CN110205388A

CN110205388A - 鸡mmp-11基因5′调控区两个突变位点分子标记方法及其在鸡性早熟性状选育中的应用

Info

Publication number: CN110205388A
Application number: CN201910438074.6A
Authority: CN
Inventors: 康丽; 凡方涛; 姜运良; 陈秀萍; 侯立
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2019-05-24
Filing date: 2019-05-24
Publication date: 2019-09-06
Anticipated expiration: 2039-05-24
Also published as: CN110205388B

Abstract

本发明公开了一种鸡MMP‑11基因5′调控区两个突变位点分子标记方法及其在鸡性早熟性状育种中的应用。本发明首次发现了鸡MMP‑11基因5′调控区存在3个突变位点，即g.‑889(C>T)、g.‑636(A>G)和g.‑518(C>T)位点，其中g.‑889(C>T)、g.‑636(A>G)两个SNP位点与鸡的开产日龄和30周龄前期产蛋数性状存在显著关联，CA/CA基因型对应较小的开产日龄和较高的早期产蛋数。而TG/TG基因型个体对应开产晚，可见检测这2个与性成熟性状相关联的分子标记位点，有助于选育性早熟品种/系，为鸡育种工作特别是对性成熟较晚的地方鸡种提供有利的帮助，同时为分子标记辅助育种芯片定制提供准确有效的标记位点。

Description

鸡MMP-11基因5′调控区两个突变位点分子标记方法及其在鸡性早熟性状选育中的应用

技术领域

本发明涉及分子遗传学技术领域，具体涉及一种鸡MMP-11基因5′调控区两个突变位点分子标记方法及其在鸡性早熟性状育种中的应用。

背景技术

基质金属蛋白酶(MMPs)是一类依赖锌离子的蛋白水解酶，可以降解细胞外基质、基底膜、以及间质基质，在卵巢卵泡的发育中具有重要作用，MMPs是参与细胞外基质(extracellular matrix，ECM)降解和重建的主要蛋白酶系统(Goldman et al.,2004)。MMPs协同其组织抑制因子TIMP以及其它细胞因子在卵泡生长、排卵、闭锁和退化等生物学过程中发挥重要调控作用，成为当前繁殖系统研究的新领域(Littlepage et al.,2010；Margheri et al.,2009)。

MMP-11属于MMPs家族，并具有一些独特的特性，MMP-11能降解非细胞外基质的丝氨酸蛋白酶抑制剂、α1抗胰蛋白酶、胰岛素样生长因子结合蛋白-1；而且MMP-11以45kDa的活化酶形式在细胞内释放(Massova et al.,1998)。区别于MMPs家族其他成员，MMP-11结构域含有一个转化酶furin的识别位点，MMP-11和多数MT-MMPs在细胞内被细胞内蛋白酶激活，以活性的形式分泌到细胞外，而大多数MMPs以无活性的酶原形式分泌到细胞外，在细胞外得以激活。MMP-11有一个信号肽序列，由17-29个氨基酸组成，其作用是引导翻译后的新生肽至胞浆内质网。MMP-11的C末端有一个血红素结合蛋白样结构域，参与大分子底物的识别以及同组织金属蛋白酶抑制剂的结合。

目前对于MMP-11的研究主要集中在对胃癌、喉鳞状细胞癌、乳腺癌、胰腺癌的调控等方面。还未见有MMP-11与卵巢发育相关的报道。

分子标记辅助选择育种，是在分子水平上对目标性状进行选择，可以不受环境影响和年龄限制，从而加速育种过程及精准度。基因表达转录受5′调控区序列的调控，其碱基突变通常会影响转录的起始，从而影响基因的表达。因此，研究鸡MMP-11基因的5′调控区的SNPs，旨在找到与性成熟相关的有效的分子标记，为鸡的性早熟性状的分子标记辅助选择育种提供有利的理论依据。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种鸡MMP-11基因5′调控区两个突变位点分子标记方法及其在鸡性早熟性状育种中的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种鸡MMP-11基因5′调控区与性成熟性状关联的突变位点分子标记方法，其具体标记方法是：

