CN108998540A - 绵羊eif2s3y基因的单核苷酸多态性标记及其检测引物、试剂盒、方法及应用 - Google Patents

绵羊eif2s3y基因的单核苷酸多态性标记及其检测引物、试剂盒、方法及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN108998540A
CN108998540A CN201810943879.1A CN201810943879A CN108998540A CN 108998540 A CN108998540 A CN 108998540A CN 201810943879 A CN201810943879 A CN 201810943879A CN 108998540 A CN108998540 A CN 108998540A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sheep
eif2s3y
primer
gene
single nucleotide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201810943879.1A
Other languages
English (en)
Inventor
乐祥鹏
曹学涛
李发弟
李万宏
秦芳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Lanzhou University
Original Assignee
Lanzhou University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lanzhou University filed Critical Lanzhou University
Priority to CN201810943879.1A priority Critical patent/CN108998540A/zh
Publication of CN108998540A publication Critical patent/CN108998540A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/124—Animal traits, i.e. production traits, including athletic performance or the like
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供一种绵羊EIF2S3Y基因的单核苷酸多态性标记及其检测引物、试剂盒、方法及应用。该标记是绵羊EIF2S3Y基因片段第61位的G或C的单核苷酸多态性。检测引物包括正向引物和反向引物，分别为如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。检测方法包括：提取待测公绵羊全基因组DNA；以待测公绵羊全基因组DNA为模板，以母羊DNA为阴性对照，以水为空白对照，利用检测引物进行PCR扩增绵羊EIF2S3Y基因；用限制性内切酶AciI消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据电泳结果鉴定绵羊EIF2S3Y基因上单核苷酸多态性位点的基因型。

Description

绵羊EIF2S3Y基因的单核苷酸多态性标记及其检测引物、试剂 盒、方法及应用
技术领域
本发明属于分子遗传学技术领域，具体涉及一种绵羊EIF2S3Y基因的单核苷酸多态性标记及其检测引物、试剂盒、方法及应用。
背景技术
在绵羊育种中，人们期望通过DNA标记对表型性状进行选择，达到早期选种和提高育种值准确性的目的，从而在畜禽育种中获得更大的遗传进展。
哺乳动物的性染色体(X和Y染色体)，由一对原始常染色体进化而来。Y染色体的大小约占单倍体基因组总大小的2％，Y染色体分为两个区域，一个是位于Y染色体短臂末端的区域被称为拟常染色体区(PAR)，约占Y染色体长度的5％，另外的全部区域为Y染色体雄性特异区域(MSY)，即Y染色体非重组区，约占Y染色体的95％，横跨Y染色体的长臂和短臂。
MSY区一般又可进一步细分为X退化区和Y扩增区。X退化区由单拷贝基因组成，它们虽然在减数分裂过程中不与X染色体发生重组，但是却与X染色体上的同源基因具有较高的同源性。在对该区域进行SNPs分析的难点在于如何设计雄性特异性引物，即只能扩增出Y染色体序列，而不能扩增出X染色体序列。由于尚没有人对绵羊Y染色体进行测序，进而加大了分子标记筛选的难度。正是由于上述原因，关于绵羊Y染色体研究比较少，筛选到的SNPs则少之甚少。Y扩增区序列结构非常复杂，包含有大量的重复序列和回文结构，导致序列组装极为困难，这就使得Y染色体难以进行测序和系统化研究，因而多数基因组测序计划都将Y染色体排除在外。
EIF2S3Y基因是绵羊Y染色体X退化区的一个单拷贝基因，是eIF-2家族成员eIF-2γ的编码基因。eIF-2蛋白由3个亚基组成，即eIF-2α、eIF-2β和eIF-2γ，它们形成eIF-2后与甲酰甲硫氨酸-转运RNA(Met-tRNA)以及三磷酸鸟苷(Guanosine triphosphate，GTP)结合为三聚体，从而行使其转录起始的功能。Eif2s3y基因在小鼠体内的多种组织和器官中都有广泛的表达，在多种物种中表达保守；EIF2S3Y基因和EIF2S3X基因的核苷酸序列具有86％的同源性，而编码的氨基酸序列的同源性则高达98％。
