CN110273009A - 一种与狮头鹅头围相关的分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种狮头鹅头围相关的分子标记及其应用。所述分子标记为鹅RAP1A基因DNA序列GenBank登录号为XM_013189666中第1545bp处的C/G碱基突变。通过对上述C/G突变位点的检测,可以确定目标鹅群头围大小这一性状的基因型,也可以通过基因型判别某一个体的头围是大头围还是小头围,为有目的地对鹅群头围性状进行选择提供依据,提高后代鹅头围的大小。以该分子标记建立的选育头大颈粗狮头鹅新品系的方法周期短、速度快、准确率高。
Description
技术领域
本发明属于分子标记辅助育种技术领域,更具体地,涉及一种与狮头鹅头围相关的分子标记及其应用。
背景技术
我国鹅的总饲养量占全世界的90%以上,据统计,2016年全国鹅出栏量达到5.18亿只,其中,广东省鹅出栏量为2.57亿只,数量位居全国第二。狮头鹅是广东省特色的农业家禽品种,也是世界上最大型的鹅种之一,主要养殖于澄海、潮安县、汕头郊区等地。狮头鹅具有生长速度快、体型大、产肉多、狮头鹅肝肥美、抗逆性强、适应性强、抗逆性强等优点。大头围是狮头鹅的重要经济指标之一,大头围鹅一般体型硕大,产肉量高,鹅肝质量优异,并且头大颈粗也是选育种鹅的筛选标准和市场需求。
长期以来,狮头鹅长期采用闭锁繁育等技术,育种工作相对滞后,种狮头鹅头颈、体型大小不均,个体生产性能差异大,缺乏良繁体系,缺乏现代化育种技术,传统育种技术效率低、成本高,缺乏有效的狮头鹅表型性状分析检测技术和设备,缺乏对狮头鹅基因组的研究,对重要育种基因或标记的发掘未有开展。
综合以上原因导致狮头鹅品种性能差,良种覆盖率低,这一系列问题严重阻碍了狮头鹅产业的发展。
发明内容
本发明针对于以上问题,,对头围有显著差异的狮头鹅进行全基因组关联分析(GWAS),挖掘与狮头鹅头围性状相关的主要候选基因,并逐一进行表型的相关验证,找到了所述与鹅头围相关的分子标记,并且利用该分子标记提供了一种快速筛选大头围狮头鹅的方法,也指出了该分子标记在狮头鹅选育方面和筛选大头围狮头鹅试剂盒方面的应用。
为了实现上述目的,本发明是通过以下技术方案予以实现的:
提供一种与狮头鹅头围大小相关的分子标记,其特征在于,所述分子标记为所述分子标记为鹅RAP1A基因DNA序列GenBank登录号为XM_013189666中第1545bp处的C/G碱基突变。
进一步,所述第1545bp处核苷酸为C,即基因型为C/C时,该鹅为大头围,,所述大头围为≥25cm。
狮头鹅以头似狮头二得名,大头围是其重要的经济特征之一,但实际生产中狮头鹅头围大小不均,整齐度差。头围还是挑选优种狮头鹅的市场标准之一,头围大的鹅一般体型也较大,抗病能力强,然而传统育种筛选的大头围狮头鹅种鹅的大头围性状遗传稳定性差,子代头围差异性较大,需要多世代反复筛选,育种时间长,而且耗费人力财力,所以如何通过能够遗传的分子标记更精准的选育大头围鹅种,且在幼鹅早期快速判断头围生长趋势,是生产中亟待解决的问题。
发明人首次发现RAP1A基因第1545bp处的碱基为C/G碱基突变是影响鹅头围大小的分子标记,且当该位点基因型是纯合C/C时,头围显著大于纯合G/G。
本发明也保护一种所述分子标记在制备筛选大头围狮头鹅检测试剂盒中的应用。
本领域技术人员很容易根据本发明所提供的分子标记设计出用于扩增该分子标记的引物和/或探针,用于检测狮头鹅以此标记为依据的基因型,从而判断狮头鹅头围的大小。
本发明同时保护一种权利要求1或2所述分子标记在狮头鹅育种中的应用。
利用本发明所提供的分子标记能够在短时间内确定狮头鹅与头围相关的基因型,从而为选育大头围这一重要经济性状提供理论基础,也为选育工作节省了成本、人力和时间。