采用标记引物P-MMP-11，包括：

P-MMP-11-F，其序列如SEQ ID NO.1所示；

P-MMP-11-R，其序列如SEQ ID NO.2所示；

扩增鸡育种材料的基因组DNA，PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳并回收，经测序得到的序列如SEQ ID NO.3所示，结果在MMP-11基因5'调控区检测到三个突变位点，即g.-889(C>T)、g.-636(A>G)和g.-518(C>T)位点，其中g.-889(C>T)和g.-636(A>G)两个突变位点与鸡的性早熟性状关联显著。

本发明的第二方面，提供一组与鸡产蛋性状相关的SNP分子标记，所述SNP分子标记来自MMP-11基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；SEQ ID NO.3所示序列自5′端起第178位碱基是C或T，第431位碱基是A或G。

进一步的，所述SNP分子标记的g.-889(C>T)位点CC基因型和g.-636(A>G)位点的AA基因型个体对应较小的开产日龄和较多的30周龄早期产蛋数，他们的联合单倍型CA/CA基因型个体性状表现与单位点关联分析相一致，即表现为性成熟早。

上述SNP分子标记在鸡遗传育种中的应用也是本发明的保护范围。

本发明的第三方面，提供用于检测上述SNP分子标记的引物对，所述引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

本发明的第四方面，提供一种用于检测上述SNP分子标记的试剂盒，所述试剂盒中包含SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对。

本发明的第五方面，提供上述引物对和/或试剂盒在辅助选育性早熟的鸡品种中的应用。

本发明的第六方面，提供一种利用上述SNP分子标记辅助进行鸡性早熟育种的方法，包括以下步骤：

在性成熟较晚的群体中，选择CA/CA纯合基因型公鸡和CA/CA纯合基因型的母鸡通过相互交配得到CA/CA基因型，即得到性成熟早的群体；

所述CA基因型是指MMP-11基因5'调控区-889和-636位点分别为C和A碱基。

本发明的有益效果：

(1)本发明首次发现了鸡MMP-11基因5′调控区存在三个突变位点，即g.-889(C>T)、g.-636(A>G)和g.-518(C>T)位点，其中g.-889(C>T)和g.-636(A>G)两个位点与鸡的开产日龄和30周龄早期产蛋数性状存在显著关联；开产日龄和早期产蛋数是两个存在显著负相关的性状，即开产日龄小则早期产蛋数多。g.-889(C>T)位点的CC基因型以及g.-636(A>G)位点AA基因型个体具有较小的开产日龄和较多的30周产蛋数，两位点单倍型组合分析也发现CA/CA基因型对应较小的开产日龄较高的早期产蛋数。可见检测这2个与开产性状相关联的分子标记位点，有助于选育性早熟的品系，为鸡育种工作特别是对性成熟较晚的地方鸡种提供有利的帮助。

(2)利用本发明的SNP分子标记辅助进行鸡选择育种，得到的CA/CA基因型种鸡能兼顾开产日龄和产蛋数，在开产较晚的地方鸡群体中有意增加CA/CA基因型的频率，这样的措施会使其开产提前，从而降低饲养成本。

附图说明

图1：P-MMP-11-F/R引物扩增的PCR片段电泳图。

图2：鸡MMP-11基因5′调控区g.-889(C>T)、g.-636(A>G)和g.-518(C>T)位点(正向)位点的多态性测序图。

图3：三个多态位点在济宁百日鸡群体中的连锁关系图。

图4MMP-11基因5′调控区不同删除载体片段启动活性检测示意图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

术语说明：

SNP(single nucleotide polymorphism，SNP，即单核苷酸多态性)是1996年由美国麻省理工学院的人类基因组研究中心学者Lander提出的一类分子遗传标记，主要是指基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP表现出的多态性仅涉及到单个碱基的变异，表现是有转换、颠换、插入和缺失等。

正如背景技术部分介绍的，基因表达转录受5′调控区序列的调控，其碱基突变通常会影响转录的起始，从而影响基因的表达。本发明前期利用RNA-seq技术筛选鸡卵巢中性成熟差异表达基因时，发现MMP家族多个成员包括MMP11基因的表达存在显著差异。因此，本发明重点研究鸡MMP-11基因的5′调控区的SNPs，旨在找到与性成熟相关的有效的分子标记，为鸡的性早熟性状的分子标记辅助选择育种提供有利的理论依据。

