CN104046626A - 一种与绵羊产羔数性状相关的分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于家畜分子标记制备技术领域，具体涉及一种作为绵羊标记辅助选择应用的与绵羊产羔数性状相关的分子标记的制备方法及其应用。所述的分子标记由FSHR基因克隆得到，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO：1所述。在序列表SEQIDNO：1的第88bp处有1个T88-C88的碱基替换，导致BsiEⅠ-RFLP酶切多态性。本发明还公开了扩增FSHR基因部分DNA序列所用的引物以及用于多态性检测的方法，为绵羊产羔数性状的标记辅助选择提供了一个新的分子标记。

Description

一种与绵羊产羔数性状相关的分子标记及其应用

技术领域

本发明属于家畜分子标记制备技术领域，具体涉及一种作为绵羊标记辅助选择应用的与绵羊产羔数性状相关的分子标记的制备方法及其应用。

背景技术

根据FAO（2012）的统计数据，我国现有绵羊1.87亿只，占世界饲养量（11.69亿只）的16%，居世界首位（http://www.fao.org/home/en/），是最大的羊肉生产和消费国。绵羊的群体遗传改良对保障羊肉供给，促进国民经济发展和提高人们生活水平具有重要意义。绵羊的繁殖性状，尤其产羔数是现代养羊生产中最重要的经济性状之一。随着国家生态保护战略的实施，放牧养羊的空间越来越小，要满足不断增加的羊肉市场需求，只能增加舍饲养羊的数量。舍饲养羊的成本中，母羊饲养的成本占饲养成本的60%以上，提高每只母羊的产羔数能显著增加养羊生产者的经济效益。我国部分地方绵羊品种具有一年四季发情、产羔率高等优良种质特性，其中湖羊和小尾寒羊尤为突出。由于我国地域辽阔、生态经济条件多样，养羊生产受自然条件的制约比较明显，羊肉生产的主体仍是适应性强、繁殖力低、产肉性能低的地方品种及其杂种群体。同时，尽管湖羊和小尾寒羊等品种繁殖性能突出，已经成为原产区乃至部分引种成功地区规模化舍饲养羊的当家母本，由于其肉用性能与国外引进的专门化肉用品种相比仍有很大的差距，在繁育体系不健全、杂交无序的杂种优势利用方式下，相当一部分群体容易在引入地被国外引进的专门化肉用品种改良，其中二代以上的杂种群体繁殖性能明显下降。显然，我国绵羊群体的繁殖性能总体仍然比较低，在舍饲养羊比重不断增大的大背景下，繁殖性能和产肉性能的遗传改良是当前乃至今后一段时间内我国绵羊群体遗传改良的重点，而繁殖性能遗传改良的重点应放在产羔数性状上。

