CN1409726A - I型细胞因子受体tccr - Google Patents

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Abstract

本发明涉及治疗和诊断免疫相关疾病的方法，所述疾病包括主要由Th1或Th2细胞因应答抗原刺激而释放的细胞因子介导的那些疾病。本发明进一步涉及基于TCCR基因相对表达水平以及TCCR激动剂或拮抗剂而使T－细胞偏置分化为Th1亚型或Th2亚型的方法。本发明还涉及诊断Th1－和Th2－介导的疾病的方法。

Description

I型细胞因子受体TCCR
                        发明领域
本发明主要涉及新DNA的鉴定和分离、新多肽的重组产生，以及诊断和治疗免疫相关疾病的组合物和方法，特别涉及对T-细胞向Th1和Th2亚型的分化以及细胞因子的释放特征进行调节的方法，还涉及与细胞因子释放特征相关的多种疾病。
                        发明背景
免疫相关疾病和炎症性疾病的临床表现和因果关系相当复杂，常常有多个相互连接的生物学通路，所述生物学通路在正常生理学上对于损害或损伤、引发损害或损伤组织修复以及增加先天性和获得性防御外来生物体的应答能力而言，是至关重要的。当这些正常生理通路引起另外的损害或损伤时，无论是作为异常调节或过度刺激而直接与反应强度有关，还是对其自身的反应，亦或是这些情况的结合，均导致疾病或病变发生。
尽管疾病发生常涉及多个通路并且常常具有多个不同的生物系统/通路，但是，干预这些通路中一个或多个关键点可以产生改善或治疗效果。通过拮抗有害过程/通路或者刺激有益过程/通路，可以实现治疗性干预。
T淋巴细胞(T细胞)是哺乳动物免疫应答中的重要组成部分。T细胞识别与位于主要组织相容性复合体(MHC)内的基因编码的自体-分子联合的抗原。该抗原可与MHC分子一起出现在抗原呈递细胞、感染病毒细胞、癌细胞、移植物等的表面。T细胞系统清除这些对于哺乳动物宿主的健康造成威胁的改变了的细胞。T细胞包括辅助T细胞和细胞毒T细胞。辅助T细胞在识别抗原呈递细胞上的抗原-MHC复合物之后大量增殖。辅助T细胞也分泌多种细胞因子，即淋巴因子，它们在激活B细胞、细胞毒T细胞和各种其它参加免疫应答的细胞方面，发挥着枢纽作用。
体液和细胞介导的免疫应答的中心事件是激活辅助T细胞和后者的克隆扩增(clonal expansion)。辅助T细胞的激活是由T细胞受体(TCR)-CD3与抗原呈递细胞表面的抗原-MHC复合物之间的相互作用而引发的。此相互作用介导级联生化事件，从而导致静止状态的辅助T细胞进入细胞周期(G0期向G1期转变)，并导致IL-2和有时IL-4的高亲和力受体的表达。激活的T细胞经过细胞周期各过程而增殖并分化成记忆细胞或效应细胞。
哺乳动物免疫系统由大量独特细胞构成，所述细胞协同作用从而使宿主抵御细菌、病毒、毒素和其它非-宿主自身物质的入侵。把主要负责特异性免疫系统的细胞类型称为淋巴细胞，淋巴细胞有两种类型，即B细胞和T细胞。T细胞因其在胸腺中发育而得名，而B细胞则因在骨髓中发育而被命名为B细胞。T-细胞群有数个亚群如抑制T细胞、细胞毒T细胞和T辅助细胞。T-辅助细胞亚群限定了2条免疫通路：Th1和Th2。Th1细胞是CD4+细胞的一个功能性亚群，它以增强细胞介导的免疫性的能力为特征。Th1细胞产生细胞因子I1-2和干扰素γ，并确定其不存在I1-10、I1-4、I1-5和I1-6。
Th2细胞也是一种CD4+细胞，但它明显不同于Th1细胞。Th2细胞负责抗体产生并产生细胞因子I1-4、I1-5、I1-10和I1-13(见图1)。这些细胞因子在Th1和Th2应答反应的交互抑制方面起着重要作用。Th1细胞产生的干扰素γ抑制Th2细胞增殖(图2)，而Th2细胞产生的IL-10抑制干扰素γ的产生(图2)。
业已发现，四螺旋束细胞因子家族的成员(Bazan，J.F.，1990，Proc NatlAcad Sci U SA，87：6934-8)在T辅助细胞从共同前体扩增并最终分化为不同的Th1和Th2效应细胞群的过程中起着非常关键的作用，O′Garra，A.，1998，Immunity8：275-83。IL-4主要影响Th2细胞发育，而IL-12是参与Th1细胞分化的主要因子，Hsieh，C.S.等，1993，Science，260：547-9；Seder，R.A.等，1993，ProcNatl Acad Sci U S A，90：10188-92；Le Gros，G.等，1990，J.Exp Med，172：921-9；Swain，S.L.，等，1991，Immunol Rev，123：115-44。因此，IL-4缺陷小鼠(Kuhn，R.，etal，1991，Science，254：707-10)，其IL-4受体链(Noben-Trauth，N.等，1997，Proc Natl Acad Sci U S A，94：10838-43)或IL-4特异转录因子STAT6(Shimoda，K.等，1996，Nature，380：630-3)在Th2反应中有缺陷，而IL-12缺陷鼠(Magram，J.等，1996，Imniunity，4：471-81)的IL-12受体(IL-12R)1链(Wu，C.等，1997，J Immunol，159：1658-65)或IL-12特异转录因子STAT4(Kaplan，M.H.等，1996，Nature，382：174-7)在Th1反应中有缺陷。
据信，Th-1和Th-2细胞亚型起源于称作Th-0细胞的共同前体。与Th-1和Th-2亚型产生交互排他性的细胞因子不同的是，Th-0细胞产生大多数或所有这些细胞因子。不同细胞因子对于Th-1和Th-2亚型的释放特征，在效应物机理和细胞毒细胞的选择方面起着积极作用。Th-1细胞分泌的I1-2和干扰素γ倾向于激活巨噬细胞和细胞毒细胞，而Th-2细胞分泌的I1-4、I1-5、I1-6和I1-10，则倾向于增加嗜酸性粒细胞和肥大细胞的产生以及增强包括IgE在内的抗体的产生并减低细胞毒细胞的功能。一旦建立，由产生的细胞因子维持Th-1或Th-2反应模式，所述细胞因子抑制其它亚群的产生。Th-1细胞产生的干扰素γ抑制Th-2细胞因子如I1-4和I1-10的产生，而Th-2细胞产生的I1-10则抑制Th-1细胞因子如I1-2和γ-干扰素的产生。
Th1和Th2细胞亚群之间细胞因子的微妙平衡被打破的话，将导致宿主患病。举例来说，Th1细胞因子的过度产生可导致自身免疫性炎症疾病、多发性硬化和炎性肠道疾病(例如，克罗恩氏病，局限性肠炎，远端回肠炎，肉芽肿肠炎，节段性回肠炎，末端回肠炎)。类似地，Th2细胞因子的过度产生将导致过敏性病症，包括过敏性高敏症、哮喘、过敏性鼻炎、特应性皮炎、春季结膜炎、湿疹、荨麻疹和食物变态反应，Umetsu等，Soc.Exp.Biol.Med.215：11-20(1997)。
1997年5月19日申请的WO 97/44455和Sprecher等，Biochem.Biophys.Res.Commun.246：82-90(1998)描述了细胞因子受体分子与本文所述鼠和人TCCR分子具有一定程度的序列同源性。现有技术声称，鼠和人细胞因子受体在淋巴组织表达(包括胸腺、脾、淋巴结和外周血白细胞)，并进一步指出所述受体在B-细胞和T-细胞上均有存在而且其功能与免疫细胞增殖、分化和/或活化有关，或许在免疫应答发展和调节中起作用。然而，WO97/44455和Sprecher等， 出处同上既没有确定TCCR和其同族体在介导T-细胞分化为Th1亚型和Th2亚型和细胞因子释放特征方面的精确作用，也没有推断细胞因子T-细胞亚型的释放会导致宿主患病。
                       发明概述
本发明涉及哺乳动物，包括人的免疫相关疾病，尤其由于T-细胞分化为Th1亚型或Th2亚型的通路偏置所导致的生理机能(例如，细胞因子释放)和疾病的诊断和治疗方法。本发明是基于鉴定TCCR(以前称作NPOR)的编码基因和氨基酸序列，TCCR缺乏或失活将使哺乳动物T-细胞偏置分化成Th2亚型。一些免疫性疾病通过抑制或增强T-细胞分化成Th1或Th2亚型可以治疗。
本发明还涉及提高、刺激或增强T-细胞分化为Th2亚型而不是Th1亚型的方法，包括施用有效量的TCCR拮抗剂。任选地，本方法在哺乳动物中使用，而且有效量是治疗有效量。任选地，TCCR拮抗剂诱导的T-细胞向Th2亚型细胞的分化还引起在抗原刺激下Th2细胞因子(例如，I1-4，11-5I1-10和II-13)释放。以过度产生Th1细胞因子为特征的疾病和敏感于Th2-亚型刺激对分化的平衡效果以及所致细胞因子的释放特征的疾病包括，自身免疫性炎性疾病(例如过敏性脑脊髓炎、多发性硬化、胰岛素依赖型糖尿病、自身免疫性眼色素层视网膜炎(uveoretinitis)、炎性肠道疾病(例如克罗恩氏(Crohn’s)病，溃疡性结肠炎)、自身免疫性甲状腺疾病)和同种异体移植排斥。
本发明进一步包括阻止、抑制或减弱T-细胞分化为Th2亚型(即，使T细胞分化为Th1亚型)的方法，所述方法包括施用有效量的TCCR或其激动剂。任选地，所述方法在哺乳动物中使用，而有效量是治疗有效量。任选地，TCCR或激动剂诱导的分化导致在抗原刺激下Th1细胞因子(例如，干扰素γ)释放。以过度产生Th2细胞因子(或Th1细胞因子产生不足)为特征的疾病，和可应答Th1-亚型刺激对分化的平衡作用的疾病，Th2细胞因子过度产生预期在治疗传染性疾病(例如，硕大利什曼原虫(Leishmania major)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、白色念珠菌(Candida albicans)、鼠弓浆虫(Toxoplasma gondi)、呼吸道合胞病毒、人类免疫缺陷病毒)和过敏性病症(例如，哮喘，过敏性鼻炎，特应性皮炎，春季结膜炎)中有效。
一实施方案中，本发明涉及分离的与TCCR多肽结合的抗体(例如，抗-TCCR)。一方面，抗体摹拟TCCR多肽的活性(激动型抗体)，或者相反，抗体抑制或中和TCCR多肽的活性(拮抗型抗体)。另一方面，抗体是单克隆抗体，其优选具有非人互补决定区(CDR)残基和人框架区(FR)残基。抗体可被标记和被固定在固体载体上。再一方面，抗体是抗体片段、单链抗体或抗-独特型抗体。
另一实施方案中，本发明涉及本发明多肽和抗体在制备具有上述用途的组合物或药物中的应用。
还一实施方案中，本发明涉及编码抗-TCCR抗体的核酸和载体以及含有所述核酸的重组宿主细胞。还有一实施方案中，本发明涉及按照下述过程生产所述抗体的方法：在能够表达抗体的条件下培养转化了编码抗体的核酸的宿主细胞，并从细胞培养物中回收抗体。
发明进一步涉及抑制TCCR多肽一种或多种功能或活性的TCCR多肽拮抗剂。或者，发明涉及刺激或增强TCCR多肽一种或多种功能或活性的TCCR激动剂。优选这些拮抗剂和/或激动剂是TCCR变体、肽片段、小分子、反义寡核苷酸(DNA或RNA)、核酶或抗体(单克隆抗体，人源化抗体，特异抗体，单链抗体，异源偶联抗体或这些抗体的片段)。另外，TCCR激动剂可包括潜在TCCR配体，而潜在TCCR拮抗剂可包括可溶性TCCR细胞外结构域(ECD)。
再一实施方案，发明涉及分离的与编码TCCR多肽或其互补链的核酸分子杂交的核酸分子。核酸优选是DNA，且杂交优选在严格条件下发生。此类核酸分子可作为本文鉴定的扩增基因的反义分子，后者反过来，可用于调节各自的扩增基因，或者在扩增反应中作为反义引物。此外，所述序列可用作核酶和/或三链螺旋序列的一部分，反过来，核酶和/或三链螺旋序列可用于调节被扩增的基因。
另一实施方案，发明涉及检测TCCR多肽是否存在的方法，包括将怀疑含有多肽的细胞与抗-TCCR抗体接触，并检测抗体与细胞的结合情况。
还一实施方案，发明涉及诊断哺乳动物中Th1-介导或Th2介导的病症的方法，包括检测编码TCCR多肽的基因在(a)取自哺乳动物组织细胞的待测样品中，和在(b)相同细胞类型的已知正常组织细胞的对照样品中的表达水平，如果被测样品中的表达水平相对于对照样品低的话，则表明在取得待测组织细胞的哺乳动物中存在Th2-介导的病症，如果被测样品中表达水平高于对照样品的话，则表明存在Th1-介导的病症。
另一实施方案，发明涉及哺乳动物免疫性疾病的诊断方法，包括(a)将采自哺乳动物的组织细胞的被测样品与抗-TCCR抗体接触，和(b)检测抗体和TCCR多肽之间复合物的形成。该检测可以是定量或定性的，通过与在一相同细胞类型的已知正常组织细胞的对照样品中监测到的该复合物的形成进行比较而完成。被测样品中有大量复合物形成，则表明在取得待测组织细胞的哺乳动物中存在TCCR和Th1-介导的病症，复合物形成量较少，则表明存在Th2-介导的病症。优选抗体携带可检测的标记物。可以监测复合物形成，例如使用光学显微镜、流式细胞仪、荧光测定法或本领域已知的其它技术。被测样品通常取自怀疑患有免疫系统缺陷或异常的个体。
另一实施方案，本发明涉及一诊断试剂盒，其盛有在适当包装中的抗-TCCR抗体和载体(例如缓冲剂)。该试剂盒优选含有使用该抗体检测TCCR多肽的说明书。
还一实施方案中，本发明涉及一种产品，包括：
一容器；
贴在容器上的标签；和
装在容器中的含有活性剂的组合物；其中组合物对于刺激或抑制哺乳动物的免疫应答是有效的，贴在容器上的标签注明该组合物可被用于治疗免疫相关疾病，该组合物中的活性剂是刺激或抑制TCCR多肽表达和/或活性的物质。在一优选的方面，该活性剂是TCCR多肽或抗-TCCR抗体。
再一实施方案，涉及鉴定能够调节TCCR多肽表达和/或生物活性的化合物的方法，通过使候选化合物与TCCR多肽在足以使得两个组分互相作用的条件下和时间内相接触。一具体方面，将所述候选化合物或TCCR多肽固定在固相载体上。另一方面中，未固定的组分携带可检测的标记。
                       附图简述
图1是CD4+T-细胞分化为Th1和Th2细胞的示意图，图中显示了负责影响分化的主要细胞因子，在抗原刺激下向各种亚型分化时所释放的主要细胞因子，以及所释放的细胞因子总体(profile)所介导的生理学效应。
图2是描述Th1和Th2 T-细胞亚型释放的细胞因子之间相互关系的负反馈环路示意图。
图3显示人TCCR(hTCCR)的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)。所述序列也已在1996年5月23日提交的WO97/44455中公开，并且还可以从GenBank登录号4759327下得到。该序列还描述在Sprecher等，Biochem.Biophys，Res.Commun 246(1)：82-90(1998)中。在SEQ ID NO：1中，已经鉴定出信号肽在氨基酸残基1～约32，跨膜结构域在约氨基酸残基517-约538，N-糖基化位点在约残基51-54，76-79，302-305，311-314，374-377，382-385，467-470，563-566，N-肉豆蔻酰化位点在残基约107-112、240-245、244-249、281-286、292-297、373-378、400-405、459-464、470-475、531-536和533-538，原核膜脂蛋白脂质附着位点在残基约522-532，生长因子和细胞因子受体家族识别标记1在残基约41-54。在残基183-191处有一个与人类粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)受体的第二亚单位具有显著同源性的区域。
图4显示鼠TCCR(mTCCR)的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。该序列也已在1996年5月23日提交的WO97/44455中公开，并且还可以从GenBank登记号7710109下得到。该序列也描述在Sprecher等，Biochem.Biophys，Res.Commun.246(1)：82-90(1998)中。在SEQ ID NO：2中，已经鉴定出信号肽在氨基酸残基1-约24，跨膜结构域在氨基酸残基约514-约532，N-糖基化位点位于残基约46-49、296-299、305-308、360-361、368-371和461-464，酪蛋白激酶II磷酸化位点在残基约10-13、93-96、130-133、172-175、184-187、235-238、271-274、272-275、323-326、606-609和615-618，酪氨酸激酶磷酸化位点约在残基202-209，N-肉豆蔻酰(myristoylation)化位点位于残基约43-48、102-107、295-300、321-326、330-335、367-342、393-398、525-530和527-532，酰胺化位点位于残基约240-243，原核膜脂蛋白脂质附着点在残基约516-526，而生长因子和细胞因子受体家族识别标志1在约残基36-49。与(1)人红细胞生成素在残基约14-51和(2)鼠白介素-5受体在残基211-219都存在显著同源的区域。
图5显示hTCCR(SEQ ID NO：1)与mTCCR(SEQ ID NO：2)的比较。完全相同的氨基酸用阴影表示，为了进行最佳序列比对而引入的缺口用破折号表示。预测的信号肽酶裂解位点用箭头指出。潜在的N-糖基化位点用星号标出。WSX基序，跨膜结构域和1号基序盒用框表示。
图6显示人TCCR的Northern印迹，其指示成人组织和胎儿组织的表达特征。成人的hTCCR在胸腺中表达水平最高，在外周血白细胞(PBL′s)和脾中也有信号，在肺中仅微弱表达。胎儿组织的TCCR在肺和肾微弱表达。TCCR的表达特征表明它可能参与血细胞特别是胸腺细胞的发育和增殖。
图7(A-B)检验在TCCR-/-鼠中T-细胞的数量和表型。图7A是取自TCCR-/-鼠的CD4+/CD8+T-细胞FACS分析图谱，并与野生型进行比较。图7B是CD4+/CD8+/TcR+FACS分析图谱。TCCR-/-鼠的T-细胞数量之间没有任何显著性差异，表明T-细胞增殖未受损害。
图8(A-B)检验TCCR在人T-细胞中的表达。图8A是人T-细胞表面人TCCR和全T-细胞表面标志CD2的FACS分析图谱。图8B是人B-细胞表面人TCCR和B-细胞标志CD20的FACS分析图谱。最左侧的两个图代表与第二抗体偶联的适合的荧光色素。图8A和8B联合起来表明TCCR存在于人T-细胞亚群而不存在于相当数量的B-细胞上。
图9(A-C)是使用同源重组技术的TCCR基因靶向方法学的示意图。图9A表示野生型等位基因，用实心块指示TCCR外显子，而用虚线表示内含子。″E″和″B″分别表示核酸内切酶EcoRI和BamH I的裂解位点。图9B代表靶向载体，其中TCCR的外显子3-8已经被来自质粒载体pGK-neo的新霉素抗性基因替换。已将来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶基因插入到外显子1的5′端，所述胸苷激酶基因提供对更昔洛韦(gancyclovir)所致选择压力的抗性。图9C代表在内源基因和靶向载体之间发生同源重组后最终被靶向或″基因敲除″的等位基因。
图10(A-C)是Southern印迹、PCR反应的凝胶电泳图象和Northern印迹，分别证实用TCCR靶向载体进行的转染。在图10A中，基因组DNA取自对新霉素/更昔洛韦药物筛选具有抗性的ES细胞，并与TCCR特异性的放射性标记探针进行杂交。从左数第二泳道中，既存在10Kb片段也存在12Kb片段，表明TCCR等位基因之一已被切除。图10B是取自TCCR-/-鼠尾的基因组DNA的PCR扩增反应产物。将PCR引物设计为能将野生型TCCR等位基因与重组过程产生的靶向的(″基因敲除″)等位基因区分开来。第1和第2泳道(从左数)是指示TCCR野生型的条带图案。第3泳道显示TCCR-/-鼠的PCR条带，第5和第6泳道表示TCCR杂合体鼠(+/-)。图10C是已经与TCCR特异性探针进行过杂交的Northern印迹。第1泳道标本取自TCCR-/-鼠，第2泳道取自野生型鼠。取自TCCR-/-鼠的泳道没有任何信号，表明没有产生TCCR的功能性全长度mRNA。
图11(A-B)表明TCCR-/-鼠的变应性呼吸道炎症增强。图11A显示，通过测量浸润肺的淋巴细胞数量而得知，被尘螨抗原(DMA)致敏的TCCR-/-鼠产生较大的Th2应答。
图12(A-B)是通过测定IFN-γ的产生而显示的TCCR-/-鼠中Th1/Th2应答的示意图。图12A中，自TCCR-/-鼠分离的T-细胞与引导沿Th 1通路分化的IL-12一起孵育。分析这些细胞中IFN-γ、IL-4和IL-5的产生情况。如图12A中阴影棒所显示的那样，TCCR-/-鼠中IFN-γ的产生处于显著低水平。这表明TCCR-/-鼠中Th1反应被大大减弱。图12B是有关与引导沿Th2通路分化的IL-4一起孵育后的T细胞情况的示意图。该图表明，在TCCR-/-鼠T-细胞和野生型对照细胞之间，细胞因子的产生没有差异。
图13是TCCR-/-鼠中产生的Ig水平的示意图。检测了Ig亚型IgG1、IgG2、IgG2b、IgG3、IgM和IgA的水平。如浅色阴影棒所示，TCCR-/-鼠较野生型对照鼠产生较少的IgG2a。其余的IgG水平无显著差异。IgG2a由Th1细胞产生，其在TCCR-/-鼠中的显著缺乏证实前述其它试验中观察到的Th1反应的减低现象。
图14是事先用卵白蛋白免疫过的TCCR-/-鼠中产生的IgG水平的示意图。第1和第21天，给各小鼠腹腔注射100μg OVA，于第26天放血。检测纯合基因敲除鼠的IgG1和IgG2a水平并与野生型鼠进行比较。如左侧图所示，IgG1水平在野生型和基因敲除鼠中是相等的，而TCCR-/-基因敲除鼠的IgG2a水平显著低于野生型鼠，反映出TCCR-/-鼠中Th1反应减弱。
图15(A-B)是显示鼠脾细胞中哪种细胞类型表达TCCR的示意图。图15A显示CD4、CD8、CD19、NK1.1和F4/80细胞中的表达水平，CD4 T细胞和自然杀伤细胞中的表达水平最高。图15B显示Th0、Th1和Th2细胞内的表达水平，在Th0细胞中表达水平最高，而在Th1和Th2细胞中由于CD4细胞的分化而下调。通过即时PCR并按照rp119(一种核糖体管家基因)而标准化来检测TCCR表达。Heid，C.A.等，1996，Genome Res.，6：986-94。
图16(A-D)是TCCR缺陷小鼠的淋巴结细胞受抗原诱导而产生细胞因子并增殖的示意图。用完全弗氏佐剂(CFA)中的KLH对野生型和TCCR-缺陷小鼠进行免疫。于9天后采集淋巴结并在所述KLH存在的条件下培养，分析淋巴结产生(图16A)IFN、(图16B)IL-4、(图16C)IL-5的能力或者(图16D)其增殖能力。数据用各组中5只动物的均值+/-SD表示。用不成对t检验分析两个KLH浓度时WT和KO型鼠之间的IFN水平，P＜0.004。
图17(A-C)是对IgG亚类浓度和对单核细胞增多性李斯特杆菌(L.Monocytogenes)感染敏感性的影响的示意图。从野生型和TCCR-缺陷小鼠采集血清，用ELISA测定总IgG亚类浓度(图17A)。OVA-特异性IgG1和IgG2a得自OVA/CFA致敏鼠。从用CFA中的OVA免疫过的野生型和TCCR-缺陷小鼠采集血清，用OVA-特异性ELISA测定IgG1(1∶320000稀释)和IgG2a(1∶5000稀释)水平(图17B)。给5只TCCR-缺陷小鼠或野生型同窝鼠皮下感染3×104 CFU单核细胞增多性李斯特杆菌。3天或9天后，取出肝脏并测定细菌滴度(图17C)。数据用各组中的5只鼠的均值+/-SD表示。不成对T-检验分析WT和KO在两个时间点的差异，P＜0.001。
图18(A-D)是体外诱导Th细胞分化和增殖的示意图。从野生型或TCCR-缺陷小鼠脾脏提纯的CD4+T-细胞，在(图18A)存在ConA和经辐射的野生型APC或者(图18B)用抗-CD3和抗-CD28作为刺激物的条件下，分化为Th1或Th2细胞。ELISA测定IFN和IL-4的产生。数据用各组5只鼠总的均值+/-SD表示。ND为未检测。图18C表示取自野生型和TCCR-缺陷小鼠的脾细胞经IL-12诱导的增殖情况。如图所示，在递增浓度的IL-12存在的条件下孵育被ConA活化的脾细胞24h。通过在孵育期间最后6h掺入[3H]-胸苷来测量细胞的增殖情况。图18D表示未刺激鼠(白色棒)和ConA刺激鼠(黑色棒)脾细胞中IL-12RmRNA水平。用ConA刺激脾T-细胞72h，通过即时定量PCR(Taqman)技术测定IL-12R 1和IL-12R 2的mRNA水平。倍数增加是相对于野生型未被刺激的细胞中的RNA水平。
图19显示Taqman分析中使用的引物和探针SEQ ID NOS：5-16的序列。
                     优选实施方案详述
I.定义
术语″免疫相关疾病″是指哺乳动物免疫系统成分引起、介导的疾病，或者是免疫系统成分造成哺乳动物发病率升高的疾病。也包括刺激或干预免疫应答能够对疾病进展带来改善效果的那些疾病。涵盖在此术语中的疾病有：免疫-介导的炎症性疾病，非-免疫-介导的炎症性疾病，传染性疾病，免疫缺陷性疾病，瘤形成等。
术语″Th1介导的病症″，是指以过度产生Th1细胞因子为特征的疾病，包括那些由于过度产生或T-细胞偏置分化为Th1亚型而引起的疾病。此类疾病包括例如，自身免疫炎症性疾病(如过敏性脑脊髓炎、多发性硬化、胰岛素依赖型糖尿病、自身免疫性眼色素层视网膜炎、甲状腺毒症、硬皮病、系统性红斑狼疮、类风湿病、炎性肠道疾病(例如，克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、局限性肠炎、远端回肠炎、肉芽肿性肠炎、节段性回肠炎、末端回肠炎)、自身免疫甲状腺、恶性贫血)和同种异体移植排斥。
术语″Th2介导的病症″，是指以过度产生Th2细胞因子为特征的疾病，包括那些由于过度产生或T-细胞偏置分化为Th2亚型而引起的疾病。此类疾病包括，例如，感染加剧的传染性疾病(例如，硕大利什曼原虫，麻风分枝杆菌，白色念珠菌，鼠弓浆虫，呼吸道合胞病毒，人类免疫缺陷病毒等引起的)和过敏性病症，如过敏性高敏症，哮喘，过敏性鼻炎，特应性皮炎，春季结膜炎，湿疹，荨麻疹和食物变态反应等。
其它免疫疾病、免疫-相关疾病和炎症性疾病的实例，其中一些是由T-细胞分化成Th1和Th2亚型的效果(例如，细胞因子释放特征)所介导的和根据本发明可以治疗的疾病，包括：系统性红斑狼疮，类风湿性关节炎，幼年慢性关节炎，脊椎关节病(spondyloarthropathies)，系统性硬化(硬皮病)，特发性炎症性肌病(皮肤肌炎，多肌炎)，Sjgren′s综合征，系统性结节性脉管炎，肉样瘤病，自身免疫性溶血性贫血(免疫性全细胞减少，阵发性睡眠性血红蛋白尿症)，自身免疫血小板减少症(特发性血小板减少性子癜，免疫-介导的血小板减少症)，甲状腺炎(格雷夫斯病(Grave′s disease)，桥本甲状腺炎，幼年淋巴细胞性甲状腺炎，萎缩性甲状腺炎)，自身免疫炎症性疾病(例如，过敏性脑脊髓炎，多发性硬化，胰岛素依赖型糖尿病，自身免疫性眼色素层视网膜炎，甲状腺毒症，硬皮病，系统性红斑狼疮，类风湿性关节炎，炎性肠道疾病(例如，克罗恩氏病，溃疡性结肠炎，局限性肠炎，远端回肠炎，肉芽肿性肠炎，节段性回肠炎，末端回肠炎)，自身免疫性甲状腺疾病，恶性贫血)，和同种异体移植排斥，糖尿病，免疫-介导的肾脏疾病(肾小球性肾炎，小管间质性肾炎)，中枢和外周神经系统的脱髓鞘疾病(如多发性硬化、特发性脱髓鞘多神经病或格林-巴利综合征和慢性炎症性脱髓鞘多神经病)，肝胆管疾病如传染性肝炎(甲、乙、丙、丁、戊型肝炎和其它非-嗜肝型病毒性肝炎)、自身免疫性慢性活动性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、肉芽肿性肝炎和致硬化性胆管炎，炎性肠道疾病(溃疡性结肠炎，克罗恩氏病)，谷蛋白-敏感性肠病，和惠普尔病，自身免疫或免疫-介导的皮肤疾病包括大泡性皮肤病，多形红斑和接触性皮炎，牛皮癣，过敏性疾病如哮喘、过敏性鼻炎、特应性皮炎、食物高敏症和荨麻疹，肺的免疫学性疾病如嗜酸细胞性肺炎、特发性肺纤维症和过敏性肺炎，移植术有关的疾病包括移植排斥和移植物抗宿主病。传染性疾病包括病毒性疾病如AIDS(HIV感染)，甲、乙、丙、丁和戊型肝炎，疱疹等，细菌感柒，真菌感染，原虫感染，寄生虫感染，和呼吸道合胞病毒体感染，人类免疫缺陷病毒感染等)，以及过敏性病症如过敏性高敏症、哮喘、过敏性鼻炎、特应性皮炎、春季结膜炎、湿疹、荨麻疹和食物变态反应等
″治疗″是旨在阻止病症发展或改变其病理学状况而进行的干预。因此，″治疗″既包括治疗性治疗也包括预防性措施，其目的在于防止、减缓(减轻)或改善所针对的病理状况或病症。需要治疗的病症包括已经患上的病症和将被预防的病症。在免疫相关疾病(例如，Th1-介导的和Th2-介导的病症)治疗中，治疗剂可以直接降低或增加病症中病理成分的反应幅度，或者使得疾病对于其它治疗剂(如抗生素、抗真菌剂、抗-炎剂、化疗剂等)的治疗更为敏感，。
术语″有效量″是指TCCR多肽、其激动剂和/或拮抗剂能够引发、诱导或导致T-细胞可检测水平的偏置分化为Th1亚型或Th2亚型和/或这些T-细胞亚型分泌的细胞因子释放特征的最小浓度。而″治疗有效量″，则是指TCCR多肽、其激动剂和/或拮抗剂对治疗Th1-介导的或Th2-介导的病症有效的最小浓度。
″慢性″给药，指与快速给药模式相反，将试剂以连续给药模式施用，以便在长时间内保持初始治疗效果(活性)。″间断″给药是指治疗不是没有间歇地连续进行，而是以周期性为特征。
免疫相关疾病的″病理学″包括有关患者健康的所有现象。其包括但不限于：异常或无法控制的细胞生长、抗体产生，自身抗体产生，补体产生和激活，干扰邻近细胞正常功能，细胞因子或其它分泌产物的异常水平释放，抑制或加剧任何炎症或免疫反应，炎性细胞(嗜中性粒细胞，嗜酸性粒细胞，单核细胞，淋巴细胞)向组织间隙浸润等。
意欲治疗的″哺乳动物″，是指归为哺乳动物的任何动物，包括人、家畜和农场动物，以及动物园里的动物、参与运动项目的动物或宠物如狗、马、猫、牛等。优选所述哺乳动物为人类。
与一个或多个其它治疗剂″联合″给药，包括同时给药和以任何顺序的联贯给药。
本文所用″载体″，包括在所用剂量和浓度下对细胞或哺乳动物无毒性的可药用载体、赋形剂、稳定剂。可药用载体常常是含水pH缓冲液。可药用载体的实例包括缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸；低分子量(小于10个残基)多肽；蛋白质，如白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷酰胺、天门冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂如EDTA；糖醇如甘露醇或山梨醇；成盐离子如钠；和/或非离子表面活性剂如TWEENTM、聚乙二醇(PEG)和PLURONICSTMTM。
本文所用术语“细胞毒性剂”，是指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语意在包括放射性同位素(例如I131、I125、Y90和Re186)，化疗剂，毒素如细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段。
本文所用″生长抑制剂″，是指抑制细胞生长的化合物或组合物，特别是抑制癌细胞过度表达本文鉴定的任一种基因，无论是在体内还是在体外。因此，细胞因子抑制剂是显著降低过度表达此基因的S期细胞百分比的化合物或组合物。生长抑制剂的实例包括阻断a细胞周期进程的试剂(在S期之外的环节)，譬如，诱导G1期和M-期停滞的试剂。传统的M-期阻断剂包括长春花碱(长春新碱和长春碱)、紫杉酚和拓扑酶II抑制剂如阿霉素、表阿霉素、柔红霉素、依托泊苷和博莱霉素。那些使G1期停滞的试剂也使S-期停滞，例如，DNA烷化剂如他莫昔芬、泼尼松、达卡巴嗪、氮芥、顺铂、氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶和阿糖胞嘧啶-C。进一步的信息可在下列文献中找到：TheMolecular Basis of Cancer，Mendelsohn和Israel，eds.，Chapter 1，entitled″Cellcycle regulation，oncogens，和antineoplastic drugs″by Murakami等(WBSaunders：Philadelphia，1995)，特别是第13页。
术语″细胞因子″是一般性术语，指由一个细胞群释放的对另一个细胞群起细胞间培养基作用的蛋白。这些细胞因子的实例是淋巴因子、单核因子和传统的多肽类激素。细胞因子包括生长激素，如人生长激素，N-甲二磺酰人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺素；甲状腺素；胰岛素；前胰岛素；松驰素；前松驰素；糖蛋白激素如卵泡刺激素(FSH)，甲状腺刺激素(TSH)，促黄体(生成)激素(LH)；肝细胞生长因子；成纤维细胞生长因子；催乳激素；胎盘催乳素；肿瘤坏死因子-α和β；缪氏抑制物质(mullerian-inhibitingsubstance)；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；苯丙酸诺龙；血管内皮细胞生长因子；整联蛋白；血小板生成素(TPO)；神经生长因子如NGF-β；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和-II；促红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子(osteoinductive factors)；干扰素如干扰素-α，-β，-γ；集落刺激因子(CSF)如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)；粒细胞-CSF(G-CSF)；白细胞介素(IL)如IL-1，IL-1α，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-11，IL-12；肿瘤坏死因子如TNF-α或TNF-β；和其它多肽因子包括LIF和kit配体(KL)。本文中术语细胞因子包括天然蛋白或来自重组细胞培养物的蛋白以及天然序列细胞因子的生物活性等效物。
本文使用的术语″TCCR多肽″、″TCCR蛋白″和″TCCR″，包括天然序列的TCCR和TCCR多肽变体(本文将对变体作进一步定义)。TCCR多肽可从各种来源如人组织或其它来源中分离出来，或者使用重组和/或合成方法制得。
″天然序列TCCR″，包括具有与得自自然环境的TCCR多肽具有相同氨基酸序列的多肽。此天然序列TCCR可以是从自然界分离得到的，或者是用重组和/或合成制得的。术语″天然序列TCCR″特别包括TCCR的天然-存在的截短型或分泌型(例如，细胞外结构域序列)，天然-存在的变体型(例如，或者剪切型)和天然-存在的等位基因变体。在本发明一实施方案中，天然序列人TCCR是包括图3(SEQ ID NO：1)中1-636氨基酸的成熟或全长天然序列TCCR。类似地，天然序列小鼠TCCR是包括图4(SEQ ID NO：2)中1-623氨基酸的成熟或全长天然序列TCCR。并且，尽管图3(SEQ ID NO：1)和4(SEQ ID NO：2)公开的TCCR多肽显示由本文定义为位置1的蛋氨酸残基开始，但是图3(SEQ ID NO：1)和4(SEQ ID NO：2)中氨基酸1位上游或下游的另一蛋氨酸残基作为TCCR多肽的起始氨基酸残基是可以想象到并且是可能的。
″TCCR多肽细胞外结构域″或称为″TCCR ECD″，是指TCCR多肽基本上不含跨膜和胞质结构域的一种形式。通常，TCCR多肽ECD具有小于约1％的此类跨膜和/或胞质结构域，优选具有小于约0.5％的此类结构域。应当懂得，所确定的本发明TCCR多肽的任何跨膜结构域(一个或多个)是依据本领域在鉴定疏水结构域类型中常规使用的标准而确定的。跨膜结构域的精确的边界会有不同但在最初确定的结构域的两末端之一最多不超过约5个氨基酸。因此，在本发明的一实施方案中，人TCCR多肽的细胞外结构域包括氨基酸1或约33至X1；其中X1是图3(SEQ ID NO：1)中从残基512到残基522的任何氨基酸残基。类似地，鼠TCCR多肽的细胞外结构域包括氨基酸1或约25至X2；其中X2是图4(SEQ ID NO：2)中从残基509到残基519的任何氨基酸残基。
″TCCR变体多肽″，指如下定义的与下列氨基酸残基序列具有至少约80％氨基酸序列同源性的活性TCCR多肽：(a1)图3(SEQ ID NO：1)所示人TCCR多肽的1或约33至636残基；(a2)图4(SEQ ID NO：2)所示鼠TCCR多肽的1或约25至623残基；(b1)图3(SEQ ID NO：1)所示人TCCR多肽的X3至636残基，其中X3是图3(SEQ ID NO：1)中27至37的任何氨基酸残基；(b2)图4(SEQ ID NO：2)所示鼠TCCR多肽的X4至623残基，其中X4是图4(SEQ ID NO：2)中207至30的任何氨基酸残基；(c1)1或约33至X1残基，其中X1是图3(SEQ ID NO：1)中512至522的任何氨基酸残基；(c2)1或约25至X2残基，其中X2是图4(SEQ ID NO：2)中509至519的任何氨基酸残基；(d1)X5至636残基，其中X5是图3(SEQ ID NO：1)中533至543的任何氨基酸残基；(d2)X6至623残基，其中X6是图4(SEQ ID NO：2)中527至537的任何氨基酸残基；(e)衍生自图3(SEQ ID NO：1)和图4(SEQ IDNO：2)所示氨基酸序列的另一特定片段。
此类TCCR变体多肽包括，例如，在衍生自图3(SEQ ID NO：1)和图4(SEQ ID NO：2)所示序列的N-和/或C-末端以及在一个或多个内结构域内增加或删减一个或多个氨基酸残基的TCCR多肽。通常，TCCR变体多肽与下列氨基酸残基序列：(a1)图3(SEQ ID NO：1)所示人TCCR多肽的1或约33至636残基；(a2)图4(SEQ ID NO：2)所示鼠TCCR多肽的1或约25至623残基；(b1)图3(SEQ ID NO：1)所示人TCCR多肽的X3至636残基，其中X3是图3(SEQ ID NO：1)中27至37的任何氨基酸残基；(b2)图4(SEQ IDNO：2)所示鼠TCCR多肽的X4至623残基，其中X4是图4(SEQ ID NO：2)中207至30的任何氨基酸残基；(c1)1或约33至X1残基，其中X1是图3(SEQID NO：1)中512至522的任何氨基酸残基；(c2)1或约25至X2残基，其中X2是图4(SEQ ID NO：2)中509至519的任何氨基酸残基；(d1)X5至636残基，其中X5是图3(SEQ ID NO：1)中533至543的任何氨基酸残基；(d2)X6至623残基，其中X6是图4(SEQ ID NO：2)中527至537的任何氨基酸残基；(e)衍生自图3(SEQ ID NO：1)和图4(SEQ ID NO：2)所示氨基酸序列的另一特定片段，具有至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％氨基酸序列同源性。
TCCR变体多肽的长度是至少约10个氨基酸，或更经常是至少约20个氨基酸、或者至少约30个氨基酸、或至少约40个氨基酸、或至少约50个氨基酸、或至少约60个氨基酸、或者至少约70个氨基酸、或至少约80个氨基酸、或至少约90个氨基酸、或至少约100个氨基酸、或者至少约150个氨基酸、或至少约200个氨基酸、或至少约250、或至少约300个氨基酸、或者至少约400个氨基酸、或至少约500个氨基酸、或至少约600个氨基酸或更多个氨基酸。
本文所说多肽序列″氨基酸序列同源性百分比(％)″，是指候选序列氨基酸残基与TCCR序列氨基酸残基相同的百分数，所述百分数是如下取得的：校准序列，如果必要，则插入间歇，以获取最大百分比的序列同源性，而不考虑序列同源性的任何保守取代。可使用本领域各种方法完成校准目的的氨基酸序列同源性百分比的测定，例如，使用公众可得到的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以决定测量校准的适宜参数，包括达到比较序列全长最大校准所需的任何算法。然而，为此目的，氨基酸序列同源性％值是使用下述序列对比计算机程序ALIGN-2而获得的，其中ALIGN-2程序的全部源序列码见表3(A-Q)。ALIGN-2序列对比计算机程序的作者是Genentech，Inc.，表3(A-Q)所示序列码和用户资料一起已经提交地处Washington D.C.，20559的美国版权局，其美国版权注册登记号为TXU510087。公众通过Genentech，Inc.，South San Francisco，California可以得到ALIGN-2程序，或者从表(A-Q)提供的序列码进行编制。ALIGN2程序应当为在UNIX操作系统，优选在数码UNIX V4.0D使用而进行编制。ALIGN-2程序设定了所有序列对比参数并且不变。
为了本发明目的，给定氨基酸序列A相对于给定氨基酸序列B的氨基酸序列同源性％(或者这样说：给定氨基酸序列A具有或含有给定氨基酸序列B相同氨基酸序列的％)如下计算：
                     X/Y比值乘以100
其中X是用序列校准程序ALIGN-2比较A和B氨基酸残基后计算出的相同氨基酸数量，其中Y是氨基酸残基B的总数量。可以理解，当氨基酸序列A与氨基酸序列B的长度不相等时，A与B氨基酸序列同源性％将不等于B与A氨基酸序列同源性％。作为计算氨基酸序列同源性％的一个实例，表2(A-B)说明如何计算指定氨基酸序列″对照蛋白质″与指定氨基酸序列″PRO″的氨基酸序列同源性％。
除非另外特别声明，否则本文所用所有氨基酸序列同源性％值是按照上述使用ALIGN-2序列对比计算机程序获得的。然而，氨基酸序列同源性％也可使用序列对比程序NCBI-BLAST2(Altschul等，Nucleic acids Res.25：3389-3402(1997))进行测定。NCBI-BLAST2序列对比程序可从http：//www.ncbi.nlm.nih.Gov下载，或否则从National Institute of Health，Bethesda，MD得到。NCBI-BLAST2使用数种检索参数，其中所有这些参数设定为默认值，包括例如，非掩蔽＝yes，股(strand)＝全部(all)，预期出现＝10，最低复杂长度＝15/5，多-程e-值＝0.01，多-程常数＝25，最终缺口校准的离开＝25，和评分矩阵＝BLOSUM62。
当使用NCBI-BLAST2进行氨基酸序列比较时，给定氨基酸序列A与给定氨基酸序列B的氨基酸序列同源性％(或者说，给定氨基酸序列A具有或含有给定氨基酸序列B相同氨基酸序列的％)如下计算：
X/Y比值乘以100
其中X是用序列校准程序NCBI-BLAST2比较A和B氨基酸残基后计算出的相同氨基酸数量，其中Y是氨基酸残基B的总数量。可以理解，当氨基酸序列A与氨基酸序列B的长度不相等时，A与B氨基酸序列同源性％将不等于B与A氨基酸序列同源性％。
