CN111565566A - 包含slc30a8突变的非人动物及使用方法 - Google Patents

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Abstract

提供了包含突变的Slc30a8基因座的非人动物基因组、非人动物细胞，和非人动物，以及提供了制备和使用这种非人动物基因组、非人动物细胞和，非人动物的方法。非人动物可具有增加的胰岛素分泌能力。

Description

包含SLC30A8突变的非人动物及使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2017年11月10日提交的美国申请号62/584,288、于2018年5月3日提交的美国申请号62/666,337，以及于2018年6月26日提交的美国申请号62/689,945的权益，出于所有目的将其每一个均通过引用整体并入本文。
对通过EFS Web提交为文本文件的序列表的引用
写在文件523060SEQLIST.txt中的序列表为39.2KB，创建于2018年11月5日，通过引用并入。
背景技术
糖尿病是以胰岛素反应性组织和产生胰岛素的胰岛β细胞的代谢缺陷为特征，导致无法维持体内适当的血糖水平的疾病。人类的糖尿病可被定义为与大于125mg/dL的空腹血糖浓度或在摄入75g口服葡萄糖负荷两小时后的大于199mg/dL的血浆葡萄糖浓度相对应的疾病。糖尿病的两种主要形式是I型糖尿病(T1D)和II型糖尿病(T2D)。T1D是一种自身免疫性疾病，其导致β胰腺细胞破坏和胰岛素(调节葡萄糖利用的激素)的绝对缺乏。与此相对，由于组织无法对胰岛素做出适当反应，在胰岛素水平正常甚至升高都会发生T2D。大多数T2D患者的胰岛素敏感性受损。胰岛素分泌不能补偿外周组织对胰岛素反应的抵抗力。许多T2D患者是肥胖的。1.5型糖尿病(成人晚期自身免疫性发作)显示出T1D和T2D的某些特征。
胰岛素生物合成和加工需要锌。两个锌离子络合于胰岛素原(proinsulin)的六聚体形式，最终被加工成胰岛素。
SLC30A8编码主要在胰腺胰岛中表达的锌转运体，在胰腺胰岛中，锌转运体将锌转运到含胰岛素的分泌颗粒(granules)中。SLC30A8中的杂合功能失去(LOF)突变可预防人类的2型糖尿病。已鉴定了几种Slc30a8敲除小鼠品系，但它们并未完全概括保护性人类表型。毋宁说，Slc30a8缺陷型小鼠血浆胰岛素水平降低，葡萄糖耐量减低。
发明内容
提供了包含突变的Slc30a8基因座的非人动物，以及制备和使用这种非人动物的方法。还提供了包含突变的Slc30a8基因座的非人动物基因组或细胞。
一方面，提供了包含突变的Slc30a8基因座的非人动物基因组、非人动物细胞，或非人动物。此类非人动物基因组、非人动物细胞，或非人动物可包含突变的Slc30a8基因，其中该突变的Slc30a8基因编码截短的SLC30A8蛋白，并导致该非人动物相对于没有该突变的非人动物具有增强的胰岛素分泌能力。
在一方面，提供了非人动物，其基因组包括内源Slc30a8基因座，其包含突变的Slc30a8基因，其中所述突变的Slc30a8基因编码截短的SLC30A8蛋白，并导致该非人动物相对于没有该突变的非人动物具有增强的胰岛素分泌能力。
在一些这样的非人动物中，该非人动物响应高血糖症表现出增强的胰岛素分泌能力。可选地，相对于没有该突变的非人动物，非人动物响应于由胰岛素受体抑制引起的高血糖症而具有增加的胰岛素分泌。可选地，响应于由胰岛素受体抑制引起的高血糖的胰岛素分泌增加与相对于没有该突变的非人动物的增加的β细胞增殖或增加的β细胞质量(beta-cell mass)无关。
在一些此类非人动物中，当以高脂饮食饲喂该非人动物时，观察到胰岛素分泌能力增强。可选地，当饲喂高脂饮食时，非人动物相对于没有该突变的非人动物具有增加的胰岛素分泌，其中，增加的胰岛素分泌与相对于没有该突变的非人动物的增加的β细胞增殖或增加的β细胞质量有关。可选地，增加的β细胞增殖是胰岛素受体依赖性的(例如依赖于β细胞中的胰岛素受体)。
在一些这样的非人动物、非人动物细胞，或非人动物基因组中，突变的Slc30a8基因具有提前终止密码子。在一些这样的非人动物、非人动物细胞，或非人动物基因组中，突变的Slc30a8基因在Slc30a8基因的第三外显子中包含突变。可选地，该突变位于Slc30a8基因的第三外显子的3'末端。
在一些这样的非人动物、非人动物细胞，或非人动物基因组中，突变的Slc30a8基因包含无义突变。可选地，当由突变的Slc30a8基因编码的SLC30A8蛋白与SEQ ID NO：14最佳比对时，无义突变位于与SEQ ID NO：14中编码R138的密码子相对应的密码子中。可选地，当突变的Slc30a8基因的编码序列与SEQ ID NO：21最佳比对时，无义突变位于对应于SEQID NO：21中的残基412的位置。
在一些这样的非人动物、非人动物细胞，或非人动物基因组中，突变的Slc30a8基因内源于该非人动物。在一些这样的非人动物、非人动物细胞，或非人动物基因组中，非人动物是非人哺乳动物。在一些这样的非人动物、非人动物细胞，或非人动物基因组中，该非人动物是大鼠或小鼠。可选地，该非人动物是小鼠。可选地，所述突变的Slc30a8基因编码包含SEQ ID NO：13所示序列的SLC30A8蛋白。可选地，所述突变的Slc30a8基因包含SEQ IDNO：22所示的编码序列或与其编码相同的氨基酸序列的其简并(degenerates)。
相对于没有该突变的非人动物，一些这样的非人动物响应于由胰岛素受体抑制引起的高血糖症而具有增加的胰岛素分泌。在一些这样的非人动物中，增加的胰岛素分泌与相对于没有该突变的非人动物的增加的β细胞增殖或增加的β细胞质量无关。相对于没有该突变的非人动物，某些此类非人动物具有降低的线粒体基因表达。相对于没有该突变的非人动物，某些此类非人动物具有增加的Hvcn1表达。在一些这样的非人动物中，相对于没有该突变的非人动物，该非人动物在遵循对照的普通饮食(chow diet)时具有正常的葡萄糖稳态和葡萄糖诱导的胰岛素分泌。在一些这样的非人动物中，相对于没有该突变的非人动物，该非人动物在遵循对照的普通饮食时具有正常的代谢表型。
相对于没有该突变的非人动物，一些这样的非人动物具有以下一个或多个特征：(a)当饲喂所述高脂饮食时的增加的葡萄糖诱导的胰岛素分泌；(b)当饲喂所述高脂饮食时的增加的胰腺β细胞增殖；(c)当饲喂所述高脂饮食时的增加的胰腺β细胞数量；以及(d)阻断所述胰岛素受体后的升高的进食血浆胰岛素(fed plasma insulin)水平。可选地，相对于没有该突变的非人动物，非人动物具有以下所有特征：(a)当饲喂所述高脂饮食时的增加的葡萄糖诱导的胰岛素分泌；(b)当饲喂所述高脂饮食时的增加的胰腺β细胞增殖；(c)当饲喂所述高脂饮食时的增加的胰腺β细胞数量；以及(d)阻断所述胰岛素受体后的升高的进食血浆胰岛素水平。
相对于没有该突变的非人动物，一些这样的非人动物具有以下一个或多个特征：(a)饲喂高脂饮食20周后的增加的循环胰岛素水平；(b)饲喂高脂饮食20周后的增加的胰腺β细胞数量；(c)饲喂高脂饮食时的降低的胰岛素原与胰岛素之比；以及(d)阻断所述胰岛素受体后的升高的进食血浆胰岛素水平。可选地，相对于没有该突变的非人动物，非人动物具有以下所有特征：(a)饲喂所述高脂饮食20周后的增加的循环胰岛素水平；(b)饲喂高脂饮食20周后的增加的胰腺β细胞数量；(c)饲喂高脂饮食时的降低的胰岛素原与胰岛素之比；以及(d)阻断所述胰岛素受体后的升高的进食血浆胰岛素水平。
在一些这样的非人动物中，非人动物的胰岛中的Slc30a8 mRNA表达水平是没有该突变的非人动物的胰岛中的Slc30a8 mRNA表达水平的至少25％。
一些这样的非人动物、非人动物细胞，或非人动物基因组对于突变是杂合的。一些这样的非人动物、非人动物细胞，或非人动物基因组对于突变是纯合的。一些这样的非人动物、非人动物细胞，或非人动物基因组是雄性的。一些这样的非人动物、非人动物细胞，或非人动物基因组是雌性的。
在另一方面，提供了用于制备任何上述非人动物的方法。一些这样的方法包括：(a)使不是单细胞期胚胎的非人动物多能细胞的基因组接触：(i)外源修复模板，其包含侧面为与所述Slc30a8基因座处的5'靶序列杂交的5'同源臂和与Slc30a8基因座处的3'靶序列杂交的3'同源臂的插入核酸，其中所述插入核酸包含所述突变；以及(ii)Cas9蛋白；以及(iii)与Slc30a8基因座内的向导RNA识别序列杂交的向导RNA，其中Slc30a8基因被修饰以包含所述突变；以及(b)将经修饰的非人动物多能细胞导入宿主胚胎；以及(c)将所述宿主胚胎植入代孕母体，以产生经遗传修饰的F0代非人动物，其中所述Slc30a8基因被修饰以包含所述突变，其中所述突变导致当饲喂所述高脂饮食时，所述F0代非人动物相对于没有所述突变的非人动物具有增加的胰岛素分泌能力。一些这样的方法包括：(a)使不是单细胞期胚胎的非人动物多能细胞的基因组接触：(i)外源修复模板，其包含侧面为与所述Slc30a8基因座处的5'靶序列杂交的5'同源臂和与Slc30a8基因座处的3'靶序列杂交的3'同源臂的插入核酸，其中所述插入核酸包含所述突变；以及(ii)Cas9蛋白；以及(iii)与Slc30a8基因座内的向导RNA识别序列杂交的向导RNA，其中Slc30a8基因被修饰以包含所述突变；以及(b)将经修饰的非人动物多能细胞导入宿主胚胎；以及(c)将宿主胚胎植入代孕母体，以产生经遗传修饰的F0代非人动物，其中Slc30a8基因被修饰以包含所述突变，其中所述突变导致当饲喂所述高脂饮食时，所述F0代非人动物相对于没有所述突变的非人动物具有增加的胰岛素分泌能力。可选地，所述多能细胞是胚胎干细胞。可选地，所述外源修复模板是长度至少为10kb的大靶向载体，或其中所述外源修复模板是其中的所述5'同源臂和所述3'同源臂的总长度至少为10kb的大靶向载体。
一些此类方法包括：(a)使非人动物单细胞期胚胎的基因组接触：(i)外源修复模板，其包含侧面为与所述Slc30a8基因座处的5'靶序列杂交的5'同源臂和与Slc30a8基因座处的3'靶序列杂交的3'同源臂的插入核酸，其中所述插入核酸包含所述突变；以及(ii)Cas9蛋白；以及(iii)与Slc30a8基因座内的向导RNA识别序列杂交的向导RNA，其中Slc30a8基因被修饰以包含所述突变；以及(b)将经修饰的非人动物单细胞期胚胎植入代孕母体，以产生经遗传修饰的F0代非人动物，其中Slc30a8基因被修饰以包含突变，其中所述突变导致当饲喂所述高脂饮食时，所述F0代非人动物相对于没有所述突变的非人动物具有增加的胰岛素分泌能力。一些此类方法包括：(a)使非人动物单细胞期胚胎的基因组接触：(i)外源修复模板，其包含侧面为与所述Slc30a8基因座处的5'靶序列杂交的5'同源臂和与Slc30a8基因座处的3'靶序列杂交的3'同源臂的插入核酸，其中所述插入核酸包含所述突变；(ii)Cas9蛋白；以及(iii)与Slc30a8基因座内的向导RNA识别序列杂交的向导RNA，其中Slc30a8基因被修饰以包含所述突变；以及(b)在代孕母体中孕育经修饰的非人动物单细胞期胚胎，以产生经遗传修饰的F0代非人动物，其中Slc30a8基因被修饰为包含突变，其中该突变导致当向F0代非人动物饲喂高脂饮食时，其相对于没有该突变的非人动物具有增加的胰岛素分泌能力。
在某些此类方法中，步骤(a)进一步包括使所述非人动物多能细胞或所述非人单细胞期胚胎的基因组与第二向导RNA接触，所述第二向导RNA与Slc30a8基因座中的第二向导RNA识别序列杂交。
在一些此类方法中，所述外源修复模板为单链寡脱氧核苷酸。可选地，所述外源修复模板的长度在约80个核苷酸至约200个核苷酸之间。
在另一方面，提供了筛选具有改善或加剧II型糖尿病的活性的化合物的方法。一些这样的方法包括：(a)使任何上述对象非人动物与所述化合物接触；以及(b)在所述对象非人动物中测量相对于未与所述化合物接触的对照非人动物的以下一项或多项，其中所述对照非人动物包含与所述对象非人动物相同的Slc30a8突变：(1)饲喂高脂饮食时葡萄糖诱导的胰岛素分泌；(2)饲喂高脂饮食时胰腺β细胞的增殖水平；(3)饲喂高脂饮食时胰腺β细胞的数量；以及(4)在阻断胰岛素受体后的进食血浆胰岛素水平，由此，通过对象非人动物中与对照非人动物相比的以下一种或多种，识别改善II型糖尿病的活性：(1)饲喂高脂饮食时增加的葡萄糖诱导的胰岛素分泌；(2)饲喂高脂饮食时增加的胰腺β细胞增殖；(3)饲喂高脂饮食时胰腺β细胞数量的增加；以及(4)阻断胰岛素受体后升高的进食血浆胰岛素水平，以及由此，通过对象非人动物中与对照非人动物相比的以下一种或多种，识别加剧II型糖尿病的活性：(1)饲喂所述高脂饮食时减少的葡萄糖诱导的胰岛素分泌；(2)饲喂所述高脂饮食时减少的胰腺β细胞增殖；(3)饲喂所述高脂饮食时减少的胰腺β细胞数量；以及(4)阻断所述胰岛素受体后降低的进食血浆胰岛素水平。
一些这样的方法包括：(a)使任何上述对象非人动物与所述化合物接触；以及(b)在所述对象非人动物中测量相对于未与所述化合物接触的对照非人动物的以下一项或多项，其中所述对照非人动物包含与所述对象非人动物相同的Slc30a8突变：(1)响应高血糖症分泌胰岛素的能力；(2)胰岛素清除(clearance)；(3)线粒体基因表达；以及(4)Hvcn1表达，由此，通过对象非人动物中与对照非人动物相比的以下一种或多种，识别出改善II型糖尿病的活性：(1)增加的响应高血糖症分泌胰岛素的能力；(2)增加的胰岛素清除；(3)降低的线粒体基因表达；以及(4)增加的Hvcn1表达，以及由此，通过对象非人动物中与对照非人动物相比的以下一种或多种，识别出加剧II型糖尿病的活性：(1)降低的响应高血糖症分泌胰岛素的能力；(2)降低的胰岛素清除；(3)增加的线粒体基因表达；以及(4)降低的Hvcn1表达。
在另一方面，提供了非人动物细胞，其基因组包含内源Slc30a8基因座，所述内源Slc30a8基因座包含突变的Slc30a8基因，其中所述突变的Slc30a8基因编码截短的SLC30A8蛋白，且其中包含所述突变的Slc30a8基因的非人动物相对于没有该突变的非人动物而言具有增强的胰岛素分泌能力。
在另一方面，提供了包含内源Slc30a8基因座的非人动物基因组，所述内源Slc30a8基因座包含突变的Slc30a8基因，其中所述突变的Slc30a8基因编码截短的SLC30A8蛋白，并且其中包含所述突变的Slc30a8基因的非人动物相对于没有该突变的非人动物而言具有增强的胰岛素分泌能力。
在另一方面，提供了用于在非人动物的内源Slc30a8基因座处产生突变的Slc30a8基因的靶向载体，其中所述靶向载体包括靶向所述内源Slc30a8基因座处的5'靶序列的5'同源臂和靶向所述内源Slc30a8基因座处的3'靶序列的3'同源臂，其中所述靶向载体在Slc30a8基因中包含突变，其中所述突变的Slc30a8基因编码截短的SLC30A8蛋白，且其中包含所述突变的Slc30a8基因的非人动物相对于没有所述突变的非人动物而言具有增强的胰岛素分泌能力。
附图说明
图1A-1D示出了来自遵循普通饮食的雄性R138X小鼠的胰岛的Slc30a8 RNA和蛋白质的分析。图1A示出了从野生型(WT)、纯合敲除(KO)，和纯合R138X小鼠分离的胰岛的Slc30a8 RNA原位杂交。KO胰岛用作阴性对照。红色：胰高血糖素RNA，绿色：胰岛素RNA，白色：Slc30a8 RNA。图1B示出了使用
Figure BDA0002577214450000081
分析对胰岛Slc30a8RNA水平的定量。图1C显示了从饲喂普通饮食的WT、KO，和R138X小鼠中分离的胰岛的蛋白质印迹。KO胰岛用作阴性对照。箭头：SLC30A8蛋白；*表示非特异性带。图1D示出了从WT、KO，和R138X小鼠分离的胰岛的二硫腙染色。
图2A-2P示出了遵循普通饮食的雄性纯合R138X小鼠的代谢表型。图2A-2D和2L示出了进食和空腹的WT和R138X小鼠的体重(图2L)、血糖(图2A)、血浆胰岛素(图2B)、胰岛素原(图2C)，和C肽(图2D)水平。图2E-2F示出了进食和空腹的WT和R138X小鼠的胰岛素原/胰岛素之比(图2E)和C肽/胰岛素之比(图2F)。图2G示出了在WT和R138X小鼠中的口服葡萄糖耐量测试。数据显示为随时间推移的血糖。图2H示出了在空腹过夜(时间0)之后和在腹膜内注射葡萄糖后的所指示的时间在WT或R138X小鼠中的血浆胰岛素水平。数据显示为随时间推移的血糖水平。图2I示出了从WT和R138X小鼠分离的胰腺中胰岛素的组织学。图2J示出了胰腺胰岛素染色的定量。图2K示出了胰岛数目的定量。值代表平均值±SEM(n＝每个基因型6-20只小鼠)。图2M示出了在空腹4小时的WT和R138X小鼠中的胰岛素耐受性测试的结果。数据显示为随时间推移的血糖水平(n＝6/基因型)。图2N示出了胰腺胰岛素染色的进一步定量(胰岛质量；n＝6/基因型)。值表示平均值±SEM。图2O-2P示出遵循普通饮食的进食和空腹的WT和R138X小鼠中的胰岛素原/C肽之比(图2O)和胰岛素/C肽之比(图2P)。N＝每基因型18-20只小鼠。
图3A-3M示出了遵循HFD饮食的雄性纯合R138X小鼠的代谢表型。图3A-3F示出了进食和空腹的WT和R138X小鼠的血糖(图3A)、血浆胰岛素(图3B)、胰岛素原(图3C)，和C肽(图3D)水平。图3E-3F示出了进食和空腹的WT和R138X小鼠的胰岛素原/胰岛素之比(图3E)和C肽/胰岛素之比(图3F)。图3G示出了在WT和R138X小鼠中的口服葡萄糖耐量测试。数据显示为随时间推移的血糖。曲线下方的区域显示在右侧。图3H示出了在空腹过夜(时间0)之后和在腹膜内注射葡萄糖后的所指示时间在WT或R138X小鼠中的血液胰岛素水平。数据显示为随时间推移的血糖水平。图3I示出了从WT和R138X小鼠分离的胰腺中胰岛素的组织学。图3J示出了胰腺胰岛素染色的定量。图3K示出了胰岛数目的定量。图3L示出了Ki67(绿色)和胰岛素(红色)的免疫组织化学。图3M示出了Ki67和胰岛素双阳性细胞的定量。值代表平均值±SEM(n＝每基因型4-17只小鼠)。
图4A-4K示出了遵循HFD饮食的雄性纯合Slc30a8 KO小鼠的代谢表型。图4A-4D示出了进食和空腹的WT和Slc30a8 KO小鼠的血糖(图4A)，血浆胰岛素(图4B)，胰岛素原(图4C)和C肽(图4D)水平。图4E-4F示出了进食和空腹的WT和Slc30a8 KO小鼠中的胰岛素原/胰岛素之比(图4E)和C肽/胰岛素之比(图4F)。图4G示出了WT和Slc30a8 KO小鼠中的口服葡萄糖耐量测试。数据显示为随时间推移的血糖水平。图4H示出了在空腹过夜(时间0)之后和在腹膜内注射葡萄糖后的所指示时间在WT或Slc30a8 KO小鼠中的血液胰岛素水平。数据显示为随时间推移的葡萄糖水平。图4I示出了从WT和Slc30a8 KO小鼠分离的胰腺中胰岛素的组织学。图4J示出了胰腺胰岛素染色的定量。图4K示出了胰岛数目的定量。值代表平均值±SEM(n＝每基因型6-17只小鼠)。
图5示出了通过蛋白酶体的人R138X蛋白的体外表达和稳定。在单独或同时过表达myc标签的SLC30A8 WT或R138X蛋白后，示出了HEK293裂解物的蛋白质印迹分析。用指示的化合物处理细胞6小时，并用各自的抗体探测。
图6A-6E显示了在雄性纯合的R138X小鼠中，于普通饮食(chow)和HFD条件下的胰高血糖素组织学不变。图6A示出了从饲喂普通饮食的WT和R138X小鼠分离的胰腺中胰高血糖素的组织学。图6B和6E示出了图6A所示的胰高血糖素染色的定量。值代表平均值±SEM(n＝6每个基因型)。图6C示出了从HFD饲喂的WT和R138X小鼠分离的胰腺中胰高血糖素的组织学。图6D示出了图6C所示的胰高血糖素染色的定量(n＝每基因型4-17只小鼠)。
图7A-7K示出了遵循普通饮食的雄性纯合Slc30a8 KO小鼠的代谢表型。图7A-7D示出了进食和空腹的WT和Slc30a8 KO小鼠的血糖(图7A)、血浆胰岛素(图7B)、胰岛素原(图7C)和C肽(图7D)水平。图7E-7F示出了进食和空腹的WT和Slc30a8 KO小鼠的胰岛素原/胰岛素之比(图7E)和C肽/胰岛素之比(图7F)。图7G示出了在WT和Slc30a8 KO小鼠中的口服葡萄糖耐量测试。数据显示为随时间推移的血糖水平。图7H示出了在空腹过夜(时间0)之后和在腹膜内注射葡萄糖后的所指示的时间在WT或Slc30a8 KO小鼠中的血浆胰岛素水平。数据显示为随时间推移的血糖水平。图7I示出了从WT和Slc30a8 KO小鼠分离的胰腺中胰岛素的组织学。图7J示出了胰腺胰岛素染色的定量。图7K示出了胰岛数目的定量。值代表平均值±SEM(n＝每个基因型6-10只小鼠)。
图8A-8K示出了遵循HFD的雌性纯合R138X小鼠的代谢表型。图8A-8D示出了进食和空腹的WT和R138X小鼠的血糖(图8A)、血浆胰岛素(图8B)、胰岛素原(图8C)，和C肽(图8D)水平。图8E-8F示出了进食和空腹的WT和R138X小鼠的胰岛素原/胰岛素之比(图8E)和C肽/胰岛素之比(图8F)。图8G示出了在WT和R138X小鼠中的口服葡萄糖耐量测试。数据显示为随时间推移的葡萄糖水平。图8H示出了在空腹过夜(时间0)之后和在腹膜内注射葡萄糖后的所指示时间在WT或R138X小鼠中的血浆胰岛素水平。数据显示为随时间推移的葡萄糖水平。图8I示出了从WT和R138X小鼠分离的胰腺中胰岛素的组织学。图8J示出了胰腺胰岛素染色的定量。图8K示出了胰岛数目的定量。值代表平均值±SEM(n＝每个基因型6-9只小鼠)。
图9A-9M示出了遵循HFD的杂合R138X(HET)小鼠具有较高的葡萄糖刺激的胰岛素水平。图9A示出了从饲喂普通饮食的WT杂合R138X小鼠中分离的胰岛的蛋白质印迹。箭头：SLC30A8蛋白；*表示非特异性带。图9B示出了从WT和杂合R138X小鼠分离的胰岛的二硫腙染色。图9C-9F示出了进食和空腹的WT和R138X HET小鼠的血糖(图9C)、血浆胰岛素(图9D)、胰岛素原(图9E)，和C肽(图9F)水平。图9G-9H示出了进食和空腹的WT和HET小鼠的胰岛素原/胰岛素之比(图9G)和C肽/胰岛素之比(图9H)。图9I示出了在WT和R138X HET小鼠中的口服葡萄糖耐量测试。数据显示为随时间推移的血糖水平。图9J示出了在空腹过夜(时间0)之后和在腹膜内注射葡萄糖后的所指示的时间在WT或R138X HET小鼠中的血浆胰岛素水平。数据显示为随时间推移的葡萄糖水平。图9K示出了从WT和R138X HET小鼠分离的胰腺中胰岛素的组织学。图9L示出了胰腺胰岛素染色的定量。图9M示出了胰岛数目的定量。值代表平均值±SEM(n＝每个基因型6-9小鼠)。
图10A-10C示出了靶向小鼠Slc30a8基因座以产生R138X小鼠的示意图。图10A示出了野生型小鼠基因座，并指示了通过靶向产生的pArg137*C>T点突变的位置和29bp的删除。示出了等位基因特异性筛选测定(8084AS)和
Figure BDA0002577214450000111
下游筛选测定(8084TD)。图10B示出了靶定的基因座的示意图。图10C示出了自删除(self-deleting)药物选择盒的自切除后的靶定的基因座的示意图。
图11示出了野生型小鼠SLC30A8蛋白(SEQ ID NO：12)、R138X小鼠中预期截短的SLC30A8 Arg137*蛋白(SEQ ID NO：13)，和野生型人SLC30A8蛋白(SEQ ID NO：1214的蛋白质比对。
图12示出了使用恒定的微泵输注，用S961(虚线)或PBS(实线)处理的WT(实心符号)和纯合R138X小鼠(空心符号)中的进食血浆葡萄糖水平和进食血浆胰岛素水平。在整个实验(21天)的所指示的时间测量进食血浆葡萄糖水平和胰岛素水平。
图13A-13I示出了在由胰岛素受体拮抗剂S961引起的慢性高血糖症下，R138X小鼠分泌更多的胰岛素。图13A示出了用胰岛素受体拮抗剂S961(20nMol/周)或PBS连续治疗22天的R138X和WT小鼠的非空腹(nonfasted)血浆葡萄糖水平。图13B示出了在0、4、19和22天的用S961(20nMol/周)或PBS治疗的R138X和WT小鼠的非空腹血浆胰岛素。图13C示出了治疗22天后的WT和R138X小鼠的血浆活性GLP-1水平。图13D和13E示出了在开始治疗后第19天和第20天测量的进食和空腹葡萄糖水平(图13D)和胰岛素水平(图13E)。图13F示出了KI-67(白色)、胰岛素(绿色)，和胰高血糖素(红色)的免疫组织化学。图13G示出了KI-67和胰岛素双阳性细胞的定量。图13H示出了(图13I)中所示的胰腺胰岛素染色的定量。图13I示出了治疗22天后从WT和R138X小鼠分离的胰腺中胰岛素的组织学。值代表平均值±SEM(n＝每种处理和基因型5-7只小鼠)。
图14A-14G显示了胰岛素受体拮抗剂S961(20nMol/周)或PBS S961治疗22天后的激素水平和胰高血糖素组织学。治疗22天后进食和空腹WT和R138X小鼠的胰岛素(图14A)、胰岛素原(图14B)、C肽(图14C)、胰岛素原/C肽之比(图14D)、胰岛素/C肽之比(图14E)。图14F示出了图14G所示的胰高血糖素染色的定量。图14G示出了治疗22天后从WT和R138X小鼠分离的胰腺中胰高血糖素的组织学。值代表平均值±SEM(n＝每基因型5-7只小鼠)。
图15示出了以RPKM(每千碱基读数)表示的Slc30a8的基因表达。
图16A-16C示出了来自WT和R138X小鼠的胰岛中的基因表达变化。图16A示出了胰岛素2(Ins2)和胰岛素1(Ins1)的RPKM值。图16B示出了β细胞调节剂的RPKM值。图16C示出了Hvcn1的RPKM值。
图17示出了在高脂饮食(HFD)下20周后，在进食和空腹的雄性WT和纯合R138X小鼠中的循环锌水平。小鼠大约29周龄。评估了12只WT小鼠和13只R138X小鼠。
具体实施方式
定义
