CN105400773A - 应用于大规模筛选癌症基因的CRISPR/Cas9富集测序方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种应用于大规模筛选癌症基因的CRISPR/Cas9富集测序方法，首先建立sgRNA文库；然后用慢病毒包装sgRNA文库，并收集病毒；之后在癌细胞系中筛选sgRNA文库；再提取筛选所得细胞及筛选前细胞的基因组DNA；最后富集基因组DNA中的sgRNA。与现有技术相比，本发明对CRISPR/Cas细胞的筛选过程做了改进，利用被感染细胞的puromycin抗性，用简便的方法确定了病毒感染效率，确定了病毒MOI值；更重要的是，限制性内切酶切方法与高通量方法的结合，不仅能够有效的获取正确的染色质片段，而且能够降低非特异性PCR扩增产生的假阳性，能够高效扩增sgRNA的DNA模板，提高了建库效率。
Description
技术领域
本发明属于高通量测序技术领域，尤其是涉及一种应用于大规模筛选癌症基因的CRISPR/Cas9富集测序方法。
背景技术
致癌基因和抑癌基因都是癌症基因治疗的潜在靶点，因此其鉴定在癌症的治疗中有着巨大的应用前景，目前已经针对致癌基因EGFR、Alk等基因开发出治疗癌症的药物。但是目前有效的癌症基因靶向药物还远远不能满足临床治疗的需要。基于CRISPR/Cas9(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats/clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeatsassociatedprotein9)的大规模功能基因筛选技术作为近几年的基因工程新兴技术，能够在全基因组层面筛选癌症相关基因，从而为癌症的治疗提供药物靶点候选基因。
目前CRISPR/Cas9screen技术只在国内外少数实验室应用，并未推广。并且该方法在使用过程中需要高通量测序，因为sgRNA的模板只占基因组DNA中的很小部分，为了达到足够的sgRNA覆盖率，需要对大量的DNA进行建库，因此现有的建库方法费时费力，并且需要大量的PCR酶，经济负担也比较大。为解决以上问题，需要一种能够大量富集sgRNA的方法，以便于后续测序。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种应用于大规模筛选癌症基因的CRISPR/Cas9富集测序方法。
本发明方法首先建立sgRNA文库；然后用慢病毒包装sgRNA文库，并收集病毒；之后在癌细胞系中筛选sgRNA文库；再提取筛选所得细胞及筛选前细胞的基因组DNA；最后富集基因组DNA中的sgRNA。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种应用于大规模筛选癌症基因的CRISPR/Cas9富集测序方法，该方法包括以下步骤：
(1)sgRNA文库建立：
利用网站http://crisprscan.org或http://www.e-crisp.org在线设计待筛选癌症基因群的sgRNA，或直接在addgene上购买靶向于全基因组sgRNA文库，sgRNA的载体采用LentiCRISPRv2；
(2)用慢病毒包装sgRNA文库：
无菌条件下，培养293FT细胞，并用Roche的转染试剂X-tremeGENEHPDNATransfectionReagent将LentiCRISPRv2及另外两种病毒包装质粒psPAX2和pMD2.G共转染至293FT细胞中，培养细胞，收获病毒液；
CRISPRv2、psPAX2、pMD2.G按照质量比4：3：1的比例转染293FT细胞。LentiCRISPRv2与X-tremeGENEHPDNATransfectionReagent的比例关系为6μg：30μL，以10cm的培养皿为例，LentiCRISPRv2、psPAX2、pMD2.G的质粒质量分别为6μg、4.5μg、1.5μg，X-tremeGENEHPDNATransfectionReagent的量为30μL。
细胞转染后15小时换液，并于之后的24小时和48小时收取病毒液，将两次收取的病毒液轻轻混匀，用0.44μM的滤器过滤病毒液，除去细胞碎片。
(3)sgRNA文库在细胞中的筛选：
选取合适的病毒量，感染待检测的癌细胞系，感染48小时后，用puromycin筛选2天，所得阳性细胞收取部分作为对照组，其他细胞继续培养至40-46天后收取作为实验组；
病毒感染效率通过感染病毒细胞对puromycin的抗性进行检测，在六孔板中培养细胞至融合度70％，用100μL、200μL、300μL、400μL、500μL的病毒液感染细胞，取能感染45-55％细胞的病毒量作为合适病毒量进行后续试验。
(4)提取筛选所得细胞及筛选前细胞的基因组DNA：
用细胞裂解液裂解细胞，吹打混匀后，加入RNase酶，65℃孵育30分钟，再加终浓度为10μg/ml的蛋白酶K，55℃孵育过夜，用纯化液抽提DNA片段；
细胞裂解液的成分为400μMNaCl、0.2％SDS(以质量分数计)、2mMEDTA、10mMTris-HCl。
纯化液为体积比25:24:1的酚、氯仿与异戊醇的混合液。
(5)富集基因组DNA中的sgRNA：
用限制性内切酶对基因组DNA进行酶切，37℃反应过夜，将酶切后的DNA片段放置在0.8wt％的低熔点琼脂糖胶中，80V，1小时电泳，切胶回收1600-2000bp的DNA片段；
限制性内切酶反应体系为：50μL中，含有6μgDNA，5μL10×NEBbuffer，限制性内切酶EcoNⅠ3μL。
(6)sgRNA文库构建与测序：
文库按照illumina公司的建库试剂盒说明书构建，将建好文库进行Hiseq2000的50SE进行高通量测序，结果进行生物信息分析。
