JP6868615B2 - 繁殖可能なxy雌マウスを生成するための多能性細胞の選択 - Google Patents
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Description
本出願は、2015年9月17日出願の米国特許出願第62/219,927号明細書の利益を主張し、その全体があらゆる目的のために参照によって本明細書に組み込まれる。
9.17kbのファイル484387SEQLIST.txt内に記載された配列表は、2016年9月16日に作成されたものであり、これは参照によって本明細書に組み込まれる。
大半の遺伝子改変は、2つの既存の対立遺伝子のうち1つに改変を作製するようにXY ES細胞を標的とすることによって実施され、得られたドナーマウスES細胞は、遺伝子改変についてヘテロ接合体である。しかしながら、遺伝子改変についてホモ接合体であるマウスを得ることが多くの場合に望ましい。改変を含む本質的に完全にES細胞由来の雌マウスは、F0世代では産まれないため、F0雄は、少なくとも1匹の雌(F1雌)が遺伝子改変についてヘテロ接合体の可能性がある同腹仔を生成するために典型的には雌(例えば、適合する近交系雌)と交配させる。次いで、ヘテロ接合体F1雌をF1ヘテロ接合体雄と互いに交雑させて、ホモ接合体子孫を得る。このような交配に必要なのは、高額な費用と時間のかかるステップである。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
(項目1)
非ヒト哺乳動物XY多能性細胞における雌化活性に関する標的化合物のスクリーニング方法であって、
(a)非ヒト哺乳動物XY多能性細胞の第1集団及び第2集団を、前記非ヒト哺乳動物XY多能性細胞の前記多能性を維持するのに好適な基本培地及び添加物を含む培地中で培養し、前記第1集団が、標的化合物の存在下で培養され、前記第2集団が、前記標的化合物の不存在下で培養されることと、
(b)Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち1つ以上の発現及び/または活性について、非ヒト哺乳動物XY多能性細胞の前記第1及び第2集団の各々で前記非ヒト哺乳動物XY多能性細胞のうち1種以上をアッセイし、それによって雌化活性が、前記第2集団からの前記1種以上の非ヒト哺乳動物XY多能性細胞と比較して、前記第1集団からの前記1種以上の非ヒト哺乳動物XY多能性細胞におけるDdx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上の前記発現及び/または活性の減少によって同定されることと、
(c)Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上の前記発現及び/または活性に基づいて、F0世代において繁殖可能な表現型的に雌のXY非ヒト哺乳動物を生成するために、前記第1集団からドナー非ヒト哺乳動物XY多能性細胞を選択し、前記F0世代における前記繁殖可能な表現型的に雌のXY非ヒト哺乳動物の比率が、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上の前記発現及び/または活性に逆相関することと、
(d)前記ドナー非ヒト哺乳動物XY多能性細胞を宿主胚に導入することと、
(e)ステップ(d)の前記宿主胚をレシピエント雌非ヒト哺乳動物に導入して、前記宿主胚を懐胎させることと、
(f)表現型的に雌のXY非ヒト哺乳動物を含むF0 XY非ヒト哺乳動物子孫を得て、性成熟に達すると、前記F0の表現型的に雌のXY非ヒト哺乳動物が繁殖可能かつ妊孕可能になること
とを含む、前記方法。
(項目2)
ステップ(b)の前記アッセイによって、mRNAレベルでDdx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上の発現が検出される、項目1に記載の方法。
(項目3)
ステップ(b)の前記アッセイによって、タンパク質レベルでDdx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上の発現が検出される、項目1に記載の方法。
(項目4)
前記雌化活性が、前記第2集団からの前記1種以上の非ヒト哺乳動物XY多能性細胞と比較して、前記第1集団からの前記1種以上の非ヒト哺乳動物XY多能性細胞における、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yの前記発現及び/または活性の減少によってステップ(b)で同定される、項目1〜3のいずれか1項に記載の方法。
(項目5)
前記雌化活性が、前記第1集団からの前記1種以上の非ヒト哺乳動物XY多能性細胞における、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上の発現及び/または活性の欠如によってステップ(b)で同定される、項目1〜4のいずれか1項に記載の方法。
(項目6)
前記雌化活性が、前記第1集団からの前記1種以上の非ヒト哺乳動物XY多能性細胞における、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yの発現及び/または活性の欠如によってステップ(b)で同定される、項目1〜5のいずれか1項に記載の方法。
(項目7)
ステップ(c)の前記ドナー非ヒト哺乳動物XY多能性細胞が、対照非ヒト哺乳動物XY多能性細胞、すなわち、前記対照非ヒト哺乳動物XY多能性細胞の前記多能性を維持するのに十分であるが、繁殖可能な雌子孫を生じる前記細胞の能力を変化させない培地中で培養された前記細胞と比較して、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上の減少した発現及び/または活性を有する、項目1〜6のいずれか1項に記載の方法。
(項目8)
ステップ(c)の前記ドナー非ヒト哺乳動物XY多能性細胞が、前記第2集団からの対照非ヒト哺乳動物XY多能性細胞と比較して、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上の減少した発現及び/または活性を有する、項目1〜7のいずれか1項に記載の方法。
(項目9)
ステップ(c)の前記ドナー非ヒト哺乳動物XY多能性細胞が、前記対照非ヒト哺乳動物XY多能性細胞と比較して、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yの減少した発現及び/または活性を有する、項目7または8に記載の方法。
(項目10)
ステップ(b)が、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち1つ以上の発現及び/または活性について、前記第1集団における少なくとも2種の前記非ヒト哺乳動物XY多能性細胞をアッセイすることを含み、ステップ(c)が、前記ドナー非ヒト哺乳動物XY多能性細胞として、他方のアッセイした細胞と比較して、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上の最も低い発現及び/または活性を有するステップ(b)の前記アッセイした細胞を選択することを含む、項目1〜9のいずれか1項に記載の方法。
(項目11)
ステップ(c)の前記ドナー非ヒト哺乳動物XY多能性細胞が、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上の発現及び/または活性を欠いている、項目1〜10のいずれか1項に記載の方法。
(項目12)
ステップ(c)の前記ドナー非ヒト哺乳動物XY多能性細胞が、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yの発現及び/または活性を欠いている、項目1〜11のいずれか1項に記載の方法。
(項目13)
前記第1集団が、アッセイステップ(b)の前に少なくとも1日間、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間、10日間、11日間、12日間、13日間、2週間、3週間、または4週間の間、前記標的化合物の存在下で培養される、項目1〜12のいずれか1項に記載の方法。
(項目14)
前記多能性細胞が、胚性幹(ES)細胞である、項目1〜13のいずれか1項に記載の方法。
(項目15)
前記多能性細胞が、VGF1マウスES細胞である、項目14に記載の方法。
(項目16)
前記標的化合物の不存在下で、ステップ(a)の前記培地が、前記非ヒト哺乳動物XY多能性細胞の前記多能性を維持するのに十分であるが、繁殖可能な雌子孫を生じる前記細胞の能力を変化させない、項目1〜15のいずれか1項に記載の方法。
(項目17)
前記標的化合物の不存在下で、ステップ(a)の前記培地が、約200mOsm/kg〜約329mOsm/kg未満のオスモル濃度を有する低オスモル濃度培地である、項目1〜15のいずれか1項に記載の方法。
(項目18)
前記低オスモル濃度培地が、以下の特性:
(I)前記低オスモル濃度培地が、約218mOsm/kg〜約322mOsm/kgのオスモル濃度を有すること、
(II)前記低オスモル濃度培地が、218mOsm/kgのオスモル濃度を有すること、
(III)前記低オスモル濃度培地が、約11mS/cm〜約13mS/cmの伝導度を有すること、
(IV)前記基本培地が、アルカリ金属及びハロゲン化物の塩を約50mM〜約110mMの濃度で含むこと、
(V)前記基本培地が、塩化ナトリウムを約50mM〜約110mMの濃度で含むこと、
(VI)前記基本培地が、炭酸塩を約17mM〜約30mMの濃度で含むこと、
(VII)前記基本培地が、重炭酸ナトリウムを約13mM〜約25mMの濃度で含むこと、
(VIII)前記基本培地が、約85mM〜約130mMのアルカリ金属ハロゲン化物塩及び炭酸塩の総濃度を有すること、
(IX)前記基本培地が、塩化ナトリウムを87±5mMの濃度で含み、前記低オスモル濃度培地が、261±26mOsm/kgのオスモル濃度を有すること、
(X)前記基本培地が、アルカリ金属及びハロゲン化物の塩を約50mM〜約110mMの濃度で、及び炭酸塩を約17mM〜約30mMの濃度で含み、前記低オスモル濃度培地が、約200mOsm/kg〜約329mOsm/kgのオスモル濃度を有すること、ならびに
(XI)前記低オスモル濃度培地が、218mOsm/kgのオスモル濃度を有し、前記基本培地が、塩化ナトリウムを50mM〜110mMの濃度で、及び重炭酸ナトリウムを13mM〜25mMの濃度で含むこと
のうち1つ以上を有する、項目17に記載の方法。
(項目19)
前記基本培地が、炭酸塩を約18mM〜約44mMの濃度で含む、項目17または18に記載の方法。
(項目20)
前記基本培地が、アルカリ金属及びハロゲン化物の塩を約50mM〜約110mMの濃度で含む、項目17〜19のいずれか1項に記載の方法。
(項目21)
前記炭酸塩が重炭酸ナトリウムであり、前記アルカリ金属及び前記ハロゲン化物の前記塩が塩化ナトリウムであり、前記低オスモル濃度培地が、約216mOsm/kg〜約322mOsm/kgのオスモル濃度を有する、項目17〜20のいずれか1項に記載の方法。
(項目22)
前記基本培地が、塩化ナトリウムを約3mg/mLの濃度で、及び重炭酸ナトリウムを約2.2mg/mLの濃度で含み、前記低オスモル濃度培地が、約216mOsm/kgのオスモル濃度を有する、項目17〜21のいずれか1項に記載の方法。
(項目23)
前記非ヒト哺乳動物が、げっ歯類である、項目1〜22のいずれか1項に記載の方法。
(項目24)
前記げっ歯類がラットまたはマウスである、項目23に記載の方法。
(項目25)
前記げっ歯類がC57BL/6系統を含むマウスである、項目24に記載の方法。
(項目26)
前記Y染色体が、C57BL/6系統、129系統、またはBALB/c系統からのものである、項目25に記載の方法。
(項目27)
前記げっ歯類が、C57BL/6系統及び129系統を含むマウスである、項目24〜26のいずれか1項に記載の方法。
(項目28)
前記宿主胚が前桑実期胚であり、ステップ(d)が、前記宿主胚を胚盤胞期まで培養することをさらに含む、項目1〜27のいずれか1項に記載の方法。
(項目29)
前記非ヒト哺乳動物XY多能性細胞が、前記宿主胚への導入前に少なくとも1日間、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間、10日間、11日間、12日間、13日間、2週間、3週間、または4週間の間、前記標的化合物の存在下で培養される、項目1〜28のいずれか1項に記載の方法。
(項目30)
ドナー非ヒト哺乳動物XY多能性細胞の作製方法であって、
