JPH04505261A - ポルｉｉｉプロモーターの制御下の転写可能な外来ｄｎａを含む安定的に形質転換された真核細胞 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ２、前記外来転写可能ＤＮＡが偽プライマーを特徴とする請求項１に記載の安定 に形質転換された真核細胞。

３、前記外来転写可能ＤＮＡがリボザイムを特徴とする請求項１に記載の安定に 形質転換された真核細胞。

４、前記外来転写可能ＤＮＡがアンチセンスＲＮＡを特徴とする請求項１に記載 の安定に形質転換された真核細胞。

５、前記外来転写可能ＤＮＡがｍＲＮＡを特徴とする請求項１に記載の安定に形 質転換された真核細胞。

６、前記外来転写可能ＤＮＡがポリペプチドを特徴とする請求項１に記載の安定 に形質転換された真核細胞。

７、前記ｐｏｌｌプロモーターが、ｔ−ＲＮＡまたはその突然変異体もしくは誘 導体を含む請求項１に記載の安定に形質転換された真核細胞。

８　前記ｐｏｌｌｌ［プロモーターが、ヒトｔ　ＲＮＡまたはその突然変異体も しくは誘導体をきむ請求項７に記載の安定に形質転換された真核細胞。

９、前記ｐｏｌＩ［［プロモーターが、ｔ−ＲＮＡ１”’またはその突然変異体 もしくは誘導体を含む請求項８に記載の安定に形質転換された真核細胞。

１０、前記ｐｏｌｌプロモーターが、植物ｐｏｌｎＩプロモーターまたはその突 然変異体もしくは誘導体を含む請求項８に記載の安定に形質転換された真核細胞 。

１１、前記ｐｏｌｌプロモーターが、動物ｐｏｌｌｌプロモーターまたはその突 然変異体もしくは誘導体を含む請求項８に記載の安定に形質転換された真核細胞 。

１２、前記外来転写可能ＤＮＡが、細胞内で遺伝子の発現を阻害する分子を特徴 とする請求項ｌに記載の安定に形質転換された真核細胞。

１３、前記アンチセンスＲＮＡが、病原体によってコードされるＲＮＡのセグメ ントに相補的であるＲＮＡを含む請求項４に記載の安定に形質転換された真核細 胞。

１４、前記病原体によってコードされるＲＮＡがｍＲＮＡを含む請求項１３に記 載の安定に形質転換された真核細胞。

１５、前記病原体がヒト免疫不全ウィルス（ＨｒＶ）を含１請求項１３に記載の 安定に形質転換された真核細胞。

１６、前記外来転写可能ＤＮＡが、ＲＥＶと表記される■ＩＶ遺伝子産物の認識 シグナルを特徴とする請求項１５４記載の安定に形質転換された真核細胞。

１７、前記外来転写可能ＤＮＡが、ＨＩＶ調節配列を特徴とする請求項１に記載 の安定に形質転換された真核細胞。

１８、前記ＨＩＶ調節配列が、ＴＡＢと表記されるＨＩＳ配列である請求項１７ に記載の安定に形質転換された真を細胞。

１９、前記外来転写可能ＤＮＡが、ＤＮＡ分子またはＲＪＡ分子への結合を通し て作用する遺伝子発現の調節物質σ認識配列を特徴とする請求項ｌに記載の安定 に形質転換された真核細胞。

２０、前記真核細胞が動物細胞を含む請求項１に記載の多室に形質転換された真 核細胞。

＠籾 ２１、前記蚤丑細胞が哺乳動物細胞を含む請求項２０に翫載の安定に形質転換さ れた真核細胞。

２２、前記哺乳動物細胞がヒト細胞を含む請求項２１に本む　載の安定に形質転 換された真核細胞。

２３、前記動物細胞がニワトリ細胞を含む請求項２０に記Ｈ載の安定に形質転換 された真核細胞。

に　２４．前記哺乳動物細胞が、造血幹細胞を含む請求項２１に記載の安定に形 質転換された真核細胞。

晃拡 −２５，前記ヒト細胞力１芒≦幹細胞を含む請求項２２に記載の安定に形質転換 された真核細胞６ ２６、前記真核細胞が植物細胞を含む請求項１に記載の安■　定に形質転換され た真核細胞。

核　２７．前記ｐｏｌｌ［プロモーター及び外来転写可能ＤＮＡが、遺伝子移入 ベクター中に存在する請求項１に記載の安Ｎ　定に形質転換された真核細胞。

の　２８．前記遺伝子移入ベクターがレトロウィルスベクターさ　である請求項 ２７に記載の安定に形質転換された真核細胞。

安　２９．前記レトロウィルスベクターが、該レトロウィルスベクターの３°末 端繰返し配列（ＬＴＲ）領域内に導入され紀　；　たキメラｔ−ＲＮＡを含む請 求項２８に記載の安定に形質転換された真核細胞。

ｊ己　３０．前記レトロウィルスベクターが、Ｍ−ＭｕＬＶと表記されるマウス レトロウィルスを含む請求項２８に記載の安定に形質転換された真核細胞。

３１、前記レトロウィルスベクターが、Ｎ２と表記されるレトロウィルスを含む 請求項２８に記載の安定に形質転換された真核細胞。

３２、前記レトロウィルスベクターが、ＤＣＴ５Ａと表記されるレトロウィルス を含む請求項２８に記載の安定に形質転換された真核細胞。

３３、前記レトロウィルスベクターが、ＤＣ７５Ｂと表記されるレトロウィルス を含む請求項２８に記載の安定に形質転換されな真核細胞。

３４、前記レトロウィルスベクターが、ＤＣ７５Ｃと表記されるレトロウィルス を含む請求項２８に記載の安定に形質転換された真核細胞。

３５、前記キメラｔ−ＲＮＡが、ｔ−ＲＮＡ終結シグナルの制御下にある外来Ｄ ＮＡ分子を含んでおり、前記終結シグナルは、３゛末端プロセシングＤＮＡ配列 がそこから除去されている請求項２つに記載の安定に形質転換された真核細胞。

３６．２つ以上のｐｏｌｌ［［プロモーターと２つ以上の外来転写可能ＤＮＡと を含んでおり、前記外来転写可能ＤＮＡの各々が前記ｐｏｌＩ［［プロモーター の１つの制御下にある請求項１に記載の安定に形質転換された真核細胞６３７、 その３°長末端反復（ＬＴＲ）内に導入されたキメラｔ−ＲＮＡを含むレトロウ ィルスベクター。

３８、前記キメラｔ−ＲＮＡがｐｏ１ｍプロモーターと外来転写可能ＤＮＡとを 含んでおり、前記転写可能ＤＮＡが前記ｐｏｌｌ［プロモーターの制御下にある 請求項３６に記載のレトロウィルスベクター。

３９、前記外来転写可能ＤＮＡが偽プライマーを特徴とする請求項３８に記載の レトロウィルスベクター。

４０、前記外来転写可能ＤＮＡがリボザイムを特徴とする請求項３８に記載のレ トロウィルスベクター。

４１、前記外来転写可能ＤＮＡがアンチセンスＲＮＡ分子を特徴とする請求項３ ８に記載のレトロウィルスベクター。

４２、前記外来転写可能ＤＮＡがｍＲＮＡ分子を特徴とする請求項３８に記載の レトロウィルスベクター。

４３、前記外来転写可能ＤＮＡがポリペプチドを特徴とする請求項３８に記載の レトロウィルスベクター。

４４、前記外来転写可能ＤＮＡがウィルス調節配列を特徴とする請求項３８に記 載のレトロウィルスベクター。

４５、前記外来転写可能ＤＮＡがＨＩ　Ｖｉ節配列を特徴とする請求項３８に記 載のレトロウィルスベクター。

４６、前記ＨＩＶ調節配列が、ＴＡＲと表記されるＨＩＶ調節配列である請求項 ４４に記載のレトロウィルスベクタ４７、前記ｐｏｌ［［プロモーターが、ｔ− ＲＮＡまたはその突然変異体もしくは誘導体を含む請求項３８に記載のレトロウ ィルスベクター。

４８、前記ｐｏｌｌ［［プロモーターが、ヒトｔ−ＲＮＡまたはその突然変異体 もしくは誘導体を含む請求項３８に記載のレトロウィルスベクター。

４９、前記ｐｏｌｌ［プロモーターが、ｔ−ＲＮＡ１”ｔまたはその突然変異体 もしくは誘導体を含む請求項３８に記載のレトロウィルスベクター。

５０、前記ｐｏ１１１［ア０−Ｔ−−ターが、植物ｐｏｌｌｌ１７０モーターま たはその突然変異体もしくは誘導体を含む請求項３８に記載のレトロウィルスベ クター。

５１、前記ｐｏｌｌｌプロモーターが、動物ｐｏｌｌＪプロモーターまたはその 突然変異体もしくは誘導体を含む請求項３８に記載のレトロウィルスベクター。

５２、前記外来転写可能ＤＮＡが、細胞内で遺伝子の発現を阻害する分子を特徴 とする請求項３８に記載のレトロウィルスベクター。

５３、前記アンチセンスＲＮＡ分子が、病原体によってコードされるＲＮＡのセ グメントに相補的であるＲＮＡ分子を含む請求項４１に記載のレトロウィルスベ クター。

５４、前記病原体によってコードされるＲＮＡがｍＲＮＡを含む請求項５３に記 載のレトロウィルスベクター。

５５、前記病原体がヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）を含む請求項５３に記載の レトロウィルスベクター。

５６、前記外来転写可能ＤＮＡが、ＲＥＶと表記されるＨＩＶ遺伝子の認識シグ ナルを特徴とする請求項３８に記載のレトロウィルスベクター。

５７、前記外来転写可能ＤＮＡが、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子への結合を通し て作用する遺伝子発現の調節物質の認識配列を特徴とする請求項３８に記載のレ トロウィルスベクター。

５８、前記レトロウィルスベクターが、Ｍ−ＭｕＬＶと表記されるマウスレトロ ウィルスを含む請求項３８に記載のレトロウィルスベクター。

５つ、前記レトロウィルスベクターが、Ｎ２と表記されるし・トロウィルスを含 む請求項３８に記載のレトロウィルスベクター。

６０、前記レトロウィルスベクターが、ＤＣＴ５Ａと表記されるレトロウィルス を含む請求項３８に記載のレトロウィルスベクター。

６１、前記レトロウィルスベクターが、ＤＣＴ５Ｂと表記されるレトロウィルス を含む請求項３８に記載のレトロウィルスベクター。

６２、前記レトロウィルスベクターが、ＤＣＴ５Ｃと表記されるレトロウィルス を含む請求項３８に記載のレトロウィルスベクター。

６３、前記レトロウィルスベクターが、２つ以上のｐｏｌ■プロモーターと２つ 以上の外来転写可能ＤＮＡと３含んでおり、前記外来転写可能ＤＮＡの各々が前 記ｐｏｌＩ［プロモーターの１つの制御下にある請求項３７に記載のレトロウィ ルスベクター。

６４、請求項２０に記載の安定に形質転換された動物細胞を含むトランスジェニ ック動物。

６５、請求項２１に記載の安定に形質転換された哺乳動物細胞を倉むトランスジ ェニック哺乳動物。

６６、請求項２３に記載の安定に形質転換されたニワトリ細胞を含むトランスジ ェニックニワトリ６６７、請求項２４に記載の安定に形質転換された晴乳動物細 胞を含むトランスジェニック哺乳動物。

６８、請求項２６に記載の安定に形質転換された植物細胞を含むトランスジェニ ック植物。

６９、前記外来転写可能ＤＮＡが、病原体によってコードされるＲＮＡのセグメ ントに相補的であるＲＮＡ分子を特徴とする請求項６５に記載のトランスジェニ ック動物。

７０、前記外来転写可能ＤＮＡ−が、病原体によってコードされるＲＮＡのセグ メントに相補的であるＲＮＡ分子を特徴とする請求項６４に記載のトランスジェ ニック哺乳動物。

７１、前記外来転写可能ＤＮＡが、病原体によってコードされるＲＮＡのセグメ ントに相補的であるＲＮＡ分子を特徴とする請求項６８に記載のトランスジェニ ック植物。

７２、前記病Ｗ、体がＨｒＶを含む請求項６つに記載のトランスジェニツク動物 。

７３．前記外来転写可能ＤＮＡが、ＨＩＶ調節配列なコードする請求項６４に記 載のトランスジェニック動物。

７４、前記ＨＩＶ調節配列が、ＴＡＲと表記されるＨＩＶ調節配列を含む請求項 ７３に記載のトランスジェニック動物。

７５、前記トランスジェニック動物が哺乳動物である請求項７３に記載のトラン スジェニック動物。

７６、請求項３７に記載のレトロウィルスベクターを含む遺伝子移入ベクターで あって、前記レトロウィルスベクターが２つ以上のｐｏｌｎＩプロモーターと２ つ以上の外来転−写可能ＤＮＡとを含んでおり、前記外来転写可能ＤＮＡの各々 が前記ｐｏｌｌ［プロモーターの１つの制御下にある遺伝子移入ベクター。

７７、有効免疫感作量の請求項４６に記載のレトロウィルスベクターと適当な担 体とを含む、患者をＨＩＶ感染に対して免疫にするのに有効なワクチン。

７８、請求項１に記載の安定に形質転換された真核細胞を、転写可能ＤＮＡが転 写し得る条件下に培養し、それによって外来ＲＮＡを産生ずることを含む外来Ｒ ＮＡを産生する方法。

することをよむ請求項７８に記載の方法。

８０、前記ＲＮＡ分子がアンチセンスＲＮＡを含む請求項７８に記載の方法。

８１、前記ＲＮＡ分子がｍＲＮＡ分子を含む請求項７８に記載の方法。

８２、請求項１に記載の安定に形質転換された真核細胞を、転写可能ＤＮＡがＲ ＮＡに転写され、前記ＲＮＡがポリペプチドに翻訳され得る条件下に培養し、そ れによってポリペプチドを産生ずることを含むポリペプチドを産生ずる方法。

８３、更に、このように産生されたポリペプチドを回収することを含む請求項８ ２に記載の方法。

８４、患者に請求項４６に記載のレトロウィルスベクターを投与することを含む 、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）患者を治療する方法。

８５、患者に請求項４６に記載のレトロウィルスベクターを投与することを含む 、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）患者を治療する方法。

８６、患者に有効免疫感作量の請求項７７に記載のワクチンを投与することを含 む、患者をＨＩ　Ｖ！！＋染に対して免疫にする方法。

８７、ａ）患者から造血幹細胞を採取し、ｂ）採取した前記造血幹細胞を、有効 量の請求項４６に記載のレトロウィルスベクターで感染し、Ｃ）前記レトロウイ ♂イ染した造血細胞を患者に注入して戻し、患者をＨＩＶ感染に対して細胞内免 疫にすることからなる、患者をＨＩＶ感染に対して細胞内免疫にする方法。

明細書 ポルＩＩＩプロモーターの制御下の転写可能な外来ＤＮＡを含む安定的に形質転 換された真核細胞本願は１９８９年５月１０日付けで出願された米国特許出願第 ３５４１７１号の一部継続出願であり、原出願の内容は参考資料として本明細書 の一部に加える。

