JP2009159864A - Ｔ細胞系列特異的なサイレンサー活性を有するヌクレオチド及びその利用 - Google Patents

Ｔ細胞系列特異的なサイレンサー活性を有するヌクレオチド及びその利用 Download PDF

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Abstract

【課題】ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞系列における事象の解明に有効な、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞特異的な発現システムを提供する。
【解決手段】Ｔｈ−ＰＯＫ遺伝子のシス制御領域に由来し、ヘルパーＴ細胞系列特異的発現を調節するためのヌクレオチドであって、真核細胞においてサイレンサー活性を有するヌクレオチド、前記ヌクレオチドならびにプロモーター又はプロモーター及びエンハンサーを含む発現ベクター、前記発現ベクターを導入してなる形質転換体、前記発現ベクターを導入してなるトランスジェニック非ヒト動物、前記発現ベクター又は形質転換体又は非ヒト動物を用いることを特徴とする、ヘルパーＴ細胞の機能調節剤をスクリーニングする方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、Ｔ細胞系列特異的なサイレンサー活性を有するヌクレオチド及びその利用に関する。詳しくは、Ｔ細胞系列の特定の分化段階で遺伝子の発現を調節可能なシス制御領域を用いた遺伝子導入技術に関する。
遺伝子の発現は、トランスに働く因子がシスに働く遺伝子座上の制御領域に結合することで制御されている。遺伝子の発現を正に制御するシス制御領域として、エンハンサー、プロモーターが知られている。遺伝子の発現を負に制御するシス制御領域として、サイレンサーが知られている。特定の遺伝子の時空間的な発現パターンは、シス制御領域の活性制御により規定されている。発生工学的な手法を用いてトランスジェニック動物を作製する際には、いかに目的の細胞特異的に効率よく目的の遺伝子を発現させるかが最重要であり、そのためには適切なシス制御領域を用いる必要がある。言い換えると、ある特定の細胞に目的の遺伝子を発現するトランスジェニック動物を作製するには、まず特定の細胞に特異的に機能を発揮するシス制御領域を同定することが必要となる。
ＣＤ４＋ＣＤ８＋ダブルポジティブ（ＤＰ）胸腺細胞は、ポジティブセレクションを経て、２つの機能的に異なるサブセットであるＣＤ４＋ＣＤ８−ヘルパーＴ細胞又はＣＤ４−ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞（非特許文献１〜３）を生じる。ＭＨＣクラスＩＩ拘束性ＴＣＲを発現する細胞は、ＣＤ８発現を消失し、ヘルパー系列へと分化する一方、ＭＨＣクラスＩ拘束性ＴＣＲを発現する細胞は、ＣＤ４の発現を消失し、細胞傷害性系列へと分化する（非特許文献４、５）。進化上保存されたＲｕｎｔ ＤＮＡ結合ドメインを有するＲｕｎｘタンパク質及びそれらの共通パートナーであるＣｂｆβ（非特許文献６、７）から構成されるＲｕｎｘ転写因子複合体は、Ｔ細胞分化過程でのＣＤ４及びＩＬ-４遺伝子のサイレンシングに重要な役割を果たすことが示されている（非特許文献８−１１）。ＢＴＢ／ＰＯＺドメイン含有ジンクフィンガー因子ファミリー（非特許文献１２）に属する転写因子であるＴｈ−ＰＯＫ（ｃＫｒｏｘ又はＺｂｔｂ７ｂ）の発現は、ＣＤ４＋ヘルパー系列細胞の発生にとって必要かつ十分である（非特許文献１３、１４）。したがって、ＤＰ胸腺細胞の細胞系列決定がどのように制御されているかを理解するためには、Ｔｈ−ＰＯＫのヘルパー系列特異的な発現を制御する機構の解明が必要とされる。
本発明者は、最近、ＤＰ胸腺細胞におけるＲｕｎｘ１及びＲｕｎｘ３の両遺伝子の不活化によって成熟ＣＤ８＋Ｔ細胞の劇的な損失を起こすことを報告した（非特許文献１５）。Ｒｕｎｘタンパク質は、Ｇｒｏｕｃｈｏ／ＴＬＥコリプレッサータンパク質をその標的遺伝子にリクルートするために、Ｃ末端に保存されたＶＷＲＰＹモチーフを保有する（非特許文献１６、１７）。
これまで、Ｔ細胞特異的なトランスジェニックマウスを作製する際には、Ｌｃｋプロモーター、ＣＤ２ locus control region（ＬＣＲ）、ＣＤ４エンハンサー／プロモーターなどが用いられてきた。ＣＤ４遺伝子座において、ＣＤ４−ＣＤ８−ダブルネガティブ（ＤＮ）胸腺細胞とＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞で遺伝子発現を抑制する活性をもつＣＤ４サイレンサーが同定された（非特許文献１８）。このことにより、例えばＣＤ４エンハンサー／プロモーターとＣＤ４サイレンサーとの組み合わせによりＣＤ４＋ＣＤ８＋ＤＰ（ダブルポジティブ）胸腺細胞とＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞で特異的に発現するトランスジーンが作製可能となった。しかしながら、ＤＰ胸腺細胞とＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞でサイレンサー活性を示すシス制御領域は同定されておらず、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞のみで特異的に発現する有効なシス領域の組み合わせは同定されていなかった。そのため、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞系列特異的に遺伝子を発現させる有効な発生工学的解析手段は知られていない。
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本発明の目的は、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞系列における事象の解明に有効な、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞特異的な発現システムを提供することにある。
本発明者は、本明細書において、胸腺細胞におけるＲｕｎｘ複合体機能の喪失によって、Ｔｈ−ＰＯＫの抑制解除が起こり、クラスＩ拘束性胸腺細胞のＣＤ４＋ＣＤ８−ヘルパー様Ｔ細胞への異常な分化が起こること、ならびにＴｈ−ＰＯＫ遺伝子座に同定されたＲｕｎｘ結合配列は、ポジティブセレクション前のＤＰ胸腺細胞及びＣＤ８＋細胞傷害性系列細胞におけるＴｈ−ＰＯＫ抑制のみならず、ＣＤ８＋Ｔ細胞の発生にとっても必須である転写サイレンサーとして作用することを示す。これらの結果から、Ｔｈ−ＰＯＫ発現、よって即ち、ヘルパーＴ細胞への分化プログラムは、Ｒｕｎｘ複合体依存的なＴｈ−ＰＯＫのサイレンサー活性により積極的に抑制され、細胞傷害性Ｔ細胞の分化を可能とすることを実証し、本発明を完成するに至った。
即ち、本願発明は、以下に示す通りである。
〔１〕 Ｔｈ−ＰＯＫ遺伝子のシス制御領域に由来し、ヘルパーＴ細胞系列特異的発現を調節するためのヌクレオチドであって、真核細胞においてサイレンサー活性を有するヌクレオチド。
〔２〕 前記真核細胞が哺乳動物由来の細胞である、前記〔１〕に記載のヌクレオチド。
〔３〕 サイレンサー活性がＣＤ４＋ＣＤ８＋ダブルポジティブ胸腺細胞及びＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞で発揮されるものである前記〔１〕または〔２〕に記載のヌクレオチド。
〔４〕 前記ヌクレオチドが
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなるヌクレオチド、
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列において、２５１〜３６２位の領域を必須の塩基配列として含み、かつ配列番号１に記載の塩基配列からなるヌクレオチドと同等のサイレンサー活性を有するヌクレオチド、
（ｃ）配列番号１の２５１〜３６２位の領域の塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつ配列番号１に記載の塩基配列からなるヌクレオチドと同等のサイレンサー活性を有するヌクレオチド、
（ｄ）配列番号１の２７３〜３６２位の領域の塩基配列を少なくとも２つ直列に含み、かつ配列番号１に記載の塩基配列からなるヌクレオチドと同等のサイレンサー活性を有するヌクレオチド、又は
（ｅ）配列番号１に記載の塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつ配列番号１に記載の塩基配列からなるヌクレオチドと同等のサイレンサー活性を有するヌクレオチド
からなるものである、前記〔１〕記載のヌクレオチド。
〔５〕 前記〔１〕〜〔４〕いずれかに記載のヌクレオチドならびにプロモーター又はプロモーター及びエンハンサーを含む発現ベクター。
〔６〕 目的発現遺伝子としてリコンビナーゼ遺伝子を含む、前記〔５〕記載の発現ベクター。
〔７〕 目的発現遺伝子としてドミナントネガティブ変異体遺伝子を含む、前記〔５〕記載の発現ベクター。
〔８〕 目的発現遺伝子としてレポーター遺伝子を含む、前記〔５〕記載の発現ベクター。
〔９〕 前記〔５〕〜〔８〕いずれか１項に記載の発現ベクターを導入してなる形質転換体。
〔１０〕 前記〔５〕〜〔８〕いずれか１項に記載の発現ベクターを導入してなるトランスジェニック非ヒト動物。
