CN107604059A - 一种朗德鹅填饲后鹅肥肝增重的分子标记及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及家禽育种领域，具体涉及一种朗德鹅填饲后鹅肥肝增重的分子标记及应用，它是朗德鹅TGH基因的5’‑UTR区域部分序列，该分子标记核苷酸系列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3或/和SEQ ID No.4所示。在本发明的技术方案中，朗德鹅群体中只有一种单倍型，该基因10 个位点在该品种中有已经固定，将其命名为LD1，而在地方品种中则出现另外两种单倍型ZD1和ZD2，群体水平的测试表明LD1单倍型鹅肥肝重要显著大于ZD1和ZD2。该选择的效果显著，检测方法简单快捷，且不受外界环境的影响，可以用于朗德鹅鹅肥肝重的分子遗传标记。
Description
技术领域
本发明涉及家禽育种领域，具体涉及一种朗德鹅填饲后鹅肥肝增重的分子标记及应用。
背景技术
鹅肥肝是世界三大美食之一，备受人们喜爱，由于价格不菲，鹅肥肝产业也是养殖业中利润较高的一个行业，对于农民增收脱贫具有重要意义。鹅肥肝重是衡量鹅产肝能力的一个重要指标，也是鹅肥肝生产中的重要经济性状，同时也是典型的数量性状。家禽育种工作中，通过分子生物学中的策略和方法可以鉴定出许多与鹅肥肝重相关联的候选基因法，这些基因中所包含的遗传变异可被用于家禽重要经济性状的有效选择，称之为标记辅助选择（Marker Assisted Selection，MAS）。
在实际生产中，朗德鹅因其良好的产肝效率和肥肝品质被广泛用于鹅肥肝生产，根据申请人此前的研究发现，朗德鹅肝脏在28天的填饲期内可以从约150克增加至2000克，然而，剩余的增重并不会引起朗德鹅肝脏的生理性病变，在填饲结束后，经过一周即可恢复如初，群体水平的测试表明，朗德鹅群体鹅肥肝均重都超过1000克（11月和3月填饲结束），表现出极强的肝脏蓄脂增重能力。相对于朗德鹅，其他鹅种，尤其是中国地方鹅种，由于没有系统的肝用性状选育工作，其产肝能力较差，在鹅肥肝生产中基本得不到应用，丧失了一种非常重要的生产用途。浙东白鹅的生产性能数据表明，在30天的填饲期内，其肝脏量从约100克增加至最大650克，平均肥肝重不足400克。事实证明，朗德鹅经过高强度选育，基因组上势必存在与鹅肥肝重密切相关的基因，因此，通过利用肝产量优异的朗德鹅某些基因单倍型来用于MAS工作，也将帮助我们在地方品种中开发肝用型品系。
家鹅通过短期内摄入大量高能饲料将多余能量在肝细胞中以甘油三酯（Triacylglycerol，TG）的形式储藏，肝脏分泌脂肪的能力差异是导致鹅肥肝重不同的一个重要因素，肥肝型的物种或者品种总是转运或分泌出更少的脂类，将更多的脂类保留在肝脏中以备氧化供能。TGH（TG hydrolase，TGH）基因是肝细胞中分解TG用于分泌的最重要水解酶，当细胞分泌TG时，TGH先将细胞质中的脂滴TG分解为甘油二酯（Diacylglycerol，DG），此时DG通过内质网膜进入内质网（Endoplasmic reticulum，ER），内质网中的DG在二酰甘油合酶DGAT2作用下重新生成TG用于极低密度脂蛋白的组装，这一过程需要TG转运蛋白MTP（Microsomal triacylglycerol transfer protein，MTP）、磷脂酶PLD（Phospholipase D，PLD）、ApoB等基因的编码产物共同参与，TG最终将以VLDL的形式分泌进入血液转运至机体其他部位。由此可知，TGH为VLDL的形成提供了最主要底物，其活性的高低将决定个体肝脏分泌脂类的能力，也最终影响鹅肥肝重。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种利用单倍型提高朗德鹅填饲后鹅肥肝重的方法，该方法利用朗德鹅TGH基因的单倍型对本群体填饲后鹅肥肝重进行标记辅助选择，不受环境影响。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种朗德鹅填饲后鹅肥肝增重的分子标记，它是朗德鹅TGH基因的5’-UTR区域部分序列，该分子标记核苷酸系列如SEQ IDNo.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3或/和SEQ ID No.4所示, SEQ ID No.1片段的序列长度为1150 bp，SEQ ID No.2片段的序列长度为626 bp ,SEQ ID No.3片段的序列长度为1418bp，SEQ ID No.4片段的序列长度为845 bp；目的片段经琼脂糖凝胶电泳检测后用于Sanger测序得到DNA序列，经过Chromas V2.1.3软件比对后获取SNP位点及其形成的单倍型。
