JPH10510995A - 胚細胞発現のためのレトロウイルスベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 レトロウイルスプラスミドベクターであって、骨髄増殖性肉腫ウイルスおよびポリオーマウイルスよりなるグループから選択されるウイルスから得られるエンハンサー領域、およびマウスレトロウイルスから得られるプライマー結合部位を含むレトロウイルスプラスミドベクター。このレトロウイルスプラスミドベクターは負の対照領域を含まない。ベクターは更にプロウイルスＬＴＲにあるシトシン残基の非メチル化をコード化する核酸配列を含む。このようなプラスミドベクターは胚幹細胞などの胚細胞で発現されるレトロウイルスベクター粒子の生成に特に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】 胚細胞発現のためのレトロウイルスベクター この発明はレトロウイルスベクターに関する。より詳細には、この発明は胚細 胞内および胚幹細胞内で改良された遺伝子発現を提供するレトロウイルスベクタ ーに関する。 発明の背景 レトロウイルスベクターにもとづくモロニーマウス白血病ウイルスが遺伝子治 療の目的で数多くの細胞に導入されてきた。しかしモロニーマウス白血病ウイル スＬＴＲは胚癌腫（ＥＣ）細胞系、胚幹（ＥＳ）細胞、および造血細胞に形質導 入されると不活性となり新規にメチル化されるということが観察された（リンネ イ、他、ネイチャー、３０８巻、４７０−４７２ページ（１９８４年）；ツキヤ マ、他、分子細胞生物学、９巻、４６７０−４６７６ページ（１９８９年））。 エンハンサーの不活性化は負に作用する細胞因子との相互作用により実現された （ニワ、他、細胞、３２巻、１１０５−１１１３ページ（１９８３年）；ゴーマ ン、他、細胞、４２巻、５１９−５２６ページ、９１９８５）；ワイハー、他、ウイルス学ジャーナル 、６１巻、２７４２−２７４６ページ、９１９８７）；ア クガン、他、ウイルス学ジャーナル、６５巻、３８２−３８８ページ（１９９１ 年）；ツキヤマ、他、分子細胞生物学、１２巻、１２８６−１２９１ページ（１ ９９２年））。一つのＬＴＲが骨髄増殖性肉腫ウイルス（ＭＰＳＶ）から分離さ れており（チリゴス、他、癌国際ジャーナル、３巻、２２３−２３７ページ、 １９６８年））、胚癌腫細胞において（セリジャー、他、分子細胞生物学、６巻 、２８６−２９３ページ（１９８６年）；ヒラリー、他、全米科学アカデミー紀 要 、８４巻、５２３２−５２３６ページ（１９８７年）；ワイハー、他、１９８ ７年；グレズ、他、ウイルス学ジャーナル、６５巻、４６９１−４６９８ページ （１９９１年））、また造血細胞において（オスタータグ、他、ウイルス学ジャ ーナル 、３３巻、５７３−５８２ページ（１９８０年）；ストッキング、他、全 米科学アカデミー紀要 、８２巻、５７４６−５７５０ページ（１９８５年）；ス トッキング、他、ウイルス学、１５３巻、１４５−１４９ページ（１９８６年） ；バウテル、他、分子生物学医学、４巻、２２９−２５０ページ（１９８７年） ）モロニーマウス白血病ウイルスＬＴＲよりもっと強く発現することが示された 。モロニーマウス白血病ウイルスおよび骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー反 復の間の根本的な差異は転写因子Ｓｐ１を結合するコンセンサス部位がＭＰＳＶ に存在することである。Ｓｐ１部位はメチル化があるにも拘らず機能することを 示し、モロニーマウス白血病ウイルスＬＴＲよりもＭＰＳＶ ＬＴＲを転写不活 性化により耐性にする原因となる。 他の負に作用するシス要素もモロニーマウス白血病ウイルス配列内で特徴づけ られている。ＬＴＲの５′末端に位置するそのような一つの要素は哺乳類型Ｃレ トロウイルスの９０％以上にある保存配列であり、負の対照領域すなわちｎｃｒ として引用される（フラナガン、他、ウイルス学および細胞生物学、９巻、７３ ９−７４６ページ（１９８９年））。ｎｃｒ配列は核 因子と結合することを示しており、これにより転写抑制を実現する（フラナガン 、他、ウイルス学および細胞生物学、１２巻、３８−４４ページ（１９９２年） ）。 も一つの阻害要素はモロニーマウス白血病ウイルスリーダー領域のプライマー 結合部位（ＰＢＳ）に位置する（ワイハー、他、１９８７年；フォイアー、他、ウイルス学ジャーナル 、６３巻、２３１７−２３２４ページ（１９８９年）；ロ ー、他、分子細胞生物学、７巻、３７７５−３７８４ページ（１９８７年）；タ ケト、他、ウイルス学ジャーナル、６３巻、４４３１−４４３３ページ（１９８ ９年））。モロニーマウス白血病ウイルスＰＢＳからの配列はＲＮＡ転写を阻害 する細胞因子に結合することにより作用する（ロー、他、分子細胞生物学、１０ 巻、４０４５−４０５７ページ（１９９０年）；ピータースン、分子細胞生物学 、１１巻、１２１４−１２２１ページ（１９９１年）；ケンプラー、他、ウイル ス学 、１８３巻、６９０−６９９ページ、（１９９３年））。内因性マウスレト ロウイルス、ｄ１５８７ｒｅｖがマウスゲノム配列から分離され、＋１６０の位 置でアデニンを含む新奇なＰＢＳ配列を含むことが発見された（コリセルリ、他 、ウイルス学ジャーナル、５７巻、３７−４５ページ（１９８７年））。レトロ ウイルス内でのｄ１５８７ｒｅｖ ＰＢＳの含有は野生型モロニーマウス白血病 ウイルスＰＢＳと比較して胚癌腫細胞内での発現の増加を可能にする（アクガン 、他、ウイルス学ジャーナル、６５巻、３８２−３８８ページ（１９９１年）； グレー、他、ウイルス学ジャーナル、６５巻、４６９１−４６９８ページ（１９ ９１年））。 加えてプロウイルスモロニーマウス白血病ウイルスＬＴＲ内のシトシンの広範 な新規のメチル化が胚幹細胞系およびＦ９胚癌腫細胞系で検出された（スチュワ ート、他、全米科学アカデミー紀要、７９巻、４０９８−４１０２ページ（１９ ８２年）；ニワ、他、（１９８３年））。遺伝子発現の抑制を実現するメチル化 の思いがけない役割はまだあいまいではあるけれども、メチル化は多くの異なっ た遺伝子の転写の遮断と関連してきている（シーダー、細胞、５３巻、３−４ペ ージ（１９８８年）；ボイエス、他、細胞、６４巻、１１２３−１１３４ページ （１９９１年））。 胚細胞内で発現を達成する修飾レトロウイルスベクターは広範な用途を持つで あろう。高い効率の形質導入および組込みのために、活性レトロウイルスベクタ ーは遺伝子を遺伝子導入マウスの生成のために胚幹細胞，胚幹細胞キメラに移転 するために、および胚成長の間に細胞標識研究において非常に有用な手段となる （ジェーニッシュ、サイエンス、２４０巻、１４６８−１４７５ページ（１９８ ８年）；セプコ、他、酵素学方法論、２２５巻、９３３−９６０ページ（１９９ ３年））。また胚細胞内で発現するレトロウイルス発現ベクターは更に造血幹細 胞での発現の向上を示し、これにより骨髄細胞を経由する遺伝子治療のために有 用な手段を提供する。 胚細胞にあるモロニーマウス白血病ウイルス転写単位に固有の不活性を克服す るレトロウイルスベクターを生産するために、努力が積み重ねられた。一つのア プローチは、一方ではレト ロウイルスＬＴＲをパッケージング細胞内の全長ウイルスゲノムを生産するため にのみ使用しながら、胚細胞内での遺伝子転写を実現するための内部プロモータ ーを用いてベクターを生産することであった（バウテル、他、ウイルス学ジャー ナル 、６２巻、２４６４−２４７３ページ（１９８８年）；ギルド、他、ウイル ス学ジャーナル 、６２巻、３７９５−３８０１ページ（１９８８年）；ソリアー ノ、他、ウイルス学ジャーナル、６５巻、２３１５−２３１９ページ（１９９１ 年））。