JP2001503962A

JP2001503962A - 細胞のゲノム中に組込まれる付加核酸物質を細胞に付与するためのベクターおよび方法

Info

Publication number: JP2001503962A
Application number: JP52841097A
Authority: JP
Inventors: ハンスアントンプラステルク，ロナルド; クリスチアーンフォス，ヤン
Original assignee: ヘットネーデルランツカンケルインスティチュート
Priority date: 1996-02-09
Filing date: 1997-02-07
Publication date: 2001-03-27
Also published as: AU731615B2; EP0885307A1; WO1997029202A1; AU1674697A; US6051430A

Abstract

(57)【要約】本発明は組換え核酸分子および／または組換え細胞を製造するための因子を提供する。該因子は所望の核酸物質を他の核酸物質、特に宿主細胞のゲノムに組込むことができる。該因子はトランスポゾンから、またはトランスポゾンに基づき、特にＴｃ／マリナー上科から誘導される。とりわけ、所望の核酸物質の切除・結合を可能にするＴｃ１の実質的な因子が、シスまたはトランスの関連トランスポザーゼ活性と共に付与される。

Description

【発明の詳細な説明】細胞のゲノム中に組込まれる付加核酸物質を細胞に付与するためのベクターおよび方法本発明は遺伝子工学領域、特に、対象となる核酸を含む組換えベクターの作製法の分野、組換え細胞、好ましくは組換え生産物を発現する組換え細胞の作製法の分野、および／または対象となる核酸の製造の分野に関する。さらなる実施の形態において、本発明は医学上、化学上もしくは経済上の興味の対象となる動物、植物、または他の生物のトランスジェネシスに関する。さらに他の実施の形態において、本発明は突然変異誘発の手段ならびに宿主ゲノムの（遺伝子などの）対象核酸配列の位置特定および／または同定の手段および方法に関する。付加核酸を有する細胞を付与する方法については多くの方法が当該分野で知られている。多くのタンパクが、原核細胞細菌および桿菌から酵母および真菌を経て、植物細胞、昆虫細胞および哺乳動物細胞に至る多様な細胞中で発現されている。上に述べたタンパクの発現は多くの場合成功するが、組換え技術分野のある領域では、導入すべき付加核酸の安定性など、安全性の問題あるいは技術上の問題などのために容易に成功し得ない場合がある。また、生成物がタンパクではなく、たとえば、対象の核酸（たとえば、ＤＮＡ，ＲＮＡまたはアンチセンス構成物）である遺伝子工学の応用においては、同様のあるいは類似の問題が生じている。本発明が利用できるのは特にそういった領域である。組換え技術において生じる問題の一つは、宿主細胞に導入する付加核酸物質を該宿主細胞のゲノムに組込むことがしばしば必要となることである。一旦、該付加核酸がゲノムに組込まれると、その安定性はあまり問題とならない。さらに、組込まれた物質はゲノムと一緒に複製され、且つ、同様に組換え細胞の子孫にも存在することになる。宿主細胞に付加核酸物質を組込むために付与することのできるベクターは知られてはいるが、それらには以下に述べるような幾つかの欠陥がある。本発明は、当該宿主細胞のゲノムに所望の付加核酸を組込むために広範な種類のベクターを変化させることのできる方法を提供する。その意味するところは、所望の付加核酸物質を宿主細胞のゲノムに（効果的に）組込めなかったベクターが、今や当該能力を備えることができるようになるということである。先行技術における組込みベクターの欠陥の一つは、それらがしばしば宿主細胞に効果的に形質導入し得ないということである。それ故、エレクトロポレーションなどの技術が、形質導入を遂行するために必要である。ある領域では細胞をそのように処理することは望ましくないか、あるいは不可能である。そのような領域の一つが、たとえば、遺伝子治療である。そのような場合、宿主細胞それ自身に効果的に形質導入することのできるベクター、あるいは組換えウイルス粒子に入れ込み、宿主細胞を感染させることのできるベクターをしばしば採用する。しかし、それらベクターの多くは宿主のゲノムに所望の付加核酸物質を（効果的に）組込むことができない。したがって、本発明は双方の世界にとって最良のものを提供するものであって、所望の付加核酸物質を宿主細胞に効果的に形質導入し、効果的に組込むことのできるベクターを調製し得るものである。本発明は、宿主細胞ゲノムに組込むべき核酸を機能的トランスポゾンの範囲内で付与する問題を解決する。外来ＤＮＡはトランスポゾンを用いて宿主のゲノムに導入されてきたが、しかしながら、本発明までは、トランスポゾンはむしろ種特異的と考えられてきたので、そのような系の適用範囲は非常に限られたものであると考えられていた。一種のミバエに機能するトランスポゾンが他の種のミバエゲノムにＤＮＡを組込むために用いることもできるということが示された程度であった(ルーサリス（Loutheris）ら、１９９５)。本発明者らは、少なくともあるクラスのトランスポゾンにあっては、広範な系統発生的障壁を越えてこれらのトランスポゾンが使用可能であり、多種類の宿主ゲノムにＤＮＡを組込む手段としてのこれらのトランスポゾンの広範な応用が見込まれることを発見した。