在小鼠和人的实验中，EIF2S3Y基因的缺失将导致早期精子发生过程的失败并引起不育症。研究发现，如果抑制Y染色体上相关基因的表达，精原细胞的增殖将被阻滞，之后的减数分裂过程和分裂后的精子发生过程也将随之消失。研究者利用转基因技术加入单独的Y染色体上的各个基因，最终发现EIF2S3Y基因的重新引入将促使精原细胞进行分裂增殖并进一步发生减数分裂，表明了EIF2S3Y基因在精原细胞增殖中的重要作用。EIF2S3Y基因的存在对小鼠性腺的发育是必需的。
关于绵羊EIF2S3Y基因序列扩增和SNPs筛选的研究尚未见报道，对该基因特异性序列的扩增和SNPs筛选将有助于发现品种特异性SNPs和与公羊繁殖性状相关的分子标记，进而用于绵羊胚胎性别的早期鉴定、品种父系单倍型的构建和高繁殖力种公羊的早期筛选。
发明内容
针对现有技术存在的问题以及研究绵羊EIF2S3Y基因的重要意义，本发明提供绵羊EIF2S3Y基因的单核苷酸多态性标记及其检测引物、试剂盒、方法及应用。本发明的技术方案为：
第一个方面，本发明提供一种绵羊EIF2S3Y基因的单核苷酸多态性标记，所述标记是绵羊EIF2S3Y基因片段第61位的G或C的单核苷酸多态性。
第二个方面，本发明提供上述绵羊EIF2S3Y基因的单核苷酸多态性标记的检测引物，所述引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物和所述反向引物分别为如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
第三个方面，本发明提供上述绵羊EIF2S3Y基因的单核苷酸多态性标记的检测试剂盒，所述试剂盒包括上述检测引物。
第四个方面，本发明提供上述绵羊EIF2S3Y基因的单核苷酸多态性标记的检测方法，包括以下步骤：
1)提取待测公绵羊全基因组DNA；
2)以待测公绵羊全基因组DNA为模板，以母羊DNA为阴性对照，以水为空白对照，利用检测引物进行PCR扩增绵羊EIF2S3Y基因，得到扩增产物，并于4℃保存；
3)用限制性内切酶AciI消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据电泳结果鉴定绵羊EIF2S3Y基因上单核苷酸多态性位点的基因型。
进一步地，所述利用检测引物进行PCR扩增绵羊EIF2S3Y基因的具体反应过程为：先配置反应体系： PCR SuperMix(TransGen Biotech)12.50μL，0.2μM的正向引物水溶液0.5μL，0.2μM的反向引物水溶液0.5μL，灭菌蒸馏水10.5μL，DNA模板50ng，以上体积总量为25μL；将反应体系进行PCR扩增，具体控制过程为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸50s，34个循环；72℃终延伸5min。
进一步地，所述琼脂糖凝胶电泳过程采用的琼脂糖凝胶的质量浓度为2.5％。
第五个方面，本发明提供上述绵羊EIF2S3Y基因的单核苷酸多态性标记在在绵羊辅助选择和分子育种中的应用。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明利用限制性片段长度多态性-聚合酶链反应(Restriction FragmentLength Polymorphism-Polymerase Chain Reaction，RFLP-PCR)方法对绵羊EIF2S3Y基因片段第61位C>G的突变进行分型，因为该位点位于绵羊EIF2S3Y基因内含子10，突变未引起氨基酸的改变，EIF2S3Y基因所编码蛋白的空间二、三级构型未发生变化。
(2)针对上述EIF2S3Y基因的SNP多态性，本发明的检测方法，通过设计特定的PCR引物扩增片段，能够用RFLP-PCR方法简单、快速、成本低、精确的检测其单核苷酸的多态性，而且所检测的序列位点无特殊性要求。
附图说明
图1是本发明实施例1的公绵羊血样基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图；其中，泳道1-4均为公绵羊基因组DNA；
图2是本发明实施例1的绵羊EIF2S3Y基因PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳；其中，1-3泳道为公羊DNA扩增产物(796bp)；4-6泳道为母羊DNA扩增产物；7-9泳道为灭菌水扩增产物；M为Marker；
图3是本发明实施例2的公绵羊EIF2S3Y基因PCR产物经AciI酶切后的琼脂糖凝胶电泳；其中，泳道1-3：CC基因型个体(735bp和61bp，其中61bp条带由于太小在琼脂糖电泳中不显示)；泳道4-6：GG基因型个体(796bp)；M：Marker(2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp)；
图4是本发明实施例1的公绵羊EIF2S3Y基因片段第61位的SNP的不同基因型测序峰图，其中图4a为公绵羊EIF2S3Y基因片段第61位GG基因型个体的测序结果；图4b为公绵羊EIF2S3Y基因片段第61位CC基因型个体的测序结果。
具体实施方式