しかしモロニーマウス白血病ウイルスエンハンサーおよびプライマー結 合部位は内部に位置する異種プロモーターにさえ負の効果をもたらすという証拠 がある（ゴーマン、他、細胞、４２巻、５１９−５２６ページ（１９８５年）； バウテル、他、（１９８８年））。も一つのアプローチは、骨髄増殖性肉腫ウイ ルス（ヒルバーグ、他、全米科学アカデミー紀要、８４巻、５２３２−５２３６ ページ（１９８７年））から、あるいは突然変異体ポリオーマウイルス（リンネ イ、他、ネイチャー、３０８巻、４７０−４７２ページ（１９８４年））からの エンハンサー、もしくはｄ１５８７ｒｅｖからのＰＢＳ（ワイハー、他、（１９ ８７年）；グレー、他、（１９９１年））などのモロニーマウス白血病ウイルス 配列を置換するために胚幹細胞内で活性である変異型要素のとり込みを含んでい た。これらのアプローチの成功は限定された。この成功の限定の理由はＬＴＲ内 もしくは近傍にある多重阻害要素の相互作用にある。かくして単一の修飾は転写 活性に対する障害を完全に克服するには十分ではない。 図面の簡単な説明 この発明はこれから図面と関連して説明されるであろう。ここで、 図１はプラスミドｐＧ１の構築戦略図である。 図２はｐＧ１プラスミドにある多重クローニング部位の配列である。 図３はプラスミドｐＧ１の地図である。 図４はプラスミドｐＮ２の地図である。 図５はプラスミドｐＧ１Ｎａの地図である。 図６はプラスミドＭＰ−ｎｅｏの地図である。 図７はプラスミドＭＰ−ｎｃｒ−ｎｅｏの地図である。 図８はプラスミドＭＰ−Ｔｈｙ−ｎｅｏの地図である。 図９はプラスミドｐＧＥＭ１１の地図である。 図１０はプラスミドＭＰ−ｄ１−ｎｅｏの地図である。 図１１はプラスミドＭＰ−ｎｃｒ−ｄ１−ｎｅｏの地図である。 図１２はプラスミドＭＰ−Ｔｈｙ−ｄ１−ｎｅｏの地図である。 図１３はレトロウイルスベクターのＬＴＲおよびリーダー領域に導入された修 飾の図である。 図１４はＬＮ−ｎｃｒ−ｎｅｏの地図である。 図１５はレトロウイルスベクターによるＮＩＨ ３Ｔ３細胞およびＦ９細胞へ の遺伝子移転効率に関する定量サザンブロット分析である。 図１６は安定形質導入ＮＩＨ ３Ｔ３およびＦ９細胞に関す るノーザンブロット分析である。 図１７ＡはサザンブロットによりＦ９細胞内でレトロウイルスベクターのメチ ル化分析に使用される制限酵素部位およびプローブの位置を示す修飾レトロウイ ルスベクターの図である。また、 図１７ＢはＢａｍＨＩおよび、ＥｃｏＲＶのみあるいはＥｃｏＲＶならびにＳ ｍａＩのいずれかで消化された安定形質導入Ｆ９細胞からのゲノムＤＮＡのサザ ンブロットである。 発明の詳細な説明 この発明の一つの見地に従って、骨髄増殖性肉腫ウイルスおよびポリオーマウ イルスよりなるグループから選択されるウイルスから得られるエンハンサー、お よびマウスレトロウイルスｄ１５８７ｒｅｖから得られるプライマー結合部位を 含むレトロウイルスプラスミドベクターが提供される。このレトロウイルスプラ スミドベクターは負の対照領域を含まない。 一つの実施例において、エンハンサー領域は骨髄増殖性肉腫ウイルスから得ら れる。も一つの実施例において、エンハンサー領域はポリオーマウイルスから、 とりわけポリオーマウイルスの突然変異体から得られる。ポリオーマウイルスの 突然変異体から得られるエンハンサーの例はバレリオ、他、遺伝子、８４巻、４ １９−４２７ページ（１９８９年）で詳細に説明されている。 一つの実施例において、レトロウイルスプラスミドベクターは更に非メチル化 をコード化する核酸配列を含む。一般に非メチル化をコード化する核酸配列はプ ロウイルスＬＴＲにあるシ トシン残基の非メチル化をコード化する核酸配列である。一つの実施例において 、非メチル化をコード化する核酸配列はマウスＴｈｙ−１遺伝子の５′上流領域 から得られる。 この発明のも一つの見地に従って、骨髄増殖性肉腫ウイルスおよびポリオーマ ウイルスよりなるグループから選択されるウイルスから得られるエンハンサー領 域、マウスレトロウイルスｄ１５８７ｒｅｖから得られるプライマー結合部位、 および非メチル化をコード化する核酸配列を含むレトロウイルスプラスミドベク ターが提供される。非メチル化をコード化する核酸配列は前記の通りのものであ る。 前記のレトロウイルスベクターが誘導されるレトロウイルスは、必ずしもそれ に限定されないが、モロニーマウス白血病ウイルス，脾臓壊死ウイルス、以下の ウイルスのレトロウイルス、例えばラウス肉腫ウイルス，ハーベイ肉腫ウイルス ，トリ白血症ウイルス，テナガザル白血病ウイルス，ヒト免疫不全ウイルス，骨 髄増殖性肉腫ウイルス、および乳癌ウイルスを含む。一つの実施例において、レ トロウイルスプラスミドベクターはモロニーマウス白血病ウイルスから誘導され る。 かくしてこの発明のも一つの見地に従って、モロニーマウス白血病ウイルスか ら誘導されるレトロウイルスプラスミドベクターが提供され、ここでモロニーマ ウス白血病ウイルスのＬＴＲのエンハンサー領域が除去され、骨髄増殖性肉腫ウ イルスおよびポリオーマウイルスよりなるグループから選択されるウイルスから のエンハンサー領域で置換された。またモロニーマウス白血病ウイルスのプライ マー結合領域は（ａ）突然変異され るかもしくは（ｂ）除去され、モロニーマウス白血病ウイルス以外のレトロウイ ルスから得られるプライマー結合領域で置換される。モロニーマウス白血病ウイ ルスの負の対照領域もまた欠失された。 モロニーマウス白血病ウイルスのプライマー結合部位はモロニーマウス白血病 ウイルスの塩基１４６から塩基１６３までの配列として定義される。ここで使用 される「突然変異される」という用語はモロニーマウス白血病ウイルスの天然プ ライマー結合部位の少くとも１個の塩基が異なった塩基に変更されたことを意味 する。 一つの実施例において、レトロウイルスプラスミドベクターは更に非メチル化 をコード化する核酸配列を含む。このような核酸配列は前記の通りマウスＴｈｙ −１遺伝子の５′上流領域から得られる。 も一つの実施例において、モロニーマウス白血病ウイルスのプライマー結合部 位が除去され、モロニーマウス白血病ウイルス以外のレトロウイルスから得られ るプライマー結合部位で置換される。一つの実施例において、モロニーマウス白 血病ウイルス以外のウイルスから得られるプライマー結合部位はマウスレトロウ イルスｄ１５８７ｒｅｖから得られる。 更にこの発明のも一つの見地に従って、モロニーマウス白血病ウイルスから誘 導されるレトロウイルスプラスミドベクターが提供され、ここでモロニーマウス 白血病ウイルスのＬＴＲのエンハンサー領域が除去され、骨髄増殖性肉腫ウイル スおよびポリオーマウイルスよりなるグループから選択されたウイルス からのエンハンサー領域で置換され、またモロニーマウス白血病ウイルスのプラ イマー結合部位は（ａ）突然変異され、あるいは（ｂ）除去され、モロニーマウ ス白血病ウイルス以外のレトロウイルスから得られるプライマー結合部位で置換 される。ベクターは更に非メチル化をコード化する核酸配列を含む。 一つの実施例において、モロニーマウス白血病ウイルスのプライマー結合部位 は除去され、モロニーマウス白血病ウイルス以外のレトロウイルスから得られる プライマー結合部位で置換される。このプライマー結合部位は前記の通りマウス レトロウイルスｄ１５８７ｒｅｖから得ることができる。 一つの実施例において、モロニーマウス白血病ウイルスから誘導されるレトロ ウイルスプラスミドベクターは、ベンダー、他、ウイルス学ジャーナル、６１巻 、１６３９−１６４９ページ（１９８７年）およびミラー、他、バイオテクニク ス 、７巻、９８０−９９０ページ（１９８９年）に記載の通り、ＬＮシリーズの ベクターから誘導することができる。