CN115976653A - 一种创制西瓜全基因组突变体文库的方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于育种技术领域，具体涉及一种创制西瓜全基因组突变体文库的方法和应用，通过设计西瓜全基因组sgRNA靶点序列，构建得到基因组编辑载体，利用农杆菌介导的遗传转化方法转化西瓜子叶节得到转化株系，对所述转化株系进行培育、鉴定得到西瓜突变体，该方法可对西瓜全基因组进行高通量基因编辑，获得西瓜多基因编辑突变体库，为开展西瓜功能基因研究提供材料。
Description
技术领域
本发明属于转基因技术领域。具体涉及一种创制西瓜全基因组突变体文库的方法和应用。
背景技术
西瓜(Citrullus lanatus(Thunb.)Mansfeld.et Nakai)是一种世界性的园艺作物，在世界十大果品中名列第五，在园艺作物生产和消费中具有重要的地位。西瓜种植周期短、见效快，在促进农业产业结构调整、加快农业转型升级中作用显著，西瓜种植已成为助农增收和推动农业发展现代化的主导产业之一。随着市场的多元化、差异化需求，西瓜除了甜度等口感的要求外，对品种抗性、耐储运、产量等也提出了更高的要求。品种抗性方面，目前还没有免疫或高抗枯萎病、蔓枯病、细菌性果斑病等重大病害的品种。耐储运品种的选育需要加强。当前劳动力紧缩，适宜简约化栽培的品种需求也越来越大。在种质创新过程中，长期定向的人工驯化造成西瓜育种材料亲缘基础狭窄，使得通过传统的育种方式进行种质改良遇到瓶颈。同时，传统育种方法周期长，效率低，也限制了材料创制和品种改良的进程。因此通过诱导基因突变是进行种质资源创制的重要方式之一。
CRISPR/Cas9基因编辑技术是一项简便高效的基因工程工具，具有靶向特异性强、突变频率高的特点，现已被广泛应用于拟南芥、水稻、柑橘、黄瓜等多个作物的功能基因组研究。西瓜上，Tian等(2018)建立了基于CRISPR/Cas9的基因敲除系统，成功获得了抗除草剂西瓜种质。Zhang等(2020)通过单个sgRNA靶向西瓜磺肽素基因Clpsk1，获得了基因敲除突变体，提高了植株的枯萎病抗性。这些研究都是进行单个基因的编辑。CRISPR/Cas9基因编辑技术在全基因组水平上进行高通量筛选，目前仅在水稻(Meng等，Molecular Plant,2017,10:1238-1241)、番茄(Jacobs等，Plant Physiology,2017,174:2023-2037)和大豆(Bai等，Plant Biotechnology Journal,2020,18:721-731)中有报道，而在其它作物上还未见有相关报道。因此有必要在西瓜作物上探索CRISPR/Cas9多基因编辑技术，为西瓜作物的种质改良提供新的途径。
发明内容
为了解决背景技术中提及的上述技术问题，本发明提供一种西瓜全基因组突变体文库及其创制方法。
本发明的另一目的是提供该突变体文库的应用。
本发明的又一目的是提供一种大量获得西瓜突变体的方法。
一种西瓜全基因组突变体文库，其特征在于通过以下方法构建:
(1)根据西瓜基因组序列，设计每个功能基因特异性的sgRNA靶点序列，设计要求：(a)sgRNA尽可能靠近ATG起始位点；(b)sgRNA序列不能出现TTTT连续碱基；(c)计算sgRNA脱靶特异性，错配比对数目<5；(d)sgRNA的GC含量在20％～80％之间。
(2)构建含有步骤(1)sgRNA序列的CRISPR/Cas9基因编辑载体文库：上一步设计的sgRNA后进行产物纯化，用Gibson同源重组法将纯化的DNA产物连接到CRISPR载体pZY-cas9，转化Trans1-T1活性细胞，利用载体上的Basta抗性标记筛选阳性克隆，阳性克隆提取质粒，获得含sgRNA的CRISPR/Cas9载体文库。
作为本发明的一种优选，步骤(1)中，首先在所有基因的第一个外显子中设计sgRNA，满足筛选条件的sgRNA，保留该条基因和最合适的一条sgRNA；没有满足条件的sgRNA的基因，再从该基因的第二个外显子中设计sgRNA，满足条件的保留。以此类推，一共在三个外显子中依次设计基因的sgRNA。
作为本发明的一种优选，步骤(2)中CRISPR/Cas9基因编辑载体文库构建过程中，以BsaI酶切载体骨架，再利用Gibson Mix将载体骨架和步骤(1)种的sgRNA重组，转化大肠杆菌感受态筛选阳性克隆，提取阳性克隆质粒，混合获得CRISPR/Cas9基因编辑载体质粒文库。
一种西瓜全基因组突变体文库的构建方法，包含以下步骤:
(1)根据西瓜基因组序列，设计每个功能基因特异性的sgRNA靶点序列，设计要求：(a)sgRNA尽可能靠近ATG起始位点；(b)sgRNA序列不能出现TTTT连续碱基；(c)计算sgRNA脱靶特异性，错配比对数目<5；(d)sgRNA的GC含量在20％～80％之间。
(2)构建含有步骤(1)sgRNA序列的CRISPR/Cas9基因编辑载体文库：上一步设计的sgRNA后进行产物纯化，用Gibson同源重组法将纯化的DNA产物连接到CRISPR载体pZY-cas9，转化Trans1-T1活性细胞，利用载体上的Basta抗性标记筛选阳性克隆，阳性克隆提取质粒，获得含sgRNA的CRISPR/Cas9载体文库。
作为本发明的一种优选，步骤(1)中，首先在所有基因的第一个外显子中设计sgRNA，满足筛选条件的sgRNA，保留该条基因和最合适的一条sgRNA；没有满足条件的sgRNA的基因，再从该基因的第二个外显子中设计sgRNA，满足条件的保留。以此类推，一共在三个外显子中依次设计基因的sgRNA。
作为本发明的一种优选，步骤(2)中CRISPR/Cas9基因编辑载体文库构建过程中，以BsaI酶切载体骨架，再利用Gibson Mix将载体骨架和步骤(1)种的sgRNA重组，转化大肠杆菌感受态筛选阳性克隆，提取阳性克隆质粒，混合获得CRISPR/Cas9基因编辑载体质粒文库。
本发明所述的西瓜全基因组突变体文库在创建西瓜突变体中的应用。
作为本发明的一种优选，本发明所述的西瓜全基因组突变体文库在高通量创建西瓜突变体中的应用。
本发明所述的西瓜全基因组突变体文库在西瓜育种中的应用。
一种大量获得西瓜突变体的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将本发明所述的西瓜全基因组突变体文库通过转化导入受体西瓜，获得转化株系；
(2)对转化株系中所含有的sgRNA种类进行鉴定，筛选西瓜突变体。
作为本发明的一种优选，步骤(1)西瓜转化方法为农杆菌介导法，转化株系筛选抗性为草甘膦。
作为本发明的一种优选，步骤(2)中sgRNA鉴定引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示。
本发明的有益效果：
1.通过设计sgRNA混合文库，CRISPR切割的靶点可以覆盖全基因组，在全基因组水平进行高通量筛选，而且特异性高，能够更加高效地筛选到靶点基因，实现作物的精准改良。
2.CRISPR/Cas9文库通过靶向基因的敲除诱导表型变化，诱变效率高，能够从相对较少的组织转化中产生大量突变体。
附图说明
图1为西瓜全基因组突变体文库载体结构示意图；
图2为西瓜叶片黄化突变体。a：野生型对照；b：叶片黄化表型。
图3为西瓜果皮颜色突变体。a：野生型对照；b：果皮颜色和果形突变表型。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图和具体实施例对本发明的实施方式作进一步地详细描述。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
下述实施例中所使用的方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：西瓜全基因组sgRNA文库设计
从葫芦科作物基因组数据库(http://www.cucurbitgenomics.org/)下载西瓜97103_genome_v2.fa基因组数据，提取西瓜全基因组预测功能基因序列，利用CRISPR-offinder软件设计sgRNA靶点，设计要求(1)sgRNA尽可能靠近ATG起始位点；(2)sgRNA序列不能出现TTTT连续碱基；(3)计算sgRNA脱靶特异性，错配比对数目<5；(4)sgRNA的GC含量在20％～80％之间。首先在所有基因的第一个外显子中设计sgRNA，满足筛选条件的sgRNA，保留该条基因和最合适的一条sgRNA；没有满足条件的sgRNA的基因，再从该基因的第二个外显子中设计sgRNA，满足条件的保留。以此类推，一共在三个外显子中依次设计基因的sgRNA。最终从第一个外显子中设计了19,635个基因的sgRNA，从第二个外显子中设计了1723个基因的sgRNA，从第三个外显子中设计了136个基因的sgRNA。
实施例2：构建西瓜全基因组CRISPR/Cas9载体文库
采用芯片合成的方法在体外合成实施例1中全部的单链寡核苷酸gRNA，再通过PCR延伸扩增获得双链sgRNA，等摩尔比例混合形成sgRNA文库。用MluI和NcoI酶双酶切CRISPR/Cas9载体pZY-Cas9，然后用Gibson同源重组法将sgRNA文库片段连接到线性化的pZY-Cas9载体上。连接产物转化Trans1-T1感受态细胞，均匀涂抹在含Kan(50mg/L)抗性标记的LB平板上，37℃培养24h后，用10％甘油重悬全部阳性克隆，提取质粒，获得含sgRNA的CRISPR/Cas9载体文库，命名为pZY-WM。文库示意图如图1所示。利用SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示载体骨架序列扩增包含sgRNA的序列片段，扩增产物送测序，根据测序结果统计sgRNA的覆盖度。结果显示，本发明中构建的sgRNA文库覆盖度为87.5％，说明该文库具有较高的准确性和覆盖度，可以满足需求。
实施例3：西瓜遗传转化
利用农杆菌介导法将载体文库pZY-WM导入受体西瓜品种‘SM1’，获得转化植株，包括如下步骤：
(1)外植体培养：将无菌的‘SM1’籽粒转接到1/2MS培养基上，25℃暗培养获得萌发后3d的无菌苗，取无菌苗子叶，切成0.5cm×0.5cm的小块，即为外植体；
(2)侵染：将外植体在携带pZY-cas9文库载体的EHA105农杆菌菌液中浸泡10min，取出放在无菌纸上吸干农杆菌菌液。
(3)共培养：将侵染后的外植体移至共培养培养基上，25℃暗培养3d，共培养培养基组成为MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L IAA+200μM AS,pH 5.8；
(4)选择培养：将共培养3d后的外植体转接至再生培养基上，培养6周，获得再生植株。再生培养基组成为MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L IAA+400mg/L特美汀+3mg/L Basta,pH5.8；
(5)生根：再生植株长至1.5cm时，移至生根培养基上生根，生根培养基组成为1/2MS+1.0mg/L IBA,pH 5.8；
(6)移栽：取出幼苗，洗去根上的培养基，移栽于育苗基质中，驯化10天后定植于温室或大棚。最终获得300多份独立的基因编辑株系。
实施例4：sgRNA类型鉴定
对实施例3中获得的转化株系进行sgRNA鉴定，提取每株转化株系的DNA，采用SEQID NO.1和SEQ ID NO.2所示载体骨架序列扩增包含sgRNA的序列片段，对扩增片段进行测序，根据测序结果，分析每株转化株系所含有的sgRNA类型。其中，含有单个sgRNA的株系占4.55％；含有多个sgRNA的株系占81.82％；未转化株系占13.6％。部分株系含有的sgRNA类型如表1所示。
表1转化株系sgRNA类型(部分)
T0基因编辑株系由于基因突变引起了部分植株的表型改变。其中，一些突变体(4.3％)是不育的，连续授粉均不成功，没有后代。而一些突变体(33.3％)表现出明显的表型突变，如叶片黄化(图2)、果形和果皮颜色变化等(图3)。这些突变体为开展西瓜功能基因组研究提供了有用资源。
Claims (10)
1.一种西瓜全基因组突变体文库，其特征在于通过以下方法构建:
(1)根据西瓜基因组序列，设计每个功能基因特异性的sgRNA靶点序列，设计要求：(a)sgRNA尽可能靠近ATG起始位点；(b)sgRNA序列不能出现TTTT连续碱基；(c)计算sgRNA脱靶特异性，错配比对数目<5；(d)sgRNA的GC含量在20％～80％之间。
(2)构建含有步骤(1)sgRNA序列的CRISPR/Cas9基因编辑载体文库：上一步设计的sgRNA后进行产物纯化，用Gibson同源重组法将纯化的DNA产物连接到CRISPR载体pZY-cas9，转化Trans1-T1活性细胞，利用载体上的Basta抗性标记筛选阳性克隆，阳性克隆提取质粒，获得含sgRNA的CRISPR/Cas9载体文库。
2.根据权利要求1所述的西瓜全基因组突变体文库，其特征在于首先在所有基因的第一个外显子中设计sgRNA，满足筛选条件的sgRNA，保留该条基因和最合适的一条sgRNA；没有满足条件的sgRNA的基因，再从该基因的第二个外显子中设计sgRNA，满足条件的保留。以此类推，一共在三个外显子中依次设计基因的sgRNA。
3.一种西瓜全基因组突变体文库的构建方法，其特征在于包含以下步骤:
(1)根据西瓜基因组序列，设计每个功能基因特异性的sgRNA靶点序列，设计要求：(a)sgRNA尽可能靠近ATG起始位点；(b)sgRNA序列不能出现TTTT连续碱基；(c)计算sgRNA脱靶特异性，错配比对数目<5；(d)sgRNA的GC含量在20％～80％之间。
(2)构建含有步骤(1)sgRNA序列的CRISPR/Cas9基因编辑载体文库：上一步设计的sgRNA后进行产物纯化，用Gibson同源重组法将纯化的DNA产物连接到CRISPR载体pZY-cas9，转化Trans1-T1活性细胞，利用载体上的Basta抗性标记筛选阳性克隆，阳性克隆提取质粒，获得含sgRNA的CRISPR/Cas9载体文库。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于首先在所有基因的第一个外显子中设计sgRNA，满足筛选条件的sgRNA，保留该条基因和最合适的一条sgRNA；没有满足条件的sgRNA的基因，再从该基因的第二个外显子中设计sgRNA，满足条件的保留。以此类推，一共在三个外显子中依次设计基因的sgRNA。
5.权利要求1或2所述的西瓜全基因组突变体文库在创建西瓜突变体中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于权利要求1或2所述的西瓜全基因组突变体文库在高通量创建西瓜突变体中的应用。
7.权利要求1或2所述的西瓜全基因组突变体文库在西瓜育种中的应用。
8.一种大量获得西瓜突变体的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将权利要求1或2所述的西瓜全基因组突变体文库通过转化导入受体西瓜，获得转化株系；
(2)对转化株系中所含有的sgRNA种类进行鉴定，筛选西瓜突变体。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于步骤(1)西瓜转化方法为农杆菌介导法，转化株系筛选抗性为草甘膦。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于步骤(2)中sgRNA鉴定引物序列如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示。
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| CN202211149859.XA CN115976653A (zh) | 2022-09-21 | 2022-09-21 | 一种创制西瓜全基因组突变体文库的方法和应用 |
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Family Applications (1)
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2022
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