CN113046443A - 一种影响猪肋骨数的snp分子标记及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种影响猪肋骨数的SNP分子标记及其应用。所述的影响猪肋骨数的SNP分子标记位于国际猪参考基因组Sscrofa11.1版本14号染色体上自5′末端起第87859370个核苷酸位点T>C突变处。本发明还提供一种用于鉴定上述SNP分子标记的引物，通过该分子标记及其引物可以建立高效准确的分子标记辅助育种方法，通过优选该分子标记的优势等位基因，能够选择猪肋骨数性状的遗传进展，从而有效提高猪育种的经济效益。

Description

一种影响猪肋骨数的SNP分子标记及其应用
技术领域
本发明涉及动物分子生物及动物遗传育种技术领域，尤其是提供一种能鉴别和改良猪肋骨数的主效基因SNP分子标记及其在种猪肋骨数遗传改良中的应用。
背景技术
猪肋骨数是猪生产性能的重要性状指标，是种猪遗传改良研究中的重要目的性状。但由于肋骨数活体检测很难实现，屠宰测定又导致无法留种。基于主效基因分子标记的遗传改良方法经济、快捷而有效，是对猪肋骨数性状猪开展育种工作的重要方法。
迄今为止，已有一定数量的影响猪肋骨数性状的主效基因和分子标记被鉴定，大大推动了国际种猪遗传改良的进展。Mikawa等(BMC Genetics.2011Jan14；12:5)发现位于猪7号染色体上的VRTN基因内的g.19034A>C和g.20311_20312ins291是影响肋骨数变异的重要突变；Park等(Journal of Animal Science.2017May1；95(5):1957-62)发现位于猪7号染色体上LTBP2基因内的c.4481A>C是影响肋骨数变异的重要突变。然而，仅利用上述发现的基因突变均不能完全解释肋骨数变异(Meat Science.2014Oct5；100:150-5；Journalof Animal Science.2017May1；95(5):1957-62)，说明基因组上还存在更多影响肋骨数变异的重要基因突变，继续从全基因组范围内挖掘主效基因及重要突变位点以及相关检测技术在生产上的迅速应用，对国际种猪业的发展起着重要推动作用。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术的不足，从全基因组范围内挖掘主效基因及重要突变位点以及相关检测技术在生产上的迅速应用，提供一种影响猪肋骨数的SNP分子标记。
本发明的另一个目的是提供上述SNP分子标记在种猪肋骨数性状遗传改良中的应用。
本发明的再一目的在于提供一种用于测定上述影响猪肋骨数形状的SNP分子标记的引物。
本发明的第四个目的在于提供一种检测猪肋骨数性状的方法。
本发明的第五个目的在于提供一种猪的遗传改良的方法。
本发明通过下述技术方案实现：
一种影响猪肋骨数性状的SNP分子标记，其SNP位点对应于国际猪参考基因组Sscrofa11.1版本14号染色体上自5′末端起第87859370个核苷酸位点T>C突变，猪参考基因组Sscrofa11.1版本为GenBank中更新于2017年2月的猪参考基因组序列。
所述的影响猪肋骨数的SNP分子标记在检测猪肋骨数性状和猪育种中的应用，选择上述位点碱基为T的个体，可以获得肋骨数更多的猪。
优选的猪为大白猪和民猪杂交体。
一种用于检测上述的影响猪肋骨数的SNP分子标记的引物，包含上游引物PCR-F和下游引物PCR-R；
上游引物PCR-F：5’-CACAAGAAAGGGTAAACA-3’；
下游引物PCR-R：5’-TCTATTATGCCACTCCAC-3’。
一种检测猪肋骨数的方法，包含如下步骤：以待测猪的基因组DNA为模板，加入引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，检测待测猪的PCR扩增产物，如果PCR扩增产物自5′末端起第293位碱基为C，则所述猪的基因型为CC基因型，如果PCR扩增产物自5’末端起第293位的碱基为T和C，则所述猪的基因型为TC基因型，如果PCR扩增产物自5’末端起第293位的碱基为T，则所述猪的基因型为TT基因型。
一种猪的遗传改良的方法，包含如下步骤：确定种猪核心群中种猪的SNP分子标记，并根据SNP分子标记做出相应的选择：种猪的继代选育国际猪参考基因组Sscrofa11.1版本14号染色体上自5′末端起第87859370位碱基处选择TT和/或TC型个体，提高后代猪的肋骨数。