SNP具有种群和地区特异性，一般来说，基因组中大约平均每300个碱基就会有一个SNP，因此，基因中SNP位点的数量众多，对于SNP的研究而言，其难点在于如何从众多的SNP位点中找出与某一生物学性状显著关联的SNP。为找出鸡MMP-11基因的5′调控区的SNPs，本发明根据已发表红色原鸡序列(GenBank Accession NC_006102.5、Gene ID:101751203)设计引物P-MMP-11，扩增鸡育种材料的基因组DNA，PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳并回收，经测序得到的序列如SEQ ID NO.3所示，结果在MMP-11基因5'调控区检测到三个突变位点，即g.-889(C>T)、g.-636(A>G)和g.-518(C>T)位点。

注：+1的位置是参考基因组MMP11基因转录启示位点(TSS)，往上游即为负，往下游即为正。g.-889(C>T)、g.-636(A>G)和g.-518(C>T)分别对应SEQ ID NO.3所示序列自5′端起第178位碱基是C或T，第431位碱基是A或G，第549位碱基是C或T。

经过群体的验证，发现g.-889(C>T)和g.-636(A>G)两个突变位点与鸡的性早熟性状关联显著，可作为可靠的标记位点用于性早熟性状选育。由此提出了本发明。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。本发明所采用的方法中未做详细说明的均为本领域现有技术。

实施例1：鸡MMP-11基因5′调控区序列的克隆测序、序列比对及多态性位点分析

1.试验材料

济宁百日鸡基因组(济宁大唐百日鸡保种场)、隐性白洛克鸡基因组(山东纪华家禽育种有限公司)、文昌鸡(海南省文昌鸡育种有限公司)。

2.试验方法

2.1引物设计

根据已发表红色原鸡序列(GenBank Accession NC_006102.5、Gene ID:101751203)设计引物P-MMP-11，此引物是为研究鸡MMP-11基因5′调控区的突变而根据数据库中登录的红色原鸡的序列特意设计的。

2.2 PCR扩增

随机选取济宁百日鸡、隐性白洛克和文昌鸡各48个个体的基因组混池作为模板，用引物P-MMP-11进行PCR扩增。引物见表1(SEQ ID NO.1和2)，反应体系20μL，其中包括1μL基因组DNA(50-100ng)，10μL2×PrimeSTAR GC Buffer，1.6μL dNTPs(2.5mM each，TaKaRa)，上下游引物各0.5μL(10μM)，0.1μLPrimeSTAR HSDNA polymerase(5U/μL，TaKaRa)，ddH₂O补足至20μL。扩增程序：94℃预变性5min；98℃变性10sec，58℃退火15sec，72℃延伸80sec，进行35个循环；循环结束72℃孵育5min。PCR扩增产物经1.0％琼脂糖电泳分离后切取目的带，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(AxyPrep DNA Gel Extraction Kit，AXYGEN)纯化PCR产物，送公司测序。

表1:引物序列、退火温度

3.结果与分析

PCR产物电泳见图1，目的片段的长度为1128bp(SEQ ID NO.3)。

使用DNAMAN version 7.0比对序列同源性和完成突变核苷酸的检索，用ChromasPro软件对测序结果分析，发现扩增的济宁百日鸡、隐性白洛克和文昌鸡MMP-11基因5′调控区-889(C>T)、-636(A>G)和-518(C>T)位点存在SNP(见图2)。

实施例2：鸡MMP-11基因5′调控区多态性与开产日龄和产蛋数性状的关联分析

1.试验材料

随机选取90只隐性白洛克鸡、60只文昌鸡和有产蛋记录的济宁百日鸡695只。以上均为随机采样，翅静脉采血，提取基因组后，-20℃保存。

2.试验方法

2.1KASP方法对SNP位点进行基因分型

通过KASP方法对g.-889(C>T)、g.-636(A>G)和g.-518(C>T)位点进行分型。KASP(KompetitiveAllele Specific PCR)，即竞争性等位基因特异性PCR。针对SNP/Indel位点设计3条引物，两条正向特异性引物和一条反向通用引物，两条正向引物对应两种荧光信号，经过PCR反应，最终检测两种荧光的荧光值大小来判断样本分型情况。g.-889(C>T)位点两条反向特异性引物(SEQ ID NO.4和5)和一条正向通用引物(SEQ ID NO.6)，g.-636(A>G)位点两条正向特异性引物(SEQ ID NO.7和8)和一条反向通用引物(SEQ ID NO.9)及g.-518(C>T)位点两条正向特异性引物(SEQ ID NO.10和11)和一条反向通用引物(SEQ IDNO.12)；引物信息如表2所示。

