JPH09505984A

JPH09505984A - 遺伝子座制御領域の制御下のウイルスｄｅｃｏｙタンパク質の発現およびその使用

Info

Publication number: JPH09505984A
Application number: JP7509661A
Authority: JP
Inventors: キングドンクレイグ，ロジャー; ジェラルダスグロスベルト，フランクリン; ドジェルザク，エレイン; アブラハム，デイビッド
Original assignee: セレクシスリミテッド; メディカルリサーチカウンセル
Priority date: 1993-09-24
Filing date: 1994-09-26
Publication date: 1997-06-17
Also published as: WO1995008635A1; CA2172073A1; EP0725830A1; AU7702694A; AU697095B2; GB9319772D0

Abstract

(57)【要約】核酸を宿主生物に送達するための組換え核酸ベクターであって、ウイルス遺伝子産物の転写優性ネガティブ変異体をコードする転写単位を含み、該遺伝子産物は、ウイルスにより通常感染された細胞で活性なDNA配列の制御下で、該宿主におけるネガティブな生物学的影響を実質的に避けるように選択され、そして該DNA配列は、該構成単位の、構成組織特異的であり、組込部位非依存性であり、コピー数依存性である発現を与えるに有効である、組換え核酸ベクターが記載される。

Description

【発明の詳細な説明】遺伝子座制御領域の制御下のウイルスDECOYタンパク質の発現およびその使用本発明は、健康な個体に投与されるときに、保護効果を有する抗ウイルス治療剤に関する。特に、本発明の薬剤は、変異HIV遺伝子産物であり得る。序ヒト免疫不全ウイルス(HIV)は、ヒト後天性免疫不全症候群(AIDS)の病因として同定されている(Barre-Sinoussiら、1983；Galloら、1984)。通常の治療戦略は、抗ウイルス薬物(例えば、AZT)および予防ワクチンの開発に集中してきた。しかし、細胞内の免疫化アプローチ(Baltimore、1988)は、HIV複製の抑制のための分子戦略の発展を導いた(Malimら、1989、Tronoら、1989、Sczakielら、1991 、Sullengerら、1990)。インビボでの細胞特異的治療の分子系が開示されており、これにより、毒性産物をコードする遺伝子は、その発現において、特定の細胞のみに活性的遺伝子の調節領域により制御され得る。細胞特異的切除治療における最初の研究は、水晶体(Breitmanら、1987；Lande lら、1988)または下垂体特異的プロモーター(Behringerら、1988)の制御下のジフテリアトキシンＡ(diphtheria toxin A)またはリシンＡ(ricin A)鎖遺伝子のような細胞障害物質を利用してきた。マウス胚へのマイクロインジェクションおよびトランスジェニック動物の作出の後、これらの構築物により、水晶体または下垂体細胞のいずれかの破壊が生じた。しかし、これらのトキシン遺伝子は、漏出プロモーター要素と関連づけられるとき、構成細胞致死率ならびにジフテリアトキシンおよびリシントキシンに対する哺乳類細胞の極度の感受性のために、体細胞治療(somatic therapy)に適切ではない。ヒト切除治療に使用可能な融通性のトキシンコード化遺伝子が開示されている (Borelliら、1988)。単純ヘルペスウイルス１型チミジンキナーゼ(tk)遺伝子産物は、条件細胞致死性であり、そしてヌクレオシド類似物（例えば、アシクロビル(ACV)またはガンシクロビル(GCV)）の存在下のみで哺乳類細胞に毒性が示されている。これらの類似物は、tk遺伝子産物に対して高親和性を有し、そして内因性哺乳類tkに対して親和性が殆どないかまたは全くないため、周期細胞(cycling cell)を積極的に殺す。モデル系は、tkトランスジェニックマウスの抗ヘルペス剤治療によるインビボリンパ球特異的致死を示した(Borelliら、1988、Heymanら、1989)。条件毒性の特異性は、リンパ系特異的転写制御要素および定量柔軟性がtk導入遺伝子発現および／または投与される薬物用量のレベル内に固有であることに起因する。これらの研究中で薬物を外すと、成熟なリンパ球は正常数に回復する。それゆえ、インビボ切除系は再現的で、可逆的であり、そして幹細胞に影響を与えない。しかし、優れた切除系でも、抗ウイルス治療には欠点がある。特に、この系の合理性は、ウイルス感染細胞の破壊に依存することにより損なわれる。これは、ウイルス複製、ウイルスの病原作用を防ぐにもかかわらず、HIVの場合では、Ｔリンパ球の破壊が実際には活性化される。従って、切除系は、樹立感染の場合に適応できないようであり、そしてウイルスにより感染された実質的に全ての細胞に到達することに依存しなければならない。抗HIV治療における使用の他の可能な系は、decoy(わな)遺伝子のHIV感染に対して感受性の細胞での発現を包含する。 