CN106498078B

CN106498078B - 一种检测绵羊kitlg基因的单核苷酸多态性的方法及其应用

Info

Publication number: CN106498078B
Application number: CN201611132298.7A
Authority: CN
Inventors: 乐祥鹏; 张军霞; 李发弟; 王维民; 李万宏
Original assignee: Lanzhou University
Current assignee: Tianjin aoqun Sheep Industry Research Institute Co.,Ltd.
Priority date: 2016-12-09
Filing date: 2016-12-09
Publication date: 2019-05-21
Anticipated expiration: 2036-12-09
Also published as: CN106498078A

Abstract

本发明公开了一种检测绵羊KITLG基因的单核苷酸多态性的方法及其应用：以待测绵羊全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增绵羊KITLG基因片段；用限制性内切酶SspI消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据电泳结果鉴定绵羊KITLG基因第47569的碱基多态性。由于该碱基突变位点与绵羊繁殖性状产羔数密切关联，所以该方法是一种在DNA水平上检测与绵羊繁殖性状密切相关分子遗传标记的方法，可以用于绵羊的辅助选择和分子育种，加快绵羊良种繁育速度。

Description

一种检测绵羊KITLG基因的单核苷酸多态性的方法及其应用

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，涉及以绵羊的功能基因的单核苷酸多态性(SNP)作为分子遗传标记，特别涉及绵羊KITLG基因的单核苷酸多态性及其检测方法。

背景技术

在动物育种中，人们期望通过对生长、繁殖等性状密切相关，并且与数量性状紧密连锁的DNA标记的选择，达到早期选种和提高育种值准确性的目的，从而在畜禽育种中获得更大的遗传进展。

分子育种，即分子标记辅助选择育种(Molecular Mark-Assist Selection,MAS)，该技术是借助DNA分子标记对遗传资源或育种材料进行选择，对畜禽的综合性状进行品种改良，它是利用现代分子生物学和传统遗传育种相结合的方法，进行新品种选育。

基因多态性是指不同物种或者同一物种内的不同个体间基因组序列的差异，这些差异是由于染色体中DNA等位基因中核苷酸改变引起，主要是包括碱基的替换、插入、缺失以及重复序列拷贝数的变化。

单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)是由美国麻省理工学院的人类基因组研究中心的学者Lander(1996)提出的一类遗传标记系统，就是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸(A/T/C/G)的替换而引起的多态性。SNP作为新的遗传标记已广泛应用于基因定位、克隆、遗传育种及多样性的研究。SNP是基因组中存在的一种数量非常丰富的变异形式，占人类基因组中遗传多态性的90％以上。SNP与罕见的变异不同，通常在种群中频率等于或小于1％的此种变异被称为突变，而只有频率大于1％时才被称为单核苷酸多态性。它的变异形式有：颠换、转换、插入和缺失等，主要由单个碱基的转换或者颠换所引起。具有转换型的碱基变异的SNPs约占2/3。

根据基因组中单核苷酸多态性产生的位置，可分为以下3类：基因编码区单核苷酸多态性(Coding-region SNPs,cSNPs)、基因周边单核苷酸多态性(Perigenic SNPs,pSNPs)以及基因间单核苷酸多态性(Intergenic SNPs,iSNPs)。

研究表明，位于编码区内的cSNP比较少。基因编码区内的cSNP又可分为2种：一种是编码区内的同义cSNP(Synonymous cSNP)，即SNP所致编码序列的改变并不会影响其所翻译的蛋白质中氨基酸序列的改变；另一种是编码区内的非同义cSNP(Non-SynonymouscSNP)，即碱基序列的改变将导致编码氨基酸的改变，从而导致蛋白质中氨基酸序列的改变，可能最终影响到蛋白质的功能。

