asn gcg Ala 140 cag Gin gct Ala 435 caa Gin cag acg Gin Thr 145 act Thr ttg Leu age Ser etc Leu gcg Ala 150 ate Ile tt ttagtccaac gtccagctcg 484 ttctctgggc cttctca.cca eagegcctcg ctctgggtca tctctcacac attccaggac agatgaattg ttaattatct aatttctgaa tgtgttctca r ggacatcaaa : cagaagcatt atgtgcagct aacageagaa cttctgaaac tcaccttttc ctgcggcatc cccatttggc cttgtgcggt 544 604 664 674

<210> 102 <211> 151 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 102 392

Met Ser Arg Leu Pro Vai Leu Leu Leu Leu Gin Leu Leu Vai Arg Pro 1 5 10 15 Gly Leu Gin Ala Pro Met Thr Gin Thr Thr Ser Leu Lys Thr Ser Trp 20 25 30 Vai Asn Cys Ser Asn Met ile Asp Glu Ile Ile Thr His Leu Lys Gin 35 40 45 Pro Pro Leu Pro Leu Leu Asp Phe Asn Asn Leu Asn Gly Glu Asp Gin 50 55 60 Asp Ile Leu Met Glu Asn Asn Leu Arg Arg Pro Asn Leu Glu Ala Phe 65 70 75 80 Asn Arg Ala Vai Lys Ser Leu Gin Asn Ala Ser Ala Ile Glu Ser Ile 85 90 95 Leu Lys Asn Leu Leu Pro Cys Leu Pro Leu Ala Thr Ala Ala Pro Thr 100 105 110 Arg Hls Pro Ile HÍS Ile Lys Asp Gly Asp Trp Asn Glu Phe Arg Arg 115 120 125 Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Lys Thr Leu Glu Asn Ala Gin Ala Gin Gin 130 135 140 Thr Thr Leu Ser Leu Ala Ile

145 ISO

<210> 103 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> etiqueta peptidica Glu-Glu (CEE) alternativa sem o par de resíduos Gly-Ser <400> 103

Glu Glu Tyr Met Pro Met Glu 1 5

<210> 104 <211> 513 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0>

<223> polinucleótido zCytor17Lig(m)-CEE de rato <221> CDS 393 <222> (1)...(513) <400> 104 atg ate ttc cac aca gga aca acg aag cct acc ctg gtg ctg ctt tgc 48 Met lie Phe His Thr Gly Thr Thr Lys Pro Thr Leu Val Leu Leu Cys 1 5 10 15 tgt ata gga acc tgg ctg gee acc tgc age ttg tcc ttc ggt gee cca 96 Cys Ile Gly Thr Trp Leu Ala Thr Cys Ser Leu Ser Phe Gly Ala Pro 20 25 30 ata teg aag gaa gac tta aga act aca att gac ctc ttg aaa caa gag 144 ile Ser Lys Glu Asp Leu Arg Thr Thr Ile Asp Leu Leu Lys Gin Glu 35 40 45 tct cag gat ctt tat aac aac tat age ata aag cag gca tct ggg atg 192 Ser Gin Asp Leu Tyr Asn Asn Tyr Ser Ile Lys Gin Ala Ser Gly Met 50 55 . 60 tca gca gac gaa tca ata cag ctg ccg tgt ttc age ctg gac cgg gaa 240 Ser Ala Asp Glu Ser Ile Gin Leu Pro Cys Phe Ser Leu Asp Arg Glu 65 70 75 80 gca tta acc aac ate teg gtc ate ata gca cat ctg gag aaa gtc aaa 288 Ala Leu Thr Asn ile Ser Vai ile Ile Ala His Leu Glu Lys Val Lys 85 90 95 gtg ttg age gag aac aca gta gat act tct tgg gtg ata aga tgg cta 336 Vai Leu Ser Glu Asn Thr Vai Asp Thr Ser Trp Vai Ile Arg Trp Leu 100 105 110 aca aac ate age tgt ttc aac cca ctg aat tta aac att tct gtg cct 384 Thr Asn Ile Ser Cys Phe Asn Pro Leu Asn Leu Asn Ile Ser val Pro 115 120 125 gga aat act gat gaa tcc tat gat tgt aaa gtg ttc gtg ctt acg gtt 432 Gly Asn Thr Asp Glu Ser Tyr Asp Cys Lys Vai Phe Val Leu Thr Val 130 135 140 tta aag cag ttc tca aac tgc atg gca gaa ctg cag gct aag gac aat 480 Leu Lys Gin Phe Ser Asn Cys Met Ala Glu Leu Gin Ala Lys Asp Asn 145 150 155 160 act aca tgc gaa gaa tac atg ccg atg gaa tga 513 Thr Thr Cys Glu Glu Tyr Met Pro Met Glu * 165 170

<210 > 105 <211> 170 <212> PRT <213> Sequência artificial 394 <22 0> zCytorl7Lig(m)-CEE de rato <223> polipéptido <400> 105

Met Ile Phe His Thr Gly Thr Thr Lys Pro Thr Leu Val Leu Leu Cys 1 5 10 15 Cys Ile Gly Thr Trp Leu Ala Thr Cys Ser Leu Ser Phe Gly Ala Pro 20 25 30 Ile Ser Lys Glu Asp Leu Arg Thr Thr Ile Asp Leu Leu Lys Gin Glu 35 40 45 Ser Gin Asp Leu Tyr Asn Asn Tyr Ser Ile Lys Gin Ala Ser Gly Met 50 55 60 Ser Ala Asp Glu Ser Ile Gin Leu Pro Cys Phe Ser Leu Asp Arg Glu 65 70 75 80 Ala Leu Thr Asn Ile Ser Vai ile Ile Ala His Leu Glu Lys Val Lys 85 90 95 Vai Leu Ser Glu Asn Thr Vai Asp Thr Ser Trp Val Ile Arg Trp Leu 100 105 110 Thr Asn ile Ser Cys Phe Asn Pro Leu Asn Leu Asn Ile Ser Val Pro 115 120 125 Gly Asn Thr Asp Glu Ser Tyr Asp Cys Lys Val Phe Val Leu Thr Val 130 135 140 Leu Lys Gin Phe Ser Asn Cys Met Ala Glu Leu Gin Ala Lys Asp Asn 145 150 155 160 Thr Thr Cys Glu Glu Tyr Met Pro Met Glu 165 170

<210> 106 <211> 49 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC41643 <400> 106 tccagggaat tcatataggc cggccaccat gatcttccac acaggaaca 49

<210> 107 <211> 85 <212> ADN <213> Sequência artificial 395 <22 0> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC41641 <40 0> 107 caaccccaga gctgttttaa ggcgcgcctc tagattatca ttccatcggc atgtattctt 60 cgcatgtagt attgtcctta gcctg 85 <210> 108 <211> 2529 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> CDS <222> (162) ... (2108 <40 0> 108 cgcgtgtgca gtacgaaaat tgagacagga aggcagagtg tcagcttgtt ccaccccagc 60 396 tgggaatgtg catcaggcaa ctcaagtttt tcaccacggc atgtgtctgt gaatgtccgc 120 aaaacattct ctctccccag ccttcatgtg ttaacctggg g atg acg tgg acc tgg 1*76

Met Met Trp Thr Trp 1 5 gca ctg tgg atg ctc CCC tea ctc tgc aaa ttc age ctg gca gct ctg 224 Ala Leu Trp Met Leu 10 Pro Ser Leu Cys Lys 15 Phe Ser Leu Ala Ala 20 Leu cca gct aag cct 9ag aac att tcc tgt gtc tac tac tat agg aaa aat 272 Pro Ala Lys Pro 25 Glu Asn Ile Ser Cys 30 Val Tyr Tyr Tyr Arg 35 Lys Asn tta acc tgc act tgg agt cca gga aag gaa acc agt tat acc cag tac 320 Leu Thr Cys 40 Thr Trp Ser Pro Gly 45 Lys Glu Thr Ser Tyr 50 Thr Gin Tyr aca gtt aag aga act tac gct ttc gga gaa aaa cat gat aat tgt aca 368 Thr Vai 55 Lys Arg Thr Tyr Ala 60 Phe Gly Glu Lys His 65 Asp Asn Cys Thr acc aat agt tet aca agt gaa aat cgt gct teg tgc tet ttt ttc ctt 416 Thr 70 Asn Ser Ser Thr Ser 75 Glu Asn Arg Ala Ser 80 Cys Ser Phe Phe Leu 85 cca aga ata acg ate cca gat aat tat acc att gag gtg gaa gct gaa 464 Pro Arg Ile Thr Ile 90 Pro Asp Asn Tyr Thr 95 Ile Glu Val Glu Ala 100 Glu aat gga gat ggt gta att aaa tet cat atg aca tac tgg aga tta gag 512 Asn Gly Asp Gly 105 Vai Ile Lys Ser His 110 Met Thr Tyr Trp Arg 115 Leu Glu aac ata gcg aaa act gaa cca cct aag att tcc cgt gtg aaa cca gtt 560 Asn Ile Ala 120 Lys Thr Glu Pro Pro 125 Lys Ile Phe Arg Val 130 Lys Pro Val ttg ggc ate aaa cga atg att caa att gaa tgg ata aag cct gag ttg 608 Leu Gly 135 Ile Lys Arg Met Ile 140 Gin Ile Glu Trp Ile 145 Lys Pro Glu Leu gcg cct gtt tea cct gat tta aaa tac aca ctt cga ttc agg aca gtc 656 Ala 150 Pro Vai Ser Ser Asp 155 Leu Lys Tyr Thr Leu 160 Arg Phe Arg Thr Val 165 aac agt acc age tgg atg gaa gtc aac ttc gct aag aac cgt aag gat 704 Asn Ser Thr Ser Trp 170 Met Glu Vai Asn Phe 175 Ala Lys Asn Arg Lys 180 Asp aaa aac caa acg tac aac ctc acg 999 ctg cag cct ttt aca gaa tat 752 Lys Asn Gin Thr 185 Tyr Asn Leu Thr Gly 190 Leu Gin Pro Phe Thr 195 Glu Tyr gtc ata gct ctg cga tgt gcg gtc aag gag tea aag Ctc tgg agt gac 800 Vai lie Ala 200 Leu Arg Cys Ala Vai 205 Lys Glu Ser Lys Phe 210 Trp Ser Asp tgg age caa gaa aaa acg gga atg act gag gaa gaa gcc cca tgt ggc 848 Trp Ser 215 Gin Glu Lys Met Gly 220 Met Thr Glu Glu Glu 225 Ala Pro Cys Gly ctg gaa ctg tgg aga gtc ctg aaa cca gct gag gcg gat gga aga agg 896 Leu Glu Leu Trp Arg Vai Leu Lys Pro Ala Glu Ala Asp Gly Arg Arg 397 230 235 240 245 cca gtg cgg ttg tta tgg aag aag gea aga gga gee cca gtc cta gag 944 Pro Vai Arg Leu Leu 250 Trp Lys Lys Ala Arg 255 Gly Ala Pro Val Leu 260 Glu aaa aca ctt ggc tac aac ata tgg tac tat cca gaa age aac act aac 992 Lys Thr Leu Gly 265 Tyr Asn Ile Trp Tyr 270 Tyr Pro Glu Ser Asn 275 Thr Asn ctc aca gaa aca atg aac act act aac cag cag ctt gaa ctg cat ctg 1040 Leu Thr Glu 280 Thr Met Asn Thr Thr 285 Asn Gin Gin Leu Glu 290 Leu His Leu gga ggc gag age ttt tgg gtg tct atg att tct tat aat tct ctt ggg 1088 Gly Gly 295 Glu Ser Phe Trp Val 300 Ser Het Ile Ser Tyr 305 Asn Ser Leu Gly aag tct cca gtg gee acc ctg agg att cca gct att caa gaa aaa tca 1136 Lys 310 Ser Pro Val Ala Thr 315 Leu Arg Ile Pro Ala 320 Ile Gin Glu Lys Ser 325 ttt cag tgc att gag gtc atg cag gee tgc gtt gct gag gac cag cta 1184 Phe Gin Cys Ile Glu 330 Val Met Gin Ala Cys 335 Val Ala Glu Asp Gin 340 Leu gtg gtg aag tgg caa age tct gct cta gac gtg aac act tgg atg att 1232 Vai Val Lys Trp 345 Gin Ser Ser Ala Leu 350 Asp val Asn Thr Trp 355 Met Ile gaa tgg ttt ccg gat gtg gac tca gag ccc acc acc ctt tcc tgg gaa 1280 Glu Trp Phe 360 Pro Asp Val Asp Ser 365 Glu Pro Thr Thr Leu 370 Ser Trp Glu cct gtg tct cag gee acg aac tgg acg ate cag caa gat aaa tta aaa 1328 Ser val 375 Ser Gin Ala Thr Asn 380 Trp Thr Ile Gin Gin 385 Asp Lys Leu Lys cct ttc tgg tgc tat aac ate tct gtg tat cca atg ttg cat gac aaa 1376 Pro 390 Phe Trp Cys Tyr Asn 395 Ile Ser Val Tyr Pro 400 Met Leu His Asp Lys 405 gtt ggc gag cca tat tcc ate cag gct tat gee aaa gaa ggc gtt cca 1424 Vai Gly Glu Pro Tyr 410 Ser Ile Gin Ala Tyr 415 Ala Lys Glu Gly Val 420 Pro tca gaa ggt cct gag acc aag gtg gag aac att ggc gtg aag acg gtc 1472 Ser Glu Gly Pro 425 Glu Thr Lys Val Glu 430 Asn Ile Gly Val Lys 435 Thr Val acg ate aca tgg aaa gag att ccc aag agt gag aga aag ggt ate ate 1520 Thr lie Thr 440 Trp Lys Glu Ile Pro 445 Lys Ser Glu Arg Lys 450 Gly Ile Ile tgc aac tac acc ate ttt tac caa gct gaa ggt gga aaa gga ttc tcc 1568 Cys Asn 455 Tyr Thr Ile Phe Tyr 460 Gin Ala Glu Gly Gly 465 Lys Gly Phe Ser aag aca gtc aat tcc age ate ttg cag tac ggc ctg gag tcc ctg aaa 1616 Lys 470 Thr Val Asn Ser Ser 475 Ile Leu Gin Tyr Gly 480 Leu Glu Ser Leu Lys 485 cga aag acc tct tac att gtt cag gtc atg gee age acc agt gct ggg 1664 398

Arg Lys Thr Ser Tyr 490 Ile Vai Gin Vai Het 495 Ala Ser Thr Ser Ala SOO Gly gga acc aac ggg acc age ata aat ttc aag aca ttg tca ttc agt gtc 1712 Gly Thr Asn Gly SOS Thr Ser Ile Asn Phe 510 Lys Thr Leu Ser Phe 515 Ser Vai ctt gag att ate ctc ata act tct ctg att ggt gga ggc ctt ctt att 1760 Phe Glu Ile 520 ile Leu Ile Thr Ser 525 Leu Ile Gly Gly Gly 530 Leu Leu Ile ctc att ate ctg aca gtg gea tat ggt ctc aaa aaa ccc aac aaa ttg 1808 Leu Ile 535 Ile Leu Thr Vai Ala 540 Tyr Gly Leu Lys Lys 545 Pro Asn Lys Leu act cat ctg tgt tgg ccc acc gtt ccc aac cct gct gaa agt agt ata 1856 Thr 550 His Leu Cys Trp Pro 555 Thr Vai Pro Asn Pro 560 Ala Glu Ser Ser Ile 565 gcc aca tgg cat gga gat gat ttc aag gat aag cta aac ctg aag gag 1904 Ala Thr Trp His Gly 570 Asp Asp Phe Lys Asp 575 Lys Leu Asn Leu Lys 580 Glu tct gat gac tct gtg aac aca gaa gac agg. ate tta aaa cca tgt tcc 1952 Ser Asp Asp Ser 585 Vai Asn Thr Glu Asp 590 Arg Ile Leu Lys Pro 595 Cys Ser acc ccc agt gac aag ttg gtg att gac aag ttg gtg gtg aac ttt ggg 2000 Thr Pro Ser 600 Asp Lys Leu Vai Ile 605 Asp Lys Leu Vai Vai 610 Asn Phe Gly aat gtt ctg caa gaa att ttc aca gat gaa gcc aga acg ggt cag gaa 2048 Asn Vai 615 Leu Gin Glu Ile Phe 620 Thr Asp Glu Ala Arg 625 Thr Gly Gin Glu aac aat tta gga ggg gaa aag aat ggg act aga att ctg tct tcc tgc 2096 Asn 630 Asn Leu Gly Gly Glu 635 Lys Asn Gly Thr Arg 640 Ile Leu Ser Ser Cys 645 cca act tca ata taagtgtgga ctaaaatgcg agaaaggtgt cctgtggtct 2148

Pro Thr Ser Ile atgcaaatta gaaaggacat gcagagtttt ccaactagga agactgaatc tgtggcccca 2208 agagaaccat ctctgaagac tgggtatgtg gtcttttcca cacatggacc acctacggat 2268 gcaatctgta atgcatgtgc atgagaagtc tgttattaag tagagtgtga aaacatggtt 2328 atggtaatag gaacagcttt taaaatgctc ttgtatttgg gcctttcata caaaaaagcc 2388 ataacaccat tttcatgtaa tgctatactt ctatactatt ttcatgtaat actatacttc 2448 tatactattt tcatgtaata ctatacttct atactatttt catgtaatac tatacttcta 2508 tattaaagtt ttacccactc a 2529

<210> 109 <211> 649 <212> PRT <213> Homo sapiens 399 <400> 109

Mec Met Trp Thr Trp Ala Leu Txp Met Leu Pro Ser Leu Cys Lys Phe 15 10 15

Ser Leu Ala Ala Leu Pro Ala Lys Pro Glu Asn Ile Ser Cys Vai Tyr 20 25 30

Tyr Tyr Arg Lys Asn Leu Thr Cys Thr Trp Ser Pro Gly Lys Glu Thr 35 40 45 400

Ser Tyr 50 Thr Gin Tyr Thr Vai S5 Lys Arg Thr Tyr Ala 60 Phe Gly Glu Lys His 65 Asp Asn Cys Thr Thr Asn 70 Ser Ser Thr Ser 75 Glu Asn Arg Ala Ser 80 Cys Ser Phe Phe Leu 85 Pro Arg Ile Thr Ile 90 Pro Asp Asn Tyr Thr lie 95 Glu Vai Glu Ala 100 Glu Asn Gly Asp Gly 105 Val ile Lys Ser His 110 Met Thr Tyr Trp Arg 115 Leu Glu Asn Xle Ala 120 Lys Thr Glu Pro Pro 125 Lys Ile Phe Arg Vai 130 Lys Pro Vai Leu Gly 135 Ile Lys Arg Met Ile 140 Gin Ile Glu Trp Ile 145 Lys Pro Glu Leu Ala Pro 150 Val Ser Ser Asp 155 Leu Lys Tyr Thr Leu 160 Arg Phe Arg Thr Vai 165 Asn Ser Thr Ser Trp 170 Met Glu Val Asn Phe Ala 175 Lys Asn Arg Lys 180 Asp Lys Asn Gin Thr 185 Tyr Asn Leu Thr Gly 190 Leu Gin Pro Phe Thr 195 Glu Tyr Val Ile Ala 200 Leu Arg Cys Ala Val 205 Lys Glu Ser Lys Phe 210 Trp Ser Asp Trp Ser 215 Gin Glu Lys Met Gly 220 Met Thr Glu Glu Glu 225 Ala Pro Cys Gly Leu Glu 230 Leu Trp Arg Val 235 Leu Lys pro Ala Glu 240 Ala Asp Gly Arg Arg 24S Pro Val Arg Leu Leu 250 Trp Lys Lys Ala Arg Gly 255 Ala Pro Vai Leu 260 Glu Lys Thr Leu Gly 26S Tyr Asn Ile Trp Tyr 270 Tyr Pro Glu Ser Asn 275 Thr Asn Leu Thr Glu 280 Thr Met Asn Thr Thr 285 Asn Gin Gin Leu Glu 290 Leu His Leu Gly Gly 295 Glu Ser Phe Trp Val 300 Ser Met Ile Ser Tyr 305 Asn Ser Leu Gly Lys Ser 310 Pro Val Ala Thr 315 Leu Arg Ile Pro Ala 320 Xle Gin Glu Lys Ser 325 Phe Gin Cys Ile Glu 330 Val Met Gin Ala Cys Val 335 Ala Glu ASp Gin 340 Leu val Val Lys Trp 345 Gin Ser Ser Ala Leu 350 Asp Val Asn Thr Trp 3SS Met lie Glu Trp Phe 360 Pro Asp val Asp Ser 36S Glu Pro Thr Thr Leu 370 Ser Trp Glu Ser Val 375 Ser Gin Ala Thr Asn 380 Trp Thr Ile Gin Gin 385 Asp Lys Leu Lys Pro Phe 390 Trp Cys Tyr Asn 395 Ile Ser Val Tyr Pro 400 Met Leu His Asp Lys 405 Val Gly Glu Pro Tyr 410 Ser Ile Gin Ala Tyr Ala 41S Lys Glu Gly Vai 420 Pro Ser Glu Gly Pro 425 Glu Thr Lys Val Glu 430 Asn Ile Gly Vai Lys 435 Thr Vai Thr Ile Thr 440 Trp Lys Glu Ile Pro 445 Lys Ser Glu Arg Lys 450 Gly Ile Ile Cys Asn 455 Tyr Thr Ile Phe Tyr 460 Gin Ala Glu Gly Gly Lys 465 Gly Phe Ser Lys Thr 470 Val Asn Ser Ser 475 Ile Leu Gin Tyr Gly 480 Leu Glu Ser Leu Lys 485 Arg Lys Thr Ser Tyr 490 Ile Val Gin Val Met Ala 495 Ser Thr Ser Ala SOO Gly Gly Thr Asn Gly 505 Thr Ser Ile Asn Phe 510 Lys Thr Leu Ser Phe 515 ser Vai Phe Glu Ile 520 Ile Leu Ile Thr Ser 525 Leu Ile Gly Gly Gly 530 Leu Leu ile Leu ile 535 ile Leu Thr Val Ala 540 Tyr Gly Leu Lys Lys Pro Asn Lys Leu Thr His Leu Cys Trp Pro Thr Val Pro Asn Pro 401 545 550 555 560 Ala Glu Ser Ser Ile Ala Thr Trp His Gly Asp Asp Phe I,ys Asp Lys 565 570 575 Leu Asn Leu Lys Glu Ser Asp Asp Ser Vai Asn Thr Glu Asp Arg Ile 580 585 590 Leu Lys Pro Cys ser Thr Pro Ser ASp Lys Leu Vai Ile Asp Lys Leu 595 600 605 Vai Vai Asn Phe Gly Asn Vai Leu Gin Glu Ile Phe Thr Asp Glu Ale 610 615 620 Arg Thr Gly Gin Glu Asn Asn Leu Gly Gly Glu Lys Asn Gly Thr Arg 625 630 635 640 Ile Leu Ser Ser Cys Pro Thr Ser ile 645

< 210 > 110 <211> 2402 <212> ADN <2l3> Homo sapiens <220>

<221> CDS <222> (171) ... (2366) c 4 0 0 > 110 402 ggcacgaggt gtgtgtgcag tatgaaaatt gagacaggaa ggcagagtgt cagcttgttc 60 cacctcagct gggaatgtgc atcaggcaac tcaagttttt caccacggca tgcgtctgtg 120 aatgtccgca aaacattctc tctccccagc cttcatgtgt taacctgggg atg atg 17$

Met Met 1 tgg Trp acc Thr tgg Trp 5 gea Ala ctg Leu tgg Trp atg Met ctc Leu 10 ccc Pro gea Ala gct Ala 20 ctg Leu cca Pro gct Ala aag Lys cct Pro 25 gag Glu aac Asn agg Arg 35 aaa Lys aat Asn tta Leu acc Thr tgc Cys 40 act Thr tgg Trp agt Ser acc Thr cag Gin tac Tyr aca Thr gtt Vai 55 aag Lys aga Arg act Thr tac Tyr aat Asn tgt Cys aca Thr acc Thr 70 aat Asn agt Ser tet Ser aca Thr agt Ser 75 ttt Phe ttc Phe ctt Leu 85 cca Pro aga Arg ata Ile acg Thr ate Ile 90 cca Pro gaa Glu gct Ala 100 gaa Glu aat Asn gga Gly gat Asp ggt Gly 105 gta Val att Ile aga Arg 115 tta Leu gag Glu aac Asn ata Ile gcg Ala 120 aaa Lys act Thr gaa Glu tca ctc tgc aaa ttc age ctg 224 Ser Leu Cys Lys Phe Ser Leu 15 att tcc tgt gtc tac tac tac 272 Ile Ser Cys Vai Tyr Tyr Tyr 30 cca gga aag gaa acc agt tat 320 Pro Cly Lys Glu Thr Ser Tyr 45 50 gct Ctt gga gaa aaa cat gat 368 Ala Phe Gly Glu Lys His Asp 60 65 gaa aac cgt gct teg tgc tet 416 Glu Asn Arg Ala Ser Cys Ser 80 gat aat tat acc att gag gtg 464 Asp Asn Tyr Thr Ile Glu Vai 95 aaa tet cat atg aca tac tgg 512 Lys Ser His Met Thr Tyr Trp 110 cca cct aag att ttc cgt gtg Pro Pro Lys Ile Phe Arg Vai 125 130 560 608 403 608 403 aaa cca gtt ttg Lys Pro Vai Leu ggc ate aaa cga Gly Ile Lys Arg 135 cct gtt tea tet Pro Val Ser Ser atg att caa att Met Ile Gln Ile 140 gat tta aaa tac Asp Leu Lys'Tyr 155 atg gaa gtc aac Met Glu Val Asn cct gag ttg gcg Pro Glu Leu Ala ISO agg aca gtc aac Arg Thr Val Asn 165 agt acc age tgg Ser Thr Ser Trp 170 gaa tgg ata aag Glu Trp Ile Lys 145 aca ctt cga ttc Thr Leu Arg Phe 160 ttc gct aag aac Phe Ala Lys Asn 175 cgt aag gat aaa aac caa acg tac aac ctc acg ggg ctg cag cct tet