本发明中术语“多肽”也包括前述氨基酸序列同源性比较中的多肽，不仅包括序列比较中相同的氨基酸残基，也包括具有相似特性的氨基酸残基。这些多肽被称为″阳性″。对一个感兴趣氨基酸残基评分得一个阳性分值的氨基酸残基，是那些与感兴趣氨基酸残基相同的氨基酸残基或者是感兴趣氨基酸的优选取代基(见下表I中定义)。为了本发明目的，给定氨基酸序列A相对于给定氨基酸序列B的氨基酸序列阳性值％(或者这样说：给定氨基酸序列A具有或含有给定氨基酸序列B相同氨基酸序列的阳性％)如下计算：
                    X/Y比值乘以100
其中X是用上述序列校准程序ALIGN-2比较A和B氨基酸残基后计得出的评分阳性氨基酸数量，和其中Y是氨基酸残基B的总数量。可以理解，当氨基酸序列A与氨基酸序列B的长度不相等时，A与B氨基酸序列阳性％将不等于B与A氨基酸序列阳性％。
“TCCR变体多肽”或“TCCR变体核酸序列”，是指编码下述定义的活性TCCR多肽并且与编码下列氨基酸残基序列的核酸序列具有至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％核酸序列同源性的核酸分子：(a1)图3(SEQ ID NO：1)所示人TCCR多肽的1或约33至636残基；(a2)图4(SEQ ID NO：2)所示鼠TCCR多肽的1或约25至623残基；(b1)图3(SEQ IDNO：1)所示人TCCR多肽的X3至636残基，其中X3是图3(SEQ ID NO：1)中27至37的任何氨基酸残基；(b2)图4(SEQ ID NO：2)所示鼠TCCR多肽的X4至623残基，其中X4是图4(SEQ ID NO：2)中207至30的任何氨基酸残基；(c1)1或约33至X1残基，其中X1是图3(SEQ ID NO：1)中512至522的任何氨基酸残基；(c2)1或约25至X2残基，其中X2是图4(SEQ ID NO：2)中509至519的任何氨基酸残基；(d1)X5至636残基，其中X5是图3(SEQID NO：1)中533至543的任何氨基酸残基；(d2)X6至623残基，其中X6是图4(SEQ ID NO：2)中527至537的任何氨基酸残基；(e)衍生自图3(SEQ IDNO：1)和图4(SEQ ID NO：2)所示氨基酸序列的另一特定片段。
一般地，TCCR变体多核苷酸的长度是至少约30个核苷酸，更经常是至少约60个核苷酸，或至少约90个核苷酸，或至少约120个核苷酸，或者至少约150个核苷酸，或至少约180个核苷酸，或至少约210个核苷酸，或至少约240个核苷酸，或者至少约270个核苷酸，或至少约300个核苷酸，或至少约450个核苷酸，或至少600个核苷酸，或至少900或更多个核苷酸。
本文所述有关TCCR多肽-编码核酸序列的″核酸序列同源性百分比(％)″，是指候选序列与发明的感兴趣多肽-编码核酸序列相比，具有相同核苷酸的百分数，所述百分数是如下得出的：通过校准序列，和如果必要则引入间歇，以达到最大序列同源性百分比。可使用本领域各种方法完成校准目的的核苷酸序列同源性百分比的测定，例如，使用公众可得到的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以决定测量校准的适宜参数，包括达到比较序列全长最大校准所需的任何算法。然而，为此目的，核苷酸序列同源性％值是使用下述序列对比计算机程序ALIGN-2而获得的，其中ALIGN-2程序的全部源序列码见表3(A-Q)。ALIGN-2序列对比计算机程序的作者是Genentech，Inc.，表3(A-Q)所示序列码和用户资料一起已经提交地处Washington D.C.，20559的美国版权局，其美国版权注册登记号为TXU510087。公众通过Genentech，Inc.，South San Francisco，California可以得到ALIGN-2程序，或者从表1提供的序列码进行编制。ALIGN2程序应当为在UNIX操作系统，优选在数码UNIX V4.0D使用而进行编制。ALIGN-2程序设定了所有序列对比参数并且不变。
为了本发明目的，给定核苷酸序列C相对于给定氨基酸序列D的核苷酸序列同源性％(或者这样说：给定核苷酸序列C具有或含有给定核苷酸序列D相同核苷酸序列的％)如下计算：
                      W/Z比值乘以100
其中W是用序列校准程序ALIGN-2比较C和D后计算出的相同核苷酸的数量，其中Z是氨基酸残基D的总数量。可以理解，当核苷酸序列C与核苷酸序列D的长度不相等时，C与D核苷酸序列同源性％将不等于D与C核苷酸序列同源性％。作为计算核苷酸序列同源性％的一个实例，表2(C-D)说明如何计算″对照DNA″与指定核苷酸序列″PRO-DNA″的核苷酸序列同源性％。
除非另外特别声明，否则本文所用所有核苷酸序列同源性％值是按照上述使用ALIGN-2序列对比计算机程序获得的。然而，核苷酸序列同源性％也可使用序列对比程序NCBI-BLAST2(Altschul等，Nucleic Acids Res.25：3389-3402(1997))进行测定。NCBI-BLAST2序列对比程序可从http：//www.ncbi.nlm.nih.Gov下载，或否则从National Institute of Health，Bethesda，MD得到。NCBI-BLAST2使用数种检索参数，其中所有这些参数设定为默认值，包括例如，非掩蔽＝yes，股(strand)＝全部(all)，预期出现＝10，最低复杂长度＝15/5，多-程e-值＝0.01，多-程常数＝25，最终缺口校准的离开＝25，和评分矩阵＝BLOSUM62。
当使用NCBI-BLAST2进行序列比较时，给定核苷酸序列C与给定核苷酸序列D的核苷酸序列同源性％(或者说，给定核苷酸序列C具有或含有给定核苷酸序列D相同核苷酸序列的％)如下计算：
                     W/Z比值乘以100
其中W是用序列校准程序NCBI-BLAST2比较C和D后计算出的相同核苷酸数量，其中Z是核苷酸D的总数量。可以理解，当核苷酸序列C与核苷酸序列D的长度不相等时，C与D核苷酸序列同源性％将不等于D与C核苷酸序列同源性％。
在另一实施方案中，TCCR变体多核苷酸是编码本发明活性多肽的核酸分子，它能够与编码全长本发明多肽的核苷酸序列杂交，优选在严格杂交和洗涤条件下杂交。本发明变体多肽包括由本发明变体多核苷酸编码的多肽。
在上述进行氨基酸序列同源性比较时使用的术语″阳性″，不仅包括序列比较中相同的氨基酸残基，也包括具有相似特性的氨基酸残基。对一个感兴趣氨基酸残基评分得一个阳性分值的氨基酸残基，是那些与感兴趣氨基酸残基相同的氨基酸残基或者是感兴趣氨基酸的优选取代基(见下表I中定义)。
为了本发明目的，给定氨基酸序列A相对于给定氨基酸序列B的氨基酸序列阳性值％(或者这样说：给定氨基酸序列A具有或含有给定氨基酸序列B相同氨基酸序列的阳性％)如下计算：
                    X/Y比值乘以100
其中X是用上述序列校准程序ALIGN-2比较A和B氨基酸残基后计得出的评分阳性氨基酸数量，其中Y是氨基酸残基B的总数量。可以理解，当氨基酸序列A与氨基酸序列B的长度不相等时，A与B氨基酸序列阳性％将不等于B与A氨基酸序列阳性％。
当用″分离的″来描述本文的各种多肽时，是指已从天然环境肽组分鉴定和分离和/或回收的多肽。优选地，分离的多肽与天然缔合的所有组分没有任何缔合。肽的天然环境中的污染成分是那些将干扰使用多肽进行诊断和治疗的物质，可包括酶、激素和其它蛋白性或非-蛋白性溶质。在优选的实施方案中，多肽被纯化为：(1)使用转杯式蛋白测序仪，达到足以获得N-末端或内部氨基酸序列至少15个残基的程度，或者(2)使用考马斯蓝或优选银染色，达到在非-还原或还原条件下SDS-PAGE电泳同质性的程度。分离的多肽包括在重组细胞内的原位多肽，因为TCCR自然环境中的至少一个组分是不存在的。然而，通常用至少一个纯化步骤来制备分离的多肽。
编码TCCR多肽的″分离的″核酸分子，是被鉴定的和从至少一个污染核酸分子中分离出来的核酸分子，天然来源的TCCR编码核酸通常与所述污染核酸分子缔合。优选地，分离的核酸与天然缔合的所有组分没有任何缔合。一分离的TCCR-编码核酸分子不是在自然界中发现的形式或按其设定的形式。因而，分离的核酸分子区别于TCCR-编码核酸分子，因为后者存在于天然细胞中。但是，分离的编码TCCR多肽的核酸分子，包括通常表达TCCR的细胞中所含的TCCR-编码核酸分子，例如，所述核酸分子与天然细胞所在的染色体位置不同。
术语″控制序列″，是指在特定宿主生物中表达可操作的连环编码序列所必要的DNA序列。适宜于原核生物的控制序列是例如包括启动子，任选地操纵基因序列，和核糖体结合位点。已知真核细胞是使用例如启动子、多腺苷酸化信号和增强子。
当置入核酸使与另一核酸序列功能性关联时，核酸是″可操作地连接″。例如，如果一个肽是作为参与多肽分泌的前蛋白而被表达的话，则把DNA前序列(presequence)或分泌性前导序列可操作性地连接于这个多肽的DNA；如果一编码序列影响序列的转录，则把启动子或增强子可操作地连于该编码序列；或者如果一编码序列所处位置是为了促进翻译，则把核糖体结合位点可操作地连于该编码序列。通常，″可操作地连接″是指连接的DNA序列是邻接的，和在分泌前导的情况下，是邻接的并且在阅读相。然而，增强子并非必须是邻接的。通过在适宜限制性酶切位点的连接反应完成连接。如果不存在这样的酶切位点，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸衔接子或连接子。
本文所用术语″抗体″是指最广义上的抗体，并特别包括例如单链抗-TCCR单克隆抗体(包括拮抗剂和中和抗体)、具有多表位特异性的抗-TCCR抗体组合物、单链抗-TCCR抗体和抗-TCCR抗体片段(见下述)。本文中术语″单克隆抗体″，是指来自基本上同质的抗体群的抗体，即除了可能少量存在的天然突变以外，该抗体群中的各个抗体均相同。
杂交反应的″严格″由本领域技术人员很容易地确定，通常根据经验在考虑探针长度、洗涤温度和盐浓度的基础上计算得出。一般而言，长的探针需要较高的温度以便适当的退火，而短的探针需要较低温度。在低于融合温度的环境中存在互补链时，杂交通常取决于变性DNA的重退火能力。期望探针和杂交序列之间同源程度越高，可使用的相对温度越高。结果是，相对温度较高将使反应条件趋于更加严格，而较低温度则相对较差。有关杂交反应的严格的其它细节和解释，见Ausubel等，Current Protocols in MolecularBiology，Wiley Interscience Publishers，(1995)。
本文的″严格条件″或″高度严格条件″，可以定义为：(1)使用低离子强度和高洗涤温度，例如，50℃ 0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠；(2)在杂交过程中使用变性剂如甲酰胺，譬如，42℃ 50％(v/v)甲酰胺和0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll /0.1％聚乙烯吡咯烷酮/pH 6.5 50mM磷酸钠与750mM氯化钠缓冲液，75mM柠檬酸钠；或者(3)使用42℃ 50％甲酰胺、5×SSC(0.75M NaCl，0.075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH6.8)、0.1％焦磷酸钠、5×Denhardt′s溶液、超声处理的鲑鱼精子DNA(50g/ml)、0.1％SDS和10％葡聚糖硫酸酯，于42℃在0.2×SSC(氯化钠/柠檬酸钠)中和在55℃ 50％甲酰胺中洗涤，接着于55℃用0.1×含EDTA SSC高度严格洗涤。
″中等严格条件″，可以按照Sambrook等，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，New York：Cold Spring Harbor Press，1989的描述来确定，包括使用前述洗涤溶液和较低严格杂交条件(例如，温度，离子强度和SDS％)1。中等严格条件的一个实例是，于37℃在如下组成的溶液中过夜孵育：20％甲酰胺，5×SSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸三钠)，50mM磷酸钠(pH7.6)，5×Denhardt′s溶液，10％葡聚糖硫酸酯和20mg/ml变性剪切鲑鱼精子DNA，接着于37-50℃在1×SSC中洗涤滤膜。本领域熟练技术人员懂得如何必要地调整温度、离子强度等条件以适应诸如探针长度等因素。
本文使用的术语″表位标记″，是指含有与″标记多肽″融合了的TCCR多肽的嵌合多肽。该标记多肽具有足够多的残基以为所制备抗体提供所针对的表位，而且要足够短以便它不干预与其融合的多肽的活性。标记多肽也优选确实是独一无二的，这样抗体与其它表位基本上不发生交叉反应。通常，适宜的多肽至少有6个氨基酸残基，一般为约8～50个氨基酸残基(优选约10～20个氨基酸残基)。
本文中″活性″是指保留天然或天然-存在TCCR多肽的生物学和/或免疫学活性形式的蛋白质，其中″生物学″活性指天然或天然-存在TCCR引起的生物学功能(抑制或兴奋)，而不是指诱导产生针对天然或天然-存在的本发明多肽所拥有表位的抗体的能力；类似地，″免疫学″活性则是指作为抗原在诱导产生针对天然或天然-存在的本发明多肽所拥有表位的抗体方面的能力。
本文中抗体或通过本文公开的筛选实验可以鉴定的其它分子(例如有机或无机小分子，肽等)的“生物活性”，是指这些分子诱导或抑制炎性细胞浸润进入组织的能力，刺激或抑制T-细胞增殖或活化的能力，以及刺激或抑制细胞释放细胞因子。另一优选的活性是增加增加或抑制血管通透性。最优选的活性是调节Th1/Th2反应(例如，降低Th1和/或升高Th2反应，降低Th2和/或升高Th1反应)。
术语″调节″，是指上调、下调或改变T-细胞分化成Th1和Th2亚群所引起的生理效应(例如，细胞因子释放特征)。细胞过程包括在此术语范围之内，包括但不限于：特定基因的转录；正常细胞功能，如代谢、增殖、分化、粘附、信号转导、细胞凋亡和存活，以及异常细胞过程如转化、阻断分化和转移。
本文中术语″拮抗剂″，使用其最广义含义，包括部分或完全阻断、抑制或中和本发明公开的天然序列TCCR多肽生物活性的任何分子。类似地，术语″激动剂″也使用其广义含义，包括模拟本文所述天然TCCR多肽生物活性的任何分子(例如，Th1/Th2细胞功能的下调)。以类似方式，术语″激动剂″也使用其最广义含义，包括摹拟、增强或刺激发明公开的天然序列TCCR多肽生物活性的任何分子。适宜的激动剂或拮抗剂分子特别包括：激动型或拮抗型抗体或抗体片段、本发明天然TCCR多肽的片段或氨基酸序列变体、肽、小的有机分子等。鉴定TCCR多肽的激动剂或拮抗剂的方法可包括：使TCCR多肽与候选激动剂或拮抗剂分子接触，并测定在正常情况下与TCCR多肽有关的一个或多个生物活性的可测得变化(例如，Th1/Th2细胞功能或效应的上调/下调)。
本文中″小分子″定义为分子量低于约500道尔顿的分子，并且通常是有机化合物。
″抗体″(Abs)和″免疫球蛋白″(Ig)是具有相同一般结构特征的糖蛋白。抗体显示出对特定抗原的结合特异性，而免疫球蛋白既包括抗体也包括其它缺乏抗原特异性的抗体-类分子。后一类多肽是例如，由淋巴系统少量产生而在骨髓瘤时含量大大增加。本文所用术语″抗体″是指最广义上的抗体，并特别包括例如单链抗-TCCR单克隆抗体(包括激动型抗体、拮抗型抗体和中和抗体)、具有多表位特异性的抗-TCCR抗体组合物、单链抗-TCCR抗体和抗-TCCR抗体片段(见下述)。本文中术语″单克隆抗体″，是指来自基本上同质的抗体群的抗体，即除了可能少量存在的天然突变以外，该抗体群中的各个抗体均相同。抗体可以结合于可接触到的本发明多肽的任何结构域。例如，抗体可结合于多肽的任何细胞外结构域，并且当分泌的是整个多肽时，则结合于多肽中抗体结合可利用的任何结构域。
“天然抗体”和“天然免疫球蛋白”是约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成，每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链还有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个不变区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对应，轻链的可变区与重链的可变区相对。据信特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。
术语“可变”是指可变区某些部分的序列在抗体之间有很大差异，它们可在各个抗体对其特定抗原的结合和特异性方面发挥作用。然而，该变异性不是均匀的分布于整个抗体的可变区。它集中于轻链和重链可变区中三个或四个称为“互补决定区”(CDR)或超变区的节段中。有至少两种技术可以测定CDR：(1)一种是基于交叉-物种的序列变异性(即，Kabat等，sequence ofProteins of immunological Interest(National Institute of Health，Bethesda，MD1987)；和(2)一种是基于抗原-抗体复合物的晶体照相术研究(Chothia，C.等，Nature 342：877(1989))。然而，鉴于两种技术描述不同的残基，故可以联合使用之以确定杂交的CDR。
可变区中保守性较高的区域称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变区各包括4个FR，主要采取β折叠构象，由形成环状连接的三个CDR相连接，而在某些情况下可形成部分β片层结构。每条链的CDR通过FR紧密的靠近在一起，并且与其它链的CDR一起形成抗体的抗原结合位点(见Kabat等，NIH Publ.No.91-3242，第I卷，第647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是表现出各种效应功能，例如参与抗体的抗体依赖性细胞毒性作用。
″抗体片段″包含完整抗体的一部分，优选是完整抗体的抗原结合或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；二价抗体；线形抗体(Zapata等，Protein Eng.8(10)：1057-1062[1995])；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异抗体。
木瓜蛋白酶消化抗体可产生两个相同的各带有单个抗原结合位点的抗原结合片段(称为“Fab”片段)和残余的“Fc”片段，Fc段的名称反应了其易于结晶的能力。经胃蛋白酶处理可产生具有两个抗原结合位点并仍然能交联抗原的F(ab’)2片段。
“Fv”是含有完整的抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。此区由紧密地非共价连接的一个重链可变区与一个轻链可变区的二聚体组成。在这个构象中每个可变区的三个CDR相互作用，在VH-VL二聚体表面限定一个抗原结合位点。这六个CDR共同赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变区(或Fv的一半仅含有三个抗原特异性CDR)也具有识别和结合抗原的能力，尽管与完整的结合位点相比其亲和力较低。
Fab段还包括轻链恒定区和重链的第一个恒定区(CH1)。Fab’与Fab的差别在于Fab’在重链CH1的羧基末端多出几个残基，包括抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab’-SH在本文中是指恒定区半胱氨酸残基中至少有一个游离巯基的Fab’。F(ab’)2抗体片段在最初产生为Fab’片段对，在它们之间具有铰链区半胱氨酸。抗体片段的其它化学偶联是众所周知的。
脊椎动物任何物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”，可依据其恒定区氨基酸序列而归为两种完全不同的两类(称为k和λ)中的一类。根据其重链恒定区的氨基酸序列，可将免疫球蛋白分为不同种类。主要有5类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些还可进一步分成“亚类”(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类抗体的重链恒定区，分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构象是众所周知的。
本文中术语“单克隆抗体”，是指来自基本上同质的抗体群的抗体，即除了可能少量存在的天然突变以外，该抗体群中的各个抗体均相同。单克隆抗体具有高度的特异性，针对单个抗原位点。而且，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制剂相反，每种单克隆抗体是针对抗原上的单个表位。除了其特异性之外，单克隆抗体的优点在于它们可被合成并不受其它抗体的污染。修饰词“单克隆”表明该抗体的特点，即其来自基本上同质的抗体群，不解释为需通过任何特殊方法产生该抗体。例如，根据本发明应用的单克隆抗体可通过由Kohler等(自然，256：495(1975))首先描述的杂交瘤法进行制备，或者可通过重组DNA法进行制备(例如见美国专利4816567)。“单克隆抗体”还可利用例如Clackson等(自然，352：624-628(1991))和Marks等(分子生物学杂志，222：581-597(1991))所述技术从噬菌体抗体文库中分离。也参见美国专利5750373、5571698、5403484和5223409，这些专利描述了利用噬菌粒和噬菌体载体来制备抗体。
本文中单克隆抗体特别包括“嵌合”抗体，其重链和/或轻链的一部分与源自特殊物种或属于特殊抗体种类或亚类的抗体的相应序列相同或同源，但所述链的剩余部分的序列与源自另一个物种或属于另一个抗体种类或亚类的抗体(以及此抗体的片段，只要它们显示所需的生物学活性)的相应序列相同或同源(美国专利4,816,567；和Morrison等，美国国家科学院院刊，81：6851-6855(1984))。
“人源化”型非人(例如小鼠)抗体是嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白或其每片段(如Fv、Fab、Fab’、F(ab)’或抗体的其它抗原结合序列)，它们包含最非人免疫球蛋白的最小序列。在很大程度上，人源化抗体是人免疫球蛋白(受者抗体)中受者互补决定区(CDR)残基被具有所需特异性、亲和力和性能的小鼠、大鼠、家兔或非人灵长类等非人源物种抗体(供体抗体)的CDR残基所取代。在一些实例中，人免疫球蛋白的框架区(FR)残基由相应的非人类残基所取代。而且，人源化抗体可包括在受者抗体或供体CDR或框架序列中不存在的残基。这些修饰旨在进一步改善和最大化抗体的性能。通常，人源化抗体基本上包括至少一个(通常包括两个)可变区的全部，其中CDR的全部或基本上全部对应于非人免疫球蛋白的相应部分，而FR序列的全部或基本上全部是人免疫球蛋白序列。人源化抗体还任选包括免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常为人免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。详见Jones等，自然，321：522-525(1986)；Riechmann等，自然332：323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。任选地，人源化抗体也包括“灵长类化”抗体，所述抗体的抗原结合区可从用感兴趣抗原免疫接种猕猴制得的抗体中衍生获得。抗体包括例如美国专利5658570、5693780、5681722、5750105和5756096中所述的源自非人灵长类动物(如Old World Monkey，Ape等)的残基。
本发明抗体及其片段也包括″亲和力成熟的″抗体，在所述抗体中，氨基酸序列一个或多个CDR区和/或构架区被改变，以改变抗体或其片段对所要结合的抗原的亲和力。亲和力成熟可导致成熟抗体相对于起始抗体而言对抗原的亲合力增加或降低。通常，起始抗体是人源化抗体、人抗体、嵌合抗体或鼠抗体，而亲和力成熟抗体较起始抗体具有更高亲和力。使用任何标准方法，在成熟过程中，将CDR或框架区一个或多个氨基酸残基改换为不同残基。适宜方法包括，使用众所周知的盒式诱变法进行点突变(Wells等，1985，Gene 34：315)或寡核苷酸介导的致突变法(Zoller等，1987，nucleic acids Res.，10：6487-6504)。使用已知选择方法也可进行亲和力成熟，在所述方法中，产生许多突变，基于对抗原或配体亲和力的改善而从突变体池或文库中选择出具有所需亲和力的突变体。已知的噬菌体展示技术可被很方便地用于此选择方法中。参见例如，美国专利5750373、5223409等。
人抗体也包括在本发明的抗体之内。使用本领域已知的各种技术可以制备人抗体，所述技术包括噬菌体展示文库技术[Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.，227：381(1991)；Marks等，J.MoL Biol，222：581(1991)]。也可使用Cole等和Boemer等描述的用于制备人单克隆抗体的技术[Cole等，Monocloiaal antibody and Cancer Therapy，Alan R.Liss，第77页(1985)；Boerner et aL，J.Immunol.，147 1：86-95(1991)；U.S.5,750,373]。同样地，通过把人免疫球蛋白基因座引入转基因动物，可以制备人抗体，所述转基因动物例如鼠，鼠的内源性免疫球蛋白基因已被部分或完全失活。攻击鼠后，观察到人抗体产生，所产生的抗体在各个方面均与在人观察到的极为相似，包括基因重排、装配和抗体所有组成部分。这方面的进展参见例如，美国专利5545807、5545806、5569825、5625126、5633425、5661016，和下述科学出版物：Marks等，Biol Technology 10：779-783(1992)；Lonberg等，Nature 368：856-859(1994)；Morrison，Nature 368：812-13(1994)；Fishwild等，NatureBiotechnology 14：845-51(1996)；Neuberger，Nature Biotechnology 14：826(1996)；Lonberg和Huszar，Intern.Rev.Immunol.13：65-93(1995)。
单链Fv”或“scFv”抗体片段，包括抗体的VH和VL结构域，这些结构域存在于单个多肽链上。优选Fv多肽在VH和VL结构域之间还包含一个多肽接头，它能使sFv形成抗原结合所需的结构。关于scFv的综述见Pluckthun在《单克隆抗体的药理学》，第113卷，Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag，New York，第269-315页(1994)。
术语“二价抗体”是指具有两个抗原结合位点的小分子抗体片段，这些片段在一条多肽链(VH-VL)上含有相连的一个重链可变区(VH)和一个轻链可变区(VL)。利用一种非常短的接头，其使得同一条链上的两个结构域无法配对，不得不与另一条链上的互补结构域配对，从而形成两个抗原结合位点。在EP 404097；WO93/11161；和Hollinger等，美国国家科学院院刊，90：6444-6448(1993)中有对二价抗体的更详细描述。
“分离的”抗体是已从其天然环境的组成中鉴定、分离和/或回收的抗体。其天然环境的污染成分是干扰抗体的诊断或治疗应用的物质，可包括酶、激素本文所用术语″免疫粘附″，是指结合特异性异源蛋白质(″粘附素″)与效应物功能的免疫球蛋白的恒定区结合的抗体-样分子。在结构上，免疫粘附包括：具有期望结合特异性的氨基酸序列(不是抗原识别位点和抗体结合位点)(即，是″异源的″)和免疫球蛋白的恒定区序列相融合。免疫粘附分子的粘附部分通常是包括受体或配体至少一个结合位点的邻接的氨基酸序列。免疫粘附中的免疫球蛋白恒定区序列，可以得自任何免疫球蛋白，如IgG-1、IgG-2、IgG-3或IgG-4亚型、IgA(包括IgA-1和IgA-2)、IgE、IgD或IgM。和其它蛋白性或非蛋白性溶质。在优选的实施方案中，该抗体的纯度应达到：(1)经Lowery法确定的抗体重量的95％以上，最优选所述重量的99％以上，(2)足以获得用旋转杯状(spinning cup)序列分析仪所测至少15个残基的N端或内部氨基酸序列，(3)通过还原或非还原条件下的SDS-PAGE以及考马斯亮蓝染色、优选银染色所证实的同质性。分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体，因为该抗体的自然环境中的至少一种组分已不存在。一般情况下分离的抗体可通过至少一个纯化步骤来制备。
本文中所用″标记″一词，是指直接或间接地与抗体偶联从而产生″标记″抗体的可检测化合物或组分。标记可以是其本身可被测得(例如放射性同位素标记或荧光标记)，或者如果是酶标记时，可以是可测得的催化底物化合物或组分发生的化学变化。
“固相”是指本发明抗体可粘附的非水性基质。本文中固相的实例包括部分或全部由玻璃(如控制孔径的玻璃)、多糖(如琼脂糖)、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇和硅氧烷制成的那些固相。在某些实例中，根据上下文的内容，固相可包括测试板的孔；在其它的例子中，它可以是纯化柱(如亲和层析柱)。该术语也包括美国专利4275149中公开的分散颗粒的不连续固相。
“脂质体”是由能向哺乳动物有效运送药物(如本文公开的抗TCCR抗体，和任选地化疗剂)的各类脂质、磷脂和/或表面活性剂组成的小分子囊泡。脂质体的组分通常排列为双层形式，与生物膜的脂质排列相似。
本文所用术语″免疫粘附″，是指结合特异性异源蛋白质(″粘附素″)与效应物功能的免疫球蛋白的恒定区结合的抗体-样分子。在结构上，免疫粘附包括：具有期望结合特异性的氨基酸序列(不是抗原识别位点和抗体结合位点)(即，是″异源的″)和免疫球蛋白的恒定区序列相融合。免疫粘附分子的粘附部分通常是包括受体或配体至少一个结合位点的邻接的氨基酸序列。免疫粘附中的免疫球蛋白恒定区序列，可以得自任何免疫球蛋白，如IgG-1、IgG-2、IgG-3或IgG-4亚型、IgA(包括IgA-1和IgA-2)、IgE、IgD或IgM。
II本发明的组合物和方法
A.全长TCCR多肽
本发明提供使用TCCR多肽治疗免疫相关病症的新方法，包括调节T-细胞分化成Th1和Th2亚型以及治疗通过Th1和Th2亚型而推断的宿主病症。更具体而言，已经鉴定、分离出编码TCCR多肽的cDNA，其在治疗Th1-介导的和Th2-介导的病症方面的应用将在下面作更详细的描述。需要指出的是，TCCR既指天然序列分子也指定义部分提到的变体，而术语hTCCR和mTCCR分别指图3(SEQ ID NO：1)和4(SEQ ID NO：2)所示单一的天然序列多肽。为了简明起见，在本说明书中将DNA41419(hTCCR)和/或DNA120632(mTCCR)编码的蛋白质以及前述定义的TCCR的所有其它天然同系物和变体均称为″TCCR″，而不论其起源或制备模式如何。
使用常规技术，可以从核苷酸序列预测出由DNA41419(hTCCR，SEQID NO：1)和DNA 120632(mTCCR，SEQ ID NO：2)编码的蛋白质的氨基酸序列。对于本文所述TCCR多肽及其编码核酸，申请人已经确定此时在阅读框上什么是与可利用序列信息最一致的。
使用上述ALIGN-2序列校准计算机程序，业已发现：全长天然hTCCR序列(图3，SEQ ID NO：1)和mTCCR序列(图4，SEQ ID NO：2)与登记号为475327和7710109的Dayhoff(GenBank)序列具有一定程度的序列同源性。
B.TCCR变体
除了本文描述的全长天然序列的TCCR多肽外，还可以制备TCCR变体。通过在TCCR DNA中引入适当的核苷酸改变，和/或通过合成所期望的TCCR多肽，可以制得TCCR变体。本领域技术人员懂得，氨基酸变化将会改变TCCR的翻译后过程，例如改变糖基化位点的数量和位置或者改变膜固定(anchoring)特性。
使用例如在美国专利5364934号中阐述的保守和非-保守突变的任一技术和指导路线，可以在天然全长序列TCCR或者在本文所述TCCR的各种结构域中制造变化。变化可以是取代、缺失或插入编码TCCR的一个或多个密码子，从而导致相对于天然序列TCCR的TCCR氨基酸序列变化。任选地，变化是TCCR一个或多个结构域中的至少一个氨基酸被任何其它氨基酸取代。将TCCR序列与同种已知蛋白质分子进行比较，并使高度同源区氨基酸序列数量变化最小，可以建立决定那个氨基酸残基可以被插入、取代或缺失而对所需活性无负面影响的指导原则。氨基酸取代可以是一个氨基酸被另一类似结构和/或类似化学特性氨基酸代替的结果，如丝氨酸置换亮氨酸，即保守氨基酸置换。插入或缺失可任选地在约1～5个氨基酸的范围。通过系统地在氨基酸序列中进行插入、缺失或取代并检测所产生变体显示全长或成熟天然序列活性的情况，可以决定允许的变化。
本发明也包括TCCR多肽片段。该类片段可以是，例如，与全长天然蛋白质相比，在N-末端或C-末端截短的或者是缺乏内部残基的片段。某些片段缺乏那些对于TCCR多肽期望生物活性而言非必要的氨基酸残基。
TCCR片段可以按照大量常规技术中的任何一个来制备。可以化学合成期望的肽片段。另一途径涉及用酶消化来产生TCCR片段，例如，用已知在特定氨基酸残基限定的位点裂解蛋白质的酶处理蛋白质，或用适宜的限制性内切酶消化DNA并分离所需片段。还有一适宜的技术，包括分离并用聚合酶链反应(PCR)扩增编码所需多肽片段的DNA片段。将限定DNA片段所需末端的寡核苷酸用于PCR引物的5′和3′端。优选地，多肽片段与图3(SEQID NO：1)和(图4，SEQ ID NO：2)所示TCCR多肽的至少一种生物学和/或免疫学活性相同。
在特定实施方案中，有关的保守取代冠以优选取代的名称示于下表I中。如果取代导致生物活性变化，进而引起更多实质性变化，在表I中命名为示范性取代或者如在下面将要详述的那样是指引入的氨基酸种类，则引入这些取代并筛选产物。
                        表6
原始残基          示范性取代             优选取代
Ala(A)            val；leu；ile             val
Arg(R)            lys；gln；asn             lys
Asn(N)            gln；his；lys；arg        gln
Asp(D)            glu                       glu
Cys(C)            ser                       ser
Gln(Q)            asn                       asn
Glu(E)            asp                       asp
Gly(G)            pro；ala                  ala
His(H)            asn；gln；lys；arg        arg
Ile(I)            leu；val；met；ala；phe；
                  正亮氨酸                  leu
Leu(L)            正亮氨酸；ile；val；
                  met；ala；phe             ile
Lys(K)            arg；gln；asn             arg
Met(M)            leu；phe；ile             leu
Phe(F)            leu；val；ile；ala；tyr   leu
Pro(P)            ala                       ala
Ser(S)            thr                       thr
Thr(T)            ser                       ser
Trp(W)            tyr；phe                  tyr
Tyr(Y)            trp；phe；thr；ser        phe
Val(V)            ile；leu；met；phe；
                  ala；正亮氨酸             leu
通过选择对于维持(a)取代区域多肽骨架结构，例如，片层或螺旋构象，(b)靶位点处分子的电荷或疏水性，或(c)侧链大小具有显著不同影响的取代基，来实现对本发明多肽功能或免疫学同一性的实质性修饰。基于普通侧链的特性，将天然存在的残基分成以下几组：
(1)疏水性：正亮氨酸，met，ala，val，leu，ile；
(2)中性亲水性：cys，ser，thr；
(3)酸性：asp，glu；
(4)碱性：asn，gln，his，lys，arg；
(5)影响链取向的残基：gly，pro；和
(6)芳香族：trp，tyr，phe.
非-保守取代使得一类氨基酸与其它类之间一定数量的氨基酸交换成为必要。也可将取代的残基引入到保守取代位点，或者更优选地引入其余(非-保守)位点。
可以使用本领域已知方法如寡核苷酸-介导的(定点)诱变、丙氨酸扫描和PCR诱变技术来产生变异。可以对克隆的DNA进行定点诱变[Carter等，Nucl.Acids Res.，13：4331(1986)；Zoller等，Nucl.Acids Res.，10：6487(1987)]、盒式诱变[Wells等，Gene，34：315(1985)]、限制选择诱变[Wells等，Philos.转.R.Soc.London SerA，317：415(1986)]或其它已知技术以产生TCCR变体DNA。
扫描氨基酸分析也可用于确定沿着邻接序列的一个或多个氨基酸。优选的扫描氨基酸是相对小的中性氨基酸。此类氨基酸包括丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸和半胱氨酸。通常，丙氨酸是此组中优选的扫描氨基酸，因为它不存在β-碳上的侧链并且极少改变变体的主链构象[Cunningham和Wells，Science，244：1081-1085(1989)]。优选丙氨酸的另一原因是因为它是最常用氨基酸。而且，它常常既出现在埋藏位置也出现在暴露位置[Creighton，TheProteins，(W.H.Freeman & Co.，N.Y.)；Chothia，J.Mol.Biol.，150：1(1976)]。如果丙氨酸取代不能产生足够量的变体，则可使用isoteric氨基酸。
C.TCCR的修饰
本发明包括TCCR的共价修饰。一种共价修饰包括使TCCR多肽的靶氨基酸残基与能够同TCCR的选定侧链或N-或C-末端残基发生反应的有机衍生化剂进行反应。具有双官能剂的衍生化是非常有用的，例如，TCCR与纯化抗-TCCR抗体方法中所用水溶性载体基质或表面交联，反之亦然。通常使用的交联剂包括例如，1，1-双(二偶氮乙酰基)-2-苯乙烷，戊二醛，N-羟琥珀酰亚胺酯如与4-叠氮基水杨酸的酯，高双官能亚胺基酯，包括二琥珀酰亚胺酯如3，3′-连二硫酸双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)、双官能马来酰亚胺酯如双-N-马来酰亚胺-1，8-辛酯和化学试剂如甲基-3-[(对-叠氮苯基)二硫]丙炔亚胺酯。
其它修饰包括，谷酰胺和天门冬酰残基脱酰胺分别成为相应的谷氨酰和门冬氨酰残基，脯氨酸和赖氨酸羟基化，丝氨酰或苏氨酰残基的羟基磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基甲基化[T.E.Creighton，Proteins：Structure and Molecular Properties，W.H.Freeman & Co.，San Francisco，pp.79-86(1983)]，胺的N-末端乙酰化，和任何C-末端羧基的酰胺化。
本发明还包括TCCR多肽的另一类共价修饰，所述共价修饰包括改变多肽的天然糖基化模式。″改变天然糖基化模式″，在这里的目的是为了删除天然序列多肽中一个或多个碳水化合物部分(或者通过除去发生糖基化的位点或者通过利用化学和/或酶手段而删除糖基化)，和/或在天然序列多肽中加入一个或多个本不存在的糖基化位点。此外，该短语包括天然蛋白质糖基化的性质变化，涉及不同碳水化合物部分在性质和比例上的变化。
改变氨基酸序列可以实现在多肽中加入糖基化位点。此改变可以例如，通过向天然序列多肽(为了O-连接的糖基化位点)中加入、或者用一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基取代而完成。任选地，可以通过DNA水平的变化，特别是通过使编码多肽的DNA中预先选定的碱基发生突变从而产生将会翻译成期望氨基酸的密码子，来改变多肽的氨基酸序列。
在本发明多肽上增加碳水化合物部分数目的另一方法是，将配糖体化学性或酶性地与多肽偶联。现有技术有此类方法的描述，例如1987年9月11日公布的WO 87/05330，以及Aplin和Wriston，CRC Crit.Rev.Biochem.第259-306页(1981)。
用化学或酶方法，或者通过突变性取代编码作为糖基化靶点的氨基酸残基的密码子，来实现去除本发明多肽中的碳水化合物部分。化学性去糖基化技术为本领域所公知，并描述在例如下述文献中：Hakimuddin等，Arch.Biochem.Biophys.，259：52(1987)和Edge等，Anal.Biochem.，118：131(1981)。使用Thotakura等在Meth.Enzvmol.，138：350(1987)中描述的各种内-和外-糖苷酶，可以完成多肽中碳水化合物部分的酶裂解。
本发明多肽的另一类共价修饰，包括以美国专利4640835、4496689、4301144、4670417、4791192或4179337中所述方式，将本发明多肽连接于各种非蛋白类聚合物之一，例如聚乙二醇(PEG)、聚丙烯二醇或聚氧化亚烷基。
本发明TCCR多肽也可被修饰成嵌合分子，包括将TCCR与另一、异源多肽或氨基酸序列融合。