本文可互换使用的术语“蛋白质”、“多肽”，和“肽”包括任何长度的氨基酸的聚合形式，包括编码和非编码氨基酸以及化学或生物化学修饰或衍生的氨基酸。该术语还包括已被修饰的聚合物，例如具有修饰的肽主链的多肽。术语“结构域”是指具有特定功能或结构的蛋白质或多肽的任何部分。
蛋白质被称为具有“N末端”和“C末端”。术语“N末端”是指蛋白质或多肽的起始，末端为具有游离胺基(-NH2)的氨基酸。术语“C末端”是指氨基酸链(蛋白质或多肽)的末端，其末端为是游离羧基(-COOH)。
本文可互换使用的术语“核酸”和“多核苷酸”包括任何长度的核苷酸的聚合形式，包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或其类似物或修饰形式。它们包括单链、双链，和多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂交，以及包含嘌呤碱基、嘧啶碱基，或其它天然的、化学修饰的、生物化学修饰的、非天然的，或衍生的核苷酸碱基。
核酸被称为具有“5'末端”和“3'末端”，因为单核苷酸通过使一个单核苷酸戊糖环的5'磷酸通过磷酸二酯键在一个方向上与其邻居的3'氧连接的方式反应生成寡核苷酸。如果寡核苷酸的5'磷酸未与单核苷酸戊糖环的3'氧连接，则将其称为“5'末端”。如果寡核苷酸的3'氧未与另一个单核苷酸戊糖环的5'磷酸连接，则将其末端称为“3'末端”。即使是较大的寡核苷酸内部的核酸序列也可被称为具有5'和3'末端。在线性或环状DNA分子中，离散元素被称为“下游”或3'元素的“上游”或5'。
术语“基因组整合”是指已被引入细胞以使核苷酸序列整合到细胞基因组中的核酸。可以使用任何方案将核酸稳定地掺入细胞的基因组中。
术语“靶向载体”是指可以通过同源重组、非同源末端连接介导的连接，或以任何其它重组方式引入细胞基因组中的靶向位置的重组核酸。
术语“野生型”包括具有在正常(相对于突变、患病，改变等)的状态或情景中发现的结构和/或活性的实体。野生型基因和多肽通常以多种不同形式(例如等位基因)存在。
术语“内源序列”是指天然存在于细胞或非人动物体内的核酸序列。例如，非人动物的内源Slc30a8序列是指天然存在于非人动物中的Slc30a8基因座处的天然Slc30a8序列。术语“内源基因座”是指染色体上天然发现特定遗传元件的位置。例如，非人动物的内源Slc30a8基因座是指非人动物中的天然存在的Slc30a8基因座(即非人动物基因组中天然发现Slc30a8基因的区域)。例如，内源小鼠Slc30a8基因座映射到15号染色体(NCBI RefSeqGeneID 239436；装配体(assembly)GRCm38.p4；位置NC_000081.6(52295553-52335733))。术语非人动物的“内源Slc30a8基因座”不是指随机插入非人动物基因组中的Slc30a8基因或插入非人动物基因组中除天然发现Slc30a8基因的区域以外的区域的Slc30a8基因。同样地，术语非人动物的“内源Slc30a8基因座”也并非指，例如，位于植入非人动物中的细胞(例如人类β细胞)的Slc30a8基因。
“外源”分子或序列包括通常不以该形式存在于细胞中的分子或序列。通常的存在包括在细胞的特定发育阶段和环境条件的存在。例如，外源分子或序列可以包括细胞内相应内源序列的突变形式，或者可以包括与细胞内的内源序列相对应但形式不同(即不在染色体内)的序列。与此相对，内源分子或序列包括在特定环境条件下，在特定发育阶段的特定细胞中通常以该形式存在的分子或序列。
当在核酸或蛋白质的上下文中使用时，术语“异源的”表示该核酸或蛋白质包含在同一分子中并非天然同时出现的至少两个片段。例如，当涉及核酸的片段或蛋白质的片段使用时，术语“异源的”表示该核酸或蛋白质包含两个或更多个在自然界中彼此之间没有相同关系(例如结合在一起)的子序列。作为一个实例，核酸载体的“异源”区域是在另一核酸分子内或附着于另一核酸分子的核酸片段，其在自然界中不与另一分子相关联。例如，核酸载体的异源区域可以包括编码序列，该编码序列侧接在自然界中与该编码序列不相关联的序列。同样地，蛋白质的“异源”区域是在另一肽分子内或附着于另一肽分子的氨基酸片段，其在自然界中不与另一肽分子相关联(例如融合蛋白或带有标签的蛋白)。类似地，核酸或蛋白质可包含异源标记或异源分泌或定位序列。
“密码子优化”利用密码子的简并性，如可指定氨基酸的三碱基对密码子组合的多样性所展示的，并且通常包括修饰核酸序列的过程，以在保持天然氨基酸序列的前提下，通过用宿主细胞基因中更常用或最常用的密码子替换天然序列的至少一个密码子，从而增强在特定宿主中的表达。例如，可以修饰编码Cas9蛋白的核酸，以用在给定的原核或真核细胞中(包括细菌细胞、酵母细胞、人细胞、非人细胞、哺乳动物细胞、啮齿动物细胞、小鼠细胞、大鼠细胞、仓鼠细胞，或任何其它宿主细胞)与天然核酸序列相比具有更高使用频率的密码子替换。密码子使用情况表很容易例如在“密码子使用情况数据库(Codon UsageDatabase)”中获得。这些表可以以多种方式适用。参见Nakamura et al.(2000)NucleicAcids Research 28:292，出于所有目的通过引用整体并入本文。也可获得用于在特定宿主中表达的特定序列的密码子优化的计算机算法(参见，例如Gene Forge)。
术语“基因座”是指基因(或重要序列)、DNA序列、多肽编码序列的特定位置，或生物体基因组的染色体上的位置。例如，“Slc30a8基因座”可以指Slc30a8基因、Slc30a8 DNA序列、SLC30a8编码序列，或Slc30a8在生物体基因组染色体上的特定位置，已识别出这类序列存在于该生物体基因组染色体的何处。“Slc30a8基因座”可包含Slc30a8基因的调节元件，包括例如增强子、启动子、5'和/或3'非翻译区(UTR)或其组合。
术语“基因”是指染色体中编码产物(例如RNA产物和/或多肽产物)的DNA序列，并包括被非编码内含子打断的编码区和与5'和3'末端上的与该编码区相邻的序列，使得该基因对应于全长mRNA(包括5'和3'非翻译序列)。术语“基因”还包括其它非编码序列，包括调节序列(例如启动子、增强子，和转录因子结合位点)、多腺苷酸化信号、内部核糖体进入位点、沉默子、隔绝序列(insulating sequence)，和基质附着区。这些序列可以靠近基因的编码区(例如在10kb之内)或在远处位点，并且它们影响基因转录和翻译的水平或速率。
术语“等位基因”是指基因的变体形式。一些基因具有多种不同形式，它们位于染色体上的相同位置或遗传位点上。二倍体生物在每个遗传位点具有两个等位基因。每对等位基因代表特定遗传基因座的基因型。如果在特定位点有两个相同的等位基因，则基因型被描述为纯合子，如果两个等位基因不同，则基因型被描述为杂合子。
基因的“编码区”或“编码序列”由基因的DNA或RNA的一部分组成，该部分由外显子组成，其编码蛋白质。该区域从5'末端的起始密码子开始，到3'末端的终止密码子结束。
“启动子”是DNA的调节区，其通常包含能够引导RNA聚合酶II在特定多核苷酸序列的适当转录起始位点起始RNA合成的TATA盒。启动子可以另外包含影响转录起始速率的其它区域。本文公开的启动子序列调节可操作连接(operably linked)的多核苷酸的转录。启动子可以在本文公开的一种或多种细胞类型(例如真核细胞、非人哺乳动物细胞、人类细胞、啮齿动物细胞、多能细胞、单细胞期胚胎、分化的细胞，或其组合)中具有活性。启动子可以是例如组成型活性启动子、条件启动子(conditional promoter)、诱导型启动子、时间受限的启动子(temporally restricted promoter)(例如发育调控的启动子(developmentally regulated promoter))，或空间受限的启动子(spatially restrictedpromoter)(例如细胞特异性或组织特异性启动子)。启动子的例子可以在例如WO 2013/176772中找到，其全部内容通过引用并入本文。
可操作的连接”或“可操作地连接”是指两个或更多个成分(例如启动子和另一个序列元件)的并置，使得两个成分均正常起作用，并允许至少一个成分可以介导施加在至少一个其它组件上的功能。例如，如果启动子响应一种或多种转录调节因子的存在或不存在而控制编码序列的转录水平，则该启动子可以可操作地连接至编码序列。可操作的连接可以包括这样的序列，所述序列彼此连续或反式作用(例如，调节序列可以在一定距离处起作用以控制编码序列的转录)。
术语“变体”是指不同于群体中最普遍的序列的核苷酸序列(例如一个核苷酸不同)或不同于群体中最普遍的序列的蛋白序列(例如一个氨基酸不同)。
在两个多核苷酸或多肽序列的上下文中，“序列同一性”或“同一性”是指两个序列中的残基，当在指定的比较窗口上比对以获得最大对应性时它们是相同的。当使用序列同一性百分比来表示蛋白质时，不相同的残基位置的不同之处通常为保守的氨基酸取代，其中氨基酸残基被具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的其它氨基酸残基取代，并因此不改变分子的功能特性。当序列的不同之处为保守取代时，可以向上调整序列同一性百分比以对取代的保守性质进行校正。因这种保守取代而不同的序列被称为具有“序列相似性”或“相似性”。进行这种调整的方法是众所周知的。通常，这涉及将保守取代计为部分错配而不是完全错配，从而增加序列同一性百分比。因此，例如，在相同氨基酸的评分为1，非保守取代的评分为0的情况下，保守取代的评分为0与1之间的值。保守取代的得分的计算通过例如PC/GENE程序实现(加利福尼亚州，山景城，Intelligenetics)。
“序列同一性百分比”包括通过在比较窗口中比较两个最佳比对的序列(完美匹配残基的最大数目)而确定的值，其中为了两个序列的最佳比对，比较窗口中的多核苷酸序列的部分可以包括与参考序列(其不含添加或删除)相比的添加或删除(即空隙)。通过确定两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数，以产生匹配位置数，将匹配位置数除以比较窗口中的位置总数，然后将结果乘以100，以得到序列同一性百分比。除非另有说明(例如较短的序列包括连接的异源序列)，否则比较窗口是被比较的两个序列中较短的序列的全长。
除非另有说明，否则序列同一性/相似性值包括使用GAP版本10，利用以下参数获得的值：使用GAP权重50和长度权重3以及nwsgapdna.cmp评分矩阵获得核苷酸序列的同一性％和相似性％；使用GAP权重8和长度权重2，以及BLOSUM62评分矩阵获得氨基酸序列同一性％和相似性％；或其任何等效程序。“等效程序”包括任何序列比较程序，当与由GAP版本10生成的相应比对进行比较时，对于所讨论的任何两个序列，所述序列比较程序针对所讨论的任何两个序列生成具有相同核苷酸或氨基酸残基匹配和相同百分比的序列同一性的比对。
术语“保守氨基酸取代”是指序列中通常存在的氨基酸被具有相似大小，电荷或极性的不同氨基酸取代。保守取代的实例包括用非极性(疏水)残基如异亮氨酸、缬氨酸，或亮氨酸取代另一个非极性残基。同样地，保守取代的例子包括一个极性(亲水)残基被另一个所取代，例如精氨酸和赖氨酸之间的取代、谷氨酰胺和天冬酰胺之间的取代，或甘氨酸和丝氨酸之间的取代。另外，保守取代的其它实例是用碱性残基例如赖氨酸、精氨酸，或组氨酸取代另一种碱性残基，或用一个酸性残基例如天冬氨酸或谷氨酸替代另一种酸性残基。非保守取代的实例包括将非极性(疏水)氨基酸残基，例如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丙氨酸，或蛋氨酸取代为极性(亲水)残基，如半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或赖氨酸和/或将极性残基取代为非极性残基。下文总结了典型的氨基酸分类。
表1：氨基酸分类
Figure BDA0002577214450000181
“同源”序列(例如核酸序列)是指与已知参考序列相同或基本相似的序列，使得其例如与已知参考序列至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，或100％相同。同源序列可以包括，例如，种间同源序列和种内同源序列。同源基因例如通常通过物种形成事件(speciation event)(种间同源基因)或遗传复制事件(genetic duplicationevent)(种内同源基因)源自共同的祖先DNA序列。“种间同源”基因包括通过物种形成从共同祖先基因进化而来的不同物种中的基因。种间同源物(orthologs)通常在进化过程中保持相同的功能。“种内同源”基因包括通过基因组内的复制而相关的基因。种内同源物(paralogs)可以在进化过程中进化出新功能。
术语“体外”包括人工环境以及在人工环境(例如试管)内发生的过程或反应。术语“体内”包括自然环境(例如细胞或生物体或身体)以及在自然环境中发生的过程或反应。术语“离体”包括已经从个体体内移出的细胞以及在这种细胞内发生的过程或反应。
术语“报告基因”是指具有编码基因产物(通常是酶)的序列的核酸，当包含与内源或异源启动子和/或增强子元件可操作地连接的报告基因序列的构建体被引入含有(或可以使其含有)该启动子和/或增强子元件的激活所必需的因子的细胞中时，该序列可被容易地和定量地测定。报告基因的例子包括但不限于编码β-半乳糖苷酶(lacZ)的基因、细菌氯霉素乙酰基转移酶(cat)基因、萤火虫荧光素酶基因、编码β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)的基因，和编码荧光蛋白的基因。“报道蛋白”是指由报道基因编码的蛋白。
本文所使用的术语“荧光报道蛋白”是指基于荧光可检测的报道蛋白，其中荧光可以直接来自报道蛋白、报道蛋白在荧光底物上的活性，或具有结合荧光标记的化合物的亲和力的蛋白。荧光蛋白的例子包括绿色荧光蛋白(例如GFP、GFP-2、tagGFP、turboGFP、eGFP、Emerald、Azami Green、单体Azami Green、CopGFP、AceGFP，和ZsGreenl)、黄色荧光蛋白(例如YFP、eYFP、Citrine、Venus、YPet、PhiYFP，和ZsYellowl)、蓝色荧光蛋白(例如BFP、eBFP、eBFP2、Azurite、mKalamal、GFPuv，Sapphire,和T-sapphire)、青色荧光蛋白(例如CFP、eCFP、Cerulean、CyPet、AmCyanl，和Midoriishi-Cyan)、红色荧光蛋白(例如RFP、mKate、mKate2、mPlum、DsRed单体、mCherry、mRFP1、DsRed-Express、DsRed2、DsRed-Monomer、HcRed-Tandem、HcRedl、AsRed2、eqFP611、mRaspberry、mStrawberry，和Jred)、橙色荧光蛋白(例如mOrange、mKO、Kusabira-Orange、Monomeric Kusabira-Orange、mTangerine，和tdTomato)，以及可以通过流式细胞方法检测到其在细胞中的存在的任何其它合适的荧光蛋白。
响应双链断裂(DSB)的修复主要通过两个保守的DNA修复途径发生：同源重组(HR)和非同源末端连接(NHEJ)。参见Kasparek&Humphrey(2011)Seminars in Cell&Dev.Biol.22:886-897，出于所有目的通过引用整体并入本文。同样，由外源供体核酸介导的靶核酸的修复可以包括两个多核苷酸之间交换遗传信息的任何过程。
术语“重组”包括两个多核苷酸之间的遗传信息交换的任何过程，并且可以通过任何机制发生。重组可通过同源定向修复(HDR)或同源重组(HR)发生。HDR或HR包括一种可能需要核苷酸序列同源性的核酸修复形式，其使用“供体”分子作为模板来修复“靶标”分子(即经历双链断裂的分子)，并导致遗传信息从供体转移到靶标。不希望受到任何特定理论的束缚，这种转移可能涉及在断裂的靶标和供体之间形成的异源双链DNA的错配校正，和/或合成依赖性链退火，其中供体用于重新合成遗传信息，该遗传信息将成为靶标的一部分，和/或相关过程。在一些情况下，供体多核苷酸、供体多核苷酸的一部分、供体多核苷酸的拷贝，或供体多核苷酸的拷贝的一部分整合到靶DNA中。参见Wang et al.(2013)Cell 153:910-918；Mandalos et al.(2012)PLOS ONE 7:e45768:1-9；和Wang et al.(2013)NatBiotechnol.31:530-532，出于所有目的将其每一篇均通过引用整体并入本文。
NHEJ包括通过将断裂末端彼此直接连接或与外源序列直接连接而不需要同源模板来修复核酸中的双链断裂。通过NHEJ对非连续序列进行连接通常会导致双链断裂位点附近的删除、插入，或易位。例如，NHEJ还可以通过将断裂末端与外源供体核酸的末端直接连接(即基于NHEJ的捕获)来导致外源供体核酸的靶定整合。当同源定向修复(HDR)途径不能立即使用时(例如，在非分裂细胞、原代细胞，以及较差地进行基于同源性的DNA修复的细胞中)，此类NHEJ介导的靶定整合可优选用于插入外源供体核酸。另外，与同源定向修复相反，不需要关于切割位点侧面的大范围的序列同一性的知识，这在尝试靶定插入到具有对基因组序列的认识有限的基因组的生物中时可能是有益的。整合可以通过在外源供体核酸与切割的基因组序列之间平端的连接或通过使用侧面为单链突出端的外源供体核酸连接黏性末端(即具有5'或3'单链突出端)来进行，所述单链突出端与在切割的基因组序列中由核酸酶试剂产生的那些相容。参见，例如，US 2011/020722、WO 2014/033644、WO 2014/089290和Maresca et al.(2013)GenomeRes.23(3):539-546，出于所有目的将每一篇均通过引用整体并入本文。如果连接平端，可能需要进行靶标和/或供体切除，以产生片段连接所需的微同源性区域(regions of microhomology)，这可能会在靶序列中产生不想要的改变。
术语“R138X小鼠”是指在小鼠Slc30a8基因座中携带对应于人SLC30A8假定(putative)LOF突变R138X的突变的小鼠。小鼠Slc30a8基因座中的突变是c.409C>T(转录物登录号NM_172816.3)，p.Arg137X，表示在编码序列的核苷酸409处的C至T取代，导致编码氨基酸残基137的密码子从编码精氨酸残基的密码子到终止密码子(R137*stop)的突变。相应的人SLC30A8突变为c.412C>T(转录物登录号NM_173851)，p.Arg138X，表示在编码序列的核苷酸412处的C至T取代，导致编码氨基酸残基138的密码子从编码精氨酸残基的密码子到终止密码子(R138*stop)的突变。当两者最佳比对时，小鼠SLC30A8蛋白的氨基酸残基137与人SLC30A8蛋白的氨基酸残基138相对应。参见图11。尽管小鼠Slc30a8基因中的突变位于编码小鼠SLC30A8蛋白的氨基酸残基137的密码子中，但是参考相应的人SLC30A8突变，这些小鼠在本文中被称为“R138X小鼠”。
“包含”或“包括”一个或多个所列举的要素的组合物或方法可以包括未具体列举的其它要素。例如，“包含”或“包括”蛋白质的组合物可以单独包含蛋白质或包含蛋白质以及其它成分。过渡用语“基本上由……组成”是指权利要求的范围应解释为涵盖权利要求中所述的特定要素以及不实质上影响所要求保护的发明的基本和新颖特征的要素。因此，当在本发明的权利要求书中使用时，术语“基本上由……组成”并不意图被解释为等同于“包括”。
“可选的”或“可选地”是指随后描述的事件或情况可能发生或可能不会发生，并且说明书包括事件或情况发生的情况以及事件或情况没有发生的情况。
值范围的指定包括该范围内或定义该范围的所有整数，以及该范围内的整数定义的所有子范围。
除非从上下文中另外显而易见，否则术语“约”涵盖所述值的标准测量误差范围(例如SEM)内的值。
术语“和/或”是指并涵盖一个或多个相关列出的项目的任何和所有可能的组合，以及当以备选方式(“或”)解释时组合的不存在。
术语“或”是指特定列表的任何一个成员，并且还包括该列表的成员的任何组合。
除非上下文另外明确指出，否则冠词“一”，“一个”和“所述”的单数形式包括复数形式。例如，术语“一种蛋白质”或“至少一种蛋白质”可包括多种蛋白质，包括其混合物。
具有统计学意义的均值意指p≤0.05。
详细说明
I.概述
本文公开了非人动物基因组、非人动物细胞，和在其基因组中包含突变的Slc30a8基因座的非人动物，以及使用这种非人动物细胞和非人动物的方法。锌转运蛋白SLC30A8主要表达于内分泌胰腺的胰岛中。迄今为止，SLC30A8只是假定的功能失去突变已显示出可预防II型糖尿病的发展的三个基因之一。这是一个有趣但令人费解的观察，因为缺乏Slc30a8的小鼠模型的葡萄糖稳态水平受到轻微损害。我们已经生成了一个小鼠模型，该小鼠模型包含模仿保护性人类SLC30A8等位基因的突变Slc30a8基因座。这种小鼠模型首次可以解释为什么人类可以免受II型糖尿病的侵扰。小鼠具有增加的胰岛素分泌能力。尤其地，小鼠具有更高的葡萄糖诱导的胰岛素分泌，其可以部分由增加的胰腺β细胞介导。这些SLC30A8突变数据支持以下观点：β细胞扩展(expansion)是治疗II型糖尿病的有效治疗策略。
本文公开的细胞和非人动物模型可以用于药物筛选以及提供对T2D机制(例如：SLC30A8有助于胰岛素加工和糖尿病的机制)以及潜在的新的治疗和研究靶标的见解。
II.包含突变的Slc30a8基因座的非人动物
本文公开的细胞和非人动物包含(例如在其基因组中)在Slc30a8基因座中的突变(例如在非人动物中不自然发生的突变)。突变的Slc30a8基因座可具有提前终止密码子和/或可编码截短的SLC30A8蛋白。当饲喂高脂饮食时，包含突变的Slc30a8基因座的非人动物与饲喂相同饮食且没有突变的非人动物相比的胰岛素分泌能力增强。
A.Slc30a8
本文所述的细胞和非人动物包含突变的Slc30a8(溶质载体家族30成员8)基因座。SLC30A8的其它名称包括锌转运蛋白8、ZnT-8，和Znt8。Slc30a8编码的蛋白质是锌转运蛋白，锌转运蛋白参与细胞内囊泡中锌的积累。Slc30a8在胰腺中(尤其是在胰岛中)以高水平表达。编码的蛋白质与胰岛素共定位(co-localize)在胰岛素分泌INS-1细胞的分泌途径颗粒中。
人SLC30A8映射到8号染色体上的人8q24.11(NCBI RefSeq GeneID 169026；装配体GRCh38.p7；位置116950273-117176714)。据报道，该基因有八个外显子和七个内含子。但是，也有可能具有八个以上外显子(包括非编码外显子)的异形体。野生型人SLC30A8蛋白已被赋予UniProt登录号Q8IWU4。已知两种异形体：Q8IWU4异形体1(SEQ ID NO：14)和Q8IWU4异形体2。编码异形体1的mRNA被赋予NCBI RefSeq NM_173851.2(SEQ ID NO：17)。全长人蛋白质具有369个氨基酸，包括六个跨膜区域、四个细胞内拓扑结构域，和三个细胞外拓扑结构域。这些结构域之间的划界如UniProt中所指定。对人SCL30A8的提及包括典型(野生)形式以及所有等位基因形式和异形体。人SLC30A8的任何其它形式的氨基酸均编号为与野生型最大比对，比对的氨基酸指定为相同的编号。
小鼠Slc30a8映射至15号染色体(NCBI RefSeq GeneID 239436；装配体GRCm38.p4；位置NC_000081.6(52295553-52335733))。据报道，该基因有八个外显子和七个内含子。野生型小鼠SLC30A8蛋白已被赋予UniProt登录号Q8BGG0(SEQ ID NO：12)。为编码小鼠SLC30A8的mRNA被赋予NCBI RefSeq NM_172816.3(SEQ ID NO：16)。全长小鼠蛋白质具有367个氨基酸，包括六个跨膜区域、四个细胞内拓扑结构域，和三个细胞外拓扑结构域。这些结构域之间的划界如UniProt中所指定。对小鼠SCL30A8的提及包括典型(野生)形式以及所有等位基因形式和异形体。小鼠SLC30A8的任何其它形式的氨基酸均编号为与野生型最大比对，比对的氨基酸指定为相同的编号。
示例性的大鼠SLC30A8蛋白由UniProt登录号P0CE46指定。
人SLC30A8基因的多态性与II型糖尿病(T2D)的风险改变相关。参见，例如，Sladeket al.(2007)Nature 445(7130):881-885和Davidson et al.(2014)TrendsEndocrinol.Metab.25(8):415-424，出于所有目的将其每一篇通过引用整体并入本文。人类中的某些此类多态性或突变可降低T2D风险或保护人类免于T2D。SLC30A8基因中降低T2D风险的多态性或突变包括赋予针对T2D的保护、赋予对T2D的抗性，或与针对T2D的保护或抗性相关的多态性或突变。例如，当杂合时，导致人SLC30A8中蛋白质截短的各种终止密码子突变、移码突变、剪接位点突变，或引发子密码子变异可防止T2D发生。其中之一被命名为c.412C>T(转录物登录号NM_173851)，p.Arg138X，表示在编码序列的核苷酸412处进行C至T取代，导致编码氨基酸残基138的密码子从编码精氨酸残基的密码子到终止密码子(R138*stop)的突变。参见，例如，Flannick et al.(2014)Nat.Genet.46(4):357-363，出于所有目的通过引用整体并入本文。这些表型在先前的动物模型中没有被复制，但是在本文所公开的非人动物中被复制。
B.突变的Slc30a8基因座
