CN114292852B - 一种小麦黄花叶病抗病材料创制的标记组合物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种小麦黄花叶病抗病材料创制的标记组合物，利用CRISPR/Cas9基因编辑手段，通过对小麦黄花叶病感病品种“Fielder”中TaPDIL5‑1目标基因靶序列进行编辑，随后通过杂交和分子标记辅助选择，获得了同时编辑TaPDIL5‑1基因A，B，D三个亚基因组上3个拷贝的4个纯合株系，接种小麦黄花叶病毒后发现，这些株系对小麦黄花叶病具有抗病性，而编辑1个或者2个拷贝的纯合株系对小麦黄花叶病依然感病，证明TaPDIL5‑1基因是小麦黄花叶病的感病因子，通过编辑或者敲除小麦A，B，D三个亚基因组上的3个拷贝，可以创制抗小麦黄花叶病的小麦材料。

Description

一种小麦黄花叶病抗病材料创制的标记组合物

技术领域

本发明涉及一种小麦黄花叶病抗病基因，具体涉及小麦黄花叶病隐性抗病基因TaPDIL5-1的鉴定方法和应用。

背景技术

小麦(Triticum avesticum L.)黄花叶病是一种由小麦黄花叶病毒(Wheatyellowmosaic virus,WYMV)感染引起的土传病毒病害，严重威胁我国小麦粮食生产安全。WYMV属于马铃薯Y病毒科的大麦黄花叶病毒属(Bymovirus)，是我国冬小麦种植区包括黄淮、长江中下游地区的重要病害之一。近年来，由于全球气候变暖使得介质真菌适宜生存的区域增加，加上大型农机具的推广和跨区域作业使得病原迅速蔓延，在我国该病害有不断加重蔓延的趋势。根据发病程度和发病时间的不同，小麦黄花叶病可导致小麦30％-70％的产量损失。

在自然条件下，WYMV寄生在土壤中的禾谷多黏菌(Polymyxa graminis)的休眠孢子中，由于土壤耕种、风吹土壤颗粒、含有游动孢子的水分短距离运输，病毒随真菌孢子的传播完成在不同植株和不同地域之间的传播过程。通常WYMV在秋季感染幼苗根部，次年早春最先在小麦新叶中出现花叶病症即褪绿色斑，随着病斑不断增多导致叶片黄化，严重时植株矮小、分蘖严重减少、植株发育迟缓，早枯或不抽穗结实。由于禾谷多黏菌休眠孢子在土壤中能够存活10年以上，在外界环境适宜的情况下，携带病毒的休眠孢子萌发会再次感染寄主植物，因而该病成为一种长期、持久的病害胁迫。使用抗病毒基因培育抗病品种，是防治小麦黄花叶病最为经济有效的手段。

植物RNA病毒通常只编码少数几个蛋白，其需要依赖植物编码的宿主因子实现在宿主体内的复制和增殖。宿主因子的功能丧失或者改变会导致病毒无法侵染宿主植物，由此引起的抗病性称为隐性抗病性。据报道，在作物中近50％的病毒抗病基因为隐性遗传。在多倍体物种中，每个宿主因子存在多个来源于不同染色体组的功能高度相似的同源基因，这些基因间的功能冗余，会掩盖单个或者部分同源基因变异引起的抗病遗传效应，使得多倍体中发掘隐性抗病毒基因极为困难。

在六倍体小麦中，目前发现的9个抗小麦黄花叶病遗传位点，均表现为显性遗传，尚无抗小麦黄花叶病基因被克隆。在二倍体大麦(Hordeum vulgare L.)中，二硫键异构酶基因HvPDIL5-1的功能丢失，使得大麦对大麦黄花叶病毒属的大麦黄花叶病毒(Barleyyellow mosaic virus,BaYMV)和大麦温和花叶病毒(Barley mildmosaic virus,BaMMV)具有抗病性。因此，解决这一类的问题显得尤为重要。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了小麦基因TaPDIL5-1的基因序列、基因编辑靶标位点序列、引物组合序列和鉴定方法、以及应用示例，可以创制并获得抗小麦黄花叶病毒的小麦材料，可用于小麦黄花叶病抗病育种。

为了实现上述技术方案，本发明提供了一种小麦黄花叶病抗病材料创制的标记组合物，包括有利用CRISPR/Cas9基因编辑技术实现对TaPDIL5-1基因编辑的sgRNA靶标序列，其核苷酸序列为SED ID NO.1。

一种分别检测小麦A、B、D亚基因组上TaPDIL5-1特异基因序列的分子标记，所述TaPDIL5-1特异基因序列的分子标记以小麦基因组DNA为模板，分别采用如下引物对进行扩增得到的DNA分子；

