CN107365793A - 一种适用于植物的大规模基因组编辑的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种适用于植物的大规模基因组编辑的方法，包括以下步骤：步骤一、制备CRISPR‑Cas质粒文库；步骤二、将步骤一中制备的CRISPR‑Cas质粒文库转化农杆菌后，涂布于含有抗生素的固体培养基上，培养至长出大量农杆菌菌落；步骤三、将步骤二中的得到的部分或者全部农杆菌菌落刮落重悬后，转化植物外植体，实现对植物的大规模基因组编辑。进一步地，重悬后，不经扩大培养直接转化植物外植体，实现一个转化事件产生一种基因组编辑的效果。本发明能在植物上实现大规模、高通量的基因组编辑，与传统方法相比，基因编辑植株的效率和通量获得大幅提升，从而可提供大量的种质资源，服务于育种。

Description

一种适用于植物的大规模基因组编辑的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地，涉及一种适用于植物的大规模基因组编辑的方法。
背景技术
锌指核酸技术(Zinc finger nuclease,ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶技术(transcription activator-like(TAL)effector nucleases,Talen)和CRISPR-Cas技术(Cong,L.,et al.,Multiplex genome engineering using CRISPR/Cassystems.Science,2013.339(6121):p.819-23)是这几年基因组编辑领域的几项突破性技术。这三种技术都可以在生物体基因组指定位点特异性的切割DNA产生双链断裂，从而利用生物的非同源末端连接或同源重组，进行定点编辑。ZFN和Talen技术用特异性的蛋白引导，蛋白元件的构建相对较复杂，编辑效率有待提高。CRISPR-Cas技术以RNA引导，体外构建简单，编辑效率较高。CRISPR的全称是短回文重复序列(clustered regularly interspacedshort palindromic repeats)。Cas基因的全称是CRISPR关联基因(CRISPR associated)，存在于CRISPR位点附近。Cas基因编码的蛋白质主要是双链DNA核酸酶，含有两个酶切活性位点，每个位点负责剪切靶基因DNA双螺旋中的一条单链。能在向导RNA(guide RNA)的引导下对靶位点进行切割。目前发现的Cas包括Cas1～10等多种类型。目前，这三种技术已成功的应用于多种生物，包括大肠杆菌、酵母、水稻、拟南芥、大豆、玉米、小鼠和人类细胞等。
目前，在哺乳动物的细胞系上已实现高通量的大规模基因组编辑，可以对多达10万个基因或者位点进行敲除。另外，通过采用基于CRISPR-Cas9技术，也可以实现全基因组范围的靶向激活。哺乳动物的遗传转化手段主要通过慢病毒实现，其技术相对成熟。在植物领域，农杆菌介导法是目前应用较广泛的植物遗传转化技术，植物的基因组编辑大多采用农杆菌转化来实现。但是，传统的对植物进行基因组编辑都是逐个逐个的单独进行遗传转化，还没有实现高通量的编辑。到目前为止，还没有一种能够对植物进行大规模、高通量的基因组编辑的方法。
发明内容
为了植物研究和育种的需要，本领域迫切需要开发一种高通量基因组编辑技术。本发明提供一种适用于植物的大规模基因组编辑的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、制备CRISPR-Cas质粒文库；
步骤二、将步骤一中制备的CRISPR-Cas质粒文库转化农杆菌后，涂布于含有抗生素的固体培养基上，培养至长出大量农杆菌菌落(即转化后的农杆菌)；
步骤三、将步骤二中的得到的部分或者全部农杆菌菌落刮落重悬后，转化植物外植体，实现对植物的大规模基因组编辑。
其中，步骤一中采用适用于农杆菌转化的双元载体作为质粒载体；双元载体包含CRISPR-Cas所需的sgRNA表达框。
进一步地，CRISPR-Cas质粒文库中每个质粒表达一个或多个sgRNA。
作为优选，CRISPR-Cas质粒文库为CRISPR-Cas9质粒文库。
进一步地，步骤一中的CRISPR-Cas质粒文库为用于基因敲除、基因组片段敲除和/或基因激活的质粒文库。尤其是CRISPR-Cas质粒文库为用于基因敲除的质粒文库。
进一步地，步骤一包括：
步骤1.1、对植物基因组进行分析，在全基因组范围内根据DNA序列特异性、GC含量和位置效应对每个基因选择2-3个靶点作为sgRNA，sgRNA长度为17-21bp，避免sgRNA的二级结构和Poly(T)结构；
步骤1.2、合成步骤1.1中的sgRNA，并分别在其两端加入酶切位点；
步骤1.3、PCR扩增步骤1.2合成的sgRNA，采用步骤1.2加入的酶切位点对应的内切酶对该PCR产物进行酶切，电泳回收酶切产物，用连接酶将回收片段连接至经同样的内切酶酶切的CRISPR-Cas质粒上，转化大肠杆菌，获取大肠杆菌克隆，提取大肠杆菌克隆中的质粒，得到CRISPR-Cas质粒文库。
其中，DNA序列特异性指靠近原间隔序列临近基序(protospacer adjacentmotif，PAM)的一段DNA序列在植物全基因组范围内的唯一性，这段DNA序列长度在10-15bp，优选为12bp。PAM通常由NGG三个碱基构成(N为任意碱基)。
GC含量的要求是所选择的sgRNA中的GC含量占碱基的百分比在38％-62％，优选为40％-60％,平均为50％。
位置效应的要求是位于基因5’端到3’端的前2/3处以内(即勿选择基因5’端到3’端的后1/3位置处的基因片段)，尽可能靠近基因的5’端。
进一步地，步骤1.1中当同一个基因存在多个转录本时，选择在该多个转录本的保守区域作为sgRNA。保守区域指在多个转录本中均共有或大部分共有的区域。
进一步地，步骤1.1中的植体的物种选自水稻、大豆、番茄、玉米、烟草、小麦和高粱或者其组合。
进一步地，步骤1.2中的酶切位点选自BsaI、XbaI和Hind III中的一种或者两种。
进一步地，步骤1.3中回收片段连接至CRISPR-Cas质粒的sgRNA启动子的后面，CRISPR-Cas质粒本身所具有的gRNA的前面。
进一步地，步骤二中的抗生素选自卡那霉素、氨苄青霉素、氯霉素、四环素和链霉素或者其组合；农杆菌菌株选自EHA105、EHA101、GV3101和LBA4404或者其组合，且采用的质粒转化农杆菌的方法为电击转化法或化学转化法。
进一步地，步骤三中农杆菌菌落刮落重悬后，不经过扩大培养直接转化植物外植体。有利于保证转化有sgRNA的CRISPR-Cas质粒分布的均一性。
作为优选，步骤三中农杆菌菌落重悬后到进行转化外植体操作之间的间隔时间少于6小时。时间短，避免了农杆菌菌落的扩增，有利于保证转化有sgRNA的CRISPR-Cas质粒分布的均一性。
进一步地，步骤三中重悬后的农杆菌混悬液的浓度被调整为OD600在0.05-1.0用于转化外植体。优选地，OD600是0.3。这有利于保证一个转化事件整合一种CRISPR-Cas质粒的转移DNA(Transfer DNA，T-DNA)，同时兼顾农杆菌侵染效率(即转化效率)。
步骤三中外植体物种选自水稻、大豆、番茄、玉米、烟草、小麦和高粱或者其组合。
有益效果：本发明的方法在植物中首次实现了高通量、大规模的基因组编辑。现有的植物基因组编辑流程通常是单独进行。当对成千上万的基因或位点进行编辑时，需要进行成千上万次遗传转化工作，需要独立区分大量的质粒、菌株和植株，并且要对每个转化流程进行单独管理，工作量巨大，成本高昂，几乎无法大规模实施。而采用本发明的方法，仅一次大规模转化即可对近10万个基因或位点进行基因组编辑，获得编辑植株的效率和通量急剧提升，成本大幅度下降，从而可以提供大量的种质资源，服务于育种。
附图说明
图1是水稻的全基因组CRISPR-Cas9靶点设计。
图2是植物高通量基因组编辑流程图。
图3是水稻CRISPR-Cas9质粒文库高通量测序结果。
图4是植株基因组编辑结果的鉴定流程。
图5是代表性的T0代水稻植株的生长发育表型。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细地描述。
CRISPR-Cas质粒文库构建
分析待编辑植物的基因组，并根据CRISPR-Cas的靶点设计原则获得编辑靶点。由于本发明的优势在于高通量、大规模的基因组编辑，因此往往一次设计大量的靶点并同时进行实验。如图1所示为水稻的全基因组CRISPR-Cas9靶点设计流程，总共设计了88541个靶点对34234个基因进行靶向敲除编辑。根据设计的向导RNA(single guide RNA，sgRNA)序列体外合成相应DNA片段，并构建至适用于农杆菌转化的CRISPR-Cas双元载体，获得包含尽量多的sgRNA的CRISPR-Cas质粒文库。
CRISPR-Cas农杆菌文库制备
将CRISPR-Cas质粒文库转化农杆菌，常用的农杆菌包括EHA105、EHA101、GV3101和LBA4404等。为了获得尽可能多的农杆菌菌落，可以采用电击转化法进行转化。传统的农杆菌转化外植体往往挑取一个或者多个菌落进行活化和扩繁后进行外植体侵染。但是在本发明中，为了保证转化有sgRNA的CRISPR-Cas质粒分布的均一性，将转化后的农杆菌菌落全部重悬于侵染液后直接用于外植体转化。该重悬后的农杆菌混合液即为CRISPR-Cas农杆菌文库。
外植体大规模遗传转化
为了获得大量的转化植株，通过组织培养获得大量的适用于农杆菌转化的植物外植体。将上述CRISPR-Cas农杆菌文库的浓度稀释至适合该外植体转化的浓度，OD600通常控制在0.05-1.0之间。为了保证一个转化事件整合一种CRISPR-Cas质粒的T-DNA，同时兼顾农杆菌侵染效率，农杆菌的浓度优选OD600为0.3。将稀释后的农杆菌文库侵染全部的外植体，通过组织培养即可获得大量的转化植株。可以理解，受体植物包括但不限于水稻、大豆、番茄、玉米、烟草、小麦、高粱等。本发明人大量的实验结果表明，一个转化事件基本整合一种CRISPR-Cas质粒的T-DNA，产生一种基因组编辑效果。因此，通过一次大规模的遗传转化，可以获得大量的基因组编辑植株。
植株的编辑结果鉴定
通过遗传转化后，筛选获得的基因组编辑植株与传统的农杆菌转基因植株一样，其基因组整合有T-DNA。由于该T-DNA上含有sgRNA的表达框，因此会表达出导入的sgRNA。且可根据sgRNA的表达框设计引物，对sgRNA进行鉴定。植株基因组编辑结果的鉴定包括sgRNA鉴定和剪切修复后的靶点编辑结果鉴定两步。如图4所示，LB(Left border)和RB(Rightborder)分别代表T-DNA的左、右边界；U6为sgRNA的启动子；黑框代表sgRNA，长度可以为17-21bp，图中为20bp；20bp左右两侧的箭头分别代表扩增该sgRNA的引物，其根据U6和质粒自带的gRNA序列来设计、合成。所有sgRNA均可采用相同的引物对。采用PCR扩增该sgRNA片段，通过测序和查询sgRNA数据库获知该sgRNA的序列及其靶向基因，然后对编辑后的受体植物靶点(此处并非前面用于编辑的sgRNA)进行测序可获得该植株的编辑结果。
应用
本发明可以用于植物基因工程领域，用于植物研究和种质资源的大规模创制，尤其是具有经济价值的农作物和林业作物的种质资源材料的创制。
下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)或植物分子生物学-实验手册(Plant Molecular Biology-A Laboratory Mannual,MelodyS.Clark编,Springer-verlag Berlin Heidelberg,1997)中的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
实施例1：在水稻上实现大规模、高通量的基因组靶向敲除
水稻作为东南亚的主要粮食作物之一，其基因组编辑和遗传转化流程成熟并且具有代表性。为了验证本发明在水稻种质资源创制上的应用潜力，对水稻进行了大规模的基因组编辑实验。
水稻CRISPR-Cas9质粒文库构建
对水稻的基因组(日本晴)进行分析，根据DNA序列特异性、GC含量和位置效应对每个基因选择2-3个靶点作为sgRNA。sgRNA的设计原则如图1所示：1、选取相同基因不同转录本中的保守序列作为待选片段。图中列举了A、B、C三个转录本。2、根据特异性要求确定序列长度；根据PAM位置选取序列片段。对于水稻基因组(MSU7)来说，选取靠近PAM的12bp就可以保证其在全基因组范围内是唯一的，那么sgRNA长度取20bp则完全满足特异性的要求。MSU7表示水稻基因组的版本。3、待选自的片段需要达到一定的GC含量以满足高的评估效率选。取GC含量占碱基的百分比在38％-62％的sgRNA,其评估效率为100％。4、sgRNA的位置要求是尽可能靠近基因的5’端，在本实施例中为位于基因5’端到3’端的前2/3处以内，其评估效率是100％左右。5、要避免sgRNA的二级结构和Poly(T)结构。或者sgRNA的设计原则参照文献(Wang,T.,et al.,Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9system.Science,2014.343(6166):p.80-4。Shalem,O.,et al.,Genome-scaleCRISPR-Cas9knockout screening in human cells.Science,2014.343(6166):p.84-7。Feng,Z.,et al.,Efficient genome editing in plants using a CRISPR/Cassystem.Cell Res,2013.23(10):p.1229-1232)。根据分析结果，总共设计了88541个靶点作为sgRNA，对34234个基因进行大规模的敲除，见表1。
表1水稻全基因组靶点文库统计表
根据分析获得的88541个靶点(即sgRNA)序列，采用芯片合成的方法体外合成全部的单链寡聚核苷酸，合成时在20bp的sgRNA片段两端引入BsaI的酶切识别位点。单链DNA合成后通过PCR扩增获得双链DNA，见图2。从图2中可以看出，其主要包括A-D四项操作：(A)体外合成表达sgRNA的DNA片段文库。(B)CRISPR-Cas9质粒文库。将sgRNA连接至CRISPR-Cas9载体(质粒)。(C)将CRISPR-Cas9质粒文库转化农杆菌获得大量的农杆菌菌落。(D)将固体培养基上的农杆菌菌落重悬至转化溶液后直接转化大量的植物外植体。D中左边培养皿中为转化后的大量的水稻外植体愈伤；中间培养皿为培养了一段时间的转化后的大量的水稻外植体愈伤；右边容器中的植株为通过组织培养再生的水稻再生植株。
在本实施例中，采用内切酶BsaI酶切后，电泳回收20bp的sgRNA片段。采用T4连接酶将回收得到的20bp的sgRNA片段连接至CRISPR-Cas9载体(质粒)。然后将该连接产物大规模转化大肠杆菌，获得>1000万个大肠杆菌克隆。将所有的大肠杆菌克隆直接重悬并提取质粒，即得到水稻的CRISPR-Cas9质粒文库——水稻全基因组敲除文库(Rice Genome-wideKnockout Library，RGKO-All)。
为了验证该质粒文库，采用高通量测序技术对整个质粒文库进行测序，其结果如图3所示。图中横坐标代表高通量测序测得sgRNA的拷贝数，纵坐标代表该拷贝数的sgRNA占所有sgRNA数量的比例。该水稻的CRISPR-Cas9质粒文库涵盖87788个sgRNA，即覆盖率约为99.15％；绝大部分在100到400个sgRNA拷贝数之间，说明分布均一性高；正确率达到93.8％。这些说明该方法可以用于CRISPR-Cas9质粒文库构建，也说明该CRISPR-Cas9质粒文库可以用于下一步实验。
为了有针对性的对某一类型的基因进行单独的敲除，根据基因功能将88541个靶点分成了96组，平均每组包含922个sgRNA。类似的，采用上述方法构建了96个亚文库，分别命名为RGKO#1到RGKO#96。
水稻CRISPR-Cas9农杆菌文库制备
采用电击转化法，将上述构建的水稻CRISPR-Cas9质粒文库转化农杆菌EHA105(购自上海迈其生物科技有限公司)。电击转化后涂布于含有卡那霉素(Kana)的LB固体培养基上。培养48小时后，刮取LB固体培养基上的农杆菌菌落。用水稻愈伤侵染液重悬所有的农杆菌菌落。重悬农杆菌菌落用的水稻愈伤侵染液参考Nishimura等发表的文章(Nishimura,A.,I.Aichi,and M.Matsuoka,A protocol for Agrobacterium-mediatedtransformation in rice.Nat Protoc,2006.1(6):p.2796-802)。
水稻愈伤的大规模遗传转化
为了获得大量的水稻转化植株，首先通过组织培养诱导大量的水稻外植体愈伤。将上述CRISPR-Cas9农杆菌文库重悬液的浓度稀释至OD600为0.3。将稀释后的CRISPR-Cas9农杆菌文库混合侵染全部的外植体，参考Nishimura等发表的文章(Nishimura,A.,I.Aichi,and M.Matsuoka,A protocol for Agrobacterium-mediated transformationin rice.Nat Protoc,2006.1(6):p.2796-802)获得大量的再生植株。
再生水稻植株的基因型鉴定
如表2所示，首先将3个分别含有910个、823个和733个sgRNA的亚文库采用上述方法进行高通量编辑。同时，为了与传统方法比较，将62个来自质粒文库RGKO#2的质粒采用常规方法进行单独遗传转化(实验2015051，*标注)。总共进行7次大规模的遗传转化实验，其中实验2015051为采用常规的方法进行遗传转化；其余的6次实验为采用本发明的方法进行遗传转化。鉴定结果为采用Sanger测序的抽样调查结果。抽样调查结果显示，采用本发明的方法获得的再生植株中有92.7％的植株只含有一种sgRNA，证明一个转化事件基本整合一种CRISPR-Cas质粒的T-DNA。同时，测序结果显示，其靶点的编辑效率与传统的单独转化差不多，都在80％左右。T0代植株是指直接从愈伤组织再生的这一代植株。
表2水稻T0代植株高通量编辑结果统计
表中，Total Identi.代表抽样调查的数目，Single sgRNA表示含有一个sgRNA的植株数目，RGKO sgRNA表示CRISPR-Cas9质粒文库中的sgRNA，Mutation rate表示编辑效率。
在上述实验结果的基础上，进一步采用含有88541个sgRNA的质粒文库，对水稻全基因组进行大规模编辑。整个转化工程总共获得了近10万株基因编辑植株。对整个水稻库进行抽样调查显示，89.3％的植株只含有一种sgRNA，其靶点的编辑效率为83.9％。对部分重要基因进行成功编辑可以产生一些可见的表型，这些突变体植株的表型说明基因编辑是成功的。如图5所示，其中左上角和右上角的箭头指向发育异常的突变体植株，即#1和#3水稻植株。#1和#3水稻植株分蘖减少。#2号植株生长矮小。#4号植株叶面有“类锈病”表型。#5号植株(突变体)相对于其旁边的野生型来说，其分蘖角增大。#6号植株(突变体)相对于旁边的野生型来说叶色变浅。由此可见，在编辑的水稻植株中，在T0代即可发现一些生长发育异常的植株，从另外一方面反映本发明的应用效果。
更进一步的，对整个10万株水稻植株进行高通量测序鉴定。对其中的近1万株的测序结果进行分析，发现6060株植株被成功的测序，并且其中91.4％(5541株)的植株只含有一种sgRNA，见表3。
表3水稻T0代植株sgRNA鉴定结果
表中，PCR Positive代表通过PCR成功扩增目标片段的植株数目；RGKO sgRNA表示CRISPR-Cas9质粒文库中的sgRNA；Single sgRNA表示含有一个sgRNA的植株数目。
上述这些大规模遗传转化和测序结果证明，采用本发明进行高通量基因组编辑时，一个转化事件基本整合一种CRISPR-Cas质粒的T-DNA，基因组编辑效率与传统方法类似。但是，在采用传统方法对水稻进行编辑时，如实验2015051，尽管只对62个靶点进行编辑，但是进行了62次独立转化；而采用本发明的方法，1次转化，即可对成千上万个靶点进行编辑。更重要的是，采用传统方法进行大规模基因组编辑时，需要区分成千上万的质粒、农杆菌菌株和水稻植株，并且要对每个转化流程进行单独管理，工作量巨大；而采用本发明的方法，仅一次大规模转化即可，工作量急剧下降。两种方法的比较见表4。
表4以水稻全基因组敲除为例(88541个靶点)，对传统方法单独编辑和本发明高通量基因组编辑进行对比
本发明使植物的大规模基因组编辑成为可能，并且可以应用至其他作物，如大豆、番茄、玉米、烟草、小麦、高粱等。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种适用于植物的大规模基因组编辑的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、制备CRISPR-Cas质粒文库；
步骤二、将所述步骤一中制备的CRISPR-Cas质粒文库转化农杆菌后，涂布于含有抗生素的固体培养基上，培养至长出大量农杆菌菌落；
步骤三、将所述步骤二中的得到的部分或者全部农杆菌菌落刮落重悬后，转化植物外植体，实现对植物的大规模基因组编辑。
2.如权利要求1所述的适用于植物的大规模基因组编辑的方法，其特征在于，所述步骤一中采用适用于农杆菌转化的双元载体作为质粒载体；所述双元载体包含CRISPR-Cas所需的sgRNA表达框。
3.如权利要求1所述的适用于植物的大规模基因组编辑的方法，其特征在于，所述CRISPR-Cas质粒文库中每个质粒表达一个或多个sgRNA。
4.如权利要求1所述的适用于植物的大规模基因组编辑的方法，其特征在于，所述CRISPR-Cas质粒文库为CRISPR-Cas9质粒文库；所述CRISPR-Cas质粒文库为用于基因敲除、基因组片段敲除和/或基因激活的质粒文库。
5.如权利要求1所述的适用于植物的大规模基因组编辑的方法，其特征在于，所述步骤一包括：
步骤1.1、对植物基因组进行分析，在全基因组范围内根据DNA序列特异性、GC含量和位置效应对每个基因选择2-3个靶点作为sgRNA，所述sgRNA长度为17-21bp，避免sgRNA的二级结构和Poly(T)结构；
步骤1.2、合成所述步骤1.1中的sgRNA，并分别在其两端加入酶切位点；
步骤1.3、PCR扩增所述步骤1.2合成的sgRNA，采用所述步骤1.2加入的酶切位点对应的内切酶对该PCR产物进行酶切，电泳回收酶切产物，用连接酶将回收片段连接至经同样的内切酶酶切的CRISPR-Cas质粒上，转化大肠杆菌，获取大肠杆菌克隆，提取所述大肠杆菌克隆中的质粒，得到所述CRISPR-Cas质粒文库。
6.如权利要求1所述的适用于植物的大规模基因组编辑的方法，其特征在于，所述步骤1.3中所述回收片段连接至CRISPR-Cas质粒的sgRNA启动子的后面，CRISPR-Cas质粒本身所具有的gRNA的前面。
7.如权利要求1所述的适用于植物的大规模基因组编辑的方法，其特征在于，所述步骤二中：抗生素选自卡那霉素、氨苄青霉素、氯霉素、四环素和链霉素或者其组合；农杆菌菌株选自EHA105、EHA101、GV3101和LBA4404或者其组合；采用的质粒转化农杆菌的方法为电击转化法或化学转化法。
8.如权利要求1所述的适用于植物的大规模基因组编辑的方法，其特征在于，所述步骤三中农杆菌菌落刮落重悬后，不经过扩大培养直接转化植物外植体。
9.如权利要求1所述的适用于植物的大规模基因组编辑的方法，其特征在于，所述步骤三中农杆菌菌落重悬后到进行转化外植体操作之间的间隔时间少于6小时。
10.如权利要求1所述的适用于植物的大规模基因组编辑的方法，其特征在于，所述步骤三中重悬后的农杆菌混悬液的浓度被调整为OD600在0.05-1.0用于转化所述外植体。
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