待检测的癌细胞系包括肺癌细胞与肝癌原代细胞。
与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
1、本发明在慢病毒包装中，选用Roche的转染试剂X-tremeGENEHPDNATransfectionReagent将LentiCRISPRv2及另外两种病毒包装质粒psPAX2和pMD2.G共转染至293FT细胞中，培养细胞，收获病毒液；并且通过大量实验确定了CRISPRv2、psPAX2、pMD2.G按照质量比4：3：1的比例转染293FT细胞，并且确定LentiCRISPRv2与X-tremeGENEHPDNATransfectionReagent的比例关系为6μg：30μL。之前的相关方法中常用的CRISPRv2、psPAX2、pMD2.G按照质量比为3：2：1。本专利中的发明在此基础上做了一系列质量比，确定4：3：1的比例包装的病毒的感染效率最高，并且此质量比例更接近质粒摩尔比1：1：1，更符合慢病毒在自然状态下的包装比例。
2、本发明对细胞的筛选过程做了改进，利用被感染细胞的puromycin抗性，用简便的方法确定了病毒感染效率，确定了病毒MOI值。
3、本发明采用限制性内切酶切方法与高通量方法相结合。限制性内切酶EcoNⅠ能够特异性识别LentiCRISPRv2上的两个位点，并切下一个1670bp的含有sgRNA的片段。EcoNⅠ在基因组上为稀有位点，因此DNA被EcoNⅠ酶切后主要集中在2000bp以上的位置。之后胶回收的方法能够将1600bp-2000bp的DNA片段富集，其中含有sgRNA的片段在模板DNA的比例大大提高，大多数非目的DNA被除去。因此，本发明不仅能够有效的获取正确的染色质片段，而且能够降低非特异性PCR扩增产生的假阳性，能够高效扩增sgRNA的DNA模板，提高了建库效率。
4、本发明方法建库效率高，需要的PCR酶也少。依照常规方法，107细胞得需要提出6.6μg的DNA作为模板进行后续试验，本发明只需要66ng就足够。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
对肺癌细胞PC9进行癌症相关基因的筛选。具体方法如下：
(1)sgRNA文库建立：
利用网站http://crisprscan.org和http://www.e-crisp.org在线设计与癌症相关的基因群的sgRNA。sgRNA的载体采用LentiCRISPRv2。
(2)用慢病毒包装sgRNA文库：
无菌条件下，培养293FT细胞，并用Roche的转染试剂X-tremeGENEHPDNATransfectionReagent将LentiCRISPRv2及另外两种病毒包装质粒psPAX2和pMD2.G包装慢病毒。细胞转染后15小时换液，并于之后的24小时和48小时收取病毒液，将两次收取的病毒液轻轻混匀，用0.44μM的滤器过滤病毒液，除去细胞碎片；
以10cm的培养皿为例，LentiCRISPRv2、psPAX2、pMD2.G的质粒质量分别为6μg、4.5μg、1.5μg，X-tremeGENEHPDNATransfectionReagent的量为30μL。
(3)PC9细胞中筛选sgRNA文库
选取合适的病毒量，感染PC9，48小时后，用puromycin筛选2天,所得阳性细胞收取部分作为对照组，其他细胞继续培养至40天后收取。
病毒感染效率通过感染病毒细胞对puromycin的抗性进行检测，在六孔板中培养细胞至融合度70％，用100μL、200μL、300μL、400μL、500μL的病毒液感染细胞，取能感染45-55％细胞的病毒量作为合适病毒量进行后续试验。
(4)提取筛选所得细胞及筛选前细胞的基因组DNA
用细胞裂解液裂解细胞，吹打混匀后，加入RNase酶，65℃孵育30分钟，再加终浓度为10μg/ml的蛋白酶K，55℃孵育过夜。用纯化液(体积比25:24:1的酚、氯仿与异戊醇的混合液)抽提DNA片段；
细胞裂解液的成分为400μMNaCl、0.2％SDS(以质量分数计)、2mMEDTA、10mMTris-HCl。
(5)富集基因组DNA中的sgRNA
用限制性内切酶对基因组DNA进行酶切，37℃反应过夜，将酶切后的DNA片段放置在0.8wt％的低熔点琼脂糖胶中，80V，1小时电泳，切胶回收1600-2000bp的DNA片段；
(6)sgRNA文库构建与测序：
文库按照illumina公司的建库试剂盒说明书构建，将建好文库进行Hiseq2000的50SE进行高通量测序，结果进行生物信息分析。
目前对肺癌细胞PC9进行癌症相关基因的筛选还没有常规方法。
本发明结合现有的CRISPR/Cas9大规模筛选基因的方法，结合PC9的筛选特性得到了一个新的方法。与常规CRISPR/Cas9大规模筛选基因的方法相比，本发明中步骤(2)的病毒感染效率高，无需浓缩，只需要采用25000rpm的转速即可。而通过方法需要超高速离心机(50000g)，超高速离心机价格昂贵。感染效率的确定上常规方法常用病毒PCR法，需要制作标曲和收集感染细胞，通常需要2周的时间。而本发明中的方法只需要5-6天时间，节省了一倍的时间。常规sgRNA建库直接使用基因组DNA为模板，10-7细胞的需要提出6.6μg的DNA作为模板进行后续试验，而本发明在建库前加入限制性内切酶富集sgRNA,本发明只需要66ng就足够。
实施例2
应用于肝癌原代细胞的CRISPR/Cas9应用于大规模筛选癌症基因的CRISPR/Cas9富集测序方法，包括以下步骤：
(1)sgRNA文库建立：
利用网站http://crisprscan.org和http://www.e-crisp.org在线设计与癌症相关的基因群的sgRNA。sgRNA的载体采用LentiCRISPRv2。
(2)用慢病毒包装sgRNA文库：
无菌条件下，培养293FT细胞，并用Roche的转染试剂X-tremeGENEHPDNATransfectionReagent将LentiCRISPRv2及另外两种病毒包装质粒psPAX2和pMD2.G包装慢病毒。按照4：3：1的比例转染293FT细胞，以10cm的培养皿为例LentiCRISPRv2、psPAX2、pMD2.G的质粒质量分别为6μg、4.5μg、1.5μg，X-tremeGENEHPDNATransfectionReagent的量为30μL。细胞转染后15小时换液，并于之后的24小时和48小时收取病毒液，将两次收取的病毒液轻轻混匀，用0.44μM的滤器过滤病毒液，除去细胞碎片；
(3)sgRNA文库在细胞中筛选：
选取合适的病毒量，感染待检测的癌细胞系，感染48小时后，用puromycin筛选2天,所得阳性细胞收取部分作为对照组，其他细胞继续培养至45天左右后收取。为确定病毒量，要确定病毒的感染效率。发明利用感染病毒细胞对puromycin的抗性进行检测。在六孔板中培养细胞至融合度70％，用100μL、200μL、300μL、400μL、500μL的病毒液感染细胞，取能感染50％左右细胞的病毒量作为合适病毒量进行后续试验；
(4)提取筛选所得细胞及筛选前细胞的基因组DNA：
用细胞裂解液裂解细胞，吹打混匀后，加入RNase酶，65℃孵育30分钟，再加终浓度为10μg/ml的蛋白酶K，55℃孵育过夜。用纯化液(体积比25:24:1的酚、氯仿与异戊醇的混合液)抽提DNA片段；细胞裂解液的成分为400μMNaCl、0.2％SDS、2mMEDTA、10mMTris-HCl。
(5)富集基因组DNA中的sgRNA
用限制性内切酶对基因组DNA进行酶切，37℃反应过夜，将酶切后的DNA片段放置在0.8wt％的低熔点琼脂糖胶中，80V，1小时电泳，切胶回收1600-2000bp的DNA片段；限制性内切酶反应体系为50μL中：6μgDNA、5μL10×NEBbuffer，限制性内切酶EcoNⅠ3μL。
(6)sgRNA文库构建与测序：
文库按照illumina公司的建库试剂盒说明书构建，将建好文库进行Hiseq2000的50SE进行高通量测序，结果进行生物信息分析。
目前对肝癌原代细胞进行癌症相关基因的筛选还没有常规方法。
本发明结合现有的CRISPR/Cas9大规模筛选基因的方法，得到了一个筛选肝癌原代细胞进行癌症相关基因的方法。肝癌原代细胞与普通细胞相比病毒感染困难，需要高感染能力的病毒。本发明中步骤(2)的病毒感染效率高，无需浓缩，只需要采用25000rpm的转速即可。而通过方法需要超高速离心机(50000g)，超高速离心机价格昂贵。感染效率的确定上常规方法常用病毒PCR法，需要制作标曲和收集感染细胞，通常需要2周的时间。而本发明中的方法只需要5-6天时间，节省了一倍的时间。常规sgRNA建库直接使用基因组DNA为模板，10-7细胞的需要提出6.6μg的DNA作为模板进行后续试验，而本发明在建库前加入限制性内切酶富集sgRNA,本发明只需要100ng就足够。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种应用于大规模筛选癌症基因的CRISPR/Cas9富集测序方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)sgRNA文库建立：
设计待筛选癌症基因群的sgRNA，或直接购买靶向于全基因组sgRNA文库，sgRNA的载体采用LentiCRISPRv2；
(2)用慢病毒包装sgRNA文库：
无菌条件下，培养293FT细胞，并用转染试剂X-tremeGENEHPDNATransfectionReagent将LentiCRISPRv2及另外两种病毒包装质粒psPAX2和pMD2.G共转染至293FT细胞中，培养细胞，收获病毒液；
(3)sgRNA文库在细胞中的筛选：
选取合适的病毒量，感染待检测的癌细胞系，感染48小时后，用puromycin筛选2天，所得阳性细胞收取部分作为对照组，其他细胞继续培养至40-46天后收取作为实验组；
(4)提取筛选所得细胞及筛选前细胞的基因组DNA：
用细胞裂解液裂解细胞，吹打混匀后，加入RNase酶，65℃孵育30分钟，再加终浓度为10μg/ml的蛋白酶K，55℃孵育过夜，用纯化液抽提DNA片段；
(5)富集基因组DNA中的sgRNA：
用限制性内切酶对基因组DNA进行酶切，37℃反应过夜，将酶切后的DNA片段放置在0.8wt％的低熔点琼脂糖胶中，80V，1小时电泳，切胶回收1600-2000bp的DNA片段；
(6)sgRNA文库构建与测序：
文库按照建库试剂盒说明书构建，将建好文库进行Hiseq2000的50SE进行高通量测序，结果进行生物信息分析。
2.根据权利要求1所述的一种应用于大规模筛选癌症基因的CRISPR/Cas9富集测序方法，其特征在于，步骤(2)中，CRISPRv2、psPAX2、pMD2.G按照质量比4：3：1的比例转染293FT细胞。
3.根据权利要求2所述的一种应用于大规模筛选癌症基因的CRISPR/Cas9富集测序方法，其特征在于，步骤(2)中，LentiCRISPRv2与X-tremeGENEHPDNATransfectionReagent的比例关系为6μg：30μL。
4.根据权利要求1所述的一种应用于大规模筛选癌症基因的CRISPR/Cas9富集测序方法，其特征在于，步骤(2)中，细胞转染后15小时换液，并于之后的24小时和48小时收取病毒液，将两次收取的病毒液轻轻混匀，用0.44μM的滤器过滤病毒液，除去细胞碎片。
5.根据权利要求1所述的一种应用于大规模筛选癌症基因的CRISPR/Cas9富集测序方法，其特征在于，步骤(3)中，病毒感染效率通过感染病毒细胞对puromycin的抗性进行检测，在六孔板中培养细胞至融合度70％，用100μL、200μL、300μL、400μL、500μL的病毒液感染细胞，取能感染45-55％细胞的病毒量作为合适病毒量进行后续试验。
6.根据权利要求1所述的一种应用于大规模筛选癌症基因的CRISPR/Cas9富集测序方法，其特征在于，步骤(4)中，细胞裂解液的成分为400μMNaCl、0.2％SDS、2mMEDTA、10mMTris-HCl。
7.根据权利要求1所述的一种应用于大规模筛选癌症基因的CRISPR/Cas9富集测序方法，其特征在于，步骤(4)中，纯化液为体积比25:24:1的酚、氯仿与异戊醇的混合液。
8.根据权利要求1所述的一种应用于大规模筛选癌症基因的CRISPR/Cas9富集测序方法，其特征在于，步骤(5)中，限制性内切酶反应体系为：50μL中，含有6μgDNA，5μL10×NEBbuffer，限制性内切酶EcoNⅠ3μL。
9.根据权利要求1所述的一种应用于大规模筛选癌症基因的CRISPR/Cas9富集测序方法，其特征在于，待检测的癌细胞系包括肺癌细胞与肝癌原代细胞。
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Cited By (27)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9526784B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-12-27 | President And Fellows Of Harvard College | Delivery system for functional nucleases |
| CN106399377A (zh) * | 2016-09-07 | 2017-02-15 | 同济大学 | 一种基于CRISPR/Cas9高通量技术筛选药物靶点基因的方法 |
| US9840699B2 (en) | 2013-12-12 | 2017-12-12 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for nucleic acid editing |
| CN108205614A (zh) * | 2017-12-29 | 2018-06-26 | 苏州金唯智生物科技有限公司 | 一种全基因组sgRNA文库的构建系统及其应用 |
| US10077453B2 (en) | 2014-07-30 | 2018-09-18 | President And Fellows Of Harvard College | CAS9 proteins including ligand-dependent inteins |
| US10113163B2 (en) | 2016-08-03 | 2018-10-30 | President And Fellows Of Harvard College | Adenosine nucleobase editors and uses thereof |
| US10167457B2 (en) | 2015-10-23 | 2019-01-01 | President And Fellows Of Harvard College | Nucleobase editors and uses thereof |
| US10227581B2 (en) | 2013-08-22 | 2019-03-12 | President And Fellows Of Harvard College | Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof |
| US10323236B2 (en) | 2011-07-22 | 2019-06-18 | President And Fellows Of Harvard College | Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity |
| US10508298B2 (en) | 2013-08-09 | 2019-12-17 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for identifying a target site of a CAS9 nuclease |
| US10597679B2 (en) | 2013-09-06 | 2020-03-24 | President And Fellows Of Harvard College | Switchable Cas9 nucleases and uses thereof |
| CN111471745A (zh) * | 2020-03-30 | 2020-07-31 | 华中农业大学 | 基于CRISPR/Cas9系统介导的DNA靶向捕获方法 |
| US10745677B2 (en) | 2016-12-23 | 2020-08-18 | President And Fellows Of Harvard College | Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection |
| US10858639B2 (en) | 2013-09-06 | 2020-12-08 | President And Fellows Of Harvard College | CAS9 variants and uses thereof |
| US11268082B2 (en) | 2017-03-23 | 2022-03-08 | President And Fellows Of Harvard College | Nucleobase editors comprising nucleic acid programmable DNA binding proteins |
| US11306324B2 (en) | 2016-10-14 | 2022-04-19 | President And Fellows Of Harvard College | AAV delivery of nucleobase editors |
| US11319532B2 (en) | 2017-08-30 | 2022-05-03 | President And Fellows Of Harvard College | High efficiency base editors comprising Gam |
| CN114574524A (zh) * | 2022-03-14 | 2022-06-03 | 深圳市体内生物医药科技有限公司 | 一种从全基因组中筛选肝癌抑癌基因的方法及其应用 |
| US11447770B1 (en) | 2019-03-19 | 2022-09-20 | The Broad Institute, Inc. | Methods and compositions for prime editing nucleotide sequences |
| US11542509B2 (en) | 2016-08-24 | 2023-01-03 | President And Fellows Of Harvard College | Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing |
| US11542496B2 (en) | 2017-03-10 | 2023-01-03 | President And Fellows Of Harvard College | Cytosine to guanine base editor |
| US11560566B2 (en) | 2017-05-12 | 2023-01-24 | President And Fellows Of Harvard College | Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation |
| US11661590B2 (en) | 2016-08-09 | 2023-05-30 | President And Fellows Of Harvard College | Programmable CAS9-recombinase fusion proteins and uses thereof |
| US11732274B2 (en) | 2017-07-28 | 2023-08-22 | President And Fellows Of Harvard College | Methods and compositions for evolving base editors using phage-assisted continuous evolution (PACE) |
| US11795443B2 (en) | 2017-10-16 | 2023-10-24 | The Broad Institute, Inc. | Uses of adenosine base editors |
| US11898179B2 (en) | 2017-03-09 | 2024-02-13 | President And Fellows Of Harvard College | Suppression of pain by gene editing |
| US11912985B2 (en) | 2020-05-08 | 2024-02-27 | The Broad Institute, Inc. | Methods and compositions for simultaneous editing of both strands of a target double-stranded nucleotide sequence |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2014183066A2 (en) * | 2013-05-10 | 2014-11-13 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Protein modification of living cells using sortase |
| WO2014204723A1 (en) * | 2013-06-17 | 2014-12-24 | The Broad Institute Inc. | Oncogenic models based on delivery and use of the crispr-cas systems, vectors and compositions |
| WO2015089486A2 (en) * | 2013-12-12 | 2015-06-18 | The Broad Institute Inc. | Systems, methods and compositions for sequence manipulation with optimized functional crispr-cas systems |
-
2015
- 2015-12-14 CN CN201510927424.7A patent/CN105400773B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2014183066A2 (en) * | 2013-05-10 | 2014-11-13 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Protein modification of living cells using sortase |
| WO2014204723A1 (en) * | 2013-06-17 | 2014-12-24 | The Broad Institute Inc. | Oncogenic models based on delivery and use of the crispr-cas systems, vectors and compositions |
| WO2015089486A2 (en) * | 2013-12-12 | 2015-06-18 | The Broad Institute Inc. | Systems, methods and compositions for sequence manipulation with optimized functional crispr-cas systems |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| F ANN RAN等: "Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system", 《NATURE PROTOCOLS》 * |
Cited By (47)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10323236B2 (en) | 2011-07-22 | 2019-06-18 | President And Fellows Of Harvard College | Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity |
| US10954548B2 (en) | 2013-08-09 | 2021-03-23 | President And Fellows Of Harvard College | Nuclease profiling system |
| US11920181B2 (en) | 2013-08-09 | 2024-03-05 | President And Fellows Of Harvard College | Nuclease profiling system |
| US10508298B2 (en) | 2013-08-09 | 2019-12-17 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for identifying a target site of a CAS9 nuclease |
| US10227581B2 (en) | 2013-08-22 | 2019-03-12 | President And Fellows Of Harvard College | Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof |
| US11046948B2 (en) | 2013-08-22 | 2021-06-29 | President And Fellows Of Harvard College | Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof |
| US9999671B2 (en) | 2013-09-06 | 2018-06-19 | President And Fellows Of Harvard College | Delivery of negatively charged proteins using cationic lipids |
| US10912833B2 (en) | 2013-09-06 | 2021-02-09 | President And Fellows Of Harvard College | Delivery of negatively charged proteins using cationic lipids |
| US10858639B2 (en) | 2013-09-06 | 2020-12-08 | President And Fellows Of Harvard College | CAS9 variants and uses thereof |
| US10682410B2 (en) | 2013-09-06 | 2020-06-16 | President And Fellows Of Harvard College | Delivery system for functional nucleases |
| US11299755B2 (en) | 2013-09-06 | 2022-04-12 | President And Fellows Of Harvard College | Switchable CAS9 nucleases and uses thereof |
| US9526784B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-12-27 | President And Fellows Of Harvard College | Delivery system for functional nucleases |
| US9737604B2 (en) | 2013-09-06 | 2017-08-22 | President And Fellows Of Harvard College | Use of cationic lipids to deliver CAS9 |
| US10597679B2 (en) | 2013-09-06 | 2020-03-24 | President And Fellows Of Harvard College | Switchable Cas9 nucleases and uses thereof |
| US10465176B2 (en) | 2013-12-12 | 2019-11-05 | President And Fellows Of Harvard College | Cas variants for gene editing |
| US9840699B2 (en) | 2013-12-12 | 2017-12-12 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for nucleic acid editing |
| US11124782B2 (en) | 2013-12-12 | 2021-09-21 | President And Fellows Of Harvard College | Cas variants for gene editing |
| US11053481B2 (en) | 2013-12-12 | 2021-07-06 | President And Fellows Of Harvard College | Fusions of Cas9 domains and nucleic acid-editing domains |
| US10077453B2 (en) | 2014-07-30 | 2018-09-18 | President And Fellows Of Harvard College | CAS9 proteins including ligand-dependent inteins |
| US11578343B2 (en) | 2014-07-30 | 2023-02-14 | President And Fellows Of Harvard College | CAS9 proteins including ligand-dependent inteins |
| US10704062B2 (en) | 2014-07-30 | 2020-07-07 | President And Fellows Of Harvard College | CAS9 proteins including ligand-dependent inteins |
| US11214780B2 (en) | 2015-10-23 | 2022-01-04 | President And Fellows Of Harvard College | Nucleobase editors and uses thereof |
| US10167457B2 (en) | 2015-10-23 | 2019-01-01 | President And Fellows Of Harvard College | Nucleobase editors and uses thereof |
| US10947530B2 (en) | 2016-08-03 | 2021-03-16 | President And Fellows Of Harvard College | Adenosine nucleobase editors and uses thereof |
| US10113163B2 (en) | 2016-08-03 | 2018-10-30 | President And Fellows Of Harvard College | Adenosine nucleobase editors and uses thereof |
| US11702651B2 (en) | 2016-08-03 | 2023-07-18 | President And Fellows Of Harvard College | Adenosine nucleobase editors and uses thereof |
| US11661590B2 (en) | 2016-08-09 | 2023-05-30 | President And Fellows Of Harvard College | Programmable CAS9-recombinase fusion proteins and uses thereof |
| US11542509B2 (en) | 2016-08-24 | 2023-01-03 | President And Fellows Of Harvard College | Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing |
| CN106399377A (zh) * | 2016-09-07 | 2017-02-15 | 同济大学 | 一种基于CRISPR/Cas9高通量技术筛选药物靶点基因的方法 |
| US11306324B2 (en) | 2016-10-14 | 2022-04-19 | President And Fellows Of Harvard College | AAV delivery of nucleobase editors |
| US11820969B2 (en) | 2016-12-23 | 2023-11-21 | President And Fellows Of Harvard College | Editing of CCR2 receptor gene to protect against HIV infection |
| US10745677B2 (en) | 2016-12-23 | 2020-08-18 | President And Fellows Of Harvard College | Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection |
| US11898179B2 (en) | 2017-03-09 | 2024-02-13 | President And Fellows Of Harvard College | Suppression of pain by gene editing |
| US11542496B2 (en) | 2017-03-10 | 2023-01-03 | President And Fellows Of Harvard College | Cytosine to guanine base editor |
| US11268082B2 (en) | 2017-03-23 | 2022-03-08 | President And Fellows Of Harvard College | Nucleobase editors comprising nucleic acid programmable DNA binding proteins |
| US11560566B2 (en) | 2017-05-12 | 2023-01-24 | President And Fellows Of Harvard College | Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation |
| US11732274B2 (en) | 2017-07-28 | 2023-08-22 | President And Fellows Of Harvard College | Methods and compositions for evolving base editors using phage-assisted continuous evolution (PACE) |
| US11319532B2 (en) | 2017-08-30 | 2022-05-03 | President And Fellows Of Harvard College | High efficiency base editors comprising Gam |
| US11932884B2 (en) | 2017-08-30 | 2024-03-19 | President And Fellows Of Harvard College | High efficiency base editors comprising Gam |
| US11795443B2 (en) | 2017-10-16 | 2023-10-24 | The Broad Institute, Inc. | Uses of adenosine base editors |
| CN108205614A (zh) * | 2017-12-29 | 2018-06-26 | 苏州金唯智生物科技有限公司 | 一种全基因组sgRNA文库的构建系统及其应用 |
| US11643652B2 (en) | 2019-03-19 | 2023-05-09 | The Broad Institute, Inc. | Methods and compositions for prime editing nucleotide sequences |
| US11447770B1 (en) | 2019-03-19 | 2022-09-20 | The Broad Institute, Inc. | Methods and compositions for prime editing nucleotide sequences |
| US11795452B2 (en) | 2019-03-19 | 2023-10-24 | The Broad Institute, Inc. | Methods and compositions for prime editing nucleotide sequences |
| CN111471745A (zh) * | 2020-03-30 | 2020-07-31 | 华中农业大学 | 基于CRISPR/Cas9系统介导的DNA靶向捕获方法 |
| US11912985B2 (en) | 2020-05-08 | 2024-02-27 | The Broad Institute, Inc. | Methods and compositions for simultaneous editing of both strands of a target double-stranded nucleotide sequence |
| CN114574524A (zh) * | 2022-03-14 | 2022-06-03 | 深圳市体内生物医药科技有限公司 | 一种从全基因组中筛选肝癌抑癌基因的方法及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105400773B (zh) | 2018-06-26 |
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