CN106222177B - 一种靶向人STAT6的CRISPR-Cas9系统及其用于治疗过敏性疾病的应用 - Google Patents
一种靶向人STAT6的CRISPR-Cas9系统及其用于治疗过敏性疾病的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106222177B CN106222177B CN201610668016.9A CN201610668016A CN106222177B CN 106222177 B CN106222177 B CN 106222177B CN 201610668016 A CN201610668016 A CN 201610668016A CN 106222177 B CN106222177 B CN 106222177B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- stat6
- sgrna
- crispr
- seq
- genes
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
- A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了一种针对STAT6进行基因敲除的CRISPR敲除系统，其中提供了多个sgRNA可以实现STAT6基因的高效敲除。本发明设计、合成了在CRISPR‑Cas9特异性敲除人STAT6基因中特异性靶向STAT6基因的sgRNA，并分别将该sgRNA寡核苷酸载体与酶切质粒一起成功转染细胞即可实现STAT6基因的敲除。本申请提供了一种利用Cas9/sgRNA快速、简便、高效、特异性敲除STAT6的策略。效率高，STAT6敲除效率达到80%以上；既可以针对STAT6的单个编码序列也可以针对片段进行同时敲除。sgRNA只需要小量合成多核苷酸片断，就能大批量生产，节约成本提高了效率。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，更具体地说涉及CRISPR-Cas9特异性敲除人STAT6基因的方法以及用于特异性靶向STAT6基因的sgRNA。
背景技术
支气管哮喘(简称哮喘)是由嗜酸粒细胞、肥大细胞、T细胞及白细胞等多种细胞及细胞组分参与的慢性气道炎症，在慢性炎症基础上伴随气道的高反应性(airwayhyperresponsiveness)和气道重建(airway remodelling)，其本质是气道慢性炎症。哮喘是世界公认的医学难题，被世界卫生组织列为疾病中四大顽症之一。近十多年来，世界上许多国家和地区哮喘的发病率和病死率均呈增高趋势，运一现象已引起世界卫生组织(WHO)和各国政府的重视。
哮喘以可恢复的支气管阻塞、炎性细胞浸润和气道高反应性为其特征。哮喘设及嗜酸性粒细胞、肥大细胞和T淋己细胞等多种炎症细胞、炎症介质、细胞因子的相互作用，呈现一种慢性气道炎症过程和气道高反应，从而引起可逆性气道阻塞，即迟发性哮喘反应。有报道指出，哮喘病人气道中肥大细胞数量增加，哮喘发作病人气道肥大细胞的活动性增强，气道活检标本中显示肥大细胞脱颗粒，支气管肺泡灌洗液中肥大细胞的产物增加。
目前认为,哮喘主要是气道慢性非特异性炎症,是一种多基因病,其发病由环境和遗传共同作用所致.STAT6是JAKs-STATs传导通路中的重要因子,哮喘的发病机制中很多因子都涉及STAT6。STAT6基因位于人类12q13-24,此为过敏性疾病如哮喘等的重要候选基因，近年来STAT6及基因研究在哮喘发病中的地位和作用也越来越重要。
有报道指出STAT6基因敲除小鼠的化细胞不能分化为化2细胞，而且B细胞不能产生IgEeEotaxin属于嗜酸性粒细胞趋化因子，其主要可吸引嗜酸粒细胞在肺内的募集，促进其粘附在血管内皮细胞上，进而导致组织损伤。有研究报道AL0X15有助于哮喘的发病机制，并且上皮细胞过表达AL0X15与疾病的严重度相关联。STAT6作为转录因子对Eotaxin和AL0X15的mRNA表达具有增强作用。
规律成族间隔短回文重复系统(clustered regularly interspaced shortpalindromic repeat；CRISPR-associated，CRISPR_Cas9)是一种具有核酸内切酶活性的复合体，识别特定的DNA序列，进行特定位点切割造成双链DNA断裂(Double-strand breaks，DSB)，在没有模板的条件下，发生非同源重组末端连接(Non-homologous end joining，NHEJ)，造成移码突变(frameshift mutation)，导致基因敲除(图1)。
这一技术由于能快速、简便、高效地靶向基因组任何基因，从而引起了广泛的关注，在2012年开始像爆炸一般流行开来。由于其容易操作、可以同时靶向多个基因，可以高通量制备、造价低等优势，Cas9已经成为一种发展最快的技术(Pennisi，2013)。正是由于其优越性，这一技术在Nature推荐的2013十大进展中位列第一。
Cas9靶向切割DNA是通过两种小RNA--crRNA(CRISPR RNA)和tracrRNA(trans-activating crRNA)和革E序列互补识别的原理实现的。现在已经把两种小RNA融合成一条RNA链，简称sgRNA(single guide RNA)。因此，sgRNA能否做到特异性、精确祀向目标基因是CRISPR-Cas9能否特异性敲除目标基因的先决条件，无论是脱靶还是错误靶向，都会影响CRISPR-Cas9对目标基因的特异性敲除。因此，能够设计、制备出精确性和特异性靶向目标基因的sgRNA成为CRISPR-Cas9基因敲除的关键技术(图1)。
与ZFN相比，CRISPR-Cas9具有更快速、简便、高效、多位点、特异性靶向敲除基因的优势。为高效靶向敲除CCR5,实现艾滋病及其相关疾病的治疗提供了一种可能的选择。本发明的目的就是要验证利用CRISPR-Cas9高效靶向敲除STAT6提供相应的技术方案，以达到特异性敲除STAT6的目的。
发明内容
针对现有使用同源重组或者ZFN靶向STAT6进行过敏性疾病治疗所存在的问题：(1)效率较低，只能少量敲除STAT6；(2)设计与合成一对特异性的ZFN费时、费力、费钱，使得其花费昂贵等。同源重组的方法效率低下的问题。本发明设计、合成了在CRISPR-Cas9特异性敲除人STAT6基因中特异性靶向STAT6基因的sgRNA，并分别将该sgRNA寡核苷酸载体与酶切质粒一起成功转染细胞即可实现STAT6基因的敲除。本申请提供了一种利用Cas9/sgRNA快速、简便、高效、特异性敲除STAT6的策略。有效地解决了利用ZFN治疗存在的问题：(1)效率高，STAT6敲除效率达到80％以上；(2)既可以针对STAT6的单个编码序列也可以针对片段进行同时敲除。sgRNA只需要小量合成多核苷酸片断，就能大批量生产，节约成本提高了效率。