(a)非ヒト哺乳動物XY多能性細胞の集団を、前記非ヒト哺乳動物XY多能性細胞の前記多能性を維持するのに好適な基本培地及び添加物を含む低オスモル濃度培地中で培養し、前記低オスモル濃度培地が、約200mOsm/kg〜約329mOsm/kg未満のオスモル濃度を有することと、
(b)Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち1つ以上の発現及び/または活性について、非ヒト哺乳動物XY多能性細胞の前記集団において前記非ヒト哺乳動物XY多能性細胞のうち1種以上をアッセイすることと、
(c)Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上の前記発現及び/または活性に基づいて、F0世代において繁殖可能な表現型的に雌のXY非ヒト哺乳動物を生成するためにドナー非ヒト哺乳動物XY多能性細胞を選択し、前記F0世代における前記繁殖可能な表現型的に雌のXY非ヒト哺乳動物の前記比率が、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上の前記発現及び/または活性に逆相関すること
とを含む、前記方法。
(項目31)
ステップ(b)の前記アッセイによって、前記mRNAレベルでDdx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上の発現が検出される、項目30に記載の方法。
(項目32)
ステップ(b)の前記アッセイによって、前記タンパク質レベルでDdx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上の発現が検出される、項目30に記載の方法。
(項目33)
前記ドナー非ヒト哺乳動物XY多能性細胞が、対照非ヒト哺乳動物XY多能性細胞、すなわち、前記対照非ヒト哺乳動物XY多能性細胞の前記多能性を維持するのに十分であるが、繁殖可能な雌子孫を生じる前記細胞の能力を変化させない培地中で培養された前記細胞と比較して、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上の減少した発現及び/または活性に基づいて選択される、項目30〜32のいずれか1項に記載の方法。
(項目34)
前記ドナー非ヒト哺乳動物XY多能性細胞が、前記対照非ヒト哺乳動物XY多能性細胞と比較して、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yの減少した発現及び/または活性を有する、項目33に記載の方法。
(項目35)
ステップ(b)が、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち1つ以上の発現及び/または活性について、非ヒト哺乳動物XY多能性細胞の前記集団における少なくとも2種の前記非ヒト哺乳動物XY多能性細胞をアッセイすることを含み、ステップ(c)が、前記ドナー非ヒト哺乳動物XY多能性細胞として、他方のアッセイした細胞と比較して、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上の最も低い発現及び/または活性を有するステップ(b)の前記アッセイした細胞を選択することを含む、項目30〜34のいずれか1項に記載の方法。
(項目36)
前記ドナー非ヒト哺乳動物XY多能性細胞が、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上の発現及び/または活性を欠いている、項目30〜35のいずれか1項に記載の方法。
(項目37)
前記ドナー非ヒト哺乳動物XY多能性細胞が、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yの発現及び/または活性を欠いている、項目30〜36のいずれか1項に記載の方法。
(項目38)
前記非ヒト哺乳動物XY多能性細胞が、アッセイステップ(b)の前に少なくとも1日間、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間、10日間、11日間、12日間、13日間、2週間、3週間、または4週間の間、前記低オスモル濃度培地中で培養される、項目30〜37のいずれか1項に記載の方法。
(項目39)
前記多能性細胞が、胚性幹(ES)細胞である、項目30〜38のいずれか1項に記載の方法。
(項目40)
前記多能性細胞が、VGF1マウスES細胞である、項目39に記載の方法。
(項目41)
前記低オスモル濃度培地が、以下の特性:
(I)前記低オスモル濃度培地が、約218mOsm/kg〜約322mOsm/kgのオスモル濃度を有すること、
(II)前記低オスモル濃度培地が、218mOsm/kgのオスモル濃度を有すること、
(III)前記低オスモル濃度培地が、約11mS/cm〜約13mS/cmの伝導度を有すること、
(IV)前記基本培地が、アルカリ金属及びハロゲン化物の塩を約50mM〜約110mMの濃度で含むこと、
(V)前記基本培地が、塩化ナトリウムを約50mM〜約110mMの濃度で含むこと、
(VI)前記基本培地が、炭酸塩を約17mM〜約30mMの濃度で含むこと、
(VII)前記基本培地が、重炭酸ナトリウムを約13mM〜約25mMの濃度で含むこと、
(VIII)前記基本培地が、約85mM〜約130mMのアルカリ金属ハロゲン化物塩及び炭酸塩の総濃度を有すること、
(IX)前記基本培地が、塩化ナトリウムを87±5mMの濃度で含み、前記低オスモル濃度培地が、261±26mOsm/kgのオスモル濃度を有すること、
(X)前記基本培地が、アルカリ金属及びハロゲン化物の塩を約50mM〜約110mMの濃度で、及び炭酸塩を約17mM〜約30mMの濃度で含み、前記低オスモル濃度培地が、約200mOsm/kg〜約329mOsm/kgのオスモル濃度を有すること、ならびに
(XI)前記低オスモル濃度培地が、218mOsm/kgのオスモル濃度を有し、前記基本培地が、塩化ナトリウムを50mM〜110mMの濃度で、及び重炭酸ナトリウムを13mM〜25mMの濃度で含むこと
のうち1つ以上を有する、項目30〜40のいずれか1項に記載の方法。
(項目42)
前記基本培地が、炭酸塩を約18mM〜約44mMの濃度で含む、項目30〜41のいずれか1項に記載の方法。
(項目43)
前記基本培地が、アルカリ金属及びハロゲン化物の塩を約50mM〜約110mMの濃度で含む、項目30〜42のいずれか1項に記載の方法。
(項目44)
前記炭酸塩が重炭酸ナトリウムであり、前記アルカリ金属及び前記ハロゲン化物の前記塩が塩化ナトリウムであり、前記低オスモル濃度培地が、約216mOsm/kg〜約322mOsm/kgのオスモル濃度を有する、項目30〜43のいずれか1項に記載の方法。
(項目45)
前記基本培地が、塩化ナトリウムを約3mg/mLの濃度で、及び重炭酸ナトリウムを約2.2mg/mLの濃度で含み、前記低オスモル濃度培地が、約216mOsm/kgのオスモル濃度を有する、項目30〜44のいずれか1項に記載の方法。
(項目46)
前記非ヒト哺乳動物が、げっ歯類である、項目30〜45のいずれか1項に記載の方法。
(項目47)
前記げっ歯類がラットまたはマウスである、項目46に記載の方法。
(項目48)
前記げっ歯類がC57BL/6系統を含むマウスである、項目47に記載の方法。
(項目49)
前記Y染色体が、C57BL/6系統、129系統、またはBALB/c系統からのものである、項目48に記載の方法。
(項目50)
前記げっ歯類が、C57BL/6系統及び129系統を含むマウスである、項目47〜49のいずれか1項に記載の方法。
(項目51)
(d)前記ドナー非ヒト哺乳動物XY多能性細胞を宿主胚に導入することと、
(e)ステップ(d)の前記宿主胚をレシピエント雌非ヒト哺乳動物に導入して、前記宿主胚を懐胎させることと、
(f)表現型的に雌のXY非ヒト哺乳動物を含むF0 XY非ヒト哺乳動物子孫を得て、
性成熟に達すると、前記F0の表現型的に雌のXY非ヒト哺乳動物が繁殖可能かつ妊孕可能になること
とをさらに含む、項目30〜50のいずれか1項に記載の方法。
(項目52)
前記宿主胚が前桑実期胚であり、ステップ(d)が、前記宿主胚を前記胚盤胞期まで培養することをさらに含む、項目51に記載の方法。
(項目53)
前記非ヒト哺乳動物XY多能性細胞が、前記宿主胚への導入前に少なくとも1日間、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間、10日間、11日間、12日間、13日間、2週間、3週間、または4週間の間、前記低オスモル濃度培地中で培養される、項目51または52に記載の方法。
(項目54)
(a)非ヒト哺乳動物XY多能性細胞においてDdx3y、Uty、及びEif2s3yのうち1つ以上の発現及び/または活性レベルを検出するための検出試薬と、
(b)前記検出試薬を使用して、F0世代において繁殖可能な表現型的に雌のXY非ヒト哺乳動物を生成するための前記非ヒト哺乳動物XY多能性細胞の予測傾向と検出を相互に関連付けるための説明書
とを含む、キット。
(項目55)
前記検出試薬が、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上の発現を検出するための、1つ以上のプライマーセット及び/または1つ以上のプローブを含む、項目54に記載のキット。
(項目56)
雌化培地における標的培地成分の前記濃度の最適化方法であって、
(a)非ヒト哺乳動物XY多能性細胞の第1集団及び第2集団を、前記非ヒト哺乳動物XY多能性細胞の前記多能性を維持するのに好適な基本培地及び添加物を含む培地中で培養し、
前記第1集団が、第1濃度の前記標的培地成分の存在下で培養され、前記第2集団が、前記第1濃度とは異なる第2濃度の前記標的培地成分の存在下で培養されることと、
(b)Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち1つ以上の発現及び/または活性について、非ヒト哺乳動物XY多能性細胞の前記第1及び第2集団の各々で前記非ヒト哺乳動物XY多能性細胞のうち1種以上をアッセイすることと、
(c)Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上の前記発現及び/または活性が、前記第2集団からの前記1種以上の非ヒト哺乳動物XY多能性細胞と比較して、前記第1集団からの前記1種以上の非ヒト哺乳動物XY多能性細胞で減少する場合に、前記第1濃度を選択することと、
(d)Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上の前記発現及び/または活性に基づいて、F0世代において繁殖可能な表現型的に雌のXY非ヒト哺乳動物を生成するために、前記第1集団からドナー非ヒト哺乳動物XY多能性細胞を選択し、前記F0世代における前記繁殖可能な表現型的に雌のXY非ヒト哺乳動物の前記比率が、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上の前記発現及び/または活性に逆相関することと、
(e)前記ドナー非ヒト哺乳動物XY多能性細胞を宿主胚に導入することと、
(f)ステップ(e)の前記宿主胚をレシピエント雌非ヒト哺乳動物に導入して、前記宿主胚を懐胎させることと、
(g)表現型的に雌のXY非ヒト哺乳動物を含むF0 XY非ヒト哺乳動物子孫を得て、
性成熟に達すると、前記F0の表現型的に雌のXY非ヒト哺乳動物が繁殖可能かつ妊孕可能になること
とを含む、前記方法。
(項目57)
ステップ(b)の前記アッセイによって、前記mRNAレベルでDdx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上の発現が検出される、項目56に記載の方法。
(項目58)
ステップ(b)の前記アッセイによって、前記タンパク質レベルでDdx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上の発現が検出される、項目56に記載の方法。
(項目59)
前記第1集団からの前記1種以上の非ヒト哺乳動物XY多能性細胞が、前記第2集団からの前記1種以上の非ヒト哺乳動物XY多能性細胞と比較して、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yの減少した発現及び/または活性を有する場合に、前記第1濃度がステップ(c)で選択される、項目56〜58のいずれか1項に記載の方法。
(項目60)
