MXPA02003897A

MXPA02003897A - Modulacion de la diferenciacion de celulas t para el tratamiento de enfermedades mediadas por las celulas t auxiliares.

Info

Publication number: MXPA02003897A
Application number: MXPA02003897A
Authority: MX
Inventors: Austin L Gurney
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 1999-10-20
Filing date: 2000-10-18
Publication date: 2002-12-13
Also published as: JP4931310B2; BR0015055A; CA2389317A1; AU2006200374A1; KR100874280B1; IL148936A; US20070134238A1; WO2001029070A8; WO2001029070A3; KR20080068767A; KR20070121855A; ZA200202468B; EP1222209A2; CN1409726A; AU2006200374B2; AU1095001A; KR100840033B1; CN1279054C; US20040234522A1; KR20020048971A

Abstract

La presente invencion se refiere a metodos para el tratamiento y diagnostico de enfermedades inmunes relacionadas, incluyendo aquellas mediadas por la citocina liberada principalmente de celulas Thl o Th2 en respuesta a la estimulacion antigenica. La presente invencion se refiere ademas a metodos para inclinar la diferenciacion de celulas T en el sub-tipo Thl o el sub-tipo Th2, con base en los niveles de expresion relativos del gen TCCR y sus agonistas o antagonistas. La presente invencion se refiere ademas, a un metodo de diagnostico de enfermedades mediadas por el Thl y el Th2.

Description

M3DULACICN DE LA DIFERENCIACIÓN DE C-EILÜLAS T PARA EL TR?!ñ--tENTO DE ENEEIRMEDADES MEDIADAS POR LAS CÉLULAS T AUXILIARES Campo de la Invención. La presente invención se refiere generalmente a la identificación y el aislamiento de ADN novedoso, la producción recombinante de polipéptidos novedosos y a composiciones y métodos para el diagnóstico y tratamiento de enfermedades inmunes relacionadas, específicamente a métodos de modulación de la diferenciación de células T y perfiles de liberación de citocinas dentro del subtipo Thl y los subtipos Th2, y al huésped de los padecimientos que están implicados por la liberación de los perfiles de citocina. Antecedentes de la Invención. Las enfermedades inflamatorias e inmunes relacionadas son la manifestación o consecuencia de trayectorias biológicas interconectadas, a menudo múltiples, bastante complejas, que en la fisiología normal son criticas para responder al insulto o lesión, iniciar la reparación del insulto o lesión, y aumentar las defensas adquiridas e innatas contra organismos extraños. La patología o enfermedad se presenta cuando estas trayectorias fisiológicas normales provocan una lesión o insulto adicional, ya sea relacionadas directamente con la intensidad de la respuesta, como Ref: 137168 consecuencia de la regulación anormal o estimulación excesiva, como una reacción al mismo, o como una combinación de estos. Aunque la génesis de estas enfermedades involucra a menudo trayectorias multi-etapa, y a menudo trayectorias/sistemas biológicos múltiples simples, la intervención en los puntos críticos en una o más de estas trayectorias puede tener un efecto terapéutico o aliviador. La intervención terapéutica puede presentarse por antagonismo de una trayectoria/proceso perjudicial o la estimulación de una trayectoria/proceso benéfico. Los linfocitos T (células T) son un componente importante de la respuesta inmune de los mamíferos. Las células T reconocen antigenos que se asocian con una auto-molécula codificada por los genes dentro del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) . El antigeno puede desplegarse junto con las moléculas MHC en la superficie de las células que presentan antigenos, células infectadas por virus, células de cáncer, injertos, etc. El sistema de las células T elimina estas células alteradas que plantean una amenaza a la salud del mamífero huésped. Las células T incluyen células T de ayuda y células T citotóxicas. Las células T de ayuda proliferan ampliamente después del reconocimiento de un complejo antigeno- MHC sobre una célula que presenta un antigeno. Las células T de ayuda también secretan una variedad de citocinas, esto es linfocinas, que juegan un papel central en la activación de células B, células T citotóxicas y una diversidad de otras células que participan en la respuesta inmune. Un evento central en las respuestas inmunes mediadas por célula y humorales, es la activación y la expansión clonal de las células T de ayuda. La activación de la célula T de ayuda se inicia por la interacción del receptor de células T (TCR) -complejo CD3 con un antigeno-MHC en la superficie de una célula que presenta un antigeno. Esta interacción media una cascada de eventos bioquímicos que inducen a la célula de ayuda en reposo a entrar a un ciclo celular (la transición GO hasta Gl) y resulta en la expresión de un receptor de alta afinidad para el IL-2 y algunas veces el IL-4. La célula T activada avanza a través del ciclo proliferándose y diferenciándose dentro de células de memoria o células efectoras. El sistema inmune de los mamíferos consiste de diversas células únicas que actúan en conjunto para defender al huésped de las bacterias, virus, toxinas invasoras y otras sustancias no huéspedes. El tipo de células principalmente responsables de la especificidad del sistema inmune se denomina linfocitos, de los cuales hay dos tipos, células T y B. Las células T toman su designación por desarrollarse en el timo, mientras que las células B se desarrollan en la medula ósea. La población de células T tiene diversos sub-conjuntos, tales como células T supresoras, células T citotóxicas y células T de ayuda. Los sub-conjuntos de células T de ayuda definen 2 trayectorias de inmunidad: Thl y Th2. Las células Thl, un sub-conjunto funcional de las células CD4+, se caracterizan por su capacidad de activar la inmunidad mediada por células. La célula Thl produce citocinas IL-2 y ?-interferón, y se identifican por la ausencia de 11-10, 11-4, 11-5 e 11-6. La célula Th2 también es una célula CD4+, pero es diferente de la célula Thl. Las células Th2 son responsables de la producción de anticuerpos y producen las citocinas 11-4, 11-5, 11-10 y 11-13 (ver Figura 1) . Estas citocinas juegan un papel importante en la elaboración de respuestas Thl y Th2 mutuamente inhibitorias. El ?-interferón que se produce por las células Thl inhibe la proliferación de células Th2 (Figura 2), aunque el IL-10 producido por las células Th2, reprime la producción de ?-interferón (Figura 2) . Los miembros de las 4 familias de citocinas de haz de hélice (Bazan, J. F. , 1990, Proc Nati Acad Sci USA, 87:6934-8) se ha encontrado que juegan un papel critico en la expansión y diferenciación terminal de las células T de ayuda, a partir de un precursor común dentro de poblaciones diferentes de células efectoras Thl y Th2. O'Garra, A., 1998, I munity, 8:275-83. El IL-4 tiene predominantemente influencia en el desarrollo de las células Th2 aunque el IL-12 es un factor principal involucrado en la diferenciación de las células Thl. Hsieh, C. S., y colaboradores, 1993, Science, 260:547-9; Seder, R. A., 1993, Proc Nati Acad Sci USA 90:10188-92; Le Gros, G., y colaboradores, 1990, J Exp Med, 172:921-9; Swain, S. L., y colaboradores, 1991, Immunol Rev, 123:115-44. De esta manera, los ratones deficientes en IL-4 (Kuhn, R., y colaboradores, 1991, Science, 254:707-10), cadena del receptor IL-4 (Noben-Trauth, N. y colaboradores, 1997, Proc Nati Acad Sci USA, 94:10838-43) , o el factor de transcripción especifico del IL-4, STAT6 (Shimoda, K. , y colaboradores, 1996, Nature, 380:630-3) son defectuosos en las respuestas Th2, mientras que los ratones deficientes en IL-12 (Magram, J. , y colaboradores, 1996, Immunity, 4:471:881), receptor IL-12 (IL-12R) cadena 1 (Wu, C, y colaboradores, 1997, J. Immunol, 159:1658-65), o el factor de transcripción especifico de IL-12 STAT4 (Kaplan, M. H., y colaboradores, 1996, Nature. 382:174-7) tienen respuestas afectadas al Thl.

Se cree que los sub-tipos de células Th-1 y Th-2 se derivan del precursor común, denominado una célula Th-0. En contraste con la producción de citocina mutuamente exclusiva de los sub-tipos Th-1 y Th-2, las células Th-0 producen la mayoría o todas estas citocinas. Los perfiles de liberación de las diferentes citocinas para los subtipos Th-1 y Th-2 juegan un papel activo en la selección de mecanismos efectores y células citotóxicas. El 11-2 y el ?-interferón secretados por las células Th-1 tienden a activar macrófagos y células citotóxicas, mientras que el 11-4, 11-5, 11-6 y 11-10 secretados por las células Th-2 tienden a incrementar la producción de eosinófilos y mastocitos asi como incrementar la producción de anticuerpos que incluyen IgE y disminuir la función de las células citotóxicas. Una vez establecido, el patrón de respuesta Th-1 o Th-2 se mantiene por la producción de citocinas que inhiben la producción del otro subconjunto. El ?-interferón producido por las células Th-1 inhibe la producción de las citocinas Th-2 tal como 11-4 y Il-107 aunque el 11-10 producido por las células Th-2 inhibe la producción de las citocinas Th-1 tales como el 11-2 y el ?-interferón. El desorden del balance delicado entre la citocinas producidas por los sub-conjuntos de células Thl y Th2 conduce a un huésped de padecimientos. Por ejemplo, la sobre-producción de citocina Thl puede conducir a enfermedades inflamatorias autoinmunes, esclerosis múltiple y enfermedad inflamatoria del intestino (por ejemplo, enfermedad de Crohn, enteritis regional, ileitis distal, enteritis granulomatosa, ileitis regional, ileitis terminal) . Similarmente, la sobre-producción de las citocinas Th2 conduce a padecimientos alérgicos incluyendo hipersensibilidad anafiláctica, asma, rinitis alérgica, dermatitis atópica, conjuntivitis vernal, eczema, urticaria y alergias de alimentos. Umetsu y colaboradores, Soc. Exp. Biol. Med. 215:11-20 (1997). La WO 97/44455 presentada el 19 de Mayo del 1997 y Sprecher y colaboradores, Biochem, Biophsys. Res. Commun. 246:82-90 (1998), describen moléculas receptoras de citocinas que poseen cierto grado de identidad de secuencia con las moléculas de murina y de TCCR humano en la presente. Los receptores de citocina del arte previo humanos y de murina se pretende que se expresen en el tejido linfoide incluyendo el timo, bazo, ganglios linfáticos y leucocitos de sangre periférica, y se indican además por estar presentes en las células B y T y tienen una función que se relaciona con la proliferación, diferenciación y/o activación de células inmunes, tal vez en el desarrollo y regulación de la respuesta inmune. Sin embargo, WO 97/44455 y Sprecher y colaboradores, supra, no identifican el rol preciso del TCCR y sus homólogos en la mediación de la diferenciación de células T y los perfiles de liberación de citocina dentro del sub-tipo Thl y el sub-tipo Th2, ni el huésped de padecimientos que se implica por la liberación de los sub-tipos de células T de citocina. Breve Descripción de la Invención . La presente invención se refiere a métodos para el diagnóstico y tratamiento de enfermedades inmunes relacionadas en mamíferos, incluyendo humanos, específicamente la fisiología (por ejemplo, perfiles de liberación de citocina) y enfermedades que resultan de una desviación en la trayectoria de diferenciación de células T dentro del sub-tipo Thl o el sub-tipo Th2. La presente invención se basa en la identificación del gen que codifica una secuencia de aminoácidos de TCCR (previamente conocidos como NPOR) , la ausencia o activación del cual se desvía la diferenciación de células T dentro del sub-tipo Th2 en mamíferos. Se pueden tratar ciertas enfermedades inmunes al suprimir o enriquecer la diferenciación de las células T dentro del sub-tipo Thl o del Th2. La presente invención se refiere además a un método para enriquecer, estimular o potenciar la diferenciación de células T dentro del sub-tipo Th2 en lugar del sub- tipo Thl, que comprende la administración de una cantidad efectiva de un antagonista TCCR. Opcionalmente, el método se presenta en un mamífero y la cantidad efectiva es una cantidad terapéuticamente efectiva. Opcionalmente la diferenciación inducida del antagonista TCCR de las células T dentro de las células del sub-tipo Th2, resulta además en un perfil de liberación de citocinas Th2 con la estimulación del antígeno (por ejemplo, 11-4, 11-5, 11-10 y 11-13) . Las enfermedades que se caracterizan por una sobre-producción de citocina Thl, y que serian responsables de un efecto equilibrante de la estimulación del sub-tipo Th2 de diferenciación y el perfil de liberación resultante de la citocina, incluyen enfermedades inflamatorias auto-inmunes (por ejemplo, encefalomielitis alérgica, esclerosis múltiple, diabetes mellitus dependiente de la insulina, uveoretinitis autoinmune, enfermedad inflamatoria del intestino (por ejemplo, enfermedad de Crohn, colitis ulcerante) , enfermedad autoinmune de la tiroides y rechazo de aloinjerto. La presente invención se refiere además a un método para prevenir, inhibir o atenuar, la diferenciación de células T dentro del sub-tipo Th2 (esto es, provoca la diferenciación dentro de los sub-tipos Thl) , que comprende la administración de una cantidad efectiva de un TCCR o agonista. Opcionalmente, el método se presenta en un mamífero y la cantidad efectiva es una cantidad terapéuticamente efectiva. Opcionalmente, esta diferenciación inducida por el agonista o el TCCR resulta en un perfil de liberación de la citocina Thl con la estimulación del antígeno (por ejemplo ?-interferón) . Las enfermedades que se caracterizan por una sobre-producción de las citocinas Th2 (o producción insuficiente de citocinas Thl) , y que serían responsables del efecto de equilibrio de la estimulación del sub-tipo Thl de la sobre-producción de la citocina Th2 por diferenciación, se esperaría que fueran efectivos en el tratamiento de enfermedades infecciosas (por ejemplo Leishmania major, Mycobacterium leprae, Candida albacans, Toxoplasma gondi, virus sincitial respiratorio, virus de inmunodeficiencia humana) y padecimientos alérgicos (por ejemplo asma, rinitis alérgica, dermatitis atópica, conjuntivitis vernal) . En una modalidad, la presente invención se refiere a un anticuerpo aislado que se enlaza a un polipéptido TCCR (por ejemplo anti-TCCR) . En un aspecto, el anticuerpo imita la actividad de un polipéptido TCCR (un anticuerpo agonista) o inversamente el anticuerpo inhibe o neutraliza la actividad de un polipéptido TCCR (un anticuerpo antagonista) . En otro aspecto, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, que tiene preferiblemente residuos de la región determinante de la complementariedad no humana (CDR) y residuos de la región de la estructura humana (FR) . Se puede etiquetar el anticuerpo y se puede inmovilizar en un soporte sólido. En un aspecto adicional, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo, un anticuerpo de cadena simple o un anticuerpo anti-idiotípico. En otra modalidad, la invención se refiere al uso de polipéptidos y anticuerpos de la invención para preparar una composición o medicamento que tiene los usos antes descritos . En una modalidad adicional, la invención se refiere a ácido nucleicos que codifican un anticuerpo anti TCCR y células huésped recombinantes y vectores que comprenden tal ácido nucleico. Todavía en una modalidad adicional, la invención se refiere a un método para la producción de tal anticuerpo por el cultivo de una célula huésped transformada con el ácido nucleico que codifica el anticuerpo bajo condiciones tales que se expresa el anticuerpo y se recupera el anticuerpo del cultivo celular. La invención se refiere además a antagonistas de un polipéptido TCCR que inhiben una o más funciones o actividades del polipéptido TCCR. Alternativamente, la invención se refiere a agonistas TCCR que estimulan o enriquecen una o más funciones o actividades del polipéptido TCCR. Preferiblemente tales antagonistas y/o agonistas son variantes TCCR, fragmentos de péptidos, moléculas pequeñas, oligonucleótidos antisentido (ADN o ARN) ribozimas o anticuerpos (monoclonales, humanizados, específicos, de cadena simple, heteroconjugados, o fragmentos de los anteriores) . Adicionalmente, los agonistas TCCR pueden incluir ligandos potenciales TCCR, mientras que los antagonistas potenciales TCCR pueden incluir dominios extra celulares solubles TCCR (ECD) . En una modalidad adicional, la invención se refiere a moléculas aisladas de ácido nucleico que hibridizan a las moléculas de ácido nucleico que codifican a los polipéptidos TCCR o al complemento. El ácido nucleico es preferiblemente ADN, y la hibridación se presenta preferiblemente bajo condiciones de severidad. Tales moléculas de ácido nucleico pueden actuar como moléculas antisentido de los genes amplificados ahí identificados, que a su vez, pueden encontrar uso en la modulación de los genes amplificados respectivos, o como cebadores antisentido en reacciones de amplificación. Adicionalmente, se pueden usar tales secuencias como parte de una secuencia de triple hélice y/o ribozima que a su vez puede usarse en la regulación de los genes amplificados. En otra modalidad, la invención se refiere a un método para determinar la presencia de un polipéptido TCCR que comprende exponer a una célula que se sospecha contiene al polipéptido, con un anticuerpo anti-TCCR y determinar el enlace del anticuerpo a la célula. Todavía en otra modalidad, la presente invención se refiere a un método de diagnóstico de un padecimiento mediado por el Thl o mediado por el Th2 en un mamífero, que comprender detectar el nivel de expresión de un gen que codifica un polipéptido TCCR (a) en una muestra de prueba de células de tejido obtenidas del mamífero, y (b) en una muestra de control de células de tejido normales conocidas del mismo tipo de células, en donde un nivel de expresión inferior en la muestra de prueba contra el control, indica la presencia de un padecimiento mediado por el Th2 y un nivel de expresión superior en la muestra de prueba contra el control, indica le presencia de un padecimiento mediado por Thl en el mamífero del cual se obtienen las células del tejido de prueba. En otra modalidad, la presente invención se refiere a un método de diagnóstico de una enfermedad inmune en un mamífero, que comprende (a) poner en contacto un anticuerpo anti-TCCR con una muestra de prueba de células de tejido obtenidas de un mamífero, y (b) detectar la formación de un complejo entre el anticuerpo y el polipéptido TCCR en la muestra de prueba. La detección puede ser cualitativa o cuantitativa, y se puede llevar a cabo en comparación con la observación de la formación del complejo en una muestra de control de células de tejido normal conocidas del mismo tipo celular. Una cantidad superior de complejo formado en la muestra de prueba, indica la presencia de TCCR y un padecimiento mediado por Thl, mientras que una cantidad inferior indica un padecimiento mediado por el Th2 en el mamífero del cual se obtienen las células del tejido de prueba. El anticuerpo lleva preferiblemente una etiqueta detectable. La formación del complejo se puede observar por ejemplo, por un microscopio de luz, citometría de flujo, fluorimetría u otras técnicas conocidas en el arte. La muestra de prueba se obtiene usualmente de un individuo de quien se sospecha que tiene una deficiencia o anormalidad del sistema inmune. En otra modalidad, la presente invención se refiere a un kit de diagnóstico, que contiene un anticuerpo anti TCCR y un portador (por ejemplo, una solución amortiguadora) en un empaque apropiado. El kit contiene preferiblemente instrucciones para el uso del anticuerpo para detectar el polipéptido TCCR.

En una modalidad adicional, la invención se refiere a un articulo de manufactura que comprende: un contenedor; una etiqueta en el contenedor, y una composición que comprende un agente activo contenido dentro del contenedor; en donde la composición es efectiva para estimular o inhibir una respuesta inmune en un mamífero, la etiqueta en el contenedor indica que la composición se puede usar para tratar una enfermedad inmune relacionada, y el agente activo en la composición es un agente que estimula o inhibe la expresión y/o actividad del polipéptido TCCR. En un aspecto preferido el agente activo es un polipéptido TCCR o un anticuerpo anti-TCCR. Una modalidad adicional es un método para la identificación de un compuesto capaz de modular la expresión y/o actividad biológica de un polipéptido TCCR al poner en contacto un compuesto candidato con un polipéptido TCCR bajo condiciones y por un tiempo suficiente para permitir que estos dos componentes interactúen. En un aspecto específico, cualquier componente candidato o el polipéptido TCCR se inmovilizan en un soporte sólido. En otro aspecto, el componente no inmovilizado lleva una etiqueta detectable.

Breve Descripción de los Dibujos. La figura 1 es una representación diagramática de la diferenciación de las células T CD4+ dentro de la células Thl y Th2, las citocinas primarias responsables de efectuar la diferenciación, las citocinas primarias liberadas de la diferenciación de los sub-conjuntos respectivos con la estimulación de antígenos y los efectos fisiológicos mediados por los perfiles liberados de citocina. La figura 2 es una representación diagramática del circuito de retroalimentación negativa que describe la interrelación entre las citocinas liberadas por los subtipos de células T Thl y Th2. La figura 3 muestra la secuencia de aminoácidos para el TCCR humano (hTCCR) (SEQ ID NO:l). La secuencia también ha sido publicada en WO 97/44455 presentada el 23 de Mayo de 1996 y está además disponible del GenBank bajo el número de acceso 4759327. Esta secuencia se describe además en Sprecher y colaboradores, Biochem. Biophys, Res. Commun. 246(1): 82-90(1998). En la SEQ ID NO:l, se ha identificado un péptido de señal de los residuos de aminoácidos 1 hasta alrededor de 32, un dominio de transmembrana desde alrededor de los residuos de aminoácidos 517 hasta alrededor de 538, sitios de N-glicosilación a alrededor de los residuos 51-54, 76-79, 302-305, 311-314, 374-377, 382-385, 467-470, 563-566, sitios de N-miristoilación a alrededor de los residuos 107-112, 240-245, 244-249, 281-286, 292-297, 373-378, 400-405, 459-464, 470-475, 531-536 y 533-538, un sitio de colocación de lípidos de lipoproteínas de membranas procarióticas alrededor de los residuos 522-532 y una firma 1 de la familia del receptor de citocinas y del factor de crecimiento a alrededor de los residuos 41-54. También hay una región de homología importante con la segunda subunidad del receptor para el factor estimulante de la colonia de macrófago-granulocito humano (GM-CSF) en los residuos 183-191. La figura 4 muestra la secuencia de aminoácidos para el TCCR de murina (mTCCR) (SEQ ID NO:2). La secuencia también ha sido publicada en WO 97/44455 presentada el 23 de Mayo del 1996 y está además disponible en el GenBank bajo el número de acceso 7710109. Esta secuencia se describe además en Sprecher y colaboradores, Biochem. Biophys, Res. Commun. 246 (1) : 82-90 (1998) en la SEQ ID NO: 2, se ha identificado un péptido de señal de los residuos de aminoácidos 1 a alrededor de 24, el dominio de transmembrana desde alrededor de los residuos de aminoácidos 514 a alrededor de 532, los sitios de N-glicosilación a alrededor de los residuos 46-49, 296-299, 305-308, 360-361, 368-371 y 461-464, los sitios de fosforilación de la caseína cinasa II a alrededor de los residuos 10-13, 93-96, 130-133, 172-175, 184-187, 235-238, 271-274, 272-275, 323-326, 606-609 y 615-618, un sitio de la fosforilación de la tirosina cinasa alrededor de los residuos 202-209, sitios de N-miristoilación de los residuos 43-48, 102-107, 295-300, 321-326, 330-335, 367-342, 393-398, 525-530 y 527-532, un sitio de amidación alrededor de los residuos 240-243, una colocación de lípidos de lipoproteínas de membranas procarióticas a alrededor de los residuos 516-526 y un factor de crecimiento y una firma 1 de la familia del receptor de citocina alrededor de los residuos 36-49. La región de homología importante existe con: (1) la eritropoyetina humana a alrededor de los residuos 14-51 y (2) el receptor de interleucin 5 murina en los residuos 211-219. La figura 5 es una comparación de hTCCR (SEQ ID N0:1) y mTCCR (SEQ ID NO:2). Los aminoácidos idénticos se sombrean y se indican los espacios introducidos para una alineación óptima por rayas. El sitio de desdoblamiento de la peptidasa de señal predicha se indica por una flecha. Los sitios de N-glicosilación potencial se indican con un asterisco. La porción WSX, el dominio de transmembrana y la porción del recuadro 1, están en recuadro.

La figura 6 es un manchado Northern de un TCCR humano que indica los perfiles de expresión en tejidos fetales y de adulto. En los adultos, el hTCCR se expresa más altamente en el timo, pero hay también la señal en los leucocitos de sangre periférica (PBL) , bazo así como la expresión débil en el pulmón. En los tejidos fetales, el TCCR muestra una expresión débil en el pulmón y en el riñon. El perfil de expresión de TCCR indica que puede estar involucrado en el desarrollo y proliferación de células sanguíneas, especialmente de ti ocitos. Las figuras 7A - 7B) examinan el número y fenotipo de las células T en ratones TCCR -/-. La figura 7A es una gráfica de contorno del análisis FACS de las células T CD4+/CD8+ tomadas de ratones TCCR-/- y comparadas con el tipo silvestre. La figura B7 es una gráfica de contorno del análisis FACS de CD4+/CD8+/TcR+ . La carencia de cualquier diferencia importante entre los números de células T en los ratones TCCR-/- indica que no se afecta la proliferación de las células T. Las figuras 8A - 8B) examinan la expresión de TCCR en células T humanas. La figura 8A es una gráfica del contorno de análisis FACS del TCCR humano y del marcador CD2 de crisol en la superficie de la célula T sobre las células T humanas. La figura 8B es una gráfica de contorno de una análisis FACS del TCCR humano y el marcador CD20 de las células B en las células B humanas. La gráfica más a la izquierda de ambas figuras representa el anticuerpo secundario conjugado con el fluorocromo adecuado. Acumulativamente, las figuras 8A y 8B indican que el TCCR se encuentra en un subconjunto de células T humanas y no está presente en cantidades apreciables en las células B. La figura 9A - 9C) es una representación diagramática de la metodología de direccionamiento de genes TCCR usando recombinación homologa. La figura 9A representa el alelo de tipo silvestre con los exones TCCR denotados por bloques sólidos y los intrones como líneas interventoras. La ?" y *B" indican sitios de desdoblamiento para las endonucleasas EcoRI y BamHI respectivamente. La figura 9B representa el vector de dirección en donde los exones 3-8 de TCCR se han sustituido con el gen de resistencia a la neomicina del vector plásmido pGK-neo. El gen de timidina cinasa del virus de la herpes simple, se ha insertado 5' en el exon 1, un gen que proporciona resistencia a la presión selectiva del ganciclovir. La figura 9C es una representación del alelo agénico o final dirigido después de que ha sucedido la recombinación homologa entre el gen endógeno y el vector objetivo.

Las figuras 10A - lOC) son un manchado Southern, imagen de electroforesis de gel de una reacción PCR y un manchado Northern, respectivamente confirmando la transfección con el vector objetivo TCCR. En la figura 10A, el ADN genómico se toma de las células ES resistentes a la selección de fármacos de neomicina/ganciclovir y se hibridizan con una sonda radioetiquetada específica para TCCR. En la segunda pista desde la izquierda, la existencia de un fragmento de 10 kb y de uno de 12 kb indica que se ha extirpado por corte uno de los alelos TCCR. La figura 10B es el producto de reacción del ADN genómico amplificado por PCR de las colas de ratones TCCR-/-. Los cebadores PCR se diseñaron a manera de diferenciar entre el alelo TCCR de tipo silvestre y el alelo dirigido (* agónico") que resulta del evento de recombinación. Las pistas 1 y 2 (contadas desde la izquierda) muestran un patrón de banda indicador del TCCR de tipo silvestre. La pista 3 muestra una banda PCR de un ratón TCCR-/- y las pistas 5 y 6 son indicadoras del ratón del heterocigoto TCCR(+/-) . La figura 10C es un manchado Northern que se ha hibridizado con una sonda específica para el TCCR. La pista 1 es de un ratón TCCR -/- y la pista 2 es de ratón de tipo silvestre. La carencia de cualquier señal del ratón TCCR -/- indica que no hay un mARN funcional de longitud completa del TCCR que se produzca. Las figuras HA - 11B) indican un enriquecimiento de la inflamación alérgica de las vías respiratorias en los ratones TCCR -/-. La figura 11A muestra que los ratones TCCR -/- sensibilizados con el antígeno Dust Mite (DMA) producen una respuesta superior de Th2 como se mide por el número de linfocítos que infiltran el pulmón. Las figura 12A - 12B) son una representación gráfica de las respuestas Thl/Th2 en ratones TCCR-/-, como se mide por la producción de IFN-?. En la figura 12A, las células T aisladas de los ratones TCCR-/- se incuban con IL-12, lo que provoca la diferenciación a lo largo de la trayectoria Thl. Estas células se ensayan para su producción de IFN-?, IL-4 y IL-5. El IFN-? se produce a niveles significativamente menores en los ratones TCCR-/-co o se indica por las barras sombreadas más claras en la figura 12A. Esto indica una respuesta Thl grandemente disminuida en los ratones TCCR-/-. La figura 12B es una representación gráfica de las células T que se han incubado con IL-4 lo que provoca la diferenciación a lo largo de la trayectoria Th2. Esto no indica diferencia en la producción de citocina entre las células T de ratones TCCR-/- y las células de control de tipo silvestre.

La figura 13 es una representación gráfica de los niveles Ig producidos en ratones TCCR-/-. Los niveles de los sub-tipos IgGl, IgG2, IgG2b, IgG3, IgM y IgA se examinaron. Como se indica por las barras sombreadas más claras, los ratones TCCR-/- produjeron menos IgG2a que los controles de tipo silvestre. El resto de los niveles IgG no debería diferir significativamente. El IgG2a se produce por células Thl y su notable ausencia en los ratones TCCR-/- confirma la respuesta reducida Thl observada en otros ensayos presentados aquí. La figura 14 es una representación gráfica de los niveles IgG producidos en ratones TCCR-/- que se han inmunizado previamente con ovalbú ina. Se inyectaron los ratones con lOOµg de OVA ip en el día 1 y el 21, después se sangraron el día 26. Se midieron los niveles de IgGl y IgG2a en los ratones agénicos homocigotos en comparación con el tipo silvestre. Como se muestra en el lado izquierdo de la gráfica, los niveles de IgGl fueron equivalentes en el tipo silvestre y agénico, mientras que los niveles IgG2a fueron significativamente inferiores en el TCCR-/- agénico comparado por el tipo silvestre, reflejando una respuesta debilitada de Thl en los ratones TCCR-/-. Las figuras 15A - 15B) son una representación gráfica que muestran los tipos de células dentro de los esplenocitos de murina que expresan un TCCR. La figura 15A muestra niveles de expresión en célula CD4, CD8, CD9, NK1.1 y F4/80 con los niveles más altos en las células T CD4 y en las células exterminadoras naturales. La figura 15B muestra niveles de expresión dentro de las células ThO, Thl y Th2, siendo más alta la expresión en las células ThO y subreguladas con la diferenciación CD4 en las células Thl y Th2. La expresión de TCCR se detectó por PCR en tiempo real y se normalizó a rpll9, un gen de conservación ribosomal. Heid, C.A., y colaboradores, 1996, Genome Res., 6:986-94. Las figuras (16A - 16D) son una representación gráfica de la producción y proliferación de citocina inducidas por el antígeno por células de ganglios linfáticos de ratones deficientes en TCCR. Los ratones deficientes en TCCR y de tipo silvestre se inmunizaron con KLH en un adyuvante completo de Freund (CFA) . Se cosecharon los ganglios linfáticos 9 días después y se cultivaron en presencia de KLH como se indica y analiza por su capacidad para producir (figura 16B) IFN, (figura 16B) IL-4, (figura 16C) IL-5 o (figura 16D) para proliferar. Los datos se presentan como valores medios +/-SD que se derivaron de 5 animales en cada grupo. P<0.004 por la prueba T incompleta para los niveles IFN? entre WT y KO a ambas concentraciones de KLH.

Las figuras 17A - 17C) son una representación gráfica del efecto de las concentraciones de la subclase IgG y la sensibilidad a la infección por L. monocytogenes . Se recolectó suero de ratones deficientes en TCCR y de tipo silvestre, y se determinaron las concentraciones de la subclase IgG por ELISA (Figura 17A) . IgGl y IgG2a específico del OVA de ratones cebados con OVA/CFA. Se recolectó el suero del ratón deficiente en TCCR y de tipo silvestre que se inmunizaron con OVA en CFA y los niveles de IgGl (1:320000 dilución) y IgG2a (1:5000 dilución) se determinaron por ELISA especifica de OVA (figura 17B) . Se infectaron 5 ratones deficientes en TCCR o de tipo silvestre subcutáneamente con 3x1O4 CFU de L . monocytogenes . Tres o nueve días después, se cosecharon los hígados y se determinaron las concentraciones bacterianas (figura 17C) . Los datos se presentan como valores medios +/-SD que se derivaron de 5 animales en cada grupo. P<0.001 por la prueba T incompleta entre WT y KO en ambos puntos de tiempo. Las figuras 18A - 18D) es una representación gráfica de la inducción in vitro de la diferenciación y proliferación de células Th. Las células T CD4+ purificadas de los bazos de ratones deficientes en TCCR o de tipo silvestre, se diferenciaron dentro de las células Thl o Th2 (figura 18A) en presencia de ConA y se irradiaron con APC de tipo silvestre o (figura 18B) con anti-CD3 y anti-CD28 como estímulo. La producción de IFN e IL-4 se determinó por ELISA. Los datos representan los valores medios +/-SD de acumulados de 5 ratones por grupo. ND, no detectados. La figura 18c representa la proliferación de esplenocitos inducida por IL-12 de ratones deficientes en TCCR y de tipo silvestre. Se incubaron los esplenocitos activados con ConA por 24 horas en presencia de concentraciones crecientes de IL-12 como se indica. Se midió la proliferación de células por la incorporación de [3H] -timidina durante las 6 horas finales. La figura 18D representa niveles de mARN de IL-12R en esplenocitos no estimulados (barras blancas) y estimulados con ConA (barras negras) . Las células T esplénicas se estimularon con ConA por 72 horas y se determinaron los niveles de mARN para el IL-12R 1 y IL-12R 2 por PCR cuantitativa en tiempo real (Taqman) . El incremento en múltiplo es relativo a los niveles de ARN presentes en las células no estimuladas de tipo silvestre. La figura 19 muestra las secuencias de SEQ ID NO: 5-16 que representan los cebadores y sondas que se usaron con el análisis Taqman.

Descripción Detallada de las Modalidades Preferidas. 1. Definiciones . El término * enfermedad relacionada inmune" significa una enfermedad en la cual un componente del sistema inmune de un mamífero provoca, media o contribuye de otra manera a la morbilidad en el mamífero. También se incluyen enfermedades en las cuales la estimulación o intervención de la respuesta inmune tiene un efecto mejorador en la progresión de la enfermedad. Se incluyen dentro de este término las enfermedades inflamatorias mediadas inmunes, enfermedades inflamatorias mediadas no inmunes, enfermedades infecciosas, enfermedades de inmunodeficiencia, neoplasia, etc. El término ^padecimiento mediado por Thl" significa una enfermedad que se caracteriza por la sobreproducción de citocinas Thl, incluyendo aquellas que resultan de una sobreproducción o desviación en la diferenciación de células T dentro del sub-tipo Thl. Tales enfermedades incluyen, por ejemplo, enfermedades inflamatorias autoinmunes (por ejemplo, encefalomielitis alérgica, esclerosis múltiple, diabetes mellitus dependiente de la insulina, uveoretinitis autoinmune, tirotoxicosis, escleroderma, lupus sistémico eritematoso, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria del intestino (por ejemplo, enfermedad de Crohn, colitis ulcerante, enteritis regional, ileitis distal, enteritis granutomatosa, ileitis regional e ileitis terminal) , enfermedad autoinmune de la tiroides, anemia perniciosa) y rechazo a aloinjertos. El término *padecimiento mediado por el Th2" significa una enfermedad que se caracteriza por la sobreproducción de citocinas Th2, ' incluyendo aquellas que resultan de una sobreproducción o desviación en la diferenciación de células T dentro del sub-tipo Th2. Tales enfermedades incluyen, por ejemplo, la exacerbación de la infección con enfermedades infecciosas (por ejemplo Leishmania major, Mycobacterium leprae, Candida albicans, Toxoplasma gondi, virus sincitial respiratorio, virus de inmunodeficiencia humana, etc.) y padecimientos alérgicos tales como hipersensibilidad anafiláctica, asma, rinitis alérgica, dermatitis atópica, conjuntivitis vernal, eczema, urticaria, y alergias a los alimentos, etc. Ejemplos de otras enfermedades inflamatorias e inmuno-relacionadas, inmunes, algunas de las cuales están mediadas por los efectos (por ejemplo, perfiles de liberación de citocina) de la diferenciación de células T dentro de los subtipos Thl y Th2 y que se pueden tratar según la invención incluyen, lupus sistémico eritematoso, artritis reumatoide, artritis crónica juvenil, espondiloartropatías, esclerosis sistémica (escleroderma) , miopatías inflamatorias idiopáticas (dermatomiositis, polimiositis) , síndrome de Sjógren, vasculitis sistémica, sarcoidosis, anemia hemolítica autoinmune (pancitopenia inmune, hemoglobinuria nocturnal paroxismal) , trombocitopenia autoinmune) , púrpura idiopático trombocitopénico, trombocitopenia inmuno- mediada) , tiroiditis (enfermedad de Grave, tiroiditis de ' Hashimoto, tiroiditis linfocítica juvenil, tiroiditis atrófica) , enfermedades inflamatorias autoinmunes (por ejemplo, encefalomielitis alérgica, esclerosis múltiple, diabetes mellitus dependiente de la insulina, uveoretinitis autoinmune, tirotoxicosis, escleroderma, lupus sistémico eritematoso, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria del intestino (por ejemplo, enfermedad de Crohn, colitis ulcerante, enteritis regional, ileitis distal, enteritis granulomatosa, ileitis regional, ileitis terminal) , enfermedad autoinmune de la tiroides, anemia perniciosa) y rechazo de aloinjertos, diabetes mellitus, enfermedad renal inmuno-mediada (glomerulonefritis, nefritis túbulointersticial) enfermedades de desmielinizantes del sistema nerviosos central y periférico tales como esclerosis múltiple, polineuropatia desmielinizante idiopática o síndrome de Guillain-Barré y polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, enfermedades hepatobiliares tales como hepatitis infecciosa (hepatitis A, B, C, D, E, y otros virus no hepatotróficos) , hepatitis activa autoinmune crónica, cirrosis biliar primaria, hepatitis granulomatosa y colangitis esclerótica, enfermedad inflamatoria del intestino (colitis ulcerante, enfermedad de Crohn) enteropatía sensible al gluten y enfermedad de Whipple, enfermedades de la piel inmuno-mediadas o autoinmunes incluyendo enfermedades bulosas de la piel, eritema multiforme, y dermatitis de contacto, psoriasis, enfermedades alérgicas tales como asma, rinitis alérgica, dermatitis atópica, hipersensibilidad a los alimentos, urticaria, enfermedades inmunológicas del pulmón tales como neumonías eosinofílicas, fibrosis pulmonar idiopática y neumonitis hipersensible, enfermedades asociadas con los transplantes, incluyendo rechazo de injertos, enfermedad de injerto contra huésped. Las enfermedades infecciosas incluyen enfermedades virales tales como el SIDA (infección por VIH) , hepatitis A, B, C, D, E, herpes, etc., infecciones bacterianas, infecciones fúngales, infecciones por protozoarios, infecciones parasitarias, y virus síncitial respiratorio, virus de inmunodeficiencia humana, etc.) y padecimientos alérgicos, tales como hipersensibilidad anafiláctica, asma, rinitis alérgica, dermatitis atópica, conjuntivitis vernal, eczema, urticaria, y alergias a los alimentos, etc. 'Tratamiento" es una intervención llevada a cabo con el propósito de evitar el desarrollo o alterar la patología de un padecimiento. De esta manera, 'tratamiento" se refiere al tratamiento terapéutico y profiláctico, o a medidas preventivas en donde el objetivo es prevenir, aminorar (disminuir) o mejorar la condición patológica objetivo o padecimiento. Aquellos que necesitan del tratamiento, incluyen aquellos ya con el padecimiento así como aquellos en los cuales se va a evitar el padecimiento. En el tratamiento de una enfermedad inmuno-relacionada (por ejemplo, padecimiento mediado por el Th2 y mediado por el Thl), un agente terapéutico puede disminuir o incrementar directamente la magnitud de la respuesta de un componente patológico del padecimiento, o hacer la enfermedad más susceptible al tratamiento por otros agentes terapéuticos, por ejemplo, antibióticos, antifungales, agentes anti-inflamatorios, quimioterapéuticos, etc. El término 'cantidad efectiva" es la concentración mínima del polipéptido TCCR, agonista del mismo y/o antagonista del mismo que provoca, induce o resulta en una desviación detectable en la diferenciación de células T dentro del sub-tipo Thl o el sub-tipo Th2, y/o el perfil de liberación de citocina el cual secreta estos sub-tipos de células T. Adicionalmente, una 'cantidad terapéuticamente efectiva" es la concentración mínima (cantidad) de polipéptidos TCCR, agonistas de los mismos y/o antagonistas de los mismos, que serian efectivos en el tratamiento de los padecimientos mediados por Th2 o mediados por Thl . La administración 'crónica" se refiere a la administración de los agentes en una forma continua, en oposición a un modo agudo, con objeto de conservar el efecto inicial terapéutico (actividad) por un periodo prolongado de tiempo. Administración 'intermitente" es el tratamiento que no se hace consecutivamente sin interrupción, sino más bien es cíclico en naturaleza. La 'patología" de una enfermedad inmune relacionada incluye todos los fenómenos que comprenden el bienestar del paciente. Esto incluye, sin limitaciones, crecimiento celular anormal o incontrolable, producción de anticuerpos, producción de auto-anticuerpos, producción y activación del complemento, interferencia con el funcionamiento normal de las células vecinas, liberación de citocinas u otros productos secretores a niveles anormales, supresión o agravamiento de cualquier respuesta inflamatoria o inmunológica, infiltración de células inflamatorias (neutrofílicas, eosinofílicas, monocíticas, linfocíticas) dentro de espacios de tejidos, etc. 'Mamíferos", para propósitos del tratamiento, se refiere a cualquier animal clasificado como un mamífero, incluyendo humanos, animales domésticos y de granja, y de zoológico, animales de mascota, o de deporte tales como perros, caballos, gatos, ganado, ovejas, cerdos, cabras, conejos, etc. Preferiblemente el mamífero es un humano. Administración 'en combinación con" uno o más agentes terapéuticos adicionales incluye la administración simultánea (concurrente) y consecutiva en cualquier orden. 'Portadores" como se usa en la presente, incluye portadores, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables que no son tóxicos para la célula o mamífero que se expone a ellos en las dosis y concentraciones empleadas. A menudo el portador fisiológicamente aceptable es una solución acuosa amortiguada en el pH. Ejemplos de portadores fisiológicamente aceptables incluyen soluciones amortiguadoras tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de alrededor de 10 residuos) ; proteínas tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulina; polímeros hidrofílicos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos incluyendo glucosa, mañosa o dextrina; agentes quelantes como EDTA; alcoholes de azúcar tales como manitol o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; y/o tensoactivos no iónicos tales como TWEEN™, polietilen glicol (PEG) y PLURONICS™. El término 'agente citotóxico" como se usa aquí se refiere a una sustancia que inhibe o evita la función de las células y/o provoca la destrucción de la célula. El término se pretende que incluya isótopos radioactivos (por ejemplo I131, I125, Y90 y Re186), agentes quimioterapéuticos y toxinas tales como toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fungal, de plantas o animales, o fragmentos de las mismas. Un 'agente inhibidor del crecimiento", como se usa en la presente, se refiere a un compuesto o composición que inhibe el crecimiento de una célula, especialmente células de cáncer que sobre-expresan cualquiera de los genes aquí identificados, ya sea in vitro o in vivo. Así, el agente inhibidor del crecimiento es uno que reduce significativamente el porcentaje de células que sobre-expresan tales genes en la fase S. Los ejemplos de los agentes inhibidores del crecimiento incluyen agentes que bloquean la progresión del ciclo celular (en un lugar diferente a la fase S) , agentes tales que inducen la captura de Gl y la captura de la fase M. Los bloqueadores clásicos de la fase M incluyen las vincas (vincristina y vinblastina) , taxol, e inhibidores topo II, tales como doxorubicina, epirubicina, daunorubicina, etoposido, y bleomicina. Aquellos agentes que capturan el Gl también se distribuyen dentro de la captura de fase S, por ejemplo, agentes alquiladores del ADN tales como tamoxifen, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatina, metotrexato, 5-fluorouracil, y ara-C. Información adicional se puede encontrar en The Molecular Basic of Cáncer, Mendelsohn and Israel, eds., Capítulo 1, titulado 'Cell cycle regulation, oncogens, and antineoplastic drugs" por Murakami y colaboradores, (WB Saunders: Filadelfia, 1995), especialmente la página 13.

