JP2002543792A - ベクターによるトランスポゾン配列の供給及び組込み - Google Patents
ベクターによるトランスポゾン配列の供給及び組込みInfo
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、トランスポゾンを含んでいる、好ましくはトランスポゾンと、トランスポザーゼをコードするヌクレオチド配列とを含んでいる、最も好ましくはトランスポゾンと、トランスポザーゼをコードするヌクレオチド配列と、トランスポザーゼの発現を制御するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列とを含んでいる非組込み型ベクター、好ましくは非組込み型ウイルスベクターを提供する。この非組込み型ベクターの使用方法もまた提供される。
Description
【０００１】発明の背景 ベクターは、遺伝物質を細胞に導入するために用いられる運搬体である。ベク
ターは一般にウイルス性と非ウイルス性とに分類される。今日まで、ウイルス性
ベクターは、遺伝子供給において、対応する非ウイルス性ベクターよりも非常に
高い効率を示してきた。ウイルス性ベクターは、更に細胞のゲノムに組込まれる
ものと、組込まれないままであるものとに分けられる。組込み型ウイルスは、元
々の標的細胞の子孫にまで伝わる安定な遺伝子導入を提供する。組込み型ウイル
スベクターのプロトタイプはレトロウイルスである。対照的に、非組込み型ベク
ターは、ウイルス性又は非ウイルス性に関係なく、一過的な導入のみを提供する
。なぜなら導入された遺伝子は分解されるか、又は細胞分裂に伴って失なわれる
からである。非組込み型ウイルスベクターのプロトタイプはアデノウイルス又は
ヘルペスウイルスベースのものである。今日までほとんどの臨床研究に、レトロ
ウイルスベースの組込み型ベクター又はアデノウイルスベースの非組込み型ベク
ターが用いられてきた。
ターは一般にウイルス性と非ウイルス性とに分類される。今日まで、ウイルス性
ベクターは、遺伝子供給において、対応する非ウイルス性ベクターよりも非常に
高い効率を示してきた。ウイルス性ベクターは、更に細胞のゲノムに組込まれる
ものと、組込まれないままであるものとに分けられる。組込み型ウイルスは、元
々の標的細胞の子孫にまで伝わる安定な遺伝子導入を提供する。組込み型ウイル
スベクターのプロトタイプはレトロウイルスである。対照的に、非組込み型ベク
ターは、ウイルス性又は非ウイルス性に関係なく、一過的な導入のみを提供する
。なぜなら導入された遺伝子は分解されるか、又は細胞分裂に伴って失なわれる
からである。非組込み型ウイルスベクターのプロトタイプはアデノウイルス又は
ヘルペスウイルスベースのものである。今日までほとんどの臨床研究に、レトロ
ウイルスベースの組込み型ベクター又はアデノウイルスベースの非組込み型ベク
ターが用いられてきた。
【０００２】 レトロウイルスベクターは、宿主細胞ゲノムに組込まれる性質のために、長期
間効果を有するという利点がある。しかし、それらは、高力価に生産することが
困難であり、そのほとんどは分裂している細胞にしか感染せず、しかも比較的に
不安定であり、インビボでの不活性化を受けやすい。その結果、直接的なインビ
ボ遺伝子供給による遺伝子治療では、レトロウイルスベクターが成功することに
は限界があり、その代り、エキソビボ又はインビトロ系、典型的には外植された
宿主細胞を用いた系では、成功することがより多い。エキソビボ又はインビボで
遺伝子導入されたトランスジェニック細胞を、治療として患者に投与することが
できる。これらの方法は、造血細胞、より程度は低いが、筋肉細胞や肝細胞に関
わる治療で潜在的に有用であるが、感染性のより少ない標的組織又は臓器、例え
ば心、肺、及び脳に関わる遺伝子治療では実際的ではない。
間効果を有するという利点がある。しかし、それらは、高力価に生産することが
困難であり、そのほとんどは分裂している細胞にしか感染せず、しかも比較的に
不安定であり、インビボでの不活性化を受けやすい。その結果、直接的なインビ
ボ遺伝子供給による遺伝子治療では、レトロウイルスベクターが成功することに
は限界があり、その代り、エキソビボ又はインビトロ系、典型的には外植された
宿主細胞を用いた系では、成功することがより多い。エキソビボ又はインビボで
遺伝子導入されたトランスジェニック細胞を、治療として患者に投与することが
できる。これらの方法は、造血細胞、より程度は低いが、筋肉細胞や肝細胞に関
わる治療で潜在的に有用であるが、感染性のより少ない標的組織又は臓器、例え
ば心、肺、及び脳に関わる遺伝子治療では実際的ではない。
【０００３】 アデノウイルスベースのベクターは、対照的に、高力価に生産することが容易
であり、分裂している細胞にも分裂していない細胞にも感染し、しかも比較的安
定であり、効率的にインビボで供給される。アデノウイルスベクターの主な欠点
は、導入遺伝子の発現期間が限られていることである。これは、これらのベクタ
ーが複製されない、すなわち細胞のゲノムに組込まれない性質に帰因する。導入
遺伝子の発現が一過的なので、アデノウイルスベクターを再投与しなければなら
ず、しかも典型的にはそのアデノウイルスのキャプシドタンパク質に対する中和
抗体が動物体内に作られるので、問題を生ずることがある。トランス遺伝子の発
現が一過的であることから、アデノウイルスベースのベクターの使用は、急性症
状の短期間の遺伝子治療を目的としている。
であり、分裂している細胞にも分裂していない細胞にも感染し、しかも比較的安
定であり、効率的にインビボで供給される。アデノウイルスベクターの主な欠点
は、導入遺伝子の発現期間が限られていることである。これは、これらのベクタ
ーが複製されない、すなわち細胞のゲノムに組込まれない性質に帰因する。導入
遺伝子の発現が一過的なので、アデノウイルスベクターを再投与しなければなら
ず、しかも典型的にはそのアデノウイルスのキャプシドタンパク質に対する中和
抗体が動物体内に作られるので、問題を生ずることがある。トランス遺伝子の発
現が一過的であることから、アデノウイルスベースのベクターの使用は、急性症
状の短期間の遺伝子治療を目的としている。
【０００４】 トランスポゾンは、宿主ゲノムに遺伝子を組込むことができる可動性の遺伝子
要素である。天然に存在するトランスポゾンは通常、トランスポゾンの両末端に
存在するシス作用配列によって挟まれた、トランスポザーゼをコードする遺伝子
を含んでいる（図１）。前記の末端配列は、トランスポザーゼ酵素により認識さ
れ、次にこの酵素が、染色体内のその場所からトランスポゾン全体を切り出し、
そしてゲノム上の別の場所にそれを再挿入する（「切り出しと組込み」機構：図
１）。理論的には、トランスポゾン系を用いて、宿主ゲノム内に注目遺伝子を組
込むことができるだろう。これは、必須なシス作用配列により挟まれた注目遺伝
子、並びに機能的なトランポザーゼの供給源を細胞に供給することによる。
要素である。天然に存在するトランスポゾンは通常、トランスポゾンの両末端に
存在するシス作用配列によって挟まれた、トランスポザーゼをコードする遺伝子
を含んでいる（図１）。前記の末端配列は、トランスポザーゼ酵素により認識さ
れ、次にこの酵素が、染色体内のその場所からトランスポゾン全体を切り出し、
そしてゲノム上の別の場所にそれを再挿入する（「切り出しと組込み」機構：図
１）。理論的には、トランスポゾン系を用いて、宿主ゲノム内に注目遺伝子を組
込むことができるだろう。これは、必須なシス作用配列により挟まれた注目遺伝
子、並びに機能的なトランポザーゼの供給源を細胞に供給することによる。
【０００５】 しかし、ほとんどのトランスボゾンは種特異的であり、しかも哺乳動物では、
機能的な非レトロウイルストランスポゾン系は未だに見つかっていない。今日ま
で、トランスポゾンによる哺乳動物細胞ゲノムへの注目遺伝子の組込みは、ほん
の１例のみ成功している(Ivics et al. Cell 91, 501-510 (1997); WO98/40510)
。一方、WO97/15679 (Kelly and Wilson）には、レトロトランスポゾン系を組込
んでいるアデノウイルスを用いて、哺乳動物細胞ゲノムへのトランス遺伝子の組
込みが成功したことが報告されている。しかし、レトロトランスポゾンを用いた
場合、ゲノムへの組込みは、宿主細胞が分裂するまで起こらず、従って、インビ
ボ遺伝子治療においてこの方法の有用性は非常に限定される。今日まで、脊椎動
物細胞内で機能しうるトランスポゾン由来の組込み能力を有する様に、非組込み
型ウイルスベクター、例えばアデノウイルスを修飾することに成功したという報
告はない。
機能的な非レトロウイルストランスポゾン系は未だに見つかっていない。今日ま
で、トランスポゾンによる哺乳動物細胞ゲノムへの注目遺伝子の組込みは、ほん
の１例のみ成功している(Ivics et al. Cell 91, 501-510 (1997); WO98/40510)
。一方、WO97/15679 (Kelly and Wilson）には、レトロトランスポゾン系を組込
んでいるアデノウイルスを用いて、哺乳動物細胞ゲノムへのトランス遺伝子の組
込みが成功したことが報告されている。しかし、レトロトランスポゾンを用いた
場合、ゲノムへの組込みは、宿主細胞が分裂するまで起こらず、従って、インビ
ボ遺伝子治療においてこの方法の有用性は非常に限定される。今日まで、脊椎動
物細胞内で機能しうるトランスポゾン由来の組込み能力を有する様に、非組込み
型ウイルスベクター、例えばアデノウイルスを修飾することに成功したという報
告はない。
【０００６】発明の要旨 例えばゲノム分析や遺伝子治療において、核酸供給系を使用しうるという点か
ら、細胞分裂がない状態で組込まれる核酸を細胞に供給するためのウイルスベク
ターが求められている。更に、非組込み型のウイルスベクター、例えばアデノウ
イルスや単純ヘルペスウイルスベースのベクターの利点から、ベクターによって
供給されたトランス遺伝子の長期発現を可能にする非組込み型ウイルスベクター
が求められている。本発明は、脊椎動物のゲノム、好ましくは哺乳動物、例えば
人間、マウス、ラット、霊長類動物、ヒツジ、ウシ、及びブタのゲノム、最も好
ましくは人間のゲノム内への異種ポリヌクレオチドの組込みを促進するために、
非組込み型ウイルスベクターの周知の利点と、新しく作製されたトランスポゾン
系、すなわちSBトランスポザーゼ系の特有の機能とを組合せるものである。
ら、細胞分裂がない状態で組込まれる核酸を細胞に供給するためのウイルスベク
ターが求められている。更に、非組込み型のウイルスベクター、例えばアデノウ
イルスや単純ヘルペスウイルスベースのベクターの利点から、ベクターによって
供給されたトランス遺伝子の長期発現を可能にする非組込み型ウイルスベクター
が求められている。本発明は、脊椎動物のゲノム、好ましくは哺乳動物、例えば
人間、マウス、ラット、霊長類動物、ヒツジ、ウシ、及びブタのゲノム、最も好
ましくは人間のゲノム内への異種ポリヌクレオチドの組込みを促進するために、
非組込み型ウイルスベクターの周知の利点と、新しく作製されたトランスポゾン
系、すなわちSBトランスポザーゼ系の特有の機能とを組合せるものである。
【０００７】 遺伝子治療の未来に対して、本発明の意味するところは、刺激的かつ遠大であ
る。例えば、このアデノウイルスによるトランスポゾン供給ベクターでは、レト
ロトランスポゾンではなく、トランスポゾンが用いられる。レトロトランスポゾ
ンを用いた場合、供給ベクターにより供給されるポリヌクレオチドがゲノムに組
込まれるためには、標的細胞が分裂中でなければならず、あるいは分裂を誘導す
る必要がある。対照的に、トランスポゾン配列は、細胞が分裂しているかどうか
に関わらず、ゲノムDNA 内に組込まれる。ここで「ゲノムDNA 」とは染色体DNA
及び染色体外DNA の両方を含んで用いられる。
る。例えば、このアデノウイルスによるトランスポゾン供給ベクターでは、レト
ロトランスポゾンではなく、トランスポゾンが用いられる。レトロトランスポゾ
ンを用いた場合、供給ベクターにより供給されるポリヌクレオチドがゲノムに組
込まれるためには、標的細胞が分裂中でなければならず、あるいは分裂を誘導す
る必要がある。対照的に、トランスポゾン配列は、細胞が分裂しているかどうか
に関わらず、ゲノムDNA 内に組込まれる。ここで「ゲノムDNA 」とは染色体DNA
及び染色体外DNA の両方を含んで用いられる。
【０００８】 非組込み型ウイルスベクターに組込み能力を付加することにより、全く新しい
処置の可能性が開かれる。なぜなら、この様なウイルスを、第一に、ポリペプチ
ドの長期生産に関わる応用のために用いることができるからである。本発明に従
って細胞のゲノムDNA に供給され、そして安定に組込まれたコード配列から、そ
の細胞が死滅するまで、継続的にポリペプチドが発現される。細胞のゲノムDNA
内に組込まれたコード配列から長期間ポリペプチドが発現することは、そのベク
ターを再投与する必要性が減ることからも、有利である。更に、その細胞内のベ
クターからトランスポゾンが切り出されると、そのベクターは自滅し、従ってよ
り短い期間しか細胞内に存在しない。これは有利なことである。なぜならウイル
ス遺伝子の発現に由来する生来の免疫機構及び細胞毒性により、本発明のベクタ
ーが感染した細胞が破壊される可能性が少なくなるからである。
処置の可能性が開かれる。なぜなら、この様なウイルスを、第一に、ポリペプチ
ドの長期生産に関わる応用のために用いることができるからである。本発明に従
って細胞のゲノムDNA に供給され、そして安定に組込まれたコード配列から、そ
の細胞が死滅するまで、継続的にポリペプチドが発現される。細胞のゲノムDNA
内に組込まれたコード配列から長期間ポリペプチドが発現することは、そのベク
ターを再投与する必要性が減ることからも、有利である。更に、その細胞内のベ
クターからトランスポゾンが切り出されると、そのベクターは自滅し、従ってよ
り短い期間しか細胞内に存在しない。これは有利なことである。なぜならウイル
ス遺伝子の発現に由来する生来の免疫機構及び細胞毒性により、本発明のベクタ
ーが感染した細胞が破壊される可能性が少なくなるからである。
【０００９】 本発明は、トランスポザーゼに結合する逆方向反復配列によって挟まれたポリ
ヌクレオチド、及びオペレーター配列を含有する制御配列に作用可能に連結され
たトランスポザーゼをコードするポリヌクレオチドを含んでいる非組込み型ベク
ターを提供する。前記トランスポザーゼは、配列番号９のアミノ酸配列を有する
、又は配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも約80％相同なアミノ酸配列
を有するSBポリペプチドであってよい。前記の逆方向反復配列は、配列番号７又
は８のヌクレオチド配列を含みうる。前記の逆方向反復配列は、配列番号２，３
，４又は５のヌクレオチド配列を有する直列反復配列を含みうる。
ヌクレオチド、及びオペレーター配列を含有する制御配列に作用可能に連結され
たトランスポザーゼをコードするポリヌクレオチドを含んでいる非組込み型ベク
ターを提供する。前記トランスポザーゼは、配列番号９のアミノ酸配列を有する
、又は配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも約80％相同なアミノ酸配列
を有するSBポリペプチドであってよい。前記の逆方向反復配列は、配列番号７又
は８のヌクレオチド配列を含みうる。前記の逆方向反復配列は、配列番号２，３
，４又は５のヌクレオチド配列を有する直列反復配列を含みうる。
【００１０】 この非組込み型ベクターは、非組込み型プラスミドベクターであってよい。あ
るいは、この非組込み型ベクターは、前記ポリヌクレオチド、前記逆方向反復配
列、前記のトランスポザーゼをコードするポリヌクレオチド、及び前記制御配列
の組合せを挟んでいる反復性の末端反復配列を含んでいる非組込み型ウイルスベ
クター、例えばアデノウイルスベースのベクターであってよい。このアデノウイ
ルスベースのベクターは、ヘルパー依存性のアデノウイルスベクターであってよ
い。
るいは、この非組込み型ベクターは、前記ポリヌクレオチド、前記逆方向反復配
列、前記のトランスポザーゼをコードするポリヌクレオチド、及び前記制御配列
の組合せを挟んでいる反復性の末端反復配列を含んでいる非組込み型ウイルスベ
クター、例えばアデノウイルスベースのベクターであってよい。このアデノウイ
ルスベースのベクターは、ヘルパー依存性のアデノウイルスベクターであってよ
い。
【００１１】 逆方向反復配列によって挟まれるポリヌクレオチドは、非コード配列を含んで
よい。あるいは、このポリヌクレオチドは、制御配列に作用可能に連結されたコ
ード配列を含んでよい。前記のオペレーター配列はlac オペレーター又はテトラ
サイクリン応答要素であってよい。
よい。あるいは、このポリヌクレオチドは、制御配列に作用可能に連結されたコ
ード配列を含んでよい。前記のオペレーター配列はlac オペレーター又はテトラ
サイクリン応答要素であってよい。
【００１２】 場合により、この非組込み型ベクターは更に、制御ポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチドを含んでよい。前記オペレーター配列がlac オペレーター配列
を含む場合、前記の制御ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはLacIをコ
ードする。前記オペレーター配列がテトラサイクリン応答要素を含む場合、前記
の制御ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、適当な条件下でテトラサ
イクリン応答要素に結合するポリペプチド、例えばtTA 又はrtTAをコードする。
ポリヌクレオチドを含んでよい。前記オペレーター配列がlac オペレーター配列
を含む場合、前記の制御ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはLacIをコ
ードする。前記オペレーター配列がテトラサイクリン応答要素を含む場合、前記
の制御ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、適当な条件下でテトラサ
イクリン応答要素に結合するポリペプチド、例えばtTA 又はrtTAをコードする。
【００１３】 別の点として、当該非組込み型ベクターは、トランスポザーゼに結合する逆方
向反復配列によって挟まれたポリヌクレオチド、トランスポザーゼをコードする
ポリヌクレオチド、及びこのトランスポザーゼをコードするポリヌクレオチドの
発現を改変する制御ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでよい。
トランスポザーゼをコードするポリヌクレオチドは、オペレーター配列を含んで
いる制御配列に作用可能に連結されうる。
向反復配列によって挟まれたポリヌクレオチド、トランスポザーゼをコードする
ポリヌクレオチド、及びこのトランスポザーゼをコードするポリヌクレオチドの
発現を改変する制御ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでよい。
トランスポザーゼをコードするポリヌクレオチドは、オペレーター配列を含んで
いる制御配列に作用可能に連結されうる。
【００１４】 本発明は、トランスジェニック細胞の作製方法であって、その細胞においてト
ランスポザーゼが発現する様に、逆方向反復配列によって挟まれたポリヌクレオ
チドを含んでいるゲノムDNA を保有するトランスジェニック細胞を生産するため
に、細胞を本発明の非組込み型ベクターと接触させることを含んで成る前記方法
を提供する。いくつかの点では、このトランスポザーゼをコードするポリヌクレ
オチドはオペレーター配列を含んでよい。このオペレーター配列がlac オペレー
ターである場合、トランスポザーゼの発現は、その細胞内にLacIポリペプチドが
存在しない状態を維持すること、又はその細胞にIPTGを添加することを含みうる
。いくつかの点では、当該非組込み型ベクターは、更に、制御ポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチドを含み、そしてこの制御ポリペプチドは、適当な条件
下で前記オペレーター配列と結合して、トランスポザーゼをコードするポリヌク
レオチドの発現を調節する。例えば、そのオペレーター配列がlac オペレーター
配列を含んでいる場合、その制御ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは
LacIをコードする。そのオペレーター配列がテトラサイクリン応答要素を含んで
いる場合、その制御ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはtTA 又はrtTA
をコードする。当該方法に用いられる細胞は哺乳動物細胞、例えば人間の細胞で
あってよい。当該方法をインビボ、エキソビボ、又はインビトロで行いうる。
ランスポザーゼが発現する様に、逆方向反復配列によって挟まれたポリヌクレオ
チドを含んでいるゲノムDNA を保有するトランスジェニック細胞を生産するため
に、細胞を本発明の非組込み型ベクターと接触させることを含んで成る前記方法
を提供する。いくつかの点では、このトランスポザーゼをコードするポリヌクレ
オチドはオペレーター配列を含んでよい。このオペレーター配列がlac オペレー
ターである場合、トランスポザーゼの発現は、その細胞内にLacIポリペプチドが
存在しない状態を維持すること、又はその細胞にIPTGを添加することを含みうる
。いくつかの点では、当該非組込み型ベクターは、更に、制御ポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチドを含み、そしてこの制御ポリペプチドは、適当な条件
下で前記オペレーター配列と結合して、トランスポザーゼをコードするポリヌク
レオチドの発現を調節する。例えば、そのオペレーター配列がlac オペレーター
配列を含んでいる場合、その制御ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは
LacIをコードする。そのオペレーター配列がテトラサイクリン応答要素を含んで
いる場合、その制御ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはtTA 又はrtTA
をコードする。当該方法に用いられる細胞は哺乳動物細胞、例えば人間の細胞で
あってよい。当該方法をインビボ、エキソビボ、又はインビトロで行いうる。
【００１５】 本発明は、トランスジェニック生物の作製方法であって、その細胞においてト
ランスポザーゼが発現する様に、逆方向反復配列によって挟まれたポリヌクレオ
チドを含んでいるゲノムDNA を保有するトランスジェニック生物を生産するため
に、細胞を本発明の非組込み型ベクターと接触させることを含んで成る前記方法
を提供する。
ランスポザーゼが発現する様に、逆方向反復配列によって挟まれたポリヌクレオ
チドを含んでいるゲノムDNA を保有するトランスジェニック生物を生産するため
に、細胞を本発明の非組込み型ベクターと接触させることを含んで成る前記方法
を提供する。
【００１６】 本発明は、別の点として、細胞又は生物の表現型を変更する方法であって、そ
の細胞においてトランスポザーゼが発現する様に、逆方向反復配列によって挟ま
れたポリヌクレオチドを含んでいるゲノムDNA を保有するトランスジェニック細
胞又は生物を生産するために、細胞を本発明の非組込み型ベクターと接触させる
こと、及び、そのトランスジェニック細胞、トランスジェニック生物、又はその
子孫の表現型が、逆方向反復配列によって挟まれたポリヌクレオチドを保有して
いない細胞又は生物に比べて変更されているかどうかを決定することを含んでな
る前記方法に関する。
の細胞においてトランスポザーゼが発現する様に、逆方向反復配列によって挟ま
れたポリヌクレオチドを含んでいるゲノムDNA を保有するトランスジェニック細
胞又は生物を生産するために、細胞を本発明の非組込み型ベクターと接触させる
