CN115772522B - 利用基因编辑敲除TaSK2A在增加小麦籽粒长度中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用基因编辑敲除TaSK2A在增加小麦籽粒长度中的应用，是通过设计靶向TaSK2A基因的单链引导RNA，构建敲除小麦体内TaSK2A基因的植物双元表达载体pBUE411‑TaSK2A；将该植物双元表达载体通过农杆菌转化到普通小麦中，获得TaSK2A基因敲除的转基因小麦，实现小麦种子籽粒长度的增加。实验证实TaSK2A基因敲除的转基因小麦实现了小麦种子籽粒长度的增加和千粒重的提高。本发明的应用为利用基因工程技术实现小麦快速育种、提高小麦产量，提供了一种切实可行的方法，具有重要的育种应用价值和广阔市场应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程和分子育种技术领域，具体涉及利用基因编辑敲除TaSK2A在增加小麦籽粒长度中的应用。
背景技术
小麦是世界第二大粮食作物，为人类提供20％的碳水化合物和23％的蛋白质。人类的食品安全问题面临着耕地面积的减少、全球气候变暖、人口持续增长以及环境污染加剧等问题，如何在有限的资源条件下提高小麦产量对粮食安全具有重要意义。
油菜素内酯作为植物第六大植物激素，在调控细胞伸长与分裂、叶片衰老、植物形态建成、植物抗逆等过程中起着非常重要的作用。目前已知的油菜素内酯激素信号在植物体内的传导是以磷酸化作用传递的：油菜素内酯与定位于细胞膜的受体BRI1结合，使受体BRI1与共受体BAK1相互磷酸化，进而磷酸化BSK/CDG1激酶，BSK/CDG1激酶通过磷酸化激活下游的去磷酸酶BSU1，BSU1通过去磷酸化BIN2磷酸激酶使其失活，失去对下游基因的磷酸化调控作用。
在水稻、玉米、小麦等主要粮食作物中，有研究报道调控油菜素内酯信号通路可促进细胞伸长、改善植株株型、增强植株耐逆性与抗病性等。由于油菜素内酯在植物生长和发育的过程中的广泛作用，其在小麦生产上的应用也越来越受到重视。申请人研究发现小麦TaSK2A基因是油菜素内酯信号通路的负调控磷酸激酶，是拟南芥AtBIN2与水稻OsGSK2、OsGSK3的同源基因，具有调控小麦籽粒长度的功能。该调控功能为研究油菜素内酯在小麦生长发育及高产育种提供了非常重要的理论依据。检索发现，本申请所述TaSK2A对小麦籽粒长度的调控功能为首次报道，并且有关利用基因编辑技术敲除小麦TaSK2A增加小麦籽粒长度的应用未见报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种利用基因编辑敲除TaSK2A在增加小麦籽粒长度中的应用。
本发明所述的利用基因编辑敲除TaSK2A在增加小麦籽粒长度中的应用。
其中，应用方法是：设计靶向TaSK2A基因的单链引导RNA即sgRNA，构建含有该sgRNA的敲除小麦体内TaSK2A基因的表达载体即植物双元表达载体pBUE411-TaSK2A；将该植物双元表达载体通过农杆菌转化到普通小麦中，获得TaSK2A基因敲除的转基因小麦，即实现小麦种子籽粒长度的增加，得到种子籽粒长度增加的小麦task2a敲除突变体。其中所述TaSK2A基因的核苷酸序列已公知，如SEQ ID NO.1所示。
上述应用中：所述靶向TaSK2A基因的单链引导RNA属于TaSK2A编码序列或TaSK2A编码序列的互补序列，长度为22～23个脱氧核糖核苷酸，其3’端最后紧邻三个脱氧核苷酸序列为NGG，其中N为腺嘌呤或鸟嘌呤或胸腺嘧啶或胞嘧啶；其核苷酸序列如SEQ ID NO.2、或SEQ ID NO.3所示。或是符合所述特征的sgRNA。
其中：所述靶向TaSK2A基因的sgRNA优选的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
上述应用中：所述双元表达载体pBUE411-TaSK2A由表达盒E1和表达盒E2构成，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；其中表达盒E1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，其从上游至下游依次是：来自小麦的TaU3启动子，靶向TaSK2A基因的单链引导RNA即sgRNA，终止子T1；表达盒E2的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，其从上游至下游依次是：来自玉米的泛素启动子Ubi，玉米Cas9编码序列，终止子T2。
其中：所述小麦TaU3启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述靶向TaSK2A基因的单链引导RNA的核苷酸序列是SEQ ID NO.2，或是SEQ ID NO.3；所述终止子T1的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述玉米泛素启动子Ubi的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；所述玉米Cas9编码序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；所述终止子T2的核苷酸序列如SEQID NO.11所示。
本发明所述靶向TaSK2A基因的sgRNA在增加小麦籽粒长度中的应用，其中所述靶向TaSK2A基因的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
其中：所述应用是通过构建含有该sgRNA的具有敲除TaSK2A基因功能的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的植物双元表达载体pBUE411-TaSnRK2.10，并转化到普通小麦中特异性敲除TaSK2A基因，获得TaSK2A基因敲除的转基因小麦实现。
实验证实：TaSK2A基因敲除的转基因小麦实现了小麦种子籽粒长度的增加和千粒重的提高。本发明的突出效果是：通过设计TaSK2A基因的引导单链RNA(sgRNA)，构建可以敲除小麦体内TaSK2A基因的表达载体pBUE411-TaSK2A；通过对小麦遗传转化，得到TaSK2A基因敲除的后代，获得了籽粒长度与产量增加的小麦突变体，证明TaSK2A基因的敲除对小麦籽粒发育具有显著的正调控作用，也实现了利用基因编辑敲除籽粒发育相关蛋白TaSK2A增加小麦籽粒长度的应用。本发明提供的利用基因编辑敲除TaSK2A增加籽粒长度与产量的应用为利用基因工程技术实现小麦快速育种、提高小麦产量，提供了一种切实可行的方法，具有重要的育种应用价值和广阔市场应用前景。
附图说明
图1小麦品种中国春的TaSK2A基因编码区。
其中：单下划线序列为基因编辑所用的sgRNA序列。
图2 pBUE411-TaSK2A双元表达载体测序结果。
其中：下划线为sgRNA，其余序列为载体pBUE411的载体骨架序列，双下划线为引物PBUE411-F和PBUE411-R。
图3 T0代小麦转基因株系转化鉴定结果。
其中：泳道1和22为Transgen 2K plus marker，泳道2-19、23-41为T0代转基因小麦株系鉴定结果，泳道20为以水为模板扩增的阴性对照，泳道21为重组质粒pBUE411-TaSK2A扩增结果，泳道42为野生型JW1扩增结果。
图4三个同源拷贝均发生基因编辑的株系task2-12#测序结果。
图5三个同源拷贝均发生基因编辑的株系task2-12#的蛋白编码结果。
图6 task2-12#株系编辑位点的酶切扩增片段。
其中：1为Transgen 2K plus marker，2～7为task2-12#后代PCR扩增片段的酶切结果，8、9为task2-23#后代PCR扩增片段的酶切结果，10为JW1中PCR扩增片段的酶切结果。
图7JW1和纯合基因敲除株系task2-12#籽粒大小比较。
其中：A&B，与野生型JW1小麦相比，纯合基因敲除株系task2-12#株系籽粒长度显著增加；C，与野生型JW1小麦相比，纯合基因敲除株系task2-12#籽粒千粒重显著增加。Bar＝1cm。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明内容进行详细说明。如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，应该说明的是，下述说明仅仅是为了解释本发明，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。即本发明保护内容应延伸理解为与本发明技术思想雷同的各种实施方式均属于本发明内容的范畴。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的试验材料、试剂等，如无特殊说明，均从常规生化试剂公司购买得到。
PCR扩增所需的高保真酶为KOD-FX NEO(东洋纺)；吉布森组装所需的限制性内切酶BsaI与T4连接酶均购自NEB公司；限制性内切酶AgeI、酶切片段回收所需的凝胶回收试剂盒以及质粒提取试剂盒均购自赛默飞世尔科技公司。培养基配制所需的无机盐购自国药集团，维生素和抗生素购自Sigma公司。植物CRISPR/Cas9基因编辑载体为pBUE411，含有小麦U3启动子TaU3，用以启动sgRNA，Cas9模拟了禾本科植物基因具有5’端GC含量较高的特征，是设计合成的植物密码子优化的基因。所述质粒pBUE411公众可从中国农业大学获得或购自于上海柯雷生物科技有限公司，为17430bp。本发明所用的大肠杆菌菌株是E.coliTransgen5α，购自北京全式金公司；所使用的引物由青岛擎科梓熙生物技术有限公司合成，相关引物序列如表1所示：
表1：本发明使用的引物
本发明中使用的小麦品种JW1是山东省农科院作物所自行选育的具有良好组织培养能力的新种质，公众可从山东省农业科学院作物研究所获得。
实施例1重组双元表达载体pBUE411-TaSK2A的构建
1.靶向TaSK2A的sgRNA的设计
为设计能够在TaSK2A基因编码区发生编辑的sgRNA，通过网站CRISPRdirect(http://crispr.dbcls.jp/)在TaSK2A基因的编码区寻找适合的打靶位点，在PAM结构前找到20bp序列片段设定为靶序列，本实施例以其中一个sgRNA为例进行敲除实验，其核苷酸序列为GGAGATGATGTGACCGGTCATGG，如SEQ ID NO.2所示，即图1所示TaSK2A基因序列中下划线标记序列为靶向TaSK2A基因的sgRNA序列，sgRNA 3’端的TGG为PAM序列。其中所述TaSK2A基因的核苷酸序列已公知，如SEQ ID NO.1所示。
2.含有sgRNA片段的获得
用于构建pBUE411-TaSK2A双元表达载体的2条引物TaSK2A-gR1-F和TaSK2A-gR1-R(表1)，由青岛擎科梓熙生物技术有限公司合成。分别将两条引物进行磷酸化，直接退火形成双链，反应体系为：TaSK2A-gR1-F(10μM)：4μL，TaSK2A-gR1-R(10μM)：4μL，10×T4PNKbuffer：1.5μL，PNK：1μL，ATP：1μL，ddH2O补足15μL。PCR仪反应：37℃，30min；95℃，5min；ramp to 25℃at 5℃/min。
3.pBUE411载体与sgRNA连接
采用吉布森组装完成pBUE411与sgRNA的连接，具体反应体系：pBUE411质粒(100ng/μL)：2μL，步骤2的产物片段：2μL，10×NEB T4Buffer：1.5μL，10×BSA：1.5μL，BsaI：1μL，T4Ligase：1μL，ddH2O补齐15μL。反应体系于37℃水浴锅中反应5小时，得到pBUE411载体与sgRNA连接产物。
4.转化与鉴定
将连接产物转化大肠杆菌，具体的：将连接产物加入大肠杆菌感受态Transgen 5α中冰浴20min，42℃热激反应60sec，冰浴2min，加入无抗LB，放入37℃摇床复苏1h，之后用涂布器涂于LB(含有卡那霉素)平板上，37℃倒置培养培养至克隆长出，挑3个单克隆进行测序，引物用的是pBUE411-F和pBUE411-R。
测序结果(如图2)检测到了sgRNA的靶序列，同时在靶序列上游检测到了TaU3启动子序列，测序结果说明含有sgRNA的表达盒E1成功的组装进入pBUE411双元表达载体，证明了TaSK2A的CRISPR/Cas9基因编辑载体即重组双元表达载体pBUE411-TaSK2A构建成功。该重组双元表达载体pBUE411-TaSK2A的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
实施例2转基因后代获得与鉴定
1.TaSK2A转基因后代获得
将实验例1构建好的重组双元表达载体pBUE411-TaSK2A转化至农杆菌EHA105感受态细胞，具体的：将重组双元表达载体pBUE411-TaSK2A加入农杆菌EHA105感受态中冰浴5min，液氮速冻5min，37℃热激反应5min，之后冰浴5min，加入无抗LB，放入28℃摇床复苏2h，之后用涂布器涂于LB(含有利福平、链霉素和卡那霉素)平板上，28℃倒置培养培养至克隆长出。挑取单克隆接种于含有相应抗性的LB培养液中，28℃摇菌，160rpm，培养24小时。
取授粉后15天左右的JW1小麦种子，剥取幼胚。农杆菌悬浮液取1ml菌液于1.5ml离心管中，加入1.4ul乙酰丁香酮(0.1M)混匀。加入准备好的菌液侵染5分钟后放到共培培养基上，23℃暗培养3天。共培后放到休息培养基上25℃暗培养5天。将愈伤组织转移至筛选培养基1上，用封口膜封好培养皿，在25.5℃培养箱中暗培养2周。将愈伤切割后转移到筛选培养基2上，用封口膜再次封好培养皿，在25.5℃培养箱中继续暗培养2周。愈伤切割筛选2周后，表现有绿色芽点的抗性愈伤转移到再生培养基上。封好培养皿，放到25℃培养箱中光照/黑暗(16h/8h)培养2周。再生2周后，将健康成长的小苗转移到新的抗性再生小盒里。待苗长到一定大小可以取样检测。
上述小麦遗传转化涉及的各种培养基及其配制见如下文献：
Kan Wang(ed.),Agrobacterium Protocals:Volume 1,Methods in MolecularBiology,vol.1223DOI10.007/978-1-4939-1695-5_15,Spring Science+Businedd MediaNew York 2015。
取再生小麦幼嫩叶片，CTAB法提取基因组DNA，利用BUE-DF1与BUE-DR1两个载体上的引物(表1)进行PCR鉴定，PCR反应程序为：2×PCR master mix：10μL，pBUE411-F(10μM)：0.5μL，pBUE411-R(10μM)：0.5μL，gDNA(50ng/μL)：1μL，ddH2O：8μL。PCR反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性30sec；58℃退火30sec，72℃延伸30sec，反应32个循环；72℃复性5min。结果如图3所示，条带代表转化成功的T0代小麦转基因株系，共得到37株阳性转基因株系。
2.TaSK2A转基因敲除后代鉴定
小麦为异源六倍体，TaSK2A基因为1B染色体上的拷贝，在染色体1A、1D上的同源拷贝为TaSK2B和TaSK2C，三个拷贝的DNA序列同源性很高，氨基酸序列相似度达99.5％，需要同时检测三个同源拷贝的基因编辑情况。本实验采用购自西安青雪生物科技有限公司的Hi-TOM基因编辑位点检测试剂盒，该试剂盒通过PCR完成高通量建库过程，并用Hi-TOM在线软件直接解析出多样品多位点的变异信息。利用靶向序列两侧的特异性引物(表1中的Seq-F和Seq-R)同时对TaSK2A、TaSK2B和TaSK2C进行扩增，扩增产物建库后送到西安青雪生物科技有限公司测序。
目的基因小麦TaSK2A、TaSK2B和TaSK2C基因的基因编辑结果如图4所示，其编码的氨基酸序列如图5所示。经过比对，突变体蛋白task2a自第40个氨基酸开始出现移码，第60个氨基酸翻译终止；蛋白task2b自第40个氨基酸开始出现移码，第60个氨基酸翻译终止；蛋白task2c自第40个氨基酸开始出现移码，第107个氨基酸翻译终止。结果表明，sgRNA与Cas9元件转化成功，并发挥了功能，对TaSK2s基因进行了编辑，导致TaSK2A、TaSK2B和TaSK2C三个蛋白翻译提前终止，基因相应的功能丧失。
其中：第一轮PCR反应体系：以转pBUE411-TaSK2A基因的小麦植株叶片DNA为模板1μL，试剂盒中的2×Taq Master Mix 10μL，Seq-F和Seq-R(表1)(10μM)各0.5μL，Nucleasefree Water补足体积至20μL。PCR反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸20s，共32个循环；最后72℃延伸5min。PCR结束后取5μL琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，确保目标产物存在且特异性良好。之后进行第二轮PCR反应，试剂盒中的Hi-TOM Mix 12μL，以第一轮PCR产物为模板加入1μL，Nuclease-free Water补足体积至20μL。PCR反应程序：94℃变性2min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸25s，共33个循环；最后72℃延伸5min。扩增产物混合进行胶回收，胶回收产物即为建库测序样本，随后送到西安青雪生物科技有限公司测序，基因编辑结果如图4所示。
实施例3小麦敲除TaSK2A、TaSK2B和TaSK2C基因后代表型鉴定
为得到TaSK2A、TaSK2B和TaSK2C三个同源拷贝的纯合敲除株系，针对编辑位点开发酶切扩增多态性序列(Caps)标记，对基因编辑突变体的自交后代进行鉴定，直至得到TaSK2A、TaSK2B和TaSK2C同时敲除的纯合突变体。