このようなベクターはマウス肉腫ウイルス から誘導されるパッケージングシグナルの一部および突然変異ｇａｇ開始コドン を持つ。ここで使用される「突然変異」という用語は、ｇａｇタンパク質あるい は断片もしくはその切形が発現されないようにｇａｇ開始コドンが欠失あるいは 変化したことを意味する。 も一つの実施例において、レトロウイルスベクターは少くとも４個のクローニ ング、あるいは制限酵素認識部位を含み、ここで少くとも２個の部位は１０，０ ００塩基対で１回以下の真 核遺伝子平均出現頻度を持つ。すなわち制限産物は少くとも１０，０００塩基対 の平均ＤＮＡサイズを持つ。望ましいクローニング部位はＮｏｔＩ，ＳｎａＢＩ ，ＳａｌＩ、およびＸｈｏＩよりなるグループから選択される。望ましい実施例 において、レトロウイルスベクターはこれらクローニング部位のそれぞれを含む 。このようなベクターは更に１９９２年７月２３日に受理された合衆国特許出願 連続番号９１９，０６２号で説明されており、その全体が引用例としてここにと り込まれている。 このようなクローニング部位を含むレトロウイルスベクターが使用される時、 更にレトロウイルスベクターに位置するＮｏｔＩ，ＳｎａＢＩ，ＳａｌＩ、およ びＸｈｏＩよりなるグループから選択される少くとも２個のクローニング部位と 両立できる少くとも２個のクローニング部位を含むシャトルクローニングベクタ ーが提供される。このシャトルクローニングベクターは更にシャトルクローニン グベクターからレトロウイルスベクターに移転することのできる少くとも１個の 望ましい遺伝子を含む。 シャトルクローニングベクターはクローニングあるいは制限酵素認識部位を含 む１個もしくはそれ以上のリンカーを連結する基本「バックボーン」ベクターあ るいは断片から構築することができる。クローニング部位に含まれるものは前記 の両立可能あるいは相補クローニング部位である。シャトルベクターの制限部位 に対応する末端を持つ遺伝子およびもしくはプロモーターは従来既知の方法を通 じてシャトルベクター内に連結され る。 シャトルクローニングベクターは原核システム内でＤＮＡ配列を増幅するため に使用することができる。シャトルクローニングベクターは原核システムとりわ け細菌で一般に使用されるプラスミドから調製される。かくして例えば、シャト ルクローニングベクターはｐＢＲ３２２，ｐＵＣ１８などのプラスミドから誘導 される。 このベクターは１個もしくはそれ以上のプロモーターを含む。使用される適切 なプロモーターは必ずしもそれに限定されないが、レトロウイルスＬＴＲ，ＳＶ ４０プロモーター、およびミラー、他、バイオテクニクス、７巻、９号、９８０ −９９０ページ（１９８９年）に記載されたヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ ）プロモーター、あるいは他のいずれかのプロモーター（例えば必ずしもそれに 限定されないがヒストン，ｐｏｌ ＩＩＩ、およびβ−アクチンプロモーターを 含む真核細胞プロモーターなどの細胞プロモーター）を含む。使用される他のウ イルスプロモーターは、必ずしもそれに限定されないが、アデノウイルスプロモ ーター，チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター、およびＢ１９パルボウイルス プロモーターを含む。適切なプロモーターの選択はここに含まれる教訓から従来 の技術に習熟した人にとっては明らかであろう。 この発明のレトロウイルスベクターは更に治療薬をコード化する少くとも１個 の核酸配列を含む。「治療」という用語は一般的な意味で使用され、治療薬，予 防薬および置換薬を含む。 ここで使用される「核酸配列」という用語は、ＤＮＡあるいはＲＮＡ分子を意 味し、より詳細には隣接するペントースの３′および５′炭素の間のホスホジエ ステル結合で連結された線上シリーズのデオキシリボヌクレオチドあるいはリボ ヌクレオチドを意味する。ここのでの使用に依存し、このような用語は完全ある いは部分遺伝子配列を含み、また同じくポリヌクレオチドを含む。 治療薬をコード化する核酸配列は、必ずしもそれに限定されないが、ＴＮＦ− αなどの腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）遺伝子をコード化する核酸配列；インターフェ ロンα，インターフェロンβ、およびインターフェロンγなどのインターフェロ ンをコード化する遺伝子；ＩＬ−１，ＩＬ−１β、およびインターロイキン２か ら１５などのインターロイキンをコード化する遺伝子；Ｇ−ＣＳＦ，Ｍ−ＣＳＦ 、およびＧＭ−ＣＳＦをコード化する遺伝子；アデノシンデアミナーゼすなわち ＡＤＡをコード化する遺伝子；Ｚａｐ７０キナーゼ遺伝子；リンパ球の成長因子 であるリンホカインなどの細胞成長因子をコード化する遺伝子；グルコセレブロ シダーゼ遺伝子；表皮成長因子（ＥＧＦ）、およびケラチノサイト成長因子（Ｋ ＧＦ）をコード化する遺伝子；溶解ＣＤ４をコード化する遺伝子；β−グロビン 遺伝子；因子ＶＩＩＩ；因子ＩＸ；Ｔ細胞レセプター；α−イドゥロニダーゼ遺 伝子；ＬＤＬレセプター，ＡｐｏＥ，ＡｐｏＣ，ＡｐｏＡＩおよびコレステロー ル輸送および代謝に含まれる他の遺伝子；アルファ１抗トリプシン（ａ１ＡＴ） 遺伝子；オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）遺伝子；ＣＦＴ Ｒ遺伝子；インスリン遺伝子；例えば単純性ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子， サイトメガロウイルスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子、および水痘−帯状疱疹 ウイルスチミジンキナーゼ遺伝子などのウイルスチミジンキナーゼ遺伝子などの ような自殺遺伝子；抗体の抗原結合領域のためのＦｃレセプター；Ｂ型肝炎ある いは非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスの複製を阻害するアンチセンス配列などのウイルス 複製を阻害するアンチセンス配列；アンチセンスｃ−ｍｙｂオリゴヌクレオチド ；ＭＤＲ−１遺伝子などの多剤耐性遺伝子；および必ずしもそれに限定されない が、マンガンスーパーオキシドジスムターゼ（Ｍｎ−ＳＯＤ），カタラーゼ，銅 亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ（ＣｕＺｎ−ＳＯＤ），細胞外スーパーオキ シドジスムターゼ（ＥＣ−ＳＯＤ）、およびグルタチオン還元酵素などの抗酸化 剤；およびネオマイシン耐性（ｎｅｏ^R）遺伝子，β−ガラクトシダーゼ（ｌａ ｃＺ）遺伝子，クロラムフェニコール転移酵素（ＣＡＴ）遺伝子、およびＮＧＦ −Ｒ遺伝子などの選択マーカーを含む。 少くとも１個の治療薬をコード化する核酸配列は適切なプロモーターの制御下 にある。使用される適切なプロモーターは必ずしもそれに限定されないが、アデ ノウイルス主要後期プロモーターなどのアデノウイルスプロモーター；あるいは サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターなどの異種プロモーター；呼吸シ ンシチアルウイルス（ＲＳＶ）プロモーター；ＭＭＴプロモーター，メタロチオ ネインプロモーターなどの誘導プロモーター；熱ショックプロモーター；アルブ ミンプロモー ター；ＡｐｏＡＩプロモーター；ヒトグロビンプロモーター；単純性ヘルペスチ ミジンキナーゼプロモーターなどのウイルスチミジンキナーゼプロモーター；レ トロウイルスＬＴＲ（前記の修飾レトロウイルスＬＴＲを含む）；β−アクチン プロモーター；およびヒト成長ホルモンプロモーターを含む。