由于SNPs是二等位基因分子标记，所以，理论上在一个二倍体生物群体中，SNPs可能是由2个、3个或4个等位基因构成，但实际上3个或4个等位基因的SNPs很罕见，故SNPs通常被简单地称为二等位基因分子标记。目前，主要采用几种不同的路线来发现SNPs：即DNA序列测定方法、聚合酶链反应—单链构象多态(Polymerase Chain Reaction-SingleStrand Conformation Polymorphism，PCR-SSCP)与DNA测序结合法、等位特异性PCR(Allele Specific PCR，AS-PCR)方法、引物延伸法和寡核苷酸连接反应等。在这些SNP检测技术中，DNA序列测定法是最为准确的SNP检测方法，但是，其检测费用昂贵，且需要有DNA测序仪等大型仪器，同时，在测序过程中需要非常熟练的技术人员和经验，所以，DNA序列测定法不是一种应用于生产实际的理想SNP检测方法；当然，利用PCR-SSCP与DNA测序结合法检测SNP可以适当降低检测费用，但是，PCR-SSCP的实验过程比较长，操作比较繁琐，且实验过程中存在假阳性问题，所以，也并非理想的SNP检测手段；AS-PCR方法作为一种新型的SNP检测方法，在未来的应用领域中具有非常广阔的前景，但是，该方法需要设计特别的引物，且只能针对特定的基因位点，同时，检测过程中还存在误检的概率，因此，目前不具有普遍应用的特点；而引物延伸法和寡核苷酸连接反应技术检测SNP位点，需要平板读数仪、基因芯片、微球阵列技术和质谱仪等检测平台，对于一般的分子实验室来说可实施性不强。

限制性片段长度多态性-聚合酶链反应(Restriction Fragment LengthPolymorphism-Polymerase Chain Reaction，RFLP-PCR)方法是一种检测SNP的有效技术，在发现SNP位点后设计上下游引物用限制性内切酶进行切割，然后进行琼脂糖、聚丙烯凝胶电泳分析，就能准确地鉴别SNP位点。RFLP-PCR方法不仅具有DNA测序法的准确性，又克服了费用昂贵、繁琐操作、假阳性的缺点，而且所检测的序列位点无特殊性要求。

KITLG(KIT Ligand，KL或KitL)是一种分泌生长因子，又被称为干细胞因子(StemCell Factor，SCF)，肥大细胞因子(Mast Stem Cell Factor，MCGF)或Steel因子(SteelFactor，SLF)，属于酪氨酸激酶受体家族。KITLG由Mgf cDNA编码，由284个氨基酸组成。KITLG mRNA主要在卵泡的颗粒细胞中表达)。KITLG通过其受体KIT信号影响卵母细胞与颗粒细胞之间的相互作用。颗粒细胞中的KITLG和卵母细胞中的KIT之间的互作对动物繁殖是不可或缺的。KITLG在原始生殖细胞(Primordial Germ Cells，PGCs)的生存、增殖、迁移以及卵泡的发育中发挥作用。KITLG在卵泡发育中也起很重要的作用。KITLG结合KIT诱发PI3K通路在其它多种信号通路协调下传导信息，激活卵母细胞，促进卵母细胞的生长和分泌作用。虽然有关KITLG基因在动物繁殖方面的作用的研究取得了一些进展，但是在绵羊上的研究报道较少。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测绵羊KITLG基因的单核苷酸多态性的方法及其应用，利用PCR-RFLP方法针对其基因位点上的突变进行检测，提前淘汰劣势个体，加快高繁种羊群体的建立。

本发明通过以下技术方案来实现：

绵羊KITLG基因第47569位为T或C的单核苷酸多态性的检测方法为：

以包含KITLG基因的待测绵羊全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增绵羊KITLG基因；用限制性内切酶SspI消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据电泳结果鉴定绵羊KITLG基因第47569位的单核苷酸多态性；

所述的引物对P为：

上游引物：5’-TTATCTCCAGCTTTAGGG-3’ 18nt；

下游引物：5’-AAGGTGACTTTGGTGAAT-3’ 18nt。

所述的PCR扩增反应程序为：

94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，34个循环；72℃延伸10min。

所述的琼脂糖凝胶电泳为质量浓度为1.5-3.0％的琼脂糖凝胶电泳。

根据琼脂糖凝胶电泳结果KITLG基因第47569位碱基多态性为：TT型表现：358bp和110bp；CT型表现：468bp、358bp和110bp。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明利用RFLP-PCR方法对绵羊KITLG基因第47569位点上的单核苷酸多态性进行检测，该位点位于KITLG基因的第五内含子，该核苷酸多态性能够作为一个分子遗传标记，利用标记位点信息和数量性状的表型信息，更准确估计动物个体的育种值，提高选择效率，加快育种进展。

本发明通过设计特定的PCR引物扩增片段，能够用RFLP-PCR方法简单、快速、成本低、精确的检测上述KITLG基因的单核苷酸的多态性。

本发明对KITLG基因的SNP进行了基因分型和基因频率分析，以及与绵羊繁殖性状之间进行了关联分析；结果显示KITLG基因的核苷酸多态位点能够成为分子遗传辅助育种的标记。