〔１１〕 前記〔１０〕に記載のトランスジェニック非ヒト動物の子孫動物。
〔１２〕 前記〔１０〕又は〔１１〕に記載の非ヒト動物から得られる組織又は細胞。
〔１３〕 前記〔５〕〜〔８〕いずれか１項に記載の発現ベクター又は前記〔９〕に記載の形質転換体を用いることを特徴とする、ヘルパーＴ細胞の機能調節剤をスクリーニングする方法。
〔１４〕 前記〔１０〕又は〔１１〕に記載の非ヒト動物を用いることを特徴とする、ヘルパーＴ細胞の機能調節剤をスクリーニングする方法。
本発明のヌクレオチドによると、Ｔｈ−ＰＯＫのサイレンサー活性を発揮させるために必要十分な塩基配列を提供することが可能となり、真核生物におけるＴｈ−ＰＯＫを介した転写のさらなる解明のみならず、ヘルパーＴ細胞発生の遺伝的プログラミングの解明に寄与することができる。本発明の発現ベクターによると、本発明のヌクレオチドを様々な用途に供する際に便利なツールを提供することができる。
本発明の発現ベクター、形質転換体及びトランスジェニック非ヒト動物によると、真核生物におけるＴｈ−ＰＯＫサイレンサーを介した転写のさらなる解明のみならず、ヘルパーＴ細胞発生の遺伝的プログラミングをインビトロ又はインビボで調べるためのツールを提供することができる。特定の遺伝子を連結させた本発明の発現ベクターを用いることにより、インビトロ又はインビボでヘルパーＴ細胞特異的に目的タンパク質を発現させることができ、当該タンパク質のヘルパーＴ細胞における機能の解明につながる。また、特定の遺伝子としてリコンビナーゼ遺伝子（例、Ｃｒｅ遺伝子）を連結させた本発明の発現ベクターを用いて、ヘルパーＴ細胞特異的にリコンビナーゼを発現するトランスジェニック非ヒト動物を作製することにより、ヘルパーＴ細胞特異的に目的の遺伝子を欠損させたトランスジェニック非ヒト動物の作出が容易になる。このような発生工学的手法に供せられるツールを提供することにより、ヘルパーＴ細胞の機能調節の異常に起因する病態の解明につながる。
本発明のスクリーニング方法によると、胸腺細胞の発生、分化における転写調節の中核に位置するＲｕｎｘ及びＴｈ−ＰＯＫの活性を調節可能な薬剤を簡便かつ高感度に選別することができる。
本発明者は、Ｒｕｎｘ１によるＶＷＲＰＹ依存的な抑制が成熟ＣＤ８＋Ｔ細胞の損失に関与しているか否かを調べるために、Ｒｕｎｘ３欠損バックグラウンドに、ＶＷＲＰＹモチーフを欠く変異体Ｒｕｎｘ１タンパク質を生じるＲｕｎｘ１Δ４４６アレルを導入した（Nishimura, M. et al. Blood 103, 562-70 (2004)）。Ｒｕｎｘ１Δ４４６／Δ４４６：Ｒｕｎｘ３ｆ／ｆ：Ｃｄ４−Ｃｒｅマウスでは、９０％を超えるＴ細胞がＣＤ４＋ＣＤ８−表現型を示し、脾臓ＣＤ８＋Ｔ細胞の数が顕著に減少した（図１ａ及び図５）。したがって、Ｒｕｎｘ１によるＶＷＲＰＹ依存的抑制は、成熟ＣＤ８＋Ｔ細胞の産生に関与している。
成熟ＣＤ８＋Ｔ細胞の損失は、少なくとも２つの機構によって起こり得、それにはＭＨＣクラスＩ欠損マウスにおいて見られるようなクラスＩ拘束性細胞の分化阻害（Koller, B.H., et al. Science 248, 1227-30 (1990)）、又はＴｈ−ＰＯＫトランスジェニックマウスにおいて知られているような、クラスＩ拘束性細胞のＣＤ４＋ＣＤ８−系列への異方向性の分化（He, X. et al. Nature 433, 826-33 (2005); Sun, G. et al. Nat Immunol 6, 373-81 (2005)）が含まれる。クラスＩ拘束性Ｔ細胞の分化経路を調べるために、Ｒｕｎｘ１Δ４４６／Δ４４６：Ｒｕｎｘ３ｆ／ｆ：Ｃｄ４−ＣｒｅマウスをＭＨＣクラスＩＩ欠損バックグラウンドと交配させた（Grusby, M.J., et al. Science 253, 1417-20 (1991)）。ＣＤ４＋ＣＤ８−Ｔ細胞サブセットの劇的な減少がコンロトールのクラスＩＩ欠損マウスで観察された一方で、Ｒｕｎｘ１Δ４４６／Δ４４６：Ｒｕｎｘ３ｆ／ｆ：Ｃｄ４−ｃｒｅマウスにおいては、クラスＩＩ分子の非存在下でも、ＣＤ４＋ＣＤ８−Ｔ細胞の分化が優性であった（図１ｂ）。さらに、クラスＩＩ分子の非存在下において、脾臓ＣＤ４＋ＣＤ８−Ｔ細胞の数は、コントロールのマウスよりもＲｕｎｘ１Δ４４６／Δ４４６：Ｒｕｎｘ３ｆ／ｆ：Ｃｄ４−ｃｒｅマウスで高く（図１ｃ）、クラスＩ拘束性細胞の大部分が、胸腺細胞におけるＲｕｎｘ複合体機能が減弱された場合に、ＣＤ４＋ＣＤ８−Ｔ細胞へと分化したことが確認された。次いで、これらのＣＤ４＋ＣＤ８−クラスＩ拘束性細胞の機能的な特性を調べた。ＣＤ４＋ヘルパー系列Ｔ細胞の特徴の一つは、ＴＣＲ刺激後に、ＣＤ４０のリガンドであるＣＤ１５４の早期の誘導である（Roy, M., et al. J Immunol 151, 2497-510 (1993)）。コントロールＣＤ４＋Ｔ細胞及びＩ−Ａｏ：Ｒｕｎｘ１Δ４４６／Δ４４６：Ｒｕｎｘ３ｆ／ｆ：Ｃｄ４−ｃｒｅマウス由来のＣＤ４＋ＣＤ８−クラスＩ拘束性細胞において、インビトロのＴＣＲ会合後のＣＤ１５４発現が見られたが、コントロールＣＤ８＋Ｔ細胞では見られなかった（図１ｄ）。さらに、インターロイキン−４（ＩＬ−４）の産生が、クラスＩ拘束性ＣＤ４＋ＣＤ８−細胞及び野生型ＣＤ４＋Ｔ細胞において検出されたが、その一方でコントロールＣＤ８＋Ｔ細胞は、この能力を欠如していた。対照的に、高いインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）産生がコントロールＣＤ８＋Ｔ細胞において検出されたが、野生型ＣＤ４＋Ｔ細胞及びクラスＩ拘束性ＣＤ４＋ＣＤ８−細胞においては見られなかった（図１ｄ）。これらの結果から、ＤＰ胸腺細胞における機能的なＲｕｎｘ複合体の損失がクラスＩ拘束性細胞のＣＤ４＋ＣＤ８−ヘルパー様Ｔ細胞への異方向性分化を誘導したと結論付ける。
したがって、本発明は、ヘルパーＴ細胞系列特異的発現を調節するためのヌクレオチドを提供する。前記ヌクレオチドは、Ｔｈ−ＰＯＫ遺伝子のシス制御領域に由来し、真核細胞においてサイレンサー活性を有するヌクレオチドである。
本発明において「Ｔ細胞系列特異的」とは、胸腺内で前駆細胞がＴ細胞に分化、成熟、選択される過程をいう。また、前駆細胞がＴ細胞に分化、成熟、選択される限りにおいては、胸腺外又は胸腺と同等の微小環境を提供する再構成空間でＴ細胞系列特異的な過程が行われてもよい。「ヘルパーＴ細胞系列特異的」とは、ＣＤ４＋ＣＤ８＋ダブルポジティブ（ＤＰ）胸腺細胞がポジティブセレクションを経て、ＣＤ４＋ＣＤ８−ヘルパーＴ細胞へと分化、成熟、選択される過程をいう。
本発明におけるＴｈ−ＰＯＫ（ｃＫｒｏｘ又はＺｂｔｂ７ｂともいう）とは、BTB/POZファミリーに属するZnフィンガー型の転写因子であり、その塩基配列及びアミノ酸配列は公知である。例えば、ヒト又はマウスＴｈ−ＰＯＫのゲノム情報は、NCBIに登録されたヒトHs.700874、マウスMm.262184などでその塩基配列が公表されている。Ｔｈ−ＰＯＫ遺伝子のシス制御領域は、上記配列情報に基づいて自体公知の方法により単離することができる。
本発明において「発現の調節」とは、本発明のヌクレオチドの近辺に位置する遺伝子の転写を抑制することによって、特定のＴ細胞系列で遺伝子産物を発現させることをいう。
本発明のヌクレオチドとは、その近辺に位置する遺伝子の転写を抑制する核酸をいい、通常サイレンサーと称される用語と同義である。
本発明のヌクレオチドは、一実施形態において、ＴＧＣＧＧＴモチーフ及びＡＧＣＧＧＴモチーフというＲｕｎｘ認識モチーフを含むＴｈ−ＰＯＫのシス制御領域に由来するものであり、本発明によって初めて解明された、Ｔ細胞系列特異的、具体的にはＣＤ４＋ＣＤ８＋ダブルポジティブ胸腺細胞及びＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞でサイレンサー活性を有するヌクレオチドである。
本発明のヌクレオチド中に含まれる前記ＴＧＣＧＧＴモチーフ及びＡＧＣＧＧＴモチーフは、モチーフ間の上流、下流の関係は特に限定されるものではない。
「Ｔｈ−ＰＯＫ遺伝子のシス制御領域に由来する」とは、例えばマウスＴｈ−ＰＯＫ中の本発明者により見出されたＲＢＳ−１と名付けたシス制御領域の塩基配列そのものであってもよく、本発明の目的を達成しうるサイレンサー活性を有する限りＲＢＳ−１内の塩基配列が改変されていてもよい。マウスＲＢＳ−１配列、ならびにラット、イヌ、チンパンジー及びヒトＲＢＳ−１配列のアライメントは、図６に示されており、それぞれの動物由来のＲＢＳ−１配列として、マウスＲＢＳ−１（配列番号１）、ラットＲＢＳ−１（配列番号２）、イヌＲＢＳ−１（配列番号３）、チンパンジーＲＢＳ−１（配列番号４）及びヒトＲＢＳ−１（配列番号５）を示す。上記以外の動物由来のＲＢＳ−１配列も、各種動物のゲノムデータベースを検索することにより、容易に配列情報を入手することが可能であり、当該情報に基づいて自体公知の方法により単離することができる。
本発明のヌクレオチドの好ましい例として、下記（ａ）〜（ｅ）が挙げられる。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなるヌクレオチド
本発明者によりＲＢＳ-１と名付けられた、マウスＴｈ−ＰＯＫのシス制御領域に由来する塩基配列を有するヌクレオチドである。
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列において、２５１〜３６２位の領域を必須の塩基配列として含み、かつ配列番号１に記載の塩基配列からなるヌクレオチドと同等のサイレンサー活性を有するヌクレオチド