小麦A基因组特异引物组合为SED ID NO.2以及SED ID NO.3；

小麦B基因组特异引物组合为SED ID NO.4以及SED ID NO.5；

小麦D基因组特异引物组合为SED ID NO.6以及SED ID NO.7。

分别检测小麦A、B、D亚基因组上TaPDIL5-1基因的PCR试剂，包括如权利要求2所述的引物对。

分别检测小麦A、B、D亚基因组上TaPDIL5-1基因编辑后不同序列类型的分子标记，该分子标记以上述权利要求3中获得的PCR产物为模板，分别采用如下引物对进行扩增得到的DNA分子，其中，

4bp序列缺失所用引物组合对为：SED ID NO.8和SED ID NO.9；

3bp序列缺失所用引物组合对为：SED ID NO.10和SED ID NO.9；

2bp序列缺失所用引物组合对为：SED ID NO.11和SED ID NO.9。

分别检测小麦A、B、D亚基因组上TaPDIL5-1基因序列产生编辑的PCR试剂，包括如权利要求4中的引物对的任一对，使用该引物对获得的PCR扩增产物进行限制性内切酶酶切鉴定和电泳检测，其中，4bp序列缺失所用的限制性内切酶为Ava II，3bp序列缺失所用的限制性内切酶为HinfI，2bp序列缺失所用的限制性内切酶为Bts I。

小麦黄花叶病抗病材料创制的标记组合物，包括小麦黄花叶病抗病基因TaPDIL5-1的核苷酸序列为SED ID NO.12或SED ID NO.13或SED ID NO.14。

创制小麦黄花叶病抗病材料的方法，采用如权利要求1-5任意所示的方法或权利要求6所示的序列来创制抗小麦黄花叶病的抗病材料。

该方法包含基于两轮PCR扩增得到的DNA分子，随后采用限制性内切酶酶切PCR扩增产物和凝胶电泳检测，具体步骤如下：

步骤一：利用CTAB法提取小麦基因组DNA；

步骤二：利用小麦基因组DNA为模板，利用A、B、D三个亚基因组上特异的引物组合物分别进行PCR扩增，获得三个染色体组上特异的DNA分子，A染色体上所述的引物组合物包括SED ID NO.2和SED ID NO.3；B染色体上的引物组合物包括：SED ID NO.4和SED IDNO.5；D染色体上的引物组合物包括SED ID NO.6和SED ID NO.7；

步骤三：分别以步骤二中所示的染色体上的引物组合扩增的DNA分子为模板，以如下引物组合物进行扩增，并对扩增得到的DNA分子进行酶切，其中4bp缺失所用引物组合对为：SED ID NO.8和SED ID NO.9；限制性内切酶为Ava II；

3bp缺失所用引物组合对为：SED ID NO.10和SED ID NO.9限制性内切酶为HinfI；2bp缺失所用引物组合对为：SED ID NO.11和SED ID NO.9，限制性内切酶为Bts I；

步骤四：以步骤三中扩增得到的DNA分子进行相应的酶切鉴定，其中不能酶切的代表野生型，能酶切代表基因编辑后得到的突变体。

步骤五：以步骤四中鉴定获得的小麦基因编辑材料，在人工气候培养箱条件下对播种14天后的小麦幼苗摩擦接种小麦黄花叶病毒，接种后5周收取样品提取RNA，并反转获得cDNA，以引物组合物SED ID NO.15和SED ID NO.16对病毒的cDNA样品进行扩增，定性检测WYMV的积累；以引物组合物SED ID NO.17和SED ID NO.18对病毒的cDNA样品进行扩增，通过qPCR定量检测WYMV的积累；以引物组合物为SED ID NO.19和SED ID NO.20对cDNA样品进行扩增，作为病毒定量检测的内参基因。

本发明的有益效果是：获得了小麦基因TaPDIL5-1及其序列，通过基因编辑技术可以创制抗小麦黄花叶病的小麦材料。借助本发明提供的引物组合和鉴定流程，可检测出TaPDIL5-1基因编辑后的序列变异类型，同时编辑小麦A、B、D三个亚基因组上TaPDIL5-1基因的株系对小麦黄花叶病具有完全抗病性，用于改良小麦对小麦黄花叶病的抗病性。

附图说明

图1是TaPDIL5-1在A，B，D三个亚基因组上的通用引物扩增检测。M:Marker(5000+)；1：转基因小麦植株1；2：转基因小麦植株2；3：转基因小麦植株3；4：转基因小麦植株4；5：转基因小麦植株5；6：转基因小麦植株6；7：转基因小麦植株7；8：普通小麦Fielder。