本文所公开的突变的Slc30a8基因座导致当饲喂高脂饮食时，非人动物相对于当饲喂相同饮食时没有该突变的非人动物具有增强的胰岛素分泌能力。突变的Slc30a8基因座可降低T2D风险。相对于没有该突变的非人动物(例如野生型非人动物)，包含突变的Slc30a8基因座的非人动物可以具有一个或多个或所有以下特征：(1)饲喂高脂饮食时增加的葡萄糖诱导的胰岛素分泌；(2)饲喂高脂饮食时增加的胰腺β细胞增殖；(3)饲喂高脂饮食时增加的胰腺β细胞数量；以及(4)阻断胰岛素受体后(例如使用S961)增加的进食血浆胰岛素水平。另外或替代地，相对于没有该突变的非人动物(例如野生型非人动物)，包含突变的Slc30a8基因座的非人动物可具有以下一项或多项或所有特征：(1)饲喂高脂饮食20、25、30、35、40、45，或50周后(例如20或30周后)增加的循环胰岛素水平；(2)饲喂高脂饮食20、25、30、35、40、45，或50周后(例如20或30周后)增加的胰腺β细胞数量；(3)饲喂高脂饮食时胰岛素原与胰岛素之比降低；(4)胰岛素受体阻断后(例如在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24，或25天后)增加的进食胰岛素水平；以及(5)具有改善的胰岛素加工能力的胰岛β细胞和更好的健康状况(例如，如饲喂高脂饮食时，胰岛素原与胰岛素之比的降低所证明的)。另外或可替代地，包含突变的Slc30a8基因座的非人动物可以在胰岛中具有显著的Slc30a8 mRNA表达(例如野生型水平的至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％，或100％，例如野生型水平的至少25％或30％)。
与没有该突变的非人动物(例如野生型非人动物)相比，当饲喂对照的普通饮食时，具有突变的Slc30a8基因座的非人动物可以具有正常的代谢表型。与没有该突变的非人动物(例如野生型非人动物)相比，当喂饲对照的普通饮食时，具有突变的Slc30a8基因座的非人动物可以具有正常的葡萄糖稳态和/或正常的葡萄糖诱导的胰岛素分泌。与没有该突变的非人动物(例如野生型非人动物)相比，当喂饲对照的普通饮食时，具有突变的Slc30a8基因座的非人动物还可以具有以下一项或多项或所有特征：体重差异不显著、循环血糖水平无明显差异、循环胰岛素水平无明显差异、循环胰岛素原水平无显著差异、循环C肽水平无显著差异、胰岛素原/C肽之比无显著差异、葡萄糖耐量无显著差异、胰岛素敏感性无显著差异、葡萄糖诱导的胰岛素分泌无显著差异、β细胞质量无显著差异，以及α细胞质量无显著差异。与没有该突变的非人动物(例如野生型非人动物)相比，当喂饲对照的普通饮食时，具有突变的Slc30a8基因座的非人动物可具有降低的胰岛素/C肽之比。这可能表明较高的胰岛素清除。
与没有该突变的非人动物(例如野生型非人动物)相比，具有突变的Slc30a8基因座的非人动物分泌胰岛素的能力增加。作为一个例子，当饲喂高脂饮食时，该非人动物可以具有增强的胰岛素分泌能力。相对于没有该突变的非人动物，当饲喂高脂饮食时，这种非人动物的胰岛素分泌会增加，其中胰岛素分泌的增加与相对于没有该突变的非人动物的增加的β细胞增殖或β细胞质量有关。β细胞增殖的增加可以是胰岛素受体依赖性的(例如依赖于β细胞中的胰岛素受体)。作为另一个例子，非人动物可具有响应高血糖症(例如严重高血糖症)的增加的胰岛素分泌增能力。相对于没有该突变的非人动物，此类非人动物可以响应于胰岛素受体抑制所引起的高血糖症而具有增加的胰岛素分泌。例如，相对于没有该突变的非人动物，此类非人动物可以响应于胰岛素受体抑制诱导的高血糖症而具有增加的胰岛素分泌，其中胰岛素分泌的增加与相对于没有该突变的非人动物的β细胞增殖的增加或β细胞质量的增加无关。与没有该突变的非人动物相比，胰岛素分泌的增加可为至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％，或50％。例如，非人动物可以响应由胰岛素受体抑制引起的高血糖症(例如由胰岛素受体拮抗剂S961引起的高血糖症)而具有增加的胰岛素分泌。在某些非人动物中，这种作用与增加的β细胞增殖或增加的β细胞质量无关。在某些非人动物中，血浆胰岛素的增加并非以下一项或多项或全部的结果：改善的胰岛素原加工、降低的胰岛素清除、增加的β细胞增殖、增加的胰岛质量、增加的β细胞质量、增加的α细胞质量，或β细胞中的胰岛素缺乏。
与没有突变的非人动物(例如野生型非人动物)相比，具有突变的Slc30a8基因座的非人动物可以具有降低的线粒体基因表达(例如，线粒体氧化磷酸化(OXPHOS)系统中的基因的表达减少)。此类基因的实例在实施例2和表7-9中更详细地描述。与没有突变的非人动物(例如野生型非人动物)相比，具有突变的Slc30a8基因座的非人动物可以具有增加的Hvcn1(氢电压门控通道1，或电压门控氢通道1)表达。
与没有突变的非人动物(例如野生型非人动物)相比，具有突变的Slc30a8基因座的非人动物可具有胰岛锌积累的损失。
与没有突变的非人动物(例如野生型非人动物)相比，当饲喂对照普通食物时，具有突变的Slc30a8基因座的非人动物也可以具有以下一项或多项或所有特征：体重、血糖、胰岛素，或C肽水平(进食或空腹)没有差异；进食胰岛素原水平无变化；空腹前胰岛素(proinsulin)水平可能降低；胰岛素原与胰岛素之比(进食或空腹)没有变化；C肽与胰岛素的进食之比(fed ratio)增加；C肽与胰岛素的空腹之比(fasted ratio)没有变化；并且葡萄糖耐量或葡萄糖诱导的胰岛素分泌没有变化。
与没有该突变的非人动物(例如野生型非人动物)相比，当饲喂高脂饮食时，具有突变的Slc30a8基因座的非人动物还可以具有以下一项或多项或所有特征：进食或空腹血糖无变化；进食循环胰岛素水平增加；空腹循环胰岛素水平无变化；进食胰岛素原水平无变化；空腹胰岛素原水平降低；进食循环C肽水平升高；空腹循环C肽水平无变化；胰岛素原与胰岛素之比(进食和空腹)降低；C肽与胰岛素之比没有变化；胰腺的胰岛素阳性面积增加；每个胰腺面积的胰岛数目增加；β细胞的增殖增加；以及产生胰岛素的β细胞的数量增加。另外，与没有该突变的非人动物相比，具有突变的Slc30a8基因座的非人动物在阻断胰岛素受体后(例如使用S961)可以具有增加的进食血浆胰岛素水平。
本文公开的突变的Slc30a8基因座可以是编码截短的SLC30A8蛋白(即蛋白截短的变体)的Slc30a8基因座。引起截短的突变可以是例如移码突变、无义突变、剪接位点突变，或起始密码子SNV。参见，例如，Flannick et al.(2014)Nat.Genet.46(4):357-363，出于所有目的通过引用整体并入本文。无义突变为对应于遗传密码所指定的二十个氨基酸之一的有义密码子变为链终止密码子(即终止密码子(termination codon)或终止密码子(stopcodon))的突变。当密码子的正常序列被一个或多个核苷酸的插入或删除破坏时，就会产生移码突变，前提是所添加或移除的核苷酸数目不是三的倍数。移码突变是翻译起始密码子(translation initiation codon)(起始密码子(start codon))和终止密码子(termination codon)(终止密码子(stop codon)))之间的序列变化，其中与参考序列相比，翻译移至另一框(frame)。例如，阅读框可以在5'方向移动一个核苷酸(-1移码)或在3'方向移动一个核苷酸(+1移码)。从N末端到移码突变，由具有移码突变的基因编码的蛋白质与野生型基因编码的蛋白质相同，但在此范围之外则有所不同。这样的移码会导致提前终止密码子。剪接位点突变可导致，例如，外显子的跳过以及潜在导致提前终止密码子的后续的移码。在一个实例中，本文公开的突变的Slc30a8基因座可以是其中Slc30a8基因具有提前终止密码子(termination codon)(即终止密码子(stop codon))的Slc30a8基因座。在一个具体的例子中，突变包括无义突变，基本上由无义突变组成，或由无义突变组成。
该突变可以在Slc30a8基因座内的任何地方。例如，该突变可以在Slc30a8基因的第一外显子、第二外显子、第三外显子、第四外显子、第五外显子、第六外显子、第七外显子，或第八外显子中。类似地，当与人SLC30A8基因最佳比对时，该突变可以在与人SLC30A8基因的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七，或第八外显子相对应的Slc30a8基因的区域中。在一个具体实例中，当与人SLC30A8基因最佳比对时，该突变在Slc30a8基因的第三外显子中或在Slc30a8基因的与人SLC30A8基因的第三外显子相对应的区域中。在更具体的实例中，当与人SLC30A8基因最佳比对时，该突变在Slc30a8基因的第三外显子的3'末端或在Slc30a8基因的与人SLC30A8基因的第三外显子的3'末端相对应的区域中。
在一个实例中，该突变位于当突变的Slc30a8基因的编码序列与SEQ ID NO：21最佳比对时，与SEQ ID NO：21所示的人SLC30A8编码序列(CDS)的残基412(即残基c.412，转录物登录号NM_173851)相对应的残基。替代地，该突变位于当突变的Slc30a8基因的编码序列与SEQ ID NO：21最佳比对时，SEQ ID NO：21所示的人SLC30A8编码序列的残基412(即残基c.412，转录物登录号NM_173851)的1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、40、50、100、200、300、400，或500个核苷酸内的残基上。
在另一个实例中，突变位于当突变的Slc30a8基因的编码序列与SEQ ID NO：20最佳比对时，与SEQ ID NO：20所示的小鼠Slc30a8编码序列(CDS)的残基409(即残基c.409，转录物登录号NM_173851.2)相对应的残基。替代地，该突变位于当突变的Slc30a8基因的编码序列与SEQ ID NO：20最佳比对时，SEQ ID NO：20所示的小鼠Slc30a8编码序列的残基409(即残基c.409，转录物登录号NM_173851.2)的1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、40、50、100、200、300、400，或500个核苷酸内的残基上。
在另一个实例中，当与SEQ ID NO：14最佳比对时，该突变导致与SEQ ID NO：14所示的人SLC30A8蛋白中的残基138(即UniProt登录号Q8IWU4.2的氨基酸138)相对应的密码子中的终止密码子。或者，当与SEQ ID NO：14最佳比对时，终止密码子对应于SEQ ID NO：14所示的人SLC30A8蛋白中的残基138(即UniProt登录号Q8IWU4.2的氨基酸138)的1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240，或250个氨基酸内的密码子。
在另一个实例中，当与SEQ ID NO：12最佳比对时，该突变导致与SEQ ID NO：12所示的小鼠SLC30A8蛋白中的残基137(即UniProt登录号Q8BGG0.1的氨基酸137)相对应的密码子中的终止密码子。或者，当与SEQ ID NO：12最佳比对时，终止密码子对应于SEQ ID NO：12所示的小鼠SLC30A8蛋白中的残基137(即UniProt登录号Q8BGG0.1的氨基酸137)的1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240，或250个氨基酸内的密码子。
突变的Slc30a8基因座可以内源于非人动物。在一个具体的例子中，突变的Slc30a8基因座编码一种mRNA(cDNA)，该mRNA(cDNA)包含以下、基本上由以下组成，或由以下组成：与SEQ ID NO：18至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％，或100％相同的序列。突变的SLC30A8基因座的编码序列可包含以下、基本上由以下组成，或由以下组成：与SEQ ID NO：22至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％，或100％相同的序列，或编码相同氨基酸序列的其简并。由突变的SLC30A8基因座编码的所得SLC30A8蛋白可包含以下、基本上由以下组成，或由以下组成：与SEQ ID NO：13至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％，或100％相同的序列。
可选地，突变的SLC30A8基因座可包含其它外源或异源元件。这种元件的例子可以包括选择盒、报道基因、重组酶识别位点，或其它元件。作为一个实例，突变的SLC30A8基因座可包含侧面为重组酶识别序列(例如loxP位点)的可去除选择盒(例如自删除选择盒)。或者，突变的SLC30A8基因座可以缺少其它元件(例如可以缺少选择盒和/或可以缺少报道基因)。合适的报道基因和报道蛋白的实例在本文其它地方公开。合适的选择标记的例子包括新霉素磷酸转移酶(neor)、潮霉素B磷酸转移酶(hygr)、嘌呤霉素-N-乙酰基转移酶(puror)、杀稻瘟菌素S脱氨酶(bsrr)、黄嘌呤/鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(gpt)，和单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-k)。重组酶的实例包括Cre、Flp，和Dre重组酶。Cre重组酶基因的一个例子是Crei，其中两个编码Cre重组酶的外显子被内含子隔开，以防止其在原核细胞中表达。此类重组酶可进一步包含核定位信号，以促进定位至核(例如NLS-Crei)。重组酶识别位点包括被位点特异性重组酶识别的核苷酸序列，并且可以用作重组事件的底物。重组酶识别位点的实例包括FRT、FRT11、FRT71、attp、att、rox和，lox位点，例如loxP、lox511、lox2272、lox66、lox71、loxM2，和lox5171。
其它元件(例如报道基因或选择盒)可以是侧面为重组酶识别位点的自删除盒。参见，例如，US 8,697,851和US 2013/0312129，出于所有目的，通过引用将每一篇的全部内容整体并入本文。例如，自删除盒可包含与小鼠Prm1启动子可操作连接的Crei基因(包含被内含子所隔开的两个编码Cre重组酶的外显子)和与人泛素启动子可操作连接的新霉素抗性基因。通过使用Prm1启动子，可以在F0动物的雄性生殖细胞中特异性地删除自删除盒。可以将编码选择标记物的多核苷酸可操作地连接至在被靶定的细胞中具有活性的启动子。启动子的实例在本文其它地方描述。作为另一具体实例，自删除选择盒可包含潮霉素抗性基因编码序列，所述潮霉素抗性基因编码序列可操作地连接至一个或多个启动子(例如人泛素启动子和EM7启动子)，随后是多腺苷酸化信号，接着是可操作地连接到一个或多个启动子(例如mPrm1启动子)的Crei编码序列，然后是另一个多腺苷酸化信号，其中整个盒的侧面是loxP位点。
突变的SLC30A8基因座也可以是条件等位基因。例如，条件等位基因可以是多功能等位基因，如US 2011/0104799中所述的，其出于所有目的通过引用整体并入本文。例如，条件等位基因可以包含：(a)相对于靶基因的转录而言呈有义方向的启动序列(actuatingsequence)；(b)呈有义或反义方向的药物选择盒(DSC)；(c)呈反义方向的目的核苷酸序列(NSI)；以及(d)呈反向方向(reverse orientation)的逆转条件模块(COIN，利用外显子断裂内含子和可逆转的基因诱捕样模块)。参见，例如，US 2011/0104799。条件等位基因可进一步包含在暴露于第一重组酶时重组以形成条件等位基因的可重组单元，该条件等位基因(i)缺少启动序列和DSC；以及(ii)在有义方向包含NSI，在反义方向包含COIN。参见，例如，US 2011/0104799。
C.包含突变的Slc30a8基因座的非人动物基因组、非人动物细胞，和非人动物
提供了包含如本文其它地方所述的突变的Slc30a8基因座的非人动物基因组、非人动物细胞，和非人动物。基因组、细胞，或非人动物可以是雄性或雌性。对于突变的Slc30a8基因座，基因组、细胞，或非人动物可以是杂合的或纯合的。二倍体生物在每个遗传位点具有两个等位基因。每对等位基因代表特定遗传基因座的基因型。如果在特定位点有两个相同的等位基因，则基因型被描述为纯合子(homozygous)；如果两个等位基因不同，则基因型被描述为杂合子(heterozygous)。
本文提供的非人动物基因组或细胞可以是，例如，包含Slc30a8基因座或与人SLC30A8基因座同源或种间同源的基因组基因座的任何非人动物基因组或细胞。基因组可以来自或细胞可以是真核细胞，其包括例如动物细胞、哺乳动物细胞、非人哺乳动物细胞，和人类细胞。术语“动物”包括动物界的任何成员，包括例如哺乳动物、鱼类、爬行动物、两栖动物、鸟类，和蠕虫。哺乳动物细胞可以是，例如，非人哺乳动物细胞、啮齿动物细胞、大鼠细胞、小鼠细胞，或仓鼠细胞。其它非人哺乳动物包括，例如，非人灵长类动物、猴子、猿、猩猩、猫、狗、兔子、马、家畜(例如牛科动物如奶牛、阉牛等；绵羊科动物如绵羊、山羊等；以及猪科动物如猪和野猪)。还包括家养动物和农业动物。术语“非人”不包括人类。
细胞也可以为任何类型的未分化或分化状态。例如，细胞可以是全能细胞、多能细胞(例如人多能细胞或非人多能细胞如小鼠胚胎干(ES)细胞或大鼠ES细胞)，或非多能细胞。全能细胞包括可产生任何细胞类型的未分化细胞，多能细胞包括具有发展为多于一种分化细胞类型的能力的未分化细胞。这样的多能和/或全能细胞可以是，例如，ES细胞或ES样细胞，例如诱导性多能干(iPS)细胞。ES细胞包括胚胎来源的全能或多能细胞，当引入胚胎后，它们能够促进发育中的胚胎的任何组织。ES细胞可以源自胚泡的内细胞群，并且能够分化为三个脊椎动物胚层(内胚层、外胚层，和中胚层)中任何一个的细胞。
本文提供的细胞也可以是生殖细胞(例如精子或卵母细胞)。该细胞可以是有丝分裂潜能细胞(mitotically competent cells)或有丝分裂惰性细胞、减数分裂潜能细胞或减数分裂惰性细胞。类似地，细胞也可以是初级体细胞或非初级体细胞的细胞。体细胞包括不是配子、生殖细胞、配子母细胞，或未分化干细胞的任何细胞。例如，细胞可以是β细胞、胰岛细胞，或胰腺细胞。
本文提供的合适的细胞还包括初级细胞。初级细胞包括直接从生物体、器官，或组织分离的细胞或细胞培养物。初级细胞包括既未转化也非永生的细胞。它们包括获自生物体、器官，或组织的任何细胞，所述细胞先前没有在组织培养中进行传代或先前已经在组织培养中进行了传代但是无法在组织培养中进行无限传代。这样的细胞可以通过常规技术分离，并且包括例如β细胞。
本文提供的其它合适的细胞包括永生化细胞。永生化细胞包括来自多细胞生物的细胞，这些细胞通常不会无限期增殖，但由于突变或改变(alternation)，其逃避了正常的细胞衰老而可以继续分裂。这样的突变或改变可以是自然发生的或有意诱导的。永生化细胞系的具体例子是EndoC-βH2、1.1B4、1.4E7、1.1E7、RIN、HIT、MIN、INS-1，和βTC细胞系。参见，例如，Scharfmann et al.(2014)J.Clin.Invest.124(5):2087-2098和McCluskey etal.(2011)J.Biol.Chem.286(25):21982-21992，出于所有目的，通过引用将其每一篇的全部内容整体并入本文。永生化细胞的许多类型是众所周知的。永生化或初级细胞包括通常用于培养或表达重组基因或蛋白质的细胞。
本文提供的细胞还包括单细胞期胚胎(即受精的卵母细胞或受精卵)。这样的单细胞期胚胎可以来自任何遗传背景(例如小鼠BALB/c、小鼠C57BL/6、小鼠129，或它们的组合)，可以是新鲜的或冷冻的，并且可以源自自然繁殖或体外受精。
本文提供的细胞可以是正常的健康细胞，或者可以是患病或携带突变的细胞。
包含本文描述的突变的Slc30a8基因座的非人动物可以通过本文其它地方描述的方法制备。术语“动物”包括动物界的任何成员，包括例如哺乳动物、鱼类、爬行动物、两栖动物、鸟类，和蠕虫。在具体的实施例中，非人动物是非人哺乳动物。非人哺乳动物包括，例如，非人灵长类动物、猴子、猿、猩猩、猫、狗、马、兔子、啮齿动物(如小鼠、大鼠、仓鼠，以及豚鼠)，以及家畜(例如牛科动物如奶牛和阉牛；绵羊科动物如绵羊和山羊；以及猪科动物如猪和野猪)。还包括家养动物和农业动物。术语“非人”不包括人类。优选的非人动物包括例如啮齿动物，例如小鼠和大鼠。
非人动物可以来自任何遗传背景。例如，合适的小鼠可以来自129种系、C57BL/6种系、129种系和C57BL/6种系的混合、BALB/c种系，或Swiss Webster种系。129种系的实例包括129P1、129P2、129P3、129X1、129S1(例如129S1/SV、129S1/Svlm)、129S2、129S4、129S5、129S9/SvEvH、129S6(129/SvEvTac)、129S7、129S8、129T1，和129T2。参见，例如，Festing etal.(1999)Mammalian Genome 10:836，出于所有目的通过引用整体并入本文。C57BL种系的实例包括C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/Kal_wN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr，和C57BL/Ola。合适的小鼠还可来自于前述129种系和前述C57BL/6种系的混合(例如50％129和50％C57BL/6)。类似地，合适的小鼠可来自于前述129种系的混合或前述BL/6种系的混合(例如129S6(129/SvEvTac)种系)。
类似地，大鼠可来自于任何大鼠种系，包括例如ACI大鼠种系、Dark Agouti(DA)大鼠种系、Wistar大鼠种系、LEA大鼠种系、Sprague Dawley(SD)大鼠种系，或Fischer大鼠种系(例如Fisher F344或Fisher F6)。大鼠还可获自衍生自上述两种或多种种系的混合的种系。例如，合适的大鼠可获自DA种系或ACI种系。ACI大鼠种系被表征为具有黑色刺豚鼠，其具有白色腹部和足部以及RT1av1单体型。这些种系可获自包括Harlan实验室在内的多种不同的来源。Dark Agouti(DA)大鼠种系被表征为具有刺鼠皮(agouti coat)和RT1av1单体型。这些大鼠获自包括Charles River和Harlan实验室在内的多种不同的来源。一些合适的大鼠可来自同系交配大鼠种系。参见，例如，US2014/0235933，其全部内容出于所有目的通过引用并入本文。
III.制备包含突变的Slc30a8基因座的非人动物的方法
提供了制备包含如本文其它地方所公开的突变的Slc30a8基因座的非人动物基因组、非人动物细胞，或非人动物的各种方法。用于产生转基因生物的任何方便的方法或方案都适用于产生这种转基因非人动物。参见，例如，Cho et al.(2009)Current Protocols inCell Biology42:19.11:19.11.1–19.11.22和Gama Sosa et al.(2010)BrainStruct.Funct.214(2-3):91-109，出于所有目的，将其每一篇均通过引用整体并入本文。这样的经遗传修饰的非人动物可以例如通过在靶定的Slc30a8基因座处的基因敲入来产生。
例如，产生包含突变的Slc30a8基因座的非人动物的方法可以包括：(1)修饰多能细胞的基因组以包含突变的Slc30a8基因座；(2)识别或选择包含突变的Slc30a8基因座的经遗传修饰的多能细胞；(3)将经基因修饰的多能细胞导入非人动物宿主胚胎中；以及(4)将宿主胚胎植入代孕母体并在代孕母体中孕育。例如，产生包含突变的Slc30a8基因座的非人动物的方法可以包括：(1)修饰多能细胞的基因组以包含突变的Slc30a8基因座；(2)识别或选择包含突变的Slc30a8基因座的经遗传修饰的多能细胞；(3)将经基因修饰的多能细胞导入非人动物宿主胚胎中；以及(4)在代孕母体中孕育宿主胚胎。可选地，可孵育包含修饰的多能细胞(例如非人ES细胞)的宿主胚胎直至囊泡阶段，随后将其植入代孕母体并在代孕母体中孕育以产生F0非人动物。随后代孕母体可产生包含突变的Slc30a8基因座的F0代非人动物。
所述方法可进一步包括识别具有修饰的靶标基因组基因座(即突变的Slc30a8基因座)的细胞或动物。可使用各种方法识别具有靶定的基因组修饰的细胞和动物。
修饰基因组的步骤可以例如利用外源修复模板(例如靶向载体)来修饰Slc30a8基因座，以包含本文公开的Slc30a8突变。作为一个实例，靶向载体可以用于在内源Slc30a8基因座(例如内源非人动物Slc30a8基因座)处产生突变的Slc30a8基因，其中所述靶向载体包括在所述内源Sc30a8基因座处靶向5'靶序列的5'同源臂，以及在所述内源Slc30a8基因座处靶向3'靶序列的3'同源臂，其中靶向载体包含Slc30a8基因中的突变，其中突变的Slc30a8基因编码截短的SLC30A8蛋白。作为一个具体实例，该突变可以导致对应于人SLC30A8蛋白中残基138的密码子的终止密码子。
外源修复模板可以用于非同源末端连接介导的插入或同源重组。外源修复模板可以包含脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，它们可以是单链或双链的，并且它们可以是线性或环状的形式。例如，修复模板可以是单链寡脱氧核苷酸(ssODN)。
