CN114351261B - 基于纳米孔测序平台的呼吸道样本难检病原微生物的检测方法 - Google Patents

基于纳米孔测序平台的呼吸道样本难检病原微生物的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种纳米孔测序平台的呼吸道样本难检病原的检测方法。本发明方法结合纳米孔测序平台的优势，对建库流程进行优化，显著提高呼吸道样本难检病原检出的灵敏度，同时实现DNA+RNA单一流程同时检测，具备更强目标性和时效性，作为宏基因组的重要补充，适用于临床推广应用。

Description

基于纳米孔测序平台的呼吸道样本难检病原微生物的检测 方法
技术领域
本发明属于微生物检测领域，具体涉及一种基于纳米孔测序平台的呼吸道样本难检菌和病毒的检测方法。
背景技术
感染性疾病是造成人类疾病和死亡的重要原因。WHO发布的“2019年全球十大健康威胁”中6个与感染性疾病相关，其中多数感染性疾病病因不明，不完善的病原学依据增加了诊疗的困难。在感染类疾病中，呼吸系统感染的疾病负担仍然高居全球疾病负荷排行榜的前列，且是主要致死原因之一。各类病原微生物均可引起呼吸道感染，快速准确的病原检测是实现呼吸道感染疾病有效诊治的关键，但超过50％的患者未能诊断出明确的致病微生物。
结核分枝杆菌(Mycobacterium Tuberculosis，MTB)每年在全球新增病例超过1000万例，死亡人数约170万人，其感染是威胁人类健康的公共卫生问题之一，早期确诊是患者得到及时救治以及减少MTB传播的重要基础。曲霉真菌引起人类一系列临床疾病，包括过敏性曲霉病(全球超过1000万)、慢性肺和鼻窦曲霉病(全球约300万)、侵袭性曲霉病(每年发病率>30万)，早期诊断、物种鉴定和适当的抗真菌治疗是治疗该疾病的关键要素，尤其是在进展非常迅速的肺侵袭性曲霉病病例中。耶氏肺孢子菌(Pneumocystis jirovecii)主要引起肺部感染，称为耶氏肺孢子虫肺炎(pneumocystis carinii pneumonitis，PCP)。PCP是各类免疫力低下人群最常见的机会感染性疾病，该病死亡率高，及时诊断和治疗是关键。
呼吸道病毒感染的现状会导致一些并发症以及病死率。呼吸道病毒感染最大的两个特点：1)不同的呼吸道病毒的临床表现无法通过临床症状、体征进行区分。不同的病毒临床表现可能是相同的，同一个病毒临床表现多种多样，单纯的通过临床症状区分病原非常具有挑战性；2)暴发和大流行：通过空气飞沫引起快速的暴发和大流行。从2003年的重症急性呼吸综合征SARS、2009年新型甲型H1N1流感病毒、2012年中东呼吸窘迫综合征病毒、2013年高治病性H7N9禽流感病毒、2019年新型冠状病毒的大流行。新发突发呼吸道传染病严重危害人民健康以及社会稳定。
新冠疫情后，Illumina二代和Nanopore三代测序在全球发展的如火如荼，但应用于微生物检测存在以下问题：首先，难检菌(结核分枝杆菌、曲霉、耶氏肺孢子菌)其细胞壁厚，病原破壁难度高，核酸提取效率低，导致宏基因组检出率低。《宏基因组高通量测序技术应用于感染性疾病病原检测中国专家共识》共识33条也建议对于在核酸提取过程中破壁困难的微生物即使在检测报告中读长数较低，也要考虑其为致病微生物的可能，并采用其他方法验证。《中国宏基因组学第二代测序技术检测感染病原体的临床应用专家共识》推荐意见25也说明对于结核分枝杆菌以及具有细胞壁的真菌，二代测序的检测效能会相对降低。其次，临床样本中的宿主核酸相比，病毒核酸的丰度相对较低，宏基因组对其检出灵敏度也较低。当病毒载量较低时，当前无论是Illumina二代还是Nanopore的三代宏基因组测序均会出现假阴性，在灵敏度方面不如PCR。同时《中国宏基因组学第二代测序技术检测感染病原体的临床应用专家共识》推荐意见指出，仅在不能排除RNA病毒感染时推荐进行RNA二代测序。