El término 'citocina" es un término genérico para las proteínas liberadas por una población de células que actúan sobre otras células como mediadores intercelulares. Ejemplos de tales citocinas son las linfocinas, monocinas y hormonas tradicionales de polipéptidos. Se incluyen entre las citocinas la hormona del crecimiento tal como la hormona del crecimiento humano. La hormona de crecimiento humano de N-metionilo y la hormona de crecimiento de bovino; hormona paratiroide, tiroxina, insulina, proinsulina, relaxina, prorelaxina, hormonas de glicoproteinas tales como la hormona estimuladora del folículo (FSH) , hormona estimuladora de la tiroides (TSH) , y hormona luteinizante (LH) , factor del crecimiento hepático, factor de crecimiento de fibroblasto, prolactina, lactógeno placental, factor-a y ß de necrosis de tumor, sustancia inhibidora muleriana, péptido asociado con la gonadotropina de ratón, inhibina, activina; factor de crecimiento endotelial vascular; integrina; trombopoyetina (TPO) ; factores de crecimiento de los nervios tal como NGF-ß; factor de crecimiento de plaquetas; factores de crecimiento transformantes (TGF) tal como TGF-a y TGF-ß; factor I y II de crecimiento similar a la insulina; eritropoyetina (EPO) ; factores osteoinductores; interferones tal como interferón -a, -ß y -?; factores estimulantes de las colonias (CSF) tal como macrófagos-CSF (M-CSF) ; granulocito- acrófago-CSF (GM-CSF) , y granulocito-CSF (G-CSF), interieucinas (IL) tal como IL-1, IL-la, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12; un factor de necrosis de tumor tal como TNF-a o TNF-ß; y otros factores de polipéptidos incluyendo LIF y ligando kit (KL) . Como se usa aquí, el término citocina incluye proteínas de fuentes naturales o de cultivos de células recombinantes y equivalentes biológicamente activos de las citocinas de la secuencia natural . Los términos 'polipéptido TCCR", 'proteina TCCR" o 'TCCR", cuando se usan aquí, abarcan secuencias nativas de TCCR y variantes de polipéptido de TCCR (que se definen además en la presente) . Se puede aislar el polipéptido TCCR a partir de diversas fuentes tal como de tipos de tejido humanos o de otra fuente, o preparados por métodos recombinantes y/o sintéticos. Un 'TCCR de secuencia natural" comprende un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos que un polipéptido TCCR derivado de la naturaleza. Tal secuencia natural TCCR se puede aislar de la naturaleza o se puede producir por medios recombinantes y/o sintéticos. El término 'TCCR de secuencia natural" abarca específicamente formas secretadas o truncadas que se presentan naturalmente (por ejemplo una secuencia de un dominio extracelular) , formas truncadas que se presentan naturalmente (por ejemplo, formas alternativamente empalmadas) y variantes alélicas que se presentan naturalmente del TCCR. En una modalidad de la invención, la secuencia humana natural TCCR es una secuencia TCCR natural, madura o de longitud completa, que comprende de 1 a 636 aminoácidos de la figura 3 (SEQ ID N0:1) . Similarmente, el TCCR de murina de la secuencia natural es una secuencia natural de longitud completa o madura de TCCR que comprende el aminoácido 1 al 623 de la figura 4 (SEQ ID NO.2) . También, aunque los polipéptidos TCCR descritos en la figura 3 (SEQ ID N0:1) y en la figura 4 (SEQ ID NO.2) se muestran que comienzan con el residuo de metionina designado en la presente como posición de aminoácido 1, es concebible y posible que otro residuo de metionina localizado en la dirección 5' o en la dirección 3' de la posición del aminoácido 1 en la figura 3 (SEQ ID NO.l) o en la figura 4 (SEQ ID NO: 2), se pueda emplear como el residuo de aminoácido de partida del polipéptido TCCR. El 'domino extracelular del polipéptido TCCR" o 'TCCR ECD" se refiere a la forma del polipéptido TCCR que está esencialmente libre de los dominios de transmembrana y citoplásmico. Ordinariamente, un polipéptido TCCR ECD tendrá menos de alrededor del 1% de tales dominios citoplásmicos y/o de transmembrana, y preferiblemente tendrá menos de alrededor de 0.5% de tales dominios. Se entenderá que cualquier dominio de transmembrana identificado para los polipéptidos TCCR de la presente invención, se identifican siguiendo los criterios empleados rutinariamente en el arte para identificar ese tipo de dominio hidrofóbico. Las fronteras exactas del dominio de transmembrana pueden variar, pero más probablemente no serán mayores a alrededor de 5 aminoácidos en cualquier terminación del dominio como se identifica inicialmente. Como tal, en una modalidad de la presente invención, el dominio extracelular del polipéptido humano TCCR comprende los aminoácidos 1 o alrededor de 33 hasta Xi, en donde Xx es cualquier residuo de aminoácidos desde el residuo 512 al residuo 522 de la figura 3 (SEQ ID N0:1). Similarmente, el domino extracelular del polipéptido de murina TCCR comprende los aminoácidos 1 ó alrededor de 25 para X2, en donde X2 es cualquier residuo de aminoácidos desde el residuo 509 al residuo 519 de la figura 4 (SEQ ID NO: 2) . 'Polipéptido de variante TCCR" significa un polipéptido activo TCCR como se define abajo, que tiene al menos alrededor de 80% de identidad de secuencias de aminoácidos con la secuencia de aminoácido de (ai) residuo 1 o alrededor de 33 a 636 del polipéptido humano TCCR como se muestra en la figura 3 (SEQ ID NO:l); (a2) residuo 1 o alrededor de 25 a 623 del polipéptido de murina TCCR mostrado en la figura 4 (SEQ ID NO:2); (bi) X3 a 636 del polipéptido humano TCCR mostrado en la figura 3 (SEQ ID NO:l), en donde X3 es cualquier residuo de aminoácido 27 a 37 de la figura 3 (SEQ ID NO:l); (b2) X4 a 623 del polipéptido de murina TCCR mostrado en la figura 4 (SEQ ID N0:2), en donde X4 es cualquier residuo de aminoácido desde 20 a 30 de la figura 4 (SEQ ID NO:2); (ci) 1 o alrededor de 33 a Xi, en donde Xi es cualquier residuo de aminoácido desde el residuo 512 al residuo 522 de la figura 3 (SEQ ID NO:l); (c2) 1 o alrededor de 25 hasta X2 en donde X2 es cualquier residuo de aminoácido desde el residuo 509 al 519 de la figura 4 (SEQ ID NO:2); (di) X5 a 636, en donde X5 es cualquier aminoácido del residuo 533 a 543 de la figura 3 (SEQ ID NO:l); (d2) X6 a 623, en donde X6 es cualquier aminoácido desde el residuo 527 a 537 de la figura 4 (SEQ ID NO:2), o (e) otro fragmento específicamente derivado de las secuencias de aminoácido mostradas en la figura 3 (SEQ ID NO:l) y en la figura 4 (SEQ ID NO: 2) . Tales polipéptidos de variantes TCCR incluyen, por ejemplo, los polipéptidos TCCR en donde uno o más residuos de aminoácidos se agregan o eliminan, en la terminación N y/o C, así como dentro de uno o más dominios internos de la secuencia de la figura 3 (SEQ ID N0:1) y la figura 4 (SEQ ID NO:2). Ordinariamente, un polipéptido de variante TCCR tendrá al menos alrededor de 80% de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos alrededor de 81% de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos alrededor de 82% de identidad de secuencia de aminoácidos, más pre eriblemente al menos alrededor de 83% de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos alrededor de 84% de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos alrededor de 85% de identidad de secuencia de aminoácido, más preferiblemente al menos alrededor de 86% de identidad de secuencia de aminoácido, más preferiblemente al menos alrededor de 87% de identidad de secuencia de aminoácido, más preferiblemente al menos alrededor de 88% de identidad de secuencia de aminoácido, más preferiblemente al menos alrededor de 89% de identidad de secuencia de aminoácido, más preferiblemente al menos alrededor de 90% de identidad de secuencia de aminoácido, más preferiblemente al menos alrededor de 91% de identidad de secuencia de aminoácido, más preferiblemente al menos alrededor de 92% de identidad de secuencia de aminoácido, más preferiblemente al menos alrededor de 93% de identidad de secuencia de aminoácido, más preferiblemente al menos alrededor de 94% de identidad de secuencia de aminoácido, más preferiblemente al menos alrededor de 95% de identidad de secuencia de aminoácido, más preferiblemente al menos alrededor de 96% de identidad de secuencia de aminoácido, más preferiblemente al menos alrededor de 97% de identidad de secuencia de aminoácido, más preferiblemente al menos alrededor de 98% de identidad de secuencia de aminoácido, más preferiblemente al menos alrededor de 99% de identidad de secuencia de aminoácido, con: (ai) residuo 1 o alrededor de 33 a 636 del polipéptido humano TCCR mostrado en la figura 3 (SEQ ID NO: 1); (a2) residuo 1 o alrededor de 25 a 623 del polipéptido TCCR de murina mostrado en la figura 4 (SEQ ID NO: 2); (fc>?) X3 para 636 del polipéptido humano TCCR mostrado en la figura 3 (SEQ ID NO: 1), en donde X3 es cualquier residuo de aminoácido 27 a 37 de la figura 3 (SEQ ID NO: 1); (b2) X4 a 623 del polipéptido de murina TCCR mostrado en la figura 4 (SEQ ID NO: 2), en donde X4 es cualquier residuo de aminoácido desde 20 hasta 30 de la figura 4 (SEQ ID NO: 2) ; (ci) 1 o alrededor de 33 hasta Xi en donde Xi es cualquier residuo de aminoácido del residuo 512 al residuo 522 y de la figura 3 (SEQ ID NO: 1); (c2) 1 o alrededor de 25 para X2, en donde X2 es cualquier residuo de aminoácido desde el residuo 509 al 519 de la figura 4 (SEQ ID NO: 2); (di) X5 para 636, en donde X5 es cualquier aminoácido desde el residuo 533 al 543 de la figura 3 (SEQ ID NO: 1); (d2) X6 a 623 en donde X6 es cualquier aminoácido desde el residuo 527 al 537 de la figura 4 (SEQ ID NO: 2) o (e) otro fragmento específicamente derivado de las secuencias de aminoácidos mostradas en la figura 3 (SEQ ID NO: 1) y en la figura 4 (SEQ ID NO: 2) .

Los polipéptidos de la variante TCCR son de al menos alrededor de 10 aminoácidos de longitud, a menudo alrededor de 20 aminoácidos de longitud, más a menudo al menos alrededor de 30 aminoácidos de longitud, más a menudo al menos alrededor de 40 aminoácidos de longitud, más a menudo al menos alrededor de 50 aminoácidos de longitud, más a menudo al menos alrededor de 60 aminoácidos de longitud, más a menudo al menos alrededor de 70 aminoácidos de longitud, más a menudo al menos alrededor de 80 aminoácidos de longitud, más a menudo al menos alrededor de 90 aminoácidos de longitud, más a menudo al menos alrededor de 100 aminoácidos de longitud, más a menudo al menos alrededor de 150 aminoácidos de longitud, más a menudo al menos alrededor de 200 aminoácidos de longitud, más a menudo al menos alrededor de 250 aminoácidos de longitud, más a menudo al menos alrededor de 300 aminoácidos de longitud, más a menudo al menos alrededor de 400 aminoácidos de longitud, más a menudo al menos alrededor de 500 aminoácidos de longitud, más a menudo al menos alrededor de 600 aminoácidos de longitud, o más . 'El porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos (%)" con respecto a las secuencias de polipéptidos identificadas en la presente, se define como el porcentaje de residuos de aminoácidos en una secuencia candidata que es idéntica con los residuos de los aminoácidos en una secuencia de los polipéptidos TCCR, después de alinear las secuencias e introducir espacios, si es necesario, para alcanzar el máximo porcentaje de identidad de secuencia, y no considerar ningunas substituciones conservadoras como parte de la identidad de secuencia. La alineación, para el propósito de determinar el porcentaje de identidad de secuencias de aminoácidos, se puede alcanzar de diversas maneras que están dentro de la habilidad en el arte, por ejemplo, usando un paquete de cómputo públicamente disponible tal como el BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 o Megalign (DNASTAR) . Aquellos con habilidad en el arte pueden determinar los parámetros apropiados para medir la alineación, incluyendo cualesquiera de los algoritmos necesarios para alcanzar la alineación máxima sobre la longitud completa de las secuencias que se comparan. Para los propósitos en la presente, sin embargo, los valores del porcentaje de identidad de la secuencia de aminoácidos se obtienen como se describen abajo, al usar el programa de cómputo para comparación de secuencias ALIGN-2, en donde el código fuente completo para el programa ALIGN-2 se suministra en la tabla 3 (A-Q) . El programa de cómputo para comparación de secuencias ALIGN-2, fue creado por Genetech, Inc., y el código fuente se muestra en la tabla 3 (A-Q) se ha presentado con la documentación del usuario en la oficina de derechos de autor de los Estados Unidos, Washington D.C., 20559, en donde se registró bajo el número de registro de derechos de autor en los Estados Unidos No. TXU510087. El programa ALIGN-2 está públicamente disponible a través de Genetech, Inc., South San Francisco, California o se puede integrar del código fuente proporcionado en la tabla 3 (A-Q) . El programa ALIGN-2, se debe integrar para su uso en un sistema operativo UNIX, preferiblemente el UNIX digital V4.0D. Todos los parámetros de comparación de secuencias se establecen por el programa ALIGN-2 y no varían. Para los propósitos en la presente, el porcentaje de identidad de las secuencias de aminoácidos de una secuencia A dada de aminoácidos para, con o contra una secuencia dada de aminoácidos B (que puede frasearse alternativamente como una secuencia dada A de aminoácidos que tiene o comprende un cierto porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos con, para o contra una secuencia dada de aminoácidos B) se calcula como sigue: 100 veces la fracción X/Y en donde X es el número de residuos de aminoácido registrados como correspondencias idénticas para el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 y esa alineación del programa de A y B, en donde Y es el número total de residuos de aminoácidos en B. Se apreciará que en donde la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el porcentaje de identidad de la secuencia de aminoácido de A para B no será igual al porcentaje de identidad de la secuencia de aminoácidos de B para A. Como ejemplos del porcentaje de los cálculos de identidad de secuencia de aminoácidos, la tabla 2 (A-B) demuestra como calcular el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos designada como 'proteína de comparación" con la secuencia de aminoácidos designada 'PRO" . A menos que se establezca específicamente de otra manera, todos los valores de identidad de secuencia de aminoácidos en porcentaje usados en la presente se obtienen como se describe anteriormente usando el programa de cómputo de comparación de secuencias ALIGN-2. Sin embargo, se puede también determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos usando el programa de comparación de secuencias NCBI-BLAST2 (Altschul y colaboradores, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)). El programa de comparación de secuencias NCBI-BLAST2 se puede descargar de http: // ww. ncbi .nlm.nih.gov o de otra forma obtenerse de los Institutos Nacionales de Salud Bethesda, MD, USA 20892. El NCBI-BLAST2 utiliza diversos parámetros de búsqueda, en donde todos esos parámetros de búsqueda se establecen a valores por eliminación incluyendo por ejemplo, no oculto = sí, hebra = todos, presencias esperadas = 10, longitud de complejidad baja mínima = 15/5, valor de multi-paso = 0.01, constante para multi-paso = 25, caída perpendicular para la alineación final espaciada = 25 y matriz de calificación = BLOSUM62. En situaciones en donde el NCBI-BLAST2 se emplea para comparaciones de secuencias de aminoácidos, el porcentaje de identidad de la secuencia de aminoácidos de una secuencia A dada de aminoácidos para, con o contra una secuencia B dada de aminoácidos (que se puede alternativamente frasear como una secuencia dada de aminoácidos A que tiene o comprende un cierto porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos para, con o contra una secuencia dada de aminoácidos B) se calcula como sigue: 100 veces la fracción X/Y en donde X es un número de residuos de aminoácidos registrados como correspondencias idénticas para el programa de alineación de secuencias NCBI-BLAST2, en esa alineación del programa de A y B, y donde Y es el número total de residuos de aminoácidos en B. Se apreciará que en donde la longitud de la secuencia A de aminoácidos no es igual a la longitud de la secuencia B de aminoácidos, el porcentaje de identidad de la secuencia de aminoácidos de A hasta B no será igual al porcentaje de identidad de la secuencia de aminoácidos de B hasta A. También se incluye dentro del término 'polipéptidos de la invención" los polipéptidos que en el contexto de las comparaciones de identidad de secuencia de aminoácidos llevadas a cabo como se describen arriba, incluyen residuos de aminoácidos en las secuencias comparadas que no son solamente idénticas, sino también aquellas que tienen propiedades similares. Estos polipéptidos se denominan 'positivos" . Los residuos de aminoácidos que registran un valor positivo para un residuo de aminoácido de interés, son aquellos que son ya sea idénticos con el residuo de aminoácidos de interés o son una substitución preferida (como se define en la tabla I abajo) del residuo de aminoácido de interés. Para los propósitos de la presente, el porcentaje en valor de positivos de una secuencia A dada de aminoácidos para, con o contra una secuencia dada B de aminoácidos (que se puede alternativamente frasear como una secuencia dada de aminoácidos A que tiene o comprende un cierto porcentaje de positivos para, con o contra una secuencia dada de aminoácidos B) se calcula como sigue: 100 veces la fracción X/Y en donde X es el número de residuos de aminoácidos que registran un valor positivo como se define arriba por el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en esa alineación del programa de A y B, y donde Y es el número total de residuos de aminoácidos en B. Se apreciará que en donde la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, los porcentajes positivos de A hasta B no serán iguales a los porcentajes positivos de B hasta A. 'Polinucleótido variante TCCR" o 'secuencia de ácido nucleico variante TCCR" significa una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido activo TCCR como se define abajo, y que tiene al menos alrededor de 80% de identidad de secuencia de ácido nucleico con una secuencia de ácido nucleico que codifica: (ai) residuos de aminoácidos 1 o alrededor de 33 a 636 del polipéptido humano TCCR mostrado en la figura 3 (SEQ ID NO: 1); (a2) residuos de aminoácidos 1 o alrededor de 25 hasta 623 del polipéptido de murina TCCR mostrado en la figura 4 (SEQ ID NO: 2); (bx) aminoácidos X3 a 633 del polipéptido TCCR mostrado en la figura 3 (SEQ ID NO: 1), en donde X3 es cualquier residuo de aminoácido desde 27 hasta 37 de la figura 3 (SEQ ID NO: 1); (b2) aminoácidos X4 hasta 623 del polipéptido TCCR mostrado en la figura 4 (SEQ ID NO: 2), en donde X4 es cualquier residuo de aminoácido desde 20 hasta 30 de la figura 4 (SEQ ID NO: 2) ; (ci) aminoácidos 1 o alrededor de 33 hasta Xi en donde Xi es cualquier residuo de aminoácido desde el residuo 512 hasta el residuo 522 y de la figura 3 (SEQ ID NO: 1) ; (c2) aminoácidos 1 o alrededor de 25 hasta X2, en donde X2 es cualquier residuo de aminoácido desde el residuo 509 al 519 de la figura 4 (SEQ ID NO: 2); (di) aminoácidos X5 hasta 636, en donde Xs es cualquier aminoácido desde el residuo 533 al 543 de la figura 3 (SEQ ID NO: 1); (d2) aminoácidos Xe hasta 623, en donde X6 es cualquier aminoácido desde el residuo 527 al 537 de la figura 4 (SEQ ID NO: 2) ; o (e) una secuencia de ácido nucleico que codifica otro fragmento específicamente derivado de la secuencia de aminoácido mostrada en la figura 3 (SEQ ID NO: 1) o figura 4 (SEQ ID NO: 2) . Ordinariamente, un polinucleótido de variante TCCR tendrá al menos alrededor de un 80% de identidad de secuencia de ácido nucleico, más preferiblemente al menos alrededor de 81% de identidad de secuencia de ácido nucleico, más preferiblemente al menos alrededor de 82% de identidad de secuencia de ácido nucleico, más preferiblemente al menos alrededor de 83% de identidad de secuencia de ácido nucleico, más preferiblemente al menos alrededor de 84% de identidad de secuencia de ácido nucleico, más preferiblemente al menos alrededor de 85% de identidad de secuencia de ácido nucleico, más preferiblemente al menos alrededor de 86% de identidad de secuencia de ácido nucleico, más preferiblemente al menos alrededor de 87% de identidad de secuencia de ácido nucleico, más preferiblemente al menos alrededor de 88% de identidad de secuencia de ácido nucleico, más preferiblemente al menos alrededor de 89% de identidad de secuencia de ácido nucleico, más preferiblemente al menos alrededor de 90% de identidad de secuencia de ácido nucleico, más preferiblemente al menos alrededor de 91% de identidad de secuencia de ácido nucleico, más preferiblemente al menos alrededor de 92% de identidad de secuencia de ácido nucleico, más preferiblemente al menos alrededor de 93% de identidad de secuencia de ácido nucleico, más preferiblemente al menos alrededor de 94% de identidad de secuencia de ácido nucleico, más preferiblemente al menos alrededor de 95% de identidad de secuencia de ácido nucleico, más preferiblemente al menos alrededor de 96% de identidad de secuencia de ácido nucleico, más preferiblemente al menos alrededor de 97% de identidad de secuencia de ácido nucleico, más preferiblemente al menos alrededor de 98% de identidad de secuencia de ácido nucleico, y todavía más preferiblemente al menos alrededor de 99% de identidad de secuencia de ácido nucleico con una secuencia de ácido nucleico que codifica los residuos de aminoácido: (ai) 1 o alrededor de 33 hasta 636 del polipéptido humano TCCR mostrado en la figura 3 (SEQ ID NO: 1); (a2) 1 o alrededor de 25 hasta 623 del polipéptido de murina TCCR mostrado en la figura 4 (SEQ ID 170: 2) ; (bi) X3 hasta 636 del polipéptido humano TCCR mostrado en la figura 3 (SEQ ID NO: 1), en donde X3 es cualquier residuo de aminoácido 27 hasta 37 de la figura 3 (SEQ ID NO: 1); (b2) X4 hasta 623 del polipéptido de murina TCCR mostrado en la figura 4 (SEQ ID NO: 2), en donde X4 es cualquier residuo de aminoácido desde 20 hasta 30 de la figura 4 (SEQ ID NO: 2); (c 1 o alrededor de 33 hasta Xi, en donde X es cualquier residuo de aminoácido desde el residuo 512 hasta el residuo 522 y de la figura 3 (SEQ ID NO: 1) ; (c2) 1 o alrededor de 25 hasta X2, en donde X2 es cualquier residuo de aminoácido desde el residuo 509 al 519 de la figura 4 (SEQ ID NO: 2) ; (di) X5 hasta 636, en donde X5 es cualquier aminoácido desde el residuo 533 al 543 de la figura 3 (SEQ ID NO: 1) ; (d2) Xß hasta 623, en donde X& es cualquier aminoácido desde el residuo 527 al 537 de la figura 4 (SEQ ID NO: 2) o (e) otro fragmento específicamente derivado de las secuencias de aminoácido mostradas en la figura 3 (SEQ ID NO: 1) y en la figura 4 (SEQ ID NO: 2) . Ordinariamente, los polinucleótidos variantes TCCR son de al menos alrededor de 30 nucleótidos de longitud, a menudo al menos alrededor de 60 nucleótidos de longitud, más a menudo al menos alrededor de 90 nucleótidos de longitud, más a menudo al menos alrededor de 120 nucleótidos de longitud, más a menudo al menos alrededor de 150 nucleótidos de longitud, más a menudo al menos alrededor de 180 nucleótidos de longitud, más a menudo al menos alrededor de 210 nucleótidos de longitud, más a menudo al menos alrededor de 240 nucleótidos de longitud, más a menudo al menos alrededor de 270 nucleótidos de longitud, más a menudo al menos alrededor de 300 nucleótidos de longitud, más a menudo al menos alrededor de 450 nucleótidos de longitud, más a menudo al menos alrededor de 600 nucleótidos de longitud, más a menudo al menos alrededor de 900 nucleótidos de longitud, o más. La 'identidad de secuencia de ácido nucleico en porcentaje (%)" con respecto a las secuencias de ácido nucleico que codifican al polipéptido TCCR identificado en la presente, se definen como el porcentaje de nucleótidos en una secuencia candidato que son idénticos con los nucleótidos en una secuencia codificadora del polipéptido de interés de la invención, después de alinear las secuencias e introducir espacios, si es necesario, para alcanzar el porcentaje máximo de identidad de secuencias. La alineación para propósitos de determinar la identidad de secuencia de ácido nucleico en porcentaje se puede alcanzar de diversas formas que están dentro de la habilidad en el arte, por ejemplo, usando paquetes de cómputo disponibles públicamente tales como BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 o Megalign (DNASTAR) . Aquellos con habilidad en el arte pueden determinar los parámetros adecuados para mediar la alineación, incluyendo cualesquiera de los algoritmos necesarios para lograr la alineación máxima sobre la longitud completa de las secuencias que se comparan. Para los propósitos en la presente sin embargo, se obtienen los valores de identidad de secuencia de ácido nucleico en porcentaje como se describe abajo, al usar el programa de computadora para comparación de secuencias ALIGN-2, en donde el código fuente completo para el programa ALIGN-2 se suministra en la tabla 3 (A-Q) . El programa de computadora para comparación de secuencias ALIGN-2 fue creado por Genetech Inc., y el código fuente que se muestra en la tabla 3 (A-Q) ha sido presentado con la documentación del usuario en la oficina de derechos de autor de Estados Unidos, Washington D.C., 20559, en donde está registrado bajo el número de registro de derechos de autor de los E.U. No. TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible públicamente a través de Genetech, Inc., South San Francisco, California o se puede compilar del código fuente proporcionado en la tabla 3 (A-Q) . El programa ALIGN-2 debe compilarse para su uso en un sistema operativo UNIX, preferiblemente UNIX V . OD digital. Todos los parámetros de comparación de secuencias se establecen por el programa ALIGN-2 y no varían. Para los propósitos de la presente, el porcentaje de identidad de secuencia de ácido nucleico de una secuencia C dada de ácido nucleico para, con o contra una secuencia D dada de ácido nucleico (que se puede frasear alternativamente como una secuencia C dada de ácido nucleico que tiene o comprende un cierto porcentaje de identidad de secuencia de ácido nucleico para, con o contra una secuencia dada de ácido nucleico D) , se calcula como sigue: 100 veces la fracción W/Z en donde W es el número de nucleótidos registrados como correspondencias idénticas por el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en esa alineación del programa de C y D, y en donde Z es el número total de nucleótidos en D. Se apreciará que en donde la longitud de la secuencia de ácido nucleico C no es igual con la longitud de la secuencia de ácido nucleico D, el porcentaje de identidad de secuencia de ácido nucleico de C hasta D no será igual al porcentaje de identidad de secuencia de ácido nucleico de D hasta C. Como ejemplos de los cálculos del porcentaje de identidad de secuencia de ácido nucleico, la tabla 2 (C-D) demuestra como calcular el porcentaje de identidad de secuencia de ácido nucleico de la secuencia de ácido nucleico designada como 'ADN de comparación" con la secuencia de ácido nucleico designada 'PRO-DNA" . A menos que se establezca específicamente de otra manera, todos los valores de identidad de secuencia de aminoácidos en porcentaje usados en la presente se obtienen como se describe anteriormente usando el programa de cómputo de comparación de secuencias ALIGN-2. Sin embargo, se puede también determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos usando el programa de comparación de secuencias NCBI-BLAST2 (Altschul y colaboradores, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)). El programa de comparación de secuencias NCBI-BLAST2 se puede descargar de http: //www.ncbi .nlm.nih. gov o de otra forma obtenerse de los Institutos Nacionales de Salud Bethesda, MD, USA 20892. El NCBI-BLAST2 utiliza diversos parámetros de búsqueda, en donde todos esos parámetros de búsqueda se establecen a valores por eliminación incluyendo por ejemplo, no oculto = sí, hebra = todos, presencias esperadas = 10, longitud de complejidad baja mínima = 15/5, valor 'e" multi-paso = 0.01, constante para multi-paso = 25, caída perpendicular para la alineación final espaciada = 25 y matriz de calificación = BLOSUM62. En situaciones en donde NCBI-BLAST2 se emplea para comparaciones de secuencias, el porcentaje de identidad de la secuencia de ácido nucleico de una secuencia C dada de ácido nucleico, para, con o contra una secuencia D dada de ácido nucleico (que se puede frasear alternativamente como una secuencia dada de ácido nucleico C que tiene o comprende un cierto porcentaje de identidad de secuencia de ácido nucleico para, con o contra una secuencia dada de ácido nucleico D) se calcula como sigue: 100 veces la fracción W/Z en donde W es el número de nucleótidos registrados como correspondencias idénticas por el programa de alineación de secuencias NCBI-BLAST2 en esa alineación del programa de C y D, y en donde Z es el número total de nucleótidos en D. Se apreciará que en donde la longitud de la secuencia de ácido nucleico C no es igual con la longitud de la secuencia de ácido nucleico D, el porcentaje de identidad de secuencia de ácido nucleico de C hasta D no será igual con el porcentaje de identidad de secuencia de ácido nucleico de D hasta C. En otras modalidades, los polinucleótidos variantes polipéptido activo de la invención, y que son capaces de hibridizar, preferiblemente bajo condiciones de hibridación y lavado severas, a las secuencias de nucleótidos que codifican el polipéptido de longitud completa de la invención. Los polipéptidos variantes de la invención incluyen aquellos que se codifican por un polinucleótido variante de la invención. El término 'positivos", en el contexto de las comparaciones de identidad de secuencia de aminoácidos ejecutadas como se describen anteriormente, incluyen residuos de aminoácidos en las secuencias comparadas, que no son solamente idénticos, sino también aquellos que tienen propiedades similares. Los residuos de aminoácidos que registran un valor positivo para un residuo de aminoácido de interés, son aquellos que son idénticos con los residuos de aminoácidos o son una substitución preferida (como se define en la tabla 1 abajo) del residuo de aminoácido de interés. Para los propósitos en la presente, el porcentaje en valor de positivos de una secuencia dada de aminoácidos A, para, con o contra una secuencia dada de aminoácidos B (que se puede frasear alternativamente como una secuencia dada de aminoácidos A que tiene o comprende un cierto porcentaje de positivos para, con o contra una secuencia dada de aminoácidos B se calcula como sigue: 100 veces la fracción X/Y en donde X es el número de residuos de aminoácidos que registran un valor positivo como se define arriba por el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en esa alineación del programa de A y B, y en donde Y es el número total de residuos de aminoácidos en B. Se apreciará que en donde la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual con la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el porcentaje de positivos de A hasta B no será igual al porcentaje de positivos de B hasta A. 'Aislado", cuando se usa para describir los diversos polipéptidos descritos en la presente, significa un polipéptido que ha sido identificado y separado y/o recuperado de un componente de su ambiente natural . Preferiblemente, el polipéptido aislado está libre de asociación con todos los componentes con los cuales se asocia naturalmente. Los componentes contaminantes de su medio natural son materiales que interferirían típicamente con los usos terapéuticos o de diagnóstico para el polipéptido, y pueden incluir enzimas, hormonas u otros solutos proteináceos o no proteináceos . En modalidades preferidas, el polipéptido se purificará (1) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia de aminoácidos interna o de la terminal N por el uso de un secuenciador de depósito rotatorio o (2) hasta homogeneidad por SDS PAGE bajo condiciones reductoras o no reductoras usando azul de Coomassie o preferiblemente teñido con plata. El polipéptido aislado incluye polipéptido in situ dentro de las células recombinantes, ya que al menos un componente del ambiente natural del TCCR no estará presente. Ordinariamente, sin embargo, se preparará el polipéptido aislado por al menos una etapa de purificación. Una molécula 'aislada" de ácido nucleico que codifica un polipéptido TCCR es una molécula de ácido nucleico que se identifica y separa de al menos una molécula contaminante de ácido nucleico con la cual se asocia ordinariamente en la fuente natural del ácido nucleico que codifica al TCCR. Preferiblemente, el ácido nucleico aislado está libre de asociación con todos los componentes con los cuales se asocia naturalmente. Una molécula aislada de ácido nucleico que codifica TCCR es diferente a la forma o parámetro en el cual se encuentra la naturaleza. Las moléculas aisladas de ácido nucleico, por lo tanto, se distinguen de las moléculas codificadoras del TCCR de ácido nucleico como existen en las células naturales. Sin embargo, una molécula aislada de ácido nucleico que codifica un polipéptido TCCR incluye moléculas de ácido nucleico que codifican al TCCR contenido en células que expresan ordinariamente TCCR en donde, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico está en una ubicación cromosomal diferente a aquella de las células naturales. El término 'secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificadora ligada operativamente en un organismo huésped particular. Las secuencias de control qué son apropiadas para las procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia de operador, y un sitio de enlace de ribosomas. Las células eucarióticas se conoce que utilizan, por ejemplo, promotores, señales de poliadenilación y enriquecedores .

El ácido nucleico se 'liga operativamente" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN para una pre-secuencia de un líder secretor se liga operativamente al ADN para un polipéptido si se expresa como una pre-proteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o enriquecedor se liga operativamente a una secuencia codificadora si le afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio de enlace de ribosomas se liga operativamente a una secuencia codificadora si se posiciona para facilitar la traducción. Generalmente, 'ligado operativamente" significa que las secuencias de ADN que se ligan son continuas, y en el caso del líder secretor, contiguas y en la misma estructura de lectura. Sin embargo, los enriquecedores no tienen que ser contiguos. La ligación se lleva a cabo por ligación en sitios de restricción convenientes. Si tales sitios no existen, se usan adaptadores o ligadores de oligonucleotidos sintéticos de conformidad con la práctica convencional. El término 'anticuerpo" se usa en su sentido más amplio, y cubre específicamente, por ejemplo, anticuerpos monoclonales anti-TCCR (incluyendo anticuerpos agonistas, antagonistas o neutralizantes) , composiciones de anticuerpos anti-TCCR con especificidad poliepitópica, anticuerpos anti-TCCR de cadena simple, y fragmentos de anticuerpos anti-TCCR (ver abajo). El término 'anticuerpo monoclonal" como se usa en la presente, se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos substancialmente homogéneos, esto es, los anticuerpos individuales que comprenden la población, son idénticos excepto por las mutaciones posibles que se presentan naturalmente, que pueden estar presentes en cantidades menores. La 'severidad" de las reacciones de hibridación, se determina fácilmente por alguien con habilidad ordinaria en el arte, y es generalmente un cálculo empírico que depende de la longitud de la sonda, temperatura de lavado y concentración de la sal. En general, las sondas más largas requieren temperaturas superiores para una combinación de los pares base complementarios adecuada, mientras que las sondas más cortas necesitan temperaturas inferiores. La hibridación depende generalmente de la capacidad del ADN desnaturalizado para volver a formar pares base complementarios cuando las hebras complementarias están presentes en un ambiente debajo de su temperatura de fusión. Entre mayor sea el grado de homología deseado entre la sonda y la secuencia hibridizable, mayor la temperatura relativa que se puede usar. Como resultado, sigue que las temperaturas superiores relativas tenderían a hacer las condiciones de reacción más severas, mientras que las temperaturas inferiores lo harían menos. Para detalles adicionales y explicación de la severidad de las reacciones de hibridación, ver Ausubel y colaboradores, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995) . Las 'condiciones severas" o 'condiciones de alta severidad" como se definen en la presente, se pueden identificar por aquellas que: (1) emplean una baja resistencia iónica y una alta temperatura para el lavado, por ejemplo cloruro de sodio 0.015 M / citrato de sodio 0.015 M / dodecil sulfato de sodio 0.1% a 50°C; (2) se emplea durante la hibridación un agente desnaturalizante tal como formamida, por ejemplo 50% (v/v) formamida con 0.1% de albúmina de suero de bovino/Ficoll 0.1%/0.1% de polivinilpirrolidona/50mM de solución amortiguadora de fosfato de sodio a un pH de 6.5 con cloruro de sodio 750 mM, citrato de sodio 75 mM a 42 °C; o (3) emplear formamida al 50%, 5 x SSC (0.75 M NaCl, 0.075 M citrato de sodio), fosfato de sodio 50 mM (pH 6.8), pirofosfato de sodio 0.1%, solución de Denhardt 5 x, ADN de esperma de salmón sonicado (50 ug/ml), SDS 0.1% y sulfato de dextrano al 10% a 42°C, con lavados a 42°C en 0.2 x SSC (cloruro de sodio/citrato de sodio) y formamida al 50% a 55°C, seguida por un lavado de alta severidad que consiste de 0.1 x SSC conteniendo EDTA a 55°C. Las 'condiciones moderadamente severas" se pueden identificar como se describen por Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluyen el uso de una solución de lavado y condiciones de hibridación (por ejemplo temperatura, resistencia iónica y porcentaje SDS) menos severas que aquellas anteriormente descritas. En una modalidad, las condiciones moderadamente severas involucran incubación durante la noche a 37 °C en una solución que comprende: formamida al 20%, 5 x SSC (150 mM citrato de sodio), 50 mM de fosfato de sodio (pH 7.6), solución de Denhardt 5 x, sulfato de dextrano al 10% y 20 mg/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado desnaturalizado, seguido por lavado de los filtros en 1 x SSC a alrededor de 37-50°C. El técnico habilitado reconocerá la forma de ajustar la temperatura, resistencia iónica, etc., como sea necesario, para acomodar factores tales como la longitud de la sonda y similares. El término 'etiquetado en el epítope" cuando se usa en la presente, se refiere a un polipéptido quimérico que comprende un polipéptido de la invención fundido a un 'polipéptido de etiqueta" . El polipéptido de etiqueta tiene suficientes residuos para proporcionar un epítope contra el cual se puede hacer un anticuerpo, y todavía es lo suficientemente corto que no interfiere con la actividad del polipéptido al cual está fundido. El polipéptido etiquetado también es preferiblemente bastante único, de manera que el anticuerpo no reacciona de forma cruzada substancialmente con otros epítopes. Los polipéptidos de etiqueta adecuados tienen al menos 6 residuos de aminoácidos y usualmente entre 8 y 50 residuos de aminoácidos (preferiblemente entre alrededor de 10 y 20 residuos de aminoácidos) . 'Activo" o 'actividad" para los propósitos en la presente, se refiere a una forma o formas de proteínas de la invención que retienen las actividades biológicas y/o inmunológicas de un polipéptido TCCR que se presenta naturalmente o nativo, en donde la actividad 'biológica" se refiere a una función Biológica (ya sea inhibitoria o estimulatoria) provocada por un TCCR que se presenta naturalmente o nativo, diferente a la capacidad de servir como un antígeno en la producción de un anticuerpo contra un epítope antigénico poseído por el polipéptido que se presenta naturalmente o nativo de la invención. Similarmente, una actividad 'inmunológica" se refiere a la capacidad de servir como un antígeno en la producción de un anticuerpo contra un epítope antigénico poseído por un polipéptido que se presenta naturalmente o nativo de la invención. 'Actividad biológica" en el contexto de un anticuerpo u otra molécula que se puede identificar por ensayos de separación por exclusión descritos en la presente (por ejemplo una molécula pequeña orgánica o inorgánica, péptido, etc.), se usa para referirse a la capacidad de tal molécula para inducir o inhibir la infiltración de células inflamatorias dentro de un tejido, para estimular o inhibir la proliferación o activación de células T y para estimular o inhibir la liberación de citosina por las células. Otra actividad preferida es la permeabilidad vascular creciente o la inhibición misma. La actividad más preferida es la modulación de la respuesta Thl/Th2 (por ejemplo una respuesta elevada Th2 y/o disminuida Thl, una respuesta elevada Thl y/o disminuida Th2) . El término 'modulación" o 'modulante" significa la sobre regulación, sub-regulación o alteración de la fisiología efectuada por la diferenciación de las células T dentro de los subconjuntos Thl y Th2 (por ejemplo perfiles de liberación de citocinas) . Los procesos celulares dentro del alcance pretendido del término pueden incluir, pero no se limitan a: transcripción de genes específicos; funciones celulares normales tal como metabolismo, proliferación, diferenciaciones, adhesión, transducción de señal, apoptosis y procesos celulares anormales y de supervivencia tales como transformación, bloqueo de diferenciación y metástasis. El término 'antagonista" se usa en su sentido más amplio, e incluye cualquier molécula que bloquea parcial o completamente, inhibe o neutraliza una actividad biológica de un polipéptido TCCR de secuencia nativa de la invención descrito en la presente (por ejemplo, sub-regulación de una función celular Thl/Th2) . En una forma similar, el término 'agonista" se usa en su sentido más amplio e incluye cualquier molécula que imita, enriquece o estimula una actividad biológica de un polipéptido TCCR de secuencia nativa de la invención descrito en la presente. Las moléculas agonistas o antagonistas apropiadas incluyen específicamente anticuerpos agonistas o antagonistas o fragmentos de anticuerpos, fragmentos de variantes de una secuencia de aminoácidos de los polipéptidos nativos de la invención, péptidos, moléculas orgánicas pequeñas, etc. Los métodos para la identificación de agonistas o antagonistas de un polipéptido TCCR pueden comprender hacer contacto de un polipéptido TCCR con una molécula agonista o antagonista candidata y medir un cambio detectable en una o más actividades biológicas normalmente asociadas con el polipéptido TCCR (por ejemplo sobre-regulación/sub-regulación de una función o efecto celular Thl/Th2) . Una 'molécula pequeña" se define aquí por tener un peso molecular debajo de alrededor de 500 daltones, y es generalmente un compuesto orgánico. Los 'anticuerpos" (Abs) e 'inmunoglobulinas" (Igs) son glicoproteínas que tienen las mismas características estructurales generales. Aunque los anticuerpos muestran una especificidad de enlace a un antigeno específico, las inmunoglobulinas incluyen anticuerpos y otras moléculas similares de anticuerpo que carecen de especificidad de antígenos. Los polipéptidos del último tipo son, por ejemplo, producidos a niveles bajos por el sistema linfático y a niveles crecientes por los mielomas . El término 'anticuerpo" se usa en su sentido más amplio y cubre específicamente por ejemplo, anticuerpos monoclonales simples anti-TCCR (incluyendo anticuerpos neutralizantes agonistas, y antagonistas) , composiciones de anticuerpos anti-TCCR con una especificidad poliepitópica, anticuerpos anti-TCCR de cadena simple y fragmentos de anticuerpos anti-TCCR (ver abajo) . El término 'anticuerpo monoclonal" como se usa en la presente, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos substancialmente homogéneos, esto es, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por las mutaciones posibles que se presentan naturalmente, que pueden estar presentes en cantidades menores. El anticuerpo se puede enlazar a cualquier dominio del polipéptido de la invención que puede hacer contacto por el anticuerpo. Por ejemplo, el anticuerpo se puede enlazar a cualquier dominio extracelular del polipéptido o cuando se secreta el polipéptido completo, a. cualquier dominio en el polipéptido que esté disponible para el anticuerpo para el enlace. Los 'anticuerpos nativos" e 'inmunoglobulinas nativas", son usualmente glicoproteínas heterotetraméricas de alrededor de -150,000 daltones, compuestas de dos cadenas idénticas ligeras (L) y dos cadenas idénticas pesadas. Cada cadena ligera se liga a una cadena pesada por un enlace bisulfuro covalente, mientras que el número de uniones bisulfuro varía entre las cadenas pesadas de los diferentes isotipos de inmunoglobulina. Cada cadena ligera y pesada tiene también fuentes bisulfuro entre cadenas regularmente espaciadas. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido por diversos dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante en el otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera se alinea con el primer dominio constante .de la cadena pesada, y el dominio variable de cadena ligera se alinea con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que los residuos particulares de aminoácidos forman una interfase entre los dominios de variables de cadena ligera y cadena pesada. El término 'variable" se refiere al hecho de que ciertas porciones de los dominios variables difieren ampliamente en la secuencia entre los anticuerpos y se usan en el enlace y en la especificidad de cada anticuerpo en particular para su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye uniformemente a través de los dominios de variable de anticuerpos. Se concentra en tres o cuatro segmentos denominados 'regiones determinantes de la complementariedad" (CDR) o 'regiones hipervariables" en los dominios de variable de cadena ligera y de cadena pesada. Existen al menos dos (2) técnicas para determinar las CDR: (1) un enfoque basado en la variabilidad de secuencias de especies cruzadas (por ejemplo, Kabat y colaboradores, Sequences of Proteins of Immunological Interest .(National Institute of Health, Bethesda, MD 1987); y (2) un enfoque _ basado en estudios cristalográficos de complejos de antígeno-anticuerpo (Chothia, C. y colaboradores, Nature 342:877 (1989) ) . Sin embargo, con tal de que las dos técnicas describan residuos diferentes, se pueden combinar para definir un CDR híbrido. Las porciones más altamente conservadas de los dominios de variable se denominan la estructura (FR) . Los dominios de variable de cadenas ligera y pesada nativas comprenden cada uno cuatro o cinco regiones FR, adoptando principalmente una configuración de lámina ß, conectada por los CDR, que forman circuitos que conectan, y en algunos casos forman parte de, la estructura de la lámina ß. Los CDR en cada cadena se mantienen juntos en una proximidad cercana por las regiones FR y, con los CDR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de enlace del antígeno de anticuerpos (ver Kabat y colaboradores, NIH Publ. No. 91-3242, Vol. I, páginas 647-669 (1991) ) . Los dominios constantes no se involucran directamente en el enlace de un anticuerpo a un antígeno, sino que muestran diversas funciones de efector, tales como la participación del anticuerpo en la toxicidad celular dependiente del anticuerpo. Los 'fragmentos de anticuerpos" comprenden una porción de un anticuerpo intacto, preferiblemente el enlace de antígeno o la región variable del anticuerpo intacto. Ejemplos de los fragmentos de anticuerpos incluyen Fab, Fab', F(ab')2, y fragmentos Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales (Zapata y colaboradores, Protein Eng. 8(10) : 1057-1062 [1995]); moléculas de anticuerpos de cadena sencilla y anticuerpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticuerpos. La digestión de la papaína de los anticuerpos produce dos fragmentos de enlace de antigenos idénticos, denominados fragmentos 'Fab", cada uno con un sitio de enlace de antígenos sencillo, y un fragmento residual 'Fe", cuyo nombre refleja su capacidad para cristalizarse fácilmente. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de combinación de antígenos y que todavía puede reticular antígenos . El 'Fv" es el fragmento mínimo de anticuerpos que contiene un sitio completo de enlace y de reconocimiento de antígenos. Esta región consiste de un dímero de un dominio variable de cadena ligera y uno de cadena pesada en una asociación no covalente, rígida. Es en esta configuración que los tres CDR de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de enlace de antígeno en la superficie del dímero VH-VL. En conjunto, los seis CDR le otorgan una especificidad de enlace de antígeno al anticuerpo. Sin embargo, aún un dominio variable simple (o la mitad de un Fv que comprende solamente 3 CDR específicos de un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y enlazar antígenos, aunque a una menor afinidad que el sitio completo de enlace. El fragmento Fab también contiene el dominio constante de cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab por la adición de unos cuantos residuos en la terminación carboxi del dominio de cadena pesada CH1 incluyendo una o más cisteínas de la región de articulación del anticuerpo. El Fab'-SH es la designación en la presente para el Fab' en el cual el residuo o residuos de cisteína de los dominios constantes soportan un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')2 se producen originalmente como pares de los fragmentos Fab' que tienen cistelnas de articulación entre ellos.

También se conocen otros acoplamientos químicos de los fragmentos de anticuerpos. Las 'cadenas ligeras" de anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier especie de vertebrados, se puede asignar a uno de dos tipos claramente diferentes, denominados kappa (K) y lambda (?) , con base en las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes . Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, se pueden asignar las inmunoglobulinas a diferentes clases. Existen cinco principales clases de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG, y IgM, y varias de estas se pueden dividir además en subclases (isotipos), por ejemplo IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, y IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a los diferentes tipos de inmunoglobulina se denominan a, d, e, ?, y µ, respectivamente. Las estructuras de sub-unidad y las configuraciones tridimensionales de tipos diferentes de inmunoglobulina son bien conocidas. El término 'anticuerpo monoclonal" como se usa en la presente, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos substancialmente homogéneos, esto es, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos, excepto por mutaciones posibles que se presentan naturalmente, que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, se dirigen contra un sitio antigénico simple. Adicionalmente, en contraste con las preparaciones convencionales de anticuerpos (policlonales) que incluyen típicamente diferentes anticuerpos que se dirigen contra diferentes determinantes (epítopes), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un determinante simple en el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos en que se sintetizan por el cultivo de hibridomas, se descontaminan por otras inmunoglobulinas. El modificador 'monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como se obtiene de una población substancialmente homogénea de anticuerpos, y no se constituye como que requiere la producción del anticuerpo por algún método en particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales para usarse de conformidad con la presente invención, se pueden preparar por el primer método del hibridoma descrito por Kohler y colaboradores, Nature, 256:495 [1975], o se pueden hacer por métodos de ADN recombinante (ver por ejemplo, Patente U.S. No. 4,816,567). Los 'anticuerpos monoclonales" se pueden también aislar de las colecciones de anticuerpos de fagos que usan las técnicas descritas en Clackson y colaboradores, Nature 352:624-628 (1991) y Marks y colaboradores, Mol. Biol. 222:581-597 (1991), por ejemplo. Ver también las patentes de Estados Unidos Nos. 5,750,373, 5,571,698, 5,403,484 y 5,223,409 que describen la preparación de anticuerpos utilizando vectores de fagos y fagémídos . Los anticuerpos monoclonales específicamente en la presente, incluyen anticuerpos 'quiméricos" (inmunoglobulinas) en los cuales una porción de la cadena ligera y/o pesada es idéntica a, u homologa a las secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de una especie en particular, o que pertenecen a una clase o subclase particular de anticuerpos, mientras que el resto de la cadena o cadenas, es idéntica con, o es homologa con, las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otras especies, o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpos, así como fragmentos de tales anticuerpos, con la condición de que muestren la actividad biológica deseada (Patente U.S. No. 4,816,567, Morrison y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 [1984]). Las formas 'humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, de murina) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas o fragmentos de inmunoglobulinas de las mismas (tal como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras sub-secuencias de enlace de antígenos de anticuerpos) que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. Para la mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpos receptores) en las cuales los residuos de una región determinante de la complementariedad determinante (CDR) del receptor, se reemplaza por los residuos de un CDR de una especie no humana (anticuerpo donador) tal como ratón, rata o conejo, que tiene la especificidad deseada, afinidad y capacidad. En algunos casos, los residuos de la región de estructura (FR) Fv, de la inmunoglobulina humana, se substituyen por los residuos no humanos correspondientes, especialmente cuando aquellos residuos particulares de FR tienen impacto en la conformación del sitio de enlace y/o el anticuerpo en el espacio tridimensional. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor ni en el CDR importado o en las secuencias de estructuras. Estas modificaciones se hacen para refinar además y maximizar el desempeño del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá substancialmente todo de al menos uno, y típicamente dos, dominios de variable, en los cuales todas o substancialmente todas las regiones CDR corresponden con aquellas de la inmunoglobulina no humana, y todas o substancialmente todas las regiones FR, son aquellas de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado comprenderá óptimamente también, al menos una porción de la región constante de inmunoglobulina (Fe) , típicamente aquella de una inmunoglobulina humana. Para detalles adicionales, ver Jones y colaboradores, Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann y colaboradores, Nature, 322:323-329 [1988]; y Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992). Opcionalmente, el anticuerpo humanizado puede también incluir un anticuerpo 'primatizado" en donde la región de enlace del antígeno del anticuerpo se deriva de un anticuerpo producido por los monos macacos inmunizados con el antígeno de interés . Los anticuerpos que contienen residuos de monos del viejo mundo se describen, por ejemplo, en las Patentes U.S. Nos 5,658,570; 5,693,780; 5,681,722; 5,750,105; y 5,756,096. Los anticuerpos y fragmentos de los mismos en esta invención, incluyen también anticuerpos 'madurados por afinidad" en los cuales se altera un anticuerpo para cambiar la secuencia de aminoácidos de una o más de las regiones CDR y/o las regiones de estructura, para alterar la afinidad del anticuerpo o fragmento del mismo para el antígeno al cual se enlaza. La maduración de la afinidad puede resultar en un incremento o en una disminución en la afinidad del anticuerpo madurado para el antígeno con relación al anticuerpo de partida. Típicamente, el anticuerpo de partida será un anticuerpo humanizado, humano, quimérico o de murina, y el anticuerpo madurado por afinidad tendrá una mayor afinidad que el anticuerpo de partida. Durante el proceso de maduración, se cambian uno o más de los residuos de aminoácidos en los CDR o en las regiones de estructura, para un residuo diferente usando cualquier método estándar. Los métodos apropiados incluyen mutaciones de punto usando métodos de mutagénesis de cásete bien conocidos (Wells y colaboradores, 1985, Gene 34:315) o métodos de mutagénesis mediada por oligonucleótidos (Zoller y colaboradores, 1987, Nucleic Acids Res., 10:6487-6504). La maduración por afinidad se puede también llevar a cabo usando métodos de selección conocidos en los cuales se producen diversas mutaciones y se seleccionan los mutantes que tienen la afinidad deseada a partir de un acumulado o colección de imitantes con base en la afinidad mejorada para el antígeno o el ligando. Las técnicas de despliegue de fagos conocidas, se pueden usar convenientemente en este enfoque. Ver por ejemplo U.S. 5,750,373; U.S. 5,223,409, etc. Los anticuerpos humanos están también dentro del alcance de los anticuerpos de la invención. Se pueden producir anticuerpos humanos usando diversas técnicas conocidas en el arte, incluyendo colecciones de despliegue de fagos [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol. 227:381 (1991); Marks y colaboradores, J. Mol. Biol., 222:581 (1991)]. Las técnicas de Colé y colaboradores, y Boerner y colaboradores, también están disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos (Colé y colaboradores, Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, página 77 (1985); Boerner y colaboradores, J. Immunol., 147(1): 86-95 (1991); U.S. 5,750,373). Similarmente, se pueden hacer anticuerpos humanos al introducir los lugares del cromosoma de la inmunoglobulina humana dentro de animales transgénicos, por ejemplo, ratones en los cuales los genes endógenos de la inmunoglobulina se han inactivado parcial o completamente. Con la aplicación de la prueba inmunogénica, se observa la producción de anticuerpos humanos, que se asemeja cercanamente a la que se observa en los humanos en todos los aspectos, incluyendo el rearreglo de genes, ensamble y repertorio de anticuerpos. Este enfoque se describe, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016, y en las siguientes publicaciones científicas: Marks y colaboradores, Bio/Technology 10:779-783 (1992); Lonberg y colaboradores, Nature 368:856-859 (1994); Morrison, Nature 368:812-13 (1994); Fishwild y colaboradores, Nature Biotechnology 14:845-51 (1996); Neuberg, Nature Biotechnology 14: 826 (1996); Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Im unol. 13:65-93 (1995). Los fragmentos de anticuerpos sFv o de cadena simple Fv comprenden los dominios VH y VL de anticuerpos, en donde estos dominios están presentes en una cadena simple de polipéptidos. Preferiblemente, el polipéptido Fv comprende además una unión de polipéptido entre los dominios VH y VL que permite al sFv formar la estructura deseada para el enlace de antígenos. Para una revisión del sFv ver Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., Springer-Verlag, Nueva York, páginas 269-315 (1994) . El término 'diacuerpos" se refiere a fragmentos pequeños de anticuerpos con dos sitios de enlace de antígenos, los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena de polipéptido (VH-VL) . Cuando se usa un enlazador que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios sobre la misma cadena, se fuerzan los dominios para aparearse con los dominios complementarios de la otra cadena y crear dos sitios de enlace de antígenos. Los diacuerpos se describen más completamente en, por ejemplo, EP 404,097; WO 93/11161; y Hollinger y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993) . El término 'aislado", cuando se refiere a los diversos polipéptidos de la invención, significa un polipéptido que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su ambiente natural. Los componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que interferirían con los usos diagnósticos o terapéuticos para el anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos o no proteináceos. En modalidades preferidas, el polipéptido de la invención se purificará (1) hasta más del 95% en peso del compuesto como se determina por el método de Lowry, y más preferiblemente más de 99% en peso, (2) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la terminal N o de la secuencia interna de aminoácidos por el uso de un formador de secuencias de recipiente giratorio, o (3) hasta homogeneidad por SDS-PAGE bajo condiciones reductoras o no reductoras usando azul de Coomassie o preferiblemente tinción de plata. El compuesto aislado, por ejemplo el anticuerpo o polipéptido, incluye el compuesto in situ dentro de las células recombinantes ya que no estará presente al menos un componente del ambiente natural del compuesto.