本発明はある属の細胞に、そのゲノムに組込む付加核酸物質を付与するためのベクターを提供するもので、当該ベクターは２つのトランスポザーゼ結合部位を含み、該トランスポザーゼ結合部位は同一であっても異なっていてもよく、他の属に見出されるトランスポゾンから誘導される。また、それぞれが該トランスポザーゼの切断部位に近接しておい、該付加核酸物質は該２つのトランスポザーゼ結合部位の間に位置している。勿論、広範な系統発生的障害を越えたトランスポゾンを使用し得ることが非常に好ましいことは明らかである。本発明はしたがって応用範囲の広いトランスポゾン依拠組込みシステムを提供する。この系には以下の明らかな利点がある。たとえば、トランスポゾンを用いることで、多くの場合、宿主細胞ゲノムへの組込みがより効果的になること、トランスポゾンを用いることで組込み配列（組込み因子の末端は既知である）が完全に制御されること、遺伝子（またはＤＮＡ）の位置特定が望まれる態様においては、トランスポゾンをゲノムのいずれの部位にも組込むことが可能であることは利点である(特に、遺伝子機能を目指すいわゆる突然変異誘発実験、または対象となる発現パターンの遺伝子追跡を目的とする「遺伝子トラップ」実験で有用である )。発現を目的とするためには、ゲノムのより特異的組込み部位を有するトランスポゾンを開発すること、またはより特異的な組込み部位に導く組込み法を開発することが望ましい。好ましくは、該トランスポザーセ結合部位および該切断部位は、トランスポゾンのＴｃ１／マリナー（mariner）上科からのトランスポゾンの対応する部位に基づいており、より好ましくは、それらはＴｃ１様トランスポゾンに基づいている。非常に有用なトランスポゾン因子のセットはＴｃ１トランスポゾンに必要な最小のセット、すなわち、Ｔｃ１の末端２６塩基対および近接のＴｃ１トランスポザーゼ切断部位（ＴＡ）を含む。本発明に従ったトランスポゾンの重要な利点は、それらが自己充足性（self-s ufficient）であるということである。必要とされるのは、機能的トランスポゾン結合部位、トランスポザーゼ切断部位、およびこれらの部位に機能するトランスポザーゼ活性だけである。必要とするトランスポザーゼ活性は可能な限り制限すべきである。好ましいクラスのトランスポゾンは単一のトランスポザーゼだけを必要とする。今日までに報告されたトランスポゾンが種特異性である理由は、ジャンプを可能とするために、宿主タンパクを必要とするトランスポゾンが使用されてきたということである。宿主タンパクはそれ故に、細菌由来の、またはＰ −因子の種特異性に関連する。本発明が提供するクラスのものは宿主因子を必要とせず、適度のシス−トランス要件を備えている。それ故、これらのトランスポゾンは多様な宿主のゲノムに対象とする核酸を組込むのに遥かに適している。Ｔｃ１に基づく因子が用いられる好ましい実施の形態において、そのようなトランスポゾン結合部位は少なくとも２６末端塩基対であるように思われる。恐らく、これら塩基対の全てがこの結合部位の機能に必須というものではない。それ故、そのような結合部位におけるある（保守的）変化を許容する。凡そ１００ｂｐの配列がトランスポゾン認識部位としてもっとも効果があるように思われる。本発明にとって、その要件は対応するトランスポゾン活性に機能的であるということであって、そのトランスポゾンは勿論、関係するトランスポザーゼ活性を有する限り、当初トランスポゾンと比べて、修飾されていてもよく、突然変異変化を受けていてもよく、短縮または伸長されていてもよい。トランスポザーゼ活性は他のトランスポゾン因子と同様のベクター上に、場合により所望の付加核酸物質（シス）と共に該トランスポゾンの一部としてコードしてもよいが、非常に適切には本発明による他のベクターあるいは他のベクター（トランス）によって形質導入される細胞に付与してするのがよい。トランスポザーゼ活性がトランスの形態で付与され、好ましくは誘導性および／または抑制性プロモーターの制御のもとで配列によりコードされている場合、トランスポゾンの「跳躍(jumping)」のオン、オフが可能である。宿主ゲノムへの組込みが一旦行われると、これは非常に有用なものとなる。本発明が目的とするベクターは、所望の付加核酸物質を担持することができる、好ましくは宿主細胞の形質導入および／または複製を可能とする核酸伝達体である。所望の付加核酸物質とはあるタンパクをコードするものであり、それ故、遺伝子と発現を制御する因子を含む。発現すべきタンパクは形質導入の目的に依存する。多くの応用が可能な多くの有用タンパクが組換え発現用の適切な候補として同定されている。これらの全てが本発明を用いて発現可能である。また、付加核酸物質（ＤＮＡ）は宿主細胞（またはウイルス性）核酸の転写または翻訳を阻止するＲＮＡ分子に転写（一旦形質導入）することができる。そのような付加核酸物質は、たとえば、アンチセンスＲＮＡ分子である。上述から明らかなとおり、遺伝子治療分野で本発明を使用することが特に有利である。遺伝子治療にしばしば企図されるウイルス性ベクター（、アデノウイルス、レトロウイルス、またはアデノ随伴ウイルス）は所望の核酸物質を感染細胞のゲノムに効率的に組込むことができないものであるが、今やこれらにそのような能力を付与することが可能となる。ウイルスに基づくものではないが、標的とする細胞集団にそれらを送達する手段の備わっている他のベクターにもまた、勿論有利に本発明による組込みシステムを付与することができる。