Decoy遺伝子は、HIVウイルスの複製に含まれる天然タンパク質に対するアンタゴニストとして作用するタンパク質をコードする。例えば、Decoy遺伝子は、宿主またはウイルスゲノムのトランスアクチベーター(transactivator)応答部位には結合し得るが、転写活性化し得ないトランスアクチベータータンパク質の欠損変異体をコードする。転写優性変異(transdominant mutation)は、野生型タンパク質の標的遺伝子を転写活性化する能力を失わせるかまたは弱める多くのウイルストランスアクチベーターにおいて報告されている。例には、E1A(Glenら、1987)、tax(Wachsmanら、1987)、およびVM65(Friedmanら、1988)の優性変異が挙げられる。HIV遺伝子における同様の変異は、Tatトランスアクチベーター(Pearsonら、1990)およびRev トランスアクチベーター(Bevacら、1992；Malimら、1992)について記載されている。 HIV感染細胞系中のこのような変異タンパク質の発現は、天然トランスアクチベーターとの競合およびこれによる転写活性化活性の損失をもたらす。例えば、国際特許出願第WO9014427号(Sandoz)を参照せよ。Decoy遺伝子アプローチの使用の考えられる欠点は、decoyが感染ウイルスの非存在下で発現されるとき、宿主にネガティブな生物学的影響が及ばされ得ることである。例えば、宿主免疫応答が、decoy遺伝子産物の産生から生じ得、これにより、例えば、細胞障害性Ｔリンパ球(CTL)により宿主細胞の破壊に至る。さらに、注意されるのは、decoyタンパク質が病原生物の生物学的に活性な遺伝子産物に由来し、そしてこれにより、宿主に対して不利な影響を及ぼす。例えば、HIV nef遺伝子産物の特定の対立遺伝子変異体は、胸腺細胞におけるCD4発現を降下制御(downregulate)し、そしてトランスジェニックマウス中のCD4⁺胸腺細胞の数を減少させることが示されている(本出願人らの同時係属中の英国特許出願第9305759.4号およびGuyら、1990を参照せよ)。これらの欠点を避けるために、decoy遺伝子産物の転写および発現は、例えば、HIV遺伝子産物によって転写活性化されるdecoy発現のための転写活性化可能な発現系を用いることにより、HIVによって実際に感染された細胞に限定されるべきであることが示唆されている(WO9011359号を参照せよ)。しかし、decoy遺伝子産物がHIV感染後の細胞でしか発現しないので、ウイルス複製を首尾よく阻止するためには、かなり過剰なdecoy遺伝子産物が必要とされる。なぜなら、ウイルスは有効なヘッドスタート(head start)を有するからである。感染細胞における大量のdecoyの産生は、このような細胞に対して上記のネガティブな生物学的影響を引き起こすようであり、これにより、感染細胞の死亡または無能化および先に議論された切除系の付随する欠点をもたらす。先行技術で提案されていない他のアプローチは、HIV感染に感受性の細胞においてネガティブな生物学的影響を引き起こさないdecoyタンパク質の構成性発現を保証することである。遺伝子座制御領域(LCR)は、遺伝子転移アプローチにおいて、遺伝子の位置非依存性でコピー数依存性の発現を与える要素である。これらはまた、クローン化された遺伝子の高レベルの発現を可能にし、そして組織特異性を有することが示されている。グロビン遺伝子(Grosveldら、1987)で初めて発見されたこれらの要素は、細胞ゲノムのクロマチン構造中の独立した制御ドメインの作出を管理し、これにより、同時移入遺伝子の活性を保証すると考えられる。グロビン遺伝子以外の多くのLCRが記載されており、これらには、例えば、Ｔリンパ球中のCD2遺伝子(Greavesら、1989)およびマクロファージ中のリゾチーム遺伝子(Boniferら、1990)およびＢ細胞(ヨーロッパ特許出願第460042号を参照せよ)がある。 HIV感染の標的は、主としてCD4⁺Ｔリンパ球であるが、マクロファージ、およびマクロファージに関連し、免疫応答を開始させる際に重要である樹状細胞も包含する(McCune、1991に概評される)。これらの細胞は、共通の造血幹細胞に由来しかつHIV感染に感受性であることを除いて、共通の特徴が非常に少ない。造血細胞幹細胞は、HIVによって感染されない(Molinaら、1990;Davidら、1991)。本発明者らは、CD2 LCRの制御下にあるdecoy遺伝子をコードする転写単位を幹細胞に挿入することにより、このdecoyの構成性発現が、有害な特性が低いdecoy 遺伝子の選択により、宿主に対して不利な影響を及ばせずにトランスジェニックマウスのＴリンパ球で達成され得、そして生殖細胞系を継体し得ることを決定した。