在本发明的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
本发明具体实施例以EIF2S3Y基因片段序列设计引物扩增EIF2S3Y基因796bp片段，以公绵羊全基因组为模板，进行PCR扩增，扩增产物经测序后寻找该扩增片段的单核苷酸多态。
实施例1
公绵羊EIF2S3Y基因多态性的检测
1、绵羊血样的采集及处理
取绵羊血样5mL，加入0.5mol/L的EDTA 500μL抗凝，缓慢颠倒3次后放入冰盒，-80℃保存备用。
本实施例采用的绵羊品种，具体如表1所示。
表1绵羊样品信息
2、血样基因组DNA的提取
(1)冰冻的血样在室温水浴中融化；
(2)将1mL全血转入一个无菌的2mL离心管中；
(3)加入等体积(1mL)的PBS缓冲液，温和摇动15-20min；
(4)4℃12000g离心10min；
(5)用移液枪弃上清，重复步骤3、4至上清液透明，沉淀白色；
(6)离心管中加DNA提取液650-750μL，温和摇动使细胞沉淀悬浮；
(7)37℃水浴1h；
(8)加入蛋白酶K3μL(终浓度为60μg/mL)，混匀；
(9)在恒温水浴箱中55℃温育过夜(16h左右)，至细胞沉淀物被完全消化，溶液澄清；
(10)反应液冷却至室温，加入1倍体积(800μL-1mL)的Tris饱和酚，放置冰上温和摇动15min；
(11)4℃，12000g离心10min；
(12)将上层水相用移液枪移到另一灭菌离心管中；
(13)加入0.5倍体积(0.5mL)的酚和0.5倍(0.5mL)的氯仿，放置冰上温和摇动15min；
(14)4℃，12000g离心10min；
(15)将上层水相用移液枪移到另一灭菌离心管中；
(16)加入1倍体积(1mL)的氯仿，放置冰上温和摇动15min；
(17)4℃，12000g离心10min；
(18)将上层水相用移液枪移到另一灭菌离心管中；
(19)加入2倍体积的预冷无水乙醇(-20℃)，轻轻口底摇晃多次至DNA析出，然后-20℃放置30min；
(20)4℃，12000g离心10min；弃上清液
(21)加入70％乙醇1mL，温和摇动10min；
(22)4℃，12000g离心10min，弃乙醇，重复漂洗一次；
(23)真空干燥或室温下使乙醇挥发干净；
(24)根据DNA的量，加入超纯水100-300μL，4℃保存至DNA完全溶解，分光光度计测定浓度后，-80℃保存。
3、DNA池的构建
(1)1％琼脂糖凝胶电泳检测
对DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测，选择DNA样品条带均一、无拖尾、无降解的样品进行DNA池的构建。
(2)OD值测定
用紫外光光度计测定DNA样品在260nm、280nm处的OD值。计算DNA含量和OD260/OD280的比值。如OD260/OD280比值小于1.6，说明样品中含有较多的蛋白质或酚，则应进行纯化；若比值大于1.8，则应该考虑去除RNA纯化。
DNA浓度(ng/μL)＝50×OD260值×稀释倍数
(3)品种DNA池的构建
DNA检测完毕后，每只羊DNA原液中取出一定的量稀释至50ng/μL，然后取10μL构建DNA池，每一个DNA池由10只不同绵羊的基因组DNA混合而成；
公绵羊血样基因组DNA的检测结果见图1，从图中可以看出公绵羊基因组DNA的质量非常高。
4、PCR扩增
以公绵羊DNA池为模版，以母羊DNA和水为对照，用设计的引物对P进行PCR扩增，PCR总反应体系为25μL(表2)，PCR总反应程序见表3。
表2 PCR反应体系
表3 PCR反应程序
5、PCR产物雄性特异性验证、纯化和测序
PCR扩增完成之后进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图2所示，可以清楚看到只有以公绵羊DNA为模板能扩增出PCR产物条带，且扩增产物长度与预期的796bp相符合，而以母绵羊和水为模板没有任何PCR产物，可以确定PCR产物为绵羊Y染色体基因片段；然后进行PCR产物的切胶回收及纯化：在紫外灯下从琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5mL离心管中，然后用PCR产物回收用的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根生化科技有限公司)纯化PCR产物，按照试剂盒说明书操作，具体步骤如下：
(1)首先向吸附柱中加入500μL平衡液，12000r/min离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
(2)将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下放入干净的离心管中，称取重量。
(3)向胶块中加入等体积溶液PC，60℃水浴放置10min左右，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。
(4)将上一步所得溶液加入一个吸附柱中，12000r/min离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。
(5)向吸附柱中加入700μL漂洗液，12000r/min离心1min，倒掉废液，将吸附柱重新放入收集管中。