Arg Lys Asp Lys Asn Gln Thr Tyr Asn Leu Thr Gly Leu Gln Pro Phe 180 185 190 aca gaa tat gtc ata gct ctg cga tgt gcg gtc aag gag tea aag ttc

Thr Glu Tyr Val Ile Ala Leu Arg Cys Ala Val Lys Glu Ser Lys Phe 195 200 205 210 tgg agt gac tgg age caa gaa aaa atg gga atg act gag gaa gaa gct

Trp Ser Asp Trp Ser Gln Glu Lys Met Gly Met Thr Glu Glu Glu Ala 215 220 225 cca tgt ggc ctg gaa ctg tgg aga gtc ctg aaa cca gct gag gcg gat

Pro Cys Gly Leu Glu Leu Trp Arg Val Leu Lys Pro Ala Glu Ala Asp 230 235 240 gga aga agg cca gtg cgg ttg tta tgg aag aag gea aga gga gee cca

Gly Arg Arg Pro Val Arg Leu Leu Trp Lys Lys Ala Arg Gly Ala Pro 245 250 255 gtc cta gag aaa aca ctt ggc tac aac ata tgg tac tat cca gaa age

Val Leu Glu Lys Thr Leu Gly Tyr Asn Ile Trp Tyr Tyr Pro Glu Ser 260 265 270 aac act aac ctc aca gaa aca atg aac act act aac cag cag ctt gaa

Asn Thr Asn Leu Thr Glu Thr Met Asn Thr Thr Asn Gln Gln Leu Glu 275 280 285 290- ctg cat ctg gga ggc gag age ttt tgg gtg tet atg att tet tat aat

Leu His Leu Gly Gly Glu ser Phe Trp Val Ser Met Ile Ser Tyr Asn 295 300 305 tet ctt ggg aag tet cca gtg gee acc ctg agg att cca gct att caa

Ser Leu Gly Lys Ser Pro val Ala Thr Leu Arg Ile Pro Ala lie Gln 310 315 320 gaa aaa tea ttt cag tgc att gag gtc atg cag gee tgc gtt gct gag

Glu Lys Ser Phe Gln Cys Ile Glu Val Met Gln Ala Cys Val Ala Glu 325 330 335 gac cag cta gtg gtg aag tgg caa age tet gct cta gac gtg aac act

Asp Gln Leu Val Val Lys Trp Gln Ser Ser Ala Leu Asp Val Asn Thr 340 345 350 tgg atg att gaa tgg ttt ccg gat gtg gac tea gag ccc acc acc ctt

Trp Met Ile Glu Trp Phe Pro Asp Val Asp Ser Glu Pro Thr Thr Leu 355 360 365 370 tcc tgg gaa tet gtg tet cag gee acg aac tgg acg ate cag caa gat

Ser Trp Glu Ser Val Ser Gln Ala Thr Asn Trp Thr Ile Gln Gln Asp 375 380 385 6S6 704 7S2 800 848 896 944 992 1040 1088 1136 1184 1232 1280 1328 1376 404 aaa tta aaa cct Lys Leu Lys Pro 390 cat gac aaa gtt His Asp Lys 405 Val ggc gtt cca tea Gly val 420 Pro Ser aag acg gtc acg Lys 43$ Thr Val Thr ggt ate ate tgc Gly Ile Ile Cys gga ttc tcc aag Gly Phe Ser- Lys 470 tcc ctg aaa cga Ser Leu Lys 485 Arg agt gct ggg gga Ser Ala 500 Gly Gly ttc agt gtc ttt Phe 515 Ser Val Phe ctt ctt att ctc Leu Leu Ile Leu aac aaa ttg act Asn Lys Leu Thr 550 agt agt ata gcc Ser Ser Ile 565 Ala ctg aag gag tet Leu Lys 580 Glu Ser cca tgt tcc acc Pro 595 Cys Ser Thr aac ttt ggg aat Asn Phe Gly Asn ggt cag gaa aac Gly Gin Glu Asn ttc tgg tgc tat Phe Trp Cys Tyr ggc gag cca tat Gly Glu Pro Tyr 410 gaa ggt cct gag Glu Gly Pro 425 Glu ate aca tgg aaa Ile Thr 440 Trp Lys aac tac acc ate Asn 455 Tyr Thr Ile aca gtc aat tcc Thr Val Asn Ser aag acc tet tac Lys Thr Ser Tyr 490 acc aac ggg acc Thr Asn Gly 505 Thr gag att ate ctc Glu Ile 520 Ile Leu att ate ctg aca ile 535 ile Leu Thr cat ctg tgt tgg His Leu Cys Trp aca tgg cat gga Thr Trp His Gly 570 gat gac tet gtg Asp Asp Ser 585 Val ccc agt gac aag Pro Ser 600 Asp Lys gtt ctg caa gaa Val 615 Leu Gin Glu aat tta gga ggg Asn Leu Gly Gly aac ate tet gtg Asn 395 ile Ser Val tcc ate cag gct Ser ile Gin Ala acc aag gtg gag Thr Lys Val Glu 430 gag att ccc aag Glu Ile Pro 445 Lys ttt tac caa gct Phe Tyr 460 Gin Ala age ate ttg cag Ser 475 Ile Leu Gin att gtt cag gtc Ile Val Gin Val age ata aat ttc Ser Ile Asn Phe 510 ata act tet ctg Ile Thr Ser 525 Leu gtg gea tat ggt Val Ala 540 Tyr Gly ccc acc gtt ccc Pro 555 Thr Val Pro gat gat ttc aag Asp Asp Phe Lys aac aca gaa gac Asn Thr Glu Asp 590 ttg gtg att gac Leu Val Ile 605 Asp att ttc aca gat Ile phe 620 Thr Asp gaa aag aat ggg Glu Lys Asn Gly tat cca atg ttg Tyr Pro Met Leu 400 tat gcc aaa gaa Tyr Ala Lys Glu 415 aac att ggc gtg Asn Ile Gly Vai agt gag aga aag Ser Glu Arg Lys 450 gaa ggt gga aaa Glu Gly Gly Lys 465 tac ggc ctg gag Tyr Gly Leu Glu 480 atg gcc age acc Met Ala Ser Thr 495 aag aca ttg tea Lys Thr Leu Ser att ggt gga ggc Ile Gly Gly Gly 530 ctc aaa aaa ccc Leu Lys Lys Pro 545 aac cct gct gaa Asn Pro Ala Glu 560 gat aag cta aac Asp Lys Leu Asn 575 agg ate tta aaa Arg ile Leu Lys aag ttg gtg gtg Lys Leu Val Vai 610 gaa gcc aga acg Glu Ala Arg Thr 625 tat gtg acc tgc Tyr Val Thr Cys 1424 1472 1520 1568 1616 1664 1712 1760 1808 1856 1904 1952 2000 2048 2096 405 ccc ttc agg cct gat tgt ccc ctg ggg Pro Phe Arg 645 Pro Asp Cys Pro Leu 650 Gly gtt tca cct gag ate ccg ccc aga aaa Val Ser 660 Pro Glu Ile Pro Pro 665 Arg Lys atg cca gag ggg acc cgc cca gaa gcc Met 675 Pro Glu Gly Thr Arg 680 Pro Glu Ala ggt caa agt cca gta cca gat cat ctg Gly Gin Ser Leu Val 695 Pro Asp His Leu cca tat ttg aaa aat tca gtg aca gcc Pro Tyr Leu Lys 710 Asn Ser val Thr Ala 715 aaa ctt cca gag cac acc aag gga gaa Lys Leu Pro 725 Glu His Thr Lys Gly 730 Glu gacccccggg gcctca 630 635 640 aaa agt ttt gag gag ctc cca 2144 Lys Ser Phe Glu 655 Glu Leu Pro ccc caa tac cca cgt tcg agg 2192 Ser Gin Tyr 670 Leu Arg Ser Arg aaa gag cag ctt ctc ttt tct 2240 Lys Glu 685 Gin Leu Leu Phe Ser 690 tgt gag gaa gga gcc cca aat 2288 Cys 700 Glu Glu Gly Ala Pro 705 Asn agg gaa ttt ctt gtg tct gaa 2336 Arg Glu Phe Leu Val 720 Ser Glu gtc Val taaatgcgac catagcatga 2386 2402 <210> 111 <211> 732 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 111 406

Met 1 Met Trp Thr Trp 5 Ala Leu Trp Het Leu 10 Pro Ser Leu cys Lys 15 Phe Ser Leu Ala Ala 20 Leu Pro Ala Lys Pro 25 Glu Asn Ile Ser Cys 30 Val Tyr Tyr Tyr Arg 35 Lys Asn Leu Thr Cys 40 Thr Trp Ser Pro Gly 45 Lys Glu Thr Ser Tyr 50 Thr Gin Tyr Thr val 55 Lys Arg Thr Tyr Ala 60 Phe Gly Glu Lys His 65 Asp Asn Cys Thr Thr 70 Asn Ser Ser Thr Ser 75 Glu Asn Arg Ala Ser 80 Cys Ser Phe Phe Leu 85 Pro Arg Ile Thr ile 90 Pro Asp Asn Tyr Thr 95 Ile Glu Vai Glu Ala 100 Glu Asn Gly Asp Gly 105 Val Ile Lys Ser His 110 Met Thr Tyr Trp Arg 115 Leu Glu Asn Ile Ala 120 Lys Thr Glu Pro Pro 125 Lys Ile Phe Arg vai 130 Lys Pro Vai Leu Gly 135 Ile Lys Arg Met Ile 140 Gin ile Glu Trp Ile 145 Lys Pro Glu Leu Ala 150 Pro val Ser Ser Asp 155 Leu Lys Tyr Thr Leu 160 Arg Phe Arg Thr Vai 165 Asn Ser Thr Ser Trp 170 Met Glu Val Asn Phe 175 Ala Lys Asn Arg Lys 180 Asp Lys Asn Gin Thr 18S Tyr Asn Leu Thr Gly 190 Leu Gin Pro Phe Thr 195 Glu Tyr Vai Ile Ala 200 Leu Arg Cys Ala Val 205 Lys Glu Ser Lys Phe 210 Trp Ser Asp Trp Ser 215 Gin Glu Lys Met Gly 220 Met Thr Glu Glu Glu Ala Pro Cys Gly Leu Glu Leu Trp Arg val Leu Lys Pro Ala Glu 407 225 230 Ala Asp Gly Arg Arg 245 Pro Vai Arg Ala Pro Vai Leu 260 Glu Lys Thr Leu Glu Ser Asn 275 Thr Asn Leu Thr Glu 280 Leu Glu 290 Leu His Leu Gly Gly 295 Glu Tyr 305 Asn Ser Leu Gly Lys 310 Ser Pro Ile Gin Glu Lys Ser 325 Phe Gin Cys Ala Glu Asp Gin 340 Leu Vai Val Lys Asn Thr Trp 355 Met Ile Glu Trp Phe 360 Thr Leu 370 Ser Trp Glu Ser Val 375 Ser Gin 385 Asp Lys Leu Lys Pro 390 Phe Trp Het Leu His Asp Lys 405 Vai Gly Glu Lys Glu Gly Vai 420 Pro Ser Glu Gly Gly Vai Lys 435 Thr Vai Thr Ile Thr 440 Arg Lys 450 Gly Ile ile Cys Asn 455 Tyr Gly Lys 465 Gly Phe Ser Lys 470 Thr Val Leu Glu Ser Leu Lys 485 Arg Lys Thr Ser Thr Ser Ala 500 Gly Gly Thr Asn Leu Ser Phe 515 Ser Vai Phe Glu ile 520 Gly Gly 530 Leu Leu lie Leu Ile 535 ile Lys 545 Pro Asn Lys Leu Thr 550 His Leu Ala Glu Ser Ser Ile 565 Ala Thr Trp Leu Asn Leu Lys 580 Glu Ser Asp Asp Leu Lys Pro 595 Cys Ser Thr Pro Ser 600 Vai Vai 610 Asn Phe Gly Asn Val 615 Leu Arg 625 Thr Gly Gin Glu Asn 630 Asn Leu Thr Cys Pro Phe Arg 645 Pro Asp Cys Leu pro Vai Ser 660 Pro Glu Ile Pro Ser Arg Het 675 Pro Glu Gly Thr Arg 680 Phe Ser 690 Gly Gin Ser Leu Val 695 Pro Pro 705 Asn Pro Tyr Leu Lys 710 Asn Ser Ser Glu Lys Leu Pro 725 Glu His Thr

Leu Leu 235 Trp Lys Lys Ala 240 Arg Gly Gly 250 Tyr Asn Ile Trp Tyr 255 Tyr Pro 265 Thr Het Asn Thr Thr 270 Asn Gin Gin Ser Phe Trp Val 285 Ser Met Ile Ser Val Ala Thr 300 Leu Arg ile Pro Ala Ile Glu 315 Val Met Gin Ala 320 Cys val Trp 330 Gin Ser Ser Ala Leu 335 Asp Val 345 Pro Asp Val Asp Ser 350 Glu Pro Thr Gin Ala Thr Asn 365 Trp Thr Ile Gin Cys Tyr Asn 380 lie Ser Val Tyr Pro Pro Tyr 395 Ser ile Gin Ala 400 Tyr Ala Pro 410 Glu Thr Lys val Glu 415 Asn Ile 425 Trp Lys Glu ile Pro 430 Lys Ser Glu Thr Ile Phe Tyr 445 Gin Ala Glu Gly Asn Ser Ser 460 Ile Leu Gin Tyr Gly Ser Tyr 475 Ile Val Gin val 480 Met Ala Gly 490 Thr Ser Ile Asn Phe 495 Lys Thr 505 Ile Leu Ile Thr Ser 510 Leu Ile Gly Leu Thr Val Ala 525 Tyr Gly Leu Lys Cys Trp Pro 540 Thr Val Pro Asn Pro His Gly 555 Asp Asp Phe Lys 560 Asp Lys Ser 570 Val Asn Thr Glu Asp 575 Arg Ile 585 Asp Lys Leu Val Ile 590 Asp Lys Leu Gin Glu Ile Phe 605 Thr Asp Glu Ala Gly Gly Glu 620 Lys Asn Gly Tyr Val Pro Leu 635 Gly Lys Ser Phe 640 Glu Glu Pro 650 Arg Lys Ser Gin Tyr 655 Leu Arg 665 Pro Glu Ala Lys Glu 670 Gin Leu Leu Asp His Leu Cys 685 Glu Glu Gly Ala Val Thr Ala 700 Arg Glu Phe Leu Val Lys Gly 730 715 Glu Val 720 408 <210> 112

<211> 1299 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0>

<221> CDS <222> (162)...(1133) <40 0> 112 409 tgtgtgtgca gtatgaaaat tgagacagga aggcagagtg tcagcttgtt ccacctcagc 60 tgggaatgtg catcaggcaa ctcaagtttt Ccaccacggc atgtgcctgt gaatgtccgc 120 aaaacattct ctctccccag ccttcatgtg ttaacctggg g atg atg tgg acc egg 176

Met Met Trp Thr Trp 1 5 gca ctg tgg atg ctc CCC tea ctc tgc aaa ttc age ctg gca gct ctg 224 Ala Leu Trp Met Leu 10 Pro Ser Leu Cys Lys 15 Phe Ser Leu Ala Ala 20 Leu cca gct aag cct gag aac att tcc tgt gtc tac tac cat agg aaa aat 272 Pro Ala Lys Pro 25 Glu Asn Ile Ser Cys 30 Vai Tyr Tyr Tyr Arg 35 Lys Asn tta acc tgc act tgg agt cca gga aag gaa acc agt tat acc cag tac 320 Leu Thr Cys 40 Thr Trp Ser Pro Gly 45 Lys Glu Thr Ser Tyr 50 Thr Gin Tyr aca gtt aag aga act tac gct ttt gga gaa aaa cat gat aat tgt aca 368 Thr Vai 55 Lys Arg Thr Tyr Ala 60 Phe Gly Glu Lys His 65 ASp Asn Cys Thr acc aat agt tet aca agt gaa aat cgt gct teg tgc tet ttt ttc ctt 416 Thr 70 Asn Ser Ser Thr Ser 75 Glu Asn Arg Ala Ser 80 Cys Ser Phe Phe Leu 85 cca aga ata acg ate cca gat aat tat acc att gag gtg gaa gct gaa 464 Pro Arg Ile Thr Ile 90 Pro Asp Asn Tyr Thr 95 Ile Glu Vai Glu Ala 100 Glu aat gga gat ggt gta att aaa tet cat atg aca tac tgg aga tta gag 512 Asn Gly Asp Gly 105 Vai Ile Lys Ser His 110 Met Thr Tyr Trp Arg 115 Leu Glu aac ata gcg aaa act gaa cca cct aag att ttc cgt gtg aaa cca gtt 560 Asn Ile Ala 120 Lys Thr Glu Pro Pro 125 Lys Ile Phe Arg Vai 130 Lys Pro Vai ttg ggc ate aaa cga atg att caa att gaa tgg ata aag cct gag ttg 608 Leu Gly 135 ile Lys Arg Met Ile 140 Gin Ile Glu Trp Ile 145 Lys Pro Glu Leu gcg cct gtt tea tet gat tta aaa tac aca ctt cga ttc agg aca gtc 656 Ala 150 Pro Vai Ser Ser Asp 155 Leu Lys Tyr Thr Leu 160 Arg Phe Arg Thr Vai 165 aac agt acc age tgg atg gaa gtc aac ttc gct aag aac cgt aag gat 704 Asn Ser Thr Ser Trp 170 Met Glu Vai Asn Phe 175 Ala Lys Asn Arg Lys 180 Asp aaa aac caa acg tac aac ctc acg ggg ctg cag cct ttt aca gaa tat 752 410

Lys Asn Gin Thr 185 Tyr Asn Leu Thr Gly 190 Leu Gin Pro Phe Thr 195 Glu Tyr gtc vai aca Ile gee Ala 200 ctg Leu cga Arg tgt Cys gcg Ala gtc Vai 205 aag Lys gag Glu tea Ser aag Lys tte Phe 210 tgg Trp agt Ser gac Asp 800 tgg Trp age Ser 215 caa Gin gaa Glu aaa Lys atg Met gga Gly 220 atg Met act Thr gag Glu gaa Glu gaa Glu 225 gct Ala cca Pro tgt Cys ggc Gly 848 ctg Leu 230 gaa Glu ctg Leu tgg Trp aga Arg gtc Vai 235 ctg Leu aaa Lys CCS Pro gct Ala gag Glu 240 gcg Ala gat ASP gga Gly aga Arg agg Arg 245 896 cca Pro gtg Vai cgg Arg ttg Leu tta Leu 250 tgg Trp aag Lys aag Lys gea Ala aga Arg 255 gga Gly gee Ala cca Pro gtc Vai cta Leu 260 gag Glu 944 aaa Lys aca Thr ctt Leu ggc Gly 265 tac Tyr aac Asn ata Ile tgg Trp tac Tyr 270 tat Tyr cca Pro gaa Glu age Ser aac Asn 275 act Thr aac Asn 992 ctc Leu aca Thr gaa Glu 280 aca Thr atg Met aac Asn act Thr act Thr 285 aac Asn cag Gin cag Gin ctt Leu gaa Glu 290 ctg Leu cat Hls ctg Leu 1040 gga Gly ggc Gly 295 gag Glu age Ser ttt Phe tgg Trp gtg Vai 300 tet Ser atg Met att Ile tet Ser tat Tyr 305 aat Asn tet Ser ctt Leu ggg Gly 1088 aag Lys 310 tet Ser cca Pro gtg Vai gee Ala acc Thr 315 ctg Leu agg Arg att Ile cca Pro gct Ala 320 att Ile caa Gin gaa Glu aaa Lys 1133 tagaaacttt acagatgcta gtcccagaca taaaagaaaa taatgttctg gatgtgcacg 1193 atggctcacg cctgtaatcc cagcactttg aggccaagac gggtggatcg ctgagctcag 1253 gagttcaaga caagtccagg caacatagtg aaaccctgtt tctaca 1299

<210> 113 <211> 324 <212> PRT <213> Homo sapiens <40 0> 113 411

Met Met 1 Trp Thr Trp 5 Ala Leu Trp Met Leu 10 Pro Ser Leu Cys Lys 15 Phe Ser Leu Ala Ala 20 Leu Pro Ala Lys Pro 25 Glu Asn Ile Ser Cys 30 Val Tyr Tyr Tyr Arg 35 Lys Asn Leu Thr Cys 40 Thr Trp Ser Pro Gly 45 Lys Glu Thr Ser Tyr 50 Thr Gin Tyr Thr Val 55 Lys Arg Thr Tyr Ala 60 Phe Gly Glu Lys His ASp 65 Asn Cys Thr Thr 70 Asn Ser Ser Thr Ser 75 Glu Asn Arg Ala Ser 80 Cys Ser Phe Phe Leu 85 Pro Arg ile Thr lie 90 Pro Asp Asn Tyr Thr 95 He Glu Vai Glu Ala 100 Glu Asn Gly Asp Gly 105 Val Ile Lys Ser His 110 Met Thr Tyr Trp Arg 115 Leu Glu Asn ile Ala 120 Lys Thr Glu Pro Pro 125 Lys Ile Phe Arg Val 130 Lys Pro Val Leu Gly 135 Ile Lys Arg Met Ile 140 Gin Ile Glu Trp Ile Lys 145 Pro Glu Leu Ala 150 Pro Val Ser Ser Asp 155 Leu Lys Tyr Thr Leu 160 Arg Phe Arg Thr val 165 Asn Ser Thr Ser Trp 170 Met Glu Val Asn Phe Ala 175 Lys Asn Arg Lys 180 Asp Lys Asn Gin Thr 18S Tyr Asn Leu Thr Gly 190 Leu Gin Pro Phe Thr 195 Glu Tyr Val Ile Ala 200 Leu Arg Cys Ala Val 205 Lys Glu Ser Lys Phe 210 Trp Ser Asp Trp Ser 215 Gin Glu Lys Met Gly 220 Met Thr Glu Glu Glu Ala 225 Pro Cys Gly Leu 230 Glu Leu Trp Arg Val 235 Leu Lys Pro Ala Glu 240 Ala Asp Gly Arg Arg 245 Pro Val Arg Leu Leu 250 Trp Lys Lys Ala Arg Gly 255 Ala Pro Val Leu 260 Glu Lys Thr Leu Gly 265 Tyr Asn Ile Trp Tyr 270 Tyr Pro Glu Ser Asn 275 Thr Asn Leu Thr Glu 280 Thr Met Asn Thr Thr 285 Asn Gin Gin Leu Glu 290 Leu His Leu Gly Gly 295 Glu Ser Phe Trp Val 300 Ser Met Ile Ser Tyr Asn 305 Ile Gin Ser Glu Leu Lys Gly Lys 310 Ser Pro Val Ala Thr 315 Leu Arg Xle Pro Ala 320 <210> 114 <211> 1476 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> CDS <222> (162) ... (878) 412 <400> 114 tgtgtgtgca gtatgaaaat tgggaatgtg catcaggcaa aaaacactct ctctccccag cgagacagga aggcagagtg ctcaagtttt tcaccacggc ccttcatgtg ttaacctggg tcagcttgtt ccacctcagc 60 atgtgtctgt gaatgtccgc 120 g atg acg cgg acc cgg 176 Met Met Trp Thr Trp 1 5 gca Ala ctg Leu tgg Trp atg Met ctc Leu 10 ccc Pro cca Ser ctc Leu tgc Cys aaa Lys 15 ctc Phe age Ser ctg Leu gca Ala gct Ala 20 ctg Leu cca Pro gct Ala aag Lys cct Pro 25 gag Glu aae Asn att Ile tcc Ser tgc Cys 30 gtc Vai tac Tyr tac Tyr tat Tyr agg Arg 35 aaa Lys aat Asn cta Leu acc Thr tgc Cys 40 act Thr tgg Trp agt Ser cca Pro gga Gly 45 aag Lys gaa Glu acc Thr agt Ser tat Tyr SO acc Thr cag Gin tac Tyr aca Thr gtt Vai 55 aag Lys aga Arg act Thr tac Tyr gct Ala 60 ttt Phe gga Gly gaa Glu aaa Lys cat His 65 gat Asp aat Asn tgt Cys aca Thr acc Thr 70 aat Asn agt Ser tct Ser aca Thr agt Ser 75 gaa Glu aat Asn cgt Arg gct Ala teg Ser 80 tgc Cys tct Ser ttt Phe ttc Phe ctt Leu 8S cca aga aca acg ate cca gat aat tat acc att gag gtg gaa gct gaa 224 272 320 368 416 464 413