前記第1集団からの前記1種以上の非ヒト哺乳動物XY多能性細胞が、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上の発現及び/または活性を欠いている場合に、前記第1濃度がステップ(c)で選択される、項目56〜59のいずれか1項に記載の方法。
(項目61)
前記第1集団からの前記1種以上の非ヒト哺乳動物XY多能性細胞が、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yの発現及び/または活性を欠いている場合に、前記第1濃度がステップ(c)で選択される、項目56〜60のいずれか1項に記載の方法。
(項目62)
ステップ(d)の前記ドナー非ヒト哺乳動物XY多能性細胞が、対照非ヒト哺乳動物XY多能性細胞、すなわち、前記対照非ヒト哺乳動物XY多能性細胞の前記多能性を維持するのに十分であるが、繁殖可能な雌子孫を生じる前記細胞の能力を変化させない培地中で培養された前記細胞と比較して、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上の減少した発現及び/または活性を有する、項目56〜61のいずれか1項に記載の方法。
(項目63)
ステップ(d)の前記ドナー非ヒト哺乳動物XY多能性細胞が、前記第2集団からの対照非ヒト哺乳動物XY多能性細胞と比較して、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上の減少した発現及び/または活性を有する、項目56〜62のいずれか1項に記載の方法。
(項目64)
前記ドナー非ヒト哺乳動物XY多能性細胞が、前記対照非ヒト哺乳動物XY多能性細胞と比較して、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yの減少した発現及び/または活性を有する、項目62または63に記載の方法。
(項目65)
ステップ(b)が、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち1つ以上の発現及び/または活性について、非ヒト哺乳動物XY多能性細胞の前記第1集団における少なくとも2種の前記非ヒト哺乳動物XY多能性細胞をアッセイすることを含み、ステップ(d)が、前記ドナー非ヒト哺乳動物XY多能性細胞として、他方のアッセイした細胞と比較して、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上の最も低い発現及び/または活性を有するステップ(b)の前記アッセイした細胞を選択することを含む、項目56〜64のいずれか1項に記載の方法。
(項目66)
前記ドナー非ヒト哺乳動物XY多能性細胞が、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上の発現及び/または活性を欠いている、項目56〜65のいずれか1項に記載の方法。
(項目67)
前記ドナー非ヒト哺乳動物XY多能性細胞が、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yの発現及び/または活性を欠いている、項目56〜66のいずれか1項に記載の方法。
(項目68)
前記第1及び第2集団が、アッセイステップ(b)の前に少なくとも1日間、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間、10日間、11日間、12日間、13日間、2週間、3週間、または4週間の間、前記標的培地成分の存在下で培養される、項目56〜67のいずれか1項に記載の方法。
(項目69)
前記多能性細胞が、胚性幹(ES)細胞である、項目56〜68のいずれか1項に記載の方法。
(項目70)
前記多能性細胞が、VGF1マウスES細胞である、項目69に記載の方法。
(項目71)
ステップ(a)の前記培地が、約200mOsm/kg〜約329mOsm/kg未満のオスモル濃度を有する低オスモル濃度培地である、項目56〜70のいずれか1項に記載の方法。
(項目72)
前記低オスモル濃度培地が、以下の特性:
(I)前記低オスモル濃度培地が、約218mOsm/kg〜約322mOsm/kgのオスモル濃度を有すること、
(II)前記低オスモル濃度培地が、218mOsm/kgのオスモル濃度を有すること、
(III)前記低オスモル濃度培地が、約11mS/cm〜約13mS/cmの伝導度を有すること、
(IV)前記基本培地が、アルカリ金属及びハロゲン化物の塩を約50mM〜約110mMの濃度で含むこと、
(V)前記基本培地が、塩化ナトリウムを約50mM〜約110mMの濃度で含むこと、
(VI)前記基本培地が、炭酸塩を約17mM〜約30mMの濃度で含むこと、
(VII)前記基本培地が、重炭酸ナトリウムを約13mM〜約25mMの濃度で含むこと、
(VIII)前記基本培地が、約85mM〜約130mMのアルカリ金属ハロゲン化物塩及び炭酸塩の総濃度を有すること、
(IX)前記基本培地が、塩化ナトリウムを87±5mMの濃度で含み、前記低オスモル濃度培地が、261±26mOsm/kgのオスモル濃度を有すること、
(X)前記基本培地が、アルカリ金属及びハロゲン化物の塩を約50mM〜約110mMの濃度で、及び炭酸塩を約17mM〜約30mMの濃度で含み、前記低オスモル濃度培地が、約200mOsm/kg〜約329mOsm/kgのオスモル濃度を有すること、ならびに
(XI)前記低オスモル濃度培地が、218mOsm/kgのオスモル濃度を有し、前記基本培地が、塩化ナトリウムを50mM〜110mMの濃度で、及び重炭酸ナトリウムを13mM〜25mMの濃度で含むこと
のうち1つ以上を有する、項目71に記載の方法。
(項目73)
前記基本培地が、炭酸塩を約18mM〜約44mMの濃度で含む、項目71または72に記載の方法。
(項目74)
前記基本培地が、アルカリ金属及びハロゲン化物の塩を約50mM〜約110mMの濃度で含む、項目71〜73のいずれか1項に記載の方法。
(項目75)
前記炭酸塩が重炭酸ナトリウムであり、前記アルカリ金属及び前記ハロゲン化物の前記塩が塩化ナトリウムであり、前記低オスモル濃度培地が、約216mOsm/kg〜約322mOsm/kgのオスモル濃度を有する、項目71〜74のいずれか1項に記載の方法。
(項目76)
前記基本培地が、塩化ナトリウムを約3mg/mLの濃度で、及び重炭酸ナトリウムを約2.2mg/mLの濃度で含み、前記低オスモル濃度培地が、約216mOsm/kgのオスモル濃度を有する、項目71〜75のいずれか1項に記載の方法。
(項目77)
前記非ヒト哺乳動物が、げっ歯類である、項目56〜76のいずれか1項に記載の方法。
(項目78)
前記げっ歯類がラットまたはマウスである、項目77に記載の方法。
(項目79)
前記げっ歯類がC57BL/6系統を含むマウスである、項目78に記載の方法。
(項目80)
前記Y染色体が、C57BL/6系統、129系統、またはBALB/c系統からのものである、項目79に記載の方法。
(項目81)
前記げっ歯類が、C57BL/6系統及び129系統を含むマウスである、項目78〜80のいずれか1項に記載の方法。
(項目82)
前記宿主胚が前桑実期胚であり、ステップ(e)が、前記宿主胚を前記胚盤胞期まで培養することをさらに含む、項目56〜81のいずれか1項に記載の方法。
(項目83)
前記非ヒト哺乳動物XY多能性細胞が、前記宿主胚への導入前に少なくとも1日間、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間、10日間、11日間、12日間、13日間、2週間、3週間、または4週間の間、前記標的培地成分の存在下で培養される、項目56〜82のいずれか1項に記載の方法。
(項目84)
前記多能性細胞が、標的ゲノム遺伝子座に標的遺伝子改変を含む、項目1〜53及び56〜83のいずれか1項に記載の方法。
(項目85)
前記標的遺伝子改変が、挿入、欠失、ノックアウト、ノックイン、点変異、またはこれらの組合せを含む、項目84に記載の方法。
(項目86)
(h)子孫を生成するために前記繁殖可能なF0 XY雌非ヒト哺乳動物を交配させること
をさらに含む、項目1〜29、51〜53、及び56〜85のいずれか1項に記載の方法。
(項目87)
少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、または全ての前記XY子孫が、表現型的に雄かつ繁殖可能である、項目86に記載の方法。
(項目88)
前記XY子孫には表現型的に雌がいない、項目86または87に記載の方法。
(項目89)
前記交配が、前記繁殖可能なF0 XY雌非ヒト哺乳動物をコホートF0 XY雄非ヒト哺乳動物と交雑させて、ここで前記繁殖可能なF0 XY雌非ヒト哺乳動物及び前記F0 XY雄非ヒト哺乳動物が各々、遺伝子改変についてヘテロ接合体であること、ならびに前記遺伝子改変についてホモ接合体であるF1子孫非ヒト哺乳動物を得ることを含む、項目86〜88のいずれか1項に記載の方法。
(項目90)
少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、または少なくとも95%の前記F0 XY子孫が、性成熟に達すると繁殖可能になる表現型的に雌のXY非ヒト哺乳動物である、項目1〜29、51〜53、及び56〜89のいずれか1項に記載の方法。
(項目91)
繁殖可能な表現型的に雌のXY動物である前記F0 XY子孫の前記パーセンテージが、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上のより高い発現及び/または活性を有する非ヒト哺乳動物XY多能性細胞に由来するF0 XY子孫と比較した場合に、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上の減少した発現及び/または活性を有する非ヒト哺乳動物XY多能性細胞に由来するF0 XY子孫ではより高い、項目90に記載の方法。
(項目92)
前記ドナー非ヒト哺乳動物XY多能性細胞に由来する前記F0雌の全てが、XY遺伝子型を有する、項目1〜29、51〜53、及び56〜91のいずれか1項に記載の方法。
(項目93)
前記ドナー非ヒト哺乳動物XY多能性細胞に由来する少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、または少なくとも95%の前記F0 XY雌が、繁殖可能である、項目1〜29、51〜53、及び56〜92のいずれか1項に記載の方法。
(項目94)
繁殖可能な前記F0 XY雌の前記パーセンテージが、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上のより高い発現及び/または活性を有する非ヒト哺乳動物XY多能性細胞に由来するF0 XY子孫と比較した場合に、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上の減少した発現及び/または活性を有する非ヒト哺乳動物XY多能性細胞に由来するF0 XY子孫ではより高い、項目93に記載の方法。
(項目95)
前記ドナー非ヒト哺乳動物XY多能性細胞に由来する少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、または少なくとも95%の前記F0 XY雌が、少なくとも2匹、3匹、4匹、5匹、6匹、7匹、8匹、9匹、または10匹の仔を有する同腹仔を産生することができる、項目1〜29、51〜53、及び56〜94のいずれか1項に記載の方法。
(項目96)
F0 XY雌または繁殖可能なF0 XY雌により産生される前記平均産子数が、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上のより高い発現及び/または活性を有する非ヒト哺乳動物XY多能性細胞に由来するF0 XY雌または繁殖可能なF0 XY雌と比較した場合に、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上の減少した発現及び/または活性を有する非ヒト哺乳動物XY多能性細胞に由来するF0 XY雌または繁殖可能なF0 XY雌ではより高い、項目95に記載の方法。
(項目97)
前記ドナー非ヒト哺乳動物XY多能性細胞に由来する少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、または少なくとも95%の前記F0 XY雌が、それらの生涯において少なくとも2匹、3匹、4匹、5匹、6匹、7匹、8匹、9匹、または10匹の同腹仔を産生することができる、項目1〜29、51〜53、及び56〜96のいずれか1項に記載の方法。
(項目98)