根据狮头鹅RAP1A基因第1545bp处的基因型,选择C/C型的个体,淘汰G/C和G/G的个体,以逐步提高该位点等位基因C的频率,从而改良后代狮头鹅的头围性状。
本发明还公开一种快速筛选大头围狮头鹅的方法,所述方法包括以下步骤:
S1:提取并纯化样本狮头鹅的全血基因组DNA;
S2:以步骤S1所述DNA为模板,设计引物扩增得到包含权利要求1或2所述分子标记区段的扩增产物,检测扩增产物的第1545位点的碱基进行基因分型。
S3:根据基因分型结果,基因型为C/C的为大头围狮头鹅。
进一步,所述步骤S2中引物序列为:
F:5’-AGTGGAAGTAGACTGTCAAC-3’;
R:5’-CGTGGACTGTGCTGTTAT-3’。
该引物是基于该分子标记所在位点,能扩增包含该位点的区段的引物,因此该技术领域的技术人员可以知晓,本发明中提供的引物对是只作为其中的一个实施例,而非对引物的具体限定。
进一步,所述基因分型使用的技术包括:基因测序、TaqMan探针的荧光定量法、核酸杂交或基因芯片技术中的一种或多种。
作为实施方式的一种,将扩增产物进行测序,根据测序结果,得到待测样本的基因型;该检测基因型的实施方法还可以是以步骤S1所述DNA为模板,设计引物进行荧光定量PCR扩增得到包含所述RAP1A基因第1545位点的扩增产物,其中引物包括针对1545位点为C或G所设计的荧光探针引物,以及扩增包括该位点区段的上游引物和下游引物。扩增结束后就可以根据荧光曲线得出结果,如果荧光标记设计在扩增C的探针上,那么扩增曲线为单峰的为杂合型C/G,双峰对应的基因型为C/C,曲线平缓无扩增的即样本基因型为G/G。
相对于现有技术,本发明具有如下的优点及效果:
1)本发明首次发现RAP1A基因第1545位点C/G碱基突变是影响宿主鹅头围大小的遗传性分子标记。
2)以该分子标记建立的选育头大颈粗狮头鹅新品系的方法周期短、速度快、准确率高。
3)为有目的地对鹅群头围性状进行选择提供依据,提高后代鹅头围的大小,节省了传统育种的时间和成本,为快速培头大颈粗狮头鹅新品系提供了理论依据和技术支持,能够迎合市场需求,开发大头围狮头鹅的优秀品种资源,并为其产业化发展提供参考。
附图说明
图1为头围性状的全基因组关联分析(GWAS)布图。
图2为以25cm为界限的头围关联分析曼哈顿图。
图3为头围候选基因表达量分析,其中A图表示狮头鹅头围性状候选基因的表达情况;B图表示与狮头鹅头围性状显著相关的SNP位点所在基因的表达情况。
图4为大小头围扩增序列的碱基比对。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明,但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明,本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明,本发明所用试剂和材料均为市购。
以下实施例中的狮头鹅样品均来自汕头白沙禽畜原种研究所。
实施例1:
与狮头鹅头围大小相关的SNP位点筛选
1)鹅血的采集和处理。
选取头大颈粗狮头鹅200只(头围22~30cm),头围大小与数量成正太分布。血样采集,对狮头鹅静脉采血,放入ACD抗凝剂管中,-80℃超低温冰箱里面进行保存以备后续使用。采用天根血液基因组DNA提取试剂盒操作步骤进基因组DNA的提取和纯化。
2)测序并筛选与头围显著相关的SNP位点。