本发明提供的检测方法为KITLG基因的SNP与生长性状关系的建立奠定了基础，以便用于中国绵羊生长性状的标记辅助选择，快速建立遗传资源优良的绵羊种群。

附图说明

图1为绵羊血样基因组DNA电泳检测图；

图2为绵羊KITLG基因PCR扩增的468bp片段的电泳图；M为Marker；

图3为绵羊KITLG基因468bp PCR产物的SspI酶切电泳检测KITLG基因多态性的电泳结果图；M为Marker；

图4为绵羊KITLG基因47569位SNP的不同基因型个体的测序峰图，其中，A对应TT基因型，B对应CT基因型。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，所述实施例是对本发明的解释，而不是限定。

本发明以KITLG基因保守序列设计引物扩增KITLG基因第五内含子468bp片段，以绵羊基因组为模板，进行PCR扩增，扩增产物经测序后寻找该扩增片段的单核苷酸多态；针对发现的单核苷酸多态进行性状关联性分析，并提供其检测方法，使得KITLG基因的核苷酸多态性成为一种能够快速、方便检测的分子遗传标记，为加快建立具有高繁绵羊种群提供依据。

a、绵羊KITLG基因多态性的检测

1、绵羊血样的采集及处理

取绵羊血样10mL，加入0.5mol/L的EDTA 500μL抗凝，缓慢颠倒3次后放入冰盒，-80℃保存备用。

本发明采用绵羊品种，具体如表1所示。

表1绵羊样品来源表

2、血样基因组DNA的提取

(1)将冷冻血样室温解冻，转移500μL至1.5mL Eppendorf管，加入等体积PBS缓冲液，充分混匀，12000r/min离心10min(4℃)，弃去上清液，重复上述步骤至上清液透明、沉淀呈淡黄色。

(2)在离心管中加入DNA抽提缓冲液500μL，摇动，使血细胞沉淀脱离离心管管壁，37℃水浴1h。DNA抽提缓冲液的配制：0.6057g的Tris、18.612g的EDTA和2.5g的SDS加超纯水500mL，灭菌、调pH至8.0，4℃保存备用。

(3)加蛋白酶K 3μL(20mg/mL)并混匀，55℃过夜至澄清，尚未澄清者，可补加1μL蛋白酶K混匀继续消化至澄清。

(4)将反应液冷却至室温，加Tris-饱和酚500μL，温和摇动离心管20min，使其充分混匀；4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中，重复一次。

(5)加氯仿500μL，充分混匀20min，4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中。

(6)加0.1倍体积的NaAc缓冲液及2倍体积的冰冷的无水乙醇，混合转动离心管直至白色的絮状沉淀析出，-20℃保存30～60min。

(7)4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，用70％的冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次。

(8)4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，室温下使乙醇挥发干净。

(9)干燥后的DNA溶于80～100μL的超纯水，4℃保存直至DNA完全溶解，0.8％琼脂糖凝胶电泳检测其质量，-20℃保存。

3、DNA池的构建

(1)1％琼脂糖凝胶电泳检测

选部分DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测，选择DNA样品条带均一、无拖尾、无降解的样品进行DNA池的构建。

(2)OD值测定

用紫外光光度计测定DNA样品在260nm、280nm处的OD值。计算DNA含量和OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值。如OD₂₆₀/OD₂₈₀比值小于1.6，说明样品中含有较多的蛋白质或酚，则应进行纯化；若比值大于1.8，则应该考虑去除RNA纯化。

DNA浓度(ng/μL)＝50×OD₂₆₀值×稀释倍数

(3)品种DNA池的构建

DNA检测完毕后，取出一定的量稀释至50ng/μL，然后从绵羊20个浓度为50ng/μLDNA样品中取10μL混合构建成品种DNA池；

绵羊血样基因组DNA的检测结果见图1，从图中可以看出绵羊基因组DNA的质量非常高。

4、PCR扩增

PCR反应体系采用混合加样法，即根据每一个反应体系所需的各种组分的数量和1次反应所需的PCR反应的个数，算出各种反应组分的总量，加入到1个1.5mL或者2.0mL离心管中，充分混匀后瞬时离心，再分装到每个0.2mL Eppendorf PCR管中，然后加入模板DNA，再瞬时离心后进行PCR扩增；PCR反应体系见表2。

