JP2021502089A - Slc30a8変異を含む非ヒト動物および使用方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願はそれぞれの全体があらゆる目的に関して参照により本明細書に組み込まれる、2017年11月10日に出願された米国特許出願第62/584,228号、2018年5月3日に出願された米国特許出願第62/666,337号、および2018年6月26日に出願された米国特許出願第62/689,945号の利益を主張するものである。
ファイル523060SEQLIST.txtで書かれた配列表は、39.2キロバイトであり、2018年11月5日に作成されたものであり、これにより参照により本明細書に組み込まれる。
対象非ヒト動物において、対照非ヒト動物と比較して、以下:(1)高脂肪食を摂食させた場合のグルコース誘導性インスリン分泌の増大;(2)高脂肪食を摂食させた場合の膵ベータ細胞増殖の増大;(3)高脂肪食を摂食させた場合の膵ベータ細胞の数の増大;および(4)インスリン受容体の遮断後の摂食下血漿インスリンレベルの増大のうちの1つまたは複数により、2型糖尿病を好転させる活性が同定され、
対象非ヒト動物において、対照非ヒト動物と比較して、以下:(1)高脂肪食を摂食させた場合のグルコース誘導性インスリン分泌の低減;(2)高脂肪食を摂食させた場合の膵ベータ細胞増殖の低減;(3)高脂肪食を摂食させた場合の膵ベータ細胞の数の低減、および(4)インスリン受容体の遮断後の摂食下血漿インスリンレベルの低減のうちの1つまたは複数により、2型糖尿病を増悪させる活性が同定される。
対象非ヒト動物において、対照非ヒト動物と比較して、以下:(1)高血糖に応答してインスリンを分泌する能力の増大;(2)インスリンクリアランスの増大;(3)ミトコンドリア遺伝子発現の低減;および(4)Hvcn1発現の増大のうちの1つまたは複数により、2型糖尿病を好転させる活性が同定され、
対象非ヒト動物において、対照非ヒト動物と比較して、以下:(1)高血糖に応答してインスリンを分泌する能力の低減;(2)インスリンクリアランスの低減;(3)ミトコンドリア遺伝子発現の増大;および(4)Hvcn1発現の低減のうちの1つまたは複数により、2型糖尿病を増悪させる活性が同定される。
本明細書で互換的に使用される「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」という用語は、コードされたおよびコードされていないアミノ酸ならびに化学的または生化学的に修飾されたまたは誘導体化されたアミノ酸を含めたアミノ酸の任意の長さのポリマー形態を含む。用語は、修飾されたペプチド骨格を有するポリペプチドなどの修飾されたポリマーも含む。「ドメイン」という用語は、特定の機能または構造を有するタンパク質またはポリペプチドの任意の一部を指す。
I.概要
変異したSlc30a8遺伝子座をゲノムに含む非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、および非ヒト動物、ならびにそのような非ヒト動物細胞および非ヒト動物を使用する方法が本明細書に開示される。亜鉛輸送体SLC30A8は、主に膵内分泌部の島において発現される。SLC30A8は、現在まで、推定上の機能喪失型変異により2型糖尿病の発生から保護されることが示されているたった3つの遺伝子のうち1つである。これは興味深いが、Slc30a8が欠損したマウスモデルはグルコース恒常性が穏やかに損なわれるので、不可解な知見でもある。本発明者らは、保護的なヒトSLC30A8対立遺伝子を模倣する変異したSlc30a8遺伝子座を含むマウスモデルを生成した。このマウスモデルにより、何故ヒトが2型糖尿病から保護されるかを初めて説明することができる。マウスはインスリン分泌能の増大を有する。特に、マウスは、より高いグルコース誘導性インスリン分泌を有し、これは、膵ベータ細胞の数の増大によって一部媒介され得る。これらのSLC30A8変異データにより、ベータ細胞の増大が2型糖尿病を管理するための効果的な治療戦略であるという概念が裏付けられる。
本明細書に開示される細胞および非ヒト動物は、Slc30a8遺伝子座における変異(例えば、非ヒト動物において天然には存在しない変異)を含む(例えば、それらのゲノム内に)。変異したSlc30a8遺伝子座は、中途終止コドンを有し得る、および/または短縮されたSLC30A8タンパク質をコードし得る。変異したSlc30a8遺伝子座を含む非ヒト動物は、高脂肪食を摂食させた場合、同じ食餌を摂食させた場合変異を有さない非ヒト動物と比べて、インスリン分泌能の増強を有する。