在一实施方案中，此类嵌合分子含有TCCR与标记多肽的融合体，其中的标记多肽具有抗-标记抗体选择性结合的表位。表位标记一般位于TCCR的氨基-或羧基-末端。使用抗标记多肽抗体，可以检测到此类表位-标记形式的本发明多肽的存在。另外，表位标记措施，使得利用抗-标记抗体或另一类与表位标记结合的亲和基质来亲和纯化本发明多肽变得非常容易。各种标记多肽及其各自的抗体是本领域众所周知的。实例包括聚-组氨酸(poly-his)或聚-组氨酸-甘氨酸(poly-his-gly)标记；flu HA标记多肽及其抗体12CA5[Field等，Mol.Cell.Biol.，8：2159-2165(1988)]；c-myc标记和它的8F9、3C7、6E10、G4、B7及9E10抗体[Evan等，Molecular and Cellular Biology，5：3610-3616(1985)]；和单纯疱疹病毒糖蛋白质D(gD)标记及其抗体[Paborsky等，Protein Engineering，3(6)：547-553(1990)]。其它标记多肽包括Flag-肽[Hopp等，BioTechnology，6：12041210(1988)]；KT3表位肽[Martin等，Science，255：192-194(1992)]；α-微管蛋白表位肽[Skinner等，J.Biol.Chem.，266：15163-15166(1991)]；和T7基因10蛋白质肽标记[Lutz-Freyermuth等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：6393-6397(1990)]。
在另一实施方案中，嵌合分子可包括本发明多肽与免疫球蛋白或免疫球蛋白特定区域的融合。对于二价形式的嵌合分子(也指″免疫粘附″)，融合可以是与IgG分子Fc区的融合。Ig融合优选包括溶解形式(跨膜结构域缺失或失活)的本发明多肽取代Ig分子内至少一个可变区。在一特别优选的实施方案中，免疫球蛋白融合包括IgG1分子的铰链区、CH2和CH3区，或铰链区、CH1、CH2和CH3区。为制备免疫球蛋白融合体，也参见1995年6月27日发布的美国专利5428130。
D.制备TCCR
下面的描述主要涉及通过培养转化或转染了含TCCR核酸的载体的细胞来制备TCCR。因此，当然考虑到本领域熟知的供选择方法可用于制备TCCR。譬如，通过利用固相合成技术的直接合成肽的方法来制备TCCR序列或其一部分[参见例如，Stewart等，Solid-Phase Peptide Synthesis，W.H.Freeman Co.，San Francisco，CA(1969)；Merrifield，J.Am.Chem.Soc.，，85：2149-2154(1963)]。使用手工或自动操作技术，进行蛋白质体外合成。例如，按照制造商的指示，使用实用生物系统肽合成仪(Foster City，CA)，可以完成自动合成。可以分别化学合成TCCR的各部分，然后利用化学或酶学方法制得全长TCCR。
1.编码本发明多肽DNA的分离
可以从cDNA文库获得编码TCCR的DNA，所述cDNA文库是从据信具有TCCR mRNA并且以可测得水平表达TCCR的组织制备的。因此，如实施例中所描述的那样，从人组织制备的cDNA文库中可以很方便地得到人的TCCR DNA。也可以从基因组文库或者通过已知合成方法(例如自动核酸合成)获得TCCR-编码基因。
使用为识别感兴趣基因或其编码的蛋白质而设计的探针(如本发明抗体或至少约20-80个碱基的寡核苷酸)，可以筛选文库。使用标准操作，如Sambrook等在Molecular Cloning：A Laboratory Manual(New York：ColdSpring Harbor Laboratory，1989出版)中所描述的方法，用选择的探针进行cDNA或基因组文库的筛选。分离本发明多肽的编码基因的另一个可选用方法，是使用PCR方法[Sambrook等，出处同上；Dieffenbach等，PCR Primer：A Laboratorv Manual(Cold Spring Harbor Laboratory，1995出版)]。
下述实施例描述cDNA文库筛选技术。选作探针的寡核苷酸序列应当具有足够的长度并且足够清晰，以便使假阳性出现机率最小。寡核苷酸优选是标记的，这样通过与正在筛选的文库中的DNA杂交而可被检测到。标记方法为本领域所公知，包括使用放射性标记物如32P-标记的ATP、生物素或酶标记。包括中等严格和高度严格的杂交条件，见Sambrook等 出处同上中所述。
可将在筛选文库方法中鉴定的序列与其它已知的保藏序列或公共数据库如GenBank或其它私有序列数据库中的序列进行比较和校准。使用本领域已知的和本文描述的方法，可以测定分子限定区域或全长序列的序列同源性(无论在氨基酸水平还是在核苷酸水平)。
使用本文首次公开的推定氨基酸序列，可以通过筛选选定的cDNA或基因组文库获得具有蛋白质编码序列的核酸，和如果必要，使用Sambrook等在 出处同上中描述的常规引物延伸程序，以检测没有逆转录为cDNA的mRNA。
2.宿主细胞的选择和转化
用生产本文所述TCCR的表达或克隆载体转染或转化宿主细胞，并在改良的常规营养培养基中培养宿主细胞，所述改良是为了适宜于诱导增强子、选择转化体或扩增编码期望序列的基因。无需繁琐的试验，本领域熟练技术人员就可以选择培养条件如培养基、温度、pH等。通常，使细胞培养物产量最大化的原则、方案和实用技术见于Mammalian Cell Biotechnology：a Practical Approach，M.Butler编著(IRL出版，1991)和Sambrook等 出处同 上。
转染真核细胞和转化原核细胞的方法为本领域熟练技术人员所已知，例如，CaCl2、CaPO4、脂质体-介导的方法和电穿孔法。取决于使用的宿主细胞，使用适合于该宿主细胞的标准技术进行转化。如Sambrook等在 出处同 上中所述，钙处理使用氯化钙，或电穿孔法一般用于原核生物或其它含有大量细胞壁屏障的细胞。如Shaw等在Gene，23：315(1983)和1989年6月29日公布的WO 89/05859中描述的那样，植物肥大病菌属感染用于转化某些植物细胞。对于没有细胞壁的哺乳动物来说，可以使用Graham和van derEb在Virology，52：456-457(1978)中所述的磷酸钙沉淀法。哺乳动物细胞宿主系统转化的总的情况在美国专利4399216中已有描述。根据Van Solingen等，J.Bact.，130：946(1977)和Hsiao等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，76：3829(1979)所述方法，通常可以完成向酵母的转化。然而，也可使用将DNA引入细胞的其它方法，例如通过核显微注射、电穿孔、与完整细胞的细菌原生质体融合，或者聚阳离子如聚凝胺、聚鸟氨酸。转化哺乳动物细胞的各种方法见Keown等，Methods in Enzymology，185：527-537(1990)和Mansour等，Nature，336：348-352(1988)。
克隆或表达本文所述载体中DNA的适宜宿主细胞，包括原核生物、酵母或高等真核细胞。适宜的原核生物包括但不限于革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌等真细菌，譬如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)如大肠杆菌。各种大肠杆菌株均是公众可以得到的，如大肠杆菌K12株MM294(ATCC 31446)；大肠杆菌X1776(ATCC 31537)；大肠杆菌株W3110(ATCC 27325)和K5 772(ATCC 53635)。其它适宜的原核宿主细胞包括肠杆菌科如埃希氏杆菌属，例如，大肠杆菌，肠杆菌属，欧文菌属，克雷白菌属，变形菌杆属，沙门菌属(如鼠伤寒沙门菌)，沙雷菌属(如粘质沙雷菌)和志贺菌属等，以及芽孢杆菌属如枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌(例如1989年4月12日出版的DD 266710中所述地衣芽孢杆菌41P)等，假单胞菌属的铜绿菌假单胞菌，及链霉菌。这些实例是用于说明而并非限制于此。W3110株是一个特别优选的宿主或母宿主，因为它是重组DNA产生发酵的一常用宿主株。优选地，宿主细胞分泌少量蛋白水解酶。例如，修饰W3110株以使编码宿主内源性蛋白质的基因发生遗传突变，此类宿主的实例包括大肠杆菌W3110株1 A2，该株具有完整基因型tonA；大肠杆菌W3110株9E4，该株具有完整基因型tonAptr3；大肠杆菌W3110株27C7(ATCC 55244)，该株具有完整基因型tonA ptr3 phoAE15(argF-lac)169 degP ompT kanr；大肠杆菌W3110株37D6，该株具有完整基因型tonA ptr3 phoA E15(argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG kant；大肠杆菌W3110株40B4，它是37D6发生非-卡那霉素耐药degP缺失突变的株；和具有1990年8月7日发布的美国专利4946783中披露的具有突变周质蛋白水解酶的大肠杆菌株。或者，克隆的体外方法，例如PCR或其它核酸聚合酶链反应，是适宜的。
除了原核生物，真核微生物如丝状真菌或酵母也是适于使编码TCCR的载体克隆或表达的宿主。酿酒酵母，或常用的面包酵母，在低等真核宿主微生物中最为常用。其它真核微生物包括：粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)(Beach和Nurse，Nature，290：140[1981]；1985年5月2日公布的EP 139383)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)宿主(美国专利4943529；Fleer等，Bio/Technologv，9：968-975(1991))，例如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)(MW98-8C，CBS683，CBS4574；Louvencourt等，J.Bacteriol.，154(2)：737-742[1983])、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC 12424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16045)、威克曼氏克鲁维酵母(K.wickeramll)(ATCC 24178)、K.waltii(ATCC 56500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36906；Van den Berg等，Bio/Technology，8：135(1990))、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)和克鲁维氏酵母属(K.marxianus)等；yarrowia(EP402226)；巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)(EP 183070；Sreekrishna等，J.BasicMicrobiol.，28：265-278[1988])；念珠菌属；Trichoderma reesia(EP 244234)；粗糙链孢霉(Case等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76：5259-5263[1979])；许旺氏酵母属(schwanniomyces)如西方许旺氏酵母(schwanniomyces occidentalis)(1990年10月31日公布的EP 394538)等；和丝状真菌，例如链孢霉属、青霉属、Tolypocladium(1991年1月10日公布的WO 91/00357)以及曲霉属宿主如构巢曲霉(Ballance等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，112：284289[1983]；Tilburn等，Gene，26：205-221[1983]；Yelton等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：1470-1474[1984])和黑曲霉等(Kelly和Hynes，EMBO J.，4：475-479[1985])。在本文中Methylotropic酵母是适宜的，包括但不限于选自下述属的能够在甲醇中生长的酵母：汉逊氏酵母属(Hansenula)，念珠菌属(Candida)，克勒克酵母属(Kloeckera)，毕赤酵母属(Pichia)，酵母属，球拟酵母属和红酵母属。此类酵母的例证性特定酵母属的清单见C.Anthony，TheBiochemistrv of Methylotrophs，269(1982)。
用于表达糖基化TCCR多肽的适合宿主细胞来自多细胞生物。无脊椎动物细胞的实例包括昆虫细胞(例如果蝇属S2和Spodoptera Sf9)和植物细胞。有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和COS细胞。更特异的实例包括转化了SV40(COS-7，ATCC CRL 1651)的猴肾CV1细胞系；人胚肾细胞系(293细胞或亚克隆培养成在悬浮培养液中生长的293细胞，Graham等，J.Gen Virol.36：59(1977))；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub和Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：4216(1980))；鼠赛尔托利细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.，23：243-251(1980))；人肺细胞(W138，ATCCCCL 75)；人肝脏细胞(Hep G2，HB 8065)；和鼠乳腺癌细胞(MMT 060562，ATCC CCL51)。选择合适宿主细胞是本领域常识。
3.复制型载体的选择和应用
编码TCCR的核酸(例如cDNA或基因组DNA)可被插入到复制型载体中以进行克隆(DNA扩增)或表达。各种载体是可以公开得到的。载体可以是例如质粒、粘粒、病毒颗粒或噬菌体的形式。使用各种方法可将合适的核酸序列插入载体。通常，利用本领域已知技术将DNA插入到合适的限制性核酸内切酶位点。载体组成部分一般包括但不限于：一个或多个信号序列、复制起点、一个或多个标志基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。使用本领域熟练技术人员熟知的标准连接技术，构建包括这些组成部分中一个或多个元件的适宜载体。
TCCR不仅可直接重组制备，而且还可制备成与异源多肽的融合多肽，所述异源多肽为信号序列或在成熟蛋白或多肽的N末端上具有特异性裂解位点的其它多肽。通常，信号序列是载体的一个组分或者是被插入载体的TCCR-编码DNA的一部分。信号序列可以是选自例如碱性磷酸酶、青霉素酶、1pp或热稳定肠毒素II前导区的原核信号序列。对于酵母分泌，信号序列可以是例如酵母转化酶前导区、α因子前导区(包括糖酵母属和克鲁维酵母属的α因子前导区，后者在美国专利5010182中有述)，或酸性磷酸酶前导区、白色念珠菌葡萄糖淀粉酶前导区(1990年4月4日公布的EP 362179)，或者1990年11月15日公布的WO90/13646中所述信号序列。在哺乳动物细胞表达时，可使用哺乳动物信号序列以直接分泌蛋白质，如得自相同物种或相关物种分泌型多肽的信号序列以及病毒分泌前导区。
表达载体和克隆载体均含有使载体在一个或多个选定宿主细胞中复制的核酸序列。在多种细菌、酵母和病毒中，这样的序列众所周知。来自质粒pBR322的复制起点，适宜于大多数革兰氏阴性细菌，2μ质粒复制起始点适于酵母，各种病毒复制起始点(SV40，多形瘤病毒，腺病毒，VSV或BPV)适宜于哺乳动物细胞中的克隆载体。
表达载体和克隆载体通常包含筛选基因，也称为可筛选标志。典型的筛选基因编码这样的蛋白：(a)提供对抗生素或其它毒素，如氨苄青霉素、新霉素、氨甲喋呤或四环素等的抗性，(b)弥补营养缺陷，或(c)提供从复合培养基中不能得到的关键营养物质，例如编码芽孢杆菌属D-丙氨酸消旋酶的基因。
适于哺乳动物细胞的筛选标志实例，是那些能胜任使接纳编码本发明多肽核酸的细胞得到识别的标志，例如DHFR或胸苷激酶。当使用野生型DHFR时，适当的宿主细胞是按照Urlaub等在Pric.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980)中描述的方法制备和繁殖的DHFR活性缺陷型中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。适用于酵母的合适筛选基因是存在于酵母质粒YRp7中的trp1基因[Stinchcomb等，Nature，282：39(1979)；Kingsman等，Gene，7：141(1979)；Tschemper等，Gene，10：157(1980)]。trp1基因为不能在色氨酸中生长的酵母突变株(例如ATCC 44076或PEP4-1)提供了筛选标志[Jones，Genetics，85：12(1977)]。
表达和克隆载体通常含有可操作地连接于TCCR-编码核酸序列的启动子，以指导mRNA合成。被各种潜在宿主细胞识别的启动子是众所周知的。适用于原核宿主的启动子，包括β-内酰胺酶和乳糖启动子系统[Chang等，Nature，275：615(1978)；Goeddel等，Nature，281：544(1979)]，碱性磷酸酶，色氨酸(trp)启动子系统[Goeddel，Nucleic acids Res.，8：4057(1980)；EP36776]，和杂化启动子如tac启动子[deBoer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80：21-25(1983)]。适用于细菌系统的启动子，也含有可操作地连接于编码TCCR的DNA的Shine-Dalgamo(S.D.)序列。
适用于酵母宿主的启动序列的实例包括：3-磷酸甘油酸激酶[Hitzeman等，J.Biol.Chem.，255：2073(1980)]或其它糖酵解酶[Hess等，J.Adv.EnzymeReg.，7：149(1968)；Holl和Biochemistrv，17：4900(1978)]的启动子，所述其它糖酵解酶如烯醇化酶，甘油醛-3-磷酸脱氢酶，己糖激酶，丙酮酸脱羧酶，磷酸果糖激酶，葡萄糖-6磷酸异构酶，3-磷酸甘油变位酶，丙酮酸激酶，磷酸丙糖异构酶，磷酸葡萄糖异构酶和葡萄糖激酶。
其它的酵母启动子，即那些还具有由生长条件控制转录优点的诱导型启动子，是下述基因的启动子区：乙醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢相关的降解酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶。在EP 73657中进一步描述了用于酵母表达系统的适宜载体和启动子。
在哺乳动物宿主细胞中，由载体转录的本发明多肽TCCR可受启动子调控，所述启动子来自病毒基因组如多形瘤病毒、鸡痘病毒(1989年7月5日公布的UK 2211504)、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒和猴病毒40(SV40)的启动子，或者来自异源哺乳动物的启动子，如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子等，和热休克启动子，前提是这些启动子与宿主细胞系统相容。
在载体中插入增强子序列，可以增加编码TCCR的DNA在高等真核生物中的转录。增强子是作用于启动子以增加转录的DNA的顺式作用元件，一般约10～300bp。目前已经知道了很多哺乳动物基因(球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)的增强子序列。然而，人们通常使用真核细胞病毒的增强子。实例包括在其复制起始点晚期侧的SV40增强子(bp100-270)，巨细胞病毒早期启动子增强子，在其复制起始点晚期侧的多形瘤增强子，和腺病毒增强子。所述增强子可以剪接入TCCR编码序列的5’或3’端，但优选位于启动子的5’端。
用于真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或来自其它多细胞生物的有核细胞)的表达载体，还包括对转录终止和稳定mRNA结构所必须的序列。这些序列通常来自真核或病毒DNA或cDNA的5’(偶尔为3’)非翻译区。这些区域包含转录为编码TCCR的mRNA的非翻译区中聚腺苷酸化片段的核苷酸片段。
在重组脊椎动物细胞培养中适应TCCR合成的其它适宜方法、载体和宿主细胞，见Gething等，Nature，293：620-625(1981)；Mantei等，Nature，281：40-46(1979)；EP 117060；和EP 117058中的描述。
4.检测基因扩增/表达
使用基于本文提供的序列的合适标记的探针，利用常规技术如Southern印迹、测定mRNA转录量的Northern印迹[Thomas，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：5201-5205(1980)]、点印迹(DNA分析)或原位杂交，可以直接在样品中测定基因扩增和/或表达。或者，使用能够识别特异双链体的抗体，所述双链体包括DNA双链体、RNA双链体和DNA-RNA杂化双链体或者DNA-蛋白质双链体。依次标记抗体，对双链体与表面哪个部位结合进行分析，从而基于双链体在表面的形成，探测到与双链体结合的抗体。
或者，通过免疫学方法测定基因表达以直接定量测定表达的基因产物，所述免疫学方法如细胞或组织切片的免疫组化染色和细胞培养物或体液分析。适用于免疫组化染色和/或样品液分析的抗体，可以是单克隆抗体或多克隆抗体，并且可在任何哺乳动物中制备。可以方便地制备抗天然序列TCCR多肽的抗体，或抗基于本文提供的DNA序列的合成肽的抗体，或者抗与编码本发明多肽TCCR DNA和编码特异抗体表位融合的外源序列的抗体。
5.多肽纯化
可从培养基或宿主细胞裂解物中回收TCCR。如果TCCR与膜结合，那么使用适宜去垢剂溶液(例如Triton-X 100)或通过酶裂解使之自细胞膜释放。使用各种物理或化学手段，如冻融循环、超声、机械破裂或细胞溶解剂，使表达TCCR所用的细胞破裂。
可以期望从重组细胞蛋白质或多肽中纯化TCCR。下述程序是例证性适宜的纯化步骤：在离子-交换柱上分级分离；乙醇沉淀；反相HPLC；在硅石或阳离子-交换树脂如DEAE上层析；聚焦层析；SDS-PAGE；硫酸铵沉淀；使用例如交联葡聚糖(Sephadex)G-75进行凝胶过滤；过蛋白质A琼脂糖柱以除去污染物如IgG；和结合表位-标记形式TCCR的金属螯合剂柱。可以使用蛋白质纯化的各种方法，这些方法是本领域熟知的，并在例如Deutscher，Methods in Enzymology，182(1990)；Scopes，Protein Purification：Principesand Practice，Springer-Verlag，New York(1982)中作了描述。纯化步骤的选择，取决于例如生产方法的性质和所产生的特定TCCR。
6.组织分布
通过测定人各种组织中的mRNA表达，可以确定表达本发明多肽的组织位置。基因位置的确定，提供了哪些组织最易受到刺激和抑制本发明多肽活性影响的信息。基因在特定组织的分布，也为下面讨论的活性阻断试验提供了样品组织。
如上面指出的那样，使用基于本文提供的序列而设计并予以适当标记的探针，经常规的Southem印迹、定量测定mRNA转录的Northern印迹(Thomas，Proc.NatL Acad.Sci.USA，77：5201-5205[1980])、点印迹(DNA分析)或原位杂交技术，可以测量基因在各种组织的表达。或者，使用识别特异双螺旋的抗体，所述双螺旋包括DNA双螺旋、RNA双螺旋和DNA-RNA杂合双螺旋或DNA-蛋白质双螺旋。
或者，为直接定量测定表达的基因产物，用免疫学方法测定基因表达，所述方法如细胞或组织切片的免疫组化染色和细胞培养物或体液分析。适用于免疫组化染色和/或样品液分析的抗体，可以是单克隆抗体或多克隆抗体，并且可以在任何哺乳动物中制备抗体。可以方便地制备抗天然序列本发明多肽的抗体，或抗基于编码本发明多肽的DNA序列的合成肽的抗体，或者抗与编码本发明多肽和编码特异抗体表位的DNA融合的外源序列的抗体。下面将提供产生抗体的一般技术，和用于Northern印迹与原位杂交的特别方案。
E.TCCR的应用
1.一般应用
TCCR是与IL-12β-2受体、GCSFR和IL-6受体同源的WS(G)XWS类细胞因子受体，其中与IL-12β-2受体的同源性最高(26％同源性)。这些受体转导控制细胞生长和分化的信号，特别是涉及血细胞生长和分化的细胞。例如，已经发现G-CSF在化疗后嗜中性白细胞的增殖中具有广泛的临床用途。这些类细胞因子受体和它们的激动剂/拮抗剂很可能在血液学和肿瘤学病症的治疗方面起着重要的作用。业已发现，TCCR在T-辅助细胞应答-尤其是调节T-细胞分化为Th1和Th2亚群的过程中起重要作用。因此，取决于预期的治疗目标，TCCR及其激动剂/拮抗剂在使哺乳动物免疫应答向T-辅助1反应(Th1)或T-辅助-2(Th2)反应偏置的治疗方法中非常有用。
通过增强应答中所涉及的所有其它类型细胞的募集、生长和分化，CD4+T细胞在过敏性炎症反应中发挥着关键作用。CD4+细胞的功能是通过分泌数种细胞因子而发挥的，所述细胞因子包括介素(IL-4)和IL-13，它们增强B细胞中IgE合成的诱导、肥大细胞生长以及淋巴细胞、肥大细胞和嗜碱性细胞募集到炎症部位。此外，CD4+T细胞产生IL-5，后者增加嗜酸性粒细胞和B细胞的生长和分化，CD4+T细胞还产生IL-10，后者增加肥大细胞的生长和分化并抑制γ-干扰素产生。  所有这些IL-4、IL-5、IL-10和IL-13是由称为Th2细胞的CD4+T-细胞亚群产生的。已经发现Th2细胞在过敏个体体内的含量大幅度增加。
Th1细胞分泌在激活巨噬细胞和在诱导细胞介导的免疫中起重要作用的细胞因子(IFN-γ、IL-2肿瘤坏死因子-β[TNF-β])。Th2细胞分泌在体液免疫和过敏性疾病中起重要作用的细胞因子(IL-4、IL-5和IL-10)。在Th1细胞因子抑制Th2细胞因子的同时，Th2细胞因子抑制Th1细胞因子的产生。这种负反馈环路增强免疫应答期间产生多极化细胞因子的情形。保持这些“相对立”细胞因子产生的微妙平衡是极为关键的，这是因为，据信过度产生Th1细胞因子将导致自身免疫性炎性疾病和同种异体移植物排斥。而过度产生Th2细胞因子则导致过敏性炎性疾病如哮喘和过敏性鼻炎，或者导致对细胞内病原体无效免疫。
Umetsu和DeKruyff，Proc.Soc.Exp.Bio.Med.215(1)：11-20(1997)提出了一种模型，其中将感染易感性解释为缺乏具有分泌适宜细胞因子特征的T细胞的发育，而不解释为缺乏免疫性。过敏性疾病是由CD4+T细胞不适当地分泌Th2细胞因子所引起的，而不过敏性个体之所以保持不发病，是因为他们体内发育分泌Th1细胞因子的T细胞，所分泌的Th1细胞因子抑制IgE合成和肥大细胞及嗜酸性粒细胞分化。换一种方式讲，过敏性鼻炎和哮喘代表病理性偏差或口腔/粘膜误差，其中应当正常地发育为“Th2”调节/抑制细胞的T细胞发育成了引发和增强过敏性炎症的Th2细胞。
细胞因子受体一般以具有包括细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域的多结构域结构为特征。通常，细胞外结构域的功能是结合配体，跨膜结构域的功能是把受体固定在细胞膜上，而细胞内结构域是与细胞内信号传导有关的效应物。然而，配体-结合和效应物功能可以位于多聚体受体分开的亚单位上。配体-结合结构域本身就可以具有多结构域。多聚体受体是一个广义术语，一般包括：(1)同型二聚体；(2)既具有配体-结合亚单位又具有效应物结构域亚单位的异源二聚体；和(3)具有不同功能的亚单位组件的多聚体。在Urdahl，Ann.Reports Med.Chem.26：221-228(1991)和Cosman，Cytokine 5：95-106(1993)一文中，对细胞因子受体作了进一步的综述和分类。
除了特异性免疫-相关的应用外(例如，Th1和Th2细胞介导的生理机能)，编码TCCR的核苷酸序列(或其互补链)在分子生物学领域具有多种用途，包括在染色体和基因作图以及在生产反义RNA和DNA中用作杂交探针。
使用本文公开的重组技术，TCCR核酸还可用于制备TCCR多肽。
图3(SEQ ID NO：1)和图4(SEQ ID NO：2)所示全长天然序列TCCR基因或它们的一些部分，可用作cDNA文库的杂交探针，以分离全长TCCRcDNA或分离另外一些与图3和图4(分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)所公开的TCCR序列具有所期望序列同源性的cDNAs(譬如，编码天然存在的TCCR变体或来自其它物种的TCCR的cDNAs)。任选地，任选地，探针长度是约20～约50个碱基。杂交探针可源自于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2核苷酸序列的某些区域，其中所述区域是那些不需要十分繁琐实验就可确定的区域，或从包括启动子、增强子元件和内含子的天然序列TCCR基因组序列中确定的区域。举例来说，筛选方法包括：使用已知DNA序列合成约40个碱基的选定探针，来分离TCCR基因的编码区。杂交探针可标记上各种标志，包括放射性核苷酸如32p或35S，或酶标记，所述酶标记如通过卵白素/生物素偶联系统将碱性磷酸酶与探针耦合。具有与本发明TCCR基因互补序列的标记探针，可用于筛选人cDNA文库、基因组DNA或mRNA，以测定探针与哪一文库发生杂交。下面的实施例将进一步详细描述杂交技术。使用本文披露的方法，本申请公开的EST序列可类似地用作探针。
TCCR核酸的其它有用片段，包括含有能与靶TCCR mRNA(正义)或TCCR DNA(反义)序列结合的单链核酸序列(RNA或DNA)的反义或正义寡核苷酸。根据本发明，反义或正义寡核苷酸包括TCCR DNA编码区的片段。该片段一般含有至少约14个核苷酸，优选约14～30个核苷酸。基于编码一给定蛋白质的cDNA序列得到反义或正义寡核苷酸的能力，在例如Stein和Cohen(Cancer Res.48：2659，1988)及van der Krol等(BioTechniques 6：958，1988)的文章中有描述。
反义或正义寡核苷酸与靶核酸序列的结合，导致通过一种或多种方式阻断靶序列转录或翻译的双螺旋形成，所述阻断方式包括增加双螺旋降解、转录或翻译的成熟前终止或者其它方式。因此，反义寡核苷酸可用于阻断TCCR蛋白质的表达。反义或正义寡核苷酸进一步包括具有修饰过的糖磷酸二酯主链的寡核苷酸(或其它糖链接，如WO 91/06629中描述的那些)，其中此类糖链接是耐内源性核酸酶的。此类具有抗性糖链接的寡核苷酸在体内是稳定的(即，能够抗酶降解)，同时保留序列与靶核苷酸序列的结合特异性。
正义或反义寡核苷酸的其它实例，包括那些与有机分子共价键合的寡核苷酸，如WO 90/10048中描述的那些寡核苷酸，和其它增加寡核苷酸与靶核酸序列亲和力的分子，如聚-(L-赖氨酸)。另外，嵌入剂(如椭圆玫瑰树碱)和烷基化剂或金属络合物可挂接在修饰反义或正义寡核苷酸结合特异性的正义或反义寡核苷酸上，以修饰反义或正义寡核苷酸对靶核苷酸序列的结合特异性。
使用任何基因转移方法可将反义或正义寡核苷酸引入到含有靶核酸序列的细胞中，所述方法包括例如，CaPO4-介导的DNA转染、电穿孔、或使用基因转移载体如Epstein-Barr病毒。在一优选的方法中，将反义或正义寡核苷酸插入到一适宜的逆转录病毒载体中，在体内或体外使含有靶核酸序列的细胞与重组逆转录病毒载体接触。适宜的逆转录病毒载体包括但不限于，得自小鼠逆转录病毒M-MuLV、N2(得自M-MuLV的逆转录病毒)，或称为DCT5A、DCT5B和DCT5C(见WO 90/13641)的双倍复制病毒。
也可以通过使正义或反义寡核苷酸与配体结合分子形成偶联物的形式，而将正义或反义寡核苷酸引入到含有靶核苷酸序列的细胞中，见WO91/04753的描述。适宜的配体结合分子包括但不限于：细胞表面受体、生长因子、其它细胞因子或能与细胞表面受体结合的其它配体。优选地，配体结合分子的偶联基本上不干扰配体结合分子与其相应分子或受体结合的能力，或阻断正义或反义寡核苷酸或其偶联型进入细胞。
或者，按照WO 90/10448描述的方法，通过形成寡核苷酸-脂复合物，而将正义或反义寡核苷酸引入到含有靶核酸序列的细胞中。优选地，正义或反义寡核苷酸-脂复合物是使用内源性脂酶而在细胞内分离的。
也可在PCR技术中使用探针，以产生用于鉴定最接近TCCR编码序列的一组序列。
编码TCCR的核苷酸序列，还可用于构建在描绘编码TCCR的基因图谱和对患有遗传病个体进行基因分析中使用的杂交探针。使用已知技术，如原位杂交、抗已知染色体标志物的连锁分析和与文库的杂交筛选技术，可将本文提供的核苷酸序列整合到染色体和染色体的特定区域。
既然TCCR是受体，那么TCCR的编码序列必然编码与另一蛋白结合的蛋白质。因此，本发明TCCR蛋白质可在鉴定参与结合相互作用的其它蛋白质或分子的分析中使用。使用此类方法，可以鉴定受体/配体结合相互作用的抑制剂。还可将参与此结合相互作用的蛋白质用于筛选肽或结合相互作用的小分子抑制剂或激动剂。而且，受体TCCR可用于分离相关配体。筛选分析可用于设计寻找模拟天然TCCR生物活性或TCCR配体的主要化合物。此类筛选分析包括使用化学用数据库进行高-通过量筛选分析，使之特别适宜于鉴定小分子候选药物。小分子包括合成的有机或无机化合物。可使用各种形式的分析法，包括蛋白质-蛋白质结合分析，生化筛选分析，免疫测定和以细胞为基础的分析，这些分析法均是本领域公知的。
本文所述TCCR多肽也可用作电泳中蛋白质的分子量标志。
本文所述编码TCCR多肽或其片段的核酸分子在染色体鉴定中非常有用。在此方面，由于基于实际序列数据只有相对少数几个可利用的染色体标志剂，因而一直存在着对于鉴定新染色体标志的需求。本发明每一个TCCR核酸分子均可用作染色体标志。
本发明TCCR多肽和核酸分子也可用于组织分型，其中本发明TCCR多肽在不同组织间有差别地表达。TCCR核酸分子还可用于制备PCR、Northern分析、Southern分析和Western分析用的探针。
2.抗体结合研究
本发明TCCR多肽的活性，可通过抗体结合研究而得到进一步证实。在该结合研究试验中，检测抗-TCCR抗体抑制组织细胞上TCCR多肽的能力。例证性抗体包括多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、双特异抗体和异源偶联抗体，它们的制备将在下面予以描述。
可使用本领域已知的方法进行抗体结合研究，所述方法如竞争性结合试验、直接和间接夹心试验，及免疫沉淀试验。Zola，单克隆抗体：技术指南，147-158页(CRC Press，Inc.1987)。
竞争性结合试验，依赖于标记的标准品在同限定量抗体结合中与测试样品分析物竞争的能力。测试样品中靶蛋白的量与将要同抗体结合(becomebound)的标准品的量成反比。为便于测定将要结合的标准品的量，优选抗体在竞争之前或之后是不溶性的，这样可以很方便地把与抗体结合的标准品和测试样品从保持未结合状态的标准品和测试样品中区分开来。
夹心试验涉及使用被检测蛋白质的两种抗体，每一种抗体能够结合不同的免疫原性蛋白质或表位。在一夹心试验中，首先使测试样品分析物与固定在固体载体上的第一抗体结合，然后再使第二抗体与分析物结合，从而形成不溶性的三部分复合物。参见例如美国专利4376110。第二抗体本身可标记有可检测部分(直接夹心试验)，或者通过使用标记有可检测部分的抗-免疫球蛋白抗体来测定第二抗体(间接夹心试验)。例如，一种类型的夹心试验是ELISA分析法，其中可检测部分是酶。
对于免疫组织化学而言，组织样品可以是新鲜的或冷冻的，或者是包埋在石蜡中并用防腐剂如福尔马林固定。
3.基于细胞的分析
基于细胞的分析和免疫相关疾病的动物模型，可用于进一步了解本文鉴定的基因和多肽与免疫相关疾病进展和发病机理之间的关系。
在不同的研究中，用本文描述的cDNA转染已知参与特定免疫相关疾病的细胞类型的细胞，并分析这些cDNA刺激或抑制免疫功能的能力。可用所需的基因转染适宜细胞，并监测免疫功能活性。然后，将此转染的细胞系用于检测多克隆或单克隆抗体或抗体组合物抑制或刺激免疫功能的能力，譬如用于检测调节T-细胞增殖或炎性细胞浸润的能力。用本文鉴定的基因编码序列转染的细胞，还可用于确定治疗免疫相关疾病的候选药物。
此外，尽管优选稳定的细胞系，但是得自转基因动物(见下述)的原代培养物，可用于基于细胞的分析中。从转基因动物获取连续细胞系的技术为本领域所熟知(参见例如Small等，Mol.Cell.Biol.5，642-648[1985]).
一种基于稳定细胞的分析是混合淋巴细胞反应(MLR)，见CurrentProtocols in Immunology，unit 3.12；edited by J E Coligan，A M Kruisbeek，D HMarglics，E M Shevach，W Strober，National Institutes of
Health，Published by John Wiley & Sons，Inc.。在该分析中，分析测试化合物刺激或抑制活化T细胞增殖的能力。使应答T细胞的上清液与异源刺激物细胞一起培养，通过氚标记去氧胸苷的摄取来测定T细胞增殖情况。该分析是对T细胞反应性的一般性测定。既然大多数T细胞对活化应答并产生IL-2，那么在该分析实验中应答的差异，部分反映出应答细胞产生IL-2的差异。可以用标准淋巴因子(IL-2)检测分析来证实此MLR结果，见前述CurrentProtocols in Immunology一书，3.15，6.3。
MLR分析中的增生性T细胞反应，可能是由于测试分子的直接致有丝分裂性能或者由于外源性抗原诱导的活化作用。通过共同刺激分析实验，可以获得对本发明多肽T细胞刺激活性的另外证实。T细胞活化，需要通过T-细胞受体(TCR)介导的抗原特异性信号和通过第二配体结合相互作用(例如，B7(CD80，CD86)/CD28结合相互作用)介导的共同刺激信号。CD28交联增加活化T分泌细胞淋巴因子。通过与具有负性或正性效应的配体结合，T细胞活化具有负性和正性控制。CD28和CTLA-4是与B7结合的Ig超家族中的相关糖蛋白。与B7结合的CD28具有正性共同刺激T细胞活化的效应；相反，与B7结合的CTLA-4具有负性T细胞失活效应，Chambers，C.A.和Allison，J.P.，Curr.Opin.ImmunoL(1997)9：396.Schwartz，R.H.，Cell(1992)71：1065；Linsey，P.S.和Ledbetter，J.A.，Annu.Rev.Immunol.(1993)11：191；June，C.H.etal.，Inimunol.Today(1994)15：321；Jenkins，M.K.，Immunity(1994)1：405。在共同刺激分析实验中，分析本发明多肽对T细胞共同刺激或抑制活性。
本发明多肽以及属于T细胞增殖刺激剂(共同刺激剂)和激动剂的本发明其它化合物，例如激动型抗体，例如通过MLR和共同刺激分析实验确定的那些化合物，在治疗以免疫功能差、免疫功能在最适度以下或不充分为特征的免疫相关疾病的治疗中非常有用。通过刺激T细胞增殖和活化(例如，刺激T细胞介导的免疫，Th1和/或Th2细胞因子产生)，和通过施用刺激性化合物(如本发明刺激性多肽)而增加哺乳动物免疫应答，来治疗这些疾病。刺激性多肽可以是例如TCCR配体多肽或其激动型抗体。
在用4-1BB糖蛋白的实验中，已经证实了本发明刺激性化合物的直接使用，4-1BB是肿瘤坏死因子受体家族成员之一，它与在致敏T细胞上表达的配体(4-1BBL)结合并标志T细胞活化和生长，Alderson，M.E.等，J.Immunol.(1994)24：2219。
也已实验性地证实了激动型刺激性化合物的用途。用激动型抗-4-1BB抗体处理的4-1BB活化，促进肿瘤的根除。Hellstrom，I.和Hellstrom，K.E.，Crit.Rev.ImmunoL(1998)18：1。下面将要详述的用于肿瘤治疗的免疫佐剂疗法，是使用本发明刺激性化合物的另一实例。
通过拮抗或阻断在MIR分析实验中证明是抑制性的蛋白质的活性，也可达到免疫刺激或增强效应。取消化合物的抑制活性，产生净刺激效应。适宜的拮抗剂/阻断性化合物，是识别并与抑制性蛋白质结合的抗体或其片段，从而阻断蛋白质与其受体间的相互作用并抑制通过受体的信号发送。这一效应已被在使用增强T细胞增殖的抗-CTLA-4抗体的实验中加以证实，推测其可能是由于去除了由CTLA-4结合引起的抑制信号所致，Walunas，T.L.et al，Immunity(1994)1：405。
另一方面，作为T细胞增殖/活化和/或淋巴因子分泌的直接抑制剂的本发明多肽以及本发明其它化合物，可直接用于抑制免疫应答。这些化合物在降低免疫应答程度而治疗以免疫活动过度、超出最适度或自身免疫反应为特征的免疫相关疾病中非常有用。本发明化合物的此用途，可通过上述与受体B7结合的CTLA-4使T细胞失活的实验来证实。本发明直接抑制化合物以类似方式发挥作用。
或者，化合物例如抗体，与本发明刺激性多肽结合并阻断这些分子的刺激性作用，从而产生净抑制效应，并通过抑制T细胞增殖/活化和/或淋巴因子分泌而可用于抑制T细胞介导的免疫应答。阻断多肽的刺激性效应，抑制哺乳动物的免疫应答。在使用抗-IL2抗体的实验中已证实这一用途。这些实验中，抗体与IL2结合并阻断IL2与其受体结合，从而获得T细胞抑制效应。
4.动物模型
使用动物模型在体试验，可以进一步证实基于离体细胞分析实验所得的结果并可分析T-细胞功能。各种众所周知的动物模型可用于进一步了解本文鉴定的基因在免疫相关疾病的发展和发病机理中的作用，和用于检测有效的候选治疗剂，所述候选治疗剂包括抗体和天然多肽的其它拮抗剂，后者包括小分子拮抗剂。此类模型的在体特性，使得它们可以预见在人类患者的反应。免疫相关疾病的动物模型包括非-重组动物和重组(转基因)动物。非重组动物模型包括例如，啮齿动物如小鼠模型，此类模型可如下制得：利用标准技术，如皮下注射、尾静脉注射、脾埋入法、腹膜内植入、肾囊植入法等，将细胞引入同系基因鼠体内。
将免疫活性细胞入免疫抑制或免疫耐受患者体内，将发生移植物抗宿主病。供体细胞识别并应答宿主抗原。该应答程度不等，可以是危及生命的严重炎症，也可是轻度腹泻和体重下降。抑制物抗宿主疾病模型，提供了评价T细胞抗MHC抗原和小移植抗原反应性的手段。适合的操作详见前述Current Protocols in Immunology，一书中unit 4.3。
