CN101921770A - PPAR α基因及其作为鹅脂肪性状遗传标记的用途 - Google Patents
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Abstract
一种PPARα(过氧化物酶体增值物激活受体)基因及其作为鹅脂肪性状遗传标记的用途，测定出PPARα基因中与鹅腹脂重、腹脂率相关的遗传标记，并测定从鹅获得的核酸样品中PPARα基因中多态性的存在，该多态性是与腹脂重、腹脂率相关的多态性，并可根据该基因的单核苷酸多态性可对基因组DNA中含有PPARα基因的动物进行脂肪性状选育，筛选出降低鹅腹脂重、腹脂率的优势基因型，具有极其重大的应用价值和经济效益。
Description
技术领域：
本发明涉及鹅的分子生物学技术及育种领域，具体是涉及测定与腹脂重、腹脂率相关特征的遗传标记的存在，更具体地说，是测定PPARα基因中的多态性，即与腹脂重和腹脂率相关的鹅过氧化物酶体增值物激活受体(PPAR)基因的单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，缩写为SNP)的存在。
背景技术：
现代家禽遗传育种理论和应用的发展，使肉用家禽特别是肉鸡、肉鸭的生长速度和饲料效率大幅度提高，生产效率与工厂化生产逐相适应。但同时也容易带来胴体腹部脂肪和皮下脂肪的大量沉积，导致饲料能量的浪费和胴体品质不佳。
PPAR(Peroxisome Proliferators activated receptors)属于核激素受体超家族，它能够调控许多参与细胞内外脂类代谢的目的基因，还参与脂肪细胞分化。PPAR有三种亚型：α、β、γ。PPARα的目标基因是一组参与脂类分解的基因，能调控肝脏过氧化物酶体β氧化；PPARγ参与脂肪细胞的分化及细胞内外脂类代谢相关目标基因的调控，影响脂肪酸在脂肪组织中贮存，对脂肪生成起作用，大部分PPARγ的目标基因直接参与脂肪合成途径，包括脂蛋白脂酶(LPL)、脂肪酸结合蛋白(FABP)、乙酰酰辅酶A合成酶和脂肪酸转运蛋白(FATP)。鸡PPARα基因的cDNA长593bp、CDS(mRNA反转录产物PCR的产物)为1407bp。孟和等对PPAR基因作为鸡脂肪性状候选基因的可能性做了研究，结果表明：用7对引物对AA肉鸡PPARα基因全编码区用PCR-SSCP方法进行扫描后发现引物4扩增片段上有一个C-T的单碱基突变，从而鸡群出现AA、AB、BB三个基因型。BB基因型的腹脂重和腹脂率显著较高，从而推测PPARα基因可能是影响鸡脂肪代谢的主效基因或与主效基因连锁，可用于鸡脂肪性状的分子标记辅助选择。孟和等的研究结果表明：PPARα和PPARγ的不同基因型在地方鸡、蛋鸡、肉鸡中的频率存在差异；PPARα三种基因型与腹脂、腹脂率间极显著相关，其中BB型腹脂和腹脂率最高，AA型最低。PPARγ的三种基因型间不存在此类相关。用Northern杂交法可知PPARγ基因在鸡的脂肪组织和肾脏中高量表达。推测PPARα与脂肪代谢、沉积密切相关。解相林等报道，PPAR基因单核苷酸多态与脂肪性状存在显著相关，李春雨等研究表明，鸡的PPARγ基因SNPs在沉默突变的情况下仍然与腹脂重、腹脂率等存在显著关系，推测PPARγ基因可作为鸡体脂肪性状的主效基因。
但是，目前有关鹅的DNA遗传标记、遗传多样性和相关功能基因的研究相对鸡来说还很少，且没有关于鹅PPARα基因的研究报道。
发明内容：
本发明所要解决的技术问题是：针对上述现有技术的不足，提供一种PPARα基因及其作为鹅脂肪性状遗传标记的用途；同时筛选与鹅脂肪性状相关的SNP，以期应用于标记辅助选择或标记辅助渗入，并提供上述遗传标记在鹅标记辅助选择中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种PPARα基因，是与表示鹅脂肪性状指标的腹脂重、腹脂率相关的基因，其DNA的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。该序列的第220碱基处有一个碱基突变C220-T220。