F0 XY雌または繁殖可能なF0 XY雌により産生される一生涯における同腹仔の前記平均数が、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上のより高い発現及び/または活性を有する非ヒト哺乳動物XY多能性細胞に由来するF0 XY雌または繁殖可能なF0 XY雌と比較した場合に、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上の減少した発現及び/または活性を有する非ヒト哺乳動物XY多能性細胞に由来するF0 XY雌または繁殖可能なF0 XY雌ではより高い、項目97に記載の方法。
(項目99)
F0 XY雌または繁殖可能なF0 XY雌により産生される一生涯における子孫の前記平均数が、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上のより高い発現及び/または活性を有する非ヒト哺乳動物XY多能性細胞に由来するF0 XY雌または繁殖可能なF0 XY雌と比較した場合に、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上の減少した発現及び/または活性を有する非ヒト哺乳動物XY多能性細胞に由来するF0 XY雌または繁殖可能なF0 XY雌ではより高い、項目1〜29、51〜53、及び56〜98のいずれか1項に記載の方法。
「タンパク質」、「ポリペプチド」、及び「ペプチド」という用語は、本明細書では同じ意味として使用され、コード及び非コードアミノ酸ならびに化学的または生化学的に修飾または誘導体化されたアミノ酸を含む、任意の長さのアミノ酸ポリマー形態を含む。本用語は、修飾されているポリマー、例えば、修飾ペプチド骨格を有するポリペプチドなども含む。
繁殖可能なF0 XY雌動物を生成するための方法及び組成物が提供される。方法及び組成物は、F0世代において繁殖可能な雌XY動物を生成することができるXY多能性もしくは全能性動物細胞、インビトロ細胞培養物、または胚を作製することを伴う。このような細胞(ならびに胚及びそれらに由来する動物)は、雌化培地中でXY多能性または全能性細胞を培養すること、ならびにDdx3y、Uty、及びEif2s3yのうち1つ以上の発現及び/または活性を評価することによって作製され得る。動物XY多能性または全能性細胞クローンがF0世代において繁殖可能な表現型的に雌のXY動物を生成する傾向は、これらのクローンにおけるDdx3y、Uty、及びEif2s3yの発現または活性と逆相関する。あるいは、このような細胞(ならびに胚及びそれらに由来する動物)は、Y染色体の領域をサイレンシングすることによって作製され得る。場合により、細胞はまた、雌化培地中で培養され得る、ならびに/またはSryタンパク質のレベル及び/もしくは活性を減少させるように改変され得る。低オスモル濃度培地などの雌化培地中でXY多能性または全能性動物細胞を維持することによって、XY多能性もしくは全能性動物細胞(またはインビトロ細胞培養物、胚、もしくはそれらに由来する動物)におけるY染色体の領域をサイレンシングするための方法及び組成物もまた提供される。雌化培地中でXY多能性または全能性動物細胞の集団を維持するため、及びF0世代において繁殖可能な雌XY動物を生成する高い能力を有する細胞またはクローンを選択するための方法及び組成物もまた提供される。雌化活性を有する化合物についてスクリーニングするため、またはDdx3y、Uty、及びEif2s3yのうち1つ以上の発現及び/もしくは活性の評価によって雌化培地中で成分の濃度を最適化するための方法及び組成物もまた提供され、XY多能性または全能性細胞におけるその発現及び/または活性は、動物XY多能性または全能性細胞クローンがF0世代において繁殖可能な表現型的に雌のXY動物を生成する傾向と逆相関する。
A.F0世代において繁殖可能なXY雌を生成することができるXY多能性または全能性細胞を作製する方法
XY遺伝子型を有する表現型的に雌の動物(例えば、マウス)は、特異的変異の結果として生成され得る。例えば、Lovell−Badge et al.(1990)Development 109:635−646を参照し、Colvin et al.(2001)Cell 104(6):875−889も参照のこと。しかしながら、このようなXY雌動物は、多くの場合に生殖不能である、または繁殖可能である場合、非常に不十分な妊孕力を有する。標的ゲノム遺伝子座の標的遺伝子改変についてホモ接合体の動物を生成することと関連して最も有用であるには、性転換及び繁殖力の両方が、XY雌で達成される必要がある。本明細書で提供される方法及び組成物によって、F0世代において繁殖可能な雌XYを生成することができるXY多能性もしくは全能性動物細胞または胚が作製され得る。このような細胞(ならびにインビトロ細胞培養物、胚、及びそれらに由来する動物)は、Y染色体の領域をサイレンシングすることによって作製され得る。場合により、細胞はまた、雌化培地中で培養され得る、ならびに/またはSryタンパク質のレベル及び/もしくは活性を減少させるように改変され得る。
Y染色体の領域をサイレンシングするためにXY動物細胞(例えば、XY多能性または全能性細胞、例えば、XY ES細胞など)を改変し、それによって一部の細胞を、繁殖可能な雌動物に発達する可能性のあるドナーXY多能性または全能性細胞に変換し、その結果、細胞をレシピエント胚に移植して繁殖可能な雌子孫を生じ得るための方法及び組成物が提供される。したがって、ドナーXY多能性または全能性細胞は、繁殖可能な表現型的に雌の動物を含むF0 XY子孫を生成することができる。
F0世代において繁殖可能なXY雌を促進する様々な方法及び組成物で用いられる培養培地は、それが多能性または全能性細胞(例えば、ES細胞、iPS細胞、XY ES細胞、XY iPS細胞など)を維持するというようなものである。「維持する」、「維持すること」、及び「維持」という用語は、本明細書に記載される多能性または全能性細胞(ES細胞またはiPS細胞を含む)の特性または表現型のうち少なくとも1つ以上の安定した保存を指す。このような表現型は、細胞の多能性または全能性、細胞形態、遺伝子発現プロファイル、及びその他の機能的特性を維持することを含み得る。「維持する」、「維持すること」及び「維持」という用語はまた、細胞の増殖または培養されている細胞数の増加を包含し得る。本用語は、細胞が分裂して数が増加し続ける場合もあり、またはそうでない場合もある一方で、細胞が多能性のままであることを可能にする培養条件をさらに考慮する。細胞は、様々な濃度の二酸化炭素中で培養され得る。一例では、細胞は5%二酸化炭素中で培養される。
Y染色体の領域のサイレンシングは、以下でさらに定義されるような雌化培地中でXY多能性または全能性細胞を培養または維持することによって達成され得る。同様に、Y染色体の領域をサイレンシングするさらなる改変を有するXY多能性または全能性細胞もまた、以下でさらに定義されるような雌化培地中で培養することによって維持され得る。培地中において十分な時間、細胞を培養することによって、細胞は、繁殖可能な雌動物へと発達する可能性を有するXY多能性または全能性細胞へと変換され得るため、結果として細胞は、レシピエント胚に移植されて繁殖可能な雌子孫を生じ得る。WO2011/156723及びKuno et al.(2015)Transgenic Res.24(1):19−29(その各々の全体が、あらゆる目的のために参照によって本明細書に組み込まれる)は、宿主胚へのXYドナー細胞の導入及び好適な宿主での懐胎後、繁殖可能なXY雌動物が、F0集団において産生され得るように培養下でXYドナー細胞を維持するために、このような雌化培養培地(例えば、本明細書内の他の箇所に開示されるような低オスモル濃度培地または低塩培地)を用いる方法及び組成物を提供する。いくつかのこのような方法では、特定のXY多能性または全能性細胞クローンが繁殖可能なXY雌動物を生成する傾向は、0%〜60%であり得、これらの雌化効果は、対照非雌化培地中でクローンを再成長させることによって反転され得ない。このようなF0 XY雌は、正常な雌の外的及び内的構造を有し得、宿主胚の寄与及びキメラ現象が一切ない、完全にドナー細胞由来であり得、生殖器を含む全ての組織中に1本のX染色体及び1本のY染色体を有し得、かつ可視の染色体異常もなく、正常なXY雄の核型を有し得る。雌化培地中で培養されたXY多能性または全能性細胞に由来するF0 XY雌は、XX雌と同等の繁殖力及び妊孕力を有し得る。例えば、いくつかのこのような方法では、F0 XY雌は、F1 XX雌対照物のおよそ90%の繁殖力と比較して60〜70%の繁殖力を有する。いくつかのこのような方法では、9か月の交配試験においてF0 XY雌とF1 XX雌との間で妊孕力には全く差がない。
動物XY多能性または全能性細胞またはクローンが、F0世代において繁殖可能な表現型的に雌のXY動物を生成する傾向を決定するための方法及び組成物が提供される。動物XY多能性または全能性細胞クローンがF0世代において繁殖可能な表現型的に雌のXY動物を生成する傾向は、これらのクローンにおけるDdx3y、Uty、及びEif2s3yの発現または活性と逆相関する。動物XY多能性または全能性細胞(例えば、XY ES細胞)におけるこれらの遺伝子のうち1つ以上の発現喪失は、どの細胞クローンがF0世代においてXY雌動物を生成することになるかを予測し得る:観察されるDdx3y、Uty、及びEif2s3yのサイレンシングが強くなるほど、XY ES細胞クローンがF0世代において繁殖可能な表現型的に雌のXY動物を生成する傾向がますます高くなる(例えば、実施例3を参照のこと)。同様に、動物XY多能性または全能性細胞(例えば、XY ES細胞)におけるこれらの遺伝子のうち1つ以上の活性喪失または発現及び/もしくは活性の減少は、どの細胞クローンがF0世代においてXY雌動物を生成することになるかを予測し得る:観察されるDdx3y、Uty、及びEif2s3yの発現が低下するほど、XY ES細胞クローンがF0世代において繁殖可能な表現型的に雌のXY動物を生成する傾向がますます高くなる(例えば、実施例3を参照のこと)。言い換えれば、これらの遺伝子のうち1つ以上の発現及び/または活性は、XY雌生成を予測するための代理マーカーであり得る。
Y染色体の領域をサイレンシングする改変を有するXY多能性または全能性細胞は、レシピエント胚に移植されて繁殖可能な雌子孫を生じ得るように、一部の細胞を、繁殖可能な雌動物へと発達する可能性を有するXY多能性または全能性細胞に変換させるために、Sryタンパク質の減少したレベル及び/または活性をもたらす遺伝子改変をさらに含み得る。同様に、本明細書内の他の箇所に開示されるような雌化培地中で培養されるXY多能性または全能性細胞は、Sryタンパク質の減少したレベル及び/もしくは活性をもたらす遺伝子改変を含み得る、またはそれらが、Sryタンパク質の減少したレベル及び/もしくは活性をもたらす遺伝子改変を含まないようにし得る。「性決定領域Y」タンパク質または「Sry」タンパク質は、DNA結合タンパク質の高移動度群(HMG)ボックスファミリーのメンバーである転写因子である。Sryは、雄性決定を開始する精巣決定因子である。様々な生物からのSryタンパク質の配列が既知であり、この配列は、マウス(アクセッション番号Q05738)、ラット(GenBank:CAA61882.1)、ヒト(アクセッション番号Q05066)、ネコ(アクセッション番号Q67C50)、及びウマ(アクセッション番号P36389)からのものを含み、その各々の全体が、あらゆる目的のために参照によって本明細書に組み込まれる。
Y染色体の領域をサイレンシングするようにXY多能性または全能性動物細胞を改変するために提供される方法及び組成物は、雌化培地(例えば、低オスモル濃度培地)中でXY多能性もしくは全能性動物細胞を培養することを伴う方法ならびに/またはSryタンパク質のレベル及び/もしくは活性を減少させるようにXY多能性もしくは全能性動物細胞を改変することを伴う方法と組み合わされ得る。同様に、雌化培地(例えば、低オスモル濃度培地)中でXY多能性または全能性動物細胞を培養することを伴う方法は、Y染色体の領域をサイレンシングするようにXY多能性もしくは全能性動物細胞を改変するために提供される方法及び組成物ならびに/またはSryタンパク質のレベル及び/もしくは活性を減少させるようにXY多能性もしくは全能性動物細胞を改変することを伴う方法と組み合わされ得る。XY多能性または全能性細胞は、標的ゲノム遺伝子座に対して少なくとも1つの追加の標的遺伝子改変をさらに含み得る。