従って、本発明の第１の局面によれば、宿主生物への核酸の送達のための組換え核酸ベクターが提供され、このベクターは、ウイルス遺伝子産物の転写優性のネガティブ変異体をコードする転写単位を含み、この転写単位は、ウイルスにより通常感染される細胞で活性なDNA配列の制御下でネガティブな生物学的影響を実質的に避けるように選択され、このDNA配列は、この転写単位の構成組織特異的であり、組込み部位非依存性であり、コピー数依存性である発現を与えるのに有効である。「ネガティブな生物学的影響を実質的に避ける」とは、本発明に使用されるde coyは、宿主細胞に取るに足りない程度の副作用(この副作用は、治療状況で安全に無視され得る)しか引き起こさないように選択され、または特異的に改変され、または、好ましくは副作用を全く有しないことを示すことが意図される。このネガティブな生物学的影響は、細胞機能の生物学的損傷または上記のようなCTL 応答の上昇あるいはその両方であり得る。「細胞機能の生物学的損傷」とは、患者に対してネガティブ影響を有し得る宿主細胞に対する生物学的影響(例えば、CD4の降下制御)を示すことが意図される。いくつかの場合では、この宿主細胞は、ウイルスの病理学的活動と同様の様式で、decoyにより影響され得る。他の場合では、decoyタンパク質は、ウイルス感染と通常関連しないが、構成的に発現された外来タンパク質と関連するとき好ましくない影響を有し得る。例えば、ウイルスがHIVである場合、decoyは、とりわけ、宿主の免疫機能の損傷を避けるように選択される。免疫機能の損傷は、nefの特定の対立遺伝子変異体についてインビトロで確認された(Guyら、1990)。これらの結果は、インビボで、本出願人らの同時係属中の英国特許出願第9305759.4号において補強されている。この出願は、nef発現が、CD4降下制御およびトランスジェニックマウスのCD4⁺Ｔ細胞の数の減少における役を果たし得ることを示す。CD4降下制御およびCD4⁺Ｔ細胞の損失は、HIV感染およびエイズ(AIDS)と関連する病理学的特徴の１つである。 SIVタンパク質に対するCTL応答は、SIV感染マカク(Venetら、1992)およびヒトレトロウイルス感染(Kannagiら、1983；Mitsuyaら、1983；Autranら、1991；Nix onおよびMcMichael、1991)で観察された。Nef抗原およびRev抗原に対するCTL応答は強い。しかし、Tat抗原に対するCTL応答は、まれであり、そして非常に弱いと思われる(Lamhamedi-Cherradiら、1992)。本発明者らは、HIV tat遺伝子産物がトランスジェニックマウスの細胞機能を損傷しないことを示した。従って、このtat遺伝子産物は、細胞機能の損傷を殆どまたは全く示さないようであるが、同時にCTL誘導活性が非常に低い。従って、好ましくは、本発明は、Tat decoyの構成性発現を含む。本発明は、さらに、tatにより示される所望の特性（すなわち、実質的なネガティブ生物学的影響を有しない）を有する、他の天然decoy遺伝子産物の使用を提供する。あるいは、本発明は、ネガティブな生物学的応答の発生率および強さを低減させるように特異的に変異させたdecoy遺伝子産物の使用を提供する。これは、例えば、decoy遺伝子産物の特定のドメインの変異または欠失により達成され得る。例えば、decoy遺伝子産物の細胞損傷効果は、この遺伝子における点突然変異の導入により低減され得るか、または除去され得る(Guyら、1990を参照せよ)。例えば、本発明者らは、トランスジェニックマウスでは、CD2 LCRの制御下のT at遺伝子産物の発現が、特定のサイトカイン、すなわち、TGF-β、IL4レセプターおよびTNF-βをコードするmRNAのレベルを３倍増加させることを示した。対照的に、そのエフェクター機能を失わせる点突然変異を含む変異Tat遺伝子産物が使用されるときに、サイトカインmRNAレベルは影響されない。従って、変化されたTat遺伝子産物が本発明に有利に使用される。タンパク質に対するCTL応答は、提示HLA分子への結合に関与する特定の残基に変異を導入すること、またはＴ細胞レセプターと相互作用させることのいずれかにより改変され得る(Choppinら、1992；1991a、b；Gotchら、1988を参照)。さらに、タンパク質を修飾して、細胞によるその分解速度を低下させ、それにより、このタンパク質由来の抗原の提示の発生率を低下させることが可能である(McMic haelら、1977；Bachmairら、1986；Townsendら、1988；Morrisonら、1992)。 HIVはインビボでCTL応答を避けるように自然変異すること、およびアミノ酸変化の部位は、異なる患者において、少なくとも特定の程度は保存される傾向があることが示された(Phillipsら、1991)。従って、好ましくは、本発明のdecoyは、低下されたCTL応答を示す、天然に由来のHIV単離物に従って変異させられ得る。しかし、CTL応答は、存在する抗原提示分子の変化によって、個体間で変化することが指摘されるべきである。従って、いくつかの一般的変異が共通のHLAタイプにより引き起こされるCTL応答を低減するように行われ得るが、特定の個体が、CTL誘導活性が低いと考えられるdecoyに対してもCTL応答を示し得る可能性が残る。