Pro Arg Ile Thr Ile 90 Pro Asp Asn Tyr Thr 95 Ile Glu Vai Glu Ala 100 Glu aat gga gat ggt gta att aaa tet cat atg aca tac tgg aga tta gag 512 Asn Gly Asp Gly 105 Vai Ile Lys Ser His 110 Met Thr Tyr Trp Arg 115 Leu Glu aac ata gcg aaa act gaa cca cct aag att ttc cgt gtg aaa cca gtt 560 Asn Ile Ala 120 Lys Thr Glu Pro Pro 125 Lys Ile Phe Arg Vai 130 Lys Pro Val teg ggc ate aaa cga atg att caa att gaa tgg ata aag ccc gag ttg 608 Leu Gly 135 Ile Lys Arg Met ile 140 Gin ile Glu Trp Ile 145 Lys Pro Glu Leu gcg cct gtt tea tet gat tta aaa tac aca ctt cga ttc agg aca gtc 656 Ala 150 Pro Vai Ser Ser Asp 155 Leu Lys Tyr Thr Leu 160 Arg Phe Arg Thr Val 165 aac agt acc age tgg atg gaa gtc aac ttc gct aag aac cgt aag gat 704 Asn Ser Thr Ser Trp 170 Met Glu Vai Asn Phe 175 Ala Lys Asn Arg Lys 180 Asp aaa aac caa acg tac aac ctc acg ggg ctg cag cct ttt aca gaa tat 752 Lys Asn Gin Thr 185 Tyr Asn Leu Thr Gly 190 Leu Gin Pro Phe Thr 195 Glu Tyr gtc ata gct ctg cga tgt gcg gtc aag gag tea aag ttc tgg agt gac 800 Vai Ile Ala 200 Leu Arg Cys Ala Vai 205 Lys Glu Ser Lys Phe 210 Trp Ser Asp tgg age caa gaa aaa atg gga atg act gag gaa gaa ggc aag cta ctc 848 Trp Ser 215 Gin Glu Lys Met Gly 220 Met Thr Glu Glu Glu 225 Gly Lys Leu Leu ccC Pro 230 gcg Ala att Ile CCC Pro gtc Vai ctg Leu 235 tet ser gct Ala ctg Leu gtg Vai tagggctgct ttgggctaga 898 cttggtgggg tttgtcacca cctggttggg aatcatggaa tctcatgacc ccaggggccc 958 cctgtaccat cgagagtgag cctgcacaac tttgtgcccc aaaggcaaag gatcacattt 1018 taatactcat gaggttctta tactatacat gaaagggtat catatcattt gttttgtttt 1078 gttttgtttt tgagatggag tcttactctg tcacccagga tggagtgcag tgatgtgatc 1138 tcggctcact gccaccacca cctcccgagt tcaagcaacc cttgtgcctc agcctcccaa 1198 gtagctggga ttacaggggc ccacgaccat gcccggtcga tttttgtatt tttagtagag 1258 aagggatatc accatgttgg ctaggctagt cttgaactcc tgacctcagg taatccgccc 1318 accttgacct cccaaagtgc tgggattaca ggcgtgagcc actgtgcccc gccagtatca 1378 tatcatctga aggtatcctg tgataaatta aagatacata ttgtgaatcc cggagctact 1438 actcaaaaaa taaataaagg tgcaactaat acaattta 1476

<210> 115 <211> 239 <212> PRT <213> Homo sapiens 414 <40 0> 115

Met 1 Met Trp Thr Trp 5 Ala Leu Trp Ser Leu Ala Ala 20 Leu Pro Ala Lys Tyr Tyr Arg 35 Lys Asn Leu Thr Cys 40 Ser Tyr 50 Thr Gin Tyr Thr Vai 55 Lys His 65 Asp Asn Cys Thr Thr 70 Asn Ser Cys Ser Phe Phe Leu 85 Pro Arg Ile Glu Vai Glu Ala 100 Glu Asn Gly Asp Tyr Trp Arg 115 Leu Glu Asn Ile Ala 120 Arg Vai 130 Lys Pro Vai Leu Gly 135 Ile Ile 145 Lys Pro Glu Leu Ala 150 Pro Vai Arg Phe Arg Thr Vai 165 Asn Ser Thr Lys Asn Arg Lys 180 Asp Lys Asn Gin Pro Phe Thr 195 Glu Tyr Vai Ile Ala 200 Lys Phe 210 Trp Ser Asp Trp Ser 215 Gin Glu 225 Gly Lys Leu Leu Pro 230 Ala Ile

Met Leu 10 Pro Ser Leu Cys Lys 15 Phe Pro 25 Glu Asn Ile Ser Cys 30 Vai Tyr Thr Trp Ser Pro Gly 45 Lys Glu Thr Arg Thr Tyr Ala 60 Phe Gly Glu Lys Ser Thr Ser 75 Glu Asn Arg Ala Ser 80 Thr Ile 90 Pro Asp Asn Tyr Thr 95 Ile Gly 105 Vai ile Lys Ser His 110 Met Thr Lys Thr Glu Pro Pro 125 Lys Ile Phe Lys Arg Met ile 140 Gin Ile Glu Trp Ser Ser Asp 155 Leu Lys Tyr Thr Leu 160 Ser Trp 170 Met Glu Vai Asn Phe 175 Ala Thr 185 Tyr Asn Leu Thr Gly 190 Leu Gin Leu Arg Cys Ala Vai 20S Lys Glu Ser Glu Lys Met Gly 220 Met Thr Glu Glu Pro vai Leu 235 Ser Ala Leu Vai <210> 116 <211> 2748 <212> ADN <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (237)...(222 <4 0 0> 116 415 gatggggccc tgaatgttga tctgacagaa ttccagacca acctggtggt tattgtcctt 60 ttcatctggt catgctgaat atactctcaa gatgtgctgg agaaggtgcc gctgtceggg 120 ctctcagaga aggcagtgct ggaggcgttc ctggcccggg tctcctccta ccgttcctgg 180 Cagcccagcc ttctcggggt ggaaggagaa gceggccagg cgagctctga ggaagc atg 239

Met 1 ctg age age cag aag gga tcc tgc age cag gaa cca ggg gea gee cac 287 Leu Ser Ser Gin 5 Lys Gly Ser Cys Ser 10 Gin Glu Pro Giy Ala 15 Ala HiS gtc cag cct ctg ggt gtg aac gct gga ata atg tgg acc ttg gea ctg 335 Vai Gin Pro 20 Leu Gly Vai Asn Ala 25 Gly Ile Met Trp Thr 30 Leu Ala Leu tgg gea ttc tet ttc etc tgc aaa ttc age ctg gea gtc ctg ceg act 383 Trp Ala 35 Phe Ser Phe Leu Cys 40 Lys Phe Ser Leu Ala 45 Vai Leu Pro Thr aag cca gag aac ate tcc tgc gtc ttt tac ttc gac aga aat ctg act 431 Lys 50 Pro Glu Asn Xle Ser 55 Cys Vai Phe Tyr Phe 60 Asp Arg Asn Leu Thr 65 tgc act tgg aga cca gag aag gaa acc aat gat acc age tac att gtg 479 Cys Thr Trp Arg Pro 70 Glu Lys Glu Thr Asn 75 Asp Thr Ser Tyr Ile 80 Val act ttg act tac tcc tat gga aaa age aat tat agt gac aat gct aca 527 416

Thr Leu Thr Tyr 85 Ser Tyr Gly Lys Ser 90 Asn Tyr Ser Asp Asn 95 Ala Thr gag gct tea tat tet ttt ccc cgt tcc tgt gea atg CCC cca gac ate 57 S Glu Ala ser 100 Tyr Ser Phe Pro Arg 105 Ser Cys Ala Met Pro 110 Pro Asp Ile tgc agt gtt gaa gta caa gct caa aat gga gat ggt aaa gtt aaa tet 623 Cys Ser 115 Val Glu Val Gin Ala 120 Gin Asn Gly Asp Gly 125 Lys Val Lys Ser gac ate aca tat tgg cat tta ate tcc ata gea aaa acc gaa cca cct 671 Asp 130 Ile Thr Tyr Trp His 135 Leu Ile Ser Ile Ala 140 Lys Thr Glu Pro Pro 145 ata att tta agt gtg aat cca att tgt aat aga atg ttc cag ata caa 719 lie Ile Leu Ser Val 150 Asn Pro Ile Cys Asn 155 Arg Met Phe Gin Ile 160 Gin tgg aaa ccg cgt gaa aag act cgt ggg ttt cct tta gta tgc atg ctc 767 Trp Lys Pro Arg 165 Glu Lys Thr Arg Gly 170 Phe Pro Leu Val Cys 175 Met Leu cgg ttc aga act gtc aac agt age ege tgg acg gaa gtc aat ttt gaa 81S Arg phe Arg 180 Thr Val Asn Ser Ser 185 Arg Trp Thr Glu Val 190 Asn Phe Glu aac tgt aaa cag gtc tgc aac ctc aca gga ctc cag gct ttc aca gaa 863 Asn Cys 195 Lys Gin Val Cys Asn 200 Leu Thr Gly Leu Gin 205 Ala Phe Thr Glu tat gtc ctg gct cta cga ttc agg ttc aat gac tea aga tat tgg age 911 Tyr 210 Vai Leu Ala Leu Arg 215 Phe Arg Phe Asn Asp 220 Ser Arg Tyr Trp Ser 225 aag tgg age aaa gaa gaa acc aga gtg act atg gag gaa gtt cca cat 959 Lys Trp Ser Lys Glu 230 Glu Thr Arg Val Thr 235 Met Glu Glu Val Pro 240 His gtc ctg gac ctg tgg aga att ctg gaa cca gea gac atg aac gga gac 1007 Vai Leu Asp Leu 245 Trp Arg Ile Leu Glu 250 Pro Ala Asp Met Asn 255 Gly Asp agg aag gtg cga ttg ctg tgg aag aag gea aga gga gee ccc gtc ttg 1055 Arg Lys Val 260 Arg Leu Leu Trp Lys 265 Lys Ala Arg Gly Ala 270 Pro Val Leu gag aaa aca ttt ggc tac cac ata cag tac ttt gea gag aac age act 1103 Glu Lys 275 Thr Phe Gly Tyr His 280 Ile Gin Tyr Phe Ala 285 Glu Asn Ser Thr aac ctc aca gag ata aac aac ate acc acc cag cag tat gaa ctg ctt 1151 Asn 290 Leu Thr Glu ile Asn 295 Asn Ile Thr Thr Gin 300 Gin Tyr Glu Leu Leu 305 ctg atg age cag gea cac tet gtg tcc gtg act tet ttt aat tet ctt 1199 Leu Met Ser Gin Ala 310 His Ser Val Ser Val 315 Thr Ser Phe Asn Ser 320 Leu ggc aag tcc caa gag acc ate ctg agg ate cca gat gtc cat gag aag 1247 Gly Lys Ser Gin 325 Glu Thr Ile Leu Arg 330 Ile Pro Asp Val His 335 Glu Lys 417 acc ttc cag tac att aag age atg cag gee tac ata gee gag ccc ctg 1295 Thr Phe Gin 340 Tyr Xle Lys Ser Met 345 Gin Ala Tyr Ile Ala 350 Glu Pro Leu ttg gtg gtg aac tgg caa age tcc att cct gcg gtg gac act tgg ata 1343 Leu Vai 355 Vai Asn Trp Gin Ser 360 Ser Ile Pro Ala Val 365 Asp Thr Trp Ile gtg gag tgg etc cca gaa gct gee atg teg aag ttc cct gee ctt tcc 1391 Vai 370 Glu Trp Leu Pro Glu 375 Ala Ala Met Ser Lys 380 Phe Pro Ala Leu Ser 385 tgg gaa tet gtg tet cag gtc acg aac tgg acc ate gag caa gat aaa 1439 Trp Glu Ser val Ser 390 Gin Val Thr Asn Trp 395 Thr Ile Glu Gin Asp 400 Lys cta aaa cct ttc aca tgc tat aat ata tea gtg tat cca gtg ttg gga 1487 Leu Lys Pro Phe 405 Thr Cys Tyr Asn He 410 Ser Val Tyr Pro Val 415 Leu Gly cac cga gtt gga gag ccg tat tea ate caa gct tat gee aaa gaa gga 1535 His Arg Val 420 Gly Glu Pro Tyr Ser 425 Ile Gin Ala Tyr Ala 430 Lys Glu Gly act cca tta aaa ggt cct gag acc agg gtg gag aac ate ggt ctg agg 1583 Thr Pro 435 Leu Lys Gly Pro Glu 440 Thr Arg Val Glu Asn 445 Ile Gly Leu Arg aca gee acg ate aca tgg aag gag att cct aag agt gct agg aat gga 1631 Thr 450 Ala Thr Xle Thr Trp 455 Lys Glu Ile Pro Lys 460 Ser Ala Arg Asn Gly 465 ttt ate aac aat tac act gta ttt tac caa gct gaa ggt gga aaa gaa 1679 Phe lie Asn Asn Tyr 470 Thr Val Phe Tyr Gin 475 Ala Glu Gly Gly Lys 480 Glu etc tcc aag act gtt aac tet cat gee ctg cag tgt gac ctg gag tet 1727 Leu Ser Lys Thr 4S5 Val Asn Ser His Ala 490 Leu Gin Cys Asp Leu 495 Glu Ser ctg aca cga agg acc tet tat act gtt tgg gtc atg gee age acc aga 1775 Leu Thr Arg 500 Arg Thr Ser Tyr Thr 505 Val Trp Val Met Ala 510 Ser Thr Arg gct gga ggt acc aac ggg gtg aga ata aac ttc aag aca ttg tea ate 1823 Ala Gly 515 Gly Thr Asn Gly Val 520 Arg Ile Asn Phe Lys 525 Thr Leu Ser Ile agt gtg ttt gaa att gtc ctt cta aca tet cta gtt gga gga ggc ctt 1871 Ser 530 vai Phe Glu Ile Val 535 Leu Leu Thr Ser Leu 540 Val Gly Gly Gly Leu 545 Ctt cta ctt age ate aaa aca gtg act ttt ggc CtC aga aag cca aac 1919 Leu Leu Leu Ser Ile 550 Lys Thr Val Thr Phe 555 Gly Leu Arg Lys Pro S60 Asn cgg ttg act ccc ctg tgt tgt cct gat gtt ccc aac cct gct gaa agt 1967 Arg Leu Thr Pro 565 Leu Cys Cys Pro Asp 570 Val Pro Asn Pro Ala 575 Glu Ser agt tta gee aca tgg etc gga gat ggt ttc aag aag tea aat atg aag 2015 Ser Leu Ala S80 Thr Trp Leu Gly Asp 585 Gly Phe Lys Lys Ser 590 Asn Met Lys 418 418 gag act 99a aac tet 999 aac aca gaa gac gtg gtc cta aaa cca tgt Glu Thr S95 Gly Asn Ser Gly Asn 600 Thr Glu Asp Vai Vai 605 Leu Lys Pro Cys ccc gtc ccc gcg gat ctc act gac aag ctg gta gtg aac ttt gag aat Pro 610 Vai Pro Ala Asp Leu 615 Ile Asp Lys Leu Vai 620 Vai Asn Phe Glu Asn 625 ttt ctg gaa gta gtt ttg aca gag gaa gct gga aag 991 cag gcg age Phe Leu Glu Vai Vai 630 Leu Thr Glu Glu Ala 635 Gly Lys Gly Gin Ala 640 Ser ate ttg gga 99a gaa gcg aat gag tat ate tta tcc cag gaa cea age Ile Leu Gly Gly 645 Glu Ala Asn Glu Tyr 650 Ile Leu Ser Gin Glu 655 Pro Ser 2063 2111 2159 2207 2262 2322 2382 2442 2502 2562 2622 2682 2742 2748 tgt cct ggc cac tgc tgaagctacc ctcagggtcc aggacagctg tcttgttggc Cys Pro Gly His Cys 660 acttgactct ggcaggaacc tgatctctac ttttcttctc cctgtctccg gacactttct ctccttcatg cagagaccag gactagagcg gattcctcat ggcttgccag gctcctcagt ccttgctcgg gctcaggatc ctcaacaatg ccctttctgg gacactccat catccactta tatttatttt ttgcaacatt gtggattgaa cccagggact tgtttatgcg cgcaacttca gtaactgtgg cagagactta ggaatggaga tctgaccctt tgcagaaggt ttctggacat ccgtccctgt gtgagcctca gacagcattg tctttacttt gaatcagctt ccaagttaat aaaagaaaaa cagagaggtg gcataacagc tcctgcttcc tgacctgctt gagttccagt tctgacttcc tttggtgatg aacagcaatg tgggaagtgt aagctgaata aaecctttcc tcccca <210> 117 <211> 662 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 117 419

Met 1 Leu Ser Ser Gin 5 Lys Gly Ser Cys Ser 10 Gin Glu Pro Gly Ala 15 Ala His Vai Gin Pro 20 Leu Gly Vai Asn Ala 25 Gly Ile Met Trp Thr 30 Leu Ala Leu Trp Ala 35 Phe Ser Phe Leu Cys 40 Lys Phe Ser Leu Ala 45 Vai Leu Pro Thr Lys 50 Pro Glu Asn Ile Ser 55 Cys Vai Phe Tyr Phe 60 Asp Arg Asn Leu Thr 65 Cys Thr Trp Arg Pro 70 Glu Lys Glu Thr Asn 75 Asp Thr Ser Tyr Ile 80 Vai Thr Leu Thr Tyr 85 Ser Tyr Gly Lys Ser 90 Asn Tyr Ser Asp Asn 95 Ala Thr Glu Ala Ser 100 Tyr Ser Phe Pro Arg 105 Ser Cys Ala Met Pro 110 Pro Asp Ile Cys Ser 115 Vai Glu Vai Gin Ala 120 Gin Asn Gly Asp Gly 12S Lys Vai Lys Ser Asp 130 Ile Thr Tyr Trp His 135 Leu Ile Ser Ile Ala 140 Lys Thr Glu Pro Pro 145 Ile Ile Leu Ser Vai 150 Asn Pro Ile Cys Asn 1S5 Arg Met Phe Gin Ile 160 Gin Trp Lys Pro Arg 165 Glu Lys Thr Arg Gly 170 Phe Pro Leu Vai Cys 175 Met Leu Arg Phe Arg 180 Thr Vai Asn Ser Ser 185 Arg Trp Thr Glu Vai 190 Asn Phe Glu Asn Cys 195 Lys Gin Vai Cys Asn 200 Leu Thr Gly Leu Gin 205 Ala Phe Thr 420

Glu Tyr 210 Val Leu Ala Leu Arg 215 Phe Arg Phe Asn Asp 220 Ser Arg Tyr Trp Ser Lys 225 Trp Ser Lys Glu 230 Glu Thr Arg Val Thr 235 Met Glu Glu Val Pro 240 His val Leu Asp Leu 245 Trp Arg Ile Leu Glu 250 Pro Ala Asp Met Asn Gly 255 Asp Arg Lys Val 260 Arg Leu Leu Trp Lys 265 Lys Ala Arg Gly Ala 270 Pro Val Leu Glu Lys 275 Thr Phe Gly Tyr His 280 Ile Gin Tyr Phe Ala 285 Glu Asn Ser Thr Asn 290 Leu Thr Glu Ile Asn 295 Asn Ile Thr Thr Gin 300 Gin Tyr Glu Leu Leu Leu 305 Met Ser Gin Ala 310 His Ser Val Ser Val 315 Thr Ser Phe Asn Ser 320 Leu Gly Lys Ser Gin 325 Glu Thr Ile Leu Arg 330 Ile Pro Asp Val His Glu 335 Lys Thr Phe Gin 340 Tyr Ile Lys Ser Met 345 Gin Ala Tyr Ile Ala 350 Glu Pro Leu Leu Val 355 Val Asn Trp Gin Ser 360 Ser Ile Pro Ala val 365 Asp Thr Trp Ile val 370 Glu Trp Leu Pro Glu 375 Ala Ala Met Ser Lys 380 Phe Pro Ala Leu Ser Trp 385 Glu Ser Val Ser 390 Gin Val Thr Asn Trp 395 Thr Ile Glu Gin Asp 400 Lys Leu Lys Pro Phe 405 Thr Cys Tyr Asn Ile 410 Ser Val Tyr Pro Val Leu 415 Gly His Arg Val 420 Gly Glu Pro Tyr Ser 425 ile Gin Ala Tyr Ala 430 Lys Glu Gly Thr Pro 435 Leu Lys Gly Pro Glu 440 Thr Arg Val Glu Asn 445 Ile Gly Leu Arg Thr 450 Ala Thr Ile Thr Trp 455 Lys Glu Ile Pro Lys 460 Ser Ala Arg Asn Gly phe 465 Ile Asn Asn Tyr 470 Thr Val Phe Tyr Gin 475 Ala Glu Gly Gly Lys 480 Glu Leu Ser Lys Thr 485 Val Asn Ser His Ala 490 Leu Gin Cys Asp Leu Glu 495 Ser Leu Thr Arg 500 Arg Thr Ser Tyr Thr 505 Val Trp Val Met Ala 510 Ser Thr Arg Ala Gly 515 Gly Thr Asn Gly Val 520 Arg Ile Asn Phe Lys 525 Thr Leu Ser Ile Ser 530 Val Phe Glu Ile Val 535 Leu Leu Thr Ser Leu 540 Val Gly Gly Gly Leu Leu 545 Leu Leu ser Ile 550 Lys Thr Val Thr Phe 555 Gly Leu Arg Lys Pro 560 Asn Arg Leu Thr Pro 565 Leu Cys Cys Pro Asp 570 val Pro Asn Pro Ala Glu 575 Ser Ser Leu Ala 580 Thr Trp Leu Gly Asp 585 Gly Phe Lys Lys Ser 590 Asn Met Lys Glu Thr 595 Gly Asn Ser Gly Asn 600 Thr Glu ASP Val Val 605 Leu Lys Pro Cys Pro 610 Val Pro Ala Asp Leu 615 Ile Asp Lys Leu Val 620 Val Asn Phe Glu Asn Phe 625 Leu Glu Val val 630 Leu Thr Glu Glu Ala 635 Gly Lys Gly Gin Ala 640 Ser Ile Ser Cys Leu Pro Gly Gly 660 Gly 645 His Glu Cys Ala Asn Glu Tyr 650 Ile Leu Ser Gin Glu Pro 655 421

<210> 118 <211> 2728 <212> ADN <213> Mus musculus <22 0>

<221> CDS <222> (237)...(1877) <40 0> 118 422 gacggggccc tgaatgttga tctgacagaa ctccagacca acctggtggt tattgtcctt 60 ttcatctggt catgctgaat atactctcaa gatgtgctgg agaaggtgct gctgtccggg 120 ctctcagaga aggcagtgct ggaggcgttc ctggcccggg tctcccccta cCgttcctgg 180 tagcccagcc ttctcggggt ggaaggagaa gctggccagg tgagctctga ggaagc atg 239