Ordinariamente, sin embargo, el compuesto aislado se preparará por al menos una etapa de purificación. La palabra 'etiqueta" cuando se usa en la presente se refiere a un compuesto o composición detectable que se conjuga directa o indirectamente al compuesto, por ejemplo anticuerpo o polipéptido, para generar un compuesto 'etiquetado". La etiqueta puede ser detectable por si misma (por ejemplo etiquetas de radio isótopos o etiquetas fluorescentes) o en el caso de la etiqueta enzimática, pueden catalizar la alteración química de un compuesto o composición de substrato que es detectable. Por 'fase sólida" quiere decir una matriz no acuosa a la cual se puede adherir el compuesto de la presente invención. Los ejemplos de las fases sólidas abarcados en la presente incluyen aquellos formados parcial o completamente de vidrio (por ejemplo vidrio de poro controlado) , polisacáridos (por ejemplo agarosa) poliacrilamidas, poliestireno, alcohol de polivinilo y silicones. En ciertas modalidades dependiendo del contexto, la fase sólida puede comprender el pozo de una placa de ensayo; en otros es una columna de purificación (por ejemplo una columna de cromatografía por afinidad) .

Este término incluye también una fase sólida discontinua de partículas discretas tales como aquellas descritas en la Patente U.S. No. 4,275,149.

Un 'liposoma" es una vesícula pequeña compuesta de diversos tipos de lípidos, fosfolípidos y/o tensoactivos que son útiles para la entrega de un fármaco (tal como los anticuerpos anti-Erb-2 descritos en la presente y opcionalmente, un agente quimioterapéutico) a un mamífero. Los componentes del liposoma se colocan comúnmente en una formación de bicapa, similar a la colocación de los lípidos de membranas biológicas. Como se usa en la presente, el término 'inmunoadhesina" designa moléculas similares a los anticuerpos que se combinan con la especificidad de enlace de una proteína heteróloga (una 'adhesina") con las funciones del efector de los dominios constantes de inmunoglobulina. Estructuralmente, las inmunoadhesinas comprenden una fusión de una secuencia de aminoácidos con la especificidad de enlace deseada que es diferente al reconocimiento del antígeno y el sitio de enlace de un anticuerpo (esto es, es 'heteróloga") y una secuencia de dominio constante de inmunoglobulina. La parte de la adhesina de una molécula de inmunoadhesina, es típicamente una secuencia contigua de aminoácidos que comprende al menos el sitio de enlace de un receptor o de un ligando. La secuencia de dominio constante de inmunoglobulina en la inmunoadhesina, se puede obtener de alguna inmunoglobulina tal como los subtipos IgG-1, IgG- 2, IgG-3, o IgG-4, IgA (incluyendo IgA-1 y IgA-2), IgE, IgD o IgM. II Composiciones y Métodos de la Invención. A. Polipéptido TCCR de Longitud Completa. La presente invención proporciona en parte, un método novedoso para el uso de polipéptidos TCCR, para tratar padecimientos inmuno-relacionados, incluyendo la modulación de la diferenciación de las células T dentro de los subtipos Thl y Th2, y al tratamiento del huésped de los padecimientos implicados con ello. En particular, los cADN que codifican los polipéptidos TCCR se han identificado, aislado, y su uso en el tratamiento de los padecimientos mediados por el Thl y el Th2 se describen con mayor detalle a continuación. Se observa que el TCCR define tanto a las moléculas de secuencia natural y a las variantes como se proporcionan en la sección de definición, aunque el término hTCCR y mTCCR define los polipéptidos de secuencia natural singular mostrados en las figuras 3 (SEQ ID NO:l) y 4 (SEQ ID NO: 2), respectivamente. Sin embargo por cuestiones de simplicidad, en la descripción actual la proteina codificada por ADN41419 (hTCCR) y/o ADN120632 (mTCCR) así como todos los homólogos naturales adicionales y variantes incluidos en la definición anterior de TCCR, se referirán como 'TCCR" independientemente de su origen o modo de preparación. La secuencia de aminoácidos predicha de las proteínas codificadas por ADN41419 (hTCCR, SEQ ID N0:1) y ADN120632 (mTCCR, SEQ ID NO: 2) se pueden determinar de la secuencia de nucleótidos usando habilidad de rutina. Para el polipéptido TCCR y la codificación del ácido nucleico aquí descrito, las solicitantes han identificado lo que se considera la estructura de lectura mejor identificable con la información de secuencias disponibles hasta este momento . Con el uso del programa de computadora de alineación de secuencias ALIGN-2 anterior, se ha encontrado que la secuencia natural de longitud completa hTCCR (figura 3, SEQ ID NO:l) y mTCCR (figura 4, SEQ ID NO: 2) tienen un cierto grado de identidad de secuencias con la secuencia de Dayhoff (GenBank) que tienen los números de acceso 475327 y 7710109. B. Variantes TCCR. Además de los polipéptidos TCCR de secuencias naturales de longitud completa aquí descritos, se contempla que se pueden preparar variantes de TCCR. Las variantes de TCCR se pueden preparar al introducir cambios adecuados de nucleótidos dentro del ADN del TCCR y/o por síntesis del polipéptido deseado TCCR. Aquellos con habilidad en el arte, apreciarán que los cambios de aminoácidos pueden alterar los procesos post-traduccionales del TCCR, tales como el cambio del número o posición de los sitios de glicosilación o la alteración de las características de anclaje de las membranas. Las variaciones en la secuencia TCCR natural de longitud completa, o en diversos dominios del polipéptido del TCCR aquí descrito, se pueden hacer, por ejemplo, usando cualquiera de las técnicas y lineamientos para mutaciones conservadoras y no conservadoras, establecidas por ejemplo, en la Patente U.S. No. 5,364,934. Las variaciones pueden ser una sustitución, eliminación, o inserción de uno o más codones que codifican al TCCR, que resultan en un cambio en la secuencia de aminoácidos del TCCR en comparación con la secuencia natural TCCR. Opcionalmente, la variación es por sustitución de al menos un aminoácido con algún otro aminoácido en uno o más de los dominios del TCCR. La guia para determinar cual residuo de aminoácido se puede insertar, sustituir o eliminar sin afectar adversamente la actividad deseada, se puede encontrar al comparar la secuencia del TCCR con aquella de las moléculas homologas de proteínas conocidas, y minimizar el número de cambios en la secuencia de aminoácidos hechos en las regiones de alta homología. Las sustituciones de aminoácidos pueden ser el resultado de reemplazar un aminoácido con otro aminoácido que tiene propiedades químicas y/o estructurales similares, tales como el reemplazo de una leucina con una serina, esto es, reemplazos conservadores de aminoácidos. Las inserciones o eliminaciones pueden estar opcionalmente en el intervalo de alrededor de 1 hasta 5 aminoácidos. La variación permitida se puede determinar al hacer sistemáticamente inserciones, eliminaciones o sustituciones de aminoácidos en la secuencia y probar las variantes resultantes para la actividad mostrada por la secuencia natural madura de longitud completa. Los fragmentos de polipéptidos TCCR de los polipéptidos de la invención, están también dentro del alcance de la invención. Tales fragmentos se pueden truncar en la terminación N o la terminación C, o pueden carecer de residuos internos, por ejemplo, cuando se comparan con una proteína natural de longitud completa. Ciertos fragmentos carecen de residuos de aminoácidos que no son esenciales para una actividad biológica deseada del polipéptido TCCR. Se pueden preparar los fragmentos TCCR por cualquier variedad de técnicas convencionales. Los fragmentos de péptidos deseados se pueden sintetizar químicamente. Un enfoque alternativo involucra la generación de fragmentos TCCR por digestión enzimática, por ejemplo, al tratar la proteína con una enzima conocida por desdoblar las proteínas en los sitios definidos por residuos particulares de aminoácidos, o al digerir el ADN con enzimas apropiadas de restricción y aislar el fragmento deseado. Todavía otra técnica apropiada involucra el aislamiento y amplificación de un fragmento de ADN que codifica un fragmento deseado del polipéptido, por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) . Los oligonucleótidos que definen los términos deseados de fragmento de ADN se emplean en los cebadores 5' y 3' en el PCR. Preferiblemente, los fragmentos de polipéptidos comparten al menos una actividad biológica y/o inmunológica con los polipéptidos TCCR mostrados en la figura 3 (SEQ ID NO:l) y la figura 4 (SEQ ID NO:2). En modalidades particulares, las sustituciones conservadoras de interés se muestran en la rabia 1, bajo el encabezado de sustituciones preferidas. Si tales sustituciones resultan en un cambio en la actividad biológica, entonces se introducen más cambios sustanciales, denominados sustituciones ejemplares en la tabla 1, o como se describe más adelante a continuación en referencia a las clases de aminoácidos, y se separan por exclusión los productos.

Tabla 1 Residuo Sustituciones Sustituciones Original E emplares Preferidas Ala A) val; leu; ile val Arg B) Lys; gln;asn lys Asn N) gln;hios; lys; arg gln Asp D) glu glu Cys C) ser ser Gln Q) asn asn Glu E) asp asp Gly G) pro; ala ala His H) asn; gln; lys; arg arg He I) leu; val;met; ala;phe; norleucina leu Leu L) norleucina; ile; al;met; ala; phe ile Lys K) arg;hln;asn arg Met M) leu; he; ile leu Phe ( F) leu; al; ile; ala; tyr leu Pro P) ala ala Ser S) thr thr Thr T) ser ser Trp ( W) tyr;phe tyr Tyr ( Y) trp;phe; thr; ser phe Val v) ile; leu;met; phe; ala; norleucina leu Las modificaciones sustanciales en la función o la ident .idad inmunológica del polipéptido de la invención, se logran al seleccionar sustituciones que difieren significativamente en su efecto para mantener (a) la estructura de la columna de polipéptido en el área de sustitución, por ejemplo como una conformación de la lámina o hélice, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio objetivo o (c) el grueso de la cadena lateral. Los residuos que se presentan naturalmente se dividen en grupos con base en sus propiedades comunes de cadena lateral: (1) hidrofóbico: norleucina, met, ala, val, leu, ile; (2) hidrofílico neutral: cys, ser, thr; (3) ácido: asp, glu; (4)básico: asn, gln, his, lys, arg; (5) residuos que tiene influencia en la orientación de la cadena: gly, pro, y (6) aromáticos : trp, tyr, phe. Las sustituciones no conservadoras ocasionarán el intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase. Se pueden también introducir tales residuos sustituidos dentro de los sitios de sustitución conservadora o, más preferiblemente dentro de los sitios restantes (no conservados) . Se pueden hacer variaciones usando los métodos conocidos en el arte tal como mutagénesis mediada por oligonucleótido (dirigida al sitio) , barrido de alanina, y mutagénesis PCR. La mutagénesis dirigida al sitio [Cárter y colaboradores, Nucí. Acids. Res., 13:4331 (1986); Zoller y colaboradores, Nucí. Acids Res., 10:6487(1987)], mutagénesis de cásete [Wells y colaboradores, Gene 34:315) (1985)], mutagénesis de selección por restricción [Wells y colaboradores, Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415(1986)] u otras técnicas conocidas, se pueden llevar a cabo en el ADN clonado para producir el ADN variante. El análisis de barrido de aminoácidos se puede también emplear para identificar uno o más aminoácidos junto con una secuencia contigua. Entre los aminoácidos de barrido preferidos, están los aminoácidos neutrales relativamente pequeños. Tales aminoácidos incluyen alanina, glicina, serina y cisteína. La alanina es típicamente un aminoácido de barrido preferido entre este grupo porque elimina la cadena lateral más allá del carbón-beta, y es menos probable de alterar la conformación de la cadena principal de la variante [Cunningham y Wells, Science, 244:1081-1085 (1989)]. La alanina también se prefiere típicamente porque es el aminoácido más común. Además, se encuentra frecuentemente en las posiciones expuestas y ocultas [Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1(1976)]. Si la sustitución de alanina no resulta en cantidades adecuadas de variante, se puede usar un aminoácido isotérico. C. Modificaciones de TCCR. Se incluyen las modificaciones covalentes de TCCR dentro del alcance de esta invención. Un tipo de codificación covalente incluye hacer reaccionar los residuos de aminoácidos dirigidos de un polipéptido TCCR con un agente orgánico derivador que es capaz de reaccionar con las cadenas laterales seleccionadas o los residuos terminales N o C del TCCR. Es útil la derivación con agentes bi-funcionales, por ejemplo, para reticular el TCCR con una matriz o superficie de soporte insoluble en agua para usarse en el método para purificar anticuerpos anti-TCCR y viceversa. Los agentes de reticulado comúnmente usados incluyen, por ejemplo, esteres de 1, 1-bis (diazoacetil) -2-feniletano, glutaraldehído, N-hidroxisuccinimida, por ejemplo, esteres con el ácido 4-ácido salicílico, imidoésteres homobifuncionales, incluyendo esteres de disuccinimidil tal como 3, 3' -ditiobis (succinimidilpropionato) , maleimidas bifuncionales, tal como la N-bis-maleimido-1,8-octano y agentes tales como el metil-3- (p-azidofenil) ditio] propioimidato. Otras modificaciones incluyen la desamidación de residuos de glutaminilo y asparaginilo para los residuos correspondientes glutamilo y aspartilo, respectivamente, la hidroxilación de la prolina y la lisina, la fosforilación de grupos hidroxilo de residuos de serilo o treonilo, la metilación de los grupos a-amino de lisina, arginina, y de cadenas laterales de histidina [T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, páginas 79-86 (1983)], la acetilación de la amina N-terminal, y la amidación de cualquier grupo carboxilo C-terminal. Otro tipo de modificación covalente del polipéptido de la invención, incluida dentro del alcance de esta invención, comprende alterar el patrón natural de glicosilación del polipéptido. Al "alterar el patrón natural de glicosilación" se pretende en los propósitos de la presente, significar la eliminación de una o más porciones de carbohidratos que se encuentran en el polipéptido de secuencia natural (ya sea al separar el sitio de glicosilación subyacente o al eliminar la glicosilación por medios químicos y/o enzimáticos) , y/o agregar uno o más sitios de glicosilación que no están presentes en la secuencia natural. Además, la frase incluye cambios cualitativos en la glicosilación de las proteínas naturales, involucrando un cambio en la naturaleza y proporción de diversas porciones presentes de carbohidratos.

La adición de los sitios de la glicosilación al polipéptido, se puede llevar a cabo al alterar la secuencia de aminoácidos. La alteración se puede hacer, por ejemplo, por la adición de, o la sustitución por, uno o más residuos de serina o treonina al polipéptido de la secuencia natural (para los sitios de glicosilación ligados en 0) . La secuencia de aminoácidos se puede alterar opcionalmente a través de los cambios en el nivel del ADN, particularmente al mutar el ADN que codifica al polipéptido en bases pre-seleccionadas tales que se generen codones que se traducirán en los aminoácidos deseados . Otro medio para incrementar el número de porciones de carbohidratos en el polipéptido de la invención, es por acoplamiento químico o enzimático de los glicósidos al polipéptido. Tales métodos se describen en el arte, por ejemplo, en WO 87/05330 publicada el 11 de Septiembre de 1987 y en Aplin y Wriston, CRC Crit Rev. Biochem, páginas 259-306 (1981) . La separación de las porciones de carbohidratos presentes en el polipéptido de la invención se pueden llevar a cabo químicamente o enzimáticamente, o por la sustitución mutacional de codones que codifican a los residuos de aminoácidos que sirven como objetivos para la glicosilación. Se conocen en el arte las técnicas de desglicosilación química y se describen, por ejemplo, en Hakimuddin, y colaboradores, Arch. Biochem. Biophys., 259-52 (1987) y por Edge y colaboradores, Anal. Biochem., 118-131 (1981) . Se puede realizar el desdoblamiento enzimático de las porciones de carbohidratos en los polipéptidos, por el uso de una diversidad de endo- y exo-glicosidasas como se describen por Thotakura y colaboradores, Meth. Enzymol., 138-350 (1987). Otro tipo de modificación covalente comprende la unión del polipéptido de la invención con uno de una variedad de polímeros no proteináceos, por ejemplo, polietilen glicol (PEG), polipropilen glicol, o polioxialquilenos, en la forma establecida en las Patentes U.S. No. 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 ó 4,179,337. Los polipéptidos TCCR de la presente invención se pueden también modificar para formar una molécula quimérica que comprende al polipéptido de la invención fundido a otro polipéptido heterólogo o secuencia de aminoácidos. En una modalidad, tal molécula quimérica comprende una fusión del polipéptido de la invención con un polipéptido de etiqueta que proporciona un epítope, al cual se puede enlazar selectivamente un anticuerpo anti-etiqueta. La etiqueta del epítope se coloca generalmente en la terminación amino o carboxilo del polipéptido de la invención. La presencia de tales formas etiquetadas con el epítope del polipéptido de la invención, se puede detectar usando un anticuerpo contra el polipéptido etiquetado. También, el suministro de etiquetas de epítope permite al polipéptido de la invención ser fácilmente purificado por purificación por afinidad usando un anticuerpo anti-etiqueta u otro tipo de matriz de afinidad que se enlaza a la etiqueta del epítope. Son bien conocidos en el arte diversos polipéptidos de etiqueta y sus anticuerpos efectivos. Ejemplos incluyen la poli-histidina (poly-his) o poli-histidina-glicina (poly-his-gly) en etiquetas; el polipéptido de etiqueta flu HA y su anticuerpo 12CA5 [Field y colaboradores, Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)]; la etiqueta c-myc y los anticuerpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 y 9E10 de la misma [Evan y colaboradores, Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616)]; y la glicoproteína D del virus de la herpes simple, etiqueta (gD) y su anticuerpo [Paborsky y colaboradores, Protein Engineering, 3(6): 547-553 (1990)]. Otros polipéptidos de etiqueta incluyen el péptido Flag [Hopp y colaboradores, BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)]; el péptido del epitope KT3 [Martin y colaboradores, Science, 255:192—194 (1992)]; un péptido del epítope de a-tubulina [Skinner y colaboradores, J.

Biol. Chem., 2666:15163-15166 (1991)]; y la etiqueta del péptido de la proteína 10 del gen T7 [Lutz-Freyermuth y colaboradores, Proc Nati. Acad Sci. USA, 87:6393-6397 (1990) ] . En una modalidad alternativa, la molécula quimérica puede comprender una fusión del polipéptido de la invención con una inmunoglobulina o una región particular de una inmunoglobulina. Para una forma bivalente de la molécula quimérica (también referida como una "inmunoadhesina") , tal fusión puede ser a la región Fe de una molécula IgG. Las fusiones Ig incluyen preferiblemente la sustitución de una forma soluble (dominio de transmembrana eliminado o inactivado) de un polipéptido de la invención en lugar de al menos una región variable dentro de una molécula Ig. En una modalidad particularmente preferida, la fusión de la inmunoglobulina incluye la articulación CH2 y CH3, o la articulación de las regiones CH1, CH2, y CH3 de una molécula IgGl. Para la producción de fusiones de inmunoglobulina ver también la Patente US No. 5,428,130 concedida el 27 de Junio del 1995. D. Preparación de TCCR. La descripción a continuación, se refiere principalmente a la producción de TCCR al cultivar células transformadas o transfectadas con un vector que contiene el ácido nucleico TCCR. Se contempla, por supuesto, que métodos alternativos que son bien conocidos en el arte se puedan emplear para preparar el TCCR. Por ejemplo, la secuencia TCCR o porciones de la misma se puede producir por síntesis directa de péptidos usando técnicas en fase sólida (ver por ejemplo, Stewart y colaboradores, Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154 (1963)]. Se puede llevar a cabo la síntesis de proteínas in vitro usando técnicas manuales o por automatización. La síntesis automatizada se puede llevar a cabo por ejemplo, usando un sintetizador de péptidos Applied Biosystems Peptide Synthesizer (Foster City, CA) , usando las instrucciones del fabricante. Se pueden sintetizar químicamente diversas porciones del TCCR separadamente y combinadas usando métodos químicos o enzimáticos para producir TCCR de longitud completa. 1. Aislamiento del ADN que codifica al polipéptido de la invención. El ADN que codifica el TCCR se puede obtener de una obtención de cADN preparada a partir del tejido que se cree que posee el mARN del TCCR y para expresarlo a un nivel detectable. De esta manera, se puede obtener convenientemente el ADN del TCCR humano de una colección cADN preparada a partir de tejido humano tal como se describe en los ejemplos. El gen que codifica al TCCR pueden también obtenerse de una conexión genómica o por síntesis de oligonucleótidos. Las librerías se pueden separar por exclusión por sondas (tales como anticuerpos para el polipéptido de la invención u oligonucleótidos de al menos alrededor de 20-80 bases) diseñados para identificar el gen de interés o la proteina codificada por él. La separación por exclusión del cADN o la colección genómica con las sondas seleccionadas, se puede llevar a cabo usando procedimientos estándar tales como los descritos en Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning; A Laboratory Manual (Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) . Un medio alternativo para aislar al gen que codifica al polipéptido de la invención, es el uso de la metodología PCR [Sambrook y colaboradores, supra; Dieffenbach y colaboradores, PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995) ] . Los ejemplos a continuación, describen técnicas para separar por exclusión una colección de cADN. Las secuencias de oligonucleótidos seleccionadas como sondas deberán ser de longitud suficiente y suficientemente no ambiguas para que se minimicen los positivos falsos. El oligonucleótido se etiqueta preferiblemente de manera que se puede detectar con la hibridación al ADN en la colección que se está separando por exclusión. Son bien conocidos en el arte los métodos de etiquetado, e incluyen el uso de radioetiquetas como el ATP etiquetado con 32P, la biotinilación o el etiquetado de enzima. Las condiciones de hibridación, incluyendo severidad moderada y alta severidad, se proporcionan en Sambrook y colaboradores, supra. Las secuencias identificadas en tales métodos de separación por exclusión de colecciones, se pueden comparar y alinear con otras secuencias conocidas depositadas y disponibles en las bases de datos públicas tales como el GenBank u otras bases de datos privadas de secuencias. Se puede determinar la identidad de secuencia (al nivel de aminoácido o de nucleótidos) dentro de las regiones definidas de la molécula o a través de la secuencia de longitud completa, usando métodos conocidos en el arte y como se describen en la presente. El ácido nucleico que tiene una secuencia de codificación de proteína, se puede obtener por separación, por exclusión del cADN seleccionado o de colecciones genómicas usando la secuencia deducida de aminoácidos descrita en la presente por la primera vez, y si es necesario, usar procedimientos de extensión del cebador convencionales como se describe en Sambrook y colaboradores, supra, para detectar precursores y procesar intermediarios del mARN que puede no haber sido transcritos de forma inversa dentro del cADN. 2. Selección y transformación de células huésped. Las células huésped se transfectan o transforman con vectores de expresión o clonación descritos en la presente para la producción de TCCR, y se cultivan en medios nutrientes convencionales modificados, como sea adecuado, para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. Las condiciones de cultivo tales como medios, temperatura, pH y similares, se pueden seleccionar por el técnico habilitado sin experimentación indebida. En general, se pueden encontrar los principios, protocolos y técnicas prácticas para maximizar la productividad de los cultivos de células en Mammalian Cell Biotechnology; A Practical Approach, M Butler, ed. (IRL Press, 1991) y Sambrook y colaboradores, supra. Los métodos de transfección se conocen por el técnico ordinariamente habilitado, por ejemplo, CaCl2, CaP04, mediado por liposomas y electroporación. Dependiendo de la célula huésped usada, se lleva a cabo la transformación usando técnicas estándar adecuadas para tales células. El tratamiento con calcio que emplea cloruro de calcio como se describe en Sambrook y colaboradores, supra, o la eletroporación, se usan generalmente por las procariotas u otras células que contienen barreras sustanciales célula-pared. La infección con Agrobacterium tumefaciens se usa para la transformación de ciertas células de plantas como se describe por Shaw y colaboradores, Gene, 23:315 (1983) y WO 89/05859 publicada el 29 de Junio de 1989. Para las células de mamífero sin tales paredes celulares, el método de precipitación del fosfato de calcio de Graham y van der Eb, Virology, 52:456-457 (1978) puede emplearse. Han sido descritos los aspectos generales de las transformaciones de sistemas de huésped de células de mamífero en la Patente U.S. No. 4,399,216. Las transformaciones en levadura se llevan a cabo típicamente según el método de Van Solingen y colaboradores, J. Bact. 130:946 (1977) y Hsiao y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. (USA), 76:3829 (1979). Sin embargo, otros métodos para la introducción de ADN dentro de la célula, pueden también usarse, tales como microinyección nuclear, electroporación, fusión de protoplasmas bacterianos con células intactas o policationes, por ejemplo, polibreno, poliornitina. Para diversas técnicas para la transformación de células de mamíferos, ver Keown y colaboradores, Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990) y Mansour y colaboradores, Nature, 336:348-352 (1988).

Las células huésped apropiadas para clonación o expresión del ADN en los vectores en la presente incluyen células procariotas, levaduras o células de eucariotas superiores. Las procariotas apropiadas incluyen, pero no se limitan a, las eubacterias tales como los organismos Gram-positivo y Gram-negativo por ejemplo Enterobacteriaceae tal como E. coli . Están disponibles públicamente diversas cepas de E. coli, tal como la cepa K12 del E. coli MM294 (ATCC31, 446) ; E. coli X1776 (ATCC31,537) ; E. coli cepa W3110 (ATCC27,325) y K5772 (ATCC 53,635). Otras células huésped procarióticas apropiadas incluyen En terobacteriaceae tal como Escherichia, por ejemplo, la cepa E. coli K12 MM294 (ATCC31,446) ; la E. coli X1776 (ATCC 31,537); cepa E. coli W3110 (ATCC 27,325) y K5 772 (ATTC 53,635), Enterobacter, Erwinia , Klebsiella , Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimirium, Serra tia , por ejemplo, Serratia marcescans, y Shigella, así como Bacilli tal como B. Subtilis y B . Lincheniformis (por ejemplo, B. Lincheniformis 41P descrita en DD266,710 publicada el 12 abril del 1989) , Pseudomonas tal como P. aeruginosa y Streptomyces . Estos ejemplos son ilustrativos más que limitativos. La cepa W3110 es un huésped particularmente preferido o _ huésped precursor debido a que es una cepa huésped común para fermentaciones de producto de ADN recombinante. Preferiblemente, la célula 1 segrega cantidades mínimas de enzimas proteolíticas. Por ejemplo, se puede modificar la cepa W3110 para efectuar una mutación genética en los genes que codifican proteínas endógenas para el huésped, con ejemplos de tales huéspedes incluyendo la cepa E. coli W3110 1A2, que tiene el genotipo completo tonA; la cepa E. coli W3110 9E4, que tiene el genotipo completo tonA ptr 3; la cepa E. coli W3110 27C7 (ATCC 55,244), que tiene los genotipos completos tonA ptr3 phoA E15 ( arg F-lac) 169 deg PompT kanr; la cepa E. coli W3110 37D6, que tiene el genotipo completo tonA ptr3 phoA E15 ( arg F-lac) 169 deg P ompT rbs l ilvG kan; la cepa E. coli W3110 40B4, que es la cepa 37D6 con una mutación de eliminación degP no resistente a la canamicina; y una cepa de E. coli que tiene la proteasa periférica mutante descrita en la Patente U.S. No. 4,946,83 concedida el 7 de Agosto del 1990. Alternativamente, son apropiados los métodos in vitro de clonación, por ejemplo PCR u otras reacciones en cadena de la polimerasa de ácido nucleico. Además de las procariotas, los microbios eucarióticos tales como los hongos o levaduras filamentosas son huéspedes apropiados de la clonación o expresión para vectores que codifican TCCR. La Saccharomyces cerevisiae se usa comúnmente como un microorganismo huésped eucariótico inferior. Otros incluyen Schizosaccharomyces pombe (Beach y Nurse, Nature 290:140 (1981); EP 139,383 publicado el 2 de Mayo de 1985); Kluveromyces hots (Patente U.S. No. 4,943,529; Fleer y colaboradores, Bio/technology 9: 968-975 (1991)) tal como por ejemplo K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt y colaboradores, J. Bacteriol. 154(2): 737 (1983); K. fragilis (ATTC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wicheramii (ATCC 24,178), K. wahii (ATC 56,500), K. drosophilarum (ATTC 36,906); Van den Barg y colaboradores, Bio/Technology 8: 135(1990)), K. thermotolerans y K. marxianus; yarrowia (EP 402,226); Pichia pastoris (EP 183,070); Sreekrishna y colaboradores, J. Basic Microbiol. 28:265-278 (1988); Candida; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa (Case y colaboradores, Proc. Acad. Sci. USA. 76:5259-5263 (1979); Schwanniomyces tal como Schwanniomyces occidentalis (EP 394,538 publicada el 31 de Octubre 1990) ; y hongos filamentosos tales como Neurospora , Penicilium, Tolypocladium (WO 91/00357 publicada el 10 de Enero del 1991), y huéspedes de Aspergillus tales como A. nidulans (Ballance y colaboradores, Biochem. Biophys. Res. Commun. 112:284-289(1983); Tiburn y colaboradores, Gene 26:205-221(1983), Yelton y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81: 1470-1474 (1984)) y A. niger (Kelly y Hynes, EMBO J. 4:475-479 (1985)). Levaduras metilotrópicas son apropiadas en la presente e incluyen, pero no se limitan a, levaduras capaces de crecimiento en metanol, seleccionadas de los géneros que consisten de Hansenula , Cadida , Kloeckera , Pichia , Saccharomyces, Torulopsis y Rhodotorula . Una lista de las especies específicas que son ejemplares para este tipo de levaduras se pueden encontrar en C. Anthony. The Biochemistry of Methylotrophs 269 (1982) . Las células huésped apropiadas para la expresión de polipéptidos glicosilados TCCR se derivan de organismos multicelulares. Ejemplos de las células de invertebrados incluyen células de insectos tales como Drosophila S2 y Spodoptera Sf9 y cinco altos así como células de plantas. Ejemplos de las líneas celulares huésped de mamíferos útiles incluyen células COS de ovario de hámster chino (CHO). Ejemplos más específicos incluyen la línea CV1 de riñon de mono transformada por SV40 (CSO-7, ATCC CRL 1651) ; linea de riñon embriónico humano (células 293 ó 293 subclonadas para crecimiento del cultivo en suspensión Graham y colaboradores, J. Gen Virol., 36:59 (1977)); células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub y Chasin, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)); células Sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol.

Reprod., 23:243-251 (1980)); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); y tumores mamarios de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51) . La selección de la célula huésped adecuada se considera que está dentro de la habilidad en el arte. 3. Selección y Uso de un Vector Replicable. El ácido nucleico (por ejemplo cADN o ADN genómico) que codifica el TCCR se puede insertar dentro de un vector replicable para clonación (amplificación del ADN) o para expresión. Están disponibles públicamente diversos vectores. El vector puede estar por ejemplo en forma de ün plásmido, partícula viral, fagémido o fago. La secuencia adecuada de ácido nucleico se puede insertar dentro del vector por una diversidad de procedimientos. En general, el ADN se inserta dentro de un sitio de restricción adecuado de endonucleasa usando las técnicas conocidas en el arte. Los componentes del vector incluyen generalmente, pero no se limitan a, una o más de una secuencia de señal, un origen de replícación, uno o más genes marcadores, un elemento enriquecedor, un promotor y una secuencia de terminación de la transcripción. La construcción de los vectores adecuados que contienen uno o más de estos componentes emplean técnicas estándar de ligación que se conocen por el técnico habilitado.

El TCCR se puede producir recombinantemente no sólo directamente sino también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, que puede ser una secuencia de señal u otro polipéptido que tiene un sitio de desdoblamiento específico en la terminación N de la proteína o polipéptido maduro. En general, la secuencia de señal puede ser un componente del vector o puede ser una parte del ADN que codifica al TCCR que se inserta dentro del vector. La secuencia de señal puede ser una secuencia de señal procariótica seleccionada por ejemplo, del grupo de la fosfatasa alcalina, penicilinasa, lpp, o líderes II de la enterotoxina estable al calor. Para la secreción de la levadura, la secuencia de señal puede ser por ejemplo, el lider de la invertasa de levadura, el líder del factor alfa (incluyendo líderes del factor-a Saccharomyces y Kluyveromyces , el último descrito en la Patente U.S. No. 5,010,182) o líder de la fosfatasa acida, el líder de la fosfatasa acida, el líder de la glucoamilasa C. albicans (EP 362,179 publicada el 4 de Abril de 1990), o la señal descrita en WO 90/13646 publicada el 15 de Noviembre de 1990. En la expresión de células de mamífero, se pueden usar secuencias de señal de mamífero para dirigir la secreción de la proteína, tal como secuencias de señal de polipéptidos secretado de especies iguales relacionadas, asi como líderes secretores virales. Los vectores de expresión y clonación, contienen una secuencia de ácido nucleico que permite replicar al vector en una o más células huésped seleccionadas. Tales secuencias son bien conocidas por una diversidad de bacterias, levaduras y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 es apropiado para la mayoría de las bacterias Gram-negativas, el origen de plásmido 2µ es apropiado para levadura y varios orígenes virales (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para vectores de clonación en células de mamíferos. Los vectores de expresión y clonación contendrán típicamente un gen de selección, también denominado como un marcador de selección. Los genes de selección típicos modifican proteínas que (a) le otorgan resistencia a los antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina (b) complementan las deficiencias auxotróficas, o (c) suministran nutrientes críticos que no están disponibles de medios complejos, por ejemplo, el gen que codifica la D-alanina racemasa para Bacilli . Un ejemplo de los marcadores de selección apropiados para células de mamíferos, son aquellos que permiten la identificación de células competentes para fijaciónr el ácido nucleico que codifica el polipéptido de la invención tal como la DHFR o timidina cinasa. Una célula huésped adecuada cuando se emplea un DHFR de tipo silvestre es la línea celular CHO deficiente en la actividad DHFR, preparada y propagada como se describe por Urlaub y colaboradores, Proc, Nati. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980). Un gen de selección apropiado para su uso en la levadura es en gen trpl presente en el plásmido de levadura YRp7 [Stinchcomb y colaboradores, Nature, 282:39 (1979); Kingsman y colaboradores, Gene, 7:141 (1979); Tschemper y colaboradores, Gene, 10:157 (1980)]. El gen trpl proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad de crecer en triptofano, por ejemplo, ATCC No. 44076 o PEP4-1 [Jones, Genetics, 85:12 (1977)]. Los vectores de expresión y clonación contienen usualmente un promotor ligado operativamente a la secuencia de ácido nucleico que codifica el TCCR para dirigir la síntesis de mARN. Son bien conocidos los promotores reconocidos por una diversidad de células huésped potenciales. Los promotores apropiados para su uso con huéspedes procarióticos incluyen la ß-lactamasa y los sistemas promotores de lactosa [Chang y colaboradores, Nature, 275:615 (1978); Goeddel y colaboradores, Nature, 281:544 (1979)]; fosfatasa alcalina, un sistema promotor de triptofano (trp) [Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,776], y promotores híbridos tal como el promotor tac [deBoer y colaboradores, Proc. Nati. Acad Sci. USA, 80:21-25 (1983) ] . Los promotores para su uso en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia Shine-Dalgarno (S.D.) ligada operativamente al ADN que codifica el TCCR. Los ejemplos de secuencias promotoras apropiadas para su uso con huéspedes de levadura, incluyen los promotores para la 3-fosfoglicerato cinasa [Hitzeman y colaboradores, J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)] u otras enzimas glicolíticas [Hess y colaboradores, J. Adv. Enzime Reg., 7:149 (1968); Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)], tales como la gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa, hexocinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructocinasas, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato cinasa, triosefosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa, y glucocinasa. Otros promotores de levadura, que son promotores de inducción que tienen la ventaja adicional de la transcripción controlada por condiciones de crecimiento, son las regiones promotoras para la alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa acida, enzimas degradantes asociadas en el metabolismo del nitrógeno, metalotioneína, gliceraldehído-3-fosfato deshídrogenasa, y enzimas responsables de la utilización de la maltosa y la galactosa. Los vectores y promotores adecuados para su uso en la expresión de levaduras se describen además en EP 73,657. La trascripción TCCR del polipéptido de la invención a partir de vectores en células huésped de mamífero se controla, por ejemplo, por los promotores obtenidos de los genomas de los virus tales como el virus del polioma, el virus de la viruela de la aves (UK 2,211,504 publicada el 5 de Julio 1989), adenovirus (tal como el Adenovirus 2) , virus del papiloma de bovino, virus del sarcoma de las aves, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis B y virus de los simios 40 (SV40) , de promotores mamíferos heterólogos, por ejemplo el promotor de la actina o un promotor de inmunoglobulina, y de promotores del choque por calor, con tal de que tales promotores sean compatibles con los sistemas celulares del huésped. La transcripción de un ADN que codifica el TCCR por eucaríotas superiores, puede ser incrementada al insertar una secuencia enriquecedora dentro del vector. Los enriquecedores son elementos que actúan en cis- del ADN, usualmente desde alrededor de 10 hasta 300 pares base, que actúan sobre un promotor para incrementar su transcripción. Muchas secuencias enriquecedoras se conocen ahora de genes de mamífero (globina, elastasa, albúmina, a-fetoproteína e insulina) . Típicamente, sin embargo, se usará un enriquecedor de un virus de célula eucariótica. Ejemplos incluyen el enriquecedor SV40 en el lado tardío del origen del replicación (100-270 pb) , el enriquecedor del promotor temprano del citomegalovirus, el enriquecedor del polioma en el lado tardío del origen de replicación, y enriquecedores de adenovirus. El enriquecedor se puede empalmar dentro del vector en una posición 5' ó 3' para la secuencia codificadora TCCR del polipéptido de la invención, pero se localiza preferiblemente en el sitio 5' del promotor. Los vectores de expresión utilizados en células huésped eucariótícas (levaduras, hongos, insectos, plantas, animales, humanos, o células nucleadas de otros organismos multicelulares) también contendrán secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para la estabilización del mARN. Tales secuencias están comúnmente disponibles desde las regiones no traducidas 5' y ocasionalmente 3' de ADN o cADN virales o eucarióticos. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción no traducida del mARN que codifica el TCCR.