表2 PCR反应体系

体系成分	体积(μL)
		2*Reaction Mix	12.5
上游引物(10pmol/L)	1.0
		下游引物(10pmol/L)	1.0
Taq DNA聚合酶(0.5U/μL)	0.3
		DNA模板(50ng/μL)	1.0
灭菌超纯水(H<sub>2</sub>O)	9.2
		总体积	25.0

引物对P：

上游引物：5’-TTATCTCCAGCTTTAGGG-3’ 18nt；

下游引物：5’-AAGGTGACTTTGGTGAAT-3’ 18nt。

表3 PCR反应程序

94℃预变性5min；
	94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，34个循环；
72℃延伸10min

5、PCR产物纯化和测序

PCR扩增完成之后进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图2所示，可以清楚看到468bp的条带；然后进行PCR产物的切胶回收及纯化：在紫外灯下从琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5mL离心管中，然后用PCR产物回收纯化试剂盒(北京天根生物公司)纯化PCR产物，按照试剂盒说明书操作，具体步骤如下：

(1)首先向吸附柱中加入500μL平衡液BL，12000r/min离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

(2)将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下放入干净的离心管中，称取重量。

(3)向胶块中加入等体积溶液PC，60℃水浴放置10min左右，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。

(4)将上一步所得溶液加入一个吸附柱中，12000r/min离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。

(5)向吸附柱中加入700μL漂洗液，12000r/min离心1min，倒掉废液，将吸附柱重新放入收集管中。

(6)向吸附柱中加入500μL漂洗液，12000r/min离心1min，倒掉废液，将离心吸附柱放入收集管中，12000r/min离心2min，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温或50℃温箱数分钟，彻底晾干。

(7)将吸附柱放到一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量的洗脱缓冲液，室温放置2分钟。12000r/min离心1min收集DNA溶液。

(8)为了提高DNA的回收量，可将离心得到的溶液重新加回离心吸附柱中，重复步骤7。

把以绵羊DNA池为模板的PCR纯化产物送上海生物工程有限公司进行双向测序。绵羊KITLG基因目的片段468bp的测序结果如图4所示。

对测序峰图进行分析，其中在同一位点有两个不同峰的是发生了单核苷酸突变；位于绵羊KITLG基因的第47569位出现了T、C两种检测结果，即为筛查到的绵羊KITLG基因的SNP多态性，该位点是为T或C的碱基多态性。

b、绵羊KITLG基因T>C突变多态性的RFLP-PCR检测

由于筛查到的碱基多态性为自然酶切位点，能被常用的内切酶进行PCR-RFLP来鉴定。当绵羊的KITLG基因第47569位未发生T>C突变时，即为突变前T，利用引物对P扩增的KITLG基因序列AAT^ATT，为SspI的限制性内切酶识别位点；可直接通过SspI对目的片段的酶切进行基因分型。

1、RFLP-PCR反应条件

PCR产物扩增体系和反应条件分别如表2和表3所述，PCR扩增产物的1.5％琼脂糖凝胶电泳图谱如图2所示，可以看到设计的引物对P能够扩增468bp的片段。

2、PCR扩增产物的SspI酶切

(1)10μL SspI酶切反应体系：5μL PCR产物，10×buffer(缓冲液)2.0μL，SspI(10U/μL)为0.3μL，2.7μL灭菌纯水(H₂O)；

(2)酶切消化条件：37℃恒温培养箱中消化12～16h。

(3)SspI消化PCR产物后琼脂糖凝胶电泳分析

用3.0％的琼脂糖凝胶，120V电压电泳1小时，核酸染料染色检测酶切结果，用UVP凝胶成像系统(GelDoc-It TS Imaging System)照相分析，并判型、记录其基因型；

由于PCR-RFLP扩增的468bp片段中不包含其它的SspI酶切识别位点，当KITLG基因第47569位未发生T>C突变时，PCR扩增的KITLG基因产物被限制性内切酶SspI识别后，在AAT^ATT对扩增片段酶切，将扩增片段切为2段；而当KITLG基因第47569位发生突变，不能形成新的限制性内切酶SspI酶切识别位点，扩增片段不能被酶切；

绵羊KITLG基因第47569位可形成2种不同的基因型，分别为TT和CT，其PCR-RFLP检测的凝胶结果如图3所示：

其中，TT基因型为野生型，它的两条DNA链的SNP位点均能被SspI酶切，表现为358bp和110bp条带；杂合子CT的两条链中的一条的SNP位点能够被识别而另一条不能被识别，表现为468bp，358bp和110bp条带；在检测群体中没有发现CC基因型；根据条带的个数和条带的大小，能够很清楚的判定是否发生了点突变，将两种基因型区分开，从而检测其SNP多态性。

