CN116536327A - 一种小麦黄花叶病感病基因TaEIF4E及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一个新的小麦黄花叶病感病基因TaEIF4E，其在小麦A、B、D三个亚基因组上的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22所示。利用CRISPR/Cas9基因编辑手段，通过分子标记辅助选择，获得了同时编辑TaEIF4E基因A、B、D三个亚基因组上3个拷贝的纯合株系，该株系对小麦黄花叶病完全抗病，而编辑1个或者2个拷贝的纯合株系对小麦黄花叶病依然感病，证实TaEIF4E是小麦黄花叶病的感病基因，是小麦黄花叶病毒成功侵染小麦所必须的。因此，利用基因编辑手段在优异小麦品种中同时敲除TaEIF4E基因的三个拷贝，可创制抗小麦黄花叶病的优异小麦种质资源，为小麦生物育种提供了可行的方案。
Description
技术领域
本发明涉及植物生物技术领域，具体涉及一种小麦黄花叶病感病基因TaEIF4E及其应用。
背景技术
小麦(Triticum avesticumL.)是六倍体植株(2n＝6x＝42，AABBDD)，其基因组由A、B、D三套亚基因组整合而成，小麦黄花叶病是一种由小麦黄花叶病毒(Wheat yellowmosaic virus，WYMV)感染引起的土传病毒病害，严重威胁我国小麦粮食生产安全。EIF4E(eukaryotic translation initiation factor 4E)编码真核蛋白翻译起始因子，在蛋白翻译过程中发挥重要作用，研究发现，EIF4E参与植物与病毒的互作，是多种RNA病毒侵染植物的宿主因子，又称为感病基因，而宿主因子的功能丧失或者改变会导致病毒无法侵染宿主植物，由此引起的抗病性称为隐性抗病性。因此，通过基因沉默或基因编辑突变EIF4E关键位点，干扰病毒在植物体内的蛋白合成，可以增强植物对病毒的抗性。
HvEIF4E是大麦黄花叶病的感病基因，不同氨基酸变异产生的抗性单倍型赋予大麦对大麦黄花叶病毒属(Bymovirus)病毒的抗病性。小麦中是否存在HveIF4E的同源基因，此同源基因在病毒感染时是否发挥宿主因子的功能，它的突变是否赋予小麦黄花叶病的抗病性，因此，解决这一类的问题对于发掘新的小麦抗病毒基因并创制优异的小麦抗病资源尤为重要。
发明内容
本发明的目的是提供一种小麦黄花叶病感病基因TaEIF4E及其应用，本发明的小麦TaEIF4E基因是小麦黄花叶病的感病基因，而通过敲除TaEIF4E基因可获得小麦抗黄花叶病植株，本发明的抗病材料创制方法稳定可靠，获得的小麦抗黄花叶病品系对小麦优良育种提供了可行的方案。
为了达到上述目的，本发明提供了一种小麦黄花叶病感病基因TaEIF4E，该感病基因TaEIF4E在小麦A、B、D三个亚基因组上的所编码的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.20、SEQID NO.21和SEQ ID NO.22所示，其编码的蛋白质在小麦A、B、D三个亚基因组上的氨基酸序列如SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24和SEQ ID NO.25所示。
本发明提供的感病基因TaEIF4E在小麦A、B、D三个亚基因组上的完整基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示，其中，该完整基因的核苷酸序列包含感病基因TaEIF4E的启动子区、UTR区、外显子区和内含子区。
本发明提供的感病基因TaEIF4E还包含与其核苷酸序列具有90％及以上同源性的核苷酸序列或与其核苷酸序列杂交所得的核苷酸序列。
本发明还提供了一种小麦黄花叶病抗病植株的创制方法，包含如下步骤：
将上述的感病基因TaEIF4E作为编辑靶点；
构建针对该编辑靶点的基因编辑重组载体，使编辑后的感病基因TaEIF4E所编码的蛋白不表达；
通过该基因编辑重组载体构建小麦突变体植株；
对小麦突变体植株进行筛选鉴定获得小麦黄花叶病抗病植株。
优选地，上述创制方法中的重组载体选自CRISPR/Cas9载体，该重组载体所编辑的sgRNA靶标序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
优选地，上述创制方法中的小麦突变体植株是通过将上述基因编辑重组载体转入农杆菌后，用所得的农杆菌转染小麦后构建获得。
优选地，上述创制方法中的筛选鉴定包含如下步骤：
提取待检测的突变体植株的基因组DNA；