外源修复模板也可以包含核酸插入物，该核酸插入物包括要整合在Slc30a8基因座中的DNA片段。Slc30a8基因座中核酸插入片段的整合可导致在Slc30a8基因座中添加目标核酸序列、在Slc30a8基因座中删除目标核酸序列，或置换Slc30a8基因座中的目标核酸序列(即删除和插入)。
外源修复模板也可以包含不存在于非靶定内源Slc30a8基因座处的异源序列。例如，外源修复模板可以包含选择盒，例如侧面有重组酶识别位点的选择盒。
一些外源修复模板包含同源臂。如果外源修复模板酸还包含核酸插入物，则同源臂可以位于核酸插入物的侧面。为了便于参考，本文将同源臂称为5’和3’(即上游和下游)同源臂。该术语涉及同源臂与外源修复模板内的核酸插入物的相对位置。5’和3’同源臂对应于Slc30a8基因座内的区域，其在本文分别称为“5’靶序列”和“3’靶序列”。
当两个区域彼此共享足够水平的序列同一性以充当同源重组反应的底物时，同源臂和靶序列“对应”或彼此“对应”。术语“同源”包括与相应序列相同或共享序列同一性的DNA序列。给定靶序列与外源修复模板中发现的相应同源臂之间的序列同一性可以是允许同源重组发生的任何程度的序列同一性。例如，外源修复模板(或其片段)的同源臂和靶序列(或其片段)共有的序列同一性的量可以为至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，或100％的序列同一性，以使这些序列进行同源重组。此外，同源臂和对应靶序列之间的对应同源区域可以为足以促进同源重组的任何长度。在一些靶向载体中，Slc30a8基因座中的预期突变包括在同源臂之一中。在其它靶向载体中，Slc30a8基因座中的预期突变包括在侧面为同源臂的插入核酸中。
在单细胞期胚胎以外的细胞中，外源修复模板可以是“大靶向载体”或“LTVEC”，其包括靶向载体，所述靶向载体包含对应于并衍生自核酸序列的同源臂，该核酸序列大于用于在细胞中进行同源重组的其它方法所通常使用的核酸序列。LTVEC还包括靶向载体，该靶向载体包含具有核酸序列的核酸插入物，该核酸序列大于用于在细胞中进行同源重组的其它方法所通常使用的核酸序列。例如，LTVEC使大基因座的修饰成为可能；由于其尺寸限制，传统的基于质粒的靶向载体无法容纳该大基因座。例如，靶定基因座可以是(即5'和3'同源臂可以对应于)在不存在核酸酶试剂(例如Cas蛋白)诱导的切口或双链断裂时使用常规方法不可靶定的或只能被错误地靶定的或仅以非常低的效率被靶定的细胞的基因座。LTVEC可以是任何长度，通常长度至少为10kb。LTVEC中5'同源臂和3'同源臂的总和通常至少为10kb。
筛选步骤可以包括例如用于评估亲代染色体的等位基因修饰(MOA)的定量测定。例如，可以通过定量PCR，例如实时PCR(qPCR)，来进行定量测定。实时PCR可以利用识别靶基因座的第一引物组和识别非靶参考基因座的第二引物组。引物组可以包含识别扩增的序列的荧光探针。在例如US2014/0178879和Frendewey et al.(2010)Methods Enzymol.476:295-307中描述了等位基因修饰(MOA)测定，包括等位基因丢失(LOA)测定和等位基因获得(GOA)测定，出于所有目的，通过引用将其每一篇的全部内容并入本文。也可以使用在US2016/0145646和WO 2016/081923中所描述的保留测定(retention assays)，出于所有目的将其每一篇的全部内容通过引用整体并入本文。
合适的定量测定的其它实例包括荧光介导原位杂交(FISH)、比较基因组杂交、等温DNA扩增、定量杂交至固定探针、
Figure BDA0002577214450000371
探针、
Figure BDA0002577214450000372
分子信标探针，或ECLIPSETM探针技术(参见例如US2005/0144655，其出于所有目的以全文引用方式并入本文)。
合适的多能细胞的例子是胚胎干(ES)细胞(例如小鼠ES细胞或大鼠ES细胞)。修饰的多能细胞可通过例如重组产生，通过：(a)将一种或多种外源供体核酸(例如靶向载体)引入细胞中，该外源供体核酸包含侧面为，例如，对应于5'和3'靶位点的5'和3'同源臂的可选的插入核酸，其中插入核酸或同源臂之一包含突变的Slc30a8基因座或将在Slc30a8基因座处进行的突变；以及(b)识别至少一个细胞，所述细胞在其基因组中包含在内源Slc30a8基因座处整合的插入核酸。修饰的多能细胞可以例如通过重组产生，通过：(a)将一种或多种靶向载体引入细胞中，所述靶向载体包含侧面为对应于5'和3'靶位点的5'和3'同源臂的插入核酸，其中该插入核酸包含突变的Slc30a8基因座或将在Slc30a8基因座处产生的突变；以及(b)识别至少一个细胞，所述细胞在其基因组中包含在内源Slc30a8基因座处整合的插入核酸。可以使用任何靶向载体。在一个实例中，使用大靶向载体(LTVEC)。LTVEC可具有，例如，至少为10kb的长度，或者可具有5'和3'同源臂，其总和至少为10kb的长度。作为另一个例子，靶向载体可以是单链寡脱氧核苷酸(ssODN)。ssODN的长度可以为，例如，约80至约200个核苷酸之间。
替代地，修饰的多能细胞可以通过以下产生：(a)向细胞中引入：(i)核酸酶剂，其中所述核酸酶剂在内源Slc30a8基因座内的识别位点处诱导切口或双链断裂；以及(ii)一种或多种外源供体核酸(例如靶向载体)，其可选地包含插入核酸，所述插入核酸的侧面为，例如，对应于5'和3'靶位点的5'和3'同源臂，所述5'和3'靶位点位于与识别位点足够接近之处，其中所述插入核酸或同源臂之一包含突变的Slc30a8基因座或将在Slc30a8基因座处进行的突变；以及(c)识别至少一个在内源Slc30a8基因座处包含修饰(例如插入核酸的整合)的细胞。替代地，修饰的多能细胞可以通过以下产生：(a)向细胞中引入：(i)核酸酶剂，其中所述核酸酶剂在内源Slc30a8基因座内的识别位点处诱导切口或双链断裂；以及(ii)一种或多种靶向载体，其包含侧面为对应于5'和3'靶位点的5'和3'同源臂的插入核酸，所述5'和3'靶位点位于与识别位点足够接近之处，其中所述插入核酸包含突变的Slc30a8基因座或将在Slc30a8基因座处进行的突变；以及(c)识别至少一个在内源Slc30a8基因座处包含修饰(例如插入核酸的整合)的细胞。可以使用诱导切口或双链断裂进入所需的识别位点的任何核酸酶试剂。合适的核酸酶的实例包括类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)、兆核酸酶，和成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关(Cas)系统(例如CRISPR/Cas9系统)或此类系统的组分(例如CRISPR/Cas9)。参见，例如，US2013/0309670和US 2015/0159175，出于所有目的将每一篇的全部内容通过引用整体并入本文。在例如US 2016/0145646和WO 2016/081923中描述了对细胞进行靶定修饰的合适方法的实例，出于所有目的将其每一篇的全部内容通过引用整体并入本文。
供体细胞可以在任何期(例如胚泡期或桑椹胚前期(pre-morula stage，即4细胞期或8细胞期))引入宿主胚胎。产生能够通过种系传递遗传修饰的后代。参见，例如，美国专利号7,294,754，其出于所有目的通过引用整体并入本文。
替代地，产生本文本文其它地方所述的非人动物的方法可包括：(1)使用上述修饰多能细胞的方法修饰单细胞期胚胎的基因组，以包含突变的Slc30a8基因座；(2)选择基因修饰的胚胎；和(3)将该基因修饰的胚胎植入代孕母体到并在代孕母体中孕育。替代地，产生本文其它地方所述的非人动物的方法可包括：(1)使用上述修饰多能细胞的方法修饰单细胞期胚胎的基因组，以包含突变的Slc30a8基因座；(2)选择基因修饰的胚胎；和(3)在代孕母体中孕育该基因修饰的胚胎。产生了能够通过种系传递遗传修饰的后代。
核转移技术也可以用于产生非人动物。简而言之，核转移的方法可以包括以下步骤：(1)将卵母细胞去核或提供去核卵母细胞；(2)分离或提供将与该去核卵母细胞结合的供体细胞或核；(3)将细胞或核插入去核卵母细胞中以形成重组细胞；(4)将重组细胞植入动物子宫内形成胚胎；以及(5)允许该胚胎发育。在这种方法中，卵母细胞通常是从死去的动物身上获得的，尽管它们也可以从活体动物的输卵管和/或卵巢中分离。去核之前，卵母细胞可在多种众所周知的培养基中成熟。卵母细胞的去核可以多种公知的方式进行。可以通过融合前在透明带下显微注射供体细胞，将供体细胞或核插入去核卵母细胞以形成重构细胞。可以通过在接触/融合平面上施加直流电脉冲(电融合)，通过将细胞暴露于融合促进化学物质(例如聚乙二醇)或通过灭活病毒(例如仙台病毒)来诱导融合。重建的细胞可以在核供体和受体卵母细胞融合之前、之中，和/或之后通过电和/或非电方式激活。激活方法包括电脉冲、化学诱导的电击、精子穿透、卵母细胞中二价阳离子水平的增加，以及卵母细胞中细胞蛋白的磷酸化的降低(通过激酶抑制剂的方式)。活化的重组细胞或胚胎可以在众所周知的培养基中培养，然后转移到动物的子宫中。参见，例如，US 2008/0092249、WO 1999/005266、US 2004/0177390、WO 2008/017234，和美国专利号7,612,250，出于所有目的将其每一篇的全部内容通过引用整体并入本文。
本文提供的各种方法允许产生遗传修饰的非人F0动物，其中遗传修饰的F0动物的细胞包含突变的Slc30a8基因座。取决于用于产生F0动物的方法，F0动物中具有突变的Slc30a8基因座的细胞数量将有所不同。通过例如
Figure BDA0002577214450000401
方法将供体ES细胞从相应的生物体(例如8细胞期小鼠胚胎)导入到桑椹胚前期胚胎中，从而使F0动物的细胞群体的更高百分比包含具有目的核苷酸序列的细胞，所述目的核苷酸序列包含靶定的遗传修饰。例如，至少50％、60％、65％、70％、75％、85％、86％、87％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的非人F0动物的细胞贡献可包括具有靶定修饰的细胞群体。
遗传修饰的F0动物的细胞对于突变的Slc30a8基因座可以是杂合的，或者对于突变的Slc30a8基因座可以是纯合的。
IV.化合物筛选方法
具有本文所述的突变的Slc30a8基因座的非人动物可以用于筛选化合物对于抑制、改善，或减轻II型糖尿病或改善II型糖尿病样症状潜在地有用的活性，或者筛选化合物对于促进或加剧II型糖尿病或II型糖尿病样症状方面潜在地有害的活性。通过监测与本文所描述的保护性突变Slc30a8基因座相关的表型方面，野生型非人动物或没有本文所述的突变的Slc30a8基因座的非人动物也可以被用于筛选化合物对于抑制、改善，或减轻II型糖尿病或改善II型糖尿病样症状潜在地有用的活性，或者筛选化合物对于促进或加剧II型糖尿病或II型糖尿病样症状方面潜在地有害的活性。具有抑制、改善，或减轻II型糖尿病或改善II型糖尿病样症状的活性的化合物潜在地可用作针对II型糖尿病的治疗剂或预防剂。具有促进或加剧II型糖尿病或II型糖尿病样症状的活性的化合物被识别为有毒，并应避免作为治疗剂或避免在其可能与人类接触的其它情况下使用(例如在食品、农业、建筑，或供水中)。
可以筛选的化合物的实例包括抗体、抗原结合蛋白、位点特异性DNA结合蛋白(例如CRISPR-Cas复合物)、多肽、β转角模拟物、多糖、磷脂、激素、前列腺素、类固醇、芳族化合物、杂环化合物、苯二氮
Figure BDA0002577214450000411
、低聚N取代的甘氨酸，和低聚氨基甲酸酯。化合物的大组合文库可以通过WO 1995/012608、WO 1993/006121、WO 1994/008051、WO 1995/035503，和WO1995/030642中所述的编码合成文库(ESL)方法构建，其每一篇出于所有目的通过引用整体并入本文。也可以通过噬菌体展示方法产生肽文库，参见，例如，US 5,432,018，出于所有目的通过引用整体并入本文。在例如WO 2014/204727、WO 2014/093701、WO 2015/065964，和WO 2016/011080中公开了向导RNA的文库将CRISPR-Cas系统靶向不同基因的用途，其每一篇出于所有目的通过引用整体并入本文。
基于动物的测定通常包括向包含突变的Slc30a8基因座的非人动物施用化合物，并评估与人类II型糖尿病的征兆或症状非常相似的征兆或症状、与II型糖尿病有关的征兆或症状，或评估与人类的葡萄糖、胰岛素、葡萄糖代谢，或II型糖尿病相关的表型方面的响应变化。可以在使非人动物与该化合物接触之前或之后，或通过对具有相同Slc30a8突变(例如野生型同胞兄弟姐妹)而没有该化合物的对照动物进行对照实验来评估该变化。
可以被监测的合适的表型方面包括，例如，分泌胰岛素的能力。例如，可以监测进食高脂饮食时分泌胰岛素的能力。替代地，可以监测响应于高血糖症(例如严重高血糖症)而分泌胰岛素的能力。例如，胰岛素分泌可以响应于由胰岛素受体抑制引起的高血糖症，例如由胰岛素受体拮抗剂S961引起的高血糖症。
可以被监测的其它合适的表型方面包括线粒体基因表达(例如线粒体氧化磷酸化(OXPHOS)系统中的基因表达)或Hvcn1的表达。此类线粒体基因的实例在实施例2和表6-8中更详细地描述。可以监测的其它合适的表型方面包括喂饲对照的普通饮食或胰岛素清除时的胰岛素/C肽之比。可以监测的其它合适的表型方面包括胰岛锌积累。
可以监测的其它合适的表型方面包括，例如，(1)当饲喂高脂饮食时葡萄糖诱导的胰岛素分泌(例如饲喂高脂饮食20周后的循环胰岛素水平)；(2)饲喂高脂饮食时(例如饲喂高脂饮食20周后)的胰岛β细胞增殖水平；(3)饲喂高脂饮食时(例如饲喂高脂饮食20周后)的胰岛β细胞数量；以及(4)在胰岛素受体被阻断后(例如通过使用S961)的进食血浆胰岛素水平。替代地或另外地，可以被监测的合适的表型方面包括，例如，当饲喂高脂饮食时的胰岛素原与胰岛素之比或胰岛素加工以及胰岛β细胞的健康。
例如，可以通过以下一项或两项来识别加剧II型糖尿病的活性：(1)降低的分泌胰岛素的能力(例如当饲喂高脂饮食或响应高血糖症时)或(2)降低的胰岛素清除(例如当喂饲对照普通饮食时增加的胰岛素/C肽之比)。也可以通过以下一项或两项来识别加剧II型糖尿病的活性：(1)增加的线粒体基因表达(例如线粒体氧化磷酸化(OXPHOS)系统中的基因表达)或(2)降低的Hvcn1表达。
还可通过以下一项或多项或全部来识别加剧II型糖尿病的活性：(1)饲喂高脂饮食时葡萄糖诱导的胰岛素分泌减少(例如，饲喂高脂饮食20周后循环胰岛素水平降低)；(2)饲喂高脂饮食时(例如饲喂高脂饮食20周后)，胰岛β细胞增殖减少；(3)饲喂高脂饮食时(例如饲喂高脂饮食20周后)，胰岛β细胞数量减少；以及(4)在胰岛素受体被阻断后，进食血浆胰岛素水平下降。替代地或另外地，可以通过胰岛素原与胰岛素之比的增加以及胰岛素加工和胰腺β细胞的健康的恶化中的一种或多种或全部来识别加剧II型糖尿病的活性(例如，如饲喂高脂饮食时胰岛素原与胰岛素之比的增加所证明的)。
替代地，可以通过以下一项或两项鉴定改善II型糖尿病的活性：(1)增加的分泌胰岛素的能力(例如当饲喂高脂饮食或响应高血糖症时)或(2)增加的胰岛素清除(例如当喂饲对照普通饮食时增加的胰岛素/C肽之比)。也可以通过以下一项或两项来识别加剧II型糖尿病的活性：(1)降低的线粒体基因表达(例如线粒体氧化磷酸化(OXPHOS)系统中的基因表达)或(2)增加的Hvcn1表达。
还可通过以下一项或多项或全部来识别改善II型糖尿病的活性：(1)饲喂高脂饮食时葡萄糖诱导的胰岛素分泌增加(例如，饲喂高脂饮食20周后循环胰岛素水平增加)；(2)饲喂高脂饮食时(例如饲喂高脂饮食20周后)，胰岛β细胞增殖增加；(3)饲喂高脂饮食时(例如饲喂高脂饮食20周后)，胰岛β细胞数量增加；以及(4)在胰岛素受体被阻断后，进食血浆胰岛素水平增加。替代地或另外地，可以通过胰岛素原与胰岛素之比的减少以及胰岛素加工和胰腺β细胞的健康的提高中的一种或多种或全部来识别改善II型糖尿病的活性(例如，如饲喂高脂饮食时胰岛素原与胰岛素之比的降低所证明的)。
可以如本文提供的实施例中所述测定此类表型方面。减少或增加可为统计上显著的。例如，减少或增加可为至少约1％、至少约2％、至少约3％、至少约4％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％，或100％。
出于所有目的，上文或下文所引用的所有专利文件、网站、其它出版物、登录号等均以引用的方式整体并入本文，其程度与将每个单独的项目具体并单独地指示为通过引用并入本文的程度相同。如果序列的不同版本在不同时间与登录号相关联，则意指着在本申请的有效申请日与登录号相关联的版本。有效申请日是指实际的申请日或提及登录号的优先权申请(如有的话)的申请日中较早的日期。同样，如果在不同时间发布了出版物，网站等的不同版本，则除非另有说明，是指在本申请的有效申请日最近发布的版本。除非另外明确指出，否则本发明的任何特征、步骤、元素、实施例，或方面可以与任何其它相结合使用。
序列简述
使用核苷酸碱基的标准字母缩写和氨基酸的三字母代码示出所附序列表中列出的核苷酸和氨基酸序列。核苷酸序列遵循从序列5'末端开始并向前(即每行从左到右)到3'末端的标准约定。每个核苷酸序列仅显示一条链，但任何对所示出的链提及均应理解为包括互补链。当提供编码氨基酸序列的核苷酸序列时，应当理解还提供了其编码相同氨基酸序列的密码子简并变体。氨基酸序列遵循从序列的氨基末端开始并向前(即在每行中从左至右)到达羧基末端的标准约定。
表2：序列描述
Figure BDA0002577214450000441
实施例
实施例1.包含突变的Slc30a8基因座的小鼠的产生
为了产生携带对应于假定人SLC30A8 LOF等位基因(c.412C>T(转录物登录号NM_173851.2)，p.Arg138X)的等位基因的小鼠模型，产生了突变的小鼠Slc30a8等位基因(c.409C>T(转录物登录号NM_172816.3)，p.Arg137X)。表3提供了有关小鼠Slc30a8和人SLC30A8基因的信息。图11示出了人SLC30A8和小鼠SLC30A8蛋白的比对。突变的等位基因在外显子3中编码R137的小鼠Slc30a8密码子上具有dC取代为dT(c.409C>T)，将密码子从CGA更改为TGA(p.Arg137X)，从而产生了预期会产生截短蛋白的终止密码子。突变的等位基因还具有一个自删除的新霉素选择盒，其侧面是在内含子3处插入的loxP位点(loxP-mPrm1-Crei-hUb1-em7-Neo-pA-loxP盒(4,810bp))，删除了29bp的内源内含子序列。内源Slc30a8基因座示于图10A，而靶定的Slc30a8基因座示于图10B。包含Slc30a8内含子2/Slc30a8外显子3pArg137*/Slc30a8内含子3的边界的区域的预期序列(在图10B中由水平线“A”表示)在SEQ ID NO：8中列出。包含Slc30a8内含子3/XhoI/(loxP)自删除盒的边界的区域的预期序列(在图10B中由水平线“B”表示)在SEQ ID NO：9中列出。包含自删除盒(loxP)/ICEUI/NheI/Slc30a8内含子3的边界的区域的预期序列(在图10B中由水平线“C”表示)在SEQ IDNO：10中列出。
表3：小鼠Slc30a8和人SLC30A8。
小鼠 人
正式符号 Slc30a8 SLC30A8
NCBI基因ID 239436 169026
主要来源 MGI:2442682 HGNC:20303
RefSeq mRNA ID NM_172816.3 NM_173851.2
UniProt ID Q8BGG0 Q8IWU4
基因组组装 GRCm38.p4 GRCh38.p7
位置 Chr 15:52295553-52335733(+) Chr 8:116950273-117176714(+)
图10C示出了在删除自删除
loxP-mPrm1-Crei-hUb1-em7-Neo-pA-loxP盒之后的靶定的Slc30a8基因座。盒删除后，loxP和克隆位点(77bp)保留在Slc30a8内含子3中。包括Slc30a8内含子2/Slc30a8外显子3pArg137*/Slc30a8内含子3的边界的区域的预期序列(在图10C中由水平线“A”表示)在SEQID NO：8中列出。包括Slc30a8内含子3/XhoI/loxP/ICEUI/NheI/Slc30a8内含子3的边界的区域的预期序列(在图10C中用水平线“B”表示)在SEQ ID NO：11中列出。
产生了大靶向载体，其包含5'同源臂，该5'同源臂包括在Slc30a8中靶定被删除的区域上游的62kb的序列(但具有在编码R137的小鼠Slc30a8密码子的点突变)和在Slc30a8中靶定被删除的区域下游136kb的序列。该大靶向载体被设计为以在编码R137的外显子3中的小鼠Slc30a8密码子中引入点突变，并用4,810bp自删除新霉素选择盒替换内含子3中的29bp区域。参见图10B。自删除新霉素选择盒包括从5'至3'的以下组件：loxP位点、小鼠鱼精蛋白(Prm1)启动子、Crei(经优化以包含内含子的Cre编码序列)、人泛素启动子、EM7启动子、新霉素磷酸转移酶(neor)编码序列、polyA，和loxP位点。为了产生靶定等位基因，将CRISPR/Cas9组件与大靶向载体一起引入F1H4小鼠胚胎干细胞。使用表4中列出的引物和探针进行等位基因丢失测定(loss-of-allele assays)和等位基因特异性
Figure BDA0002577214450000461
测定，以确认Slc30a8等位基因的正确修饰。在图10A中，等位基因丢失测定表示为“8084TD”(
Figure BDA0002577214450000462
下游测定)，等位基因特异性测定表示为“8084AS”(等位基因特异性测定)。此类测定描述于，例如，US 2014/0178879；US 2016/0145646；WO 2016/081923；和Frendewey etal.(2010)Methods Enzymol.476:295-307，出于所有目的，通过引用将其每一篇的全部内容并入本文。
表4：用于检测靶定的Slc30a8基因座的测定。
Figure BDA0002577214450000471
然后使用
Figure BDA0002577214450000472
方法，从靶定的ES细胞克隆中产生F0小鼠。参见，例如，US 7,576,259；US 7,659,442；US 7,294,754；US 2008/007800；和Poueymirou et al.(2007)Nature Biotech.25(1):91-99，出于所有目的，通过引用将其每一篇的全部内容并入本文。
从野生型小鼠基因座表达的期望的SLC30A8蛋白的序列在SEQ ID NO：12中列出。从靶定的小鼠基因座(SLC30A8 Arg137*)表达的期望的截短的SLC30A8蛋白的序列在SEQID NO：13中列出。两个序列的比对示于图11。
实施例2：SLC30A8 R138X小鼠的表征。
概要
SLC30A8编码锌转运蛋白，其主要在胰腺的胰岛中表达。在β细胞中，它将锌转运到含胰岛素的分泌颗粒中。SLC30A8中的功能失去(LOF)突变可预防人类的II型糖尿病。已表征了几种Slc30a8基因敲除小鼠品系，但不能完全概括人类的表型。确实，Slc30a8缺陷小鼠的血浆胰岛素水平降低且葡萄糖耐量降低，这是一种我们此处在对照Slc30a8缺陷小鼠中重复出的表型。我们生成了在小鼠Slc30a8基因座(c.409C>T(转录物登录号NM_172816.3)，p.Arg137X)中带有突变的敲入小鼠模型，该突变对应于人SLC30A8假定LOF突变R138X。尽管小鼠Slc30a8基因中的突变是在编码小鼠SLC30A8蛋白的氨基酸残基137的密码子中，但参考相应的人类突变，这些小鼠在本文中被称为“R138X小鼠”。有趣的是，当饲喂高脂饮食时，R138X小鼠的葡萄糖诱导的胰岛素分泌增加。这与增加的β细胞增殖和β细胞面积的扩张有关。重要地，杂合R138X小鼠显示出相似的葡萄糖诱导的胰岛素分泌的增加。相比之下，普通饲喂的R138X小鼠具有正常的体重、葡萄糖耐量，和胰腺β细胞质量。有趣的是，在胰岛素受体拮抗剂S961诱导的高血糖症的情况下，R138X小鼠显示出增加了约50％的胰岛素分泌。该作用与增加的β细胞增殖或β细胞质量无关。这些数据表明，人类中的SLC30A8 R138X突变部分地通过增加β细胞分泌胰岛素的能力来预防II型糖尿病。这可能部分地由数量增加的胰腺β细胞介导。
介绍
SLC30A8是位于内分泌胰腺的胰岛细胞中的锌转运蛋白(ZnT8)。在β细胞中，SLC30A8将锌转运到含胰岛素的颗粒中。两个锌离子与胰岛素的六聚体形式结合并稳定它们，从而触发胰岛素结晶。参见，例如，Dodson和Steiner(1998)Curr.Opin.Struct.Biol.8(2):189-194，出于所有目的通过引用整体并入本文。胰岛SLC30A8的损失虽然会极大地降低胰岛锌的含量和胰岛素的结晶，但其对胰岛素原加工、分泌和葡萄糖代谢的调控的影响仍不清楚。参见，例如，Lemaire et al.(2009)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.106(35):14872-14877和Nicolson et al.(2009)Diabetes 58(9):2070-2083，出于所有目的将其每一篇通过引用整体并入本文。几个研究小组已整体地或仅限于胰腺β细胞地生成了Slc30a8基因敲除(KO)小鼠模型。这些模型所观察到的代谢表型较弱，且尽管研究之间存在差异，但大多数模型显示的是没有变化或与血浆胰岛素水平降低或不变相关的葡萄糖耐量的轻度损害。参见，例如，Rutter et al.(2016)Proc.Nutr.Soc.75(1):61-72，出于所有目的通过引用整体并入本文。最重要的是，没有一项研究报告了与Slc30a8的缺乏相关的有益作用。因此，当Flannick及其同事报道SLC30A8的单倍剂量不足可预防人类II型糖尿病(T2D)的发展时，这是令人惊讶的。参见，例如，Flannick et al.(2014)Nat.Genet.46(4):357-363，出于所有目的通过引用整体并入本文。他们的研究识别了12种假定功能失去(LOF)变体，这些变体集体将T2D的风险降低了65％。引起提前终止密码子的最大量的变体之一，p.Arg138*(在本文中称为R138X)单独与预防T2D相关，并据报道编码不稳定的ZnT8蛋白。参见，例如，Flannick et al.(2014)Nat.Genet.46(4):357-363，出于所有目的通过引用整体并入本文。因此，小鼠和人类数据似乎相互矛盾，目前尚不清楚罕见的假定LOF变体如何降低T2D风险。