繁殖性状属阈性状，是一种低遗传力（平均0.1）的性状，并且在不同环境和不同饲养条件下产羔数也受到一定影响，因此常规育种方法遗传改良进展缓慢，亟需人们加深对繁殖性状遗传机制的了解，以促进绵羊繁殖性状的遗传改良。繁殖性状受微效多基因控制，而且为加性-显性基因作用模式。随着现代分子生物技术的发展，分子标记已在绵羊生产中广泛应用，并取得了一定成绩。对于绵羊繁殖性状候选基因的研究，最早且作用机制相对最清楚的是FecB基因，它是于1980年由Davis在Booroola绵羊的常染色体上发现的，具有提高排卵率和产羔数等生物学作用（Davis GH等，Segregation of a major gene influencing fecundity in progeny of Booroola sheep. NZJ Agric Res, 1982, 25:525-529；C.J.H.Souza等，Secretion of Inhibin A and Follicular Dynamics throughout the Estrous Cycle in the Sheep with and without the Booroola Gene(FecB). Endocrinology, 1997, 138(12):5333-5340）。之后，Mulsant等和Wilson等几乎同时报道了将FecB基因定位于绵羊6号染色体6q23-31，并发现该基因是由于BMPR-IB基因高度保守的胞内激酶信号区域一个突变（Q249R）的结果（Wilson T等，Highly prolific Booroola sheep have a mutation in the intracellular (ALK-6) that is expressed in both oocyte sand granulosa cells. Biol Reprod, 2001, 1225-1235；Mulsant P等，Mutation in bone morphogenetic protein receptor-IB is associated with increased ovulation rate in Booroola Merino ewes. Proc Natl Acad Sci USA, 2001, 98: 5104-5109）。Souza等将Booroola羊与普通绵羊的cDNA进行比对时发现830bp处有一个A>C突变，使BMPR-IB的胞内信号区第249位氨基酸由Glu变成Arg（Q249R），从而导致Booroola母羊出现超多产羔数基因型（Souza C J等，The Booroola (FecB) Phenotype is assoeiated with a mutation in the bone morphogenetic receptor type IB (BMPR-IB) gene. J Endoerinol, 2001, 169(2):1-6）。随后FecXI、FecXH、FecX2W、GDF9等影响绵羊繁殖性状的候选基因相继被鉴定出来，其中FecXI、FecXH 被定位于Xp11.2-p11.4（Davis G H. Discovery of the inverdale gene (fecXI). Proceeding of the New Zealand Society of Animal Production, 1995(55):289-290）。储明星等采用PCR-SSCP的方法对BMP4基因进行多态性分析，发现其也是影响小尾寒羊产羔数的基因（Chun M X等，Polymorphism of BMP4 Gene and Its Relationship with Prolificacy of Small Tail Han Sheep. Journal of Agricultural Biotechnology. 2008, 16(2):237-241）。董文艳等采用同样的方法发现ESR基因对湖羊产羔数也有显著的影响（董文艳. 湖羊ESR基因的检测及基因型与多态性能的关系. 杭州：浙江大学. 2009）。

FSHR（促卵泡素受体）属G蛋白偶联受体超家族中的糖蛋白亚家族成员，由胞外区、跨膜区和C-末端区构成。它包括至少10个亮氨酸丰富的重复单位（LPR），每个约有24个氨基酸残基。与FSH产生特异性结合的位点位于LPR5-LPR10之间；7个α螺旋构成的跨膜结构是G蛋白偶联受体家族的特征性基序。FSHR基因的cDNA于1990年首次被克隆（Sprengel R等，The testicular receptor for follicle-stimulating hormone:structure and functional expression of cloned cDNA. Mol Endocrinol,1990,4(4):525-530），FSHR突变对生殖表型具有深刻的影响（Aittomaki K等，Mutation in the folliclestimulating hormone receptor gene causes hereditary hypergonadotropic ovarian failure. Cell,1995,82(6):959-968）。FSHR在动物繁殖活动中具有传递促卵泡生长发育生物学信息的作用，其基因突变可能增强或削弱转导FSH信息的功能，对生殖表型具有深刻的影响。人的FSHR基因位于2号染色体短臂2区1带，包括10个外显子和9个内含子（Gmmoll J等，Localization of the human FSH receptor to chromosome 2 p21 using a genomic probe comprising exon 10,Mol.EndocrinoL ,1994(12):265-271；Rousseau-Merck等，The chromosomal localization of the human follicle-stimulating hormone receptor gene on 2p21-p16 is similar to that of the luteinizing hormone receptor gene,Genomics,1993(15):222-224）。Satoko Sudo等（2002）用PCR-SSCP分析FSHR基因多态性，检测其基因型频率，研究表明激素水平及一些妇科病与FSHR基因多态性相关。国内在二花脸猪上检测到了FSHR基因座位的多态性，研究结果表明，在FSHR基因座位发现的这个PCR-SSCP标记与二花脸猪的产活仔数显著相关，基因型的不同可导致猪的产活仔数有显著差异（陈杰等，二花脸猪足嗍位PCR-SSCP标记与产活仔数的关系．南京农业大学学报，2002，25(3)：53-56）。Rahal等报道，牛FSHR基因的第10外显子存在多态性（Rahal P等，Polymorphisms in the bovine follicle—stimulating hormone receptor gene.Anita Genet,2000，31(4)：280-281）。雷雪芹等以秦川牛和荷斯坦奶牛的双胎母牛和单胎母牛为实验材料，以牛的FSHR基因的第10个外显子作为标记牛双胎性状的候选基因，用SNP法进行了多态检测，得出FSHR基因的第10个外显子有可能作为双胎性状的候选基因的这一结论（雷学芹等，牛FSHR基因第l0外显子单核苷酸多态性及其与双胎性状的关系．中国生物化学与分子生物学报．2004，10(1)：34-37）。