克隆PPARα基因所用引物的序列如下：
正向引物：5’-AATCACCCAGTGGAGCAG-3’，
反向引物：5’-CAGACCTTGGCATTCGTC-3’。
所述PPARα基因在鹅遗传标记辅助选择中的应用。
一种鉴定鹅脂肪性状的遗传标记的方法，该鹅具有与表示脂肪性状指标的腹脂重、腹脂率相关的基因，该方法包括：测定从鹅获得的核酸样品中PPARα基因中多态性的存在，该多态性是与表示鹅脂肪性状指标的腹脂重、腹脂率相关的多态性，该多态性在PPARα基因序列的220bp处有一个C→T的突变。
上述方法具体包括如下步骤：
(1)根据GenBank中鸡PPARα基因的mRNA序列，用Primer 5.0设计引物，覆盖该基因部分编码序列，再获得鹅基因组DNA；
(2)以上述鹅基因组DNA为模板，PCR扩增，产物纯化，克隆，获得如序列表SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列；
(3)鉴定该基因序列的第220碱基处是否存在多态性。
所述引物为：正向引物：5’-AATCACCCAGTGGAGCAG-3’，
反向引物：5’-CAGACCTTGGCATTCGTC-3’。
上述步骤(3)中PPARα基因序列第220碱基处的多态性是指一个碱基突变C220-T220。
上述方法还包括根据PPARα基因中多态性的测定结果，选出具有与所需特征相关的鹅进行育种。
现代家禽遗传育种理论和应用的发展，使肉用家禽特别是肉鸡、肉鸭的生长速度和饲料效率大幅度提高，生产效率与工厂化生产逐相适应。但同时也容易带来胴体腹部脂肪和皮下脂肪的大量沉积，导致饲料能量的浪费和胴体品质的不佳。针对这个问题，本发明人选择鹅作为研究对象，采用分子生物学的方法筛选鹅脂肪性状相关基因，其步骤如下：
(1)选择相同日龄的健康雏苗洞庭草鹅配套系商品鹅200只进行饲养试验。
所有供试鹅于84日龄进行屠宰测定，测定和计算按照《畜禽遗传资源调查技术手册》中的“家禽生产性能名词术语和度量统计方法”进行。用电子秤测定屠体重、全净膛重、肝脏重、腹脂重和用卡尺测量皮脂厚等。计算胴体脂肪性状比率指标。
(2)根据PPARα基因的序列设计引物，对样品进行扩增、测序；
(3)筛选与腹脂率高低相关的SNP。
本发明采用PCR与DNA测序结合的方法首先筛选出PPARα基因为鹅脂肪沉积的相关基因，继而从鹅PPARα基因上筛选到与性状相关的SNP，并且通过生产实践验证确定PPARα基因为脂肪沉积相关基因，筛选的SNP为与之相关的SNP。本发明筛选的鹅PPARα基因的SNP可作为鹅辅助选择的遗传标记，从而培育出腹脂更少的鹅，具有极其重大的应用价值和经济效益。
附图说明：
图1是本发明的鹅PPARα基因的部分序列，220bp处的变异位点用()标出表示。
图2是本发明的鹅PPARα基因部分序列的PCR-SSCP电泳图。
具体实施方式：
下面结合具体实施例对本发明作进一步地解释，但具体实施例并不对本发明做任何限定。
实施例1鹅相关基因SNP筛选
选择相同日龄的健康雏苗洞庭草鹅配套系商品鹅200只进行饲养试验。对该些鹅进行高腹脂型和低腹脂型鉴定，并从高腹脂型和低腹脂型样本中分别提取其基因组DNA。
根据GenBank中鸡PPARα基因的mRNA序列，用Primer 5.0设计引物，覆盖该基因部分编码序列，引物序列为：5’AATCACCCAGTGGAGCAG 3’(SEQ ID NO：2，正向)，5’CAGACCTTGGCATTCGTC 3’(SEQ ID NO：3，反向)，由上海英韦创津公司合成。用上述引物分别对提取的鹅基因组DNA进行扩增。
PCR：10μl反应体系：10×buffer(含Mg2+)1μl，上、下引物(20μmol/L)各0.15μl，dNTPs(10μmol/L)0.2μl，Taq酶1U，DNA(100ng)0.7μl，超纯水补至所需体积。
PCR扩增程序：94℃5分钟预变性后30个PCR循环参数为：95℃30秒，57℃30秒，72℃30秒，最后72℃7分钟。
