CN115786590A - Sars相关冠状病毒全基因组获取方法及扩增引物和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及冠状病毒技术领域，尤其是一种SARS相关冠状病毒全基因组获取方法及扩增引物和试剂盒，该方法针对SARS相关冠状病毒全基因组序列保守区域设计了扩增引物，进行一步法RT‑PCR，产物进行NGS测序获取全基因组序列。本发明针对SARS‑CoV‑1簇和SARS‑CoV‑2簇各设计一套引物，提高了扩增的特异性。本发明可以直接获取未知的野生动物来源的SARS相关冠状病毒全基因组序列，还大量减少了NGS测序的成本。该方法有效提高了SARS相关冠状病毒的进化分析工作、溯源研究、流行病学调查等领域的研究效率，适于大范围推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及冠状病毒技术领域，具体领域为Sarbecovirus亚属中SARS相关冠状病毒全基因组序列的获取方法，尤其适用于样本中病毒含量低或者未知序列(如野生动物拭子样本)SARS样冠状病毒的全基因组序列的获取。
背景技术
人们对SARS相关冠状病毒(含SARS-CoV-1和SARS-CoV-2)的研究越来越多。冠状病毒是一类单股正链RNA病毒，可被分为α、β、γ和δ四个属。SARS-CoV-1和SARS-CoV-2是β属Sarbecavirus亚属中的SARS相关冠状病毒的成员。研究表明，自然界其他物种中(如蝙蝠和穿山甲)存在大量遗传多样的SARS相关冠状病毒。
研究人员通过长达十几年的调查，先后发现了蝙蝠携带有SARS-CoV-1相关冠状病毒，成功分离利用SARS-CoV-1同源受体人血管紧张素转化酶2(ACE2)的SARS-CoV-1相关冠状病毒，并且发现了一系列遗传多样的SARS-CoV-1相关冠状病毒，系统的解答了SARS-CoV-1来源于蝙蝠这一科学问题。
而SARS-CoV-2的溯源问题一直备受关注，野生动物携带的SARS相关冠状病毒的流行病学调查工作和全基因组的获取工作显得尤为重要。
目前，已有的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的全基因组捕获方法基本上都是针对已知的SARS-CoV-2。如CN111118226A公开了一种新型冠状病毒全基因组捕获方法、引物组以及试剂盒，其技术思路正是针对已知的SARS-CoV-2分离毒株基因组全序列设计了98对叠瓦式PCR扩增引物。但是这种方法只能获得已知毒株的SARS-CoV-2全基因组序列，不适用于遗传距离较远的SARS-CoV-2相关冠状病毒全基因组序列的获取。
另外，传统的RNA直接测序获取方法在病毒极低含量样品中或者距离已知病毒相似度较低时，常常伴随有个别片段或者部分区域二代测序reads覆盖度较低的情况(gaps)产生，需要结合一代Sanger测序的方法来验证和补充这些区域，由此产生了大量补充gap的工作量。
综上所述，为了获取更多未知的野生动物来源的SARS相关冠状病毒的全基因组序列，有必要建立一种更为快速、有效的SARS相关冠状病毒全基因组的获取方法。
发明内容
针对未知的野生样本来源的SARS相关冠状病毒，本发明提供了一种SARS相关冠状病毒全基因组获取方法及扩增引物和试剂盒。通过本发明方法获得的全基因组序列中gap较为集中，补充gap的工作量比常规二代测序工作量更少，且仅需要较少的RNA样本和NGS数据量，在节约成本、提高效率的同时，也节约了宝贵的核酸及样本。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种SARS相关冠状病毒全基因组的扩增引物，包括SARS-CoV-1簇全基因组扩增引物和/或SARS-CoV-2簇全基因组扩增引物，所述SARS-CoV-1簇全基因组扩增引物共13对，序列如SEQ ID NO：1-26所示，所述SARS-CoV-2簇全基因组扩增引物共13对，序列如SEQ IDNO：27-52所示。