本明細書全体を通して多数の文献を括弧内の番号により引用した。これらの文献 の完全な名称＆よ明細書の末尾の請求の範囲の直前に列挙する。これらの文献の 開示内容番よ、本発明が関係する技術状態をより完全に説明するために、その全 体を参考資料として本明細書の一部Ｇこ加える。

魚凹Ｉと１量 生存細胞中で特定遺伝子の発現を抑制する可能性番よ、アンチセンスＲＮＡ　（ 又はＤＮＡ）抑制（「アンチセンス抑制」）と呼称される技術を使用して最近立 証された。この技術は、ターゲットＲＮＡの一部に相補的な（アンチセンスＲＮ Ａ又はＤＮＡと呼称される一重鎮ＲＮＡｘ＆よりＮＡ分子の形態の）配列を細胞 に導入することにより、ＤＮＡからＲＮＡを介してタンパク質へ内力１う遺伝情 報の流れを阻止することに基づく、ヌクレオチド塩基対合により、複数の可能な メカニズムの１つ（例えばデュプレクスの分解、翻訳の抑制等）を介してＲＮＡ 転写産物でコードされる遺伝子の機能の発現を阻害するデュプレクスが形成され る（１１．２２．３７）。

アンチセンスＲＮＡによる遺伝子発現の調節は、まず最初に原核生物に天然に存 在するメカニズムとして認識された（１１）。特定遺伝子機能を抑制するために 相補的配列を使用する可能性は、特定のｍＲＮＡ種の翻訳をｉｎ　ｖｉｔｒｏで 抑制するために相補的核酸を使用したＰａｔｅｒｓｏｎ、ｅｔ　ａｌ、（２８） により立証された。もつとも、アンチセンスＲＮＡによる生存細胞中の特定遺伝 子の発現の実験的抑制を最初に立証したのはＺａｍｅｃｎｉｋ　ａｎｄ　５ｔｅ ｐｈｅｎｓｏｎ（３８）のパイオニア的研究であった。この抑制は、培養細胞中 のウィルス複製を抑制するためにラウス肉腫ウィルス（Ｒ８Ｖ）の一部に相補的 な合成オリゴヌクレオチドを使用することにより達成された。

アンチセンスＤＮＡ鋳型（アンチセンス遺伝子とも呼称する）を使用する特定遺 伝子の抑制は、まず最初にＰｅ５ｔｋａ　（２９）及びＣｏｌｅｍａｎ、ｅｔ　 ａｌ、（５）により細菌で立証され、その後、Ｉｚａｎｔ　ａｎｄ　Ｗｅ　ｉ　 ｎｔｒａｕｂ　（１６）により真核細胞で立証された。

アンチセンスＤＮＡ鋳型（「アンチセンス鋳型」）は真核細胞に導入すると連続 的にアンチセンスＲＮＡを合成することができ、従って、細胞及びその子孫に長 期的継続効果を与える可能性があるので、これは重要な開発であった。

一時的アンチセンス抑制及び安定的アンチセンス抑制プロトコルの各々は目的が 異なり、異なる技術を使用するので、これらのプロトコルを区別することは重要 である。一時的アンチセンス抑制はその名の通り、細胞に一時的な抑制状態を形 成する。一時的アンチセンス抑制を達成するプロトコルの例としては、アンチセ ンスオリゴヌクレオチドの使用、アンチセンスＲＮＡのマイクロインジェクショ ン又は一時的ＤＮＡ）ランスフェクションプロトコル、及びＳＶ４０に由来する ベクターの使用を挙げることができる（２２）。

他方、安定的アンチセンスＲＮＡ抑制は、細胞及びその子孫で持続するアンチセ ンス鋳型を導入し、アンチセンスＲＮＡを連続的に合成することにより、細胞の 永久的遺伝子改変をもたらすものである。アンチセンス鋳型を細胞に安定的に導 入するには、数種の遺伝子転移技術の任意のものを使用することができる。細胞 の改変に使用されるこのような技術の非限定的な例は、（ｉ　）　Ｃａ　Ｐ　Ｏ ４を介するＤＮＡトランスフェクションのような物理的方法、（ｉｉ）エレクト ロポレーション、又は（ｉｉｉ）レトロウィルスベクターのようなウィルスベク ターの使用である。これらの方法は、アンチセンスＤＮＡを細胞染色体に挿入す ることにより、又はウシ乳頭腫ウィルス又はエプスタイン−パールウィルスのよ うなウィルスベクターを介して、自由に複製するエビンームとして細胞中で持続 するアンチセンス鋳型を導入することにより、安定的に改変した細胞を生成１こ ＝とが−（゛さる（２２）。

アン　センス 安定的形態のアンチセンスＲＮＡの抑制は、宿主細胞及びその子孫に一定状態の 遺伝子抑制をもたらす永続的効果を有する。従って、安定的抑制は一時的プロト コルの使用に比較して明らかに有利である。

安定的アンチセンス抑制プロトコルは、細胞に転移させると、ターゲット遺伝子 の発現を抑制するために十分なレベルのアンチセンスＲＮＡを合成することが可 能なりＮＡ鋳型の設計を必要とする。この目的を達成するためには、ＤＮＡ鋳型 は有効な転写単位をコードしなければならない。

真核転写単位は、（ｉ　）ＲＮＡ転写を開始するためのプロモーター、（ｉｉ） ＲＮＡ転写産物の鋳型、及び（ｉｉｉ）ＲＮＡ転写終結を指示する第３の領域を 含む。真核細胞には、（ａ）リポソーム遺伝子を転写するＲＮＡポリメラーゼＩ （ポル■）、（ｂ）タンパク質をコードする細胞遺伝子の発現に関与するＲＮＡ ポリメラーゼＩＩ（ポルＩＩ）、並びに（Ｃ）５Ｓ及びｔ−ＲＮＡ遺伝子を転写 するＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ　（ポルＩＩＩ＞の３種の異なるＲＮＡポリメラ ーゼが存在することが知られている。

アンチセンスＲＮＡ抑制にはアンチセンスＲＮＡとターゲットＲＮＡとの間の安 定的なデュプレクスの形成が必要であるため、安定的アンチセンス抑制プロトコ ルは更に、過剰のＲＮＡ転写産物を必要とする。実際にいくつかの報告によると 、遺伝子発現を１０分の１〜２０分の１にするためには見かけ上３０〜１００倍 のアンチセンスＲＮＡが必要である（１６，１７．２０及び２６）。一方、３〜 １０倍程度程度察可能な抑制が得られると示している文献もある（４，２１．２ ５及び考察として２２）。

従って、安定的及び一時的アンチセンスＲＮＡ抑制の有効性は、アンチセンスＲ ＮＡとセンスＲＮＡとの比により決定され、この比自体は、対応するＤＮＡ＠型 がらのアンチセンスＲＮＡ合成効率により決定される。

真核細胞における有効な安定的アンチセンス抑制プロトコルの開発は、十分なレ ベルのアンチセンスＲＮＡを合成することが可能な有効なアンチセンス鋳型の不 在により妨げられている。プロモーターの性質及びそのポリメラーゼは、安定的 に形質導入された細胞中でアンチセンス鋳型を用いて高レベルのアンチセンスＲ ＮＡを産生する有効なアンチセンス鋳型を設計する上で極めて重要である。今ま でのところ、安定的アンチセンス抑制プロトコルでアンチセンス転写産物を生成 するためにはポルＩＩ由来のプロモーターしか使用されていない（２２）。

ポルＩＩＩ　の　１ 安定的遺伝子転移プロトコルを使用してアンチセンスＲＮＡ合成を改良するため には、アンチセンスＲＮＡの発現を導くためにポルＩＩＩプロモーターの使用を 検討することができる。ポルＩＩＩプロモーターを使用する基本的な理由は、ポ ルＩＩＩプロモーターがポルＩＩプロモーターに比較して実質的に高いレベルの ＲＮＡ転写産物を細胞中で生成し得るという点にある。例えば、真核細胞では約 ６×１０７個のｔ−ＲＮＡ分子及び７Ｘ１０’個のｍＲＮＡ分子が生成され、即 ちこの類のポル１Ｍ転写産物は合計ポルＩＩ転写産物の約１００倍であると予想 される（３９）。

細胞光たり約１００個の活性なｔ−ＲＮＡ遺伝子が生成されるので、各ｔ−ＲＮ Ａ遺伝子は平均して合計ポルＩＩ転写産物と同一数のＲＮＡ転写産物を生成する 。平均ポルＩ■転写産物が合計量ＲＮＡの約０．０１％であるのに対して、過剰 のポルＩＩ遺伝子転写産物は合計量ＲＮＡの約１％であるので、ｔ−ＲＮＡ（ポ ルＩＩＩ）由来転写単位１はポルＩＩ由来転写単位の１００倍〜１００００倍の ＲＮＡを生成することができると考えられる。

複数の文献が、真核細胞でＲＮＡを発現させるためにポルＩＩＩプロモーターを 使用することについて記載している。Ｌｅｗｉｓ　ａｎｄ　Ｍａｎｌｅｙ（２３ ）及び５ｉｓｏｄｉａ（３４）はアデノウィルスＶＡ−１プロモーターを種々の ＤＮＡ配列（ヘルペスＴＫ遺伝子グロビン及びチュープリン）に融合し、トラン スフェクションプロトコルを用いてＤＮＡ構築物を培養細胞に転移させ、形質導 入細胞でＲＮＡを一時的に合成した。Ｄｅ　ｌａ　Ｐｅｎａａｎｄ　Ｚａｓｌｏ ｆｆ（６）は、カエル卵ａｍ胞にマＪｏｙは、ＶＡ−１゛遺伝子プロモーター５ ：Ｓ■４０由来ベクターから誘導したＤ　：Ｎ　、Ａフラグメントｔ：融合する ことによりアンチセンスＲＮＡ鋳型を構築し、同様にアンチセンスＲＮＡを一時 的に発現させ、ターゲット遺伝子を制限的に抑制した（１８）。

上記引用文献の共通点は、遺伝子転移手順を使用゛してポルＩＩＩ由来ＤＮＡ鋳 型を細胞に導入し、ポルＴＩＩにより導かれるＲＮＡ転写産物を細胞中で単に一 時的に合成したに過ぎないという点である。更に、一時的に形、質導入された細 胞中に存在する活性なりＮＡ鋳型の数を決定することができないので、ポルＩＩ Ｉに基づく転写の効率は決定されず、才な、決定し得なかった。

本発明の目的は、真核細胞に安定的に転移させることができ且つ大量のアンチセ ンスＲＮＡ、ＲＮＡ又は遺伝子産物を合成することが可能な改良されたＤＮＡ鋳 型を設計することである。

良朋！ν４力 本発明は、ポルＩＩＩプロモーター及び転写可能な外来ＤＮＡを含む安定的に形 質転換された真核細胞を提供するものであり、転写可能な外来ＤＮＡはポルＩＩ Ｉプロモーターの制御下にある。

本発明は更にレトロウィルスベクターも提供し、該ベクターはレトロウィルスベ クターの３’　ＬＴＲに導入されたキメラｔ−ＲＮＡを含む。

１皿ムＩ１ １図！１ニブ１０１トターイブ’ｔ−ｒＲＩＮＡ、ヒトｔ−ＲＮＡ１”°１誘導 体及テパキメーラ”ｔ−ＲＩ′ＩＮλ遺伝子の構造。

図ＩＡ′はプロ；トク・ビーブｔ−ＲＮＡ遺伝子の構造を示す。

・ｔ−’ＲＮＡ１ｌ伝子は８５〜９５塩基対長である。２つの領域Ａ及びＢは、 −次転写産物を生成するためにＲＮＡ転写を開始するプロモーターをコードする 。転写の終結はセンス鏡上の４個以上のＴ残基列により明示される。矢印は転写 が通常第３番目のＴの後で終結することを示す。−次ｔ−ＲＮＡ転写産物は更に 、成熟ｔ−ＲＮＡ転写産物を生成するために図示するように５°末端及び３′末 端の両側か塩基修飾を含む付加的修飾は図示せず）８その他の情報についてはＧ ｅ１ｄｕｓｃｈｅｋ、１９８８（９）の報告を参照されたい。

図ＩＢはヒトｔ−ＲＮＡ１”を誘導体３−５の構造を示す、３−５は遺伝子の３ ”末端から１９ｂＰを欠失させることによりクローン化ヒトｔ−ＲＮＡ遺伝子か ら誘導した（１）、終結シグナルが与えられるならば截頭遺伝子は転写され得る が、−次転写産物の３°末端の処理は行われない。

図ＩＣはキメラｔ−ＲＮＡバンドを示す。外来配列をｔ−ＲＮＡ１”ｔ３−５に 融合し、更に終結シグナルを加える。転写の結果、外来配列に融合したｔ−ＲＮ Ａ転写産物から構成されるキメラＲＮＡ種が形成される。

図２　：　ｔ−ＲＮＡ　ｉ”ｔ３−５に融合した３個のＤＮＡフラグメントの配 列。

図２はＤＮＡフラグメントＡ及びＢがＨＩＶ単離物の右側と左側に認められる配 列であるヌクレオチド夫々５３０〜５５９及び５９６０〜５９８９に対応するこ とを示す（３３）。ＤＮＡフラグメントＣは、Ｍ−ＭｕＬＶに認められる配列で あるヌクレオチド１６４５〜１６７４に対応する（３１）。各ＤＮＡフラグメン トの５′末端の付加的配列は、指示するようにＳａｃ　ＩＩｒ付着末端」を生成 する。

各フラグメントの３°末端には、指示するようにｔ−ＲＮＡ転写終結シグナル及 びＭｌｕＩ　ｒ付着末端」を生成するために付加的ヌクレオチドが存在する。

図３：キメラｔ−ＲＮＡ遺伝子を含むレトロウィルスベクターの構造。

Ｎ２は従来記載されているマウスレトロウィルスＭ−ＭｕＬＶに由来するレトロ ウィルスベクターである（２）。

Ｎ２ベクターはまず最初に、３’　ＬＴＲに存在するＮｈｅ工部位に５２ｂｐの 長いポリリンカー配列を挿入することにより修飾した。ポリリンカー配列はＮ２ プラスミドに固有の５個の制限部位、ＡｐａＩ、Ｂｇｌ　Ｉｌ、５ｎａＢＩ、Ｓ ａｃ　ＩＩ及びＭｌｕＩを含む（１４）、１ｄｅｎｉｙｉ−Ｊｏｎｅｓ　（１） により記載されているように）プラスミド３−５でコードされるｔ−ＲＮＡを含 むＤＮＡフラグメントをＳｔｕ　Ｉ及びＢａｍＨＩで切り出し、Ｋｌｅｎｏｗフ ラグメントで処理してプラント末端を生成し、修飾したＮ２ベクターのＳｎａ　 ＢＩ部位にクローニングした。図２に示す３個のＤＮＡフラグメントをＮ２ベク ターのポリリンカーのＳａｃ　ＩＩ及びＭｕ　Ｉ部位にクローニングした。３− ５の３°末端に融合した図２に示すような配列は、外来配列がＨＩＶ　ＲＮＡ（ Ａ及びＢ）又はＭ−ＭｕＬＶ　（Ｃ）に相補的である融合ＲＮＡ転写産物を生成 する。文猷（１４，２７）に記載されているような確立された手順を使用して、 キメラｔ−ＲＮＡを含むＮ２ベクターＤＮＡを対応するウィルスに変換した。図 ３は更に、感染細胞でキメラｔ−ＲＮＡが複製され、両方のしＴＲに存在するこ とを示す（１４）。なお、ＬＴＲは末端反復配列、Ｎｅｏはネオマイシン耐性遺 伝子、３−５は図丁芭剰１ したＤＮＡフラグメント、γは図２に示した転写終結シグナルを表す。