为了研究人SLC30A8假定LOF变体与Slc30a8 KO小鼠模型之间的这种差异，并深入了解为何SLC30A8假定LOF变体在人类中具有保护性，我们生成并表型化了带有R138X突变的新Slc30a8小鼠模型作为代表性的人假定LOF变体。有趣的是，我们发现R138X小鼠中的β细胞具有响应严重高血糖症的非凡的分泌胰岛素的能力。
结果
尽管部分保护了R138X转录物不受无义介导的衰变的影响，但R138X胰岛似乎显示出SLC30A8功能的丧失。为了研究人SLC30A8假定LOF变体如何影响T2D的风险，我们将小鼠基因组中编码氨基酸残基137(密码子137，相当于人中的138密码子)的Slc30a8的密码子从CGA更改为TGA，将精氨酸转变为终止密码子(R138X)，如实施例1中所详述的。R138X小鼠出生时具有预期的孟德尔比率，没有明显的生长异常。RNA原位杂交在野生型(WT)小鼠的胰岛中显示出强Slc30a8 mRNA染色，但在纯合Slc30a8 KO小鼠的胰岛中未见染色，验证了探针的特异性(图1A)。与来自Slc30a8 KO小鼠的胰岛相对，来自R138X小鼠的胰岛显示出大量的Slc30a8 RNA染色(图1A)。使用实时PCR定量Slc30a8 mRNA，显示R138X胰岛减少了70％，尽管R138X胰岛中的绝对Slc30a8转录物水平(CT值：22.2)仍然很高，并且与管家基因Gapdh(CT值：22.1)的表达水平相当(图1B)。R138X小鼠中这种高水平的Slc30a8 RNA的存在表明R138X转录物无法通过无义介导的mRNA降解而有效降解，所述无义介导的mRNA降解是一种会降解携带提前翻译终止密码子的mRNA的过程。参见，例如，Holbrook et al.(2004)Nat.Genet.36(8):801-808，出于所有目的通过引用整体并入本文。
为了确定在R138X小鼠中检测到的RNA是否被翻译成截短的蛋白质，我们使用针对小鼠蛋白质N末端肽产生的抗体，对SLC30A8蛋白质进行了蛋白质(免疫)印迹。尽管当在HEK293细胞中过表达时，能够检测R138X蛋白并通过蛋白酶体抑制使其稳定(图5)，但我们无法在当前条件下从分离的胰岛的裂解物中识别出预期分子量(单体为～16kDa)的截短蛋白(图1C)。类似地，对来自WT和R138X胰岛的全细胞裂解物或免疫沉淀物的质谱分析未识别出R138X胰岛中的SLC30A8肽(数据未显示)。此外，使用二硫腙进行锌染色后发现来自KO和R138X小鼠的胰岛为锌缺乏的，表明两种小鼠品系均不存在功能性SLC30A8蛋白(图1D)。然而，循环锌水平未观察到明显变化(图17)。总之，将人R138X假定LOF变体引入小鼠Slc30a8基因似乎会导致SLC30A8功能丧失。
饲喂普通饮食的R138X小鼠具有正常的代谢表型。我们首先研究了R138X终止密码子的引入是否改变了普通饲喂的小鼠的代谢参数。WT和R138X小鼠的体重、循环血糖和胰岛素水平无差异(图2A-2C、2L；表5)。由于锌与胰岛素的加工和清除密切关联，因此我们还测量了循环胰岛素原和C肽水平，并计算了这些激素与胰岛素之比(图2C-2F)。尽管循环C肽没有差异，但R138X小鼠的空腹胰岛素原水平略有降低(图2C)。WT和R138X小鼠之间的胰岛素原与胰岛素之比没有差异，但是在进食状态下C肽与胰岛素的之比略有升高，表明降低的低胰岛素清除(图2E-2F)。WT和R138X小鼠之间的循环胰岛素原和C肽水平相似(图2C-2D)。虽然胰岛素原/C肽之比没有变化，但我们确实观察到胰岛素/C肽之比的轻微降低，表明R138X小鼠中的胰岛素清除更高，与Slc30a8 KO小鼠中所观察到的相似(图2P)。参见，例如，Tamaki et al.(2013)J.Clin.Invest.123(10):4513-4524，出于所有目的通过引用整体并入本文。降低的葡萄糖耐量在R138X小鼠中不明显，且我们没有观察到葡萄糖诱导的胰岛素分泌的变化(图2G-2H)。R138X和对照组小鼠的葡萄糖耐量和胰岛素敏感性相似，且我们没有观察到葡萄糖诱导的胰岛素分泌的变化(图2G、2H，和2M)。另外，由于胰岛素和胰高血糖素的染色没有改变，因此胰岛锌的缺席不会影响胰岛的形态(图2I-2K；图6A-6B)。此外，因为β细胞和α细胞的质量没有改变，胰岛锌的缺席不会影响胰岛的形态，(图2I、2N、6A，和6E)。综上所述，这些数据表明，R138X变体不影响普通饲喂的小鼠体内的葡萄糖稳态或葡萄糖诱导的胰岛素分泌。
表5：SLC30A8 KO和R138X小鼠的体重。
基因型 性别 饮食 体重(g)
WT 公 普通 26±0.4
R138K 公 普通 27±0.4
WT 公 普通 29±1.1
KO 公 普通 27±0.6
WT 公 HFD 55±1.9
R138X 公 HFD 57±0.9
WT 公 HFD 53±1.4
KO 公 HFD 54±1.2
WT 公 HFD 51±0.9
R138HET 公 HFD 48±0.8
WT 母 HFD 54±4.2
R138X 母 HFD 54±2.1
表6：普通饲喂的SLC30A8 KO和R138X小鼠的身体组成。
Figure BDA0002577214450000511
我们还产生了Slc30a8 KO小鼠，其中删除了从Slc30a8起始密码子到Slc30a8终止密码子的编码序列(即整个编码序列)。然后，我们对遵循普通饮食的Slc30a8 KO小鼠进行了表型鉴定(图7A-7K)。与发表的结果一致，Slc30a8 KO小鼠表现出轻度的葡萄糖耐量降低和葡萄糖诱导的血浆胰岛素水平降低(图7B、7G、7H)。参见，例如，Lemaire et al.(2009)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.106(35):14872-14877；Nicolson et al.(2009)Diabetes 58(9):2070-2083；和Rutter et al.(2016)Proc.Nutr.Soc.75(1):61-72，出于所有目的，将每一篇均通过引用整体并入本文。此外，Slc30a8 KO小鼠的C肽与胰岛素之比更高，这表明与最近的报道相似的增加的胰岛素清除，并且可能反映了Slc30a8 KO胰岛的锌分泌受损。参见，例如，Tamaki et al.(2013)J.Clin.Invest.123(10):4513-4524和Mitchell et al.(2016)Mol.Endocrinol.30(1):77-91，出于所有目的，通过引用将其每篇的全部内容整体并入本文。
总的来说，这些数据表明，在维持常规普通饮食的小鼠中，R138X假定LOF变体的引入对胰岛素原的加工具有较小的影响，并且不改变葡萄糖稳态或葡萄糖诱导的胰岛素分泌。因此，该R138X表型不同于在Slc30a8KO小鼠中观察到的表型；当维持常规普通饮食时，在Slc30a8 KO小鼠中观察到的表型具有受损的葡萄糖耐量和降低的葡萄糖诱导的血浆胰岛素水平。
高脂饮食的R138X小鼠增加了胰岛素分泌和β细胞数量。由于人R138X的携带者受到保护而免于T2D的发展，因此我们以高脂饮食(HFD)挑战了小鼠。WT和R138X小鼠的体重和进食葡萄糖水平无差异(表5，图3A)。然而，HFD 20周后，我们观察到进食的R138X小鼠的循环胰岛素水平与野生型小鼠相比更高(图3B)。尽管循环C肽水平模拟胰岛素水平，但R138X小鼠的空腹胰岛素原水平却较低，导致胰岛素原与胰岛素的之比降低(图3C-3F)。尽管进食胰岛素增加，但R138X小鼠的葡萄糖耐量并未显著增加(图3G)。为了更详细地检查胰岛素分泌，我们在口服葡萄糖耐量测试(oGTT)后测量了循环胰岛素。在R138X小鼠中，与WT小鼠相比，口服葡萄糖推注在15分钟时使循环胰岛素的量增加了一倍(图3H)。令人惊讶的是，这与产生胰岛素的β细胞数量的增加有关(图3I)。胰岛素染色的定量显示胰岛素阳性面积以及胰岛数目增加了一倍(图3J-3K)。与此相对，我们使用胰高血糖素染色未检测到α细胞数量的变化(图6C-6D)。Ki67染色表明β细胞面积的增加继发于增强的β细胞增殖。与WT小鼠相比，R138X小鼠的胰腺中胰岛素和Ki67双阳性细胞的数量增加了两倍。在雌性R138X小鼠中观察到了相似但更为不明显的代谢表型(图8A-8K)。在遵循HFD超过20周后，雌性R138X小鼠在空腹时表现出降低的胰岛素原与胰岛素之比，以及与更高数量的胰岛相关的循环胰岛素水平增加(图8B-8K)。
因为在杂合携带者中观察到R138X变体的保护表型，所以我们还分析了遵循HFD的杂合R138X小鼠(图9A-9M)。蛋白质印迹分析显示来自杂合R138X小鼠的胰岛中SLC30A8蛋白的强烈降低(图9A)，而用二硫腙染色检查时，胰岛锌水平与WT小鼠相当(图9B)。尽管与纯合R138X小鼠相比表型更温和，但杂合R138X小鼠遵循HFD超过20周(图9K-9M)后显示出与β细胞面积的扩张相关的葡萄糖诱导的胰岛素分泌增加(图9J)。综上所述，这些数据表明，携带人R138X突变的HFD小鼠具有更高的分泌胰岛素的能力，这部分是由于β细胞数量的增加所致。
作为诱导胰岛素抵抗和增加β细胞胰岛素分泌的另一种方法，我们使用了胰岛素受体拮抗剂S961来阻断R138X小鼠和WT小鼠中的胰岛素受体。如在R138X小鼠和WT小鼠中所预期的，对胰岛素受体的阻断增加了循环葡萄糖水平和胰岛素水平。但是，我们观察到与WT小鼠相比，R138X小鼠的循环胰岛素翻倍。参见图12。与WT小鼠(数据未显示)相比，SLC30A8KO小鼠的胰岛素分泌没有显示出这种增加。这些数据与表明携带人R138X突变的HFD小鼠具有更强的分泌胰岛素能力的数据一致。
遵循高脂饮食的Slc30a8 KO小鼠没有增加的循环胰岛素水平或β细胞数量。我们还检查了我们遵循HFD 20周后的Slc30a8 KO小鼠(图4A-4K)。这些小鼠未显示进食循环胰岛素水平升高，但具有降低的空腹胰岛素、胰岛素原和C肽水平(图4B-4D)。与R138X小鼠相似，Slc30a8 KO小鼠中的胰岛素原与胰岛素之比较低(图4E)。然而，在Slc30a8 KO小鼠中，C肽与胰岛素之比升高，与遵循普通饮食所观察到的相似。尽管葡萄糖耐量没有变化，但Slc30a8 KO小鼠显示出较低的葡萄糖诱导的循环胰岛素水平。与我们在R138X小鼠中观察到的相反，Slc30a8 KO小鼠中的β细胞数量没有变化(图4I-4K)。
R138X小鼠响应于胰岛素受体抑制诱导的高血糖症而具有增加的胰岛素分泌。接下来，我们想研究R138X突变在代谢挑战的小鼠中的潜在作用。我们使用胰岛素受体拮抗剂S961诱导严重的胰岛素抵抗和高血糖症。参见，例如，Schaffer et al.(2008)Biochem.Biophys.Res.Commun.376(2):380-383，出于所有目的通过引用整体并入本文。如所期望的，S961在所有经处理的动物中引起高血糖症(约600mg/dl)，而对照动物保持正常的进食葡萄糖水平(约200mg/dl)(图13A)。在所有处理的小鼠中，循环胰岛素水平响应于S961而升高。令人惊讶的是，与S961处理的WT小鼠相比，在S961诱导的高血糖症后，R138X小鼠的循环胰岛素水平高出50％以上(WT：42.33±5.03ng/ml；R138X：67.75±19.16ng/ml)(图13B)。血浆胰岛素的增加不是胰岛素原加工的改善或胰岛素清除的降低的结果(图14A-14E)，也不是R138X和WT小鼠之间循环GLP-1水平变化的结果(图13C)。在用S961处理的R138X小鼠中，进食和空腹条件下的循环胰岛素更高，但是由于S961抑制了对胰岛素受体的胰岛素作用，因此基因型之间的血糖水平没有差异(图13D-13E)。值得注意的是，尽管空腹血糖水平正常，但与PBS处理的小鼠相比，WT和R138X小鼠经S961处理后，空腹胰岛素水平显著升高。
为了研究突变小鼠中较高的胰岛素水平是否是β细胞增殖增加的结果，我们测量了Ki-67/胰岛素阳性β细胞。尽管通过S961处理，β细胞增殖明显增加，但R138X和WT小鼠之间的β细胞增殖没有差异(图13F-13G)。与增殖数据一致，在经S961处理的WT和R138X小鼠中，胰岛或α细胞的质量没有差异(图13F和13H，图14F-14G)。尽管血液中的胰岛素大量增加，但用S961处理过的R138X小鼠的β细胞似乎没有比用S961处理过的WT小鼠的β细胞更为胰岛素缺乏(图13F)。总之，这些数据表明，当受到高血糖症挑战时，来自R138X小鼠的胰岛具有更高的分泌胰岛素的能力。
来自R138X小鼠的胰岛具有降低的线粒体基因表达和增加的Hvcn1表达。为了更详细地了解WT和R138X胰岛之间的差异，我们对分离自普通饲喂的小鼠的胰岛进行了RNA测序。与我们的RNAscope和
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数据相印证(图1A-1B)，Slc30a8 mRNA的含量极大地降低(从WT中的约500RPKM至R138X中的约100RKPM)，但并非不存在(图15)。我们发现R138X胰岛中有61个基因(19个基因增加，43个基因减少)受到差异调节(表7)。有趣的是，该基因清单不包含参与锌代谢或胰岛素生物合成的基因。但是，胰岛素2(Ins2)的表达显著下调，胰岛素1(Ins1)的表达也趋于降低(图16A)。这促使我们更加仔细地研究β细胞调节剂的表达水平，包括胰岛素的转录因子。如图16B所示，Mafa在R138X小鼠的胰岛中显著上调，但未达到我们1.5倍的临界值。由于Mafa正向调节胰岛素的转录，其表达通常与该激素的表达呈正相关，因此不能解释Ins2基因表达的降低。在43个下调基因中，有12个基因是线粒体蛋白，其中7个属于Oxphos基因的组别(表7)。因此，我们研究了所有Oxphos基因的表达水平，并注意到这些基因中的大多数的表达均降低了(表8、表9)。复合物I、III，和V主要受到基因表达下降约40％的影响，表明产生ATP的能力下降。
表7：来自普通饲喂的WT和R138X小鼠的胰岛中的差异调节基因(线粒体基因以粗体标记)。
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Figure BDA0002577214450000561
Figure BDA0002577214450000571
Figure BDA0002577214450000581
表8：WT和R138X小鼠的胰岛中的Oxphos基因表达变化的总结。
复合物 总数 显著调节(p<0.05) 调节％
复合物I 43 19 44.19
复合物II 4 1 25.00
复合物III 10 4 40.00
复合物IV 19 5 26.32
复合物V 20 9 45.00
表9：来自WT和R138X小鼠的分离的胰岛中的所有Oxphos基因的表达的变化(粗体为显著改变的基因)。
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Figure BDA0002577214450000601
Figure BDA0002577214450000611
Figure BDA0002577214450000621
值得注意的是，在来自R138X小鼠的胰岛中，电压门控质子通道Hv1(Hvcn1，替代名称VSOP，HV1)的表达上调。由于此通道受Zn2+调节并存在于胰岛素分泌颗粒中，并且Hvcn1表达的删除会损害体内和体外的胰岛素分泌，因此这对于在R138X小鼠中观察到的表型可能很重要。参见，例如，Zhao et al.(2015)Biochem.Biophys.Res.Commun.468(4):746-751；Wang et al.(2017)“The Voltage-gated Proton Channel Hv1 Is Required forInsulin Secretion in PancreaticβCells,”bioRxiv 097816,doi.org/10.1101/097816；和Qiu et al.(2016)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.113(40):E5962-E5971，每一篇均出于所有目的通过引用整体并入本文。
讨论
在这项研究中，我们生成了新的Slc30a8假定LOF小鼠模型(R138X小鼠)，该模型模拟了两种最常见的人SLC30A8假定LOF(p.Arg138*)。参见，例如，Flannick et al.(2014)Nat.Genet.46(4):357-363，出于所有目的通过引用整体并入本文。从这些小鼠获得的数据首次可以解释为什么人体内SLC30A8假定LOF突变对T2D的发生具有保护作用。R138X突变的引入导致增加的β细胞数量，从而在胰岛素抵抗状态下允许更高的胰岛素分泌。这些数据表明，R138Xβ细胞因此可以更好地补偿胰岛素需求增加，从而预防和/或延迟β细胞的衰竭和T2D的发作。使用此模型，我们示出R138X突变的引入导致响应高血糖症而分泌50％更多的胰岛素。这些数据表明，对人类T2D的保护至少部分地由胰岛素分泌能力的提高介导，胰岛素分泌能力的提高使β细胞能够补偿胰岛素需求的增加，从而防止或延迟了这些细胞的衰竭和T2D的发作。因此，本方法证明了使用小鼠遗传学探索被识别的人类T2D风险或保护性基因如何起作用的机制的可行性。本方法还强调了小鼠遗传学在探索影响人类T2D风险的遗传变异的机制中的作用。
已经报道了超过八种不同的Slc30a8基因敲除小鼠模型。参见，例如，Lemaire etal.(2009)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.106(35):14872-14877；Nicolson et al.(2009)Diabetes 58(9):2070-2083；Tamaki et al.(2013)J.Clin.Invest.123(10):4513-4524；Pound et al.(2009)Biochem.J.421(3):371-376；Pound et al.(2012)PLoS One 7(7):e40972；Wijesekara et al.(2010)Diabetologia 53(8):1656-1668；和Hardy et al.(2012)Am.J.Physiol.Endocrinol.Metab.302(9):E1084-E1096，出于所有目的，将每一篇均通过引用整体并入本文。这些模型在遗传背景、Slc30a8靶向策略，以及产生具有β细胞特异性删除的小鼠时使用的特定Cre系方面有所不同。这些小鼠的代谢表型也不同。在遵循普通饮食和高脂饮食(HFD)下，报道了体重增加、葡萄糖耐量和胰岛素分泌的差异。参见，例如，Rutter et al.(2016)Proc.Nutr.Soc.75(1):61-72,，出于所有目的通过引用整体并入本文。但是，所有已发表的Slc30a8基因敲除表型都表明葡萄糖控制恶化，在至少六个出版物中同时观察到葡萄糖耐量降低。出于比较原因，我们还生成了100％C57BL/6背景的Slc30a8 KO小鼠系，与R138X相同。该基因敲除的小鼠在很大程度上拟表型(phenocopy)了已发表的数据，显示出葡萄糖耐量受损(遵循普通饮食)、较低的葡萄糖诱导的胰岛素分泌(遵循普通饮食和HFD)，和受损胰岛素清除(遵循普通饮食和HFD)。相反，我们没有观察到主要的代谢表型，包括遵循普通饮食的R138X小鼠中血糖控制的恶化。在遵循HFD20多个星期后，基因敲除小鼠系和R138X小鼠系之间的差异变得更加明显。R138X小鼠中的胰岛素分泌和β细胞的数量增加了，但Slc30a8 KO小鼠中却没有。观察到的表型的较晚出现表明，在HFD饲喂中，β细胞增殖和数量的代偿性增加的发生相当晚。但是，我们不能排除在没有观察到胰岛素分泌变化的情况下，饲喂HFD 10周后β细胞数量已经发生变化的可能性。Hardy等观察到在经HFD处理16周后，在它们的全局(global)Slc30a8 KO小鼠体内的β细胞数量和循环胰岛素的增加。参见，例如，Hardy et al.(2012)Am.J.Physiol.Endocrinol.Metab.302(9):E1084-E1096，出于所有目的通过引用整体并入本文。然而，这很可能是由于他们的KO小鼠与野生型小鼠相比的血糖控制水平下降，伴随显著的肥胖、高血糖症，以及胰岛素抵抗增强而导致的，这一结果在本研究未观察到。重要的是，尽管Hardy等观察到Slc30a8 KO小鼠中胰岛素原与胰岛素之比增加，我们观察到遵循HFD的R138X小鼠中该比的降低，这表明β细胞与WTβ细胞相比具有改善的胰岛素加工和改善的健康。参见，例如，Hardy et al.(2012)Am.J.Physiol.Endocrinol.Metab.302(9):E1084-E1096，出于所有目的通过引用整体并入本文。有趣的是，在我们的Slc30a8 KO小鼠中也观察到胰岛素原与胰岛素之比的改善，这表明基因敲除小鼠和R138X小鼠在所有代谢方面都没有差异。由于高胰岛素原与胰岛素之比与人类发展至T2D有关，因此这也可能有助于SLC30A8 LOF介导的对T2D的预防。参见，例如，Kirchhoff et al.(2008)Diabetologia 51(4):597-601；Loopstra-Masters etal.(2011)Diabetologia54(12):3047-3054；和Saad et al.(1990)J.Clin.Endocrinol.Metab.70(5):1247-1253，出于所有目的，通过引用将其全部内容整体并入本文。
所有Slc30a8 KO表型显示循环胰岛素的无变化或减少，这在某些情况下与葡萄糖耐量的降低有关。参见，例如，Nicolson et al.,(2009)Diabetes 58(9):2070-2083；Poundet al.(2009)Biochem.J.421(3):371-376；和Mitchell et al.(2016)Mol.Endocrinol.30(1):77-91，出于所有目的，通过引用将其每一篇的全部内容整体并入本文。相反，在来自三个KO模型的胰岛中观察到了体外胰岛素分泌的增加。参见，例如，Nicolson et al.,(2009)Diabetes 58(9):2070-2083；Tamaki et al.(2013)J.Clin.Invest.123(10):4513-4524；以及Hardy et al.(2012)Am.J.Physiol.Endocrinol.Metab.302(9):E1084-E1096，出于所有目的，将其每一篇均通过引用整体并入本文。我们没有在普通饮食饲喂的R138X小鼠中观察到主要的代谢表型，包括葡萄糖诱导的胰岛素分泌的变化。但是，当受到S961挑战时，这些小鼠比WT小鼠能够分泌更多的胰岛素。胰岛素分泌的这种增加并非继发于β细胞质量增加，并且在任何Slc30a8 KO模型中都没有报道。
尚不清楚为什么R138X小鼠的代谢表型与Slc30a8 KO小鼠有如此大的差异，但是数据表明R138X等位基因有潜在的功能获得。目前，尚不清楚R138X小鼠是否像Slc30a8 KO小鼠，因为我们不能排除剩余的mRNA被翻译成截短的蛋白的可能性。我们无法检测到可以轻松解释R138X小鼠胰岛中的表型差异的SLC30A8蛋白质的截短版本。但是，RNA显然存在，并且在HEK293细胞中检测到过表达的R138X蛋白，并通过蛋白酶体抑制而聚集(图5)，这与之前在HeLa细胞中所观察到的相反。参见，例如，Flannick et al.(2014)Nat.Genet.46(4):357-363，出于所有目的通过引用整体并入本文。因此，我们不能排除或许来自R138X小鼠的胰岛细胞的亚类(subset)中低水平蛋白质的存在。独立于R138X小鼠中的SLC30A8蛋白的潜在表达，二硫腙染色清楚地表明引入R138X假定LOF突变会导致胰岛锌积累的损失，这与Slc30a8 KO小鼠中描述的一致。另一种可能性是，截短的Slc30a8 mRNA虽然不再编码肽，现在充当了较长的非编码RNA，从而反式地影响了相关基因(可能包括其它Slc30a家族成员)的转录。参见，例如，Batista and Chang(2013)Cell 152(6):1298-1307，出于所有目的通过引用将其全部内容合并于此。
出于多种原因，亚细胞游离Zn2+的改变可能导致增殖和/或胰岛素分泌增加。哺乳动物细胞中大量的细胞内信号系统受到游离Zn2+的影响，几乎有10％的细胞蛋白质组能够结合这些离子。参见，例如，Rutter et al.(2016)Proc.Nutr.Soc.75(1):61-72，出于所有目的通过引用整体并入本文。尽管由于β细胞中Slc30a8失活，细胞质中的游离Zn2+浓度可能会全局降低，但R138Xβ细胞中质膜附近的游离Zn2+的高度局部升高可能会通过抑制蛋白质酪氨酸磷酸酶，增强受体酪氨酸激酶(例如胰岛素或IGF1受体)的信号传送，从而促进细胞生长。参见，例如，Gerber et al.(2014)Diabetologia 57(8):1635-1644and Bellomo etal.(2014)Metallomics 6(7):1229-1239，出于所有目的，将每一篇均通过引用整体并入本文。另一方面，例如通过与胱天蛋白酶相互作用，预期全局降低的胞质Zn2+水平降低凋亡率。参见，例如，Fukamachi et al.(1998)Biochem.Biophys.Res.Commun.246(2):364-369，出于所有目的通过引用整体并入本文。