(6)向吸附柱中加入500μL漂洗液，12000r/min离心1min，倒掉废液，将离心吸附柱放入收集管中，12000r/min离心2min，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温或50℃温箱数分钟，彻底晾干。
(7)将吸附柱放到一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量的洗脱缓冲液，室温放置2分钟。12000r/min离心1min收集DNA溶液。
(8)为了提高DNA的回收量，可将离心得到的溶液重新加回离心吸附柱中，重复步骤7。
把以公绵羊DNA池为模板的PCR纯化产物送上海生物工程有限公司进行双向测序。绵羊EIF2S3Y基因目的片段的测序结果如图4所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
对测序峰图进行分析，其中在同一位点有两个不同峰的是发生了单核苷酸突变；位于绵羊EIF2S3Y基因片段第61位出现了C和G两种检测结果，即为筛查到的绵羊EIF2S3Y基因SNP多态性，该位点是为C或G的碱基多态性。
实施例2
绵羊EIF2S3Y基因C>G突变多态性的RFLP-PCR检测
由于筛查到的碱基多态性为自然酶切位点，能被常用的内切酶进行PCR-RFLP鉴定。当绵羊EIF2S3Y基因片段第61位未发生C>G突变时，即为突变前C，利用引物对P扩增的EIF2S3Y基因序列CCGC/GGCG，为AciI的限制性内切酶识别位点；可直接通过AciI对目的片段的酶切进行基因分型。
1、RFLP-PCR引物
PCR扩增引物为上述验证为雄性特异性的引物P：
正向引物：5’-ACCTTGGCATTAGCATACC-3’19nt(SEQ IDNO.1)；
反向引物：5’-GGCAGTCTTCCTACATCAG-3’19nt(SEQ IDNO.2)。
该引物能够扩增绵羊EIF2S3Y基因796bp片段。
2、RFLP-PCR反应条件
PCR产物扩增体系和反应条件分别如表2和表3所述，PCR扩增产物的1％琼脂糖凝胶电泳图谱如图2所示，可以看到设计的引物对P能够扩增796bp的片段。
3、PCR扩增产物的AciI酶切
(1)酶切体系为：为AciI内切酶1μL，Buffer 5μL，ddH2O 15μL，4μL PCR扩增产物，总计25μL。
(2)酶切消化条件：37℃恒温培养箱中消化3-4h。
(3)AciI消化PCR产物后琼脂糖凝胶电泳分析
用1％的琼脂糖凝胶，140V电压电泳50min，核酸染料染色检测酶切结果，用UVP凝胶成像系统(GelDoc-It TS Imaging System)照相分析，并判型、记录其基因型；
由于PCR-RFLP扩增的796bp片段中包含其它的AciI酶切识别位点，当EIF2S3Y基因片段第61位不发生C>G突变时，PCR扩增的EIF2S3Y基因产物被限制性内切酶AciI识别后，在CCGC/GGCG对扩增片段酶切，将扩增片段切为2段；而当EIF2S3Y基因片段第61位发生突变，内切酶AciI不能将扩增片段切开。
由于绵羊的Y染色体为单倍体，所以当发生C>G的突变时，可形成2种不同的基因型，分别为CC和GG基因型，其PCR-RFLP检测的凝胶结果如图3所示：
其中CC基因型为野生型，能被AciI酶切，表现为735bp和61bp的两条带；GG基因型为突变型，不能被AciI酶切，表现为796bp一条带。根据条带的个数和条带片段大小，如图3所示的凝胶电泳检测结果能够很清楚的判定是否发生了点突变，将两种基因型区分开，从而检测其SNP多态性。
(4)不同基因型个体PCR产物的测序验证
利用ABI 5019和ABI 3730测序仪对不同基因型个体PCR产物分别进行正反双向测序；同时，进行SNP位置分析，结果表明包含61bp和735bp的两条带的CC基因型个体其EIF2S3Y基因片段第61位测序图的确表示为C，如图4a所示；而GG基因型，如图4b所示。
实施例3
绵羊EIF2S3Y基因片段第61位的SNP作为分子标记在不同绵羊品种中的多态性
1、群体单核苷酸多态性的检测
利用上述的SNP多态性检测方法对绵羊676份DNA样品，进行SNP多态性的鉴定；统计其SNP位点的频率分布情况。
2、SNP位点的频率统计分析
由于Y染色体的雄性特异区在减数分裂的过程中不与X染色体发生重组，为单倍体，只有两种基因型，故其基因频率和基因型相等。
基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率。
基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。因此，其基因频率和基因型相等。
3、基因效应的关联分析
基因型数据：AciI识别的基因型(CC和GG)
公羊睾丸大小数据：湖羊(6月龄)睾丸和附睾相关性状，包括：左右侧睾丸重量、左右侧睾丸体积、左右侧附睾重量、睾丸周径、宰前活重。
利用SPSS 19.0软件分析基因位点与湖羊睾丸大小的相关性。先对数据进行描述性统计分析，确定是否存在离群值，根据数据特征，利用单因素方差分析(ANOVA)探究基因型效应。
结果表明(见表4和表5)：对于AciI可识别EIF2S3Y基因片段第61位的SNP位点只在湖羊和滩羊两个品种中表现出多态性，而在白萨福克、萨福克、特克塞尔羊、杜泊羊、东弗里升羊、南非肉用美利奴羊、藏羊和岩羊中则没有表现出多态性。性状关联分析表明，在湖羊群体中，CC基因型个体的睾丸有比GG基因型个体大的趋势(0.05<P<0.1)，CC基因型个体的附睾质量显著大于GG型个体(P<0.05)，表明该位点可用于筛选筛选睾丸和附睾较大的绵羊个体。