表2：AS-SNP和KASP分型所用引物信息

2.2单倍型构建及关联分析

R软件用于统计基因型和基因型频率，PHASE软件用于单倍型构建，用SHEsis在线软件和HaploView软件分析MMP-11基因5′调控区3个SNPs位点在济宁百日鸡中的连锁不平衡关系。数据统计采用SAS8.2统计软件包的GLM程序进行基因型与性状(产蛋数、开产日龄)的关联分析。不同基因型间的比较分析用最小二乘法，试验数据用最小二乘均值±标准误表示(LSM±SE)，显著差异水平设定P<0.05。

3.结果与分析

3.1 MMP-11基因5′调控区3个突变位点在不同品种中基因型和等位基因频率的分布

统计了济宁百日鸡、隐性白洛克鸡和文昌鸡品种的基因型和等位基因频率，分析结果见表3。

表3：多态位点的基因型和等位基因频率在不同品种中的分布

注：当HWE(P>0.05)时，说明群体基因遗传平衡。

g.-889C>T、g.-636A>G和g.-518C>T位点的优势等位基因分别是T^-889、G^-636和T^-518。群体遗传学分析显示，3个SNPs位点的等位基因分布均处于哈代温伯格平衡(P>0.05)。

3.2 MMP-11基因5′调控区三个位点多态性分析及其与生产性能的关联分析

在558只济宁百日鸡群体，分析MMP-11基因5′调控区g.-889C>T、g.-636A>G和g.-518C>T位点与开产日龄(AFE)、30周产蛋数(E30)及50周产蛋数(E50)性状的关系，结果g.-889C>T和g.-636A>G位点对开产日龄(AFE)和30周(E30)产蛋数的效应差异显著(P<0.05)，g.-889C>T位点的CC基因型型与g.-636A>G位点的AA基因型对应开产日龄早和早期产蛋数较多的个体(表4)。而g.-518C>T与开产日龄和30周龄产蛋数性状关联不显著(P＝0.053)，且它与g.-636A>G位点相连锁。

表4：三个突变位点多态性分析及其与生产性能的关联分析

3.3 MMP-11基因5′调控区三个位点连锁不平衡分析

用SHEsis在线软件和HaploView软件分析MMP-11基因5′调控区3个SNPs位点在济宁百日鸡中的连锁不平衡关系，分析结果如图3所示，其中g.-636(A>G)和g.-518(C>T)位点呈现连锁状态。

3.4 MMP-11基因5′调控区g.-889(C>T)和g.-636(A>G)两位点单倍型组合与产蛋性状关联分析

因为g.-518(C>T)位点与性状关联未达到统计显著，故针对g.-889(C>T)和g.-636(A>G)两个位点构建单倍型并进行联合单倍型与性状关联分析。用PHASE软件对鸡g.-889(C>T)和g.-636(A>G)位点的四种单倍型(分别为CA、CG、TA、TG)构建了5种双倍型，分别为：CA/CA、CA/TG、CG/TG、TA/TG和TG/TG。对2个SNPs位点的单倍型组合进行性状关联分析，结果如表5所示：各基因型与开产日龄(P＝0.001)、30周产蛋数(P＝0.011)性状的关联分析均达到了显著水平。CA/CA基因型个体对应较小的开产日龄和较高的产蛋数。因此，在育种群体中有意增加CA/CA基因型频率，则有望提早群体的性成熟时间和提高产蛋数。