取扩增产物5μl，加入变性剂(95％甲硝铵)10μl，95℃变性10分钟，再冰浴5分钟后，点样于15％的聚丙烯酰胺凝胶上电泳(丙烯酰胺/N，N’-亚甲基双丙烯酰胺为29∶1)，电压保持在80～100V，常温下电泳约16～18小时，直至兰色溴酚蓝染料至凝胶最底端为止。凝胶用硝酸银染色，结果参见图2，SSCP分析结果表现为：鹅PPARα基因部分DNA片段有三种不同条带类型，说明该DNA片段存在SNP。三种不同条带类型分别定义为AA型和BB型，杂合型定义为AB型。
取PCR扩增产物50μl，产物纯化后送上海英韦创津公司测序，测序结果确证了PCR产物是PPARα基因，PCR产物的长度为240bp，序列如序列表中的SEQID NO：1所示。将鹅PPARα基因片段序列与其它16个物种的GenBank中已登录的PPARα基因序列进行同源性比对，结果表明：鹅PPARα基因片段序列与番鸭、家鸭、鼠等动物有95％以上同源性，而与鸡、人、牛、羊等动物的有80％以上，进一步说明PPARα基因在进化过程中有较高的保守性。
将上述产物进行氨基酸序列分析，结果如下(见SEQ ID NO：4)：
KNKNIVGIKPQATITEYMLVKVVRVFLGEQSD-NSSMINAIAIAKFRKKIVISANTVVFRSAFQLECHIMQYVLDECQGL
氨基酸序列分析表明，鹅PPARα基因序列的一个碱基突变没有导致该基因在表达时所转录的蛋白质中氨基酸序列发生变异，即沉默突变。
上述实验结果表明，从鹅腹部脂肪提取的鹅脂肪性状相关基因为PPARα基因，并且在该基因序列中筛选到与腹脂沉积有关的SNP，很可能这就是影响腹脂沉积的原因。
实施例2鹅PPARα基因多态性在各品种中的分布情况
由下表1所示，可知该群体样本属于非平衡群体，这与该群体是由两品种杂交而成的商品鹅基本相符。在本次研究检测的群体中，A基因频率显著低于B基因频率；纯合子基因型AA和BB频率较低，而杂合子基因型频率偏高。
表1基因频率、基因型频率表
| 基因型 | 样本数 | 基因型频率 | 期望频率 | 基因 | 基因频率 |
| AA | 23 | 0.126 | 0.155 | A | 0.393 |
| BB | 62 | 0.341 | 0.368 | B | 0.607 |
| AB | 97 | 0.533 | 0.477 |
实施例3与腹脂率有关的SNP在生产实践中的验证
选择相同日龄及相同饲养管理条件的健康洞庭草鹅182只进行饲养试验。所有供试鹅于84日龄进行屠宰测定，宰前测定体重并采集血样2ml/只，并对屠体再进行称重和胴体脂肪性状测定。
采集高腹脂型和低腹脂型的鹅各30头血样，提取基因组DNA，利用实施例1中的引物扩增，并按照实施例1的方法检测其SNP。
1、PCR
PCR反应体系，如下所示：
成分 用量(μl) 终浓度
10倍缓冲液 4.0 1X
MgCl2 4.0 2.5mM
dNTPs 0.8 0.2mM
F引物 0.2 0.2μM
R引物 0.2 0.2μM
Taq酶 0.4 1U
DNA模板 0.8 50-500ng
总体积 40
PCR循环参数如下：
34个循环：94℃，4min；94℃，30s；59℃，40s。
72℃，7min。
2、PPARα基因型与鹅脂肪性状的相关分析
2.1不同基因型对溆浦鹅脂肪性状的影响
分析不同SNP基因型对洞庭草鹅脂肪性状的影响，结果见表2。从下表2中可见：不同SNP基因型对洞庭草鹅的腹脂重、腹脂率有显著影响；其中AA型和BB型腹脂重显著低于AB型(p＜0.05)，AA型和BB型的腹脂重差异不显著(P＞0.05)；BB型腹脂率显著低于AB型(P＜0.05)，AA型和BB型之间差异不显著(P＞0.05)；不同基因型之间的肝脏重、皮脂厚和肝脏率差异不显著(P＞0.05)。
表2SNP基因型对脂肪性状的影响
| 基因型 | 数量 | 腹脂重(g) | 肝脏重(g) | 皮脂厚(mm) | 腹脂率(％) | 肝脏率(％) |
| AA | 62 | 12.06±1.51b | 52.8±3.20 | 1.71±0.27 | 0.62±0.11ab | 1.93±0.20 |