皮肤同种异体移植排斥的动物模型，是检测T细胞介导体内组织破坏能力的手段和检测在移植排斥中作用的措施。最常用和最接受的模型是使用小鼠尾部皮肤移植。反复实验业已证实，皮肤同种异体移植排斥是由T细胞、辅助T细胞和杀伤-效应物T细胞介导的，而不是抗体所介导，Auchincloss，H.Jr.和Sachs，D.H.，Fundamental Immunology，2nd ed.，W.E.Paul ed.，RavenPress，NY，1989，889-992。适宜操作详见前述Current Protocols in Imnaunology一书中unit 4.4。可用于检测本发明化合物的其它移植排斥模型，是Tanabe，M.等在Transplantation(1994)58：23中和Tinubu，S.A.等在J.Immunol.(1994)4330-4338中描述的同种异体心脏移植模型。
迟发型过敏反应的动物模型，也可用于分析细胞介导的免疫功能。迟发型过敏反应是T细胞介导的体内免疫应答，其以在抗原攻击后一段期间之后达到炎症高峰为特征。这些反应也发生在组织特异性自身免疫性疾病，如多发性硬化(MS)和实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE，MS的模型)。适宜操作详见前述Current Protocols in Immunology一书中unit 4.5。
EAE是T细胞介导的以T细胞和单核细胞细胞炎症及中枢神经系统轴索继发性脱髓鞘为特征的自身免疫性疾病。EAE通常被认为是人MS的相关动物模型，Bolton，C.，Multilocular Sclerosis(1995)1：143。已开发出急性模型和复发-缓解性模型。使用前述Current Protocols in Immunology一书中units 15.1和15.2部分公开的方案，可检测本发明化合物对T细胞抗免疫介导的脱髓鞘疾病的刺激性或抑制性活性。也参见Duncan，I.D.等在Molec.Med.Today(1997)554-561中所述的髓磷脂疾病的模型，其中少突神经胶质细胞或许旺氏细胞被移植到中枢神经系统中。
接触性过敏是在体分析细胞介导的免疫功能的简单的迟发型过敏反应。在此过程中，皮肤暴露于外原性半抗原，引发迟发型过敏反应，测量并定量测定过敏反应。接触敏感性涉及起始敏化期，接着是诱发期。当T淋巴细胞与以前曾经接触过的抗原再次相遇时，则出现诱发期。发生肿胀和炎症，使得其成为人过敏性接触性皮炎的极好的模型。适宜操作详见Current Protocolsin Immunology，Eds.J.E.Cologan，A.M.Kruisbeek，D.H.Margulies，E.M.Shevach和W.Strober，John Wiley & Sons，Inc.，1994，unit 4.2。也参见Grabbe，S.和Schwarz，T，lmmun.Today 19(1)：37-44(1998)。
关节炎的一种动物模型是胶原诱导的关节炎。该模型与人自身免疫类风湿性关节炎具有相同的临床、组织学和免疫学特性，是人自身免疫性关节炎的合适模型。小鼠和大鼠模型以滑膜炎、软骨和软骨下骨侵蚀为特征。使用前述Current Protocols in Immunology一书中units 15.5部分介绍的方案，可以检测本发明化合物抗自身免疫关节炎的活性。也参见使用Issekutz，A.C.等在Immunology(1996)88：569中所述抗CD18和VLA-4整联蛋白的单克隆抗体的模型。
哮喘模型已有描述，其中通过用卵白蛋白敏化动物，然后用气溶胶释放形式的相同蛋白质刺激动物，从而诱导抗原-诱导的气道高反应性、肺嗜酸性粒细胞增多和炎症。数种动物模型(豚鼠，大鼠，非-人灵长类)在气溶胶抗原攻击后表现出类似于人特应性哮喘的症状。鼠模型具有人哮喘的多种特性。Wolyniec，W.W.等在Am.J.Respir. Cell Mol.BioL(1998)18：777中描述了检测本发明化合物治疗哮喘活性和效力的适宜操作，将该文献引入本文作为参考。
另外，可在牛皮癣类疾病动物模型中检测本发明化合物。证据提示牛皮癣的T细胞发病机理。可在Schon，M.P.等Nat.Med.(1997)3：183所述scid/scid小鼠模型中检测本发明化合物，所述模型中小鼠表现出酷似牛皮癣的组织病理性皮肤病损。另一适宜的模型，是按照Nickoloff，B.J.等在Am.J.PathoL(1995)146：580中所述方法制备的人皮肤/scid小鼠嵌合体。
使用生产转基因动物的标准技术，通过向感兴趣动物的基因组引入本文鉴定的基因的编码部分，可以对重组(转基因)动物模型进行工程改造。可作为转基因靶的动物包括但不限于小鼠、大鼠、兔、豚鼠、绵羊、山羊、猪和非-人灵长目动物如狒狒、黑猩猩和猴子。本领域已知的将转基因引入动物的技术，包括原核显微注射(Hoppe和Wanger，美国专利4873191)；逆转录病毒-介导的基因转移入干细胞系(germ lines)(例如，Van der Putten等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：6148-615[1985])；基因靶向进入胚胎干细胞(Thompson等，Cell 56：313-321[1989])；胚胎的电穿孔(Lo，Mol.CeL.BioL3，1803-1814[1983])；精子-介导的基因转移(Lavitrano etal，Cell 57，717-73[1989])。有关评述参见例如美国专利4736866。
为了本发明的目的，转基因动物包括那些仅在其细胞部分携带转基因的动物(″镶嵌型动物″)。该转基因可以单个转基因形式或者以多联体形式(如头-头或头-尾串联体)进行整入。根据例如Lasko等在Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89，6232-636(1992)中公开的技术，将转基因选择性引入特定类型细胞也是可能的。
使用标准技术，可以监测转基因动物中转基因的表达。例如，Southern印迹分析或PCR扩增技术可用于证实转基因的整入。然后，使用诸如原位杂交、Northern印迹分析、PCR或免疫细胞化学法等技术，可分析mRNA的表达水平。
编码TCCR或其修饰形式的核酸，也可用于生产转基因动物或″基因敲除″动物，所得动物反过来对于开发和筛选适合的治疗剂是非常有用的。本领域所用术语“基因敲除动物”，是为了描述其内源性基因已被“基因敲除”或切除的转基因动物，如由于使用同源重组而产生的动物。同源重组是本领域用于描述与内源性基因同源的靶向载体区域的术语。这些同源区域将彼此杂交并重组到宿主的基因组中，在共有同源性区域限定的位置和方向用载体插入序列替换宿主内源性序列。基因敲除动物的基因型用“-/-”基因表示。这使得它与用“-/+”表示的只有一个等位基因被“基因敲除”的动物区别开来。已被“基因敲除”的内源性基因，在整个动物的所有细胞中均不再被表达。
转基因动物(例如小鼠或大鼠)是含有转基因细胞的动物，所述转基因被引入到动物或孕期(例如胚胎期)祖代动物中。转基因是整合入细胞基因组的DNA，由所述细胞发展为转基因动物。在一实施方案中，使用已经建立的技术，编码TCCR的cDNA可用于克隆编码TCCR的基因组DNA，并将基因组序列用于生产含有表达编码TCCR DNA细胞的转基因动物。生产转基因动物的方法，特别是诸如小鼠或大鼠这样的动物，已经成为本领域常规技术，并在例如美国专利4736866和4870009中有描述。通常，带有组织-特异增强子的TCCR转基因被整合入特定细胞中。含有胚胎期被整合入动物干细胞的一个拷贝编码TCCR转基因的转基因动物，可用于检测增加编码TCCR DNA表达的效果。此类动物可用作检测认为对于例如与过度表达有关的病理病症具有保护作用的药剂的试验动物。根据本发明的一个方面，与未经治疗的携带转基因的动物相比，用药剂治疗的动物，其病理病症的发生率降低，这表明药剂对于病理病症具有潜在的治疗干预作用。
或者，将编码多肽的内源性基因与编码相同多肽的基因组DNA的同源重组物引入动物胚胎干细胞，而构建其编码本文鉴定的多肽的基因缺陷或改变的″基因敲除″动物。例如，按照已经建立的技术，编码特定多肽的cDNA可用于克隆编码该多肽的基因组DNA。编码特定多肽的基因组DNA的一部分，可被删除或用其它基因替换，如被用于监控整合的选择性标志的编码基因替换。通常，将数千碱基对未被改变的旁侧DNA(5′或3′末端)引入到载体中[参见例如Thomas和Capecchi，Cell，51：503(1987)对同源重组载体的描述]。将载体引入胚胎干细胞系(例如通过电穿孔)，并选出引入了已经与内源性DNA同源重组过的DNA的细胞[参见例如，Li等，Cell，69：915(1992)]。接着，将选出的细胞注入动物(例如小鼠或大鼠)的胚囊中，以形成聚集嵌合体[参见例如，Bradley，in Teratocarcinomas和Embryonic Stem Cells：A Practical Approach，E.J.Robertson编著(IRL，Oxford，1987)，113-152页]。将嵌合胚胎植入适宜的假妊娠雌性养育动物体内，胚胎生长到足月即成为″基因敲除″动物。使用标准技术，鉴定出在其干细胞中携带有同源重组DNA的子代动物，用这些子代动物繁殖出在所有动物细胞中均含有同源重组DNA的动物。基因敲除动物的特征在于，例如，抵御某些病理病症的能力和由于动物缺乏多肽而发生病理病症。
对于本发明，建立基因敲除小鼠是为了研究TCCR激动/拮抗Th1和/或Th2免疫应答及其介导的病症的效果。
5.嵌合受体
另外，为了测定具有未知配体的受体发出信号的效果，可以对嵌合受体再改造。嵌合受体是检验受体功能而不分离配体的证明手段，Chang等，Mol.Cell Biol.18(2)：896-905(1998)。
6.免疫佐剂治疗
在一实施方案中，本发明免疫刺激化合物可用于肿瘤(癌)治疗的免疫佐剂疗法中。目前已很好地建立了识别人肿瘤特异抗原的T细胞。由MAGE、BAGE和GAGE基因家族编码的一组肿瘤抗原，在所有成人正常组织中是不活动的，但是在肿瘤如黑色素瘤、肺肿瘤、头颈部肿瘤和膀胱癌中却大量表达，DeSmet，C.et aL，(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93：7149。已经证实，T细胞的共同刺激在体内和体外均诱导肿瘤消退和抗肿瘤反应，Melero，I.等，Nature Medicine(1997)3：682；Kwon，E.D.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1997)94：8099；Lynch，D.H.等，Nature Medicine(1997)3：625；Finn，O.J.和Lotzc，M.T.，J Immunol.(1998)LI：114。本发明刺激性化合物可作为佐剂单独施用或与生长调节剂、细胞毒性剂或化疗剂一起施用，以刺激T细胞增殖/活化和针对肿瘤抗原的抗肿瘤反应。可按照已知的给药方案来施用生长调节剂、细胞毒性剂或化疗剂。本发明化合物的免疫刺激活性允许减少生长调节剂、细胞毒性剂或化疗剂的用量，从而潜在地降低了对患者的毒性。
7.候选药物筛选试验
候选药物筛选试验，目的是鉴定与由本文确定的TCCR核酸或其生物活性变体编码的多肽结合或复合的化合物，或者相反，鉴定那些干扰基因编码的多肽与其它细胞蛋白质相互作用的化合物。此类筛选试验包括使用高通过量化学数据库筛选分析，使之特别适于鉴定小分子候选药物。考虑到的小分子包括合成的有机或无机化合物，包括肽，特别是可溶性肽、(多)肽-免疫球蛋白融合体，和尤其是抗体，包括但不限于多克隆抗体和单克隆抗体以及抗体片段、单链抗体、抗-独特型抗体和嵌合抗体或人源化抗体或片段，以及人抗体和抗体片段。
试验可按照多种方式进行，包括蛋白质-蛋白质结合分析、生化筛选分析、免疫测定和基于细胞的分析，这些分析方法在本领域已被很好描述。本文中所有的候选药物筛选试验均具有共同的特性，那就是：在控制条件下将候选药物与TCCR多肽接触足够时间，以使两种分子相互作用。
在结合分析中，相互作用是结合，从反应混合物中分离或检测形成的复合物。既然本发明TCCR多肽是受体，那么TCCR ECD片段也适用于鉴定候选药物，后者包括TCCR变体、TCCR拮抗剂和/或激动剂。在一特定实施方案中，通过共价或非-共价附着方式，把由本文鉴定的基因编码的多肽或候选药物固定在固相上，如固定微量滴定板上。非-共价附着，一般通过用TCCR多肽溶液包封固体表面并进行干燥而实现。或者，固定抗体，例如固定的对TCCR多肽具有特异性的单克隆抗体，可用于使TCCR多肽固定到固体表面。试验这样进行：向固定组分中加入非固定组分，所述非固定组分可以标记上可检测的标记物，所述固定组分譬如含有使多肽固着的组分的被包封表面。当反应完成时，除去未反应的组分(例如，通过洗涤方式)，并检测固着在固体表面的复合物。当原来非固定组分带有可检测标记物时，检测到固定在表面的标记物，就表明复合物形成。如果原来非-固定组分没有携带标记物，则可以检测复合，例如，通过使用与固定复合物特异结合的抗体来进行检测。
如果候选化合物与本文确定的特定TCCR蛋白相互作用但是又不与之结合，那么，使用已知的检测蛋白质-蛋白质相互作用的方法来分析与TCCR蛋白的相互作用。此类分析方法包括惯常的方法，例如，交联、共-免疫沉淀和通过梯度或层析柱的共-纯化。此外，按照Fields与其同事(Fields和Song，Nature(340：245-246(1989)；Chien等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：9578-9582(1991))和Chevray和Nathans，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：5789-5793(1991)公开的方法，使用酵母-基遗传系统可以检测蛋白质-蛋白质相互作用。许多转录激活剂，如酵母GAL4，它由两个完全分散的分子结构域构成，其一作为DNA-结合区，另一个作为激活转录的区。前述出版物中描述的酵母表达系统(一般指″二因子杂合系统″)利用此特性，并使用两个杂交蛋白，其一的靶蛋白质与GAL4的DNA-结合区融合，另一个的候选激活蛋白质与激活区融合。在GAL4-激活的增强子控制下GAL1-lacZ报告基因的表达，依赖于通过蛋白质-蛋白质相互作用重建的GAL4活性。用β-半乳糖苷酶的显色底物检测含有相互作用多肽的菌丛。从Clontech可以商购利用二因子杂合技术鉴定两个特异蛋白质间蛋白质-蛋白质相互作用的全套试剂盒(MATCHMAKERTM)。该系统也可被扩展到描绘参与特异蛋白质相互作用的蛋白质结构域，以及对于这些相互作用起关键作用的精确氨基酸残基的图谱。
为了寻找干扰本文确定的TCCR多肽与其它细胞内或细胞外组分相互作用的化合物，通常在控制条件下，制备含有基因产物和细胞内或细胞外组分产物的反应混合物，使两种产物相互作用和结合一定时间。为了测试候选化合物抑制上述相互作用的能力，在含有和不含有受试化合物的条件下进行反应。另外，可把安慰剂加入到第三反应混合物中，作为阳性对照。按照上述方法，监测混合物中受试化合物与细胞内或细胞外组分之间的结合(复合物形成)。在对照反应中有复合物形成，而在含有受试化合物的反应混合物中没有复合物形成，则表明受试复合物干预受试化合物与其配伍化合物之间的相互作用。
8.治疗免疫相关疾病的组合物和方法
适宜于治疗免疫相关疾病(例如，Th1-和/或Th2-介导的病症)的组合物，包括但不限于抑制或刺激免疫功能的蛋白质、抗体、小的有机分子、肽、磷肽、反义分子和核酶分子、三链螺旋分子等，所述免疫功能例如T细胞增殖/活化、淋巴因子释放或免疫细胞浸润。
举例来说，反义RNA和RNA分子通过与靶mRNA杂交和阻止蛋白质翻译而直接阻断mRNA翻译。当使用反义DNA时，优选得自翻译起始位点(例如靶基因核苷酸序列约-10～+10位)的寡脱氧核糖核苷酸。
核酶是能够催化RNA特异性裂解的具有酶性质的RNA分子。核酶通过序列-特异性杂交于靶RNA互补链，接着通过核酸内裂解而发挥作用。使用已知技术，可以鉴定位于潜在RNA靶内的特异核酶裂解位点。进一步的细节请参见例如Rossi，Current Biology，4：469-471(1994)，和PCT出版物WO97/33551(1997年9月18日公布)。
用于抑制转录的三链螺旋构型的核酸分子，应当是单链并由脱氧核苷酸构成。这些寡核苷酸的碱基组成是设计好的，这样它通过Hoogsteen碱基对原则促进三链螺旋的形成，这一般需要双螺旋中一条链上的嘌呤或嘧啶相当大的延伸。更详细情况请参见例如，PCT出版物WO 97/33551，出处同上。
用上述讨论的筛选试验中的任何一个或其任何联合，和/或使用本领域技术人员熟知的任何其它筛选技术，可以鉴定这些分子。
本文描述的TCCR多肽、激动剂和拮抗剂(TCCR分子)，也可用作治疗剂。按照已知的方法，通过TCCR分子与可药用载体联合，可将本发明TCCR分子制备成有用的药物组合物。为了治疗制剂贮存方便，将具有所需纯度的活性组分与任选的可药用载体、赋形剂或稳定剂混合(Reminaton′sPharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A.编著(1980))，制备成冷冻干燥制剂或或水溶液形式。可接受的载体、赋形剂或稳定剂，在所用剂量和浓度范围对接受者没有毒性，其包括缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮，氨基酸如甘氨酸、谷酰胺、天门冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物如葡萄糖甘露糖或糊精；螫合剂如EDTA；糖醇如甘露醇或山梨醇；成盐离子如钠；和/或非离子表面活性剂如TWEENTM、PLURONICSTM或PEG。
用于体内给药的制剂必须是无菌的。这可以在冷冻干燥和重新配制之前或之后通过除菌滤膜过滤而轻易实现。
本文的治疗组合物一般盛放在具有无菌存取口的容器中，例如该容器是静脉注射袋或带有能通过皮下注射针穿刺的塞子的小瓶。
给药途径与已知方法一致，例如注射或静脉输注、腹膜内、卤内、肌内、眼内、动脉内或损伤内(intralesional)给药、局部用药或使用持续释放系统给药。
本发明药物组合物的剂量和所需药物浓度将依预想的特定用途而异。决定适宜剂量或给药途径是普通内科医师完全能够很好胜任的事情。动物试验为决定治疗人类患者所用剂量提供可靠指导。可按照Yacobi等编著的Toxicokinetics and New Drug Development(Pergamon Press，New York 1989)一书中，Mordenti，J.和Chappell在W.″The use of interspecies scaling intoxicokinetics″第42-96页所给出的方法，换算种属间有效剂量的比例。
体内施用TCCR分子时，取决于给药途径，每日标准剂量范围为约10ng/kg至高达100mg/kg哺乳动物体重或更多，优选地约1μg/kg/日～10mg/kg/日。文献提供了有关特定剂量和给药方法的指导，参见例如美国专利4657760；5206344或5225212。可以预期：对于不同疗法和不同病症而言，不同制剂能够奏效，并且意欲治疗特定器官或组织的给药使得以不同于施用于其它器官或组织的方式进行释放成为必需。
当期望TCCR分子在具有适宜于治疗需要施用TCCR分子的任何疾病或病症的释放特性的制剂中持续释放给药时，考虑使用微囊包封。持续释放用的重组蛋白质微囊包封已被成功地用于人生长激素(rhGH)、干扰素-α、-β、-γ(rhIFN-α，-β，-γ)、白介素-2和MN rgp 120的持续释放。Johnson等，Nat.Med.，2：795-799(1996)；Yasuda，Biomed.Ther.，27：1221-1223(1993)；Hora等，Bio/Technologv 8：755-758(1990)；在Powell和Newman编著的Vaccine Design：The Subunit and Adjuvant Approach(Plenum Press：New York，1995)一书中第439-462页，Cleland，″Design and Production of SingleImmunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems″；WO 97/03692，WO 96/40072，WO 96/07399；和美国专利5654010。
使用聚乳酸-共羟基乙酸(PLGA)聚合物来制备TCCR分子的持续释放制剂，该聚合物具有生物相容性很宽范围的生物降解特性。PLGA的降解产物，即乳酸和羟基乙酸，在体内被快速清除。而且，可以根据该聚合物的分子量和构成来调节其降解特性，可以是数月到数年不等。进一步信息见M.Chasin和R.Langer(编著)，Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems(Marcel Dekker：New York，1990)一书中第1-41页，Lewis，″Controlled releaseof active agents from lactide/glycolide polymer″。
9.TCCR激动剂和拮抗剂的鉴定
发明包括筛选化合物的方法，以鉴定那些模拟或增强TCCR多肽效应(激动剂)或者阻止或抑制TCCR多肽一种或多种功能或活性(拮抗剂)的化合物。优选地，此类拮抗剂和激动剂是TCCR变体、肽片段小分子、反义寡核苷酸(DNA或RNA)或抗体(单克隆抗体、人源化抗体、特异抗体、单链抗体、异源偶联抗体或前述这些抗体的片段)。此外，TCCR拮抗剂可包括潜在的TCCR配体，而潜在的TCCR激动剂可包括可溶性TCCR细胞外结构域(ECD)。
拮抗剂和/或激动剂候选药物的筛选试验，目的是鉴定与由本文确定的基因编码的TCCR多肽结合或复合的化合物，或者相反，鉴定那些干扰编码多肽与其它细胞蛋白质相互作用的化合物。此类筛选试验包括使用高通过量化学数据库筛选分析，使之特别适于鉴定小分子候选药物。
试验可按照任何方式进行，包括蛋白质-蛋白质结合分析、生化筛选分析、免疫测定和基于细胞的分析，这些分析方法在本领域已被很好描述。
本文所述筛选拮抗剂的试验的共同之处是：在控制条件下，使候选药物与TCCR多肽接触足够时间以使得这两种组分充分相互作用。
适宜于鉴定TCCR拮抗剂和激动剂的有用实例已在前面第7.候选药物筛选试验中确定。
作为拮抗剂试验的附加实例，可将TCCR多肽与被筛选化合物一起加入到细胞中，一定活性和能力的化合物抑制共存的TCCR多肽的有关活性，则表明化合物是TCCR多肽的拮抗剂。或者，在适当条件下使TCCR多肽和潜在拮抗剂与结合在膜上的TCCR多肽受体或重组受体结合，通过竞争性抑制实验来检测拮抗剂。可标记TCCR多肽，如放射性标记，这样，与受体结合的TCCR多肽分子的数量，就可用于测定潜在拮抗剂的效力。使用本领域已知的众多方法，例如，配体淘选和FACS分选，可以鉴定编码受体的基因。Coligan等，Current Protocols in Immun.，1(2)：Chapter 5(1991)。优选使用表达克隆，其中多聚腺苷酸化RNA是从对TCCR多肽易感细胞中制备的，由该RNA建立的cDNA文库被分成数个库，用于转染COS细胞或其它对TCCR多肽不易感的细胞。使玻璃载波片上生长的转染细胞与标记的TCCR多肽接触。可用各种方法标记TCCR多肽，包括位点特异蛋白激酶识别位点的碘化或包埋(inclusion)。固定和孵育后，载玻片接受放射自显影分析。鉴定阳性库，制备亚-库(sub-pool)，并使用交互作用性亚-库进行再转染，重新进行筛选过程，直至得到编码推定受体的单个克隆。
在拮抗剂另一分析方法中，在候选化合物存在的条件下，哺乳动物细胞或表达受体的膜制品与标记的TCCR多肽孵育。然后测定化合物增强或阻断相互作用的能力。
潜在拮抗剂的更特异实例，包括与免疫球蛋白和TCCR多肽的融合物结合的寡核苷酸，特别是抗体，包括但不限于多克隆和单克隆抗体及抗体片段、单链抗体、抗-独特型抗体，和嵌合抗体或人源化抗体或抗体片段，以及人抗体和抗体片段。或者，潜在拮抗剂是密切相关的蛋白质，例如，TCCR多肽的变种，后者识别受体但不引起效应，从而竞争性抑制TCCR多肽的作用。最后，另一潜在TCCR拮抗剂是TCCR ECD，后者与可利用的配体竞争，有效地使天然TCCR受体信号释放(free)。
另一潜在TCCR多肽拮抗剂是使用反义技术制备的反义RNA或DNA构建体，其中例如，反义RNA或DNA分子通过与靶mRNA杂交和阻止蛋白质翻译，起着直接阻断mRNA翻译的作用。通过三链螺旋结构形成或反义DNA或RNA，反义技术可用于控制基因表达，两种方法均建立在多聚核苷酸与DNA或RNA结合的基础上。
例如，多聚核苷酸序列的5′编码部分，该部分编码本文所述成熟TCCR多肽，被用于设计约10～40个碱基对长度的反义RNA寡核苷酸。DNA寡核苷酸被设计成参与转录的基因区的互补链(三链螺旋参见Lee等，Nucl.Acids Res.，6：3073(1979)；Cooney等，Science，241：456(1988)；Dervan等，Science，251：1360(1991))，由此阻止转录和TCCR多肽产生。反义RNA寡核苷酸在体内与mRNA杂交，阻断mRNA分子翻译成TCCR多肽(反义，见Okano，Neurochem.，56：560(1991)；寡脱氧核苷酸作为基因表达的反义抑制剂(CRC Press：Boca Raton，FL，1988)。也可把上述寡核苷酸释放入细胞中，这样反义RNA或DNA可在体内表达，而抑制TCCR多肽的产生。当使用反义DNA时，优选衍生自翻译起始位点的寡脱氧核苷酸，例如，靶基因核苷酸序列的约-10和+10位。
潜在的拮抗剂包括与活性位点结合的小分子、受体结合位点、或生长因子或TCCR多肽其它相关结合位点，从而阻断TCCR多肽的正常生物活性。小分子的实例包括但不限于，小肽或类-肽分子，优选溶解的肽和合成的非-肽有机或无机化合物。
核酶是能够催化RNA特异性裂解的具有酶性质的RNA分子。核酶通过序列-特异性杂交于靶RNA互补链，接着通过核酸内裂解而发挥作用。使用已知技术，可以鉴定位于潜在RNA靶内的特异核酶裂解位点。进一步的细节请参见例如Rossi，Current Biology，4：469-471(1994)，和PCT出版物WO97/33551(1997年9月18日公布)。
用于抑制转录的三链螺旋构型的核酸分子，应当是单链并由脱氧核苷酸构成。这些寡核苷酸碱基组成是设计好的，这样它通过Hoogsteen碱基对原则促进三链螺旋的形成，这一般需要双螺旋中一条链上的嘌呤或嘧啶相当大的延伸。更详细情况请参见例如，PCT出版物WO 97/33551，出处同上。
用上述讨论的任何一个或多个筛选试验，和/或使用本领域技术人员熟知的任何其它筛选技术，可以鉴定这些分子。
10.TCCR和基因治疗
也可将编码TCCR多肽的核酸用于基因治疗。在基因治疗应用中，将基因引入细胞以便达到在体内合成治疗有效的基因产物，例如置换缺陷基因。″基因治疗″既包括经单次治疗就可获得永久效果的常规基因治疗，也包括基因治疗剂的给药，后者涉及一次或重复多次施用治疗有效量的DNA或mRNA。反义RNA和DNA可用作阻断体内特定基因表达的治疗剂。业已证明，短链反义寡核苷酸可整合入细胞中，在所述细胞中，短链反义寡核苷酸起抑制剂的作用，而不论由于细胞膜的限制性摄取所导致其低细胞内浓度如何。(Zamecnik等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：4143-4146[1986])。可修饰寡核苷酸以增强其摄取，例如用不带电荷的基团取代带阴性电荷的磷酸二酯。
有各种可利用的技术来把核酸引入到活细胞中。技术依是否将核酸转移进体外培养细胞或意欲的宿主体内细胞中而异。将核酸转移入哺乳动物体外细胞的适宜技术，包括使用脂质体、电穿孔、显微注射、细胞融合、DEAE-葡聚糖、磷酸钙沉淀法等。目前流行的体内基因转移技术，包括用病毒(通常为逆转录病毒)载体转染和用病毒包衣蛋白质-脂质体介导的转染(Dzau等，Trends in Biotechnology 11，205-210[1993])。有些情况下，希望提供带有针对靶细胞的物质的核酸源，所述物质如对细胞表面膜蛋白具有特异性的抗体，或靶细胞上受体的配体等。使用脂质体时，将与参与胞吞的细胞表面膜蛋白结合的蛋白质用作靶向和/或促进摄取的物质，例如对特定型细胞具有向性的病毒壳体蛋白或其片段、在循环中发生内化的蛋白质的抗体、靶向于细胞内定位(localization)并增加细胞内半衰期的蛋白质。有关受体-介导的胞吞的技术在例如Wu等，J.Biol.Chem.262，4429-4432(1987)；和Wagner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，3410-3414(1990)中有描述。关于基因标志和基因治疗方案的综述，请参见Anderson等，Science 256，808-813(1992)。
11.抗体
本发明进一步提供抗-TCCR抗体。例举性抗体包括多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、双特异抗体和异源偶联抗体。
i.多克隆抗体
抗-TCCR抗体包括多克隆抗体。制备多克隆抗体的方法为本领域熟练技术人员所已知。多克隆抗体可在哺乳动物中产生，例如，通过一次或多次注射致免疫剂，如果需要，可加入佐剂。通常，对哺乳动物皮下或腹膜内多次注射致免疫剂和/或佐剂。致免疫剂可包括TCCR多肽或其融合蛋白。将致免疫剂与针对所免疫的哺乳动物具有免疫原性的蛋白进行偶联是有效的。所述免疫原性蛋白的实例包括但不限于：匙孔血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白和大豆胰蛋白酶抑制剂。可以使用的佐剂的实例包括弗氏完全佐剂和MPL-TDM佐剂(单磷脂酰脂质A，合成的海藻糖双白喉菌酸酯(dicorynomycolate))。无需繁琐的试验，本领域技术人员就可选择致免疫方案。
ii.单克隆抗体
或者，抗-TCCR抗体是单克隆抗体。可以使用杂交瘤方法制备单克隆抗体，如Kohler和Milstein在Nature，256：495(1975)中描述的方法。在杂交瘤方法中，通常用致免疫剂免疫小鼠、仓鼠或其它适宜宿主动物，以引发产生或能够产生将与致免疫剂特异性结合的抗体的淋巴细胞。或者，在体外致敏淋巴细胞。
致免疫剂通常包括TCCR多肽或其融合蛋白。一般而言，如果需要来源于人的细胞，则使用外周血淋巴细胞(“PBLs”)，如果需要非人哺乳动物来源的细胞，那么就使用脾细胞或淋巴结细胞。然后，使用适宜的融合试剂如聚乙二醇，将淋巴细胞与无限增殖细胞系融合，从而形成杂交瘤细胞[Goding，单克隆抗体：Principles和Practice，Academic Press，(1986)59-103页]。无限增殖细胞系通常是转化的哺乳动物细胞，特别是啮齿类、牛和人类起源的骨髓瘤细胞。通常使用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。可在适宜培养基中培养杂交瘤细胞，所述培养基优选含有一种或多种抑制未融合的无限增殖细胞生长或生存的物质。例如，母代细胞缺乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，杂交瘤的培养基通常包括次黄嘌呤、氨蝶呤和胸苷(″HAT培养基″)，这些物质抑制HGPRT-缺陷型细胞生长。
优选的无限增殖细胞系，是那些有效融合、支持筛选出的抗体-生成细胞稳定地高水平表达抗体，并且对培养基如HAT敏感的细胞系。更优选的无限增殖细胞系是小鼠骨髓瘤系，后者可得自例如Salk Institute CellDistribution Center，San Diego，California和美国典型培养物保藏中心，Manassas，Virginia。人骨髓瘤和小鼠-人杂交骨髓瘤细胞系也已用于产生人单克隆抗体[Kozbor，J.Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur等，Monocloneantibody Production Techniques and Applications，Marcel Dekker，Inc.，NewYork，(1987)pp.51-63]。
接下来，可以检定培养杂交瘤细胞的培养基中是否存在直接抗TCCR的单克隆抗体。优选地，用免疫沉淀或体外结合试验如放免分析(RIA)或酶联免疫吸附分析(ELISA)，来测定杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性。这些技术和试验分析方法是本领域所已知的。使用例如Scatchard analysisof Munson和Pollard，Anal.Biochem.，107：220(1980)公开的方法，可以测定单克隆抗体的结合亲和力。
鉴定出所需的杂交瘤细胞之后，经有限稀释法将克隆进行亚克隆处理并采用标准方法使之生长[Goding，出处同上]。用于此目的适宜的培养基包括例如，Dulbecco′s改进的Eagle′s培养基和RPMI-1640培养基。或者，杂交瘤细胞可在哺乳动物体内以腹水形式生长。
使用常规免疫球蛋白纯化方法，例如蛋白质A-琼脂糖凝胶、羟基磷灰石层析法、凝胶电泳、渗析或亲和层析，可以从培养基或腹水中分离或纯化由亚克隆分泌的单克隆抗体。
也可使用重组DNA方法生产单克隆抗体，例如在美国专利4816567中描述的方法。使用常规技术(例如，使用能够与编码小鼠抗体重链和轻链的基因特异结合的寡核苷酸探针)，很容易地分离编码本发明单克隆抗体的DNA并进行序列测定。本发明的杂交瘤细胞作为此DNA的优选来源。一旦分离出该DNA，就可将其植入到表达载体中，然后用后者转染宿主细胞，所述宿主细胞如猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或不产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞，以便在重组宿主细胞中合成单克隆抗体。也可对DNA进行修饰，例如人重链和轻链恒定区的编码序列被相应的鼠序列置换[美国专利4816567；Morrison等，出处同上]，或者将非-免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列共价连接到免疫球蛋白的编码序列上。可用此类非-免疫球蛋白多肽取代本发明抗体的恒定区，或者取代本发明抗体一个抗原结合位点的可变区，以产生嵌合二价抗体。
抗体可以是单价抗体。制备单价抗体的方法为本领域所已知。例如，有一个方法涉及免疫球蛋白轻链和修饰后重链的重组表达。通常在Fc区的任何位点将重链截短，从而防止重链交联。或者，用其它氨基酸残基代替相关的半胱氨酸残基或者半胱氨酸残基缺失以防止交联。
体外方法也适于制备单价抗体。使用本领域常规技术可以完成抗体消化而产生抗体片段，特别是Fab片段。
iii.人抗体和人源化抗体
本发明抗-TCCR抗体进一步包括人源化抗体或人抗体。非-人(例如小鼠)的人源化抗体是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其包含非人免疫球蛋白最小序列的片段(如Fv，Fab，Fab′，F(ab′)2或抗体的其他抗原结合亚序列)。人源化抗体包括受者人免疫球蛋白(受者抗体)中互补决定区(CDR)残基被具有所需特异性、亲和力和性能的小鼠、大鼠、家兔等非人源物种抗体(供体抗体)的CDR残基所取代。在一些实例中，人免疫球蛋白的Fv框架区残基由相应的非人类残基所取代。人源化抗体也可包含受者抗体或供体CDR或框架序列中均不存在的残基。通常，人源化抗体基本上包括至少一个、通常两个可变区的全部，其中CDR的全部或基本上全部对应于非人免疫球蛋白的相应部分，而FR序列的全部或基本上全部是人免疫球蛋白序列。人源化抗体还任选包括免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常为人免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。详见Jones等，Nature，321：522-525(1986)；Riechmann等，Nature，332：323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。
人源化非-人抗体的方法是本领域技术人员所已知的。通常，人源化抗体中已导入一或多个源自非人类的氨基酸残基。这些非人类氨基酸残基常称为“引进的”残基，它们通常来自“引进的”可变区。人源化过程基本如Winter及其同事(Jones等，Nature，321：522-525(1986)；Riechmann等，Nature，332：323-327(1988)；Verhoeyen等，Science，239：1534-1536(1988))所述，用一个或多个CDR序列取代人类抗体的相应序列来进行。因此，这样的“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利4816567)，其中完整人类可变区的很少一部分被非人类物种的相应序列取代。实践中，人源化抗体通常是人的抗体，其中一些CDR残基且可能有部分FR残基被啮齿类抗体中类似位点的残基取代。
使用本领域已知的各种技术可以制备人抗体，所述方法包括噬菌体展示文库[Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.，227：381(1991)；Marks等，J.Mol.Biol.，222：581(1991)]。也可使用Cole等和Boemer等描述的技术制备人单克隆抗体[Cole等，Monoclonal Antibody and Cancer Therapy，Alan R.Liss，(1985)第7页，和Boerner等，J.Immunol.，147 1：86-95(1991)]。类似地，通过把人免疫球蛋白的基因座插入转基因动物例如鼠来生产人抗体，所述宿主动物的内源性免疫球蛋白基因已被部分或全部灭活。攻击后，观察到人抗体产生，这在各个方面均与在人体所见的极为相似，包括基因重排、装配和抗体所有组成成分。有关进展在例如下列专利和科学出版物中作了描述：美国专利5545807；5545806；5569825；5625126；5633425；5661016；Marks等，Bio/Technologv 10，779-783(1992)；Lonberg等，Nature 368 856-859(1994)；Morrison，Nature 368，812-13(1994)；Fishwild等，Nature Biotechnologv 14，845-51(1996)；Neuberger，Nature Biotechnology 14，826(1996)；Lonberg和Huszar，Intern.Rev.Immunol.13 65-93(1995)。
使用前述已知的选择和/或诱变方法，也可以使抗体亲和力成熟。优选的亲和力成熟抗体，较制备成熟抗体所用起始抗体(通常为鼠抗体、人源化抗体或人抗体)的亲和力大5倍，更优选10倍，甚至更优选20或30倍。
iv.双特异抗体
双特异抗体是单克隆抗体，优选具有针对至少两种不同抗原的结合特异性的人抗体或人源化抗体。在本发明中，一种结合特异性针对TCCR，另一种针对其它抗原，优选针对细胞表面蛋白质或受体或受体亚单位。
制备双特异抗体方法为本领域所已知。通常，双特异性抗体的重组产生是基于两种免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中两条重链具有不同特异性(Millstein等，Nature，305：537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(细胞杂交瘤(quadroma))可能产生10种不同抗体分子的混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和层析步骤来完成所述正确分子的纯化。类似的方法公开在WO93/08829和Traunecker等，EMBO J，10：3655-3659(1991)中。
可将具有所需结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变区与免疫球蛋白恒定区序列融合。该融合优选与包含铰链区、CH2及CH3区的至少一部分的免疫球蛋白重链恒定区融合。优选使含有轻链结合所需位点的第一重链恒定区(CH1)出现在至少在一种融合中。可将编码免疫球蛋白重链融合体，以及必要时，编码免疫球蛋白轻链的DNA插入不同表达载体，共转染至适当宿主生物。产生双特异抗体的进一步细节内容，请参见例如Suresh等，Methods in Enzymology，121：210(1986)。
根据WO 96/27011所述的另一种方法，可改造一对抗体分子之间的界面，使得从重组细胞培养中获得的异源二聚体的百分比最大。优选的界面包括抗体恒定区CH3结构域的至少一部分。在该方法中，源于第一抗体分子界面上的一条或多条氨基酸小侧链被较大侧链(如酪氨酸或色氨酸)取代。与所述大侧链大小相同或相近的互补“沟”可通过将氨基酸大侧链用小侧链(如丙氨酸或苏氨酸)取代而在第二抗体分子的界面上形成。这使得异二聚体的产量比不想要的终产物如同型二聚体的高。
双特异抗体可以制备成全长抗体或抗体片段(如F(ab’)2双特异抗体)。从抗体片段制备双特异性抗体的技术已有文献描述。例如，双特异性抗体可利用化学连接制备。Brennan等，Science，229：81(1985)中描述了将完整抗体经蛋白水解制备片段的方法。这些片段在二巯基复合剂亚砷酸钠存在时被还原，从而稳定相邻的巯基，并阻止分子间二硫键的形成。生成的Fab’片段被转化为硫硝基苯甲酸盐(TNB)衍生物。然后，其中一种Fab’-TNB衍生物经巯基乙胺还原成Fab’-硫醇，再与等分子量的其它Fab’-TNB衍生物混合形成双特异性抗体。如此产生的双特异性抗体可用作酶的选择性固相化中的试剂。
Fab’片段可从大肠杆菌中直接回收并且经化学偶联而形成双特异性抗体。Shalaby等在J.Exp.Med.175：217-225(1992)中描述了完全人源化双特异性抗体F(ab’)2分子的产生。每一Fab’片段分别从大肠杆菌中分泌出来，在体外被直接化学偶联从而形成双特异性抗体。如此制备的双特异性抗体能与过度表达ErbB2受体的细胞和正常人T细胞结合，还能引发人类细胞毒淋巴细胞对人乳腺肿瘤细胞的裂解活性。
直接从重组细胞培养物中制备并分离双特异性抗体片段的多种技术也已有描述。例如，可用亮氨酸拉链制备双特异性抗体。Kostelny等，J.Immunol.，148(5)：1547-1553(1992))。将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽与两种不同抗体的Fab′部分通过基因融合而连接。使抗体的同型二聚体在铰链区被还原成单体，然后被再氧化形成抗体的异二聚体。该方法也可用于制备抗体同型二聚体。由Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993)描述的“二价抗体”技术，提供了另一种制备双特异性抗体片段的方法。所述片段中含有重链可变区(VH)，其通过接头与轻链可变区(VL)相连，该接头非常短，使得同一链的两个结构域之间无法配对。因此，同一片段上的VH和VL结构域被迫与另一片段上的互补VL和VH结构域配对，从而形成两个抗原结合位点。此外还报道了另一种用单链Fv(sFv)二聚体来制备双特异性抗体的策略。见Gruber等，免疫学杂志，152：5368(1994)。还考虑了二价以上的抗体。如可制备三特异性抗体。Tutt等，J.Immunol.，147：60(1991)。