本实施例采用MGIEasyDNA文库快速制备试剂盒进行进行双酶切打断建库测序。共构建6个测序文库。采用MGISEQ-500测序。采用SOAPnuke对测序数据进行过滤,将cleanreads比对到参考基因(AnsCyg_PRJNA183603_v1.0;http s://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/31397),比对信息见表1。
采用GATK进行变异检测。对原始SNP数据进行过滤,过滤条件:
“QD<2.0||ReadPosRankSum<-8.0||FS>60.0||MQ<40.0||SOR>3.0||MQRankSum<-12.5||QUAL<30”,最小等位基因频率>0.05,call rate>0.7,hardy-wenberg平衡检验p值>1e-6
表1测序深度、覆盖率、比对率、错配率
本实施例采用全基因组关联分析的方法鉴定与狮头狮头鹅头围性状显著相关的SNP位点,分析由EMMAX软件完成。关联分析模型如下:
P=μ+Zα+SNP+e
P:表型向量,μ:截距,Z:随机多基因效应关系矩阵,α:群体结构效应,SNP:SNP效应,e:残差,e~(0,Iσe),I:单位矩阵。
全基因组5%显著性阈值(significant value)采用bonferrorni方法确定。由于基因组中存在大量的连锁不平衡区域,为减少假阴性,将该阈值扩大20倍作为第二阈值(suggestive value)。由于scaffold太多,按照50,000,000碱基为阈值,将scaffold按照顺序模拟成21条染色体。
结果见图1,GWAS结果表明,对比头围大小显著差异的狮头鹅测序结果,发现与狮头鹅头围显著关联的SNP位点有两个,分别位于5号和第11号模拟染色体。
本实施例根据狮头鹅选育数据,将头围阈值定位25cm。头围在25cm以下的狮头鹅归类为阴性对照组,25cm以上的狮头鹅归类为阳性群体,根据二分类变量进行关联分析。
如果图2所示,两个SNP位点分别位于5号和第11号模拟染色体上的位置是NW_013185723和NW_013185674,且NW_013185723位点关联性最大。因基因组中存在大量的连锁不平衡,为了充分挖掘狮头鹅头围性状的候选基因,本研究检测了NW_013185723处SNP位点上下游500kb以内的全部基因。共计找到13个候选基因。
3)候选基因的qRT-PCR复筛验证
RNA提取与cDNA合成
选取头围28cm以上的狮头鹅和头围23cm以下的狮头鹅血液样品各10份提取RNA。
(1)将200μL采集的鹅全血样品加入800μL TRIZOL,裂解,在无RNA酶的1.5mL管中利用震荡机振荡至液体均匀。
(2)静置5min后加入200μL氯仿,离心管利用漩涡振荡器混匀20s,静置2min后4℃,12000rpm离心10min。
(3)吸取500μL上清到1.5mL离心管中,加入500μL在-20℃提前预冷好的异丙醇试剂,离心管利用漩涡振荡器混匀20s,静置10min后4℃,12000rpm离心10min。
(4)取出离心管可见管底RNA白色沉淀,小心弃去上清,加入1000μL在-20℃预冷的75%乙醇(使用DEPC水配制),轻轻吹打洗涤沉淀,4℃,10000rpm离心5min。
(5)小心吸取并去掉上清废液,再用在冰上冷冻过的75%乙醇洗涤一次,4℃,10000rpm离心5min。
(6)小心弃去上清,将离心管在通风橱中风干20min,待乙醇全部挥发后加入50μLDEPC水溶解RNA。
(7)对刚抽取的RNA用微量分光光度计尽快测定它的浓度及纯度,1%琼脂糖凝胶电泳测定RNA完整性,之后于-80℃储存。
(8)以上步骤全部都在低温环境下进行操作。
将获得的RNA吹打混匀后离心至干净的离心管内,在42℃条件下充分反应以去除gDNA。gDNA去除反应体系见表2。
表2 gDNA去除反应体系