此外，无论是Illumina二代还是Nanopore的三代宏基因组测序平台常规的RNA建库需要单独RNA病毒提取，进行逆转录，再进行后续建库操作。这种RNA和DNA病毒流程分开操作繁琐、时间长，也无法实现DNA+RNA单一流程快速同时检测，不能满足感染样本对于时效性的需求。
综上，对于呼吸道样本重点关注病原和病毒宏基因组检测灵敏度的痛点问题，急需目标性和时效性更强的富集方法能快速、准确的鉴定出感染病原体。基于以上，提出本发明。
发明内容
针对上述呼吸道样本在难检病原细菌、真菌和病毒检出的临床痛点问题，本发明拟解决的核心问题是寻求一种能够快速针对呼吸道样本难检病原微生物快速富集及其检测方法，从而提高难检病原和病毒检出的灵敏度，能快速、准确的鉴定出感染病原微生物。本发明针对呼吸道样本创新性提出宏+靶双测序体系鉴定病原一网打尽，宏流程检测所有DNA病原，靶向Panel富集难检微生物，作为宏基因组检测的重要补充。
本方法属于靶向Panel富集体系，聚焦临床呼吸道样本难检且重点关注的结核分枝杆菌、曲霉、耶氏肺孢子菌病原以及低丰度的DNA/RNA病毒，通过设计特异性引物，对目标病原微生物进行正向富集，结合纳米孔测序平台的优势，基于ONT PCR条形码试剂盒(SQK-PBK004)，巧妙利用其自带的条码连接设计的特异性引物(上游引物5’–TTTCTGTTGGTGCTGATATTGC–目标病原微生物特异性引物-3’，下游引物5’–ACTTGCCTGTCGCTCTATCTTC-目标病原微生物特异性引物–3’)，引入两轮PCR(目标病原微生物扩增PCR和BP接头连接PCR)，创新性的实现临床对于呼吸道样本重点关注病原微生物单一流程的同时检测。相比网捞鱼式的病原宏基因组，可显著提高呼吸道样本难检菌和病毒的检出灵敏度，靶向富集具备更强的目标性和时效性(TAT，4.5～5小时)，可作为宏基因组的重要补充，适用于临床推广应用。
为实现上述目的，本发明具体采用如下技术方案：
本发明首先提供一种基于纳米孔测序平台的呼吸道样本难检菌和病毒的建库方法，所述方法包括如下步骤：
步骤1)核酸提取；
步骤2)目的片段PCR扩增；
步骤3)BP接头连接PCR扩增；
步骤4)混库。
进一步的，所述方法是基于ONT PCR条形码试剂盒SQK-PBK004。
进一步的，所述步骤2)中的PCR扩增的引物为：
上游引物：5’–TTTCTGTTGGTGCTGATATTGC–目标病原微生物特异性引物–3’，
下游引物：5’–ACTTGCCTGTCGCTCTATCTTC–目标病原微生物特异性引物–3’。
进一步的，本发明所述的呼吸道样本难检菌包括真菌、细菌和/或病毒；
进一步的，呼吸道样本难检菌包括结核分枝杆菌(胞内菌)、曲霉(真菌)、耶氏肺孢子菌(真菌)临床重点关注病原。
进一步的，呼吸道样本病毒包括呼吸道常见的DNA病毒和RNA病毒。临床样本宿主含量高、病毒载量低，宏基因组对其检出灵敏度也较低。DNA病毒包括腺病毒和疱疹病毒。RNA病毒包括冠状病毒、流感病毒、副流感病毒、肠病毒、鼻病毒、人偏肺病毒以及呼吸道合胞病毒。
进一步的，针对真菌和细菌，核酸提取为DNA核酸提取；针对DNA病毒和/或RNA病毒，核酸提取为DNA+RNA核酸共提取。
进一步的，所述方法实现了DNA+RNA单一流程同时检测。
进一步的，步骤1)呼吸道样本难检菌(结核分枝杆菌、曲霉、耶氏肺孢子菌)核酸提取分2步，1是细胞壁破除，2是核酸提取。细胞壁破除，以提高核酸提取效率。细胞壁处理有机械破壁法、酶消化法、液氮研磨法。推荐破壁采用机械法，破壁条件为Lysing Matrix E管FastPrep-24 TM 5G上6m/s震荡40s设置1次。呼吸道病毒核酸提取采用DNA+RNA病毒共提取策略。
进一步的，本发明以ONT PCR条形码试剂盒(SQK-PBK004)为基础，巧妙利用其自带条码接设计的特异性引物(上游引物5’TTTCTGTTGGTGCTGATATTGC–目标病原微生物特异性引物–3’，下游引物5’–ACTTGCCTGTCGCTCTATCTTC–目标病原微生物特异性引物–3’)连进行设计实验，创新的引入两轮PCR(目标病原微生物PCR扩增和BP接头连接PCR)，显著提高了呼吸道样本难检病原检出的灵敏度，具备更强目标性和时效性，作为宏基因组的重要补充，适用于临床推广应用。