Se describen todavía otros métodos, vectores y células huésped apropiadas para su adaptación a la síntesis del TCCR en cultivos de células recombinantes de vertebrados en Gething y colaboradores, Nature, 293:620-625 (1981); Mantei y colaboradores, Nature, 281:40-46 (1979); EP 117,060; y EP 117,058. 4. Ampli icación/Expresión de los Genes detectores . La amplificación y/o expresión de genes se puede medir en una muestra directamente, por ejemplo, por manchado Southern convencional, manchado Northern para cuantificar la transcripción del mARN [Thomas, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77:5201-5205 (1980)], manchado de punto (análisis de ADN) o hibridación in situ, usando una sonda adecuadamente etiquetada con base en las secuencias aqui proporcionadas. Alternativamente, se pueden emplear anticuerpos que pueden reconocer los dúplex específicos, incluyendo dúplex de ADN, dúplex de ARN, y dúplex híbridos de ADN-ARN o dúplex de proteína ADN. Los anticuerpos en turno, se pueden etiquetar y se puede llevar a cabo un ensayo en donde se enlaza el dúplex a una superficie, de manera que con la formación de un dúplex en la superficie, se puede detectar la presencia del anticuerpo enlazado al dúplex. Alternativamente, la expresión de genes se puede medir por métodos inmunológicos tales como tinción inmunohistoquímica de células o secciones de tejidos y el ensayo de cultivos celulares o de fluidos corporales, para cuantificar directamente la expresión del producto de genes. Los anticuerpos útiles para la tinción inmunohistoquímica y/o ensayos de fluidos de muestra pueden ser monoclonales o policlonales, y se pueden preparar en cualquier mamífero. Convenientemente, los anticuerpos se pueden preparar contra una secuencia natural, de polipéptido TCCR o contra un péptido sintético con base en las secuencias de ADN aquí proporcionadas o contra secuencias exógenas fundidas a un ADN TCCR que codifica al polipéptido de la invención y codifica un epítope de anticuerpo específico. 5. Purificación del Polipéptido. Las formas del TCCR se pueden recuperar del medio de cultivo o de los Usados de las células huésped. Si se enlaza a la membrana, se puede liberar de la membrana usando una solución apropiada de detergente (por ejemplo Triton®-X100) o por desdoblamiento enzimático. Las células empleadas en la expresión del polipéptido de TCCR se pueden dividir por diversos medios físicos o químicos, tales como un ciclo de congelación-deshielo, sonicación, disrupción mecánica, o agentes de lisado de célula. Se puede desear purificar el TCCR a partir de proteínas o polipéptidos de células recombinantes. Los siguientes procedimientos son ejemplares de procedimientos apropiados de purificación: por fraccionamiento sobre una columna de intercambio de iones; precipitación por etanol; CLAR de fase inversa; cromatografía sobre sílice o una resina de intercambio de cationes tal como la DEAE; cromatofocalización; SDS-PAGE; precipitación por sulfato de amonio; filtración por gel usando, por ejemplo, Sephadex G-75; columnas de proteina A de sefarosa para separar contaminantes tales como el IgG y columnas queladoras de metales para enlazarse a formas etiquetadas por epítopes del polipéptido de la invención. Se pueden emplear diversos métodos de purificación de proteínas, y se conocen en el arte tales métodos y se describen, por ejemplo, en Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purifcation: Principies and Practice, Springer-Verlag, Nueva York (1982) . Las etapas de purificación seleccionadas dependerán, por ejemplo, de la naturaleza del proceso de producción usado y el TCCR en particular producido. 6. Distribución del Tejido. La ubicación de los tejidos que expresan a los polipéptidos de la invención se puede identificar al determinar la expresión del mARN en diversos tejidos humanos. La ubicación de tales genes proporciona información acerca de los tejidos que más probablemente serán afectados por la estimulación y actividades inhibidoras de los polipéptidos de la invención. La ubicación de un gen en un tejido específico, también proporciona un tejido de muestra para los ensayos de bloqueo de actividad abajo descritos. Como se señala anteriormente, la expresión de genes en diversos tejidos, se puede medir por un manchado Southern convencional, manchado Northern para cuantificar la transcripción del mARN (Thomas, Proc. Nati. Acad. Sci, 77:5210-5205 [1980]), manchado de punto (análisis de ADN) , o hibridación in situ, usando una sonda adecuadamente etiquetada, con base en las secuencias proporcionadas en la presente. Alternativamente, se pueden emplear anticuerpos que pueden reconocer los dúplex específicos, incluyendo dúplex de ADN, dúplex de ARN y dúplex híbridos de ADN-ARN o dúplex de proteínas de ADN. Alternativamente, la expresión de genes en diversos tejidos, se puede medir por métodos inmunológicos tales como la tinción inmunohistoquímica de secciones de tejido y el ensayo de cultivo de células o fluidos corporales, para cuantificar directamente la expresión del producto de genes. Los anticuerpos útiles para la tinción inmunohistoquímica y/o el ensayo de fluidos de muestra pueden ser monoclonales o policlonales, y se pueden preparar en cualquier mamífero. Convenientemente, se pueden preparar los anticuerpos contra una secuencia natural de un polipéptido de la invención o contra un péptido sintético con base en las secuencias de ADN que codifican al polipéptido de la invención o contra una secuencia exógena fundida a un ADN que codifica un polipéptido de la invención y que codifica un epítope de anticuerpo específico. Las técnicas generales para la generación de anticuerpos, y los protocolos especiales para el manchado Northern y la hibridación in situ, se proporcionan a continuación. E. Usos del TCCR. 1. Usos Generales . El TCCR es de la clase WS(G)XWS de los receptores de citocina, con homología al receptor IL-12ß-2, G-CSFR y al receptor IL-6, teniendo la mayor homología con el receptor IL-12ß-2 (26% de identidad) . Estos receptores transducen una señal que puede controlar el crecimiento y diferenciación de las células, especialmente las células involucradas en el crecimiento y diferenciación de células sanguíneas. Por ejemplo, el G-CSF ha encontrado un amplio uso en aplicaciones clínicas para la proliferación de neutrófilos después de la quimioterapia. Estos tipos de receptores de citocina y agonistas/antagonistas, es probable que jueguen papeles importantes en el tratamiento de padecimientos hematológicos y oncológicos. El TCCR se ha encontrado que juega un papel en la respuesta de células de ayuda T, en particular en la modulación de la diferenciación de células T dentro de los subconjuntos Thl y Th2. Como resultado, el TCCR y sus agonistas/antagonistas pueden ser útiles en un método terapéutico para desviar la respuesta inmune en mamíferos a una respuesta 1 de ayuda T (Thl) o una respuesta 2 de ayuda T (Th2) , dependiendo de la meta terapéutica deseada. Las células T CD4+ juegan un papel crítico en las respuestas inflamatorias alérgicas al incrementar la acumulación, crecimiento y diferenciación de todos los otros tipos de células involucradas en la respuesta. Las células CD4+, llevan a cabo esta función al secretar diversas citocinas, incluyendo la interleucina (IL-4) y la IL-13, que incrementan la inducción de las síntesis de IgE en células B, el crecimiento de los mastocitos, y la acumulación de linfocitos, mastocitos y basófilos en los sitios de inflamación. Además, las células T CD4+ producen IL-5, que incrementa el crecimiento y diferenciación de los eosinófilos y células B, y el IL-10 que incrementa el crecimiento y diferenciación de mastocitos e inhibe la producción de ?-interferón. La combinación de IL-4, IL-5, IL-10 y IL-13 se produce por un subconjunto de células T CD4+ denominadas células Th2, que se encuentran en abundancia creciente en los individuos alérgicos. Las células Thl secretan citocinas importantes en la activación de macrófagos (IFN-?, IL-2, factor de necrosis de tumor-ß [TNF-ß] ) y en la inmunidad mediada inducida por células. Las células Th2 secretan citocinas importantes en la inmunidad humoral y las enfermedades alérgicas (IL-4 , IL-5 y IL-10) . Aunque las citocinas Thl inhiben la producción de la citocina Th2, las citocinas Th2 inhiben la producción de las citocinas Thl. Este circuito de retroalimentación negativa, acentúa la producción de los perfiles polarizados de citocinas durante las respuestas inmunes. El mantenimiento de un balance delicado entre la producción de estas citocinas "opuestas" es crítico, ya que se cree que la sobreproducción de citocinas Thl resulta en enfermedades inflamatorias autoinmunes y en el rechazo de aloinjerto. De manera concomitante, la sobreproducción de las citocinas Th2, resulta en enfermedades inflamatorias alérgicas tales como asma y rinitis alérgica, o inmunidad no efectiva para los patógenos intracelulares. Umetsu y DeKruyff, Proc. Soc. Exp. Bio. Med. 215(l):ll-20 (1997) han propuesto un modelo en donde la susceptibilidad para la infección se explica no solamente como una carencia de inmunidad, sino también como el desarrollo de células T que secretan un perfil adecuado _de citocinas. La enfermedad alérgica se provoca por las células T CD4+, que secretan inadecuadamente las citocinas Th2, mientras que los individuos no alérgicos permanecen asintomáticos debido a que desarrollan células T que secretan las citocinas Thl, que inhiben la síntesis IgE y los mastocitos y la diferenciación de eosinófilos. Establecido de otra manera, la rinitis alérgica y el asma pueden representar una aberración patológica o una tolerancia oral/mucosal, en donde las células T que normalmente desarrollarían células supresoras/regulatorias "Th2", desarrollan en su lugar las células "Th2" que inician e intensifican la inflamación alérgica. Los receptores de citocina se caracterizan generalmente por una estructura multi-dominio que comprende un dominio extra celular, un dominio de transmembrana y un dominio intracelular. El dominio extracelular funciona usualmente para enlazar el ligando, el dominio de transmembrana se ancla al receptor a la membrana de célula, y el dominio intracelular es usualmente un efector involucrado en la transducción de señal dentro de la célula. Sin embargo, las funciones de efector y de enlace al ligando pueden residir en subunidades separadas de un receptor multimérico. El dominio de enlace de ligando puede, por sí mismo, tener dominios múltiples. Los receptores multiméricos es un término amplio que incluye generalmente: (1) el homodimero; (2) heterodímeros que tienen sub-unidades con los dominios del efector y en enlace al ligando; y (3) los multímeros tienen sub-unidades componentes con funciones dispares. Los receptores de citocina se revisan y clasifican adicionalmente en Urdahl, Ann. Reports Med. Chem. 26:221-228 (1991) y Cosman, Cytokine 5:95-106 (1993). Además de los usos específicos inmuno-relacionados (por ejemplo, células Thl y Th2 con fisiología mediadas), las secuencias de nucleótidos (o su complemento) que codifican TCCR, tienen diversas aplicaciones en el arte de la biología molecular, incluyendo usos como sondas de hibridación, en el mapeo de cromosomas y genes y en la generación de ARN y ADN antisentido. El ácido nucleico TCCR será también útil para la preparación de polipéptidos TCCR por las técnicas recombinantes descritas en el arte. El gen TCCR de secuencia natural de longitud completa descrito en la figura 3 (SEQ ID NO:l) y en la figura 4 (SEQ ID NO:2), o porciones del mismo, se puede usar como sondas de hibridación para una colección de cADN para aislar el cADN TCCR de longitud completa o para aislar todavía otros cADN (por ejemplo, aquellos que codifican variantes que se presentan naturalmente de TCCR o de TCCR de otras especies) que tienen una identidad de secuencia deseada con la secuencia TCCR descrita en la figuras 3 y 4 (SEQ ID N0:1 y 2 respectivamente) . Opcionalmente, la longitud de las sondas será de alrededor de 20 a 50 bases. Las sondas de hibridación se pueden derivar de regiones de la secuencia de nucleótido de la SEQ ID NO: 1 y 2, en donde esas regiones se pueden determinar sin experimentación indebida o a partir de secuencias genómicas incluyendo promotores, elementos enriquecedores e intrones de la secuencia nativa TCCR. A manera de ejemplo, un método de separación por exclusión comprenderá el aislamiento de la región codificadora del gen TCCR usando la secuencia conocida de ADN para sintetizar una sonda seleccionada de alrededor de 40 bases. Se pueden etiquetar las sondas de hibridación por una diversidad de etiquetas, incluyendo radionucleótidos tales como 32P o 35S, o etiquetas enzimáticas tales como la fosfatasa alcalina acoplada con la sonda por medio de sistemas de acoplamiento de avidina/biotina . Las sondas etiquetadas que tienen una secuencia complementaria con aquella del gen TCCR de la presente invención, se pueden usar para separar por exclusión conexiones de cADN humano, ADN genómico o mARN para determinar cuales miembros de tales conexiones se hibridizan con las sondas. Las técnicas de hibridación se describen en mayor detalle en los ejemplos a continuación. Se pueden, similarmente, emplear como sondas cualquier fragmento de secuencia de EST u otros descritos en la presente, usando los métodos descritos en la presente. Otros fragmentos útiles de los ácidos nucleicos TCCR incluyen oligonucleótidos antisentido o sentido que comprenden una secuencia de hebra simple de ácido nucleico (ya sea ARN o ADN) , capaz de enlazarse al mARN del TCCR objetivo (sentido) o a la secuencia de ADN TCCR (antisentido) . Los oligonucleótidos antisentido o sentido, de conformidad con la presente invención, comprenden un fragmento de la región codificadora del ADN TCCR. Tal fragmento comprende generalmente al menos alrededor de 14 nucleótidos, preferiblemente desde alrededor de 14 hasta 30 nucleótidos. La capacidad de derivar un oligonucleótido antisentido o sentido, con base en una secuencia de cADN que codifica una proteína dada, se describe en, por ejemplo, Stein y Cohén, Cáncer Res. 48: 2659 (1988) y van der Krol y colaboradores, BioTechniques 6:958 (1988). El enlace de oligonucleótidos de sentido o antisentido a las secuencias objetivo de ácido nucleico, resulta en la formación de dúplex que bloquean la transcripción o traducción de la secuencia objetivo por uno de diversos medios, incluyendo la degradación enriquecida de los dúplex, terminación prematura de la transcripción o traducción o por otros medios. Los oligonucleótidos antisentido pueden así usarse para bloquear la expresión de las proteínas TCCR. Los oligonucleótidos de sentido o antisentido comprenden, además, oligonucleótidos que tienen estructuras modificadas de fosfodiéster-azúcar (u otras uniones de azúcar tales como aquellas descritas en WO 91/06629) y en donde tales uniones de azúcar son resistentes a las nucleasas endógenas. Tales oligonucleótidos con uniones de azúcar resistentes son estables in vivo (esto es, capaces de resistir la digestión enzimática) pero retienen la especificidad de secuencia para poder enlazarse a las secuencias objetivo de nucleótidos. Otros ejemplos de los oligonucleótidos de sentido o antisentido, incluyen aquellos oligonucleótidos que se unen covalentemente a porciones orgánicas, tales como aquellas descritos en WO 90/100048, y otras porciones que incrementan la afinidad del oligonucleótido para una secuencia objetivo de ácido nucleico tal como la poli (L-lisina) . Todavía además, los agentes intercaladores tales como la elipticina, y agentes alquilantes o complejos de metal, se pueden colocar a los oligonucleótidos de sentido o antisentido para modificar las especificidades de enlace de los oligonucleótidos de sentido o antisentido para modificar las especificidades de enlace para el oligonucleótido de sentido o antisentido de la secuencia de nucleótido objetivo. Los oligonucleótidos de sentido o antisentido se pueden introducir dentro de una célula que contiene la secuencia objetivo de ácido nucleico por cualquier método de transferencia de genes, incluyendo, por ejemplo, la transfección de ADN mediada por CaP0 , electroporación, o por el uso de vectores de transferencia de genes tales como el virus de Epstein-Barr. En un procedimiento preferido, se inserta un oligonucleótido antisentido o de sentido dentro de un vector retroviral apropiado. Se hace contacto con una célula que contiene la secuencia objetivo de ácido nucleico con el vector retroviral recombinante, ya sea in vivo o ex vivo. Los vectores retrovirales apropiados incluyen, pero no se limitan a aquellos derivados del retrovirus de murina M-MuLV, N2 (un retrovirus derivado de M-MuLV) , o a los vectores de copia doble designados DCT5A, DCT5B y DCT5C (ver WO 90/13641) . Se pueden también introducir los oligonucleótidos de sentido o antisentido dentro de una célula que contiene la secuencia objetivo de nucleótido por la formación de un conjugado con una molécula de enlace a los ligandos como se describe en WO 91/04753. Las moléculas de enlace a ligandos apropiadas incluyen, pero no se limitan a, receptores de la superficie celular, factores de crecimiento, otras citocinas, otros ligandos que enlazan a los receptores de la superficie celular. Preferiblemente, la conjugación de la molécula de enlace de ligando no interfiere sustancialmente con la capacidad de la molécula de enlace de ligandos para enlazar a su molécula correspondiente o receptor, o bloquear la entrada del oligonucleótido de sentido o antisentido o su versión conjugada dentro de las células. Alternativamente, un oligonucleótido de sentido o de antisentido se puede introducir dentro de una célula que contiene la secuencia objetivo de ácido nucleico por la formación de un complejo oligonucleótido-lípido como se describe en WO 90/10448. El complejo de oligonucleótido-lípido antisentido o de sentido se disocia preferiblemente dentro de la célula por una lipasa endógena. Se pueden también emplear las sondas en técnicas PCR para generar un acumulado de secuencias para la identificación de secuencias de codificación de TCCR cercanamente relacionadas.

Las secuencias de nucleótidos que codifican el TCCR se pueden también usar para construir sondas de hibridación para el mapeo del gen que codifica al TCCR y para el análisis genético de individuos con padecimientos genéticos. Las secuencias de nucleótidos proporcionadas en la presente, se pueden mapear para un cromosoma y regiones específicas de un cromosoma usando técnicas conocidas tales como la hibridación in situ, análisis de uniones contra marcadores cromosomales conocidos y separación por exclusión de hibridación con colecciones.

Ya que el TCCR es un receptor, las secuencias de purificación para el TCCR codifican una proteína que se enlaza con otra proteína. Como resultado, se pueden usar las proteínas TCCR de la invención en ensayos para identificar otras proteínas o moléculas involucradas en la interacción del enlace. Por tales métodos, se pueden identificar los inhibidores de la interacción de enlaces del ligando/receptor. Las proteínas involucradas en tales interacciones de enlace, se pueden también usar para separar por exclusión el péptido o inhibidores o agonistas de moléculas pequeñas de la interacción del enlace. También, el receptor TCCR se puede usar para aislar al ligando o ligandos correlativos. Los ensayos de separación se pueden usar para encontrar compuestos lideres que imitan la actividad biológica de un TCCR natural o un ligando para el TCCR. Tales ensayos de separación por exclusión incluirán ensayos responsables de la separación por exclusión de alta producción de las colecciones químicas, haciéndolos particularmente apropiados para identificar candidatos a fármacos de moléculas pequeñas. Las moléculas pequeñas contempladas incluyen compuestos orgánicos o inorgánicos sintéticos. Los ensayos se pueden llevar a cabo en una diversidad de formatos, incluyendo ensayos de enlace proteína-proteína, ensayos de separación por exclusión bioquímica, inmunoensayos y ensayos basados en células, que están bien caracterizados en el arte. Los polipéptidos TCCR descritos en la presente, se pueden también emplear como marcadores de peso molecular para propósitos de electroforesis de proteínas. Las moléculas de ácido nucleico que codifican a los polipéptidos TCCR o fragmentos de los mismos descritos en la presente, son útiles para la identificación de cromosomas. A este respecto, existe una necesidad constante de identificar los nuevos marcadores de cromosomas, ya que relativamente pocos reactivos marcadores de cromosomas, con base en los datos reales de secuencias, están actualmente disponibles. Se puede usar cada molécula de ácido nucleico TCCR de la presente invención como un marcador de cromosomas.

Los polipéptidos TCCR y moléculas de ácido nucleico de la presente invención, se pueden también usar para tipificación de tejidos, en donde los polipéptidos TCCR de la presente invención se pueden expresar diferencialmente en un tejido en comparación con el otro. Las moléculas de ácido nucleico TCCR encontraran uso para la generación de sondas para PCR, análisis Northern, análisis Southern y análisis Western. 2. Estudios de Enlace de Anticuerpos. La actividad de los polipéptidos TCCR de la invención, se puede además verificar por estudios de enlace de anticuerpos, en los cuales se prueba la capacidad de los anticuerpos anti-TCCR para inhibir el efecto de los polipéptidos TCCR en las células de tejidos. Los anticuerpos ejemplares incluyen anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados, biespecíficos, y heteroconjugados, la preparación de los cuales se describirá a continuación. Se pueden llevar a cabo estudios de enlace de anticuerpos en cualquier método conocido de ensayo, tales como ensayos competitivos de enlace, ensayos intercalados directos e indirectos y ensayos de inmnunoprecipitación. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, páginas 147-158 (CRC Press, Inc., 1987).

Los ensayos de enlace competitivo se soportan en la capacidad de un estándar etiquetado para competir con el analito de la muestra de prueba para enlazarse con una cantidad limitada de anticuerpos. La cantidad de proteína objetivo en la muestra de prueba es inversamente proporcional a la cantidad del estándar que se enlaza a los anticuerpos. Para facilitar la determinación de la cantidad del estándar que se enlaza, los anticuerpos se insolubilizan preferiblemente antes o después de la competición, de manera que el estándar y el analito que se enlazan a los anticuerpos se puedan separar convenientemente del estándar y del analito que permanecen sin enlazar. Los ensayos intercalados involucran el uso de dos anticuerpos, cada uno capaz de enlazarse a una diferente porción inmunogénica, o epítope, de la proteína a detectarse. En un ensayo intercalado, el analito de la muestra se enlaza por un primer anticuerpo que se inmoviliza sobre un soporte sólido, y de ahi en adelante un segundo anticuerpo se enlaza al analito formando así un complejo insoluble de tres partes. Ver, por ejemplo, Patente U.S. No. 4,376,110. El segundo anticuerpo puede por sí mismo etiquetarse con una porción detectable (ensayos de intercalado directo) o se puede medir usando un anticuerpo, anti-inmunoglobulina que se etiqueta con una porción detectable (ensayo de intercalado directo) . Por ejemplo, un tipo de ensayo intercalado es un ensayo ELISA en el cual la porción detectable es una enzima. Para la inmunohistoquímica, la muestra de tejido puede estar fresca o congelada o puede estar alojada en parafina y fijarse con un conservador tal como, por ejemplo, la formalina. 3. Ensayos Basados en Células . Los ensayos basados en células y los modelos animales para enfermedades inmuno-relacionadas se pueden usar para entender adicionalmente la relación entre los genes y los polipéptidos identificados en la presente y el desarrollo y patogénesis de la enfermedad inmuno-relacionada . En un enfoque diferente, se transfectan las células de un tipo de células conocido por involucrarse en una enfermedad particular inmuno-relacionada con los cADN aquí descritos, y se analiza la capacidad de estos cADN para estimular o inhibir la función inmune. Se pueden transfectar células apropiadas con el gen deseado y observarse para su actividad de función inmune. Tales líneas celulares transfectadas se pueden usar entonces para probar la capacidad de los anticuerpos poli o monoclonales, o las composiciones de anticuerpos para inhibir o estimular la función inmune, por ejemplo para modular la proliferación de células T o la infiltración de células inflamatorias. Las células transfectadas con la secuencia de codificación de los genes identificados en la presente, se pueden además usar para identificar candidatos a fármacos para el tratamiento de enfermedades inmuno-relacionadas . Además, se pueden usar cultivos primarios derivados de animales transgénicos (como se describe abajo) en los ensayos basados en células en la presente, aunque se prefieren lineas celulares estables. Las técnicas para derivar líneas celulares continuas de animales transgénicos son bien conocidas en el arte (ver por ejemplo, Small y colaboradores, Mol. Cell. Biol. 5, 642-648 [1985]). Un ensayo apropiado basado en células es la reacción mezclada de linfocitos (MLR) . Current Protocols in Immunology, unidad 3.12; editado por J. E. Coligan, A. M Kruisbeek, D. H. Margues, E. M. Shevach, W. Strober, National Institutes of Health, publicado por John Wiley & Sons, Inc. En este ensayo, se ensaya la capacidad de un compuesto de prueba para estimular o inhibir la proliferación de células T activadas. Se cultiva una suspensión de células T de respuesta con células T estimuladoras alogénicas, y la proliferación de las células T se mide por la fijación de la timidina titulada. Este ensayo es una medida general de la reactividad de células T. Ya que la mayoría de las células T responde a, y producen IL-2 con la activación, las diferencias en la respuesta en este ensayo reflejan en parte las diferencias en la producción IL-2 por las células de respuesta. Se pueden verificar los resultados MLR por un ensayo de detección de linfocina (IL-2) estándar. Current Protocols in Immunology, arriba, 3, 15, 6.3. Una respuesta proliferativa a las células T en un ensayo MLR, puede ser debido a propiedades mitogénicas directas de una molécula ensayada, o a la activación inducida por el antígeno externo. Se puede obtener la verificación adicional de la actividad estimulatoria de las células T de los polipéptidos de la invención, por un ensayo de co-estimulación. La activación de la célula T requiere una señal específica de antígeno mediada a través de un receptor de célula T (TCR) y una señal co-estimulatoria mediada a través de una segunda interacción de enlace de ligando, por ejemplo, la interacción B7(CD80, CD86)/CD28 de enlace. El reticulado del CD28 incrementa la secreción de linfocinas por las células T activadas. La activación de las células T tiene tanto controles negativos como positivos del enlace de los ligandos que tienen un efecto negativo o positivo. La CD28 y la CTLA-4 son glicoproteínas relacionadas en la superfamilia Ig que se enlazan a B7. El enlace del CD28 a B7 tiene un efecto positivo de co-estimulación de la activación de células T; inversamente, el enlace del CTLA-4 a B7 tiene un efecto negativo desactivante de células T. Chambers; C.A. y Allison, J.P., Curr. Opin. Immunol. (1997) 9:396. Schwartz, R.H., Cell (1992) 71:1065; Linsey, P.S. y Ledbetter, J. A., Annu. Rev. Immunol. (1993) 11:191; June, C.H. y colaboradores, Immunol. Today (1994) 15:321; Jenkins, M. K. I munity (1994) 1:405. En un ensayo de co-estimulación, se ensayan los polipéptidos de la invención para una actividad inhibitoria o co-estimulatoria de las células T. Los polipéptidos de la invención, así como otros compuestos de la invención que son estimuladores (co-estimuladores) de la proliferación de células T y agonistas, por ejemplo anticuerpos de agonistas, a los mismos como se determinan por MLR y ensayos de co estimulación, por ejemplo, son útiles en el tratamiento de enfermedades inmuno-relacionadas, y que se caracterizan por una función inmune pobre, sub-óptima o inadecuada. Estas enfermedades se tratan al estimular la proliferación y activación de células T (por ejemplo, inmunidad mediada por células T, producción de citosina Thl y/o Th2) y el enriquecimiento de la respuesta inmune en un mamífero a través de la administración de un compuesto estimulatorio, tal como los polipéptidos estimulatorios de la invención. El polipéptido estimulatorio puede, por ejemplo, ser un polipéptido del ligando TCCR o un anticuerpo antagonista del mismo. El uso directo de un compuesto estimulante como en la invención, se ha validado en experimentos con la glicoproteína 4-1BB, un miembro de la familia del receptor del factor de necrosis de tumor, que se enlaza a un ligando (4-1BBL) expresado en las células T cebadas y señala la activación y crecimiento de las células T. Alderson, M. E. y colaboradores, J. Immunol. (1994) 24:2219. También ha sido validado experimentalmente el uso de un compuesto estimulante del agonista. La activación del 41BB por tratamiento con un agonista de anticuerpo anti-4-1BB enriquece la erradicación de tumores. Hellstrom, I. y Hellstrom, K. E., Crit. Rev. Immunol. (1998) 18:1. La terapia inmunoadyuvante para el tratamiento de tumores, descrita en mayor detalle a continuación, es otro ejemplo del uso de los compuestos estimuladores de la invención.

Un efecto estimulador o enriquecedor inmune, se puede también alcanzar al antagonizar o bloquear la actividad de la proteína que se ha encontrado que se inhibe en el ensayo MLR. La negación de la actividad inhibitoria del compuesto produce un efecto estimulador neto. Los compuestos antagonistas/de bloqueo apropiados son anticuerpos de fragmentos de los mismos que reconocen y enlazan la proteína inhibitoria, por lo cual bloquean la interacción efectiva de la proteína con su receptor que inhibe la señalización a través del receptor. Se ha validado este efecto en experimentos usando anticuerpos anti-CTLA-4, que enriquecen la proliferación de células T, presumiblemente por la separación de la señal inhibitoria provocada por el enlace CTLA-4. Walunas, T. L. y colaboradores, Immunity (1994) 1:405. Por otro lado, los polipéptidos de la invención, así como otros compuestos de la invención, que son inhibidores directos de la activación/proliferación de células T y/o la secreción de linfocinas, se pueden usar directamente para eliminar la respuesta inmune. Estos compuestos son útiles para reducir el grado de la respuesta inmune y para tratar enfermedades relacionadas con lo inmune, caracterizadas por una respuesta autoinmune, super-óptima o hiperactiva. Se puede validar este uso de los compuestos de la invención por los experimentos descritos anteriormente, en los cuales el enlace CTLA-4 al receptor B7 desactiva las células T. Los compuestos inhibitorios directos de la invención funcionan de una manera análoga.

Alternativamente, los compuestos, por ejemplo anticuerpos, que se enlazan a los polipéptidos estimulantes de la invención y bloquean el efecto estimulador de las moléculas, producen un efecto inhibitorio neto y se pueden usar para suprimir la respuesta inmune mediada por las células T al inhibir la activación/proliferación de células T/ y la secreción de linfocinas. El bloqueo del efecto estimulador de polipéptidos suprime la respuesta inmune del mamífero. Este uso se ha validado en experimentos usando un anticuerpo IL-2. En estos experimentos, el anticuerpo se enlaza al IL-2 y bloquea el enlace del IL-2 a su receptor, con lo cual se alcanza un efecto inhibidor de las células T. 4. Modelos Animales . Los resultados de los ensayos in vitro basados en células, se pueden además verificar usando modelos animales e in vivo y ensayos para la función de células T. Se pueden usar una diversidad de modelos animales bien conocidos para entender, además, el papel de los genes identificados en la presente en el desarrollo y patogénesis de la enfermedad relacionada con lo inmune, y probar la eficiencia de los agentes terapéuticos candidatos, incluyendo anticuerpos y otros antagonistas de los polipéptidos nativos, incluyendo antagonistas de molécula pequeña. La naturaleza in vivo de tales modelos los hace predictivos de respuestas en pacientes humanos. Los modelos animales de las enfermedades relacionadas con lo inmune incluyen animales recombinantes (transgénicos) y no recombinantes. Los modelos de animales no recombinantes incluyen, por ejemplo, modelos de roedores, por ejemplo de murina. Tales modelos se pueden generar por la introducción de células dentro de los ratones singénicos usando técnicas estándar, por ejemplo inyección sub-cutánea, inyección en la vena de la cola, implantación de bazo, implantación intraperitoneal, implantación bajo la cápsula renal, etc. La enfermedad de injerto contra huésped, se presenta cuando las células inmunocompetentes se transplantan dentro de pacientes inmunodeprimidos o tolerantes. Las células donadoras reconocen y responden a los antígenos huéspedes. La respuesta puede variar desde una inflamación severa que amenaza la vida, hasta casos moderados de diarrea y pérdida de peso. Los modelos de enfermedad de injerto contra huésped proporcionan un medio de evaluar la actividad de las células T contra antígenos MHC y antígenos de transplantes menores. Se describe un procedimiento apropiado en detalle en Current Protocols in Immunology, arriba, unidad 4.3.

Un modelo animal para el rechazo de aloinjertos de piel es un medio para probar la capacidad de las células T para mediar la destrucción de tejidos in vivo y una medida de su papel en el rechazo de transplantes. Los modelos más comunes y aceptados usan injertos de piel de cola murina. Los experimentos repetidos han demostrado que el rechazo de piel de aloinjertos está mediado por las células T, células T de ayuda y células T efectoras-exterminadoras y no por anticuerpos. Auchincloss, H. Jr. y Sachs, D.H. Fundamental I munology, 2nd ed., W.E. Paul ed., Raven Press, NY, 1989,889-992. Se describe en detalle un procedimiento apropiado en Current Protocols in Immunology, arriba, unidad 4.4. Otros modelos de rechazo de transplantes que se pueden usar para probar los compuestos de la invención, son los modelos de transplante de corazón alogénicos descritos por Tanabe, M. y colaboradores, Transplantation (1994) 58:23 y Tinubu, S.A. y colaboradores, J. Immunol. (1994) 4330-4338. También los modelos animales para la hipersensibilidad de tipo retrasado proporcionan un ensayo de la función inmune mediada por células. Las reacciones de hipersensibilidad de tipo retrasado son una respuesta inmune in vivo mediada por las células T, caracterizada por una inflamación que no alcanza un pico hasta después de un periodo de tiempo transcurrido después de la prueba inmunogénica con un antígeno. Estas reacciones también se presentan en enfermedades autoinmunes específicas del tejido tal como la esclerosis múltiple (MS) y la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE, un modelo para MS) . Se describe en detalle un procedimiento apropiado en Current Protocols in Immunology, arriba, unidad. 4.5. El EAE, es una enfermedad autoinmune mediada por las células T, caracterizada por la inflamación de células mononucleares y células T y la desmielinización posterior de axones en el sistema nervioso central. Se considera generalmente que el EAE es un modelo animal relevante para MS en humanos. Bolton, C, . Múltiple Sclerosis (1995) 1:143. Han sido desarrollado tanto los modelos agudos como de restitución-retroceso. Los compuestos de la invención se pueden probar para la actividad inhibitoria o estimulatoria de las células T contra una enfermedad desmielinizante mediada por inmune usando el protocolo descrito en Current Protocols in Immunology, arriba, unidades 15.1 y 15.2. Ver también los modelos para la enfermedad de mielina en la cual los oligodendrocitos o células Schwann se injertan dentro del sistema nervioso central como se describe en Duncan, I.D. y colaboradores, Molec. Med. Today (1997) 554-561.

La hipersensibilidad de contacto es un ensayo in vivo de hipersensibilidad de tipo retrasado simple de la función inmune mediada por las células. En este procedimiento, la exposición cutánea a haptenos exógenos que da lugar a una reacción de hipersensibilidad de tipo retrasado que se mide y cuantifica. La sensibilidad de contacto involucra una fase inicial de sensibilización seguida por una fase de elicitación. La fase de elicitación se presenta cuando los linfocitos T encuentran un antígeno con el cual hayan tenido contacto previo. Se presentan hinchazón e inflamación, haciendo de este un modelo excelente de la dermatitis humana de contacto alérgico. Se describe en detalle un procedimiento apropiado en Current Protocols in Immunology, Eds. J. E. Cologan A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach y W. Strober, John Wiley & Sons, Inc., 1994, unidad 4.2. ver también Grabbe, S. y Schwarz, T, Immun. Today 19 (1): 37-44(1998). Un modelo animal para la artritis es la artritis inducida por colágeno. Este modelo comparte características clínicas, histológicas e inmunológicas de artritis reumatoide humana autoinmune, y es un modelo aceptable para la artritis humana autoinmune. Los modelos de rata y de ratón se caracterizan por la sinovitis, erosión del cartílago y hueso subcondrial. Se pueden probar los compuestos de la invención para su actividad contra la artritis autoinmune usando los protocolos descritos en Current Protocols in Immunology, arriba, unidades 15.5. Ver también el modelo que usa un anticuerpo monoclonal para el CD18 y para las integrinas VLA-4 descritas en Issekutz, A.C. y colaboradores, Immünology (1996) 88:569. Se ha descrito un modelo de asma en el cual la hiper-reactividad de las vías respiratorias inducida por antígenos, la eosinofilia pulmonar y . la inflamación se inducen al sensibilizar un animal con ovalbúmina, y después aplicar una prueba inmunogénica al animal con la misma proteína suministrada por el aerosol. Diversos modelos animales (conejillos de indias, ratas, primates no humanos) muestran síntomas similares al asma atópica en humanos después de la aplicación de una prueba inmunogénica con antígenos de aerosol. Los modelos de murina tienen muchas de las características del asma humana. Se describen procedimientos apropiados para probar los compuestos de la invención para su actividad y efectividad en el tratamiento del asma por Wolyniec, W. W. y colaboradores, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. (1998) 18:777 y las referencias ahí citadas. Adicionalmente, se pueden probar los compuestos de la invención en modelos animales para enfermedades similares a la psoriasis. La evidencia sugiere una patogénesis de células T para la psoriasis. Los compuestos de la invención se pueden probar en el modelo de ratón scid/scid descrito por Schon, M.P. y colaboradores, Nat. Med. (1997) 3:183, en el cual los ratones demuestran lesiones histopatológicas de la piel que se asemejan a la psoriasis. Otro modelo apropiado es la quimera de ratón Scid/piel humana preparada como se describe por Nickoloff, B. J. y colaboradores, Am. J. Pathol. (1995) 146:580. Se pueden preparar por ingeniería los modelos animales recombinantes (transgénicos) al introducir la porción codificadora de los genes identificados en la presente, dentro del genoma de los animales de interés, usando técnicas estándar para la producción de animales transgénicos. Los animales que pueden servir como objetivo para la manipulación transgénica, incluyen sin limitación, ratones, ratas, conejos, conejillos de indias, ovejas, cabras, cerdos y primates no humanos, por ejemplo babuinos, chimpancés y monos. Las técnicas conocidas en el arte para introducir un transgen dentro de tales animales incluyen la microinyección pronucléica (Hoppe y Wanger, Pat. U.S. No. 4,873,191); la transferencia de genes mediada por retrovirus dentro de líneas germen (por ejemplo, Van der Putten y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82: 6148-615 [1985] ) ; el direccionamiento de genes en células madre embriónicas (Thompson y colaboradores, Cell 56: 313-321 [1989]); la electroporación de embriones (Lo, Mol, Cel. Biol. 3, 1803-1814 [1983]; la transferencia de genes mediada por esperma (Lavitrano y colaboradores, Cell 57, 717-73 [1989] ) . Para una revisión ver, por ejemplo, Patente U.S. No. 4,736.866. Para el propósito de la presente invención, los animales transgénicos incluyen aquellos que llevan solamente el transgen en parte de sus células ("animales mosaicos") . Se puede integrar el transgen ya sea como un transgen simple o en concatámeros, por ejemplo, en tándems cabeza a cabeza o cabeza a cola. La introducción selectiva de un transgen dentro de un tipo particular de célula también es posible al seguir, por ejemplo, la técnica de Lasko y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89, 6232-636 (1992) . La expresión del transgen en animales transgénicos se puede observar por técnicas estándar. Por ejemplo, el análisis de manchado Southern o amplificación por PCR se puede usar para verificar la integración del transgen. El nivel de la expresión del mARN se puede después analizar usando técnicas tales como la hibridación in situ, análisis de manchado Northern, PCR o inmunocitoquímica.

Los animales se pueden examinar, además, para signos de patología de enfermedad inmune, por ejemplo por examen histológico para determinar la infiltración de células inmunes dentro de los tejidos específicos. Se pueden también llevar a cabo experimentos de bloqueo en los cuales, se tratan los animales transgénicos con los compuestos de la invención, para determinar el grado de la proliferación, estimulación o inhibición de células T de los compuestos. En estos experimentos, los anticuerpos de bloqueo que se enlazan al polipéptido de la invención preparados como se describe arriba, se administran al animal y se determina el efecto en la función inmune. Se pueden también usar ácidos nucleicos que codifican el TCCR o sus formas modificadas para generar animales transgénicos o animales "agónicos" que a su vez, son útiles en el desarrollo y separación de reactivos terapéuticamente útiles. El término "agénico" se usa en el arte para describir un animal transgénico en el cual el gen endógeno se ha "agenizado" o extirpado, de manera tal que resulta del uso de la recombinación homologa. La recombinación homologa es un término del arte usando para describir las regiones del vector objetivo que son homologas con el gen endógeno. Estas regiones de homología hibridizarán una a la otra y recombinarán al genoma del huésped que resulta del reemplazo de la secuencia endógena del huésped con la secuencia del inserto del vector en la ubicación y en la orientación definida por las regiones de homología compartidas. El genotipo de un animal agénico se señala por el nombre del gen seguido por un "-/-". Esto lo distingue de un animal en el cual solamente un alelo ha sido "agenizado" (heterocigoto) que se denominan "-/+". Un gen endógeno que ha sido "agenizado" ya no se expresa en todas las células a través del animal. El análisis detallado de las células específicas puede identificar la función del gen extirpado. Un animal transgénico (por ejemplo, un ratón o rata) es un animal que tiene células que contienen un transgen, cuyo transgen se introdujo dentro del animal o un antecesor del animal en una etapa prenatal, por ejemplo, embriónica. Un transgen es un ADN que se integra dentro del genoma de una célula de la cual se desarrolla un animal transgénico. En una modalidad, el cADN que codifica el TCCR se puede usar para clonar ADN genómico que codifica TCCR de conformidad con técnicas establecidas y las secuencias genómicas usadas para generar animales transgénicos que contienen células que expresan el ADN que codifica al TCCR. Los métodos para la generación de animales transgénicos, particularmente animales tales como ratas o ratones, se han vuelto convencionales en el arte y se describen, por ejemplo, en las Patentes U.S. Nos. 4,736,866 y 4,870,009. Típicamente, las células particulares se atacarían por la incorporación del transgen TCCR con enriquecedores específicos del tejido. Los animales transgénicos que incluyen una copia de un transgen que codifica al TCCR introducido dentro de la línea germen de los animales en una etapa embriónica, se pueden usar para examinar el efecto de la expresión creciente del ADN que codifica el TCCR. Se pueden utilizar tales animales como animales probadores para reactivos que se cree que otorgan protección de, por ejemplo, condiciones patológicas asociadas con su sobre-expresión. De conformidad con esta faceta de la invención, se trata un animal con el reactivo y una incidencia reducida de la condición patológica en comparación con los animales sin tratar que soportan el transgen, indicaría una intervención terapéutica potencial para la condición patológica. Alternativamente, los animales "agónicos" se pueden construir para que tengan un gen alterado o defectuoso que codifica a un polipéptido identificado en él, como un resultado de la recombinación homologa entre el gen endógeno que codifica al polipéptido y el ADN genómico alterado que codifica al mismo polipéptido introducido dentro de una célula embriónica del animal. Por ejemplo, el cADN que codifica un polipéptido en particular, se puede usar para clonar el ADN genómico que codifica al polipéptido de conformidad con las técnicas establecidas. Se puede eliminar o reemplazar una porción del ADN genómico que codifica a un polipéptido en particular con otro gen, tal como un gen que codifica un marcador de selección que se puede usar para observar la integración. Típicamente, se incluyen diversos kilobases de ADN de flanqueo no alterado (tanto en las terminaciones 5' como en la 3') en el vector [ver por ejemplo, Thomas y Capecchi, Cell, 51:503 (1987) para una descripción de los vectores de recombinación homologa] . Se introduce el vector dentro de una linea celular madre embriónica (por ejemplo por electroporación) y se seleccionan las células en las cuales el ADN introducido se ha recombinado de manera homologa con el ADN endógeno [ver por ejemplo, Li y colaboradores, Cell, 69:915 (1992)]. Se inyectan después las células seleccionadas dentro de un blastocisto de un animal (por ejemplo, un ratón o rata) para formar quimeras de agregación [ver por ejemplo, Bradley, en Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), páginas 113-152], Se puede implantar después un embrión quimérico dentro de un animal apropiado criado, hembra pseudo-preñada, y el embrión se lleva a término para crear un animal "agénico". La progenie que aloja al ADN recombinado de forma homologa en sus células germen, se puede identificar por técnicas estándar y usarse para procrear animales en los cuales todas las células del animal contienen el ADN recombinado de forma homologa. Los animales agónicos se pueden caracterizar, por ejemplo, por su capacidad de defenderse contra ciertas condiciones patológicas y por su desarrollo de condiciones patológicas debido a la ausencia del polipéptido. Para la presente invención, los ratones agónicos se crearon con objeto de estudiar el efecto de la agonízación/antagonización del TCCR de la respuesta inmune Thl y/o Th2 y los padecimientos mediados por los mismos. 5. Receptores quiméricos Adicionalmente, se pueden volver a crear los receptores quiméricos para determinar el efecto de la señalización por un receptor que tiene un ligando desconocido. Los receptores quiméricos son un medio aprobado para examinar la función del receptor sin el aislamiento del ligando. Chang y colaboradores, Mol. Cell Biol. 18(2): 896-905 (1998). 6. Terapia inmunoadyuvante En una modalidad, se pueden usar los compuestos inmunoestimulantes de la invención en la terapia inmunoadyuvante para el tratamiento de tumores (cáncer) . Está ahora bien establecido que las células T reconocen los antígenos específicos de tumores humanos. Un grupo de los antígenos de tumores, * codificado por las familias MAGE, BAGE y GAGE de genes, son silentes en todos los tejidos adultos normales, pero se expresan en cantidades importantes en tumores tales como melanomas, tumores de pulmón, tumores de cabeza y cuello y carcinomas de la vejiga. DeSmet, C. y colaboradores, (1996) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 93:7149. Se ha demostrado que la coestimulación de las células T induce la regresión del tumor y una respuesta anti-tumor tanto in vitro como in vivo. Melero, I. y colaboradores, Nature Medicine (1997) 3:682; Kwon, E.D. y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1997) 94:8099; Lynch, D.H. y colaboradores, Nature Medicine (1997) 3:625; Finn, O.J. y Lotze, M.T., J. Immunol. (1998) 21:114. Se pueden administrar los compuestos estimuladores de la invención como adyuvantes, solos o en conjunto con un agente regulador del crecimiento, agente citotóxico o agente quimioterapéutico para estimular la proliferación/activación de una célula T y una respuesta anti-tumor para los antígenos del tumor. El agente citotóxico o quimioterapéutico regulador del crecimiento, se puede administrar en cantidades convencionales usando regímenes _ conocidos de administración. La actividad inmunoestimulante de los compuestos de la invención, permite cantidades reducidas de agentes citotóxicos o quimioterapéuticos reguladores del crecimiento, por lo cual se disminuye potencialmente la citotoxicidad para el paciente. 7. Ensayos de separación por exclusión para los candidatos a fármacos Los ensayos de separación por exclusión para los candidatos a fármacos, se diseñan para identificar compuestos que se enlazan a, o forman complejos con, los polipéptidos codificados por los ácidos nucleicos TCCR identificados por la presente o una variante biológicamente activa de los mismos, o que interfieren de otra manera con la interacción de los polipéptidos codificados con otras proteínas celulares. Tales ensayos de separación por exclusión incluirán ensayos receptivos para la separación de alta producción de colecciones químicas, haciéndolos particularmente apropiados para la identificación de candidatos a fármacos de molécula pequeña. Las moléculas pequeñas contempladas incluyen compuestos orgánicos o inorgánicos, sintéticos, incluyendo péptidos, preferiblemente péptidos solubles, fusiones de polipéptido-inmunoglobulina, y en particular, anticuerpos que incluyen sin limitación, anticuerpos poli y monoclonales y fragmentos de anticuerpos, anticuerpos de cadena simple, anticuerpos anti-idiotípicos y versiones quiméricas o humanizadas de tales anticuerpos o fragmentos, así como anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpos . Los ensayos se pueden llevar a cabo en diversos formatos, incluyendo ensayos de enlace proteína-proteína, ensayos de separación por exclusión bioquímica, inmunoensayos y ensayos basados en células que son bien caracterizados en el arte. Todos los ensayos de separación por exclusión de candidatos a fármacos identificados en la presente, tienen la propiedad en común de que requieren hacer contacto del fármaco en ausencia del candidato con un polipéptido TCCR bajo condiciones y por un tiempo suficiente para permitir que estas dos moléculas interactúen. En ensayos de enlace, la interacción es enlace y el complejo formado se puede aislar o detectar en la mezcla de reacción. Ya que los polipéptidos TCCR de la presente invención son receptores, se puede también emplear apropiadamente un fragmento TCCR ECD para el propósito de identificar candidatos a fármacos incluyendo variantes TCCR, antagonistas de los mismos y/o agonistas de los mismos. En una modalidad en particular, el polipéptido codificado por el gen identificado en la presente o el candidato a fármaco, se inmoviliza en una fase sólida por ejemplo, en una placa de microtitulación por colocaciones covalentes o no covalentes. El enlace no covalente se lleva a cabo generalmente al recubrir la superficie sólida con una solución del polipéptido y secar. Alternativamente, un anticuerpo inmovilizado, por ejemplo, un anticuerpo mopoclonal específico para el polipéptido a ser inmovilizado, se puede usar para anclarlo a una superficie sólida. Ei ensayo se lleva a cabo al agregar el componente no inmovilizado que se puede etiquetar por una etiqueta detectable al componente inmovilizado, por ejemplo la superficie recubierta que contiene el componente anclado. Cuando la reacción está completa, se separan los componentes sin reaccionar, pcr ejemplo al lavar, y se detectan los complejos anclados en la superficie sólida. Cuando el componente originalmente no inmovilizado lleva una etiqueta detectable, la detección de la etiqueta inmovilizada en la superficie indica que ha sucedido la formación del complejo. En donde el componente originalmente no inmovilizado no lleva ur.a etiqueta, se puede detectar la formación del complejo, por ejemplo, al usar un anticuerpo etiquetado que enlaza específicamente al complejo inmovilizado.

Si el compuesto candidato interactúa pero no se enlaza con una proteína particular TCCR identificada en la presente, se puede ensayar su interacción con esa proteína por métodos bien conocidos para la detección de interacciones proteína-proteína. Tales ensayos incluyen enfoques tradicionales tales como reticulado, co-inmunoprecipitación y co-purificación a través de gradientes o columnas cromatográficas . Además, se pueden observar las interacciones proteína-proteína al usar un sistema genético basado en levadura descrito por Fields y colaboradores [Fields and Song, Nature (London) 340, 245-246 (1989); Chien y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88*: 9578-9582 (1991)] como se describe por Chevray y Nathans [Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89: 5789-5793 (1991) ] . Muchos activadores transcripcionales, tal como la levadura GAL4, consisten de dos dominios modulares físicamente discretos, uno actúa como el dominio de enlace al ADN, mientras que el otro funciona como el dominio de activación de la transcripción. El sistema de expresión de levaduras descrito en las publicaciones anteriores (generalmente referido como el "sistema de dos híbridos") , aprovecha esta propiedad y emplea dos proteínas híbridas, una en la cual se funde la proteína objetivo al dominio de enlace del ADN del GAL4, y otra en la cual se funden las proteínas candidato activadoras al tercera mezcla de reacción para que sirva como un control ^padecimientos mediados por Thl y/o Th2) incluyen sin limitación proteínas, anticuerpos, moléculas orgánicas pequeñas, peptidos, fosfopéptidos, moléculas antisentido y de ribpzimas, moléculas de hélice triple, etc, que inhiben o estimulan la función inmune, por ejemplo, la proliferación/activación de células ,T, liberación de linfocinas o infiltración de células inmunes. Por ejemplo, las moléculas de ARN y de ARN antisentido, actúan para bloquear directamente la traducción del t RN a hibridizar un ARN objetivo y evitar la traducción de la proteína. Cuando se usa un ADN antisentido, se prefieren los oligodesoxiribonucleótidos derivados del sitio de iniciación de la traducción, por ejemplo entre alrededor de f -10 y +10 posiciones de la secuencia de nucleótidos del gen objetivo. Las ribozimas son moléculas enzimáticas de ARN capaces de catalizar el desdoblamiento específico del ARN. Las ribozimas actúan por hibridación específica de secuencias con el ARN objetivo complementario, seguido por el desdoblamiento endonucleolítico. Los sitios de desdoblamiento de ribozimae específicas dentro de un objetivo potencial de ARN se pueden identificar por técnicas conocidas. Para detalles adicionales ver por ejemplo Rossi, Current Biology 4: 469-471 (1994), y la publicación PCT No. WO 97/33551 (publicada el 18 de Septiembre 1997) . Las moléculas de ácido nucleico en la formación de triple hélice usadas para inhibir la transcripción deben ser de hebra simple y compuestas de desoxinucleótidos . La composición base de estos oligonucleótidos se diseña de manera gue promueve la formación de hélices triples por medio de reglas de apareamiento de base de Hoogsteen que requieren generalmente extensiones dimensionables de purinas o pirimidinas sobre una hebra del dúplex. Para detalles adicionales ver poi. ejemplo la publicación PCT número WO 97/33551, supra. 4 Estas moléculas se pueden identificar por cualquier combinación de los ensayos de separación por exclusión arriba discutidos y/o por cualesquiera de otras técnicas de separación por exclusión bien conocidas por aquellos hábiles en el arte. Se pueden emplear también los polipéptidos TCCR, agonistas y antagonistas (moléculas TCCR) descritos en la presente como agentes terapéuticos. Se pueden formular las moléculas TCCR de la presente invención de conformidad con métodos conocidos para preparar composiciones farmacéuticamente útiles, por io cual se combina ía molécula TCCR en combinación con un vehículo portador farmacéuticamente aceptable. Se preparan las formulaciones terapéuticas por almacenamiento al mezclar las moléculas TCCR que tienen el grado deseado de pureza, , cpn 'portadores, excipientes o estabilizadores opcionales fisiológicamente aceptables, Remington's Pharmaceuti cal Sciences lßth edición. Osol. A. Ed. (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los portadores, excipientes o estabilizadores aceptables son no tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen soluciones amortiguadoras tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo el ácido ascórbico; pclipéptidos de bajo peso molecular (menos de alrededor de 10 residuos) ; proteínas tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tales como la polivinil pirrolidona, aminoácidos tales como la glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos incluyendo glucosa, mañosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA, alcoholes de azúcar tales como manitol o sorbitol, contraiones formadores de sales tales como sodio; y/o tensoactivos no iónicos tales como TWEEN®, PLURONICS® o PEG. Las formulaciones para usarse en la administración in vivo deben ser estériles. Esto se logra fácilmente por la filtración a través de membranas estériles de filtración, previo a, o después de, la liofilización y reconstitución. Las composiciones terapéuticas en la presente, se colocan generalmente dentro de un contenedor que tiene un puerto de acceso estéril por ejemplo, una bolsa o dial de solución intravenosa que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica. La vía de administración está de acuerdo con los métodos conocidos, por ejemplo, inyección o infusión por vías intravenosa, intraperitoneal, intracerebral, intramuscular, intraocular, intraarterial o intralesional, administración local o por sistemas de liberación sostenida. Las dosis y concentraciones deseadas del fármaco de las composiciones farmacéuticas de la presente invención, pueden variar dependiendo del uso particular vislumbrado. La determinación de la dosis adecuada o vía de administración se encuentra bien dentro de la habilidad del médico ordinario. Los experimentos con animales proporcionan una guía confiable para la determinación de dosis efectivas para terapia humana. El escalamiento entre especies de dosis efectivas, se puede llevar a cabo siguiendo los principios establecidos por Mordenti, J. y Chappell, W. "The use of interspecies scaling in toxicokinetics" en Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi y colaboradores, Eds., Pergamon Press, Nueva York 1989, páginas 42-96. Cuando se emplea la administración in vivo de moléculas TCCR del mismo, las cantidades normales de dosis pueden variar desde alrededor de 10 ng/kg hasta alrededor de 100 mg/kg de peso corporal de mamífero o más por día, preferiblemente alrededor de 1 µg/kg/día hasta 10 mg/kg/día, dependiendo de la vía de administración. Se proporciona la guía para las dosis particulares y métodos de entrega en la literatura, ver por ejemplo las Patentes U.S. Nos. 4,657,760; 5,206,344 ó 5,225,212. Se anticipa que serán efectivas formulaciones diferentes para tratamientos diferentes y padecimientos diferentes, y que la administración pretendida para tratar un órgano o tejido específico, puede necesitar la entrega de una forma diferente a aquella de otro órgano o tejido. En donde se desea la administración por liberación sostenida de las moléculas TCCR en una formulación con características de liberación apropiadas para el tratamiento' de alguna enfermedad o padecimiento que requiere la administración de moléculas TCCR, se contempla la microencapsulación de moléculas TCCR. La microencapsulación de proteínas recombinantes para la liberación sostenida, se ha llevado a cabo exitosamente con la hormona del crecimiento humano (rhGH) , interferon- , -ß, -?(rhIFN-a, -ß,-?) , interleucin-2, y MN rgp 120. Johnson y colaboradores, Nat. Med. 2: 795-799 (1996); Yasuda, Biomed. Ther. 27: 1221-1223 (1993); Hora y colaboradores, Bio/Technology 8: 755-758 (1990); Cleland, "Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Microsphere -Systems" en Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell and Newman, eds., (Plenum Press: Nueva York, 1995), páginas 439-462; WO 97/03692, WO 96/40072, WO 96/07399 y Pat. U.S. No. 5, 654,010.

