JP2001500729A

JP2001500729A - 哺乳類及びヒトｒｅｃ２

Info

Publication number: JP2001500729A
Application number: JP10513444A
Authority: JP
Inventors: ケー．ホロマン，ウィリアム; シー．ライス，マイケル; ティー．スミス，シェリル; シュ，ツィガン; ビー．クミエク，エリック
Original assignee: トーマスジェファーソンユニバーシティ; コーネルリサーチファウンデーション，インコーポレイティド
Priority date: 1996-09-11
Filing date: 1997-09-11
Publication date: 2001-01-23
Also published as: WO1998011214A1; CA2265492A1; EP0961827A4; NZ334646A; AU4315997A; AU735296B2; US6410226B1; EP0961827A1

Abstract

(57)【要約】本発明は哺乳類はコンビナーゼ遺伝子(REC２)に関する。細胞中でのREC２の過剰発現は相同性組換え、特にDNA／RNAキメラオリゴヌクレオチドを用いる相同性組換えを促進し、そして照射のオポフトティック効果に対する細胞の感受性を敏感にすることが見出される。強力なエンハンサー、例えばSV40エンハンサーと組合わされたREC２プロモーターは、細胞の照射に従う強力なプロモーターであることが見出された。照射誘導プロモーターは、該照射誘導性プロモーターを、その発現がプロドラッグをドラッグに転換する遺伝子、例えばヘルペスのチミジンキナーゼ遺伝子、に作用可能に連結することにより、照射処理への細胞の感受性を高めるのに使用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】哺乳類及びヒトREC２１．発明の分野本発明は、分子遺伝学及び医学の分野に関する。特に、それは、相同組換えに関与するＡ−タンパク質をコードする遺伝子、及び哺乳類細胞における損傷を受けたゲノムDNAの修復に関する。特に、本発明は、哺乳類ATP−依存性相同対合タンパク質をコードする遺伝子；遺伝子療法をもたらすためへの前記遺伝子の使用方法；医学目的のための哺乳類組織を分類するためへの前記遺伝子及び前記遺伝子のフラグメントの使用方法；及び無効果にされた遺伝子の１つ又は両対立遺伝子を有するトランスジェニックマウスに関する。より特定には、本発明の遺伝子は、菌類ウスチラゴマイジス(Ustilago maydis)から前に単離されたREC２と称する遺伝子のヒト及びネズミ相同体である。２．発明の背景あらゆる生物の生存の間、その細胞のDNAはその構造の変更を引き起こす化学的及び物理的現象、すなわち潜在的な突然変異に一定してゆだねられる。それらの潜在的突然変異は、DNAの鎖間のミスマッチのために、細胞に見出されるDNA修復酵素により認識される。それらの潜在的な突然変異が固定されるようになる場合に生じる低下する効果を妨げるために、すべての動物は、DNAミスマッチを修復する種々の機構を有する。さらに、高等動物は機構を進化せしめ、それにより高く損傷を受けたDNAを有する細胞はプログラムされた死の工程（“アポプトシス”）を受ける。腫瘍学的疾病の経路及び発生、その疾病の処置に対する進行及び応答を誘発する、DNAミスマッチ修復における欠損とアポプトシスとの間の関連性が広く認識され、不完全ではあるが、医学科学者により理解されている。Chung，D.C．& Ru stgi，A.K.，1995，Gastroenterology 109：1685-99；Lowe，S.W.,など.，1994 ，Science 266：807-10。従って、DNA修復及びDNAミスマッチモニターリングに関与するタンパク質をコードする遺伝子を同定し、そしてクローン化する連続した必要性がある。細菌、菌類及び酵母による研究は、ミスマッチ修復工程に関与する遺伝子の３種の遺伝的に定義されたグループを同定している。それらのグループは、それぞれ、除去修復グループ、エラープロン修復グループ及び組換え修復グループと呼ばれる。個々のグループの遺伝子における変異体は、特徴的な表現型をもたらす。酵母における組換え修復グループの変異体は、イオン化放射線、胞子形成欠損及び低められた又は不在の有糸分裂組換えに対して高い感受性を有する表現型をもたらす。Petes，T.D.,など.，1991，Broach，J.R.，など.，eds.，The Molecu lar Biology of the Yeast Saccharomyces，pp．407-522（Cold Spring Harbor Press，1991）。いくつかの系統発生学的に関連する次のような遺伝子が組換え修復グループにおいて同定されている：Ｅ．コリ（E.coli）においてrecA，Radding，C.M.，198 9，Biochim．Biophys．Acta 1008：131-145；Ｓ．セレビシアエ（S．cerevisiae ）におけるRAD51，Shinohara，A.，1992，Cell 69：457-470，Aboussekhra，A.R .，など.，1992，Mol．Cell．Biol．12：3224-3234，Basile，G.，など.，1992 ，Mol．Cell．Biol．12：3235-3246；Ｓ．セレビシアエにおけるRAD57，Gene 10 5：139-140；Ｕ．マイジスにおけるREC２，Bauchwitz，R.，& Holloman，W.K.， 1990，Gene 96：285-288，Rubin, B.P.,など.，1994，Mol．Cell．Biol．14：6287-6296。第３のＳ．セレビシアエ遺伝子DMC１はrecAに関連するが、但しDMC１の変異体は、細胞−循環進行、組換え及び減数分裂において欠損を示しているが、しかし組換え修復においては示していない。 REC２欠損性Ｕ．マイジス変異体の表現型は、イオン化放射線、欠損性有糸分裂組換え及びプラスミド間組換えに対する高い感受性及び完全な減数分裂に対する無能性により特徴づけられる。Holliday，R.，1967，Mutational Research ４：275-288。UmREC２、すすなわちＵ．マイジスのREC２遺伝子生成物は広く研究されて来た。それは、ATPの存在下で、広範囲の種類の環境下で相同DNA鎖の対合を触媒する781個のアミノ酸ATPアーゼであり、例えばUmREC２は、変性された鎖からの二本鎖DNAの形成、二本鎖及び一本鎖相同DNA間の鎖交換及び同一の鎖間でのヌクレアーゼ耐性複合体の形成を触媒する。Kmiec，E.B.,など.，1994，Mol． Cell．Biol．14：7163-7172。UmREC２は、それが相同体対を形成する唯一の真核 ATPアーゼであり、すなわちそれがＥ．コリ酵素recAと共有する活性においてユニークである。 W.K．Holloman and E.B．Kmiecにより1995年１月17日に出願されたアメリカ特許出願第08/373,134号は、Ｕ．マイジスからのREC２、組換えUmREC２の生成方法及びその使用方法を開示する。本発明の前、ヒトREC２cDNAのフラグメントは、プラスミドp153195として、IMAGE協会、すなわちLawrence Livermore National Laboratoriesから入手できた。p153195の約400bpの配列が、dbESTデータベースに公開されている。 Michael C．Riceなど．により1997年７月に出版されたIsolation of Human an d Mouse Genes Based on Homology to REC２の標題の科学出版物(Proc．Natl． Acad．Sci．94：7417-7422)は、ネズミ及びヒトRec２及びヒトREC２c DNAの配列を開示し、そして照射が一次ヒト包皮線維芽細胞においてhsREC２転写体のレベルを高めることを開示する。３．発明の要約本発明は、哺乳類ATP−依存性相同対合タンパク質（“哺乳類組換え酵素”）、特にヒト及びネズミATP−依存性相同対合タンパク質（それぞれhsREC２及びmu REC２）をコードする核酸を供給する。本発明はさらに、哺乳類組換え酵素をコードするmRNAのコピーを含むDNAクローン（“mREC cDNA”）、及びmREC遺伝子又はそのフラグメントを含むゲノムDNAのコピーを含むDNAクローンを供給する。さらなる態様においては、本発明は、異種プロモーター、すなわち哺乳類組換え酵素プロモーター以外のプロモーターに連結されるmREC cDNAを含んで成る核酸に関し、その連結の結果、哺乳類組換え酵素は、昆虫及び哺乳類細胞及び細菌において発現され、又は過剰発現され得る。１つの態様においては、異種プロモーターはバキュウィルスオートグラフィカカリホルニカ(Autographia californica) からの多価プロモーターであり、そして本発明は単離され、そして精製された哺乳類組換え酵素、特に単離され、そして精製されたhsREC２を供給する。本発明は前記核酸及び単離され、そして精製されたタンパク質のいくつかの利用性を提供する。遺伝子療法及びトランスジェニック動物の構成の分野においては、本発明は、哺乳類組換え酵素を発現するプラスミドを細胞中に導入することによって細胞のゲノムと外因性核酸との間での相同組換えを高める方法を提供し、前記方法は、遺伝子欠損を修復し、そしてそれにより、遺伝子疾病を治癒するために使用され得る。他方では、トランスジェニック動物の構成のためには、本発明は精製された哺乳類組換え酵素を細胞中に導入することによって細胞のゲノムと外因性核酸との間での相同組換えを高めるための方法を提供する。他方では、本発明は、組換え酵素がいくつかの又はすべての組織において過剰発現されるよう、強いプロモーターに操作可能的に連結されるトランスジェニック哺乳類組換え酵素遺伝子を有するトランスジェニック動物、たとえばマウスの構成を提供する。そのようなトランスジェニック動物は相同組換えを受けるよう高く適合される。さらに、本発明は、サンプル中の細胞がhsREC２の２つの又は１つのコピーを含むが又はまったく含まないかどうかを決定することによって、及び前記細胞が含むhsREC２のコピーが突然変異誘発されるかどうかを決定することによって、診断及び予後のためのヒト組織のサンプルを分類するための２つの方法を提供する。組織サンプルの診断及び分類のためには、本発明は第１に、hsREC２のフラグメントのPCR増幅のために適切である対合されたオリゴヌクレオチドを供給し、そして第２に、hsREC２に対して密接して連結されるマイクロサテライトDNA配列、すなわちD14S258を同定する。本発明は中断され、そしてそれにより不活性化されるmuREC２の１つの又は両者の対立遺伝子を有するトランスジェニックマウスを供給する。それぞれヘテロ接合性及びホモ接合性REC２−ノックアウトマウスと称するそれらの得られる動物は、化学的発癌物質による腫瘍形成に対して敏感である。REC２−ノックアウトマウスは、興味ある化学物質又は工程に関係する発癌の有意な危険性が存在するかどうかを決定するために使用され得る。muREC２の減じられたレベル又は不在は、REC２−ノックアウトマウスを野生型よりもより感受性の試験動物にする。本発明はさらに、たとえば標的細胞における高レベルの組換え酵素の発現を引き起こすことを含んで成る、γ−又はUV照射からの又は腫瘍学的療法に通常使用される細胞毒性剤からのDNA損傷に対して標的細胞を感作するための方法を提供する。そのようなレベルの発現は、DNA損傷に応答して細胞のより容易なアポプトシスの受容を引き起こす。