为了解决上述技术问题，本申请的技术方案如下:
一、sgRNA寡核普酸的设计和选择
1.靶向STAT6基因的sgRNA的设计:
因为没有使用体外转录，只是构建普通载体的方式制作。所以如无特殊说明，文中的sgRNA序列指的是sgRNA对应DNA序列。
首先在STAT6基因上选择5’-GGN(19)GG的序列，如果没有5’-GGN(19)GG的序列，5’-GN(20)GG或者5’-N(21)GG也可以。sgRNA在STAT6基因上的靶向位点位于基因的外显子。在UCSC数据库中用BLAT或NCBI数据库中用BLAST，确定sgRNA的靶序列是否唯一。同时根据其他的sgRNA的设计规则，共设计了97个sgRNA，然而通过最后的实验证实，其中只有15个具有靶向修饰的功能，在此，没有功能的序列就不一一列举，仅仅给出3个反例，这也充分说明在现有技术中，sgRNA的设计并不能仅仅根据设计规则不需要实验即可得到有功能的sgRNA，本发明涉及的sgRNA序列如下：
STAT6-sg1：ggaagtgcccgctgagaaagg(SEQ ID NO:2)
STAT6-sg2：gcggcatcttctgggtgactgg(SEQ ID NO:3)
STAT6-sg3：cgacgccttctgctgcaacttgg(SEQ ID NO:4)
STAT6-sg4：gtccagcaccttcaggcctcgg(SEQ ID NO:5)
STAT6-sg5：acccttgagagcatatatcagagg(SEQ ID NO:6)
STAT6-sg6：gaagaactcaagtttaagacagg(SEQ ID NO:7)
STAT6-sg7：gccctggccatgctactgcagg(SEQ ID NO:8)
STAT6-sg8：gtcaccagttgcttcctggtgg(SEQ ID NO:9)
STAT6-sg9：gcgggagctgagtgtgcctcagg(SEQ ID NO:10)
STAT6-sg10：ccaggccctgtctctgcccctgg(SEQ ID NO:11)
STAT6-sg11：ggacaatgccttctctgagatgg(SEQ ID NO:12)
STAT6-sg12：caatgacaacagcctcagtatgg(SEQ ID NO:13)
STAT6-sg13：ggacctcaccaaacgctgtctccgg(SEQ ID NO:14)
STAT6-sg14：cactacaagcctgaacagatgg(SEQ ID NO:15)
STAT6-sg15：ggcccagatatggtgccccagg(SEQ ID NO:16)
STAT6-sg16：gagagcctggccccactccagg(SEQ ID NO:17)
STAT6-sg17：tccgctggtcagggccgacatgg(SEQ ID NO:18)
STAT6-sg18：tcccagagcacttcctcttcctgg(SEQ ID NO:19)
二、构建sgRNA的寡聚核苷酸双链
根据选择的sgRNA,在其5’加上CCGG得到正向寡核苷酸(Forward oligo)(如果序列本身在5’端已经有I或者2个G，那么就对应的省略I或者2个G)；根据选择的sgRNA，获得其对应DNA的互补链，并且在其5’加上AAAC得到反向寡核苷酸(Reverse oligo)。分别合成上述正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，将合成的sgRNA寡聚核苷酸的forward oligo和reverseoligo成对变性、退火,退火之后形成可以连入U6真核表达载体的双链,如下:
针对STAT6-sg1：ggaagtgcccgctgagaaagg，设计的正向寡核苷酸(Forward oligo)为：CCggaagtgcccgctgagaaagg(SEQ ID NO：20)；反向寡核苷酸(Reverse oligo)为aaaccctttctcagcgggcac(SEQ ID NO：21)。
三、sgRNA寡聚核普酸质粒的构建
1.线性化pGL3-U6-sgRNA质粒。
2.将退火的sgRNA寡聚核普酸双链与线性化pGL3-U6-sgRNA质粒连接获得pGL3-U6-stat6-sg1质粒。
3.转化并涂Amp+平板(50微克/ml)。
4.用通用引物U6测序的方法鉴定阳性克隆，所述引物为atggactatcatatgcttaccgta。
5.37度摇床摇菌过夜并用质粒抽提试剂盒抽提pGL3-U6-hPDlsg质粒。
四、转染细胞获得STAT6基因敲除细胞
1、按照LipofectamineTM2000Transfection Reagent(Invitrogen,11668-019)的操作手册，将分别带有对应sgRNA寡聚核苷酸的pGL3-U6-stat6-sg1质粒与pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF质粒混匀，共转染细胞。
2、用T7EN1酶切检测和TA克隆测序确认STAT6基因己经被敲除。
附图说明
图1：CRISPR系统的工作原理
图2：STAT6基因敲除前后细胞内ECMl的蛋白表达量的差异图
具体实施方式
下面结合附图和具体的实施例对本发明的技术方案做进一步介绍。
实施例1sgRNA的设计
首先根据SEQ ID NO：1所示的STAT6基因上选择5’-GGN(19)GG的序列，如果没有5’-GGN(19)GG的序列，5’-GN(20)GG或者5’-N(21)GG也可以。sgRNA在STAT6基因上的靶向位点位于基因的外显子。在UCSC数据库中用BLAT或NCBI数据库中用BLAST，确定sgRNA的靶序列是否唯一。同时根据其他的sgRNA的设计规则，共设计了97个sgRNA，然而通过最后的实验证实，其中只有15个具有靶向修饰的功能，在此，没有功能的序列就不一一列举，仅仅给出3个反例，这也充分说明在现有技术中，sgRNA的设计并不不能仅仅根据设计规则不需要实验即可得到有功能的sgRNA，本发明涉及的sgRNA序列如下：
STAT6-sg1：ggaagtgcccgctgagaaagg(SEQ ID NO:2)
STAT6-sg2：gcggcatcttctgggtgactgg(SEQ ID NO:3)
STAT6-sg3：cgacgccttctgctgcaacttgg(SEQ ID NO:4)
STAT6-sg4：gtccagcaccttcaggcctcgg(SEQ ID NO:5)
STAT6-sg5：acccttgagagcatatatcagagg(SEQ ID NO:6)
STAT6-sg6：gaagaactcaagtttaagacagg(SEQ ID NO:7)
STAT6-sg7：gccctggccatgctactgcagg(SEQ ID NO:8)
STAT6-sg8：gtcaccagttgcttcctggtgg(SEQ ID NO:9)