この場合、本発明は、個体ベースでdecoyを変異させて、この個体におけるCTL応答を低減させるかまたは除去する手段を提供する。「転写優性ネガティブ変異体」とは、そのウイルス類似物によりも機能的に転写優性とされ、そしてこのウイルス類似物の活性をブロックするのに有効である遺伝子産物を意味すると意図される。従って、この用語は、機能的に解釈され、そしてこの用語の通常の意味での、改変されたアミノ酸配列を有する変異体ならびに代替的プロセスまたはスプライスされた変異体および発現パターンが野生型タンパク質とは異なる変異体を含む。例えば、HIVのNef遺伝子産物は、過剰に発現されるとき、転写優性インヒビターとなることが知られている。従って、過剰産生のNefタンパク質は、用語「転写優性ネガティブ変異体」に含まれる。構成的発現は、本発明の特定の利点を与え、これは、健常細胞中のdecoy遺伝子の存在が感染ウイルスの樹立を有効に防ぐことである。decoy遺伝子がウイルスによる感染の後に活性化されるならば、decoyがいずれの有意な抗ウイルス影響を及ぼす前に、このウイルスが樹立され得る可能性がある。本発明のベクターの転写単位を制御するDNA配列は、好ましくは遺伝子座制御領域(LCR)である。当該分野では、多くのLCRが記載されており、そして適切なLC Rの選択は、当業者の能力の範囲にある。しかし、HIV感染の治療の場合では、CD 2およびマクロファージ特異的リゾチームLCRの使用が好ましい。CD2 LCRが活性的であるＴ細胞、およびマクロファージの両方が、HIV感染のための標的である。 LCRに加え、本発明のベクターは、標的組織タイプで構成的に活性であるプロモーターを備えている。例えば、標的化される細胞がＴ細胞である場合、CD2プロモーターが使用され得る。しかし、このプロモーターは、標的組織以外の細胞で活性であり得る。このような場合、非標的細胞では高レベル発現が起こりそうもない。なぜなら、LCRがこれらの細胞で不活性であるからである。特定の量の非特異的発現細胞が存在する場合でさえ、このような発現は、ネガティブな生物学的を避けるように遺伝子産物が選択されるので、有害にならない。いずれの場合でも、非特異的発現は、本発明のベクターを送達する有効なベクター標的化技法の使用により最小限化され得る。核酸ベクターは、細胞に核酸を送達し得るいずれのベクターであり得る。例えば、このベクターは、プラスミド、ウイルス、または線状DNAフラグメントであり得る。ベクターは、露出状態(naked)であり得るか、タンパク質と複合化体され得るか、あるいはリポソーム、ウイロソーム、またはレセプター介在複合体のような送達システムにパッケージされ得る。本発明のベクターは、好ましくは、幹細胞のトランスフェクションにおいて使用である。そこからの幹細胞では、本発明のさらなる利点は、decoyが特定の系統の全ての細胞で発現されることである。ベクターがHIV decoyをコードするとき、幹細胞は造血幹細胞であり得る。あるいは、Ｔ細胞が直接標的化され得る。Ｔ細胞の標的化は、例えば、HIV感染が既に樹立されているが、ウイルスが未だ末梢Ｔ細胞集団に伝播していない場合に、所望である。この場合、このような細胞は、ウイルス感染から有効に保護され得る。幹細胞およびＴ細胞のトランスフェクションのための多くのプロトコールは当該分野で知られている。このうち、例えば、ヨーロッパ特許出願第0455482号および第0451611号に記載のような全細胞集団からの幹細胞の単離が挙げられる。幹細胞およびＴ細胞のトランスフェクションのための改良方法は、本出願人らの同時係属中の英国特許出願第9317380.5号に記載されており、この出願の開示は本明細書中で参考として援用されている。宿主生物は、哺乳類、昆虫、魚、植物またはウイルス性疾患からの保護を必要とする他の生物であり得る、好ましくは、宿主生物はヒトである。 decoyがTat decoyである場合、このdecoyは、当該分野で公知のプロトコールのいずれもに従って調製され得る。例えば、Pearsonら(1990)の方法は、転写活性化機能を欠いているが、tat領域に結合する能力を保持しているTatの欠失変異体を生成するために使用され得る。このような欠失変異体は、Pearsonらに記載のように、または本出願人らの同時係属中の英国特許出願第9305759.4号および国際特許出願WO90/14427に記載の方法に従い、decoy活性について試験され得る。このような変異体のいずれもの潜在毒性は、以下に記載の方法により試験され得る。このような変異体が患者でCTL応答を引き起こすことが分かったら、これらは、この応答を低減させるように、当該分野で公知の方法に従ってさらに変異され得る。 decoy遺伝子は、ヒトまたは他の生物(植物を含む)で感染を引き起こすあらゆるウイルスに由来し得る。しかし、特に好ましくは、Tat、Rev、またはNef deco yのようなHIV decoyである。 decoyは、本発明のベクターと戦うと意図されるので、同じウイルスに由来し得る。