本発明はさらに、REC２プロモーター、すなわち照射又は他のDNA損傷物質により誘発できる哺乳類プロモーターも供給する。４．図面の簡単な説明図１Ａ−１Ｇ．図１Ａ及び１Ｂは、hsREC２の誘導されたアミノ酸配列（配列番号１）を示し、そして図１Ｃ及び１Ｄは、hsREC cDNAコード鎖の核酸配列（配列番号２）を示す。図１Ｅ及び１ＦはmuREC２の誘導されたアミノ酸配列（配列番号３）を示し、そして図１ＧはhsREC２ cDNAコード鎖の核酸配列（配列番号４）を示す。図２Ａ−２Ｄ．図２ＡはhsREC２の注釈されたアミノ酸配列である。核局在配列（“NLS”）、Ａボックス及びＢボックス型配列、DNA結合配列、及びsrc−型リン酸化部位（“Ｐ”）が特に注目されるべきである。図２Ｂは、特にrecAに最も密接に関連する領域80−200を示す注釈された配列の下絵である。図２Ｃ−２Ｄは、hsREC２とウスチラゴマイジンREC２との間の配列相同性を示す。最大の類似性、すなわち43％の相同性の領域が太字で示されている。図３．図３は付与されるバキュロウィルス−産生ヘキサヒスチジルHsREC２の機能としてのDNAアニーリングを示す。図４．図４はssDNAへのhsREC２−チオレドキシン融合タンパク質の結合がATP又はγ−SATP依存性であることを示すゲルシフトアッセイである。図５Ａ−５Ｂ．図５Ａは、hsREC発現ベクターpcHsREC２，pcDNA ３又はpcCAT制御プラスミド、又はSC１の存在又は不在下でEBV−形質転換されたヒトリンパ芽球の集団において、β−グロビン遺伝子における付加されたβ^S− β^Aキメラ修復ベクター（SC１）の機能としての鎌状細胞疾患突然変異の修復の頻度を示す。図５Ｂは、鎌状細胞突然変異の領域におけるSC１，β^S及びβ^Aの配列を示す。下方の場合（ａ，ｃ，ｇ及びｕ）は、２’−OMeヌクレオチドを示す。図６．図６は、123ntのDNAフラグメントのアニーリングがGST/REC２融合タンパク質により触媒されることを示す。図７Ａ−７Ｆ．図７Ａ−７ＣはhsREC２プロモーターの配列を示し、そして図７Ｄ−７ＦはmuREC２プロモーターの配列を示す。酵母における既知のcis−作用性放射線応答性要素の配列に対して相同の配列の位置が下線を引かれており、そしてその対応する酵母遺伝子が示されている。図８Ａ−８Ｈ．図８Ａ−８Ｈは、hsREC２発現プラスミド（15C8）又は無関係な対照プラスミド(Neo)のいづれかによりトランスフェクトされている、RNアーゼ処理され、ヨウ化プロピジウム染色されたCHO細胞のFACSヒストグラムを示す。細胞のDNA含有量は、水平軸で示される。ヒストグラムは、照射されていない細胞のものであり（８Ａ，８Ｅ）、又は15Ｉ／ｍ²UV照射への24，48又は72時間の後暴露された細胞のものである（８Ｂ−８Ｄ，８Ｆ−８Ｈ）。その比較は、hsRE C２の発現が二倍体DNA含有量よりも低い含有量を有する照射された細胞の画分を高めることを示し、このことは、アポプトシスの徴候である。５．発明の特定の記載本明細書において使用される場合、遺伝子はたとえばhsREC２のようなイタリック体で書かれ、そしてその対応するタンパク質は通常の活字体で存在する。５．１ hsREC ２及びその生成物hsREC２の構造 UmREC２プローブによる非−緊縮条件下でのハイブリダイゼーションによりhsR EC２cDNAを得るための努力の結果は、満足の行くものではなかった。努力は、Um REC２配列に基づいてペンタペプチドをコードするプライマーを用いてのPCR増幅によるhsREC２のフランキングの単離に向けられた。UmREC２の残基256−260をコードする４種の前方向プライマーの混合物、すなわちGKTQM(配列番号７)が、gly 及びthrコドンのための第３塩基としてイノシンを用いて、及び５’非コードGC ジヌクレオチド、すなわち５’−GCGGIAA（G/A）ACICA（G/A）ATG−３’を用いて構成された。UmREC２の残基330−334をコードすることができる配列に対して相補的な８種の逆方向プライマーの混合物、すなわちYITSGが、前方向プライマー、すなわち５’−CCICCG（C/G）(T/A)’IGTIAT（A/G）TA−３’と同じ手段でイノシンを用いて合成された。前記プライマーは、２回の再増幅に結合されるEx pand^TM system(Boehringer)を用いて、ヒトゲノム及びcDNAライブラリーのフラグメントを増幅するために使用された。再増幅の後、フラグメントは、pCRII（I nvitrogen）にクローン化された。すべての９種の異なったペンタペプチドをコードするプライマーの10種の異なった混合物を用い、そして合計約60のフラグメントが配列決定された。ヒト腎臓cDNAライブラリーからの１つの110bpフラグメント、すなわちhsr110は、UmREC２と統計学的に有意な相同性を有した。データベースdbESTのコンピュータサーチが、UmREC２及びhsr110との有意な相同性を有するタンパク質をコードするcDNAのクローンを見出すために実施された。プラスミドp153195は、UmREC２との有意な相同性を有するものとして同定され、そしてそれはhsr110を含んだ。Um REC２及びhsREC２の44個の残基の１つのセグメントにおいては、UmREC２とhsREC ２との間に43％の相同性が存在し、すなわち個々の配列の中の44個の残基の19個の残基が同一であった。さらに、８個の保存性置換が存在した。１：４種の組合せのうちわずか２つの組合せがserコドンに対して相同であるが、しかしながら、それらはヒトにおいて最ともしばしば使用されるserコドンに対しては相同である。高い相同性のこの領域は、hsREC２の残基84−127及びUmREC２の残基226−270 に対応する。図２Ｃ−２Ｄ参照。UmREC２の残基226−270は、recA及び次の組換え修復グループの関連するメンバーに比較される場合、最とも高く保存されるUm REC２の一部である：recAの残基40〜95，DMC１の残基95〜13，RAD51の残基100〜 144、及びRAD51の残基160−204。たとえば図２、Rubinなど.，1994前記を参照のこと。 hsREC２の５’末端を欠いているそのクローンp153195が、開始コドンの不在により決定された。hsREC２ cDNAの５’末端が、クローニングベクターからの前方向プライマー及びp153195に基づく一群の逆方向プライマーを用いてcDNAライブラリーのPCR増幅により得られた。十分な長さのhsREC２ cDNAを再構成するために使用されるユニーク制限部位を含む約100bpのオーバーラッグが同定された。再構成されたhsREC２ cDNAの配列は、図１Ａ−１Ｂに示されており、そしてhsR EC２の誘導された配列が図１Ｃ−１Ｄに示される。hsREC２ cDNAは、350個のアミノ酸のタンパク質、すなわち配列番号１をコードする。hsREC２ cDNA及びその補体の配列は、それぞれ配列番号２及び３である。p153195の５’側境界は、配列番号２の約nt280であった。 hsREC２配列とUmREC２配列との比較は、統計学的には有意であるが、しかし異なった相同性を示す（ｐ＝2.8×10^-5）。同じレベルの相同性が、hsREC２と酵母タンパク質DMC１との間に見出される。強いプロモーター、たとえばサイトメガロウィルスプロモーターの制御下で完全なhsREC２ cDNAを含む発現ベクター(pcHSREC２)が、トランスフェクトされた真核細胞におけるhsREC２の過剰発現のために構成され得る。精製されたhsREC２の生成のためには、バキュロウィルス多価プロモーターの制御下でのhsREC２の発現のために適切なベクターが構成され得る。生成物の精製において助けとなるタンパク質又はペプチド、たとえばヘキサヒスチジルペプチド又はグルタチオンＳ−トランスフェラーゼから成るREC２融合タンパク質を合成するベクターを構成することが好ましい。図１Ｅ−１Ｆ及び１Ｇは、ネズミREC２（muREC２）cDNA の誘導されたアミノ酸及び核酸を示す。５．２ hsREC ２の相同体本発明は、hsREC２の哺乳類相同体を包含する。いづれかの哺乳類種からのREC ２をコードする核酸は、図１Ａ−１Ｄ及び／又はhsREC２ cDNAクローンの配列情報を用いて、当業者に通常である技法により同定され、そして単離され得る。そのような通常の技法は、他の哺乳類種からのcDNA及びゲノムライブラリーをプローブするためにhsREC２ cDNA又はそのフラグメントの使用、及び哺乳類REC２ cDNAのフラグメントのPCR増幅のためのプライマーを構成するためへの配列データーの使用を包含する。hsREC２及びmuREC２ゲノムDNA(gDNA)のクローニングは下記に記載される。 hsREC２の高レベルの転写体が心臓及び骨格筋、肺、脾臓、膵臓及び胸腺、並びに胎盤に見出され得る。中位又は低レベルのhsREC 転写体が、肝臓、腎臓、脳及び精巣に見出される。従って、哺乳類REC２クローンを得るためにcDNAライブラリーを構成するためのmRNAの源は決定的ではない。 UmREC２のアミノ酸226−270に対応する残基83−127の配列は、特に高く保存され、そして従って、哺乳類REC２相同体の同定において有用である。 hsREC２の哺乳類相同体が、遺伝子の高く保存される部分、すなわちhsREC２の残基83−127に対して相同の部分におけるhsREC２に比較して、80％以上、及び好ましくは90％以上のアミノ酸同一性の存在により同定され得る。好ましい態様においては、哺乳類組換え酵素遺伝子は、hsREC２の残基83−127と相同の残基をコードする約130bpのセグメント内のhsREC２遺伝子と80％以上の配列同一性を共有する。hsREC２のそのような哺乳類相同性はまた、DNAアニーリングを触媒する上記に示された活性、ATPアーゼ活性、及びATP−依存性ssDNA結合活性も有するであろう。本明細書において使用される場合、それらの３種の活性の個々を有するタンパク質は、ATP−依存性相同対合タンパク質（“哺乳類組換え酵素”）と呼ばれる。hsREC２と80％以上の配列同一性を有する哺乳類組換え酵素は、“mREC２”と呼ばれる。細菌及び酵母相同組換えタンパク質の広い研究に基づけば、当業者は、すべての哺乳類組換え酵素がhsREC２と80％以上のアミノ酸配列同一性を有し、すなわちmREC２であり得ることを予測する。本発明はさらに、哺乳類REC２タンパク質又はそのフラグメントを含んで成る融合タンパク質を包含し、ここで前記REC２フラグメントは、生来のREC２と実質的に同じ程度に上記３種の活性の少なくとも１つ及び好ましくは３種の個々を示す。当業者は、発現システムに基づいて細菌及び昆虫細胞における哺乳類タンパク質の組換え生成及び精製は、興味あるタンパク質を含む融合タンパク質、及び得られる融合タンパク質を安定化し、そしてその精製を促進する第２タンパク質の構成により促進されることを理解する。融合タンパク質の非制限例は、REC ２のアミノ末端に融合される、ヘキサヒスチジル、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ及びチオレドキシンを包含する。１つの態様においては、本発明は、ATP−依存性相同対合タンパク質である、すなわちDNA再アニーリングのATP−依存性触媒であり、ATPアーゼであり、そしてATP又はγ−SATPの存在下でssDNAを結合する単離され、そして精製されたタンパク質を含む組成物であり、そして前記タンパク質は哺乳類ATP−依存性相同対合酵素に見出されるポリペプチドに対して実質的に同一である少なくとも115個のアミノ酸のポリペプチドを含んで成る。より好ましくは、その単離され、そして精製されたタンパク質は、hsREC２の残基80〜200に対して実質的に同一であるポリペプチドを含んで成る。