STAT6-sg9：gcgggagctgagtgtgcctcagg(SEQ ID NO:10)
STAT6-sg10：ccaggccctgtctctgcccctgg(SEQ ID NO:11)
STAT6-sg11：ggacaatgccttctctgagatgg(SEQ ID NO:12)
STAT6-sg12：caatgacaacagcctcagtatgg(SEQ ID NO:13)
STAT6-sg13：ggacctcaccaaacgctgtctccgg(SEQ ID NO:14)
STAT6-sg14：cactacaagcctgaacagatgg(SEQ ID NO:15)
STAT6-sg15：ggcccagatatggtgccccagg(SEQ ID NO:16)
STAT6-sg16：gagagcctggccccactccagg(SEQ ID NO:17)
STAT6-sg17：tccgctggtcagggccgacatgg(SEQ ID NO:18)
STAT6-sg18：tcccagagcacttcctcttcctgg(SEQ ID NO:19)
实施例2、构建sgRNA的寡聚核苷酸双链
根据选择的sgRNA：STAT6-sg1,在其5’加上CCGG得到正向寡核苷酸(Forwardoligo)(如果序列本身在5’端已经有1或者2个G，那么就对应的省略1或者2个G)；根据选择的sgRNA，获得其对应DNA的互补链，并且在其5’加上AAAC得到反向寡核苷酸(Reverseoligo)。分别合成上述正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，针对STAT6-sg1：ggaagtgcccgctgagaaagg，设计的正向寡核苷酸(Forward oligo)为：CCggaagtgcccgctgagaaagg(SEQ ID NO：20)；反向寡核苷酸(Reverse oligo)为aaaccctttctcagcgggcac(SEQ ID NO：21)。
将合成的sgRNA寡聚核苷酸的forward oligo和reverse oligo成对变性、退火,退火之后形成可以连入U6真核表达载体的双链,如下:
所述条件为：2.5μl forward Oligo(100μM)，2.5μl reverse Oligo(100μM)，1u1NEB buffer，4μl灭菌水。在PCR仪中按照以下touch down程序运行:95度,5min；95-82度at-1.8度/s；85-25度at-0.1度/s；hold at4度。
实施例3、sgRNA寡聚核普酸质粒的构建
1.线性化pGL3-U6-sgRNA质粒。酶切体系和条件如下:2μg pGL3-U6-sgRNA(400ng/u 1)；1μ1CutSmart Buffer；1μ1BsaI(NEB,R0535L)；补水至50μ1,37度孵育3-4小时，每隔一段时间振荡一下并离心以防液滴蒸发至管盖上。
2.将退火的sgRNA寡聚核苷酸双链与线性化pGL3-U6-sgRNA质粒连接获得pGL3-U6-stat6-sg1质粒。
3.转化并涂Amp+平板(50微克/ml)。
4.用通用引物U6测序的方法鉴定阳性克隆，所述引物为atggactatcatatgcttaccgta。
5.37度摇床摇菌过夜并用质粒抽提试剂盒抽提pGL3-U6-stat6-sg1质粒。
实施例4、转染细胞获得STAT6基因敲除细胞
(1)HEK293T细胞接种培养于DMEM高糖培养液中(HyClone,SH30022.01B)，其中含10％FBS，penicillin(100U/ml)和streptomycin(100微克/ml)。(2)在转染前分至12孔板中，待80％密度时进行转染。按照LipofectamineTM2000Transfection Reagent(Invitrogen,11668-019)的操作手册，将分别带有对应sgRNA寡聚核苷酸的pGL3-U6-stat6-sg1质粒1微克与pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF质粒2微克混匀，共转染至每孔细胞中，6.5h换液，加入Blasticidin和Puromycin药筛，48小时后收集细胞。
T7EN1酶切检测
将收集的细胞在裂解液(10u M Tris-HCl,0.4M NaCl,2u M EDTA,1％SDS)中用100μg/ml蛋白酶K裂解消化后，酚-氯仿抽提后溶解到50u 1去离子水中。(2)使用引物，上游序列为：agagctccag ggagggacct gg，下游引物为：cagattgtgtacagtagattat(4010bp扩增大小)进行PCR扩增，纯化获得PCR回收产物，取200ng统一稀释到20u 1,在20u 1体系中加入T7EN1 0.3u 1,370C酶切30分钟后，加入2u 1lOXLoading Buffer，用2.5％的琼脂糖胶电泳检测。结果显示，通过琼脂糖胶电泳可以发现:发生断裂末端连接修复的基因组因为与原基因组不完全匹配，而被T7EN1切割。显示出较小的条带。说明基因敲除成功。
将上述步骤获得的PCR回收产物用rTaq进行加A反应。加A反应体系为:800ng PCR回收产物，5u 1lOX Buffer(Mg2+free)，3u 1Mg2+，4u 1dNTP，0.5u 1rTaq(TAKARA,ROOlAM)，补水至50u 1体系。
37度温育30分钟后，取lul产物与pMD19-T vector连接并转化感受态细胞DH5a。挑取单克隆以通用引物U6序列atggactatcatatgcttaccgta测序，根据测序结果发现:靶基因STAT6缺失了sgRNA靶序列，基因敲除成功。
实施例5
将HEK293T细胞敲除前后的各取1X 106细胞，收获后，用新鲜加入了各种抑制剂(1mM Na orthovanadate,1mMPMSF,10μg/ml Aprotinin,Leupeptin,胃酶抑素)的2Oμl裂解液(5OmMHEPES[pΗ7.0],1％NP-40,5mM EDTA,450mM NaCl,IOmM Na pyrophosphate和50mMNaF)在室温下超声处理后，加入I％β巯基乙醇，100℃中放置5分钟。在SDS-PAGE胶中，每孔上样10μ1样品。电泳后转膜将蛋白样品转移到硝酸纤维素膜上。转膜结束后用TTBS洗膜一次，用5％脱脂奶粉封闭膜1小时，用TTBS洗膜一次，将稀释后的一抗与膜室温杂交2小时或4℃过夜。用TTBS洗涤三次后将稀释后的二抗与膜室温杂交1小时，用TTBS洗涤后加入底物显色，暗室曝光，其中以actin作为内参蛋白对照。
结果显示，敲除了STAT6基因的细胞中的ECMl蛋白的表达相对于原始细胞，蛋白的表达量显著下降86.4％，这也充分的说明，通过敲除STAT6，可以用于治疗过敏性疾病。
实施例6其它sgRNA效果验证