(4)不同基因型个体PCR产物的测序验证

利用ABI 3730测序仪对不同基因型个体PCR产物分别进行正反双向测序；同时，进行SNP位置分析，结果表明包含468bp、358bp和110bp条带的杂合子CT基因型个体其第47569位的测序图的确表示为C或T，如图4B所示，自左向右第7个峰为两个峰；而TT基因型为T，如图4A所示。

c、不同绵羊群体中KITLG基因第47569位的SNP作为分子标记的应用

1、群体单核苷酸多态性的检测

利用上述的SNP多态性检测方法对432份小尾寒羊和509份湖羊DNA样品进行SNP多态性的鉴定；统计其SNP位点的频率分布情况。

2、SNP位点的频率统计分析

基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率。P_AA＝N_AA/N，其中P_AA代表某一位点的AA基因型频率；N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数；N为检测群体的总数量。

基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。计算的公式可以写成：P_A＝(2N_AA+N_Aa1+N_Aa2+……+N_Aan)/2N。式中，P_A表示等位基因A频率，N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数量，N_Aai表示群体中具有Aai基因型个体数量，a1-an为等位基因A的n个不同的复等位基因；统计结果见表4。

表4绵羊KITLG基因第47569位SNP基因频率分布表

3、基因效应的关联分析

基因型数据：SspI识别的基因型(TT和CT)

生长性状数据：湖羊和小尾寒羊第一胎产羔数

利用SAS(9.2)软件分析基因位点与繁殖性状(产羔数)的相关性。先对数据进行描述性统计分析，确定是否存在离群值，根据数据特征，利用t分析、方差分析或是多元线性模型分析基因型效应。在数据处理中，根据影响产羔数因素不同，考虑到环境效应、年龄、基因型效应及相关的互作效应，采用固定模型进行分析，同时，根据实际情况进行取舍。完整的模型如下：

Y_ijk＝μ+G_j+E_ijk

其中：Y_ijk为个体表型记录；μ为群体均值；G_j为各位点的基因型效应；E_ijk为随机误差。

结果表明(见表5)：对于SspI可识别的第47569位的SNP位点，CT基因型为优势基因型；性状关联分析表明，在小尾寒羊群体中，CT基因型个体的产羔数显著的高于TT基因型，而在湖羊群体中各基因型个体差异不显著。结果说明CT基因型可以成为一个提高小尾寒羊产羔性状育种速度的分子遗传标记。根据这个研究结果，可以通过选择，建立基因型为CT杂合子小尾寒羊群体，提高其产羔率。

表5 KITLG基因单核苷酸多态性与绵羊繁殖性状之间的关联分析

注：具有相同字母肩标的平均值间差异不显著(P>0.05)，具有不同字母肩标的平均值间差异显著(P<0.05)。

核苷酸序列表

<110> 兰州大学

<120> 一种检测绵羊KITLG基因的单核苷酸多态性的方法及其应用

<160> 2

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

ttatctccag ctttaggg 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

aaggtgactt tggtgaat 18

Claims

1.一种检测绵羊KITLG基因的单核苷酸多态性的方法，其特征在于，包括以下步骤：

以待测小尾寒羊全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增绵羊KITLG基因片段；用限制性内切酶SspI酶切PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳；根据电泳结果鉴定小尾寒羊KITLG基因上单核苷酸多态性位点的基因型；

所述的引物对P为：

上游引物：5’-TTATCTCCAGCTTTAGGG-3’；

下游引物：5’-AAGGTGACTTTGGTGAAT-3’；

所述的单核苷酸多态性位点表现为T或C的单核苷酸多态性，具有TT以及CT两种基因型，电泳结果分别为：TT型表现为358bp和110bp两个条带；CT型表现为468bp、358bp和110bp三个条带；CT基因型为优势基因型。

2.如权利要求1所述的检测绵羊KITLG基因的单核苷酸多态性的方法，其特征在于，所述的PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，34个循环；72℃延伸10min。

3.如权利要求1所述的检测绵羊KITLG基因的单核苷酸多态性的方法，其特征在于，所述的琼脂糖凝胶的质量浓度为1.5-3.0％。

4.如权利要求1所述的检测绵羊KITLG基因的单核苷酸多态性的方法在绵羊辅助选择和分子育种中的应用，其特征在于：所述绵羊选自小尾寒羊。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：建立基因型为CT杂合型的绵羊群体，提高绵羊产羔率。