表5：济宁百日鸡群体中MMP-11基因启动子区两个SNPs位点单倍型联合分析

注：表中数值为AFE(开产日龄)、E30(30W产蛋量)和E50(50W产蛋量)的最小二乘均值±标准误，P<0.05差异显著，P<0.01差异极显著。

实施例3：鸡MMP-11基因5′调控区核心启动子区筛选

1.试验材料

随机采取高峰产蛋期(42w)的健康海兰褐鸡(3～5只)，用于卵泡颗粒细胞的培养。

2.试验方法

2.1 MMP-11基因5′调控区删除载体的构建

以百日鸡基因组DNA为模板，以5′-GGAGCAGCACC TGGTAACT-3′为上游引物，命名为[MMP-11-(-3423/+62)-F]，以5′-CTGCCTTTTGTTCTCCCCTC-3′为下游引物，命名为[MMP-11-(-3423/+62)-R]，扩增MMP-11启动子区(GenBank AccessionNC_006102.5、Gene ID:101751203)-3423～+62区段(共3485bp，序列如SEQ ID NO.13所示；序列中自5′端起第3424位碱基“C”为TSS。)，命名为F1。其中，上游引物5′端加Kpn I酶切位点及保护碱基，下游引物5′端加Xho I酶切位点及保护碱基，分别用双下划线标注。以构建的F1载体为骨架，用DNAMAN对MMP-11基因的5′调控区进行删除载体的引物设计，以3′端固定向前步移800bp左右，扩增不同长度片段。上游引物5′端加Kpn I酶切位点及保护碱基，下游引物5′端加Xho I酶切位点及保护碱基。

2.2鸡颗粒细胞的分离培养

1)取产蛋高峰期母鸡，用灭菌的小剪刀小心的取下整个卵巢，迅速放入到盛有3％PBS的500mL烧杯中，带入细胞间进行后续操作；

2)用弯头镊子将外膜层剥离下来，用弯头镊子将卵泡刺破释放卵黄，从刺破口入手将释放卵黄后的卵泡铺成片状，然后小心将内膜层和颗粒细胞层分离开；

3)将颗粒细胞转移到15mL离心管中，加入适量0.25％的胰酶消化15min；然后加入M199培养基终止消化。用200目滤器进行过滤，将滤液收集到15mL离心管中，1800rpm离心5min，弃上清，加入PBS吹打沉淀，1800rpm离心5min，弃上清，加入M199培养基悬浮沉淀，进行铺板；向细胞培养板所有孔中加入相应的细胞悬液并加入M199培养基补足至1mL，将接种好的24孔板放于38℃、5％CO₂培养箱中进行培养；

4)培养至细胞贴壁70-90％时进行后续的转染实验。

2.3细胞瞬时转染及荧光素酶活性检测

1)细胞瞬时转染

本实验采用Lipofectamine^TMLTX Reagent转染。转染在24孔板中进行，每个载体质粒至少做4个重复，并进行3次平行试验。

2)双荧光素酶活性检测

用Promega公司的Dual-Luciferase Reporter Assay System双荧光素酶报告基因检测试剂盒，来检测报告基因的表达水平。根据所得的M1/M2值即为报告基因的启动活性。

3.结果与分析

3.1 MMP-11 5′调控区不同片段的删除载体的双荧光素酶活性分析

将构建好的MMP-11基因5′调控区不同片段长度的删除载体，分别转染到体外培养的等级前颗粒细胞中，转染48h后进行双荧光素酶活性检测，结果如图4所示：在MMP-11基因启动子-1066bp到-512bp区域均检测到报告基因的活性显著上升(P<0.01)，表明在这550bp区域内含有增强MMP-11基因转录调控的顺式作用元件，是MMP-11基因的核心启动子区。上述3个SNPs位点正是位于-1066bp到-512bp的核心启动子区域。

综合以上结果：

通过以上3个鸡品种比较，表明MMP-11基因5′调控区存在三个突变位点。在济宁百日鸡中两个位点基因型与繁殖性状存在相关，CA/CA基因型个体与开产日龄早和30周产蛋数多的性状关联显著(P<0.05)，即CA/CA基因型对应较小的开产日龄和早期高产蛋数。双荧光素酶检测结果表明这三个SNPs位点位于核心启动子区域内。由此，通过这种标记方法得到的CA/CA型种鸡能兼顾开产日龄和产蛋数，在产蛋性能低的地方品种中有意增加CA/CA基因型的频率对提早开产和提高产蛋数是一个有效措施，而对于开产较晚的群体，这样的措施会使其开产适当提前，从而实现早期选种。具体示例如下：