进一步的，步骤2)目的片段PCR扩增，通过设计特异性引物，对目标序列进行正向富集。特异性引物设计原则：引物长度18-21bp，GC含量为40％-60％，引物Tm为50-70℃，目的片段长度优选1-5K，覆盖保守区间与可变区间。
进一步的，步骤2)针对真菌、细菌以及DNA病毒的扩增酶优选Takara的GXL DNA Polymerase。
进一步的，步骤2)真菌、细菌以及DNA病毒的靶向富集过程中，PCR扩增反应体系为50μL。
进一步的，步骤2)真菌、细菌以及DNA病毒的靶向富集过程中，PCR扩增反应液配置如下：
组分 体积
5×PrimeSTAR GXL Buffer 10μL
dNTP Mixture(2.5mM each) 4μL
Primer 1 0.1-0.4μM
Primer 2 0.1-0.4μM
Template 10μL
PrimeSTAR GXL DNA Polymerase 2μL
Nuclease-free water Up to 50μL
在一些具体实施方式中，步骤2)真菌、细菌以及DNA病毒的靶向富集过程中，PCR扩增条件如下：
进一步的，步骤2)RNA病毒的逆转录以及扩增酶选用Takara的PrimeScriptTMIIHigh Fidelity One Step RT-PCR Kit中的PrimeScript II RT Enzyme Mix，逆转录反应10分钟，在一个反应管中连续进行逆转录+PCR一步扩增反应(PrimeSTAR GXL for 1stepRT-PCR)，避免了常规RNA病毒建库需要两步法(逆转录+PCR分开操作)，节约了全流程建库时间，提高了时效性。
进一步的，步骤2)RNA病毒逆转录以及PCR扩增反应体系为50μL。
进一步的，步骤2)RNA病毒逆转录以及PCR扩增反应液配置如下：
组分 体积
2×One Step High Fidelity Buffer 25μL
PrimeScript II RT Enzyme Mix 1μL
PrimeSTAR GXL for 1step RT-PCR 4μL
Primer 1 0.1-0.4μM
Primer 2 0.1-0.4μM
Template 10μL
Nuclease-free water Up to 50μL
进一步的，步骤2)RNA病毒逆转录以及PCR扩增反应条件如下：
进一步的，步骤3)中，BP接头连接PCR扩增配优选Takara的GXL DNAPolymerase配置体系如下：
在一些具体实施方式中，步骤3)BP接头连接PCR扩增反应程序如下：
进一步的，步骤4)混库，经过两轮PCR(目标病原微生物扩增PCR和BP接头连接PCR)，根据纯化后的产物浓度，按照数据产出要求成比例混库。保持混库总量在400～1800ng。
与现有技术相比，本发明至少具有如下优势：
1.常规检测流程中RNA病毒和DNA病毒流程分开，不能实现DNA+RNA单一流程同时检测，时效性差。本发明对目标病原微生物进行正向富集，结合纳米孔测序平台的优势，基于ONT PCR条形码试剂盒(SQK-PBK004)，巧妙利用其自带的条码连接设计的特异性引物，引入两轮PCR(目标病原微生物扩增PCR和BP接头连接PCR)，并通过多重酶的选择，创新性的实现临床对于呼吸道样本重点关注病原微生物DNA+RNA单一流程的同时检测，具备更强的目标性和时效性(TAT，4.5-5小时)，作为宏基因组的重要补充，适用于临床推广应用。
2.难检病原真菌或细菌(结核分枝杆菌、曲霉、耶氏肺孢子菌)其细胞壁厚，病原破壁难度高，核酸提取效率低，导致宏基因组检出率低；难检病毒类(DNA病毒、RNA病毒)核酸的丰度相对较低，宏基因组对其检出灵敏度也较低；针对以上目标病原微生物检测过程中痛点问题，本发明通过试验设计，对目标病原微生物进行正向靶向富集，结合纳米孔测序平台的优势，对建库流程进行优化(包括括酶、反应体系、反应条件等)，显著提高了呼吸道样本难检病原(结核分枝杆菌、曲霉、耶氏肺孢子菌、DNA病毒、RNA病毒)检出的灵敏度。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1、本发明的实验流程图；