sgRNA选择STAT6-sg2～18，按照实施例2-5相同的实验方法进行相应的基因敲除以及蛋白水平检测，在此，由于步骤基本相同，具体的操作条件就不一一赘述。通过实验发现，STAT6-sg2～15，这14个sgRNA可以实现基因的敲除，其效率达到了85％，而STAT6-sg16、STAT6-sg17、STAT6-sg18都没有实现基因的敲除，这也说明sgRNA的选择并非简单容易的。
另外蛋白表达水平检测的结果如下：
从以上结果可以看出，STAT6-sg1～15都能够实现基因的敲除，并且都能够达到相似的降低ECMl蛋白表达的效果。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
〈110〉李蒙
〈120〉一种靶向人STAT6的CRISPR-Cas9系统及其用于治疗过敏性疾病的应用
〈160〉19
〈210〉1
〈211〉4031
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉STAT6
1 agagctccag ggagggacct gggtagaagg agaagccgga aacagcgggctggggcagcc
61 actgcttaca ctgaagaggg aggacgggag aggagtgtgt gtgtgtgtgtgtgtgtgtgt
121 gtgtatgtat gtgtgtgctt tatcttattt ttctttttgg tggtggtggtggaagggggg
181 aggtgctagc agggccagcc ttgaactcgc tggacagagc tacagacctatggggcctgg
241 aagtgcccgc tgagaaaggg agaagacagc agaggggttg ccgaggcaacctccaagtcc
301 cagatcatgt ctctgtgggg tctggtctcc aagatgcccc cagaaaaagtgcagcggctc
361 tatgtcgact ttccccaaca cctgcggcat cttctgggtg actggctggagagccagccc
421 tgggagttcc tggtcggctc cgacgccttc tgctgcaact tggctagtgccctactttca
481 gacactgtcc agcaccttca ggcctcggtg ggagagcagg gggaggggagcaccatcttg
541 caacacatca gcacccttga gagcatatat cagagggacc ccctgaagctggtggccact
601 ttcagacaaa tacttcaagg agagaaaaaa gctgttatgg aacagttccgccacttgcca
661 atgcctttcc actggaagca ggaagaactc aagtttaaga caggcttgcggaggctgcag
721 caccgagtag gggagatcca ccttctccga gaagccctgc agaagggggctgaggctggc
781 caagtgtctc tgcacagctt gatagaaact cctgctaatg ggactgggccaagtgaggcc
841 ctggccatgc tactgcagga gaccactgga gagctagagg cagccaaagccctagtgctg
901 aagaggatcc agatttggaa acggcagcag cagctggcag ggaatggcgcaccgtttgag
961 gagagcctgg ccccactcca ggagaggtgt gaaagcctgg tggacatttattcccagcta
1021 cagcaggagg taggggcggc tggtggggag cttgagccca agacccgggcatcgctgact
1081 ggccggctgg atgaagtcct gagaaccctc gtcaccagtt gcttcctggtggagaagcag
1141 cccccccagg tactgaagac tcagaccaag ttccaggctg gagttcgattcctgttgggc
1201 ttgaggttcc tgggggcccc agccaagcct ccgctggtca gggccgacatggtgacagag
1261 aagcaggcgc gggagctgag tgtgcctcag ggtcctgggg ctggagcagaaagcactgga
1321 gaaatcatca acaacactgt gcccttggag aacagcattc ctgggaactgctgctctgcc
1381 ctgttcaaga acctgcttct caagaagatc aagcggtgtg agcggaagggcactgagtct
1441 gtcacagagg agaagtgcgc tgtgctcttc tctgccagct tcacacttggccccggcaaa
1501 ctccccatcc agctccaggc cctgtctctg cccctggtgg tcatcgtccatggcaaccaa
1561 gacaacaatg ccaaagccac tatcctgtgg gacaatgcct tctctgagatggaccgcgtg
1621 ccctttgtgg tggctgagcg ggtgccctgg gagaagatgt gtgaaactctgaacctgaag
1681 ttcatggctg aggtggggac caaccggggg ctgctcccag agcacttcctcttcctggcc
1741 cagaagatct tcaatgacaa cagcctcagt atggaggcct tccagcaccgttctgtgtcc
1801 tggtcgcagt tcaacaagga gatcctgctg ggccgtggct tcaccttttggcagtggttt
1861 gatggtgtcc tggacctcac caaacgctgt ctccggagct actggtctgaccggctgatc
1921 attggcttca tcagcaaaca gtacgttact agccttcttc tcaatgagcccgacggaacc
1981 tttctcctcc gcttcagcga ctcagagatt gggggcatca ccattgcccatgtcatccgg
2041 ggccaggatg gctctccaca gatagagaac atccagccat tctctgccaaagacctgtcc
2101 attcgctcac tgggggaccg aatccgggat cttgctcagc tcaaaaatctctatcccaag
2161 aagcccaagg atgaggcttt ccggagccac tacaagcctg aacagatgggtaaggatggc