例证性双特异性抗体可与本文指定的TCCR多肽上的两种不同表位结合。或者，可将抗-TCCR多肽臂与结合在白细胞上引发分子的臂结合，从而强化针对表达特定TCCR多肽细胞的细胞防御机制，所述引发分子如T细胞受体分子(CD2、CD3、CD28或B7)，或IgG Fc受体(FcγR)如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)。双特异性抗体还可用于将细胞毒制剂定位至表达特定TCCR多肽的细胞上。这些抗体具有TCCR-结合臂和结合细胞毒制剂或放射性同位素半抗原的臂，如EOTUBE、DPTA、DOTA或TETA。另一有关的双特异抗体结合TCCR多肽并且进一步结合组织因子(TF)。
v.异源偶联抗体
异源偶联的抗体由两个共价连接的抗体组成。有观点认为，这类抗体可用于将免疫细胞导向不想要的细胞(美国专利4676980)，也可用于治疗HIV感染(WO91/00360，WO92/200373，EP03089)。可考虑使用蛋白化学合成中已知方法，包括涉及使用交联剂，在体外制备异源偶联抗体。举例来说，使用二硫化物交换反应或通过形成硫醚键，可以构建免疫毒素。用于此目的适当试剂的实例，包括免疫硫醇盐和甲基-4-巯基，巯基butyrimidate以及例如在美国专利4676980中描述的那些。
vi.效应物功能的工程改造
在效应物功能方面可能希望改进本发明的抗体，以增强在治疗(例如治疗癌症)时的效果。例如，可在Fc区域中引入半胱氨酸残基，从而在该区域中形成链间二硫键。这样制得的均二聚体可能有改进的内化能力和/或提高的补体介导细胞杀伤能力及依赖于抗体的细胞毒性(ADCC)。参见Caron等，J.Exp Med.176：1191-1195(1992)和Shopes，B.J.Immunol.148：2918-2922(1992)。也可如Wolff等，Cancer Research 53：2560-2565(1993)描述的那样，用异二聚功能性交联剂来制备抗肿瘤活性增强的均二聚抗体。或者，可将抗体工程改造成具有双Fc区，从而可能增强补体裂解和ADCC能力。见Stevenson等，Anti-Cancer Drug Design 3：219-230(1989)。
vii.免疫偶联物
本发明还涉及含有与细胞毒性剂偶联的抗体的免疫偶联物，所述细胞毒性剂如化疗剂、毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放射偶联物)。
适用于制备这类免疫偶联物的化疗剂已在上文作过描述。可以应用的酶活性毒素及其片段包括：白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单孢菌)、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒素A链、α-帚曲毒素、油桐(Aleutites fordii)蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆(Phytolaca Americana)蛋白(PAPI，PAPII，PAP-S)、苦瓜(momordicacharantia)抑制因子、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonariaofficinalis)抑制剂，白树毒素，米托菌素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素和单端孢菌毒素(tricothecenes)。多种放射性同位素可用于制备放射性偶联的抗ErbB2抗体，实例包括Bi212、I131、In131、Y90和Re186。
抗体与细胞毒性剂的偶联物可通过多种双功能蛋白偶联剂来连接，所述双功能蛋白偶联剂如：N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二巯基)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨甲基)环己烷-1-羧酸酯，亚氨基硫烷(iminothiolane)(IT)，亚氨酸酯的双功能衍生物(如亚氨基己二酸二甲酯盐酸盐)，活性酯类(如二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)，醛类(如戊二醛(glutareldehyde))，双-叠氮化合物(如双(对-叠氮基苯甲酰基)己二胺)，双-重氮衍生物(如双-(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)，二异氰酸酯(如亚甲代苯基2，6-二异氰酸酯)，和双-活性氟化合物(如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒蛋白免疫毒素可如Vitetta等，科学238：1098(1987)所述制备。C14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三氨五乙酸酯(MX-DTPA)是将放射性核苷酸偶联至抗体的偶联剂之一。见WO94/11026。
在另一实施方案中，抗体可与组织预靶向中使用的“受体”(如链霉抗生物素蛋白)偶联，将该抗体-受体偶联物施用于患者，之后用清除剂除去循环中未结合的偶联物，再施用已偶联了细胞毒性剂(如放射性核苷酸)的“配体”(如抗生物素蛋白)。
viii.免疫脂质体
本文公开的蛋白质、抗体，还可制备成免疫脂质体。含抗体的脂质体可通过本领域已知方法制备，如Epstein等，Proc.Natl Acad.Sci.USA 82：3688(1985)；Hwang等，Proc.Natl Acad.Sci.USA 77：4030(1980)；美国专利4485045和4544545及1997年10月23日公开的WO97/38731。在美国专利5013566中公开了增加了循环时间的脂质体。
特别有用的脂质体，可利用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物经反相蒸发法而制得。脂质体挤压通过限定孔径的滤膜，获得具有所需直径的脂质体。本发明抗体的Fab’片段，可如Martin等在J.Biol.Chem，257：286-288(1982)中所述的那样，经二硫化物交换反应与脂质体偶联。在所述脂质体中可任选包含一种化疗剂。见Gabizon等，J.National Cancer Inst，81(19)1484(1989)。
ix.抗-TCCR-抗体的用途
本发明抗-TCCR抗体具有多种用途。例如，抗-TCCR抗体可用于TCCR的诊断分析，譬如，检测TCCR在特定细胞、组织或血清的表达。可使用本领域已知的各种诊断分析试验，如竞争性结合试验、直接和间接夹心试验及异源或同源相进行的免疫沉淀试验[Zola，Monoclonal Antibody：技术指南，147-158页(CRC Press，Inc.1987)]。还可将诊断中所用抗体标记上可检测部分。可检测部分应当能够直接或间接产生可测得信号。例如，可测得部分是放射性核素如3H、14C、32P、35S或125I，荧光或化学发光化合物如荧光素异硫氰酸盐、蓝光碱性蕊香红或萤虫素，或者酶如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或辣根过氧化物酶。本领域已知的将抗体与可检测分偶联的任何方法均可使用，包括在Hunter等，Nature，144：945(1962)；David等，Biochemistry，13：1014(1974)；Pain等，J.Immunol.Meth.，40：219(1981)；和Nygren，J.Histochem.和Cytochem.，30：407(1982)中描述的方法。
抗-TCCR抗体也适用于从重组细胞培养物或天然来源中亲和纯化TCCR。在该过程中，使用本领域已知方法将抗TCCR抗体固定在适当载体上，所述载体如交联葡聚糖树脂或滤纸。然后，将固定的抗体与含有欲纯化TCCR的样品接触，接下来用能够基本上将样品中与固定载体结合的TCCR之外的所有物质去除的适宜溶剂洗涤载体。最后，用能从抗体中释出TCCR的另一适宜溶剂洗涤载体。
10.药物组合物
为治疗免疫相关疾病，可以药学组合物形式施用本发明活性分子、多肽和抗体以及前述用筛选试验鉴定的其它分子。
为了靶向TCCR的细胞内部分或靶向仍位于细胞内的TCCR多肽，则优选内化抗体。另外，也可用脂质转染物或脂质体来把抗体或抗体片段释放至细胞内。使用抗体片段时，优选与靶蛋白质结合域特异结合的最小抑制性片段。例如，基于抗体可变区序列，可把肽分子设计为保持与靶蛋白质序列结合能力。此类肽可以化学合成和/或用重组DNA技术产生。参见例如Marasco等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：7889-7893(1993)。
活性分子优选本发明多肽或抗体，其治疗制剂如下制备：将具有所需纯度的抗体与任选的药用载体、赋形剂或稳定剂(雷氏药学(Remington’sPharmaceutical Sciences)第16版，Osol，A.编(1980))混合，然后以冻干剂或含水剂的形式保存。可药用载体、赋形剂、稳定剂在所用剂量及浓度下对受治者无毒性，并包括缓冲剂例如磷酸盐，柠檬酸盐及其它有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵，苯索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；烷基对羟基苯甲酸酯，如甲基或丙基对羟基苯甲酸酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖及其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂如EDTA；糖类，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐反离子如钠；金属复合物(例如锌-蛋白复合物)；和/或非离子表面活性剂，如吐温TM，PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
使用本领域熟知的标准技术，可以类似方式制备经本发明筛选试验鉴定的化合物。
对于被治疗的特定适应征而言，如果必要，本文制剂也可含有一种以上的活性化合物，优选那些彼此间具有互补活性而没有不利影响的活性化合物。或者或另外，组合物可含有细胞毒性剂、细胞因子或生长抑制剂。这些分子的联合用量是对意欲治疗目的而言的有效量。
也可将活性组分包封在按照例如凝聚技术或界面聚合技术制备的微胶囊中，例如，分别在胶态药物释放系统(例如脂质体，白蛋白微球体，微乳剂，纳米颗粒和毫微胶囊)或粗滴乳化剂中的羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。这些技术公开在Remington′s PharmaceuticalSciences，16th edition，Osol，A.Ed.(1980)中。
用于体内给药的制剂必须是无菌的。这可以通过除菌滤膜过滤而轻易实现。
也可制备控释制剂。控释制剂的适当实例包括含有抗体的固态疏水聚合物的半通透性基质，所述基质为具有一定形状的制品，如膜或微胶囊。控释制剂实例包括聚酯、水凝胶(如聚(2-羟基乙基-异丁烯酸酯)或聚(乙烯醇)，聚交酯(美国专利3773919)，L-谷氨酸与γ乙基-L-谷氨酸酯的共聚物，不可降解的乙烯乙酸乙酯，可降解的乳酸-羟基乙酸共聚物如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-羟基乙酸共聚物和亮氨酰脯氨酸(leuprolide)乙酸酯组成的可注射的微球体)，以及聚D-(-)-3-羟丁酸。尽管聚合物如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-羟基乙酸能持续释放分子100天以上，但是某些水凝胶释放蛋白的时间却较短。当胶囊化的抗体长时间停留在体内时，它们会由于暴露在37℃水分下而变性或凝聚，从而导致生物活性损失，且免疫原性可能会改变。可以根据涉及的机理来设计稳定化的合理策略。例如，如果发现凝聚的机理是通过硫代二硫键互换而形成了分子间S-S键，则可通过修饰巯基残基、自酸性溶液中冻干、控制湿度程度、采用合适的添加剂和开发特殊的聚合物基质组合物来达到稳定化。
11.治疗方法
考虑到将多肽、抗体和本发明其它活性化合物用于治疗各种免疫相关疾病和病症，如T细胞介导的疾病，包括那些以炎症细胞浸润到组织中，刺激T-细胞增殖，抑制T-细胞增殖，增加或降低或者抑制血管通透性为特征的疾病。
用多肽、抗体和本发明其它化合物治疗的例证性病症或障碍包括但不限于：系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、幼年慢性关节炎、骨关节炎、脊椎关节炎、系统性硬化病(硬皮病)、特发性炎症性肌病(皮肌炎，多肌炎)、斯耶格伦氏综合征(Sjogretis syndrome)、全身性脉管炎、类肉瘤病、自身免疫性溶血性贫血(免疫性全血细胞减少，睡眠性血红蛋白尿症)、自身免疫性血小板减少症(特发性血小板减少性子癜，免疫-介导的血小板减少症)、甲状腺炎(格雷夫斯病(Grave′s disease)，桥本甲状腺炎(Hashimoto′s thyroiditis)，幼年淋巴细胞性甲状腺炎，萎缩性甲状腺炎)、糖尿病、免疫-介导的肾脏疾病(肾小球肾炎，小管间质性肾炎)、中枢和外周神经系统脱髓鞘疾病(如多发性硬化，特发性脱髓鞘性多神经病或格-巴二氏综合征(Guillain-Barresyndrome)及慢性-炎症性脱髓鞘性多神经病)、肝胆管疾病(如传染性肝炎(A、B、C、D、E型肝炎和其它非-亲肝病毒性肝炎)，自身免疫性慢性活动性肝炎，原发性胆汁性肝硬变，肉芽肿性肝炎和硬化性胆管炎)、炎性肠道疾病(溃疡性结肠炎：克罗恩氏病)、谷蛋白-敏感性肠病和惠普耳氏病(Whipple′sdisease)、自身免疫性或免疫-介导的皮肤病(包括大疱性皮肤病，多形红斑和接触性皮炎，牛皮癣)、过敏性疾病(如哮喘，过敏性鼻炎，特应性皮炎，食物高敏症和荨麻疹)、肺免疫性疾病(如嗜酸细胞性肺炎，特发性肺纤维化症和过敏性肺炎)、移植有关的疾病(包括移植排斥和移植物抗宿主病)。
在系统性红斑狼疮中，疾病的中枢介体是针对自身蛋白/组织的自体-反应抗体的产生，接着发生免疫-介导的炎症。抗体直接或间接介导组织损伤。尽管尚未证实T淋巴细胞直接参与组织损伤，但是T淋巴细胞在产生自体-反应抗体的过程中是必需的。因此，疾病的发生是T淋巴细胞依赖性的。临床上表现为累及多个器官和系统，包括肾、肺、肌肉骨骼系统、皮肤粘膜、眼、中枢神经系统、心血管系统、胃肠道、骨髓和血液。
类风湿性关节炎(RA)是主要累及多个关节滑膜以致造成关节软骨损伤的慢性全身性自身免疫性炎性疾病。其发病是T淋巴细胞依赖性的并且与类风湿因子的产生有关，所述类风湿因子是直接针对自身IgG的自体-抗体，结果造成免疫复合物形成并在关节液和血液中达到很高水平。关节中的这些免疫复合物，可以诱导大量的淋巴细胞和单核细胞浸润进入滑膜，继而引起显著的滑膜变化；关节腔隙/关节炎被类似细胞以及大量中性粒细胞浸润。受累组织主要是关节，经常呈对称性。然而，也发生两种主要形式的关节外疾病。一种是随着关节疾病紧展而发生的关节外损害，代表性损害是肺纤维化、结节性脉管炎和皮肤溃疡。第二种形式的关节外疾病是所谓的费尔蒂综合征(Felty′s syndrome)，它发生在RA疾病病程的晚期，有时出现在关节疾病已经处于静止期之后，涉及中性白细胞减少症、血小板减少症和脾肿大。并可伴有多器官中伴随梗塞形成的结节性脉管炎、皮肤溃疡和坏疽。患者受累及关节的皮下组织中还出现类风湿结节；晚期结节具有被混合炎症细胞浸润围绕的坏死中心。RA可发生的其它表现包括：心包炎、胸膜炎、冠状动脉炎、伴有肺纤维化的肠性肺炎、干燥性角膜结膜炎和类风湿结节。
幼年慢性关节炎，是常常低于16岁即开始发病的慢性特发性炎性疾病。其表型与RA有某些相似性；其中一些类风湿因子阳性的患者分类为幼年类风湿性关节炎。该疾病再细分为三种主要类型：少关节幼年型类风湿性关节炎、多关节幼年型类风湿性关节炎和全身性幼年型类风湿性关节炎。关节炎可以非常严重并且通常是破坏性的，因而导致关节强硬和生长迟缓。其它临床表现包括慢性前眼色素层炎和系统性淀粉样变性。
脊椎关节炎是一组具有一些共同临床特征和与HLA-B27基因产物有共同关系的病症。病症包括：强直性脊椎炎、莱特尔氏综合征(反应性关节炎)、与炎性肠道疾病有关的关节炎、与牛皮癣有关的脊椎炎、幼年发病的脊椎关节炎和未分化型脊椎关节炎。区别特征包括：伴有或不伴有脊椎炎的骶髂关节炎；炎性不对称关节炎；与HLA-B27(血清学定义的I类MHCHLA-B基因座的等位基因)有关的症状；眼部炎症和与其它类风湿性疾病有关的自体抗体的缺乏。推断诱导疾病的最关键细胞细胞是CD8+T淋巴细胞，它是靶向I类MHC分子呈递的抗原的细胞。CD8+T细胞可能对I类MHC等位基因HLA-B27进行应答，就好象后者是MHC I类分子表达的外来肽一样。已有这样的假定：HLA-B27的表位可能摹拟细菌性或其它微生物表位，从而诱导CD8+T细胞应答。
系统性硬化病(硬皮病)的病因学尚不清楚。该疾病的标志是皮肤硬化；皮肤硬化很可能是由活动性炎症过程引起的。硬皮病可以是局部的或者是全身性的；血管病变是共有的，而且微血管内皮细胞损伤是系统性硬化病发展的早期且重要事件；血管损伤可以是免疫介导的。皮肤病损中存在单核细胞浸润和许多患者存在抗-核抗体的事实，暗示着其发病的免疫学基础。皮肤病损中成纤维细胞的细胞表面ICAM-1常常上调，提示T细胞与这些细胞的相互作用可能在疾病的发病中起着某种作用。累及的其它器官包括，胃肠道：导致异常蠕动/能动性的平滑肌萎缩和纤维化；肾脏：累及小弓形动脉和小叶间动脉的同心性内皮下内膜增殖，造成肾皮质血流减少，导致蛋白尿、氮质血症和高血压；骨骼肌：萎缩、间质纤维化；炎症；肺：间质性肺炎和间质性纤维化；以及心脏：收缩性带状坏死、瘢痕形成/纤维化。
包括皮肌炎、多肌炎等的特发性炎性肌病是不明病因导致肌肉无力的慢性肌肉炎症性病症。肌肉损伤/炎症常常是对称性的和进展性的。自体抗体与大多数类型有关。这些肌炎-特异性自体抗体直接对抗和抑制参与蛋白质合成的组分、蛋白质和RNA的功能。
斯耶格伦氏综合征，是由于免疫-介导性炎症和继而出现泪腺和唾液腺功能破坏的病症。该疾病与炎性结缔组织病有关或者伴随有炎性结缔组织病。疾病与抗Ro抗原和抗La抗原的自体抗体的产生有关，所述两个抗原均是小RNA-蛋白质复合物。病变导致干燥性角膜结膜炎、口腔干燥症，伴有或相关的其它临床表现包括胆汁性肝硬化、外周或感觉神经病以及可触知的紫癜。
全身性脉管炎，是主要病变为炎症并继发血管损伤从而导致由受累血管供血的组织发生局部缺血/坏死/变性并在一些情况下最终以器官机能障碍为结局的疾病。脉管炎也可作为免疫炎症介导的疾病的二级损伤或后遗症而存在，所述疾病如类风湿性关节炎、系统性硬化病等，尤其是也与免疫复合物形成有关的疾病。属于原发性全身性脉管炎疾病一组的疾病包括，全身性坏死性血管炎：结节性多动脉炎、变应性脉管炎和肉芽肿病、多脉管炎；韦格内氏肉芽肿病；淋巴瘤样肉芽肿病；和巨细胞动脉炎。杂类脉管炎包括：皮肤粘膜淋巴结节综合征(MLNS或川崎病(Kawasaki′s disease))、孤立性CNS脉管炎、Behet′s疾病、闭塞性血栓性脉管炎(伯格氏病(Buerger′s disease))和皮肤坏死性血管炎。据信，所述大多数脉管炎的致病机制主要由于免疫球蛋白复合物在管壁沉积并继而通过ADCC、补体活化二者之一或者二者共同诱导炎症反应所致。
肉样瘤病，是不明原因的以机体几乎任何组织均存在上皮样肉芽肿为特征的病症；最常见的是累及肺。发病机理涉及疾病部位存留活化的巨噬细胞和淋巴样细胞，并继发由于这些类型细胞释放的活性产物的局部和系统性释放而致的慢性后遗症。
自体免疫性溶血性贫血，包括自身免疫溶血性贫血、免疫性全血细胞减少和发作性睡眠性血红蛋白尿症，它是抗体与红细胞(和有时包括血小板在内的其它血细胞)表面表达的抗原发生反应而导致的结果，并且是通过补体介导和/或ADCC/Fc-受体-介导的溶解去除那些抗体包被细胞的机理的反映。
自身免疫性血小板减少症，包括血小板减少性紫癜和其它临床背景中免疫-介导的血小板减少症，其中血小板破坏/除去的发生是抗体或补体附着于血小板并继而通过补体溶解、ADCC或者FC-受体介导的机理的结果。
甲状腺炎，包括格雷夫斯病，桥本甲状腺炎，幼年淋巴细胞性甲状腺炎和萎缩性甲状腺炎，是对甲状腺抗原自身免疫性应答伴有与甲状腺中存在并且常常是特异性的蛋白质进行反应的抗体产生的结果。现有的实验模型包括自发性模型：大鼠(BUF和BB大鼠)和鸡(肥胖鸡种系)甲状腺炎；诱导模型：用甲状腺球蛋白、甲状腺微粒体抗原(甲状腺过氧化物酶)免疫动物。
I型糖尿病或胰岛素-依赖性糖尿病是胰腺小岛β细胞的自身免疫性破坏；该破坏是由自体抗体和自体-反应T细胞介导的。胰岛素抗体或胰岛素受体也可产生胰岛素-非-应答表型。
免疫介导性肾脏疾病，包括肾小球性肾炎和小管间质性肾炎，是抗体或T淋巴细胞介导的对肾组织损伤的结果，所述损伤是直接由于针对肾抗原的自体反应抗体或T细胞产生所致，或者是间接地由于抗其它非-肾抗原的抗体和/或免疫复合物在肾脏沉积所致。因此，导致免疫-复合物形成的其它免疫-介导性疾病也可诱导作为间接后遗症的免疫介导性肾脏疾病。
直接和间接免疫机制导致肾脏组织产生/诱导损伤发展的炎症反应，结果造成器官功能障碍并在某些情况导致肾衰。体液免疫和细胞免疫机制均参与损伤的发病机制。
中枢和外周神经系统的脱髓鞘疾病，包括多发性硬化、特发性脱髓鞘性多神经病或格-巴二氏综合征以及慢性炎性脱髓鞘性多神经病，据信具有自身免疫性基础，并且由于直接损伤少突神经胶质细胞或损伤髓磷脂而导致神经脱髓鞘。在MS中，有证据表明疾病诱导和进展取决于T淋巴细胞。多发性硬化是T淋巴细胞-依赖性的脱髓鞘疾病，并且具有复发-缓解性病程或者慢性进展性病程。其病因学不明；然而，与病毒感染、遗传素质、环境因素和自身免疫均有关。病变包含主要由T淋巴细胞介导的、小神经胶质细胞和浸润性巨噬细胞浸润；病变处，CD4+T淋巴细胞是主要细胞类型。少突神经胶质细胞的细胞死亡和继发的脱髓鞘机制尚属未知，但可能是由T淋巴细胞所驱动。
炎性和纤维化肺病，包括嗜酸性粒细胞肺炎、特发性肺纤维化和过敏性肺炎，可能涉及错误调节性(disregulated)免疫-炎症反应。抑制该反应将有益于治疗。
自身免疫性或免疫-介导的皮肤病，包括大泡性皮肤病、多形红斑和由自体抗体介导的接触性皮炎，其发生是T淋巴细胞-依赖性的。
牛皮癣是T淋巴细胞-介导的炎性疾病。病损处包括T淋巴细胞、巨噬细胞、抗原加工细胞以及一些中性白细胞浸润。
过敏性疾病，包括哮喘、过敏性鼻炎、特应性皮炎、食物高敏症和荨麻疹，是T淋巴细胞依赖性的。这些疾病主要是由T淋巴细胞诱导的炎症、IgE介导的炎症所致，或者由二者联合介导所致。
移植相关疾病，包括移植排斥和移植物抗宿主病(GVHD)，是T淋巴细胞-依赖性的；抑制T淋巴细胞功能使疾病缓解。
干预免疫和/或炎症反应得以受益的其他疾病，包括但不限于：病毒感染(包括但不限于AIDS，A、B、C、D、E型肝炎和疱疹)、细菌性感染、真菌感染和原虫及寄生虫感染(刺激MLR的分子(或衍生物/激动剂)可治疗性地用于增强对感染剂的免疫应答)、免疫缺陷疾病(刺激MLR的分子/衍生物/激动剂可治疗性地用于增强对遗传性、获得性、感染(如HIV感染)导致的病症的免疫应答)，或医原性(即由于化疗所致)免疫缺陷，和瘤形成。
业已证实，某些人类癌症患者产生针对肿瘤细胞上的抗原的抗体和/或T淋巴细胞反应。在肿瘤形成动物模型中也已证实：增强免疫应答可导致排斥肿瘤或特别是肿瘤消退。在MLR中增强T淋巴细胞反应的分子，在体内可用于增强抗瘤形成的免疫应答。在MLR中增强T淋巴细胞增殖反应的分子(或小分子激动剂或以激动方式作用于同一受体的抗体)，可治疗性地用于治疗癌症。在MLR中抑制淋巴细胞反应分子，在体内也发挥作用，它是在抑制针对肿瘤的免疫应答的瘤形成期间发挥作用；该分子或者由肿瘤细胞自身表达，或者由肿瘤细胞诱导其在其细胞它表达。此类抑制性分子的拮抗作用(或者通过抗体、小分子拮抗剂，或者通过其他手段)增强免疫-介导的肿瘤排斥。
此外，抑制具有原炎症(proinflammatory)性质的分子，有益于下述疾病的治疗：再灌注损伤；中风；心肌梗塞；动脉粥样硬化；急性肺损伤；出血性休克；烧伤；败血症/脓毒性休克；急性肾小管坏死；子宫内膜异位；退行性关节疾病和胰腺炎。
按照已知方法，如经静脉内快速浓注或连续输注一段时间，或者经肌内注射、腹膜内注射、脑脊柱内注射(intracerobrospinal)、皮下注射、关节内注射、滑膜腔内注射、鞘内注射、口服、局部施用或吸入(鼻内吸入，肺内吸入)途径给药，将本发明化合物如多肽或抗体施用于哺乳动物，特别是人，多肽和抗体的静脉或吸入给药为优选。
在免疫佐剂治疗中，其它治疗方案，如施用抗癌剂，可与本发明蛋白质、抗体或化合物联合给药。例如，接受本发明免疫佐剂治疗的患者，也可接受抗癌剂(化疗剂)治疗或放射治疗。此类化疗剂的配制和给药方案，按照制造商的指示进行或者由熟练的临床医师根据经验决定。化疗剂的配制和给药方案在Chemotherapy Service Ed.，M.C.Perry，Williams & Wilkins，Baltimore，MD(1992)中也有描述。化疗剂可以在免疫佐剂之前或之后给药，或者二者同时给药。此外，抗-雌激素化合物如他莫昔芬或抗-孕激素如奥那司酮(见EP 616812)，可按其已知用量给药。
也期望施用抗其它免疫疾病相关或肿瘤相关的抗原的抗体，如将结合CD20、Cdlla、CD18、ErbB2、EGFR、ErbB3、ErbB4或血管内皮因子(VEGF)的抗体。或者，或另外，本文公开的结合同一个或二个或多个不同抗原的二个或多个抗体，可联合施用于患者。有时，将一种或多种细胞因子也施用于患者是是非常有益的。一个实施方案中，本发明多肽与生长抑制剂联合给药。例如，首先施用生长抑制剂，接下来施用本发明多肽。然而，也考虑了同时施用或首先施用本发明多肽。生长抑制剂的适宜剂量是目前所用剂量，同时由于生长抑制剂和本发明多肽的联合作用(协同作用)而可以降低用量。
为了治疗免疫相关疾病或减轻其严重程度，本发明化合物的适宜剂量取决于所治疾病的类型(如上所述)、疾病的严重程度和病程(无论给药目的是预防还是治疗)、先前的治疗、患者的临床病史和对化合物的应答以及主治医生的判断。化合物适宜于一次性地或在一系列治疗中施用于患者。
例如，取决于受治疾病的类型和严重程度，抗体施用于患者的抗体的初始候选剂量是1μg/kg～15mg/kg(如0.1-20mg/kg)，无论是例如通过一次或分多次给药，还是通过连续输注给药。依据上述因素，代表性的每日剂量为约1μg/kg～100mg/kg或更多。重复给药数天或更长时间时，视具体情况而将治疗持续至出现对疾病症状的所需抑制为止。然而，其它剂量方案也可能是有用的。治疗的进展很容易通过常规技术和试验分析加以监测。
12.制品
在本发明的另一个实施方案中，提供了含有用于治疗上述疾病的物质的制品。所述制品包括一个容器、一个标签和一张包装插页。适当的容器包括瓶子，小瓶，注射器等。容器可由各种材料如玻璃或塑料制成。该容器内盛放能有效诊断或治疗病症的组合物，并具有无菌存取口(例如，该容器可以是静脉注射袋或带有能通过皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的活性剂是本发明多肽或抗体。容器上的或附带的标签说明该组合物用于诊断或治疗所选出的病症。制品还包括第二个容器，其中含可药用的缓冲液，例如磷酸盐缓冲盐液，Ringer’s溶液和葡萄糖溶液。制品还可进一步包括具有商业需要以及符合用户需要的其它材料，如其它缓冲液、稀释剂，滤器，针头和注射器。
13.免疫相关疾病的诊断和预后
细胞表面蛋白，如在一定免疫相关疾病中过度表达的蛋白质，是候选药物或疾病治疗的良好的靶。相同蛋白质与由免疫相关疾病中增强的(amplified)基因编码的分泌蛋白质一起，表明它们在这些疾病的诊断和预后中的另一用途。譬如，直接针对在多发性硬化、类风湿性关节炎或其它免疫相关疾病中增强的基因的蛋白质产物的抗体，可用作诊断剂或预后剂。
举例来说，抗体(包括抗体片段)，可用于定性或定量测定由增强或过度表达基因(″标记基因产物″)编码的蛋白质的表达。抗体优选连接有可检测标记物，例如荧光素标记，并且可用光学显微镜、流式细胞仪、荧光测定仪或本领域已知的其它技术监测抗体结合。如果过度表达基因编码细胞表面蛋白，那么这些技术是特别适合的。此结合分析基本上按照前面的描述进行。
可通过例如免疫荧光或免疫电子显微镜检查法，完成在原位检测抗体与标志基因产物的结合。为此目的，自患者采出组织学样品，将标记抗体用在样品上，优选将抗体覆盖在生物样品上。此过程也可以测定标志基因产物在被测组织的分布。关于原位检测，大量的各种组织学方法是可以利用的，此点对于本领域技术人员而言是显而易见的。
下述实施例只是为了描述的目的而提供，并非旨在以任何方式限定本发明的保护范围。
本说明书中引证的所有专利和参考文献，以其全部在此引入作为参考。
                          实施例
除非另外指出，否则实施例中所提到的可商购试剂，按照制造商的说明使用。在下述实施例和整个说明书中用ATCC登记号定义的细胞的来源是在美国典型培养物保藏中心，Manassas，VA进行保藏的。除非另外声明，否则本发明使用重组DNA技术的标准操作，如前面和在下列教科书中描述的那些：Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborPress N.Y.，1989；Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，GreenPublishing Associates和Wiley Interscience，N.Y.，1989；Innis等，PCRProtocols：A Cuide to Methods and Applications，Academic Press，inc.，N.Y.，1990；Harlow等，Antibody：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，1988；Gait，M.J.，Oligonucleotide Synthesis，IRL Press，Oxford，1984；R.I.Freshney，Animal cell Culture，1987；Coligan等，CurrentProtocols in Immunology，1991。
实施例1  TCCR的分离与克隆
用细胞因子受体和/或以WS(G)XWS结构域为特征的受体检索公共EST数据库，结果分离出hTCCR(SEQ ID NO：1)和mTCCR(mTCCR)。
或者，图4(SEQ ID NO：2)描述的鼠TCCR已在1996年5月23日申请的WO97/44455中公开，还以登记号7710109公开在GenBank中。该现有技术分子也描述在Sprecher等，Biochem.Biophys，Res.Commun.246(1)：82-90(1998)中。在图4(SEQ ID NO：2)中，已经鉴定出信号肽在氨基酸残基1-约24处，跨膜结构域在氨基酸残基约514-约532，N-糖基化位点在残基约46-49、296-299、305-308、360-361、368-371和461-464，酪蛋白激酶II磷酸化位点在残基约10-13、93-96、130-133、172-175、184-187、235-238、271-274、272-275、323-326、606-609和615-618，酪氨酸激酶磷酸化位点在残基约202-209，N-肉豆蔻酰化(myristoylation)位点在残基约43-48、102-107、295-300、321-326、330-335、367-342、393-398、525-530和527-532，酰胺化位点在残基约240-243，原核膜脂蛋白脂类附着在残基约516-526处，而生长因子和细胞因子受体家族识别标志I则位于残基约36-49处。(1)与人红细胞生成素存在显著同源性的区域在残基约14-51处，(2)与鼠白介素-5受体存在显著同源性的区域在残基211-219处。
在1996年5月23日提交的WO 97/44455中，公开了与图3(SEQ ID NO：1)所示人TCCR高度同源的多肽，也可以登记号4759327而从GenBank中得到。该现有技术分子也描述在Sprecher等，Biochem.Biophys，Res.Commun.246(1)：82-90(1998)中。在图3(SEQ ID NO：1)中，已经鉴定出信号肽位于氨基酸残基1-约32，跨膜结构域在氨基酸残基约517-约538，N-糖基化位点在残基约51-54、76-79、302-305、311-314、374-377、382-385、467-470、563-566、N-肉豆蔻酰化位点在残基约107-112、240-245、244-249、281-286、292-297、373-378、400-405、459-464、470-475、531-536和533-538处，原核膜脂蛋白脂附着位点在残基约522-532处，而生长因子和细胞因子受体家族识别标志1在残基约41-54处。与人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)受体的第二个亚单位具有显著同源性的区域在残基183-191处。
人TCCR(SEQ ID NO：1)和鼠TCCR(SEQ ID NO：2)序列比较示于图5。该比较显示人和鼠序列之间具有约62％的序列同源性。
实施例2   TCCR″基因敲除″鼠
1.制备靶向载体(targeting vector)
术语″靶向载体″，是为了基因切除而构建的核酸序列的术语。图9A描述了用于本实施例中分离的TCCR分子的靶向载体。更具体而言，使用含有最开始的两个外显子的2.4kb XhoI-HindIII片段和含有外显子9-14的6.0kb Eco RI-Bam HI片段构建靶向载体。所分离的特定TCCR基因含有14个外显子和13个内含子。在该靶向载体中，已经用赋予庆大霉素抗性的pGK-neo基因取代了外显子3-8，而保持外显子1和2完整无损。单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)编码区域已经取代了外显子1的5′端，使得可用更昔洛韦进行选择。此类药物选择性标志，如更昔洛韦，使得能够选择含有所述靶向载体的稳定转染的细胞系，并且还允许制备聚合酶链反应(PCR)的引物，所述引物将扩增靶向构建体中能使其有别于内源性基因的独一无二的核酸片段。将该构建体插入载体pBluescript(Stratagene，La Jolla，CA)并转化到DH10B细菌中。收获单菌落，用于制备更大量的靶向载体。
2.制奋TCCR-/-干细胞
靶向载体经限制性核酸内切酶NotI消化而线性化，并转染入胚胎干(ES)细胞。之所以选择ES细胞，是因为它们能够整合到发育期的胚胎干系中，以便于将靶向载体传递至子代。优选的ES系是ESGS系，但是也可使用D3系(ATCC CRL-1934)。通过使用重悬浮在0.8ml PBS中的ES细胞，而完成电穿孔。把线性化靶向载体(20ug)加入到细胞中，这发生在无菌电穿孔小杯(0.4cm Bio-Rad，Hercules，CA)中。使用设定为500μF、240伏特的Bio-Rad电穿孔装置完成电穿孔。将小杯中的内容物转移到410ml ES培养基中。ES培养基的构成：高葡萄糖DMEM(Gibco 11960-010)，10％FBS(ES细胞testedGibco 16141-061)和1000单位/ml ESGRO鼠LIF(Gibco 13275-0290)。然后将这些细胞等分到20个96孔板中。转染靶向载体后，使用致死浓度的前面提到的药物来筛选ES细胞。G418的使用浓度为400μg/ml。只有携带靶向载体的那些ES细胞具有存活所必需的抗生素抗性标志。然后，通过Southern印迹法(图10A)、PCR(图10B)、内源性靶基因mRNA表达的缺乏(图10C)从选出的ES细胞菌落中甄别具有正确整合载体的菌落。接着，把符合上述标准的ES克隆显微注射到胚胎中。
3.注射和筛选TCCR-/-小鼠
使用本领域任何适宜技术，优选显微注射，把上一步骤筛选和甄别出的ES细胞克隆转移到发育期胚胎中。适宜的显微注射技术描述在Hogan等，Manipulating the mouse embryo：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.1986中。尽管只要事后能被识别，就可以使用任何胚胎，但是优选用于显微注射的胚胎是雄性并具有与含有靶向载体的ES细胞的基因所编码的毛色相对立的毛色的胚胎。例如，得自白色皮毛动物的ES细胞注射到将发育成棕色/黑色皮毛动物的胚胎中。以这种方式成功进行显微注射的胚胎，根据马赛克式的皮毛而选择出其成熟成年动物。得到的马赛克式动物(创立者)是TCCR-/+，然后使之回交(与其它TCCR-/+子代配偶)以产生TCCR-/-鼠。
为了证实TCCR-/-基因型，从尾部剪取物中提取DNA，所述DNA是通过于60℃在0.5ml裂解缓冲液中孵育尾组织过夜而获得的。裂解缓冲液的构成：0.5％SDS，100mM NaCl，50mM Tric-HCL(pH8.0)，7.5mM EDTA(pH8.0)和1mg/ml蛋白酶K(Boehringer-Mannheim)。过夜孵育后，室温下离心75μl 8M醋酸钾、600ml CHCl3的完全反应混合物的等份试样10分钟。移出水相层并置于另一eppendorf管中，向该管中加入600ml 100％乙醇，离心5分钟使DNA沉淀。用70％乙醇洗涤DNA沉淀小团，进行空气干燥。去除残留的乙醇后，在150-200μl水中重新悬浮DNA小团。接着，可将该DNA用于Southern印迹和PCR分析。在Southern印迹时，可用neo基因作探针；PCR时，使用筛选ES细胞时所用的引物。
结果见图10A、10B和10C，表明成功地切除了TCCR基因。TCCR-缺陷小鼠能够生长发育、繁殖，未表现出明显异常。详细的组织学检验未显示出任何明显缺陷。取自多个野生型和基因敲除鼠胸腺、脾、淋巴结和派伊尔氏淋巴集结(peyer′s patches)的细胞用CD3、CD4、CD8、CD25、CD19、B220、CD40、NK1.1、DX5、F4/80、CD14、CD16、MHCII和CD45抗体染色后经流式细胞仪分析，未显示这两种基因型之间有明显差异。
实施例3   TCCR-/-鼠过敏性气道炎症的增加
哮喘是众多引发支气管梗阻和炎症的变应性和非-变应原因子相互作用所致复杂疾病。气道炎症的一个关键方面是气道壁被Th2细胞浸润。由于本文制备的TCCR-/-鼠具有更大的Th2反应，所以这些TCCR-/-鼠是研究过敏性气道炎症的非常有用的模型。
动物：12只TCCR-/-鼠和11只野生型同窝鼠(WT)随机分为下列四组：组1-非-致敏的TCCR-/-；组2-非致敏的TCCR WT(n＝4)；组3一致敏的TCCR-/-(n＝8)；组4-致敏的TCCR WT(n＝7)。
致敏：在第0天，给15只小鼠(雄性和雌性)腹腔注射体积为0.1ml的吸附在1mg/ml明矾中的300单位/ml尘螨抗原(Bayer Pharmaceutical)，使小鼠致敏。非致敏对照小鼠(n＝8)接受腹腔注射0.1ml 0.9％NaCl和1mg/ml明矾。在第7天，如上述这两组鼠腹腔注射抗原(致敏组)或NaCl(非致敏组)，予以强化。
吸入攻击：致敏并强化后，于第16天开始进行4次DMA吸入攻击。为了形成气雾剂，将尘螨用Dulbecco′s PBS和0.1％Tween-20稀释，使其在喷雾器中的终浓度为6000单位/ml。所有吸入攻击都在Plexiglaspie暴露室，开始用PARIIS-2喷雾器将DMA气化20分钟，然后10分钟内向暴露室中再注入1.5ml。肺的总沉积剂量为约6.5AU的DMA。
AHR(使麻醉)：在第24天，最后一次DMA气雾剂攻击的约18小时后，用戊巴比妥(25mg/kg)和乌拉坦(1.8g/kg)的混合物麻醉小鼠，在右侧颈静脉上制造1cm切口并进行插管。游离、切开颈静脉，插入导管(PE-10连接到PE-50)并固定好。另外，切开小鼠的气管(1cm颈部切口，游离、切开气管，插入套管并固定好)。然后将小鼠装入Plexiglas流动体积描记器中，以测量胸廓扩胀和气道压力。以170bpm的频率给小鼠通入100％氧气，Vt等于9μl/gm。用电脑化(Buxco Electronics)数据捕获程序连续监测呼吸力学(肺阻力和动力顺应性)。测量基线后，小鼠接受一次性10秒量的乙酰甲胆硷(MCH剂量为500μg/kg)，使用原液浓度为200μg/ml的MCH。
处死：气道反应性的测量完成后，用EDTA管收集经眼眶后静脉窦采集的血液，以便分离得到血清。剖开腹部，切断降主动脉，切开横隔。使动物放血一段时间后流血而死，进行细支气管肺泡(bronchioalveolar)灌洗(BAL)。通过前述插入的气管套管，用相同的无菌生理盐水(30μg/g鼠重)快速水流(bolus)灌洗肺3次。快速水流充入肺中至总肺容量的约70％。以1000xg和4℃离心BAL样品(回流平均80％)10分钟。轻轻倒出上清液并立即冷冻于-80℃。细胞小团重新悬浮于250ml含2％BSA(Sigman，St.Louis，MO)的PBS中，然后用自动计数仪(Baker Instruments，Allentown，PA)计数，记录为总BAL细胞数/μl。接着，将细胞悬浮液调整至200细胞/μl，取100ml在包被的Superfrost Plus显微镜载玻片(Baxter Diagnostics，Deerfield，IL)上使用cytospin(Shandon，Inc.，Pittsburgh，PA)以800xg离心10分钟。风干载玻片，在100％甲醇中固定1分钟，用Diff-Quik(Baxter Health Care，Miami，Fol)染色。每一玻片上至少分析200个细胞，以得到示差(differentral)白细胞计数。
BAL之后，取出右肺、脾和气管支气管淋巴结在液氮中冷冻，以备mRNA分析(并且，然后放置到干冰中)。取鼠尾剪切物并冷冻于干冰中，以便于日后进行基因型测定。取出小鼠剩下的左肺，以评价和比较实验各组之间肺部病理学变化的严重程度和特征。此目的如下实现：在10％中性-缓冲的福尔马林中初步固定肺组织，石蜡包埋，用苏木精和伊红染色3μm切片。沿着初级支气管切出肺切片，盲性评价整个切片并基于气道和血管周围炎症的严重程度予以评分。使用0(无炎症和气道改变)至4级(明显的炎症和气道改变)来描述气道上皮细胞肥大程度。