R138X小鼠中的胰岛素分泌可以通过电压门控质子通道Hvcn1的上调而被上调。Hvcn1存在于分泌颗粒中，并被锌离子抑制。参见，例如，Qiu et al.(2016)Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.113(40):E5962-E5971，出于所有目的通过引用整体并入本文。此外，Hvcn1 KO小鼠胰岛素分泌减少，血糖控制受损。Wang et al.(2017)“The Voltage-gated Proton Channel Hv1 Is Required for Insulin Secretion in PancreaticβCells,”bioRxiv 097816,doi.org/10.1101/097816，出于所有目的通过引用整体并入本文。由于来自R138X小鼠的胰岛中锌缺乏，因此可以预期该通道的活性会增加。最重要的是，我们在来自R138X小鼠的胰岛中看到Hvcn1转录物的3倍上调。虽然这些数据表明胰岛素分泌的增加至少部分是由Hvcn1介导的，但必须进行进一步的实验以验证这一假设。另一个有趣的发现是R138X小鼠线粒体基因表达的减少。这似乎是违反直觉的，因为需要ATP合成才能适当地分泌胰岛素。参见，例如，Wiederkehr and Wollheim(2012)Mol.Cell.Endocrinol.353(1-2):128-137，出于所有目的通过引用整体并入本文。但是，最近的研究描述了激活β细胞中胰岛素分泌的另一种途径。参见，例如，De Marchi et al.(2017)J.Cell.Sci.130(11):1929-1939，出于所有目的通过引用整体并入本文。该途径独立于ATP合成(耐寡霉素)，取决于允许的胞质Ca2+，伴随着较小的线粒体谷胱甘肽还原，并且通过激活线粒体复合物II来实现。考虑到Gpx2表达(谷胱甘肽过氧化物酶2)(表7)和R138X小鼠的Oxphos复合物II的仅一个基因被还原，这很有趣。相应地，β细胞中蛋白激酶肝激酶B1(LKB1)的选择性删除导致明显的线粒体缺陷和受损的Ca2+动力学，而葡萄糖刺激的胰岛素分泌最可能由于后者途径的上调而增强。参见，例如，Swisa et al.(2015)J.Biol.Chem.290(34):20934-20946，出于所有目的通过引用整体并入本文。可以进行进一步的检查呼吸和胰岛素分泌的实验，以研究这种替代途径是否主要用于来自R138X小鼠的β细胞。
β-细胞数量的恢复是开发新型T2D药物的关键策略。这种方法的最大挑战之一是在啮齿动物中促进β细胞复制的因子在人类β细胞中通常无法做到这一点。但是，我们在模拟人SLC30A8 R138X突变的小鼠中的数据表明，β细胞数量的增加是人类某些SLC30A8突变的T2D保护作用的基础机制之一。因此，了解在R138X小鼠中观察到的β细胞区域扩展的潜在机制可能导致识别新的治疗靶标，其转化至人类的机会更高。
总之，我们从R138X小鼠获得的数据首次提供了关于为什么携带R138X突变的人类被保护免受T2D的解释。参见，例如，Flannick et al.(2014)Nat.Genet.46(4):357-363，出于所有目的通过引用整体并入本文。因此，它是研究这种保护的基础机制的相关模型。鉴于增加的胰岛素分泌是对抗T2D的重要治疗策略，这一点尤其重要。因此，了解R138X小鼠胰岛素分泌增加的潜在机理可能导致识别新的治疗靶标。
作用机理
我们已经产生了新的小鼠模型(R138X)，其模仿人SLC30A8 LoF突变p.Arg138*，其保护人类免受II型糖尿病的发展。高脂饮食(high-fed-diet)条件下的R138X小鼠具有与β细胞质量和增殖的增加相关的胰岛素分泌增加。替代地，当我们使用S961(胰岛素受体抑制剂)诱导高血糖症时，与WT小鼠相比，R138X小鼠的胰岛素分泌增加了50％，该增加独立于β细胞质量和增殖变化。这表明R138X小鼠中增殖的增加需要胰岛素受体。此外，在遵循高脂饮食的小鼠中，β细胞中的胰岛素受体已被证明是β细胞增殖的增加所必需的。由于R138X小鼠分泌胰岛素的能力增强，因此，更高的胰岛素可以作用于β细胞中的胰岛素受体并诱导与WT小鼠相比更大程度的增殖。为了对此进行研究，通过对由高脂饮食或S961处理的WT和R138X小鼠的胰腺中p-Akt、p-S6，和p-Erk进行组织学研究，检查胰岛素途径的激活。此外，检查分离的胰岛，以确定它们是否具有更高的p-AKT和p-Erk水平，以及它们是否在体外更多地增殖。
方法
动物。所有程序均按照瑞泽恩制药公司机构动物护理和使用委员会(RegeneronPharmaceuticals Institutional Animal Care and Use Committee)批准的规程进行。Slc30a8 R138X和敲除小鼠系使用VELOCIGENE技术在纯C57BL/6NTac背景下制备。参见，例如，Valenzuela et al.(2003)Nat.Biotechnol.21(6):652-659，出于所有目的通过引用整体并入本文。为了产生敲除小鼠系，删除了整个Slc30a8编码区，并替换为LacZ基因。通过使用自删除的新霉素选择盒移除新霉素基因。为了生成R138X小鼠，外显子3中的409核苷酸从T变为C，这将精氨酸变成终止密码子。突变的等位基因具有自删除的新霉素选择盒，其侧面是插入在内含子3上的loxP位点，删除了29bp的内源内含子3序列(CAGCTGACAGCAAGATTAATGGAAGTACC(SEQ ID NO：24))。将小鼠圈养(每笼最多五只小鼠)在受控的环境中(12小时的光照/黑暗周期，22±1℃，湿度为60％-70％)，并从12-18周龄开始随意饲喂普通饮食(Purina Laboratory 23Rodent Diet 5001，LabDiet)或高脂饮食(Research Diets，D12492；脂肪含量为卡路里的60％)。所有示出数据与WT同窝小鼠进行比较。
葡萄糖耐量测试。让小鼠空腹过夜(16小时)，然后以2g/kg体重的量经口管饲葡萄糖(Sigma)。在指定的时间从尾静脉获得血液样本，并使用AlphaTrak2血糖仪(Abbott)测量血糖水平。在单独的实验中，分别在注射后0、15和30分钟进行下颌下出血，以免干扰葡萄糖的测量。
胰岛素耐受性测试。让小鼠空腹4小时，然后腹膜内注射0.75U/kg(普通饲喂)或1.5U/kg(高脂饲喂)的人胰岛素(Eli Lilly)。在指定的时间从尾静脉获得血液样本，并使用AlphaTrak2血糖仪(Abbott)测量葡萄糖。
血浆胰岛素、胰岛素原和C肽的测量。在早晨或在oGTT之后进行过夜空腹的动物或饲喂的动物的下颌下出血。用小鼠胰岛素ELISA(Mercodia)分析胰岛素。用小鼠胰岛素原ELISA(Mercodia)分析胰岛素原。用小鼠C肽ELISA(ALPCO)分析C肽。所有ELISA均按照制造商的说明进行。
组织学研究。将胰腺在10％中性缓冲的福尔马林溶液中固定48小时，然后包埋在石蜡中。用α-胰高血糖素(REGN745，内部(in-house)产生的α-胰高血糖素单克隆抗体)或α-胰岛素(Dako)抗体对来自每只动物的胰腺的两个切片进行染色，并使用Halo数字成像分析软件(Indica Labs)测量胰高血糖素和胰岛素阳性细胞的面积。计算胰高血糖素和胰岛素阳性面积相对于整个胰腺面积的百分比。计算每张玻片的胰岛数目，并标准化至整个胰腺区域。设置分析以捕获低至单个细胞分辨率的每簇胰岛素阳性细胞。我们排除了小于一个单一β细胞(<150μm2；使用约14μm的直径计算的面积)的伪影(例如碎片)。为了进行荧光染色，将胰腺切片用α-胰岛素(Dako，A0564)抗体和α-KI67抗体(R&D)的组合进行染色，然后再用适当的第二抗体进行染色。使用显微镜玻片扫描仪(Zeiss Axio Scan.Z1)检测荧光信号。使用Cytonuclear Fluorescence模块(Indica Labs)的HALO图像分析对胰岛细胞类型进行定量。计算了胰高血糖素阳性面积和胰岛素阳性面积相对于整个胰腺面积的百分比。以面积为基础，通过将每只动物的α细胞面积乘以动物胰腺的重量来计算α细胞质量。为了量化胰岛质量，可通过计算切片上胰岛素阳性胰岛的数量来测量胰岛的数量和大小。将大于150μm的每个染色区域计为胰岛。将胰岛数量标准化为整个胰岛面积乘以单个胰腺的重量，以获得胰岛质量。
RNA原位杂交。对于RNA分析，按照制造商的说明(Advanced Cell Diagnostics)将胰腺组织渗透并与小鼠Gcg、Ins2，和Slc30A8的mRNA探针的组合杂交。使用荧光试剂盒扩增mRNA信号。使用显微镜载玻片扫描仪(Zeiss Axio Scan.Z1)检测荧光信号。
胰岛分离和二硫腙染色。在用Liberase TL(Roche，#05401020001)通过胆总管灌注胰腺后，通过密度梯度分离法分离小鼠胰岛。在37℃下消化13分钟后，将胰腺溶液洗涤并通过400-μm筛网过滤器过滤，并通过Histopaque梯度离心(Sigma-Aldrich，#H 1077)或在解剖显微镜下手动挑选以分离胰岛。将分离的胰岛在补充有10％(v/v)FBS、10mM HEPES、50μMβ-巯基乙醇、1.0mM丙酮酸钠、100U/mL青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI-1640培养基(Gibco)中，于37℃及含有5％的CO2的空气气氛中培养过夜。手工挑选多达50个胰岛，然后转移到含有100μg/ml二硫腙溶液的新培养皿中。将胰岛染色长达10分钟，然后转移回PBS溶液中进行显微镜检查(蔡司共聚焦显微镜)。
蛋白质(免疫)印迹分析。将胰岛在RIPA裂解缓冲液中裂解，并测定蛋白质浓度。在还原条件下，使用Criterion TGX 4-20％预制凝胶(Bio-Rad)，通过SDS/PAGE解析20μg总细胞裂解液，并转移至硝酸纤维素膜上。用多克隆α-小鼠-SLC30A8兔抗体(Rabbit Ab)(由Thermo Fisher定制)探测该膜，并使用增强的化学发光检测系统对该膜进行检测。SLC30A8多克隆抗体针对横跨小鼠SLC30A8蛋白第29-43位氨基酸的肽产生。
R138X过表达和蛋白酶体抑制。用C末端myc标签克隆了人SLC30A8 WT以及之后的终止密码子的前137个氨基酸。将HEK293细胞(0.4×106个细胞/孔)接种到6孔板中。第二天，按照制造商的说明，使用Mirus TransIT-TL1，用0.1μgDNA/孔转染细胞。转染两天后，加入DMSO、蛋白酶体(10μMMG-132或1μM环氧酶素(epoxomicin))或溶酶体抑制剂(10μg/ml氯喹盐)。在RIPA缓冲液中处理6小时后收获细胞。通过蛋白质印迹分析30μg细胞裂解物。
qPCR分析。在将要进行的每个RT-qPCR测定中，将37.5纳克至375纳克的RNA与
Figure BDA0002577214450000701
VILOTM预混液(Master Mix)(ThermoFisher，目录号11755500)混合，并根据制造商的说明进行循环。用无核酸酶的水将cDNA稀释至每微升0.5微克至每微升5微克。通过将水、预混液(ThermoFisher，目录号4370074或Bioline，目录号CSA-01113)，和20X测定混合物合并，以进行RT-qPCR分测定析。该测定混合物是可商购混合物，其为结合了荧光标记和淬灭的探针序列的正向和反向引物(ThermoFisher，目录号351372或LGC BioSearch，目录号DLO-RFBL-MIX)。通过向每个孔中移入5微升稀释的cDNA和10微升适当的RT-PCR测定，在384孔板(ThermoFisher，目录号4343370)上一式三份运行样品。将384孔板盖上光学透明的密封件(Agilent，目录号16985-001)，旋转离心(spin down)，并在带有384孔模块和自动化附件的ABI 7900HT快速实时PCR系统(ThermoFisher，目录号4329002)上根据使用的预混料的具体情况读取40个循环。Slc30a8探针和引物的序列如下：探针：TCCAAAACTGGGCAGTGAGTTCAACA(SEQ ID NO：25)、正向引物：AATTGCAGTGCTGCTTTGC(SEQ IDNO：26)、反向引物：AGCTGCGGCTGTTGTTGTC(SEQ ID NO：27)。
RNA制备。如上文所述分离胰岛，并在37℃下孵育过夜。第二天，将每基因型500个胰岛作为一个样品放入Trizol(Invitrogen)中，并保持在-80℃直至RNA提取和测序。分析了五个不同的WT样品和四个不同的R138X样品。根据制造商的说明，使用MagMAXTM-96微阵列总RNA分离试剂盒(Life Technologies的Ambion)从所有样品中纯化总RNA。使用MagMAXTMTurboTMDNase缓冲剂和TURBO DNA酶从上文列出的MagMAX试剂盒(LifeTechnologies的Ambion)中移除基因组DNA。使用
Figure BDA0002577214450000711
mRNA纯化试剂盒(Invitrogen)从总RNA中纯化mRNA。使用KAPA mRNA-Seq文库制备试剂盒(KapaBiosystems)制备链特异性RNA-seq文库。进行十二个循环的PCR以扩增文库。在Illumina
Figure BDA0002577214450000712
(Illumina)上，通过33次循环的多路单读运行(multiplexed single-readrun)进行测序。
差异表达的RNA的RNAseq序列比对(Read Mapping)和统计分析。原始序列数据(BCL文件)已通过Illumina bcl2fastq v2.17转换为FASTQ格式。根据条形码对序列(reads)进行解码，并使用FastQC评估序列质量。使用
Figure BDA0002577214450000721
软件
Figure BDA0002577214450000722
将序列映射到小鼠基因组(NCBI GRCm38)，允许两个错配。映射到基因外显子的序列在基因水平上求和。通过DESeq2包识别了差异表达的基因，并定义了显著受干扰的基因，其在向上或向下方向的倍数变化不小于1.5，且p值至少为0.01。
数据分析。数据报道为平均值±SEM。使用Prism 6.0(GraphPad Software)进行统计分析。如所示，所有参数均通过双向方差分析(*p)和学生T检验(#p)进行分析，始终比较基因型而非处理；P<0.05的阈值被认为具有统计学意义。图的顶部示出了双向方差分析的基因型之间的显著差异。特定数据点的显著差异示于该点/图的顶部。*p/#p<0.5，**p/##p<0.01，***p/###p<0.001，****p/####p<0.0001。
序列表
<110> 瑞泽恩制药公司
<120> 包含SLC30A8突变的非人动物及使用方法
<130> 57766-523060
<150> US 62/584,228
<151> 2017-11-10
<150> US 62/666,337
<151> 2018-05-03
<150> US 62/689,945
<151> 2018-06-26
<160> 27
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 1
cgaggccccc ttccaa 16
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 2
catttgggtg gtatcga 17
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 3
tgcgcaatca gagaatgtta cc 22
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 4
catttgggtg gtattga 17
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 5
tgtgggaatg tgagctctca ac 22
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 6
cagctgacag caagattaat ggaagtacc 29
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 7
gaccctggag acagaaatgt c 21
<210> 8
<211> 229
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(51)
<223> Slc30a8 内含子2
<220>
<221> misc_feature
<222> (52)..(198)
<223> Slc30a8 外显子3 pArg137X
<220>
<221> misc_feature
<222> (199)..(229)
<223> Slc30a8 内含子3
<400> 8
cctaattgca ttcccagcct ttaacccagt gtgatattgt gcatctcaca ggtggacacg 60
ttgctgggag tctggctatc ctcactgatg cggctcatct cttaattgac ctgactagtt 120
tcctgctcag tctcttttct ttgtggttgt catcgaggcc cccttccaag cggctgacat 180
ttgggtggta ttgagcaggt aacattctct gattgcgcaa tagtgaatg 229
<210> 9
<211> 224
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(47)
<223> Slc30a8 内含子3
<220>
<221> misc_feature
<222> (48)..(53)
<223> XhoI
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)..(87)
<223> loxP
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)..(224)
<223> 自删除新霉素选择盒
<400> 9
ctcaggataa aataaccatg tgggaatgtg agctctcaac attaattctc gagataactt 60
cgtataatgt atgctatacg aagttatatg catgccagta gcagcaccca cgtccacctt 120
ctgtctagta atgtccaaca cctccctcag tccaaacact gctctgcatc catgtggctc 180
ccatttatac ctgaagcact tgatggggcc tcaatgtttt acta 224
<210> 10
<211> 273
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(129)
<223> 自删除新霉素选择盒
<220>
<221> misc_feature
<222> (90)..(123)
<223> loxP
<220>
<221> misc_feature
<222> (130)..(155)
<223> ICEUI
<220>
<221> misc_feature
<222> (156)..(161)
<223> NheI
<220>
<221> misc_feature
<222> (162)..(273)
<223> Slc30a8 内含子3
<400> 10
gatcagcagc ctctgttcca catacacttc attctcagta ttgttttgcc aagttctaat 60
tccatcagac ctcgacctgc agcccctaga taacttcgta taatgtatgc tatacgaagt 120
tatgctaggt aactataacg gtcctaaggt agcgagctag ctcctctact atgggacaac 180
agaaatagct gtatcgtgat gccagacatt tctgtctcca gggtctagga gatgattctt 240
tcggttactc tacatccttc gaagaaagga tga 273
<210> 11
<211> 424
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(137)
<223> Slc30a8 内含子3
<220>
<221> misc_feature
<222> (138)..(143)
<223> XhoI
<220>
<221> misc_feature
<222> (144)..(177)
<223> loxP
<220>
<221> misc_feature
<222> (184)..(209)
<223> ICEUI
<220>
<221> misc_feature
<222> (210)..(215)
<223> NheI
<220>
<221> misc_feature
<222> (216)..(424)
<223> Slc30a8 内含子3
<400> 11
atgatataga ttcaaacaga gcttgaaaaa aagggggaag gtaaagagaa agccttgccc 60
aataattccc tctgggctac aagcctgctg ctcaggataa aataaccatg tgggaatgtg 120
agctctcaac attaattctc gagataactt cgtataatgt atgctatacg aagttatgct 180
aggtaactat aacggtccta aggtagcgag ctagctcctc tactatggga caacagaaat 240
agctgtatcg tgatgccaga catttctgtc tccagggtct aggagatgat tctttcggtt 300
actctacatc cttcgaagaa aggatgaagg cagagaatct agggtttagt gattgtccct 360
agggagttag gcataaaata tggactttct taatcacaca catagtcatt cctacgatct 420
gaat 424
<210> 12
<211> 367
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 12
Met Glu Phe Leu Glu Arg Thr Tyr Leu Val Asn Asp Gln Ala Thr Lys
1 5 10 15
Met Tyr Ala Phe Pro Leu Asp Arg Glu Leu Arg Gln Lys Pro Val Asn
20 25 30
Lys Asp Gln Cys Pro Gly Asp Arg Pro Glu His Pro Glu Ala Gly Gly
35 40 45
Ile Tyr His Cys His Asn Ser Ala Lys Ala Thr Gly Asn Arg Ser Ser
50 55 60
Lys Gln Ala His Ala Lys Trp Arg Leu Cys Ala Ala Ser Ala Ile Cys
65 70 75 80
Phe Ile Phe Met Val Ala Glu Val Val Gly Gly His Val Ala Gly Ser
85 90 95
Leu Ala Ile Leu Thr Asp Ala Ala His Leu Leu Ile Asp Leu Thr Ser
100 105 110
Phe Leu Leu Ser Leu Phe Ser Leu Trp Leu Ser Ser Arg Pro Pro Ser
115 120 125
Lys Arg Leu Thr Phe Gly Trp Tyr Arg Ala Glu Ile Leu Gly Ala Leu
130 135 140
Leu Ser Val Leu Cys Ile Trp Val Val Thr Gly Val Leu Leu Tyr Leu
145 150 155 160
Ala Cys Glu Arg Leu Leu Tyr Pro Asp Tyr Gln Ile Gln Ala Gly Ile
165 170 175
Met Ile Thr Val Ser Gly Cys Ala Val Ala Ala Asn Ile Val Leu Thr
180 185 190
Met Ile Leu His Gln Arg Asn Phe Gly Tyr Asn His Lys Asp Val Gln
195 200 205
Ala Asn Ala Ser Val Arg Ala Ala Phe Val His Ala Leu Gly Asp Val
210 215 220