其中所述SEQ ID No.1第570位点由A>G、第582位点由A>C、第887位点由T>C、第1019位点由A>G，所述SEQ ID No.2第353位点由T>C，所述SEQ ID No.3第610位点由T>C、第647位点由G>C、第698位点由A>T、第704位点由C>G，所述SEQ ID No.4第300位点由T>C。
显然对于本领域技术人员来说，扩增上述分子标记的引物也属于本发明要求保护的范围，用于扩增SEQ ID No.1的引物为US1,序列为：F：5'-TCATTTAGTCTTCATCGGG-3'，R：5'-CCTCCTACCTTATTTGTGTGAT-3'；用于扩增SEQ ID No.2的引物为USP11,序列为：F：5' -GAGGGCAAAAGTCTTCTGAT-3'，R：5' -ATTTGGGTAGTAACCGCACA -3'；用于扩增SEQ ID No.3的引物为US3,序列为：F：5'-CACTGTGTTTGGCTTTGTA-3'，R：5'-TTCTCCACCTACCACTCAG-3', 用于扩增SEQ ID No.4的引物为US4,序列为：F：5’-TTCATATCACGCCTGGGTG-3’，R：CCTCCTCAGTGTATTGCCT-3’。
本发明还保护一种朗德鹅填饲后鹅肥肝增重的分子标记在朗德鹅育种中的应用。
本发明的原理为：针对TGH基因设计4 对引物（US1、USP11、US3 和US4），引物US1扩增产物存在4 个SNP位点，USP11产生1个SNP位点，US3产生1个SNP位点，US4产生4个SNP位点，这些位点均位于TGH基因的5’-UTR区域，是调控基因活性的重点候选区域。
本发明的有益技术效果是：在本发明的技术方案中，朗德鹅群体中只有一种单倍型，该基因10 个位点在该品种中有已经固定，将其命名为LD1，而在地方品种中则出现另外两种单倍型ZD1和ZD2，群体水平的测试表明LD1单倍型鹅肥肝重要显著大于ZD1和ZD2。该选择的效果显著，检测方法简单快捷，且不受外界环境的影响，可以用于朗德鹅鹅肥肝重的分子遗传标记。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是朗德鹅TGH基因10个SNPs 位点的序列比较。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例
1、采样
随机采取江西汇和科技有限公司同一批次50 只填饲朗德鹅血样，同时采集浙东白鹅、狮头鹅及皖西白鹅等3个地方品种各12个个体血液。采用AxyPrep Blood Genomic DNAMiniprep kit提取鹅基因组DNA，保存于TE溶液，提取完毕后利用Quawell公司的Q3000 核酸浓度测定仪测定浓度和纯度并将基因组保存于-20℃冰箱。
2、引物设计与PCR 扩增
根据GenBank 中已发表的鹅TGH基因序列（Gene ID:MG383670），采用Primer 5.0 设计4 对引物，引物序列如下：
US1,F：5'-TCATTTAGTCTTCATCGGG-3'，R：5'-CCTCCTACCTTATTTGTGTGAT-3'，扩增片段长度1150 bp（SEQ ID No.1）；
USP11，F：5' -GAGGGCAAAAGTCTTCTGAT-3'，R：5' -ATTTGGGTAGTAACCGCACA -3'，扩增片段长度626 bp（SEQ ID No.2）；
US3，F：5'-CACTGTGTTTGGCTTTGTA-3'，R：5'-TTCTCCACCTACCACTCAG-3'，扩增片段长度1418 bp（SEQ ID No.3）；
US4，F：5’-TTCATATCACGCCTGGGTG-3’，R：CCTCCTCAGTGTATTGCCT-3’，扩增片段长度845bp（SEQ ID No.4）；
PCR 反应体系为为20μL，包括10×PCR Mix（Dye plus） 2μL，上下游引物（10μmol/L）各0.5 μL，模板1 μL，补双蒸水至20 μL。反应条件为94℃预变性5min ；33 个循环（94℃变性30s，各自最佳退火温度退火30s，72℃延伸1min30s）；最后72℃延伸性10min，16℃保存产物。PCR 产物用1.2% 琼脂糖凝胶检测。
3、琼脂糖凝胶分析和测序
琼脂糖胶每个点样孔上样5 μL PCR 产物，120 V电压条件下电泳35 min观测DNA条带，检测完毕后将产物送往公司测序。
测序共在TGH基因的5’-UTR区域发现10个SNP位点，引物US1 扩增产物（SEQ IDNo.1）存在4 个SNP位点，USP11扩增产物（SEQ ID No.2）产生1个SNP位点，US3扩增产物（SEQID No.3）产生4个SNP位点，US4扩增产物（SEQ ID No.3）产生1个SNP位点，如图1所示。所发现的10个位点在朗德鹅中已经固定为单一等位基因，只产生一种单倍型LD1，而在地方品种中多以杂合子状态出现，目前检测出两种主要单倍型ZD1和ZD2。朗德鹅平均肝重为1129.5±222.5克，而浙东白鹅等地方品种的群体鹅肥肝均重只有500克，高出约56%，因此，筛选LD1 单倍型可作为提高朗德鹅填饲后鹅肥肝重的方法。