2221 aggggttatg tcccagctac catcaagatg accgtggaaa gggaccaaccacttcctacc
2281 ccagagctcc agatgcctac catggtgcct tcttatgacc ttggaatggcccctgattcc
2341 tccatgagca tgcagcttgg cccagatatg gtgccccagg tgtacccaccacactctcac
2401 tccatccccc cgtatcaagg cctctcccca gaagaatcag tcaacgtgttgtcagccttc
2461 caggagcctc acctgcagat gccccccagc ctgggccaga tgagcctgccctttgaccag
2521 cctcaccccc agggcctgct gccgtgccag cctcaggagc atgctgtgtccagccctgac
2581 cccctgctct gctcagatgt gaccatggtg gaagacagct gcctgagccagccagtgaca
2641 gcgtttcctc agggcacttg gattggtgaa gacatattcc ctcctctgctgcctcccact
2701 gaacaggacc tcactaagct tctcctggag gggcaagggg agtcggggggagggtccttg
2761 ggggcacagc ccctcctgca gccctcccac tatgggcaat ctgggatctcaatgtcccac
2821 atggacctaa gggccaaccc cagttggtga tcccagctgg agggagaacccaaagagaca
2881 gctcttctac tacccccaca gacctgctct ggacacttgc tcatgccctgccaagcagca
2941 gatggggagg gtgccctcct atccccacct actcctgggt caggaggaaaagactaacag
3001 gagaatgcac agtgggtgga gccaatccac tccttccttt ctatcattcccctgcccacc
3061 tccttccagc actgactgga agggaagttc aggctctgag acacaccccaacatgcctgc
3121 acctgcagcg cgcacacgca cgcacacaca catacagagc tctctgagggtgatggggct
3181 gagcaggagg ggggctgggt aagagcacag gttagggcat ggaaggcttctccgcccatt
3241 ctgacccagg gcctaggacg gataggcagg aacatacaga cacatttacactagaggcca
3301 gggatagagg atattgggtc tcagccctag gggaatggga agcagctcaagggaccctgg
3361 gtgggagcat aggaggggtc tggacatgtg gttactagta caggttttgccctgattaaa
3421 aaatctccca aagccccaaa ttcctgttag ccaggtggag gcttctgatacgtgtatgag
3481 actatgcaaa agtacaaggg ctgagattct tcgtgtatag ctgtgtgaacgtgtatgtac
3541 ctaggatatg ttaaatgtat agctggcacc ttagttgcat gaccacatagaacatgtgtc
3601 tatctgcttt tgcctacgtg acaacacaaa tttgggaggg tgagacactgcacagaagac
3661 agcagcaagt gtgctggcct ctctgacata tgctaacccc caaatactctgaatttggag
3721 tctgactgtg cccaagtggg tccaagtggc tgtgacatct acgtatggctccacacctcc
3781 aatgctgcct gggagccagg gtgagagtct gggtccaggc ctggccatgtggccctccag
3841 tgtatgagag ggccctgcct gctgcatctt ttctgttgcc ccatccaccgccagcttccc
3901 ttcactcccc tatcccattc tccctctcaa ggcaggggtc atagatcctaagccataaaa
3961 taaattttat tccaaaataa caaaataaat aatctactgt acacaatctgaaaagaaaaa
4021 aaaaaaaaaa a
〈210〉2
〈211〉21
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉STAT6-sg1
ggaagtgcccgctgagaaagg
〈210〉3
〈211〉22
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉STAT6-sg2
gcggcatcttctgggtgactgg
〈210〉4
〈211〉23
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉STAT6-sg3
cgacgccttctgctgcaacttgg
〈210〉5
〈211〉22
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉STAT6-sg4
gtccagcaccttcaggcctcgg
〈210〉6
〈211〉24
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉STAT6-sg5
acccttgagagcatatatcagagg
〈210〉7
〈211〉23
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉STAT6-sg6
gaagaactcaagtttaagacagg
〈210〉8
〈211〉22
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉STAT6-sg7
gccctggccatgctactgcagg
〈210〉9
〈211〉22
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉STAT6-sg8
gtcaccagttgcttcctggtgg
〈210〉10
〈211〉24
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉STAT6-sg9
gcgggagctgagtgtgcctcaggg
〈210〉11
〈211〉23
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉STAT6-sg10
ccaggccctgtctctgcccctgg
〈210〉12
〈211〉23
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉STAT6-sg11
ggacaatgccttctctgagatgg
〈210〉13
〈211〉23
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉STAT6-sg12
caatgacaacagcctcagtatgg
〈210〉14
〈211〉25
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉STAT6-sg13
ggacctcaccaaacgctgtctccgg
〈210〉15
〈211〉22
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉STAT6-sg14
cactacaagcctgaacagatgg
〈210〉16
〈211〉22
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉STAT6-sg15
ggcccagatatggtgccccagg
〈210〉17
〈211〉22
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉STAT6-sg16
gagagcctggccccactccagg
〈210〉18
〈211〉23
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉STAT6-sg17
tccgctggtcagggccgacatgg
〈210〉19
〈211〉24
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉STAT6-sg18
tcccagagcacttcctcttcctgg
Claims (3)
1.在CRISPR-Cas9特异性敲除人STAT6基因中用于特异性靶向STAT6基因的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA对应的DNA序列如序列表SEQ ID NO：2-16任一所示。
2.一种利用CRISPR-Cas9系统在体外特异性敲除人STAT6基因的方法，其中使用的sgRNA如SEQ ID No：2-16任一所示。
3.根据权利要求1所述的sgRNA在制备用于治疗过敏性疾病的药物中的用途。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610668016.9A CN106222177B (zh) | 2016-08-13 | 2016-08-13 | 一种靶向人STAT6的CRISPR-Cas9系统及其用于治疗过敏性疾病的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610668016.9A CN106222177B (zh) | 2016-08-13 | 2016-08-13 | 一种靶向人STAT6的CRISPR-Cas9系统及其用于治疗过敏性疾病的应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN106222177A CN106222177A (zh) | 2016-12-14 |
| CN106222177B true CN106222177B (zh) | 2018-06-26 |
Family
ID=57548479
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201610668016.9A Active CN106222177B (zh) | 2016-08-13 | 2016-08-13 | 一种靶向人STAT6的CRISPR-Cas9系统及其用于治疗过敏性疾病的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN106222177B (zh) |
Families Citing this family (25)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2734621B1 (en) | 2011-07-22 | 2019-09-04 | President and Fellows of Harvard College | Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity |
| US9163284B2 (en) | 2013-08-09 | 2015-10-20 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for identifying a target site of a Cas9 nuclease |
| US9359599B2 (en) | 2013-08-22 | 2016-06-07 | President And Fellows Of Harvard College | Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof |
| US9526784B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-12-27 | President And Fellows Of Harvard College | Delivery system for functional nucleases |
| US9322037B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-04-26 | President And Fellows Of Harvard College | Cas9-FokI fusion proteins and uses thereof |
| US9340799B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-05-17 | President And Fellows Of Harvard College | MRNA-sensing switchable gRNAs |