Het 1 ctg age age cag aag gga tcc tgc age cag gaa cca ggg gea gee cac 287 Leu Ser Ser Gin 5 Lys Gly Ser Cys Ser 10 Gin Glu Pro Gly Ala 15 Ala HÍS gtc cag cct ctg ggt gtg aac gct gga ata atg tgg acc ttg gea ctg 335 vai Gin Pro 20 Leu Gly Val Asn Ala 25 Gly Ile Met Trp Thr 30 Leu Ala Leu tgg gea ttc tet ttc ctc tgc aaa ttc age ctg gea gtc ctg ccg act 383 Trp Ala 35 Phe Ser Phe Leu Cys 40 Lys Phe Ser Leu Ala 45 Val Leu Pro Thr aag cca gag aac att tcc tgc gtc ttt tac ttc gac aga aat ctg act 431 Lys 50 Pro Glu Asn Ile Ser 55 Cys Val Phe Tyr Phe 60 Asp Arg Asn Leu Thr 65 tgc act tgg aga cca gag aag gaa acc aat gat acc age tac att gtg 479 Cys Thr Trp Arg Pro 70 Glu Lys Glu Thr Asn 75 Asp Thr Ser Tyr Ile 80 Val act ttg act tac tcc tat gga aaa age aat tat agt gac aat gct aca 527 Thr Leu Thr Tyr 85 Ser Tyr Gly Lys Ser 90 Asn Tyr Ser Asp Asn 95 Ala Thr gag gct tea tat tet ttt ccc cgt tcc tgt gea atg ccc cca gac ate 575 Glu Ala Ser 100 Tyr Ser Phe Pro Arg 105 Ser Cys Ala Met Pro 110 Pro Asp Ile tgc agt gtt gaa gta caa gct caa aat gga gat ggt aaa gtt aaa tet 623 Cys Ser 115 Vai Glu Vai Gin Ala 120 Gin Asn Gly Asp Gly 125 Lys Val Lys Ser gac ate aca tat tgg cat tta ate tcc ata gea aaa acc gaa cca cct 671 Asp 130 Ile Thr Tyr Trp His 135 Leu ile Ser Ile Ala 140 Lys Thr Glu Pro Pro 145 ata att tta agt gtg aat cca att tgt aat aga atg ttc cag ata caa 719 Ile Ile Leu Ser Vai 150 Asn Pro ile Cys Asn 155 Arg Met Phe Gin lie 160 Gin tgg aaa ccg egt gaa aag act cgt ggg ttt cct tta gta tgc atg ctt 767 Trp Lys Pro Arg 165 Glu Lys Thr Arg Gly 170 Phe Pro Leu val Cys 175 Met Leu cgg ttc aga act gtc aac agt age ege tgg acg gaa gee aat ttt gaa 815 Arg Phe Arg 180 Thr Vai Asn Ser Ser 185 Arg Trp Thr Glu Val 190 Asn Phe Glu aac tgt aaa cag gtc tgc aac ctc aca gga ctt cag gct ttc aca gaa 863 423

Asn Cys 195 Lys Gin val Cys Asn 200 Leu Thr Gly Leu Gin 205 Ala Phe Thr Glu tat gtc ctg gct cta cga ttc agg ttc aat gac tea aga tat tgg age 911 Tyr 210 Val Leu Ala Leu Arg 215 Phe Arg Phe Asn Asp 220 Ser Arg Tyr Trp Ser 225 aag tgg age aaa gaa gaa acc aga gtg act atg gag gaa gtt cca cat 959 Lys Trp Ser Lys Glu 230 Glu Thr Arg Val Thr 235 Met Glu Glu Val Pro 240 His gtc ctg gac ctg tgg aga att ctg gaa cca gea gac atg aac gga gac 1007 Vai Leu Asp Leu 245 Trp Arg ile Leu Glu 250 Pro Ala Asp Met Asn 255 Gly Asp agg aag gtg cga ttg ctg tgg aag aag gea aga gga gee ccc gtc ttg 1055 Arg Lys val 260 Arg Leu Leu Trp Lys 265 Lys Ala Arg Gly Ala 270 Pro Val Leu gag aaa aca ttt ggc tac cac ata cag tac ttt gea gag aac age act 1103 Glu Lys 275 Thr Phe Gly Tyr His 280 Ile Gin Tyr Phe Ala 285 Glu Asn Ser Thr aac ctc aca gag ata aac aac ate acc acc cag cag tat gaa ctg ctt 1151 Asn 290 Leu Thr Glu Xle Asn 295 Asn Ile Thr Thr Gin 300 Gin Tyr Glu Leu Leu 305 ctg atg age cag gea cac tet gtg tcc gtg act tet ttt aat tet ctt 1199 Leu Met Ser Gin Ala 310 His Ser Val Ser Val 315 Thr Ser Phe Asn ser 320 Leu ggc aag tcc caa gag acc ate ctg agg ate cca gat gtc cat gag aag 1247 Gly Lys Ser Gin 325 Glu Thr Ile Leu Arg 330 Ile Pro Asp Val His 335 Glu Lys acc ttc cag tac att aag age atg cag gee tac ata gee gag ccc ctg 1295 Thr Phe Gin 340 Tyr He Lys Ser Met 345 Gin Ala Tyr Ile Ala 350 Glu Pro Leu ttg gtg gtg aac tgg caa age tcc att cct gcg gtg gac act tgg ata 1343 Leu Val 355 Val Asn Trp Gin Ser 360 Ser Ile Pro Ala Val 365 Asp Thr Trp Ile gtg gag tgg ctc cca gaa gct gee atg teg aag ttc cct gee ctt tcc 1391 Vai 370 Glu Trp Leu Pro Glu 375 Ala Ala Met Ser Lys 380 Phe Pro Ala Leu Ser 385 tgg gaa tet gtg tet cag gtc acg aac tgg acc ate gag caa gat aaa 1439 Trp Glu Ser Val Ser 390 Gin Val Thr Asn Trp 395 Thr Ile Glu Gin Asp 400 Lys cea aaa cct ttc aca tgc tat aat ata tea gtg tat cca gtg ttg gga 1487 Leu Lys Pro Phe 405 Thr Cys Tyr Asn Ile 410 Ser Val Tyr Pro Val 41S Leu Gly cac cga gtt gga gag ccg tat tea ate caa gct tat gee aaa gaa gga 1535 Mis Arg val 420 Gly Glu Pro Tyr Ser 425 Ile Gin Ala Tyr Ala 430 Lys Glu Gly acc cca tta aaa ggt cct gag acc agg gtg gag aac ate ggt ctg agg 1583 Thr Pro 435 Leu Lys Gly Pro Glu 440 Thr Arg Val Glu Asn 445 Ile Gly Leu Arg 424 424 aca gcc acg ate aca tgg aag gag att cct aag agt gct agg aat gga 1631 Thr 450 Ala Thr Ile Thr Trp 455 Lys Glu Ile Pro Lys 460 Ser Ala Arg Asn Gly 465 ttt ate aac aat tac act gta ttt tac caa gct gaa ggt gga aaa gaa 1679 Phe lie Asn Asn Tyr 470 Thr Vai Phe Tyr Gin 475 Ala Glu Gly Gly Lys 480 Glu ctc tec aag act gtt aac tet cat gcc ctg cag tgt gac ctg gag tet 1727 Leu Ser Lys Thr 485 Vai Asn Ser His Ala 490 Leu Gin Cys ASp Leu 495 Glu Ser ctg aca cga agg acc tet tat act gtt tgg gtc atg gcc age acc aga 1775 Leu Thr Arg 500 Arg Thr Ser Tyr Thr 505 val Trp Val Met Ala 510 Ser Thr Arg gct gga ggt acc aac ggg gtg aga ata aac ttc aag aca ttg tea ate 1823 Ala Gly 515 Gly Thr Asn Gly Val 520 Arg ile Asn Phe Lys 525 Thr Leu Ser Ile agt gag tac tgg ctt cag gcc tea ttc tgg agt tta ctt cgg gtt gga 1871 Ser 530 Glu Tyr Trp Leu Gin 535 Ala Ser Phe Trp Ser 540 Leu Leu Arg Val Gly 545 aat gtt tgacaggagc aaggagagcc agcagagggc agcagagcat ggcttctcct 1927 Asn Val gctctctctg gttagaccaa aagcaagcaa ggccagctcc cagaggtcac gtttgtttgt caaatttgct gctgagggca gagttccagg tcaatcagtc aaccaaaaaa taaagtagac acaatgcctt ataaaaatca gctcactcac ctcccaggag ttactgagga gctggcaaag ggagggctga 1967 caggccactt tgacccttgc tggtaagcag ccacaaataa tcttaagatg 2047 catccacttc agcctcagcc acgtcaaagg ctgttgcctg agctcacact 2107 taaatgtcag gagttgtgca atagaacctg ggaaggaaca actggttgat 2167 tgacaaggga cttaatgtta ccatctgcgg tggggctttt gtttcgtttt 2227 tatgtgtatt caacttatca gcttttacgt tgaaaacatg aaaagcaaga 2287 agatatcaca tataatgtga aacataatag tttaataatt gagtaggaaa 2347 tgtaatagac agagggaaaa gaagaggaaa gccagcctgg tctacaaagt 2407 acagccaggg ctacatggag aaaccctgtc tcaatcaatc aatcaatcaa 2467 aatcaatcaa aattcaagca gcattgacaa gttttgcaat aactactata 2S27 gtcatcttga tgtacctcag aagccccttg ttatttatgt tcctgaagac 2587 cgtggctctg agaaccatga gcaagataac acgttctgtc ctgcagccta 2647 cttggtattc tttctgatac aacctctaaa ataacttttt tctaaaaaaa 2707 tgttacagct a 2728 <210> 119 <211> 547 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 119 425

Met 1 Leu Ser Ser Gin S Lys Gly Ser Cys Ser 10 Gin Glu Fro Gly Ala 15 Ala His Vai Gin Pro 20 Leu Gly Vai Asn Ala 25 Gly Ile Met Trp Thr 30 Leu Ala Leu Trp Ala 35 Phe Ser Phe Leu Cys 40 Lys Phe Ser Leu Ala 45 Vai Leu Pro Thr Lys 50 Pro Glu Asn Ile Ser 55 Cys Vai Phe Tyr Phe 60 Asp Arg Asn Leu Thr 65 Cys Thr Trp Arg Pro 70 Glu Lys Glu Thr Asn 75 Asp Thr Ser Tyr Ile 80 Vai Thr Leu Thr Tyr 85 Ser Tyr Gly Lys Ser 90 Asn Tyr Ser Asp Asn 95 Ala Thr Glu Ala Ser 100 Tyr Ser Phe Pro Arg 105 Ser Cys Ala Met Pro 110 Pro Asp 426

Ile Cys Ser 115 Vai Glu val Gin Ala 120 Gin Asn Gly Asp Gly 125 Lys Val Lys Ser Asp 130 Ile Thr Tyr Trp His 135 Leu ile Ser Ile Ala 140 Lys Thr Glu Pro Pro 145 Ue Ile Leu Ser val ISO Asn Pro Ile Cys Asn 155 Arg Met Phe Gin Ile 160 Gin Trp Lys Pro Arg 165 Glu Lys Thr Arg Gly 170 Phe Pro Leu Val Cys 17S Met Leu Arg Phe Arg 180 Thr Val Asn Ser Ser 185 Arg Trp Thr Glu Val 190 Asn Phe Glu Asn Cys 195 Lys Gin Val Cys Asn 200 Leu Thr Gly Leu Gin 205 Ala Phe Thr Glu Tyr 210 Vai Leu Ala Leu Arg 215 Phe Arg Phe Asn Asp 220 Ser Arg Tyr Trp Ser 225 Lys Trp Ser Lys Glu 230 Glu Thr Arg Val Thr 235 Met Glu Glu Val Pro 240 HÍS Vai Leu Asp Leu 245 Trp Arg Ile Leu Glu 250 Pro Ala Asp Met Asn 255 Gly Asp Arg Lys val 260 Arg Leu Leu Trp Lys 265 Lys Ala Arg Gly Ala 270 Pro Val Leu Glu Lys 275 Thr Phe Gly Tyr His 280 Ile Gin Tyr Phe Ala 285 Glu Asn Ser Thr Asn 290 Leu Thr Glu Ile Asn 295 Asn Ile Thr Thr Gin 300 Gin Tyr Glu Leu Leu 305 Leu Met Ser Gin Ala 310 His Ser Val Ser Val 315 Thr Ser Phe Asn Ser 320 Leu Gly Lys Ser Gin ^ ^ Glu Thr Ile Leu Arg »-»n Ile Pro Asp Val His 335 Glu Lys Thr Phe Gin 340 Tyr Ile Lys Ser Met 345 Gin Ala Tyr Ile Ala 350 Glu Pro Leu Leu Vai 355 Val Asn Trp Gin Ser 360 Ser Ile Pro Ala Val 365 Asp Thr Trp Ile Vai 370 Glu Trp Leu Pro Glu 375 Ala Ala Met Ser Lys 380 Phe Pro Ala Leu Ser 385 Trp Glu Ser Val Ser 390 Gin Val Thr Asn Trp 395 Thr Ile Glu Gin Asp 400 Lys Leu Lys Pro Phe 405 Thr Cys Tyr Asn Ile 410 Ser Val Tyr Pro Val 415 Leu Gly His Arg Val 420 Gly Glu Pro Tyr Ser 425 Ile Gin Ala Tyr Ala 430 Lys Glu Gly Thr Pro 435 Leu Lys Gly Pro Glu 440 Thr Arg Val Glu Asn 445 Ile Gly Leu Arg Thr 450 Ala Thr Ile Thr Trp 455 Lys Glu Ile Pro Lys 460 Ser Ala Arg Asn Gly 465 Phe Ile Asn Asn Tyr 470 Thr Val Phe Tyr Gin 475 Ala Glu Gly Gly Lys 480 Glu Leu Ser Lys Thr 485 Val Asn Ser His Ala 490 Leu Gin Cys Asp Leu 495 Glu Ser Leu Thr Arg 500 Arg Thr Ser Tyr Thr 505 Val Trp Val Met Ala 510 Ser Thr Arg Ala Gly 515 Gly Thr Asn Gly Val 520 Arg Ile Asn Phe Lys 525 Thr Leu Ser Ile Gly 545 Ser 530 Asn Glu Vai Tyr Trp Leu Gin 535 Ala Ser Phe Trp Ser 540 Leu Leu Arg Val <210> 120 427 <211> 2196 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> polinucleótido degenerado <221> misc_feature <222> (1)...(2196) <223> n = A, T, C ou G <400> 120 atgatgtgga cntgggcnyt ntggatgytn ccnwsnytnt gyaarttyws nytngcngcn 60 ytnccngcna arccngaraa yathwsntgy gtntaytayt aymgnaaraa yytnacntgy 120 acntggwsnc cnggnaarga racnwsnCay acncartaya cngcnaarmg nacntaygcn 180 ttyggngara arcaygayaa ytgyacnacn aaywsnwsna cnwsngaraa ymgngcnwsn 240 tgywsnttyt tyytnccnmg nathacnath ccngayaayt ayacnathga rgtngargcn 300 garaayggng ayggngtnat haarwsncay atgacntayt ggmgnytnga raayachgcn 360 aaracngarc cnccnaarat httymgngtn aarccngcny CnggnaChaa rmgnatgath 420 carathgarc ggathaarcc ngarycngcn ccngtnwsnw sngayycnaa rtayacnytn 480 mgnctymgna cngtnaayws nacnwsnCgg atggargtna ayttygcnaa raaymgnaar 540 gayaaraayc aracntayaa yytnacnggn ytncarccnt tyacngarta ygtnathgcn 600 ytnmgntgyg cngcnaarga rwsnaartty cggwsngayc ggwsncarga raaratgggn 660 atgacngarg argargcncc ntgyggnytn garytntggm gngtnytnaa rccngcngar 720 gcngayggnm gnmgnccngC nmgnytnytn tggaaraarg cnmgnggngc nccngCnycn 780 garaaracny tnggntayaa yathtggtay Cayccngarw snaayacnaa yytnacngar 840 acnatgaaya cnacnaayca rcarytngar ytncayytng gnggngarws nccycgggcn 900 wsnatgatbw sntayaayws nytnggnaar wsnccngtng cnacnytrung nathccngcn 960 achcargara arwsnccyca rtgyathgar gtnatgcarg cntgygtngc ngargaycar 1020 ytngtngcna artggcarws nwsngcnytn gaygcnaaya cntggatgat hgartggtty 1080 ccngaygtng aywsngarcc nacnacnytn wsntgggarw sngtnwsnca rgcnacnaay 1140 tggacnathc arcargayaa rytnaarccn ttytggtgyt ayaayathws ngcncayccn 1200 atgytncayg ayaargtngg ngarccntay wsnathcarg cntaygcnaa rgarggngtn 1260 ccnwsngarg gnccngarac naargtngar aayachggng tnaaracngt nacnathacn 1320 tggaargara thccnaarws ngarmgnaar ggnathatht gyaaytayac nathttytay 1380 cargcngarg gnggnaargg nccywsnaar acngtnaayw snwsnathyt ncarCayggn 1440 ytngarwsny tnaarmgnaa racnwsnCay achgtncarg tnatggcnws nacnwsngcn 1500 ggnggnacna ayggnacnws nachaaytcy aaracnytnw sntcywsngt nttygarath 1560 achycnatha cnwsnytnat hggnggnggn ytnytnathy cnathachyt nacngtngcn 1620 tayggnytna araarccnaa yaarytnacn cayytntgyc ggccnacngt nccnaayccn 1680 gcngarwsnw snathgcnac ntggcayggn gaygayctya argayaaryt naayytnaar 1740 garwsngayg aywsngtnaa yacngargay mgnathytna arccncgyws nacnccnwsn 1800 gayaarytng cnachgayaa rytngtngtn aayttyggna aygtnycnca rgarathtCy 1860 acngaygarg cnmgnacngg ncargaraay aayytnggng gngaraaraa yggntaygtn 1920 acntgyccnt tymgnccnga ytgyccnytn ggnaarwsnc tygargaryt nccngtnwsn 1980 ccngarathc cnccnmgnaa rwsncartay ytrungnwsnm gnatgccnga rggnacnmgn 2040 ccngargcna argarcaryt nytntcywsn ggncarwsny cngtnccnga ycayytntgy 2100 gargarggng cnccnaaycc ntayytnaar aaywsngtna cngenmgnga rttyytngtn 2160 wsngaraary tnccngarca yacnaarggn gargtn 2196 428

<210> 121 <211> 1947 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> polinucleótido degenerado da SEQ ID N°: 109 <221> misc_feature <222> (1)...(1947) <223> n = A, G, C ou G <40 0> 121 atgatgtgga cntgggcnyt ytnccngcna arccngaraa acntggwsnc cnggnaarga ttyggngara arcaygayaa tgywsnttyt tyytnccnmg garaayggng ayggngtnat aaracngarc cnccnaarat carathgart ggathaarcc mgnttymgna cngcnaayws gayaaraayc aracnCayaa ytrungntgyg cngtnaarga atgacngarg argargcncc gcngayggnm gnmgnccngt garaaracny tnggntayaa acnatgaaya cnacnaayca wsnatgathw sntayaayws athcargara arwsnttyca ytngtngtna artggcarws ccngaygtng aywsngarcc tggacnathc arcargayaa atgytncayg ayaargtngg ccnwsngarg gnccngarac tggaargara thccnaarws cargcngarg gnggnaargg ytngarwsny tnaarmgnaa ggnggnacna ayggnacnws athytnatha cnwsnytnat tayggnytna araarccnaa gcngarwsnw snathgcnac garwsngayg aywsngtnaa gayaarytng tnathgayaa acngaygarg cnmgnacngg athytnwsnw sntgyccnac ntggatgytn ccnwsnytnt yachwsntgy gtntaytayt racnwsntay acncartaya ytgyacnacn aaywsnwsna nathacnath ccngayaayt haarvsncay atgacntayt httymgngtn aarccngtny ngarytngcn ccngtnwsnw nacnwsntgg atggargcna yytnacnggn ytncarccnt rwsnaarcty tggwsngayt ntgyggnytn garycntggm nmgnytnytn tggaaraarg yathtggtay tayccngarw rcarytngar ytncayytng nytnggnaar wsnccngtng rtgyathgar gtnatgcarg nwsngcnytn gaygcnaaya nacnacnytn wsntgggarw rytnaarccn ttytggtgyt ngarccntay wsnachcarg naargtngar aayathggng ngarmgnaar ggnathatht nttywsnaar acngtnaayw racnwsntay athgtncarg nathaaytty aaracnytnw hggnggnggn ytnytnathy yaarycnacn cayytntgyt ntggcayggn gaygayttya yacngargay mgnathytna rytngtngtn aayttyggna ncargaraay aayytnggng nwsnath gyaarttyws nytngcngcn aymgnaaraa yytnacntçry cngtnaarmg nacntaygcn cnwsngaraa ymgngcnwsn ayacnathga rgtngargcn ggmgnytnga raayathgcn tnggnathaa rmgnatgath sngayytnaa rtayacnytn aytCygcnaa raaymgnaar tyacngarta ygtnathgcn ggwsncarga raaratgggn gngtnytnaa rccngcngar cnmgnggngc nccngtnytn snaayacnaa yytnacngar gnggngarws nctytgggtn cnacnytnmg nathccngcn cntgygtngc ngargaycar cntggatgat hgartggtty sngtnwsnca rgcnacnaay ayaayathws ngtntayccn cntaygcnaa rgarggngtn tnaaracngt nacnathacn gyaaytayac nathttytay 'snwsnathyt ncartayggn tnatggcnws nacnwsngcn snttywsngt nttygarath tnathathyt nacngtngcn ggccnacngt nccnaayccn argayaaryt naayytnaar arccntgyws nacnccnwsn aygtnytnca rgarathtty gngaraaraa yggnacnmgn 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1947 <210> 122 429 <211> 1986 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> polinucleótido degenerado <221> misc_ feature <222> (D .. .(1986) <223> n = A , T, C ou G <40 0> 122 ID N° 5 atgaarytnw snccncarcc nwsntgygtn aayytnggna tgatgtggac ntgggcnytn 60 tggatgycnc cnwsnytntg yaarttywsn ytngcngcny tnccngcnaa rccngaraay 120 athwsntgyg tntaytayta ymgnaaraay ytnacntgya cntggwsncc nggnaargar 180 acnwsntaya cncartayac ngtnaarmgn acntaygcnt tyggngaraa rcaygayaay 240 tgyacnacna aywsnwsnac nwsngaraay mgngcnwsnt gywsnttytt yytnccnmgn 300 athacnathc cngayaayta yacnathgar gCngargcng araayggnga yggngtnath 360 aarwsncaya tgacntaytg gmgnytngar aayathgcna aracngarcc nccnaarath 420 ttymgngtna arccngtnyt nggnathaar mgnatgachc arathgartg gathaarccn 480 garytngcnc cngtnwsnws ngayytnaar tayacnytnm gnttymgnac ngtnaaywsn 540 acnwsntgga tggargtnaa yttygcnaar aaymgnaarg ayaaraayca racntayaay 600 ytnacnggny tncarccntt yacngartay gtnathgcny tnmgntgygc ngtnaargar 660 wsnaarttyt ggwsngaytg gwsncargar aaratgggna tgacngarga rgargcnccn 720 tgyggnytng arytncggwg ngtnytnaar ccngcngarg cngayggnmg nrognccngtn 780 mgnytnytnt ggaaraargc nmgnggngcn ccngtnytng araaracnyt nggntayaay 840 athtggtayt ayccngarws naayacnaay ytnacngara cnatgaayac nacnaaycar 900 carytngary tncayytngg nggngarwsn tcytgggtnw snatgathws ntayaaywsn 960 ytnggnaarw snccngtngc nacnytrungn achccngcna thcargaraa rwsnttycar 1020 tgyathgarg tnatgcargc ntgygtngcn gargaycary tngtngtnaa rtggcarwsn 1080 wsngcnytng aygtnaayac ntggatgath gartggttyc cngaygtnga ywsngarccn 1140 acnacnytnw sncgggarws ngtnwsncar gcnacnaayc ggacnathca rcargayaar 1200 ytnaarccnt tytggtgyta yaayathwsn gtntayccna tgytncayga yaargcnggn 1260 garccntayw snathcargc ntaygcnaar garggngtnc cnwsngargg nccngaracn 1320 aargtngara ayathggngt naaracngtn acnathacnt ggaargarat hccnaarwsn 1380 garmgnaarg gnathathtg yaaytayacn athttytayc argcngargg nggnaarggn 1440 ttywsnaara cngcnaayws nwsnathytn carcayggny tngarwsnyt naarmgnaar 1500 acnwsntaya thgtncargt natggcnwsn acnwsngcng gnggnacnaa yggnacnwsn 1560 athaayttya aracnytnws nttywsngtn ttygaratha thytnathac nwsnytnath 1620 ggnggnggny tnytnathyt nathathytn acngtngcnt ayggnytnaa raarccnaay 1680 aarytnacnc ayytntgytg gccnacngtn ccnaayccng cngarwsnws nachgcnacn 1740 tggcayggng aygayttyaa rgayaarytn aayytnaarg arwsngayga ywsngtnaay 1800 acngargaym gnathytnaa rccntgywsn acnccnwsng ayaarytngt nathgayaar 1860 ytngtngtna ayttyggnaa ygtnytncar garathttya cngaygargc nmgnacnggn 1920 cargaraaya ayytnggngg ngaraaraay ggnacnmgna thytnwsnws ntgyccnacn 1980 wsnath 1986 430 430 <210> 123 <211> 19 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador oligonucleot. <40 0> 123 gccgactaag ccagagaac 19 <210> 124 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador oligonucleot. <40 0> 124 ctgttgacag ttctgaaccg 20 <210> 125 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador oligonucleot. ZC3 8.239 ZC38.245 ZC38,238 <40 0> 125 cgcggtttcc attgtatctg 20 <210> 126 <211> 2748 431 <212> ADN <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (237)...(2222 <400> 126 gatggggccc tgaatgttga tctgacagaa ttcatctggt catgctgaat atactctcaa ctctcagaga aggcagcgct ggaggcgtCc Cagcccagcc ttctcggggt ggaaggagaa ttccagacca acccggcggt tattgtcctt 60 gacgcgctgg agaaggtgct getgtccggg 120 ccggcccggg tcccctccta ccgttcctgg 180 gctggccagg tgagctctga ggaagc atg 239