最后所应说明的是：以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
序列表
<110> 上海市农业科学院
<120> 一种朗德鹅填饲后鹅肥肝增重的分子标记及应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1150
<212> DNA
<213> TGH基因US1片段(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 1
tcatttagtc ttcatcgggg atgagtttta aaaaaataaa aataaactga ccattttaaa 60
tgcatgttta aacatttgta ccctacatac ttgaagcaaa atgtatttct gagctctttt 120
tttttttttt ttttttttaa ttgtgggcct ataaatgtgg tatttgtctc tatttttctg 180
ttattgaaat caagacaggt agcaatgcat taatgtataa agaggcaaat gtcatcatat 240
ggcaggattt ttctggcttg gtccctgact tgtgcgttgc tcactgattg agggtaagct 300
gcaaaatgtt ctttcttaaa attaaatgca aagcagtctt caaaaaatcc acttgccagg 360
tacatagcac tgtctccaga ttcccaaatt tagtagtcta tatcactaga gtaaggattt 420
ccgcatttgc agaggtatgt cctgtttgta gatccataca aaggtctgta gccaaggtgg 480
taaagatcta aaattccatt tgtttatttt gtcatgtaaa tcaggtcatc acagttcaca 540
gatagcattt tgcactggta gtaatttccg gatggctgat acctttggcc ttcaagttgt 600
gtatctctgg gaccatggat gggatatgag ctgagacagt ttgcagaatg ggtacttgag 660
caaggaagag tagaacaatg aaagattgaa gagtaaatct tggaaaatag aatcgtaaat 720
gaagggtgaa aataaaggga aagcaaattg taaagggcag acttttagaa aaccagaaag 780
agcaggagat agaaaataaa ttatttatgg aaattcataa ggtttgtttc agcaaaagga 840
gagagcaatg agcagattgc actgtgtttg gctttgtagc aatggactcc tcctgtagtt 900
ggtgggttac aagtagttga ggcatgcatg ctcttcagga tggaaggcaa gtgttgcaag 960
cagggattct tgtagcttca ccttgcactg aaacagttta cccatgctag gaaccaaagc 1020
agtccgagga cattctgaga gaacttacaa cagtattcaa ccaggcaaac aggagagcag 1080
agtttactac tacaaagtac tcctgctctt tgcttccagg aaacctttat cacacaaata 1140
aggtaggagg 1150
<210> 3
<211> 626
<212> DNA
<213> TGH基因USP11片段(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 3
gagggcaaaa gtcttctgat aacggagtaa atgcttagga taattagtat gcattgaata 60
tacacatctg aaacaagctg ccaatagttt gcaccctgag cagtccagtt taaagttgcc 120
tggatttacc tacatgagct gtgaatcaca cctgtccaga ccaacttaga tactagagta 180
aagcatctct tcggagtgcc tgaacacagc ctgacacaca ggacactaca cgcttaacat 240
acgtgctcaa ctaatgtaag actgtgggtc ttaggacaca cgtagctgaa acaaaggtac 300