Y染色体の領域をサイレンシングするように改変されたドナーXY多能性または全能性細胞を含むインビトロ細胞培養物がさらに提供される。本明細書内の他の箇所に開示されるような雌化培地中で培養されるドナーXY多能性または全能性を含むインビトロ細胞培養物もまた提供される。このような細胞を維持または培養するための方法及び組成物もまた提供される。細胞は、Sryタンパク質のレベル及び/または活性を減少させる改変をさらに含み得る。同様に、XY多能性または全能性細胞は、標的ゲノム遺伝子座に対して少なくとも1つの追加の標的遺伝子改変をさらに含み得る。
Y染色体の領域をサイレンシングするように改変された少なくとも1種の異種ドナー多能性または全能性XY細胞を有する内部細胞塊を含むF0胚がさらに提供される。同様に、本明細書内の他の箇所に開示されるような雌化培地中で培養または維持された少なくとも1種の異種ドナー多能性または全能性XY細胞を有する内部細胞塊を含むF0胚がさらに提供される。異種ドナー多能性または全能性XY細胞は、本明細書に開示される方法によって生成され得る。異種ドナー多能性または全能性XY細胞は、Sryタンパク質のレベル及び/または活性を減少させる改変をさらに含み得る。同様に、異種ドナー多能性または全能性XY細胞は、標的ゲノム遺伝子座に対して少なくとも1つの追加の標的遺伝子改変をさらに含み得る。
Y染色体の領域のサイレンシングを含む改変を有するXY多能性または全能性細胞を用いる様々な方法及び組成物が、標的ゲノム遺伝子座に対して追加の標的遺伝子改変を場合により含む繁殖可能なF0 XY雌動物を生成するために使用され得る。同様に、本明細書内の他の箇所に開示されるような雌化培地中で培養または維持されるXY多能性または全能性細胞を用いる様々な方法及び組成物が、標的ゲノム遺伝子座に対して追加の標的遺伝子改変を場合により含む繁殖可能なF0 XY雌動物を生成するために使用され得る。例えば、本明細書に開示される方法によって生成されるF0 XY雌動物は、F1世代を生成するために野生型動物と交雑させた場合に繁殖可能であり得る。
F0世代において繁殖可能な雌XY動物を作製するための方法及び組成物が提供される。このような方法によって生成され、得られた繁殖可能な表現型的に雌のXY動物もまた提供される。F0世代において繁殖可能な表現型的に雌のXY動物を作製する方法は、(a)本明細書内の他の箇所に開示される改変ドナーXY多能性または全能性細胞(すなわち、F0世代において繁殖可能なXY雌を生成することができるドナーXY多能性または全能性細胞)のいずれかを宿主胚に導入すること、(b)ステップ(a)の宿主胚をレシピエント雌動物に導入して、宿主胚を懐胎させること、及び(c)表現型的に雌のXY動物を含むF0 XY動物子孫を得て、性成熟に達すると、F0の表現型的に雌のXY動物が繁殖可能になることを含み得る。F0世代において繁殖可能な表現型的に雌のXY動物を作製するその他の方法は、(a)本明細書内の他の箇所に開示される改変胚のいずれかをレシピエント雌動物に導入して、胚を懐胎させること、及び(b)表現型的に雌のXY動物を含むF0 XY動物子孫を得て、性成熟に達すると、F0の表現型的に雌のXY動物が繁殖可能になることを含み得る。
いくつかの方法では、Y染色体の領域をサイレンシングする遺伝子改変を有するXY多能性または全能性細胞(すなわち、XY ES細胞またはXY iPS細胞)に由来する、得られた繁殖可能なXY雌F0世代を動物と交雑させて、F1世代子孫を得る。F0世代雌XY非ヒト動物は、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも94%、少なくとも96%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、または完全にドナーXY多能性または全能性細胞(例えば、XY ES細胞)に由来し得る。
標的遺伝子改変(例えば、Y染色体の領域をサイレンシングする、Sryタンパク質のレベル及び/もしくは活性を減少させる、または本明細書内の他の箇所に開示されるような任意の追加の標的ゲノム遺伝子座を改変する)を作製するための様々な方法及び組成物が使用され得る。標的遺伝子改変を作製する1つの手段は組換えによるものであり、これは2つのポリヌクレオチド間における遺伝情報の交換という任意のプロセスを含む。二本鎖切断(DSB)に応答する組換えは、主として2つの保存されたDNA修復経路:すなわち、非相同末端結合(NHEJ)及び相同組換え(HR)によって生じる。Kasparek&Humphrey(2011)Seminars in Cell&Dev.Biol.22:886−897を参照し、その全体があらゆる目的のために参照によって本明細書に組み込まれる。NHEJは、相同鋳型の必要なく、切断末端を互いに直接連結することによる核酸の二本鎖切断の修復を含む。NHEJによる不連続配列の連結によって、多くの場合に二本鎖切断部位の近傍に欠失、挿入、または転座がもたらされ得る。このようなシステムは、例えば、標的機能喪失遺伝子改変の生成に用途を見出す。
所望の認識部位にニックまたは二本鎖切断を誘導する任意のヌクレアーゼ剤が、本明細書に開示される方法及び組成物で使用され得る。天然に存在する、もしくは天然ヌクレアーゼ剤が用いられ得る、または改変もしくは操作ヌクレアーゼ剤(例えば、所望の認識部位におけるニックもしくは二本鎖切断を特異的に認識して誘導するために、その天然型から操作される(改変もしくは誘導される)ヌクレアーゼ)が用いられ得る。
標的化ベクターは、核酸インサートをゲノム標的遺伝子座中に導入して、核酸インサート及び核酸インサートに隣接する相同腕を含むために用いられ得る。標的化ベクターは、線状形態または環状形態であり得、一本鎖または二本鎖であり得る。参照を容易にするために、相同腕は、本明細書において5’及び3’(すなわち、上流及び下流)相同腕と称される。本用語は、標的化ベクター内の核酸インサートに対する相同腕の相対位置に関する。5’及び3’相同腕は、標的遺伝子座内の領域に対応し、これらは本明細書においてそれぞれ「5’標的配列」及び「3’標的配列」と称される。
いくつかの方法は、小さな標的化ベクターまたはsmallTVECを利用する。Y染色体に対して標的遺伝子改変を作製するためにsmallTVECを使用する例は、例えば、WO2015/200805及びUS2015/0376651に開示されていて、その各々の全体が、あらゆる目的のために参照によって組み込まれる。「smallTVEC」は、短い相同腕を含む標的化ベクターを含む。smallTVEC上の相同腕の長さは、例えば、約400bp〜約1000bpであり得る。smallTVECの相同腕は、対応する標的部位との相同組換え事象を促進するのに十分な任意の長さ、例えば、約400bp〜約500bp、約500bp〜約600bp、約600bp〜約700bp、約700bp〜約800bp、約800bp〜約900bp、または約900bp〜約1000bpを含む長さであり得る。smallTVEC上の相同腕の好ましい長さは、約700bp〜約800bpである。smallTVECの5’及び3’相同腕の合計は、例えば、約0.5kb〜約10kbであり得る。このような方法では、短い長さの相同腕は、より長い相同腕を有する標的化ベクターと比較した場合、標的化効率を向上させ得る。高頻度反復配列を有するY染色体の性質によって、smallTVECの短腕は、Y染色体上における高度に特異的な標的化を可能にし得る。
一部の標的化ベクターは、「大きな標的化ベクター」または「LTVEC」であり、これは、細胞中で相同組換えを実施することを目的とするその他の手法で典型的には使用される配列よりも大きな核酸配列に対応し、かつそれらに由来する相同腕を含む標的化ベクターを含む。LTVECを使用して標的遺伝子改変を生成する例は、例えば、WO2015/088643、US2015/0159175、US2015/0159174、US2014/0310828、US2014/0309487、及びUS2013−0309670に開示されていて、その各々の全体が、あらゆる目的のために参照によって本明細書に組み込まれる。LTVECは、細胞中で相同組換えを実施することを目的とするその他の手法で典型的には使用される配列よりも大きな核酸配列を有する核酸インサートを含む標的化ベクターも含む。例えば、LTVECは、従来のプラスミドに基づく標的化ベクターではそれらのサイズ制限のために収容できない大きな遺伝子座の改変を可能にする。例えば、標的遺伝子座は、ヌクレアーゼ剤(例えば、Casタンパク質)によって誘導されるニックまたは二本鎖切断の不存在下では、従来の方法を使用しても標的化できない、または不正確にしか、もしくは大幅に低い効率でしか標的とされ得ない細胞の遺伝子座であり得る(すなわち、5’及び3’相同腕がこの遺伝子座に対応し得る)。
細胞中への核酸の導入を可能にする様々な方法及び組成物が、本明細書で提供される。いくつかの場合には、核酸を導入するために用いられるシステムは、特定のゲノム遺伝子座における標的組込みを可能にする。このようなシステムは様々な成分を用いて、参照を容易にするために、「標的ゲノム組込みシステム」という用語は一般に、組込み事象に必要な全ての成分(例えば、ヌクレアーゼ剤、ヌクレアーゼ切断部位、挿入DNAポリヌクレオチド、標的化ベクター、標的ゲノム遺伝子座、及び対象となるポリヌクレオチドのうち1つ以上)を含む。
様々な種類の標的遺伝子改変が、Y染色体の領域をサイレンシングするために(例えば、Y染色体の領域の欠失または破壊によって)使用され得る。例えば、タンパク質のレベル及び/または活性の減少は、タンパク質をコードする遺伝子に対する、またはタンパク質のレベルもしくは活性に影響を及ぼす、もしくはそれらを制御するゲノム遺伝子座に対する標的遺伝子改変によって達成され得る。このような標的改変としては、例えば、1つ以上のヌクレオチドの付加、1つ以上のヌクレオチドの欠失、1つ以上のヌクレオチドの置換、点変異、対象となるポリヌクレオチドもしくはその一部のノックアウト、対象となるポリヌクレオチドもしくはその一部のノックイン、内因性核酸配列と異種、外因性、もしくはオルソロガス核酸配列との置換え、ドメインスワップ、エクソンスワップ、イントロンスワップ、調節配列スワップ、遺伝子スワップ、またはこれらの組合せを挙げることができる。例えば、少なくとも1、2、3、4、5、7、8、9、10またはそれを超えるヌクレオチドが、標的ゲノム改変を形成するために変化され得る。欠失、挿入、または置換えは、本明細書内の他の箇所に開示されるような任意のサイズのものであり得る。様々な方法が、標的遺伝子改変を生成するために使用され得る。例えば、Wang et al.(2013)Cell 153:910−918、Mandalos et al.(2012)PLOS ONE 7:e45768:1−9、及びWang et al.(2013)Nat Biotechnol.31:530−532を参照し、その各々の全体が、あらゆる目的のために参照によって本明細書に組み込まれる。
様々な方法が、欠失または挿入などの標的改変を有する細胞を同定するために使用され得る。このような方法は、標的遺伝子座に(例えば、第1及び第2CRISPR RNA認識配列間に)標的改変を有する1つの細胞を同定することを含み得る。スクリーニングは、改変ゲノム遺伝子座を有するこのような細胞を同定するために行われ得る。
上記方法及び組成物(例えば、細胞、胚)の動物としては、哺乳動物、魚類、及び鳥類を含む、任意の動物を挙げることができる。哺乳動物としては、例えば、ヒト、非ヒト哺乳動物、非ヒト霊長類(例えば、サル、マーモセット、アカゲザル、及び類人猿)、げっ歯類(例えば、マウス、ラット、ハムスター、及びモルモット)、家畜または農業哺乳動物(例えば、ヤギ、雄ウシ、シカ、バイソン、ウマなどのウマ種、ウシ及び去勢ウシなどのウシ種、ヒツジなどのヒツジ種、ならびにブタ及び雄ブタなどのブタ種)、ならびに馴化哺乳動物(例えば、ネコ、イヌ、ウサギ、及びフェレット)が挙げられる。鳥類としては、例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、ダチョウ、ガチョウ、及びアヒルが挙げられる。非ヒト動物は、ヒト以外の任意の動物であり得る。例えば、非ヒト動物は、非ヒト哺乳動物、げっ歯類、マウス、ラット、ハムスター、サル、農業哺乳動物、馴化哺乳動物、魚類、または鳥類であり得る。