さらなる態様においては、本発明の単離され、そして精製されたタンパク質は配列番号１の残基２〜350であるポリペプチドを含んで成る。本明細書において使用される場合、実質的に同一とは、同一であるか又は20個のアミノ酸当たり多くとも１つの保存性置換を有することを意味する。本明細書で使用される場合、ヒトタンパク質は、そのタンパク質を含む組成物がすべての他の通常の細胞内ヒトタンパク質を実質的に有さないが、しかし定義された組の個々に同定されたヒトタンパク質を有する場合、単離され、そして精製されたヒトタンパク質であり；同様に、単離され、そして精製された哺乳類タンパク質はすべての他の通常の細胞内哺乳類タンパク質を有さないが、但し定義された組の個々に同定された哺乳類タンパク質を除く。本明細書において使用される場合、“命名された材料を実質的に有さない定義されたタンパク質を含んで成る組成物”とは、組成物における命名された材料の重量が組成物におけるタンパク質の重量の５％以下であることを意味する。本発明はさらに、哺乳類ATP−依存性相同対合タンパク質の配列又は実質的に同一の配列を含んで成る配列を有する、タンパク質又は融合タンパク質をコードする哺乳類種に由来する、すなわちcDNA又はgDNAクローンに由来する単離され、そして精製された核酸を供給する。本明細書において使用される場合、単離され、そして精製された核酸は、他の哺乳類タンパク質をコードする核酸又はそのフラグメントを有さない単離され、そして精製された核酸である。本明細書において使用される場合、哺乳類ATP−依存性相同対合タンパク質の配列は、天然に存在する、すなわち哺乳類に見出される野生型ATP−依存性相同対合タンパク質、又は野生型哺乳類ATP−依存性相同対合タンパク質のいづれかの変異体の配列を意味する。好ましい態様において、本発明の核酸は、hsREC２に対して80％以上の配列同一性、又は他方では90％以上の配列同一性を有するタンパク質をコードする。当業者は、Ｎ−末端及びＣ−末端の１つ、２つ又は３個のアミノ酸は効果を伴わないで置換又は欠失され得、そして本明細書において使用される場合、そのように特定しない限り、配列の一部として見なされないことを理解する。当業者はさらに、相同タンパク質の進行の間、１〜４個の保存性アミノ酸の挿入又は欠失が通常であることを理解する。従って、配列の定義においては、タンパク質間の同一性は、同一性を最大にするために１つの配列又は両配列において４個もの多くの、又は１〜４個の残基ギャップの導入を包含する。本発明の単離され、そして精製された核酸は、哺乳類ATP−依存性相同対合タンパク質をコードする哺乳類遺伝子のcDNA及びgDNAクローンのみならず、また特定部位の突然変異誘発によりクローン化された前記cDNA及びgDNAに由来する核酸も包含する。通常のPCR技法の使用により、当業者はDNAの配列における特定の予定された変更を行なうことができる。特定部位の突然変異誘発はいづれかの方法により行なわれ得る。Ho，S.N.，など .，Gene 77：51-59（引用により本明細書に組込まれる）の方法が適切である。H oの方法によれば、オーバーラップする、突然変異誘発されたゲノムフラグメントが２つの別々のPCR反応において合成される。４種のプライマーが２つの反応に使用され、２つはお互いに対して相補的であり、そして所望する突然変異を導入する。PCR反応は、１つの生成物のセンス鎖が他のもののアンチセンス鎖の３ ’末端に対して相補的であるよう実施される。２種のPCR生成物は変性され、混合され、そして再アニーシルされる。次に、オーバーラップする部分的複合分子が延長され、十分な長さのdsDNAが形成され、第３PCR反応において増幅され、生成物が単離され、そして従来の組換え技法により親遺伝子中に挿入される。また、Liang，Q.,など.，1994，PCR Methods & Applic．４：269-74；Weiner，M.P． & Costa，G.L.，1994，PCR Methods & Applic．４：S131-136；Barrettino，D., など.，1994，Nacleic Acids Research 22：541；Stemmer，W.P.，など.，1992 ，Biotechniques 13：214-220を参照のこと。そのような技法の複数回の適用により、クローン化されたDNAの配列におけるいづれかの所望する修飾が導入され得る。従って、本発明の核酸は、天然に存在する配列を有する単離され、そして精製された核酸にのみ限定されず、しかしまた、天然に存在する哺乳類組換え酵素と実質的に同じ配列を有するATP−依存性相同対合タンパク質をコードする核酸も包含する。本発明の組成物は、さらに、哺乳類タンパク質を実質的に有さないよう単離され、そして精製された哺乳類組換え酵素のみならず、また天然に存在する哺乳類組換え酵素と実質的に同じ配列を有するいづれかの単離され、そして精製されたATP−依存性相同対合タンパク質も含んで成る組成物を包含する。 hsREC２配列は、他のタンパク質において特定の機能を有することが同定されているいくつかの配列を含む。図２Ａは、hsREC２の配列を示し、そして核局在化配列、すなわちrecAに関係する４種の配列、すなわちＡボックス、Ｂボックス、sre−様リン酸化部位及びDNA結合部位の位置を示す。当業者は、UmREC２のために見出されるように、mREC２タンパク質の部分は、ATP−依存性相同結合タンパク質を特徴づけるインビトロ活性のためにすべてが必要ではないことを理解するであろう。しかしながら、recA−様である、約残基80へ残基200までの約120個のアミノ酸の領域は、それらの活性のために必須である。５．３細胞のゲノムと外因性核酸との間の相同組換えを行うためのｍＲＥＣ２およびｍＲＥＣ２をコードする遺伝子の使用本発明の１つの態様において、ｍＲＥＣ２を発現するプラスミドを使用して、外因性核酸と細胞のゲノムとの間の相同組換え速度を増加する。１つの実施例において、外因性核酸は、混合リボ−およびデオキシリボヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドである、キメラ修復ベクター（ＣＲＶ）である。ＣＲＶの構造は、米国特許出願第０８／３５３，６５７号（１９９４年１２月４日提出）および米国特許出願第０８／６６４，４８７号（１９９６年６月１７提出）に開示されている。米国特許出願第０８／６４０，５１７号（１９９６年５月１提出）、発明の名称「突然変異により引き起こされる疾患を治療する方法および化合物」（Ｅ．Ｂ．Ｋｍｉｅｃ、Ａ．Ｃｏｌｅ−ＳｔｒａｕｓｓおよびＫ．Ｙｏｏｎ（米国特許出願第０８／６４０，５１７号は、これは引用することによって本明細書の一部とされる）には、疾患を引き起こす突然変異を修復するためにＣＲＶを使用することが記載されている。特に、米国特許出願第０８／６４０，５１７号は、造血細胞、例えば、鎌状赤血球の疾患を引き起こすβ−グロビンに影響を与える突然変異の修復に関する。本発明によれば、修復すべき疾患を引き起こす突然変異を有する細胞（標的細胞）を被検者から取り出す。次いで、標的細胞をｍＲＥＣ２（ｍＲＥＣ２発現ベクター）に作用可能に連鎖されたプロモーターを有する核酸でトランスフェクトし、こうして哺乳動物のＡＴＰ依存性相同対合タンパク質が標的細胞において過度に発現されるようにする。ヒト細胞の大部分の型について、サイトメガロウイルスからの即時型プロモーターは適当である。ＡＴＰ依存性相同対合タンパク質の持続的過度の発現は標的細胞の増殖および分化を行うことができるので、ｍＲＥＣ２発現ベクターは標的細胞において複製可能であってはならない。ｍＲＥＣ２発現ベクターは、この分野において知られているか、あるいは開発される任意の技術により標的細胞の中に導入することができる。リポソーム組成物、例えば、LIPOFECTIN^TMおよびDOTAP^TMは適当である。ｍＲＥＣ２発現ベクターでトランスフェクトした後、標的細胞を２４時間培養し、次いで疾患を引き起こす突然変異を修復するように設計されたＣＲＶを、米国特許出願第０８／６４０，５１７号に従い、標的細胞の中に導入し、次いで修復された標的細胞を被検者に再移植する。あるいは、修復された標的細胞を凍結し、臨床的に適切な時間に再移植することができる。ヒトＥＢ形質転換リンパ芽球様細胞株における鎌状赤血球疾患を引き起こす突然変異を修復するＣＲＶの有効性を増強するために、ｍＲＥＣ２発現ベクターを使用した結果を第５Ａ図に示す。これらのデータが示唆するように、約１００ｎｇ／ｍｌのＣＲＶの濃度において、第５Ａ図に「ｐｃｈＲＥＣ２」と表示するｍＲＥＣ２発現ベクターｐｃＨｓＲＥＣ２による標的細胞の前処理は、β−グロビンの修復されたコピーにおいて、１２％から６５％に、約５倍の増加を引き起こした。２５０ｎｇ／ｍｌにおいて、β−グロビンのコピーの８０％以上が修復された。ＣＲＶのより高い濃縮において、ｐｃＨｓＲＥＣ２処理された標的細胞と対照標的細胞との間の差は顕著でなくなる。非複製エピソームを使用して、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に作用可能に連鎖された、ｍＲＥＣ２ｃＤＮＡ遺伝子（ｈｓＲＥＣ２）を標的細胞の中に導入し、そしてｍＲＥＣ２を一時的に発現させることによって、本発明を例示する。本発明の別の態様は、ゲノム遺伝子のコピーの導入により産生することができる。このコピーは相同ｍＲＥＣ２プロモーターに作用可能に連鎖するか、あるいはＣＭＶまたは他の異種プロモーターにより相同プロモーターが置換されるように修飾することができる。異なる状況における相同組換えを増加するために使用することができる他の変法は、組織特異的プロモーター、例えば、ＣＤ４、免疫グロブリン、インスリンまたはグロビンのプロモーターへのｍＲＥＣ２ｃＤＮＡまたはｇＤＮＡの連鎖を包含する。組織特異的プロモーターを使用することによって、ただ１つの特定の組織においてｍＲＥＣ２を過度に発現する、トランスジェニック動物、特にマウス、ラットおよびブタを構築することができる。なお他の別の態様において、プロモーターは誘導可能なプロモーターであることができる。本発明において特に適当な誘導可能なプロモーターはテトラサイクリンの誘導可能なプロモーターであり、これは米国特許第５，４６４，７５８号（これは引用することによって本明細書の一部とされる）に記載されている。当業者はさらに理解するように、完全なｍＲＥＣ２ｇＤＮＡのすべてではなく、一部分を含有するｍＲＥＣ２をコードする遺伝子を構築することができる。このような遺伝子は、ｍＲＥＣ２ｇＤＮＡとｍＲＥＣ２ｃＤＮＡとの混合物である。本明細書において使用するとき、用語「ｍＲＥＣ２遺伝子」は、一般に、ｍＲＥＣ２ｃＤＮＡ、ｍＲＥＣ２ｇＤＮＡ、またはｍＲＥＣ２ｇＤＮＡおよびｍＲＥＣ２ｃＤＮＡのフラグメントからなる全長のＲＥＣ２タンパク質をコードする核酸を意味すると理解すべきである。さらに、本発明は、Capecchi、M．R．、1989、Science 244:1288および米国特許第５，４８７，９９２号、第２３〜２４列（これらは引用することによって本明細書の一部とされる）の方法に従い、培養された胚幹細胞（「ＥＳ細胞」）を使用するトランスジェニック動物の構築を促進するために、ｍＲＥＣ２発現ベクターを使用することを包含する。導入された誘導可能なｍＲＥＣ２遺伝子を有するトランスジェニックマウスを構築することができる。このようなトランスジェニックマウスからのＥＳ細胞を取得し、増加したレベルのｍＲＥＣ２を有するように誘導することができる。このような細胞はキメラの突然変異ベクター（「ＣＭｕｔＶ」）との相同組換えを容易に行うであろう。