| US9840699B2 (en) | 2013-12-12 | 2017-12-12 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for nucleic acid editing |
| AU2015298571B2 (en) | 2014-07-30 | 2020-09-03 | President And Fellows Of Harvard College | Cas9 proteins including ligand-dependent inteins |
| IL310721A (en) | 2015-10-23 | 2024-04-01 | Harvard College | Nucleobase editors and their uses |
| EP3494215A1 (en) | 2016-08-03 | 2019-06-12 | President and Fellows of Harvard College | Adenosine nucleobase editors and uses thereof |
| EP3497214B1 (en) | 2016-08-09 | 2023-06-28 | President and Fellows of Harvard College | Programmable cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof |
| WO2018039438A1 (en) | 2016-08-24 | 2018-03-01 | President And Fellows Of Harvard College | Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing |
| JP2019530464A (ja) | 2016-10-14 | 2019-10-24 | プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ | 核酸塩基エディターのａａｖ送達 |
| US10745677B2 (en) | 2016-12-23 | 2020-08-18 | President And Fellows Of Harvard College | Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection |
| WO2018165504A1 (en) | 2017-03-09 | 2018-09-13 | President And Fellows Of Harvard College | Suppression of pain by gene editing |
| CN110914310A (zh) | 2017-03-10 | 2020-03-24 | 哈佛大学的校长及成员们 | 胞嘧啶至鸟嘌呤碱基编辑器 |
| IL306092A (en) | 2017-03-23 | 2023-11-01 | Harvard College | Nucleic base editors that include nucleic acid programmable DNA binding proteins |
| WO2018209320A1 (en) | 2017-05-12 | 2018-11-15 | President And Fellows Of Harvard College | Aptazyme-embedded guide rnas for use with crispr-cas9 in genome editing and transcriptional activation |
| EP3658573A1 (en) | 2017-07-28 | 2020-06-03 | President and Fellows of Harvard College | Methods and compositions for evolving base editors using phage-assisted continuous evolution (pace) |
| WO2019139645A2 (en) | 2017-08-30 | 2019-07-18 | President And Fellows Of Harvard College | High efficiency base editors comprising gam |
| CN111757937A (zh) | 2017-10-16 | 2020-10-09 | 布罗德研究所股份有限公司 | 腺苷碱基编辑器的用途 |
| WO2019237365A1 (zh) * | 2018-06-15 | 2019-12-19 | 深圳市博奥康生物科技有限公司 | CRISPR-Cas9特异性敲除人MER6基因的方法及其特异的sgRNA |
| CN110751982B (zh) * | 2018-07-04 | 2023-11-10 | 广州赛业百沐生物科技有限公司 | 一种智能并行化敲除策略筛选的方法及系统 |
| DE112020001306T5 (de) | 2019-03-19 | 2022-01-27 | Massachusetts Institute Of Technology | Verfahren und zusammensetzungen zur editierung von nukleotidsequenzen |
| JP2023525304A (ja) | 2020-05-08 | 2023-06-15 | ザ ブロード インスティテュート，インコーポレーテッド | 標的二本鎖ヌクレオチド配列の両鎖同時編集のための方法および組成物 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1665789A (zh) * | 2002-06-28 | 2005-09-07 | 山之内制药株式会社 | 二氨基嘧啶酰胺衍生物 |
| CN103820441A (zh) * | 2014-03-04 | 2014-05-28 | 黄行许 | CRISPR-Cas9特异性敲除人CTLA4基因的方法以及用于特异性靶向CTLA4基因的sgRNA |
-
2016
- 2016-08-13 CN CN201610668016.9A patent/CN106222177B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1665789A (zh) * | 2002-06-28 | 2005-09-07 | 山之内制药株式会社 | 二氨基嘧啶酰胺衍生物 |