細胞またはクローンが化合物の存在下で培養される場合、動物XY多能性または全能性細胞またはクローンに対して雌化活性を有する(すなわち、細胞またはクローンがF0世代において繁殖可能な表現型的に雌のXY動物を生成する傾向を高める)化合物についてスクリーニングするための方法及び組成物が提供される。動物XY多能性または全能性細胞クローンがF0世代において繁殖可能な表現型的に雌のXY動物を生成する傾向は、これらのクローンにおけるDdx3y、Uty、及びEif2s3yの発現または活性と逆相関する。動物XY多能性または全能性細胞(例えば、XY ES細胞)におけるこれらの遺伝子のうち1つ以上の発現喪失は、どの細胞クローンがF0世代においてXY雌動物を生成することになるかを予測し得る:観察されるDdx3y、Uty、及びEif2s3yのサイレンシングが強くなるほど、XY ES細胞クローンがF0世代において繁殖可能な表現型的に雌のXY動物を生成する傾向がますます高くなる(例えば、実施例3を参照のこと)。同様に、動物XY多能性または全能性細胞(例えば、XY ES細胞)におけるこれらの遺伝子のうち1つ以上の活性喪失または発現及び/もしくは活性の減少は、どの細胞クローンがF0世代においてXY雌動物を生成することになるかを予測し得る:観察されるDdx3y、Uty、及びEif2s3yの発現が低下するほど、XY ES細胞クローンがF0世代において繁殖可能な表現型的に雌のXY動物を生成する傾向がますます高くなる(例えば、実施例3を参照のこと)。言い換えれば、これらの遺伝子のうち1つ以上の発現及び/または活性は、XY雌生成を予測するための代理マーカーであり得る。
動物XY多能性または全能性細胞またはクローンに対する雌化活性増加(すなわち、細胞またはクローンがF0世代において繁殖可能な表現型的に雌のXY動物を生成する傾向の増加)のために、雌化培地中で成分の濃度を最適化するための方法及び組成物が提供される。動物XY多能性または全能性細胞クローンがF0世代において繁殖可能な表現型的に雌のXY動物を生成する傾向は、これらのクローンにおけるDdx3y、Uty、及びEif2s3yの発現または活性と逆相関する。動物XY多能性または全能性細胞(例えば、XY ES細胞)におけるこれらの遺伝子のうち1つ以上の発現喪失は、どの細胞クローンがF0世代においてXY雌動物を生成することになるかを予測し得る:観察されるDdx3y、Uty、及びEif2s3yのサイレンシングが強くなるほど、XY ES細胞クローンがF0世代において繁殖可能な表現型的に雌のXY動物を生成する傾向がますます高くなる(例えば、実施例3を参照のこと)。同様に、動物XY多能性または全能性細胞(例えば、XY ES細胞)におけるこれらの遺伝子のうち1つ以上の活性喪失または発現及び/もしくは活性の減少は、どの細胞クローンがF0世代においてXY雌動物を生成することになるかを予測し得る:観察されるDdx3y、Uty、及びEif2s3yの発現が低下するほど、XY ES細胞クローンがF0世代において繁殖可能な表現型的に雌のXY動物を生成する傾向がますます高くなる(例えば、実施例3を参照のこと)。言い換えれば、これらの遺伝子のうち1つ以上の発現及び/または活性は、XY雌生成を予測するための代理マーカーであり得る。
本明細書内の他の箇所に開示されるような雌化培地(例えば、低オスモル濃度培地)中でXY多能性または全能性動物細胞を維持することによって、XY多能性もしくは全能性動物細胞(またはインビトロ細胞培養物、胚、もしくはそれらに由来する動物)におけるY染色体の領域をサイレンシングするための方法及び組成物ならびにY染色体の領域におけるサイレンシングを同定するためにXY多能性または全能性細胞をアッセイするための方法及び組成物もまた提供される。このような方法は、例えば、標的改変が遺伝子の発現を低減または排除するために使用されることになる状況(例えば、遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を阻害するためのノックアウト)に用途を見出し得る。雌化培地での培養によるサイレンシングに要する時間は、特異的標的改変の生成よりもはるかに短いため、サイレンシングを達成することがより効率的な手段である。
添付の配列表に列挙されるヌクレオチド及びアミノ酸配列は、ヌクレオチド塩基の標準文字略号、及びアミノ酸の3文字コードを使用して示される。ヌクレオチド配列は、配列の5’末端で始まり、3’末端へと進む(すなわち、各ラインの左から右へ)という標準規則に従う。各ヌクレオチド配列の1本鎖のみが示されているが、表示された鎖の任意の参照によって、相補鎖が含まれると理解される。アミノ酸配列は、配列のアミノ末端で始まり、カルボキシ末端へと進む(すなわち、各ラインの左から右へ)という標準規則に従う。
材料及び方法
ES細胞培養。本明細書に記載される全ての結果は、VGF1、すなわち、発明者らのC57BL6NTac/129S6SvEv F1ハイブリッドXY ES細胞株を用いて実施された実験からの結果であった(Poueymirou et al.(2007)Nat.Biotechnol.25:91−99、Valenzuela et al.(2003)Nat.Biotechnol.21:652−659)。ES細胞を、以前に記載された通りに培養した(Matise et al.(2000)Production of targeted embryonic stem cell clones.In:Joyner AL(ed)Gene targeting:a practical approach.Oxford University press,New York,pp101−132)。表3に示したNaHCO3濃度を有する特注の高グルコースDMEM培地(LifeTech)に、0.1mMの非必須アミノ酸、1mMのピルビン酸ナトリウム、0.1mMの2−メルカプトエタノール、4mMのL−グルタミン、100U/mlのペニシリン及び100μg/mlのストレプトマイシン(Life Technologies)、15%FBS(Hyclone)、ならびに2,000U/mlの白血病抑制因子(LIF、Millipore)を補充した。培地のオスモル濃度を、単一試料用浸透圧計(Advanced Instruments,Inc.モデル3250)で測定した。エレクトロポレーション法では、発明者らは、120μlのエレクトロポレーション緩衝液(Millipore)中に溶解させた1.5μgの標的化ベクターDNAを、7.5×106ES細胞と混合して、BTX多層エレクトロポレーションプレート(Harvard Apparatus)に移した。エレクトロポレーション後、細胞を氷上で10分間インキュベートして、その後2つの15cmゼラチン化ディッシュ上に播種した。選択培地を、エレクトロポレーションから48時間後に添加し、それ以降毎日取り替えた。コロニーを、エレクトロポレーションから10日後に選定して、トリプシンを含有する96ウェルプレートの個々のウェルに移し、その後、細胞をゼラチン化96ウェルプレート中に播種した。3日後、細胞を再度トリプシン処理して、3分の2の各ウェルの内容物を凍結し、残存する3分の1をDNA抽出のために新しいプレートに移した。
交配試験及び表現型決定試験の両方についてVELOCIMICE(登録商標)の収率を最適化するために、発明者らは、遺伝子標的化実験中に、及び8細胞胚注入前に様々なES細胞培養培地を試験した。発明者らが評価した1つの成分は、Knockout(商標)DMEM(KO−DMEM、Life Technologies)として既知の基本培地であった。当初、KO−DMEMを用いて調製した培地中で成長させたES細胞では、標準的なDMEM(ダルベッコ改変イーグル培地)を用いて作製した培地中で維持した細胞と比較して、発明者らが、より少ない雄VELOCIMICE(登録商標)を得たという点で良い結果にならなかったと思われた。しかし、発明者らは、雌VELOCIMICE(登録商標)の大幅な増加も観察した:34の異なる遺伝子についての標的化実験から得られた78のクローン注入から生成したVELOCIMICE(登録商標)の31%が、雌であった(表3、KO−DMEM)。従来のDMEM培地中で成長させた500を超える標的ES細胞クローンの注入に関する、発明者らのマウス生成データベースで記録した結果の後ろ向き比較によって、全てのVELOCIMICE(登録商標)において1%のみが、雌であると同定されたことが明らかとなった(表3、DMEM)。稀な雌VELOCIMICE(登録商標)は、交配させなかったため、さらに調査しなかった。KO−DMEM培地中で成長させたXY ES細胞クローンからの雌の高発生率にもかかわらず、この実験からの雄と雌のVELOCIMICE(登録商標)における18%全収率は、DMEM培地中で誘導したクローンを用いた発明者らの過去の経験と同一であった(表3、KO−DMEM及びDMEM)。
不和合性の遺伝的背景(Eicher et al.(1982)Science 217:535−537、Taketo−Hosotani et al.(1989)Development 107:95−105)または性決定に必要な遺伝子の変異(Bagheri−Fam et al.(2008)Dev.Biol.314:71−83、Barrionuevo et al.(2006)Biol.Reprod.74:195−201、Bogani et al.(2009)PLoS Biol 7:e1000196、Chaboissier et al.(2004)Development 131:1891−1901、Colvin et al.(2001)Cell 104:875−889、Gierl et al.(2012)Dev.Cell 23:1032−1042、Hammes et al.(2001)Cell 106:319−329、Katoh−Fukui et al.(1998)Nature 393:688−692、Meeks et al.(2003)Nat.Genet.34:32−33、Tevosian et al.(2002)Development 129:4627−4634、Warr et al.(2012)Dev.Cell 23:1020−1031)によって引き起こされるものであろうと、マウスの雄から雌への性転換は、ほぼ常に不妊症を伴う。主要な雄の性決定遺伝子であるSryに変異を持つ一部のXY雌は、繁殖可能であるが、小さく稀な同腹仔及び短い生殖寿命を有する(Lovell−Badge and Robertson(1990)Development 109:635−646)。最近では、類似した低繁殖力及び妊孕力が、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)での指向性標的化によって生成されたSryの41塩基対(bp)欠失を持つXY雌マウスについて報告された(Wang et al.(2013)Nat.Biotechnol.31:530−532)。TALEN誘導Sry変異の別の例では、2bp欠失を持つ1匹のXY雌マウスが生殖不能であることが見出された(Kato et al.(2013)Sci.Rep.3:3136)。
胚を発達段階の性交後日数(dpc)11.5日で切離し、タイラーステージ診断を使用してそれらのおよその段階を決定した。妊娠期間が同腹仔内で大幅に変動するため、個々の胚についてのより正確なステージ診断を、後肢芽の後方から尾部の末端まで尾体節(ts)数を計数することにより達成した。この技術を使用して、8尾体節を有する胚は、10.5dpcであり、18尾体節は11.5dpcであり、30尾体節は12.5dpcである(Hacker,Capel,Goodfellow and Lovell−Badge,Devel 1995から)。
表11は、VGF1 ES細胞株における遺伝子標的化によるXY ES細胞クローンが、8細胞胚へのXY ES細胞クローンのマイクロインジェクション後に雌VELOCIMICE(登録商標)を生成する傾向を示す。全てのクローンを、標的化及びマイクロインジェクションプロセス全体を通して、KO−DMEMに基づく培地中で維持し、培養した。クローンのこの試料から、XY雌VELOCIMICE(登録商標)を生成する能力がクローン特異的であり、0〜60%の範囲であることは明らかである。これらの結果は、複数回のマイクロインジェクション実験で再現可能であった:雌を生成しなかったクローンが、反復マイクロインジェクションにおいてこの形質を維持したのに対して、雌を生じたクローンは、反復マイクロインジェクション実験においておよそ同じ比率の雌を生じる傾向があった。効果を、DMEMに基づく培地中でクローンを再成長させることによって反転できなかった。ES細胞を、標的化プロセス全体、すなわち、エレクトロポレーション、薬物耐性コロニーの選択、標的変異についてのスクリーニング、増殖、及び凍結保存において、DMEMに基づく培地またはKO−DMEMに基づく培地のいずれかで成長させて維持した遺伝子標的化実験からのES細胞クローンを解凍し、8細胞胚へのマイクロインジェクションに備えて3日間、反対の培地中で成長させた。DMEMに基づく培地中で誘導したクローンは、低頻度の雌VELOCIMICE(登録商標)生成を維持し、これは、KO−DMEMへの短時間曝露で増加し得なかった。同様に、KO−DMEMに基づく培地中で誘導したクローンは、より高頻度の雌VELOCIMICE(登録商標)を生成し、DMEMへの短時間曝露によって、雌を生成するXYクローンの傾向が低減することはなかった。