こと、及び、そのトランスジェニック細胞、トランスジェニック生物、又はその
子孫の表現型が、逆方向反復配列によって挟まれたポリヌクレオチドを保有して
いない細胞又は生物に比べて変更されているかどうかを決定することを含んでな
る前記方法に関する。
【００１７】 更に別の点として、本発明は、核酸供給系の作製方法に関する。この方法は、
トランスポザーゼと結合する逆方向反復配列によって挟まれたポリヌクレオチド
、及びオペレーター配列を含んでいる制御配列に作用可能に連結されたトランス
ポザーゼをコードするポリヌクレオチドを含んでいる非組込み型アデノウイルス
ベースのウイルスベクター、例えばヘルパー依存性アデノウイルスベクターを構
築すること、次にそのトランスポザーゼが発現しない条件下で、その非組込み型
アデノウイルスベースのウイルスベクターをパッケージングすることを含んで成
る。前記オペレーター配列はlac オペレーターであってよく、そしてパッケージ
ングは、LacIの存在を維持することを含みうる。なぜならLacIはトランスポザー
ゼをコードするポリヌクレオチドの発現を阻害するからである。この非組込み型
ベクターは、更に、制御ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとして、La
cIをコードするポリヌクレオチドを含みうる。前記オペレーター配列はテトラサ
イクリン応答要素であってもよく、その場合、この非組込み型ベクターは更に、
制御ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとして、tTA 又はrtTAをコード
するポリヌクレオチドを含みうる。
トランスポザーゼと結合する逆方向反復配列によって挟まれたポリヌクレオチド
、及びオペレーター配列を含んでいる制御配列に作用可能に連結されたトランス
ポザーゼをコードするポリヌクレオチドを含んでいる非組込み型アデノウイルス
ベースのウイルスベクター、例えばヘルパー依存性アデノウイルスベクターを構
築すること、次にそのトランスポザーゼが発現しない条件下で、その非組込み型
アデノウイルスベースのウイルスベクターをパッケージングすることを含んで成
る。前記オペレーター配列はlac オペレーターであってよく、そしてパッケージ
ングは、LacIの存在を維持することを含みうる。なぜならLacIはトランスポザー
ゼをコードするポリヌクレオチドの発現を阻害するからである。この非組込み型
ベクターは、更に、制御ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとして、La
cIをコードするポリヌクレオチドを含みうる。前記オペレーター配列はテトラサ
イクリン応答要素であってもよく、その場合、この非組込み型ベクターは更に、
制御ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとして、tTA 又はrtTAをコード
するポリヌクレオチドを含みうる。
【００１８】 また本発明は、核酸供給系の作製方法であって、トランスポザーゼと結合する
逆方向反復配列によって挟まれたポリヌクレオチド、トランスポザーゼをコード
するポリヌクレオチド、及びそのトランスポザーゼをコードするポリヌクレオチ
ドの発現を改変する制御ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでい
る非組込み型アデノウイルスベースのウイルスベクター、例えばヘルパー依存性
アデノウイルスベクターを構築することを含んでいる前記作製方法にも関する。
この方法は更に、トランスポザーゼの発現を抑制する条件下で、前記非組込み型
アデノウイルスベースのウイルスベクターをパッケージングすることを含んでな
る。前記非組込み型ベクターは更に、前記のトランスポザーゼをコードするポリ
ヌクレオチドに作用可能に連結したオペレーター配列を含みうる。このオペレー
ター配列がlac オペレーター配列を含んでいる場合、前記の制御ポリペプチドを
コードするポリヌクレオチドはLacIをコードし、そしてこのLacIはトランスポザ
ーゼをコードするポリヌクレオチドの発現を阻害する。前記のオペレーター配列
がテトラサイクリン応答要素を含んでいる場合、前記の制御ポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドはtTA 又はrtTAをコードする。
逆方向反復配列によって挟まれたポリヌクレオチド、トランスポザーゼをコード
するポリヌクレオチド、及びそのトランスポザーゼをコードするポリヌクレオチ
ドの発現を改変する制御ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでい
る非組込み型アデノウイルスベースのウイルスベクター、例えばヘルパー依存性
アデノウイルスベクターを構築することを含んでいる前記作製方法にも関する。
この方法は更に、トランスポザーゼの発現を抑制する条件下で、前記非組込み型
アデノウイルスベースのウイルスベクターをパッケージングすることを含んでな
る。前記非組込み型ベクターは更に、前記のトランスポザーゼをコードするポリ
ヌクレオチドに作用可能に連結したオペレーター配列を含みうる。このオペレー
ター配列がlac オペレーター配列を含んでいる場合、前記の制御ポリペプチドを
コードするポリヌクレオチドはLacIをコードし、そしてこのLacIはトランスポザ
ーゼをコードするポリヌクレオチドの発現を阻害する。前記のオペレーター配列
がテトラサイクリン応答要素を含んでいる場合、前記の制御ポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドはtTA 又はrtTAをコードする。
【００１９】 本発明は更に、哺乳動物、例えば人間を治療する方法であって、患者に非組込
み型ウイルスベクターを投与することを含んでなる前記治療方法に関する。この
非組込み型ウイルスベクターは、第一制御配列に作用可能に連結された治療剤を
コードするポリヌクレオチド、トランスポザーゼと結合する逆方向反復配列によ
って挟まれた治療剤をコードするポリヌクレオチドと第一制御配列との組合せ、
及びオペレーター配列を含んでいる第二制御配列に作用可能に連結されたトラン
スポザーゼをコードするポリヌクレオチドを含んでいる。別の点として、この非
組込み型ウイルスベクターは、第一制御配列に作用可能に連結された治療剤をコ
ードするポリヌクレオチド、トランスポザーゼと結合する逆方向反復配列によっ
て挟まれた治療剤をコードするポリヌクレオチドと第一制御配列との組合せ、ト
ランスポザーゼをコードするポリヌクレオチド、及び、そのトランスポザーゼを
コードするポリヌクレオチドの発現を改変する制御ポリペプチドをコードするポ
リヌクレオチドを含んでいる。この非組込み型ウイルスベクターを、患者の臓器
又は組織、例えば肝臓、神経系、脳、肺、皮膚、心臓血管系、心臓、造血系、骨
髄、又は筋肉に投与しうる。前記治療剤はポリペプチド又はRNA 分子であってよ
い。前記患者は、あるポリペプチド又はRNA の生産が標準未満に低下することを
特徴とする遺伝病を有する患者でよい。
み型ウイルスベクターを投与することを含んでなる前記治療方法に関する。この
非組込み型ウイルスベクターは、第一制御配列に作用可能に連結された治療剤を
コードするポリヌクレオチド、トランスポザーゼと結合する逆方向反復配列によ
って挟まれた治療剤をコードするポリヌクレオチドと第一制御配列との組合せ、
及びオペレーター配列を含んでいる第二制御配列に作用可能に連結されたトラン
スポザーゼをコードするポリヌクレオチドを含んでいる。別の点として、この非
組込み型ウイルスベクターは、第一制御配列に作用可能に連結された治療剤をコ
ードするポリヌクレオチド、トランスポザーゼと結合する逆方向反復配列によっ
て挟まれた治療剤をコードするポリヌクレオチドと第一制御配列との組合せ、ト
ランスポザーゼをコードするポリヌクレオチド、及び、そのトランスポザーゼを
コードするポリヌクレオチドの発現を改変する制御ポリペプチドをコードするポ
リヌクレオチドを含んでいる。この非組込み型ウイルスベクターを、患者の臓器
又は組織、例えば肝臓、神経系、脳、肺、皮膚、心臓血管系、心臓、造血系、骨
髄、又は筋肉に投与しうる。前記治療剤はポリペプチド又はRNA 分子であってよ
い。前記患者は、あるポリペプチド又はRNA の生産が標準未満に低下することを
特徴とする遺伝病を有する患者でよい。
【００２０】 本発明はまた、哺乳動物、例えば人間を治療する方法であって、患者の細胞を
外植すること、及び、第一制御配列に作用可能に連結された治療剤をコードする
ポリヌクレオチド、トランスポザーゼと結合する逆方向反復配列によって挟まれ
た治療剤をコードするポリヌクレオチドと第一制御配列との組合せ、及びオペレ
ーター配列を含んでいる第二制御配列に作用可能に連結されたトランスポザーゼ
をコードするポリヌクレオチドを含んでいる非組込み型ウイルスベクターに、前
記の外植した細胞を接触させることを含んでなる前記治療方法にも関する。ある
いは、前記の外植した細胞を、第一制御配列に作用可能に連結された治療剤をコ
ードするポリヌクレオチド、トランスポザーゼと結合する逆方向反復配列によっ
て挟まれた治療剤をコードするポリヌクレオチドと第一制御配列との組合せ、ト
ランスポザーゼをコードするポリヌクレオチド、及びそのトランスポザーゼをコ
ードするポリヌクレオチドの発現を改変する制御ポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチドを含んでいる非組込み型ウイルスベクターに接触させる。次に、そ
の患者内で治療剤の生産を誘発するために、このトランスジェニック細胞を患者
に移植する。前記細胞は、造血幹細胞、肝細胞、筋原細胞、線維芽細胞、角化細
胞、内皮細胞、又は腫瘍細胞、例えばガン細胞であってよい。前記治療剤はポリ
ペプチド又はRNA であってよい。
外植すること、及び、第一制御配列に作用可能に連結された治療剤をコードする
ポリヌクレオチド、トランスポザーゼと結合する逆方向反復配列によって挟まれ
た治療剤をコードするポリヌクレオチドと第一制御配列との組合せ、及びオペレ
ーター配列を含んでいる第二制御配列に作用可能に連結されたトランスポザーゼ
をコードするポリヌクレオチドを含んでいる非組込み型ウイルスベクターに、前
記の外植した細胞を接触させることを含んでなる前記治療方法にも関する。ある
いは、前記の外植した細胞を、第一制御配列に作用可能に連結された治療剤をコ
ードするポリヌクレオチド、トランスポザーゼと結合する逆方向反復配列によっ
て挟まれた治療剤をコードするポリヌクレオチドと第一制御配列との組合せ、ト
ランスポザーゼをコードするポリヌクレオチド、及びそのトランスポザーゼをコ
ードするポリヌクレオチドの発現を改変する制御ポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチドを含んでいる非組込み型ウイルスベクターに接触させる。次に、そ
の患者内で治療剤の生産を誘発するために、このトランスジェニック細胞を患者
に移植する。前記細胞は、造血幹細胞、肝細胞、筋原細胞、線維芽細胞、角化細
胞、内皮細胞、又は腫瘍細胞、例えばガン細胞であってよい。前記治療剤はポリ
ペプチド又はRNA であってよい。
【００２１】発明の詳細な説明 非組込み型ベクター 本文では、用語「非組込み型ベクター」とは、ほとんど検出されない割合で宿
主細胞のゲノムDNA 内に組込まれるポリヌクレオチドを指す。好ましくは、非組
込み型ベクターは宿主細胞のゲノムDNA 内に組込まれ得ない。本発明のいくつか
の点では、当該非組込み型ベクターは、トランスポゾンの存在によって付与され
る組込み能力を有する。しかし、宿主細胞のゲノム内に組込まれるものはトラン
スポゾンであり、非組込み型ベクターではない。 本文では、用語「宿主細胞」、「標的細胞」及び「細胞」は、本発明の非組込
み型ベクターを導入しようとする、又は導入した真核細胞、好ましくは人間の細
胞を指すために互換的に用いられる。
主細胞のゲノムDNA 内に組込まれるポリヌクレオチドを指す。好ましくは、非組
込み型ベクターは宿主細胞のゲノムDNA 内に組込まれ得ない。本発明のいくつか
の点では、当該非組込み型ベクターは、トランスポゾンの存在によって付与され
る組込み能力を有する。しかし、宿主細胞のゲノム内に組込まれるものはトラン
スポゾンであり、非組込み型ベクターではない。 本文では、用語「宿主細胞」、「標的細胞」及び「細胞」は、本発明の非組込
み型ベクターを導入しようとする、又は導入した真核細胞、好ましくは人間の細
胞を指すために互換的に用いられる。
【００２２】 本文では、用語「ポリヌクレオチド」は、任意の長さの、リボヌクレオチド又
はデオキシリボヌクレオチドのいずれかのヌクレオチドの重合体を指し、二本鎖
及び一本鎖のDNA 及びRNA の双方を含んでいる。ポリヌクレオチドは、種々の機
能を有するヌクレオチド配列、例えばコード配列、及び制御配列などの非コード
配列を含みうる。コード配列、非コード配列、及び制御配列を下記で定義する。
ポリヌクレオチドを、天然の材料から直接得ること、あるいは組換え的、酵素的
又は化学的方法により調製することができる。ポリヌクレオチドは、構造上線状
又は還状でよい。ポリヌクレオチドは、例えば、発現ベクター又はクローニング
ベクターなどのベクターの一部分、あるいは断片でよい。特に言及しない場合、
本発明の用語は単数又は複数を含んで意味する。
はデオキシリボヌクレオチドのいずれかのヌクレオチドの重合体を指し、二本鎖
及び一本鎖のDNA 及びRNA の双方を含んでいる。ポリヌクレオチドは、種々の機
能を有するヌクレオチド配列、例えばコード配列、及び制御配列などの非コード
配列を含みうる。コード配列、非コード配列、及び制御配列を下記で定義する。
ポリヌクレオチドを、天然の材料から直接得ること、あるいは組換え的、酵素的
又は化学的方法により調製することができる。ポリヌクレオチドは、構造上線状
又は還状でよい。ポリヌクレオチドは、例えば、発現ベクター又はクローニング
ベクターなどのベクターの一部分、あるいは断片でよい。特に言及しない場合、
本発明の用語は単数又は複数を含んで意味する。
【００２３】 非組込み型ベクターは、限定ではないが、非組込み型プラスミドベクター及び
非組込み型ウイルスベクターを含んでいる。非組込み型ベクターは、クローニン
グ、すなわちポリヌクレオチドの増幅のためにも提供されうる。非組込み型ベク
ターを、宿主細胞にトランスポゾン要素を導入するために用いることもできる。
典型的には、非組込み型プラスミドベクターは、細菌宿主、例えば大腸菌内で複
製することができる。典型的には、非組込み型ウイルスベクターは、真核細胞内
で複製することができる。
非組込み型ウイルスベクターを含んでいる。非組込み型ベクターは、クローニン
グ、すなわちポリヌクレオチドの増幅のためにも提供されうる。非組込み型ベク
ターを、宿主細胞にトランスポゾン要素を導入するために用いることもできる。
典型的には、非組込み型プラスミドベクターは、細菌宿主、例えば大腸菌内で複
製することができる。典型的には、非組込み型ウイルスベクターは、真核細胞内
で複製することができる。
【００２４】 好ましくは、非組込み型ベクターは非組込み型ウイルスベクターである。非組
込み型ウイルスベクターは、適当な条件下でポリヌクレオチドの複製及びパッケ
ージングのために提供されるヌクレオチド配列を含んでいる。限定ではなく、好
ましい非組込み型ウイルスベクターの例には、アデノウイルス、単純ヘルペスウ
イルス(HSV）、アルファウイルス、サルウイルス40、ピコルナウイルス、及びワ
クシニアウイルスがある。好ましい非組込み型ウイルスベクターの別の例はアデ
ノ関連ウイルス(AAV）であり、これはいくつかの組織の細胞中では非組込み的で
ある。好ましくは、非組込み型ウイルスベクターはアデノウイルス、HSV 、又は
AAV であり、より好ましくはアデノウイルス又はHSV であり、最も好ましくはア
デノウイルスである。非組込み型ウイルスベクターの利点は多く、高力価で生産
できること、インビボで安定であること、そして宿主細胞に効率的に感染するこ
となどがある。
込み型ウイルスベクターは、適当な条件下でポリヌクレオチドの複製及びパッケ
ージングのために提供されるヌクレオチド配列を含んでいる。限定ではなく、好
ましい非組込み型ウイルスベクターの例には、アデノウイルス、単純ヘルペスウ
イルス(HSV）、アルファウイルス、サルウイルス40、ピコルナウイルス、及びワ
クシニアウイルスがある。好ましい非組込み型ウイルスベクターの別の例はアデ
ノ関連ウイルス(AAV）であり、これはいくつかの組織の細胞中では非組込み的で
ある。好ましくは、非組込み型ウイルスベクターはアデノウイルス、HSV 、又は
AAV であり、より好ましくはアデノウイルス又はHSV であり、最も好ましくはア
デノウイルスである。非組込み型ウイルスベクターの利点は多く、高力価で生産
できること、インビボで安定であること、そして宿主細胞に効率的に感染するこ
となどがある。
【００２５】 本発明のアデノウイルスベクターは、反復性の末端反復配列(ITR）を含んでい
て、これは、パッケージング中におけるアデノウイルスベクターの複製に必要で
ある。本発明の好ましい態様では、「ヘルパー依存性(HD)」のアデノウイルスベ
クターが用いられる（例えばWO97/15679; Parks et al., Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA, 93, 13565-13570 (1996); Hardy et al., J. Virol., 71, 1842-1849 (
1997）参照）。HDアデノウイルスベクターは、当技術分野では「中身のない(gut
ted)」又は「ガッツのない(gutless）」アデノウイルスベクターとも称されてい
る。HDアデノウイルスは、典型的には、通常のアデノウイルスに比べて有意に低
い免疫応答を示し、しかも当該構成体内のトランスポゾン関連成分をより良く挿
入することができる。HDアデノウイルスベクターは、最低限、アデノウイルス中
に存在する反復性の末端反復配列(ITR）を含んでいる。
て、これは、パッケージング中におけるアデノウイルスベクターの複製に必要で
ある。本発明の好ましい態様では、「ヘルパー依存性(HD)」のアデノウイルスベ
クターが用いられる（例えばWO97/15679; Parks et al., Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA, 93, 13565-13570 (1996); Hardy et al., J. Virol., 71, 1842-1849 (
1997）参照）。HDアデノウイルスベクターは、当技術分野では「中身のない(gut
ted)」又は「ガッツのない(gutless）」アデノウイルスベクターとも称されてい
る。HDアデノウイルスは、典型的には、通常のアデノウイルスに比べて有意に低
い免疫応答を示し、しかも当該構成体内のトランスポゾン関連成分をより良く挿
入することができる。HDアデノウイルスベクターは、最低限、アデノウイルス中
に存在する反復性の末端反復配列(ITR）を含んでいる。
【００２６】 場合により、非組込み型ベクターは、更に、このベクターの供給に用いること
ができる供給担体を含みうる。例えば、このベクターを、リポソーム内に封入す
るか、又はポリカチオン性ポリペプチド（例えばポリリシン含有ポリペプチド又
はポリエチレンイミン）などの核酸濃縮剤により濃縮することができる。あるい
は、このベクターがウイルスベクターであるならば、この特定のベクターに適す
る方法によりこのベクターをパッケージングすることができる。この様な方法は
当分野で既知である（アデノウイルスの場合、例えばBecker et al., Methods i
n Cell Biol., 43 (PtA), 161-189 (1994); Parks et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 93, 13565-13570 (1996)参照）。
ができる供給担体を含みうる。例えば、このベクターを、リポソーム内に封入す
るか、又はポリカチオン性ポリペプチド（例えばポリリシン含有ポリペプチド又
はポリエチレンイミン）などの核酸濃縮剤により濃縮することができる。あるい
は、このベクターがウイルスベクターであるならば、この特定のベクターに適す
る方法によりこのベクターをパッケージングすることができる。この様な方法は
当分野で既知である（アデノウイルスの場合、例えばBecker et al., Methods i
n Cell Biol., 43 (PtA), 161-189 (1994); Parks et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 93, 13565-13570 (1996)参照）。
【００２７】 本発明では、当該非組込み型ベクター、好ましくは非組込み型ウイルスベクタ
ーを用いて、種々の組合せで、トランスポゾン、トランスポゾンの切り出し及び
挿入を仲介するトランスポザーゼをコードするヌクレオチド配列、及び／又は、
トランスポザーゼの発現を制御する制御ポリペプチドをコードするヌクレオチド
配列を宿主細胞に供給することができる。好ましくは、当該非組込み型ベクター
は、トランスポゾン、より好ましくはトランスポゾン及びトランスポザーゼをコ
ードするヌクレオチド配列の両方を含んでいる。最も好ましくは、当該非組込み
型ベクターは、トランスポゾン、トランスポザーゼをコードするヌクレオチド配
列、及び制御ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでいる。
ーを用いて、種々の組合せで、トランスポゾン、トランスポゾンの切り出し及び
挿入を仲介するトランスポザーゼをコードするヌクレオチド配列、及び／又は、
トランスポザーゼの発現を制御する制御ポリペプチドをコードするヌクレオチド
配列を宿主細胞に供給することができる。好ましくは、当該非組込み型ベクター
は、トランスポゾン、より好ましくはトランスポゾン及びトランスポザーゼをコ
ードするヌクレオチド配列の両方を含んでいる。最も好ましくは、当該非組込み
型ベクターは、トランスポゾン、トランスポザーゼをコードするヌクレオチド配
列、及び制御ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでいる。
【００２８】トランスポゾン 本発明の非組込み型ベクターは、トランスポゾン要素（本文ではトランスポゾ
ンとも称する）を含むことができる。トランスポゾンは、その両末端上のシス作
用性ヌクレオチド配列によって挟まれたポリヌクレオチドを含んでいる。本発明
は、ある特定のトランスポゾン要素の使用に限定されるものではない。なぜなら
本発明の非組込み型ベクターを、限定なく、標的細胞内で機能を示す任意のトラ
ンスポゾンを供給するために用いることができると予想されるからである。好ま
しくは、非組込み型ウイルスベクターからトランスポゾンが切り出されて、細胞
が分裂しているか否かに関わらず、細胞のゲノムDNA にそれが組込まれうる。少
なくとも１つのシス作用性ヌクレオチド配列がポリヌクレオチドの5'側に配置さ
れ、そして少なくとも１つのシス作用性ヌクレオチド配列がそのポリヌクレオチ
ドの3'側に配置された場合、そのポリヌクレオチドはシス作用性ヌクレオチド配
列によって挟まれている。シス作用性ヌクレオチド配列は、トランスポゾンの各
末端に少なくとも１つの逆方向反復配列(IR)を含んでいて、それに、トランスポ
ザーゼ、好ましくはSBファミリー内のトランスポザーゼが結合する。SBファミリ
ーのトランスポザーゼを下記に詳しく述べる。
ンとも称する）を含むことができる。トランスポゾンは、その両末端上のシス作
用性ヌクレオチド配列によって挟まれたポリヌクレオチドを含んでいる。本発明
は、ある特定のトランスポゾン要素の使用に限定されるものではない。なぜなら
本発明の非組込み型ベクターを、限定なく、標的細胞内で機能を示す任意のトラ