利用Seq-F和Seq-R(表1)对基因编辑后代的TaSK2A、TaSK2B和TaSK2C基因进行PCR扩增。PCR反应体系为：KOD-FX NEO buffer：10μL，dNTP(2mM)：4μL，Seq-F(10μM)：0.6μL，Seq-R(10μM)：0.6μL，基因敲除株系gDNA(约20ng/μL)：1μL，KOD-FX NEO：0.4μL，ddH2O补齐20μL。PCR反应程序为：98℃预变性2min，98℃变性12sec；58℃退火20sec，68℃延伸45sec，反应35个循环；68℃复性5min。
扩增产物使用赛默飞世尔生产的限制性内切酶AgeI进行酶切，酶切反应体系为：PCR产物：15μL，10×Buffer Tango：2μL，限制性内切酶AgeI：0.5μL。反应体系于37℃水浴锅中酶切2h，之后进行电泳检测，结果如图6所示。电泳鉴定纯合突变体，野生型基因均可被切开，基因编辑成功的位点均不能被切开，由此可筛选出转基因纯合三拷贝基因敲除株系task2a-12#。
将野生型受体品种JW1和TaSK2A基因及其同源拷贝的纯合敲除株系(命名为task2-12#)，一起种植于山东大学青岛校区人工气候室，培养条件为：光照16h，黑暗8小时；白天温度22℃，夜间温度16℃；湿度40％-50％；CO2浓度为500ppm-700ppm。收种后，于30℃烘箱烘干处理14天，利用佳能高性能单反照相机对JW1、task2-12#的籽粒进行拍照，同时利用Image-Pro Plus 6.0对图片进行分析测量，统计JW1、task2-12#籽粒的长度。分别计数六个单株的JW1、task2-12#1000粒种子，并用百分天平称取其重量，计算千粒重，每个株系随机称取3次，取平均值，共取6个单株。
结果显示：与野生型JW1相比，突变体株系task2-12#籽粒长度显著增加(如图7A，7B)。测量其籽粒千粒重表型，与野生型JW1相比，突变体株系task2-12#籽粒千粒重显著增加(如图7C)。表明：TaSK2A基因的敲除对小麦籽粒发育具有显著的正调控作用，本发明通过构建含有sgRNA、能够特异靶向TaSK2A及其同源基因的pBUE411-TaSK2A双元重组载体，利用农杆菌侵染小麦幼胚诱导的愈伤组织，特异性的编辑TaSK2A基因，使其丧失功能，显著增加了小麦籽粒长度从而增加产量，为培育高产小麦提供了一个新的方法。
Claims (1)
1.一种利用基因编辑敲除TaSK2A增加小麦籽粒长度的方法，其特征在于：所述方法的步骤是：
设计靶向TaSK2A基因的sgRNA，构建含有该sgRNA的敲除小麦体内TaSK2A基因的双元表达载体pBUE411-TaSK2A；将该双元表达载体通过农杆菌转化到普通小麦中，获得TaSK2A基因敲除的转基因小麦，得到籽粒长度增加的小麦突变体；
其中，
所述靶向TaSK2A基因的sgRNA的核苷酸序列为GGAGATGATGTGACCGGTCA；
所述双元表达载体pBUE411-TaSK2A包含表达盒E1和表达盒E2，其核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示；其中表达盒E1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，其从上游至下游依次是：来自小麦的TaU3启动子，靶向TaSK2A基因的sgRNA，终止子T1；表达盒E2的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示，其从上游至下游依次是：来自玉米的泛素启动子Ubi，Cas9编码序列，终止子T2；其中，所述来自小麦的TaU3启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述靶向TaSK2A基因的sgRNA的核苷酸序列为GGAGATGATGTGACCGGTCA；所述终止子T1的核苷酸序列如SEQ IDNO.8所示；所述来自玉米的泛素启动子Ubi的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；所述Cas9编码序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；所述终止子T2的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
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| GR01 | Patent grant | ||
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