Se pueden desarrollar formulaciones de liberación sostenida de moléculas TCCR usando ácido poliláctico-coglicólico (PLGA) , un polímero que muestra un fuerte grado de biocompatibilidad y un amplio grado de propiedades biodegradables. Los productos de degradación del PLGA, ácidos láctico y glicólico, se depuran rápidamente del cuerpo humano. Además, se puede ajustar la degradabilidad de este polímero desde meses hasta años dependiendo de su peso molecular y composición. Para información adicional ver Lewis, "Controlled Reléase of Bioactive Agents From Lactide/Glycolide polymer" en Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems M. Chasin y R. Langeer, editores (Marcel Dekker: Nueva York, 1990), páginas 1-41. 9. Identificación de agonistas y antagonistas del TCCR.

La presente invención proporciona también métodos de separación por exclusión de compuestos para identificar aquellos que imitan o enriquecen un efecto del polipéptido TCCR (agonistas) o evitan o inhiben una o más funciones o actividades de un polipéptido TCCR. Preferiblemente, tales antagonistas y agonistas son variantes TCCR, moléculas pequeñas de fragmentos de péptidos, oligonucleótidos antisentido (ADN o ARN) o anticuerpos (monoclonales, humanizados, específicos, de cadena simple, heteroconjugados o fragmentos de los anteriores) . Adicionalmente, los antagonistas TCCR pueden incluir ligandos potenciales TCCR, mientras que los agonistas potenciales TCCR pueden incluir dominios extracelulares solubles TCCR (ECD) . Los ensayos de separación por exclusión para los candidatos a fármacos antagonistas y/o agonistas, se diseñan para identificar compuestos que enlazan o forman complejos con los polipéptidos TCCR codificados por los genes identificados en la presente, o interfieren de otra manera con la interacción de los polipéptidos codificados con otras proteínas celulares. Tales ensayos de separación por exclusión, incluirán ensayos receptivos para la separación por exclusión de alta producción de colecciones químicas, haciéndolas particularmente apropiadas para la identificación de candidatos a fármacos de molécula pequeña. Los ensayos se pueden llevar a cabo en diversos formatos, incluyendo ensayos de enlace proteína-proteína, ensayos de separación bioquímica, inmunoensayos y ensayos basados en células que están bien caracterizados en el arte. Los ensayos de separación contemplados en la presente para los antagonistas tienen en común el proceso de hacer contacto al candidato del fármaco con un polipéptido TCCR bajo condiciones y por un tiempo suficiente para permitir que interactúen estos dos componentes . Ejemplos de los ensayos apropiados útiles para identificar antagonistas y agonistas TCCR se han identificado previamente arriba bajo el punto 7. Ensayos de separación por excl usión para candida tos a fármacos . Como un ejemplo adicional de un ensayo de antagonistas, se puede agregar el polipéptido TCCR a una célula junto con el compuesto a ser separado por exclusión para una actividad en particular, y la capacidad del compuesto para inhibir la actividad de interés en presencia del polipéptido TCCR indica que el compuesto es un antagonista para el polipéptido TCCR. Alternativamente, se pueden detectar antagonistas al combinar al polipéptido TCCR y un antagonista potencial con receptores de polipéptidos TCCR enlazados a la membrana o receptores recombinantes bajo condiciones apropiadas para un ensayo de inhibición competitiva. Se puede etiquetar el polipéptido TCCR tal como por radioactividad, de manera que se puedan usar el número de moléculas de polipéptido TCCR enlazadas al receptor para determinar la efectividad del antagonista potencial. Se puede identificar al gen que codifica al receptor por diversos métodos conocidos por aquellos de habilidad en el arte, por ejemplo, lavado de ligandos y selección FACS. Coligan y colaboradores, Current Protocols in Immunol. 1(2): Ch 5 (1991). Preferiblemente, la clonación de la expresión se emplea en donde el ARN poliadenilado se prepara de una célula en respuesta al polipéptido TCCR y una colección de cADN creada de este ARN, se divide en acumulados y se usa para transfectar las células COS u otras células que no dan respuesta al polipéptido TCCR. Las células transfectadas que crecen en los portaobjetos de vidrio se exponen al polipéptido TCCR etiquetado. Se puede etiquetar el polipéptido TCCR por diversos medios incluyendo la yodación o inclusión de un sitio de reconocimiento para una proteína cinasa específica del sitio. Después de la fijación e incubación, los portaobjetos se someten a un análisis autoradiográfico. Se identifican los acumulados positivos y se preparan los sub-acumulados y se vuelven a transfectar usando un subacumulado interactivo y un proceso de re-separación por exclusión, resultando eventualmente un clon simple que codifica al receptor supuesto. En otro ensayo para los antagonistas, se incubarían células de mamíferos o preparaciones de membrana que expresan al receptor, con el polipéptido TCCR etiquetado en presencia del compuesto candidato. Se puede después medir la capacidad del compuesto para enriquecer o bloquear esta interacción.

Ejemplos más específicos de los antagonistas potenciales incluyen un oligonucleótido que se enlaza a las fusiones de la inmunoglobulina con el polipéptido TCCR, y en particular anticuerpos que incluyen, sin limitación, anticuerpos poli y monoclonales y fragmentos de anticuerpos, anticuerpos de cadena simple anticuerpos anti-idiotípicos y versiones quiméricas o humanizadas de tales anticuerpos o fragmentos, así como anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpos. Alternativamente, un antagonista potencial puede ser una proteína cercanamente relacionada, por ejemplo, una forma mutada del polipéptido TCCR que reconoce al ligando, pero no le imparte efecto, por lo cual se inhibe competitivamente la acción del polipéptido TCCR. Finalmente, otro antagonista TCCR potencial es un ECD del TCCR que puede competir por el ligando disponible, dejando libre efectivamente la señal del receptor TCCR natural. Otro antagonista del polipéptido TCCR potencial, es un constructo de ARN o ADN antisentido preparado utilizando tecnología antisentido, en donde, por ejemplo, una molécula antisentido de ARN o ADN actúa para bloquear directamente la traducción del mARN al hibridizar el mARN objetivo y evitar la traducción de proteínas. Se puede usar la tecnología antisentido para controlar la expresión de genes a través de la formación de hélices triples o ADN o ARN antisentido, ambos métodos los cuales se basan en el enlace de un polinucleótido al ADN o ARN.

Por ejemplo, la porción codificadora 5' de la secuencia de polinucleótido, que codifica a los polipéptidos maduros TCCR en la presente, se usa para diseñar un oligonucleótido de ARN antisentido desde alrededor de 10 hasta 40 pares base de longitud. Un oligonucleótido de ADN se diseña para ser complementario a una región del gen involucrado en la transcripción (hélice triple - ver Lee y colaboradores, Nucí. Acids. Res. 6: 3073 (1979); Cooney y colaboradores, Science 241: 456 (1988); Dervan y colaboradores, Science, 251: 1360 (1991)), con lo cual se evita la transcripción y la producción del polipéptido TCCR. El oligonucleótido antisentido de ARN se hibridiza a un mARN in vivo y bloquea la traducción de la molécula de mARN dentro del polipéptido TCCR (antisentido - Okano, Nerochem. 56: 560 (1991) ; Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gen Expression (CRC Press: Boca Ratón, FL, 1988). Los oligonucleótidos arriba descritos se pueden también suministrar a células tal que el ADN o el ARN antisentido se pueda expresar in vivo para inhibir la producción del polipéptido TCCR. Cuando se usa el ADN antisentido, se prefieren los oligodesoxiribonucleótidos derivados del sitio de iniciación de la traducción, por ejemplo, entre alrededor de -10 y +10 posiciones de la secuencia de nucleótido del gen objetivo. Los antagonistas potenciales incluyen moléculas pequeñas que se enlazan al sitio activo, el sitio de enlace del receptor o factor de crecimiento u otro sitio de enlace relevante del polipéptido TCCR, por lo cual se bloquea la actividad biológica normal del polipéptido TCCR. Los ejemplos de las moléculas pequeñas incluyen pero no se limitan a, péptidos pequeños o moléculas similares a los péptidos, preferiblemente péptidos solubles y compuestos orgánicos o inorgánicos sintéticos no peptidilos. Las ribozimas son moléculas enzimáticas de ARN capaces de catalizar el desdoblamiento específico del ARN. Las ribozimas actúan por la hibridación específica de secuencias con el ARN objetivo complementario, seguido por el desdoblamiento endonucleolítico. Los sitios específicos de desdoblamiento de ribozimas dentro de un objetivo de ARN potencial se pueden identificar por técnicas conocidas. Para detalles adicionales ver por ejemplo Rossi, Current Biology, 4: 469-471 (1994), y publicado el 18 de Septiembre de 1997). Las moléculas de ácido nucleico en la formación de hélice triple usadas para inhibir la transcripción, deben ser de hebra simple y compuestas de desoxinucleótidos. La composición base de estos oligonucleótidos se diseña de manera que promueve la formación de hélices triples por medio de las reglas de apareamiento de bases de Hoogsteen, que requieren generalmente extensiones dimensionales de purinas o pirimidinas en una hebra de un dúplex. Para mayores detalles ver, por ejemplo, la publicación PCT No. WO 97/33551, supra. Estas moléculas se pueden identificar por uno o más de los ensayos de separación por exclusión usados hasta aquí anteriormente y/o por otras técnicas de separación por exclusión bien conocidas por aquellos hábiles en el arte. 10. TCCR y Terapia de Genes. El ácido nucleico que codifica a los polipéptidos TCCR se puede también usar en terapia de genes. En las aplicaciones de terapia de genes, se introducen los genes dentro de las células con objeto de lograr la síntesis in vivo de un producto genético terapéuticamente efectivo, por ejemplo por el reemplazo de un gen defectuoso. La "terapia de genes" incluye la terapia de genes convencional en donde un efecto duradero se alcanza por un tratamiento simple, y la administración de agentes terapéuticos de genes, que involucra la administración repetida y en un tiempo de una cantidad terapéuticamente efectiva de ADN o mARN. Se pueden usar los ARN y ADN antisentido como agentes terapéuticos para el bloqueo de la expresión de ciertos genes in vivo. Ya se ha demostrado que los oligonucleótidos cortos antisentido se pueden importar dentro de células en donde actúan como inhibidores, independientemente de sus concentraciones intracelulares bajas provocadas por la fijación restringida por la membrana celular. Zamecnik y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 83: 4143-4146 (1986) ) . Se pueden modificar los oligonucleótidos para enriquecer su fijación, por ejemplo, al sustituir sus grupos fosfodiéster negativamente cargados por grupos no cargados . Existe una diversidad de técnicas disponibles para introducir ácidos nucleicos dentro de células viables. Las técnicas varían dependiendo de si el ácido nucleico se transfiere dentro de células cultivadas in vitro o in vivo en las células del huésped pretendido. Las técnicas apropiadas para la transferencia de ácido nucleico dentro de células mamíferas in vitro incluyen el uso de liposomas, electroporación, micro-inyección, fusión celular, DEAE-dextrano, el método de precipitación de fosfato de calcio, etc. Las técnicas de transferencia de genes in vivo actualmente preferidas incluyen la transfección con vectores vírales (típicamente retrovirales) y la transfección mediada por liposoma- proteína de recubrimiento viral (Dzau y colaboradores, Trends in Biotechnology 11: 205-210 (1993)). En algunas situaciones, es deseable proporcionar la fuente de ácido nucleico con un agente que ataca las células objetivo, tal como un anticuerpo específico para una proteína de membrana de superficie celular o la célula objetivo, un ligando para un receptor en la célula objetivo etc. En donde se emplean liposomas, se pueden usar proteínas que se enlazan a una proteína de membrana de superficie celular asociada con la endocitosis, para atacar y/o facilitar la fijación, por ejemplo, proteínas cápsidas o fragmentos de las mismas, trópicos para un tipo celular en particular, anticuerpos para proteínas que se someten a la internalización en el ciclizado, proteínas que atacan la localización intracelular y enriquecen la vida media intracelular. La técnica de la endocitosis mediada por el receptor se describe, por ejemplo, por Wu y colaboradores, J. Bio. Chem. 262: 4429-4432 (1987); y Wagner y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87: 3410-3414 (1990) . Para una revisión de los protocolos de terapia de genes y de marcado de genes, ver Anderson y colaboradores, Science 256: 808-813 (1992). 11. Anticuerpos La presente invención proporciona además, anticuerpos anti-TCCR. Los anticuerpos ejemplares incluyen anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados específicos y heteroconjugados, incluyendo fragmentos de los anticuerpos que pueden inhibir (antagonistas) o estimular (agonistas) la proliferación de células T, la infiltración de eosinófilos etc. i. Anticuerpos Policlonales . Los anticuerpos anti-TCCR pueden comprender anticuerpos policlonales. Se conocen los métodos de preparación de anticuerpos policlonales por el técnico habilitado. Se pueden formular anticuerpos policlonales en un mamífero, por ejemplo, por una o más inyecciones de un agente inmunizante, y si se desea un adyuvante. Típicamente, el agente inmunizante y/o adyuvante se inyectará en el mamífero por inyecciones múltiples subcutáneas e intraperitoneales. El agente inmunizante puede incluir el polipéptido TCCR o una proteína de fusión del mismo. Puede ser útil conjugar el agente inmunizante con una proteína por ser inmunogénica en el mamífero que se inmuniza. Los ejemplos de tales proteínas inmunogénicas incluyen, pero no se limitan a, la hemocianina de una variedad de lapa, la albúmina de suero, tiroglobulina de bovino y el inhibidor de la tripsina de soya. Ejemplos de los adyuvantes que se pueden emplear incluyen el adyuvante completo de Freund y el adyuvante MPL-TDM (lípido A de monofosforilo, dicorinomicolato de trehalosa sintético) . Se puede seleccionar el protocolo de inmunización por alguien habilitado en el arte sin experimentación indebida. ii. Anticuerpos Monoclonales . Los anticuerpos anti-TCCR pueden ser alternativamente anticuerpos monoclonales. Se pueden preparar anticuerpos monoclonales usando métodos de hibridoma tales como aquellos descritos por Kohler y Milstein, Nature, 256:495 (1975). En un método del hibridoma, se inmuniza típicamente un ratón, hámster u otro animal huésped adecuado, con un agente inmunizante para obtener linfocitos que producen o pueden producir anticuerpos que se enlazarán específicamente al agente inmunizante. Alternativamente, se pueden inmunizar in vitro los linfocitos. El agente inmunizante incluirá típicamente el polipéptido TCCR o una proteína de fusión del mismo.

Generalmente, se usan linfocitos de sangre periférica ("PBL") si se desean células de origen humano, o se usan células del bazo o células de ganglios linfáticos si se desean fuentes mamíferas no humanas. Se funden después los linfocitos con una línea celular inmortalizada usando un agente adecuado de fusión, tal como el polietilen glicol para formar una célula de hibridoma [Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, Academic Press, (1986) páginas 59-103] . Las líneas celulares inmortalizadas, son usualmente células mamíferas transformadas, particularmente células de mieloma o de roedores, bovinas y de origen humano. Usualmente, se emplean líneas celulares de mieloma de rata o de ratón. Se pueden cultivar las células de hibridoma en un medio de cultivo apropiado que contiene preferiblemente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de las células inmortalizadas sin fundir. Por ejemplo, si las células madre carecen de la enzima de hipoxantina guanina fosforibosil transferasa (HGPTR o HPRT) , el medio de cultivo para los hibridomas incluirá típicamente hipoxantina, aminopterina, y timidina ("medio HAT"), cuyas sustancias evitan el crecimiento de células deficientes en HGPRT. Las líneas celulares inmortalizadas preferidas son aquellas que se funden eficientemente, soportan una expresión estable de alto nivel del anticuerpo por las células seleccionadas productoras de anticuerpos, y son sensibles a un medio tal como el medio HAT. Las líneas celulares inmortalizadas más preferidas son líneas de mieloma de murina, que se pueden obtener, por ejemplo, del Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California y de la American Type Culture Collection, Rockville, Maryland. También se han descrito líneas celulares de mieloma humano y de heteromieloma humano-ratón para la producción de anticuerpos monoclonales [Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur y colaboradores, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, (1987) páginas 51-63] . El medio de cultivo en el cual se cultivan las células de hibridoma se puede después ensayar para la presencia de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el TCCR. Preferiblemente, la especificidad de enlace de los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma, se determina por inmunoprecipitación o por un ensayo de enlace in vitro, tal como un radioinmunoensayo (RÍA) o ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) . Se conocen tales técnicas y ensayos en el arte. La afinidad de enlace del anticuerpo monoclonal puede determinarse, por ejemplo, por un análisis Scatchard de Munson y Pollard, Anal. Biochem. 107:220 (1980). Después que se identifican las células de hibridoma deseadas, se pueden sub-clonar los clones por procedimientos de dilución limitantes y crecer por métodos estándar [Goding, supra] . Los medios de cultivo apropiados para este propósito incluyen, por ejemplo, el medio Eagle modificado de Dulbecco y el medio RPMI-1640.

Alternativamente, pueden hacerse crecer las células de hibridoma in vivo como ascitos en un mamífero. Los anticuerpos monoclonales secretados por los sub clones, se pueden aislar y purificar del medio de cultivo o del fluido de los ascitos por procedimientos de purificación convencional de inmunoglobulina tales como, por ejemplo, proteína A-sefarosa, cromatografía de hidroxiapatita, electroforesis de gel, diálisis, o cromatografía de afinidad. Se pueden también hacer los anticuerpos monoclonales por métodos recombinantes de ADN tales como aquellos descritos en la Patente U.S. No. 4,816,567. El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales de la invención se puede aislar fácilmente y formar secuencias usando procedimientos convencionales (por ejemplo, al usarse sondas de oligonucleótidos que pueden enlazarse específicamente a los genes que codifican las cadenas ligera y pesada de los anticuerpos de murina) . Las células de hibridoma de la invención sirven como una fuente preferida de tal ADN. Una vez que se aisla, se puede colocar el ADN dentro de los vectores de expresión, que se transfectan después en células huésped tales como COS de simios, células de ovario de hámster chino (CHO) , o células de mieloma que no producen de otra manera proteína de inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales de células huésped recombinantes. El ADN puede también modificarse, por ejemplo, al sustituir la secuencia de codificación para los dominios constantes de cadena ligera y pesada humana en lugar de las secuencias homologas de murina [Patente U.S. No. 4,816,567; Morrison y colaboradores, supra], o al unir de forma covalente a la secuencia codificadora de inmunoglobulina todo o parte de la secuencia codificadora para un polipéptido que no es de inmunoglobulina. Tal polipéptido que no es de inmunoglobulina se puede sustituir por los dominios constantes de un anticuerpo de la invención, o se pueden sustituir por los dominios variables de un sitio de combinación de antígenos de un anticuerpo de la invención para crear un anticuerpo bivalente quimérico. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monovalentes. Los métodos para la preparación de anticuerpos monovalentes son bien conocidos en el arte. Por ejemplo, un método involucra la expresión recombinante de la cadena ligera de la inmunoglobulina y la cadena pesada modificada. La cadena pesada se trunca generalmente en algún punto de la región Fe para evitar el entrecruzado de cadenas pesadas. Alternativamente, se sustituyen los residuos relevantes de cisteina con otro residuo de aminoácidos o se eliminan para evitar el reticulado.

Los métodos in vitro también son apropiados para la preparación de anticuerpos monovalentes. La digestión de anticuerpos para producir fragmentos de los mismos, particularmente fragmentos Fab, se puede lograr usando técnicas de rutina conocidas en el arte. iii. Anticuerpos Humanos y Humanizados . Los anticuerpos anti-TCCR de la invención, pueden comprender además anticuerpos humanizados o anticuerpos humanos. Las formas humanizadas de anticuerpos no humanos (por ejemplo murina) son las inmunoglobulinas quiméricas, cadenas o fragmentos de inmunoglobulina de las mismas (tal como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras subsecuencias de enlace de antígenos de los anticuerpos) , que contienen una secuencia mínima derivada de la inmunoglobulina no humana. Los anticuerpos humanizados incluyen inmunoglobulinas humanas (anticuerpos receptores) en los cuales los residuos de una región determinante complementaria (CDR) del receptor, se reemplazan por los residuos de un CDR de una especie no humana (anticuerpo donador) tal como ratón, rata o conejo que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseada. En algunos casos, los residuos de la estructura Fv de la inmunoglobulina humana, se reemplazan por los residuos no humanos correspondientes. Los anticuerpos humanizados pueden también comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor ni en las secuencias de estructura o de CDR importado. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todo de al menos uno, y típicamente dos, dominios de variable, en los cuales todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a aquellas de la inmunoglobulina no humana, y todas o sustancialmente todas las regiones FR son aquellas de la secuencia de consenso de la inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado, comprenderá óptimamente, también al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fe) típicamente aquella de una inmunoglobulina humana [Jones y colaboradores, Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann y colaboradores, Nature, 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)]. Los métodos para la humanización de anticuerpos no humanos son bien conocidos en el arte. Generalmente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácidos introducidos dentro de éste a partir de una fuente que no es humana. Estos residuos de aminoácido no humanos, se refieren a menudo como residuos de 'importación", que se toman típicamente de un dominio variable 'importado". La humanización se puede llevar a cabo esencialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores (Jones y colaboradores, Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann y colaboradores, Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen y colaboradores, Science, 239:1534-1536 (1988), al sustituir la secuencia CDR o los CDR de roedor por las secuencias correspondientes del anticuerpo humano. De esta manera, tales anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (Patente U.S. No. 4,816,567), en donde sustancialmente menos de un domino intacto de variable humana se ha sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los cuales se sustituyen algunos residuos CDR y posiblemente algunos residuos FR por los residuos de los sitios análogos en los anticuerpos de roedores. Se pueden también producir anticuerpos humanos usando diversas técnicas conocidas en el arte, incluyendo colecciones de despliegue de fagos [Hoogenboom y Winter, J. Mol: Biol., 227:381(1991); Marks y colaboradores, J. Mol. Biol., 222:581(1991)]. Las técnicas de Colé y colaboradores, y Boerner y colaboradores, también están disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos (Colé y colaboradores, Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, página 77 (1985); Boerner y colaboradores, J. Immunol., 147(1): 86- 95 (1991); U.S. 5,750,373]. Similarmente, se pueden hacer anticuerpos humanos al introducir los lugares del cromosoma de la inmunoglobulina humana dentro de animales transgénicos, por ejemplo ratones, en los cuales los genes endógenos de inmunoglobulina se han inactivado parcial o completamente. Con la aplicación de una prueba inmunogénica, se observa la producción de anticuerpos humanos, que se asemejan cercanamente a la que se observa en los humanos en todos los aspectos, incluyendo el rearreglo de genes, ensamble y repertorio de anticuerpos. Este enfoque se describe, por ejemplo, en las Patentes U.S. Nos. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016; y en las siguientes publicaciones científicas: Marks y colaboradores, Bio/Technology 10, 779-783(1992); Lonberg y colaboradores, Nature 368:856-859 (1994); Morrison, Nature 368:812-13(1994); Fishwild y colaboradores, Nature Biotechnology 14:845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14:826(1996); Lonberg y Huszar Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995). Los anticuerpos pueden también madurarse por afinidad usando métodos de mutagénesis y/o selección conocidos, como se describe anteriormente. Los anticuerpos de maduración de afinidad preferidos tiene una afinidad que es de cinco veces, más preferiblemente 10 veces, aun más preferiblemente 20 ó 30 veces mayores que el anticuerpo de partida (generalmente murina, humanizado o humano) del cual se prepara el anticuerpo madurado. iv. Anticuerpos Biespecificos . Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos monoclonales, preferiblemente humanos o humanizados, que tienen especificidad de enlace para al menos dos antígenos diferentes. En el caso actual, una de las especificidades de enlace puede ser para el polipéptido de la invención, la otra para cualquier otro antígeno y preferiblemente para una proteina de superficie celular o receptor o sub-unidad del receptor. Se conocen en el arte los métodos para la elaboración de anticuerpos biespecíficos. Tradicionalmente la producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basa en la co-expresión de dos pares de cadena ligera/cadena pesada de inmunoglobulina, en donde las dos cadenas pesadas tienen diferentes especificidades (Milsen y Cuello, Nature, 305:537-539 [1983]). Debido a la selección aleatoria de las cadenas de inmunoglobulina pesada y ligera, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de diez diferentes moléculas de anticuerpos, de las cuales solamente una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta se lleva a cabo usualmente por etapas de cromatografía de afinidad. Se describen procedimientos similares en WO 93/08829, publicados en 13 de Mayo 1993; y Traunecker y colaboradores, EMBO J. , 10:3655-3659 (1991). Los dominios de variable de anticuerpos con las especificidades de enlace deseadas (sitos de combinación de antígeno-anticuerpo) se pueden fundir a secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. La fusión está preferiblemente con un domino constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende al menos una parte de las regiones de articulación CH2 y CH3. Se prefiere tener la primera constante de cadena pesada (CH1) que contiene los sitios necesarios para el enlace de cadena ligera presente en al menos una de la fusiones. Los ADN codifican las fusiones de inmunoglobulina de cadena pesada y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina se inserta dentro de vectores de expresión separados, y se co-transfectan dentro de un organismo huésped apropiado. Para detalles adicionales de la generación de anticuerpos biespecíficos, ver por ejemplo, Suresh y colaboradores, Methods in Enzymology, 121:210 (1986) . De conformidad con otro aspecto descrito en WO 96/27011, la interfase entre un par de moléculas de anticuerpos se puede preparar por ingeniería para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recuperan del cultivo de células recombinantes. La interfase preferida comprende al menos una parte de la región CH3 de un dominio constante de anticuerpos. En este método, una o más cadenas pequeñas laterales de aminoácidos que forman la interfase de la primera molécula de anticuerpo, se reemplazan con cadenas laterales más largas (por ejemplo, tirosina o triptofano) . Las "cavidades" compensatorias de tamaño idéntico o similar con la cadena mayor, se crean en la interfase de la segunda molécula de anticuerpo al reemplazar cadenas laterales grandes de aminoácidos con pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina) . Esto proporciona un mecanismo para incrementar el rendimiento del heterodímero sobre otros productos indeseables finales como los homodímeros. Se pueden preparar anticuerpos biespecíficos como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos F(ab')2. Las técnicas para la generación de anticuerpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpos se han descrito en la literatura. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos biespecíficos usando unión química. Brennan y colaboradores, Science 229:81 (1985) describe un procedimiento en donde se desdoblan proteolíticamente los anticuerpos intactos para generar fragmentos F(ab')2. Estos fragmentos se reducen en presencia de un agente formador de complejo de ditiol de arsenito de sodio para estabilizar los ditioles vecinales y evitar la formación intermolecular de bisulfuro. Los fragmentos Fab' generados de convierten después a los derivados de tionitrobenzoato (TNB) . Uno de los fragmentos Fab' generados se convierte después a los derivados de tionitrobenzoato (TNB). Uno de los derivados de Fab' -TNB se vuelve a convertir después al Fab' -Tiol por reducción por mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado Fab' -TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos se pueden usar como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas. Los fragmentos Fab' se pueden recuperar directamente de E. coli y acoplarse químicamente para formar anticuerpos biespecíficos. Shalaby y colaboradores, J. Exp. Med. 175:217-225 (1992), describe la producción de una molécula F(ab')2 de anticuerpo biespecífica completamente humanizada. Cada fragmento Fab' se secreta separadamente de la E. coli y se somete a un acoplamiento químico dirigido in vitro para formar el anticuerpo biespecífico. El anticuerpo biespecífico así formado, pudo enlazarse a las células que sobreexpresan el receptor ErbB2 y las células T humanas normales, así como reforzarlas la actividad lítica de los linfocitos citotóxicos humanos contra los objetivos de tumores humanos de pecho. Se conocen diversas técnicas para hacer y aislar fragmentos de anticuerpos biespecíficos directamente de cultivos de células recombinantes. Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecíficos usando cremalleras de leucina. Kostelny y colaboradores, J. Immunol. 148 (5) : 1547-1553 (1992). Los péptidos de cremallera de leucina de las proteínas Fos y Jun, se ligan a las porciones Fab' de dos anticuerpos diferentes por fusión de genes. Se reducen los homodímeros de anticuerpos en la región de articulación para formar monómeros, y después se vuelven a oxidar para formar los heterodímeros y anticuerpos. Se puede también utilizar este método para la producción de homodímeros de anticuerpos. La tecnología "diacuerpos" descrita por Hollinger y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993) ha suministrado un mecanismo alternativo para elaborar fragmentos de anticuerpo biespecíficos. Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) por un enlace que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena. De esta manera, los dominios VH y VL de un fragmento se fuerzan a aparearse con los dominios complementarios VL y VH de otro fragmento, por lo cual se forman dos sitios de enlace de antígenos. También se ha reportado otra estrategia para hacer fragmentos de anticuerpo biespecíficos por el uso de dímeros de cadena simple Fv(sFv). Ver, Gruger y colaboradores, J. Immunol 152:6368 (1994). Se contemplan anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, se puede preparar anticuerpos triespecíficos. Tutt y colaboradores, J. Immunol. 147:60 (1991) . Los anticuerpos biespecíficos ejemplares se pueden enlazar a dos epítopes diferentes sobre un polipéptido TCCR dado. Alternativamente, una extensión del polipéptido anti-TCCR se puede combinar con una extensión que se enlace a una molécula de refuerzo en un leucocito, tal como una* molécula receptora de células T (por ejemplo, CD2, CD3, CD28, o B7), o receptores Fe para el IgG(Fc?R), tal como Fc?RI(CD64), Fc?RII(CD32) y Fc?RIII (CD16) para enfocarse en mecanismos de defensa celular para la célula que expresa el polipéptido particular TCCR. Se pueden también usar anticuerpos biespecíficos para localizar agentes citotóxicos para las células que expresan el polipéptido TCCR particular. Estos anticuerpos poseen una extensión de enlace TCCR y una extensión que enlaza un agente citotóxico o un quelador radionucleótido como EOTUBE, DPTA, DOTA o TETA. Otro anticuerpo biespecífico de interés enlaza el polipéptido TCCR y enlaza además el factor de tejido (TF) . v. Anticuerpos Heteroconjugados . Los anticuerpos heteroconjugados se componen de dos anticuerpos unidos de forma covalente. Tales anticuerpos han sido propuestos, por ejemplo, para atacar células del sistema inmune para células indeseables [Patente U.S. No. 4,676,980], y para el tratamiento de la infección por VIH [WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089] . Se contempla que los anticuerpos se puedan preparar in vitro usando métodos conocidos en la química de proteínas sintéticas, incluyendo aquellos que involucran agentes de reticulado. Por ejemplo, se pueden construir inmunotoxinas usando una reacción de intercambio de bisulfuro, o por la formación de un enlace de tioéter. Los ejemplos de los reactivos apropiados para este propósito incluyen el iminotiolato y metil-4-mercaptobutirimidato, y aquellos descritos, por ejemplo, en la Patente U.S. No. 4,676,980. vi. Ingeniería de la Función del Efector. Puede ser deseable modificar el anticuerpo de la invención con respecto a la función del efector, de manera de enriquecer la efectividad del anticuerpo en por ejemplo, el tratamiento de una enfermedad inmune relacionada. Por ejemplo, se puede introducir un residuo o residuos de cisteína en la región Fe, por lo cual se permite la formación entre cadenas de un enlace disulfuro en esta región. El anticuerpo homodimérico así generado puede tener una capacidad de internalización mejorada y/o una citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo y una exterminación celular creciente mediada por el complemento (ADCC) . Ver Carón y colaboradores, J. Exp. Med. 176:1191-1195 (1992) y Shopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992). Los anticuerpos homodiméricos con una actividad anti-tumor enriquecida, se pueden también preparar usando reticuladores heterobifuncionales como se describe en Wolff y colaboradores, Cáncer Research 53:2560-2565 (1993). Alternativamente, se puede preparar por ingeniería un anticuerpo que tiene regiones duales Fe y puede, por lo cual, tener una lisis de complemento enriquecida y capacidades ADCC. Ver Stevenson y colaboradores, Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989). vii. Inmunoconjugados . La invención también se refiere a inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo conjugado con un agente citotóxico tal como un agente quimioterapéutico, toxina (por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fungal, de plantas o animales, o fragmentos de la misma) o un isótopo radioactivo, (esto es un radiocon ugado) .

Los agentes quimioterapéuticos útiles en la generación de tales inmunoconjugados, se han descrito anteriormente. Las toxinas y fragmentos enzimáticamente activos de los mismos que se pueden usar incluyen la cadena de difteria A, fragmentos activos no de enlace de la toxina de la difteria, cadena de la exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa ) , la cadena de ricina A, la cadena de abrina A, la cadena de modeccina A, alfa-sarcina, proteínas de Aleuri tes fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, Y PAP-S), inhibidor de la momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de la sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos . Está disponible una variedad de radionúclidos para la producción de anticuerpos radioconjugados. Los ejemplos incluyen 212Bi, 131I, 131In, 90Y y 186Re. Los conjugados del agente citotóxico y de anticuerpos se hacen usando una diversidad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales tales como el N-succinimidil-3- (2-piridilditiol) propionato (SPDP) , iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tal como el clorohidrato del dimetil adipimidato HCL) , esteres activos (tal como el suberato de disuccinimidilo) , aldehidos (tal como el glutaraldehído) , compuestos bis-azido (tal como el bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina) , derivados de bis-diazonio (tal como el bis (p-diazoniobenzoil) -etilendiamina) , diisocianatos (tal como el folien 2, 6-diisocianato) , y compuestos de flúor bis-activos (tal como 1, 5-difluoro-2, 4-dinitrobenceno) . Por ejemplo, se puede preparar una inmunotoxina de ricina como se describe en Vietta y colaboradores, Science 238:1098 (1987). El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilen triaminopentaacético etiquetado con 14 carbones (MX-DTPA) es un agente quelador ejemplar para la conjugación del radionucleótido en el anticuerpo. Ver WO 94/11026. En otra modalidad, el anticuerpo se puede conjugar a un "receptor" (tal como la estreptavidina) para utilización en un tejido pre-objetivo en donde el conjugado receptor del anticuerpo se administra al paciente, seguido por la eliminación del conjugado no enlazado de la circulación usando un agente de depuración y, después la administración de un "ligando" (por ejemplo, avidina) que se conjuga a un agente citotóxico (por ejemplo un radionucleótido) . viii. Inmunoliposomas . Las proteínas, anticuerpos, etc, descritos en la presente, se pueden también formular como inmunoliposomas. Los liposomas que contienen el anticuerpo se preparan por métodos conocidos en el arte tales como los descritos en Epstein y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82:3688(1985); Hwang y colaboradores, Proc, Nati. Acad. Sci. USA 77:4030(1980); y las Patentes U.S. Nos. 4,485,045 y 4,544,545. Las liposomas con un tiempo de circulación enriquecido se describen en la Patente U.S. No. 5,013,556. Se pueden generar liposomas particularmente útiles por el método de evaporación en fase inversa con una composición de lípidos que comprende la fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivada de PGE (PEG-PE) . Las liposomas se extruyen a través de filtros de tamaño de poro definido para producir liposomas con el diámetro deseado. Los fragmentos Fab' del anticuerpo de la presente invención se pueden conjugar con las liposomas como se describen en Martin y colaboradores, J. Biol. Chem. 257: 286-288(1982) por medio de una reacción de intercambio de bisulfuro. Un agente quimioterapéutico (tal como la doxorubicina) puede contenerse opcionalmente dentro de la liposoma. Ver Gabizon, y colaboradores, J. National Cáncer Inst. 81(19): 1484 (1989). ix. Uso de los Anticuerpos anti-TCCR. Los anticuerpos anti-TCCR de la presente invención tienen diversas utilidades. Por ejemplo, se pueden usar los anticuerpos anti-TCCR en ensayos de diagnóstico para el TCCR, por ejemplo la detección de su expresión en células, tejidos o suero específico. Se pueden usar diversas técnicas de ensayo de diagnóstico conocidas en el arte tales como ensayo de enlace competitivo, ensayos intercalados directos o indirectos y ensayos de inmunoprecipitación llevados a cabo en fases heterogéneas u homogéneas [Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987) páginas 147-158] . Los anticuerpos usados en los ensayos de diagnóstico se pueden etiquetar con una porción detectable. La porción detectable debe ser capaz de producir, ya sea directa o indirectamente, una señal detectable. Por ejemplo la porción detectable puede ser un radioisótopo tal como 3H, 14C, 32P, 35S ó 125I, un compuesto fluorescente o quimioluminiscente tal como isotiocianato de fluoresceina, rodamina o luciferina, o una enzima tal como fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o peroxidasa de raíz de rábano. Se puede emplear cualquier método conocido en el arte para la conjugación del anticuerpo hasta la porción detectable, incluyendo varios métodos descritos por Hunter y colaboradores, Nature 144:945 (1962); David y colaboradores, Boichemistry 13:1014 (1974); Pain y colaboradores, J. Immunol Meth. 40:219 (1981) y Nygren, J. Histochem. Cytochem. 30:407 (1982).

Los anticuerpos anti-TCCR son también útiles para purificación por afinidad del TCCR a partir de un cultivo de célula recombinante o de fuentes naturales. En este proceso, los anticuerpos TCCR se inmovilizan en un soporte adecuado tal como la resina Sephadex o papel filtro, usando métodos bien conocidos en el arte. El anticuerpo inmovilizado se pone en contacto después con una muestra que contiene el TCCR a purificarse, y posteriormente se lava el soporte con un solvente apropiado que eliminará sustancialmente todo el material en la muestra excepto el TCCR, que se enlaza al anticuerpo inmovilizado. Finalmente, se lava el soporte con otros solventes apropiados que liberarán el TCCR del anticuerpo. 10. Composiciones Farmacéuticas . Las moléculas activas de la invención, polipéptidos y anticuerpos, así como otras moléculas identificadas por los ensayos de separación por exclusión arriba descritos, se pueden administrar para el tratamiento de enfermedades inmunes relacionadas, en forma de composiciones farmacéuticas . Con objeto de atacar la porción íntracelular del TCCR o atacar el TCCR mientras está todavía intracelular, se pueden usar anticuerpos internalizantes. Adicionalmente, se pueden usar también lipofecciones o liposomas para entregar el anticuerpo, o fragmento de un anticuerpo, dentro de las células. En donde se usan fragmentos de anticuerpos, se prefiere el fragmento inhibidor más pequeño que se enlaza específicamente al dominio de enlace de la proteína objetiva. Por ejemplo, se pueden diseñar moléculas de péptidos con base en las secuencias de región variable de un anticuerpo, que retienen la capacidad para enlazar la secuencia de la proteína objetivo. Tales péptidos de pueden sintetizar químicamente y/o producirse por tecnología de ADN recombinante. Ver, por ejemplo, Marasco y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:7889-7893 (1993). Las formulaciones terapéuticas de la molécula activa, preferiblemente un polipéptido o anticuerpos de la invención, se preparan para almacenamiento con mezclado de la molécula activa que tiene el grado deseado de pureza con los portadores, excipientes o estabilizadores opcionales farmacéuticamente aceptables (Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A. Ed. [1980]), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los portadores, excipientes o estabilizadores aceptables no son tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas e incluyen soluciones amortiguadoras tales como fosfato, citrato, y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico, y metionina; conservadores (tal como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio, cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, fenol, alcohol de bencilo o butilo, alquil parabenos, tales como metil o propil paraben; catecol; resorcinol, ciciohexanol, 3-pentanol; y m-cresol) ; polipéptidos de bajo peso molecular (de menos de alrededor de 10 residuos) ; proteínas tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulina; polímeros hidrofílicos tal como la polivinilpirrolidona; aminoácidos tal como la glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos incluyendo glucosa, mañosa, o dextrinas; agentes quelantes tal como EDTA; azúcares tal como sacarosa, manitol, trehalosa, o sorbitol contraiones formadores de sales tal como sodio; complejos de metal (por ejemplo, complejos de proteína-Zn) ; y/o tensoactivos no iónicos tales como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilen glicol (PEG) . Los compuestos identificados por los ensayos de separación por exclusión de la presente invención, se pueden formular de una manera análoga usando técnicas estándar bien conocidas en el arte. La formulación en la presente puede también contener más de un compuesto activo como sea necesario, para la indicación particular a tratarse, preferiblemente aquellos con actividades complementarias que no afectan adversamente uno del otro. Alternativamente, o además, la composición puede comprender un agente citotóxico, citocina o agente inhibidor del crecimiento. Tales moléculas están adecuadamente presentes en combinación en cantidades que son efectivas para el propósito pretendido. Las moléculas activas también puede entramparse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetil celulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli- (metilmetacrilato) , respectivamente, en sistemas de entrega de fármacos coloidales (por ejemplo liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nano-partículas, y nanocápsulas) o en macroemulsiones . Tales técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences 16a. edición, Osol, A. Ed. (1980) . Las formulaciones a usarse para una administración in vivo deben ser estériles. Esto de logra fácilmente por filtración a través de membranas de filtración estériles.

Se pueden elaborar preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos apropiados de las preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros sólidos hidrofóbicos que contienen el anticuerpo, cuyas matrices están en forma de artículos formados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Los ejemplos de las matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles, (por ejemplo poli (2-hidroxietil-metacrilato) o poli (alcohol vinílico) , polilacturos (Patente U.S. No. 3,773,919), copolímeros del ácido L-glutámico y ?-etil L-glutamato, acetato de vinilo-etileno no degradable, copolímeros de ácido glicólico-ácido láctico degradable tal como LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas de un copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida) , y ácido poli-D-(-) -3-hidroxibutírico. Aunque los polímeros tales como etileno-acetato de vinilo y el ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas por más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteinas por periodos de tiempo más cortos. Cuando permanecen los anticuerpos encapsulados en el cuerpo por un tiempo prolongado, se pueden desnaturalizar o agregar como resultado de la exposición a la humedad a 37 °C, resultando en una pérdida de actividad biológica y cambios posibles en la inmunogenicidad. Se pueden vislumbrar estrategias racionales para la estabilización, dependiendo del mecanismo involucrado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es una formación intermolecular de enlace S-S a través del intercambio tio-bisulfuro, se puede lograr la estabilización al modificar los residuos de sulfhidrilo, liofilizarlos de las soluciones acidas, controlar el contenido de humedad usando aditivos adecuados y desarrollar composiciones específicas de matriz de polímero. 11. Métodos de Tratamiento. Se contempla que los polipéptidos, anticuerpos y otros compuestos activos de la presente invención se puedan usar para tratar diversas enfermedades y condiciones inmunes relacionadas, tales como enfermedades mediadas por la células T, incluyendo aquellas caracterizadas por la infiltración de células inflamatorias dentro de un tejido, estimulación de la proliferación de células T, inhibición de la proliferación de células T, permeabilidad vascular incrementada o disminuida o la inhibición de la misma. Las condiciones ejemplares o padecimientos a tratarse con los polipéptidos, anticuerpos y otros compuestos de la invención incluyen, pero no se limitan a, lupus sistémico eritematoso, artritis reumatoide, artritis juvenil crónica, osteoartritis, espondilartropatía, esclerosis sistémica (escleroderma) , miopatías inflamatorias idiopáticas (dermatomiositis, polimiositis) , síndrome de Sjógren, vasculitis sistémica, sarcoidosis, anemia hemolítica, autoinmune (pancitopenia inmune, hemoglobinuria nocturnal paroxismal) , trombocitopenia autoinmune (púrpura idiopático trombocitopénico, trombocitopenia mediada inmune) , tiroiditis (enfermedad de Grave, tiroiditis de Hashimoto, tiroiditis juvenil linfocítica, tiroiditis atrófica) , diabetes mellitus, enfermedad renal mediada por lo inmune, (glomerulonefritis, nefritis tubulointersticial) , enfermedades desmielinizantes del sistema nervioso central y periférico tal como la esclerosis múltiple, polineuropatía desmielinizante idiopática o síndrome de Guillain-Barré, y polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, enfermedades hepatobiliares tales como hepatitis infecciosa (hepatitis A, B, C, D, E y otros virus no hepatotróficos) , hepatitis activa crónica autoinmune, cirrosis biliar primaria, hepatitis granulomatosa y colangitis esclerotizante, enfermedad inflamatoria del intestino (colitis ulcerante, enfermedad de Crohn) , enteropatía sensible al gluten y enfermedad de Whipple, enfermedades de la piel mediadas por inmune o autoinmune, incluyendo enfermedades bulosas de la piel, eritema multiforme y dermatitis de contacto, psoriasis, enfermedades alérgicas tales como asma, rinitis alérgica, dermatitis atópica, hipersensibilidad de alimento y urticaria, enfermedades inmunológicas de pulmón tales como neumonías eosinofílicas, fibrosis pulmonar idiopática y neumonitis hipersensible, enfermedades asociadas con los transplantes, incluyendo rechazo de injertos y enfermedad de injerto contra huésped. En el lupus sistémico eritematoso, el mediador central de la enfermedad es la producción de anticuerpos auto-reactivos para las proteínas/tejidos mismos y la generación posterior de inflamación mediada por inmune. Los anticuerpos median directa o indirectamente la lesión del tejido. Aunque los linfocitos T no han demostrado estar directamente involucrados en el daño a los tejidos, se requieren los linfocitos T para el desarrollo de anticuerpos auto-reactivos. La génesis de la enfermedad es entonces dependiente de los linfocitos T. Se afectan órganos y sistemas múltiples clínicamente, incluyendo riñon, pulmón, sistema músculo-esqueletal mucocutáneo, ojo, sistema nervioso central, sistema cardiovascular, tracto gastrointestinal, medula ósea, y la sangre. La artritis reumatoide (RA) , es una enfermedad inflamatoria autoinmune sistémica crónica, que involucra principalmente la membrana sinovial de las articulaciones múltiples con la lesión resultante al cartílago articular. La patogénesis es dependiente de los linfocitos T y se asocia con la producción de factores reumatoides, auto-anticuerpos dirigidos contra la misma IgG, con la formación resultante de complejos inmunes que alcanzan altos niveles de fluido en las articulaciones y en la sangre. Estos complejos en la articulación pueden inducir al infiltrado marcado de linfocitos y monocitos dentro del sinovio y los cambios posteriores sinoviales marcados; el fluido/espacio de articulaciones si se infiltra por células similares con la adición de neutrófilos numerosos. Los tejidos afectados son principalmente las articulaciones, a menudo en un patrón simétrico. Sin embargo, la enfermedad extra-articular también se presenta en dos formas principales. Una forma es el desarrollo de lesiones extra-articulares con una enfermedad de articulación progresiva continua y lesiones típicas de fibrosis pulmonar, vasculitis y úlceras cutáneas. La segunda forma de enfermedad extra-articular es el denominado síndrome de Felty que se presenta después en el curso de la enfermedad RA, algunas veces después de que la enfermedad de las articulaciones se ha vuelto quiescente, e involucra la presencia de neutropenia, trombocitopenia y esplenomegalia . Esto se puede acompañar por vasculitis en órganos múltiples con formaciones de infartos, úlceras de la piel y gangrenas. Los pacientes también desarrollan a menudo nodulos reumáticos en el tejido subcutis que subyace a las articulaciones afectadas; los nodulos en la etapa tardía tienen centros necróticos rodeados por un infiltrado celular inflamatorio mezclado. Otras manifestaciones que se pueden presentar en el RA incluyen: pericarditis, pleuritis, arteritis coronaria, neumonitis intersticial con fibrosis pulmonar, queratoconjuntivitis sicca, y nodulos reumatoides. La artritis juvenil crónica es una enfermedad inflamatoria crónica idiopática que comienza a menudo a menos de los 16 años de edad. Su fenotipo tiene algunas similitudes con el RA; algunos pacientes que tienen un factor reumático positivo se clasifican como artritis reumatoide juvenil. La enfermedad de sub-clasifica en tres categorías principales: pauciarticular, poliarticular, y sistémica. La artritis puede ser severa y es típicamente destructiva, y conduce a anquilosis de las articulaciones y al crecimiento retardado. Otras manifestaciones pueden incluir uveitis anterior crónica y amiloidosis sistémica. Las espondiloartropatías son un grupo de padecimientos con algunas características clínicas comunes y la asociación común con la expresión del producto de genes HLA-B27. Los padecimientos incluyen: esponilitis anquilosante, síndrome de Reiter, (artritis reactiva) , artritis asociada con enfermedad inflamatoria del intestino, espondilitis asociada con psoriasis, espondiloartropatía de comienzo juvenil y espondiloartropatía no diferenciada. Las características diferenciantes incluyen sacroileitis con o sin espondilitis, artritis asimétrica inflamatoria, asociación con HLA-B27 (un alelo definido serológicamente del lugar cromosómico HLA-B de la clase I MHC) ; inflamación ocular y ausencia de auto-anticuerpos asociados con otra enfermedad reumatoide. Las células más implicadas como clave para la inducción de la enfermedad, es el linfocito T CD+8, una célula que ataca el antigeno presentado por las moléculas MHC de clase I. Las células T CD8+ pueden reaccionar contra el alelo MHC de clase I HLA-B27 como si fuera un péptido extraño expresado por moléculas MHC de clase I. Se ha hecho la hipótesis de que un epítope de HLA-B27 puede imitar un epítope antigénico bacteriano o de otros microbios, e incluir así una respuesta en las células T CD8+. La esclerosis sistémica (escleroderma) tiene una etiología desconocida. Un sello distintivo de la enfermedad es el endurecimiento de la piel, que probablemente se induce esto por un proceso inflamatorio activo. El escleroderma se puede localizar o ser sistémico; son comunes las lesiones vasculares y la lesión celular endotelial en la microvascularidad es un evento temprano e importante en el desarrollo de la esclerosis sistémica; la lesión vascular puede estar mediada por inmune. Una base inmunológica está implicada por la presencia de infiltrados de células mononucleares en las lesiones cutáneas y la presencia de anticuerpos anti-nucleares en muchos pacientes. El ICAM-1 está, a menudo, sobre-regulado en la superficie celular de los fibroblastos en lesiones de la piel, sugiriendo que la interacción de células T con estas células puede tener un papel en la patogénesis de la enfermedad. Otros órganos involucrados incluyen: el tracto gastrointestinal, atrofia del músculo liso, y fibrosis que resulta de una peristalsis anormal/motilidad; riñon: proliferación intimal, sub-endotelial concéntrica que afecta las arterias interlobulares y arqueadas pequeñas con un flujo sanguíneo cortical renal reducido resultante, resulta en proteinuria, azotemia e hipertensión; músculo esqueletal: atrofia, fibrosis intersticial; inflamación; pulmón: neumonitis intersticial y fibrosis intersticial; y corazón: necrosis de banda de contracción, cicatrización/fibrosis .