本明細書に記載の細胞および非ヒト動物は、変異したSlc30a8(溶質キャリアファミリー30メンバー8(solute carrier family 30 member 8))遺伝子座を含む。SLC30A8の他の名称として、亜鉛輸送体8、ZnT−8、およびZnt8が挙げられる。Slc30a8によってコードされるタンパク質は、細胞内小胞中の亜鉛の蓄積に関与する亜鉛輸送体である。Slc30a8は、膵臓、特にランゲルハンス島において高いレベルで発現される。コードされるタンパク質は、インスリン分泌INS−1細胞の分泌経路顆粒においてインスリンと共局在化する。
本明細書に開示される変異したSlc30a8遺伝子座により、高脂肪食を摂食させた場合、同じ食餌を摂食させた場合変異を有さない非ヒト動物と比べてインスリン分泌能の増強を有する非ヒト動物がもたらされる。変異したSlc30a8遺伝子座により、T2Dリスクが低減し得る。変異したSlc30a8遺伝子座を含む非ヒト動物は、変異を有さない非ヒト動物(例えば、野生型非ヒト動物)と比べて、以下の特徴:(1)高脂肪食を摂食させた場合のグルコース誘導性インスリン分泌の増大;(2)高脂肪食を摂食させた場合の膵ベータ細胞増殖の増大;(3)高脂肪食を摂食させた場合の膵ベータ細胞の数の増大;および(4)インスリン受容体の遮断(例えば、S961を用いた)後の摂食下血漿インスリンレベルの増大のうちの1つまたは複数または全てを有し得る。それに加えて、またはその代わりに、変異したSlc30a8遺伝子座を含む非ヒト動物は、変異を有さない非ヒト動物(例えば、野生型非ヒト動物)と比べて、以下の特徴:(1)20、25、30、35、40、45、または50週間高脂肪食を摂食させた後(例えば、20または30週間後)の循環インスリンレベルの増大;(2)20、25、30、35、40、45、または50週間高脂肪食を摂食させた後(例えば、20または30週間後)の膵ベータ細胞の数の増大;(3)高脂肪食を摂食させた場合のプロインスリン対インスリン比の低減;(4)インスリン受容体の遮断後(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23後、24、または25日後)の摂食下血漿インスリンレベルの増大;ならびに(5)インスリンプロセシングの改善およびより良好な健康を有する膵ベータ細胞(例えば、高脂肪食を摂食させた場合のプロインスリン対インスリン比の低減によって証明される)のうちの1つまたは複数または全てを有し得る。それに加えて、またはその代わりに、変異したSlc30a8遺伝子座を含む非ヒト動物は、島における顕著なSlc30a8 mRNA発現を有し得る(例えば、野生型レベルの少なくとも5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、または100%、例えば、野生型レベルの少なくとも25%または30%)。
本明細書の他の箇所に記載の変異したSlc30a8遺伝子座を含む非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、および非ヒト動物が提供される。ゲノム、細胞、または非ヒト動物は、雄または雌であり得る。ゲノム、細胞、または非ヒト動物は、変異したSlc30a8遺伝子座についてヘテロ接合性、またはホモ接合性であり得る。二倍体の生物体は、各遺伝子座に2つの対立遺伝子を有する。対立遺伝子の各対は、特定の遺伝子座の遺伝子型を表す。遺伝子型は、特定の遺伝子座に2つの同一の対立遺伝子が存在する場合、ホモ接合性と、2つの対立遺伝子が異なる場合、ヘテロ接合性と記載される。
本明細書の他の箇所で開示されている変異したSlc30a8遺伝子座を含む非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物を作製するための様々な方法が提供される。遺伝子改変された生物体を作出するための任意の都合のよい方法またはプロトコールが、そのような遺伝子改変された非ヒト動物を作出するために適している。例えば、そのそれぞれの全体があらゆる目的に関して参照により本明細書に組み込まれるCho et al. (2009) Current Protocols in Cell Biology 42: 19.11: 19.11.1-19.11.22およびGamaSosa et al. (2010) Brain Struct. Funct. 214 (2-3): 91-109を参照されたい。そのような遺伝子改変された非ヒト動物は、例えば、標的とするSlc30a8遺伝子座での遺伝子ノックインによって生成することができる。