图2、10种DNA扩增酶以HCMV_10copies为模板的扩增效率比较图。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下术语或定义仅仅是为了帮助理解本发明而提供。这些定义不应被理解为具有小于本领域技术人员所理解的范围。
除非在下文中另有定义，本发明具体实施方式中所用的所有技术术语和科学术语的含义意图与本领域技术人员通常所理解的相同。虽然相信以下术语对于本领域技术人员很好理解，但仍然阐述以下定义以更好地解释本发明。
如本发明中所使用，术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”或“涉及”为包含性的(inclusive)或开放式的，且不排除其它未列举的元素或方法步骤。术语“由…组成”被认为是术语“包含”的优选实施方案。如果在下文中某一组被定义为包含至少一定数目的实施方案，这也应被理解为揭示了一个优选地仅由这些实施方案组成的组。
在提及单数形式名词时使用的不定冠词或定冠词例如“一个”或“一种”，“所述”，包括该名词的复数形式。
本发明中的术语“大约”、“大体”表示本领域技术人员能够理解的仍可保证论及特征的技术效果的准确度区间。该术语通常表示偏离指示数值的±10％，优选±5％。
此外，说明书和权利要求书中的术语第一、第二、第三、(a)、(b)、(c)以及诸如此类，是用于区分相似的元素，不是描述顺序或时间次序必须的。应理解，如此应用的术语在适当的环境下可互换，并且本发明描述的实施方案能以不同于本发明描述或举例说明的其它顺序实施。
本发明所述的基于纳米孔测序平台的呼吸道样本难检难检病原的建库方法大体包括如图1所示：
步骤1)核酸提取；
步骤2)目的片段PCR扩增；
步骤3)BP接头连接PCR扩增；
步骤4)混库。
在一些实施方式中，本发明所述的呼吸道样本难检菌包括真菌、细菌和/或病毒；
在一些具体实施方式中，呼吸道样本难检菌包括结核分枝杆菌(胞内菌)、曲霉(真菌)、耶氏肺孢子菌(真菌)临床重点关注病原，早期确诊是患者得到及时救治的重要基础。一方面这些病原临床培养困难或无法在体外进行培养；另一方面其细胞壁坚韧，病原破壁难度高，核酸提取效率低，宏基因流程检出率低。
在一些具体实施方式中，呼吸道样本病毒包括呼吸道常见的DNA病毒和RNA病毒。临床样本宿主含量高、病毒载量低，宏基因组对其检出灵敏度也较低。DNA病毒包括腺病毒和疱疹病毒。RNA病毒包括冠状病毒、流感病毒、副流感病毒、肠病毒、鼻病毒、人偏肺病毒以及呼吸道合胞病毒。
在一些具体实施方式中，针对真菌和细菌，核酸提取为DNA核酸提取；针对DNA病毒和/或RNA病毒，核酸提取为DNA+RNA核酸提取。
在一些具体实施方式中，步骤1)呼吸道样本难检菌(结核分枝杆菌、曲霉、耶氏肺孢子菌)核酸提取分2步，1是细胞壁破除，2是核酸提取。细胞壁破除，以提高核酸提取效率。细胞壁处理有机械破壁法、酶消化法、液氮研磨法。推荐破壁采用机械法，破壁条件为Lysing Matrix E管FastPrep-24 TM 5G上6m/s震荡40s设置1次。呼吸道病毒核酸提取采用DNA+RNA病毒共提取策略。
在一些具体实施方式中，本发明以ONT PCR条形码试剂盒(SQK-PBK004)为基础，巧妙利用其自带的条码接设计的特异性引物(上游引物5’–TTTCTGTTGGTGCTGATATTGC–目标病原微生物特异性引物–3’，下游引物5’–ACTTGCCTGTCGCTCTATCTTC–目标病原微生物特异性引物–3’)(对应下文primer1和2)连进行设计实验，引入两轮PCR(目标原微生物PCR和BP接头连接PCR)。
在一些具体实施方式中，步骤2)目标原微生物PCR扩增，通过设计特异性引物，对目标序列进行正向富集。特异性引物设计原则：引物长度18-21bp，GC含量为40％-60％，引物Tm为50-70℃，目的片段长度优选1-5K，覆盖保守区间与可变区间。