图2是TaPDIL5-1在A，B，D三个亚基因组上的特异性扩增检测。M：Marker(5000+)；1：基因编辑小麦aabbdd-1；2：基因编辑小麦aabbdd-2；3：基因编辑小麦aabbdd-3；4：基因编辑小麦aabbdd-4；5：基因编辑小麦aabbDD；6：基因编辑小麦aaBBdd；7：基因编辑小麦AAbbdd；8：基因编辑小麦aaBBDD；9：基因编辑小麦AAbbDD-1；10：基因编辑小麦AAbbDD-2；11：基因编辑小麦AABBdd；12：Fielder；13：Fielder；14：Fielder；15：ddH₂O(作为负对照)。所有检测植株的基因型均为纯合基因型。

图3是利用PCR扩增和酶切检测TaPDIL5-1基因编辑材料的凝胶电泳检测结果。其中aabbdd-1代表A亚基因组-4bp，B亚基因组-2bp，D亚基因组-4bp；aabbdd-2代表A亚基因组-4bp，B亚基因组-2bp，D亚基因组-3bp；aabbdd-3代表A亚基因组-4bp，B亚基因组-3bp，D亚基因组-3bp；aabbdd-4代表A亚基因组-3bp，B亚基因组-3bp，D亚基因组-4bp；aabbDD代表A亚基因组-4bp，B亚基因组-2bp，D亚基因组无编辑；aaBBdd代表A亚基因组-4bp，B亚基因组无编辑，D亚基因组-4bp；AAbbdd代表A亚基因组无编辑，B亚基因组-2bp，D亚基因组-4bp；aaBBDD代表A亚基因组-4bp，B亚基因组无编辑，D亚基因组无编辑；AAbbDD代表A亚基因组无编辑，B亚基因组-2bp，D亚基因组无编辑；AABBdd代表A亚基因组无编辑，B亚基因组无编辑，D亚基因组-4bp；AABBDD代表A，B，D三个亚基因组均无编辑。+，酶切，-，未酶切。所有检测植株的基因型均为纯合基因型。

图4是对A，B，D三个亚基因组上TaPDIL5-1基因同时编辑的4个纯合株系的小麦黄花叶病抗病性鉴定结果。A是病毒接种五周后的植株体内半定量PCR扩增检测WYMV的积累情况，其中，AABBDD代表Fielder野生型，三个亚基因组无编辑，对小麦黄花叶病感病；aabbdd-1，aabbdd-2，aabbdd-3和aabbdd-4是TaPDIL5-1在A，B，D三个亚基因组上同时发生编辑的4个纯合株系，对小麦黄花叶病抗病。B是病毒接种五周后的植株体内WYMV的定量检测结果。C是对病毒接种六周后小麦叶片的表型拍照结果，其中AABBDD植株感染WYMV后呈现褪绿色斑，aabbdd-1，aabbdd-2，aabbdd-3和aabbdd-4这4个纯合株系均未出现褪绿色斑。

图5是对A，B，D三个亚基因组上TaPDIL5-1基因部分或者全部拷贝敲除纯合株系的小麦黄花叶病抗病性鉴定结果。A是病毒接种五周后植株的半定量PCR扩增检测WYMV的积累情况。其中AABBDD代表Fielder野生型，三个亚基因组无编辑；aabbdd-1是同时敲除A，B，D三个亚基因组上三个TaPDIL5-1基因拷贝的纯合株系，对小麦黄花叶病抗病；aabbDD，aaBBdd，AAbbdd代表同时敲除A，B，D三个亚基因组上两个TaPDIL5-1基因拷贝的纯合株系，对小麦黄花叶病感病；aaBBDD，AAbbDD，AABBdd代表敲除A，B，D三个亚基因组上单个TaPDIL5-1基因拷贝的纯合株系。B是对病毒接种五周后植株的WYMV定量检测结果。C是对病毒接种六周后小麦叶片的表型拍照结果，除aabbdd-1植株未出现感病病症外，其余株系均呈现褪绿色斑。

具体实施方式

为了加深对本发明的理解，下面将结合实施例对本发明做进一步详述，本实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定。

实施例一

本实施例提供了一种小麦基因组DNA提取和PCR扩增测试样品质量检测方法，检测方法如下：

步骤一：实验材料为普通小麦品种“Fielder”和利用CRISPR/Cas9基因编辑技术创制的小麦幼苗。

步骤二：利用CTAB法提取小麦基因组DNA提取，具体步骤如下：

S1、预先准备2ml离心管，含2颗玻璃珠子(Sigma，18406-500G，5mm)。单株收集100-200mg新鲜幼嫩叶片放入试管中，迅速投入液氮冷冻。组织破碎仪研磨2-3次，每次1分钟。加入1ml的2*CTAB缓冲液，充分混匀。