化合物を、2型糖尿病を阻害する、好転させる、もしくは軽減する、もしくは2型糖尿病様症状を好転させるのに潜在的に有用な活性についてスクリーニングするため、または化合物を、2型糖尿病もしくは2型糖尿病様症状を促進するもしくは増悪させるのに潜在的に有害な活性についてスクリーニングするために、本明細書に記載の変異したSlc30a8遺伝子座を有する非ヒト動物を使用することができる。本明細書に記載の保護的な変異したSlc30a8遺伝子座に関連する表現型の態様をモニタリングすることにより、化合物を、2型糖尿病を阻害する、好転させる、もしくは軽減するのに、もしくは2型糖尿病様症状を好転させるのに潜在的に有用な活性についてスクリーニングするため、または化合物を、2型糖尿病もしくは2型糖尿病様症状を促進するもしくは増悪させるのに潜在的に有害な活性についてスクリーニングするために、本明細書に記載の変異したSlc30a8遺伝子座を有さない野生型非ヒト動物または非ヒト動物を使用することもできる。2型糖尿病を阻害する、好転させる、もしくは軽減する、または2型糖尿病様症状を好転させる活性を有する化合物は、2型糖尿病に対する治療薬または予防薬として潜在的に有用である。2型糖尿病または2型糖尿病様症状を促進するまたは増悪させる活性を有する化合物は、毒性であると識別され、治療薬としてまたはヒトと接触する恐れのある他の状況(例えば、食品、農業、建設、または水供給)において回避されるべきである。
添付の配列表に列挙されているヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、ヌクレオチド塩基については標準の文字略語、およびアミノ酸については3文字コードを使用して示されている。ヌクレオチド配列は、配列の5’末端から始まり、3’末端まで前方に(すなわち、各線の左から右に)進行する標準の慣習に従う。各ヌクレオチド配列の一方の鎖のみが示されているが、相補鎖は、示されている鎖への任意の言及によって含まれることが理解される。アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が提供される場合、同じアミノ酸配列をコードするそのコドン縮重バリアントも提供されることが理解される。アミノ酸配列は、配列のアミノ末端から始まり、カルボキシ末端まで前方に(すなわち、各線の左から右に)進行する標準の慣習に従う。
推定ヒトSLC30A8 LOF対立遺伝子(c.412C>T(転写物受託番号NM_173851.2)、p.Arg138X)に対応する対立遺伝子を有するマウスモデルを生成するために、変異したマウスSlc30a8対立遺伝子を生成した(c.409C>T(転写物受託番号NM_172816.3)、p.Arg137X)。マウスSlc30a8遺伝子およびヒトSLC30A8遺伝子に関する情報を表3に提示する。ヒトSLC30A8とマウスSLC30A8タンパク質のアラインメントを図11に示す。変異した対立遺伝子は、エクソン3内のR137をコードするマウスSlc30a8コドンにおけるdCのdTによる置き換え(c.409C>T)を有し、コドンをCGAからTGAに変化させ(p.Arg137X)、短縮されたタンパク質を産生することが予測される停止コドンを作製する。変異した対立遺伝子は、イントロン3に挿入された、loxP部位に挟まれた自己欠失性ネオマイシン選択カセットも有し(loxP−mPrm1−Crei−hUb1−em7−Neo−pA−loxPカセット(4,810bp))、内因性イントロン3配列の29bpを欠失させる。内因性Slc30a8遺伝子座を図10Aに示し、標的とするSlc30a8遺伝子座を図10Bに示す。Slc30a8イントロン2/Slc30a8エクソン3 pArg137*/Slc30a8イントロン3の境界を含む領域(図10Bにおいて横線「A」により示されている)の予測される配列は配列番号8に記載されている。Slc30a8イントロン3/XhoI/(loxP)自己欠失性カセットの境界を含む領域(図10Bにおいて横線「B」により示されている)の予測される配列は配列番号9に記載されている。自己欠失性カセット(loxP)/ICEUI/NheI/Slc30a8イントロン3の境界を含む領域(図10Bにおいて横線「C」により示されている)の予測される配列は配列番号10に記載されている。
概要
SLC30A8は、主に膵臓のランゲルハンス島において発現される亜鉛輸送体をコードする。ベータ細胞において、SLC30A8は亜鉛をインスリン含有分泌顆粒に輸送する。SLC30A8において機能喪失型(LOF)変異は、ヒトにおいて2型糖尿病から保護する。いくつかのSlc30a8ノックアウトマウス系統が特徴付けられているが、ヒト表現型を十分に再現するものではない。実際に、Slc30a8欠損マウスは血漿インスリンレベルの低下および耐糖能障害を有し、これは、本発明者らがここで対照Slc30a8欠損マウスで再現した表現型である。本発明者らは、ヒトSLC30A8推定LOF変異、R138Xに対応するマウスSlc30a8遺伝子座における変異(c.409C>T(転写物受託番号NM_172816.3)、p.Arg137X)を有するノックインマウスモデルを生成した。マウスSlc30a8遺伝子における変異は、マウスSLC30A8タンパク質のアミノ酸残基137をコードするコドンにおいてであるが、これらのマウスは、本明細書では、対応するヒト変異に関して「R138Xマウス」と称される。興味深いことに、R138Xマウスは、高脂肪食を摂食させた場合、グルコース誘導性インスリン分泌の増大を有した。これは、ベータ細胞増殖の増大およびベータ細胞面積の拡大に関連していた。