以提取的基因组DNA为模板，分别采用核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的特异扩增引物进行扩增，得到特异扩增产物；
以得到的特异扩增产物为模板，分别采用核苷酸序列如SEQ ID NO.11和SEQ IDNO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.12所示的鉴定引物进行扩增，得鉴定扩增产物；
对得到的鉴定扩增产物进行酶切鉴定，其中不能酶切的代表野生型，能酶切代表基因编辑后得到的突变体，同时对该特异扩增产物序列进行测序验证。
其中，引物SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6对应扩增小麦A亚基因组上的片段，引物SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8对应扩增小麦B亚基因组上的片段，引物SEQ ID NO.9和SEQ IDNO.10对应扩增小麦D亚基因组上的片段。
以引物SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12扩增所得的扩增产物能发生酶切代表发生了1bp序列的插入，其中酶切选用的限制性内切酶为ApaI；以引物SEQ ID NO.13和SEQ IDNO.12扩增所得的扩增产物能发生酶切代表发生了1bp序列的缺失，其中酶切选用的限制性内切酶为Sca I。
本发明还可将制备的小麦A、B、D三个亚基因组上杂合的突变体植株通过自交和杂交，获得在小麦A、B、D三个亚基因组上同时编辑的纯合植株即为小麦黄花叶病抗病株。
本发明还提供了一种通过上述创制方法制备的小麦黄花叶病抗病植株。
本发明提供的感病基因TaEIF4E或创制方法可被应用于小麦育种中，尤其可用于创制抗黄花叶病小麦品系。
本发明揭示了一种小麦黄花叶病的感病基因TaEIF4E，创制了小麦抗黄花叶病品系，解决了小麦易感黄花叶病的问题，并具有以下优点：
本发明获得了小麦黄花叶病感病基因TaEIF4E及其序列，通过基因编辑方法获得了TaEIF4E基因的三拷贝同时敲除的突变体，并对其功能进行深入的研究，发现通过敲除TaEIF4E基因获得同时编辑小麦A、B、D三个亚基因组上TaEIF4E基因的株系对小麦黄花叶病具有完全抗病性，可用于改良小麦对小麦黄花叶病的抗病性，以及对小麦优良育种提供了可行的技术方案。
附图说明
图1为本发明中小麦TaEIF4E基因在A、B、D三个亚基因组上的拷贝与大麦HveIF4E基因结构示意图及进化树分析图。
图2为本发明中TaEIF4E基因在A、B、D三个亚基因组上的特异性扩增检测结果图。
图3为本发明中通过两轮杂交创制纯合双突变体和纯合三突变体材料流程示意图。
图4为本发明中利用PCR扩增后酶切检测TaEIF4E基因编辑材料的凝胶电泳检测结果图。
图5为本发明中对A、B、D三个亚基因组上TaEIF4E基因部分或者全部拷贝敲除纯合株系的小麦黄花叶病抗病性鉴定结果图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实验例1基因获取
本实验例提供了利用大麦HveIF4E在小麦中鉴定同源基因的方法，具体鉴定如下：
步骤一：以大麦HveIF4E的全长CDS序列，通过blast比对小麦“中国春”的基因组序列，获得同源性最高的三个基因拷贝，并命名为TaEIF4E-A、TaEIF4E-B、TaEIF4E-D，分别为基因TaEIF4E在小麦A、B、D三个亚基因组上的命名。同时可知该基因在小麦A、B、D三个亚基因组上的全长核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示，其中，该全长序列包含了该基因的启动子区、UTR区域、外显子区和内含子区；可知该基因在小麦A、B、D三个亚基因组上的CDS的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22所示，其CDS所编码的氨基酸序列分别对应如SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25所示。
步骤二：对获得的三个基因及大麦HveIF4E序列通过MEGA7进行进化树分析，并对基因结构进行同源比对分析，结果如图1所示，其中，进化树分析采用邻接法，bootstrap值为1000。外显子和内含子分别用灰色的长方形和黑色的横线表示。
实验例2基因编辑载体的构建