S2、65℃恒温混匀仪中温育30分钟。

S3、加600ul预冷的氯仿/异戊醇(v/v，24:1)，剧烈振荡30秒，充分混匀。13000rpm离心15分钟。

S4、吸取650μL上清液，转移到新的1.5ml离心管中。

S5、加入5μL RNaseA(10mg/ml)，颠倒混匀，37℃恒温箱温育15分钟。

S6、加入650μL异丙醇，颠倒离心管3次，充分混匀，沉淀DNA。

S7、4℃条件下13000rpm离心10分钟，白色DNA沉淀通常清晰可见。

S8、加入800μL70％乙醇，室温漂洗2分钟。13000rpm离心5分钟，吸尽上清，小心操作避免吸走附在管壁的DNA。

S9、打开离心管盖，室温下干燥5-10分钟。

S10、加入100μLTE-buffer溶解DNA，55℃温育10分钟。利用Nanodrop微量分光光度计检测DNA浓度。

本实施例中，提取DNA所用溶剂为：

2*CTAB(室温存放)

2％CTAB(溴化十六烷基三甲铵)

200mM Tris/HCl(pH 8.0)(三羟甲基氨基甲烷/盐酸)

20mM EDTA(乙二胺四乙酸)

1.4M NaCl(氯化钠)

1.0％PVP(聚乙烯吡咯烷酮)

20mlβ-巯基乙醇

TE-buffer(pH 8.0)(室温存放)

10mM Tris/HClpH 8.0(三羟甲基氨基甲烷/盐酸)

1mM EDTA(乙二胺四乙酸)

步骤三：PCR扩增检测基因组DNA质量

PCR反应体系为20μL:DNA模板(浓度为10ng/μL)2μL，2×Phanta Max buffer 10μL,10mM dNTP mix 0.4μL，引物名称和序列为：TaPDIL5-1-ABD-F，GAGCCTAGGAACTCTTTGGGAG；TaPDIL5-1-ABD-R，GCATTAGCGGATCCTGCTAT，10μM的PCR引物溶液各0.4μL，Phanta Max Super-Fidelity DNApolymerase(南京诺唯赞生物科技股份有限公司；P505；1U/μL)0.2μL，ddH₂O 6.6μL。

PCR反应程序如下：

步骤四：利用1％(w/v)琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，结果如图1所示。

实施例二

本实施例提供了一种小麦A，B，D亚基因组上TaPDIL5-1特异片段的PCR扩增和凝胶电泳检测方法，检测步骤如下：

步骤一：采用与实施例一相同的DNA提取方法；

步骤二：以小麦基因组DNA为模板，分别利用A，B，D三个亚基因组特异的引物组合物进行PCR扩增，获得A，B，D三个染色体上特异的TaPDIL5-1序列。其中，除引物以外，PCR反应体系与实施例1相同。其中，

A染色体上所述的引物组合物为：

SED ID NO.2和SED ID NO.3；

B染色体上所述的引物组合物为：

SED ID NO.4和SED ID NO.5；

D染色体上所述的引物组合物为：

SED ID NO.6和SED ID NO.7。

其中，PCR反应程序如下：

步骤三：利用1％(w/v)琼脂糖凝胶电泳进行跑胶检测，结果如图2所示。

实施例三

本实施例提供了一种小麦A，B，D亚基因组上TaPDIL5-1编辑片段检测方法，具体检测方法如下：

步骤一：以实施例二中获得PCR分子为模板，PCR反应体系与实施例1相同，除引物以外，PCR反应体系与实施例1相同。其中，

扩增4bp序列缺失的引物组合为：

SED ID NO.8和SED ID NO.9；

扩增3bp序列缺失的引物组合为：

SED ID NO.10和SED ID NO.9；

扩增2bp序列缺失的引物组合为：

SED ID NO.11和SED ID NO.9；

其中，PCR扩增反应程序如下：

步骤二：通过限制性内切酶酶切PCR产物，反应检测体系如下：

其中，检测4bp序列缺失的限制性内切酶为HinfI(NEB；R0155S)，37℃恒温箱中酶切16h；检测3bp序列缺失的限制性内切酶为Ava II(NEB；R0153S)，37℃恒温箱中酶切16h；检测2bp序列缺失的限制性内切酶为Bts I(NEB；R0667S)，恒温箱中55℃酶切16h。