重要なことに、ヘテロ接合性R138Xマウスでは、グルコース誘導性インスリン分泌に同様の増大が示された。対照的に、固形飼料を摂食させたR138Xマウスは、正常な体重、耐糖能、および膵臓ベータ細胞質量を有した。興味深いことに、インスリン受容体アンタゴニストS961によって誘導される高血糖条件では、R138Xマウスはインスリン分泌の約50%の増大を示した。この効果は、ベータ細胞増殖またはベータ細胞質量の増強に関連していなかった。これらのデータから、ヒトにおけるSLC30A8 R138X変異が、一部においてベータ細胞のインスリンを分泌する能力を増大させることによって2型糖尿病から保護することが示唆される。これは、一部において膵ベータ細胞の数の増大によって媒介され得る。
SLC30A8は、膵内分泌部の島細胞内に位置する亜鉛輸送体(ZnT8)である。ベータ細胞において、SLC30A8が亜鉛をインスリン含有顆粒に輸送する。2つの亜鉛イオンが六量体形態のインスリンと結合し、それを安定化し、インスリン結晶化を誘発する。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるDodson and Steiner (1998) Curr. Opin. Struct. Biol. 8 (2): 189-194を参照されたい。島SLC30A8の喪失により、島亜鉛含有量およびインスリン結晶化が実質的に低減するが、プロインスリンプロセシング、分泌およびグルコース代謝の制御に対するその効果は依然として不明である。例えば、そのそれぞれの全体があらゆる目的に関して参照により本明細書に組み込まれるLemaireet al. (2009) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (35): 14872-14877およびNicolson etal. (2009) Diabetes 58 (9): 2070-2083を参照されたい。いくつかのグループが、包括的にまたは膵ベータ細胞に制限してSlc30a8ノックアウト(KO)マウスモデルを生成している。これらのモデルの観察される代謝表現型は、弱く、研究間で差異があるが、モデルの大部分で、血漿インスリンレベルの低下または変化なしに関連する耐糖能の変化がないか、または軽度の機能障害が示される。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるRutteret al. (2016) Proc. Nutr. Soc. 75 (1): 61-72を参照されたい。最も重要なことに、いずれの研究でもSlc30a8欠損に関連する有益な効果は報告されていない。したがって、Flannickおよび共同研究者により、SLC30A8のハプロ不全がヒトにおける2型糖尿病(T2D)の発生に対して保護的であることが報告された時には驚かされた。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるFlannicket al. (2014) Nat. Genet. 46 (4): 357-363を参照されたい。彼らの研究により、T2Dのリスクを65%集合的に低減する12種の推定機能喪失型(LOF)バリアントが同定された。最も豊富なバリアントのうちの1つである、中途停止コドンを引き起こすp.Arg138*(本明細書ではR138Xと称される)は、T2Dからの保護に個別に関連付けられ、不安定なZnT8タンパク質をコードすることが報告された。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるFlannicket al. (2014) Nat. Genet. 46 (4): 357-363を参照されたい。したがって、マウスとヒトのデータは、表面上は互いに矛盾し、稀な推定LOFバリアントによりどのようにT2Dのリスクが低減するかは現在のところ明らかでない。
R138X島は、ナンセンス媒介性崩壊からのR138X転写物の部分的保護にもかかわらずSLC30A8機能の喪失を示すと思われる。ヒトSLC30A8推定LOFバリアントがT2Dのリスクにどのように影響を及ぼすかを調査するために、本発明者らは、実施例1において詳述されている通り、アミノ酸残基137をコードするマウスゲノム内のSlc30a8のコドン(コドン137、ヒトにおけるコドン138と同等である)をCGAからTGAに変更し、アルギニンを停止コドン(R138X)に変化させた。R138Xマウスは、予測されるメンデル比で生まれており、明白な成長異常はなかった。RNA in situハイブリダイゼーションにより、野生型(WT)マウス由来の膵島では強力なSlc30a8 mRNA染色が示されたが、ホモ接合性Slc30a8 KOマウス由来の島において染色は示されず、プローブの特異性が検証された(図1A)。