本实验例根据获取到的基因采用常规方法设计TaEIF4E基因编辑的sgRNA序列，其核苷酸序列如SED ID NO.4所示，同时该sgRNA序列的靶标序列位于图1中的外显子1的箭头指示处，用黑色竖线标注。选择常用的pWMB110-SpCas9质粒，采用同源重组的方法获得同时含有sgRNA和Cas9的基因编辑表达载体pWMB110-SpCas9-TaEIF4E，再将基因编辑载体转化入农杆菌C58C1中。
实验例3农杆菌介导小麦幼胚转化
本实验例提供了农杆菌介导的小麦幼胚转化方法，具体步骤如下：
步骤一：小麦幼胚的处理，取开花后14天左右的小麦幼胚，通过70％乙醇处理1min以及15％次氯酸钠处理10min对幼胚进行灭菌处理，并用无菌水清洗4～5遍。通过解剖刀和镊子将完整的胚从种子上剥离下来并置于没有乙酰丁香酮的1/10MS液体培养基中。
步骤二：农杆菌侵染和共培养，将含有pWMB110-SpCas9-TaEIF4E的C58C1农杆菌28℃过夜培养，取2mL菌液5000rpm离心5min，去上清，用2mL含有1.4％乙酰丁香酮(AS)的1/10MS液体培养基重悬菌体，并侵染小麦幼胚约10min，然后将侵染农杆菌的幼胚盾片朝上放置于共培养基中，23℃黑暗培养2天。
步骤三：愈伤组织的诱导，对共培养后的胚切除胚轴，盾片面朝上转移到愈伤诱导培养基中，进行愈伤组织的诱导和第一次筛选培养，25℃黑暗培养14天左右，将愈伤组织转移到新的培养基进行第二次筛选培养，25℃黑暗培养21天左右。
步骤四：愈伤组织的分化及转基因苗的生根和移栽，将愈伤组织转移到分化培养基，25℃光照培养2-3周，诱导绿芽分化。将绿芽转到1/2MS生根培养基中25℃继续光照培养，直至长出根系健壮的小麦幼苗，并将其移栽至条件可控的光照培养箱中，待后续编辑材料的鉴定和筛选。
实验例4 TaEIF4E基因的分子标记及其检测
本实验例提供了一种小麦A、B、D亚基因组上TaEIF4E基因特异片段的PCR扩增和凝胶电泳检测方法，检测步骤如下：
步骤一：采用CTAB法提取小麦基因组DNA，包括上述获得的转基因编辑小麦、野生型小麦植株和转入了空载体的小麦植株；
步骤二：以小麦基因组DNA为模板，分别利用A、B、D三个亚基因组特异的引物组合物进行PCR扩增，获得A、B、D三个亚基因组上特异的TaEIF4E基因特异扩增产物序列。其中，PCR反应体系为20μL:DNA模板(浓度为10ng/μL)2μL，2×Phanta Max buffer 10μL，10mMdNTP mix 0.4μL，10μM的PCR引物组合溶液各0.4μL，Phanta Max Super-Fidelity DNApolymerase(南京诺唯赞生物科技股份有限公司；P505；1U/μL)0.2μL，ddH2O 6.6μL。
其中，PCR反应程序如下：
其中，A亚基因组上特异的引物组合物为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；
B亚基因组上特异的引物组合物为SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；
D亚基因组上特异的引物组合物为SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10。
步骤三：利用1％(w/v)琼脂糖凝胶电泳进行跑胶检测，结果如图2所示，其中，图中的M为Marker(5000+)，泳道1～7为转基因编辑小麦，泳道8为野生型小麦植株，泳道9为转入了cas9空载体的野生型植株，泳道10为模板为水的阴性对照。结果表明，可以利用上述的三对引物在突变体小麦和转基因编辑小麦中分别特异性地扩增获得TaeIF4E在A、B、D亚基因组上特异序列，便于后续分别在A、B、D亚基因组上通过Sanger测序鉴定TaeIF4E的不同编辑突变类型。
实验例5突变材料的杂交流程
理论上通过突变可以得到三个拷贝同时敲除的株系，但是在研究中对突变的植株进行测序鉴定后，并未获得T0代在三个位点同时突变的株系。因此，本实验例提供了小麦TaEIF4E基因在A、B、D三个亚基因组上同时突变的材料创建和筛选过程，主要涉及两轮杂交和分子标记辅助选择方法。具体步骤如下：
步骤一：对T0代获得的TaEIF4E基因在亚基因组A、B、D上各自突变的植株进行播种，并对其进一步鉴定获得纯合单突变体植株即#41-2(AABBdd)、#15-3(aaBBDD)和#87-5(AAbbDD)。
步骤二：第一轮杂交以#41-2(AABBdd)为母本，以#15-3(aaBBDD)为父本，通过人工授粉，获得在亚基因组A和D两个位点突变的杂合植株(AaBBDd)。