図４：キメラｔ−ＲＮＡを含むアンチセンスベクターで感染させた細胞のＲＮＡ プロット分析。

確立された手順（１２，２７）にしたがってパラゲージング細胞ＰＡ３１７のト ランスフェクションによりキメラｔ−ＲＮＡを含むウィルスを生成した。全細胞 ＲＮＡを単離し、８％尿素−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動にかけ、ニトロ セルロースフィルターにプロットし、ヒトを−ＲＮＡｉ”ｔ１０−プにハイブリ ダイズした。このプローブはヒト及びマウス両方のｔ−ＲＮＡ１’″＠ｔＲＮＡ 種（１３）とキメラｔ−ＲＮＡ転写産物とを検出する。パネルＡ、Ｂ及びＣは、 非感染細胞で２つのＲＮＡ転写産物が検出されることを示す（パネルＡ及びＢの ＮＩＨ３Ｔ３．パネルＣのＨＵＴ７８）。長いほうの種はマウス細胞における一 次ＲＮＡ転写産物を表し、短いほうの種は成熟ｔ−ＲＮＡを表す。（マウス細胞 における一次転写産物はヒト細胞の一次転写産物よりも長いが、成熟ｔ−ＲＮＡ の寸法は同一である）、キメラｔ−ＲＮＡを棲息させる細胞はｔ−ＲＮＡ１″１ プローブで検出される付加的なＲＮＡ種を含む。

このＲＮＡ種の寸法は対応する鋳型から発現される転写産物（図２及び３参照） の推定寸法に対応し、ヒト及びマウス細胞の両方で同一寸法である。

パネルＡはＮＩＨ３Ｔ３細胞に感染させるために使用したＤＮＡ１築物ＤＣＴ５ Ａ及びＤＣＴ５Ｂに対応づるウィルスを示す。Ｇ４１８耐性コロニーを単離し、 その後、ＲＮＡ分析のためにプールした。キメラｔ−ＲＮＡバンドの強度の変化 は、適切なベクターＤＮＡを棲息させる細胞のフラクションの変化に起因する。

パネルＢはＤＣＴ５Ｃに対応するウィルスで感染させたＮＩＨ３Ｔ３細胞を示す 、Ｇ４１８耐性コロニーを単離（Ｃ１〜Ｃ４）し、個々に分析した。

パネルＣはＤＣＴ５Ａで感染させたＨＵＴ　７８細胞を示す、Ｇ４１８耐性コロ ニーを軟質寒天中で単離しくＡｔ−Ａ３）、個々に分析した。

図５＝アンチセンスベクターを棲息させるＮＩＨ３Ｔ３ＩＩＩ胞におけるＭ−Ｍ ｕＬＶ複製の抑制。

ＭＭｕＬＶ特異的アンチセンスベクターＤＣＴ５Ｃ１，２及び４（図４８．ＲＮ Ａ分析参照）とアンチセンス配列を含まないが、３−５ｔ−ＲＮＡｉ’″°１誘 導体（ＤＣＴ５　１．２）を含む親ベクター（）Ｃ７０とを棲息させるクローン 化細胞系（６ｃｍプレート当たり１０６細胞）を約２のＭ、Ｏ，１，でＭ−Ｍｕ ＬＶにより感染させ、培地中のＲ，Ｔ、活性を測定することにより感染から３日 後のウィルスの分泌を決定した（１０）。

図６＝アンチセンスベクターを棲息させるＮＩＨ３Ｔ３細胞の培養におけるウィ ルス伝播の抑制。

ＮＩＨ３Ｔ３細胞及びアンチセンスベクター（ＤＣＴ５Ｃ−２、図４及び５参照 ）を棲息させるクローニングにより誘導した細胞系を０．００２のＭ、Ｏ，１， （６ｃｍプレート当たり１０’、ｉ［Ｂ胞）でＭ−ＭｕＬＶにより感染させた。

細胞を半集密まで増殖させ、１：２０に分割した。

インキュベート時（４，６，８及び１１日）に光トリプシン処理により細胞をプ レートから除去し、免疫蛍光染色及びＦＡＣ８分析を使用して細胞表面上のウィ ルス特異的エンベロープの存在を決定することにより、ウィルスを棲息させる細 胞のフラクションを測定した。要約すると、トリプシン処理した細胞をＭ−Ｍｕ ＬＶエンベロープ特異的モノクローナル抗体と反応させた後、ＦＩＴＣ５ｌ識し たヤギ抗マウス抗体と反応させ、ＦＡＣＳマシンで分類した。１０１蛍光単位を 任意に選択して陰性及び陽性細胞を区別（ゲート）した。最上段の２つのパネル は、Ｍ−ＭｕＬＶで慢性感染させたＮＩＨ３Ｔ３細胞の培養物では９１．８％の 細胞が陽性感染細胞であり、非感染ＮＩＨ３Ｔ３細胞の培養物では陽性は１．８ に過ぎず、即ちこの手順の実験バックグラウンドを構成することを示す、下段の 左ノ（ネルは、低ウィルス多重度（Ｍ、○、ｒ、０．００２、即ち細胞５０００ 個につき１個）で感染させた培養物ではウィルス感染が培養物中に伝播し、８及 び１１日後には細胞の夫々８０％及び９０？≦が感染することを示す。これとは 対照的に右側のパネルは、アンチセンスベクターを含む培養物中のウィルスの伝 播が著しく抑制され、８及び１１日後に夫々的３％及び１１％に達することを示 す。

図７＝アンチセンスベクターを棲息させるＨＵＴ　７８細胞におけるＨＩＶ複製 の抑制。

ＨＵＴ　７８細胞をＤＣＴ５Ａウィルス、ＤＣ７５Ｂウィルス及び対照ウィルス （Ｎ２ベクターの３°ＬＴＲにヒ）ＡＤＡミニ遺伝子を挿入したＤＣＡ）で感染 させた（１４）、感染から２日後、細胞を０．７ｍｇ／ｍｌ　Ｇ４１８の存在下 で軟質寒天に平板培養した０種々のベクターで感染させた培養物中に１０〜１４ 日後に耐性コロニーが現れた。独立したコロニーを単離し、その後の使用に備え て細胞系に拡大した。図４Ｃに示すようにＤＣＴ５Ａを含む細胞系（Ａｌ−Ａ３ ）でキメラｔ−ＲＮＡ転写産物の発現を決定したが、３種のＤＣＡを含む細胞系 （対照）又はＤＣＴ５Ｂから誘導される細胞系（Ｂｌ〜Ｂ４）については決定し なかった。

各ａｔ胞系をＨＩＶ″′Ｃ′感染させ（使用したウィルス株はＡＲＶ−２（３１ ）であり、ウィルス１：１０希釈液ｍ１当たり１０５ｍ胞とした）、細胞を３− ４日おきＧこ１：５６二分割した。ＨＩＶ感染から１４日後に種々の細胞系（こ お４するＲ、Ｔ、活性を測定することにより細胞培養物中のＨＩＶの存在を決定 し、（３種の対照厨胞系の平均をゼロ抑制として）アンチセンスベクターを棲息 させる各細胞系（Ａ１−Ａ３及び８１〜Ｂ４）の抑制度を示した。４種の細胞系 でＲ，Ｔ、活性は検出できず（１００％抑制）、２種の細胞系Ａ２及びＡ３では 低レベルのＲ，Ｔ、活性力（検出され（夫々９２％及び８２％の抑制）、１種の 細胞系Ｂ３ではＨＩＶ複製は抑制されなかった。ＤＣ７５Ｂを含む細胞系からＲ ＮＡ分析を実施しなかったので、この細胞系が（高レベルの）アンチセンスＲＮ Ａを含んでｌＩＸな力）つた力）又（よ発現しなかったと推定するのは主光であ る。

図８はヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）のＴＡＲ配列をコードする６０塩基対オ リゴヌクレオチドを示す。

図９はＴＡＲ″ｄｅｃｏｙ”を含む細胞（こおけるＲ、Ｔ。

活性の抑制を示す、この実験では、ＴＡＲを発現する細胞で）（ＩＶが複製する 能力を、ＴＡＲを発現しな（Ａ同様のベクターを含むように同時に加工した細胞 Ｇこ比較した。

図１０は感染後２４日までのＴＡＲ″ｄｅｃｏｙ”を含む細胞におけるＲ、Ｔ、 活性の抑制を示す。

ｒ　Ｏ＝　ｆ、１１ 本発明は、安定的に形質転換した真核細胞、即ち外来ＤＮＡ又はＲＮＡフラグメ ントを、この外来ＤＮＡもしくはＲＮＡ又はその転写体もしくは逆転写体が多く の世代にわたって子孫の中に維持されるように導入した細胞であって、ｐｏｌ　 ｌ１１７０モーターと転写可能外来ＤＮＡとを含み、この転写可能外来ＤＮＡが 前記ｐｏｌ　Ｉｌｌプロモーターの制御下にある真核細胞を提供する。

転写可能外来ＤＮＡは事実上、ＲＮＡに転写できる任意のＤＮＡであってよく、 このようなＲＮＡがその後例えばポリペプチドに翻訳されるが否がは問題ではな い。転写可能ＤＮＡは、偽プライマー即ち逆転写を開始するためのプライマーと して機能できるＲＮＡ　；リボザイム（ｒｉｂｏｚｙｍｅ）即ちタンパク質では なくＲＮＡで作られた酵素；アンチセンスＲＮＡ　；又はこのアンチセンスＲＮ Ａから翻訳し得るポリペプチドを含むｍＲＮＡ　；又はウィルス調節配列、例え ばＴＡＲと称するＨＩＶ調節配列をコードし得る。

ｐｏｌ　ＩＩＩｌｌプロモーターｐｏｌ　ＩＩＩ　ＲＮＡポリメラーゼによって 認識される任意のプロモーターであってよい０本発明の実施に有用なｐｏｌ　Ｉ Ｉｌｌプロモーター非限定的具体例としては、ヒト、植物もしくは動物のｐｏｌ 、ＩＩＩｌｌプロモーターうなｔ−ＲＮＡ　ｐｏｌＩＩＩプロモーター、又はそ の突然変異体、又はそのキメラ誘導体を含む誘導体、例えばヒトｔ−ＲＮＡ１” ’又はその３−５誘導体が挙げられる。ｐｏｌ　Ｉｒｒプロモーターによって制 御される転写可能外来ＤＮＡは、任意の遺伝子トランスファー法によって細胞中 に導入し得る。このクション又はエレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏ ｌａｔｉｏｎ　）の使用が挙げられる６ 成る実施態様では、転写可能外来ＤＮＡが、例えばヒト免疫不全ウィルス（ＨＩ Ｖ）のようなレトロウィルス又は細菌もしくは寄生虫のような病原体によ）てコ ードされるＲＮＡのセグメントに対して相補的なアンチセンスＲＮＡをコードす る。あるいは、転写可能ＤＮＡが、ＨｒＶ転写°゛を活性化すべく、）（ＩＶ 転写可能外来ＤＮＡは、内在遺伝子又は外来遺伝子、例えば細胞内に存在するウ ィルス遺伝子又はしトロウィルス遺伝子のような細胞内遺伝子の発現を阻害する 分子をコードし得る。例えば、転写可能外来ＤＮＡは、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子 又は調節タンパク質への結合を通して細胞内で活動する遺伝子発現調節体の認識 配列をコードし得る。

本発明の実施に有用な真核細胞は植物細胞又は哺乳動物細胞のような動物細胞、 貴４社例えばヒト細胞又はニワトリ細胞であり得る。哺乳動物細胞及びヒト細胞 は造血幹細胞からなり得るが、これに限定はされない。

本発明は、ｐｏｌ　Ｉｌｌプロモーターと転写可能外来ＤＮＡとを含み、転写可 能ＤＮＡがｐｏｌ　ＩＩＩｌｌプロモーター御下にあり、ｐｏｌ　ＩＩＩｌｌプ ロモーター転写可能外来ＤＮＡが遺伝子トランスファーベクター内に存在してい る、安定的に形質転換した真核細胞も提供する。

遺伝子トランスファーベクターはレトロウィルスベクターであってよい、遺伝子 トランスファーベクターはまた、し本発明の実施に有用なレトロウィルスベクタ ーの非限定的具体例としては、ネズミレトロウイルスＭ−ＭｕＬＶ；レトロウィ ルスＮ２；並びに二重コピーベクターＤＣＴ−７が３°末端プロセ・ンシングＤ ＮＡ配列を除去してｐする。

本発明の安定的に形質転換した真核細胞は、２つ以上のｐｏｌ　ＩＩＩプロモー ターと２つ以上の転写可能外来ＤＮＡとを含み得、各転写可能外来ＤＮＡがｐｏ ｌＩＩＩプロモーターの１つによって制御される。前記２つ以上のｐｏｌ　ＩＩ Ｉプロモーターは単一の遺伝子トランスファーベクター、例えばレトロウィルス ベクター中Ｇこ含まれ得る。

−も提供する。このキメラｔ−ＲＮＡはｐｏｌ　ＩＩＩプロモーターと転写可能 外来ＤＮＡとを含み得、この転写可能ＤＮＡは’ＰＲ記ｐｏ　ｌ　Ｉ　Ｉ　Ｉプ ロモーターによって制御される。このレトロウィルスベクターはまた２つ以上の ｐｏｌ　ＩＩＩプロモーターと２つ以上の転写可能ＤＮＡとを含み得、各転写可 能ＤＮＡがｐｏｌ　ＩＩＩプロモー、　ターの１つによって制御される。

転写可能外来ＤＮＡは事実上、ＲＮＡに転写できる任意のＤＮＡであり得、この ようなＲＮＡがその後で例えばポリペプチドに翻訳されるか否かは問題ではない 。この転写可能ＤＮＡは、偽プライマー即ち逆転写の開始に必要なプライマーと して活動できるＲＮＡ　、リボザイム即ちタンパク質ではなくＲＮＡで作られた 酵素：アンチセンスＲＮＡ；又はこのアンチセンスＲＮＡから翻訳し得るポリペ プチドを含むｍＲＮＡ　；又は例えばＨＩ　Ｖｍ節配列ＴＡＲのようなウィルス 調節配列をコードし得る。ｐｏｌ　ＩＩＩプロモーターは、ｐｏｌ　ＩＩＩ　Ｒ ＮＡポリメラーゼによって認識される任意のプロモーターであり得る１本発明の 実施に有用なｐｏｌ　ＩＩＩプロモーターの非限定的具体例としては、ｔ−ＲＮ Ａ　ｐｏｌ　ＩＩＩプロモーター、例えばヒト、植物又は動物のｐｏｌ　ＩＩＩ プロモーター、その突然変異体、又はそのキメラ誘導体を含む誘導体、例えばヒ トｔ−ＲＮＡ１’″０を又はその３−５誘導体が挙げられる。