プロモーターは治 療薬をコード化する遺伝子を制御する天然プロモーターであってもよい。しかし この発明の範囲は特異的な外部遺伝子あるいはプロモーターに制限されるもので ないことは理解されるべきである。 レトロウイルスプラスミドベクターは生産者細胞系を形成するためにパッケー ジング細胞系を形質導入するのに使用される。形質移入されるパッケージング細 胞の例は必ずしもそれに限定されないが、ＰＥ５０１，ＰＡ３１７，Ψ−２，Ψ −ＡＭ，ＰＡ１２，Ｔ１９−１４Ｘ，ＶＴ−１９−１７−Ｈ２，ΨＣＲＥ，ΨＣ ＲＩＰ，ＧＰ＋Ｅ−８６，ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２、およびＤＡＮ細胞系を含み、 それらはミラー、ヒト遺伝子治療、１巻、５−１４ページ（１９９０年）で説明 されており、その全体が引用例としてここにとり込まれている。ベクターは従来 既知のいずれかの方法を通じてパッケージング細胞を形質導入する。そのような 方法は必ずしもそれに限定されないが、電気穿孔法、前記記載のようなリポソー ムの使用、およびリン酸カルシウム沈殿を含む。一つの選択肢において、レトロ ウイルスプラスミドベクターはリポソーム内に被包され、あるいは脂質に結合さ れ、次いで同じく前記の通り宿主に投与される。 生産者細胞系は治療薬をコード化する核酸配列を含む感染性レトロウイルスベ クター粒子を生成する。このようなレトロウイルスベクター粒子は次いで試験管 内あるいは生体内のいずれかで真核細胞を形質導入するのに使用される。形質導 入真核細胞は治療薬をコード化する核酸配列を発現するであろう。形質導入真核 細胞は、必ずしもそれに限定されないが、胚幹細胞，胚癌腫細胞、同じく造血幹 細胞，肝細胞，繊維芽細胞，筋芽細胞，ケラチノサイト，内皮細胞、および気管 支上皮細胞を含む。 このようなレトロウイルスベクター粒子が真核細胞を試験管内で形質導入する のに使用される時、レトロウイルスベクター粒子は真核細胞を約０．００１から 約１０まで、望ましくは約１から約１０までの感染多重度（ｍｏｉ）で形質導人 する。形質導入真核細胞は次いで宿主に遺伝子治療手順の一部として投与される 。この細胞は哺乳類宿主，非ヒト霊長類宿主、あるいはヒト宿主である宿主に約 １×１０²から約１×１０¹¹細胞、望ましくは約５×１０⁴から約５×１０⁸細胞 、より望ましくは約５×１０⁶から約５×１０⁸細胞の量で投与される。真核細胞 の正確な用量は年齢，体重、および宿主の性，形質導入される細胞の型、ならび に治療される疾病あるいは疾患を含む各種の因子に依存する。 生体内で投与される時には、レトロウイルスベクター粒子は宿主に治療効果を 生むのに有効な量で宿主に投与される。一般に、レトロウイルス粒子は細胞当り １から約１０粒子の量で投与される。投与されるべき粒子の正確な用量は前記の 因子に依 存する。 この発明のレトロウイルスベクターは胚細胞、とりわけ胚幹細胞での形質導入 時に特に適用できる。例えばレトロウイルスベクターは遺伝子導入動物の生成の ための胚幹細胞，胚幹細胞キメラに遺伝子を移転するために使用することができ 、あるいは胚成長期間中の細胞標識研究で使用することができる。加えて胚細胞 で発現するレトロウイルスベクターは、造血幹細胞の発現の向上を示し、従って このようなレトロウイルスベクターは骨髄細胞を経る遺伝子治療に有用である。 この発明のレトロウイルスベクターは各種の疾病および疾患の治療に使用する ことができる。このような疾病あるいは疾患は必ずしもそれに限定されないが、 異常血色素症などの遺伝病；リソソーム蓄積症；代謝疾患；免疫不全；癌白血病 ；およびエイズを含む。 加えて、レトロウイルスベクター粒子は遺伝子治療処置の有効性を決定するた めに動物モデルに使用できる。このような動物モデルにおいて、治療薬をコード 化する遺伝子を含むレトロウイルスベクター粒子、あるいはそのようなレトロウ イルスベクター粒子で試験管内で形質導入された真核細胞は動物に投与される。 そのような投与に引き続き、動物は動物内で治療薬をコード化する遺伝子の発現 を検査される。このような検査から、ヒト患者に投与されるべきそのレトロウイ ルス粒子で形質導入されるレトロウイルス粒子あるいは真核細胞の量を決定する ことができる。 更にレトロウイルスベクター粒子は、前記の通り試験管内で 治療薬の試験管内生産のために真核細胞を形質導入することができ、この治療薬 は従来の技術に習熟した人に既知の方法により形質導入真核細胞の培養から得る ことができる。 実施例 この発明はこれから以下の実施例と関連して説明されるであろう。しかしこの 発明の範囲はそれにより限定されるものではない。 実施例１ ベクターの構築 Ａ．ｐＧ１Ｎａの構築 プラスミドｐＧ１はｐＬＮＳＸ（パーマー、他、血液、７３巻、４３８−４４ ５ページ）から構築され、引用例としてここにとり込まれた。プラスミドｐＧ１ の構築戦略は図１で示される。５′モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭｏＭｕＳＶ ）ＬＴＲを含む１．６キロベースＥｃｏＲＩ断片、および３′ＬＴＲ，細菌複製 起点およびアンピシリン耐性遺伝子を含む３．０キロベースＥｃｏＲＩ／Ｃ１ａ Ｉ断片が別々に分離された。７個のユニーククローニング部位を含むリンカーが 次いでそれ自身にＥｃｏＲＩ／Ｃ１ａＩ断片を閉じるために利用され、かくして プラスミドｐＧＯを生成した。プラスミドｐＧＯは５′ＬＴＲを含む１．６キロ ベースＥｃｏＲＩ断片をｐＧＯのユニークＥｃｏＲＩ部位に挿入することにより プラスミドｐＧ１（図３）を生成するために使用された。かくしてｐＧ１（図３ ）は、ＭｏＭｕＳＶから誘導される５′部分，真正ＡＴＧ出発コドンがＴＡＧに 突然変異されたｇａｇの短い部分（ベンダー、他、 １９８７年）、５′から３′までにＥｃｏＲＴ，ＮｏｔＩ，ＳｎａＢＩ， Ｓａ ｌＩ，ＢａｍＨＩ，ＸｈｏＩ，ＨｉｎｄＩＩ，ＡｐａＩ、およびＣ１ａＩの各部 位を含む５４塩基対多重クローニング部位（ＭＣＳ）、ならびに塩基対７７６４ から７８１３までのＭｏＭｕＬＶの３′部分（バン・ビバレン、他、コールド・ スプリング・ハーバー 、２巻、５６７ページ、１９８５年に記載された番号）で 構築されるレトロウイルスベクターバックボーンよりなり、引用例としてここに とり込まれている（図２）。ＭＣＳは、ｐＧ１プラスミド，ｎｅｏ^r遺伝子，β −ガラクトシダーゼ遺伝子，ヒグロマイシン^r遺伝子、およびＳＶ４０プロモー ターの非切断制限酵素部位の選別にもとづき最大数のユニーク挿入部位を生成す るように設計された。 「バックボーン」ベクターｐＧ１ＮａはｐＧ１およびｐＮ２から構築された（ アーメンターノ、他、ウイルス学ジャーナル、６１巻、１６４７−１６５０ペー ジ（１９８７年））。ｐＧ１ＮａはｐＮ２をＥｃｏＲＩおよびＡｓｕＩＩで切断 し（図４）、ｎｅｏ^R遺伝子を含むＥｃｏＲＩ／ＡｓｕＩＩ断片の末端に注入し 、ｐＧ１Ｎａを形成するためにこの断片をＳｎａＢＩ消化ｐＧ１に連結すること により構築された（図５）。 Ｂ．ＭＰｎｅｏ，ＭＰｎｃｒｎｅｏ，ＭＰｄ１ｎｅｏ，ＬＮｎｃｒｎｅｏ，ＭＰ ｔｈｙｎｅｏ，ＭＰｔｈｙｄ１ｎｅｏ、およびＭＰｎｃｒｄ１ｎｅｏの構築 骨髄増殖性肉腫ウイルス（ＭＰＳＶ）ＬＴＲ（ドイツ、ハンブルク、ハインリ ッヒーペッテ・インスティチューテ・ダブ リュ．オスタータークより提供されたもの）がＭＰｎｅｏを作るためにｐＧ１Ｎ ａの３′モロニーマウス白血病ウイルスＬＴＲと置換するため使用された。ｐＧ １Ｎａはモロニーマウス白血病ウイルス３′ＬＴＲを放出させるためＣ１ａＩ部 位（塩基対２３６６）およびＡｃｃＩ部位（塩基対３２４８）で切断された。Ｍ ＰＳＶからの３′ＬＴＲはＭＰ−ｎｅｏを作るためにｐＧ１ＮａのＣ１ａＩ−Ａ ｃｃＩ部位にクローンされた（図６）。負の対照領域（ｎｃｒ）はＮｈｅＩとし て（ＬＴＲのヌクレオチド３３で）ＭＰＳＶ ＬＴＲから（ＬＴＲ内のヌクレオ チド９７での）Ｓａｕ３ａ断片に移された。ＬＴＲの切断末端はＭＰｎｃｒ３′ ＬＴＲを作るためにクレノウＤＮＡポリメラーゼによる末端への注入後連結され 、これは次いでｐＧ１ＮａのＣ１ａＩ／ＡｃｃＩ部位にクローンされ、ＭＰｎｃ ｒｎｅｏを産出した（図７）。プラスミドブルースクリプト（ストラータジェン ）（カナダ、モントリオール、マッギル・ユニバーシティ、エム．シーフにより 提供されたもの）内のＴｈｙ−１断片は３′挿入後直ちにＳｍａＩ部位で開かれ 、合成ＸｂａＩ部位５′−ＣＴＣＴＡＧＡＧ−３′（マサチューセッツ、ビバリ ー、ニューイングランド・バイオラブス）が適所に連結された。Ｔｈｙ−１断片 は次いでＸｂａＩ／ＸｂａＩ断片として分離され、ブルースクリプトにあるＭＰ ＳＶ ＬＴＲのＮｈｅＩ部位にクローンされた。Ｔｈｙ−１置換ＭＰＳＶ ＬＴ Ｒ（ＭＰｔｈｙ）はＭＰｔｈｙｎｅｏを作るためにｐＧ１ＮａのＣ１ａＩ／Ａｃ ｃＩ部位にクローンされた（図８）。 ｐＧ１ＮａはＥｃｏＲＩで切断されたが、それは５′ＬＴＲ ，ｐｂｓ、およびリーダー（Ｐｓｉ）領域を含む断片を得るために塩基対１４６ ０および塩基対５３７５で切断された。この断片はｐＧＥＭ１１（プロメガ）に サブクローンされた（図９）。ｐｂｓはこのｐＧ１Ｎａ誘導断片からＫｐｎＩ／ ＳｐｅＩ断片として除去され、ｄ１５８７ｒｅｖからのＫｐｎＩ／ＳｐｅＩ ｐ ｂｓ断片で置換された。５′ＬＴＲおよびリーダー（Ｐｓｉ）領域は次いで酵素 ＥｃｏＲＩでＭＰ−ｎｅｏから除去され、ｄ１５８７ｒｅｖからのＫｐｎＩ−Ｓ ｐｅＩ断片を含む５′ＬＴＲ−リーダー領域のＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＩ断片で置 換された。これはプラスミドＭＰ−ｄＩ−ｎｅｏを産出した（図１０）。５′Ｌ ＴＲ，ｄ１５８７ｒｅｖ ｐｂｓ、およびリーダー領域を持つ同じＥｃｏＲＩ／ ＥｃｏＲＩ断片はＭＰ−ｎｃｒ−ｎｅｏおよびＭＰ−Ｔｈｙ−ｎｅｏのＥｃｏＲ Ｉ／ＥｃｏＲＩ部位内に置換されそれぞれＭＰ−ｎｃｒ−ｄＩ−ｎｅｏ（図１１ ）およびＭＰ−Ｔｈｙ−ｎｅｏ（図１２）を作った。 ＬＮｎｃｒｎｅｏを作るために、ｎｃｒ領域（図１３、位置３３のＮｈｅＩか ら位置９７のＳａｕ３ａまで）がｐＧ１Ｎａの３′ＬＴＲから欠失された。特異 的に、ｐＧ１Ｎａからの３′ＬＴＲの一部がＣ１ａＩ／ＳｓｔＩ断片としてブル ースクリプトにサブクローンされた。次いでＰＣＲがＳａｕ３ａ部位（塩基対９ ７），５′−ＧＡＣＣＧＣＴＡＧＣＡＧＡＴＣＴＡＧＧＴＣＡＧＧ−３′（セン ス）およびＳｓｔＩ部位（アンチセンス），５′−ＣＴＧＧＡＧＣＴＣＧＧＧＧ ＡＧＣＡＧＡ−３′（アンチセンス）をオーバーラッピングするプライマーを 用いて行われた。センスプライマーの配列は５′オーバーハングを含み、これは ＮｈｅＩの認識部位を含み（プライマー配列の肉太活字部分）、それをＢｇ１Ｉ Ｉ部位に転換するＳａｕ３ａ部位（プライマー配列のアンダーライン部分）をオ ーバーラッピングする配列が続いた。ｎｃｒ領域を欠いている３２０塩基対ＰＣ Ｒ製品はＮｈｅＩおよびＳｓｔＩで消化され、３８０塩基対ＮｈｅＩを３′ＬＴ ＲのＳｓｔＩ断片に置換するために使用され、ｎｃｒを効果的に除去し、新奇な Ｂｇ１ＩＩ部位を加えた。ブルースクリプトにｎｃｒ欠失を含むＣ１ａＩ／Ｓｂ ａＩ断片はｐＧ１Ｎａプラスミドにある３′ＬＴＲのＣ１ａＩ／ＳｂａＩ部分を 置換するのに使用され、ＬＮｎｃｒｎｅｏを産出した（図１４）。 Ｃ．プラスミドベクターの細胞系への形質導入 プラスミドベクターＭＰｎｅｏ，ＭＰｄ１ｎｅｏ，ＭＰｎｃｒｄ１ｎｅｏ，Ｌ Ｎｎｃｒｎｅｏ，ＭＰｔｈｙｎｅｏ、およびＭＰｔｈｙｄ１ｎｅｏは、形質移入 試薬（インディアナ、インディアナポリス、ベーリンガー・マンハイム・コーポ レイション、ＤＯＴＡＰ）および活性Ｇ４１８、０．５ｎｇ／ｍｌでの選択（メ リーランド、ベセスダ、ジブコ−ＢＲＬ、ジェネティシン）を用いてエコトロピ ックパッケージング細胞系ＧＰ＋Ｅ−８６（ニューヨーク、コロンビア・ユニバ ーシティ、エイ．バンクより入手）に形質移入された。ＧＰ＋Ｅ−８６細胞は新 生ウシ血清１０％、ヒポキサンチン（１５μｇ／ｍｌ）、キサンチン（２５０μ ｇ／ｍｌ）で補充されたＤＭＥＭで選択圧の下で成長した（マーコヴィッツ、他 、ウイルス学ジャーナル、 ６２巻、１１２０−１１２４ページ（１９８８年））。培養上澄みは収集され、 ＰＡ３１７（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ９０７８）両種性パッケージング細胞系を形質 導入するために使用された。ＰＡ３１７細胞は次いでＦＣＳ１０％を含むＤＭＥ Ｍで成長した。ＰＡ３１７細胞は次いでＧ４１８内で選択され細胞クローンが分 離された。クローンからの上澄みはウシ血清１０％を補充されたＤＭＥＭで成長 するＮＩＨ３Ｔ３繊維芽細胞（ＡＴＣＣ番号６４７３）について連続希釈により 滴定された。高力価のクローンがＭＰｎｅｏ，ＭＰｄ１ｎｅｏ、およびＭＰｎｃ ｒｄ１ｎｅｏのＰＡ３１７プールから誘導され、一方ＭＰｔｈｙｎｅｏ，ＭＰｔ ｈｙｄ１ｎｅｏ、およびＬＮｎｃｒｎｅｏの高力価プールは続く分析に使用され た。 実施例２ ＦＣＳ１０％を含むＤＭＥＭ内のウイルス上澄みがベクター生産ＰＡ３１７繊 維芽細胞の密集１００mm組織培養平板から収穫され、０．４５μｍフィルターを 通過させられた。これは全量５ｍｌで１０倍連続希釈された。希釈は以下の通り であった：非希釈，１：１０，１：１００，１：１，０００，１：１０，０００ およびウイルスなしのもの。各希釈物の２ｍｌが６ウエル組織培養皿で２．５× １０⁴細胞を２４時間前に平板培養されたＦ９細胞および３Ｔ３細胞それぞれに 上掛けされた。 形質導入はポリブレン８μｇ／ｍｌの存在の下で２時間行われた。次いで細胞 は食塩加リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄され、それぞれの培地で培養された。２ ４時間後Ｇ４１８（ジブ コ−ＢＲＬ）が０．５ｍｇ／ｍｌで加えられた。非形質導入ウエルで細胞が見ら れなくなるまで選択が１２−１４日で行われ可視コロニーが形質導入ウエルで形 成された。次いで細胞はＰＢＳで洗浄されメタノール内でのクリスタル紫０．５ ％で染色された。Ｇ４１８耐性コロニーが計数され、ウイルス懸濁液のミリリッ トル当りコロニー形成単位（Ｇ４１８ｃｆｕ／ｍｌ）が計数された。Ｆ９細胞内 で発現する異なったベクターの相対能力がＦ９細胞の有効力価（Ｇ４１８^Rｃｆ ｕ／ｍｌ）を３Ｔ３細胞の力価（Ｇ４１８^Rｃｆｕ／ｍｌ）で割ることで定量化 され、従って調製物の間で感染性ウイルス粒子の数の差を説明するものとなる。 この結果は以下の表Ｉで示される。 表Ｉで示されるように、標準モロニーマウス白血病ウイルスベースのベクター 、ＬＮは、ＮＩＨ ３Ｔ３と比較したＦ９胚癌腫細胞に対する活性が僅か１／１ ２０（あるいは０．００８２）の有効性と限定されていることを示した。モロニ ーマウス白血病ウイルスエンハンサーに代って骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハン サーの存在はＦ９細胞に対し形成されたＧ４１８耐性ｃｆｕ／ｍｌの相対的数字 が僅かに増加していた（０．０３５２）。モロニーマウス白血病ウイルスプライ マー結合部位のｄ１５８７ｒｅｖプライマー結合部位との置換はＦ９細胞への有 効力価を更に増加させなかった（０．０２４５）。ｄ１５８７ｒｅｖプライマー 結合部位に加えてＭＰＳＶエンハンサーおよびｎｃｒ欠失を含むベクター（ＭＰ ｎｃｒｄ１ｎｅｏ）は、ＮＩＨ ３Ｔ３繊維芽細胞と比べて約半分の効率でＧ４ １８耐性をＦ９細胞に移転することができた。ｄ１５８７ｒｅｖプライマー結合 部位に加えて非メチル化をコード化するＴｈｙ−１断片の存在はベクター（ＭＰ ｔｈｙｄ１ｎｅｏ）内にＮＩＨ ３Ｔ３繊維芽細胞と比べて１／５の効率でＧ４ １８耐性をＦ９細胞に移転する結果を示した。 実施例３ Ｆ９および３Ｔ３細胞は同時に前記記載のレトロウイルスプラスミドベクター から生成されたウイルス粒子で６ウエル平板で各３時間ウイルス上澄みに４回露 出して形質導入された。細胞は次いで２週間培養され、細胞ペレットはＤＮＡお よびＲＮＡ抽出で調製された。 ゲノムＤＮＡおよび全細胞ＲＮＡがサザンブロットおよび ノーザンブロット分析のためにレトロウイルス形質導入Ｆ９および３Ｔ３細胞ペ レットから抽出された。ＤＮＡは５５℃で３−４時間ＳＤＳ／タンパク質分解酵 素ＫおよびＲＮａｓｅ消化により分離された。消化サンプルはフェノール−クロ ロホルムで抽出され、ＤＮＡはエタノールで沈殿され、ＴＥ緩衝液で再懸濁され た（サムブルック、他、分子クローニング：実験室マニュアル、第２版、コール ド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（１９８９年））。定量サザ ンブロットがプロウイルスコピー数を測定するために行われた。対照およびサン プルＤＮＡ（１０μｇ）は制限酵素ＳｓｔＩ（ジブコ−ＢＲＬ）で消化されたが 、それは各ＬＴＲで１度切断し、それにより全長プロウイルス配列を解放した。 標準曲線を得るために、ｎｅｏ遺伝子の単一コピーを含むＰＡ３１７クローンか らのＤＮＡが親ＰＡ３１７細胞からのＤＮＡで希釈された。希釈は１００％，５ ０％，１０％，５％、および０％であった。消化ＤＮＡはアガロースゲル１．３ ％上で電気泳動され、変性されナイロン膜にブロットされた。フィルターは次い で³²Ｐ−標識ｎｅｏＤＮＡでプローブされ（ファインバーグ、他、分析生化学、 １３７巻、２６６ページ（１９８４年））、−７０℃でコダックＸ−オーマット フィルム（ニューヨーク、ロチェスター、イーストマン−コダック）に露出する ために使用された。十分な露出が得られた後、膜はＤＮＡ負荷の差異を定量化す るために取り去られ１．６キロベースヒトグルコセレブロシダーゼｃＤＮＡプロ ーブで再雑種形成された。フィルターは再びオートラジオグラフィで分析された 。比重計分析がユー． エス．バイオケミカル・サイエンスのスキャン５０００（オハイオ、クリーブラ ンド）を使用してサザンブロットで行われた（図１５）。 サザンブロットは、ＬＮプロウイルスの細胞当り１コピーを含むＰＡ３１７細 胞系から抽出された連続希釈ゲノムＤＮＡにより作られたコピー数に対する標準 曲線を含んでいた（図１５、レーン１−５）。コピー数標準曲線は、比重計でプ ロウイルスｎｅｏシグナルの強度を測定し、その結果をグルコセレブロシダーゼ 内因性マーカーに標準化しそれによりＤＮＡサンプル間の負荷の差を説明するこ とによりプロットされた。形質導入ＮＩＨ ３Ｔ３細胞（図１５、レーン６−１ ２）およびＦ９細胞（図１５、レーン１３−１９）におけるプロウイルスコピー 数は標準曲線から誘導された。類似の形質導入効率は限定された実験バリエーシ ョンでＦ９細胞およびＮＴＨ ３Ｔ３細胞の異なったベクターで達成された。 ノーザンブロットに対しては、ＲＮＡはコムチンスキー、他、分析生化学、１ ６３巻、１５６−１５９ページ（１９８７年）で説明されたチオシアン酸グアニ ジウム酸−フェノールクロロホルム法により分離された。ＲＮＡ１５μｇがホル ムアルデヒドゲル１．２％で電気泳動され、変性され、中和され、毛管ブロッテ ィングでナイロン膜に移された。フィルターは³²Ｐ−標識ｎｅｏＤＮＡで雑種形 成され、−７０℃でＸ線フィルムに露出するため使用された。フィルターはＲＮ Ａの水準を計量するためにベータスコープ６０３ブロットアナライザー（マサチ ューセッツ、ウォルサム、ベータゲン）を用いて分析され た。フィルターは次いで取り去られ、マウスβ−アクチンＤＮＡプローブで再雑 種形成され、再びオートラジオグラフィで分析された。ノーザンブロットは図１ ６で示される。 ７個のベクターすべてはＮＩＨ ３Ｔ３繊維芽細胞内で同じ水準で発現された （図１６、レーン１−８）。しかしＬＮ，ＭＰｎｅｏ，ＭＰｄ１ｎｅｏ，ＬＮｎ ｃｒｎｅｏ、およびＭＰｔｈｙｎｅｏベクターからのＦ９細胞ではＲＮＡ転写は 検出されなかった（図１６、レーン１０−１３および図１５）。３個の修飾を含 む２種のベクター、ＭＰｎｃｒｄ１ｎｅｏおよびＭＰｔｈｙｄ１ｎｅｏはＦ９細 胞でＲＮＡ転写の検出水準を促進した（図１６、レーン１４および１６）。 実施例４ メチル化分析 前記記載のレトロウイルスベクターで形質導入されたＦ９細胞からのゲノムＤ ＮＡ（１５μｇ）は高分子量ＤＮＡのサイズを減少させるために制限酵素Ｂａｍ ＨＩ（メリーランド、ビバリー、ニューイングランド・バイオラブス）で消化さ れ、次いでＥｃｏＲＶ（ジブコ−ＢＲＬ）で消化された。次いで各ＤＮＡサンプ ルの半分がメチル化感受性制限酵素ＳｍａＩ（ニューイングランド・バイオラブ ス）で消化された。酵素消化が完全に行われたかをモニターするために、消化混 合物の２０μｌサンプルがＥｃｏＲＶ消化のためにラムダＤＮＡ（ジブコ−ＢＲ Ｌ）と、またＳｍａＩ消化のためにアデノウイルスタイプ２ＤＮＡ（ジブコ−Ｂ ＲＬ）と混合された。混合物は同時に主サンプルと３７℃で保温され、アガロー ス検査ゲルで続いて流され た。ＥｃｏＲＶおよびＥｃｏＲＶ／ＳｍａＩ消化ゲノムＤＮＡは１．５％アガロ ースゲル上で電気泳動され、変性され、ナイロン膜にブロットされた。ブロット はｐＧ１ＮａプラスミドのＮｏｔＩ部位からＰｖｕＩＩ部位でｎｅｏ遺伝子の５ ′末端からの２８５塩基対プローブで雑種形成された。ブロットのいくつかの露 出がＸ線フィルムで得られた。オートラジオグラムはＳｍａＩ感受性およびＳｍ ａＩ耐性帯の相対強度をユー．エス．バイオケミカル・サイエンスのスキャン５ ０００で測定して分析された。ＥｃｏＲＶおよびＳｍａＩ制限酵素部位の位置を 示す修飾レトロウイルスベクターの図、およびメチル化分析に使用されるプロー ブ、ならびにＳｍａＩ消化後に生成される２．０キロベースおよび１．７キロベ ースの帯が図１７Ａで示される。ブロットは図１７Ｂで示される。レーン１−９ はＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＶのみで消化された安定形質導入Ｆ９細胞からのゲ ノムＤＮＡのブロットであり、またレーン１０−１８はＢａｍＨＩ，ＥｃｏＲＶ 、およびＳｍａＩで消化された安定形質導入Ｆ９細胞からのゲノムＤＮＡのブロ ットである。この図はまた、ＳｍａＩ消化後に生成された２．０キロベースおよ び１．７キロベースの帯の相対強度としてプロウイルスのＳｍａＩ耐性割合の値 を描く。この値は同じブロットの２個の異なった露出の分析から得られた平均値 を表す。 ＳｍａＩ部位はＦ９細胞内でのＬＮベクターのモロニーマウス白血病ウイルス ＬＴＲで大幅にメチル化され、９８．３％のＳｍａＩ耐性を示す（図１７Ｂ、レ ーン１２）。ベクターＭＰｎｅｏ，ＭＰｄ１ｎｅｏ，ＬＮｎｃｒｎｅｏ、および ＭＰｔｈ ｙｎｅｏはメチル化の著しい減少を示さずそれぞれ９５．０％，９７．８％，９ ４．３％、および９７．４％のＳｍａＩ耐性の値を記録した（図１７Ｂ、レーン １３，１４，１６および１７）。ベクターＭＰｎｃｒｄ１ｎｅｏおよびＭＰｔｈ ｙｄ１ｎｅｏはそれぞれ５２．７％および５４．６％のＳｍａＩ耐性を持ち、親 ベクターよりも著しく低いメチル化であった（図１７Ｂ、レーン１５および１８ ）。