表4绵羊EIF2S3Y基因基因片段第61位SNP基因频率分布表
表5 EIF2S3Y基因片段第61位SNP与湖羊繁殖性状之间的关联分析
综上，在本发明具体实施例中，首先，利用限制性片段长度多态性-聚合酶链反应(Restriction Fragment Length Polymorphism-Polymerase Chain Reaction，RFLP-PCR)方法对绵羊EIF2S3Y基因片段第61位C>G的突变进行分型，因为该位点位于绵羊EIF2S3Y基因内含子10，突变未引起氨基酸的改变，EIF2S3Y基因所编码蛋白的空间二、三级构型未发生变化。其次，针对上述EIF2S3Y基因的SNP多态性，本发明检测方法通过设计特定的PCR引物扩增片段，能够用RFLP-PCR方法简单、快速、成本低、精确的检测其单核苷酸的多态性，而且所检测的序列位点无特殊性要求。此外，本发明将筛选得到的SNPs位点与绵羊6月龄睾丸大小及附睾大小相关性状进行关联分析，发现该SNPs位点与相关性状紧密相关，可用于筛选睾丸和附睾较大的绵羊个体。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
序列表
<110> 兰州大学
<120> 绵羊EIF2S3Y基因的单核苷酸多态性标记及其检测引物、试剂盒、方法及应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
accttggcat tagcatacc 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggcagtcttc ctacatcag 19
<210> 3
<211> 796
<212> DNA
<213> EIF2S3Y
<400> 3
tgattttttt attttacctt ggcccattac atacccaagc ttgattgtaa tatttctttc 60
tagttcattt ttgaatctga cagtgtgaac tccagaaata gctttcacca cagtagattt 120
tccatgagca acgtgaccaa ttgtacctat aaaggccaaa aaacacttaa tttatatgca 180
taccattata ccaagtattt cagtaaagtt agaaaaacaa aaggcataat tcactataaa 240
tatttcaaac tacaaccaac agagatttca tttatgccct ccatatattc tttcaacaca 300
aaattttttc tgaaacatgt acctgaaaat tttatttaaa aatcatatta ttcaacttgt 360
tatctgaaaa aaggagttca cttgaaataa acattcattt aaaaacacaa aattttgtat 420
attaataaaa tttccagtat tttgattgag gtaaacatgc acaaagtgaa gtgaaagttg 480
ctcagtagca tccaactctt tgcaacccca taggctacac agtctttgga attctccagg 540
ccagaatact gcagtgggta gccttttcct tctgtgtatc ttcccaaccc agagatcaaa 600
cccaggtctt ccacaacgca ggtggattct ttaccagctg agccacagtg aagcctaaac 660
atgcacagat ccatgaaaac taggaaacaa ctccaatctg attacagtaa aacaagtaaa 720
tgttcagagt gagcaccgca agtggctcag caataaagaa tctgccttca atccaagaga 780
tggggggtcc aatccc 796

Claims (7)

1.一种绵羊EIF2S3Y基因的单核苷酸多态性标记，其特征在于，所述标记是绵羊EIF2S3Y基因片段第61位的G或C的单核苷酸多态性。
2.权利要求1所述的一种绵羊EIF2S3Y基因的单核苷酸多态性标记的检测引物，其特征在于，所述引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物和所述反向引物分别为如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
3.权利要求1所述的一种绵羊EIF2S3Y基因的单核苷酸多态性标记的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求2所述的检测引物。
4.权利要求1所述的一种绵羊EIF2S3Y基因的单核苷酸多态性标记的的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取待测公绵羊全基因组DNA；
2)以待测公绵羊全基因组DNA为模板，以母羊DNA为阴性对照，以水为空白对照，利用检测引物进行PCR扩增绵羊EIF2S3Y基因，得到扩增产物，并于4℃保存；