Slc30a8 KOマウス由来の島とは対照的に、R138Xマウス由来の島では実質的な量のSlc30a8 RNA染色が示された(図1A)。リアルタイムPCRを使用したSlc30a8 mRNAの定量化により、R138X島における70%の低下が明らかになったが、R138X島における絶対的なSlc30a8転写レベル(CT値:22.2)は依然として高く、ハウスキーピング遺伝子であるGapdhの発現レベル(CT値:22.1)と同等であった(図1B)。R138Xマウスにおけるこの高レベルのSlc30a8 RNAの存在により、中途翻訳終止コドンを有するmRNAを分解するプロセスであるナンセンス媒介性mRNA崩壊ではR138X転写物を有効に分解することができないことが示唆される。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるHolbrook et al. (2004) Nat. Genet. 36 (8): 801-808を参照されたい。
この研究では、本発明者らは、2つの最も一般的なヒトSLC30A8推定LOFのうちの1つ(p.Arg138*)を模倣する新しいSlc30a8推定LOFマウスモデル(R138Xマウス)を生成した。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるFlannick et al. (2014) Nat. Genet. 46 (4): 357-363を参照されたい。これらのマウスから得られたデータにより、ヒトにおけるSLC30A8推定LOF変異が何故T2Dの発生に対して保護的であるかを初めて説明することができる。R138X変異の導入により、ベータ細胞の数の増大が結果としてもたらされ、それにより、インスリン抵抗性の状態でより高いインスリン分泌が可能になる。これらのデータから、したがって、R138Xベータ細胞がインスリン要求の増大を代償し、ベータ細胞の不全およびT2Dの発症を防止し、かつ/または遅延することが示される。このモデルを使用し、本発明者らは、R138X変異の導入により、高血糖に応答して50%多いインスリンの分泌が結果としてもたらされることを示す。これらのデータから、ヒトにおけるT2Dからの保護が、少なくとも一部において、インスリン分泌能の増大によって媒介され、ベータ細胞がインスリン要求の増強を代償することが可能になり、それにより、これらの細胞の不全およびT2Dの発症を防止または遅延することが示唆される。したがって、本手法により、同定されたヒトT2Dリスクまたは保護的な遺伝子がどのように作用するかの機構を探究するためにマウス遺伝学を使用することの実現性が実証される。本手法では、ヒトにおけるT2Dのリスクに影響を及ぼす遺伝子バリアントの機構を探究するためのマウス遺伝学の有用性も強調される。
本発明者らは、ヒトを2型糖尿病の発生から保護するヒトSLC30A8 LoF変異p.Arg138*を模倣する新しいマウスモデル(R138X)を生成した。高脂肪食(high-fed‐diet)条件下のR138Xマウスはベータ細胞質量および増殖の増大に関連するインスリン分泌の増大を有する。あるいは、S961(インスリン受容体の阻害剤)を使用して高血糖を誘導した場合、R138Xマウスは、WTマウスと比較して、ベータ細胞質量および増殖の変化とは無関係にインスリン分泌の50%の増大を有する。これにより、R138Xマウスにおける増殖の増大にはインスリン受容体が必要であることが示唆される。さらに、ベータ細胞におけるインスリン受容体は高脂肪食下のマウスにおけるベータ細胞増殖の増大に必要であることが示されている。R138Xマウスはインスリンを分泌する能力の増大を有するので、WTマウスよりも高いインスリンがベータ細胞におけるインスリン受容体に対して作用し、増殖を大きな程度まで誘導し得る。これを調査するために、高脂肪食またはS961で処置したWTおよびR138Xマウス由来の膵臓におけるp−Akt、p−S6、およびp−Erkについての組織学を行うことにより、インスリン経路の活性化を調べる。さらに、単離された島を調べて、これらがより高いp−AKTおよびp−Erkレベルを有するかどうか、ならびにこれらがin vitroにおいてより多く増殖するかどうかを決定する。
動物。全ての手順をRegeneron Pharmaceuticals Institutional Animal Care and Use Committeeにより認可されたプロトコールに従って行った。Slc30a8 R138Xおよびノックアウトマウス系統は純粋なC57BL/6NTac背景でVELOCIGENE技術を使用して作製した。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるValenzuela et al. (2003) Nat. Biotechnol. 21 (6): 652-659を参照されたい。ノックアウトマウス系統の生成のために、Slc30a8コード領域全体を欠失させ、LacZ遺伝子で置き換えた。