ンスポゾンを供給するために用いることができると予想されるからである。好ま
しくは、非組込み型ウイルスベクターからトランスポゾンが切り出されて、細胞
が分裂しているか否かに関わらず、細胞のゲノムDNA にそれが組込まれうる。少
なくとも１つのシス作用性ヌクレオチド配列がポリヌクレオチドの5'側に配置さ
れ、そして少なくとも１つのシス作用性ヌクレオチド配列がそのポリヌクレオチ
ドの3'側に配置された場合、そのポリヌクレオチドはシス作用性ヌクレオチド配
列によって挟まれている。シス作用性ヌクレオチド配列は、トランスポゾンの各
末端に少なくとも１つの逆方向反復配列(IR)を含んでいて、それに、トランスポ
ザーゼ、好ましくはSBファミリー内のトランスポザーゼが結合する。SBファミリ
ーのトランスポザーゼを下記に詳しく述べる。
【００２９】 各逆方向反復配列は、好ましくは１又は複数の直列反復配列を含んでいる。こ
の直列反復配列のヌクレオチド配列は、好ましくは、下記の共通直列反復配列（
配列番号１）に対して少なくとも約80％相同である。直列反復配列の長さは、典
型的には約25〜約35塩基対、好ましくは約29〜約31塩基対である。それにもかか
わらず、逆方向反復配列は、場合により、単一の直列配列しか含んでいない。こ
の場合、この直列反復配列は、現実には反復配列ではないが、それでも、下記に
詳しく説明する共通直列反復配列に少なくとも約80％相同であるポリヌクレオチ
ドである。
の直列反復配列のヌクレオチド配列は、好ましくは、下記の共通直列反復配列（
配列番号１）に対して少なくとも約80％相同である。直列反復配列の長さは、典
型的には約25〜約35塩基対、好ましくは約29〜約31塩基対である。それにもかか
わらず、逆方向反復配列は、場合により、単一の直列配列しか含んでいない。こ
の場合、この直列反復配列は、現実には反復配列ではないが、それでも、下記に
詳しく説明する共通直列反復配列に少なくとも約80％相同であるポリヌクレオチ
ドである。
【００３０】 本発明のいくつかの点では、各逆方向反復配列には２つの直列反復配列が存在
する。この直列反復配列（この態様では、その数は４つ）は、下記詳細の通り、
類似するポリヌクレオチドを有する。この態様のトランスポゾンの5'側、すなわ
ち左側に存在する逆方向反復配列は、典型的には、１つ目の直列反復配列（すな
わち左外側反復配列）、介在領域、そして２つ目の直列反復配列（すなわち左内
側反復配列）を含んでいる。この態様のトランスポゾンの3'側、すなわち右側に
存在する逆方向反復配列は、１つ目の直列反復配列（すなわち右内側反復配列）
、介在領域、そして２つ目の直列反復配列（すなわち右外側反復配列）を含んで
いる。
する。この直列反復配列（この態様では、その数は４つ）は、下記詳細の通り、
類似するポリヌクレオチドを有する。この態様のトランスポゾンの5'側、すなわ
ち左側に存在する逆方向反復配列は、典型的には、１つ目の直列反復配列（すな
わち左外側反復配列）、介在領域、そして２つ目の直列反復配列（すなわち左内
側反復配列）を含んでいる。この態様のトランスポゾンの3'側、すなわち右側に
存在する逆方向反復配列は、１つ目の直列反復配列（すなわち右内側反復配列）
、介在領域、そして２つ目の直列反復配列（すなわち右外側反復配列）を含んで
いる。
【００３１】 それらは、トランスポゾン上で相互に逆転しているので、そのトランスポゾン
の5'側逆方向反復配列内の直列反復配列は、そのトランスポゾンの3'側逆方向反
復配列内の直列配列に対して逆方向を示す。逆方向反復配列内の介在領域の長さ
は、一般的には少なくとも約150 塩基対、好ましくは少なくとも約160 塩基対で
ある。この介在領域の長さは、好ましくは約200 塩基対以下、より好ましくは約
180 塩基対以下である。一方の逆方向反復配列内の介在領域のヌクレオチド配列
は、もう一方の逆方向反復配列内の介在領域のヌクレオチド配列に対して相似で
も、又は相似でなくてもよい。
の5'側逆方向反復配列内の直列反復配列は、そのトランスポゾンの3'側逆方向反
復配列内の直列配列に対して逆方向を示す。逆方向反復配列内の介在領域の長さ
は、一般的には少なくとも約150 塩基対、好ましくは少なくとも約160 塩基対で
ある。この介在領域の長さは、好ましくは約200 塩基対以下、より好ましくは約
180 塩基対以下である。一方の逆方向反復配列内の介在領域のヌクレオチド配列
は、もう一方の逆方向反復配列内の介在領域のヌクレオチド配列に対して相似で
も、又は相似でなくてもよい。
【００３２】 ほとんどのトランスポゾンは完全な逆方向反復配列を有するが、SBタンパク質
と結合する逆方向反復配列は、好ましくは、共通直列反復配列に対して少なくと
も約80％、好ましくは少なくとも約90％相同である直列反復配列を含んでいる。
好ましい共通直列反復配列は5'-CMSWKKRRGTCRGAAGTTTACATACACTTAAK(配列番号１
）である。ただしＭはＡ又はＣ、ＳはＧ又はＣ、ＷはＡ又はＴ、ＫはＧ又はＴ、
そしてＲはＧ又はＡである。SBタンパク質の推定コア結合部位は配列番号１のヌ
クレオチド３〜31である。
と結合する逆方向反復配列は、好ましくは、共通直列反復配列に対して少なくと
も約80％、好ましくは少なくとも約90％相同である直列反復配列を含んでいる。
好ましい共通直列反復配列は5'-CMSWKKRRGTCRGAAGTTTACATACACTTAAK(配列番号１
）である。ただしＭはＡ又はＣ、ＳはＧ又はＣ、ＷはＡ又はＴ、ＫはＧ又はＴ、
そしてＲはＧ又はＡである。SBタンパク質の推定コア結合部位は配列番号１のヌ
クレオチド３〜31である。
【００３３】 ヌクレオチドの相同性は、ある直列反復配列と配列番号１との比較として定義
され、そしてこれは、前記の２つのポリヌクレオチド（すなわち候補の直列反復
配列のヌクレオチド配列及び配列番号１のヌクレオチド配列）の残基を、それら
の配列に沿って同一ヌクレオチド数が最大となる様に整列させることによって決
定される。共有するヌクレオチド数を最大にするために、その整列を作成する際
に、一方又は両方の配列中にギャップを入れてもよいが、それでも各配列のヌク
レオチドの適正な順番を保たなければならない。候補の直列反復配列とは、配列
番号１の配列と比較される直列反復配列のことである。
され、そしてこれは、前記の２つのポリヌクレオチド（すなわち候補の直列反復
配列のヌクレオチド配列及び配列番号１のヌクレオチド配列）の残基を、それら
の配列に沿って同一ヌクレオチド数が最大となる様に整列させることによって決
定される。共有するヌクレオチド数を最大にするために、その整列を作成する際
に、一方又は両方の配列中にギャップを入れてもよいが、それでも各配列のヌク
レオチドの適正な順番を保たなければならない。候補の直列反復配列とは、配列
番号１の配列と比較される直列反復配列のことである。
【００３４】 好ましくは、２つのヌクレオチド配列を、BLAST2検索アルゴリズムのBlastnプ
ログラム、バージョン2.0.11を用いて比較する。これは、Tatiana, et al., FEM
S Microbiol Lett, 174, 247-250 (1999）に記載されており、そしてhttp://www
.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html において利用できる。好ましくは、BLAST2検
索の全てのパラメーターにおいてデフォルト値を用いる。例えばreward for mat
ch = 1, penalty for mismatch = -2, open gap penalty = 5, extension gap p
enalty = 2, gap x dropoff = 50, expect = 10, wordsize = 11、そしてフィル
ターオンである。BLAST 検索アルゴリズムによる２つのヌクレオチド配列の比較
において、ヌクレオチドの相同性を単に相同性ともいう。
ログラム、バージョン2.0.11を用いて比較する。これは、Tatiana, et al., FEM
S Microbiol Lett, 174, 247-250 (1999）に記載されており、そしてhttp://www
.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html において利用できる。好ましくは、BLAST2検
索の全てのパラメーターにおいてデフォルト値を用いる。例えばreward for mat
ch = 1, penalty for mismatch = -2, open gap penalty = 5, extension gap p
enalty = 2, gap x dropoff = 50, expect = 10, wordsize = 11、そしてフィル
ターオンである。BLAST 検索アルゴリズムによる２つのヌクレオチド配列の比較
において、ヌクレオチドの相同性を単に相同性ともいう。
【００３５】 SBタンパク質と結合する直列反復配列の例には、左外側反復配列5'-GTTGAAGTC
GGAAGTTTACATACACTTAA-3'(配列番号２）；左内側反復配列5'-CAGTGGGTCAGAAGTTT
ACATACACTAAG-3'(配列番号３）；右内側反復配列5'-AACTCACATACAATTGAAGACTGGG
TGAC-3'(配列番号４）；及び右外側反復配列5'-ATTCCACATACATTTGAAGGCTGAAGTTG
-3'(配列番号５）がある。前記の通り、右側直列反復配列（配列番号４及び５）
は、トランスポゾン上で存在するであろう通りに表している。すなわち、それら
のヌクレオチドは、左側反復配列（配列番号２及び３）のポリヌクレオチドと相
同性を比較する場合とは逆の順序になっている。好ましくは、逆方向反復配列（
配列番号５）は、トランスポゾンの3'側、すなわち右側に存在し、そしてそのト
ランスポゾンは、各逆方向反復配列内に２つの直列反復配列を含んでなる。
GGAAGTTTACATACACTTAA-3'(配列番号２）；左内側反復配列5'-CAGTGGGTCAGAAGTTT
ACATACACTAAG-3'(配列番号３）；右内側反復配列5'-AACTCACATACAATTGAAGACTGGG
TGAC-3'(配列番号４）；及び右外側反復配列5'-ATTCCACATACATTTGAAGGCTGAAGTTG
-3'(配列番号５）がある。前記の通り、右側直列反復配列（配列番号４及び５）
は、トランスポゾン上で存在するであろう通りに表している。すなわち、それら
のヌクレオチドは、左側反復配列（配列番号２及び３）のポリヌクレオチドと相
同性を比較する場合とは逆の順序になっている。好ましくは、逆方向反復配列（
配列番号５）は、トランスポゾンの3'側、すなわち右側に存在し、そしてそのト
ランスポゾンは、各逆方向反復配列内に２つの直列反復配列を含んでなる。
【００３６】 一つの態様では、直列反復配列は、少なくとも下記配列：ACATACAC（配列番号
６）を含んでいる。 本発明の１つの好ましい逆方向反復配列は配列番号７： 5'-AGTTGAAGTC GGAAGTTTAC ATACACTTAA GTTGGAGTCA TTAAAACTCG TTTTTCAACT ACACCACAAA TTTCTTGTTA ACAAACAATA GTTTTGGCAA GTCAGTTAGG ACATCTACTT TGTGCATGAC ACAAGTCATT TTTCCAACAA TTGTTTACAG ACAGATTATT TCACTTATAA TTCACTGTAT CACAATTCCA GTGGGTCAGA AGTTTACATA CACTAA-3' であり、そしてもう１つの好ましい逆方向反復配列は配列番号８： 5'-TTGAGTGTAT GTTAACTTCT GACCCACTGG GAATGTGATG AAAGAAATAA AAGCTGAAAT GAATCATTCT CTCTACTATT ATTCTGATAT TTCACATTCT TAAAATAAAG TGGTGATCCT AACTGACCTT AAGACAGGGA ATCTTTACTC GGATTAAATG TCAGGAATTG TGAAAAAGTG AGTTTAAATG TATTTGGCTA AGGTGTATGT AAACTTCCGA CTTCAACTG-3' である。
６）を含んでいる。 本発明の１つの好ましい逆方向反復配列は配列番号７： 5'-AGTTGAAGTC GGAAGTTTAC ATACACTTAA GTTGGAGTCA TTAAAACTCG TTTTTCAACT ACACCACAAA TTTCTTGTTA ACAAACAATA GTTTTGGCAA GTCAGTTAGG ACATCTACTT TGTGCATGAC ACAAGTCATT TTTCCAACAA TTGTTTACAG ACAGATTATT TCACTTATAA TTCACTGTAT CACAATTCCA GTGGGTCAGA AGTTTACATA CACTAA-3' であり、そしてもう１つの好ましい逆方向反復配列は配列番号８： 5'-TTGAGTGTAT GTTAACTTCT GACCCACTGG GAATGTGATG AAAGAAATAA AAGCTGAAAT GAATCATTCT CTCTACTATT ATTCTGATAT TTCACATTCT TAAAATAAAG TGGTGATCCT AACTGACCTT AAGACAGGGA ATCTTTACTC GGATTAAATG TCAGGAATTG TGAAAAAGTG AGTTTAAATG TATTTGGCTA AGGTGTATGT AAACTTCCGA CTTCAACTG-3' である。
【００３７】 この逆方向反復配列（配列番号８）は、ヌクレオチド104〜109にポリＡシグナ
ルAATAAAを含んでいる。このポリＡシグナルは、トランスポゾン内に存在するコ
ード配列により用いられうるものであり、その結果mRNAにポリＡ尾部が付加され
る。典型的には、mRNAへのポリＡ尾部の付加により、そのmRNAの安定性が、ポリ
Ａ尾部のない同一mRNAに比べて増加する。
ルAATAAAを含んでいる。このポリＡシグナルは、トランスポゾン内に存在するコ
ード配列により用いられうるものであり、その結果mRNAにポリＡ尾部が付加され
る。典型的には、mRNAへのポリＡ尾部の付加により、そのmRNAの安定性が、ポリ
Ａ尾部のない同一mRNAに比べて増加する。
【００３８】 逆方向反復配列(IR)により挟まれたポリヌクレオチドは、コード配列又は非コ
ード配列を含んでよい。本文では「コード配列」とは、RNA をコードし、そして
適当な制御配列の支配下に配置すると、そのコードされたRNA を発現するポリヌ
クレオチドのことである。このRNA は、生物学的に活性なRNA 、例えばmRNA又は
リボザイムであってよい。mRNAは、宿主細胞内で翻訳され、そして生物学的に活
性なポリペプチドを生産する。コード領域の境界は一般的には、5'末端の翻訳開
始コドンと3'末端の翻訳停止コドンにより決定される。
ード配列を含んでよい。本文では「コード配列」とは、RNA をコードし、そして
適当な制御配列の支配下に配置すると、そのコードされたRNA を発現するポリヌ
クレオチドのことである。このRNA は、生物学的に活性なRNA 、例えばmRNA又は
リボザイムであってよい。mRNAは、宿主細胞内で翻訳され、そして生物学的に活
性なポリペプチドを生産する。コード領域の境界は一般的には、5'末端の翻訳開
始コドンと3'末端の翻訳停止コドンにより決定される。
【００３９】 「制御配列」は、これが作用可能に連結されているコード配列の発現を制御す
るヌクレオチド配列である。制御配列の例は、限定でなく、プロモーター、エン
ハンサー、転写開始部位、翻訳開始部位、翻訳停止部位、転写停止部位、及びポ
リＡシグナルである。用語「作用可能に連結された」とは、成分の並置であって
、それらの成分が、各々の意図した様式で機能できる関係にある様に並置される
ことを指す。制御配列がコード領域に作用可能に連結される場合、その制御配列
に適合する条件下でそのコード領域の発現が達成される様になる。便宜上、かつ
下記で明白となる理由のために、IRによって挟まれたコード配列に作用可能に連
結される制御配列を、本文では第一制御配列と称する。
るヌクレオチド配列である。制御配列の例は、限定でなく、プロモーター、エン
ハンサー、転写開始部位、翻訳開始部位、翻訳停止部位、転写停止部位、及びポ
リＡシグナルである。用語「作用可能に連結された」とは、成分の並置であって
、それらの成分が、各々の意図した様式で機能できる関係にある様に並置される
ことを指す。制御配列がコード領域に作用可能に連結される場合、その制御配列
に適合する条件下でそのコード領域の発現が達成される様になる。便宜上、かつ
下記で明白となる理由のために、IRによって挟まれたコード配列に作用可能に連
結される制御配列を、本文では第一制御配列と称する。
【００４０】 コード領域に作用可能に連結される第一制御配列内に存在するプロモーターは
、標的細胞内で機能するものであり、例えば制御性プロモーター、例えば誘導性
及び抑制性プロモーターなどである。制御性プロモーターの例は、組織特異的プ
ロモーター、すなわち、特定の組織を構成する細胞内に存在しなければ発現され
ないプロモーターである。組織特異的プロモーターの例は、限定でなく、肝細胞
で発現されるアルファ１抗トリプソンプロモーターである。場合により、当該プ
ロモーターは、構成的プロモーター、例えばサイトメガロウイルスの初期プロモ
ーター又はSV40の初期プロモーターである。
、標的細胞内で機能するものであり、例えば制御性プロモーター、例えば誘導性
及び抑制性プロモーターなどである。制御性プロモーターの例は、組織特異的プ
ロモーター、すなわち、特定の組織を構成する細胞内に存在しなければ発現され
ないプロモーターである。組織特異的プロモーターの例は、限定でなく、肝細胞
で発現されるアルファ１抗トリプソンプロモーターである。場合により、当該プ
ロモーターは、構成的プロモーター、例えばサイトメガロウイルスの初期プロモ
ーター又はSV40の初期プロモーターである。
【００４１】トランスポザーゼ 本発明の非組込み型ベクターは、場合により、トランスポザーゼをコードする
コード配列を含んでいる。このトランスポザーゼが、本発明の非組込み型ベクタ
ーからのトランスポゾンの切り出し、これに続いてそのトランスポゾンの、標的
細胞のゲノムDNA への組込みを仲介するならば、本発明は、特定のトランスポザ
ーゼの使用には限定されない。
コード配列を含んでいる。このトランスポザーゼが、本発明の非組込み型ベクタ
ーからのトランスポゾンの切り出し、これに続いてそのトランスポゾンの、標的
細胞のゲノムDNA への組込みを仲介するならば、本発明は、特定のトランスポザ
ーゼの使用には限定されない。
【００４２】 本発明で用いるための好ましいトランスポザーゼは、「眠り姫(Sleeping Beau
ty）」トランスポザーゼであり、これは本文ではSBトランスポザーゼ又はSBポリ
ペプチドと称される(Z. Ivics et al., Cell, 91, 501-510 (1997); WO98/40510
）。SBトランスポザーゼは、トランスポゾン由来の配列番号７及び８の逆方向反
復配列、及び直列反復配列（配列番号２〜５）、並びに共通直列反復配列（配列
番号１）と結合することができる。SBトランスポザーゼには、WO98/40510に詳述
されている通り、そのアミノ末端からカルボキシ末端に向かって、おそらくロイ
シンジッパーを有する対合様(paired-like）ドメイン、１又は複数の核局在化ド
メイン(NLS）、及びDD(34)E ボックスやグリシンリッチボックスを含んでいる触
媒ドメインを含んでいる。このSBファミリーのポリペプチドには、配列番号９の
アミノ酸配列を有するポリペプチドがある。好ましくは、SBファミリーのポリペ
プチドには、配列番号９に対して少なくとも約80％、より好ましくは少なくとも
約90％、最も好ましくは95％のアミノ酸相同性を有するアミノ酸配列を有するポ
リペプチドもある。
ty）」トランスポザーゼであり、これは本文ではSBトランスポザーゼ又はSBポリ
ペプチドと称される(Z. Ivics et al., Cell, 91, 501-510 (1997); WO98/40510
）。SBトランスポザーゼは、トランスポゾン由来の配列番号７及び８の逆方向反
復配列、及び直列反復配列（配列番号２〜５）、並びに共通直列反復配列（配列
番号１）と結合することができる。SBトランスポザーゼには、WO98/40510に詳述
されている通り、そのアミノ末端からカルボキシ末端に向かって、おそらくロイ
シンジッパーを有する対合様(paired-like）ドメイン、１又は複数の核局在化ド
メイン(NLS）、及びDD(34)E ボックスやグリシンリッチボックスを含んでいる触
媒ドメインを含んでいる。このSBファミリーのポリペプチドには、配列番号９の
アミノ酸配列を有するポリペプチドがある。好ましくは、SBファミリーのポリペ
プチドには、配列番号９に対して少なくとも約80％、より好ましくは少なくとも
約90％、最も好ましくは95％のアミノ酸相同性を有するアミノ酸配列を有するポ
リペプチドもある。
【００４３】 アミノ酸の相同性は、SBファミリーのポリペプチドと配列番号９との比較とし
て定義され、そしてこれは、前記の２つのアミノ酸配列（すなわち候補アミノ酸
配列及び配列番号９のアミノ酸配列）の残基を、それらの配列に沿って同一アミ
ノ酸数が最大となる様に整列させることによって決定される。同一のアミノ酸数
を最大にするために、その整列を作成する際に、一方又は両方の配列中にギャッ
プを入れてもよいが、それでも各配列のアミノ酸の適正な順番を保たなければな
らない。候補のアミノ酸配列とは、配列番号９のアミノ酸配列と比較されるアミ
ノ酸配列のことである。候補アミノ酸配列を、天然の材料から単離すること、あ
るいは組換え技術により作ること、あるいは化学的又は酵素的に合成することが
できる。
て定義され、そしてこれは、前記の２つのアミノ酸配列（すなわち候補アミノ酸
配列及び配列番号９のアミノ酸配列）の残基を、それらの配列に沿って同一アミ
ノ酸数が最大となる様に整列させることによって決定される。同一のアミノ酸数
を最大にするために、その整列を作成する際に、一方又は両方の配列中にギャッ
プを入れてもよいが、それでも各配列のアミノ酸の適正な順番を保たなければな
らない。候補のアミノ酸配列とは、配列番号９のアミノ酸配列と比較されるアミ
ノ酸配列のことである。候補アミノ酸配列を、天然の材料から単離すること、あ
るいは組換え技術により作ること、あるいは化学的又は酵素的に合成することが
できる。
【００４４】 好ましくは、２つのアミノ酸配列を、BLAST2検索アルゴリズムのBlastpプログ
ラム、バージョン2.0.11を用いて比較する。これは、Tatiana, et al., FEMS Mi
crobiol Lett, 174, 247-250 (1999）に記載されており、そしてhttp://www.ncb
i.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html において利用できる。好ましくは、BLAST2検索の
全てのパラメーターにおいてデフォルト値を用いる。例えばmatrix = BLOSUM62,
open gap penalty = 11, extension gap penalty = 1, gap x dropoff = 50, e
xpect = 10, wordsize = 3、そしてフィルターオンである。BLAST 検索アルゴリ
ズムによる２つのアミノ酸配列の比較において、アミノ酸相同性を単に相同性と
もいう。好ましくは、SBポリペプチドは、約10％ SDSポリアクリルアミドゲル上
で約35kD〜約40kDの分子量を有する。
ラム、バージョン2.0.11を用いて比較する。これは、Tatiana, et al., FEMS Mi
crobiol Lett, 174, 247-250 (1999）に記載されており、そしてhttp://www.ncb
i.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html において利用できる。好ましくは、BLAST2検索の