ＲＢＳ-１の２５１〜３６２位の領域は、サイレンサー活性を発揮するコアとなる配列である。したがって、当該領域を含み、かつ配列番号１に記載の塩基配列からなるヌクレオチドと同等のサイレンサー活性を有するヌクレオチドは、本発明のヌクレオチドとして好ましい。
ここで、配列番号１に記載の塩基配列からなるヌクレオチドと同等のサイレンサー活性は、後述するレポーターアッセイにより測定することができる。同等とは、配列番号１に記載の塩基配列からなるヌクレオチドと同じレベルのサイレンサー活性であってもよく、より高いレベルのサイレンサー活性であってもよい。レポーターアッセイにおける（ａ）の塩基配列からなるヌクレオチドのサイレンサー活性を１とした場合、（ｂ）の塩基配列からなるヌクレオチドのサイレンサー活性は、通常、０．５〜１００である。
（ｃ）配列番号１の２５１〜３６２位の領域の塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつ配列番号１に記載の塩基配列からなるヌクレオチドと同等のサイレンサー活性を有するヌクレオチド
２５１〜３６２位の領域は、サイレンサー活性を発揮するコアとなる配列であるが、かかる領域の塩基配列と７０％以上の同一性、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドであっても、配列番号１に記載の塩基配列からなるヌクレオチドと同等のサイレンサー活性を有するヌクレオチドは、本発明のヌクレオチドとして好ましい。ここで、同一性（％）は、当該分野で慣用のホモロジー検索プログラム（例えば、BLAST、FASTA等）を初期設定で用いて決定することができる。また、MacVector9.5.2のClustalWアルゴリズムを使用することもできる。本発明において、塩基配列の「同一性」とは、比較する２種の塩基配列を整列（アラインメント）させ、整列により一致した塩基配列の数を基準となる塩基配列の総数で除して算出した割合を％で示した数字である。なお、整列により生じたギャップは、不一致と見なして算出する。また、同等のサイレンサー活性とは、前記（ｂ）に記載した通りである。
（ｄ）配列番号１の２７３〜３６２位の領域の塩基配列を少なくとも２つ直列に連結して含み、かつ配列番号１に記載の塩基配列からなるヌクレオチドと同等のサイレンサー活性を有するヌクレオチド
配列番号１の２７３〜３６２位の領域は、単独ではサイレンサー活性をほとんど発揮しないが、当該領域を少なくとも２つ直列に連結した場合、配列番号１に記載の塩基配列からなるヌクレオチドと同等のサイレンサー活性を有することが見出された。かかる塩基配列を含むヌクレオチドも、サイレンサーとして好ましい。配列番号１の２７３〜３６２位の領域の連結数は、少なくとも２つ、好ましくは３つである。連結の向きは、２７３位から３６２位をすべて５’から３’の向きにすることが好ましい。
（ｅ）配列番号１に記載の塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつ配列番号１に記載の塩基配列からなるヌクレオチドと同等のサイレンサー活性を有するヌクレオチド
マウスＲＢＳ-１領域の一具体例である配列番号１に記載塩基配列と完全同一ではなくても、かかる領域の塩基配列と７０％以上の同一性、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドであって、かつ配列番号１に記載の塩基配列からなるヌクレオチドと同等のサイレンサー活性を有するヌクレオチドは、本発明のヌクレオチドとして好ましい。ここで、同一性は、前記（ｃ）に記載した通りである。また、同等のサイレンサー活性とは、前記（ｂ）に記載した通りである。
本発明におけるサイレンサー活性は、Ｔｈ−ＰＯＫのプロモーター配列とレポーター遺伝子としてＧＦＰ遺伝子を作動可能に連結したベクター内のプロモーター配列の上流に測定対象のヌクレオチドを挿入し、マウス受精卵にマイクロインジェクションすることにより作製したトランスジェニックマウス由来のリンパ球でのＧＦＰの発現を指標にして調べることができる。
本発明におけるサイレンサー活性は真核細胞において発揮されるものであるが、当該細胞としては、胸腺組織の発達した動物由来の細胞が好ましく、哺乳動物由来の細胞がより好ましい。哺乳動物としては、ヒトを始め、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、サル等の実験動物、ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ等の家畜が挙げられる。前記動物由来の細胞の中でも、Ｔ細胞系列、すなわち、ＤＰ胸腺細胞、ＣＤ８＋細胞傷害性細胞などが好ましい。
本発明のヌクレオチドは、プロモーター又はプロモーター及びエンハンサーとともに発現ベクターを構成することができる。本発明は、かかる発現ベクターを提供する。本発明の発現ベクターは、真核細胞（好ましくは哺乳動物由来）に導入された場合にＣＤ４＋ＣＤ８＋ダブルポジティブ胸腺細胞及びＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞で発現抑制され、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞で特異的に目的遺伝子を発現させることができる。本発明の発現ベクターは、本発明のヌクレオチドを真核細胞に導入してそのサイレンサー機能を発揮させるためのツールとなりうる。
本発明の発現ベクターに使用されるプロモーターとしては特に限定されるものではなく、発現目的遺伝子に応じて適宜選択されるが、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞で特異的に目的遺伝子を発現させるためには、リンパ球、特にＴ細胞で作動可能なプロモーターが好ましい。プロモーターの好適な例として、ＣＤ４プロモーター、Ｔｈ−ＰＯＫプロモーター、ＣＤ３プロモーター等が挙げられる。
本発明の発現ベクターに使用されるエンハンサーとしては特に限定されるものではなく、本発明の目的に応じて適宜選択されるが、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞で特異的に目的遺伝子を発現させるためには、リンパ球、特にＴ細胞で活性なエンハンサーが好ましい。エンハンサーの好適な例として、ＣＤ４エンハンサー、Ｔｈ−ＰＯＫエンハンサー（本発明者によりＲＢＳ−２と名付けられたＴｈ−ＰＯＫシス制御領域に由来するヌクレオチド）、ＣＤ３ｅエンハンサー等が挙げられる。
本発明の発現ベクターの基本骨格となるベクターは特に限定されるものではなく、本発明の目的に応じて適宜選択される。例えば、トランスジェニック動物を作製するためのターゲティングベクターとして使用する場合、形質転換を行う細胞（例えば、大腸菌）中で自己複製可能なものであればよい。例えば、市販のｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、ｐＺＥｒＯ １．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＧＥＭ−１（Ｐｒｏｍｅｇａ社）等が使用可能である。
本発明の発現ベクターに導入可能な目的遺伝子は特に限定されるものではなく、本発明の目的に応じて適宜選択される。例えば、ヘルパーＴ細胞特異的にリコンビナーゼを発現可能なトランスジェニック動物を作製するためには、本発明の発現ベクターにリコンビナーゼ遺伝子を導入することが好ましい。リコンビナーゼ遺伝子としては、バクテリオファージＰ１由来のＣｒｅ、酵母由来のＦＬＰなどが挙げられる。
本発明の発現ベクターをターゲティングベクターとして用いる場合、２以上のリコンビナーゼ標的配列を含むことが好ましい。２以上のリコンビナーゼ標的配列は、同一又は反対の配向性 (orientation)で配置することができる。
リコンビナーゼ標的配列としては、当該分野で公知の配列、例えば、バクテリオファージＰ１由来のＣｒｅ／ｌｏｘＰシステムで用いられるｌｏｘＰ配列（ｆｌｏｘ配列）、酵母由来のＦＬＰ／ＦＲＴシステムで用いられるＦＲＴ配列を使用することができる。
Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ系を利用する好ましいターゲティングベクターの例は、ある特定の遺伝子に相同な第一のポリヌクレオチド及び第二のポリヌクレオチド、及び選択マーカーを含み、Ｃｒｅ認識配列（例えば、ｆｌｏｘ）を少なくとも３箇所に含む。Ｃｒｅ認識配列は、コンディショナルノックアウトで欠失させる部位を両側から挟む態様で配置される。
本発明の発現ベクターに導入可能な目的遺伝子の別の例として、ドミナントネガティブ変異体遺伝子が挙げられる。ドミナントネガティブ変異体とは、あるタンパク質に対する変異の導入によりその活性が低減したものをいう。ドミナントネガティブ変異体は、天然のタンパク質と競合することで間接的にその機能を阻害することができる。ドミナントネガティブ変異体は、目的タンパク質をコードする核酸に変異を導入することによって作製することができる。変異としては、例えば、機能性部位における、当該部位が担う機能の低下をもたらすようなアミノ酸の変異（例えば、１以上のアミノ酸の欠失、置換、付加）が挙げられる。ドミナントネガティブ変異体遺伝子は、ＰＣＲや公知のキットを用いる自体公知の方法により作製することができる。