自己欠失性ネオマイシン選択カセットの使用によってネオマイシン遺伝子を除去した。R138Xマウスの生成のために、エクソン3内のヌクレオチド409をTからCに変化させ、それによりアルギニンを停止コドンに変化させた。変異した対立遺伝子は、イントロン3に挿入されたloxP部位に挟まれた自己欠失性ネオマイシン選択カセットを有し、29bpの内因性イントロン3配列(CAGCTGACAGCAAGATTAATGGAAGTACC(配列番号24))を欠失させる。マウスを制御された環境(12時間の明/暗サイクル、22±1℃、湿度60〜70%)下に収容し(ケージ当たり最大5匹のマウス)、12〜18週齢で開始して固形飼料(Purina Laboratory 23 Rodent Diet 5001、LabDiet)または高脂肪食(Research Diets、D12492;カロリーで60%が脂肪)のいずれかを自由に摂食させた。示されているデータは全てWT同腹仔と比較したものである。
Claims (43)
- ゲノムに、変異したSlc30a8遺伝子を含む内因性Slc30a8遺伝子座が含まれる非ヒト動物であって、前記変異したSlc30a8遺伝子が、短縮されたSLC30A8タンパク質をコードし、前記変異を有さない非ヒト動物と比べてインスリン分泌能の増強を有する非ヒト動物を結果としてもたらす、非ヒト動物。
- 前記インスリン分泌能の増強が、高血糖に応答するものである、請求項1に記載の非ヒト動物。
- 前記変異を有さない非ヒト動物と比べて、インスリン受容体の阻害によって誘導される高血糖に応答したインスリン分泌の増大を有する、請求項2に記載の非ヒト動物。
- 前記インスリン受容体の阻害によって誘導される高血糖に応答したインスリン分泌の増大が、前記変異を有さない非ヒト動物と比べたベータ細胞増殖またはベータ細胞質量の増大に関連しない、請求項3に記載の非ヒト動物。
- 前記インスリン分泌能の増強が、高脂肪食を摂食させた場合のものである、前記請求項のいずれかに記載の非ヒト動物。
- 高脂肪食を摂食させた場合、前記変異を有さない非ヒト動物と比べてインスリン分泌の増大を有し、前記インスリン分泌の増大が、前記変異を有さない非ヒト動物と比べたベータ細胞増殖またはベータ細胞質量の増大に関連する、請求項5に記載の非ヒト動物。
- 前記ベータ細胞増殖の増大が、インスリン受容体依存性である、請求項6に記載の非ヒト動物。
- 前記変異したSlc30a8遺伝子が、中途終止コドンを有する、前記請求項のいずれかに記載の非ヒト動物。
- 前記変異したSlc30a8遺伝子が、Slc30a8遺伝子の第3のエクソンに変異を含む、前記請求項のいずれかに記載の非ヒト動物。
- 前記変異が、Slc30a8遺伝子の第3のエクソンの3’末端にある、請求項9に記載の非ヒト動物。
- 前記変異したSlc30a8遺伝子が、ナンセンス変異を含む、前記請求項のいずれかに記載の非ヒト動物。
- 前記ナンセンス変異が、前記変異したSlc30a8遺伝子によってコードされるSLC30A8タンパク質を配列番号14と最適にアラインメントした場合、配列番号14のR138をコードするコドンに対応するコドンにある、請求項11に記載の非ヒト動物。
- 前記ナンセンス変異が、前記変異したSlc30a8遺伝子のコード配列を配列番号21と最適にアラインメントした場合、配列番号21の残基412に対応する位置にある、請求項11または12に記載の非ヒト動物。
- 前記変異したSlc30a8遺伝子が、前記非ヒト動物に対して内因性である、前記請求項のいずれかに記載の非ヒト動物。
- ラットまたはマウスである、前記請求項のいずれかに記載の非ヒト動物。
- マウスである、請求項15に記載の非ヒト動物。
- 前記変異したSlc30a8遺伝子が、配列番号13に記載の配列を含むSLC30A8タンパク質をコードする、請求項16に記載の非ヒト動物。
- 前記変異したSlc30a8遺伝子が、配列番号22に記載のコード配列を含む、請求項16または17に記載の非ヒト動物。
- 前記変異を有さない非ヒト動物と比べてミトコンドリア遺伝子発現の低減を有する、前記請求項のいずれかに記載の非ヒト動物。
- 前記変異を有さない非ヒト動物と比べてHvcn1発現の増大を有する、前記請求項のいずれかに記載の非ヒト動物。
- 対照固形飼料食では、前記変異を有さない非ヒト動物と比べて正常なグルコース恒常性およびグルコース誘導性インスリン分泌を有する、前記請求項のいずれかに記載の非ヒト動物。
- 対照固形飼料食では、前記変異を有さない非ヒト動物と比べて正常な代謝表現型を有する、前記請求項のいずれかに記載の非ヒト動物。
- 前記変異を有さない非ヒト動物と比べて、以下の特徴:
(a)高脂肪食を摂食させた場合のグルコース誘導性インスリン分泌の増大;
(b)高脂肪食を摂食させた場合の膵ベータ細胞増殖の増大;
(c)高脂肪食を摂食させた場合の膵ベータ細胞の数の増大;および
(d)インスリン受容体の遮断後の摂食下血漿インスリンレベルの増大