モロニーマウス肉腫ウイルスベースベクターにおける３個の修飾の同時とり 込みは、ＲＮＡ転写での増加と同時にＦ９胚癌腫細胞におけるプロウイルスのメ チル化の状態を減少させる。 実施例５ ５′ＬＴＲの配列化 前記の実施例において、プロウイルスの５′ＬＴＲおよびリーダー領域は、パ ッケージングおよび連続形質導入後にすべての修飾を正しく複製し維持するため にまずＰＡ３１７細胞で、次いでＦ９細胞で配列された。 プロウイルス配列はＬＴＲの５′末端（５′−ＧＡＣＣＣＣＡＣＣＴＧＴＡＣ ＧＴＡＴＧＧＣＡＡ−３′、センス）およびｎｅｏ遺伝子の５′末端（５′−Ｇ ＣＴＧＧＣＣＡＧＧＴＴＡＡＣＴＣＣＣ−３′、アンチセンス）までのプライマ ーを用いるゲノムＤＮＡのＰＣＲにより増幅された。１．７−１．９キロベース ＰＣＲ製品は１．２％アガロースゲル上で電気泳動により精製され、キアックス ・ゲル抽出キット（カリフォルニア、チャッツワース、キアーゲン・インコーポ レイテッド）を用いて抽出された。次いで配列化が³⁵Ｓ−ｄＡＴＰおよびサイ クル配列化を伴う内部標識によりサーカムベント・サーマル・サイクル配列化キ ット（ニューイングランド・バイオラブス）を用いて行われた。エンハンサー領 域の配列化のために、（前記の）ＬＴＲの５′末端でのプライマーが使用された 。ＰＢＳ領域のためには、スプライス供与体部位からのオリゴヌクレオチド（５ ′−ＧＣＴＧＧＣＣＡＧＧＴＴＡＡＣＴＣＣＣ−３′、アンチセンス）およびＲ ／Ｕ５領域（５′−ＴＧＣＡＴＣＣＧＡＡＴＣＧＴＧＧＴＣＴＣ−３′、センス ）が使用された。Ｔｈｙ−１配列からのプライマー（５′−ＴＣＧＧＧＧＴＧＧ ＡＧＣＡＧＴＣＴＴＣＴ−３′、センス）はＴｈｙ−１断片を含む２個のベクタ ーのエンハンサー領域の配列化を可能にした。 実施例６ ベクターＭＰ−ｎｅｏ，ＭＰ−ｎｃｒ−ｎｅｏ，ＭＰ−Ｔｈｙ−ｎｅｏ，ＭＰ −ｄ１−ｎｅｏ，ＭＰ−ｎｃｒ−ｄ１−ｎｅｏ、およびＭＰ−Ｔｈｙ−ｄ１−ｎ ｅｏはＣＣＥ系の一次マウス胚肝細胞に形質導入された（ブラッドレー、他、ネ イチャー 、３０９巻、２５５−２５６ページ（１９８４年））。形質導入細胞は Ｇ４１８選択なしで２週間培養で拡大され、核酸分析のために収穫された。その 結果はＦ９細胞で見られたものと類似していた。ベクターの５′ＬＴＲはＭＰ− ｎｃｒ−ｄ１−ｎｅｏおよびＭＰ−Ｔｈｙ−ｄ１−ｎｅｏのものを除いて完全な メチル化を示した。これら２個のベクターは約５０％のＬＴＲがＳｍａＩで切断 され得たことを示し、かくしてこれらのベクターで著しくメチル化が減少したこ とを例証した。 ノーザンブロット分析はこれら２個のベクターがまたベクター誘導転写物の検出 水準を産出したことを示した。他のものはすべてＲＮＡの検出水準を産出しなか った。かくしてこれらのベクターは一次胚幹細胞で転写活性である。これらのベ クターを用いる外因性遺伝子の胚幹細胞への導入は、例えばインターロイキン１ から１５までを含むインターロイキン；転写因子；ホメオボックス遺伝子；ある いは表面抗原遺伝子などの挿入遺伝子を発現する遺伝子導入マウスを生成するの に使用することができる。 これら新奇なベクターの活性はヒト遺伝子治療に重大な関連を有している。有 効な遺伝子治療にとって基本的な技術要件は患者細胞内での挿入遺伝子の永続的 な発現である。マウスおよびネズミにおける研究は骨髄幹細胞，肝細胞、および 筋細胞を含む一次細胞に挿入された遺伝子はこの細胞の生きた動物への回帰後に 「沈黙する」ということを示した。マウス遺伝子移動／骨髄移植モデルにおいて 、ベクターのモロニーマウス白血病ウイルスＬＴＲはＬＴＲのシトシンのメチル 化と関連して沈黙することが例証されている。かくしてメチル化に抵抗し活性を 維持するベクターは遺伝子治療に有効に使用される。 実施例７ 骨髄がＣ５７ｂ１／６マウスから収集され、骨髄細胞はＭＰ−ｎｃｒ−ｄ１− ｎｅｏ，ＭＰ−Ｔｈｙ−ｄ１−ｎｅｏ、あるいは対照ベクターＬＮのいずれかで 形質導入された。形質導入はカリタ、他、全米科学アカデミー紀要、９１巻、２ ５６７−２５７１ページ（１９９４年）、およびクラ、他、血液、８３ 巻、２３７３−２３７８ページ（１９９４年）に記載された方法に従って実施さ れた。生後６−８週間のＣ５７ｂ１／６マウスは次いで９５０ラドで照射され、 各グループからの形質導入骨髄がマウスに注射された。骨髄はマウス内で３乃至 ４ケ月成長を許され、次いでマウスは犠牲とされた。骨髄が収集され二次照射マ ウスに移植された。１２日後二次マウスは犠牲とされ、脾臓の移植骨髄から形成 されたコロニー（２°ＣＦＵ−Ｓ）が分離された。２°ＣＦＵ−Ｓでのベクター の存在はｎｅｏ^R遺伝子のＰＣＲ検定で確認された。ＤＮＡ ＰＣＲにもとづく ベクターを含む２°ＣＦＵ−Ｓは次いでノーザンブロット分析によりベクター発 現を確認するために分析された。ノーザンブロット分析の結果は以下の表IIでリ ストされる。 ＬＮベクターの発現の殆どすべては１個の一次供与体から生産された２°ＣＦ Ｕ−Ｓで見られたが、それは偶然に発現を異常に許容する染色体部位にＬＮベク ターを挿入したことを反映するものである。ＬＮベクターからの基線発現の高い 割合にも拘らず、両方の修飾ベクターは高い発現頻度を示し、ＭＰ− Ｔｈｙ−ｄ１−ｎｅｏベクターを含む２°ＣＦＵ−Ｓは５９％の発現を、またＭ Ｐ−ｎｃｒ−ｄ１−ｎｅｏのそれは６９％の発現を示した。かくしてＦ９細胞で 発現の増加を示した修飾ベクターは前記マウス遺伝子移転／骨髄移植モデルでよ り高い発現頻度を示した。 この出願で引用されたすべての特許，公開情報（公開特許出願を含む）および データベースエントリーの開示は、あたかも各個別特許，公開情報およびデータ ベースエントリーが特異的かつ個別的に引用例としてとり込まれているかのよう に同じ範囲でその全体が引用例として特異的にとり込まれている。 しかしこの発明の範囲は前記の特異な実施例に限定されるべきではないことは 理解されねばならない。この発明は特に説明されたもの以外にも実施可能であり 、しかも以下の請求の範囲内にある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:92）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．一つのレトロウイルスプラスミドベクターであって、 (i)骨髄増殖性肉腫ウイルスおよびポリオーマウイルスよりなるグループから 選択されるウイルスから得られるエンハンサー領域、 (ii)マウスレトロウイルスｄ１５８７ｒｅｖから得られるプライマー結合部位 であり、ここで前記レトロウイルスプラスミドベクターが負の対照領域を含まな いプライマー結合部位、 を含むことを特徴とするレトロウイルスプラスミドベクター。 ２．請求の範囲第１項記載のレトロウイルスプラスミドベクターであって、ここ で前記プラスミドベクターが更に非メチル化をコード化する核酸配列を含むこと を特徴とするレトロウイルスプラスミドベクター。 ３．一つのレトロウイルスプラスミドベクターであって、 (i)骨髄増殖性肉腫ウイルスおよびポリオーマウイルスよりなるグループから 選択されるウイルスから得られるエンハンサー領域、 (ii)マウスレトロウイルスｄ１５８７ｒｅｖから得られるプライマー結合部位 、および (iii)非メチル化をコード化する核酸配列、 を含むことを特徴とするレトロウイルスプラスミドベクター。 ４．