Las miopatías inflamatorias idiopáticas incluyendo dermatomiositis, polimiositis y otras son padecimientos de la inflamación crónica de los músculos de etiología desconocida, que resultan en debilidad de los músculos. La inflamación/lesión de los músculos es a menudo simétrica y progresiva. Los auto-anticuerpos se asocian con la mayoría de las formas. Estos auto-anticuerpos de miositis específicos, se dirigen contra, e inhiben la función de los componentes, proteínas y ARN involucrados en la síntesis de proteínas. El síndrome de Sjdgren se debe a una inflamación mediada por lo inmune y la destrucción funcional posterior de las glándulas lagrimales y glándulas salivales. La enfermedad se puede asociar con, o se acompaña por, enfermedades inflamatorias del tejido conectivo. La enfermedad se asocia en la producción de auto-anticuerpos contra los antígenos Ro y La, ambos de los cuales son complejos pequeños de proteína-ARN . Las lesiones resultan en queratoconjuntivitis sicca, xerostomia, con otras manifestaciones o asociaciones incluyendo cirrosis biliar, neuropatía sensorial periférica y púrpura palpable. Las vasculitis sistémicas son enfermedades en las cuales la lesión principal es la inflamación y el daño posterior a los vasos sanguíneos que resulta en isquemia/necrosis/degeneración de los tejidos suministrados por los vasos afectados y una disfunción eventual del órgano terminal en algunos casos. Pueden también presentarse vasculitidos como una lesión secundaria, o secuelas de otras enfermedades inflamatorias mediadas inmunes, tal como artritis reumatoide, esclerosis sistémica, etc, particularmente en enfermedades también asociadas con la formación de complejos inmunes. Las enfermedades en el grupo primario de vasculitis sistémica incluyen: vasculitis necrotizante sistémica, poliarteritis nodosa, angiitis alérgica, y granulomatosis, poliangiitis : granulomatosis de Wegener; granulomatosis linfomatoide; y arteritis de células gigantes. Los vasculitidos misceláneos incluyen: síndrome de ganglio linfático mucocutáneo (enfermedad de Kawasaki o MLNS) , vasculitis aislada del CNS, enfermedad de Behet, tromboangiitis obliterans (enfermedad de Buerger) , y venulitis necrotizante cutánea. El mecanismo patogénico de la mayor parte de las vasculitis enlistadas se cree que se debe principalmente a la deposición de complejos de inmunoglobulina en la pared de los vasos y la inducción posterior de la respuesta inflamatoria ya sea por medio de un ADCC, activación del complementólo ambas.

La sarcoidosis es una condición de etiología desconocida que se caracteriza por la presencia de granulomas epiteliales en casi cualquier tejido en el cuerpo; el involucrar el pulmón es lo más común. La patogénesis involucra la persistencia de macrófagos activados y células linfoides en sitios de la enfermedad con secuelas crónicas posteriores que resultan de la liberación de productos activos local y sistémicamente liberados por estos tipos de células. La anemia hemolítica autoinmune que incluye anemia hemolítica autoinmune, pancitopenia inmune y hemoglobinuria noctural paroxismal, es un resultado de la producción de anticuerpos que reaccionan con antígenos expresados en la superficie de las células de los glóbulos rojos (y en algunos casos otras células sanguíneas incluyendo también plaquetas) y es un reflejo de la eliminación de aquellas células recubiertas con anticuerpos por medio de lisis, mediada por el complemento y/o mecanismos mediados por el receptor Fc/ADCC. En la trombocitopenia autoinmune que incluye el púrpura trombocitopénico, y la trombocitopenia mediada inmune en otras situaciones clínicas, sucede la destrucción/eliminación de plaquetas como resultado del anticuerpo o del complemento que se sujeta a las plaquetas y la posterior eliminación por lisis de complemento, ADCC o mecanismos mediados por el receptor FC. La tiroiditis que incluye enfermedad de Grave, tiroiditis de Hashimoto, tiroiditis linfocítica juvenil, y tiroiditis atrófica, son el resultado de la respuesta autoinmune contra antígenos de la tiroides con la producción de anticuerpos que reaccionan con las proteínas presentes en, y a menudo específicas para la glándula de la tiroides. Existen modelos experimentales, incluyendo modelos espontáneos: ratas (ratas BUF y BB) y pollos (cepas de pollo obeso) ; modelos de inducción; inmunización de animales con tiroglobulina, antígeno microsomal de tiroides (peroxidasa de la tiroides) . La diabetes mellitus de tipo I o la diabetes dependiente de la insulina, es la destrucción autoinmune de las células ß de isletas pancreáticas; esta destrucción está mediada por auto-anticuerpos y células T auto-reactivas. Los anticuerpos para la insulina, o para el receptor de la insulina, pueden también producir el fenotipo de la respuesta no de insulina. Las enfermedades renales mediadas inmunes, incluyendo la glomerulonefritis y la nefritis tubulointersticial, son el resultado de lesiones mediadas por linfocitos T o anticuerpos para los tejidos renales, ya sea directamente como resultado de la producción de anticuerpos auto-reactivos o de células T contra antígenos renales, o indirectamente como resultado de la deposición de anticuerpos y/o complejos inmunes en el riñon, que reaccionan contra otros antígenos no renales. Así, otras enfermedades mediadas inmunes, que resultan en la formación de complejos inmunes, pueden también inducir la enfermedad renal mediada inmune como secuelas indirectas. Los mecanismos inmunes directos e indirectos resultan en una respuesta inflamatoria que produce/induce el desarrollo de la lesión en tejidos renales con una obstrucción de la función de los órganos resultantes y en algunos casos la progresión hasta falla renal. Tanto los mecanismos inmunes celulares y los humorales, pueden estar involucrados en la patogénesis de las lesiones. Las enfermedades desmielinizantes del sistema nervioso central y periférico, incluyendo esclerosis múltiple; polineuropatía desmielinizante idiopática o síndrome de Guillain-Barré; y polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, se cree que tienen una base autoinmune y resultan en la desmielinización de nervios como resultado del daño provocado a los oligodendrocitos o directamente a la mielina. En la MS, hay evidencia para sugerir que la inducción y la progresión de la enfermedad dependen de los linfocitos T. La esclerosis múltiple es una enfermedad desmielinizante que depende del linfocito T y tiene un curso de disminución-recaída o un curso progresivo crónico. La etiología es desconocida; sin embargo, infecciones virales, predisposiciones genéticas, ambiente y autoinmunidad contribuyen todos. Las lesiones contienen infiltrados predominantemente de células microgliales mediadas por los linfocitos T y macrófagos infiltrados; los linfocitos T CD4+ son el tipo de célula predominante en las lesiones. No se conoce el mecanismo en la muerte celular de los oligodendrocitos y la desmielinización posterior, pero es probable que se impulse por los linfocitos T. La enfermedad de pulmón fibrótica e inflamatoria, incluyendo las neumonías eosinofílicas, fibrosis pulmonar idiopática y neumonitis de hipersensibilidad pueden involucrar una respuesta desregulada inflamatoria inmune. La inhibición de esa respuesta sería de beneficio terapéutico. La enfermedad de la piel mediada inmune o autoinmune, incluyendo enfermedades bulosas de la piel, eritema multiforme y dermatitis de contacto están mediadas por auto-anticuerpos, la génesis de los cuales depende de los linfocitos T. La psoriasis es una enfermedad inflamatoria mediada por los linfocitos T. Las lesiones contienen infiltrados de linfocitos T, macrófagos y células procesadoras de antígenos y algunos neutrófilos. Las enfermedades alérgicas que incluyen asma, rinitis alérgica, dermatitis atópica, hipersensibilidad a los alimentos, y urticaria, dependen de los linfocitos T. Estas enfermedades están predominantemente mediadas por la inflamación inducida por linfocitos T, inflamación mediada por IgE o una combinación de ambos . Enfermedades asociadas con el transplante que incluyen el rechazo de injertos y la enfermedad de injerto contra huésped (GVHD) , dependen de los linfocitos T; la inhibición de la función de los linfocitos T es mejoradora . Otras enfermedades, en las cuales la intervención de la respuesta inmune o inflamatoria tiene beneficio, son las enfermedades infecciosas, incluyendo, pero no limitándose a, infección viral (incluyendo, pero no limitándose a, SIDA, hepatitis A, B, C, D, E y herpes) , infección bacteriana, infecciones fúngales, e infecciones parasitarias y por protozoarios (moléculas (o derivados/agonistas) que estimulan la MLR, se pueden utilizar terapéuticamente para aumentar la respuesta inmune a los agentes infecciosos), enfermedades de inmunodeficiencia (moléculas/derivados/agonistas) que estimulan la MLR, pueden usarse terapéuticamente para aumentar la respuesta inmune para condiciones de inmunodeficiencia inducida, infecciosa adquirida, heredada (por ejemplo, una infección por VIH) , o iatrogénicas (esto es, de quimioterapia), y neoplasia. Se ha demostrado que algunos pacientes con cáncer desarrollan una respuesta a los anticuerpos y/o linfocitos T para antígenos en las células neoplásticas. Se ha demostrado también en modelos animales de neoplasia, que el aumento de la respuesta inmune puede resultar en el rechazo o regresión de ese neoplasma en particular. Las moléculas que aumentan la respuesta de los linfocitos T en el MLR tienen utilidad in vivo en aumentar las respuestas inmunes contra la neoplasia. Las moléculas que aumentan la respuesta proliferativa de linfocitos T en el MLR (o agonistas de moléculas pequeñas o anticuerpos que afectan al mismo receptor en una forma agonista) , se pueden usar terapéuticamente para tratar el cáncer. Las moléculas que inhiben la respuesta de linfocitos en el MLR también funcionan in vivo durante la neoplasia para suprimir la respuesta inmune de un neoplasma; tales moléculas se pueden expresar por células neoplásticas en sí mismas, o su expresión se puede inducir por el neoplasma en otras células. El antagonismo de tales moléculas inhibitorias (ya sea con anticuerpos, antagonistas de molécula pequeña u otros medios) aumenta el rechazo mediado inmune de tumores. Adicionalmente, la inhibición de moléculas con propiedades pro-inflamatorias puede tener un beneficio terapéutico en la lesión por reperfusión, apoplejía, infarto al miocardio, ateroesclerosis, lesión pulmonar aguda, choque hemorrágico, quemaduras, choque séptico/sepsis, necrosis tubular aguda, endometriosis, enfermedad degenerativa de las articulaciones y pancreatitis. Los compuestos de la presente invención, por ejemplo polipéptidos o anticuerpos, se administran a un mamífero, preferiblemente un humano, según los métodos conocidos tales como administración intravenosa, como un bolo o por infusión continua durante un periodo de tiempo, por vías intramusculares, intraperitoneales, intracerebroespinales, subcutáneas, intraarticulares, intrasinovial, intratecal, oral, tópica, o por inhalación, (intranasal, intrapulmonar) . La administración intravenosa o inhalada de polipéptidos y anticuerpos se prefiere. En la terapia con inmunoadyuvantes, se pueden combinar otros regímenes terapéuticos, tales como la administración de un agente anti-cáncer, con la administración de las proteínas, anticuerpos o compuestos de la invención actual. Por ejemplo, el paciente a tratarse con un inmunoadyuvante de la invención, puede también recibir un agente anti-cáncer (agente quimioterapéutico) o terapia de radiación. La preparación y los programas de dosificación para tales agentes quimioterapéuticos se pueden usar de conformidad con las instrucciones del fabricante, o como se determina empíricamente por el técnico habilitado. También se describe la preparación y programas de dosificación para tal quimioterapia en Chemotherapy Service ED. , M. C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992) . El agente quimioterapéutico puede anteceder o seguir a la administración del inmunoadyuvante, o se le puede dar simultáneamente con el mismo. Adicionalmente, se puede dar un compuesto anti-estrógeno, tal como el tamoxifen, o anti-progesterona tal como la onapristona (ver EP 616812), en dosis conocidas para tales moléculas. Puede ser deseable también administrar anticuerpos contra otros antígenos asociados con enfermedad inmune o asociados con el tumor, tales como los anticuerpos que se enlazan a CD20, CDlla, CD18, ErbB2, EGFR, ErbB3, ErbB4, o al factor endotelial vascular (VEGF) . Alternativamente, o además, dos o más moléculas que se enlazan a los mismos, o dos o más antigenos diferentes descritos en la presente, se pueden co-administrar al paciente. Algunas veces puede ser benéfico también administrar una o más citocinas al paciente. En una modalidad, los polipéptidos de la invención se co-administran con un agente inhibidor del crecimiento. Por ejemplo, se puede administrar el agente inhibidor del crecimiento primero, seguido por un polipéptido de la invención, sin embargo, la administración simultánea o la administración primera también se contempla. Las dosis apropiadas para el agente inhibidor del crecimiento son aquellas actualmente usadas, y se pueden disminuir debido a la acción combinada (sinergia) del agente inhibidor del crecimiento y del polipéptido de la invención. Para el tratamiento o reducción en la severidad de la enfermedad inmune relacionada, la dosis apropiada de un compuesto de la invención dependerá del tipo de enfermedad a tratarse como se define anteriormente, la severidad y curso de la enfermedad, ya sea que el agente se administre para propósitos terapéuticos o preventivos, terapia previa, la historia clínica del paciente y la respuesta al compuesto, y la discreción del médico asistente. El compuesto se administra adecuadamente al paciente una vez o durante una serie de tratamientos. Por ejemplo, dependiendo del tipo o severidad de la enfermedad, alrededor de 1 µg/kg a 15 mg/kg (por ejemplo 0.1-20 mg/kg) del polipéptido o anticuerpo, es una dosis candidato inicial para la administración al paciente ya sea, por ejemplo, por una a más administraciones separadas o por infusión continua. Una dosis diaria típica puede estar desde alrededor de 1 µg/kg hasta 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores arriba mencionados. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la condición, se mantiene el tratamiento hasta que se presenta una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Sin embrago, pueden ser útiles otros regímenes de dosis. El progreso de esta terapia se observa fácilmente por técnicas y ensayos convencionales. 12. Artículos de Manufactura. En otra modalidad de la invención, se proporciona un artículo de manufactura que contiene materiales útiles para el diagnóstico o tratamiento de los padecimientos antes descritos. El artículo de manufactura comprende un contenedor y una etiqueta. Los contenedores apropiados incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringas, y tubos de ensayo. Los contenedores se pueden formar de una diversidad de materiales como vidrio o plástico. El contenedor conserva una composición que es efectiva para el diagnóstico o tratamiento de la condición, y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el contenedor puede ser una bolsa o un vial de solución intravenosa que tiene un tapón que se puede perforar por una aguja de inyección hipodérmica) . El agente activo en la composición es usualmente un polipéptido o un anticuerpo de la invención. La etiqueta sobre, o asociada con el contenedor, indica que la composición se usa para el diagnóstico o tratamiento de la condición de elección. El artículo de manufactura puede comprender, además, un segundo contenedor que comprende una solución amortiguadora farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina amortiguada de fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede además incluir otros materiales deseables desde un punto de vista comercial del usuario, incluyendo otras soluciones amortiguadoras, diluyentes, filtros, agujas, jeringas, e insertos de empaque con instrucciones de uso. 13. Diagnóstico y Prognosis de la Enfermedad Inmune Relacionada. Las proteínas de la superficie celular, tales como las proteínas que se sobre-expresan en ciertas enfermedades relacionadas inmunes, son objetivos excelentes para los candidatos a fármacos o el tratamiento de enfermedades. Las mismas proteínas, junto con las proteínas secretadas codificadas por los genes amplificados en los estados de enfermedad inmuno relacionados, encuentran uso adicional en el diagnóstico y prognosis de estas enfermedades. Por ejemplo, los anticuerpos que se dirigen contra los productos de proteínas de los genes amplificados en la esclerosis múltiple, artritis reumatoide, u otra enfermedad inmuno relacionada, se pueden usar como diagnósticos o prognósticos . Por ejemplo, se pueden usar anticuerpos, incluyendo fragmentos de anticuerpos, para detectar cuantitativamente o cualitativamente, la expresión de las proteínas codificadas por los genes amplificados y sobre-expresados ("productos de gen marcador") . El anticuerpo se equipa preferiblemente con una etiqueta detectable, por ejemplo fluorescente, y se puede revisar el enlace por un microscopio de luz, citometría de flujo, fluorimetría u otras técnicas conocidas en el arte. Estas técnicas son particularmente apropiadas si el gen sobre-expresado codifica una proteína de superficie celular. Tales ensayos de enlace se llevan a cabo esencialmente como se describen anteriormente. La detección in situ de enlace del anticuerpo a los productos de gen marcador, se puede llevar a cabo, por ejemplo, por microscopio de inmuno-fluorescencia o inmuno-electrón. Para este propósito, se separa un espécimen histológico del paciente y se le aplica un anticuerpo etiquetado, preferiblemente al sobreponer el anticuerpo sobre una muestra biológica. Este procedimiento permite también la determinación de la distribución del producto del gen marcador en el tejido examinado. Será aparente para aquellos con habilidad en el arte, que están disponibles una amplia variedad de métodos histológicos para la detección in situ. Los siguientes ejemplos se ofrecen para propósitos ilustrativos solamente y no pretenden limitar el alcance de la presente invención de ninguna manera. Todas las referencias a patentes y literaturas citadas en la presente descripción, se incorporan aquí como referencia en su totalidad. EJEMPLOS . Se utilizaron los reactivos comercialmente disponibles referidos en los ejemplos, de conformidad con las instrucciones del fabricante, al menos que se indique de otra manera. La fuente de aquellas células identificadas en los siguientes ejemplos, y a lo largo de la descripción, por los números de acceso ATCC, es la American Type Culture Collection, Manassas, VA. A menos que se observe de otra manera, la presente invención utiliza procedimientos estándar de tecnología de ADN recombinante, tales como aquellos descritos hasta aquí y en los siguientes libros de texto: Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press N.Y., 1989; Ausubel y colaboradores, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., 1989; Innid y colaboradores, PCR Protocols; A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc., N.Y., 1990; Harlow y colaboradores, Antibodies; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, 1998; Gait, M.J., Oligonucleotide Synthesis, IRL Press, Oxford, 1984; R.l. Freshney, Animal Cell Culture, 1987; Coligan y colaboradores, Current Protocols in Immunology, 1991. EJEMPLO 1 Aislamiento y clonación de TCCR. Se utilizaron receptores de citocina y/o un receptor caracterizado por un dominio WS(G)XWS para buscar en bases de datos públicas EST y resultaron en el aislamiento de hTCCR (SEQ ID NO:l) y mTCCR (mTCCR). Alternativamente, el TCCR de murina detallado en la figura 4 (SEQ ID NO: 2) ha sido publicado en WO 97/44455 presentada el 23 de Mayo del 1996, así como en el GenBank como número de acceso 7710109. También se describe la molécula del arte previo en Sprecher y colaboradores, Biochem, Biophys, Res. Commun. 246(1) :82-90 (1998). En la figura 4 (SEQ ID NO:2), se ha identificado un péptido de señal de los residuos de aminoácidos 1 hasta alrededor de 24, el dominio de transmembrana desde alrededor de los residuos de aminoácidos 514 hasta alrededor de 532, los sitios de N-glicosilación a alrededor de los residuos 46-49, 296-299, 305-308, 360-361, 368-371 y 514 hasta 532, los sitios de fosforilación de la casein cinasa II a alrededor de los residuos 10-13, 93-96, 130-133, 172-175, 184-187, 235-238, 271-274, 272-275, 323-326, 606-609 y 615-618, un sitio de fosforilación de la tirosina cinasa a alrededor de los residuos 202-209, sitios de N-miristoilación a alrededor de los residuos 43-48, 102-107, 295-300, 321-326, 330-335, 367-342, 393-398, 525-530 y 527-532, un sitio de amidación a alrededor de los residuos 240-243, una colocación de lípidos de lipoproteína de membrana procariótica a alrededor de los residuos 516-526 y un factor de crecimiento y una firma 1 de la familia del receptor de citocina a alrededor de los residuos 36-49. La región de homología importante existe con: (1) la eritropoyetina humana a alrededor de los residuos 14-54 y (2) el receptor de interleucin-5-murina en los residuos 211-219. Se ha publicado un polipéptido que tiene una alta homología con el TCCR humano detallado en la figura 3 (SEQ ID NO:l) en WO 97/44455 presentada el 23 de Mayo del 1996, que también está disponible en el GenBank como número de acceso 4759327. La molécula del arte previo se describe también en Sprecher y colaboradores, Biochem. Biophys, Res. Commun. 246(1): 82-90 (1998). En la figura 3 (SEQ ID NO:l), se ha identificado un péptido de señal de los residuos de aminoácidos 1 hasta alrededor de 32, el domino de transmembrana desde alrededor de los residuos de aminoácidos 517 a alrededor de 538, sitios de N-glicosilación alrededor de los residuos 51-54, 76-79, 302-305, 311-314, 374-377, 382-385, 467-470, 563-466, un sitio de N-miristoilación a alrededor de los residuos 107-112, 240-245, 244-249, 281-286, 292-297, 373-378, 400-405, 459-464, 470-475, 531-536 y 533-538, un sitio de colocación de un lípido de lipoproteínas de membrana procariótica a alrededor de los residuos 522-532 y un factor de crecimiento y firma 1 de la familia de receptor de citocinas a alrededor de los residuos 41-54. Hay también una región de homología importante con la segunda sub-unidad del receptor para el factor estimulante de colonias de macrófagos-granulocitos humanos (GM-CSF) en los residuos 183-191. Una comparación de las secuencias TCCR humanas (SEQ ID NO:l) y del TCCR de murina (SEQ ID NO: 2) se muestran en la figura 5. La comparación revela alrededor de un 62% de identidad de secuencia entre las secuencias humanas y la de murina . EJEMPLO 2 Ratón "Agénico" TCCR 1. Preparación del vector objetivo. El término "vector objetivo" es un término del arte que se refiere a una secuencia de ácido nucleico que se construye para la extirpación de genes. La figura 9 describe el vector objetivo usado para la molécula TCCR aislada en este ejemplo. Específicamente, el vector objetivo se construyó usando un fragmento 2.4 kb Xhol-HindlII que contenía los primeros 2 exones y un fragmento de 6.0 kb Eco Rl- Bam Hl que contenía los exones 9 al 14. El gen específico TCCR aislado contenía 14 exones y 13 intrones. En este vector objetivo, el neo gen-pGK que confiere la resistencia a la gentamicina, se ha utilizado para reemplazar los exones 3-8, dejando intactos los exones 1 y 2. La región codificadora de la timidina cinasa (HSV-TK) del virus de herpes simplex, se ha colocado 5' del exon 1, permitiendo la selección con ganciclovir. Tales marcadores de selección de fármacos tales como el ganciclovir, permiten la selección de líneas celulares estables transfectadas que contienen el vector objetivo, y permiten además que se preparen los cebadores de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que amplificarán un fragmento de ácido nucleico único para el constructo objetivo que se diferenciará del gen endógeno. Este constructo se insertó dentro del vector pBluescript (Stratagene, La Jolla, CA) y se transformó dentro de las bacterias DHIOB. Se recolectan las colonias simples y se usan para preparar cantidades mayores del vector objetivo. 2. Preparación de células madre -/- de TCCR.

Se linealizó el vector objetivo por digestión con la endonuclease de restricción en Notl y se transfectó dentro de células madre embriónicas (ES) . Las células ES se escogieron por su capacidad para integrarse dentro de la línea germen de los embriones en desarrollo, de manera de transmitir el vector objetivo a su progenie. La línea ES preferida de elección es la línea ESGS, pero se puede usar también la línea D3 (ATCC CRL1934) . Se hace la electroporación usando 2-5 millones de células ES resuspendidas en 0.8 ml de PBS. Se agrega el vector objetivo linealizado (20 µg) a las células, y este se coloca en una cubeta estéril de electroporación (0.4 cm Bio-Rad, Hercules, CA) . Se lleva a cabo la electroporación usando el aparato de electroporación Bio-Rad fijado a 500 µF, 240 voltios. Se transfieren los contenidos de la cubeta dentro de 410 ml de ES. El medio ES se compone de: DMEM de alta glucosa (Gibco 11960-010), FBS al 10% (Gibco probado con células ES 16141-061) y 1000 unidades/ml de LIF de murina ESGRO (Gibco 13275-0290) . Se forman después alícuotas de esta célula dentro de 20 placas de 96 pozos. Después de la transfección del vector objetivo, se seleccionan las células ES al usar una concentración letal de los fármacos previamente mencionados. En el caso del G418, se utilizan 400 µg/ml. Solamente aquellas células ES que llevan al vector objetivo tendrán los marcadores de resistencia para antibióticos necesarios para sobrevivir. Las colonias seleccionadas de células ES se separan después por exclusión para la integración correcta del vector por medio de manchado Southern (figura 10A) , PCR (figura 10B) , carencia de la expresión de mARN del gen objetivo endógeno (figura 10C) . Los clones ES que pasan los criterios anteriores, se usan después para la microinyección dentro de embriones. 3. Inyección y separación por exclusión de ratones -/-TCCR. Se transfieren las colonias de células ES seleccionadas y separadas de la etapa previa, dentro de un embrión en desarrollo en cualquier técnica apropiada en el arte, preferiblemente por microinyección. Las técnicas apropiadas de la invención se describen en Hogan y colaboradores, Manipulating the mouse embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 1986. Aunque se puede usar cualquier embrión proporcionado que se puede identificar posteriormente, preferiblemente los embriones seleccionados para microinyección son machos y tienen color de recubrimiento que es opuesto al color de recubrimiento codificado por los genes de la célula ES que contiene el vector objetivo. Por ejemplo, las células ES de un animal con pelaje blanco se inyectarían dentro de un embrión que desarrollaría un pelaje café/negro. De esta manera, se pueden seleccionar los embriones exitosamente micro-inyectados como adultos madurados sobre la base del color de recubrimientos mosaico. Los animales mosaico resultantes (fundadores) son TCCR -/+ y se vuelven a cruzar (apareados por otra progenie TCCR -/+) para crear ratones TCCR -/-. Para confirmar el genotipo TCCR -/-, se extrae ADN de recortes de la cola que se efectúan al incubar el tejido de la cola a 60 C durante la noche en 0.5 ml de solución amortiguadora de lisis. La solución amortiguadora de lisis consiste de 0.5 % SDS, 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCL (pH 8.0), 7.5 mM EDTA (pH 8.0) y 1 mg/ml de proteinasa K (Boehringer-Mannheim) . Después de la incubación durante la noche, se mezclan alícuotas de 75 µl de acetato de potasio 8M, de 600 ml de CHC13, en la reacción completa, centrifugada durante 10 minutos a temperatura ambiente. La capa acuosa se separa y coloca en un tubo eppendorf separado, que se le agregan 600 ml de etanol al 100%, y se precipita el ADN por centrifugación durante 5 minutos. Se lava un peletízado de ADN con etanol al 70% y se deja secar en aire. Después de la separación del etanol residual, se vuelve a suspender el peletizado de ADN en 150-200 µl de agua. Este ADN se puede usar después por manchado Southern y para análisis PCR. Para el manchado Southern, el neo gen se puede usar como sonda; para el PCR, se emplean los cebadores usados para la separación por exclusión de las células ES. Los resultados se reportan en las figuras 10A, 10B y 10C, indicando la extirpación exitosa del gen TCCR. Los ratones deficientes en TCCR fueron viables, fértiles y no mostraban anormalidades manifiestas. El examen histológico detallado no reveló ningún defecto obvio. El análisis de citometría de flujo de las células obtenidas del timo, bazo, ganglio linfático, y parches de peyer de ratones agónicos y de tipo silvestre múltiples teñidos con los anticuerpos para CD3, CD4, CD8, CD25, CD19, B220, CD40, NK1.1, DX5, F4/80, CD14, CD16, MHC II y CD45, no revelaron ninguna diferencia importante entre los dos genotipos . EJEMPLO 3 Inflamación de las Vías Respiratorias Alérgica Aumentada en Ratones TCCR -/-.

El asma es una enfermedad que resulta de la interacción de una multitud de factores alérgicos y no alérgicos que resultan en la obstrucción e inflamación bronquial. Uno de los aspectos clave de la inflamación de las vías respiratorias es la infiltración de la pared de las vías respiratorias por las células Th2. Debido a que los ratones TCCR -/- producidos en la presente tienen una mayor respuesta del Th2, son un modelo útil para la inflamación alérgica de la vías respiratorias. Animales : Doce ratones TCCR -/- y once carnadas de tipo silvestre (WT) , se dividieron aleatoriamente dentro de los siguientes 4 grupos: grupo 1- no sensibilizado TCCR -/-; grupo 2 no sensibilizado TCCR WT (n=4); grupo 3- sensibilizado TCCR -/- (n=8); y grupo 4 sensibilizado TCCR Wt (n=8) . Sensibilización : Se sensibilizaron 15 ratones (machos y hembras) con 300 unidades/ml de antígeno de ácaros del polvo (Bayer Pharmaceutical) absorbido a 1 mg/ml de Alum, dando IP en el día 0 en un volumen de 0.1 ml . Los ratones de control no sensibilizados (n=8) recibieron 0.1 ml de 0.9 % de NaCl y 1 mg/ml Alum IP.

Ambos grupos de ratones se reforzaron el día 7 con una inyección de antígeno IP (grupo sensibilizado) o NaCl (grupo no sensibilizado) como se describió anteriormente.

Aplicación de pruebas inmunogénicas de inhalación: Después de la sensibilización y el refuerzo, se administraron cuatro pruebas inmunogénicas de inhalación de DMA, comenzando el día 16. Para la aplicación en aerosol, la concentración final del acaro del polvo en el nebulizador fue de 6000 unidades /ml después de diluirse con PBS de Dulbecco y 0.1 de Tween®-20. Todas las aplicaciones de pruebas inmunogénicas de inhalación se administraron en una cámara de exposición de pastel Plexiglás®. Se formó aerosol con DMA durante 20 minutos, usando un nebulizador PARÍ IS-2 inicialmente, y después rellenándolo con 1.5 ml, 10 minutos en exposición. La dosis total depositada en el pulmón fue de ~6.5 AU de DMA. AHR (paralizado) : El dia 24, se anestesiaron los ratones a aproximadamente 18 horas después de la última aplicación de prueba inmunogénica con aerosol de DMA, con una mezcla de pentobarbital (25 mg/kg) y uretano (1.8 g/kg) y se cateterizaron con una incisión de 1 cm sobre la vena yugular derecha. Se diseccionó la vena yugular libre y se insertó un catéter (PE-10 conectado al PE-50) y se sujetó en su lugar. Adicionalmente, se les aplicó la traqueotomía a los ratones (una incisión de 1 cm en el cuello, la tráquea diseccionada libre y una cánula insertada y sujetada en su lugar) . Se cargaron después los ratones dentro de un pletismógrafo de reflujo Plexiglás® para medición de la expansión torácica y la presión en las vías respiratorias. Se ventilaron los ratones usando 100% de oxígeno a una frecuencia de 170 bpm y Vt igual a 9 µl/gm. Se observaron continuamente los mecanismos de respiración (resistencia en los pulmones y cumplimiento dinámico) usando un programa de adquisición de datos computarizados (Buxco Electronics) . Después de las mediciones en la línea base, los ratones recibieron una dosis de 10 segundos una vez de metacolina (dosis de MCH de 500 µg/kg) usando 200 µg/ml MCH como la concentración de reserva. Sacrificio : Después de la terminación de la medición de reactividad de las vías respiratorias, se utilizaron tubos de EDTA para recolectar la sangre por medio del seno retro orbital para obtener suero. Se abrió el abdomen, se rompió la aorta descendente y se cortó el diafragma. Después de transcurrido el tiempo de que a los animales les extrajeran la sangre, se llevó a cabo un lavado bronquioalveolar (BAL) . Se lavaron los pulmones tres veces con el mismo bolo de solución salina estéril (30 µg/g por peso de ratón) a través de la cánula traqueal previamente insertada. El bolo llenó el pulmón hasta aproximadamente 70% de la capacidad total del pulmón. Se centrifugaron las muestras de BAL (el retorno promedio de 80%) a lOOOxg y 4°C durante 10 minutos. Se decantaron los sobrenadantes y se congelaron inmediatamente a -80°C. Se volvieron a suspender los peletizados de célula en 250 ml de PBS con 2% de BSA (Sigman, San Luis, MO) , después se numeraron usando un contador automatizado (Baker, Allentown, PA) y se registraron como número total de células BAL/µl . La suspensión de células se ajustó después a 200 células/µl y se centrifugaron 100 ml sobre portaobjetos de microscopio recubiertos Superfrost Plus (Baxter Diagnostics, Deefield, IL) a 800 x g durante 10 minutos usando una citospina (Shandon, Inc., Pittsburgh, PA) . Se secaron con aire los portaobjetos, se fijaron por 1 minuto en 100% de metanol y se tiñeron con Dic-Quik™ (Baxter Health Care, Miami, FL) . Se evaluaron al menos 200 células por portaobjeto para obtener un conteo diferencial de leucocitos. Después del BAL, el pulmón derecho, el bazo y los ganglios linfáticos de la tráquea bronquial se separaron y congelaron con nitrógeno líquido para un análisis de mARN (y se colocaron después en hielo seco) . Se tomaron cortes de la cola y se congelaron en hielo seco para una formación posterior del genotipo. Los pulmones izquierdos restantes de los ratones se separaron para evaluar y comparar la severidad y carácter de los cambios patológicos en los pulmones entre los grupos experimentales. Esto se llevó a cabo al fijar inicialmente el tejido de pulmón en formalina amortiguada al 10% neutral, alojada en parafina, y se tiñeron secciones de 3 µm con hemotoxilina y eosina. Se tomaron secciones de pulmón transversalmente al bronquio primario y se evaluó la sección completa en ciego y se registró con base a la severidad de la inflamación alrededor de las vías respiratorias y los vasos sanguíneos. El grado de hipertrofia en las células epiteliales de las vias respiratorias usa una escala de 0 (sin inflamación y cambios en la vías respiratorias) hasta 4 (inflamación marcada en las vías respiratorias) . ELISA de IgG: Para la ELISA total intercalada de IgE, se utilizó el fluido BAL con la muestra de suero en forma diluida o no diluida 1:2 a 1:20 (BAL) y 1:25 a 1:200 (suero) en solución amortiguadora ELISA. El anticuerpo de captura fue IgE anti-ratón de conejo (2 µg/ml PBS) y se recubrieron en las placas durante 24-48 horas a 4°C. El estándar IgE de murina (PharMingen, San Diego, CA) que se diluyó en serie 1:2, empezando con una concentración de 100 ng/ml. Se usó el anticuerpo de detección biotiniladq FceRI-IgG a una dilución de 1:2000 durante 1-1.5 horas. El HRP-SA y en las etapas de desarrollo de enzimas fueron idénticas con aquellas utilizadas para los ensayos de citocina. Los resultados demuestran un crecimiento importante en la infiltración de linfocitos dentro del pulmón en los ratones TCCR -/- más que en los de tipo silvestre (figura 11) . EJEMPLO 4 Expresión de TCCR de E. coll . Este ejemplo ilustra la preparación de una forma no glicosilada de TCCR por la expresión recombinante en E. coli . La secuencia de ADN que codifica al TCCR se amplifica inicialmente usando los cebadores PCR seleccionados. Los cebadores deben contener sitios de enzimas de restricción que corresponden a los sitos de enzimas de restricción en el vector de expresión seleccionado. Se puede emplear una diversidad de vectores de expresión. Un ejemplo de un vector apropiado es el pBR322 (derivado de E. coli ; ver Bolívar y colaboradores, Gene, 2:95 (1997)), que contiene genes para resistencia a la ampicilina y la tetraciclina. El vector se digiere con enzimas de restricción y se desfosforila . Las secuencias amplificadas de PCR se ligan después dentro del vector. El vector se incluirá preferiblemente con secuencias que codifican un gen de resistencia a los antibióticos, un promotor trp, un líder polyhis (incluyendo los primeros 6 codones STII, secuencia polyhis, y el sitio de desdoblamiento de la enterocinasa) , la región codificadora TCCR, terminador transcripcional lambda y un gen argU. Se usa después la mezcla de ligación para transformar una cepa seleccionada de E. coli usando los métodos conocidos en Sambrook y colaboradores, supra. Se identifican los transformantes por su capacidad de crecer en placas LB y se seleccionan después las colonias resistentes a los antibióticos. El ADN del plásmido se puede aislar y confirmar por análisis de restricción y formación de secuencias de ADN. Los clones seleccionados pueden crecer durante la noche en un medio de cultivo líquido tal como un caldo LB complementado con antibióticos. El cultivo durante la noche se puede usar posteriormente para inocular un cultivo de mayor escala. Las células se hacen crecer después hasta una densidad óptica deseada durante la cual se activa el promotor de la expresión. Después de cultivar las células por varias horas más se pueden cosechar las células por centrifugación. Se puede solubilizar el peletizado de células obtenido por centrifugación, usando diversos agentes conocidos en el arte, y se puede después purificar la proteína TCCR solubilizada usando una columna queladora de metal bajo condiciones que permiten un enlace firme de la proteína. El TCCR también se puede expresar en E. coli en una forma etiquetada poly-His, usando el siguiente procedimiento. El ADN que codifica el TCCR se amplifica inicialmente usando los cebadores PCR seleccionados. Los cebadores contienen sitios de enzimas de restricción, que corresponden a los sitios de enzimas de restricción en el vector de expresión seleccionado, y otras secuencias útiles que proporcionan la iniciación de la traducción eficiente y confiable, purificación rápida en una columna queladora de metal y la separación proteolítica con enterocinasa. Las secuencias etiquetadas poly-his amplificadas en PCR, se ligan después dentro de un vector de expresión que se usa para transformar un huésped E. coli con base en la cepa 52 (W3110 fuhA(tonA) Ion galE rpoHts (htpRts) clpP(lacIq). Se hacen crecer primero los transformantes LB conteniendo 50 mg-ml de carbenicilina a 30°C con agitación hasta que se alcanza un O.D. de 600 de 3-5. Se diluyen después los cultivos 50-100 veces dentro de medios CRAP (preparados al mezclar 3.57 g de (NH4)2S04, 0.71 g de citrato de sodio 2H20, 1.07 g de KCl, 5.36 g de extracto de levadura Difco, 5.36 g de Hycase Sheffield SF en 500 ml de agua, así como 100 mM MPOS, pH 7.3, 0.55 % (p/v) glucosa y 7 mM MgS0 ) , y se hace crecer durante aproximadamente 20-30 horas a 30°C con agitación. Se separan las muestras para verificar la expresión por análisis SDS-PAGE, y el cultivo grueso se centrífuga para peletizar las células. Se congelan los peletizados de célula hasta la purificación y repliegue. Se vuelve a suspender la pasta de E. coli de las fermentaciones de 0.5 hasta 1 L (6-10 g de peletizados), en 10 volúmenes (p/v) en guanidina 7 M, 20 mM Tris, pH 8 de solución amortiguadora. Se agrega sulfito de sodio sólido y tetrationato de sodio hasta hacer concentraciones finales de 0.1 M y 0.02 M respectivamente, y la solución se agita durante la noche a 4°C. Esta etapa resulta en una proteína desnaturalizada con todos los residuos de cisteína bloqueados por sulfitolización. Se centrífuga la solución a 40,000 rpm en una centrífuga Beckman durante 30 minutos. Se diluye en sobrenadante con 3-5 volúmenes de una solución amortiguadora en columna de quelato metálico (6 M guanidina, 20 mM Tris, pH 7.4), y se filtra a través de filtros de 0.22 mieras para clarificar. Dependiendo de la condición, se carga el extracto clarificado sobre una columna de quelato metálico de 5 ml de Qiagen Ni-NTA equilibrada en la solución amortiguadora de la columna del quelato metálico. Se lava la columna con solución amortiguadora adicional que contiene 50 mM de imidazol (Calbiochem, grado Utrol) , pH 7.4. Se eluye la proteína con solución amortiguadora que contiene 250 mM de imidazol. Se acumulan y almacenan a 4°C las fracciones que contienen la proteína deseada. Se estima la concentración de proteína por su absorbancia a 280 nm usando el coeficiente de extinción calculado con base en su secuencia de aminoácido. Las proteínas se repliegan al diluir la muestra lentamente dentro de solución amortiguadora de repliegue recientemente preparada que consiste de: 20 mM Tris, pH 8.6, 0.3 M NaCl, 2.5 M urea, 5 mM cisteína, 20 mM glicina y 1 mM EDTA. Se escogen los volúmenes de repliegue de manera que la concentración final de proteína esté en 50 hasta 100 microgramos/ml. La solución de repliegue se agita suavemente a 4°C durante 12-36 horas. Se apaga la reacción de repliegue por la adicción de TFA hasta una concentración final de 0.4% (pH de aproximadamente 3). Antes de la purificación adicional de la proteína, se filtra la solución a través de un filtro de 0.22 mieras, y se agrega acetonitrilo hasta una concentración de 2-10%. Se cromatografía la proteína desplegada en una columna de fase inversa Poros Rl/H usando una solución amortiguadora móvil de TFA al 0.1 % con elución con un gradiente de acetonitrilo del 10 hasta el 80%. Se analizan las alícuotas de las fracciones con la absorbancia A280 sobre geles de poliacrilamida SDS y se acumulan las fracciones que contienen la proteina replegada homogénea. Generalmente, las especies replegadas adecuadamente de la mayoría de las proteínas, se eluyen a las concentraciones más bajas de acetonitrilo, ya que esas especies son las más compactas con sus interiores hidrofóbicos protegidos de la interacción con la resina de fase inversa. Las especies agregadas se eluyen usualmente a concentraciones superiores al acetonitrilo. Además para resolver las formas mal plegadas de proteína de la forma deseada, la etapa de fase inversa también elimina la endotoxina de las muestras. Las fracciones que contienen las proteínas TCCR plegadas deseadas respectivamente, se acumulan y se separa el acetonitrilo usando una corriente abundante de nitrógeno dirigida a la solución. Las proteínas se formulan en Hepes 20 mM, pH 6.8 con cloruro de sodio 0.14 M y manitol al 4% por diálisis o por filtración en gel usando resinas G25 Superfine (Pharmacia) equilibradas en la solución amortiguadora de formulación y filtrada estéril. EJEMPLO 5 Expresión del TCCR en células mamíferas .

Este ejemplo ilustra la preparación de una forma potencialmente glicosilada de TCCR por expresión recombinante en células mamíferas. El vector, pRK15 (ver EP 307,247, publicada el 15 de Marzo de 1989) , se emplea como el vector de expresión. Opcionalmente, el ADN de TCCR se liga dentro del pRK5 con las enzimas de restricción seleccionadas para permitir la inserción del ADN de TCCR usando métodos de ligación tales como los descritos en Sambrook y colaboradores, supra. El vector resultante se denomina por ejemplo pRK5-TCCR. En una modalidad, las células huésped seleccionadas pueden ser células 293. Las células 293 humanas (ATCC CCL 1573) se hacen crecer hasta confluencia en placas de cultivo de tejido en medios tales como DMEM complementado con suero de becerro fetal y opcionalmente, componentes nutrientes y antibióticos. Alrededor de lOµg de pRK5-TCCR de ADN se mezcla con alrededor de 1 µg de ADN que codifica el gen VA ARN [Thimmappaya y colaboradores, Cell 31:543 (1982)] y se disuelve en 500 µl de 1 mM Tris-HCl, 0.1 EDTA, 0.227 M CaCl2. A esta mezcla se le agregan, gota a gota, 500 µl de 50 mM HEPES (pH 7.35), 280 mm NaCl, 1.5 mM NaP04, y se deja formar un precipitado durante 10 minutos a 25°C. Se suspende el precipitado y se agrega a las células 293 y se dejan asentar por alrededor de 4 a 37 °C. El medio de cultivo se aspira completamente y se agregan 2 ml de glicerol al 20% en PBS durante 30 segundos. Las células 293 se lavan después con un medio libre de suero, se agrega medio fresco y se incuban las células durante alrededor de 5 días. Aproximadamente 24 horas después de las transfecciones, se separa el medio de cultivo y se reemplaza con medio de cultivo (solamente) o medio de cultivo que contiene 200 uCi/ml de 35S-cisteína y 200 µCi/ml de 35S-metionina. Después de una incubación durante 12 horas, se recolecta el medio acondicionado, se concentra en un filtro rotatorio y se carga sobre un gel SDS al 15%. El gel procesado se puede secar y exponer a la película por un periodo seleccionado de tiempo para revelar la presencia del polipéptido TCCR. Las células transfectadas que contienen los cultivos se pueden someter a incubación adicional (en medio libre de suero) , y se prueba el medio en bioensayos seleccionados. En una técnica alternativa, el TCCR se puede introducir dentro de las células 293 transitoriamente usando el método del sulfato de dextrano descrito por Somparyrac y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. 12:7575 (1981). Se hacen crecer las células 293 hasta una densidad máxima en un matraz rotatorio, y se agregan 700 µg de pRK5-TCCR ADN. Se concentran primero las células del matraz rotatorio por centrifugación y se lavan con PBS. Se incuba el precipitado de dextrano-ADN sobre el peletizado de las células durante 4 horas. Se tratan las células con 20% de glicerol durante 90 segundos, se lavan con medio de cultivo de tejido, y se vuelven a introducir dentro del matraz rotatorio que contiene el medio de cultivo de tejido, 5µg/ml de insulina de bovino y 0.1 µg/ml de transferrina de bovino. Después de alrededor de 4 días, se centrifugan y filtran los medios acondicionados para separar las células y los desechos. La muestra que contiene el TCCR expresado se puede después concentrar y purificar por cualquier método seleccionado, tal como diálisis y cromatografía en columna. En otra modalidad, se puede expresar el TCCR en células CHO. El pRK5-TCCR se puede trasnfectar en células CHO usando reactivos conocidos tales como CaP0 o DEAE-dextrano. Como se describió anteriormente, los cultivos de células se pueden incubar y el medio reemplazarse con medio de cultivo (solamente) o medio que contiene una radioetiqueta tal como 35S-metionina. Después de determinar la presencia de TCCR, se puede reemplazar el medio de cultivo con medio libre de suero. Preferiblemente, se incuban los cultivos por alrededor de 6 días y después se cosecha el medio acondicionado. El medio que contiene el TCCR expresado se puede después concentrar y purificar por cualquier método seleccionado.