のうちの1つまたは複数を有する、前記請求項のいずれかに記載の非ヒト動物。 - 前記変異を有さない非ヒト動物と比べて、以下の特徴:
(a)高脂肪食を摂食させた場合のグルコース誘導性インスリン分泌の増大;
(b)高脂肪食を摂食させた場合の膵ベータ細胞増殖の増大;
(c)高脂肪食を摂食させた場合の膵ベータ細胞の数の増大;および
(d)インスリン受容体の遮断後の摂食下血漿インスリンレベルの増大
の全てを有する、前記請求項のいずれかに記載の非ヒト動物。 - 前記変異を有さない非ヒト動物と比べて、以下の特徴:
(a)20週間高脂肪食を摂食させた後の循環インスリンレベルの増大;
(b)20週間高脂肪食を摂食させた後の膵ベータ細胞の数の増大;
(c)高脂肪食を摂食させた場合のプロインスリン対インスリン比の低減;および
(d)インスリン受容体の遮断後の摂食下血漿インスリンレベルの増大
のうちの1つまたは複数を有する、前記請求項のいずれかに記載の非ヒト動物。 - 前記変異を有さない非ヒト動物と比べて、以下の特徴:
(a)20週間高脂肪食を摂食させた後の循環インスリンレベルの増大;
(b)20週間高脂肪食を摂食させた後の膵ベータ細胞の数の増大;
(c)高脂肪食を摂食させた場合のプロインスリン対インスリン比の低減;および
(d)インスリン受容体の遮断後の摂食下血漿インスリンレベルの増大
の全てを有する、前記請求項のいずれかに記載の非ヒト動物。 - 前記非ヒト動物の島におけるSlc30a8 mRNA発現レベルが、前記変異を有さない非ヒト動物の島におけるSlc30a8 mRNA発現レベルの少なくとも25%である、前記請求項のいずれかに記載の非ヒト動物。
- 前記変異についてヘテロ接合性である、前記請求項のいずれかに記載の非ヒト動物。
- 前記変異についてホモ接合性である、請求項1から27のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
- 雄である、前記請求項のいずれかに記載の非ヒト動物。
- 雌である、請求項1から29のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
- 前記請求項のいずれかに記載の非ヒト動物を作製する方法であって、
(a)1細胞期胚ではない非ヒト動物多能性細胞のゲノムを、
(i)Slc30a8遺伝子座の5’標的配列にハイブリダイズする5’相同アームと前記Slc30a8遺伝子座の3’標的配列にハイブリダイズする3’相同アームに挟まれた挿入核酸を含む外因性修復鋳型であって、前記挿入核酸が変異を含む、外因性修復鋳型;
(ii)Cas9タンパク質;および
(iii)前記Slc30a8遺伝子座内のガイドRNA認識配列にハイブリダイズするガイドRNA
と接触させるステップであって、
Slc30a8遺伝子が、前記変異を含むように改変される、ステップと、
(b)改変された前記非ヒト動物多能性細胞を宿主胚に導入するステップと、
(c)前記宿主胚を代理母に移植して、前記Slc30a8遺伝子が前記変異を含むように改変された遺伝子改変F0世代非ヒト動物を作出するステップであって、前記変異が、高脂肪食を摂食させた場合、前記変異を有さない非ヒト動物と比べてインスリン分泌能の増強を有するF0世代非ヒト動物を結果としてもたらす、ステップと
を含む、方法。 - 前記多能性細胞が、胚性幹(ES)細胞である、請求項32に記載の方法。
- 前記外因性修復鋳型が、少なくとも10kbの長さである大型標的化ベクターであるか、または前記外因性修復鋳型が、前記5’相同アームと前記3’相同アームの合計が少なくとも10kbの長さである大型標的化ベクターである、請求項32または33に記載の方法。
- 請求項1から31のいずれか一項に記載の非ヒト動物を作製する方法であって、
(a)非ヒト動物1細胞期胚のゲノムを、
(i)Slc30a8遺伝子座の5’標的配列にハイブリダイズする5’相同アームと前記Slc30a8遺伝子座の3’標的配列にハイブリダイズする3’相同アームに挟まれた挿入核酸を含む外因性修復鋳型であって、前記挿入核酸が変異を含む、外因性修復鋳型;
(ii)Cas9タンパク質;および
(iii)前記Slc30a8遺伝子座内のガイドRNA認識配列にハイブリダイズするガイドRNA
と接触させるステップであって、
Slc30a8遺伝子が、前記変異を含むように改変される、ステップと、
(b)改変された前記非ヒト動物1細胞期胚を代理母に移植して、前記Slc30a8遺伝子が前記変異を含むように改変された遺伝子改変F0世代非ヒト動物を作出するステップであって、前記変異が、高脂肪食を摂食させた場合、前記変異を有さない非ヒト動物と比べてインスリン分泌能の増強を有するF0世代非ヒト動物を結果としてもたらす、ステップと
を含む、方法。 - ステップ(a)が、前記非ヒト動物多能性細胞または前記非ヒト1細胞期胚のゲノムを前記Slc30a8遺伝子座内の第2のガイドRNA認識配列にハイブリダイズする第2のガイドRNAと接触させることをさらに含む、請求項32から35のいずれか一項に記載の方法。