モロニーマウス白血病ウイルスから誘導される一つのレトロウイルスプラス ミドベクターであって、ここで(i)前記モロ ニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲのエンハンサー領域が除去され、骨髄増殖性 肉腫ウイルスおよびポリオーマウイルスよりなるグループから選択されるウイル スから得られるエンハンサー領域で置換され、また (ii)前記モロニーマウス白血病ウイルスのプライマー結合部位が（ａ）突然変 異され、あるいは（ｂ）除去されかつモロニーマウス白血病ウイルス以外のレト ロウイルスから得られるプライマー結合部位で置換され、更にここで前記モロニ ーマウス白血病ウイルスの負の対照領域が欠失している、 ことを含むことを特徴とするレトロウイルスプラスミドベクター。 ５．請求の範囲第４項記載のレトロウイルスプラスミドベクターであって、ここ で前記レトロウイルスプラスミドベクターが更に非メチル化をコード化する核酸 配列を含むことを特徴とするレトロウイルスプラスミドベクター。 ６．請求の範囲第４項記載のレトロウイルスプラスミドベクターであってここで 前記モロニーマウス白血病ウイルスの前記プライマー結合部位が除去されモロニ ーマウス白血病ウイルス以外のレトロウイルスから得られるプライマー結合部位 で置換されることを特徴とするレトロウイルスプラスミドベクター。 ７．請求の範囲第６項記載のレトロウイルスプラスミドベクターであって、ここ でモロニーマウス白血病ウイルス以外の前記ウイルスがマウスレトロウイルスｄ １５８７ｒｅｖであることを特徴とするレトロウイルスプラスミドベクター。 ８．モロニーマウス白血病ウイルスから誘導される一つのレト ロウイルスプラスミドベクターであって、ここで(i)前記モロニーマウス白血病 ウイルスのＬＴＲのエンハンサー領域が除去され、骨髄増殖性肉腫ウイルスおよ びポリオーマウイルスよりなるグループから選択されるウイルスから得られるエ ンハンサー領域で置換され、 (ii)前記モロニーマウス白血病ウイルスのプライマー結合部位が（ａ）突然変 異され、あるいは（ｂ）除去されモロニーマウス白血病ウイルス以外のレトロウ イルスから得られるプライマー結合部位で置換され、および (iii)非メチル化をコード化する核酸配列 を含むことを特徴とするレトロウイルスプラスミドベクター。 ９．請求の範囲第８項記載のレトロウイルスプラスミドベクターであって、ここ で前記モロニーマウス白血病ウイルスの前記プライマー結合部位が除去されモロ ニーマウス白血病ウイルス以外のレトロウイルスから得られるプライマー結合部 位で置換されることを特徴とするレトロウイルスプラスミドベクター。 １０．請求の範囲第９項記載のレトロウイルスプラスミドベクターであって、こ こでモロニーマウス白血病ウイルス以外の前記ウイルスがマウスレトロウイルス ｄ１５８７ｒｅｖであることを特徴とするレトロウイルスプラスミドベクター。 １１．請求の範囲第１項記載のレトロウイルスプラスミドベクターであって、こ こで前記ベクターが更に治療薬をコード化する少くとも１個の核酸配列を含むこ とを特徴とするレトロウイルスプラスミドベクター。 １２．請求の範囲第３項記載のレトロウイルスプラスミドベクターであって、こ こで前記ベクターが更に治療薬をコード化する少くとも１個の核酸配列を含むこ とを特徴とするレトロウイルスプラスミドベクター。 １３．請求の範囲第４項記載のレトロウイルスプラスミドベクターであって、こ こで前記ベクターが更に治療薬をコード化する少くとも１個の核酸配列を含むこ とを特徴とするレトロウイルスプラスミドベクター。 １４．請求の範囲第８項記載のレトロウイルスプラスミドベクターであって、こ こでベクターが更に治療薬をコード化する少くとも１個の核酸配列を含むことを 特徴とするレトロウイルスプラスミドベクター。 １５．請求の範囲第１１項記載のレトロウイルスプラスミドベクターで形質導入 されることを特徴とするパッケージング細胞。 １６．請求の範囲第１５項記載のパッケージング細胞から生成されることを特徴 とするレトロウイルスベクター粒子。 １７．請求の範囲第１６項記載のレトロウイルスベクター粒子で形質導入される ことを特徴とする真核細胞。 １８．請求の範囲第１７項記載の細胞であって、前記細胞が胚癌腫細胞であるこ とを特徴とする細胞。 １９．請求の範囲第１７項記載の細胞であって、前記細胞が胚幹細胞であること を特徴とする細胞。 ２０．請求の範囲第１２項記載のレトロウイルスプラスミドベクターで形質導入 されることを特徴とするパッケージング細 胞。 ２１．請求の範囲第２０項記載のパッケージング細胞から生成されることを特徴 とするレトロウイルスベクター粒子。 ２２．請求の範囲第２１項記載のレトロウイルスベクター粒子で形質導入される ことを特徴とする真核細胞。 ２３．前記細胞が胚癌腫細胞であることを特徴とする請求の範囲第２２項記載の 細胞。 ２４．前記細胞が胚幹細胞であることを特徴とする請求の範囲第２２項記載の細 胞。 ２５．請求の範囲第１３項記載のレトロウイルスプラスミドベクターで形質導入 されることを特徴とするパッケージング細胞。 ２６．請求の範囲第２５項記載のパッケージング細胞から生成されることを特徴 とするレトロウイルスベクター粒子。 ２７．請求の範囲第２６項記載のレトロウイルスベクター粒子で形質導入される ことを特徴とする真核細胞。 ２８．前記細胞が胚癌腫細胞であることを特徴とする請求の範囲第２７項記載の 細胞。 ２９．前記細胞が胚幹細胞であることを特徴とする請求の範囲第２７項記載の細 胞。 ３０．請求の範囲第１４項記載のレトロウイルスプラスミドベクターで形質導入 されることを特徴とするパッケージング細胞。 ３１．請求の範囲第３０項記載のパッケージング細胞から生成されることを特徴 とするレトロウイルスベクター粒子。 ３２．請求の範囲第３１項記載のレトロウイルスベクター粒子で形質導入される ことを特徴とする真核細胞。 ３３．前記細胞が胚癌腫細胞であることを特徴とする請求の範囲第３２項記載の 細胞。 ３４．前記細胞が胚幹細胞であることを特徴とする請求の範囲第３２項記載の細 胞。 ３５．宿主に遺伝子治療処置を実施する一つの方法であって、宿主に治療効果を 生むのに有効な量で請求の範囲第１６項記載のレトロウイルス粒子を宿主に投与 することよりなることを特徴とする方法。 ３６．宿主に遺伝子治療処置を実施する一つの方法であって、宿主に治療効果を 生むのに有効な量で請求の範囲第１７項記載の真核細胞を宿主に投与することよ りなることを特徴とする方法。 ３７．宿主に遺伝子治療処置を実施する一つの方法であって、前記宿主に治療効 果を生むのに有効な量で請求の範囲第２１項記載のレトロウイルス粒子を宿主に 投与することよりなることを特徴とする方法。 ３８．宿主に遺伝子治療処置を実施する一つの方法であって、前記宿主に治療効 果を生むのに有効な量で請求の範囲第２２項記載の真核細胞を宿主に投与するこ とよりなることよりなることを特徴とする方法。 ３９．宿主に遺伝子治療処置を実施する一つの方法であって、前記宿主に治療効 果を生むのに有効な量で請求の範囲第２６項記載のレトロウイルスベクター粒子 を宿主に投与することより なることを特徴とする方法。 ４０．宿主に遺伝子治療処置を実施する一つの方法であって、前記宿主に治療効 果を生むのに有効な量で請求の範囲第２７項記載の真核細胞を宿主に投与するこ とよりなることを特徴とする方法。 ４１．宿主に遺伝子治療処置を実施する一つの方法であって、前記宿主に治療効 果を生むのに有効な量で請求の範囲第３１項記載の真核細胞を宿主に投与するこ とよりなることを特徴とする方法。 ４２．宿主に遺伝子治療処置を実施する一つの方法であって、前記宿主に治療効 果を生むのに有効な量で請求の範囲第３２項記載の真核細胞を宿主に投与するこ とよりなることを特徴とする方法。 ４３．３′ＬＴＲの負の対照領域が欠失していることを特徴とする修飾骨髄増殖 性肉腫ウイルス３′ＬＴＲ。 ４４．３′ＬＴＲの負の対照領域が欠失していることを特徴とする修飾ポリオー マウイルス３´ＬＴＲ。