CN103224941B - 一种检测猪肉质性状相关的分子标记及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于家畜分子标记制备技术领域，具体涉及一种作为猪标记辅助选择应用的与猪肉质性状相关的分子标记的克隆及应用。所述的分子标记由GAS6基因克隆得到，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所述。在序列表SEQ ID NO：1的第333bp处有一个A/G的碱基突变，导致PCR-RFLP-Bgl I多态性。本发明还公开了扩增基因DNA序列所用的引物以及用于多态性的检测方法。本发明为猪肉质性状标记辅助选择提供了新的分子标记。

Description

一种检测猪肉质性状相关的分子标记及应用

技术领域

本发明属于家畜分子生物学技术领域，涉及一种包含如SEQIDNO：1所示猪基因核苷酸的核酸分子。本发明还涉及如SEQIDNO：1所示的多核苷酸序列中的单核苷酸多态性位点以及检测所述单核苷酸多态性位点的方法。

背景技术

猪肉是我国城乡居民动物性蛋白的主要来源，随着人们对肉品需要量的增加，对肉质质量的要求也相对提高。而这主要是由基因控制，并存在主基因效应。分子生物技术的发展，使人们可以在DNA水平寻找控制肉质性状的主基因或与其紧密连锁的分子标记，在育种过程中应用于标记辅助选择，以提高选择进程，更好地改善猪肉质性状，满足人们的需要，以获得更大的经济效益。

生长抑制特异因子6基因（GrowthArrest-specificgene6，GAS6）最先是从小鼠肌肉中克隆的基因，GAS6蛋白是Axl（Anexeleto）、Met（Methionine）及Sky(Tyro3)等几个受体酪氨酸激酶亚家族（TAM）成员的配体，其分子结构包括与磷脂和膜蛋白结合的氨基末端和与受体酪氨酸激酶亚家族成员（Axl、Met及Sky）结合的羧基末端，N端是Gla（gamma-carboxyglutamicacid）区，含有11-12个γ-羧基谷氨酸基，中间部分是4个表皮生长因子样(endoth-elialgrowthfactor，EGF)重复区，C端是性激素连接球蛋白样区(sexhormone-bindingglubin，SHBG)，是与Axl受体结合的区域。Gla区在Ca²⁺参与下，与带负电荷的磷脂结合，参与细胞的粘附和识别；EGF区与膜分子的结合有关；SHBG区引起Axl，Mer的磷酸化，参与信号途径，与细胞的存活、增殖、生长调节有关。Gla区和EGF区都不单独起作用，但两者可能直接或间接促进SHBG区与受体的结合，并在体内调节GAS6蛋白的活性。

GAS6蛋白含有678个氨基酸，并发现其氨基酸序列与人抗凝血S蛋白的同源性为46%且有共同的分子结构（S蛋白是一种血液共调节途径VK依赖的负调控因子），与小鼠的同源性为81%。GAS6蛋白和S蛋白在γ-羧化谷氨酸富集域和4个EGF-like域相似程度最大。

但是，目前国内外关于猪GAS6基因的相关研究很少。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：针对上述现有技术的不足，提供一种猪肉质性状相关基因GAS6及其在猪标记辅助选择中的应用，为猪标记辅助选择提供新的分子标记。

为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案是：一种猪肉质性状相关基因GAS6在猪分子标记辅助选择中的应用，该猪肉质性状相关基因GAS6基因的DNA序列如SEQIDNO：1所示的第333bp处有一个A/G的碱基突变，导致PCR-RFLP-BglI多态性。

上述GAS6基因的多态性是利用比较基因组学方法根据人的GAS6基因的保守区设计引物，以猪的基因组DNA为模板扩增，扩增片段利用SSCP技术和测序技术发现SNP，并利用PCR－RFLP进行基因分型，再利用SAS软件GLM（通用线性模型）分析SNP与肉质性状的关联。

申请人通过克隆得到一种与猪肉质性状相关的基因片段，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO：1所述。序列表SEQIDNO：1的333bp处有1个A/G的碱基突变，导致PCR-RFLP-BglI多态性。

