CN109957842B - 一种用模块化设计构建双系统表达质粒文库的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用模块化设计构建双系统表达质粒文库的方法；是用已有cDNA或ORF质粒文库通过模块化设计构建双系统表达质粒(类UAS‑cDNA/ORF)文库的方法。具体包括：用基因编辑技术切割已有cDNA或ORF基因文库质粒的cDNA或ORF上游载体序列，使其线性化；制备模块化插入序列片段，该序列包含类酵母UAS、果蝇核心启动子及抗生素抗性基因；运用无缝克隆技术将所述模块化插入序列片段与所述线性化质粒连接，转化大肠杆菌制备类UAS‑cDNA/ORF文库质粒。本发明由于引入了模块化设计理念，较现有技术具有简单、适用范围广、适合大容量文库构建、高效、经济的优点。
Description
技术领域
本发明涉及质粒文库构建方法，具体涉及一种利用任何已有cDNA或ORF质粒文库，简单、快速、高效地构建UAS-cDNA/ORF质粒文库的方法。
背景技术
全基因组无偏好遗传学筛选(genome-wide unbiased genetic screen)是一个研究基因功能的强大手段，被广泛地应用于生物学研究的各个领域。全基因组无偏好遗传学筛选主要分为功能丧失(loss of function)和功能获得(gain of function)这两类方法。果蝇因其具有成本低、繁殖快、数目多且足够复杂而又大部分基因进化保守等优点，成为全基因组无偏好遗传学筛选的一个常用动物模型。果蝇很多基因没有明显的loss offunction表型，利用UAS/GAL4系统在任意特定组织进行gain of function筛选是研究这些基因功能的一个重要手段。
UAS/GAL4系统是果蝇遗传学中一种常用的组织特异的基因过表达系统。其原理是利用特定的启动子组织特异地表达酵母转录激活因子GAL4，GAL4进一步与GAL4结合元件(UAS)结合，激活靶基因(cDNA/ORF)的转录。因此，只需构建UAS-cDNA/ORF转基因果蝇，然后再与组织特异表达GAL4的果蝇交配，即可组织特异表达该基因。为了利用UAS/GAL4系统在任意特定组织进行gain of function筛选，需要构建UAS-cDNA/ORF转基因果蝇文库。
传统构建UAS-cDNA/ORF质粒，需要针对每一个基因设计引物、PCR、测序、限制酶切、胶回收等。构建全基因组UAS-RNAi转基因果蝇文库相对简单，因为RNAi序列短，只需要PCR扩增几百碱基对，所以1998年在线虫里首次发现RNAi后，到2007年就已构建好全基因组UAS-RNAi转基因果蝇文库。而构建全基因组UAS-ORF转基因果蝇文库则没有那么简单。果蝇编码蛋白基因有将近14000个，2002年已构建好超过12000个果蝇cDNA质粒，但是目前为止，还没有构建好全基因组UAS-cDNA/ORF转基因果蝇文库。因为ORF序列比RNAi序列长很多，用现有方法构建UAS-cDNA/ORF质粒耗时又费力，构建质粒这一步就成为构建转基因果蝇文库的主要限速步骤。因此，迫切需要建立一种简单、快速、高效地构建全基因组UAS-cDNA/ORF转基因果蝇质粒文库的方法。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术存在的不足，提供一种用模块化设计构建双系统表达质粒文库(UAS-cDNA/ORF质粒文库，以及类UAS-cDNA/ORF质粒文库)的方法，发明人将其命名为CRISPR-based modular assembly，缩写为CRISPRmass。本发明具体涉及利用任何已有cDNA或ORF质粒文库，将基因编辑技术和无缝克隆技术结合起来，并且同时在模块化插入序列中引入与已有cDNA或ORF质粒文库的质粒所不同种类的抗生素抗性基因以便于筛选。简单、快速、高效地构建类UAS-cDNA/ORF质粒文库的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明涉及一种用模块化设计构建双系统表达质粒文库的方法，所述方法包括如下步骤：
S1、利用基因编辑技术切割已有cDNA或ORF质粒文库的质粒cDNA或ORF的5’端上游的载体序列，使其线性化，得到原质粒文库的线性化质粒；
S2、设计并构建模块化插入序列质粒，该模块化插入序列包含类酵母UAS序列、果蝇核心启动子序列、转基因果蝇筛选标记基因、用于把转基因定点插入到果蝇基因组特定位点的定点整合序列、与原cDNA或ORF质粒所不同的抗生素抗性基因序列；该序列两端与步骤S1的原质粒文库的线性化质粒末端序列重叠；将模块化插入序列从所述模块化插入序列质粒上切下，电泳分离回收，得到模块化插入序列片段；
S3、运用无缝克隆技术将步骤S2回收的模块化插入序列片段与步骤S1的原质粒文库的线性化质粒连接，然后转化大肠杆菌，在同时含有模块化插入序列抗性和原质粒文库的质粒抗性的对应的抗生素的LB固体平板上培养，再从平板上挑取克隆后过夜培养，提取质粒并鉴定即得到类UAS-cDNA/ORF文库质粒。
上述方法步骤S1中，利用基因编辑技术切割任何已有质粒文库中基于相同载体的不同质粒的载体序列，从而实现了对质粒文库中基于相同载体的不同质粒的相同操作，使得利用模块化设计理念大规模高效快速改造质粒文库成为可能，这是本发明的核心所在之一。
优选的，步骤S1中，所述已有cDNA或ORF质粒文库的质粒选自果蝇DGRC GoldCollection文库质粒、人OHS6087 CCSB Lentiviral Expression Library文库质粒或小鼠Mouse MGC Collection文库质粒。
优选的，步骤S1中，所述已有的cDNA或ORF质粒文库质粒的载体包括pOT2、pFLC-I、pBS SK-(即pBlusescript SK(-))、pOTB7、pOTB7_DraIII、pCR2.1、pDNR-Dual、pLX304-Blast-V5、pCMV-SPORT6、pSPORT1中的一种或几种。
优选的，步骤S1中，具体为使用CRISPR/Cas9技术切割质粒，包括针对已有cDNA或ORF质粒文库的质粒cDNA或ORF的5’端上游的载体序列，设计多个Cas9的靶序列；所述Cas9的靶序列及其对应载体包括：序列如SEQ ID NO.1-18所示的针对pOT2载体的sgRNA的靶序列，序列如SEQ ID NO.19-32所示的针对pOTB7和pOTB7_DraIII载体的sgRNA的靶序列，序列如SEQ ID NO.33-57所示的针对pBS SK-载体的sgRNA的靶序列，序列如SEQ ID NO.58-66所示的针对pFlc-1载体的sgRNA的靶序列，序列如SEQ ID NO.67-96、SEQ ID NO.97-137所示的针对pCR2.1载体的sgRNA的靶序列，序列如SEQ ID NO.138-175所示的针对pDNR-Dual载体的sgRNA的靶序列,序列如SEQ ID NO.176-183所示的针对pLX304-Blast-V5载体切点A的sgRNA的靶序列,序列如SEQ ID NO.184-219所示的针对pLX304-Blast-V5载体切点B的sgRNA的靶序列,序列如SEQ ID NO.220-246所示的针对pCMV-SPORT6载体切点A的sgRNA的靶序列,序列如SEQ ID NO.247-263所示的针对pCMV-SPORT6载体切点B的sgRNA的靶序列。
优选的，步骤S2中，所述类酵母UAS序列包括UAS、LexAop、QUAS或VAS序列。
优选的，步骤S2中，所述果蝇核心启动子序列包括Hsp70核心启动子和DSCP核心启动子；所述转基因果蝇筛选标记基因包括mini-white或vermilion；所述用于把转基因定点插入到果蝇基因组特定位点的定点整合序列为用于把转基因定点插入到果蝇基因组attP位点的定点整合序列attB。
优选的，步骤S2中，所述与原cDNA或ORF质粒所不同的抗生素抗性基因序列包括氨苄青霉素抗性基因序列、氯霉素抗性基因序列、卡那霉素抗性基因序列、壮观霉素抗性基因序列、四环素抗性基因、庆大霉素抗性基因、博莱霉素抗性基因、链霉素抗性基因、潮霉素抗性基因。其本质是常用的几种质粒抗生素抗性基因的替换使用。如原cDNA或ORF质粒是氨苄青霉素抗性则本模块序列中引入氯霉素抗性基因序列。
优选的，步骤S2中，所述果蝇核心启动子序列位于模块化插入序列的3’端，所述类酵母UAS序列位于果蝇核心启动子序列的5’端且紧邻果蝇核心启动子序列；转基因果蝇筛选标记基因、用于把转基因定点插入到果蝇基因组特定位点的定点整合序列、与原cDNA或ORF质粒所不同的抗生素抗性基因序列排列顺序可互换的位于类酵母UAS序列的5’端。
优选的，步骤S1中，所述双系统表达质粒文库中的双系统包括GAL4-UAS系统、Q系统、LexA-LexAop系统和TALE-VAS系统。
优选的，步骤S3中，所述无缝克隆技术包括Gibson Assembly、In-Fusion、Red/ETRecombination、SLIC(Sequence and Ligation-Independent Cloning)、SLiCE(SeamlessLigation Cloning Extract)、SHA(Successive Hybridization Assembling)。
本发明还具体涉及一种UAS-cDNA/ORF转基因果蝇质粒文库的构建方法；如图1所示，所述方法包括如下步骤：
(1)、针对已有基因的cDNA或ORF文库质粒中cDNA或ORF的5’端上游邻近的载体序列，设计CRISPR/Cas9sgRNAde的靶序列；然后根据该序列构建sgRNA体外转录模板，体外转录合成CRISPR/Cas9sgRNA；再利用CRISPR/Cas9技术切割已有cDNA或ORF基因文库质粒cDNA或ORF的5’端上游的邻近的载体序列，使其线性化；
(2)、设计并构建模块化插入序列质粒，该模块化插入序列包含酵母UAS序列、果蝇Hsp70核心启动子序列、转基因果蝇筛选标记基因、用于把转基因定点插入到果蝇基因组特定位点的定点整合序列、原cDNA或ORF质粒所不含的新的抗生素抗性基因序列，该序列两端与步骤(1)的线性化原基因文库质粒末端序列重叠；将模块化插入序列从质粒上切下，电泳分离后，回收模块化插入序列片段；
(3)、运用无缝克隆技术将步骤(2)回收的片段与步骤(1)的线性化质粒连接，然后转化大肠杆菌，把转化产物涂于LB固体平板(含类UAS模块序列中抗生素抗性基因对应的抗生素)，培养后挑取克隆即得到UAS-cDNA/ORF转基因果蝇文库质粒。所构建质粒的限制性内切酶酶切结果分析表明，本方法构建质粒的阳性克隆率接近100％。所构建的质粒可直接用于果蝇胚胎注射，进而构建UAS-cDNA/ORF转基因果蝇。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、模块化。本发明突破了现有方法中将不同的cDNA或ORF片段插入到相同的载体中这一固定思维模式，在构建基因组规模的类UAS-cDNA/ORF质粒文库中，首次引入了模块化设计理念，设计了针对同一载体的统一的模块化插入序列。对文库质粒中相同载体的质粒的载体部分，进行统一的模块化操作。首次将基因编辑技术引入基因组规模的类UAS-cDNA/ORF质粒文库的构建中，并将基因编辑技术与无缝克隆技术结合，使模块化操作文库质粒中相同载体的质粒的载体部分成为可能。
2、简单。现有方法需要针对文库中上万个基因每个基因进行个体化引物设计、个体化PCR全基因扩增、个体化PCR扩增产物纯化回收、个体化限制性酶切、全基因测序等步骤，本发明避免了现有方法中针对文库中上万个基因每个基因的个体化操作。变为针对质粒载体的统一程序化标准化操作，极大简化了构建流程。而且操作简单，操作人员不需要高超的专业技术，即可胜任质粒构建工作。
3、适用范围广。现有方法由于需要PCR扩增cDNA或ORF序列全长，如果基因cDNA或ORF序列过长或GC含量过高，将影响PCR扩增效率，甚至难以扩增，而且也容易引起序列突变。这些都增加了构建质粒文库的难度。本发明由于在质粒载体上进行操作，不需要进行PCR扩增cDNA或ORF序列全长，绕过了这一难点，因此不受cDNA或ORF序列长度和GC含量的限制。
4、适合大容量文库构建。由于引入了模块化设计，针对同一载体的模块可反复应用。与现有方法相比，文库容量越大，本发明越节省人力、物力、财力和时间，越显示出其优越性。
5、高效。现有方法由于不能进行正筛选，所以构建质粒的克隆正确率难以保证，因此为了得到正确质粒，需要鉴定不止一个质粒克隆，这对于构建含有上万个质粒的文库而言，极大增加了工作量和成本。本发明由于在模块化插入序列中引入抗生素抗性基因，可以对构建质粒进行正筛选，所以理论上构建质粒的克隆正确率100％，我们的实验证实，利用本方法构建克隆时，在5986个得到克隆的转化中，每个反应随机挑选一个克隆鉴定，酶切分析表明，成功插入模块化序列的克隆数为5923，占总克隆数的98.95％。所以针对含有上万个质粒的文库的构建，本方法构建质粒的克隆正确率接近100％，可以极大地减少工作量。
6、经济。按照传统的方法，构建基因组规模的类UAS-cDNA/ORF质粒文库需要耗费大量的人力、物力、财力和时间，所以现在还未成功构建好任何物种的基因组规模的类UAS-cDNA/ORF质粒文库。本发明极大节省了人力、物力、财力和时间，将极大加快基因组规模的类UAS-cDNA/ORF质粒文库的构建进程。
附图说明
图1为本发明的用模块化设计构建双系统表达质粒文库的方法的路线流程图；
图2为应用本发明方法所构建针对果蝇DGRC Gold Collection文库、人OHS6087CCSB Lentiviral Expression Library、小鼠Mouse MGC Collection文库的UAS-cDNA/ORF质粒的鉴定图，表明应用本方法所构建阳性克隆率接近100％；其中，A为以pFLC-I、pBSSK-、pCR2.1和pDNR-Dual为载体的cDNA或ORF，应用本方法所构建的UAS-cDNA/ORF质粒的酶切鉴定图谱；B为以pOT2和pOTB7为载体的cDNA或ORF，应用本方法所构建的UAS-cDNA/ORF质粒的酶切鉴定图谱；C为以pLX304-Blast-V5和pCMV-SPORT6为载体的cDNA或ORF，应用本方法所构建的UAS-cDNA/ORF质粒的酶切鉴定图谱；
且，图2A：
M:GeneRuler 1 Kb Plus DNA Ladder
1.用PvuII切割pFLC-UAS-Duba质粒
2.用BamHI切割pBS-UAS-CG7747-3Myc#1质粒
3.用BamHI切割pBS-UAS-CG7747-3Myc#2质粒
4.用BamHI切割pBS-UAS-CG7747-3Myc#3质粒
5.用BamHI切割pBS-UAS-CG7747-3Myc#4质粒
6.用HindIII切割pCR2.1-UAS-CG13296-3Myc#1质粒
7.用HindIII切割pCR2.1-UAS-CG13296-3Myc#2质粒
8.用PstI切割pDNR-UAS-Usp20-33-3Myc#1质粒
9.用PstI切割pDNR-UAS-Usp20-33-3Myc#2质粒
10.用PstI切割pDNR-UAS-Usp20-33-3Myc#3质粒；
图2B：
M:GeneRuler 1 Kb Plus DNA Ladder
1.用PstI切割pOT2-UAS-CG4968-3Myc质粒
2.用PstI切割pOTB7-UAS-Rpn8-3Myc#1质粒
3.用PvuII切割pOTB7-UAS-Rpn8-3Myc#1质粒
4.用PstI切割pOTB7-UAS-Rpn8-3Myc#2质粒
5.用PvuII切割pOTB7-UAS-Rpn8-3Myc#2质粒；
图2C：
M:GeneRuler 1 Kb Plus DNA Ladder
1.用PvuII切割pLX304-UAS-COPS5-V5质粒
2.用PvuII切割pLX304-UAS-STAMBP-V5质粒
3.用PvuII切割pLX304-UAS-USP1-V5质粒
4.用PvuII切割pLX304-UAS-USP8-V5质粒
5.用PvuII切割pLX304-UAS-USP32-V5质粒
6.用PvuII切割pLX304-UAS-USP54-V5质粒
7.用PvuII切割pSPORT6-UAS-Ctbp2-2Myc质粒；
图3为应用本方法所构建质粒注射果蝇胚胎得到转基因果蝇，用该果蝇分别与在运动神经元特异表达OK6-GAL4和在眼睛特异表达GMR-GAL4果蝇进行交配即得到在神经和眼睛中过表达该基因的果蝇；免疫荧光实验和Western blot已证明基因表达；其中，A和B为用转基因果蝇与OK6-GAL4果蝇交配得到的三龄幼虫进行免疫荧光染色，检测转基因的表达；C、D和E为用转基因果蝇与GMR-GAL4果蝇交配得到的成体果蝇头部进行Western blot，检测转基因的表达；
图4为应用本方法所构建质粒注射果蝇胚胎得到转基因果蝇,用该果蝇分别与眼睛特异表达GMR-GAL4,翅膀特异表达A9-GAL4和肌肉特异表达MEF2-GAL4果蝇进行交配，所展示的为在特定组织中过表达具有特殊表型的基因及其表型，表明应用本方法构建质粒用于构建的转基因果蝇具备转基因过表达，可应用于基因筛选；其中，A为用转基因果蝇与GMR-GAL4果蝇交配得到眼睛退化的成体果蝇的眼睛普通光学显微镜照片；B为用转基因果蝇与A9-GAL4果蝇交配得到翅膀脉络异常的成体果蝇的翅膀普通光学显微镜照片；C为用转基因果蝇与MEF2-GAL4果蝇交配得到三龄幼虫的肌肉Phalloidin染色的激光共聚焦显微镜照片。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明做进一步说明。
实施例1、利用已有果蝇DGRC Gold Collection文库质粒构建UAS-cDNA/ORF质粒
本实施例涉及一种利用已有果蝇DGRC Gold Collection文库质粒构建UAS-cDNA/ORF质粒文库的方法，具体包括如下步骤：
(1)DGRC Gold Collection共有12192个质粒，克隆在7种载体上，这些载体含有氨苄青霉素或氯霉素抗性基因。在这7种载体中，对于克隆在pOTB7和pOTB7_DraIII这两种载体上的cDNA质粒，其cDNA的5’端上游载体序列完全相同，因此，这两类质粒可以按照一种载体进行操作。针对这7种质粒载体cDNA或ORF的5’端上游载体序列，本发明设计并构建了6种sgRNA体外转录模板，分别用于体外转录切割质粒所需sgRNA；具体见以下SEQ ID NO.1-158。利用CRISPR/Cas9切割DGRC Gold Collection文库质粒cDNA或ORF的5’端上游载体序列，使其线性化(见图1)，即得到原质粒文库的线性化质粒。
针对pOT2载体的sgRNA的靶序列(5’->3’)：SEQ ID NO.1-18
靶序列#1 ACGACTCACTATAGGGAGAC
靶序列#2 AATTAATACGACTCACTATA
靶序列#3 CATTAGGCGGGTTAAATTCC
靶序列#4 GGCGATGATATCAGATCTGC
靶序列#5 ATGAATCGGCTGCAGTACCC
靶序列#6 AATGAATCGGCTGCAGTACC
靶序列#7 AAAAAGCCCGCTCATTAGGC
靶序列#8 CGTATTAATTTCGATAAGCC
靶序列#9 GTTAACCTGCATTAATGAAT
靶序列#10 TTCATTAATGCAGGTTAACC
靶序列#11 ATTAGGCGGGTTAAATTCCC
靶序列#12 AAATTAATACGACTCACTAT
靶序列#13 TGCAGCCGATTCATTAATGC
靶序列#14 ATTTAACCCGCCTAATGAGC
靶序列#15 AATTTAACCCGCCTAATGAG
靶序列#16 CAAAAAAAAGCCCGCTCATT
靶序列#17 AAAAAAGCCCGCTCATTAGG
靶序列#18 TGATATCATCGCCACTGTGC
针对pOTB7和pOTB7_DraIII载体的sgRNA的靶序列(5’->3’)：SEQ ID NO.19-32
靶序列#1 GGTCCTAAGGTAGCGAGGCC
靶序列#2 GTCCTAAGGTAGCGAGGCCT
靶序列#3 CACCCAGGCCTCGCTACCTT
靶序列#4 ATAACGGTCCTAAGGTAGCG
靶序列#5 CAGTAACTATAACGGTCCTA
靶序列#6 CTTAGGACCGTTATAGTTAC
靶序列#7 CTAAGGTAGCGAGGCCTGGG
靶序列#8 AAAGCAGGCTTGTAAAACGA
靶序列#9 ACGACGGCCAGTAACTATAA
靶序列#10 ACAAGTTTGTACAAAAAAGC
靶序列#11 GGTACGTCGACGTTAGAACG
靶序列#12 TCGTATGTGTATGATACATA
靶序列#13 GTATCATACACATACGATTT
靶序列#14 GGTGACACTATAGAACTCGA
针对pBS SK-载体的sgRNA的靶序列(5’->3’)：SEQ ID NO.33-57
靶序列#1 AGCTTTTGTTCCCTTTAGTG
靶序列#2 AGCATAAAGTGTAAAGCCTG
靶序列#3 TTTCGAGCTTGGCGTAATCA
靶序列#4 GCTTTTGTTCCCTTTAGTGA
靶序列#5 AAGCTGGAGCTCCACCGCGG
靶序列#6 CTTCCGGCTCGTATGTTGTG
靶序列#7 AAGCATAAAGTGTAAAGCCT
靶序列#8 GAAGCATAAAGTGTAAAGCC
靶序列#9 GGCTTTACACTTTATGCTTC
靶序列#10 CGAAATTAACCCTCACTAAA
靶序列#11 AGCGGATAACAATTTCACAC
靶序列#12 TCGAAATTAACCCTCACTAA
靶序列#13 ATGTTGTGTGGAATTGTGAG
靶序列#14 GTGAGGGTTAATTTCGAGCT
靶序列#15 TCACTAAAGGGAACAAAAGC
靶序列#16 GGCGGCCGCTCTAGAACTAG
靶序列#17 CAAAAGCTGGAGCTCCACCG
靶序列#18 TTCTAGAGCGGCCGCCACCG
靶序列#19 TAGAGCGGCCGCCACCGCGG
靶序列#20 CTAGAACTAGTGGATCCCCC
靶序列#21 ATTCCACACAACATACGAGC
靶序列#22 GGGATCCACTAGTTCTAGAG
靶序列#23 TCTAGAACTAGTGGATCCCC
靶序列#24 TAGTGGATCCCCCGGGCTGC
靶序列#25 CTGGAGCTCCACCGCGGTGG
针对pFlc-1载体的sgRNA的靶序列(5’->3’)：SEQ ID NO.58-66
靶序列#1 ATTATACGAAGTTATGGATC
靶序列#2 AAGTTATGCGGCCGCCACCG
靶序列#3 GCATACATTATACGAAGTTA
靶序列#4 GAATTCGAGCTCGGCCGATT
靶序列#5 AGTTATGGATCAGGCCAAAT
靶序列#6 GTATGCTATACGAAGTTATG
靶序列#7 TTGGAGCTCCACCGCGGTGG
靶序列#8 GAATTGGAGCTCCACCGCGG
靶序列#9 TTATGCGGCCGCCACCGCGG
针对所插入ORF方向为正向的pCR2.1载体的sgRNA的靶序列(5’->3’)：SEQ IDNO.67-96
靶序列#1 GGCTTTACACTTTATGCTTC
靶序列#2 CTTCCGGCTCGTATGTTGTG
靶序列#3 GAAGCATAAAGTGTAAAGCC
靶序列#4 AAGCATAAAGTGTAAAGCCT
靶序列#5 GCTCACTCATTAGGCACCCC
靶序列#6 AGCATAAAGTGTAAAGCCTG
靶序列#7 ATTCCACACAACATACGAGC
靶序列#8 GACCATGATTACGCCAAGCT
靶序列#9 GAGCTCGGATCCACTAGTAA
靶序列#10 ACACTGGCGGCCGTTACTAG
靶序列#11 TCCGAGCTCGGTACCAAGCT
靶序列#12 GCCAAGCTTGGTACCGAGCT
靶序列#13 TACCAAGCTTGGCGTAATCA
靶序列#14 GGAGAGGCGGTTTGCGTATT
靶序列#15 TGTGAGTTAGCTCACTCATT
靶序列#16 TAATGAATCGGCCAACGCGC
靶序列#17 AATGAATCGGCCAACGCGCG
靶序列#18 ATCGGCCAACGCGCGGGGAG
靶序列#19 AACCGCCTCTCCCCGCGCGT
靶序列#20 GGCCGATTCATTAATGCAGC
靶序列#21 TTAATGAATCGGCCAACGCG
靶序列#22 TCACTGCCCGCTTTCCAGTC
靶序列#23 CAGGTTTCCCGACTGGAAAG
靶序列#24 GGCACGACAGGTTTCCCGAC
靶序列#25 GGCCAACGCGCGGGGAGAGG
靶序列#26 GGGAGAGGCGGTTTGCGTAT
靶序列#27 CTCACTGCCCGCTTTCCAGT
靶序列#28 AGGTTTCCCGACTGGAAAGC
靶序列#29 AGCGGATAACAATTTCACAC
靶序列#30 ATGTTGTGTGGAATTGTGAG
针对所插入ORF方向为反向的pCR2.1载体的sgRNA的靶序列(5’->3’)：SEQ IDNO.97-137
靶序列#1 CGAATGGACGCGCCCTGTAG
靶序列#2 CGAAAGGGGGATGTGCTGCA
靶序列#3 GTGCTGCAAGGCGATTAAGT
靶序列#4 TGCTGCAAGGCGATTAAGTT
靶序列#5 CATTCAGGCTGCGCAACTGT
靶序列#6 AGGCTGCGCAACTGTTGGGA
靶序列#7 CTCTTCGCTATTACGCCAGC
靶序列#8 GCAGATATCCATCACACTGG
靶序列#9 ATTAAGCGCGGCGGGTGTGG
靶序列#10 CGATTAAGTTGGGTAACGCC
靶序列#11 GATTAAGTTGGGTAACGCCA
靶序列#12 GACTCACTATAGGGCGAATT
靶序列#13 CGCTCGAGCATGCATCTAGA
靶序列#14 CCGCTCGAGCATGCATCTAG
靶序列#15 TCGAGCGGCCGCCAGTGTGA
靶序列#16 CGACTCACTATAGGGCGAAT
靶序列#17 TTGTAATACGACTCACTATA
靶序列#18 GTCACGACGTTGTAAAACGA
靶序列#19 ATTGTAATACGACTCACTAT
靶序列#20 CAACAGTTGCGCAGCCTGAA
靶序列#21 GGCTGCGCAACTGTTGGGAA
靶序列#22 CGCGCTTAATGCGCCGCTAC
靶序列#23 CAACTGTTGGGAAGGGCGAT
靶序列#24 GCGCTTAATGCGCCGCTACA
靶序列#25 CGCATTAAGCGCGGCGGGTG
靶序列#26 CTGTAGCGGCGCATTAAGCG
靶序列#27 CAGCTGGCGTAATAGCGAAG
靶序列#28 AGCGGCGCATTAAGCGCGGC
靶序列#29 TTGGGAAGGGCGATCGGTGC
靶序列#30 TGCGCAGCCTGAATGGCGAA
靶序列#31 ATTCAGGCTGCGCAACTGTT
靶序列#32 GTTGGGAAGGGCGATCGGTG
靶序列#33 TAGCGGCGCATTAAGCGCGG
靶序列#34 CACATCCCCCTTTCGCCAGC
靶序列#35 TATTACGCCAGCTGGCGAAA
靶序列#36 TGAGTCGTATTACAATTCAC
靶序列#37 CGTCGTGACTGGGAAAACCC
靶序列#38 TTACGCCAGCTGGCGAAAGG
靶序列#39 ATTACGCCAGCTGGCGAAAG
靶序列#40 GGCGCGTCCATTCGCCATTC
靶序列#41 CTATTACGCCAGCTGGCGAA
针对pDNR-Dual载体的sgRNA的靶序列(5’->3’)：SEQ ID NO.138-175
靶序列#1 ATGGAAAAACGCCAGCAACG
靶序列#2 ACTCGCTGCGCTCGGTCGTT
靶序列#3 CGTCAGGGGGGCGGAGCCTA
靶序列#4 GCTCACTGACTCGCTGCGCT
靶序列#5 AAAATCGACGCTCAAGTCAG
靶序列#6 CAAAAGGCCAGCAAAAGGCC
靶序列#7 TGCGCTCGGTCGTTCGGCTG
靶序列#8 TCTGTAATACGACTCACTAT
靶序列#9 GCCTTACGCGTGTAAAACGA
靶序列#10 TGCGTTATCCCCTGATTCTG
靶序列#11 ACAGAATCAGGGGATAACGC
靶序列#12 CTGTAATACGACTCACTATA
靶序列#13 ACACGCGTAAGGCGGTAATA
靶序列#14 GCGCAGCGAGTCAGTGAGCG
靶序列#15 GCGCACGAGGGAGCTTCCAG
靶序列#16 AGCGCACGAGGGAGCTTCCA
靶序列#17 GAGCGCACGAGGGAGCTTCC
靶序列#18 CGGAACAGGAGAGCGCACGA
靶序列#19 CAGAGGTGGCGAAACCCGAC
靶序列#20 AGCTTCCAGGGGGAAACGCC
靶序列#21 GGTATCTTTATAGTCCTGTC
靶序列#22 TGGTATCTTTATAGTCCTGT
靶序列#23 GACAGGACTATAAAGATACC
靶序列#24 AGATACCAGGCGTTTCCCCC
靶序列#25 TCGGAACAGGAGAGCGCACG
靶序列#26 GTATGCTATACGAAGTTATG
靶序列#27 GAGTCGTATTACAGATCTAC
靶序列#28 AAAGGCCAGGAACCGTAAAA
靶序列#29 GTAAGCGGCAGGGTCGGAAC
靶序列#30 CGCACGAGGGAGCTTCCAGG
靶序列#31 ACGGTTATCCACAGAATCAG
靶序列#32 TACGGTTATCCACAGAATCA
靶序列#33 CGAGTCAGTGAGCGAGGAAG
靶序列#34 ATCGACGCTCAAGTCAGAGG
靶序列#35 GTGAGCAAAAGGCCAGCAAA
靶序列#36 TGTGATGCTCGTCAGGGGGG
靶序列#37 ATACGGTTATCCACAGAATC
靶序列#38 GGAAAGAACATGTGAGCAAA
(2)设计并构建模块化插入序列质粒。该模块化插入序列包含酵母UAS序列、果蝇Hsp70核心启动子序列、转基因果蝇筛选标记基因(mini-white)、用于把转基因定点插入到果蝇基因组特定attP位点的定点整合序列attB、与原cDNA或ORF质粒所不同种类的抗生素抗性基因序列。该模块化插入序列两端，与根据步骤(1)所设计的靶序列得到的sgRNA与Cas9切割文库原质粒所得线性化质粒末端序列重叠28-40bp(见图1)。将模块化插入序列从所述模块化插入序列质粒上切下，电泳分离后，回收模块化插入序列片段。
本发明的模块化插入序列包含
A、类酵母UAS序列：UAS,LexAop,QUAS,VAS
关于UAS序列的文献:Brand AH,Perrimon N.Targeted gene expression as ameans of altering cell fates and generating dominantphenotypes.Development.1993 Jun；118(2):401-15.
关于LexAop序列的文献:Lai SL,Lee T.Genetic mosaic with dual binarytranscriptional systems in Drosophila.Nature Neuroscience.2006 May；9(5):703-9.
关于QUAS序列的文献:Potter CJ,Tasic B,Russler EV,Liang L,Luo L.The Qsystem:a repressible binary system for transgene expression,lineage tracing,and mosaic analysis.Cell.2010 Apr；141(3):536-48.
关于VAS序列的文献:Toegel M,Azzam G,Lee EY,Knapp DJHF,Tan Y,Fa M,FulgaTA.A multiplexable TALE-based binary expression system for in vivo cellularinteraction studies.Nature Communications.2017 Nov；8(1):1663.
B、果蝇核心启动子序列：hsp70,DSCP
关于hsp70核心启动子(hsp70 core promoter,hsp70 minimal promoter,hsp70TATA box)序列的文献:Brand AH,Perrimon N.Targeted gene expression as a meansof altering cell fates and generating dominant phenotypes.Development.1993Jun；118(2):401-15.
关于DSCP(合成的果蝇核心启动子，Drosophila synthetic core promoter)序列的文献:Pfeiffer BD,Jenett A,Hammonds AS,Ngo TT,Misra S,Murphy C,Scully A,Carlson JW,Wan KH,Laverty TR,Mungall C,Svirskas R,Kadonaga JT,Doe CQ,EisenMB,Celniker SE,Rubin GM.Tools for neuroanatomy and neurogenetics inDrosophila.Proc Natl AcadSci U S A.2008Jul；105(28):9715-20.
C、转基因果蝇筛选标记基因：mini-white，vermilion
关于mini-white序列的文献:Brand AH,Perrimon N.Targeted gene expressionas a means of altering cell fates and generating dominantphenotypes.Development.1993 Jun；118(2):401-15.
关于vermilion序列的文献:Ni JQ,Markstein M,Binari R,Pfeiffer B,Liu LP,Villalta C,Booker M,Perkins L,Perrimon N.Vector and parameters for targetedtransgenic RNA interference in Drosophila melanogaster.Nat Methods.2008 Jan；5(1):49-51.
D、用于把转基因定点插入到果蝇基因组特定位点的定点整合序列：attB
关于attB序列的文献:Groth AC,Fish M,Nusse R,Calos MP.Construction oftransgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phagephiC31.Genetics.2004Apr；166(4):1775-82.
E、与原cDNA或ORF质粒所不同的抗生素抗性基因序列:
氨苄青霉素抗性基因(ampicillin resistance gene)GenBank AccessionNumber:KC844055
氯霉素抗性基因(chloramphenicol resistance gene)GenBank AccessionNumber:NC_005923 REGION:complement(2136..2795)
卡那霉素抗性基因(kanamycin resistance gene)GenBank Accession Number:NC_022333 REGION:complement(92991..93785)
壮观霉素抗性基因(spectinomycin resistance gene)GenBank AccessionNumber:NC_014476
四环素抗性基因(tetracycline resistance gene,TcR)编码区核苷酸序列：
参见Addgene质粒pHD7,网址http://www.addgene.org/browse/sequence/14254
庆大霉素抗性基因(gentamycin resistance gene)GenBank Accession Number:
KY977452
博莱霉素抗性基因(bleomycin resistance gene)GenBank Accession Number:L36850 REGION:5896..6270
链霉素抗性基因(streptomycin resistance gene,SmR)编码区核苷酸序列:
参见Addgene质粒pAN4037,网址http://www.addgene.org/74703/
潮霉素抗性基因(hygromycin resistance gene)编码区核苷酸序列:
参见Addgene质粒pNAHA,网址http://www.addgene.org/44169/
(3)根据步骤(1)确定的靶序列设计PCR引物，然后通过PCR反应制备可用于体外转录sgRNA的模板。体外转录反应体系如下：
0.5ng PCR反应模板：pX330(购自Addgene，plasmid 42230)
0.5μM正向引物*
0.5μM反向引物(5’->3’)AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTT SEQ ID NO.264
50μL 2X Q5Hot-start High-Fidelity Master Mix(NEB，M0494s)
加双蒸水至总体积100μL
正向引物(PAGE纯化)的序列(5’->3’):TAATACGACTCACTATAGG(N)20GTTTTAGAGCTAGAAATAG SEQ ID NO.265，其中(N)20代表含有20个核苷酸的靶序列，如果靶序列起始是GG，则去掉(N)20前面的GG；如果靶序列是GN，则去掉(N)20前面的一个G；如果靶序列起始是NN，则不需要去掉GG。
PCR反应程序：
PCR产物用琼脂糖凝胶电泳分离，再用QIAquick Gel Extraction Kit(购自Qiagen，货号28704)进行回收。回收的DNA片段可用于体外转录制备sgRNA。
(4)用步骤(3)制备的DNA片段作为模板，进行体外转录制备sgRNA。
体外转录试剂盒HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit购自NewEngland Biolabs(货号E2050S)。体外转录反应体系如下：
330ng sgRNA模板
3.3μL NTP Buffer Mix
0.67μL T7 RNA Polymerae Mix
加DEPC处理过的双蒸水至总体积10μL
37℃4小时
(5)利用Cas9和步骤(4)制备的相应质粒sgRNA来切割果蝇DGRC Gold Collection文库质粒。
切割反应体系如下：
20ng与切割质粒对应的sgRNA
0.4μL Cas9(购自GenScript,货号Z03386-50)
0.015 pmol质粒
0.6μL 10X Cas9 Buffer
补加DEPC处理过的双蒸水至反应总体积6μL。
切割反应在37℃进行1小时。
(6)用Gibson assembly方法将骤(2)制备的含有UAS等元件的模块插入被Cas9切开的果蝇DGRC Gold Collection文库质粒中cDNA或ORF的5’端上游载体序列。
Gibson assembly反应体系如下：
0.2μL含有UAS等元件的模块(22.5ng/μL)
2μL第3步中被Cas9切开的果蝇DGRC Gold Collection文库质粒
2μL 
HiFi DNA Assembly Master Mix(购自New England Biolabs，货号E2621X)
反应总体积为4.2μL，反应在50℃进行1小时。
(7)取步骤(6)反应产物1μL，转化10μL感受态大肠杆菌(购自北京全式金生物技术有限公司，货号CD101-01)。转化产物涂在含有氨苄青霉素和氯霉素的LB平板上，37℃培养过夜。挑取任意一个克隆鉴定。应用本方法所获UAS-cDNA/ORF克隆阳性率接近100％。代表性鉴定结果(见图2A和图2B)。
(8)本方法所构建的质粒可用于胚胎注射，进而构建UAS-cDNA/ORF转基因果蝇。
用果蝇DGRC Gold Collection文库质粒中六种载体，每种载体选取一个代表性基因，运用本发明方法构建相应的UAS-cDNA/ORF质粒，进而制备转基因果蝇。用这些转基因果蝇分别与OK6-GAL4和GMR-GAL4果蝇进行交配，即分别得到在三龄幼虫运动神经元表达该基因的三龄幼虫和在成体果蝇眼睛中过表达该基因的成体果蝇，免疫荧光(见图3A第2-7行)和Western blot(见图3C)实验已证明基因表达。利用本发明针对果蝇DGRC GoldCollection文库中31个去泛素化酶基因质粒和CG13296基因质粒构建了相应的32个UAS-cDNA/ORF质粒，并用这些质粒注射果蝇胚胎得到了32个UAS-cDNA/ORF转基因果蝇品系。利用本实施例中32个转基因果蝇品系，与常用的在果蝇眼睛中特异过表达基因的GMR-GAL4品系进行交配，得到在眼睛中特异过表达相应基因的果蝇，其中三个基因过表达导致了眼睛退化(见图4A)，表明Usp10、CG4751和DUBAI在果蝇眼睛发育中起重要作用。利用本实施例中32个转基因果蝇品系，与常用的在果蝇翅膀中特异过表达基因的A9-GAL4品系进行交配，得到在翅膀中特异过表达相应基因的果蝇，其中三个基因过表达导致了翅膀脉络形态异常，两个基因过表达导致果蝇死亡(见图4B)，表明USP15-31、not、USP16-45、DUBAI和USP30在果蝇翅膀发育中起重要的作用。利用本实施例中32个转基因果蝇品系，与常用的在果蝇三龄幼虫肌肉中特异过表达基因的MEF2-GAL4品系进行交配，得到在三龄幼虫肌肉中特异过表达相应基因的果蝇幼虫，其中三个基因过表达导致了肌肉形态异常，一个基因过表达导致果蝇死亡(见图4C)，表明CG4711、USP14、Uch、USP15-31、USP30、Rpn11、Usp5、CYLD和DUBAI在果蝇肌肉发育中起重要作用。
实施例2、利用已有人OHS6087
CCSB Lentiviral Expression Library文库质粒
构建UAS-ORF转基因果蝇文库质粒
本实施例涉及利用已有人OHS6087 CCSB Lentiviral Expression Library文库质粒构建UAS-ORF转基因果蝇文库质粒的方法，具体包括如下步骤：
(1)人OHS6087 CCSB Lentiviral Expression Library共有大约16000个质粒，克隆在pLX304-Blast-V5载体上。本应用针对这种质粒ORF的5’上游载体2个特定适宜公共位点A和B，针对这两个切点分别设计并构建了2种sgRNA转录模板，分别用于转录切割质粒所需sgRNA。利用Cas9及这两种sgRNA切割人OHS6087 CCSB Lentiviral Expression Library质粒，该操作的目的是使质粒变小，并弃去原质粒上对构建UAS-cDNA/ORF质粒不必须的CMV启动子等序列,并使其线性化。
针对pLX304-Blast-V5载体切点A，可供选择的sgRNA的靶序列(5’->3’)：SEQ IDNO.176-183
靶序列#1 GAGCTCTCTGGCTAACTGTC
靶序列#2 AAATGGGCGGTAGGCGTGTA
靶序列#3 GGGCGGTAGGCGTGTACGGT
靶序列#4 TGGGCGGTAGGCGTGTACGG
靶序列#5 AGAGCTCTCTGGCTAACTGT
靶序列#6 CGGTAGGCGTGTACGGTGGG
靶序列#7 TCTATATAAGCAGAGCTCTC
靶序列#8 ACAAGTTTGTACAAAAAAGT
针对pLX304-Blast-V5载体切点B，可供选择的sgRNA的靶序列(5’->3’)：SEQ IDNO.184-219
靶序列#1 GGAGAGGCGGTTTGCGTATT
靶序列#2 AACCGCCTCTCCCCGCGCGT
靶序列#3 GCGCAGCGAGTCAGTGAGCG
靶序列#4 GCTCACTGACTCGCTGCGCT
靶序列#5 GGCACGACAGGTTTCCCGAC
靶序列#6 ATCGGCCAACGCGCGGGGAG
靶序列#7 AATGAATCGGCCAACGCGCG
靶序列#8 CAGGTTTCCCGACTGGAAAG
靶序列#9 GGCCGATTCATTAATGCAGC
靶序列#10 TTAATGAATCGGCCAACGCG
靶序列#11 TAATGAATCGGCCAACGCGC
靶序列#12 TGCGCTCGGTCGTTCGGCTG
靶序列#13 ACTCGCTGCGCTCGGTCGTT
靶序列#14 GCTCACTCATTAGGCACCCC
靶序列#15 TGTGAGTTAGCTCACTCATT
靶序列#16 TCACTGCCCGCTTTCCAGTC
靶序列#17 TGCGTTATCCCCTGATTCTG
靶序列#18 CTCACTCAAAGGCGGTAATA
靶序列#19 AGCGGTATCAGCTCACTCAA
靶序列#20 CAAAAGGCCAGCAAAAGGCC
靶序列#21 ACAGAATCAGGGGATAACGC
靶序列#22 AGGTTTCCCGACTGGAAAGC
靶序列#23 TACGGTTATCCACAGAATCA
靶序列#24 AAAGGCCAGGAACCGTAAAA
靶序列#25 GGTATCAGCTCACTCAAAGG
靶序列#26 CTCACTGCCCGCTTTCCAGT
靶序列#27 GGGAGAGGCGGTTTGCGTAT
靶序列#28 GGCCAACGCGCGGGGAGAGG
靶序列#29 ACGGTTATCCACAGAATCAG
靶序列#30 CGAGTCAGTGAGCGAGGAAG
靶序列#31 ATACGGTTATCCACAGAATC
靶序列#32 TGCCAGCTGCATTAATGAAT
靶序列#33 GTGAGCAAAAGGCCAGCAAA
靶序列#34 ATTAATGCAGCTGGCACGAC
靶序列#35 GGTCGTTCGGCTGCGGCGAG
靶序列#36 GGAAAGAACATGTGAGCAAA
(2)设计并构建模块化插入序列质粒。该模块化插入序列包含酵母UAS序列、果蝇Hsp70核心启动子序列、转基因果蝇筛选标记基因(mini-white)、用于把转基因定点插入到果蝇基因组特定位点的定点整合序列、原cDNA或ORF质粒所不含的氯霉素抗性基因序列，该模块化插入序列两端，与根据步骤(1)所设计的靶序列得到的sgRNA与Cas9切割文库原质粒所得线性化质粒末端序列重叠35-40bp(见图1)。将模块化插入序列从质粒上切下，电泳分离后，回收模块化插入序列片段。详见实例1步骤2。
(3)根据步骤(1)确定的靶序列设计PCR引物，然后通过PCR反应制备可用于体外转录sgRNA的模板。详见实例1步骤3。
(4)用步骤(3)制备的DNA片段作为模板，进行体外转录制备sgRNA。详见实例1步骤4。
(5)利用Cas9和步骤(4)制备的相应质粒sgRNA来切割人OHS6087 CCSBLentiviral Expression Library文库质粒。切割反应体系如下：
20ng与质粒pLX304-Blast-V5载体切点A对应的sgRNA
20ng与质粒pLX304-Blast-V5载体切点B对应的sgRNA
0.4μL Cas9(购自GenScript,货号Z03386-50)
0.015 pmol质粒
0.6μL 10X Cas9 Buffer
补加DEPC处理过的双蒸水至反应总体积6μL。
切割反应在37℃进行1小时。
(6)用Gibson assembly方法将骤(2)制备的含有UAS等元件的模块插入被Cas9切开的人OHS6087 CCSB Lentiviral Expression Library文库质粒中cDNA或ORF的5’端上游载体序列。详见实例1步骤6。
(7)取步骤(6)反应产物1μL，转化10μL感受态大肠杆菌(购自北京全式金生物技术有限公司，货号CD101-01)。转化产物涂在含有氨苄青霉素和氯霉素的LB平板上，37℃培养过夜。挑取任意一个克隆鉴定。应用本方法所获UAS-cDNA/ORF克隆阳性率接近100％。代表性鉴定结果(见图2C样品1-6)。
(8)本方法所构建的质粒可用于果蝇胚胎注射，进而构建人源基因UAS-ORF转基因果蝇。
从人OHS6087 CCSB Lentiviral Expression Library文库质粒中，选取一个USP8基因，运用本发明方法构建相应的UAS-ORF质粒，进而制备转基因果蝇。用这个转基因果蝇品系分别与OK6-GAL4和GMR-GAL4果蝇进行交配，即分别得到在三龄幼虫运动神经元表达该基因的三龄幼虫和在成体果蝇眼睛中过表达该基因的成体果蝇，免疫荧光(见图3B)和Western blot(见图3D)实验已证明基因表达。利用本发明针对人OHS6087 CCSBLentiviralExpression Library文库中6个去泛素化酶基因质粒构建了相应的6个UAS-ORF质粒，并用这些质粒注射果蝇胚胎得到了6个UAS-ORF转基因果蝇品系。利用本实施例中6个转基因果蝇品系，与常用的在果蝇眼睛中特异过表达基因的GMR-GAL4品系进行交配，得到在眼睛中特异过表达相应基因的果蝇，这些果蝇眼睛外在形态未见明显异常，本实验可用来探讨这些基因在果蝇眼睛发育中的作用。利用本实施例中6个转基因果蝇品系，与常用的在果蝇翅膀中特异过表达基因的A9-GAL4品系进行交配，得到在翅膀中特异过表达相应基因的果蝇，其中USP54基因过表达导致了翅膀脉络形态异常(见图4B)，表明USP54在果蝇翅膀发育中起重要的作用。利用本实施例中6个转基因果蝇品系，与常用的在果蝇三龄幼虫肌肉中特异过表达基因的MEF2-GAL4品系进行交配，得到在三龄幼虫肌肉中特异过表达相应基因的果蝇幼虫，这些幼虫肌肉形态未见明显异常，本实验可用来探讨这些基因在果蝇肌肉发育中的作用。
实施例3、利用已有小鼠Mouse MGC Collection文库质粒构建UAS-cDNA/ORF转基
因果蝇文库质粒
本实施例涉及利用已有小鼠Mouse MGC Collection文库质粒构建UAS-cDNA/ORF转基因果蝇文库质粒的方法，包括如下步骤：
(1)Mouse MGC Collection共大约20000个cDNA或ORF质粒，克隆在9种载体质粒上。本发明挑选了其中1种基于pCMV-SPORT6载体的含有氨苄青霉素抗性基因的质粒，针对这种质粒ORF的5’上游载体2个特定适宜公共位点A和B，针对这两个切点分别设计并构建了2种sgRNA转录模板，分别用于转录切割质粒所需sgRNA。利用CRISPR/Cas9和sgRNA切割pCMV-SPORT6载体中cDNA或ORF上游邻近的载体序列，使其线性化。
针对pCMV-SPORT6载体切点A，可供选择的sgRNA的靶序列(5’->3’)：SEQ IDNO.220-246
靶序列#1 CGGACTCTAGCCTAGGCCGC
靶序列#2 CCGGACTCTAGCCTAGGCCG
靶序列#3 CGGCCTAGGCTAGAGTCCGG
靶序列#4 TAGTGAACCGTCAGATCGCC
靶序列#5 CTCTAGCCTAGGCCGCGGGA
靶序列#6 TGTTATCCGTCCCGCGGCCT
靶序列#7 TGTCACCTAAATAGGCCTAA
靶序列#8 TATGACCATTAGGCCTATTT
靶序列#9 AGGAAACAGCTATGACCATT
靶序列#10 TGAAATTGTTATCCGTCCCG
靶序列#11 CTAGAGTCCGGAGGCTGGAT
靶序列#12 CAGCCTCCGGACTCTAGCCT
靶序列#13 TTGACCTCCATAGAAGACAC
靶序列#14 ACAGCGTGGATGGCGTCTCC
靶序列#15 GGCGTCTCCAGGCGATCTGA
靶序列#16 ATCGGTCCCGGTGTCTTCTA
靶序列#17 TCCGGAGGCTGGATCGGTCC
靶序列#18 ACCGGGACCGATCCAGCCTC
靶序列#19 GGAGGTCAAAACAGCGTGGA
靶序列#20 TTCTATAGTGTCACCTAAAT
靶序列#21 CTATGGAGGTCAAAACAGCG
靶序列#22 GACGGATAACAATTTCACAC
靶序列#23 TGACCTCCATAGAAGACACC
靶序列#24 CTAGGCTAGAGTCCGGAGGC
靶序列#25 GTTTGTACAAAAAAGCAGGC
靶序列#26 GGTCCCGGTGTCTTCTATGG
靶序列#27 ACAAGTTTGTACAAAAAAGC
针对pCMV-SPORT6载体切点B，可供选择的sgRNA的靶序列(5’->3’)：SEQ IDNO.247-263
靶序列#1 ACTCGCTGCGCTCGGTCGTT
靶序列#2 TGCGCTCGGTCGTTCGGCTG
靶序列#3 GCTCACTGACTCGCTGCGCT
靶序列#4 GCGCAGCGAGTCAGTGAGCG
靶序列#5 GGAGAGGCGGTTTGCGTATT
靶序列#6 CTCACTCAAAGGCGGTAATA
靶序列#7 AGCGGTATCAGCTCACTCAA
靶序列#8 TGCGTTATCCCCTGATTCTG
靶序列#9 ACAGAATCAGGGGATAACGC
靶序列#10 GGGAGAGGCGGTTTGCGTAT
靶序列#11 ACGGTTATCCACAGAATCAG
靶序列#12 TACGGTTATCCACAGAATCA
靶序列#13 GGTATCAGCTCACTCAAAGG
靶序列#14 CGAGTCAGTGAGCGAGGAAG
靶序列#15 ATACGGTTATCCACAGAATC
靶序列#16 GGAAAGAACATGTGAGCAAA
靶序列#17 GGTCGTTCGGCTGCGGCGAG
(2)设计并构建模块化插入序列质粒。该模块化插入序列包含酵母UAS序列、果蝇Hsp70核心启动子序列、转基因果蝇筛选标记基因(mini-white)、用于把转基因定点插入到果蝇基因组特定位点的定点整合序列、原cDNA或ORF质粒所不含的氯霉素抗性基因序列，该模块化插入序列两端，与步骤(1)所得线性化质粒末端序列重叠40bp(见图1)。将模块化插入序列从质粒上切下，电泳分离后，回收模块化插入序列片段。详见实例1步骤2。
(3)根据步骤(1)确定的靶序列设计PCR引物，然后通过PCR反应制备可用于体外转录sgRNA的模板。详见实例1步骤3。
(4)用步骤(3)制备的DNA片段作为模板，进行体外转录制备sgRNA。详见实例1步骤4。
(5)利用Cas9和步骤(4)制备的相应质粒sgRNA来切割小鼠Mouse MGC Collection文库质粒。详见实例2步骤5。
(6)用Gibson assembly方法将骤(2)制备的含有UAS等元件的模块插入被Cas9切开的Mouse MGC Collection文库质粒中cDNA或ORF的5’端上游载体序列。详见实例1步骤6。
(7)取步骤(6)反应产物1μL，转化10μL感受态大肠杆菌(购自北京全式金生物技术有限公司，货号CD101-01)。转化产物涂在含有氨苄青霉素和氯霉素的LB平板上，37℃培养过夜。挑取任意一个克隆鉴定。应用本方法所获UAS-cDNA/ORF克隆阳性率接近100％。鉴定结果见图2C样品7。
(8)本方法所构建的质粒可用于果蝇胚胎注射，进而构建鼠源基因UAS-cDNA/ORF转基因果蝇。
应用本方法，已成功构建去泛素化酶Ctbp2的UAS-cDNA/ORF转基因果蝇，免疫荧光(见图3A最后一行)和Western blot(见图3E)实验已证明基因表达。
(9)本方法所构建的质粒可用于果蝇胚胎注射，进而构建鼠源基因UAS-cDNA/ORF转基因果蝇。
从Mouse MGC Collection文库质粒中，选取一个Ctbp2基因，运用本发明方法构建相应的UAS-cDNA/ORF质粒，进而制备转基因果蝇。用这个转基因果蝇品系分别与OK6-GAL4和GMR-GAL4果蝇进行交配，即分别得到在三龄幼虫运动神经元表达该基因的三龄幼虫和在成体果蝇眼睛中过表达该基因的成体果蝇，免疫荧光((见图3A最后一行)和Western blot(见图3E)实验已证明基因表达。利用本发明针对Mouse MGC Collection文库1个去泛素化酶基因质粒构建了相应的1个UAS-ORF质粒，并用这些质粒注射果蝇胚胎得到了1个UAS-ORF转基因果蝇品系。利用本实施例中1个转基因果蝇品系，与常用的在果蝇眼睛中特异过表达基因的GMR-GAL4品系进行交配，得到在眼睛中特异过表达相应基因的果蝇，这些果蝇眼睛外在形态未见明显异常，本实验可用来探讨这些基因在果蝇眼睛发育中的作用。利用本实施例中1个转基因果蝇品系，与常用的在果蝇翅膀中特异过表达基因的A9-GAL4品系进行交配，得到在翅膀中特异过表达相应基因的果蝇，其中Ctbp2基因过表达导致了翅膀脉络形态异常(见图4B)，表明Ctbp2在果蝇翅膀发育中起重要的作用。利用本实施例中1个转基因果蝇品系，与常用的在果蝇三龄幼虫肌肉中特异过表达基因的MEF2-GAL4品系进行交配，得到在三龄幼虫肌肉中特异过表达相应基因的果蝇幼虫，这些幼虫肌肉形态未见明显异常，本实验可用来探讨这些基因在果蝇肌肉发育中的作用。
进一步的，为了彰显本发明方法在构建基因组规模质粒文库方面的优势，我们以利用已有果蝇DGRC Gold Collection文库质粒构建UAS-cDNA/ORF质粒文库为例，将本发明方法与传统克隆技术以及重组克隆技术(Gateway)进行了比较，如下表：
以利用果蝇DGRC Gold Collection文库质粒构建UAS-cDNA/ORF质粒文库(共12192个质粒)为例，对比本发明方法与现有技术