IgE ELISA：在总IgE夹心ELISA中，使用不稀释或者在ELISA缓冲剂中以1∶2～1∶20(BAL)和1∶25～1∶200(血清)稀释的BAL液或血清样品。捕获抗体是兔抗-小鼠IgE(2μg/ml PBS)，板于4℃包被24-48小时。标准品是鼠IgE(PharMingen，San Diego，CA)，按照1∶2进行系列稀释，起始浓度为100ng/ml。使用1∶2000稀释的生物素化FcεRI-IgG作为检测抗体作用1-1.5小时。HRP-SA和酶显色步骤与细胞因子分析所用相同。
结果证实：TCCR-/-鼠中淋巴细胞浸润较野生型鼠显著增加(图11)。
实施例4   TCCR在大肠杆菌中的表达
该实施例描述通过在大肠杆菌中的重组表达制备非糖基化形式的TCCR。使用选择的PCR引物，将编码TCCR的DNA序列进行初步扩增。引物应当含有对应于所选表达载体中限制性酶切位点的限制性酶切位点。可使用各种表达载体。适宜载体的一个实例是pBR322(得自大肠杆菌；见Bolivar等，Gene，2：95(1977))，它含有氨苄青霉素和四环素抗药性基因。该载体用限制性内切酶消化并去磷酸化。然后把PCR扩增的序列连接到该载体中。载体优选包括编码抗生素抗性基因的序列、trp启动子、聚组氨酸前导序列(包括最初6个STII密码子、聚组氨酸序列和肠激酶裂解位点)、TCCR编码区、λ转录终止子和argU基因。
接着，使用Sambrook等在出处同上中描述的方法，用上述连接混合物转染所选大肠杆菌株。通过在LB平板上的生长能力来鉴定转化体，然后选择抗生素抗性菌落。可分离质粒DNA，并用限制性分析和DNA测序加以确认。
选出的克隆可在液体培养基(如添加了抗生素的LB肉汤)中生长过夜。过夜培养物随后用于接种更大规模的培养基。然后细胞生长至所需光密度，在此期间表达启动子被打开。
继续培养细胞数小时后，离心收获细胞。使用本领域已知的各种试剂可以溶解离心所得细胞小团，然后，使用金属螫合柱在允许紧密结合已溶的TCCR蛋白的条件下纯化该蛋白。TCCR也可经下述操作在大肠杆菌中以聚组氨酸标记形式表达。使用选择的PCR引物初步扩增编码TCCR的DNA。引物含有对应于所选表达载体中限制性酶切位点的限制性酶切位点和其它对于提供有效、可靠翻译起始、在金属螯合柱上快速纯化、和被肠激酶水解去除都有用的序列。接下来，将PCR扩增的聚组氨酸标记序列连接到表达载体中，后者用于转化基于菌株52(W3110 fuhA(tonA)Ion galE rpoHts(htpRts)clpP(lacIq)的大肠杆菌宿主。转化体首先于30℃在含有50mg/ml羧苄青霉素的LB中振荡培养，直至O.D.600达到3-5。接着，把培养物用CRAP培养基(在500mL水中混合3.57g(NH4)2SO4，0.71g柠檬酸钠·2H2O，1.07g KCl，5.36g Difco酵母提取物，5.36g Sheffield hycase SF，以及110mMMPOS、pH7.3、0.55％(w/v)葡萄糖和7mM MgSO4而制得)稀释50-100倍，于30℃振荡培养约20-30小时。移出样品，用SDS-PAGE分析证实表达，把大批量培养物离心成细胞团。冷冻细胞团直至纯化和重折叠(refolding)。
在10倍体积(w/v)的7M胍、20mM Tris、pH8缓冲剂中，重新悬浮得自0.5～1L发酵物(6-10g小团)的大肠杆菌糊状物。加入固体亚硫酸钠和连四硫酸钠使终浓度分别为0.1M和0.02M，在4℃搅拌该溶液过夜。该步骤产生变性蛋白质，其中所有半胱氨酸残基被亚硫酸化(sulfitolization)封闭。在Beckman Ultracentifuge上40000rpm离心该溶液30分钟。上清液用3-5倍体积的金属螯合柱缓冲液(6M胍，20mM Tris，pH7.4)稀释，并通过0.22微米滤器过滤以使澄清。将已澄清的提取液装载到已用金属螯合柱缓冲液平衡的5ml Qiagen Ni-NTA金属螯合柱上。用另一含有50mM咪唑(Calbiochem，Utrol grade)的pH7.4缓冲液洗涤金属螯合柱。用含250mM咪唑的缓冲液洗脱蛋白质。收集合有所需蛋白质的级分并于4℃贮存。利用基于蛋白质氨基酸序列计算出的消光系数，通过280nm处的吸收度估算蛋白质浓度。
将样品缓慢倒入新鲜配制的重折叠缓冲液中进行稀释，从而将蛋白质重折叠，所述重折叠缓冲液的构成是：pH8.6 20mM Tris、0.3M NaCl、2.5M尿素、5mM半胱氨酸、20mM甘氨酸和1mM EDTA。选择重折叠液的体积以使蛋白质终浓度为50～100微克/ml。于4℃轻轻搅拌重折叠液12-36小时。加入TFA至终浓度为0.4％(pH约为3)来淬灭重折叠液。进一步纯化白质之前，溶液通过0.22微米滤器过滤，加入乙腈至终浓度为2-10％。在PorosR1/H反相柱上对重折叠的蛋白质进行层析分析，使用的流动相缓冲液为0.1％TFA，用10～80％乙腈梯度洗脱。在SDS聚丙烯酰胺凝胶上分析那些有A280吸收的级分的等份试样，收集合有均相重折叠的蛋白质级分。通常，大多数蛋白的正确重折叠类别在最低乙腈浓度时洗脱下来，这是由于这些类别的蛋白质具有阻隔其与反相树脂相互作用的疏水内部因而是最紧密的。聚集类别的蛋白通常在较高乙腈浓度时洗脱下来。除了从所需形式蛋白质中消除错误折叠形式的蛋白质外，该反相步骤也从样品中去除内毒素。
分别收集含有所需折叠型TCCR蛋白的级分，用氮气流直接轻吹溶液而去除乙腈。经透析或通过用已在配制缓冲液中平衡的G25 Superfine(Pharmacia)树脂进行凝胶过滤，而将蛋白质配制成pH6.8 20mM Hepes的溶液，其中含0.14M氯化钠和4％甘露醇，并进行无菌过滤。
实施例5   TCCR在哺乳动物细胞中的表达
该实施例描述通过在哺乳动物细胞中的重组表达来制备高度糖基化形式的TCCR。
载体pRK5(见EP 307247，公开日为1989年3月15日)用作表达载体。任选地，使用诸如Sambrook等在出处同上中描述的连接方法，将TCCR DNA连接至带有所选择限制酶以便插入TCCR DNA的pRK5中。由此产生的载体称为pRK5-TCCR。
在一实施方案中，所选宿主细胞是293细胞。人293细胞(ATCC CCL1573)在组织培养板上生长融合，所述培养基如添加了胎牛血清和任选的营养成分和/或抗生素的DMEM。约10μg pRK5-TCCR DNA与约1μg编码VA RNA基因[Thimmappaya等，Cell，31：543(1982)]的DNA混合，溶于500μl 1mM Tris-HCl、0.1mM EDTA、0.227M CaCl2中。向该混合物中滴加500μl 50mM HEPES(pH7.35)、280mM NaCI、1.5mM NaPO4，25℃10分钟使形成沉淀。悬浮该沉淀物，加入293细胞，使在37℃沉降约4小时。吸出培养基，用30秒种时间加入20％甘油的PBS溶液2ml。然后用不含血清的培养基洗涤293细胞，加入新鲜培养基，将细胞培养约5天。
转染的约24小时后，弃除培养基，代之以培养基(单独)或含有200μCi/ml35S-半胱氨酸和200μCi/ml35S-蛋氨酸的培养基。培养12小时后，收集条件培养液，在旋转滤器上浓缩，装载到15％SDS凝胶上。完成电泳后使凝胶干燥，并于胶片上曝光一段时间，从而揭示TCCR多肽的存在。可进一步培养含有转染细胞的培养物(在不含血清的培养基中培养)，在选定的生物鉴定法中检测培养物。
在另一技术中，使用Somparyrac等在Proc.Natl.Acad.Sci.，12：7575(1981)中描述的葡聚糖硫酸酯方法，可将TCCR瞬时引入293细胞。293细胞在旋转烧瓶中生长至最大密度，加入700μg pRK5-TCCR DNA。首先通过离心从旋转烧瓶中浓缩细胞，用PBS洗涤。在细胞小团上培养DNA-葡聚糖沉淀物4小时。用20％甘油处理细胞90秒，用组织培养基洗涤，再次装入含有5μg/ml牛胰岛素和0.1μg/ml牛转铁蛋白的组织培养基的旋转烧瓶中。约4天后，离心条件培养基，过滤去除细胞和碎片。然后，用任何选定方法，如透析和/或柱层析来浓缩和纯化含有表达的TCCR的样品。
在另一实施方案中，可在CHO细胞中表达TCCR。使用已知试剂如CaPO4或DEAE葡聚糖，可将pRK5-TCCR转染入CHO细胞。如上所述，培养细胞培养物，用培养基(单独的)或含有放射标记物如35S-蛋氨酸的培养基替换培养基。测定了TCCR的存在后，可用不含血清的培养基替换培养基。优选地，培养物培养约6天后，收获条件培养基。接着，用任何选定方法浓缩并纯化该含有表达的TCCR的培养基。
也可在宿主CHO细胞中表达表位-标记的TCCR。TCCR可以从pRK5载体亚克隆出来。可对该亚克隆插入物进行PCR，以与所选定表位标记物如聚组氨酸-标记物融合在杆状病毒表达载体中的一个阅读框架内。接着，可将聚组氨酸标记的TCCR插入物亚克隆入含有选择标志(如用于选择稳定克隆的DHFR)的SV40驱动载体中。最后，用SV40驱动载体转染CHO细胞(如上所述)。可按上述进行标记，以证实表达。然后，用任何选定方法，如用Ni2+-蝥合亲和层析法，可以浓缩并纯化含有表达的聚组氨酸标记型TCCR的培养基。
还可通过瞬时表达方法在CHO和/或COS细胞中表达TCCR，或通过另一稳定表达方法而在CHO细胞中表达TCCR。
使用下述操作，可完成在CHO细胞中的稳定表达。蛋白质可表达为，例如(1)IgG构建体(免疫粘附)，其中编码每种蛋白的可溶形式(例如细胞外结构域)的序列分别与包括铰链CH2结构域的IgG恒定区序列融合，和/或(2)聚组氨酸标记形式。
PCR扩增后，使用Ausubel等在Current Protocols of Molecular Biology.Unit 3.16，John Wiley和Sons(1997)中所述标准技术，分别将每个DNA亚克隆入CHO表达载体中。构建CHO表达载体，使其在目标DNA的5′和3′端具有相容的限制性酶切位点，以便于cDNA的往返穿梭。CHO细胞中表达所用载体在Lucas等，Nucl.Acids Res.24：9(1774-1779(1996)中有描述，并且使用SV40早期启动子/增强子来驱动目标cDNA和二氢叶酸还原酶(DHFR)的表达。DHFR表达允许选择转染后稳定维持的质粒。
使用商购转染试剂Superfect(Quiagen)、Dosper或Fugene(Boehringer Mannheim)，将12微克所需质粒DNA引入约1千万个CHO细胞中。按Lucas等在出处同上中所述方法，使细胞生长。为使细胞如下所述进一步生长和增殖，在每一安瓿中冷冻约3×107个细胞。
把含有质粒DNA的安瓿放入水浴中解冻并涡旋混合。用移液管将内容物移入盛有10mL培养基的离心管中，1000rpm离心5分钟。吸出上清液，用10mL选择培养基(0.2μm过滤的PS20和5％0.2μm渗滤的(diafiltered)胎牛血清)悬浮细胞。然后将细胞等分至含有90mL选择培养基的100mL旋转器中。1-2天后，将细胞转移至盛有150mL选择生长培养基的250mL旋转器中，并于37℃孵育。再过2-3天，在250mL、500mL和2000mL旋转器中接种3×105细胞/mL。离心后用新鲜培养基替换细胞培养基，在生产培养基中重悬浮。尽管可以使用任何适宜的CHO培养基，但是实际使用的是1992年6月16日颁布的美国专利5122469中所述生产培养基。3L生产旋转器中接种1.2×106细胞/mL。在0天，测定细胞数pH。第1天，从旋转器取样，并开始用过滤的空气喷雾。第2天，从旋转器中取样，温度调至33℃，取500g/L葡萄糖30mL和10％止泡剂0.6mL(例如35％聚二甲基硅氧烷乳液，Dow Coming 365 Medical Grade Emulsion)。整个生产过程中，必要时调整pH使之保持在7.2左右。10天后，或直至活力降至70％时，离心收获细胞并通过0.22μm滤膜过滤。滤出液要么贮于4℃，要么立即上柱纯化。
对于聚组氨酸标记的构建体，使用Ni-NTA柱(Qiagen)纯化蛋白质。纯化前，向条件培养基中加入咪唑至浓度为5mM。于4℃，将该条件培养基以4-5ml/min速度泵到6ml Ni-NTA柱上，该柱己用含0.3M NaCI和5mM咪唑的20mM Hepes、pH7.4缓冲液平衡。上样后，再用平衡缓冲液洗柱，用含有0.25M咪唑的平衡缓冲液洗脱蛋白质。随后，用25ml G25 Superfine(Pharmacia)柱，将高度纯化的蛋白质在pH6.8含有10mM Hepes、0.14MNaCl和4％甘露醇的贮藏缓冲液中脱盐，并贮于-80℃。
按照下述步骤，从条件培养基中纯化免疫粘附素(含有Fc)构建体。条件培养基泵入5ml蛋白A柱(Pharmacia)，后者已经用pH6.8 20mM磷酸钠缓冲液平衡。上样后，在用pH3.5 100mM柠檬酸洗脱前，先用平衡液彻底洗柱。通过收集1ml级分至含有275μL pH9 1M Tris缓冲液的试管中，而将洗脱的蛋白质立即中和。接着，按照前述使聚组氨酸标记的蛋白质脱盐的方法在贮存缓冲液中使高度纯化的蛋白质脱盐。用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析和用Edman降解技术进行N末端氨基酸序列分析，来测定同质性。
实施例6   TCCR在酵母中的表达
下述方法描述TCCR在酵母中的重组表达。
首先，构建酵母表达载体，以使在细胞内自ADH2/GAPDH启动子产生或分泌TCCR。将编码TCCR的DNA和所述启动子插入到所选质粒的适宜限制性酶切位点中，以引导TCCR的细胞内表达。为了分泌，可将编码TCCR的DNA，与编码ADH2/GAPDH启动子的DNA、天然TCCR信号肽或其它哺乳动物信号肽、或者例如酵母α-因子或转化酶分泌信号/前导序列以及连接序列(如果需要)一起克隆入所选质粒中以便表达TCCR。
然后，可用上述表达质粒转化酵母细胞如酵母株AB 110，并在选择的发酵培养基中培养。通过10％三氯醋酸沉淀和用SDS-PAGE分离，接着用考马斯蓝染色凝胶，可以检测转化的酵母上清液。
随后，经离心而从发酵培养基中除去酵母细胞，接着使用选择的筒式过滤器浓缩培养基，由此而分离和纯化重组的TCCR。使用选择的柱层析树脂，可以进一步纯化含TCCR的浓缩物。
实施例7   TCCR在杆状病毒-感染的昆虫细胞中的表达
下述方法描述重组TCCR在杆状病毒-感染的昆虫细胞中的表达。
将TCCR的编码序列融合在杆状病毒表达载体所含的表位标记物的上游。这些表位标记物包括聚组氨酸标记物和免疫球蛋白标记物(如IgG的Fc区)。可使用各种质粒，包括商购质粒如pVL1393(Novagen)。简言之，使用与5′和3′区互补的引物经PCR扩增TCCR的编码序列或TCCR编码序列的所需部分，如编码跨膜蛋白质细胞外结构域的序列或，如果蛋白质是胞外蛋白质时编码成熟蛋白质的序列。5′引物可整合入(选择的)限制性酶切位点的侧面。然后用那些选择的限制性内切酶消化产物并亚克隆入表达载体中。
重组杆状病毒是这样产生的：使用Lipofectin(购自GIBCO-BRL)，将上述质粒和BaculoGoldTM病毒DNA(Pharmingen)共-转染入草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)(″Sf9″)细胞(ATCC CRL 1711)中。28℃孵育4-5天后，收获释放出的病毒，并将病毒进一步扩增。病毒感染和蛋白质表达按照O′Reilley等在Baculovirus Express Vectors：A Laboratory Manual，Oxford：Oxford University Press(1994)中的描述进行。
接下来，可通过如下Ni2+-螯合亲和层析纯化所表达的聚组氨酸标记的TCCR。重组病毒-感染的Sf9细胞的提取物的制备按照Rupert等在Nature，362：175-179(1993)中所述方法进行。简要讲，洗涤Sf9细胞，在超声处理的缓冲液(25mL Hepes，pH7.9；12.5mM MgCl2；0.1mM EDTA；10％甘油；0.1％NP-40；0.4M KCl)中重悬浮，冰浴中超声2次，各20秒钟。离心澄清超声后的产物，用上样缓冲液(50mM磷酸盐，300mM NaCl，10％甘油，pH7.8)50倍稀释上清液，经0.45μm滤器过滤。制备Ni2+-NTA琼脂糖柱(购自Qiagen)，床体积5mL，用25mL水洗涤，25mL上样缓冲液平衡。以每分钟0.5mL的速度将过滤后的细胞提取液上柱，用上样缓冲液洗柱至A280基线，在此点开始收集级分。接着，用第二洗涤缓冲液(50mM磷酸盐；300mM NaCl，10％甘油，pH6.0)洗柱，此过程洗脱出非特异结合的蛋白质。重又达到A280基线后，用第二洗涤缓冲液中0～500mM的咪唑梯度洗柱。收集1mL级分，通过SDS-PAGE和银染色或通过用碱性磷酸酶(Qiagen)偶联型Ni2+-NTA经Western印迹法进行分析。汇总含洗脱的组氨酸10-标记型TCCR的级分，用上样缓冲液透析。
或者，使用已知层析技术，包括例如蛋白A或蛋白G柱层析法，对IgG标记(或Fc标记)的TCCR进行纯化。
另外，也可利用Hi-5细胞经改良的杆状病毒操作来表达本发明的TCCR分子。在该操作中，编码所需序列的DNA用适宜系统如Pfu(Stratagene)扩增，或者与包含在杆状病毒表达载体中的表位标记物的上游(5′-端)融合。此类表位标记物包括聚组氨酸标记物和免疫球蛋白标记物(如IgG的Fc区)。可使用各种质粒，包括商购得到的质粒如pIE-1(Novagen)。pIEI-1和pIEl-2载体被设计成能在稳定转化的昆虫细胞中由杆状病毒iel启动子对重组蛋白进行重组表达。该质粒仅在多克隆位点的定向上不同，并且含有已知对于ie 1-介导的在未感染型昆虫细胞中的基因表达而言重要的所有启动子序列以及hr5增强子元件。pIEI-I和pIEI-2包括iel翻译起始位点，并可用于生产融合蛋白。简要讲，用与5′和3′区互补的引物经PCR扩增所需序列或序列的所需部分(如编码跨膜蛋白细胞外结构域的序列)。5′引物可整合入(所选择的)限制性酶切位点的侧面。然后，用那些选择的限制性内切酶消化产物，并亚克隆入表达载体。例如，pIEl-1的衍生物可包括人IgG的Fc区(pb.PH.IgG)或所需序列下游(3′-端)的8个组氨酸(pb.PH.His)标记物。优选地，对载体构建体进行测序从而加以确认。
Hi5细胞在27℃、没有CO2、没有青霉素/链霉素(pen/strep)的条件下生长至50％融合。对于每一个150mm平皿，含有所述序列的30μg基于pIE的载体与1ml Ex-Cell培养基(Media：Ex-Cell 401+1/100 L-Glu JRHBiosciences #14401-78P(注意：该培养基是光敏的))混合。单独地，100μl细胞Fectin(Cell-FECTIN，Gibco BRL+10362-010，预涡旋的)与1mlEx-Cell培养基混合。合并两种溶液并在室温下孵育15分钟。8ml Ex-Cell培养基加入到2ml DNA/Cell-FECTIN混合物中，将其铺至已经用Ex-Cell培养基洗涤过一次的Hi5细胞的上层。然后，室温避光孵育该平皿1小时。接着，吸出DNA/Cell-FECTIN混合物，用Ex-Cell培养基洗涤细胞一次，以除去过量的CellFECTIN。加入30ml新鲜Ex-Cell培养基，于28℃孵育细胞3天。收集上清液，如下测定杆状病毒表达载体中所述序列的表达：分批将1ml上清液与25ml用于组氨酸标记型蛋白的Ni-NTA珠(QIAGEN)或用于IgG标记型蛋白的蛋白-A琼脂糖CL-4B珠(Pharmacia)结合，之后进行SDS-PAGE分析，通过考马斯蓝染色与已知浓度的蛋白标准品进行比较。
通过离心除去细胞而从转染细胞中收获条件培养基(0.5-3L)，并经0.22微米滤器过滤。对于聚组氨酸标记的构建体，使用Ni-NTA柱(Qiagen)纯化含有所述序列的蛋白质。纯化前，于48℃保持咪唑的流速为4-5ml/min。上样后，再用平衡缓冲液洗柱，用含有0.25M咪唑的平衡缓冲液洗脱蛋白质。随后，用25ml G25 Superfine(Pharmacia)柱使高度纯化的蛋白质在pH6.8含有10mM Hepes、0.14M NaCl和4％甘露醇的贮藏缓冲液中除去盐分，并贮于-80℃。
按照下述步骤，从条件培养基中纯化免疫粘附(含有Fc)构建体。条件培养基泵入5ml蛋白A柱(Pharmacia)，后者事先已经用pH6.8 20mM磷酸钠缓冲液平衡过。上样后，在用pH3.5 100mM柠檬酸洗脱之前，先用平衡液彻底洗柱。通过按1ml级分收集在含有275μl pH9 1M Tris缓冲液的试管中，而将洗脱的蛋白质立即中和。接着，按照前述使聚组氨酸标记的蛋白质脱去盐分的方法使高度纯化的蛋白质脱盐至贮存缓冲液中。用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析和用Edman降解技术进行N末端氨基酸序列分析，来测定同质性。
实施例8   制备结合TCCR的抗体
该实施例描述能够与TCCR特异结合的单克隆抗体的制备。
生产单克隆抗体的技术为本领域技术人员所已知，例如在Goding，出处同上中有描述。可以使用的免疫原包括纯化的TCCR、含有TCCR的融合蛋白，和在细胞表面表达重组TCCR的细胞。无需繁琐实验，本领域熟练技术人员就可对免疫原作出选择。
皮下或腹腔内(intraperitoneal)注射1-100微克在完全Freund′s佐剂中乳化的TCCR免疫原，来免疫小鼠如Balb/c。或者，免疫原在MPL-TDM佐剂(Ribi Immunochemical Research，Hamilton，MT)中乳化，并注射入动物的后足垫。10～12天后，再次用在所选佐剂中乳化的免疫原对免疫小鼠进行加强免疫。此后数周，还可增加免疫注射而对小鼠加强免疫。经后-眼眶放血方式定期采集小鼠血清样品，进行ELISA分析，以检测抗-TCCR的抗体。
检测到适宜的抗体后，对抗体“阳性”动物最后一次静脉注射TCCR。3或4天后，处死小鼠，取其脾细胞。然后将脾细胞与所选鼠骨髓瘤细胞系(如P3×63AgU.1，得自ATCC CRL 1597)融合(使用35％聚乙二醇)。
接着，将融合产生的杂交瘤细胞接种到96孔组织培养板上，所述培养板上含有HAT(次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷)培养基以抑制非-融合细胞、骨髓瘤杂合体和脾细胞杂合体的增殖。
根据ELISA中针对TCCR的反应性来筛选杂交瘤细胞。对那些能分泌所需抗TCCR单克隆抗体的“阳性”杂交瘤细胞的测定是本领域常识。
可给同系Balb/c小鼠腹腔注射阳性杂交瘤细胞，以产生含有抗-TCCR单克隆抗体的腹水。或者，使杂交瘤细胞在组织培养烧瓶或滚瓶中生长。使用硫酸铵沉淀，继之用凝胶排阻层析法，可以完成对腹水中产生的单克隆抗体的纯化。或者，使用基于抗体与蛋白A或蛋白G的结合的亲和层析法。
实施例9   使用特异抗体纯化TCCR多肽
使用蛋白质纯化领域的各种标准技术，可进行天然或重组TCCR多肽的纯化。譬如，使用目标TCCR多肽的特异性抗体经免疫亲和层析法纯化原-TCCR多肽、成熟TCCR多肽或前-TCCR多肽。总体上讲，免疫亲和柱是通过将抗-TCCR多肽抗体与活化的层析树脂共价偶联而构建的。
通过硫酸铵沉淀或者通过在固相化蛋白A(Pharmacia LKBBiotechnology，Piscataway，N.J.)上的纯化法，可以从免疫血清制备多克隆免疫球蛋白。同样地，用硫酸铵沉淀或通过固相化蛋白A层析法，可从小鼠腹水中制备单克隆抗体。使部分纯化的免疫球蛋白共价附着于层析树脂如CnBr-活化的SEPHAROSETM(Pharmacia LKB Biotechnology)。抗体与树脂共价偶联，封闭树脂，按照制造商的指示洗脱该衍生化树脂。
通过从细胞中制备含有可溶型TCCR多肽的级分，可在TCCR多肽的纯化中使用此免疫亲和柱。通过溶解整个细胞或溶解经加入去污剂差异离心或使用本领域公知方法获得的亚细胞部分，而完成所述制备。或者，含有信号序列的可溶型TCCR多肽可以以有效量分泌到细胞生长所在的培养基中。
使含有可溶性TCCR多肽的制剂流经免疫亲和柱，在使得优先吸附TCCR多肽的条件下(例如，存在去污剂时的高离子强度缓冲液)洗柱。然后，在使抗体/TCCR多肽结合被破坏的条件下(例如，低pH缓冲液如pH约2-3，或高浓度离液剂如尿素或硫氰酸盐离子)洗脱柱，并收集TCCR多肽。
实施例10   药物筛选
可使用那些能在任何药物筛选技术中通过利用TCCR多肽或其结合片段而筛选化合物的特别有用的方法。本实验所用TCCR多肽或其片段可以是溶液中的游离形式，也可以是固定在固体载体上、产生于细胞表面或位于细胞内。药物筛选方法之一，是利用用表达TCCR多肽或片段的重组核酸稳定地转化了的真核或原核宿主细胞。在竞争性结合试验中筛选抗此转化细胞的药物。活细胞形式或者固定形式的此类细胞，可用于标准结合试验。可以测定例如TCCR多肽或其片段与被测试剂之间复合物的形成。或者，可以检验由被测试剂造成的TCCR多肽与其靶细胞或靶受体之间复合物形成的减少。
因此，本发明提供筛选药物或任何其它可影响TCCR多肽-相关疾病或病症的试剂的方法。这些方法包括将这类试剂与TCCR多肽或其片段接触，并使用本领域熟知方法分析(I)该试剂与TCCR多肽或片段的复合物的存在，或(ii)TCCR多肽或片段与细胞的复合物的存在。在此类竞争性结合试验中，TCCR多肽或片段通常是标记的。适宜孵育之后，游离TCCR多肽或片段与结合形式的TCCR多肽或片段分开，游离或未形成复合物的标记物的量，可以衡量受测特定试剂与TCCR多肽的结合能力或者对TCCR多肽/细胞复合的阻碍能力。
用于药物筛选的另一技术提供高效率筛选具有与多肽的适宜结合亲和力的化合物，详细描述见1984年9月13日公开的WO 84/03564中。简要讲，在固体基底(如塑料钉或其它表面)上合成大量不同的小肽测试化合物。如用于TCCR多肽的那样，将肽测试化合物与TCCR多肽反应并洗涤。用本领域熟知方法检测结合的TCCR多肽。也可将纯化的TCCR多肽直接包埋在前述药物筛选技术所用的板上。此外，非-中和抗体可用于捕获肽并将肽固定在固体载体上。
本发明也考虑了使用竞争性药物筛选试验，在所述试验中，能够与TCCR多肽特异性结合的中和抗体与被测化合物竞争性地同TCCR多肽或其片段特异性结合。以这种方式，抗体可用于检测与TCCR多肽具有一个或多个相同表位的任何肽的存在。
实施例11  合理的药物设计
合理药物设计的目标是生产目标生物活性多肽(即TCCR多肽)的结构类似物或与多肽相互作用的小分子例如激动剂、拮抗剂或抑制剂。其中任何实例可用于形成药物，所述药物是更具活性或更稳定形式的TCCR多肽，或者药物增强或干扰TCCR多肽的体内功能(c.f.，Hodgson，Bio/Technologv，9：19-21(1991))。
在一种方法中，用x-射线晶体照相术、计算机模型设计或者最通常这二者的结合，来测定TCCR多肽或TCCR多肽-抑制剂复合物的三维结构。为描述结构和测定分子的活性位点，必须确定TCCR多肽的形状和电荷。不常用的方法是，通过基于同源蛋白质结构的模型，来获取关于TCCR多肽结构的有用信息。两种情况均使用相关的结构信息来设计类似的TCCR多肽样分子或用于鉴定有效抑制剂。合理药物设计的有用实例，包括Braxton和Wells，Biochemistry，31：7796-7801(1992)所证实的具有改进活性或稳定性的分子，或者Athauda等，J.Biochem.，113：742-746(1993)所述作为天然肽的抑制剂、激动剂或拮抗剂的分子。
还有一种可能是分离靶特异抗体，通过如上所述的功能分析进行筛选，然后解决其晶体结构。大体而言，这种途径产生药物母核(pharmacore)，可基于该母核设计药物。通过产生针对功能性、药理活性抗体的抗-独特型抗体(抗-独特型)，可完全绕开蛋白晶体构象。作为镜象的镜象，预计抗-独特型抗体的结合位点是原始受体的类似物。因此，抗-独特型抗体可用于从化学或生物学产生的肽库中鉴定和分离肽。随后，分离的肽可用作药物母核。
本发明可提供足够量的TCCR多肽来完成诸如X-线晶体照相术等分析研究。另外，本文提供的TCCR多肽氨基酸序列的信息，将对那些使用计算机模型技术代替x-射线晶体照相术或除使用x-射线晶体照相术之外还使用计算机模型技术的人员提供指导。
表2(A-D)显示使用ALIGN-2序列比较计算机程序，用下述方法测定氨基酸序列同一性％(表2(A-B))和核酸序列同一性％(表2(C-D))的假设的例证，其中″PRO″表示本发明假设的目标多肽的氨基酸序列，″对照蛋白质″表示使目标″PRO″多肽与其进行比较的多肽的氨基酸序列，″PRO-DNA″表示编码目标核酸序列的假设的″PRO″，″对照DNA″表示使目标核酸分子″PRO-DNA″与其进行比较的核酸分子的核苷酸序列，″X″、Y″和″Z″各自代表不同的假定氨基酸残基，而″N″、″L″和″V″各自代表不同的假定核苷酸。
实施例12   TCCR在免疫应答的产生中的作用
T细胞应答：为了进行抗-KLH应答，用100μg KLH的盐水溶液与CFA的1∶1乳液(Difco Laboratories，Detroit，MI)对小鼠后足垫进行免疫，所述乳液中含有1mg/ml结核分枝杆菌H37Ra。9天后，取出胭窝淋巴结，制备细胞悬浮液。在添加了5％FCS的DMEM基中，于各种浓度KLH下培养淋巴结细胞(每个孔5×105个细胞)。培养5天，在最后18小时加入1μCi[3H]-胸苷(ICN，Irvine，CA)来测定增殖，并通过液闪计数仪分析放射活性的掺入。将5×105个来自KLH-致敏的野生型或TCCR-缺陷型小鼠的引流淋巴结细胞，在指示量KLH存在的条件下，于96孔板上200ml的终体积中培养，以此分析由T细胞产生的细胞因子。培养96小时后，从每个孔中取出150μl培养上清液，使用购自Pharmingen(San Diego，CA)的抗体，在推荐条件下用ELISA测定细胞因子水平。
体外诱导T细胞分化：用抗-CD4磁珠(MACS)纯化取自野生型或TCCR-缺陷型同窝鼠的脾和淋巴结的CD4+T细胞。在经照射(3000rad)的同系野生型或基因敲除APC(106/ml)和ConA(2.5μg/ml，Bochringer，Mannheim，Germany)存在的条件下，激活纯化的T细胞(106细胞/ml)，或者通过铺板到已用5μg/ml抗-CD3和1μg/ml抗-CD28抗体包被的板上而激活。培养基中添加IL-2(20U/ml)、IL-12(3.5ng/ml，R & D Systems)和500ng/ml抗-IL-4抗体(Pharmingen)以备Th1分化，并添加IL-2(20U/ml)、IL-4(103U/ml，R & DSystems)和500ng/ml抗-IFN抗体(Phamingen)以备Th2分化。3天后，裂解细胞提取RNA，或者彻底洗涤、计数并在ConA(2.5μg/ml)存在的条件下或者在包被了5μg/ml抗-CD3抗体的板上再次激活密度为106细胞/ml的细胞。24小时后，收集上清液并分析细胞因子的存在。
总免疫球蛋白和OVA-特异性免疫球蛋白水平：给12周龄或更大些的未免疫小鼠放血，ELISA分析血清中各种免疫球蛋白同种型的存在。对于抗-OVA特异抗体，用100μg在完全Freund′s佐剂中的OVA(i.p.)免疫6周龄野生型或TCCR-缺陷小鼠，21天后，用100μg在不完全Freund′s佐剂中的OVA(i.p.)攻击。攻击的7天后，给小鼠放血并分析血清中OVA-特异性抗体的存在。
实时PCR分析：经FACS而将鼠脾细胞区分出T辅助细胞(CD4阳性，F4/80阴性，97％纯)、B细胞(CD19阳性，97％纯)、自然杀伤细胞(NK1.1阳性，99％纯)和巨噬细胞(F4/80阳性，＞95％纯)，经MACS区分出细胞毒T细胞(CD8阳性，85％纯)。Qiagen RNeasy柱提取总RNA，并用DNA酶I消化以除去污染的DNA。使用Taqman 18探测TCCR RNA。所有反应均作平行双份，并参照rp119这种核蛋白体管家基因而标准化。包括一个没有RT对照的反应，该反应显示所有样品均未被DNA污染。所有引物和探针的序列示于图19。
用匙孔血蓝蛋白(KLH)免疫野生型和TCCR-缺陷小鼠，9天后，收获引流淋巴结，评价在体外用KLH刺激后细胞因子的产生(图16A和B)。用KLH攻击时，TCCR-缺陷细胞产生IFN的能力显著削弱，而IL-4的产生明显增加。IL-5的产生和抗原诱导的TCCR-缺陷小鼠致敏淋巴结细胞的增殖是正常的(图16C和16D)。测得LPS刺激后TCCR-缺陷小鼠的IFN产生水平正常，表明这些小鼠的IFN产生似乎没有本质的缺陷。这些结果指出，TCCR-缺陷小鼠在增加Th1反应方面的能力受损。Th1反应的损失伴随着Th2反应的增强，此与在Th1细胞因子如IL-12缺陷的小鼠中所观察到的情况相似(Magram，J.等，1996，Immunity，4：471-81；Wu，C.等，1997，J.Immunol.，159：1658-65)。
除调节细胞免疫应答的作用外，IFN也参与免疫球蛋白(Ig)同种型的调节。特别是，已知IFN增强IgG2a抗体的产生，以及较小程度的IgG3抗体的产生(Snapper，C.M.，& Paul，W.E.，1987，Science，236：944-7；Huang，S.，等，1993，Science，259：1742-5)。与Th1细胞IFN的产生减少一致的是，TCCR-缺陷小鼠总血清IgG2a浓度降低而所有其它免疫球蛋白同种型的水平是正常的(图17A)。而且，用卵白蛋白(OVA)体内攻击后，TCCR-缺陷小鼠OVA-特异性IgG2a的滴度急剧下降(约为对照的20％；图17B)。
Th1反应在针对细胞内病原体如单核细胞增多性李斯特杆菌(L.monocytogenes)的防御中是至关重要的。为了进一步确定TCCR在体内控制Th1反应中的作用，用亚致死量(3×104菌落形成单位(CFU))的单核细胞增多性李斯特杆菌感染TCCR-缺陷小鼠和对照同窝鼠。感染的3天或9天后测定细菌滴度，发现TCCR-缺陷小鼠肝脏中的细菌滴度最多高出106-倍(图17C)。
之后，研究了TCCR在介导体外Th1反应分化方面的作用。在适宜Th1或Th2细胞发育的条件下，在有经照射的APC存在时，取自野生型和TCCR-缺陷小鼠的CD4+T细胞在体外分化。培养3-4天后，洗涤细胞，并ConA再刺激，24小时后，分析上清液中细胞因子的存在。当分化为Th1细胞时，TCCR-缺陷型淋巴细胞较其野生型同窝鼠淋巴细胞的IFN-产生量减少80％(图18A)。相反地，在IL-4和抗-IFN-抗体存在的条件下生长的TCCR-缺陷型淋巴细胞产生略多的IL-4。使用CD4+CD45Rbhigh天然完整细胞得到类似结果。该效应对于T细胞是固有的，其原因有2个：首先，在APC存在时，得自野生型或TCCR-缺陷小鼠的T细胞的分化结果相似。第二，使用板-固相化抗-CD3/CD28，在不含APC的系统中进行T细胞分化，可重现该效应(图18B)。用细胞内FACS染色测定发现，IFN产生的减少也与IFN产生细胞数量的减少有关。由于受体的两个亚单位在活化的T-细胞上正常表达，所以观察到的Th1缺乏并不是IL-12受体缺陷的结果。既然IL-12仍能够促进ConA刺激的野生型和TCCR-缺陷小鼠T细胞的增殖，看来这些小鼠的IL-12信号通路没有缺陷(图18C和18D)。
表3(A-Q)提供ALIGN-2序列比较计算机程序的完整源代码。它可常规应用于UNIX操作系统以便提供ALIGN-2序列比较计算机程序。
                        表2A
PRO            XXXXXXXXXXXXXXX(长度＝15个氨基酸)
对照蛋白质     XXXXXYYYYYYY(长度＝12个氨基酸)
氨基酸序列同源性％＝(用ALIGN-2测定对比两个多肽序列之间相同氨基酸残基的数量)除以(PRO多肽氨基酸残基的总数)＝5除以15＝33.3％。
                        表2B
PRO           XXXXXXXXXX(长度＝10个氨基酸)
对照蛋白质    XXXXXYYYYYYZZYZ(长度＝15个氨基酸)
氨基酸序列同源性％＝(用ALIGN-2测定对比两个多肽序列之间相同氨基酸残基的数量)除以(PRO多肽氨基酸残基的总数)＝5除以10＝50％。
                        表2C
PRO-DNA    NNNNNNNNNNNNNN(长度＝14个核苷酸)
对照DNA    NNNNNNLLLLLLLLLL(长度＝16个核苷酸)
核酸序列同源性％＝(用ALIGN-2测定对比两个核酸序列之间相同核苷酸的数量)除以(PRO-DNA核酸序列)＝6除以14＝42.9％。
                        表2D
PRO-DNA    NNNNNNNNNNNN(长度＝12个核苷酸)
对照DNA    NNNNLLLVV(长度＝9个核苷酸)
核酸序列同源性％＝(用ALIGN-2测定对比两个核酸序列之间相同核苷酸的数量)除以(PRO-DNA核酸序列)＝4除以12＝33.3％。
                               表3A
/*
 *
 * C-C increased from 12 to 15
 * Z is average of EQ
 * B is average of ND
 * match with stop is_M;stop-stop=0;J(joker)match=0
 */
#define  _M         -8       /* value of a match with a stop */
int      _day[26][26]={
/*       A B C D E F G H I J K L M N O P Q R S T U V W X Y Z*/
/* A */     {2,0,-2,0,0,-4,1,-1,-1,0,-1,-2,-1,0,_M,1,0,-2,1,1,0,0,-6,0,-3,0},
/* B */     {0,3,-4,3,2,-5,0,1,-2,0,0,-3,-2,2,_M,-1,1,0,0,0,0,-2,-5,0,-3,1},
/* C */     {-2,-4,15,-5,-5,-4,-3,-3,-2,0,-5,-6,-5,-4,_M,-3,-5,-4,0,-2,0,-2,-8,0,0,-5},
/* D */     {0,3,-5,4,3,-6,1,1,-2,0,0,-4,-3,2,_M,-1,2,-1,0,0,0,-2,-7,0,-4,2},
/* E */     {0,2,-5,3,4,-5,0,1,-2,0,0,-3,-2,1,_M,-1,2,-1,0,0,0,-2,-7,0,-4,3},
/* F */     {-4,-5,-4,-6,-5,9,-5,-2,1,0,-5,2,0,-4,_M,-5,-5,-4,-3,-3,0,-1,0,0,7,-5},
/* G */     {1,0,-3,1,0,-5,5,-2,-3,0,-2,-4,-3,0,_M,-1,-1,-3,1,0, 0,-1,-7,0,-5,0},
/* H */     {-1,1,-3,1,1,-2,-2,6,-2,0,0,-2,-2,2,_M,0,3,2,-1,-1,0,-2,-3,0,0,2},
/* I */     {-1,-2,-2,-2,-2,1,-3,-2,5,0,-2,2,2,-2,_M,-2,-2,-2,-1,0,0,4,-5,0,-1,-2},
/* J */     { 0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,_M,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0},
/* K */     {-1,0,-5,0,0,-5,-2,0,-2,0,5,-3,0,1,_M,-1,1,3,0,0,0,-2,-3,0,-4,0},
/* L */     {-2,-3,-6,-4,-3,2,-4,-2,2,0,-3,6,4,-3,_M,-3,-2,-3,-3,-1,0,2,-2,0,-1,-2},
/* M */     {-1,-2,-5,-3,-2,0,-3,-2,2,0,0,4,6,-2,_M,-2,-1,0,-2,-1,0,2,-4,0,-2,-1},
/* N */     {0,2,-4,2,1,-4,0,2,-2,0,1,-3,-2,2,_M,-1,1,0,1,0,0,-2,-4,0,-2,1},
/* O */     {_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,0,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M},
/* P */     {1,-1,-3,-1,-1,-5,-1,0,-2,0,-1,-3,-2,-1,_M,6,0,0,1,0,0,-1,-6,0,-5,0},
/* Q */     {0,1,-5,2,2,-5,-1,3,-2,0,1,-2,-1,1,_M,0,4,1,_1,-1,0,-2,-5,0,-4,3},
/* R */     {-2,0,-4,-1,-1,-4,-3,2,-2,0,3,-3,0,0,_M,0,1,6,0,-1,0,-2,2,0,-4,0},
/* S */     {1,0,0,0,0,-3,1,-1,-1,0,0,-3,-2,1,_M,1,-1,0,2,1,0,-1,-2,0,-3,0},
/* T */     {1,0,-2,0,0,-3,0,-1,0,0,0,-1,-1,0,_M,0,-1,-1,1,3,0,0,-5,0,-3,0},
/* U */     {0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,_M,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0},
/* V */     {0,-2,-2,-2,-2,-1,-1,-2,4,0,-2,2,2,-2,_M,-1,-2,-2,-1,0,0,4,-6,0,-2,-2},
/* W */     {-6,-5,-8,-7,-7,0,-7,-3,-5,0,-3,-2,-4,-4,_M,-6,-5,2,-2,-5,0,-6,17,0,0,-6},
/* X */     {0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,_M,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0},
/* Y */     {-3,-3,0,-4,-4,7,-5,0,-1,0,-4,-1,-2,-2,_M,-5,-4,-4,-3,-3,0,-2,0,0,10,-4},
/* Z */     {0,1,-5,2,3,-5,0,2,-2,0,0,-2,-1,1,_M,0,3,0,0,0,0,-2,-6,0,-4,4}
};