特に、標的とする系としてリポソームまたはポリマーを使用することが期待される。先に述べたように、細胞の子孫もまたその能力を持つであろう。それ故、本発明により幹細胞が産生された場合、それは非常に効果的な遺伝子治療法となり得る。本発明のベクター（または組込みシステム）は勿論、科学的、経済的もしくは医学的に興味の対象となる形質転換動物、植物または他の生物を生産するためにも用いることができる。トランスジェネシスの有用な応用については当業においてよく知られている。このように、細胞または動物、植物などを形質転換する本発明ベクターを使用する方法を開示するが、本発明の一部はそのような方法により得られる細胞、動物または植物などである。本発明を突然変異誘発の研究などに使用することも、上述したように他の好ましい実施の形態である。本発明を、Ｔｃ１の一例をもってより詳細に説明するが、本発明はこれに限るものではない。詳細な説明Ｔｃ１は線虫、節足動物および脊索動物に見出されるトランスポゾンのＴｃ１／マリナー上科に属する(ヘニコッフ(Henikoff)１９９２、ラディス(Raddice)ら ,１９９４、ロバートソン(Robertson)１９９５、プラスターク(Plasterk)１９９５)。垂直および水平転移の双方が動物界全般にわたってこれら因子の拡大に寄与している(ロバートソン(Robertson)１９９３、ラディス(Radice)ら、１９９４、ロバートソンおよびランペ(Lampe)１９９５)。トランスポゾンのＴｃ１／マリナー科が広範に存在していることは、異なった種間の転移を制限する種特異的宿主ファクターなど存在しないことの証と捉えることができる。それ故、Ｔｃ１／マリナー因子は遺伝子送達ベクター開発においての魅惑的候補である。Ｔｃ１様因子は１．７kbの長さに近く、トランスポザーゼ遺伝子をフランキングする短い逆方向の末端繰返しを有し、その末端に標的部位を意味するＴＡにより両側を挟まれた保存配列ＣＡＧＴを有し、それが組込みに際し複製される(バン・リューネン(Van Luenen)ら、１９９４)。該因子−コードタンパクは細菌性トランスポザーゼとレトロウイルス性インテグラーゼを有する相同性触媒ドメインを分け合っている(ドーク(Doak)ら、１９９４)。シー・エレガンス(C.elegans )からのＴｃ１は１６１２ｂｐの長さのトランスポゾンであり、３４３アミノ酸のトランスポザーゼをコードする遺伝子をフランキングする５４ｂｐの逆方向繰返しを有するもの（エモンズ(Emmons)ら、１９８３、ローゼンツバイク(Rosenzw eig)ら、１９８３、ボス(Vos)ら、１９９３）であって、逆方向繰返しに結合している(ボスら、１９９３、ボスおよびプラスターク(Plasterk)１９９４)。該因子の最末端保存ヘキサヌクレオチド配列ＴＡＣＡＧＴはトランスポザーゼ結合部位の部分ではないが、転位反応の触媒作用において役割を演じていると考えられる(ボスおよびプラスターク、１９９４)。ここに我々は、形質転換線虫から調製した抽出物を用いて、Ｔｃ１のイン・ビトロ切除および転位について記載する。転位の最少シス−要件を定義し、イン・ビトロでの標的部位選択についてイン・ビボのものと比較する。さらに我々は、大腸菌（E.coli）から精製した組換えトランスポザーゼが転位を維持することが可能であり、イン・ビトロでのＴｃ１転位にとって必須の他のファクターは存在しないことを証明する。結果Ｔｃ１のイン・ビトロ転位我々は熱ショックプロモーターの制御下でＴｃ１トランスポザーゼ遺伝子を有する形質転換虫を生成せしめた。このものは高レベルのトランスポザーゼ核抽出物の調製を可能とし、活性検出に非常に重要であることを証明していた。該抽出物をＴｃ１因子含有プラスミドで培養した。物理的アッセイにより切除を検討した。反応物のサザン・ブロット分析により切除したＴｃ１因子の概観を示す(図１、レーン１)。さらに、電気泳動に先立って(レーン２)、プラスミドバックボーン内で生成物をＳｃａｌで消化すると、Ｔｃ１の左端または右端のいずれかでの切断が検出される。切断は二価のカチオン（Ｍｇ²⁺またはＭｎ²⁺）を必要とし、エチレングリコールまたは５％ＤＭＳＯ（データ未開示）の存在により促進される。トランスポゾンの一方の端での切断効率は、基質が線状であれば低下することはない(レーン２および５と比較せよ)。また、トランスポゾンの両端の欠失は残り末端(レーン６および１１)での切断を無効とするものではなく、切断が二つの末端間での相互作用を必要としないことを示唆している。単一端での切断に対比して、完全因子の切除は基質が線状であれば、約２倍減少するが、このことは両末端の同調切断が基質の超コイル化により促進されることを示唆している。線状基質で観察される大部分の完全切除生成物が、両端での非同調切断により説明することができる。二本鎖切断の位置をヌクレオチド・レベルで決定するために、ＰＣＲによるプライマー拡張を各鎖に特異的な末端標識オリゴヌクレオチドを用いて実施した( 図２)。最大量と認められるＰＣＲ産生物に基づくと、５’切断はトランスポゾン内２ｂｐであり、３’切断はトランスポゾンの末端に位置づけられる。これは関連するシー・エレガンス（C．elegans）トランスポゾンＴｃ３のイン・ビボ研究に某づくモデルを確認するものであるが、その理由は切除が結果として２ｂｐスタッガー３’オーバーハングに至るということが示されたからである(バン・ルーネンら、１９９４)。