ドミナントネガティブ変異体遺伝子の好適な例としては、ヘルパーＴ細胞における機能と特定の疾患との関連が示されている、あるいは将来示されるであろう遺伝子が限定なく用いられる。一具体例として、ＴＧＦβ受容体のドミナントネガティブ変異体遺伝子が例示される。かかる遺伝子を導入した本発明のベクターを用いてトランスジェニック動物を作製し、Ｔ細胞のヘルパー機能調節の異常と腸炎との因果関係を調べることにより、腸炎の病態の解明が進み、ひいては腸炎の治療薬の標的としての評価にもつながる。
本発明の発現ベクターに導入可能な目的遺伝子の別の例として、レポーター遺伝子が挙げられる。ここで、レポーター遺伝子とは、本発明のヌクレオチドのサイレンサー活性を調べるために組み込まれる目印用の遺伝子をいい、公知のあらゆるレポーター遺伝子を制限なく用いることができる。検出が簡単で定量化も可能であるという観点から、レポーター遺伝子は発光タンパク質遺伝子又は蛍光タンパク質遺伝子が好ましい。
前記発光タンパク質としては、ホタル由来のルシフェラーゼ、Renilla（ウミシイタケ）由来のルシフェラーゼなどが挙げられる。これら発光タンパク質及び当該タンパク質をコードする核酸は、公知である。
前記蛍光タンパク質としては、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＣＦＰ、ＢＦＰ、Ｖｅｎｕｓなどのオワンクラゲ由来蛍光タンパク質及びそれらの類似体、ウミシイタケ由来蛍光タンパク質及びその類似体、ＤｓＲｅｄ、ＨｃＲｅｄ、ＡｓＲｅｄ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ＡｍＣｙａｎ、ＡｃＧＦＰ、Ｋａｅｄｅなどのサンゴ由来蛍光タンパク質及びそれらの類似体などが挙げられる。これら蛍光タンパク質及びそれらの類似体ならびに当該タンパク質をコードする核酸は、公知である。
本発明の発現ベクターには、本発明のヌクレオチドであるサイレンサーに加え、第２のサイレンサーを含んでいてもよい。第２のサイレンサーとしては、現在使用可能な、あるいは将来使用可能となるあらゆるサイレンサーを用いることができる。好適な一具体例としてＣＤ４のサイレンサーが挙げられる。ＣＤ４のサイレンサー配列は、Sawada, S. et al. Cell 77, 917-929 (1994)に記載されている。本発明の発現ベクターに前記２種類のサイレンサーを含むことにより、目的の細胞における目的遺伝子に対するより確実なサイレンサー活性が発揮されるので好ましい。
本発明の発現ベクター中の構成要素であるサイレンサー、プロモーター、エンハンサー及び目的遺伝子の位置は、当該分野の技術常識に基づいて適宜決定することができる。前記構成要素の連結も、当該分野で周知の方法により行うことができる。
このようにして構築された本発明の発現ベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。本発明は、かかる形質転換体を提供する。
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、動物細胞などが用いられる。エシェリヒア属菌は、本発明のヌクレオチド又は発現ベクターを調製するためにもっぱら用いられ、その他の宿主は本発明のヌクレオチドの活性等を調べるために用いられる。
エシェリヒア属菌としては、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２・ＤＨ１、ＪＭ１０３、ＪＡ２２１、ＨＢ１０１、Ｃ６００などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・ズブチルス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ−，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア パストリス（Pichia pastoris）などが用いられる。
動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−））、マウスＬ細胞、マウスＡｔＴ−２０、マウスミエローマ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞、ヒト２９３Ｔ細胞、ヒトＪｕｒｋａｔ細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６９巻，２１１０(１９７２)やGene，１７巻，１０７(１９８２)などに記載の方法に従って行なうことができる。
バチルス属菌を形質転換するには、例えば、Molecular ＆ General Genetics，１６８巻，１１１(１９７９)などに記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、例えば、Methods in Enzymology，１９４巻，１８２−１８７（１９９１）、Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ，７５巻，１９２９(１９７８）などに記載の方法に従って行なうことができる。
動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８新細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、Virology，５２巻，４５６(１９７３)に記載の方法に従って行なうことができる。
前記発現ベクターを導入することにより、トランスジェニック非ヒト動物を作出することができる。本発明は、かかるトランスジェニック非ヒト動物を提供する。本発明におけるトランスジェニック非ヒト動物には、いわゆるノックアウト非ヒト動物及びノックイン非ヒト動物が含まれる。
本発明のトランスジェニック非ヒト動物には、前記ヌクレオチド及び場合によってはレポーター遺伝子が対立遺伝子の両方に導入されたホモ接合動物、対立遺伝子の片方に導入されたヘテロ接合動物及びそれらの出生前の胎仔も含まれる。前記ホモ接合動物は、前記ヘテロ接合動物を交配することにより得られるものである。
用いられる非ヒト動物（本発明においては、単に動物と略す場合がある。）としては、ヒト以外の動物であれば特に限定されるものではない。好適な動物としては、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、サル等の実験動物ならびにウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ等の家畜が挙げられるが、遺伝子工学的に利用が容易であるところから、マウスがより好ましい。
本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、自体公知の方法により製造することができる。本発明のノックアウト又はノックイン非ヒト動物、胚性幹細胞、ターゲティングベクターの作製の詳細については、例えば、下記文献を参照のこと。
１．別冊 実験医学 ザ・プロトコールシリーズ 「ジーンターゲティングの最新技術」（2000年、羊土社）コンディショナルターゲティング法p.115-120
２．バイオマニュアルシリーズ８ 「ジーンターゲティング」−ＥＳ細胞を用いた変異マ
ウスの作製（1995年、羊土社）p.71-77
３．Sambrookら, Molecular Cloning: A LABORATORY MANUAL, 第3版, COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS, 2001年, 4.82-4.85
４．Robertson E. J. in Teratocarcinomas and embryonic stem cells-a practical approach, ed. Robertson, E. J. (IRL Press, Oxford), 1987: pp.108-112
５．Dynecki, S. M.ら, Gene Targeting -a practical approach, 2nd edition, ed. Joyner, A.L. (Oxford Univ. Press), 2000: pp.68-73
６．Dynecki, S. M. ら, Gene Targeting -a practical approach, 2nd edition, ed. Joyner, A. L. (Oxford Univ. Press), 2000: pp.75-81
このようにして得られた本発明のトランスジェニック非ヒト動物、当該動物をさらに交配して得られる子孫動物、これら動物に由来する組織又は細胞も本発明に含まれる。前記組織としては、すべての組織が挙げられ、脳、神経、骨髄、筋肉、心臓、腎臓、肝臓、血球及びその前駆体、幹細胞などが好ましい。また、前記細胞としては、前記組織中に含まれる細胞、組織中から単離された細胞、これら細胞から樹立した細胞株が挙げられ、具体的にはＴ細胞が好ましい。
本発明は、前記発現ベクター又は形質転換体を用いることを特徴とする、ヘルパーＴ細胞の機能調節剤をスクリーニングする方法（スクリーニング方法Ｉ）を提供する。スクリーニング方法Ｉの一具体例として、下記工程（ａ）〜（ｃ）を含む。
（ａ）本発明の発現ベクターをＴ細胞に導入し、あるいは本発明の発現ベクターを既に導入したＴ細胞（形質転換体）と被験物質とを接触させる工程