成る実施態様では、転写可能外来ＤＮＡが例えばヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ ）のようなレトロウィルス又は細菌もしくは寄生虫のような病原体によってコー ドされるＲＮＡのセグメントに対して相補的なアンチセンスＲＮ　Ａをコードす る。あるいは、転写可能ＤＮＡが、ＴＡＲ配列のようなＨＩＶ調節配列又はＨＩ ＶのＲＥＶ認識シグナルをコードし得る。

転写可能外来ＤＮＡは、内在遺伝子又は外来遺伝子、例えば細胞内に存在するウ ィルス遺伝子又はレトロウィルス遺伝子のような細胞内遺伝子の発現を阻害する 分子をコードし得る０例えば、転写可能外来ＤＮＡは、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子 又は調節タンパク質への結合を通して細胞内で活動する遺伝子発現調節体の認識 配列をコードし得る。

遺伝子トランスファーレトロウィルスベクターはまた、レトロウィルスベクター の３°側ＬＴＲに導入されたキメウィルスベクターの非限定的具体例としては、 ネズミレトロウイルスＭ−ＭｕＬＶ；レトロウィルスＮ２．並びに二重コピーベ クターＤＣＴ５Ａ、ＤＣ７５Ｂ及びＤＣＴ５Ｃｌが３°末末端プロセッシングＤ ＮＡ列を除去している。

本発明は、安定的に形質転換した動物細胞；植物細胞；補乳動ｍｍ胞、例えば哺 乳動物及びヒトの造血幹細胞；並びにニワトリ細胞も提供する。これらの細胞は いずれも、前述のごとくｐｏｌ　ＩＩＩプロモーターと転写可能外来ＤＮＡとを 含み、この転写可能ＤＮＡが前記ｐｏｌＩ丁Ｉプロモーターの制御下にある。こ れらの安定的に形質転換した細胞はそれぞれトランスジェニック動物、トランス ジェニック植物、トランスジェニック晴乳動物及びトランスジェニックニワトリ の中に含まれ得る。

前述のトランスジェニック動物、植物、哺乳動物又はニワトリは、病原体によっ てコードされるＲＮＡのセグメントに対して相補的なＲＮＡ分子をコードする転 写可能外来ＤＮＡを含み得る。病原体の非限定的具体例としては、ＨＩＶのよう なレトロウィルス、細菌又は寄生虫が挙げられる。

本発明は、患者をＨＩＶ感染に対して免疫するのに有用なワクチンも提供する。

このワクチンは、転写可能外来ＤＮＡがＨＩＶ調節配列、例えばＴＡＲと称する ＨＩＶ調節配列をコードする有効量の前記レトロウィルスベクターと、適当なキ ャリヤーとを含む。本発明の実施に有用な適当なキャリヤーの非限定的具体例と しては、医薬的に許容し得る任意のキャリヤー、例えば滅菌生理的食塩水、リン 酸塩Ｍｌｆ生理的食塩水又はエマルジョンが挙げられる。

本発明は、外来ＲＮＡの製造方法も提供する。この方法は、前述の安定的に形質 転換した細胞を転写可能ＤＮＡの転写を生起させるような条件下で培養し、それ によって外来ＲＮＡを産生ずることからなる。この方法は更に、このようにして 製造した外来ＲＮＡ分子の回収も行う。外来ＲＮＡ分子の非限定的具体例として はアンチセンスＲＮＡ、ｍＲＮＡ又は非１０セツシング（ｕｎｐｒｏｃｅｓｓｅ ｄ　）　ＲＮ　Ａが挙げられる。

本発明は、ポリペプチドの製造方法も提供する。この方法は、前述の安定的に形 質転換した細胞を、転写可能ＤＮＡからＲＮＡへの転写とこのＲＮＡがらポリペ プチドへの翻訳とを生起させるような条件下で培養することからなる。

本発明の実施態様の１つでは、このようにして産生したポリペプチドを回収する 。

本発明は、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）患者を治療するか、又は患者のＨ ＩＶ感染を予防する方法も提供する。

この方法は、転写可能外来ＤＮＡが、ＨＩＶによってコードされるセグメントに 対して相補的なアンチセンスＲＮＡ分子をコードする前述のレトロウィルスベク ター、又は転写可能外来ＤＮＡが配列ＴＡＲのようなＨＩＶ調節配列をコードす るレトロウィルスベクターを患者に投与することからなる。レトロウィルスベク ターを医薬形態で投与する適当な方法は当業者には良く知られており、例えば、 非限定的ではあるが、レトロウィルスベクターを医薬的に許容し得るキャリヤー 中に存在させて投与し得る。適当な医薬的キャリヤーは前述の通りである。適当 な投与方法の非限定的具体例としては、経口投与、静脈内投与又は非経口投与が 挙げられる。ベクターの投与は、ベクターが細胞中に形質導入され、その結果外 来ＤＮＡ配列がＨＩＶ感染及び／又は複製の阻止に効果的な量で転写されるよう な形態で適量ずつ行わなければならない。

本発明は、患者をＨＩ　Ｖ！５染に対して細胞内免疫する方法も提供する。この 方法では、まず患者から造血幹細胞を採取し、採取した幹細胞に、転写可能外来 ＤＮＡが調節配列ＴＡＲのようなＨＩＶ調節配列をコードする前述のレトロウィ ルスベクターを有効量感染させる。次いで、感染した細胞を患者に戻し、即ち患 者の骨髄に投与し、それによって患者をＨｒ　Ｖ感染に対して、ｆ［胞内免疫す る。本発明では、細胞内免疫というのは感染の予防措置及び治療を意味する。

１１えＬＬＬ ｔ−ＲＮ／Ｍ　’ｉ 第１Ａ図は原形（ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ）　’ｌｉ乳動！ｌｌｌ１Ｊｔ　−ＲＮ　 □Ａ遺伝子の構造を示している（大きさは９５〜１０５ｂｐ）。タンパク質コー ド遺伝子（ｐｏｌ　ＩＩＩによって転写される）と異なり、ｔ−ＲＮＡプロモー ターはｔ−ＲＮＡ遺伝Ｉ遥 チドに挟まれた４つ以上のＴヌクレオチドを含むｔ−ＲＮＡ遺伝子（第１図参照 ）の３°末端に存在する配列によって特定される。ｔ−ＲＮＡ遺伝子の転写は第 ２又は第３のＴで終結する。ｔ−ＲＮＡ遺伝子の転写されたＲＮＡ即ち一次転写 産物を更に処理して、第１区に示すように、該−次転写産物の５′末端及び３゛ 末端から配列を除去する（９）。

ヒトｔ−ＲＮＡ１”’　び３−５； ヒトゲノムは、真核細胞の闇に高度に保存されている１　０　１２　ｔ　ＲＮＡ 　ｉ”’遺伝子（３２）　（ヒト及びマウスのｔ−ＲＮＡ１”を遺伝子は同じも のであり、他の細胞ｔ−ＲＮＡにはクロスハイブリダイズしない（１３）　）を 含む。この遺伝子は、哺乳動物細胞内で合成される１−ＲＮＡ全体の１０〜１５ ％を合成せしめる。前記計算に従えば、１つのｔ　−ＲＮＡ　ｉ　”を遺伝子か らのＲＮＡの発現は、細胞内で発現される総量ＲＮＡ　（ｐｏ　ｌ　Ｉ　Ｉ　ベ ース）転写体の量と同じかそれ以上になり得る。第１Ｂ図は、後述の研究で使用 した３−５と称するｔ−ＲＮＡ　ｉ　’″°１誘導体の構造を示している。３− ５は３′プロセツシングシグナルを効果的に除去したｔ−ＲＮＡ遺伝子の３′末 端かの研究（１）は、３−５　ｔ−ＲＮＡ誘導体の末端と終結シフ°゛プル （−）２−ｍ−／ ±り立との間に外来配列を挿入すると、ｔ−ＲＮＡ転写体の大半が外来ＲＮＡ配 列に融合したまま残るキメラＲＮＡが合成されることを強く示唆している。これ を第１Ｃ図に示した。

外来ＲＮＡ転写体のプロセッシング及び／又は細胞ロー力すゼーションの操作に は、他のｔ−ＲＮＡ誘導体及び他のｐｏｌ　ＩＩＩプロモーター（例えばリポソ ーム５Ｓ又はアデノウィルスＶＡＩプロモーター）を使用し得る。例えば、八ｄ ｅｎｉｙｉ−Ｊｏｎｅｓ　（１）によって記述されている３−転写体が除去され 、ｔ−ＲＮＡ部分から分離される。

を使用すれば、ＲＮＡ転写体を細胞の核又は細胞質中へ向けることが可能であり 得る。

−ｔ−ＲＮＡの をコードする　゛　′″８　第３のＤＮＡ標準的組換えＤＮＡ技術を用いて、長 さ２９及び３０ｂｐのＤＮＡフラグメントを３−５の３°末端に融合し、３つの ＤＮＡフラグメントの配列は第２図に示す通りである。これらの研究で扱ったの は、培４Ｊ！細胞中へのキメラｔ−４ＮＡ遺伝子の安定な遺伝子トランスファー が対応するＲＮＡの合成につながるか否かという問題である。

ＤＣレトロウィルスベクターへのクローニングレトロウィルスベクターを用いて キメラｔ−ＲＮＡ遺伝子を培養マウス線維芽細胞中に導入した。第３図は使用し たレトロウィルスベクターの構造、クローニングの方法及びこの特定のベクター の本質的特徴を示している。レトロウィルスベクターはＮ２Ａと称する二重コピ ー（ＤＣ）べ５Ｂ及びＤＣＴ５Ｃを形成した。確立された方法を用いて、ベクタ ーＤＮＡを対応するウィルスに変換し、このウィルスをＮＩＨ３Ｔ３細胞、即ち 確立されたマウス線維芽細胞系に感染させた。感染した細胞では、キメラｔ−Ｒ ＮＡ挿入体が重複され（ｄｕｐｌｉｃａｔｅｄ）　、第３図に示すように５′便 及び３′側ＬＴＲに現れるはずである。これは、ハイブリッドｔ、−ＲＮＡ遺伝 子の発現を容易にし得る特徴である（１４）。

メラｔ−ＲＮＡベ　ターに喀゛シｔ゛４　の確立された方法（１４，２７）を用 いて、第２図及び第３図に示した前述の３つのｔ−ＲＮＡベースベクターを対応 するウィルスに変換した。簡単に説明すると、Ｄ　ＣＴ　５　Ａ及びＤＣＴ５Ｂ ベクターＤＮＡなＰＡ３１７即ちアンホトロビツクパツゲージング細胞系（ａ＋ ＊ｐｈｏｔｒｏｐｉｃ　ｐａｃｋａｇｉｎｇｃｅｌｌ　１ｉｎｅ）　（２７）に トランスフェクションし、Ｇ４１８耐性コロニーをプールし、上清をＮＩＨ３Ｔ ３細胞に感染させるためのウィルス源として使用した。ベクター感染ＮＩＨ３Ｔ ３，１胞を０４１８中で選択し、プールしたコロニーを分析した。ＰＡ３１７細 胞の過渡的トランスフェン後４８時間で回収した上清をＮＩＨ３Ｔ３１ｆ［Ｉ胞 に感染させ、０４１８選択を行い、個々のＧ４１８耐性コロニーを単離して前述 のごとく分析した。ＮＩＨ３Ｔ３細胞中色体に組込まれたベクターＤＮＡの構造 を公知のＤＮＡプロッティング法によって調べたところ、完全なものであった（ 図示せず）、［第３図に示すように、またＨａｎｔｚｏｐｏｕｌｏｓらの論文（ １４）に記述されているように、ＤＣベクターを使用するとキメラｔ−ＲＮＡが 感染細胞中で重複される。コキメラｔ−ＲＮＡを有する細胞が対応するＲＮＡを ＮＩＨ３Ｔ３細胞中に発現するか否かを調べるために、ＲＮＡプロット分析を行 った。ｌ全細胞ＲＮＡを８％アクリルアミド−尿素ゲル中で電気泳動にかけ、ナ イロンフィルターにプロットし、１２ｐ−標識ｔ−ＲＮＡ１”°１特異的プロー ブとハイブリダイズした。この分析の結果は第４Ａ図及び第４Ｂ図に示す。前記 ｔ−ＲＮＡプローブは、非感染ＮＩＨ３Ｔ３細胞中では、成熟ｔ−ＲＮＡ１”− その非処理形態とを表す大きさ７０〜９０ヌクレオチドの２つのＲＮＡ種を検出 する。ｔ−ＲＮＡ融合遺伝子に感染した細胞では、ｔ−ＲＮＡが外来配列に融合 されているキメラＲＮＡ転写体にサイズ的に対応する別の種が検出される。

ハイブリダイゼーションの強さから判断して、キメラ転写体は細胞中で合成され るｔ−ＲＮＡ１”’全体の５％〜２５％を占める。これは、これの転写体が極め て効果的に発現されることを意味する。［ｔ−ＲＮＡ１’″°゛が総ｔ−ＲＮＡ の１０〜１５％を占め、ゲノム当たり１０−１２のｔ−４ＮＡ遺伝子が存在し且 つｔ−ＲＮＡの量がｍＲＮＡ即ちｐｏｌ　ＩＩ転写体の１００倍であるとすれば 、細胞中に存在するキメラｔ−４ＮＡは（成る大きさの範囲では）ｐｏｌｙＡ＋ 転写体の総数に等しいと見なすことができる。

これは、外来配列を担持するキメラｔ　−ＲＮＡの量が個々のｐｏｌ　ＩＩ転写 体の１００〜１０，０００倍であることを意味する。キメラｔ−ＲＮＡ遺伝子の 発現はマウス線維芽細胞系ＮＩＨ３Ｔ３には限定されない、ＤＣＴ５Ａ及びＤＣ Ｔ５Ｂに対応するウィルス上清を用いてＨＵＴ７８細胞、ヒトＴリンパ球系に感 染させ、Ｇ４１８選択で単離した個々のクローンを分析してＲＮＡ発現を調べた 。

第４Ｃ図に示すように、キメラｔ−ＲＮＡ遺伝子はこのヒト細胞系でも同等の活 性を示した。

ＨＩ　Ｖ−ＴＡＲベ　−の Ｎ２Ａベクターの構築については既に説明した。このＮ２ＡベクターのＳｎａ　 ８１部位に、転写がＬＴＲ開始転写と平行に起こるように、３−５　ｔ−ＲＮＡ １”’遺ｐｏｌ　ＩＩＩ終結配列“Ｔｅｒ″をＮ２Ａポリリンカのオリゴヌクレ オチド配列はＢａｎ　ＨＩ制限部位゛を含む。

他のＢａｍ　ＨＩ部位は、当業者に公知の方法を用いて、予めベクターから除去 した。

次いで、６３ｂｐのＴＡＲオリゴヌクレオチド（第８図参照）をｐｏｔ　ＩＩＩ 終結配列の上流の“’Ｔｅｒ”オリゴヌクレオチドからＳａｃ　ＩＩ　−Ｂａｍ 　ＨＩ部位の間にクローンした。このＴＡＲ配列はＨＴ　Ｖ−１のＡＲＶ−Ｚ株 から誘導したものである（３１）。