全てのパラメーターにおいてデフォルト値を用いる。例えばmatrix = BLOSUM62,
open gap penalty = 11, extension gap penalty = 1, gap x dropoff = 50, e
xpect = 10, wordsize = 3、そしてフィルターオンである。BLAST 検索アルゴリ
ズムによる２つのアミノ酸配列の比較において、アミノ酸相同性を単に相同性と
もいう。好ましくは、SBポリペプチドは、約10％ SDSポリアクリルアミドゲル上
で約35kD〜約40kDの分子量を有する。
【００４５】 本発明のいくつかの点で有用であるSBポリペプチドには、配列番号９の活性な
アナログ又は活性な断片がある。SBポリペプチドの活性アナログ又は活性断片は
、非組込み型ベクター、好ましくは非組込み型ウイルスベクターからのトランス
ポゾンの切り出しを仲介することができるものである。活性アナログ又は活性断
片は、トランスポゾン由来の配列番号７及び８の逆方向反復配列及び直列反復配
列（配列番号２〜５）、並びに共通直列反復配列（配列番号１）と結合すること
ができる。
アナログ又は活性な断片がある。SBポリペプチドの活性アナログ又は活性断片は
、非組込み型ベクター、好ましくは非組込み型ウイルスベクターからのトランス
ポゾンの切り出しを仲介することができるものである。活性アナログ又は活性断
片は、トランスポゾン由来の配列番号７及び８の逆方向反復配列及び直列反復配
列（配列番号２〜５）、並びに共通直列反復配列（配列番号１）と結合すること
ができる。
【００４６】 SBポリペプチドの活性アナログには、非組込み型ベクターからトランスポゾン
を切り出す能力を失わないアミノ酸置換を有するポリペプチドがある。置換アミ
ノ酸は、対象アミノ酸が属するクラス中の他のアミノ酸から選択されうる。例え
ば、非極性（疎水性）アミノ酸にはアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン
、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンがある。極性中性
アミノ酸にはグリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラ
ギン酸塩及びグルタミン酸塩がある。正荷電（塩基性）アミノ酸にはアルギニン
、リシン及びヒスチジンがある。負荷電（酸性）アミノ酸にはアスパラギン酸及
びグルタミン酸がある。好ましい保存置換の例には、正電荷を維持するためにAr
g の代りにLys 、及びその逆；負電荷を維持するためにAsp の代りにGlu 、及び
その逆；遊離-OH を維持するためにThr の代りにSer ；そして、遊離NH2 を維持
するためにAsn の代りにGln への置換がある。
を切り出す能力を失わないアミノ酸置換を有するポリペプチドがある。置換アミ
ノ酸は、対象アミノ酸が属するクラス中の他のアミノ酸から選択されうる。例え
ば、非極性（疎水性）アミノ酸にはアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン
、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンがある。極性中性
アミノ酸にはグリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラ
ギン酸塩及びグルタミン酸塩がある。正荷電（塩基性）アミノ酸にはアルギニン
、リシン及びヒスチジンがある。負荷電（酸性）アミノ酸にはアスパラギン酸及
びグルタミン酸がある。好ましい保存置換の例には、正電荷を維持するためにAr
g の代りにLys 、及びその逆；負電荷を維持するためにAsp の代りにGlu 、及び
その逆；遊離-OH を維持するためにThr の代りにSer ；そして、遊離NH2 を維持
するためにAsn の代りにGln への置換がある。
【００４７】 本文では用語「活性アナログ」には、修飾されたポリペプチドも含まれる。本
発明のポリペプチドの修飾には、１又は複数の構成アミノ酸における化学的及び
／又は酵素的誘導化、例えば側鎖の修飾、骨格の修飾、並びにＮ末端とＣ末端の
修飾、例えばアセチル化、水酸化、メチル化、アミド化、更に、炭水化物又は脂
質、補助因子及び類似物の結合が含まれる。ポリペプチドの活性断片には、生成
するポリペプチドが非組込み型ベクターからトランスポゾンを切り出すことがで
きる様に、１又は複数の連続又は非連続アミノ酸の欠失又は付加を有するポリペ
プチドの一部分が含まれる。
発明のポリペプチドの修飾には、１又は複数の構成アミノ酸における化学的及び
／又は酵素的誘導化、例えば側鎖の修飾、骨格の修飾、並びにＮ末端とＣ末端の
修飾、例えばアセチル化、水酸化、メチル化、アミド化、更に、炭水化物又は脂
質、補助因子及び類似物の結合が含まれる。ポリペプチドの活性断片には、生成
するポリペプチドが非組込み型ベクターからトランスポゾンを切り出すことがで
きる様に、１又は複数の連続又は非連続アミノ酸の欠失又は付加を有するポリペ
プチドの一部分が含まれる。
【００４８】 SBポリペプチドをコードするコード配列は、配列番号９のアミノ酸配列をコー
ドする配列番号10のヌクレオチド配列を含みうる。SBポリペプチドをコードする
ヌクレオチド配列を必ず変更するであろう前記アミノ酸置換の他に、あるSBタン
パク質と同じアミノ酸配列、例えば配列番号９のアミノ酸配列を有するSBポリペ
プチドをコードするが、特定のアミノ酸を規定するために用いられる３文字コド
ンの縮重が利用されている別のヌクレオチド配列が存在する。この様な遺伝子コ
ドンの縮重は当分野に周知であり、従って本開示の一部とみなす。更に、特定の
細胞タイプにとって好ましいコドンを用いる様に、特定のヌクレオチド配列を修
飾することもできる。この様な改変は当業者に既知であり、従って本開示の一部
とみなす。
ドする配列番号10のヌクレオチド配列を含みうる。SBポリペプチドをコードする
ヌクレオチド配列を必ず変更するであろう前記アミノ酸置換の他に、あるSBタン
パク質と同じアミノ酸配列、例えば配列番号９のアミノ酸配列を有するSBポリペ
プチドをコードするが、特定のアミノ酸を規定するために用いられる３文字コド
ンの縮重が利用されている別のヌクレオチド配列が存在する。この様な遺伝子コ
ドンの縮重は当分野に周知であり、従って本開示の一部とみなす。更に、特定の
細胞タイプにとって好ましいコドンを用いる様に、特定のヌクレオチド配列を修
飾することもできる。この様な改変は当業者に既知であり、従って本開示の一部
とみなす。
【００４９】 非組込み型ベクターがトランスポゾンと、トランスポザーゼをコードするポリ
ヌクレオチドとを共に含んでいる場合、そのトランスポザーゼをコードするポリ
ヌクレオチドの発現を制御することが好ましい。これにより、トランスポザーゼ
の発現が実質的に低下している条件下で、当該ベクターを操作すること、例えば
構築且つ増殖することが可能となる。従って、トランスポザーゼをコードする配
列を含んでいる非組込み型ベクターは、そのトランスポザーゼをコードするコー
ド配列に作用可能に連結された制御配列をも含んでいることが好ましい。トラン
スポザーゼをコードするコード配列に作用可能に連結される制御配列を、特に断
わらない限り、本文では「第二」制御配列と呼ぶ。
ヌクレオチドとを共に含んでいる場合、そのトランスポザーゼをコードするポリ
ヌクレオチドの発現を制御することが好ましい。これにより、トランスポザーゼ
の発現が実質的に低下している条件下で、当該ベクターを操作すること、例えば
構築且つ増殖することが可能となる。従って、トランスポザーゼをコードする配
列を含んでいる非組込み型ベクターは、そのトランスポザーゼをコードするコー
ド配列に作用可能に連結された制御配列をも含んでいることが好ましい。トラン
スポザーゼをコードするコード配列に作用可能に連結される制御配列を、特に断
わらない限り、本文では「第二」制御配列と呼ぶ。
【００５０】 好ましくは、第二制御配列は、標的細胞内で機能するプロモーターを含んでい
る。例えば、本発明のいくつかの態様では、このプロモーターは構成的プロモー
ター、例えばサイトメガロウイルスプロモーターである。好ましくは、この様な
プロモーターは、標的細胞に非組込み型ベクターを導入する前に、そのベクター
を構築及び／又は増殖するために用いられる細胞内では機能しないものである。
例えば、他の態様では、制御性プロモーターが好ましい。当該ベクターの操作中
、例えば非組込み型ウイルスベクターのパッケージング中に、トランスポザーゼ
の発現を最小にすることは、完全なベクターの生産を可能にするであろうことか
ら、有益であると予想される。この様な点で、好ましいプロモーターは、例えば
制御性プロモーター、例えば誘導性及び抑制性プロモーターである。
る。例えば、本発明のいくつかの態様では、このプロモーターは構成的プロモー
ター、例えばサイトメガロウイルスプロモーターである。好ましくは、この様な
プロモーターは、標的細胞に非組込み型ベクターを導入する前に、そのベクター
を構築及び／又は増殖するために用いられる細胞内では機能しないものである。
例えば、他の態様では、制御性プロモーターが好ましい。当該ベクターの操作中
、例えば非組込み型ウイルスベクターのパッケージング中に、トランスポザーゼ
の発現を最小にすることは、完全なベクターの生産を可能にするであろうことか
ら、有益であると予想される。この様な点で、好ましいプロモーターは、例えば
制御性プロモーター、例えば誘導性及び抑制性プロモーターである。
【００５１】 制御性プロモーターの例は、組織特異的プロモーター、すなわち、特定の組織
を構成する細胞内に存在しなければ発現しないプロモーターである。組織特異的
プロモーターの例は、限定でなく、肝細胞で発現されるアルファ１抗トリプソン
プロモーターである。制御性プロモーターの他の例は、限定でなく、重金属イオ
ン、温度増加、又はホルモンによって誘導されるプロモーターである。当分野に
おいて知られている、トランスポザーゼの発現を制御する他の方法を用いること
もできる。あるいは、トランスポゾンの逆方向反復配列に結合し、そして当核ベ
クターからのトランスポゾンの切り出し及び宿主細胞のゲノムDNA への組込みを
仲介するというトランスポザーゼの能力を制御する方法を用いることもできる。
を構成する細胞内に存在しなければ発現しないプロモーターである。組織特異的
プロモーターの例は、限定でなく、肝細胞で発現されるアルファ１抗トリプソン
プロモーターである。制御性プロモーターの他の例は、限定でなく、重金属イオ
ン、温度増加、又はホルモンによって誘導されるプロモーターである。当分野に
おいて知られている、トランスポザーゼの発現を制御する他の方法を用いること
もできる。あるいは、トランスポゾンの逆方向反復配列に結合し、そして当核ベ
クターからのトランスポゾンの切り出し及び宿主細胞のゲノムDNA への組込みを
仲介するというトランスポザーゼの能力を制御する方法を用いることもできる。
【００５２】 場合により、そして好ましくは、第二制御配列は、更に、作用可能に連結され
ているコード配列の発現を制御するために供される追加ヌクレオチド配列を含ん
でいる。例えば、第二制御配列は、更に、その中に存在するプロモーターに作用
可能に連結されるオペレーター配列を含んでよい。本文では用語「オペレーター
配列」は、作用可能に連結されているコード配列の発現を変更するために、制御
ポリペプチドが結合することができるヌクレオチド配列のことである。本文では
用語「制御ポリペプチド」は、制御配列に結合して、その制御配列に作用可能に
連結されているコード配列の転写開始を抑制するか、又は活性化するポリペプチ
ドを含んでいる。好ましくは、制御ポリペプチドはオペレーター配列と結合する
。
ているコード配列の発現を制御するために供される追加ヌクレオチド配列を含ん
でいる。例えば、第二制御配列は、更に、その中に存在するプロモーターに作用
可能に連結されるオペレーター配列を含んでよい。本文では用語「オペレーター
配列」は、作用可能に連結されているコード配列の発現を変更するために、制御
ポリペプチドが結合することができるヌクレオチド配列のことである。本文では
用語「制御ポリペプチド」は、制御配列に結合して、その制御配列に作用可能に
連結されているコード配列の転写開始を抑制するか、又は活性化するポリペプチ
ドを含んでいる。好ましくは、制御ポリペプチドはオペレーター配列と結合する
。
【００５３】 オペレーター配列の例はlac オペレーター配列である。lac オペレーターは、
LacIリプレッサータンパク質が結合して、転写開始を抑制するヌクレオチド配列
である。作用可能に連結されているコード配列の発現を制御するために、lac オ
ペレーターを用いることは、当分野で既知である（例えばBeckwith, lac : The
Genetic System, The Operon, Miller et al. (eds.), Cold Spring Harbor Lab
oratory Press, New York, 11-30 (1980); Fieck et al., Nucleic Acids Res.,
20, 1785-1791 (1992) 参照）。オペレーター配列の別の例は、テトラサイクリ
ン応答要素(TRE）である。TRE は、ある条件下で誘導因子ポリペプチドが結合し
て、発現を誘導するヌクレオチド配列である。作用可能に連結されているコード
配列の発現を制御するために、TRE を用いることは、当分野で既知である（例え
ば、米国特許5,464,758 (Gossen et al.)及び5,814,618（Bujard et al.)参照）
。
LacIリプレッサータンパク質が結合して、転写開始を抑制するヌクレオチド配列
である。作用可能に連結されているコード配列の発現を制御するために、lac オ
ペレーターを用いることは、当分野で既知である（例えばBeckwith, lac : The
Genetic System, The Operon, Miller et al. (eds.), Cold Spring Harbor Lab
oratory Press, New York, 11-30 (1980); Fieck et al., Nucleic Acids Res.,
20, 1785-1791 (1992) 参照）。オペレーター配列の別の例は、テトラサイクリ
ン応答要素(TRE）である。TRE は、ある条件下で誘導因子ポリペプチドが結合し
て、発現を誘導するヌクレオチド配列である。作用可能に連結されているコード
配列の発現を制御するために、TRE を用いることは、当分野で既知である（例え
ば、米国特許5,464,758 (Gossen et al.)及び5,814,618（Bujard et al.)参照）
。
【００５４】制御ポリペプチド 本発明の非組込み型ベクターは更に、制御ポリペプチドをコードするコード配
列を含みうる。前記の通り、制御ポリペプチドには、あるコード配列の転写開始
を抑制するか、又は活性化するポリペプチドがある。好ましくは、制御ポリペプ
チドの作用を、ある化合物の添加によって改変することができる。制御ポリペプ
チドの例は、イソプロピルβ-D- チオガラクトピラノシド(IPTG)の非存在下にla
c オペレーターに結合するLacIリプレッサーである。IPTGの添加により、LacIリ
プレッサーはlac オペレーターにもはや結合しなくなり、従って転写開始をもは
や抑制しなくなる。好ましくは、制御ポリペプチドは、第二制御配列のある領域
に結合して、トランスポザーゼの発現に影響を与える。
列を含みうる。前記の通り、制御ポリペプチドには、あるコード配列の転写開始
を抑制するか、又は活性化するポリペプチドがある。好ましくは、制御ポリペプ
チドの作用を、ある化合物の添加によって改変することができる。制御ポリペプ
チドの例は、イソプロピルβ-D- チオガラクトピラノシド(IPTG)の非存在下にla
c オペレーターに結合するLacIリプレッサーである。IPTGの添加により、LacIリ
プレッサーはlac オペレーターにもはや結合しなくなり、従って転写開始をもは
や抑制しなくなる。好ましくは、制御ポリペプチドは、第二制御配列のある領域
に結合して、トランスポザーゼの発現に影響を与える。
【００５５】 制御ポリペプチドの別の例はtTA 及びrtTAである。tTA は、テトラサイクリン
又はそのアナログの非存在下にTRE に結合して、転写を誘導する。テトラサイク
リンの好ましいアナログはドキシサイクリンである。テトラサイクリン又はその
アナログが存在すると、tTA は転写を誘導しない。rtTAは、テトラサイクリン又
はそのアナログの非存在下にはTRE に結合せず、従って、作用可能に連結されて
いるコード配列の転写を誘導しない。テトラサイクリン又はそのアナログが存在
すると、rtTAは転写を誘導する。
又はそのアナログの非存在下にTRE に結合して、転写を誘導する。テトラサイク
リンの好ましいアナログはドキシサイクリンである。テトラサイクリン又はその
アナログが存在すると、tTA は転写を誘導しない。rtTAは、テトラサイクリン又
はそのアナログの非存在下にはTRE に結合せず、従って、作用可能に連結されて
いるコード配列の転写を誘導しない。テトラサイクリン又はそのアナログが存在
すると、rtTAは転写を誘導する。
【００５６】 制御ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、好ましくは、制御配列に
作用可能に連結されている。この様な制御配列を、本文では、特に言及しない限
り、「第三」制御配列と称する。第三制御配列は、好ましくは、標的細胞内で機
能するプロモーター、例えば制御性プロモーター、例えば誘導性プロモーター及
び抑制性プロモーターである。制御性プロモーターの例は組織特異的プロモータ
ー、すなわち、特定の組織を構成する細胞内に存在しない限り発現されないプロ
モーターである。組織特異的プロモーターの例は、限定でなく、肝細胞で発現さ
れるアルファ-1抗トリプソンプロモーターである。場合により、当該プロモータ
ーは構成的プロモーター、例えばサイトメガロウイルスの初期プロモーター又は
SV40の初期プロモーターである。
作用可能に連結されている。この様な制御配列を、本文では、特に言及しない限
り、「第三」制御配列と称する。第三制御配列は、好ましくは、標的細胞内で機
能するプロモーター、例えば制御性プロモーター、例えば誘導性プロモーター及
び抑制性プロモーターである。制御性プロモーターの例は組織特異的プロモータ
ー、すなわち、特定の組織を構成する細胞内に存在しない限り発現されないプロ
モーターである。組織特異的プロモーターの例は、限定でなく、肝細胞で発現さ
れるアルファ-1抗トリプソンプロモーターである。場合により、当該プロモータ
ーは構成的プロモーター、例えばサイトメガロウイルスの初期プロモーター又は
SV40の初期プロモーターである。
【００５７】使用方法 本発明はまた、前記の非組込み型ベクター、好ましくは非組込み型ウイルスベ
クターの使用方法に関する。いくつかの好ましい点で、本発明の非組込み型ベク
ターの使用方法は、IRによって挟まれたポリヌクレオチドを、標的細胞のゲノム
内に挿入することに関する。この様な方法は、トランスポザーゼと結合する逆方
向反復配列によって挟まれたポリヌクレオチドを含んでいる非組込み型ベクター
を細胞に接触させること、及び、その細胞に適当なトランスポザーゼを提供する
ことにより、そのベクターからトランスポゾンを切り出させ、それを標的細胞の
ゲノムDNA 内に挿入させることを含んで成る。本文では、用語「接触させる」と
は、細胞と本発明のベクターとを、そのベクターがその細胞に進入する様に、物
理的に混合することを指す。
クターの使用方法に関する。いくつかの好ましい点で、本発明の非組込み型ベク
ターの使用方法は、IRによって挟まれたポリヌクレオチドを、標的細胞のゲノム
内に挿入することに関する。この様な方法は、トランスポザーゼと結合する逆方
向反復配列によって挟まれたポリヌクレオチドを含んでいる非組込み型ベクター
を細胞に接触させること、及び、その細胞に適当なトランスポザーゼを提供する
ことにより、そのベクターからトランスポゾンを切り出させ、それを標的細胞の
ゲノムDNA 内に挿入させることを含んで成る。本文では、用語「接触させる」と
は、細胞と本発明のベクターとを、そのベクターがその細胞に進入する様に、物
理的に混合することを指す。
【００５８】 逆方向反復配列によって挟まれたポリヌクレオチドは、「トランスポゾン」の
章に記載の通り、コード配列又は非コード配列を含んでよい。例えば、機能的な
ゲノミクスの応用では、標的細胞内に存在するコード配列の機能を単に破壊する
ことが望まれうる。従って、その場合に遺伝的に組込まれるポリヌクレオチドは
RNA 又はポリペプチドをコードする必要はなく、好ましくは翻訳停止部位及び／
又は転写停止部位などのヌクレオチド配列を含んでいる。別の応用では、トラン
スジェニック細胞又は生物において、RNA 又はポリペプチド、特には生物学的に
活性なポリペプチド又はRNA の生産が意図され、その場合、当該方法によって遺
伝的に組込まれるポリヌクレオチドは、それが希望ポリペプチドをコードする様
に選択される。
章に記載の通り、コード配列又は非コード配列を含んでよい。例えば、機能的な
ゲノミクスの応用では、標的細胞内に存在するコード配列の機能を単に破壊する
ことが望まれうる。従って、その場合に遺伝的に組込まれるポリヌクレオチドは
RNA 又はポリペプチドをコードする必要はなく、好ましくは翻訳停止部位及び／
又は転写停止部位などのヌクレオチド配列を含んでいる。別の応用では、トラン
スジェニック細胞又は生物において、RNA 又はポリペプチド、特には生物学的に
活性なポリペプチド又はRNA の生産が意図され、その場合、当該方法によって遺
伝的に組込まれるポリヌクレオチドは、それが希望ポリペプチドをコードする様
に選択される。
【００５９】 別の応用では、組込まれるポリヌクレオチドはマーカーとして機能し、すなわ
ち検出可能又は選択可能なマーカーをコードする。本文で「マーカー」とは、慣
習的な方法、例えばハイブリダイゼーション又はポリメラーゼ連鎖反応(PCR）に
よって検出することができる特定のヌクレオチド配列を指す。本文で、用語「検
出可能なマーカー」及び「選択可能なマーカー」とは、各々、そのマーカーが細
胞内に存在することを検出することができるポリペプチド、又はそのマーカーを
発現している細胞を選択するために用いることができるポリペプチドをコードす
るコード配列を指す。限定するわけではないが、検出可能なマーカーの例は、蛍
光タンパク質（例えば青緑、赤、黄）、ルシフェラーゼ、及びベータ−ガラクト
シダーゼである。限定するわけではないが、選択可能なマーカーの例は、G418耐
性を規定するneo 遺伝子の産物ポリペプチド、ピューロマイシン耐性を規定する
puro、メトトレキセート耐性を規定するジヒドロ葉酸レダクターゼ変異体である
。
ち検出可能又は選択可能なマーカーをコードする。本文で「マーカー」とは、慣
習的な方法、例えばハイブリダイゼーション又はポリメラーゼ連鎖反応(PCR）に
よって検出することができる特定のヌクレオチド配列を指す。本文で、用語「検
出可能なマーカー」及び「選択可能なマーカー」とは、各々、そのマーカーが細
胞内に存在することを検出することができるポリペプチド、又はそのマーカーを
発現している細胞を選択するために用いることができるポリペプチドをコードす
るコード配列を指す。限定するわけではないが、検出可能なマーカーの例は、蛍
光タンパク質（例えば青緑、赤、黄）、ルシフェラーゼ、及びベータ−ガラクト
シダーゼである。限定するわけではないが、選択可能なマーカーの例は、G418耐
性を規定するneo 遺伝子の産物ポリペプチド、ピューロマイシン耐性を規定する
puro、メトトレキセート耐性を規定するジヒドロ葉酸レダクターゼ変異体である
。
【００６０】 当該方法の１つの態様では、トランスポザーゼはトランスで提供される。例え