通过以上资料我们可以得出FSHR基因参与动物繁殖调控过程并发挥着重要的作用。寻找基因中的变异位点，通过与性状间的关联分析发现基因与性状间的关系是研究基因功能的一个重要手段，也是进行标记辅助选择的基础。为此开展了绵羊FHSR基因部分5’-UTR（Untranslated Regions，非翻译区）序列的克隆和SNP筛查、检测及与产羔数性状关联分析。

发明内容

本发明的目的在于克隆一种作为绵羊标记辅助选择的与绵羊产羔数性状相关的分子标记，并建立适用于绵羊产羔数性状的分子标记的方法。

本发明通过以下技术方案实现：

申请人从绵羊FSHR基因片段中克隆得到一种作为绵羊标记辅助选择的与产羔数性状相关的分子标记，它位于绵羊FSHR基因5’-UTR，其序列如序列表SEQ ID NO：1所示。该序列的第88bp处有一个T88- C88的碱基替换，并导致BsiEⅠ-RFLP酶切多态性。

本发明还提供用于检测上述分子标记的引物或探针。所述引物至少能特异性地扩增SEQ ID NO：1所示的序列或其特异性片段，该片段至少包括所述序列的第88位碱基。本领域技术人员只要从样品中特异性地扩增出该片段，通过现有的检测手段即可判断所述序列的第88bp处是否发生了T88- C88的碱基替换，从而能够对绵羊进行分子辅助选择。对于所述的特异性引物，本领域技术人员可以遵照《分子克隆实验指南》第三版的相关内容进行设计和筛选，或者是按照本领域的公知常识进行设计和筛选。

优选地，用于检测所示序列SEQ ID NO：1的第88bp处有一个T88-C88的碱基替换的引物对的DNA序列如下所示：

正向引物：5’- CGTATCTTTCCACGCCCTCT - 3’，

反向引物：5＇- CCATCCACCCGATTGCTT - 3＇。

本发明还提供含有上述引物或探针的检测试剂盒。

应用常规的PCR-RFLP的方法对序列表SEQ ID NO：1的第88位碱基突变进行了检测，同时申请人将上述克隆的分子标记成功地应用于与绵羊产羔数性状相关分子标记辅助选择的关联分析上，表明本发明的分子标记及相关检测手段能够有效地对绵羊进行分子辅助选择，为绵羊育种提供了良好的技术手段，降低了成本，提高了效率，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1：绵羊FHSR基因部分5’-UTR片段和PCR-RFLP检测的DNA片段凝胶电泳图。

图2：是本发明中绵羊FSHR基因BsiEⅠ-RFLP的三种基因型(CC， TC， TT)电泳结果。图中M：DNA分子量标准（DL2000 ladder），其中2、3、6、8、9、11、15泳道为TT型，1、4、5、7、10、13、14泳道为TC型，12和16泳道为CC型。