步骤三：采用浓度为3％的琼脂糖凝胶，通过电泳检测酶切结果，如图3所示。

实施例四

本实施例提供了一种小麦A，B，D三个亚基因组上TaPDIL5-1基因同时编辑的4个纯合株系的小麦黄花叶病抗病性鉴定方法，对实施例三中获得的A，B，D三个亚基因组上TaPDIL5-1基因同时编辑的4个纯合株系(aabbdd-1，aabbdd-2，aabbdd-3和aabbdd-4)为材料，通过人工气候箱培养条件下接种小麦黄花叶病毒，检测小麦材料的抗病性。具体步骤如下：

步骤一：人工接种WYMV病毒

在人工气候培养箱中播种小麦，培养14天待幼苗长至两叶一心期。将含有WYMV的病叶加入K₂HPO₄(pH9.1)缓冲溶液和石英砂(150目：200目＝1:1)利用研钵研磨出汁液，通过摩擦接种小麦幼苗。5天后进行第二次摩擦接种增强WYMV的侵染效率。其中接种病毒后的植株培养条件为12℃，10h光照/8℃，14h黑暗。每个基因型材料接种10-15株。

步骤二：收取小麦新叶的叶片，用于提取总RNA

在接种WYMV后第五周，剪取每株材料的新叶1cm左右，通过Trizol试剂和方法(Invitrogen；15596-026)提取总RNA，并通过Nanodrop对RNA进行定量。

步骤三：反转录合成cDNA

取1μg总RNA，利用HiScript III RT SuperMix反转录试剂盒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司：R312-02)获得检测样品的cDNA，并加水稀释10倍后用于检测和定量WYMV病毒。

步骤四：通过半定量PCR检测基因编辑材料中WYMV的积累

除引物以外，采用与实施例一相同的PCR反应体系检测WYMV。其中，检测WYMV的引物组合为SED ID NO.15和SED ID NO.16，采用与实施例三相同的PCR反应程序，分别扩增的循环数分别为28，32和34个；检测内参基因ACTIN的引物组合为SED ID NO.19和SED IDNO.20，循环数为28个。PCR产物通过1％浓度的琼脂糖凝胶电泳检测，鉴定出PCR条带的植株为小麦黄花叶病感病，无PCR条带的植株为抗病，结果如图4A所示。

步骤五：通过实时荧光定量PCR方法检测基因编辑材料中WYMV的积累

检测WYMV的引物组合物为SED ID NO.17和SED ID NO.18，检测内参基因ACTIN的引物组合为SED ID NO.19和SED ID NO.20。

PCR反应的体系为：1:10稀释后的cDNA样品模板2μl，2*ChamQ Universal SYBRqPCR Master mix预混液(南京诺唯赞生物科技股份有限公司；Q712)5μl，5μM的PCR引物各0.4μl，ddH₂O 2.2μl。其中PCR反应的退火温度为60℃，利用ABI 7500(AppliedBiosystems)实时荧光定量PCR仪进行检测，基因的相对表达量利用2^-ΔΔCT法进行计算，结果如图4B所示。PCR反应程序为：

步骤六：在病毒接种后六周，对基因编辑株系和野生型对照材料的叶片表型进行拍照，如图4C所示。

实施例五

本实施例提供了对A，B，D三个亚基因组上TaPDIL5-1基因部分或者全部拷贝敲除纯合株系的小麦黄花叶病抗病性鉴定方法，检测材料包括A，B，D三个亚基因组上TaPDIL5-1基因三个拷贝同时编辑的纯合株系(aabbdd-1)，两个拷贝同时编辑的纯合株系(aabbDD，aaBBdd，AAbbdd)和单个拷贝敲除的纯合株系(aaBBDD，AAbbDD，AABBdd)。实验方法与实施例四中的方法相同。其中，半定量PCR检测WYMV的积累结果如图5A所示，实时荧光定量PCR检测WYMV的积累结果如图5B所示，病毒接种后六周的叶片表型结果如图5C所示。

本发明利用CRISPR/Cas9基因编辑手段，通过对小麦黄花叶病感病品种“Fielder”中TaPDIL5-1目标基因靶序列进行编辑，随后通过杂交和分子标记辅助选择，获得了同时编辑TaPDIL5-1基因A，B，D三个亚基因组上3个拷贝的4个纯合株系，接种小麦黄花叶病毒后发现，这些株系对小麦黄花叶病具有抗病性，而编辑1个或者2个拷贝的纯合株系对小麦黄花叶病依然感病，证明TaPDIL5-1基因是小麦黄花叶病的感病因子，通过编辑或者敲除小麦A，B，D三个亚基因组上的3个拷贝，可以创制抗小麦黄花叶病的小麦材料。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