| CN103820441A (zh) * | 2014-03-04 | 2014-05-28 | 黄行许 | CRISPR-Cas9特异性敲除人CTLA4基因的方法以及用于特异性靶向CTLA4基因的sgRNA |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening;NE Sanjana et al;《Nature Methods》;20140831;第11卷(第8期);第783-784页 * |
| NM_003153.4;Anonymous;《GenBank》;20160313;第1-13页 * |
| RNA-Guided Human Genome Engineering via Cas9;Prashant Mali et al;《SCIENCE》;20130215;第339卷;第823-826页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN106222177A (zh) | 2016-12-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN106222177B (zh) | 一种靶向人STAT6的CRISPR-Cas9系统及其用于治疗过敏性疾病的应用 | |
| US12065667B2 (en) | Modified Cpf1 MRNA, modified guide RNA, and uses thereof | |
| CN107083392B (zh) | 一种CRISPR/Cpf1基因编辑系统及其在分枝杆菌中的应用 | |
| CN103911376B (zh) | CRISPR‑Cas9靶向敲除乙肝病毒cccDNA及其特异性sgRNA | |
| KR102425438B1 (ko) | 서열결정에 의해 평가된 DSB의 게놈 전체에 걸친 비편향된 확인 (GUIDE-Seq) | |
| US20180340176A1 (en) | Crispr-cas sgrna library | |
| CN108410907A (zh) | 一种基于CRISPR/Cas9技术实现HMGCR基因敲除的方法 | |
| CN110747187B (zh) | 识别TTTV、TTV双PAM位点的Cas12a蛋白、植物基因组定向编辑载体及方法 | |
| WO2019227640A1 (zh) | 利用碱基编辑修复fbn1t7498c突变的试剂和方法 | |
| Pu et al. | A CRISPR/LbCas12a‐based method for highly efficient multiplex gene editing in Physcomitrella patens | |
| JP2021528975A (ja) | Ｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓ及びトランスポザーゼを利用した増幅用の組成物、システム、及び方法 | |
| CN112941635A (zh) | 一种提高文库转化率的二代测序建库试剂盒及其方法 | |
| CN116694603A (zh) | 新型的Cas蛋白、Crispr-Cas系统及其在基因编辑领域中的用途 | |
| CN117210437A (zh) | 两种基因编辑工具酶鉴定及其在核酸检测中的应用 | |
| WO2022247629A1 (zh) | 非同源双链寡聚核苷酸片段在基因敲除系统中的应用 | |
| CN116716298A (zh) | 一种引导编辑系统和目的基因序列的定点修饰方法 | |
| Venkatesh et al. | Heat stress induced potato virus X-mediated CRISPR/Cas9 genome editing in Nicotiana benthamiana | |
| CN115948503A (zh) | 基于crispr高效富集靶向序列的方法 | |
| CN113584028B (zh) | 一种用于基因编辑的sgRNA靶点序列、载体、编辑系统和应用 | |
| EP3654763A1 (en) | Plant promoter for transgene expression | |
| CN108085331B (zh) | 用于环状rna过表达的dna框架及其应用 | |
| CN110724712A (zh) | 一种miRNA海绵表达载体的构建方法及其应用 | |
| CN101532181B (zh) | 原位构建基因突变文库的方法及试剂盒 | |
| CN117363644B (zh) | Vigs沉默效率报告质粒、评价沉默效率的方法及应用 | |
| CN108060160A (zh) | 一种用于fish探针标记的bac-dna的快速制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| TA01 | Transfer of patent application right | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20180525 Address after: 211500 Jiangbei new district, Nanjing, Jiangsu, the three phase of A01 accelerator in the bio pharmaceutical valley area. Applicant after: Jiangsu collection pharmacy Biotechnology Co., Ltd. Address before: 221116 Xuzhou Normal University, 101 Shanghai Road, Copper Mt. New District, Xuzhou, Jiangsu Applicant before: Li Meng |
|
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CP03 | Change of name, title or address | ||
| CP03 | Change of name, title or address |
Address after: No.12, Xuefu Road, Jiangbei new district, Nanjing, Jiangsu Province, 210000 Patentee after: Jiangsu Jicui Yaokang Biotechnology Co., Ltd Address before: 211500 Jiangbei new district, Nanjing, Jiangsu, the three phase of A01 accelerator in the bio pharmaceutical valley area. Patentee before: GEMPHARMATECH Co.,Ltd. |