ば、トランスポゾンを含んでいる非組込み型ベクターに接触させた細胞を、更に
、トランスポザーゼをコードするコード配列を含んでいる第二の非組込み型ベク
ターに接触させることができる。あるいは、前記細胞を、トランスポザーゼに異
なる形態で接触させることができる。例えば、前記細胞を、トランスポザーゼを
コードするmRNAに接触させるか、又は、トランスポザーゼポリペプチドに接触さ
せることができる。
ば、トランスポゾンを含んでいる非組込み型ベクターに接触させた細胞を、更に
、トランスポザーゼをコードするコード配列を含んでいる第二の非組込み型ベク
ターに接触させることができる。あるいは、前記細胞を、トランスポザーゼに異
なる形態で接触させることができる。例えば、前記細胞を、トランスポザーゼを
コードするmRNAに接触させるか、又は、トランスポザーゼポリペプチドに接触さ
せることができる。
【００６１】 しかし、当該方法の好ましい態様では、トランスポザーゼをシスで提供する。
例えば、トランスポゾンを含んでいる非組込み型ベクターは、更に、トランスポ
ザーゼをコードするコード配列を含みうる。好ましくは、このトランスポザーゼ
は、前記の通り、SBファミリーに属するトランスポザーゼであるか、又はその活
性アナログ又は活性断片である。そのトランスポザーゼをコードするコード配列
を、前記ベクターが細胞に進入するとそのトランスポザーゼが発現する様に、プ
ロモーターに作用可能に連結することができる。
例えば、トランスポゾンを含んでいる非組込み型ベクターは、更に、トランスポ
ザーゼをコードするコード配列を含みうる。好ましくは、このトランスポザーゼ
は、前記の通り、SBファミリーに属するトランスポザーゼであるか、又はその活
性アナログ又は活性断片である。そのトランスポザーゼをコードするコード配列
を、前記ベクターが細胞に進入するとそのトランスポザーゼが発現する様に、プ
ロモーターに作用可能に連結することができる。
【００６２】 あるいは、そして好ましくは、「トランスポザーゼ」の章に記載した通り、ト
ランスポザーゼをコードするコード配列は、プロモーター及びオペレーター配列
を含みうる制御配列に作用可能に連結される。トランスポゾン、及びオペレータ
ー配列に作用可能に連結されているトランスポザーゼをコードするポリヌクレオ
チドを含んでいる非組込み型ベクターに細胞を接触させることを含んでなる本発
明のこの様な方法では、好ましくは、その非組込み型ベクターは更に、制御ポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでいる。制御ポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドは、「制御ポリペプチド」の章に記載されている。
ランスポザーゼをコードするコード配列は、プロモーター及びオペレーター配列
を含みうる制御配列に作用可能に連結される。トランスポゾン、及びオペレータ
ー配列に作用可能に連結されているトランスポザーゼをコードするポリヌクレオ
チドを含んでいる非組込み型ベクターに細胞を接触させることを含んでなる本発
明のこの様な方法では、好ましくは、その非組込み型ベクターは更に、制御ポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでいる。制御ポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドは、「制御ポリペプチド」の章に記載されている。
【００６３】 好ましくは、制御ポリペプチドは、当該ベクターが細胞内に進入した場合に発
現され、そしてトランスポザーゼの発現を変更する。制御ポリペプチドの作用を
、ある化合物の添加又は除去によって変更することができる。例えば、制御ポリ
ペプチドがLacIリプレッサーである場合、LacIがlac オペレーター配列に結合す
ることが抑制されない限り、トランスポザーゼは発現されない。IPTGを用いて、
LacIがlac オペレーター配列に結合することを抑制することができる。
現され、そしてトランスポザーゼの発現を変更する。制御ポリペプチドの作用を
、ある化合物の添加又は除去によって変更することができる。例えば、制御ポリ
ペプチドがLacIリプレッサーである場合、LacIがlac オペレーター配列に結合す
ることが抑制されない限り、トランスポザーゼは発現されない。IPTGを用いて、
LacIがlac オペレーター配列に結合することを抑制することができる。
【００６４】 制御ポリペプチドがtTA 又はrtTAである場合、この制御ポリペプチドは、トラ
ンスポザーゼを発現させるために、テトラサイクリン応答要素に結合しなければ
ならない。テトラサイクリン又はそのアナログを用いて、これらの制御ポリペプ
チドのテトラサイクリン応答要素への結合を変更することができる。制御ポリペ
プチドの作用の変更により、トランスポザーゼの発現、それに続く、ベクターか
らのトランスポゾンの切り出し、そして標的細胞のゲノムDNA へのその組込みが
起きる。
ンスポザーゼを発現させるために、テトラサイクリン応答要素に結合しなければ
ならない。テトラサイクリン又はそのアナログを用いて、これらの制御ポリペプ
チドのテトラサイクリン応答要素への結合を変更することができる。制御ポリペ
プチドの作用の変更により、トランスポザーゼの発現、それに続く、ベクターか
らのトランスポゾンの切り出し、そして標的細胞のゲノムDNA へのその組込みが
起きる。
【００６５】 細胞を、本発明の非組込み型ベクターに接触させる場合、好ましくは、このベ
クターは、細胞への進入が可能となる形態である。例えば、当該非組込み型ベク
ターを、当分野に既知の方法により、裸のDNA として導入することができる。あ
るいは、そして好ましくは、当該非組込み型ベクターを、リポソームや核酸凝縮
剤などの供給担体中に封入することができる。あるいは、このベクターがウイル
スベクター、好ましくはアデノウイルスベクターであるならば、その特定のベク
ターに適する方法により、それをパッケージングすることができる。
クターは、細胞への進入が可能となる形態である。例えば、当該非組込み型ベク
ターを、当分野に既知の方法により、裸のDNA として導入することができる。あ
るいは、そして好ましくは、当該非組込み型ベクターを、リポソームや核酸凝縮
剤などの供給担体中に封入することができる。あるいは、このベクターがウイル
スベクター、好ましくはアデノウイルスベクターであるならば、その特定のベク
ターに適する方法により、それをパッケージングすることができる。
【００６６】 本発明の非組込み型ベクターに接触させる細胞は、インビトロの細胞（すなわ
ち培養細胞）、エキソビボの細胞（すなわち被験者の体から取り出した細胞）、
又はインビボの細胞（すなわち被験者の体内の細胞）であってよい。好ましくは
、当該細胞は、インビトロ、エキソビボ又はインビボの細胞、より好ましくはイ
ンビトロ又はエキソビボの細胞、最も好ましくはインビトロの細胞である。本発
明は、接触する細胞の種類によって限定されるものではなく、例えば、本発明の
非組込み型のベクターを、任意の臓器、組織又は体液から単離した、あるいはそ
れらの中に存在する細胞に導入することができる。
ち培養細胞）、エキソビボの細胞（すなわち被験者の体から取り出した細胞）、
又はインビボの細胞（すなわち被験者の体内の細胞）であってよい。好ましくは
、当該細胞は、インビトロ、エキソビボ又はインビボの細胞、より好ましくはイ
ンビトロ又はエキソビボの細胞、最も好ましくはインビトロの細胞である。本発
明は、接触する細胞の種類によって限定されるものではなく、例えば、本発明の
非組込み型のベクターを、任意の臓器、組織又は体液から単離した、あるいはそ
れらの中に存在する細胞に導入することができる。
【００６７】 本発明の非組込み型ベクターを用いて、標的細胞のゲノム内にトランスポゾン
を挿入することによって、トランスジェニック細胞を生産することができる。本
文で用語「トランスジェニック」とは、本発明の非組込み型ベクターによって供
給されたトランスポゾンを含んでいる細胞を表すものであり、ただしそのトラン
スポゾンが、その細胞に内在するヌクレオチド配列を含んでいるか否かには関係
しない。例えば、宿主細胞がヒトの細胞であり、トランスポゾンがヒトのアデノ
シンデアミナーゼをコードするポリヌクレオチドを含んでいる場合、その宿主細
胞はトランスジェニックとみなされる。
を挿入することによって、トランスジェニック細胞を生産することができる。本
文で用語「トランスジェニック」とは、本発明の非組込み型ベクターによって供
給されたトランスポゾンを含んでいる細胞を表すものであり、ただしそのトラン
スポゾンが、その細胞に内在するヌクレオチド配列を含んでいるか否かには関係
しない。例えば、宿主細胞がヒトの細胞であり、トランスポゾンがヒトのアデノ
シンデアミナーゼをコードするポリヌクレオチドを含んでいる場合、その宿主細
胞はトランスジェニックとみなされる。
【００６８】 場合により、本発明の方法は、細胞の表現型を改変することを含んでいる。本
発明のこの方法では、トランスジェニック細胞を生産し、そしてトランスポゾン
を含んでいない細胞と比較して、そのトランスジェニック細胞の表現型が改変さ
れているかどうかを決定するために、その細胞を観察する。当分野に既知の方法
により、改変された表現型を検出することができる。
発明のこの方法では、トランスジェニック細胞を生産し、そしてトランスポゾン
を含んでいない細胞と比較して、そのトランスジェニック細胞の表現型が改変さ
れているかどうかを決定するために、その細胞を観察する。当分野に既知の方法
により、改変された表現型を検出することができる。
【００６９】 本発明の別の点として、前記の方法を用いて、１又は複数の細胞内に特定のマ
ーカー配列を保有するか、又は特定のポリペプチドを発現するトランスジェニッ
ク生物を生産することができる。トランスジェニック動物の生産方法は当分野に
既知であり、そしてこれらの方法に、本発明の方法を組込むために、過度の実験
は必要ではない。例えば、マウスの胚幹細胞を、本発明の非組込み型ベクターに
接触させることができる。このトランスジェニック動物はモザイクであるか、又
はその動物の全細胞がトランスポゾンを保有することになりうる。１つの点とし
て、トランスポゾン内のコード配列によってコードされるポリペプチドは、細胞
から分離される生産物である。例えば、トランスジェニック動物をバイオリアク
ターとして用いて、その動物から容易に採取される乳、尿、血液、卵又はその他
の材料中に多量のポリペプチドを生産することができる。
ーカー配列を保有するか、又は特定のポリペプチドを発現するトランスジェニッ
ク生物を生産することができる。トランスジェニック動物の生産方法は当分野に
既知であり、そしてこれらの方法に、本発明の方法を組込むために、過度の実験
は必要ではない。例えば、マウスの胚幹細胞を、本発明の非組込み型ベクターに
接触させることができる。このトランスジェニック動物はモザイクであるか、又
はその動物の全細胞がトランスポゾンを保有することになりうる。１つの点とし
て、トランスポゾン内のコード配列によってコードされるポリペプチドは、細胞
から分離される生産物である。例えば、トランスジェニック動物をバイオリアク
ターとして用いて、その動物から容易に採取される乳、尿、血液、卵又はその他
の材料中に多量のポリペプチドを生産することができる。
【００７０】 場合により、本発明の方法は動物の表現型を改変することを含みうる。本発明
のこの点において、トランスジェニック細胞を生産し、次にそれを用いて、トラ
ンスジェニック動物を生産する。生成したトランスジェニック動物を観察して、
そのトランスジェニック細胞の表現型が、トランスポゾンを保有していない細胞
と比べて変化しているかどうかを決定する。
のこの点において、トランスジェニック細胞を生産し、次にそれを用いて、トラ
ンスジェニック動物を生産する。生成したトランスジェニック動物を観察して、
そのトランスジェニック細胞の表現型が、トランスポゾンを保有していない細胞
と比べて変化しているかどうかを決定する。
【００７１】 本発明の別の点は、動物の処置であって、その動物の細胞に治療剤を生産させ
ることによる処置に関する。この方法は、動物に、本発明の非組込み型ベクター
、より好ましくは非組込み型ウイルスベクター、最も好ましくはアデノウイルス
ベクターを投与することによって、動物をインビボで処置することを含みうる。
この非組込み型ベクターは、治療剤をコードするポリヌクレオチドを含んでいる
トランスポゾンを含んでいる。この非組込み型ベクターを、動物の臓器又は組織
に、例えば肝臓、神経系、脳、肺、皮膚、心血管系、心臓、造血系、骨髄、及び
筋肉に投与又は標的指向的に供給することができる。
ることによる処置に関する。この方法は、動物に、本発明の非組込み型ベクター
、より好ましくは非組込み型ウイルスベクター、最も好ましくはアデノウイルス
ベクターを投与することによって、動物をインビボで処置することを含みうる。
この非組込み型ベクターは、治療剤をコードするポリヌクレオチドを含んでいる
トランスポゾンを含んでいる。この非組込み型ベクターを、動物の臓器又は組織
に、例えば肝臓、神経系、脳、肺、皮膚、心血管系、心臓、造血系、骨髄、及び
筋肉に投与又は標的指向的に供給することができる。
【００７２】 この非組込み型ベクターの供給は、任意の従来の形で行うことができ、目的又
は標的による制限以外の制限はない。例えば、当該ベクターを、静脈内、筋肉内
、皮下、硬膜下腔内、又は頭蓋内への注射又は点滴により、あるいは吸入により
供給することができる。従来のアデノウイルスベクターを用いて、吸入により、
肺上皮細胞のインビボ形質導入が成功している(Bellon et al., Human Gene The
r., 8, 15-25 (1997))。必要ならば、当該ベクターを特定の種類の細胞に標的指
向的に供給するための方法を用いることができる。この様な方法は当分野に既知
である。場合により、そして好ましくは、前記動物内で、ある化合物、例えばIP
TG又はテトラサイクリン、あるいはそれらのアナログの存在を変更することによ
り、トランスポザーゼが発現され、従って前記非組込み型ベクターからトランス
ポゾンが切り出され、それがそのベクターを保有する細胞のゲノムDNA 内に挿入
される。
は標的による制限以外の制限はない。例えば、当該ベクターを、静脈内、筋肉内
、皮下、硬膜下腔内、又は頭蓋内への注射又は点滴により、あるいは吸入により
供給することができる。従来のアデノウイルスベクターを用いて、吸入により、
肺上皮細胞のインビボ形質導入が成功している(Bellon et al., Human Gene The
r., 8, 15-25 (1997))。必要ならば、当該ベクターを特定の種類の細胞に標的指
向的に供給するための方法を用いることができる。この様な方法は当分野に既知
である。場合により、そして好ましくは、前記動物内で、ある化合物、例えばIP
TG又はテトラサイクリン、あるいはそれらのアナログの存在を変更することによ
り、トランスポザーゼが発現され、従って前記非組込み型ベクターからトランス
ポゾンが切り出され、それがそのベクターを保有する細胞のゲノムDNA 内に挿入
される。
【００７３】 インビボで治療用核酸を直接的に導入することの他に、本発明の遺伝子治療は
、エキソビボでの細胞への形質導入、それに続く、生成したトランスジェニック
細胞の患者への投与を含んでいる。エキソビボでの適用では、患者から外植した
細胞又はその他の細胞の使用が考えられ、更に、患者とは異なる種から外植した
細胞の形質導入及び移植が含まれうる。本発明のこの点において、患者から細胞
を外植し、そして本発明の非組込み型ベクター、より好ましくは非組込み型ウイ
ルスベクター、最も好ましくはアデノウイルスに接触させる。この非組込み型ベ
クターは、治療剤をコードするポリヌクレオチドを含んでいるトランスポゾンを
含んでいる。次に、前記ベクターに接触させた外植細胞を動物内に移植して、そ
の動物内で治療剤を生産させる。使用しうる細胞の例は、限定でなく、造血幹細
胞、肝細胞、筋芽細胞、線維芽細胞、角化細胞、内皮細胞、腫瘍細胞、及びガン
細胞である。
、エキソビボでの細胞への形質導入、それに続く、生成したトランスジェニック
細胞の患者への投与を含んでいる。エキソビボでの適用では、患者から外植した
細胞又はその他の細胞の使用が考えられ、更に、患者とは異なる種から外植した
細胞の形質導入及び移植が含まれうる。本発明のこの点において、患者から細胞
を外植し、そして本発明の非組込み型ベクター、より好ましくは非組込み型ウイ
ルスベクター、最も好ましくはアデノウイルスに接触させる。この非組込み型ベ
クターは、治療剤をコードするポリヌクレオチドを含んでいるトランスポゾンを
含んでいる。次に、前記ベクターに接触させた外植細胞を動物内に移植して、そ
の動物内で治療剤を生産させる。使用しうる細胞の例は、限定でなく、造血幹細
胞、肝細胞、筋芽細胞、線維芽細胞、角化細胞、内皮細胞、腫瘍細胞、及びガン
細胞である。
【００７４】 トランスポゾンによってコードされる治療剤はポリペプチド又はRNA 分子でよ
い。本発明の処置方法は、遺伝病の治療、例えば欠陥遺伝子の置換、ポリペプチ
ド薬物の供給、又は代謝活性の補充に有用である。本発明の非組込み型ベクター
による治療の範囲内の症状の例は、嚢胞性繊維症、糖尿病、心血管疾患、ガン、
及び脳の機能不全である。例えば、本発明のアデノウイルスベクターを用いて、
嚢胞性繊維症に罹った患者の肺内に、機能的なCFTRのコード配列を組込むことが
できる。同様に、本発明のアデノウイルスベクターを用いて、低レベルの組織プ
ラスミノーゲンアクチベーター(TPA）を増加させるために、心臓病患者の心臓細
胞に、TPA をコードするポリヌクレオチドを供給することができる。
い。本発明の処置方法は、遺伝病の治療、例えば欠陥遺伝子の置換、ポリペプチ
ド薬物の供給、又は代謝活性の補充に有用である。本発明の非組込み型ベクター
による治療の範囲内の症状の例は、嚢胞性繊維症、糖尿病、心血管疾患、ガン、
及び脳の機能不全である。例えば、本発明のアデノウイルスベクターを用いて、
嚢胞性繊維症に罹った患者の肺内に、機能的なCFTRのコード配列を組込むことが
できる。同様に、本発明のアデノウイルスベクターを用いて、低レベルの組織プ
ラスミノーゲンアクチベーター(TPA）を増加させるために、心臓病患者の心臓細
胞に、TPA をコードするポリヌクレオチドを供給することができる。
【００７５】 ガンを治療するために、患者の免疫応答を増強、補充、又は誘発するポリペプ
チドをコードするコード配列を、正常細胞又はガン細胞のゲノム内にインビボで
導入するために、本発明の非組込み型ベクターを用いることができる。例えば、
哺乳動物の細胞に、１又は複数のサイトカインを分泌させるか、又は、免疫系の
細胞を誘引する表面分子を発現させることができる。別の適用では、本発明の非
組込み型ベクターを用いて、例えば、薬剤に対する耐性を付与するコード配列を
発現させることによって、化学療法の毒性副作用に対する保護を正常細胞に提供
するために、トランスジェニック細胞を作製することができる。
チドをコードするコード配列を、正常細胞又はガン細胞のゲノム内にインビボで
導入するために、本発明の非組込み型ベクターを用いることができる。例えば、
哺乳動物の細胞に、１又は複数のサイトカインを分泌させるか、又は、免疫系の
細胞を誘引する表面分子を発現させることができる。別の適用では、本発明の非
組込み型ベクターを用いて、例えば、薬剤に対する耐性を付与するコード配列を
発現させることによって、化学療法の毒性副作用に対する保護を正常細胞に提供
するために、トランスジェニック細胞を作製することができる。
【００７６】 別の手法は、プロドラッグの活性化を含んでいる。例えば、本発明のアデノウ
イルスベクターを用いて、単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼ(HSV-t
k)を発現する様に、患者において、工学的にトランスジェニックガン細胞を作製
することができる。ヌクレオチドアナログ、例えばガンシクロビル又はアシクロ
ビルを投与すると、これが、前記のトランスジェニック細胞の核酸内に組込まれ
、その結果、その細胞が死滅する。場合により、この非組込み型ベクターは、宿
主細胞内に組込むことを意図するトランスポゾンに適するHSV-tkコード配列だけ
でなく、付加的な短期間の効果のために、当該アデノウイルスから構成的に発現
されるHSV-tkコード配列をも含んでいる。
イルスベクターを用いて、単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼ(HSV-t
k)を発現する様に、患者において、工学的にトランスジェニックガン細胞を作製
することができる。ヌクレオチドアナログ、例えばガンシクロビル又はアシクロ
ビルを投与すると、これが、前記のトランスジェニック細胞の核酸内に組込まれ
、その結果、その細胞が死滅する。場合により、この非組込み型ベクターは、宿
主細胞内に組込むことを意図するトランスポゾンに適するHSV-tkコード配列だけ
でなく、付加的な短期間の効果のために、当該アデノウイルスから構成的に発現
されるHSV-tkコード配列をも含んでいる。
【００７７】 標的細胞のゲノムDNA 内における本発明のトランスポゾンの存在を、当分野に
既知のいくつかの方法によって確認することができる。例えば、組込まれたポリ
ヌクレオチドがマーカーとして機能するならば、ハイブリダイゼーション又はPC
R によってそのマーカーを検出することができる。組込まれたポリヌクレオチド
が検出可能又は選択可能マーカーをコードするならば、そのマーカーを検出する
ことができる。
既知のいくつかの方法によって確認することができる。例えば、組込まれたポリ
ヌクレオチドがマーカーとして機能するならば、ハイブリダイゼーション又はPC
R によってそのマーカーを検出することができる。組込まれたポリヌクレオチド
が検出可能又は選択可能マーカーをコードするならば、そのマーカーを検出する
ことができる。
【００７８】 本発明の別の点は、トランスポゾン供給系の作製に関する。トランスポゾン供
給系の作製は、種々の組合せで、トランスポゾン（「トランスポゾン」の章に記
載されている）、トランスポザーゼをコードするポリヌクレオチド（「トランス
ポザーゼ」の章に記載されている）、及び／又は制御ポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチド（「制御ポリペプチド」の章に記載されている）を含んでいる
非組込み型ウイルスベクターを構築することを含んでいる。好ましくは、この非
組込み型ベクターはトランスポゾンを、より好ましくはトランスポゾン及びトラ
ンスポザーゼをコードするポリヌクレオチドの両方を含んでいる。最も好ましく
は、この非組込み型ベクターは、トランスポゾン、トランスポザーゼをコードす
るポリヌクレオチド、及び制御ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含
んでいる。
給系の作製は、種々の組合せで、トランスポゾン（「トランスポゾン」の章に記
載されている）、トランスポザーゼをコードするポリヌクレオチド（「トランス
ポザーゼ」の章に記載されている）、及び／又は制御ポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチド（「制御ポリペプチド」の章に記載されている）を含んでいる
非組込み型ウイルスベクターを構築することを含んでいる。好ましくは、この非
組込み型ベクターはトランスポゾンを、より好ましくはトランスポゾン及びトラ
ンスポザーゼをコードするポリヌクレオチドの両方を含んでいる。最も好ましく
は、この非組込み型ベクターは、トランスポゾン、トランスポザーゼをコードす
るポリヌクレオチド、及び制御ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含
んでいる。
【００７９】 トランスポゾン供給系の作製はまた、前記非組込み型ウイルスベクターのパッ
ケージングを含んでいる。パッケージング方法は、使用するウイルスベクターの