このようなキメラの突然変異ベクターは、ＣＲＶと同様な構造および構造を有し、標的野生型遺伝子の中に特定の突然変異を導入するために使用することができる。ＣＭｕｔＶの使用により、それ以上の標的された遺伝子の変更を有する第２世代およびより高い世代のトランスジェニック動物を構築することができる。本発明の他の態様は、トランスジェニック動物の構築における単離され、精製されたｍＲＥＣ２タンパク質の使用に関する。トランスジェニック動物を構築する当業者は理解するように、Brinster、R．L．、et a l.、1989、Proc．Natl．Acad．Sci．86:7087に記載されている方法に従い核酸を卵の前核の中に直接注入することによって、トランスジェニック動物は構築される；また、米国特許第４，８７３，１９１号（Ｔ．Ｅ．ＷａｇｎｅｒおよびＰ．Ｃ．Ｈｏｐｐｅ）を参照のこと（これらは引用することによって本明細書の一部とされる）。このような直接的注入は、注入された本発明の核酸のランダムな統合を生ずる。前述したように、相同組換えによるトランスジーンの導入技術は開発されてきているが、このような技術は、マウスについてのみ利用可能である、特殊化された胚幹細胞系統を必要とし、さらに、相同組換え速度が非常に低いので、相同組換え体を培養において選択できるように、遺伝的変更を設計することを必要とする。ＣＭｕｔＶと組み合わせて本発明を使用すると、特定の変更を標的遺伝子のコピーの大きい部分、例えば、８０％の中に導入することができるので、本発明はトランスジェニック動物を構築する実際的技術を提供し、ここで特異的に標的された遺伝子の双方のアレレの機能がｍＲＥＣ２ＣＭｕｔＶ混合物を直接的に注入された卵を使用する相同組換えにより検出（「ノックアウト」）されることを当業者は理解するであろう。本発明によれば、卵の前核の中にｍＲＥＣ２タンパク質およびＣＭｕｔＶを注入することによって、トランスジェニック動物は構築される。好ましい態様において、ＣＭｕｔＶとｍＲＥＣ２タンパク質との混合物を卵の前核の中に注入する。好ましい態様において、注入すべき核酸はノックアウトすべき遺伝子の中に停止コドンまたはフラグメントの突然変異を導入するＣＭｕｔＶである。使用すべきタンパク質の濃度は、ＣＭｕｔＶの５，０００塩基対〜５０塩基対当たり約１分子のｍＲＥＣ２タンパク質、好ましくはＣＭｕｔＶの約１００〜５００塩基対当たり１分子のＣＭｕｔＶである。また、突然変異領域をフランクする相同領域を含有する、慣用の線状化ＤＮＡフラグメントにより、ＣＭｕｔＶを置換することができる。５．４ｍｕＲＥＣ２−ノックアウトマウスの構築本発明は、さらに、不活性化ｍｕＲＥＣ２を有するトランスジェニックマウスを提供する。このようなヘテロ接合性ｍｕＲＥＣ２−ノックアウトトランスジェニックマウスは、適当な突然変異をｍｕＲＥＣ２（ｍｕＲＥＣ２^ko）を有する胚幹細胞系（ＥＳ細胞）をネズミ胚盤胞に注入することによって構築することができる。Nichols、J.、et al.、1990、DEVELOPMENT 110:1341-48の技術を使用することができる。胚幹細胞系注入胚盤胞を使用するトランスジェニックマウスを構築することに関するそれ以上の教示は、米国特許第５，４８７，９９２号（ＣａｐｅｃｃｈｉおよびＴｈｏｍａｓ）（これは引用することによって本明細書の一部とされる）の中に見出すことができる。異種ｍｕＲＥＣ２−ノックアウトマウスを相互交雑し、ｍｕＲＥＣ２^koアレレについてホモ接合性である子孫を選択することによって、ホモ接合性ｍｕＲＥＣ２−ノックアウトマウスを得ることができる。限定されずに、ｍｕＲＥＣ２^ko遺伝子は２つの方法で作ることができる。ＣＭｕｔＶは米国特許第５，５６５，３５０号に従い構築することができ、これは１またはそれより多い停止コドンをｍｕＲＥＣ２内の異なる位置に導入するように設計される（「ｍｕＲＥＣ２^koキメラベクター」）。好ましくは、重複停止コドンを導入するように設計された、いくつかのｍｕＲＥＣ２^koキメラベクターを使用して、逆転速度を減少する。処理後、ＥＳ細胞をクローニングし、機能的ｍｕＲＥＣ２遺伝子の損失を配列の分析によるか、あるいは突然変異したコドンに対して特異的なプライマーを使用するＰＣＲ増幅により確証することができる。また、ジシストロン性ターゲッティング構築物を使用して、ｍｕＲＥＣ２^ko突然変異を導入することができる。Mountford、P.、et al.、1994、Proc．Natl．A cad．Sci．91:4303-07。さらに詳しくは、５’→３’の向きに、スプライスアクセプター部位、脳心筋ウイルス（ＥＭＣＶ）からの５００ｂｐの内のリボソーム入口部位（ＩＲＥＳ）、融合遺伝子βｇｅｏ（これはβ−ガラクトシダーゼおよびＧ４１８の双方の耐性活性を有する）、およびＳＶ４０からのポリアデニル化シグナルから成るカセットを有するターゲッティングベクターを構築する。ターゲッティング構築物において、例えば、限定されないが、ｍｕＲＥＣ２遺伝子の第２エクソンのイントロン３’および５’からの２つのフラグメントの間に、カセットは挿入され、ここで５’最も近いエクソンは第１エクソンであり、３’にすぐ近くのエクソンから５’最も近いエクソンまでは第２エクソンおよびその他である。フラグメントの長さは好ましくは約５００ｂｐ〜５，０００ｂｐであることができる。ＥＳ細胞の中へのＤＮＡのトランスフェクションに適当な任意の技術により、線状化ターゲッティング構築をＥＳ細胞の中に導入することができる。トランスフェクトされたＥＳ細胞のｍｕＲＥＣ２遺伝子は相同組換えを行い、ここでカセットは第２エクソンを置換し、こうしてカセットはｍｕＲＥＣ２プロモーターから転写され、そしてβｇｅｏタンパク質はＩＲＥＳに結合したリボソームにより翻訳される。トランスフェクトされた細胞をＧ４１８に暴露し、そして組織化学的に染色してガラクトシダーゼ陽性細胞を検出することによって、転写的に活性な遺伝子の中に統合されたカセットを有するＥＳ細胞を選択することができる。典型的には、βｇａｌ＊／ｎｅｏ’二重形質転換体の７０％〜９０％程度に多くがターゲッテッド遺伝子の相同組換えを行った。ホモ接合性ｍｕＲＥＣ２^koマウスは、化学的および物理的因子により引き起こされる突然変異に対する増加した感受性を有する。このような動物を使用して、産物が突然変異原性であるかどうか、特にこのような産物が発癌性であるかどうかを決定することができる。ホモ接合性および異種の双方のｍｕＲＥＣ２^koマウスは、また、良性および悪性の腫瘍の発生に対していっそう感受性であろう。これらの動物を使用して、生物医学的研究において使用するための異なる組織の型の腫瘍を発生させることができる。５．５試料のｈｓＲＥＣ２遺伝子によりヒト組織の試料の分類当業者は理解するように、化学的に誘発された突然変異および複製のエラーをそのＤＮＡから除去する細胞の能力と、悪性の発生および進行させる遺伝的変化を発生させる細胞の潜在性との間に密接な関連性が存在する。Altonen、L．A．、1993、Science 260:812-816;Chung、D．C．およびRustgi、A．K．、1995、Gas troenterology 109:1685-99。突然変異および複製のエラーを除去する細胞の能力は、まず、細胞がＤＮＡのミスマッチの修復に必須である遺伝子の正常の、すなわち、二倍体の数のコピーを含有するどうかを決定し、第２に、存在するコピーが変更されている、すなわち、突然変異を含有するかどうかを決定することによって、分類することができる。細胞のＲＥＣ２における欠陥のためにＤＮＡのミスマッチを除去する能力が減少した細胞は悪性であるか、あるいは突然変異のそれ以上の蓄積のために悪性となる傾向をいっそう有する。１つの実施例において、本発明は、二倍体ゲノム当たりのｈｓＲＥＣ２遺伝子のコピー数に従い、ヒト組織を分類することから成る。２より小さい数の減少は、残りのコピーにおける突然変異がＡＴＰ依存性相同対合活性を非存在としたために、組織のある細胞がＤＮＡのミスマッチを修復する能力が減少したであろうことを示す。配列識別ＮＯ：２のフラグメントまたはその補体である配列を含有する標識化核酸から構築されたプローブを使用する定量的ブロッティングにより、遺伝子のコピー数を容易に決定することができる。組織の試料における二倍体ゲノム当たりのｈｓＲＥＣ２遺伝子の数を決定する別の方法は、ｈｓＲＥＣ２遺伝子がバンド１４ｑ２３−２４の中に位置すること、特に、それがマーカーＤ１４Ｓ２５８の近位側に緊密に連鎖し、また、マーカーＤ１４Ｓ２５１に緊密に連鎖するという事実に頼る。Ｄ１４Ｓ２５８マーカーに連鎖する位置においてヘテロ接合性である個体におけるｈｓＲＥＣ２遺伝子のコピーの損失は、ヘテロ接合性の損失から推理することができる。本発明の別の態様は、ヒト組織の試料がｈｓＲＥＣ２遺伝子の非突然変異のコピーを含有するか、否かに従い、その試料を分類することから成る。当業者に知られているか、あるいは開発すべき任意の技術により、試料のｈｓＲＥＣ２遺伝子および標準的組織のｈｓＲＥＣ２を比較することができる。本発明のこの態様の実施のための感受性の技術は、一本鎖のコンフォメーションの多形性（ＳＳＣＰ）である。Orita、M.、et al.、1989、Genomics 5: 874-879;Hayashi、K.、1 991、PCR Methods and Applic．1:34-38。この技術は、問題の遺伝子のフラグメントをＰＣＲにより増幅し、フラグメントを変性し、そして非変性条件下に２つの変性された一本鎖を電気泳動させることから成る。一本鎖は、鎖の電気泳動の移動度に影響を与える、複雑な配列依存性鎖内二次構造を取る。したがって、組織の試料からのｈｓＲＥＣ２遺伝子の増幅されたフラグメントを、標準的組織のｈｓＲＥＣ２遺伝子からの適用されたフラグメントと比較することは、試料のｈｓＲＥＣ２中の突然変異を検出する感度の高い技術である。組織の試料中の非突然変異のｈｓＲＥＣ２遺伝子の非存在は、組織の細胞が悪性の表現型に形質転換したか、あるいはするであろうことを示す。本発明の他の別の態様において、組織の試料のＤＮＡのサザンブロッティングにより、試料を分類することができる。ブロット中の組織特異的バンドの存在は、試料のＲＥＣ２遺伝子の少なくとも１つのコピーが突然変異の事象を行ったことの証拠である。本発明のなお他の態様において、ＲＥＣ２遺伝子のフラグメントをＰＣＲにより増幅し、そして増幅されたフラグメントの配列および長さが正常のＲＥＣ２遺伝子から期待できるものであるかどうかを、配列決定または電気泳動により、決定することによって、組織の試料を分類することができる。限定されないが、本発明に従い分類できる組織の試料の特定の型は、バンド１４ｑ２３−２４における細胞発生的異常性に関連する腫瘍を包含する。このような腫瘍の型は、腎臓癌腫および卵巣癌を包含する。Mittelman、F.、1994、Catal og of Chromosome Aberrations in Cancer、（Johansson、B.およびMertens、F. 編）、Wiley-Liss、New York、pp.2303-2484。また、領域１４ｐ２３−２４に連鎖したマーカーのヘテロ接合性の損失を示す腫瘍の型は、本発明の方法に従う分類のために適当である。このような腫瘍の型は、髄膜腫、神経芽細胞腫、星状細胞腫および結腸アデノーマを包含する。Cox、D．W．1994、Cytogenetic Cell Ge net．66:2-9。突然変異したｈｓＲＥＣ２遺伝子を有するか、あるいは密接に連鎖した位置Ｄ１４Ｓ２５８におけるマイクロサテライトＤＮＡのヘテロ接合性を喪失していることが見出された、乳房腺癌の高い割合は特に興味あることである。