メーｔ　−ＲＮ　Ａアン　センス　Ｊ卆゛・　゛のＭ−長さ２９ヌクレオチドの 配列に融合したキメラｔ−ＲＮＡ遺伝子を含んでいる。Ｍ−ＭｕＬＶは−Ｕ５Ｃ がＭ−ＭｕＬＶ複製を阻止する能力は、遺伝子の発現を阻止して細胞をウィルス の複製から保護するためのこの新しい方法の可能性に関するストリンジェントテ スト（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ　ｔｅｓｔ）を構成する。

第５図に示した実験では、ＤＣＴ５Ｃベクターを含む３つのＮＩＨ３Ｔ３誘導ク ローンと、親ベクターＤＣＴ５（アンチセンス配列を含まない）を含む２つのク ローンとに、約２の感染多重度ＣＭ、Ｏ，１，）でＭ−ＭｕＬＶを感染させた。

細胞からのウィルスの分泌を測定することにより、細胞がＭ−ＭｕＬＶの複製を 支持する能力を調べた（感染細胞の上清中の逆転写酵素（Ｒ，Ｔ、）活性の出現 によって測定）。第５図に示すように、アンチセンス鋳型を含む細胞中ではＭ− ＭｕＬＶ複製が７０％〜９５％抑制された。

アンチセンスベクターが培養物中でのＭ−ＭｕＬＶの拡大を阻止する能力を調べ る第２の実験では、前述の細胞系を０．００２のＭ、Ｏ，１，で感染させ、Ｍ− ＭｕＬＶの細胞中にＭ−ＭｕＬＶ特異的アンチセンス鋳型が存在すると、Ｍ−Ｍ ｕＬＶが培養物中で広がる能力が著しく抑制される。

このセクションで説明した実験は下記のことを立証している＝（ａ）キメラｔ− ＲＮＡベース転写体単位は真核細胞中に安定的に導入することができ、その結果 対応するＲＮＡが高しベルで発現される。（ｂ）Ｍ−ＭｕＬＶ特異的アンチセン ス鋳型をｔ−ＲＮＡプロモーターに融合すると、対応する細胞中でのＭ　ＭｕＬ Ｖ複製が効果的に抑制される。Ｍ　−Ｍ　ｕ　Ｌ　Ｖは極めて効果的な転写単位 であるから、第５図及び第６図に示した実験はｐｏｔ　ＩＩＩベース転写単位の 効力を証明するものである。

ＤＣＴ５Ａ及びＤＣＴ５Ｂは、転写によりＨＩＶゲノムア１１１−に対して相補 的なＲＮＡ種を形成する長さ３０ｂｐのヌクレオチド配列に融合したキメラｔ− ＲＮＡ遺伝子を含む（第２図及び第３図参照）、これら２つのベクター、ＤＣＴ ５Ａ及びＤＣＴ５Ｂが、感染し易いヒトリンパ球中でのＨＩＶの複製を阻止する 能力を検査し、結果を第７図に示した。

ＤＣＴ５Ａ及びＤＣＴ５Ｂに対応するウィルスを用いてＨＵＴ　７８細胞（ヒト 皮膚Ｔ細胞リンパ腫誘導細胞系）に感染させ、個々に感染した細胞を０４１８の 存在下で軟ＨＩＶの複製を支持する能力について検査した。対照としのベクター から誘導したウィルスとＨＵＴ　７８細胞に惑染させた。培地中のＲ，Ｔ、活性 の出現を測定することによって、ＨＩＶがアンチセンスベクターを含むＨＵＴ７ ８紺胞及び対照ベクターを含むＨＵ　７７８　ｍｌ胎胞中複製される能力を調べ た。第７図はこのような実験の結果を示している。第７［２Ｉに示すように、Ｄ ＣＴ５Ａベクターを含むＨＩＶ細胞系（Ａｌ−Ａ３）の複製は３つの細胞系の間 で阻止されており、これは、第４ｃ図がら明らがなように、細胞中に存在するア ンチセンスＲＮＡの量に関連している。

ＤＣ７５Ｂベクターを含む３つの細胞系におけるＨＩＶの複製は事実上抑止され ている（第７図、Ｂ１．Ｂ２及びＢ４）。１つの細胞系Ｂ３では、ＨＩＶの複製 に影響が見られなかった。その理由は不明である。インサイド（ｉｎｓｉｔｅ） イムノフルオレサンス（ＩＦ、Ａ）を用いて、ＨＩＶがＨＵＴ　７８誘導細胞系 中で複製される能力も測定したところ、この実験の結果はＲ，Ｔ、分析と合致し ていた（図示せず）。例えば、１４日間培養した後では、３つの対照細胞系にお ける細胞の４０〜８０％が陽性を示したが、細胞系Ａ１、Ｂ１、Ｂ２及びＢ４で は陽性細胞は検出されず（°約１０００個の細胞を含む領域で）、細胞Ａ２及び Ａ３中には陽性細胞が数個しか存在してぃながった。Ｂ３細胞は対照と見分けが つかなかった。

要約すれば、このセクションで説明した実験は、ｆｌ　Ｉ　Ｖ特異的アンチセン ス鋳型に融合したキメラｔ−ＲＮＡからなるＤＮＡ構造体を細胞中に安定的にト ランスファーするとＨＩＶの複製が抑制されることを示している。換言すれば、 アンチセンスへフタ−を含む細胞はＨＩＶの複製から保護され、従ってその有害 な作用からも保護される。この手法をヒトＡＩＤＳ患者に適用できれば、即ち患 者をＨＩＶの複製から保護し、更にはＡＩＤＳの進展からも保護すべく、アンチ センスベクターを患者の体内に導入することができれば、この恐ろしい病気と闘 うための興味深い新たな戦法となるであろう（３）。

”ＴＡＲ”＝コイ　゛（７）ＨＩＶ　Ｒ，Ｔ、　（７１ＨＩｖ遺伝子の発現を、 ｔａｔと称するウィルス遺伝子産物によって調節する。ＨＩＶ遺伝子の発現及び ウィルスの発生には、ｔａｔ遺伝子産物がウィルスＲＮＡの特定配ＴＡＲ配列を 囲む６０ｂｐオリゴヌクレオチドを化学的に合成した（第８図参照）。ＴＡＩ” （を含むオリゴヌクレオチドをｔ　−ＲＮ　Ａ遺伝子に融きし且つＭ−ＭｕＬＶ ベースＮ２ベクターの３′側ＬＴＲ，に挿入して第１図〜第３図に示すレトロウ ィルスベクターを構築した。このベクターの−、に、約２の感染多重度 （Ｍ、○、■、）でＨＩＶ−１を感染させた。ベクターがＴＡＲを効果的に合成 しそれによってＨＩＶの複製を阻止する能力を、細胞からのウィルスの分泌の測 定によって調べた（感染した細胞の上滑中での逆転写酵素（Ｒ，Ｔ、）活性の出 現によって測定）。第９図に示すように、対照ベクターを含むという特徴を有す る２つのＣＥＭＳＳ細胞クローン単離体は確かにＨＩＶの複製を支持した。これ は、培地中での逆転写酵素（Ｒ，Ｔ、）活性の出現によって立証される。

一方、ＴＡＲ配列を含み且つこれを発現するという特徴ＨＩＶの複製が著しく抑 制され、抑制率が９０〜９５％であった。

第１０図は前述のように実施した個々の実験の結果を示している。例外として、 Ｒ，Ｔ、活性は感染後２４日までゆ醤帰臂測定した。第１０図から明らかなよう に、感染後１４日に対照と比べてＨＩＶの複製が著しく抑制されているばかりで なく、抑制効果が感染後２４日まて持続した。

第９図及び第１０図に示した実験は、キメラＴＡＲを含む転写体の合成が、ＨＩ Ｖ惑染感染細胞内で合成されたｔａｔ遺伝子産物に結合する「デコイ」として機 能し、そのためｔａｔがその生理学的ターゲットであるＨＩＶゲノム中のＴＡＲ 配列に結合しなくなることを立証している。

その結果、ＨＩＶ遺伝子発現の活性化が失われ、培養ＣＥＭＳＳ細胞中でのＨＩ Ｖの複製が阻止される。

−によって゛　される　θ」■ベースのｌ血二見豊ｌ」１ 真核細胞中で特定のＲＮＡ転写物を高レベルで遺伝的に安定に合成する能力は、 広範囲にわたる有効な用途を提供するので、幾つかの例を以下に列挙する。

ヒト生　の感　）の 安定遺伝子移入によって達成されるアンチセンスＲＮＡ阻簀プロトコルは、細胞 を病原体の複製に対して耐性とすＡ分子を合成することができる転写単位をコー ドするＤＮＡ分子を、アンチセンスベクターによって未感染細胞中に導入し、所 与の病原体に特異的なアンチセンスＲＮＡｔ−構成的に発現させることを含む、 病原体を誘発しても、その遺伝子の発現またはその複製のいかなる他の局面も阻 害され、結果的に、細胞中での病原体の複製及び他の細胞への拡散は制限される 。ヒトＴリンパ球中のヒトレトロウィルスであるＨＴＬＶ−１の複製を阻害する このような方法の可能性は最近示されておりく３０）、図５及び図６に示した実 験は、ｔ−ＲＮＡベースのアンチセンステンプレートがを示している。ＡＩＤＳ 及び他の病原体に起因する疾患の治療へのこの技術の適用を考えることができる （３）。腫瘍原性遺伝子のようなヒト患者に有害な他の遺伝子を阻害するために アンチセンスＲＮＡ技術を使用することもできる。

病原体の宿主に耐性を示す新たな動物及び植物種を生成するために、有効なアン チセンステンプレートを保有するトランスジェニック動物または植物の生成を使 用することができる。アンチセンスＲＮＡベースの方法を使用してトランスジェ ニック植物が生成されてきたが、多くの場合に、病原体から有効に防御するには 不十分な阻害レベルを得たのみで成功は制限されている（２２）。

前のセクションで記載した実験は、真核細胞中で所望のＲＮＡ転写物を高レベル で遺伝的に安定に発現させるために、ｐｏｌ［［ベースのプロモーターを使用で き、またこのプロモーターが、有効なアンチセンステンプレートを保有する動物 及び植物種の生成に有効となり得ることを示している。同じ技術は、トランスジ ェニック動物または植物において特定の遺伝子を失活させるためにも一般的な方 法で使用することができる。また、トランスジェニック種の種々の機能及び特性 を調節するため（２１）、特定の突然変異を導入してヒト遺伝性疾患のモデル系 を形成するため（１９）または遺伝子機能障害の結果を調査するための手段とし てこれを使用することもできる。

ＲＮＡム　パ　の１の　゛ 安定遺伝子移入による遺伝子阻害の概念は最近Ｎａｔｕｒｅの評釈論文中で討論 されており、細胞を感染性病原体の複製から防御するために使用し得る（３）が 故に゛′細胞内免疫（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ）”と称されている。この目的（即ち遺伝子阻害）で使用され得る機構は恐らく 多数あり、アンチセンスＲＮＡ阻害はこのような方法の１つである。単純ヘルペ スウィルス（Ｈ３Ｖ）の遺伝子発現及び複製の際に拮抗阻害物質として機能する 欠陥調節タンパク質の構築を含む別の方法も記載されている（８）。

ＨＩＶ遺伝子の転写を活性化するのに必要なＨＩＶタンパク質に結合するための 拮抗阻害物質として機能する調節タンパク質の使用を含む１つの特定の適用とし ては、ＴＡＲ配列を含むベクターの構築を挙げることができる。

上記“細胞内免疫”療法においては、全ての重要な造血幹細胞を含む骨髄細胞を 患者から採取する。次いでこの幹細胞を、ＨＩＶ　ｔａｔ　タンパク質がＴＡＲ デコイに結合し、ＨＩＶゲノムに結合する上で打ち負かされ、それによって転写 の活性化を阻害するような量のＴＡＲオリゴヌクレオチドデコイを生成するのに 有効な量のＴＡＢを含むレトロウィルスベクターで感染させる。

噂 次いで、当業者には公知の方法で、上記の変性幹細胞を患者内に注射し、骨髄に 戻す、移植細胞の増殖を容易にするためには、放射線療法または患者に細胞毒性 薬物を投与する方法が使用され得る。この“細胞内免疫”療法は、ＨＩＶ陽性患 者を治療するために有効であるばかりか、ＨＩＶ惑染感染防するのにも有効であ ろう。

このセクションは、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂら（３７）、ＣＯｌ　ｅｍａｎら（５） 及びｖａｎ　ｄｅｒ　Ｋｒｏｌら（２２）によって記載されているような安定Ｒ ＮＡ　：　ＲＮＡまたはＲＮＡ　：　ＤＮＡハイブリッドの形成を含む、アンチ センス阻害方法とは異なる３つの遺伝子阻害方法を説明する。これら３つの方法 に共通な特徴は、本発明の課題である細胞中で特定のＲＮＡを高レベルで発現す る能力に依存することである。

レトロウィルスの複製を阻害するのに有効である。ウィルスが細胞中に侵入する と、その複製の初期事象の１つには、ウィルスＲＮＡゲノムの二重ｊｌｉＤＮＡ 形態への逆転写が含まれる。この反応は、逆転写酵素（Ｒ、Ｔ　、）と称される ウィルス特異的酵素によって実施される。逆転写の開始は、ウィルスゲノムの特 定の領域に結合した細胞ｔ−ＲＮＡが１ライマーとして作用するプライミング反 応によって生起される。伸長はＤＮＡｇの合成を含むのみならず、逆転写酵素の 一部であるがまたはそれに物理的に付随するＲＮＡａｓｅＨ活性によるＲＮＡテ ンプレートの分解をも含む（３６）。

偽プライミング方法は、ウィルスゲノム全体を通して種々の位置において逆転写 とピリオンＲＮＡの分解とを開始し、従って複製サイクルの無効（ａｂｒｏｇａ ｔ　１ｏｎ）をもたらす特定のプライマーの合成を含む。

熱力学的に安定なＲＮＡ　：　ＲＮＡハイブリッドの形成を必要とするアンチセ ンスＲＮＡ阻害と比較した場合の偽プライミングの長所は、（ａ）安定なハイブ リッドの形成を必要としないこと、及び（ｂ）ターゲットＲＮＡの（分解によっ て）不可逆的な阻害となることである。