步骤三：第二轮杂交，以第一轮获得的杂合植株(AaBBDd)为母本，以#87-5(AAbbDD)为父本，进行人工授粉，获得在A、B、D三位点同时杂合的F1(AaBbDd)株系。
步骤四：对三位点同时杂合的F1单株进行种植，获得F2自交群体，并对自交群体通过分子标记辅助选择结合Sanger测序，获得在三位点同时纯合的单、双、三突变体敲除材料。其中杂交流程图如图3所示。
实验例6 TaEIF4E基因编辑片段检测
本实验例提供了一种小麦A、B亚基因组上TaEIF4E基因编辑片段检测方法，可结合测序辅助鉴定实验例5中获得的自交群体的编辑类型，具体检测方法如下：
步骤一：为得到转基因编辑植株的准确基因型，以实验例4中获得的PCR特异扩增产物为模板，除引物以外，PCR反应体系与实验例4相同，扩增得到鉴定扩增产物，并对所得的鉴定扩增产物进行酶切鉴定。
其中，鉴定A亚基因组的引物组合为核苷酸序列如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示，并在其中引入限制性内切酶为ApaI的酶切位点，用于检测原序列中插入1bp的编辑类型；
鉴定B亚基因组的引物组合为核苷酸序列如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.12所示，并在其中引入限制性内切酶为ScaI的酶切位点，用于检测原序列中缺失1bp的编辑类型；
其中，PCR扩增反应程序如下：
步骤二：通过限制性内切酶酶切PCR产物，反应检测体系如下：
其中，检测1bp序列插入的限制性内切酶为Apa I(NEB；R0114S)，酶切条件为25℃恒温箱中酶切16h；检测1bp序列缺失的限制性内切酶为Sca I(NEB；R3122S)，酶切条件为37℃恒温箱中酶切16h。
步骤三：采用浓度为3％的琼脂糖凝胶，通过电泳检测酶切后的产物，结果如图4所示，其中，“+”代表进行了酶切，“-”代表未进行酶切。可知，泳道1的植株为A、B亚基因组双敲纯合株系；泳道2的植株为A、B亚基因组双敲纯合株系；泳道3的植株为A亚基因组单敲纯合、B亚基因组未编辑的株系；泳道4的植株为A亚基因组未编辑、B亚基因组单敲纯合株系；泳道5为A亚基因组单敲纯合、B亚基因组未编辑的株系；泳道6为A亚基因组未编辑、B亚基因组单敲纯合株系；泳道7为A、B亚基因组均无编辑的株系；泳道8为转入了编辑载体但未成功编辑的野生型株系；泳道9～10均为未进行编辑的野生型株系；泳道11和12是发生了相应编辑的阳性质粒对照。
步骤四：对步骤三中鉴定的转基因株系分别进行A，B，D亚基因组上Sanger测序，结合测序结果，进一步可知，图4中泳道1的植株基因型为aabbdd，泳道2的植株基因型为aabbDD，泳道3的植株基因型为aaBBdd，泳道4的植株基因型为AAbbdd，泳道5的植株基因型为aaBBDD，泳道6的植株基因型为AAbbDD，泳道7的植株基因型为AABBdd，其中，泳道1所在的植株为本次基因编辑的目标植株。a代表A亚基因组+1bp，b代表B亚基因组-1bp，d代表D亚基因组-2bp。
实验例7 TaEIF4E基因抗病功能研究
本实验例提供了TaEIF4E基因在小麦黄花叶病抗病功能研究中的方法。利用A，B，D三个亚基因组上TaEIF4E基因部分或者全部拷贝敲除纯合株系，包括A，B，D三个亚基因组上TaEIF4E基因三个拷贝同时编辑的纯合株系(aabbdd)，两个拷贝同时编辑的纯合株系(aabbDD，aaBBdd，AAbbdd)和单个拷贝敲除的纯合株系(aaBBDD，AAbbDD，AABBdd)。通过人工气候箱培养条件下接种小麦黄花叶病毒，检测小麦材料的抗病性。
具体步骤如下：
步骤一：人工接种小麦黄花叶病毒(WYMV)
在人工气候培养箱中播种小麦，培养14天待幼苗长至两叶一心期。将含有WYMV的病叶加入K2HPO4(pH9.1)缓冲溶液和石英砂(150目：200目＝1:1)利用研钵研磨出汁液，通过摩擦接种小麦幼苗。5天后进行第二次摩擦接种增强WYMV的侵染效率。其中接种病毒后的植株培养条件为12℃，10h光照/8℃，14h黑暗。每个基因型材料接种10-15株。
步骤二：收取小麦新叶的叶片，用于提取总RNA
在接种WYMV后第五周，剪取每株材料的新叶1cm左右，通过Trizol试剂(Invitrogen；15596-026)和方法提取总RNA，并通过Nanodrop对RNA进行定量。
步骤三：反转录合成cDNA
取1μg总RNA，利用HiScriptIIIRTSuperMix反转录试剂盒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司：R312-02)获得检测样品的cDNA，并加水稀释10倍后用于检测和定量WYMV病毒。