济宁百日鸡属蛋用型山东地方鸡种，体重轻，耗料少，抗病能力强，济宁百日鸡开产最早为80天，一般100至140天开产，在较粗放饲养条件下，产蛋量为150至180个，高产鸡达220个以上，以其为素材筛选性成熟相关分子标记，可用于性早熟的品种/系的培育。表5百日鸡群体中单倍型组合与产蛋性状关联分析结果显示：CA/CA型的平均开产日龄约147天，30周龄平均产蛋数均为49枚；TG/TG型个体平均开产日龄约150天，30周龄平均产蛋数均为44枚。CA/CA型比TG/TG型个体开产日龄提早3天，30周龄早期产蛋数多5枚。通过以上育种得到的CA/CA型能兼顾开产日龄和产蛋数，可以提早整个群体的开产日龄也兼顾了较高的产蛋数。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东农业大学

<120> 鸡MMP-11基因5′调控区两个突变位点分子标记方法及其在鸡性早熟性状选

育中的应用

<130> 2019

<160> 13

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cattcagcct gggatgtta 19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ctgccttttg ttctcccctc 20

<210> 3

<211> 1128

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cattcagcct gggatgttag gaagctttac ccactcccca tgcaccagca caggcagctg 60

gagatcaaag tctccttatt tgcatacatt tcttgaacca atttgcagtt aaactctgct 120

gaggggatgc tgacacagtg cagggcctct tccccacagg aaccaagaaa ccagagccgt 180

gcactgcctg cctccatctc caggctgagc ggatggaggc tttggcatcc ccaaaatgaa 240

ggtttagcct tccttcccct tcctcagcat cctgcccagg gaaagccttc ctgagggtgg 300

tgagtgcagg gccagacaca cacagcggct cccgcagagc cccacagatg caaagcagtg 360

atgcaagcac atttctttca ttaaatccag agatcagatc ttccctgtga gcaccaaaag 420

gtccaggtgc acagaggatg gttttcgtcc tggggagggg aattggaaaa caccttcact 480

gctctcccac ttgctcccct catcccaggc atcggtcctt ttctgaattg tcacagatga 540

cagcaaaaca tcggacccat tccttctacc ctgctttggg gcagcaacaa gagcttttgc 600

agcaccacaa agcacgcact gggtagagaa tggtgaacgc ttgtgggatt acagcaccac 660

ttttcaaccc aactcccaag cttgccacgc agagcagtcc cagcttggaa caccatccca 720

gtgagagcag aaaccagctc cgggactgga aggaagcgct tgcagcgcgt gtgcaacttg 780

cagccaggtg ctgcctcact gtacatgcag acggccggag gcgaaacagc atcgtcagcc 840

cgagggcagc agcgcacagc cccgcacctc cttttcttcc ccttctccct cgtcctcctc 900

ctcctctctc cgctccggcc ggggctgcag cctccggcgg ccccgcgccg ttcggccgcg 960

gctcccggcg cctcactccc tccctccctc ccacgggggc atgaagcccg ggggggccgg 1020

ggagcggcgg ggcggccccg ttcccgggcg gctccgcccg cgataccgac gggccgcatc 1080

ccctcggccc gcaaggctgt aacccgacga ggggagaaca aaaggcag 1128

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gaaccaagaa accagagcc 19

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

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gaaccaagaa accagagct 19

<210> 6

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<212> DNA

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aagtgggaga gcagtgaag 19

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

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ccaggacgaa aaccatcctc tgt 23

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

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caggacgaaa accatcctct gc 22

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tcagatcttc cctgtgagca ccaaa 25

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ggtagaagga atgggtccga tg 22

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gggtagaagg aatgggtccg ata 23