                                                                                 Page 1 of day.h
                                   表3B
/*
 */
#include＜stdio.h＞
#include＜ctype.h＞
#define  MAXJMP          16      /* max jumps in a diag */
#define  MAXGAP          24      /* don't continue to penalize gaps larger than this */
#define  JMPS            1024    /* max jmps in an path */
#define  MX              4       /* save if there's at least MX-1 bases since last jmp */
#define  DMAT            3       /* value of matching bases */
#define  DMIS            0       /* penalty for mismatched bases */
#define  DINS0           8       /* penalty for a gap */
#define  DINS1           1       /* penalty per base */
#define  PINS0           8       /* penalty for a gap */
#define  PINS1           4       /* penalty per residue */
struct jmp{

         short           n[MAXJMP];              /* size of jmp(neg for dely) */

         unsigned short  x[MAXJMP];              /* base no.of jmp in seq x */
};                                               /* limits seq to 2^16-1*/
struct diag{

         int             score;                  /* score at last jmp */

         long            offset;                 /* offset of prev block */

         short           ijmp;                   /* current jmp index */

         struct jmp      jp;                     /* list of jmps */
};
struct path{

         int      spc;                /* number of leading spaees */

         short    n[JMPS];/* size of jmp (gap) */

         int      x[JMPS];/* loc of jmp(last elem before gap)*/
};
char              *ofile;                       /* output file name */
char              *namex{2];                    /* seq names getseqs() */
char              *prog;                        /* prog name for err msgs */
char              *seqx[2];                     /* seqs:getscqs() */
int               dmax;                         /* best diag:nw() */
int               dmax();                       /* final diag */
int               dna;                          /* set if dna:main() */
int               endgaps;                      /* set if penalizing end gaps */
int               gapx,gapy;                    /* total gaps in seqs */
int               len0,len1;                    /* seq lens */
int               ngapx,ngapy;                  /* total size of gaps */
int               smax;                         /* max score:nw() */
int               *xbm;                         /* bitmap for matching */
long              offset;                       /* currenl offset in jmp file */
struct   diag     *dx;                          /* holds diagonals */
struct   path     pp[2];                        /* holds path for seqs */
char              *calloc(),*malloc(),*index(),*strepy();
char              *getseq(),*g_calloc();

                                                                                     Page 1 of nw.h
                                             表3C
/* Needleman-Wunsch alignment program
 *
 * usage:progs filel file2
 * where file1 and file2 are two dna or two protein sequences.
 * The sequences can be in upper- or lower-case an may contain ambiguity
 * Any lines beginning with ';', '＞' or '＜' are ignored
 * Max file length is 65535(limited by unsigned short x in the jmp struct)
 * A sequence with 1/3 or more of its elements ACGTU is assumed to be DNA
 * Output is in thc file ″align.out″
 *
 * The program may create a tmp file in/tmp to hold info about traceback.
 * Original version developed under BSD 4.3 on a vax 8650
 */
#include ″nw.h″
#include ″day.h″
static     _dbval[26]={

           1,14,2,13,0,0,4,11,0,0,12,0,3,15,0,0,0,5,6,8,8,7,9,0,10,0
};
static     _pbval[26]={

           1,21(1＜＜('D'-'A'))1(1＜＜('N'-'A')),4,8,16,32,64,

           128,256,0xFFFFFFF,1＜＜10,1＜＜11,1＜＜12,1＜＜13,1＜＜14,

           1＜＜15,1＜＜16,1＜＜17,1＜＜18,1＜＜19,1＜＜20,＜＜21,1＜＜22,

           1＜＜23,1＜＜24,1＜＜251(1＜＜('E'-'A'))1(1＜＜('Q'-'A'))
main(ac,av)                                                                                          main

           int      ac;

           char     *av[];
{

           prog=av[0];

           if(ac!=3){

                     fprintf(stdcrr,″usage:%s file1 file2\n″,prog);

                     fprintf(stderr,″wherc file1 and file2 are two dna or two protein sequences.\n″);

                     fprintf(stderr,″The sequences can be in upper- or lower-case\n″);

                     fprintf(stderr,″Any lines beginning with ';' or'＜' are ignored\n″);

                     fprintf(stderr,″Output is in the file \″align.out\″\n″);

                     exit(1);

           }

           namex[0]=ay[1];

           namex[1]=av[2];

           seqx[0]=gatseq(namex[0],&len0);

           seqx[1]=getseq(namex[1],&len1);

           xbm=(dna)?_dbval:_pbval;

           endgaps=0;                                  /* 1 to penalize endgaps */

           ofile= ″align.out″;             /* output file */

           nw();                 /* fill in the matrix,gct the possible jmps */

           readjmps();           /* get the actual jmps */

           print();              /* print stats,alignment */

           clcanup(0);           /* unlink any tmp files */
} 

                                                                                                  Page 1 of nw.c
                                                    表3D
/*do the alignment,retum best score:main()
 * dna:values in Fitch and Smith,PNAS,80,1382-1386,1983
 * pro:PAM 250 values
 * When scores are equal,we prefer mismatches to any gap,prefer
 * a new gap to extending an ongoing gap,and prefer a gap in seqx
 * to a gap in seq y.
 */
nw()                                                                                                          nw
{

            char              *px,*py;           /* seqs and ptrs */

            int               *ndely,*dely;      /* keep track of dely */

            int               ndelx,delx;        /* keep track of delx */

            int               *tmp;              /* for swapping row0,row1 */

            int               mis;               /* score for each type */

            int               ins0,ins1;         /* insertion penalties */

            register          id;                /* diagonal index */

            register          ij;                /* jmp index */

            register          *col0,*col1;       /* score for curr,last row */

            register          xx,yy;             /* index into seqs */

            dx=(struct diag *)g_calloc(″to get diags″,lcn0+len1+1,sizeof(struct diag));

            ndely=(int *)g_calloc(″to get ndely″,len1+1,sizeof(int));

            dely=(int *)g_calloc(″to get dely″,len1+1,sizeof(int));

            col0=(int *)g_calloc(″to get col0″,len1+1,sizeof(int));

            col1=(int *)g_calloc(″to get col1″,len1+1,sizeof(int));

            ins0=(dna)?DINS0:PINS0;

            ins1=(dna)?DINS1:PINS1;

            smax=-10000;

            if(endgaps){

                        for(col0[0]=dely[0]=-ins0,yy=1;yy＜=len1;yy++){

                                    col0[yy]=dely{yy]=col0[yy-1]-ins1;

                                    ndely[yy]=yy;             }

                        col0[0]=0;         /* Waterman Bull Math Biol 84 */     }

            else

                        for(yy=1;yy＜=len1;yy4+)

                                    dely[yy]=-ins0;

            /* fill in match matrix

             */

            for(px=seqx[0],xx=1;xx＜=len0;px++,xx++){

                    /* initialize first entry in col

                     */

                    if(endgaps){

                              if(xx==1)

                                     col1[0]=delx=-(ins0+ins1);

                              else

                                     col1[0]=delx=col0[0]-ins1;

                              ndelx=xx;

                   }

                   elsc{

                              col1[0]=0;

                              delx=-ins0;

                              ndelx=0;

                   }                                                     Page 2 of nw.c
                                     表3E
                                                                                  ...nw
for(py=seqx[1],yy=1;yy＜=len1;py++,yy++){

        mis=col0[yy-1];

        if(dna)

                  mis+=(xbm[*px-'A']&xbm[*py-'A'])?DMAT:DMIS;

        else

                  mis+=_day[*px-'A'][*py-'A'];

        /* update penalty for del in x seq;

         * favor new del over ongong del

         * ignore MAXGAP if weighting endgaps

         */

        if(endgaps‖ndely[yy]＜MAXGAP){

                  if(col0[yy]-ins0＞=dely[yy]){

                            dely[yy]=col0[yy]-(ins0+ins1);

                            ndely[yy]=1;

                  }else{

                            dely[yy]-=ins1;

                            ndely[yy]++;

                  }

         }else{

                  if(col0[yy]-(ins0+ins1)＞=dely[yy]){

                            dely[yy]=col0[yy]-(ins0+ins1);

                            ndely[yy]=1;

                  }else

                            ndely[yy]++;

         }

         /* update penalty for del in y seq;

          * favor new del over ongong del

          */

         if(endgaps‖ndelx＜MAXGAP){

                   if(col1[yy-1]-ins0＞=delx){

                           delx=col1[yy-1]-(ins0+ins1);

                           ndelx=1;

                   }else{

                           delx-=ins1;

                           ndelx++;

                   }

          }else{

                   if(col1[yy-1]-(ins0+ins1)＞=delx){

                           delx=col1[yy-1]-(ins0+ins1);

                           ndelx=1;

                   }else

                           ndelx++;

          }

          /* pick the maximum score;we're favoring

           * mis over any del and delx over dely

           */

                                                                                     Page 3 of nw.c
                                                  表3F
                       id=xx-yy+len1-1:

                       if(mis＞=delx && mis＞=dely[yy])

                                col1[yy]=mis;

                       else if(delx＞=dely[yy]){

                                col1[yy]=delx;

                                ij=dx[id].ijmp;

                                if(dx[id].jp.n[0]&&(!dna‖(ndclx＞=MAXJMP

                                && xx＞dx[id].jp.x[ij]+MX)‖mis＞dx[id].score+DINSO)){

                                      dx[id].ijmp++;

                                      if(++ij＞=MAXJMP){

                                               writejmps(id);

                                               ij=dx[id].ijmp=0;

                                               dx[id].offset=offset;

                                               offset+=sizeof(struct jmp)+sizeof(offset);   }

                                      }

                                     dx[id].jp.n[ij]=ndelx;

                                     dx[id[.jp.x[ij]=xx:

                                     dx[id].score=delx;        }

                       else{         col1[yy]=dely[yy];

                                     ij=dx[id].ijmp;

      if(dx[id].jp.n[0]&&(!dna ‖(ndely[yy]＞=MAXJMP

                                     && xx＞dx[id].jp.x[ij]+MX)‖mis＞dx[id].score+DINS0)){

                                           dx[id].ijmp++;

                                           if(++ij＞=MAXJMP){

                                                    writejmps(id);

                                                    ij=dx[id].ijmp=0;

                                                    dx[id].offset=offset;

                                                    offset+=sizeof(struct jmp)+sizeof(offset);  }       }

                                    dx[id]-jp.n[ij]=-ndely[yy];

                                    dx[id].jp.x[ij]=xx;

                                    dx[id].score=dely[yy];              }

                       if(xx=len0 && yy＜len1){

                                    /* last col

                                     */

                                    if(endgaps)

                                            col1[yy]-=ins0+ins1 *(len1-yy);

                                    if(col1[yy]＞smax){

                                            smax=col1[yy];

                                            dmax=id;     }

                         }

                }

                if(endgaps && xx＜len0)

                        col1[yy-1]-=ins0+ins1*(len0-xx);

                if(col1[yy-1]＞smax){

                        smax=col1[yy-1];

                        dmax=id;               }

                tmp=col0;col0=col1;col1=tmp;   }

       (void)free((char *)ndcly);

       (void)free((char *)dcly);

       (void)free((char *)col0);

       (void)free((char *)col1);
}                                                                                  Page 4 of nw.c
                                           表3G
/*
 *
 * print()--only routine visible outside this module
 * static:
 * getmat()--trace back best path,count matches:print()
 * pr_align()--print alignment of described in array p[]:print()
 * dumpblock()--dump a block of lines with numbers,stars:pr_align()
 * nums()--put out a number line:dumpblock()
 * putline()--put out a line(name,[num],seq,[num]):dumpblock()
 * stars()--put a line of stars:dumpblock()
 * stripname()--strip any path and prefix from a seqname
 */
#inelude ″nw.h″
#define SPC        3
#define P_LINE     256      /* maximum output line */
#define P_SPC      3        /* space between name or num and seq */
extern   _day[26][26];
int      olen;              /* set output line length */
FILE     *fx;               /* output file */
print()                                                                                                 print
{

         int       1x,1y,firstgap,lastgap;      /* overlap */

         if((fx=fopen(ofile,″w″))=0){

                   fprintf(stderr,″%s:can't write %s\n″,prog,ofile);

                   cleanup(1);      }

         fprintf(fx,″＜first sequence:%s(length=%d)\n″,namex[0],len0);

         fprintf(fx,″＜second sequence:%s(length=%d)\n″,namex[1],len1);

         olen=60;

         1x=len0;

         1y=len1;

         firstgap=lastgap=0;

         if(dmax＜len1-1){          /* leading gap in x */

                   pp[0].spc=firstgap=len1-dmax-1;

                   1y-=pp[0].spc;

         }

         else if(dmax＞len1-1){     /* leading gap in y */

                   pp[1].spc=firstgap=dmax-(len1-1);

                   1x-=pp[1].spc;

         }

         if(dmax0＜len0-1){         /* trailing gap in x */

                   lastgap=len0-dmax0-1;

                   1x-=lastgap;

         }

         else if(dmax0＞len0-1){    /* trailing gap in y */

                   lastgap=dmax0-(len0-1);

                   1y-=lastgap;

         }

         getmat(1x,1y,firstgap,lastgap);

         pr_align();
}                                                                                         Page 1 of nwprint.c
                                    表3H
/*
 * trace back the best path,count matches
 */
statie
getmat(1x,1y,firstgap,lastgap)                                                                         getmat

          int       1x,1y;                      /* ″core″(minus endgaps) */

          int       firstgap,lastgap;           /* leading trailing overlap */
{

          int                 nm,i0,i1,siz0, siz1;

          char                outx[32];

          double              pct;

          register            n0,n1;

          register char       *p0,*p1;

          /* get total matches,score

           */

          i0=i1=siz0=siz1=0;

          p0=seqx[0]+pp[1].spc;

          p1=seqx[1]+pp[0].spe;

          n0=pp[1].spc+1;

          n1=pp[0].spc+1;

          nm=0;

          while(*p0 && *p1){

                 if(siz0){

                          p1++;

                          h1++;

                          siz0--;}
                 else if(siz1){

                          p0++;

                          n0++;

                          siz1--;}

                 else{

                          if(xbm[*p0-'A']&xbm[*p1 -'A'])

                                  nm++;

                          if(n0++==pp[0].x[i0])

                                  siz0=pp[0].n[i0++];

                          if(n1++==pp[1].x[i1])

                                  sizl=pp[1].n[i1++];

                           p0++;

                           pt++;   }

          }

          /* pet homology:

           * if penalizing endgaps,base is the shorter seq

           * else,knock off overhangs and take shorter core

           */

          if(endgaps)

                   1x=(len0＜len1)?len0:len1;

          else

                   1x=(1x＜1y)?1x:1y;

          pet=100.*(double)nm/(double)1x;

          fprintf(fx,″\n″);

          fprintf(fx,″＜%d match%s in an overlap of %d:%.2f percent similarity\n″,

                   nm,(nm==1)?″″:″es″,1x,pct);

                                                                                          Page 2 of nwprint.c
                                                         表3I
           fprintf(fx,″＜gaps in first sequence:%d″,gapx);                                                  ...getmat

           if(gapx){

                       (void)sprintf(outx,″(%d %s %s)″,

                                ngapx,(dna)?″basc″:″residue″,(ngapx==1)?″″:″s″);

                        fprintf(fx,″%s″,outx);

           fprintf(fx,″,gaps in second sequence:%d″,gapy);

           if(gapy){(void)sprintf(outx,″(%d %s %s)″,

                                ngapy,(dna)?″base″:″residue″,(ngapy==1)?″″:″s″);

                                fprinff(fx,″%s″,outx);       }

           if(dna)

                        fprintf(fx,

                        ″\n＜score:%d(match=%d,mismatch=%d,gap penalty=%d+%d per base)\n″,

                        smax,DMAT,DMIS,DINS0,DINS1);

           else
                        fprintf(fx,

                        ″\n＜score;%d(Dayhoff PAM 250 matrix,gap penalty=%d+%d per residue)\n″,

                        smax,PINS0,PINS1);

            if(endgaps)

                        fprintf(fx,

                        ″＜endgaps penalized.left endgap:%d %s %s,right endgap:%d %s%s\n″,

                        firstgap,(dna)?″base″:″residue″,(firstgap==1)?″″:″s″,

                        lastgap,(dna)?″base″:″residue″,(lastgap==1)?″″:″s″);

            else

                        fprintf(fx,″＜endgaps not penalized\n″);}
static                  nm;                 /* matches in core--for checking */
static                  lnax;               /* lengths of stripped file names */
static                  ij[2];              /* jmp index for a path */
static                  nc[2];              /* number at start of current line */
static                  ni[2];              /* current clem number--tor gapping */
static                  siz[2];
static char             *ps[2];             /* ptr to current element */
static char             *po[2];             /* ptr to next output char slot */
static char             out[2][P_LINE];     /* output line */
static char             star[P_LINE];       /* set by stars() */
/*
 * print alignment of described in struct path pp[]
 */
static
pr_align()                                                                                                         pr_align
{

            int              nn;            /* char count */

            int              more;

            register         i;

            for(i=0,lmax=0;i＜2;i++){nn=stripname(namex[i]);

                        if(nn＞lmax)

                             lmax=nn;

                        nc[i]=1;

                        ni[i]=1;

                        siz[i]=ij[i]=0;

                        ps[i]=seqx[i];

                        po[i]=out[i];

        }

                                                                                                        Page 3 of nwprint.c
                                                 表3J
          for(nn=nm=0,more=1;more;){                                                                    ...pr_align

                  for(i=more=0;i＜2;i++){

                           /*

                            * do we have more of this scquence?