<110> 中国农业科学院作物科学研究所

<120> 一种小麦黄花叶病抗病材料创制的标记组合物

<130> 0119

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> ArtificialSequence

<400> 1

gtctgctcaa aggtggacat 20

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> ArtificialSequence

<400> 2

cacagcaaga gcctaggaac tc 22

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> ArtificialSequence

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tctctccaaa gactaaatgg aggg 24

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> ArtificialSequence

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gccatctcaa ttttgaactc ctg 23

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> ArtificialSequence

<400> 5

ctcgccatag aagtatagaa tagcat 26

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> ArtificialSequence

<400> 6

ggttccacat gctttcttcc tt 22

<210> 7

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<212> DNA

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<400> 7

cgccattcca agagtattga acc 23

<210> 8

<211> 33

<212> DNA

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<400> 8

ggaaaagttg attgcggtgc aagcaaaccg gtc 33

<210> 9

<211> 31

<212> DNA

<213> ArtificialSequence

<400> 9

gcaatagatt ccaacatggt tttcatggta g 31

<210> 10

<211> 34

<212> DNA

<213> ArtificialSequence

<400> 10

ggaaaagttg attgcggtgc aagcaaacca gact 34

<210> 11

<211> 31

<212> DNA

<213> ArtificialSequence

<400> 11

gaaaagttga ttgcggtgca agcaaagcag t 31

<210> 12

<211> 1932

<212> DNA

<213> ArtificialSequence

<400> 12

atggatccgg ctcttcggcg ccgctcccgc ctccctatcc acctcctgct ggtggccgtc 60

acgttactcg ccgccctggc cgcgcgatcc ggcgccgagg tcatcaccct caccgaagag 120

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tgccgtagcg gtgacatgga tgtatcaact acaatgcgag ttttgaccgc ttgctgctaa 660

acaaggatgc cttctacatt tacacagcaa gagcctagga actctttggg aggacctcgg 720

gaaggttatt gaaggtacgg atgaaattga gatcggaaaa gttgattgcg gtgcaagcaa 780

accagtctgc tcaaaggtgg acattcattc atacccaaca ttcaaggtgt tctatgatgg 840

cgaagaagtt gcaaaatata aaggtaatcc ctctcacatc ttacttctgt ttgacaagga 900

caacataaac tagataccac taccatgaaa accatgttgg aatctattgc atctggttcg 960

atactcttgg aatggcgata cattttagaa accaaaacca cattgttgac ttgtattgtg 1020

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agattacatt ttaggcgcga tttttgtata tagcaggatc cgctaatgcg gaaaatttag 1140

aatttcttct ttggaccagc catgacttgg atgttactga tatactcctc cattcacaaa 1200

tataagatgt tctaactttt gtctgagtcg gatgtatata gacacgtttt agtgtgtttg 1260

ttacactcat ttcagtccgt atgtggtcca tattgaaata tccaaaacat cttatatttg 1320

taatcggagg gagtatcagc tagttcttaa cagcagaggt gacgatattt cataactaaa 1380

taaacaacat gagggaggaa aactttgtgt acaactttgt tcacatatca ttttatttta 1440

ttttttgctt ttattgatca tgaatgcatg ctttttcaac attttattag atggatatgt 1500

tatcatgttg ctccacctgt tggatttgtt gtggtacttt gttcatgaaa atgctattct 1560

atagcgagtc tccactttca accatcaatt cataatcctg gaccgtatca tgtccctgaa 1620

gttgatttaa tgtaacactt acaattttct tgtactgtca ttcggcatca ccgctcaaaa 1680

gatcatatgc agtatggcaa tacacttttt gctgcatttt ctttgtacac gcagtttgtt 1740

gccttctgat gtgcttctat tttcccatta tgtatgattc tttgttttga aaatattcgt 1800

ctagtaagtg ctcaatgcct aatccaacta ctcaatggca ttgcagggcc tagggacgtg 1860

gagtctctca agacctttgt gttgaacgaa gctgagaaag caggtgaggt gaggcctgaa 1920

gatgagctat ag 1932

<210> 13

<211> 1894

<212> DNA

<213> ArtificialSequence

<400> 13

atggatccgg cgcgccgctc ccgcctccct acccatctcc tgctggtggc cgtgacgtta 60

ctcgcggccc tggccgcgcg atccggcgcc gaggtcatca ccctcaccga agagaccttc 120

tccgacaagg taccgactgc tttccccttc tcgtgtctct cccctcttcc acctccccat 180

cgagatataa tagtagtagt actctaaggc acgccgcaga cccaagaaca gctgaatttt 240

cgacttatca cttggctacg ctgggatgca gtgtagcagg cggtgtgctt agttactgac 300

atgtggccgt ttcccagatt tgctactgat tccagcatga tttcttaata ataaaccgat 360

agatcattat tcctggtgta ttaattgtcc caatcacgga aggttccgtg tttagatgcg 420

gcgcgccatc tcaattttga actcctgttt tggttcgagt tacttcgctg caatgcttgt 480

gcactgccgt tgcttaatcc agcttggatt ttctctctct tgtgtttaga taaaggagaa 540

ggacacagtg tggtttgtgc aattctgcgt cccttggtgt aagcactggt aagctctaca 600

tgccgtagtg gtgacatgga tatatcaagt acaatgcaat ttttgactaa tttctgctaa 660

acacggatgc ctgctacatt tacagcaaga gcctaggaac tctttgggag gaccttggga 720

aggttattga aggtacggat gaaattgaga tcggaaaagt tgattgcggt gcaagcaaac 780

cagtctgctc aaaggtggac attcattcat acccaacatt caaggtgttc tatgatggcg 840

aagaagttgc aaaatataaa ggtaatccct ctcacatctt acttctgttt gacaaggaca 900

acataaacta gatactacta ccatgaaaac catgttggaa tctattgcat gtggttcagt 960

actcttggaa tggcgataga ttttagaaac caaaaccaca ctgttgactt gtattgtgag 1020

agtagggcat gactcttaaa agattaaaac ctctgaactt gaaccaaaag gttggaaaag 1080

attacatttt aggcgcgatt ttcgtatata gcaggatccg ctaatgcgga aaatttagaa 1140

tttctttttt ggaccagccg tgacttggat gttactgata tactcctcca ttcacaaata 1200

taagattttc taacttttgt ctgaattgga tgtatataga cactgggttt gttacactca 1260

tttcaatgtg gtccatattg aaatatccaa aacatcttat atttgtaatc ggagggagta 1320

tcagctagtt cttaacagca gaggtgacaa tatttcataa ctaaataaac aacatgaggg 1380

aggaaaactt tgtgtacaac tttgctcaca tatcattcta ttttattttt tgcttttatt 1440

ggtcatgaat gcgtgctttt tcaatattct attagtcatc atgttgctcc acctgttgga 1500

tttgttgtgg tactttgttc atgaaaatgc tattctatac ttctatggcg agtctccact 1560

ttcaaccatc aattcataat cctggactgt atcatgtccc tgaagttgat ttaatgtaac 1620

agttacagtt ttcttgtact gtcatttggc atcaccgctc aaaagatcat atgcagtttg 1680

gcaataaatt tttcgctgca ttttctttgt atacacacag tttgtcccat tatgtatgat 1740

tctttatttt gaaaatattc gtctagtaag tgctcaatgc ctaatccaac tactcaatgg 1800

cattgcaggg cctagggacg tggaggctct caagaccttt gtgttgaagg aagctgagaa 1860

agcaggagag gtgaggcttg aagatgagct atag 1894

<210> 14

<211> 1912

<212> DNA

<213> ArtificialSequence

<400> 14

atggatccgg ctcttcggcg ccgctcccgc ctccctatcc acctcctgct ggtggccgtc 60

actttactcg ccgccctggc cgcgcgatcc gacgcggagg tcatcaccct caccgaagag 120

accttctccg acaaggtacc gactgctttc cccttctcgt gtctccaccc tcttccacct 180

cctcatcgag atgtaatagt agtagtactc taaggcacgc cgcagaccca agaacagctg 240

attcttcgac ttatcacttg gctacgctgg gatgcagtgt agcaggcggt gtgcttagtt 300

actgacatgt agccgtttcc cagatttgct actgattcca gcatgatttc ttaataataa 360

accgatagat cattattctt ggtgtattaa ttgttccaat catggaaggt tcggtgttta 420

gatgcggcgc gccatctgaa ctcctgtttt ggttcgagtt acttcgctgc aatgcttgtg 480

cacagccgtt gcttaagcca gtttggattt tttttctctt gtgtctagat aaaggagaag 540

gacacagtat ggtttgtgca attctgcgtc ccttggtgta agcactggta agctctacat 600

gccgtagcgg tgacatggat atatcaacta caatgcgagt tttgaccgct tgctgctaaa 660

caaggatgcc ttctacattt acacagcaag agcctaggaa ctctttggga ggacctcgga 720

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gaagaagttg caaaatataa aggtaatccc tctcacatct tacttttgtt tgacaaggac 900

aacataaact agatactact accatgaaaa ccatgttgga atctattgca tgtggttcaa 960

tactcttgga atggcgatag attttagaaa ccaaaaccac gctgttgact tgtattgtga 1020

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atttcttttt tggaccagcc atgacttgga tgttactgat atactcctcc tccattcaca 1200