Ｔｃ１の完全切除は転位が切断・結合（cut.and-pas te）工程を経て生起することを示しているが、結果はＴｃ１切除に基づく供与体ＤＮＡ分子の二本鎖切断修復の遺伝的データと矛盾しない(プラスターク（Plast erk）１９９１)。我々は組込み事象を検出するために高感度アッセイ法を案出した。我々はトランスポゾン担持抗生物質抵抗性遺伝子を超コイル供与体プラスミドから標的プラスミドへ跳躍させるために選択した(図３)。反応生成物を適当な大腸菌（E.coli）にエレクトロポレーションすると、多くの転位事象を検出できるようになった(図１)。非形質転換Ｎ２虫から、またはいわゆる高跳躍株、ＴＲ６７９（コリンズ（Collins）ら、１９８７）から調製した抽出物は高頻度の生殖系列転位を示すが、このアッセイでは転位生成物を検出可能レベルまで生成することはない。供与体プラスミドを線状化すると、転位の効率は略２０倍減少した。転位には二つの逆方向反復塩基配列を必要とするが、その理由はトランスポゾンの一端を欠失しても組込みは得られなかったからである。さらに、ＡＴＰ，ＧＴＰまたはｄＮＴＰを加えても転位のレベルは上昇しないが(データ未記載)、このことはこの工程ではエネルギー消費が中性であり、補助因子から独立していることを意味している。約９０の独立イン・ビトロＴｃ１の組込みを配列決定により分析し、ＴＡジヌクレオチドに見出したが、これはこの工程で複製されたものであった。二つの異常組込み事象を検出したが、そこではＴｃ１が配列ＴＴＧまたはＣＣＴに組込まれていた。両方の場合に、我々は３ｂｐ標的部位の重複を見出した。標的部位の選択これまでに、数百種ものイン・ビボＴｃ１およびＴｃ３の組込みがｇｐａ−２遺伝子の１ｋｂ領域で分析されている(バン・ルーネンおよびプラスターク、１９９４)。これは組込み標的として、ある制約下でのＴＡジヌクレオチドセットを選択的に使用したことを示したものであるが、Ｔｃ１およびＴｃ３の間の優位性に決定的な違いがある。クロマチン構造が組込み部位の選択にある役割を果たしていたのか否かを検討するために、我々はイン・ビボで以前にアッセイした同じ標的領域を用いて、裸のＤＮＡへの組込み様式をイン・ビトロで決定した。そこで我々は我々の標的プラスミドにｇｐａ−２を組み入れた。全体として同じ組込み様式が見られるのは明らかである(図４)。イン・ビボでのホット部位はイン・ビトロでもホットであるように思われ、イン・ビトロでのコールド部位はイン・ビボでもコールドである。このことは少なくともゲノムのこの領域において、ゲノム、クロマチン構造またはＤＮＡの転写状況がイン・ビボでは標的選択の主要決定因子ではないことを意味している。組換えトランスポザーゼによる転位線虫はトランスポザーゼの大規模精製にとって手ごろなタンパク源ではない。そこで我々は異種系で該タンパクを発現させた。バキュロウイルス(Baculovirus )およびＳｆ９細胞を用いる発現（データ未記載）あるいは大腸菌(E．coli)での発現ではいずれもＴｃ１転位を支持することのできるトランスポザーゼを産生した。組換えトランスポザーゼは封入体から略等質性までに精製した(図５)。表１は転位の頻度を示すものであって、ここでは虫体抽出物および精製タンパクについてのトランスポゾン相当量を用いた。組換えタンパクの場合における９種の独立した組換えについての配列分析が示すところによると、複製したＴＡ標的配列への転位が起こっていて、そこから結論できることは真実転位が起こっていたということである。それ故、我々はＴｃ１トランスポザーゼがＴｃ１転位にとって必要な唯一のタンパクであると結論する。線虫誘導および細菌性トランスポザーゼとの間の効率上の差異についてはさらなる研究が必要である。それは精製処理中に変性および再生された細菌性トランスポザーゼの折りたたみの問題あるいは線虫抽出物に存在する宿主因子の刺激の役割を反映していると思われる。最小シス−要件我々は全トランスポザーゼ結合部位を構成する、両側にＴＡ標的部位を備えたＴｃ１の末端２６ｂｐが、人工トランスポゾンを形成するのに充分であるという可能性を検討した。これらＴｃ１−特異配列のみから成る因子は、低い頻度ながらなおイン・ビトロで転位することができる(表１)。我々は数種の組込みにつき配列を決定し、それが正しいことを見出した。さらに我々は、保存配列であるヘキサヌクレオチドＴＡＣＡＧＴの重要性につき検討した。末端２６ｂｐならびにフランキングＴＡジヌクレオチドのみを有するミニ−Ｔｃ１の一端に変異を導入した。２つの野生型末端をもつ因子の切除は物理的アッセイにより容易に検出し得るが、トランスポザーゼ結合部位の変異、末端のフランキングＴＡ配列は、当該因子では切除できなかた(図６)。野生型末端での二本鎖切断は他のトランスポゾン末端での変異により影響を受けなかった。ＰＣＲに基づくプライマー・エクステンションにより切断を分析した結果、ＣＡからＴＧへの変異についてのみ、トランスポゾンの５’末端での一本鎖切断が起こることが分かった(データ未開示)。我々は無細胞Ｔｃ１転位系を開発した。トランスポゾン末端での二本鎖切断により切除が起こり、２ｂｐスタッガー３'オーバーハングを生じた。転位の切断・結合のメカニズムはＴｃ１に対して適応するように思われる(図７)。