SryのlacZ置換対立遺伝子を含む標的欠失を、Sry開始コドンとインフレームで融合したlacZならびに38及び37kbの相同腕に隣接し、bMQライブラリー(129S7/SvEv Brd−Hprt b−m2)からのBACに基づくネオマイシン耐性遺伝子を含む挿入カセットを含む大きな標的化ベクター(LTVEC)を用いて作製した。LTVEC(NIH KOMPプロジェクトVG12778 LTVEC(URL“velocigene.com/komp/detail/12778”のWorld Wide Web(www)上でインターネットによって入手可能)を参照のこと)は、その相同腕において、Sry発現に関する全ての既知の制御エレメントを含む。そのlacZコードベータ−ガラクトシダーゼは、Sry遺伝子の組織特異的かつ発達段階特異的発現のレポーターとして機能する。標的化ベクターを用いたSry遺伝子の正確な標的化によって作製した対立遺伝子は、Sryコード配列の欠失及び挿入カセットによる置換を含む。標的化ベクターを使用して、VGB6(B6A6としても知られる)C57BL/6及びVGF1(F1H4としても知られる)C57BL6/129 F1ハイブリッドES細胞株の両方でSry遺伝子を標的とした。VGF1(F1H4)マウスES細胞は、雌C57BL/6NTacマウスを雄129S6/SvEvTacマウスと交雑させることによって生成したハイブリッド胚に由来した。したがって、VGF1 ES細胞は、129S6/SvEvTacマウスからのY染色体を含有する。VGF1細胞株から生成した雌XYマウスは、129S6/SvEvTacマウスに由来するY染色体を含有する。
どのY染色体遺伝子がマウス胚性幹(ES)細胞中で発現されて、性転換マーカーの候補であり得るのかを決定するために、RNA−seq分析をF1H4 ES細胞で行った。表15に示す通り、Eif2s3y、Ddx3y、Erdr1、Kdm5d、Uty、Ube1y1、Zfy1、Zfy2、Rbmy1a1、Sly、Usp9y、LOC100041346は、F1H4 ES細胞において検出可能な発現レベルを有する。Sryは、F1H4 ES細胞中で検出可能な発現レベルを有しなかった。
Claims (46)
- 非ヒト哺乳動物XY胚性幹(ES)細胞における雌化活性を持つ標的化合物のスクリーニング方法であって、
(a)非ヒト哺乳動物XY ES細胞の第1集団及び第2集団を、前記非ヒト哺乳動物XY ES細胞の多能性を維持するのに好適な基本培地及び添加物を含む培地中で培養し、前記第1集団が、標的化合物の存在下で培養され、前記第2集団が、前記標的化合物の不存在下で培養されることと、
(b)Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち1つ以上の発現及び/または活性について、非ヒト哺乳動物XY ES細胞の前記第1及び第2集団の各々で前記非ヒト哺乳動物XY ES細胞のうち1種以上をアッセイし、それによって雌化活性が、前記第2集団からの前記1種以上の非ヒト哺乳動物XY ES細胞と比較して、前記第1集団からの前記1種以上の非ヒト哺乳動物XY ES細胞におけるDdx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上の前記発現及び/または活性の減少によって同定されることと、
とを含み、前記雌化活性は、F0世代において繁殖可能な表現型的に雌のXY非ヒト哺乳動物を生成する比率が増加した、非ヒト哺乳動物XY ES細胞をもたらす、前記方法。 - (c)Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上の前記発現及び/または活性に基づいて、F0世代において繁殖可能な表現型的に雌のXY非ヒト哺乳動物を生成するために、前記第1集団からドナー非ヒト哺乳動物XY ES細胞を選択し、前記F0世代における前記繁殖可能な表現型的に雌のXY非ヒト哺乳動物の比率が、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上の前記発現及び/または活性に逆相関すること、をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- (d)前記ドナー非ヒト哺乳動物XY ES細胞を宿主胚に導入することと、
(e)ステップ(d)の前記宿主胚をレシピエント雌非ヒト哺乳動物に導入して、前記宿主胚を懐胎させることと、
(f)表現型的に雌のXY非ヒト哺乳動物を含むF0 XY非ヒト哺乳動物子孫を得て、性成熟に達すると、前記F0の表現型的に雌のXY非ヒト哺乳動物が繁殖可能かつ妊孕可能になること
とをさらに含む、請求項2に記載の方法。 - 前記標的化合物の不存在下で、ステップ(a)の前記培地が、前記非ヒト哺乳動物XY ES細胞の前記多能性を維持するのに十分であるが、繁殖可能な雌子孫を生じる前記細胞の能力を変化させない、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記雌化活性が、前記第2集団からの前記1種以上の非ヒト哺乳動物XY ES細胞と比較して、前記第1集団からの前記1種以上の非ヒト哺乳動物XY ES細胞における、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yの前記発現及び/または活性の減少によってステップ(b)で同定される、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- ステップ(b)の前記アッセイによって、mRNAレベルでDdx3y、Uty、及びEif2s3yのうち1つ以上の発現が検出される、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1集団からの前記1種以上の非ヒト哺乳動物XY ES細胞における、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上のmRNA発現が、前記第2集団からの前記1種以上の非ヒト哺乳動物XY ES細胞における、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上のmRNA発現より少なくとも90%低い場合に、雌化活性が同定される、請求項6に記載の方法。
- 前記第1集団からの前記1種以上の非ヒト哺乳動物XY ES細胞における、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのmRNA発現が、前記第2集団からの前記1種以上の非ヒト哺乳動物XY ES細胞における、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのmRNA発現より少なくとも90%低い場合に、雌化活性が同定される、請求項7に記載の方法。
- 前記雌化活性が、前記第1集団からの前記1種以上の非ヒト哺乳動物XY ES細胞における、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上の発現及び/または活性の欠如によってステップ(b)で同定される、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記雌化活性が、前記第1集団からの前記1種以上の非ヒト哺乳動物XY ES細胞における、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yの発現及び/または活性の欠如によってステップ(b)で同定される、請求項9に記載の方法。
- 雌化培地における標的化合物の濃度の最適化方法であって、
(a)非ヒト哺乳動物XY胚性幹(ES)細胞の第1集団及び第2集団を、前記非ヒト哺乳動物XY ES細胞の多能性を維持するのに好適な基本培地及び添加物を含む培地中で培養し、
前記第1集団が、第1濃度の前記標的化合物の存在下で培養され、前記第2集団が、前記第1濃度とは異なる第2濃度の前記標的化合物の存在下で培養されることと、
(b)Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち1つ以上の発現及び/または活性について、非ヒト哺乳動物XY ES細胞の前記第1及び第2集団の各々で前記非ヒト哺乳動物XY ES細胞のうち1種以上をアッセイすることと、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上の前記発現及び/または活性が、前記第2集団からの前記1種以上の非ヒト哺乳動物XY ES細胞と比較して、前記第1集団からの前記1種以上の非ヒト哺乳動物XY ES細胞で減少する場合に、前記第1濃度を選択すること、とを含む、前記方法。 - (c)Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上の前記発現及び/または活性に基づいて、F0世代において繁殖可能な表現型的に雌のXY非ヒト哺乳動物を生成するために、前記第1集団からドナー非ヒト哺乳動物XY ES細胞を選択し、前記F0世代における前記繁殖可能な表現型的に雌のXY非ヒト哺乳動物の比率が、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上の前記発現及び/または活性に逆相関すること、をさらに含む、請求項11に記載の方法。
- (d)前記ドナー非ヒト哺乳動物XY ES細胞を宿主胚に導入することと、
(e)ステップ(d)の前記宿主胚をレシピエント雌非ヒト哺乳動物に導入して、前記宿主胚を懐胎させることと、
(f)表現型的に雌のXY非ヒト哺乳動物を含むF0 XY非ヒト哺乳動物子孫を得て、性成熟に達すると、前記F0の表現型的に雌のXY非ヒト哺乳動物が繁殖可能かつ妊孕可能になること
とをさらに含む、請求項12に記載の方法。 - 前記第1集団からの前記1種以上の非ヒト哺乳動物XY ES細胞が、前記第2集団からの前記1種以上の非ヒト哺乳動物XY ES細胞と比較して、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yの減少した発現及び/または活性を有する場合に、前記第1濃度がステップ(b)で選択される、請求項11〜13のいずれか1項に記載の方法。
- ステップ(b)の前記アッセイによって、mRNAレベルでDdx3y、Uty、及びEif2s3yのうち1つ以上の発現が検出される、請求項11〜14のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1集団からの前記1種以上の非ヒト哺乳動物XY ES細胞における、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上のmRNA発現が、前記第2集団からの前記1種以上の非ヒト哺乳動物XY ES細胞における、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上のmRNA発現より少なくとも90%低い場合に、前記第1の濃度が選択される、請求項15に記載の方法。
- 前記第1集団からの前記1種以上の非ヒト哺乳動物XY ES細胞における、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのmRNA発現が、前記第2集団からの前記1種以上の非ヒト哺乳動物XY ES細胞における、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのmRNA発現より少なくとも90%低い場合に、前記第1の濃度が選択される、請求項16に記載の方法。
- 前記第1集団からの前記1種以上の非ヒト哺乳動物XY ES細胞が、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上の発現及び/または活性を欠いている場合に、前記第1濃度がステップ(b)で選択される、請求項11〜17のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1集団からの前記1種以上の非ヒト哺乳動物XY ES細胞が、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yの発現及び/または活性を欠いている場合に、前記第1濃度がステップ(b)で選択される、請求項18に記載の方法。
- 前記第1集団が、アッセイステップ(b)の前に少なくとも1日間、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間、10日間、11日間、12日間、13日間、2週間、3週間、または4週間の間、前記標的化合物の存在下で培養される、請求項1〜19のいずれか1項に記載の方法。