Phe Gln Ser Ile Ser Val Leu Ile Ser Ala Leu Ile Ile Tyr Phe Lys
225 230 235 240
Pro Asp Tyr Lys Ile Ala Asp Pro Val Cys Thr Phe Ile Phe Ser Ile
245 250 255
Leu Val Leu Ala Ser Thr Val Met Ile Leu Lys Asp Phe Ser Ile Leu
260 265 270
Leu Met Glu Gly Val Pro Lys Gly Leu Ser Tyr Asn Ser Val Lys Glu
275 280 285
Ile Ile Leu Ala Val Asp Gly Val Ile Ser Val His Ser Leu His Ile
290 295 300
Trp Ser Leu Thr Val Asn Gln Val Ile Leu Ser Val His Val Ala Thr
305 310 315 320
Ala Ala Ser Gln Asp Ser Gln Ser Val Arg Thr Gly Ile Ala Gln Ala
325 330 335
Leu Ser Ser Phe Asp Leu His Ser Leu Thr Ile Gln Ile Glu Ser Ala
340 345 350
Ala Asp Gln Asp Pro Ser Cys Leu Leu Cys Glu Asp Pro Gln Asp
355 360 365
<210> 13
<211> 136
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 13
Met Glu Phe Leu Glu Arg Thr Tyr Leu Val Asn Asp Gln Ala Thr Lys
1 5 10 15
Met Tyr Ala Phe Pro Leu Asp Arg Glu Leu Arg Gln Lys Pro Val Asn
20 25 30
Lys Asp Gln Cys Pro Gly Asp Arg Pro Glu His Pro Glu Ala Gly Gly
35 40 45
Ile Tyr His Cys His Asn Ser Ala Lys Ala Thr Gly Asn Arg Ser Ser
50 55 60
Lys Gln Ala His Ala Lys Trp Arg Leu Cys Ala Ala Ser Ala Ile Cys
65 70 75 80
Phe Ile Phe Met Val Ala Glu Val Val Gly Gly His Val Ala Gly Ser
85 90 95
Leu Ala Ile Leu Thr Asp Ala Ala His Leu Leu Ile Asp Leu Thr Ser
100 105 110
Phe Leu Leu Ser Leu Phe Ser Leu Trp Leu Ser Ser Arg Pro Pro Ser
115 120 125
Lys Arg Leu Thr Phe Gly Trp Tyr
130 135
<210> 14
<211> 369
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 14
Met Glu Phe Leu Glu Arg Thr Tyr Leu Val Asn Asp Lys Ala Ala Lys
1 5 10 15
Met Tyr Ala Phe Thr Leu Glu Ser Val Glu Leu Gln Gln Lys Pro Val
20 25 30
Asn Lys Asp Gln Cys Pro Arg Glu Arg Pro Glu Glu Leu Glu Ser Gly
35 40 45
Gly Met Tyr His Cys His Ser Gly Ser Lys Pro Thr Glu Lys Gly Ala
50 55 60
Asn Glu Tyr Ala Tyr Ala Lys Trp Lys Leu Cys Ser Ala Ser Ala Ile
65 70 75 80
Cys Phe Ile Phe Met Ile Ala Glu Val Val Gly Gly His Ile Ala Gly
85 90 95
Ser Leu Ala Val Val Thr Asp Ala Ala His Leu Leu Ile Asp Leu Thr
100 105 110
Ser Phe Leu Leu Ser Leu Phe Ser Leu Trp Leu Ser Ser Lys Pro Pro
115 120 125
Ser Lys Arg Leu Thr Phe Gly Trp His Arg Ala Glu Ile Leu Gly Ala
130 135 140
Leu Leu Ser Ile Leu Cys Ile Trp Val Val Thr Gly Val Leu Val Tyr
145 150 155 160
Leu Ala Cys Glu Arg Leu Leu Tyr Pro Asp Tyr Gln Ile Gln Ala Thr
165 170 175
Val Met Ile Ile Val Ser Ser Cys Ala Val Ala Ala Asn Ile Val Leu
180 185 190
Thr Val Val Leu His Gln Arg Cys Leu Gly His Asn His Lys Glu Val
195 200 205
Gln Ala Asn Ala Ser Val Arg Ala Ala Phe Val His Ala Leu Gly Asp
210 215 220
Leu Phe Gln Ser Ile Ser Val Leu Ile Ser Ala Leu Ile Ile Tyr Phe
225 230 235 240
Lys Pro Glu Tyr Lys Ile Ala Asp Pro Ile Cys Thr Phe Ile Phe Ser
245 250 255
Ile Leu Val Leu Ala Ser Thr Ile Thr Ile Leu Lys Asp Phe Ser Ile
260 265 270
Leu Leu Met Glu Gly Val Pro Lys Ser Leu Asn Tyr Ser Gly Val Lys
275 280 285
Glu Leu Ile Leu Ala Val Asp Gly Val Leu Ser Val His Ser Leu His
290 295 300
Ile Trp Ser Leu Thr Met Asn Gln Val Ile Leu Ser Ala His Val Ala
305 310 315 320
Thr Ala Ala Ser Arg Asp Ser Gln Val Val Arg Arg Glu Ile Ala Lys
325 330 335
Ala Leu Ser Lys Ser Phe Thr Met His Ser Leu Thr Ile Gln Met Glu
340 345 350
Ser Pro Val Asp Gln Asp Pro Asp Cys Leu Phe Cys Glu Asp Pro Cys
355 360 365
Asp
<210> 15
<211> 137
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 15
Met Glu Phe Leu Glu Arg Thr Tyr Leu Val Asn Asp Lys Ala Ala Lys
1 5 10 15
Met Tyr Ala Phe Thr Leu Glu Ser Val Glu Leu Gln Gln Lys Pro Val
20 25 30
Asn Lys Asp Gln Cys Pro Arg Glu Arg Pro Glu Glu Leu Glu Ser Gly
35 40 45
Gly Met Tyr His Cys His Ser Gly Ser Lys Pro Thr Glu Lys Gly Ala
50 55 60
Asn Glu Tyr Ala Tyr Ala Lys Trp Lys Leu Cys Ser Ala Ser Ala Ile
65 70 75 80
Cys Phe Ile Phe Met Ile Ala Glu Val Val Gly Gly His Ile Ala Gly
85 90 95
Ser Leu Ala Val Val Thr Asp Ala Ala His Leu Leu Ile Asp Leu Thr
100 105 110
Ser Phe Leu Leu Ser Leu Phe Ser Leu Trp Leu Ser Ser Lys Pro Pro
115 120 125
Ser Lys Arg Leu Thr Phe Gly Trp His
130 135
<210> 16
<211> 1906
<212> DNA
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 16
atgtgcgcgc acgcgcgcgc gcacacacac acacacacac acacacacac acacacacac 60
acacttatta caattgtacc tttgagtctc ccagaaaagc agtttctgtg agtgatagaa 120
tgagtctagg tgattttcca aggagactgt taattttcac agatttaccc acaacactga 180
tataggaggc ctcattaact caagtactgg aagaattttt ctaatttctt aggaagttgt 240
gtgaatataa taatatcagt gcttctttac ttccaaaact ggacagcgca tcaaacatca 300
gaaacaacag tatcagctcc tgtcccaact accatggagt ttcttgagag aacttatctt 360
gtgaatgatc aagccaccaa gatgtacgcc ttccctctag acagagaact tcgacagaag 420
cctgtgaata aagatcagtg tcctggagac aggccagagc atccagaggc aggaggcatc 480
tatcactgcc acaacagcgc caaggccaca gggaacaggt cgagcaagca agcgcatgcc 540
aagtggagac tctgtgctgc ttcagcaata tgcttcatct ttatggtggc agaggtggtg 600
ggtggacacg ttgctgggag tctggctatc ctcactgatg cggctcatct cttaattgac 660
ctgactagtt tcctgctcag tctcttttct ttgtggttgt catcgaggcc cccttccaag 720
cggctgacat ttgggtggta tcgagcagag atcctcggtg ccctgctgtc tgtcctttgc 780
atctgggtgg tgactggtgt gctgctgtac cttgcctgtg agcgcctttt gtatcctgat 840
taccagatcc aagcaggtat catgatcact gtttcaggct gtgcagtggc agccaacatt 900
gtactaacta tgattttgca ccaacggaac tttggctaca accacaagga tgtacaagct 960
aatgccagtg tccgagcagc ctttgtgcat gccctggggg atgtatttca gagcatcagt 1020
gtgctaatta gtgctctcat tatctacttt aagcctgact acaaaattgc tgatccagtg 1080
tgcacattta tcttttccat cctggttttg gccagcaccg tcatgatctt aaaagacttc 1140
tccatcttac tcatggaagg tgttccaaag ggcctgagtt acaacagtgt gaaagagatc 1200
atcctcgcag ttgatggcgt gatctccgtg cacagtctac acatctggtc actgactgtg 1260
aaccaagtga ttctctctgt tcatgttgct acagctgcca gccaggacag ccagtctgtg 1320
cggacaggaa ttgctcaagc cctcagcagc tttgatcttc actctcttac cattcagata 1380
gaatctgcag cagaccagga ccccagctgc cttctctgcg aagaccctca ggactagctc 1440
ggtcacactg tcagcttcct gtgtttccta ggccatgata agatgcagca aagtttctgc 1500
aatgcacaat gaggcagccg tcggaataga tttgagaaag tcatgatgat gcaatgtgca 1560
cactcttcct ttgtatttat ctctatccac catgaacgag gatgcatggg atttgtcggc 1620
ttcttggatt atacactaat cagtagttgt gctcaattgt agtatatata gattattcct 1680
aactggagct gaaataacag atgtttgcaa tcataggtaa tgaatgattc acttgcctac 1740
aatagtgggt atagttttac tcggaaatgc ctttctagga atccacagca tgagaaacaa 1800
acatttgaag agaatttgag gccttagaat ttgattctgc caccatactc aatgagatct 1860
ttattttttg tgaaacagta aaacttccct cttttgacct tgcatg 1906
<210> 17
<211> 5373
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 17
agcagttttt gtaggtgaaa acaatgaagc caggtaatat tgcaaggagg ctgtaatttt 60
agcagaccta ccaacaacac tgatgtagga agctcattat tttaatttct ggagcctttt 120
aattttttct ttagaaagtg tataaataat tgcagtgctg ctttgcttcc aaaactgggc 180
agtgagttca acaacaacga caacaacagc cgcagctcat cctggccgtc atggagtttc 240
ttgaaagaac gtatcttgtg aatgataaag ctgccaagat gtatgctttc acactagaaa 300
gtgtggaact ccaacagaaa ccggtgaata aagatcagtg tcccagagag agaccagagg 360
agctggagtc aggaggcatg taccactgcc acagtggctc caagcccaca gaaaaggggg 420
cgaatgagta cgcctatgcc aagtggaaac tctgttctgc ttcagcaata tgcttcattt 480
tcatgattgc agaggtcgtg ggtgggcaca ttgctgggag tcttgctgtt gtcacagatg 540
ctgcccacct cttaattgac ctgaccagtt tcctgctcag tctcttctcc ctgtggttgt 600
catcgaagcc tccctctaag cggctgacat ttggatggca ccgagcagag atccttggtg 660
ccctgctctc catcctgtgc atctgggtgg tgactggcgt gctagtgtac ctggcatgtg 720
agcgcctgct gtatcctgat taccagatcc aggcgactgt gatgatcatc gtttccagct 780
gcgcagtggc ggccaacatt gtactaactg tggttttgca ccagagatgc cttggccaca 840
atcacaagga agtacaagcc aatgccagcg tcagagctgc ttttgtgcat gcccttggag 900
atctatttca gagtatcagt gtgctaatta gtgcacttat tatctacttt aagccagagt 960
ataaaatagc cgacccaatc tgcacattca tcttttccat cctggtcttg gccagcacca 1020
tcactatctt aaaggacttc tccatcttac tcatggaagg tgtgccaaag agcctgaatt 1080
acagtggtgt gaaagagctt attttagcag tcgacggggt gctgtctgtg cacagcctgc 1140
acatctggtc tctaacaatg aatcaagtaa ttctctcagc tcatgttgct acagcagcca 1200
gccgggacag ccaagtggtt cggagagaaa ttgctaaagc ccttagcaaa agctttacga 1260
tgcactcact caccattcag atggaatctc cagttgacca ggaccccgac tgccttttct 1320
gtgaagaccc ctgtgactag ctcagtcaca ccgtcagttt cccaaatttg acaggccacc 1380
ttcaaacatg ctgctatgca gtttctgcat catagaaaat aaggaaccaa aggaagaaat 1440
tcatgtcatg gtgcaatgca cattttatct atttatttag ttccattcac catgaaggaa 1500
gaggcactga gatccatcaa tcaattggat tatatactga tcagtagctg tgttcaattg 1560
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cggcaatacc aaattcatct cccttccaat aatgcatctt gagaacacat aggtaaattt 1680
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taacgccaca ttagaacttg gttctctcac caagctgtaa tgtgattttt ttttctactc 1860
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cagccaaaga atgtggttgt agagacccag aagtcttcaa gaacagccga caaaaacatt 2100
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<210> 18
<211> 1906
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 18
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cactcttcct ttgtatttat ctctatccac catgaacgag gatgcatggg atttgtcggc 1620
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<210> 19
<211> 5373
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 19
agcagttttt gtaggtgaaa acaatgaagc caggtaatat tgcaaggagg ctgtaatttt 60
agcagaccta ccaacaacac tgatgtagga agctcattat tttaatttct ggagcctttt 120
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aaaacattag aaacaaaaaa taaggagagc caagtcagga ataaaagtga ctctgtatgc 1800
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ctggaaatcc tatgtcaatg ggtttggttt ggaacctgga cttctgcatt tttaaaagtt 2400
acccagagat gcttctaaag atgagccata gtctagaaga ttgtcaacca caggagttca 2460
ttgagtggga cagctagaca catacattgg cagctacaat agtatcatga attgcaatga 2520
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ccactgaatg gttttgtttt tccatatttt gcataggacg ccctaaagac taggtgactt 3300
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gtgtggtcag aactccaggt cactggaagt tagtggaatc atgtagttga attctttact 3720
tcaagacatt gtattctctc cagctatcaa aacattaatg atcttttatg tctttttttt 3780
gttattgtta tactttaagt tctggggtac atgtgcggaa catgtaggtt tgttacatag 3840
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tctgtctttc aaagcaacac tctgttcttc tgagtagtga aatcaggtca actttaccac 3960
cagcctccat ttttaatatg cttcaccatc atccagcacc tacttaagat ttatctaggg 4020
ctctgtggtg atgttaggac ccataaaaga aatttatgcc ttccatatgt ttggttacag 4080
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tagtgttcag tacatgttaa atgttgtttt ttattatgta caaacatgag tgggcacaga 4380
attttaaatc atctcaactt ttgagaaatt ttgagttatc aacaccgttc ccacaagaca 4440
gtggcaaaat tattggtgag aattaaacag ctgtttctca gaggaagcaa tggaggcttg 4500
ctgggataaa ggcatttact gagaggctgt tacctagtga gagtgatgaa ttaattaaaa 4560
tagtcgaatc cctttctgac tgtctctgaa agcttccgct tttatctttg aagagcagaa 4620
ttgtcactcc aaggacattt attaataaaa agaacaactg tccagtgcaa tgaaggcaaa 4680
gtcataggtc tcccaagtct taccccattc ctgtgaaata tcaagttctt ggcttttctc 4740
tgtcatgtag cctcaacttt ctctgaccgg gtgcatttct ttctctggtt tctaaattgc 4800
cagtggcaaa tttggatcac ttacttaata tctgttaaat tttgtgaccc aacaaagtct 4860
tttagcactg tggtgtcaaa aagaaaaaca cctcccaggc atatacattt tatagattcc 4920
tggagaatgt tgctctccag ctccatcccc acccaatgaa atatgatcca gagagtcttg 4980
caaagagaca agcctcattt tccacaatta gctctaaagt gcctccagga aatgattttc 5040
tcagctcatc tctctgtatt ccctgttttg gatcacaggg caatctgttt aaatgactaa 5100
ttacagaaat cattaaaggc accaagcaaa tgtcatctct gaatacacac atcccaagct 5160