Se puede también expresar en las células CHO huésped el TCCR etiquetado con epítopes. Se puede subclonar el TCCR del vector pRK5. El inserto del subclon se puede someter a PCR para fundirse en una estructura con una etiqueta seleccionada de epítope tal como una etiqueta poly-his dentro de un vector de expresión de baculovirus. El inserto TCCR etiquetado con poly-his se puede después subclonar en un vector impulsado por SV40 que contiene un marcador de selección tal como el DHFR para la selección de los clones estables. Finalmente, se pueden transfectar las células CHO (como se describe arriba) con un vector impulsado por SV40. Se puede llevar a cabo el etiquetado como se describe arriba para verificar la expresión. Se puede después concentrar y purificar por cualquier método seleccionado, el medio de cultivo que contiene el TCCR expresado etiquetado con poly-his, tal como por cromatografía de afinidad del quelato Ni2+. Se puede también expresar el TCCR en células CHO y/o COS por un procedimiento de expresión transitorio, o en células CHO por otro procedimiento de expresión estable.

La expresión estable en células CHO se puede llevar a cabo usando el procedimiento abajo detallado. Se pueden expresar las proteínas, por ejemplo, ya sea como un (1) constructo IgG (inmunoadhesión) en el cual las secuencias de codificación para las formas solubles (por ejemplo dominios extracelulares) de las proteínas respectivas se funden a una secuencia de región constante IgG que contiene el dominio de articulación CH2, y/o (2) una forma etiquetada poly-His. Después de la amplificación por PCR, se subclonan los ADN respectivos en un vector de expresión CHO usando técnicas estándar como se describen en Ausubel y colaboradores, Current Protocols of Molecular Biology, Unit 3.16, John Wiley and Sons (1997). Se construyen los vectores de expresión CHO para tener sitios de restricción compatibles 5' y 3' del ADN de interés para permitir la transferencia conveniente de los cADN. El vector usado en la expresión en las células CHO es como se describe en Lucas y colaboradores, Nucí. Acids Res. 24:9 (1774-1779 (1996), y utiliza el promotor/enriquecedor temprano de SV40 para activar la expresión del cADN de interés y la dihidrofolato reductasa (DHFR) . La expresión de la DHFR permite la selección para el mantenimiento estable del plásmido después de la transfección. Se introducen 12 microgramos del ADN de plásmido deseado dentro de aproximadamente 10 millones de células CHO usando reactivos de transfección comercialmente disponibles Superfect® (Qiagen) , Dosper® o Fugene (Boehringer Mannheim) . Las células se hacen crecer como se describe en Lucas y colaboradores, supra. Se congelan aproximadamente 3 x 10"1 células en un ámpula para un posterior crecimiento y producción como se describe abajo. Las ámpulas que contienen el ADN de plásmidos se deshielan por colocación en un baño con agua y se mezclan por formación de vórtices. Se pipetean los contenidos dentro de un tubo centrífugo que contiene 10 ml de medios y se centrifugan a 1000 rpm durante 5 minutos. Se aspira el sobrenadante y se vuelven a suspender las células en 10 ml de medios selectivos (0.2 µm filtrado de PS20 con 0.2 µm de suero de bovino fetal diafiltrado al 5%). Las células se forman después en alícuotas dentro de un extractor centrífugo de 100 ml que contiene 90 ml de medio selectivo. Después de 1-2 días, las células se transfieren dentro de un extractor centrífugo de 250 ml llenado con 250 mL de medio de crecimiento selectivo e incubado a 37°C. Después de otros 2-3 días, se siembran extractor centrífugos de 250 ml, 500 mL y 2000 mL con 3 x 105 células/mL. Los medios de la célula se intercambian con medios frescos por centrifugación y resuspensión en el medio de producción. Aunque se puede emplear cualquier medio apropiado de CHO, se puede de hecho utilizar un medio de producción descrito en la Patente U.S. No. 5,122,469, concedida el 16 de Junio 1992. Se siembra un extractor centrífugo de producción de 3L a 1.2 x 106 células/mL. El día 0, se determina el pH del número de célula. El día 1, se muestrea el extractor centrífugo y comienza el burbujeo con el aire filtrado. El dia 2 se muestrea el extractor centrífugo, se cambia la temperatura a 33 °C y se toman 30 ml de 500 g/L de glucosa y 0.6 mL de antiespumante al 10% (por ejemplo, emulsión al 35% de polidimetilsiloxano, Dow Corning 365 Medical Grade Emulsión) . A lo largo de la producción, se ajusta el pH como sea necesario para mantenerlo alrededor de 7.2. Después de 10 días, o hasta que la viabilidad cae debajo del 70%, se cosecha el cultivo de células por centrifugación y filtración a través de un filtro de 0.22 µm. El filtrado se almacena a 4°C o se carga inmediatamente sobre columnas para purificación. Para los constructos etiquetados con poly-his, las proteínas se purifican usando una columna Ni-NTA (Qiagen) . Antes de la purificación, se agrega imidazol a los medios acondicionados hasta una concentración de 5 mm. Los medios acondicionados se bombean sobre una columna de 6 ml de Ni-NTA equilibrada en Hepes 20 M pH 7.4, solución amortiguadora que contiene 0.3 M de NaCl y 5 mM de imidazol a un flujo de 4-5 mL/minutos a 4°C.

Después de la carga, se lava la columna con solución amortiguadora de equilibrio adicional, y se eluye la proteína con solución amortiguadora de equilibrio que contiene imidazol 0.25 M. La proteína altamente purificada se desala posteriormente dentro de una solución amortiguadora de almacenamiento que contiene Hepes 10 mM, NaCl 0.14 M y 4% de manitol, pH 6.8, con una columna de 25 ml Superfine G25 (Pharmacia) y se almacena a -80°C. Los constructos de inmunoadhesina (que contienen Fe) se purifican de los medios acondicionados como sigue. El medio acondicionado se bombea sobre una columna de proteína A de 5 ml (Pharmacia) que ha sido equilibrada en solución amortiguadora de fosfato de Na 20 mM, pH 6.8. Después de cargar, se lava abundantemente la columna con solución amortiguadora de equilibrio antes de la elución con ácido cítrico 100 mM, pH 3.5. La proteína eluída se neutraliza inmediatamente al recolectar fracciones de 1 ml dentro de tubos que contienen 275 µL de solución amortiguadora Tris 1 M pH 9. Esta proteína altamente purificada se desala posteriormente dentro de una solución amortiguadora de almacenamiento como se describe arriba para las proteínas etiquetadas poly-His. Se evalúa la homogeneidad por los geles de poliacrilamida SDS y por la formación de secuencias de aminoácidos en la terminal N por la degradación de Edman. EJEMPLO 6 Expresión del TCCR en levadura El siguiente método describe la expresión recombinante del TCCR en levadura. Primero, se construyen los vectores de expresión de levadura para la producción o secreción intracelular de TCCR del promotor ADH2/GAPDH. El ADN que codifica el TCCR y el promotor se insertan dentro de sitios de restricción de enzimas apropiados en el plásmido seleccionado para dirigir la expresión intracelular de TCCR. Para la secreción, se puede clonar el ADN que codifica el TCCR dentro del plásmido seleccionado, junto con el ADN que codifica al promotor ADH2/GAPDH, un péptido de señal natural TCCR u otro péptido de señal de mamíferos o, por ejemplo, un factor de levadura alfa o una secuencia líder de señal secretora de invertasa, y secuencias de enlace (si se necesita) para la expresión de TCCR. Se pueden después transformar células de levaduras tales como la cepa de levadura AB110, con los plásmidos de expresión descritos anteriormente y cultivados en los medios de fermentación seleccionados. Se pueden analizar los sobrenadantes transformados de levadura por precipitación con ácido tricloroacético al 10% y separación por SDS PAGE, seguido por la tinción de los geles con tinte de azul de Coomassie. El TCCR recombinante se puede posteriormente aislar y purificar al separar las células de levadura del medio de fermentación por centrifugación, y después concentrar el medio usando filtros de cartucho seleccionados. El concentrado que contiene el TCCR se puede además purificar usando resinas de cromatografía en columna seleccionadas . EJEMPLO 7 Expresión del TCCR en células de insectos infectadas con baculovirus . El siguiente método describe la expresión recombinante del TCCR en células de insecto infectadas con baculovirus. La secuencia codificadora para el TCCR se funde en la dirección ascendente de una etiqueta de epítope que está contenida dentro de un vector de expresión de baculovirus. Tales etiquetas de epítope incluyen etiquetas poly-his y etiquetas de inmunoglobulina (como las regiones Fe e IgG) . Se pueden emplear una diversidad de plásmidos, incluyendo plásmidos derivados de plásmidos comercialmente disponibles tales como pVLl393 (Novagen) . Brevemente, la secuencia que codifica el TCCR o la porción deseada de la' secuencia codificadora de TCCR (tal como la secuencia que codifica el dominio extracelular de una proteína de transmembrana, o la secuencia que codifica la proteína madura si la proteína es extracelular) , se amplifica por PCR con cebadores complementarios a las regiones 5' y 3'. El cebador 5' puede incorporar sitios de enzimas de restricción de flanqueo (seleccionado) . El producto se digiere después con aquellas enzimas de restricción seleccionadas y subclonadas dentro del vector de expresión. El baculovirus recombinante se genera al co-transfectar el plásmido anterior y el ADN del virus BaculoGold™ (Pharmingen) dentro de células de Spodoptera frugiperda ("Sf9") (ATCC CRL 1711) usando lipofectina (comercialmente disponible de GIBCO-BRL) . Después de 4-5 dias de incubación a 28 °C, se cosechan los virus liberados y se usan para amplificaciones adicionales. Se lleva a cabo la infección viral y la expresión de proteínas como se describe por O'Reilley y colaboradores, Baculovirus expression vectors: A Laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994) . Se puede después purificar el TCCR etiquetado con poly-his expresado, por ejemplo, por cromatografía de afinidad de quelatos Ni2+ como sigue. Los extractos se preparan de células Sf9 infectadas con el virus recombinante como se describen por Rupert y colaboradores, Nature, 362: 175-179 (1993). Se lavan brevemente células Sf9 vueltas a suspender en una solución amortiguadora de sonicación (25 mL Hepes, pH 7.9; 12.5 mM MgCl2; 0.1 mM EDTA; glicerol 10%; NP-40 0.1%; KCl 0.4 M) , y se tratan por sonicación dos veces durante 20 segundos sobre hielo. Los productos tratados por sonicación se depuran por centrifugación y se diluye el sobrenadante 50 veces en una solución amortiguadora de carga (fosfato 50 mM, 300 mM NaCl, 10% glicerol, pH 7.8) y se filtran a través de un filtro de 0.45 µm. Se prepara una columna de agarosa A Ni+-NTA (comercialmente disponible de Qiagen) con un volumen de lecho de 5 mL, lavada con 25 mL de agua y equilibrada con 25 mL de solución amortiguadora de carga. El extracto de las células filtradas se carga sobre la columna a 0.5 mL por minuto. Se lava la columna hasta una línea base A280 con solución amortiguadora de carga, en cuyo punto se comienza la recolección de la fracción. Enseguida, se lava la columna con una solución amortiguadora de lavado secundaria (50 mM fosfato; 300 mM NaCl, 10% glicerol, pH 6.0), que eluye la proteína de enlace de forma no específica. Después de alcanzar nuevamente la línea base a 280, se desarrolla la columna con un gradiente de imidazol de 0 a 500 mM en la solución amortiguadora de lavado secundaria. Se recolectan y analizan fracciones de un mL por SDS PAGE y tinción con plata o manchado Western con un Ni2+-NTA- conjugado a la alcalina fosfatasa (Qiagen) . Las fracciones que contienen el TCCR etiquetado con Hisio eluído se acumulan y dializan contra la solución amortiguadora de carga. Alternativamente, se puede llevar a cabo la purificación del TCCR etiquetado con IgG (o etiquetado con Fe) usando técnicas de cromatografía conocidas, incluyendo por ejemplo, cromatografía en columna de proteína A o proteína G. Todavía alternativamente, las moléculas TCCR de la invención se pueden expresar usando un procedimiento modificado de baculovirus que emplea células Hi-5. En este procedimiento, el ADN que codifica la secuencia deseada se amplificó con los sistemas apropiados, tales como Pfu (Stratagene) o fundido en la dirección ascendente (5' de) una etiqueta de epítope contenida dentro de un vector de expresión de baculovirus. Tales etiquetas de epitope incluyen etiquetas poly-His y etiquetas de inmunoglobulina (como las regiones Fe del IgG) . Se puede emplear una diversidad de plásmidos incluyendo los plásmidos derivados de plásmidos comercialmente disponibles tales como pIE-1 (Novagen) . Los vectores pIEl-1 y pIEl-2 se diseñan para la expresión constitutiva de proteínas recombinantes a "partir del promotor de baculovirus ie 1 en células de insectos transformadas establemente. Los plásmidos difieren solamente en la orientación de los sitios de clonación múltiple y contienen todas las secuencias de promotor conocidas por ser importantes para la expresión de genes mediada por ie 1 en células de insecto no infectadas, así como el elemento enriquecedor hr5. El pIEl-1 y pIEl-2 incluyen el sitio de iniciación de la traducción ie 1 y se pueden usar para producir proteínas de fusión. Brevemente, la secuencia deseada o la porción deseada de la secuencia (tal como la secuencia que codifica el dominio extracelular de la proteína de membrana) , se amplifica por PCR con cebadores complementarios a las regiones 5' y 3' . El cebador 5' puede incorporar sitios de enzimas de restricción de flanqueo (seleccionado) . El producto se digiere después con aquellas enzimas de restricción seleccionadas y se subclonan dentro del vector de expresión. Por ejemplo, los derivados de pIEl-1 pueden incluir la región Fe del IgG humano (pb.PH.IgG), o una etiqueta de histidina 8 (pb.PH.His) en la dirección descendente (3'-) de la secuencia deseada. Preferiblemente, se forma la secuencia del constructo del vector para confirmación. Las células Hi5 se hacen crecer hasta una confluencia del 50% bajo las condiciones de 27 °C, sin C02, sin pen/strep. Para cada placa de 150 mm, se mezclan 30 µg del vector basado en pIE que contiene la secuencia con medio Ex-Cell 1 ml (medios: Ex-Cell 401 + 1/100 L-Glu JRH Biosciences # 14401-78P (nota: este medio es sensible a la luz) ) . Separadamente, se mezclan 100 µl de célula fectina (CellFECTIN, Gibco BRL + 10362-010, pre-formada en vórtice) con 1 ml de medio Ex-Cell. Se combinan e incuban las dos soluciones a temperatura ambiente durante 15 minutos. Se agregan 8 ml de medios Ex-Cell a los 2 ml de mezcla de ADN/CellFECTIN, y ésta se forma en capas sobre células Hi5 que se han lavado una vez con el medio EX-Cell. La placa se incuba después en la oscuridad durante 1 hora a temperatura ambiente. La mezcla ADN/célula FECTINA se aspira después y se lavan las células una vez con Ex-Cell para remover el exceso de célula FECTINA. Se agregan 30 ml de medio fresco Ex-Cell y se incuban las células durante 3 días a 28 °C. Se cosecha el sobrenadante y se determina la expresión de la secuencia en el vector de expresión de baculovirus por enlace de lotes de 1 ml de sobrenadante a 25 ml de perlas de Ni-NTA (QIAGEN) , para las proteínas etiquetadas con histidina de las perlas CL-4B de la proteína A sefarosa (Pharmacia) , para las proteínas etiquetadas con IgG seguido por un análisis SDS-PAGE en comparación a una concentración conocida del estándar de proteína por tinción de azul de Coomassie. Se cosechan los medios acondicionados de las células transfectadas (0.5 a 3L) por centrifugación para separar las células y filtrarlas a través de filtros de 0.22 mieras. Para los constructos etiquetados con poly-His, la proteína que comprende las secuencias se purifica usando una columna Ni-NTA (Qiagen) . Antes de la purificación, se da imidazol a una tasa de flujo de 4-5 ml/minuto a 48 °C. Después de la carga, se lava la columna con solución de equilibrio adicional y se eluye la proteína con solución amortiguadora de equilibrio que contiene imidazol 0.25M. La proteína altamente purificada se desala posteriormente dentro de una solución amortiguadora de almacenamiento que contiene Hepes 10 mM, NaCl 0.14 M y manitol al 4%, pH 6.8 con una columna de 25 ml de G25 Superfine (Pharmacia) y almacenado a -80°C. Los constructos de inmunoadhesión (que contienen Fe) , se pueden también purificar de los medios acondicionados como sigue: El medio acondicionado se bombea en una columna de proteína A de 5 ml (Pharmacia) que había sido previamente equilibrada en una solución amortiguadora de fosfato de sodio 20 ml pH 6.8. Después de cargar, la columna se lava extensivamente con la solución amortiguadora de equilibrio antes de la elución con ácido cítrico 100 mM pH 3.5. La proteína eluída se neutraliza inmediatamente al recolectar fracciones de 1 ml dentro de los tubos que contienen 275 µl de solución amortiguadora Tris 1M pH 9. La proteína altamente purificada se desala posteriormente dentro de solución amortiguadora de almacenamiento como se describe anteriormente para las proteínas etiquetadas con poly— His. Se evalúa la homogeneidad por geles de SDS poliacrilamida y por la formación de secuencias de aminoácidos en la terminal N por la degradación Edman. EJEMPLO 8 Preparación de anticuerpos que se enlazan al TCCR. Este ejemplo ilustra la preparación de anticuerpos monoclonales que se pueden enlazar específicamente al TCCR. Las técnicas para la producción de anticuerpos monoclonales se conocen en el arte y se describen, por ejemplo, en Goding, supra. Los inmunógenos que se pueden emplear incluyen TCCR purificado, proteínas de fusión que contienen TCCR y células que expresan el TCCR recombinante en la superficie celular. Se puede hacer la selección del inmunógeno por el técnico habilitado sin experimentación indebida. Se inmunizan ratones tales como el Balb/c, con el inmunógeno TCCR emulsificado en un adyuvante completo de Freund, e inyectado subcutáneamente o intraperitonealmente en una cantidad desde 1-100 microgramos. Alternativamente, el inmunógeno se emulsifica en un adyuvante MPL-TDM (Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT) y se inyecta dentro de las patas traseras del animal. Los ratones inmunizados se refuerzan 10 a 12 días después con inmunógeno adicional emulsificado en el adyuvante seleccionado. De allí en adelante por varias semanas, los ratones se pueden también reforzar con inyecciones adicionales de inmunización. Se pueden obtener periódicamente muestras de suero de los ratones por sangrado retro-orbital para probar en ensayos ELISA, para detectar los anticuerpos anti-TCCR. Después de que se ha detectado una concentración apropiada de anticuerpos, se pueden inyectar los animales "positivos" para anticuerpos con una inyección final intravenosa de TCCR. De tres a cuatro días después, se sacrifican los ratones y se cosechan las células del bazo. Las células del bazo se funden después (usando polietilen glicol al 35%) hasta una línea celular de mieloma de murina seleccionada tal como P3X63AgU.l, disponible de ATCC No. CRL 1597. Las fusiones generan células de hibridoma que se pueden colocar después en placas de cultivo de tejido de 96 pozos que contienen medio HAT (hipoxantina, aminopterina y timidina) para inhibir la proliferación de células no fundidas, híbridos de mieloma e híbridos de células del bazo. Las células de hibridoma se separan por exclusión en un ELISA para su reactividad contra el TCCR. La determinación de las células de hibridoma "positivas" que secretan los anticuerpos monoclonales deseados contra el TCCR, se encuentra dentro de la habilidad en el arte. Las células positivas de hibridoma se pueden inyectar intraperitonealmente dentro de ratones singénicos Balb/c para producir ascitos que contienen los anticuerpos monoclonales anti-TCCR. Alternativamente, se pueden hacer crecer células de hibridoma en matraces de cultivo de tejidos o botellas redondas. La purificación de los anticuerpos monoclonales producidos en los ascitos, se puede efectuar usando precipitación con sulfato de amonio, seguida por cromatografía de exclusión de gel. Alternativamente, se puede emplear la cromatografía de afinidad con base en el enlace del anticuerpo a la proteína A o la proteína G. EJEMPLO 9 Purificación de polipéptidos TCCR usando anticuerpos específicos Se pueden purificar los polipéptidos TCCR naturales o recombinantes por una diversidad de técnicas estándar en el arte de la purificación de proteína. Por ejemplo, los polipéptidos pro-TCCR, polipéptidos TCCR maduros o polipéptidos pre-TCCR, se pueden purificar por cromatografía de inmunoafinidad usando anticuerpos específicos para el polipéptido TCCR de interés. En general, se construye una columna de inmunoafinidad por un acoplamiento covalente del anticuerpo anti-TCCR de polipéptido con una resina cromatográfica activada. Se preparan las inmunoglobulinas policlonales de sueros inmunes, ya sea por precipitación con sulfato de amonio, o por purificación sobre una proteína A inmovilizada (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, N.J.). Similarmente, se preparan los anticuerpos monoclonales de fluido de ascitos de ratón por precipitación con sulfato de amonio o cromatografía sobre una proteína A inmovilizada. La inmunoglobulina parcialmente purificada se coloca covalentemente a una resina cromatográfica, tal como SEPHAROSE™, activada con CnBr (Pharmacia LKB Biotechnology) . El anticuerpo se acopla a la resina, se bloquea la resina y se lava la resina derivada según las instrucciones del fabricante. Tal columna de inmunoafinidad se utiliza en la purificación del polipéptido TCCR al preparar una fracción de las células que contienen al polipéptido TCCR en una forma soluble. Esta preparación se deriva por solubilización de la célula entera o de una fracción subcelular obtenida por medio de centrifugación diferencial por la adición de detergente o por otros métodos bien conocidos en el arte. Alternativamente, el polipéptido soluble TCCR que contiene una secuencia de señal se puede secretar en una cantidad útil dentro del medio en el cual se hacen crecer las células. Se hace pasar una preparación que contiene un polipéptido TCCR soluble sobre la columna de inmunoafinidad, y se lava la columna bajo condiciones que permiten la absorbancia preferencial del polipéptido TCCR (por ejemplo, soluciones amortiguadoras de alta resistencia iónica en presencia del detergente) . Después, se eluye la columna bajo condiciones que rompen el enlace del polipéptido TCCR/anticuerpo (por ejemplo, una solución amortiguadora de bajo pH, tal como aproximadamente pH 2-3, o una alta concentración de un caotropo tal como urea o ion de tiocianato) y se recolecta el polipéptido TCCR. EJEMPLO 10 Separación por exclusión de fármacos Se pueden emplear métodos de separación por exclusión que son particularmente útiles para compuestos usando polipéptidos TCCR o fragmentos de enlace de los mismos, en cualquiera de una diversidad de técnicas de separación por exclusión de fármacos. El polipéptido TCCR, o fragmento empleado en tal prueba, puede estar libre en solución, fijo a un soporte sólido soportado en una superficie celular o localizado intracelularmente. Un método de separación por exclusión de fármacos utiliza células huésped eucarióticas o procarióticas, que se transforman establemente con los ácidos nucleicos recombinantes que expresan el polipéptido o fragmento TCCR. Los fármacos se separan por exclusión contra células transformadas en ensayos de enlace competitivos. Tales células, ya sea en una forma fija o viable, se pueden usar para ensayos de enlace estándar. Se puede medir, por ejemplo, la formación de complejos entre el polipéptido TCCR o fragmento del mismo y el agente que se prueba. Alternativamente, se puede examinar la disminución en la formación de complejos entre el polipéptido TCCR y su célula objetivo, o receptores objetivo provocados por el agente que se prueba. Así, la presente invención proporciona métodos para la separación por exclusión de fármacos, o cualesquiera otros agentes, que pueden afectar la enfermedad o padecimiento asociado con el polipéptido TCCR. Estos métodos comprenden poner en contacto a tal agente con un polipéptido TCCR o fragmento del mismo, y ensayar (i) para la presencia de un complejo entre el agente y el polipéptido o fragmento TCCR, o (ii) para la presencia de un complejo entre el polipéptido o el fragmento TCCR y la célula por métodos bien conocidos en el arte. En tales ensayos de enlace competitivos, el polipéptido TCCR o fragmento se etiqueta típicamente. Después de una incubación apropiada, se separa el polipéptido libre TCCR, o fragmento del mismo de aquel, presente en forma enlazada, y la cantidad de etiqueta libre, o sin formar complejo, es una medida de la capacidad del agente particular para enlazar al polipéptido por TCCR o para interferir con el complejo de célula/polipéptido TCCR. Otra técnica para la separación por exclusión de fármacos, proporciona una separación de compuestos de alta producción que tiene una afinidad de enlace adecuada a un polipéptido y se describe en detalle en WO 84/03564, publicada el 13 de Septiembre de 1984. Brevemente, grandes números de compuestos de prueba de péptidos pequeños diferentes, se sintetizan en un substrato sólido, tal como alfileres de plástico o alguna otra superficie. Cuando se aplican a un polipéptido TCCR, los compuestos de prueba de péptidos se hacen reaccionar con un polipéptido TCCR y se lavan. El polipéptido TCCR enlazado se detecta por métodos bien conocidos en el arte. Se puede recubrir también directamente el polipéptido purificado . TCCR sobre las placas para su uso en las técnicas de separación por exclusión de fármacos arriba mencionadas. Además, se pueden usar anticuerpos no neutralizantes para capturar el péptido e inmovilizarlo sobre el soporte sólido. Esta invención también contempla el uso de ensayos de separación de fármacos competitivos, en los cuales los anticuerpos neutralizantes capaces de enlazar al polipéptido de enlace TCCR, compiten específicamente con un compuesto de prueba para enlazar al polipéptido TCCR o fragmentos de los mismos. De esta manera, se pueden usar los anticuerpos para detectar la presencia de algún péptido que comparte uno o más determinantes antigénicos con el polipéptido TCCR. EJEMPLO 11 Diseño Racional de Fármacos . La meta del diseño racional de fármacos es producir análogos estructurales del polipéptido biológicamente activo de interés (esto es un polipéptido TCCR) , o de moléculas pequeñas que interactúan, por ejemplo, agonistas antagonistas o inhibidores. Cualquiera de estos ejemplos se puede usar para modelar fármacos que sean formas más activas o estables del polipéptido TCCR, o que aumenten o interfieran con la función del polipéptido TCCR in vivo (referencia, Hodgson, Bio/Tecnology 9:19-21 (1991) ) . En un enfoque, la estructura tridimensional del polipéptido TCCR, o de un complejo inhibidor del polipéptido TCCR se determina por cristalografía de rayos X, por modelado en computadora, o más típicamente por una combinación de estos enfoques. Tanto la forma y las cargas del polipéptido TCCR, se deben determinar para obtener la estructura y para determinar los sitios, o sitio activo, de la molécula. Menos frecuente, se puede obtener la información útil referente a la estructura del polipéptido TCCR al modelar con base en las estructuras de las proteínas homologas. En ambos casos, la información estructural relevante se usa para diseñar moléculas similares a polipéptidos TCCR análogos, o para identificar inhibidores eficientes. Los ejemplos útiles del diseño racional de fármacos pueden incluir moléculas que tienen actividad o estabilidad mejorada, como se muestra por Braxton y Wells, Biochemistry 31: 7796-7801 (1992), o que actúan como inhibidores, agonistas o antagonistas de los péptidos nativos como se muestran en Athauda y colaboradores, J. Biochem. 113:742-746 (1993).

También es posible aislar un anticuerpo específico objetivo seleccionado por un ensayo funcional, como se describe arriba, y después resolver su estructura de cristal. Este enfoque, en principio, produce un núcleo sobre el cual se puede basar el diseño posterior del fármaco. Es posible derivar la cristalografía de la proteína junto al generar anticuerpos anti-idiotípicos (anti-ids) para un anticuerpo funcional farmacológicamente activo. Como una imagen al espejo de una imagen reflejada, el sitio de enlace de los anti-ids se esperaría que fuera un análogo del receptor original. El anti-id se puede después usar para identificar y aislar péptidos de bancos de péptidos producidos química o biológicamente. Los péptidos aislados actuarían entonces como un farmanúcleo. En virtud de la presente invención, se pueden hacer disponibles cantidades suficientes del polipéptido TCCR para llevar a cabo tales estudios analíticos, como la cristalografía de rayos X. Además, el conocimiento de la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos TCCR proporcionados en la presente, proporcionará una guía para aquellos- que emplean técnicas de modelado en computadora, en lugar de, o además de, la cristalografía de rayos X. La tabla 2 (A-D) muestra ejemplificaciones hipotéticas para el uso del método abajo descrito, para determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos (tabla 2 (A-B) ) , y el % de identidad de secuencia de ácido nucleico (tabla 2 (C-D) ) , usando el programa de cómputo para comparación de secuencias ALIGN-2, en donde "PRO" representa la secuencia de aminoácidos de un polipéptido hipotético de la invención de interés, "Proteína de Comparación" representa la secuencia de aminoácido de un polipéptido contra el cual se está comparando el polipéptido de interés PRO. "PRO-ADN" representa un PRO hipotético que codifica la secuencia de ácido nucleico de interés, "ADN de Comparación" representa la secuencia de nucleótido de una molécula de ácido nucleico contra la cual se está comparando la molécula de interés de ácido nucleico "PRO-ADN", "X", "Y" y "Z" representan cada uno diferentes residuos hipotéticos de aminoácidos, y "N", "L" y "V" representan cada uno diferentes nucleótidos hipotéticos. EJEMPLO 12 Papel del TCCR en la generación de una respuesta inmune . Respuestas en las células T: Para las respuestas anti-KLH, se inmunizaron ratones con 100 µg de KLH en solución salina, en una emulsión 1:1 con CFA, que contenía 1 mg/ml de cepa de Mycobacterium tuberculosis H37Ra, (Difco Laboratories, Detroit, MI) en la patas traseras. Después de 9 dias, se separaron los ganglios linfáticos popliteales y se prepararon suspensiones de células. Las células de los ganglios linfáticos se cultivaron (5 X 105 por pozo) en diversas concentraciones de KLH en un medio de DMEM suplementado con FCS al 5%. Se midió la proliferación por la adición de lµCi de [3H]-timidina (ICN; Irvine, CA) durante las últimas 18 horas de un cultivo de 5 días, y se ensayó la incorporación de la radioactividad por un conteo de escintilación líquida. Se llevaron a cabo ensayos para la producción de citocina por células T, al cultivar 5 x 105 de células drenantes de ganglio linfático, ya sea de tipo silvestre cebado con KLH o de ratones deficientes en TCCR, en presencia de cantidades indicadas del KLH en placas de 96 pozos en un volumen final de 200 ml. Después de 96 horas de cultivo, de separaron 150 µl de sobrenadante de cultivo de cada pozo, y se determinaron los niveles de citocina por ELISA usando anticuerpos de Pharmingen (San Diego, CA) , en las condiciones recomendadas. Inducción in vi tro de la diferenciación de células T: Las células T CD4+ del bazo y de los ganglios linfáticos de camadas deficientes en TCCR de tipo silvestre, se purificaron con perlas magnéticas anti CD4 (MACS) . Se activaron las células T purificadas (106 células/ml) en presencia de APC de tipo silvestre radiado singénico (3000 rad) o agénico (106/ml) y ConA (2.5µg/ml, Boehringer, Mannheim, Alemania) , o colocando sobre placas recubiertas con 5 µg/ml de anti-CD3 y 1 µg/ml de anti-CD28 de anticuerpos. El medio de cultivo se complementó con IL-2 (20U/ml) , IL-12(3.5 ng/ml, R&D Systems) y 500 ng/ml de anticuerpo anti IL-4 (Pharmingen) para la diferenciación Thl, con IL-2 (20U/ml), IL-4(103 U/ml, R&D Systems) y 500 ng/ml de anticuerpos anti-IFN (Pharmingen) para la determinación de Th2. Después de 3 días, las células se usaron para extracción con ARN o se lavaron ampliamente, se contaron y reestimularon a 106 células/ml en presencia de ConA (2.5 µg/ml) o sobre placas recubiertas con anticuerpos anti-CD3 5 µg/ml. Después de 24 horas se cosecharon los sobrenadantes, y se analizaron para la presencia de citocina. Niveles de inmunoglobulina específicos de OVA y totales : Los ratones no inmunizados, de 12 semanas de edad o más viejos, se sangraron y se analizó el suero para la presencia de varios isotipos de inmunoglobulina por ELISA. Para los anticuerpos específicos anti-OVA, se inmunizaron ratones deficientes en TCCR, o de tipo silvestre, de 6 semanas de edad, con 100 µg de OVA en adyuvante completo de Freund (i.p.), y se les aplicó una prueba inmunogénica 21 días después con 100 µg de OVA en adyuvante incompleto de Freund (i.p.). Siete días después de la aplicación de la prueba inmunogénica, se hicieron sangrar los ratones y se analizó el suero para la presencia de anticuerpos específicos OVA. Análisis de PCR en tiempo real : Se separaron esplenocitos de murina dentro de la célula T de ayuda (CD4 positivo, F4/80 negativo, 97% puro), células B (CD19 positivo, 97% puro) , células exterminadoras naturales (NK 1.1 positivo, 99 %puro) , y macrófagos (F4/80 positivo, > 95% puro) por FACS, y dentro de células T citotóxicas (CD8 positivo, 85% puro) por MACS. El ARN total se extrajo con columnas Qiagen RNeasy y se digirió con ADNasa 1 para separar el ADN contaminante. Se formaron sondas de ANR para el TCCR usando Taqman 18. Se hicieron todas las reacciones por duplicado y se normalizaron hasta rpll9, un gen de mantenimiento ribosomal. Una reacción de control RT se incluyó, y mostró que todas las muestras estaban libres de ADN contaminante. La secuencia de todos los cebadores y sondas se describe en la figura 19. Se inmunizaron ratones deficientes en TCCR y de tipo silvestre con hemocianina de una variedad de lapa (KLH) , y se cosecharon los ganglios linfáticos drenantes 9 días después, se evaluaron para la producción de citocinas después de una estimulación in vitro con KLH (figura 16A y B) . La capacidad de las células deficientes en TCCR para producir IFN se perjudicó de manera significativa cuando se aplicó la prueba inmunogénica con KLH, aunque la producción de IL-4 se incrementó marcadamente. La producción de IL-5 y la proliferación inducida por antígeno de las células de ganglio linfático, cebadas in vivo, deficientes en TCCR, fueron normales (figura 16C y D) . Se midieron los niveles normales de producción IFN con la estimulación LPS de ratones deficientes en TCCR, indicando que parece no tener defectos intrínsecos en la producción IFN en estos ratones. Estos resultados indican que los ratones deficientes del TCCR están incapacitados en su capacidad para elevar una respuesta Thl . La pérdida de la respuesta Thl se acompaña por una respuesta Th2 incrementada similar a la que se ha observado en ratones deficientes en las citocinas Thl tal omo 11-12 (Magram, J y colaboradores, 1996, Immunity, 4:471-81; Wu, C, y colaboradores, 1997, J Immunol., 159:1658-65). Además de su papel en la regulación de la respuesta inmune celular, el IFN también esta involucrado en la regulación del isotipo de inmunoglobulina (Ig) . En particular, se conoce que el IFN incrementa la producción de anticuerpos IgG2a y a un menor grado los anticuerpos IgG3 (Snapper, C.M., & Paul, W.E., 1987, Science, 236:944-7; Huang. S., y colaboradores, 1993, Science, 259:1742-5). Consistente con una producción disminuida de IFN por las células Thl, los ratones deficientes en TCCR habían disminuido las concentraciones de suero total IgG2a, aunque los niveles de todos los otros isotipos de inmunoglobulina eran normales (figura 17A) . Adicionalmente, con la aplicación de una prueba inmunológica in vivo con ovalbúmina (OVA) , los ratones deficientes en TCCR habían reducido severamente las concentraciones de IgG2a específico de OVA (~20% de controles; figura 17B) . La respuesta Thl es crucial en la defensa contra los patógenos intracelulares tales como Listeria monocytogenes (L . monocytogenes) . Para establecer además el rol in vivo del TCCR en el control de la respuesta Thl, se infectaron ratones deficientes en TCCR y camadas de control con un dosis sub letal de L . monocytogenes (3 x 104 unidades formadoras de colonias (CFU) ) . Se determinaron las concentraciones bacterianas 3 días ó 9 días después de la infección, y se encontraron que eran hasta 106 veces superiores en los hígados de los ratones deficientes TCCR (figura 17C) . El papel del TCCR al mediar la diferenciación de una respuesta de Thl in vitro se investigó enseguida. Las células T CD4+ de tipo silvestre y los ratones deficientes del TCCR, se diferenciaron in vitro en presencia de APC irradiado bajo condiciones que favorecen el desarrollo de células Thl o Th2. Después de 3-4 días de cultivo, se lavaron las células y se volvieron a estimular con ConA, y 24 horas después se analizaron los sobrenadantes para la presencia de citocina. Cuando se diferenciaron dentro de células Thl, los linfocitos deficientes en TCCR produjeron 80% menos de IFN que las camadas de tipo silvestre (figura 18A) . En contraste, los linfocitos deficientes en TCCR que crecieron en presencia de IL-4 y de anticuerpos anti-IFN, produjeron ligeramente más IL-4. Se obtuvieron resultados similares con células T originales Cd4+ CD5Rbalta . Este efecto es intrínseco para las células T por 2 razones: primero, se obtuvieron resultados similares cuando las células T se diferenciaron en presencia de APC derivado de tipo silvestre o de ratones deficientes de TCCR. Segundo, el efecto fue reproducible en un sistema libre de APC donde la diferenciación de células T se lleva a cabo usando un anti-CD3/CD28 inmovilizado en placas (figura 18B) . La reducción en la producción de IFN también se correlaciona con una disminución en el número de células productoras de IFN como se mide por la tinción intracelular FACS. La deficiencia en Thl observada no parece ser el resultado de un defecto en el receptor IL-12, ya que ambas subunidades del receptor se expresaron normalmente en células T activadas. Ya que el IL-12 puede todavía promover la proliferación de las células T estimuladas con ConA, de los ratones deficientes en TCCR y de tipo silvestre, parecen no existir el efecto en la trayectoria de señalización IL-12 en estos ratones (figura 18C y D) .

La tabla 3 (A-Q) proporciona el código fuente completo para el programa de computadora, para comparación de secuencia ALIGN-2. Este código fuente se puede compilar rutinariamente para su uso en un sistema operativo UNIX para proporcionar el programa de cómputo de comparación de secuencia ALIGN-2.