前述の方法に加えて、本発明の態様は、ｈｓＲＥＣ２遺伝子のフラグメントを増幅するためにプライマーとして使用するために適当なオリゴヌクレオチドの対からなるキットを包含し、前記対は配列識別ＮＯ：２のフラグメントの配列を有する５’−プライマー、およびその補体のフラグメントの配列を有する３’−プライマーから成り、この補体において３’−プライマーは５’−プライマー配列の位置の３’に横たわる配列識別ＮＯ：２の配列の一部分に対して相補的である。３’および５’−プライマーの長さは少なくとも１２ヌクレオチドであり、好ましくは約１６〜２５ヌクレオチド、より好ましくは１８〜２４ヌクレオチドである。さらに、本発明は、配列識別ＮＯ：２のフラグメントまたはその補体の配列および標識を有し、ｈｓＲＥＣ２遺伝子のゲノムのブロットとのハイブリダイゼーションに適するオリゴヌクレオチドから成る。標識は、放射性標識、例えば、³²Ｐ、蛍光性標識、あるいは核酸配列の特異的検出を可能とする既知であるか、あるいは開発すべき任意の標識を包含する。ｈｓＲＥＣ２ｃＤＮＡがＣＭＶの即時型プロモーターに作用可能に連鎖されたプラスミドｐｃＨｓＲＥＣ２は、１９９６年８月２０日に、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）米国マリイランド州ロックビレ）に寄託され、受け入れ番号９７６８５を与えられた。このプラスミドは名称「ｐｃＨｕＲＥＣ２」で受託されたが、それは本明細書において一貫性のためｐｃＨｓＲＥＣ２と呼ぶ。プラスミドｐｃＨｓＲＥＣ２は商業的に入手可能なプラスミドｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）から誘導され、ｈｓＲＥＣ２をコードする１．２ｋｂのインサートを含有し、このインサートは制限酵素ＸｂａＩおよびＫｐｎＩを使用する切断によりｐｃＨｓＲＥＣ２から除去することができる。それぞれ、ｈｓＲＥＣ２遺伝子の５’および３’領域の１２ｋｂおよび１６ｋｂのフラグメントを含有する、λ５ＡおよびＡ１Ｃと表示する、ＥＭＢＬ−３型 λファージのクローンは、１９９６年８月２０日に寄託され、それぞれ、受け入れ番号９７６８３および９７６８２を与えられた。それぞれ、株１２９ＳＶＩのｍｕＲＥＣ２ｇＤＮＡの５’および３’領域の１４ｋｂおよび１４．９ｋｂのフラグメントを含有する、λ５Ｄ２ａおよびλ７Ｂ１ａと表示する、ＡＦＩＣＩＩ型λファージのクローンは、１９９６年８月２２日及び１９９６年８月２０日に寄託され、それぞれ、受け入れ番号９７６８６および９７６８４を与えられた。インサートλ５Ｄ２ａおよびλ７Ｂ１ａは、ＮｏｔＩ制限酵素を使用する切断により解放される。５．６ＲＥＣ２プロモーターｈｓＲＥＣ２およびｍｕＲＥＣ２のプロモーターをクローニングした。２工程のＰＣＲに基づくプロモーターのウォーキング技術により、ｈｓＲＥＣ２プロモーターをクローニングした。簡単に述べると、それぞれ、第１および第２工程において、ＤｒａＩおよびＳｓｐＩで消化することによって、平滑末端のゲノムのフラグメントを作る。制限フラグメントをアダプターに結合する。遺伝子の５’ 末端からの遺伝子特異的プライマーおよびアダプター特異的プライマーを使用して、一次的ＰＣＲ増幅を実施する。ネステッド、遺伝子およびアダプター特異的プライマーを使用して、二次的ＰＣＲを実施する。第１工程の、一次的および二次的遺伝子特異的プライマーは、それぞれ、下記の通りであった：5'-CAG ACG G TC ACA CAG CTC TTG TGA TAA-3'(配列識別ＮＯ：８)および5'-ACC CAC TCG TTTT AG TTT CTT GCTAC-3'（配列識別ＮＯ：９）。第２工程のプロモーターのウォーキング一次的および二次的遺伝子プライマーは、それぞれ、下記の通りであった：5'-TAG AGA GAG AGA GAG AGC GAG ACA G-3'(配列識別ＮＯ：１０)および5'-GTC GAC CAC GCG TGC CCT ATA G-3'(配列識別ＮＯ：１１)。第１工程および第２工程のフラグメントは、それぞれ、０．８および０．９ｋｂの長さであった。クローンλ５Ｄ２ａをＸｂａＩで消化することによって、ｍｕＲＥＣ２プロモーターを配列決定した。プロモーターは約７ｋｂの最大のフラグメント上に見出された。ｈｓＲＥＣ２およびｍｕＲＥＣ２の配列は、それぞれ、第７Ａ図〜第７Ｃ図および第７Ｄ図〜第７Ｆ図に記載されている。細胞を¹³⁷Ｃｓの照射に暴露したとき、培養したヒト包皮繊維芽細胞中のＲＥＣ２転写物のレベルは増加することが示された。放射線誘導可能である、いくつかの酵母遺伝子が同定され、そしてこのような遺伝子のプロモーターからの放射線感受性シス作用性対照配列が同定された。表Ｉ〜ＩＩＩに対する脚注において引用した参考文献を参照のこと。したがって、ｈｓＲＥＣ２およびｍｕＲＥＣ２のプロモーターの配列をこのような配列の存在について検査した。第７図は、多数のこのような配列が存在すること証明する。表Ｉ〜ＩＩＩは、酵母のＵＶ応答性因子の配列、それらが見出された酵母遺伝子中のそれらの位置、およびそれらが記載されている科学刊行物に対する文献を示す。トランスフェクトされたＨｅＬａ細胞におけるＵＶ放射線およびルシフェラーゼリポーター遺伝子を使用して、ｈｓＲＥＣ２遺伝子の放射線誘導可能性を直接アッセイした。ｈｓＲＥＣ２プロモーターをルシフェラーゼリポーター遺伝子およびＳＶ４０エンハンサーに作用可能に連鎖し、ポリＡ付加シグナルの下流に配置した。任意の強いエンハンサー、例えば、サイトメガロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、α−フェトプテイン、ラウス肉腫ウイルスまたはシミアンウイルス４０からのエンハンサーを使用するすることができる。この構築物において、ｈｓＲＥＣ２プロモーターは、放射線の非存在において、ＳＶ４０の即時型プロモーターとほぼ同じ程度に強いプロモーターであった。細胞をＵＶ照射（３５１／ｍ² ＵＶ）したとき、ｈｓＲＥＣ２プロモーターはほぼ２〜３倍の活性の増加を示した。下記の節６．８を参照のこと。例えば、癌の放射線治療と組み合わせて、放射線誘導可能なプロモーターを使用して、放射線に対する細胞の感受性を増加させることができる。「スイサイド遺伝子」、例えば、ヘルペスチミジンキナーゼに作用可能に連鎖されたｈｓＲＥＣ２プロモーターを含有する構築物を、レトロウイルスをベースとするベクターを使用して、有糸分裂的に活性な細胞の中に導入することができる。腫瘍細胞を照射し、そして、同時に、ヘルペスチミジンキナーゼにより変換されるガンシクロビア（ｇａｎｃｙｃｌｏｖｉｒ）、すなわち、ＤＮＡ抗仲介プロドラッグを添加することができる。当業者は理解するように、欠失を実施した後のフラグメントの活性を試験することによって、ＲＥＣ２プロモーターの活性をさらに局在化することができる。第７図のフラグメントよりも小さい、機能的な、放射線誘導可能なプロモーターを見出すことができる。したがって、本明細書において使用するとき、ヒトＲＥＣ２プロモーターおよびネズミＲＥＣ２プロモーターは、それぞれ、第７Ａ図〜第７Ｃ図または第７Ｄ図〜第７Ｆ図に見出される配列を有するＤＮＡとして、あるいはそのフラグメントとして定義され、ここで前記フラグメントはＨｅＬａ細胞におけるプロモーターである。ｈｓＲＥＣ２プロモーターおよびｍｕＲＥＣ２プロモーターという用語は、それぞれ、第７Ａ図〜第７Ｃ図または第７Ｄ図〜第７Ｆ図に見出される配列を有するＤＮＡを意味する。任意の種からのＲＥＣ２プロモーターを同様に定義することができる。したがって、１つの実施例において、本発明は、限定された数の型のＤＮＡ分子のみを含有し、それらの分子の１つがＲＥＣ２プロモーターを含んでなる組成物に関する。本明細書において使用するとき、このような組成物は、単離され、精製されたＲＥＣ２プロモーターを含んでなると言われる。別の態様において、本発明は、哺乳動物のＲＥＣ２プロモーターおよび、詳しくは、ヒトまたはネズミのＲＥＣ２プロモーターを含んでなる、細菌の複製起点を有するプラスミド（以後「クローニングプラスミド」）に関する。さらに、当業者は理解するように、第７図の配列の中に存在するシス作用性の放射線感受性コントロール因子は、適当な欠失を有するフラグメントの系統的試験により同定することができる。したがって、ｈｓＲＥＣ２プロモーターよりも放射線誘導可能性が低い、上記において定義したような、ＲＥＣ２プロモーターが存在しうる。本明細書において使用するとき、哺乳動物のＲＥＣ２プロモーターは、少なくとも２倍の活性の増加を示す場合、放射線誘導可能性であると言われ、そしてｈｓＲＥＣ２が少なくとも４倍の増加を示す条件下に試験したとき、３倍の増加を示す場合、ＲＥＣ２プロモーターは「３倍誘導可能性」であると呼ばれる。他の態様において、ＲＥＣ２プロモーターはエンハンサーに作用可能に連鎖される。ＳＶ４０エンハンサーの使用により、本発明を例示する。ＳＶ４０と同じように強い、任意のエンハンサーを使用できることを当業者は理解するであろう。別のエンハンサーは、サイトメガロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、α−フェトプロテイン、ラウス肉腫ウイルスまたはシミアンウイルス４０のエンハンサーを包含する。表Ｉサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＤＮＡ修復遺伝子ＵＳＡｓ表ＩＩサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＤＮＡ修復遺伝子のＵＳＡｓ表ＩＩＩサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＤＮＡ修復遺伝子のＵＲＡｓ５．７ＲＥＣ２−トランスフェクタントは、照射に対し感作されている。本発明の１つの実施形態は、好ましくは例えばＣＭＶ即時早期プロモータといった構成性プロモータである強いプロモータに対してｍＲＥＣ２ｃＤＮＡが作動的にリンクされている、プラスミド又はその他の分離された精製済みＤＮＡである。さらなる実施形態においては、本発明は、このようなプラスミド又は分離精製済みＤＮＡでのトランスフェクションを受けＲｅｃ２を過剰発現する哺乳動物の細胞から成る。Ｒｅｃ２の過剰発現は、哺乳動物の細胞を、例えばシクロホスファミド、γ−線又はＵＶ照射といったアルキル化作用物質などのＤＮＡ損傷作用物質に対し過敏なものにする。従って、本発明は、Ｒｅｃ２を発現するプラスミドでの選択的なトランスフェクションを受ける可能性のある１組の細胞を感作させるのに使用することができる。このような感作は悪性疾患を治療するべく従来の腫瘍学的化学療法又は照射療法と組合わせた形で使用することができる。６．例６．１ Autographica californicaのバキュロウイルス感染による、組換え型 hsＲＥＣ２タンパク質の産生 hsＲＥＣ２発現ベクターの構築を容易にするため、hsＲＥＣ２ｃＤＮＡに対しＰＣＲ増幅によりＸｈｏ１及びＫｐｈ１のための制限部位を添加した。ｎｔ７１で始まるhsＲＥＣ２ｃＤＮＡを、順方向プライマ5'-GAG CTCGAG GGTACC C ATG GGT AGC AAG AAA C-3'（配列番号１４）を用いて増幅させ、これによりＸｈｏ１及びＫｐｎ１部位（下線）は開始コドンから５’のところに置かれた。hsＲＥＣ２ｃＤＮＡの全コーディング配列を含む組換え型分子は、配列番号２のｎｔ１２７０と１２８０の間にある唯一のＸｂａ１部位及びＸｈｏ１又はＫｐｎ１のいずれかを用いて除去できる。バキュロウィルスに感染したSpondoptera frugiperda（Ｓｆ−９）昆虫細胞（ＡＴＣＣ細胞系統No.ＣＲＬ１７１１，Rockville ＭＤ）の中でのＨｓＲＥＣ２の発現のためのベクターｐＢａｃＧＳＴＳＶは、Zailin Yu博士（バキュロウイルス発現研究所、トーマスジェファーソン大学）から得た。