Mec 1 432 ctg age age cag aag gga tcc tgc age cag gaa cca ggg gea gee cac 287 Leu Ser Ser Gin 5 Lys Gly Ser Cys Ser 10 Gin Glu Pro Gly Ala 15 Ala His gtc cag cct ctg ggt gtg aac gct gga ata atg tgg acc ttg gea ctg 335 vai Gin Pro 20 Leu Gly val Asn Ala 25 Gly Ile Met Trp Thr 30 Leu Ala Leu tgg gea ttc tet ttc ctc tgc aaa ttc age ctg gea gtc ctg ccg act 383 Trp Ala 35 Phe Ser Phe Leu Cys 40 Lys Phe Ser Leu Ala 45 Val Leu Pro Thr aag cca gag aac att tcc tgc gtc ttt tac ttc gac aga aat ctg act 431 Lys 50 Pro Glu Asn Ile Ser 55 Cys Val Phe Tyr Phe 60 Asp Arg Asn Leu Thr 65 tgc act tgg aga cca gag aag gaa acc aat gat acc age tac att gtg 479 Cys Thr Trp Arg Pro 70 Glu Lys Glu Thr Asn 75 Asp Thr Ser Tyr ile 80 Val act ttg act tac tcc tat gga aaa age aat tat agt gac aat gct aca 527 Thr Leu Thr Tyr 85 Ser Tyr Gly Lys Ser 90 Asn Tyr Ser Asp Asn 95 Ala Thr gag gct tea tat tet ttt ccc cgt tcc tgt gea atg ccc cca gac ate 575 Glu Ala Ser 100 Tyr Ser Phe Pro Arg 105 Ser Cys Ala Met Pro 110 Pro Asp Ile tgc agt gtt gaa gta caa gct caa aat gga gat ggt aaa gtt aaa tcc 623 Cys Ser 115 Vai Glu Vai Gin Ala 120 Gin Asn Gly Asp Gly 125 Lys Val Lys Ser gac ate aca tat tgg cat tta ate tcc ata gea aaa acc gaa cca cct 671 Asp 130 lie Thr Tyr Trp His 135 Leu Ile Ser Ile Ala 140 Lys Thr Glu Pro Pro 145 ata att tta agt gtg aat cca att tgt aac aga atg ttc cag ata caa 719 Xle Xle Leu Ser Val 150 Asn Pro Ile Cys Asn 155 Arg Met Phe Gin ile 160 Gin tgg aaa ccg cgt gaa aag act cgt ggg ttt cct tta gta tgc atg ctt 767 Trp Lys Pro Arg 165 Glu Lys Thr Arg Giy 170 Phe Pro Leu Val Cys 175 Met Leu cgg ttc aga act gtc aac agt age ege tgg acg gaa gtc aat ttt gaa 815 Arg Phe Arg 180 Thr Val Asn Ser Ser 185 Arg Trp Thr Glu Val 190 Asn Phe Glu aac tgt aaa cag gtc tgc aac ctc aca gga ctt cag gct ttc aca gaa 863 Asn Cys 195 Lys Gin Val Cys Asn 200 Leu Thr Gly Leu Gin 205 Ala Phe Thr Glu tat gtc ctg gct cta cga ttc agg ttc aat gac tea aga tat tgg age 911 Tyr 210 vai Leu Ala Leu Arg 215 Phe Arg Phe Asn Asp 220 Ser Arg Tyr Trp Ser 225 aag tgg age aaa gaa gaa acc aga gtg act atg gag gaa gtt cca cat 959 Lys Trp Ser Lys Glu 230 Glu Thr Arg Val Thr 235 Met Glu Glu Val Pro 240 His gtc ctg gac ctg tgg aga att ctg gaa cca gea gac atg aac gga gac 1007 433

Vai Leu Asp Leu 245 Trp Arg Ile Leu Glu 250 Pro Ala Asp Met Asn 255 Gly Asp agg aag gtg cga ttg ctg tgg aag aag gea aga gga gcc ccc gtc ttg 1055 Arg Lys Vai 260 Arg Leu Leu Trp Lys 265 Lys Ala Arg Gly Ala 270 Pro Val Leu gag aaa aca ttt ggc tac cac ata cag tac ttt gea gag aac age act 1103 Glu Lys 275 Thr Phe Gly Tyr His 280 Ile Gin Tyr Phe Ala 285 Glu Asn Ser Thr aac ctc aca gag ata aac aac ate acc acc cag cag tat gaa ctg ctt 1151 Asn 290 Leu Thr Glu ile Asn 295 Asn Ile Thr Thr Gin 300 Gin Tyr Glu Leu Leu 305 ctg atg age cag gea cac tet gtg tcc gtg act tet ttt aat tet ctt 1199 Leu Met Ser Gin Ala 310 His Ser Val Ser Val 315 Thr Ser Phe Asn Ser 320 Leu ggc aag tcc caa gag acc ate ctg agg ate cca gat gtc cat gag aag 1247 Gly Lys Ser Gin 32S Glu Thr Ile Leu Arg 330 Ile Pro Asp val His 335 Glu Lys ace ttc cag cac act aag age atg cag gcc tac ata gcc gag ccc ctg 1295 Thr Phe Gin 340 Tyr Ile Lys Ser Met 34S Gin Ala Tyr Ile Ala 350 Glu Pro Leu ttg gcg gtg aac tgg caa age tcc att cct gcg gtg gac act tgg ata 1343 Leu Vai 355 Vai Asn Trp Gin Ser 360 Ser Ile Pro Ala Val 365 Asp Thr Trp Ile gtg gag tgg ctc cca gaa gct gcc atg teg aag ttc cct gcc ctt tcc 1391 Vai 370 Glu Trp Leu Pro Glu 375 Ala Ala Met Ser Lys 380 Phe Pro Ala Leu Ser 385 tgg gaa tet gtg tet cag gtc acg aac tgg acc ate gag caa gat aaa 1439 Trp Glu Ser Vai Ser 390 Gin Vai Thr Asn Trp 395 Thr Ile Glu Gin Asp 400 Lys cta aaa cct ttc aca tgc tat aat ata tea gtg tat cca gtg ttg gga 1487 Leu Lys Pro Phe 405 Thr Cys Tyr Asn Ile 410 Ser Val Tyr Pro Val 415 Leu Gly cac cga gtt gga gag ccg tat tea ate caa gct tat gcc aaa gaa gga 1535 His Arg Vai 420 Gly Glu Pro Tyr Ser 425 Ile Gin Ala Tyr Ala 430 Lys Glu Gly act cca tta aaa ggt cct gag acc agg gtg gag aac ate ggt ctg agg 1583 Thr Pro 435 Leu Lys Gly Pro Glu 440 Thr Arg Val Glu Asn 445 Ile Gly Leu Arg aca gcc acg ate aca tgg aag gag att cct aag agt gct agg aat gga 1631 Thr 450 Ala Thr Ile Thr Trp 455 Lys Glu Ile Pro Lys 460 Ser Ala Arg Asn Gly 465 ttt ate aac aat tac act gta ttt tac caa gct gaa ggt gga aaa gaa 1679 Phe Ile Asn Asn Tyr 470 Thr Vai Phe Tyr Gin 475 Ala Glu Gly Gly Lys 480 Glu ctc tcc aag act gtt aac tet cat gcc ctg cag tgt gac ctg gag tet 1727 Leu Ser Lys Thr 485 Vai Asn Ser His Ala 490 Leu Gin Cys Asp Leu 495 Glu Ser 434 ctg aca cga agg acc tet tat act gtt tgg gtc atg gee age acc aga 1775 Leu Thr Arg SOO Arg Thr Ser Tyr Thr 505 Val Trp Val Met Ala 510 Ser Thr Arg gct gga ggt acc aac ggg gtg aga ata aac ttc aag aca ttg tea ate 1823 Ala Giy 515 Gly Thr Asn Gly val 520 Arg Ile Asn Phe Lys 525 Thr Leu Ser He agt gtg ttt gaa att gtc ctt cta aca tet cta gtt gga gga ggc ctt 1871 Ser 530 Vai Phe Glu Ile Val 535 Leu Leu Thr Ser Leu 540 Val Gly Gly Gly Leu 545 ctt cta ctt age ate aaa aca gtg act ttt ggc ctc aga aag cca aac 1919 Leu Leu Leu Ser ile 550 Lys Thr Val Thr Phe 555 Gly Leu Arg Lys Pro 560 Asn cgg ttg act ccc ctg tgt tgt cct gat gtt CCC aac cct gct gaa agt 1967 Arg Leu Thr Pro 565 Leu Cys Cys Pro Asp 570 Val Pro Asn Pro Ala 575 Glu Ser age eta gee aca tgg ctc gga gat ggt ttc aag aag tea aat atg aag 2015 Ser Leu Ala 580 Thr Trp Leu Gly Asp 585 Gly Phe Lys Lys Ser 590 Asn Met Lys gag act gga aac tet ggg aac aca gaa gac gtg gtc cta aaa cca tgt 2063 Glu Thr 595 Gly Asn Ser Gly Asn 600 Thr Glu Asp Val Val 605 Leu Lys Pro Cys cec gtc ccc gcg gat ctc att gac aag ctg gta gtg aac ttt gag aat 2111 Pro 610 val Pro Ala Asp Leu 615 Ile Asp Lys Leu val 620 Val Asn Phe Glu Asn 625 ttt ctg gaa gta gtt ttg aca gag gaa gct gga aag ggt cag gcg age 2159 Phe Leu Glu Val Val 630 Leu Thr Glu Glu Ala 635 Gly Lys Gly Gin Ala 640 Ser att ttg gga gga gaa gcg aat gag tat ate tta tcc cag gaa cca age 2207 Ile Leu Gly Gly 645 Glu Ala Asn Glu Tyr 650 Ile Leu Ser Gin Glu 655 Pro Ser tgc cct ggc cat tgc tgaagctacc ctcagggtcc aggacagccg tcttgttggc 2262 Cys Pro Gly His Cys 660 ecttgactct ggcaggaacc tgatctctac ttttcttctc cctgtctccg gacactttct 2322 ctccttcatg cagagaccag gactagagcg gatecctcat ggtttgccag gctcctcagt 2382 ccttgctcgg gctcaggatc ttcaacaatg ccctttctgg gacactccat cacccactta 2442 tatttatttt ttgcaacaet gtggattgaa cccagggact tgtttatgcg cgcaacttca 2502 gtaactgtgg cagagactta ggaacggaga tctgaccctt tgcagaaggt tcctggacat 2562 ccgtccctgt gtgagcctca gacagcattg tctttacttt gaatcagctt ccaagttaat 2622 aaaagaaaaa cagagaggtg gcataacagc tcctgcttcc tgacctgctt gagttccagt 2682 tctgacttcc tttggtgatg aacagcaatg tgggaagcgt aagctgaata aaccccttcc 2742 tcccca 2748

<210> 127 <211> 662 <212> PRT 435 <213> Mus musculus <400> 127

Met Leu Ser Ser Gin Lys Gly Ser Cys Ser Gin Glu Pro Gly Ala Ala 15 10 15

His Vai Gin Pro Leu Gly Vai Asn Ala Gly He Met Trp Thr Leu Ala 436 20 25 30 Leu Trp Ala 35 Phe Ser Phe Leu Cys 40 Lys Phe Ser Leu Ala 45 Val Leu Pro Thr Lys 50 Pro Glu Asn Ile Ser 55 Cys val Phe Tyr Phe 60 Asp Arg Asn Leu Thr Cys 65 Thr Trp Arg Pro 70 Glu Lys Glu Thr Asn Asp 75 Thr Ser Tyr Ile 80 Vai Thr Leu Thr Tyr 85 Ser Tyr Gly Lys Ser 90 Asn Tyr Ser ASp Asn Ala 95 Thr Glu Ala Ser 100 Tyr Ser Phe Pro Arg 105 Ser Cys Ala Met Pro 110 Pro Asp Ile Cys Ser 115 Vai Glu Vai Gin Ala 120 Gin Asn Gly Asp Gly 125 Lys Val Lys Ser Asp 130 Ile Thr Tyr Trp His 135 Leu Ile Ser Ile Ala 140 Lys Thr Glu Pro Pro Ile 145 Ile Leu Ser Vai 150 Asn Pro Ile Cys Asn Arg 155 Met Phe Gin Ile 160 Gin Trp Lys Pro Arg 16S Glu Lys Thr Arg Gly 170 Phe Pro Leu Val Cys Met 175 Leu Arg Phe Arg 180 Thr Vai Asn Ser Ser 18S Arg Trp Thr Glu Val 190 Asn Phe Glu Asn Cys 195 Lys Gin Vai Cys Asn 200 Leu Thr Gly Leu Gin 205 Ala Phe Thr Glu Tyr 210 Vai Leu Ala Leu Arg 215 Phe Arg Phe Asn Asp 220 Ser Arg Tyr Trp Ser Lys 225 Trp Ser Lys Glu 230 Glu Thr Arg val Thr Met 235 Glu Glu Val Pro 240 His Vai Leu Asp Leu 245 Trp Arg Ile Leu Glu 250 Pro Ala Asp Met Asn Gly 255 Asp Arg Lys Vai 260 Arg Leu Leu Trp Lys 265 Lys Ala Arg Gly Ala 270 Pro Val Leu Glu Lys 275 Thr Phe Gly Tyr His 280 Ile Gin Tyr Phe Ala 285 Glu Asn Ser Thr Asn 290 Leu Thr Glu Ile Asn 295 Asn Ile Thr Thr Gin 300 Gin Tyr Glu Leu Leu Leu 305 Met Ser Gin Ala 310 His Ser Val Ser Val Thr 315 Ser Phe Asn Ser 320 Leu Gly Lys Ser Gin 325 Glu Thr Ile Leu Arg 330 ile Pro Asp Val His Glu 335 Lys Thr Phe Gin 340 Tyr Ile Lys Ser Met 345 Gin Ala Tyr Ile Ala 350 Glu Pro Leu Leu Vai 355 Vai Asn Trp Gin Ser 360 Ser Ile Pro Ala Val 365 Asp Thr Trp Ile Vai 370 Glu Trp Leu Pro Glu 375 Ala Ala Met Ser Lys 380 Phe Pro Ala Leu Ser Trp 385 Glu Ser Vai Ser 390 Gin Vai Thr Asn Trp Thr 395 Ile Glu Gin Asp 400 Lys Leu Lys Pro Phe 405 Thr Cys Tyr Asn lie 410 Ser Val Tyr Pro Val Leu 41S Gly His Arg Vai 420 Gly Glu Pro Tyr Ser 425 Ile Gin Ala Tyr Ala 430 Lys Glu Gly Thr Pro 435 Leu Lys Gly Pro Glu 440 Thr Arg Val Glu Asn 44S Ile Gly Leu Arg Thr 450 Ala Thr Ile Thr Trp 455 Lys Glu Ile Pro Lys 460 Ser Ala Arg Asn Gly Phe 465 Ile Asn Asn Tyr 470 Thr Vai Phe Tyr Gin Ala 475 Glu Gly Gly Lys 480 Glu Leu Ser Lys Thr 485 Vai Asn Ser His Ala 490 Leu Gin Cys Asp Leu Glu 495 Ser Leu Thr Arg SOO Arg Thr Ser Tyr Thr 505 Val Trp Val Met Ala 510 Ser Thr Arg Ala Gly 51S Gly Thr Asn Gly Vai 520 Arg Ile Asn Phe Lys S25 Thr Leu Ser 437

Ile Ser 530 Vai Phe Glu lie Vai 535 Leu Leu Thr Ser Leu 540 Val Gly Gly Gly Leu 545 Leu Leu Leu Ser Ile 550 Lys Thr Vai Thr Phe 555 Gly Leu Arg Lys Pro 560 Asn Arg Leu Thr Pro 565 Leu Cys Cys Pro Asp 570 Vai Pro Asn Pro Ala 575 Glu Ser Ser Leu Ala 580 Thr Trp Leu Gly Asp Gly 585 Phe Lys Lys Ser 590 Asn Met Lys Glu Thr 595 Gly Asn Ser Gly Asn 600 Thr Glu Asp val Val 605 Leu Lys Pro Cys Pro 610 Vai Pro Ala Asp Leu 615 Ile Asp Lys Leu Val 620 Val Asn Phe Glu Asn 625 Phe Leu Glu Vai Vai 630 Leu Thr Glu Glu Ala 635 Gly Lys Gly Gin Ala 640 Ser Ser Xle Cys Leu Pro Gly Gly 660 Gly 645 His Glu Cys Ala Asn Glu Tyr 650 Ile Leu Ser Gin Glu 655 Pro <210> 128 <211> 2728 <212> ADN <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (237)...(187 <4 Ο 0> 128 438 gatggggccc tgaatgttga tctgacagaa ttccagacca acctggtggt tattgtcctt $0 ttcatctggt catgctgaat atactctcaa gatgtgctgg agaaggtgct gctgtccggg 120 ctctcagaga aggcagtgct ggaggcgttc ctggcccggg tctcctccta ctgttcctgg 180 cagcccagcc ttctcggggt ggaaggagaa gctggccagg tgagctctga ggaagc atg 239

Met 1 ctg age age cag aag gga tcc tgc age cag gaa cca ggg gea gee cac 287 Leu Ser Ser Gin 5 Lys Gly Ser Cys Ser 10 Gin Glu Pro Gly Ala 15 Ala His gtc cag cct ctg ggt gtg aac gct gga ata atg tgg acc ttg gea ctg 335 Vai Gin Pro 20 Leu Gly vai Asn Ala 25 Gly Ile Met Trp Thr 30 Leu Ala Leu tgg gea ttc tet ttc etc tgc aaa ttc age ctg gea gtc ctg ccg act 383 Trp Ala 35 Phe Ser Phe Leu Cys 40 Lys Phe Ser Leu Ala 45 Vai Leu Pro Thr aag cca gag aac att tcc tgc gtc ttt tac ttc gac aga aat ctg act 431 Lys 50 Pro Glu Asn Ile Ser 55 Cys Vai Phe Tyr Phe €0 Asp Arg Asn Leu Thr 65 tgc act tgg aga cca gag aag gaa acc aat gat acc age tac att gtg 479 Cys Thr Trp Arg Pro 70 Glu Lys Glu Thr Asn 75 Asp Thr Ser Tyr Ile 80 Vai act ttg act tac tcc tat gga aaa age aat tat agt gac aat gct aca 527 Thr Leu Thr Tyr 85 Ser Tyr Gly Lys Ser 90 Asn Tyr Ser Asp Asn 95 Ala Thr gag gct tea tat tet ttt ccc cgt tcc tgt gea atg ccc cca gac ate 575 Glu Ala Ser Tyr Ser Phe Pro Arg Ser Cys Ala Met Pro Pro Asp ile 439 100 105 110 tgc agt gtt gaa gta caa gct caa aat gga gat ggt aaa gtt aaa tet 623 Cys Ser 115 Vai Glu Vai Gin Ala 120 Gin Asn Gly Asp Gly 125 Lys Vai Lys Ser gac atC aca tat tgg cat tta ate tcc aca gea aaa acc gaa cca cct 671 Asp 130 Ile Thr Tyr Trp His 135 Leu Ile Ser ile Ala 140 Lys Thr Glu Pro Pro 145 ata att tta agt gtg aat cca att tgt aat aga atg ttc cag ata caa 719 He Ile Leu Ser Vai 150 Asn Pro Ile Cys Asn 155 Arg Met Phe Gin Ile 160 Gin tgg aaa ccg cgt gaa aag act cgt ggg ttt cct tta gta tgc atg ctt 767 Trp Lys Pro Arg 165 Glu Lys Thr Arg Gly 170 Phe Pro Leu Vai Cys 175 Met Leu cgg ttc aga act gtc aac agt age ege tgg acg gaa gtc aat ttc gaa 815 Arg Phe Arg 180 Thr Vai Asn Ser Ser 185 Arg Trp Thr Glu Vai 190 Asn Phe Glu aac tgt aaa cag gtc tgc aac ctc aca gga ctt cag gct ttc aca gaa 863 Asn Cys 195 Lys Gin Vai Cys Asn 200 Leu Thr Gly Leu Gin 205 Ala Phe Thr Glu tat gtc ctg gct cta cga ttc agg ttc aat gac tea aga tat tgg age 911 Tyr 210 Vai Leu Ala Leu Arg 215 Phe Arg Phe Asn Asp 220 Ser Arg Tyr Trp Ser 225 aag cgg age aaa gaa gaa acc aga gtg act atg gag gaa gtt cca cat 959 Lys Trp Ser Lys Glu 230 Glu Thr Arg Vai Thr 235 Met Glu Glu Vai Pro 240 His gtc ctg gac ctg tgg aga att ctg gaa cca gea gac atg aac gga gac 1007 Vai Leu Asp Leu 245 Trp Arg ile Leu Glu 250 Pro Ala Asp Met Asn 255 Gly Asp agg aag gtg cga ttg ctg tgg aag aag gea aga gga gee ccc gtc ttg 1055 Arg Lys Vai 260 Arg Leu Leu Trp Lys 265 Lys Ala Arg Gly Ala 270 Pro Vai Leu gag aaa aca ttt ggc tac cac ata cag tac ttt gea gag aac age act 1103 Glu Lys 275 Thr Phe Gly Tyr His 280 Ile Gin Tyr Phe Ala 285 Glu Asn Ser Thr aac ctc aca gag ata aac aac ate acc acc cag cag tat gaa ctg ctt 1151 Asn 290 Leu Thr Glu ile Asn 295 Asn Ile Thr Thr Gin 300 Gin Tyr Glu Leu Leu 305 ctg atg age cag gea cac tet gtg tcc gtg act tet ttt aat tet ctt 1199 Leu Met Ser Gin Ala 310 His Ser Vai Ser Vai 315 Thr Ser Phe Asn Ser 320 Leu ggc aag tcc caa gag acc ate ctg agg ate cca gat gtc cat gag aag 1247 Gly Lys Ser Gin 325 Glu Thr Ile Leu Arg 330 ile Pro Asp Vai His 335 Glu Lys acc ttc cag tac att aag age atg cag gee tac ata gee gag ccc ctg 1295 Thr Phe Gin 340 Tyr Ile Lys Ser Met 345 Gin Ala Tyr Ile Ala 350 Glu Pro Leu ttg gtg gtg aac tgg caa age tcc att cct gcg gtg gac act tgg ata 1343 440

LqU Vai 355 Vai Asn Trp Gin Ser 360 Ser Ile Pro Ala val 365 Asp Thr Trp Ile gtg gag tgg etc cca gaa gct gee atg teg aag ttc cct gee ctt tcc 1391 Vai 370 Glu Trp Leu Pro Glu 375 Ala Ala Met Ser Lys 380 Phe pro Ala Leu Ser 385 tgg gaa tet gtg tet cag gtc acg aac tgg acc ate gag caa gat aaa 1439 Trp Glu Ser val Ser 390 Gin Val Thr Asn Trp 395 Thr Ile Glu Gin Asp 400 Lys cta aaa cct ttc aca tgc tat aat ata tea gtg tat cca gtg ttg gga 1487 Leu Lys Pro Phe 405 Thr Cys Tyr Asn Xle 410 Ser Val Tyr Pro Val 415 Leu Gly cac cga gtt gga gag ccg tat tea ate caa gct tat gee aaa gaa gga 1535 His Arg Val 420 Gly Glu Pro Tyr Ser 425 Ile Gin Ala Tyr Ala 430 Lys Glu Gly act cca tta aaa ggt cct gag acc agg gtg gag aac ate ggt ctg agg 1583 Thr Pro 435 Leu Lys Gly Pro Glu 440 Thr Arg Val Glu Asn 445 Ile Gly Leu Arg aca gee acg ate aca tgg aag gag att cct aag agt gct agg aat gga 1631 Thr 450 Ala Thr Ile Thr Trp 455 Lys Glu Ile Pro Lys 460 Ser Ala Arg Asn Gly 465 ttt ate aac aat tac act gta ttt tac caa gct gaa ggt gga aaa gaa 1679 Phe lie Asn Asn Tyr 470 Thr Val Phe Tyr Gin 475 Ala Glu Gly Gly Lys 480 Glu ctc tcc ããy ãCC ytt ããC tet cat gee ctg cag tgt yãC ctg gag tet 4 «tat ± f * / Leu Ser Lys Thr 485 Val Asn Ser His Ala 490 Leu Gin Cys Asp Leu 495 Glu Ser ctg aca cga agg acc tet tat act gtt tgg gtc atg gee age acc aga 1775 Leu Thr Arg 500 Arg Thr Ser Tyr Thr 505 Val Trp Val Met Ala 510 Ser Thr Arg gct gga ggt acc aac 999 gtg aga ata aac ttc aag aca ttg tea acc 1823 Ala Gly 515 Gly Thr Asn Gly val 520 Arg Ile Asn Phe Lys 525 Thr Leu Ser Ile age gag tac tgg ctt cag gee tea ttc tgg agt tta ctt cgg gtt gga 1871 Ser 530 Glu Tyr Trp Leu Gin 535 Ala Ser Phe Trp Ser 540 Leu Leu Arg Val Gly 54S aat gtt Cgacaggagc aaggagagcc agcagagggc agcagagcat ggcttctccc 1927 Asn Vai gctctctctg gctcactcac ctcccaggag ttactgagga gctggcaaag ggagggccga 1987 gttagaccaa caggccattt tgatccttgc tggtaagcag ccacaaataa tcttaagacg 2047 aagcaagcaa catccacttc agcctcagcc acgtcaaagg ctgttgcctg agctcacact 2107 ggccagcccc taaatgtcag gagttgtgca atagaacctg ggaaggaaca actggttgat 2167 cagaggccac tgacaaggga cttaatgtta ccatctgcgg tggggctttt gtttcgtttt 2227 gtctgtttgt tatgcgtatt caacttatca gcttttacgt tgaaaacatg aaaagcaaga 2287 caaacctgcc agatatcaca tataatgtga aatataatag tttaataatt gagtaggaaa 2347 gctgagggca tgtaatagac agagggaaaa gaagaggaaa gccagtctgg tctacaaagt 2407 gagtcccagg acagccaggg ctacatggag aaaccctgtc tcaatcaatc aatcaatcaa 2467 tcaatcagtc aatcaatcaa aattcaagca gcattgacaa gttttgcaat aactactata 2527 aaccaaaaaa gtcaccttga tgtatctcag aagccccttg ttatttatgt tcctgaagac 2587 taaagtagac cgtggctctg agaaccatga gcaagataac acgttctgtc ctgcagccta 2647 441 acaatgcctt ctrtggtattc tttttgatac aacttctaaa ataacttttt cttaaaaaaa 2707 ataaaaatca tgttacagcc a 2728