3)用限制性内切酶AciI消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据电泳结果鉴定绵羊EIF2S3Y基因上单核苷酸多态性位点的基因型。
5.根据权利要求4所述的一种绵羊EIF2S3Y基因的单核苷酸多态性标记的的检测方法，其特征在于，所述利用检测引物进行PCR扩增绵羊EIF2S3Y基因的具体反应过程为：先配置反应体系：2× PCR SuperMix(TransGen Biotech)12.50μL，0.2μM的正向引物水溶液0.5μL，0.2μM的反向引物水溶液0.5μL，灭菌蒸馏水10.5μL，DNA模板50ng，以上体积总量为25μL；将反应体系进行PCR扩增，具体控制过程为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸50s，34个循环；72℃终延伸5min。
6.根据权利要求4所述的一种绵羊EIF2S3Y基因的单核苷酸多态性标记的的检测方法，其特征在于，所述琼脂糖凝胶电泳过程采用的琼脂糖凝胶的质量浓度为2.5％。
7.权利要求1所述的一种绵羊EIF2S3Y基因的单核苷酸多态性标记在绵羊辅助选择和分子育种中的应用。
CN201810943879.1A 2018-08-18 2018-08-18 绵羊eif2s3y基因的单核苷酸多态性标记及其检测引物、试剂盒、方法及应用 Pending CN108998540A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810943879.1A CN108998540A (zh) 2018-08-18 2018-08-18 绵羊eif2s3y基因的单核苷酸多态性标记及其检测引物、试剂盒、方法及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810943879.1A CN108998540A (zh) 2018-08-18 2018-08-18 绵羊eif2s3y基因的单核苷酸多态性标记及其检测引物、试剂盒、方法及应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108998540A true CN108998540A (zh) 2018-12-14

Family

ID=64593106

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810943879.1A Pending CN108998540A (zh) 2018-08-18 2018-08-18 绵羊eif2s3y基因的单核苷酸多态性标记及其检测引物、试剂盒、方法及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108998540A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110241227A (zh) * 2019-07-01 2019-09-17 兰州大学 一种检测绵羊spata6基因单核苷多态性的方法及应用
CN114438224A (zh) * 2022-01-27 2022-05-06 江苏省家禽科学研究所 一种鸭蛋壳性状相关基因型的分子标记、引物及其检测方法和应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102181443A (zh) * 2011-03-21 2011-09-14 中国科学院植物研究所 一种多重检测基因组dna多态性的方法及其专用探针
CN104837989A (zh) * 2012-07-31 2015-08-12 重组股份有限公司 通过等位基因替代生成fmdv抗性牲畜
WO2017049240A1 (en) * 2015-09-17 2017-03-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Selection of pluripotent cells for production of fertile xy female mice
CN108315445A (zh) * 2018-04-26 2018-07-24 兰州大学 一种检测绵羊sry基因的单核苷酸多态性的方法与应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102181443A (zh) * 2011-03-21 2011-09-14 中国科学院植物研究所 一种多重检测基因组dna多态性的方法及其专用探针
CN104837989A (zh) * 2012-07-31 2015-08-12 重组股份有限公司 通过等位基因替代生成fmdv抗性牲畜
WO2017049240A1 (en) * 2015-09-17 2017-03-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Selection of pluripotent cells for production of fertile xy female mice