步骤四：通过半定量方法检测基因编辑材料中WYMV的积累
用WYMV特异的扩增引物组合和内参基因引物采用与实验例5相同的PCR反应体系和PCR反应程序，扩增循环数分别为28，32和36个；检测内参基因ACTIN，循环数为28个。PCR产物通过1％浓度的琼脂糖凝胶电泳检测，鉴定出PCR条带的植株为小麦黄花叶病感病，无PCR条带的植株为抗病，结果如图5中的5A所示。
其中，图5中的5A是病毒接种五周后植株的半定量PCR扩增检测WYMV的积累情况。其中AABBDD(wt)代表Fielder野生型，三个亚基因组无编辑；AABBDD(mock)代表含有Cas9载体但是三个亚基因组无编辑；aabbdd是同时敲除A、B、D亚基因组上三个TaEIF4E基因拷贝的纯合株系，对小麦黄花叶病抗病；aabbDD，aaBBdd，AAbbdd代表同时敲除A、B、D亚基因组上两个TaEIF4E基因拷贝的纯合株系，对小麦黄花叶病感病；aaBBDD，AAbbDD，AABBdd代表敲除A、B、D亚基因组上单个TaEIF4E基因拷贝的纯合株系。
其中，所用的引物序列如下所示(5’-3’)
WYMV RT F(SEQ ID NO.14)：CCGCCACCAAAGAGAAATGG；
WYMV RT R(SEQ ID NO.15)：TCGGAGGTGAGCATGGTATT；
TaACTIN F(SEQ ID NO.16)：GTGTGATGTGGATATCAGGAAGG；
TaACTIN R(SEQ ID NO.17)：TTAGAAGCACTTCCGGTGGA。
步骤五：通过实时荧光定量检测基因编辑材料中WYMV的积累
用WYMV特异的qPCR引物和内参基因引物采用如下条件进行定量PCR，PCR反应的体系为：1：10稀释后的cDNA样品模板2μL，2XChamQUniversalSYBRqPCRMaster mix预混液(南京诺唯赞生物科技股份有限公司；Q712)5μL，5μM的PCR引物各0.4μL，ddH2O2.2μL。其中PCR反应的退火温度为60℃，利用ABI7500(AppliedBiosystems)实时荧光定量PCR仪进行检测，基因的相对表达量利用2-ΔΔCT法进行计算，其相对定量检测结果如图5中的5B所示。
其中，PCR反应程序为：
其中，所用的引物序列如下所示(5’-3’)
WYMV qPCR F(SEQ ID NO.18)：GACAAATTAAAGAGCGCACCCA；
WYMV qPCR R(SEQ ID NO.19)：TAGCGTGAACAATGAATGGGGA；
TaACTIN F(SEQ ID NO.16)：GTGTGATGTGGATATCAGGAAGG；
TaACTIN R(SEQ ID NO.17)：TTAGAAGCACTTCCGGTGGA。
步骤六：在病毒接种后六周，对基因编辑株系和野生型对照材料的叶片表型进行拍照，如图5中的5C所示，结果表明，未感染WYMV的野生型植株未感病，而感染了WYMV的株系中除aabbdd植株未出现感病病症外，其余均为感病植株，呈现褪绿色斑。
本发明利用大麦同源基因HveIF4E序列在小麦中进行同源比对，鉴定获得小麦中的三个TaEIF4E拷贝，通过CRISPR/Cas9基因编辑手段，对小麦黄花叶病感病品种“Fielder”中TaEIF4E目标基因靶序列进行编辑，随后通过杂交和分子标记辅助选择，获得了同时编辑TaEIF4E基因A、B、D三个亚基因组上3个拷贝的纯合株系，接种小麦黄花叶病毒后发现，这些株系对小麦黄花叶病具有抗病性，而编辑1个或者2个拷贝的纯合株系对小麦黄花叶病依然感病，证明TaEIF4E基因是小麦黄花叶病的感病基因，通过敲除小麦A、B、D三个亚基因组上的3个拷贝，可以创制抗小麦黄花叶病的小麦材料。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
Claims (10)
1.一种小麦黄花叶病感病基因TaEIF4E，其特征在于，所述感病基因TaEIF4E在A、B、D三个亚基因组上的所编码的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22所示。
2.根据权利要求1中所述的感病基因TaEIF4E，其特征在于，所述感病基因TaEIF4E在A、B、D三个亚基因组上的完整基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.3所示，其中，所述的完整基因的核苷酸序列包含所述感病基因TaEIF4E的启动子区、UTR区、外显子区和内含子区。