在一些具体实施方式中，步骤2)针对真菌、细菌以及DNA病毒的扩增酶优选Takara的GXL DNA Polymerase。
在一些具体实施方式中，步骤2)真菌、细菌以及DNA病毒的靶向富集过程中，PCR扩增反应体系为50μL。
在一些具体实施方式中，步骤2)真菌、细菌以及DNA病毒的靶向富集过程中，PCR扩增反应液配置如下：
组分 体积
5×PrimeSTAR GXL Buffer 10μL
dNTP Mixture(2.5mM each) 4μL
Primer 1 0.1-0.4μM
Primer 2 0.1-0.4μM
Template 10μL
PrimeSTAR GXL DNA Polymerase 2μL
Nuclease-free water Up to 50μL
在一些具体实施方式中，步骤2)真菌、细菌以及DNA病毒的的靶向富集过程中，PCR扩增条件如下：
在一些具体实施方式中，步骤2)RNA病毒的逆转录以及扩增选用Takara的PrimeScriptTMII High Fidelity One Step RT-PCR Kit中的PrimeScript II RT EnzymeMix进行逆转录反应10分钟，在一个反应管中连续进行逆转录+PCR一步扩增反应(扩增酶采用PrimeSTAR GXL for 1step RT-PCR)，避免了常规RNA病毒建库需要两步法(逆转录+PCR分开操作)，节约了全流程建库时间，提高了时效性。
在一些具体实施方式中，步骤2)RNA病毒逆转录以及PCR扩增反应体系为50μL。
在一些具体实施方式中，步骤2)RNA病毒逆转录以及PCR扩增反应液配置如下：
组分 体积
2×One Step High Fidelity Buffer 25μL
PrimeScript II RT Enzyme Mix 1μL
PrimeSTAR GXL for 1step RT-PCR 4μL
Primer 1 0.1-0.4μM
Primer 2 0.1-0.4μM
Template 10μL
Nuclease-free water Up to 50μL
在一些具体实施方式中，步骤2)RNA病毒逆转录以及PCR扩增反应条件如下：
在一些具体实施方式中，步骤3)中，BP接头连接PCR扩增配优选Takara的GXL DNA Polymerase配置体系如下：
在一些具体实施方式中，步骤3)BP接头连接PCR扩增反应程序如下：
在一些具体实施方式中，步骤4)混库，经过两轮PCR(目标病原微生物扩增PCR和BP接头连接PCR)，根据纯化后的产物浓度，按照数据产出要求成比例混库。保持混库总量在400～1800ng。
在一些具体实施方式中，基于纳ONT PCR条形码试剂盒(SQK-PBK004)为基础，巧妙利用其自带的条码连接设计的特异性引物，引入两轮PCR(目的片段扩增PCR和接头连接PCR)。示例性的，如下为一种特定的基于纳米孔测序的建库方法，其不对本发明保护范围作限制。
本发明所述的宏基因组鉴定方法可应用于包括但不限于临床研究和科学研究等领域。
如下为本发明具体的实施方式。
下述实施例和实验例涉及的仪器包括：生物安全柜、震荡金属浴、移液器、离心机、打断破碎仪、超净台、PCR仪、磁力架、GridION、Qubit 4.0、冰箱等。
涉及的试剂包括：核酸提取试剂盒、Takara的GXL DNA Polymerase、Takara的PrimeScriptTMII High Fidelity One Step RT-PCR Kit、建库PCR扩增酶、ONT建库试剂盒、AMPure XP纯化磁珠、QubitTM检测试剂盒、ONT测序芯片、人巨细胞病毒(HCMV)液体室内质控品(广州邦德盛)、人副流感3型病毒液体室内质控品(PIV3)(广州邦德盛)等。
实施例1本发明性能优化和参数探索
本发明以ONT PCR条形码试剂盒(SQK-PBK004)为基础进行设计实验，巧妙利用其自带的条码连接设计了特异性引物(上游引物5’–TTTCTGTTGGTGCTGATATTGC–目标病原微生物特异性引物–3’，下游引物5’–ACTTGCCTGTCGCTCTATCTTC–目标病原微生物特异性引物–3’)，创新性的引入两轮PCR(目标病原微生物扩增PCR和BP接头连接PCR，而传统是只经1轮靶向富集，1轮靶向富集对扩增效率影响非常大)。此外，对RNA病毒打破常规建库两步法(逆转录+PCR分开操作)，采用在一个反应管中连续进行逆转录+PCR一步扩增反应(得益于上述引物和酶的选择)，节约了建库时间，提高了时效性。创新性的实现临床对于呼吸道样本重点关注病原微生物DNA+RNA单一流程的同时检测，相比网捞鱼式的病原宏基因组，可显著提高呼吸道样本难检菌和病毒检出的灵敏度，靶向富集具备更强的目标性和时效性(TAT，约4.5～5小时)，可作为宏基因组的重要补充，适用于临床推广应用。
1、DNA多重酶的筛选
考虑到靶向富集多重酶的扩增效率、实验精度、以及时间成本等要求非常高，实验中不同型号的扩增酶可能对于病原富集以及建库或者测序的结果产生很大的影响。因此，本发明前期对DNA多重酶进行了筛选。共调研了市面上8个厂家的10种DNA多重酶，以HCMV_10copies为模板进行扩增，定量比较扩增效率。如下图2所示，初步筛选出Toyobo-KODOneTM PCR Master Mix(KMM101)，GXL DNA Polymerase(R050A)。
Toyobo-KOD OneTM PCR Master Mix(KMM101)，GXL DNAPolymerase(R050A)进一步上机测试。
DNA酶 模板 出库量(ng) Reads
Takara-R050A HCMV-10copies/μL 60.5 1175
Toyobo-KMM101 HCMV-10copies/μL 18.4 261
综上，从定量结果以及上机结果，综合考虑选择GXL DNAPolymerase(R050A)作为DNA多重扩增酶。
2、RNA多重酶的筛选
常规RNA病毒建库需要两步法(逆转录+PCR分开操作)，考虑到感染样本对于时效性的要求兼顾扩增效率，本发明在测试了多款市售酶基础上，确定了2款市场上RNA多重酶可以实现在一个反应管中连续进行逆转录+PCR一步扩增反应分别为Takara_PrimeScriptTMII High Fidelity One Step RT-PCR Kit(R026A)，Vazyme_HiScript IIIU+One Step qRT-PCR Probe 5×Master Mix(Q611)。
Vazyme_Q611扩增效率与Takara_R026A差异不显著，但考虑到感染样本的时效性，综合考虑选择Takara_PrimeScriptTMII High Fidelity One Step RT-PCR Kit(R026A)中的PrimeSTAR GXL for 1step RT-PCR和PrimeScript II RT Enzyme Mix作为RNA多重酶。
3、DNA多重酶、RNA多重酶使用条件的优化筛选
前期实验室已经对Takara_PrimeScriptTMII High Fidelity One Step RT-PCRKit(R026A)进行过反应体系和延伸时间筛选为反应体系50μL,延伸时间45s，本部分进一步对接下来对退火温度进行测试。
1)DNA多重酶退火温度确定(针对非RNA病毒)
DNA多重酶测试了反应体系50μL,延伸时间45s条件下52℃、55℃、58℃、61℃四个退火温度，从PCR后产物浓度看55℃、58℃、61℃差异不显著，优选58℃
2)RNA多重酶退火温度确定(针对RNA病毒)
考虑到Takara_PrimeScriptTMII High Fidelity One Step RT-PCR Kit(R026A)与GXL DNA Polymerase(R050A)是类似同款DNA扩增酶，Takara_(R026A)的特色在于逆转录反应10分钟，在一个反应管中连续进行逆转录+PCR一步扩增反应，操作简便且时效性好。因此延用50μL，延伸时间45s条件下，参考退火温度微调，选用2个退火温度58℃和60℃，测试了4个实验组，均是60℃优于58℃。
因此RNA多重酶50μL,延伸时间45s条件下退火温度优选60℃。
实施例2确立本发明方法体系
基于实施例1的优化实验，获得本发明的建库方法体系，本发明以ONT PCR条形码试剂盒(SQK-PBK004)为基础。
一、核酸提取
二、目的片段PCR扩增
1.PCR反应
类型 模板
真菌、细菌 提取DNA核酸
DNA病毒 提取的DNA+RNA核酸
RNA病毒 提取的DNA+RNA核酸
1)真菌、细菌及DNA病毒反应管配置：
组分 体积
5×PrimeSTAR GXL Buffer 10μL
dNTP Mixture(2.5mM each) 4μL
Primer 1 0.1-0.4μM each
Primer 2 0.1-0.4μM each
Template 10μL
PrimeSTAR GXL DNA Polymerase 2μL
Nuclease-free water Up to 50μL
2)真菌、细菌及DNA病毒PCR扩增反应程序：
3)RNA病毒反应管配置
组分 体积
2×One Step High Fidelity Buffer 25μL
PrimeScript II RT Enzyme Mix 1μL
PrimeSTAR GXL for 1step RT-PCR 4μL
Primer 1 0.1-0.4μM each
Primer 2 0.1-0.4μM each
Template 10μL
Nuclease-free water Up to 50μL
4)RNA病毒反应程序
三、纯化
1.特殊病原以及病毒PCR产物混合，加入0.5×的AMPure XP beads室温混匀孵育5min，离心弃上清；
2.80％酒精洗2次beads；
3.加入Nuclease-free water，室温混匀孵育2min。
四、BP接头连接PCR扩增
1.配置体系如下：
组分 体积
5×PrimeSTAR GXL Buffer 10μL
DNA 30μL
BP接头引物 1μL
dNTP Mix 4μL
PrimeSTAR GXL 2μL
Nuclease-free water 补至50μL
2.反应程序如下：
五、纯化和混库
1.加入0.5×AMPure XP beads室温混匀孵育5min，离心弃上清；
2.80％酒精洗2次beads；
3.加入Nuclease-free water，室温混匀孵育2min；
4.混库：根据纯化后的样本浓度，按照数据产出要求成比例混库，保持混库总量在400～1800ng。
六、加接头
1.加入0.5×AMPure XP beads室温混匀孵育5min，离心弃上清；
2.80％酒精洗2次beads；
3.10mM Tris-HCl(50mM NaCl)pH 8.0洗脱液洗脱，室温混匀孵育2min；
4.加入1μL RAP，室温反应5min。
七、按照标准纳米孔测序上机流程上机测序。
实施例3临床样本检测------本发明靶向富集流程与传统宏基因组流程的检测比较
基于实施2本发明的流程，测试了呼吸道临床样本(痰液和肺泡灌洗液)，分别用本发明基于PCR条形码试剂盒(SQK-PBK004)对同一份样本进行靶向富集流程和传统SQK-PBK004宏基因流程进行建库，下机数据比较。
如下表所示，1小时下机数据靶向流程在特殊病原、病毒序列数的检出上明显优于宏基因流程，相比网捞鱼式的病原宏基因组，可显著提高呼吸道样本难检菌和病毒检出的灵敏度，靶向富集具备更强的目标性，对于物种的鉴定可信度大大增加，可作为宏基因组的重要补充，适用于临床推广应用。
实施例4临床样本检测------本发明流程1小时下机数据与mNGS宏基因组测序比较