<210> 12

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

cttttctgaa ttgtcacaga tgacagcaa 29

<210> 13

<211> 3485

<212> DNA

<213> MMP-11启动子区

<400> 13

ggagcagcac ctggtaactc aacgtctgtc caagagggaa atcctcccca gccctggcgt 60

ttctaagggc agttcaccac atatgccctc cagccctgtt tgcacctacc agcacctgca 120

caaacatcca ctttggctgc ccggggaaaa acatgatgcc agggccaaag caaaagagaa 180

cctctgaaaa atgagagggt cagagcagtg agatggtgat gctttcccat gtattaccca 240

cggagcagtg gtgatggaga caattcatga ggccatcacc tactgaggga ataggaaaga 300

tatcagagga accaaaaggc tttctctgtc ctggggtgct ggcttcagaa ccctcctcca 360

gctgctcaca gcaatgcccc agaggtgcag tgctcctgct gactttgcag ggaccctgag 420

gccaggccct cagccccaca gaacacagct gtgaaagtca caccagggag gtggcaggaa 480

acaaaaggac tttggacaga caggcctaat ccatttaaat tcagtttatc tctcacctcc 540

cccttcccct tctctcagag acctcttctc tctcctgctc tcagtccaaa gtgccacagc 600

agtgtctcac tgctgtttca cgctgaaatg gcccactgac agatagttat gctcttagct 660

gttcacaaca gagagaaatc agaactgctg tatccttcat cttgcacact gttagcactg 720

gctggtgctt ccttgcaagg ctcatgtcat aattagcacc aaaggaacaa gatggtctcg 780

cactatgacc ctgcaaattg tcccccaaat ccagctagat agggattatc cagagagctg 840

gaaaaaatga gtgggggagg ctggctgcaa gcaaaagggc agggaatccc catgctcact 900

gtttctgagg ccacagagct catcatacat atgacacagc tgatccctgc ctcacaaaca 960

tccctaccat tctcatccct gctggcagct ctggctggcc aacagctcct ggtccgagcc 1020

ccatcactac tcaggcatca aggaacaaag tatgtggccc agcctctgat cacagaccag 1080

caggcactga ggcagctgtt gagcaagaag atccatgcat ggggatgctg cagtcagtga 1140

ttggtgggac ctcccagtca tgaaggttcc tatggatctc ctgcagccac cacaagctcc 1200

ctgatcccca aaggttgctc cagcccagca ggagcttcag gaaagcaagc aggttgcacc 1260

tgcactgaag tgtcagcctg ttggtgttcc ggggttgggg tggaagccct atgctctgaa 1320

tcctctgtac attcagcaag ctgcacactc atgtaaggat gagggctgca caggcagact 1380

gactgcaaga gctcctagca gagcagtgtt agcagaaagg gcttgtgctg gctgcacgta 1440

gggctgtcag cagaaggtga gcacacaggc tcccaaccca ctcagtgggc catcttcccg 1500

ctgctgaaca tgtccctgct ctgctggaaa atgcttggaa tcccaaacac accatgcact 1560

ttcttctgtg ctcagtgtct tggcaggaac cgctgttctc acgcatggtc ccatctctgt 1620

aaggcctgtg tttcccagaa cacccccttc ccaagtctcc cttttttaag aagagccaag 1680

ctgcctgtcg ctgcctcgca ggctgctccc acgcctctcc ctgcttcccc agggcaccaa 1740

cagactcccc tggcatgggc tgaaggccct gagctcccag agacaccagc cattcaaatg 1800

aaagacacta aagaaaagca aaacaaaggc aggaaagctt tccttgctgg aacccagctg 1860

tctgactcaa agcaaggcaa gaaagtaaga actgctgttt gttccagagc agcagagtgt 1920

acactccata gcatgcagcc tgagcccagc aagcacattt ccctgcttct tccctctggc 1980

tgctcccaca ggtgtggctt ctgggatacc tctactacac aactccaaca agggacagct 2040

cctgccagcc ccagtgctcg cagcgggagc cacggtgggg cccaagctgt gaccaggtgt 2100

ggagctctac agctctacac attagatctg tgcagggtca ggtcaggaca tcgctctcga 2160