参照Takara公司的反转录试剂盒说明书反转录成cDNA,反转录体系如表3所示。
表3反转录反应体系
反转录过程为:37℃ 15min;85℃ 5s,4℃保存。将制备好的cDNA保存于-20℃备用。
实时荧光定量PCR
根据NCBI上下载狮头鹅筛选出来头围候选基因的mRNA序列。实时荧光定量的引物序列委托上海生物工程股份有限公司合成,置于-20℃保存备用。
表4头围候选基因引物序列
狮头鹅头围性状候选基因的相对表达量见图3。大头围(>25cm)狮头鹅群体中RAP1A基因表达量极显著(P<0.01)低于小头围狮头鹅群体。其他狮头鹅头围性状候选基因在大、小头狮头鹅群体中表达量无差异。
实施例2
RAP1A基因SNP与狮头鹅头围的关联性分析
选取头围28cm以上的狮头鹅和头围23cm以下的狮头鹅血液样品各10份提取DNA。以NCBI数据库中狮头鹅的RAP1A基因DNA序列(GenBank登录号:XM_013189666)为参考,设计引物PCR扩增各样品DNA中RAP1A基因中包含标记位点的139bp,
引物序列为F:5’-AGTGGAAGTAGACTGTCAAC-3’;
R:5’-CGTGGACTGTGCTGTTAT-3’。
表5 PCR体系
反应程序设置为:95℃ 10min;95℃ 30s,55℃ 30s,72℃ 90s,29cycles;72℃10min,4℃保存。
将扩增产物测序比对,得到SNP位点所在的位置和对应碱基。
测序结果见图4,大头围和小头围鹅的RAP1A基因第1545号位置存在SNP位点,基因型为C/C的个体对应的鹅头均为大头围。基因型G/G对应鹅头均为小头围。
实施例3
SNP位点基因频率统计
本实施例以C/C,G/C,G/G三种基因型做基因频率分析,结果如下表:
表6:SNP位点基因频率统计
如表6所述,C/C基因型个体在群体中的频率较小,仅为6/208,G/G所占的频率最大,为135/208,G/C频率为67/208。可见大头围的C/C在养殖生产中出现的频率小,需要逐步优化提高其基因频率,增加大头围鹅的群体。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种与狮头鹅头围大小相关的分子标记,其特征在于,所述分子标记为所述分子标记为鹅RAP1A基因DNA序列GenBank登录号为XM_013189666中第1545bp处的C/G碱基突变。
2.根据权利要求1所述与狮头鹅头围大小相关的分子标记,其特征在于,所述第1545bp处核苷酸为C,即基因型为C/C时,该鹅为大头围,所述大头围为≥25cm。
3.一种权利要求1或2所述分子标记在制备筛选大头围狮头鹅检测试剂盒中的应用。
4.一种权利要求1或2所述分子标记在狮头鹅育种中的应用。
5.一种快速筛选大头围狮头鹅的方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:
S1:提取并纯化样本狮头鹅的全血基因组DNA;
S2:以步骤S1所述DNA为模板,设计引物扩增得到包含权利要求1或2所述分子标记区段的扩增产物,检测扩增产物分子标记位点的碱基进行基因分型;
S3:根据基因分型结果,基因型为C/C的为大头围狮头鹅。
6.根据权利要求5所述快速筛选大头围狮头鹅的方法,其特征在于,所述步骤S2中引物序列为:
F:5’-AGTGGAAGTAGACTGTCAAC-3’;
R:5’-CGTGGACTGTGCTGTTAT-3’。
7.根据权利要求5所述快速筛选大头围狮头鹅的方法,其特征在于,所述基因分型使用的技术包括基因测序、TaqMan探针的荧光定量法、核酸杂交或基因芯片技术中的一种或多种。
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