具体实施方式：

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。

实施例1、FSHR基因部分5’-UTR序列的克隆

（1）引物设计

根据绵羊FSHR基因序列(GenBank收录号：NC_019460.1)，利用Primer5.0软件设计上下游引物M-F和M-R，序列如下

FHSR：      M-F：5＇- CGTATCTTTCCACGCCCTCT - 3＇，

             M-R：5＇- CCATCCACCCGATTGCTT - 3＇。

（2）PCR产物的克隆和测序

将纯化后的PCR产物与pMD-18 T载体（购自Takara）在4℃水浴连接过夜；无菌状态下取100~120 μl 感受态细胞于1.5 ml Ependorff 管中，将5 μl的连接产物加入混匀，在冰上放置30 min，42℃ 热激90 s，后冰浴3~4 min，加入400 μl无抗生素的LB液体培养基，37℃振荡培养45 min。取100 μl涂布于异丙基硫代－β-D－半乳糖苷（IPTG)X-gal的琼脂平板上，37℃平放1 h后倒置培养。挑取平板上的单菌落，接种于2~3ml LB中，37℃300r/min培养过夜。用1.5ml EP管12,000r/min离心数秒收集菌体进行制备少量的质粒。验证后的重组质粒采用双脱氧末端终止法在DNA自动测序仪上进行测序，序列测定由上海桑尼生物技术有限公司完成，得到一条长度为244bp的UTR序列（见SEQ ID NO：1 所示），该序列的第88bp处有一个T88- C88的碱基替换。

DNA序列同源性检索鉴定：

通过美国国家生物技术信息中心（NCBI, National Center for Biotechnology Information, http:// www.ncbi. nlm.nih.gov）网站的BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）软件，将测序后获得的DNA序列与GenBank数据库中公布的已知生理功能基因进行序列同源性比较，以鉴定和获得该DNA序列的功能信息。检索结果表明所测序列与绵羊FSHR基因DNA(GenBank收录号：NC_019460.1)的部分序列同源性达96%。

实施例2、PCR-RFLP诊断方法的建立

（1）、引物序列

FSHR:       M-F：5＇- CGTATCTTTCCACGCCCTCT - 3＇，

             M-R：5＇- CCATCCACCCGATTGCTT - 3＇。

（2）PCR扩增条件

PCR反应总体积20μl，其中绵羊基因组DNA约100 ng，含1×的buffer (购自Promega公司)，1.5 mmol/L MgCl₂，dNTP 终浓度为150 μmol/L，引物终浓度为0.4 μmol/L ，2U Taq DNA聚合酶（Promega）。PCR扩增程序是：94℃ 3 min，循环35次 94℃ 30 s， 58℃ 30 s，然后72℃ 25s，最后72℃延伸5min。PCR反应产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测。结果如图1所示。扩增获得244bp特异片段，该片段位于5’-UTR。测序的结果发现在该244bp片段中存在一个BsiEⅠ酶切位点(CGRY↓CG)，其中第90bp处为多态性切点，位于5’-UTR中。

（3）PCR-RFLP 检测条件

PCR产物酶切反应体积是10μl，其中1×buffer 1μl，PCR产物3~5 μl，限制性内切酶BsiEⅠ0.3μl (10U)，用H₂O补足10μl，将样品混匀后离心，37℃水浴4h，用2%琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，在紫外灯下拍照，并记录基因型。对该位点两个纯合子的测序结果显示，当第88bp位置是T时，则该BsiEⅠ酶切位点不存在，BsiEⅠ酶切后检测结果只有1个片段，长度是244bp（定为等位基因T）；但存在T88→C88的替换时，其结果导致第90bp处一个BsiEⅠ酶切位点的产生，得到2个片段，长度分别为90bp和154bp（定为等位基因C），三种基因型TT，TC，CC如图2所示。

（4）本发明的分子标记在绵羊产羔数相关性状关联分析中的应用

试验共检测了18只杜泊羊，761只湖羊，869只小尾寒羊，106只杜湖F₁代（♂杜泊羊×湖羊♀），144只美湖F₁代（♂南非肉用美利奴×湖羊♀）的多态性，确定其基因型，并进行基因型与产羔数的关联分析。