このメカニズムは遺伝子データ（プラスターク（Plasterk）１９９１）ならびにイン・ビボ転位生成物の分析（バン・ルーネン（Van Luenen）１９９４）に基づきすでに提案されていた。非複製転位は細菌のトランスポゾンＴｎ７（ベイントン（Bain ton）ら、１９９３）およびＴｎ１０（ベンダー（Bender）およびクレックナー( Kleckner)１９８６）ならびにドロソフィラ（Drosophila）Ｐ因子（カウフマン( Kaufman)およびリオ（Rio）１９９２）と共にしている。逆に、ＭｕおよびＴｎ３転位可能因子は複製メカニズムを介して転位する(グリンドレイ(Grindley)およびシェラット（Sherratt）１９７８、シャピロ（Shapiro）１９７９、ミズウチ（Mizuuchi）１９９２)。Ｔｃ１転位はヌクレオチド補助因子の添加と無関係のように思われるが、一方、Ｐ因子はＧＴＰを利用し(カウフマンおよびリオ、１９９２)、また、Ｔｎ７はＡＴＰを補助因子として利用する(ベイントンら、１９９３)。Ｔｃ１／マリナー科の著しい特徴はＴＡジヌクレオチドを標的部位として無条件に使用することである。標的部位のイン・ビボでの選択について徹底的に研究した結果、利用可能なＴＡジヌクレオチドのサブセットのみを使用し、標的選択ではシー・エレガンス（C.elegans）中の２つの関連トランスポゾンＴｃ１およびＴｃ３の間には明らかな違いのあることが分かった(バン・ルーネンおよびプラスターク、１９９４)。我々はイン・ビボで観察したと同じ全体にわたる組込みパターンをイン・ビトロでも見出す。このことが示唆するのは、ＤＮＡの染色体環境が、少なくとも分析したゲノムの領域において標的選択に影響しないということである。それ故に、我々は、強力な共通配列を同定することはできなかったが、両側にＴＡをもつ一次ＤＮＡ配列に基づいて、転位コンプレックスが最初にその標的部位を選択するという考えを好む(バン・ルーネンおよびプラスターク、１９９４)。クロマチン構造の明らかな影響がレトロウイルスの組込みについて証明されている(プリシアック(Pryciak)およびヴァーマス(Varmus)１９９ころによると、恐らくＤＮＡの屈曲の故に、ヌクレオソームＤＮＡ内の領域に優先性がある。我々はＤＮＡ結合タンパクがＴｃ１組込みの優先性に影響する可能性を否定できない。ｇｐａ−２遺伝子の染色体構築については何も分かっていないので、イン・ビトロでの再構築したヌクレオソームＤＮＡを用いて組込み部位を比較することは興味深い。イン・ビトロでの転位にはトランスポザーゼ結合部位および保存ヘキサヌクレオチド配列をもつトランスポゾンの最末端を必要とし、それが切除にとって重要である。我々の観察によると、トランスポゾン全長の転位と２６ｂｐ末端逆方向反復配列をもつＴｃ１因子との間の転位効率が低下するが、このことは付加配列が転位効率に寄与していることを示唆している。我々は付加的なトランスポザーゼ結合部位について指し示すものをもたないが、多分、高い易動性群のタンパクに似た小型の塩基性タンパク（グロスシェドル（Grosschedl）ら、１９９４）が結合して転位を促進するのかも知れない。あるいは、トランスポゾン末端に見出される特有のＡ−Ｔに富む配列がＤＮＡ屈曲の補助に加わっているのかも知れない。トランスポゾンの最末端にある保存ヘキサヌクレオチド配列が、少なくとも切断段階において重要であることは示されている。（ＣＡからＴＧへの）変異の一つに見られる５'末端一本鎖切断は、恐らく一本鎖切断の特別の状態、すなわち、最初の非転移鎖を示すものであり、これはＴｃ１０について報告されているもの（ボランド(Bolland)およびクレックナー(Kleckner)１９９５）と反対である。大腸菌から略均質なものにまで精製したトランスポザーゼはＴｃ１のジャンピングを達成することができるが、この事実が示すのはトランスポザーゼがＴｃ１の切除と組込みのために必要な唯一のタンパクであるということである。線虫の抽出物で得られた高い効率は、宿主因子が反応の頻度を増大させていることを示唆している。たとえば、哺乳動物タンパクＨＭＧＩおよびＨＭＧ２は原核生物の組換えを促進できることが示されている(ポウルら、１９９３)。種特異因子の独立性は、何故Ｔｃ１／マリナー科のものが、多分、水平転移という手段によって非常に多くの異なった門(phyla)に拡散するのかということの説明となる(ロバートソン(Robertson)およびランペ(Lampe)１９９５)。このことはドロソフィラ種に限定されるＰ因子とは著しく異なっている。他の種でのＰ因子の転位は観察されていない(リオら、１９８８)。Ｐ転位における種特異宿主因子の可能な候補は逆方向反復結合タンパク、ＩＲＢＰ（ビール（Beall）ら、１９９４）である。イン・ビトロＴｃ１転位のための単純なシス−およびトランス−要件は、広範な動物種での遺伝子送達のためのよいベクターである。マーカー遺伝子を用いて、Ｔｃ３トランスポザーゼが哺乳動物の培養に際して、組換えＴｃ３因子の転位を触媒することができることが示されている。材料と方法プラスミドの構築ｐＲＰ４６６は、ＢａｍＨＩ−ＸｂａＩフラグメントとしてｐＵＣ１９にクローン化したｐ１Ｍ４０（モリ、１９８８）から誘導される０．４ｋｂフランキング配列を有するＴｃ１因子を包含する。ｐＲＰ４６７およびｐＲＰ４６８はｐＲＰ４６６の誘導体であって、いずれにおいてもＣｌａＩ−Ａｓｐ７１８またはＰｓｔＩ−ＡｐａＩフラグメントが欠失している。