タイプに依存して変更され、そして当分野に既知である。パッケージング中にお
けるトランスポザーゼの発現により、非組込み型ウイルスベクターからトランス
ポゾンが切り出され、従ってパッケージングの効率が低下する。本発明のこの点
において、前記ウイルスベクターが、トランスポゾン及びトランスポザーゼをコ
ードするヌクレオチド配列の両方を含んでいる場合、好ましくは、この非組込み
型ウイルスベクターを、トランスポザーゼが発現しない様な条件下でパッケージ
ングする。
ケージングを含んでいる。パッケージング方法は、使用するウイルスベクターの
タイプに依存して変更され、そして当分野に既知である。パッケージング中にお
けるトランスポザーゼの発現により、非組込み型ウイルスベクターからトランス
ポゾンが切り出され、従ってパッケージングの効率が低下する。本発明のこの点
において、前記ウイルスベクターが、トランスポゾン及びトランスポザーゼをコ
ードするヌクレオチド配列の両方を含んでいる場合、好ましくは、この非組込み
型ウイルスベクターを、トランスポザーゼが発現しない様な条件下でパッケージ
ングする。
【００８０】 本発明を下記の実施例によって説明する。特定の例、物質、量、及び方法は、
本発明の範囲及び意図に従って広く解釈されるべきである。実施例１ AdSB10、すなわちSBトランスポザーゼを形質導入するアデノウイルスの構築 アデノウイルスの仲介によるトランスポザーゼ機能の供給を検査するために、
SB10トランスポザーゼを形質導入するアデノウイルスベクターを、SB10配列をア
デノウイルスゲノム（図３）内に相同的に挿入することによって構築し、そして
パッケージングした。 SB10トランスポザーゼのコード配列を、pSB10 から、BamHI 及びSalIによる消
化により取り出した。pSB10 の構築は、Ivics et al., Cell, 91, 501-510 (199
7)に詳述されている。
本発明の範囲及び意図に従って広く解釈されるべきである。実施例１ AdSB10、すなわちSBトランスポザーゼを形質導入するアデノウイルスの構築 アデノウイルスの仲介によるトランスポザーゼ機能の供給を検査するために、
SB10トランスポザーゼを形質導入するアデノウイルスベクターを、SB10配列をア
デノウイルスゲノム（図３）内に相同的に挿入することによって構築し、そして
パッケージングした。 SB10トランスポザーゼのコード配列を、pSB10 から、BamHI 及びSalIによる消
化により取り出した。pSB10 の構築は、Ivics et al., Cell, 91, 501-510 (199
7)に詳述されている。
【００８１】 SB10トランスポザーゼのコード配列を含んでいるBamHI/SalI断片を、pACCMV.p
LpA (Becker et al., Methods in Cell Biol., 43 (PtA), 161-189 (1994); Glu
zman et al., Eucaryotic Viral Vectors, Gluzman (ed.), 187-192, Cold Spri
ng Harbor Laboratory Press, New York (1982))内で、サイトメガロウイルスの
初期プロモーター配列の下流にあるBamHI 部位とSalI部位との間に連結すること
によって、pACCMVSB10を作製した。pACCMVSB10は、交差単位(mu)０〜17の領域の
アデノウイルス配列を含んでいて、その中のmu1.3〜9.3のE1領域が、前記のプロ
モーター及びトランス遺伝子配列によって中断されているものである。
LpA (Becker et al., Methods in Cell Biol., 43 (PtA), 161-189 (1994); Glu
zman et al., Eucaryotic Viral Vectors, Gluzman (ed.), 187-192, Cold Spri
ng Harbor Laboratory Press, New York (1982))内で、サイトメガロウイルスの
初期プロモーター配列の下流にあるBamHI 部位とSalI部位との間に連結すること
によって、pACCMVSB10を作製した。pACCMVSB10は、交差単位(mu)０〜17の領域の
アデノウイルス配列を含んでいて、その中のmu1.3〜9.3のE1領域が、前記のプロ
モーター及びトランス遺伝子配列によって中断されているものである。
【００８２】 標準的な方法により、pACCMVSB10を、pJM17 と共にヒト293 細胞に同時にトラ
ンスフェクションした（例えばLarregina et al., Gene Ther., 5, 563-568 (19
98）参照）。pJM17 (McGrory et al., Virol., 163, 614-617 (1998))は、mu3.7
の位置でプラスミド配列によって中断された完全なアデノウイルスゲノムを含ん
でいる。相同組換えによって（図３、交差）、プロモーター及びトランス遺伝子
を含んでいるpACCMVSB10構成体内の配列と、mu3.7 の位置に挿入配列を有する領
域とが置換し、その結果、前記のアデノウイルスゲノム内のmu1.3 と9.3 との間
にCMV の初期プロモーター及びSB10コード配列が挿入されたアデノウイルスゲノ
ムが生じる。
ンスフェクションした（例えばLarregina et al., Gene Ther., 5, 563-568 (19
98）参照）。pJM17 (McGrory et al., Virol., 163, 614-617 (1998))は、mu3.7
の位置でプラスミド配列によって中断された完全なアデノウイルスゲノムを含ん
でいる。相同組換えによって（図３、交差）、プロモーター及びトランス遺伝子
を含んでいるpACCMVSB10構成体内の配列と、mu3.7 の位置に挿入配列を有する領
域とが置換し、その結果、前記のアデノウイルスゲノム内のmu1.3 と9.3 との間
にCMV の初期プロモーター及びSB10コード配列が挿入されたアデノウイルスゲノ
ムが生じる。
【００８３】 （組換えウイルスの感染により）明確な細胞の病的症状が、10日以内に細胞に
認められ、そしてプラークの精製のために、その上清を集めた。次に、大量のウ
イルス調製品を得るために、プラークから精製したウイルスを増幅した。挿入さ
れたSB10用のプローブによる前記ウイルスのサザンブロットの結果は、前記アデ
ノウイルスゲノム内への相同的挿入に合致した。また、挿入SB10の存在（プライ
マーＩ及びII：5'-CCGCGTTCCGGGTCAAAGTTGGCG(配列番号11）及び5'-GTCACATCCAG
CATCACAGGC(配列番号12)）、並びにpACCMVSB10プラスミドと前記アデノウイルス
ゲノムとの間の相同組換え（プライマーIII及びIV（5'-GGAAGGCTACCCGAAACGTTT(
配列番号13）及び5'-CCAAGTTGCTGTCCAACGCC(配列番号14))を確認するために、PC
R 分析を行った。これらの結果は、pACCMVSB10のパッケージングの成功を示した
。このパッケージングされたpACCMVSB10をAdSB10とした。
認められ、そしてプラークの精製のために、その上清を集めた。次に、大量のウ
イルス調製品を得るために、プラークから精製したウイルスを増幅した。挿入さ
れたSB10用のプローブによる前記ウイルスのサザンブロットの結果は、前記アデ
ノウイルスゲノム内への相同的挿入に合致した。また、挿入SB10の存在（プライ
マーＩ及びII：5'-CCGCGTTCCGGGTCAAAGTTGGCG(配列番号11）及び5'-GTCACATCCAG
CATCACAGGC(配列番号12)）、並びにpACCMVSB10プラスミドと前記アデノウイルス
ゲノムとの間の相同組換え（プライマーIII及びIV（5'-GGAAGGCTACCCGAAACGTTT(
配列番号13）及び5'-CCAAGTTGCTGTCCAACGCC(配列番号14))を確認するために、PC
R 分析を行った。これらの結果は、pACCMVSB10のパッケージングの成功を示した
。このパッケージングされたpACCMVSB10をAdSB10とした。
【００８４】実施例２ AdSB10によるトランスポザーゼSBの細胞内発現 AdSB10がSBトランスポザーゼタンパク質を発現できるかどうかを調べるために
、前記ウイルスに感染した293 細胞の抽出物を、ウエスタンブロット分析した。
その抽出タンパク質をSDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、そし
てニトロセルロース支持体上に電気的に転写した。次に、SBタンパク質のコード
配列から予測されるSBタンパク質のＣ末端ペプチドに対するポリクローナル抗体
を用いて、そのブロット上のSBタンパク質を探索した。その結果、AdSB10に感染
した293 細胞の抽出物を添加したレーンには、抗SB免疫反応性を示す物質の明確
なバンド（SB矢印）が認められるが、コントロール(293細胞）レーンには認めら
れないことが明かに示された。これらの結果は、AdSB10による293 細胞の形質導
入により、その標的細胞内で抗SB免疫反応性を有する物質が発現したことを示す
。
、前記ウイルスに感染した293 細胞の抽出物を、ウエスタンブロット分析した。
その抽出タンパク質をSDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、そし
てニトロセルロース支持体上に電気的に転写した。次に、SBタンパク質のコード
配列から予測されるSBタンパク質のＣ末端ペプチドに対するポリクローナル抗体
を用いて、そのブロット上のSBタンパク質を探索した。その結果、AdSB10に感染
した293 細胞の抽出物を添加したレーンには、抗SB免疫反応性を示す物質の明確
なバンド（SB矢印）が認められるが、コントロール(293細胞）レーンには認めら
れないことが明かに示された。これらの結果は、AdSB10による293 細胞の形質導
入により、その標的細胞内で抗SB免疫反応性を有する物質が発現したことを示す
。
【００８５】実施例３ AdSB10により発現されたトランスポザーゼSBの細胞内機能 AdSB10により発現させたSBトランスポザーゼの機能を調べるために、HeLa細胞
に形質導入した。精製した当該ベクターがHeLa細胞に形質導入されると、そのア
デノウイルスベクターは細胞表面に効率良く結合し、内部に取り込まれ、次にそ
のビリオンキャプシドを含むエンドソームが遊離し、そして核に移行し、そこで
そのゲノムが蓄積する。一旦、このアデノウイルスベクターゲノムが核内に供給
されると、そのCMV プロモーターがSBトランスポザーゼ酵素の発現を仲介する。
に形質導入した。精製した当該ベクターがHeLa細胞に形質導入されると、そのア
デノウイルスベクターは細胞表面に効率良く結合し、内部に取り込まれ、次にそ
のビリオンキャプシドを含むエンドソームが遊離し、そして核に移行し、そこで
そのゲノムが蓄積する。一旦、このアデノウイルスベクターゲノムが核内に供給
されると、そのCMV プロモーターがSBトランスポザーゼ酵素の発現を仲介する。
【００８６】 AdSB10によるHeLa細胞への形質導入を、pT/Neoによるトランスフェクションの
１日前（図５、４番）、１日後（３番）又は２日後（２番）に行った。pT/neoと
pSB10 との同時トランスフェクションをポジティブコントロールとして用いた。
pT/neoは、SV40プロモーター／エンハンサー及びSB40ポリアデニル化シグナルに
作用可能に連結されたneo コード配列を含み、それらは全て逆方向反復配列によ
って挟まれている。pT/neoの構築はIvics et al., Cell, 91, 501-510 (1997)に
詳しく述べられている。全ての培養細胞を、４日目にG418を含有する選択培地上
にまいた。
１日前（図５、４番）、１日後（３番）又は２日後（２番）に行った。pT/neoと
pSB10 との同時トランスフェクションをポジティブコントロールとして用いた。
pT/neoは、SV40プロモーター／エンハンサー及びSB40ポリアデニル化シグナルに
作用可能に連結されたneo コード配列を含み、それらは全て逆方向反復配列によ
って挟まれている。pT/neoの構築はIvics et al., Cell, 91, 501-510 (1997)に
詳しく述べられている。全ての培養細胞を、４日目にG418を含有する選択培地上
にまいた。
【００８７】 pSB10 との同時トランスフェクション（５番）により、そのG418耐性コロニー
形成は、pT/neo単独をトランスフェクションした細胞（１番）と比べて13.2倍増
加した。AdSB10の感染により、G418耐性コロニー形成の頻度は2.4〜6.4倍増加し
た。このことは、感染したAdSB10から発現したSB10トランスポザーゼにより、T/
neo 配列の転移が起きたことを示す。pT/neoトランスポゾンのトランスフェクシ
ョンの前にAdSB10を感染させた細胞において、AdSB10がコードするSBにより仲介
される転移の頻度が最高であったことが認められた（４番）。これらの結果は、
AdSB10により形質導入した細胞内で発現しているSB10トランスポザーゼタンパク
質が転移を誘発して、新しい遺伝物質を標的細胞の染色体内へ挿入することがで
きたことを示す。
形成は、pT/neo単独をトランスフェクションした細胞（１番）と比べて13.2倍増
加した。AdSB10の感染により、G418耐性コロニー形成の頻度は2.4〜6.4倍増加し
た。このことは、感染したAdSB10から発現したSB10トランスポザーゼにより、T/
neo 配列の転移が起きたことを示す。pT/neoトランスポゾンのトランスフェクシ
ョンの前にAdSB10を感染させた細胞において、AdSB10がコードするSBにより仲介
される転移の頻度が最高であったことが認められた（４番）。これらの結果は、
AdSB10により形質導入した細胞内で発現しているSB10トランスポザーゼタンパク
質が転移を誘発して、新しい遺伝物質を標的細胞の染色体内へ挿入することがで
きたことを示す。
【００８８】実施例４ AdT/neo 、すなわちneo トランスポゾンを形質導入するアデノウイルスの作製 転移がアデノウイルスゲノムから細胞ゲノムに起きるかどうか調べるために、
AdT/neo を構築し、そしてパッケージングした。AdT/neo は、選択マーカーとし
てneo 遺伝子を含んでいるトランスポゾンを含んでいるアデノウイルスである。 SV40初期プロモーター及び逆方向反復配列を含んでいるフランキング配列を有
するneo トランスポゾン（図２）を、KpnI/SalI 断片として、pACCMV.pLpA プラ
スミド（図３）内に連結し、次に、それを、AdSB10のパッケージングの記載（実
施例１）の通りに、pJM17 と共にヒト293 細胞に同時トランスフェクションする
。同時トランスフェクションの約19日後に、その単層細胞は完全に溶解した。そ
の後、その培地を集め、そして凍結融解サイクルを数回行って、残存する生菌を
溶解する。遠心により細胞残渣を沈殿させ、ウイルスを含んでいる上清を用いて
、293 細胞への感染を行う。細胞の病的症状に続いて、確立したHirtの方法(Hir
t, J. Mol. Biology., 26, 365-369 (1967))により細胞からウイルスDNA を抽出
する。
AdT/neo を構築し、そしてパッケージングした。AdT/neo は、選択マーカーとし
てneo 遺伝子を含んでいるトランスポゾンを含んでいるアデノウイルスである。 SV40初期プロモーター及び逆方向反復配列を含んでいるフランキング配列を有
するneo トランスポゾン（図２）を、KpnI/SalI 断片として、pACCMV.pLpA プラ
スミド（図３）内に連結し、次に、それを、AdSB10のパッケージングの記載（実
施例１）の通りに、pJM17 と共にヒト293 細胞に同時トランスフェクションする
。同時トランスフェクションの約19日後に、その単層細胞は完全に溶解した。そ
の後、その培地を集め、そして凍結融解サイクルを数回行って、残存する生菌を
溶解する。遠心により細胞残渣を沈殿させ、ウイルスを含んでいる上清を用いて
、293 細胞への感染を行う。細胞の病的症状に続いて、確立したHirtの方法(Hir
t, J. Mol. Biology., 26, 365-369 (1967))により細胞からウイルスDNA を抽出
する。
【００８９】実施例５ アデノウイルスゲノムから宿主細胞ゲノムへの転移の検査 培養哺乳動物細胞における転移を証明するために、実施例４に記載のAdT/neo
ベクターを、SB10トランスポザーゼを発現するプラスミドと共に用いることがで
きる。この実験では、このAdT/neo ベクターによる感染の前又は後に、pSB10 を
HeLa細胞にトランスフェクションする。発現したSBトランスポザーゼは、このア
デノウイルスベクターからSV-neoトランスポゾンを切り出し、そしてそれを宿主
細胞ゲノム内に組込む。ネオマイシンアナログG418の存在下におけるコロニー形
成により、この新しい遺伝物質の存在を検査することができる。全ての細胞に形
質導入されることを保証するために、宿主細胞を、種々の濃度のベクターに接触
させ、その２日後に、G418を含んでいる選択培地により10倍ずつ連続的に希釈し
た細胞をプレート培養することにより、当該行程の効率を決定する。G418耐性の
クローン群から抽出したDNA をサザンブロット分析して、ベクター配列の欠失、
及びトランスポゾンを挟み込んでいる染色体の配列の存在を確認することにより
、転移によるneo 配列の安定な導入を確認する。
ベクターを、SB10トランスポザーゼを発現するプラスミドと共に用いることがで
きる。この実験では、このAdT/neo ベクターによる感染の前又は後に、pSB10 を
HeLa細胞にトランスフェクションする。発現したSBトランスポザーゼは、このア
デノウイルスベクターからSV-neoトランスポゾンを切り出し、そしてそれを宿主
細胞ゲノム内に組込む。ネオマイシンアナログG418の存在下におけるコロニー形
成により、この新しい遺伝物質の存在を検査することができる。全ての細胞に形
質導入されることを保証するために、宿主細胞を、種々の濃度のベクターに接触
させ、その２日後に、G418を含んでいる選択培地により10倍ずつ連続的に希釈し
た細胞をプレート培養することにより、当該行程の効率を決定する。G418耐性の
クローン群から抽出したDNA をサザンブロット分析して、ベクター配列の欠失、
及びトランスポゾンを挟み込んでいる染色体の配列の存在を確認することにより
、転移によるneo 配列の安定な導入を確認する。
【００９０】 感染の２日後、HeLa細胞を、G418を含有する選択培地内でサブ培養し、２週間
後に、薬剤耐性コロニー形成を評価する。pSB10 をトランスフェクションした細
胞における薬剤耐性コロニー形成の頻度が、トランスフェクションしていない細
胞に比べて増加することは、SBトランスポザーゼにより前記アデノウイルスベク
ターゲノムからneo 発現カセットが切り出され、そしてそのneo 発現カセットが
宿主細胞ゲノム内に転移し、そして組込まれることに由来する。更に、細胞ゲノ
ムにおいてneo 発現カセットを挟み込んでいる配列を（逆PCR 法又はリンカーを
用いたPCR 法により）同定することにより、転移によりneo 配列が挿入されるこ
とが確認される。これらの実験における転移の証拠から、SBトランスポザーゼが
、基質としてのアデノウイルスベクターゲノムからのトランスポゾンの切り出し
を介したアデノウイルスゲノムからの転移と、それに続く、宿主細胞ゲノム内へ
のトランスポゾンの挿入を介した転移とを仲介することができることが証明され
る。
後に、薬剤耐性コロニー形成を評価する。pSB10 をトランスフェクションした細
胞における薬剤耐性コロニー形成の頻度が、トランスフェクションしていない細
胞に比べて増加することは、SBトランスポザーゼにより前記アデノウイルスベク
ターゲノムからneo 発現カセットが切り出され、そしてそのneo 発現カセットが
宿主細胞ゲノム内に転移し、そして組込まれることに由来する。更に、細胞ゲノ
ムにおいてneo 発現カセットを挟み込んでいる配列を（逆PCR 法又はリンカーを
用いたPCR 法により）同定することにより、転移によりneo 配列が挿入されるこ
とが確認される。これらの実験における転移の証拠から、SBトランスポザーゼが
、基質としてのアデノウイルスベクターゲノムからのトランスポゾンの切り出し
を介したアデノウイルスゲノムからの転移と、それに続く、宿主細胞ゲノム内へ
のトランスポゾンの挿入を介した転移とを仲介することができることが証明され
る。
【００９１】 下記の２つの機能が独立のベクターにより供給されることを検査するために、
HeLa細胞を、同時に、又は連続して、ベクターによるトランスポザーゼ機能の供
給のためのAdSB10と、ベクターによるトランスポゾン機能の供給のためのAdT/ne
o とによって感染させた。２日後に、この細胞を、G418を含有する選択培地上に
まき、２週間後に、薬剤耐性コロニーを評価する。AdSB10の感染により、薬剤耐
性コロニーの形成の頻度が、AdT/neo 単独の感染の場合と比べて高くなることは
、AdT/neo ゲノムから宿主細胞の染色体へのneo 発現カセットの転移が、この場
合には、AdSB10ベクターから発現されるSBトランスポザーゼにより仲介されるこ
との証拠となると考えられる。組込まれたneo カセットを挟んでいる配列の分子
的分析により、転移によって生じた遺伝子の移行が確認される。この実験におい
て予測された転移の証拠から、異なるベクターから供給されたトランスポゾン及
びトランスポザーゼの両成分が、ベクターゲノムから宿主細胞ゲノムへの転移を
仲介する様に機能することが証明される。
HeLa細胞を、同時に、又は連続して、ベクターによるトランスポザーゼ機能の供
給のためのAdSB10と、ベクターによるトランスポゾン機能の供給のためのAdT/ne
o とによって感染させた。２日後に、この細胞を、G418を含有する選択培地上に
まき、２週間後に、薬剤耐性コロニーを評価する。AdSB10の感染により、薬剤耐
性コロニーの形成の頻度が、AdT/neo 単独の感染の場合と比べて高くなることは
、AdT/neo ゲノムから宿主細胞の染色体へのneo 発現カセットの転移が、この場
合には、AdSB10ベクターから発現されるSBトランスポザーゼにより仲介されるこ
との証拠となると考えられる。組込まれたneo カセットを挟んでいる配列の分子
的分析により、転移によって生じた遺伝子の移行が確認される。この実験におい
て予測された転移の証拠から、異なるベクターから供給されたトランスポゾン及
びトランスポザーゼの両成分が、ベクターゲノムから宿主細胞ゲノムへの転移を
仲介する様に機能することが証明される。
【００９２】実施例６ トランスポザーゼのコード領域およびT/neo トランスポゾンを含んでいるアデノ ウイルスゲノムの作製 ベクターによるトランスポゾン配列の供給のために最も有効なベクターは、ト
ランスポゾン及びトランスポザーゼのコード配列の両方を含んでいるベクターで
あると思われる。しかし、トランスポゾン及びトランスポザーゼのコード配列を
含んでいるアデノウイルスのパッケージングの過程において、トランスポザーゼ
の発現により、トランスポゾンの切り出しが起き、従ってパッケージング過程が
中断されてしまうだろう。この問題を、パッケージング中にトランスポザーゼの
発現を制御することにより解決する。
ランスポゾン及びトランスポザーゼのコード配列の両方を含んでいるベクターで
あると思われる。しかし、トランスポゾン及びトランスポザーゼのコード配列を
含んでいるアデノウイルスのパッケージングの過程において、トランスポザーゼ
の発現により、トランスポゾンの切り出しが起き、従ってパッケージング過程が
中断されてしまうだろう。この問題を、パッケージング中にトランスポザーゼの
発現を制御することにより解決する。
【００９３】テトラサイクリンによるトランスポザーゼ発現の制御 単一ベクターからの転移の、テトラサイクリンによる制御には、下記の３つの