建立如下所述的最小二乘模型：

Y_ijkl=μ+ Genotype_i+ Breed_i+P_k+S_l+Combination_m+ε_ijklm。

其中，Y_ijkl是性状观察值，μ为总体均数，Genotype_i为基因型效应，Breed_j为品种效应，P_k为胎次效应，S_i为季节效应，Combination_l为组合的效应，ε_ijkl为随机误差，假定ε_ijkl相互独立，服从N（0，σ²）分布。基因型检测结果表明在1898个个体中CC基因型，有55个，TC基因型有1177个个体，TT基因型有666个个体。基因型与性状关联分析的结果是：FSHR基因与产羔数呈显著相关。

由表1可知，FSHR基因SNP位点对产羔数有极显著影响（P<0.01），其中CC基因型个体的产羔数极显著，显著高于TC和TT基因型个体的对应值，TC基因型个体的对应值居中，TT基因型个体的对应值最低。

表1:绵羊FSHR基因BsiEⅠ-RFLP酶切位点的多态性对产羔数性状的影响

注：*表示P<0.05，**表示P<0.01。表中性状值为平均数±标准误。

 

序列表

<110>  兰州大学

<120>  一种与绵羊产羔数性状相关的分子标记及其应用

<130>  PN140623-02

<160>  3     

<170>  PatentIn version 3.5

<210>  1

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  1

cgtatctttc cacgccctct                                                   20

<210>  2

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  2

ccatccaccc gattgctt                                                     18

<210>  3

<211>  244

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<221>  mutation

<222>  (88)..(88)

<400>  3

cgtatctttc cacgccctct acttttccca ccccaccccc cccaaagcca ctgcggccat       60

tcggaaattt tgttattttt ttggaagyga cggataaaaa aggaaaaaaa ggaaagcggc      120

cctgggcggg tcacgtgacc ctaccagctc ccaatgcaga cctcttctca aaagggctca      180

gtgtggagcc tcagaaatcc gggcaggatt gtgtctgcca aaaccaaagc aatcgggtgg      240

atgg                                                                       244

序列表

 

<110>  兰州大学

 

<120>  一种与绵羊产羔数性状相关的分子标记及其应用

 

<130>  PN1406233-02

 

<160>  3    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

cgtatctttc cacgccctct                                                   20

 

 

<210>  2

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

ccatccaccc gattgctt                                                     18

 

 

<210>  3

<211>  244

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

 

<220>

<221>  mutation

<222>  (88)..(88)

 

<400>  3

cgtatctttc cacgccctct acttttccca ccccaccccc cccaaagcca ctgcggccat       60

 

tcggaaattt tgttattttt ttggaagyga cggataaaaa aggaaaaaaa ggaaagcggc      120

 

cctgggcggg tcacgtgacc ctaccagctc ccaatgcaga cctcttctca aaagggctca      180

 

gtgtggagcc tcagaaatcc gggcaggatt gtgtctgcca aaaccaaagc aatcgggtgg      240

 

atgg                                                                       244

Claims (5)

1.一种克隆的与绵羊产羔数性状相关的分子标记，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，所述序列的第88bp处有1个T88- C88的碱基替换。

2.用于检测权利要求1所述分子标记的PCR引物或探针。

3.检测权利要求1所述分子标记的碱基突变引物对，所述引物对的正向引物为5’- CGTATCTTTCCACGCCCTCT - 3’，反向引物为5＇- CCATCCACCCGATTGCTT - 3＇。

4.含有权利要求2的引物或探针或权利要求3所述的碱基突变引物对的检测试剂盒。

5.权利要求1所述的分子标记、权利要求2所述的引物或探针、权利要求3所述的碱基突变引物对或权利要求4所述检测试剂盒在绵羊标记辅助选择中的应用。