偽プライミングによる遺伝子阻害には、（ＤＮＡ鎖が付加される）３′末末端体 にターゲットＲＮＡに相補的なＲＮＡを合成することが必要となる。従って、ｐ ｏｌＩＩ転写物は３°末端に一連のポリＡを含むが故に、偽プライミングにより 遺伝子を阻害するためにｐｏｌ［ベースの転写単位を使用することはできない、 また、ｐｏｌｌ［は要求されるＲＮＡプライマーを生成するために使用すること ができるので、ｐｏｌｌｌベースの転写単位は、偽プライミングにより遺伝子を 阻害するのに唯−適している。ｐｏｌｌ［転写物のＲＮＡ終結の唯一の機能によ って、３″末末端体で所与のＲＮＡテンプレートに相補的であり従って逆転写の ためのプライマーとして作用し得る特定の転写物を構築することができる。簡単 に言えばｐｏｌｌ［［は、Ｇ及び／またはＣヌクレオチドの領域によってひとま とめとされる４つ以上続くＴにおいて転写を終結させる（９）。ｐｏｌｌ［転写 物は、２番目または３番目のＴの後に終結する。その結果、３′末端に配列（Ｇ またはＣ）２Ａ　Ａ　Ａを含むレトロウィルスゲノムの特定の領域に対応するよ うにプライマーを生成することができる。化学的に合成され得るプライマー配列 は５′末端でｐｏｌＩ［［プロモーターに結合される。３′末端にはプライマー は、ｐｏｌｌ［転写終結シグナルを再生するために、２つまたは３つのＴヌクレ オチドと次いで幾っがのＧ及び／またはＣヌクレオチドとの付加配列を含む。

リボ゛イムによる゛　−一゛ 人工リボザイムを使用しＲＮＡ分子を特定の配列で切断することが可能であるこ とをＨａｓｅｌｏｆｆ及びＧｅｒＩａｃｈ（１５）が最近示した。この実験方法 を使用し、かかるリボザイムをコードする転写単位を構築することにより特定の 遺伝子を失活させることができる。

−・　の　ゝ 細胞中で特定のＲＮＡ種を有効に合成することを必要とする別の方法は、遺伝子 活性物質または阻害物質を機能的に失活させ、その結果、遺伝子発現を阻害また は活性化するために使用することができる。例えば、ＨＩＶにコードされるｒｅ ｖ遺伝子産物は遺伝子活性物質であり、ＲＲＥと称されるＨＩＶゲノム上の特定 の配列に直接結合することにより、５染細胞中でのＨＩＶゲノムの発現を調節す る＜１２．２４）。ＲＲＥ配列を含むＲＮＡ転写物を高レベルで発現する細胞を 操作することにより、ｒｅｖ遺伝子はこ°Ｒ のＲＮＡに結合し、従ってＨＩＶ　Ｒ／！Ｅ配列に結合することはできなくなる 。その結果ＨＩＶ遺伝子は発現されず、従ってＨＩＶ産生及び拡散が阻害される 。

同様に、特定のＤＮＡ配列に結合することによりその機能を達成する遺伝子調節 物質の機能を失活するために、ｔ−４ＮＡプロモーターベースのＲＮＡ転写単位 を使用することもできる。これは、ＤＮＡ結合遺伝子調節物質の認識配列に対応 する配列を含む二重鎖構造中に折り込まれるパリンドロームを含むＤＮＡ転写物 を産生ずるＤＮＡテンプレートを構築することにより達成され得る。実際のＤＮ Ａ配列は細胞中にたった２コピーしか存在しないのと比べ、二重ｇＲＮＡ形態の 認識配列が高レベルで存在すると、ＤＮＡ結合タンパク質と効果的に拮抗し得る 。

でのタンパク　の 遺伝子工学の出現は特定のタンパク質の大量生産への扉を開き、このことは全体 として新たなバイオテクノロジー工業を生み出した。細菌はこのプロセスにおい て特別の主役であるが、多くの場合に、生物学的に活性な生産物を得るために哺 乳動物細胞ベースの生産系を使用することが必要となる。哺乳動物細胞ベースの 生産系はより複雑で、高価で、しかも細菌ベースの系と比べてタンパク質合成の 効率はずっとよくない。目下のところ、哺乳動物細胞における遺伝的に操作され たタンパク質の生産を向上するために使用される主な方法は、ＤＨＦＨのような 増幅可能遺伝子に結合された対応する遺伝子の同時増幅を含む、この方法の主な 制約は、増幅プロセスに約８〜１２カ月を要し、主に増幅プロセスの間に所望の 遺伝子が頻繁に損失することに起因し不確定性に満ちていることである。

本明細書に記載の実験は、便宜的に使用したｐｏｌＩ［ベースの転写単位系と比 較し、細胞中でＲＮＡ転写物を１００〜１０　、ＯＯ０倍高いレベルで産生ずる が故に、哺乳動物細胞においてタンパク質を大量生産するための別の方法を提供 する。ｐｏｌｌｌベースの系は、長々しい増幅プロセスなしにタンパク質合成の ためのｍＲＮＡを生産し得る可能性をもつ。

下記の文献は明細書中に引用されたものである：５ａｑｕｅｎｃａｓ　ｉｎ　ｔ ｈｅ　ｈｕｍａｎ　ｔＲＮＡｉ−ｇａｎｅ、Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄ　Ｒａｓ。

工ｚ：　ｌｘｏニー１１１５゜ ２、Ａｒｍａｎｔａｎｏ、　Ｄ、、　Ｙｕ、　Ｓ−Ｆ、　Ｋａｎｔｏｆｆ、　Ｐ 、Ｗ、、　ｖｏｎ　Ｒｕｄａｎ、　Ｔ、。

入ｎｄａｒｓｏｎ、Ｗ、Ｆ、、ａｎｄ　Ｇ１１ｂｏａ、Ｅ、　（１９８〕）、　 Ｅｆｆ＠ｃｔ　ｏｆｉｎｔａｒｎａｌ　ｖｉｒａｌ　ｓ＠ｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｎ 　ｔｈｅ　ｕｔｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｒ＠ｔｒｏｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒｓ、、、 ７．　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌ、ム：　１６４７−１６５０゜３、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ 、Ｄ、、（１９８８）、Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏ ｎ。

Ｎａｔｕｒａ、　ユニコニ　コ９５−３９６゜４、Ｃｈａｎｇ、　Ｌ−Ｊ、、　 ５ｔｏｌｔｚｆｕｓ、　Ｃ，Ｍ、　（１５？ａ５）、Ｇｓｎａ　ｅｘｐｒｅｓｓ ｉｏｎｆｒｏｍ　ｂｏｔｈ　１ｎｔｒｏｎｌａｓｓ　ａｎｄ　ｉｎｔｒｏｎ−ｃ ｏｎｔａｉｎｉｎｇ　Ｒｏｕｓ　ｓａｒｃｏｍａｖｉｒｕｓ　ｃ工ｏｎｅ！ｌｉ ｓ　５ｐａｃｉｆｉｃａｌｌｙ　１ｎｈｉｂｉｔｅｄ　ｂｙ　ａｎｔｉｓａｎｓ ｅＲＮ入、Ｍｏ１．　Ｃａ１１．　Ｂｉｏｌ、ｆｉ：　２コ４１−２３４８゜５ 、　Ｃｏｌａｍａｎ、３．、Ｈｉｒａｓｈｉｍａ、Ａ、、工ｎｏｋｕｃｈｉ、Ｙ 、、Ｇｒｅｅｎ、Ｐ、Ｊ。

ａｎｄ工ｎｏｕｙａ、　Ｍ、　（１９８５）、Ａ　ｎｏｖ＠ｌ　ｉｍｍｕｎａ　 ５ｙｓｔ＠ｍ　ａｇａｉｎｓｔｂａｃｔａｒｉｏｐｈａｇａ　１ｎｆｅｃｔｉｏ ｎ　ｕｓｉｎｇ　ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ　ＲＮＡ　（ｍｉｃＲＮ）、　Ｎ ａｔｕｒｅ、　ユｉ：　６０１−６０３゜６、Ｄｏ　ｌａ　Ｐ＠ｎａ、　Ｐ、　 ａｎｄ　Ｚａｓｌｏｆｆ、　Ｍ、、　（１９８７）−Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ　 ｏｆｍＲＮＡ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔ　ｂｙ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ 　ｅｌｅｍｅｎｔｓ、Ｃ＠１１．ｊ２ｉ：６１コー６１９゜ ７、Ｆａｎ、　Ｈ，ａｎｄ　Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、　Ｄ、（１９７］）、ＲＮＡ 　ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　ｏｆｍｕｒｉｎａ　ｌａｕｋａｍｉａ　ｖｉｒｕｓ： 　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｖｉｒｕｓ−ｓｐ＠ｃｉｆｉｃ　ＲＮＡ５＠ｑｕ ｅｎｃａｓ　ｉｎ　１ｎｆａｃｔａｄ　ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　１ｄｅｎｔｉｆｉ ｃａｔｉｏｎ　ｏｆｖｉｒｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｍａｓｓｅｎｇｅｒ　ＲＮ Ａ、Ｊ、Ｍｏ１．　Ｂｉｏ、旦Ω：　９３−１１７゜ａ、　Ｆｒｉａｄｍａｎ、 入、Ｄ、、Ｔｒｉｅｚｅｎｂａｒｇ、Ｓ、Ｊ、ａｎｄ　ＭｃＫｎｉｇｈｔ、Ｓ、 Ｌ。

（１９８８）、　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｔｒｕｎｃａｔｅｄ　ｖｉ ｒａｌ　ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｏｒ　５ｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ　ｉｍｐａ ｄｅｓ　１ｙｔｉｃ　１ｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｂｙ　ｉｔｓｃｏｇｎａｔｅ　ｖｉ ｒｕｓ、Ｎａｔｕｒｅ、Ｌ匝：　４５２−４５４゜９、　Ｇａ１ｄｕｓｃｈｅｋ 、Ｅ、Ｐ、（１９８８）、　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｂｙ　ＲＮＡｐｏｌ ｙｍａｒａｓｅエエエ、Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　：ＬＬ：　８ ７：ｌ−９１４゜１０、Ｇｏｆｆ、Ｓ、、Ｔｒａｋｔｍａｎ、Ｐ、ａｎｄ　Ｂａ ｌｔｉｍｏｒｅ、Ｄ、、（１９８１）。

工５ｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆ　Ｍｏ１ｏｎｅｙ　 ｍｕｒｉｎｅ　ｌｅｕ）ｃｅｍｉａｖｉｒｕｓ　ｍｕｔａｎｔｓ：　ｖｉａ　ｏ ｆ　ｒａｐｉｄ　ａｓｓａｙ　ｆｏｒ　ｒａｌａａｓａ　ｏｆｖｉｒｉｏｎ　ｒ ｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓａ、　Ｊ、ｏｆ　Ｖｉｒｏｌ、ユ旦＝ 　２３９−２４８゜ １１、Ｇｒｅｅｎ、　Ｐ、Ｊ、、　Ｐｉｎａｓ、−０，ａｎｄ工ｎｏｕｙｅ、　 Ｍ、　（１９８６）、’ｒｈａ　ｒｏｌｅｏｆ　ａｎｔｉｓａｎｓ＠　ＲＮＡ　 ｉｎ　ｇａｎａ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ、　Ａｎｎ、Ｒｅｖ。

Ｂｉｏｃｈａｍ、　５ｉ：　５６９−５９７゜ｐｒｏｔａｉｎ　ａｘｐｒａｓｓ ｉｏｎ　ｖｉａ　ａ　ｃｉｓ−ａｃｔｉｎｇ　５ｅｑｕ＠ｎｃｅ　ｉｎ　ｔｈｅ 　ｅｎｖｒ＠ｇｉｏｎ、Ｊ、　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌ、　ｆＬｌ：　１２６５−１２ ７４゜１コ、　Ｒａｎ、　Ｊ、Ｈ，、Ｒｏｏｎｅｙ、　Ｒ，Ｊ、　ａｎｄ　Ｗａ ｒｄｉｎｇ、　Ｊ、Ｄ、　（１９８４）。

５ｔｒｕｃｔｕｒａ　ａｎｄ　ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍａｍｍａｌｉａｎ 　ｔＲＮＡ　ｇｅｎａｓ：ｓ＠ｑｕａｎｃａ　ｏｆ　ａ　ｍｏｕｓｅ　ｔＲＮＡ ｉ″（ｇａｎｇ、ｔｈａ　５’−ｆｌａｎｋｉｎｇｒｅｇｉｏｎ　ｏｆ　ｗｈｉ ｃｈ　ｉｓ　ｈロｍロｌｏｇ口ｕｓ　ｔｏ　ａ　ｈｕｍａｎ　ｇａｎａ、　Ｇ＠ ｎ＠。

２旦：　２４９−２５５゜ １４、Ｈａｎｔｚｏｐｏｕｌｏｓ、Ｐ、Ａ、、Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ、Ｂ、Ａ、、 Ｕｎｇｅｒ、Ｇ、ａｎｄＧｉｌｂｏａ、Ｅ、（１９８９）、　工ｍｐｒｏｖａｄ 　ｇａｎｇ　＠ｘｐｒ＠５ｓｉｏｎ　ｕｐｏｎｔｒａｎｓｆｅｒ　ｏｆ　ｔｈａ 　ａｄｅｎｏｓｉｎｅ　ｄａａｍｉｎａｓｅ　ｍｉｎｉｇｅｎｅ　ｏｕｔｓｉｄ ｅｔｈｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ｕｎｉｔ　ｔ口ａ　ｒｅｔｒｏｖ ｉｒａｌ　ｖｅｃｔｏｒ、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　５ｃｉ、　ＵＳＡ、　（工ｎ　Ｐｒｅｓｇ）。

１５、Ｈａｓ＠１ｏｆｆ、Ｊ、ａｎｄ　Ｇａｒｌａｃｈ、Ｗ、Ｌ、（１９８Ｂ） 、　Ｓｉｍｐｌａ　ＲＮＡａｎｚｙｍ＠ｓ　ｗｉｔｈ　ｎｅｗ　ａｎｄ　ｈｉｇ ｈｌｙ　５ｐｅｃｉｆｉｃ　ｅｎｄｏｒｉｂｏｎｕｃｌａａｓｅａｃｔｉｖｉｔ ｉａｓ、Ｎａｔｕｒｅ　ΣＩ：　５８５−５９１１６、Ｉｚａｎｔ、Ｊ、Ｇ、ａ ｎｄ　Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ　Ｈ，（１９８４）、Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆｔ ｈｙｍｉｄｉｎａ　ｋｉｎａｓｅ　ｇａｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｂｙ　ａ ｎｔｉｓａｎｓａ　ＲＮＡ：　Ａｍｏｌａｃｕｌａｒ　ａｐｐｒｏａｃｈ　ｔｏ 　ｇｅｎｅｔｉｃ　ａｎａｌｙｓ＠ｓ、Ｃａ１ｌ　皿＝　１００７−１０１５゜ ｉ７．　：Ｃｚａｎｔ、　Ｊ、Ｇ、　ａｎｄ　Ｈ，Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ　（１９ ８５）、Ｃｏｎ５ｔｉｔｕｔｉｖ＠ａｎｄｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ　５ｕｐｐｒ ｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ａｘｏｇａｎｏｕｓ　ａｎｄ　ａｎｄｏｇａｎｏｕｓｇａ ｎｅｓ　ｂｙ　ａｎｔｉｓａｎｓａ　ＲＮＡ、５ｃｉｅｎｃｅ、１２ｊｌ”　３ ４５−３５２゜１８、．７＠ｒＬｎ土ｎｑｔｘ、Ｐ、λ、ａｎｄ　Ｍｏ１ｌｏｙ 、Ｐ、Ｌ、、（１９８７）、　工ｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆＳＶ４０　ｒｅｐｌ ｉｃｏｎ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｂｙ　ｅｎｇｉｎｅａｒｅｄ　ａｎｔｉｓａｎｓ ａ　ＲＮＡｔｒａｎｓｓｃｒｉｂ＠ｄ　ｂｙ　ＲＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓ＠工Ｉ 工、Ｔｈ＠ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌｆｚ：３０４コー３０４７゜ ユ９．　Ｘａｔｓｕｋｉ、　Ｍ、、　５ａｔｏ、　Ｍ、、　Ｋｉｍｕｒａ、　Ｍ 、、　Ｙｏｋｏｙａｍａ−、Ｍ。