gggcactaag ataatgttta gaaatgctgt ctcagacaac tgagaattat gatgccatag 360
aattacaaaa taggctttct ggaacaagag ctactgactc ttgccaaaaa aaaaaaaaaa 420
aagcaaagca aggaaacata gaacaaacac aaccacctag ttacatagta gataatctct 480
tttactgata gtttctttta tttctattca tctatgtctt gccttttttt catatcacgc 540
ctgggtgaca ggcatgagtt cacatggaag tctccaaacg ctcctgattt cttcataggg 600
attaaatgtg cggttactac ccaaat 626
<210> 3
<211> 1415
<212> DNA
<213> TGH基因US3片段(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 3
cactgtgttt ggctttgtag caatggactc ctcctgtagt tggtgggtta caagtagttg 60
aggcatgcat gctcttcagg atggaaggca agtgttgcaa gcagggattc ttgtagcttc 120
accttgcact gaaacagttt acccatgcta ggaaccaaag cagtccgagg acattctgag 180
agaacttaca acagtattca accaggcaaa caggagagca gagtttacta ctacaaagta 240
ctcctgctct ttgcttccag gaaaccttta tcacacaaat aaggtaggag gtagtttatg 300
ctaaagtcca ttacttgcag tccaggtgtc tgtttccatt cattgccttt aacagtgcat 360
atgtggatca atacagtacg gactttacat tcataacagt acagactaat gccagcccag 420
ttttcatggc atgaacttta ctcttgagaa acaatacagg aaaaaaaggc tctcaaagga 480
catttataaa actgtaaaaa ttctacaatg aagttacagt ccacattatt tacttagaag 540
ctcaaatgtg ttatcccatt tgccagtgta tacttgcact aaccctacat tccgaaacag 600
cagataagcc atctggcatt ggcattaaca gtgtagcggc tgcatcacag agctgctgta 660
gtacagaggg caaaagtctt ctgataacgg agtaaatgct taggataatt agtatgcatt 720
gaatatacac atctgaaaca agctgccaat agtttgcacc ctgagcagtc cagtttaaag 780
ttgcctggat ttacctacat gagctgtgaa tcacacctgt ccagaccaac ttagatacta 840
gagtaaagca tctcttcgga gtgcctgaac acagcctgac acacaggaca ctacacgctt 900
aacatacgtg ctcaactaat gtaagactgt gggtcttagg acacacgtag ctgaaacaaa 960
ggtacgggca ctaagataat gtttagaaat gctgtctcag acaactgaga attatgatgc 1020
catagaatta caaaataggc tttctggaac aagagctact gactcttgcc aaaaaaaaaa 1080
aaaaaaagca aagcaaggaa acatagaaca aacacaacca cctagttaca tagtagataa 1140
tctcttttac tgatagtttc ttttatttct attcatctat gtcttgcctt tttttcatat 1200
cacgcctggg tgacaggcat gagttcacat ggaagtctcc aaacgctcct gatttcttca 1260
tagggattaa atgtgcggtt actacccaaa tcctttagta ttgctcccat ggtacaatag 1320
ttgagaaagc ctctctttag tattacaaaa ctcttttatt ttgagataaa agacaaacat 1380