本发明还提供了一种试剂盒，其中包括SARS-CoV-1簇全基因组扩增引物和/或SARS-CoV-2簇全基因组扩增引物，所述SARS-CoV-1簇全基因组扩增引物共13对，序列如SEQID NO：1-26所示，所述SARS-CoV-2簇全基因组扩增引物共13对，序列如SEQ ID NO：27-52所示。
一种SARS相关冠状病毒全基因组的获取方法，包括以下步骤：
(1)RNA提取：将样本中的SARS相关冠状病毒进行病毒核酸提取；
(2)PCR扩增：使用针对SARS-CoV-1簇设计的13对扩增引物，序列如SEQ ID NO：1-26所示；或者针对SARS-CoV-2簇设计的13对扩增引物，序列如SEQ ID NO：27-52所示，采用RT-PCR扩增体系，进行多重PCR扩增；
(3)测序：将PCR产物直接用于高通量测序或者保存至-20℃以备后续高通量测序。
其中，所述步骤(1)中，使用QIAamp Viral RNA Mini Kit核酸提取试剂盒进行病毒核酸的提取。
其中，所述步骤(2)中，将SARS-CoV-1簇或SARS-CoV-2簇的全长划分为13个片段，将13个片段分为3个PCR反应管进行扩增，每个PCR反应管扩增4或5个片段。所述片段的划分方法为将约30kb的全基因组划分为13个长度约为2500-3000bp的小片段，每个小片段间有约300bp的重叠区域；可以覆盖遗传多样的SARS相关冠状病毒。
其中，片段1、3、5、7和9在同一个PCR管中进行扩增；片段2、4、10和12在同一个PCR管中进行扩增；片段6、8、11和13在同一个PCR管中进行扩增。
其中，所述步骤(3)中，使用PrimeScriptTMII High Fidelity One Step RT-PCRKit试剂盒进行多重PCR扩增，25μL PCR体系中包含2×One Step High Fidelity Buffe12.5μL，PrimeScript II RT Enzyme Mix 0.5μL，PrimeSTAR GXL for 1step RT-PCR 2μL，引物20μM各0.15μL，Botine 2.5μL，RNA 2μL，NFW补至25μL。
反应条件为：45℃反转录15min，94℃预变性2min；98℃变性10s，55℃退火15s，68℃延伸2min，共8个循环；98℃变性10s，55℃退火15s，68℃延伸2min，共27个循环；68℃再延伸5min。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)因野生动物来源的病毒可能与已知的序列亲缘关系较远且含量低，为了提高全基因组的获取工作，本发明针对SARS相关冠状病毒的保守区域设计了扩增引物，通过结合RT-PCR技术和二代测序技术来获取SARS相关冠状病毒全基因组序列，同时降低了成本。
(2)本发明针对SARS-CoV-1簇和SARS-CoV-2簇各设计一套引物用于扩增，提高了扩增的特异性。利用本发明方法通常可直接获得未知的野生动物来源的SARS相关冠状病毒全基因组序列，即使存在gaps，其位置相对集中，省去了大量人工补充散在gaps的工作量。
(3)本发明大大提高了获取未知野生动物来源的SARS相关冠状病毒全基因组序列的可能，还大量减少了NGS测序的成本。该方法有效提高了SARS相关冠状病毒的进化分析工作、溯源研究、流行病学调查等领域的研究效率，适于大范围推广应用。
附图说明
图1为SARS-CoV-1扩增模式图。
图2为样品1通过RNA直接测序获得全基因组序列，通过Genious软件与参考序列比对的结果。
图3为样品1采用本发明方法获得全基因组序列，通过Genious软件与参考序列比对的结果。
图4为样品2通过RNA直接测序获得全基因组序列，通过Genious软件与参考序列比对的结果。
图5为样品2采用本发明方法获得全基因组序列，通过Genious软件与参考序列比对的结果。