| BB | 23 | 11.41±1.25b | 50.6±3.76 | 1.66±0.25 | 0.57±0.09b | 1.96±0.18 |
| AB | 97 | 12.94±1.78a | 52.3±2.96 | 1.64±0.28 | 0.68±0.10a | 2.02±0.21 |
注：同一列肩注字母相同为差异不显著(p＞0.05)；不同小写字母为差异显著(p＜0.05)。
2.2SNP基因型对性状贡献率
洞庭草鹅不同SNP基因型对脂肪性状贡献率的计算结果见表3。由表3可见，如选择AB基因型将对洞庭草鹅腹脂率产生显著(p＜0.05)的正向贡献率5.263％；而选择BB基因型对洞庭草鹅腹脂重、腹脂率产生显著(p＜0.05)的负向贡献率-8.331％和-11.765％；如选择BB基因型对洞庭草鹅脂肪性状无明显贡献率(P＞0.05)。
表3SNP基因型对脂肪性状的贡献率
| N | 腹脂重(g) | 肝脏重(g) | 皮脂厚(mm) | 腹脂率(％) | 肝脏率(％) | |
| μ | 182 | 12.447 | 52.255 | 1.666 | 0.646 | 1.982 |
| AA | 62 | -0.387 | 0.545 | 0.044 | -0.026 | -0.052 |
| CP | -3.109 | 1.043 | 2.641 | -4.025 | -2.624 | |
| BB | 23 | -1.037 | -1.655 | -0.006 | -0.076 | -0.022 |
| CP | -8.331* | -3.167 | -0.360 | -11.765* | -1.110 | |
| AB | 97 | 0.493 | 0.045 | -0.026 | 0.034 | 0.038 |
| CP | 3.961 | 0.086 | -1.561 | 5.263* | 1.917 |
注：*P＜0.05，CP＝基因型效应的贡献率(％)
2.3PPARα基因主效应指数
计算各性状PPARα基因的主效应指数(MEI)，结果如表4所示。PPARα基因对脂肪性状的MEI值较大。其中PPARα基因对洞庭草鹅腹脂重的MEI达到12.11，对腹脂率为17.31，表明洞庭草鹅这两个性状的表型变异中有12％以上是来自PPARα基因SNP的联合方差。各个性状SNP联合方差与其表型方差之间的关联系数为0.9815，表明SNP联合方差能很好地反映表型方差的变化。
表4PPARα基因对脂肪性状的主效应指数
| 样本数 | 腹脂重(g) | 肝脏重(g) | 皮脂厚(mm) | 腹脂率(％) | 肝脏率(％) |
| 182 | 12.110 | 4.565 | 1.344 | 17.310 | 4.279 |
综上所述，洞庭草鹅的PPARα基因的SNP基因型对鹅的腹脂重、腹脂率有显著的影响，其中AA型和BB型腹脂重显著低于AB型(p＜0.05)，BB型腹脂率显著低于AB型(P＜0.05)，而AA型和BB型之间各脂肪性状差异不显著(P＞0.05)；推测PPARα基因可作为鹅体脂肪性状的主效基因。BB基因型是降低鹅腹脂重、腹脂率的优势基因型，其贡献率超过8％，而AB基因型对洞庭草鹅腹脂率产生5.263％(p＜0.05)的正向贡献率。
PPARα基因对洞庭草鹅腹脂重的MEI达到12.11，对腹脂率为17.31，表明洞庭草鹅这两个性状的表型变异中有12％以上是来自PPARα基因SNP的联合方差。各个性状SNP联合方差与其表型方差之间的关联系数为0.9815，表明SNP联合方差能很好地反映表型方差的变化。这进一步表明PPARα基因可作为鹅脂肪性状的主效应基因或与控制腹脂性状的主基因连锁。
序列表
<110>湖南农业大学
曲，湘勇
<120>PPARα基因及其作为鹅脂肪性状遗传标记的用途
<130>PHW10248
<160>4
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>240
<212>DNA
<213>鹅
<400>1