- 前記外因性修復鋳型が、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドである、請求項32、33、35、および36のいずれか一項に記載の方法。
- 前記外因性修復鋳型が、約80ヌクレオチド〜約200ヌクレオチドの間の長さである、請求項37に記載の方法。
- 化合物を、2型糖尿病を好転させるまたは増悪させる活性についてスクリーニングする方法であって、
(a)請求項1から31のいずれか一項に記載の対象非ヒト動物を前記化合物と接触させるステップと、
(b)前記化合物と接触させていない対照非ヒト動物と比べて、前記対象非ヒト動物における以下:(1)高脂肪食を摂食させた場合のグルコース誘導性インスリン分泌;(2)高脂肪食を摂食させた場合の膵ベータ細胞増殖レベル;(3)高脂肪食を摂食させた場合の膵ベータ細胞の数;および(4)インスリン受容体の遮断後の摂食下血漿インスリンレベルのうちの1つまたは複数を測定するステップであって、前記対照非ヒト動物が、前記対象非ヒト動物と同じSlc30a8変異を含む、ステップと
を含み、
前記対象非ヒト動物において、前記対照非ヒト動物と比較して、以下:(1)高脂肪食を摂食させた場合のグルコース誘導性インスリン分泌の増大;(2)高脂肪食を摂食させた場合の膵ベータ細胞増殖の増大;(3)高脂肪食を摂食させた場合の膵ベータ細胞の数の増大;および(4)インスリン受容体の遮断後の摂食下血漿インスリンレベルの増大のうちの1つまたは複数により、2型糖尿病を好転させる活性が同定され、
前記対象非ヒト動物において、前記対照非ヒト動物と比較して、以下:(1)高脂肪食を摂食させた場合のグルコース誘導性インスリン分泌の低減;(2)高脂肪食を摂食させた場合の膵ベータ細胞増殖の低減;(3)高脂肪食を摂食させた場合の膵ベータ細胞の数の低減、および(4)インスリン受容体の遮断後の摂食下血漿インスリンレベルの低減のうちの1つまたは複数により、2型糖尿病を増悪させる活性が同定される、方法。 - 化合物を、2型糖尿病を好転させるまたは増悪させる活性についてスクリーニングする方法であって、
(a)請求項1から31のいずれか一項に記載の対象非ヒト動物を前記化合物と接触させるステップと、
(b)前記化合物と接触させていない対照非ヒト動物と比べて、前記対象非ヒト動物における以下:(1)高血糖に応答したインスリンを分泌する能力;(2)インスリンクリアランス;(3)ミトコンドリア遺伝子発現;および(4)Hvcn1発現のうちの1つまたは複数を測定するステップであって、前記対照非ヒト動物が、前記対象非ヒト動物と同じSlc30a8変異を含む、ステップと
を含み、
前記対象非ヒト動物において、前記対照非ヒト動物と比較して、以下:(1)高血糖に応答したインスリンを分泌する能力の増大;(2)インスリンクリアランスの増大;(3)ミトコンドリア遺伝子発現の低減;および(4)Hvcn1発現の増大のうちの1つまたは複数により、2型糖尿病を好転させる活性が同定され、
前記対象非ヒト動物において、前記対照非ヒト動物と比較して、以下:(1)高血糖に応答したインスリンを分泌する能力の低減;(2)インスリンクリアランスの低減;(3)ミトコンドリア遺伝子発現の増大;および(4)Hvcn1発現の低減のうちの1つまたは複数により、2型糖尿病を増悪させる活性が同定される、方法。 - ゲノムに、変異したSlc30a8遺伝子を含む内因性Slc30a8遺伝子座が含まれる非ヒト動物細胞であって、前記変異したSlc30a8遺伝子が、短縮されたSLC30A8タンパク質をコードし、前記変異したSlc30a8遺伝子を含む非ヒト動物が、前記変異を有さない非ヒト動物と比べてインスリン分泌能の増強を有する、非ヒト動物細胞。
- 変異したSlc30a8遺伝子を含む内因性Slc30a8遺伝子座を含む非ヒト動物ゲノムであって、前記変異したSlc30a8遺伝子が、短縮されたSLC30A8タンパク質をコードし、前記変異したSlc30a8遺伝子を含む非ヒト動物が、前記変異を有さない非ヒト動物と比べてインスリン分泌能の増強を有する、非ヒト動物ゲノム。
- 非ヒト動物における内因性Slc30a8遺伝子座において変異したSlc30a8遺伝子を生成するための標的化ベクターであって、前記標的化ベクターは、前記内因性Slc30a8遺伝子座の5’標的配列を標的化する5’相同アームおよび前記内因性Slc30a8遺伝子座の3’標的配列を標的化する3’相同アームを含み、前記標的化ベクターは、Slc30a8遺伝子に変異を含み、前記変異したSlc30a8遺伝子が、短縮されたSLC30A8タンパク質をコードし、そして前記変異したSlc30a8遺伝子を含む非ヒト動物が、前記変異を有さない非ヒト動物と比べてインスリン分泌能の増強を有する、標的化ベクター。
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