tcctgaatgc acaggactga gtggtaggtg gagaa 1415
<210> 4
<211> 845
<212> DNA
<213> TGH基因US4片段(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 4
ttcatatcac gcctgggtga caggcatgag ttcacatgga agtctccaaa cgctcctgat 60
ttcttcatag ggattaaatg tgcggttact acccaaatcc tttagtattg ctcccatggt 120
acaatagttg agaaagcctc tctttagtat tacaaaactc ttttattttg agataaaaga 180
caaacattcc tgaatgcaca ggactgagtg gtaggtggag aatccacctt gcaggaaaag 240
ctgagatttt tccagtattg gttttgtcaa aaaatatccc tttgtgagat gaaaaatctt 300
ccaatcttta cttcagcaaa ggcacttttt tcaggattat tgttttggat tttggtcttt 360
gtggatatgc tgtgtgttac atatattgaa atgaagcaat tacatactaa aatgaagtaa 420
atgtaataag attatagggt agttttcctg gtttcttcag cgtgtagtgg gagattaagt 480
cctaattttt caaagatggt agtgttattg tagcaggaag aatctcctga tgttatgagg 540
actatttaca atgtttttta aagcaaatag ttgaggcctg atattccatg aataagattt 600
ataagaagcc gtgggcagct agtatgaaac ttgtggagac attcttcata taggtctcgc 660
tgttcccata tacagacaag ctgctgtgca ctccccttga agggagtggc ttacagtcag 720
ggcagttgct caggctggcc acagttggtt tggtttcaca gcttgagaaa tgctttaact 780
aatcagtgtt tgtcttgcgt aacagttata cttcacagag tattaaaggc aatacactga 840
ggagg 845
Claims (3)
1.一种朗德鹅填饲后鹅肥肝增重的分子标记，它是朗德鹅TGH基因的5’-UTR区域部分序列，其特征在于，该分子标记核苷酸系列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3或/和SEQ ID No.4所示；
其中所述SEQ ID No.1第570位点由A>G、第582位点由A>C、第887位点由T>C、第1019位点由A>G，所述SEQ ID No.2第353位点由T>C，所述SEQ ID No.3第610位点由T>C、第647位点由G>C、第698位点由A>T、第704位点由C>G，所述SEQ ID No.4第300位点由T>C。
2.用于扩增权利要求1所述分子标记的引物，其特征在于，用于扩增SEQ ID No.1的引物为US1,序列为：F：5'-TCATTTAGTCTTCATCGGG-3'，R：5'-CCTCCTACCTTATTTGTGTGAT-3'；用于扩增SEQ ID No.2的引物为USP11,序列为：F：5' -GAGGGCAAAAGTCTTCTGAT-3'，R：5' -ATTTGGGTAGTAACCGCACA -3'；用于扩增SEQ ID No.3的引物为US3,序列为：F：5'-CACTGTGTTTGGCTTTGTA-3'，R：5'-TTCTCCACCTACCACTCAG-3', 用于扩增SEQ ID No.4的引物为US4,序列为：F：5’-TTCATATCACGCCTGGGTG-3’，R：CCTCCTCAGTGTATTGCCT-3’。
3.一种朗德鹅填饲后鹅肥肝增重的分子标记在朗德鹅育种中的应用。
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-
2017
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |
Application publication date: 20180119 |
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| WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |