WO2019128743A1 - 一种猪全基因组sgRNA文库及其构建方法和应用 - Google Patents

一种猪全基因组sgRNA文库及其构建方法和应用 Download PDF

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许朋阳
徐凤丹
段广有
闵文波
夏步高
葛毅
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苏州金唯智生物科技有限公司
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Definitions

  • the inventor deeply studied the theoretical knowledge and practical methods of the DNA editing system of CRISPR/Cas9-sgRNA, and optimized the experimental flow and algorithm for constructing high-quality sgRNA library with high activity and meeting the experimental requirements.
  • the module designed a large number of experiments to explore the design rules and screening methods of sgRNA, and finally found the optimal screening combination and filtration criteria to obtain a genome-wide custom sgRNA library specific for pigs.
  • the criteria for screening according to step (3) further comprise: selecting no more than 6 sgRNAs per target sequence, retaining only the optimal and low-risk sgRNA, and ensuring that the selected sgRNA covers as much as possible different transcription of the gene.
  • the plurality of sgRNAs of each gene are targeted as far as possible to different positions of the gene, and the GC content is in any one of 20%-80% or a combination of at least two, for example, no more than 6 pieces can be selected for each target sequence.

Abstract

一种猪全基因组sgRNA文库及其构建方法和应用，该文库包括猪(Sus scrofus)全基因组中20438个基因的sgRNA序列，其中17410个基因设计得到6条sgRNA，2828个基因设计得到sgRNA数量在1-5条之间，该sgRNA的获取过程为：首先在靶序列上获取候选sgRNA，然后对候选sgRNA进行脱靶分析并打分，最后根据打分结果对sgRNA过滤；通过采用多种设计标准及筛选原则，优化模块内细节及流程，最终构建得到猪全基因组sgRNA文库。

Description

一种猪全基因组sgRNA文库及其构建方法和应用
相关申请的交叉引用
本申请要求于2017年12月29日提交中国专利局的申请号为CN201711490244.2、名称为“一种猪全基因组sgRNA文库及其构建方法和应用”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。
技术领域
本申请涉及基因工程领域，尤其涉及一种猪全基因组sgRNA文库及其构建方法和应用。
背景技术
CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)，被称为规律成簇间隔短回文重复，实际上就是一种基因编辑器，是细菌用以保护自身对抗病毒的一个系统，也是一种对付攻击者的基因武器。后来，研究人员发现，它似乎是一种精确的万能基因武器，可以用来删除、添加、激活或抑制其他生物体的目标基因，这些目标基因包括人、老鼠、斑马鱼、细菌、果蝇、酵母、线虫和农作物细胞内的基因，这也意味着基因编辑器是一种可以广泛使用的生物技术，CRISPR基因编辑器的工作过程图如图1所示。
CRISPR簇是一个广泛存在于细菌和古生菌基因组中的特殊DNA重复序列家族，其序列由一个前导区(Leader)、多个短而高度保守的重复序列区(Repeat)和多个间隔区(Spacer)组成。前导区一般位于CRISPR簇上游，是富含AT长度为300～500bp的区域，被认为可能是CRISPR簇的启动子序列。重复序列区长度为21～48bp，含有回文序列，可形成发卡结构。重复序列之间被长度为26～72bp的间隔区隔开。Spacer区域由俘获的外源DNA组成，类似免疫记忆，当含有同样序列的外源DNA入侵时，可被细菌机体识别，并进行剪切使之表达沉默，达到保护自身安全的目的。
通过对CRISPR簇的侧翼序列分析发现，在其附近存在一个多态性家族基因。该家族编码的蛋白质均含有可与核酸发生作用的功能域(具有核酸酶、解旋酶、整合酶和聚合酶等活性)，并且与CRISPR区域共同发挥作用，因此被命名为CRISPR关联基因(CRISPR associated)，缩写为Cas。目前发现的Cas包括Cas1～Cas10等多种类型。Cas基因与CRISPR共同进化，共同构成一个高度保守的系统，CRISPR簇的系统结构图如图2所示。
当细菌抵御噬菌体等外源DNA入侵时，在前导区的调控下，CRISPR被转录为长的RNA前体(Pre RISPR RNA，pre-crRNA)，然后加工成一系列短的含有保守重复序列和间隔区的成熟crRNA，最终识别并结合到与其互补的外源DNA序列上发挥剪切作用。
目前发现的CRISPR/Cas系统有三种不同类型即I型、II型和III型，它们存在于大约40％已测序的真细菌和90％已测序的古细菌中。其中II型的组成较为简单，以Cas9蛋白 以及向导RNA(gRNA)为核心组成，也是目前研究中最深入的类型。
在II型系统中pre-crRNA的加工由Cas家族中的Cas9单独参与，Cas9含有在氨基末端的RuvC和蛋白质中部的HNH2个独特的活性位点，在crRNA成熟和双链DNA剪切中发挥作用。此外，pre-crRNA转录的同时，与其重复序列互补的反式激活crRNA(Trans-activating crRNA，tracrRNA)也转录出来，并且激发Cas9和双链RNA特异性RNase III核酸酶对pre-crRNA进行加工。加工成熟后，crRNA、tracrRNA和Cas9组成复合体，识别并结合于crRNA互补的序列，然后解开DNA双链，形成R-loop，使crRNA与互补链杂交，另一条链保持游离的单链状态，然后由Cas9中的HNH活性位点剪切crRNA的互补DNA链，RuvC活性位点剪切非互补链，最终引入DNA双链断裂(DSB)。CRISPR/Cas9的剪切位点位于crRNA互补序列下游邻近的PAM区(Protospacer Adjacent Motif)的5'-GG-N18-NGG-3'特征区域中的NGG位点，而这种特征的序列在每128bp的随机DNA序列中就重复出现一次。研究结果表明，Cas9还可以剪切线性和超螺旋的质粒，其剪切效率堪比限制性内切酶。由于crRNA参与并且起到精确导向的作用，所以CRISPR/Cas9打靶系统也被称为RNA导向(RNA guided)打靶系统，打把系统的原理图如图3所示。
基于CRISPR/Cas9-sgRNA的DNA编辑系统已经发展成基因编辑的一个有效工具。CRISPR/Cas9-sgRNA系统包含两个主要组分—Cas9蛋白和sgRNA。sgRNA决定了基因编辑的位点和基因编辑的效率。研究已经表明，不同的sgRNA有不同的编辑效率。在动物和人类中通过高通量比较分析sgRNA的效率，研究人员已经获得了高效sgRNA的参数。
CN106845151A公开一种CRISPR-Cas9系统sgRNA作用靶点的筛选方法，包括：(1)利用已公布物种的全基因组序列及基因注释信息，获取基因组中具有5’-Nx-NGG-3’序列的区段(x为19～22之间的整数，N代表A/T/C/G)，作为CRISPR-Cas9系统sgRNA的候选靶点；(2)将基因组打断成22～25bp的片段并筛选以NGG结尾的，且在基因组上无重复的序列；(3)将步骤(1)的候选靶点序列与步骤(2)中筛到的序列进行比对，根据错配信息及评选公式对相应的优选序列进行筛选及排序，获取最优的全基因组sgRNA作用靶点集合。CN105886616A公开了一种用于猪基因编辑的高效特异性sgRNA识别位点引导序列及其筛选方法，所述筛选方法包括步骤：功能基因筛选及ORF分析、功能基因sgRNA识别位点引导序列预测、全基因组脱靶位点检测、依据脱靶信息与靶位点位置对预测的靶位点打分，排序、结果筛选与统计、算法优化与软件开发。本申请的猪的特异性sgRNA识别位点引导序列经过了严格的筛选与检验，包含所有猪蛋白编码基因的用于CRISPR-Cas9基因编辑的sgRNA识别位点引导序列。但上述现有技术的构建步骤繁琐，优化筛选标准落后，得到的sgRNA质量不高。
但是，由于低质量sgRNA直接浪费科研人员的时间和金钱，因此选择高效率的sgRNA 是避免该结果发生的一个有效途径。目前，尽管已经有一些sgRNA设计软件，但是这些软件大多都是逐个基因设计sgRNA，缺乏定制全基因组sgRNA文库设计的生物信息学工作流程。因此，提供一种针对猪的全基因组定制sgRNA文库制备方法，得到高质量的猪全基因组sgRNA，具有重要的科研价值和应用前景。
发明内容
针对现有技术的不足及实际的需求，本申请提供一种猪全基因组sgRNA文库及其构建方法和应用，通过采用多种设计标准及筛选原则，优化算法和流程，最终构建得到高质量和高活性的猪全基因组sgRNA文库，所述方法简洁高效，得到的文库质量高，活性好，便于应用在基因编辑研究中。
为达此目的，本申请采用以下技术方案：
第一方面，本申请提供一种猪全基因组sgRNA文库，所述文库包括猪(Sus scrofus)全基因组中的20438个基因的sgRNA序列；
所述sgRNA主要通过在获取的靶序列上筛选候选sgRNA，然后对候选sgRNA进行脱靶分析并打分，最后根据打分结果对sgRNA过滤得到。
优选地，所述候选sgRNA的筛选标准包括20％-80％的GC含量。
所述GC含量为20-80％，例如可以是20％、30％、45％、46％、48％、50％、52％、55％、60％、70％或80％，优选为40-70％。
优选地，所述sgRNA的筛选标准包括19-21nt的长度。
所述长度为19-21nt，例如可以是19nt、20nt或21nt。
优选地，所述sgRNA的过滤标准包括选择靠近5’端的sgRNA。
优选地，所述sgRNA的过滤标准包括每个CDS片段的sgRNA数量不超过2条。
发明人在长期的生物信息测序实验过程中，深入研究CRISPR/Cas9-sgRNA的DNA编辑系统理论知识和实践手段，为构建高质量和能满足实验要求的高活性的sgRNA文库，优化实验流程和算法模块，设计大量实验探讨sgRNA的设计规则和筛选方法，最终发现最优的筛选组合和过滤标准，得到特异性针对猪的全基因组定制sgRNA文库。
第二方面，本申请提供一种如第一方面所述的猪全基因组sgRNA文库用于构建基于敲除突变体文库和/或基于敲除动物模型。
第三方面，本申请提供一种猪全基因组sgRNA文库的构建方法，包括如下步骤：
(1)靶序列选择：从数据库中下载基因组序列和注释文件，选取具有5’-20 nt+NGG-3’的序列特征的位点并移除跨越外显子区域的序列作为输入靶序列；
(2)sgRNA设计：根据GC含量为20％-80％和长度为19-21nt筛选候选sgRNA，并进行全基因组序列比对，并根据指定允许的错配数进行脱靶率评估并分级；
(3)sgRNA过滤：将评估并分级后的sgRNA根据以下标准进行筛选：选择靠近5’端的sgRNA和每个CDS片段的sgRNA数量不超过2条。
优选地，步骤(1)所述靶序列的选择标准包括蛋白质编码基因选择CDS区域作为靶序列。
优选地，步骤(2)所述筛选依据还包括PAM序列和单双链模式。
优选地，步骤(2)所述允许的错配数为0-5个，例如可以是0个、1个、2个、3个、4个或5个，优选为5个。
优选地，步骤(2)所述sgRNA设计的脱靶率评估标准为：
1)将能够精确比对到基因组中多个位点的sgRNA过滤掉；
2)只比对到基因组中该sgRNA对应位置的sgRNA为Best；
3)对于其他的sgRNA根据错配位置从5’->3’罚分逐渐递减，再结合错配数进行综合打分，罚分越高风险越高。
优选地，步骤(2)所述分级的级别包括：最优、低风险、风险适中和高风险四个级别。
优选地，步骤(3)所述筛选的标准还包括：每个靶序列选择不大于6条的sgRNA、只保留级别为最优和低风险的sgRNA、确保选择的sgRNA尽可能覆盖基因的不同转录本、每个基因的多个sgRNA尽量靶定到基因的不同位置、GC含量在20％-80％中的任意一种或至少两种的组合，例如可以是每个靶序列选择不大于6条的sgRNA和只保留级别为最优和低风险的sgRNA的组合，每个基因的多个sgRNA尽量靶定到基因的不同位置和GC含量在20％-80％中的组合，每个靶序列选择不大于的6条sgRNA、只保留级别为最优和低风险的sgRNA、确保选择的sgRNA尽可能覆盖基因的不同转录本、每个基因的多个sgRNA尽量靶定到基因的不同位置、GC含量在20％-80％的组合，优选为每个靶序列选择不大于6条的sgRNA、只保留级别为最优和低风险的sgRNA、确保选择的sgRNA尽可能覆盖基因的不同转录本、每个基因的多个sgRNA尽量靶定到基因的不同位置、GC含量在20％-80％的组合。
作为优选技术方案，本申请提供一种猪全基因组sgRNA文库的构建方法，具体包括如下步骤：
(1)靶序列选择：从数据库中下载基因组序列和注释文件，选取具有5’-20 nt+NGG-3’的序列特征的位点并移除跨越外显子区域的序列作为输入靶序列；
其中，蛋白质编码基因选择CDS区域作为靶序列；
(2)sgRNA设计：根据PAM序列、单双链模式、GC含量为20-80％和长度为19-21nt筛选候选sgRNA，并进行全基因组序列比对，进行序列同源分析，并根据指定0-5个的错配数进行脱靶率评估并分为最优、低风险、风险适中和高风险四个级别；
其中，脱靶率评估的标准为：
1)将能够精确比对到基因组中多个位点的sgRNA过滤掉；
2)只比对到基因组中该sgRNA对应位置的sgRNA为Best；
3)对于其他的sgRNA根据错配位置从5’->3’罚分逐渐递减，再结合错配数进行综合打分，罚分越高风险越高；
(3)sgRNA过滤：将评估并分级后的sgRNA根据以下标准进行筛选：选择靠近5’端的sgRNA、每个CDS片段的sgRNA数量不超过2条、每个靶序列选择不大于6条的sgRNA、只保留级别为最优和低风险的sgRNA、确保选择的sgRNA尽可能覆盖基因的不同转录本、每个基因的多个sgRNA尽量靶定到基因的不同位置和GC含量在20％-80％。
与现有技术相比，本申请具有如下有益效果：
(1)本申请提供的sgRNA文库质量较高，全基因组的20438个基因均设计得到对应的sgRNA，，其中17410个基因设计得到6条sgRNA，2828个基因设计得到sgRNA数量在1-5条之间，所有sgRNA的活性均能满足后续实验的要求；
(2)本申请提供的猪全基因组sgRNA文库的构建方法简洁高效，便于操作和实际应用，通过优化模块内流程及细节，调整sgRNA的设计标准及筛选原则，全面且特异性地针对猪全基因组进行sgRNA设计和过滤，节省时间和人力，便于推广应用。
附图说明
图1为本申请的CRISPR基因编辑器的工作过程图；
图2为本申请的CRISPR簇的系统结构图；
图3为本申请的CRISPR/Cas9打靶系统的原理图；
图4为本申请的sgRNA构建流程图。
具体实施方式
为更进一步阐述本申请所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本申请的技术方案，但本申请并非局限在实施例范围内。
实施例1
sgRNA的构建流程如图4所示，流程依次为全基因组CDS序列筛选、根据sgRNA识别位点选取候选sgRNA序列、全基因组脱靶位点检测、根据脱靶位点信息和脱靶位点位置对设计的候选sgRNA打分、结果筛选和设计以及对全程的算法优化和软件开发。
具体步骤如下：
(1)靶序列选择：从数据库中下载基因组序列和注释文件，选取具有5’20 nt+NGG-3’的序列特征的位点并移除跨越外显子区域的序列作为输入靶序列；
其中，蛋白质编码基因选择CDS区域作为靶序列；
(2)sgRNA设计：根据PAM序列、单双链模式、GC含量为20％-80％和长度为20nt筛选候选sgRNA，并进行全基因组序列比对，并根据指定5个的错配数进行脱靶率评估并分为最优、低风险、风险适中和高风险四个级别；
其中，脱靶率评估的标准为：
1)将能够精确比对到基因组中多个位点的sgRNA过滤掉；
2)只比对到基因组中该sgRNA对应位置的sgRNA为Best；
3)对于其他的sgRNA根据错配位置从5’->3’罚分逐渐递减，再结合错配数进行综合打分，罚分越高风险越高；
(3)sgRNA过滤：将评估并分级后的sgRNA根据以下标准进行筛选：选择靠近5’端的sgRNA、每个CDS片段的sgRNA数量不超过2条、每个靶序列选择不大于6条的sgRNA、只保留级别为最优和低风险的sgRNA、确保选择的sgRNA尽可能覆盖基因的不同转录本、每个基因的多个sgRNA尽量靶定到基因的不同位置和GC含量在20％-80％。
最终构建得到的猪全基因组sgRNA文库中，一共有20438个基因设计得到sgRNA，其中17410个基因设计得到6条sgRNA，2828个基因设计得到sgRNA数量在1-5条之间，实验对sgRNA质量的检验结果显示，Lowrisk以上的均为高质量的sgRNA，文库构建所得到的sgRNA活性均能满足后续实验的要求。
申请人声明，本申请通过上述实施例来说明本申请的详细方法，但本申请并不局限于上述详细方法，即不意味着本申请必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本申请的任何改进，对本申请产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本申请的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

  1. 一种猪全基因组sgRNA文库，其特征在于，所述文库包括猪(Sus scrofus)全基因组中的20438个基因的sgRNA；
    所述sgRNA的获取过程为：首先在靶序列上获取候选sgRNA，然后对候选sgRNA进行脱靶分析并打分，最后根据打分结果对sgRNA过滤。
  2. 根据权利要求1所述的sgRNA文库，其特征在于，所述候选sgRNA的筛选标准包括20％-80％的GC含量；
    优选地，所述候选sgRNA的筛选标准包括40％-70％的GC含量；
    优选地，所述候选sgRNA的筛选标准还包括19-21nt的长度。
  3. 根据权利要求1或2所述的sgRNA文库，其特征在于，所述sgRNA的过滤标准包括选择靠近5’端的sgRNA；
    优选地，所述sgRNA的过滤标准包括每个CDS片段的sgRNA数量不超过2条。
  4. 一种如权利要求1-3中任一项所述的猪全基因组sgRNA文库用于构建基于敲除突变体文库和/或基于敲除动物模型。
  5. 一种猪全基因组sgRNA文库的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
    (1)靶序列选择：从数据库中下载基因组序列和注释文件，选取具有5’20nt+NGG-3’的序列特征的位点并移除跨越外显子区域的序列作为输入靶序列；
    (2)sgRNA设计：根据GC含量为20％-80％和长度为19-21nt筛选候选sgRNA，并进行全基因组序列比对，并根据指定允许的错配数进行脱靶率评估并分级；
    (3)sgRNA过滤：将评估并分级后的sgRNA根据以下标准进行筛选：选择靠近5’端的sgRNA和每个CDS片段的sgRNA数量不超过2条。
  6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述靶序列的选择标准包括蛋白质编码基因选择CDS区域作为靶序列；
    优选地，步骤(2)所述筛选依据还包括PAM序列和单双链模式。
  7. 根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述允许的错配数为0-5个，优选为5个；
    优选地，步骤(2)所述sgRNA设计的脱靶率评估标准为：
    1)将能够精确比对到基因组中多个位点的sgRNA过滤掉；
    2)只比对到基因组中该sgRNA对应位置的sgRNA为Best；
    3)对于其他的sgRNA根据错配位置从5’->3’罚分逐渐递减，再结合错配数进行综合打分，罚分越高风险越高。
  8. 根据权利要求4-7中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述分级的级别包括：最优、低风险、风险适中和高风险四个级别。
  9. 根据权利要求5-8中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述筛选的标准还包括：每个靶序列选择不大于6条的sgRNA、只保留级别为最优和低风险的sgRNA、确保选择的sgRNA尽可能覆盖基因的不同转录本、每个基因的多个sgRNA尽量靶定到基因的不同位置、GC含量在20％-80％中的任意一种或至少两种的组合，优选为每个靶序列选择不大于6条的sgRNA、只保留级别为最优和低风险的sgRNA、确保选择的sgRNA尽可能覆盖基因的不同转录本、每个基因的多个sgRNA尽量靶定到基因的不同位置、GC含量在20％-80％的组合。
  10. 根据权利要求5-9中任一项所述的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
    (1)靶序列选择：从数据库中下载基因组序列和注释文件，选取具有5’-20nt+NGG-3’的序列特征的位点并移除跨越外显子区域的序列作为输入靶序列；
    其中，蛋白质编码基因选择CDS区域作为靶序列；
    (2)sgRNA设计：根据PAM序列、单双链模式、GC含量为20％-80％和长度为19-21nt筛选候选sgRNA，并进行全基因组序列比对并根据指定0-5个的错配数进行脱靶率评估并分为最优、低风险、风险适中和高风险四个级别；
    其中，脱靶率评估的标准为
    1)将能够精确比对到基因组中多个位点的sgRNA过滤掉；
    2)只比对到基因组中该sgRNA对应位置的sgRNA为Best；
    3)对于其他的sgRNA根据错配位置从5’->3’罚分逐渐递减，再结合错配数进行综合打分，罚分越高风险越高；
    (3)sgRNA过滤：将评估并分级后的sgRNA根据以下标准进行筛选：选择靠近5’端的sgRNA、每个CDS片段的sgRNA数量不超过2条、每个靶序列选择不大于6条的sgRNA、只保留级别为最优和低风险的sgRNA、确保选择的sgRNA尽可能覆盖基因的不同转录本、每个基因的多个sgRNA尽量靶定到基因的不同位置和GC含量在20％-80％。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113990394A (zh) * 2021-10-27 2022-01-28 云舟生物科技（广州）有限公司 向导rna作用靶点的筛选方法、计算机存储介质及电子设备
CN116206684A (zh) * 2022-12-26 2023-06-02 纳昂达(南京)生物科技有限公司 一种评估基因组重复区探针捕获安全性的方法及其装置
WO2023116681A1 (zh) * 2021-12-21 2023-06-29 翌圣生物科技(上海)股份有限公司 靶序列随机sgRNA全覆盖组的制备方法

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108221058A (zh) * 2017-12-29 2018-06-29 苏州金唯智生物科技有限公司 一种猪全基因组sgRNA文库及其构建方法和应用
CN109817340B (zh) * 2019-01-16 2023-06-23 苏州金唯智生物科技有限公司 疾病风险分布信息确定方法、装置、存储介质及设备
CN109957842B (zh) * 2019-02-11 2022-06-24 王纪武 一种用模块化设计构建双系统表达质粒文库的方法
CN110358766A (zh) * 2019-06-10 2019-10-22 云南农业大学 一种基于全基因组CRISPR/Cas9文库筛选异种移植抗原基因的方法
CN113436683A (zh) * 2020-03-23 2021-09-24 北京合生基因科技有限公司 筛选候选插入片段的方法和系统
CN111733159B (zh) * 2020-06-01 2022-09-27 五邑大学 用于猪MBP基因敲除的sgRNA组合物及用途
CN111849983A (zh) * 2020-07-17 2020-10-30 中国农业大学 一种sgRNA及其应用
CN112992277B (zh) * 2021-03-18 2021-10-26 南京先声医学检验实验室有限公司 一种微生物基因组数据库构建方法及其应用
GB202114206D0 (en) * 2021-10-04 2021-11-17 Genome Res Ltd Novel method

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105886616A (zh) 2016-04-20 2016-08-24 广东省农业科学院农业生物基因研究中心 一种用于猪基因编辑的高效特异性sgRNA识别位点引导序列及其筛选方法
WO2017075529A1 (en) * 2015-10-29 2017-05-04 The Research Foundation For The State University Of New York Genomic combinatorial screening platform
CN106845151A (zh) 2015-12-07 2017-06-13 中国农业大学 CRISPR-Cas9系统sgRNA作用靶点的筛选方法及装置
CN108205614A (zh) * 2017-12-29 2018-06-26 苏州金唯智生物科技有限公司 一种全基因组sgRNA文库的构建系统及其应用
CN108221058A (zh) * 2017-12-29 2018-06-29 苏州金唯智生物科技有限公司 一种猪全基因组sgRNA文库及其构建方法和应用

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX9305855A (es) * 1992-09-24 1995-01-31 Tadatsugu Taniguchi Factores 1 y 2 reguladores del interferon en el diagnostico de latumorigenicidad.
WO2014204727A1 (en) * 2013-06-17 2014-12-24 The Broad Institute Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions methods, screens and applications thereof
WO2015065964A1 (en) * 2013-10-28 2015-05-07 The Broad Institute Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions, methods, screens and applications thereof
CA3001683A1 (en) * 2015-06-05 2016-12-08 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for generating crispr/cas guide rnas
CN107365793A (zh) * 2017-06-19 2017-11-21 百格基因科技（江苏）有限公司 一种适用于植物的大规模基因组编辑的方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017075529A1 (en) * 2015-10-29 2017-05-04 The Research Foundation For The State University Of New York Genomic combinatorial screening platform
CN106845151A (zh) 2015-12-07 2017-06-13 中国农业大学 CRISPR-Cas9系统sgRNA作用靶点的筛选方法及装置
CN105886616A (zh) 2016-04-20 2016-08-24 广东省农业科学院农业生物基因研究中心 一种用于猪基因编辑的高效特异性sgRNA识别位点引导序列及其筛选方法
CN108205614A (zh) * 2017-12-29 2018-06-26 苏州金唯智生物科技有限公司 一种全基因组sgRNA文库的构建系统及其应用
CN108221058A (zh) * 2017-12-29 2018-06-29 苏州金唯智生物科技有限公司 一种猪全基因组sgRNA文库及其构建方法和应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PATRICK D. HSU.: "Development and Applications of CRISPR-Cas9 for Genome Engineering", CELL, vol. 157, no. 6, 5 June 2014 (2014-06-05), pages 1262 - 1278, XP028849523, ISSN: 0092-8674, DOI: 10.1016/j.cell.2014.05.010 *
See also references of EP3733936A4
YANG XIAOFENG; TANG FEI; LI ZICONG; LIU DEWU; WU ZHENFANG; CAI GENGYUAN; ZHENG ENQIN: "Application of the CRISPR/Cas9 Gene Editing Technology in Pigs", HEILONGJIANG ANIMAL SCIENCE AND VETERINARY MEDICINE., vol. 293, no. 5-9, 31 May 2017 (2017-05-31), CN, pages 71 - 76, XP009522195, ISSN: 1004-7034, DOI: 10.13881/j.cnki.hljxmsy.2017.0771 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113990394A (zh) * 2021-10-27 2022-01-28 云舟生物科技（广州）有限公司 向导rna作用靶点的筛选方法、计算机存储介质及电子设备
CN113990394B (zh) * 2021-10-27 2023-01-24 云舟生物科技(广州)股份有限公司 向导rna作用靶点的筛选方法、计算机存储介质及电子设备
WO2023116681A1 (zh) * 2021-12-21 2023-06-29 翌圣生物科技(上海)股份有限公司 靶序列随机sgRNA全覆盖组的制备方法
CN116206684A (zh) * 2022-12-26 2023-06-02 纳昂达(南京)生物科技有限公司 一种评估基因组重复区探针捕获安全性的方法及其装置
CN116206684B (zh) * 2022-12-26 2024-01-30 纳昂达(南京)生物科技有限公司 一种评估基因组重复区探针捕获安全性的方法及其装置

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CN108221058A (zh) 2018-06-29
EP3733936A1 (en) 2020-11-04
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