图6为样品3采用本发明方法获得全基因组序列，通过Genious软件与参考序列比对的结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种SARS相关冠状病毒全基因组的获取方法，包括以下步骤：
(1)RNA提取：使用QIAamp Viral RNA Mini Kit核酸提取试剂盒进行病毒核酸的提取。
(2)PCR扩增
将Sarbecovirus分为两大簇，即SARS-CoV-1簇和SARS-CoV-2簇，分别设计全基因组引物，具体引物序列信息见表1和表2。针对SARS-CoV-1簇设计的13对扩增引物，序列如SEQ ID NO：1-26所示；或者针对SARS-CoV-2簇设计的13对扩增引物，序列如SEQ ID NO：27-52所示。
表1 SARS-CoV-1簇全基因组扩增引物信息
表2 SARS-CoV-2簇全基因组扩增引物信息
将SARS-CoV-1簇和SARS-CoV-2簇的全长均划分为13个片段，将13个片段分为3个PCR反应管中进行扩增，每个PCR反应管扩增4/5个片段，片段的划分方法为：将约30kb的全基因组划分为13个长度约为2500-3000bp的小片段，每个小片段间有约300bp的重叠区域。
片段划分及扩增模式图(以SARS-CoV-1为例，见图1)，每种颜色代表在同一个PCR管中扩增，即片段1、3、5、7和9在一个PCR管中进行扩增，片段2、4、10和12在一个PCR管中进行扩增，片段6、8、11和13在一个PCR管中进行扩增。
使用PrimeScriptTM II High Fidelity One Step RT-PCR Kit试剂盒进行多重PCR扩增，25μL PCR体系中包含2×One Step High Fidelity Buffe 12.5μL，PrimeScriptII RT Enzyme Mix 0.5μL，PrimeSTAR GXL for1 step RT-PCR 2μL，引物(20μM)各0.15μL，Botine 2.5μL，RNA 2μL，NFW补至25μL。
反应条件为：45℃反转录15min，94℃预变性2min；98℃变性10s，55℃退火15s，68℃延伸2min，共8个循环；98℃变性10s，55℃退火15s，68℃延伸2min，共27个循环；68℃再延伸5min。
(3)测序：将PCR产物直接用于高通量测序或者保存至-20℃以备后续高通量测序。
PCR产物样本利用华大基因的测序技术进行高通量测序，即利用MGIEasy FS DNALibrary Prep Set(96RXN)(Cat.No.:1000006988)进行DNA库的建立，利用MGISEQ-2000平台形成150bp的序列原始数据。
应用实例1
针对样品1(蝙蝠肛拭子来源的SARS-CoV-1阳性样本ct值：23)将本发明上述的全基因组序列获取方法与常规RNA直接测序进行对比。
通过RNA直接测序，直接获得全基因组序列，NGS原始数据：16.01G，通过Genious软件与参考序列比对的结果，如图2所示。
采用本发明上述的全基因组序列获取方法，通过先进行PCR反应特异性扩增再NGS测序获得全基因组序列，如SEQ ID NO:53所示，NGS原始数据：1.74G，通过Genious软件与参考序列比对的结果，如图3所示。
应用实例2
针对样品2(蝙蝠肛拭子来源的SARS-CoV-1阳性样本，ct值：29)将本发明上述的全基因组序列获取方法与常规RNA直接测序进行对比。
通过RNA直接测序，由于样本中病毒含量较低，未直接获得全基因组序列，且gaps较分散，NGS原始数据：12.10G，通过Genious软件与参考序列比对的结果，如图4所示。
采用本发明上述的全基因组序列获取方法，通过先扩增再NGS测序获得全基因组序列，如SEQ ID NO:54所示，NGS原始数据：1.55G，通过Genious软件与参考序列比对的结果，如图5所示。
应用实例3
针对样品3(SARS-CoV-2阳性样本，ct值：24)采用本发明上述的全基因组序列获取方法，通过先进行PCR反应特异性扩增再NGS测序获得全基因组序列，如SEQ ID NO:55所示，NGS原始数据：1.23G，通过Genious软件与参考序列比对的结果，如图6所示。