CN108315445A (zh) * 2018-04-26 2018-07-24 兰州大学 一种检测绵羊sry基因的单核苷酸多态性的方法与应用

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
K. M. CLIFFE等: "Analysis of the non‐recombining Y chromosome defines polymorphisms in domestic pig breeds: ancestral bases identified by comparative sequencing", 《ANIMAL GENETICS》 *
MUZNY,D.M.等: "Bos taurus Y Chr BAC CH240-269L13 (Children"s Hospital Oakland Research Institute Bovine BAC Library (male)) complete sequence", 《GENBANK》 *
P.J.DAS等: "Characterization of the Bovine Pseudoautosomal Region and Comparison with Sheep, Goat, and Other Mammalian Pseudoautosomal Regions", 《CYTOGENET GENOME RESEARCH》 *
曹学涛: "绵羊Y染色体基因的鉴定和SNPs筛选", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库农业科技辑（月刊）》 *
李娜: "Eif2s3y促进胚胎干细胞向生精细胞的分化", 《中国博士学位论文全文数据库基础科学辑（月刊）》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110241227A (zh) * 2019-07-01 2019-09-17 兰州大学 一种检测绵羊spata6基因单核苷多态性的方法及应用
CN114438224A (zh) * 2022-01-27 2022-05-06 江苏省家禽科学研究所 一种鸭蛋壳性状相关基因型的分子标记、引物及其检测方法和应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111705140B (zh) 体重性状相关的SNPs分子标记及其在湖羊辅助育种中的应用
CN107022604B (zh) 猪ntf3启动子区snp作为公猪繁殖性状分子标记与应用
CN116083597B (zh) 影响鸡后期产蛋数的snp遗传标记及其应用
CN109371144B (zh) 一种与猪生长性状相关联的snp分子标记
CN106498078B (zh) 一种检测绵羊kitlg基因的单核苷酸多态性的方法及其应用
CN112662788A (zh) 与中国南方荷斯坦奶牛产奶性状相关的snp标记及其应用
CN108998540A (zh) 绵羊eif2s3y基因的单核苷酸多态性标记及其检测引物、试剂盒、方法及应用
CN106755371A (zh) 利用pcr‑rflp检测绵羊pcnp基因单核苷酸多态性的方法及其应用
CN108315445A (zh) 一种检测绵羊sry基因的单核苷酸多态性的方法与应用
US20060166244A1 (en) DNA markers for increased milk production in cattle
CN112980962B (zh) 一种与猪初生重性状相关的snp标记及应用
CN113817841B (zh) 一种与猪乳头数性状相关的snp标记引物对及其应用
CN109825600A (zh) 一种与苏淮猪肌肉滴水损失相关的snp标记及检测方法
JP5544537B2 (ja) 遺伝子マッピング及びハプロタイプ決定の方法
CN106701930B (zh) 利用pcr-sscp检测绵羊fth-1基因插入缺失多态性的方法及其应用
CN111394502B (zh) 鉴定大豆RN型CMS恢复基因的InDel标记及方法
CN114717329A (zh) 与母猪产死胎性状相关的snp分子标记及其应用
CN112210607B (zh) 与水牛白毛色表型相关的分子标记及应用
CN109295236B (zh) 牛serpina3基因遗传标记辅助检测牛生长和胴体性状的方法及其应用
CN113046443A (zh) 一种影响猪肋骨数的snp分子标记及其应用
CN106755370B (zh) 利用pcr-rflp检测绵羊fth-1基因单核苷酸多态性的方法及其应用
CN113151573B (zh) 芝麻籽粒圆度主效qtl位点、与qtl位点紧密连锁的分子标记、分子标记引物、应用
CN113718039B (zh) 一种与猪肋骨数性状相关的snp标记引物对及其应用
CN114703289B (zh) 一种鉴别杜长大三元猪和长大二元猪的snp标记引物对及其应用
CN109735630A (zh) 绵羊zfy基因单核苷酸多态性标记的检测方法及标记应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20181214

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication