CN108205614A - 一种全基因组sgRNA文库的构建系统及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种全基因组sgRNA文库的构建系统及其应用，所述系统包括输入模块、sgRNA设计模块和sgRNA过滤模块，通过构建系统的三大模块，优化模块内细节及流程，采用多种设计标准及筛选原则，最终构建得到全基因组sgRNA文库，所述系统及方法简洁高效，得到的文库质量高，活性好，便于应用在基因编辑研究中。

Description

一种全基因组sgRNA文库的构建系统及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种全基因组sgRNA文库的构建系统及其应用。
背景技术
CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)，被称为规律成簇间隔短回文重复，实际上就是一种基因编辑器，是细菌用以保护自身对抗病毒的一个系统，也是一种对付攻击者的基因武器。后来，研究人员发现，它似乎是一种精确的万能基因武器，可以用来删除、添加、激活或抑制其他生物体的目标基因，这些目标基因包括人、老鼠、斑马鱼、细菌、果蝇、酵母、线虫和农作物细胞内的基因，这也意味着基因编辑器是一种可以广泛使用的生物技术，CRISPR基因编辑器的工作过程图如图1所示。
CRISPR簇是一个广泛存在于细菌和古生菌基因组中的特殊DNA重复序列家族，其序列由一个前导区(Leader)、多个短而高度保守的重复序列区(Repeat)和多个间隔区(Spacer)组成。前导区一般位于CRISPR簇上游，是富含AT长度为300～500bp的区域，被认为可能是CRISPR簇的启动子序列。重复序列区长度为21～48bp，含有回文序列，可形成发卡结构。重复序列之间被长度为26～72bp的间隔区隔开。Spacer区域由俘获的外源DNA组成，类似免疫记忆，当含有同样序列的外源DNA入侵时，可被细菌机体识别，并进行剪切使之表达沉默，达到保护自身安全的目的。
通过对CRISPR簇的侧翼序列分析发现，在其附近存在一个多态性家族基因。该家族编码的蛋白质均含有可与核酸发生作用的功能域(具有核酸酶、解旋酶、整合酶和聚合酶等活性)，并且与CRISPR区域共同发挥作用，因此被命名为CRISPR关联基因(CRISPRassociated)，缩写为Cas。目前发现的Cas包括Cas1～Cas10等多种类型。Cas基因与CRISPR共同进化，共同构成一个高度保守的系统，CRISPR簇的系统结构图如图2所示。
当细菌抵御噬菌体等外源DNA入侵时，在前导区的调控下，CRISPR被转录为长的RNA前体(Pre RISPR RNA，pre-crRNA)，然后加工成一系列短的含有保守重复序列和间隔区的成熟crRNA，最终识别并结合到与其互补的外源DNA序列上发挥剪切作用。
目前发现的CRISPR/Cas系统有三种不同类型即I型、II型和III型，它们存在于大约40％已测序的真细菌和90％已测序的古细菌中。其中II型的组成较为简单，以Cas9蛋白以及向导RNA(gRNA)为核心组成，也是目前研究中最深入的类型。
在II型系统中pre-crRNA的加工由Cas家族中的Cas9单独参与，Cas9含有在氨基末端的RuvC和蛋白质中部的HNH2个独特的活性位点，在crRNA成熟和双链DNA剪切中发挥作用。此外，pre-crRNA转录的同时，与其重复序列互补的反式激活crRNA(Trans-activatingcrRNA，tracrRNA)也转录出来，并且激发Cas9和双链RNA特异性RNase III核酸酶对pre-crRNA进行加工。加工成熟后，crRNA、tracrRNA和Cas9组成复合体，识别并结合于crRNA互补的序列，然后解开DNA双链，形成R-loop，使crRNA与互补链杂交，另一条链保持游离的单链状态，然后由Cas9中的HNH活性位点剪切crRNA的互补DNA链，RuvC活性位点剪切非互补链，最终引入DNA双链断裂(DSB)。CRISPR/Cas9的剪切位点位于crRNA互补序列下游邻近的PAM区(Protospacer Adjacent Motif)的5'-GG-N18-NGG-3'特征区域中的NGG位点，而这种特征的序列在每128bp的随机DNA序列中就重复出现一次。研究结果表明，Cas9还可以剪切线性和超螺旋的质粒，其剪切效率堪比限制性内切酶。由于crRNA参与并且起到精确导向的作用，所以CRISPR/Cas9打靶系统也被称为RNA导向(RNA guided)打靶系统，打把系统的原理图如图3所示。
基于CRISPR/Cas9-sgRNA的DNA编辑系统已经发展成基因编辑的一个有效工具。CRISPR/Cas9-sgRNA系统包含两个主要组分—Cas9蛋白和sgRNA。sgRNA决定了基因编辑的位点和基因编辑的效率。研究已经表明，不同的sgRNA有不同的编辑效率。在动物和人类中通过高通量比较分析sgRNA的效率，研究人员已经获得了高效sgRNA的参数。
CN106845151A公开一种CRISPR-Cas9系统sgRNA作用靶点的筛选方法，包括：(1)利用已公布物种的全基因组序列及基因注释信息，获取基因组中具有5’-Nx-NGG-3’序列的区段(x为19～22之间的整数，N代表A/T/C/G)，作为CRISPR-Cas9系统sgRNA的候选靶点；(2)将基因组打断成22～25bp的片段并筛选以NGG结尾的，且在基因组上无重复的序列；(3)将步骤(1)的候选靶点序列与步骤(2)中筛到的序列进行比对，根据错配信息及评选公式对相应的优选序列进行筛选及排序，获取最优的全基因组sgRNA作用靶点集合。CN105886616A公开了一种用于猪基因编辑的高效特异性sgRNA识别位点引导序列及其筛选方法，所述筛选方法包括步骤：功能基因筛选及ORF分析、功能基因sgRNA识别位点引导序列预测、全基因组脱靶位点检测、依据脱靶信息与靶位点位置对预测的靶位点打分，排序、结果筛选与统计、算法优化与软件开发。本发明的猪的特异性sgRNA识别位点引导序列经过了严格的筛选与检验，包含所有猪蛋白编码基因的用于CRISPR-Cas9基因编辑的sgRNA识别位点引导序列。但上述现有技术的构建步骤繁琐，优化筛选标准落后，得到的sgRNA质量不高。
但是，由于低质量sgRNA直接浪费科研人员的时间和金钱，因此选择高效率的sgRNA是避免该结果发生的一个有效途径。目前，尽管已经有一些sgRNA设计软件，但是这些软件大多都是逐个基因设计sgRNA，缺乏定制全基因组sgRNA文库设计的生物信息学工作流程。因此，提供一种全基因组定制sgRNA文库构建系统，得到高质量的全基因组sgRNA，具有重要的科研价值和应用前景。
发明内容
针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种全基因组sgRNA文库的构建系统及其应用，通过构建系统的三大模块，优化模块内细节及流程，采用多种设计标准及筛选原则，最终构建得到全基因组sgRNA文库，所述系统及方法简洁高效，得到的文库质量高，活性好，便于应用在基因编辑研究中。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
一方面，本发明提供一种sgRNA文库的构建系统，所述系统包括如下模块：
(1)输入模块：从数据库中下载基因组序列和注释文件，提取CDS序列作为输入靶序列；
该模块用来为sgRNA设计模块准备输入数据。首先，从Ensembl或NCBI下载基因组序列和注释文件；然后，通过分析注释文件获取每个基因CDS区域的位置信息；最后，根据每个基因CDS区域的位置信息从基因组序列文件中提取所有基因的CDS序列，保存到fasta文件中，作为sgRNA设计模块的输入靶序列；
(2)sgRNA设计模块：在靶序列的正义链和反义链上根据参数设定选择候选sgRNA，并进行全基因组序列比对，根据指定允许的错配数进行脱靶率评估并分级，其中，在正义链上选择20nt+NGG作为候选sgRNA，在反义链上选择GGN+20nt作为候选sgRNA；
该模块在所有基因的CDS序列上设计sgRNA，流程如下：1.根据PAM序列、序列长度、GC含量、单或双链模式等参数设定，在每条输入靶序列上寻找所有满足条件的序列作为候选sgRNA；2.指定允许的错配数，对所有的候选sgRNA进行全基因组序列比对；3.根据错配数和错配位置进行脱靶率评估，根据脱靶率将sgRNA的质量分为以下等级：Best(最优)，Low_Risk(低风险)，Moderate_Risk(风险适中)，High_Risk(高风险)等脱靶风险梯度；
(3)sgRNA过滤模块：将评估并分级后的sgRNA根据以下标准进行筛选：去掉包含4个及以上连续碱基的sgRNA，确保sgRNA之间没有重叠，确保sgRNA在CDS上尽量均匀分布。
优选地，步骤(1)所述靶序列的选择标准为：蛋白质编码基因选择CDS区域作为靶序列，非蛋白质编码基因选择exon区域作为靶序列。
优选地，步骤(2)所述参数包括PAM序列、序列长度、GC含量、允许的错配数和单双链模式。
优选地，步骤(2)所述允许的错配数为3-6个，例如可以是3个、4个、5个或6个，优选为5个。
优选地，步骤(2)所述脱靶率评估标准为：
1)将能够精确比对到基因组中多个位点的sgRNA过滤掉；
2)只比对到基因组中该sgRNA对应位置的sgRNA为Best；
3)对于其他的sgRNA根据错配位置从5’->3’罚分逐渐递减，再结合错配数进行综合打分，罚分越高风险越高。
优选地，步骤(2)所述分级的级别包括：最优、低风险、风险适中和高风险四个级别。
优选地，步骤(3)所述筛选的标准还包括：每个靶序列最多选择6条sgRNA、只保留级别为最优和低风险的sgRNA、确保选择的sgRNA尽可能覆盖基因的不同转录本、每个基因的多个sgRNA尽量靶定到基因的不同位置、GC含量在20％-80％中的任意一种或至少两种的组合，例如可以是每个靶序列最多选择6条sgRNA和只保留级别为最优和低风险的sgRNA的组合，确保选择的sgRNA尽可能覆盖基因的不同转录本和每个基因的多个sgRNA尽量靶定到基因的不同位置的组合，每个靶序列最多选择6条sgRNA、只保留级别为最优和低风险的sgRNA、确保选择的sgRNA尽可能覆盖基因的不同转录本、每个基因的多个sgRNA尽量靶定到基因的不同位置和GC含量在20％-80％的组合，优选为每个靶序列最多选择6条sgRNA、只保留级别为最优和低风险的sgRNA、确保选择的sgRNA尽可能覆盖基因的不同转录本、每个基因的多个sgRNA尽量靶定到基因的不同位置和GC含量在20％-80％的组合。
第二方面，本发明提供一种采用如第一方面所述的构建系统构建sgRNA文库的方法，包括如下步骤：
(1)靶序列选择：从数据库中下载基因组序列和注释文件，提取CDS序列作为输入靶序列；
(2)sgRNA设计：在靶序列的正义链和反义链上根据参数设定选择候选sgRNA，并进行全基因组序列比对，根据指定允许的错配数进行脱靶率评估并分级；
其中，在正义链上选择20nt+NGG作为候选sgRNA，在反义链上选择GGN+20nt作为候选sgRNA；
(3)sgRNA筛选：将评估并分级后的sgRNA根据以下标准进行筛选：去掉包含4个及以上连续碱基的sgRNA，确保sgRNA之间没有重叠，确保sgRNA在CDS上尽量均匀分布。
优选地，步骤(1)所述靶序列的选择标准为：蛋白质编码基因选择CDS区域作为靶序列，非蛋白质编码基因选择exon区域作为靶序列。
优选地，步骤(2)所述参数包括PAM序列、序列长度、GC含量、允许的错配数和单双链模式。
优选地，步骤(2)所述允许的错配数为3-6个，例如可以是3个、4个、5个或6个，优选为5个。
优选地，步骤(2)所述脱靶率评估标准为：
1)将能够精确比对到基因组中多个位点的sgRNA过滤掉；
2)只比对到基因组中该sgRNA对应位置的sgRNA为Best；
3)对于其他的sgRNA根据错配位置从5’->3’罚分逐渐递减，再结合错配数进行综合打分，罚分越高风险越高。
优选地，步骤(2)所述分级的级别包括：最优、低风险、风险适中和高风险四个级别。
作为优选技术方法，本发明提供一种采用如第一方面所述构建系统构建sgRNA文库的方法，具体包括如下步骤：
(1)靶序列选择：从数据库中下载基因组序列和注释文件，提取CDS序列作为输入靶序列；
对于蛋白质编码基因，选择CDS区域作为靶序列设计sgRNA，如果基因具有多个转录本则使用各个转录本的全部CDS序列作为靶序列，只有单个转录本的基因则使用全部的CDS区域作为靶序列；非蛋白质编码基因使用其exon区域作为靶序列；
首先，从Ensemble或NCBI下载基因组序列和注释文件；然后，通过分析注释文件获取每个基因CDS区域的位置信息；最后，根据每个基因CDS区域的位置信息从基因组序列文件中提取所有基因的CDS序列，保存到fasta文件中，作为sgRNA设计模块的输入靶序列；
(2)sgRNA设计：在靶序列的正义链和反义链上根据PAM序列、序列长度、GC含量和单双链模式的参数设定选择候选sgRNA，在正义链上选择20nt+NGG作为候选sgRNA，在反义链上选择GGN+20nt作为候选sgRNA，并进行全基因组序列比对，距离PAM序列(NGG或者GGN)较远的错配更容易引起脱靶，根据允许的错配数进行脱靶率评估并分为最优、低风险、风险适中和高风险的脱靶风险梯度等级，最后进行sgRNA选择时，去掉Moderate risk和Highrisk的sgRNA，并且优先选择Best的sgRNA，其次选择Low risk的sgRNA；
其中，所述脱靶率评估标准为：
1)将能够精确比对到基因组中多个位点的sgRNA过滤掉；
2)只比对到基因组中该sgRNA对应位置的sgRNA为Best；
3)对于其他的sgRNA根据错配位置从5’->3’罚分逐渐递减，再结合错配数进行综合打分，罚分越高风险越高；
(3)sgRNA过滤：将评估并分级后的sgRNA根据以下标准进行筛选：去掉包含4个及以上连续碱基的sgRNA、确保sgRNA之间没有重叠、确保sgRNA在CDS上尽量均匀分布、每个靶序列最多选择6条sgRNA、只保留级别为最优和低风险的sgRNA、确保选择的sgRNA尽可能覆盖基因的不同转录本、每个基因的多个sgRNA尽量靶定到基因的不同位置和GC含量在20％-80％；
对于蛋白质编码基因，优先选择靠近5’端的sgRNA，每个CDS片段的sgRNA数量不超过2条，对于非蛋白质编码基因，在基因的exon序列上设计4条，设计得到的sgRNA之间不能有重叠；
选择的sgRNA要尽可能的覆盖基因的不同转录本，并且尽量在不同的CDS片段上均匀分布，从而能保证设计得到的sgRNA能确保敲除基因的全部转录本，并且每个基因的多个sgRNA尽量靶定到基因的不同位置上，以确保敲除效率。
第三方面，本发明提供一种根据第二方面所述的方法构建得到的全基因组sgRNA文库。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明提供的全基因组sgRNA文库的构建系统简洁高效，便于操作和实际应用，通过优化模块内流程及细节，调整sgRNA的设计标准及筛选原则，全面且特异性地针对全基因组进行sgRNA设计和过滤，节省时间和人力，便于推广应用；
(2)本发明通过提供的构建系统得到的sgRNA文库质量较高，以猪为实施例，全基因组有91.1％的基因均设计得到对应的sgRNA，所有sgRNA的活性均能满足后续实验的要求。
附图说明
图1为本发明的CRISPR基因编辑器的工作过程图；
图2为本发明的CRISPR簇的系统结构图；
图3为本发明的CRISPR/Cas9打靶系统的原理图；
图4为本发明的sgRNA构建流程图。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
实施例1
创建一种全基因组sgRNA文库的构建系统，包括如下模块：
(1)输入模块：从数据库中下载基因组序列和注释文件，提取CDS序列作为输入靶序列；
(2)sgRNA设计模块：在靶序列的正义链和反义链上根据参数设定选择候选sgRNA，并进行全基因组序列比对，根据指定允许的错配数进行脱靶率评估并分级；
其中，在正义链上选择20nt+NGG作为候选sgRNA，在反义链上选择GGN+20nt作为候选sgRNA；
(3)sgRNA过滤模块：将评估并分级后的sgRNA根据以下标准进行筛选：去掉包含4个及以上连续碱基的sgRNA、确保sgRNA之间没有重叠、确保sgRNA在CDS上尽量均匀分布、每个靶序列最多选择6条sgRNA、只保留级别为最优和低风险的sgRNA、确保选择的sgRNA尽可能覆盖基因的不同转录本、每个基因的多个sgRNA尽量靶定到基因的不同位置和GC含量在20％-80％。
实施例2
根据实施例1的构建系统构建猪全基因组sgRNA文库，构建流程如图4所示，流程依次为全基因组CDS序列筛选、根据sgRNA识别位点选取候选sgRNA序列、全基因组脱靶位点检测、根据脱靶位点信息和脱靶位点位置对设计的候选sgRNA打分、结果筛选和设计以及对全程的算法优化和软件开发，具体步骤如下：
(1)首先在从Ensemble下载猪的全基因组序列和注释文件，使用的版本为release90，然后，通过分析注释文件获取每个基因CDS区域的位置信息；最后，根据每个基因CDS区域的位置信息从基因组序列文件中提取所有基因的CDS序列，保存到fasta文件中，作为sgRNA设计模块的输入靶序列；对于蛋白质编码基因，选择CDS区域作为靶序列设计sgRNA，如果基因具有多个转录本则使用各个转录本的全部CDS序列作为靶序列，只有单个转录本的基因则使用全部的CDS区域作为靶序列，非蛋白质编码基因使用其exon区域作为靶序列。
(2)在靶序列的正义链和反义链上根据PAM序列、序列长度、GC含量和单双链模式的参数设定选择候选sgRNA，在正义链上选择20nt+NGG作为候选sgRNA，在反义链上选择GGN+20nt作为候选sgRNA，并进行全基因组序列比对，距离PAM序列(NGG或者GGN)较远的错配更容易引起脱靶，根据指定5个的允许的错配数进行脱靶率评估并分为最优、低风险、风险适中和高风险的脱靶风险梯度等级，最后进行sgRNA选择时，去掉Moderaterisk和Highrisk的sgRNA，并且优先选择Best的sgRNA，其次选择Lowrisk的sgRNA；
脱靶率评估标准为：
1)将能够精确比对到基因组中多个位点的sgRNA过滤掉；
2)只比对到基因组中该sgRNA对应位置的sgRNA为Best；
3)对于其他的sgRNA根据错配位置从5’->3’罚分逐渐递减，再结合错配数进行综合打分，罚分越高风险越高；
(3)将评估并分级后的sgRNA根据以下标准进行筛选：去掉包含4个及以上连续碱基的sgRNA、确保sgRNA之间没有重叠、确保sgRNA在CDS上尽量均匀分布、每个靶序列最多选择6条sgRNA、只保留级别为最优和低风险的sgRNA、确保选择的sgRNA尽可能覆盖基因的不同转录本、每个基因的多个sgRNA尽量靶定到基因的不同位置和GC含量在20％-80％；
对于蛋白质编码基因，优先选择靠近5’端的sgRNA，每个CDS片段的sgRNA数量不超过2条，对于非蛋白质编码基因，在基因的exon序列上设计4条，设计得到的sgRNA之间不能有重叠；
(4)文库总体概况：猪全基因组sgRNA文库构建一共有20438个基因设计得到sgRNA，其中17410个基因设计得到6条sgRNA，2828个基因设计得到sgRNA数量在1-5条之间。实验对sgRNA质量的检验结果显示，Low risk以上的均为高质量的sgRNA，文库构建所得到的sgRNA活性均能满足后续实验的要求。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种全基因组sgRNA文库的构建系统，其特征在于，所述系统包括如下模块：
(1)输入模块：从数据库中下载基因组序列和注释文件，提取CDS序列作为输入靶序列；
(2)sgRNA设计模块：在靶序列的正义链和反义链上根据参数设定选择候选sgRNA，并根据指定的允许错配数进行全基因组序列比对，根据脱靶位点和数量进行脱靶率评估并分级；
其中，在正义链上选择20nt+NGG作为候选sgRNA，在反义链上选择GGN+20nt作为候选sgRNA；
(3)sgRNA过滤模块：将评估并分级后的sgRNA根据以下标准进行筛选：去掉包含4个及以上连续碱基的sgRNA，确保sgRNA之间没有重叠，确保sgRNA在CDS上尽量均匀分布。
2.根据权利要求1所述的构建系统，其特征在于，步骤(1)所述靶序列的选择标准为：蛋白质编码基因选择CDS区域作为靶序列，非蛋白质编码基因选择exon区域作为靶序列。
3.根据权利要求1或2所述的构建系统，其特征在于，步骤(2)所述参数包括PAM序列、序列长度、GC含量、单双链模式和基因组比对允许的错配数。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的构建系统，其特征在于，步骤(2)所述允许的错配数为3-6个，优选为5个；
优选地，步骤(2)所述脱靶率评估标准为；
1)将能够精确比对到基因组中多个位点的sgRNA过滤掉；
2)只比对到基因组中该sgRNA对应位置的sgRNA为Best；
3)对于其他的sgRNA根据错配位置从5’->3’罚分逐渐递减，再结合错配数进行综合打分，罚分越高风险越高。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的构建系统，其特征在于，步骤(2)所述分级的级别包括：最优、低风险、风险适中和高风险四个级别。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的构建系统，其特征在于，步骤(3)所述筛选的标准还包括：每个靶序列最多选择6条sgRNA、只保留级别为最优和低风险的sgRNA、确保选择的sgRNA尽可能覆盖基因的不同转录本、每个基因的多个sgRNA尽量靶定到基因的不同位置、GC含量在20％-80％中的任意一种或至少两种的组合，优选为每个靶序列最多选择6条sgRNA、只保留级别为最优和低风险的sgRNA、确保选择的sgRNA尽可能覆盖基因的不同转录本、每个基因的多个sgRNA尽量靶定到基因的不同位置和GC含量在20％-80％的组合。
7.一种采用如权利要求1-6中任一项所述的构建系统构建sgRNA文库的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)靶序列选择：从数据库中下载基因组序列和注释文件，提取CDS序列作为输入靶序列；
(2)sgRNA设计：在靶序列的正义链和反义链上根据参数设定选择候选sgRNA，并根据指定的允许的错配数进行全基因组序列比对，根据脱靶位点和数量进行脱靶率评估并分级；
其中，在正义链上选择20nt+NGG作为候选sgRNA，在反义链上选择GGN+20nt作为候选sgRNA；
(3)sgRNA筛选：将评估并分级后的sgRNA根据以下标准进行筛选：去掉包含4个及以上连续碱基的sgRNA，确保sgRNA之间没有重叠，确保sgRNA在CDS上尽量均匀分布。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述靶序列的选择标准为：蛋白质编码基因选择CDS区域作为靶序列，非蛋白质编码基因选择exon区域作为靶序列；
优选地，步骤(2)所述参数包括PAM序列、序列长度、GC含量、单双链模式和基因组比对允许的错配数；
优选地，步骤(2)所述允许的错配数为3-6个，优选为5个；
优选地，步骤(2)所述脱靶率评估标准为：
1)将能够精确比对到基因组中多个位点的sgRNA过滤掉；
2)只比对到基因组中该sgRNA对应位置的sgRNA为Best；
3)对于其他的sgRNA根据错配位置从5’->3’罚分逐渐递减，再结合错配数进行综合打分，罚分越高风险越高；
优选地，步骤(2)所述分级的级别包括：最优、低风险、风险适中和高风险四个级别。
9.一种采用如权利要求1-6中任一项所述的构建系统构建sgRNA文库的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
(1)靶序列选择：从数据库中下载基因组序列和注释文件，提取CDS序列作为输入靶序列；
其中，所述靶序列的选择标准为：蛋白质编码基因选择CDS区域作为靶序列，非蛋白质编码基因选择exon区域作为靶序列。
(2)sgRNA设计：在靶序列的正义链和反义链上根据PAM序列、序列长度、GC含量、单双链模式和允许错配数的参数设定选择候选sgRNA，并根据允许的错配数进行全基因组序列比对，然后根据错配数和错配位置进行脱靶率评估并分为最优、低风险、风险适中和高风险的脱靶风险梯度等级；
其中，在正义链上选择20nt+NGG作为候选sgRNA，在反义链上选择GGN+20nt作为候选sgRNA；
脱靶率评估标准为：
1)将能够精确比对到基因组中多个位点的sgRNA过滤掉；
2)只比对到基因组中该sgRNA对应位置的sgRNA为Best；
3)对于其他的sgRNA根据错配位置从5’->3’罚分逐渐递减，再结合错配数进行综合打分，罚分越高风险越高；
(3)sgRNA过滤：将评估并分级后的sgRNA根据以下标准进行筛选：去掉包含4个及以上连续碱基的sgRNA、确保sgRNA之间没有重叠、确保sgRNA在CDS上尽量均匀分布、每个靶序列最多选择6条sgRNA、只保留级别为最优和低风险的sgRNA、确保选择的sgRNA尽可能覆盖基因的不同转录本、每个基因的多个sgRNA尽量靶定到基因的不同位置和GC含量在20％-80％。
10.根据权利要求9所述的方法构建得到的全基因组sgRNA文库。
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019128743A1 (zh) * 2017-12-29 2019-07-04 苏州金唯智生物科技有限公司 一种猪全基因组sgRNA文库及其构建方法和应用
WO2019128744A1 (zh) * 2017-12-29 2019-07-04 苏州金唯智生物科技有限公司 一种全基因组sgRNA文库的构建系统及其应用
CN110322927A (zh) * 2019-08-02 2019-10-11 中南大学 一种crispr诱导rna文库设计方法
CN113073099A (zh) * 2021-03-19 2021-07-06 深圳市第三人民医院 sgRNA库、敲低基因文库及敲低基因文库的构建方法和应用
CN113990394A (zh) * 2021-10-27 2022-01-28 云舟生物科技（广州）有限公司 向导rna作用靶点的筛选方法、计算机存储介质及电子设备
WO2023116681A1 (zh) * 2021-12-21 2023-06-29 翌圣生物科技(上海)股份有限公司 靶序列随机sgRNA全覆盖组的制备方法

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110656123B (zh) * 2019-10-12 2021-07-13 中国农业大学 基于CRISPR-Cas13d系统的sgRNA高效作用靶点的筛选方法及应用
WO2023108430A1 (zh) * 2021-12-14 2023-06-22 中国医学科学院药用植物研究所 基于全基因组分析与基因组编辑的植物物种鉴定方法与应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105400773A (zh) * 2015-12-14 2016-03-16 同济大学 应用于大规模筛选癌症基因的CRISPR/Cas9富集测序方法
CN105886616A (zh) * 2016-04-20 2016-08-24 广东省农业科学院农业生物基因研究中心 一种用于猪基因编辑的高效特异性sgRNA识别位点引导序列及其筛选方法
CN106845151A (zh) * 2015-12-07 2017-06-13 中国农业大学 CRISPR-Cas9系统sgRNA作用靶点的筛选方法及装置
CN107365793A (zh) * 2017-06-19 2017-11-21 百格基因科技（江苏）有限公司 一种适用于植物的大规模基因组编辑的方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX9305855A (es) * 1992-09-24 1995-01-31 Tadatsugu Taniguchi Factores 1 y 2 reguladores del interferon en el diagnostico de latumorigenicidad.
US20150067922A1 (en) * 2013-05-30 2015-03-05 The Penn State Research Foundation Gene targeting and genetic modification of plants via rna-guided genome editing
WO2014204727A1 (en) * 2013-06-17 2014-12-24 The Broad Institute Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions methods, screens and applications thereof
WO2015065964A1 (en) * 2013-10-28 2015-05-07 The Broad Institute Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions, methods, screens and applications thereof
CN107090466B (zh) * 2017-04-20 2020-02-28 清华大学 双sgRNA表达质粒及其文库的构建方法
CN108205614A (zh) * 2017-12-29 2018-06-26 苏州金唯智生物科技有限公司 一种全基因组sgRNA文库的构建系统及其应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106845151A (zh) * 2015-12-07 2017-06-13 中国农业大学 CRISPR-Cas9系统sgRNA作用靶点的筛选方法及装置
CN105400773A (zh) * 2015-12-14 2016-03-16 同济大学 应用于大规模筛选癌症基因的CRISPR/Cas9富集测序方法
CN105886616A (zh) * 2016-04-20 2016-08-24 广东省农业科学院农业生物基因研究中心 一种用于猪基因编辑的高效特异性sgRNA识别位点引导序列及其筛选方法
CN107365793A (zh) * 2017-06-19 2017-11-21 百格基因科技（江苏）有限公司 一种适用于植物的大规模基因组编辑的方法

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019128743A1 (zh) * 2017-12-29 2019-07-04 苏州金唯智生物科技有限公司 一种猪全基因组sgRNA文库及其构建方法和应用
WO2019128744A1 (zh) * 2017-12-29 2019-07-04 苏州金唯智生物科技有限公司 一种全基因组sgRNA文库的构建系统及其应用
CN110322927A (zh) * 2019-08-02 2019-10-11 中南大学 一种crispr诱导rna文库设计方法
CN110322927B (zh) * 2019-08-02 2021-04-09 中南大学 一种crispr诱导rna文库设计方法
CN113073099A (zh) * 2021-03-19 2021-07-06 深圳市第三人民医院 sgRNA库、敲低基因文库及敲低基因文库的构建方法和应用
CN113073099B (zh) * 2021-03-19 2023-08-22 深圳市第三人民医院 sgRNA库、敲低基因文库及敲低基因文库的构建方法和应用
CN113990394A (zh) * 2021-10-27 2022-01-28 云舟生物科技（广州）有限公司 向导rna作用靶点的筛选方法、计算机存储介质及电子设备
CN113990394B (zh) * 2021-10-27 2023-01-24 云舟生物科技(广州)股份有限公司 向导rna作用靶点的筛选方法、计算机存储介质及电子设备
WO2023116681A1 (zh) * 2021-12-21 2023-06-29 翌圣生物科技(上海)股份有限公司 靶序列随机sgRNA全覆盖组的制备方法

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