以上所述为本发明的3个应用实例。但本发明不应局限于该实施例所公开的内容。所以，凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改，都落入本发明的保护范围。
序列表
<110> 王纪武
<120> 一种用模块化设计构建双系统表达质粒文库的方法
<141> 2019-02-11
<160> 265
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acgactcact atagggagac 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aattaatacg actcactata 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cattaggcgg gttaaattcc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggcgatgata tcagatctgc 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atgaatcggc tgcagtaccc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aatgaatcgg ctgcagtacc 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aaaaagcccg ctcattaggc 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cgtattaatt tcgataagcc 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gttaacctgc attaatgaat 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ttcattaatg caggttaacc 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
attaggcggg ttaaattccc 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
aaattaatac gactcactat 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tgcagccgat tcattaatgc 20
<210> 14
<211> 20
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n 120
gttttagagc tagaaatag 41
Claims (10)
1.一种用模块化设计构建双系统表达质粒文库的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1、利用CRISPR/Cas9技术切割已有cDNA或ORF质粒文库的质粒cDNA或ORF的5’端上游的载体序列，使其线性化，得到原质粒文库的线性化质粒；
S2、设计并构建模块化插入序列质粒，该模块化插入序列包含类酵母UAS序列、果蝇核心启动子序列、转基因果蝇筛选标记基因、用于把转基因定点插入到果蝇基因组特定位点的定点整合序列、与原cDNA或ORF质粒所不同的抗生素抗性基因序列；该模块化插入序列两端与步骤S1的原质粒文库的线性化质粒末端序列重叠；将模块化插入序列从所述模块化插入序列质粒上切下，电泳分离回收，得到模块化插入序列片段；
S3、运用无缝克隆技术将步骤S2回收的模块化插入序列片段与步骤S1的原质粒文库的线性化质粒连接，然后转化大肠杆菌，在同时含有模块化插入序列抗性和原质粒文库的质粒抗性的对应的抗生素的LB固体平板上培养，再从平板上挑取克隆后过夜培养，提取质粒并鉴定即得到类UAS-cDNA/ORF文库质粒。
2.根据权利要求1所述的用模块化设计构建双系统表达质粒文库的方法，其特征在于，步骤S1中，所述已有cDNA或ORF质粒文库的质粒选自果蝇DGRC(Drosophila GenomicsResource Center)Gold Collection文库质粒、人OHS6087 CCSB Lentiviral ExpressionLibrary文库质粒或小鼠Mouse MGC Collection文库质粒。
3.根据权利要求1所述的用模块化设计构建双系统表达质粒文库的方法，其特征在于，步骤S1中，所述已有的cDNA或ORF质粒文库质粒的载体包括pOT2、pFLC-I、pBS SK-、pOTB7、pOTB7_DraIII、pCR2.1、pDNR-Dual、pLX304-Blast-V5、pCMV-SPORT6、pSPORT1中的一种或几种。
4.根据权利要求1所述的用模块化设计构建双系统表达质粒文库的方法，其特征在于，步骤S1中，具体为使用CRISPR/Cas9技术切割质粒，包括针对已有cDNA或ORF质粒文库的质粒cDNA或ORF的5’端上游的载体序列，设计多个Cas9的靶序列；所述Cas9的靶序列及其对应载体包括：序列如SEQ ID NO.1-18所示的针对pOT2载体的sgRNA的靶序列，序列如SEQ IDNO.19-32所示的针对pOTB7和pOTB7_DraIII载体的sgRNA的靶序列，序列如SEQ ID NO.33-57所示的针对pBS SK-载体的sgRNA的靶序列，序列如SEQ ID NO.58-66所示的针对pFlc-1载体的sgRNA的靶序列，序列如SEQ ID NO.67-96、SEQ ID NO.97-137所示的针对pCR2.1载体的sgRNA的靶序列，序列如SEQ ID NO.138-175所示的针对pDNR-Dual载体的sgRNA的靶序列,序列如SEQ ID NO.176-183所示的针对pLX304-Blast-V5载体切点A的sgRNA的靶序列,序列如SEQ ID NO.184-219所示的针对pLX304-Blast-V5载体切点B的sgRNA的靶序列,序列如SEQ ID NO.220-246所示的针对pCMV-SPORT6载体切点A的sgRNA的靶序列,序列如SEQ IDNO.247-263所示的针对pCMV-SPORT6载体切点B的sgRNA的靶序列。
5.根据权利要求1所述的用模块化设计构建双系统表达质粒文库的方法，其特征在于，步骤S2中，所述类酵母UAS序列包括UAS、LexAop、QUAS或VAS序列。
6.根据权利要求1所述的用模块化设计构建双系统表达质粒文库的方法，其特征在于，步骤S2中，所述果蝇核心启动子序列包括Hsp70核心启动子和DSCP核心启动子；所述转基因果蝇筛选标记基因包括mini-white或vermilion；所述用于把转基因定点插入到果蝇基因组特定位点的定点整合序列为用于把转基因定点插入到果蝇基因组attP位点的定点整合序列attB。
7.根据权利要求1所述的用模块化设计构建双系统表达质粒文库的方法，其特征在于，步骤S2中，所述与原cDNA或ORF质粒所不同的抗生素抗性基因序列包括氨苄青霉素抗性基因序列、氯霉素抗性基因序列、卡那霉素抗性基因序列、壮观霉素抗性基因序列、四环素抗性基因、庆大霉素抗性基因、博莱霉素抗性基因、链霉素抗性基因、潮霉素抗性基因。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的用模块化设计构建双系统表达质粒文库的方法，其特征在于，步骤S2中，所述果蝇核心启动子序列位于模块化插入序列的3’端，所述类酵母UAS序列位于果蝇核心启动子序列的5’端且紧邻果蝇核心启动子序列；转基因果蝇筛选标记基因、用于把转基因定点插入到果蝇基因组特定位点的定点整合序列、与原cDNA或ORF质粒所不同的抗生素抗性基因序列排列顺序可互换的地位于类酵母UAS序列的5’端。
9.根据权利要求1所述的用模块化设计构建双系统表达质粒文库的方法，其特征在于，步骤S1中，所述双系统表达质粒文库中的双系统包括GAL4-UAS系统、Q系统、LexA-LexAop系统和TALE-VAS系统。
10.根据权利要求1所述的用模块化设计构建双系统表达质粒文库的方法，其特征在于，步骤S3中，所述无缝克隆技术包括Gibson Assembly、In-Fusion、Red/ETRecombination、SLIC(Sequence and Ligation-Independent Cloning)、SLiCE(SeamlessLigation Cloning Extract)、SHA(Successive Hybridization Assembling)。
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