- (I)ステップ(c)の前記ドナー非ヒト哺乳動物XY ES細胞が、対照非ヒト哺乳動物XY ES細胞、すなわち、前記対照非ヒト哺乳動物XY ES細胞の前記多能性を維持するのに十分であるが、繁殖可能な雌子孫を生じる前記細胞の能力を変化させない培地中で培養された前記細胞と比較して、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上の減少した発現及び/または活性を有するか、もしくは、ステップ(c)の前記ドナー非ヒト哺乳動物XY ES細胞が、前記対照非ヒト哺乳動物XY ES細胞と比較して、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yの減少した発現及び/または活性を有するか、または
(II)ステップ(c)の前記ドナー非ヒト哺乳動物XY ES細胞が、前記第2集団からの対照非ヒト哺乳動物XY ES細胞と比較して、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上の減少した発現及び/または活性を有するか、もしくは、ステップ(c)の前記ドナー非ヒト哺乳動物XY ES細胞が、前記対照非ヒト哺乳動物XY ES細胞と比較して、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yの減少した発現及び/または活性を有する、請求項2〜10および12〜20のいずれか1項に記載の方法。 - 前記第1集団及び前記第2集団が、同じ細胞株または同じクローンに由来するか、または同じ遺伝子型を有する、請求項1〜21のいずれか1項に記載の方法。
- 前記基本培地がDMEMまたはKO−DMEMである、請求項1〜22のいずれか1項に記載の方法。
- ドナー非ヒト哺乳動物XY胚性幹(ES)細胞の作製方法であって、
(a)非ヒト哺乳動物XY ES細胞の集団を、前記非ヒト哺乳動物XY ES細胞の多能性を維持するのに好適な基本培地及び添加物を含む低オスモル濃度培地中で培養し、前記低オスモル濃度培地が、約218mOsm/kg〜約322mOsm/kg未満のオスモル濃度を有し、前記基本培地が、塩化ナトリウムを約50mM〜約110mMの濃度で、及び重炭酸ナトリウムを約18mM〜約44mMの濃度で含むことと、
(b)Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち1つ以上の発現及び/または活性について、非ヒト哺乳動物XY ES細胞の前記集団において前記非ヒト哺乳動物XY ES細胞のうち1種以上をアッセイすることと、
(c)Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上の前記発現及び/または活性に基づいて、F0世代において繁殖可能な表現型的に雌のXY非ヒト哺乳動物を生成するためにドナー非ヒト哺乳動物XY ES細胞を選択し、前記F0世代における前記繁殖可能な表現型的に雌のXY非ヒト哺乳動物の比率が、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上の前記発現及び/または活性に逆相関すること
とを含む、前記方法。 - (d)前記ドナー非ヒト哺乳動物XY ES細胞を宿主胚に導入することと、
(e)ステップ(d)の前記宿主胚をレシピエント雌非ヒト哺乳動物に導入して、前記宿主胚を懐胎させることと、
(f)表現型的に雌のXY非ヒト哺乳動物を含むF0 XY非ヒト哺乳動物子孫を得て、性成熟に達すると、前記F0の表現型的に雌のXY非ヒト哺乳動物が繁殖可能かつ妊孕可能になること
とをさらに含む、請求項24に記載の方法。 - 前記非ヒト哺乳動物XY ES細胞が、アッセイステップ(b)の前に少なくとも1日間、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間、10日間、11日間、12日間、13日間、2週間、3週間、または4週間の間、前記低オスモル濃度培地中で培養される、請求項24または25に記載の方法。
- ステップ(c)の前記ドナー非ヒト哺乳動物XY ES細胞が、対照非ヒト哺乳動物XY ES細胞、すなわち、前記対照非ヒト哺乳動物XY ES細胞の前記多能性を維持するのに十分であるが、繁殖可能な雌子孫を生じる前記細胞の能力を変化させない培地中で培養された前記細胞と比較して、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上の減少した発現及び/または活性を有するか、または、ステップ(c)の前記ドナー非ヒト哺乳動物XY ES細胞が、前記対照非ヒト哺乳動物XY ES細胞と比較して、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yの減少した発現及び/または活性を有する、請求項24〜26のいずれか1項に記載の方法。
- ステップ(b)の前記アッセイによって、mRNAレベルでDdx3y、Uty、及びEif2s3yのうち1つ以上の発現が検出され、前記ドナー非ヒト哺乳動物XY ES細胞における、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上のmRNA発現が、前記対照非ヒト哺乳動物XY ES細胞における、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上のmRNA発現より少なくとも90%低い場合に、前記ドナー非ヒト哺乳動物XY ES細胞がステップ(c)で選択される、請求項27に記載の方法。
- ステップ(b)の前記アッセイによって、mRNAレベルでDdx3y、Uty、及びEif2s3yの発現が検出され、前記ドナー非ヒト哺乳動物XY ES細胞における、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのmRNA発現が、前記対照非ヒト哺乳動物XY ES細胞における、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのmRNA発現より少なくとも90%低い場合に、前記ドナー非ヒト哺乳動物XY ES細胞がステップ(c)で選択される、請求項28に記載の方法。
- 前記基本培地がDMEMまたはKO−DMEMである、請求項24〜29のいずれか1項に記載の方法。
- ステップ(a)の前記培地が、約218mOsm/kg〜約322mOsm/kg未満のオスモル濃度を有する低オスモル濃度培地であり、前記基本培地が、塩化ナトリウムを約50mM〜約110mMの濃度で、及び重炭酸ナトリウムを約18mM〜約44mMの濃度で含む、請求項1〜23のいずれか1項に記載の方法。
- 前記低オスモル濃度培地が、以下の特性:
(I)前記低オスモル濃度培地が、218mOsm/kgのオスモル濃度を有すること、
(II)前記低オスモル濃度培地が、約11mS/cm〜約13mS/cmの伝導度を有すること、
(III)前記基本培地が、約85mM〜約130mMのアルカリ金属ハロゲン化物塩及び炭酸塩の総濃度を有すること、
(IV)前記基本培地が、塩化ナトリウムを87±5mMの濃度で含み、前記低オスモル濃度培地が、261±26mOsm/kgのオスモル濃度を有すること、ならびに
(V)前記基本培地が、塩化ナトリウムを約3mg/mLの濃度で、及び重炭酸ナトリウムを約2.2mg/mLの濃度で含み、前記低オスモル濃度培地が、約216mOsm/kgのオスモル濃度を有すること
のうち1つ以上を有する、請求項24〜31のいずれか1項に記載の方法。 - ステップ(b)の前記アッセイによって、タンパク質レベルでDdx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上の発現が検出される、請求項1〜32のいずれか1項に記載の方法。
- ステップ(b)が、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち1つ以上の発現及び/または活性について、前記第1集団における少なくとも2種の前記非ヒト哺乳動物XY ES細胞をアッセイすることを含み、ステップ(c)が、前記ドナー非ヒト哺乳動物XY ES細胞として、他方のアッセイした細胞と比較して、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上の最も低い発現及び/または活性を有するステップ(b)の前記アッセイした細胞を選択することを含む、請求項2〜10および12〜33のいずれか1項に記載の方法。
- ステップ(c)の前記ドナー非ヒト哺乳動物XY ES細胞が、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上の発現及び/または活性を欠いている、請求項2〜10および12〜34のいずれか1項に記載の方法。
- ステップ(c)の前記ドナー非ヒト哺乳動物XY ES細胞が、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yの発現及び/または活性を欠いている、請求項35に記載の方法。
- 前記非ヒト哺乳動物が、げっ歯類である、請求項1〜36のいずれか1項に記載の方法。
- 前記げっ歯類がラットまたはマウスである、請求項37に記載の方法。
- 前記げっ歯類がマウスである、請求項37に記載の方法。
- 前記ES細胞が、VGF1マウスES細胞である、請求項39に記載の方法。
- 前記げっ歯類がC57BL/6系統を含むか、C57BL/6系統、129系統、もしくはBALB/c系統からのY染色体を含むか、または、C57BL/6系統及び129系統の混合物を含むマウスである、請求項37に記載の方法。
- 前記非ヒト哺乳動物XY ES細胞が、標的ゲノム遺伝子座に標的遺伝子改変を含む、請求項1〜41のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標的遺伝子改変が、挿入、欠失、ノックアウト、ノックイン、点変異、またはこれらの組合せを含む、請求項42に記載の方法。
- 前記非ヒト哺乳動物XY ES細胞がマウスXY ES細胞であり、
前記第1集団及び前記第2集団が、同じ細胞株または同じクローンに由来するか、または同じ遺伝子型を有し、
ステップ(b)の前記アッセイによって、mRNAレベルでDdx3y、Uty、及びEif2s3yの発現が検出され、
前記第1集団からの1種以上のマウスXY ES細胞における、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのmRNA発現が、前記第2集団からの1種以上のマウスXY ES細胞における、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのmRNA発現より少なくとも90%低い場合に、雌化活性が同定される、
請求項1に記載の方法。 - 前記非ヒト哺乳動物XY ES細胞がマウスXY ES細胞であり、
前記第1集団及び前記第2集団が、同じ細胞株または同じクローンに由来するか、または同じ遺伝子型を有し、
ステップ(b)の前記アッセイによって、mRNAレベルでDdx3y、Uty、及びEif2s3yの発現が検出され、
前記第1集団からの1種以上のマウスXY ES細胞における、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのmRNA発現が、前記第2集団からの1種以上のマウスXY ES細胞における、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのmRNA発現より少なくとも90%低い場合に、前記第1の濃度が選択される、
請求項11に記載の方法。 - 前記非ヒト哺乳動物XY ES細胞がマウスXY ES細胞であり、
ステップ(b)の前記アッセイによって、mRNAレベルでDdx3y、Uty、及びEif2s3yの発現が検出され、
前記ドナー非ヒト哺乳動物XY ES細胞における、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのmRNA発現が、前記対照非ヒト哺乳動物XY ES細胞における、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのmRNA発現より少なくとも90%低い場合に、前記ドナー非ヒト哺乳動物XY ES細胞がステップ(c)で選択される、
請求項24に記載の方法。
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