ttacaaatcc tgcctggctt gacagtgatg aggccactta acagtccagc gcaggcggat 5220
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cttaacgtct gtcattctgt tactgggcac ctgtttaaat tctattttaa aatgttaatg 5340
tgtgttgttt aaaataaaat caagaaagag aga 5373
<210> 20
<211> 1104
<212> DNA
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 20
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cctctagaca gagaacttcg acagaagcct gtgaataaag atcagtgtcc tggagacagg 120
ccagagcatc cagaggcagg aggcatctat cactgccaca acagcgccaa ggccacaggg 180
aacaggtcga gcaagcaagc gcatgccaag tggagactct gtgctgcttc agcaatatgc 240
ttcatcttta tggtggcaga ggtggtgggt ggacacgttg ctgggagtct ggctatcctc 300
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tggttgtcat cgaggccccc ttccaagcgg ctgacatttg ggtggtatcg agcagagatc 420
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tcaggctgtg cagtggcagc caacattgta ctaactatga ttttgcacca acggaacttt 600
ggctacaacc acaaggatgt acaagctaat gccagtgtcc gagcagcctt tgtgcatgcc 660
ctgggggatg tatttcagag catcagtgtg ctaattagtg ctctcattat ctactttaag 720
cctgactaca aaattgctga tccagtgtgc acatttatct tttccatcct ggttttggcc 780
agcaccgtca tgatcttaaa agacttctcc atcttactca tggaaggtgt tccaaagggc 840
ctgagttaca acagtgtgaa agagatcatc ctcgcagttg atggcgtgat ctccgtgcac 900
agtctacaca tctggtcact gactgtgaac caagtgattc tctctgttca tgttgctaca 960
gctgccagcc aggacagcca gtctgtgcgg acaggaattg ctcaagccct cagcagcttt 1020
gatcttcact ctcttaccat tcagatagaa tctgcagcag accaggaccc cagctgcctt 1080
ctctgcgaag accctcagga ctag 1104
<210> 21
<211> 1110
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 21
atggagtttc ttgaaagaac gtatcttgtg aatgataaag ctgccaagat gtatgctttc 60
acactagaaa gtgtggaact ccaacagaaa ccggtgaata aagatcagtg tcccagagag 120
agaccagagg agctggagtc aggaggcatg taccactgcc acagtggctc caagcccaca 180
gaaaaggggg cgaatgagta cgcctatgcc aagtggaaac tctgttctgc ttcagcaata 240
tgcttcattt tcatgattgc agaggtcgtg ggtgggcaca ttgctgggag tcttgctgtt 300
gtcacagatg ctgcccacct cttaattgac ctgaccagtt tcctgctcag tctcttctcc 360
ctgtggttgt catcgaagcc tccctctaag cggctgacat ttggatggca ccgagcagag 420
atccttggtg ccctgctctc catcctgtgc atctgggtgg tgactggcgt gctagtgtac 480
ctggcatgtg agcgcctgct gtatcctgat taccagatcc aggcgactgt gatgatcatc 540
gtttccagct gcgcagtggc ggccaacatt gtactaactg tggttttgca ccagagatgc 600
cttggccaca atcacaagga agtacaagcc aatgccagcg tcagagctgc ttttgtgcat 660
gcccttggag atctatttca gagtatcagt gtgctaatta gtgcacttat tatctacttt 720
aagccagagt ataaaatagc cgacccaatc tgcacattca tcttttccat cctggtcttg 780
gccagcacca tcactatctt aaaggacttc tccatcttac tcatggaagg tgtgccaaag 840
agcctgaatt acagtggtgt gaaagagctt attttagcag tcgacggggt gctgtctgtg 900
cacagcctgc acatctggtc tctaacaatg aatcaagtaa ttctctcagc tcatgttgct 960
acagcagcca gccgggacag ccaagtggtt cggagagaaa ttgctaaagc ccttagcaaa 1020
agctttacga tgcactcact caccattcag atggaatctc cagttgacca ggaccccgac 1080
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<210> 22
<211> 1104
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 22
atggagtttc ttgagagaac ttatcttgtg aatgatcaag ccaccaagat gtacgccttc 60
cctctagaca gagaacttcg acagaagcct gtgaataaag atcagtgtcc tggagacagg 120
ccagagcatc cagaggcagg aggcatctat cactgccaca acagcgccaa ggccacaggg 180
aacaggtcga gcaagcaagc gcatgccaag tggagactct gtgctgcttc agcaatatgc 240
ttcatcttta tggtggcaga ggtggtgggt ggacacgttg ctgggagtct ggctatcctc 300
actgatgcgg ctcatctctt aattgacctg actagtttcc tgctcagtct cttttctttg 360
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ctcggtgccc tgctgtctgt cctttgcatc tgggtggtga ctggtgtgct gctgtacctt 480
gcctgtgagc gccttttgta tcctgattac cagatccaag caggtatcat gatcactgtt 540
tcaggctgtg cagtggcagc caacattgta ctaactatga ttttgcacca acggaacttt 600
ggctacaacc acaaggatgt acaagctaat gccagtgtcc gagcagcctt tgtgcatgcc 660
ctgggggatg tatttcagag catcagtgtg ctaattagtg ctctcattat ctactttaag 720
cctgactaca aaattgctga tccagtgtgc acatttatct tttccatcct ggttttggcc 780
agcaccgtca tgatcttaaa agacttctcc atcttactca tggaaggtgt tccaaagggc 840
ctgagttaca acagtgtgaa agagatcatc ctcgcagttg atggcgtgat ctccgtgcac 900
agtctacaca tctggtcact gactgtgaac caagtgattc tctctgttca tgttgctaca 960
gctgccagcc aggacagcca gtctgtgcgg acaggaattg ctcaagccct cagcagcttt 1020
gatcttcact ctcttaccat tcagatagaa tctgcagcag accaggaccc cagctgcctt 1080
ctctgcgaag accctcagga ctag 1104
<210> 23
<211> 1110
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 23
atggagtttc ttgaaagaac gtatcttgtg aatgataaag ctgccaagat gtatgctttc 60
acactagaaa gtgtggaact ccaacagaaa ccggtgaata aagatcagtg tcccagagag 120
agaccagagg agctggagtc aggaggcatg taccactgcc acagtggctc caagcccaca 180
gaaaaggggg cgaatgagta cgcctatgcc aagtggaaac tctgttctgc ttcagcaata 240
tgcttcattt tcatgattgc agaggtcgtg ggtgggcaca ttgctgggag tcttgctgtt 300
gtcacagatg ctgcccacct cttaattgac ctgaccagtt tcctgctcag tctcttctcc 360
ctgtggttgt catcgaagcc tccctctaag cggctgacat ttggatggca ctgagcagag 420
atccttggtg ccctgctctc catcctgtgc atctgggtgg tgactggcgt gctagtgtac 480
ctggcatgtg agcgcctgct gtatcctgat taccagatcc aggcgactgt gatgatcatc 540
gtttccagct gcgcagtggc ggccaacatt gtactaactg tggttttgca ccagagatgc 600
cttggccaca atcacaagga agtacaagcc aatgccagcg tcagagctgc ttttgtgcat 660
gcccttggag atctatttca gagtatcagt gtgctaatta gtgcacttat tatctacttt 720
aagccagagt ataaaatagc cgacccaatc tgcacattca tcttttccat cctggtcttg 780
gccagcacca tcactatctt aaaggacttc tccatcttac tcatggaagg tgtgccaaag 840
agcctgaatt acagtggtgt gaaagagctt attttagcag tcgacggggt gctgtctgtg 900
cacagcctgc acatctggtc tctaacaatg aatcaagtaa ttctctcagc tcatgttgct 960
acagcagcca gccgggacag ccaagtggtt cggagagaaa ttgctaaagc ccttagcaaa 1020
agctttacga tgcactcact caccattcag atggaatctc cagttgacca ggaccccgac 1080
tgccttttct gtgaagaccc ctgtgactag 1110
<210> 24
<211> 29
<212> DNA
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 24
cagctgacag caagattaat ggaagtacc 29
<210> 25
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 25
tccaaaactg ggcagtgagt tcaaca 26
<210> 26
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 26
aattgcagtg ctgctttgc 19
<210> 27
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 27
agctgcggct gttgttgtc 19

Claims (43)

1.一种非人动物，其基因组包含内源Slc30a8基因座，所述内源Slc30a8基因座包含突变的Slc30a8基因，其中所述突变的Slc30a8基因编码截短的SLC30A8蛋白，并导致所述非人动物相对于没有突变的非人动物具有增强的胰岛素分泌能力。
2.根据权利要求1所述的非人动物，其中所述增强的胰岛素分泌能力是响应于高血糖症。
3.根据权利要求2所述的非人动物，其中相对于所述没有突变的非人动物，所述非人动物响应于由胰岛素受体抑制引起的高血糖症而具有增加的胰岛素分泌。
4.根据权利要求3所述的非人动物，其中响应于由胰岛素受体抑制引起的高血糖症的所述增加的胰岛素分泌与相对于所述没有突变的非人动物的增加的β细胞增殖或增加的β细胞质量无关。
5.根据前述权利要求中任意一项所述的非人动物，其中所述增强的胰岛素分泌能力是在被饲喂高脂饮食时。
6.根据权利要求5所述的非人动物，其中当饲喂高脂饮食时，所述非人动物相对于所述没有突变的非人动物具有增加的胰岛素分泌，其中所述增加的胰岛素分泌与相对于所述没有突变的非人动物的增加的β细胞增殖或增加的β细胞质量有关。
7.根据权利要求6所述的非人动物，其中所述增加的β细胞增殖是胰岛素受体依赖性的。
8.根据前述权利要求中任意一项所述的非人动物，其中所述突变的Slc30a8基因具有提前终止密码子。
9.根据前述权利要求中任意一项所述的非人动物，其中所述突变的Slc30a8基因在Slc30a8基因的第三外显子中包含突变。
10.根据权利要求9所述的非人动物，其中所述突变位于所述Slc30a8基因的第三外显子的3'末端。
11.根据前述权利要求中任意一项所述的非人动物，其中所述突变的Slc30a8基因包含无义突变。
12.根据权利要求11所述的非人动物，其中当由所述突变的Slc30a8基因编码的SLC30A8蛋白与SEQ ID NO：14最佳比对时，所述无义突变位于与SEQ ID NO：14中编码R138的密码子相对应的密码子中。
13.根据权利要求11或12所述的非人动物，其中当所述突变的Slc30a8基因的编码序列与SEQ ID NO：21最佳比对时，所述无义突变位于对应于SEQ ID NO：21中的残基412的位置。
14.根据前述权利要求中任意一项所述的非人动物，其中所述突变的Slc30a8基因内源于所述非人动物。
15.根据前述权利要求中任意一项所述的非人动物，其中所述非人动物是大鼠或小鼠。
16.根据权利要求15所述的非人动物，其中所述非人动物是小鼠。
17.根据权利要求16所述的非人动物，其中所述突变的Slc30a8基因编码包含SEQ IDNO：13所示序列的SLC30A8蛋白。
18.根据权利要求16或17所述的非人动物，其中所述突变的Slc30a8基因包含SEQ IDNO：22所示的编码序列。
19.根据前述权利要求中任意一项所述的非人动物，其中所述非人动物相对于所述没有突变的非人动物具有降低的线粒体基因表达。
20.根据前述权利要求中任意一项所述的非人动物，其中所述非人动物相对于所述没有突变的非人动物具有增加的Hvcn1表达。
21.根据前述权利要求中任意一项所述的非人动物，其中相对于所述没有所述突变的非人动物，所述非人动物在遵循对照的普通饮食时具有正常的葡萄糖稳态和葡萄糖诱导的胰岛素分泌。
22.根据前述权利要求中任意一项所述的非人动物，其中相对于所述没有突变的非人动物，所述非人动物在遵循对照的普通饮食时具有正常的代谢表型。
23.根据前述权利要求中任意一项所述的非人动物，其中相对于所述没有突变的非人动物，所述非人动物具有以下一个或多个特征：
(a)当饲喂所述高脂饮食时的增加的葡萄糖诱导的胰岛素分泌；
(b)当饲喂所述高脂饮食时的增加的胰腺β细胞增殖；
(c)当饲喂所述高脂饮食时的增加的胰腺β细胞数量；以及
(d)阻断所述胰岛素受体后的升高的进食血浆胰岛素水平。
24.根据前述权利要求中任意一项所述的非人动物，其中相对于所述没有突变的非人动物，所述非人动物具有以下所有特征：
(a)当饲喂所述高脂饮食时的增加的葡萄糖诱导的胰岛素分泌；
(b)当饲喂所述高脂饮食时的增加的胰腺β细胞增殖；
(c)当饲喂所述高脂饮食时的增加的胰腺β细胞数量；以及
(d)阻断所述胰岛素受体后的升高的进食血浆胰岛素水平。
25.根据前述权利要求中任意一项所述的非人动物，其中相对于所述没有突变的非人动物，所述非人动物具有以下一个或多个特征：
(a)饲喂所述高脂饮食20周后的增加的循环胰岛素水平；
(b)饲喂所述高脂饮食20周后的增加的胰腺β细胞数量；
(c)饲喂所述高脂饮食时的降低的胰岛素原与胰岛素之比；以及
(d)阻断所述胰岛素受体后的升高的进食血浆胰岛素水平。
26.根据前述权利要求中任意一项所述的非人动物，其中相对于所述没有突变的非人动物，所述非人动物具有以下所有特征：
(a)饲喂所述高脂饮食20周后的增加的循环胰岛素水平；
(b)饲喂所述高脂饮食20周后的增加的胰腺β细胞数量；
(c)饲喂所述高脂饮食时的降低的胰岛素原与胰岛素之比；以及
(d)阻断所述胰岛素受体后的升高的进食血浆胰岛素水平。
27.根据前述权利要求中任意一项所述的非人动物，其中所述非人动物的胰岛中的Slc30a8 mRNA表达水平是所述没有突变的非人动物的胰岛中的Slc30a8 mRNA表达水平的至少25％。
28.根据前述权利要求中任意一项所述的非人动物，其中所述非人动物对于所述突变是杂合的。
29.根据权利要求1-27中任意一项所述的非人动物，其中所述非人动物对于所述突变是纯合的。
30.根据前述权利要求中任意一项所述的非人动物，其中所述非人动物是雄性的。
31.根据权利要求1-29中任意一项所述的非人动物，其中所述非人动物是雌性的。
32.制备根据前述权利要求中任意一项所述的非人动物的方法，包括：
(a)使不是单细胞期胚胎的非人动物多能细胞的基因组接触：
(i)外源修复模板，其包含侧面为与所述Slc30a8基因座处的5'靶序列杂交的5'同源臂和与所述Slc30a8基因座处的3'靶序列杂交的3'同源臂的插入核酸，其中所述插入核酸包含所述突变；
(ii)Cas9蛋白；以及
(iii)与所述Slc30a8基因座内的向导RNA识别序列杂交的向导RNA，
其中所述Slc30a8基因被修饰以包含所述突变；以及
(b)将经修饰的非人动物多能细胞导入宿主胚胎；以及
(c)将所述宿主胚胎植入代孕母体，以产生经遗传修饰的F0代非人动物，其中所述Slc30a8基因被修饰以包含所述突变，其中所述突变导致当饲喂所述高脂饮食时，所述F0代非人动物相对于没有突变的非人动物具有增加的胰岛素分泌能力。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述多能细胞是胚胎干(ES)细胞。
34.根据权利要求32或33所述的方法，其中所述外源修复模板是长度至少为10kb的大靶向载体，或其中所述外源修复模板是其中的所述5'同源臂和所述3'同源臂的总长度至少为10kb的大靶向载体。
35.制备根据权利要求1-31中任意一项所述的非人动物的方法，包括：
(a)使非人动物单细胞期胚胎的基因组接触：
(i)外源修复模板，其包含侧面为与所述Slc30a8基因座处的5'靶序列杂交的5'同源臂和与所述Slc30a8基因座处的3'靶序列杂交的3'同源臂的插入核酸，其中所述插入核酸包含所述突变；
(ii)Cas9蛋白；以及
(iii)与所述Slc30a8基因座内的向导RNA识别序列杂交的向导RNA，
其中所述Slc30a8基因被修饰以包含所述突变；以及
(b)将经修饰的非人动物单细胞期胚胎植入代孕母体，以产生经遗传修饰的F0代非人动物，其中所述Slc30a8基因被修饰以包含所述突变，其中所述突变导致当饲喂所述高脂饮食时，所述F0代非人动物相对于没有突变的非人动物具有增加的胰岛素分泌能力。
36.根据权利要求32-35中任意一项所述的方法，其中步骤(a)进一步包括使所述非人动物多能细胞的基因组或所述非人单细胞期胚胎的基因组与第二向导RNA接触，所述第二向导RNA与所述Slc30a8基因座中的第二向导RNA识别序列杂交。
37.根据权利要求32、33、35，和36中任意一项所述的方法，其中所述外源修复模板为单链寡脱氧核苷酸。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述外源修复模板的长度在约80个核苷酸至约200个核苷酸之间。
39.筛选具有改善或加剧II型糖尿病的活性的化合物的方法，包括：
(a)使权利要求1-31中任意一项的对象非人动物与所述化合物接触；以及
(b)在所述对象非人动物中相对于未与所述化合物接触的对照非人动物测量以下一项或多项，其中所述对照非人动物包含与所述对象非人动物相同的Slc30a8突变：(1)饲喂高脂饮食时葡萄糖诱导的胰岛素分泌；(2)饲喂所述高脂饮食时胰腺β细胞的增殖水平；(3)饲喂所述高脂饮食时胰腺β细胞的数量；以及(4)在阻断胰岛素受体后的进食血浆胰岛素水平，
由此，通过所述对象非人动物中与所述对照非人动物相比的以下一项或多项，识别改善II型糖尿病的活性：(1)饲喂所述高脂饮食时增加的葡萄糖诱导的胰岛素分泌；(2)饲喂所述高脂饮食时增加的胰腺β细胞增殖；(3)饲喂所述高脂饮食时增加的胰腺β细胞数量；以及(4)阻断所述胰岛素受体后升高的进食血浆胰岛素水平，以及
由此，通过所述对象非人动物中与所述对照非人动物相比的以下一项或多项，识别加剧II型糖尿病的活性：(1)饲喂所述高脂饮食时减少的葡萄糖诱导的胰岛素分泌；(2)饲喂所述高脂饮食时减少的胰腺β细胞增殖；(3)饲喂所述高脂饮食时减少的胰腺β细胞数量；以及(4)阻断所述胰岛素受体后降低的进食血浆胰岛素水平。
40.筛选具有改善或加剧II型糖尿病的活性的化合物的方法，包括：
(a)使权利要求1-31中任意一项的对象非人动物与所述化合物接触；以及
(b)在所述对象非人动物中测量相对于未与所述化合物接触的对照非人动物的以下一项或多项，其中所述对照非人动物包含与所述对象非人动物相同的Slc30a8突变：(1)响应高血糖症分泌胰岛素的能力；(2)胰岛素清除；(3)线粒体基因表达；以及(4)Hvcn1表达，
由此，通过所述对象非人动物中与所述对照非人动物相比的以下一项或多项，识别出改善II型糖尿病的活性：(1)增加的响应高血糖症分泌胰岛素的能力；(2)增加的胰岛素清除；(3)降低的线粒体基因表达；以及(4)增加的Hvcn1表达，以及
由此，通过所述对象非人动物中与所述对照非人动物相比的以下一项或多项，识别出加剧II型糖尿病的活性：(1)降低的响应高血糖症分泌胰岛素的能力；(2)降低的胰岛素清除；(3)增加的线粒体基因表达；以及(4)降低的Hvcn1表达。
41.非人动物细胞，其基因组包含内源Slc30a8基因座，所述内源Slc30a8基因座包含突变的Slc30a8基因，其中所述突变的Slc30a8基因编码截短的SLC30A8蛋白，且其中包含所述突变的Slc30a8基因的非人动物相对于没有突变的非人动物而言具有增强的胰岛素分泌能力。
42.包含内源Slc30a8基因座的非人动物基因组，所述内源Slc30a8基因座包含突变的Slc30a8基因，其中所述突变的Slc30a8基因编码截短的SLC30A8蛋白，且其中包含所述突变的Slc30a8基因的非人动物相对于没有突变的非人动物而言具有增强的胰岛素分泌能力。
43.用于在非人动物中的内源Slc30a8基因座处产生突变的Slc30a8基因的靶向载体，其中所述靶向载体包括靶向所述内源Slc30a8基因座处的5'靶序列的5'同源臂和靶向所述内源Slc30a8基因座处的3'靶序列的3'同源臂，其中所述靶向载体在Slc30a8基因中包含突变，其中所述突变的Slc30a8基因编码截短的SLC30A8蛋白，且其中包含所述突变的Slc30a8基因的非人动物相对于没有突变的非人动物而言具有增强的胰岛素分泌能力。
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