ttgtggggat aaagcctcag gctaccatta cggagtacat gcttgtgaag gttgtaaggg 60
tttttttagg agaacaatcc gattgaaact catctatgat aaatgcgatc gcaattgcaa 120
aattcagaaa aaaaatcgta ataagtgcca atactgtcgt tttcagaagt gcctttcagt 180
tggaatgtca cataatgcaa tacgttttaa aaacaaaaac aggacgaatg ccaaggtctg 240
<210>2
<211>18
<212>DNA
<213>鹅
<400>2
aatcacccag tggagcag 18
<210>3
<211>18
<212>DNA
<213>鹅
<400>3
cagaccttgg cattcgtc 18
<210>4
<211>79
<212>PRT
<213>鹅
<400>4
Lys Asn Lys Asn Ile Val Gly Ile Lys Pro Gln Ala Thr Ile Thr Glu
1 5 10 15
Tyr Met Leu Val Lys Val Val Arg Val Phe Leu Gly Glu Gln Ser Asp
20 25 30
Asn Ser Ser Met Ile Asn Ala Ile Ala Ile Ala Lys Phe Arg Lys Lys
35 40 45
Ile Val Ile Ser Ala Asn Thr Val Val Phe Arg Ser Ala Phe Gln Leu
50 55 60
Glu Cys His Ile Met Gln Tyr Val Leu Asp Glu Cys Gln Gly Leu
65 70 75
Claims (9)
1.一种PPAR α基因，是与表示鹅脂肪性状指标的腹脂重、腹脂率相关的基因，其DNA序列如SEQ ID NO.1所示。
2.如权利要求1所述的PPAR α基因，其特征在于：所述基因PPAR α序列的第220碱基处有一个碱基突变C220-T220。
3.如权利要求1所述的PPAR α基因，其特征在于：克隆PPAR α基因所用引物的序列如下：
正向引物：5’-AATCACCCAGTGGAGCAG-3’，
反向引物：5’-CAGACCTTGGCATTCGTC-3’。
4.权利要求1-3中任一项所述的PPAR α基因在鹅遗传标记辅助选择中的应用。
5.一种鉴定鹅脂肪性状的遗传标记的方法，该鹅具有与表示脂肪性状指标的腹脂重、腹脂率相关的基因，其特征在于：该方法包括：测定从鹅获得的核酸样品中PPAR α基因中多态性的存在，该多态性是与表示鹅脂肪性状指标的腹脂重、腹脂率相关的多态性，该多态性在PPAR α基因序列的220bp处有一个C→T的突变。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：该方法具体包括如下步骤：
(1)根据GenBank中鸡PPAR α基因的mRNA序列，用Primer 5.0设计引物，覆盖该基因部分编码序列，再获得鹅基因组DNA；
(2)以上述鹅基因组DNA为模板，PCR扩增，产物纯化，克隆，获得如序列表SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；
(3)鉴定该基因序列的第220碱基处是否存在多态性。
7.如权利要求6所述方法，其特征在于F：所述引物为：
正向引物：5’-AATCACCCAGTGGAGCAG-3’，
反向引物：5’-CAGACCTTGGCATTCGTC-3’。
8.根据权利要求6所述方法，其特征在于：所述步骤(3)中PPAR α基因序列第220碱基处的多态性是指一个碱基突变C220-T220。
9.根据权利要求5所述方法，其特征在于：该方法还包括根据PPAR α基因中多态性的测定结果，选出具有与所需特征相关的鹅进行育种。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20101222 |