しかし、治療に意図されるもの以外のウイルスに由来するのdecoyが使用され得ることは想記される。例えば、HTLV1 Rex decoyがHIV1 Rev機能の抑制に活性であるが注目されている(Bohnleinら、1991)。さらに、特殊化されたdecoy タンパク質をコードする人工の全decoy遺伝子が設計され得ることが想記される。例えば、HIV Tatトランスアクチベーターのtar-結合ドメインのみか、または野生型Tatとの結合について有効に競合するtar-結合ドメインの類似物をコードする人工decoy遺伝子が設計され得る。本発明のベクターは、好ましくは、ウイルス性疾患の治療のために、インビボまたは半ビボでの患者の細胞のトランスフェクションにおいて有用である。従って、本発明の第２の局面によれば、治療における使用のために、本発明の第１の局面に従うベクターが提供される。「治療」とは、ウイルス感染の予防と希釈または除去との両方を示すことをが意図される。上記のように、本発明のベクターが、ウイルス感染の予防のために使用されるのが好ましい。なぜなら、これは、宿主におけるウイルス感染の樹立を避けるのに重要であると考えられるからである。しかし、本発明のベクターは、特にウイルス感染の早期段階では、ウイルス感染を希釈し、そして結果的に除去するのに有効な従来の治療的適用を有し得ることが直視される。好ましくは、本発明のベクターは、半ビボで幹細胞またはＴ細胞の処置のために使用される。従って、本発明の第３の局面では、半ビボで幹細胞またはＴ細胞の処置における使用のために、本発明の第１の局面に従うベクターが提供される。幹細胞またはＴ細胞は、上記の先行技術に記載の手順に従って単離され得る。あるいは、好ましくは、幹細胞またはＴ細胞は、例えば、本出願人らの同時係属中の英国特許出願第9317380.5号に記載されているような有効な標的化トランスフェクション技術を用いて標的化され得る。このような技術を用いると、患者から得られる、全血液中の幹細胞またはＴ細胞を極めて高い効率でトランスフェクトすることが可能である。本発明のさらなる局面によれば、以下の工程を包含する、ウイルス感染を治療または予防する方法が提供される：ａ）患者の体内から細胞を取り出す工程；ｂ）この細胞を、本発明の第１の局面のベクターに従うトランスフェクトする工程；およびｃ）この細胞を、患者の体内に戻す工程。好ましくは、細胞は幹細胞である。例えば、この細胞は、造血幹細胞である。あるいは、この細胞はＴ細胞であり得る。造血幹細胞およびＴ細胞は、患者の体内（例えば、臍帯血、末梢血または骨髄吸引液）から容易に取り出される。幹細胞のトランスフェクションは、上記で引用されるいずれものプロトコールにより行われ得る。トランスフェクトされた幹細胞は、一旦患者の体内に戻されると、通例の様式で分裂し、そして本発明のベクターに含まれる異種遺伝子を有する細胞系を患者に移植させる(populate)。従って、誘導された細胞系は、異種遺伝子により与えられる抗ウイルス能を保有する。本発明のさらに別の局面に従って、ウイルス性疾患の治療または予防において用いられる組成物の製造における、本発明のベクターの使用が提供される。好ましくは、この組成物は、本発明のベクターを、インビボまたは半ビボのいずれかでの細胞のトランスフェクションに用いられる適切な緩衝液中に含む。インビボで用いられる場合、緩衝液は、薬学的に受容可能な賦形剤、希釈剤、またはキャリアから本質的になる。半ビボでの使用については、緩衝液の性質は、用いられるトランスフェクションプロトコルにより決定される。例えば、本出願人らの同時係属中の英国特許出願第9317380.5号に記載の方法が用いられる場合、この出願に記載のような緩衝液が用いられる。本発明のさらに別の局面では、本発明のベクターによりコードされる転写単位を含む細胞が提供される。好ましくは、この細胞は幹細胞であり、そして有利には造血幹細胞である。あるいは、この細胞はＴ細胞であり得る。本発明は、ウイルス感染の治療または予防のための方法をさらに提供し、この方法は、薬学的に有効な量の組成物を患者に投与する工程を包含し、この組成物は、本発明のベクターを薬学的に受容可能な賦形剤、希釈剤、またはキャリアと混合して含む。本発明は、現在のところ、以下に説明するような図面を参照にしながら、以下の実施例において説明の目的にのみ記載される。図１は、CD2-Tat導入遺伝子の構造を表す模式図である。図２は、CD2-Tat導入遺伝子を有するトランスジェニックマウスにおけるTat D NAの同定を示す。図３ＡおよびＢは、CD2-Tat導入遺伝子を有するトランスジェニックマウスにおけるTat RNAの同定を示す。図４は、トランスジェニックマウスおよび非トランスジェニックマウス由来の胸腺組織のFACS分析を示す。図５は、トランスジェニックマウスおよび非トランスジェニックマウス由来の脾臓組織およびリンパ節組織のFACS分析を示す。図６は、トランスジェニックマウスにおけるサイトカイン遺伝子発現における Tat導入遺伝子の存在の影響を示す。図７は、Tyr47がAlaに変異された変異Tat導入遺伝子を有するトランスジェニックマウスの生成を示すスロットブロットである。