ベクターＰＶＬＧＳは、本書に参考として内含されている（Smith & Johnson，GENE ６７：３１（１９８８）の中で記述されている）ＰＧＥＸ−２Ｔからのトロンビン分割部位及び日本住血吸虫グルタチオンＳ−トランスフェラーゼポリペプチドをコードするフラグメントを、ベクターｐＶＬ１３９３の中に挿入することによって構築された。ｐＶＬＧＳ内にポリＡ終結シグナル配列を挿入してｐＢａｃＧＳＴＳＶを生成した。１．２kbのhsＲＥＣ２フラグメントを含有するプラスミドをＫｐｎ１で切断し、３’の未対合末端をＴ４ポリメラーゼで除去し、産物をXbalで切断した。結果として得たフラグメントを、Smal，Xbalで切断されたｐBacＧＳＴＳＶベクター内に挿入してｐＧＳＴ/hsＲＥＣ２を得た。ｐＧＳＴ/hsＲＥＣ２からのインサートを含む組換え型ウィルスを、通常の方法で分離し、Ｓｆ−９細胞を感染させた。Ｓｆ−９細胞を、SF-900IISFM(Gibco/ BRLCat#10902)又はTNM-FH（Gibco/BRLCat#11605-011)に１０％のＦＢＳを加えたものの中で成長させる。３〜５日の培養の後、感染を受けた細胞を収集し、Ｃａ⁺⁺ 及びＭｇ⁺⁺を含まないＰＢＳの中で洗浄し、プロティナーゼ阻害物質（ICNCat ♯158837），１％のＮＰ−４０，２５０ｍＭＮａＣｌを加えた５×１０⁷個の細胞につき５ｍｌのＰＢＳの中で音波処理に付す。２０分間３００００×ｇでの遠心分離によりリゼイトを清澄させる。次に、５×１０⁷個の細胞につき０．５ｍｌのグルタチオン−アガロース樹脂（Sigma Chem．Co．Cat＃C4510）に対し、上清を適用する。５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，１５０ｍＭのＮａＣｌ及び２．５ｍＭのＣａＣｌ₂の緩衝液の中で樹脂を洗浄し、同じ緩衝液の中で２３℃で２時間、トロンビン（Sigma Chem Co．Cat＃Ｔ７５１３）での処理により hsＲＥＣ２を解放させる。いくつかの実験については、アミノカプロイル−Ｐ− クロロベンジルイミドアフィニティカラム（Sigma Chem Co．Cat＃Ａ９５２７）を用いて、Thompson及びDavie，１９７１，Biochem Biophys Acta２５０：２１０の技術によりトロンビンを除去する。６．２ hsＲＥＣ２タンパク質の酵素特性の検出バキュロウイルス産生のヘキサヒステジルhsＲＥＣ２を、Kmiec， E.B.，& Holloman，W.K.,１９８２，Cell２９：３６７−７４に記述されているとおりＤＮＡ再アニーリング検定においてテストした。図３の結果は、hsＲＥＣ２が変性ＤＮＡの再アニーリングの触媒として作用することを示した。最適な反応は、５０〜１００のヌクレオチドにつき約１個のhsＲＥＣ２で発生した。 hsＲＥＣ２を特徴づけするためのさらなる研究は、それがＡＴＰ−ＡＤＰ＋ＰＯ₄反応の触媒として作用することを示した。recＡと同様に、＜１００μｍのＡＴＰ濃度で、hsＲＥＣ２分子の間に協同性が存在する。Hill係数（１．８）は、ＡＴＰ加水分解のための機能単位が少なくとも二量体であることを示唆している。ssＤＮＡに結合するhsＲＥＣ２のＡＴＰ依存性を決定するため、ゲル遅延実験を行なった。これらの実験の結果は、hsＲＥＣ２がＡＴＰ又はその加水分解不能なチオ類似体γ−ＳＡＴＰの存在下でのみｓｓＤＮＡに結合するということを示した。ここでも、hsＲＥＣ２の結果は、recＡの結果と近似している。分離・精製されたhsRec２を用いた特異的検定のさらなる例は以下のとおりである。６．２．１．１本鎖ＤＮＡに対する結合７３ヌクレオチドの１本鎖ＤＮＡ（ＳＳ）を、ポリヌクレオチドキナーゼを用いて²²Ｐ末端標識付けした。２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．４，１０ｍＭのＭｇＣｌ₂，４ｍｌのＡＴＰ及び１ｍＭのＤＴＴ及びタンパク質中の０．２５ｎｇの標識づけされたＳＳを用いてＤＮＡ結合を実施した。Thiobond^TM（Invitr ogen）上でhsRec２−チオレドキシンと部分的に精製し、Microcon３０スピンカラム（Amicon）を用いて脱塩、濃縮させた。約０．３μｇのタンパク質を添加した。反応混合物を３７℃で３０分間インキュベートし、その後、ポリアクリルアミドゲル上への装てんを容易にするためスクロースを添加した。混合物を、１５０Ｖで３時間、９０ｍＭのトリス、９０ｍＭのホウ酸塩、ｐＨ８．３，２ｍＭのＥＤＴＡ中１２％の非変性ゲル上に装てんした。次にゲルを乾燥させ、一晩露呈した。ＡＴＰ又はγＳ−ＡＤＰの存在下で、約３％の標識が遅延され、一方、ＡＴＰ又はγＳ−ＡＤＰのいずれも存在しない状態では、結合した標識の量は減少した。６．２．２．ＤＮＡ再アニーリングの触媒作用１２３ヌクレオチドフラグメントの再アニーリングを以下の要領で決定した。１本鎖の１２３ヌクレオチド（ＳＳ）を、ポリヌクレオチドキナーゼを用いて³² Ｐ末端標識づけした。５ｍＭのＡＴＰが任意に存在する状態で、２５μｌの２０ｍＭトリスＨＣｌｐＨ７．５，１０ｍＭのＭｇＣｌ₂，０．５ｍＭのＤＴＴの中の０．５ｎｇのＳＳに対し、親和力精製された可変的量のＧＳＴ−hsRec２融合タンパク質を添加した。標本を３７℃で３０分インキュベートし、その後、反応を停止させるためフェノール／クロロホルム抽出を行ない、続いて３７℃で３０分間２回目のインキュベーションを行なった。次に反応混合物を、上述の第６．２．１節にある通りに電気泳動させ、オートラジオグラフィに付した。図６に示された結果は、ＧＳＴ−hsＲＥＣ２がＡＴＰの存在下及び不在下の両方においてＳＳの再アニーリングの触媒として作用することを立証している。６．３ hsＲＥＣ２の過剰発現は、ＵＶＣ誘発型突然変異を抑制する hsRec２の存在が、ＵＶＣ誘発型突然変異からの培養細胞を防御するか否かを決定するため、線形化されたｐｃＨｓＲＥＣ２及びＰＣＭＶneoの混合物で、ＣＨＯ細胞系統をトランスフェクションに付し、Ｇ４１８に対する耐性をもつクローンを選択した（「１５Ｃ８ hsＲＥＣ２」）。バキュロウイルス産生のhsRec ２融合タンパク質に対し発生させられたウサギの抗血清を用いた免疫ブロット法により、hs ＲＥＣ２発現のレベルの上昇を確認した。易変性は、以下の通りに決定された。１００ｍｍのペトリ皿の中で、１．６× １０⁶個の１５Ｃ８ hsＲＥＣ２細胞を平板固定し、０又は２．０〜５．０ｌ／ｍ²のＵＶ放射に露呈した。７日間の培養の後、残りの細胞を４０μＭの６−ＴＧに露呈した。生存細胞は、ＨＰＲＴ遺伝子の不活性化を受けていた。さらに７〜１０日培養した後、コロニー数を計数した。６−ＴＧ無しで限界数の細胞を平板固定することで決定される個体群のクローニング効率について、突然変異の頻度を調整した。結果は、トランスフェクションを受けなかったｐＣＭＶneo及び１５Ｃ８ hs ＲＥＣ２細胞がＵＶＣ照射なしでそれぞれ１００万につき１．７，６．２及び０．４という突然変異率を有していたことを示している。ＵＶＣ放射の後、観察された突然変異率は、３回の実験において、トランスフェクションを受けなかった細胞、ｐＣＭＶでトランスフェクションを受けた細胞及び１５Ｃ８ hsＲＥＣ２細胞についてそれぞれ１００万あたり９４〜１６，６１〜７４，そして３〜３７であった。かくしてhsＲＥＣ２の発現は、ＵＶＣ誘発型突然変異に対するＣＨＯ細胞の感受性の著しい低下ならびに自然突然変異頻度の低下をひきおこした。６．４培養され、ＥＢ形質転換されたヒトリンパ芽球の中でのβ−グロビン修復の増強鎌状赤血球病β−グロビンの中に見られる突然変異を修復するように設計されたキメラベクターであるＳＣ１は、５つのＤＮＡ残基の介在ブロックにフランキングする各々１０個の２’−Ｏ−メチルＲＮＡ残基のブロックを２個含んでいた。図５Ｂ参照。この分子が２重鎖立体配座へと折りたたまれた時点で、１本のストランドはＤＮＡ残基のみを含み、一方もう１本のストランドはＲＮＡ／ＤＮＡブロックを含んでいた。この場合、内部配列は、ボールドで表わされ星印で指定された単一塩基（Ｔ）を除いて、β^S突然変異の部位にまたがる２５の残基の広がり全体にわたりβ^Sグロビン配列に相補的である。ＲＮＡ残基がフランキングした５つのＤＮＡ残基は、β^Sコーディング配列内の突然変異体Ｔ残基を中心としている。図３には、β^S突然変異の特異的部位がボールド体で表わされた状態で、β^A，β^S 及び密に関係するδ−グロビン遺伝子のゲノミック配列も表示されている。リンパ芽球様細胞は次のように調整された鎌状赤血球病を患う患者の廃棄された臨床材料から、ヘパリン処置された血液を得た。フィコール中での密度勾配遠心分離により血液（＝８ｍｌ）から単核細胞を調製し、マルモセット細胞系統Ｂ９５・８（Corneill Institute for Medical Research ＃ＧＭ０７４０４Ｄ）内ですでに増殖させられたエプスタイン・バー（ＥＢ）ウイルスで感染させた。感染は、Ｔ２５フラスコ中で２０％のウシ胎児血清が補足された１０ｍｌのＲＰＭＩ培地の中で０．１ｍｇのロイコアグルチシンＰＨＡ−Ｌを付加して実施した。培養は５日目から始めて１週間に２回補給され、２１日目に、６０〜７０％の細胞が生存可能な状態にとどまった時点で、確立したものとみなされた。β^A及びβ^Sのリンパ芽球様細胞を、１０％のウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ培地内で維持した。ＥＢＶで形質転換されたリンパ芽球様細胞を、ｐｃＤＮＡ３ベクター又はhsＲＥＣ２ｃＤＮＡを挿入したベクター（ｐｃＨｓＲＥＣ２）のいずれかを用いて、過渡的にトランスフェクションに付した。以下で詳述する通り、１５μｌのＤＯＴＡＰ及び２．５μｇのＤＮＡの混合物を用いてトランスフェクションを行なった。トランスフェクションの後、細胞を２４時間インキュベートし、その後、可変的量のＳＣ１で処置した。以下の要領で、β^S対立遺伝子についてホモ接合の上述のリンパ芽球様細胞の中にＳＣ１を導入した。実験の前日に、２４ウェルの組織培養皿の各ウェル内の１ｍｌの培地中に、細胞（１×１０⁵／ｍｌ）を播種した。１５分間室温でインキュベートし、培養細胞に添加した、２０ｍｌの２０ｍＭのＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．３中の３μｌのＤＯＴＡＰ（Ｎ−〔１−（２．３−ジオレオイロキシ）プロピル〕−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルスルフェート，Boehringer− Mannheim）と、０〜２５０ｎｇの量のキメラオリゴヌクレオチドを混合することによってトランスフェクションを実施した。６時間後に遠心分離により細胞を収獲し、洗浄し、E.S.Kawasaki，PCR Protocols，Eds．M.A.Innis,D.H．Gelfand， J.J.Sninsky及びT.J.White，PP１４６−１５２，Academic Press,（１９９０）の手順に従ってＰＣＲ増幅のため準備した。 β^S突然変異の結果得られた周知の制限フラグメント長多形現象を利用して、単一塩基突然変異の補正を評定した（RF Greeves et al．１９８１，Proc．Natl .Acad．Sci，７８：５０８１；J.C．Chang and Y.W.Kan，１９８２，N.Eng．J.M ed．３０７：３０；S.H.Orkin et al.，ibid.，ｐ３２；J.T．Wilson et al.，１９８２，Proc．Natl．Acad.Sci．７９：３６２８）。β^S対立遺伝子内でのＡからＴへの塩基転換の結果、Bsu３６１制限部位（ＣＣＴＧＡＧＧ）が喪失した。