Tabla 2A PRO XXXXXXXXXXXXXXX (Longitud = 15 aminoácidos) Proteína de Comparación XXXXXYYYYYYY (Longitud = 12 aminoácidos) % identidad de secuencia de aminoácidos= (el número de residuos idénticamente correspondientes de aminoácidos entre las dos secuencias de polipéptidos como se determina por ALIGN-2) dividido entre (el número total de residuos de aminoácidos del polipéptido PRO)= 5 dividido por 15 = 33.3% Tabla 2B PRO XXXXXXXXXX (Longitud = 10 aminoácidos) Proteína de Comparación XXXXXYYYYYYZZYZ (Longitud = 15 aminoácidos) % identidad de secuencia de aminoácidos= (el número de residuos idénticamente correspondientes de aminoácidos entre las dos secuencias de polipéptidos como se determina por ALIGN-2) dividido entre (el número total de residuos de aminoácidos del polipéptido PRO)= 5 dividido por 15 = 50% Tabla 2C PRO-ADN NNNNNNNNNNNNNN (Longitud = 14 nucléotidos) ADN de Comparación NNNNNNLLLLLLLLLL (Longitud = 16 nucleótidos) % identidad de secuencia de ácido nucleico= (el número de nucleótidos idénticamente correspondientes entre las dos secuencias de polipéptidos como se determina por ALIGN-2) dividido entre (el número total de nucleótidos de la secuencia de ácido nucleico PRO-ADN) = 6 dividido por 14 = 42.9% Tabla 2D PRO-ADN NNNNNNNNNNNN (Longitud = 12 nucléotidos) ADN de Comparación NNNNLLLVV (Longitud = 9 nucleótidos) % identidad de secuencia de ácido nucleico= (el número de nucleótidos idénticamente correspondientes entre las dos secuencias de polipéptidos como se determina por ALIGN-2) dividido entre (el número total de nucleótidos de la secuencia de ácido nucleico PRO-ADN) = 4 dividido por 12 = 33.3% Tabla 3A * C-C incrementado desde 12 hasta 15 * Z es el promedio de EQ * B es el promedio de ND * corresponde con la detención es _M; detención-detención = 0; J (comodín) correspondencia = 0 */ #definir _M -8 /* valor de una correspondencia con una detención */ int _día[26] [26]={ /* A B C D E F G H I J K L M N O P Q R S T U V W X Y Z */ /* A */ {2, 0,-2, 0,0, -4, 1,-1, -1,0, -1,-2, -1,0, _M, 1,0, - 2,1,1,0,0,-6,0,-3,0}, /* B */ {0, 3, -4, 3, 2, -5, 0,1, -2, 0,0, -3,-2, 2, _M, - 1,1,0,0,0,0,-2,-5,0,-3,1}, /* C */ {-2, -4, 15, -5, -5, -4, -3, -3, -2, 0,-5, -6,-5, -4,_M, - 3,-5,-4,0,-2,0,-2,-8,0,0,-5}, /* D */ {0, 3, -5, 4, 3, -6, 1,1, -2, 0,0, -4,-3, 2, _M, -1,2, - 1,0,0,0,-2,-7,0,-4,2}, /* E */ {0, 2, -5, 3, 4, -5, 0,1, -2, 0,0, -3,-2, 1,_M, -1,2,-1,0,0,0,-2,-7,0,-4,3}, /* F */ {-4, -5, -4, -6, -5, 9, -5, -2, 1,0, -5, 2, 0,-4, _M, -5, - 5,-4,-3,-3,0,-1,0,0,7,-5}, /* G */ {1, O, -3, 1,0, -5, 5, -2, -3, 0,-2, -4,-3,0, _M, -1,-1, - 3,1,0,0,-1,-7,0,-5,0}, /* H */ {-1, 1,-3, 1,1, -2, -2, 6, -2, 0,0, -2,-2, 2, _M, 0,3,2, - 1,-1,0,-2,-3,0,0,2}, /* I */ {-1, -2, -2, -2, -2, 1,-3, -2, 5, 0,-2, 2, 2,-2, _M, -2, - 2,-2,-1,0,0,4,-5,0,-1,-2}, /* J */ {0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, _M, 0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0}, /* K */ {-1, 0, -5, 0,0, -5, -2, 0,-2, 0,5, -3, 0,1, _M,- 1,1,3,0,0,0,-2,-3,0,-4,0}, /* L */ {-2, -3, -6, -4, -3, 2, -4, -2, 2, 0,-3, 6, 4,-3, _M, -3, - 2,-3,-3,-1,0,2,-2,0,-1,-2}, /* M */ {-1, -2, -5, -3, -2, 0,-3, -2, 2, 0,0, 4, 6,-2, _M, -2, - 1,0,-2,-1,0,2,-4,0,-2,-1}, /* N */ {0, 2, -4, 2, 1,-4, 0,2, -2, 0,1, -3,-2, 2, _M, - 1,1,0,1,0,0,-2,-4,0,-2,1}, /* 0 */ {_M, _M, _M, _M,_M, _M, _M, _M, _M,_M,_M, _M, _M, _M, 0 ,_M, _M, _M, _M, _M, _M, _M, _M,_M,_M,_M}, /* P */ {1,-1,-3,-1,-1,-5,-1,0,-2,0,-1,-3,-2,- 1,_M, 6,0,0,1,0,0,-1,-6,0,-5,0) , /* Q */ {0, 1,-5, 2, 2, -5, -1,3, -2, 0,1, -2,-1,1, _M, 0,4,1, -1,-1,0,-2,-5,0,-4,3}, /* R */ {-2,0,-4,-1,-1,-4,-3,2,-2,0,3,- 3, 0,0, _M, 0,1, 6, 0,-1, 0,-2, 2, 0,-4,0}, /* S */ {1, 0,0, 0,0, -3, 1,-1, -1,0, 0,-3, -2,1, _M,1, - 1,0,2,1,0,-1,-2,0,-3,0}, /* T */ {1, 0, -2, 0, 0, -3, O, -1,0, 0, 0, -1,-1, 0, _M, 0,-1, - 1,1,3,0,0,-5,0,-3,0}, /* U */ {0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, _M, 0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0), /* V */ {0,-2,-2,-2,-2,-l,-l,-2,4,0,-2,2,2,-2,_M,-l,- 2,-2,-1,0,0,4,-6,0,-2,-2}, /* W */ {-6, -5, -8, -7, -7, 0,-7, -3, -5, 0,-3, -2,-4, -4,_M, - 6,-5,2,-2,-5,0,-6,17,0,0,-6}, /* X */ {0, 0, 0, 0, 0, 0,0, 0,0, 0,0,0, 0,0, _M, 0,0, 0,0, 0,0, 0,0, 0,0,0}, /* Y */ {-3, -3, 0, -4, -4, 7, -5, 0,-1, 0,-4, -1,-2, -2, _M, -5,- 4,-4,-3,-3,0,-2,0,0,10,-4}, /* Z */ {0,1,-5,2,3,-5,0,2,-2,0,0,-2,- 1,1, _M, 0,3,0,0,0,0,-2,-6,0,-4,4} }; Tabla 3B /* */ #incluir <stdio.h> #incluir <ctype.h> #definir MAXSALTO 16 /*max saltos en una diag */ #definir MAXESPACIO 24 /* no continuar para penalizar espacios más grandes que este */ #definir SALTOS 1024 /* max saltos en una trayectoria */ #definir MX 4 /* salvar si hay al menos MX-1 bases desde el último salto */ #definir DMAT 3 /* valor de las bases de correspondencia*/ #definir DMIS 0 /* penalidad para las bases no correspondientes */ #definir DINSO 8 /* penalidad para un espacio */ #definir DINSI 1 /* penalidad por base */ #definir PINSO 8 /* penalidad para un espacio •/ #definir PINSI 4 /* penalidad por residuo */ estruct salto { corto n [MAXSALTO]; /* tamaño del salto (neg para dely) */ corto sin firma x [MAXSALTO]; /* no. base no. del salto en la seq x */ }; /* limita la sec hasta 2?16-1 */ estruct diag { int registro; /* registro en el último salto */ largo compensación; /* compensación del bloque previo */ corto isalto; /* índice de salto actual */ estruct salto jp; /* lista de saltos */ }, estruct trayectoria { int spe; /* número de espacios líderes */ short n [SALTOS];/* tamaño del salto (espacio) */ int x [SALTOS];/* loe del salto (último elem antes del salto) */ }; char *oarchivo; /* nombre del archivo de salida */ char *nombrex[2]; /* nombres de sec: traer secs ( ) */ char *prog; /* nombre del programa para er msgs */ char *seqx[2]; /* secs: traer secs() */ int dmax; /* mejor diag: nw ( ) */ int dmax(); /* diag final */ int dna; /* fijar si el adn: principal () */ int endespacios; /* fijar si se penalizan los espacios finales */ int espaciox, espacioy; /* espacios totales en secs */ int lenO, lenl; /* lente de sec */ int nespaciox, nespacioy; /* tamaño total de los espacios */ int smax; /* registro max: nw ( ) */ int *xbm; /* mapa de bit para la correspondencia */ long compensación; /* compensación actual en el archivo de salto */ estruct diag *dx; /* sostiene diagonales */ estruct tray pp[2]; /* sostiene trayectoria para secs */ char *calloc(), *malloc(), *índice(), *strepy () ; char *obtenersec () , *g callocO; Tabla 3C /* programa de alineación Needleman-Wunsch * * uso: progs archivol archivo2 * donde archivol y archivo2 son dos secuencias de adn o dos secuencias de proteínas . * Las secuencias pueden estar en el recuadro superior o inferior y pueden contener ambigüedad * Se ignoran las líneas que comienzan con ',','>' o '<' * Max longitud de archivo es 65535 (limitada por el corto sin firma x en la estructura de salto) * Una secuencia con 1/3 o más de sus elementos ACGTU se supone que es ADN DNA * La salida está en el archivo "align. fuera" * El programa puede crear un archivo temporal en /tmp para conservar info sobre el rastreo. * Versión Original desarrollada bajo BSD 4.3 en un vax 8650 */ iincluir "nw.h" #incluir "day.h" estático dbval[26] = { 1,14,2, 13, 0,0, 4, 11, 0,0, 12, 0,3, 15, 0,0, 0,5, 6, 8, 8, 7, 9, 0,10,0 }/ estático _pbval[26] = { 1, 21(1«(,D,-,A, ) )|(1«( 'N'-' A')), 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, OxFFFFFFF, 1«10, 1«11, 1«12, 1«13, 1«14, 1«15, 1«16, 1«17, 1«18, 1«19, 1«20, 1«21, 1«22, 1«23, 1«24, K^SKK^'E'-'A') )|(1«('Q'-'A')) }; principal (ac, av) principal int ac; char *av[ ] ; { prog = av[0] ; si(ac !=3) { fimprimirf (stderr, "uso: %s archivo 1 archivo2\n", prog) ; fimprimirf (stderr, " donde archivol y archivo2 son dos secuencias de adn o dos secuencias de proteínas . \n" ) ; fimprimirf (stderr, " Las secuencias pueden estar en el recuadro superior o inferior\n") ; fimprimirf (stderr, " Se ignoran las líneas que comienzan con ','>' o ?<'\n"); fimprimirf (stderr, "Salida es en el archivo V'align. fuera\"\n" ) ; salir (1) ; } nombrex [0] = av[l]; nombrex [1] = av[2]; secx[0] = obtenersec (nombrex [0] , &len0) ; secx[l] = obtenersec (nombrex [1] , &lenl) ; xbm = (dna) ?_dbval :_pbval; espacios finales =0; /* 1 para penalizar espacios terminales */ oarchivo = "align. fuera" ; salida archivo */ nw ( ) ; /* llenar la matriz, obtener posibles saltos */ leer saltosO; /* obtener los saltos actuales */ imprmir ( ) ; /* imprimir stats, alineación */ limpiar (O) ; /* no enlazar ningún archivo tmp */ } Tabla 3D /* hacer la alineación, regresar al mejor marcador: principal ( ) * adn: valores en Fitch and Smith, PNAS, 80, 1382-1386, 1983 * pro: PAM 250 valores * Cuando los registros son iguales, se prefiere no correspondencia con cualquier espacio, preferir * un nuevo espacio para extender un espacio en curso, y preferir un espacio en secx para un espacio en secy. */ nw () nw char px, FY /* secs y ptrs */ int ndely, *dely; observar dely */ int ndelx, delx; /* observar delx */ int *tmp /* para trueque hileraO, hileral */ int mis; registro para cada tipo */ int insO,insl; /* penalizaciones por inserción */ registro id; /* índice diagonal */ registro ij ; /* índice de salto */ registro *colO, *coll; /* calificación para hilera actual, última */ registro xx, yy; /* índice dentro de secs */ dx= (estruct diag*) g_calloc ("to get diags", IenO+lenl+1, tamaño de (estruct diag)); ndely = (int*) g__calloc ("obtener ndely", lenl+1, tamaño de (int)); dely = (int*) g_calloc ("obtener dely", lenl+1, tamaño de (int) ) ; colO = (int*) g_calloc ("obtener colO", lenl+1, tamaño de (int) ) ; coll = (int*) g_calloc ("obtener coll", lenl+1, tamaño de (int) ) ; insO = (adn) ? DINSO : PINSO; insi = (adn)? DINS1 : PINS1; smax = -10000; si (espacios finales) { para (col0[0] = dely[0] = -insO, yy = 1; yy <= len 1; yy++) { colO [yy] = dely [yy] =col0 [yy-1] - insl; ndely [yy] = yy; } colO[0] = 0; /* Waterman Bull Math Biol 84 */ } más para (yy = 1; yy <= lenl; yy++) delyfyy] = -insO; /* llenar en la matriz de correspondencia */ para (px = seqx[0], xx = 1; xx <= lenO; px++, xx++) { /* inicializar la primera entrada en la col */ si (espacios finales) { si (xx== 1) coll[0]= delx =- (insO+insl) mas coll[0]= delx =col0[0]-insl; ndelx = xx; más { coll[0]=0; delx = -insO; ndelx=0; Tabla 3E para (py = seqx[l], yy = 1; yy <= lenl; py++, yy++) { mis=col0 [yy-1] ; si (adn) mis += (xbm[*px-'A' ] &xbm[*py-'A' ] ) ? DMAT : DMIS; más mis += _day [*px-*A' ] [*py-'A' ] ; /* actualizar penalidad para del en x sec; * favorecer nuevo del sobre del en progreso * ignorar MAXESPACIO si se ponderan espacios terminales 7 si (espacios terminales II ndely [yy] < MAXESPACIO) { si (col0[yy] - insO >= dely[yy]) { dely[yy] = col0[yy] [insO+insl) ; ndely [yy] = 1; } más { dely[yy] -= insl; ndely [yy]++; } más { si (colO [yy] (insO+insl) >=dely[yy]) { dely[yy] colO [yy] (insO+insl) ndely [yy] = 1; }más ndely [yy] ++; /* actualizar penalidad para del en y sec; * favorecer nuevo del sobre del en progreso */ si (espacios terminales II ndelx < MAXESPACIO) si (coll [yy-1] - ins0>=delx) { delx = coll [yy-1] 'insO+insl! ndelx = 1; } más { delx -= ins] ; ndelx++; } más { si (coll [yy-1] - (insO+insl) >= delx) { delx coll [yy-1] (insO+insl) ndelx = 1; }más ndelx++; } /* tomar la clasificación máxima; se favorece * mis sobre cualquier del y delx sobre dely */ Tabla 3F id =xx - yy + lenl 1; ...nw si (mis >= delx && mis >= dely[yy]) coll [yy] = mis; además si (delx >= dely[yy]) { coll[yy] = delx; ij = dx [id] . isalto; si (dx[id] . ip.n[0] && ( ! dna II (ndelx >= MAXSALTO &&xx>dx[id] . jp.x[ij]+MX) II mis>dx[id] .calificación+DINSO) ) { dx[id] . isalto++; si(++ij>= MAXSALTO) { escribir saltos (id) ; ID dx [id] . isalto = 0; dx [id] . compensación=compensación; compensación+=tamaño de (estruct salto) +tamaño de (compensación) ; } dx [id] . jp.n [ij ] = ndelx; dx [id] . jp.x [ij ] = xx; dx[id] .calificación = delx; } además { coll[yy] = delyfyy]; ij = dx [id] . isalto; si(dx[id] . jp.n[0]&& ( !adn II (ndely[yy] >= MAXSALTO && xx > dx[id] . jp.x[ij]+MX) II mis > dx[íd] .calificación+DINSO) ) { dx[id] .isalto++; si (++ij>=MAXSALTO) { writesaltos (id) ; iD dx[id] .isalto = 0; dx [id] . compensación = compensación; compensación+=tamaño de (estructsalto) ttamaño de (compensación) ; } } dx[id] . jp.n[ij ] = -ndely[yy]; dx[id] . jp.x[ij ] = xx; dx [id] . calificación = dely [yy] ; } si (xx lenO && yy < lenl) { /* last col */ si (espacios terminales] coll[yy] insO+insl* (lenl-yy) si (coll[yy] > smax) { smax = coll[yy]; dmax = id; } si (espacios terminales && xx < lenO) coll [yy-1] -= insO+insl* (lenO-xx) ; si (coll [yy-1] >smax) { smax = coll [yy-1]; dmax = id; } tmp = colO; colO = coll; coll = tmp; } (vacío) libre ((char *) ndely); (vacío) libre ((char *)dely); (vacío) libre ((char *)col0); (vacío) libre ((char *)coll); Tabla 36 /* * imprimir () solamente rutina visible fuera de este módulo * estático: * getmatO - rastrear la mejor trayectoria, contar las correspondencias: imprimir () * pr_align() - imprimir alineación de lo descrito en arreglo p[]: imprimir () * vaciar bloque () - vaciar un bloque de líneas con números, estrellas: pr_align() * nums ( ) - colocar una línea número: vaciar bloque () * ponerlínea() - colocar una línea (nombre, [num], sec. [num]): vaciar bloque () * estrellas () - colocar una línea de estrellas: vaciar bloque ( ) * nombre de cinta () - marcar alguna trayectoria y prefijar de un nombre de sec */ #incluir "nw.h" idefinir SPC 3 #definir P LÍNEA 256 /* línea de salida máxima */ #definir P_SPC 3 /* espacio entre nombre o num y sec */ extern _día [26] [26] ; int olen; /* fijar longitud de línea de salida */ ARCHIVO *fx; /* archivo de salida */ imprimir () imprimir { int lx, ly, primer espacio, último espacio; /* traslape */ si((fx = fabrir (oarchivo, "w") ) == 0) { fimprimirf (stderr, "%s : no puede escribir %s\n", prog, oarchivo); limpiar (1) ; } fimprimirf (fx, "<primera secuencia: %s (longitud = %d}\n", nombrex [0], lenO) ; fimprimirf (fx, "<segunda secuencia: %s (longitud = %d)\n", nombrexfl], lenl); olen = 60; lx = lenO; ly = lenl; primer espacio = último espacio = 0; si (dmax < len 1 - 1) { /* espacio líder in x */ pp[0].spc = primer espacio = lenl -dmax - 1 ; ly -= pp[0] .spc; } además si (dmax > lenl - 1) { /* espacio líder in y */ pp[l] .spc = primer espacio = dmax -(lenl - 1) ; lx-=pp[l] . spc; } si (dmaxO < lenO - 1) { /* espacio de guía in x */ último espacio = lenO - dmaxO -1; lx -= último espacio; } además si (dmaxO > lenO - 1) { /* espacio de guía in y */ último espacio = dmaxO - (lenO - 1); ly -= último espacio; } getmat (lx, ly, primer espacio, último espacio) ; pr align () ; Tabla 3H /* * rastrear la mejor trayectoria, contar las correspondencias */ estático getmat (lx, ly, primer espacio, último espacio) getmat int lx, ly; /*"núcleo" (menos espacios terminales) */ int primer espacio, último espacio; /*traslape líder guía */ { int nm, iO, il, sizO, sizl; char fuerax[32]; double pct; registro nO, ni; registro char *p0,*pl; /* tener correspondencias totales registro */ i0=il = sizO = sizl = 0; ?0=seqx[0] +pp[l] .spc; pl=seqx [1] +pp [0] .spc; n0= pp[l] .spc + 1; nl= pp[0] .spc + 1; nm=0; mientras (*p0&&*pl) { si (sizO) { pl++; nl++; sizO—; ademássi (sizl) { pO++; n0++; sizl—; además { si (xbm[*pO-'A' ] &xbm[*pl- 'A'] nm++; si(n0++==pp[0] .x[i0] ) sizO pp[0] .n[i0++] si (nl++==pp[l] .x[il] ) sizl pp[l] .n[il++] p0++; pl++; } /* homología pct: * si los espacios terminales de penalización, la base es el sec más corto * además, desprender colgantes y tomar el núcleo más corto */ si (espacios terminales) lx= (len0<lenl) ?len0 : lenl; además lx=(l?<ly) ?lx : ly; pct= 100.* (doble) nm/ (doble) lx; fimprimirf (fx, "\n") ; fimprimirf (fx, "<%d correspondencia%s en un traslape de%d: %.2f porcentaje de similitud-in" . nm, (nm == 1)? "" : "es", lx, pct); Tabla 31 > fimprimirf (fx, "<espacios en la primera secuencia: %d", espaciox) ; ...getmat si (espaciox) { (vacío) simprimirf (fuerax, "(%d%s%s)", nespaciox, (adn)? "base" : "residuo", (nespaciox == l)?"":"s"); fimprimirf (fx, "%s", fuerax); fimprimirf (fx, ", espacios en la segunda secuencia: %d", espacioy) ; si(espacioy) {(vacío) simprimirf (fuerax, " (%d%s%s) ", nespacioy, (adn)? "base" : "residuo", (nespacioy == 1)? "":"s"); fimprimirf (fx, "%s", fuerax); } si (dna) fimprimirf (fx, "\n<calificación: %d (correspondencia=%d, no correspondencia=%d, espacio penalidad = %d + %d per base)\n", smax, DMAT, DMIS, DINSO, DINS1); además fimprimirf ( f , "\n<calificación:%d (Dayhoff PAM 250 matriz, espacio penalidad = %d + %d por residuo) \n", smax.PINSO.PINSl) ; si (espacios terminales) fimprimirf (fx, "<espacios terminales penalizados, espacio terminal izquierdo: %d %s%s, espacio terminal derecho: %d %s%s\n", primer espacio, (adn)? "base": "residuo", (primer espacio == 1)? "": "s", último espacio, (adn)? "base" : "residuo", (último espacio == 1)? "" : "s"); además fimprimirf (fx, "<espacios terminales no penalizados\n") ; } estático nm; /* correspondencias en núcleo - para verificación */ estático Imax; /* longitudes de nombres de archivo en tiras */ estático ij[2]; /* índice de salto para una trayectoria */ estático nc[2]; /* número al comienzo de la línea actual */ estático ni [2]; /* número actual de elem — para formación de espacios */ estático siz [2] ; estático char *ps[2]; /* ptr al elemento actual */ estático char *po[2]; /* ptr a la siguiente ranura de salida de char estático char fuera [2] [P_LÍNEA] ; /* línea de salida */ estático char star [P_LÍNEA] ; /* fijo por estrellas () */ /* * imprimir alineación de los descrito en la trayectoria de estructura pp [ ] */ estático pr_alinear ( ) pr_alínear { int nn; /*contar char */ int más; registro i; para (i= 0,lmax=0; i<2;i++) {nn = nombre de tiras (nombrex [i] ) ; si (nn > Imax) Imax = nn; nc[i]=l; ni[i]=l; siz[i]=ij [i]=0; ps [i]=seqx[i] ; po [i] =fuera [i] ; Tabla 3J para [nn nm = 0, más = 1; más;) { ,.pr alinear para (i=más=0; i<2; i++) { /* * ¿se tiene más de esta secuencia? */ si(!*ps[i]) continuar; más++; si (pp [i] .spc) { /* espacio líder */ *po[i] ++ =' ' ; pp[i] .spc— ; además si (siz [i]) { /* en un espacio */ *po [i] ++='-' ; siz [i] —; además { se coloca un elemento sec kpo [ i ] = *ps [ i ] ; si (esmenor (*ps [i] ) *ps (i] =toupper ( *ps [ i ] ) ; po[i]++; ps[i]++; /* * ¿se está en el siguiente espacio para esta secuencia? */ si(ni[i]==pp[i] .?[ij [i] ] ) { * se necesita unir todos los espacios * en este punto */ siz [i] =pp[i] .n[ij [i]++] mientras (ni[i] == pp[i] .x[ij [i] ] siz [i] += pp[i] .n[ij [i]++] ni[i]++; } si (++nn == olen II !más && nn) { vaciar bloque (); para (i = 0; i < 2; i++) po [i] =fuera [i] ; nn = 0; } /* * vaciar un bloque de líneas, incluyendo números, estrellas: pr_alinear() */ estático vaciar bloque ( ) vaciar bloque { registro i; para (i = 0; i < 2; i++) *po[i]- = \0'; Tabla 3K ...vaciar bloque (vacío) colocare (\n ' , fx) ; para (i = 0; i < 2; i-r+) { si (*fuera [i] && (*fuera [i] ! = ¡¡*(po[i]) ! = ")) { si(i==0) nu s ( i) ; si(i==0&&*fuera[l] ) estrellas () ; colocar línea (i); si (i==0&&*fuera [1] ) fimprimirf (fx, estrella) si(i==l) nums (i) ; } /* * colocar una línea número: vaciar bloque ( [ * / estático nums ( ix) nums int ix; /* índice en fuera [] sostener línea de sec */ { char nlínea[P_LlNE] ; registro i/j; registro char *pn, *px, *py; para (pn = nlínea, i = 0; i < Imax+P SPC; i++, pn++) rpn para (i = nc[ix], py = fuera [ix]; *py; py++, pn++) { si (*py ==• rpy == -' n además { si(i%10==0| | (i== && nc[ix] != 1) ) { J=(i<0) ?-i:i; para (px pn;j;j/l= 10, px—) tpx=j%10+'0I ; si (i < 0) *px= ' - ' además *pn = ' ' i++; *pn = \0'; nc[ix] = i; para (pn = nlínea; *pn; pn++) (vacío) ponerc(*pn, fx) ; (vacío) poneré (\n', fx) ; } /' * extender una línea (nombre, [num] , sec, [num] ) vaciar bloque () */ estático poner línea (ix) poner línea int ?x; Tabla 3L ...ponerlínea int i; registro char *px; para (px = nombrex [ix], i = 0; *px && *px ! = ' : ' ; px++, i++) (vacío) ponerc(*px, fx) ; para (; i < lmax+P_SPC; i++) (vacío) poneré ('' , fx) ; /* estas cuentan desde 1: * ni[] es elemento actual (desde 1) * nc[] es número al comienzo de la línea actual */ para (px = fuera [ix]; *px; px++) (vacío) poneré (*px&Ox7F, fx) ; (vacío) ponerc(\n', fx) ; * poner una línea de estrellas (secs siempre en fuera [0], fuera [1]): vaciar bloque () */ estático estrellas () estrellas int i; registro char rp0, *pl, cx, *px; si{ !*fuera[0] I | (*fuera [0] ==' ' &&* (po [0] ) ==" ) | | !*fuera[l] | | (*fuera [1] ==' '&&* (po [1] ) ==")) regresar; px = estrella; para (i = Imax+P_SPC; i; i—) *px++ =' ' ; para (p0=fuera [0] , pl=fuera [1] ; *p0&&*pl;p0++,pl++) { si (isalpha (*p0) &&isalpha (*pl) ) { si (xbm[*pO-'A' ] &xbm[*pl- 'A']) { cx ' * I nm++; además si(!dna&& day[*pO-'A'] [*pl-'A']>0) cx además cx además cx = rpx++=cx; } *px++=\n' ; 10 *px = \0'; Tabla 3M /* * trayectoria de cinta o prefijo de pn, regresar len: pr_alíneaar ( ) */ estático nombre de cinta (pn) nombre de cinta char *pn; /* archivo nombre (puede ser trayectoria) */ { registro char *px, *py; py=0; para (px = pn; *px; px++) sí (*px =='/') py=px+ 1; si (py) (vacío) strcpy(pn, py) ; regresar (strlen (pn) ) ; Tabla 3N /* * limpieza ()—limpiar cualquier archivo tmp * obtenersec ()—leer en sec, fijar adn, len, maxlen * g_calloc ()—calloc () con verificación de error * leer saltos ()—obtener los saltos nuevos, del archivo tmp si es necesario * escribir saltos ()—escribir un arreglo lleno de saltos hasta un archivo tmp: nw ( ) */ #incluir "nw.h" iincluir <sys/archivo. h> char *jnombre = "/tmp/homgXXXXXX"; /' tmp archivo para saltos */ ARCHIVO *fj; int limpiar ( ) ; /* limpiar archivo tmp */ largo Ibuscar () ; /* * eliminar cualquier archivo tmp si se ventila */ limpiar (i) limpiar int i; { si(fj) (vacío) no unir (jnombre) ; salida (i) ; } /' * leer, regresar ptr a sec, fijar adn, len, maxlen * omitir líneas comenzando con ';', '<', o ' >' * sec en recuadro superior o inferior */ char * obtenersec (archivo, len) obtenersec char *archivo; /* archivo nombre */ int *len; /* seq len */ { char línea [1024], *pseq; registro char * x^ *py; int natgc, tlen; ARCHIVO *fp; si ( (fp = fopen (archivo, "r") ) == 0) { fimprimirf (stderr, "%s : no puede leer %s\n", prog. archivo); salida (1) ; } tlen = natgc = 0; mientras (fgets (línea, 1024, fp) ) { si (*línea == ' ; ' | | *línea '<' I I *línea == •>» ) continuar; para (px = línea; *px != \n'; px++) si (isuppcr (*px) | | islower (*px) ) tlen++; } si ( (pseq = malloc((sin firmar) (tlen+6) )) == 0) { fimprimirf (stderr, "%s:malloc() falla para obtener %d bitios para %s\n",prog, tlen+6, archivo); salida (1) ; } pseq[0] = pseq[l] = pseq[2] = pseq[3] = \0'; Tabla 30 ...obtenersec py=pseq+4; *len = tlen; rebobinar (fp) ; mientras (fgets (línea, 1024,fp)){ si (*línea ==' ; ' | | *linea *línea == »>' ) continuar; para (px = línea; *px != \n'; px++) { si (es superior (*px) ) *py++ = *px; además si (es inferior (*px) ) *py++ = toupper (*px) ; si (índice ("ATGCU", * (py-1) ) ) natgc++; } *py++=\0'; *py=\0'; (vacío) fcerrar(fp); dna = natgc > (tlen/3) ; regresar (pseq+4 ) ; char g_calloc (msg, nx, sz; g_calloc char ''msg; /* programa, llama a rutina */ int nx, sz; /* número y tamaño de los elementos */ { char *px, *calloc(); si ( (px = calloc ( (unsigned) nx, (unsigned) sz) ) == 0) { si (*msg) { fiirprimirf (stderr, "%s:g__calloc() falló %s(n=%d, sz=%d) \n",prog,msg,nx, sz) ; exit (1) ; } } regresar (px) ; } /* * obtener final saltos de dx[] o tmp archivo, fijar pp[] reestablecer dmax: main() */ leersaltos ( ) leersaltos { int fd=-l; int siz,i0,il; registro i,j,xx; si(fj) { (vacío) fclose(fj); si((fd = abrir (jnombre, 0_RDONLY,0)) < 0) { rimprimirf (stderr, "%s: no puede abrir ( ) %s\n", prog, jnombre) ; limpiar (1) ; } } para (i = iO = il =0, dmaxO = dmax, xx = lenO; ; i++) { mientras (1) { para (j=dx [dmax] . isalto; j>=0&&dx [dmax] . jp. x [j ] >=xx; j —) Tabla 3P ... leersaltos si ( j<0&&dx [dmax] . compensación&&f j ) { (vacío) lseek(fd, dx[dmax] .compensación, 0) ; (vacío) read(fd, (char*) &dx [dmax] .jp, tamaño de(estruct salto)); (vacío) leer (fd, (char*) &dx (dmax] .compensación, tamaño de (dx [dmax] . compensación) ) ; dx[dmax] . isalto=MAXSALTO-l; } además romper; } si(i>=SALTOS) { fimprimirf (stderr, "%s: demasiados espacios en alineación\n", prog); limpiar (1) ; } si(j>=0) { siz =dx[dmax) . jp.n [j ] ; xx = dx [dmax] . jp. x [j ] ; dmax += siz; si (siz < 0) { /* espacio en segunda sec */ pp[l] . [il]=-siz; xx += siz; /* id = xx - yy + len 1 - 1 */ pp[l].x[il] = xx-dmax+len 1 - 1; espacioy++; nespacioy -= siz; /* ignorar MAXESPACIO cuando se hacen espacios terminales */ siz = (-siz < MAXESPACIO I I espacios terminales)? -siz: MAXESPACIO; il++; } además si (siz>0) { /* espacio en primera sec */ pp [0 ] . n [i0] = siz; pp[0] .x[i0] = xx; espaciox++; nespaciox += siz; /* ignorar MAXESPACIO cuando se hacen espacios terminales */ siz = (siz < MAXESPACIO I I espacios terminales)? siz : MAXESPACIO; Í0++; { además romper; } /* invertir el orden de los saltos */ para (j=0, iO — ; J < iO; j++, iO — ) { i pp[0] .n[j];pp[0] .n[j]=pp[0] .n[i0];pp[0] .n[iO]=i; i pp[0] .x[j];pp(0] .x[j]=pp[0] .x[i0];pp(0] .x[iO]=i; para (j =0, il — ;j<il;j++,il — ) { pp[l] .n[j];pp[l] .n[j]=pp[l] .n[il];pp[l] .n[il]=i; pp[l] .x[j];PP[l] .x[J]=Pp[l] .x(il];pp[l] .x[il]=i; si(fd >=0) (vacío) cerrar (fd); si(fj) { (vacío) no enlazar (jnombre) ; fj=0; compensación = 0;} } Tabla 3Q /* * escribir una compensación de estructura de salto lleno del previo (si hay alguno) : nw ( ) */ escribirsaltos (ix) escribirsaltos int ?x; char *mktemp ( ) ; si(!fj) { si (mktemp (jnombre) <0) { fimprimirf (stderr, "%s: can't mktemp ( ) %s\n", prog. jnombre) ; limpiar (1) ; } si ((fj = fabrir (jnombre, "w")) == 0) { fimprimirf (stderr, "%s: no puede escribir %s\n", prog, jnombre); salida (1) ; } } (vacío) fescribir ( (char *) &dx [ix] . jp, tamaño de (estruct salto), 1, fj ) ; (vacío) fescribir ( (char *) &dx [ix] . compensación, tamaño de (dx [ix] . compensación) , 1, fj ) ; } Listado de Secuencias <110> Genentech, Inc. De Sauvage, Fre eric- Gre al , Iqbal Gurpey, Austin L <120> Receptor TCCR de la Citocina de Tipo I <130> P1748R1PCT <141> 2000-10-18 <150> US 60/160,542 <151>-I999-10-20 <160> 16 <210> 1 <211> 536 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Arg Gly Gly Arg Gly Ala Pro Phe Trp Leu Trp Pro Leu Pro 1 5 10 15 Lys Leu Ala Leu Leu Pro Leu Leu Trp Val Leu Phe Gln Arg Thr 20 25 30 Arg Pro Gln C-ly Ser Ala Gly Pro Leu Gln Cys Tyr Gly Val Gly 35 40 45 Pro Leu Gly Asp Leu Asn Cys Ser Trp Glu Pro Leu Gly Asp Leu 50 55 - 60 Gly Ala Pro Ser Glu Leu His Leu Gln Ser Gln Lys Tyr Arg Ser 65 70 75 Asn Lys Thr Gln Thr Va] Ala Vai Aja Ala Gly Arg Ser Trp Val 80 85 90 Ala lie Pro Arg Glu Gln Leu Thr Met Ser Asp Lys Leu Leu Val 95 100 105 Trp Gly Thr Lys Ala Gly Gln Pro Leu Trp Pro Pro Val Phe Val 110 115 120 Asn Leu Glu Thr Gln Met Lys Pro Asn Ala Pro Arg Leu Gly Pro 125 130 135 Asp Val Asp Phe Ser Glu Asp Asp Pro Leu Glu Ala Thr Val His 140 145 150 Trp Ala Pro Pro Thr Trp Pro Ser His Lys Val Leu lie Cys Gln 155 160 165 Phe His Tyr Arg Arg Cys Gln Glu Ala Ala Trp Thr Leu Leu Glu 170 175 180 Pro Glu Leu Lys Thr He Pro Leu Thr Pro Vai Glu He Gln Asp 185 190 195 Leu Glu Leu Ala Thr Gly Tyr Lys Val Tyr Gly Arg Cys Arg Met 200 205 210 Glu Lys Glu Glu ? p Leu Trp Gly Glu Trp Ser Pro He Leu Ser ib 220 22b Phe Gln Thr Pro Pro Ser Ala Pro Lys Asp Val Trp Val Ser Gly 230 235 240 Asn Leu Cys Gly Thr Pro Gly Gly Glu Glu Pro Leu Leu Leu Trp 245 250 255 Lys Ala Pro Gly Pro Cys Val Gln Val Ser Tyr Lys Val Trp Phe 260 265 270 Trp Val Gly Gly Arg Glu Leu Ser Pro Glu Gly He Thr Cys Cys 275 280 285 Cys Ser Leu He Pro Ser Gly Ala Glu Trp Ala Arg Val Ser Ala 290 295 300 Val Asn Ala Thr Ser Trp Glu Pro Leu Thr Asn Leu Ser Leu Val 305 310 315 Cys Leu Asp Ser Ala Ser Ala Pro Arg Ser Val Ala Val Ser Ser 320 325 330 He Ala Gly Ser Thr Glu Leu Leu Val Thr Trp Gln Pro Gly Pro 335 340 345 Gly Glu Pro Leu Glu His Val Val Asp Trp Ala Arg Asp Gly Asp 350 355 360 Pro Leu Glu Lys Leu Asn Trp Val Arg Leu Pro Pro Gly Asn Leu 365 370 375 Ser Ala Leu Leu Pro Gly Asn Phe Thr Val Gly Val Pro Tyr Arg 380 385 390 He Thr Val Thr Ala Val Ser Ala Ser Gly Leu Ala Ser Ala Ser 395 400 405 Ser Val Trp Gly Phe Arg Glu Glu Leu Ala Pro Leu Val Gly Pro 410 415 420 Thr Leu Trp Arg Leu Gln Asp Ala Pro Pro Gly Thr Pro Ala He 425 430 435 Ala Trp Gly Glu Val Pro Arg His Gln Leu Arg Gly Hxs Leu Thr 440 445 450 His Tyr Thr Leu Cys Ala Gln Ser Gly Thr Ser Pro Ser Val Cys 455 460 465 Met Asn Val Ser Gly Asn Thr Gln Ser Val Thr Leu Pro Asp Leu 470 475 480 Pro Trp Gly Pro Cys Glu Leu Trp Val Thr Ala Ser Thr He Ala 485 490 495 Gly Gln Gly Pro Pro Gly Pro He Leu Arg Leu His Leu Pro Asp 500 505 510 Asn Thr Leu Arg Trp Lys Val Leu Pro Gly He Leu Phe Leu Trp 515 520 525 Gly Leu Phe Leu Leu Gly Cys Gly Leu Ser Leu Ala Thr Ser Gly 530 535 540 Arg Cys Tyr His Leu Arg His Lys Val Leu Pro Arg Trp Val Trp 545 550 555 Glu Lys Val Pro Asp Pro Ala Asn Ser Ser Ser Gly Gln Pro His 560 565 570 Met Glu Gln Val Pro Glu Ala Gln Pro Leu Gly Asp Leu Pro He 575 580 5S5 Leu Glu Val Glu Glu Met Glu Pro Pro Pro Val Met Glu Ser Ser 590 595 600 Gln Pro Ala Gln Ala Thr Ala Pro Leu Asp Ser Gly Tyr Glu Lys 605 610 615 His Phe Leu Pro Thr Pro Glu .Glu Leu Gly Leu Leu Gly Pro Pro 620 625 630 Arg Pro Gln Val Leu Ala 635 <210> 2 <211> 623 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Met Asn Arg Leu Arg Val Ala Arg Leu Thr Pro Leu Glu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Ser Leu Met Ser Leu Leu Leu Gly Thr Arg Pro His Gly Ser 20 25 30 Pro Gly Pro Leu Gln Cys Tyr Ser Val Gly Pro Leu Gly He Leu 35 40 45 Asn Cys Ser Trp Glu Pro Leu Gly Asp Leu Glu Thr Pro PÍO Val 50 _ 55 60 Leu Tyr His Gln Ser Gln Lys Tyr His Pro Asn Arg Val Trp Glu 65 70 75 Val Lys Val Pro Ser Lys Gin Ser Trp Val Thr He Pro Arg Glu 80 85 90 Phe Thr Met Ala Asp Lys Leu Leu He Trp Gly Thr Gln Lys 95 100 105 Gly Arg Pro Leu Trp Ser Ser Val Ser Val Asn Leu Glu Thr Gln 110 115 120 Met Lys Pro Asp Thr Pro Gln He Phe Ser Gln Val Aep He-Ser 125 130 135 Glu Glu Ala Thr Leu Glu Ala Thr Val Gln Trp Ala Pro Pro Val 140 145 150 Trp Pro Pro Gln Lys Ala Leu Thr Cys Gln Phe Arg Tyr Lys Glu 155 160 165 Cys Gln Ala Glu Ala Trp Thr Arg Leu Glu Pro Gln Leu Lys Thr 170 175 180 Asp Gly Leu Thr Pro Val Giu Met Gln Asn Leu Glu Pro Gly Thr 185 190 - 195 Cys Tyr Gln Val Ser Gly Arg Cys Gln Val Glu Asn Gly Tyr Pro 200 205 210 Trp Gly Glu Trp Ser Ser Pro Leu Ser Phe Gln Thr Pro Phe Leu 215 220 225 Asp Pro Glu Asp Val Trp Val Ser Gly Thr Val Cys Glu Thr Ser 230 235 240 Gly Lys Arg Ala Ala Leu Leu Val Trp Lys Aso Pro Arg Pro Cys 245 250 255 Val Gln Val Thr Tyr Thr Val Trp Phe Gly Ala Gly Asp He Thr 260 265 270 Thr Thr Gln Glu Glu Val Pro Cys Cys Lys Ser Pro Val Pro Ala 275 280 285 Trp Met Glu Trp Ala Val Val Ser Pro Gly Asn Ser Thr Ser Trp 290 295 300 Val Pro Pro Thr Asn Leu Ser Leu Val Cys Leu Ala Pro Glu Ser 305 310 315 Ala Pro Cys Asp Val Gly Val Ser Ser Ala Asp Gly Ser Pro Gly 320 325 330 He Lys Val Thr Trp Lys Gln Gly Thr Arg Lys Pro Leu Glu Tyr 335 340 345 Val Val Asp Trp Ala Gln Asp Gly Asp Ser Leu Asp Lys Leu Asn 350 355 360 Trp Thr Arg Leu Pro Pro Gly Asn Leu Ser Thr Leu Leu Pro Gly 365 370 375 Glu Phe Lys Gly Gly Val Pro Tyr Arg He Thr Val Thr Ala Val 380 385 390 Tyr Ser Gly Gly Leu Ala Ala Ala Pro Ser Val Trp Gly Phe Arg 395 400 405 Glu Glu Leu Val Pro Leu Ala Gly Pro Ala Val Trp Arg Leu Pro 410 415 420 Asp Asp Pro Pro Gly Thr Pro Val Val Ala Trp Gly Glu Val Pro 425 430 435 Arg His Gln Leu Arg Gly Gln Ala Tnr His Tyr Thr Phe Cys He 440 445 450 Gln Ser Arg Gly Leu Ser Thr Val Cys Arg Asn Val Ser Ser Gln 455 46Q 465 Thr Glr. Thr Ala Thr Leu Pro Asn Leu His Ser Gly Ser Phe Lyn 470 475 480 Leu Trp Val Thr Val Ser Thr Val Ala Gly Gln Gly Pro Pro Gly 485 490 495 Pro Asp Leu Ser Leu His Leu Pro Asp Asn Arg He Arg Trp Lys 500 505 510 Ala Leu Pro Trp Phe Leu Ser Leu Trp Gly Leu Leu Leu Met Gly 515 520 525 Cys Gly Leu Ser Leu Ala Ser Tnr Arg Cys Leu Gln Ala Arg Cys 530 535 540 Leu His "rp Arg His Lys jßu Leu Pro Gln Trp He Trp Glu Arg 545 550 555 Val Pro Asp Pro Ala Asn Ser Asn Sei Gly Gln Pro Tyr He Lys 560 565 570 Glu Val Ser Leu Pro Glp Pro Pro Lys Asp Gly Pro He Leu Glu 575 580 585 Val Glu Glu Val Glu Leu Gln Pro Val Val Glu Ser Pro Lys Ala 590 595 600 Ser Ala Pro He Tyr Ser Gly -Tyr Glu Lys His Phe Leu Pro Thr 605 610 615 Pro Glu Glu Leu Gly Leu Leu Val 620 <210> 3 <211> 2646 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> inseguro <222> 2433 <223> base desconocida <400> 3 ÍJtgggttcgg cttcccgttg cgcctcgggg gctgtaccca gagctcgaag 50 aggagcagcg cggcccgcac ccggcaaggc tgggccggac tcggggctcc 100 cgagggacgc catgcgggga ggcaggggcg cccctttctg gctgtggccg 150 ctgcccaagc tggcgctgct gcctctgttg tgggtgcttt tccagcggac 200 gcgtccccag ggcagcgccg ggccactgca gtgctacgga gttggaccct 250 tgggcgactt gaactgctcg tgggagcctc ttggggacct gggagccccc 300 tccgagttac acctccagag ccaaaagtac cgttccaaca aaacccagac 350 tgtggcagtg gcagccggac ggagctgggt ggccattcct cgggaacagc 400 tcaccatgtc tgacaaactc cttgtctggg gcactaaggc aggccagcct 450 ctctggcccc ccgtcttcgt gaacctagaa acccaaatga agccaaacgc 500 cccccggctg ggccctgacg tggacttttc cgaggatgac cccctggagg 550 ccactgtcca ttgggcccca cctacatggc catctcataa agttctgatc 600 tgccagttcc actaccgaag atgtcaggag gcggcctgga ccctgctgga 650 accggagctg aagaccatac ccctgacccc tgttgagatc caagatttgg 700 agctagccac tggctacaaa gtgtatggcc gctgccggat ggagaaagaa 750 gaggatttgt ggggcgagtg gagccccatt ttgtccttcc agacaccgcc 800 ttctgctcca aaagatgtgt gggtatcagg gaacctctgt gggacgcctg 850 gaggagagga acctttgctt ctatggaagg ccccagggcc ctgtgtgcag 900 gtgagctaca aagtctggtt ctgggttgga ggtcgtgagc tgagtccaga 950 aggaattacc tgctgctgct ccctaattcc cagtggggcg gagtgggcca 1000 gggtgtccgc tgtcaacgcc acaagctggg agcctctcac caacctctct 1050 Ltggtctgct tggattcagc ctctgccccc cgtagcgtgg cagtcagcag 1100 catcgctggg agcacggagc tactggtgac ctggcaaccg gggcctgggg 1150 aaccactgga gcatgtagtg gactgggctc gagatgggga ccccctggag 1200 aaactcaact gggtccggct tccccctggg aacctcagtg ctctgttacc 1250 agggaatttc actgtcgggg tcccctatcg aatcactgtg accgcagtct 1300 ctgcttcagg cttggcctct gcatcctccg tc gggggtt cagggaggaa 1350 ttagcacccc tagtggggcc aacgctttgg cgactccaag atgcccctcc 1400 agggaccccc gccatagcgt ggggagaggt cccaaggcac cagcttcgag 1450 gccacctcac ccactacacc ttgtgtgcac agagtggaac cagcccctcc 1500 gtctgcatga atgtgagtgg caacacacag agtgtcaccc tgcctgacct 1550 tccttggggt ccctgtgagc tgtgggtgac agcatctacc atcgctggac 1600 agggccctcc tggtcccatc ctccggcttc atctaccaga taacaccctg 1650 aggtggaaag ttctgccggg catcctattc tt ggggct tgttcctgtt 1700 ggggtgtggc ctgagcctgg ccacctctgg aaggtgc ac cacctaaggc 1750 acaaagtgct gccccgctgg g ctgggaga aag cc ga tcc gccaac 1800 agcagttcag gccagcccca catggagcaa gtacctgagg cccagcccct 1850 tggggacttg cccatcctgg aagtggagga gatggagccc ccgccggtta 1900 tggagtcctc ccagcccgcc caggccaccg ccccgcttga ctctgggtat 1950 gagaagcact tcctgcccac acctgaggag ctgggccttc tggggccccc 2000 caggccacag gttctggcct gaaccacacg tctggctggg ggctgccagc 2050 caggctagag ggatgctcat gcaggttgca ccccagtcct ggattagccc 2100 tcttgatgga tgaagacact gaggactcag agaggctgag tcacttacct 2150 gaggacaccc agccaggcag agctgggatt gaaggacccc tatagagaag 2200 ggcttggccc ccatggggaa gacacggatg gaaggtggag caaaggaaaa 2250 tacatgaaat tgagagtggc agctgcctgc caaaatctgt tccgctgtaa 2300 cagaactgaa tttggacccc agcacagtgg ctcacgcctg taatcccagc 2350 actttggcag gccaaggtgg aaggatcact tagagctagg agtttgagac 2400 cagcctgggc aatatagcaa gacccctcac tanaaaaata aaacatcaaa 2450 aacaaaaaca attagctggg catgatggca cacacctgta gtccgagcca 2500 cttgggaggc tgaggtggga ggatcggttg agcccaggag ttcgaagctg 2550 cagggacctc tgattgcacc actgcactcc aggctgggta acagaatgag 2600 acct atctc aaaaataaac aaactaataa aaaaaaaaaa aaaaaa 2546 <210> 4 <211> 2005 <212> ADN <213> Mus rausculus <40Q> 4 tcggttctat cgatggggcc atgaaccggc tccgggttgc acgcctcacg 50 ccg tggagc ttctgctgtc gctgatgtcg ctgctgctcg ggacgcggcc 100 ccacggcagt ccaggcccac tgcagtgcta cagcgtcggt cccctgggaa 150 tcctgaactg ctcctgggaa cctttgggcg acctggagac tccacctgtg 200 ctgtatcacc agagtcagaa ataccatccc aatagagtct gggaggtgaa 250 ggtgccttcc aaacaaagtt gggtgaccat tccccgggaa cagttcacca 300 tggctgacaa actcctcatc t-gggggacac aaaagggacg gcctctgtgg 350 tcctctgtct ctgtgaacct ggagacccaa atgaagccag acacacctca 400 gatcttctct caagtggata tttctgagga agcaaccctg gaggccactg 450 tgcagtgggc gccgcccgtg tggccaccgc agaaagctct cacctgtcag 500 ttccggtaca aggaatgcca ggctgaagca tggacccggc tggagcccca 550 gctgaagaca gatgggctga ctcctgttga gatgcagaac ctggaacctg 600 gcacctgcta ccaggtgtct ggccgctgcc aggtggagaa cggatatcca 650 t-ggggcgagt ggagttcgcc cctgtccttc cagacgccat tcttagatcc 700 tgaagatgtg tgggtatcgg ggaccgtctg tgaaacttct ggcaaacggg 750 cagccc gc tgtctggaag gacccaagac cttgtgtgca ggtgacttac 800 acagtctggt ttggggctgg agatattact acaactcaag aagaggtccc 850 gtgctgcaag tcccctgtcc ctgcatggat ggagtgggct gtggtctctc 900 ctggcaacag caccagctgg gtgcctccca ccaacctgtc tctggtgtgc 950 ttggctccag aatctgcccc ctgtgacgtg ggagtgagca gtgctgatgg 1000 gagcccaggg ataaaggtga cctggaaaca agggaccagg aaaccattgg 1050 agtatgtggt ggactgggct caagatggtg acagcctgga caagctcaac 1100 tggacccgtc tcccccctgg aaacctcagc acattgttac caggggag 1150 caaaggaggg gtcccctatc gaattacagt gactgcagta tactctggag 1200 gattagctgc tgcaccctca gtttggggat tcagagagga gttagtaccc 1250 cttgctgggc cagcagtttg gcgac cca gatgaccccc cagggacacc 1300 Lgttgtagcc tggggagaag taccaagaca ccagctcaga ggccaggcta 1350 ctcactacac cttctgcata cagagcagag gcctctccac tgtctgcagg 1400 aacgtgagca gtcaaaccca gactgccact ctgcccaacc ttcactcggg 1450 ttccttcaag ctgtgggtga cggtgtccac cgttgcagga cagggcccac 1500 ctggtcccga cctttcactt cacctaccag ataataggat caggtggaaa 1550 gctctgccct ggtttctgtc cctgtggggt ttgcttctga tgggctgtgg 1600 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Mus musculus <400> 11 tcgcgtctct gggaagct 18 <210> 12 <211> 24 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 12 tttaagccaa tgtatccgag actg 24 <210> 13 <211> 20 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 13 cgccagcgtc ctcctcgtgg 20 <210> 14 <211> 21 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 14 caagcatttg catcgctatc a 21 <210> 15 <211> 19 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 15 aatgcctLLL gccggaagt 19 <210> 16 <211> 24 <212> ADN <213> Mus musculus 15 <400> 16 acgaattgag aacgtgccca ccgt 24 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

Reivindicaciones : Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones . 1. El uso de un antagonista TCCR para la manufactura de un medicamento para aumentar, estimular o potenciar la diferenciación de células T dentro del sub-tipo Th2 en lugar del sub-tipo Thl .
2. El uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde el aumento, estimulación o potenciación se presenta en un mamífero, y la cantidad efectiva es una cantidad terapéuticamente efectiva.
3. El uso de un antagonista del polipéptido TCCR para la manufactura de un medicamento para tratar una enfermedad mediada por el Thl en un mamífero.
4. El uso de conformidad con la reivindicación 3, en donde la enfermedad mediada por el Thl se selecciona del grupo que consiste de enfermedad inflamatoria auto inmune y rechazo de aloinjerto.
5. El uso de conformidad con la reivindicación 4, en donde la enfermedad inflamatoria auto inmune se selecciona del grupo que consiste de encefalomielitis alérgica, esclerosis múltiple, diabetes mellitus dependiente de la insulina, uveoretinitis autoinmune, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad auto inmune de la tiroides .
6. El uso de conformidad con la reivindicación 3, en donde el antagonista es una molécula pequeña.
7. El uso de conformidad con la reivindicación 3, en donde el antagonista es un oligonucleótido antisentido.
8. El uso de conformidad con la reivindicación 7, en donde el oligonucleótido es ARN.
9. El uso de conformidad con la reivindicación 7, en donde el oligonucleótido es ADN.
10. El uso de conformidad con la reivindicación 3, en donde antagonista es una variante TCCR que carece de actividad biológica.
11. El uso de conformidad con la reivindicación 3, en donde el antagonista es un anticuerpo monoclonal.
12. El uso de conformidad con la reivindicación 11, en donde el anticuerpo tiene una región determinante de la complementariedad no humana (CDR) y residuos de la región de la estructura humana (FR) .
13. El uso de conformidad con la reivindicación 3, en donde el antagonista es un fragmento de anticuerpo o un anticuerpo de cadena simple.
14. El uso de conformidad con la reivindicación 3, en donde el antagonista es un ligando TCCR.
15. El uso de un polipéptido TCCR o agonista del mismo para la manufactura de un medicamento para la prevención, inhibición o atenuación de la diferenciación de células T dentro del sub-tipo Th2.
16. El uso de conformidad con la reivindicación 15, en donde la prevención, inhibición o atenuación, se presenta en un mamífero, y la cantidad efectiva es una cantidad terapéuticamente efectiva.
17. El uso de un polipéptido TCCR o agonista para la manufactura de un medicamento para tratar una enfermedad mediada por Th2 en un mamífero.
18. El uso de conformidad con la reivindicación 17, en donde la enfermedad mediada por el Th.2 se selecciona del grupo que consiste de: enfermedades infecciosas y padecimientos alérgicos.
19. El uso de conformidad con la reivindicación 18, en donde la enfermedad infecciosa selecciona del grupo que consiste de: Leishmania major, Mycobacteri um leprae, Candida albicans, Toxoplasma gondi , virus respiratorio sincitial y virus de inmunodeficiencia humana.
20. El uso de conformidad con la reivindicación 18, en donde el padecimiento alérgico se selecciona del grupo que consiste de asma, rinitis alérgica, dermatitis atopica y conjuntivitis vernal.
21. El uso de conformidad con la reivindicación 15, en donde el agonista es una molécula pequeña.
22. El uso de conformidad con la reivindicación 15, en donde el agonista es una variante TCCR que tiene actividad biológica.
23. El uso de conformidad con la reivindicación 15, en donde el agonista es un anticuerpo monoclonal.
24. El uso de conformidad con la reivindicación 23, en donde el anticuerpo tiene residuos de la región (CDR) determinante de la complementariedad no humana, y residuos de la región de estructura (FR) humana.
25. El uso de conformidad con la reivindicación 15, en donde el agonista es un fragmento de anticuerpo o un anticuerpo de cadena simple.
26. El uso de conformidad con la reivindicación 15, en donde el agonista es un ECD de TCCR estable.
27. Un método para determinar la presencia de un polipéptido TCCR en una célula, caracterizado porque comprende exponer la célula a un anticuerpo anti-TCCR, y medir el enlace del anticuerpo con la célula, en donde el enlace del anticuerpo a la célula es indicador de la presencia del polipéptido TCCR.
28. Un método para el diagnóstico de una enfermedad mediada por el Thl o Th2 en un mamífero, caracterizado porque comprende detectar el nivel de expresión de un gen que codifica a un polipéptido TCCR (a) en una muestra de prueba de células de tejido obtenidas del mamífero, y (b) en una muestra de control de células de tejido normal conocidas del mismo tipo de células conocidas, en donde un nivel de expresión inferior en la muestra de prueba en comparación con la muestra de control indica la presencia de un padecimiento mediado por el Th2 y un nivel de expresión superior en la muestra de prueba en comparación con la muestra de control indica la presencia de un padecimiento mediado por Thl.
29. Un método para la identificación de un compuesto capaz de inhibir la expresión de un polipéptido TCCR, caracterizado porque comprende poner en contacto un compuesto candidato con el polipéptido bajo condiciones y por un tiempo suficiente para permitir que interactúen estos dos componentes.
30. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el compuesto candidato se inmoviliza en un soporte sólido.
31. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque el componente no inmovilizado lleva una etiqueta detectable.
32. Un método para la identificación de un compuesto capaz de inhibir una actividad biológica de un polipéptido TCCR, caracterizado porque comprende poner en contacto un compuesto candidato con el polipéptido bajo condiciones y por un tiempo suficiente para permitir que estos dos componentes interactúen.
33. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque el compuesto candidato se inmoviliza en un soporte sólido.
34. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque el componente no inmovilizado lleva una etiqueta detectable.