Ｋｏｂａｙａｓｈｉ、　Ｋ、　ａｎｄ　Ｎｏｍｕｒａ　（１９８８）　、Ｃｏｎ ｖａｒｓｉｏｎ　ｏｆ　ｎｏｒｍａｌｂｅｈａｖｉｏｒ　ｔｏ　５ｈｉｖａｒｅ ｒ　ｂｙ　ｍｙｅｌｉｎ　ｂａｓｉｃ　ｐｒｏｔａｉｎ　ａｎｔｉｓｅｎｓ＠Ｃ ＤＮＡ　＝ｎ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｍ１ｃａ、　５ｃｉａｎｃｅ　ｕａよ： 　５９３−５９５゜２０．　Ｋｉｎ、Ｓ、Ｘ、、Ｗｏｌｄ、Ｂ、Ｊ、（１９８５ ）、　５ｔａｂｌｅ　ｒａｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆｔｈｙｍｉｄｉｎａ　ｋｉｎａ ｓａ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｉｎ　ｃａｌｌｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ　ｈｉｇｈ １＠ｖ＠ｌｓ　ｏｆ　ａｎｔｉｓａｎｓｅ　ＲＮＡ、　Ｃａ１ｌ　、［：　１２ ９−１３８゜２１、ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｋｒｏｌ、Ａ、Ｒ，、Ｌｅｎｔｉｎｇ、Ｐ 、Ｅ、、Ｖａａｎｓｔｒａ、Ｊ、、ｖａｎｄａｒ　Ｍａｅｒ、工、Ｍ、、Ｋｏｅ ｓ、Ｒ，Ｅ、、Ｇｅｒａｔｓ、Ａ　−Ｇ、Ｍ、、Ｍｏｌ、Ｊ　−Ｎ、Ｍ。

ａｎｄ　５ｔｕｉｔｊｅ、Ａ、Ｒ，（１９８８）、　入ｎ　ａｎｔｉｓａｎｓａ 　、ｃｈａｌｃｏｎａｓｙｎｔｈａｓｅ　ｇｅｎａ　ｉｎ　ｔｒａｎｓｇａｎｉ ｃ　ｐｌａｎｔｓ　１ｎｈｉｂｉｔｓ　ｆｌｏｗｅｒｐｉｇｍ＠ｎｔａｔｉｏｎ 、Ｎａｔｕｒａ、　２２２：　８６６−８６９゜２２、ｖａｎ　ｄａｒ　Ｋｒｏ ｌ、Ａ、Ｒ，、Ｍｏ１．　Ｊ、Ｎ、Ｍ、、ａｎｄ　５ｔｕｉｔｊｅ、Ａ、Ｒ，。

（１９８Ｂ）、Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｕｋａｒｙｏｔｉｃ　ｇａｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｂｙｃｏｍｐｌａｍｅｎｔａｒｙ　ＲＮＡ　Ｏｒ　ＤＮ Ａ　５ｅｑｕｅｎｃｅ’、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、　ｆｌ：９５８−９７ ６゜ ２：３．　Ｌ＠ｗｉｓ、　Ｄ、Ｅ、　Ｍａｎｌｅｙ、　Ｊ、Ｌ、（１９８６）、 Ｐｏ１ｙａｄａｎｙｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎｍＲＮＡ　ｐｒａｃｕｒｓｏｒ　 ｏｃｃｕｒｓ　１ｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏ ｎ　ｂｙＲＮＡ　ｐｏｌｙｍａｒａｓｅ　エエ　ｉｎ　ｖｉｖｏ、　Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、入ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ旦ユニ　８５５５−８５５９゜ ２４、Ｍａｌｉｍ、　Ｍ、Ｈ，、Ｈａｕｂｅｒ、　Ｊ、、　Ｌａ、　５．−Ｙ、 、　Ｍａｉｚｅｌ、　Ｊ、Ｖ、　ａｎｄｎｕｃｌｅａｒ　ｅｘｐｏｒｔ　ｏｆ　 ｕｎｓｐｌｉｃａｄ　ｖｉｒａｌ　ｍＲＮＡ、Ｎａｔｕｒａ　Σ胆：２５４−２ ５７゜ ２５、ＭｃＧａｒｒｙ、　Ｔ、Ｊ、　ａｎｄ　Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔ、　Ｓ、　（ １９８６）、工ｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆｈｅａｔ　５ｈｏｃｋ　ｐｒｏセｓｉ ｎ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｂｙ　ｈａａｔ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅａｎｔｉｓａｎ ｓａ　ＲＮＡ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ旦ユニ　３９９ −４０３゜２６、　Ｍａｌｔｏｎ、　Ｄ、　（１９１１５）、　工ｎｊｅｃｔｅ ｄ　ａｎｔｉｓａｎｓａ　ＲＮＡ５ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ　ｂｌｏｃｋ　ｍ ａｓｓａｎｇｅｒ　ＲＮＡ　ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｖｉｖｏ。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、入ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、Ｑ：　１４４−１４８゜２７ 、Ｍｉｌｌａｒ、λ、Ｄ、、　ａｎｄ　Ｂｕｔｔｉｍｏｒａ、　Ｃ，、（１９８ ６）、Ｒａｄａｓｉｇｎ　ｏｆｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ　ｐａｃｋａｇｉｎｇ　ｃ ｅｌｌ　１ｉｎｅｓ　ｔｏ　ａｖｏｉｄ　ｒ＠ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｌｅａｄ ｉｎｇ　ｔｏ　ｈａｌｐｅｒ　ｖｉｒｕｓ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、　Ｍｏ１． 　Ｃａ１１．　Ｂｉｏｌ。

旦：　２８９５−２９０２゜ ２Ｂ、Ｐａｔｅｒｓｏｎ、　Ｂ、Ｍ、、　Ｒｏｂｅｒｔｓ、　Ｂ、Ｅ、　ａｎｄ 　Ｋｕｆｆ、　Ｅ、Ｌ、（Ｌ９７７）。

５ｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｇａｎｇ　１ｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｍ ａｐｐｉｎｇ　ｂｙ　ＤＮＡ　ｍＲＮＲＮＡｂｒｉｄ−ａｒｒｅｓｔ　ｃｅｌｌ −ｆｒｅｅ　ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

ＳＣ１，ＵＳＡ　ヱ４：　４３７０−４３７４゜２９、Ｐｅ５ｔｋａ、　Ｓ、、 　Ｄａｕｇｈａｒｔｙ、　Ｂ、Ｌ、、　Ｊｕｎｇ、　Ｖ、、　Ｈｏｔｔａ、　Ｋ 、　ａｎｄＰａｓｔｋａ、Ｒ，に、（１９８４）、　Ａｎｔｉ−ｍＲＮＡ：・　 ５ｐｅｃｉｆｉｃ　１ｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆ　ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　ｏｆ 　ｓｉｎｇｌｅ　ＲＮＡ　ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

入ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　旦Ｑ：　７５２５−７５２８゜ｐｒｉｍａｒｙ　ｈ ｕｍａｎ　Ｔ　ｃｅｌｌｓ　ｔｈａｔ　ａｘｐｒａｓｓ　ａｎｔｉｓａｎｓ＠　 ＲＮＡ、Ｊ＋ｏｆ　Ｖｉｒｏｌ、　、ｊｄ：　６７７−６８２゜３Ｌ　５ａｎｃ ｈ＠ｚ−Ｐｒｅｓｃａｄｏｒ、　Ｒ，、Ｐｏｗｅｒ、　Ｍ、Ｄ、、　Ｂａｒｒ、 　Ｐ、Ｊ、。

＠ｘｐｒ＠５ｓｉｏｎ　ｏｆ　ａｎ　Ａ工０５−Ａ５ｓｏｃｉａｔｅｄ　Ｒｅｔ ｒｏｖｉｒｕｓｓ　（入ＲＶ−２）＋５ｃｉ−ＬＬＬ：　４８４−４９２゜ ３２、５ａｎｔｏｓ、　Ｔ、　ａｎｄ　Ｚａｓｌｏｆｆ、　Ｍ、　（１９８１） 、　Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｃｈｒｏｍ ｏｓｏｍａｌ　５ｅｑ１！Ｉｅｎｔｓ　ｂｅａｒｉｎｇｎｏｎａｌｌａｌｉｃ　 ｄｉｓｐａｒｓａｄ　ｔＲＮＡｉ”’　ｇａｎｅｓ、　Ｃｅ１ｌ　２ＪＬ＝　６ ９９−７０９゜３３、５ｈｉｎｎｉｃｋ、　Ｔ、Ｍ、、　Ｌｅｒｎｅｒ、　Ｒ， Ａ、、　ａｎｄ　５ｕｔｃｌｉｆｆｅ、　Ｊ、Ｇ。

（１９８１）　、Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ａｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｍｏ１ｏｎ ｅｙ　ｍｕｒｉｎａ　ｌｅｕｋｅｍｉａｖｉｒｕｓ、Ｎａｔｕｒｅ　２１１：　 ５４］−５４８゜コ４．　５ｉｓｏｄｉａ、　５．５．、　Ｓｏｌｌｎｅｒ−ｗ ｅｂｂ、　Ｂ、、　Ｃ１ａｖａｌａｎｄ、　Ｄ、Ｗ。

（１９８７）、　５ｐａｃｉｆｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ＲＮＡ　ｍａｔｕｒａｔｉｏ ｎ　ｐａｔｈｗａｙｓ：　ＲＮＡ５ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ　ｂｙ　ＲＮＡ　ｐ ｏｌｙｍｅｒａｓ＠　エエエ　ａｒｅ　ｎｏｔ　５ｕｂｓｔｒａｔｅｓｆｏｒ　 ｓｐｌｉｃｉｎｇ　ｏｒ　ｐｏｌｙａｄａｎｙｌａｔｉｏｎ、　Ｍｏ１．Ｃａ１ ｌ　Ｂｉｏｌ、ヱ：３６０２−３６１２＋ ：３ｓ、Ｔｏｂｉａｎ、Ｊ、入、、Ｄｒｉｎｋａｒｄ、Ｌ、、ａｎｄ　Ｚａｓｌ ｏｆｆ、Ｍ、（１９８５）。

乞ＲＮＡ　ｎｕｃｌａａｒ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔ：　Ｄｅｆｉｎｉｎｇ　ｔｈ＠ 　ｃｒｉｔｉｃａｌ　ｒ＠ｇｉｏｎｓｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｔＲＮＡｉ″ｔｂｙ　 ｐｏｉｎｔ　ｍｕｔａｇａｎａｓｉｓ、Ｃａ１１．　ｕ：　４１５−４２２゜ １６、　Ｖａｒｍｕｓ、Ｌ　ａｎｄ　Ｓｗａｎｓｔｒｏｍ、Ｌ、、（１９８２） 、　Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆｒａｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ、（Ｒ，Ｗｅｉｓ ｓ、　Ｎ、　Ｔａ１ｓｈ、　Ｈ，Ｖａｒｍｕｓ　ａｎｄ　Ｊ。

Ｃｏｆｆ１ｎ、＠ｄｓ、）　ＲＮＡ　Ｔｕｍｏｒ　Ｖｉｒｕｓｅｓ、Ｃｏ１ｄ　 Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＰｒ＠ｓｓ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏ ｒ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、コロ９−５１２゜３７、Ｗ＠１ｎｔｒａｕｂ、Ｈ，、工 ｚａｎｔ、Ｊ、Ｇ、、Ｈａｒｌａｎｄ、Ｒ，Ｍ、、（１９８５）。

入ｎｔｉｓ＠ｎｓ＊　ＲＮＡ　ａｓ　ａ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｔｏｏｌ　ｆｏ ｒ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ。

Ｔｒａｄｓ　ｉｎ　Ｇｅｎａｔｉｃｓ、、ｌ：　２２−２５゜３Ｂ、　Ｚａｍｅ ｃｎｉｋ、Ｐ、Ｃ，ａｎｄ　５ｔｅｐｈａｎｓｏｎ、Ｍ、Ｌ、（１９７Ｂ）、　 工ｎｈｉｂｉｔｉｏｎ口ｆ　Ｒｏｕｓ　ｓａｒｃｏｍａ　ｖｉｒｕｓ　’ｒｅｐ ｌｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃａｌｌｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｂｙ　ａ 　５ｐａｃｉｆｉｃ　ｏｌｉｇｏｄａｏｘｙｎｕｃｌ＠ｏｔｉｄｅ・Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　ヱ５：　２８０−２８４゜アンチセンス ベクターを含む３Ｔ３細胞系におけるＭＬｖＲ，Ｔ、の抑制Ｆ’Ｉ■ｕ５ 対ｗａ　ＩＤＣＱＩＣ−１１ Ｈ［１７７ｇ細胞における旧ＶＲ，τの抑制ｎα房１７ ＦＩＧＵＲＥ　８ ＴＡＲ配列をコードするオＩＪゴヌクレオチド配３１１ＣＴＧＧＧＡＧＣＴＣＴ ＣＴＧＧＣＴＡＡＣＴＡＧＧＧＡＡＣＣＣＡＣ／ＧＦＩＧＵＲＥ　９ ＴＡＲＤＥＣＯＹ”を含む細胞におけるＲ、　Ｔ、活性の抑制３２Ｐ　ＣＰＭ取 込み量 国際調査報告 ＰＣＴ　ＵＳ９０１０２６５６ ＡｔｔｅｌｃｈｍｅｎｔｔｏＦＯｒｍＰＣＴ／ＩｓＡ／２１０（ＳｅＣＯｎｄ９ ｒ＋ｅｅｔ）　’ＩＰａｒｔ　ＩＩｌ、　Ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ　ｃｏｎｓｉｄｅ ｒｅｄ　ｔｏ　ｂｅ　ｒｅｌｅｖｅｎｔＣａｔｅｇＯｎＪＣｌｔａｔｉｏｎ　Ｃ ｌａｉｍＮ。

ＰＣＴ　ＬＩＳ９０１０２６５６ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ　ｔｏ　Ｆ　Ｏｒｍ　ＰＣＴ／　ＩｓＡ／２　ＩＱ　（ｓ ｅｃｏｎｄ　５ｈｅｅｔ）　”２ＰＣＴＵ＋９０１０２６５６ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ　ｔｏ　Ｆｏｒｍ　ＰＣＴ／１５４／２　ＩＱ　（ｓｅｃ ｏｒｕｊ　５ｈｅｅｔ）　’３ン件Ｑ

Claims (87)