機能の導入が必要であろう。(i）トランスポゾン機能；(ii)テトラサイクリン応
答要素(TRE）による転写制御下にあるトランスポザーゼ機能；及び(iii) テトラ
サイクリンの存在又は非存在に応答して、TRE に結合し、そしてSBトランスポザ
ーゼの発現を制御するテトラサイクリントランスアクチベーターのための転写単
位（図６）。
機能の導入が必要であろう。(i）トランスポゾン機能；(ii)テトラサイクリン応
答要素(TRE）による転写制御下にあるトランスポザーゼ機能；及び(iii) テトラ
サイクリンの存在又は非存在に応答して、TRE に結合し、そしてSBトランスポザ
ーゼの発現を制御するテトラサイクリントランスアクチベーターのための転写単
位（図６）。
【００９４】 TRE を用いることによるトランスポザーゼの発現を制御する場合、同一細胞内
でテトラサイクリントランスアクチベーターが同時に発現されない限り、トラン
スポザーゼは発現されない。更に、このテトラサイクリントランスアクチベータ
ーは、テトラサイクリンによりTRE への結合が活性化される形（rtTA又はtet-ON
とよぶ) (Gossen et al., Science, 268, 1766-1769 (1995)）、又はテトラサイ
クリンにより阻害される形(tTA又はtet-OFF とよぶ）(Gossen et al., Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA, 89, 5547-5551 (1992)）のいずれかで提供される。tet-ON
又はtet-OFF をコードする転写単位は、トランスポゾン機能及びSBトランスポザ
ーゼ機能と共に、当該ベクター構成体内に含まれている（図６）。
でテトラサイクリントランスアクチベーターが同時に発現されない限り、トラン
スポザーゼは発現されない。更に、このテトラサイクリントランスアクチベータ
ーは、テトラサイクリンによりTRE への結合が活性化される形（rtTA又はtet-ON
とよぶ) (Gossen et al., Science, 268, 1766-1769 (1995)）、又はテトラサイ
クリンにより阻害される形(tTA又はtet-OFF とよぶ）(Gossen et al., Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA, 89, 5547-5551 (1992)）のいずれかで提供される。tet-ON
又はtet-OFF をコードする転写単位は、トランスポゾン機能及びSBトランスポザ
ーゼ機能と共に、当該ベクター構成体内に含まれている（図６）。
【００９５】 tet-OFF を含有するベクター（図6a）をテトラサイクリン（又はテトラサイク
リンアナログ）の存在下でパッケージングすることにより、SBトランスポザーゼ
の発現が抑制され、従って前記の３成分を含んでいる完全なベクターの完全なパ
ッケージングが可能となる。次に、標的細胞に形質導入するために、テトラサイ
クリンの非存在下で使用することにより、TRE により制御されたSBトランスポザ
ーゼ発現が活性化され、従って形質導入された標的細胞において、SBによる転移
の発生が可能となる。
リンアナログ）の存在下でパッケージングすることにより、SBトランスポザーゼ
の発現が抑制され、従って前記の３成分を含んでいる完全なベクターの完全なパ
ッケージングが可能となる。次に、標的細胞に形質導入するために、テトラサイ
クリンの非存在下で使用することにより、TRE により制御されたSBトランスポザ
ーゼ発現が活性化され、従って形質導入された標的細胞において、SBによる転移
の発生が可能となる。
【００９６】 tet-ONを含有するベクター（図6b）をテトラサイクリン（又はテトラサイクリ
ンアナログ）の非存在下でパッケージングすることによっても、SBトランスポザ
ーゼの発現が抑制され、従って前記の３成分系ベクターの完全なパッケージング
が可能となる。次に、標的細胞に形質導入するために、テトラサイクリンの存在
下で使用することにより、TRE により制御されたSBトランスポザーゼ発現が活性
化され、従ってその標的細胞において、SBによる転移の発生が可能となる。
ンアナログ）の非存在下でパッケージングすることによっても、SBトランスポザ
ーゼの発現が抑制され、従って前記の３成分系ベクターの完全なパッケージング
が可能となる。次に、標的細胞に形質導入するために、テトラサイクリンの存在
下で使用することにより、TRE により制御されたSBトランスポザーゼ発現が活性
化され、従ってその標的細胞において、SBによる転移の発生が可能となる。
【００９７】細胞内でのトランスポザーゼ発現及びトランスポゾン機能の制御 トランスポゾンの転移を制御するために、テトラサイクリンによる転移の制御
を利用する場合、TRE により制御されるトランスポザーゼが、テトラサイクリン
に応答してトランスポザーゼ発現及びトランスポゾン機能を制御することができ
なければならない。この能力を検査した（図８）。トランスポゾンを含んでいる
プラスミドpT/neoは、Ivics et al., Cell, 91, 501-510 (1997)に記載されてい
る。ppATRES は、TRE により制御されるSBトランスポザーゼ発現カセットを含ん
でいるプラスミドである。ppATRES は、下記のpTRES と同じである。
を利用する場合、TRE により制御されるトランスポザーゼが、テトラサイクリン
に応答してトランスポザーゼ発現及びトランスポゾン機能を制御することができ
なければならない。この能力を検査した（図８）。トランスポゾンを含んでいる
プラスミドpT/neoは、Ivics et al., Cell, 91, 501-510 (1997)に記載されてい
る。ppATRES は、TRE により制御されるSBトランスポザーゼ発現カセットを含ん
でいるプラスミドである。ppATRES は、下記のpTRES と同じである。
【００９８】 このTRE により制御されるSBトランスポザーゼ発現カセットを、pSB10 からSB
トランスポザーゼのコード配列を取り出し、それをpTRE (Clontech) のマルチク
ローニング部位内に挿入することにより構築した。次に、この発現カセットを、
pLPBL1アデノウイルスベクタープラスミド（図７）のXhoI部位に導入した。生成
したこの構成体をppATRES と称した。ppATRESTOFF は、tet-OFF 転写単位(Clont
ech, Palo Alto, California）を含んでいるppATRES の誘導体であり、Tet-Off
転写単位を、XhoIからBseRI までの断片として挿入することにより、これを構築
した。pCMVSB10はpSB10 と同じである。
トランスポザーゼのコード配列を取り出し、それをpTRE (Clontech) のマルチク
ローニング部位内に挿入することにより構築した。次に、この発現カセットを、
pLPBL1アデノウイルスベクタープラスミド（図７）のXhoI部位に導入した。生成
したこの構成体をppATRES と称した。ppATRESTOFF は、tet-OFF 転写単位(Clont
ech, Palo Alto, California）を含んでいるppATRES の誘導体であり、Tet-Off
転写単位を、XhoIからBseRI までの断片として挿入することにより、これを構築
した。pCMVSB10はpSB10 と同じである。
【００９９】 これらのプラスミドを、図８に示した組合せで用いて、細胞を形質転換した。
予想した通り、pTneo 及びppATRES をトランスフェクションした細胞では、トラ
ンスポゾンの転移は認められなかった（G418耐性コロニー形成の増加により決定
した）。対照的に、pTneo 及びppATRESTOFF の両方をトランスフェクションした
細胞では、ただしDox の非存在下でのみ、トランスポゾンの転移が認められた（
図８）。これらの結果は、TRE により制御されるトランスポザーゼが、細胞内で
、トランスポザーゼ発現及び転移を制御することができることを示す。
予想した通り、pTneo 及びppATRES をトランスフェクションした細胞では、トラ
ンスポゾンの転移は認められなかった（G418耐性コロニー形成の増加により決定
した）。対照的に、pTneo 及びppATRESTOFF の両方をトランスフェクションした
細胞では、ただしDox の非存在下でのみ、トランスポゾンの転移が認められた（
図８）。これらの結果は、TRE により制御されるトランスポザーゼが、細胞内で
、トランスポザーゼ発現及び転移を制御することができることを示す。
【０１００】トランスポゾン及びトランスポザーゼ発現の機能の共直線的な供給 標的細胞及び組織に、同一ベクターの部分として、トランスポゾン及びトラン
スポザーゼの両機能が供給されたならば、最も有効であろう。プラスミドのトラ
ンスフェクション実験において、この能力を検査した。T/Neo を含んでいるプラ
スミドpLPBLTNeoを、pT/Neo をSacI及びSalIによって消化し、その断片をpLPBL1
に挿入することにより構築した。pLPBLSBTNeoは、T/neo トランスポゾン及び、C
MV プロモーターに連結されたSBトランスポザーゼのコード配列を含んでいるプ
ラスミドであり、これを下記の通りに構築した。
スポザーゼの両機能が供給されたならば、最も有効であろう。プラスミドのトラ
ンスフェクション実験において、この能力を検査した。T/Neo を含んでいるプラ
スミドpLPBLTNeoを、pT/Neo をSacI及びSalIによって消化し、その断片をpLPBL1
に挿入することにより構築した。pLPBLSBTNeoは、T/neo トランスポゾン及び、C
MV プロモーターに連結されたSBトランスポザーゼのコード配列を含んでいるプ
ラスミドであり、これを下記の通りに構築した。
【０１０１】 CMV-SB10を含有する断片を、pSB10 から、EcoRI 及びSalIによる消化により得
た。次に、それを、pLPBL1内のEcoRI とSalIとの間に挿入して、プラスミドpLPB
L/CMVSB10 を得た。T/Neo を、pLPBL/TNeoから、XhoI及びSalIにより切り出し、
次に、それをpLPBL/SMVSB10 のSalI部位に挿入して、pLPBLSBTNeo を得た。 pLPBLSBTNeo から、制限酵素AscIにより、SBTNeoを含有する断片を切り出し、
それを、pDelta28のAscI部位に挿入することにより、pDelta28SBTNeoを構築した
。pLPBLSBTNeo から、制限酵素AscIにより、TRESTONTneo 断片を含んでいる断片
を切り出し、それを、pDelta28のAscI部位に挿入することにより、pDelta28TRES
TONTneo を構築した。
た。次に、それを、pLPBL1内のEcoRI とSalIとの間に挿入して、プラスミドpLPB
L/CMVSB10 を得た。T/Neo を、pLPBL/TNeoから、XhoI及びSalIにより切り出し、
次に、それをpLPBL/SMVSB10 のSalI部位に挿入して、pLPBLSBTNeo を得た。 pLPBLSBTNeo から、制限酵素AscIにより、SBTNeoを含有する断片を切り出し、
それを、pDelta28のAscI部位に挿入することにより、pDelta28SBTNeoを構築した
。pLPBLSBTNeo から、制限酵素AscIにより、TRESTONTneo 断片を含んでいる断片
を切り出し、それを、pDelta28のAscI部位に挿入することにより、pDelta28TRES
TONTneo を構築した。
【０１０２】 これらのプラスミドを、図９に示した組合せで用いて、細胞にトランスフェク
ションした。トランスポゾン及びトランスポザーゼの両機能をシスで含んでいる
pLBPLSBTNeo 構成体を用いた場合、pSB10 とpLBPLTNeo とを同時にトランスフェ
クションした細胞に比べて、G418耐性コロニーの形成頻度が３倍増加することが
認められた。これらの結果は、同一の供給ベクターによりトランスポゾン及びト
ランスポザーゼの機能を供給することができること、並びに、トランスポゾン及
びトランスポザーゼの機能をシスで同時に供給することにより、実際に、転移の
頻度が向上したことを示す。
ションした。トランスポゾン及びトランスポザーゼの両機能をシスで含んでいる
pLBPLSBTNeo 構成体を用いた場合、pSB10 とpLBPLTNeo とを同時にトランスフェ
クションした細胞に比べて、G418耐性コロニーの形成頻度が３倍増加することが
認められた。これらの結果は、同一の供給ベクターによりトランスポゾン及びト
ランスポザーゼの機能を供給することができること、並びに、トランスポゾン及
びトランスポザーゼの機能をシスで同時に供給することにより、実際に、転移の
頻度が向上したことを示す。
【０１０３】トランスポゾン、トランスポザーゼ及びテトラサイクリントランスアクチベータ ーを含んでいるプラスミドの構築 ベクターAd-TRESTON/TNeo(図6b）を下記の通り構築する。SBトランスポザーゼ
のコード配列をpSB10 から取り出し、それを、pTRE (Clontech）のマルチクロー
ニング部位に挿入した。制限エンドヌクレアーゼXhoI及びHindIII により、TRE
及びSBトランスポザーゼのコード配列を含んでいる配列を切り出し、それを、受
容ベクターpLPBL1内に挿入して、pTRES を得た。 PCR に基づく部位特異的変異誘発法により、プラスミドpTet-On (Clontech)の
位置2350にXhoI部位を工作した。その後、そのpTet-On から、XhoI断片として、
Tet-Onのコード配列を切り出し、それをpTRES 内に挿入して、pTRESTONを得た。
のコード配列をpSB10 から取り出し、それを、pTRE (Clontech）のマルチクロー
ニング部位に挿入した。制限エンドヌクレアーゼXhoI及びHindIII により、TRE
及びSBトランスポザーゼのコード配列を含んでいる配列を切り出し、それを、受
容ベクターpLPBL1内に挿入して、pTRES を得た。 PCR に基づく部位特異的変異誘発法により、プラスミドpTet-On (Clontech)の
位置2350にXhoI部位を工作した。その後、そのpTet-On から、XhoI断片として、
Tet-Onのコード配列を切り出し、それをpTRES 内に挿入して、pTRESTONを得た。
【０１０４】 最後に、制限エンドヌクレアーゼSalI及びNdeIにより、pT/NeoHSVTK から、Ne
o トランスボゾンを切り出した。BamHI によりプラスミドpHSVTK106 (BRL, Rock
ville, Maryland)からHSV-tkを切り出し、それをpT/Neoに挿入することにより、
pT/NeoHSVTK を構築した。SalI及びNdeIによりpT/NeoHSVTK を消化することによ
り、Neo トランスポゾンのみを取り出したが、HSV-tkは取り出されない。このNe
o トランスポゾンの両部位を平滑化し、それを、pTRESTONの、平滑化したApaI部
位に挿入して、pTRESTON/TNeo を得た。 pTRESTON/TNeo を制限エンドヌクレアーゼにより切断し、プラスミドpΔ28 に
挿入し、これを適当な条件下でパッケージングすることにより、ヘルパー依存性
アデノウイルスベクターAd-TRESTON/TNeo(図6b）を得る。
o トランスボゾンを切り出した。BamHI によりプラスミドpHSVTK106 (BRL, Rock
ville, Maryland)からHSV-tkを切り出し、それをpT/Neoに挿入することにより、
pT/NeoHSVTK を構築した。SalI及びNdeIによりpT/NeoHSVTK を消化することによ
り、Neo トランスポゾンのみを取り出したが、HSV-tkは取り出されない。このNe
o トランスポゾンの両部位を平滑化し、それを、pTRESTONの、平滑化したApaI部
位に挿入して、pTRESTON/TNeo を得た。 pTRESTON/TNeo を制限エンドヌクレアーゼにより切断し、プラスミドpΔ28 に
挿入し、これを適当な条件下でパッケージングすることにより、ヘルパー依存性
アデノウイルスベクターAd-TRESTON/TNeo(図6b）を得る。
【０１０５】 本文中に引用した全ての特許、特許出願、文献の完全な開示内容、並びに核酸
とタンパク質データベースのデータ、例えばGenBank やEMBLのアクセス番号を、
本文に組込む。本発明の範囲及び意図から逸脱することなく、本発明の改修及び
変更は当業者に明白であり、また本発明は、例示としての実施態様に不当に制限
されるものではない。
とタンパク質データベースのデータ、例えばGenBank やEMBLのアクセス番号を、
本文に組込む。本発明の範囲及び意図から逸脱することなく、本発明の改修及び
変更は当業者に明白であり、また本発明は、例示としての実施態様に不当に制限
されるものではない。
【０１０６】 配列番号の説明 配列番号１ 共通直列反復配列 配列番号２ 直列反復配列 配列番号３ 直列反復配列 配列番号４ 直列反復配列 配列番号５ 直列反復配列 配列番号６ 直列反復配列 配列番号７ 逆方向反復配列 配列番号８ 逆方向反復配列 配列番号９ SBトランスポザーゼのアミノ酸配列 配列番号10 配列番号９をコードするヌクレオチド配列 配列番号11 プライマー 配列番号12 プライマー 配列番号13 プライマー 配列番号14 プライマー
【配列表】
【図１】 図１は、機能性トランスポゾンの作用機構を例示する。この例示では、トラン
スポザーゼ（遺伝子Ｘ）のコード配列は、トランスポゾンのシス作用性逆方向反
復配列の間に存在する。
スポザーゼ（遺伝子Ｘ）のコード配列は、トランスポゾンのシス作用性逆方向反
復配列の間に存在する。
【図２】 図２は、アデノウイルスによるトランスポゾン供給ベクターの例である。この
例では、トランスポザーゼのコード配列及び組込まれるポリヌクレオチド(neo）
の両方は同一ベクター上に存在し、かつアデノウイルス(Ad)の反復性末端反復配
列(ITR）に挟まれている。pA：ポリアデニル化配列、ｐ：プロモーター、SV：サ
ルウイルス40のプロモーター。
例では、トランスポザーゼのコード配列及び組込まれるポリヌクレオチド(neo）
の両方は同一ベクター上に存在し、かつアデノウイルス(Ad)の反復性末端反復配
列(ITR）に挟まれている。pA：ポリアデニル化配列、ｐ：プロモーター、SV：サ
ルウイルス40のプロモーター。
【図３】 図３は、アデノウイルスによるトランスポザーゼ供給ベクターAdSB10の生産に
おける、pACCMVSB10とpJM17 との間の交差現象を例示する。cmv ：ヒトサイトメ
ガロウイルスプロモーター、mu：交差単位、I, II, III及びIV：PCR プライマー
の位置。
おける、pACCMVSB10とpJM17 との間の交差現象を例示する。cmv ：ヒトサイトメ
ガロウイルスプロモーター、mu：交差単位、I, II, III及びIV：PCR プライマー
の位置。
【図４】 図４は、アデノウイルスによるトランスポザーゼ供給ベクターAdSV10により形
質導入したヒト293 細胞が「Sleeping Beauty (SB)」トランスポザーゼを生産す
ることを示すウエスタンブロットである。kd：キロダルトン。
質導入したヒト293 細胞が「Sleeping Beauty (SB)」トランスポザーゼを生産す
ることを示すウエスタンブロットである。kd：キロダルトン。
【図５】 図５は、アデノウイルスによるトランスポザーゼ供給ベクターAdSB10、及び、
SV40初期プロモーターに作用可能に連結され、かつSBトランスポゾン系のシス作
用性要素によって挟まれているneo 遺伝子を含んでいるプラスミドpT/neoにより
処理したHeLa細胞における、T/neo 配列の転移の成功を示すグラフである。pSB1
0 ：SBトランスポザーゼをコードするヌクレオチド配列を含んでいるプラスミド
。
SV40初期プロモーターに作用可能に連結され、かつSBトランスポゾン系のシス作
用性要素によって挟まれているneo 遺伝子を含んでいるプラスミドpT/neoにより
処理したHeLa細胞における、T/neo 配列の転移の成功を示すグラフである。pSB1
0 ：SBトランスポザーゼをコードするヌクレオチド配列を含んでいるプラスミド
。
【図６】 図６は、アデノウイルスによるトランスポゾン供給ベクターからの、テトラサ
イクリンにより制御される転写を例示する。パネルＡは、テトラサイクリン(TET
）の存在下でトランスポザーゼ発現が抑制される様に、活性化タンパク質(tTA）
を構成的に発現する構成体を示す。パネルＢは、テトラサイクリンの非存在下で
トランスポザーゼ発現が抑制される様に、逆の活性を有する様に改変された組換
え活性化タンパク質(rtTA)を構成的に発現する構成体を示す。AdITR ：アデノウ
イルスの反復性の末端反復配列、TRE ：テトラサイクリン応答要素、pA：ポリア
デニル化配列、SV：サルウイルス40のプロモーター、neo ：ネオマイシンアナロ
グG418への耐性を付与するコード配列、cmv ：ヒトサイトメガロウイルスのプロ
モーター。
イクリンにより制御される転写を例示する。パネルＡは、テトラサイクリン(TET
）の存在下でトランスポザーゼ発現が抑制される様に、活性化タンパク質(tTA）
を構成的に発現する構成体を示す。パネルＢは、テトラサイクリンの非存在下で
トランスポザーゼ発現が抑制される様に、逆の活性を有する様に改変された組換
え活性化タンパク質(rtTA)を構成的に発現する構成体を示す。AdITR ：アデノウ
イルスの反復性の末端反復配列、TRE ：テトラサイクリン応答要素、pA：ポリア
デニル化配列、SV：サルウイルス40のプロモーター、neo ：ネオマイシンアナロ
グG418への耐性を付与するコード配列、cmv ：ヒトサイトメガロウイルスのプロ
モーター。
【図７】 図７は、pLPBL1のプラスミド地図である。
【図８】 図８は、テトラサイクリンアナログのドキシサイクリンに応答してTRE により
制御されるトランスポザーゼ発現及びトランスポゾン機能を示すグラフである。
+Dox及び-Dox：各々、ドキシサイクリンの存在及び非存在。
制御されるトランスポザーゼ発現及びトランスポゾン機能を示すグラフである。
+Dox及び-Dox：各々、ドキシサイクリンの存在及び非存在。
【図９】 図９は、トランスポザーゼ及びトランスポゾンが同一ベクター上に存在してい
る場合における、細胞内のトランスポゾン機能の制御を示すグラフである。
る場合における、細胞内のトランスポゾン機能の制御を示すグラフである。
【図１０】 図10(A) は、SBタンパク質をコードする二本鎖核酸配列（配列番号10）である
。図10(B) は、SBトランスポザーゼのアミノ酸配列（配列番号９）である。主な
機能性ドメインを強調して示す。NLS ：２部に分かれた核局在化シグナル、転移
を触媒するDDE ドメイン(Doak, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91, 94
2-946 (1994)) を含んでなる、Ｄ及びＥに印を付けたボックス、DD(34)E ボック
ス：２つの不変なアスパラギン酸残基D(153)及びD(244)、並びに１つのグルタミ
ン酸残基E(279)を含んでいる（ただし後の２残基は43アミノ酸離れている）触媒
ドメイン。
。図10(B) は、SBトランスポザーゼのアミノ酸配列（配列番号９）である。主な
機能性ドメインを強調して示す。NLS ：２部に分かれた核局在化シグナル、転移
を触媒するDDE ドメイン(Doak, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91, 94
2-946 (1994)) を含んでなる、Ｄ及びＥに印を付けたボックス、DD(34)E ボック
ス：２つの不変なアスパラギン酸残基D(153)及びD(244)、並びに１つのグルタミ
ン酸残基E(279)を含んでいる（ただし後の２残基は43アミノ酸離れている）触媒