aatataagat attctaactt ttgtctgaat tggatgtata tagacacgtt ttagtgtgtt 1260

tgttacactc atttcagtcc gtatgtggtc catattgaaa tatccaaaac atcttatatt 1320

tgtaatcgga gggagtatca gctagttctt aacagcagag gtgacgatat ttcataacta 1380

aataaacaac atgagggagg aaaactttgt gtacaacttt gttcacatat cattttattt 1440

tattttttgc ttttattgat catgaatgcg tgctttttca atattctatt agatggatat 1500

gtcatcatgt tgctccacct gttggatttg ctgtggtact ttgttcatga aaatgctatt 1560

ctatagcgag tctccacttt caaccatcaa ttcataatca tggaccgtat catgtccctg 1620

aagttgattt aatctaacag ttacagtttt cttgtactgt cattcggcat caccgctcaa 1680

aagatcatat gcagtttggc aataaatttt ttgctgcatt ttctttgtat acacgcagtt 1740

tgtcccatta tgtatgattc tttgttttga aaatattcgt ctagtaagtg ctcaatgcct 1800

aatccaacta ctcaatgaca ttgcagggcc tagggacgta gagtctctca agacctttgt 1860

gttgaacgaa gctgagaaag caggagaggt gaggcttgaa gatgagctat ag 1912

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> ArtificialSequence

<400> 15

ccgccaccaa agagaaatgg 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

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<400> 16

tcggaggtga gcatggtatt 20

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<211> 22

<212> DNA

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<210> 18

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<212> DNA

<213> ArtificialSequence

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tagcgtgaac aatgaatggg ga 22

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> ArtificialSequence

<400> 19

gtgtgatgtg gatatcagga agg 23

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<212> DNA

<213> ArtificialSequence

<400> 20

ttagaagcac ttccggtgga 20

Claims (2)

1.一种小麦黄花叶病抗病材料的创制方法，其特征在于：利用CRISPR/Cas9基因编辑技术实现对TaPDIL5-1基因编辑，其中TaPDIL5-1基因编辑的sgRNA靶标序列的核苷酸序列为SED ID NO.1；小麦黄花叶病抗病基因TaPDIL5-1的核苷酸序列为SED ID NO.12或SED IDNO.13或SED ID NO.14。

2.根据权利要求1所述的一种小麦黄花叶病抗病材料的创制方法，其特征在于：基于两轮PCR扩增得到的DNA分子，随后采用限制性内切酶酶切PCR扩增产物和凝胶电泳检测来鉴定基因编辑后的小麦黄花叶病抗病材料，具体步骤如下：

步骤一：利用CTAB法提取基因编辑后的小麦基因组DNA；

步骤二：利用小麦基因组DNA为模板，利用A、B、D三个亚基因组上特异的引物组合物分别进行PCR扩增，获得三个染色体组上特异的DNA分子，A染色体上所述的引物组合物为SEDID NO.2和SED ID NO.3；B染色体上的引物组合物为：SED ID NO.4和SED ID NO.5；D染色体上的引物组合物为SED ID NO.6和SED ID NO.7；

步骤三：分别以步骤二中所示的染色体上的引物组合扩增的DNA分子为模板，以如下引物组合物进行扩增，并对扩增得到的DNA分子进行酶切，其中4bp缺失所用引物组合对为:SED ID NO.8和SED ID NO.9，限制性内切酶为Ava II；

3bp缺失所用引物组合对为SED ID NO.10和SED ID NO.9，限制性内切酶为Hinf I；2bp缺失所用引物组合对为：SED ID NO.11和SED ID NO.9，限制性内切酶为Bts I；

步骤四：以步骤三中扩增得到的DNA分子进行相应的酶切鉴定，其中不能酶切的代表野生型，能酶切代表基因编辑后得到的突变体，只有同时编辑小麦A、B、D三个亚基因组上TaPDIL5-1基因的纯合株系为抗小麦花黄叶病的基因编辑材料；

步骤五：以步骤四中鉴定获得小麦基因编辑材料，在人工气候培养箱条件下对播种14天后的小麦幼苗摩擦接种小麦黄花叶病毒，接种后5周收取样品提取RNA，并反转获得cDNA，以引物组合物SED ID NO.15和SED ID NO.16对病毒的cDNA样品进行扩增，定性检测WYMV的积累；以引物组合物SED ID NO.17和SED ID NO.18对病毒的cDNA样品进行扩增，通过qPCR相对定量检测WYMV的积累；以引物组合物为SED ID NO.19和SED ID NO.20对cDNA样品进行扩增，作为病毒定量检测的内参基因。

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