【特許請求の範囲】
1. １．ｐｏｌＩＩＩプロモーターと外来転写可能ＤＮＡとを含む安定に形質転換さ れた真核細胞であって、前記外来転写可能ＤＮＡが前記ｐｏｌＩＩＩプロモータ ーの制御下にある前記真核細胞。
2. ２．前記外来転写可能ＤＮＡが偽プライマーをコードする請求項１に記載の安定 に形質転換された真核細胞。
3. ３．前記外来転写可能ＤＮＡがリボザイムをコードする請求項１に記載の安定に 形質転換された真核細胞。
4. ４．前記外来転写可能ＤＮＡがアンチセンスＲＮＡをコードする請求項１に記載 の安定に形質転換された真核細胞。
5. ５．前記外来転写可能ＤＮＡがｍＲＮＡをコードする請求項１に記載の安定に形 質転換された真核細胞。
6. ６．前記外来転写可能ＤＮＡがポリペプチドをコードする請求項１に記載の安定 に形質転換された真核細胞。
7. ７．前記ｐｏｌＩＩＩプロモーターが、ｔ−ＲＮＡまたはその突然変異体もしく は誘導体を含む請求項１に記載の安定に形質転換された真核細胞。
8. ８．前記ｐｏｌＩＩＩプロモーターが、ヒトｔ−ＲＮＡまたはその突然変異体も しくは誘導体を含む請求項７に記載の安定に形質転換された真核細胞。
9. ９．前記ｐｏｌＩＩＩプロモーターが、ｔ−ＲＮＡｉｍｅｔまたはその突然変異 体もしくは誘導体を含む請求項８に記載の安定に形質転換された真核細胞。
10. １０．前記ｐｏｌＩＩＩプロモーターが、植物ｐｏｌＩＩＩプロモーターまたは その突然変異体もしくは誘導体を含む請求項８に記載の安定に形質転換された真 核細胞。
11. １１．前記ｐｏｌＩＩＩプロモーターが、動物ｐｏｌＩＩＩプロモーターまたは その突然変異体もしくは誘導体を含む請求項８に記載の安定に形質転換された真 核細胞。
12. １２．前記外来転写可能ＤＮＡが、細胞内で遺伝子の発現を阻害する分子をコー ドする請求項１に記載の安定に形質転換された真核細胞。
13. １３．前記アンチセンスＲＮＡが、病原体によってコードされるＲＮＡのセグメ ントに相補的であるＲＮＡを含む請求項４に記載の安定に形質転換された真核細 胞。
14. １４．前記病原体によってコードされるＲＮＡがｍＲＮＡを含む請求項１３に記 載の安定に形質転換された真核細胞。
15. １５．前記病原体がヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）を含む請求項１３に記載の 安定に形質転換された真核細胞。
16. １６．前記外来転写可能ＤＮＡが、ＲＥＶと表記されるＨＩＶ遺伝子産物の認識 シグナルをコードする請求項１５に記載の安定に形質転換された真核細胞。
17. １７．前記外来転写可能ＤＮＡが、ＨＩＶ調節配列をコードする請求項１に記載 の安定に形質転換された真核細胞。
18. １８．前記ＨＩＶ調節配列が、ＴＡＲと表記されるＨＩＶ配列である請求項１７ に記載の安定に形質転換された真核細胞。
19. １９．前記外来転写可能ＤＮＡが、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子への結合を通し て作用する遺伝子発現の調節物質の認識配列をコードする請求項１に記載の安定 に形質転換された真核細胞。
20. ２０．前記真核細胞が動物細胞を含む請求項１に記載の安定に形質転換された真 核細胞。
21. ２１．前記動物を細胞が哺乳動物細胞を含む請求項２０に記載の安定に形質転換 された真核細胞。
22. ２２．前記哺乳動物細胞がヒト細胞を含む請求項２１に記載の安定に形質転換さ れた真核細胞。
23. ２３．前記動物細胞がニワトリ細胞を含む請求項２０に記載の安定に形質転換さ れた真核細胞。
24. ２４．前記哺乳動物細胞が、造血幹細胞を含む請求項２１に記載の安定に形質転 換された真核細胞。
25. ２５．前記ヒト細胞が造血幹細胞を含む請求項２２に記載の安定に形質転換され た真核細胞。
26. ２６．前記真核細胞が植物細胞を含む請求項１に記載の安定に形質転換された真 核細胞。
27. ２７．前記ｐｏｌＩＩＩプロモーター及び外来転写可能ＤＮＡが、遺伝子移入ベ クター中に存在する請求項１に記載の安定に形質転換された真核細胞。
28. ２８．前記遺伝子移入ベクターがレトロウイルスベクターである請求項２７に記 載の安定に形質転換された真核細胞。
29. ２９．前記レトロウイルスベクターが、該レトロウイルスベクターの３′末端繰 返し配列（ＬＴＲ）領域内に導入されたキメラｔ−ＲＮＡを含む請求項２８に記 載の安定に形質転換された真核細胞。
30. ３０．前記レトロウイルスベクターが、Ｍ−ＭｕＬＶと表記されるマウスレトロ ウイルスを含む請求項２８に記載の安定に形質転換された真核細胞。
31. ３１．前記レトロウイルスベクターが、Ｎ２と表記されるレトロウイルスを含む 請求項２８に記載の安定に形質転換された真核細胞。
32. ３２．前記レトロウイルスベクターが、ＤＣＴ５Ａと表記されるレトロウイルス を含む請求項２８に記載の安定に形質転換された真核細胞。
33. ３３．前記レトロウイルスベクターが、ＤＣＴ５Ｂと表記されるレトロウイルス を含む請求項２８に記載の安定に形質転換された真核細胞。
34. ３４．前記レトロウイルスベクターが、ＤＣＴ５Ｃと表記されるレトロウイルス を含む請求項２８に記載の安定に形質転換された真核細胞。
35. ３５．前記キメラｔ−ＲＮＡが、ｔ−ＲＮＡ終結シグナルの制御下にある外来Ｄ ＮＡ分子を含んでおり、前記終結シグナルは、３′末端プロセシングＤＮＡ配列 がそこから除去されている請求項２９に記載の安定に形質転換された真核細胞。
36. ３６．２つ以上のｐｏｌＩＩＩプロモーターと２つ以上の外来転写可能ＤＮＡと を含んでおり、前記外来転写可能ＤＮＡの各々が前記ｐｏｌＩＩＩプロモーター の１つの制御下にある請求項１に記載の安定に形質転換された真核細胞。
37. ３７．その３′長末端反復（ＬＴＲ）内に導入されたキメラｔ−ＲＮＡを含むレ トロウイルスベクター。
38. ３８．前記キメラｔ−ＲＮＡがｐｏｌＩＩＩプロモーターと外来転写可能ＤＮＡ とを含んでおり、前記転写可能ＤＮＡが前記ｐｏｌＩＩＩプロモーターの制御下 にある請求項３６に記載のレトロウイルスベクター。
39. ３９．前記外来転写可能ＤＮＡが偽プライマーをコードする請求項３８に記載の レトロウイルスベクター。
40. ４０．前記外来転写可能ＤＮＡがリボザイムをコードする請求項３８に記載のレ トロウイルスベクター。
41. ４１．前記外来転写可能ＤＮＡがアンチセンスＲＮＡ分子をコードする請求項３ ８に記載のレトロウイルスベクター。
42. ４２．前記外来転写可能ＤＮＡがｍＲＮＡ分子をコードする請求項３８に記載の レトロウイルスベクター。
43. ４３．前記外来転写可能ＤＮＡがポリペプチドをコードする請求項３８に記載の レトロウイルスベクター。
44. ４４．前記外来転写可能ＤＮＡがウイルス調節配列をコードする請求項３８に記 載のレトロウイルスベクター。
45. ４５．前記外来転写可能ＤＮＡがＨＩＶ調節配列をコードする請求項３８に記載 のレトロウイルスベクター。
46. ４６．前記ＨＩＶ調節配列が、ＴＡＲと表記されるＨＩＶ調節配列である請求項 ４４に記載のレトロウイルスベクター。
47. ４７．前記ｐｏｌＩＩＩプロモーターが、ｔ−ＲＮＡまたはその突然変異体もし くは誘導体を含む請求項３８に記載のレトロウイルスベクター。
48. ４８．前記ｐｏｌＩＩＩプロモーターが、ヒトｔ−ＲＮＡまたはその突然変異体 もしくは誘導体を含む請求項３８に記載のレトロウイルスベクター。
49. ４９．前記ｐｏｌＩＩＩプロモーターが、ｔ−ＲＮＡｉｍｅｔまたはその突然変 異体もしくは誘導体を含む請求項３８に記載のレトロウイルスベクター。
50. ５０．前記ｐｏｌＩＩＩプロモーターが、植物ｐｏｌＩＩＩプロモーターまたは その突然変異体もしくは誘導体を含む請求項３８に記載のレトロウイルスベクタ ー。
51. ５１．前記ｐｏｌＩＩＩプロモーターが、動物ｐｏｌＩＩＩプロモーターまたは その突然変異体もしくは誘導体を含む請求項３８に記載のレトロウイルスベクタ ー。
52. ５２．前記外来転写可能ＤＮＡが、細胞内で遺伝子の発現を阻害する分子をコー ドする請求項３８に記載のレトロウイルスベクター。
53. ５３．前記アンチセンスＲＮＡ分子が、病原体によってコードされるＲＮＡのセ グメントに相補的であるＲＮＡ分子を含む請求項４１に記載のレトロウイルスベ クター。
54. ５４．前記病原体によってコードされるＲＮＡがｍＲＮＡを含む請求項５３に記 載のレトロウイルスベクター。
55. ５５．前記病原体がヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）を含む請求項５３に記載の レトロウイルスベクター。
56. ５６．前記外来転写可能ＤＮＡが、ＲＥＶと表記されるＨＩＶ遺伝子の認識シグ ナルをコードする請求項３８に記載のレトロウイルスベクター。
57. ５７．前記外来転写可能ＤＮＡが、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子への結合を通し て作用する遺伝子発現の調節物質の認識配列をコードする請求項３８に記載のレ トロウイルスベクター。
58. ５８．前記レトロウイルスベクターが、Ｍ−ＭｕＬＶと表記されるマウスレトロ ウイルスを含む請求項３８に記載のレトロウイルスベクター。
59. ５９．前記レトロウイルスベクターが、Ｎ２と表記されるレトロウイルスを含む 請求項３８に記載のレトロウイルスベクター。
60. ６０．前記レトロウイルスベクターが、ＤＣＴ５Ａと表記されるレトロウイルス を含む請求項３８に記載のレトロウイルスベクター。
61. ６１．前記レトロウイルスベクターが、ＤＣＴ５Ｂと表記されるレトロウイルス を含む請求項３８に記載のレトロウイルスベクター。
62. ６２．前記レトロウイルスベクターが、ＤＣＴ５Ｃと表記されるレトロウイルス を含む請求項３８に記載のレトロウイルスベクター。
63. ６３．前記レトロウイルスベクターが、２つ以上のｐｏｌＩＩＩプロモーターと ２つ以上の外来転写可能ＤＮＡとを含んでおり、前記外来転写可能ＤＮＡの各々 が前記ｐｏｌＩＩＩプロモーターの１つの制御下にある請求項３７に記載のレト ロウイルスベクター。
64. ６４．請求項２０に記載の安定に形質転換された動物細胞を含むトランスジェニ ック動物。
65. ６５．請求項２１に記載の安定に形質転換された哺乳動物細胞を含むトランスジ ェニック哺乳動物。
66. ６６．請求項２３に記載の安定に形質転換されたニワトリ細胞を含むトランスジ ェニックニワトリ。
67. ６７．請求項２４に記載の安定に形質転換された哺乳動物細胞を含むトランスジ ェニック哺乳動物。
68. ６８．請求項２６に記載の安定に形質転換された植物細胞を含むトランスジェニ ック植物。
69. ６９．前記外来転写可能ＤＮＡが、病原体によってコードされるＲＮＡのセグメ ントに相補的であるＲＮＡ分子をコードする請求項６５に記載のトランスジェニ ック動物。
70. ７０．前記外来転写可能ＤＮＡが、病原体によってコードされるＲＮＡのセグメ ントに相補的であるＲＮＡ分子をコードする請求項６４に記載のトランスジェニ ック哺乳動物。
71. ７１．前記外来転写可能ＤＮＡが、病原体によってコードされるＲＮＡのセグメ ントに相補的であるＲＮＡ分子をコードする請求項６８に記載のトランスジェニ ック植物。
72. ７２．前記病原体がＨＩＶを含む請求項６９に記載のトランスジェニック動物。
73. ７３．前記外来転写可能ＤＮＡが、ＨＩＶ調節配列をコードする請求項６４に記 載のトランスジェニック動物。
74. ７４．前記ＨＩＶ調節配列が、ＴＡＲと表記されるＨＩＶ調節配列を含む請求項 ７３に記載のトランスジェニック動物。
75. ７５．前記トランスジェニック動物が哺乳動物である請求項７３に記載のトラン スジェニック動物。
76. ７６．請求項３７に記載のレトロウイルスベクターを含む遺伝子移入ベクターで あって、前記レトロウイルスベクターが２つ以上のｐｏｌＩＩＩプロモーターと ２つ以上の外来転写可能ＤＮＡとを含んでおり、前記外来転写可能ＤＮＡの各々 が前記ｐｏｌＩＩＩプロモーターの１つの制御下にある遺伝子移入ベクター。
77. ７７．有効免疫感作量の請求項４６に記載のレトロウイルスベクターと適当な担 体とを含む、患者をＨＩＶ感染に対して免疫にするのに有効なワクチン。
78. ７８．請求項１に記載の安定に形質転換された真核細胞を、転写可能ＤＮＡが転 写し得る条件下に培養し、それによって外来ＲＮＡを産生することを含む外来Ｒ ＮＡを産生する方法。
79. ７９．更に、このように産生された外来ＲＮＡ分子を回収することを含む請求項 ７８に記載の方法。
80. ８０．前記ＲＮＡ分子がアンチセンスＲＮＡを含む請求項７８に記載の方法。
81. ８１．前記ＲＮＡ分子がｍＲＮＡ分子を含む請求項７８に記載の方法。
82. ８２．請求項１に記載の安定に形質転換された真核細胞を、転写可能ＤＮＡがＲ ＮＡに転写され、前記ＲＮＡがポリペプチドに翻訳され得る条件下に培養し、そ れによってポリペプチドを産生することを含むポリペプチドを産生する方法。
83. ８３．更に、このように産生されたポリペプチドを回収することを含む請求項８ ２に記載の方法。
84. ８４．患者に請求項４６に記載のレトロウイルスベクターを投与することを含む 、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）患者を治療する方法。
85. ８５．患者に請求項４６に記載のレトロウイルスベクターを投与することを含む 、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）患者を治療する方法。
86. ８６．患者に有効免疫感作量の請求項７７に記載のワクチンを投与することを含 む、患者をＨＩＶ感染に対して免疫にする方法。
87. ８７．ａ）患者から造血幹細胞を採取し、ｂ）採取した前記造血幹細胞を、有効 量の請求項４６に記載のレトロウイルスベクターで感染し、ｃ）前記レトロウイ ルス感染した造血細胞を患者に注入して戻し、患者をＨＩＶ感染に対して細胞内 免疫にすることからなる、患者をＨＩＶ感染に対して細胞内免疫にする方法。