ctgcctggca cacagtgctc ggtgggcttt tgcttttctg cctcacctcc ctttgctcag 2220

cattgcagtg ttgtccaagc aaggccacca ccaggctcat tcttcttgca tctgcttatc 2280

gtactcagta tttacaccct aaatatggtt tccataaagt aaaatatgaa caattcatca 2340

caggcaaata aaacagtcat tcagcctggg atgttaggaa gctttaccca ctccccatgc 2400

accagcacag gcagctggag atcaaagtct ccttatttgc atacatttct tgaaccaatt 2460

tgcagttaaa ctctgctgag gggatgctga cacagtgcag ggcctcttcc ccacaggaac 2520

caagaaacca gagccgtgca ctgcctgcct ccatctccag gctgagcgga tggaggcttt 2580

ggcatcccca aaatgaaggt ttagccttcc ttccccttcc tcagcatcct gcccagggaa 2640

agccttcctg agggtggtga gtgcagggcc agacacacac agcggctccc gcagagcccc 2700

acagatgcaa agcagtgatg caagcacatt tctttcatta aatccagaga tcagatcttc 2760

cctgtgagca ccaaaaggtc caggtgcaca gaggatggtt ttcgtcctgg ggaggggaat 2820

tggaaaacac cttcactgct ctcccacttg ctcccctcat cccaggcatc ggtccttttc 2880

tgaattgtca cagatgacag caaaacatcg gacccattcc ttctaccctg ctttggggca 2940

gcaacaagag cttttgcagc accacaaagc acgcactggg tagagaatgg tgaacgcttg 3000

tgggattaca gcaccacttt tcaacccaac tcccaagctt gccacgcaga gcagtcccag 3060

cttggaacac catcccagtg agagcagaaa ccagctccgg gactggaagg aagcgcttgc 3120

agcgcgtgtg caacttgcag ccaggtgctg cctcactgta catgcagacg gccggaggcg 3180

aaacagcatc gtcagcccga gggcagcagc gcacagcccc gcacctcctt ttcttcccct 3240

tctccctcgt cctcctcctc ctctctccgc tccggccggg gctgcagcct ccggcggccc 3300

cgcgccgttc ggccgcggct cccggcgcct cactccctcc ctccctccca cgggggcatg 3360

aagcccgggg gggccgggga gcggcggggc ggccccgttc ccgggcggct ccgcccgcga 3420

taccgacggg ccgcatcccc tcggcccgca aggctgtaac ccgacgaggg gagaacaaaa 3480

ggcag 3485

Claims

1.一种鸡MMP-11基因5′调控区与性成熟性状关联的突变位点分子标记方法，其特征在于，具体标记方法是：

采用标记引物P-MMP-11，包括：

P-MMP-11-F，其序列如SEQ ID NO.1所示；

P-MMP-11-R，其序列如SEQ ID NO.2所示；

扩增鸡育种材料的基因组DNA，PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳并回收，经测序得到的序列如SEQ ID NO.3所示，结果在MMP-11基因5'调控区检测到三个突变位点，分别位于MMP11基因TSS上游889bp、636bp和518bp，即g.-889(C>T)、g.-636(A>G)和g.-518(C>T)位点，其中g.-889(C>T)和g.-636(A>G)两个突变位点与性成熟性状存在显著关联。

2.一组与鸡性成熟性状相关的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记来自MMP-11基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；SEQ ID NO.3所示序列自5′端起第178位碱基是C或T，第431位碱基是A或G。

3.根据权利要求2所述的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记的CA/CA基因型个体表现出开产早性状。

4.权利要求2或3所述的SNP分子标记在鸡遗传育种中的应用。

5.用于检测权利要求2或3所述的SNP分子标记的引物对，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

6.用于检测权利要求2或3所述的SNP分子标记的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含权利要求5所述的引物对。

7.权利要求5所述的引物对和/或权利要求6所述的试剂盒在辅助选育性成熟早的鸡品种中的应用。

8.一种利用权利要求2或3所述的SNP分子标记辅助进行鸡选择育种的方法，其特征在于，包括以下步骤：

在性成熟较晚的群体中，选择CA/CA纯合基因型公鸡和CA/CA纯合基因型的母鸡通过相互交配得到CA/CA基因型，即得到性成熟早的群体。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述CA基因型是指MMP-11基因5'调控区-889和-636位点分别为C和A碱基。