<210> 129 <211> 547 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 129 442

Met 1 Leu Ser Ser Gin 5 Lys >1 O Ser Cys Ser 10 Gin Glu Pro Gly Ala 15 Ala His Vai Gin Pro 20 Leu Gly val Asn Ala 25 Gly Ile Met Trp Thr 30 Leu Ala Leu Trp Ala 35 Phe Ser Phe Leu Cys 40 Lys Phe Ser Leu Ala 45 Val Leu Pro Thr Lys 50 Pro Glu Asn Ile Ser 55 Cys Val Phe Tyr Phe 60 Asp Arg Asn Leu Thr 65 Cys Thr Trp Arg Pro 70 Glu Lys Glu Thr Asn 75 Asp Thr Ser Tyr Ile 80 Vai Thr Leu Thr Tyr 85 Ser Tyr Gly Lys Ser 90 Asn Tyr Ser Asp Asn 95 Ala Thr Glu Ala Ser 100 Tyr Ser Phe Pro Arg 105 Ser Cys Ala Met Pro 110 Pro Asp Ile Cys Ser 115 Val Glu Val Gin Ala 120 Gin Asn Gly Asp Gly 125 Lys Val Lys Ser Asp 130 Ile Thr Tyr Trp His 135 Leu Ile Ser Ile Ala 140 Lys Thr Glu Pro Pro 145 Ile Ile Leu Ser Val ISO Asn Pro Ile Cys Asn 155 Arg Met Phe Gin ile 160 Gin Trp Lys Pro Arg 165 Glu Lys Thr Arg Gly 170 Phe Pro Leu Val Cys 175 Met Leu Arg Phe Arg 180 Thr Val Asn Ser Ser 185 Arg Trp Thr Glu Val 190 Asn Phe Glu Asn Cys 195 Lys Gin Val Cys Asn 200 Leu Thr Gly Leu Gin 205 Ala Phe Thr Glu Tyr 210 Val Leu Ala Leu Arg 215 Phe Arg Phe Asn Asp 220 Ser Arg Tyr Trp Ser 225 Lys Trp Ser Lys Glu 230 Glu Thr Arg Val Thr 235 Met Glu Glu Val Pro 240 His Vai Leu Asp Leu 245 Trp Arg Ile Leu Glu 2S0 Pro Ala Asp Met Asn 255 Gly Asp Arg Lys val 260 Arg Leu Leu Trp Lys 265 Lys Ala Arg Gly Ala 270 Pro Val Leu Glu Lys 275 Thr Phe Gly Tyr His 280 Ile Gin Tyr Phe Ala 28S Glu Asn Ser Thr Asn 290 Leu Thr Glu Ile Asn 295 Asn Ile Thr Thr Gin 300 Gin Tyr Glu Leu Leu 305 Leu Met Ser Gin Ala 310 His Ser Val Ser val 315 Thr Ser Phe Asn Ser 320 Leu Gly Lys Ser Gin 325 Glu Thr Ile Leu Arg 330 Ile Pro Asp Val His 335 Glu Lys Thr Phe Gin 340 Tyr Ile Lys Ser Met 345 Gin Ala Tyr Ile Ala 350 Glu Pro Leu Leu Val 355 Val Asn Trp Gin Ser 360 Ser Ile Pro Ala Val 365 Asp Thr Trp He Val 370 Glu Trp Leu Pro Glu 375 Ala Ala Met Ser Lys 380 Phe Pro Ala Leu Ser 385 Trp Glu Ser Val Ser 390 Gin Val Thr Asn Trp 395 Thr Ile Glu Gin Asp 400 Lys Leu Lys Pro Phe 405 Thr Cys Tyr Asn Ile 410 Ser Val Tyr Pro Val 415 Leu Gly His Arg Val 420 Gly Glu Pro Tyr Ser 425 Ile Gin Ala Tyr Ala 430 Lys Glu 443 443 Arg Vai Glu Asn Ile Gly Leu 445 Ile Pro Lys Ser Ala Arg Asn 460 Tyr Gin Ala Glu Gly Gly Lys 475 480 Ala Leu Gin Cys Asp Leu Glu 490 495 Vai Trp Vai Met Ala Ser Thr 510 Ile Asn Phe Lys Thr Leu Ser 525 Phe Trp Ser Leu Leu Arg Vai 540

Gly Thr Pro Leu Lys Gly Pro Glu Thr 435 440

Arg Thr Ala Thr lie Thr Trp Lys Glu 450 455

Gly Phe Ile Asn Asn Tyr Thr Vai Phe 465 470

Glu Leu Ser Lys Thr Vai Asn Ser His 485

Ser Leu Thr Arg Arg Thr Ser Tyr Thr 500 505

Arg Ala Gly Gly Thr Asn Gly Vai Arg 515 520

Ile Ser Glu Tyr Trp Leu Gin Ala Ser 530 535

Gly Asn Vai 545

<210> 130 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC41.764 <40 0> 130

atcgaattca gaccaatggc tttctctgtg 30 <210> 131 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC41.598 <40 0> 131 acagtagtgt tctgactcag ttgg 24 <210> 132 <211> 21 444

<212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC41.948 <40 0> 132 ggtactgttc tctttgtctc g 21 <210> 133 <211> 27 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC41.766 <40 0> 133 atctctagat gtttactgtt caccttg27 <210> 134 <211> 4026 <212> ADN <213> Mus musculus <22 0> <221> CDS <222> (780)...(3692) <40 0> 134 445 ctgtggacat tttaccatgc agccataaag agaggtcaaa aatgtctttc aagtgcccgg 60 ttagtaaaga cctgacggcg tcctaaggag agaaaggaac ttggaccccc gtggacaaag 120 aattcaggtc tgtagctgaa ggaggcgtgg ccacacaggg cgtttccagg tcctgtagag 180 gaagcacagt tcatagatct ctgttctaac acgtctgtct tgctctgaac gccgaaagtc 240 aactcgatca caagtttgat ccaacagttt gacatttcag gtaattttca gacggagcgc 300 tggggttgga cctcccaagc aacacaattg gctctgtgca ggacacctgg cacggggcac 360 tgggtcgcag ctcgtcccct ctccctccag gaacaacgat gctcaaggac cagcttttcc 420 tcccaggcct ctcccacttc ccttctcacc ggtgctgccc gcccggtccc gggaaccgcg 480 cccgtcgcag ggtcccgatc gtccccccta caccccttgg gaccaggagc aaattcctgt S40 gggccccagg agtgccaaaa gtgctcagcg agacgggaaa ttgcaacagt acCtggccct 600 tcggccctcc cccggcgctt tcccgtaact cccgcccctg gacacttgtc ccgtagttga 660 ttcatagctg gggcgcgggg ccgcctccac acgcctggac agacgtccgc gcccgttccc 720 ctgtgaggcc gaggaccggc aaggctccgg agcaggtcgc caggcgggta atcagacca 779 atg Met 1 gct Ala ttc Phe tet Ser gtg Vai 5 gtc Vai ctt Leu cat His cca Pro gee Ala 10 ttc Phe ctc Leu ctg Leu gea Ala gtg Val 15 ctg Leu 827 tcc Ser ctg Leu agg Arg gea Ala 20 tcc Ser cga Arg age Ser gaa Glu gtc Val 25 ttg Leu gag Glu gag Glu cct Pro tta Leu 30 cca Pro ttg Leu 875 act Thr cct Pro gag Glu 35 ata Xle cat His aaa Lys gtt Vai tcc Ser 40 ttt Phe caa Gin ttg Leu aaa Lys ctt Leu 45 caa Gin gaa Glu gtg val 923 aat Asn tta Leu e a JW gaa Glu tgg Trp act Thr gtc Vai cca Pro 55 gee Ala ctt Leu act Thr cat His gaa Glu íT λ QU gaa Glu tta Leu aac Asn atg Ket 971 ata lie 65 ttt Phe cag Gin ata Ile gag Glu ate Ile 70 agt Ser aga Arg ctg Leu aac Asn ata Ile 75 tcc Ser aac Asn acc Thr ate Ile tgg Trp 80 1019 gtg Vai gag Glu aat Asn tat Tyr age Ser 85 acc Thr act Thr gtg Vai aag Lys cgt Arg 90 gaa Glu gaa Glu gct Ala gtg Val cgt Arg 95 tgg Trp 1067 aac Asn tgg Trp acg Thr tet Ser 100 gat Asp ate Ile cct Pro ttg Leu gag Glu 105 tgt Cys gtc Val aaa Lys cat His ttc Phe 110 ata Ile aga Arg 1115 ate Ile agg Arg gct Ala 115 ctg Leu gta Vai gat Asp gac Asp acc Thr 120 aag Lys tcc Ser ctt Léu cca Pro cag Gin 125 agt Ser tcc Ser tgg Trp 1163 ggc Gly aac Asn 130 tgg Trp agt Ser tcc Ser tgg Trp aaa Lys 135 gaa Glu gtt Val aat Asn gea Ala aag Lys 140 gtt Val tcc Ser gtt Val gaa Glu 1211 cet Pro 145 gat Asp aaa Lys tea Ser tta Leu ata Ile 150 ttt Phe cct Pro aaa Lys gac Asp aaa Lys 155 gtg val ttg Leu gaa Glu gaa Glu ggc Gly 160 1259 tcc aat gtc acc ate tgt ctg atg tat ggg cag aat gta tat aat gta 1307 446

Ser Asn val Thr He 165 Cys Leu Met Tyr Gly 170 Gin Asn Val Tyr Asn 175 Val tcc tgt aag ttg caa gat gag cca ate cat gga gaa caa ctt gat tcc 1355 Ser Cys Lys Leu 180 Gin Asp Glu Pro Ile 185 His Gly Glu Gin Leu 190 Asp Ser cac gtg tca tta tta aaa ttg aac aat gta gct ttc ctt agt gac aca 1403 His Vai Ser 195 Leu Leu Lys Leu Asn 200 Asn Val Val Phe Leu 205 Ser Asp Thr ggg aca aac ate aat tgt caa gee acg aag ggt cct aaa aga ata ttt 1451 Gly Thr 210 Asn Ile Asn Cys Gin 215 Ala Thr Lys Gly Pro 220 Lys Arg Ile Phe ggt act gtt ctc ttt gtc teg aaa gtg ctc gag gaa cct aag aat gtt 1499 Gly Thr 225 Val Leu Phe Val 230 Ser Lys Val Leu Glu 235 Glu Pro Lys Asn Val 240 tcc tgt gaa acc cga gac ttt aag act ttg gac tgt tca tgg gaa cct 1547 Ser Cys Glu Thr Arg 245 Asp Phe Lys Thr Leu 250 Asp Cys Ser Trp Glu 255 Pro ggg gta gat acg act ttg act tgg cgt aaa caa aga ttc caa aac tac 1595. Gly Vai Asp Thr 260 Thr Leu Thr Trp Arg 265 Lys Gin Arg Phe Gin 270 Asn Tyr act tta tgt gaa teg ttc tet aag aga tgt gag gtt tet aac tac agg 1643 Thr Leu Cys 275 Glu Ser Phe Ser Lys 280 Arg Cys Glu Val Ser 285 Asn Tyr Arg aac tcc tat acc tgg caa ate act gaa ggc tca cag gaa atg tat aac 1691 Asn Ser 290 Tyr Thr Trp Gin Ile 295 Thr Glu Gly Ser Gin 300 Glu Met Tyr Asn ttt act ctc aca gct gaa aac caa cta agg aaa aga agt gtc aac att 1739 Phe Thr 305 Leu Thr Ala Glu 310 Asn Gin Leu Arg Lys 315 Arg Ser Val Asn Ile 320 aat ttt aac ctg acc cat aga gtt cat cca aag gct ccg cag gac gtc 1787 Asn Phe Asn Leu Thr 325 His Arg Val His Pro 330 Lys Ala Pro Gin Asp 335 Val acc ctt aaa att ata ggt gct aca aaa gee aac atg act tgg aag gtt 1835 Thr Leu Lys Ile 340 Ile Gly Ala Thr Lys 345 Ala Asn Met Thr Trp 350 Lys Val cac tcc cat gga aac aac tac aca ctt ttg tgt cag gtt aaa ctc caa 1883 His Ser His 355 Gly Asn Asn Tyr Thr 360 Leu Leu Cys Gin Val 365 Lys Leu Gin tat gga gaa gtg att cat gag cac aat gtt tet gtc cac atg age gea 1931 Tyr Gly 370 Glu Val Ile His Glu 375 His Asn val Ser Val 380 His Met Ser Ala aac tac ctc ttc agt gat ctg gat cca gac aca aag tac aag gct ttt 1979 Asn Tyr 38S Leu Phe Ser Asp 390 Leu Asp Pro Asp Thr 395 Lys Tyr Lys Ala Phe 400 gtg cgc tgt gea agt gee aac cac ttc tgg aaa tgg age gac tgg acc 2027 Vai Arg Cys Ala Ser 405 Ala Asn His phe Trp 410 Lys Trp Ser Asp Trp 415 Thr 447 caa aaa gag ttc age aca ccc gag act gct ccc tea cag gct ctt gat 2075 Gin Lys Glu Phe 420 Ser Thr Pro Glu Thr 425 Ala Pro Ser Gin Ala 430 Leu Asp gta tgg aga caa gtg tgg teg gag aat gga aga ege att gtg act tta 2123 Vai Trp Arg 43S Gin Val Trp Ser Glu 440 Asn Gly Arg Arg Ile 445 Val Thr Leu Ctc tgg aag cca cta tta aaa tea cag gee aat ggc aaa ate ata ccc 2171 Phe Trp 450 Lys Pro Leu Leu Lys 455 Ser Gin Ala Asn Gly 460 Lys Ile Ile Ser tat aat ata gtt gta gaa aat gaa gee aaa cca act gag tea gaa cac 2219 Tyr 465 Asn Tle Val Val Glu 470 Asn Glu Ala Lys Pro 475 Thr Glu Ser Glu His 480 tac tgt gtc tgg gea cca gee ctc age aca aac ctg age ctt gac ctg 2267 Tyr Cys Vai Trp Ala 485 Pro Ala Leu Ser Thr 490 Asn Leu Ser Leu Asp 495 Leu caa cct tac aag att ege ate aca gee aac aac age atg ggg gea tcc 2315 Gin Pro Tyr Lys 500 Ile Arg Ile Thr Ala 505 Asn Asn Ser Met Gly 510 Ala Ser cct gag tcc ttg atg gtc ctt tet aat gat tet gga cac gag gtc aag 2363 Pro Glu Ser 515 Leu Met Val Leu Ser 520 Asn Asp Ser Gly His 525 Glu Val Lys gaa aag aca att aaa ggt ata aag gat gea ttc aat att tet tgg gag 2411 Glu Lys 530 Thr Ile Lys Gly Ile 535 Lys Asp Ala Phe Asn 540 ile Ser Trp Glu ccc gta tet gga gac acg atg ggc tat gtt gtg gac tgg tgt gea cat 2459 Pro 545 Vai Ser Gly Asp Thr 550 Met Gly Tyr Val Val 555 Asp Trp Cys Ala His 560 tcc cag gac caa ege tgt gat ttg cag tgg aag aac ctt ggt ccc aat 2507 Ser Gin Asp Gin Arg 565 Cys Asp Leu Gin Trp 570 Lys Asn Leu Gly Pro 575 Asn acc aca age acc acc ate acc tea gat gat ttt aaa cca ggc gtc cgt 2555 Thr Thr Ser Thr 580 Thr Ile Thr Ser Asp 585 ASp Phe Lys Pro Gly 590 Val Arg tac aac ttc aga att ttt gaa agg tet gtg gaa cac aaa gct cgg tta 2603 Tyr Asn Phe 595 Arg Ile Phe Glu Arg 600 Ser Val Glu His Lys 605 Ala Arg Leu gta gag aaa caa aga gga tac acc cag gaa ctg gct cct ttg gtg aat 2651 Vai Glu 610 Lys Gin Arg Gly Tyr 615 Thr Gin Glu Leu Ala 620 Pro Leu Val Asn cca aaa gtg gag att cct tac teg acc cct aac tcc ttc gtt cta aga 2699 Pro 625 Lys Vai Glu Ile Pro 630 Tyr Ser Thr Pro Asn 635 Ser Phe Val Leu Arg 640 tgg cca gat tat gac age gac ttc cag gct ggc ttt ata aaa 999 tac 2747 Trp Pro Asp Tyr Asp 645 Ser Asp Phe Gin Ala 650 Gly Phe Ile Lys Gly 655 Tyr ctc gtg tat gtg aaa tcc aag gag atg cag tgc aac caa ccc tgg gaa 2795 Leu Vai Tyr Val 660 Lys Ser Lys Glu Met 665 Gin Cys Asn Gin Pro 670 Trp Glu 448 agg acc ctc ctt cca gat aat tca gtc ctc tgt aaa tac gac ate aat 2843 Arg Thr Leu 675 Leu Pro Asp Asn Ser 680 Val Leu Cys Lys Tyr 685 Asp ile Asn 99c tca gag aca aag aca ctc acc gtg gaa aac ctt cag cca gag tcc 2891 Gly Ser 690 Glu Thr Lys Thr Leu 695 Thr val Glu Asn Leu 700 Gin Pro Glu Ser ctc tat 9ag ttt ttc gtc act ccg tac acc age gct ggc cca gga ccc 2939 Leu 705 Tyr Glu Phe Phe Val 710 Thr Pro Tyr Thr Ser 715 Ala Gly Pro Gly Pro 720 aat gaa acg ttc aca aag gtc aca act cca gat gea ege tcc cac atg 2987 Asn Glu Thr Phe Thr 725 Lys Val Thr Thr Pro 730 Asp Ala Arg Ser His 735 Met ctg ctg cag ate ata cta ccc atg acc ctc tgc gtc ttg ctc age ate 3035 Leu Leu Gin Ile 740 Ile Leu Pro Met Thr 745 Leu Cys Val Leu Leu 750 Ser Ile att gtc tgc tac tgg aaa agt cag tgg gtg aag gag aag tgc tac cct 3083 ile Val Cys 755 Tyr Trp Lys Ser Gin 760 Trp Val Lys Glu Lys 76S Cys Tyr Pro gac att ccc aat ccg tac aag age age att ctg tca ctc ata aaa tcc 3131 Asp ile 770 Pro Asn Pro Tyr Lys 775 Ser Ser Ile Leu Ser 780 Leu Ile Lys Ser aag aag aat cct cac tta ata atg aat gtc aaa gac tgc att cca gat 3179 Lys 785 Lys Asn Pro His Leu 790 Ile Het Asn val Lys 795 Asp Cys Ile pro Asp 800 gtc ctt gaa gtg ata aac aaa gea gaa ggc age aag aca cag tgt gta 3227 Val Leu Glu Val Ile 805 Asn Lys Ala Glu Gly 810 Ser Lys Thr Gin Cys 815 Val ggc tct 999 aaa Ctt cac att gaa gat gta ccc act aag ccg cca ate 3275 Gly Ser Gly Lys 820 Leu His Ile Glu A$p 825 Val Pro Thr Lys Pro 830 Pro Ile gcg cca aca gaa aag gat tcc tca ggg cct gtg ccc tgc ate ttc ttt 3323 Val Pro Thr 835 Glu Lys Asp Ser Ser 840 Gly Pro Val Pro Cys 845 Ile Phe Phe gag aat ttt act tac gat cag tca gct ttt gac tct ggt tcc cat ggc 3371 Glu Asn 850 Phe Thr Tyr Asp Gin 855 Ser Ala Phe Asp Ser 860 Gly Ser His Gly ctc att cca 991 ccc cta aaa gac aca gea cac caa ctt gga cta ttg 3419 Leu 865 Ile Pro Gly Pro Leu 870 Lys Asp Thr Ala His 875 Gin Leu Gly Leu Leu 880 gct cca cct aac aag ttc cag aac gta tta aaa aat gac tac atg aag 3467 Ala Pro Pro Asn Lys 885 Phe Gin Asn Val Leu 890 Lys Asn Asp Tyr Met 895 Lys ccc ctg gtc gaa agt cca act gaa gaa act age ttg att tat gtg tca 3515 Pro Leu Val Glu 900 Ser Pro Thr Glu Glu 905 Thr Ser Leu Ile Tyr 910 val Ser cag ctg gct tca ccc atg tgc gga gac aag gac acg ctt gee aca gaa 3563 Gin Leu Ala Ser Pro Met Cys Gly Asp Lys Asp Thr Leu Ala Thr Glu 449 915 920 925 cca ccc gtg cca gtg Cât ggt tca gag tat aaa agg caa atg gta gtt 3611 Pro Pro 930 val Pro Val HÍS Gly 935 Ser Glu Tyr Lys Arg 940 Gin Met Val Val ccc 009 age ccc gea tca cct tet ctg aag gag gat aac age ctg acc 3659 Pro 945 Gly Ser Leu Ala Ser 950 Pro Ser Leu Lys Glu 955 Asp Asn Ser Leu Thr 960 tca Ser acg Thr gee Val ccc Leu tta Leu 965 ggc Gly caa Gin ggt Gly gaa Glu cag Gin 970 caa * acaccacgca gcacaaataa 3712 atgcactcca cacactatag gcactttggg agatgtagct gctaccatgc caacaccacg 3772 tgccctggtt ggttccaggg gtgggggttg aggggagact cattatctgc agtgctgatt 3832 tatcaacgat cactacagac caacagactt aaggaccata taatatggtg ttcaccctga 3892 aggcgttccc tagaaatggc agatccgaga gcatgctgac cttgctatta tctggtccag 3952 gctcaccctt aCtgcagtag cttgacatag ggtgtacacc agtcatttcg cagagcctac 4012 ctactcaaaa ctac 4026

<210> 135 <211> 970 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 135 450

Mec Ala 1 Phe Ser Vai 5 Vai Leu His Pro Ala 10 Phe Leu Leu Ala Val 15 Leu Ser Leu Arg Ala 20 Ser Arg Ser Glu Val 25 Leu Glu Glu Pro Leu 30 Pro Leu Thr Pro Glu 35 Ile His Lys Vai Ser 40 Phe Gin Leu Lys Leu 45 Gin Glu Val Asn Leu 50 Glu Trp Thr Vai Pro 55 Ala Leu Thr His Glu 60 Glu Leu Asn Met Ile Phe 65 Gin Ile Glu Ile 70 Ser Arg Leu Asn Ile 75 Ser Asn Thr Ile Trp 80 Vai Glu Asn Tyr Ser 85 Thr Thr Vai Lys Arg 90 Glu Glu Ala Val Arg 9S Trp Asn Trp Thr Ser 100 Asp Ile Pro Leu Glu 105 Cys val Lys His Phe 110 Ile Arg Ile Arg Ala 115 Leu Vai Asp Asp Thr 120 Lys Ser Leu Pro Gin 125 Ser Ser Trp Gly Asn 130 Trp Ser Ser Trp Lys 135 Glu Val Asn Ala Lys 140 Val Ser Val Glu Pro Asp 145 Lys Ser Leu Ile 150 Phe Pro Lys Asp Lys 155 Val Leu Glu Glu Gly 160 Ser Asn Vai Thr Ile 165 Cys Leu Met Tyr Gly 170 Gin Asn Val Tyr Asn 175 Val Ser Cys Lys Leu 180 Gin Asp Glu Pro Ile 185 His Gly Glu Gin Leu 190 Asp Ser His vai Ser 195 Leu Leu Lys Leu Asn 200 Asn Val Val Phe Leu 205 Ser Asp Thr Gly Thr 210 Asn Ile Asn Cys Gin 215 Ala Thr Lys Gly Pro 220 Lys Arg Ile Phe Gly Thr 225 Vai Leu Phe Vai 230 Ser Lys Val Leu Glu 235 Glu Pro Lys Asn Val 240 Ser Cys Glu Thr Arg 245 ASp Phe Lys Thr Leu 250 Asp Cys Ser Trp Glu 255 Pro Gly Vai Asp Thr 260 Thr Leu Thr Trp Arg 265 Lys Gin Arg Phe Gin 270 Asn Tyr Thr Leu Cys 275 Glu Ser Phe Ser Lys 280 Arg Cys Glu Val Ser 285 Asn Tyr Arg 451