ここで用いる発現ベクターは、本発明のサイレンサー、エンハンサー、プロモーター、およびＴ細胞機能調節候補遺伝子を含むベクターが例示される。発現ベクターのＴ細胞への導入は、常法により行うことができ、一過性に導入して発現させてもよいし、安定的に発現させてもよい。さらには、安定的に発現する細胞株から形質転換体を樹立させて用いることも可能である。
前記工程（ａ）において、被験物質とは、いかなる公知物質および新規物質であってもよく、例えば、核酸、糖質、脂質、蛋白質、ペプチド、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分などが挙げられる。また、これらの化合物の２種以上の混合物を試料として供することもできる。
前記Ｔ細胞（形質転換体）と被験物質との接触は、前記Ｔ細胞（形質転換体）を適当な培地中に入れ、約２５〜４０℃のインキュベーター中で培養し、次に、前記培地中に被験物質を添加し、インキュベートを続けることで接触がなされうる。
前記被験物質の添加量は、有効成分の種類、培地に対する溶解性、細胞の感受性等によって適宜設定することができる。
（ｂ）前記被験物質を接触させたＴ細胞の培養上清中のインターロイキン４（ＩＬ４）の産生量を調べ、被験物質を接触させないＴ細胞の培養上清中のＩＬ４の量と比較する工程
前記被験物質を接触させたＴ細胞の培養上清中のＩＬ４の産生量は、自体公知の方法により調べることができる。感度および操作の容易性の観点から、ＥＬＩＳＡ法などを用いることが好ましい。
前記工程（ｂ）において、被験物質を接触させないＴ細胞の培養上清中のＩＬ４の量も同時にまたは別途調べ、被験物質を接触させた場合の結果と無接触の場合の結果とを比較する。
（ｃ）前記比較結果に基づいて、ＩＬ４の産生量を変動（増加または減少）させる被験物質を選択する工程
選択する基準は、非接触の場合を基準として、培養上清中のＩＬ４の有意な増加または減少を指標にすればよい。ＩＬ４を増加させる被験物質を選択した場合、当該物質は、ヘルパーＴ細胞機能増強を介した免疫応答活性化剤の候補物質となりうる。ＩＬ４を低下させる被験物質を選択した場合、当該物質は、ヘルパーＴ細胞機能抑制を介した免疫応答抑制剤の候補物質となりうる。
本発明は、前記トランスジェニック非ヒト動物を用いることを特徴とする、ヘルパーＴ細胞の機能調節剤をスクリーニングする方法（スクリーニング方法II）を提供する。スクリーニング方法IIの一具体例として、下記工程（ａ）〜（ｃ）を含む。
（ａ）前記トランスジェニック非ヒト動物に被験物質を投与する工程
ここで用いるトランスジェニック非ヒト動物は、本発明のサイレンサー、エンハンサー、プロモーター、およびＴ細胞機能調節候補遺伝子を含む発現ベクターを導入された動物が例示される。
スクリーニング方法IIの工程（ａ）における被験物質は、スクリーニング方法Ｉと同様のものが挙げられる。
前記被験物質を本発明の非ヒト動物に投与する方法は特に限定されるものではないが、経口的または非経口的に投与され得る。非経口的投与経路としては、例えば、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、気道内等の全身投与、あるいは標的細胞付近への局所投与等が挙げられる。
前記被験物質の投与量は、有効成分の種類、分子の大きさ、投与経路、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって適宜設定することができる。
（ｂ）前記被験物質を投与した非ヒト動物における末梢血試料中のＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞との存在比を調べ、被験物質を投与しない非ヒト動物における存在比と比較する工程
被験物質を投与した非ヒト動物における末梢血試料中のＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞との存在比は、例えば、動物から採取した末梢血を用いて、フローサイトメトリーにより調べることができる。
前記工程（ｂ）において、被験物質を投与しない非ヒト動物における末梢血試料中のＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞との存在比も同時にまたは別途調べ、投与動物の結果と非投与動物の結果とを比較する。
（ｃ）前記比較結果に基づいて、ＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞との存在比を変動（増加または低下）させる被験物質を選択する工程
工程（ｂ）で得られた比較結果に基づき、ＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞との存在比を変動（増加又は低下）させる被験物質を選択する。選択する基準は、非投与の動物を基準として、ＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞との存在比の有意な増加又は低下を指標にすればよい。存在比を増加させる被験物質を選択した場合、当該物質は、ヘルパーＴ細胞機能増強を介した免疫応答活性化剤の候補物質となりうる。存在比を低下させる被験物質を選択した場合、ヘルパーＴ細胞機能抑制を介した免疫応答抑制剤の候補物質となりうる。
このようにしてスクリーニング方法ＩまたはIIで選択された被験物質は、ヘルパーＴ細胞特異的に作用し、有害な副作用を引き起こすことなく、ヘルパーＴ細胞の機能を調節することによって免疫応答の調節剤となりうる。
本発明のスクリーニング方法により選別されうる疾患の予防または治療剤としては特に限定されるものではないが、例えば、アレルギー疾患、自己免疫疾患、がんなどの予防または治療剤が挙げられる。
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
マウス
Ｒｕｎｘ１ｆ、Ｒｕｎｘ１Δ４４６、Ｒｕｎｘ３ｆ及びＣｂｆβｆマウス系統は、以前に記載されている（Taniuchi, I. et al. Cell 111, 621-33 (2002)；Naoe, Y. et al. J Exp Med 204, 1749-1755 (2007)；Egawa, T. et al.J Exp Med 204, 1945-1957 (2007)）。Ｃｄ４−Ｃｒｅマウス及びＭＨＣクラスＩＩ（Ｉ−Ａβ）欠損マウス（Grusby, M.J. et al. Science 253, 1417-20 (1991)）は、それぞれＣｈｒｉｓ Ｗｉｌｓｏｎ博士及びＹｏｋｏｓｕｋａ博士から供与された。全てのマウスは理研免疫・アレルギー科学総合研究センターの動物施設において維持され、全ての実験は動物管理のための施設のガイドラインにしたがって行われた。
フローサイトメトリー及びＴ細胞の単離
胸腺、脾臓、及びリンパ節から調製されたリンパ球懸濁液を、標準的なプロトコールにしたがって、フローサイトメトリーによって解析した。サイトカインの細胞内染色は、既報に従って行った（Naoe, Y. et al. J Exp Med 204, 1749-1755 (2007)）。Ｔ細胞サブセットを、フローサイトメトリーによってソーティングした。
ＲＴ−ＰＣＲ
Ｔｈ−ＰＯＫの定量ＲＴ−ＰＣＲのためのプライマー及びプローブは、以前に記載されている（He, X. et al. Nature 433, 826-33 (2005)）。
クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）及びタイリングアレイ
抗Ｃｂｆβ２抗体及び抗Ｒｕｎｘ１抗体でのＣｈＩＰ実験を、既報に従って行った（Naoe, Y. et al. J Exp Med 204, 1749-1755 (2007)）。ＲＢＳ−１及びＲＢＳ−２を増幅するためのプライマー配列は、以下の通りである。
RBS-1:5’-cagaataggc gcgcagtta-3’(forward)（配列番号６）
RBS-1:5’-ctggctggtc caagtacaca-3’(reverse) （配列番号７）
RBS-2:5’-ctaaagagct gtgtgctaga cc-3’(forward) （配列番号８）
RBS-2:5’-gtttcaggca ggtgaggttc-3’(reverse) （配列番号９）
UP1 :5’-tgtttagttt ggcttgagcc c-3’(forward) （配列番号１０）
UP1 :5’-ccctcctact cgtttcaaac-3’(reverse) （配列番号１１）
ＣｈＩＰ−ｏｎ−ｃｈｉｐ実験のためには、抗Ｃｂｆβ２抗体で合計１千万個の胸腺細胞由来の沈殿させたＤＮＡを、製造者（ＮｉｍｂｌｅＧｅｎ）のプロトコールにしたがってＬＭ−ＰＣＲで一度増幅した。５０ｎｔのオリゴヌクレオチドプローブでＴｈ−ＰＯＫローカス周辺の５０ｋｂ配列をタイリングしたカスタムマイクロアレイを用いた。フォワード鎖を表すプローブは、１００塩基毎に配置され、かつアレイ上の４つのランダムな位置にてプリントされた。プローブハイブリダイゼーション及びオリゴヌクレオチドアレイデータの解析は、Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ Ａｒｒａｙ Ｓｅｒｖｉｃｅ（ＧｅｎｅＦｒｏｎｔｉｅｒ）の一部として、ＮｉｍｂｌｅＧｅｎ Ｓｙｓｔｅｍｓで行った。
試験例１
トランスジェニックマウスの作出