一种猪的遗传改良的方法，包含如下步骤：确定种猪核心群中种猪的SNP分子标记，并根据SNP分子标记做出相应的选择：种猪的继代选育国际猪参考基因组Sscrofa11.1版本14号染色体上自5′末端起第87859370位碱基处选择CC型个体，减少后代猪的肋骨数。
优选的猪为大白猪和民猪杂交体。
附图说明
图1为CC基因型个体猪参考基因组Sscrofa11.1的14号染色体上g.87859370T>C多态性位点附近序列的测序结果。
图2为TT基因型个体猪参考基因组Sscrofa11.1的14号染色体上g.87859370T>C多态性位点附近序列的测序结果。
图3为TC基因型个体猪参考基因组Sscrofa11.1的14号染色体上g.87859370T>C多态性位点附近序列的测序结果。
图4为猪14号染色体上影响肋骨数位点在大白猪和民猪杂交群体中的全基因组关联图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步描述。本发明的实施方式不限于此。
一、猪S14_87859370多态性位点的确定
(一)本发明使用的实验群体为大白猪和民猪的杂交群体，上述所有实验猪只均饲养于中国农业科学院北京畜牧兽医研究所昌平实验基地，猪只自由采食饮水，并按统一饲养标准。267头个体饲养至240±7日龄屠宰测定。表型测定在北京市第五肉联厂进行，猪在宰前20小时断食，但可自由饮水，整个屠宰过程按照标准商业程序实施，屠宰后统计其肋骨数。
从上述实验群体中的每个个体采集一小块耳组织样，以标准酚氯仿方法提取基因组DNA，将DNA溶解于TE缓冲液中。
(二)引物的设计与合成
根据国际猪参考基因组Sscrofa11.1版本的序列，设计并合成如下引物：
Figure BDA0002784074550000041
(三)PCR扩增
步骤(一)得到的实验猪的267个个体用于数据分析。分别以基因组DNA为模板，以U和D为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
PCR扩增体系：猪基因组DNA200ng，1.5mM MgCl2，0.2mM dNTP，正反向引物各0.2μM，0.03单位Taq DNA聚合酶及1*PCR bufferTAKARA缓冲液。
PCR扩增程序：94℃5min；94℃20s，54℃30s，72℃60s，共30个循环；最后在72℃延伸3min。PCR扩增产物使用1.5％琼脂糖凝胶电泳(Promega)进行分离，并在紫外线下拍照。然后将它们纯化并在ABI 377测序仪(ABI，美国加利福尼亚州福斯特城)上测序。
(四)测序及序列分析
全基因组关联(GWAS)分析及候选基因的确定：
使用TASSEL软件中的混合线性模型，利用大白猪和民猪杂交群体所有个体的60KSNP标记基因型数据、S14_87859370位点基因型数据和肋骨数表型数据进行GWAS分析，模型为：y＝μ+a+e。其中y是动物的肋骨数，μ是总体平均值，a是动物的随机加性遗传效应，e是随机残留效应。采用Bonferroni法确定SNP与肋骨数性状关联程度的显著性阈值，基因组水平显著阈值为0.05除以有效SNP位点数量，即0.05/42918＝1.17e-6。GWAS结果如图2显示，猪14号染色体上g.87859370位点(S14_87859370)为全基因组范围内与肋骨数性状最显著关联的SNP位点。
S14_87859370位点不同基因型与肋骨数性状的关联分析：
主效突变位点对肋骨数性状的影响效应分析，本发明针对主效突变位点g.87859370T>C与猪肋骨数进行关联性分析。采用特异性引物PCR扩增后直接测序的方法检测g.87859370T>C突变位点的基因型。上下游扩增引物利用引物在线设计软件Primer3.0(http://frodo.wi.mit.edu/)设计如表1。25ul的聚合酶链式反应(PCR)反应体系中，包括4ng/μL的猪基因组DNA，1.5mM MgCl2，0.2mM dNTP，正反向引物各0.2μM，0.03单位DNA聚合酶(Taq酶)及1*PCR buffer(缓冲液)(TAKARA)。PCR采用Touchdown程序，扩增条件为：94℃5min；94℃20s，54℃30s，72℃60s,30个循环；最后在72℃延伸3min。PCR扩增产物使用1.5％琼脂糖凝胶电泳(Promega)进行分离，并在紫外线下拍照。然后将它们纯化并在ABI 377测序仪(ABI，美国加利福尼亚州福斯特城)上测序。测序结果利用公用的DNAStar的SeqMan软件进行分析。如图4所示，GWAS结果显示，猪14号染色体上存在与肋骨数显著关联的SNP位点S14_87859370。