図８は、変異TatがTNF-β遺伝子の発現において影響がないことを示すスロットブロットである。方法 CD2-Tatマウス Tatコーディング配列を含むDNAフラグメント（図１を参照のこと）は、p2629C D2発現プラスミド中のCD2遺伝子の第１エキソン中の独自のEcoR1部位に連結した。このプラスミドは、D．Kioussis博士、NIMR、Mill Hill，Great Britainから入手した。CD2 LCRを含む4.5kbフラグメントをp2694（これもまたKioussos博士から入手した）から単離し、そしてp2629の独自のBam H1−Not 1部位に連結した。次いで、CD2-Tat構築物を含む12kbのSal 1−Not 1フラグメントを切り出し、単細胞マウス胚に既に記載されているようにしてマイクロインジェクトした（Gr osveldら、1987）。ポジティブの創始動物を、CBAマウスとC57 BL/10マウスとを交配させることにより育種し、この系統を異型接合体として維持した。 DNAおよび発現分析創始動物由来のテイルDNA（10μｇ）を、HindIIIまたはAsp718での消化後サザンブロット分析により分析した。DNAを１％アガロース／トリス酢酸、EDTAゲル、上に流し、ニトロセルロース上でブロットし、そしてランダムにプライムした BamHI−SmaI Tatフラグメントでプローブした。1.2kbのThy-1.2フラグメントを、ローディングコントロールプローブとして用いた。 10μgのゲノムDNA中にスパイクされた適切な量のpCD2Tatをコピー数コントロールとして用いた。定量は、分子動力学ホスホルイメージャー（Molecular Dyna mics PhosphorImager）上で行った。 RNAを塩化リチウム／尿素法（Fraserら、1990）を用いて調製した。ノーザンブロット分析（Sambrookら、1989）のために、10μgのRNAを１％ホルムアルデヒドゲル上に流し、ニトロセルロース上でブロットし、そしてpTG1147由来の800bp のBamHI−SmaIのnefフラグメントでプローブした。RNAスロットブロット（Sambr ookら、1989）のために、５μgのRNAをニトロセルロース上にブロットし、そして上述のようにプローブした。Nef産生CRIP Lプロデューサー細胞株（Schwarts ら,1992）由来のRNAをポジティブコントロールとして用いた。実施例１トランスジェニックマウスにおけるCD2-Tatの発現 HIV-1 TAT遺伝子のエキソン１（アミノ酸１〜72をコードする）を、ヒトCD2遺伝子の第１エキソンの転写開始部位の下流に挿入した（図１および２）。停止コドンを、CD2タンパク質の生産を除去するように、ヒトCD2エキソン２の配列中に構築した。ヒトCDR LCR要素をこの構築物の3'末端に連結した。Sal1−Not1フラグメントを稔性化されたマウス卵に注入した。少なくとも３つのトランスジェニック系統を作出した。系統Ｃ（図３Ａの２）は70コピーを含み、そして系統Ｅ（図３Ａの４）は40コピーを含む。 S1ヌクレアーゼRNA保護を、TATエクソン１プローブを用いて、トランスジェニックマウスおよび非トランスジェニックマウス由来の種々の組織で行った。図３Ｂに示されるように、胸腺のみがTATを高度に発現した。脾臓はTATを低レベルでのみ発現した。トランスジェニックマウスの腎臓または肝臓あるいはコントロールの非トランスジェニックマウスのいずれもの組織においては、発現は見られなかった。 CD4およびCD8のＴ細胞サブセットがHIV-TATの過剰発現により影響を受けるかどうかを決定するために、抗体染色およびFACS分析をCD2-TATトランスジェニックマウス由来の胸腺細胞、脾臓細胞、およびリンパ節細胞で行った（図４および５）。単細胞懸濁液を、系統Ｃおよび系統Ｅのトランスジェニックマウス（それぞれサンプル３および４）およびそれらの非トランスジェニック同腹兄弟（サンプル１および２）から調製した。PE標識CD8抗体およびFITC標識CD4抗体を細胞とインキュベートし、FACS分析を行った。対プロットにおいて示されるように、トランスジェニックマウスの胸腺においては、二重ネガティブサブセット、二重ポジティブサブセット、または一重ネガティブサブセットの割合に変化は見られなかった。さらに、トランスジェニックマウスの脾臓またはリンパ節において、非トランスジェニックマウスに比較した場合、CD4またはCD8一重ポジティブサブセットの割合の変化は見られなかった。従って、HIV-TATの高レベルの発現は、リンパ系器官においてインビボでのサブセット分布に影響しなかった。 TNT-βのTAT誘導転写上昇制御は細胞障害性により測定される機能的TNF-βの過剰発現に至る。 TATトランスジェニック系統ＣおよびＥ由来のRNAのノーザンブロット分析は、 TNβ転写を2.3倍増大することを示した（図６Ａ）。