3.根据权利要求1中所述的感病基因TaEIF4E，其特征在于，所述感病基因TaEIF4E包含与其核苷酸序列具有90％及以上同源性的核苷酸序列或与其核苷酸序列杂交所得的核苷酸序列。
4.如权利要求1中所述的小麦黄花叶病感病基因TaEIF4E编码的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质在A、B、D三个亚基因组上的氨基酸序列如SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24和SEQID NO.25所示。
5.一种小麦黄花叶病抗病植株的创制方法，其特征在于，包含如下步骤：
将如权利要求1所述的感病基因TaEIF4E作为编辑靶点；
构建针对所述编辑靶点的基因编辑重组载体，使编辑后的所述感病基因TaEIF4E所编码的蛋白不表达；
通过所述的基因编辑重组载体构建小麦突变体植株；
对所述的突变体植株进行筛选鉴定获得小麦黄花叶病抗病植株。
6.根据权利要求5所述的创制方法，其特征在于，所述的重组载体选自CRISPR/Cas9载体，所述的重组载体所编辑的sgRNA靶标序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
7.根据权利要求5所述的创制方法，其特征在于，所述的小麦突变体植株是通过将所述基因编辑重组载体转入农杆菌后，用所得的农杆菌转染小麦后构建获得。
8.根据权利要求5所述的创制方法，其特征在于，所述的筛选鉴定包含如下步骤：
提取待检测所述突变体植株的基因组DNA；
以提取的基因组DNA为模板，分别采用核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6、SEQID NO.7和SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的特异扩增引物进行扩增，得到特异扩增产物；
以得到的特异扩增产物为模板，分别采用核苷酸序列如SEQ ID NO.11和SEQ IDNO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.12所示的鉴定引物进行扩增，得到鉴定扩增产物；
对得到的鉴定扩增产物进行酶切鉴定，其中不能酶切的代表野生型，能酶切代表基因编辑后得到的突变体，同时对特异扩增产物序列进行测序验证；
其中，引物SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6对应扩增小麦A亚基因组上的片段，引物SEQ IDNO.7和SEQ ID NO.8对应扩增小麦B亚基因组上的片段，引物SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10对应扩增小麦D亚基因组上的片段；
以引物SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12扩增所得的扩增产物且能发生酶切代表发生了1bp序列的插入；
以引物SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.12扩增所得的扩增产物且能发生酶切代表发生了1bp序列的缺失。
9.一种根据权利要求5所述的创制方法制备的小麦黄花叶病抗病植株。
10.如权利要求1所述的感病基因TaEIF4E或权利要求5所述的创制方法在小麦育种中的应用。
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| CN117431256A (zh) * | 2023-12-06 | 2024-01-23 | 南京农业大学 | 一个小麦黄花叶病抗病基因TaRx-2D及其编码的蛋白和应用 |
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2022
- 2022-09-26 CN CN202211175660.4A patent/CN116536327A/zh active Pending
Cited By (2)
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| CN117431256B (zh) * | 2023-12-06 | 2024-03-08 | 南京农业大学 | 一个小麦黄花叶病抗病基因TaRx-2D及其编码的蛋白和应用 |
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