ｐＲＰ４７２はｐＡＣＢ１０４（ボイド(Boyd)およびシェラット(Sherratt)１９９５）誘導体であって、ＣｌａＩおよびＡｐａＩ部位の間に挿入されたｐＢＲ３２２のＡｖａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを有するＴｃ１を包含している。ＸｈｏＩ−部位間のｐＵＣ４ＫのＨｉｎｄＩＩＫａｎ^Rカセット（ファルマシア）を有するｐＲＰ４６６のＸｂａＩ−ＢａｍＨＩフラグメントをｐＡＣＢ１０４にクローニングしてｐＲＰ４９０を得た。ｐＲＰ４９１はｐＲＰ４９０に相当する。末端２６ｂｐ以外の内部Ｔｃ１配列の全てが置き換わっている。シー・エレガンス（C.elegans）のトランスジェネシスブリストル（Bristol）系統ＣＢ１３９２株（ｎｕｃ−１９ｅ１３９２）に１５０μｇ／ｍｌのｐＲＰ４６９および５μｇ／ｍｌのｐＲＰ４６５(ボス（Vos）ら、１９９３)、５０μｇ／ｍｌのｐＲＦ４（クラマー（Kramer）ら、１９９０）を顕微注射し(メロ（Mello）ら、１９９１)、形質転換したブリストル系を得た。Ｘ線照射により、安定した系、ＮＬ８１８（ｐｋ１ｓ２２１）を生み出した (ウエイ（Way）ら、１９９１)。抽出物の調製安定した系ＮＬ８１８を液体培地中１８℃で成長させ、３３℃で３時間熱ショックに付してトランスポザーゼ発現を誘導した。１８℃でさらに２時間成長させ、ボスら（１９９３）の記載に従い、バッファーを変えて核抽出物を調製した。ＮＩＢ＝２５ｍＭトリスｐＨ７．５、２０ｍＭＫＣｌ，０．５Ｍスクロース、０．５ｍＭＥＤＴＡ、５ｍＭ β−メルカプトエタノール、０．１ｍＭＰＭＳＦ、ＮＥＢ＝２５ｍＭトリスｐＨ７．５、０．１ｍＭＥＤＴＡ、５００ｍＭＮａＣｌ、１５％グリセリン、０．２５％トイーン(Tween)−２０、０．１ｍＭＰＭＳＦ、１ｍＭＤＴＴ。核抽出物は２．５ｍｇ／ｍｌタンパクを含有し、Ｔｃ１Ａの濃度は約１０μｇ／ｍｌである。組換えトランスポザーゼの発現および精製大腸菌（E.coli）ＢＬ２１ｐＬｙｓＳ株を、Ｔ７プロモーター(ボスら、１９９３)の制御下にＴｃ１トランスポザーゼ遺伝子含有ｐＲＰ４７０で形質転換し、２ｘＹＴ培地で生育し、ＯＤ＝０．６(６００ｎｍ)、３７℃、３時間、０．５ｍＭＩＰＴＧで誘導した。封入体をナガイおよびソーゲルセン(Thogersen)(１９７８)の記載に従い精製した。封入体を８Ｍ尿素および２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）に溶解し、ＣＭセルロースＣＬ−６Ｂカラム（ファルマシア）に負荷した。タンパクは０〜５００ｍＭＮａＣｌの直線勾配により溶出した。トランスポザーゼ含有画分を６Ｍグアニジン塩酸塩および５０ｍＭトリス(ｐＨ８．０)で平衡化したセフアクリル（Sephacryl）Ｓ４００ＨＲゲル濾過カラムに負荷した。トランスポザーゼ画分を８Ｍ尿素、５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）および１ｍＭＤＴＴに対して透析した。該タンパクをセファロースＦＦカラムに負荷し、同一バッファー中５００ｍＭＮａＣｌで溶出した。全ての工程は室温で実施した。タンパクを氷冷バッファー(５０ｍＭトリス(ｐＨ８．０)、１００ｍＭＮａＣｌ，５ｍＭＤＴＴ、５ｍＭＭｇＣｌ₂)中１００倍希釈して復元した。３０分後、エッペンドルフ遠心機で１５分間遠心して不溶のタンパクを除去した。トランスポザーゼ濃度は２００μｇ／ｍｌであり、純度９０％以上と評価した。イン・ビトロ転位反応標準反応条件：２５ｍＭトリス(ｐＨ８．０)、２５ｍＭＮａＣｌ，１ｍＭＤＴＴ、１０％エチレングリコール、５ｍＭＭｇＣｌ₂（または２．５ｍＭＥＤＴＡ），４ｍＭスペルミジン、および０．０５μｇ／μｌＢＳＡ。標的ＤＮＡ２．５μｇ（全容量５０μｌ）を添加する前に、供与体プラスミド２００ｎｇを２．５μｌ線虫抽出物または０．２５μｌ精製タンパクで氷上５分間前培養した。培養は３０℃で１時間行った。２５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）５．５μｌ、５０ｍＭＥＤＴＡ、５％ＳＤＳおよびプロティナーゼＫ２ｍｇ／ｍｌを添加して反応を停止させた。３７℃、１時間後、ＤＮＡを沈殿させ、水５０μｌに再懸濁した。イン・ビトロ切断部位の地図作成直線ＰＣＲ増幅を、５μｌ鋳型および０．５ｐモルプライマーを用い、２０μ ｌ中２０サイクル行った。条件は実質的にクラックストン（Craxton１９９１）に従い、１'、９４℃、１'、６０℃、１'、７２℃で実施した。配列プライマーＢＩＧＲ＝５'AGATTTCCACTTATATCATGTTTTATGTTTTGC，Ｒ２(バン・ルーネンおよびプラスターク、１９９４)。遺伝子アッセイ電子応答能のあるＤＳ９４１ラムダ溶原菌（フリン(Flinn)ら、１９８９）を調製し、記載のとおりに使用した(ザバロフスキー(Zabarovsky)およびワインバーグ(Winberg)１９９０)。供与体プラスミドはラムダ起源の複製を含んでいるが、ＤＳ９４１ラムダ溶原菌では複製できない。標的プラスミドはＣｏｌＥ１起源の複製を有する。１回のエレクトロポレーション当たりＤＮＡ１〜５μｌを用い、希釈後、バクテリア５％をアンピシリン上に載せた。残りのバクテリアは二重選択に付した。ここではその効率に依存して２００倍の形質転換細胞を産生した。図面の説明図１イン・ビトロＴｃ１転位反応生成物のサザーン・ブロット分析。イン・ビトロ転位反応生成物を１％アガロース・ゲル上で分離し、ニトロセルロースに移し、放射標識したＴｃ１でプローブした。標準反応はＭｇＣｌ₂（レーン１〜３および５）またはＥＤＴＡ（レーン４）を含んでいた。電気泳動に先立って、生成物をベクターＤＮＡ中のＳｃａＩ（レーン２，７，１０）またはＴｃ１ＤＮＡ中のＡｐａＩで消化した。レーン５，８および１１は基質をイン・ビトロ切断に先立ってＳｃａＩで線状化したときの反応生成物を示す。レーン１〜５は、完全Ｔｃ１因子を有する基質としてｐＲＰ４６６を用いた反応生成物を示す(図４参照)。レーン６〜８ではＴｃ１の左方末端が欠失しているｐＲＰ４６７を基質として用いており、一方、レーン９〜１１はＴｃ１の右端が欠失している基質としてのｐＲＰ４６７８を示す。ＲＥＣおよびＬＥＣはそれぞれ右端および左端の切断を表す。ＲＨおよびＬＨはＴｃ１の右方側および左方側の位置を示す。ＳｃａＩ線状化ｐＲＰ４６６の図式を本図の下部に示してある。図２ヌクレオチドレベルでのイン・ビトロ切断部位のマッピング。ＰＣＲによるプライマー拡張を、供与体としてｐＲＰ４６６を用い、ＭｇＣｌ₂（＋）またはＥＤＴＲＡ（−）の存在下に得た反応生成物について実施した。ＰＣＲ生成物の末端にＴａｑポリメラーゼにより１ケの余分のヌクレオチドが付加するのを証明するために、比較対照反応はＥｃｏＲＶで消化したｐＲＰ４６６（ＲＶレーン）を用い実施した(クラーク（Clark）1988参照)。生成物を配列決定用ゲル上で分析した。配列反応物（ＧＡＴＣ）をマーカーとして加えた。ＰＣＲはプライマーＲ２（右パネル）またはプライマーＢＩＧＲ（左パネル）で実施した。関連配列についてはＥｃｏＲＶ部位を四角で囲み、また、ＴＡ標的部位には下線を引いて示してある。切断部位は矢印で示す。他のトランスポゾンでの切断位置を決めた際に同じ結果が得られた。図３遺伝子転位アッセイの図解。ラムダ起源の複製を有する供与体プラスミド、ｐＡＣＢ１０４誘導体（ボイドおよびシェラット、１９９５）は抗生物質耐性遺伝子をもつＴｃ１因子を含有している。標的プラスミドｐＲＰ４７５は１，４ｋｂのｈｉｎｄＩＩｇｐａ−２フラグメントおよびＣｏｌＥ１起源の複製（ｐＳＰ７２、プロメガ(Promega)）を有する。反応生成物をラムダ溶原菌にエレクトロポレーションした。大腸菌株を供与体に対して逆選択した。組込み事象は２種の抗生物質上で選択した。図４標的部位選択。イン・ビトロ（黒棒）およびイン・ビボ（白抜き棒）でのＴｃ１挿入分布の比較。ｐＲＰ４７２を供与体として、ｐＲＰ４７５を標的として、シー・エレガンス（Ｃ.ｅｌeｇａｎｓ）抽出物を用いる標準イン・ビトロ転位反応において使用した。Ｘ軸上のいずれのマークも文献（バン・ルーネンおよびプラスターク、１９９４）に詳細に記載されたｇｐａ−２フラグメント中のＴＡジヌクレオチドを表す。図５大腸菌からのＴｃ１トランスポザーゼの精製。封入体から精製したトランスポザーゼの１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミド・ゲル上の分析。レーンＭ＝分子量マーカー(ＫＤａで表示)。レーン１＝誘導前の細菌溶菌物。レーン２＝誘導後の細菌溶菌物。レーン３＝精製封入体。レーン４＝再折りたたみ後の精製トランスポザーゼ。図６Ｔｃ１関与切除の最末端での変異。ＭｇＣｌ₂（＋）またはＥＤＴＥ（−）の存在下にシー・エレガンス抽出物を用い、上部に示したように、供与体としてｐＲＰ４８０(ｗｔ)、ｐＲＰ４８１(ＴＡ)、ｐＲＰ４８２(ＣＡ)、ｐＲＰ４８３（ＧＴ）またはｐＲＰ４８４（ＢＳ）を用い、イン・ビトロ反応生成物を得た。生成物を１％アガロース・ゲル上で分離し、ニトロセルロースに移し、放射標識Ｋａｎ^R遺伝子フラグメントでプローブした。供与体プラスミドは、ｐＵＣ１９のＳｍａＩ部位（ｗｔ配列）とＨｉｎｄＩＩ部位（ｗｔまたは変異体配列）との間にｐＵＣ４ＫをＫａｎ^Rカセットでクローン化した２８−マーを含む。ＴＡはＣＧに、ＣＡはＴＧに、ＧＴはＡＣにそれぞれ変異した。トランスポザーゼ結合部位変異において、ＢａｌＩおよびＥｃｏＲＶ部位はそれぞれＴＣＣＣＡおよびＧＧＧＣＣＣに変異している(ボスおよびプラスターク１９９４参照)。図７Ｔｃ１転位のモデル。２ｂｐスタッガー・オーバーハングをもつ切除した線状因子を示す非複製Ｔｃ１転位のモデル。組込みの結果はＴＡ標的部位の複製であった。二本鎖切断を修復すると特徴的なフットプリントを生成する(バン・ルーネンら１９９４も参照)。表１転位頻度。イン・ビトロＴｃ１転位反応を超コイルまたは線状プラスミドを用い、また、表に示したタンパク源を用い実施した。ａｍｐ^R−ｋａｎ^R対ａｍｐ^R コロニーの比（^*１０⁸）を二つの別の実験で示す。反応をＥＤＴＡの存在下に実施した場合、組込み生産物は回収されなかった。表１

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１０年４月２０日（１９９８．４．２０）【補正内容】請求の範囲１．特定属の細胞に、そのゲノムに組込まれる付加核酸物質を付与するためのベクターであって、当該ベクターは２つのトランスポザーゼ結合部位を含み、該トランスポザーゼ結合部位は同一であっても異なっていてもよく、他の属に見出されるトランスポゾンのＴｃ１／マリナー上科のトランスポゾンから誘導され、また、それぞれが該トランスポゾンの切断部位に近接しており、該付加核酸物質はトランスポゾンのＴｃ１／マリナー上科から誘導される付加核酸物質ではなく、該付加核酸物質は該２つのトランスポザーゼ結合部位の間に位置している、細胞に付加核酸物質を付与するためのベクター。２．該トランスポザーゼ結合部位と切断部位はＴｃ１様トランスポゾンに基づくことを特徴とする請求項１に記載のベクター。３．Ｔｃ１トランスポザーゼのトランスポザーゼ結合部位および切断部位としてＴｃ１の少なくとも末端２６塩基対を含むことを特徴とする請求項２に記載のベクター。４．標的細胞に形質導入するための手段をさらに含むことを特徴とする上記請求項のいずれかに記載のベクター。５．該ベクター中に存在するトランスポザーゼ結合部位および切断部位に機能するトランスポザーゼ活性をコードする核酸配列をさらに含むことを特徴とする上記請求項のいずれかに記載のベクター。６．該付加核酸物質はタンパクをコードすることを特徴とする上記請求項のいずれかに記載のベクター。７．該付加核酸物質は、アンチセンスＲＮＡのようなブロック核酸を付与することを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載のベクター。８．該ベクターはウイルスベクター、好ましくはアデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、またはアデノ関連ウイルスベクターから誘導されることを特徴とする上記請求項のいずれかに記載のベクター。９．標的細胞に、そのゲノムに組込まれる付加核酸物質を付与するための方法において、該細胞に上記請求項のいずれかのベクターを形質導入し、該ベクター中に存在するトランスポザーゼ結合部位および切断部位に機能するトランスポザーゼ活性を該標的細胞に付与することから成る方法。１０．該形質導入は該ベクターを含む感染性粒子を経由して実施されることを特徴とする請求項９に記載の方法。１１．請求項９または１０に記載の方法により得られる組換え標的細胞。１２．対象の核酸を異なった属の細胞ゲノムに組込む際に、特定属に見出されるトランスポゾンのＴｃ１／マリナー上科の機能的トランスポゾンの用途。１３．遺伝子治療法における請求項１２に記載の用途。１４．形質転換動物の生産のための請求項１２に記載の用途。１５．標的細胞に、そのゲノムに組込まれる付加核酸物質を付与するための請求項１〜８のいずれかに記載のベクターの用途。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者フォス，ヤンクリスチアーンオランダ国エヌエル―1062 カーベーアムステルダムウィットヘンステインラーン 63

Claims

【特許請求の範囲】１．特定属の細胞に、そのゲノムに組込まれる付加核酸物質を付与するためのベクターであって、当該ベクターは２つのトランスポザーゼ結合部位を含み、該トランスポザーゼ結合部位は同一であっても異なっていてもよく、他の属に見出されるトランスポゾンから誘導され、また、それぞれが該トランスポゾンの切断部位に近接しており、該付加核酸物質は該２つのトランスポザーゼ結合部位の間に位置している、細胞に付加核酸物質を付与するためのベクター。２．該トランスポザーゼ結合部位と切断部位が、トランスポゾンのＴｃ１／マリナー上科からのトランスポゾンの対応部位に基づくことを特徴とする請求項１に記載のベクター。３．トランスポザーゼ結合部位と切断部位はＴｃ１様トランスポゾンに基づくことを特徴とする請求項１または２に記載のベクター。４．Ｔｃ１トランスポザーゼのトランスポザーゼ結合部位および切断部位としてＴｃ１の少なくとも末端２６塩基対を含むことを特徴とする請求項３に記載のベクター。５．標的細胞に形質導入するための手段をさらに含むことを特徴とする上記請求項のいずれかに記載のベクター。６．該ベクター中に存在するトランスポザーゼ結合部位および切断部位に機能するトランスポザーゼ活性をコードする核酸配列をさらに含むことを特徴とする上記請求項のいずれかに記載のベクター。７．該付加核酸物質はタンパクをコードすることを特徴とする、上記請求項のいずれかに記載のベクター。８．該付加核酸物質はアンチセンスＲＮＡのようなブロック核酸を付与することを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載のベクター。９．該ベクターはウイルスベクター、好ましくはアデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、またはアデノ関連ウイルスベクターから誘導されることを特徴とする上記請求項のいずれかに記載のベクター。１０．標的細胞に、そのゲノムに組込まれる付加核酸物質を付与するための方法において、該細胞に上記請求項のいずれかに記載のベクターを形質導入し、該ベクター中に存在するトランスポザーゼ結合部位および切断部位に機能するトランスポザーゼ活性を該標的細胞に付与することからなる方法。１１．該形質導入は該ベクターを含む感染性粒子を経由して実施されることを特徴とする請求項１０に記載の方法。１２．請求項１０または１１に記載の方法により得られる組換え標的細胞。１３．対象の核酸を異なった属の細胞ゲノムに組込む際に、特定属に見出される機能的トランスポゾンの用途。１４．遺伝子治療法における請求項１３に記載の用途。１５．形質転換動物の生産のための請求項１３に記載の用途。