基本となるトランスジェニック発現カセットベクターを、１）ＲＮＡスプライシングアクセプターシグナルを提供するための、エキソンＩＩの上流のＰＣＲ増幅したＮｏｔＩ−ＮｃｏＩの１ｋｂゲノム断片と、及び２）ｇｆｐ遺伝子及びｐｏｌｙＡシグナルを含むＮｃｏＩ−ＸｈｏＩ断片との、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドのＮｏｔＩ−ＸｈｏＩ部位へのライゲーションによって作出した。Ｔｇ−ａコンストラクトを作出するために用いたマウスＴｈ−ＰＯＫ遺伝子のゲノム断片を、ファージライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）から単離した。適当な制限酵素で消化して調製したゲノム断片を、基本トランスジェニック発現カセットベクターの５’ポリリンカー部位に配置した。ＲＢＳ−１の３’側半分に相当する６７４ｂｐのＫｐｎＩ−Ｅｃｏ４７ＩＩＩ断片を除去するために、最初に、遠位プロモーターの上流に位置する４．４ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩゲノム断片をｐＣＲ−ＴＯＰＯベクターにクローニングした。次いで、このプラスミドを、平滑末端に変換したＫｐｎＩ部位とＥｃｏ４７ＨＩ部位との間で分子内ライゲーションした。Ｔｇ−ｇコンストラクトにおける５６２ｂｐのＲＢＳ−１断片又はＴｇ−ｅコンストラクトにおける５９３ｂｐのＲＢＳ−２断片をＰＣＲで得て、適当な制限酵素部位を両端に付加した後、シークエンシングした。Ｔｈ−ＰＯＫトランスジーンを構築するためには、Ｎ末端にｆｌａｇ−ＨＡエピトープタグを含む野生型Ｔｈ−ＰＯＫをコードするｃＤＮＡを、ＣＤ４エンハンサー／プロモーターの下流に挿入した。トランスジェニックコンストラクトのマイクロインジェクションは、ＲＩＫＥＮ ＲＣＡＩ及び日本エスエルシー株式会社にて行った。
試験例２
Ｔｈ−ＰＯＫ及びＴｈ−ＰＯＫGFPローカスからのＲＢＳ−１サイレンサーの除去
Ｔｈ−ＰＯＫ及びＴｈ−ＰＯＫGFPローカスから６７４ｂｐのＫｐｎＩ−Ｅｃｏ４７ＩＩＩ配列を除去する標的化ベクターを構築するため、第一に、２．８５ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＫｐｎＩゲノム断片を、ｐＣＲ−ＴＯＰＯベクターのＨｉｎｄＩＩＩ−ＫｐｎＩ部位にライゲーションし、３’末端にＳｐｅＩ部位を付加した。次いで、２．８５ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｐｅＩ断片を、ｌｏｘＰ配列に隣接したｎｅｏ遺伝子の下流のＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ部位に挿入し、５’末端にＮｏｔＩ部位を付加し、ｎｅｏ遺伝子の下流にＣｌａＩ部位を付加した。３’側の長い相同領域については、９．５ｋｂのＥｃｏ４７ＩＩＩ−Ｅｃｏ４７ＩＩＩゲノム断片を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターのＨｉｎｃＩＩ部位にライゲーションした（ｐＢＳ／Ｅｃｏ４７ ９．５ベクター）。５’側の短い相同領域及びｎｅｏ遺伝子は、ＮｏｔＩ−ＣｌａＩ消化によって調製し、ｐＢＳ／Ｅｃｏ４７ ９．５ベクターのＮｏｔＩ−ＣｌａＩ部位にライゲーションした。野生型Ｔｈ−ＰＯＫアレル及びＴｈ−ＰＯＫGFPアレルを持つＥＳ細胞へのトランスフェクションに先立ち、ＮｏｔＩ消化によって標的化ベクターを直線化した。
結果
Ｔｈ−ＰＯＫの異所性発現は、クラスＩ拘束性細胞にＣＤ４＋ＣＤ８−細胞への異方向性の分化を誘導をするため（He, X. et al. Nature 433, 826-33 (2005)；Sun, G. et al. Nat Immunol 6, 373-81 (2005)）、Ｒｕｎｘ変異体マウスにおける胸腺細胞の分化中のＴｈ−ＰＯＫの発現を測定した。以前の報告（He, X. et al. Nature 433, 826-33 (2005)）と一致して、Ｔｈ−ＰＯＫ発現は、選択前のコントロールのＣＤ６９−ＤＰ胸腺細胞では検出されなかった。しかし、Ｒｕｎｘ１欠損か若しくはＲｕｎｘ１Δ４４６変異のいずれかがＲｕｎｘ３欠損と組み合わされたＣＤ６９−ＤＰ胸腺細胞においては、Ｔｈ−ＰＯＫ転写物の４０倍の増加が検出された（図２ａ）。さらに、Ｃｂｆβの損失の場合にＴｈ−ＰＯＫ発現レベルの同様な増加は、Ｒｕｎｘ複合体がＴｈ−ＰＯＫ抑制において必須の役割を果たすことを確証させた（図２ａ）。
Ｃｂｆβｆ／ｆ：Ｃｄ４−ｃｒｅマウスにおいては、遺伝子の不活化後に残留したＣｂｆβタンパク質があり、これによってＣＤ４＋ＣＤ８−細胞及びＣＤ４＋ＣＤ８ｉｎｔＣＤ８系列細胞から構成される成熟Ｔ細胞の発生を可能にした（Naoe, Y. et al. J Exp Med 204, 1749-1755 (2007)）。Ｔｈ−ＰＯＫ ｍＲＮＡは、コントロールのＣＤ８＋Ｔ細胞及びＲｕｎｘ１又はＲｕｎｘ３を欠損するＣＤ８＋Ｔ細胞において検出できなかったものの、一方でＣｂｆβｆ／ｆ：Ｃｄ４−ｃｒｅマウス由来のＣＤ４＋ＣＤ８ｉｎｔＴ細胞には存在した（図２ｂ）。したがって、機能的なＲｕｎｘ複合体の再構築によって、Ｔｈ−ＰＯＫ抑制が末梢ＣＤ４＋ＣＤ８ｉｎｔ細胞において回復するか否かを調べた。Ｃｂｆβｆ／ｆ：Ｃｄ４−ｃｒｅマウス由来の精製されたＣＤ４＋ＣＤ８−及びＣＤ４＋ＣＤ８ｉｎｔ細胞に、Ｃｂｆβ２をコードするレトロウイルスベクター又は空のベクターコントロールを形質導入した。図２ｃにおいて示されるように、Ｔｈ−ＰＯＫの発現は、ＣＤ４＋ＣＤ８ｉｎｔ細胞におけるＣｂｆβ２の再発現の際には顕著に減少したが、ＣＤ４＋ＣＤ８−細胞では影響はなかった。これらの結果は、Ｒｕｎｘ介在性Ｔｈ−ＰＯＫ抑制が末梢ＣＤ８＋Ｔ細胞において機能していることを示唆する。
Ｔｈ−ＰＯＫのＲｕｎｘ介在性抑制の根底にある機構を理解するために、Ｒｕｎｘ複合体がＴｈ−ＰＯＫローカスと直接関連するか否かを調べた。Ｔｈ−ＰＯＫ転写産物に対する５’ＲＡＣＥを使用し、遠位（Ｐ１）又は近位（Ｐ２）プロモーターを用いて転写される異なる２つのエキソンＩａ及びＩｂ（図３ａ）を検出した（データ示さず）。抗Ｃｂｆβ２抗体を用いた「ＣｈＩＰ−ｏｎ−ｃｈｉｐ」実験によって、Ｔｈ−ＰＯＫローカス内において、Ｒｕｎｘ複合体が結合する２つの領域が同定された。遠位及び近位Ｒｕｎｘ結合配列（Ｒｕｎｘ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）（それぞれＲＢＳ−１及びＲＢＳ−２）は、それぞれエキソンＩａの約３．１ｋｂ上流及び約７．４ｋｂ下流に位置した（図３ａ）。ＲＢＳ−１内には２つの保存されたＲｕｎｘモチーフが存在する一方で、ＲＢＳ−２内にはＲｕｎｘモチーフは１つしか保存されていない（図３ａ及び図６、７）。抗Ｃｂｆβ２抗体及び抗Ｒｕｎｘ１抗体でのＴ細胞サブセットにおけるＣｈＩＰアッセイを用い、Ｒｕｎｘ複合体とこれら２つの領域との間の関連性を確認した（図３ｂ、データ示さず）。しかし、Ｒｕｎｘ複合体のＲＢＳ−１及びＲＢＳ−２への結合は、Ｔｈ−ＰＯＫ発現細胞及び非発現細胞の両方において検出され、したがってＲｕｎｘ複合体のこれらの領域への結合はＴｈ−ＰＯＫ抑制と相関しないことが実証された。
ＲＢＳ−１及びＲＢＳ−２の機能的な活性を調べるため、一連のトランスジェニックレポーターアッセイを行った。Ｒｕｎｘ結合配列並びにエキソンＩａ及びＩｂを含む１５．５ｋｂのゲノム断片を、エキソンＩＩのスプライス受容配列及びレポーターｇｆｐ遺伝子を有するトランスジェニック発現カセットへ連結した（図３ａのＴｇ−ａ）。Ｔｇ−ａで得られた３匹のファウンダー全てにおいて、ＧＦＰ発現はＣＤ４＋ＣＤ８ｉｎｔ胸腺細胞で最初に検出され、ＣＤ４＋ＳＰ胸腺細胞で増強し、脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞でも高発現が保たれていた一方で、脾臓ＣＤ８＋Ｔ細胞においてはほぼ検出不可能であった（図３ｃ）。ＣＤ４＋Ｔ細胞サブセット内におけるＧＦＰ＋細胞の割合は、ファウンダーによって様々であったが、これはおそらくトランスジーンの斑入り位置効果によるものである（Festenstein, R. et al. Science 271, 1123-5 (1996)）。しかし、ＧＦＰのＣＤ４＋ヘルパー系列特異的発現は全てのＴｇ−ａファウンダーにおいて見られ、１５．５ｋｂ断片が、ヘルパー系列におけるＴｈ−ＰＯＫの発現を方向付ける主要なシス調節領域を含んでいたことを示す。
最も重要なＴｈ−ＰＯＫ調節領域をさらに絞り込むため、１５．５ｋｂ断片から５’又は３’配列を除去した。エキソンＩａの５’側の６．５ｋｂセグメント（Ｔｇ−ｂ）は、胸腺細胞分化の間のヘルパー系列特異的な発現を調節するのに十分であったが、ＲＢＳ−２を含む５９３ｂｐ断片の３’側配列（図３に示す（Ｔｇ−ｅ））は、ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＧＦＰ発現を維持するために必要であり（図３ｃ）、ＲＢＳ−２が転写エンハンサーとして機能することが示唆された。ＲＢＳ−１の３’側半分（６．５ｋｂ上流配列内に含まれる６７４ｂｐのＫｐｎＩ−Ｅｃｏ４７ＩＩＩ断片）の除去（Ｔｇ−ｃ）は、ＣＤ４＋ヘルパー系列細胞のみならず、ＣＤ８＋細胞傷害性系列細胞においてもＧＦＰ発現をもたらし、ＲＢＳ−１が、ＣＤ８系列細胞におけるレポーター遺伝子を抑制するのに必要な転写サイレンサーであることを示した。１０．１ｋｂの５’側配列を欠くトランスジーン（Ｔｇ−ｆ）もまた、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞両方におけるＧＦＰ発現を方向付けたが、ＲＢＳ−１の進化的に保存された５６２ｂｐ断片（Ｔｇ−ｇ）を包含させることで（図６に示す）ＣＤ８＋細胞傷害系列細胞におけるＧＦＰの効率的な抑制をもたらし（図３ｃ）、ＲＢＳ−１配列がサイレンサー活性を持つ結果と一致していた。