ドメイン。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 43/00 １０５ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ， ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (71)出願人 マクアイバー，アール スコット アメリカ合衆国，ミネソタ 55416，セン ト ルイス パーク ストリート，グレン ハースト アベニュ サウス 3745 (71)出願人 アギラー−コルドバ，エスタルド アメリカ合衆国，テキサス 77035，ヒュ ーストン，オメアラ ドライブ 4310 (72)発明者 マクアイバー，アール．スコット アメリカ合衆国，ミネソタ 55416，セン ト ルイス パーク，グレンハースト ア ベニュ サウス 3745 (72)発明者 アギラー−コルドバ，エスタルド アメリカ合衆国，テキサス 77035，ヒュ ーストン，オメアラ ドライブ 4310 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA20 CA20 DA02 DA03 EA02 EA04 FA02 GA11 HA17 4B065 AA90X AA95Y AB01 BA01 CA44 4C084 AA02 BA03 CA18 MA05 NA10 NA13 ZB21 4C086 AA01 EA16 MA02 MA05 NA13 ZB21 4C087 AA01 BB54 BC83 MA05 NA13 ZB21
Claims (93)
- 【請求項１】 トランスポザーゼと結合する逆方向反復配列によって挟まれ
たポリヌクレオチド、及びオペレーター配列を含んでいる制御配列に作用可能に
連結されたトランスポザーゼをコードするポリヌクレオチドを含んでなる非組込
み型ベクター。 - 【請求項２】 前記トランスポザーゼがSBポリペプチドである、請求項１の
非組込み型ベクター。 - 【請求項３】 前記SBポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号９の配列に
対して少なくとも約80％相同である、請求項２の非組込み型ベクター。 - 【請求項４】 前記SBポリペプチドが配列番号９のアミノ酸配列を有する、
請求項３の非組込み型ベクター。 - 【請求項５】 前記の逆方向反復配列が配列番号７又は８の配列を含んでな
る、請求項２の非組込み型ベクター。 - 【請求項６】 前記の逆方向反復配列が、配列番号２，３，４及び５からな
る群から選択されるヌクレオチド配列を含んでなる直列反復配列ポリヌクレオチ
ドを含んでなる、請求項２の非組込み型ベクター。 - 【請求項７】 非組込み型ウイルスベクターである、請求項１の非組込み型
ベクター。 - 【請求項８】 前記のポリヌクレオチド、逆方向反復配列、トランスポザー
ゼをコードするポリヌクレオチド、及び制御配列の組合せを挟んでいる反復性の
末端反復配列を含んでなるアデノウイルスベースのベクターである、請求項１の
非組込み型ベクター。 - 【請求項９】 ヘルパー依存性アデノウイルスベクターである、請求項８の
非組込み型ベクター。 - 【請求項１０】 前記の逆方向反復配列によって挟まれたポリヌクレオチド
が非コード配列を含んでなる、請求項１の非組込み型ベクター。 - 【請求項１１】 前記制御配列が第一の制御配列であり、そして前記の逆方
向反復配列によって挟まれたポリヌクレオチドが、第二の制御配列に作用可能に
連結されたコード配列を含んでなる、請求項１の非組込み型ベクター。 - 【請求項１２】 前記オペレーター配列が、lac オペレーター及びテトラサ
イクリン応答要素からなる群から選択される、請求項１の非組込み型ベクター。 - 【請求項１３】 制御ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを更に含
んでなる、請求項１の非組込み型ベクター。 - 【請求項１４】 前記のオペレーター配列がlac オペレーター配列を含んで
なり、そして前記の制御ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドがLacIをコ
ードする、請求項13の非組込み型ベクター。 - 【請求項１５】 前記のオペレーター配列がテトラサイクリン応答要素を含
んでなり、そして前記の制御ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、適
当な条件下でテトラサイクリン応答要素と結合するポリペプチドをコードする、
請求項13の非組込み型ベクター。 - 【請求項１６】 前記の制御ポリペプチドが、tTA 及びrtTAからなる群から
選択される、請求項15の非組込み型ベクター。 - 【請求項１７】 プラスミドベクターである、請求項１の非組込み型ベクタ
ー。 - 【請求項１８】 トランスポザーゼと結合する逆方向反復配列によって挟ま
れたポリヌクレオチド、トランスポザーゼをコードするポリヌクレオチド、及び
、そのトランスポザーゼをコードするポリヌクレオチドの発現を変更する制御ポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなる非組込み型ベクター。 - 【請求項１９】 前記トランスポザーゼがSBポリペプチドである、請求項18
の非組込み型ベクター。 - 【請求項２０】 前記SBポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号９の配列
に対して少なくとも約80％相同である、請求項19の非組込み型ベクター。 - 【請求項２１】 前記SBポリペプチドが配列番号９のアミノ酸配列を有する
、請求項20の非組込み型ベクター。 - 【請求項２２】 前記の逆方向反復配列が配列番号７又は８の配列を含んで
なる、請求項19の非組込み型ベクター。 - 【請求項２３】 前記の逆方向反復配列が、配列番号２，３，４及び５から
なる群から選択されるヌクレオチド配列を含んでなる直列反復配列ポリヌクレオ
チドを含んでなる、請求項19の非組込み型ベクター。 - 【請求項２４】 非組込み型ウイルスベクターである、請求項18の非組込み
型ベクター。 - 【請求項２５】 前記のポリヌクレオチド、逆方向反復配列、トランスポザ
ーゼをコードするポリヌクレオチド、及び制御ポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチドの組合せを挟んでいる反復性の末端反復配列を含んでなるアデノウイ
ルスベースのベクターである、請求項18の非組込み型ベクター。 - 【請求項２６】 ヘルパー依存性アデノウイルスベクターである、請求項25
の非組込み型ベクター。 - 【請求項２７】 前記のトランスポザーゼをコードするポリヌクレオチドが
、オペレーター配列を含んでなる制御配列に作用可能に連結されている、請求項
18の非組込み型ベクター。 - 【請求項２８】 前記のオペレーター配列がlac オペレーター配列を含んで
なり、そして前記の制御ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドがLacIをコ
ードする、請求項27の非組込み型ベクター。 - 【請求項２９】 前記のオペレーター配列がテトラサイクリン応答要素を含
んでなり、そして前記の制御ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、tT
A 及びrtTAからなる群から選択される、請求項27の非組込み型ベクター。 - 【請求項３０】 前記の逆方向反復配列によって挟まれたポリヌクレオチド
が非コード配列を含んでなる、請求項18の非組込み型ベクター。 - 【請求項３１】 前記の逆方向反復配列によって挟まれたポリヌクレオチド
が、制御配列に作用可能に連結されたコード配列を含んでなる、請求項18の非組
込み型ベクター。 - 【請求項３２】 プラスミドベクターである、請求項24の非組込み型ベクタ
ー。 - 【請求項３３】 トランスジェニック細胞の作製方法であって、 細胞を、 トランスポザーゼと結合する逆方向反復配列によって挟まれた選択されたポリ
ヌクレオチド、及び オペレーター配列を含んでなる制御配列に作用可能に連結されたトランスポザ
ーゼをコードするポリヌクレオチド を含んでなる非組込み型ベクターに接触させ、その結果、その細胞内でトランス
ポザーゼを発現させることによって、前記の選択されたポリヌクレオチドを含ん
でいるゲノムDNA を保有するトランスジェニック細胞を形成すること、 を含んでなる前記方法。 - 【請求項３４】 前記の非組込み型ベクターが、前記のポリヌクレオチド、
逆方向反復配列、トランスポザーゼをコードするポリヌクレオチド、及び制御配
列の組合せを挟んでいる反復性の末端反復配列を含んでなるアデノウイルスベク
ターである、請求項33の方法。 - 【請求項３５】 前記の非組込み型ベクターがプラスミドベクターである、
請求項33の方法。 - 【請求項３６】 前記トランスポザーゼがSBポリペプチドである、請求項33
の方法。 - 【請求項３７】 前記オペレーター配列がlac オペレーターである、請求項
33の方法。 - 【請求項３８】 前記のトランスポザーゼを発現させることが、前記細胞内
でLacIポリペプチドの非存在を維持することを含んでなる、請求項37の方法。 - 【請求項３９】 前記のトランスポザーゼを発現させることが、前記細胞へ
IPTGを添加することを含んでなる、請求項37の方法。 - 【請求項４０】 前記の非組込み型ウイルスベクターが、更に、制御ポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなる、ただしその制御ポリペプチ
ドは、適当な条件下で前記オペレーター配列に結合し、そして前記のトランスポ
ザーゼをコードするポリヌクレオチドの発現を制御するものである、請求項33の
方法。 - 【請求項４１】 前記オペレーター配列がlac オペレーター配列を含んでな
り、そして前記の制御ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドがLacIをコー
ドする、請求項40の方法。 - 【請求項４２】 前記のオペレーター配列がテトラサイクリン応答要素を含
んでなり、そして前記の制御ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドがtTA
をコードする、請求項40の方法。 - 【請求項４３】 前記のオペレーター配列がテトラサイクリン応答要素を含
んでなり、そして前記の制御ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドがrtTA
をコードする、請求項40の方法。 - 【請求項４４】 前記の逆方向反復配列によって挟まれたポリヌクレオチド
が、非コード配列及びコード配列からなる群から選択されるポリヌクレオチドを
含んでなる、請求項33の方法。 - 【請求項４５】 前記の細胞が哺乳動物の細胞である、請求項33の方法。
- 【請求項４６】 前記の哺乳動物の細胞が人間の細胞である、請求項45の方
法。 - 【請求項４７】 インビボで行なわれる、請求項33の方法。
- 【請求項４８】 エキソビボで行なわれる、請求項33の方法。
- 【請求項４９】 インビトロで行なわれる、請求項33の方法。
- 【請求項５０】 トランスジェニック生物の作製方法であって、 細胞を、 トランスポザーゼと結合する逆方向反復配列によって挟まれた選択されたポリ
ヌクレオチド、 トランスポザーゼをコードするポリヌクレオチド、及び そのトランスポザーゼをコードするポリヌクレオチドの発現を変更する制御ポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチド を含んでなる非組込み型ベクターに接触させ、その結果、その細胞内でトランス
ポザーゼを発現させることによって、前記の選択されたポリヌクレオチドを含ん
でいるゲノムDNA を保有するトランスジェニック生物を形成すること、 を含んでなる前記方法。 - 【請求項５１】 前記の非組込み型ベクターが、前記のポリヌクレオチド、
逆方向反復配列、トランスポザーゼをコードするポリヌクレオチド、及び制御配
列の組合せを挟んでいる反復性の末端反復配列を含んでなるアデノウイルスベク
ターである、請求項50の方法。 - 【請求項５２】 前記の非組込み型ベクターがプラスミドベクターである、
請求項50の方法。 - 【請求項５３】 前記トランスポザーゼがSBポリペプチドである、請求項50
の方法。 - 【請求項５４】 前記のトランスポザーゼをコードするポリヌクレオチドが
、オペレーター配列を含んでなる制御配列を含んでなる、請求項50の方法。 - 【請求項５５】 前記オペレーター配列がlac オペレーター配列を含んでな
る、請求項54の方法。 - 【請求項５６】 前記のオペレーター配列がテトラサイクリン応答要素を含
んでなり、そして前記の制御ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドがtTA
をコードする、請求項54の方法。 - 【請求項５７】 前記のオペレーター配列がテトラサイクリン応答要素を含
んでなり、そして前記の制御ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドがrtTA
をコードする、請求項54の方法。 - 【請求項５８】 前記の逆方向反復配列によって挟まれたポリヌクレオチド
が、非コード配列及びコード配列からなる群から選択されるポリヌクレオチドを
含んでなる、請求項50の方法。 - 【請求項５９】 前記の細胞が哺乳動物の細胞である、請求項50の方法。
- 【請求項６０】 前記の哺乳動物の細胞が人間の細胞である、請求項59の方
法。 - 【請求項６１】 インビボで行なわれる、請求項50の方法。
- 【請求項６２】 エキソビボで行なわれる、請求項50の方法。
- 【請求項６３】 インビトロで行なわれる、請求項50の方法。
- 【請求項６４】 細胞の表現型を変更する方法であって、 細胞を、 トランスポザーゼと結合する逆方向反復配列によって挟まれた選択されたポリ
ヌクレオチド、及び オペレーター配列を含んでなる制御配列に作用可能に連結されたトランスポザ
ーゼをコードするポリヌクレオチド を含んでなる非組込み型ベクターに接触させ、その結果、その細胞内でトランス
ポザーゼを発現させることによって、前記の逆方向反復配列によって挟まれたポ
リヌクレオチドを含んでなるゲノムDNA を保有するトランスジェニック細胞を形
成すること、及び そのトランスジェニック細胞又はその子孫の表現型が、前記の選択されたポリ
ヌクレオチドを保有していない細胞と比較して変更されているかどうかを決定す
ること、 を含んでなる前記方法。 - 【請求項６５】 生物の表現型を変更する方法であって、 細胞を、 トランスポザーゼと結合する逆方向反復配列によって挟まれた選択されたポリ
ヌクレオチド、 トランスポザーゼをコードするポリヌクレオチド、及び 制御ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド を含んでなる非組込み型ベクターに接触させ、その結果、その細胞内でトランス
ポザーゼを発現させることによって、前記の逆方向反復配列によって挟まれたポ
リヌクレオチドを含んでなるゲノムDNA を保有するトランスジェニック生物を形
成すること、及び そのトランスジェニック生物又はその子孫の表現型が、前記の選択されたポリ
ヌクレオチドを保有していない細胞と比較して変更されているかどうかを決定す
ること、 を含んでなる前記方法。 - 【請求項６６】 核酸供給系の作製方法であって、 トランスポザーゼと結合する逆方向反復配列によって挟まれたポリヌクレオチ
ド、及び、 オペレーター配列を含んでなる制御配列に作用可能に連結されたトランスポザ
ーゼをコードするポリヌクレオチド を含んでなる非組込み型のアデノウイルスベースのウイルスベクターを構築する
こと、及び その非組込み型のアデノウイルスベースのウイルスベクターを、前記のトラン
スポザーゼが発現しない条件下でパッケージングすること、 を含んでなる前記方法。 - 【請求項６７】 前記のアデノウイルスベースのウイルスベクターがヘルパ
ー依存性のアデノウイルスベクターである、請求項66の方法。 - 【請求項６８】 前記オペレーター配列がlac オペレーターである、請求項
66の方法。 - 【請求項６９】 前記のパッケージングが、LacIが前記のトランスポザーゼ
をコードするポリペプチドの発現を抑制する様に、そのLacIの存在を維持するこ
とを含んでなる、請求項67の方法。 - 【請求項７０】 前記の非組込み型ウイルスベクターが、更に、制御ポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチドを含んでいて、そのポリヌクレオチドがLa
cIをコードし、そして前記オペレーター配列がlac オペレーター配列を含んでな
る、請求項66の方法。 - 【請求項７１】 前記の非組込み型ウイルスベクターが、更に、制御ポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチドを含んでいて、そのポリヌクレオチドがtT
A をコードし、そして前記オペレーター配列がテトラサイクリン応答要素を含ん
でなる、請求項66の方法。 - 【請求項７２】 前記の非組込み型ウイルスベクターが、更に、制御ポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチドを含んでいて、そのポリヌクレオチドがrt
TAをコードし、そして前記オペレーター配列がテトラサイクリン応答要素を含ん
でなる、請求項66の方法。 - 【請求項７３】 核酸供給系の作製方法であって、 トランスポザーゼと結合する逆方向反復配列によって挟まれたポリヌクレオチ
ド、 トランスポザーゼをコードするポリヌクレオチド、及び そのトランスポザーゼをコードするポリヌクレオチドの発現を変更する制御ポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチド を含んでなる非組込み型のアデノウイルスベースのウイルスベクターを構築する
こと、及び その非組込み型のアデノウイルスベースのウイルスベクターを、前記のトラン
スポザーゼの発現を抑制する条件下でパッケージングすること、 を含んでなる前記方法。 - 【請求項７４】 前記のアデノウイルスベースのウイルスベクターがヘルパ
ー依存性のアデノウイルスベクターである、請求項73の方法。 - 【請求項７５】 前記の非組込み型ウイルスベクターが、更に、前記のトラ
ンスポザーゼをコードするポリヌクレオチドに作用可能に連結されたオペレータ
ー配列を含んでいる、請求項73の方法。 - 【請求項７６】 前記オペレーター配列がlac オペレーター配列を含んでな
り、そして前記の制御ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドがLacIをコー
ドし、そしてそのLacIが、前記のトランスポザーゼをコードするポリペプチドの
発現を抑制する、請求項75の方法。 - 【請求項７７】 前記のオペレーター配列がテトラサイクリン応答要素を含
んでなり、そして前記の制御ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドがtTA
をコードする、請求項75の方法。 - 【請求項７８】 前記のオペレーター配列がテトラサイクリン応答要素を含
んでなり、そして前記の制御ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドがrtTA
をコードする、請求項75の方法。 - 【請求項７９】 哺乳動物の患者を処置する方法であって、 その患者に、 第一の制御配列に作用可能に連結された治療剤をコードするポリヌクレオチド
、及び、 オペレーター配列を含んでいる第二の制御配列に作用可能に連結されたトラン
スポザーゼをコードするポリヌクレオチド、 を含んでなる、ただし前記の治療剤をコードするポリヌクレオチドと第一制御配
列との組合せが、トランスポザーゼと結合する逆方向反復配列によって挟まれて
いる、非組込み型ウイルスベクターを投与すること、 を含んでなる前記方法。 - 【請求項８０】 前記の非組込み型ウイルスベクターを、患者の臓器又は組
織に投与する、請求項79の方法。 - 【請求項８１】 前記の臓器又は組織が、肝臓、神経系、脳、肺、皮膚、心
血管系、心臓、造血系、骨髄、及び筋肉からなる群から選択される、請求項80の
方法。 - 【請求項８２】 前記治療剤がポリペプチドである、請求項79の方法。
- 【請求項８３】 前記治療剤がRNA 分子である、請求項79の方法。
- 【請求項８４】 前記患者が、あるポリペプチド又はRNA の生産が標準未満
であることを特徴とする遺伝病を有し、そして前記治療剤がそのポリペプチド又
はRNA を含んでなる、請求項79の方法。 - 【請求項８５】 哺乳動物の患者を処置する方法であって、 その患者に、 第一の制御配列に作用可能に連結された治療剤をコードするポリヌクレオチド
、 トランスポザーゼをコードするポリヌクレオチド、及び そのトランスポザーゼをコードするポリヌクレオチドの発現を変更する制御ポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチド、 を含んでなる、ただし前記の治療剤をコードするポリヌクレオチドと第一制御配
列との組合せが、トランスポザーゼと結合する逆方向反復配列によって挟まれて
いる、非組込み型ウイルスベクターを投与すること、 を含んでなる前記方法。 - 【請求項８６】 哺乳動物の患者を処置する方法であって、 （ａ）その患者の細胞を外植すること、 （ｂ）その外植された細胞を、 第一の制御配列に作用可能に連結された治療剤をコードするポリヌクレオチド
、及び、 オペレーター配列を含んでいる第二の制御配列に作用可能に連結されたトラン
スポザーゼをコードするポリヌクレオチド、 を含んでなる、ただし前記の治療剤をコードするポリヌクレオチドと第一制御配
列との組合せが、トランスポザーゼと結合する逆方向反復配列によって挟まれて
いる、非組込み型ウイルスベクターと接触させること、及び （ｃ）そのトランスジェニック細胞を患者内に移植して、その患者内で前記の
治療剤を生産させること、 を含んでなる前記方法。 - 【請求項８７】 前記細胞が、造血幹細胞、肝細胞、筋芽細胞、線維芽細胞
、角化細胞、内皮細胞及び腫瘍細胞からなる群から選択される、請求項86の方法
。 - 【請求項８８】 前記細胞がガン性腫瘍細胞である、請求項87の方法。
- 【請求項８９】 前記治療剤がポリペプチドである、請求項86の方法。
- 【請求項９０】 前記治療剤がRNA 分子である、請求項86の方法。
- 【請求項９１】 前記患者が、あるポリペプチド又はRNA の生産が標準未満
であることを特徴とする遺伝病を有し、そして前記治療剤がそのポリペプチド又
はRNA を含んでなる、請求項86の方法。 - 【請求項９２】 前記患者が人間である、請求項86の方法。
- 【請求項９３】 哺乳類の患者を処置する方法であって、 （ａ）その患者の細胞を外植すること、 （ｂ）その外植された細胞を、 第一の制御配列に作用可能に連結された治療剤をコードするポリヌクレオチド
、 トランスポザーゼをコードするポリヌクレオチド、及び そのトランスポザーゼをコードするポリヌクレオチドの発現を変更する制御ポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチド、 を含んでなる、ただし前記の治療剤をコードするポリヌクレオチドと第一制御配
列との組合せが、トランスポザーゼと結合する逆方向反復配列によって挟まれて
いる、非組込み型ウイルスベクターと接触させること、及び （ｃ）そのトランスジェニック細胞を患者内に移植して、その患者内で前記の
治療剤を生産させること、 を含んでなる前記方法。
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