このことによりTNF-βタンパク質生産の増大が生じたかどうかを試験するために、本発明者らは、TATトランスジェニックマウス（C+1、C+2、E+1、およびE+2）および非トランスジェニックマウス（C-およびE-）由来のＴ細胞の細胞溶解物を用いて細胞障害性アッセイを行った。各サンプル中のTNF-βタンパク質の活性等価物を既知のTNF-βタンパク質標準（単位において）に対して定量した。図６Ｂに示されるように、４つのトランスジェニックマウスの全てが、非トランスジェニックコントロールに比較して有意に高いレベルのTNF-β（２〜４倍）を生じた。サイトカイン遺伝子発現はHIV-TAT圧により影響される。ノーザンブロット分析をCD2-TATトランスジェニックマウス由来のRNAで行い、サイトカイン遺伝子発現における定量的差異について試験した（図６Ａ）。全mR NAを系統Ｃのトランスジェニックマウス（C+1およびC+2）および非トランスジェニック同腹兄弟（C-）の胸腺細胞ならびに系統Ｅのトランスジェニックマウス（ E+1およびE+2）および非トランスジェニック同腹兄弟（E-）の胸腺細胞から調製した。ホルムアルデヒドアガロースゲル上に、レーン当たり10μgのRNAを載せた。RNAをフィルターに移し、RNA定量コントロールとしてのβ-アクチンプローブと、そして導入遺伝子発現の確証のためにTATプローブとハイブリダイズさせた。フィルターを、サイトカイン遺伝子TGF-β、IL-4R、TNF-β、およびTNF-αに対するプローブと数回再ハイブリダイズさせた。ノーザンブロットのオートラジオグラムは、TATトランスジェニックマウスにおけるTGF-β、IL-4R、およびTNF- β遺伝子発現の発現増大を示す。しかし、TNF-αプローブとのハイブリダイゼーションシグナルは、TatポジティブマウスにおいてTNF-α遺伝子発現に変化がないことまたは減少していることを示唆する。このノーザンブロットの結果をホスホルイメージャーで定量し、そして倍数増減を算出した。表１に示されるように、シグナルをβ-アクチン定量コントロールに対して標準化した場合、TGF-β、IL-4R、およびTGF-βの定常状態mRNAはトランスジェニックマウスにおいて増加した。TGF-βレベルは平均して2.8倍増加し、IL-4Rレベルは3.5倍増加し、そしてTNF-βは2.3倍増加した。TNF-αレベルは約25％低下した。従って、胸腺細胞のTAT発現は、サイトカイン遺伝子発現において影響を有する。 RNA倍数変化は非トランスジェニック同腹兄弟に比較したものである。実施例２トランスジェニックマウスにおけるCD2-TAT（47ala）の発現 CD2プロモーターおよびLCR要素および47位アミノ酸がチロシンからアラニン（ 47 Tyr−−→Ala）に変換されたHIV-1 TAT遺伝子の変異形態エキソン１（アミノ酸１〜72をコードする）を含む12kbのSalI−NotIフラグメントを、稔性化されたマウス卵中に注入した。図７に示されるように、３つのトランスジェニッック創始動物を作出した（系統Ａ６、Ａ７、およびＡ８）。０〜50の導入遺伝子コピー数コントロール（レーンＢ）と比較して、これらの創始動物は８コピーと25コピーとの間の導入遺伝子を含んだ。胸腺Ｔ細胞サブセットが変異形態のHIV-TAT（47ala）の発現により影響を受けるかどうかを決定するために、抗体染色およびFACS分析をCD2-TAT（47ala）トランスジェニックマウス由来の胸腺細胞において行った。単細胞懸濁液をマウスＡ６および非トランスジェニック動物Ａ４から調製した。PE標識CD8抗体およびFIT C標識CD4抗体を細胞とインキュベートし、FACS分析を行った。表２に示されるように、トランスジェニックマウスまたは非トランスジェニックマウスのいずれかに由来の全胸腺細胞数において変化は見られなかった。さらに、トランスジェニック由来の胸腺において、非トランスジェニックマウスと比較したところ、CD4 またはCD8細胞の二重ネガティブ（DN）、二重ポジティブ（DP）、または一重ポジティブ（SP）の相対的割合において差異は観察されなかった。サイトカイン遺伝子発現（TNF-β）は変異HIV-TAT（47ala）の存在によって影響を受けない。 RNAスロットブロット分析をCD2-TAT（47ala）トランスジェニックマウス由来のRNAで行い、サイトカイン遺伝子発現の定量的差異について試験した（図８）。全RNAを、CD2-TAT（47ala）トランスジェニックマウスA.6およびA.7、２つの非トランスジェニックコントロールA.4およびA.5、ならびに２つのトランスジェニックマウス（一方は系統Ｃ（c.1）由来であり、そして他方は野生型HIV-TATを有する系統E（E.1）由来である）由来の胸腺細胞から調製した。２組の10μgのR NAサンプルを変性させ、フィルター上に載せ、RNA定量コントロールとしてのβ- アクチンプローブとハイブリダイズさせ、そして次いでサイトカインTNF-βに対して特異的なプローブとハイブリダイズさせた。RNAブロットのオートラジオグラフは、野生型HIB-TATを含むトランスジェニックマウスにおいてはTNF-βの発現の増大が見られるが、変異HIV-TAT（47ala）を含むマウスにおいてはTNF-βの発現の増大が観察されないことを示す。