为了进一步评价本发明的优势，本实施比较了本发明流程和mNGS宏基因组测序的效果。测试了呼吸道临床样本(痰液和肺泡灌洗液),分别进行Illumina二代和Nanopore的三代靶向富集建库上机，从1小时下机数据靶向流程在特殊病原(结核分枝杆菌、烟曲霉)、病毒(EB病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒1型、呼吸道合胞病毒)序列数的检出上可以看出，本发明是明显优于Illumina二代宏基因流程。本发明流程既提高了灵敏度，又兼顾了时效性，可以满足临床感染样本的快检需求。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims (4)

1.一种基于纳米孔测序平台的呼吸道样本难检病原的建库方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
步骤1)核酸提取；
步骤2)目的片段PCR扩增；
步骤3)BP接头连接PCR扩增；
步骤4)混库；
所述建库方法基于ONT PCR条形码试剂盒SQK-PBK004；
所述难检病原包括真菌、细菌和病毒；
所述病毒包括DNA病毒和RNA病毒；所述方法实现DNA+RNA单一流程同时检测；
所述步骤2)中的PCR扩增的引物为：
上游引物：5’–TTTCTGTTGGTGCTGATATTGC–目标病原微生物特异性引物–3’，
下游引物：5’–ACTTGCCTGTCGCTCTATCTTC–目标病原微生物特异性引物–3’；
所述步骤2)中PCR扩增的多重酶包括Takara的GXL DNA Polymerase、PrimeScriptTMII RT Enzyme Mix和PrimeSTAR GXL for 1 step RT-PCR；
所述步骤2)中，针对真菌、细菌以及DNA病毒，所述PCR扩增的多重酶为Takara的GXL DNA Polymerase，PCR扩增体系如下：
组分 体积 5×PrimeSTAR GXL Buffer 10μL dNTP Mixture(2.5mM each) 4μL Primer 1 0.1-0.4μM Primer 2 0.1-0.4μM Template 10μL PrimeSTAR GXL DNA Polymerase 2μL Nuclease-free water Up to 50μL
；
所述步骤2)中，针对RNA病毒，所述PCR扩增在一个反应管中同时连续进行逆转录+PCR一步扩增反应：所述PCR扩增的多重酶包括：逆转录酶Takara的PrimeScriptTMII RT EnzymeMix，和扩增酶PrimeSTAR GXL for 1 step RT-PCR，PCR扩增的体系如下：
组分 体积 2×One Step High Fidelity Buffer 25μL PrimeScript II RT Enzyme Mix 1μL PrimeSTAR GXL for 1 step RT-PCR 4μL Primer 1 0.1-0.4μM Primer 2 0.1-0.4μM Template 10μL Nuclease-free water Up to 50μL
所述步骤3)PCR扩增酶为Takara的GXL DNA Polymerase，基于BP接头引物进行扩增，PCR扩增体系如下：
。
2.根据权利要求1所述的建库方法，其特征在于，所述步骤1)的核酸提取包括DNA和RNA核酸提取；针对真菌和细菌，核酸提取为DNA核酸提取；针对DNA病毒和/或RNA病毒，核酸提取为DNA+RNA核酸共提取；所述步骤1)中还包括细胞壁破除步骤；所述细胞壁破除包括机械破壁法、酶消化法、液氮研磨法。
3.根据权利要求1所述的建库方法，其特征在于，所述步骤2)中，目标病原微生物特异性引物的设计原则为：引物长度18-21bp，GC含量为40％-60％，引物Tm为50-70℃，目的片段长度1-5K，覆盖保守区间与可变区间。
4.一种基于纳米孔测序平台的呼吸道样本难检病原的检测方法，其特征在于，所述方法包括权利要求1所述的方法，并进一步包括对混库后样本上机测序和生信分析。
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