ＲＢＳ−１サイレンサーの潜在的な生理機能を調べるため、ＥＳ細胞における相同組み換えによって、Ｔｈ−ＰＯＫローカスから６７４ｂｐのＫｐｎＩ−Ｅｃｏ４７ＩＩＩ配列を除去した（図４ａ及び図８）。１つのＴｈ−ＰＯＫアレル内のＲＢＳ−１の欠失は、Ｔｈ−ＰＯＫトランスジェニックマウス（He, X. et al. Nature 433, 826-33 (2005); Sun, G. et al. Nat Immunol 6, 373-81 (2005)）及びＲｕｎｘ１Δ４４６／Δ４４６：Ｒｕｎｘ３ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ： Ｃｄ４−ｃｒｅマウス（図１ａ）の両方において見られたような、末梢ＣＤ８＋Ｔ細胞の損失をもたらした（図４ｂ）。さらに、Ｔｈ−ＰＯＫの抑制解除がＣＤ６９−ＤＰ胸腺細胞において見られた（図４ｃ）。さらに、選択前のＣＤ６９−ＤＰ胸腺細胞におけるＴｈ−ＰＯＫの抑制解除を、相同組み換えによってＴｈ−ＰＯＫのコーディング配列がｇｆｐ遺伝子と置換されたマウスを利用して調べた。Ｔｈ−ＰＯＫGFPのヘテロ接合体マウスにおけるＧＦＰ発現により、単一の細胞レベルでのＴｈ−ＰＯＫ遺伝子の発現を検討することが可能である。Ｔｈ−ＰＯＫGFPローカスからのＧＦＰ発現はＣＤ６９−ＤＰ胸腺細胞においては検出されなかったが、ＲＢＳ−１（図４ａにおけるＴｈ−ＰＯＫGFP：ＳΔローカス）の欠失によりＣＤ６９−ＤＰ胸腺細胞において、低レベルではあるが、ＧＦＰの均一な発現が誘導された（図４ｄ）。これらの結果は、Ｔｈ−ＰＯＫ抑制及びＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細系列の特定にとってＲＢＳ−１が必須であることを実証する。
上記結果は、ヘルパー系列特異的なＴｈ−ＰＯＫの発現が、ＲＢＳ−１サイレンサー（その活性は、Ｒｕｎｘ複合体の結合に依存する）によって制御されていることを明らかにする。したがって、ＲＢＳ−１をＴｈ−ＰＯＫサイレンサーと呼ぶ。
Ｔｈ−ＰＯＫ遺伝子の発現は、ＤＰ胸腺細胞において、また胸腺細胞を細胞傷害性系列へ発生させる際に、Ｒｕｎｘ依存的Ｔｈ−ＰＯＫサイレンサーによって抑制される。Ｒｕｎｘ複合体は、Ｔｈ−ＰＯＫローカスと２つの領域（Ｒｕｎｘ結合配列（Ｒｕｎｘ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）（ＲＢＳ）−１及びＲＢＳ−２）と会合する。ＲＢＳ−１は、ＤＰ胸腺細胞及び細胞傷害性系列細胞においてＴｈ−ＰＯＫ発現を抑制するのに必須な転写サイレンサーとして作用する一方で、ＲＢＳ−２は、少なくとも末梢ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるレポータートランスジーンの発現を維持するために必要な転写エンハンサーとして機能する（図７、マウスＲＢＳ−２（配列番号１２）、ラットＲＢＳ−２（配列番号１３）、イヌＲＢＳ−２（配列番号１４）、チンパンジーＲＢＳ−２（配列番号１５）及びヒトＲＢＳ−２（配列番号１６））。したがって、Ｔｈ−ＰＯＫ遺伝子のヘルパー系列特異的発現は、Ｒｕｎｘ複合体の結合に依存するサイレンサー活性を有するＲＢＳ−１サイレンサー(Ｔｈ−ＰＯＫサイレンサー)によって制御されている。
Ｔｈ−ＰＯＫを発現する細胞でもＲｕｎｘ複合体がＴｈ−ＰＯＫサイレンサーと会合していることから、Ｔｈ−ＰＯＫサイレンサー活性の特異性はＲｕｎｘ複合体の結合により制御されているものではないと考えられる。これは、IL-４サイレンサー（その活性がＲｕｎｘ複合体の結合と相関する）によるIL-４遺伝子の抑制とは異なる（Djuretic, I.M. et al. Nat Immunol 8, 145-53 (2007); Naoe, Y. et al. J Exp Med 204, 1749-1755 (2007)）。したがって、Ｔｈ−ＰＯＫサイレンサー活性の制御において、Ｔｈ−ＰＯＫサイレンサーと結合したＲｕｎｘ因子と相互作用するさらなる分子、あるいはＴｈ−ＰＯＫサイレンサーに結合しているＲｕｎｘ複合体の翻訳後修飾が中心的な役割を有する可能性が考えられる。
前駆細胞において２つの相対する運命が誘導される場合に、一次系列決定転写因子間の相互排他的なループ、又は拮抗的相互作用がしばしば見られる（Rothenberg, E.V. Nat Immunol 8, 441-4 (2007); Orkin, S.H. Nat Rev Genet 1, 57-64 (2000)）。このループ内では、２つの転写因子は、互いの発現を抑制し合うか、又は互いの活性を拮抗し合う。Ｔｈ−ＰＯＫは近年、Ｒｕｎｘ依存的Ｃｄ４サイレンサー活性を阻害することが記載された（Wildt, K.F. et al. J Immunol 179, 4405-14 (2007)）。これは、これらの２つの因子間の拮抗的相互作用を支持するものである。本研究は、ＣＤ４＋ヘルパー対ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞に対するＤＰ胸腺細胞の系列特異性を制御する転写因子のネットワークの一端を明らかにしたものであり、Ｔｈ−ＰＯＫ及びＲｕｎｘ複合体標的遺伝子の同定は、このネットワークのさらなる解明に役立つであろう。
Ｔｈ−ＰＯＫサイレンサーの欠失の際のＣＤ６９−ＤＰ胸腺細胞集団におけるＴｈ−ＰＯＫの抑制解除は、サイレンサーによるＴｈ−ＰＯＫ抑制が全てのＤＰ胸腺細胞においてＭＨＣ／ＴＣＲ相互作用による選択に先立って機能していることを示す。したがって、ＭＨＣクラスＩＩとの相互作用によるＴＣＲシグナルが、Ｔｈ−ＰＯＫサイレンサー活性に対して拮抗的に働き、Ｔｈ−ＰＯＫの発現を誘導する可能性が考えられる。あるいは、クラスＩ拘束性ＴＣＲの結合が、Ｔｈ−ＰＯＫサイレンサー活性を維持するシグナルを提供し、ポジティブセレクション中及び細胞傷害性T細胞分化過程でＴｈ−ＰＯＫ発現を抑制する可能性が考えられる。ヘルパー系列の分化決定には、ＴＣＲとＭＨＣクラスＩＩとの相互作用による持続性のＴＣＲシグナルが必要と考えられていることは（Yasutomo, K., et al. Nature 404, 506-10 (2000); Liu, X. & Bosselut, R. Nat Immunol 5, 280-8 (2004); Sarafova, S.D. et al. Immunity 23, 75-87 (2005) 、クラスＩＩ拘束性ＴＣＲシグナリングの抗サイレンサー機能を支持する。この場合、Ｔｈ−ＰＯＫサイレンサーの機能解除は、ＴＣＲシグナルに依存しないＴｈ−ＰＯＫサイレンサーの機能解除機構が獲得するまでは、ある特定の期間クラスＩＩ特異的ＴＣＲシグナルに依存して居ると考えられる。これらの結果により、Ｔｈ−ＰＯＫサイレンサー活性を制御する機構は、ＴＣＲシグナリングにおける定性的及び継続的な差を判定するセンサーとして作用することが示唆される。Ｔｈ−ＰＯＫサイレンサーと複合体化した結合因子の同定を含む、Ｔｈ−ＰＯＫ抑制の制御経路のさらなる研究は、外部刺激によって開始されるシグナルが、どのようにして細胞核における遺伝子プログラムへと変換されるかを明らかにするであろう。
本発明によれば、Ｔｈ−ＰＯＫのサイレンサー活性を発揮させるために必要十分な塩基配列を提供することが可能となり、真核生物におけるＴｈ−ＰＯＫサイレンサーを介した転写のさらなる解明のみならず、ヘルパーＴ細胞発生の遺伝的プログラミングをインビトロ又はインビボで調べるためのツールを提供することができる。かかるツールを用いて、ヘルパーＴ細胞の機能調節の異常に起因する病態を解明することが可能である。本発明のスクリーニング方法によると、胸腺細胞の発生、分化における転写調節の中核に位置するＲｕｎｘ及びＴｈ−ＰＯＫの活性を調節可能な薬剤を簡便かつ高感度に選別することができる。
図１ａは、示されたマウス由来のリンパ節αβＴ細胞上のＣＤ４及びＣＤ８発現を示す。 図１ｂは、示されたマウス由来のリンパ節αβＴ細胞上のＩ−Ａ ＭＨＣクラスＩＩ分子の存在下（ＩＩ＋）又は非存在下（ＩＩｏ）でのＣＤ４及びＣＤ８の発現を示す。 図１ｃは、以下のマウスにおける脾臓ＣＤ４＋ＣＤ８−αβＴ細胞の細胞数を示す：クラスＩＩ＋：コントロールマウス（レーン１）、クラスＩＩｏ：コントロールマウス（レーン２）、クラスＩＩ＋：Ｒｕｎｘ１Δ４４６／Δ４４６：Ｒｕｎｘ３ｆ／ｆ：Ｃｄ４−Ｃｒｅマウス（レーン３）及びクラスＩＩｏ：Ｒｕｎｘ１Δ４４６／Δ４４６：Ｒｕｎｘ３ｆ／ｆ：Ｃｄ４−Ｃｒｅマウス（レーン４）。 図１ｄは、コントロールＣＤ４＋、ＣＤ８＋、及びクラスＩ拘束性ＣＤ４＋ＣＤ８−細胞上でのインビトロＴＣＲ刺激４２時間後のＣＤ１５４の発現（左のパネル）を示す。最初のインビトロＴＣＲ刺激に続いて、５日間培養された細胞の再刺激６時間後に解析されたＩＬ−４（中央のパネル）及びＩＦＮ−γ（右のパネル）の細胞内染色。 図２ａは、以下のマウス由来の、ソーティングされたＣＤ６９−ＤＰ胸腺細胞における正規化されたＴｈ−ＰＯＫ発現レベルを示す：野生型（レーン１）、Ｒｕｎｘ１ｆ／ｆ：Ｃｄ４−Ｃｒｅ（レーン２）、Ｒｕｎｘ１Δ４４６／Δ４４６（レーン３）、Ｒｕｎｘ３ｆ／ｆ：Ｃｄ４−Ｃｒｅ（レーン４）、Ｒｕｎｘ１ｆ／ｆ：Ｒｕｎｘ３ｆ／ｆ：Ｃｄ４−ｃｒｅ（レーン５）、Ｒｕｎｘ１Δ４４６／Δ４４６：Ｒｕｎｘ３ｆ／ｆ：Ｃｄ４−Ｃｒｅ（レーン６）、Ｃｂｆβｆ／ｆ：ｌｃｋ−ｃｒｅ（レーン７）及びＣｂｆβｆ／ｆ：Ｃｄ４−Ｃｒｅ（レーン８）。