Asn Ser 290 Tyr Thr Trp Gin Ile 295 Thr Glu Gly Ser Gin 300 Glu Met Tyr Asn Phe 305 Thr Leu Thr Ala Glu 310 Asn Gin Leu Arg Lys 31S Arg Ser Vai Asn Ile 320 Asn Phe Asn Leu Thr 325 His Arg Vai His Pro 330 Lys Ala Pro Gin Asp 335 Vai Thr Leu Lys Ile 340 Ile Gly Ala Thr Lys 345 Ala Asn Met Thr Trp 350 Lys Vai His Ser His 355 Gly Asn Asn Tyr Thr 360 Leu Leu Cys Gin Vai 365 Lys Leu Gin Tyr Gly 370 Glu Vai Ile His Glu 375 His Asn Vai Ser Vai 380 His Met Ser Ala Asn 385 Tyr Leu Phe Ser Asp 390 Leu Asp Pro Asp Thr 395 Lys Tyr Lys Ala Phe 400 Vai Arg Cys Ala Ser 405 Ala Asn HiS Phe Trp 410 Lys Trp Ser Asp Trp 415 Thr Gin Lys Glu Phe 420 Ser Thr Pro Glu Thr 425 Ala Pro Ser Gin Ala 430 Leu Asp Vai Trp Arg 435 Gin Vai Txp Ser Glu 440 Asn Gly Arg Arg Ile 445 vai Thr Leu Phe Trp 450 Lys Pro Leu Leu Lys 455 Ser Gin Ala Asn Gly 460 Lys Ile Ile Ser Tyr 465 Asn Ile Vai Vai Glu 470 Asn Glu Ala Lys Pro 475 Thr Glu Ser Glu His 480 Tyr Cys Vai Trp Ala 485 Pro Ala Leu Ser Thr 490 Asn Leu Ser Leu Asp 495 Leu Gin Pro Tyr Lys 500 Ile Arg Ile Thr Ala 505 Asn Asn Ser Met Gly 510 Ala Ser Pro Glu Ser 515 Leu Mec Vai Leu Ser 520 Asn Asp Ser Gly His 525 Glu Vai Lys Glu Lys 530 Thr Ile Lys Gly He 535 Lys Asp Ala Phe Asn 540 Ile Ser Trp Glu Pro 545 Vai Ser Gly Asp Thr 550 Met Gly Tyr Vai Vai 555 Asp Trp Cys Ala His 560 Ser Gin Asp Gin Arg 565 Cys Asp Leu Gin Trp 570 Lys Asn Leu Gly Pro 575 Asn Thr Thr Ser Thr 580 Thr Ile Thr Ser Asp 585 Asp Phe Lys Pro Gly 590 Vai Arg Tyr Asn Phe 595 Arg Ile Phe Glu Arg 600 Ser Vai Glu His Lys 605 Ala Arg Leu Vai Glu 610 Lys Gin Arg Gly Tyr 615 Thr Gin Glu Leu Ala 620 Pro Leu Vai Asn Pro 625 Lys Vai Glu ile Pro 630 Tyr Ser Thr Pro Asn 635 Ser phe Vai Leu Arg 640 Trp Pro Asp Tyr Asp 645 Ser Asp Phe Gin Ala 650 Gly Phe Ile Lys Gly 655 Tyr Leu Vai Tyr Vai 660 Lys Ser Lys Glu Met 665 Gin Cys Asn Gin Pro 670 Trp Glu Arg Thr Leu 675 Leu Pro Asp Asn Ser 680 Vai Leu Cys Lys Tyr 68S Asp Ile Asn Gly Ser 690 Glu Thr Lys Thr Leu 695 Thr Vai Glu Asn Leu 700 Gin Pro Glu Ser Leu 705 Tyr Glu Phe Phe Vai 710 Thr Pro Tyr Thr Ser 715 Ala Gly Pro Gly Pro 720 Asn Glu Thr Phe Thr 725 Lys Vai Thr Thr Pro 730 Asp Ala Arg Ser His 735 Met Leu Leu Gin Ile 740 Ile Leu Pro Met Thr 745 Leu Cys Vai Leu Leu 750 Ser Ile Ile Vai Cys 755 Tyr Trp Lys Ser Gin 760 Trp Vai Lys Glu Lys 765 Cys Tyr Pro Asp lie 770 Pro Asn Pro Tyr Lys 775 Ser Ser Ile Leu Ser 780 Leu Ile Lys Ser Lys Lys Asn Pro His Leu Ile Mec Asn Vai Lys Asp Cys Ile Pro Asp 452 785 790 795 800 Vai Leu Glu Val Ile Asn Lys Ala Glu Gly Ser Lys Thr Gin Cys Val 805 810 815 Gly Ser Gly Lys Leu His Ile Glu Asp Val Pro Thr Lys Pro Pro ile 820 825 830 Vai Pro Thr Glu Lys Asp Ser Ser Gly Pro val Pro Cys Ile Phe Phe 835 840 845 Glu Asn Phe Thr Tyr Asp Gin Ser Ala Phe Asp Ser Gly Ser His Gly 850 855 860 Leu Ile Pro Gly Pro Leu Lys Asp Thr Ala His Gin Leu Gly Leu Leu 865 870 875 880 Ala Pro Pro Asn Lys Phe Gin Asn val Leu Lys Asn Asp Tyr Met Lys 885 890 89S Pro Leu Vai Glu Ser Pro Thr Glu Glu Thr Ser Leu Ile Tyr Val Ser 900 905 910 Gin Leu Ala Ser Pro Met Cys Gly ASp Lys Asp Thr Leu Ala Thr Glu 915 920 925 Pro Pro Vai Pro val His Gly Ser Glu Tyr Lys Arg Gin Het Val Val 930 935 940 Pro Gly Ser Leu Ala Ser Pro Ser Leu Lys Glu Asp Asn Ser Leu Thr 945 950 955 960 Ser Thr Val Leu Leu Gly Gin Gly Glu Gin 965 970

<210> 136 <211> 2910 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> sequência polinucleotidica degenerada que codifica o polipéptido da SEQ ID N°: 135. <221> misc_feature <222> (1) .. (2910) <223> n = A, T, G ou C <400> 136 453 atggcnttyw sngtngtnyt ncayccngcn ttyytnytng cngtnytnws nytnmgngcn 60 wsnntgnwsng argtnytnga rgarccnytn ccnytnacnc cngarathca yaargtnwsn 120 ttycarytna arytncarga rgtnaayytn gartggacng tnccngcnyt nacncaygar 180 garycnaaya tgathttyca rathgarath wsnmgnytna ayathwsnaa yacnathtgg 240 gtngaraayt aywsnacnac ngcnaarmgn gargargcng tiungntggaa ytggacnwsn 300 gayathccny tngartgygt naarcaytty athmgnachm gngcnytngt ngaygayacn 360 aarwsnytnc cncarwsnws ntggggnaay tggwsnwsnt ggaargargt naaygcnaar 420 gtnwsngtng arccngayaa rwsnytnath ttyccnaarg ayaargtnyt ngargarggn 480 wsnaaygtna cnathcgyyc natgtayggn caraaygtnt ayaaygtnws ntgyaarytn 540 cargaygarc cnathcaygg ngarcarytn gaywsncayg tnwsnytnyt naarytnaay 600 aaygtngtnt tyytnwsnga yacnggnacn aayathaayt gycargenac naarggnccn 660 aanognatht tyggnacngc nytnttygtn wsnaargtny tngargarcc naaraaygtn 720 wsntgygara cnmgngaytt yaaracnytn gaytgywsnt gggarccngg ngtngayacn 780 acnytnacnt ggingnaarca nngnttycar aaytayacny tntgygarws nttywsnaar 840 mgntgygarg tnwsnaayta ymgnaaywsn tayacntggc arathacnga rggnwsncar 900 garatgtaya ayttyacnyt nacngcngar aaycarytnro gnaarmgnws ngtnaayach 960 aayttyaayy cnacncaymg ngtncayccn aargcnccnc argaygtnac nytnaarath 1020 athggngcna cnaargcnaa yatgacntgg aargtncayw sncayggnaa yaaytayacn 1080 ytnytntgyc argtnaaryt ncartayggn gargtnathc aygarcayaa ygtnwsngtn 1140 cayatgwsng cnaaytayyt nttywsngay ytngayccng ayacnaarta yaargcntty 1200 gtiungntgyg cnwsngcnaa ycayttytgg aarcgçfwsng aytggacnca raargartty 1260 wsnacnccng aracngcncc nwsncargcn ytngaygtnt ggmgncargt ntggwsngar 1320 aayggnxngnm gnathgtnac nytnttytgg aarccnytny tnaarwsnca rgcnaayggn 1380 aarathathw sntayaayat hgtngtngar aaygargcna arccnacnga rwsngarcay 1440 taytgygtnt gggcnccngc nytnwsnacn aayytnwsny tngayytnca rccntayaar 1500 athmgnatha cngcnaayaa ywsnatgggn gcnwsnccng arwsnytnat ggtnytnwsn 1560 aaygaywsng gncaygargt naargaraar acnathaarg gnathaarga ygcnttyaay 1620 achwsntggg arccngtnws nggngayacn atgggntayg tngtngaytg gtgygcncay 1680 wsncargayc armgntgyga yytncartgg aaraayytng gnccnaayac nacnwsnacn 1740 acnathacnw sngaygaytt yaarccnggn gcnmgntaya ayttymgnac httygarrogn 1800 wsngtngarc ayaargcnng nytngtngar aarcarmgng gntayacnca rgarytngcn 1860 ccnytngcna ayccnaargt ngarathccn taywsnacnc cnaaywsntt ygtnytnmgn 1920 tggccngayt aygaywsnga yttycargcn ggnttyatha arggntayyt ngtntaygtn 1980 aarwsnaarg aratgcartg yaaycarccn tgggarmgna cnytnytncc ngayaaywsn 2040 gtnytntgya artaygayat haayggnwsn garacnaara cnytnacngt ngaraayytn 2100 carccngarw snytntayga rttyttygtn acnccntaya cnwsngcngg nccnggnccn 2160 aaygaracnt tyacnaargt nacnacnccn gaygcnmgnw sncayatgyt nytncarath 2220 athytnccna tgacnytntg ygtnytnytn wsnathathg tncgytaytg gaarwsncar 2280 tgggtnaarg araartgyta yccngayath ccnaayccnt ayaarwsnws nathytnwsn 2340 ycnathaarw snaaraaraa yccncayytn achacgaayg tnaargaytg yachccngay 2400 gtnytngarg tnachaayaa rgcngarggn wsnaaracnc artgygtngg nwsnggnaar 2460 ytncayaL·hg argaygtncc nacnaarccn ccnathgtnc cnacngaraa rgaywsnwsn 2520 ggnccngtnc cntgyathct yttygaraay ttyacntayg aycarwsngc nttygaywsn 2580 ggnwsncayg gnytnathcc nggnccnytn aargayacng cncaycaryt nggnytnytn 2640 gcnccnccna ayaarttyca raaygtnytn aaraaygayt ayatgaarcc nytngtngar 2700 wsnccnacng argaracnws nytnathtay gtnwsncary tngcnwsncc natgtgyggn 2760 gayaargaya cnytngcnac ngarccnccn gtnccngtnc ayggnwsnga rtayaarntgn 2820 caratggtng tnccnggnws nytngcnwsn ccnwsnytna argargayaa ywsnytnacn 2880 wsnacngtny tnytnggnca rggngarcar 2910

<210> 137 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência artificial 454 <22 0> <223> Iniciador ZC43891 <40 0> 137 gggcagtagg atatgaatca gcat <210> 138 <211> 19 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador ZC43900 <40 0> 138 gaaggcccca gtgctacgt 19

<210> 139 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sonda ZC43896de OSMRbeta <40 0> 139 tcatccggag tcgtgacctt cgtg 24 <210> 140 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador ZC43280 455 <40 0> 140 gagcacgccc ttctcttcct 20 <210> 141 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador ZC43281 <40 0> 141 cgttgcccgt ccgtttacta 20

<210> 142 <211> 40 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sonda ZC43275 de zcytorl71ig <40 0> 142 ctgtaattcc tcgactattt tctgtacatc atcacttggt 40 <210> 143 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador ZC40574 <40 0> 143 456 ctcatttgga attttgccga tt 22

<210> 144 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador ZC40575 <40 0> 144 ccgagtgaag atcccctttt ta 22

<210> 145 <211> 26 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sonda ZC43017 de GUS <40 0> 145 tgaacagtca ccgacgagag tgctgg 26

<210> 146 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador ZC28480 <40 0> 146 cgattcagga cagtcaacag tacc 24 457 <210> 147 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador ZC41653 <40 0> 147 ccttcgtgaa cgtagcactg g 21 <210> 148 <211> 19 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador ZC41655 <40 0> 148 ctgaaatcca aggcgaggc 19 <210> 149 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador ZC41703 <40 0> 149 tgaagctggc cttgctctct 20 <210> 150 <211> 19 458 <212> ADN <213> Sequência art if icial <22 0> <223> Iniciador ZC417 04 <40 0> 150 gagatatgcc cggatggct 19 <210> 151 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência art if icial <22 0> <223> Iniciador ZC432 72 <40 0> 151 gctggtatca ttggtttcct tctc <210> 152 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência art if icial <22 0> <223> Iniciador ZC432 73 <40 0> 152 cattctcttt cctctgcaaa ttca <210> 153 <211> 34 <212> ADN <213> Sequência art if icial 459 <22 0> <223> sonda ZC43478 de zcytorl7 <40 0> 153 tagagaacat ttcctgcgtc ttttacttcg acag 34 <210> 154 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador ZC43278 <40 0> 154 aaacaagagt ctcaggatct ttataacaac 30 <210> 155 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador ZC43279 <40 0> 155 acggcagctg tattgattcg t 21 <210> 156 <211> 26 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> 460 <223> sonda ZC43276 de zcytorl71ig <40 0> 156 taaagcaggc atctgggatg tcagca 26 <210> 157 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador ZC43045 <40 0> 157 aaacatgata tttcagatag agatcagtag <210> 158 <211> 26 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador ZC43046 <40 0> 158 cttatgaaat gtttgacaca ctccaa 26 <210> 159 <211> 29 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sonda ZC43141 de OSMRbeta 461 <40 0> 159 ctgtgcgttg gaactggacg tctgatatc 29 <210> 160 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência artifici al <22 0> <223> Iniciador ZC43004 <40 0> 160 gaaacccgcc gcatattact t 21 <210> 161 <211> 19 <212> ADN <213> Sequência artifici al <22 0> <223> Iniciador ZC43005 <40 0> 161 tggcgttgct cacaaaggt 19 <210> 162 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência artifici al <22 0> <223> sonda ZC43018 de GUS murino acccacacca aagccctgga cctc 462 <210> 163 <211> 23 <212> ADN. <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador ZC40269 <40 0> 163 gccagtttca cacactcctc ttt <210> 164 <211> 26 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador ZC40268 <40 0> 164 gcagctattg cactagtcat tttctt 26

<210> 165 <211> 29 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sonda ZC40298 do receptor de transferrina <40 0> 165 cccaggtagc cactcatgaa tccaatcaa 29 <210> 166 463 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador ZC43140 <40 0> 16 6 ttcttccaca gcaatcgcac 20 <210> 167 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador ZC43139 <40 0> 167 atgcatgctt cggttcagaa c 21 <210> 168 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador ZC41608 <40 0> 168 gcagacaatg atgctgagca agac 24

<210> 169 <211> 24 <212> ADN 464 <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador ZC41609 <40 0> 169 caacgctgtg atttgcagtg gaag <210> 170 <211> 18 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador ZC41502 <40 0> 170 agcgggcctt cctcactc 18 <210> 171 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador ZC41500 <40 0> 171 ggacaaaata aaaacataaa taac <210> 172 <211> 40 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> 465 <223> Ligante <40 0> 172 tgtcgatgaa gccctgaaag acgcgcagac taattcgagc 40 <210> 173 <211> 60 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Ligante <40 0> 173 cgcgaattcg acgcgcagac taattcgagc tcccaccatc accatcacca gtaccgctgg 60 <210> 174 <211> 60 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Ligante <40 0> 174 ccagcggtac actcactata gggcgaattg cccgggggat ccacgcggaa cgaattcgcg 60

<210> 175 <211> 42 <212> ADN <213> Seguência artificial <22 0> 46 6 <223> Ligante <40 0> 175 acggccagtg aattgtaata cgactcacta tagggcgaat tg 42

<210> 176 <211> 825 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0>

<221> CDS <222> (48)...(518) <40 0> 176 467 ateaetctet ttaatcacta ctcacattaa cctcaactcc tgccaca atg tac agg 56

Met Tyr Axg 1 aatcttatac ttattgctga 598 taaaactata aatatggatc 658 gtttacctta tttatcccaa 718 tgtagattgg ttagtaaaac 778 aaaaaaa 825 aaaacatatc aggccttcta atgtatggtt gctacctatc ttttatgatt ctttttgtaa aaatatttat tattatgctg tatttaataa atttgataaa tttatttatt taaatattta gtaactatta ttcttaatcc gccctagggg ctctaaaatg aatgttaaat atagtatcta tataaaaaaa aaaaacaaaa atg Met caa Gin 5 ctc Leu ctg Leu tet Ser tgc Cys att Ile 10 gca Ala cta Leu att Ile ctt Leu gca Ala 15 ctt Leu gtc Val aca Thr aac Asn 104 agt Ser 20 gca Ala cct Pro act Thr tea Ser agt Ser 25 teg Ser aca Thr aag Lys aaa Lys aca Thr 30 aag Lys aaa Lys aca Thr cag Gin cta Leu 35 152 caa Gin ctg Leu gag Glu cat His tta Leu 40 Ctg Leu ctg Leu gat Asp tta Leu cag Gin 45 atg Het att Ile ttg Leu aat Asn gga Gly SO att Ile 200 aat Asn aat Asn tac Tyr aag Lys 55 aat Asn CCC Pro aaa Lys ctc Leu acc Thr 60 agg Arg atg Met ctc Leu aca Thr ttt Phe 65 aag Lyç ttt Phe 248 tac Tyr atg Met ccc Pro 70 aag Lys aag Lys gee Ala aca Thr gaa Glu 75 ctg Leu aaa Lys cag Gin ctt Leu cag Gin 80 tgt Cys cta Leu gaa Glu 296 gaa Glu gaa Glu 85 ctc Leu aaa Lys cct Pro ctg Leu gag Glu 90 gaa Glu gtg Val ctg Leu aat Asn tta Leu 95 gct Ala caa Gin age Ser aaa Lys 344 aac Asn 100 ttt Phe cac His tta Leu aga Arg ccc Pro 105 agg Arg gac Asp tta Leu ate Ile age Ser 110 aat Asn ate Ile aac Asn gta Val ata Ile 115 392 gtt Vai ctg Leu gaa Glu cta Leu aag Lys 120 gga Gly tet Ser gaa Glu aca Thr aca Thr 125 ttc Phe atg Met tgt Cys gaa Glu tat Tyr 130 gca Ala 440 gat gag aca gca acc att gta gaa ttt ctg aac aga tgg att acc ttt 488 Asp Glu Thr Ala 135 Thr Ile Vai Glu Phe 140 Leu Asn Arg Trp Ile 145 Thr Phe tgt Cys caa Gin age Ser 150 ate lie ate Ile tea Ser aca Thr cta Leu 155 act Thr tga * taattaagtg < cttcccactt 538

<210> 177 <211> 156 <212> PRT 468 <213> Homo sapiens <40 0> 177

Met Tyr Arg Met Gin Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu lie Leu Ala Leu 1 5 10 15 Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Lys Lys 20 25 30 Thr Gin Leu Gin Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gin Met Ile Leu 35 40 45 Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr 50 55 60 Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys Gin Leu Gin 65 70 75 80 Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala 85 90 95 Gin Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile 100 105 110 Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys 115 120 .125 Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp 130 135 140 Ile Thr Phe Cys Gin Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr 145 150 155 <210> 178 <211> 614 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (64)...(525) <400> 178 469 gatcgttagc ttctcctgat aaactaatcg cctcacattg tcactgcaaa tcgacaccta 60 tca atg Met 1 ggt ctc Gly Leu acc Thr tcc Ser 5 caa Gin ctg Leu ctt Leu ccc Pro cct Pro 10 ctg Leu ttc Phe ttc Phe ctg Leu cta Leu 15 108 gca tgt gcc ggc aac ttt gtc cac gga cac aag tgc gat ate acc tta 1S6 Ala Cys Ala Gly Asn 20 Phe Vai His Gly His 25 Lys Cys Asp Ile Thr 30 Leu cag gag ate ate aaa act ttg aac age ctc aca gag cag aag act ctg 204 Gin Glu Ile Ile 35 Lys Thr Leu Asn Ser 40 Leu Thr Glu Gin Lys 45 Thr Leu cgc acc gag ttg acc gta aca gac ate ttt gct gcc tcc aag aac aca 252 Cys Thr Glu 50 Leu Thr vai Thr Asp 55 Ile Phe Ala Ala Ser 60 Lys Asn Thr act gag aag gaa acc ttc tgc agg gct gcg act gtg ctc cgg cag ctc 300 Thr Glu 65 Lys Glu Thr Phe Cys 70 Arg Ala Ala Thr Vai 75 Leu Arg Gin Phe tac age cac cat gag aag gac act cgc tgc ctg ggt gcg act gca cag 348 Tyr 80 Ser His His Glu Lys 85 Asp Thr Arg Cys Leu 90 Gly Ala Thr Ala Gin 95 cag ttc cac agg cac aag cag ctg ate cga ttc ctg aaa cgg ctc gac 396 Gin Phe His Arg His 100 Lys Gin Leu ile Arg 10S Phe Leu Lys Arg Leu 110 ASp agg aac ctc tgg ggc ctg gcg ggc ttg aat tcc tgt cct gtg aag gaa 444 Arg Asn Leu Trp 115 Gly Leu Ala Gly Leu 120 Asn Ser Cys Pro Vai 125 Lys Glu gcc aac cag agt acg ttg gaa aac ttc ttg gaa agg cta aag acg ate 492 Ala Asn Gin 130 Ser Thr Leu Glu Asn 135 Phe Leu Glu Arg Leu 140 Lys Thr Ile atg Met aga Arg 145 gag Glu aaa Lys tat Tyr tca Ser aag Lys 150 tgt Cys teg Ser age Ser tga * atattttaat ttatgagttt 545 ttgatagctt tattttttaa gtacttatat atttataact catcataaaa taaagtacat 605 atagaatct g <210> 179 <211> 153 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 179 470