このRNAスロットブロットの結果をホスホルイメージャーで定量し、そしてサイトカイン遺伝子発現の倍数変化を決定した。表３に示されるように、シグナルを内部定量コントロールβ-アクチンに対して標準化した場合、TNF-βの定常状態mRNAを系統Ｃおよび系統Ｅにおいて評価したが、変異HIV-TAT（47ala）トランスジェニックマウスにおけるこのサイトカインの発現において増大はなかった。従って、変異HIV-TAT（47ala）の発現は、TNF-βサイトカイン発現において影響がない。 RNA倍数変化は非トランスジェニックマウスに比較したものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｎ 5/10 9051−4ＣＡ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者クレイグ，ロジャーキングドンイギリス国シーダブリュー11 ０エックスエイチェシアー，サンドバッチ，スモールウッド，スペングリーン，ジュビリーハウスファーム（番地なし) (72)発明者グロスベルト，フランクリンジェラルダスオランダ国エヌエル―3065 エヌエルロッテルダム，ヤコブスバンベッセンシンゲル９ (72)発明者ドジェルザク，エレインイギリス国エヌダブリュー５２ジェイワイロンドン，パッツヒルロード 40 (72)発明者アブラハム，デイビッドイギリス国エムイー20 ６イーエヌケント，メイドストーン，ディットン，セダークローズ 12

Claims

【特許請求の範囲】１．核酸を宿主生物に送達するための組換え核酸ベクターであって、ウイルス遺伝子産物の転写優性ネガティブ変異体をコードする転写単位を含み、該遺伝子産物は、ウイルスにより通常感染された細胞で活性なDNA配列の制御下で、該宿主におけるネガティブな生物学的影響を避けるように選択され、そして該DNA配列は、該転写単位の、構成組織特異的であり、組込部位非依存性であり、コピー数依存性である発現を与えるに有効である、組換え核酸ベクター。２．前記宿主におけるCTL応答を避けるように選択されるウイルス遺伝子産物をコードする、請求項１に記載の組換え核酸ベクター。３．前記宿主における免疫損傷を避けるように選択されるウイルス遺伝子産物をコードする、請求項１または２に記載の組換え核酸ベクター。４．前記転写単位を制御するDNA配列が遺伝子座制御領域(LCR)を含む、前記請求項のいずれかに記載の組換え核酸ベクター。５．前記転写単位を制御するDNA配列が構成性活性プロモーターを含む、前記請求項のいずれかに記載の組換え核酸ベクター。６．標的細胞に対して特異的である、前記請求項のいずれかに記載の組換え核酸ベクター。７．前記標的細胞が造血幹細胞である、請求項４に記載の組換え核酸ベクター。８．前記標的細胞がＴ細胞である、請求項４に記載の組換え核酸ベクター。９．前記標的細胞がマクロファージである、請求項４に記載の組換え核酸ベクター。１０．前記転写単位が、HIV遺伝子産物の転写優性ネガティブ変異体をコードする、前記請求項のいずれかに記載の組換え核酸ベクター。１１．前記転写単位が、HIV Tat遺伝子産物の転写優性ネガティブ変異体をコードする、請求項８に記載の組換え核酸ベクター。１２．前記転写単位が、いかなるネガティブな生物学的影響をも低下させるようにさらに変異された転写優性ネガティブ変異体をコードする、前記請求項のいずれかに記載の組換え核酸ベクター。１３．前記転写単位が、サイトカイン遺伝子発現における影響を低下させるかまたは除去するように改変された転写優性ネガティブ変異体をコードする、請求項１２に記載の組換え核酸ベクター。１４．治療において用いられるための、前記請求項のいずれかに記載の核酸ベクター。１５．インビボにおける幹細胞、Ｔ細胞、またはマクロファージの処理において用いられるための、請求項１４に記載の核酸ベクター。１６．半ビボにおける幹細胞、Ｔ細胞、またはマクロファージの処理において用いられるための、請求項１４に記載の核酸ベクター。１７．ウイルス感染を治療または予防するための方法であって、以下の工程を包含する、方法：ａ）患者の体内から細胞を取り出す工程；ｂ）該細胞を請求項１から８のいずれかに記載のベクターでトランスフェクトさせる工程；およびｃ）該患者の体内に該細胞を戻す工程。１８．ウイルス感染を治療または予防するための方法であって、薬学的に有効な量の組成物を患者に投与する工程を包含し、そして該組成物は、請求項１から１３のいずれか一項に記載のベクターを、薬学的に受容可能な賦形剤、希釈剤、またはキャリアと混合して含む、方法。１９．ウイルス性疾患の治療または予防における使用のための組成物の製造における、請求項１から１３のいずれか一項に記載のベクターの使用。２０．請求項１から１３のいずれか一項に記載のベクターによりコードされる転写単位を含む細胞。２１．前記細胞が幹細胞である、請求項２０に記載の細胞。２２．前記細胞がＴ細胞である、請求項２０に記載の細胞。２３．前記細胞がマクロファージである、請求項２０に記載の細胞。