制备了检测上述序列表SEQIDNO：1基因片段突变的引物对，所述引物对，

正向引物为5′-GAGTGCCAAGGAGCAGAAAT-3′。

反向引物为5′-CCCGCTAAGGTGTGTTTGTT-3′。

利用上述制备的与猪肉质性状相关的分子标记对外来猪种和中国地方品种进行了关联分析的应用，从而完成了本发明。

SNP发现与检测方法建立：申请人设计了扩增包含该SNP引物，经分析A/G位点的突变可以采用BglI进行酶切检测多态性。在扩增的516bp的片断上，存在1个BglI的酶切位点，2%琼脂糖凝胶电泳检测结果显示在GAS6基因的A/G位点存在3种基因型，AA型（516bp）、AG型（183bp、333bp、516bp）和GG基因型（183bp、333bp）。

基因型－肉质性状间关联结果：利用SAS软件中的一般线性模型（GeneralLinearModel,GLM）程序对基因型与性状进行关联分析，模型如下为Y_ijkn=μ+h_i+l_j+g_k+ε_ijkn，Y_ijkn为性状表型值，μ为总体均数，h_i为牧场效应，l_j为年代效应，g_k为GAS6基因型不同位点对性状的效应，ε_ijkn为随机误差效应，服从正态分布（0,σ²）。分析表明GAS6基因SNP位点有显著影响（P<0.05），此位点对其它肉质性状没有显著影响。

本发明将为猪肉质性状的分子标记，为标记辅助选择（MAS）奠定坚实的基础，进一步阐明肉质性状的分子机制，将为改善猪肉品质提供理论依据，提高养猪生产经济效益，并指导猪的育种实践。

附图说明

图1是本发明的GAS6基因片段的PCR扩增产物的电泳结果图；图中：M：100bpDNALadderMarker，1-6表示泳道。

图2是本发明的GAS6基因A333G位点的BglI酶切电泳结果；图中：泳道5,7：AG基因型；泳道1,2,4,6：GG基因型：泳道3：AA基因型；M：100bpDNALadderMarker。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作进一步地解释，但具体实施并不对本发明做任何限定。

PCR-RFLP技术检测GAS6基因的BglI多态性。

引物设计：利用比较基因组学方法根据人的GAS6基因（GenBank收录号为KC526197）的第12内含子到第13内含子，以该基因在GenBank作BLAST序列比对后筛选出GAS6基因候选SNPs位点，选取GAS6基因的第2056bp候选SNPs位点，以KC526197序列为标准，设计特异性引物，用这些引物来扩增从猪耳组织提取的基因组DNA。

引物为：F：5′-GAGTGCCAAGGAGCAGAAAT-3′，

R：5′-CCCGCTAAGGTGTGTTTGTT-3′

PCR条件所需的DNA提取：DNA样品来自8个品种共887头，其中益阳农科所种猪场杜洛克猪56头、大白猪118头；湘潭北农大种猪场大白猪106头；岳阳正虹种猪场大白猪362头，新五丰猪场长白猪46头；地方品种宁乡猪68头、桃源黑猪69头、大围子猪49头、沙子岭猪77头和五指山猪55头。取小块供试猪耳组织提取DNA。

PCR条件：PCR反应体系（总体积20μL）：10×Buffer2μL，2mmol/LdNTPs1.6μL，20mmol/LMgCl₂1.6μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.4μL，DNA模板（100ng/μL）1μL，上下游引物（10pmol/μL）各0.4μL，ddH₂O12.6μL。

PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸40s，共35个循环；72℃后延伸10min，最后4℃保存。

取10μLPCR扩增产物，加2μL溴酚蓝上样缓冲液混匀后，点样于2%的琼脂糖凝胶（含0.05%EB）上，然后点6μL100bpDNAMarkers作为参照。5V/cm电泳0.5～1.0h。电泳结束后在凝胶成像系统中观察扩增结果并拍照，结果如图1所示。将纯化后的PCR产物送铂尚生物技术公司测序。