レーン９は、コントロールＣＤ４＋ＣＤ８−ＳＰ胸腺細胞におけるＴｈ−ＰＯＫ発現レベルを示す。 図２ｂは、示された遺伝子型のマウスにおけるＣＤ４＋及びＣＤ８＋末梢αβＴ細胞中の正規化されたＴｈ−ＰＯＫの発現レベルを示す。 図２ｃは、Ｒｕｎｘ複合体機能の再構築後の正規化されたＴｈ−ＰＯＫの発現レベルを示す。Ｃｂｆβｆ／ｆ：Ｃｄ４−Ｃｒｅマウス由来の精製されたＣＤ４＋ＣＤ８−及びＣＤ４＋ＣＤ８ｉｎｔ細胞に、コントロールレトロウイルスベクター（ＧＦＰ）又はＣｂｆβ２をコードするベクター（Ｃｂｆβ２）を形質導入した。 図３ａは、マウスＴｈ−ＰＯＫローカスの構造を示す。マウスＴｈ−ＰＯＫローカスの構造は、上部に黒い線として示される。丸は、推定Ｒｕｎｘモチーフを表し、赤のものは進化的に保存されたＲｕｎｘモチーフを示す。黒い長方形は、エキソンを表し、緑の各バーは、ＣｈＩＰ−ｏｎ−ｃｈｉｐ実験における個々のオリゴヌクレオチドプローブのシグナル強度を表す。青い長方形は、ＮｉｍｂｌｅＧｅｎのシステムソフトウェアであるＳｉｇｎａｌＭａｐによって同定されたＲｕｎｘ結合配列（ＲＢＳｓ）を表す。各レポータートランスジーンコンストラクトのマップ（Ｔｇ−ａからＴｇ−ｇ）が示される。示される制限部位は、Ｅｃｏ４７ＩＩＩ（Ｅ４７）、ＥｃｏＲＶ（ＲＶ）、ＨｉｎｄＩＩＩ（Ｈ）、ＫｐｎＩ（Ｋｐ）及びＸｈｏＩ（Ｘ）である。 図３ｂは、示されたＴ細胞サブセットにおけるＲｕｎｘ複合体とＲＢＳ−１及びＲＢＳ−２との結合を示す、抗Ｃｂｆβ２抗体でのＣｈＩＰ実験の結果を示す。保存されたＲｕｎｘモチーフを含むエキソンＩａの上流１ｋｂの領域（ＵＰ１）及びＴＣＲβエンハンサー（ＴＣＲβ）をそれぞれ、陰性及び陽性コントロールとして用いた。 図３ｃは、各コンストラクトの代表のトランスジェニック系統由来の、示されたＴ細胞サブセットにおけるＧＦＰ発現パターンを示すヒストグラムである。破線は、非トランスジェニック同腹子のコントロールを示す。ヒストグラムにおける数字は、ＧＦＰ陽性細胞の割合を示し、カッコ内の数字は、ＧＦＰ＋細胞におけるＧＦＰの平均蛍光強度を示す。得られたトランスジェニック系統の総数に対するＧＦＰ発現トランスジェニック系統の数が、右に示される。 図４ａは、Ｔｈ−ＰＯＫ、Ｔｈ−ＰＯＫＳΔ、Ｔｈ−ＰＯＫGFP及びＴｈ−ＰＯＫGFP：ＳΔローカスの概略構造を示す。Ｔｈ−ＰＯＫGFPローカスは、ＥＳ細胞における相同組み換えによってＴｈ−ＰＯＫのコーディング配列をｇｆｐ遺伝子で置換することによって作出した。ＲＢＳ−１サイレンサーを、相同組み換えによってＴｈ−ＰＯＫ又はＴｈ−ＰＯＫGFPローカスから除去し、それぞれＴｈ−ＰＯＫＳΔ又はＴｈ−ＰＯＫGFP：ＳΔローカスを生成する。エキソン及びｌｏｘＰ配列を、それぞれ黒い長方形及び黒い三角形として示す。 図４ｂは、野生型（＋／＋）マウス、Ｔｈ−ＰＯＫＳΔヘテロ接合性（ＳΔ／＋）マウス及びＴｈ−ＰＯＫヘミ接合性形質転換（Ｔｈ−ＰＯＫ Ｔｇ）マウス由来のリンパ節αβＴ細胞上のＣＤ４及びＣＤ８発現を示す。 図４ｃは、Ｔｈ−ＰＯＫサイレンサーの欠失の際にソーティングされたＣＤ６９−ＤＰ胸腺細胞におけるＴｈ−ＰＯＫの抑制解除を示す、それらの細胞における正規化されたＴｈ−ＰＯＫ発現レベルを示すグラフである。 図４ｄは、示された胸腺細胞サブセットにおけるＴｈ−ＰＯＫGFP及びＴｈ−ＰＯＫGFP：ＳΔアレルからのＧＦＰ発現を示す。破線及び太線は、それぞれコントロールマウス及びＴｈ−ＰＯＫ＋／ＧＦＰ（＋／ＧＦＰ）マウス又はＴｈ−ＰＯＫ＋／ＧＦＰ：ＳΔ（＋／ＧＦＰ：ＳΔ）マウスにおけるＧＦＰ発現を示す。カッコ内の数字は、全ＣＤ６９−ＤＰ胸腺細胞におけるＧＦＰの平均蛍光強度を示す。 図５は、脾臓ＣＤ４＋及びＣＤ８＋αβＴ細胞の絶対数を示すグラフである。示されたマウス由来のＣＤ４＋ＣＤ８＋サブセット（ＣＤ８＋）を含む脾臓ＣＤ４＋ＣＤ８−（ＣＤ４＋）及びＣＤ８＋細胞の細胞数を、平均＋／−ＳＤとして示す。 図６は、マウス、ラット、イヌ、チンパンジー及びヒトにおける、ＲＢＳ−１の配列アライメントを示す。影付きの区域は、保存された配列の領域を示す。点線は、最大のアライメントを維持するために導入したギャップを示す。２つの保存されたＲｕｎｘ認識モチーフは、オレンジの線で囲まれている。ＫｐｎＩ制限酵素部位は、黒い線として示される。アライメントは、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ９．５．２のＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムを用いて作成された。 図７は、マウス、ラット、イヌ、チンパンジー及びヒトにおける、ＲＢＳ−２の配列アライメントを示す。影付きの領域は、保存された配列の領域を示す。点線は、最大のアライメントを維持するために導入したギャップを示す。保存されたＲｕｎｘ認識モチーフは、オレンジの線で囲まれており、マウス配列において非保存的なＲｕｎｘモチーフは、オレンジの線で印付けられている。アライメントは、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ９．５．２のＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムを用いて作成された。 図８は、ＥＳ細胞における相同組み換えによってＴｈ−ＰＯＫサイレンサーを除去するための標的化ストラテジーを示す。（ａ）野生型Ｔｈ−ＰＯＫローカス、標的化ベクター及び標的化されたＴｈ−ＰＯＫＮＳΔローカスの構造。６７４ｂｐのＫｐｎＩ−Ｅｃｏ４７ＩＩＩゲノム断片を、Ｔｈ−ＰＯＫＮＳΔローカスにおけるＴｈ−ＰＯＫローカスから除去した。ＥＳ細胞におけるｎｅｏ遺伝子を、Ｃｒｅリコンビナーゼをコードする発現ベクターの一過性導入によって取り除き、Ｔｈ−ＰＯＫＳΔを作出した。エキソン及びｌｏｘＰ配列は、それぞれ黒い長方形及び黒い三角形として示される。サザンブロットで用いたプローブＤＮＡは、灰色の長方形として示される。制限酵素部位は、以下のように示される：ＥｃｏＲＩ（ＲＩ）、Ｅｃｏ４７ＩＩＩ（Ｅ４７）、ＨｉｎｄＩＩＩ（Ｈ）及びＫｐｎＩ（Ｋｐ）。（ｂ）相同組み換え及びｎｅｏ遺伝子の除去を確認するためのＥＳ細胞クローンのサザンブロット。同一の標的化ストラテジーを用いて、Ｔｈ−ＰＯＫＧＦＰローカスからＴｈ−ＰＯＫサイレンサーを除去した。

Claims (14)

  1. Ｔｈ−ＰＯＫ遺伝子のシス制御領域に由来し、ヘルパーＴ細胞系列特異的発現を調節するためのヌクレオチドであって、真核細胞においてサイレンサー活性を有するヌクレオチド。
  2. 前記真核細胞が哺乳動物由来の細胞である、請求項１に記載のヌクレオチド。
  3. サイレンサー活性がＣＤ４＋ＣＤ８＋ダブルポジティブ胸腺細胞及びＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞で発揮されるものである請求項１または２に記載のヌクレオチド。
  4. 前記ヌクレオチドが
    （ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなるヌクレオチド、
    （ｂ）配列番号１に記載の塩基配列において、２５１〜３６２位の領域を必須の塩基配列として含み、かつ配列番号１に記載の塩基配列からなるヌクレオチドと同等のサイレンサー活性を有するヌクレオチド、
    （ｃ）配列番号１の２５１〜３６２位の領域の塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつ配列番号１に記載の塩基配列からなるヌクレオチドと同等のサイレンサー活性を有するヌクレオチド、
    （ｄ）配列番号１の２７３〜３６２位の領域の塩基配列を少なくとも２つ直列に含み、かつ配列番号１に記載の塩基配列からなるヌクレオチドと同等のサイレンサー活性を有するヌクレオチド、又は
    （ｅ）配列番号１に記載の塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつ配列番号１に記載の塩基配列からなるヌクレオチドと同等のサイレンサー活性を有するヌクレオチド
    からなるものである、請求項１記載のヌクレオチド。
  5. 請求項１〜４いずれかに記載のヌクレオチドならびにプロモーター又はプロモーター及びエンハンサーを含む発現ベクター。
  6. 目的発現遺伝子としてリコンビナーゼ遺伝子を含む、請求項５記載の発現ベクター。
  7. 目的発現遺伝子としてドミナントネガティブ変異体遺伝子を含む、請求項５記載の発現ベクター。
  8. 目的発現遺伝子としてレポーター遺伝子を含む、請求項５記載の発現ベクター。
  9. 請求項５〜８いずれか１項に記載の発現ベクターを導入してなる形質転換体。
  10. 請求項５〜８いずれか１項に記載の発現ベクターを導入してなるトランスジェニック非ヒト動物。
  11. 請求項１０に記載のトランスジェニック非ヒト動物の子孫動物。
  12. 請求項１０又は１１に記載の非ヒト動物から得られる組織又は細胞。
  13. 請求項５〜８いずれか１項に記載の発現ベクター又は請求項９に記載の形質転換体を用いることを特徴とする、ヘルパーＴ細胞の機能調節剤をスクリーニングする方法。
  14. 請求項１０又は１１に記載の非ヒト動物を用いることを特徴とする、ヘルパーＴ細胞の機能調節剤をスクリーニングする方法。
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