Met Giy Leu Thr Ser Gin Leu Leu Pro Pro Leu Phe Phe Leu Leu Ala 1 5 10 15 Cys Ala Gly Asn Phe Vai His Gly His Lys Cys Asp ile Thr Leu Gin 20 25 30 Glu Ile Ile Lys Thr Leu Asn Ser Leu Thr Glu Gin Lys Thr Leu Cys 35 40 45 Thr Glu Leu Thr Vai Thr Asp lie Phe Ala Ala Ser Lys Asn Thr Thr 50 55 60 Glu Lys Glu Thr Phe Cys Arg Ala Ala Thr Vai Leu Arg Gin Phe Tyr 65 70 75 80 Ser His His Glu Lys Asp Thr Arg Cys Leu Gly Ala Thr Ala Gin Gin 85 90 95 Phe His Arg His Lys Gin Leu Ile Arg Phe Leu Lys Arg Leu ASp Arg 100 105 110 Asn Leu Trp Gly Leu Ala Gly Leu Asn Ser Cys Pro Vai Lys Glu Ala 115 120 125 Asn Gin Ser Thr Leu Glu Asn Phe Leu Glu Arg Leu Lys Thr Ile Het 130 135 140 Arg Glu Lys Tyr Ser Lys Cys Ser Ser 145 150 <210> 180 <211> 756 <212> ADN <213> Homo sapien <220> <221> CDS <222> (9) . . .(443) <400> 180 471 gctggagg atg tgg ctg cag age ccg ctg etc ttg ggc act gtg gee tgc 50 Met Trp Leu Gin Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Vai Ala Cys 15 xo age ate tet gea ccc gee ege teg ccc age ccc age acg cag ccc tgg 98 Ser 15 Ile Ser Ala Pro Ala 20 Arg Ser Pro Ser Pro 25 Ser Thr Gin Pro Trp 30 gag cat gtg aat gee ate cag gag gee cgg cgt etc ctg aac ctg agt 146 Glu His Vai Asn Ala 35 Ile Gin Glu Ala Arg 40 Arg Leu Leu Asn Leu 45 Ser aga gac act gct gct gag atg aat gaa aca gta gaa gtc ate tea gaa 194 Arg Asp Thr Ala 50 Ala Glu Met Asn Glu 55 Thr Vai Glu Vai Ile 60 Ser Glu atg ttt gac etc cag gag ccg acc tgc cta cag acc ege ctg gag ctg 242 Met Phe Asp 65 Leu Gin Glu Pro Thr 70 Cys Leu Gin Thr Arg 75 Leu Glu Leu tac aag cag ggc ctg cgg ggc age etc acc aag etc aag ggc ccc ttg 290 Tyr Lys 80 Gin Gly Leu Arg Gly 85 Ser Leu Thr Lys Leu 90 Lys Gly Pro Leu acc atg atg gee age cac tac aag cag cac tgc cct cca acc ccg gaa 338 Thr 95 Met Met Ala Ser HiS 100 Tyr Lys Gin His Cys 105 Pro Pro Thr Pro Glu 110 aet tcc tgt gea acc cag act ate acc ttt gaa agt ttc aaa gag aac 386 Thr Ser Cys Ala Thr 115 Gin Thr Ile Thr Phe 120 Glu Ser Phe Lys Glu 125 Asn ctg aag gac ttt ctg ctt gtc ate ccc ttt gac tgc tgg gag cca gtc 434 Leu Lys Asp Phe 130 Leu Leu Vai Ile Pro 135 Phe Asp Cys Trp Glu 140 Pro Vai cag gag tga gaccggccag atgaggctgg ccaagccggg gagctgctct 463

Gin Glu * ctcatgaaac aagagetaga aacccaggat ggtcatcttg gagggaccaa ggggtgggcc 543 acagccatgg tgggagtggc ctggacctgc cctgggccac actgaccctg atacaggcat 603 ggcagaagaa tgggaatatt ttatactgac agaaatcagt aatatttata tatttatatt 663 tttaaaatat ttatttattt atttatttaa gtteatatte catatttatt caagatgttt 723 taccgtaata atcattatta aaaatatgct tet 756

<210> 181 <211> 144 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 181 472 472 Met 1 Trp Leu Gin Ser S Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val 10 Ala cys Ser 15 Ile Ser Ala Pro Ala 20 Arg Ser Pro Ser Pro 25 Ser Thr Gin Pro Trp 30 Glu His Vai Asn Ala 35 Ile Gin Glu Ala Arg Arg 40 Leu Leu Asn Leu 45 Ser Arg Asp Thr Ala Ala 50 Glu Met Asn Glu 55 Thr Val Glu Val Ile 60 Ser Glu Met Phe Asp 65 Leu Gin Glu Pro Thr 70 Cys Leu Gin Thr Arg 75 Leu Glu Leu Tyr Lys 80 Gin Gly Leu Arg Gly 85 Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly 90 Pro Leu Thr 95 Met Met Ala Ser His 100 Tyr Lys Gin His Cys 105 Pro Pro Thr Pro Glu 110 Thr Ser Cys Ala Thr 115 Gin Thr Ile Thr Phe 120 Glu Ser Phe Lys Glu 125 Asn Leu Lys Asp Phe Leu 130 Leu Val He Pro 135 Phe Asp Cys Trp Glu 140 Pro Val Gin Glu <210> 182 <211> 60 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <2 21> CDS <222> (D . . . (60) <221> mi sc. _feature <222> (25) ...(30) <223> n = A, T, G <400> 182 48

gaa ctc aaa cct Glu Leu Lys Pro IS gce aca gaa ctg aaa cag ctt cag nnn nnn gaa gaa Ala Thr Glu Leu Lys Gin Leu Gin xaa Xaa Glu Glu 15 10 ctg gag gaa gtg 60

Leu Glu Glu Vai 20

<210> 183 <211> 20 <212> PRT 473 <213> Homo sapiens <22 0> <221> VARIANTE <222> (9)...(10) <223> Qualquer aminoácido <40 0> 183

Ala Thr Glu Leu Lys Gin Leu Gin Xaa Xaa Glu Glu Glu Leu Lys Pro 15 10 15

Leu Glu Glu Vai 20 474

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição • WO 0200721 A [0010] • US 892949 A [0073] • US 5925735 A [0073] [0285] • WO 0073451 A [0073] • US 5284755 A, Gearing [0075] [016 • US 350325 P [0087] • US 375323 P [0087] • US 4683202 A, Mullis [0101] • US 5155027 A [0129] [0170] • US 5567584 A [0129] [0170] • US 5223409 A, Ladner [0142] • WO 92062045 A [0142] WO 9720078 A [0143] US 5037743 A, Welch [0151] [0158] US 5143830 A, Holland [0151] US 4713339 A, Levinson [0154] US 4784950 A, Hagen [0154] US 4579821 A, Palmiter [0154] US 4656134 A, Ringold [0154] US 4956288 A [0154] US 4601978 A [0154] US 5162222 A, Guarino [0156] WO 9406463 A [0156] US 5300435 A [0157] US 4599311 A, Kawasaki [0158] US 4931373 A, Kawasaki [0158] US 4870008 A, Brake [0158] 475 us 4845075 A, Murray [0158] us 4615974 A, Kingsman [0158] us 4977092 A, Bitter [0158] us 4990446 A [0158] us 5063154 A [0158] us 5139936 A [0158] us 4661454 A [0158] us 4882279 A, Cregg [0158] us 4935349 A, McKnight [0158] us 5162228 A, Sumino [0158] us 4486533 A, Lambowitz [0158] wo 9717450 A [0159] wo 9717451 A [0159] wo 9802536 A [0159] wo 9802565 A [0159] wo 9521930 A [0167] wo 9824893 A [0186] us 5399346 A, Anderson [0245] us 4650764 A, Temin [0245] us 4980289 A, Temin [0245] us 5124263 A, Temin [0245] wo 9507358 A, Dougherty [0245] JP 4244018 A [0266] us 4603044 A, Geho [0267] us 60435361 . B [0563] us 6038910S 1 B [0563] us 60350325 B [0563]

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Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um receptor de citocina multimérico ou heterodimérico isolado que compreende: um primeiro polipéptido que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90 por cento de identidade de sequência com os residuos 20-227 da SEQ ID NO: 111; e um segundo polipéptido que compreende os residuos 28-429 da SEQ ID NO: 7; em que o receptor de citocina multimérico ou heterodimérico liga um ligando que compreende os residuos 27-164 da SEQ ID NO :2.

2. Um receptor de citocina multimérico ou heterodimérico isolado de acordo com a reivindicação 1, em que o primeiro polipéptido compreende os resíduos de aminoácido 20-732 da SEQ ID NO: 111.

3. Um receptor de citocina multimérico ou heterodimérico isolado de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o segundo polipéptido compreende os residuos de aminoácido 28-739 da SEQ ID NO: 7.

4. Um receptor de citocina multimérico ou heterodimérico isolado de acordo com a reivindicação 1, em que o primeiro polipéptido compreende os residuos de aminoácido 20-519 da SEQ ID NO: 111.

5. Um receptor de citocina multimérico ou heterodimérico isolado de acordo com a reivindicação 1, em que o receptor de citocina multimérico ou heterodimérico antagoniza uma actividade de um ligando que compreende os residuos 27-164 da SEQ ID NO: 2.

6. Um receptor de citocina multimérico ou heterodimérico isolado de acordo com a reivindicação 1, em que o receptor 2 de citocina multimérico ou heterodimérico inibe a proliferação de células hematopoiéticas, inibe a proliferação de células imunes, inibe a proliferação de células inflamatórias, inibe uma resposta imune, inibe uma resposta inflamatória, ou inibe a proliferação de células tumorais de origem epitelial.

7. Um receptor de citocina multimérico ou heterodimérico isolado de acordo com a reivindicação 1 ou 4, em que o receptor de citocina multimérico ou heterodimérico é solúvel.

8. Um receptor de citocina multimérico ou heterodimérico isolado de acordo com a reivindicação 1, em que o primeiro ou segundo polipéptido compreende ainda uma etiqueta de afinidade ou molécula citotóxica.

9. Um receptor de citocina multimérico ou heterodimérico isolado de acordo com a reivindicação 8, em que a etiqueta de afinidade é polihistidina, proteína A, glutationa S transferase, Glu-Glu, substância P, péptido Flag™, péptido de ligação a estreptavidina, ou polipéptido Fc de imunoglobulina.

10. Um receptor de citocina multimérico ou heterodimérico isolado de acordo com a reivindicação 8, em que a molécula citotóxica é uma toxina ou radionuclídeo.

11. Um polinucleótido isolado que compreende: um primeiro polinucleótido que codifica um primeiro polipéptido que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90 por cento de identidade de sequência com os resíduos 20-227 da SEQ ID NO: 111; e um segundo polinucleótido que codifica um segundo polipéptido que compreende os resíduos 28-429 da SEQ ID NO: 7; 3 em que o primeiro e segundo polipéptidos formam um receptor de citocina multimérico ou heterodimérico que liga um ligando que compreende os resíduos 27-164 da SEQ ID NO: 2.

12. Um polinucleótido isolado de acordo com a reivindicação 11, em que o primeiro polipéptido compreende os resíduos de aminoácido 20-732 da SEQ ID NO: 111.

13. Um polinucleótido isolado de acordo com a reivindicação 11, em que o segundo polipéptido compreende os resíduos de aminoácido 28-739 da SEQ ID NO: 7.

14. Um polinucleótido isolado de acordo com a reivindicação 11, em que o primeiro polipéptido compreende os resíduos de aminoácido 20-519 da SEQ ID NO: 111.

15. Um polinucleótido isolado de acordo com a reivindicação 11, em que o receptor de citocina multimérico ou heterodimérico antagoniza uma actividade de um ligando que compreende os resíduos 27-164 da SEQ ID NO: 2.

16. Um polinucleótido isolado de acordo com a reivindicação 11, em que o receptor de citocina multimérico ou heterodimérico inibe a proliferação de células hematopoiéticas, inibe a proliferação de células imunes, inibe a proliferação de células inflamatórias, inibe uma resposta imune, inibe uma resposta inflamatória, ou inibe a proliferação de células tumorais de origem epitelial.

17. Um polinucleótido isolado de acordo com a reivindicação 11 ou 14, em que o receptor de citocina multimérico ou heterodimérico é solúvel.

18. Um polinucleótido isolado de acordo com a 4 reivindicação 11, em que o receptor de citocina multimérico ou heterodimérico compreende ainda uma etiqueta de afinidade ou molécula citotóxica.

19. Um polinucleótido isolado de acordo com a reivindicação 18, em que a etiqueta de afinidade é polihistidina, proteína A, glutationa S transferase, Glu-Glu, substância P, péptido Flag™, péptido de ligação a estreptavidina, ou polipéptido Fc de imunoglobulina.

20. Um polinucleótido isolado de acordo com a reivindicação 18, em que a molécula citotóxica é uma toxina ou radionuclídeo.

21. Um vector de expressão que compreende os seguintes elementos ligados operativamente: um promotor de transcrição; um segmento de ADN que compreende um polinucleótido de acordo com qualquer das reivindicações 11-20, em que dito primeiro polipéptido compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90 por cento de identidade de sequência com os resíduos 20-227 da SEQ ID NO: 111; e um terminador de transcrição; em que o primeiro e segundo polipéptidos formam um receptor de citocina multimérico ou heterodimérico, e em que o receptor de citocina multimérico ou heterodimérico liga um ligando que compreende os resíduos 27-164 da SEQ ID NO: 2.

22. Um vector de expressão que compreende os seguintes elementos ligados operativamente: a) um primeiro promotor de transcrição; um primeiro segmento de ADN que compreende um polinucleótido que codifica um primeiro polipéptido que tem pelo menos 90 por cento de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos que compreende os resíduos 20-227 da SEQ ID NO: 5 111; e um primeiro terminador de transcrição; e b) um segundo promotor de transcrição; um segundo segmento de ADN que compreende um polinucleótido que codifica um segundo polipéptido que compreende os resíduos 28-429 da SEQ ID NO: 7; e um segundo terminador de transcrição; em que o primeiro e segundo polipéptidos formam um receptor de citocina multimérico ou heterodimérico; e em que o receptor de citocina multimérico ou heterodimérico liga a um ligando que compreende os resíduos 27-164 da SEQ ID NO: 2.

23. Uma célula cultivada que compreende um vector de expressão de acordo com a reivindicação 21 ou 22, em que a célula expressa o primeiro e segundo polipéptidos codificados por o segmento de ADN ou segmentos de ADN.

24. Uma célula cultivada que compreende: um primeiro vector de expressão que compreende: a) um promotor de transcrição; b) um segmento de ADN que codifica um primeiro polipéptido que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90 por cento de identidade de sequência com os resíduos 20-227 da SEQ ID NO: 111; e c) um terminador de transcrição; e um segundo vector de expressão que compreende: a) um promotor de transcrição; b) um segmento de ADN que codifica um segundo polipéptido que compreende os resíduos 28-429 da SEQ ID NO: 7; e c) um terminador de transcrição; em que o primeiro polipéptido e o segundo polipéptido formam um receptor de citocina multimérico ou heterodimérico; e em que o receptor de citocina multimérico ou heterodimérico liga a um ligando que compreende os 6 resíduos 27-164 da SEQ ID NO: 2.

25. Um método de produção de um receptor de citocina multimérico ou heterodimérico que compreende: cultivar uma célula de acordo com a reivindicação 23 ou 24; e isolar o receptor de citocina multimérico ou heterodimérico produzido pela célula.

26. Uma composição que compreende um receptor solúvel de citocina multimérico ou heterodimérico de acordo com a reivindicação 7; e um veículo farmaceuticamente aceitável.

27. Um método de produção de um anticorpo contra um receptor de citocina multimérico ou heterodimérico de acordo com a reivindicação 1, em que o receptor de citocina multimérico ou heterodimérico provoca uma resposta imune num animal inoculado para produzir um anticorpo que especificamente liga o receptor de citocina multimérico ou heterodimérico; e em que o anticorpo pode ser isolado do animal.

28. Um anticorpo ou fragmento de anticorpo que especificamente liga a um receptor de citocina multimérico ou heterodimérico, em que o receptor de citocina multimérico ou heterodimérico compreende: um primeiro polipéptido que consiste em resíduos de aminoácido 20-227 ou resíduos de aminoácido 20-519 da SEQ ID NO: 111; e um segundo polipéptido que consiste em resíduos de aminoácido 28-429 ou resíduos de aminoácido 28-739 da SEQ ID NO: 7; e em que o receptor de citocina multimérico ou heterodimérico liga um ligando que compreende os resíduos 27-164 da SEQ ID NO: 2.

29. Um anticorpo de acordo com a reivindicação 28, em que 7 o anticorpo é do grupo de: (a) um anticorpo policlonal, (b) um anticorpo monoclonal murino, (c) um anticorpo humanizado derivado de (b) , (d) um fragmento de anticorpo, (e) um anticorpo monoclonal humano ou (f) um anticorpo quimérico.

30. Um anticorpo de acordo com a reivindicação 28, em que o anticorpo compreende ainda um radionuclideo, enzima, substrato, cofactor, marcador fluorescente, marcador quimioluminescente, etiqueta de péptido, partícula magnética, fármaco, ou toxina.

31. Um método de detecção ou quantificação da presença de um receptor de citocina multimérico ou heterodimérico numa amostra biológica, que compreende as etapas de: (a) colocar em contacto a amostra biológica com um anticorpo, ou um fragmento de anticorpo, de acordo com qualquer das reivindicações 28-30, em que a colocação em contacto é realizada sob condições que permitem a ligação do anticorpo ou fragmento de anticorpo à amostra biológica; e (b) detectar ou quantificar qualquer anticorpo ligado ou fragmento de anticorpo ligado; e deste modo detectar ou quantificar a presença de um receptor de citocina multimérico ou heterodimérico na amostra biológica.

32. Um método in vitro para reduzir células hematopoiéticas e células progenitoras hematopoiéticas numa amostra de medula óssea ou células de sangue periférico de um mamífero, o método que compreende: cultivar a dita amostra com uma composição que compreende uma quantidade eficaz de um receptor solúvel de citocina multimérico ou heterodimérico de acordo com a reivindicação 7 para produzir uma diminuição no número de células linfóides na medula óssea ou células de sangue periférico, em comparação com medula óssea ou células de sangue periférico cultivadas na ausência do receptor de citocina multimérico ou heterodimérico.

33. Um método in vitro de acordo com a reivindicação 32, em que a composição é uma composição de acordo com a reivindicação 26.

34. Um método de acordo com a reivindicação 32 ou 33, em que as células hematopoiéticas e células progenitoras hematopoiéticas são células linfóides.

35. Um método de acordo com a reivindicação 34, em que as células linfóides são macrófagos ou células T.

36. Um método in vitro para destruir células de cancro, que compreende formular um receptor de citocina multimérico ou heterodimérico produzido pelo método de acordo com a reivindicação 25 num veiculo farmaceuticamente aceitável; e expor uma amostra biológica que contém as células de cancro à composição de receptor de citocina multimérico ou heterodimérico; em que o receptor de citocina multimérico ou heterodimérico destrói as células.

37. Um método in vitro de acordo com a reivindicação 36, em que o receptor de citocina multimérico ou heterodimérico é ainda conjugado a uma toxina.

38. Um receptor de citocina multimérico ou heterodimérico produzido pelo método de acordo com a reivindicação 25 para uso no tratamento de cancro, pela destruição de células de cancro.

39. Um receptor para uso de acordo com a reivindicação 38, em que dito receptor multimérico ou heterodimérico é ainda 9 conjugado a uma toxina.

40. Uma composição de acordo com a reivindicação 26 para uso na supressão de uma resposta inflamatória num mamífero com inflamação, em que pela: (1) determinação de um nível de uma molécula inflamatória antes da administração de dita composição; (2) determinação de um nível após a administração da molécula inflamatória; e (3) comparação do nível da molécula inflamatória na etapa (1) com o nível da molécula inflamatória na etapa (2) ; uma falta de crescimento ou uma diminuição no nível de molécula inflamatória é indicativo de supressão de uma resposta inflamatória.

41. Um antagonista de um polipéptido de zcytorl71ig como é mostrado na SEQ ID NO: 2, para uso no tratamento de um mamífero que sofre com uma doença inflamatória, tal como uma doença inflamatória em que dito zcytorl71ig desempenha um papel, em que o antagonista é uma composição de acordo com a reivindicação 26, ou um anticorpo de acordo com a reivindicação 28, num veículo farmaceuticamente aceitável.

42. Um antagonista para uso de acordo com a reivindicação 41, em que a doença é uma doença inflamatória crónica.

43. Um antagonista para uso de acordo com a reivindicação 42, em que a doença inflamatória crónica é seleccionada a partir do grupo de: (a) doença inflamatória do intestino; (b) colite ulcerativa; (c) doença de Crohn; (d) dermatite atópica; (e) eczema; e 10 (f) psoríase.

44. Um antagonista para uso de acordo com a reivindicação 41, em que a doença é uma doença inflamatória aguda.

45. Um antagonista para uso de acordo com a reivindicação 44, em que a doença inflamatória aguda é seleccionada a partir do grupo de: (a) endotoxemia; (b) septicemia; (c) sindrome do choque tóxico; e (d) doença infecciosa.

46. Um antagonista para uso de acordo com a reivindicação 41, em que o receptor solúvel de citocina multimérico ou heterodimérico ou anticorpo compreende ainda um radionuclideo, enzima, substrato, cofactor, marcador fluorescente, marcador quimioluminescente, etiqueta de péptido, partícula magnética, fármaco, ou toxina.

47. Um método para detectar inflamação num paciente, que compreende: incubar uma amostra de tecido ou amostra biológica do paciente com um receptor solúvel de citocina multimérico ou heterodimérico de acordo com qualquer das reivindicações 1-7, sob condições em que o receptor solúvel de citocina multimérico ou heterodimérico liga ao seu polipéptido complementar na amostra de tecido ou amostra biológica; visualizar o receptor solúvel de citocina multimérico ou heterodimérico ligado na amostra de tecido ou amostra biológica; e comparar níveis de receptor solúvel de citocina multimérico ou heterodimérico ligado na amostra de tecido ou amostra biológica do paciente a uma amostra de controlo normal de tecido ou amostra biológica; 11 em que um aumento no nível de receptor solúvel de citocina multimérico ou heterodimérico ligado à amostra de tecido ou amostra biológica do paciente com relação à amostra de controlo normal de tecido ou amostra biológica é indicativo de inflamação no paciente.

48. Um método para detectar inflamação num paciente, que compreende: realizar um método de acordo com a reivindicação 31 em uma amostra biológica do paciente; em que um nível elevado de dito receptor de citocina multimérico ou heterodimérico na amostra biológica é indicativo de inflamação no paciente.

49. Um receptor de citocina multimérico ou heterodimérico de acordo com a reivindicação 1, em que o receptor é solúvel, e compreende do resíduo de aminoácido 20 ao resíduo de aminoácido 227 da SEQ ID NO: 111 e do resíduo de aminoácido 28 ao resíduo de aminoácido 429 da SEQ ID NO: 7; e em que dito receptor de citocina multimérico ou heterodimérico liga um ligando que compreende os resíduos 27-164 da SEQ ID NO: 2.

50. Um anticorpo de acordo com a reivindicação 28 para uso no tratamento de cancro.

51. Um anticorpo para uso de acordo com a reivindicação 50, para tratar cancro pela redução da proliferação de monócitos ou macrófagos neoplásicos.

52. Um anticorpo para uso de acordo com a reivindicação 50, em que dito cancro é seleccionado a partir de: (i) cancro pancreático; (ii) leucemia; (iii) linfoma; 12 (iv) discrasia de célula plasmática tal como mieloma múltiplo; ou (v) tumores de origem de célula epitelial tal como carcinoma, adenocarcinoma e melanoma.

53. Um anticorpo de acordo com a reivindicação 28 para uso no tratamento de: (i) asma; (ii) alergias; ou (iii) doenças auto-imune tal como diabetes mellitus dependente de insulina (IDDM), esclerose múltipla (MS), Lúpus eritematoso sistémico (SLE), miastenia grave e artrite reumatoide.

54. Um anticorpo de acordo com a reivindicação 28 para uso no tratamento de: (i) nefropatias tal como glomerulosclerose, neuropatia membranosa, amiloidose, arteriosclerose renal e glomerulonefrite; (ii) doenças fibroproliferativas do rim; ou (iii) disfunção renal, associada, por exemplo, a SLE, IDDM, diabetes tipo II (NIDDM) ou tumores renais.

55. Um anticorpo para uso de acordo com qualquer das reivindicações 50-54, em que dito anticorpo é um anticorpo monoclonal.

56. Um anticorpo para uso de acordo com qualquer das reivindicações 50-55, em que dito anticorpo é conjugado a uma toxina.

57. Utilização de um receptor de citocina multimérico ou heterodimérico produzido pelo método de acordo com a reivindicação 25 para o fabrico de um medicamento para tratar cancro, pela destruição de células de cancro. 13

58. Utilização de uma composição de acordo com a reivindicação 26 para o fabrico de um medicamento para suprimir uma resposta inflamatória num mamífero com inflamação, em que pela: (1) determinação de um nível de uma molécula inflamatória antes de administração de dita composição; (2) determinação de um nível após a administração da molécula inflamatória; e (3) comparação do nível da molécula inflamatória na etapa (1) com o nível da molécula inflamatória na etapa (2); uma falta de crescimento ou uma diminuição no nível de molécula inflamatória é indicativo de supressão de uma resposta inflamatória.

59. Utilização de um antagonista de um polipéptido de zcytorl71ig como é mostrado na SEQ ID NO: 2, para o fabrico de um medicamento para tratar um mamífero que sofre com uma doença inflamatória, tal como uma doença inflamatória em que dito zcytorl71ig desempenha um papel; em que o antagonista é uma composição de acordo com a reivindicação 26, ou um anticorpo de acordo com a reivindicação 28, num veículo farmaceuticamente aceitável.

60. Utilização de um anticorpo de acordo com a reivindicação 28 para o fabrico de um medicamento para tratar: (i) cancro; (ii) asma; (iii) alergias; (iv) doenças auto-imune, tal como diabetes mellitus dependente de insulina (IDDM), esclerose múltipla (MS), Lúpus eritematoso sistémico (SLE), miastenia grave e artrite reumatoide; (v) nefropatias, tal como glomerulosclerose, neuropatia 14 14 e membranosa, amiloidose, arteriosclerose renal glomerulonefrite; (vi) doenças fibroproliferativas do rim; ou SLE, (vii) disfunção renal, associada, por exemplo, a IDDM, diabetes tipo II (NIDDM) ou tumores renais.