PCR产物的BglI酶切：在10μLPCR产物中加入8μL10×内切酶缓冲液、0.2μL限制性内切酶和2μL双蒸水，总体积为20.2μL，37℃消化10h。A/G位点用1%琼脂糖凝胶电泳分析，5V/cm电压电泳0.5h，紫外灯下观察结果并拍照，酶切结果如图2，扩增产物进行测序，序列如SEQIDNO：1所示，扩增片断为猪GAS6基因的1873bp到2388bp，为第12内含子到第13内含子的片断，共516bp，为PCR-RFLP-BglI分子标记，图1是本发明中GAS6基因PCR-RFLP的三种基因的AA、AG和GG电泳结果。图中M：DNA分子量标准（DL100bpladder），图2是本发明的GAS6基因A333G位点的BglI酶切电泳结果。

本发明选择猪GAS6基因作为猪肉质性状的候选基因，以5个地方猪种(宁乡猪、桃源黑猪、大围子猪、沙子岭猪和五指山猪)和3个外来猪种(杜洛克猪、大白猪、长白猪)为试验材料，采用PCR-RFLP方法对GAS6基因A/G位点的基因频率、基因型频率进行检测，并分析其遗传结构，分析该基因与肉质性状的相关性。

PCR-RFLP-BglI多态性在各品种中的分布情况如下表1所示，由表1可以看出，在宁乡猪、大围子猪、沙子岭猪、桃源猪、五指山猪这5个地方品种中G基因为优势等位基因，其中沙子岭猪G基因频率最高（0.8636），而在3个外来品种杜洛克猪、长白猪、大白猪中G基因也为优势等位基因，G基因频率最高（0.9029）；从基因型分布频率看，GG型占优势。

表1不同品种GAS6基因A/G位点的基因频率与基因型频率

本发明的分子标记在猪肉质性状标记性状关联分析中的应用。

运用SAS8.02（StatisticalAnalysisSystem）统计软件对GAS6基因型与猪肉质性状进行关联分析。模型如下：

Y_ijkn=μ+h_i+l_j+g_k+ε_ijkn

Y_ijkn为性状表型值，μ为总体均数，h_i为牧场效应，l_j为年代效应，g_k为GAS6基因型不同位点对性状的效应，ε_ijkn为随机误差效应，服从正态分布（0,σ²）。

表2猪GAS6基因A/G位点与肉质性状关联分析表

由表2可知，在杜洛克猪中，AA基因型熟肉率比GG基因型熟肉率提高了5.66％(p<0.05)，而失水率则显著高于GG基因型，多了3.76%(p<0.05)；AA基因型的贮存损失低于GG基因型，为0.24%（p<0.05），AA、AG和GG基因型pH值、肉色等级和大理石纹之间差异均不显著。在大白猪中，AA和AG基因型瘦肉率、失水率和贮存损失与GG基因型差异并不特别显著，其中AA型熟肉率比GG型提高了1.63％(p<0.05)，AA型失水率低于GG型1.8％(p<0.05)，AA和AG基因型之间差异不显著，AA型贮存损失低于GG型0.28％(p<0.05)；AA、AG和GG基因型pH值、肉色等级和大理石纹之间差异均不显著。在长白猪中，AA基因型贮存损失低于GG基因型0.3％（p<0.05），其它性状上的差异均未达到显著水平。在杜长大三元杂中，GG基因型的瘦肉率要比AA基因型高3.74%（p<0.05）；而贮存损失则高于AA基因型，多了0.7%（p<0.05）；失水率比AA基因型低了2.54%（p<0.05）；AA、AG和GG基因型pH值、肉色等级和大理石纹之间差异均不显著。

Claims (2)

1.一种检测与猪肉质性状相关的GAS6基因片段的方法，按照以下步骤进行：序列表SEQIDNO：1所示的GAS6基因的333bp处存在的A/G的碱基突变，导致PCR-RFLP-BglI多态性；

利用正向引物为5′-GAGTGCCAAGGAGCAGAAAT-3′，反向引物为5′-CCCGCTAAGGTGTGTTTGTT-3′的引物进行PCR扩增，PCR产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，利用限制性内切酶BglI对PCR产物进行酶切鉴定，最后用2％琼脂糖凝胶电泳检测AA、AG和GG基因型的分布。

2.一种将猪肉质性状相关的基因片段作为分子标记在猪肉质性状辅助选择中的应用，序列表SEQIDNO：1所示的GAS6基因的333bp处有1个A/G的碱基突变，导致PCR-RFLP-Bgl1多态性。