通过上述实例可以看出，采用本发明针对SARS-CoV-1簇和SARS-CoV-2簇设计的扩增引物以及全基因组序列获取方法，既减少了NGS数据量，又减少了大量补充gaps的工作任务，大大提高了工作效率。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (9)
1.一种SARS相关冠状病毒全基因组的扩增引物，其特征在于：包括SARS-CoV-1簇全基因组扩增引物和/或SARS-CoV-2簇全基因组扩增引物，所述SARS-CoV-1簇全基因组扩增引物共13对，序列如SEQ ID NO：1-26所示，所述SARS-CoV-2簇全基因组扩增引物共13对，序列如SEQ ID NO：27-52所示。
2.一种试剂盒，其特征在于：包括SARS-CoV-1簇全基因组扩增引物和/或SARS-CoV-2簇全基因组扩增引物，所述SARS-CoV-1簇全基因组扩增引物共13对，序列如SEQ ID NO：1-26所示，所述SARS-CoV-2簇全基因组扩增引物共13对，序列如SEQ ID NO：27-52所示。
3.一种SARS相关冠状病毒全基因组的获取方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)RNA提取：将样本中的SARS相关冠状病毒进行病毒核酸提取；
(2)PCR扩增：使用针对SARS-CoV-1簇设计的13对扩增引物，序列如SEQ ID NO：1-26所示；或者针对SARS-CoV-2簇设计的13对扩增引物，序列如SEQ ID NO：27-52所示，采用RT-PCR扩增体系，进行多重PCR扩增；
(3)测序：将PCR产物直接用于高通量测序或者保存至-20℃以备后续高通量测序。
4.根据权利要求3所述的SARS相关冠状病毒全基因组的获取方法，其特征在于：所述步骤(1)中，使用QIAamp Viral RNA Mini Kit核酸提取试剂盒进行病毒核酸的提取。
5.根据权利要求3所述的SARS相关冠状病毒全基因组的获取方法，其特征在于：所述步骤(2)中，将SARS-CoV-1簇或SARS-CoV-2簇的全长划分为13个片段，将13个片段分为3个PCR反应管进行扩增，每个PCR反应管扩增4或5个片段。
6.根据权利要求5所述的SARS相关冠状病毒全基因组的获取方法，其特征在于：所述片段的划分方法为：将全基因组划分为13个长度2500-3000bp的小片段，每个小片段间有250～350bp的重叠区域。
7.根据权利要求6所述的SARS相关冠状病毒全基因组的获取方法，其特征在于：片段1、3、5、7和9在同一个PCR反应管中进行扩增；片段2、4、10和12在同一个PCR管中进行扩增；片段6、8、11和13在同一个PCR反应管中进行扩增。
8.根据权利要求3所述的SARS相关冠状病毒全基因组的获取方法，其特征在于：所述步骤(3)中，使用PrimeScriptTMII High Fidelity One Step RT-PCR Kit试剂盒进行多重PCR扩增，25μL PCR体系中包含2×One Step High Fidelity Buffe 12.5μL，PrimeScript IIRT Enzyme Mix 0.5μL，PrimeSTAR GXL for 1 step RT-PCR 2μL，引物20μM各0.15μL，Botine 2.5μL，RNA 2μL，NFW补至25μL。
9.根据权利要求8所述的SARS相关冠状病毒全基因组的获取方法，其特征在于：所述步骤(3)中，反应条件为：45℃反转录15min，94℃预变性2min；98℃变性10s，55℃退火15s，68℃延伸2min，共8个循环；98℃变性10s，55℃退火15s，68℃延伸2min，共27个循环；68℃再延伸5min。
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