二、猪S14_87859370位点不同基因型在大白猪和民猪杂交群体中与肋骨数的关联分析
针对大白猪和民猪杂交群体，利用上述的PCR扩增后直接测序的方法检测国际猪基因组11.1版本参考序列猪14号染色体上g.87859370位点(S14_87859370)基因型，开展不同基因型个体与肋骨数性状的关联分析。
本实施例中利用大白猪和民猪杂交群体为实验动物。用特异性引物对259头大白猪和民猪杂交猪基因组DNA进行PCR扩增后直接测序。根据测序结果对S14_87859370主效标记位点基因型进行判定。关联分析所用模型为Y＝G+e，其中，Y为肋骨数，G为基因型效应，e为残差效应。表2为S14_87859370位点不同基因型在大白猪和民猪杂交群体中与肋骨数的关联分析结果表。从表2可见，TT基因型和TC基因型的猪的肋骨数显著大于CC基因型的猪的肋骨数，TT基因型猪的肋骨数比CC基因型猪的肋骨数多约0.65对(P<0.05)，TC基因型猪的肋骨数比CC基因型猪的肋骨数多约0.6对(P<0.05)，TT基因型猪的肋骨数和TC基因型猪的肋骨数差异不显著。结果表明，用BMPR1A基因内的国际猪基因组11.1版本参考序列自5’末端起第87859370位单核苷酸多态性可用于鉴定猪的肋骨数性状。在实际的猪育种中，为获得更多肋骨数的猪，最好选择TT和/或TC基因型的猪进行育种；为获得更少肋骨数的猪，最好选择CC基因型的猪进行育种。
S14_87859370位点不同基因型在大白猪和民猪杂交群体中与肋骨数的关联分析表如下：
Figure BDA0002784074550000061
注：同列上标不同字母表示差异显著(P<0.05)
SEQ1
Figure BDA0002784074550000062
Figure BDA0002784074550000071
SEQ2
Figure BDA0002784074550000072

Claims (9)

1.一种影响猪肋骨数性状的SNP分子标记，其特征在于：其SNP位点对应于国际猪参考基因组Sscrofa11.1版本14号染色体上自5′末端起第87859370个核苷酸位点T>C突变，猪参考基因组Sscrofa11.1版本为GenBank中更新于2017年2月的猪参考基因组序列。
2.根据权利要求1所述的影响猪肋骨数的SNP分子标记在检测猪肋骨数性状和猪育种中的应用。
3.根据权利要求2所述的影响猪肋骨数的SNP分子标记在检测猪肋骨数性状和猪育种中的应用，其特征在于：优选的猪为大白猪和民猪杂交体。
4.一种用于检测权利要求1所述的影响猪肋骨数的SNP分子标记的引物，其特征在于：包含上游引物PCR-F和下游引物PCR-R；
上游引物PCR-F：5’-CACAAGAAAGGGTAAACA-3’；
下游引物PCR-R：5’-TCTATTATGCCACTCCAC-3’。
5.权利要求4所述的用于检测影响猪肋骨数的SNP分子标记的引物在检测猪肋骨数和猪育种中的应用。
6.一种检测猪肋骨数的方法，其特征在于，包含如下步骤：以待测猪的基因组DNA为模板，加入引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，检测待测猪的PCR扩增产物，如果PCR扩增产物自5′末端起第293位碱基为C，则所述猪的基因型为CC基因型，如果PCR扩增产物自5’末端起第293位的碱基为T和C，则所述猪的基因型为TC基因型，如果PCR扩增产物自5’末端起第293位的碱基为T，则所述猪的基因型为TT基因型。
7.一种猪的遗传改良的方法，其特征在于，包含如下步骤：确定种猪核心群中种猪的SNP分子标记，并根据SNP分子标记做出相应的选择，种猪的继代选育国际猪参考基因组Sscrofa11.1版本14号染色体上自5′末端起第87859370位碱基处选择TT和/或TC型个体，提高后代猪的肋骨数。
8.一种猪的遗传改良的方法，其特征在于，包含如下步骤：确定种猪核心群中种猪的SNP分子标记，并根据SNP分子标记做出相应的选择，种猪的继代选育国际猪参考基因组Sscrofa11.1版本14号染色体上自5′末端起第87859370位碱基处选择CC型个体，减少后代猪的肋骨数。
9.根据权利要求7或8所述的猪的遗传改良方法，其特征在于：优选的猪为大白猪和民猪杂交体。
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