かくして、β^S対立遺伝子を、Bsu３６１で切断されたゲノミックＤＮＡのサザンハイブリデーション分析により検出することができる。通常存在するβ−グロビン遺伝子の１．２ＫｂのBsu３６１ＤＮＡフラグメントは、β^S対立遺伝子の中には存在せず、診断用の１．４ｋｂフラグメントで置換されている。ホモ接合β^Sリンパ芽球様細胞から回収されたゲノミックＤＮＡをこの手順で分析した場合、予想通りの１．４Ｋｂのフラグメントが得られた。しかしながら、ＳＣ１ＣＲＶでのトランスフェクションを受けた細胞からのＤＮＡの中には２つのフラグメントが観察された。１．４Ｋｂのフラグメントに加えて、１．２Ｋｂのフラグメントが存在することは、β^S対立遺伝子の部分的補正が用量依存的に起こったことを表わしている。実験結果は、図５Ａに示されている。１００ｎｇ及び２５０ｎｇのＳＣ１で、６５％〜８５％のβ^S対立遺伝子が、ｐｃＨｓＲＥＣ２でのトランスフェクションを受けた細胞中でβ^A対立遺伝子へと突然変異し、これに対し、予めトランスフェクションを受けていない細胞中では１０％〜２５％、対照のトランスフェクションを受けた細胞中では無視できるほどのレベルの突然変異しかみられなかった。２５ｎｇ〜５０ｎｇの間のＳＣ１レベルでは、対照細胞個体群のいずれにおいてもいかなる突然変異も検出されず、一方、ｐｃＨｓＲＥＣ２で予備トランスフェクションを受けた細胞の中では、β^S対立遺伝子の３０％〜４０％がβ^A対立遺伝子へと突然変異した。これらの結果は、hsＲＥＣ２の過剰発現が、ＳＣ１といったキメラ突然変異ベクターによる突然変異に対する細胞の感受性の著しい増加をひき起こすことを示している。６．５ｍＲＥＣ２ｇＤＮＡクローンの同定と分離ヒト及びマウスの１２９ＳＶＩ株のＤＮＡのゲノミックブロットを、Xbal及びＢａｍＨＩ消化物を用いて行なった。Zeta−Probe^TM膜（Bio−Rad）へ移した後、０．２５ＭのＮａＨＰＯ₄，ｐＨ７．２，７％ＳＤＳ，１ｍＭＥＤＴＡ中で５５℃で３０分、膜を予備ハイブリダイゼーションに付し、無作為プライミングを受けた全長ＨｓＲＥＣ２プローブを用いて一晩ハイブリダイゼーションに付した。洗浄は、０．０４ＭのＮａＨＰＯ₄，ｐＨ７．２，５％ＳＤＳ，１ｍＭＥＤＴＡ中，４２℃で２０分を２回、各々０．０４ＭＮａＨＰＯ₄，ｐＨ７．２，１％ＳＤＳ，１ｍＭＥＤＴＡ中で２０分４２℃及び５０℃を１回、であった。結果は、以下のサイズのバンドであった：ヒトXbal ６．０，４．１，２．６，２．０及び１．５Ｋｂ；ヒト−BamＨＩ９．５，８．５，６．５，４．６，１．５Ｋｂ；マウス−Xbal ９．０，６．０，４．１，３．５，１．９，０．８Ｋｂ；及びマウス−BamＨＩ８．０，２．７，及び１．８。ｃＤＮＡ又はＤＮＡライブラリからｍＲＥＣ２を含むクローンを同定し増殖させるためには、λ−ファージライブラリを用いる標準的なクローニング技術が利用された。ＥＭＢＬ−３中のヒトゲノムライブラリ及びＸＦ１ＸII中のマウスゲノミックライブラリをスクリーニングした。標準的な技術によりファージプラークをハイブリダイゼーションフィルタまで移送し、放射線標識づけされたhsＲＥＣ２ｃＤＮＡでフィルタをプローブ探査した。ハイブリダイゼーションの後、フィルタを洗浄した。２ｘＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ中２０分、４２℃での２回とそれに続く同じ溶液中２０分５０℃での３回から成る洗浄を用いて、マウスのｇＤＮＡクローンを分離した。ヒトｇＤＮＡクローンを分離するための洗浄手順は以下のとおりであった：４０ｍＭのＮａＨＰＯ₄，ｐＨ７．２，１ｍＭのＥＤＴＡ及び５％のＳＤＳ中４２℃，２０分で２回，とそれに続いて，１％のＳＤＳを除き同じ溶液中での５０℃で２０分１回。以下のλファージクローン中で、ｍｕＲＥＣ２及びhsＲＥＣ２ｇＤＮＡの５’ 及び３’フラグメントを回収した：λ５Ｄ２ａ（１４Ｋｂのインサート，５’ｍｕＲＥＣ２）；λ７Ｂ１ａ（１４．９Ｋｂのインサート，３’ｍｕＲＥＣ２）；Ａ５Ａ（１２Ｋｂのインサート，５’ hsＲＥＣ２）；λＩＣ（１６Ｋｂのインサート，３’hsＲＥＣ２），なお、これらは各々ＡＴＣＣ，Bethesda，MDに預託されている。ゲノミッククローンのフラグメントは、腫瘍細胞内のhsＲＥＣ２の再配列、欠失又はその他の異常を同定するためにゲノミックブロックのプローブとして使用できる。当業者であれば、さらに、普通の配列分析及び配列番号２の配列との比較により、hsＲＥＣ２のエキソン及びイントロンの境界を同定できることがわかるだろう。イントロン／エキソンの境界における配列を知ることにより、第６．６節の方法の代替案として各エキソンの増幅及び分析に適したＰＣＲの構築が可能となる。６．６乳房の腺癌におけるｈｓＲＥＣ２異常の発生数上昇乳房の原発性腺管癌３０例の標本を、ｈｓＲＥＣ２ｃＤＮＡでプローブしたサザーンブロットにより、そしてｈｓＲＥＣ２遺伝子と相接して連結されたマイクロサテライトマーカーＤ１４Ｓ２５８のＰＣＲ生成物の高分解能ゲルにより分析した。３０例の標本のうちの１０例が２つの検定の一方で異常結果を示し、３例が両方の検定で異常を示した。対比した場合、原発性腎細胞癌の標本１６例はどれも、サザーンブロットで明らかな異常を示さなかった。６．６．１：ｈｓＲＥＣ２と連結したマイクロサテライトＤＮＡのヘテロ接合性の消失ｈｓＲＥＣ２の位置は、マイクロサテライトマーカーＤ１４Ｓ２５８の近位側に密接に連結されることが判明した。マイクロサテライト配列の長さに広範囲の多型性が認められるため、ほとんどの個体がＤ１４Ｓ２５８遺伝子座でヘテロ接合性であった。多型性遺伝子座と側面を接する独特の配列に特異的なプライマーを用いて、その長さが対立遺伝子特異的であるＰＣＲ断片を生成し得る。Ｄ１４Ｓ２５８に特異的なプライマーは、Dr．Lincoln Stein，Whitehead Institute，MIT，Cambrid ge MAから入手した。「５‘」プライマーは5'-TCACTGCATCTGGAAGCAC-3’（配列番号：１２）であり、「３’」プライマーは5'-CTAACTAAATGGCGAGCATTGAG-3’（配列番号：１３）である。２．０ｎｇ／μｌのゲノムＤＮＡ濃縮物、１０．０μ Ｍのプライマー濃縮物、１０．０μＭのｄＮＴＰ、５００μＭのＴｒｉｓＨＣｌ，ｐＨ９．２、１７．５μＭのＭｇＣｌ₂、１６０μＭの（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄及び０．０３Ｕ／μｌのポリメラーゼ濃縮物を用いて、ＰＣＲを実施した。増幅は各々５０秒のサイクルを３５サイクル、５７℃と９４℃の間で交互におこなった後、７２℃で７分間延長し、９４℃で５分間の初期加熱浸潰を先行させた。予測生成物は、約１６０〜１７０ヌクレオチドの長さであった。フランキングプライマーを用いた腫瘍のＰＣＲ増幅の生成物と正常組織対照ＤＮＡの比較により、Ｄ１４Ｓ２５８遺伝子座のいずれか又は両方の消失が明示されたが、これは連結ｈｓＲＥＣ２も失われていたことを示唆する。乳癌標本３０例のうち７例の分析結果は、遺伝子座Ｄ１４Ｓ２５８の対立遺伝子の１つの完全又は部分的消失を示した。これらの結果は、ｈｓＲＥＣ２の位置と密接に連結した遺伝子座の不安定性及び消失が、乳房のヒト腺管癌の大分画に見出されたことを示す。６．６．２：ｈｓＲＥＣ２の頻発性再配列原発性腎臓癌１６例及び原発性乳癌３０例の腫瘍組織標本からのゲノムＤＮＡを、ＸｂａＩ又はＢａｍＨＩ制限酵素で消化し、０．８％アガロースゲルで電気泳動処理し、ｈｓＲＥＣ２ｃＤＮＡから作成した標識ランダムプライマー処理コピーとのハイブリダイゼーションのためにプロセッシングした。転移後、Zetaprobeブロッティング膜をＵＶ架橋し、０．２５ＭＮａＨＰＯ₄，ｐＨ７．４、７％ＳＤＳ、１ｍＭＥＤＴＡ中で６５℃で２０分間予備ハイブリダイズした後、同一条件下で一夜ハイブリダイズした。膜を、４０ｍＭＮａＨＰＯ₄，ｐＨ７．２、５％ＳＤＳ、１ｍＭＥＤＴＡを用いて４２℃で２０分間、１回予備洗浄した後、同一溶液中で６０℃で繰り返し洗浄したが、但し、１％ＳＤＳに関しては、膜周辺部がバックグラウンドレベルに達するまで用いた。次に、フィルターをフィルムに露出させた。乳癌の３０例のうち６例は再配列又は異常を示したが、一方腎細胞癌の１６例はどれも明らかな再配列を示さなかった。６．７：ＭｕＲＥＣ２含有ＥＳ細胞株の構築ｍｕＲＥＣ２ｇＤＮＡクローンλ５Ｄ２ａは、最初の２つのエキソンを含有する。第二エキソンは、断片５‘の境界から約１．２Ｋｂの３．６ＫｂＥｃｏＲ１断片上に位置する。第二エキソンは、ＩＲＥＳ−βｇｅｏポリＡカセットを挿入された独自のＳｔｕＩ部位を含有する（Mountford，P.,et al.,1994，Proc ．Natl．Acad．Sci．91，4303-4307）。ＥＳ細胞を、標準プロトコールにしたがって、原発性マウス胚繊維芽細胞上で培養した（Hogan，B.，et al.,1996，MANI PULATING THE MOUSE EMBRYO，Cold Spring Harbor Press）。約２ｘ１０⁷個のＥＳ細胞を、２５μｇの線状化ＤＮＡを用いて電気穿孔によりトランスフェクトした。２５０μｇ／ｍｌのＧ４１８を用いて３６時間目に選択を開始し、８日目まで継続した。３０のコロニーを単離し、ＸｂａＩ消化及びサザーンブロットにより試験した結果、１つのコロニーが野生型サイズのＸｂａ１断片を欠き、予測サイズの新規の断片を有することが判明した。従来の技法（同上）により、このＥＳ細胞株からトランスジェニックマウスを構築した。６．８ＨｓＲＥＣ２プロモーターは放射線誘発性であるｈｓＲＥＣ２開始コドンに対する５‘に隣接した１．８Ｋｂ断片をクローニングした。ルシフェラーゼレポーター遺伝子構築物ｐＧＬ２（Promegaカタログ番号Ｅ１６１１）を用いて、プロモーターとして断片を試験し、ルシフェラーゼレポート試験キット（Boehringer Mannheimカタログ番号１６６９８９３）を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。プロモーターの活性を、ＨｅＬａ細胞で、以下のように検定した：ＨｅＬａ細胞を−１日目にトリプシン処理し、３ｍｌのＤＭＥＭ中の６．６ｘ１０⁵個／６０ｍｍウエルでプレート化した。２日目、１時間前に培地を血清無含有培地に置き換えて、１：４のＤＮＡ：ＤＯＳＰＥＲ比でＤＯＳＰＥＲを含有する種々の量のプラスミドで細胞をトランスフェクトした。５時間目に、ＦＢＳを補充した培地をさらに３．０ｍｌ付加した。２４時間目に、細胞をＵＶ線で照射した（Stra talinker）。４８時間目に細胞を収穫し、タンパク質を抽出して、検定した。ｈｓＲＥＣ２プロモーターの代わりにＳＶ４０極初期プロモーターを有する同一プラスミドを用いて、対照実験を実施した。付加ＤＮＡ（μｇ） 1.対応するルシフェラーゼは、０ジュール／ｍ²での５１３．９ｐＳＶ４０− ｌｕｃ−ＳＶ４０エンハンサーである。 2.対応するルシフェラーゼは、０ジュール／ｍ²での３８４ｐＳＶ４０−ｌｕｃ−ＳＶ４０エンハンサーである。配列番号：５のヌクレオチド８６９で開始して３‘ ０．８ＫｂのｈｓＲＥＣ２プロモーターを試験した場合、この０．８Ｋｂ断片は活性の低下を示すプロモーターを含有するが、しかしこれは、細胞株が正常ｐ５３遺伝子を含有するＨＣＴ１１６で３５ｊ／ｍ²のＵＶ線を用いて約５倍の誘発性も示すことが確定された。ＨＣＴにおけるＲＥＣ２誘発性プロモーターの好ましい形態は、ヌクレオチド８６９で開始する短縮形態である。６．９ＲＥＣ２の発現は放射線感受性の増大を引き起こすＵＶ照射は野生型ＨｓＲｅｃ２を発現する安定トランスフェクト体にアポトーシスを誘発するが、しかし切頭型又はチロシン１６３部位変形を有する全長では誘発しない。ＵＶ誘導放射率に及ぼすＲＥＣ２発現の影響を測定するために、ＣＨＯ細胞を照射した。照射後の２４時間長期回復期間中、無関係な又は非機能性タンパク質を発現した対照細胞より多くの野生型ＨｓＲｅｃ２発現ＣＨＯ細胞が死亡することが観察された。細胞死がアポトーシスの結果であるか否かを確定するために、非同時性細胞を１５ｊ／ｍ²の用量で照射し、照射後２４、４８及び７２時間目にエタノール中で固定した。ＦＡＣＳ分析を、以下のように実施した：細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで１回洗浄して、７０％エタノール中で、４ ℃で少なくとも３０分間固定した。細胞ペレットをＤＮアーゼ無含有ＲＮアーゼで７０℃で３０分間処理して、最終濃度を０．１６ｍｇ／ｍｌとし、ヨウ化プロピジウム（０．０５ｍｇ／ｍｌ）で１５分間染色し、次に一夜保存した後、ＦＡＣＳにより分析した。ＦＡＣＳ分析及びＧ１、Ｓ及びＧ２期の細胞のパーセンテージの確定（多周期流動計画）を、トーマスジェファーソン大学のキンメル癌研究所の細胞周期センタ−Cell Cycle C enter at the Kimmel Cancer Institute of Thomas Jefferson Universityで実行した。二重培養からの細胞を同時点で収穫し、ＤＮＡ単離用に−８０℃で凍結した。ＱＩＡＧＥＮ血液キット（QIAGEN Inc.，Chatsworth，CA）を用いてＤＮＡを単離し、ゲル上で操作するまで４℃で保存した。ＴＡＥ緩衝液中の１％アガロースゲル上でＤＮＡを動かして、ＳＹＢＲグリーンＩ（FMC，Rockland，ME）の１：１０，０００希釈液で３０分間染色した。次に、Fluorimager（Molecular Diagnostics，San Diego，CA）を用いて、ゲルを走査した。分析には４種類の細胞を用いた：空ベクター（Ｎｅｏ‘）を含有するＣＨＯ細胞、ＨｓＲｅｃ２△１０３−３５０（３Ｄ２）、ＨｓＲｅｃ２^ala63（ＰＨ４）及び野生型ＨｓＲｅｃ２（１５Ｃ８）を発現するＣＨＯ細胞。野生型ＨｓＲｅｃ２を発現するＣＨＯ細胞のみに関して、照射後２４、４８及び７２時間目に、亜Ｇ１集団が検出された。アポトーシスが起きていたことを確証するために、細胞空ＤＮＡを単離し、１％アガロースゲル上で動かして、ＳＹＢＲグリーンＩで染色して、走査した。比較した各時間に関しては、１５Ｃ８は他のクローンより多くの顕著な梯子形状を示した。ＨｓＲｅｃ２^ala63を発現するクローンに関して少量のアポトーシスが存在すると思われるが、野生型ＨｓＲｅｃ２クローンよりかなり低く、Ｎｅｏ’又は切頭型タンパク質を発現するトランスフェクト体はいずれも比較に適さない。したがって、Ｇ１は遅延し、アポトーシスは野生型ＨｓＲｅｃ２を必要とし、このことはＣＨＯ細胞中に存在する突然変異体ｐ５３とＲｅｃ２との間の共働が、おそらくはこれらの細胞におけるゲノム監視に関与することを示唆する。ＨｓＲｅｃ２発現クローン及びＮｅｏ‘発現クローンのＦＡＣＳ分析の結果を、図８Ａ〜８Ｈに示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者ホロマン，ウィリアムケー. アメリカ合衆国，ニューヨーク 10598, ヨークタウンハイツ，ハンターブルックロード 2025 (72)発明者ライス，マイケルシー. アメリカ合衆国，ペンシルバニア 18940, ニュータウン，サウスステイトストリート 258 (72)発明者スミス，シェリルティー. アメリカ合衆国，ペンシルバニア 19010, ブリンマウアー，オールドレイルロードアベニュ 754 (72)発明者シュ，ツィガンアメリカ合衆国，ペンシルバニア 19020, ベンサレム，ハミングバードレーン 629 (72)発明者クミエク，エリックビー. アメリカ合衆国，ペンシルバニア 19067, ヤードリー，リーパーコート 1570

Claims

【特許請求の範囲】１．単離され且つ精製された核酸であって、ａ．哺乳類ATP−依存性同種性（homologsus）ペアリングタンパク質又は配列番号：１のタンパク質と実質的に同一の蛋白質の配列を含んで成るタンパク質をコードし；ｂ．42℃にて20分間２×SSC，0.1％SDS中で２回洗浄され、次に50℃にて20分間で２回洗浄されるサザンブロットにおいて、ランダム−プライムされたhsREC ２により標識され；そしてｃ．少なくとも132ヌクレオチドの連続するコード配列であって、100ヌクレオチドより多くが配列番号：２の連続する132ヌクレオチド配列と同一である配列を含有する；ことを特徴とする核酸。２．哺乳類の種から得られるcDNAを含んで成る、請求項１に記載の核酸。３．哺乳類の種から得られるゲノムDNAを含んで成る、請求項１に記載の核酸。４．それぞれATCC No．97683及びATCC No．97682として寄託されているクローンλ５Ａ及びλ１Ｃの挿入部を含んで成る、請求項３に記載の核酸。５．配列番号：１の残基２〜350の配列を含んで成る蛋白質をコードする、請求項３に記載の核酸。６．前記ペアリング蛋白質の配列が配列番号：１の残基４〜347に対して90％より多く同一である、請求項１に記載の核酸。７．それぞれATCC No．97686及びATCC No．97684として寄託されているクローンλ５Ｄ２ａ及びλ７Ｂ１ａの挿入部を含んで成る、請求項６に記載の核酸。８．配列番号：１の残基４〜347に実質的に同一である配列を含んで成るタンパク質をコードする、請求項６に記載の核酸。９．配列番号：２のbp74〜1120の配列を含んで成る配列を有する、請求項５に記載の核酸。 10．プロモーターを更に含んで成る、請求項９に記載の核酸。 11．ATCC No．97685として寄託されているpcHsREC２である、請求項10に記載の核酸。 12．配列番号：２もしくは配列番号：４又はその相補体の少なくとも20個のヌクレオチドの断片及び標識を含んで成る配列を有する核酸。 13．ａ．配列番号：２の少なくとも12個のヌクレオチドの５’−配列を含んで成る配列を有する５’−核酸断片；及びｂ．配列番号：２の相補体の少なくとも12個のヌクレオチドの３’−配列を含んで成る配列を有する３’−核酸断片を含んで成り、ここで、前記３’−配列は３’から５’への配列である配列番号：２の部分に対して相補的である、ことを特徴とするキット。 14．ATPアーゼを含んで成る組成物であって、該組成物は他の通常細胞内に存在する哺乳類タンパク質を実質上含有せず、前記ATPアーゼの配列は、哺乳類ATP −依存性同種性ペアリングタンパク質の少なくとも120アミノ酸の長さの連続する配列と実質的に同一である配列を含んで成り、そして該ATPアーゼは、ATP−依存性同種性ペアリングタンパク質であることを特徴とする組成物。 15．前記ATPアーゼがmREC２である、請求項14に記載の組成物。 16．配列番号：１の少なくとも115アミノ酸又はそれと実質的に同一のアミノ酸を含んで成る配列を有するATPアーゼを含んで成る請求項14に記載の組成物。 17．ATPアーゼを含んで成る組成物であり、該組成物は他の通常細胞内に存在する哺乳類タンパク質を実質的に含有せず、ここでATPアーゼの配列は、配列番号：１の残基80〜200の配列と実質的に同一である配列を含んで成り、そして前記ATPアーゼは、ATP−依存性同種性ペアリングタンパク質である、ことを特徴とする、組成物。 18．前記ATPアーゼがmREC２である、請求項17に記載の組成物。 19．前記ATPアーゼが、hsREC２と実質的に同一である、請求項18に記載の組成物。 20．前記ATPアーゼの配列が配列番号：１のアミノ酸２〜350を含んで成る、請求項19に記載の組成物。 21．ヒト組織のサンプルを分類する方法であって、ａ．サンプル組織の２倍体ゲノム当りのhsREC２のコピーを定量し；そしてｂ．前記サンプル組織の二倍体ゲノム当りのhsREC２の量を、標準組織の二倍体ゲノム当りのhsREC２の量と比較する；ことを含んで成る方法。 22．マーカーD14S258でのミクロサテライトの長さを測定しそして前記サンプル組織中に存在するサイズと、前記標準組織中に存在するサイズとを比較することにより、前記の比較を行い、ここで該標準組織と該サンプル組織とは同一の対象からのものである、請求項21に記載の方法。 23．サンプル組織のhsREC２遺伝子と標準組織のhsREC２遺伝子とを比較することを含んで成る、ヒト組織のサンプルの分類方法。 24．サンプル組織のhsREC２ゲノムと標準組織のhsREC２ゲノムとの間の１本鎖コンホーメーション多形性の存否を決定することにより前記の比較を行う、請求項23に記載の方法。 25．サンプル組織のhsREC２の断片の配列を得、そして得られた配列と、配列番号：２の配列又はその相補配列とを比較することにより前記の比較を行う、請求項23に記載の方法。 26．muREC２タンパク質をコードする２倍体ゲノム当りmuREC２の最高１個のコピー数を有するトランスジェニックマウス。 27．muREC２タンパク質をコードする遺伝子を有しない、請求項26に記載のトランスジェニックマウス。 28．異種性プロモーターに作用可能に連結されたmREC２遺伝子を含んで成り、該mREC２遺伝子が発現される、トランスジェニック動物。 29．前記プロモーターが組織特異的プロモーター又は誘導性プロモーターである、請求項28に記載のトランスジェニック動物。 30．異種性プロモーターに作用可能に連結されたmREC２遺伝子を含んで成り、該mREC２遺伝子が発現される胚幹細胞系。 31．前記プロモーターが組織特異的プロモーター又は誘導性プロモーターである、請求項30に記載の胚幹細胞系。 32．配列番号：１の配列を有するタンパク質に組合し、他のヒトタンパク質に結合しない抗体又はその断片。 33．哺乳類細胞中で特異的遺伝子変化を行う方法において、ａ．該細胞中のmREC２のレベルを増加せしめ；そしてｂ．前記細胞に、該細胞のゲノムと相同性の領域を導入し；ここで前記核酸と前記細胞のゲノムとは相同性組換えを行い、該ゲノム中に変異を生じさせる、ことを特徴とする方法。 34．段階（ａ）が、mREC２をコードする外来核酸を前記細胞に輸送することを含んで成る、請求項33に記載の方法。 35．段階（ａ）が、外来性mREC２タンパク質を前記細胞に輸送することを含んで成る、請求項33に記載の方法。 36．変異を含有する核酸がCMutVである、請求項33に記載の方法。 37．単離されそして精製された哺乳類REC２プロモーターを含んで成る組成物。 38．前記REC２プロモーターが、放射誘導性プロモーターである、請求項37に記載の組成物。 39．前記REC２プロモーターが、エンハンサーに作用可能に連結されている、請求項37に記載の組成物。 40．前記REC２プロモーターが、哺乳類R２タンパク質以外のタンパク質をコードする遺伝子に作用可能に連結されている、請求項37に記載の組成物。 41．前記REC２プロモーターが、ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子をコードする遺伝子に作用可能に連結されている、請求項37に記載の組成物。 42．前記REC２プロモーターを含む細菌クローニングプラスミドをさらに含んで成る、請求項37に記載の組成物。 43．強力なエンハンサーに作用可能に連結された哺乳類放射誘導性プロモーターを含んで成る組成物。 44．哺乳類細胞をさらに含んで成る、請求項43に記載の組成物。 45．前記REC２プロモーターがhsREC２プロモーターである、請求項43に記載の組成物。 46．前記エンハンサーが、SV40エンハンサー、ヘルペスＢウイルスエンハンサー、サイトメガロウイルス、エンハンサー及びα−フェトプロテインエンハンサーから成る群から選択される、請求項43に記載の組成物。 47．哺乳類細胞である、請求項43に記載の組成物。