                            */

                           if(!*ps[i])

                                      continue;

                           more++;

                           if(pp[i].spc){     /* lcading space */

                                     *po[i]++=″;

                                     pp[i].spc--;                     }

                           else if (siz[i]){  /* in a gap */

                                      *po[i]++= '-';

                                      siz[i]--;                  }

                           else{              /* we're putting a seq clement

                                               */

                                     *po[i]=*ps[i];

                                     if(islower(*ps[i]))

                                               *ps[i]=toupper(*ps[1]);

                                     po[i]++;

                                     ps[i]++;

                                     /*

                                      * are we at next gap for this seq?

                                      */

                                     if(ni[i]=pp[i].x[ij[i]]){

                                              /*

                                               * we need to merge all gaps

                                               * at this location

                                               */

                                              siz[i]=pp[i].n[ij[i]++];

                                              while (ni[i]==pp[i].x[ij[i]])

                                                        siz[i]+=pp[i].n[ij[i]++];           }

                                     no[i]++,

                            }

                   }

                   it(++nn==olen‖!more && nn){

                            dumpblock();

                            for(i=0;i＜2;i++)

                                      po[i]=out[i];

                            nn=0;             }

          }
/*
 * dump a block of lines,including numbers,stars:pr_align()
 */
static
dumpblock()                                                                                                     dumpblock
{

          register i;

          for(i=0;i＜2;i++)

                     *po[i]--=\0';

                                                                                                      Page 4 of nwprint.c
                                                           表3K
                                                                                                             ...dumpblock

            (void)putc(\n', fx);

            for(i=0;i＜2;i++){

                      if(*out[i]&&(*out[i]!=″‖*(po[i])!=″)) {

                                 if(i==0)

                                        nums(i);

                                 if(i==0 && *out[1])

                                        stars();

                                 putline(i);

                                 if(i==0 && *out[1])

                                        fprintf(fx,star);

                                 if(i==1)

                                        nums(i);            }

           }
/*
 * put out a number line:dumpblock()
 */
static
nums(ix)                                                                                                             nums

            int      ix;         /* index in out[]holding seq line */
{           char                 nline[P_LINE];

            register             i,j;

            register char        *pn,*px,*py;

            for(pn=nline,i=0;i＜1max+P_SPC;i++,pn++)

                      *pn=″;

            for(i=nc[ix],py=out[ix];*py;py++,pn++){

                     if(*py==″‖ *py=='-')

                                  *pn=″;

                     else{

                                 if(i％10=0‖(i=1 && nc[ix]!=1)){

                                          j=(i＜0)?-i:i;

                                          for(px=pn;j;j/=10,px--)

                                                   *px=j％10+'0';

                                          if(i＜0)

                                                   *px='-';            }

                                 else

                                          *pn=″;

                                 i++;            }

            }

            *pn=\0';

            nc[ix]=i;

            for(pn=nline;*pn;pn++)

                    (void)putc(*pn,fx);

            (void)putc(\n',fx);}
/*
 * put out a line(name,[num],seq,[num]):dumpblock()
 */
static
putline(ix)                                                                                                       putline

            int      ix;
{

                                                                                                       Page 5 of nwprint.c
                                                     表3L
                                                                                                        ...putlinc

           int                 i;

           register char       *px;

           for(px=namex[ix],i=0;*px && *px!=':';px++,i++)

                   (void)putc(*px,fx);

           for(;i＜1max+P_SPC;i++)

                   (void)putc(″,fx);

           /* these count from 1:

            * ni[]is curent element(from 1)

            * nc[]is number at start of current line

            */

           for(px=out[ix];*px;px++)

                   (void)putc(*px&0x7F,fx);

           (void)putc(\n',fx);
}
/*
 * put a linc of stars(seqs always in out[0],out[1]):dumpblock()
 */
static
stars()                                                                                                      stars{

           int                   i;

           register char         *p0,*p1,cx.*px;

           if(!*out[0]‖(*out[0]==″&& *(po[0])==″)‖

              !*out[1]‖(*out[1]==″&& *(po[1])==″))

                    return;

            px=star;

            for(i=lmax+P_SPC;i;i--)

                    *px++=”;

            for(p0=out[0],p1=out[1];*p0 && *p1;p0++,p1++) {

                    if(isalpha(*p0) && isalpha(*p1)){

                              if(xbm[*p0-'A']&xbm[*p1-'A']){

                                       cx='*'

                                       nm++;

                              }

                              else if(!dna && _day[*p0-'A'][*p1-'A']＞0)

                                       cx='.';

                              else

                                       cx='';

                     }

                     else

                              cx=''；

                        *px++=cx;

            }

            *px++=\n';

            *px=\0';
}                                                                                              Page 6 of nwprint.c
                                           表3M
/*
* strip path or prefix from pn,return len:pr_align()
*/
static
stripname(pn)                                                                                         stripname

            char     *pn;      /* file name(may be path) */
{

            register char      *px,*py;

            py=0;

            for(px=pn;*px;px++)

                     if(*px=='/')

                               py=px+1;

           if(py)

                     (void)strcpy(pn,py);

            return(strlen(pn));
}

                                                                                            Page 7 of nwprint.c
                                      表3N
/*
 * cleanup()--cleanup any trap file
 * getseq()--read in seq,scet dna,len,maxlen
 * g_calloc()--calloc()with error checkin
 * readjmps()--get the good imps,from tmp file if necessary
 * writejmps()--write a filled array ofjmps to a trap file;nw()
 */
#include ″nw.h″
#include＜sys/filc.h＞
char      *jname=″/tmp/homgXXXXXX″;             /* tmp file for jmps */
FILE      *fj;
int       cleanup();                         /* cleanup imp file */
long      Iseek();
/*
 * remove any tmp file if we blow
 */
cleanup(i)                                                                                              cleanup

          int         i;
{         if(fj)

                     (void) unlink(jname);

          exit(i);}
/*
 * read,return ptr to seq,set dna,len,maxlen
 * skip lines starting with ';', '＜', or'>'
 * seq in upper or lower case
 */
char      *
getseq(file,len)                                                                                                         getseq

         char     *file;       /* file name */

         iht      *Ien;        /* seq len */
 {

         char                  line[1024], *pseq;

         register char         *px,*py;

         int                   natgc,tlen;

         FILE                  *fp;

         if((fp=fopen(file,″r″))==O){

                  fprintf(stderr,″%s:can't read %s\n″,prog,file);

                  exit(1);

         }

         tlen=natgc=0;

         while(fgets(line,1024.fp)){

                  if(*line ==';'‖*line=='＜'‖*line =='>')

                              continue;

                  for(px=line;*px!=\n';px++)

                              if(isupper(*px)‖islower(*px))

                              tlen++;

         }

         if((pseq=malloc((unsigned)(tlen+6)))==0){

                  fprintf(stderr,″%s:malloc()failed to get %d bytes for %s\n″,prog,tlen+6,file);

                  exit(1);

         }

         pseq[0]=pseq[1]=pseq[2]=pseq[3]=\0';

                                                                                                             Page 1 of nwsubr.c
                               表3O
                                                                                                    ...getseq
           py=pseq+4;

           *len=tlen;

           rewind(fp);

           while(fgets(linc,1024,fp)){

                    if(*linc==';' ||*linc== '＜' ||*line=='>')

                             continue:

                    for(px=line;*px!=\n';px++){

                             if(isupped*px))

                                      *py++=*px;

                             else if(islower(*px))

                                      *py++=toupper(*px);

                             if(index(″ATGCU″,*(py-1)))

                                       natgc++;                }

           }

          *py++=\0';

          *py=\0';

           (void)fclose(fp);

           dna=natgc＞(tlen/3);

           return(pseq+4);
}
char       *
g_calloc(msg,nx,sz)                                                                                   g_calloc

           char     *msg;              /* program,calling routine */

           int      nx,sz;             /* number and size of elements */
{

           char              *px,*calloc();

           if((px=calloc((unsigned)nx,(unsigned)sz))==0){

                    if(*msg){

                             fprintf(stderr,″%s:g_calloc()failed %s(n=%d,sz=%d)\n″,prog,msg,nx,sz);

                             exit(I);            }

           }

           return(px);
}
/*
 * get final jmps from dx[] or tmp file.set pp[],rcset dmax:main()
 */
readjmps()                                                                                            readjmps{

           int               fd=-1;

           int               siz,i0,i1;

           register i,j,xx;

           if(fj){

                     (void)fclose(fj);

                     if{(fd=open(jname,O_RDONLY,0))＜0){

                             fprintf(stderr,″%s:can't open() %s\n″,prog,jname);

                             cleanup(1);                }

           }

           for(i=i0=i1=0,dmax0=dmax,xx=len0;;i++){

                     while(1){

                             for(j=dx[dmax].ijmp;j＞=0 && dx[dmax].jp.x[j]＞=xx;j--)

                                    ;

                                                                                           Page 2 of nwsubr.c
                                                    表3P
                                                                                                                      ...readjnps

                          if(j＜0&&dx[dmax].offset && fj){

                                  (void)lseek(fd,dx[dmax].offset,0);

                                  (void)read(fd,(char *)&dx[dmax].jp,sizeof(struct jmp));

                                  (void)read(fd,(char *)&dx[dmax].offset,sizeof(dx[dmax].offset));

                                  dx[dmax].ijmp=MAXJMP-1;                                  }

                          else

                                  break;         }

                  if(i＞=JMPS){

                          fprintf(stderr,″%s:too many gaps in alignment\n″,prog);

                          cleanup(1);                     }

                  if(j＞=0){

                          siz=dx[dmax].jp.n[j];

                          xx=dx[dmax].jp.x[j];

                          dmax+=siz;

                          if(siz＜0){                   /* gap in second seq */

                                   pp[1].n[i1]=-siz;

                                   xx+=siz;

                                   /*id=xx-yy+len1-1

                                   */

                                   pp[1].x[i1]=xx-dmax+lcn1-1;

                                   gapy++;

                                   ngapy-=siz;
/*ignore MAXGAP when doing endgaps */

                                   siz=(-siz＜MAXGAP‖endgaps)?-siz:MAXGAP;

                                   i1++;                   }

                          else if(siz＞0){  /* gap in first seq */

                                   pp[0].n[i0]=siz;

                                   pp[0].x[i0]=xx;

                                   gapx++;

                                   ngapx+=siz;
/*ignorc MAXGAP when doing endgaps */

                                   siz=(siz＜MAXGAP‖endgaps)?siz：MAXGAP;

                                   i0++;                 }

                 }

                 else

                          break;  }

         /*reverse the order of jmps

         */

         for(j=0,i0--;j＜i0;j++,i0-){

                 i=pp[0].n[j];pp[0].n[j]=pP[0].n[i0];pp[0].n[i0]=i;

                 i=pp[0].x[j];pp[0].x[j]=pp[0].x[i0];pp[0].x[i0]=i;}

         for(j=0,i1--;j＜i1;j++,i1--){

                 i=pp[1].n[j];pp[1].n[j]=pp[1].n[i1];pp[1].n[i1]=i;

                 i=pp[1].x[j];pp[1].x[j]=pp[1].x[i1];pp[1].x[i1]=i;}

         if(fd＞=0)

                 (void)close(fd);

         if(fj){

                 (void)unlink(jname);

                 fj=0;

                 offset=0;}
}                                                                                                              Page 3 of nwsubr.c
                                                             表3Q
/*
 * write a filled jmp struct offset of the prev one(if any):nw()
 */
writejmps(ix)                                                                                    writejmps

          int      ix;
{

          char     *mktemp();

          if(!fj){

                   if(mktemp(jname)＜0){

                            fprintf(stderr,″s:can't mktemp()%s\n″,prog,jname);

                            cleanup(I);

                   }

                   if((fj=fopen(jname,″w″))==0){

                            fprintf(stderr,″%s:can't write %s\n″,prog,jname);

                            exit(1);

                   }

          }

          (void)fwrite((ehar *)&dx[ix].jp,sizeof(struet imp),1,fj);

          (void)fwrite((char *)&dx[ix].offset,sizeof(dx[ix].offset),1,fj);
}
                             序列表
                             序列表<110>杰南技术公司(Genentech，Inc.)
 弗雷德里克.J.德索韦格(De Sauvage，Frederic)
 伊奎贝尔.格雷沃尔(Grewal，Iqbal)
 奥斯汀.L.格尼(Gurney，Austin L.)<120>I型细胞因子受体TCCR<130>P1748R1PCT<140>PCT/US00/28827<141>2000-10-18<150>US 60/160,542<151>1999-10-20<160>16<210>1<211>636<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>1Met Arg Gly Gly Arg Gly Ala Pro Phe Trp Leu Trp Pro Leu Pro1               5                  10                  15Lys Leu Ala Leu Leu Pro Leu Leu Trp Val Leu Phe Gln Arg Thr
             20                  25                  30Arg Pro Gln Gly Ser Ala Gly Pro Leu Gln Cys Tyr Gly Val Gly
             35                  40                  45Pro Leu Gly Asp Leu Asn Cys Ser Trp Glu Pro Leu Gly Asp Leu
             50                  55                  60Gly Ala Pro Ser Glu Leu His Leu Gln Ser Gln Lys Tyr Arg Ser
             65                  70                  75Asn Lys Thr Gln Thr Val Ala Val Ala Ala Gly Arg Ser Trp Val
             80                  85                  90Ala lle Pro Arg Glu Gln Leu Thr Met Ser Asp Lys Leu Leu Val
             95                 100                 105Trp Gly Thr Lys Ala Gly Gln Pro Leu Trp Pro Pro Val Phe Val
            110                 115                 120Asn Leu Glu Thr Gln Met Lys Pro Asn Ala Pro Arg Leu Gly Pro
            125                 130                 135Asp Val Asp Phe Ser Glu Asp Asp Pro Leu Glu Ala Thr Val His
            140                 145                 150Trp Ala Pro Pro Thr Trp Pro Ser His Lys Val Leu Ile Cys Gln
            155                 160                 165Phe His Tyr Arg Arg Cys Gln Glu Ala Ala Trp Thr Leu Leu Glu
            170                 175                 180Pro Glu Leu Lys Thr Ile Pro Leu Thr Pro Val Glu Ile Gln Asp
            185                 190                 195Leu Glu Leu Ala Thr Gly Tyr Lys Val Tyr Gly Arg Cys Arg Met
            200                 205                 210Glu Lys Glu Glu Asp Leu Trp Gly Glu Trp Ser Pro Ile Leu Ser
            215                 220                 225Phe Gln Thr Pro Pro Ser Ala Pro Lys Asp Val Trp Val Ser Gly
            230                 235                 240Asn Leu Cys Gly Thr Pro Gly Gly Glu Glu Pro Leu Leu Leu Trp
            245                 250                 255Lys Ala Pro Gly Pro Cys Val Gln Val Ser Tyr Lys Val Trp Phe
            260                 265                 270Trp Val Gly Gly Arg Glu Leu Ser Pro Glu Gly Ile Thr Cys Cys
            275                 280                 285Cys Ser Leu Ile Pro Ser Gly Ala Glu Trp Ala Arg Val Ser Ala
            290                 295                 300Val Asn Ala Thr Ser Trp Glu Pro Leu Thr Asn Leu Ser Leu Val
            305                 310                 315Cys Leu Asp Ser Ala Ser Ala Pro Arg Ser Val Ala Val Ser Ser
            320                 325                 330Ile Ala Gly Ser Thr Glu Leu Leu Val Thr Trp Gln Pro Gly Pro
            335                 340                 345Gly Glu Pro Leu Glu His Val Val Asp Trp Ala Arg Asp Gly Asp
            350                 355                 360Pro Leu Glu Lys Leu Asn Trp Val Arg Leu Pro Pro Gly Asn Leu
            365                 370                 375Ser Ala Leu Leu Pro Gly Asn Phe Thr Val Gly Val Pro Tyr Arg
            380                 385                 390Ile Thr Val Thr Ala Val Ser Ala Ser Gly Leu Ala Ser Ala Ser
            395                 400                 405Ser Val Trp Gly Phe Arg Glu Glu Leu Ala Pro Leu Val Gly Pro
            410                 415                 420Thr Leu Trp Arg Leu Gln Asp Ala Pro Pro Gly Thr Pro Ala Ile
            425                 430                 435Ala Trp Gly Glu Val Pro Arg His Gln Leu Arg Gly His Leu Thr
            440                 445                 450His Tyr Thr Leu Cys Ala Gln Ser Gly Thr Ser Pro Ser Val Cys
            455                 460                 465Met Asn Val Ser Gly Asn Thr Gln Ser Val Thr Leu Pro Asp Leu
            470                 475                 480Pro Trp Gly Pro Cys Glu Leu Trp Val Thr Ala Ser Thr Ile Ala
            485                 490                 495Gly Gln Gly Pro Pro Gly Pro Ile Leu Arg Leu His Leu Pro Asp
            500                 505                 510Asn Thr Leu Arg Trp Lys Val Leu Pro Gly Ile Leu Phe Leu Trp
            515                 520                 525Gly Leu Phe Leu Leu Gly Cys Gly Leu Ser Leu Ala Thr Ser Gly
            530                 535                 540Arg Cys Tyr His Leu Arg His Lys Val Leu Pro Arg Trp Val Trp
            545                 550                 555Glu Lys Val Pro Asp Pro Ala Asn Ser Ser Ser Gly Gln Pro His
            560                 565                 570Met Glu Gln Val Pro Glu Ala Gln Pro Leu Gly Asp Leu Pro Ile
            575                 580                 585Leu Glu Val Glu Glu Met Glu Pro Pro Pro Val Met Glu Ser Ser
            590                 595                 600Gln Pro Ala Gln Ala Thr Ala Pro Leu Asp Ser Gly Tyr Glu Lys
            605                 610                 615His Phe Leu Pro Thr Pro Glu Glu Leu Gly Leu Leu Gly Pro Pro
            620                 625                 630Arg Pro Gln Val Leu Ala
            635<210>2<211>623<212>PRT<213>小鼠(Mus musculus)<400>2Met Asn Arg Leu Arg Val Ala Arg Leu Thr Pro Leu Glu Leu Leu1               5                  10                  15Leu Ser Leu Met Ser Leu Leu Leu Gly Thr Arg Pro His Gly Ser
             20                  25                  30Pro Gly Pro Leu Gln Cys Tyr Ser Val Gly Pro Leu Gly Ile Leu
             35                  40                  45Asn Cys Ser Trp Glu Pro Leu Gly Asp Leu Glu Thr Pro Pro Val
             50                  55                  60Leu Tyr His Gln Ser Gln Lys Tyr His Pro Asn Arg Val Trp Glu
             65                  70                  75Val Lys Val Pro Ser Lys Gln Ser Trp Val Thr Ile Pro Arg Glu
             80                  85                  90Gln Phe Thr Met Ala Asp Lys Leu Leu Ile Trp Gly Thr Gln Lys
             95                 100                 105Gly Arg Pro Leu Trp Ser Ser Val Ser Val Asn Leu Glu Thr Gln
            110                 115                 120Met Lys Pro Asp Thr Pro Gln Ile Phe Ser Gln Val Asp Ile Ser
            125                 130                 135Glu Glu Ala Thr Leu Glu Ala Thr Val Gln Trp Ala Pro Pro Val
            140                 145                 150Trp Pro Pro Gln Lys Ala Leu Thr Cys Gln Phe Arg Tyr Lys Glu
            155                 160                 165Cys Gln Ala Glu Ala Trp Thr Arg Leu Glu Pro Gln Leu Lys Thr
            170                 175                 180Asp Gly Leu Thr Pro Val Glu Met Gln Asn Leu Glu Pro Gly Thr
            185                 190                 195Cys Tyr Gln Val Ser Gly Arg Cys Gln Val Glu Asn Gly Tyr Pro
            200                 205                 210Trp Gly Glu Trp Ser Ser Pro Leu Ser Phe Gln Thr Pro Phe Leu
            215                 220                 225Asp Pro Glu Asp Val Trp Val Ser Gly Thr Val Cys Glu Thr Ser
            230                 235                 240Gly Lys Arg Ala Ala Leu Leu Val Trp Lys Asp Pro Arg Pro Cys
            245                 250                 255Val Gln Val Thr Tyr Thr Val Trp Phe Gly Ala Gly Asp Ile Thr
            260                 265                 270Thr Thr Gln Glu Glu Val Pro Cys Cys Lys Ser Pro Val Pro Ala
            275                 280                 285Trp Met Glu Trp Ala Val Val Ser Pro Gly Asn Ser Thr Ser Trp
            290                 295                 300Val Pro Pro Thr Asn Leu Ser Leu Val Cys Leu Ala Pro Glu Ser
            305                 310                 315Ala Pro Cys Asp Val Gly Val Ser Ser Ala Asp Gly Ser Pro Gly
            320                 325                 330Ile Lys Val Thr Trp Lys Gln Gly Thr Arg Lys Pro Leu Glu Tyr
            335                 340                 345Val Val Asp Trp Ala Gln Asp Gly Asp Ser Leu Asp Lys Leu Asn
            350                 355                 360Trp Thr Arg Leu Pro Pro Gly Asn Leu Ser Thr Leu Leu Pro Gly
            365                 370                 375Glu Phe Lys Gly Gly Val Pro Tyr Arg Ile Thr Val Thr Ala Val
            380                 385                 390Tyr Ser Gly Gly Leu Ala Ala Ala Pro Ser Val Trp Gly Phe Arg
            395                 400                 405Glu Glu Leu Val Pro Leu Ala Gly Pro Ala Val Trp Arg Leu Pro
            410                 415                 420Asp Asp Pro Pro Gly Thr Pro Val Val Ala Trp Gly Glu Val Pro
            425                 430                 435Arg His Gln Leu Arg Gly Gln Ala Thr His Tyr Thr Phe Cys Ile
            440                 445                 450Gln Ser Arg Gly Leu Ser Thr Val Cys Arg Asn Val Ser Ser Gln
            455                 460                 465Thr Gln Thr Ala Thr Leu Pro Asn Leu His Ser Gly Ser Phe Lys
            470                 475                 480Leu Trp Val Thr Val Ser Thr Val Ala Gly Gln Gly Pro Pro Gly
            485                 490                 495Pro Asp Leu Ser Leu His Leu Pro Asp Asn Arg Ile Arg Trp Lys
            500                 505                 510Ala Leu Pro Trp Phe Leu Ser Leu Trp Gly Leu Leu Leu Met Gly
            515                 520                 525Cys Gly Leu Ser Leu Ala Ser Thr Arg Cys Leu Gln Ala Arg Cys
            530                 535                 540Leu His Trp Arg His Lys Leu Leu Pro Gln Trp Ile Trp Glu Arg
            545                 550                 555Val Pro Asp Pro Ala Asn Ser Asn Ser Gly Gln Pro Tyr Ile Lys
            560                 565                 570Glu Val Ser Leu Pro Gln Pro Pro Lys Asp Gly Pro Ile Leu Glu
            575                 580                 585Val Glu Glu Val Glu Leu Gln Pro Val Val Glu Ser Pro Lys Ala
            590                 595                 600Ser Ala Pro Ile Tyr Ser Gly Tyr Glu Lys His Phe Leu Pro Thr
            605                 610                 615Pro Glu Glu Leu Gly Leu Leu Val
            620<210>3<211>2646<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220><221>不确定<222>2433<223>未知碱基<400>3gtgggttcgg cttcccgttg cgcctcgggg gctgtaccca gagctcgaag 50aggagcagcg cggcccgcac ccggcaaggc tgggccggac tcggggctcc 100cgagggacgc catgcgggga ggcaggggcg cccctttctg gctgtggccg 150ctgcccaagc tggcgctgct gcctctgttg tgggtgcttt tccagcggac 200gcgtccccag ggcagcgccg ggccactgca gtgctacgga gttggaccct 250tgggcgactt gaactgctcg tgggagcctc ttggggacct gggagccccc 300tccgagttac acctccagag ccaaaagtac cgttccaaca aaacccagac 350tgtggcagtg gcagccggac ggagctgggt ggccattcct cgggaacagc 400tcaccatgtc tgacaaactc cttgtctggg gcactaaggc aggccagcct 450ctctggcccc ccgtcttcgt gaacctagaa acccaaatga agccaaacgc 500cccccggctg ggccctgacg tggacttttc cgaggatgac cccctggagg 550ccactgtcca ttgggcccca cctacatggc catctcataa agttctgatc 600tgccagttcc actaccgaag atgtcaggag gcggcctgga ccctgctgga 650accggagctg aagaccatac ccctgacccc tgttgagatc caagatttgg 700agctagccac tggctacaaa gtgtatggcc gctgccggat ggagaaagaa 750gaggatttgt ggggcgagtg gagccccatt ttgtccttcc agacaccgcc 800ttctgctcca aaagatgtgt gggtatcagg gaacctctgt gggacgcctg 850gaggagagga acctttgctt ctatggaagg ccccagggcc ctgtgtgcag 900gtgagctaca aagtctggtt ctgggttgga ggtcgtgagc tgagtccaga 950aggaattacc tgctgctgct ccctaattcc cagtggggcg gagtgggcca 1000gggtgtccgc tgtcaacgcc acaagctggg agcctctcac caacctctct 1050ttggtctgct tggattcagc ctctgccccc cgtagcgtgg cagtcagcag 1100catcgctggg agcacggagc tactggtgac ctggcaaccg gggcctgggg 1150aaccactgga gcatgtagtg gactgggctc gagatgggga ccccctggag 1200aaactcaact gggtccggct tccccctggg aacctcagtg ctctgttacc 1250agggaatttc actgtcgggg tcccctatcg aatcactgtg accgcagtct 1300ctgcttcagg cttggcctct gcatcctccg tctgggggtt cagggaggaa 1350ttagcacccc tagtggggcc aacgctttgg cgactccaag atgcccctcc 1400agggaccccc gccatagcgt ggggagaggt cccaaggcac cagcttcgag 1450gccacctcac ccactacacc ttgtgtgcac agagtggaac cagcccctcc 1500gtctgcatga atgtgagtgg caacacacag agtgtcaccc tgcctgacct 1550tccttggggt ccctgtgagc tgtgggtgac agcatctacc atcgctggac 1600agggccctcc tggtcccatc ctccggcttc atctaccaga taacaccctg 1650aggtggaaag ttctgccggg catcctattc ttgtggggct tgttcctgtt 1700ggggtgtggc ctgagcctgg ccacctctgg aaggtgctac cacctaaggc 1750acaaagtgct gccccgctgg gtctgggaga aagttcctga tcctgccaac 1800agcagttcag gccagcccca catggagcaa gtacctgagg cccagcccct 1850tggggacttg cccatcctgg aagtggagga gatggagccc ccgccggtta 1900tggagtcctc ccagcccgcc caggccaccg ccccgcttga ctctgggtat 1950gagaagcact tcctgcccac acctgaggag ctgggccttc tggggccccc 2000caggccacag gttctggcct gaaccacacg tctggctggg ggctgccagc 2050caggctagag ggatgctcat gcaggttgca ccccagtcct ggattagccc 2100tcttgatgga tgaagacact gaggactcag agaggctgag tcacttacct 2150gaggacaccc agccaggcag agctgggatt gaaggacccc tatagagaag 2200ggcttggccc ccatggggaa gacacggatg gaaggtggag caaaggaaaa 2250tacatgaaat tgagagtggc agctgcctgc caaaatctgt tccgctgtaa 2300cagaactgaa tttggacccc agcacagtgg ctcacgcctg taatcccagc 2350actttggcag gccaaggtgg aaggatcact tagagctagg agtttgagac 2400cagcctgggc aatatagcaa gacccctcac tanaaaaata aaacatcaaa 2450aacaaaaaca attagctggg catgatggca cacacctgta gtccgagcca 2500cttgggaggc tgaggtggga ggatcggttg agcccaggag ttcgaagctg 2550cagggacctc tgattgcacc actgcactcc aggctgggta acagaatgag 2600accttatctc aaaaataaac aaactaataa aaaaaaaaaa aaaaaa 2646<210>4<211>2005<212>DNA<213>小鼠(Mus musculus)<400>4tcggttctat cgatggggcc atgaaccggc tccgggttgc acgcctcacg 50ccgttggagc ttctgctgtc gctgatgtcg ctgctgctcg ggacgcggcc 100ccacggcagt ccaggcccac tgcagtgcta cagcgtcggt cccctgggaa 150tcctgaactg ctcctgggaa cctttgggcg acctggagac tccacctgtg 200ctgtatcacc agagtcagaa ataccatccc aatagagtct gggaggtgaa 250ggtgccttcc aaacaaagtt gggtgaccat tccccgggaa cagttcacca 300tggctgacaa actcctcatc tgggggacac aaaagggacg gcctctgtgg 350tcctctgtct ctgtgaacct ggagacccaa atgaagccag acacacctca 400gatcttctct caagtggata tttctgagga agcaaccctg gaggccactg 450tgcagtgggc gccgcccgtg tggccaccgc agaaagctct cacctgtcag 500ttccggtaca aggaatgcca ggctgaagca tggacccggc tggagcccca 550gctgaagaca gatgggctga ctcctgttga gatgcagaac ctggaacctg 600gcacctgcta ccaggtgtct ggccgctgcc aggtggagaa cggatatcca 650tggggcgagt ggagttcgcc cctgtccttc cagacgccat tcttagatcc 700tgaagatgtg tgggtatcgg ggaccgtctg tgaaacttct ggcaaacggg 750cagccctgct tgtctggaag gacccaagac cttgtgtgca ggtgacttac 800acagtctggt ttggggctgg agatattact acaactcaag aagaggtccc 850gtgctgcaag tcccctgtcc ctgcatggat ggagtgggct gtggtctctc 900ctggcaacag caccagctgg gtgcctccca ccaacctgtc tctggtgtgc 950ttggctccag aatctgcccc ctgtgacgtg ggagtgagca gtgctgatgg 1000gagcccaggg ataaaggtga cctggaaaca agggaccagg aaaccattgg 1050agtatgtggt ggactgggct caagatggtg acagcctgga caagctcaac 1100tggacccgtc tcccccctgg aaacctcagc acattgttac caggggagtt 1150caaaggaggg gtcccctatc gaattacagt gactgcagta tactctggag 1200gattagctgc tgcaccctca gtttggggat tcagagagga gttagtaccc 1250cttgctgggc cagcagtttg gcgacttcca gatgaccccc cagggacacc 1300tgttgtagcc tggggagaag taccaagaca ccagctcaga ggccaggcta 1350ctcactacac cttctgcata cagagcagag gcctctccac tgtctgcagg 1400aacgtgagca gtcaaaccca gactgccact ctgcccaacc ttcactcggg 1450ttccttcaag ctgtgggtga cggtgtccac cgttgcagga cagggcccac 1500ct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Claims (34)

1.增强、刺激或加强T-细胞分化为Th2亚型而非Th1亚型的方法，包括将所述T-细胞与有效量的TCCR拮抗剂接触。
2.权利要求1所述方法，其中增强、刺激或加强作用发生在哺乳动物中且有效量是治疗有效量。
3.治疗哺乳动物中Th1-介导的疾病的方法，包括向所述哺乳动物施用治疗有效量的TCCR多肽拮抗剂。
4.权利要求3所述方法，其中Th1-介导的疾病选自下组疾病：自身免疫性炎性疾病和同种异体移植排斥。
5.权利要求4所述方法，其中自身免疫性炎性疾病选自下组疾病：过敏性脑脊髓炎、多发性硬化、胰岛素依赖型糖尿病、自身免疫性眼色素层视网膜炎、炎性肠道疾病和自身免疫性甲状腺疾病。
6.权利要求3所述方法，其中拮抗剂是小分子。
7.权利要求3所述方法，其中拮抗剂是反义寡核苷酸。
8.权利要求7所述方法，其中寡核苷酸是RNA。
9.权利要求7所述方法，其中寡核苷酸是DNA。
10.权利要求3所述方法，其中拮抗剂是没有生物活性的TCCR变体。
11.权利要求3所述方法，其中拮抗剂是单克隆抗体。
12.权利要求11所述方法，其中抗体具有非人互补决定区(CDR)残基和人框架区(FR)残基。
13.权利要求3所述方法，其中拮抗剂是抗体片段或单链抗体。
14.权利要求3所述方法，其中拮抗剂是TCCR配体。
15.阻止、抑制或减弱T-细胞分化为Th2亚型的方法，包括施用有效量的TCCR多肽或其激动剂。
16.权利要求15所述方法，其中阻止、抑制或减弱作用发生在哺乳动物中且有效量是治疗有效量。
17.治疗哺乳动物中Th2-介导的疾病的方法，包括向所述哺乳动物施用治疗有效量的TCCR多肽或其激动剂。
18.权利要求17所述方法，其中Th2-介导的疾病选自传染性疾病和过敏性病症。
19.权利要求18所述方法，其中传染性疾病选自下组疾病：硕大利什曼原虫、麻风分枝杆菌、白色念珠菌、鼠弓浆虫、呼吸道合胞病毒和人类免疫缺陷病毒所致疾病。
20.权利要求18所述方法，其中过敏性病症选自哮喘、变应性鼻炎、特应性皮炎和春季结膜炎。
21.权利要求15所述方法，其中激动剂是小分子。
22.权利要求15所述方法，其中激动剂是具有生物活性的TCCR变体。
23.权利要求15所述方法，其中激动剂是单克隆抗体。
24.权利要求23所述方法，其中抗体具有非人互补决定区(CDR)残基和人框架区(FR)残基。
25.权利要求15所述方法，其中激动剂是抗体片段或单链抗体。
26.权利要求15所述方法，其中激动剂是稳定的TCCR ECD。
27.测定细胞中TCCR多肽的存在的方法，包括将细胞暴露于抗-TCCR抗体并检测抗体与细胞的结合，其中抗体与细胞结合则表明存在TCCR多肽。
28.诊断哺乳动物中Th1-介导的或Th2-介导的疾病的方法，包括检测编码TCCR多肽的基因在(a)取自哺乳动物组织细胞的待测样品中，和在(b)相同细胞类型的已知正常组织细胞的对照样品中的表达水平，如果待测样品中的表达水平低于对照样品的，则表明存在Th2-介导的病症，如果待测样品中的表达水平高于对照样品的，则表明存在Th1-介导的病症。
29.鉴定能够抑制TCCR多肽表达的化合物的方法，包括使候选化合物与所述多肽在足以使这两种组分相互作用的条件下和时间内进行接触。
30.权利要求29所述方法，其中候选化合物固定在固体载体上。
31.权利要求30所述方法，其中非-固定组分携带可检测标记物。
32.鉴定能够抑制TCCR多肽生物活性的化合物的方法，包括使候选化合物与所述多肽在足以使这两种组分相互作用的条件下和时间内进行接触。
33.权利要求32所述方法，其中候选化合物固定在固体载体上。
34.权利要求33所述方法，其中非-固定组分携带可检测标记物。
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